Ortsgerichtete Modifikation von Somatostatin zur Darstellung
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Ortsgerichtete Modifikation von Somatostatin zur Darstellung stimuli-responsiver Biokonjugate DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm vorgelegt von Dipl. Chem. Jessica Thomas aus Ulm 2015 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Joachim Ankerhold 1. Gutachter: Prof. Dr. Tanja Weil 2. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Maas Tag des Promotionskolloquiums: 28.07.2015 . Inhaltsverzeichnis 1 Theoretische Grundlagen 1 1.1 Einleitung 1 1.2 Biomoleküle als selbstassemblierende Liganden 2 1.3 Interkalation in Disulfidbindungen zur ortsgerichteten Modifikation 4 1.4 Das zyklische Modelpeptid Somatostatin 7 1.5 Unterschiedliche Modifizierungswege nach den Methoden des „grafting from“ und „grafting onto“ 11 1.6 Selbstassemblierung 13 1.7 Kronenether und die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen 14 1.8 Übergangsmetall-Komplexe - basierend auf Bipyridin-Liganden 19 1.9 Phenylboronsäuren und deren Komplexbildung mit dem Salicylhydroxamat-System 25 2 Motivation 32 3 Ergebnisse und Diskussion 35 3.1 Somatostatin-Konjugate – Entwicklung nach der grafting onto Methode 36 3.1.1 Entwicklung unterschiedlich funktionalisierter Interkalator-Verbindungen 38 3.1.2 Biokonjugationsreaktionen der Interkalatoren: Somatostatin versus Glutathion 92 3.2 Somatostatin-Konjugate – Entwicklung nach der grafting from Methode 121 3.2.1 Darstellung von Aza-Kronenether-Somatostatin via Click-Reaktion 121 3.2.2 Darstellung von Boronsäure-Somatostatin via Click-Reaktion 123 3.2.3 Darstellung des Salicylhydroxamsäure-Somatostatins via Click-Reaktion 125 3.2.4 Zusammenfassung der Syntheseversuche der Somatostatin-Konjugate nach der grafting from-Methode 3.3 Design multivalenter und stimuli-responsiver Somatostatin-Biokonjugate 127 129 3.3.1 Multivalente Somatostatin-Konjugate 3.3.2 Darstellung responsiver Somatostatin-Konjugate 129 durch ortsgerichtete, supramolekulare Chemie 137 4 Zusammenfassung und Ausblick 142 5 Experimenteller Teil 149 5.1 Allgemeine Vorbemerkungen 149 5.1.1 Arbeitstechniken 149 5.1.2 HPLC-Systeme 149 5.1.3 Analyse-Geräte/Methoden 150 5.1.4 Verwendete Chemikalien 151 5.2 Arbeitsvorschriften 153 5.2.1 Mannich-Salz 154 5.2.2 Bisulfid 155 5.2.3 Bisulfon 156 5.2.4 Boc-TEO-Linker 157 5.2.5 Boc-geschützter Amin-Interkalator 158 5.2.6 Amin-Interkalator 160 5.2.7 Säure-funktionalisierter Aza-Kronenether 161 5.2.8 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante A 162 5.2.9 Boc-geschützter TEO-Aza-Kronenether 164 5.2.10 TEO-Aza-Kronenether 165 5.2.11 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante B 166 5.2.12 Lithiiertes/Stannyliertes Pyridin 168 5.2.13 Methylester-funktionalisiertes 2,2´Bipyridin 169 5.2.14 Säure-funktionalisiertes 2,2´-Bipyridin 170 5.2.15 2,2´-Bipyridin-Säurechlorid 171 5.2.16 2,2´-Bipyridin-Interkalator 172 5.2.17 Geschützter Boronsäure-Interkalator 174 5.2.18 Boronsäure-Interkalator 175 5.2.19 Azido-Transfer-Agent 176 5.2.20 Boc-geschützter Azid-TEO-Linker 177 5.2.21 Azid-TEO-Linker 178 5.2.22 Azid-Bisulfid-Interkalator 179 5.2.23 Azid-Interkalator 181 5.2.24 Salicylhydroxamsäure-Interkalator 183 5.2.25 NHS-aktivierte Pentinsäure 185 5.2.26 Pentinsäure-modifizierter Aza-Kronenether 186 5.2.27 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante C 187 5.2.28 Azid-Somatostatin 189 5.2.29 Aza-Kronenether-Somatostatin 190 5.2.30 Bipyridin-Somatostatin 191 5.2.31 Boronsäure-Somatostatin 192 5.2.32 Salicylhydroxamsäure-Somatostatin 193 5.2.33 Azid-Glutathion 194 5.2.34 Aza-Kronenether-Glutathion 195 5.2.35 Bipyridin-Glutathion 196 5.2.36 Boronsäure-Glutathion 197 5.2.37 Salicylhydroxamsäure-Glutathion 198 5.2.38 Maleimid-modifizierter Aza-Kronenether 199 5.2.39 Maleimid-Aza-Kronenether-Glutathion 200 5.2.40 Somatostatin-Dimer 202 5.2.41 Trimer-Kern-Verbindung 203 5.2.42 Tosylierter Ethinyl-TEO-Linker 204 6 7 5.2.43 TEO-Trimer-Kern-Verbindung 205 Verzeichnisse 206 6.1 Abkürzungsverzeichnis 206 6.2 Liste der synthetisierten Verbindungen 209 6.3 Abbildungsverzeichnis 212 6.4 Tabellenverzeichnis 215 6.5 Schemataverzeichnis 216 Literatur 219 Theoretische Grundlagen | 1 1 Theoretische Grundlagen 1.1 Einleitung Die Entwicklung neuartiger Biomaterialien, basierend auf selbstassemblierenden Peptid- und Protein-Systemen, gewinnt, aufgrund der vielfältigen Eigenschaften, im Feld der NanoBiotechnologie immer mehr an Bedeutung. Ihr Einsatzgebiet erstreckt sich von Nanoröhren[1], über Hydrogele[2] und der Halbleitertechnik[3] bis hin zum medikamentösen Wirkstofftransport[4]. Meist wird dazu ein Konjugat, bestehend aus den Komponenten Biomolekül sowie reaktiver Plattform, entwickelt. Durch die Verknüpfung beider Komponenten entsteht ein System, welches sowohl die biologischen Eigenschaften des Biomoleküls als auch die der gebundenen funktionalen Moleküle in sich vereinigt. Ein wichtiger Schwerpunkt liegt dabei in der Durchführbarkeit einer exakten Kontrolle hinsichtlich gewünschter struktureller und funktionaler Eigenschaften dieser Materialien. An diesem Punkt kann die Selbstassemblierung einen großen Beitrag leisten, da diese auch in der Natur, ohne Eingriff des Menschen, die notwendige Steuerung des Aufbaus bioaktiver Architekturen ermöglicht. Eines von vielen interessanten Beispielen in der Natur, stellen die Metall-gerichteten Protein-Komplexe, wie das Eisen-speichernde Metalloprotein Ferritin, dar. Diese Komplexe werden meist durch Selbstassemblierung aufgebaut und über nicht-kovalente Bindungen miteinander vernetzt.[5] Abbildung 1-1. Oberflächenmodelle a) eines Ferritin-Protein-Komplexes; b) eine der 24 Ferritin-Untereinheiten; c) Metall[5] Bindungsstellen in den Untereinheiten. Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Chemical Biology [5], copyright 2013. 2 | Theoretische Grundlagen 1.2 Biomoleküle als selbstassemblierende Liganden Die Natur und deren Prozesse als Vorbild für neue Forschungen heranzuziehen, führen natürlich zu gewissen Herausforderungen. Denn allein die Entwicklung kleinster organischer Bausteine, welche selbständig eine spontane aber gleichzeitig definierte Organisation eingehen um dabei makroskopische Strukturen, basierend auf nicht-kovalenten Bindungen, auszubilden, stellt oftmals eine Schwierigkeit dar. Die Verwendung von Peptiden und Proteinen als geeignete Bausteine nimmt aufgrund ihrer Komplexität und ihres Einflusses auf den Organismus auch in der Natur einen besonderen Stellenwert ein. Unter den biologischen Molekülen stellen sie die vielfältigste Klasse dar, da aus den über 20 verschiedenen Aminosäuren und den daraus resultierenden Kombinationsmöglichkeiten unzählige Variationen zustande kommen können. Sie spielen dabei im menschlichen Körper in vielen Prozessen, wie Gen-Expression, Stoffwechsel, Transport von kleineren Molekülen oder Rezeptor-Bindung, eine wichtige Rolle.[6,7] Um diese Biomoleküle auch im Labor als geeigneten Baustein einsetzten zu können, müssen diese gezielt modifiziert werden indem eine Plattform eingeführt wird welche mittels eines spezifischen Reizes, wie beispielsweise dem pH-Wert oder der Zugabe von bestimmten Ionen, angesteuert werden kann. Durch die Vielfalt an funktionellen Gruppen und den daraus resultierenden Eigenschaften, waren daher gerade Peptide und Proteine hinsichtlich einer Anwendung in der Selbstassemblierung für Chemiker lange Zeit nicht zugänglich. Heutzutage stellt die einfachste und am häufigsten verwendete Methode der Modifizierung von Proteinen die Funktionalisierung der Aminosäurereste auf der Oberfläche dar. Jedoch führt dies meist nur zu rein statistischer Modifikation, wodurch ein gezielter Aufbau definierter Biokonjugate mittels Selbstassemblierung nicht realisierbar ist. Im Hinblick auf nicht-kovalente Bindungen, stellen auch die oftmals ausgeprägten Protein-ProteinWechselwirkungen ein großes Hindernis dar, wodurch es zu unterwünschten Quervernetzungen kommen kann. Diesem Problem mussten sich auch Tezcan et al. stellen, welche versuchten, Nanoröhren sowie mehrdimensionale kristalline Proteinschichten über Metall-Koordination entsprechender Oberflächenreste monomerer Proteine zu assemblieren. Gesteuert wurden diese Prozesse mittels Metallkonzentration und pH-Wert.[8] Theoretische Grundlagen | 3 Abbildung 1-2. Schematische Darstellung der Zn-vermittelten Dimerisierung des RIDC3-Monomers sowie die Bildung [8] einer helikalen 1D Kette aus RIDC3-Dimeren. Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Chemistry [8], copyright 2012. Eine weitere Schwierigkeit stellt die Erhaltung der biologischen Aktivität der Biomoleküle dar. Diese ist besonders im Hinblick auf eine medizinische Anwendung von großer Bedeutung. Sie beruht meist auf intermolekularen Wechselwirkungen der Reste der Aminosäuren, welche auch für den Aufbau der dreidimensionalen Tertiärstruktur der Proteine verantwortlich sind. Finden nun Modifikationen an den funktionellen Gruppen der Protein-Oberfläche statt, können die Wechselwirkungen und somit die biologische Aktivität beeinflusst werden und es im schlimmsten Fall zu einer Denaturierung des Proteins kommen. Eine Alternative stellt die Modifizierung des grundsätzlichen Aufbaus der Biomoleküle dar. Dazu können eine oder mehrere Aminosäuren entweder durch nicht-native Liganden[9] oder durch entsprechend modifizierte Aminosäuren ersetzt und so eine ortsgerichtete Modifikation ermöglicht werden. Ein Beispiel hierfür, stellt die 2008 von Chmielewski et al. publizierte Forschung zur Metall-getriggerten Selbstassemblierung von Kollagen-PeptidFibern dar. Diese Fibern weisen verschiedene Wiederholungseinheiten auf, beispielsweise die Pro-Hyp-Gly-Abfolge (Prolin-(2S,4R)-4-Hydroxyprolin-Glycin). Die Gruppe ersetzte nun den Hyp-Teil gegen Lysin-OH, welches nachfolgend mit einem Bipyridin verknüpft wurde. Dadurch wurde es ermöglicht einen Tripel-Komplex aus den Kollagen-Fibern durch Zugabe von Eisen(II)-Ionen zu bilden.[10] 4 | Theoretische Grundlagen Abbildung 1-3. a) Aminosäurensequenz des modifizierten H-byp; b) Seitliche Ansicht nach Tripel-Helix-Bildung; c) Ansicht [10] von oben auf einen einzelnen Tripel-Helix-Strang, gefolgt von der Metall-getriggerten Selbstassemblierung. Reprinted with permission from [10], copyright 2008 American Chemical Society. Eine Form der ortsgerichteten Modifikation erlaubt die Interkalation in intramolekulare Disulfidbrücken von Peptiden und Proteinen. Da diese Methode auch die Grundlage dieser Arbeit darstellt, wird diese nun näher erläutert. 1.3 Interkalation in Disulfidbindungen zur ortsgerichteten Modifikation Disulfidbindungen erfüllen je nach Lokalisation im Protein unterschiedliche Aufgaben, wobei sie im hydrophoben Inneren für Struktur und Funktion und in der Nähe der Oberfläche für die Stabilität des Proteins verantwortlich sind.[11] Ein Vorteil ist dabei, dass diese Bindungen in Peptiden und Proteinen nahezu ohne Konkurrenzreaktionen gezielt adressiert werden können, da Cystein als einzige Aminosäure einen reaktiven Thiol-Rest besitzt. Für die Spaltung einer Disulfidbrücke muss ein Reduktionsmittel eingesetzt werden, wobei hier der Einsatz von TCEP oder DDT, welche beide spezifisch Disulfidbindungen angreifen und so auf Schutzgruppen verzichtet werden kann, vorteilhaft ist. TCEP kann außerdem bei Raumtemperatur und wässrigen Lösungsmitteln, sowohl im basischen als auch im sauren Milieu, verwendet werden und muss bei nachfolgenden Reaktionen nicht als Störfaktor entfernt werden. Diese Eigenschaften sind damit ideal für einen Einsatz in der Proteinchemie.[12,13] Unter dem Vorgang der Interkalation in Disulfidbindungen versteht man im Allgemeinen die reduktive Spaltung der Bindung gefolgt von dem Einbau einer Verbindung, dem sogenannten Interkalator, und einem darauffolgenden Wiederaufbau der zuvor gespaltenen Theoretische Grundlagen | 5 Disulfidbrücke über das Interkalator-Molekül hinweg. Der Ursprung der Interkalatoren geht zurück auf Nelson und Lawton im Jahre 1966.[14] Sie stellten Verbindungen vor, welche alle dem nachfolgend dargestellten Aufbau zugrunde liegen und heutzutage unter der Bezeichnung des Michael-Akzeptors bekannt sind: Abbildung 1-4. Allgemeiner Aufbau eines Michael-Akzeptors, wobei W (blau) für eine elektronenziehende Gruppe und X (rot) für eine Abgangsgruppe steht. [14] Diese weisen jeweils eine elektronenziehende Gruppe (W) in direkter Nachbarschaft einer Doppelbindung sowie eine entsprechende Abgangsgruppe (X) auf. Im Laufe der Zeit entwickelten sich in verschiedenen Arbeitsgruppen Michael-Akzeptoren mit einer Vielfalt an funktionellen Gruppen, beispielsweise 𝑊 = −𝐶𝑂2 𝑅, −𝑁𝑂2 , −𝐶𝑁, −𝑆𝑂2 𝑅, sowie 𝑋 = −𝐶𝑙, −𝐵𝑟, −𝑁(𝐶𝐻3 )+ 3 . 1979 gelang es schließlich Lawton et al., eines dieser Moleküle als Verbindungsstück zwischen zwei nukleophilen Gruppen innerhalb eines Proteins einzusetzen und legten somit den Grundstein zur Interkalation.[15] Sie bezeichneten diese MolekülGruppe als ETAC-Reagenzien (Equilibrium Transfer Alkylating Cross-link). Die ersten Versuche am Beispiel der Ribonuklease gelangen ihnen mit folgenden Verbindungen. Abbildung 1-5. ETAC-Reagenzien der ersten Stunde. [15] 1988 postulierten Lawton et al. einen Mechanismus für die konsekutiven Additionen zweier nukleophiler Reste an den Michael-Akzeptor, welcher bis heute gültig ist.[16] Schema 1-1. Mechanismus der konsekutiven Michael-Additionen zweier nukleophiler Reste. [16] 6 | Theoretische Grundlagen Je nach Nukleophilie des Angreifers sowie der Aktivierung der Doppelbindung durch W und X, findet im ersten Schritt eine Michael-Addition oder eine sofortige Verdrängung statt. Nach dem nukleophilen Angriff am Akzeptor bildet sich, durch E1cB-Eliminierung der Abgangsgruppe X, automatisch ein neues Michael-Akzeptor-System aus, welches erneut nukleophil angegriffen werden kann. Im Falle einer reduktiv gespaltenen Disulfidbrücke, können beide Thiol-Reste als Nukleophile an einem ETAC-Molekül angreifen und durch zwei aufeinander folgenden Michael-Additionen über drei Kohlenstoff-Atome wieder rückverbrückt werden. 1990 gelang es Lawton und Brocchini, durch Weiterentwicklung der ersten Generation an ETAC-Reagenzien, eine bis dato neuartige Verbindung zu synthetisieren, deren Grundgerüst auch in dieser Arbeit eingesetzt wurde.[17] Es handelt sich um ein α,α-bis[(pTolylsulfonyl)methyl]acetophenon-Gerüst, wobei der Acetophenon-Ring mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen substituiert werden kann und somit einen vielfältigen Verknüpfungspunkt aufweist. Abbildung 1-6. Grundgerüst einer neuartigen Interkalator-Verbindung. [17] Die aromatische Keton-Funktion, gewährleistet dabei die nötige Aktivierung für die MichaelAddition. Die beiden Toluolsulfonsäure-Reste sorgen für die in der Proteinchemie nötige Wasserlöslichkeit und stellen gleichzeitig die Abgangsgruppen dar. Bevor die Verbindung in einer Michael-Addition eingesetzt werden kann, muss das Michael-Akzeptor-System durch die Abspaltung einer der beiden Toluolsulfonsäure-Reste in leicht basischem Milieu ausgebildet werden. Nun enthält die Verbindung alle zur Michael-Addition notwendigen Bausteine: eine elektronenziehende Carboxygruppe, einen Toluolsulfonsäure-Rest als gute Abgangsgruppe sowie eine α,β-ungesättigte Doppelbindung als Angriffspunkt. Der hier beschriebene Vorgang, ist nachfolgend in Schema 1-2 dargestellt. Theoretische Grundlagen | 7 Schema 1-2. Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems durch Abspaltung eines Toluolsulfonsäure-Restes. Handelt es sich bei den Nukleophilen um die zwei Thiol-Reste der gespaltenen Disulfidbindung, wird diese über das Interkalator-Molekül hinweg wieder aufgebaut. Dieser Vorgang wird als Interkalation bezeichnet und bietet somit die Möglichkeit selektiv Disulfidbrücken zu modifizieren. Brocchini nutzte dies um unterschiedliche Peptide und Proteine mit einer Polyethylenoxid-Kette zu modifizieren, ohne dabei den üblichen Weg über die Verknüpfung mit nukleophilen Aminogruppen zu gehen. Einer seiner ersten Erfolge erzielte er mit der Interkalation in eine der Disulfidbindungen von Interferon-α 2, einer antiviralen Protein-Wirkstoffkomponente.[18] Ein Großteil der biologisch relevanten Proteine kann mittels dem von Brocchini vorgestellte Konzept modifiziert werden, ohne dass es dabei zu einer Beeinträchtigung ihrer Funktion sowie des strukturellen Aufbaus des Proteins kommt.[18] Dies trifft unter anderem auch auf das Peptidhormon Somatostatin zu, welches in dieser Arbeit als Modelpeptid in Bezug auf die Herstellung stimuli-responsiver Biokonjugate verwendet wurde. 1.4 Das zyklische Modelpeptid Somatostatin Beim Somatostatin handelt es sich um ein natürlich vorkommendes zyklisches Peptidhormon, welches im menschlichen Blutkreislauf zirkuliert und 1973 erstmals erwähnt wurde.[19] Es agiert im menschlichen Körper als Hemmstoff gegenüber der Ausschüttung verschiedener Substanzen, unter anderem den Wachstumshormonen Insulin und Glucagon.[20] Gebildet wird es in den Zellen des Hypothalamus sowie im Gastrointestinaltrakt einschließlich der Bauchspeicheldrüse und erfüllt je nach Ort und Gewebe unterschiedliche physiologische Aufgaben. Im peripheren Gewebe agiert es als Regulator endo- und exokriner Ausschüttung von Hormonen und Sekreten, und beeinflusst die Aktivität des Gastrointestinaltrakts, insbesondere die Freisetzung der Magensäure. Im zentralen 8 | Theoretische Grundlagen Nervensystem hingegen fungiert es als Neurotransmitter bzw. –Modulator.[21] Diese Inhibitionseffekte machen den Einsatz von Somatostatin sowie seiner Analoga als Wirkstoffkomponente in der klinischen Behandlung, beispielsweise bei Wachstumshormonstörungen und endokrinen Tumoren, interessant.[22,23] Es existieren zwei natürlich vorkommende, biologisch aktive Formen des zyklischen Peptids, das Somatostatin-14 sowie -28, welche aus 14 bzw. 28 Aminosäuren aufgebaut sind. Sie unterscheiden sich in ihrer Selektivität, üben aber prinzipiell denselben biologischen Einfluss aus. In der Forschung wird allerdings überwiegend das Somatostatin-14 verwendet, welches in Abbildung 1-7 dargestellt ist. Die Cyclisierung des Peptids, erfolgt über eine intramolekulare Disulfidbrücke, der Thiol-Reste der Cysteine Cys3 und Cys14. Abbildung 1-7. Natives Somatostatin-14 und das Analoga Octreotid, wobei die Disulfidbrücken rot und die pharmakologisch aktive Aminosäuresequenz blau dargestellt sind. Im Allgemeinen ist der räumliche Aufbau eines Peptids bzw. Proteins und somit die Ausrichtung der Seitenketten der Aminosäuren für dessen biologische Aktivität, wie die Bindung an einen Rezeptor, verantwortlich. Jedoch sind meist nicht alle Aminosäuren an diesem Prozess beteiligt, so auch beim Somatostatin. Lediglich die Aminosäure-Sequenz Phe7-Trp8-Lys9-Thr10 (blau dargestellt in Abbildung 1-7) sowie deren Konformation, sind essentiell für die pharmakologische Aktivität des Hormons und dürfen daher bei Modifizierungen nicht verändert werden.[24] Aufrechterhalten und stabilisiert wird diese Konformation durch die intramolekulare Disulfidbrücke.[25] Die gesamte 3D-Struktur des Somatostatins ist allerdings bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Es gab zwar Ansätze bezüglich Wechselwirkungen zwischen den aromatischen Resten von Phe6 und Phe11, welche Theoretische Grundlagen | 9 allerdings nicht bestätigt werden konnten. Daher einigte man sich zwischenzeitlich auf die Existenz verschiedener Konformationen in einem Gleichgewicht.[26] Das native Somatostatin weist eine Plasma-Halbwertzeit von nur wenigen Minuten auf und kann daher ohne Modifikation nicht für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Untersuchungen hinsichtlich des Metabolismus zeigten, dass Somatostatin gezielt an fünf Stellen durch Peptidasen proteolytisch gespalten wird.[27] Abbildung 1-8. Natives Somatostatin, sowie mit blauen Pfeilen gekennzeichnet die metabolischen Abbaustellen. Diese Instabilität war die Grundlage zur Entwicklung von Somatostatin-Analoga welche zu pharmakologischen Zwecken eingesetzt werden sollen. Auf dem weltweiten Markt bilden Octreotid (Sandostatin®, siehe Abbildung 1-7) und Lanreotid (Somatulin®) bis heute die einzigen, als Wirkstoff zugelassenen synthetische Analoga.[26] Diese weisen im Gegensatz zum Somatostatin wesentlich höhere Zirkulationszeiten im Bereich mehrerer Stunden auf. Ihre Einschränkung liegt allerdings in der selektiven Bindung an nur einen der fünf bestehenden Somatostatin-Rezeptoren (Vergleich Tabelle 1).[23] Die Wirkungsweise des Somatostatins beruht auf der hohen Affinität der Bindung an fünf verschiedene Rezeptoren, die sogenannten SSTR1-5. Sie gehören zur Familie der G-Proteingekoppelten Rezeptoren und werden an der Oberfläche verschiedener Zelltypen, unter anderem auch Tumorzellen, in unterschiedlicher Verteilung expressioniert.[28] Durch die Bindung werden verschiedene Prozesse in der Zelle gestartet. Hierzu gehört die Hemmung der Aktivität der Kalzium-Kanäle und der Adenylylcyclasen, wodurch bestimmte Ausscheidungsprozesse beeinflusst werden. Weiterhin werden die Aktivitäten der Phosphotyrosin Phosphotase sowie der MAP (Mitogen-aktivierte Protein) Kinase gestört, was eine wichtige Rolle hinsichtlich der Regulierung des Zellwachstums spielt.[29] Einen Vergleich der Bindungsstärken des nativen Somatostatins sowie die beiden Analoga gegenüber den fünf Rezeptoren ist in nachfolgender Tabelle zusammengefasst. 10 | Theoretische Grundlagen Tabelle 1. Bindungsstärken von Somatostatin, Octreotid und Lanreotid an die fünf Somatostatin-Rezeptoren (SSTR). [30] Reprinted with permission from [30], copyright © 2002, European Society of Endocrinology. IC50-Werte [nM] SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5 Somatostatin 0.93 0.15 0.56 1.5 0.29 Octreotid 180 0.54 14 230 17 Lanreotid 280 0.38 7.1 >1000 6.3 Nicht alle fünf Varianten der Rezeptoren werden gleich häufig expressioniert, was vor allem für die Tumor-Therapie von Bedeutung ist. Da Octreotid und Lanreotid hauptsächlich an SSTR2 binden, wird hinsichtlich des Einsatzes als Wirkstoff nach einer Alternative gesucht, da gerade SSTR2 beispielsweise von Pankreas-Tumoren gar nicht und von Prostata- und Dickdarm-Tumoren nur gering expressioniert wird. Einige Tumore weisen sogar eine Mutation des SSTR2 auf, welche den gegenteiligen Effekt, also Stimulation statt Hemmung, zur Folge hat.[23] Bei den angesprochenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren handelt es sich um eine Rezeptor-Klasse, welche in Zellmembranen zu finden sind und Signale außerhalb einer Zelle über GTP-bindende Proteine in das Innere weiterleiten (Signaltransduktion). Der Rezeptor ist aus sieben helikalen, die Zellmembran durchdringende, Untereinheiten aufgebaut. Diese Einheiten sind durch jeweils drei intra- und extrazelluläre Schleifen miteinander verbunden und weisen so eine räumliche Struktur auf, die in der Lage ist, beidseitig der Membran spezifische Liganden zu binden. Findet nun außerhalb der Membran eine Bindung statt, wird dadurch die räumliche Struktur des Rezeptors verändert, wodurch im Inneren der Zelle die G-Proteine aktiviert werden, welche ihrerseits wiederum eine spezifische Signalkaskade auslösen.[31] Der einzigartige pharmakologische Effekt des nativen Somatostatin-14 beruht also auf der hohen Bindungsaffinität gegenüber allen fünf Rezeptoren. Die wichtigste therapeutische Einschränkung liegt aber in der sehr kurzen Plasma Halbwertszeit von unter drei Minuten. [32] Ein erste Strategie zur Lösung dieser Probleme bot die Synthese von Somatostatin-Analoga welche höhere Stabilität, aber leider nur sehr geringe Selektivität bezüglich der Rezeptoren aufwiesen. Eine alternative Strategie liegt nun in einer gezielten Modifikation des nativen Somatostatins. Theoretische Grundlagen | 11 Da die Bindung an die Rezeptoren über die räumliche Koordination der β-Schleife stattfindet, darf also der räumliche Aufbau nicht gestört werden, was somit eine statistische Modifizierung der Aminosäure-Reste ausschließt. Die intramolekulare Disulfidbrücke hingegen, ist zwar für den Erhalt der Tertiärstruktur verantwortlich, kann aber über den vorgestellten Weg der Interkalation spezifisch modifiziert werden. Die Art des Aufbaus des Interkalators ermöglicht dabei eine Einführung von unterschiedlichen Plattformen, wobei dies wiederum über zwei verschiedene Methoden erzielt werden kann. 1.5 Unterschiedliche Modifizierungswege nach den Methoden des „grafting from“ und „grafting onto“ Somatostatin-Konjugate, welche mittels der Interkalation aufgebaut werden, bestehen im Grunde aus drei Komponenten, dem Somatostatin als Biomolekül, dem funktionalen Baustein sowie der Interkalator-Verbindung als verknüpfende Einheit. Die Vereinigung dieser drei Komponenten kann jedoch über zwei unterschiedliche Synthesestrategien erfolgen welche im Allgemeinen als grafting from und grafting onto bezeichnet werden (Abbildung 1-9). Die grafting from (A) Methode verläuft über einen zweistufigen Prozess, welcher eine nachträgliche Modifikation des interkalierten Somatostatins beinhaltet. Dabei wird eine Interkalator-Variante verwendet, welche eine reaktive funktionelle Gruppe aufweist, die sich auch interkaliert noch selektiv adressieren lässt. Der erste Schritt besteht also in der Interkalation besagter Verbindung in die Disulfidbrücke des Biomoleküls. Im zweiten Schritt wird dieses Biokonjugat mittels der funktionellen Gruppe des Interkalators über eine geeignete Reaktion mit dem gewünschten Baustein verknüpft. Vorteilhaft ist hierbei, dass während dem Interkalations-Vorgang keine Rücksicht auf mögliche Wechselwirkungen oder Nebenreaktionen der funktionalen Bausteine genommen werden muss, da diese erst nachfolgend eingeführt werden. Jedoch ergeben sich daraus mehrere Reaktions- sowie Aufreinigungsschritte, bei welchen das Biomolekül bereits anwesend ist und es somit zu Einschränkungen aufgrund dessen sensitiver Eigenschaften kommen kann. 12 | Theoretische Grundlagen Die Variante des grafting onto (B) dagegen, sieht eine vorherige Funktionalisierung des Interkalators vor. Dazu werden die gewünschten Bausteine, meist über ein Linker-Molekül, an das Interkalator-Grundgerüst gebunden und die synthetisierte Verbindung im Anschluss interkaliert. Hierbei handelt es sich um die häufiger verwendete Methode, da hier zum einen nur ein Aufreinigungsschritt mit Biomolekül durchgeführt werden muss und es daher zu geringeren Verlusten kommt. Zum anderen wird bei der Entwicklung der unterschiedlich funktionalisierten Interkalatoren rein organische Synthese betrieben, wodurch ein breites Reaktions- sowie Charakterisierungsspektrum eingesetzt werden kann. Nachteilig ist hierbei allerdings, dass für jede gewünschte Plattform zuerst ein geeigneter Interkalator synthetisiert und bei der Interkalation die jeweiligen idealen Reaktionsbedingungen neu untersucht werden müssen. Abbildung 1-9. Darstellung der beiden unterschiedlichen Synthesestrategien grafting from und grafting onto am Beispiel der Interkalation in die Disulfidbrücke eines Biomoleküls. Da beide Synthesestrategien gewisse Vor- und Nachteile aufweisen, wurden in dieser Arbeit beide Ansätze parallel verfolgt. Unabhängig von der gewählten Synthesestrategie wurde die Wahl der geeigneten funktionalen Plattform getroffen. Diese sollte die gewünschte Fähigkeit zur Selbstassemblierung mit sich bringen und werden nachfolgend näher beschrieben. Theoretische Grundlagen | 13 1.6 Selbstassemblierung Die Selbstassemblierung gehört, zusammen mit der Wirt-Gast-Chemie, zu den wichtigsten Prozessen der supramolekularen Chemie und beschäftigt sich mit der Bildung hochdefinierter, übergeordneter Strukturen, welche durch Assoziation von MolekülEinheiten mittels reversibler nicht-kovalenter Wechselwirkungen entstehen. Im Grunde orientiert sich die supramolekulare Chemie an den komplexen Strukturen der Natur und stellt somit eine Brücke zwischen den Wissenschaften der Biologie und der Chemie dar. [33] Ihre Ursprünge liegen im 19. Jahrhundert, als Van der Waals[34] 1873 die Existenz intermolekularer Kräfte und Werner[35] 1893 die Idee der Koordinationschemie postulierten. 1920 folgten Latimer und Rodebush mit ihren Forschungsberichten über Wasserstoffbrückenbindungen.[36] Auch Fischer leistete 1894 einen bahnbrechenden Beitrag, als er das sogenannte „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ der Enzym-Substrat-Wechselwirkung vorstellte und somit die Grundlage der Wirt-Gast-Komplexbildung schaffte.[37] 1960 wurde ein weiterer Meilenstein errungen, als Pedersen die Entdeckung der Kronenether, einer der berühmtesten Verbindungsklassen, zur Komplexierung von Kationen, gelang.[38] Inspiriert durch diese Erkenntnisse folgten weitere Forscher wie Vogtle, Cram und Lehn, welche sich an der Synthese selektiver Rezeptoren versuchten und so dazu betrugen, dass sich dieses Forschungsgebiet innerhalb weniger Jahrzehnte rasant vergrößerte und zunehmend an Bedeutung gewann. Aus heutiger Sicht betrachtet, gilt der Franzose Jean-Marie Lehn als einer wichtigsten Mitbegründer der „Supramolekularen Chemie“ und wurde 1987 zusammen mit Donald J. Cram und Charles J. Pedersen mit dem Nobelpreis der Chemie für ihre Forschung im Feld der Supramolekularen Chemie ausgezeichnet.[39] Der Begriff der nicht-kovalenten Bindung umfasst eine Vielzahl an unterschiedlichen intraund intermolekularen Wechselwirkungen und somit einen großen Bereich an Bindungsstärke.[40] In nachfolgender Tabelle ist eine Übersicht Wechselwirkungen, mit jeweiliger Stärke, dargestellt. der wichtigsten nicht-kovalenten 14 | Theoretische Grundlagen Tabelle 2. Zusammenfassung von nicht-kovalenten Wechselwirkungen. [40] Wechselwirkung Stärke [kJ mol-1] Beispiel Ion-Ion 100-350 Natrium-Chlorid Ion-Dipol 50-200 [15]Krone-5-Natrium Dipol-Dipol 5-50 Aceton, Salzsäure Wasserstoffbrückenbindung 4-120 Wasser, Terpyridine Kation-π 5-80 Benzol-Natrium π-π 0-50 Benzol Van-der-Waals <5 Alkane Hydrophobisch Lösungsmittelabhängig Cyclodextrine Diese Kräfte bilden die Grundlage der Ausbildung der Komplexe im Bereich der Selbstassemblierung. Zu den klassischen Vertretern, auch im Hinblick auf Biomoleküle, zählen sicherlich die Wirt-Gast-Komplexe mit den Kronenethern sowie die ÜbergangsmetallKomplexe mit Bipyridin-Liganden. In den letzten Jahrzehnten rückte auch die Kategorie der Boronsäure-Komplexe immer weiter in den Fokus der Forschung. Daher werden diese drei Systeme nun näher erläutert. 1.7 Kronenether und die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen Die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen beruht auf dem Konzept der molekularen Erkennung bzw. dem sogenannten Schlüssel-Schloss-Prinzip. Es beschreibt die Aggregation zwischen einem Wirt und einem Gast, bzw. Rezeptor und Substrat. Als Wirt wird dabei jenes Molekül bezeichnet, welches für die Erkennung verantwortlich ist. Der Gast ist dementsprechend das zu erkennende Molekül. Die Komplementarität ist dabei ein essentieller Faktor für die molekulare Erkennung, aber keine Garantie für eine tatsächliche Bindung. Vor allem in der Biochemie spielen diese Vorgänge eine wichtige Rolle, da sie sämtliche Reaktionen, Regulationen und Transporte im menschlichen Körper steuern. Einige der wichtigsten Vorgänge sind enzymatische Reaktionen, Antigen-Antikörper-Erkennung, Signalinduktion durch Neurotransmitter oder zelluläre Erkennungsprozesse. Theoretische Grundlagen | 15 Auch im Bereich der Chemie gibt es einige Vertreter die durch ihren strukturellen Aufbau oder funktionellen Gruppen in der Lage sind spezielle Gastmoleküle aufzunehmen, wie beispielsweise Cyclodextrine, Zeolithe, Porphyrine oder Kronenether. Kronenether Die Entdeckung dieser Stoffklasse durch Pedersen geschah eher zufällig, als dieser bei einer Bisphenol-Synthese die Nebenprodukte und deren Eigenschaften genauer untersuchte. [41] Schema 1-3. Bisphenol-Synthese von C. J. Pedersen. [41] Bei Kronenethern handelt es sich um zyklische Polyether, bestehend aus einer unterschiedlichen Anzahl an Ethyloxy-(-CH2-CH2-O-)-Einheiten, welche es ermöglichen, dass Kronenether sowohl in wässrigen als auch in organischen Lösungsmitteln gut löslich sind. Diese Eigenschaft macht man sich zu Nutze um ionische, hydrophile Elemente oder Verbindungen in organische Phasen zu überführen. Die Nomenklatur folgt dabei [m]Krone[n], wobei m für die Anzahl der Atome und n für die Anzahl der Sauerstoffatome im Ring steht.[38] Kronenether können auch in anderen Modifikationen, wie Substitution eines Sauerstoff-Atoms oder Verbrückungen, auftreten. Abbildung 1-10. Unterschiedliche Vertreter der Stoffklasse der Kronenether. Die hohe Anzahl an freien Elektronenpaaren der elektronegativen Sauerstoffatome ermöglicht der Krone als Wirt zu agieren und Alkali-, Erdalkali- oder Metallionen über DipolIon-Wechselwirkungen zu binden, solange diese eine sphärische Elektronendichte sowie die passende Größe aufweisen. Diese Verbindungen führen meist zu kristallinen Feststoffen, welche sich gut anhand von Röntgenstrukturanalyse untersuchen lassen. Organische 16 | Theoretische Grundlagen Kationen, wie Ammonium-Ionen, können ebenfalls komplexiert werden, wobei hier die Wechselwirkungen eher auf Wasserstoffbrückenbindungen beruhen.[42] Die KomplexStabilität sowie die Gast-Selektivität hängen hauptsächlich von der Anzahl der EthyloxyEinheiten und somit der Ringgröße sowie vom Durchmesser des Gastes ab.[43] Abbildung 1-11. Vergleich der Durchmesser von Krone und Kation für die Bildung eines 1:1-Komplexes. [43] Je nach Größe des Gastes, sitzt dieser inner- oder oberhalb der Molekülebene des Kronenethers.[44] Ist der Gast nun wesentlich größer als der Hohlraum, kann dieser, im Gegensatz zur gewöhnlichen 1:1 (Wirt:Gast)-Komplexierung, zur Bildung eines SandwichKomplexes, also im Verhältnis 2:1 (Ligand-Gast) führen.[45,47] Abbildung 1-12. Schematische Darstellung einer Kalium-induzierten Aggregierung durch Ausbildung von SandwichKomplexen in einem Natrium-haltigen Medium. [46] Reprinted (adapted) with permission from [46], copyright 2002 American Chemical Society. Die [18]Krone-6 bildet dabei bevorzugt mit K+ stabile 1:1-Komplexe, die [15]Krone-5 mit Na+, bevorzugt jedoch mit K+ 2:1-Sandwich-Komplexe.[46] Ferner spielt auch das Lösungsmittel Theoretische Grundlagen | 17 hinsichtlich der Komplexbildung und Stabilität eine Rolle, da jenes die Konformation und somit die Affinität bezüglich der Ionen beeinflussen kann. In unpolaren Lösungsmitteln ist die Stabilitätskonstante eines Kationen-Komplexes meist wesentlich höher als in polaren Lösungsmittel, da sich die Krone ähnlich einem Tropfen Wasser in Öl verhält und die freien Elektronenpaare in das Innere der Krone richtet, wodurch die Koordination eines Kations bevorzugt wird. In hydrophilen Medien muss sich die Krone für eine Koordination zuerst vororganisieren, was energetisch weniger bevorzugt wird. Im Wesentlichen stellt sich die Frage in wieweit die Lösungsmittel-Moleküle mit einem Gast bezüglich der intermolekularen Bindung konkurrieren.[47] Abbildung 1-13. Lösungsmittel-Einfluss auf die Konformation der Kronenether. [47] Kristallstrukturanalysen zeigen, dass Kronenether in unkomplexiertem Zustand keinen richtigen Hohlraum aufweisen und eher die Form eines Parallelogramms einnehmen als die eines Rings. Dabei drehen sich zwei CH2-Gruppen nach innen und ragen so in den Hohlraum hinein. Für den Vorgang der Komplexbildung muss sich die Krone also zuerst konformativ umwandeln und desolvatisieren. Dies geschieht allerdings erst in Gegenwart eines potentiellen Gasts, beispielsweise KSCN (siehe Schema 1-4). Die treibende Kraft dieser Konformationsänderung ist die Ion-Dipol-Bindung zwischen dem Kalium-Ion und dem Dipol der Sauerstoff-Atome im Ether-System.[48] Diese Flexibilität sorgt für einen gewissen Spielraum bezüglich der Größe des Gastes. [48,49] Schema 1-4. Konformation einer [18]Krone-6 vor und nach der Komplexbildung mit einem Kalium-Ion. Ein sowohl für die Chemie als auch Biologie interessanter Aspekt, ist natürlich die Möglichkeit die Komplexbildung gezielt durch spezifische Stimuli kontrollieren zu können. 18 | Theoretische Grundlagen Hierzu existieren bereits unterschiedliche Konzepte, beispielsweise durch physikalische Reize, wie Licht, oder durch Elektronen getriebene Erkennung mittels Redox-Reaktionen.[41] Abbildung 1-14. Beispiele für Licht- und Redox-induzierte Komplexbildung. [41] In der Peptidchemie werden Kronenether oftmals zur Funktionalisierung von Aminosäuren verwendet, um gezielt bestimmte Eigenschaften der Biomoleküle zu verändern. Werden nun Peptide aus diesen modifizierten Aminosäuren aufgebaut, kann beispielsweise deren Konformation durch die Zugabe eines geeigneten Ions gezielt beeinflusst werden. Voyer konnte auf diese Weise mittels Cäsiumionen eine Änderung von β-Faltblatt zu α-Helix erreichen.[50] Abbildung 1-15. Kronenether-funktionalisierte Aminosäure, sowie die durch Cäsiumionen getriggerte Ausbildung einer α[51] Helix-Konformation. Adapted from [51] with permission of The Royal Society of Chemistry. Dass auch Aza-Kronen in der Lage sind 2:1-Sandwich-Komplexe auszubilden, zeigten Beletskaya et al. mit ihrer Forschungsarbeit an der Kationen-induzierten Dimerisierung von Porphyrinen, welche zuvor mit Aza-Kronen modifiziert worden waren.[52] Theoretische Grundlagen | 19 Abbildung 1-16. Komplexierung von Aza-Kronenether-modifizierten Porphyrinen mit Natrium (1:1-Komplex) und Kalium [52] (2:1-Komplex). Adapted from [52] with permission of The Royal Society of Chemistry. Wie bereits mehrfach erwähnt, binden Kronenether über ihre Sauerstoffatome. Den Prozess, dass Liganden über mehrere Bindungsstellen an einen Gast binden, wird als Chelatisierung, die daraus resultierende Erhöhung der Stabilität als Chelat-Effekt beschrieben.[53] Kronenether stellen dabei aufgrund ihrer Ringstruktur eine Besonderheit dar, wodurch die Anordnung im Ring die Bewegung der einzelnen Bindungen hemmt und dadurch eine Dissoziation des Komplexes erschwert wird (Makrozyklischer-Effekt). Am häufigsten wird der Begriff der Chelate jedoch in der Koordinationschemie, im Hinblick auf die Komplexierung von Übergangsmetallen, verwendet. 1.8 Übergangsmetall-Komplexe - basierend auf Bipyridin-Liganden Übergangsmetall-Komplexe sind meist das Ergebnis der Wechselwirkung einer Lewis-Säure mit einer Lewis-Base, wobei erstere durch das Übergangsmetall als Zentralatom und letztere durch einen Liganden repräsentiert wird. Der Ligand übernimmt damit die Rolle des Elektronenpaar-Donors, welcher die Lücke in der Elektronenkonfiguration des Zentralatoms bzw. des Akzeptors auffüllt.[54] n+ Abbildung 1-17. Schematische Darstellung eines Übergangsmetalls M mit ein-, zwei- und dreizähnigen Liganden L. 20 | Theoretische Grundlagen Als Zentralatom können prinzipiell alle Übergangsmetalle dienen, welche den Liganden für eine Bindung ausreichend freie d-Orbitale zur Verfügung stellen. Welches Metall und somit wie viele Valenzelektronen in den Orbitalen enthalten sind, beeinflusst den Aufbau und die Stabilität des späteren Komplexes entscheidend. Typische Vertreter sind Cu 2+, Fe0/2+/3+ und Ru2+. Als Liganden können theoretisch alle Verbindungen verwendet werden, welche als Lewis-Base agieren können und somit Elektronen in die Bindung zum Zentralatom einbringen. Nachfolgend sind einige der bekanntesten Liganden dargestellt, wobei das 2,2´Bipyridin zu den am häufigsten verwendeten Verbindungen in der Komplexchemie zählt.[54] Abbildung 1-18. Die am häufigsten verwendeten Liganden in der Übergangsmetall-Komplexierung. Die Bipyridine sind eine Stoffklasse organischer Verbindungen, welche aus zwei direkt miteinander verknüpften Pyridin-Ringen bestehen. Jedes Pyridin-Molekül weist dabei drei mögliche Verknüpfungspositionen auf, wodurch sich sechs Bipyridin-Isomere ausbilden können. Aufgrund der Position der sp2-hybridisierten Stickstoffatome sind jedoch nur das 2,2´- und das 4,4´-Isomer als Stickstoff-Donor-Ligand in der Komplexbildung von Bedeutung. Abbildung 1-19. Darstellung der sechs möglichen Bipyridin-Isomere. Das 2,2´-Bipyridin wurde 1888 von Blau entdeckt.[55] Er erkannte die Fähigkeit zur Koordination und synthetisierte den ersten Bipyridin-Eisen-Komplex.[56] Die meisten der Übergangsmetallionen bilden mit bis zu vier koordinierten Bipy-Liganden stabile Komplexe aus. Die im Allgemeinen hohen Bindungsaffinitäten der Stickstoff-Liganden gegenüber den Metall-Kationen beruhen hauptsächlich auf dem Chelatisierungs-Effekt sowie der π- Theoretische Grundlagen | 21 Akzeptor-Fähigkeit. Im Allgemeinen reichen die Bindungen in der Koordinationschemie von gänzlich ionischen, nicht-kovalenten Ion-Dipol-Wechselwirkungen bis hin zu vollständig kovalent. Im nicht-kovalenten Fall bilden die freien Elektronenpaare des Liganden eine dative Bindung mit einem positiv-geladenen Metall-Kation, im kovalenten Fall dagegen findet eine Orbitalüberlappung zwischen den Valenzorbitalen des Metalls und dem Liganden statt. Die meisten Verbindungen liegen allerdings irgendwo zwischen den beiden Extremen und beinhalten so immer einen nicht-kovalenten Anteil in den Bindungen. Wie groß dieser Anteil ist hängt von der Ladung des Metalls, der Größe und dem Liganden ab, wobei kleine, mehrfach geladene Metallionen bzw. diejenigen mit abgeschlossener Valenzschale eher dazu tendieren ionische Wechselwirkungen einzugehen. Die Koordinationszahl wird dabei durch die Zahl der Liganden bestimmt, welche sich um das Metallion anordnen können. [57] Bipyridine besitzen wie die Terpyridine ein ausgedehntes π-System, wodurch sie in Form eines Metall-Komplexes Licht absorbieren können. Ein Beispiel hierfür sind Ruthenium-BipyKomplexe, welche bei Raumtemperatur in Lösung einen langlebigen angeregten TriplettZustand von etwa 102-103 ns aufweisen.[58] [59] Abbildung 1-20. Strukturformel und 3D-Modell des [Ru(bipy)3]Cl2-Komplexes. Ruthenium-Komplexe gehören dabei zu den best-analysiertesten Bipyridin-Komplexen. Das einfachste und bekannteste Beispiel ist der [Ru(bipy)3]Cl2-Komplex (Abbildung 1-20). Hierbei handelt es sich um ein rotes, kristallines Salz, welches hohe Wasserlöslichkeit aufweist und einen oktaedrisch angeordneten Komplex mit D3-Symmetrie ausbildet. Zu Bekanntheit gelangte der Komplex aufgrund seiner optischen Eigenschaften. Er stellte die Forschungsgrundlage für die Klasse der Chromophore dar, welche wiederum die Entwicklung der Übergansmetall-basierten Umwandlung von Solarenergie beeinflussten. In wässrigen Medien absorbieren [Ru(bipy)3]Cl2-Komplexe Licht im UV- und sichtbaren Bereich und bilden dabei durch Intersystem Crossing einen langlebigen energetisch niedrigen Triplet-Zustand 22 | Theoretische Grundlagen (3MLCT, Metall-Ligand-Charge-Transfer) aus.[60] Wie in nachfolgender Abbildung dargestellt, sind noch weitere Übergange möglich. 2+ Abbildung 1-21. Absorptions-Spektrum von Ru(bipy)3 ; LC: 185/285 nm, MC: 322/344 nm, MLCT: 240/450 nm. [61] ; Reprinted from Coordination Chemistry Reviews, Vol. 84, A. Juris, V. Balzani, F. Barigelletti, S. Campagna, P. Belser, A. von Zelewsky, Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, eletrochemistry, and chemiluminescence, Pages 85–277, Copyright 1988, with permission from Elsevier. Auch die Emission der Ruthenium-Bipy-Komplexe ist von großem Interesse. Anregung führt zu lumineszenter Emission, deren Intensität, Lebensdauer und Wellenlänge durch Temperatur und Lösungsmittel beeinflusst werden können.[61] Die gezielte Steuerung der optischen Eigenschaften des Komplexes bietet die Möglichkeit einer Vielzahl an unterschiedlichen Einsatzgebieten, beispielsweise in der Medizin in Form der Photodynamischen Therapie, bei welcher Krebszellen mit Hilfe von lichtempfindlichen Therapeutika getötet werden können.[62] Neben den optischen finden auch die Selbstassemblierungs-Eigenschaften der BipyKomplexe breite Anwendung. Der Einsatz von Proteinen als Liganden in der MetallKoordinationschemie ist in der Natur schon lange etabliert. Es wird dadurch möglich, die oft schwachen und ungerichteten Wechselwirkungen von Proteinen sowohl inter- als auch intramolekular gezielt zu steuern und sie durch die Bindung an ein Metall-Zentrum zu verstärken aber gleichzeitig labil genug zu halten.[63] Einige interessante Forschungsergebnisse diesbezüglich, lieferten 2011 Thulstrup und Jensen mit einer durch Eisen(II)-Ionen kontrollierten Selbstassemblierung von modifiziertem Insulin.[64] Es ist bekannt, dass natives Insulin mittels Selbstorganisation die Bildung von Dimeren, über Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Oberflächen, durchläuft. Dies bildet die Grundlage für die Zink-koordinierte Hexamer-Bildung aus drei Dimeren (siehe Abbildung Theoretische Grundlagen | 23 1-22).[65] Diese Hexamere werden im Pankreas gespeichert und können in den Blutkreislauf abgegeben werden, wo dann das Insulin-Monomer für die Regulierung des Glukose-Spiegels im Blut zuständig ist.[66] Die Arbeitsgruppe verknüpfte nun den Lysin-Rest des Insulins mit einem 2,2´-Bipyridin und erzielte durch Zugabe einer Eisen-(II)-Lösung die Ausbildung eines stabilen und zugleich reversiblen Insulin-Trimers. Ihr Ziel war dabei die Erhöhung der Stabilität des Insulins vor dem Hintergrund der Diabetes-Behandlung. Ihnen gelang damit ein maßgeblicher Schritt in Richtung neuartiger Peptid- und Protein-Wirkstoffe.[64] [67] Abbildung 1-22. Links: Natives Insulin-Hexamer (Koordination von HisB10-Reste (grün) an Zn(II) (grau)); Rechts: Model [64] des erwarteten Trimers aus 2,2´-Bipy-(lila)-modifiziertem Insulin mit Fe(II) (magenta). Reprinted with permission from [64], copyright © 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Dass der Einsatz gerade von nicht-nativen Liganden immense Vorteile für die Koordinationseigenschaften eines Proteins mit sich bringt, erkannten auch Sasaki et al. Ihre Idee war es, mit Hilfe kovalent an α-helikale Peptid-Segmente gebundene 2,2´-Bipyridine über Selbstassemblierung, durch Koordination an Eisen-(II)-Ionen, ein aus drei Helices bestehendes Protein selbstständig auszubilden.[68] Sie leisteten dabei einen interessanten Beitrag hinsichtlich Synthesen neuartiger Proteine, angelehnt an die Klasse der natürlich vorkommenden, aus vier α-Helices aufgebauten, Proteinen.