Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit
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Aus dem Institut für Humangenetik der Universität zu Lübeck Direktorin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck - Aus der Sektion Medizin - vorgelegt von Charlotte Runge aus Schleswig Lübeck 2013 1. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach 2. Berichterstatter/Berichterstatterin: Priv.-Doz. Dr. med. Matthias Nitschke Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2013 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 31.10.2013 -Promotionskommission der Sektion Medizin- Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ 3 Verzeichnis der Abbildungen................................................................................ 6 Verzeichnis der Tabellen...................................................................................... 6 Verzeichnis der Abkürzungen .............................................................................. 8 1. Einleitung ................................................................................................... 11 1.1. Epilepsie ............................................................................................. 11 1.2. Mentale Retardierung ......................................................................... 13 1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie ......................................... 14 1.3.1. Das Angelman-Syndrom ................................................................. 14 1.3.2. Das Rett-Syndrom .......................................................................... 14 1.4. 1.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 16 1.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 17 1.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 18 1.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 19 1.5. 2. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen .................................. 15 Aufgaben und Zielsetzung .................................................................. 20 Material und Methoden ............................................................................... 21 2.1. Materialien .......................................................................................... 21 2.1.1. Patienten ........................................................................................ 21 2.1.2. Geräte ............................................................................................ 22 2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme .................................................. 22 2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen ............................................................... 23 2.1.5. Verbrauchsmaterial......................................................................... 23 2.1.6. DNA-Proben ................................................................................... 24 2.1.7. Computersoftware .......................................................................... 24 2.1.8. Internetressourcen .......................................................................... 24 2.2. Methoden ........................................................................................... 25 2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................. 25 2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte...................... 27 2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes ................................................... 28 2.2.4. Sequenzierung nach Sanger .......................................................... 29 2.2.5. Auswertung der Sequenzen ............................................................ 30 2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .............. 30 2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese .......................................... 32 2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen ......................................... 33 3 Inhaltsverzeichnis 3. Ergebnisse ................................................................................................. 35 3.1. 3.1.1. Anamnese und klinische Befunde ................................................... 35 3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm .............................................. 39 3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT) .. 40 3.1.4. Familienanamnese ......................................................................... 40 3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen ................... 41 3.2. 4. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde ..................................... 35 Molekulargenetische Analysen ........................................................... 42 3.2.1. Sequenzanalysen ........................................................................... 42 3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens............................................... 42 3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens ................................................. 45 3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens................................................... 47 3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens ............................................. 47 3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen .......................................... 49 Diskussion .................................................................................................. 51 4.1. Diskussion des Phänotyps .................................................................. 51 4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde .................................. 52 4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen ................................ 52 4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen .................................. 55 4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen .............................. 56 4.3. Diskussion der Methoden ................................................................... 57 4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den Vorbefunden .................................................................................................. 59 4.5. Weitere Differentialdiagnosen ............................................................. 59 4.6. Ausblick .............................................................................................. 62 5. Zusammenfassung ..................................................................................... 63 6. Literaturverzeichnis .................................................................................... 64 7. Anhänge..................................................................................................... 74 7.1. Informationsblatt zur Studie ................................................................ 74 7.2. Einwilligungserklärung der Studie ....................................................... 76 7.3. Fragebogen der Studie ....................................................................... 78 7.4. Reaktionsbedingungen ....................................................................... 80 7.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 80 7.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 81 7.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 84 7.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 86 7.5. MLPA-Ansätze.................................................................................... 88 4 Inhaltsverzeichnis 7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte ..... 89 7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick .......................................... 92 7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie 94 7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen .................................... 97 8. Danksagung ............................................................................................. 100 9. Lebenslauf ............................................................................................... 101 10. Erklärung .............................................................................................. 102 Eidesstattliche Versicherung ............................................................................ 102 5 Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel .......................43 Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens. ...44 Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens ..........................45 Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens ........46 Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens ......47 Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens ..48 Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens. ...48 Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen...............................................50 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens ...........................................27 Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6Gens ............................................................................................................................27 Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .............................29 Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .......................30 Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA ..........................32 Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten Patientenkohorte ..........................................................................................................35 Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der Datenerhebung ............................................................................................................37 Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten Patientenkohorte ..........................................................................................................37 Tabelle 9 Dysmorphiezeichen ......................................................................................38 Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide ...............................................................80 Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen ....................................................................................................................................80 Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen........81 Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen .......................................................81 Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen .................................................81 Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................81 Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen 82 Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARXGens ............................................................................................................................82 6 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens ....................................................................................................................................82 Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des ARX-Gens....................................................................................................................83 Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen ...........................................................83 Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen .....................................................83 Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................84 Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des SLC9A6-Gens ..............................................................................................................84 Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6Gens ............................................................................................................................85 Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen .....................................................85 Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen ...............................................85 Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4Gen ..............................................................................................................................86 Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen ....................................................................................................................................86 Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen .........................................................87 Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen ....................................................87 7 Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen A Adenin ACTH Adrenocorticotropes Hormon a.d. aqua destillata ARX Aristaless-Related Homeobox ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare C Cytosin CDKL5 Cyclin-dependent kinase-like 5 cDNA complementary DNA CLB Clobazam CLZ Clonazepam cMRT craniale Magnetresonanztomographie CT Computertomogramm dATP 2‟-Desoxyadenosintriphosphat dCTP 2‟-Desoxycytidintriphosphat ddNTP 2‟,3‟-Didesoxyribonukleosidtriphosphat del Deletion dGTP 2‟-Desoxyguanosintriphosphat DNA 2‟-Desoxyribonukleinsäure dNTP 2‟-Desoxyribonukleosidtriphosphat dTTP 2‟-Desoxythymidintriphosphat EDTA Ethylendiamintetraacetat EEG Elektroenzephalogramm ESM Ethosuximid ExoSap Exonuklease / Shrimp Alkaline Phosphatase FLB Felbamat F-Primer forward primer (Vorwärts-Primer) G Guanin GTP Guanosintriphosphat HPLC high performance liquid chromatography Wasser Hz Hertz kb Kilobasen (1000 bp) LEV Levetiracetam LGS Lennox-Gastaut-Syndrom 8 Verzeichnis der Abkürzungen LM Lebensmonat LTG Lamotrigin M molar (mol / l) Mb Mega-Basenpaare (106 bp) MgCl2 Magnesiumchlorid Min. Minuten µl Mikroliter MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification mRNA messenger RNA MRT Magnetresonanztomographie OXC Oxcarbazepin PB Phenobarbital PCR Polymerasekettenreaktion PHT Phenytoin PLP Pyridoxalphosphat RNA Ribonukleinsäure R-Primer reverse primer (Rückwärts-Primer) RSP Risperidon RUF Rufinamid Sek. Sekunden Ser Serin SLC9A6 Sodium Like Channel 9A6 SNP Single Nucleotide Polymorphism STM Sultiam STP Stiripentol T Thymin Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TCF4 Transcription Factor 4 TEMED NNNN-Tetramethylethylenediamine Thr Threonin TPM Topiramat Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan UBE3A ubiquitin-protein ligase E3A Gen UTR untranslated region UV Ultraviolett V Volt 9 Verzeichnis der Abkürzungen VGB Vigabatrin Vol. Volumen VNS Vagusnervstimulator VPA Valproinsäure ZNS Zonisamid 10 Einleitung 1. Einleitung 1.1. Epilepsie Zerebrale Anfälle sind die Folge einer plötzlichen Funktionsstörung des Gehirns. Aufgrund unterschiedlicher Ursachen kommt es dabei zu abnormem Auftreten und Ausbreiten oder zu unzureichender Hemmung hirnelektrischer Aktivität. Von einer Epilepsie spricht man nach dem Auftreten zumindest eines epileptischen Anfalls sowie einer andauernden Veränderung im Gehirn, welche weitere Anfälle wahrscheinlich macht (Fisher et al., 2005). Ätiologisch werden die Epilepsien in symptomatische und idiopathische Formen unterteilt. Bei den symptomatischen Formen liegt eine organische Störung des Gehirns zugrunde, bei der idiopathischen Form ist keine Strukturstörung erkennbar. Symptomatische Krampfanfälle können durch Fieber, Trauma, Tumoren oder auch durch akute Stoffwechselstörungen verursacht werden. Sowohl symptomatische als auch idiopathische Epilepsien können im Rahmen einer syndromalen Erkrankung auftreten (Lindsay et al., 2010). Der Ausschluss einer symptomatischen Ursache im Rahmen einer Hirnschädigung, eines Tumors, eines Traumas, einer Infektion oder einer Stoffwechselerkrankung macht eine genetische Ursache wahrscheinlich (Todt, 2004). Mehr als die Hälfte aller Epilepsien werden auf eine genetische Ursache zurückgeführt (Pal et al., 2010). Die epileptischen Anfälle werden grob in fokale (partiell, herdbezogene) und primär generalisierte Anfälle unterteilt. Fokale Anfälle gehen von einem Herd im Gehirn aus und können unter Umständen sekundär generalisieren. Bei primär generalisierten Anfällen hingegen betrifft die pathologische neuronale Aktivität den gesamten Cortex und geht in der Regel mit einem Bewusstseinsverlust einher. Zu den generalisierten Anfällen werden tonisch-klonische, atonische (Sturzanfälle), tonische (symmetrische Versteifungskrämpfe), klonische (beidseitige rhythmische Muskelzuckungen) und myoklonische Anfälle (beidseitige Zuckungen bei erhaltenem Bewusstsein) sowie Absencen (Bewusstseinsunterbrechungen von wenigen Sekunden) gerechnet (Lindsay et al., 2010). Zum Zeitpunkt der Geburt ist das Gehirn noch unzureichend entwickelt und bei den meisten Neugeborenen ist zu diesem Zeitpunkt lediglich der intakte Hirnstamm funktionsfähig. In der normalen postnatalen Entwicklung durchläuft das Gehirn einen komplexen Reifeprozess, der mit sehr hoher neuronaler Erregbarkeit verbunden ist. Während seiner Entwicklung ist das Gehirn ständiger Synaptogenese, Apoptose und Myelinisierung ausgesetzt. 11 Einleitung Gerade das sich entwickelnde Gehirn ist besonders anfällig für Krampfanfälle. In der neonatalen und frühkindlichen Periode können Krampfanfälle durch schwerwiegende Gründe verursacht werden, welche zu altersspezifischen epileptischen Enzephalopathien führen. Bei der frühkindlichen epileptischen Enzephalopathie – early infantile epileptic encephalopathy (EIEE) – handelt es sich um eine progrediente neurologische Erkrankung, welche sich in kognitiver und motorischer Einschränkung äußert und häufig mit schwerer geistiger Behinderung einhergeht (Asher und Scaglia, 2012). Die frühkindlichen epileptischen Enzephalopathien sind eine Gruppe von Erkrankungen, welche auch als altersabhängige Enzephalopathien beschrieben werden. Sie beginnen innerhalb der ersten Wochen bis Monate des Lebens (frühkindlich – infantile) mit therapieresistenten Krampfanfällen, zeichnen sich durch wiederkehrende spontan auftretende Krampfanfälle (Epilepsie) und führen zu tiefgreifenden Entwicklungsverzögerungen und geistiger Behinderung (Enzephalopathie), da wichtige Meilensteine der Entwicklung des Gehirns nicht erreicht werden können (Zupanc, 2009). Die EIEE ist eine seltene Epilepsieform, die aus therapieresistenten Krampfanfällen, tonischen Spasmen oder häufiger partiellen Anfällen und einem spezifischen Muster im Elektroenzephalogramm (EEG), welches in den ersten Lebensmonaten auftritt, besteht (Asher und Scaglia, 2012). Sie stellt den gemeinsamen Endweg einer heterogenen Gruppe von genetischen, metabolischen oder strukturell bedingten Erkrankungen dar. Im Säuglingsalter treten vor allem sogenannte Blitz-Nick-Salaam-Krämpfe (BNSKrämpfe), die auch infantile Spasmen genannt werden, auf. Dabei kommt es zu blitzartigen, unwillkürlichen Muskelzuckungen (Myoklonien) mit Hochreißen der Arme, Nickbewegungen des Kopfes und dem orientalischem Salaam-Gruß ähnelnden tonischen Anfällen. Die Spasmen können von autonomen oder fokalen Aspekten wie Atempausen und Blickdeviation begleitet sein. Im EEG kann sich eine sogenannte Hypsarrhythmie zeigen, die aus diffusen gemischten Krampfpotentialen besteht. Die Kombination von BNS-Krämpfen und einer Hypsarrhythmie im EEG wird als WestSyndrom bezeichnet. 60% der Kinder mit persistierenden BNS-Krämpfen entwickeln im Alter von etwa 3-12 Monaten das sogenannte Lennox-Gastaut-Syndrom, das sich durch tonische oder atonische Krampfanfälle und ein zunehmend synchrones EEG mit generalisierten „slow-spikes“ und „slow-waves“ bei 1,5-2 Hz auszeichnet. Viele Patienten mit einer im frühen Kindesalter beginnenden Epilepsie zeigen Rückstände in der geistigen und motorischen Entwicklung. Eine persistierende Enzephalopathie beeinflusst die Ausbildung der neuronalen Netzwerke in hohem Maße 12 Einleitung und abnorme Synaptogenese und eine ungünstige Entwicklung sind meist die Folgen. Das klinische Bild kann mit einem Wachstumsstillstand des Gehirns, welches zu Mikrozephalie und Hirnatrophie führt, einhergehen. (Zupanc, 2009). 1.2. Mentale Retardierung Mentale Retardierung wird generell als eine Behinderung definiert, die durch signifikante Einschränkungen der intellektuellen Funktionen und des adaptiven Verhaltens mit Beginn vor dem 18.Lebensjahr und einem Intelligenzquotienten von 70 oder weniger gekennzeichnet ist (American Psychiatric Association, 1994; Schalock et al., 2010; Salvador-Carulla et al., 2011). Milde Formen der mentalen Retardierung, bei einem Intelligenzquotienten (IQ) von 50 bis 70, werden von moderater (IQ <50) und schwerer (IQ < 35) mentaler Retardierung abgegrenzt. In den industrialisierten Nationen liegt die Prävalenz bei etwa 2% und ist einer der häufigsten Gründe für humangenetische Beratungen (Ropers, 2006). Im englischen Sprachgebrauch wurde der Begriff der mentalen Retardierung weitgehend durch intellectual disability ersetzt. Im deutschen Sprachgebrauch hat sich allerdings bislang keine äquivalent zu gebrauchende Neuerung durchgesetzt. Konventionell wird mentale Retardierung (MR) in syndromale und nicht-syndromale MR unterteilt. Syndromale MR wird dadurch charakterisiert, dass neben der geistigen Behinderung weitere Veränderungen wie Dysmorphien oder Fehlbildungen vorliegen. Bei nicht-syndromalen Formen der mentalen Retardierung sind kognitive Einschränkungen die einzige Manifestation (Chelly et al., 2006). Mentale Retardierung ist beim männlichen Geschlecht häufiger als beim weiblichen Geschlecht, was mit der X-chromosomalen Vererbung von Gendefekten, die eine wichtige Rolle in der Ätiologie von geistiger Behinderung spielen, in Verbindung gebracht wird. Sowohl eine Epilepsie als auch mentale Retardierung können isoliert oder im Rahmen eines übergeordneten Krankheitsbildes auftreten. Bei einem Teil der Patienten mit Epilepsie, mentaler Retardierung und eventuell zusätzlichen Auffälligkeiten wie Mikrozephalie, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und Bewegungsstörungen wurde die genetische Ursache identifiziert. Dazu gehören unter anderen das Angelman-Syndrom, welches zum ersten Mal 1965 von Harry Angelman beschrieben wurde (Angelman, 1965) und das erstmalig von Andreas Rett 1966 beschriebene Rett-Syndrom (Rett, 1966). 