Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radiologische Onkologie

Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radiologische Onkologie
(Direktor: Univ. - Prof. Dr. M. Molls)
Klinikum rechts der Isar
Technische Universität München
Etablierung eines Modells zur Untersuchung
strahleninduzierter Spätfolgen an der Niere
und möglicher Modulatoren
Lu Cai
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der
Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen
Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ. - Prof. Dr. D. Neumeier
Prüfer der Dissertation:
1. Univ. - Prof. Dr. M. Molls
2. Univ. - Prof. Dr. Dr. R. Senekowitsch-Schmidtke
Die Dissertation wurde am 27. März 2007 bei der Technischen Universität
München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 14. Oktober 2007
angenommen.
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
2. Wissenschaftlicher Hintergrund
2
2.1. Ionisierende Strahlen und ihre Wirkungen auf den Organismus
2
2.1.1. Strahlenbiologie
2
2.1.2. Die Strahlennephropathie
2.1.2.1. Die Niere
2.1.2.2. Die Strahlennephropathie
2.1.2.3. Therapieversuche mit verschiedenen Substanzen
3
3
5
6
2.2. IGF-1
8
2.2.1. Allgemeines
8
2.2.2. IGF - binding protein
9
2.2.3. IGF - Rezeptor und Signaltransduktion
10
2.2.4. IGF Effekte
2.2.4.1. auf verschiedene Organe
2.2.4.2. auf bestrahlte Organe
2.2.4.3. auf die gesunden Nieren
2.2.4.4. auf die insuffizienten Nieren
12
12
13
14
15
2.3. pifithrin-α
16
2.3.1. p53
2.3.1.1. normale Funktion von p53
2.3.1.2. p53 und Tumorentstehung
16
16
17
2.3.2. p53-Inhibitor
18
3. Eigene Untersuchungen
19
3.1. Zielvorstellungen
19
3.2. Material und Methoden
19
3.2.1. Versuchstiere
19
3.2.2. Versuchsplan
20
3.2.3. Nierenszintigraphie
3.2.3.1. Allgemeines
3.2.3.2. Injektion des 99mTc-DMSA
3.2.3.3. Nierenszintigraphie-Aufnahme
3.2.3.4. Auswertung der Nierenszintigraphie-Aufnahme
22
22
23
23
26
3.2.4. Bestrahlung
27
3.2.5. IGF-1 Injektion
30
3.2.6. p53-Inhibitor Injektion
30
4. Ergebnisse
31
4.1. Morbidität und Mortalität während der Nachbeobachtungszeit 31
4.1.1. Nebenwirkung der Anästhesie
32
4.1.2. Folgen der Bestrahlung
33
4.2. Nierenszintigramme
33
4.3. Auswertung der Nierenszintigraphie - Daten
35
4.3.1. Ausgangswerte
35
4.3.2. Ausschlusskriterien
35
4.3.3. Verlauf der Nierenszintigraphie-Werte
35
4.3.4. Statistik
4.3.4.1. Kontroll- und IGF-1-Gruppen
4.3.4.2. pifithrin-α-Gruppe
36
37
42
4.4. Vorhersage des Verlaufs der Nierenfunktion
44
5. Diskussion
5.1. Einfluss der Methodik auf die Ergebnisse
45
45
5.1.1. Bestrahlung
45
5.1.2. Narkosen
46
5.1.3. Messung der Nierenfunktion
47
5.1.4. Auswertung
48
5.2. Ergebnisse
5.2.1. Kontrollgruppen
5.2.2. IGF-1-Gruppen
5.2.3. pifithrin-α-Gruppe
49
49
49
50
5.3. Strahlennephropathie
51
5.4. IGF-1 Anwendungen und Tumoren
53
5.4.1. IGF-1-Konzentration am Wirkungsort
53
5.4.2. Optimierung der IGF-1-Applikationen
53
5.4.3. IGF-1 und die Niere
54
5.4.4. IGF-1 und Tumoren
55
5.4.5. Anwendungsmöglichkeiten
56
5.5. pifithrin-α Anwendungsmöglichkeiten und Tumoren
57
6. Zusammenfassung
59
7. Abkürzungsverzeichnis
60
8. Literaturverzeichnis
62
9. Danksagung
72
1. Einleitung
Seit Beginn der diagnostischen und therapeutischen Nutzung von ionisierenden
Strahlen im Jahre 1896, wenige Monate nach der Veröffentlichung seiner
Entdeckung durch Wilhelm Conrad Röntgen, sind Strahlenfolgen am gesunden
Gewebe ein unerwünschter und dosislimitierender Faktor. Bei der ersten
therapeutischen Anwendung durch den Dermatologen Leopold Freund gegen einen
großflächigen Naevus pigmentosus piliferus wurde eine verbrennungsartige
Zerstörung der Haut verursacht, die eine bleibende Narbe hinterließ.
Heutzutage wird die Strahlentherapie bei über 50 Prozent der Patienten mit malignen
Erkrankungen
eingesetzt.
Durch
verbesserte
strahlenbiologische
Kenntnisse
bezüglich der Dosierung und fraktionierten Applikation der Dosis und neuere
Techniken
(z.B.
Hochvolttherapie,
Mehrfelderbestrahlung,
konformale
und
stereotaktische Verfahren, zum Teil mit intensitätsmodulierten Feldern) können bei
guter Erfassung des Tumors die Nebenwirkungen am umliegenden gesunden
Gewebe erheblich verringert werden.
In bestimmten Situationen, z.B. bei der Ganzkörperbestrahlung zur Vorbereitung
einer
Stammzelltransplantation,
können
trotz
zahlreicher
Fortschritte
die
Normalgewebereaktionen dosislimitierend sein, wenn man das Risiko chronischer
Strahlenspätfolgen niedrig halten möchte.
In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Substanzen getestet, die das gesunde
Gewebe vor den schädigenden Einflüssen ionisierender Strahlung schützen sollen. In
der vorliegenden Arbeit wird die radioprotektive Wirkung von insulin-like growth
factor-1 (IGF-1) und dem p53-Inhibitor pifithrin-α in einem Tiermodell zur
abdominalen Strahlentherapie unter Einschluss der Niere untersucht.
1
2. Wissenschaftlicher Hintergrund
2.1. Ionisierende Strahlen und ihre Wirkungen auf den Organismus
2.1.1. Strahlenbiologie
Hochenergetische
Strahlungen
können
im
Organismus
zu
verschiedenen
physikalischen, chemischen und biologischen Effekten führen. Durch Übertragung
ihrer Energie auf das Gewebe kommt es zur Ionisation, Zerstörung von chemischen
Strukturen, Entstehung von hochreaktiven Radikalen, Spaltung von Bindungen,
Wechselwirkung mit verschiedenen biologischen Zielstrukturen, Schädigung der
Zellgefüge etc.
Eine Schlüsselrolle bei der Vererbung und Steuerung der Zellfunktionen übernimmt
die DNA im Zellkern. Eine irreparable Schädigung ist besonders schwerwiegend für
die Funktion und das Überleben der Zelle. Durch Einwirkung der Strahlen können an
der DNA Einzel- oder Doppelstrangbrüche, Veränderungen an den Basen und
Zerstörung der Wasserstoffverbindungen auftreten. Des Weiteren kann es zu
Störungen des Stoffwechsels durch Schädigung der (Kern-)Membran und
Eiweißdenaturierungen kommen. Für die Reparatur dieser Schäden besitzt die Zelle
verschiedene Reparaturmechanismen.
Nach einer irreparablen Beschädigung kann die Zelle unterschiedlich reagieren:
entweder sie stirbt ab (Nekrose) oder sie wird in die Apoptose (programmierter
Zelltod) überführt, oder, wenn die Veränderung an der DNA nicht erkannt wird, kann
diese auch bei noch teilungsfähigen Zellen an die nächstfolgende Generation
weitergegeben werden. Auf diese Weise können zum Beispiel Tumoren entstehen,
wenn die regulatorische Gene und Moleküle mutiert oder funktionsunfähig sind.
Ein wichtiger "Wächter" dieser Vorgänge und der Integrität des Genoms ist das p53Tumorsuppressorgen bzw. -protein, das unter anderem die Apoptose induzieren und
2
somit verhindern kann, dass die Mutationen an die Nachkommen weitergegeben
werden 130.
2.1.2. Die Strahlennephropathie
2.1.2.1. Die Niere
Die Niere ist ein beim Menschen ca. 150 Gramm schweres, bohnenförmiges, paarig
angelegtes Organ, das retroperitoneal unterhalb des Zwerchfells zu beiden Seiten der
Wirbelsäule liegt. Makroskopisch unterscheidet man verschiedene Zonen Nierenrinde, -mark und -becken. Sie besteht aus ca. einer Million ihrer funktionellen
Einheiten, dem Nephron, bestehend aus Glomerulum, proximalen Tubulus,
Henle'scher Schleife und distalen Tubulus.
Im Glomerulum wird aus einem Kapillarknäuel, das von der Bowman’schen Kapsel
ausgekleidet und vom Mesangium umgeben wird (Abbildung 2.1), der Primärharn
durch die Poren zwischen den Podozytenausläufern aus dem Blut filtriert. Im
Tubulussytem wird durch Rückresorption von Wasser, Elektrolyten und anderen
filtrierten Molekülen der Harn konzentriert und durch Sekretion von körperfremden
Stoffen (z.B. Medikamente) und körpereigenen Stoffwechselprodukten (z.B.
Harnsäure) das Blut gereinigt. Schließlich gelangt der Harn in die Sammelrohre und
von dort über das Nierenbecken und die Harnleiter in die Blase, von wo er
ausgeschieden wird 68.
Glomeruläre Mesangiumzellen enthalten in ihren Fortsätzen kontraktile Filamente,
die durch Kontraktion eine Reduktion des glomerulären Filtrationskoeffizienten
bewirken und damit zu einem Abfall der glomerulären Filtrationsrate (GFR) führen
können. Daneben sind sie Bestandteil des Retikuloendothelialen Systems und zur
Phagozytose fähig 85.
3
Mit einem arteriellen Blutfluss von ca. einem Liter pro Minute, was etwa 20 Prozent
des Herzzeitvolumens entspricht, gehört die Niere zu den am besten durchbluteten
Organen. Die GFR beträgt etwa 120 Milliliter pro Minute, was hochgerechnet rund
170 Liter Primärharn pro Tag gleichkommt. Nach Konzentrierung entstehen letztlich
900 bis 1500 Milliliter Harn pro Tag 68.
Mit der Produktion des Harns reguliert die Niere den Wasser- und Elektrolythaushalt
und den osmotischen Druck sowie das Säure-Basen-Gleichgewicht. Über die
Hydroxylierung
von
25-Hydroxy-Calciferol
zu
1,25-Dihydroxy-Calciferol
kontrolliert die Niere den Calcium- und Phosphat-Haushalt. Die Differenzierung von
hämatopoetischen Stammzellen wird durch das in der Niere produzierte
Erythropoetin (EPO) gefördert. Mit dem ebenfalls in der Niere hergestellten Renin
kann über das Renin-Angiotensin-System unter anderem der Blutdruck kontrolliert
werden.
1 = Glomeruluskapillaren
2 = Gefäßendothel
3 = Globuläre Basalmembran
(GBM)
4 = Mesangium
5 = Podozyt
6 = parietales Epithel der
Bowmanschen Kapsel
7 = Basalmenbran der
Bowmanschen Kapsel
8 = Übergang dieser Basalmembran
in die GBM
9 = proximaler Tubulus
10 = Kapselraum
11 = intraglomer uläres Segment der
efferenten Arteriole
12 = extraglomeruläres Mesangium
13 = Macula densa als Zellplaque in
der Pars recta des distalen
Tubulus
14 = granulierte Zellen
15 = glatte Muskelzellen der
glomerulären Arteriolen
16 = sympathische Nervenfasern
12, 13, 14 bilden nach klassischer Definition den
juxtaglomerulären Apparat (JGA)
Abb. 2.1.: Schematische Darstellung eines Längsschnittes durch ein Nierenkörperchen mit Gefäß- und
68
Harnpol (aus Benninghoff, 1994, Band 2, Seite 42)
4
2.1.2.2. Die Strahlennephropathie
Zum ersten Mal wurden die Auswirkungen von Strahlen auf die Nieren Anfang des
20. Jahrhunderts beschrieben
7, 26
. Somit wurde die Niere schon früh als sehr
strahlenempfindliches Organ des menschlichen Organismus erkannt.
Durch ionisierende Strahlen können an der Niere vielfältige Veränderungen
hervorgerufen werden. Die Übergänge von einer leichten Beeinträchtigung der
Funktion bis zum Vollbild einer Strahlennephropathie sind fließend. Es treten
unterschiedliche vaskuläre, glomeruläre und tubuläre Veränderungen auf. Die Höhe
der Strahlendosis und das Volumen des bestrahlten Nierenareals sowie die
individuelle Disposition spielen eine große Rolle für die Wahrscheinlichkeit des
Auftretens und das Ausmaß der Schädigung 16.
Klinisch unterscheidet man die akute und chronische „Strahlennephritis“, wobei
dieser Begriff etwas irreführend ist, da histologisch keine eindeutigen Anzeichen
einer Entzündung vorliegen. Bei der akuten „Strahlennephritis“ kann sechs bis zwölf
Monate nach Bestrahlung eine Azotämie, Hypertension und Anämie
16
sowie eine
Proteinurie klinisch festgestellt werden. Daneben treten Veränderungen der GFR, des
renalen
Plasmaflusses
„Strahlennephritis“
kann
und
der
sich
Tubulusfunktion
primär
oder
auf.
sekundär
Die
aus
chronische
der
akuten
„Strahlennephritis“ entwickeln 79. Sie ist durch tubuläre und vaskuläre Schädigungen
gekennzeichnet.
Nach einer hochdosierten Ganzkörperbestrahlung als Vorbereitung für die
Stammzelltransplantation
können
die
Merkmale
der
thrombotischen
Mikroangiopathie oder ein hämolytisch urämisches Sydrom auftreten 16.
Die histologischen Veränderungen der Niere können bis zu einer schweren
interstiellen Fibrose, Mesangiolyse (Auflösung von Mesangiumzellen und Matrix),
Gefäßsklerose und Tubulusatrophie fortschreiten. Die Glomeruli sind überwiegend
intakt, eine prominente Kernvergrößerung sowie eine Hyalinisierung sind möglich.
5
Die Niere wird in einem fortgeschrittenen Stadium narbig umgebaut und erscheint
makroskopisch verkleinert 16.
