Die Rolle des xCT-Transporters bei der Progression maligner Gliome

Aus der Klinik für Neurochirurgie
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. M. Buchfelder
Die Rolle des xCT-Transporters bei der Progression maligner Gliome
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Alexandra Rebekka Heckel
aus
Gera
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. Michael Buchfelder
Korreferent:
PD Dr. med. Ilker Eyüpoglu
Tag der mündlichen Prüfung:
14.03.2011
Widmung
Ich möchte diese Promotion meinen Eltern, Frau Uta Heckel und Herrn Gerd Heckel, in
inniger Verbundenheit widmen und mich für ihre unerschöpfliche Unterstützung in
allen Lebenslagen, ihre Motivation und ihre unendliche Geduld bedanken.
I nhaltsverzeichnis
Widmung
3
I nhaltsverzeichnis
4
1
Zusammenfassung
6
1.1
Hintergrund und Ziele
6
1.2
Untersuchungsmethoden
6
1.3
Ergebnisse
6
1.4
Praktische Schlussfolgerungen
7
2
3
Conclusion
8
2.1
Background and aims
8
2.2
Methods
8
2.3
Results
8
2.4
Clinical significance
8
Einleitung
10
3.1
Definition und histologische Einteilung der Gliome
10
3.2
Kausalität, Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild der
11
Gliome
3.3
Charakteristika der Gliomausbreitung
12
3.4
Glutamat als Neurotransmitter und als Induktor der neuronalen
14
Apoptose
3.5
Der Astrozyt und seine Transporter
15
3.6
Das xCT-System und ihr Missbrauch durch Gliome
16
3.7
Die Entstehung des Gehirnödemes sowie Unterscheidung zweier
17
Subtypen
3.8
4
Fragestellung der Arbeit
18
M aterial und M ethoden
19
4.1
Verwendete chemische Substanzen
19
4.2
Zelllinien, Zellkultur und deren Splitting
19
4.3
Transfektion der F98-Gliomzellen
20
4.4
Zellfärbung
21
4.5
Proteinpräparation und Immunoblotting
21
4.6
Patientenauswahl
22
4.7
siRNA-Vektorkloning und Expressionsanalyse
22
4.8
RNA-Isolation und die RT-PCR-Analyse
23
4.9
Organotypische Gehirnschnittkulturen und das organotypische
24
Gliominvasionsmodell (OGIM)
5
4.10
Mikroskopische Evaluierung
25
4.11
Xenograft-Studien und die mikrodialytische Untersuchung
25
4.12
Quantifizierung von Glutamat
27
4.13
MRT und die Bestimmung des Gehirnödemes
27
4.14
Statistische Auswertung
28
Ergebnisse
29
5.1
29
Sichtbarmachung der Tumorausbreitung auf Basis des OGIM
5.1.1 Quantifizierung der Gliomproliferation und der Gliominvasion
29
5.1.2 Analysen der Tumor-induzierten Neurotoxizität
32
5.2
34
Beweise für eine Glutamatexzitotoxizität
5.2.1 MK 801-Behandlung
34
5.2.2 GYKI 52466-Behandlung
35
5.3
Analyse des Rezeptorstatus in Gliomen
36
5.4
Hemmung der Expression des xCT-Systems
38
5.4.1 Reduktion der Glutamatsekretion durch den xCT-Knockdown
39
5.5
42
Klinische Relevanz der verminderten Glutamatansammlung
5.5.1 Nachweis von reduzierter Glutamatsekretion in vivo und ex vivo
43
5.5.2 Prolongierte Überlebenszeiten bei verzögertem Auftreten von
45
neurologischen Defiziten
5.6
Bildgebende Darstellung der verminderten Glutamatansammlung
47
5.6.1 Verringerung des perifokalen Ödemes
47
6
Diskussion
49
7
Literaturverzeichnis
53
8
Abkürzungsverzeichnis
60
9
Veröffentlichungen
62
10 Danksagung
63
11 Lebenslauf
64
6
1 Zusammenfassung
1.1
Hintergründe und Ziele
Die ungehemmte Proliferation, das invasive Wachstumsverhalten, die pathologische
Angiogenese sowie die massive Induktion der Neurodegeneration als auch des
Gehirnödemes kennzeichnen einen der aggressivsten und häufig tödlich endenden
menschlichen primären Hirntumoren, das maligne Gliom, mit seinem bösartigsten
Vertreter des Glioblastoma multiforme WHO Grad IV. Trotz chirurgischer Resektion,
adjuvanter Radio- und Chemotherapie kann der Tumor bis heute nicht geheilt werden
und geht daher mit einer durchschnittlichen Überlebenszeit von ca. 12 Monaten nach
Diagnosestellung einher. Die bei der Entstehung der neuronalen Degeneration und des
Gehirnödemes zugrunde liegenden Mechanismen sind bis heute ungeklärt, wobei
Vermutungen vorliegen, in denen bestimmten extrazellulären neurotoxischen Faktoren
eine wichtige Rolle in diesem Prozess zugesprochen wird. Die Motivation dieser Arbeit
lag darin, diese unbestätigten Prozesse näher zu beleuchten, die zugrundeliegenden
molekularen Faktoren zu identifizieren und daran mögliche neue Behandlungsansätze
abzuleiten.
1.2
Untersuchungsmethoden
Um dieser These nachzugehen, wurde in dieser experimentellen Studie speziell eine
Technik entwickelt, in der mit einem zeitmessenden Mikroskop die lebenden
Gliomzellen in einem organotypischen Umgebungsmodell untersucht und mittels der
Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden konnten. Damit war es zum einen
möglich, das Gliomzellwachstum selbst zu verfolgen und sich zum anderen Zugang
zum Extrazellularraum zu verschaffen, wobei das Hauptaugenmerk auf der
Glutamatbestimmung lag. Zur Berechnung des vorliegenden Gehirnödemes wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten MRT-Aufnahmen im in-vivo-Modell vorgenommen.
1.3
Ergebnisse
Im Rahmen der Promotion konnte gezeigt werden, dass der exzitatorische
Neurotransmitter Glutamat vornehmlich zur Induktion der neuronalen Apoptose
beiträgt. Die Glutamattransporteranalyse in primären menschlichen Gliomen ermittelte
den Cystin/Glutamat-Antiporter (System xCT) als führende Instanz in diesem Prozess.
Die sogenannte siRNA-vermittelte Herabregulierung dieses xCT-Transporters erzielte
zum einen eine verminderte Glutamatsekretion mit konsekutiver Senkung der
Neurodegeneration, wobei jedoch das Tumorwachstum selbst unbeeinflusst blieb. Das
7
kernspintomographisch ermittelte zerebrale Ödem zeigte zum anderen in den xCTherabregulierten Gliomen, die in Rattengehirne implantiert wurden, eine deutlich
geringere Ausdehnung, und erreichte dadurch einen verzögerten klinischen Eintritt der
neurologischen Ausfallsmuster mit längerer Überlebenszeit der Ratten. Diese Resultate
belegen die kritische Funktion und Stellung von xCT in der Gliom-induzierten
Neurodegeneration und der Entwicklung des Gehirnödemes.
1.4
Praktische Schlussfolgerungen
Anhand dieser Ergebnisse kann die These unterstützt werden, dass die perifokale
Ödemzone um die Gliome, zumindest zum Teil, eine Konsequenz der erhöhten
extrazellulären Glutamatansammlung mit dem nachfolgenden peritumoralen Zelltod
sein könnte. Möglicherweise könnte dies als Ansatzpunkt in der zukünftigen
Behandlungsstrategie der malignen Gliome dienen. Diese Kenntnisse können sowohl
das Überleben als auch die neurologischen Schäden zugunsten der Patienten
beeinflussen, und dadurch eine Steigerung der Lebensqualität verschaffen.
8
2 Conclusion
2.1
Background and aims
Malignant gliomas, for example glioblastoma multiforme WHO IV, represent one of the
most aggressive and lethal human neoplasias. Hallmarks are unresisted proliferation,
invasive tumour growth, angiogenesis and induction of neurodegeneration and brain
edema. Neurosurgery and adjuvant therapies like irradiation and chemotherapy are
mostly insufficient options. The mechanisms by which malignant gliomas cause
neuronal degeneration and brain edema are still unclear. It is thought, that extracellular
neurotoxic factors play an important role in this process. To illuminate these unresolved
processes and possibly to create new methods for treatment, both were incentives for
this work.
2.2
M ethods
To address this issue, we have developed, in this experimental study, a technique for
tracking glioma cell growth and for making the extracellular fluid accessible in an
organotypic brain environment using real-time live cell microscopy with fluorescence.
Determination of glutamate was the main focus of attention. Cerebral edema was
measured by MRI scans at different time periods.
2.3
Results
In this study, the excitatory neurotransmitter glutamate has been mainly shown as an
inductor of neuronal apoptosis. Analysis of glutamate transporters revealed further that
the cystine-glutamate-exchanger xCT is elevated in primary human gliomas. SiRNAmediated-knockdown of xCT achieved diminished glutamate secretion in gliomas and
consequently reduced glioma-induced cell death, although xCT is dispensable for
malignant glioma growth. To characterize the impact of these results, we assessed the
clinical status of the xCT-knockdown implanted gliomas in rat brains and used MRI
imaging. Gliomas with silenced xCT showed a delayed onset of neurological deficits
and a prolonged survival. MRI scans with xCT-knockdown gliomas revealed a
significant smaller perifocal edema. xCT demonstrate a critical role for glioma-induced
neurodegeneration and the development of brain edema.
2.4
Clinical significance
Probably these results offer a new starting point for strategy in the treatment of malign
gliomas in future, supporting the concept, that perifocal edema formation around
9
gliomas may in part be a consequence of the high glutamate concentrations and
peritumoral cell death.
These examinations may have an influence on an elongated survival of the patients in
the first instance and enhance quality of life.
10
3 Einleitung
3.1
Definition und histologische Einteilung der Gliome
Epidemiologisch stellen Neoplasien gegenwärtig eine der häufigsten Todesursachen in
den Industrienationen dar. Mit einem Prozentsatz von approximativ 2 %, gemessen an
allen auftretenden Neoplasien, nimmt die Gesamtheit der Tumoren des Gehirnes und
des Rückenmarkes einen relativ geringen Anteil ein, wobei jedoch die Inzidenz der
zerebralen Neoplasien deutlich überwiegt [15]. Unter ihnen zählen die malignen
Gliome, und im Speziellen die Glioblastome WHO Grad IV, zu den bösartigsten und
aggressivsten Tumoren überhaupt [14]. Die mittlere Überlebenszeit ab dem Zeitpunkt
der Diagnosestellung und nach stattgehabter adjuvanter Behandlung beträgt in vielen
Fällen weniger als 12 Monate [13], wobei das Alter und der Karnofsky-Index in diesem
Zusammenhang eine prädiktive Rolle spielen und für die Einschätzung der Prognose
berücksichtigt werden müssen [41].
Definitionsgemäß
werden
Gliome
im
Allgemeinen
als
hirneigene
Tumoren
neuroektodermalen Ursprungs und mit unterschiedlicher Dignität bezeichnet, die sich
durch
zytogenetische
Entartungen
der
im
Gehirnparenchym
vorkommenden
astrozytären, oligodendrozytären und ependymalen Zellen entwickeln können [41]. Die
Astrozyten, Oligodendrozyten wie auch die Ependymzellen werden unter dem Begriff
der Gliazellen zusammengefasst und nehmen jeweils verschiedenartige und vielfältige
Funktionen ein.
Im Rahmen der Promotion wird der Fokus im Besonderen auf die Astrozyten gerichtet,
deren Hauptfunktion unter anderem in der Ausbildung eines Stützskelettes im ZNS
liegt. Weitere sehr wichtige Aufgaben bestehen in der Aufrechterhaltung der Blut-HirnSchranke über zahlreiche Fortsätze der Astrozyten und in der Ernährung der Neuronen
über die Nähe zu den Kapillaren. Zudem nehmen die Astrozyten eine bedeutende Rolle
in der Wiederaufnahme von Transmittern bei und nach der Erregungsübertragung sowie
in der Synthese antioxidativer Substanzen zur Protektion der umliegenden Neurone ein
[67].
Die aktuelle Einteilung der Gliome gemäß der WHO [34; 32] erfolgt in vier Grade,
wofür vorrangig morphologische und histologische Kriterien zur Unterscheidung
herangezogen werden. Für WHO Grad I ist beispielsweise das pilozytische Astrozytom
anzuführen, welches einem gut abgrenzbaren, hoch differenzierten und teilweise
11
zystischen Tumor mit langsamer Wachstumstendenz entspricht. WHO Grad II
Tumoren, mit dem Vertreter des diffusen Astrozytomes, unterscheiden sich nicht
wesentlich von dem des I. Grades, jedoch werden hier histologisch eindeutig diffuse
Parenchyminfiltrationszonen und eine erhöhte Mitoserate nachgewiesen. Beide
Tumorgrade beschränken sich somit auf ein lokales und langsames Wachstum und
werden zusammen als Gliome niedrigeren Malignitätsgrades bezeichnet.
Im Gegensatz dazu stehen die sich schnell entwickelnden, invasiv wachsenden und
wenig differenzierten Gliome des III. und IV. Grades, die den hochgradig malignen
Neoplasien zugerechnet werden. Diese Einteilung bezieht sich fast ausschließlich auf
die histologischen Malignitätskriterien und definiert sich über eine immens erhöhte
mitotische und apoptotische Aktivität mit daraus resultierender gesteigerter Zelldichte
im Zentrum des Tumors. Weitere Hinweise zur histologischen Diagnose eines malignen
Glioms liefern die Zeichen der zellulären Anaplasie mit Kernatypien und vielfältige
pathologische Gefäßproliferationen [34]. Alle aufgeführten Merkmale treffen sicher auf
ein Gliom III. Grades zu, wobei als Exempel das anaplastische Astrozytom angeführt
werden kann. Um ein Glioblastom (WHO IV) davon abgrenzen zu können, sollten
zentrale Nekrosen kleineren oder größeren Ausmaßes nachweisbar sein [34], die
Mitoserate zeigt sich nochmalig um ein Vielfaches gesteigert und der Tumor ist über
multiple pathologische Gefäßproliferate versorgt. Das makroskopisch sichtbare
perifokale Gehirngewebe lässt eine äußerst hohe Vulnerabilität durch die Ausbildung
eines Hirnödemes erkennen, das unter anderem mit der Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke (vasogenes Ödem) entsteht.