13 Einleitung 1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie 1.3.1. Das Angelman-Syndrom Das Angelman-Syndrom ist ein neurogenetisches Syndrom, welches sich durch eine schwere geistige Behinderung, ein schweres Sprachdefizit, Phasen mit unangemessenem Lachen, eine Skoliose, eine Ataxie, erworbene Mikrozephalie und eine Epilepsie auszeichnet (Clayton-Smith und Laan, 2003, Williams, 2005). Bei Patienten mit dem Angelman-Syndrom verlaufen die pränatale Entwicklung und Geburt normal, bei Neugeborenen und Kleinkindern können jedoch Schwierigkeiten bei der Nahrungsaufnahme auftreten. Meist wird im Alter von 6-12 Monaten eine Entwicklungsverzögerung offensichtlich, wenn ein reduzierter Muskeltonus, eine Rumpfataxie und häufiges Lächeln auftreten (Fiumura et al., 2010). Die Entwicklung schreitet nur verzögert fort, jedoch ohne den Verlust erworbener Fähigkeiten. Weitere Kriterien für die Diagnose des Angelman-Syndroms umfassen eine schwere mentale Retardierung, und Verhaltensauffälligkeiten wie Schlafstörungen (Bruni et al., 2004, Dagli et al., 2011). Im Schädel-MRT oder Schädel-CT können eine milde kortikale Atrophie und Myelinisierungsdefizite auffallen. Die Diagnose wird häufig erst nach mehreren Wiedervorstellungen beim Neuropädiater gestellt, da typische klinische Merkmale wie Krampfanfälle oder ruckartige Bewegungen sich erst im Verlauf einstellen. Das EEG ist bei Patienten mit Angelman-Syndrom besonders charakteristisch und für die Diagnosestellung hilfreich (Williams, 2005). Das für das Krankheitsbild verantwortliche UBE3A-Gen liegt auf dem Chromosom 15 im Bereich 15q11-q13 und kodiert für das zelluläre Ubiquitin-Ligase-Enzym. Es gibt vier genetische Mechanismen (maternale Deletion, paternale uniparentale Disomie 15q11q12, Imprinting-Defekte und Mutationen im UBE3A-Gen), die alle mit der Expression des UBE3A-Gens interferieren und für das Angelman-Syndrom ursächlich sind (Kishino et al.,1997; Matsuura et al., 1997). Bei 10-15% der Individuen mit der klinischen Diagnose Angelman-Syndrom kann die molekulare Ursache nicht identifiziert werden (Williams, 2005). 1.3.2. Das Rett-Syndrom Das Rett-Syndrom ist eine X-chromosomal dominant vererbte gravierende Entwicklungsstörung, die mit Epilepsie und mentaler Retardierung einhergeht und erstmals 1966 von Andreas Rett beschrieben wurde (Rett, 1966). Etwa 1 von 10 000 Mädchen und wahrscheinlich 1 von 100 000 lebend geborenen Jungen sind betroffen (Kerr und Stephonson, 1986; Kozinetz et al., 1993; Hagberg und Hagberg, 1997). 14 Einleitung Hierbei zeigen sich dem Angelman-Syndrom ähnliche Symptome wie Ataxie, eine erworbene Mikrozephalie, häufiges Lachen, eine fehlende Sprache, Skoliose sowie Krampfanfälle mit pathologischem EEG-Muster (Noh et al., 2012). Mutationen im MECP2-Gen, welches für das Methyl-CpG binding protein-2 kodiert, wurden bei Rett-Patienten erstmals 1999 erwähnt (Amir et al., 1999). Bis zu 95% der Patienten mit klassischem Rett-Syndrom haben eine Mutation im MECP2-Gen, welche normalerweise de novo auftritt. Beim atypischen Rett-Syndrom finden sich hingegen nur bei 40-60% der Patienten MECP2-Veränderungen (Glaze et al., 2010,Armani et al., 2012). Studien konnten zeigen, dass der Großteil der Mutationen im MECP2-Gen auf dem väterlichen X-Chromosom entsteht. Ob ein Zusammenhang mit dem väterlichen Alter besteht, ist bislang nicht geklärt (Zhu et al., 2010, Ravn et al., 2011). In vielen Fällen, in denen keine Veränderung im MECP2-Gen dem beschriebenen Krankheitsbild zugrunde liegt, ist die Ursache für die Erkrankung unklar. Die Kleinkinder, fast ausschließlich Mädchen, entwickeln sich bis zum 6.-18. Lebensmonat scheinbar normal. Auf eine Phase, in der die Entwicklung stagniert, folgen Rückschritte mit Verlust erworbener Fähigkeiten wie der expressiven Sprache und motorischer Fertigkeiten. Zusätzlich entwickeln die Patienten stereotype Handbewegungen, eine Mikrozephalie, Epilepsie, Autismus, intermittierende Hypo- und auch Hyperventilationsepisoden sowie Lernschwierigkeiten und Gangstörungen (Kerr und Stephonson, 1986). Jungen mit einer Mutation im MECP2-Gen können den Phänotyp des Rett-Syndroms wie Mädchen (bei einem Karyotyp 47,XXY oder somatischen Mosaik für die MECP2-Mutation) haben, einen Verlauf mit einer schweren Enzephalopathie und Tod im Kindesalter haben oder weniger schwere Manifestationen mit vorwiegend psychiatrischen Auffälligkeiten wie bipolare Störungen oder Schizophrenie zeigen. Bei der dritten Gruppe werden Mutationen beschrieben, die nicht bei Mädchen gefunden wurden. Es handelt sich um Mutationen, die bei Heterozygoten wahrscheinlich sehr milde Auswirkungen haben (Moretti und Zoghbi, 2006). Bei der Epilepsie bei Patienten mit Rett-Syndrom handelt es sich meist um generalisiert tonisch-klonische und partiell-komplexe Anfälle, andere Anfallstypen wie fokal tonische Anfälle wurden jedoch ebenfalls beobachtet (Zhu et al., 2010). Die Krampfanfälle variieren je nach Mutation und sind mit dem klinischen Schweregrad des Erscheinungsbildes assoziiert (Glaze et al., 2010). 1.4. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen In den vergangenen Jahren wurden weitere Gene identifiziert, deren Veränderungen zu einer Epilepsie mit mentaler Retardierung führen und daher eine wichtige 15 Einleitung Differentialdiagnose zu den Krankheitsbildern Angelman-Syndrom und Rett-Syndrom darstellen. Zu diesen Genen gehören die Gene CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6. 1.4.1. Das CDKL5-Gen Das CDKL5-Gen ist in der Chromosomenregion Xp22 lokalisiert und besteht aus 23 Exons, von denen die ersten drei Exons nicht kodierend sind (Kalscheuer et al., 2003). Es kodiert für das cdkl5-Protein (cyclin-dependent kinase like 5). Die genaue Funktion dieses Proteins ist bis heute weitgehend unklar, allerdings wird eine Interaktion mit dem MECP2-Gen beschrieben. (Carouge et al., 2010). De novo aufgetretene Mutationen und Deletionen im X-chromosomal vererbten CDKL5Gen wurden in den letzten Jahren bei etwa 80 Patienten im Zusammenhang mit dem atypischen Rett-Syndrom beschrieben. (Rademacher et al., 2011)Einige Mutationen wurden mehrfach beschrieben (Castrén et al., 2011). Bislang wurde keine Korrelation zwischen dem Ort der Mutation und der Schwere des Krankheitsbildes identifiziert (Mei et al., 2010). Beide Geschlechter können von Veränderungen im CDKL5-Gen betroffen sein (Elia et al., 2008, Fichou et al., 2009; Sartori et al., 2009). Die Symptomatik und der Schweregrad der Erkrankung ist bei Jungen und Mädchen identisch (Van Esch et al., 2007; Erez et al., 2009; Liang et al., 2011). Etwa 5% der männlichen Patienten und 14% der weiblichen Patienten mit epileptischer Enzephalopathie einer Untersuchung von Liang et al. trugen pathogene CDKL5-Veränderungen (Liang et al., 2011). Diese Veränderungen gelten als Ursache für eine früh beginnende therapieresistente Epilepsie mit BNS-Krämpfen, tonischen und tonisch-klonischen generalisierten Anfällen, Mikrozephalie, einer schweren psychomotorischen Entwicklungsverzögerung und Bewegungsstörungen (Melani et al., 2011). Im Vergleich zum klassischen Rett-Syndrom manifestiert sich die Epilepsie bei Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen bereits im Alter von 2-3 Monaten meist in Form von BNS-Krämpfen, die sich schließlich zu einer therapieresistenten oder schwer behandelbaren Epilepsie entwickeln (Tao et al., 2004; Erez et al., 2009). In der Zusammenschau der Literatur scheint es kein spezifisches EEG-Muster, das mit Veränderungen im CDKL5-Gen assoziiert ist, zu geben (Buoni et al., 2006; Archer et al., 2006; Pintaudi et al., 2008). Im kranialen CT bzw. MRT finden sich kortikale Atrophie kombiniert mit hyperintensen Arealen der weißen Substanz im Temporallappen, die mit Myelinisierungsstörungen zu vereinbaren sind (Bahi-Buisson et al., 2008a). Liang et al. beschreiben eine milde Frontallappenatrophie (Liang et al., 2011). 16 Einleitung 1.4.2. Das ARX-Gen Das ARX-Gen kodiert für das Aristaless-related-homeobox-Protein. Der Transkriptionsfaktor nimmt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, speziell in der Entwicklung des zentralen Nervensystems bei Proliferation und Differenzierung von Interneuronen ein (Bienvenu et al., 2002, Kitamura et al., 2002). Es ist auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.13) lokalisiert und besteht aus fünf kodierenden Exons (Strømme et al., 2002). Das arx-Protein setzt sich aus der Homeobox-Domäne sowie der Aristaless-Domäne zusammen und enthält vier Polyalanin-Abschnitte. Die am häufigsten identifizierte Mutation ist eine 24bp-Duplikation im Exon 2 und führt zu einer Verlängerung des zweiten Polyalanin-Abschnitts (Kitamura et al., 2002, Suri, 2005). Die Mutationen oder Deletionen treten familiär aber auch sporadisch auf. Gécz et al. postulierten 2006, dass das eine Veränderung im ARX-Gen bei 9,5% der Patienten mit X-chromosomaler mentaler Retardierung vorliege (Gécz et al., 2006). Seit 2002 wurden zumindest zehn Formen von Entwicklungsstörungen im Zusammenhang mit Mutationen im ARX-Gen beschrieben, die eine beeindruckende Vielfalt des klinischen Erscheinungsbildes demonstrieren (Sherr, 2003, Gécz et al., 2006, Shoubridge et al., 2010). Die intra- und interfamiliäre Pleiotropie sowie die genetische Heterogenität sind ein Kennzeichen für ARX-Mutationen (Shoubridge et al., 2010). Der Erbgang ist je nach Mutationsschweregrad X-chromosomal dominant oder X-chromosomal rezessiv. Weibliche Trägerinnen der Mutationen sind vermutlich meist phänotypisch unauffällig, in seltenen Fällen zeigen sie ein variables Erscheinungsbild mit mentaler Retardierung, Epilepsie und Agenesie des Corpus Callosum sowie Hyperreflexie (Scheffer et al., 2002, Marsh et al., 2009). Bei den männlichen Betroffenen variiert das Erscheinungsbild und wird im Folgenden beschrieben. Große Deletionen, Mutationen, die zum Abbruch des Proteins führen, und „missense“Mutationen in der Homeobox-Domäne verursachen die schwersten Phänotypen. Dazu gehören Lissenzephalie mit abnormen Genitalien (X-linked lissencephaly with absent corpus callosum and ambiguous genitalia - XLAG) (Kitamura et al., 2002), XLAG mit Hydrozephalus und das Proud-Syndrom. Letzteres umfasst schwere mentale Retardierung, eine therapieresistente Epilepsie, abnorme Genitalien sowie Agenesie des Corpus callosum (Proud et al., 1992; Suri, 2005, Conti et al., 2011). Andere Veränderungen im ARX-Gen führen zu Phänotypen wie das West-Syndrom, welches aus BNS-Krämpfen, mentaler Retardierung und Hypsarrhythmie im EEG besteht (Strømme et al., 2002) sowie mentale Retardierung, tonische Anfälle und Dystonie ohne BNS-Krämpfe und das Ohtahara-Syndrom (frühkindliche epileptische Enzephalopathie). Weiterhin ist das ARX-Gen ursächlich für das Partington-Syndrom. 