2.1.2.3. Therapieversuche mit verschiedenen Substanzen
Bisher konnte eine manifeste Strahlennephropathie größtenteils nur symptomatisch
therapiert werden.
Die hochreaktiven Radikale, die durch die Strahlen gebildet werden, verursachen
neben den direkten DNA Schäden einen Teil der Zell- und Gewebereaktionen.
Antioxidantien (z.B. Amifostin
135
) können Radikale abfangen und damit
radioprotektiv wirken. Ob dies selektiv, ohne die gewünschte Therapiewirkung zu
vermindern, erfolgt, ist umstritten. Ein zugelassenes Einsatzgebiet ist die Prävention
der Xerostomie bei der Bestrahlung im Kopf-Hals-Bereich (Mundhöhlen-Pharynxund Larynxkarzinome). Daten zur Strahlennephropathie liegen nicht vor.
Auch Vitamine (A, C und E) haben antioxidative Eigenschaften. Ihre Wirkung als
radioprotektive Agentien ist seit über 50 Jahren bekannt. Die Wirkung (z.B. von
Vitamin A) auf die Strahlennephropathie ist umstritten 8, 95.
Eine Behandlung mit Steroiden wie Dexamethason schützt im Tierversuch (Ratten)
die Niere vor der Destruktion des Nephrons 37. 90 Tage nach der lokalen Bestrahlung
mit 20 Gray wurden in der histologischen Untersuchung, bei Laborparametern und
Nierenfunktion eine im Vergleich zu den unbehandelten Tieren geringere
Schädigung der Glomeruli und Tubuli beobachtet. Eine Wirkung auf die
Fibrosierung wurde nicht festgestellt.
Eine andere Möglichkeit, die intensiv erforscht wird, ist der medikamentöse Eingriff
in das Renin-Angiotensin-System. Eine Therapie mit Hemmstoffen des Angiotensin
Converting Enzyme (ACE-Hemmern) oder Angiotensin II-Rezeptor-Subtyp-1Antagonisten (AT1-Antagonisten) senkt durch Vasodilatation (verminderte Bildung
und Wirkung des vasokonstriktorischen Angiotensin II) den intraglomerulären Druck
6
und verlangsamt somit die sklerotischen Prozesse 82. In einem Tiermodell konnte die
Arbeitsgruppe um Moulder bei Ratten zeigen, dass die Gabe von ACE-Hemmern
oder AT1-Antagonisten in niedriger Dosierung zur Behandlung der Nephropathie
beitragen kann
bestätigen
18, 19, 89 - 94
. Auch andere Autoren konnten diesen positiven Effekt
139
. Andererseits kann die Gabe von Angiotensin II dosis- und
zeitpunktabhängig die Strahlennephropathie verschlechtern 17.
Die Ausbildung von Thrombosen in den Arterien und Arteriolen ist eines der
Phänomene, die während der Manifestation der Strahlennephropathie beobachtet
wurden. Dabei spielen die Metabolite der Arachidonsäure eine große Rolle. Sie
können unter anderem die glomeruläre Permeabilität für Albumin erhöhen
123
. Eine
Langzeittherapie mit Acetylsalicylsäure (über die hemmende Wirkung auf die
Thromboxan A2 - Synthese und die Plättchenaggregation) vermag aber nur eine
mäßige, nicht signifikante Reduktion der Strahlenschäden an der Niere zu bewirken,
wobei histologisch keine Veränderungen zu unbehandelten Kontrolltieren sichtbar
sind 131, 132.
Wachstumsfaktoren können in Zellkulturen die strahleninduzierte Mortalität senken.
Der Effekt ist wahrscheinlich auf die erhöhte Fähigkeit zur Zellreparatur
zurückzuführen 81.
Erythropoetin (EPO) dagegen scheint keine protektive Wirkung aufzuweisen. Im
Tierversuch verschlechterte sich die Nierenfunktion im Vergleich zur Kontrollgruppe
6
.
7
2.2. IGF-1
2.2.1. Allgemeines
Es gibt zwei Vertreter der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren, IGF-1 und IGF-2,
die strukturelle Ähnlichkeiten mit Proinsulin aufweisen
116
. Von Bedeutung für die
vorliegende Arbeit ist nur IGF-1.
IGF-1 ist ein einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7,649
Kilodalton, das aus 70 Aminosäuren besteht und drei Disulfidbrücken enthält. Das
endogene IGF wird durch die Stimulation des hypophysären Wachstumshormons
(STH) in der Leber (ca. 70 Prozent des im Blut zirkulierenden IGF), den Nieren, dem
Bindegewebe und anderen Organen produziert. Die Effekte des STH werden teils
durch
IGF-1
vermittelt,
daher
der
ältere
Name
Somatomedin
C.
Die
Serumkonzentration von IGF-1 ist altersabhängig. Die höchste Konzentration findet
man während der Pubertät, während bei Kleinkindern und im Alter kaum IGF-1
nachweisbar ist. Neben dem Alter beeinflussen auch das Geschlecht und in geringem
Maße Rauchen die IGF-1-Konzentration 65, 113.
2.2.2. IGF-binding protein
Da IGF-1 eine sehr kurze Halbwertszeit hat, wird es im Blut an Transportproteine,
sogenannte insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP), gebunden. Dadurch
wird die Halbwertszeit auf mehrere Stunden ausgedehnt. Nur weniger als ein Prozent
des IGF-1 zirkuliert in freier Form. Insgesamt sind bisher sieben Proteine der
IGFBP-Familie zugeordnet
63, 119, 136
. Sie wurden numerisch IGFBP-1 bis IGFBP-7
benannt. Hauptbildungsort der Proteine ist die Leber.
8
Von Bedeutung ist unter allem das IGFBP-3 (264 Aminosäuren, Molekulargewicht
29 Kilodalton). Es liegt mit IGF und einer säurelabilen Untereinheit (acid-labile
subunit, ALS) in einem Komplex vor und verhindert damit, dass IGF-1 die
Gefäßwände durchdringen und an seinen Rezeptor gelangen kann. Erst nach der
Spaltung durch Proteasen wird IGF-1 freigesetzt und kann seine Wirkung entfalten.
Neben der Transport- und Reservoirfunktion für IGF haben die IGFBP IGF-1unabhängige Wirkungen, z.B. induziert IGFBP-3 die Apoptose und fördert die
Produktion von anderen wachstumshemmenden Faktoren wie Transforming-Growth
Factor-ß (TGF-β) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)
110
. Der antiproliferative
Effekt des IGFBP-3 wird über seinen eigenen Rezeptor, den IGFBP-3-Rezeptor,
welcher möglicherweise mit dem Typ V TGF-β-Rezeptor identisch ist
73
, an der
Zellmembran vermittelt. Die Wechselwirkung der IGFBP auf Tumoren sind sehr
kompliziert und werden noch erforscht 39, 40, 41, 42, 103.
2.2.3. IGF-Rezeptor und Signaltransduktion
IGF-Rezeptoren wurden in der Niere auf glomerulären Mesangiumzellen,
proximalen Tubuluszellen und Gefäßendothelzellen sowie vaskulären Muskelzellen
nachgewiesen 27.
IGF-1 bindet vornehmlich an den Typ-1-IGF-Rezeptor, ein Transmembranprotein
mit intrazellulärer Tyrosinkinaseaktivität. Die Rezeptoren befinden sich als
Monomere, bestehend aus einer extrazellulären α-Untereinheit und einer trans- bzw.
intrazellulären β-Untereinheit, die über Disulfidbrücken verbunden sind, in der
Membran. Nach Bindung eines Liganden durch den extrazellulären Teil des
Rezeptors kommt es zur Dimerisierung und Autophosphorylierung bestimmter
Tyrosin-Reste innerhalb der zytosolischen Domäne. Dadurch wird eine Bindungsund Anlagerungsstelle für die Signalmoleküle geschaffen 3.
9
Über verschiedene Signalmoleküle (IRS-1/2, Shc, Grb-2 etc.) werden durch den rasMAP-Signaltransduktionsweg
und
die
PI3-Kinasekaskade
Einfluss
auf
die
Transkription der Gene, das Zellwachstum, die Differenzierung der Zellen sowie auf
den programmierten Zelltod genommen 71, 129.
Abb. 2.2. Signaltransduktion über den Typ-I-IGF-Rezeptor (aus LeRoith, 2001)
71
Bei der Schädigung des Erbmaterials (DNA) kann IGF-1 über die p53-Signalkaskade
in die Reparaturmechanismen eingreifen 49.
IGF-1 kann auch an den Typ-2-IGF-Rezeptor, einen kationen-abhängigen Mannose6-Phosphat-Rezeptor, binden. Die Affinität zu diesem Rezeptor ist viel geringer als
zu dem Typ-1-Rezeptor. Vor allem IGF-2 bindet normalerweise an diesen Rezeptor
3
.
Durch seine insulinähnliche Struktur kann IGF an den Insulin-Rezeptor binden,
allerdings ist die Affinität zum Insulin-Rezeptor sehr gering. Bei normaler IGF-1
10
Serumkonzentration spielt dieser Prozess keine große Rolle. Hochdosiertes exogenes
IGF
kann
möglicherweise
eine
Hypoglykämie
durch
die
Bindung
an
Insulinrezeptoren auslösen.
2.2.4. IGF Effekte
IGF-1 vermittelt sowohl endokrine als auch auto-/parakrine Effekte. Es wirkt
antiapoptotisch und fördert die DNA-Synthese und damit die Zellteilung/vermehrung. Möglicherweise beschleunigt IGF-1 während des Zellzyklus den
Übergang vom G1- in die S-Phase 14, 72.
2.2.4.1. auf verschiedene Organe
In der Klinik nutzt man bei Patienten mit Akromegalie die Messung des IGF-1Serumspiegels zur Erfolgskontrolle der Therapie. IGF vermittelt einige der STHWirkungen an den Knochen. Während das STH direkt die Osteoblasten und
Chondrozyten an den Epiphysen stimuliert, fördert IGF die Kollagensynthese, die
Proliferation der Zellen und den Knochenumsatz
140
.
Durch seine Insulinähnliche Struktur beeinflusst IGF den Insulin-Regelkreis. IGF
erhöht die Insulinsensitivität und erniedrigt gleichzeitig die Insulinsekretion. Ein
geringer Insulinspiegel fördert die Lipolyse und die Freisetzung von freien
Fettsäuren ins Blut. In der Leber hemmt IGF die Bildung des VLDL-Lipoproteins
140
.
Da IGF einen muskelaufbauenden und proteinsparenden Effekt durch verminderte
Proteolyse und Proteinoxidation hat, wird IGF auch als Anabolikum verwendet. Bei
dieser Langzeit-Anwendung wurde eine Downregulation des IGF-Rezeptors
beschrieben 2.
11
IGF verbessert die Funktion und die Pumpleistung des Herzens durch eine
Stimulation der Herzkontraktion (positiv inotroper Effekt) und Senkung der Nachlast
(durch Abnahme des Gefäßwiderstands und Dilatation der Gefäße), was eventuell
eine Therapiemöglichkeit bei Herzinsuffizienz darstellt
Dilatation der Gefäße zu einer Senkung des Blutdrucks
25
. Außerdem führt die
105
. Unter IGF-Einfluss
wurde eine Erhöhung der Herzzeitminuten, der Ejektionsfraktion und des
Schlagvolumens beobachtet. Eine langfristige Wirkung von IGF auf das Herz ist
möglicherweise auf die Stimulation von myofibrillären Genen zurückzuführen 24.
Andererseits wird dem IGF-1 eine Rolle bei pathologischen Gefäßprozessen, wie
z.B. Atherosklerose, Hypertension und diabetische Gefäßerkrankung zugeschrieben
22
.
Als neurotrophischer Faktor begünstigt IGF das Wachstum und die Differenzierung
von Oligodendrozyten und deren Vorläuferzellen
9, 84
. In Tierversuchen wirkt IGF-1
positiv auf die experimentelle Autoimmunencephalomyelitis
experimentell erzeugte cerebrale Hypoxie-Ischämie
Multipler Sklerose erkrankten Patienten
31
75
15, 77
und auf die
. Die klinische Studie mit an
ergab dagegen keine positiven Resultate.
Auch auf das periphere Nervensystem (z.B. auf die Motoneuronen) wirkt IGF-1
fördernd auf das Wachstum und die Regernation nach Schädigung 98.
12
2.2.4.2. auf bestrahlte Organe
Bisher wurde über die IGF Wirkung auf zwei Organsysteme (Darm und zentrales
Nervensystem) berichtet.
Howart et al. beschrieben eine protektive Wirkung von IGF-1 auf die
strahleninduzierte Enteritis in Ratten, wobei sie bei der Gruppe, die nach der
abdominellen Bestrahlung mit zehn Gray vier Tage lang IGF-1 erhalten hatte, einen
verringerten Gewichtsverlust und eine beschleunigte Erholung der interstinalen
Mucosa entdeckten
55, 56
. Einen Einfluss auf die Dysmotilität als Folge der
Bestrahlung scheint IGF-1 nicht auszuüben 33.
Ebenso hatte eine Gruppe in Griechenland diese Wirkung untersucht
4, 96
. Die
Autoren evaluierten an Ratten vier Tage nach der Bestrahlung mit elf Gray
histologisch den Darm (terminales Ileum). Die Gruppe, die an den ersten drei Tagen
nach der Bestrahlung je 0,1 Milligramm IGF-1 pro Kilogramm Körpergewicht
subcutan erhalten hatte, wies weniger Apoptose der intestinalen Epithelzellen auf als
die unbehandelten Tiere.
In
einem
Modell
der
Strahlenmyelopathie
strahleninduzierten Neurotoxizität beobachtet
wurde
eine
Reduktion
der
99-101
. Die Ratten wurden im
Zervikalmarkbereich bestrahlt (33 bzw. 36 Gray) und in einer zwölf-monatigen
Nachbeobachtungszeit auf neurologische Auffälligkeiten und Paresen untersucht.
Neben IGF-1 wurde in dieser Studie basic fibroblast growth factor (bFGF)
eingesetzt. Die Kombination beider Substanzen ergab bessere Ergebnisse als die
alleinige Gabe dieser Substanzen.
13
2.2.4.3. auf die gesunden Nieren
IGF-1 wird von Mesangiumzellen
20
und Sammelrohrzellen
10, 45-47
freigesetzt und
wirkt autokrin sowie parakrin auf die Zellen in ihrer Umgebung, die IGF-Rezeptoren
besitzen. Es steigert die glomeruläre Filtrationsrate und den renalen Plasmafluß
durch die Erhöhung des glomerulären Ultrafiltrationskoeffizienten und Verringerung
des Widerstandes der (efferenten) Arteriolen
54
. Die Erhöhung der GFR ist
möglicherweise auf das Wirken von Stickoxid (NO) und vasodilatatorische
Prostaglandine zurückzuführen 127 und oder die Kinine 58.