[69] Abbildung 1-23. Metall-induzierte Bildung eines 3-α-Helix-Bündel. 1991, American Chemical Society. [68] Adapted with permission from [68], Copyright © 24 | Theoretische Grundlagen Auch die dreidimensionale Anordnung von Aminosäuren in einem Protein stellt eine Art der Selbstassemblierung dar. Ersetzt man eine bestimmte Anzahl an natürlichen Aminosäuren gegen Bipyridine, kann durch Zugabe eines geeigneten Metalls eine Koordination und somit ein künstliches Metalloprotein erzeugt werden. 2006 gelang Ishida et al. die erste Synthese dieser Art, indem er einen Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)-Komplex als Kern eines Proteins einsetzte.[9] Abbildung 1-24. Entwurf eines künstlichen Metalloproteins mit einem Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)-Komplex als Kern. [9] Reprinted with permission from [9], copyright © 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Selbstassemblierungsprozesse und die daraus resultierenden Produkte, basierend auf Metall-Koordination, weisen viele Vorteile wie Stabilität, hohe Reaktionsgeschwindigkeiten und Umsätze, ein gerichteter Reaktionsverlauf oder milde Reaktionsbedingungen auf. Metalle zeigen jedoch oft ein hohes Maß an Toxizität, was ihren Einsatz unter physiologischen Bedingungen erschwert. Es gibt zwar Metalle, wie Eisen, welche auch auf natürliche Weise im menschlichen Körper vorkommen, allerdings können diese dadurch auch unerwünschte Konkurrenzreaktionen verursachen. Hinsichtlich des medikamentösen Wirkstofftransports durch Proteine oder andere körpereigene Verbindungen, spielt neben Stabilität und Bioorthogonalität auch Reversibilität eine entscheidende Rolle. Unter Berücksichtigung dieser Kriterien intensivierte sich über die letzten Jahrzehnte die Forschung in einer weiteren zur Selbstorganisation fähigen Verbindungsklasse, die sogenannten Boronsäuren. Theoretische Grundlagen | 25 1.9 Phenylboronsäuren und deren Komplexbildung mit dem Salicylhydroxamat-System Boronsäuren sind dafür bekannt mit bestimmten Liganden sehr schnell, stabile Komplexe auszubilden. Entdeckt wurden sie 1860 von Frankland und Duppa[70], jedoch erst 1959 veröffentlichten Lorand und Edwards[71] ihre quantitativen Untersuchungen zur Wechselwirkung von Boronsäuren mit unterschiedlichen Poly-Alkoholen und leisteten später einen großen Beitrag zur Aufklärung der Geometrie und des Reaktionsverhaltens des Boronat-Anions. Sie konnten zeigen, dass ein dreifach substituiertes Bor-Atom in einer sp2 trigonal planaren Geometrie mit einem vakanten p-Orbital vorliegt, welches orthogonal zur Molekülebene der Substituenten steht. Nukleophile sind daher in der Lage mit ihrem freien Elektronenpaar an diesem leeren Orbital anzugreifen und an das Boratom zu binden und so eine Änderung der Hybridisierung und daraus folgend der Geometrie herbeizuführen. Der exakte Vorgang der Komplexierung ist allerdings bis heute nicht vollständig geklärt. Abbildung 1-25. Angriff eines Nukleophils am Bor-Zentrum. [80] Aufgrund des schwachen Lewis-Säure-Charakters des Bor-Zentrums, kann das Bor-Atom als Rezeptor für harte Anionen, wie Cyanide, Hydroxide und Fluoride, agieren. Trotz der oft vorliegenden Hydroxylgruppen, hat die Azidität der Boronsäuren keinen Brönsted-SäureCharakter und spielt nur bei kovalenten Wechselwirkungen eine Rolle. [80] Bei 25°C in Wasser liegt der pKa-Wert einer Phenylboronsäure bei etwa 8.70[72], wobei die Säurekonstante Ka durch die Reaktion von Phenylboronsäure mit Wasser und der daraus resultierenden Freisetzung eines Protons definiert wird.[73] Gerade in wässrigen Medien können Boronsäuren neben 1,2- oder 1,3-Alkoholen[74] auch eine Vielzahl anderer Nukleophile, wie beispielsweise Amine[75], Dicarbonsäuren[76] oder α-Hydroxy-Carbonsäuren[79] komplexieren. Hierbei ist es von großem Interesse, dass diese Komplexierungs-Reaktionen unter physiologischen Bedingungen eine pH-abhängige Reversibilität zeigen. In wässrigen Medien stellt sich meist ein Gleichgewicht zwischen trigonal planaren Komplexen und tetraedrischen 26 | Theoretische Grundlagen Boronat-Anionen ein (Abbildung 1-26). Man geht jedoch davon aus, dass die Reaktion ausgehend vom tetraedrischen Anion schneller verläuft.[77] Ishihara lieferte 2008 die Erkenntnis, dass die Reaktionskonstante des Boronat-Anions mit aliphatischen Diolen viel kleiner ist, als die der Boronsäure.[78] Anhand aller Erkenntnisse lässt sich nachfolgend dargestellter thermodynamischer Kreis aufstellen, wobei gilt Ktet > Ktrig und pKa > pKa´.[73] Abbildung 1-26. Thermodynamische Analyse der Wechselwirkungen von Phenylboronsäure mit 1,2-Ethandiol. [73] Je nach Art des Diols können sich prinzipiell sowohl fünf- (1,2-Diol) als auch sechsgliedrige (1,3-Diol) Ringe ausbilden, wobei der sechs-Ring meist geringere Stabilität aufweist.[77] Dies hängt aber im Wesentlichen von der Azidität der beteiligten Reaktionspartner ab, wobei gilt, je höher die Azidität der Boronsäure oder des Liganden, desto höher ist auch die Stabilitätskonstante des Komplexes.[79] Experimentell betrachtet ist die Stabilität vom Lösungsmittel und dem pH-Wert der Umgebung abhängig,[74] wobei als Referenz gilt, dass der optimale pH-Wert für die Wechselwirkung zwischen Boronsäure und einem Diol oberhalb des pKa-Wertes der Boronsäure liegen sollte.[72] Der Haupteinsatzbereich für Boronsäuren und Diole ist ihre Nutzung als Baustein in vielen Selbstorganisations-Reaktionen, welche auch reversibel verlaufen können und auf der Ausbildung einer kovalenten B-O-Bindung beruhen.[80] Zwei Beispiele für BoronsäureMakrozyklen von Severin et al. sind nachfolgend dargestellt.[81,82] Theoretische Grundlagen | 27 [81,82] Abbildung 1-27. Boronsäure-Makrozyklen. Einige dieser Makrozyklen sind auch in der Lage einen Wirt-Gast-Komplex einzugehen, indem sie Metallionen oder andere kleinere Verbindungen wie eine Art Kapsel reversibel umschließen. Kubo et al. veröffentlichte dazu 2009 ein durch Amine getriggerte Verkapselung mittels Boronsäure-Veresterung.[83] Abbildung 1-28. Beispiel einer Verkapselungsreaktion durch Boronsäure-Veresterung, Kubo et al.. [83] Adapted from [83] with permission of The Royal Society of Chemistry. Neben der Komplexierung von Diolen in Form von B-O-Bindungen sind auch Amine als Reaktionspartner in der Boronsäure-Chemie von Bedeutung. Diese sogenannten koordinativen oder dativen B-N-Wechselwirkungen wurden erstmals 1862 von Frankland beschrieben, welcher eine Komplexbildung zwischen Ammoniak und Trimethylboran beobachten konnte.[84] Nachfolgende Forschungen an B-N-Bindungen zeigten eine gewisse Abhängigkeit der Substituenten des Bor-Zentrum. Wird die Lewis-Azidität beispielsweise durch elektronenziehende Substituenten erhöht, steigert dies die Stickstoff-BorWechselwirkung, eine Erniedrigung dagegen, lässt sich bei sterisch anspruchsvollen Substituenten feststellen.[72] Neben den Substituenten konnte Zhu et al. auch einen Einfluss des Lösungsmittels feststellen, indem B-N-Verbindugen mittels 11 B-NMR-Spektrosokopie sowie Röntgenstrukturanalyse untersucht wurden. Sie konnten so das Vorhandensein von 28 | Theoretische Grundlagen dativen N-B-Bindungen in aprotischen Lösungsmitteln und eine mögliche Einlagerung von protischen Lösungsmittel-Molekülen in die B-N-Bindung feststellen.[85] Abbildung 1-29. Einfluss eines Lösungsmittelmoleküls auf die B-N-Bindung. [85] Die Eigenschaften der Boronsäuren ermöglichen eine Reaktionsvielfalt, welche in den letzten Jahren zu einem breit gefächerten Anwendungsgebiet führte, beispielsweise als Sensoren für Anionen[80], als elektrochemische Sensoren[86], in der Chromatographie zur Immobilisation von Proteinen[76] oder zur Bildung von Biokonjugaten.[72] Von besonderem Interesse ist jedoch das relativ neue Komplex-System mit der Verbindungsklasse der Salicylhydroxamsäure. Die Salicylhydroxamsäure Die Salicylhydroxamsäure verdankt ihren Namen der Kombination zweier unterschiedlicher Verbindungs-Klassen. Das Grundgerüst stellt dabei die Salicylsäure (Trivialname der oHydroxybenzoesäure) dar. Die strukturell wichtigste Eigenschaft stellt die Hydroxy-Funktion in ortho-Position dar, wodurch später eine Ringbildung mit Boronsäuren ermöglicht wird. Der bekannteste Vertreter dieser Klasse ist die Acetylsalicylsäure, bekannt unter dem Markennamen Aspirin® (Bayer AG). ® Abbildung 1-30. a) Salicylhydroxamsäure; b) Salicylsäure/o-Hydroxybenzoesäure; c) Aspirin / Acetylsalicylsäure. Bei der zweiten Verbindungsklasse handelt es sich um die Hydroxamsäure, einem Hydroxylamin-substituiertes Carbonsäure-Derivat. Die -CO-NHOH-Funktion liegt dabei in einem tautomeren Gleichgewicht zwischen Hydroxamsäure und Hydroximsäure Theoretische Grundlagen | 29 (Hxdroxyimin) vor.[87] Es wird vermutet, dass die Resonanzfähigkeit der HydroxamsäureVerbindungen die, im Vergleich zu den strukturell ähnlichen Amiden, relativ hohe Azidität verursacht. Es ist den Hydroxamsäuren in Abhängigkeit von Substituenten und Lösungsmittel möglich, sowohl O- als auch N-azide zu agieren, was sich in der Bildung zweier unterschiedlicher Anionen wiederspiegelt.[88] Abbildung 1-31. Gleichgewicht der Ausbildung von O-Anion und N-Anion einer Hydroxamsäure-Verbindung. [88] Das Einsatzgebiet von Hydroxamsäuren liegt hauptsächlich in der Bildung von Komplexen, vorzugsweise mit Metallsalzen. Bereits seit frühester Zeit sind beispielsweise ihre purpurroten Eisen(III)-Komplexe bekannt, welche damals für die qualitative und quantitative Bestimmung von Carbonsäuren und ihren Derivaten verwendet wurden.[89] Dieser Nachweis ist unter dem Namen Angeli-Rimini bekannt. [90] Diese komplexierende Eigenschaft überträgt die Hydroxamsäure auch auf die Sylicylhydroxamsäure, welche abgesehen von Boronsäuren auch mit Metallen wie Palladium(II), Platin(II) oder Kupfer(II) Komplexe ausbildet.[91,92] Gerade in biologischen Prozessen werden sie oft als Transportmittel für Metallionen oder als Inhibitoren von Matrix-Metalloproteinasen eingesetzt, indem sie die aktiven Metallionen des Enzyms, wie Zink oder Calcium, binden und so die Aktivität des Proteins unterbinden. [93] Die Komplexbildung kann dabei entweder über den [O,O]- oder den [N,O´]-Weg unter Einbeziehung des Phenolat-Sauerstoffs als O-Donor stattfinden.[91] Abbildung 1-32. Zwei mögliche Wege der Ausbildung von Metall-Komplexen der Salicylhydroxamsäure; a) [O,O]; b) [N,O´]. [91] 30 | Theoretische Grundlagen Das Phenylboronsäure-Salicylhydroxamsäure-Komplex-System Hinsichtlich der Klasse der bioorthogonalen Reaktionen ist die Komplexbildung zwischen Phenylboronsäuren (PBS) und Salicylhydroxamsäuren (SHS) von großem Interesse. Hierbei handelt es sich um ein pH-sensitives System, welches auf der starken Wechselwirkung zwischen Bor- und Stickstoff-Atom beruht. 2001 wurde nachfolgend dargestelltes System erstmals von Wiley et al. vorgestellt.[94] Abbildung 1-33. PH-abhängige Gleichgewichtsreaktion zwischen Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure. [98] Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass sich der durch die Komplexierung ausgebildete sechsgliedrige Ring, aus B-N- und B-O-Bindungen, dem fünfgliedrigen Ring gegenüber bevorzugt gebildet wird. Durch 11Bor-NMR-Spektroskopie konnte bewiesen werden, dass der unterschiedliche Hybridisierungszustand (trigonal oder tetrahedral) im Bor-Atom vom pHWert abhängig ist.[98] Der interessanteste Aspekt dieser Komplexierung ist allerdings die grundsätzliche pH-Abhängigkeit der Reaktion. Denn bei einem pH-Wert > 7.4 liegt ein stabiler Boronsäureester vor, wohingegen eine Erniedrigung des pH-Werts auf < 5.0 zu Hydrolyse führt und wieder die freie Phenylboronsäure vorliegt. Ein weiterer Vorteil ist der Verzicht auf jegliche Art von Katalysator und somit Metalle bzw. Metallsalze, welche meist ein hohes Maß an Toxizität aufweisen und so eine Limitierung in biomedizinischen Gebieten zur Folge hat. Dieses Problem tritt meist bei kupferkatalysierten Click-Reaktionen auf, welche häufig im biologischen Bereich eingesetzt werden. Daher geht der Trend eher zu metallfreien bioorthogonalen Reaktionen wie der Staudinger-Ligation oder der kupferfreien Cycloaddition. Vergleicht man nun diese Reaktionstypen mit dem hier beschriebenen PBS-SHS-System, so weist dieses eine wesentlich höhere Reaktionsgeschwindigkeit auf. Shin et al.[95] konnte mit Hilfe von UV-Vis-Spektroskopie für dieses System bei pH = 7.4 eine Kinetikrate von k = 7.0 × 106 M-1s-1 messen, was einen deutlichen Unterschied zu Azid-Alkin-Cycloadditionen k = 10-4 M-1s-1[96] oder der spurlosen Staudinger-Ligation k = 7.7 × 10-3 M-1s-1[97] darstellt. Dieselbe Arbeitsgruppe bewies durch Theoretische Grundlagen | 31 biologische Experimente die Bioorthogonalität solcher Systeme, auch unter physiologischen Bedingungen, bei welchen eine komplexe Mischung an unterschiedlichen Verbindungen und Proteinen vorliegt. Diese Eigenschaften ermöglichten auch in der Biologie einen breiten Anwendungsbereich, angefangen bei Proteinimmobilisierung über Biokonjugate[94,98] bis hin zur Polymerchemie[99]. Zusammengefasst bietet das PBS-SHS-System also eine durch den pHWert steuerbare, reversible Reaktion, welche sehr schnell bioorthogonal sowie ohne Einsatz von Katalysatoren stattfinden kann. Auch in unserem Institut fand das hier beschriebene System bereits Anwendung in der Proteinchemie. Dabei wurde das PBS-SHS-System, als pH-abhängig schaltbare supramolekulare Schutzgruppe, mittels der selbstassemblierenden Bildung eines DendrimerEnzym-Komplexes, genutzt.[101] Abbildung 1-34. PH-abhängige Bildung und Spaltung eines Dendrimer-Enzym-Komplexes. [100] Hierzu wurden PAMAM-Dendrime mit Salicylhydroxamsäuren sowie die Oberfläche katalytisch aktiver Enzyme (Trypsin, Papain, DNAse I) mit Phenylboronsäuren modifiziert. Durch die Einstellung des pH-Werts auf > 7.4 konnte das Enzym durch eine PAMAMDendrimer-Hülle reversibel geschützt und in diesem Zuge inaktiviert werden. Eine Abspaltung der Hülle unter sauren Bedingungen führte zur vollständigen Rückgewinnung der katalytischen Aktivität des Enzyms, auch innerhalb von sauren Zellkompartimenten in A549Zellen.[101] 32 | Motivation 2 Motivation Ziel dieser Arbeit war die Darstellung neuartiger Biokunjugate. Diese sollten mittels eingeführter stimuli-responsiver Plattformen, über den Weg einer definierten Selbstorganisation, aufgebaut werden. Die Idee war, ein Biomolekül mit einem Baustein zu verknüpfen, welcher die gewünschte ortsgerichtete Selbstassemblierung ermöglichen kann. Dies sollte gezielt durch einen bestimmten Stimulus, wie beispielsweise Ionen oder ein pHWert erreicht werden. Aufgrund der dafür idealen Eigenschaften, wurden ein AzaKronenether, ein 2,2´-Bipyridin sowie die beiden komplementären Reaktionspartner, Phenylboronsäure sowie Salicylhydroxamsäure, als reaktive Bausteine ausgewählt. Da die Verwendung eines Proteins als biologische Komponente, aufgrund der Vielzahl an Aminosäuren, zu Einschränkungen hinsichtlich Charakterisierung und selektiver Adressierung führen kann, sollte in dieser Arbeit Somatostatin, ein aus 14 Aminosäuren aufgebautes Peptidhormon, als Modellpeptid verwendet werden. Es wird vom Körper selbst gebildet und kann über bestimmte Rezeptoren in Zellen aufgenommen werden. Da auch viele Krebszellen diese Rezeptoren überexprimieren, ist die biologische Aktivität des Somatostatins und seiner Derivate von großem Interesse. Da es sich um ein zyklisches Peptid handelt, dessen Ringschluss auf der Ausbildung einer Disulfidbindung beruht, ist es möglich dieses Peptid selektiv an dieser Bindung zu modifizieren. Dazu wurde das von Lawton et. al entwickelte Konzept der Interkalation in Disulfidbrücken von Biomolekülen herangezogen.[15] Unter Verwendung von Interkalatoren kann es so ermöglicht werden, dass die besagte Disulfidbrücke, nach einer reduktiven Spaltung durch eine neu gebildete 3-zentrige Kohlenstoff-Bindung über das InterkalatorMolekül hinweg, wieder erhalten wird. Vorteilhaft ist dabei, dass durch einen Wiederaufbau der Bindung, die biologische Aktivität des Somatostatins nicht beeinflusst wird und das Peptid weiterhin von Zellen aufgenommen werden kann. Der Interkalator ermöglicht so also eine selektive Modifizierung des Peptids. Nebenbei stellt er mittels reaktiver Endgruppen einen idealen Ausgangspunkt für die Verknüpfung mit den Bausteinen dar und verbindet diese somit mit dem Biomolekül. Motivation | 33 Die erste synthetische Herausforderung stellt also die Darstellung verschieden funktionalisierter Somatostatin-Konjugate dar, welche über die zwei unterschiedlichen Synthesestrategien grafting onto und grafting from ermöglicht werden soll. Erstere Variante sieht die vorherige Funktionalisierung eines Interkalators mit anschließender Interkalation ins Somatostatin und letztere Variante eine nachträgliche Funktionalisierung des bereits interkalierten Biomaterials vor. Mittels der grafting onto-Methode besteht nun der erste Schritt in der Synthese der Interkalator-Verbindungen, bei welchen die gewünschten Bausteine über einen Tetraethylenoxid-Linker an das Interkalator-Grundgerüst gebunden werden sollten. Diese Verbindungen werden im Anschluss in die Disulfidbrücke des Somatostatin interkaliert. Bei der Anwendung der grafting from-Methode sollte die reaktive Plattform erst nach dem Schritt der Interkalation in das Biomolekül eingeführt werden. Dazu müssen zuerst Somatostatin-Derivate mit einer gut zugänglichen funktionellen Gruppe (FG) synthetisiert werden, welche nachfolgend mit einer entsprechenden Verbindung umgesetzt werden. Da beide Synthesestrategien gewisse Vor- und Nachteile aufweisen, sollen in dieser Arbeit beide Modifikationsmethoden durchgeführt und anschließend evaluiert werden. Nach erfolgreicher Synthese sollen die Somatostatin-Derivate schließlich mit sich selbst bzw. einem komplementären Reaktionspartner umgesetzt und dessen Eigenschaften im chemischen sowie biologischen Hinblick charakterisiert werden. Die Entwicklung, Synthese und Charakterisierung der unterschiedlich funktionalisierten Interkalator-Verbindungen sowie deren Verhalten in Bezug auf die Biokonjugation mit Somatostatin, auch im Vergleich zu einem wesentlich kleineren Tripeptid, stellen somit den zentralen Schwerpunkt dieser Arbeit dar. Des Weiteren werden die verschiedenen Reaktionsmöglichkeiten sowie erste Ergebnisse hinsichtlich des Designs multivalenter und stimuli-responsiver Somatostatin-Biokonjugate vorgestellt. Eine Übersicht der geplanten Syntheserouten ist in nachfolgender Abbildung schematisch dargestellt. 34 | Motivation Schema 2-1. Übersichtsschema der beiden Syntheserouten zur Herstellung von Somatostatin-Konjugaten, welche mittels eines komplementären Reaktionspartners responsive, definierte Biokonjugate ausbilden können. Ergebnisse und Diskussion | 35 3 Ergebnisse und Diskussion Die Darstellung von Biokonjugaten jeglicher Art stellt, aufgrund der Vielfalt an funktionellen Gruppen der Aminosäurereste, auch heutzutage noch eine große Herausforderung dar. Daher wurde in dieser Arbeit die spezifische Modifizierung intramolekularer Disulfidbrücken von Peptiden mittels des Vorgangs der Interkalation angestrebt. Neben der Selektivität, liegt ein weiterer Vorteil dieser Methode in der Tatsache, dass keine zusätzlich aufwendigen Schützungsschritte notwendig sind. Für die Reaktion, wird allerdings der sogenannte Interkalator benötigt, jene Verbindung, welche aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften die Interkalation in die Disulfidbindung ermöglicht und somit von zentraler Bedeutung für die in dieser Arbeit vorgestellte Forschung, ist. Seit mehr als 50 Jahren wird nun am Interkalator-Molekül geforscht und dessen grundsätzlicher struktureller Aufbau weiterentwickelt.[15] Lawton und Brocchini publizierten 1990 eine bis dato neuartige Interkalator-Verbindung (Abbildung 3-1, I), deren MichaelAkzeptor-System maskiert vorliegt und erst unter bestimmten Bedingungen ausgebildet werden muss. Auf diese Weise kann die Interkalation gezielt gestartet werden.[17] Ersetzt man R1 durch eine Carboxygruppe und die Reste R2/3 durch Methylgruppen, erhält man eine von Brocchini 2006 unter dem Namen „Bisulfon“ (II) veröffentlichte Variante.[18] Abbildung 3-1. I) Grundgerüst der 1990 veröffentlichten Interkalator-Verbindung; II) Bisulfon-Interkalator. [17,18] Ausgehend vom Grundgerüst des Bisulfons II werden im nachfolgenden Kapitel unterschiedlich funktionalisierte Interkalator-Verbindungen entwickelt, charakterisiert und mit Somatostatin umgesetzt. In Kapitel 3.2 wird die Synthese der Somatostatin-Konjugate über einen gegensätzlichen Weg vorgestellt und im Anschluss beide Varianten miteinander verglichen. Im letzten Kapitel 3.3 werden schließlich die weiterführenden Reaktionen der synthetisierten Somatostatin-Konjugate untersucht. 36 | Ergebnisse und Diskussion 3.1 Somatostatin-Konjugate – Entwicklung nach der grafting onto Methode Der erste Schritt in der Darstellung von Somatostatin-Konjugaten, unter Verwendung der grafting onto Methode, war die Synthese der Interkalatoren. Dabei sollte jeweils ein Baustein eingeführt werden, welcher die Grundlage für die später durchzuführende Selbstorganisation der Somatostatin-Derivate darstellt. Die Carboxygruppe des Bisulfons stellte dabei den Ausgangspunkt zur Verknüpfung mit den angesprochenen Bausteinen dar. In Schema 3-1 ist ein Überblick der in Kapitel 3.1.1 verfolgten Syntheseroute zur Darstellung der funktionalisierten Interkalatoren inklusive der jeweils eingeführten Plattform dargestellt. Wie im Schema bereits angedeutet, werden im darauffolgenden Kapitel 3.1.2 ausführlich die Interkalations-Reaktionen der zuvor synthetisierten Interkalatoren mit Somatostatin erläutert, wobei auch ein möglicher elektronischer Einfluss der Substituten hinsichtlich dem Verlauf der Reaktion diskutiert wird. Um die daraus erhaltenen Ergebnisse besser interpretieren zu können, wurde als Vergleich zum Somatostatin auch die Biokonjugation mit Glutathion untersucht. Schema 3-1. Übersicht der Synthesestrategie I zur Darstellung von Somatostatin-Konjugaten nach der Methode des grafting onto. Dazu wurde zuerst eine Bibliothek an unterschiedlich funktionalisierten Interkalator-Verbindungen synthetisiert und im Anschluss deren Verhalten bei der Biokonjugation mit Somatostatin und Glutathion untersucht. Ergebnisse und Diskussion | 37 Wie aus Schema 3-1 ersichtlich, wurde zu Beginn die Strategie verfolgt, eine InterkalatorVerbindung mit einer Aminogruppe als Basis zur Verknüpfung mit Kronenether-, Bipyridinund Phenylboronsäure-Derivaten zu verwenden. Der Nachteil bestand hier allerdings in der Tatsache, dass der Amino-Interkalator selbst nicht zur Interkalation herangezogen werden kann, da auch das Somatostatin diese funktionelle Gruppe mehrfach aufweist und somit später keine Reaktionen selektiv an der Aminogruppe des interkalierten Somatostatins durchgeführt werden können. Da die Postmodifizierung einer der Plattformen nicht sinnvoll war, wurde eine Azidgruppe eingeführt, welche sowohl vor als auch nach einer vollzogenen Interkalation sehr gut zugänglich ist und beispielsweise mittels der 1,3-dipolaren Cycloaddition umgesetzt werden kann. Diese Art der Reaktion wurde hier sofort eingesetzt und auf diesem Weg Interkalator-Verbindungen mit einem weiteren Kronenether sowie einer Salicylhydroxamsäure, dem komplementären Reaktionspartner der Phenylboronsäure, dargestellt. Das Übersichtsschema deutet außerdem an, dass die jeweils eingeführten funktionellen Bausteine nicht direkt an der Carboxygruppe des Bisulfon gebunden, sondern über ein Linker-Molekül (gewellte Linie) räumlich voneinander getrennt werden. Denn bei Reaktionen mit Biomolekülen spielt Sterik eine wichtige Rolle, wodurch es in diesem Fall sinnvoll war, einen entsprechenden Linker zwischen Bisulfon und dem gewünschten SO-Baustein einzubauen. Abgesehen vom hier verwendeten Carbonsäure-Derivat des Bisulfons, sind auch Iodo-, Bromo- und Ethinylgruppen als Substituenten bekannt, welche weiterführende Reaktionen der Somatostatin-Derivate direkt am Interkalator ermöglichen. Entsprechende Reaktionen konnten durch Anne Pfisterer im Rahmen ihrer Dissertation erfolgreich durchgeführt werden.[149] Teile, der in diesem Kapitel vorgestellten Ergebnisse, wurden bereits in folgenden Publikationen veröffentlicht: Bis-sulfide bioconjugates for glutathione triggered tumor responsive drug release, T. Wang, D. Y. W. Ng, Y. Wu, J. Thomas, T. T. Tram, T. Weil, Chemical Communications, 2014, 50, 11161118. A Disulfide Intercalator Toolbox for Site-Directed Protein Chemistry, T. Wang, Y. Wu, S. L. Kuan, O. Dumele, D. Y. W. Ng, J. Thomas, M. Lamla, C. Barner-Kowollik, T. Weil, Chemistry, 2015, 21, 228-238. 38 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1 Entwicklung unterschiedlich funktionalisierter Interkalator- Verbindungen In diesem Kapitel wird nun detailliert auf die Synthese sowie die vollständige Charakterisierung der einzelnen Interkalator-Verbindungen eingegangen. Begonnen wird dabei mit der Synthese des Bisulfons, welches als Grundgerüst für alle weiteren Modifikationen notwendig war und mittels der Carboxygruppe den Ausgangspunkt in der weiteren Entwicklung der Interkalatoren darstellte. 3.1.1.1 Das Bisulfon – Grundgerüst der Interkalator-Verbindungen Beim Bisulfon handelt es sich um ein α,α-Bis[(p-Tolylsulfonyl)methyl]acetophenon-Gerüst, welches eine Carboxygruppe am Acetophenon-Ring aufweist. Wie bereits angesprochen, liegt das Besondere dieser Verbindung in der Maskierung des für die Interkalation notwendigen Michael-Akzeptor-Systems. Hierunter versteht man α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen, wie beispielsweise α,β-ungesättigte Ketone, Aldehyde oder Carbonsäureamide[102], welche im Zuge einer Michael-Addition von Michael-DonorVerbindungen, wie zum Beispiel Carbanionen oder Thiolen, nukleophil angegriffen werden können. Im Falle des Bisulfons sorgt das in para-Position substituierte aromatische Keton für die nötige Aktivierung zur Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems. Die Toluolsulfonsäure stellt dabei eine gute Abgangsgruppe dar und wird, wie nachfolgend dargestellt, über den E1cB-Mechanisums eliminiert.[15] Die Ketogruppe bietet zusätzlich den Vorteil, dass diese unter milden Bedingungen zu einem Alkohol reduziert werden und auf diese Weise eine Rückreaktion, die sogenannte Retro-Michael-Addition, unterbunden werden kann.[103] Schema 3-2. Eliminierung der Toluolsulfonsäure nach dem E1cB-Mechanismus. Ergebnisse und Diskussion | 39 Nach der Abspaltung weist die Verbindung nun die für eine Michael-Addition essentiellen Voraussetzungen auf: eine elektronenziehende aromatische Ketogruppe, eine α, βungesättigte Doppelbindung sowie eine in β´-Position befindliche aromatische Sulfonylgruppe als weitere Abgangsgruppe. Befindet sich nun ein Nukleophil (Michael-Donor), beispielsweise ein aktiviertes Thiol, in unmittelbarer Nähe des Michael-Akzeptors, kann dieses an der reaktiven Doppelbindung über einen Additions-Eliminierungsschritt angreifen und so in situ ein neues MichaelAkzeptor-System erzeugen. Sind in der Lösung ausreichend Nukleophile vorhanden, kann die neu entstandene Verbindung im Anschluss eine weitere Michael-Addition durchlaufen. Weist die Reaktionslösung unterschiedliche Nukleophile auf, können diese nacheinander am gleichen Interkalator-Molekül angreifen (I), vorausgesetzt ihre Größe lässt dies aufgrund von sterischer Hinderung zu. Andernfalls bleibt die Reaktion nach dem ersten Angriff stehen. Im Falle des zyklischen Peptidhormons Somatostatin, welches eine intramolekulare Disulfidbrücke aufweist, ist es sogar möglich, diese Brücke nach einer reduktiven Spaltung und konsekutiven Addition der beiden Thiol-Reste am gleichen Interkalator-Molekül, über drei Kohlenstoff-Atome wieder aufzubauen (II). Der grundsätzliche Ablauf der angesprochenen Reaktionen wird in Schema 3-3 kurz zusammengefasst. Schema 3-3. Konsekutive Michael-Additions-Reaktionen am aktivierten Bisulfon-Interkalator mit unterschiedlichen Peptiden, welche ein oder zwei Thiolgruppen aufweisen. Der erste synthetische Schritt bestand in der Herstellung des Bisulfon-Interkalator-Moleküls, wobei sich hier größtenteils an der Originalliteratur orientiert wurde. [18] Die dreistufige Syntheseroute ist in folgendem Schema dargestellt. 40 | Ergebnisse und Diskussion Schema 3-4. Syntheseroute des Bisulfon-Interkalators 3; i) Piperidin-Hydrochlorid, Paraformaldehyd, Salzsäure, EtOH, 105 °C, 18 h; ii) 4-Methylthiophenol, Piperidin, 37% Formaldehydlösung, EtOH/MeOH (1:1), 105 °C 4 h; iii) Oxone, MeOH/H20 (1:1), 24 h, RT. Die erste Stufe bestand in der Synthese des Mannich-Salzes 1. Hierzu wurde pAcetylbenzoesäure als Ausgangsverbindung verwendet und in einer Mannich-Reaktion mit Piperidin-Hydrochlorid und einem Überschuss an Paraformaldehyd umgesetzt. Nach der Zugabe einer katalytischen Menge an konzentrierter Salzsäure wurde das Reaktionsgemisch für 18 h unter Rückfluss erhitzt, wobei nach vier Stunden nochmals Paraformaldehyd zugegeben wurde. Die Verlängerung der Reaktionszeit von laut Literatur zehn auf 18 Stunden, zeigte eine Verbesserung der Ausbeute von 45% auf 54%. Dies führte außerdem dazu, dass sich das Produkt nach Ende der Reaktionszeit bereits als weißer Feststoff im Kolben niedergeschlagen hatte. Der diesem Reaktionsschritt zu Grunde liegende Mechanismus, der Mannich-Reaktion, ist im nachfolgenden Schema dargestellt. Schema 3-5. Mechanismus der Mannich-Reaktion über die Zwischenstufe der Bildung eines Iminiumions. [104] Ergebnisse und Diskussion | 41 Das Mannich-Salz 1 wurde ohne weitere Aufreinigungsschritte sofort weiter zum Bisulfid 2 umgesetzt. Dazu wurde 1 zusammen mit 4-Methylthiophenol in einer Mischung aus Ethanol und Methanol gelöst und nacheinander Piperidin sowie wässrige Formaldehydlösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend vier Stunden unter Rückfluss erhitzt und nach einer Stunde nochmals Formaldehyd zugegeben. Das Produkt wurde sauer extrahiert und anschließend säulenchromatographisch aufgereinigt. Um das überschüssige 4-Methylthiophenol zu entfernen, wurde zu Beginn der Trennung 100% Dichlormethan als Laufmittel verwendet. Danach wurden dem Laufmittel langsam bis zu 10% Methanol beigemischt und Verbindung 2 mit einer Ausbeute von 71% erhalten. Nach dieser Stufe konnte auf zwei Wegen weiterverfahren werden. Entweder wurde Verbindung 2 über ein Oxidationsmittel zum Bisulfon 3 oxidiert und anschließend weiter modifiziert oder das Bisulfid 2 wurde zuerst modifiziert und im Anschluss daran oxidiert. Welche Syntheseroute gewählt wurde, war dabei hauptsächlich von der Oxidationsempfindlichkeit der eingeführten Substituenten abhängig. Für die Oxidation beider Schwefelatome des Bisulfids zum Bisulfon wurde Oxone® (Kalium Peroxomonosulfat) verwendet. Hierbei handelt es sich um ein Dreifachsalz, bestehend aus den Komponenten KHSO5, KHSO4 und K2SO4. Aufgrund seiner Eigenschaften, wie einer hohen Stabilität, einfacher und gefahrloser Handhabung sowie geringer Kosten und keiner Toxizität, findet Oxone® in zahlreichen Veröffentlichungen in unterschiedlichsten Oxidationsprozessen Erwähnung. Wie vielfältig das Anwendungsgebiet ausfällt, wird in nachfolgender Abbildung verdeutlicht.[105] Abbildung 3-2. Die vielfältigen Einsatzgebiete von Oxone®. American Chemical Society. [105] Adapted with permission from [105]. Copyright © 2003, 42 | Ergebnisse und Diskussion Aufgrund der hohen Reaktivität des Oxones® gegenüber einer Vielzahl an funktionellen Gruppen, wurden in dieser Arbeit sowohl das Bisulfid als auch das Bisulfon für weiterführende Modifikationen eingesetzt. Für die Oxidationsreaktion wurde Bisulfid 2 zusammen mit einem sechsfachen Überschuss an Oxone® in einer Methanol-Wasser-Lösung (1:1) für 24 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend durch Extraktion mit Chloroform aufgereinigt. Der Mechanismus der Oxone®-Oxidation ist im Schema 3-6 aufgezeigt. Schema 3-6. Mechanismus einer Sulfid-Oxidation via Oxone®. Um die Vollständigkeit der Oxidation zu überprüfen, wurde die 1H-NMR-Spektroskopie herangezogen sowie beide Verbindungen mittels HR-ESI-MS analysiert. 1 Abbildung 3-3. H-NMR-Spektren (CDCl3) von Bisulfid 2 und Bisulfon 3 im Vergleich. Ergebnisse und Diskussion | 43 Im Vergleich der beiden Spektren lässt sich deutlich die Änderung der chemischen Verschiebung der, den Sulfongruppen benachbarten, aromatischen Signale 5 und 6 erkennen. Diese Änderung beruht auf dem tieffeldverschiebenden Effekt der Sulfongruppen im Gegensatz zu den Sulfiden, wodurch es zu einer Überlagerung der Signale 2 und 5 des Bisulfons kommt. Im Falle des Bisulfids lässt sich außerdem der Dacheffekt der aromatischen Signale 5 und 6 sowie 1 und 2 beobachten. Beide Verbindungen erwiesen sich als stabil gegenüber Sauerstoff und müssen nicht unter Argonatmosphäre und Ausschluss von Wasser gelagert werden. Es konnte auch keine Zersetzung des Bisulfons in den später verwendeten organischen Lösungsmitteln beobachtet werden. Bei einigen der nachfolgend beschriebenen Synthesen waren basische Reaktionsbedingungen unumgänglich. Dies hatte zur Folge, dass sich, wie in Schema 3-2 erläutert, teilweise durch die Eliminierung der Toluolsulfonsäure das Monosulfon bereits während der Reaktion ausbildete. Dies führte zu Schwierigkeiten bei der Charakterisierung, vor allem bezüglich der NMR-Spektroskopie sowie bei der Bestimmung der Ausbeute. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit, war es ohne Zuhilfenahme der HPLC nicht möglich, dass Monosulfon vollständig abzutrennen. Da allerdings die Biokonjugation mit Peptiden das eigentliche synthetische Ziel darstellte, war die Ausbildung des Monosulfons ohnehin der nächste Schritt und stellte somit synthetisch gesehen kein Problem dar. Eine Trennung der Produktgemische aus Bi- und Monosulfon wurde daher nur zum Zwecke der Charakterisierung durchgeführt. Wie in Schema 3-1 aufgezeigt, sollte nach erfolgreicher Darstellung des Bisulfons ein AminoInterkalator als Basis für Postmodifikationen synthetisiert werden. 44 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.2 Entwicklung des Amino-Interkalators als reaktive Ausgangsplattform Der Amino-Interkalator wurde in Zusammenarbeit mit Tao Wang entwickelt, wobei dieser von Beginn an nicht für die Interkalationsreaktion in Betracht gezogen werden konnte, aber aufgrund seiner reaktiven Plattform synthetisch trotzdem von enormer Bedeutung war. Über die Aminosäure Lysin weisen viele Peptide und Proteine, auch das Somatostatin, freie Aminogruppen auf. Eine Interkalation des Amino-Interkalators ist daher wenig sinnvoll, da dessen Aminogruppe nicht mehr selektiv adressiert werden kann. Wie in den darauffolgenden Kapiteln erläutert, stellte diese Aminogruppe allerdings bei der grafting onto-Entwicklung der unterschiedlich funktionalisierten Interkalator-Verbindungen eine ideale Basis für die Einführung jeglicher Art an Bausteine dar, solange diese mit einer Aminogruppe umgesetzt werden konnten. Zu Beginn des Kapitels 3.1 wurde bereits erläutert, dass der Einbau eines Linker-Moleküls zwischen Bisulfon-Teil und dem reaktiven Substituenten geplant war. Durch die geeignete Wahl des Linker-Moleküls lassen sich neben Abstand und Flexibilität auch gezielt bestimmte chemische Eigenschaften einer Verbindung verändern. Gerade im Hinblick auf biologische und medizinische Anwendung spielen Wasserlöslichkeit und Toxizität eine wichtige Rolle. Beide Eigenschaften können heutzutage durch die gezielte Einführung der polaren Polyethylenoxid-Ketten (PEO, engl.: Polyethylenglycol, PEG), welche aus [-CH2-CH2-O-]Monomer-Einheiten aufgebaut sind, beeinflusst werden. Dieser Vorgang wird auch als PEGylierung bezeichnet und ist eine bewährte Methode, um Stabilität und Zirkulationszeiten von Proteinen und liposomalen Pharmazeutika zu erhöhen.[106] Da im Falle der Biokonjugation der hier synthetisierten Interkalatoren eine gewisse Wasserlöslichkeit nötig war, sowie Sterik bei späteren Reaktionen der Biomoleküle eine Rolle spielte, war der Einsatz einer polaren PEO-Kette als Linker das Mittel der Wahl. Zumal bei der Entwicklung der unterschiedlichen Interkalator-Verbindungen auch eine eindeutige Charakterisierung gefordert war, wurde hier kein Polymer sondern lediglich eine Triethylenoxid-(TEO)-Kette verwendet. Dieser TEO-Linker wurde gleichzeitig auch dazu verwendet, die Aminogruppe in die Verbindung einzuführen. Dazu wurde ein 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin eingesetzt, welches beidseitig terminale Aminogruppen aufwies (Schema 3-7). Ergebnisse und Diskussion | 45 Für den Aufbau des Amino-Interkalators sollte nun der Diamino-TEO-Linker an die Carboxygruppe des Bisulfons geknüpft werden. Die Syntheseroute ist aus nachfolgendem Schema ersichtlich. Schema 3-7. Syntheseroute des Amin-Interkalators 6; i) Di-tert-butyldicarbonat, 1,4-Dioxan, RT, 18 h; ii) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, 24 h, iii) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 24 h. Um nur eine der beiden terminalen Aminogruppen zu funktionalisieren, musste im ersten Schritt eine Boc-Schützung einer Aminogruppe vorgenommen werden. Hierzu wurde das Diamin in Dioxan gelöst und in einem 2:1 Verhältnis tropfenweise mit Di-tertbutyldicarbonat umgesetzt. Um Nebenprodukte vom Mono-Boc-TEO 5 abzutrennen, wurde das Reaktionsgemisch säulenchromatographisch mit 10% Methanol in Dichlormethan aufgereinigt. Aufgrund der zusätzlichen Bildung des zweifach Boc-geschützten Diamins, bzw. nicht reagierten Edukts, belief sich die Ausbeute auf maximal 35%. Aufgrund der starken Wechselwirkung der freien Aminogruppe mit dem bei der Säulenchromatographie verwendeten Kieselgel, gestaltete sich die Trennung trotz Verwendung von Druck als äußerst langwierig. Daher wurde eine literaturbekannte Variante ohne säulenchromatographische Aufreinigung versucht.[107] Hierzu wurde das Diamin mit Di-tert-butyldicarbonat im Verhältnis 6:1 im Dioxan umgesetzt und nach 12 h Reaktionszeit sollte das Mono-geschützte Produkt durch Extraxtion mit Dichlormethan sowie gesättigter Natriumchlorid-Lösung rein erhalten werden. Allerdings war es selbst bei einer Erhöhung der Äquivalente auf 12:1 nicht 46 | Ergebnisse und Diskussion möglich, wie in der Literatur beschrieben, nur durch Extraktion das Produkt von den Nebenprodukten abzutrennen. Als zweiter Änderungsversuch wurde dem Laufmittelgemisch 1% Ammoniak zugesetzt, um damit die Laufgeschwindigkeit des Produkts zu erhöhen. Dies führte zu einer drastischen Verkürzung der benötigten Aufreinigungszeit und gleichzeitig zu einer Erhöhung der Ausbeute auf bis zu 43%. Das Boc-geschützte Diamin 4 konnte nun mit dem Bisulfon 3 umgesetzt werden. Für die Verknüpfung von Aminen mit Carbonsäuren stehen, zur Erhöhung der Reaktivität, verschiedene Hilfsreagenzien, wie EDC, DCC, BOP oder HBTU, zur Verfügung. Diese spielen in der Peptid-Chemie eine große Rolle und werden in diesem Kontext als Kupplungsreagenzien bezeichnet. Die Nomenklatur ist zurückzuführen auf die Reaktion zweier Aminosäuren unter Bildung einer Peptidbindung, welche in diesem Forschungsgebiet als Kupplungsreaktion beschrieben wird.[108] Auch in dieser Arbeit wird diese Bezeichnung verwendet werden, wobei eine klare Abtrennung zur metallkatalysierten C-C-Verknüpfung der Homo- und Kreuzkupplungen der organischen Chemie vollzogen wird. Der Mechanismus dieser Art von Kupplungsreaktion ist in Schema 3-8 dargestellt.[109] Schema 3-8. Mechanismus der HBTU-Kupplungsreaktion zwischen einer Carboxy- und einer Aminverbindung. Dabei wurde jeweils in verschiedenen Testreaktionen ermittelt, welches der Reagenzien das beste Resultat lieferte. In diesem konkreten Fall war dies HBTU mit DIEA, als nichtnukleophile Base. Die Reaktion wurde in trockenem Dimethylformamid durchgeführt. Die Aufreinigung erfolgte durch Extraktion und Säulenchromatographie (3% Methanol in Chloroform). Die zweite Stufe bestand in der Entschützung des Boc-geschützten Amins. Hierzu wurde 5 in DCM gelöst und mit einem zehnfachen Überschuss an Trifluoressigsäure für 24 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Trifluoressigsäure ist eine starke organische Säure, welche sowohl mit Wasser als auch mit organischen Lösungsmitteln mischbar ist, bis 400° C stabil bleibt und sich unempfindlich Ergebnisse und Diskussion | 47 gegenüber Sauerstoff verhält, weshalb sie auch in der Proteinchemie häufig eingesetzt wird. Ein synthetischer Vorteil ist dabei, dass nicht abreagierte Säure zusammen mit während der Abspaltungsreaktion entstandenem Kohlenstoffdioxid sowie Isobuten, einfach am Vakuum entfernt werden können und keine weiteren aufwendigen Trennschritte nötig sind. Bei der Kupplungsreaktion konnte sehr gut der vorher erwähnte Vorgang der Ausbildung des Monosulfons, durch die Nutzung von DIEA, beobachtet werden. Dass das Produktgemisch mittels Säulenchromatographie nicht vollständig getrennt werden konnte, lies sich durch LCMS-Untersuchungen bestätigen. In Abbildung 3-4 kann man mit M = 547 g/mol in Spektrum C das Monosulfon und in Spektrum D das Bisulfon mit M = 702 g/mol erkennen. Abbildung 3-4. LC-MS-Spektren des Amino-Interkalators 6; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 + nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 547 g/mol [Mmono] ; D) MS-Spektrum (-) t = 7.75 min: m/z = 702 g/mol [M] ; berechnet: [Mmono] = 547 g/mol, [M] = 702.32 g/mol. Die Abspaltung der Toluolsulfonsäure lässt sich auch im 1H-NMR-Spektrum in Abbildung 3-5 erkennen. Zur genauen Zuordnung der Signale erfolgten, neben 1 H- und Spektroskopie, zusätzliche H,H-COSY-, HMBC- und HSQC- sowie DEPT-Experimente. 13 C-NMR- 48 | Ergebnisse und Diskussion 1 Abbildung 3-5. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Amin-Interkalators 6. Vergleicht man dieses 1H-NMR-Spektrum mit dem des Bisulfons in Abbildung 3-3, kann man auch hier die aromatischen Signale (11,12,15,16) sowie die Methylgruppen 17 des BisulfonGrundgerüsts eindeutig zuordnen. Jedoch kommt es hier nicht zu einer Überlagerung der Signale 15 und 12. Sie werden getrennt voneinander aufgespalten und man kann deutlich den Dacheffekt der korrelierenden Signale 11-12 sowie 15-16 erkennen. Durch die Entstehung des Monosulfons bildete sich, wie bereits erwähnt, eine neue Doppelbindung aus. Im Vergleich kann man hier daher zwei zusätzliche Signale bei 5.96 und 6.17 ppm erkennen, welche durch die beiden H-Atomen der neuen Doppelbindung in Position 13 verursacht werden. Aufgrund dieser neuen Bindung spalten auch die Protonen 14 nicht wie zuvor als zwei Multipletts im Bereich von 3.40 – 3.70 ppm auf, sondern sind dem Singulett bei 4.35 ppm zuzuweisen. Da die Trennung von Mono- und Bi-Interkalator nicht vollständig möglich war, kommt es bei Signal 17 zu zwei dicht beieinander liegenden Singuletts. Die der Aminogruppe direkt benachbarte Methylengruppe 1 kann dem Multiplett bei 3.23 ppm, die beiden Methylengruppen 2 und 9, aufgrund ihrer Nachbarschaft zur Amid/Aminogruppe und einem TEO-Sauerstoff, den Multipletts bei 1.95 und 1.84 ppm zugeordnet werden. Abgesehen vom Triplett 3, überlagern sich die restlichen TEO-Methylengruppen-Signale, wodurch sie trotz C,H-Korrelationsexperimente nur grob den Bereichen 3.49-3.55 und 3.573.62 ppm zugewiesen werden konnten. Vergleicht man die Zahlenwerte der Integrale des Interkalator-Teils mit denen der TEO-Kette, kann man ebenfalls auf eine Mischung aus Ergebnisse und Diskussion | 49 Monosulfon- und Bisulfon-Interkalator schließen, da die Integralwerte des Interkalator-Teils im Vergleich zum TEO-Teil erniedrigt sind. Das übergeordnete synthetische Ziel dieses Kapitels, war die Darstellung von InterkalatorVerbindungen, welche mittels bestimmter Bausteine in der Lage sein sollten, sich durch einen spezifischen Stimulus selbstassemblierend zu ordnen. Die Einführung dieser Bausteine wird in den nachfolgenden Kapiteln, angefangen beim Aza-Kronenether über das 2,2Bipyridin hin zur Phenylboronsäure, erläutert. Der soeben vorgestellte Interkalator 6, diente dabei mittels der Aminogruppe als Ausgangsverbindung, um die angesprochenen Bausteine einzuführen. 50 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.3 Synthese und Charakterisierung der Aza-Kronenether-Interkalatoren Die erste vom Amino-Interkalator 6 ausgehende Zielverbindung stellte der KronenetherInterkalator dar. Kronenether zeigen sowohl in organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln hohe Löslichkeit sowie Stabilität und sind daher insbesondere im Hinblick auf die Peptid- und Proteinchemie von Interesse. Neben der Löslichkeit des zyklischen Polyethers selbst, erlaubt der strukturelle Aufbau einer Abfolge aus Ethyloxy-Einheiten eine Komplexierung unterschiedlichster Ionen. Die Komplexierung erfolgt dabei meist über die freien Elektronenpaare der elektronegativen Sauerstoffatome der Ethergruppen im Ring, wobei vor allem die Größe des zu komplexierenden Ions eine entscheidende Rolle hinsichtlich Stabilität und Aufbau des Komplexes spielt.[42] Denn nur wenn das Verhältnis des Durchmessers von Ion und Hohlraums der Krone ideal zueinander passen, kommt es zur Ausbildung eines 1:1 (Ligand:Ion) Komplexes. Ist das Ion jedoch etwas größer, kann es zur Entstehung eines Sandwich-Komplexes, also einer 2:1 (Ligand:Ion) Komplexierung, kommen. Die [15]Krone-5 beispielsweise, bevorzugt für einen 1:1-Komplex Na+, die [18]Krone-6 hingegen K+. Jedoch bildet K+ mit der [15]Krone-5 stabile 2:1-Komplexe aus.[45,46] Da die typischen Kronenether jedoch nur über sich wiederholende Ethyloxy-Einheiten verfügen, gestaltet es sich schwierig, diese gezielt zu modifizieren, um sie mit anderen Verbindungen zu verknüpfen. Eine vielversprechende Alternative stellt daher die Aza-Krone dar, bei welcher ein oder mehrere Sauerstoffatome gegen Stickstoffatome ersetzt wurden. Abbildung 3-6. Strukturformeln und Kugel-Strich-Modelle der [15]Krone-5 sowie der Modifikation Aza-[15]Krone-5. Die Motivation hinter dieser Modifizierung ist die Veränderung bzw. Verbesserung der Funktionalität der Krone. Stickstoffatome können beispielsweise als Verknüpfungspunkt oder Knotenpunkt für zusätzliche Arme bzw. Brücken, wie im Falle der Lariat-Kronenether, dienen. Neben diesen Möglichkeiten sind elektronische Effekte von Interesse. Im Hinblick auf Pearsons HSAB-Konzept (hard soft acid base-concept), besitzen Stickstoff-Donor-Atome im Vergleich zum Sauerstoff eine andere Präferenz bezüglich der Bindung von Kationen.