3.2
Kausalität, Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild der Gliome
Die Frage nach der Ursache für das Entstehen der Gliome, das entweder über einen
primären Prozess oder über eine sekundäre Malignisierung möglich ist, wird noch
weitgehend als ungeklärt angesehen. Die Vermutungen gehen dahin, dass eine
chronische Exposition gegenüber petrochemischen Stoffen wie z. B. Benzol ein
auslösender Faktor sein könnte [41].
Zudem lassen sich genetische Faktoren nicht gänzlich von der Hand weisen, speziell
kann hier die Mutation des p53-Tumorsuppressorgens und des Bc1-2 Proteins
12
aufgeführt werden, da diese Substanzen im Originalzustand regulierend auf die Mitose
und Apoptose wirken [50].
Gliome stellen mit einem Anteil von 30-50% die häufigsten aller intrakraniellen
Tumoren [41] dar, wovon über die Hälfte den Glioblastomen (WHO IV) zugeschrieben
wird, an zweiter Stelle folgen die Astrozytome WHO Grad I - III und die Meningeome.
Der Manifestationsgipfel liegt bei den malignen Gliomen um das 50.-60. Lebensjahr,
wobei das männliche Geschlecht häufiger betroffen ist [41].
Klinisch auffällig werden die Gliome meist erst in einem sehr fortgeschrittenen
Wachstumsstadium, grundsätzlich abhängig vom histologischen Typ und von der
anatomischen Lokalisation des Tumors. Bei Neubildungen in sogenannten stummen
Arealen bleiben diese über eine geraume Zeit unerkannt und können sich ungehemmt
ausbreiten. Vorzugsweise treten sie supratentoriell auf und äußern sich zunächst nicht
selten vorerst unbemerkt in neurologischen Ausfällen, wie Paresen und/oder
Sensibilitätsstörungen mit langsamer Progredienz. Bei Manifestation der Gliome in
Arealen mit niedrigem epileptischem Schwellenpotential kann ein fokaler oder
generalisierter epileptischer Anfall ein erster Hinweis in Richtung Tumor sein. Dabei
muss der Tatsache Beachtung geschenkt werden, dass Krampfanfälle ihre Ursache auch
in anderen Krankheitsbildern als Tumoren haben können [44].
Nicht selten berichten die Patienten von länger bestehenden lokalen oder diffusen
Zephalgien, die bildgebend erstmalig näher abgeklärt wurden, und als Zufallsbefund
bereits Tumoren in fortgeschrittenen Stadien zeigten.
3.3
Charakteristika der Gliomausbreitung
In der heute zur Verfügung stehenden Bildgebung mittels Computertomographie oder
Magnetresonanztomographie mit Kontrastmittelgabe lassen sich maligne Gliome
makroskopisch häufig relativ scharf gegenüber dem umliegenden Gehirnparenchym
abgrenzen und werden in der Regel von einem ausgeprägten perifokalen Ödem
begleitet. Dieses ist in den meisten Fällen für den erhöhten Hirndruck verantwortlich
und bewirkt Verschiebungen von Gehirngewebe, die sich, wie oben erwähnt, unter
anderem in verschiedenartigen Zephalgien äußern können [41].
Mikroskopisch findet sich jedoch eine völlig gegensätzliche Darstellung.
13
Maligne Gliome besitzen die verheerende Eigenschaft, sich durch Infiltration im
intakten Gehirnparenchym über nur zum Teil bekannte molekulare Mechanismen
auszubreiten [14]. Diese Invasivität betrifft nicht nur das peritumorale Gewebe, sondern
auch Gehirnregionen, die anatomisch eng miteinander in Verbindung stehen [41].
Bei bifrontaler Lokalisation mit Wachstum über das Corpus callosum spricht man hier
auch von einem sogenannten Schmetterlingsgliom.
Eine klassische Metastasierung in extrakranielle Gewebe findet bei den Gliomen nicht
statt. Im Rahmen ihrer Invasivität beschränken sich die Wege der Metastasierung im
Gehirn, wie schon angeführt, zum einen auf die Kommissurenbahnen von einer zur
anderen Großhirnhemisphäre, zum anderen kann eine weitere Ausbreitung über die
Meningen, die inneren und äußeren Liquorräume, einschließlich des Ventrikelsystemes,
erfolgen. In umgekehrter Weise kommen im menschlichen Körper Syndrome vor, die
mit einem gehäuften Auftreten von Glioblastomen oder anderen höhergradigen
hirneigenen Tumoren einhergehen, jedoch hereditären Ursprunges sind, wie zum
Beispiel das seltene Turcot-Syndrom oder das Li-Fraumeni-Syndrom [33].
Neben der unkontrollierten Zellproliferation sowie der diffusen Gewebeinvasion stellen
der peritumorale Zelltod und die Entwicklung eines Gehirnödemes Kennzeichen von
malignen Gliomen dar [23; 36; 71]. Es wird vermutet, dass extrazelluläre neurotoxische
Faktoren eine große Rolle innerhalb dieser Prozesse spielen [11; 65]. In früheren invitro-Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die Gliomzellen die exzitatorische
Aminosäure Glutamat sezernieren [53; 73; 74]. Dieser Ansatzpunkt wurde im Rahmen
der Promotion erneut aufgegriffen.
Jedes der genannten Merkmale sowie die Kombination der Attribute lassen die Tatsache
plausibel erscheinen, dass der Tumor mittels einer oder multipler operativer
Maßnahmen nicht komplett in Remission gebracht werden kann, ohne die Gefahr
einzugehen, ein beträchtliches Maß an Gehirnparenchym bei diffuser Infiltration
mitzuresezieren. Die nachfolgenden Einbußen an neurologischer Funktion und die
konsekutiv eingeschränkte Lebensqualität des Patienten wären dementsprechend groß,
so dass daher in vielen Fällen lediglich Subtotalresektionen, unter Berücksichtigung
dieses Aspektes, vorgenommen werden können. Die malignen Gliome werden aus
diesem Grund, entsprechend dem heutigen Standard, obligat mit einer adjuvanten
Radiatio und Chemotherapie nachbehandelt. Beide Behandlungstherapien haben einen
zytotoxischen Wirkmechanismus [59], der bei simultaner Gabe einen guten Effekt
erzielen kann. Das derzeitige Chemotherapeutikum der Wahl ist Temodal, für das, im
14
Vergleich zur solitären Radiatio, eine deutliche Verlängerung der Überlebenszeit
nachgewiesen werden konnte [64].
3.4
Glutamat als Neurotransmitter und I nduktor der neuronalen Apoptose
Die saure Aminosäure
L-Glutamat ist wohl der verbreiteste exzitatorische
Neurotransmitter im ZNS und somit an vielen physiologischen Abläufen, wie z.B. der
Kognition, der Gedächtnisfunktion und dem Lernen beteiligt [12]. Der ubiquitär
vorkommende Neurotransmitter ist ebenso während der normalen Gehirnentwicklung
an der Verbreitung der Astrozyten beteiligt, dem Zelltyp, aus dem sich die Glioblastoma
multiforme entwickeln [37; 60]. Nach synaptischer Freisetzung entfaltet Glutamat seine
Wirkung sowohl post- als auch präsynaptisch über verschiedene Subtypen von
ionotropen und metabotropen Glutamatrezeptoren [29]. Innerhalb der Gruppe der
ionotropen
ligandengesteuerten
Glutamatrezeptoren
lassen
sich
3
Klassen
differenzieren, die besser unter den Namen der AMPA-, der Kainat- und der NMDARezeptoren bekannt sind [16]. Diese 3 Subtypen befinden sich hauptsächlich auf den
Neuronen [40], wohingegen AMPA-Rezeptoren zusätzlich in der Zellmembran der
Astrozyten vorkommen.
Die Konzentration von extrazellulärem Glutamat liegt unter physiologischen
Bedingungen gewöhnlich unter 1 µM, sie kann jedoch unter pathophysiologischen
Zuständen im ZNS, die durch Defekte in der Blut-Hirn-Schranke charakterisiert sind,
bis auf Werte um 20 µM und höher ansteigen [42]. Krankheitsbilder, die mit länger
anhaltenden erhöhten Glutamatkonzentrationen im Zusammenhang stehen, sind unter
anderem die Epilepsie, hierzu zählt ebenso die tumorassoziierte, insbesondere bei
malignen Tumoren auftretende, Epilepsie [44]. Weitere Beispiele stellen der Apoplex,
Traumata, die Multiple Sklerose und diverse Meningitiden dar [4]. Diese enormen
Konzentrationssteigerungen an Glutamat über einen längeren Zeitraum sowie die
exzessive Aktivierung der Glutamatrezeptoren können eine akute Degeneration, den
konsekutiven Zelltod von Neuronen aber auch die Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke
verursachen [3; 9; 38]. Dieser Vorgang wird als Exzitotoxizität bezeichnet.
Die Mechanismen, die kaskadenförmig zum exzitotoxischen Untergang von neuronalen
Zellen führen, sind komplex und sollen im Folgenden näher erläutert werden.
15
Glutamat besitzt die Fähigkeit, über zwei molekulare Wege den neuronalen Zelltod
herbeizuführen. Zum einen kann Glutamat an die bereits aufgeführten ionotropen
Rezeptoren binden und darüber einen Anstieg des intrazellulären Kalziums im Neuron
bewirken, was in einem nächsten Schritt die Aktivierung von potenziell destruktiven
Faktoren wie der Phosphokinase C (PKC) und dem Transkriptionsfaktor NF- B nach
sich zieht. Diese sind beide in der Lage, direkt die neuronale Apoptose einzuleiten,
wohingegen die PKC über Zwischenschritte, das PARP und die Caspase 3, dieses Ziel
erreichen kann [72].
Auf der anderen Seite besitzt der Neurotransmitter Glutamat die Eigenschaft, ebenso
über
die
Blockade
eines
in
der
neuronalen
Zellmembran
lokalisierten
Cysteintransporters den Weg zum irreversiblen Zelluntergang zu induzieren. Man
bezeichnet diesen Weg auch als rezeptorunabhängigen oxidativen Signalweg [59], der
über
eine
chemische
Reduktion
des
intrazellulären
Cysteins
und
der
Glutathionsynthetase das zelltoxische Wasserstoffperoxid in die Höhe steigen lässt, was
konsekutiv zum Zelltod von Neuronen führt.
Beide Kaskaden beeinflussen sich gegenseitig und führen in Kombination zu einem
rasch fortschreitenden neuronalen Zelltod.
3.5
Der Astrozyt und seine Transporter
Um diesen pathologischen Abläufen vorzubeugen und sie bis zu einem gewissen Grad
aufhalten zu können, bedarf es im ZNS wirksamer Systeme, die das Glutamat nach
Freisetzung wieder aus dem Extrazellularraum aufnehmen und verstoffwechseln
können. Das Ziel ist, eine niedrige, nichttoxische Glutamatkonzentration im
synaptischen Spalt zu erreichen. Hierfür stehen sogenannte Natrium-abhängige
Glutamattransporter zur Verfügung, die in der Lage sind, das aufgenommene Glutamat
unter dem Kotransport von Natrium intrazellulär auf das 10000-fache gegenüber dem
Extrazellularraum zu konzentrieren [28; 43].
Bis dato ist es gelungen, fünf dieser Natrium-abhängigen Glutamattransporter zu
identifizieren, von denen zwei im Rahmen der Promotion besonders von Interesse sind.
Es handelt sich hier um die humanen Transporter SLC1A3 und SLC1A, die eine sehr
hohe Homologie zu den bei der Ratte als GLAST [63] und GLT-1 [49] bezeichneten
16
Transportern aufweisen. Nachfolgend wird, zur Vereinfachung, ausschließlich die
Nomenklatur der bei den Ratten vorkommenden Transportern verwendet.
Sowohl GLAST als auch GLT-1 sind vorwiegend in der astrozytären Plasmamembran
lokalisiert [8] und nehmen, von allen Glutamattransporten, den größten Anteil an der
Glutamathomöostase im Extrazellularraum ein [51; 1]. Eine ganze Reihe von Faktoren,
wie das Glutamat selbst, Zytokine und Wachstumsfaktoren, können sowohl die
Expression als auch die Aktivität der Glutamattransporter beeinflussen und dadurch
regulierend in diesen Prozess eingreifen. Die Aufgabe der Transporter beschränkt sich
nicht ausschließlich auf den synaptischen Spalt, sie gibt auch Informationen an die
1DFKEDUV\QDSVHQ ZHLWHU VR GDVV KLHU DXFK YRQ HLQHP LQWHUV\QDSWLVFKHQ Ä&URVVWDON
gesprochen wird [48].
Das aufgenommene Glutamat steht wiederum im Zellinneren zur Synthese von z.B. ȖAminobuttersäure (GABA) und Glutathion sowie zum Energieaufbau zur Verfügung
[12].
3.6
Das xCT-System und ihr M issbrauch durch die Gliome
Der Astrozyt besitzt, neben der Fähigkeit über die genannten Glutamattransporter
Glutamat in das Zellinnere aufzunehmen, ebenso das Vermögen, Glutamat von
intrazellulär nach extrazellulär zu befördern. Für diesen Vorgang existiert in der
Zellmembran der Astrozyten ein weiterer Transporter, der im Gegensatz zu den bisher
beschriebenen
Transportern
Natrium-unabhängig
und
über
einen
Austausch-
mechanismus funktioniert und somit als ein Antiporter bezeichnet wird. Durch die
Aufnahme von extrazellulärem Cystein kann über diesen Antiporter zudem
überschüssiges intrazelluläres Glutamat aus den Astrozyten befördert werden. Somit
nimmt dieser Cystin/Glutamat-Antiporter [11; 25], der in der Literatur dem Terminus
xCT-System gleichgesetzt wird, eine regulierende Instanz in der Glutamathomöostase
im Bereich der Astrozyten ein. Das aufgenommene Cystein ist dabei essentiell, da es
intrazellulär zur Synthese von Glutathion (GSH), einem Peptid, benötigt wird und den
Astrozyten auf diese Weise vor äußerem oxidativem Stress in Form von freien
Radikalen schützt [6; 70].