Durch seine wachstumsfördernden Eigenschaften spielt IGF-1 eine Rolle bei der
Regulation des Wachstums der proximalen Tubuluszellen
die Mesangiumzellen
20
62
und wirkt mitogen auf
. Außerdem fördert IGF-1 in den Mesangiumzellen die
Genexpression und Proteinsekretion von Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF)
43
. Durch die Förderung der mesangialer Matrixproduktion und der
Proliferation der Zellen kann möglicherweise eine glomeruläre Sklerose begünstigt
werden 28.
Die Phosphatresorption im proximalen Tubulus wird durch IGF um bis zu 80 Prozent
erhöht 52. Auf die Podozyten wirkt IGF-1 über den PI3-Kinase-Weg antiapoptotisch
11
. Interessant ist auch, dass IGF eine direkte inhibitorische Wirkung auf die EPO-
Sekretion bei Ratten haben kann 124.
14
2.2.4.4. auf die insuffizienten Nieren
Verschiedene Studien über die Wirkung von IGF bei akutem und chronischem
Nierenversagen wurden durchgeführt 115.
Während die Arbeitsgruppe um Franklin in einer randomisierten Doppelblindstudie
eine möglicherweise positive Wirkung des IGF bei postoperativem Nierenversagen
bei Hochrisikopatienten feststellen konnte 32, konnte in einer Multicenterstudie keine
Wirkung auf ein akutes Nierenversagen nachgewiesen werden
53
. Andere
Arbeitsgruppen entdeckten eine beschleunigte Regeneration und Reparatur bei
akutem
Nierenversagen
Nierenarterienverschluss
87
23,
51,
88
,
weniger
Nierenschäden
nach
und eine positive Wirkung bei Quecksilberchlorid
(HgCl2)-induziertem akutem Nierenversagen 34.
Bei chronischem Nierenversagen verlangsamt IGF eventuell dessen Progression
durch Aufrechterhaltung der autoregulatorischen Kontrolle des renalen Blutflusses 74
und kann kurzfristig die Clearance steigern 133.
Andererseits wurden auch negative Auswirkungen der IGF-Gabe beschrieben, z.B. in
der Studie von Fernandez, in der zwar eine Verbesserung der Nierenfunktion bei
IGF-1 behandelten Ratten mit ischämisch induziertem akutem Nierenversagen, aber
paradoxerweise auch eine erhöhte Mortalität in der IGF-1-Gruppe beobachtet
wurden. Histologisch wurde eine gesteigerte inflammatorische Reaktion und eine
Akkumulation neutrophiler Granulozyten beschrieben 29.
Bei Tieren mit nephrotischen Syndrom fördert IGF-1 die Kollagensekretion und
somit eine tubulo-intestinale Fibrose 50. Möglicherweise spielt IGF-1 eine Rolle bei
der Entwicklung der diabetischen Nephropathie
102
und führt bei anhaltend hoher
Akkumulation von IGF-1 in der Niere zur renalen Hypertrophie
122
und zur
Glomerulosklerose 78.
15
2.3. pifithrin-α
2.3.1. p53
2.3.1.1. normale Funktion von p53
P53 ist ein Tumorsuppressorprotein aus 393 Aminosäuren mit einem Genlokus auf
dem Chromosom 17 (17p13.1) und einem Molekulargewicht von 53 Kilodalton. Es
ist ein im Zellkern lokalisiertes Protein, meist in einem Komplex mit mdm-2
gebunden, und erfüllt dort sehr wichtige und vielfältige Aufgaben. Normalerweise
befinden sich dort nur wenige p53-Moleküle, da ihre Halbwertszeit sehr kurz ist.
Wenn das Erbgut aufgrund von Noxen beschädigt wird, kommt p53 zum Einsatz.
Doppelstrangbrüche lösen über diverse Sensorproteine wie z.B. das Ku-Protein eine
Phosphorylierung von p53 durch eine DNA-abhängige Proteinkinase aus. Dies führt
zu einer Verlängerung der Halbwertszeit, unter anderem durch eine Verringerung der
Affinität zu mdm-2. Nun können sich p53-Tetramere bilden, an die DNA binden und
mit der RNA-Polymerase interagieren.
Die Signalkaskade, die der Transkriptionsfaktor p53 aktivieren kann, wird in
Abbildung 2.3. dargestellt. Nur einige ausgewählte Interaktionspartner sind darin
aufgelistet.
Unterschiedliche Gene werden aktiviert, die zur Arretierung der Zelle in der G1Phase führen und somit die Reparatur der Schäden ermöglichen, sowie, wenn die
Schäden irreparabel sind, die Apoptose induzieren.
P53 fördert neben der Produktion dieser zellzyklusregulierenden Proteine auch die
Herstellung von mdm-2. Mdm-2 inhibiert durch Komplexbildung die Funktion von
p53 und fördert dessen Abbau. Es ist ein Teil einer negativen Rückkopplungsschleife
40
.
16
Ionisierende Strahlung
DNA-Doppelstrangbrüche
Sensorproteine
z.B. Ku-Protein
ATM
DNA-abhängige Proteinkinase
Æ Phosphorylierung von p53
→ T½ von p53 ×
Ө
P53 ×
PCNA
Inhibition
der DNASynthese
Tetramerisierung
Transkriptionsaktivierung
GADD45
mdm2
Komplexbildung
Regulation
und Abbau
von p53
Reparatur
P21/CIP1/WAF1
PIG3
Fas/CD95
NOXA
DR5/Killer
Hemmung von
Cdk 4/D
Cdk 2/D
Cdk 2/e
Arretierung in G1Phase
(zur Reparatur)
bax
Perforation mitochondrialer Membrane
→Freisetzung von Cytochrom C
Apoptose
Abb. 2.3.: p53 und einige mögliche Signalkaskaden
2.3.1.2. p53 und Tumorentstehung
Aufgrund seiner wichtigen Funktion in der Zelle wird p53 auch "Wächter des
Genoms" genannt. In über 50 Prozent aller Tumoren ist das p53-Gen mutiert und das
Genprodukt nicht mehr zu seiner normalen Funktion fähig. Die Schäden an der DNA
werden so direkt an die Nachkommen weitergegeben.
17
Das funktionsuntüchtige p53 reichert sich in der Zelle an und kann mit Hilfe von
immunhistologischen Verfahren nachgewiesen werden. In normalen Geweben ist
p53 wegen seiner geringen Konzentration nicht nachweisbar.
Mutiertes p53 kann außerhalb der Zelle gelangen und das Immunsystem aktivieren,
so dass Antikörper gegen p53 gebildet werden. Patienten mit Antikörpern gegen p53
leiden mit hoher Wahrscheinlichkeit an einer Tumorerkrankung, wobei diese
Immunglobuline nicht spezifisch für einen bestimmten Tumor sind 40.
2.3.2. p53-Inhibitor
Die Substanz pifithrin-α ("p-fifty three-inhibitor-α) blockiert reversibel das Protein
p53 und somit die Apoptose der Zellen. In einem Tierversuch konnte die
Arbeitsgruppe um Komarov feststellen, dass durch die Gabe von pifithrin-α die Tiere
vor der letalen Wirkung einer tödlichen Dosis einer Chemo- oder Strahlentherapie
geschützt werden konnten 67.
Da in den Tumorzellen p53 meist defekt oder funktionsunfähig ist oder fehlt, hat die
Inhibierung des p53 keine nennenswerte Auswirkung auf das Wachstum dieser
entarteten Zellen. Somit kann pifithrin-α eventuell angewandt werden, um die
Nebenwirkungen von aggressiven Krebstherapien abzuschwächen.
Ob pifithrin-α selbst neue Tumorerkrankungen herbeiführen kann, konnte bisher
noch nicht definitiv beantwortet werden.
Pifithrin-α kann durch Ischämie geschädigte Nierenzellen unter anderem durch die
Downregulation der transkriptionellen Aktivierung von bax vor der Apoptose
schützen und die Nierenfunktion verbessern 21.
In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, ob protektive Wirkungen von pifithrin-α
auch bei bestrahlten Nieren vorhanden sind.
18
3. Eigene Untersuchungen
3.1. Zielvorstellungen
Ziel der hier vorliegenden Arbeit ist es, zu untersuchen, ob entweder der
Wachstumsfaktor IGF-1 oder der chemische p53-Inhibitor pifithrin-α eine
radioprotektive Wirkung auf die Niere hat. Dazu wird an einem Mausmodell die
rechte Niere bestrahlt und die Funktion dieser Niere im Laufe einer
Nachbeobachtungszeit von einem Jahr untersucht. Dies wird mit Hilfe von
Nierenszintigrammen durchgeführt.
3.2. Material und Methoden
3.2.1. Versuchstiere
Die Untersuchungen werden an 147 weiblichen C3H-Mäusen (Charles River
Deutschland GmbH, Sulzfeld) durchgeführt. Zu Beginn der Versuchsreihe sind sie
zwischen 78 und 84 Tagen alt und ihr Gewicht beträgt zwischen 22 und 26 Gramm.
Maximal 20 Mäuse werden zusammen in einem Gruppenkäfig (Makrolon Typ 4)
gehalten. Futter (Alleinfuttermittel für Mäuse und Ratten Altromin 1324) und Wasser
stehen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Tierhaltung erfolgt im Institut für
Experimentelle Onkologie und Therapieforschung, Klinikum rechts der Isar.
Jeden Montag und Donnerstag werden die Tiere in sterilisierte Käfige mit frischer
Streu umgesetzt. Die Temperatur im Nagetierraum beträgt zwischen 22 und 25 Grad
Celsius und die Luftfeuchtigkeit durchschnittlich 60 Prozent.
Das Protokoll wurde von der zuständigen Behörde (Regierung von Oberbayern)
unter dem Aktenzeichen 209.1/211-2531-99/02 genehmigt.
19
3.2.2. Versuchsplan
Die Tiere werden in Kontroll- und IGF-1-Gruppen, sowie eine p53-Inhibitor-Gruppe,
aufgeteilt. Die Aufteilung wird in der Abbildung 3.1. dargestellt.
Alle Tiere werden im Bereich der rechten Niere mit Dosen, die eine nachweisbare
strahleninduzierte Nierenfunktionsstörung auslösen, bestrahlt. In diesen Versuchen
betragen die Dosen zehn, zwölf, 15 und 17 Gray.
Zur Ermittlung der Nierenfunktion wird in dieser Versuchsreihe die statische
Nierenszintigraphie angewendet. Vor der Bestrahlung werden damit zunächst die
Ausgangswerte bestimmt. Beginnend 19 Wochen nach der Bestrahlung folgen in
einem Sechs-Wochen Rhythmus weitere Nierenszintigramme. Jede Gruppe erhielt
maximal sieben Szintigramme während der einjährigen Nachbeobachtung.
Bei den „IGF-1 simultan zur Bestrahlung“ – Gruppen wurde die IGF-1 Lösung
jeweils 16 Stunden vor, zwei Stunden vor und 20 Stunden nach der Bestrahlung
subkutan in die Nackenfalte gespritzt.
Die „verzögert IGF-1“ – Gruppen erhielten, beginnend 26 bzw. 27 Wochen nach der
Bestrahlung, 30 Tage lang jeden Tag einmal die IGF-1-Lösung in der jeweilig
angegebenen Dosis subkutan.
Zusätzlich zu den Kontroll- und IGF-1-Gruppen erhielt eine Gruppe von sechs
Tieren den p53-Inhibitor 1-(4-Methylphenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)benzo) ethanone hydrobromid, der auch als pififthrin-α bezeichnet wird, vor der
Bestrahlung intraperitoneal injiziert.
20
147 Mäuse
Kontrolle
Vier Gruppen
n = 43
IGF-1
Elf Gruppen
n = 98
Pifithrin-α
Eine Gruppe
n=6
IGF-1
zur IGF-1 26 bzw. 27 Wochen nach Bestrahlung Anzahl der
Bestrahlung Bestrahlung
(Gy)
Tiere (n)
Dosis (μg) Dauer (d) Dosis (μg) Dauer (d)
Abkürzung
Gruppe
K B10
K B12
K B15
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
10
12
15
6
6
23
K B17
Kontrolle
17
8
G 0,5 B12
G 1,25 B12
IGF-1
IGF-1
12
12
0,5
1,25
3
3
10
10
G 5 B12
IGF-1
12
5
3
11
G 0,5 B15
G 1,25 B15
G 5 B15
G 5 B15 14d
IGF-1
IGF-1
IGF-1
IGF-1
15
15
15
15
0,5
1,25
5
5
3
3
3
14
10
15
12
6
G 25 B15
IGF-1
15
25
3
6
V 1,25 B15
V 5 B15
IGF-1
IGF-1
15
15
1,25
5
30
30
6
6
V 25 B15
IGF-1
15
25
30
6
Abb. 3.1.: Gruppeneinteilung Kontroll- und IGF-1-Gruppen
21
3.2.3. Nierenszintigraphie
3.2.3.1. Allgemeines
Die Szintigramme wurden mit
durchgeführt.
99m
Technetium-Dimercaptosuccinat (99mTc-DMSA)
99m
Technetium zerfällt unter Emission von γ-Strahlung mit einer
mittleren Energie von 140 Kiloelektronenvolt. Die Halbwertszeit beträgt sechs
Stunden. Nach der intravenösen Injektion wird das
99m
Tc-DMSA an Plasmaproteine
gebunden transportiert und wird vor allem in der Nierenrinde gespeichert, was
mittels Gamma-Kamera dargestellt werden kann. Ein geringerer Teil wird von der
Leber und Milz aufgenommen. Die Ausscheidung erfolgt renal in unveränderter
Form über den Urin. Die Anwendungsgebiete liegen in der Nierenszintigraphie in
der Beuteilung von Lage, Form und Größe der Nieren, zur Feststellung von Narben
und Parenchymdefekten sowie zur Quantifizierung des Nieren-Uptakes und
Abschätzung der seitengetrennten Nierenfunktion (laut Gebrauchsanweisung und
Fachinformation, TechneScan®)
Das
99m
Tc-DMSA wird am Morgen des Aufnahmetages ca. 20 bis 60 Minuten vor
der Injektion in der Klinik für Nuklearmedizin hergestellt. Dabei werden 500
Megabecquerel Technetium, das im Klinikumeigenen Nucleotidgenerator hergestellt
wird, in ein Fläschchen mit DMSA (TechneScan® DMSA, Mallinckrodt Medical
BV, Petten, Niederlande, DRN 4341) gegeben und mit einer isotonen
Natriumchloridlösung ad fünf Milliliter gemischt. Somit ergibt sich in diesem
Gemisch eine Konzentration von 100 Megabecquerel pro Milliliter.