[42] Ergebnisse und Diskussion | 51 Dies macht sich beispielsweise bei Übergangsmetall-Kationen wie Kupfer bemerkbar. Dass auch Aza-Kronen in der Lage sind, 2:1-Sandwich-Komplexe auszubilden, konnte in der Literatur bereits mehrfach gezeigt werden.[52] Anhand dieser Eigenschaften entstand die Idee, ein Biokonjugat dank der Sandwich-Komplexierung von Natriumionen durch Kronenether zu entwickeln. Der erste Schritt bestand in der Synthese eines Aza-[15]Krone-5Interkalators. Dies wurde, aufgrund nicht zufriedenstellender Ausbeuten, über zwei verschiedene Varianten versucht. Begonnen wurde dabei mit Variante A, welche über die Kupplung der Krone an den Amino-Interkalator 6 verlief. In Variante B wurde dagegen ein umgekehrter Aufbau verfolgt, in dem ein TEO-Linker zuerst an die Krone und erst im Anschluss an das Bisulfon 3 geknüpft worden war. Synthese-Variante A über den Amino-Interkalator 6 Die Syntheseroute des ersten Aza-Kronenether-Interkalators 8, über den Weg der SäureAmin-Kupplung, ist im nachfolgenden Schema aufgezeigt. Schema 3-9. Syntheseroute A des Aza-Kronenther-Interkalators 8; i) THF, Reflux, 3 h; Dimethylformamid, RT, 24 h. [151] ii) HBTU, DIEA, Um die Aza-Krone mit dem Amino-Interkalator verknüpfen zu können, war es notwendig eine Carboxygruppe in den Kronenether einzuführen. Dies geschah mittels des Einsatzes von Glutarsäure.[151] Dazu wurde 1-Aza-[15]Krone-5 in THF gelöst, mit Dihydropyran-2,6-dion versetzt und für drei Stunden refluxiert. Nach saurer Extraktion konnte das Produkt 7 ohne zusätzlich notwendige Aufreinigungsschritte mit 89% Ausbeute erhalten werden. Im 52 | Ergebnisse und Diskussion Anschluss wurde die modifizierte Aza-Krone 7 wieder in einer Kupplungsreaktion, unter Verwendung von HBTU sowie DIEA, mit dem Amin-Interkalator 6 verknüpft und mit einer Ausbeute von 43% erhalten. Auch hier konnte, aufgrund der basischen Reaktionsbedingungen, wie bereits zuvor bei der Amino-Interkalator-Synthese beschrieben, die Ausbildung des Monosulfons festgestellt werden. Da sich die beiden Produkte durch Säulenchromatographie nicht vollständig voneinander trennen ließen, wurde eine zusätzliche Aufreinigung unter Verwendung der HPLC durchgeführt. Die korrekte Masse der Verbindung 8 konnte durch LC-MS-Analyse bestätigt und die Struktur anhand der 1H-NMR-Spektroskopie untersucht werden. Die Zuordnung der Signale wird in Abbildung 3-7 wiedergegeben. 1 Abbildung 3-7. H-NMR-Spektrum (MeOD) des Aza-Kronenether-Interkalators 8. Trotz C,H-Korrelationsexperimenten, konnten auch hier nicht alle Signale eindeutig zugeordnet werden. Gerade die Signale 18 sowie 20 unterscheiden sich in ihrer chemischen Umgebung hinsichtlich ihrer benachbarten Carboxy-Kohlenstoff-Atome nur so geringfügig, dass auch eine gegensätzliche Zuordnung zutreffen könnte. Die Protonen der Methylengruppen des TEO-Linkers 11-14 sowie der Aza-Krone 23-29 können aufgrund der Ergebnisse und Diskussion | 53 Überlagerungen ihrer Signale im Bereich von 3.60 bis 3.66 ppm ebenfalls nicht näher charakterisiert werden. Mit Hilfe von HSQC- und HMBC-Analysen, konnten genauere Zuweisungen bezüglich der Signale 9, 16, 17 sowie 19 der Methylengruppen getroffen werden. Bei allen anderen Protonen des TEO- sowie Kronenether-Teils, konnte nur eine Einschränkung auf das jeweilige Mulitplett im Bereich von 3.47-3.56 oder 3.60-3.66 ppm getroffen werden. Eindeutig zuweisen ließen sich die für den Interkalator typischen aromatischen Signale 2,3,6 und 7 sowie die Methylgruppen 1 und das Multiplett 5. Die Interkalator-Multipletts der Signale 4a und b überlagern sich hier allerdings zum einen mit Signal 22 der Krone und zum anderen mit einigen Signalen der TEO-Einheiten, sind jedoch beide im Vergleich zum vorherigen Interkalator um etwa 0.1 ppm tieffeldverschoben. Synthese-Variante B über den Bisulfon-Interkalator 3 Da die Ausbeute bei Variante A bei nur 43% lag, wurde als Alternative ein umgekehrter Aufbau des Kronenether-Interkalators in Betracht gezogen. Hierbei sollte die Aza-Krone zuerst mit einem TEO-Linker verknüpft und erst zuletzt mit dem Bisulfon 3 umgesetzt werden. Eine Übersicht über diese Syntheseroute ist in Schema 3-10 dargestellt. Schema 3-10. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Interkalators 11; i) BOP, HOBt, DIEA, Dimethylformamid, RT, 48 h; ii) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 24 h; iii) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h. Der hier verwendete TEO-Linker, N-Boc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamin, wurde in der abgebildeten Form käuflich erworben und wies daher bereits eine Bocgeschützte Aminogruppe sowie eine Carboxygruppe auf, welche im ersten Syntheseschritt 54 | Ergebnisse und Diskussion mit der 1-Aza-[15]Krone-5 verknüpft werden sollte. Zur Aktivierung wurden wieder die Reagenzien HBTU sowie DIEA verwendet. Aufgrund der geringen Ausbeute von nur 23%, wurde, als Alternative zu HBTU, eine Kombination aus BOP sowie geringe Mengen an HOBT eingesetzt, wodurch die Ausbeute auf 63% erhöht werden konnte. Eine Verlängerung der Reaktionszeit von 24 auf 48 h erwies sich dabei zusätzlich als vorteilhaft. Die Aufarbeitung erfolgte säulenchromatographisch (10% Methanol in Chloroform) und ergab Verbindung 9 mit einer Ausbeute von 63%. Der Mechanismus der BOP-Aktivierung verläuft, aufgrund des strukturell ähnlichen Aufbaus (Abbildung 3-8), analog zu dem in Schema 3-8 dargestellten Mechanismus mit HBTU. Abbildung 3-8. Vergleich der Strukturformeln der Kupplungsreagenzien HBTU, BOP und HOBT. Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe des Amins wurde 9 in DCM gelöst, mit einem zehnfachen Überschuss an Trifluoressigsäure versetzt und für 18 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels und der überschüssigen Trifluoressigsäure erfolgten keine weiteren Aufreinigungschritte der Verbindung 10. Die Vollständigkeit der Entschützung wurde mittels NMR-Spektroskopie überprüft. Der letzte Syntheseschritt bestand in der Verknüpfung des entschützten Linkers 10 und dem Bisulfon 3. Hierzu wurden wieder beide Kombinationen an Kupplungsreagenzien, sowohl HBTU/DIEA als auch BOP/HOBT/DIEA, getestet. Leider lieferten beide Varianten Komponente 11 in nur geringen Ausbeuten im Bereich von 15% (HBTU) bis 25% (BOP/HOBT). Die Aufreinigung erfolgte jeweils zuerst unter Anwendung der präparativen Säulenchromatographie (5% Methanol in Chloroform). Um analytische Reinheit zu erlangen, wurde ein zusätzlicher Reinigungsschritt via HPLC durchgeführt. Die korrekten Massen der Verbindungen 9 bis 11 wurden mittels LC-MS, im Falle des Interkalators 18 zusätzlich durch MALDI-FTICR-MS-Analysen bestätigt. Die Struktur des Aza- Ergebnisse und Diskussion | 55 Kronenether-Interkalators konnte mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie analysiert werden. Das entsprechende Spektrum ist in nachfolgender Abbildung dargestellt. 1 Abbildung 3-9. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 11. Die für den Bisulfon-Teil typischen Signale 1, 4 und 5 können hier, wie in den bisherigen NMR-Spektren, leicht zugeordnet werden und finden sich an gewohnter Position im Spektrum wieder. Die aromatischen Signale 2 und 3 sowie 6 und 7 zeigen sich zwar grob im Bereich von 7.30 und 7.80 ppm, im Vergleich zu allen anderen Interkalator-NMR-Spektren jedoch merklich verschoben. Alle anderen Signale wiesen dagegen im Vergleich keinerlei unerwartete Verschiebungen auf. Wieder lassen sich die Signale 9 und 16 im Bereich von 1.71 - 1.93 ppm den jeweils mittleren Methylengruppen zuordnen. Wie zuvor bei Verbindung 8, sind auch hier die Signale 18 und 19, bei 2.58 – 2.79 ppm, aufgrund ihrer ähnlichen chemischen Umgebung untereinander nicht eindeutig zuzuweisen. Die restlichen TEO-Signale zeigen sich, abgesehen von 17 (3.30 ppm), wieder im Bereich von etwa 3.40 – 3.70 ppm in zwei großen Multipletts und überlagern sich mit den Signalen des AzaKronenethers. Einzige Ausnahme stellt wieder Signal 21 der Aza-Krone dar, welches sich separiert von den Multipletts als Triplett bei 3.78 ppm wiederfindet. Im Gegensatz zu allen anderen NMR-Spektren wurde in Abbildung 3-9 keine Integration der Signale abgebildet. Der Grund hierfür ist ein Phänomen, welches nur bei dieser Verbindung 56 | Ergebnisse und Diskussion auftrat und mit unterschiedlichen Ansätzen und NMR-Lösungsmitteln reproduziert werden konnte. Das Problem lag in der Kalibrierung der Integrale der einzelnen Signale. Wählt man für die Kalibrierung ein Signal des Bisulfon-Interkalator-Teils (z.B. 5), dann stimmen die Integralwerte aller am Interkalator lokalisierten Protonen, jedoch im Verhältnis nicht die des Aza-Kronenether-TEO-Teils der Verbindung (siehe Spektrum A). Zueinander weist dieser Teil allerdings ein korrektes Verhältnis auf. Wählt man umgekehrt beispielsweise Signal 9 der TEO-Kette, stimmen genauso nur die Verhältnisse dieses Teils untereinander, aber nicht im Verhältnis zum Bisulfon-Teil (Spektrum B). Die Multipletts im Bereich von 3.46 – 3.69 ppm enthalten beide Signale, sowohl vom Bisulfon- als auch vom Kronenether-TEO-Teil und ergeben bei beiden Kalibrierungsansätzen die falschen Werte. Betrachtet man allerdings nur die Verhältnisse der beiden Mulitpletts zueinander, welche 10:26 ergeben sollten, sind diese, wie in nachfolgender Abbildung in Spektrum C dargestellt, auch tatsächlich korrekt. 1 Abbildung 3-10. H-NMR-Spektren (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 11, dessen Integrale über verschiedene Ausgangssignale kalibriert wurden; Integration ausgehend vom Bisulfon-Teil (A), Aza-Kronenether-TEO-Teil (B); C) Integration der beiden Mulitpletts im Bereich von 3.46 – 3.69 ppm. Das NMR-Spektrum lieferte keinen Hinweis darauf, dass sich die Verbindung möglicherweise vor oder während der Messung zersetzt haben könnte. Zur näheren Untersuchung, ob es sich möglicherweise um ein temperaturabhängiges Phänomen der Komplexbildung der TEO- Ergebnisse und Diskussion | 57 Kette mit dem Kronenether handelt, wurden zusätzlich 1H-NMR-Spektren bei ±45 °C gemessen, welche allerdings zum gleichen Ergebnis führten. Wurde die vermessene NMRLösung sofort im Anschluss mittels LC-MS-Messungen untersucht, konnten nur Produkt und keinerlei Zersetzungsfragmente, weder Bisulfon, Aza-Kronenether noch TEO-Kette, detektiert werden. Der Versuch einen Kronenether-Interkalator herzustellen, wurde über zwei mögliche Varianten versucht. Leider konnten die Verbindungen 8 und 11, im Vergleich zum AminoInterkalator 6, mit nur geringen Ausbeuten von 43% bzw. 25% erhalten werden. Daher wurde später ein dritter Versuch unternommen, bei welchem die Krone mit Hilfe der kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition an einen Azid-Interkalator gebunden werden sollte. Dies wird in Kapitel 3.1.1.8 näher erläutert. Für die später durchgeführten Biokonjugationsreaktionen mit Somatostatin und Glutathion wurde der Interkalator 11 eingesetzt (Kapitel 3.1.2). Nachfolgend wird nun die Entwicklung eines Bipyridin-Interkalators vorgestellt, welcher analog zu Verbindung 8 auf dem Amino-Interkalator aufgebaut wurde. 58 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.4 Synthese und Charakterisierung des 2,2´-Bipyridin-Interkalators Neben den Kronenethern nehmen auch die Bipyridine, vor allem das 2,2´-Bipyridin, einen besonderen Stellenwert in der Koordinationschemie ein. Wie bereits erwähnt, zählen sie zu den am häufigsten verwendeten Übergangsmetall-Liganden. Die Stabilität der BipyridinKomplexe beruht auf dem strukturellen Aufbau zweier miteinander verknüpften PyridinRinge und somit dem Vorhandensein zweier Stickstoffatome, welche als Donoren für die Bindung zu einem Akzeptor-Metall zur Verfügung stehen. Mit den meisten Übergangsmetallen bilden die 2,2´-Bipyridine oktaedrische Komplexgeometrien aus, bei welchen drei Bipy-Liganden an das Metallzentrum gebunden werden. n+ Abbildung 3-11. 3D-Modell eines oktaedrischen [M(bipy)3] -Komplexes. [110] Die Bedeutung dieser stabilen Komplexe wächst nicht nur in der rein organischen Synthese, sondern auch im biologisch-pharmazeutischen Bereich. Dies beruht auf der Tatsache, dass viele der Bipyridin-Komplexe, je nach Substituent und Gegenion, Löslichkeit in Wasser und somit auch unter physiologischen Bedingungen zeigen können.[111,112] Ihr Einsatz hinsichtlich der Selbstassemblierung von Proteinen ist daher schon seit vielen Jahren etabliert. Dabei werden sie auch als nicht-nativer Ligand sowohl als Ersatz von Aminosäuren im Aufbau eines synthetischen Proteins selbst eingebaut,[9] aber auch als zusätzlicher Ligand mit den Seitenketten eines natürlich vorkommenden Proteins verknüpft.[113] Diesem Prinzip folgend, sollte es daher auch möglich sein, Selbstassemblierung eines Somatostatin-Derivats, mittels verknüpftem Bipyridin, durch Zugabe eines geeigneten Metalls, hervorzurufen. Zur Entwicklung eines geeigneten Bipyridin-Interkalators, wurde wieder der AminoInterkalator 6 als Ausgangsverbindung herangezogen. Ähnlich der Synthesestrategie der zuvor beschriebenen Kronenether-Interkalatoren, solle daher auch hier zuerst eine SäureFunktion in das Bipyridin eingeführt werden. Damit der Bipyridin-Interkalator später möglichst gute komplexierende Eigenschaften aufweisen kann, wurde unter den Bipyridinen das 2,2´-Derivat ausgewählt. Um später sterische Hinderungen bei der Komplexbildung von Ergebnisse und Diskussion | 59 Beginn an möglichst gering zu halten, sollte das 2,2´-Bipyridin in 4-Position mit der Carbonsäure funktionalisiert werden. Synthese des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins (14) Die Syntheseroute des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins ist im nachfolgenden Schema zusammengefasst, wobei die Schritte i-iii in Anlehnung an verschiedene Literaturvorschriften[152,153,154], jedoch in einer abgewandelter Form erfolgten. Schema 3-11. Syntheseroute des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins 14. i) n-BuLi, Tetrahydrofuran, -78 °C, 1 h; ii) Trimethylzinnchlorid, Tetrahydrofuran, -78 °C – RT, 90 Min; iii) 2-Chloropyridin-4-methylester, Tetrakis(triphenyl[154] phosphan)-Palladium, Dioxan, Reflux, 18 h; iv ) NaOH, Methanol, HCl, RT, 5 h; v) Oxalylchlorid, Tetrahydrofuran, Reflux, 3 h. Die Synthese des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins erfolgte über drei Stufen, ausgehend von 2Brompyridin, welches in einer Lithiierung mittels n-BuLi in eine reaktive Zwischenstufe überführt worden war. Aufgrund der Reaktivität musste absolut wasserfrei und unter ständiger Argonathmosphäre gearbeitet werden. Die Lithiierungs-Reaktion wurde in Tetrahydrofuran bei -78 °C durchgeführt. Hierzu wurde das 2-Brompyridin zuerst in Tetrahydrofuran gelöst und mit Hilfe eines Aceton-Trockeneisbads abgekühlt. Im Anschluss wurde die n-BuLi-Lösung langsam tropfenweise hinzugegeben. Das so entstandene lithiierte Pyridin wurde aufgrund der Instabilität, hervorgerufen durch hohe Reaktivität, ohne weitere Charakterisierung sofort weiter umgesetzt. 60 | Ergebnisse und Diskussion Für die Stannylierung wurde Trimethylzinnchlorid ebenfalls in Tetrahydrofuran gelöst und bei -78 °C der Pyridin-Reaktionslösung zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde nun langsam unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmt und das Lösungsmittel entfernt. Das so erhaltene Rohprodukt wurde mittels 1H-NMR-Spektroskopie hinsichtlich der Entstehung des gewünschten 2-(Trimethylstannyl)-Pyridins 12 analysiert. Auf weitere Aufarbeitungsschritte wurde aufgrund der hohen Toxizität der Zinn-Verbindung verzichtet. Im folgenden Syntheseschritt wurde eine palladiumkatalysierte Stille-Kreuzkupplung durchgeführt. Die Einführung einer Säure-Funktion in 4-Position des 2,2´-Bipyridins gelang über die Verwendung des 2-Chlorpyridins, welches an besagter 4-Position einen Methylester aufwies. Die Umsetzung erfolgte wieder unter Argonatmosphäre in absolutem Dioxan unter dem Einsatz eines Tetrakis(triphenylphosphan)palladium-Katalysators, welcher im Vorfeld von Matthias Arzt synthetisiert worden war. Der Mechanismus der Stille-Kreuzkupplung ist im nachfolgenden Schema am Beispiel der vorgestellten Synthese dargestellt.[114] Schema 3-12. Mechanismus der Palladiumkatalysierten Stille-Kreuzkupplung am Beispiel der Synthese des 4Carbonsäure-2,2´-Bipyridins (14). Die Aufarbeitung des Bipyridins 13 erfolgte säulenchromatographisch mit dem Laufmittelgemisch 10% Methanol in Chloroform. Die Verbindung wurde mittels NMRSpektroskopie charakterisiert. Ergebnisse und Diskussion | 61 Der letzte Schritt bestand in der Spaltung des Methylesters und wurde nach Literaturvorschrift[154] durchgeführt. Dazu wurde 13 in heißem Methanol gelöst und mit Natronlauge versetzt. Nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels wurde der pHWert der wässrigen Phase mittels Salzsäure auf vier eingestellt und im Eisbad abgekühlt. Der sich dadurch ausgebildete weiße Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Da der Niederschlag jedoch extrem feinpulvrig war, konnte die Filtration nicht vollständig durchgeführt werden und das gewünschte 2,2´-Bipyridin-4-carboxylat mit einer Ausbeute von nur 20% erhalten werden. Die Charakterisierung erfolgte wieder über NMRSpektroskopie. Um nachfolgend das 1H-NMR-Spektrum des Bipyridin-Interkalators mit dem von 14 vergleichen zu können, ist dieses in Abbildung 3-12 wiedergegeben. 1 Abbildung 3-12. H-NMR-Spektrum (DMSO) des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins 14. Durch das 1 H-NMR-Spektrum sichtbar, ist die korrekte 2,2´-Verknüpfung sowie 4- Substitution der beiden unterschiedlichen Pyridine, was sich deutlich in der Art der Aufspaltung der Proton-Signale innerhalb des jeweiligen Pyridin-Rings erkennen lässt. Dem substituierten Pyridin lassen sich das Singulett 1 (8.82 ppm) sowie den beiden Dubletts 2 (7.86 ppm) und 3 (8.87 ppm) zuordnen, wobei Proton 2 aufgrund der Wechselwirkung mit Proton 3 und 1 als Multiplett höherer Ordnung (dd) vorliegt. Vergleicht man die Lage der Signale 1 und 3 mit 7 und 4 lässt sich gut der tieffeldverschiebende Einfluss der Säuregruppe auf die umliegenden Protonen feststellen. Im zweiten Pyridin-Ring sind deutlich die Multipletts höherer Ordnung (ddd) der Protonen 5 und 6 zu erkennen, welche jeweils miteinander, mit ihrem Nachbarn sowie mit dem am gleichen Pyridin-Ring über vier Bindungen entfernten Proton in Wechselwirkung treten. 62 | Ergebnisse und Diskussion Das Säure-funktionalisierte Bipyridin 14 konnte nun mit dem Amino-Interkalator 6 umgesetzt werden. Dazu standen zwei unterschiedliche Wege zur Verfügung, welche nachfolgend erläutert werden. Synthese des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 16 Für die Synthese bot es sich an, wieder eine Kupplungsreaktion mit Hilfe von Kupplungsreagenzien durchzuführen (i-a). Durch die Säuregruppe ergab sich auch die alternative Variante, ein Säurechlorid 15 herzustellen und dieses anschließend unter basischen Bedingungen mit dem Amino-Interkalator umzusetzen (i-b). Da beide Wege vielversprechend waren, wurden beide Optionen parallel durchgeführt. Eine Übersicht der Syntheseroute ist in nachfolgender Abbildung dargestellt. Schema 3-13. Syntheseroute des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 28. i-a) EDC·HCl, DMAP, Triethylamin, Dimethylformamid, RT, 24 h; i-b) Triethylamin, Tetrahydrofuran, Reflux, 3 h. Variante i-a: EDC-Kupplung Für die Verknüpfung des Amino-Interkalators 6 mit der Bipyridin-Säure 14 wurde eine EDCKupplungs-Reaktion (i-a) durchgeführt. EDC gehört zur Klasse der Carbodiimide und wird häufig in der Carbonsäureamid-Synthese verwendet. Meist wird es als Hydrochlorid eingesetzt und dient der Aktivierung von Carbonsäuren. EDC-Kupplungen verlaufen ähnlich dem in Schema 3-8 beschriebenen HBTU-Mechanismus. Als Hilfsreagenz während der Reaktion wird hier meist DMAP verwendet, welches häufig als nukleophiler Katalysator eingesetzt wird. Ergebnisse und Diskussion | 63 Der Mechanismus in allgemeiner Form, ist in Schema 3-14 abgebildet. Schema 3-14. Schematischer Mechanismus einer EDC-Aktivierung. [115,116] Für die Kupplungs-Reaktion wurde die Bipyridin-Säure 14 in Dimethylformamid gelöst und mit EDC·HCl sowie DMAP versehen. Anschließend wurde der Amino-Interkalator 6 zugegeben und 24 h gerührt. Die Aufreinigung erfolgte durch Extraktion mit anschließender Säulenchromatographie (10% Methanol in Chloroform) und ergab Verbindung 16 mit einer Ausbeute von 37%. Aufgrund der basischen Reaktionsbedingungen konnte auch hier wieder die Bildung einer Mischung aus Mono- und Bisulfon-Produkt beobachtet werden. Variante i-b: Säurechlorid Parallel zur Kupplungs-Reaktion wurde Variante i-b über das Säurechlorid des Bipyridins durchgeführt. Dazu wurde die Bipyridin-Säure 14 unter Argonatmosphäre in trockenem Tetrahydrofuran gelöst, mit Oxalylchlorid versetzt und unter Reflux erhitzt, woraufhin sich dunkelvioletter Niederschlag ausbildete. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Bipyridin-Säurechlorid 15, aufgrund der hohen Hydrolyseempfindlichkeit, ohne weitere Aufreinigungsschritte oder Charakterisierung sofort weiter umgesetzt. Für die Reaktion des Amino-Interkalators 6 mit dem Bipyridin-Säurechlorid 15, wurden beide Reagenzien unter Argonatmosphäre in trockenem Tetrahydrofuran gelöst und mit der Base 64 | Ergebnisse und Diskussion Triethylamin versetzt. Die Aufreinigung erfolgte analog zu Variante i-a durch Extraktion und anschließender Säulenchromatographie. Die Ausbeute betrug hier 47% und stellte damit, im Vergleich zur Kupplung (i-a), eine Erhöhung um 27% dar, wobei hier natürlich berücksichtigt werden muss, dass ein zusätzlicher Syntheseschritt notwendig war. In beiden Fällen wurden zur Untersuchung der Masse LC-MS- sowie zur Abklärung der Struktur C,H-Korrelationsexperimente durchgeführt. Das 1H-NMR-Spektrum des BipyridinInterkalators 16 ist in nachfolgender Abbildung dargestellt. 1 Abbildung 3-13. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 16. Die bereits zuvor angesprochene Mischung aus Bisulfon- und kleinsten Mengen an Monosulfon-Produkt, kann im Spektrum an den vier kleinen Singuletts a, b und c nachvollzogen werden. Sie rühren von der Ausbildung der Doppelbindung durch die Abspaltung der Toluolsulfonsäure her. Im Vergleich zu den vorherigen Interkalator-NMRSpektren überlagern sich hier, aufgrund der chemisch ähnlichen Verknüpfung an beiden Enden der TEO-Kette, die Methylen-Signale fast vollständig in einem großen Multiplett im Bereich von 3.43 – 3.64 ppm. Einzige Ausnahmen stellen die Protonen 9 und 16 dar, welche sich untereinander ebenfalls überlagern und dem Multiplett im Bereich von 1.81 – 1.87 ppm zugewiesen werden können. Die für die Bisulfon-Protonen charakteristischen Signale 1 und 5 befinden sich auch hier an gewohnter Position bei 2.44 ppm sowie 4.34 ppm. Die Signale der Ergebnisse und Diskussion | 65 vier Protonen 4 lassen sich im Multiplett der TEO-Einheiten finden. Die aromatischen Signale des Interkalator-Teils überlagern sich teilweise mit denen des Bipyridins. Schön zu erkennen sind die beiden Tripletts der Amidgruppen 8a und 17a bei 7.49 und 7.54 ppm. Die Aufspaltung und Lage der Signale 18 bis 24 der Protonen des Bipyridins werden durch die Bindung an den Amin-Interkalator im Vergleich zur freien Bipyridin-Säure (Abbildung 3-12) nur bedingt verändert. Es konnte gezeigt werden, dass es über zwei verschiedene Reaktionsweisen möglich war, den 2,2´-Bipyridin-Interkalator 16, ausgehend vom Amino-Interkalator 6 und der BipyridinSäure 14, zu synthetisieren. Daher wurde später auch dessen Reaktivität gegenüber Somatostatin und Glutathion untersucht. Die Ergebnisse hierzu werden in Kapitel 3.1.2 dargestellt. Im nachfolgenden Kapitel wird nun die Synthese einer phenylboronsäure-funktionalisierten Interkalator-Verbindung erläutert, welche somit nach dem Kronenether- sowie dem Bipyridin-Interkalator die dritte, direkt auf dem Amino-Interkalator aufgebaute Verbindung darstellt. 66 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.5 Synthese und Charakterisierung des Boronsäure-Interkalators Bezüglich der Selbstorganisation sind bereits unterschiedlichste Makro-Strukturen basierend auf Boronsäure-Bausteinen bekannt. Diese reichen von Makrozyklen, welche teilweise zu Verkapselungen und so zu Wirt-Gast-Komplexen fähig sind, bis hin zu zwei- oder dreidimensionalen Polymeren unterschiedlichster Struktur. Gerade die Tatsache, dass viele der Reaktionen dieser Stoffklasse unter bestimmten Bedingungen reversibel verlaufen können, steigerte ihre Popularität in den letzten Jahrzehnten enorm. Der grundsätzliche Aufbau aller Strukturen beruht meist auf der Bildung von kovalenten B-O-Bindungen in stabilen Boronat-Estern, welche durch die Wechselwirkung von Boronsäuren mit Diolen entstehen. Je nach Verbindung können diese pH-Änderungen auch reversibel wieder gespalten werden. Abgesehen von kovalenten Bindungen, ist es den Boronsäuren grundsätzlich auch möglich, nur durch nicht-kovalente Wasserstoffbrückenbindungen mit Reaktionspartnern in Wechselwirkung zu treten.[80] Hinsichtlich der Reversibilität sind als Reaktionspartner, neben den klassischen Diol-Verbindungen, gerade die Salicylhydroxamsäure-Verbindungen von Bedeutung. Das von Wiley et al.[94] 2001 veröffentlichte pH-sensitive System, welches auf der Wechselwirkung von Bor und Stickstoff beruht, zeigt die Reaktion zwischen einem Salicylhydroxamsäure-Derivat (SHS) und einer Phenylboronsäure (PBS), beruhend auf einem Gleichgewicht welches durch die Einstellung des pH-Wertes < 5.0 (Dissoziation) oder > 7.4 (Komplexbildung) nachhaltig beeinflusst werden kann.[101] Gerade in biologischen und physiologischen Einsatzgebieten ist eine pH-abhängige Reaktionssteuerung von großem Interesse, da auch die Natur einen Großteil ihrer oft sehr komplexen Vorgänge über den pHWert steuert. Wie bereits angesprochen, fand auch in unserem Institut das hier beschriebene PBS-SHS-Grundsystem bereits mehrfache Anwendung, insbesondere unter Verwendung von Proteinen und ist im nachfolgenden Schema nochmals dargestellt.[100,101,117] Schema 3-15. pH-abhängige Wechselwirkung zwischen substituierter Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure. Ergebnisse und Diskussion | 67 Die daraus gewonnen Erfahrungen stellten hinsichtlich der in dieser Arbeit verfolgten Selbstassemblierung von Biokonjugaten ein attraktives Fundament dar. Daher wurden diese auch in die Entwicklung von Interkalator-Verbindungen miteinbezogen. Die Verknüpfung einer Boronsäure mit einer Interkalator-Verbindung wurde in unserem Institut auch durch Tao Wang über den Weg einer HBTU-Kupplungsreaktion, der in Schema 3-15 dargestellten 4-Boronbenzoesäure und einem Amino-Interkalator, versucht und konnte mit einer Ausbeute von 60% durchgeführt werden.[118] Christiane Seidler synthetisierte im Rahmen ihrer Dissertation eine mit 2,2-Dimethylpropan-1,3-diol geschützte und dabei gleichzeitig durch NHS aktivierte 4-Boronbenzoesäure (siehe Schema 3-16), welche in einer Kondensationsreaktion mit dem Amin-Interkalator 6 unter basischen Bedingungen umgesetzt und im Anschluss daran entschützt werden sollte. Dieser Ansatz war hinsichtlich der Ausbeute vielversprechender, da die Entschützung nahezu ohne Verluste verlaufen sollte und die Anzahl an Nebenprodukten bei einer Kondensationsreaktion wesentlich geringer ausfallen sollte als bei einer Kupplungsreaktion mittels HBTU. Eine Übersicht über den Reaktionsverlauf liefert Schema 3-16. Schema 3-16. Syntheseroute des Boronsäure-Interkalators 18; i) DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h; ii) Trifluoressigsäure, Chloroform, RT, 24 h. Die NHS-aktivierte, geschützte Boronsäure und der Amino-Interkalator 6 wurden im Verhältnis 1.2:1 eingesetzt. Beide wurden in Dimethylformamid gelöst und mit der nichtnukleophilen Base DIEA versetzt. Nach 24 h wurde das Reaktionsgemisch zur 68 | Ergebnisse und Diskussion Reaktionskontrolle anhand von LC-MS-Messung untersucht. Das UV-Chromatogramm sowie die den Signalen zugehörigen Massen-Spektren sind nachfolgend zusammengefasst. Abbildung 3-14. LC-MS-Spektren des Rohprodukts 17; A) UV-Chromatogramm 254nm; B) MS-Spektrum t = 10 min, + + [MMono+H ] = 695 g/mol; C) MS-Spektrum t = 11.5 min, [M+H ] = 851 g/mol; berechnet: [M-SG] = 850.30 g/mol. Betrachtet man das UV-Chromatogramm A, sind drei Signale zu erkennen. Beim Signal t = 6 min konnte keine Masse detektiert werden, was für die im Überschuss zugesetzte Boronsäure spricht. Durch die sauren Bedingungen während der LCMS-Untersuchungen wird der NHS-Ester gespalten und die Boronsäure kann aufgrund ihrer geringen Masse nicht mehr detektiert werden. Die MS-Spektren der beiden Signale bei t = 10 min (B) sowie t = 11.5 min (C) können dem gewünschten Produkt zugeordnet werden, wobei B [M+H+] = 695 g/mol das Mono- und C [M+H+] = 851 g/mol das Bisulfon-Produkt darstellen. Vergleicht man das Chromatogramm mit dem des Amin-Interkalator-Edukts 6 in Abbildung 3-4, lässt sich feststellen, dass sich in der Probe bei t = 6.25 min sowie t = 7.75 min keine Signale der Verbindung 6 zu finden sind. Dies bedeutet, dass der Amino-Interkalator vollständig mit der Boronsäure zum gewünschten Produkt 17 abreagiert hatte. Aufgrund der Trifluoressigsäure der mobilen Phase der LC-MS-Messung, konnte nur die Masse des bereits entschützten Produkts 18 (850 g/mol) detektiert werden. Die Aufreinigung erfolgte unter Verwendung der präparativen HPLC. Das Produkt konnte wieder in einer Mischung aus Monosulfon- und Bisulfon-Interkalator 17, mit einer Ausbeute von 100% erhalten, aber aufgrund von Verlusten bei der Aufreinigung mittels HPLC mit insgesamt 91% isoliert werden. Die Ausbeute bei dieser Variante der Synthese liegt also signifikant höher, als die von Tao Wang über den Weg der Kupplungschemie erzielten 60%[118] und stellt somit eine wertvolle Alternative dar. Weitere Charakterisierung dieser Stufe erfolgte anhand der NMR-Spektroskopie. Ergebnisse und Diskussion | 69 Zum finalen Schritt der Entschützung wurde Verbindung 17 in Chloroform gelöst und mit einem zehnfachen Überschuss an Trifluoressigsäure versetzt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels und der überschüssigen Säure, wurden keine weiteren Aufreinigungsschritte mit Verbindung 18 unternommen, da das Vorhandensein des abgespaltenen Diols für die nachfolgend durchzuführenden Biokonjugationsreaktionen keine Schwierigkeit darstelle. Außerdem konnte bei Verbindung 17, aufgrund der Verwendung der HPLC, bis zu 9% Verlust festgestellt werden, wodurch hier auch zur Unterbindung weiterer Verluste auf eine HPLCAufreinigung verzichtet wurde. Zur Strukturaufklärung und Charakterisierung wurden NMRSpektroskopie sowie LCMS- und MALDI-FTICR-MS-Messungen durchgeführt. Das 1H-NMRSpektrum ist in nachfolgender Abbildung dargestellt. 1 Abbildung 3-15. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Boronsäure-Interkalators 18. Aufgrund der chemisch nahezu symmetrischen Substituenten am Verknüpfungspunkt an beiden Seiten der TEO-Kette, gestaltet sich der aliphatische Bereich, im Vergleich zu anderen Interkalator-Spektren, recht übersichtlich, da sich nahezu alle Signale der Protonen 8-17 mit Ausnahme von 9 und 16 in einem großen Multiplett im Bereich von 3.45 – 3.64 ppm überlagern. 9 und 16 überlagern sich aufgrund der Symmetrie ebenfalls bei 1.85 ppm. Die unterschiedlichen Signale der Bisulfon-Protonen sind in diesem NMR-Spektrum wieder deutlich zu erkennen und lassen sich gut zuordnen. Die beiden Methylgruppen 1 finden sich wieder bei 2.46 ppm als Singulett, das Proton 5 bei 4.37 ppm als Multiplett. Im aromatischen 70 | Ergebnisse und Diskussion Bereich erkennt man bei 7.51 ppm ein kleines Triplett, welches einem der beiden an den Amid-Stickstoff gebundenen Protonen zugewiesen werden kann. Da hier aufgrund zu geringer Substanzmenge keine C,H-Korrelationsexperimente durchgeführt worden waren, ist die genaue Zuordnung leider nicht möglich. Wie bei einigen der zuvor besprochenen Interkalatoren überlagern sich auch hier die Signale der aromatischen Protonen 3 und 7 des Bisulfon-Teils bei 7.62 – 7.67 ppm, in diesem Fall sogar zusätzlich noch mit den Signalen der Boronsäure benachbarten Phenyl-Protonen 19. Die Protonen 2 können separiert dem Dublett vom Dublett bei 7.34 ppm zugeordnet werden. Das letzte Signal bei 7.74 ppm wird durch die Protonen 6 und 18 hervorgerufen. Der Boronsäure-Interkalator konnte mit einer hervorragenden Ausbeute von fast 100% hergestellt werden. Nach der ebenfalls erfolgreichen Interkalation in das Somatostatin (siehe Kapitel 3.1.2), war es natürlich von großem Interesse, auch den zur Phenylboronsäure entsprechenden komplementären Baustein, die Salicylhydroxamsäure, in einen Interkalator einzubauen. Auf diese Weise sollten beide Somatostatin-Derivate synthetisiert und untersucht werden, ob auch diese bei Einstellung des entsprechenden pH-Werts in der Lage sind, wie in Schema 3-15 beschrieben, einen stabilen Komplex auszubilden. Die Einführung der Salicylhydroxamsäure konnte allerdings aufgrund der vorhandenen funktionellen Gruppen nicht ausgehend vom Amino-Interkalator 6 erfolgen und wird daher an späterer Stelle in diesem Kapitel erläutert. Der Interkalator 6 erwies sich, dank der Aminogruppe, bisher als gute Ausgangsverbindung. Jedoch können nicht alle gewünschten Bausteine mittels dieser funktionellen Gruppe verknüpft werden. Zusätzlich ist die Aminogruppe, wie bereits zu Beginn des Kapitels erwähnt, nur für die Synthese neuer Interkalator-Verbindungen von großer Bedeutung, jedoch nicht für die Interkalation selbst geeignet. Es war daher reizvoll, einen Baustein zu besitzen, welcher sowohl in der Interkalatoren-Entwicklung zu weiteren Modifikationen als auch in Form des Somatostatin-Derivats für Reaktionen am Peptid genutzt werden konnte. Eine funktionelle Gruppe, welche diesen Kriterien entsprechen kann, ist die Azidgruppe und wird daher im nachfolgenden Kapitel genauer vorgestellt. Ergebnisse und Diskussion | 71 3.1.1.6 Synthese und Charakterisierung des Azid-Interkalators Dass eine Aminogruppe auch als funktionelle Gruppe eines Aminosäurerests in Peptiden vorkommen kann, ist synthetisch gesehen ein Nachteil hinsichtlich der Reaktionsvielfalt am interkalierten Peptid. Daher ist die Verwendung funktioneller Gruppen, welche nichtnatürlich im Aufbau von Peptiden vorkommen, wie die Azidgruppe, eine vielversprechende Alternative. Sie bietet den Vorteil, eine gezielte Reaktion an dieser Gruppe zu ermöglichen und dabei gleichzeitig auf Schutzgruppen, bezüglich möglicher Nebenreaktionen, verzichten zu können. Eine Reaktionsmöglichkeit der Azidgruppe stellt die kupferkatalysierte 1,3-dipolare Cycloaddition dar, welche hinsichtlich der bioorthogonalen Reaktivität in den letzten Jahren deutlich an Attraktivität gewonnen hat. Die 1,3-dipolare Cycloaddition von Aziden und Alkinen nach Huisgen gilt als die typische Click-Reaktion. Durch die exergone Vereinigung der zwei ungesättigten Reaktanden, entsteht eine Vielzahl an unterschiedliche substituierten fünf-gliedrigen 1,2,3-Triazolringen. Die relativ einfache Einführung von Azid- und Alkingruppen sowie ihre Stabilität gegenüber den meisten organischen Reaktionsbedingungen, inklusive Wasser und Sauerstoff, zählen zu den Vorzügen dieser Reaktion.[119] Dank der schwachen Säure-Base-Eigenschaften verhalten sie sich nahezu inert gegenüber biologischen Molekülen und den Umgebungsbedingungen in Zellen,[120] wodurch die Reaktion auch in der Biologie von großem Interesse ist. Unkatalysiert erhält man allerdings meist eine Produktmischung aus 1,4- und 1,5-Regioisomeren.[121] Abbildung 3-16. 1,3-dipolare Cycloaddition ohne Katalysator; 1:1-Produktgemisch aus 1,4- und 1,5-substituierten [122] Triazolringen. Die kupferkatalysierte Reaktion[123] stellt eine vielversprechendere Variante dar, da hier beim Einsatz von terminalen Alkinen regioselektiv nur das 1,4-Produkt entsteht und gleichzeitig die Reaktionsgeschwindigkeit um das 107-fache zunehmen kann.[124] Hohe Reaktionstemperaturen werden zwar weiterhin toleriert, sind aber dadurch nicht länger notwendig. Vor allem für die Proteinchemie vorteilhaft, sind die während der Reaktion 72 | Ergebnisse und Diskussion vorherrschende Akzeptanz fast aller organischer funktioneller Gruppen, geringer Aufarbeitungsaufwand sowie im Regelfall hohe Ausbeuten.[125,126] Hinsichtlich der biologischen Aktivität sind auch die 1,2,3-Triazole selbst von Interesse. Sie spielen bereits in unterschiedlichen Forschungsrichtungen, beispielsweise in der anti-HIV-Aktivität, eine wichtige Rolle.[127] Sie können als eine Art starre Verlinkungseinheit eine Peptid-Bindung imitieren, ohne dabei ähnlich anfällig für Spaltungen durch Hydrolyse oder Redoxreaktionen zu sein.[128] Eine Azidgruppe kann auf unterschiedlichen Wegen in ein organisches Molekül eingeführt werden. Die am häufigsten verwendete Route verläuft über einen nukleophilen Angriff einer Azidgruppe unter Abspaltung einer geeigneten Abgangsgruppe. Hierbei kann es allerdings zu unerwünschten Reaktionen, hinsichtlich Stereochemie oder Eliminierung kommen. Eine Alternative dazu stellt die Nutzung eines sogenannten Diazo-Transfer-Reagenzes dar, welches eine Aminogruppe unter relativ milden Reaktionsbedingungen in eine Azidgruppe überführen kann. Der Diamin-TEO-Linker, welcher bereits bei der Synthese des AminoInterkalators 6 verwendet wurde, war daher ideal für diese Reaktion geeignet und sollte im Anschluss mittels der Carboxygruppe mit dem Interkalator-Grundgerüst verbunden werden. Erste Versuche hierzu wurden bereits im Rahmen der Diplomarbeit des Autors durchgeführt.[129] Synthese des Diazo-Transfer-Reagenzes 19 sowie des Azid-Triethylenoxid-Linkers 21 Im ersten Schritt wurde wieder die Boc-Schützung einer der beiden terminalen Enden vorgenommen. Anschließend wurde die verbliebene ungeschützte Aminogruppe, unter Verwendung eines Diazo-Transfer-Reagenzes, in eine Azidgruppe umgewandelt. Im letzten Schritt wurde die Boc-Schutzgruppe entfernt und auf diese Weise die Aminogruppe als Verknüpfungspunkt mit der Carboxygruppe des Bisulfids 2 wieder freigegeben. Die beschriebene Route ist im nachfolgenden Schema dargestellt. Ergebnisse und Diskussion | 73 Schema 3-17. Syntheseroute des Azid-TEO-Amins 21 mittels Diazo-Transfer-Reagenzes; i) Sulfurylchlorid, Imidazol, 0 °C, ACN, Acetylchlorid, EtOH; ii) Di-tert-butyldicarbonat, 1,4-Dioxan, RT, 18 h; iii) K2CO3, MeOH, CuSO4, H2O, RT, 24 h; iv) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 16 h. Vor Beginn der Azid-Linker-Synthese musste zuerst das Diazo-Transfer-Reagenz 19 hergestellt werden. Das aus Schema 3-17 ersichtliche Imidazol-1-sulfonyl-azid Hydrochlorid, wurde 2007 von Goddard-Borger und Stick entwickelt.[130] Es handelt sich dabei um ein neues, bezüglich Synthese und Handhabung relativ unbedenkliches Transfer-Reagenz. Der Mechanismus des Diazo-Transfers verläuft vermutlich ähnlich dem Mechanismus mit Trifluormethansulfonylazid, welcher im nachfolgenden Schema erläutert wird.[131] Schema 3-18. Mechanismus eines Diazo-Transfers mit Trifluormethansulfonylazid. Die Synthese des Diazo-Transfer-Reagenzes 19 wurde ausgehend von Natriumazid gestartet. Dieses wurde in Acetonitril gelöst und unter Eiskühlung zuerst tropfenweise mit der äquimolaren Menge an Sulfurylchlorid und anschließend mit einem Überschuss an Imidazol versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung wurde unter Eiskühlung vorsichtig in situ präparierte Salzsäure (Acetylchlorid in Ethanol) zugegeben. Das Produkt konnte schließlich als weißer, pulvriger Feststoff erhalten werden und mittels 1H-NMR-Spektroskopie analysiert werden. Es 74 | Ergebnisse und Diskussion musste allerdings darauf geachtet werden, dass die Substanz unter Argonatmosphäre sowie gekühlt gelagert wird, da es ansonsten zu einer rapiden Zersetzung unter stechender Geruchsentwicklung kommen kann. Für die Synthese des Azid-TEO-Linkers 21, wurde als Ausgangsverbindung wieder das 4,7,10Trioxa-1,13-tridecandiamin gewählt. Für die Boc-Schützung der zweiten Aminogruppe wurde das Diamin wieder in Dioxan gelöst, in einem 2:1 Verhältnis tropfenweise mit Di-tertbutyldicarbonat umgesetzt und säulenchromatographisch mit 10% Methanol in Dichlormethan sowie 1% Ammoiak aufgereinigt. Im nächsten Schritt fand schließlich der Diazo-Transfer statt. Hierzu wurde Verbindung 4 in Methanol gelöst und mit dem Diazo-Transfer-Reagenz 19, Kaliumcarbonat sowie katalytischen Mengen an Kupfersulfat versetzt. Die Aufarbeitung erfolgte durch saure Extraktion mit anschließender Säulenchromatographie mit Hexan:EA = 1:1 und ergab Verbindung 20 mit einer Ausbeute von 72%. Der Erfolg des Diazo-Transfers konnte sofort anhand der FT-IR-Spektroskopie überprüft werden. Die Bande einer Azid-Funktion sollte theoretisch im Bereich von 2000-2200 cm-1 liegen. Wie man in Abbildung 3-17 erkennen kann, lies sich hier eine starke Bande bei einer Wellenlänge von 2095 cm -1 bestimmen. Zur weiteren Charakterisierung wurden LC-MS-Analysen sowie die NMR-Spektroskopie herangezogen. Abbildung 3-17. FT-IR-Spektrum (KBr) des Azid-Boc-TEO-Linkers 20. Ergebnisse und Diskussion | 75 Der letzte Schritt der Linker-Synthese bestand in der Entschützung des Boc-geschützten Amins. Dazu wurde 20 in Dichlormethan gelöst und mit einem zehnfachen Überschuss an Trifluoressigsäure versetzt. Das Azid-TEO-Amin 21 wurde schließlich als Salz der Trifluoressigsäure mit einer Ausbeute von 95% erhalten. Alle Stufen wurden über 1H- und 13 C-NMR-Spektroskopie sowie die korrekte Masse mittels LC-MS-Messungen charakterisiert. Im Gegensatz zum Diazo-Transfer-Reagenz, ist die an den TEO-Linker gebundene Zersetzungserscheinungen, Azidgruppe weder wesentlich gegenüber stabiler Sauerstoff, und Wasser, zeigt keine organischen Lösungsmitteln oder höheren Temperaturen. Synthese des Azid-Interkalators 23 Nach Erhalt des Azid-TEO-Linkers 21, konnte dieser nun mit dem Bisulfid-Grundgerüst 2 verknüpft werden. Dies geschah wieder unter Verwendung des Kupplungsreagenzes HBTU. Der Syntheseweg ist nachfolgend dargestellt. Schema 3-19. Syntheseroute des Azid-Interkalators 23; i) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, 24 h; ii) Oxone®, MeOH/H2O (1:1), RT, 48 h. Bisher wurden alle Interkalatoren ausgehend vom Bisulfon 3 aufgebaut. Dies würde auch in diesem Fall nur eine Stufe bedeuten, weswegen dieser Weg auch zu Beginn verfolgt wurde. Im Vergleich zur in Schema 3-19 dargestellten Syntheseroute, konnte bei einer direkten Kupplung an das Bisulfon 3 nur eine geringe Ausbeute von maximal 27% erzielt werden. Da die Azidgruppe allerdings keine Oxidationsempfindlichkeit aufweist, wurde der Azid-Linker 76 | Ergebnisse und Diskussion daher an das Bisulfid 2 gekuppelt und erst im Anschluss die Oxidation der Sulfidgruppen mittels Oxone® durchgeführt. Die Kupplungsreaktion wurde schließlich wieder unter Argonatmosphäre in trockenem Dimethylformamid durchgeführt. Zur Aktivierung der Carboxygruppe wurde Bisulfid 2 mit HBTU und DIEA für zehn Minuten im Eisbad inkubiert. Nach der Zugabe des Azid-TEO-Linkers 21 wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Aufarbeitung erfolgte über Extraktion sowie Säulenchromatographie und lieferte eine Ausbeute von 70%. Da während der Kupplung nicht der oxidierte Interkalator verwendet worden war, ergab sich hier der Vorteil, dass sich unter den basischen Bedingungen das Michael-System durch die Abspaltung von Toluolsulfonsäure noch nicht hatte ausbilden können. Im letzten Schritt wurde das Sulfid 22, analog zur Bisulfon-Synthese, in einer MethanolWasser-Mischung gelöst und mit einem sechsfachen Überschuss des Oxidationsmittels Oxone® versetzt. Um eine vollständige Umsetzung zu erlangen, musste die Reaktionszeit im Vergleich zum Bisulfid 2 allerdings auf 48 h erhöht werden. Um gewährleisten zu können, dass sich die Azidgruppe während der beiden Reaktionsschritte nicht zersetzt hatte, wurde wieder die FT-IR-Spektroskopie genutzt, wobei keine Zersetzungserscheinungen festgestellt werden konnten. Abbildung 3-18. FT-IR-Spektrum (KBr) des Azid-Interkalators 23. Wie bereits beim Azid-Boc-TEO-Linkers 20 (Abbildung 3-17), konnte auch für den AzidInterkalator 23 eine Azid-Bande bei einer Wellenlänge von 2095 cm-1 nachgewiesen werden. Ergebnisse und Diskussion | 77 Zusätzlich wurde die Masse und Reinheit der Verbindung durch LC-MS-Messungen belegt. Zur weiteren Charakterisierung und Bestätigung der vorliegenden Struktur, erfolgten neben 1 H- und 13C-NMR-Spektroskopie zusätzliche H,H-COSY-, HMBC- und HSQC-Experimente. Das 1 H-NMR-Spektrum der Verbindung ist in nachfolgender Abbildung wiedergegeben. 1 Abbildung 3-19. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Azid-Interkalators 23. Vergleicht man dieses Spektrum mit dem des Bisulfons in Abbildung 3-3, kann man auch hier die aromatischen Signale (11,12,15,16) sowie die Methylgruppen 17 des InterkalatorMoleküls eindeutig zuordnen. Auch die Signale 13 und 14 sind im Vergleich zum Bisulfon kaum verändert. Aufgrund der Verknüpfung der Carboxy-Verbindung mit dem TEO-Linker, erscheint Signal 11 des para-substituierten Acetophenons im Vergleich hochfeldverschoben. Die Signale des TEO-Linkers führen aufgrund ihrer ähnlichen chemischen und magnetischen Umgebung zu Überlagerungen im Bereich von 3.45-3.70 ppm. Diese ließen sich großteils auch mit Hilfe von C,H-Korrelationsexperimenten nur ungenau zuordnen. Dies traf insbesondere auf die Signale 5-8 zu, welche sich nur auf den Bereich 3.60-3.70 ppm eingrenzen lassen, wobei es hier noch zusätzlich zu einer Überlagerung mit Signal 14a kommt. 14b hingegen überlagert sich mit den Signalen 3 und 4. Die Methylengruppen 2 und 9 können aufgrund ihrer Position zwischen TEO-Sauerstoff und Azid- bzw. Amidgruppe den beiden Signalen im Bereich von 1.75-1.95 ppm zugewiesen werden. Die der Azidgruppe direkt benachbarten Methylengruppe kann aufgrund des –M-Effekts eindeutig als Signal 1 bestimmt werden. 