Die Gliome machen sich diesen Regulationsmechanismus gezielt zunutze, da im Zuge
der erhöhten extrazellulären Glutamatkonzentrationen das protektive xCT-System
17
inhibiert wird, so dass keine Aufnahme von Cystein aus dem Extrazellularraum erfolgen
kann und konsekutiv die Glutathionsynthese sowie das Abwehren von freien Radikalen
in den Astrozyten stark vermindert ist. Infolge des steigenden oxidativen Stresses
intraastrozytär kommt es zum Zelluntergang [59] und zu einer weiteren Freisetzung von
Glutamat durch die induzierte Apoptose.
Die Gliome besitzen zugleich die Fähigkeit, selbst Glutamat über Kalzium-durchlässige
AMPA-Rezeptoren zu transduzieren, was zum einen die Migration und zum anderen die
Proliferation der Gliome wesentlich begünstigt. Dieser autokrine Loop fördert
nochmalig
das
Ungleichgewicht
der
intra-
gegenüber
der
extrazellulären
Glutamatkonzentration und unterstützt zusätzlich die Induktion der neuronalen
Apoptose [35].
Die Ausführungen lassen erkennen, dass xCT eine bedeutende Rolle innerhalb dieser
Prozesse einnimmt, so dass im Rahmen dieser Promotion das Augenmerk auf xCT als
möglicher weiterer Zielpunkt einer multimodalen Tumorbehandlung gerichtet wird.
3.7
Die Entstehung des Gehirnödemes sowie Unterscheidung zweier Subtypen
Die massiv gesteigerten extrazellulären Glutamatkonzentrationen können zu einer
exzitotoxisch bedingten Neurodegeneration sowie zu einer Zerstörung der intakten BlutHirn-Schranke führen [3; 9; 38]. Durch die geschädigte Barriere zwischen den
Blutgefäßen und dem Gehirnparenchym kann es zu einem vermehrten Übertritt an
Proteinen,
Elektrolyten
und
konsekutiv
Flüssigkeitsansammlung wird als
an
vasogenes
Plasmavolumen
kommen.
Diese
oder extrazelluläres Gehirnödem
bezeichnet. Eine weitere Form stellt das sogenannte zytotoxische oder auch
intrazelluläre Gehirnödem dar. Hierbei kommt es in Folge der gestörten NatriumKalium-ATPase in der Plasmamembran zu einer intrazellulären Hypernatriämie, die
durch eine erhöhte Flüssigkeitsaufnahme versucht wird auszugleichen und schließlich,
nach Aufbrauchen der Reserveräume, in der Lyse endet [21]. Bei der peritumoralen
Ödemansammlung geht man davon aus, dass beide Mechanismen an der Entstehung
beteiligt sind, wobei das vasogene Ödem überwiegt [31; 46]. Durch den gestörten
Flüssigkeitsabfluss kommt es zu einer intrakraniellen Drucksteigerung, die zunächst
noch versucht wird zu kompensieren, jedoch im Verlauf bei aufgebrauchten
Reservekapazitäten rapide zu steigen beginnt (Monro-Kellie-Doktrin). Klinisch äußert
18
VLFK HLQ HUK|KWHU +LUQGUXFN LQ GHU 6\PSWRPHQWULDV Ä.RSIVFKPHU]HQ 6FKZLQGHO
Übelkeit und Erbrechen" [41]. Symptomatisch wird das peritumorale Ödem in erster
Linie mit hochdosierten Glucokortikoiden behandelt, jedoch können diese aufgrund des
Nebenwirkungsprofiles wie zum Beispiel der Entwicklung eines Diabetes mellitus und
der Osteoporose nicht als Dauertherapie eingesetzt werden. Alternativ, jedoch nur in
Ausnahmefällen, kommt in der Tumorbehandlung der Einsatz von hyperosmolaren
Substanzen in Frage [27].
3.8
Fragestellung der Arbeit
Es ist bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht eindeutig bewiesen und erforscht, über welche
Mechanismen der Expansion zum einen die Ausbreitung der malignen Gliome erfolgt
und zum anderen das peritumorale Gehirnparenchym konsekutiv zerstört wird. Ist es
möglich, dass das umliegende Gehirnparenchym einerseits durch das Wachstum der
Gliome und andererseits durch die Kalotte als begrenzenden äußeren Faktor dem
Zelltod zugeführt wird oder besitzen die Gliome die Fähigkeit, neurotoxische
Substanzen aktiv zu produzieren, die das Gewebe auf diesem Weg zugrunde gehen
lassen?
Um dieser Frage nachzugehen und nähere Erkenntnisse zu erlangen, wurde ein Modell
entwickelt, das es ermöglicht, bestimmte Gehirnregionen auf zellulärer, molekularer
und anatomischer Ebene zu erforschen und zu jedem Zeitpunkt mikroskopisch sichtbar
zu machen und dokumentieren zu können.
Es handelt sich hier
um organotypische Schnittkulturen von Rattengehirnen, die
möglicherweise eine Brücke zwischen den in-vitro-Einzelzellkulturen und den in-vivoVerhältnissen im Gehirn, die von außen nicht einsehbar sind, spannt. Mittels dieser
Schnittkulturen konnten experimentelle Transplantationen und pharmakologische sowie
genetische Manipulationen durchgeführt werden, die uns Aufschluss über den
Ausbreitungsmechanismus der Gliome gaben und die Rolle des xCT-Systemes im
Speziellen näher beleuchtete.
19
4 M aterial und M ethoden
4.1
Verwendete chemische Substanzen
Die Substanzen MK 801, Glutamat, PI und der Antikörper gegen GLT-1 wurden von
der Firma Sigma-Aldrich, mit Firmensitz in München, bezogen, und MK 801, der als
hochpotenter und selektiver nicht-kompetitiver NMDA-Rezeptorantagonist fungiert,
wurde nach Auflösung in sterilem Wasser in einer Endkonzentration von 100 µM
hinzugegeben.
Der selektive nicht-kompetitive AMPA-Rezeptorantagonist GYKI 52466 wurde von der
Firma Biotrend in Köln erworben, und musste zunächst in Methanol aufgelöst werden,
um schließlich in einer Endkonzentration von 80 µM zur Anwendung zu kommen. Der
xCT-Antikörper wurde freundlicherweise von Dr. P. Kalivas von der Medical
University of
South
Carolina
bereitgestellt.
Die
Zellkulturmedien
und
die
entsprechenden Zusätze konnten von der Firma Biochrom in Berlin erhalten werden.
Als Lieferant von NeuN und GFAP und dem Aquaporin 4-Antikörper stand die
englische Firma Chemicon aus Hants zur Verfügung.
4.2
Zelllinien, Zellkultur und deren Splitting
Die Rattengliomzelllinien F98 (Passage 30-60) und C6, die menschliche Gliomzelllinie
U87MG (American Type Culture Collection, Manassas, VA, Passage 130-150), die den
Mäusen zugehörige Nervenzelllinie HT22 (Subklon der HT4 Zelllinie mit Gewinnung
aus dem Hippokampus MORIMOTO, Passage 60-80) und die Mausgliomzelllinien
SMA560 sowie GL261 (New England Medical Center Boston, Passage 30-50) wurden
allesamt in DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) von der Firma Gibco aus
Karlsruhe kultiviert. Das Medium war mit 10 % fetalem Kalbsserum (Biochrom, Berlin)
und 1 % antibiotischen Substanzen (Gibco) versetzt. Die Kulturen wurden konsequent
in einer 37°C warmen Atmosphäre mit hoher Luftfeuchtigkeit aufbewahrt, die 5 %
Kohlendioxid und 95 % Luft enthielt. Bei ausreichender Dichte des Zellrasens in den
Zellflaschen mit 10 ml Medium, wurde das verbrauchte Medium abpipettiert und die
Zellen ca. 1 - 3 mal mit PBS gewaschen, um die apoptotischen Zellen herauszufiltern.
Zur Ablösung des Zellrasens selbst verwendete man 5 ml Trypsin, gab es für 10 min in
20
die 37° C warme Atmosphäre, pipettierte im Folgenden dieses Gemisch aus Trypsin mit
den losgelösten Zellen in ein 20 ml Tube, und zentrifugierte es für 8 min bei 900 U/min.
Danach wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 10 ml frischem Medium
vermischt. Anschließend erfolgt das Splitting in die gewünschte Anzahl von
Versuchsflaschen, um neues Zellmaterial für nachkommende Versuchsreihen zu
erzeugen.
4.3
Transfektion der F98-Gliomzellen
Die Transfektion der F98-Gliomzellen erfolgte mittels des Plasmides pEGFP-N1 (BD
Biosciences Clontech, Heidelberg) unter Verwendung der von Sambrook und Russell
entwickelten Kalzium-Phosphat-Methode [54]. Hierbei wurden die F98-Zellen zunächst
mit einer Dichte von 20000 Zellen in 1,9 cm2 Schälchen zusammen mit 500 µl
Kulturmedium ausplattiert. Nach einer Dauer von 24 h verwarf man vorsichtig dieses
Medium und ersetzte es durch 500 µl des DNA-Präzipitates, welches in jedes Well
gegeben wurde. Das DNA-Präzipitat selbst wurde folgendermaßen hergestellt, man
pipettierte 417,5 µl steriles Wasser, 62,5 µl des 2M-CaC12, 20 µg des DNA-Plasmides
und 500 µl BES-Puffer (enthielt 1,07 g BES von Sigma-Aldrich, 1,63 g NaC1 und
0,0267 g Na2HPO4 x 2H2O auf 100 ml steriles Wasser bei einem pH von 6,95)
zusammen und füllte es mit dem Kulturmedium auf ein Endvolumen von 10 ml auf. Die
nachfolgende Inkubation der Zellen betrug 20 h bei 37° C in einer Atmosphäre mit 5 %
CO2 und 95 % Luft.
Danach folgten die Entfernung des DNA-Mediums und eine weitere Inkubation der
Zellen in normalem Kulturmedium für 24 h. Die transfizierten Zellen wurden
anschließend für 4 Wochen in einem Selektionsmedium (es enthielt 500 µg G418/ml)
kultiviert, wobei das Selektionsmedium alle 2 Tage gewechselt wurde.
Roti-Fect (Firma Roth, Karlsruhe) wurde alternativ zur Transfektion herangezogen, da
dies nicht auf der Kalzium-Phosphat-Methode basierte, und konnte entsprechend dem
Herstellerprotokoll verwendet werden.
21
4.4
Zellfärbung
Die Zelllinien U87MG, GL261 und HT22 wurden mittels eines Vybrant CFDA SE
Färbesets (Molecular Probes, Eugene, OR) koloriert. Dabei diffundiert das CFDA SE
passiv in die Zellen. Es ist farblos und nicht-fluoreszierend, bis seine Acetatgruppen
durch intrazelluläre Esterasen gespalten werden. Diese Eigenschaft wird nach
Zellteilung oder Zellvereinigung an die Tochterzellen vererbt und kann nicht auf die
angrenzenden Zellen in einer Population übertragen werden. Die geschätzten
Gipfelpunkte der Anregung und Abregung nach Hydrolyse betragen jeweils 492 und
517 nm.
4.5
Proteinpräparation und I mmunoblotting
Die Durchführung und Auswertung der Westernblots basierte auf früheren
Protokollanordnungen, wie bei [7]. Für die gesamte Proteinextraktion wurden die
Zellpellets in einen Lysepuffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HC1 (pH 8, SigmaAldrich), 150 mM NaCl (Merck, Nürnberg ), 1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 0,1 %
SDS (Sigma-Aldrich), 1 mM EDTA (pH 8, Merck), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF, Roche, Mannheim) und 1 Tablette eines Proteaseinhibitors (Roche) enthielt.
Nach der Zentrifugierung mit dem 15000-fachen der Erdbeschleunigung für 10 min bei
4° C wurde der aus diesem Procedere entstandene Überstand mit einem 12%-igen
Polyacrylamidgel auf einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetragen. Hierbei
dienten als Standard 20 µg pro Bahn. Die getrennten Proteine wurden zum Vorgang des
Elektroblottens auf einer Nitrozellulosemembran (Sigma-Aldrich) aufgebracht. Der
monoklonale
ß-Actin-Anti-Maus-Antikörper
diente
als
Referenzprobe
bei
gleichwertiger Ladungsmasse. Zur Zellanalyse fanden entsprechend den Protokollen des
Herstellers die jeweiligen Antikörper und Chemolumineszenzmethoden (Amersham,
Freiburg) Anwendung, wobei hier GLT-1 oder xCT analysiert wurden.
22
4.6
Patientenauswahl
Sechs operative Beispiele, die in dieser Studie herangezogen wurden, waren
histologisch entsprechend der WHO-Klassifikation als ein Glioblastoma multiforme
diagnostiziert worden. Eine Einverständniserklärung von Patientenseite über die
wissenschaftliche Verwendung des gewonnenen Materiales lag in schriftlicher Form
vor.
4.7
siRNA-Vektorkloning und Expressionsanalyse
Entsprechend den Kriterien von [68] wurden drei 19-er siRNAs für die RNA-Störung
mit den vom Nagetier stammenden xCT-Kopien (Genbank acc. AB022345) ausgewählt.
Das Klonen der synthetischen Oligonukleotide in den pSuperGFP-Vektor (pS-GFP;
Oligoengine, Seattle, USA) wurde durchgeführt, indem ein leerer Vektor mit EcoRl und
Xho 1 beladen wurde, entsprechend den vorliegenden Protokollen des Herstellers. Die
Zellen wurden bei einer geringen Dichte (< 20.000 Zellen/cm ) mit dem Vektor
transfiziert und anschließend 72 h nach Transfektion geerntet. Nach Auflösung der
Zellen in einem 12%-igen SDS-Gel führte man einen Elektroblot auf einer
Nitrozellulosemembran (Millipore, Deutschland) durch. Alle Inkubationen verliefen
über Nacht bei 4°C in der Lösung PBST. Das xCT-Antiserum wurde in einer
Verdünnungskonzentration
von
1:200
verwendet.
Sekundäre
Anti-Kaninchen-
Antikörper, die an die Meerrettich-Peroxidase gekoppelt waren, fanden in einer
Verdünnung von 1:5000 Anwendung, und wurden über eine Inkubation in ECLReagenzien (Amersham) nachgewiesen. Hier benutzte man als Vergleichsladung
wiederum
den
monoklonalen
Mausantikörper
ß-Actin
(Sigma-Aldrich).
In
Abhängigkeit von der Proteinmolekularmasse nahm man Myosin (212 kDa), MBP-bGalaktosidase (158 kDa) und das maltosebindende Protein 2 (42 kDa) zum Vergleich.