22
3.2.3.2. Injektion des 99mTc-DMSA
Narkose
Die Mäuse werden in einen, im Durchmesser etwa 15 Zentimeter (oder 25
Zentimeter, je nach Verfügbarkeit) großen, gläsernen Standzylinder gesetzt, in dem
sich einige mit Ether (Diethylether, (C2H5)2O, Merck KGaA, Darmstadt) getränkte
Zellstofflagen befinden. Nach Eintritt der Bewusstlosigkeit wird das Tier aus dem
Zylinder entnommen. Bei Bedarf wird dem Tier ein kleinerer Plastikzylinder, in dem
sich ebenfalls eine mit Ether getränkte Zellstofflage befindet, vor die äußeren
Atmungsorgane (Nase und Mund) gehalten.
99m
Tc-DMSA-Injektion
Die 99mTc-DMSA-Lösung wird mit Insulinspritzen aufgezogen. Jede Maus erhält pro
Szintigraphie 10 Megabecquerel (entsprich 0,1 Milliliter) des Radiopharmakons
intravenös über die Schwanzvene. Die Skala auf der Spritze besteht aus 40 Units, das
bedeutet, 0,1 Milliliter entsprechen vier Einheiten auf der Spritze.
Der Schwanz der Maus wird in einen Glasbehälter mit warmem Wasser von 25 – 30
Grad Celsius eingetaucht, damit die Venen sich vermehrt füllen und man sie besser
identifizieren kann.
3.2.3.3. Nierenszintigraphie-Aufnahme
Nach einer Wartezeit von durchschnittlich vier Stunden, während der sich das 99mTcDMSA in den Nieren angereichert hatte, wurden in erneuter Narkose die Aufnahmen
gemacht.
23
Narkose
Zur Anästhesie wurde den Tieren 200 bis 250 Mikroliter einer Rompun-KetaminMischung intraperitoneal gespritzt. Diese besteht aus folgenden Komponenten:
8 % Rompun® 2% (Xylazin), Bayer, Leverkusen
10 % Ketavet® 100mg/ml Ketaminhydrochlorid, Pharmacia & Upjohn,
Erlangen
82 % physiologische NaCl-Lösung, 0,9%
Dieses Gemisch wurde bei den meisten Narkosen (außer den unten genannten)
verwendet. Damit wird eine Narkose von ca. 30 bis 40 Minuten Dauer erreicht.
Bei einer Szintigraphie wurde eine Narkose mit Isofluran (Forene® 250 Milliliter,
Abbott, Ludwigshafen) versucht. Dabei erhalten die Mäuse ein Gemisch aus
Isofluran und Sauerstoff aus dem Volker Kleintiernarkosegerät über einen speziell
angefertigten Schlauch, der mit Masken für den Kopf der Mäuse ausgestattet worden
ist (Abbildung 3.2.). Es wurden zehn Masken in den Schlauch eingelassen, so dass
von maximal zehn Tieren gleichzeitig die Aufnahmen gemacht werden können.
Abb. 3.2. Nierenszintigraphie-Aufnahme mit Isofluran als Narkotikum
24
Wegen des fehlenden Lidschlusses durch das Narkotikum wurde eine Augensalbe
(Vidisic®, Dr. Mann Pharma, Berlin) auf der Cornea verteilt.
Vorbereitung
Die Tiere werden auf dem Rücken liegend auf die Detektorplatte gelegt und ein
wenig mit Klebeband für den Zeitraum der Aufnahme fixiert (Abbildung 3.3.)
Abb. 3.3. Nierenszintigraphie-Aufnahme auf der Forte Kamera und Lage der Tiere auf der
Detektorplatte
Aufnahmen
Die Aufnahmen wurden in Form einer Fünf-Minuten-Summationsaufnahme an einer
Philips FORTE™ Doppelkopfkamera gemacht. Als Collimator wird VXHR (Vertex
High Resolution) verwendet. Die Daten für die Kamera sind in der folgenden Tabelle
aufgelistet:
25
Procedure ID
KS KNOCHEN SPAET
Matrix Size
256 x 256 x 16
Time
300 Sekunden
Collimator
VXHR
Detector Mask
Center 25,4 cm SQUARE
Tab. 3.1. Kameradaten der Aufnahme
Blase
rechte Niere
Niere rechts
Niere links
Leber
linke Niere
Leber
MRT
(coronar, T2 gewichtet)
-
99mTc-DMSA -Szintigraphie
-
Abb. 3.4. Lage der einzelne Organe in der Nierenszintigraphie- und MRT-Aufnahme
3.2.3.4. Auswertung der Nierenszintigraphie-Aufnahme
Die Auswertung erfolgt mit Hilfe von ROIs (Region of Interest). Dazu zeichnet man
über der rechten Niere eine Fläche, die etwa der Ausdehnung des Organs entspricht,
ein. Diese Fläche kann man dann spiegeln und mit der linken Niere überlagern, um
die Werte für ein Areal identischer Größe zu erhalten. Die Abbildung 3.5. zeigt die
eingezeichneten ROIs.
26
linke Niere
Rechte Niere
Roi (re)
Roi (li)
Roi
Abb. 3.5. Nierenszintigraphie-Aufnahme der gleichen Maus (rechts mit eingezeichneten Rois)
Die Werte der einen Niere werden ins Verhältnis zu dem Gesamtwert beider Nieren
gesetzt. Dadurch erhält man die relative Nierenfunktion in Prozent.
Roi (re) - Roi
Nierenfunktion (re) =
[Roi (re) – Roi] + [Roi (li) – Roi]
3.2.4. Bestrahlung
Jede Maus erhält einmalig eine Bestrahlung der rechten Niere. Dies geschieht
durchschnittlich eine Woche nach der ersten Nierenszintigraphie. Vorbereitend
wurden an toten C3H Mäusen gleicher Größe Messungen zur Position des
Strahlenfeldes
und
zur
Dosisverteilung
gemacht.
Hierzu
wurden
Thermoluminiszenzdosimeter auf der Oberfläche der rechten Niere angebracht und
bestrahlt.
27
Narkose
Die Narkose wird mit Isofluran (Forene® 250 Milliliter, Abbott, Ludwigshafen)
durchgeführt. Für die Dauer der Positionierung und Bestrahlung atmen die Mäuse
über ein Mundstück ein Gemisch aus Sauerstoff und Isofluran ein (Abbildung 3.6.).
Diese Inhalationsnarkose wird mit Hilfe des Volker Kleintiernarkosegeräts
durchgeführt, womit man den Sauerstoff- und Isofluran-Gehalt einstellen und
kontrollieren kann.
Vorbereitung
Die Mäuse werden auf dem Bauch liegend auf eine ebene Unterlage gelagert. Die
rechte Niere einer Maus von normaler Größe (acht Zentimeter von der Schnauze bis
zum Schwanzansatz) erstreckt sich über eine Länge von 4,5 bis 5,5 Zentimeter (von
der Schnauzenspitze aus gemessen). In der ersten Nierenszintigraphie wurden
ebenfalls die Positionen der Nieren festgestellt. Bei den Tieren wurde keine
Abweichung von diesem Richtwert beobachet. Mit einem Lineal wird bei jeder Maus
von außen die Lokalisation der Nierenmitte, entsprechend fünf Zentimeter ab
Schnauzenspitze, ermittelt.
Über der Mitte der rechten Niere wird der Bestrahlungstubus mit einem Durchmesser
von 1,5 Zentimeter Durchmesser fixiert. Somit wird die Niere mit einem
Sicherheitssaum von jeweils 2,5 Millimeter nach cranial und caudal erfasst. Der
Tubus ist seitlich partiell mit einer zwei Millimeter dicken Bleiplatte abgedeckt, so
dass die linke Niere und Teile des Darms geschont werden.
28
Abb. 3.6. Lage der Maus bei der Bestrahlung
Bestrahlungsgerät
Zur Bestrahlung wird das Weichstrahltherapiegerät Philips RT 100 verwendet. Das
Gerät wird mit 70 Kilovolt betrieben. Alternativ stehen auch 55 Kilovolt zur
Verfügung. In der folgenden Tabelle ist die Zeitdauer der Bestrahlung aufgelistet.
Bestrahlungsdosis
55 kV
10 Gy
70 kV
1,82 min
12 Gy
2,78 min
2,12 min
15 Gy
3,48 min
2,68 min
17 Gy
3,04 min
Tab. 3.2. Bestrahlungsdosis und die zugehörige Bestrahlungsdauer
Der Strahlengang erfolgt posterior-anterior. Der Focus-Haut-Abstand beträgt zehn
Zentimeter.
29
3.2.5. IGF-1 Injektion
IGF-1 wurde als gebrauchsfertige Lösung (10 mg pro ml) von Genentech, Inc., S.
San Francisco, USA, bereitgestellt und subkutan in die Nackenfalte injiziert (Spritze:
Microliter™ Syringes, Hamilton, Bonaduz, Schweiz).
Bei den Gruppen, die IGF-1 gleichzeitig zur Bestrahlung erhalten haben, wurden die
Injektionen 16 Stunden vor, zwei Stunden vor und 20 Stunden nach der Bestrahlung
durchgeführt. Bei den Gruppen mit einer Dosis von 0,5 Mikrogramm und 1,25
Mikrogramm IGF-1 wurde die Lösung mit PBS (phosphate buffered saline)
verdünnt.
Die drei Gruppen, die das IGF-1 „verzögert“, beginnend 26 bzw. 27 Wochen nach
der Bestrahlung, erhalten haben, erhielten die Injektionen an den 30 Tagen am
Vormittag zwischen neun und elf Uhr.
3.2.6. p53-Inhibitor Injektion
Die Lösung mit dem p53-Inhibitor, der von A.G. Scientific, Inc., San Diego, USA,
bezogen wurde, wurde intraperitoneal 30 Minuten bis eine Stunde vor der
Bestrahlung injiziert (Spritze: Microliter™ Syringes, Hamilton, Bonaduz, Schweiz).
Dabei erhielt jede Maus eine Dosis von zwei Milligramm pro Kilogramm
Körpergewicht. Bei einem Körpergewicht von 22 bis 26 Gramm erhalten die Mäusen
0,05 Milligramm pifithrin.
30
4. Ergebnisse
4.1. Morbidität und Mortalität während der Nachbeobachtungszeit
Während der Follow-Up-Phase von 49 Wochen nach der Bestrahlung sind ein Teil der
Tiere interkurrent verstorben. In dem Diagramm 4.1. ist die Anzahl der Tiere zum
Zeitpunkt der jeweiligen Nierenszintigraphie aufgetragen. Weitere detaillierte
Informationen sind in Tabelle 4.1 zusammengestellt.
Anzahl der Tiere bei den jeweiligen
Nierenszintigramme
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Anzahl der Mäuse
Narkosekomplikationen
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Anzahl der Narkosekomplikationen
7
6
5
Isofluran
4
Ether
3
Ketanest
2
1
0
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Abb. 4.1.: Todesfälle in der Follow-Up-Phase bzw. Aufteilung nach Narkosezwischenfällen und Art der
Anästhesie
31
Gruppe
K B10
K B12
K B15
Anzahl
Überleben nach Bestrahlung (in Tagen)
(Tod nach
Anästhesie)
* Tod nach Anästhesie, nach der 7. Szintigraphie eingeschläfert
[ ] Drei Tiere aus der Auswertung ausgeschlossen - siehe Kapitel 4.3.2.
Ω
Ω
126*, 126*, 261, 337, 339 , 339
6 (2)
6
21+[2] (2)
Ω
20, 209, 236, 245, 314, 339
Ω
0*, 6, 7, 28, 38, 52, 68, 79, 102, 127, 148, 150, 154, 161, 168*, 179, 179, 199,
Ω
Ω
Ω
Ω
211, [337 ], [337 ], 339 , 339
Ω
23, 95, 168*, 215, 231, 242, 316, 337
K B17
8 (1)
Ω
Ω
Ω
25, 127*, 163, 168, 222, 244, 263, 265 , 265 , 265
G0,5 B12
10 (1)
Ω
Ω
Ω
Ω
Ω
19, 23, 183, 222, 292, 340 , 340 , 340 , 340 , 340
G1,25 B12
10
Ω
Ω
0*, 69, 128*, 146, 152, 210, 215, 253, 294*, 340 , 340
G5 B12
11 (3)
17, 58, 76, 208, 210*, 210*, 210*, 210, 219, 227
G0,5 B15
10
Ω
Ω
8, 23, 92, 98, 119, 163, 212, 219, 246, 306, 309, 332, 337 , 337 , [340]
G1,25 B15
14+[1]
0*, 20, 28, 30, 83, 87, 97, 114, 140, 156, 178, 266
G5 B15
12 (1)
Ω
0*, 171, 193, 225, 268, 350
G5 B15 14d 6 (1)
23, 26, 180, 181, 210*, 216
G25 B15
6
Ω
6, 20, 102, 279, 286, 341
V1,25 B15
6
Ω
Ω
7, 233, 241, 252, 255 , 255
V5 B15
6
Ω
11, 54, 114, 161, 333*,337
V25 B15
6 (1)
0, 22, 88, 90, 171, 176
p53-inhibitor 6
Tab. 4.1. Überleben nach Bestrahlung (Gruppeneinteilung siehe Abbildung 3.1., K=Kontrollgruppe,
B=Bestrahlungsdosis in Gy, G=IGF zur Bestrahlung in µg, V=IGF 30 Tage lang 26/27
Wochen nach Bestrahlung in µg, 14 d= IGF statt 3 insgesamt 14 Tage zur Bestrahlung)
4.1.1. Nebenwirkung der Anästhesie
Insgesamt sind 18 (=12 Prozent) der Tiere nicht mehr aus der Narkose erwacht.
Während der Bestrahlung hatten alle Tiere die kurze Isofluran-Narkose gut toleriert. Bei
den Narkosen in der Vorbereitung für die Nierenszintigraphie ereigneten sich einige
Zwischenfälle (Abbildung 4.1.).
Bei der Injektion des Radiopharmakons wurde eine kurze Ethernarkose verwendet.
Danach sind insgesamt drei Tiere nicht mehr aufgewacht. Bei einigen Tieren wurde
einige Minuten nach dem Aufwachen eine opistotone Haltung beobachtet.