78 | Ergebnisse und Diskussion Der Azid-Interkalator 23 ließ sich dank der Kupplung an das Bisulfid 2, anstatt dem Bisulfon 3, gefolgt von der Oxone-Oxidation mit einer sehr guten Ausbeute herstellen. Wie bereits angesprochen, diente die eingeführte Azidgruppe nicht nur als neue Basis in der organischen Syntheseentwicklung unterschiedlicher Interkalator-Verbindungen als Alternative bzw. Erweiterung der Aminogruppe, sondern sollte auch interkaliert in das Somatostatin als neue reaktive Plattform dienen und es auf diese Weise ermöglichen, auch das interkalierte PeptidDerivat nachträglich weiter zu modifizieren. Der Prozess der Interkalation wird im Kapitel 3.1.2, weiterführende Reaktionen am interkalierten Biomolekül werden im Kapitel 3.2 beschrieben. In den beiden nachfolgenden Kapiteln werden nun die Synthesen eines Salicylhydroxamsäure-Interkalators sowie eines weiteren Aza-Kronenether-Interkalators, beide ausgehend vom Azid-Interkalator 23, erläutert. Ergebnisse und Diskussion | 79 3.1.1.7 Synthese und Charakterisierung des Salicylhydroxamsäure-Interkalators Bereits in Kapitel 3.1.1.5 wurde die pH-sensitive Komplexbildung zwischen der Phenylboronsäure und der Salicylhydroxamsäure geschildert, welche im nachfolgenden Schema nochmals, in der von David Ng etablierten Variante, aufgezeigt wird.[101] Schema 3-15. pH-abhängige Wechselwirkung zwischen substituierter Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure. Es konnte außerdem die erfolgreiche Synthese eines Boronsäure-Interkalators unter Verwendung der 4-Boronbenzoesäure gezeigt werden. Dadurch war es natürlich von großem Interesse, als komplementärer Baustein zur Boronsäure, auch einen Interkalator zu entwickeln, welcher die Salicylhydroxamsäure (SHS) aufweist. Durch den Erhalt dieser beiden Verbindungen sowie den entsprechenden Somatostatin-Derivaten sollte eine Grundlage für pH-steuerbare Assemblierungen der Biokonjugate geschaffen werden. Nach der Herstellung eines Interkalators mit einer Azidgruppe, war es nun möglich, die in Schema 3-15 dargestellte Ethinyl-funktionalisierte SHS-Verbindung für die Synthese zu nutzten. Dies erfolgte schließlich im Zuge der kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition. Die 1,3-dipolare Huisgen-Cycloaddition Wie bereits im vorherigen Kapitel angesprochen, handelt es sich bei der kupferkatalysierten Variante der 1,3-dipolaren Cycloaddition nach Huisgen um eine attraktive Methode, bei welcher stereoselektiv 1,4-Regioisomere des 1,2,3-Triazolrings synthetisiert werden können.[121] Nebenbei führt der Katalysator zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und ermöglicht die Durchführung der Reaktion bei Raumtemperatur.[124-126] Der Kupferkatalysator kann dabei entweder direkt als CuI, durch in situ-Reduktion von CuII oder Komproportionierung[132] von Cu0 und CuII erzeugt werden. Aufgrund der Oxidationsempfindlichkeit[133] sowie Reinheit und Kosten der CuI-Salze eignet sich die in situErzeugung aus einem Kupfer(II)-Salz, mittels einem Reduktionsmittel, im Normalfall besser. 80 | Ergebnisse und Diskussion Meist wird CuSO4·5H2O und Ascorbinsäure bzw. Natriumascorbat als Reduktionsmittel verwendet.[122,134] Als CuI-Salz wird hauptsächlich CuI eingesetzt, wobei hier gewöhnlich Acetonitril als Co-Lösungsmittel und ein Äquivalent einer Stickstoff-Base, wie Pyridin oder Triethylamin, zur Beschleunigung der Reaktion benötigt werden. Allerdings führt dies oft zu unerwünschten Nebenprodukten, wie beispielsweise den Bis-Triazolen.[126] Eine dritte, weniger häufig genutzte Variante ist der Einsatz von heterozyklischen Liganden zur Stabilisierung von CuI, welche durch Abschirmung vor Zersetzung schützen sollen.[135] Kupfer als Katalysator dieser Reaktion wurde 2002 unabhängig voneinander sowie in unterschiedlicher Ausführung von den Arbeitsgruppen Sharpless[122] und Meldal[126] entdeckt, wobei letztere auf CuI und Sharpless auf die in situ-Erzeugung setzten. Bis heute herrschen Spekulationen und Uneinigkeit bezüglich des Mechanismus. Es wird angenommen, dass ein stufenweise fortschreitender Verlauf vorliegt, welcher mit der Bildung eines CuI-Acetylid-π-Komplexes beginnt. Die Rolle eines zweiten Kupfers stellt wohl die Aktivierung der Azid-Funktionalität dar. Durch die Cu-Komplexierungen wird zweifellos die Reaktivität des Acetylids verändert und hinsichtlich einer Zyklisierung positiv beeinflusst. Es ist zwar bewiesen, dass diese Spezies die entscheidende Rolle für den Erfolg der Reaktion einnimmt, jedoch ist immer noch sehr wenig über die Natur dieser Komplexe bekannt.[136] Ein möglicher Verlauf des Mechanismus ist in Schema 3-20 abgebildet.[137] Schema 3-20. Schematischer Mechanismus einer kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition. Ergebnisse und Diskussion | 81 Die Synthese des SHS-Interkalators geschah in Kooperation mit Christiane Seidler im Rahmen ihrer Masterarbeit.[117] Die funktionalisierte Salicylhydroxamsäure wurde von ihr unter der Anleitung von David Ng synthetisiert, indem die Verbindung mit einer zuvor NHS-aktivierten 4-Pentinsäure umgesetzt und anschließend die Hydroxamsäure-Funktion mit Hilfe einer Trityl-Schutzgruppe geschützt worden war. Dies war notwendig, da die ungeschützte Salicylhydroxamsäure in der Lage ist, abgesehen von den Boronsäuren auch andere Reaktionspartner, wie beispielsweise Kupfer[138], zu komplexieren und somit unerwünschte Nebenreaktionen zu verursachen. Schema 3-21. Syntheseroute des 2-Hydroxy-4-(pent-4-inamido)-N-(trityloxy)-benzamids; i) DIEA, Dimethylformamid, 80 °C, 48 h; ii) N-Trityloxyamin, Tetrahydrofuran, RT, 48 h. Wie im nachfolgenden Schema dargestellt, war die Syntheseroute, die funktionalisierte SHSVerbindung durch die 1,3-dipolaren Cycloaddition mit dem Azid-Interkalator 23 über einen 1,2,3-Triazolring miteinander zu verbinden. Schema 3-22. Syntheseroute des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, THF/H2O (2:1), RT, 24 h. Für die Click-Reaktion wurden sowohl der Interkalator 23 als auch die geschützte Salicylhydroxamsäure in Tetrahydrofuran gelöst. In einem zweiten Reaktionsgefäß wurden Kupfer(II)-sulfat und Natriumascorbat im Verhältnis 2:1 in demineralisiertem Wasser gelöst und die Farbänderung von dunkelbraun zu hellbeige abgewartet. Diese Änderung der Farbe 82 | Ergebnisse und Diskussion spiegelt die Reduktion des Kupfer(II) zum eigentlichen Katalysator Kupfer(I) durch das Reduktionsmittel Natriumascorbat wieder. Da für die Click-Reaktion das Vorliegen von Kuper(I) notwendig ist, verbessert sich der Reaktionsfortschritt, wenn die in situ-Bildung des Kupfers(I) bereits abgeschlossen ist, bevor die beiden Click-Edukte zum Katalysator gegeben werden. Nach der Farbänderung der Katalysatorlösung wurde diese der EduktReaktionsmischung zugegeben und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Im Laufe der Reaktionszeit bildete sich allmählich ein dunkelgrün-brauner Niederschlag aus, welcher auf Kupfersalz hindeutete. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das grünlich-türkise Reaktionsgemisch ohne vorherige Abtrennung des Niederschlags säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt und Verbindung 24 mit einer Ausbeute von 60% erhalten. Die Masse konnte durch MALDI-FTICR-MS bestätigt werden. Zur Strukturaufklärung wurden C,H-Korrelationsexperimente durchgeführt. Das 1 H-NMR-Spektrum abgebildet. 1 Abbildung 3-20. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24. ist nachfolgend Ergebnisse und Diskussion | 83 Auch in diesem 1H-NMR-Spektrum lassen sich an den Signalen a und b sowie den kleinen Dubletts bei 7.83 und 7.70 ppm, ein geringer Anteil an Monosulfon-Produkt in der Probe festzustellen. Dies macht sich auch in den erniedrigten Intergralsummen des Bisulfon-Teils (1,2,3) bemerkbar. Die Protonen 1, 4 und 5 des Bisulfon-Teils sind an gewohnter Stelle zu finden, wobei sich Signal 5 mit Signal 17 der TEO-Kette überlagert. Die Signale der Protonen 19 und 20, zwischen Triazolring und Amidbindung, werden den Multipletts bei 3.02 ppm sowie 2.68 ppm zugewiesen. Die TEO-Signale 8 sowie 10-14 überlagern sich mit den Signalen 4a und 4b des Interkalators im Bereich 3.40 – 3.66 ppm. 9 und 16 des Linkers, lassen sich den beiden Signalen bei 1.88 und 2.01 ppm zuordnen. Signal 15 kann aufgrund der Nähe zum Triazolring bei dieser Verbidnung als eigenständiges Multiplett bei 3.27 ppm lokalisiert werden. Die aromatischen Signale 2 des Interkalators überlagern sich mit den aromatischen Signalen 24 und 26 der Trityl-Schutzgruppe sowie 18 des Triazol-Rings und bilden dadurch ein großes Multiplett, welches zusätzlich mit dem Chloroform-Signal des NMR-Lösungsmittel interferiert. Die Protonen 25 werden in einem eigenständigen Multiplett bei 7.50 ppm aufgespalten. Die Signale 3 und 7 des Interkalators bilden zusammen mit Signal 23 des Salicylaldehydrings ein Multiplett bei 7.66 ppm. Die anderen beiden Signale 21 und 22 des Rings befinden sich separiert bei 7.06 und 6.94 ppm. Die Synthese des SHS-Interkalators 24, über den Weg der Click-Chemie, konnte als gut umsetzbare Methode etabliert werden. Aus den hier gewonnen positiven Erkenntnissen entstand die Idee, den Azid-Interkalator 23 sowie die Click-Chemie als dritte Variante für die Synthese eines Kronenether-Interkalators einzusetzen. 84 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.8 Synthese und Charakterisierung des Aza-Kronenether-Interkalators unter Anwendung der Click-Chemie Im Kapitel 3.1.1.3 wurden bereits zwei Varianten für die Synthese eines Aza-KronenetherInterkalators erläutert. Beide Wege nutzten dabei die Verknüpfung von Amin- und Carboxygruppe, wobei in beiden Fällen keine zufriedenstellende Ausbeute erreicht werden konnte. Nach der erfolgreichen Darstellung des Azid-Interkalators 23 eröffnete sich dank der Azidgruppe die neue Synthesestrategie der Click-Chemie. Synthese-Variante C über den Azid-Interkalator 23 Aufgrund der Notwendigkeit einer Ethinylgruppe am Kronenether, sollte eine [15]Krone-5 mit einer Verbindung verknüpft werden, welche bereits eine Ethinylgruppe aufwies. Dazu wurde wieder 1-Aza-[15]Krone-5 verwendet, welche in einem Schritt mit einer zuvor NHSaktivierten 4-Pentinsäure umgesetzt wurde. Anschließend fand die Click-Reaktion mit dem Azid-Interkalator 23 statt. Eine Übersicht der Syntheseschritte ist in Schema 3-23 zu sehen. Schema 3-23. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Interkalators 27 via Click-Reaktion; i) N-Hydroxysuccinimid, EDC·HCl, [157] DMAP, Dichlormethan, RT, 24 h; ii) DCM, RT, 24 h; iii) DIEA, Kupfer(I)iodid, THF, RT, 24 h. Die NHS-Aktivierung der 4-Pentinsäure erfolgte in Anlehnung an die Literatur von Slater et al.[157] Dazu wurden 4-Pentinsäure sowie N-Hydroxysuccinimid unter Argonatmosphäre in trockenem Dichlormethan vorgelegt, mit EDC·HCl sowie DMAP versetzt und für 24 h gerührt. Ergebnisse und Diskussion | 85 Die Aufarbeitung der Verbindung 25 erfolgte via Säulenchromatographie (EA:n-Hexan = 1:1). Im Anschluss wurde 25 unter Argonatmosphäre in DCM gelöst und mit 1-Aza-[15]Krone-5 versetzt. Nach 24 h wurde das Produkt 26 mittels Säulenchromatographie (10% Methanol in Chloroform) aufgereinigt und mit einer Ausbeute von 95% erhalten. Die Click-Reaktion zwischen dem Azid-Interkalator 23 und der Ethinyl-modifizierten AzaKrone 26 stellte den letzten Schritt dar. Hierzu wurden beide Reaktanden in Tetrahydrofuran gelöst und mit einem Überschuss an DIEA versetzt. Zum Schluss wurde der Katalysator Kupfer(I)-iodid hinzugefügt und die Reaktionsmischung für 24 h gerührt, woraufhin sich Kupfersalz als dunkelgrün-brauner Niederschlag im Reaktionsgefäß absetzte. Dieses Salz wurde mit Hilfe einer kurzen Aluminiumoxid-Säule abfiltriert. Anschließend wurde das Produkt 27 zuerst säulenchromatographisch (10% Methanol in Chloroform) und für analytische Reinheit zusätzlich mittels HPLC aufgereinigt. Die Ausbeute betrug allerdings nur 28%, was möglicherweise die Folge des Einsatzes von Kupfer(I) sein könnte, da dieses leicht zu Kupfer(II) reduziert werden kann und somit nicht mehr die gewünschte Katalyse bewirken kann. Da eine mögliche Kupferkomplexierung durch den Kronenether offensichtlich die Reaktion nicht grundlegend zu unterbinden schien, wurden die Reaktionsbedingungen hinsichtlich des Kupfersalzes verändert, indem statt DIEA und Kupfer(I)-iodid, Natriumascorbat und Kupfer(II)-sulfat eingesetzt wurden. Da hier der eigentliche Katalysator Kupfer(I) direkt in situ gebildet wird, versprach dieser Weg an sich eine bessere Ausgangssituation, jedoch waren die komplexierenden Eigenschaften der Krone hinsichtlich des Natriumions zu berücksichtigen. Wie erwartet, führte dieser Ansatz daher leider nicht zum gewünschten Ziel, woraus geschlossen werden konnte, dass der Kronenether unter den gegebenen Reaktionsbedingungen unter Umständen neben dem Kupfer- auch das Natrium-Ion komplexierte und so zu einer verminderten Reaktionsfähigkeit der Ethinyl-funktionalisierten Krone führte. Unterstützt wurde diese Vermutung durch den Vergleich zum SHS-Interkalator 24. Denn die Reaktionsbedingungen des gescheiterten, zweiten Syntheseversuchs, inklusive des Azid-Interkalator-Edukts 23, stimmten mit denen der Synthese des SHS-Interkalators überein. Dieser konnte allerdings mit einer relativ guten Ausbeute von 60% erhalten werden, wohingegen der Aza-Kronenether-Interkalator 27 auf diesem Weg nicht synthetisiert werden 86 | Ergebnisse und Diskussion konnte. Mögliche unerwünschte Komplexierungen waren auch der Grund für die Nutzung der Trityl-geschützten Salicylhydroxamsäure. Die korrekte Masse der Verbindung 27 wurde mittels LC-MS sowie MALDI-FTICR-MSMessungen belegt und die Struktur durch 1 H-NMR-Spektroskopie charakterisiert. Die Zuordnung der Daten ist in nachfolgender Abbildung wiedergegeben. 1 Abbildung 3-21. H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 27. Die Struktur der Verbindung 27, gleicht bis zur Amidbindung der Struktur des SHSInterkalators 24. Es ist daher interessant, beide 1H-NMR-Spektren bezüglich einiger Signale in Vergleich zu setzten. In Abbildung 3-21 zeigt sich wieder die typische Aufspaltung der aromatischen Signale 2, 3 sowie 6 und 7 des Bisulfon-Teils der Verbindung 27. Ungewöhnlich für Interkalator-NMR-Spektren, ist es in diesem Fall möglich, das Amid-Proton 8a als Triplett bei 7.59 ppm zu erkennen. Außerdem kann im aromatischen Bereich dem Signal 7.55 ppm das Proton 18 zugewiesen werden, welches dem, bei der Click-Reaktion neu gebildeten, Triazol-Ring entstammt. Aufgrund der elektronischen Einflüsse dieses Ringes auf die TEOKette, kommt es besonders bei Signal 17 zu einer deutlichen Tieffeld-Verschiebung um mehr als 1 ppm. Dies hat eine Überlagerung mit dem für das Proton in Position 5 typischen Signal bei etwa 4.38 ppm zur Folge. Gleiches konnte bereits beim SHS-Interkalator 24 beobachtet werden. Der Einfluss des Triazolrings spiegelt sich auch in der Verschiebung der Multipletts Ergebnisse und Diskussion | 87 der TEO-Kette wieder. Sehr gut zu erkennen bei Signal 16, welches um ca. 0.3 ppm auf 2.08 ppm verschoben wurde. Die Protonen der Methylengruppe 9 bleiben von diesem unerreicht und zeigen im Vergleich zu den beiden vorherigen NMR-Spektren keinerlei Veränderung hinsichtlich ihrer chemischen Verschiebung. Gleiches gilt für die Protonen der Aza-Krone, inklusive dem markanten Signal 22, verglichen mit den beiden Aza-KronenetherInterkalatoren 8 und 11. Die beiden Methylengruppen 19 und 20, welche zwischen TriazolRing und Aza-Kronenether lokalisiert sind, können den Signalen 2.80 und 3.04 ppm, im Vergleich zum SHS-Interkalator jedoch genau gegensätzlich, zugwiesen werden. Der Versuch den Baustein des Kronenethers, mittels der 1-Aza-[15]Krone-5, im Aufbau einer neuen Interkalator-Verbindung zu verwenden, konnte nun über drei verschiedene Wege gezeigt werden. Auch die letzte Variante, unter Anwendung der kupferkatalysierten 1,3dipolaren Cycloaddition, konnte keine gewünschte Steigerung der Ausbeute liefern. Verglichen mit der Synthese des SHS-Interkalators 24, lässt sich festhalten, dass der Erfolg der Click-Reaktion in einer gewissen Abhängigkeit zu den verwendeten Reaktionspartnern steht, sobald diese unerwünschte Komplexierungen der Natrium- bzw. Kupferionen bewirken können. Einen Vergleich über alle in diesem Kapitel vorgestellten Interkalator-Verbindungen wird nachfolgend angestellt. Im Anschluss daran werden schließlich die Biokonjugationsreaktionen der erfolgreich synthetisierten Interkalatoren mit Somatostatin und Glutathion durchgeführt und vergleichend in Kapitel 3.1.2 erläutert. 88 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.1.9 Zusammenfassung der Synthesen der Interkalator-Verbindungen Im Verlauf des aktuellen Kapitels konnten die Synthesen einer Reihe unterschiedlich funktionalisierter Interkalatoren und deren resultierendem breiten Reaktionsspektrum vorgestellt werden. Alle Interkalatoren beruhen auf dem von Lawton und Brocchini entwickelten Bisulfon-System, wodurch über das Konzept der Interkalation in die Disulfidbindung eine optimale Verknüpfung mit Peptiden und Proteinen gewährleistet werden sollte.[17] Die Funktionalisierung des Interkalator-Grundgerüsts erfolgte meist ausgehend von der Stufe des Bisulfons sowie einer mit diesem Grundgerüst verknüpften kurzen TEO-Kette, welche im Anschluss mit unterschiedlichen supramolekular zugänglichen Funktionalitäten modifiziert worden war. Schema 3-24. Allgemeine Syntheseroute der funktionalisierten Interkalatoren. Das Bisulfon 3 sowie dessen nicht-oxidierte Vorstufe das Bisulfid 2 waren synthetisiert und jeweils über ihre Carboxygruppe mit der Aminogruppe des TEO-Linkers verknüpft worden. Dabei wurden die Kupplungsreagenzien EDC, HBTU sowie BOP verwendet. Dabei konnte festgestellt werden, dass bei gleichem TEO-Linker die Ausbeuten beim Bisulfid im Gegensatz zum Bisulfon meist deutlich höher ausfielen. Auch die Aufreinigung gestaltete sich einfacher, da das Bisulfon-Produkt durch die meist basischen Reaktionsbedingungen bereits während der Reaktion, unter Abspaltung des Toluolsulfonsäure-Rests, das Michael-Akzeptor-System ausbildete (siehe Schema 3-2). Dadurch war es ohne HPLC kaum möglich, das BisulfonProdukt vollständig vom Monosulfon-Produkt abzutrennen. Die Nutzung des Bisulfids konnte allerdings nur durchgeführt werden, wenn die eingeführte Funktionalität keine Reaktivität gegenüber einer nachfolgenden Oxidation mittels Oxone® aufwies. Ergebnisse und Diskussion | 89 Um im Hinblick auf die spätere Biokonjugation eine verbesserte Wasserlöslichkeit der rein organischen Interkalatoren zu erlangen, wurde eine kurze TEO-Kette, als Linker zwischen Interkalator-Grundgerüst und der neu eingeführten Funktionalität, verwendet. Zusätzlich sollte dieser Linker für mehr Flexibilität in der Verbindung sorgen. Durch seine Funktion als Abstandshalter, zwischen dem Angriffspunkt des Michael-Systems und der eingeführten reaktiven Gruppe, konnten so sterische Hinderungen im Interkalations-Vorgang sowie späteren Folgereaktionen reduziert werden. Über diese Verbindung wurde schließlich auch die Aminogruppe, mittels der Kupplung an das Bisulfon 3, eingeführt. Der AminoInterkalator 6 konnte mit einer Ausbeute von 64% synthetisiert werden und stellte die Ausgangsverbindung in der Entwicklung weiterer Interkalatoren dar. Die darauffolgend eingeführten supramolekularen Funktionalitäten sind hier nochmals dargestellt, wobei jeder Baustein individuelle synthetische Herausforderungen mit sich brachte. Abbildung 3-22. Übersicht der eingeführten Bausteine der synthetisierten Interkalatoren. Im Vergleich zum Amino-Interkalator gestalteten sich die Synthesen eines Kronenethermodifizierten Interkalators als wesentlich schwieriger. Aufgrund einiger synthetischer Schwierigkeiten wurden mit verschiedenen Herangehensweisen experimentiert. Dabei handelte es sich zum einen um Kupplungsreaktionen sowohl an dem bereits verknüpften TEO-Rest als auch direkt am Bisulfon-Grundgerüst, und zum anderen um kupferkatalysierte Click-Reaktionen, wiederum sowohl mit Kupfer(I) als auch Kupfer(II). Die erfolgreichste Methode (Variante A, 8) mit einer Ausbeute von 43% stellte die HBTU-Kupplung zwischen dem Amino-Interkalator 6 und einer Aza-[15]Krone-5 dar, welche zuvor mit einer Carboxygruppe modifiziert worden war. Der zweite Weg (Variante B, 11) verlief über zwei aufeinanderfolgende Kupplungsreaktionen, zuerst zwischen der Aza-[15]Krone-5 und einer kurzen TEO-Kette, gefolgt von der Kupplung dieser Zwischenstufe an das Bisulfon. Das Produkt konnte allerdings nur mit einer Ausbeute von 25% erhalten werden. Da die beiden 90 | Ergebnisse und Diskussion Kupplungsreaktionen nicht den gewünschten Durchsatz lieferten, wurde als dritte Strategie (Variante C, 27) die kupferkatalysierte Click-Reaktion verfolgt. Dazu wurde die Aza[15]Krone-5 zuerst mit einer Ethinyl-modifizierten Verbindung und anschließend mit dem Azid-Interkalator 23 umgesetzt, wobei die Katalyse einmal direkt mit Kupfer(I) und einmal über die in situ-Reduktion von Kupfer(II) durchgeführt wurde. Die eigentlich vielversprechendere Variante der in situ-Kupfer(I)-Erzeugung verlief gänzlich ohne Erfolg und auch der direkte Einsatz von Kupfer(I) erzielte nur eine geringe Ausbeute von 28%. Da andere Click-Reaktionen mit dem Azid-Interkalator sehr gut funktionierten, lässt sich daraus schlussfolgern, dass das Problem wohl auf seitens des Kronenethers liegen musste. Das größte Hindernis stellten dabei sicherlich die komplexierenden Eigenschaften der Krone sowohl gegenüber Alkaliionen als auch Kupfer dar. Dies hat zur Folge, dass zum einen der zur Reaktion notwendige Kupferkatalysator nicht mehr aktiv sein kann und zum anderen dass sich möglicherweise das Reaktionsverhalten der komplexierten im Vergleich zur unkomplexierten Krone verschlechtert. Auch die Reaktionsbedingungen im Umgang mit der Krone sind sehr problematisch, da penibel darauf geachtet werden musste, dass die KronenVerbindungen nicht in Kontakt mit Natrium- oder Kalium-Ionen kamen, um unerwünschte Komplexe zu vermeiden. Im Gegensatz zu anderen reaktiven Funktionalitäten ist es beim Kronenether leider nicht möglich eine Schutzgruppe zu verwenden. Da die Stärke und Vielfalt der Komplexbildung bezüglich Alkaliionen oder Übergangsmetallen gleichzeitig von unterschiedlichen Faktoren, unter anderem auch dem Lösungsmittel, abhängig ist, ist es schwierig zur Inhibition einer unerwünschten Komplexierung eine reversible, für die Durchführung einer Reaktion temporäre, Komplexierung vorzunehmen. Zusammengefasst über alle drei Routen lässt sich also sagen, dass die Einführung des Aza-Kronenethers problematisch verlief und nur mit geringen Ausbeuten erreicht werden konnte. Im Falle des Bipyridin-Interkalators 16, wurde zuerst ein 4-Carbonsäure-2,2,´-Bipyridin synthetisiert, welches im Anschluss einmal direkt, mittels EDC-Katalyse, sowie parallel dazu als Säurechlorid mit dem Amin-Interkalator 6 umgesetzt worden war. Vergleicht man die Ausbeuten beider Varianten, zeigt sich, dass der Weg über das Säurechlorid mit 47% eine Verbesserung um 27% nach sich zog. Dies liegt zum einen an der erhöhten Reaktivität des Säurechlorids im Vergleich zur in der Kupplung aktivierten Säuregruppe. Zum anderen kann die Verwendung des Hilfsreagenz EDC, wie in Schema 3-14 ausführlich dargestellt, eine Reihe von Nebenreaktionen und somit Nebenprodukte verursachen, wodurch sich der Ergebnisse und Diskussion | 91 Reaktionsumsatz erniedrigen kann. Außerdem kann im Gegensatz zum Säurechlorid hier nicht sichergestellt werden, dass 100% der Säure-Verbindung durch das EDC aktiviert wurde und somit eine vollständige Umwandlung theoretisch überhaupt möglich wäre. Der Nachteil des Säurechlorids liegt dagegen in einem zusätzlich notwendigen Reaktionsschritt sowie einer hohen Hydrolyseempfindlichkeit, wodurch immer in absolut trockenen Lösungsmitteln sowie unter Argonatmosphäre gearbeitet werden muss. Es ist daher von Vorteil, wenn die benötigte Menge an Säurechlorid frisch hergestellt und ohne Aufreinigungsschritte sofort weiter umgesetzt werden kann. Eine hervorragende Umsetzung von fast 100% konnte dagegen bei der Synthese des Boronsäure-Interkalators 17 erreicht werden. Hierzu wurde eine geschützte Phenylboronsäure als Reaktionspartner verwendet, deren Säure-Funktion durch NHS zuvor aktiviert worden war. Diese wurde im Überschuss unter basischen Bedingungen mit dem Amin-Interkalator 6 umgesetzt und führte zu einer vollständigen Umsetzung. Um eine funktionelle Gruppe zu besitzen, welche auch interkaliert noch selektiv modifiziert werden kann, wurde ein Azid-Interkalator entwickelt. Die Synthese der Verbindung 23 erfolgte durch Überführung der Aminogruppe der verwendeten TEO-Kette in eine Azidgruppe, gefolgt von einer Kupplung an das Bisulfid sowie einer anschließenden Oxidation mittels Oxone®. Beim Kuppplungsschritt konnte dabei eine gute Ausbeute von 70% erreicht werden, gefolgt von einem vollständig verlaufenden Oxidationsschritt. Für die Synthese des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24 war eine Ethinyl-modifizierte Salicylhydroxamsäure eingesetzt und mittels kupferkatalysierter Click-Reaktion mit dem Azid-Interkalator 23 verknüpft worden. Aufgrund der komplexierenden Eigenschaften dieser Verbindung, auch hinsichtlich Kupfer, wurde die mit Triphenylmethyl geschützte Variante eingesetzt und sich an den Reaktionsbedingungen der Variante C der KronenetherInterkalator-Synthese orientiert. Der geschützte Interkalator konnte auf diesem Weg mit einer Ausbeute von bis zu 60% synthetisiert werden. Im nachfolgenden Kapitel werden nun die Biokonjugationsreaktionen der unterschiedlich funktionalisierten Interkalatoren mit Somatostatin sowie Glutathion untersucht und die Ergebnisse hinsichtlich der Reaktivität vergleichend analysiert. 92 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.2 Biokonjugationsreaktionen der Interkalatoren: Somatostatin versus Glutathion Die Biokonjugationsreaktion der Interkalatoren war eine wichtige synthetische Hürde in der Darstellung modifizierter Biokonjugate. Da der mechanistische Vorgang bei allen nachfolgenden Reaktionen analog verlief, wird zu Beginn des Kapitels, vor der Darstellung der synthetischen Ergebnisse, auf den Mechanismus sowie die beiden verwendeten ModelPeptide Somatostatin und Glutathion eingegangen. Mittels des Bisulfon-Grundgerüsts sind alle der im vorherigen Kapitel synthetisierten Interkalatoren in der Lage über das Michael-Akzeptor-System von Nukleophilen angegriffen zu werden. Im Falle des Somatostatins findet die Biokonjugation in Form der Interkalation statt. Das Besondere an dieser gezielten Art der Modifikation stellt der mechanistische Prozess der Interkalation dar, welcher mit dem Wiederaufbau der Disulfidbindung über das interkalierte Molekül hinweg endet. Dies ist hinsichtlich des Einsatzes von Proteinen von großer Bedeutung, da die Zerstörung der Disulfidbrücke meist mit einer Veränderung der dreidimensionalen Struktur einhergeht, was wiederum in einer Inaktivierung der biologischen Aktivität resultieren kann. Die selektive Spaltung der Brücke wird dabei durch bestimmte Reduktionsmittel, wie beispielsweise TCEP, realisiert.[12] Die zur Interkalation notwendige Verbindung muss, wie bereits in Kapitel 3.1.1.1 angesprochen, bestimmte strukturelle Eigenschaften, wie eine elektronenziehende Gruppe in Nachbarschaft zu einem Akzeptor-System sowie eine geeignete Abgangsgruppe, aufweisen. Die Arbeitsgruppe um Brocchini entwickelte hierfür die Bisulfon-Verbindung. welche die angesprochenen Eigenschaften vereint und darüber hinaus durch den Prozess der Michael-Addition ein zweites neues Michael-Akzeptor-System ausbilden kann, welches wiederum nukleophil angegriffen werden kann.[18] Abbildung 3-23. Grundgerüst I) eines Michael-Akzeptor-Systems, II) eines aktivierten Bisulfon-Interkalators, III) eines Bisulfon-Interkalators nach der ersten Michael-Addition eines Nukleophils. Ergebnisse und Diskussion | 93 Die Grundform des Bisulfon-Interkalators weist eine weitere Besonderheit auf. Dabei handelt es sich um die Eigenschaft, dass der Beginn der Interkalations-Reaktion gezielt über den pH-Wert gesteuert werden kann, denn das das zur Michael-Addition notwendige Akzeptor-System (Abbildung 3-23, II) wird erst durch die Einstellung des pH-Werts der Lösung auf etwa 8 ausgebildet. Dieser pH-Wert ermöglicht, dass eine der beiden Abgangsgruppen nach dem E1cB-Mechanismus eliminiert wird, wodurch eine α,βungesättigte Carbonyl-Verbindung entsteht. Diese ist in der Lage, zwei aufeinanderfolgende Michael-Additionen einzugehen. Schema 3-25. Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems unter basischen Bedingungen durch Abspaltung eines Toluolsulfonsäure-Restes, ausgehend von der Grundform des Bisulfons. Der Mechanismus der Interkalation in Disulfidbindungen Der Mechanismus, ausgehend vom Monosulfons, kann in vier Schritte unterteilt werden, welche in Schema 3-26 aufgezeigt werden. Schema 3-26. Mechanismus der Interkalation, dargestellt mit Somatostatin als zyklisches Peptid; a) Reduktive Spaltung der Disulfidbindung; b) Nukleophiler Angriff am Michael-Akzeptor-System; c) Abspaltung der Abgangsgruppe sowie Ausbildung eines neuen Akzeptor-Systems; d) Wiederaufbau der früheren Disulfidbindung durch eine zweite Michael[18] Addition. 94 | Ergebnisse und Diskussion Schritt a stellt die reduktive Spaltung der Disulfidbindung mittels eines Reduktionsmittels dar, wodurch zwei reaktive Thiol-Reste entstehen, welche nukleophil am Interkalator angreifen können. Der zweite Schritt b beinhaltet den nukleophilen Angriff am MichaelAkzeptor-System des Interkalators. Hierbei greift eine der Thiolgruppen an der Doppelbindung der α,β-ungesättigten Carbonyl-Verbindung an, wodurch es zu einer Verschiebung der Elektronendichte hin zum Carbonyl-Sauerstoff kommt. Diese reaktive Zwischenstufe reagiert nun in Schritt c durch Abspaltung des Toluolsulfonsäure-Rests zu einer neuen α,β-ungesättigten Carbonyl-Verbindung, welche somit erneut nukleophil angegriffen werden kann. Der Vorgang des nukleophilen Angriffs am Akzeptor, gefolgt von der Abspaltung der Abgangsgruppe und somit der Ausbildung der Carbonyl-Verbindung, wird im Allgemeinen als Michael-Addition bezeichnet. Dass die Verbindung erneut eine MichaelAddition eingehen kann, stellt zum einen die strukturelle Besonderheit des BisulfonInterkalator-Moleküls und zum anderen die für eine Interkalation notwendige Grundvoraussetzung dar. Nur durch einen Angriff des zweiten Thiols (Schritt d) an der bereits mit dem ersten Thiol des Peptids verknüpften Interkalator-Verbindung, ist der vollständige Einbau des Moleküls in die frühere Disulfidbindung möglich. Theoretisch könnte das zweite Thiol auch an einem anderen Interkalator-Molekül angreifen, wodurch es zur Entstehung von unerwünschten Nebenprodukten kommen kann. Greift nun in Schritt d das Thiol an der Doppelbindung an, kommt es wieder zu einer Verschiebung der Elektronendichte hin zum Carbonyl-Sauerstoff und somit zur Entstehung einer Zwischenstufe, welche durch Tautomerie in eine stabile Carbonyl-Verbindung übergeht. In diesem letzten Schritt wird nun über drei Kohlenstoff-Atome hinweg die frühere SchwefelSchwefel-Bindung und somit auch die Tertiärstruktur des Somatostatins wieder aufgebaut.[18] Die Model-Peptide Somatostatin und Glutathion Wie bereits angesprochen, wurde in dieser Arbeit das zyklische Peptidhormon Somatostatin, als typischer Vertreter für ein Biomolekül mit intramolekularer Disulfidbindung, verwendet. Die biologische Aktivität beruht auf der räumlichen Anordnung der Aminosäure-Sequenz Phe7-Trp8-Lys9-Thr10. Es ist daher notwendig, dass die Tertiärstruktur aufgrund der Modifizierung der Disulfidbrücke zwischen den Cysteinen Cys3 und Cys14 nicht gestört wird. Ergebnisse und Diskussion | 95 Neben der Aktivität ist auch die Plasma-Stabilität von Interesse. Diese liegt beim nativen Somatostatin bei wenigen Minuten und kann anhand der hier beschriebenen Art der Modifizierung deutlich erhöht werden. Dass diese Annahmen auch auf die Nutzung der Bisulfon-Interkalatoren zutrifft, konnte bereits durch Anne Pfisterer belegt werden. [149] Somatostatin weist mit seinen 14 Aminosäuren oftmals bereits Protein-ähnliche Eigenschaften auf, besonders im Hinblick auf Stabilität und Löslichkeit. Proteine sind allerdings aus chemischer Sichtweise schwierig zu charakterisieren. Beim Somatostatin hingegen ist es noch möglich, Techniken wie die NMR-Spektroskopie zu nutzten und auf diese Weise sogar die Vollständigkeit der Interkalations-Reaktion zu überwachen. Es eignet sich daher ideal als Model-Peptid zur Untersuchung des Einflusses der InterkalationsProzesse auf die gesamten Eigenschaften eines Peptids. Da bei der Verwendung des Peptids allerdings Sterik sowie Zersetzung eine wichtige Rolle spielen, wurden als Vergleich hinsichtlich Größe und Reaktivität alle Reaktionen der Interkalatoren auch mit dem Tripeptid Glutathion wiederholt. Hierbei handelt es sich um ein nicht-zyklisches Tripeptid, bestehend aus den Aminosäuren Glycin, Cystein und Glutaminsäure, wobei hier keine richtige Peptidverknüpfung zwischen Cystein und Glutaminsäure vorliegt. Durch das Cystein weist das Glutathion eine reaktive Thiolgruppe auf, welche am Interkalator angreifen kann. Im menschlichen Körper lässt es sich in fast allen Zellen in relativ hoher Konzentration vorfinden und spielt in zellulären Redoxreaktionen eine entscheidende Rolle.[139] Auch in Krebszellen, wie beispielsweise Blasenkrebs, konnte eine stark erhöhte Konzentration an Glutathion nachgewiesen werden.[140] Im menschlichen Körper kann es in zwei Formen vorliegen, dem aktiven reduzierten Monomer und dem oxidierten Dimer. Abbildung 3-24. L-Glutathion, aufgebaut aus den Aminosäuren Glycin (grün), Cystein (rot) und Glutaminsäure (blau) in der reduzierten Form als Monomer und in der Variante als Dimer. Die reduzierte Form des L-Glutathion sollte nun im Vergleich zum Somatostatin unter nahezu identischen Bedingungen mit den Interkalatoren umgesetzt werden. Dadurch sollte die Reaktivität der unterschiedlichen Interkalatoren besser analysiert werden und so bei 96 | Ergebnisse und Diskussion Schwierigkeiten bessere Rückschlüsse gezogen werden können, ob die Ursache im verwendeten Peptid oder beim jeweiligen Interkalator liegt. Anmerkungen zum Kapitel Da es sich bei der Verwendung des Glutathions um reine Testreaktionen handelte, wurden, mit Ausnahme des Azid-Interkalators, nur geringe Mengen der Interkalatoren eingesetzt. Nach HPLC-Aufreinigung war daher eine korrekte Bestimmung der Ausbeute nicht möglich. Das Lösungsmittel der erhaltenen Fraktionen der Produkte wurde mittels Lyophilisation unter Zuhilfenahme von Eppendorf- oder Falcon-Tube-Reaktionsgefäßen entfernt, wodurch sich bei der Wägung das Problem ergab, dass die Massendifferenz der Plastikgefäße vor und nach der Lyophilisation größer war, als die eigentliche Produktmenge. Zusätzlich war auch die Messungenauigkeit, welche sich durch mehrmaliges Wiegen des Produkts ergab, im Bereich der Produktmenge. Daher wurde hier auf eine Bestimmung der Ausbeute verzichtet und eine Charakterisierung nur mittels LC-MS oder MALDI-MS-Messungen durchgeführt. In den nachfolgenden Kapiteln wird aufgrund der Übersichtlichkeit das SomatostatinMolekül meist nur schematisch dargestellt. Abbildung 3-25. Einführung der schematischen Darstellung des Somatostatins. Nachfolgend werden nun die Ergebnisse der Interkalations-Versuche der in den vorherigen Kapiteln synthetisierten, funktionalisierten Interkalatoren mit dem zyklischen Peptid Somatostatin vorgestellt. Angefangen wird dabei beim Azid-Interkalator 23, da bereits im Rahmen der Diplomarbeit damit begonnen wurde, diesen im Hinblick auf die Interkalation mit Somatostatin zu untersuchen.[129] Ergebnisse und Diskussion | 97 3.1.2.1 Synthese und Charakterisierung von Azid-Somatostatin/Glutathion Im Allgemeinen verliefen die Durchführung der Interkalation bzw. Reaktion mit Glutathion, die Aufreinigung sowie die Analyse der Produkte bei allen Interkalatoren auf ähnliche Weise und werden am ersten Beispiel des Azid-Interkalators 23 ausführlicher erläutert. Darstellung des Azid-Somatostatins Ein Überblick über die dreistufige Synthese-Route des Azid-Somatostatin ist im nachfolgenden Schema dargestellt. Schema 3-27. Synthese des Azid-Somatostatins 28; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 40 min; iii) RT, 24 h. Der erste Schritt in der Durchführung der Interkalation bestand in der Inkubation der Interkalator-Verbindung. Dazu wurde ein Gemisch aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8) verwendet. Ein Äquivalent des Interkalators wurde in Acetonitril gelöst, anschließend mit Phosphatpuffer verdünnt und das Reaktionsgemisch für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Je nach strukturellem Aufbau des Interkalators konnte die Inkubationszeit von mehreren Stunden bis hin zu einem Tag variieren. Dies wurde mittels LC- 98 | Ergebnisse und Diskussion MS-Untersuchungen überwacht, indem nach verschiedenen Zeiten Proben entnommen und hinsichtlich der Bildung von 23a untersucht worden waren. Bevor das Somatostatin der Inkubationslösung zugegeben werden konnte, musste die Disulfidbindung der Cysteinreste gespalten werden. Dies geschah indem das Peptid in Phosphatpuffer gelöst, mit zwei Äquivalenten an TCEP, ebenfalls in Phosphatpuffer gelöst, versetzt und das Reaktionsgemisch anschließend für etwa 40 Minuten geschüttelt wurde. Nun wurde die zuvor inkubierte Interkalator-Lösung dem Somatostatin-TCEP-Gemisch zugegeben und für 24 h auf einem Rüttler geschüttelt. Im Verlauf der Reaktionszeit konnte eine Trübung der Lösung sowie die Bildung einer geringen Menge an Niederschlag beobachtet werden. Die Aufreinigung des Produkts geschah mittels präparativer HPLC mit einem Laufmittelgemisch aus Wasser und Acetonitril, jeweils mit 0.1% TFA versetzt. Nach Lyophilisation wurde das Produkt als weißer Feststoff mit einer, für Interkalationen relativ hohen, Ausbeute von 40% erhalten. Wie bereits angesprochen, wurde schon während der Diplomarbeit an der Interkalation mit dem Azid-Interkalator gearbeitet. Damals wurde das Somatostatin im Verhältnis 1:2 gegenüber dem Interkalator eingesetzt. Es konnten jedoch nur Ausbeuten im Bereich von 22% erzielt werden. Im Laufe der Dissertation konnten schließlich die hier verwendeten Konditionen, auch hinsichtlich Puffer/Acetonitril-Verhältnisses sowie der Menge an TCEP, als Idealbedingungen gefunden werden. Auch wurde damals zur Entfernung von Puffersalzen, den im Überschuss zugegebenen Interkalator sowie nicht abreagiertem Somatostatin, eine Dialyse unter Verwendung einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 2 kDA durchgeführt. Allerdings zeigte sich im Laufe dieser Arbeit, dass dieser Vorgang zu immensen Verlusten des Produkts führte und wurde daher nicht weiter verfolgt. Verschiedene Testreaktionen ergaben, dass sich bei der Reduktion der Disulfidbindung eine Wartezeit von etwa 30 Minuten positiv auf den späteren Interkalations-Prozess auswirkte. Je nach verwendetem Interkalator, konnte eine Erhöhung der Reaktionszeit von 24 auf 48 h zu einer Verbesserung, in manchen Fällen jedoch auch zu einer Verschlechterung der Ausbeute führen. Beim Azid-Interkalator ergaben 24 h das beste Ergebnis. Für die Durchführung aller Interkalations-Reaktionen mit Somatostatin wurden bewusst ein Rüttler und kein Rührer eingesetzt, da das Rühren zu einer deutlichen Erniedrigung des Reaktionsumsatzes führte. Ursachen hierfür können entweder in der Zersetzung des Produkts oder möglicherweise in Ergebnisse und Diskussion | 99 einer Störung des Interkalations-Prozess durch den Magnetrührer liegen. Die Charakterisierung des Somatostatin-Derivats erfolgte mittels LC-MS- sowie MALDI-MSMessungen. Abbildung 3-26. Azid-Somatostatin 28: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; 3+ 2+ C) MS-Spektrum (+) t = 13.75 min: m/z = 686 g/mol [M+H] , m/z = 1029 g/mol [M+H] ; D) MS-Spektrum (-) t = 13.75 2 + min: m/z = 1027 g/mol [M-H] ; E) MALDI-TOF-MS: m/z = 2058.03 [M+2H] ; berechnet: [M] = 2056.39 g/mol. Nach erfolgreicher Synthese des Azid-Somatostatins 28 erfolgte die Umsetzung mit Glutathion. Darstellung des Azid-Glutathions Die reduzierte Form des Glutathions weist aufgrund der Aminosäure Cystein eine reaktive Thiolgruppe auf. Daher ist es bei Zugabe der entsprechenden Äquivalente auch möglich, zwei Moleküle Glutathion nacheinander an die Verbindung 23a zu binden. Die Untersuchung, ob nun nach der Reaktion mit dem ersten Glutathion auch ein zweites Molekül angreifen kann, ist von Interesse, da sich bei der Interkalation mit Somatostatin natürlich immer die Frage stellt, ob nach dem Angriff des ersten Thiols auch das zweite Thiol reagiert und der Zyklus wieder geschlossen werden kann und ob die Sterik dabei einen entscheidenden Faktor darstellt. Glutathion ist im Vergleich zum Somatostatin wesentlich kleiner und sollte daher geringere sterische Probleme verursachen. Die Syntheseroute kann nachfolgendem Schema entnommen werden. 100 | Ergebnisse und Diskussion Schema 3-28. Synthese des Azid-Glutathions 29; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8), RT, 24 h; ii) Glutathion, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24 h. Für einen aussagekräftigen Vergleich zur Somatostatin-Interkalation, sollte die Synthese unter nahezu identischen Bedingungen erfolgen. Dazu wurde wieder zuerst der AzidInterkalator 23 im Phosphatpuffer für 24 h inkubiert. Anschließend wurden 5 Äquivalente Glutathion, analog zum Somatostatin, in Phosphatpuffer gelöst, der inkubierten InterkalatorLösung zugegeben und das Reaktionsgemisch für 24 h geschüttelt. L-Glutathion wurde zwar bereits als reduzierte Form käuflich erworben, zur Absicherung wurden der GlutathionLösung jedoch katalytische Mengen an TCEP beigemischt. Nach den 24 h wurde das Rohprodukt mittels LC-MS hinsichtlich der Vollständigkeit der Reaktion sowie dem Verhältnis der Umsetzung des Interkalators bezüglich einem oder zwei Glutathion-Molekülen, untersucht. Abbildung 3-27. LC-MS-Spektren Azid-Glutathion 29; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; C) 2+ MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 517 g/mol [M+2H] ; D) MS-Spektrum (-) t = 6.25 min: m/z = 1029 g/mol [M-H] , m/z = 1030 g/mol [M] ; berechnet: [M] = 1030.37 g/mol. Wie aus den Chromatogrammen A und B in Abbildung 3-27 ersichtlich, gibt es nur zwei dicht aufeinander folgenden Signale im Bereich von t = 6.0-6.75 min. Dies bedeutet, dass der Azid- Ergebnisse und Diskussion | 101 Interkalator 23a vollständig mit Glutathion abreagiert hatte. Beide Signale weisen außerdem ein identisches Massenspektrum mit den Massen 517, 1029 und 1030 g/mol auf, welche alle zum Produkt 29, also dem mit zwei Glutathion-Molekülen, gehören. Das Doppelsignal entsteht durch das Vorliegen eines Isomerengemischs, welches durch die Reaktion mit LGlutathion entstehen kann. Die Aufarbeitung erfolgte, analog zum Azid-Somatostatin 28, mittels präparativer HPLC. Das Produkt 29 wurde mittels LC-MS-Messungen sowie 1H-NMR-Spektroskopie analysiert. 1 Abbildung 3-28. H-NMR-Spektrum (MeOD) des Azid-Glutathions 29. Im aromatischen Bereich des Spektrums finden sich die Ring-Protonen 11 und 12 des Interkalators bei 7.95 und 8.11 ppm. Auch das Interkalator-Signal 13 kann an gewohnter Stelle bei 4.11 ppm gefunden werden. Die Protonen 14 können nun, aufgrund der Verknüpfung zum Glutathion, hochfeldverschoben den Mulitpletts im Bereich von 2.722.93 ppm zugeordnet werden. Vergleicht man die Signale dieses NMR-Spektrums mit denen des Azid-Interkalators 23 in Abbildung 3-19, so kann man auch hier die Protonen 1, 2 und 9 des Azid-TEO-Linkers, aufgrund ihrer Nachbarschaft zur Azid- bzw. Amidgruppe, separat aufgespalten den Mulitpletts bei 3.37, 1.81 und 1.91 ppm zuweisen. Das Signal der Protonen 10 überlagert sich mit den restlichen Signalen der TEO-Kette 3-8 im Bereich von 3.513.65 ppm. Die Menge des synthetisierten Azid-Glutathions reichte nicht für C,HKorrelationsexperimente aus, weswegen bei der Zuordnung der Signale der beiden 102 | Ergebnisse und Diskussion Glutathion-Moleküle auch auf einen Vergleich mit NMR-Spektren des nativen L-Glutathions zurück gegriffen wurde. Die Protonen 17 lassen sich aufgrund der benachbarten Amid- und Säuregruppe dem Singulett bei 3.92 ppm zuordnen. Die Position der Protonen 16 zwischen zwei Amid-Bindungen spiegelt sich im tieffeldverschobenen Multiplett bei 4.59 ppm wieder. Ähnlich den Protonen 14 spalten sich auch die Protonen 15 im Bereich von 2.95-3.09 ppm auf. Die Methylengruppen 18 und 19 korrelieren mit den Signalen bei 2.19 und 2.54 ppm, 20 mit dem Mulitplett bei 4.01 ppm. Vergleicht man nun die Reaktivität des Azid-Interkalators 23 gegenüber dem Somatostatin und Glutathion, so führten beide Reaktionen zu vielversprechenden Ausbeuten von 40% und 90%, was Rückschlüsse auf eine sehr gute Zugänglichkeit des Michael-Akzeptor-Systems hinsichtlich eines nukleophilen Angriffs mittels Thiol-Verbindungen zulässt. Gerade beim Glutathion konnte bereits nach 24 h eine vollständige Umsetzung mit zwei Molekülen LGlutathion beobachtet werden. Die Einführung der Azidgruppe hatte das Ziel nach der Biokonjugation eine reaktive Plattform in das Biomolekül einzuführen und so weitere Postmodifikationen, beispielsweise mittels der Click-Reaktion, durchführen zu können. Einige praktische Anwendungen des Azid-Somatostatins 28 wurden auch im Rahmen dieser Forschungsarbeit durchgeführt und werden in späteren Kapiteln wieder aufgegriffen. Ergebnisse und Diskussion | 103 3.1.2.2 Synthese und Charakterisierung von Aza-Kronenether-Somatostatin/Glutathion In Kapitel 3.1.1 wurden auf verschiedenen Wegen die drei Aza-Kronenether-Interkalatoren, 8, 11 und 27 synthetisiert. Die nachfolgenden Reaktionen mit Somatostatin und Glutathion wurden, aufgrund der synthetisierten Menge der drei Interkalatoren, vorerst nur mit Verbindung 11 durchgeführt. Das Reaktionsschema ist nachfolgend im Überblick dargestellt. Schema 3-29. Biokonjugation des Azid-Kronenether-Interkalators 11 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. Darstellung des Aza-Kronenether-Somatostatins Die Durchführung der Interkalation erfolgte analog zur Azid-Somatostatin-Synthese 28. Wieder wurde der Interkalator 11 in 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. Das Somatostatin wurde ebenfalls im Puffer gelöst, mit der TCEP-Pufferlösung versetzt und 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden beide Lösungen vereinigt und für weitere 24 h geschüttelt. Die Aufreinigung erfolgte mittels HPLC. Das Produkt 30 konnte mit einer Ausbeute von 25% erhalten werden und wurde mittels LCMS und MALDI-FTICR-MS-Messungen analysiert. 