Die Quantifizierung der Immunoblotte über die Anfärbung der Gele mittels Mohnfarbe
erfolgte mittels der Dichtemessung von Metamorph (Universal Imaging, USA).
23
4.8
RNA-I solation und die RT-PCR-Analyse
Die Isolation der gesamten RNA geschah unter Verwendung des RNeasy Mini Kit und
der QIA-Zerkleinerungssäulen, entsprechend den vorliegenden Protokollen des
Herstellers (Qiagen, Hilden). Die relative Quantifizierung der Zielgenexpression wurde
über 2 Schritte vorgenommen, zum einen erfolgte sie über den QuantiTect SYBR Green
RT-PCR Kit und zum anderen mittels der Bestätigung über den QuantiTect Primer
Assays (Qiagen) auf einem bereitgestellten Biosystem 7500 Real-Time PCR System.
Die folgenden Ratten- und Menschen-QuantiTect Primer Assay waren in Gebrauch:
Ratten-ß-Actin (Ratten-Actb, NM_031144, Rn_Actb_l_SG, Kat.-Nr.: QT00193473,
Amplikonlänge:
145
bp);
Ratten-Slcla3
(EAAT1,
GLAST,
NM_019225,
Rn_SIcla3_SG_I, Kat.No.: QT00189329, Amplikonlänge: 78 bp); Ratten-Slcla2
(EAAT2,
GLT1,
NM_017215,
Rn_Slc1a2_SG_1,
Kat.-Nr.:
QT00181090,
Amplikonlänge: 91 bp); Ratten-S1c7all (xCT, XM_227120 Rn_LOC310392_1_SG,
Kat.-Nr.: QT00393841, Amplikonlänge: 90 bp); Ratten-S1c3a2 (4F2HC, CD98,
NM_019283 Rn_Slc3a2_SG_1, Kat.-Nr.: QT00175665, Amplikonlänge: 84 bp);
Humanes ß-Actin (Hs_ACTB_SG_1, Kat.-Nr.: QT0005431); Humaner SLC1A3
(EAAT1, GLAST, Hs_SLC1A3_1_SG, QT00069874); Humaner SLC1A2 (EATT2,
GLT-1,
Hs_SLC1A2_1_SG,
Hs_SLC7A1l_l_SG,
QT00085339);
QT00002674);
Humaner
Humaner
SLC3A2
SLC7A11
(XCT,
(4F2HC,
CD98,
Hs_SLC3a2_1_SG, QT00085987).
Amplikons wurden zur Erfassung einer äußeren Grenze entwickelt, um falsch positive
Nachweise von genomischen Verschmelzungen auszuklammern. Jeder 20 µl RT-PCRMix beinhaltete 10 ng reine RNA, 2 µl des QuantiTect Primer Assays, 2x 10 µl
QuantiTect SYBR Green RT-Master-Mix und 0,2 µl des QuantiTect RT-Mix. Die EinSchritt-RT-PCR-Reaktionen wurden in 96-Well Reaktionsplatten ausgeführt, die mit
optisch behafteten Materialen (Applied Biosystems, Darmstadt) bedeckt waren. Die
folgenden Zyklen mussten eingehalten werden:
50° C für 30 min, 95° C für 15 min, weitere 40 Zyklen bei 94° C für 15 sec, 55° C für
30 sec und 72° C für 35 sec. Die Real-Time (RT)-PCR wurde 4 Mal für jedes Gen und
jede RNA-Probe vorgenommen. In einer vergleichbaren Methode zur Bestimmung der
relativen Quantifikation wurde für jedes Zielgen das relative Expressionsniveau
herangezogen und gegenüber den nichtbehandelten Kontrollproben abgewogen, wobei
ȕ-Actin als Referenzwert diente. Die Genauigkeit der RT-PCR für jede einzelne
24
Reaktion wurde durch verschmolzene Kurvenanalysen überprüft und anschließend über
eine Elektrophorese mit 2%-igem Agarosegel bestätigt.
4.9
Organotypische Gehirnschnittkulturen und das organotypische Gliominvasionsmodell (OGI M )
Die Hirnschnittkulturen wurden vorbereitet und instand gehalten, der detaillierte
Hergang hierzu wird an anderer Stelle erfasst [17].
Nach der Dekapitation von 7 Tage alten Wistar-Ratten oder C57BL/6 Mäusen entfernte
man zügig unter sterilen Bedingungen das Gehirn dieser Tiere und gab es in ein
eisgekühltes Präparationsmedium. Die Gehirne wurden im Präparationsmedium unter
Verwendung eines Vibratoms (Technical Products International, St. Louis, MO) in
350 µm dünne horizontale Scheiben zugeschnitten und bei einer Temperatur von 35° C
mit hoher Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid im Kulturmedium kultiviert.
5000 stabil transfizierte GFP-positive F98-Gliomzellen (p-EGFP-Nl von der Firma BD
Biosciences Clontech, Heidelberg) oder 5000 CFDA SE-gefärbte U87MG, GL261 oder
HT22-Zellen wurden einen Tag nach der Schnittpräparation zusammen mit 0,1 µl
Medium in den entorhinalen Kortex (Schicht II und III) implantiert [18]. Die
Implantation der F98- und U87MG- Zellen erfolgte auf Rattenschnittkulturen, dagegen
die GL261 und HT22-Zellen auf Mausschnittkulturen. Ein Mediumswechsel wurde
direkt einen Tag nach Präparation und im Verlauf jeden zweiten Tag vorgenommen. Im
gleichen zeitlichen Intervall wurde mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (BX51
Mikroskop der Firma Olympus, Hamburg) das Wachstum und die Invasion der Gliome
beurteilt sowie ausgewertet. Am fünften Tag nach Präparation inkubierte man die
Schnitte für 20 min mit 11.1 g/ml Propidiumjodid, um die Tumor-induzierte
Neurotoxizität zu analysieren und wechselte anschließend das Medium vollständig aus.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Schnittkulturen zudem in eine Lösung aus
destilliertem Wasser mit 4 % Formaldehyd und 1 % Glutaraldehyd eingetaucht und für
2 h fixiert. Nach der Fixation wurden die Schnitte mit 0,1 M Phosphatpuffer
abgewaschen und im Folgenden für 2 Wochen in einer 0,8 M Saccharoselösung
aufbewahrt, im Anschluss daran erfolgte mit Hilfe eines Kryostaten (HM560 Microm,
Walldorf) der Zuschnitt auf 14 µm dünne Scheiben.
25
4.10 M ikroskopische Evaluierung
Für die morphometrischen Analysen nutzte man eine digitalisierte Hochleistungskamera
mit optischen Rastern (CCD-Kamera, Soft Imaging System, Münster), die an das bereits
erwähnte
BX51
Mikroskop
angeschlossen
und
in
Verbindung
mit
einem
Bildverarbeitungsprogramm (analySIS, Soft Imaging System) eingesetzt werden
konnte.
Die
fluoreszenzmarkierten
Zellen
als
auch
die
Stärke
der
Propidiumjodidfärbung wurden mittels eines Olympusmikroskopes (IX70) analysiert.
Die qualitativ hochwertige technische Ausstattung des Olympusmikroskopes mit einem
TRITC-
(Anregungsfilter
520 - 550 nm,
Schrankenfilter
580 nm)
und
FITC-
(Anregungsfilter 450 - 490 nm, Schrankenfilter 520 - 550 nm) Schmalbandfilter sowie
einer CCD-Kamera und einem adaptierten Bildverarbeitungsprogramm erlauben eine
exakte Untersuchung des Materiales. Überkoppelungen und das Auslaufen des
Fluochromfilters zwischen dem Übertragungsweg wurde regelmäßig kontrolliert und
die Software korrekt angewandt. Die konfokale direkte Zellabbildung erfolgte mittels
des Leica DM/IRE2 inversen Mikroskopes, das gleichzeitig einen TCS-AOBS
Scankopf und eine temperaturregulierte Vorkammer aufweist (Leica, Mannheim). Die
Zellzyklusanalysen wurden mit Hilfe eines FACS Calibur (BD Biosciences, CA, USA)
durchgeführt, in dem eine Argonlaserlinie sowie eine rote Laserdiode inkludiert sind.
Die Quantifizierung selbst konnte aus der Multiplikation der Bildgröße mit dem Faktor
1,27 (NIH, USA) ermittelt werden. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's
t-Test ermittelt (Statview II Abacus, Berkeley, CA).
4.11 Xenograft Studien und die mikrodialytische Untersuchung
Grundsätzlich wurde bei den durchgeführten Tierexperimenten auf die exakte
Umsetzung der europäischen Richtlinien im Umgang mit Labortieren geachtet
(86/609/EEC). Die weiblichen Fisher-Ratten mit einem Gewicht von 150 - 200 g
(Charles River, Sulzfeld) erhielten über eine intraperitoneale Injektion Narkotika in
einer Mischung aus 70 mg/kg Körpergewicht Ketamin (Pfizer, Karlsruhe), 15 mg/kg
Körpergewicht Xylazin (Bayer, Leverkusen) und 0,05 mg/kg Körpergewicht Atropin
(Braun, Kronberg/Taunus). Sie wurden anschließend in einem stereotaktischen Rahmen
26
(David Kopf Instruments, Bilaney Consultants, Düsseldorf) fixiert. Stabile xCT oder
unspezifische siRNA, die von den F98-Rattengliomzellen exprimiert wurden, wurden
auf stereotaktischem Weg mit einer Hamilton Spritze (VWR, Darmstadt) mit einem
Gesamtvolumen von 5 µl (1,5 x 105) in den rechten Frontallappen (2 mm seitlich der
Bregma,
4
mm
tief
ab
der
Duraoberfläche)
der
Tiere
implantiert.
Die
Tumorimplantation wurde für 10 Tage nach dem operativen Eingriff mit einem 1,5
Tesla MRT-Gerät überwacht. Zur Einschätzung der neurologischen Defizite benutzte
man eine feststehende klinische Skala [20], nach der die Tiere täglich bewertet wurden
(Grad 0: keine Defizite; Grad 1: Rumpfschwäche oder -paralyse, Grad 2; Paraparese der
Hinterläufe oder Hemiparese; Grad 3: Paralyse der Hinterläufe oder Hemiplegie; Grad
4: Tetraplegie, Erstarrungsphase oder Tod) [19]. Sechs Tiere wurden nach der MRTKontrolle getötet und deren Gehirne zur histologischen Aufarbeitung bestimmt. Hierzu
fand eine Fixierung der Gehirne statt, die mittels eines Gemisches aus 4 %
Paraformaldehyd und 1 % Glutaraldehyd in destilliertem Wasser erreicht werden
konnte. Nachdem die Gehirne mit PBS abgespült waren, bewahrte man sie bei 4° C in
einer 30 %-igen Saccharoselösung für 5 Tage auf. Für die weiteren histologischen
Analysen fertigte man 10 µm dünne koronare Kryoschnitte an und führte
Immunfärbungen für xCT, GFAP, Aquaporin-4 und NeuN oder Hämatoxylin&Eosin
(H&E) durch. Die Ausdehnung der Tumormasse wurde über Digitalbilder und den
entsprechenden Bildverarbeitungsprogrammen (AnalySIS, Soft Imaging System,
Münster) dokumentiert.
Die extrazellulären Glutamatlevel errechnete man in vivo über mikrodialytische
Messsonden. Die Ratten wurden hierfür, wie bereits beschrieben, anästhesiert und in
den stereotaktischen Rahmen platziert. Eine mikrodialytische Messsonde (CMA 12/4;
Durchstichgröße 20 kDa; CMA Microdialysis, Semrau) wurde unter fluoreszierender
Lichtkontrolle in der peritumoralen Region platziert und die Sonde mit ACSF (147 mM
NaCL; 4 mM KCl; 2,3 mM CaCl2; 1 mM MgCl2) bei einer Flussrate von 1,6 µl/min
perfundiert. Die ersten 6 Fraktionen wurden verworfen, um Beimengungen von
Gehirnparenchym vorzubeugen und um approximativ einen gleichbleibenden Zustand
sicherzustellen.
27
4.12 Quantifizierung von Glutamat
In jedem Schritt dieses analytischen Verfahrens fand eine chemische Bestimmung statt,
wofür eine Waters 600S mit einer C-18 Säule (Atlantis, USA) genutzt wurde. Dieser
Hochleistungschromatograph für gleichzeitig mehrere Flüssigkeiten (HPL = high
performance liquid chromatography) ist in der Lage, die Glutamatkonzentration über
einen abtastenden fluoreszierenden Detektor mit einer Anregungswellenlänge von
320 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm zu ermitteln. Die Quantifizierung
der Glutamatkonzentration erfolgte über den Vergleich der Ausschlaghöhe der Gipfel
von den gewonnenen Proben mit den externen Standards. Es wurde im Ablauf zunächst
in der Vorsäule eine Derivatisierung und eine Proteinabsonderung durchgeführt. Eine
ausführliche und eingehende Beschreibung des Vorganges kann an anderer Stelle
nachvollzogen werden
[75]. Zusammenfassend kann erläutert werden, dass die
deproteinisierten Proben mit einem O-Phthalaldehyd/ß-Mercapthethanol (pH 10,4) für 2
Minuten derivatisiert und anschließend in die umgekehrte Phase der C18- Säule
eingebracht wurden. Das daraus resultierende Isoindol-Glutamatderivat mit zusätzlicher
Thio-Gruppe konnte dann in der isostatischen umgekehrten Phase des HPLC gesondert
erhalten werden. Die mobile Phase A und B bestand aus 0,02 mol/l wasserhaltigem
Natriumacetat (pH 6,1) und 100 % Methanol, und wurde mit einer Flussrate von
1,7 ml/min durch das HPLC-System gepumpt.
4.13 M RT und die Bestimmung des Gehirnödemes
Die kernspintomographische Bildgebung wurde mit einem 1,5 Tesla-Gerät (Sonata,
Siemens,
Erlangen)
ausgeführt,
wobei
eine
40 mm
durchmessende
Orbita-
Mikromagnetspule als Empfänger eingesetzt wurde. Die Übersichtsbilder und eine 3DCISS-Sequenz (Wiederholungzeit: 9 ms, Echozeit: 5 ms, Rekonstruktionen mit einer
Schichtdicke von 0,4 mm) wurden in koronarer, axialer und transversaler
Schnittführung angefertigt. Zehn koronare T1- und T2- gewichtete Schichten, jeweils
mit 1 mm Dicke und mit einem Abstand von 0,2 mm zwischen den Schichten, wurden
über dem Tumor auf den transversalen Übersichtsbildern positioniert. Die T1 gewichteten Bilder waren mit einem 256 x 256 Raster ausgestattet, das Blickfeld betrug,
wie bereits angemerkt, 40 mm. Die Wiederholungzeit kann mit 507 ms angegeben
28
werden, die Echozeit mit 17 ms. Der gesamte Scanvorgang konnte nach 3 min 42 sec
als abgeschlossen angesehen werden.