Die Isofluran-Narkose bei der Nierenszintigraphie-Aufzeichnung wurde nur an zwei
Gruppen getestet, einmal bei der zweiten und einmal bei der vierten Szintigraphie. Nach
dem Tod von fünf Tieren wurde wieder die Rompun-Ketamin-Mischung wie zu den
anderen Zeitpunkten verwendet.
32
4.1.2. Folgen der Bestrahlung
Nach der Bestrahlung wurde keine klinische gastrointestinale Symptomatik wie
Durchfall oder Erbrechen beobachtet. Alle Tiere haben im Strahlenfeld ihr Fell
verloren, welches im weiteren Verlauf weiß, ohne Pigmente, nachgewachsen ist.
Bei der Entnahme der Nieren post mortem ist bei vielen Tiere makroskopisch eine
Darmstenose beobachtet worden. Bei einigen Tieren waren die prästenotischen
Darmanteile bis zu einem Zentimeter Durchmesser dilatiert. Die linke Niere war häufig
hypertrophiert, während die rechte Niere atrophisch imponierte. Die Makroskopie der
Nieren korreliert mit den Ergebnissen der letzten Nierenszintigraphie. In der Aufnahme
stellt sich die geschrumpfte rechte Niere deutlich weniger aktivitätsaufnehmend dar,
während die linke Niere meist deutlich an Größe zugenommen hat.
4.2. Nierenszintigramme
Mit Hilfe der Nierenszintigramme lässt sich die relative Nierenfunktion berechnen. An
dem Beispiel der Aufnahmen einer Maus (Abbildung 4.2.) kann man die Abnahme der
Nierenfunktion im Zeitverlauf erkennen. Die relative Nierenfunktion der rechten Niere
nimmt in Anhängigkeit von der Dosis ab, während gleichzeitig die der linken Niere
zunimmt. Bei manchen Tieren nimmt die Nierenfunktion der rechten Niere deutlicher
ab. Sie entwickeln früh eine Niereninsuffizienz, während bei einigen anderen Tieren bis
zur letzten Szintigraphie 49 Wochen nach der Bestrahlung eine im Vergleich gute
Nierenfunktion vorhanden ist.
33
links
rechts
Ausgangsaufnahme
nach 37 Wochen
nach 19 Wochen
nach 43 Wochen
naxh 25 Wochen
nach 31 Wochen
nach 49 Wochen
Abb. 4.2. Nierenszintigraphie-Aufnahme im Verlauf der Follow-Up-Phase
34
4.3. Auswertung der Nierenszintigraphie-Daten
In den folgenden Kapiteln wird mit den Nierenfunktionswerten der rechten bestrahlten
Niere gerechnet. Die Summe der prozentualen Funktion beider Nieren ergibt 100
Prozent.
4.3.1. Ausgangswerte
Die Ausgangswerte der rechten Niere wurden mit der ersten Nierenszintigraphie, die in
der Woche vor der Bestrahlung durchgeführt worden ist, festgestellt. Sie beträgt für die
rechte Niere zwischen 44 Prozent (Minimum) und 62,9 Prozent (Maximum). Der
Median liegt bei 53,2 Prozent.
4.3.2. Ausschlusskriterien
Vier Tiere (drei mit 15 Gray Bestrahlung und eins mit 15 Gray Bestrahlung und 1,25
Mikrogramm IGF-1 zur Bestrahlung) entwickelten aus unbekannten Gründen eine
höhere relative Nierenfunktion auf der bestrahlten rechten Seite als auf der linken Seite.
Diese vier Tiere wurden von den weiteren Auswertungen ausgenommen.
4.3.3. Verlauf der Nierenszintigraphie-Werte
Die
relative
Nierenfunktion
der
rechten
Niere
nimmt
im
Verlauf
der
Nachbeobachtungszeit ab. In der Abbildung 4.3. sind die Nierenszintigraphie-Werte der
Tiere aufgezeichnet, die alle mit zwölf Gray bestrahlt worden sind und 1,25
35
Mikrogramm IGF-1 für drei Tage „simultan“ zur Bestrahlung erhalten haben. Dies soll
exemplarisch verdeutlichen, dass die Verläufe während der Nachbeobachtungszeit weit
auseinanderweichen können. Einige Tiere sind im Verlauf der Follow-Up-Phase
gestorben. Bei der letzten Szintigraphie kann man deutlich die Streuung der Werte
innerhalb einer Gruppe erkennen.
Nierenszintigraphie-Werte
Nierenfunktionswerte (%)
70
Maus 1
60
Maus 2
50
Maus 3
40
Maus 4
30
Maus 5
20
Maus 6
10
Maus 7
Maus 8
0
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Abb. 4.3. Verlauf der Nierenszintigraphie-Werte der einzelnen Tiere innerhalb einer Gruppe am Beispiel
der Gruppe, die 1,25 µg IGF-1 drei Tage lang zur Bestrahlung erhalten hat.
4.3.4. Statistik
Die statistische Auswertung der Arbeit erfolgte mir Hilfe von Microsoft Excel und dem
Statistik-Programm SPSS.
Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte, die dazugehörige Standardabweichung,
Median mit Maximal- und Minimalwerten sowie die Signifikanzen mit Hilfe der
Wilcoxon- bzw. Mann-Whitney Tests. Um den zeitlichen Verlauf darzustellen, wurden
die Mediane der jeweiligen Gruppen in einem Diagramm eingezeichnet.
36
37
(n= 6)
38,4 / 35,7
37,1
55,3 / 51,6
53,5
39,1
43,4 / 35,8
(n= 6)
60,0 / 48,4
55,1
39,3
45,9 / 30,9
(n= 6)
58,3 / 50,2
58,1
39,9
46,2 / 25,7
(n= 6)
59,4 / 49,2
55,0
46,9
54,6 / 4,9
(n= 6)
56,9 / 51,4
52,2
42,6
44,7 / 40,5
(n=12)
57,1 / 45,2
50,2
42,5
50,5 / 1,5
(n=14)
57,0 / 47,7
51,5
42,4
47,4 / 37,7
(n=10)
58,9 / 48,0
53,8
41,2
50,1 / 12,5
(n=11)
53,8 / 48,7
51,0
39,3
50,9 / 35,2
(n=10)
59,2 / 49,3
52,6
40,3
47,7 / 30,8
(n=10)
62,9 / 44,0
55,6
37,3
52,6 / 9,8
(n= 8)
56,2 / 45,5
49,8
42,3
53,4 / 24,3
(n=20)
59,7 / 46,1
53,8
37,7
46,1 / 30,2
(n= 6)
58,4 / 49,9
53,6
46,7
49,2 / 36,6
(n= 6)
(n= 2)
(n= 5)
(n= 3)
(n= 4)
(n= 5)
(n= 4)
(n= 9)
(n= 7)
(n= 9)
(n= 8)
(n= 8)
(n= 6)
(n=12)
(n= 5)
(n= 6)
2. Szintigraphie
56,2 / 50,7
55,2
1.Szintigraphie
(n=2)
16,3 / 25,6
25,9
33,7 / 29,4
31,6
29,2
34,3 / 6,3
(n=5)
41,9 / 12,8
34,9
10,0
44,6 / 9,3
(n=3)
43,2 / 14,6
32,9
27,2
35,7 / 18,6
(n=4)
40,8 / 23,8
32,4
43,1
52,9 / 2,1
(n=5)
52,0 / 1,7
41,3
41,9
41,9 / 41,9
(n=2)
48,6 / 8,2
41,2 / 32,4
36,8
(n=8)
35,0
45,9 / 8,5
35,5
33,1
44,6 / 9,2
(n=7)
43,4 / 12,8
42,7 / 19,8
31,2
(n=7)
35,1
44,7 / 4,9
37,9
26,6
47,1 / 15,6
(n=8)
34,9 / 10,1
49,2 / 16,9
29,0
(n=7)
13,4
39,1 / 7,9
26,1
21,1
49,8 / 5,5
(n=6)
47,9 / 7,7
49,7 / 10,6
32,3
(n=5)
30,1
47,0 / 4,8
33,8
28,7
32,2 / 9,0
(n=5)
44,7 / 10,5
38,3
31,8
47,6 / 16,7
(n=4)
(n=2)
(n=5)
(n=3)
(n=2)
(n=3)
(n=2)
(n=8)
(n=6)
(n=5)
(n=7)
(n=6)
(n=5)
(n=2)
(n=4)
(n=4)
4. Szintigraphie
50,6 / 22,0
35,0
3. Szintigraphie
26,1 / 22,2
24,2
27,6 / 1,1
10,5
37,5 / 1,0
3,9
51,6 / 3,9
[27,8]
37,3
37,3
41,5 / 3,7
28,1
36,1 / 34,2
34,6
42,4 / 12,3
23,3
14,5 / 4,9
9,4
0,9 / 0,1
0,5
47,4 / 9,2
28,3
30,1 / 3,9
17,0
46,2 / 9,7
33,1
(n=2)
(n=5)
(n=3)
(n=2)
(n=1)
(n=5)
(n=3)
(n=6)
(n=4)
(n=2)
(n=2)
(n=2)
(n=4)
5. Szintigraphie
22,9 / 21,9
22,4
38,2
[38,2]
53,1
[53,1]
44,9 / 11,9
25,4
37,6 / 35,1
37,1
42,6 / 12,2
23,5
10,9 / 9,8
10,3
49,7 / 5,9
27,8
28,1 / 13,2
20,6
33,0 / 6,7
24,0
(n=2)
(n=1)
(n=1)
(n=5)
(n=3)
(n=5)
(n=2)
(n=2)
(n=2)
(n=3)
6. Szintigraphie
Tab. 4.2.: Mediane , Maximal-, Minimalwerte und Anzahl (n) der Mäuse (Gruppeneinteilung siehe Abbildung 3.1)
V 25 B15
V 5 B15
V 1,25 B15
G 25 B15
G 5 B15 14d
G 5 B15
G 1,25 B15
G 0,5 B15
G 5 B12
G 1,25 B12
G 0,5 B12
K B17
K B15
K B12
K B10
Gruppe
4.3.4.1. Kontroll- und IGF-1-Gruppen
23,8
6,8
24,8 / 22,8
23,8
39,4
[39,4]
49,4
[49,4]
44,3 / 37,1
[40,7]
36,2 / 33,2
34,7
40,6 / 8,1
6,8
47,9 / 4,8
26,3
22,3
22,3
32,8 / 4,6
23,9
(n=2)
(n=1)
(n=1)
(n=2)
(n=2)
(n=5)
(n=1)
(n=2)
(n=1)
(n=3)
7. Szintigraphie
38
1.Szintigraphie 2. Szintigraphie 3. Szintigraphie 4. Szintigraphie 5. Szintigraphie 6. Szintigraphie 7. Szintigraphie
54,33 ± 1,96 44,80 ± 4,59 35,65 ± 10,23 31,95 ± 11,02 30,53 ± 13,25 21,23 ± 10,91 20,43 ± 11,77
53,73 ± 2,48 37,64 ± 5,59 33,78 ± 12,49 24,65 ± 9,36 17,0 ± 13,1
20,65 ± 7,45
22,3
54,06 ± 3,92 41,30 ± 8,26 33,84 ± 12,96 30,10 ± 17,8
28,3 ± 19,1
27,8 ± 21,9 26,35 ± 21,55
51,05 ± 3,99 35,92 ± 14,07 31,03 ± 16,2 26,48 ± 17,13
0,5 ± 0,4
10,35 ± 0,55
6,8
54,67 ± 5,75 39,04 ± 5,90 25,4 ± 9,20 16,70 ± 8,55
9,55 ± 4,10
53,38 ± 3,30 40,70 ± 4,80 31,90 ± 10,50 29,7 ± 11,0
27,7 ± 10,0
24,82 ± 10,9 24,84 ± 11,6
51,16 ± 1,68 37,80 ± 10,90 27,76 ± 15,8 32,46 ± 10,30 34,97 ± 0,82 36,6 ± 1,09
34,7 ± 1,5
53,07 ± 3,50 43,01 ± 3,40 33,16 ± 7,20 28,6 ± 13,90
51,83 ± 2,79 36,38 ± 15,12 32,57 ± 11,45 28,89 ± 13,69 25,35 ± 14,80 26,875 ± 13,5
40,7 ± 3,6
50,67 ± 3,46 42,60 ± 1,49 36,80 ± 4,40
41,9
37,3
53,36 ± 2,05 39,86 ± 17,77 35,28 ± 17,39 32,7 ± 22,0 37,75 ± 23,85
53,1
49,39
54,72 ± 2,97 37,93 ± 8,53 32,33 ± 6,03 27,15 ± 8,55
55,53 ± 3,77 38,70 ± 6,13 30,23 ± 11,8
21,3 ± 16,5 14,13 ± 16,60
38,2
39,4
55,22 ± 4,20 39,10 ± 2,50 27,82 ± 12,2
22,6 ± 12,3 13,07 ± 11,01
55,45 ± 1,85 37,05 ± 1,35 31,55 ± 2,15 25,95 ± 0,35 24,15 ± 1,95
22,4 ± 0,5
23,8 ± 1,0
Tab. 4.3. Mittelwerte und Standardabweichungen (Gruppeneinteilung siehe Abbildung 3.1., K=Kontrollgruppe, B=Bestrahlungsdosis in Gy, G=IGF
zur Bestrahlung in µg, V=IGF 30 Tage lang 26/27 Wochen nach Bestrahlung in µg, 14 d= IGF statt 3 insgesamt 14 Tage zur
Bestrahlung)
Gruppe
K B10
K B12
K B15
K B17
G0,5 B12
G 1,25 B12
G5 B12
G0,5 B15
G 1,25 B15
G5 B15
G 5 B15 14d
G25 B15
V 1,25 B15
V5 B15
V25 B15
Die Mediane der einzelnen Gruppen sind in den folgenden Diagrammen
gegeneinander aufgetragen:
Kontrollgruppen untereinander:
Kontrollgruppen
60
50
K B10
40
K B12
30
K B15
20
K B17
10
0
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Kontroll- und IGF-1-Gruppen mit 12 Gy Bestrahlung und IGF zur Bestrahlung:
Kontroll- und IGF-Gruppen (12 Gy)
60
50
K B12
40
G0,5 B12
30
G1,25 B12
20
G5 B12
10
0
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
39
Kontroll- und IGF-1-Gruppen mit 15 Gy Bestrahlung und IGF zur Bestrahlung:
Werte der rechte Niere (%)
Kontroll- und IGF-Gruppen (15Gy)
60
K B15
50
G0,5 B15
G1,25 B15
40
G5 B15
G5 B15 14d
30
G25 B15
20
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Kontroll- und IGF-1-Gruppen mit 15 Gy Bestrahlung und IGF 26 bzw. 27 Wochen nach Bestrahlung:
Kontroll- und IGF-Gruppen
Werte der rechte Niere
(%)
(IGF-1-Gabe nach 16 bzw. 27 Wochen)
70
60
50
40
30
20
10
0
K B15
IGF-1-Gabe
↓
V1,25 B15
V5 B15
V25 B15
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7. Szintigraphie
Abb. 4.4. Mediane der Nierenszintigraphie-Werte der jeweils zugehörigen Gruppen im Vergleich
(Gruppeneinteilung siehe Abbildung 3.1.)