17 Einleitung Die klinischen Zeichen des Partington-Syndroms umfassen mentale Retardierung, milde fokale Dystonien (meist der Hände) und eine Dysarthrie (Partington et al., 1988; Turner et al., 2002). 1.4.3. Das SLC9A6-Gen Das SLC9A6-Gen (Sodium Like Channel 9A6-Gen) besteht aus 16 Exons und ist auf dem X-Chromosom im Bereich Xq26.3 lokalisiert. Das Gen kodiert für den mitochondrialen Natrium-Wasserstoff-Ionentransporter NHE6, der unter anderem an der Regulation des intrazellulären pH-Wertes beteiligt ist (Numata et al., 1998). Mutationen im SLC9A6-Gen werden X-chromosomal vererbt und sind für das Christianson-Syndrom und das X-chromosomale „Angelman-ähnliche-Syndrom“ verantwortlich. Über die Häufigkeit von Mutationen im SLC9A6-Gen gibt es bislang keine genauen Daten. Erstmals wurden Veränderungen im SLC9A6-Gen bei männlichen Patienten mit geistiger Behinderung, Mikrozephalie, Epilepsie, Ataxie und Verhaltensauffälligkeiten, die an das Angelman-Syndrom erinnerten, beschrieben (Gilfillan et al., 2008). Mittlerweile wurden einige Familien mit männlichen Betroffenen aus mehreren Generationen beschrieben (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008, Garbern et al., 2010). Seitdem haben sich drei unterschiedliche klinische Erscheinungsbilder abgezeichnet (Strømme et al., 2011): Die häufigste Manifestationsform scheint ein Xchromosomales an das Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild zu sein. Die zweite Form, auch als das Christianson-Syndrom bekannt, ist ebenfalls eine an das Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild (Christianson et al., 1999). Christianson beschreibt bei den Patienten kraniofaziale Dysmorphiezeichen wie ein langes schmales Gesicht mit einer langen Nase und eine Prognathie. Häufig wird über eingeschränkte Augenbeweglichkeit berichtet, wobei vor allem Störungen der lateralen und vertikalen Bewegungen vorliegen (Christianson et al., 1999). Hier zeigt sich bei älteren Patienten ein etwas abweichender Phänotyp (Gilfillan et al., 2008, Schroer et al., 2010). Bei dem dritten Phänotyp liegen eine kortikobasale Degeneration sowie Ablagerungen von TauProteinen einhergehend mit schwerer geistiger Behinderung und autistischem Verhalten vor (Garbern et al., 2010). Das klinische Erscheinungsbild der männlichen Betroffenen umfasst eine sekundäre Mikrozephalie, Kleinwuchs, eine globale psychomotorische Entwicklungsretardierung mit Ataxie einhergehend mit Muskelhypotonie und fehlender Sprachentwicklung (Gilfillan et al., 2008). Die Patienten zeigen eine fröhliche Grundstimmung mit Lachanfällen und häufigem spontanen Händeklatschen. 18 Einleitung Die meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie beginnt im zweiten Lebensjahr und besteht aus tonisch-klonischen Anfällen und Absencen. Mit Verschlechterung der Anfallssituation verlieren viele der Patienten bereits erworbene Fähigkeiten. Bei weiblichen Trägerinnen einer Veränderung im SLC9A6-Gen zeigen sich Verhaltensauffälligkeiten und Lernschwierigkeiten. Im cMRT finden sich eine fokale Atrophie sowie eine Hypoplasie des Vermis im Kleinhirn und im weiteren Verlauf eine progressive Kleinhirnatrophie (Gilfillan et al., 2008; Schroer et al., 2010). 1.4.4. Das TCF4-Gen Das TCF4-Gen (Transcription Factor 4-Gen) ist auf Chromosom 18 im Bereich 18q21 lokalisiert und kodiert für den basis helix-loop-helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor 4. Das Gen besteht aus 20 Exons. Erstmals wurde das Pitt-Hopkins-Syndrom 1978 bei zwei nicht verwandten Patienten mit geistiger Behinderung, einem breiten Mund und Hyperventilationsepisoden beschrieben (Pitt und Hopkins, 1978). 2007 wurde die Haploinsuffizienz des TCF4Gens als eine Ursache für das Pitt-Hopkins-Syndrom erwähnt (Amiel et al., 2007; Brockschmidt et al., 2007, Zweier et al., 2007). Die Erkrankung wird autosomal dominant vererbt und beide Geschlechter können gleichermaßen betroffen sein. Die bisher bekannten Fälle traten sporadisch auf und wurden durch de novo-Mutationen verursacht (Amiel et al., 2007). Klinisch ähnelt das Pitt-Hopkins-Syndrom dem Angelman-Syndrom und dem Rett-Syndrom hinsichtlich des Verhaltens, der Schlafstörungen und der fröhlichen Grundstimmung (Takano et al., 2010). Patienten mit Pitt-Hopkins-Syndrom zeigen eine schwere psychomotorische Retardierung mit fehlender Sprachentwicklung sowie charakteristische Gesichtszüge. Sie haben ein grob wirkendes Gesicht mit tief liegenden Augen, einen breiten Nasenrücken mit gebogener Nasenspitze, einen breiten Mund mit bogenförmiger Oberlippe, weit auseinanderstehende Zähne und eine Prognathie. Die Ohren sind oft antevertiert und dysplastisch. Mit steigendem Alter vergröbern die Gesichtszüge zunehmend (Zweier et al., 2009). Die Patienten entwickeln in der späten Kindheit Hyperventilationsepisoden mit darauf folgenden Apnoen, die mit Zyanose einhergehen können (Zweier et al., 2007). Zudem wurden bei einigen Patienten eine Epilepsie, eine sekundäre Mikrozephalie und Wachstumsrückstand hypoplastisches beschrieben. Corpus Im Callosum, MRT wurden auffällig in manchen gebogene Nuclei Fällen ein Caudati, Ventrikelasymmetrien und Atrophie des frontalen bzw. parietalen Cortex beschrieben. 19 Einleitung Muskelhypotonie und Obstipationsneigung sind ebenfalls zu finden (Zweier et al., 2009). Zusätzlich wurden Muskelhypotonie, gastrointestinale Komplikationen und eine fröhliche Grundstimmung mit Lachanfällen beschrieben (Peippo et al., 2006). Zum Zeitpunkt des Beginns der Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurde davon ausgegangen, dass das Pitt-Hopkins-Syndrom aufgrund der schweren mentalen Retardierung, der Epilepsie und der Hyperventilationsepisoden eine wichtige Differentialdiagnose zum Angelman- sowie zum Rett-Syndrom darstellte. Whalen et al., definierten 2012 den Phänotyp des durch Veränderungen im TCF4-Gen verursachte Pitt-Hopkins-Syndroms präziser mittels einer Analyse aller bisher in der Literatur beschriebenen Patienten (79) und 33 neuer Patienten mit einer Veränderung im TCF4-Gen. Demnach sind die wichtigsten Merkmale die bereits beschriebenen charakteristischen Gesichtszüge, eine schwere motorische Entwicklungsverzögerung, eine fehlende Sprache sowie stereotype Handbewegungen. Seltener sind Hyperventilation, Angst oder Agitation, Hypotonie, Lächeln, ein ataktisches Gangbild und Strabismus (Whalen et al., 2012). 1.5. Aufgaben und Zielsetzung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Vorkommen von genetischen Veränderungen in den Genen TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX bei Patienten mit unterschiedlichen Formen von Epilepsie und mentaler Retardierung in einer Gruppe von 34 Patienten zu untersuchen. Mutationen in diesen Genen führen häufig zu Phänotypen, die eine häufige Differentialdiagnose zum Rett-Syndrom und AngelmanSyndrom bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung darstellen. Zunächst etablierte ich die Bedingungen für PCR und Sequenzierung des TCF4-Gens für den diagnostischen Gebrauch. In einem zweiten Schritt sollten Patienten mit Veränderungen in den genannten Genen klinisch näher charakterisiert werden. Die Ergebnisse sollten zur Systematisierung und zum besseren Verständnis des jeweiligen Krankheitsbildes beitragen. Nach der Auswertung der klinischen Daten, MRT-Untersuchungen, EEG- Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen Anamnese wurde festgelegt, in welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine Mutationsanalyse der Gene TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX durchgeführt wird. Dazu verwendete ich die von Sequenzierungsbedingungen mir für das sowie die TCF4-Gen im entwickelten Institut bereits PCR- und etablierten Untersuchungsmethoden für die Gene CDKL5, SLC9A6 und ARX. 20 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1. Patienten Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Kohorte setzt sich aus 34 Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung ohne bislang bekannte genetische Ursache zusammen. Wir rekrutierten die Patienten über eine Anfrage an Sozialpädiatrische Zentren, Epilepsiezentren und Neuropädiater in ganz Deutschland. Es wurden Patienten mit einer Epilepsie und mentaler Retardierung gesucht, bei denen das Angelman-Syndrom und das Rett-Syndrom ausgeschlossen worden war. Die Art der Epilepsie war nicht näher eingeschränkt. Die Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz Deutschland, sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Sie wurden entweder im Institut für Humangenetik der Universität zu Lübeck oder in den zuweisenden Ambulanzen vorgestellt, durch die behandelnden Ärzte evaluiert und dieser Studie zugewiesen. Die Sorgeberechtigten der Patientinnen und Patienten wurden ausführlich aufgeklärt und ein schriftliches Einverständnis wurde eingeholt (siehe 7.1 und 7.2). Der Fragebogen diente der Systematisierung der klinischen Informationen über die Patienten (siehe 7.3) und wurde von den betreuenden Ärzten ausgefüllt. Die Informationen umfassen unter anderem Angaben zu Art und Beginn der Epilepsie, EEG-Muster, das Vorhandensein morphologischer Veränderungen im Gehirn, klinische Symptome wie Hyperventilationszustände, Atemwegsinfektionen, gastroösophagealer Bewegungsstörungen und weitere Reflux, häufige Auffälligkeiten oder Fehlbildungen. Nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEG- Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen Anamnese wurde entschieden, bei welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine Mutationsanalyse durchgeführt wird. Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009 genehmigt (Aktenzeichen 09-079). 