Zur Erstellung von kontrastmittelverstärkten Bildern erhielt jedes Tier 1 ml eines
Kontrastmittelagens pro kg Körpergewicht, in unserem Fall Magnevist von der Firma
Schering aus Berlin, welches 10 min vor dem Beginn der T1-gewichteten Sequenz
appliziert wurde. Die T2-gewichteten Bilder wurden ebenfalls mit einer 512 x 512
Matrix belegt, das Blickfeld vergrößerte sich auf 52 mm. Die Wiederholungzeit betrug
4500 ms, die Echozeit 158 ms, die gesamte Phase des Scanvorganges verlängerte sich
hier auf 6 min 12 sec. Die Bildanalyse wurde für jede Ratte in den zentralen Schichten
unter Verwendung des eingebauten Bildberechnungsprogrammes von Siemens
durchgeführt,
um
das
eigentliche
Tumorvolumen
in
den
T1-gewichteten
kontrastmittelverstärkten Bildern abzugrenzen. Das totale Tumorvolumen errechnete
sich aus der Summe aller Schichtebenen multipliziert mit dem festgelegten
Schichtabstand. Das Resultat wurde im Anschluss mit dem histologisch abgeleiteten
Tumorvolumen verglichen. Zur endgültigen Bestimmung des Ödemvolumens
subtrahierte man das erfasste Tumorausmaß von dem Volumen des hyperintensen
Bereiches in den T2-gewichteten Bildern.
4.14 Statistische Auswertung
Die Daten aller Versuchsreihen wurden in unabhängigen Experimenten ermittelt und
zusammengefasst. Die Daten der in den Abbildungen gezeigten Immunoblots sind
ausgewählte typische Beispiele der durchgeführten Experimente. Für die Auswertung
wurde der Mann-Whitney U-Test angewandt (Statview II, Abacus, USA) oder der
entsprechend beschriebene Vorgang. Das Signifikanzniveau betrug bei P* < 0.05, bei
P** < 0.01 und bei P*** < 0.001. Der Fehlerbalken soll das Signifikanzniveau
verdeutlichen.
29
5 Ergebnisse
5.1
Sichtbarmachung der Turmorausbreitung auf Basis des OGI M
5.1.1 Quantifizierung der Gliomproliferation und der Gliominvasion
Für die Beobachtungsreihe wurden lebende Hirnschnittkulturen verwendet, die zur
Überwachung der Gliomproliferation und -invasion innerhalb der organotypischen
Umgebung der hippokampalen Formation und des entorhinalen Kortex, der enge
anatomische Verbindungen zum Hippokampus aufweist, dienten.
Die GFP-markierten F98-Gliomzellen wurden in den entorhinalen Kortex eines
Rattengehirnes implantiert, was die Analyse als auch die Manipulation zum einen der
Interaktion zwischen den malignen Zellen und den Neuronen erlaubt und zum anderen
Einblicke in die zellulären Metabolismen gibt.
A: Kultivierung der entorhinohippokampalen
Rattenschnittkulturen für 6 Tage.
B: Identische Schnittkultur wie in A nach
Implantation von ungefähr 5000 GFPtransfizierten F98-Gliomzellen. Balken = 100
µm; DG = Gyrus dentatus; EC = Entorhinaler
Kortex; NC = Neokortex
Abb. 1: Beispiel für das OGIM
30
Um nähere Erkenntnisse hinsichtlich der lokalen Ausbreitung der Gliomzellen zu
erlangen, wurden die infiltrierten Tumorareale im Anschluss an die Implantation im
Verlauf nach 1, 3, 5, 10 und 20 Tagen mikroskopisch dargestellt.
Es konnte zu allen Zeitpunkten eine kontinuierliche Zunahme der Haupttumormasse
beobachtet und dokumentiert werden. Eine diffuse Umrandung, die in einiger
Entfernung des Tumors sichtbar wird, repräsentiert die äußere Grenze der
Tumorzellinfiltration in das umliegende Gehirnparenchym. Der gesamte entorhinale
Kortex war innerhalb von 20 Tagen nach der Implantation von den Tumorzellen
befallen.
Die
Implantationsexperimente
wurden
unter
Verwendung
der
menschlichen
Gliomzelllinie U87MG und der Maus-Gliomzelllinie GL261 wiederholt und ebenfalls
mikroskopisch festgehalten.
Abb. 2: Implantation von neoplastischen und nicht-neoplastischen Zellen
in die organotypischen Schnittkulturen.
A-E:
Die
Ratten-F98Gliominfiltrations-areale (grüne Fluoreszenz) wurden 1, 3, 5, 10 und 20 Tage
nach der Implantation (DAI) gemessen,
wobei nur die Fluoreszenzbilder
abgebildet sind. Die Pfeile in B zeigen
die Tumormasse 3 Tage nach
Implantation. Eine fluoreszierende
Korona trat nach insgesamt 5 Tagen auf
(Pfeilspitzen in C), was die Gliomzellinvasion in das umliegende Gehirnparenchym verdeutlicht.
F: In Abhängigkeit von der Zeit wurde das F98-Tumorwachstum ermittelt und errechnete sich als
Durchschnitt der GFP-positiven Areale 1 Tag nach Implantation (definiert als (100%). Die Daten sind
Durchschnittswerte ± der Standardabweichung aus 9 Schnittkulturexperimenten in jeder Gruppe (dies gilt
ebenso für die Berechnungen in I, L, O und R).
G-I: Die Daten stammen aus ähnlichen
Experimenten, wobei die humanen
Gliomzellen
U87MG
verwendet
wurden.
J-L: Verwendung der Mausgliomzellen
GL261, wobei Mausschnittkulturen
angefertigt wurden.
31
M-O: Implantation der humanen
Be(2)c-Neuroblastomzellen in den
entorhinalen Kortex. Es fehlt hier jegliche Tumorkorona 5 Tage nach Implantation.
P-R: Implantation von HT22 neuronalen Zellen in die mausspezifischen
entorhinohippokampalen Schnittkulturen.
Balken 100 µm (A-E, G, H, J, K, M, N,
P und Q)
Es konnte ein ähnliches Invasionsmuster, wie gerade eben für F98 beschrieben,
beobachtet werden, bei der die diffuse Umrandung jedoch bereits fünf Tage nach
Implantation auftrat. Diese Korona wurde vergleichsweise nicht in den Experimenten
beobachtet, in denen die Neuroblastom Be(2)c-Zellen oder die neuronale Zelllinie HT22
verwendet wurden, was als Beweis herangezogen werden kann, dass die Invasion in den
organotypischen Hirnschnittkulturen spezifisch für die Gliomzellen ist. Nichtsdestotrotz
zeigten alle Zelllinien eine Progression der Haupttumormasse während der gesamten
experimentellen Zeitperiode.
Um die Gehirninvasion weiter zu analysieren, wurden die F98-Rattenzelllinien mit den
GFP-implantierten Gliomzellen in den Schnittkulturen fixiert, tiefgefroren und zu
verschiedenen Zeitpunkten mit einem Kryostaten hauchdünn geschnitten. Verglichen
mit der scharfen Umrandung der Haupttumormasse, die am dritten Tag nach
Implantation sichtbar war, beginnen die Gliomzellen in dieser Darstellung bereits aus
dem makroskopisch nahtlosen Verbund auszubrechen und sich zunehmend radiär in den
Folgetagen in der organotypischen Gehirnumgebung auszubreiten. Dies erklärt die
unscharf wirkende peritumorale Tumorzone bei vermehrtem Tumorwachstum. Um den
radiär erscheinenden Invasionscharakter und damit die Ausbreitung in die Tiefe besser
demonstrieren
zu
können,
wurden
die
Hirnschnittkulturen
mittels
der
Konfokalmikroskopie bildgebend aufgearbeitet und damit die Invasion makro- und
mikroskopisch bewiesen.
32
Abb. 3: Mikrophotographische Dokumentation der histopathologischen Analyse der Gliom-implantierten
Schnittkulturen. A-C: Die F98-implantierten Schnittkulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert
und mit einem Kryostaten auf 14 µm dünne Scheiben zugeschnitten. Die fluoreszenzmikroskopischen
Bilder sind hier gezeigt. Die Pfeile markieren die scharfe Grenze des Tumors 3 Tage nach Implantation.
Am 5. Tag nach Implantation wanderten die Gliomzellen entlang von radiär ausgerichteten Pfaden in das
umliegende Gehirnparenchym, was ebenfalls am 10. Tag sichtbar wird. Die Pfeilspitzen in B und C
markieren die grün fluoreszierenden Gliomzellen außerhalb der Tumormasse. D: Die konfokale
Laserscannmikroskopie am 5. Tag nach Implantation verdeutlicht die zentrifugalen Wanderungswege
ebenso wie die Invasion in die Tiefe in der Schnittkultur. Balken = 12,5 µm (A-C) und 15 µm (D)
5.1.2 Analysen der Tumor-induzierten Neurotoxizität
Die Implantation von GFP-transfizierten F98-Gliomzellen in den entorhinalen Kortex
der Ratten zeigte weiterhin als Ergebnis, dass sich die Tumorausbreitung nicht nur in
einem lokalen Tumorwachstum äußerte, sondern dass auch im infiltrierten
Gehirnparenchym zytotoxische Schäden mittels des Zelltodmarkers Propidiumjodid
nachweisbar waren.
Überraschenderweise stellte sich ebenfalls eine übermäßige Propidiumjodid-Aufnahme
(PI) in den neuroanatomisch-assoziierten Gehirnarealen dar, was als Beweis für die
tumorassoziierten Mechanismen eines anterograden neuronalen Zelltodes dient.
Eine vergleichende Analyse hinsichtlich der PI-Aufnahme zwischen den implantierten
Schnitten und zeitgleichen nicht-malignen Kontrollen wies eindeutig auf, dass ein
irreversibler
Zellschaden
vorliegen
muss,
da
das
PI lediglich über einen
Membranschaden in den Zellkern aufgenommen werden kann.
33
Signifikante PI-Anstiege innerhalb des entorhinalen Kortex. (139,6 % ± 1,1 %) und des
anatomisch-assoziierten Gyrus dentatus (131,5 % ± 5,3 %) sind gut mit der
zytotoxischen Eigenschaft der malignen Gliomzellen vereinbar.
In der organotypischen Hirnschnittkultur ist der Neokortex nicht in die entorhinalenhippokampalen Projektionsbahnen miteingebunden. Es wurde daher auch eine
Implantation von F98-Gliomzellen in den Neokortex vorgenommen und die
konsekutive PI-Aufnahme im entorhinalen Kortex und im Gyrus dentatus gemessen.
Hier konnte jedoch kein signifikanter Anstieg der PI-Intensität, verglichen mit
zeitgleichen Kontrollproben, festgestellt werden. Das dazugehörige bildgebende
Material wird zum besseren Vergleich mit dem nächsten Ergebnisteil zusammen
abgebildet und in diesem Abschnitt nicht gesondert aufgeführt.
Weitere immunhistochemische Charakterisierungen der peritumoralen Zelltodareale
enthüllten fast alle untergehenden Zellen als Neuronen (92 % ± 6 %), wodurch der
Tumorinvasion und -expansion der Gliomzellen der Weg im Gehirn selbst geebnet
wird. Dies dient weiterhin als indirekter Beweis für den Gliom-induzierten neuronalen
Zelltod.
Abb. 4: Immunhistochemische Analysen der abgestorbenen Zellen (mit PI markiert) zeigten, dass die
meisten Zellen NeuN-Zellen darstellten (Pfeile). Verdeutlicht wird dies im rechten Bild der
Tumorimplantation, bei dem die PI-Färbung und die Anfärbung der neuronalen Zellen maßstabsgetreu
übereinandergelegt wurden. Die untere Reihe stellt die Kontrolle dar. Balken = 15 µm.
34
In einem weiteren Versuch, in dem Gehirnschnittkulturen mit Kulturmedien behandelt
wurden, die von malignen Zellkulturen stammten, konnte wiederum ein signifikanter
Anstieg an Zelltod beobachtet werden, was den Rückschluss zulässt, dass die Gliome
eine lösliche neurotoxische Substanz in den Extrazellularraum freisetzen. Auf eine
bildgebende Darstellung wurde an dieser Stelle verzichtet.
5.2
Beweise für die Glutamatexzitotoxizität
Um der These nachzugehen, ob der peritumorale Gewebezelluntergang durch
extrazelluläre neurotoxische Substanzen verursacht wird und ob es in dieser Hinsicht
therapeutische
Ansätze
gibt,
behandelte
man
die
Gliom-transplantierten
Hirnschnittkulturen mit unterschiedlichen Medikamenten. Diese Pharmaka sollten die
Fähigkeit besitzen, das vitale Gehirnparenchym zu schützen und zu einer Verminderung
des Gliom-induzierten neuronalen Zelltodes beitragen. Bereits frühere in-vitro-Studien
haben gezeigt, dass die Gliomzellen die exzitatorische Aminosäure Glutamat in den
Extrazellularraum sekretieren und dies bei überdurchschnittlicher Anreicherung zur
Neurodegeneration sowie zur Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke führt [3; 9; 38]. Die
Gliomzellen wurden für einen Zeitraum von insgesamt 5 Tagen mit den unten
aufgeführten Medikamenten behandelt und anschließend wurde für jede einzelne
Substanz die Neurotoxizität ermittelt.
5.2.1 M K 801-Behandlung
Die Behandlung von F98-implantierten Hirnschnittkulturen erfolgte mit Pharmaka, die
Einfluss
auf
den
Glutamatzyklus
besitzen.
Zunächst
wurde
der
NMDA-
Rezeptorantagonist MK 801, ein bekannter nicht-kompetitiver Antagonist, verwendet.