40
Die Signifikanz wird mit Hilfe des Wilcoxon-Tests berechnet. Zwei Gruppen werden
jeweils
miteinander
verglichen
(IGF-
und
Kontrollgruppen,
IGF-Gruppen
untereinander). Das Signifikanzniveau wird auf 0,05 festgesetzt. Die Werte sind in
den folgenden Tabellen aufgelistet.
Gruppe
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szintigraphie
Kontrollgruppen untereinander:
1-2
0,521
0,068
1,000
0,386
0,165
1,000
0,655
1-3
0,907
0,349
0,522
0,480
1,000
1,000
0,564
1-4
0,195
0,521
0,522
0,624
0,064
0,564
0,655
2-3
0,870
0,343
0,855
0,724
0,439
1,000
1,000
2-4
0,244
0,855
0,855
1,000
0,121
0,121
0,317
3-4
0,071
0,453
0,631
0,655
0,121
1,000
1,000
IGF-1-Gruppen mit 12 Gy und Kontrollgruppen:
2-5
0,550
0,558
0,167
0,522
1,000
2-6
0,587
0,464
0,661
0,850
0,505
0,699
0,770
2-7
0,029*
0,641
0,515
0,086
0,083
0,083
0,221
1,000
1,000
0,221
0,221
IGF-1-Gruppen mit 15 Gy und Kontrollgruppen:
3-8
0,527
0,767
1,000
0,796
3-9
0,124
0,887
0,897
0,540
0,699
3-10
0,022*
0,903
0,739
0,655
1,000
3-11
0,622
0,399
0,584
0,827
1,000
3-12
0,779
0,628
1,000
0,564
Gruppe:
-Kontrolle:
10 Gy (1), 12 Gy (2),
15 Gy (3), 17 Gy (4)
-IGF zur Bestrahlung:
0,5 µg 12 Gy (5),
1,25 µg 12 Gy (6),
5 µg 12 Gy (7),
0,5 µg 15 Gy (8),
1,25 µg 15 Gy (9),
5 µg 15 Gy (10),
5 µg 15 Gy für 14
Tagen (11),
25 µg 15 Gy (12)
-IGF nach 26/27
Wochen:
1,25 µg 15 Gy (13),
5 µg 15 Gy (14),
25 µg 15 Gy (15)
-p53-Inhibitor (16)
IGF-1-Gruppen mit 12 und 15 Gy untereinander:
*Artefakt
5-8
0,450
0,355
0,142
0,297
6-9
0,380
0,773
0,600
0,817
0,584
7-10
1,000
0,758
0,770
0,380
0,180
10-11
0,282
0,142
0,439
0,655
1,000
0,917
0,121
1,000
1,000
1,000
1,000
0,380
1,000
„Verzögert“ IGF-1-Gruppen und Kontrollgruppen:
3-13
0,534
0,470
1,000
0,827
0,248
3-14
0,516
0,343
0,855
0,881
0,564
3-15
0,763
0,361
0,739
0,564
1,000
„Verzögert“-IGF-1-Gruppen und IGF-zur Bestrahlung-Gruppen:
9-13
0,131
0,644
0,838
0,540
0,456
10-14
0,079
0,086
0,699
0,143
0,180
12-15
0,867
1,000
1,000
1,000
Tab. 4.4. Signifikanzen Kontroll- und IGF-1-Gruppen
41
Pro Gruppe sind nur wenige Fälle mit langer Nachbeobachtungszeit enthalten, daher
ist die statistische Power begrenzt. Letztlich konnte mit Hilfe der statistischen Tests
die
Nullhypothese
weder
bewiesen
noch
widerlegt
werden,
da
die
Wahrscheinlichkeit einen Fehler erster Art zu machen zu groß ist. Die, wegen
unerwarteten Nebenwirkungen der Bestrahlung, kleine Stichprobe schränkt die
Aussagekraft dieser Studie erheblich ein.
Bei den Ausgangswerten (1. Szintigraphie) sind bei zwei Gruppen (fünf
Mikrogramm IGF-1 drei Tage lang zur Bestrahlung mit zwölf bzw. 15 Gray
Bestrahlung im Vergleich mit deren zugehörige Kontrollgruppe) signifikante pWerte berechnet worden, obwohl eigentlich keine unterschiedlichen Ausgangswerte
zwischen den Gruppen zu erwarten sind („falsch“ signifikantes Ergebnis (α-Risiko).
Dies ist wahrscheinlich auf die ungünstige Auswahl der Stichproben, also einen
zufälligen Unterschied, zurückzuführen. Deswegen wurden diese Ergebnisse in der
Tabelle als Artefakte bezeichnet.
4.3.4.2. pifithrin-α-Gruppe
Die Berechnungen wurden ebenso wie bei den anderen Gruppen durchgeführt. Die
pifithrin-α-Gruppe wurde mit 15 Gray bestrahlt und wird mit der Kontrollgruppe mit
der gleichen Bestrahlungsdosis verglichen. In der folgenden Tabelle sind die
Mediane, Anzahl der Tiere zu den jeweiligen Szintigraphiezeitpunkten (in runden
Klammern),
Maximal-
und
Minimal-Werte
(in
eckigen
Klammern)
und
Signifikanzen der beiden Gruppen aufgelistet.
42
Gruppe
Median [Max/Min]
Pifithrin-α
Anzahl der Tiere
Mittelwert ±
Standardabweichung
Median [Max/Min]
Kontrolle
15 Gy
Signifikanz
Anzahl der Tiere
Mittelwert ±
Standardabweichung
1.Szintigraphie
2. Szintigraphie
3. Szintigraphie
51,1 [56,2/47,5]
(n=6)
51,4 ± 2,68
53,8 [59,7/46,1]
(n=20)
54,06 ± 3,92
42,8 [43,9/41,7]
(n=2)
42,8 ± 1,1
42,3 [53,4/24,3]
(n=12)
41,3 ± 8,26
33,2 [37,2/29,2]
(n=2)
33,2 ± 4
33,8 [47,0/4,8]
(n=5)
33,84 ± 12,96
0,107
0,855
1,000
Tab. 4.5. Mediane, Anzahl der Tiere, Maximal- und Minimal-Werte und Signifikanzen
Die Mediane der beiden Gruppen sind in dem folgenden Diagramm gegeneinander
aufgetragen:
Werte der rechte Niere (%)
Kontroll- und pifithrin-α-Gruppe
60
55
50
45
40
35
30
25
K B15
p53-inhibitor
1.
2.
3.
Szintigraphie
Abb. 4.5. Mediane der beiden Gruppen im Verlauf
43
4.4. Vorhersage des Verlaufs der Nierenfunktion
In diesem Kapitel wird die Frage erörtert, ob es möglich ist, auf den Werten der
ersten Szintigraphien basierend den weiteren Verlauf vorherzusagen und als
prädiktiven Parameter zu verwenden, um die Follw-Up-Zeit zu verkürzen.
Nierenszintigraphie-Werte
70
Nierenfunktion (%)
60
Maus 1
50
Maus 2
40
Maus 3
30
Maus 4
20
Maus 5
10
0
1
2
3
4
5
6
7
Szintigraphie
Abb. 4.6. Verschiedene Verläufe der Nierenszintigraphie-Werte
An dem Beispiel der Nierenszintigraphie-Werte einiger ausgewählter Verläufe kann
man erkennen, dass man auf der Basis der ersten Werte keine Aussage über die
zukünftige Entwicklung treffen kann. Während die Funktion der rechten Niere von
Maus 5 auf einem relativ konstant guten Niveau stagniert, verschlechtert sich die
Nierenfunktion von Maus 1 innerhalb von 25 Wochen rapide, um dann nur noch
langsam weiter abzunehmen. Die Nierenfunktion von Maus 3 und 4 nimmt relativ
kontinuierlich mit der Zeit ab, bis eine Niereninsuffizienz eintritt. Die
Nierenszintigraphie-Werte von Maus 2 und 3 sind bei der zweiten Szintigraphie fast
gleich, danach verschlechtert sich die Nierenwerte von Maus 3 mehr als von Maus 2.
44
5. Diskussion
5.1. Einfluss der Methodik auf die Ergebnisse
5.1.1. Bestrahlung
Bei der Bestrahlung wurde mit Hilfe von Bleiabdeckungen versucht, die Umgebung
der rechten Niere zu schützen, die Mortalität ist dennoch nicht nur bei höheren
Bestrahlungsdosen sehr hoch. Dies wirkt sich sehr nachteilig auf die Auswertung der
Ergebnisse aus. Die Möglichkeit einer Wirkung der untersuchten Substanzen kann in
diesem Dosisbereich weder bestätigt noch definitiv verworfen werden.
Die Schädigung der umgebenden Strukturen, vor allem von Darmabschnitten, ist ein
limitierender Faktor der Nachbeobachtungszeit. In der Literatur sind protektive
Effekte von IGF-1 auf die Strahlenenteritis beschrieben 4, 55, 56, 96. Aber die genannten
Autoren haben die Tiere nur vier Tage nachbeobachtet, da der histologische Schaden
in der akuten Phase am vierten Tag am höchsten ist 128.
Vergleichbare Experimente mit der Substanz pifithrin-α sind in der Literatur in der
Form noch nicht beschrieben worden. Die Arbeitsgruppe um Komorov
67
hat nach
Ganzkörperbestrahlung das Überleben der Tiere nach der letalen Strahlendosis und
mit Hilfe einer
14
C-Thymidin-Bindungstest die DNS-Synthese untersucht. Die
Wirkung auf die einzelnen Organsysteme (z.B. auf die Nieren) ist bei dieser
Versuchsreihe nicht separat analysiert worden.
Trotz
des
gleichen
Versuchsaufbaus
entwickeln
einige
Tiere
eher
eine
Niereninsuffizienz als andere Tiere. Einige Mäuse behalten bis zum Ende der
Nachbeobachtungszeit
eine
relativ
wenig
verringerte
Nierenfunktion
bei.
Möglicherweise lag bei diesen Tieren nicht die ganze Niere im Hochdosisbereich, so
dass Erholungsvorgänge dazu führen konnten, dass sich die Nierenfunktion kaum
verschlechtert hat.
45
Um die umgebenden Strukturen zu schützen, gibt es verschiedene Möglichkeiten.
Eine Möglichkeit ist die Fraktionierung der Bestrahlungsdosis. Dadurch entstehen
bei jeder Bestrahlung geringere Schäden und das Gewebe hat die Möglichkeit, diese
Schäden besser zu reparieren. Die Gesamtdosis muss allerdings etwas hoeher
gewaehlt werden, um an der Niere noch einen Effekt zu sehen. Von Nachteil
bezueglich Aufwand und Toxizitaet ist die hohe Zahl der erforderlichen Narkosen.
Eine intraoperative Bestrahlung mit Abdeckung der Umgebung – insbesondere der
umgebenden Darmabschnitte – wäre ebenfalls eine Möglichkeit, wäre aber bei einer
Anzahl von über 140 Tieren sehr aufwendig. Außerdem wäre dabei eine längere
Narkosedauer und höheres Risiko durch die Operation und deren Komplikationen
gegeben.
5.1.2. Narkosen
Die Isofluran-Narkose während der Bestrahlung wurde von den Tieren gut toleriert.
Da bei den Nierenszintigraphien mit Ketamin als Narkotikum einige Todesfälle
auftraten, wurde bei zwei Szintigraphien versuchsweise mit Isofluran gearbeitet. Die
Schwierigkeit dabei ist, über den Schlauch alle Tiere (maximal zehn) gleichzeitig mit
genügend Sauerstoff und Narkotikum zu versorgen. Mehrere Tiere, die an Masken an
dem ableitenden Schenkel des Schlauches angeschlossen waren, haben weniger von
dem Ketamin und Sauerstoff-Gemisch erhalten. Wahrscheinlich traten aufgrund des
erniedrigten Sauerstoff-Gehalts und einer erhöhten Kohlendioxid-Konzentration
Todesfälle auf.
Die Verringerung der Mortalitätsrate, unter anderem durch eine Optimierung der
Anästhesie, ist ein wesentlicher Punkt in der Durchführung weiterer Versuchsreihen.
Durch die Bestrahlung sind die Tiere bereits geschwächt. Die anfänglich gut
tolerierten
Narkotika-Dosen
können
bei
diesen
Tieren
bei
den
Kontrollszinitigraphien häufiger zu Komplikationen führen.
46
Außerdem wurde nach mehreren Anästhesien eine Toleranzentwicklung gegenüber
dem Ketamin beobachtet. Bei gleichbleibender Dosierung treten vermehrt
Zuckungen während der Narkose auf. Um eine gute Bildqualität zu erreichen,
wurden die Tiere an dem Detektor für den Zeitraum der NierenszintigraphieAufnahme fixiert. Eine Erhöhung der Ketamin-Dosierung wurde nicht erprobt, da
vermehrt Todesfälle zu befürchten gewesen wäre.
5.1.3. Messung der Nierenfunktion
Der Verlauf der Nierenfunktion wird mit Hilfe einer statischen Szintigraphie
ermittelt. Diese nuklearmedizinische Untersuchung mit DMSA als Radiopharmakon
kann zur Beuteilung von Lage, Form und Größe der Nieren, zur Feststellung von
Narben und Parenchymdefekten herangezogen werden. Sie ermittelt nur die relative
Nierenfunktion zu einem bestimmten Zeitpunkt und kann keine direkte Aussage über
die glomeruläre Filtrationsrate, renale Durchblutung oder Clearance der Nieren
machen. Es gibt allerdings Studien, die der statischen Nierenszintigraphie eine
exzellente Korrelation mit der glomerulären Filtrationsrate bescheinigen 125.
Die
Nierenfunktion
der
bestrahlten
Seite
nimmt
im
Verlauf
der
Nachbeobachtungszeit ab. Bei den vorliegenden Versuchsreihen wird angenommen,
dass die gesunde, unbestrahlte Niere die Schäden auf der Gegenseite kompensiert.