21 Material und Methoden 2.1.2. Geräte BioDocAnalyze Geldokumentationssystem Biometra, Göttingen Biometra T Gradient Cycler Biometra, Göttingen Biophotometer 6131 Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5414 C, 5804 Eppendorf, Hamburg Discovery Autoclavable Pipetten (0,5-1µl, 2-2µl, 20-200µl, 100-1000µl) ABIMED Labortechnik, Langenfeld Elektronische Waage IP 65 Sartorius AG, Göttingen 0,5-10µl Finnpipetten 4510 Thermo Fisher Scientific, München Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia Biotech, Freiburg HE 99x submarine electrophoresis unit Amersham Biosciences, Schweiz 3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA 3130xl Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA Mastercycler PE 9600 Eppendorf, Hamburg Mikrowellengerät Micro 700 Hitachi, Japan Multipette Stream Eppendorf, Hamburg Oberflächenheizplatte IKA Combing RCT IKA Labortechnik, Staufen 2700 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA 2720 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA UV-Strahler Chroma 43 Vetter GmbH, Wiesloch Vortexschüttler MS 2 Minishaker IKA Labortechnik, Staufen 2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme Agarose (Pulver) StarLab, Ahrensburg Aqua destillata Merck, Darmstadt Borsäure Merck,Darmstadt DMSO (Dimethylsulfoxid) Roche, Penzberg Ethidiumbromid (10mg/ml) Merck, Darmstadt Ficoll 400 Pharmacia Biotech, Freiburg GC Rich PCR System Roche, Mannheim HiDi™ Formamide Applied Biosystems, USA HPLC Wasser Merck, Darmstadt Illustra™ Sephadex™ G-50 GE Healthcare, München Low DNA Mass Ladder Invitrogen, USA MP Taq Core Kits 10 MP Biomedicals, Eschwege SALSA MLPA Kits P075-A1, P189-B1 MLPA Holland, Niederlande TaqPolymerase 5U/µl Roche, Penzberg 22 Material und Methoden Titriplex III (EDTA) Merck, Darmstadt Tris MP Biomedicals, Eschwege Xylencyanol Serva, Heidelberg 2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen 3x Ficoll-Probenpuffer 145 μM Bromphenolblau 186 μM Xylencyanol 15 % (w/v) Ficoll 400 1x TBE-Puffer 36gTris 18,3g Borsäure 2,47g Titriplex III auf 4 l aqua dest. 2%ige Agarosegel-Lösung 100 ml 1xTBE-Puffer 2g Agarosepulver 5µl Ethidiumbromid 2.5x TerminatorMix 1.1 Applied Biosystems, USA 5x Sequenzierpuffer Applied Biosystems, USA 2.1.5. Verbrauchsmaterial Acetate Folie für Microtest Well Plates Sarstedt, Nümbrecht Combitips Plus (0,1ml, 0,5ml) Eppendorf, Hamburg Domed 8 Cap Strips Thermo Scientific, UK Finntip Pipettenspitzen (0,5-10µl) Thermo Scientific, UK Multiply®µ Strip Pro 8er Kette Sarstedt, Nümbrecht 96-Well PCR Plate nonskirted 0,2ml Thermo Scientific, UK Multiscreen 96-Well Plates Millipore, Irland Micro Amp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode Applied Biosystems, USA Multitest Plate 96-Well Vee Bottom Sarstedt, USA MultiScreen Filter Plates Millipore, Irland Pipettenspitzen Finntip 10-300µl Thermo Scientific, UK Pipettenspitzen (-2µl) Pipettenspitzen (2-200µl) Fisher Scientific, Schwerte Sarstedt, Nümbrecht Pipettenspitzen (200-400µl) Sarstedt, Nümbrecht 23 Material und Methoden Pipettenspitzen (-2µl) Eppendorf, Hamburg Tubes (- 0,5, - 1,5, - 2ml) Sarstedt, Nümbrecht 2.1.6. DNA-Proben Die DNA der 34 Patienten wurde teilweise im Institut für Humangenetik der Universität Lübeck sowie teilweise in den einsendenden Laboren aus Blutproben extrahiert. Die Kontroll-DNA-Proben stammen aus dem Institut für Humangenetik der Universität Lübeck. 2.1.7. Computersoftware 3100 Avant Data Collection 2.0 Applied Biosystems, USA Gene Mapper 3.5 Applied Biosystems, USA Microsoft Word 2010 Microsoft Microsoft Excel 2010 Microsoft SequencePilot Module MLPA 3.3 JSI Medical Systems SeqScape 2.5 Applied Biosystems, USA Sequencing Analysis 5.2 Applied Biosystems, USA Seqworks 1.03 beta Sven Opitz 2.1.8. Internetressourcen Ensembl www.ensembl.org GeneReviews www.genetests.org Human Genome Browser Gateway genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgGateway MRC Holland www.mrc-holland.com Mutation T@ster www.mutationtaster.org National Center for Biotechnology Information (NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ Datenbank der EinzelnukleotidPolymorphismen dbSNP www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP NCBI Map Viewer www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview Oligonucleotide Properties Calculator www.basic.northwestern.edu/ biotools/oligocalc.html Datenbank der Publikationen www.pubmed.com 24 Material und Methoden 2.2. Methoden Die im Folgenden beschriebenen Methoden wandte ich im Rahmen dieser Arbeit im Labor an. Zunächst soll auf gängige molekulargenetische Methoden eingegangen werden, um danach die Etablierung der PCR für das TCF4-Gen zu beschreiben. 2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction- PCR) ist eine von Kary Mullis entwickelte Methode, welche dazu dient, sehr kleine Mengen spezifischer DNAFragmente in vitro exponentiell zu amplifizieren (Mullis et al., 1986). Der Ablauf einer PCR setzt sich üblicherweise aus den Schritten Denaturierung, Annealing (Anlagerung der Primer) und Elongation bei drei unterschiedlichen Temperaturstufen zusammen. Dazu werden eine geringe Menge der zu vervielfältigenden DNA (Template-DNA), zwei einzelsträngige aus etwa 20 Basen bestehende Oligonukleotid-Primer, freie Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) sowie eine hitzestabile DNA-Polymerase benötigt. Die gesamte Reaktion findet in einem vollautomatisierten ThermoCycler statt. Zunächst wird die genomische DNA durch Erhöhung der Temperatur auf 95°C in ihre zwei Einzelstränge aufgetrennt (Denaturierung). Da die DNA zu Beginn der Denaturierung noch in ihrer komplexen, hochmolekularen Struktur vorliegt, ist für den initialen Schritt eine Zeit von fünf Minuten notwendig, damit auch GC-reiche Regionen aufgetrennt werden. Daraufhin erfolgt die Anlagerung der Primer an die ihnen komplementären DNAEinzelstränge. Bei den Primern handelt es sich um synthetisch hergestellte Oligonukleotide aus etwa 20 Nukleotiden. Der Vorwärts-(F-)Primer und der Rückwärts(R-)Primer flankieren das zu vervielfältigende DNA-Fragment, wobei der F-Primer am „sense“-Strang und der R-Primer am „antisense“-Strang bindet. Bei der Auswahl der Primer gilt es einige Dinge zu beachten: Ihre Länge sollte bei etwa 20 Nukleotiden liegen, sie sollten einen ausgeglichenen A/T- und G/C- Gehalt aufweisen und die Schmelztemperatur eines F-und R-Primerpaares sollte nicht weiter als 5-10°C auseinander liegen. Außerdem sollten „ungewöhnliche“ Basenfolgen wie polyASequenzen, polyT-Sequenzen und G/C-reiche Primer vermieden werden. Für das Annealing wird die Temperatur im ThermoCycler auf die durch die Zusammensetzung der Primer bestimmte Annealingtemperatur heruntergekühlt. Sie liegt in der Regel um 55°C und damit knapp unter der errechneten Schmelztemperatur der Oligonukleotide. Beim Annealing entsteht ein kurzer Abschnitt doppelsträngiger DNA mit einem freien 3„-OH-Ende, was entsprechend verlängert werden kann. 25 Material und Methoden Im dritten Schritt beginnt das hier verwendete Enzym Taq-Polymerase bei seinem Aktivitätsoptimum von 72°C mit der Synthese von zwei komplementären DNA-Strängen in 3„-Richtung (Elongation). Hierbei erkennt die Taq-Polymerase den Primer-DNAKomplex und synthetisiert den Gegenstrang ausgehend vom freien 3„-OH-Ende aus den im Reaktionsansatz vorliegenden freien Nukleotiden (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in 5„3„-Richtung. Die Desoxribonukleosidtriphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTP sollten hierbei in einem äquimolaren Verhältnis vorliegen. Eine Pufferlösung sorgt für eine adäquate Reaktionsumgebung. Die Elongationsdauer beträgt für 1000 Basenpaare etwa 60 Sekunden und hängt von der verwendeten DNA-Polymerase ab. Die Taq-DNA-Polymerase stammt aus dem thermophilen Bakterium Thermicus aquaticus und wird auch bei Temperaturen bis 95°C nicht denaturiert oder inaktiviert. Die hier verwendete rekombinante, HPLC-gereinigte Taq-DNA-Polymerase besitzt neben der 5„3„-DNA-Polymeraseaktivität eine 5„3„Exonukleasenaktivität, jedoch keine 3„5„ Exonukleaseaktivität. Die Fehlerrate des Enzyms liegt mit einem Fehler bei 106 synthetisierten Basen relativ hoch, was in der fehlenden 3„5„ Exonukleaseaktivität und damit der fehlenden postsynthetischen Kontrolle (proof-reading-Mechanismus) begründet ist. Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Elongation wird üblicherweise 30-35 Mal wiederholt. Dabei nimmt die amplifizierte DNA-Menge exponentiell zu. Nach Beendigung des letzten Zyklus findet eine 7-minütige sogenannte Endelongation statt, während der bis dahin eventuell unvollständige Produkte komplettiert werden. Bei einem Großteil der PCR-Anwendungen liegt nach 30 Zyklen genügend Produkt für die nachfolgenden Analyseschritte vor. Da es sich bei der PCR um eine extrem empfindliche und für Kontamination anfällige Methode handelt, ist es von äußerster Bedeutung, schon in diesem Schritt einen Kontrollansatz (Negativprobe), der keine DNA enthält, mitzuführen. Die PCR-Bedingungen für das Exon 1 des SLC9A6-Gens sind exemplarisch in Tabelle 1 und 2 gezeigt. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Exons des SLC9A6-Gens sowie für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind dem Anhang zu entnehmen. 26 Material und Methoden Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens Konzentration DNA Hersteller Volumen (in µl) 50 ng/µl a.d. (HPLC) 1,5 Merck 13,25 Puffer 5x Roche 5 dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 5M Roche 2,5 F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 5 U/µl Roche 0,25 GC-rich Resolution Taq-Polymerase Ansatzvolumen 25 Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6Gens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 95°C 5 Min Denaturierung 95°C 30 Sek. Annealing 60°C 30 Sek. Elongation 72°C 1 Min. Elongation 72°C 20 Min. 30 Zyklen Durchführung der PCR: Die den Tabellen (s.o. sowie im Anhang) zu entnehmenden Reaktionsansätze wurden in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben. Dabei wurde die DNA vorgelegt und anschließend wurde der Mix aus Primern, 10xPuffer, dNTPs und Taq-Polymerase darauf pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde mit Deckelstrips verschlossen, in den vorgeheizten ThermoCycler gestellt und das gewünschte PCR-Programm verwendet. Die PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurden im Rahmen der Laborarbeit für diese Dissertation etabliert. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Gene waren bereits etabliert und konnten weitestgehend übernommen werden. 