Durch diese spezifische Blockade, die mit einer initialen Konzentration von 100 µM
durchgeführt wurde, erreichte man eine deutliche Verringerung des lokalen Zelltodes im
Bereich des Gyrus dentatus, wohingegen jedoch keine Auswirkungen auf die
Tumorinvasion in den Arealen des entorhinalen Kortex erzielt werden konnten. In
höheren Dosierungen bis 500 µM nahm der neuroprotektive Effekt weiterhin zu und im
35
Gegenzug wurde die Gliom-induzierte Neurodegeneration abgeschwächt, höhere
Konzentrationen über 500 µM zeigten keine relevanten Ergebnisse.
5.2.2 GYKI 52466-Behandlung
In einem zweiten Schritt wurden spezifische Inhibitoren der AMPA-Rezeptoren zur
Anwendung gebracht, wie zum Beispiel GYKI 52466, ZK 200775 oder CPG 39551.
Man beschränkte sich auf die Nutzung von GYKI 52466, der zu Beginn in einer
Konzentration von 80 µM vorlag. Auch unter dieser Behandlung ergab sich ein
deutlicher Abfall des Zelltodes im direkt umliegenden Invasionsgebiet des Tumores,
wohingegen das Projektionsfeld im Gyrus dentatus unbetroffen blieb. In höheren
Dosierungen bis 500 µM konnte der Effekt ebenso gesteigert werden, gleichermaßen
der gemeinsame Gebrauch von NMDA- und AMPA-Rezeptor-Antagonisten.
Die Zugabe von MK 801 oder von GYKI 52466 ergab in beiden Fällen eine niedrige,
aber doch signifikante Neuroprotektion, mit der die These untermauert wird, dass die
Gliom-induzierte Neurotoxizität über den Neurotransmitter Glutamat vonstatten geht.
36
Abb. 5: Behandlung mit Glutamatrezeptorantagonisten im OGIM. A: Der neurotoxische Zellschaden
konnte durch die Inkubation der Gehirnschnittkulturen mit PI in einer isotonischen Lösung sichtbar
gemacht werden. Lediglich eine dezente Degeneration konnte nach 11 Kulturtagen festgestellt werden. B:
Nach der F98-Gliomtransplantation in den entorhinalen Kortex mit GFP konnte ein signifikanter Anstieg
des PI im umliegenden Gehirnparenchym beobachtet werden (Pfeile). Zusätzlich waren die
Projektionsareale im Hippokampus und im Gyrus dentatus betroffen (Pfeilspitzen). C: Die F98Gliomzellen wurden in den Neokortex implantiert, auch hier beobachtete man im angrenzenden
Gehirnparenchym einen deutlichen PI-Anstieg (Pfeile), dem gegenüber trat keine PI-Erhöhung im
entorhinalen Kortex und im Gyrus dentatus verglichen mit den zeitgleichen Kontrollen aus A auf. D: Die
Behandlung mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten MK 801 verminderte den Gliom-induzierten Zelltod
im Gyrus dentatus, aber nicht in der umgebenden Tumorinfiltrationszone. E: Im Gegensatz dazu
verringerte die Behandlung mit dem AMPA-Rezeptorantagonisten GYKI 52466 den Gliom-induzierten
Zelltod nur im entorhinalen Kortex und nicht im Hippokampus und dem Gyrus dentatus. F: Schematische
Darstellung der neuroanatomischen Verbindungen in der organotypischen Gehirnschnittkultur. Die roten
Linien repräsentieren die laterale Bahn des perforierenden Weges, die grünen Linien die mediale Bahn;
CA1 und CA3 = Pyramidenzellschichten des Hippokampus; gcl = Granulationszellschicht des Gyrus
dentatus. G: Die Balkengraphik fasst den PI-Anstieg im entorhinalen Kortex und im Gyrus dentatus in
den Schnittkulturen mit und ohne die F98-Gliomimplantation zusammen (alle Zellschnittkohorten
wurden für 11 Tage kultiviert). Die Daten sind Durchschnittswerte ± der Standardabweichung aus 9
Schnittkulturexperimenten in jeder Gruppe. *p < 0,01; Student's t-Test; Maßstabsbalken 100 µm (A-E).
5.3
Um
Analyse des Rezeptorstatus in Gliomen
die
Glutamatsekretion
näher
zu
beleuchten,
war
einerseits
die
Glutamattransporterexpression in den Gliomzellen und andererseits die Stellung der
einzelnen Transporter in den unterschiedlichen Zelllinien von Interesse. Hierzu wurde
eine Realtime-PCR-Analyse zum einen für GLT-1, zum anderen für GLAST und als
drittes für das System xCT durchgeführt. Das xCT-System setzt sich aus zwei Teilen
zusammen, dem xCT-Transporter und dem CD98-Part, wobei letzterer die schwere
Kette des 4F2-Antigens darstellt. Das xCT selbst repräsentiert den Cystin/GlutamatAntiporter, welcher Natrium-unabhängig funktioniert und der Aufnahme von Cystin im
Austausch gegen Glutamat bedarf, wodurch das intrazellulär angereicherte L-Cystin für
die Glutathionsynthese verwendet werden kann. Konsekutiv dient das gebildete
Glutathion der antioxidativen Zellabwehr, indem es für die Aufrechterhaltung des
Redoxpaargleichgewichtes intrazellulär verantwortlich ist [6; 70]. Glutamat wird
möglicherweise als Nebenprodukt gebildet und anschließend in den Extrazellularraum
transportiert.
Für die Testung waren hauptsächlich die menschlichen Gliomzelllinien U87MG und
U373MG von Interesse, und es konnte gezeigt werden, dass sowohl xCT als auch CD98
in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden konnten, wohingegen die GLAST und
GLT-1 Transporter lediglich eine geringe Expression aufzeigten [58]. Die bildlichen
37
Darstellungen verdeutlichen den Sachverhalt, dass die Expression von xCT und CD98
in den Gliomzelllinien im Vergleich zu den menschlichen Kontrollzelllinien auf das 46-fache angestiegen war, was mit hoher Wahrscheinlichkeit für einen Missbrauch des
xCT- Systemes durch die Gliomzellen spricht und somit zu einer möglichen verstärkten
Glutamatsekretion führen kann. Die verminderte Nachweisbarkeit von GLAST und
GLT-1 Transportern, die für die Entfernung von Glutamat aus dem synaptischen Spalt
verantwortlich sind, und damit die Neuronen vor übermäßiger Aktivierung schützen,
unterstreicht die hier vorliegende Konstellation, um die Glutamatkonzentration
extrazellulär konstant hoch zu halten.
Abb. 6: Gliomzellen exprimieren im Besonderen xCT und sekretieren neurotoxische Glutamatkonzentrationen. Die quantitative Real-time-PCR-Expressionsanalyse der Glutamattransporter xCT,
CD98, GLAST und GLT-1 in den humanen Gliomzellen und dem menschlichen Gehirn (brain h) zeigt,
dass eine über dreifach so hohe Expression von xCT in den Gliomen vorliegt, GLAST und GLT-1
jedoch kaum mehr existent sind.
Um herauszufinden, ob diese Beobachtungen und Erkenntnisse eine klinische
Aussagekraft besitzen, wurde nun die Expression von xCT in primären menschlichen
Gliomproben untersucht. Das Ergebnis offenbarte, dass in allen getesteten humanen
malignen Gliomen im Vergleich zu den nicht-malignen humanen Proben eine
eindeutige erhöhte xCT-Expression nachgewiesen werden konnte [58]. In weiteren
Versuchsreihen ergab sich ein sichtbarer Unterschied des aufgezeigten xCTVorkommens zwischen dem Tumorverband selbst und der perifokalen Tumorzone, da
in der angrenzenden Tumorregion kein xCT-Protein existierte.
38
A
Abb. 7: A: xCT weist erhöhte Konzentrationen in primären menschlichen
Gliomen (GBM, WHO Grad IV) auf.
Repräsentative Bilder werden hier von
immungefärbten menschlichen Kortexpräparaten (Cx, obere Reihe) von einem
Patienten ohne malignen primären
Tumor und von einem Patienten mit
diagnostiziertem GBM (WHO Grad IV,
untere Reihe) gezeigt. Die weiß
gestrichelte Linie in der unteren Reihe
zeigt die Grenze des Tumors zwischen
den grün immungefärbten GFAP (oberer
Anteil) und dem peritumoralen Gebiet
(unterer Anteil). Der Maßstabsbalken
entspricht in beiden Reihen 60 µm.
B
B: Quantifizierung der xCT-immungefärbten Zellen in der Kontrollprobe
(cx), dem Tumor (T) und dem
peritumoralen Gewebe (PT). P* < 0,05,
Student's t-Test, Durchschnittswerte ±
des Signifikanzniveaus außer n = 4.
C
C: Sechs repräsentative menschliche
Proben mit der gesicherten Diagnose
eines GBM (GBM1-GBM6) und zwei
Proben ohne malignen Tumor (Cxl,
Cx2) wurden bezüglich xCT einem
Immunoblot unterzogen, GAPDH diente
hier als Kontrollprotein.
5.4
Hemmung der Expression des xCT-Systems
Basierend auf den bisherigen pharmakologischen und molekularen Resultaten stellt sich
nun die Frage, ob die Gliomproliferation und die Glutamatsekretion auf direktem Wege
39
von xCT betroffen sind oder nicht, und ob dies möglicherweise als Ansatzpunkt für
therapeutische Behandlungsmaßnahmen dienen kann.
Um dieser Fragestellung nachzugehen, näherte man sich der xCT-Expression auf dem
genetischen Wege unter Verwendung von RNA-Interferenzen (RNAi). Dies ist ein
molekularbiologisches Verfahren, um die Aktivität eines bestimmten Genes zu
blockieren. Hierzu werden auf enzymatischer Ebene über sogenannte Dicer die
mikroRNA-Interferenzen aus der doppelsträngigen RNA herausgelöst, die in der Lage
sind, an die komplementäre Boten-RNA (Messenger-RNA, mRNA) zu binden und
damit die Bildung des entsprechenden Proteines zu verhindern oder zu zerstören. Dieser
Vorgang wird auch als posttranskriptionales Gene-Silencing bezeichnet [76]. Von
besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang die small-interfering RNA
(siRNA), die eine experimentelle Gruppe der durch Dicer herausgelösten mikroRNA
darstellen.
Ob die gewünschte Herabregulierung des xCT-Proteines über die siRNA effizient war,
wurde über Immunoblots 72 h nach der Transfektion in den Gliomzellen bestimmt.
5.4.1 Reduktion der Glutamatsekretion durch den xCT-Knockdown
Die auf dem genetischen Wege faktisch erzielte Herabregulation von xCT konnte
zunächst in Westernblots im Vergleich zu einem verwendeten Kontrollprotein, in
diesem Fall GAPDH, aufgetragen und sichtbar gemacht werden. Eine vollständige
Unterdrückung von xCT war nicht möglich, jedoch konnte eine signifikante
Herabregulierung bei Gegenüberstellung mit dem Ausgangs-siRNA-Vektor erreicht
werden [58]. Um eine Plasmid-spezifische Wirkung auszuschließen, wurde das
Experiment mit zwei unterschiedlichen Vektoren xCT und xCT2 durchgeführt und man
erhielt ein beinahe identisches erniedrigtes Expressionsresultat. Die Reparabilität dieses
Knockdowns wurde durch den Überexpressionsversuch mit dem humanen xCT-Vektor
bewiesen, so dass sich xCT deutlich verstärkt im Westernblot vergleichsweise mit dem
Knockdown-Resultat als auch mit dem ursprünglichen siRNA-Vektor darstellt.
40
Abb. 8: Der si-RNA vermittelte Knockdown von xCT in den Gliomzellen wird durch einen Immunoblot
verdeutlicht, GADPH dient hier als Kontrollprotein. Reproduzierbare Überexpression nach Behandlung
mit dem humanen xCT-Vektor. PS-con = Kontrollgliome; pS-xCT(2) = herabregulierte Gliome; pS-xCT+
p-HxCT = mit humanem xCT überexprimierte Gliome.
Nach dem erfolgreichen Knockdown für xCT wurden die herabregulierten Gliomzellen
anschließend auf die organotypischen Hirnschnittkulturen transplantiert, um weitere
Untersuchungen
hinsichtlich
Tumorwachstumes
selbst
der
und
extrazellulären
des
Glutamatkonzentration,
intrazellulären
Levels
an
des
reaktiven
Sauerstoffmolekülen (= freien Radikalen) vorzunehmen. Interessanterweise hatte der
Knockdown keinerlei Einfluss auf die Morphologie der Gliomzellen und somit auf die
fortschreitende Proliferation der Tumorzellen [58]. Es konnte gezeigt werden, dass in
den verschiedenen Stadien eines Zellteilungszyklus, selbst nach erniedrigter
Genexpression von xCT, keine vermehrte Apoptose zu verzeichnen war, was für einen
normalen Ablauf der Zellteilung spricht. Prozentuale Messungen der Tumorgröße in
beiden Vergleichsgruppen ergaben ebenfalls keine greifbaren Divergenzen. Auf
intrazellulärer Ebene sollte man vermuten, dass durch den Knockdown die
Konzentration
an
reaktiven
Sauerstoffmolekülen
durch
eine
verminderte
Cystinanwesenheit deutlich Überhand nehmen müsste, was sich jedoch in den
Auswertungen nicht bestätigte, da in beiden Vergleichsgruppen, mit und ohne
Genregulation, quantitativ kein Unterschied feststellbar war. Die unveränderte
Konzentration der reaktiven Sauerstoffmoleküle zeigt, dass xCT für die malignen
Gliome überflüssig ist, was sich bereits in der Entwicklung der Säugetiere und in der
unzureichenden Funktion von xCT bei Mäusen abzeichnete [56].
41
A
B
Abb. 9: A: Die Zellzyklusanalysen des xCT-Knockdowns (pS-xCT) wie auch der verschlüsselten siRNA
der transfizierten Gliomzellen (ps-con) basieren auf der Fluoreszenz-aktivierten Zellfraktionierung, die
sich weitestgehend für alle Zellphasen identisch darstellen. Fast jede Phase des Zellzyklus erreicht
übereinstimmende Prozentzahlen. B: Das Zellwachstum, das konsekutive Tumorvolumen als auch die
Anzahl der freien Radikale (ROS) im Tumor ergaben keinen signifikanten Unterschied in den
Kontrollgliomen (ps-con) und den Knockdown-Gliomen (ps-xCT).