104 | Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3-29. Aza-Kronenether-Somatostatin 30: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV4+ 3+ Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.50 min: m/z = 584 g/mol [M+H] , 778 g/mol [M+H] , 1167 2+ 2[M+2H] ; D) MS-Spektrum (-) t = 13.50 min: m/z = 1164 g/mol [M-H] ; E) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 2332.12 + g/mol [M+2H] ; berechnet: [M] = 2330.10 g/mol. Der verwendete Phosphatpuffer wurde aus NaH2PO4 und Na2HPO4 hergestellt, wodurch sich beim Aza-Kronenether wieder das Problem der Komplexierung von Alkalimetallen ergab. Es konnten allerdings weder bei LC-MS noch bei MALDI-MS-Messungen Komplexe jeglicher Art detektiert werden. Dies kann entweder bedeuten, dass nie eine Komplexierung stattgefunden hatte oder dass der Komplex unter den Messbedingungen wieder zerstört worden war. Daher wurde in einer Test-Reaktion ein Puffer aus Kalium-Salzen für die Interkalation verwendet. Dies führte jedoch zu einem identischen Ergebnis. Darstellung des Aza-Kronenether-Glutathions Die Umsetzung mit Glutathion erfolgte nach der bereits zuvor beschriebenen Vorgehensweise. Der Interkalator wurde im Acetonitril/Phosphatpuffer-Gemisch 24 h inkubiert, mit der Glutathion-Pufferlösung versetzt und für 24 h gerüttelt. Anhand der MALDI-FTICR-MS-Untersuchungen des Rohprodukts konnte Produkt 31 mit zwei verknüpften Glutathion-Molekülen als Hauptbestandteil detektiert werden. Im Gegensatz zur AzidGlutathion-Synthese konnten hier allerdings trotz identischer Reaktionsbedingungen geringe Mengen des einfach Glutathion-modifizierten Interkalators nachgewiesen werden. Die Abtrennung des Nebenproduktes erfolgte mittels HPLC. Die Reinheit wurde anhand von LCMS- Messungen analysiert. Ergebnisse und Diskussion | 105 Abbildung 3-30. LC-MS-Spektren Aza-Kronenether-Somatostatin 31; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV3+ 2+ Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.0 min: m/z = 436 g/mol [M+H] , 654 g/mol [M+H] , 1307 g/mol + [M+2H ; D) MS-Spektrum (-) t = 13.0 min: m/z = 1304 g/mol [M-H] ; berechnet: [M] = 1305.54 g/mol. Auch bei dieser Reaktion konnten keine Komplexe mit Alkaliionen detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, sollte ein bereits interkaliertes Somatostatin mit einem Kronenether verknüpft werden. Da im Institut von Tao Wang bereits ein Somatostatin mit einer Thiolgruppe (Schema 3-31) synthetisiert worden war, sollte eine Aza-Krone mit einem Maleimid funktionalisiert werden. Dies geschah mittels einer Kupplungsreaktion zwischen 1-Aza-[15]Krone-5 und einer Maleimid-funktionalisierten Hexansäure, welche ebenfalls im Institut von David Ng synthetisiert worden war. Es wurden BOP und HOBt als Kupplungsreagenzien verwendet und das Produkt 38 nach säulenchromatographischer Aufarbeitung mit einer Ausbeute von 43% erhalten. Die Charakterisierung erfolgte durch NMR-Spektroskopie und LC-MS-Messungen. Schema 3-30. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenethers 38; i) BOP, HOBt, DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h. Dieses Molekül wurde anschließend in unterschiedlichen Verhältnissen in einem 1:1 Gemisch aus Wasser und Dimethylformamid mit dem Thiol-Somatostatin umgesetzt. Schema 3-31. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenther-Somatostatins; i) H2O/Dimethylformamid, RT, 24 h. 106 | Ergebnisse und Diskussion Da keine der Reaktionen zu positivem Ergebnis führte, wurde Verbindung 38 nun auf zwei verschiedene Varianten mit Glutathion im Überschuss umgesetzt. In Variante A wurde 38 im üblichen Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) und in Variante B, um Alkaliionen zu vermeiden in Dimethylformamid gelöst. Es wurden jeweils drei Äquivalente L-Glutathion zugesetzt und das Reaktionsgemisch für 24 h bei 45 °C geschüttelt. Zur Abtrennung des überschüssigen Tripeptids wurde die analytische HPLC verwendet. Schema 3-32. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenether-Glutathions 39; i-a) Glutathion, Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), 45 °C, 24 h; i-b) Glutathion, Dimethylformamid, 45 °C, 24 h. Beide Varianten führten unabhängig vom verwendeten Lösungsmittel zum gewünschten Produkt 39. Die Verbindung wurde mittels NMR- und LC-MS-Messungen charakterisiert. Allerdings konnten auch hier keine Komplexbildungen jeglicher Form beobachtet werden. Es bleibt nun weiterhin die Frage bestehen, ob die Bildung eines Alkalimetall-Komplexes bisher aufgrund Instabilität sowie Limitationen seitens der Analysemethoden nur nicht nachgewiesen werden konnte oder gar nicht erst stattfand. Genauere Untersuchungen hierzu werden in Kapitel 3.3.2.1 diskutiert. Ergebnisse und Diskussion | 107 3.1.2.3 Synthese und Charakterisierung von 2,2´-Bipyridin-Somatostatin/Glutathion Für die Reaktionen des Bipyridin-Interkalators 16 mit den beiden Peptiden wurden, im Vergleich zum Aza-Kronenether-Interkalator, keine Schwierigkeiten bezüglich Nebenreaktionen durch Komplexbildung erwartet, weswegen hier das bereits etablierte Verfahren der Biokonjugation verfolgt wurde. Schema 3-33. Biokonjugation des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 16 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. Darstellung des 2,2´-Bipyridin-Somatostatins Die Synthese des 2,2´-Bipyridin-Somatostatins 32 erfolgte analog der bereits beschriebenen Durchführung, wobei jedoch eine Erhöhung der Reaktionsdauer der Interkalation von 24 auf 48 h eine Verbesserung der Ausbeute nach sich zog. Die Entstehung des Produkts 32 wurde mittels MALDI-MS-Messungen kontrolliert. Das überschüssige Somatostatin konnte durch Einsatz präparativer HPLC abgetrennt und das Produkt mit 34% Ausbeute erhalten werden. Die Reinheit wurde wieder mittels MALDI-FTICR-MS und MALDI-TOF-MS überprüft. 108 | Ergebnisse und Diskussion + Abbildung 3-31. 2,2´-Bipyridin-Somatostatin 32: A) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 2213.00 g/mol [M+H] ; B) MALDI+ TOF-MS-Spektrum: : m/z = 2213.05 g/mol [M+H] ; berechnet: [M] = 2212.57 g/mol. Darstellung des 2,2´-Bipyridin-Glutathions Da die Synthese des Bipyridin-Somatostatins 32 mit einer, für die Interkalation, guten Ausbeute von 34% gelang, wurde erwartet, dass auch die Reaktion mit L-Glutathion erfolgreich verlaufen sollte und das Hauptprodukt dabei die Verbindung mit zwei Molekülen des Tripeptids darstellt. Die Durchführung erfolgte ebenfalls analog zu den vorherigen Glutathion-Reaktionen. Im Gegensatz zum Somatostatin wurde hier bereits nach 24 h Reaktionszeit eine vollständige Umsetzung des Interkalators 28 festgestellt. Wie im Falle des Azid-Glutathions 29 konnte auch hier durch MALDI-MS-Messungen kein Produkt mit nur einem verknüpften Molekül Glutathion detektiert werden. Nach der Aufreinigung durch analytische HPLC wurde die erhaltene Verbindung mittels LC-MS-Messungen untersucht. Abbildung 3-32. 2,2´-Bipyridin-Glutathion 33: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 3+ 2+ 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 5.50 min: m/z = 397 g/mol [M+H] , 594 g/mol [M+H] ; D) MS-Spektrum (-) t = 5.50 min: + m/z = 1185 g/mol [M-2H] ; E) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 1209.42 g/mol [M-H+Na] ; berechnet: [M] = 1187.30 g/mol. Ergebnisse und Diskussion | 109 Analog zum Azid-Interkalator 23, lieferte auch der Bipyridin-Interkalator 16, hinsichtlich der Biokonjugation mit Somatostatin und Glutathion, sehr zufriedenstellende Ergebnisse. Nach erfolgter Synthese, sollte das Somatostatin-Derivat 32 nun auch für die Komplexbildung mit Übergangsmetallen herangezogen werden, worauf in Kapitel 3.3 näher eingegangen wird. Nachfolgend wird nun die Biokonjugation des Boronsäure-Interkalators 18 erörtert. 110 | Ergebnisse und Diskussion 3.1.2.4 Synthese und Charakterisierung von Boronsäure-Somatostatin-/Glutathion Auch die Reaktionen des Boronsäure-Interkalators 18 erfolgten nach bereits bekanntem Verfahren. Nachfolgend ist der Reaktionsweg der Biokonjugationsreaktionen aufgezeigt. Schema 3-34. Biokonjugation des Boronsäure-Interkalators 18 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24-48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. Darstellung des Boronsäure-Somatostatins Analog zur Bipyridin-Somatostatin-Synthese, führte auch hier eine Erhöhung der Reaktionsdauer von 24 auf 48 h zu vermehrter Produktbildung. Nach der Aufarbeitung unter Verwendung der präparativen HPLC konnten 21% der Verbindung 34 isoliert und mittels LCMS und MALDI-FTICR-Messungen charakterisiert werden (Abbildung 3-33). Verglichen mit den Ausbeuten der anderen Interkalationen, verlief diese Reaktion bisher am schlechtesten. Möglicherweise kann dies auf die freie Boronsäure zurückgeführt werden. Daher wurde in Erwägung gezogen, statt 18 die noch geschützte Variante des Interkalators (17) zu nutzen und die Entschützung erst nach erfolgter Interkalation durchgezogen. Die Stabilität der Schutzgruppe der Boronsäure gegenüber Säuren ist allerdings höher als die der BocSchutzgruppe, weswegen bei der Abspaltungs-Reaktion mit Trifluoressigsäure auf eine Ergebnisse und Diskussion | 111 ausreichende Reaktionsdauer sowie entsprechenden Überschuss geachtet werden musste. Da Somatostatin jedoch nur bis zu einem gewissen Grad gegenüber Trifluoressigsäure stabil bleibt, wurde diese Alternative wieder verworfen. Abbildung 3-33. Boronsäure-Somatostatin 34; LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 3+ 2+ 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 715 g/mol [M-2H2O+H] , 1071 g/mol [M-2H2O] ; D) MS-Spektrum (-) t = 2+ 6.25 min: m/z = 1078 g/mol [M-H2O-2H] ; MALDI-FTICR-MS-Spektrum (CHCA): m/z = 2142.97 g/mol [M-2H2O+H] , + + 2150.98 g/mol [M-2H2O+9H] , 2160.98 g/mol [M-H2O+H] ; berechnet: [M] = 2177.99 g/mol. Es war nun interessant zu sehen, in wie fern sich auch die Biokonjugation mit Glutathion bezüglich des Reaktionsumsatzes verhält. Darstellung des Boronsäure-Glutathions Bei der Kronenether-Somatostatin-Reaktion war die Ausbeute in einem ähnlichen Bereich wie hier beim Boronsäure-Interkalator. Da bei der Kronenether-Glutathion-Reaktion bisher zum ersten Mal auch Mono-Glutathion-Produkt gefunden werden konnte, konnte auch beim Boronsäure-Interkalator Mono-Produkt erwartet werden, falls eine Korrelation zwischen der Reaktivität gegenüber Somatostatin und Glutathion bestehen sollte. Für die Synthese wurde der inkubierte Interkalator 18a mit der Glutathion-Pufferlösung versetzt und insgesamt 48 h inkubiert. Nach 24 h wurde eine Probe entnommen, wobei nur geringe Mengen an zweifach modifiziertem Produkt detektiert werden konnten. Aus diesem Grund wurde die Reaktionszeit analog zur Somatostatin-Interkalation um weitere 24 h verlängert. MALID-FTICR-MS-Messungen zeigten anschließend, dass in den zusätzlichen 24 h nahezu das gesamte einfach modifizierte Produkt mit einem weiteren Molekül L-Glutathion weiter reagiert hatte. 112 | Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3-34. Boronsäure-Glutathion 35; LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 2+ + nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.0 min: m/z = 568 g/mol [M(2Glu)-H2O+H] , 1135 g/mol [M(2Glu)-H2O+H] ; D) MS-Spektrum 2(-) t = 6.0 min: m/z = 557 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H] , 1115 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H] ; MALDI-FTICR-MS-Spektrum: 1004.35 + + + g/mol [M(1Glu)+DHB+4H] , 1157.49 g/mol [M(2Glu)+5H] , 1293.43 g/mol [M(2Glu)+DHB-H2O+5H] ; berechnet: [M(2Glu)] = 1152.42 g/mol. Beide Biokonjugationsreaktionen des Boronsäure-Interkalators 18 führten zum gewünschten Produkt, jedoch im Falle des Somatostatins leider nur mit einer Ausbeute von 21%. Die Umsetzung mit Glutathion zeigte nach 24 h, im Gegensatz zu den bisherigen Reaktionen, noch große Mengen an Mono-Glutathion-Produkt. Nach erfolgreicher Synthese des Boronsäure-Somatostatin-Derivats, sollte nun die Darstellung des komplementären Reaktionspartners, das Salicylhydroxamsäure-Derivat, versucht werden. Aufgrund der Ergebnisse der bereits durchgeführten Reaktionen der vier Interkalatoren, war es nun von Interesse, in welchem Umfang die Interkalation des Salicylhydroxamsäure-Interkalators in das Somatostatin verlaufen wird und ob sich wieder eine Korrelation zur Reaktion mit Glutathion erkennen lässt. Ergebnisse und Diskussion | 113 3.1.2.5 Synthese und Charakterisierung von Salicylhydroxamsäure- Somatostatin/Glutathion Für die Reaktionen mit Somatostatin und Glutathion wurde die Trityl-geschützte Variante des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24 eingesetzt, um von Anfang an mögliche Nebenreaktionen oder Störungen der Interkalation durch unerwünschte Komplexbildungen zu vermeiden. Da nur geringe Mengen an Säure notwendig sind, um die Trityl-Schutzgruppe abzuspalten, sollte das interkalierte Somatostatin-Produkt genügend Stabilität aufweisen, um die Schutzgruppe nach der Interkalation oder Reaktion mit Glutathion zu entfernen. Nachfolgend ist der geplante Syntheseweg abgebildet. Schema 3-35. Biokonjugation des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24-48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. Darstellung des Salicylhydroxamsäure-Somatostatins 114 | Ergebnisse und Diskussion Die Interkalation wurde wieder nach dem Standardverfahren durchgeführt. Dazu wurde der Interkalator 24 in Acetonitril gelöst und mit Puffer verdünnt. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Interkalatoren konnte hier eine sofortige Trübung und nach kurzer Zeit auch weißer Niederschlag beobachtet werden. Es wurde daraufhin weiter nach Syntheseplan verfahren und die Somatostatin-TCEP-Lösung zugegeben. Nach jeweils 24 und 48 h Reaktionszeit wurden dem Reaktionsgemisch Proben entnommen und mittels LC-MS und MALDI-MS-Messungen untersucht. Anhand der LC-MS-Spektren konnte weder Produkt, noch der Interkalator selbst detektiert werden. Ein Problem war dabei, dass durch die TFAhaltige mobile Phase während der Messung die Tritylgruppe sehr wahrscheinlich abgespalten wurde und die ungeschützte Verbindung, aufgrund der stark veränderten Wechselwirkungen, nicht detektiert werden konnte. Die Reaktion wurde mehrmals mit veränderten Reaktionsbedingungen wiederholt. Eine Untersuchung mittels MALDI-FTICR-MS zeigte jedoch im besten Fall nur Spuren eines möglichen Produkts 36. Alle weiteren detektierten Massen konnten, abgesehen vom Somatostatin, nicht zugeordnet werden. Abbildung 3-35. MALDI-FTICR-MS-Spektrum der Reaktionslösung der Somatostatin-Interkalation des SHS-Interkalators + + 24; m/z = 2305.02 g/mol [M+2H] , 2327.01 g/mol [M+Na+H] ; berechnet: [M] = 2303.05 g/mol; Somatostatin: m/z = + 1661.72 g/mol [M+Na+2H] ; berechnet: [M] = 1637.90 g/mol. Es stellte sich nun die Frage, ob sich möglicherweise das Michael-Akzeptor-System (Verbindung 24a) durch die Inkubation nicht ausbilden konnte oder ob die Reaktion mit dem Somatostatin das Problem darstellte. Da während der Inkubation sowohl Trübung als auch Niederschlag beobachtet werden konnte, wurde versucht, die Inkubationslösung zu analysieren. Weder durch LC-MS noch MALDI-MS-Untersuchungen konnten jedoch die Massen der Verbindungen 24 und 24a detektiert werden. Ergebnisse und Diskussion | 115 Ein Problem war nun, dass neben der Tatsache, dass die Synthese fehlgeschlagen sein könnte, auch die Möglichkeit bestand, dass nur die Flugeigenschaften der Verbindungen zu schlecht waren und somit eine Detektion mittels MALDI-MS schlichtweg nicht realisiert werden konnte. Um nun herauszufinden, ob die Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems oder die Reaktion mit Somatostatin das grundsätzliche Problem darstellt, wurde die Glutathion-Reaktion durchgeführt. Darstellung des Salicylhydroxamsäure-Glutathions Für die Reaktion wurden wieder 5 Äquivalente des Glutathions eingesetzt. Nach 24 h wurde das Reaktionsgemisch analysiert und es konnten sowohl Verbindung 37 mit zwei Molekülen Glutathion als auch Verbindung 37a mit nur einem verknüpften Glutathion detektiert werden. Im Gegensatz zu den vorherigen Reaktionen mit jeweils 5 Äquivalenten an LGlutathion, stellte hier allerdings 37a das Hauptprodukt dar. Aus diesem Grund wurde die Reaktion mit 3 und 8 Äquivalenten wiederholt. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-36 dargestellt, wobei alle Verbindungen ohne Schutzgruppe detektiert wurden. Dies hat möglicherweise die Ursache, dass die Trityl-Schutzgruppe während der MALDI-FTICR-MS-Messung durch die Laserbestrahlung abgespalten werden kann. Es lässt sich daher keine genaue Aussage darüber treffen, ob die Schutzgruppe aufgrund der Messung oder bereits während der Reaktion abgespalten wurde. Da die Schutzgruppe allerdings nur zum Zwecke der besseren Reaktivität verwendet wurde und im nächsten Schritt ohnehin abgespalten werden würde, stellt dies synthetisch gesehen kein Problem dar. Diesbezüglich wäre die NMR-Spektroskopie zur besseren Charakterisierung heranzuziehen. Deren Durchführung war hier aber aufgrund der geringen Substanzmenge der Testreaktionen nicht möglich. 116 | Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3-36. MALDI-FTICR-MS-Spektren der Glutathion-SHS-Interkalator-Reaktionslösungen mit 3, 5 und 8 Eq. + + + Glutathion; A) m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H] , 1301.44 g/mol [M(2Glu)+Na] ; B) m/z = 972.24 g/mol [M(1Glu)+H] , + + + 1279.46 g/mol [M(2Glu)+H] ; C) m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H] , 1317.44 g/mol [M(2Glu)+K] ; berechnet: [M(1Glu)] = 971.37 g/mol, [M(2Glu)] = 1278.54 g/mol. Vergleicht man nun die drei MS-Spektren, lässt sich bei der Erhöhung von 3 auf 5 sowie 8 Äquivalenten L-Glutathion eine Zunahme der Bildung der Verbindung 37 im Verhältnis zu 37a von 1:7 über 1:5 auf 1:3.5 feststellen. Im Vergleich zu allen bisherigen Reaktionen mit 5 Äquivalenten Glutathion lässt sich sagen, dass die Reaktivität des SHS-Interkalators im Vergleich zu den bisherigen Interkalatoren deutlich niedriger ausfällt und wesentlich höhere Mengen an Peptid notwendig sind, um zwei Moleküle Glutathion zu binden. Da sowohl 37 als auch 37a erfolgreich synthetisiert werden konnten, lässt sich daraus im Hinblick auf die Interkalation mit Somatostatin schließen, dass nicht wie vermutet die Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems der Verbindung 24a, sondern der Prozess der Interkalation ein Hindernis darzustellen scheint. Aus diesem Grund wurde nicht weiter versucht, das Somatostatin-Derivat 36 durch eine Variation der Reaktionsbedingungen zu synthetisieren, sondern es wurde ein alternativer Weg in Betracht gezogen. Für den Aufbau des Interkalators 24 wurde die SHS-Verbindung mittels Click-Reaktion in guten Ausbeuten an den Azid-Interkalator 23 gebunden. Durch die Synthese des Azid-Somatostatins 28, könnte eine Click-Reaktion dieses Derivats mit der SHS-Verbindung eine vielversprechendere Alternative zum bereits verwendeten Syntheseweg darstellen. Diese Synthese wird in Kapitel 3.2.3 näher untersucht. Ergebnisse und Diskussion | 117 3.1.2.6 Zusammenfassung der Somatostatin/Glutathion-Derivat-Synthesen Nachfolgend ist tabellarisch eine Zusammenfassung der Produktbildung der Biokonjugationsreaktionen der Interkalatoren dargestellt. Es wird dabei zwischen dem Mono- und Di-Glutathion-Addukt sowie der Interkalation in die Disulfidbrücke des Somatostatins unterschieden. Konnte bei der Reaktion kein Produkt nachgewiesen werden, erfolgte eine Kennzeichnung mit , Spuren wurden mit und das Hauptprodukt mit markiert. Aufgrund der Substanzmenge konnten die jeweiligen Ausbeuten nur bei der Interkalation mit Somatostatin bestimmt werden und sind ebenfalls in der Tabelle vermerkt. Tabelle 3. Zusammenfassung der Reaktivität der funktionalisierten Interkalatoren gegenüber dem Glutathion und dem Somatostatin, inklusive der Ausbeute, wobei = kein Produkt, = Spuren und = Hauptprodukt darstellt. Interkalatoren 1 Glu 2 Glu Somatostatin 40% 25% 34% 00 - 21% Die unterschiedlich funktionalisierten Interkalatoren sind jeweils aus den drei Komponenten Bisulfon-Grundgerüst, TEO-Linker sowie einem reaktiven Baustein aufgebaut. Durch den Einbau des Triethylenoxid-Linkers konnte ein räumlicher Abstand zwischen den beiden reaktiven Zentren der Verbindungen ermöglicht werden. Es war daher davon auszugehen, dass der jeweils eingeführte Baustein, trotz der prinzipiell beweglichen TEO-Kette, keinen nennenswerten Einfluss auf die Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems sowie der Reaktivität hinsichtlich der Interkalation ausüben sollte. 118 | Ergebnisse und Diskussion Alle Reaktionen waren nach dem gleichen Schema durchgeführt worden. Der Interkalator wurde jeweils in Acetonitril gelöst, mit Phosphatpuffer verdünnt und für 24 h inkubiert. Im Laufe dieser Zeit sollte sich das Michael-Akzeptor-System des Bisulfon-Interkalator-Teils der unterschiedlichen Verbindungen vollständig ausgebildet haben. Im Falle der Interkalation, wurde die Disulfidbindung mittels Zugabe des Reduktionsmittels TCEP gespalten, dieses Gemisch langsam der inkubierten Interkalator-Lösung hinzugefügt und in einem Rüttler für 24-48 h inkubiert. Das Glutathion wurde ebenfalls in Phosphatpuffer gelöst, zur InterkalatorLösung gegeben und analog für 24-48 h inkubiert. Bei beiden Reaktionstypen erfolgte nach dem Entfernen des Puffers eine Aufarbeitung mittels HPLC. Betrachtet man Tabelle 3, lassen sich deutliche Unterschiede hinsichtlich der Reaktivität der verschiedenen Interkalatoren, in Abhängigkeit der eingeführten reaktiven Gruppe, feststellen. Die Ausbeuten der Somatostatin-Interkalationen variieren beispielsweise im Bereich von 0 - 40%, wobei sich die Frage stellt, ob die Limitation der Reaktion vom Interkalator oder vom Somatostatin herrührt. Zum Vergleich wurden alle Interkalatoren auch mit Glutathion umgesetzt, welches im Vergleich zum Somatostatin wesentlich höhere Stabilität sowie Reaktivität bezüglich der Cystein-Thiolgruppe und dem Michael-AkzeptorSystem aufweist. Es lassen sich daher bessere Rückschlüsse auf die Zugänglichkeit der Interkalatoren ziehen. Vergleicht man nun in Tabelle 3 die drei Spalten der Produktbildung, so fällt auf, dass sobald ein Interkalator hohe Reaktivität mit Somatostatin zeigt, er ausschließlich zum Di-GlutathionProdukt abreagiert, wie im Falle des Azid- und Bipyridin-Interkalators. Findet die Interkalation dagegen nur mit geringerem Umsatz statt, wird neben dem Di-GlutathionProdukt auch eine Bildung des Mono-Addukts beobachtet (siehe dazu Kronenether- und PBS-Interkalator). Im Falle des SHS-Interkalators konnten nur sehr geringe Spuren des Somatostatin-Produkts hergestellt werden. Ähnlich verhielt es sich auch beim Glutathion, auch hier konnte das Di- im Vergleich zum Mono-Produkt nur in geringen Mengen erhalten werden. Es scheint sich also ein Zusammenhang bezüglich einer ähnlichen Reaktivität der Interkalatoren jeweils gegenüber beiden Peptiden abzuzeichnen. Zumindest bei den hier verwendeten Peptiden konnte keine Abhängigkeit der Reaktion von der Art des Thiol-Peptids festgestellt werden, wobei beim Glutathion, als reaktives Tripeptid, im Vergleich zum Somatostatin höhere Ausbeute erwartet worden waren. Jedoch scheinen, wie bisher Ergebnisse und Diskussion | 119 angenommen, die sterischen Ansprüche des Somatostatins während der Interkalation nicht die Hauptrolle zu spielen. Anhand der Ergebnisse der Reaktionen dieser fünf unterschiedlichen Interkalatoren lässt sich also klar feststellen, dass die Wahrscheinlichkeit, dass eine reaktive Thiol-Verbindung am Michael-Akzeptor-System erfolgreich angreifen kann, durch das Verändern der eingeführten Gruppe massiv beeinflusst werden kann und daher eingehender untersucht werden sollte. Welchen Einfluss nun die eingeführten Endgruppen auf die Interkalator-Funktion haben, konnte bisher nicht genau geklärt werden, da sich kein eindeutiges Muster hinsichtlich elektronischer Einflüsse abgezeichnet hatte. Warum ausgerechnet der SHS-Interkalator so schlechte Reaktivität zeigt, liegt unter Umständen doch an einer gewissen sterischen Hinderung, welche durch die SHS-Gruppe nach Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems auftritt. Eine andere Vermutung sind Löslichkeitsprobleme. Während der Inkubation des SHS-Interkalators traten im Laufe der Zeit, im Vergleich zu den anderen Interkalatoren, starke Trübungen sowie Niederschlag auf, was auf eine verminderte Löslichkeit des aktivierten Interkalators hindeuten kann. Da das Mono-Glutathion-Produkt trotzdem gebildet werden konnte, ist die Löslichkeit des Intekalators jedoch hoch genug, um einmal mit Glutathion zu reagieren. Die daraus resultierende Abspaltung des ToluolsulfonsäureRests sorgt möglicherweise für eine so drastische Herabsetzung der Löslichkeit, dass das Produkt ausfällt und somit keine Reaktion mit einem weiteren Molekül Glutathion möglich ist. Ähnliches könnte sich im Falle des Somatostatins nach Angriff des ersten Thiols abspielen, wodurch es zu keiner bzw. nur geringer Produktbildung oder Ausfällung kam. Anne Pfisterer konnte an den von ihr synthetisierten Interkalatoren, bei welchen die eingeführten Substituenten direkt am Bisulfon gebunden waren, starke Einflüsse dieser Substituenten hinsichtlich der Reaktivität feststellen. Aktivierende Reste führten, aufgrund einer schlechteren Stabilisierung des Übergangszustands, zu einer erhöhten Reaktionsdauer mit erniedrigten Ausbeuten, jedoch gleichzeitiger Unterbindung der Rückreaktion. Ein desaktivierender Rest verursachte gegenteiliges Verhalten und ermöglichte bei geeignetem reaktiven Nukleophil sogar einen Austausch des bereits gebundenen Nukleophils. [149] Da bei den in dieser Arbeit untersuchten Interkalatoren ein TEO-Linker als eine Art Abstandshalter verwendet worden war, ist es unwahrscheinlich, dass die Einflüsse des eingeführten Bausteins so weitreichend über das gesamte Molekül hinweg wirken können. 120 | Ergebnisse und Diskussion Zusammengefasst lässt sich also festhalten, dass der Erfolg der Biokonjugationsreaktionen der unterschiedlichen Interkalatoren, trotz TEO-Linker, in einer gewissen Abhängigkeit zu den verwendeten Substituenten stehen und aus diesem Grund der Verlauf der Reaktion nicht zufriedenstellend vorhergesagt werden kann. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Peptide, welche sich sowohl in Größe als auch Eigenschaften wie Stabilität oder Löslichkeit unterscheiden, trotzdem eine übereinstimmende Tendenz bezüglich des Umsatzes der Reaktion aufweisen. Bis auf das SHS-Somatostatin, konnten alle Derivate über die hier vorgestellte erste Synthesestrategie hergestellt und hinsichtlich der korrekten Masse charakterisiert werden. Diese Konjugate konnten nun, mittels der eingeführten stimuli-responsiven Plattformen, zum Aufbau definierter Biokonjugate genutzt werden. Einblicke hierzu liefert Kapitel 3.3. Nachfolgend wird nun die alternative Syntheseroute, bezüglich der Darstellung von Somatostatin-Konjugaten, nach dem Prinzip des grafting from vorgestellt. Ergebnisse und Diskussion | 121 3.2 Somatostatin-Konjugate – Entwicklung nach der grafting from Methode Im vorherigen Kapitel konnte gezeigt werden, dass die zweistufige Synthese der Somatostatin-Konjugate über den Weg des grafting onto zu sehr guten Resultaten geführt hatte. Es wurden dabei in einem ersten Schritt unterschiedlich funktionalisierte InterkalatorVerbindungen hergestellt, welche in einem zweiten Schritt mittels der Interkalation in das Somatostatin eingebaut worden waren. Parallel dazu ergab sich natürlich die Option, die gewünschten Bausteine nicht vor sondern erst nach der Interkalation in das Somatostatin einzuführen. Dieses Prinzip der Postmodifikation wird auch als grafting from bezeichnet. Dazu wurden, aufgrund der Reaktivität der beiden funktionellen Gruppen, das AzidSomatostatin 28 sowie ein Ethinyl-Derivat als Ausgangsverbindungen gewählt. In diesem Kapitel werden nun die Syntheseversuche dieser Modifizierungsart vorgestellt bzw. erläutert warum für bestimmte Bausteine dieser Weg ungeeignet war. Es wird dabei die gleiche Reihenfolge wie bei der vorherigen Synthesestrategie verfolgt, angefangen bei der Synthese eines Kronenether-Derivats. 3.2.1 Darstellung von Aza-Kronenether-Somatostatin via Click-Reaktion In Kapitel 3.1.1.8 wurde die Synthese des Aza-Kronenether-Interkalators 27 über den Weg der kupferkatalysierten Click-Reaktion zwischen einer Ethinyl-funktionalisierten Aza-Krone 26 und dem Azid-Interkalator 23 beschrieben. Dabei konnte Verbindung 27 mit 28% Ausbeute erhalten werden. Unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen, Kupfer(I)-iodid sowie DIEA als Base, sollte es daher theoretisch auch möglich sein, die AzaKrone 26 an das Azid-Somatostatin 28 zu klicken (siehe Schema 3-36). Die Krone 26 wurde dazu in THF, das Azid-Somatostatin 28 in Wasser gelöst. Dies war notwendig, da sich das Somatostatin in rein organischen Lösungsmitteln meist nicht vollständig in Lösung bringen lässt bzw. es zur Ausfällung des Peptids kommen kann. Zum Schluss wurden das DIEA und das Kupfer(I)-iodid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 24 h auf dem Rüttler geschüttelt. Aufgrund der Oxidationsempfindlichkeit des Kupfer(I)Salzes wurde die Reaktion unter Argonatmosphäre durchgeführt. 122 | Ergebnisse und Diskussion Schema 3-36. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Somatostatins über das Azid-Somatostatin 28; i) DIEA, Kupfer(I)iodid, THF/H2O, RT, 24 h. Zur Analyse des Reaktionsumsatzes wurde eine Probe entnommen und diese mittels MALDITOF-MS untersucht. Es ließ sich nur die Masse des Azid-Somatostatin 28, jedoch keine Produktmasse detektieren. Da jedoch die Reaktion mit dem Azid-Interkalator 23 positiv verlief, lässt sich daraus folgern, dass unter Umständen das Peptid ein Hindernis darstellt. Viele Peptide sind dafür bekannt, dass es ihnen möglich ist Metallionen, wie beispielsweise Kupfer, in ihrer Tertiärstruktur einzulagern. Dies ist insbesondere beim Einsatz im Prozess des medikamentösen Wirkstofftransports ein schwerwiegender Nachteil, da Kupfer meist Zytotoxizität aufweist.[141] Es ist daher vorstellbar, dass dies auch hier beim Somatostatin, zusätzlich zur Komplexierung durch den Kronenether, aufgetreten ist und daher der Kupferkatalysator der Reaktionslösung entzogen worden war. Auf einen alternativen Syntheseversuch des Bipyridin-Somatostatins wurde, aufgrund weiterer notwendiger Modifizierungen der Bipyridin-Säure, verzichtet. Da dies insgesamt zu einer hohen Anzahl an synthetischen Schritten geführt hätte, wäre, selbst bei gewünschtem Reaktionsausgang, auch die Rentabilität im Vergleich zur bereits vorgestellten Syntheseroute stark gesunken. Im Falle einer Click-Reaktion, hätte sich hier zusätzlich das Problem einer möglichen Komplexierung des Kupfers durch den zweizähnigen Bipyridin-Liganden ergeben. Eine zur Bipyridin-Interkalator-Synthese (16) analoge Kupplung an eine Amin-Somatostatin wäre aufgrund der Lysin-Aminogruppen des Peptids ebenfalls nicht sinnvoll. Ergebnisse und Diskussion | 123 3.2.2 Darstellung von Boronsäure-Somatostatin via Click-Reaktion Als Alternative zur Interkalation des PBS-Interkalators 18, wurde auch hier ein Weg über die Click-Chemie versucht. Christiane Seidler synthetisierte im Rahmen ihrer Dissertation eine Phenylboronsäure, welche mit einer Azidgruppe funktionalisiert worden war. Diese Verbindung sollte schließlich in einer kupferkatalysierten Click-Reaktion mit einem EthinylSomatostatin umgesetzt werden. Dieses Derivat wurde bereits in der Diplomarbeit[129] unter Anleitung von Tao Wang synthetisiert. Der geplante Syntheseweg ist nachfolgend dargestellt. Schema 3-37. Syntheseroute von Boronsäure-Somatostatin via Click-Reaktion; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, THF/H2O, RT, 24 - 48 h. Da der Einsatz des Kupfer(I)-iodids in der Aza-Kronenether-Somatostatin-Synthese keine Umsetzung erzielt hatte sowie die Tatsache, dass hier Natriumionen keine Nebenreaktionen verursachen konnten, sollten in dieser Synthese die bereits bekannten Komponenten Kupfer(II)-sulfat und Natriumascorbat verwendet werden. Diese wurden separat in Wasser gelöst, vereinigt und die Farbänderung von dunkelbraun nach beige-orange abgewartet. Das Ethinyl-Somatostatin wurde ebenfalls in Wasser, die Azid-Boronsäure aufgrund der Löslichkeit in Tetrahydrofuran gelöst und beide Lösungen vereinigt. Anschließend wurde die Katalysatorlösung hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 24 – 48 h inkubiert. Für die Reaktion wurde die Azid-Boronsäure im Überschuss zugesetzt und in unterschiedlichen Reaktionsversuchen das Verhältnis von Kupfersulfat und Natriumascorbat variiert. 124 | Ergebnisse und Diskussion Tabelle 4. Äquivalent-Verhältnisse der Synthese des Boronsäure-Somatostatins via Click-Reaktion. Eth.Soma N3-BS CuSO4 NaAsc 1 3 5 10 1 3 10 20 1 3 20 40 Es konnte jedoch in keinem Fall Produkt mittels MALDI-TOF-MS-Messungen nachgewiesen werden. Möglicherweise stellten auch hier die sehr guten komplexierenden Eigenschaften der Boronsäure, hinsichtlich des Kupferkatalysators, ein zu großes Hindernis dar. Da die Herstellung des Boronsäure-Somatostatins 34, mittels des Schritts der Interkalation, bereits zu guten Resultaten geführt hatte, stellt der hier beschriebene Weg keine interessante Alternative dar. Auch die Synthese eines weiteren Boronsäure-Interkalators ist, aufgrund der fast vollständigen Umsetzung bei der in Kapitel 3.1.1.5 beschriebenen Syntheseroute, nicht sinnvoll. Nachfolgend wird nun die Darstellung des SHS-Somatostatins über das Prinzip des grafting from erläutert. Ergebnisse und Diskussion | 125 3.2.3 Darstellung des Salicylhydroxamsäure-Somatostatins via Click-Reaktion Im Gegensatz zu allen anderen Somatostatin-Derivaten, konnte das SHS-Somatostatin im grafting onto-Kapitel nicht synthetisiert werden. Es war zwar möglich, den SHS-Interkalator 24 in guter Ausbeute (60%) herzustellen, jedoch scheiterte die Biokonjugationsreaktion mit Somatostatin. Da in den beiden vorherigen Kapiteln die verwendeten Click-Reaktionen sowohl mit Kupfer(I) als auch Kupfer(II) nicht funktionierten, war auch hier die Erwartungshaltung gegenüber einer Produktbildung gering. Das Salicylhydroxamsäure-Somatostatin 36 sollte nun analog der in Kapitel 3.1.1.7 beschriebenen kupferkatalysierten Click-Reaktion, zwischen dem Azid-Interkalator 23 und der Trityl-geschützten Ethinyl-modifizierten Salicylhydroxamsäure, synthetisiert werden. Wie aus Schema Schema 3-38 ersichtlich, wurde zum Vergleich sowohl die Trityl-geschützte als auch die ungeschützte Variante der Verbindung eingesetzt. Schema 3-38. Synthese des Salicylhydroxamsäure-Somatostatins 36 via Click-Reaktion; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, Tetrahydrofuran, H2O, RT, 24-48 h. Für die Reaktion wurden die beiden Reaktanden Azid-Somatostatin 28 und Salicylhydroxamsäure sowie Kupfer(II)-sulfat und Natriumascorbat in unterschiedlichen Verhältnissen zueinander eingesetzt. Da die Salicylhydroxamsäure gut in Tetrahydrofuran löslich ist, wurde als Reaktionsmedium eine 1:1 Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran gewählt. Wieder wurden der Kupferkatalysator und das Reduktionsmittel Natriumascorbat separat in Wasser gelöst, vereinigt und die Farbänderung der Lösung von dunkelbraun zu beige-orange abgewartet. Anschließend wurden die beiden Ausgangsverbindungen mit der 126 | Ergebnisse und Diskussion Katalysator-Lösung vereinigt und zwischen 24 und 48 h auf dem Rüttler inkubiert. Die eingesetzten Äquivalent-Verhältnisse der Reaktion sind in Tabelle 5 aufgeführt, wobei die rot markierten Äquivalente den besten Umsatz mit einer Ausbeute von 55% erzielten. Tabelle 5. Verhältnisse der Äquivalente der Synthese von Salicylhydroxamsäure-Somatostatin 36 via Click-Reaktion. N3-Soma g.SHS CuSO4 NaAsc 1 3 3 1.5 1 3 2 4 1 3 5 10 1 5 5 10 1 5 10 20 Wie auch bei der Synthese des SHS-Interkalators 24 beobachtet, konnte eine Produktbildung nur mit der geschützten Variante der Salicylhydroxamsäure erreicht werden. Die Aufreinigung des Produkts 36 erfolgte mittels HPLC sowie einer Charakterisierung der Masse durch MALDI-FTICR-MS. Abbildung 3-37. MALDI-FTICR-MS-Spektrum des SHS-Somatostatins 36, hergestellt über den Weg der Click-Reaktion; + m/z = 2305.02 g/mol [M+2H] , berechnet: [M] = 2303.05 g/mol. Beim Versuch der Interkalation des SHS-Interkalators 24 in Kapitel 3.1.2.5 wurde bei der Charakterisierung der Reaktionslösung die Vermutung angestellt, dass möglicherweise die Flugeigenschaften der Produktsubstanz schlecht waren und daher eine Detektion mittels MALDI-Massenspektrometrie nicht aussagekräftig war. Da bei dieser Click-Reaktion das Produkt 36 allerdings ohne Schwierigkeiten detektiert werden konnte, kann diese Vermutung dadurch wiederlegt werden. Ergebnisse und Diskussion | 127 Im direkten Vergleich der Reaktion von Trityl-geschützter und ungeschützter SHSVerbindung konnte hier bewiesen werden, dass die ausgeprägten komplexierenden Eigenschaften der der Salicylhydroxamsäure jegliche Produktbildung unterbinden können. 3.2.4 Zusammenfassung der Syntheseversuche der Somatostatin-Konjugate nach der grafting from-Methode Mittels der zweistufigen grafting onto-Methode der vorherigen Kapitel, konnten das AzidSomatostatin sowie Derivate mit den Plattformen Aza-Kronenether, 2,2´-Bipyridin sowie Boronsäure erfolgreich mit Ausbeuten zwischen 21 und 40% dargestellt werden. Lediglich der SHS-Interkalator zeigte nahezu keine Reaktivität gegenüber dem Peptid. Der Vorteil dieser Methode lag zum einen darin, dass das Peptid erst am Ende der Syntheseroute eingesetzt und daher während der organischen Synthese keine Rücksicht auf dessen Sensitivität gegenüber Temperatur oder Lösungsmittel genommen werden musste. Zum anderen war dadurch eine exakte Charakterisierung der rein organischen InterkalatorVerbindungen mittels NMR-Spektroskopie möglich. Im aktuellen Kapitel wurde dagegen versucht die Derivate über eine Postmodifikation eines bereits interkalierten Somatostatin-Derivats herzustellen. Aufgrund der Aminogruppen des Somatostatins, war die Verwendung eines Amin-Derivats und somit der bewährten Kupplungschemie nicht möglich. Aus diesem Grund wurde auch auf eine alternative Darstellung des Bipyridin-Somatostatins verzichtet. Es wurde daher versucht, die Bausteine über die kupferkatalysierte Click-Chemie einzuführen, wobei sowohl auf die Kupfer(I)- sowie die Kupfer(II)-Variante zurückgegriffen wurde. Wie es sich herausstellte, war dieser Reaktionsweg im Falle des Aza-Kronenethers und der Phenylboronsäure nicht erfolgreich, obwohl bei der Krone nahezu identische Reaktionsbedingungen wie bei der Click-Reaktion im Verlauf der Kronenether-InterkalatorSynthese (27) verwendet worden waren. Eine mögliche Schlussfolgerung aus diesem Reaktionsverhalten war der Einfluss des Somatostatins, welches zu einer Komplexierung der Kupferionen und somit zu einer Inaktivierung des Katalysators geführt haben könnte. 128 | Ergebnisse und Diskussion Die Click-Synthese des SHS-Somatostatins 36, über die Trityl-geschützte SHS-Verbindung, verlief allerdings mit 55% Ausbeute durchaus erfolgreich. Da bei dieser Reaktion analog wie zuvor beim Kronenether das Azid-Somatostatin 28 eingesetzt worden war, bleibt das Reaktionsverhalten des Somatostatins bei kupferkatalysierten Click-Reaktionen weiterhin fraglich und sollte zukünftig noch genauer untersucht werden. Nach der erfolgreichen Synthese aller gewünschten Somatostatin-Derivate konnte nun mit der Darstellung der komplexeren Biokonjugate begonnen werden. Ergebnisse und Diskussion | 129 3.3 Design multivalenter und stimuli-responsiver Somatostatin-Biokonjugate Im letzten Kapitel soll nun auf die eigentliche Darstellung der responsiven, definierten Biokonjugate eingegangen werden. Dazu sollten die zuvor hergestellten SomatostatinDerivate herangezogen werden. Begonnen wird dabei mit den Forschungsergebnissen zur Darstellung multivalenter Somatostatin-Dimere sowie –Trimere. Diese beruhen auf kupferkatalysierten Click-Reaktionen unter Verwendung des Azid-Somatostatins 28 und stellen damit ein interessantes Beispiel bezüglich der Postmodifikation eines Biokonjugats über die reaktive Plattform der Azidgruppe dar. Im Anschluss daran, werden erste Reaktionsversuche sowie vorläufige Ergebnisse der stimuli-responsiven Derivate, das 2,2´Bipyridin-, das Phenylboronsäure- sowie das Salicylhydroxamäsure-Somatostatin, vorgestellt. 3.3.1 Multivalente Somatostatin-Konjugate Multivalenz beschreibt das Konzept, dass Liganden in der Lage sind über mehrere identische Bindungsstellen an eine mehrfach vorhandene Akzeptoreinheit zu binden. Dabei ist es von großem Interesse, wie sich die Bindungsaffinität in Abhängigkeit der möglichen Mehrfachbindungen im Vergleich zur normalen Einfachbindung verändern kann. [142] Denn, wie auch im Falle der Antikörper-Antigen-Bindung, kann es bei multivalenten Bindungstellen zu einer Vervielfachung der Bindungsstärke kommen.[143] Ist eine Zelle nun in der Lage Somatostatin-Rezeptoren auszubilden, werden diese in hoher Zahl auf der Oberfläche expressioniert. Möglicherweise kann nun auch bei einer gleichzeitigen Bindung mehrerer Somatostatine, verknüpft über ein Kernsystem, eine deutliche Verbesserung der Zellaufnahme verfolgt werden. Das Ziel war es daher, ein Interkalator-System mit mehreren verknüpften Somatostatin-Molekülen aufzubauen, welches somit über mehrere Bindungsstellen gleichzeitig mit den Rezeptoren der Zellen in Wechselwirkung treten kann. Dieses Konzept wurde bereits von Anne Pfisterer im Rahmen ihrer Dissertation aufgegriffen. Ihr war es möglich multivalente rigide Linkersysteme zu synthetisieren (Abbildung 3-38), welche über zwei oder drei Bisulfongruppen verfügten und somit mittels Interkalation Somatostatin-Dimere und –Trimere synthetisch zugänglich waren.[149] 130 | Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3-38. Multivalente Linkersysteme, synthetisiert von Anne Pfisterer. Der von ihr gewählte Weg des grafting onto sah vor, zuerst das Linkersystem aufzubauen und in einem zweiten Schritt die Interkalation zu vollziehen. Aufgrund der Rigidität der Systeme war zu erwarten, dass die Somatostatin-Moleküle klar definiert ohne sterische Hinderungen verknüpft werden. Es stellten sich allerdings, vor allem beim Trimer, schwerwiegende Löslichkeitsprobleme ein, welche eine weiterführende Verwendung und Charakterisierung der Eigenschaften erschwerten. Dass gerade Wasserlöslichkeit eine entscheidende Rolle spielt, wurde auch bei Octreotid-Multimeren von Yim et al. beobachtet.[144] Aus diesem Grund sollten in dieser Arbeit, für die Synthese von Somatostatin-Multimeren, TEO-Linker zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit eingesetzt werden. Da der grafting ontoAnsatz mit einigen synthetischen Hürden verbunden war, sollten die Multimere hier über den alternativen Weg des grafting from synthetisiert werden, indem die Verknüpfung bereits interkalierter Somatostatin-Derivate über ein Kern-Molekül realisiert wird. Nachfolgend wird nun die Synthese von Somatostatin-Dimer und -Trimer mittels der ClickReaktion vorgestellt. Ergebnisse und Diskussion | 131 3.3.1.1 Darstellung eines Somatostatin-Dimers mittels Triazol-Kerns Ein Dimer stellt die einfachste Form eines Mulimers dar und kann auf verschiedenen Wegen mit den bereits vorgestellten Somatostatin-Derivaten entwickelt werden. Hierfür verwendet wurde schließlich das Azid-Somatostatin 28. Dieses konnte bereits mehrfach mittels kupferkatalysierten Click-Reaktionen in guten Ausbeuten umgesetzt werden. Als Reaktionspartner wurde das Ethinyl-Somatostatin-Derivat eingesetzt, welches strukturell sehr ähnlich dem Azid-Derivat aufgebaut ist und im nachfolgenden Schema zusammen mit der Syntheseroute abgebildet wird. Schema 3-39. Syntheseroute des Somatostatin-Dimers 40 via kupferkatalysierter Click-Reaktion; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, H2O, RT, 24 h. Die Durchführung der Click-Reaktion geschah nach der bereits bekannten Vorgehensweise. Die beiden Somatostatin-Derivate wurden dazu in äquimolarem Verhältnis in Wasser gelöst. Der Kupfer(II)-Katalysator sowie das Natriumascorbat wurden ebenfalls separat in Wasser gelöst, vereinigt und die Kupfer(I)-Bildung abgewartet. Diese Lösung wurde anschließend der Somatostatin-Reaktionslösung beigemischt und für 24 h inkubiert. Das Produkt 40 konnte mittels LC-MS- und MALDI-FTICR-MS-Messungen im Rohprodukt nachgewiesen werden, wobei beide Messungen auf eine nahezu vollständige Umsetzung hindeuteten. Da es sich hierbei um eine reine Testreaktion handelte, wurden vorerst keine Aufreinigungsschritte durchgeführt. 