Nur unter dieser Bedingung stellt der relative Wert, welcher durch die statische
Nierenszintigraphie ermittelt wird, ein Maß für die Nierenfunktion dar. Es erscheint
sinnvoll, in der Zukunft auch die Gesamtfunktion der Nieren (z.B. mit Hilfe der
Kreatinin-Clearance oder einer dynamischen Szintigraphie) zu messen, um hierϋber
weitere Informationen zu erhalten.
47
5.1.4. Auswertung
Je stärker die Niereninsuffizienz fortgeschritten ist, desto schwerer kann die rechte
Niere von den sie umgebenden Strukturen, die ebenfalls das Radiopharmakon
aufnehmen, wie zum Beispiel der Leber, abgegrenzt werden. Dadurch können unter
Umständen falsch hohe Werte von einer bereits insuffizienten Niere entstehen.
Linke Niere
Leber
Kopf
Abb. 5.1. Nierenszintigraphie-Aufnahme: Maus mit Niereninsuffizienz rechts
Zusätzlich ist bei der bestrahlten Niere das Areal kleiner, welches die Aktivität
aufnimmt. Bei der Auswertung wird ein Gebiet der gleichen Ausdehnung bei der
linken Niere markiert, welches aber nicht die gesamte linke Niere umfasst, sondern
nur die Gebiete mit der höchsten Aktivität. Dadurch kann im Vergleich bei der
rechten Niere eine relativ geringere Funktion angezeigt werden.
Außerdem kann die Partialfunktionsberechnung aus der dorsalen Projektion zu
niedrigeren Werten für die rechte Niere führen als wenn man das geometrische
Mittel aus dorsaler und ventraler Projektion ermittelt 30. Möglicherweise unterschätzt
man dadurch bei der Berechnung die Nierenfunktion der rechten bestrahlten Niere.
48
5.2. Ergebnisse
5.2.1. Kontrollgruppen
Die Kontrollgruppen wurden mit vier verschiedenen Bestrahlungsdosen (zehn,
zwölf, 15 und 17 Gray) bestrahlt. Die Annahme, dass die Niere mit zunehmend
höherer Bestrahlungsdosis mehr geschädigt wird, hat sich nicht eindeutig bestätigt.
Die Nierenszintigraphie-Werte der Gruppen liegen vielmehr nahe beieinander.
Deswegen war es nicht möglich gewesen, mit diesen Werten Dosis-Effekt-Kurven zu
zeichnen. Möglichweise liegen die Werte bereits am abgeflachten oberen Rand der
sigmoiden Kurven.
Nur die Gruppe, die mit 17 Gray bestrahlt worden ist, zeigt im Diagramm
(Abbildung 4.4.) eine deutlichere Abnahme der Nierenfunktion als die drei Gruppen
mit niedrigeren Bestrahlungsdosen. Statistisch gesehen zeigen sich keine
signifikanten Unterschiede, wobei wegen der kleinen Anzahl der Tiere innerhalb
einer Gruppe und der großen Streubreite eine geringe statistische Power besteht und
eher ein Trend als ein signifikantes Ergebnis zu erwarten ist. Man muss auch als
Fehlerquelle berücksichtigen, dass die empfindlichsten Tiere in den Gruppen mit
hoher Strahlendosis früh verstorben sind und dadurch wahrscheinlich eine zu
optimistische Bewertung der Nierenfunktion erfolgt.
5.2.2. IGF-1-Gruppen
Eine leichte Tendenz, dass IGF-1 über eine radioprotektive Wirkung auf die Niere
verfügen könnte, lässt sich aus den Kurven ablesen. Vor allem die Gruppen, die fünf
Mikrogramm IGF zur Bestrahlung erhalten hatten, heben sich in den Diagrammen
von den anderen Gruppen hervor. Hier muss diskutiert werden, dass auch in den ZNS
49
Experimenten mittlere IGF-1-Dosen am besten wirkten und dass nicht die höchste
Dosis am effektivsten ist
99-101
. Falls eine Protektion durch Wachstumsfaktoren
möglich ist, scheint eher eine nicht-lineare Dosis-Wirkungsbeziehung vorzuliegen.
Wegen der geringen Fallzahlen lässt sich durch statistische Tests aber kein
signifikanter Unterschied nachweisen.
Die Gruppen, die das IGF-1 26 bzw. 27 Wochen nach der Bestrahlung für 30 Tage
erhalten haben, weisen dagegen kaum Unterschiede zu der Kontrollgruppe auf. Trotz
der eingeschränkten Aussagekraft (kleine Fallzahl in diesen Gruppen), zeigt keines
der Tiere eine Tendenz zu einer Verbesserung der Nierenfunktion. IGF-1 scheint
somit kaum Wirkung bei einer bereits bestehenden Nierenschädigung zu haben.
5.2.3. pifithrin-α-Gruppe
Bei der Gruppe, die den p53-Inhibitor pifithrin-α in der Dosierung zwei Milligramm
pro Kilogramm Körpergewicht erhalten hat, lässt sich aus den ermittelten Daten kein
Unterschied der Nierenfunktion zur Kontrollgruppe nachweisen. In dem Diagramm
verlaufen die Kurven der beiden Gruppen nahezu identisch. Die Aussagekraft mit
nur einer Gruppe von sechs Tieren, die das pifithrin-α in einer Dosierung erhalten
haben, ist allerdings gering. Mit diesem Versuch kann nicht ausgeschlossen werden,
dass
pifithrin-α
in
anderer
Dosierung
und
möglicherweise
längerer
Anwendungsdauer eine Wirkung auf die strahlenindizierte Nephropathie haben
könnte. Insgesamt erscheint es aber wenig wahrscheinlich, dass pifithrin-α in diesem
Modell sinnvoll eingesetzt werden kann.
Bei den Versuchen der Arbeitsgruppe um Komarov 67 wurde bei der Behandlung mit
pifithrin-α eine höherer Überlebensrate der Tiere, die mit einer letalen
Ganzkörperbestrahlung mit einer Dosis von sechs bzw. acht Gy bestrahlt worden
sind, beobachtet. Die Aufnahme und Einbau des radioaktiv markierte 14C-Thymidin,
ein Zeichen für die DNA-Polymerase-Tätigkeit, ist nach Behandlung mit pifithrin-α
50
weniger reduziert als bei der Kontrollgruppe. Daraus wird geschlossen, dass
pifithrin-α die blockierende Wirkung des p53 auf die DNA-Replikation abmildert
und somit die Apoptoserate verringert.
Bei der Versuchsreihe in der vorliegenden Arbeit scheint pifithrin-α das Überleben
der Tiere nicht verbessert zu haben, da alle sechs Tiere bereits nach der dritten
Szintigraphie verstorben sind.
5.3. Die Strahlennephropathie
Verschiedene Studien haben sich mit der Strahlennephropathie nach abdominaler
oder Ganzkörperbestrahlung vor Knochmarkstransplantation beschäftigt (Tabelle
5.1.). Von den vielen getesteten Substanzen scheint der Eingriff in das ReninAngiotensin-System in Kombination mit einer Steroidtherapie im Vergleich am
wirkungsvollsten zu sein, aber Nachfolgestudien darüber fehlen. Aktuellere Studien
konzentrieren sich vor allem auf eine Therapie mit verschiedenen Angiotensin IIRezeptor-Antagonisten 93, 94.
Die
meisten
dieser
Behandlungsoptionen
können
die
Ausbildung
der
Strahlenschäden nicht verhindern, sondern mildern und verzögern.
Ein positiver Effekt auf eine bestehende Strahlennephropathie wurde in einem
klinischen Fall beschrieben. Aber die Patientin war bereits mit verschiedenen
Medikamenten (Prednisolon, Azatioprin, Lisinopril, Heparin etc.) vorbehandelt und
hatte nur 750 Zentigray in fünf Fraktionen mehr als 20 Jahre zuvor erhalten. Unter
Losartan-Einnahme konnte der Blutdruck auf normale Werte gesenkt und die
Verschlechterung der glomerulären Filtrationsrate aufgehalten werden 18.
51
52
Einzeldosis 10-16 Gy oder
fraktionierte Bestrahlung
20 x 2 Gy
250 kV Röntgenstrahlen
unilateral
Einzeldosis 6-10 Gy
70 kV Röntgenstrahlen
Einzeldosis 6 Gy
Ganzkörperbestrahlung
Mäuse
Mäuse
Mäuse
Ratten
IGF-1
ASS im Trinkwasser
3 Wochen, 6,2-7,7 mg/d
Clopidogrel im Trinkwasser
2 Wochen vor der
Bestrahlung
15/20/25 mg/kg/d
Erythropoetin s.c.-Injektion
500 bzw. 2000 IU/kg/Injektion
18h bzw. 2h vor und 23h
nach der Bestrahlung
Cremophor-El 50 µl/kg ein
Tag vor Bestrahlung
Eigene
Daten
van
Kleef,
2000131
te Poele,
2001126
Mäuse
Laborkontrolle (u.a.
Harnstoff, Kreatinin)
am 1./ 3./ 7. Tag
32 Tage follow-up
99m-Tc-DMSASzintigraphie
37 Wochen follow-up
Plättchenaggregation,
Fibrinogen/Fibrin-Ablagerung
(immunhistologischer Nachweis)
51 Cr-EDTA-Retension
≤44 Wochen follow-up
TXA2-Plasma-Level /
Plättchenaggregation
Blutdruck, renaler
Proteinverlust
99m-Tc-DMSASzintigraphie
49 Wochen follow-up
51 Cr-EDTA-Retension
80 Wochen follow-up
KG, WBC, RBC, Hk,
PlasmaHarnstoff
51 Cr-EDTA-Retension
90 Tage follow-up
Nierenfunktion
(Harnstoff, Kreatinin,
renaler Proteinverlust)
Histopathologie +
Überlebenszeit
Ein Jahr follow-up
51 Cr-EDTA-Retension
Blutharnstoff-Stickstoff
Follow-Up
Tabelle 5.1.: Einige ausgewählte Literatur mit Versuchen zur Therapie der Strahlennephropathie
Ramadan,
2001111
Andraschke,
20066
bilateral über lateral
tangentiale Felder,
Gesamtdosis 0-40 Gy
unilateral
Einzeldosis 12-15 Gy
unilateral
Ratten
Enalapril/Hydrochlorthiazid
Junocs,
199364
Ratten
Ratten
Geraci,
1993 36,
199237
Geraci,
199535
Ganzkörperbestrahlung
8-15 Gy oder 27-35 Gy
(bei fraktionierter
Bestrahlung)
mit nachfolgender
Knochmarktransplantation
bilateral intraoperativ
Einzeldosis 13-20 Gy
bilateral intraoperativ
Einzeldosis 20 Gy
15-27 Gy bilateral, in 12
Fraktionen
Bestrahlung
Captopril 62,5 oder 500 mg/l
oder AT II-Rezeptor(Typ 1)Antagonisten (L158,809) 20
mg/l im Trinkwasser
9d vor der Bestrahlung bis
zum Ende der Studie
Dexamethason/Captopril
und in Kombination
Dexamethason
Ratten
Ratten
Captopril (500 mg/l)
im Trinkwasser; 6 Monate nach
Bestrahlung, wenn Nlutharnstoff
>4,1mmol/l
Versuchstiere
Substanz
Moulder,
199890
Literatur
Cohen,
199219
Signifikante protektive Wirkung auf die
strahleninduzierte Leber-/ Nieren/Knochenmarkschädigung; kaum Einfluß auf die
Kreatinin-Konzentration
Mehr Strahlennephropathie als bei unbehandelten
Kontrolltieren, Effekt steigt mit der Erythropoetin
Dosis
Keine Wirkung auf prothrombotische
Veränderungen und auf die Entwicklung der
Strahlennephropathie
Enalapril hat günstige Wirkung auf die Nierenfunktion und Struktur, Hydrochlorthiazid nicht
Leichte Tendenz, dass IGF-1 protektiv auf die
Strahlennephropathie wirkt, Effekte nicht
signifikant
Geringe, aber nicht-signifikante Verbesserung der
Nierenfunktion, keine Verringerung der
histologischen Schäden
Signifikant geringere Erhöhung der Blutharnstoff
–Stickstoff-Konzentration, geringere renale
Proteinverluste und verlängerte Überlebenszeit
Signifikante Verbesserung der Nierenfunktion
und der Überlebensrate durch beide Substanzen;
ATII-Rezeptorantagonisten wirksamer als ACEHemmer (Captopril); Die kontinuierliche
niedrigdosierte Gabe des ACE-Hemmers wirkt
besser als die höhere Dosierung
Bei gemeinsamer Gabe beider Substanzen
additiver Effekt
Signifikant erhöhte Überlebensrate
Verzögerte Entwicklung der Nierenschäden (v.a.
geringere Schäden an den Glomeruli und Tubuli)
Ergebnisse
5.4. IGF-1 Anwendungen und Tumoren
5.4.1. IGF-1-Konzentration am Wirkungsort
Die Menge an freiem IGF-1 am Wirkungsort hängt von vielen Faktoren ab. Alter,
Geschlecht und Rauchgewohnheiten wirken sich auf die Konzentration des IGF-1
aus
65
. In den Gefäßen sind verschiedene Proteine, unter anderem die sieben IGF-
Binding Proteins (IGFBPs), die das freie IGF-1 binden. Die Konzentration dieser
Proteine sowie das Vorhandensein und die Menge der IGF-Rezeptoren entscheiden
darüber, wie viel von dem applizierten IGF-1 an seinem geplanten Wirkungsort
gelangen und wirken kann. Durch Bindung und Inaktivierung der IGFBPs kann die
Konzentration des freien IGF-1 erhöht werden 118.
Labortechnisch gibt es Möglichkeiten, die Menge an freiem IGF-1 und den IGFBPs
im Blut zu bestimmen. Die Konzentration von IGF-1-Rezeptoren an bestrahlten
Geweben ist noch nicht untersucht worden.
5.4.2. Optimierung der IGF-1-Applikationen
In der vorliegenden Versuchsreihe wurde das IGF-1 in vier Dosierungen (0,5; 1,25; 5
und 25 Mikrogramm) für drei oder 14 Tage parallel zur Bestrahlung appliziert. Die
Gruppe, die das IGF-1 zwei Wochen lang erhalten hatte, scheint im Vergleich zu den
anderen Gruppen tendenziell bessere Nierenfunktionswerte zu haben (Abbildung
5.2.).