Was jedoch mit dem xCT-Knockdown erzielt werden konnte und für die weiteren
Analysen sehr hohe Bedeutung hatte, war die massive Reduktion der extrazellulären
Glutamatsekretion, was bisher einzig und allein durch eine vielfache Hinzugabe von LCystin realisierbar war. Die ursprüngliche Glutamatkonzentration von 60 µM konnte
auf unter 10 µM vermindert werden, was einer Kürzung auf 1/6 entspricht. Die
Reproduzierbarkeit bei anschließender Überexpression mit dem humanen xCT-Vektor
ist, wie bei den Westernblotverfahren, gegeben.
42
Abb. 10: Der Knockdown von xCT ex vivo unterdrückt signifikant die Glutamatsekretion und konsekutiv
die Gliom-induzierte Neurodegeneration. Nach Überexpression mit dem humanen xCT-Vektor wird
annähernd die Ausgangskonzentration der Kontrollproben erreicht. PS-con = Kontrollgliome; ps-xCT
herabregulierte Gliome; pS-xCt = mit humanem xCT überexprimierte Gliome.
Dies alles lässt erkennen, dass der xCT-Knockdown in der Zellkultur keine
Auswirkungen auf die Gliomzellproliferation und deren Migration besitzt, sondern zu
einer geringeren Neurodegeneration über eine verminderte Glutamatsekretion führt
[58].
5.5
Klinische Relevanz der verminderten Glutamatansammlung
Um zu beurteilen, ob die Herabregulation von xCT in Gliomen mit der konsekutiven
Verminderung der Glutamatsekretion in vivo positive Effekte hinsichtlich der
raumfordernden Läsion der Gliome aufzeigt und somit gegebenenfalls das klinische
Outcome beeinflussen kann, wurden Gliomzellen mit und ohne Knockdown von xCT
auf stereotaktischem Wege in Rattengehirne im Bereich des rechten Frontallappens
implantiert und nachfolgend der klinische Status beurteilt. Um die Ergebnisse der in
vivo-Experimente beschreiben zu können, wurde einerseits die Glutamatsekretion und
das Gliomwachstum unter Verwendung von mikrodialytischen Techniken analysiert
und andererseits die Tiere beider Gruppen anhand des klinischen Verlaufes beurteilt.
43
5.5.1 Nachweis von reduzierter Glutamatsekretion in vivo und ex vivo
Zur Verdeutlichung und Sichtbarmachung des implantierten Tumorgewebes, das sich
makroskopisch nach Trepanation vom normalen Gehirnparenchym nicht identifizieren
lässt, wurde über die Fluoreszenzmikroskopie das Tumorkonvolut kenntlich gemacht.
Zur Untersuchung der Gliom-abhängigen Glutamatsekretion in vivo wurden zum einen
über das Verfahren der Mikrodialyse direkte Messungen des peritumoralen
extrazellulären Glutamates bei den Tieren mit und ohne xCT-Herabregulierung
vorgenommen. Hier ergaben sich signifikant erniedrigte Glutamatlevel mit einer
durchschnittlichen Konzentration von 3,58 µM bei den Tieren mit dem Knockdown für
das xCT-Gen im Vergleich zu den gemessenen Wildtypgliomen, die im Durchschnitt
eine Glutamatkonzentration von 9,85 µM aufwiesen, was einer Steigerung um das
knapp 3-fache entsprach.
A
B
Abb. 11: A: Die in den Frontallappen der Ratten stereotaktisch eingebrachten GFP-exprimierenden F98Tumorzellen können unter der Fluoreszenz sichtbar gemacht und in situ lokalisiert (Pfeil) werden. B: Die
quantitative Analyse der extrazellulären Glutamatkonzentration (Glutamat o) in der Peritumoralzone der
Kontrollgliome (pS-con) und der herabregulierten Gliome (pS-xCT). Das Ergebnis demonstriert eine
deutliche Konzentrationsminderung in der Knockdown-Gruppe.
Auf der anderen Seite und zur weiteren Verifizierung der Glutamatsekretion, hier
jedoch ex vivo, wurde die Neurodegeneration des umliegenden Tumorgewebes nach
Implantation in den Kontrollgliomen und den xCT-Knockdown-Gliomen mittels der
44
Verwendung des Zelltodmarkers Propidiumjodid bestimmt. Beide Gruppen wiesen eine
vergleichbare zeitliche Tumorgrößenprogression auf, was sich mit den Resultaten aus
der Zellkultur deckt, jedoch zeigte sich das Ausmaß des neuronalen Zelltodes in der
xCT-unterdrückten Gruppe, welches über die Fluoreszenzmikroskopie bildlich
dargestellt werden konnte, merklich vermindert. Eine vollständige Reduktion der
peritumoralen Apoptose war nicht möglich, dennoch konnte die Ausgangsquote im
Rahmen der transplantierten Gliomzellen um ca. 1/3 dezimiert werden. In den
organotypischen
Gehirnschnittkulturen
vergleichsweise
konnte
bei
identischer
Versuchsdurchführung mit Propidiumjodid die Neurodegeneration der Gliomzellen mit
und ohne xCT-Knockdown prozentual sogar um circa die Hälfte minimiert werden,
während ex vivo nur annähernd diese Resultate realisiert wurden.
A
B
Abb. 12: A: Zelltodanalysen an Gehirnschnitten, die von xCT-Knockdown-Gliomen (pS-xCT) und von
Kontrollgliomen (pS-con) stammen. Der Zelltod wurde kontrolliert, mittels des Apoptosemarkers
Propidiumjodid (PI) gemessen und in ein Säulendiagramm übertragen (wie es auf der rechten Seite
sichtbar ist). Es zeigt eine deutliche Reduktion des neuronalen Zelltodes. B: Implantation von
45
transfizierten GFP-positiven Gliomzellen mit {TI (pS-xCT)} und ohne {TI (pS-con)} Herabregulation
von xCT auf die Gehirnschnitte und Auswertung des Zelltodes nach 5 Tagen. Die statistische Signifikanz
ZXUGHPLWGHP6WXGHQW¶VW-Test berechnet (Durchschnittswerte ± Standardabweichung, *P < 0,05; n = 10
Schnitte pro Gruppe). Balken in A und B = 100 µm.
Zusammenfassend unterstreichen die bisherigen Ermittlungen das Konzept, dass die
malignen Gliome über den xCT-Transporter Glutamat sezernieren und darüber für den
neuronalen Zelltod verantwortlich sind [58].
5.5.2 Prolongierte Überlebenszeiten bei verzögertem Auftreten von neurologischen
Defiziten
Basierend auf den in vivo- und ex vivo-Resultaten, wurden die Tiere beider
Implantationsgruppen für insgesamt 3 Wochen klinisch unter Beobachtung genommen
und das zeitliche Auftreten von klinisch-neurologischen Ausfallsmustern sowie der
Zeitpunkt ihres Todes ermittelt. Anhand der Kaplan-Meier-Überlebenszeitkurve zeigten
die Tiere mit den herabregulierten xCT-Gliomen ein deutlich verlängertes Dasein im
Vergleich zu den Wildtypgliomen, wobei die Zeitspanne zwischen dem Ableben beider
Parteien hier 5 Tage beträgt. Bemerkenswert ist, dass, nach dem Eintreten erster
neurologischer Defizite, der weitere Progress in beiden Kollektiven in nahezu gleichem
Tempo stattfindet, lediglich der Beginn der neurologischen Entwicklung ist verzögert
und entspricht zeitlich gesehen im Durchschnitt ebenfalls einer Differenz von 5 Tagen.
Nach Implantation der Wildtypgliome und der xCT-Knockdown-Gliome in den rechten
Frontallappen der Ratten konnte zunächst im Wildtypkollektiv nach 7 Tagen eine
Schwäche bzw. eine Lähmung im Bereich der Hinterläufe und des Schwanzes
beobachtet werden, während die identische klinische Symptomatik im xCT-Kollektiv
erst nach 12 Tagen zu verzeichnen war. Im weiteren Verlauf traten bei den Ratten
beider Gruppen Hemiparesen bzw. Hemiplegien auf, die im Finalstadium in einer
Tetraplegie endeten.
46
AA
Abb. 13 A: Kaplan-Meier-Überlebenskurve, in
der die Rattengruppe mit den xCTherabregulierten Gliomen (pS-xCT) 5 Tage
länger als die Kontrollgruppe ohne xCTKnockdown lebte; jeweils n = 6;
B
Um eine
Abb. 13 B: Durch stereotaktische Implantation von Gliomzellen mit (blaue Punkte) und ohne (schwarze
Rechtecke) xCT-Knockdown in den rechten Frontallappen der Ratten ergab sich ein unterschiedliches
Auftreten an neurologischen Defiziten. Rechts werden die
klinisch-neurologischen
Beurteilungskriterien in beiden Gruppen veranschaulicht, hier ergab sich eine Latenz von 6-7 Tagen
(Grad 0: keine Symptome, Grad 1: Schwäche oder Paralyse des Rumpfes, Grad 3: Paralyse der
Hinterläufe oder Hemiparalyse, Grad 4: komplette Paralyse/Tetraplegie).
Um einen einzelnen zelllinienspezifischen rattenabhängigen Effekt auszuschließen,
wurde der xCT-Knockdown ebenfalls in GL261 Zellen vorgenommen und schließlich
in das Gehirn von Mäusen implantiert. Auch hier bestätigte sich das prolongierte
Auftreten von neurologischen Ausfällen sowie ein längeres Überleben im Vergleich zu
den Mäusen, die den Wildtyp implantiert bekamen. Auf die bildgebende Darstellung
wurde an dieser Stelle verzichtet.
47
5.6
Bildgebende Darstellung der verminderten Glutamatansammlung
Aufgrund dieser Erkenntnisse stellte sich nun die Frage, warum bei den Tieren mit dem
xCT-Knockdown eine verlängerte Existenz möglich war und welche Faktoren dies
beeinflussen können. Dazu machte man sich die in der heutigen Zeit allzeit zur
Verfügung stehende bildgebende Diagnostik zu Nutze. Im Speziellen wurden
kernspintomographische Schnittbildverfahren angefertigt, die besonders für das
Gehirnparenchym geeignet sind und Kontraste über verschiedene Relaxationszeiten der
Gewebearten hervorrufen können. Zusätzlich wurde den Tieren Kontrastmittel
appliziert, um manche Kontraste besser hervorheben zu können oder überhaupt erst
sichtbar zu machen.
5.6.1 Verringerung des perifokalen Ödemes
Nach Implantation der Gliomzellen mit und ohne xCT-Knockdown in den rechten
Frontallappen der Ratten wurde das Tumorwachstum in vivo über 10 Tage lang per
Magnetresonanztomographie (MRT) kontrolliert. In den T1-gewichteten Sequenzen
nach Kontrastmittelgabe wurde die Haupttumormasse in beiden Fällen sichtbar, wobei
das Tumorvolumen selbst über die Dauer des Beobachtungszeitraum von 10 Tagen
keine massiv divergierenden Messungen ergab. Die durchschnittliche räumliche
Ausdehnung der implantierten Kontrollgliome zeigte 73 mm 3, die der xCTunterdrückten Gliome 68,1 mm3. Zur Verdeutlichung des realen Tumoraktionsradius,
der nicht nur den Tumor selbst, sondern auch das perifokale Ödem umfasst, wurden T2gewichtete Schnittbilder durchgeführt, die das perifokale Ödem hyperintens darstellten.
Hier fand sich im Bereich der xCT-Knockdown-Gliome ein signifikant kleineres Ödem
als in den Kontrollgliomen. Prozentual gesehen konnte eine Reduktion um 2/3 im
Vergleich zum Kontrollödem in den T2-Wichtungen erreicht werden. Das wiederum
deutete auf eine verminderte Störung der Blut-Hirn-Schranke hin.
48
Abb.14: Repräsentative MRT-Analysen 10 Tage nach Tumorimplantation. Die Haupttumormasse
konnte nach Applikation eines intraperitonealen Kontrastmittels und anschließenden T1-gewichteten
Bildern (T1+CM) für die Gliomgruppen mit und ohne xCT-Knockdown sichtbar gemacht werden. Die
Bilder darunter stellen das Perifokalödem in den T2-gewichteten Bildern dar. Rechts ist die
Verringerung der Ödemausbreitung in der xCT-Knockdown-Gruppe verdeutlicht. Die statistische
6LJQLILNDQ]ZXUGHPLWGHP6WXGHQW¶VW-Test berechnet (Durchschnitt ± Standardabweichung, *P < 0,5)
Die Rückschlüsse, die aus den vorliegenden Erkenntnissen gezogen werden können,
sind, dass bei einer identischen Tumorgröße das verbesserte klinische Outcome in der
Gruppe der Gliome des xCT-Knockdowns eine direkte Konsequenz der reduzierten
Ödementstehung ist [581. Diese verminderte Ödemansammlung, die ebenfalls mit einer
geringeren
Schädigung
der
Blut-Hirn-Schranke
einherging,
wurde
zusätzlich
histologisch aufgearbeitet. Es fanden sich weniger geschwollene Astrozyten und eine
reduzierte Expression von GFAP und Aquaporin-4 in der Perifokalzone (Daten sind an
dieser Stelle nicht veröffentlicht) [45; 69]. Ob die Resultate dieser Versuchsreihen auch
als Ansatzpunkte für die Behandlung im klinischen Alltag herangezogen werden
können und ob diese realisierbar sind, soll im Folgenden diskutiert werden.
49
6 Diskussion
Massiver Zelltod und ein ausgeprägtes perifokales Ödem sind die herausragenden
pathologischen Merkmale, die ein Glioblastoma multiforme WHO Grad IV ausmachen,
und diese Tumoren somit zu den aggressivsten Neoplasien der Menschheit zählen
lassen [24; 52]. Neueste Berichte über einen möglichen Pathomechanismus haben
bereits vermuten lassen, dass die exzitatorische Aminosäure Glutamat und die
dazugehörigen Rezeptoren essentiell für die Gliomproliferation und -invasion sind [26;
53; 62].
Darüber hinaus konnte an Gliomzelllinien und an primären Gliomen gezeigt werden,
dass
eine mangelnde Glutamatwiederaufnahme in die Astrozyten
auf eine
beeinträchtigte Aktivität und Expression der zuständigen Glutamattransporter
zurückzuführen
war,
wobei
gleichzeitig
ein
Anstieg
der
extrazellulären
Glutamatkonzentration zu verzeichnen war [73]. Wir stellten damit die These auf, dass
maligne Gliome über den xCT-Kanal neurotoxische Glutamatkonzentrationen in den
Extrazellularraum sezernieren, somit massive Neuronenschäden verursachen können
und für das entstehende Gehirnödem verantwortlich sind.