2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, DNAFragmente einer Größenordnung von 0,5-25 kb voneinander zu trennen und zu identifizieren. Die DNA wandert infolge der negativen Ladung ihrer Phosphatgruppen im elektrischen Feld zur Anode. Aufgrund der Siebstruktur der Agarose bieten die Poren kleineren 27 Material und Methoden Fragmenten weniger Widerstand. Somit durchlaufen große DNA-Fragmente Agarosegele langsamer als kleine. Um die DNA-Fragmente im Agarosegel sichtbar zu machen, wird Ethidiumbromid während der hinzugegeben. Herstellung des Gels Ethidiumbromid lagert der Fluoreszenzfarbstoff sich an die DNA beziehungsweise schiebt sich zwischen die Basen (Interkalation). Die PCR-Produkte werden gemeinsam mit 3xFicoll in die Probentaschen des Agarosegels gegeben. Als Größenmarker dient eine 100bp-DNA-Leiter (low mass ladder), die bei jeder Elektrophorese aufgetragen wird. Für die vorliegende Arbeit wurden die Agarosegele aus einer 2%igen Agaroselösung hergestellt. Hierzu wurde das Agarosepulver mit dem 1x TBE-Elektrophoresepuffer vermischt, im Mikrowellengerät aufgekocht und anschließend auf etwa 60°C abgekühlt. Dann wurde die Lösung mit Ethidiumbromid versetzt. Aus der erkaltenden Lösung wurden mithilfe eines Gelschlittens und Kämmen, die in einer als Form dienenden Gelschale lagen, die Agarosegele gegossen. Die abgekühlten und fest gewordenen Gele wurden in eine mit 1xTBE-Elektrophoresepuffer gefüllte Kammer gesetzt und die Geltaschen wurden mit einem Mix aus 4µl DNA-Probe sowie 3µl 3xFicoll beladen. Die Elektrophorese erfolgte unter konstanter Spannung von 120 V über 30 Minuten. Im Anschluss wurde das Ergebnis der Elektrophorese unter UV-Licht mit dem bioDocAnalyzer fotodokumentiert und die Qualität der PCR-Produkte ließ sich beurteilen. 2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes Um in den der PCR folgenden Analyseschritten mit sauberen Produkten weiter zu arbeiten, wurden die PCR-Produkte einer Aufreinigung unterzogen. Die hierfür verwendete Lösung bereitet PCR-Produkte für die Sequenzierung vor, indem aus der PCR noch vorhandene überschüssige dNTPs und Primer durch die in der Lösung enthaltenen Enzyme hydrolysiert werden. Bei den Enzymen handelt es sich um eine Exonuklease I und eine Shrimp Alkalische Phosphatase, die in einem Puffer gelöst sind. Es sind zwei Inkubationsschritte notwendig. Im ersten Schritt findet bei 37°C für 15 Minuten die Aufreinigung statt und im zweiten Schritt werden die Enzyme bei 80°C in 15 Minuten inaktiviert. Für den Aufreinigungsschritt wurden 5µl PCR-Produkt, welches nach Bedarf verdünnt wurde, und 2µl ExoSAP in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben und für 30 Minuten im ThermoCycler wie oben beschrieben behandelt. 28 Material und Methoden 2.2.4. Sequenzierung nach Sanger Bei der DNA-Sequenzierung nach Sanger werden die aufgereinigten PCR-Produkte zunächst denaturiert (Sanger et al.,1977). Zwar kann auch doppelsträngige DNA verwendet werden, die Ergebnisse mit einzelsträngiger DNA sind jedoch weitaus besser, da sie längere Sequenzen liefert. Nach der Denaturierung bindet am 3„-Ende des zu sequenzierenden Abschnittes ein Primer, an welchem mittels einer DNAPolymerase ein zum DNA-Fragment komplementärer Strang synthetisiert wird. Dafür werden einerseits im Reaktionsansatz enthaltene 2„-Desoxynukleotide (dNTPs) sowie zusätzlich mit einer Fluoreszenzgruppe markierte sogenannte 2„3„-Didesoxynukleotide (ddNTPs) eingebaut. Dem ddNTP fehlt die notwendige Hydroxylgruppe am dritten CAtom der Ribose, an welche üblicherweise das nächste Nukleotid geknüpft wird. Daher bricht die Amplifikation nach jedem Einbau eines ddNTPs ab und am Ende der Sequenzierreaktion liegen unterschiedliche lange DNA-Fragmente vor. basenspezifische Markierung werden vier verschiedene Für die Fluoreszenzgruppen verwendet. Im automatischen Sequenziergerät wird eine Gelkapillare mit den Reaktionsprodukten geladen. Ein Laser regt die markierten ddNTPs zur Fluoreszenz an. Das Fluoreszenzmaximum für jeden der vier Farbstoffe liegt bei einer anderen Wellenlänge. Diese Informationen werden digital aufgezeichnet und die ausgelesene Sequenz wird gespeichert. Der DNA-Abschnitt wird in farbigen Peaks (Ausschlägen) dargestellt. Nach der ExoSAP-Behandlung werden die zu sequenzierende DNA zusammen mit dem Primer (Vorwärts- oder Rückwärts-Primer) in eine 96Well- Mikrotiterplatte vorgelegt, der separat vorbereitete Mix dazu pipettiert und die Platte verschlossen in den ThermoCycler gestellt. Die Sequenzierbedingungen für das SLC9A6-Gen sind exemplarisch in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Die Sequenzierbedingungen für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind dem Anhang zu entnehmen. Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens Konzentration ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 5x SeqPuffer F- oder R-Primer 2,5x Terminator Mix 1.1 a.d. (HPLC) Ansatzvolumen Hersteller 10 pmol/µl Volumen (in µl) 1 Applied Biosystems 1,5 Biomers 0,5 Applied Biosystems 1 Biomers 6 10 29 Material und Methoden Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 96°C 1 Min. Denaturierung 96°C 10 Sek. Annealing 60°C 5 Sek. Elongation 60°C 1 Min. 25 Zyklen Im Anschluss an die Sequenzierung werden die Produkte mit 10µl HPLC-Wasser verdünnt und 10µl des verdünnten Produktes werden über der Sephadexsäule aufgereinigt. Die Sephadexaufreinigung wird eingesetzt, um Nukleotide und Salze von DNAFragmenten zu trennen und funktioniert nach dem Prinzip der Gelfiltration. Moleküle von einer Größe bis zu 20bp können die Matrix aus Dextran- und Epichlorhydrinmolekülen nicht passieren, die größeren Sequenzprodukte jedoch schon. Hierfür wurden die Kammern einer Multiscreen-Filterplatte mit 45µl Sephadex™-G50Pulver sowie 300µl pro Kammer HPLC a.d. befüllt und für etwa 2 Stunden zum Quellen bei Raumtemperatur gelagert. Danach wurde das überschüssige Wasser bei 2900 Umdrehungen/Minute abzentrifugiert und 10µl der verdünnten Sequenzprodukte über der Sephadexsäule mittels Zentrifugation bei 2900 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten filtriert. Im letzten Schritt wurden 10µl HiDi™-Formamide in eine Micro Amp Optical 96Well- Messplatte vorgelegt und etwa 5µl aufgereinigte Sequenzprobe dazu pipettiert. Die Proben wurden bei 12-18 Sekunden Injektionszeit im 3130xl Genetic Analyzer mittels kapillarelektrophoretischer Auftrennung gemessen. 2.2.5. Auswertung der Sequenzen Mithilfe der Programme „Sequencing Analysis“ und „Seq Scape“ erfolgte die Auswertung der digitalisierten Sequenzdaten. Die Daten wurden mit den Referenzsequenzen aus genetischen Datenbanken verglichen. Zusätzlich wurden die Sequenzdaten manuell mit der jeweiligen Referenzsequenz abgeglichen. Von jedem DNA-Abschnitt wurden die Vorwärts- und die Rückwärts-Sequenz ausgewertet. 2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) MLPA wurde 2002 als neue vielseitig anwendbare Methode zur schnellen Analyse von Duplikationen und Deletionen eingeführt (Schouten et al., 2002). Mithilfe MLPA lassen sich in einem Ansatz Variationen in der Kopienzahl von bis zu 45 unterschiedlichen Sequenzabschnitten erfassen und analysieren (Slater et al., 2003). Dabei wird die Menge vorhandener bestimmter DNA-Abschnitte ins Verhältnis zur entsprechenden 30 Material und Methoden Menge bei gesunden Testpersonen (Kontrolle) gesetzt. Bei MLPA werden nicht DNAFragmente sondern die Sonden, welche den zu untersuchenden DNA-Fragmenten der Proben komplementär sind, amplifiziert und quantifiziert. Ob die Sonden amplifiziert werden, hängt davon ab, ob die Zielsequenzen der Sonden in der DNA-Probe enthalten sind. Jede Sonde setzt sich aus zwei Oligonukleotiden zusammen, die an benachbarte Lokalisationen der Zielsequenz hybridisieren. Die Sonden werden gebunden und können danach amplifiziert werden. Alle gebundenen Sonden besitzen identische Endsequenzen am 5„- und 3„-Ende, was die Benutzung von nur einem Primerpaar während der nachfolgenden PCR erlaubt. Die Größe des Amplifikationsproduktes liegt zwischen 130 und 480 Basenpaaren und ist spezifisch für jede Sonde (Schouten et al., 2002). Für die Untersuchung der Gene CDKL5 und ARX wurde das Kit SALSA®-MLPA®-Kit P189-B1 und für das Gen TCF4 das SALSA®-MLPA®-Kit P075-A1 verwendet. Mittels des SALSA®-MLPA®-Kits P075-A1 wurde außerdem das Gen FOXG1 untersucht und mittels des SALSA®-MLPA®-Kits P 189-B1 zusätzlich das NTNG1-Gen. Kurz zusammengefasst besteht die MLPA aus folgenden Schritten: 1. Denaturierung 2. Hybridisierung 3. Ligation 4. Amplifizierung / PCR Um die zu untersuchenden Sequenzen zu amplifizieren, wird ein Mix von MLPA®Sonden zu den Proben gegeben. Jede Sonde ist zu einer bestimmten Zielsequenz komplementär. Die Sonden bestehen aus zwei Teilen, nämlich zwei Oligonukleotiden, welche sofort aneinander angrenzend hybridisieren, und jeweils eine der Sequenzen enthalten, die vom Primerpaar erkannt wird. Nach der Hybridisierung an ihre spezifischen Ziele werden die zwei „Hemi-Sonden“ durch zwei spezifische LigaseEnzyme gebunden. Das resultierende Produkt der Ligase-Reaktion enthält beide Primersequenzen in einem Fragment und wird während der PCR exponentiell vervielfältigt. Im Gegensatz zu diesem vollständigen Produkt enthalten Sonden, welche in der Ligasereaktion nicht gebunden wurden, lediglich eine einzige Primersequenz. Sie wurden folglich nicht exponentiell amplifiziert und erzeugen während der Messung im Kapillarsequenzierer kein Fluoreszenzsignal. Daher ist die Entfernung der nichtgebundenen Sonden vor der Messung nicht notwendig. Für die vorliegende Arbeit wurden 2µl der DNA-Proben (DNA-Gehalt 50ng/µl) in eine Mikrotiterplatte vorgelegt, zunächst mit 3µl a.d. verdünnt und dann in verschlossener 31 Material und Methoden Mikrotiterplatte fünf Minuten lang bei 98°C denaturiert. Für die Hybridisierungsreaktion wurden je 1,5µl SALSA-Probemix (Sonden-Mix) und Pufferlösung hinzugefügt. Nach einer einminütigen Inkubation bei 95°C wurden die Sonden bei 60°C 16 Stunden lang hybridisiert. Dann wurde bei 54°C 32µl des zuvor angesetzten Ligase-65 Mix auf die hybridisierten Proben gegeben, für 15 Minuten bei 54°C inkubiert und anschließend die Ligase 5 Minuten lang bei 98°C hitzeinaktiviert. In einer neuen Mikrotiterplatte wurden 10µl Polymerase-Mix, welcher Primer, dNTPs und Polymerase enthält, vorgelegt, um danach den MLPA-Ligationsansatz hierauf zu pipettieren. Der PCR-Ansatz wurde im ThermoCycler unter folgenden Bedingungen behandelt: Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Denaturierung 95°C 30 Sek. Annealing 60°C 30 Sek. Elongation 72°C 1 Min. Elongation 72°C 20 Min. 35 Zyklen Eine detaillierte Aufführung des MLPA-Ansatzes findet sich im Anhang in 7.5 MLPAAnsätze. Im Anschluss an die PCR wurden 20µl MLPA-Produkt über der Sephadexsäule (beschrieben unter 2.2.4 Sequenzierung) aufgereinigt und 1:5 mit a.d. verdünnt. 3µl des aufgereinigten, verdünnten Produktes wurden für die Messung im 3100xl Genetic Analyzer mit je 9µl mit HiDi® -Formamide verdünntem ROX 500 in eine Messplatte gegeben. Nach der Denaturierung bei 98°C für 3-4 Minuten wurden die Proben im Kapillarsequenziergerät aufgetrennt und die Analysedaten digitalisiert. Die Auswertung erfolgt anhand der Signalhöhe des Ergebnisses des Sequenziergerätes, was dem Vergleich des Gendosismusters der Patienten mit dem gesunder Kontrollpersonen entspricht. 