132 | Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3-39. Somatostatin-Dimer 40: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 6+ 5+ 4+ nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.70 min: 677 g/mol [M+H] , 812 g/mol [M+H] , 1014 g/mol [M] ; D) MS-Spektrum (-) t = 65+ 13.73 min: m/z = 676 g/mol [M] , 812 g/mol [M+H] ; E) MALDI-TOF-MS-Spektrum: m/z = 4057.06 g/mol [M+2H] ; berechnet: [M] = 4054.69 g/mol. Die Synthese des Dimers konnte ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden, wobei eine Analyse des Rohprodukts mittels MALDI-TOF-MS sowie LC-MS eine nahezu vollständige Umsetzung wiederspiegelte. Verglichen mit den Dimer-Synthese-Versuchen von Anne Pfisterer, welche versucht hatte, die zuvor synthetisierten Tetrasulfone (siehe Abbildung 3-38) beidseitig in das Somatostatin zu interkalieren, scheint die hier vorgestellte Synthese wesentlich vielversprechender. In ihrem Fall konnten die beiden Produkte zwar als Niederschlag in der Reaktionslösung nachgewiesen werden, jedoch aufgrund von fehlender Wasserlöslichkeit nicht weiter charakterisiert und verwendet werden. Das hier synthetisierte Dimer 40 zeigt dagegen sehr gute Wasserlöslichkeit und wäre daher für eine Untersuchung der biologischen Aktivität hinsichtlich der Zellaufnahme aber auch eine Charakterisierung mittels AFM bezüglich möglicher Überstrukturbildung von Interesse. Nach der erfolgreichen Darstellung des Dimers sollte nun ein Somatostatin-Trimer ebenfalls mittels Click-Chemie und Einsatz des Azid-Somatostatins synthetisiert werden. Die Syntheseversuche werden in folgendem Kapitel beschrieben. Ergebnisse und Diskussion | 133 3.3.1.2 Darstellung von Somatostatin-Trimeren mittels unterschiedlicher Phenyl-Kerne Da mit dem Azid-Somatostatin 28 bisher in allen Reaktionen die besten Ergebnisse erzielt worden waren, sollte es auch beim Syntheseversuch eines Somatostatin-Trimers mittels kupferkatalysierter Click-Reaktion eingesetzt werden. Es musste daher ein symmetrisches Kernmolekül mit drei Ethinylgruppen eingesetzt werden. Da Azid-Somatostatin im Hinblick auf die Wasserlöslichkeit des Produkts bereits einen TEO-Linker enthielt, wurde beim Aufbau des Kernmoleküls darauf verzichtet. Daher wurde Phloroglucin, ein Derivat des Benzols mit drei Hydroxygruppen in symmetrischer 1,3,5-Stellung, zur weiteren Funktionalisierung verwendet. Die Ethinylgruppen wurden, wie in Schema 3-40 dargestellt, mittels 4Pentinsäure eingeführt. Schema 3-40. Synthese der Trimer-Kernverbindung 41; i) EDC, DMAP, Tetrahydrofuran, RT, 24 h. Für die vollständige Modifizierung mit drei Ethinyl-Verbindungen, wurden in mehreren Testreaktionen zwischen 1.2 und 2 Äquivalenten 4-Pentinsäure pro Hydroxygruppe variiert, wobei mit 2 Äquivalenten das gewünschte Trimer 41 als Hauptprodukt erhalten werden konnte. Daher wurde die 4-Pentinsäure in sechsfachem Überschuss eingesetzt, in Tetrahydrofuran gelöst und die Carboxygruppe durch den Einsatz von EDC und DMAP aktiviert. Nach der Zugabe des Pholorglucin wurde das Reaktionsgemisch 24 h gerührt und im Anschluss säulenchromatographisch mit 10% Methanol in Chloroform als Eluens aufgereinigt. Verbindung 41 konnte mit 56% Ausbeute erhalten werden. Für die Synthese des Somatostatin-Trimer, wurde Verbindung 41 in Tetrahydrofuran, AzidSomatostatin in Wasser gelöst und beide Lösungen vereinigt. Kupfersulfat sowie Natriumascorbat wurden jeweils in Wasser gelöst, ebenfalls vereinigt, anschließend der Edukt-Lösung beigemischt und für 24 - 48 h inkubiert. Das Syntheseschema ist nachfolgend dargestellt. 134 | Ergebnisse und Diskussion Schema 3-41. Syntheseroute des Somatostatin-Trimers via Kernverbindung 41; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, Tetrahydrofuran/Wasser, RT, 24-48 h. Es wurden alle vier Verbindungen in unterschiedlichen Verhältnissen zueinander eingesetzt. Eine Übersicht über die Reaktionsbedingungen ist in Tabelle 6 zusammengestellt. Tabelle 6. Verhältnisse der Äquivalente der Synthese des Somatostatin-Trimers via Click-Reaktion. Vbdg. 41 N3-Soma CuSO4 NaAsc 1 1.2 2 4 1 1.2 5 10 1 2 2 4 1 2 5 10 1 1.5 10 20 Alle Reaktionslösungen wurden mittels MALDI-TOF-MS-Messungen analysiert. Es konnte jedoch weder die Produktbildung noch die Masse von Verbindung 41 verknüpft mit einem oder zwei Molekülen Azid-Somatostatin nachgewiesen werden. Es wurden allerdings größere Mengen an Niederschlag im Reaktionsgefäß gefunden, was möglicherweise ein Ergebnisse und Diskussion | 135 Hinweis auf zu geringe Wasserlöslichkeit der Kern-Verbindung oder auf eine Ausfällung der Peptid-Verbindung sein kann und somit eine Ursache für das Fehlschlagen der Reaktion darstellt. Da die in Kapitel 3.2 vorgestellte Click-Reaktion des SHS-Somatostatins 36 mit AzidSomatostatin unter sehr ähnlichen Reaktionsbedingungen zu positivem Ergebnis führte, lag die Vermutung nahe, dass das Kernmolekül die Ursache des Problems darstellte. Um dies näher untersuchen zu können, wurde eine zweite Phenyl-basierte Kernverbindung synthetisiert, welche, aufgrund zusätzlicher TEO-Linker, eine wesentlich verbesserte Wasserlöslichkeit aufweisen sollte. Die Syntheseroute ist im nachfolgenden Schema dargestellt, wobei als Ausgangsverbindung wieder das Phloroglucin herangezogen wurde. Ein dazu geeigneter Ethinyl-funktionalisierter TEO-Linker wurde nach Literaturvorschrift[145] synthetisiert. Schema 3-42. Syntheseroute der TEO-Trimer-Kernverbindung 43; i) wässrige Natronlauge, Tetrahydrofuran, 5 °C, RT, 2 h; ii) Kaliumcarbonat, Dimethylformamid, 80 °C, 24 h . Für die Synthese des Trimer-Kerns musste nun zuerst der TEO-Linker aktiviert werden, was durch die Umsetzung mit Toluolsulfonsäurechlorid realisiert wurde. Dazu wurde der Linker in Tetrahydrofuran gelöst, mit wässriger NaOH versetzt und abgekühlt. Zur Aufarbeitung wurde neutral gewaschen und das Produkt 42 anschließend säulenchromatographisch mit einer 1:1 n-Hexan/Ethylacetat-Mischung als Eluens abgetrennt und mit 80% Ausbeute erhalten. Im nächsten Schritt wurde der TEO-Linker 42 unter Argonatmosphäre, zusammen mit Pholoroglucin, in Dimethylformamid gelöst, Kaliumcarbonat hinzugefügt und das 136 | Ergebnisse und Diskussion Reaktionsgemisch für 24 h bei 80 °C erhitzt. Die Aufarbeitung erfolgte analog Verbindung 42. Der TEO-Phenyl-Kern 43 wurde mit einer Ausbeute von 61% erhalten. Aufgrund der Wasserlöslichkeit des TEO-Kernmoleküls konnten nun, für die Umsetzung mit dem Azid-Somatostatin 28, beide Ausgangsverbindungen in Wasser gelöst und wieder mit Kupfersulfat und Natriumascorbat umgesetzt werden. Schema 3-43. Synthese des Somatostatin-Trimers via Kernverbindung 43; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, Wasser, RT, 24-48 h. Für die Click-Reaktion wurden wieder die bereits zuvor in Tabelle 6 dargestellten Äquivalentverhältnisse eingesetzt. Allerdings konnten auch hier mittels MALDI-TOF-MSMessungen keine Produktbildung detektiert werden. Trotz der erfolgreichen Darstellung des Dimers scheiterten beide Syntheseversuche der Somatostatin-Trimere, da es nicht möglich war das Azid-Somatostatin mit den beiden KernVerbindungen 41 und 43 zu verknüpfen. Auch die Verbesserung der Wasserlöslichkeit über die zusätzliche Einführung von TEO-Linker im Falle von 43 erzielte keine Änderung. Dass die Umsetzung des Azid-Somatostatins 28 unter ähnlichen Reaktionsbedingungen möglich ist, konnte bereits mehrfach gezeigt werden, wodurch ein Scheitern der Trimer-Synthesen hier grundsätzlich nicht erwartet worden war und daher eine genauere Untersuchung des Reaktionsverhaltens nötig wäre. Anne Pfisterer konnte über ihren Weg zwar die Bildung eines Somatostatin-Trimers nachweisen, jedoch war eine Abtrennung der Nebenprodukte und somit genauere Charakterisierung auch in ihrem Fall nicht möglich. Im nächsten Kapitel wird nun der Einsatz der Somatostatin-Derivate im Hinblick auf die Darstellung stimuli-responsiver Biokonjugate erläutert. Ergebnisse und Diskussion | 137 3.3.2 Darstellung responsiver Somatostatin-Konjugate durch ortsgerichtete, supramolekulare Chemie Neben dem Azid-Somatostatin 28 wurden im Rahmen dieser Arbeit Somatostatin-Derivate hergestellt, welche durch die jeweils eingeführte Plattform in der Lage sind, über den Weg der Selbstorganisation stimuli-responsive, definierte Biokonjugate auszubilden. In diesem Kapitel wird nun näher auf die Reaktionsvielfalt dieser Derivate eingegangen. Begonnen wird dabei beim Aza-Kronenether-Somatostatin 30 und dessen Komplexierung mittels Alkaliionen. Darauffolgend werden vorläufige Ergebnisse bezüglich der Nutzung von 2,2´-Bipyridin-Somatostatin 32 in der übergangsmetallkatalysierten Darstellung von Biokonjugaten vorgestellt. Zum Schluss werden kurz die Reaktionsmöglichkeiten des pHabhängige SHS-PBS-Systems unter Verwendung von SHS-Somatostatin 36 sowie des Boronsäure-Somatostatins 34 erläutert. 3.3.2.1 Komplexierung des Aza-Kronenether-Somatostatins mittels Alkaliionen Bekanntermaßen bilden Kronenether mit Alkaliionen relativ stabile Komplexe aus, welche je nach Größenverhältnis von Ligand zu Ion in 1:1- oder 2:1-Form vorliegen können.[45,46] Hinsichtlich der Komplexierung des Aza-Kronenether-Somatostatins 30 lag das Augenmerk natürlich auf der 2:1-Sandwichform, welche, beim Vorliegen einer Aza-[15]Krone-5, durch Zugabe von Kaliumionen erreicht werden sollte.[52] Schema 3-44. Dimerisierung des Aza-Kronenther-Somatstatins 30; i) Wasser, KI/NaBr in Wasser, RT, 1 h. 138 | Ergebnisse und Diskussion Da Verbindung 30 allerdings nur in sehr geringen Mengen vorlag und im zeitlichen Rahmen der Arbeit nicht in größeren Mengen nachsynthetisiert werden konnte, wurden vorerst nur wenige Testreaktionen durchgeführt. Das Aza-Kronenether-Somatostatin wurde in Wasser gelöst und 0.1, 0.5 sowie 1 Äquivalent K+ in Form einer wässrigen KI-Lösung zugegeben. Die Reaktionen wurden auch mit NaBr wiederholt und jeweils mittels MALDI-MS-Messungen analysiert. Es war allerdings nur eine Detektion des Ausgangsprodukts möglich. Gebildete Komplexe könnten natürlich aufgrund der Lasersbestrahlung während der MALDI-MS-Messungen zerstört worden sein. Bei LC-MSMessungen können, aufgrund der Detektionsgrenze von 2000 g/mol, nur mehrfach geladene Komponenten detektiert werden. Aber auch hier konnten nur Massen des Edukts gefunden werden. Beide Analyse-Methoden stellen keine geeigneten und aussagekräftigen Charakterisierungsmittel dar, da die Komplexbildung nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden konnte. Weitere Untersuchungen waren im Rahmen dieser Arbeit aufgrund der geringen Substanzmenge der Verbindung 30 nicht möglich. Für zukünftige Analysen wären spektroskopische Untersuchungen mittels UV-Vis-Titration besser geeignet, da hierbei eine Komplexbildung oder -veränderung im Spektrum aufgrund einer Änderung des Absorptionsverhaltens der Substanz sichtbar sein sollte. Eine weitere Alternative stellt sicherlich die NMR-Spektroskopie dar, deren Einsatz allerdings durch die Komplexität des Somatostatins sowie der benötigten Substanzmenge limitiert wird. Es sollte jedoch prinzipiell möglich sein, die Komplexierung in Form einer Änderung der chemischen Verschiebung der Signale, beobachten zu können. Ergebnisse und Diskussion | 139 3.3.2.2 Darstellung von Bipyridin-Biokonjugaten mittels Übergangsmetall-Komplexierung In der Natur gibt es viele Beispiele für Metall-gerichtete Protein-Komplexe, wie beispielsweise das Eisen-speichernde Metalloprotein Ferritin.[5] Oft beruhen diese Vorgänge auf nicht-kovalenten aber definierten Bindungen zu Metall-Ionen auch unter physiologischen Bedingungen.[64] Um diese Prozesse besser verstehen und möglicherweise auch kontrollieren zu können, wird versucht, diese Vorgänge zu imitieren und so neuartige Protein-Komplexe durch Selbstassemblierung zu entwickeln. Durch die Verwendung von Proteinen als Liganden im Gegensatz zu kleineren rein organischen Liganden, ergeben sich natürlich gewisse Herausforderungen. Ein Problem stellt die selektive Bindung des Proteins an das Metall dar, besonders bei höheren Metallionen-Konzentrationen. Aufgrund der Größe der Biomoleküle, treten hier nicht vernachlässigbare Wechselwirkungen untereinander auf, wodurch auch das Problem einer Quervernetzung auftreten kann.[146] Um dies zu umgehen, werden oftmals nicht-native Liganden, wie das Bipyridin, verwendet. Da alle metall-koordinierenden nativen Gruppen der Aminosäuren einzähnig sind, kann gerade durch die Verwendung von mehrzähnigen Liganden, eine erhöhte Chelatisierung erreicht werden. Daher sollte nun das 2,2´-Bipyridin-Somatostatin 32 hinsichtlich einer Koordination an ein Übergangsmetall untersucht werden. Dazu wurde eine erste Reaktion mit Verbindung 32 und Rutheniumchlorid durchgeführt, welche im nachfolgenden Schema dargestellt wird. Dies wurde in Zusammenarbeit mit Pascal Heitel im Zuge seiner Masterarbeit untersucht, welche zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit noch nicht fertiggestellt war.[147] Sein Ziel war es, Biomoleküle, welche mit Heterozyklen funktionalisiert worden waren, mittels Komplexbildung zu verknüpfen. Bipyridin-Komplexe sind inzwischen mit nahezu jedem Übergangsmetall bekannt. Da beim Somatostatin ein Einsatz unter physiologischen Bedingungen erwünscht ist, sollte ein nicht-nativ im menschlichen Körper vorkommendes Metall verwendet werden. Die Wahl fiel daher auf Ruthenium. Dessen Komplexe können in Zellen aufgenommen werden und gelten daher als vielversprechende Anti-KrebsTherapeutika.[148] Da zur Komplexbildung normalerweise geheizt werden muss, war die Befürchtung, dass das Somatostatin denaturiert werden könnte. Für die Synthese wurde das Ruthenium-Chlorid im Verhältnis 1:2 zum Bipyridin-Somatostatin 32 zugegeben und das Reaktionsgemisch für 18 h bei 80 °C in Ethanol geheizt. Die Reaktionslösung wurde mittels LC-MS-Messungen untersucht, wobei jedoch nur Verbindung 32 detektiert werden konnte. 140 | Ergebnisse und Diskussion Schema 3-45. Übergangsmetall-Komplexbildung des Bipyridin-Somatostatins 32; i) RuCl3, EtOH, 80 °C, 18 h. Da es sich nur um eine erste Testreaktion handelte, sollten weitere Optimierungen, unter anderem hinsichtlich eines Eisen-Salzes, folgen. Da dieses Vorgehen sehr zeitintensiv ist, jedoch der Aufbau dieser Biokonjugate trotzdem von großem Interesse ist, konnte dies im Rahmen dieser Arbeit nicht weiterverfolgt werden und sollte daher in der Masterarbeit von Pascal Heitel erarbeitet werden. Ein Alternative sollte die Bildung eines Bipyridin-Terpyridin-Komplexes sein, bei welchem das Somatostatin mit dem Protein BSA verknüpft werden sollte. Als Metallsalz sollte dabei Eisenchlorid verwendet werden. Das Terpyridin wurde dazu von Pascal Heitel mit einem Maleimid verknüpft und im Anschluss über die Thiolgruppe der Aminosäure Cystein mit BSA verbunden. Um die Bildung eines bis- oder tris-Bipyridin-Komplexes zu vermeiden, wurde die Terpyridin-BSA-Verbindung zuerst mit einer wässrigen Fe(II)-chlorid-Lösung umgesetzt und erst im Anschluss 32 zugegeben. Die Reaktionslösung wurde bei 37 °C für 24 h gerührt und mit MALDI-MS analysiert. Nach einer ersten Testreaktion konnte noch kein Produkt detektiert werden. Es sollten jedoch Optimierungen hinsichtlich Temperatur und Reaktionsdauer folgen. Die Struktur des möglichen Produkts ist in nachfolgender Abbildung dargestellt. Abbildung 3-40. Mögliches Produkt einer Nickelbasierten Komplexbildung des Bipyridin-Somatostatins 32 und einem Terpyridin, welches zuvor mit einem Molekül BSA verknüpft worden war. Ergebnisse und Diskussion | 141 3.3.2.3 Komplexbildung der Salicyhydroxamsäure- und Boronsäure-Somatostatin- Derivate über die Einstellung des pH-Werts Als letzter Punkt soll hier kurz die pH-abhängige Komplexbildung des SHS-PBS-Systems erläutert werden. Die in Schema 3-46 dargestellte Komplexbildung zwischen den Derivaten 36 und 34, konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgrund der geringen Substanzmengen der beiden Derivate nicht mehr durchgeführt werden, wird hier aber der Vollständigkeit halber aufgeführt. Schema 3-46. Mögliches Somatostatin-Dimer via dem pH-sensitiven SHS-PBS-System. Wie bereits angesprochen, führt die Einstellung des entsprechenden pH-Werts zu einer Komplexbildung aufgrund spezifischer nicht-kovalenter Wechselwirkungen zwischen den beiden Bausteinen Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure. Dabei gilt, liegt der pHWert der Lösung über 7.4, kann eine Komplexbildung stattfinden, fällt der pH-Wert hingegen unter 5.0, kommt es zur Dissoziation der Bausteine. Die Ausbildung des Komplexes kann dabei mittels 1 H-NMR-Spektroskopie beobachtet werden, indem die chemische Verschiebung der an der Komplexbildung beteiligten Protonen analysiert wird. Das acide Amid-Proton sowie das phenolische Hydroxy-Proton der SHS-Verbindung bilden mit dem Bor-Atom einen sechsgliedrigen Ring aus, wodurch die Signale der beiden Protonen im Laufe der Komplexierung verschwinden.[94] Aufgrund der Komplexstabilität kann auch eine Massenbestimmung mittels MALDI-TOF-MS durchgeführt werden. 142 | Zusammenfassung und Ausblick 4 Zusammenfassung und Ausblick Das Ziel dieser Forschungsarbeit war die Darstellung von Somatostatin-Konjugaten, welche mittels eingebauter stimuli-responsiver Plattformen in der Lage sein sollten, definierte Biokonjugate mit sich selbst oder einem komplementären Reaktionspartner auszubilden. Die Synthese besagter Somatostatin-Derivate stellte dabei den zentralen Kern der Arbeit dar und wurde über zwei gegensätzliche Synthesestrategien, welche nachfolgend dargestellt sind, verwirklicht. Schema 4-1. Schematische Darstellung eines Somatostatin-Konjugats, sowie die beiden verfolgten Synthesestrategien grafting onto und grafting from. Begonnen wurde dabei mit einer zweistufigen Route, welche der Methode des grafting onto folgte. Im ersten Schritt beinhaltete dies die Entwicklung der gewünschten InterkalatorVerbindungen, welche anschließend in einem zweiten Schritt mit dem Peptid Somatostatin umgesetzt wurden. Um am Ende eine möglichst breit gefächerte Reaktivität gewährleisten zu können, wurden bei der Wahl der Bausteine Komplexbildner unterschiedlicher Art herangezogen. Ihre Gemeinsamkeit sollte in einem jeweils spezifischen Stimulus liegen, welcher als Antwort eine selbstständige Komplexierung bewirken kann. Unterscheiden sollten sie sich jedoch in der Art der Wechselwirkung, welche die Bildung des entsprechenden Komplexes realisiert. Die Wahl fiel daher auf den Kronenether, das 2,2´Bipyridin sowie den beiden komplementären Reaktanden die Phenylboronsäure und die Salicylhydroxamsäure. Zusammenfassung und Ausblick | 143 Abbildung 4-1. Auswahl der reaktiven Bausteine, welche in die Interkalator-Verbindungen eingeführt worden waren. Der Aufbau der unterschiedlich funktionalisierten Interkalator-Verbindungen erfolgte ausgehend vom sogenannten Bisulfon-Interkalator-Grundgerüst 3, welches strukturell für die Biokonjugation mit Somatostatin notwendig war. Dessen Carboxygruppe stellte den Verknüpfungspunkt zu einem TEO-Linker dar, welcher zum einen als Abstandshalter zwischen dem Bisulfon-Interkalator sowie dem eingeführten Baustein und zum anderen zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit dienen sollte. Der gewählte Diamino-TEO-Linker ermöglichte zusätzlich die einfache Einführung einer Aminogruppe, welche als Ausgangsplattform im Aufbau der weiteren Interkalatoren verwendet wurde. Im Falle des Kronenethers wurde, aufgrund der besseren Zugänglichkeit für Modifikationen, ein Aza-Derivat der [15]Krone-5 eingesetzt. Dieses wurde Säure-funktionalisiert und über zwei Varianten durch Bildung eines Amids mit dem Amino-Interkalator verknüpft. Das 2,2´-Bipyridin wurde ebenfalls vor Verwendung Säure-funktionalisiert. Aus sterischen Gründen wurde ein 4-CarbonsäureDerivat unter Ausführung der Stille-Kreuzkupplung synthetisiert, welches anschließend direkt sowie alternativ über die Zwischenstufe des Säurechlorids mit dem Amino-Interkalator umgesetzt wurde. Die erfolgreichste Synthese war die des Boronsäure-Interkalators, welche über die vollständige Umsetzung des Amino-Interkalators mit einer NHS-aktivierten geschützten Phenylboronsäure verlief. Die Einführung der Salicylhydroxamsäure konnte angesichts des Vorliegens einer Ethinyl-Funktion nicht ausgehend vom Amino-Interkalator durchgeführt werden. Mithilfe eines Diazo-Transfer-Reagenzes wurde daher eine Azidgruppe basierend auf der Aminogruppe des TEO-Linkers hergestellt, welche zum Aufbau weiterer Interkalatoren eingesetzt wurde. Zusätzlich erwies sie sich, im Gegensatz zu den anderen Bausteinen, auch eingebaut in das Somatostatin, als ein reaktiver und einfach adressierbarer Zugangspunkt für Postmodifikationen. Nach Erhalt dieser wertvollen Verbindung wurde, über den Weg der kupferkatalysierten Click-Reaktion, die Salicylhydroxamsäure mit dem Azid-Interkalator verknüpft. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde die Synthese eines weiteren Aza-Kronenether-Interkalators mittels einer analogen Reaktionsweise, jedoch mit wesentlich geringerem Erfolgt, versucht. Insgesamt verliefen die verschiedenen Synthesen 144 | Zusammenfassung und Ausblick aller Interkalatoren sehr erfolgreich. Es war möglich alle ausgewählten Liganden einzubauen und die Strukturen dieser Verbindungen mittels NMR-Spektroskopie vollständig zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass es prinzipiell möglich sein sollte, jegliche Art an funktioneller Gruppe bzw. Baustein mit dem Interkalator-Grundgerüst zu verbinden. Dies spiegelt eine enorme Bandbreite hinsichtlich möglicher unterschiedlicher Reaktionswege als auch vielfältigen Einsatzgebieten wieder. Nach der Interkalatoren-Synthese, stellte die Biokonjugation mit Somatostatin den nächsten Schritt dar. Wie bereits mehrfach angesprochen, handelt es sich dabei um ein zyklisches Peptidhormon, dessen Ringschluss auf der Ausbildung einer Disulfidbindung zwischen den Resten der Aminosäure Cystein beruht. Diese Bindung ermöglichte die spezifische Modifizierung des Peptids über den Weg der Interkalation, ohne dabei die Tertiärstruktur und somit die biologische Aktivität des Somatostatins zu verändern. Diese Art der Biokonjugationsreaktion beruht auf konsekutiven Michael-Additionen, welche über das Bisulfon-Grundgerüst aller synthetisierten Interkalatoren ermöglicht wird. Der Mechanismus der Bisulfon-Biokonjugation/Interkalation ist nachfolgend nochmals kurz aufgeführt.[18] Schema 4-2. Mechanismus der Biokonjugation bzw. Interkalation eines Bisulfons, dargestellt am Beispiel zweier unterschiedlicher Peptide sowie einem Peptid mit intramolekularer Disulfidbrücke. Nach der Optimierung der Reaktionsbedingungen verlief die Durchführung der Interkalation aller Verbindungen nach dem gleichen Schema. Dazu wurde der Interkalator in einem Gemisch aus basischem Phosphatpuffer und Acetonitril gelöst, um so eine der beiden Toulosulfonsäuregruppen abzuspalten und auf diese Weise das zur Reaktion notwendige Michael-Akzeptor-System auszubilden. Das Somatostatin wurde ebenfalls im Phosphatpuffer gelöst und mit dem Reduktionsmittel TCEP zur Spaltung der Disulfidbindung versetzt. Die Reaktionsdauer wurde je nach Interkalator zwischen 24 und 48 h variiert. Die Aufarbeitung Zusammenfassung und Ausblick | 145 erfolgte in allen Fällen mittels HPLC. Auf diese Weise konnten, bis auf das Salicylhydroxamsäure-Derivat, alle Interkalatoren mit einer Ausbeute zwischen 21 und 40% in das Somatostatin interkaliert werden. Um das Reaktionsverhalten der verschiedenen Interkalatoren gegenüber dem Somatostatin besser einordnen zu können, wurden alle Verbindungen unter nahezu identischen Reaktionsbedingungen auch mit dem Tripeptid Glutathion umgesetzt. Dieses Peptid weist ebenfalls eine reaktive Thiolgruppe auf, ist jedoch aufgrund seiner Größe weniger anspruchsvoll hinsichtlich Sterik und Lösungsmitteln. Da das Glutathion keine Ringstruktur aufweist, war es somit möglich, dass zwei Moleküle nacheinander an den Interkalator binden (siehe Vergleichsreaktion konnte eine gewisse Schema 4-2). Anhand dieser Abhängigkeit des Ausgangs der Biokonjugationsreaktion vom eingeführten Baustein des Interkalators festgestellt werden. Denn in allen Reaktionen der fünf verschiedenen Verbindungen verhielt sich die Reaktivität zu Somatostatin und zu Glutathion ähnlich. Das bedeutet, war der Umsatz mit Somatostatin gut, entstand ausschließlich das Zweifach-Glutathion-Addukt. Verhielt sich der Umsatz eher moderat, konnten auch größere Mengen an Einfach-Glutathion-Addukt detektiert werden. Im Falle der Salicylhydroxmsäure, welche so gut wie keine Reaktion mit Somatostatin zeigte, konnte das Zweifach-Addukt nur in geringen Mengen, das Einfach-Addukt jedoch als Hauptprodukt erhalten werden. Die zuvor angestellte Vermutung, dass die Größe des Somatostatins sowie der Ringschluss limitierende Faktoren der Interkalations-Reaktion darstellen, konnte mittels der Vergleichsreaktion mit Glutathion nicht bestätigt werden. Die Verwendung dieser zweistufigen Methode stellte eine interessante und vielfältige Möglichkeit zur Entwicklung der Somatostatin-Konjugate dar. Sie bot den Vorteil, dass Bausteine unterschiedlichster Art, bereits auf der Stufe der Interkalator-Synthese eingeführt werden konnten. Im Grunde ermöglicht dies die Nutzung sämtlicher organischer Synthesewege, da der Aufbau der Interkalatoren großen Spielraum für individuelles Design bietet und im ersten Schritt keine Rücksicht auf die Eigenschaften des zu verwendenden Peptids genommen werden muss. Einzige Bedingung ist dabei, dass der Einbau des Bisulfons ermöglicht werden muss. Bezüglich der Umsetzung mit Somatostatin muss zusätzlich gewährleistet werden, dass eine gewisse Wasserlöslichkeit der Verbindungen vorhanden ist. Auch eine genaue Charakterisierung der Derivate konnte angesichts dieser Syntheseroute ermöglicht werden. Gerade beim Einsatz von Proteinen ist dies, aufgrund der Vielzahl und Vielfalt an Aminosäuren, oft schwierig insbesondere die Struktur genauestens zu 146 | Zusammenfassung und Ausblick analysieren. Da die Interkalatoren jedoch auf rein organischen Molekülen beruhen, kann hier die NMR- Spektroskopie verwendet werden. Die Arbeit mit Peptiden und Proteinen stellt meist auch aufgrund ihres hohen Preises im Einkauf bzw. einer aufwendigen Synthese eine zusätzliche Herausforderung dar. Oft können daher Reaktionsansätze nur im NanomolBereich durchgeführt werden, was sowohl Aufarbeitung als auch Charakterisierung erschwert. Dieses Problem kann jedoch bei diesem ersten Syntheseweg durch die anfangs rein organische Synthese der Interkalatoren zumindest im ersten Schritt einfach umgangen werden. Die zweite Synthesestrategie, welche in dieser Arbeit eingesetzt worden war, folgte der grafting from-Methode (siehe Schema 4-1). Im Vergleich zum vorherigen Weg, wurde hier versucht, ein bereits interkaliertes Somatostatin-Derivat anhand einer funktionellen Gruppe mit dem jeweiligen Bausteinen aus Abbildung 4-1 zu verknüpfen. Nicht-nativ in Aminosäuren vorkommende funktionelle Gruppen erweisen sich, hinsichtlich möglicher Nebenreaktionen, als vorteilhaft für die Postmodifikation von Peptiden bzw. Proteinen. Daher wurde hier auf Ethinyl- und Azidgruppen zurückgegriffen. Angesichts dieser beiden Gruppen fiel die Entscheidung auf die Nutzung der kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition nach Huisgen. Diese Reaktion wurde bereits zuvor erfolgreich in der Synthese zweier Interkalatoren eingesetzt. Leider führte nur die Synthese des Salicylhydroxamsäure-Derivats zum erhofften Produkt, denn sowohl das Aza-Kronenether- als auch das PhenylboronsäureSomatostatin konnten über diesen Syntheseweg nicht dargestellt werden. Die KatalysatorZugabe erfolgte dabei sowohl in Form eines Kupfer(I)-Salzes als auch der in situ-Erzeugung unter Verwendung von Kupfer(II) und dem Reduktionsmittel Natriumascorbat. Limitationen des verwendeten Reaktionswegs lagen hier sicherlich in den komplexierenden Eigenschaften aller beteiligten Reaktanden. Zum einen ist allein das Somatostatin in der Lage, Kupferionen im Rahmen der Aminosäurereste einzuschließen und so der Reaktion zu entziehen. Zum anderen sind gerade der Kronenether sowie die Boronsäure für ihre Komplexe bekannt. Allerdings konnte wiederum auch gezeigt werden, dass sowohl das Somatostatin als auch die Aza-Krone grundsätzlich unter Anwendung der Click-Chemie modifiziert werden können. Die genauen Hintergründe hierzu konnten leider nicht vollständig aufgeklärt werden. Zukünftig wäre hier die Verwendung der kupferfreien Variante der Click-Chemie eine vielversprechende Alternative. Auch gäbe es die Möglichkeit, bestimmte Liganden Zusammenfassung und Ausblick | 147 einzusetzen, welche das Kupfer während der Reaktion stabilisieren und somit eine unerwünschte Komplexbildung unterbinden könnten. Nach der erfolgreichen Synthese der Somatostatin-Derivate, sollte das eigentliche Ziel der Arbeit, die Darstellung definierter, responsiver Biokonjugate unter Verwendung dieser Derivate erreicht werden. Begonnen wurde dabei mit der Entwicklung multivalenter Systeme. Es war versucht worden, symmetrische Dimere und Trimere über das AzidSomatostatin mittels der Click-Chemie aufzubauen. Dabei gelang die Synthese eines Dimers unter Verwendung des Ethinyl-Somatostatins sowie der Click-Chemie ohne Schwierigkeiten, jedoch scheiterten alle Versuche der Synthese eines Trimers. Als symmetrischen Kern der Trimer-Verbindung wurden ein kurzkettiges sowie ein, zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit, mit TEO-Ketten modifiziertes Phenylsystem synthetisiert. Beide Kerne ließen sich allerdings nicht mit dem Azid-Somatostatin verknüpfen. Die Verwendung bereits interkalierter Derivate sollte dabei den gegensätzlichen Aufbau im Vergleich zu bereits veröffentlichten Syntheseversuchen zu multivalenten Somatostatin-Systeme darstellen.[149] Dort wurde die Strategie verfolgt, ein mulitvalentes Linkersystem aufzubauen, welches erst zum Schluss mit dem Somatostatin umgesetzt worden war. Auch diese Versuche führten hauptsächlich aufgrund von Löslichkeitsproblemen nicht zum gewünschten Erfolg. Beide Synthesestrategien weisen bisher noch großen Überarbeitungsbedarf auf und sollten daher möglicherweise über einen anderen Weg versucht werden. Eine vielversprechendere Möglichkeit wäre die Verwendung eines Kernsystems mit Maleimiden, an welchen ein ThiolSomatostatin-Derivat nukleophil angreifen könnte. Die Hoffnung, im Bereich der stimuli-responsiven Konjugat-Bildung, mehr Erfolg vorweisen zu können, konnte bisher leider nicht erfüllt werden. Notwendige, intensive Forschungsarbeit war jedoch im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht mehr umsetzbar. Es war die Bildung eines 2:1 Sandwich-Komplexes des Aza-Kronenether-Somatostatins versucht worden, jedoch konnte dieser nicht nachgewiesen werden. Wie bereits angesprochen wäre hier bei ausreichender Substanzmenge eine Analyse mittels einer UV-Vis-Titration oder der NMR-Spektroskopie sinnvoll. Bei der Umsetzung des Bipyridin-Somatostatins mit einem entsprechenden Übergangsmetall wurden bis jetzt nur erste Testversuche mit Rutheniumchlorid durchgeführt. Weitere Reaktionen, unter anderem auch mit Terpyridinfunktionalisierten Biomolekülen, sollten in der Masterarbeit von Pascal Heitel unternommen 148 | Zusammenfassung und Ausblick werden. Da in der Literatur, gerade auch im biologischen Bereich, bereits viele unterschiedliche Komplexe mit Bipyridinen bekannt sind, zeigen sich hier, bei entsprechender Investition von Zeit und Arbeit, wohl die besten Erfolgsaussichten. Die Verwendung von Peptiden und Proteinen im Hinblick auf chemische Reaktionen, stellt immer eine große Herausforderung dar. Wichtige Eckpunkte wie Temperatur und Lösungsmittel können im Umgang mit Biomolekülen meist nicht groß variiert werden und sind daher, abgesehen vom finanziellen Aspekt, die größten Limitationen dieser Forschung. Bei der Überlegung von Synthesestrategien für Postmodifikationen müssen diese Gesichtspunkte sowie die natürliche Vielfalt an funktionellen Gruppen immer mitberücksichtigt werden, wodurch alternative chemische Reaktionswege oft nicht einfach durchgeführt werden können. Dies traf auch auf die Nutzung von Somatostatin zu, welches in der Forschung aufgrund seiner Eigenschaften oft als Modelpeptid im Hinblick auf die eigentlich gewünschte Verwendung von Proteinen eingesetzt wird. Auch eine fehlende Reproduzierbarkeit von Reaktionsergebnissen beim Somatostatin erschwerte des Öfteren die Weiterentwicklung der Forschungsarbeit. Zum einen wurden Testreaktionen im Nanomol-Bereich ausgeführt und ließen sich bei Wiederholung im größeren Maßstab oftmals nicht mit dem gleichen Ergebnis wiederholen. Zum anderen kam es auch bei exakt gleichen Reaktionsbedingungen teilweise zur Ausfällung des Peptids. Dies sollte auch bei zukünftigen Forschungen am Somatostatin bedacht werden. Nichtsdestotrotz bleibt das Gebiet der Selbstassemblierung von Biokonjugaten weiterhin von großem Interesse. Gerade die Möglichkeit, Komplexbildung bzw. Dissoziation mittels eines spezifischen Reizes steuern zu können, ist heute in unterschiedlichsten Bereichen gefragt. Vor dem Hintergrund der Verwendung von Biomolekülen, wie Peptiden und Proteinen, ist natürlich besonders ein Einsatz im menschlichen Körper hinsichtlich des medikamentösen Wirkstofftransports interessant. Die Natur steuert viele wichtige Prozesse nur über kleinste Stimuli, welche auch in Zukunft ein Vorbild für diese Art der Forschungsarbeit darstellen werden. Gerade das Somatostatin ist, dank der rezeptorvermittelten Zellaufnahme, prädestiniert für diese Forschung, vor allem vor dem Hintergrund der Exprimierung dieser Rezeptoren auf der Oberfläche von Krebszellen. Experimenteller Teil | 149 5 Experimenteller Teil 5.1 Allgemeine Vorbemerkungen 5.1.1 Arbeitstechniken Alle hydrolyseempfindliche Reaktionen wurden unter Schutzgas und mit Hilfe der Schlenktechnik durchgeführt. Als Schutzgas diente Argon der Reinheitsstufe 4.6 (entspricht 99.9996%) der Firma MTI. Sämtliche in diesem Zusammenhang benutzten Lösungsmittel wurden nach jeweiliger Standardmethode getrocknet und über Molsieb gelagert. [150] Zur Reaktionsverfolgung bzw. Kontrolle der Aufreinigung mittels Säulenchromatographie wurde Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Hierzu wurden Kieselgel-beschichtete Aluminiumfolien (Kieselgel 60 F254) der Firma Merck verwendet. Zur Detektion wurden Iod, ethanolische KMnO4-Lösung, ethanolische Ninhydrin-Lösung sowie die Wellenlängen 254 nm und 365 nm herangezogen. Die Säulenchromatographie erfolgte unter Einsatz von Glassäulen unterschiedlichen Durchmessers. Als stationäre Phase wurde Kieselgel 60 (0.040 – 0.063 mm) ebenfalls der Firma Merck verwendet. Als Eluenten wurden unterschiedliche Lösungsmittel mit technischem Reinheitsgrad genutzt. 5.1.2 HPLC-Systeme Präparative HPLC Shimadzu LC-20AP Prominence Säule: Atlantis T3 OBD Prep Column, 5 µm, 19 mm X 100 mm Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10 Lösungsmittel mobile Phase: A (Wasser, 0.1% TFA); B (Acetonitril, 0.1% TFA) Analytische HPLC Dionex P 680 HPLC (Thermo Scientific) Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4 150 | Experimenteller Teil Lösungsmittel mobile Phase: A (Wasser, 0.1% TFA); B (Acetonitril, 0.1% TFA) 5.1.3 Analyse-Geräte/Methoden 1 H-NMR-Spektroskopie 13 C-NMR-Spektroskopie Bruker Avance 400 (400.13 MHz) Bruker Avance 400 (100.62 MHz) Bruker Avance 500 (125.77 MHz) Massenspektrometrie MALDI-TOF-MS: Bruker Daltonics Reflex III MALDI-FTICR-MS: Bruker Solarix FTICR-MS LC-MS: Shimadzu LC-MS 2020 Säule: Gemini 5u C18 110 Å IR-Spektroskopie Bruker, Vektor 22 FT-IR, He-Ne-Laser Software Bruker, Opus NT 2.06 NMR-Spektroskopie Alle Spektren wurden bei 298 K aufgenommen. Als Standard dienten die Signale der verwendeten Lösemittel: Chloroform-d1 (CHCl3): δ = 7.24 ppm und 77.16 ppm Methanol-d4 (MeOD): δ = 3.31 ppm und 49.00 ppm Dimethylsulfoxid-d6 (DMSO): δ = 2.50 ppm und 39.43 ppm Die Angaben zur chemischen Verschiebung beziehen sich auf die δ-Skala in ppm. Die Auswertung der Spektren erfolgte nach 1. Ordnung. Die Kopplungskonstanten J sind in Hertz [Hz], die Signalmuster wie folgt angegeben: s (Singulett), d (Dublett), dd (Dublett vom Dublett), ddd (Dublett vom Dublett vom Dublett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett). Für die spezifische Zuordnung der NMR-spektroskopischen Daten wurden bei einigen Verbindungen APT-, COSY-, HSQC- und HMBC-Experimente durchgeführt. Experimenteller Teil | 151 Massenspektrometrie MALDI Als Matrix der MALDI-TOF- bzw. MALDI-FTICR-MS-Messungen wurden DHB, CHCA und Sinapinsäure verwendet. LC-MS Der Gradient der LC-MS-Messungen begann mit 95% Lösungsmittel B (Wasser, 0.1% FA) und 5% Lösungsmittel A (Acetonitril, 0.1%) und stieg innerhalb von 20 Min auf 95% A und 5% B. Nach 8 Min kehrte dieser innerhalb von 0.1 Min zurück zu 95% B und 5% A. Nach insgesamt 35 Min wurde der Lauf beendet. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 0.4 mL/min. Die Absorption wurde bei 214 nm und 254 nm gemessen. IR-Spektroskopie Die Kennzeichnung der Bandenintensität erfolgte nach s = stark, m = mittel, w = schwach, br = breit. Die Feststoffe wurden als KBr-Pressling vermessen. 5.1.4 Verwendete Chemikalien Alle nachfolgend aufgelisteten Chemikalien wurden käuflich erworben und ohne weitere Aufreinigung in den beschriebenen Reaktionen eingesetzt: 1,4-Dioxan (Merck), 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (Merck), 4-Methylthiophenol (SigmaAldrich), Acetylchlorid (Acros Organics), N,N-Diisopropylethylamine (Merck), (Deuter o), Ditert-butyldicarbonat (Merck), 4-(Dimethylamino)-pyridin (Merck), Formaldehyd (Alfa Aesar), Imidazol (Merck), Kaliumcarbonat (Merck), Kupferbromid (Merck), Kupfer(II)-sulfat wasserfrei (Merck), Magnesiumsulfat (Merck), Natriumascorbat (Alfa Aesar), Natriumazid (Sigma Aldrich), Natriumhydrogencarbonat (Merck), Natriumsulfat (Merck), Oxone® (Sigma Aldrich), Paraformaldehyd (Sigma Aldrich), Piperidine Hydrochlorid (Merck) Salzsäurekonz (VWR Prolabo), Somatostatin (Shanghai Hanhong Chemical Co.), Tris(2- carboxyethyl)phosphin Hydrochlorid (Alfa Aesar), Trifluoressigsäure (Sigma Aldrich), p- 152 | Experimenteller Teil Acetylbenzoesäure (GL Biochem Shanghai), HBTU (Shanghai Hanhong Chemical Co.), 1-Ethyl3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (Shanghai Hanhong Chemical Co.), BOP (GL Biochem Shanghai), Glutathion (AppliChem), Kupfer(I)-iodid (Merck), Trimethylamin (Merck), Oxalylchlorid (Acros Organics), Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) (Sigma Aldrich), Methyl-2-chloropyridin-4-carboxylat n-Butyllithium (Acros, 1-Hydroxybenzotriazol 2.5 M (Sigma (Sigma in Aldrich), Toluol), Aldrich), Brompyridin (Sigma Aldrich), N-Hydroxysuccinimid (Sigma Aldrich), Ethylendiamintetraessigsäure (AppliChem), 4-Pentinsäure (Sigma Aldrich), Dihydropyran-2,6-dion (Sigma Aldrich), 1-Aza-[15]Krone-5 (Sigma Aldrich), N-Boc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamin (Sigma Aldrich). Folgende Lösemittel wurden käuflich erworben: Aceton, Ethylacetat, Ethanol, Methanol, Diethylether, n-Hexan, Dichlormethan, Chloroform, Tetrahydrofuran (alle VWR BDH Prolabo, GPR Rectapur), Dimethylformamid (Sigma), Acetonitril (AppliChem), Dimethylsulfoxid (AppliChem), Chloroform-d1 (Deutero), Dimethylsulfoxid-d6 (Deutero). Methanol-d4 (Deutereo), Experimenteller Teil | 153 5.2 Arbeitsvorschriften In diesem Kapitel wird aufgrund der Übersichtlichkeit das Somatostatin-Molekül, wie nachfolgend abgebildet, nur schematisch dargestellt. 154 | Experimenteller Teil 5.2.1 Mannich-Salz 4-(3-(Piperidin-1-yl)propanoyl)benzoesäure-Hydrochlorid (Carbonsäure-Mannich-Salz)[18] Es wurden 600 mg (3.66 mmol, 1 eq.) p-Acetylbenzoesäure in 5 mL EtOHabs vorgelegt. Hierzu wurden unter 444 mg (3.66 mmol, 1 eq.) Piperidin-Hydrochlorid sowie 329 mg (10.0 mmol, 3 eq.) Paraformaldehyd gegeben. Als letzter Schritt wurden 36 µL (1.18 mmol) Salzsäurekonz dem Gemisch zugefügt und dieses anschließend insgesamt 18 h bei 105 °C unter Rückfluss erhitzt. Nach vier Stunden wurde die Lösung kurzzeitig abgekühlt und weitere 329 mg (10.0 mmol, 3 eq.) Paraformaldehyd hinzugegeben. Der sich bereits während der Reaktionszeit ausgebildete weiße Niederschlag wurde vom Lösungsmittel getrennt, mit Aceton gewaschen und am Vakuum getrocknet. 588 mg (1.97 mmol, 54%) der Verbindung wurden als gelblichweißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.54-1.99 (m, 6H, 1-H, 2-H), 3.05 (m, 2H, 4-H), 3.53-3.57 (m, 2H, 5-H), 3.61-3.68 (m, 4H, 3-H), 8.12-8.18 (m, 4H, 6-H, 7-H). 13 C-NMR (100 MHz, DMSO): δ = 21.41, 22.51, 43.57, 50.94, 52.29, 128.33, 139.40, 134.92, 139.01, 167.68, 197.64. LC-MS: m/z = 262.6 g/mol [M-HCl+H]+, berechnet: [M] = 261.14 g/mol. Experimenteller Teil | 155 5.2.2 Bisulfid 4-(3-(p-Tolylthio)-2-(p-tolylthiomethyl)propanoylbenzoesäure[18] 300 mg (1.01 mmol, 1 eq.) der Verbindung 1 sowie 251 mg (2.01 mmol, 2 eq.) 4Methylthiophenol wurden in einer Mischung aus 3 mL EtOHabs und 3 mL MeOHabs gelöst. Hierzu wurden nacheinander in folgender Reihenfolge 42 µL (39.0 mg, 456 mmol, 0.5 eq.) Piperidin und 300 µL (330 mg, 6.48 mmol, 10 eq.) Formaldehydaqu zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde unter Rückfluss erhitzt. Nach kurzem Abkühlen wurden nochmals 300 µL (330 mg, 6.48 mmol, 10 eq.) Formaldehydaqu zugegeben und die Reaktionslösung für weitere drei Stunden refluxiert. Nach dem die Lösungsmittel entfernt worden waren, wurde der Rückstand in Dichlormethan gelöst und mehrmals mit 1M Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Anschließend wurde das Produkt säulenchromatographisch aufgereinigt, wobei hierzu zuerst reines Dichlormethan zur Entfernung des überschüssigen Methylthiophenols benutzt wurde und danach bis zu 10% Methanol zugefügt wurde. 52 mg (0.12 mmol, 71%) der Verbindung wurden als weißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.34 (s, 6H, 7-H), 3.12-3.26 (m, 4H, 4-H), 3.76-3.82 (m, 1H, 3- H), 7.04 (d, 3J = 8.0 Hz, 2H, 6-H), 7.12 (d, 3J = 8.1 Hz, 2H, 5-H), 7.59 (d, 3J = 8.4 Hz, 2H, 2-H), 8.03 (d, 3J = 8.4 Hz, 2H, 1-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.13, 36.39, 45.93, 128.34, 129.88, 130.29, 131.07, 131.57, 133.00, 137.29, 140.51, 170.50, 200.65. HR-ESI-MS: m/z = 435 g/mol [M-H]+, berechnet: [M] = 436.12 g/mol. 156 | Experimenteller Teil 5.2.3 Bisulfon 4-(3-Tosyl-2-(tosylmethyl)propanoylbenzoesäure[18] Es wurden 500 mg (1.15 mmol, 1 eq.) Bisulfid 2 und 4.25 g (6.85 mmol, 6 eq.) Oxone® vorgelegt. Nach der Zugabe von 10 mL eines Gemisches aus MeOH und H2O (1:1) bildete sich eine weiße Suspension aus, welche 24 h bei RT gerührt wurde. Anschließend wurde das Methanol am Vakuum entfernt, der Rückstand in Wasserdemin verdünnt und mehrmals mit Chloroform gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt als Feststoff erhalten. 851 mg (1.70 mmol, 74%) der Verbindung wurden als weißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.47 (s, 6H, 7-H), 3.46-3.51 (m, 2H, 4-H), 3.59-3.64 (m, 2H, 4- H), 4.37-4.40 (m, 1H, 3-H), 7.35 (d, 3J = 8.1 Hz, 4H, 6-H), 7.70 (m, 3J = 8.2 Hz, 6H, 5-H, 2-H), 8.07 (d, 3J = 8.4 Hz, 2H, 1-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.90, 35.83, 55.79, 128.49, 128.72, 130.37, 130.73, 135.40, 138.28, 142.58, 145.77, 170.29, 195.51. HR-ESI-MS: m/z = 501 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 500.10 g/mol. Experimenteller Teil | 157 5.2.4 Boc-TEO-Linker 1N-Tert-Butoxycarbonyl-4,7,10-trioxa-1,13-triceandiamin[18] 1.00 mL (1.00 g, 4.50 mmol, 2 eq.) 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin wurden in 8 mL 1,4Dioxan vorgelegt. Hierzu wurde unter Rühren über 15 Minuten hinweg langsam eine Lösung aus 508 µL (479 mg, 2.25 mmol, 1 eq.) Di-tert-butyldicarbonat in 7 mL 1,4-Dioxan zugetropft. Die Reaktionslösung wurde 12 h bei RT gerührt und anschließend das Lösungsmittel am Vakuum entfernt. Das Produkt wurde säulenchromatographisch (10% Methanol in Dichlormethan, 1% Ammoniumhydroxid) aufgereinigt und als gelbes Öl mit einer Ausbeute von 43% (620 mg, 1.94 mmol) erhalten. 1 H-NMR (400MHz, CDCl3): δ = 1.42 (s, 9H, 12-H), 1.71-1.76 (m, 4H, 3-H, 10-H), 2.80 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, 2-H), 3.20-3.23 (m, 2H, 11-H), 3.51-3.64 (m, 12H, 4-H-9-H), 5.13 (s, 2H, 1-H). 13 C-NMR (100MHz, CDCl3): δ = 28.57 (13-C), 29.74 (9-C), 33.03 (2-C), 38.57 (10-C), 39.68 (1- C), 69.62 (3-C, 8-C), 70.29/70.33 (4-C, 7-C), 70.68 (5-C, 6-C), 79.03 (12-C), 156.25 (11-C). LC-MS: m/z = 320 g/mol [M]+, berechnet: [M] = 320.23 g/mol. 158 | Experimenteller Teil 5.2.5 Boc-geschützter Amin-Interkalator Tert-Butyl(1-oxo-1-(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)phenyl)-6,9,12-trioxa-2-azapentadecan-15-yl)carbamat 1.00 g (2.00 mmol, 1 eq.) Bisulfon 3 wurden in 5 mL DMFabs gelöst und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Nun wurden 1.21 g (3.19 mmol, 1.6 eq.) HBTU und 663 µL (517 mg, 4.00 mmol, 2 eq.) DIEA zugegeben und für zehn Minuten im Eisbad belassen. Ebenfalls bei 0 °C wurden anschließend 768 mg (2.40 mmol, 1.2 eq.) Boc-TEO-Amin 4 zugefügt und das Reaktionsgemisch langsam auf RT erwärmt und für 24 h gerührt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt worden war, wurde der Rückstand in Chloroform gelöst und mehrmals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie Brine gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Phasen über Magnesiumsulfat wurde das Produkt säulenchromatographisch (3% Methanol in Chloroform) aufgereinigt und 1.02 g (1.27 mmol, 64%) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.36 (s, 9H, 20-H), 1.61–1.67 (m, 2H, 17-H), 1.82–1.88 (m, 2H, 10-H), 2.43 (s, 3H, 1-H), 3.11–3.13 (m, 2H, 18-H), 3.40 (t, 3J = 5.95 Hz, 2H, 16-H), 3.44–3.45 (m, 2H, 15-H), 3.54–3.63 (m, 10H, 9-H, 11-H, 12-H, 13-H, 14-H), 4.29 (s, 4H, 4-H), 5.93/6.19 (s, 2H, 5-H), 7.28–7.31 (m, 2H, 2-H), 7.61–7.66 (m, 2H, 6-H), 7.71–7.73 (m, 2H, 3-H), 7.82– 7.84 (m, 2H, 7-H). Experimenteller Teil | 159 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.70 (1-C), 28.40 (27-C), 28.71 (16-C), 29.58 (23-C), 38.34 (24-C), 39.03 (15-C), 57.65 (6-C), 69.39 (22-C), 70.03 (21-C), 70.22/70.37/70.39/70.56 (17-C20-C), 78.81 (26-C), 127.06 (12-C), 128.26 (4-C), 129.58 (11-C), 129.88/130.17 (3-C), 134.31 (8-C), 135.20/135.93 (5-C), 135.72/135.76 (7-C), 138.31 (10-C), 138.37 (13-C), 145.10/145.54 (2-C), 156.04 (25-C), 166.16 (14-C), 194.23 (9-C). MALDI-TOF-MS: m/z = 804.41 g/mol [M+2H]+, berechnet: [M] = 802.32 g/mol. 160 | Experimenteller Teil 5.2.6 Amin-Interkalator N-(3-(2-(2-(3-Aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)benzamid Es wurden 150 mg (187 µmol, 1 eq.) Boc-Amin-Interkalator 5 in 2 mL DCM gelöst und unter Rühren 137 µL (213 mg, 1.87 mmol, 10 eq.) Trifluoressigsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT gerührt und das Lösungsmittel sowie die überschüssige Trifluoressigsäure am Vakuum entfernt. 