Die Expressionsanalyse der Glutamattransporter in den Gliomzellen und in den
primären menschlichen Gliomen identifizierte das System xCT als vorrangigen
Transporter in den Gliomzellen, wohingegen andere Glutamattransporter in wesentlich
geringerer Ausprägung gefunden wurden. Der heterodimerische Aminosäuretransporter
xCT setzt sich aus 12 transmembranen Domänen und der schweren Kette CD98/4F2
zusammen, ist selektiv für Cystin und Glutamat und vermittelt die Glutamatsekretion im
Austausch gegen Cystin. Cystin wird wiederum intrazellulär für die Glutathionsynthese
(GSH) benötigt, die ihrerseits zur zellulären Entgiftung und zur Aufrechterhaltung des
oxidativen Gleichgewichtes beiträgt [5; 22; 55; 61], da beobachtet worden war, dass
xCT in kultivierten Zellen zusehends bei oxidativem Stress hochreguliert wurde [30],
womit sowohl dem Cystin als auch dem xCT-Rezeptor eine wichtige Rolle in diesen
Abläufen zukommt.
In einem Versuch den Gliom-induzierten Zelltod über die Glutamatrezeptoren zu
verhindern, näherten wir uns diesem Prozess auf pharmakologische und genetische
Weise.
Der peritumorale Zelltod konnte durch die pharmakologische Blockade der
glutamatergen
NMDA-
und
AMPA-Rezeptoren,
abhängig
von
der
50
Ausgangskonzentration gemindert, jedoch nicht vollständig verhindert werden. Dies
könnte auf die oxidative Glutamattoxizität zurückzuführen sein, die auf einem
rezeptor-unabhängigen
Weg
geschieht,
und
daher
nicht
über
selektive
Rezeptorantagonisten alleine gestoppt werden kann [59]. Wir entschieden uns daher in
einem nächsten Schritt direkt die Glutamatsekretion in Gliomen zu manipulieren.
Eine andere Medikamententestung mit S-4CPG, welche im Rahmen dieser Dissertation
nicht veröffentlicht wird, erlaubt die effiziente selektive Blockade des xCT-Systemes
[47]. Wir zeigten, dass S-4CPG die Gliom-abhängige Glutamatausschüttung blockierte
und daraus folgend den peritumoralen Zelltod abschwächte, wobei das Tumorwachstum
selbst nicht beeinflusst werden konnte.
Die Überlebensfähigkeit der Neuronen und der glialen Zellen war über diese
pharmakologische Blockade nicht steigerbar, da über die Quote der Glutamateinsparung
nach
extrazellulär
gleichermaßen
die
Cystinkonzentration
stieg
und
ebenso
Neurodegeneration verursachte. In einem weiteren Versuch die xCT-Expression direkt
üEHU HLQH ÄVPDOO-interfering RNA" zu beeinflussen, erbrachte eine verminderte
Glutamatsekretion in den Gliomen. Dieser siRNA-Knockdown des xCT-Systemes hatte
keinerlei Wirkung auf die Gliomzellproliferation und -migration. Nachdem diese
Gliome mit dem herabregulierten xCT-Protein in Gehirnschnitte implantiert wurden,
konnte gezeigt werden, dass der Knockdown von xCT im Vergleich zur
pharmakologischen Variante zu einer abgeschwächten Neurodegeneration führte. Die
Blockade von xCT alleine beweist noch nicht die Ursächlichkeit der Gliomproliferation
und es stellt sich hier die Frage, ob dieser Versuch Auswirkungen in Bezug auf die
klinische Relevanz am Lebenden und auf das beschädigte peritumorale Gewebe hat. Um
die Bedeutung dieser Ergebnisse in vivo charakterisieren zu können, wurden hierfür die
Glutamatsekretion
und
Fremdtransplantatmodell
das
unter
Gliomwachstum
der
Verwendung
in
von
einem
genidentischen
Mikrodialyse
und
der
bildgebenden MRT-Technik analysiert. Mit der Bestimmung von extrazellulären
Glutamatkonzentrationen in vivo legte man offen dar, dass der siRNA-vermittelte
Knockdown des xCT-Systemes in Gliomen signifikant die Glutamatkonzentration in
den peritumoralen Regionen verminderte. Trotzdem wiesen die Tiere, denen die Gliome
mit dem xCT-Knockdown implantiert wurden, ein deutlich kleineres perifokales Ödem
im Vergleich zu den Kontrollen auf, obwohl die Tumormasse überall gleich groß war.
Im Normalfall erhöht das Tumorödem den effektiven Durchmesser des Tumores und
beschleunigt damit den Anstieg des physiologischen intrakraniellen Druckes, der
51
eventuell zum Tode führen kann. Diese Auffassung wurde in unseren klinischen
Analysen bestätigt. Ratten mit den abgeschwächt exprimierenden xCT-Gliomen
demonstrierten einen verzögerten Beginn der neurologischen Defizite und überlebten
deutlich länger als die Ratten, die das Wildtyp-Gliom in sich trugen. Der Knockdown
von xCT in den Gliomzellen verminderte jedoch die Zellproliferation nicht deutlich
genug, woraus sich die gleiche Tumorgröße ergab, und wodurch gezeigt werden konnte,
dass das verbesserte klinische Outcome auf das eindeutig reduzierte Ödem
zurückzuführen war.
Unsere experimentellen Daten werden darüber hinaus durch die Tatsache gestützt,
dass sich die xCT-Proteine in allen primär menschlichen Gnomen in erhöhter
Konzentration im Vergleich zum Normalgehirn befinden. Wir stellten uns daher die
Frage, ob die exzessive Glutamatsekretion in den Extrazellularraum über xCT vermittelt
ist.
Dort agiert die exzitatorische Aminosäure auf zwei Wegen: Zum einen verursacht
Glutamat den direkten neuronalen Zelltod, der über eine exzessive Aktivierung
neuronaler Glutamatrezeptoren funktioniert und somit zu einem Kalziumeinstrom mit
konsekutiver Zellschwellung führt [2; 10]. Währenddessen bewirken wahrscheinlich
zum anderen die steigenden Glutamatkonzentrationen eine Störung der Blut-HirnSchranke, was wiederum über eine Absonderung von Wasser und Plasmaproteinen aus
den betroffenen Blutgefäßen zu einer erneuten Schädigung der neuronalen Zellen führt.
Auf diese Art und Weise entsteht ein Teufelskreis, der den intrakraniellen Druck immer
weiter verstärkt. Diese Hypothese wird von der Tatsache gestützt, dass Glutamat zu
einer Unterbrechung der Funktionsfähigkeit der endothelialen Zellen im Gehirn und
folglich der Blut-Hirn-Schranke führt [3; 38]. Wir konnten ebenfalls durch eine erhöhte
Aquaporin-4-Expression
einen
Schwellzustand
der
Astrozyten
(Daten
nicht
veröffentlicht) zeigen. Diese astrozytäre Schwellung kann ebenfalls die Freisetzung von
Glutamat verursachen [39; 66] und damit zusätzlich eine schädigende Rolle im
Zusammenhang mit Gehirntumoren spielen.
Ob die Neurodegeneration eine Voraussetzung für die Entstehung eines Hirnödemes ist
oder welches Ausmaß an Gliom-induzierter neuronaler Degeneration zur Ausbildung
eines Hirnödemes beiträgt, ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht definiert. Es ist jedoch eine
Tatsache, dass eine verminderte Glutamatausschüttung die Ausbildung eines Ödemes
reduziert. Das zeigt, dass neben einer unkontrollierten Proliferation die xCT-vermittelte
52
Glutamatsekretion ein weiteres malignes klinisches Kriterium von primären
Gehirntumoren darstellt.
Zusammenfassend konnten wir das allererste Mal zeigen, dass eine unterdrückte xCTExpression in Gliomen einen signifikanten klinischen Nutzen in Bezug auf ein
geringeres perifokales Ödem an Ort und Stelle haben kann und sich im Verlauf auf eine
längere Überlebensfähigkeit auswirkt. Das wiederum beweist, dass toxische
Glutamatlevel einen neuronalen Zelltod und ein Hirnödem verursachen und eine
Verschlechterung der bestehenden Gehirnfunktionen durch die Gliomeinwirkung
erwarten lässt.
Obwohl xCT für das maligne Wachstum sowie für die Migration der Gliome
entbehrlich ist, vermittelt es jedoch zwei Hauptcharakteristika der malignen Gliome.
Daher stellt unsere Studie neue Einblicke in den Gliom-induzierten neuronalen Zelltod
und in die Entwicklung des Gehirnödemes bereit, und sieht xCT in einer kritischen
Rolle innerhalb dieser Prozesse.
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8 Abkürzungsverzeichnis
Bei der Verwendung von Abkürzungen wurde zum Teil auf die in der Literatur
geläufige angelsächsische oder lateinische Version zurückgegriffen.
acc.:
accumulating
AMPA:
Į-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid
BES:
Bis (2-Hydroxyethyl)-2-Aminomethansulfonsäure
bp:
base pair
ca.:
circa
CA1:
Cornu Anterior 1
CaCl2:
Kalziumchlorid
CFDA SE:
Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester
cm :
Quadratzentimeter
CO2:
Kohlendioxid
d:
Tage
DMEM:
Dulbecco Modified Eagle Medium
EDTA:
Ethlene Diamine Tetra-Acetate
EGFP:
Enhanced-Green-Fluorescent-Protein
FDA:
Fluorescein Diacetat
GAPDH:
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GBM:
Glioblastoma multiforme
GFAP:
Glial Fibrillary Acidic Protein
GLAST:
Glutamat-Aspartat-Transporter
GLT-1:
Glutamat-Transporter
g:
Gramm
GSH:
y-L-Glutamyl-L-Cysteinylglycin (= Glutathion)
GYKI 52466:
1-(4-Amino-pheny1)-4-Methyl-7,8-Methyl-Endioxyl-5H-2,3Benzodiazepin
h:
Stunden
HCl:
Salzsäure
H2O:
Wasser
H2O2:
Wasserstoffperoxid
KCI:
Kaliumchlorid
61
kDa:
Kilodalton
M:
Molar/Mol
MgCl2:
Magnesiumchlorid
min:
Minuten
MK 801:
(+)-5-Methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzol[a,d]cyclohepten5,10-imine-maleat
ml:
Milliliter
MRT/MRI:
Magnetresonanztomographie
NaCl:
Natriumchlorid
Na2PO4:
Dinatriumhydrogenphosphat
NF- B:
nuklearer Transskriptionsfaktor- B
ng:
Nanogramm
nm:
Nanometer
NMDA:
N-Methyl-D-Aspartat
o.g.:
oben genannte(n)
PARP:
Poly (ADP-Ribose)-Polymerase
PCR:
Polymerase Chain Reaction
PBS:
Phosphate Buffered Saline
PBST:
Phosphate Buffered Saline with Tween
PI:
Propidiumjodid
PKC:
Phosphokinase C
RNA:
Ribo-Desoxy-Nuclein Acid
SDS:
Sodiumdodecylsulfat
siRNA:
short-interfering Ribodesoxynukleinsäure
SLC1A(3):
solute carrier family 1A(3)
S4-CPG:
(S)-4-Carboxyphenylglycin
z. B.:
zum Beispiel
ZNS:
Zentrales Nervensystem
µg:
Mikrogramm
µl:
Mikroliter
µm:
Mikrometer
µM:
MikroMol
62
9 Veröffentlichungen
77. Eyüpoglu, I. Y., Hahnen, E., Heckel, A., Siebzehnrübl, F. A., Buslei, R., Fahlbusch,
R., Blümcke, I.; Malignant glioma-induced neuronal cell death in an organotypic
glioma invasion model. Technical note. J Neurosurg, 2005. 102(4): p. 738-44.
78. Savaskan, N. E., Heckel, A., Hahnen, E., Engelhorn, T., Doerfler, A., Ganslandt,
O., Nimsky, C., Buchfelder, M., Eyüpoglu, I. Y.; Small interfering RNA-mediated
xCT silencing in gliomas inhibits neurodegeneration and alleviates brain edema.
Nat Med, 2008. 14(6): p. 629-32.
63
10 Danksagung
Mit der Fertigstellung dieser Dissertationsarbeit ist es an der Zeit, nochmals denjenigen
zu danken, die am Zustandekommen der Arbeit beteiligt waren und mich auf diesem
Weg stets begleitet und unterstützt haben.
Zunächst gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Michael Buchfelder, dem Ärztlichen Direktor
der Neurochirurgischen Klinik an der Universitätsklinik Erlangen, der mir die
Möglichkeit gab, meine Dissertation in seiner Abteilung zu erstellen und die dafür
notwendigen Versuchsreihen im neurochirurgischen Labor durchführen zu können.
Mein ganz besonderer Dank geht an meinen Doktorvater, Herrn PD Dr. Ilker Eyüpoglu,
der mir jederzeit geduldig mit Rat und Tat zur Seite gestanden hat, der mir seine
fachlichen Kenntnisse weitergab, der mit immer neuen Ideen und Anregungen diese
Arbeit vorantrieb und ehrlich an den verschiedenen Variationen dieser Arbeit Kritik
leistete, die letztendlich zum Gelingen führte.
Weiterhin möchte ich Herrn PD Dr. Nicolai Savaskan danken, der mich stets
ermunterte, die Arbeit fertigzustellen und durch seine fachliche Kritik und
Begutachtung meiner Arbeit einen nicht unwesentlichen Beitrag geleistet hat.
Im Rahmen der unzähligen Versuchsreihen möchte ich auch meinen Dank an die MTAs
des neurochirurgischen Labors richten, die mir stets über die Schulter geschaut haben
und mir den Einstieg in die Laborarbeit erleichtert haben.
Nicht zuletzt meinen Eltern bin ich für die unentwegte, gleichermaßen moralische und
tatkräftige Unterstützung sowohl während des Studiums als auch während des
Dissertationsprojektes zu tiefstem Dank verpflichtet. Obgleich die Anfertigung einer
Dissertationsschrift
ein
hohes
Maß
an
persönlichem
Verzicht,
Fleiß
und
Beharrungsvermögen abverlangt, läge diese Schrift ohne ihre Hilfe sicherlich nicht vor.
Ihnen sei die vorliegende Arbeit von ganzem Herzen gewidmet.