2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese Mithilfe der Programme „Gene Mapper“ sowie „SequencePilot“ erfolgte die Auswertung der digitalisierten Daten aus den kapillarelektrophoretischen Messungen der MLPA. Die Analyse erfolgt anhand der Signalhöhe bzw. -fläche. Dabei werden die Gendosismuster der Patienten mit denen gesunder Kontrollpersonen verglichen 32 Material und Methoden 2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen Meine Aufgabe im Rahmen der Laborarbeit bestand neben der molekulargenetischen Untersuchung der Gene CDKL5, ARX, SLC9A6 und TCF4 in der Etablierung der PCRBedingungen für das TCF4-Gen. Für die Entwicklung einer PCR-Routineanalytik müssen valide PCR-Methoden etabliert werden. Dies setzt die Kenntnis relevanter DNA-Sequenzen voraus, welche in Datenbanken zur Verfügung stehen. Das Prinzip des PCR-Verfahrens ist im Abschnitt 2.2.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) beschrieben. Für das TCF4-Gen etablierte ich die PCR-Bedingungen neu. Häufig ist es problematisch, ein DNA-Fragment spezifisch, das heißt ohne die Entstehung zusätzlicher unspezifischer Nebenprodukte, zu amplifizieren. Die Spezifität und Effizienz der PCR hängen von etlichen Parametern wie Temperatur, Anzahl der Zyklen, Reaktionsdauer und der verwendeten DNA-Polymerase ab. Von entscheidender Bedeutung sind die Primer und ihre Hybridisierungstemperatur. Die Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche PCR ist das Design optimaler Primer (Mülhardt, 2006). Bei der Etablierung der PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurde darauf geachtet, eine Primer-Länge von 18-30 Basen nicht zu überschreiten und ein ausgewogenes Verhältnis von Guanidin und Cytosin (40-60%) zu Adenin und Thymin einzuhalten. Ebenso sollten möglichst nicht mehr als vier gleiche Basen hintereinander vorliegen. Durch optimale Primer-Länge und ein ausgewogenes Basen werden Leserasterverschiebungen und Fehlhybridisierungen vermieden. Die Schmelztemperatur eines Primerpaares sollte 55-80°C betragen, damit ausreichend hohe Annealingtemperaturen möglich sind (Scheinert, 1997). Schließlich sollten Primer möglichst wenig komplementär zueinander sein, um sich nicht gegenseitig als Template zu dienen. Die Sequenz muss möglichst spezifisch für das gewünschte PCR-Produkt sein, damit die Primer nur an der richtigen Stelle hybridisieren. Diesem potentiellen Problem entgeht man über hohe Annealingtemperaturen, wenn es der Aufbau der Primer erlaubt. Die Schmelztemperatur gibt Auskunft darüber, bei welcher Temperatur fünfzig Prozent des Primers nicht mehr an das Template bindet, jedoch nicht, ab wann der Primer zuverlässig hybridisiert. Daher sollte die Hybridisierungstemperatur 5-10°C niedriger als die errechnete Schmelztemperatur Tm gewählt werden. Die Schmelztemperatur Tm errechnet sich nach folgender Gleichung: Tm= 4x (Anzahl G bzw. C) + 2x (Anzahl A bzw. T) Diese Gleichung gilt für kurze Primer von etwa 20 Basen, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden (Mülhardt, 2006). 33 Material und Methoden Die Primer wurden entsprechend der aufgeführten Kriterien ausgesucht. Zunächst wurden die optimalen Annealingtemperaturen berechnet und die ersten PCRs mit Kontroll-DNA durchgeführt. Außerdem wurde die PCR einiger Exons in Cyclern, die Temperaturgradienten ermöglichen, durchgeführt, um die errechnete Annealingtemperatur zu überprüfen und gegebenenfalls zu korrigieren. Die PCRBedingungen, bei denen sich optimale Produkte ergaben, sind dem Abschnitt 7.4.4 im Anhang zu entnehmen. 34 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die mittels eines Fragebogens erhobenen klinischen Daten aus der Vorgeschichte der Patienten ausgewertet. 3.1.1. Anamnese und klinische Befunde In die Studie wurden 13 (38,2%) Jungen und 21 (61,8%) Mädchen im Alter von 20 Monaten bis 49 Jahren aufgenommen. Auswahlkriterien für die Aufnahme in die Studie waren eine schwer behandelbare oder therapieresistente Epilepsie und eine mentale Retardierung. Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt. Die Schwangerschaft verlief bei 25/33 Müttern (76%) komplikationslos, bei 8/33(24%) traten Komplikationen auf. Zu den Komplikationen gehörten Gestationshypertonie, Plazentainsuffizienz, ein pathologisches Schwangerschaftswoche, ein Cardiotokogramm Pneumothorax, bei zwei (CTG) in Müttern der 28. vorzeitige Wehentätigkeit mit drohender Frühgeburt, Harnwegsinfekte der Mutter sowie Komplikationen aufgrund einer Prothrombin-Mutation (Faktor-II-Mutation) bei einer Mutter. Die Entbindung erfolgte bei 21/31 (67,8%) Patienten spontan vaginal. 10/31 (32,2%) wurden per Sectio entbunden, zwei Kaiserschnitte davon wurden sekundär aufgrund eines pathologischen CTG während der Geburt durchgeführt, eine weitere Sectio wurde aufgrund des Verdachts auf eine intrauterine Infektion bei grünem Fruchtwasser durchgeführt. In der Neugeborenen- und Säuglingszeit traten bei 16/30 (53,3%) Patienten Fütterungsprobleme auf, bei 14/30 (46,7%) Patienten nicht. Bei 11 der Patienten mit Fütterungsproblemen lag eine muskuläre Hypotonie vor, eine Patientin hatte Fütterungsprobleme aufgrund einer Kiefer-Gaumen-Spalte. Der Muskeltonus war bei insgesamt 17/29 (58,6%) Patienten erniedrigt (hypoton), bei 11/29 (38%) normal und eine Patientin (3,4%) hatte eine muskuläre Hypertonie. Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten Patientenkohorte primär sekundär nein keine Angabe Mikrozephalie 1/27 (3,7%) 9/27 (33,3%) 17/27 (63%) 7/34 Kleinwuchs 0/26 3/26 (11,5%) 23/26 (88,5%) 8/34 Dystrophie 0/25 3/25 (12%) 22/25 (88%) 9/34 35 Ergebnisse Tabelle 6 bietet eine Zusammenfassung zu Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie der Patienten. Dazu wurden die Körpermaße zum Zeitpunkt der Geburt und die Körpermaße zum Zeitpunkt der Datenerhebung ausgewertet. Im Anhang findet sich eine detaillierte Tabelle mit den Körpermaßen zum Zeitpunkt der Geburt sowie zum Zeitpunkt der Datenerhebung. Liegen der frontookzipitale Kopfumfang unterhalb der 3.Perzentile oder mehr als zwei Standardabweichungen unterhalb des Altersdurchschnitts für Geschlecht und ethnologischer Herkunft sowie ein Missverhältnis zwischen Gesichts- und Hirnschädel vor, spricht man von Mikrozephalie (Hay Jr et al., 2007). Ein kleiner Kopfumfang kann mit einer verzögerten Entwicklung und Wachstum des Gehirns einhergehen. In dem Entwicklungsverzögerung oder Zusammenhang können Symptome neurologische Auffälligkeiten wie wie eine beispielsweise Krampfanfälle und Spastiken auftreten (Hay Jr et al., 2007). Kleinwuchs wird als eine Körpergröße unter der 3.Perzentile definiert (Zabranski, 2007). Dystrophie beschreibt in diesem Zusammenhang eine Gedeihstörung aufgrund der Grunderkrankung der Patienten. Bei keinem der Patienten liegt eine primäre, also konnatale Dystrophie vor, eine sekundäre im Verlaufe der Erkrankung wird von 3 (12%) entwickelt. Ursächlich dafür können beispielsweise eine unkontrollierte Anfallssituation oder Hypalimentation sein. 18/33 (54,4%) Patienten konnten frei laufen. Auffällig ist, dass diejenigen Patienten, die das freie Laufen erlernten, es mit durchschnittlich 24 Monaten und damit etwa 12 Monate später als gesunde Kinder erlernten. 12/28 (43%) der Patienten entwickelten stereotype Handbewegungungen wie „Waschbewegungen“, Händereiben oder sie führten Hände und Finger häufig zum und in den Mund. 17/30 (57%) Patienten hatten eine Bewegungsstörung. Bei sechs Patienten wurde diese als eine Ataxie, bei zwei als eine Dyskinesie, bei vier Patienten als eine Dystonie und bei zwei weiteren als eine Spastik beschrieben. Bei Dystonien und Dyskinesien handelt es sich um repetititve, unwillkürliche Muskelkontraktionen, die entweder Rumpf, Körper oder Extremitäten in bestimmte Haltungen zwingen oder zu abnormen Bewegungsabläufen führen. Die Bewegungsstörungen werden häufig bei Patienten mit Veränderungen in den Genen CDKL5,ARX,TCF4 und SLC9A6 beschrieben. Bei 11/31 (35,5%) Patienten wird von einem Verlust erworbener Fähigkeiten berichtet. Dazu gehören eine Verschlechterung des Gangbildes, ein Verlust der aktiven Sprache oder Verlernen von Greifen und freiem Sitzen. Tabelle 7 bietet einen Überblick über die sprachliche Entwicklung der Patienten. 36 Ergebnisse Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der Datenerhebung Häufigkeit Prozent Keine 20/31 64,5% Einzelne Wörter 8/31 25,8% Mehrwortsätze 3/31 9,7% Keine Angabe 3/34 Expressive Sprache Sprachverständnis Sehr eingeschränkt bis fehlend 18/30 60% Einzelne Aufforderungen 9/30 30% Gut 3/30 10% Keine Angabe 4/34 In Tabelle 8 sind Angaben über die Häufigkeit von Dysmorphiezeichen, Hyperventilationszuständen und Neigung zu Infekten der Luftwege zusammengefasst. Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten Patientenkohorte Ja Nein Keine Angabe Dysmorphiezeichen 6/28 (21,4%) 22/28 (78,6%) 6/34 Organfehlbildungen 0/28 28/28 (100%) 6/34 Hyperventilationszustände 2/31 (6,4%) 29/31 (93,6%) 3/34 Häufige Luftwegsinfekte 10/32 (31%) 22/32 (69%) 2/34 Bei 6/28 Patienten wurde von den untersuchenden Ärzten über Dysmorphiezeichen berichtet. Fünf dieser Patienten werden ausführlicher beschrieben. Patientin 2 hat einen leichten Hypertelorismus, eine breite Mundspalte, breite Zahnzwischenräume und lange dünne, spitz zulaufende Finger (sogenanntes „Tapering“). Diese Merkmale wären mit den Auffälligkeiten bei Pitt-Hopkins-Syndrom, das häufig durch Mutationen im TCF4-Gen verursacht wird, zu vereinbaren. Bei Patientin 6 liegt eine milde Syndaktylie der zweiten und dritten Zehe beidseits vor. Dieser Befund ist auch bei dem gesunden Onkel und bei dem Cousin der Patientin väterlicherseits beschrieben. Die Anomalie hat somit mit hoher Wahrscheinlichkeit keinen Krankheitswert. Bei Patient 9 werden tiefliegende Augen mit dichten, geschwungenen Wimpern, ein kurzes Philtrum, eine milde Retrognathie, prominente Schneidezähne und spitz zulaufende Finger beschrieben. 37 Ergebnisse Patient 13 hat eine hohe, vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen und leicht splitternde Fußnägel. Bei der Patientin 14 wurden eine prominente Stirn, tief liegende Augen und ein Telekanthus beschrieben. Sie hatte einen hohen, schmalen Gaumen, weit auseinanderstehende, relativ kleine Zähne und eine dünne Oberlippe. Außerdem standen die Ohren etwas ab, die Nase war relativ kurz und sie hatte ein langes Philtrum. Die Mamillen waren invertiert. Tabelle 9 fasst die zum Zeitpunkt der Datenerhebung beschriebenen Dysmorphiezeichen zusammen. Tabelle 9 Dysmorphiezeichen Pat. Dysmorphiezeichen 2 leichter Hypertelorismus, breite Mundspalte, breite Zahnzwischenräume, lange dünne Finger mit angedeutetem Tapering. 