131 mg (186 mmol, 99%) der Verbindung wurden als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.84–1.90 (m, 2H, 10-H), 1.94–1.99 (m, 2H, 17-H), 2.41 (s, 3H, 1-H), 3.20–3.25 (m, 2H, 18-H), 3.47–3.55 (m, 4H, 9-H, 11-H), 3.57–3.62 (m, 8H, 12-H, 13-H, 14-H, 15-H), 3.72 (t, 3J = 5.22 Hz, 2H, 16-H), 4.33 (s, 2H, 4-H), 5.96/6.17 (s, 2H, 5-H), 7.33–7.35 (m, 2H, 2-H), 7.59–7.67 (m, 2H, 6-H), 7.69–7.77 (m, 2H, 3-H), 7.83–7.85 (m, 2H, 7-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.74 (1-C), 26.15 (23-C), 29.30 (16-C), 38.01 (15-C), 40.97 (24-C), 57.91 (6-C), 69.04 (17-C), 69.42/69.74/69.80/70.28 (18-C-21-C), 71.01 (22-C), 127.33 (12-C), 128.43 (4-C), 129.78 (11-C), 130.12 (3-C), 134.79 (8-C), 135.01 (5-C), 135.66 (7-C), 137.53 (10-C), 138.98 (13-C), 145.48 (2-C), 167.68 (14-C), 194.50 (9-C). LC-MS: m/z = 702 g/mol [M]+, 547 g/mol [M-C7H8SO2+H]+, berechnet: [M] = 702.26 g/mol. Experimenteller Teil | 161 5.2.7 Säure-funktionalisierter Aza-Kronenether 5-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-5-oxopentinsäure[151] Es wurden 46.0 mg (404 µmol, 1 eq.) Dihydropyran-2,6-dion in 5 mL THFabs gelöst. Unter Rühren wurden 106 mg (484 µmol, 1.2 eq.) 1-Aza-[15]Krone-5 zugegeben und das Reaktionsgemisch für 3 h refluxiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt in Chloroform gelöst, mit 1M Salzsäure extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Es wurden 120 mg (369 µmol, 89%) der Verbindung als farbloses, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.95-2.02 (m, 2H, 2-H), 2.43-2.53 (m, 4H, 1-H, 3-H), 3.51 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, 4-H), 3.56-3.69 (m, 16H, 6-H-13-H), 3.81 (t, 3J =6.7 Hz, 2H, 5-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 20.44 (2-C), 31.99 (1-C), 33.34 (3-C), 49.58 (4-C), 50.57 (13-C), 69.51 (5-C), 69.72 (12-C), 70.08/70.12/70.15/70.36/70.66/71.63 (6-C-11-C), 173.26 (3a-C), 177.08 (1a-C). LC-MS: m/z = 334 g/mol [M]+, 332 g/mol [M-H]-, berechnet: [M] = 333.18 g/mol. 162 | Experimenteller Teil 5.2.8 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante A N-(19-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-15,19-dioxo-4,7,10-trioxa-14azanonadecyl)-4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)benzamid 30.0 mg (90.0 µmol, 1 eq.) der Verbindung 7 wurden in 3 mL DMFabs vorgelegt und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Unter Rühren wurden 54.6 mg (144 µmol, 1.6 eq.) HBTU sowie 29.9 µL (23.3 mg, 180 µmol, 2 eq.) DIEA zugegeben und für zehn Minuten im Eisbad belassen. Im Anschluss wurden ebenfalls bei 0 °C 94.9 mg (135 µmol, 1.5 eq.) Amin-Interkalator 6 zugegeben. Die Reaktionslösung wurde langsam unter Rühren auf RT erwärmt und schließlich für 24 h weiter gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 4 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 6 Min aus 40% B und 60% A und bei 38 Min schließlich aus 65% B und 35% A. Nach 42 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 45 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Die Verbindung wurde mit 39.3 mg (38.6 µmol, 43%) als gelbliches, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.70-1.76 (m, 2H, 16-H), 1.83-1.94 (m, 4H, 9-H, 19-H), 2.21 (t, 3 J = 7.4 Hz, 2H, 20-H), 2.40-2.44 (m, 2H, 18-H), 2.50 (s, 6H, 1-H), 3.21-3.26 (m, 2H, 17-H), 3.47-3.56 (m, 10H, 8-H, 10-H, 15-H, 21-H, 30-H), 3.59-3.66 (m, 24H, 4b-H, 11-H-14-H, 23-H29-H), 3.73-3.80 (m, 4H, 4a-H, 22-H), 4.10-4.16 (m, 1H, 5-H), 7.43 (d, 3J =8.0 Hz, 4H, 2-H), 7.56 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 6-H), 7.62 (d, 3J = 8.3 Hz, 4H, 3-H), 7.80 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 7-H). Experimenteller Teil | 163 13 C-NMR (100 MHz, MeOD): δ = 21.69 (1-C), 22.76 (26-C), 30.33 (15-C), 30.43 (22-C), 33.32 (25-C), 36.42 (27-C), 37.08(7-C), 37.82 (23-C), 38.94(14-C), 50.21 (-C), 51,61 (29-C), 56.42 (6C), 69.90 (21-C), 70.04/70.28 (X-C), 70.89 (30-C), 70.98 (X-C), 71.17 (X-C), 71.21 (16-C), 71.24/71.30/71.38/71.54 (X-C), 128.68 (11-C), 129.50 (4-C), 129.64 (10-C), 131.17 (3-C), 136.64 (5-C), 138.14 (12-C), 140.09 (9-C), 147.13 (2-C), 167.79 (13-C), 175.31 (28-C), 176.00 (24-C), 196.73 (8-C); (X-C): (17-C-20-C, 31-C-38-C). LC-MS: m/z = 1018 g/mol [M+H]+, 1016 g/mol [M-H]-, berechnet: [M] = 1017.43 g/mol. 164 | Experimenteller Teil 5.2.9 Boc-geschützter TEO-Aza-Kronenether Tert-butyl(18-(1,4,7,10-tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa14-azaoctadecyl)carbamat Es wurden 58.0 mg (137 µmol, 1 eq.) N-Boc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamin unter Argonatmosphäre in 4 mL DMFabs gelöst und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Anschließend wurden unter Rühren 66.7 mg (151 µmol, 1.1 eq.) BOP, 19.4 mg (151 µmol, 1.1 eq.) DIEA sowie 1.85 mg (13.7 µmol, 0.1 eq.) HOBT hinzugefügt. Nach zehn Minuten wurden 60.1 mg (274 µmol, 2 eq.) 1-Aza-[15]Krone-5 zugegeben und das Reaktionsgemisch langsam auf RT erwärmt und für 48 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt. 53.7 mg (86.3 µmol, 63%) der Verbindung wurden als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.43 (m, 9H, 1-H), 1.69-1.79 (m, 4H, 3-H, 10-H), 2.47 (t, 3 J =7.0 Hz, 2H, 12-H), 2.68-2.74 (m, 2H, 13-H), 3.12 (t, 3J = 6.8 Hz, 2H, 2-H), 3.25 (t, 3J = 6.8 Hz, 2H, 11-H), 3.49-3.66 (m, 30H, 4-H-9-H, 14-H, 16-H-23-H), 3.80 (t, 3J = 6.2 Hz, 2H, 15-H). 13 C-NMR (100 MHz, MeOD): δ = 28.81 (1-C), 29.71 (5-C), 30.41 (12-C), 30.93 (16-C), 32.11 (15-C), 37.83 (13-C), 38.72 (4-C), 50.34 (18-C), 51.60 (27-C), 69.87 (26-C), 70.04 (19-C), 70.86/71.05/71.21/71.26/71.40/71.57/71.75/72.18 (6-C-11-C, 20-C-25), 79.88 (2-C), 156.32 (3-C), 174.64 (17-C), 174.87 (14-C). LC-MS: m/z = 622 g/mol [M+H]+, 666 g/mol [M+2Na-H]-, berechnet: [M] = 621.38 g/mol. Experimenteller Teil | 165 5.2.10 TEO-Aza-Kronenether N-(3-(2-(2-(3-Aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4-(1,4,7,10-tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-4-oxobutanamid 75.0 mg (121 µmol, 1 eq.) der Verbindung 9 wurden in 3 mL DCM gelöst. Anschließend wurden 92.9 µL (137 mg, 1.21 mmol, 10 eq.) TFA zugegeben und die Reaktionslösung für weitere 18 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel sowie die überschüssige TFA wurden am Vakuum entfernt. Die Verbindung wurde mit 62.9 mg (120 µmol, 99%) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.73-1.78 (m, 2H, 9-H), 1.90-1.95 (m, 2H, 2-H), 2.47 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, 11-H), 2.69-2.74 (m, 2H, 12-H), 3.07-3.13 (m, 2H, 1-H), 3.22-3.27 (m, 2H, 10-H), 3.503.69 (m, 30H, 3-H-8-H, 13-H, 15-H-22-H), 3.79 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, 14-H). 13 C-NMR (100 MHz, MeOD): δ = 28.04 (2-C), 29.60 (9-C), 30.53 (13-C), 31.90 (12-C), 37.72 (10-C), 40.34 (1-C), 50.30 (15-C), 51.40 (24-C), 69.62 (23-C), 70.02 (16-C), 70.50/70.80/70.91/70.99/71.00/71.07/71.23/71.40/71.41/71.68/71.98 (3-C-8-C, 17-C-22-C), 174.77 (14-C), 175.00 (11-C). LC-MS: m/z = 522 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 521.33 g/mol. 166 | Experimenteller Teil 5.2.11 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante B N-(18-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl)-4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)-propanoyl)benzamid Es wurden 44.0 mg (87.8 µmol, 1 eq.) Bisulfon 3 in 4 mL DMFabs gelöst und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Anschließend wurden unter Rühren 52.8 mg (139 µmol, 1.6 eq.) HBTU sowie 22.4 mg (174 µmol, 2 eq.) DIEA zugegeben. Nach etwa zehn Minuten wurden ebenfalls bei 0 °C 50.4 mg (96.6 µmol, 1.1 eq.) der Verbindung 10 hinzugefügt und das Reaktionsgemisch langsam auf RT erwärmt und für 24 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch zuerst säulenchromatographisch (5% Methanol in Chloroform) und anschließend via präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 10 Min aus 45% B und 55% A und bei 38 Min schließlich aus 52% B und 48% A. Nach 40 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 45 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Es wurden 21.9 mg (21.8 µmol, 25%) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.69-1.75 (m, 2H, 16-H), 1.89-1.95 (m, 2H, 9-H), 2.48 (s, 6H, 1- H), 2.58-2.63 (m, 2H, 18-H), 2.76-2.79 (m, 2H, 19-H), 3.28-3.33 (m, 2H, 17-H), 3.45-3.52 (m, 10H, 8-H, 10-H, 15-H, 20-H, 29-H), 3.55-3.69 (m, 26H, 4-H, 11-H-14-H, 22-H-28-H), 3.78 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, 21-H), 4.32-4.39 (m, 1H, 5-H), 7.36 (dd, 3J = 7.2 Hz 4H, 2-H), 7.41 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 6-H), 7.66 (dd, 3J = 8.4 Hz, 2H, 7-H), 7.70-7.72 (m, 4H, 3-H). Experimenteller Teil | 167 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.65, 30.33, 30.39, 35.55, 37.12, 37.17, 38.94, 39.81, 51.62, 56.34, 71.01, 71.20, 71.31, 71.38, 71.54, 71.56, 71.64, 71.72, 72.13, 128.33, 129.53, 129.56, 129.64, 129.74, 131.34, 131.36, 136.78, 142.54, 147.11, 147.13, 167.29, 175.35, 181.83, 196.51. LC-MS m/z = 1004 g/mol [M+H]+, 503 g/mol [M+H]2+, berechnet: [M] = 1003.42 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 1004.42 g/mol [M+H]+, 1026.41 g/mol [M+Na]+, 1042.39 g/mol [M+K]+, berechnet: [M] = 1003.42 g/mol. 168 | Experimenteller Teil 5.2.12 Lithiiertes/Stannyliertes Pyridin 2-(Trimethylstannyl)-pyridin[152,153] Unter Argonatmosphäre wurden 500 mg (3.16 mmol, 1 eq.) 2-Brompyridin in 5 mL THFabs gelöst. Diese Reaktionslösung wurde mit Hilfe eines Aceton-Trockeneisbads auf -78 °C abgekühlt und langsam tropfenweise 1.30 mL (3.16 mmol, 1 eq.) einer 2.5M n-BuLi-Lösung (2.5 M in Toluol) zugegeben, woraufhin sich die Lösung zuerst braun grünlich und schließlich schwarz verfärbte. Nach dem Zutropfen wurde die Lösung 1 h bei -78 °C weitergerührt. In einem 10 mL Rundhalskoben wurden unter Argonatmosphäre 693 mg (3.48 mmol, 1.1 eq.) Trimethylzinnchlorid in 2 mL THFabs gelöst und zum vorherigen Reaktionsgemisch bei -78 °C zugegeben. Diese Lösung wurde weitere 1.5 h gerührt und dabei langsam auf RT erwärmt. Anschließend wurde das Lösungsmittel am Vakuum entfernt und die Entstehung des Produkts mittels 1H-NMR-Untersuchungen des Reaktionsgemisches nachgewiesen. Auf weitere Aufarbeitungsschritte wurde aufgrund der hohen Toxizität der Stannylverbindung verzichtet. Experimenteller Teil | 169 5.2.13 Methylester-funktionalisiertes 2,2´Bipyridin 2,2'-Bipyridin-4-methylester[152,153] 764 mg (3.16 mmol, 1 eq.) 2-(Trimethylstannyl)-pyridin 12 wurden unter Argonatmosphäre in 10 mL Dioxanabs vorgelegt. Hierzu wurden unter Rühren 183 mg (158 µmol, 0.05 eq.) Pd(PPh3)4 sowie 651 mg (3.79 mmol, 1.2 eq.) 2-Chloropyridin-4-methylester zugegeben und die Reaktionsmischung unter Reflux 18 h erhitzt, woraufhin sich die Lösung schwarz verfärbte. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt. Es wurden 237 mg (1.11 mmol, 35%) der Verbindung als gelb-braunes Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.97 (s, 3H, 1-H), 7.34-7.37 (m, 1H, 5-H), 7.82-7.88 (m, 2H, 2- H, 6-H), 8.42 (dt, 3J = 7.9 Hz, 3J = 1.0 Hz, 1H, 4-H), 8.72-8.74 (m, 1H, 3-H), 8.83 (dd, 3J = 5.0 Hz, 1H, 7-H), 8.94 (s, 1H, 8-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 52.63, 120.41, 121.26, 122.79, 124.16, 137.09, 138.51, 149.44, 149.93, 155.33, 157.38, 165.71. 170 | Experimenteller Teil 5.2.14 Säure-funktionalisiertes 2,2´-Bipyridin 2,2'-Bipyridin-4-carbonsäure[154] 20.0 mg (93.4 µmol) 2,2'-Bipyridin-4-methylester 13 wurden in 3 mL heißem MeOH gelöst. Hierzu wurden langsam 3 mL 1N Natronlauge gegeben und die Reaktionslösung bei RT 5 h gerührt. Nach dem Entfernen des Methanols am Vakuum wurde die wässrige Phase mittels 1M Salzsäure auf pH 4 eingestellt und im Eisbad abgekühlt. Hierdurch bildete sich weißer Niederschlag aus, welcher abfiltriert und am Vakuum getrocknet wurde. 3.74 mg (18.7 µmol, 20%) der Verbindung wurden als weißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.51 (ddd, 3J = 7.5 Hz, 3J = 4.8 Hz, 4J = 1.0 Hz, 1H, 5-H), 7.87 (dd, 3 J = 4.9 Hz, 4J = 1.4 Hz, 1H, 2-H), 7.99 (ddd, 3J = 7.8 Hz, 4J = 1.6 Hz, 1H, 6-H), 8.42 (d, 3J = 7.9 Hz, 1H, 7-H), 8.73 (dd, 3J = 4.1 Hz, 1H, 4-H), 8.83 (s, 1H, 1-H), 8.88 (d, 3J = 4.9 Hz, 1H, 3-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 119.49 (6-C), 120.68 (8-C), 123.07 (3-C), 124.76 (10-C), 137.67 (9-C), 139.43 (2-C), 149.49 (11-C), 150.49 (4-C), 154.35(7-C), 156.32 (5-C), 166.13 (1C). Experimenteller Teil | 171 5.2.15 2,2´-Bipyridin-Säurechlorid 2,2'-Bipyridin-4-carbonsäurechlorid 40.0 mg (200 mmol, 1 eq.) (2,2'-Bipyridin)-4-carbonsäure 14 wurden unter Argonatmosphäre in 3 mL THFabs gelöst. 50.8 mg (400 mmol, 2 eq.) Oxalylchlorid wurden ebenfalls unter Argonatmosphäre in 2 mL THFabs gelöst und der ersten Reaktionslösung langsam zugegeben. Anschließend wurde dem Gemisch ein Tropfen DMFabs zugefügt und für 3 h refluxiert, woraufhin sich ein dunkelvioletter Niederschlag bildete. Nach dem Abkühlen auf RT wurde das Lösungsmittel am Vakuum entfernt und ohne weitere Reinigungsschritte weiterverwendet. 43.6 mg (200 mmol, 100%) der Verbindung wurden als schwarzdunkelgrauer Feststoff erhalten. Aufgrund der Hydrolyseempfindlichkeit des Säurechlorids wurde dieses ohne weitere Charakterisierung sofort weiter umgesetzt. 172 | Experimenteller Teil 5.2.16 2,2´-Bipyridin-Interkalator N-(1-Oxo-1-(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)phenyl)-6,9,12-trioxa-2-azapentadecan15-yl)-[2,2'-bipyridin]-4-carboxamid Variante A Es wurden 20.0 mg (99.9 µmol, 1 eq.) (2,2'-Bipyridin)-4-carbonsäure 14 unter Argonatmosphäre in 3 mL DMFabs vorgelegt und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Unter Rühren wurden 23.0 mg (120 µmol, 1.2 eq.) EDC, 1.46 mg (12.0 µmol, 0.12 eq.) DMAP sowie 17.3 µL (12.1 mg, 120 µmol, 1.2 eq.) Triethylamin zugegeben und für zehn Minuten im Eisbad belassen. Anschließend wurden bei 0 °C 84.3 mg (120 µmol, 1.2 eq.) Amin-Interkalator 6 hinzugefügt und das Reaktionsgemisch langsam auf RT erwärmt und für weitere 24 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Chloroform gelöst und mit Natriumhydrogencarbonat sowie Brine gewaschen. Daraufhin wurde das Produkt säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt. 32.3 mg (36.5 µmol, 37%) der Verbindung wurden als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. Variante B In einem 50 mL Rundhalskolben wurden unter Argonatmosphäre 70.0 mg (99.5 µmol, 1 eq.) Amin-Interkalator 6 sowie 43.4 mg (199 µmol, 2 eq.) Bipyridin-Säurechlorid 15 in THFabs gelöst und mit 43.1 µL (30.1 mg, 298 µmol, 3 eq.) Triethylamin versetzt. Die Reaktionslösung wurde 3h bei RT gerührt und anschließend für weitere 3 h refluxiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels am Vakuum wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst mit Natriumhydrogencarbonat sowie Wasserdemin extrahiert. Anschließend wurde das Produkt Experimenteller Teil | 173 säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt. Es wurden 40.3 mg (45.5 mmol, 47%) der Verbindung als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.81-1.87 (m, 4H, 9-H, 16-H), 2.44 (s, 6H, 1-H), 3.43-3.65 (m, 20H, 4-H, 8-H, 10-H-15-H, 17-H), 4.31-4.36 (m, 1H, 5-H), 7.26-7.33 (m, 5H, 21-H, 2-H), 7.49 (t, 3 J = 5.0 Hz, 1H, 8a), 7.54 (t, 3J = 5.0 Hz, 1H, 17a), 7.62-7.66 (m, 6H, 7-H, 3-H), 7.72 (t, 3J = 5.1 Hz, 4J = 1.7 Hz, 1H, 24-H), 7.78-7.86 (m, 3H, 6-H, 20-H), 8.37 (d, 3J = 8.0 Hz, 1H, 19-H), 8.62 (d, 3J = 4.7 Hz, 1H, 22-H), 8.66 (s, 1H, 18-H), 8.73 (d, 3J = 4.9 Hz, 1H, 23-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.83 (1-H), 28.75 (22-C), 28.87 (15-C), 35.56 (7-C), 39.00 (23- C), 39.29 (14-C), 55.65 (6-C), 70.23/70.30/70.43/70.48/70.76 (16-C-21-C), 117.97 (26-C), 121.36 (28-C), 121.77 (34-C), 124.27 (30-C), 127.74 (10-C), 128.35 (11-C), 128.74 (4-C), 130.30 (3-C), 135.36 (5-C), 136.11 (12-C), 137.20 (29-C), 139.73 (9-C), 143.11 (25-C), 145.69 (2-C), 149.28 (31-C), 150.08 (33-C), 155.44 (27-C), 156.86 (32-C), 165.58 (24-C), 165.97 (13C), 195.35 (8-C). LC-MS: m/z = 885 g/mol [M+H]+, 444 g/mol [M+H]2+, berechnet: [M] = 884.31 g/mol. 174 | Experimenteller Teil 5.2.17 Geschützter Boronsäure-Interkalator 4-(5,5-Dimethyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)-N-(1-oxo-1-(4-(3-tosyl-2-(tosyl-methyl)propanoyl)phenyl)-6,9,12-trioxa-2-azapentadecan-15-yl)-benzamid Unter Argonatmosphäre wurden 22.0 mg (69.8 µmol, 1.2 eq.) NHS-aktivierte Boronsäure (1(4-(5,5-dimethyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)benzoyl)pyrrolidine-2,5-dion) in DMFabs gelöst und mit 40.9 mg (58.2 µmol, 1 eq.) Amin-Interkalator 6 versetzt. Anschließend wurden 18.2 µL (13.5 mg, 0.105 mmol, 1.5 eq.) DIEA zugegeben und das Reaktionsgemisch für 24 h bei RT gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), erreichte bei 40 Min 95% B und 5% A und verlief für weitere 3 Min konstant. Bei insgesamt 46 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Das Produkt konnte mit 48.7 mg (52.96 µmol, 91%) als farbloses, hochviskoses Öl erhalten werden. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.28 (s, 6H, 21-H), 1.83-1.85 (m, 4H, 9-H, 16-H), 2.45 (s, 6H, 1- H), 3.44-3.63 (m, 24H, 4-H, 20-H, 8-H, 10-H-15-H, 17-H), 4.35-4.38 (m, 1H, 5-H), 7.32-7.34 (d, 3 J = 8.2 Hz, 4H, 2-H), 7.47 (t, 3J = 4.9 Hz, 1H, -NH), 7.60-7.65 (m, 8H, 3-H, 7-H, 19-H), 769-7.71 (d, 3J = 7.8 Hz, 4H, 6-H, 18-H). LC-MS: m/z = 851 g/mol [M-SG+H+]+, 895 g/mol [M-SG+2Na]+, berechnet: [M-SG] = 850.30 g/mol (Aufgrund von FA im Lösungsmittel war nur die entschützte Masse nachweisbar). Experimenteller Teil | 175 5.2.18 Boronsäure-Interkalator (4-((1-Oxo-1-(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)phenyl)-6,9,12-trioxa-2-azapentadecan15-yl)carbamoyl)phenyl)boronsäure In einem 5 mL Rundhalskolben wurden 12.0 mg (13.1 µmol, 1 eq.) geschützter BoronsäureInterkalator 17 in 2 mL CHCl3 gelöst und unter Rühren 10.0 µL (14.9 mg, 131 µmol, 10 eq.) Trifluoressigsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 24 h bei RT gerührt und anschließend das Lösungsmittel sowie die überschüssige Trifluoressigsäure am Vakuum entfernt. 11.0 mg (13.0 mmol, 99%) der Verbindung wurden als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.83-1.85 (m, 4H, 9-H, 16-H), 2.46 (s, 6H, 1-H), 3.49–3.62 (m, 20H, 4-H, 8-H, 10-H-15-H, 17-H), 4.34-4.39 (m, 1H, 5-H), 7.34 (d, 3J = 8.2 Hz, 4H, 2-H), 7.51 (t, 3 J = 4.9 Hz, 1H, -NH), 7.62-7.67 (m, 8H, 3-H, 7-H, 19-H), 7.74 (d, 3J = 7.8 Hz, 4H, 6-H, 18-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.82 (1-C), 28.83/31.25 (15-C/22-C), 35.49 (7-C) 38.82/38.95 (14-C/23-C), 55.74 (6-C), 69.90/69.95 (16-C/21-C), 70.04/70.06/70.18/70.25 (17-C-20-C), 126.29 (26-C), 127.86 (10-C), 128.32/128.83 (4-C/11-C), 130.41 (3-C), 134.30 (27-C), 135.22 (25-C), 135.61 (28-C), 135.76 (5-C), 136.33 (12-C), 139.17 (9-C), 145.93 (2-C), 167.03/168.60 (13-C/24-C), 195.42 (8-C). LC-MS: m/z = 851 g/mol [M+H]+, 895 g/mol [M+2Na]+, berechnet: [M] = 850.30 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 851.31 g/mol [M+H]+, 969.31 g/mol [M+DHB-2H2O]+, berechnet: [M] = 850.30 g/mol. 176 | Experimenteller Teil 5.2.19 Azido-Transfer-Agent Imidazol-1-sulfonylazid Hydrochlorid[155] Unter Rühren wurden 500 mg (7.69 mmol, 1 eq.) Natriumazid in 8 mL ACN gelöst und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 622 µL (7.69 mmol, 1 eq.) Sulfurylchlorid langsam hinzugetropft, woraufhin sich die Lösung milchig-weiß eintrübte. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf RT erwärmt und für weitere 24 h gerührt. Wieder unter Eiskühlung wurden in kleinen Portionen insgesamt 1.05 g (15.4 mmol, 2 eq.) Imidazol zugegeben. Nach dem sich das Gemisch unter Rühren auf RT erwärmt hatte, wurde es für weitere drei Stunden gerührt, woraufhin sich die Suspension gelblich verfärbte. Nach dem das Lösungsmittel entfernt worden war, wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst und mehrmals mit Wasserdemin sowie mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wurde eine eisgekühlte Lösung aus 800 µL (11.0 mmol) Acetylchlorid in 2.8 mL Ethanolabs langsam zu der ebenfalls eisgekühlten organischen Phase hinzugetropft, woraufhin sich weißer Niederschlag ausbildete. Nach kurzer Zeit wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Rückstand mehrmals mit eiskaltem Ethylacetat gewaschen. 1.02 g (4.96 mmol, 63%) der Verbindung wurden als weißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400MHz, MeOD): δ = 7.80 (dd, 1H, 2-H), 8.21 (dd, 1H, 1-H), 9.75 (dd, 1H, 3-H). 13 C-NMR (100MHz, MeOD): δ = 127.61 (1-C), 135.29 (2-C), 145.60 (3-C). HR-ESI-MS: m/z = 173.9 g/mol [M-HCl+H]+, berechnet: [M-HCl] = 173.00 g/mol. Experimenteller Teil | 177 5.2.20 Boc-geschützter Azid-TEO-Linker Tert-Butyl (3-(2-(2-(3-azidopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamat [155] Unter Rühren wurden 180 mg (562 µmol, 1 eq.) der Verbindung 4, 176 mg (843 µmol, 1.5 eq.) Imidazole-1-Sulfonylazide 19 sowie 38.8 mg (281 µmol, 0.5 eq.) Kaliumcarbonat in 10 mL MeOHabs gelöst. 0.90 mg (5.62 µmol, 0.01 eq.) Kupfer(II)-sulfat wurde in Wasserdemin gelöst und ebenfalls der Reaktionslösung hinzugefügt und diese 24 h bei RT gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Wasserdemin gelöst und mehrmals mit Ethylacetat gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit 1M Salzsäure gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Produkt konnte säulenchromatographisch (n-Hexan:EA = 2:1) aufgereinigt werden. 140 mg (406 µmol, 72%) der Verbindung wurden als gelbes hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (s, 9H, 11-H), 1.73-1.76 (m, 2H, 9-H), 1.82-1.85 (m, 2H, 2- H), 2.92-2.95 (m, 2H, 1-H), 3.20-3.25 (m, 2H, 10-H), 3.52-3.68 (m, 12H, 3-H-8-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 28.59 (13-C), 29.82 (9-C), 30.96 (2-C), 38.50 (10-C), 39.87 (1- C), 69.46 (8-C), 69.88 (3-C), 70.16/70.21/70.44/70.64 (4-C, 5-C, 6-C, 7-C), 79.13 (12-C), 156.38 (11-C). LC-MS: m/z = 347 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 346.22 g/mol. 178 | Experimenteller Teil 5.2.21 Azid-TEO-Linker 3-(2-(2-(3-Azidopropoxy)ethoxy)ethoxy)propan-1-amin[156] Es wurden 30.0 mg (86.7 µmol, 1 eq.) Boc-geschütztes TEO-Amin 20 in 1 mL DCM gelöst und unter Rühren 64 µL (98.8 mg, 867 µmol, 10 eq.) Trifluoressigsäure hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel sowie die überschüssige Trifluoressigsäure am Vakuum entfernt und das Produkt als gelbes hochviskoses Öl mit einer Ausbeute von 95% (20.3 mg, 82.4 µmol) erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.78-187 (m, 2H, 2-H), 1.93-1.97 (m, 2H, 9-H), 3.23-3.27 (m, 2H, 1-H), 3.37 (t, 3J =6.4 Hz, 2H, 10-H), 3.54-3.67 (m, 10H, 3-H-7-H), 3.75 (t, 3J=5.3 Hz, 2H, 8H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 25.98 (9-C), 28.47 (2-C), 40.93 (10-C), 48.42 (1-C), 68.31/69.35/69.72/69.89/69.97/70.80 (3-C-8-C). FT-IR (KBr): ν̃ [cm-1] = 3371 (br), 2927 (s), 2868 (s), 2354 (w), 2095 (s), 1713 (s), 1517 (s), 1456 (m), 1371 (m), 1366 (s), 1252 (s), 1173 (s), 1124 (s), 1024 (w), 982 (w), 862 (w), 781 (w), 668 (w), 559 (w). LC-MS: m/z = 247 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 246.17 g/mol. Experimenteller Teil | 179 5.2.22 Azid-Bisulfid-Interkalator N-(3-(2-(2-(3-Azidopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4-(3-(p-tolylthio)-2((ptolylthio)methyl)propanoyl)benzamid Unter Argonatmosphäre wurden 266 mg (609 µmol, 1 eq.) Bisulfid 2 in 3 mL DMFabs gelöst und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Hierzu wurden unter Rühren 123 µL (157mg, 1.22 mmol, 2 eq.) DIEA und 369 mg (974 µmol, 1.6 eq.) HBTU gegeben und für zehn Minuten im Eisbad belassen. Anschließend wurden dem Reaktionsgemisch bei 0 °C 150 mg (609 µmol, 1 eq.) Azid-TEO-Amin 21 hinzugefügt, langsam auf RT erwärmt und für 24 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels am Vakuum wurde der Rückstand in Dichlormethan gelöst, mehrmals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie Brine gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend säulenchromatographisch (EA:n-Hexan= 1:1) aufgereinigt. Die Verbindung wurde mit 284 mg (426 mmol, 70%,) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.74-1.80 (m, 2H, 2-H), 1.87-1.92 (m, 2H, 9-H), 2.34 (s, 6H, 17- H), 3.10-3.25 (m, 4H, 14-H), 3.31 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, 1-H), 3.43-3.49 (m, 4H, 3-H, 4-H), 3.563.67 (m, 10H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 10-H), 3.74-3.81 (m, 1H, 13-H), 7.04 (dd, 3J = 8.0 Hz, 4H, 16H), 7.11-7.13 (m, 4H, 15-H), 7.34 (t, 1H, NH), 7.58 (dd, 3J = 8.5 Hz, 2H, 12-H), 7.75 (dd, 3J = 8.5 Hz, 2H, 11-H). 180 | Experimenteller Teil 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.19 (23-C), 28.74 (9-C), 29.09 (2-C), 36.47 (18-C), 39.31 (10- C), 45.62 (17-C), 48.46 (1-C), 67.97 (3-C), 70.28 (4-C), 70.36/70.47 (6-C, 7-C), 70.48 (5-C), 70.89 (8-C), 127.34 (13-C), 128.55 (14-C), 129.94 (21-C), 131.19 (19-C), 131.57 (20-C), 137.30 (22-C), 138.52 (15-C), 138.91 (12-C), 166.21 (11-C), 200.45 (16-C). MALDI-TOF-MS: m/z = 665.36 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 664.88 g/mol. Experimenteller Teil | 181 5.2.23 Azid-Interkalator N-(3-(2-(2-(3-Azidopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)-propanoyl)benzamid Es wurden 130 mg (196 µmol, 1 eq.) Azid-TEO-Bisulfid 22 und 721 mg (1.17 mmol, 6 eq.) Oxone® in einem 50 mL Rundhalskolben vorgelegt. Hierzu wurden 5 mL eines Gemischs aus Methanol und Wasser (1:1) gegeben und die milchige Suspension für 48 Stunden bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittelgemisch größtenteils am Vakuum entfernt, der verbliebene Rückstand in Wasserdemin verdünnt und mehrmals mit Chloroform gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Phase wurde das Lösungsmittel am Vakuum entfernt und das Produkt mit 128 mg (177 µmol, 90%) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.75-1.81 (m, 2H, 2-H), 1.88-1.94 (m, 2H, 9-H), 2.48 (s, 6H, 17- H), 3.32 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, 1-H), 3.45-3.52 (m, 6H, 3-H, 4-H, 14b-H), 3.59-3.69 (m, 12H, 5-H-8H, 10-H, 14a-H), 4.31-4.38 (m, 1H, 13-H), 7.36 (d, 3J = 8.0 Hz, 4H, 16-H), 7.64-7.69 (m, 6H, 15H, 12-H), 7.80 (d3J = 6.7 Hz, 2H, 11-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.89 (23-C), 28.71 (9-C), 29.12 (2-C), 35.66 (17-C), 39.49 (10- C), 48.52 (1-C), 55.68 (18-C), 67.99 (3-C), 70.32/70.45/70.53 (8-C)/70.57/71.02 (4-C-7-C), 182 | Experimenteller Teil 127.73 (13-C), 128.44 (20-C), 128.79 (14-C), 130.34 (21-C), 135.54 (19-C), 136.18 (12-C), 139.76 (15-C), 145.71 (22-C), 165.96 (11-C), 195.33 (16-C). FT-IR (KBr): ν̃ [cm-1] = 3371 (br), 3047 (w), 2921 (s), 2866 (s), 2355 (w), 2095 (s), 1664 (s), 1652 (s), 1596 (s), 1538, 1494 (m), 1451 (m), 1404 (m), 1303 (s), 1141 (s), 1086 (s), 968 (m), 928 (m), 860 (m), 814 (m), 740 (m), 667 (m), 571 (s), 518 (s). LC-MS: m/z = 729.65 g/mol [M+H]+, berechnet [M] = 728.88 g/mol. Experimenteller Teil | 183 5.2.24 Salicylhydroxamsäure-Interkalator N-2-Dihydroxy-4-(3-(1-(1-oxo-1-(4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)-phenyl)-6,9,12trioxa-2-azapentadecan-15-yl)-1H-1,2,3-triazol-5-yl)-propanamido)benzamid Es wurden 9.00 mg (18.3 µmol, 1 eq.) 2-Hydroxy-4-(pent-4-inamido)-N-(trityloxy)-benzamid und 20.0 mg (27.5 µmol, 1.5eq) Azid-Interkalator 23 in 3 mL THFabs gelöst. In einem weiteren Reaktionsgefäß wurden 8.76 mg (54.9 µmol, 3 eq.) Kupfer(II)-sulfat sowie 5.44 mg (27.5 µmol, 1.5 eq.) Natriumascorbat in jeweils 1.5 mL Wasserdemin gelöst und anschließend vereinigt, wodurch sich die Lösung aufgrund der Reduktion des Kupfers langsam von dunkelbraun zu hellbeige verfärbte. Im Anschluss wurden die beiden Reaktionslösungen vereinigt und bei RT für 24 h gerührt. Nach dem destillativen Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde das Gemisch säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt und 13.4 mg (11.0 µmol, 60%) als gelber, zäher Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.87-1.90 (m, 2H, 9-H), 2.0-2.03 (m, 2H, 16-H), 2.46 (s, 6H, 1- H), 2.65-2.71 (m, 2H, 20-H), 2.98-3.06 (m, 2H, 19-H), 3.24-3.28 (m, 2H, 15-H), 3.40-3.50 (m, 4H, 4a-H, 10-H), 3.54-3.66 (m, 12H, 4b-H, 8-H, 11-H-14-H), 4.31-4.39 (m, 3H, 5-H, 17-H), 6.926.98 (m, 1H, 22-H), 7.06 (s, 1H, 21-H), 7.28-7.37 (m, 14H, 2-H, 18-H, 24-H, 26-H), 7.48-7.50 (m, 6H, 25-H), 7.63-7.66 (m, 5H, 7-H, 3-H, 23-H), 7.76 (d, 3J = 8.3 Hz, 2H, 6-H). 184 | Experimenteller Teil 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.27 (26-C), 21.88 (1-C), 28.81 (15-C), 30.16 (22-C), 35.46 (7- C), 36.43 (27-C), 39.28 (14-C), 45.44 (23-C), 47.11 (-C), 55.76 (6-C), 67.12 (21-C), 70.21 (16-C), 70.40, 70.45, 70.51, 70.55, 70.76 (17-C-20-C), 93.36 (36-C), 107.64 (30-C), 110.42 (34-C), 111.12 (32-C), 122.40 (24-C), 127.82 (40-C), 128.03 (38-C), 128.17 (10-C), 128.36 (4-C), 128.42 (11-C), 128.78/129.06 (39-C), 130.13 (33-C), 130.39 (3-C), 135.35 (5-C), 136.16 (12-C), 139.74 (9-C), 141.98 (37-C), 143.57 (29-C), 145.83 (2-C), 146.23 (25-C), 162.71 (31-C), 166.21 (13-C), 166.53 (35-C), 171.09 (28-C), 195.64 (8-C). MALDI-FTICR-MS: m/z = 976 g/mol [M-Trt]+, 998 g/mol [M-Trt+Na]-, 1242 g/mol [M+Na]+, berechnet: [M] = 1219.43 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 842 g/mol [M(-C7H8SO2)-Trt+Na]+, 1062 g/mol [M(-C7H8SO2)-H]+, 1086 g/mol [M(-C7H8SO2)+Na]+, berechnet: [M(-C7H8SO2)] = 1063.22 g/mol. Experimenteller Teil | 185 5.2.25 NHS-aktivierte Pentinsäure 2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl-pent-4-ynoat[157] Unter Argonatmosphäre wurden 1.00 g (10.2 mmol, 1 eq.) 4-Pentinsäure und 1.41 g (12.3 mmol, 1.2 eq.) NHS in 35 mL DCMabs vorgelegt. Unter Rühren wurden 2.34 g (12.2 mmol, 1.2 eq.) EDC sowie 150 mg (1.22 mmol, 0.12 eq.) DMAP hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT gerührt. Im Gegensatz zur Literatur wurde das Produktgemisch nach dem Entfernen des Lösungsmittels sofort säulenchromatographisch über Silicagel (Ethylacetat:n-Hexan = 1:1) aufgereinigt. Es wurden 1.67 g (8.57 mmol, 84%) als weißer Feststoff erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.05 (t, 4J = 3.1 Hz, 1H, 1-H), 2.61 (td, 3J = 8.0 Hz, 4J = 2.7 Hz, 2H, 2-H), 2.84 (s, 4H, 4-H), 2.88 (t, 3J = 7.9 Hz, 2H, 3-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 14.01 (3-C), 25.51 (7-C), 30.21 (4-C), 69.99 (1-C), 80.82 (2-C), 166.99 (5-C), 168.97 (6-C). 186 | Experimenteller Teil 5.2.26 Pentinsäure-modifizierter Aza-Kronenether 1-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)pent-4-yn-1-on Unter Argonatmosphäre wurden 50.0 mg (256 µmol, 1 eq.) der Verbindung 25 in DCMabs vorgelegt. Unter Rühren wurden 72.8 mg (333 µmol, 1.3 eq.) 1-Aza-[15]Krone-5 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 24 h bei RT gerührt und anschließend das Lösungsmittel entfernt. Das Produkt wurde säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt und mit 72.8 mg (243 µmol, 95%) als gelbliches, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.96 (t, 3J = 2.5 Hz, 1H, 1-H), 2.51-2.55 (m, 2H, 2-H), 2.60-2.64 (m, 2H, 3-H), 3.53 (t, 3J = 7.0 Hz, 2H, 4-H), 3.57-3.70 (m, 16H, 6-H-13-H), 3.81 (t, 3J = 7.0 Hz, 2H, 5-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 14.72 (3-C), 32.41 (4-C), 49.64 (15-C), 50.48 (6-C), 68.74 (1-C), 69.72 (14-C), 69.78 (7-C), 70.22/70.26/70.28/70.52/70.80/71.81 (8-C-13-C), 83.83 (2-C), 171.49 (5-C). LC-MS: m/z = 300 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 299.17 g/mol. Experimenteller Teil | 187 5.2.27 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante C N-(3-(2-(2-(3-(5-(3-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-3-oxopropyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)propoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4-(3-tosyl-2-(tosylmethyl)propanoyl)benzamid Unter Argonatmosphäre wurden 10.0 mg (33.4 µmol, 1 eq.) der Verbindung 26 und 48.7 mg (66.8 µmol, 2 eq.) Azid-Interkalator 23 in 2 mL THFabs gelöst. Anschließend wurden 215 mg (1.67 mmol, 50 eq.) DIEA und 13.0 mg (66.8 µmol, 2 eq.) Kupfer(I)-iodid hinzugefügt und die Reaktionslösung für 24 h bei RT gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde die Reaktionsmischung säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) gereinigt. Für analytische Reinheit wurde das Produkt zusätzlich mit Hilfe der analytischen HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4) weiter aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 2 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA) und bei 35 Min schließlich aus 50% A und 50% B. Nach 36 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 38 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. 9.70 mg (9.43 µmol, 28%) der Verbindung wurden als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.88-1.94 (m, 2H, 9-H), 2.05-2.11 (m, 2H, 16-H), 2.48 (s, 6H, 1- H), 2.80 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, 20-H), 3.04 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, 19-H), 3.36 (t, 3J = 5.8 Hz, 2H, 15-H), 3.46-3.55 (m, 8H, 8-H, 10-H, 21-H, 30-H), 3.59-3.69 (m, 26H, 4-H, 11-H-14-H, 23-H-29-H), 3.74 (t, 3J = 6.4 Hz, 2H, 22-H), 4.33-4.41 (m, 3H, 5-H, 17-H), 7.36 (d, 3J = 8.1 Hz, 4H, 2-H), 7.55 (s, 1H, 18-H), 7.59 (t, 3J = 5.1 Hz, 1H, -NH), 7.67 (d, 3J = 8.3 Hz, 6H, 3-H, 6-H), 7.83 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 7-H). 188 | Experimenteller Teil 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.89 (1-C), 26.53 (26-C), 29.83 (15-C), 30.35 (22-C), 32.83 (27-C), 35.64 (7-C), 39.43 (14-C), 47.07 (23-C), 49.49 (29-C), 50.43 (38-C), 55.67 (6-C), 67.36/69.55/69.78/70.19/70.27/70.33/70.44/70.50/70.58/70.61/70.86/71.61(16-C-23-C, 30C-37-C), 127.79 (11-C), 128.44 (4-C), 128.77 (10-C), 130.35 (3-C), 135.44 (24-C), 135.83 (5-C), 136.17 (12-C), 139.78 (9-C), 145.171 (2-C), 147.02 (25-C), 166.52 (13-C), 172.46 (28-C), 195.33 (8-C). LC-MS: m/z = 1028 g/mol [M+H]+, 515 g/mol [M+H]2+, 1026 g/mol [M-H]-, 1072 g/mol [M+2Na-H]-, berechnet: [M] = 1027.43 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 1028.44 g/mol [M+H]+, 1050.42 g/mol [M+Na]+, 1066.39 g/mol [M+K]+, berechnet: [M] = 1027.43 g/mol. Experimenteller Teil | 189 5.2.28 Azid-Somatostatin 8.73 mg (12.0 µmol, 1 eq.) Azid-Interkalator 23 wurden in 10 mL eines Gemischs aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8) gelöst und für 24 h inkubiert. 39.3 mg (24.0 µmol, 2 eq.) Somatostatin wurden in 5 mL Phosphatpuffer gelöst und mit einer Lösung aus 10.3 mg (36.0 µmol, 3 eq.) TCEP in 3 mL Phosphatpuffer versetzt. Dieses Gemisch wurde für 40 Minuten bei RT geschüttelt. Anschließend wurde die inkubierte AzidInterkalator-Lösung langsam zur Somatostatin-Lösung hinzugefügt und das gesamte Reaktionsgemisch für 24 h mit 700 rpm geschüttelt. Die Entfernung des Puffersalzes erfolgte durch Dialyse in H2Odemin über 24 h. Die weitere Aufreinigung des Produktes geschah mittels präparativer HPLC (Säule: Atlantis T3 OBD Prep Column, 5 µm, 19 mm X 100 mm). Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 20 Min aus 100% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 0% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 25 Min aus 30% A und 70% B. Nach 34 Min erreichte der Gradient innerhalb von 1 Min 40% B und 60% A. Zwischen 46 und 51 Min stieg der Gradient schließlich auf 100% B und 0% A und endete nach insgesamt 60 Min. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 10 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Nach Lyophilisation wurden 4.93 mg (2.40 µmol, 40%) als weißer Feststoff erhalten. MALDI-TOF-MS: m/z = 2058.03 [M+2H]+, berechnet: [M] = 2056.39 g/mol LC-MS: m/z = 686 g/mol [M+H]3+, 1029 g/mol [M+H]2+, 1027 g/mol [M-H]2-, berechnet: [M] = 2056.39 g/mol. 190 | Experimenteller Teil 5.2.29 Aza-Kronenether-Somatostatin Es wurden 10.0 mg (9.96 µmol, 1 eq.) Aza-Kronenether-Interkalator 11 in 6 mL eines Gemischs aus 40% Acetonitril und Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und für 24 h inkubiert. 32.6 mg (19.9 µmol, 2 eq.) Somatostatin wurden in 5 mL Phosphatpuffer gelöst und mit einer Lösung aus 7.47 mg (29.9 µmol, 3 eq.) TCEP in 3 mL Phosphatpuffer versetzt und für 30 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Interkalator-Lösung schrittweise zur Somatostatin-Lösung hinzugegeben und das gesamte Reaktionsgemisch für 24 h bei 700 rpm geschüttelt. Die Aufreinigung des Produktes geschah mittels analytischer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4). Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 2 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 6 Min aus 25% B und 75% A und bei 35 Min aus 45% B und 55% A. Nach 36 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 39 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. Nach Lyophilisation wurden 5.80 mg (2.49 µmol, 25%) des Produkts als weißer Feststoff erhalten. LC-MS m/z = 1167 [M+2H]2+, 778 g/mol [M+H]3+, 584 g/mol [M+H]4+, 1164 g/mol [M-H]2-, berechnet: [M] = 2330.10 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 2332.12 g/mol [M+2H]+, 2354.17 g/mol [M+Na+H]+, 2373.22 g/mol [M+K+4H]+, berechnet: [M] = 2330.10 g/mol. Experimenteller Teil | 191 5.2.30 Bipyridin-Somatostatin Es wurden 10.0 mg (11.3 µmol, 1 eq.) Bipyridin-Interkalator 16 in 10 mL eines Gemischs aus 40% Acetonitril und Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und für 24 h inkubiert. 37.0 mg (22.6 µmol, 2 eq.) Somatostatin wurden in 5 mL Phosphatpuffer gelöst und mit einer Lösung aus 8.49 mg (33.9 µmol, 3 eq.) TCEP in 3 mL Phosphatpuffer versetzt und für 30 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Interkalator-Lösung schrittweise zur Somatostatin-Lösung hinzugegeben und das gesamte Reaktionsgemisch für 48 h bei 700 rpm geschüttelt. Die Aufreinigung des Produktes geschah mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10). Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA) und bei 12 Min aus 55% B und 45% A. Nach 43 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 3 Min konstant. Bei insgesamt 48 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Die Verbindung wurde nach Lyophilisation mit 4.18 mg (1.89 µmol, 34%) als weißer Feststoff erhalten. MALDI-FTICR-MS: m/z = 2213.00 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 2212.57 g/mol. MALDI-TOF-MS: m/z = 2213.05 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 2212.57 g/mol. 192 | Experimenteller Teil 5.2.31 Boronsäure-Somatostatin 10.0 mg (11.8 µmol, 1 eq.) Boronsäure-Interkalator 18 wurden in 10 mL einer Mischung aus 45% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 38.6 mg (23.6 µmol, 2 eq.) Somatostatin wurden in 6 mL Phosphatpuffer und 8.81 mg (35.2 µmol, 3 eq.) TCEP in 1 mL Phosphatpuffer gelöst und beide Lösungen miteinander vereinigt und für 30 Minuten inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Interkalator-Lösung zugegeben und das Gemisch für 48 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt. Nach dem destillativen Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), erreichte bei 40 Min 95% B und 5% A und verlief für weitere 3 Min konstant. Bei insgesamt 46 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Nach Lyophilisation wurden 5.39 mg (2.48 µmol, 21%) der Verbindung als weißer Feststoff erhalten. MALDI-FTICR-MS (CHCA) m/z = 2142.97 g/mol [M-2H2O+H]+, 2160.98 g/mol [M-H2O+H]+, berechnet: [M] = 2177.99 g/mol. LC-MS m/z = 547 g/mol [M+2H]4+, 1088 g/mol [M-H]2+, 715 g/mol [M-2H2O+H]3+, 1071 g/mol [M-2H2O]2+, 1078 g/mol [M-H2O-2H]2-, berechnet: [M] = 2177.99 g/mol. Experimenteller Teil | 193 5.2.32 Salicylhydroxamsäure-Somatostatin Variante A: Interkalation 5.00 mg (4.10 µmol, 1 eq.) Salicylhydroxamsäure-Interkalator 24 wurden in 5 mL einer Mischung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 13.4 mg (8.20 µmol, 2 eq.) Somatostatin wurden in 3 mL Phosphatpuffer und 3.08 mg (12.3 µmol, 3 eq.) TCEP in 1 mL Phosphatpuffer gelöst, beide Lösungen miteinander vereinigt und für 30 Minuten inkubiert. Im Anschluss wurde die Interkalator-Lösung langsam zugegeben und das Gemisch für 48 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt. Variante B: Click-Reaktion 500 µg (0.243 µmol, 1 eq.) Azid-Somatostatin 28 wurden in 85 µL Wasserdemin gelöst und 357 µg (0.729 µmol, 3 eq.) der Trityl-geschützten Salicylhydroxamsäure in 125 µL THFabs dazugegeben. In einem seperaten Reaktionsgefäß wurden 74.7 µg (0.486 µmol, 2 eq.) Kupfer(II)-sulfat sowie 193 µg (0.972 µmol, 4 eq.) Natriumascorbat in jeweils in 20 µL Wasserdemin gelöst und vereinigt, wodurch eine Farbänderung von dunkelbraun zu beigeorange stattfand. Die beiden Lösungen wurden nun vereinigt und bei RT für 48 h bei 700 rpm geschüttelt. Die Aufreinigung erfolgte mittels analytischer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4). Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 2 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 6 Min aus 25% B und 75% A und bei 35 Min aus 45% B und 55% A. Nach 36 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 39 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. Nach Lyophilisation konnten 309 µg (0.134 µmol, 55%) als weißer Feststoff isoliert werden. MALDI-FTICR-MS: m/z = 2305.02 g/mol [M+2H]+, berechnet: [M] = 2303.05 g/mol. 194 | Experimenteller Teil 5.2.33 Azid-Glutathion Es wurden 5.00 mg (6.85 µmol, 1 eq.) Azid-Interkalator 23 in 3 mL einer Lösung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8) gelöst und 24 h inkubiert. 10.5 mg (34.3 µmol, 5 eq.) Glutathion wurden zusammen mit katalytischen Mengen an TCEP in 1 mL Phosphatpuffer gelöst und zur inkubierten Interkalator-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt und mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), erreichte bei 40 Min 95% B und 5% A und verlief für weitere 3 Min konstant. Bei insgesamt 46 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Nach Lyophilisation konnten 6.35 mg (6.17 µmol, 90%) als weißer Feststoff isoliert werden. 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.77-1.83 (m, 2H, 2-H), 1.88-1.94 (m, 2H, 9-H), 2.13-2.25 (m, 4H, 19-H), 2.51-2.57 (m, 4H, 18-H), 2.72-2.93 (m, 4H, 14-H), 2.95-3.09 (m, 4H, 15-H), 3.353.39 (m, 2H, 1-H), 3.51-3.65 (m, 14H, 3-H-8-H, 10-H ), 3.92 (s, 4H, 17-H), 3.99-4.04 (m, 2H, 20-H), 4.07-4.14 (m, 1H, 13-H), 4.57-4.62 (m, 2H, 16-H), 7.95 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 12-H), 8.11 (d, 3J = 8.4 Hz, 2H, 11-H). 13 C-NMR (100 MHz, MeOD): δ = 27.18, 30.13, 30.31, 31.43, 32.49, 35.22, 38.90, 41.85, 51.58, 53.86, 54.17, 68.85, 68.91, 70.21, 70.23, 71.25, 71.27, 71.52, 71.53, 128.85, 129.83, 137.97 140.50, 168.27, 171.99, 172.75, 174.50, 177.80 202.85. LC-MS: m/z = 1029 g/mol [M-H]+, 516 g/mol [M+H]2+, berechnet: [M] = 1030.37 g/mol. Experimenteller Teil | 195 5.2.34 Aza-Kronenether-Glutathion 5.00 mg (4.98 µmol, 1 eq.) Aza-Kronenether-Interkalator 11 wurden in 4 mL einer Lösung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 7.64 mg (24.9 µmol, 5 eq.) Glutathion wurden in 1.5 mL Phosphatpuffer gelöst und zur inkubierten Interkalator-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt und mittels analytischer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 5 Min aus 15% B und 85% A und bei 31 Min aus 30% B und 70% A. Nach 34 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 38 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. LC-MS m/z = 654 g/mol [M+H]2+, 436 g/mol [M+H]3+, 1304 g/mol [M-H]-, berechnet: [M] = 1305.54 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 1310.58 g/mol [M+5H]+, 1331.56 g/mol [M+Na+3H]+, 1351.61 g/mol [M+K+7H]+, berechnet: [M] = 1305.54 g/mol. 196 | Experimenteller Teil 5.2.35 Bipyridin-Glutathion Es wurden 5.00 mg (5.65 µmol, 1 eq.) Bipyridin-Interkalator 16 in 5 mL einer Lösung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 8.68 mg (28.2 µmol, 5 eq.) Glutathion wurden in 1.5 mL Phosphatpuffer gelöst und zur inkubierten Interkalator-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt und mittels analytischer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 2 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA) und bei 35 Min schließlich aus 50% B und 50% A. Nach 36 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 38 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. LC-MS: m/z = 1185 g/mol [M-2H]-, 594 g/mol [M+H]2+, 397 g/mol [M+H]3+, berechnet: [M] = 1187.30 g/mol. MALDI-FTICR-MS: m/z = 1209.42 g/mol [M-H+Na]+, berechnet: [M] = 1187.30 g/mol. Experimenteller Teil | 197 5.2.36 Boronsäure-Glutathion 5.00 mg (5.88 µmol, 1 eq.) Boronsäure-Interkalator 18 wurden in 5 mL einer Lösung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 9.03 mg (29.4 µmol, 5 eq.) Glutathion wurden in 1.5 mL Phosphatpuffer gelöst und zur inkubierten Interkalator-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 48 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt. Nach dem destillativen Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch mittels präparativer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 10 µm, LiChroCART® 250-10) aufgereinigt. Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), erreichte bei 40 Min 95% B und 5% A und verlief für weitere 3 Min konstant. Bei insgesamt 46 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 4 mL/min. Die Absorption wurde bei 254 nm und 280 nm gemessen. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. MALDI-FTICR-MS m/z = 850.33 g/mol [M(1Glu)+4H]+, 1004.35 g/mol [M(1Glu)+DHB+4H]+, 1157.49 g/mol [M(2Glu)+5H]+, 1293.43 g/mol [M(2Glu)+DHB-H2O+5H]+, berechnet: [M(1Glu)] = 845.33 g/mol, [M(2Glu)] = 1152.42 g/mol. LC-MS m/z = 568 g/mol [M(2Glu)-H2O+H]2+, 1135 g/mol [M(2Glu)-H2O+H]+, 557 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H]2-, 1115 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H]-, 1133 g/mol [M(2Glu)-H2O-H]-, berechnet: [M(2Glu)] = 1152.42 g/mol. 198 | Experimenteller Teil 5.2.37 Salicylhydroxamsäure-Glutathion Es wurden 5.00 mg (4.10 µmol, 1 eq.) Salicylhydroxamsäure-Interkalator 24 in 5 mL einer Lösung aus 40% Acetonitril in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) gelöst und 24 h inkubiert. 6.30 mg (20.5 µmol, 5 eq.) Glutathion wurden in 1.5 mL Phosphatpuffer gelöst und zur inkubierten Interkalator-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei RT mit 700 rpm geschüttelt. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. Die Reaktion wurde ebenfalls mit 3 eq. sowie 8 eq. Glutathion durchgeführt. 