Eine längere IGF-1-Applikation zur Bestrahlung scheint also wirksamer zu sein als
eine kurze Intervention von drei Tagen. Da aus der Gruppe, die das IGF-1 vierzehn
Tage lang erhalten hat, alle Tiere bereits nach der vierten Szintigraphie verstorben
sind, konnte die Langzeitwirkung einer längeren IGF-1 Gabe aber nicht bestimmt
53
werden. Weitere Versuche sind notwendig, um zu klären, wie die Applikation des
IGF-1 optimiert werden kann. Möglicherweise wirkt eine längere Gabe günstiger auf
die Nierenfunktion. Interessant wäre auch zu untersuchen, ob eine IGF-1-Gabe
länger vor der Bestrahlung einen Effekt hat.
Werte der rechte Niere (%)
Kontroll- und IGF-Gruppen (15Gy)
60
K B15
50
G5 B15
G5 B15 14d
40
30
1.
2.
3.
4.
Szintigraphie
Abb. 5.2. Ausschnitt aus den Median-Kurven der Gruppen mit 15 Gy Bestrahlung
5.4.3. IGF-1 und die Niere
IGF-1 hat verschiedene Wirkungen auf die Niere. Einerseits fördert IGF-1 die
Proliferation und steigert die glomeruläre Filtrationsrate sowie den renalen
Plasmafluß. Möglicherweise hängt der Effekt auf die Strahlennephropathie von dem
Zeitpunkt der IGF-1-Gabe ab. Eine frühe Gabe des IGF-1 kann protektiv auf die
Entstehung der Schäden wirken, während bei bestehender Niereninsuffizienz durch
IGF-1 eher die Ausbildung einer Fibrose und Glomerulosklerose begünstigt wird
50,
78, 102
. IGF-1 wirkt in der Niere vor allem auf die Mesangiumzellen und die Zellen
des Sammelrohres
10, 20
. Möglicherweise muss man die geringe protektive Wirkung
54
auf das normale Gewebe gegenüber den proliferationsfördernden Signalen der
Wachstumsfaktoren
abwägen.
Über
den
Wirkmechanismus
der
einzelnen
Wachstumsfaktoren ist zu wenig bekannt. Sie sind in viele Signalkaskaden
verwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurde nur die spezielle Wirkung des IGF-1
auf die Niere untersucht.
5.4.4. IGF-1 und Tumoren
Bei der Anwendung von IGF-1 mϋssen verschiedene Faktoren berücksichtigt
werden. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass IGF-1 möglicherweise das
Tumorwachstum begünstigen oder gar Tumor hervorrufen kann 12, 60, 66, 108, 113.
Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Menschen mit höherem IGF-1-Level
ein höheres Krebsrisiko haben
(Mamma-
107, 108
48, 69, 104, 121
Prostata-Karzinom
, Ovarial-
106, 107
114
. In Versuchen mit verschiedenen Tumorarten
, Colorektal-
1, 13, 60, 83, 138
, Lungen-
57, 59, 97
,
und Gioblastom 5) wurde der Einfluss von IGF-1 auf die
Proliferation und Apoptose untersucht. Möglicherweise korreliert die Höhe der IGF1- und IGFBP-3-Level mit dem Risiko, an einem Kolonkarzinom zu erkranken. In
prospektiven Studien wurde das Blut von über 30.000 Frauen und 10.000 Männern
diesbezüglich untersucht 38, 80. Bei beiden korreliert das Krebsrisiko mit höhere IGF1- und niedrigere IGFBP-3-Konzentration im Blut.
Eine Verringerung der IGF-1-Effekte durch eine Hemmung des Rezeptors 114, 120, 134,
mit Hilfe eines Analogons
106
oder durch Senkung des freien IGF-1
137
konnte im
Labor und in Tierversuchen gezeigt werden. In den sensiblen Tumoren konnte im
Vergleich zu unbehandelten Kontrollen die Proliferationsrate gesenkt und die
Metastasierung verhindert werden.
55
5.4.5. Anwendungsmöglichkeiten
Bisher wird die Messung der IGF-1-Konzentration in der Klinik bei der Erkennung
und Verlaufskontrolle der Akromegalie eingesetzt. GH- und IGF-1-Spiegel im altersund geschlechtsentsprechenden Bereich schließen eine Akromegalie weitgehend aus
86
.
Aufgrund seiner anabolen Eigenschaften wird IGF-1 auch zum Doping verwendet 2.
Die Behandlungsmöglichkeiten verschiedener Erkrankungen mit IGF-1 sind noch in
experimenteller Erprobungsphase.
IGF-1 fördert die Proliferation und Myelinierung der Oligodendrozyten im Gehirn
84
.
Trotz
der
positiven
Resultate
experimentellen Bedingungen
15, 77
auf
die
Autoimmunencephalitis
9,
unter
lässt sich dieser Effekt bei Multiple-Sklerose-
Erkrankten Patienten nicht reproduzieren
31
, wobei die Aussagefähigkeit bei einer
kleinen Kohorte von sieben Patienten und einer 24-wöchigen Behandlungsdauer sehr
eingeschränkt ist. Möglicherweise ist die Interaktion des IGF-1 im menschlichen
Organismus komplexer und schwieriger zu steuern als unter experimentellen
Bedingungen. Auch bei der strahleninduzierten Neurotoxizität lässt sich im
Tierversuch eine gewisse neuroprotektive Wirkung des IGF-1 nachweisen 99-101.
Bei der Anwendung von IGF-1 muss berücksichtigt werden, dass eine Erhöhung der
freien IGF-1 Spiegel das Tumorwachstum fördern kann
61
. Einige Gruppen
beschäftigen sich mit der Wirkung von IGF-1-Rezeptor-Antagonisten auf die
Hemmung des Tumorwachstums
134
. Die Gabe von IGF-1 zum Schutz gesunder
Gewebe vor ionisierender Strahlung ist sicherlich aus heutiger Sicht nur sinnvoll,
wenn eine deutlich signifikante protektive Wirkung nachgewiesen wird, und, wenn
die Grunderkrankung – der maligne Tumor – nicht auf das Wachstumsstimulus
reagiert.
56
5.5. pifithrin-α Anwendungsmöglichkeiten und Tumoren
Der p53-Inhibitor pifithrin-α ist eine Substanz, der erst seit einigen Jahren bekannt
ist und erforscht wird 67. Bisher gibt es keine klinische Indikation für die Anwendung
von pifithrin-α.
Durch die Blockierung des Tumorsupressors p53 könnten die therapiebedingten
Nebenwirkungen von Chemo- und Strahlentherapie reduziert werden
67
. Als
„Wächter des Genoms“ vermittelt p53 die Reparatur der Schäden an der Erbsubstanz
und erst bei irreversiblen Schäden setzt es die Signalkette in Richtung Apoptose frei.
Verschiedene Studien untersuchen die Möglichkeit, pifithrin-α zur Therapie
bestimmter Erkrankungen einzusetzen, bei denen die p53-induzierte Apoptose eine
große Rolle spielt. Bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. M.
Alzheimer scheint pifithrin-α das Neuronensterben zu reduzieren. Auch nach
Infarkten und im Zusammenhang mit ischiämieinduzierter Apoptose wirkt pifithrinα protektiv auf das Gehirn, Herz und Niere 44.
Bei Zytostatikatherapie wirkt pifithrin-α unter anderem protektiv gegenüber der
Doxorubicin-induzierte Kardiotoxizität
76
. Pifithrin-α wurde 30 Minuten vor und
zwei Stunden nach der Doxorubicin-Gabe verabreicht und hat anscheinend keine
Einfluss
auf
die
Wirksamkeit
des
Doxorubicin
auf
die
Tumorzellen
(Prostatacarzinom).
Da in vielen Tumoren das p53 mutiert oder inaktiviert ist, hat pifithrin-α keine
Wirkung auf das Wachstum oder die Apoptose dieser entarteten Zellen. Bei Zellen
mit funktionsfähigem p53 vermindert pifithrin-α die Apoptose. Patienten mit
malignen Tumoren haben manchmal bereits in ihrem Genom disponierende
Faktoren, die eine Entartung begϋnstigen können, z.B. Mutation an den
Reparaturmechanismen oder an den Tumorsupressorgenen. Eine Inhibition des
funktionsfähigen p53 bei solchen Personen kann negative Auswirkungen haben.
Bisher sind die klinischen Nebenwirkungen des pifithrin-α noch unerforscht. Es ist
57
aber anzunehmen, dass unter Anwendung von pifithrin-α die Wahrscheinlichkeit der
Ausbildung von Tumoren erhöht wird, da die Reparatur der Schäden, die durch die
mutagenen Effekte ionisierender Strahlen hervorgerufen werden, blockiert ist.
58
6. Zusammenfassung
Sowohl eine lokale Bestrahlung der Nieren mit höheren Dosen als auch
Ganzkörperbestrahlungen vor einer Knochenmarkstransplantation können eine
strahleninduzierte Nephropathie zur Folge haben. Diese Spätkomplikation limitiert
unter anderem die Höhe der Bestrahlungsdosis. Die protektive Wirkung
verschiedener Substanzen (wie z.B. Steroide und ACE-Hemmer) auf die bestrahlte
Niere sind früher bereits untersucht worden.
In der vorliegenden Studie wird die protektive Wirkung von Insulin-like growth
factor–1 (IGF-1) und dem p53-Inhibitor pifithrin-α auf die bestrahlte Niere getestet.
IGF-1 wirkt antiapoptotisch und fördert die DNS-Synthese und die Zellvermehrung.
In der Niere erhöht es den renalen Plasmafluss und die glomeruläre Filtration.
Pifithrin-α blockiert reversibel das Protein p53 und somit die Apoptose der Zellen.
Die Abnahme der Nierenfunktion der bestrahlten Niere wird mit Hilfe von statischen
Nierenszintigrammen festgestellt. Tendenziell lässt sich bei den Gruppen, die IGF
parallel zur Bestrahlung erhalten haben, ein besserer Erhalt der Nierenfunktion
feststellen. Besonders die Gruppen, die fünf Mikrogramm IGF erhalten haben, heben
sich in den Kurven von den anderen Kontroll- und IGF-1-Gruppen mit den gleichen
Bestrahlungsdosen hervor.
Bei der pifithrin-α –Gruppe lässt sich kein Unterschied zur Kontrollgruppe erkennen.
Wegen der geringen Fallzahlen, unter anderem durch interkurrente Todesfälle,
konnte kein statistisch signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
Inwiefern IGF-1 protektiv auf die Strahlennephropathie wirkt, kann in der
vorliegenden Studie noch nicht ausreichend beurteilt werden. Dafür wären weitere
Experimente mit größeren Fallzahlen oder einer optimierten Methodik (z.B.
Fraktionierung der Bestrahlung, besserer Schutz der umgebenden Strukturen) nötig.
Tendenziell kann man aber vermuten, dass intermediäre Dosen von IGF-1 eine
protektive
Wirkung
aufweisen
und
für
weitere
Optimierungen
des
Applikationsschemas als Ausgangspunkt dienen können.
59
7. Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ACE
Angiotensin Converting Enzyme
ALS
acid-labile subunit
ASS
Acetylsalicylsäure
AT1-Antagonist
Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyp-1-Antagonist
B
Bestrahlungsdosis
bFGF
Basic fibroblast growth factor
bzw.
beziehungsweie
ca.
circa
cGy
Zentigray
cm
Zentimeter
Cr-EDTA
Chrom-Ethylendiamintetraessigsäure
d
Tage
DNA / DNS
Desoxyribonukleinsäure
EPO
Erythropoetin
G
Gruppe mit IGF-1-Gabe zur Bestrahlung
GFR
Glomeruläre Filtrationsrate
Grb-2
growth factor receptor-bound protein 2
Gy
Gray
i.v.
intravenös
IGF
Insulin-like growth factor
IGFBP
Insulin-like growth factor binding protein
IRS-2
Insulin Receptor Substrate 2
K
Kontrollgruppe
kV
Kilovolt
l
Liter
MBq
Megabecquerel
Mdm2
murine double minute-2
µg
Mikrogramm
60
min
Minuten
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mm
Millimeter
MRT
Magnetresonanztomographie
n
Anzahl
NaCl
Natriumchlorid
NO
Stickstoffmonooxid
p-Werte
Signifikanzniveau
PBS
phosphate buffered saline
PI3-Kaskade
Phosphoinositol-3-Kinase-Kaskade
RNA
Ribonukleinsäure
Roi
Region of Interest
s.c.
subcutan
Shc
Src-homologes Kollagen Protein
STH
somatotropes Hormon = Wachstumsfaktor
Tab.
Tabelle
Tc-DMSA
Technetium-Dimercaptosuccinat
TGF-β
Transforming Growth Factor - β
TNF-α
Tumornekrosefaktor - α
V
Gruppe mit IGF-1-Gabe verzögert 26. bzw. 27 Wochen nach Bestrahlung
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
VLDL
Very low density lipoprotein
VXHR
Vertex High Resolution
z.B.
zum Beispiel
ZNS
Zentralnervensystem
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9. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich an alle Menschen, die mir beim Gelingen dieser Arbeit tatkräftig
zur Seite standen, meinen herzlichen Dank aussprechen.
An erster Stelle möchte ich Dr. Nieder für die Überlassung dieses Dissertationsthemas, die
Betreuung während des experimentellen Teils und die Korrektur der Arbeit danken. Weiterhin
danke ich Prof. Molls, Prof. Dr. D. Neumeier und Prof. Dr. Dr. R. Senekowitsch-Schmidtke.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Andraschke für seine Betreuung, Hilfe bei der Statistik und
Vorschläge für die Verbesserung des schriftlichen Teils der Arbeit;
Dr. Astner für ihre
Unterstützung bei einigen Experimenten.
Den Mitarbeitern des nuklearmedizinschen Instituts, insbesondere Dr. Weber und Frau J.
Carlsen danke ich für die unverzichtbare Hilfe bei den Nierenszintigraphien und deren
Auswertungen.
Und natürlich den Tierpflegerinnen und Tierpflegern für die verantwortungsvolle Betreuung der
Tiere.
Für ihre wertvolle Hilfe bei der Statistik danke ich Frau R. Hollweck und den Mitarbeitern des
Instituts für Medizinische Statistik und Epidemiologie.
Der Deutsche Forschungsgemeinschaft danke ich für die Förderung dieses Projekts.
Außerdem Frau C. Walther, Frau A. Strassner und Frau M. Hobke für die Durchsicht der
Arbeit.
Abschließend möchte ich meinen Eltern und all meinen FreundInnen und Bekannten danken,
die an mich und an das Gelingen der Arbeit geglaubt haben und mich diesbezüglich stets
unterstützt haben.
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