3 eq.: MALDI-FTICR-MS: m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H]+, 1301.44 g/mol [M(2Glu)+Na]+, berechnet: [M(1Glu)] = 971.37 g/mol, [M(2Glu)] = 1278.54 g/mol. 5 eq.: MALDI-FTICR-MS: m/z = 972.24 g/mol [M(1Glu)+H]+, 1279.46 g/mol [M(2Glu)+H]+, berechnet: [M(1Glu)] = 971.37 g/mol, [M(2Glu)] = 1278.54 g/mol. 8 eq.: MALDI-FTICR-MS: m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H]+, 1317.44 g/mol [M(2Glu)+K]+, berechnet: [M(1Glu)] = 971.37 g/mol, [M(2Glu)] = 1278.54 g/mol. Experimenteller Teil | 199 5.2.38 Maleimid-modifizierter Aza-Kronenether 1-(6-(1,4,7,10-tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-6-oxohexyl)-1H-pyrrole-2,5-dion In einem 5 mL Rundhalskolben wurden 30.0 mg (142 µmol, 1 eq.) 6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro1H-pyrrol-1-yl)hexansäure unter Argonatmosphäre in 4 mL DMFabs vorgelegt und im Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Anschließend wurden unter Rühren 68.9 mg (156 µmol, 1.1 eq.) BOP, 20.1 mg (156 µmol, 1.1 eq.) DIEA sowie eine Spatelspitze HOBt zugegeben. Nach zehn Minuten bei 0 °C wurden dem Reaktionsgemisch 62.2 mg (284 µmol, 2 eq.) 1-Aza[15]Krone-5 hinzugefügt und anschließend langsam auf RT erwärmt. Nach 24 h wurde das Produkt säulenchromatographisch (Methanol:Chloroform = 1:9) aufgereinigt. Es wurden 25.1 mg (6.09 µmol, 43%) der Verbindung als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.28-1.36 (m, 2H, 4-H), 1.57-1.69 (m, 4H, 3-H, 5-H), 2.33 (t, 3J = 7.7 Hz, 2H, 6-H), 3.50-3.70 (m, 20H, 7-H-16-H), 3.79 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, 2-H), 6.68 (s, 2H, 1-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 24.87 (6-C), 26.65 (5-C), 28.51 (4-C), 33.01 (7-C), 37.80 (3-C), 49.35 (9-C), 50.42 (18-C), 69.74 (10-C), 69.80 (17-C), 70.15/70.39/70.72/71.67 (11-C-16-C), 134.12 (1-C), 170.92 (2-C), 173.23 (8-C). LC-MS: m/z = 413 g/mol [M+H]+, berechnet: [M] = 412.22 g/mol. 200 | Experimenteller Teil 5.2.39 Maleimid-Aza-Kronenether-Glutathion N-5-(3-((1-(6-(1,4,7,10-Tetraoxa-13-azacyclopentadecan-13-yl)-6-oxohexyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)thio)-1-((carboxymethyl)amino)-1-oxopropan-2-yl)glutamin Variante A 10.0 mg (24.2 µmol, 1 eq.) Maleimid-Aza-Kronenether 38 wurden in 2 mL Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0) vorgelegt. Im Anschluss wurden 22.3 mg (72.7 µmol, 3 eq.) Glutathion hinzugefügt und die Reaktionslösung für 24 h bei 45 °C mit 700 rpm inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgte mittels analytischer HPLC (Säule: Merck, LiChrospher® 100, RP-18, 5 µm, LiChroCART® 125-4). Zu Beginn der Trennung bestand das Lösungsmittelgemisch für 3 Min aus 95% Lösungsmittel A (Wasser, 0.1% TFA) und 5% Lösungsmittel B (Acetonitril, 0.1% TFA), bei 5 Min aus 15% B und 85% A und bei 31 Min aus 30% B und 70% A. Nach 34 Min erreichte der Gradient 95% B und 5% A und verlief für weitere 2 Min konstant. Bei insgesamt 38 Min wurde das Ausgansverhältnis von 95% A und 5% B wieder erreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 mL/min. Die Absorption wurde bei 220 nm, 254 nm und 280 nm gemessen. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. Variante B 10.0 mg (24.2 µmol, 1 eq.) Maleimid-Aza-Kronenether 38 wurden in 2 mL DMFabs gelöst und mit 22.3 mg (72.7 mmol, 3 eq.) Glutathion versetzt. Diese Reaktionslösung wurde ebenfalls bei 45 °C für 24 h mit 700 rpm geschüttelt. Die Aufarbeitung erfolgte wieder mittels analytischer HPLC. Experimenteller Teil | 201 1 H-NMR (400 MHz, MeOD): δ = 1.29-1.38 (m, 2H, 11-H), 1.56-1.66 (m, 4H, 10-H, 12-H), 2.12- 2.28 (m, 2H, 2-H), 2.41 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, 13-H), 2.59 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, 3-H), 2.75-2.95 (m, 2H, 6-H), 3.16-3.25 (m, 2H, 8-H), 3.51-3.67 (m, 21H, 7-H, 14-H-23-H), 3.77 (t, 3J = 6.2 Hz, 2H, 9-H), 3.95 (s, 2H, 5-H), 3.98-4.08 (m, 2H, 1-H), 4.68-4.75 (m, 1H, 4-H). 13 C-NMR (100 MHz, MeOD): δ = 25.96 (18-C), 27.03 (17-C), 27.39 (16-C), 28.31 (3-C), 32.39 (19-C), 33.88 (4-C), 36.78 (15-C), 39.64 (12-C), 40.52 (10-C), 41.31 (11-C), 41.83 (8-C), 50.22 (21-C), 51.69 (6-C), 53.53 (2-C), 70.07/71.01/71.20/71.41/71.73/71.24 (22-C-30-C), 168.26 (14-C), 172.57 (20-C), 172.68 (13-C), 174.30 (7-C), 175.99 (1-C), 176.84 (5-C), 179.04 (9-C). LC-MS: m/z = 720 g/mol [M+H]+, 361 g/mol [M+H]2+, 718 g/mol [M-H]-, berechnet: [M] = 719.30 g/mol. 202 | Experimenteller Teil 5.2.40 Somatostatin-Dimer Es wurden 252 µg (0.125 µmol, 1eq.) Ethinyl-Somatostatin und 260 µg (0.126 µmol, 1eq.) Azid-Somatostatin 28 in 100 µl H2Odemin gelöst. In einem seperaten Reaktionsgefäß wurden 101 µg (0.632 µmol, 5 eq.) Kupfer(II)-sulfat sowie 251 µg (1.26 µmol, 10 eq.) Natriumascorbat in jeweils in 20 µL Wasserdemin gelöst, vereinigt und die Farbänderung von dunkelbraun zu beige-orange abgewartet. Anschließend wurden beide Lösungen vereinigt und bei RT für 24 h bei 700 rpm inkubiert. Eine Ausbeutenbestimmung konnte nicht durchgeführt werden. LC-MS: m/z = 677 g/mol [M+H]6+, 812 g/mol [M+H]5+, 1014 g/mol [M]4+, 676 g/mol [M]6-, 812 g/mol [M+H]5-, berechnet: [M] = 4054.69 g/mol. MALDI-TOF-MS: m/z = 4057.06 g/mol [M+2H]+, berechnet: [M] = 4054.69 g/mol. Experimenteller Teil | 203 5.2.41 Trimer-Kern-Verbindung 1,3,5-Triyl-tris(pent-4-ynoat)-Benzol Unter Argonatmosphäre wurden 233 mg (2.38 mmol, 6 eq.) 4-Pentinsäure in 10 mL THF gelöst und im Eisbad abgekühlt. Unter Rühren wurden 2.38 g (2.38 mmol, 6 eq.) EDC sowie 13.0 mg (0.107 mmol, 0.36 eq.) DMAP hinzugefügt. Nach zehn Minuten wurden 50.0 mg (0.396 mmol, 1 eq.) 1,3,5-Trihydroxybenzol zugegeben und das Reaktionsgemisch 24 h bei RT gerührt. Das Produktgemisch wurde nach dem Entfernen des Lösungsmittels säulenchromatographisch mit 10% Methanol in Chloroform aufgereinigt. Es wurden 81.3 mg (0.222 mmol, 56%) der Verbindung als gelbes hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.04 (t, 4J = 2.6 Hz, 3H, 4-H), 2.58-2.63 (td, 4J = 2.7 Hz, 3J = 7.1 Hz, 6H, 3-H), 2.79 (t, 3J = 7.5 Hz, 6H, 2-H), 6.88 (s, 3H, 1-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 14.44 (3-C), 33.50 (2-C), 69.74 (4-C), 81.92 (7-C), 112.93 (1-C), 151.06 (5-C), 169.61 (7-C). MALDI-TOF-MS: m/z = 367.17 g/mol [M+H]+, 389.14 g/mol [M+Na]+, 405.11 g/mol [M+K]+, berechnet: [M] = 366.41 g/mol. 204 | Experimenteller Teil 5.2.42 Tosylierter Ethinyl-TEO-Linker 2-(2-(2-(Prop-2-yn-1-yloxy)ethoxy)ethoxy)ethyl-p-tolylsulfat Es wurden 600 mg (3.19 mmol, 1 eq.) Ethinyl-TEO-Linker in 20 mL THF gelöst. Hierzu wurde eine Lösung aus 166 mg (4.15 mmol, 1.3 eq.) NaOH in 3 mL H2O gegeben und das Reaktionsgemisch auf 5 °C abgekühlt. Anschließend wurde unter starkem Rühren eine Lösung aus 730 mg (3.83 mmol, 1.2 eq.) Toluolsulfonsäurechlorid in 5 mL THF langsam hinzugetropft und weiter zwei Stunden bei RT gerührt. Im Anschluss wurde mit H 2O und Dichlormethan gewaschen, die organische Phase abgetrennt und solange mit H 2O gewaschen, bis ein pH-Wert von 7 erreicht war. Nach dem Trocken über MgSO4 wurde das Produktgemisch säulenchromatographisch mit n-Hexan:Ethylacetat 1:1 aufgereinigt und das Produkt als weißer Feststoff mit 914 mg (2.55 mmol, 80%) erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.43 (t, 4J = 2.3 Hz, 1H, 1-H), 2.45 (s, 3H, 11-H), 3.59-3.70 (m, 10H, 3-H-7-H), 4.16 (t, 3J = 4.7 Hz, 2H, 8-H), 4.19 (d, 4J = 2.3 Hz, 2H, 2-H), 7.34 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, 9-H), 7.80 (d, 3J = 8.3 Hz, 2H, 10-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 21.59 (11-C), 58.32 (2-C), 68.61/69.00/69.19/70.34/70.76 (3- C-7-C), 72.28 (8-C), 74.55 (1-C), 79.52 (1a-C), 127.92 (9-C), 129.78/129.81 (10-C), 132.87 (10a-C), 144.78 (9a-C). Experimenteller Teil | 205 5.2.43 TEO-Trimer-Kern-Verbindung 1,3,5-Tris(2-(2-(2-(prop-2-yn-1-yloxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)benzol 50.0 mg (0.396 mmol, 1 eq.) 1,3,5-Trihydroxybenzol wurden zusammen mit 568 mg (1.59 mmol, 4 eq.) tosyliertem Ethinyl-TEO 42 in 10 mL DMFabs unter Argonatmosphäre gelöst. Anschließend wurden 1.09 g (7.92 mmol, 20 eq.) Kaliumcarbonat hinzugegeben und das Reaktionsgemisch bei 80 °C für 24 h erhitzt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde mehrmals mit H2O und DCM gewaschen, die organische Phase abgetrennt und solange mit H2O gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht worden war. Nach dem Trocken über MgSO4, wurde das Produkt säulenchromatographisch mit n-Hexan:Ethylacetat 1:1 aufgereinigt und mit 154 mg (0.242 mmol, 61%) als gelbes, hochviskoses Öl erhalten. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.43 (t, 4J = 2.4 Hz, 3H, 9-H), 3.67-3.74 (m, 24H, 4-H-7H), 3.83 (t, 3J = 5.04 Hz, 6H, 3-H), 4.06 (t, 3J = 4.56 Hz, 6H, 2-H), 4.20 (d, 4J = 2.4 Hz, 6H, 8-H), 6.10 (s, 3H, 1-H). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 58.51 (8-C), 67.50/69.21/69.76/70.56/70.76/70.89 (2-C-7-C), 74.70 (9-C), 79.76 (8a-C), 94.43 (1-C), 160.59 (1a-C). MALDI-TOF-MS: m/z = 637.42 g/mol [M+H]+, 659.49 g/mol [M+Na]+, 675.37 g/mol [M+K]+, berechnet: [M] = 636.73 g/mol. 206 | Verzeichnisse 6 Verzeichnisse 6.1 Abkürzungsverzeichnis Abs Absolut AFM Rasterkraftmikroskop (engl. atomic/scanning force microscope) APT Attached Proton Test Boc tert-Butyloxycarbonyl BOP (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat bpy Bipyridin BSA Bovine serum albumin CHCA α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure COSY Correlated Spectroscopy Cys Cystein d (NMR) Dublett DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid DCM Dichlormethan dd (NMR) Dublett vom Dublett ddd (NMR) Dublett vom Dublett vom Dublett DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure DIEA Diisopropylethylamin DMAP 4-(Dimethylamino)-pyridin DMSO Dimethylsulfoxid EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ESI Elektrosprayionisation Eth. Ethinyl EtOH Ethanol Eq./eq. Äquivalent Verzeichnisse | 207 FG Funktionelle Gruppe FTICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry FT-IR Fourier-Transform-Infrarotspektrometer g.SHS Trityl-geschützte Salicylhydroxamsäure Glu Glutathion h Stunde H Proton HBTU N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uranium-hexafluorophosphat HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HOBt 1-Hydroxybenzotriazol HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz Hertz IK Interkalator konz konzentriert L Ligand LC-MS Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (engl. liquid chromatography–mass spectrometry) Lys Lysin m (NMR) Multiplett M Molekulargewicht M Molar [mol/l] m Masse MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation MeOD Methanol (deuteriert) MeOH Methanol Min Minuten MS Massen NaAsc Natriumascorbat 208 | Verzeichnisse N3 Azid NMR Kernspinresonanz (engl. Nuclear Magnetic Resonance) p para PBS Phenylboronsäure PEG Polyethylene glycol PEO Polyethylenoxid Phe Phenylalanin ppm parts per million q (NMR) Quartett R Rest rpm Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute) RT Raumtemperatur s (NMR) Singulett SG Schutzgruppe SHS Salicylhydroxamsäure Soma Somatostatin t (NMR) Triplett t Zeit (engl. time) TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine TEO Tetraethylenoxid TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran Thr Threonin TOF Time of flight Trp Tryptophan UV Ultraviolett Vbdg Verbindung z Ladung δ (NMR) Chemische Verschiebung Verzeichnisse | 209 6.2 Liste der synthetisierten Verbindungen Mannich-Salz 1 Bisulfid 2 Boc-geschützter Amin-Interkalator 5 Säure-funktionalisierter Aza-Kronenether 7 Boc-TEO-Linker 4 Amin-Interkalator 6 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante A 8 Boc-geschützter TEO-Aza-Kronenether 9 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante B 11 Säure-funktionalisiertes 2,2´-Bipyridin 14 Bisulfon 3 2,2´-BipyridinSäurechlorid 15 Geschützter Boronsäure-Interkalator 17 TEO-Aza-Kronenether 10 Stannyliertes Pyridin 12 2,2'-Bipyridin-4methylester 13 2,2´-Bipyridin-Interkalator 16 Boronsäure-Interkalator 18 210 | Verzeichnisse Azido-Transfer-Agent 19 Boc-geschützter Azid-TEO-Linker 20 Azid-Bisulfid-Interkalator 22 Azid-Interkalator 23 Salicylhydroxamsäure-Interkalator 24 Pentinsäure-modifizierter AzaKronenether 26 Azid-TEO-Linker 21 NHS-aktivierte Pentinsäure 25 Aza-Kronenether-Interkalator: Variante C 27 Azid-Somatostatin 28 Azid-Glutathion 29 Aza-Kronenether-Somatostatin 30 Aza-Kronenether-Glutathion 31 Bipyridin-Somatostatin 32 Bipyridin-Glutathion 33 Verzeichnisse | 211 Boronsäure-Somatostatin 34 Boronsäure-Glutathion 35 Salicylhydroxamsäure-Somatostatin 36 Salicylhydroxamsäure-Glutathion 37 Maleimid-Aza-KronenetherGlutathion 39 Trimer-KernVerbindung 41 Maleimid-modifizierter AzaKronenether 38 Somatostatin-Dimer 40 Tosylierter Ethinyl-TEO-Linker 42 TEO-Trimer-Kern-Verbindung 43 212 | Verzeichnisse 6.3 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1-1. Oberflächenmodelle a) eines Ferritin-Protein-Komplexes; b) eine der 24 FerritinUntereinheiten; c) Metall-Bindungsstellen in den Untereinheiten.[5] Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Chemical Biology [5], copyright 2013. .............................................. 1 Abbildung 1-2. Schematische Darstellung der Zn-vermittelten Dimerisierung des RIDC3-Monomers sowie die Bildung einer helikalen 1D Kette aus RIDC3-Dimeren.[8] Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Chemistry [8], copyright 2012. ......................................................... 3 Abbildung 1-3. a) Aminosäurensequenz des modifizierten H-byp; b) Seitliche Ansicht nach TripelHelix-Bildung; c) Ansicht von oben auf einen einzelnen Tripel-Helix-Strang, gefolgt von der Metallgetriggerten Selbstassemblierung.[10] Reprinted with permission from [10], copyright 2008 American Chemical Society. .................................................................................................................................... 4 Abbildung 1-4. Allgemeiner Aufbau eines Michael-Akzeptors, wobei W (blau) für eine elektronenziehende Gruppe und X (rot) für eine Abgangsgruppe steht.[14] ........................................... 5 Abbildung 1-5. ETAC-Reagenzien der ersten Stunde.[15] ......................................................................... 5 Abbildung 1-6. Grundgerüst einer neuartigen Interkalator-Verbindung.[17] ........................................... 6 Abbildung 1-7. Natives Somatostatin-14 und das Analoga Octreotid, wobei die Disulfidbrücken rot und die pharmakologisch aktive Aminosäuresequenz blau dargestellt sind. ......................................... 8 Abbildung 1-8. Natives Somatostatin, sowie mit blauen Pfeilen gekennzeichnet die metabolischen Abbaustellen............................................................................................................................................ 9 Abbildung 1-9. Darstellung der beiden unterschiedlichen Synthesestrategien grafting from und grafting onto am Beispiel der Interkalation in die Disulfidbrücke eines Biomoleküls. ......................... 12 Abbildung 1-10. Unterschiedliche Vertreter der Stoffklasse der Kronenether..................................... 15 Abbildung 1-11. Vergleich der Durchmesser von Krone und Kation für die Bildung eines 1:1Komplexes.[43] ........................................................................................................................................ 16 Abbildung 1-12. Schematische Darstellung einer Kalium-induzierten Aggregierung durch Ausbildung von Sandwich-Komplexen in einem Natrium-haltigen Medium.[46] Reprinted (adapted) with permission from [46], copyright 2002 American Chemical Society. ..................................................... 16 Abbildung 1-13. Lösungsmittel-Einfluss auf die Konformation der Kronenether.[47] ............................ 17 Abbildung 1-14. Beispiele für Licht- und Redox-induzierte Komplexbildung.[41] .................................. 18 Abbildung 1-15. Kronenether-funktionalisierte Aminosäure, sowie die durch Cäsiumionen getriggerte Ausbildung einer α-Helix-Konformation.[] Adapted from [51] with permission of The Royal Society of Chemistry. ............................................................................................................................................. 18 Abbildung 1-16. Komplexierung von Aza-Kronenether-modifizierten Porphyrinen mit Natrium (1:1Komplex) und Kalium (2:1-Komplex).[52] Adapted from [52] with permission of The Royal Society of Chemistry. ............................................................................................................................................. 19 Abbildung 1-17. Schematische Darstellung eines Übergangsmetalls Mn+ mit ein-, zwei- und dreizähnigen Liganden L. ....................................................................................................................... 19 Abbildung 1-18. Die am häufigsten verwendeten Liganden in der Übergangsmetall-Komplexierung. 20 Abbildung 1-19. Darstellung der sechs möglichen Bipyridin-Isomere. ................................................. 20 Abbildung 1-20. Strukturformel und 3D-Modell[] des [Ru(bipy)3]Cl2-Komplexes.................................. 21 Abbildung 1-21. Absorptions-Spektrum von Ru(bipy)32+; LC: 185/285 nm, MC: 322/344 nm, MLCT: 240/450 nm.[]; Reprinted from Coordination Chemistry Reviews, Vol. 84, A. Juris, V. Balzani, F. Verzeichnisse | 213 Barigelletti, S. Campagna, P. Belser, A. von Zelewsky, Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, eletrochemistry, and chemiluminescence, Pages 85–277, Copyright 1988, with permission from Elsevier. ...................................................................................................................... 22 Abbildung 1-22. Links: Natives Insulin-Hexamer (Koordination von HisB10-Reste (grün) an Zn(II) (grau));[] Rechts: Model des erwarteten Trimers aus 2,2´-Bipy-(lila)-modifiziertem Insulin mit Fe(II) (magenta).[64] Reprinted with permission from [64], copyright © 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. .................................................................................................................................. 23 Abbildung 1-23. Metall-induzierte Bildung eines 3-α-Helix-Bündel.[68] Adapted with permission from [68], Copyright © 1991, American Chemical Society. ........................................................................... 23 Abbildung 1-24. Entwurf eines künstlichen Metalloproteins mit einem Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)Komplex als Kern.[9] Reprinted with permission from [9], copyright © 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. ......................................................................................................................... 24 Abbildung 1-25. Angriff eines Nukleophils am Bor-Zentrum.[80] ........................................................... 25 Abbildung 1-26. Thermodynamische Analyse der Wechselwirkungen von Phenylboronsäure mit 1,2Ethandiol.[73] .......................................................................................................................................... 26 Abbildung 1-27. Boronsäure-Makrozyklen.[81,82] ................................................................................... 27 Abbildung 1-28. Beispiel einer Verkapselungsreaktion durch Boronsäure-Veresterung, Kubo et al..[83] Adapted from [83] with permission of The Royal Society of Chemistry. ............................................. 27 Abbildung 1-29. Einfluss eines Lösungsmittelmoleküls auf die B-N-Bindung.[85] .................................. 28 Abbildung 1-30. a) Salicylhydroxamsäure; b) Salicylsäure/o-Hydroxybenzoesäure; c) Aspirin®/ Acetylsalicylsäure. ................................................................................................................................. 28 Abbildung 1-31. Gleichgewicht der Ausbildung von O-Anion und N-Anion einer HydroxamsäureVerbindung.[88] ....................................................................................................................................... 29 Abbildung 1-32. Zwei mögliche Wege der Ausbildung von Metall-Komplexen der Salicylhydroxamsäure; a) [O,O]; b) [N,O´].[91] ........................................................................................ 29 Abbildung 1-33. PH-abhängige Gleichgewichtsreaktion zwischen Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure.[98] ............................................................................................................................ 30 Abbildung 1-34. PH-abhängige Bildung und Spaltung eines Dendrimer-Enzym-Komplexes.[] ............. 31 Abbildung 3-1. I) Grundgerüst der 1990 veröffentlichten Interkalator-Verbindung; II) BisulfonInterkalator.[17,18] ................................................................................................................................... 35 Abbildung 3-2. Die vielfältigen Einsatzgebiete von Oxone®.[105] Adapted with permission from [105]. Copyright © 2003, American Chemical Society. ................................................................................... 41 Abbildung 3-3. 1H-NMR-Spektren (CDCl3) von Bisulfid 2 und Bisulfon 3 im Vergleich.......................... 42 Abbildung 3-4. LC-MS-Spektren des Amino-Interkalators 6; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UVChromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 547 g/mol [Mmono]+ ; D) MSSpektrum (-) t = 7.75 min: m/z = 702 g/mol [M]-; berechnet: [Mmono] = 547 g/mol, [M] = 702.32 g/mol. ............................................................................................................................................................... 47 Abbildung 3-5. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Amin-Interkalators 6. .................................................. 48 Abbildung 3-6. Strukturformeln und Kugel-Strich-Modelle der [15]Krone-5 sowie der Modifikation Aza-[15]Krone-5. ................................................................................................................................... 50 Abbildung 3-7. 1H-NMR-Spektrum (MeOD) des Aza-Kronenether-Interkalators 8............................... 52 Abbildung 3-8. Vergleich der Strukturformeln der Kupplungsreagenzien HBTU, BOP und HOBT. ....... 54 Abbildung 3-9. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 11. ............................. 55 214 | Verzeichnisse Abbildung 3-10. 1H-NMR-Spektren (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 11, dessen Integrale über verschiedene Ausgangssignale kalibriert wurden; Integration ausgehend vom Bisulfon-Teil (A), Aza-Kronenether-TEO-Teil (B); C) Integration der beiden Mulitpletts im Bereich von 3.46 – 3.69 ppm. ............................................................................................................................................................... 56 Abbildung 3-11. 3D-Modell eines oktaedrischen [M(bipy)3]n+-Komplexes.[]......................................... 58 Abbildung 3-12. 1H-NMR-Spektrum (DMSO) des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins 14. ........................... 61 Abbildung 3-13. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 16. ................................. 64 Abbildung 3-14. LC-MS-Spektren des Rohprodukts 17; A) UV-Chromatogramm 254nm; B) MSSpektrum t = 10 min, [MMono+H+] = 695 g/mol; C) MS-Spektrum t = 11.5 min, [M+H+] = 851 g/mol; berechnet: [M-SG] = 850.30 g/mol. ...................................................................................................... 68 Abbildung 3-15. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Boronsäure-Interkalators 18. .................................... 69 Abbildung 3-16. 1,3-dipolare Cycloaddition ohne Katalysator; 1:1-Produktgemisch aus 1,4- und 1,5substituierten Triazolringen.[]................................................................................................................ 71 Abbildung 3-17. FT-IR-Spektrum (KBr) des Azid-Boc-TEO-Linkers 20. .................................................. 74 Abbildung 3-18. FT-IR-Spektrum (KBr) des Azid-Interkalators 23. ........................................................ 76 Abbildung 3-19. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Azid-Interkalators 23. ................................................ 77 Abbildung 3-20. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24. ................... 82 Abbildung 3-21. 1H-NMR-Spektrum (CDCl3) des Aza-Kronenether-Interkalators 27. ........................... 86 Abbildung 3-22. Übersicht der eingeführten Bausteine der synthetisierten Interkalatoren................ 89 Abbildung 3-23. Grundgerüst I) eines Michael-Akzeptor-Systems, II) eines aktivierten BisulfonInterkalators, III) eines Bisulfon-Interkalators nach der ersten Michael-Addition eines Nukleophils. . 92 Abbildung 3-24. L-Glutathion, aufgebaut aus den Aminosäuren Glycin (grün), Cystein (rot) und Glutaminsäure (blau) in der reduzierten Form als Monomer und in der Variante als Dimer............... 95 Abbildung 3-25. Einführung der schematischen Darstellung des Somatostatins. ................................ 96 Abbildung 3-26. Azid-Somatostatin 28: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UVChromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.75 min: m/z = 686 g/mol [M+H]3+, m/z = 1029 g/mol [M+H]2+; D) MS-Spektrum (-) t = 13.75 min: m/z = 1027 g/mol [M-H]2; E) MALDI-TOF-MS: m/z = 2058.03 [M+2H]+; berechnet: [M] = 2056.39 g/mol. ............................................................................ 99 Abbildung 3-27. LC-MS-Spektren Azid-Glutathion 29; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UVChromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 517 g/mol [M+2H]2+; D) MSSpektrum (-) t = 6.25 min: m/z = 1029 g/mol [M-H]-, m/z = 1030 g/mol [M]-; berechnet: [M] = 1030.37 g/mol. .................................................................................................................................................. 100 Abbildung 3-28. 1H-NMR-Spektrum (MeOD) des Azid-Glutathions 29. .............................................. 101 Abbildung 3-29. Aza-Kronenether-Somatostatin 30: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.50 min: m/z = 584 g/mol [M+H]4+, 778 g/mol [M+H]3+, 1167 [M+2H]2+; D) MS-Spektrum (-) t = 13.50 min: m/z = 1164 g/mol [M-H]2-; E) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 2332.12 g/mol [M+2H]+; berechnet: [M] = 2330.10 g/mol. ....... 104 Abbildung 3-30. LC-MS-Spektren Aza-Kronenether-Somatostatin 31; A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.0 min: m/z = 436 g/mol [M+H]3+, 654 g/mol [M+H]2+, 1307 g/mol [M+2H+; D) MS-Spektrum (-) t = 13.0 min: m/z = 1304 g/mol [M-H]-; berechnet: [M] = 1305.54 g/mol. ........................................................................................................ 105 Verzeichnisse | 215 Abbildung 3-31. 2,2´-Bipyridin-Somatostatin 32: A) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 2213.00 g/mol [M+H]+; B) MALDI-TOF-MS-Spektrum: : m/z = 2213.05 g/mol [M+H]+; berechnet: [M] = 2212.57 g/mol. .................................................................................................................................................. 108 Abbildung 3-32. 2,2´-Bipyridin-Glutathion 33: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 5.50 min: m/z = 397 g/mol [M+H]3+, 594 g/mol [M+H]2+; D) MS-Spektrum (-) t = 5.50 min: m/z = 1185 g/mol [M-2H]-; E) MALDI-FTICR-MS-Spektrum: m/z = 1209.42 g/mol [M-H+Na]+; berechnet: [M] = 1187.30 g/mol. .................................................. 108 Abbildung 3-33. Boronsäure-Somatostatin 34; LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UV-Chromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.25 min: m/z = 715 g/mol [M-2H2O+H]3+, 1071 g/mol [M-2H2O]2+; D) MS-Spektrum (-) t = 6.25 min: m/z = 1078 g/mol [M-H2O-2H]2-; MALDI-FTICRMS-Spektrum (CHCA): m/z = 2142.97 g/mol [M-2H2O+H]+, 2150.98 g/mol [M-2H2O+9H]+, 2160.98 g/mol [M-H2O+H]+; berechnet: [M] = 2177.99 g/mol. ........................................................................ 111 Abbildung 3-34. Boronsäure-Glutathion 35; LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UVChromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 6.0 min: m/z = 568 g/mol [M(2Glu)-H2O+H]2+, 1135 g/mol [M(2Glu)-H2O+H]+; D) MS-Spektrum (-) t = 6.0 min: m/z = 557 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H]2-, 1115 g/mol [M(2Glu)-2H2O-H]-; MALDI-FTICR-MS-Spektrum: 1004.35 g/mol [M(1Glu)+DHB+4H]+, 1157.49 g/mol [M(2Glu)+5H]+, 1293.43 g/mol [M(2Glu)+DHB-H2O+5H]+; berechnet: [M(2Glu)] = 1152.42 g/mol. .................................................................................................................................................. 112 Abbildung 3-35. MALDI-FTICR-MS-Spektrum der Reaktionslösung der Somatostatin-Interkalation des SHS-Interkalators 24; m/z = 2305.02 g/mol [M+2H]+, 2327.01 g/mol [M+Na+H]+; berechnet: [M] = 2303.05 g/mol; Somatostatin: m/z = 1661.72 g/mol [M+Na+2H]+; berechnet: [M] = 1637.90 g/mol. ............................................................................................................................................................. 114 Abbildung 3-36. MALDI-FTICR-MS-Spektren der Glutathion-SHS-Interkalator-Reaktionslösungen mit 3, 5 und 8 Eq. Glutathion; A) m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H]+, 1301.44 g/mol [M(2Glu)+Na]+; B) m/z = 972.24 g/mol [M(1Glu)+H]+, 1279.46 g/mol [M(2Glu)+H]+; C) m/z = 994.36 g/mol [M(1Glu)+Na+H]+, 1317.44 g/mol [M(2Glu)+K]+; berechnet: [M(1Glu)] = 971.37 g/mol, [M(2Glu)] = 1278.54 g/mol. .................................................................................................................................... 116 Abbildung 3-37. MALDI-FTICR-MS-Spektrum des SHS-Somatostatins 36, hergestellt über den Weg der Click-Reaktion; m/z = 2305.02 g/mol [M+2H]+, berechnet: [M] = 2303.05 g/mol. ............................. 126 Abbildung 3-38. Multivalente Linkersysteme, synthetisiert von Anne Pfisterer. ............................... 130 Abbildung 3-39. Somatostatin-Dimer 40: LC-MS-Spektren: A) UV-Chromatogramm 254 nm; B) UVChromatogramm 214 nm; C) MS-Spektrum (+) t = 13.70 min: 677 g/mol [M+H]6+, 812 g/mol [M+H]5+, 1014 g/mol [M]4+; D) MS-Spektrum (-) t = 13.73 min: m/z = 676 g/mol [M]6-, 812 g/mol [M+H]5-; E) MALDI-TOF-MS-Spektrum: m/z = 4057.06 g/mol [M+2H]+; berechnet: [M] = 4054.69 g/mol. .......... 132 Abbildung 3-40. Mögliches Produkt einer Nickelbasierten Komplexbildung des BipyridinSomatostatins 32 und einem Terpyridin, welches zuvor mit einem Molekül BSA verknüpft worden war. ...................................................................................................................................................... 140 Abbildung 4-1. Auswahl der reaktiven Bausteine, welche in die Interkalator-Verbindungen eingeführt worden waren. .................................................................................................................................... 143 6.4 Tabellenverzeichnis Tabelle 1. Bindungsstärken von Somatostatin, Octreotid und Lanreotid an die fünf SomatostatinRezeptoren (SSTR).[] Reprinted with permission from [30], copyright © 2002, European Society of Endocrinology. ....................................................................................................................................... 10 216 | Verzeichnisse Tabelle 2. Zusammenfassung von nicht-kovalenten Wechselwirkungen.[40] ........................................ 14 Tabelle 3. Zusammenfassung der Reaktivität der funktionalisierten Interkalatoren gegenüber dem Glutathion und dem Somatostatin, inklusive der Ausbeute, wobei = kein Produkt, = Spuren und = Hauptprodukt darstellt. ................................................................................................................ 117 Tabelle 4. Äquivalent-Verhältnisse der Synthese des Boronsäure-Somatostatins via Click-Reaktion.124 Tabelle 5. Verhältnisse der Äquivalente der Synthese von Salicylhydroxamsäure-Somatostatin 36 via Click-Reaktion. ..................................................................................................................................... 126 Tabelle 6. Verhältnisse der Äquivalente der Synthese des Somatostatin-Trimers via Click-Reaktion.134 6.5 Schemataverzeichnis Schema 1-1. Mechanismus der konsekutiven Michael-Additionen zweier nukleophiler Reste.[16] ........ 5 Schema 1-2. Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems durch Abspaltung eines ToluolsulfonsäureRestes. ..................................................................................................................................................... 7 Schema 1-3. Bisphenol-Synthese von C. J. Pedersen.[41] ....................................................................... 15 Schema 1-4. Konformation einer [18]Krone-6 vor und nach der Komplexbildung mit einem KaliumIon.[48,] .................................................................................................................................................... 17 Schema 2-1. Übersichtsschema der beiden Syntheserouten zur Herstellung von SomatostatinKonjugaten, welche mittels eines komplementären Reaktionspartners responsive, definierte Biokonjugate ausbilden können. ........................................................................................................... 34 Schema 3-1. Übersicht der Synthesestrategie I zur Darstellung von Somatostatin-Konjugaten nach der Methode des grafting onto. Dazu wurde zuerst eine Bibliothek an unterschiedlich funktionalisierten Interkalator-Verbindungen synthetisiert und im Anschluss deren Verhalten bei der Biokonjugation mit Somatostatin und Glutathion untersucht. ...................................................................................... 36 Schema 3-2. Eliminierung der Toluolsulfonsäure nach dem E1cB-Mechanismus. ............................... 38 Schema 3-3. Konsekutive Michael-Additions-Reaktionen am aktivierten Bisulfon-Interkalator mit unterschiedlichen Peptiden, welche ein oder zwei Thiolgruppen aufweisen. ..................................... 39 Schema 3-4. Syntheseroute des Bisulfon-Interkalators 3; i) Piperidin-Hydrochlorid, Paraformaldehyd, Salzsäure, EtOH, 105 °C, 18 h; ii) 4-Methylthiophenol, Piperidin, 37% Formaldehydlösung, EtOH/MeOH (1:1), 105 °C 4 h; iii) Oxone, MeOH/H20 (1:1), 24 h, RT. .................................................. 40 Schema 3-5. Mechanismus der Mannich-Reaktion über die Zwischenstufe der Bildung eines Iminiumions.[] ........................................................................................................................................ 40 Schema 3-6. Mechanismus einer Sulfid-Oxidation via Oxone®. ........................................................... 42 Schema 3-7. Syntheseroute des Amin-Interkalators 6; i) Di-tert-butyldicarbonat, 1,4-Dioxan, RT, 18 h; ii) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, 24 h, iii) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 24 h. ................................. 45 Schema 3-8. Mechanismus der HBTU-Kupplungsreaktion zwischen einer Carboxy- und einer Aminverbindung. ................................................................................................................................... 46 Schema 3-9. Syntheseroute A des Aza-Kronenther-Interkalators 8; i) THF, Reflux, 3 h;[151] ii) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h........................................................................................................ 51 Schema 3-10. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Interkalators 11; i) BOP, HOBt, DIEA, Dimethylformamid, RT, 48 h; ii) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 24 h; iii) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h. ................................................................................................................................................. 53 Verzeichnisse | 217 Schema 3-11. Syntheseroute des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins 14. i) n-BuLi, Tetrahydrofuran, -78 °C, 1 h; ii) Trimethylzinnchlorid, Tetrahydrofuran, -78 °C – RT, 90 Min; iii) 2-Chloropyridin-4-methylester, Tetrakis(triphenyl-phosphan)-Palladium, Dioxan, Reflux, 18 h; iv[154]) NaOH, Methanol, HCl, RT, 5 h; v) Oxalylchlorid, Tetrahydrofuran, Reflux, 3 h. ......................................................................................... 59 Schema 3-12. Mechanismus der Palladiumkatalysierten Stille-Kreuzkupplung am Beispiel der Synthese des 4-Carbonsäure-2,2´-Bipyridins (14). ................................................................................ 60 Schema 3-13. Syntheseroute des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 28. i-a) EDC·HCl, DMAP, Triethylamin, Dimethylformamid, RT, 24 h; i-b) Triethylamin, Tetrahydrofuran, Reflux, 3 h. .................................... 62 Schema 3-14. Schematischer Mechanismus einer EDC-Aktivierung.[,] ................................................. 63 Schema 3-15. pH-abhängige Wechselwirkung zwischen substituierter Salicylhydroxamsäure und Phenylboronsäure. ................................................................................................................................ 66 Schema 3-16. Syntheseroute des Boronsäure-Interkalators 18; i) DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h; ii) Trifluoressigsäure, Chloroform, RT, 24 h. .......................................................................................... 67 Schema 3-17. Syntheseroute des Azid-TEO-Amins 21 mittels Diazo-Transfer-Reagenzes; i) Sulfurylchlorid, Imidazol, 0 °C, ACN, Acetylchlorid, EtOH; ii) Di-tert-butyldicarbonat, 1,4-Dioxan, RT, 18 h; iii) K2CO3, MeOH, CuSO4, H2O, RT, 24 h; iv) Trifluoressigsäure, DCM, RT, 16 h. ........................... 73 Schema 3-18. Mechanismus eines Diazo-Transfers mit Trifluormethansulfonylazid. .......................... 73 Schema 3-19. Syntheseroute des Azid-Interkalators 23; i) HBTU, DIEA, Dimethylformamid, 24 h; ii) Oxone®, MeOH/H2O (1:1), RT, 48 h....................................................................................................... 75 Schema 3-20. Schematischer Mechanismus einer kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloaddition. . 80 Schema 3-21. Syntheseroute des 2-Hydroxy-4-(pent-4-inamido)-N-(trityloxy)-benzamids; i) DIEA, Dimethylformamid, 80 °C, 48 h; ii) N-Trityloxyamin, Tetrahydrofuran, RT, 48 h.................................. 81 Schema 3-22. Syntheseroute des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, THF/H2O (2:1), RT, 24 h. ........................................................................................... 81 Schema 3-23. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Interkalators 27 via Click-Reaktion; i) NHydroxysuccinimid, EDC·HCl, DMAP, Dichlormethan, RT, 24 h;[157] ii) DCM, RT, 24 h; iii) DIEA, Kupfer(I)iodid, THF, RT, 24 h. ................................................................................................................ 84 Schema 3-24. Allgemeine Syntheseroute der funktionalisierten Interkalatoren. ................................ 88 Schema 3-25. Ausbildung des Michael-Akzeptor-Systems unter basischen Bedingungen durch Abspaltung eines Toluolsulfonsäure-Restes, ausgehend von der Grundform des Bisulfons................ 93 Schema 3-26. Mechanismus der Interkalation, dargestellt mit Somatostatin als zyklisches Peptid; a) Reduktive Spaltung der Disulfidbindung; b) Nukleophiler Angriff am Michael-Akzeptor-System; c) Abspaltung der Abgangsgruppe sowie Ausbildung eines neuen Akzeptor-Systems; d) Wiederaufbau der früheren Disulfidbindung durch eine zweite Michael-Addition.[18] ................................................ 93 Schema 3-27. Synthese des Azid-Somatostatins 28; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 40 min; iii) RT, 24 h. ................ 97 Schema 3-28. Synthese des Azid-Glutathions 29; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=7.8), RT, 24 h; ii) Glutathion, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24 h. ..................................................... 100 Schema 3-29. Biokonjugation des Azid-Kronenether-Interkalators 11 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h......................................... 103 Schema 3-30. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenethers 38; i) BOP, HOBt, DIEA, Dimethylformamid, RT, 24 h. ............................................................................................................................................... 105 218 | Verzeichnisse Schema 3-31. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenther-Somatostatins; i) H2O/Dimethylformamid, RT, 24 h. ..................................................................................................................................................... 105 Schema 3-32. Synthese des Maleimid-Aza-Kronenether-Glutathions 39; i-a) Glutathion, Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), 45 °C, 24 h; i-b) Glutathion, Dimethylformamid, 45 °C, 24 h. ............................................................................................................................................... 106 Schema 3-33. Biokonjugation des 2,2´-Bipyridin-Interkalators 16 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h................................................... 107 Schema 3-34. Biokonjugation des Boronsäure-Interkalators 18 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24-48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. ............................................ 110 Schema 3-35. Biokonjugation des Salicylhydroxamsäure-Interkalators 24 mit Somatostatin und Glutathion; i) 40% ACN in Phosphatpuffer (50 mM, 10 mM EDTA, pH=8.0), RT, 24 h; ii) Somatostatin, TCEP, Phosphatpuffer, RT, 24-48 h; iii) Glutathion, Phosphatpuffer, RT, 24 h. .................................. 113 Schema 3-36. Syntheseroute des Aza-Kronenether-Somatostatins über das Azid-Somatostatin 28; i) DIEA, Kupfer(I)iodid, THF/H2O, RT, 24 h. ............................................................................................. 122 Schema 3-37. Syntheseroute von Boronsäure-Somatostatin via Click-Reaktion; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, THF/H2O, RT, 24 - 48 h. .......................................................................................... 123 Schema 3-38. Synthese des Salicylhydroxamsäure-Somatostatins 36 via Click-Reaktion; i) Kupfer(II)sulfat, Natriumascorbat, Tetrahydrofuran, H2O, RT, 24-48 h. ............................................................ 125 Schema 3-39. Syntheseroute des Somatostatin-Dimers 40 via kupferkatalysierter Click-Reaktion; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, H2O, RT, 24 h. .............................................................................. 131 Schema 3-40. Synthese der Trimer-Kernverbindung 41; i) EDC, DMAP, Tetrahydrofuran, RT, 24 h. . 133 Schema 3-41. Syntheseroute des Somatostatin-Trimers via Kernverbindung 41; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, Tetrahydrofuran/Wasser, RT, 24-48 h. .................................................................. 134 Schema 3-42. Syntheseroute der TEO-Trimer-Kernverbindung 43; i) wässrige Natronlauge, Tetrahydrofuran, 5 °C, RT, 2 h; ii) Kaliumcarbonat, Dimethylformamid, 80 °C, 24 h . ........................ 135 Schema 3-43. Synthese des Somatostatin-Trimers via Kernverbindung 43; i) Kupfer(II)-sulfat, Natriumascorbat, Wasser, RT, 24-48 h. .............................................................................................. 136 Schema 3-44. Dimerisierung des Aza-Kronenther-Somatstatins 30; i) Wasser, KI/NaBr in Wasser, RT, 1 h. .......................................................................................................................................................... 137 Schema 3-45. Übergangsmetall-Komplexbildung des Bipyridin-Somatostatins 32; i) RuCl3, EtOH, 80 °C, 18 h. ..................................................................................................................................................... 140 Schema 3-46. Mögliches Somatostatin-Dimer via dem pH-sensitiven SHS-PBS-System. ................... 141 Schema 4-1. Schematische Darstellung eines Somatostatin-Konjugats, sowie die beiden verfolgten Synthesestrategien grafting onto und grafting from. ......................................................................... 142 Schema 4-2. Mechanismus der Biokonjugation bzw. Interkalation eines Bisulfons, dargestellt am Beispiel zweier unterschiedlicher Peptide sowie einem Peptid mit intramolekularer Disulfidbrücke. ............................................................................................................................................................. 144 Literatur | 219 7 Literatur [1] S. Sangiambut, K. Channon, N. M. 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Ferner möchte ich mich bei Markus Lamla für die zahlreichen MALDI-Messungen sowie einer nicht enden wollenden Diskussionsbereitschaft bezüglich dieser Spektren bedanken. Ich danke auch Ulrich Ziegler und Birgit Mögenburg für die Durchführung aller NMR-Messungen sowie Magdalene Zimmermann für die Bestellungen. Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Praktikanten und Bachelorstudenten, unter anderem Lena Ebert, Maxim Pfeiffer, Thuy Tam Tran und Alexander Mengele. Ich danke der gesamten Arbeitsgruppe OC3 für die außerordentlich nette Arbeitsatmosphäre sowie einer guten wissenschaftlichen und persönlichen Zusammenarbeit. Für die netten Grillabende und viele lustige Gespräche danke ich insbesondere Felix Boldt, Andreas Riegger, Matthias Arzt, Christiane Seidler, Fabian Bischoff, Pascal Heitel und Stefanie Sieste. Mein ganz besonderer Dank geht an Laura Pendi, Bettina Stöckle, Jan Szabo und Roman Vill, welche auch privat immer ein offenes Ohr für mich und meine viiiielen Problemen hatten und ohne die ich die letzten Jahre sicher nicht überstanden hätte. Zum Schluss danke ich Martin Rauscher, welcher mich während meines gesamten Studiums sowie meiner Doktorarbeit mit unendlicher Geduld ertragen und mit ganz viel Verständnis unterstützt hat. Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Alle Stellen, die dem Wortlaut oder dem Sinn gemäß anderen Arbeiten entnommen wurden, sind durch Angabe der Quellen kenntlich gemacht. ………………………………………………….. Ort, Datum …………………………………… Unterschrift Aus datenschutzrechlichen Gründen sind persönliche Kapitel in dieser Version nicht verfügbar. Publikationen Bis-sulfide bioconjugates for glutathione triggered tumor responsive drug release T. Wang, D. Y. W. Ng, Y. Wu, J. Thomas, T. T. Trana, T. Weil, Chem. Comm. 2014, 50, 11161118. A Disulfide Intercalator Toolbox for Site-Directed Protein Chemistry T. Wang, Y. Wu, S. L. Kuan, O. Dumele, D. Y. W. Ng, J. Thomas, M. Lamla, C. Barner-Kowollik, T. Weil, Chem. Eur. J. 2015, 21, 228-238