4 auffällig breiter Mund 6 Mikrozephalie, milde Syndaktylie 2-3 beidseits an den Füßen, auch beim Bruder und Neffen des Vaters 9 tiefliegende Augen mit dichten geschwungenen Wimpern, kurzes Philtrum, milde Retrognathie, prominente obere Schneidezähne, Finger spitz zulaufend 13 hohe vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen. Die Fußnägel splittern leicht. 14 Prominente Stirn, tief liegende Augen, Telekanthus, hoher, schmaler Gaumen, weit auseinanderstehende, relativ kleine Zähne, dünne Oberlippe, etwas abstehende Ohren, insbesondere rechts. Nase relativ kurz, Philtrum lang. Invertierte Mamillen. Bei 2/31 Patienten wird über Hyperventilationszustände berichtet. Hyperventilationsepisoden werden im Zusammenhang mit dem Pitt-Hopkins-Syndrom beschrieben. 10/31 (31%) Patienten hatten häufige Infekte der oberen Atemwege. Alle 34 Patienten dieser Studie haben eine Epilepsie, bei 27/32 (84,4%) handelt es sich um therapieresistente Anfälle. Fünf Patienten haben eine Epilepsie, welche nach vielen Therapieversuchen schließlich auf eine Behandlung anspricht. Die Anfälle bestehen bei ihnen aus myoklonischen Anfällen, die teilweise auch nachts auftreten, tonischen Anfällen sowie fokalen und komplex fokalen Anfällen mit sekundärer Generalisierung. Bei zwei dieser Patienten entwickelte sich die Epilepsie im ersten Lebensjahr, bei den weiteren drei Patienten traten die ersten Anfälle nach dem zweiten Lebensjahr auf. Alle 38 Ergebnisse fünf Patienten werden mit Valproat therapiert, bei zwei Patienten wird zusätzlich Sultiam bzw. Ethosuximid gegeben. 10/32 Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie haben BNS-Krämpfe in ihrer Anamnese. Bei ihnen begann die Epilepsie im Alter zwischen zwei Lebensmonaten und zwei Lebensjahren. Sieben dieser Patienten entwickelten im Verlauf eine komplexe Epilepsie, die sich aus verschiedenen Anfallsarten zusammensetzt, wie zum Beispiel die Epilepsie von Patient 13. Er entwickelte im 4.Lebensmonat BNS-Anfälle, die in ein Lennox-Gastaut-Syndrom übergingen. Zum Zeitpunkt der Anamnese lag eine multifokale Epilepsie mit komplex-fokalen, einfach-fokalen, generalisierten tonischklonischen Anfällen sowie Nickanfällen vor. Teilweise traten die Anfälle im Schlaf auf, teilweise waren sie tonisch einhergehend mit Zyanose sowie Hypersalivation. Das EEG zeigte bei diesem Patienten einen temporalen Fokus auf der linken Seite, einzelne fokal beginnende Anfälle sowie eine multifokale hypersynchrone Aktivität in Form von „sharpwaves“, links und rechts „spike-polyspike-waves“ mit wiederholter Generalisierung. Die Tabelle im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zeigt eine Zusammenschau der Merkmale der Epilepsien der Patienten, bei denen eine therapieresistente Epilepsie besteht. 21/30 (70%) Patienten hatten eine schwere mentale Retardierung, 8/30 (27%) eine moderate und bei einem Patienten wurde eine milde mentale Retardierung beschrieben. Von den Patienten mit therapieresistenter Epilepsie haben 19/27 eine schwere mentale Retardierung. Schwer behandelbare bzw. therapieresistente Epilepsien können für eine Entwicklungsverzögerung und mentale Retardierung verantwortlich sein. Die Patienten mit therapieresistenten Epilepsien wurden alle mit einer unterschiedlich aufgebauten Kombinationstherapie behandelt. Dabei wurden auch Antiepileptika zweiter Wahl hinzugezogen, nachdem die Medikamente erster Wahl bei der betreffenden Epilepsieform nicht anschlugen. Die Medikation der Patienten mit therapieresistenter Epilepsie sowie der Grad der mentalen Retardierung ist der Tabelle im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zu entnehmen. 3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm Die EEG-Befunde wurden im Rahmen der regelmäßigen Untersuchungen durch die betreuenden Ärzte erhoben und schriftlich übermittelt. Sie sind der Tabelle im Abschnitt 7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie zu entnehmen. 39 Ergebnisse Die Befunde reichten von unauffälligen Befunden ohne epilepsietypische Aktivität über leicht abnorme interiktale Grundrhythmen zu schweren Allgemeinveränderungen und pathologischen Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen. Die EEG-Befunde der fünf Patienten, deren Epilepsie nicht therapieresistent ist, sind bei drei Patienten unauffällig oder zeigen leichte Allgemeinveränderungen. Dazu gehört ein zu langsamer oder diskontinuierlicher Grundrhythmus. Die anderen zwei Patienten mit einer auf Valproat ansprechenden Epilepsie haben links fokale, fronto-zentrale epilepsietypische Muster bei einer komplex-fokalen Epilepsie mit linkshemisphärischen Dämmerattacken und teilweiser sekundärer Generalisierung sowie pathologische Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen mit generalisierten „polyspike-wave“Paroxysmen mit klinischen Myoklonien. Auch die EEG-Befunde der Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie sind vielfältig. Die EEG-Befunde stellen eine Bandbreite von Mustern dar. Bislang sind in der Literatur für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Krankheitsbilder wenige EEG-Muster beschrieben. Lediglich für Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen sind mittlerweile genauere Untersuchungen vorhanden. Melani et al. berichten davon, dass Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen besonders lang andauernde Anfälle, die sich als tonisch-klonische Anfälle mit tonisch-klonisch-myoklonischen Manifestationen darstellen, haben (Melani et al., 2011) 3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT) Bei Untersuchungen im cMRT ergaben sich bei 10/30 (33,3%) Patienten keine Auffälligkeiten. 20/30 (66,7%) haben hingegen pathologische Befunde. Davon zeigen 11/20 eine Atrophie des Gehirns, die teilweise global oder supratentoriell ist. Drei Patienten haben komplexe Hirnfehlbildungen. Die cMRT-Befunde sind im Anhang im Abschnitt 7.8 zusammengefasst. Eine Atrophie der weißen und grauen Substanz, eine Hypoplasie oder Agenesie des Corpus callosum oder Myelinisierungsstörungen geben Hinweise auf ein übergeordnetes Krankheitsbild. 3.1.4. Familienanamnese Bei vier Patienten wurde von Auffälligkeiten in der Familienanamnese berichtet. Die Mutter von Patient 9 war an einer juvenilen myoklonischen Epilepsie erkrankt und zudem besteht eine Epilepsie bei mehreren der Familienmitglieder. Der Patient 9 hatte eine auf Valproat ansprechende idiopathische, atypische generalisierte Epilepsie mit myoklonischen Anfällen sowie einzelnen fiebergebundenen komplex fokalen Anfällen. 40 Ergebnisse Laut Symptomatik der Mutter und des Patienten kann ein Zusammenhang zwischen ihren Symptomen und den Symptomen des Patienten bestehen. Es werden autosomal dominante, autosomal rezessive sowie multifaktorielle Vererbungsmuster im Zusammenhang mit juveniler myoklonischer Epilepsie beschrieben (Gardiner, 2005; Alfradique und Vasconcelos, 2007). Im Falle des Patienten 9 ist eine genetische Erkrankung wahrscheinlich. Da jedoch keine weiteren Informationen zu den übrigen Familienmitgliedern vorliegen, ist es schwierig, eine genaue Aussage über einen möglichen Erbgang und die genetische Grundlage zu treffen. Die Mutter von Patientin 14 hatte drei Fehlgeburten. Bei den Feten lagen Fehlbildungen vor. Die Patientin hat zwei gesunde Geschwister. Im Rahmen der Diskussion wird genauer auf die Patientin eingegangen. Der Großvater väterlicherseits der Patientin 18 erkrankte im neunten Lebensjahr an einer nicht näher beschriebenen Epilepsie. Es ist nicht sehr wahrscheinlich, dass die Erkrankung des Großvaters dieselbe Ursache hat wie die der Patientin. Zwei Cousins ersten Grades von Patientin 26 sowie ein Kind in der weiteren Verwandtschaft hatten eine ähnliche Symptomatik wie die Indexpatientin. Da die Verwandtschaft in Serbien lebte, konnte leider kein näherer Kontakt aufgenommen werden. Die Patientin hat komplex fokale und sekundär generalisierte Anfälle, die medikamentös nicht kontrolliert sind. 3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen Bei 22/34 (64,7%) Patienten wurde im Vorfeld eine Chromosomenanalyse durchgeführt, welche bei 9/22 einen unauffälligen männlichen Chromosomensatz 46,XY und bei 13/22 einen unauffälligen weiblichen Chromosomensatz 46,XX ergab. Damit wurden größere chromosomale Aberrationen als Ursache für die klinische Symptomatik im Vorfeld ausgeschlossen. Ein Angelman-Syndrom wurde bei 8/9 Patienten im Vorfeld ausgeschlossen, bei 25/34 Patienten wurde in dieser Rubrik des Fragebogens keine Angabe gemacht. Bei 11/14 Patienten wurde das MECP2-Gen auf Veränderungen, die zum RettSyndrom führen, untersucht. Bei 3/14 Patienten wurde die Untersuchung im Hinblick des Rett-Syndroms nicht durchgeführt und bei 20/34 Patienten liegen keine Angaben vor. Außerdem wurde bei 20/34 (59%) Patienten eine Array-CGH-Untersuchung durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse lassen sich Chromosomenveränderungen nachweisen, die so klein sind, dass sie in der konventionellen Chromosomenanalyse nicht erkannt werden können. Dabei werden Verluste von Chromosomenanteilen (Deletionen) sowie Hinzugewinne derselben (Duplikationen) genomweit detektiert. 41 Ergebnisse 17/20 Array-CGH-Analysen waren unauffällig, bei drei Analysen wurden auffällige Befunde erhoben. Bei Patient 5 fand sich in der Chromosomenregen 10q21.1 eine 74,11 kb große Deletion. Die Karyotypformel nach ISCN lautet arr10q21.1.(55,351,19255,276,981)x1 (nach NCBI 36/hg18). Die Veränderung liegt ebenfalls bei der phänotypisch unauffälligen Mutter vor. Bei Patientin 8 fand sich in der Array-CGH-Analyse eine 133,3 kb große Deletion in der Chromosomenregion Xq13.3. Die Karyotypformel lautet arrXq13.2(74,016,050- 74,149,351)x1 (nach NCBI 36/hg18). Ob die Eltern untersucht wurden, ist nicht bekannt. Bei Patient 12, der an einer fokalen Epilepsie mit sekundärer Generalisierung leidet, fand sich eine Auffälligkeit, die ebenso bei der klinisch unauffälligen Mutter besteht. Da keine näheren Informationen zu dem Befund der Array-CGH-Untersuchung vorliegen, lassen sich lediglich Vermutungen anstellen. Es besteht die Möglichkeit, dass die Veränderung auf dem X-Chromosom lokalisiert ist. Insbesondere in diesem Fall könnte die Veränderung für das Krankheitsbild des Sohnes ursächlich sein. 3.2. Molekulargenetische Analysen 3.2.1. Sequenzanalysen Die Reihenfolge der Sequenzanalysen der Gene CDKL5, TCF4, ARX und SLC9A6 wurde nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEGUntersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen Anamnese der Patienten festgelegt. Zur Orientierung diente die Auswertung des Fragebogens (siehe Abschnitt 3.1.). Eine zusammenfassende Übersicht über die erhobenen Befunde im Rahmen der genetischen Untersuchungen bietet die Tabelle Ergebnisse der genetischen Untersuchungen im Abschnitt 7.9. im Anhang. 3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens Das CDKL5-Gen wurde zunächst bei Patienten mit sich früh manifestierenden BNSKrämpfen, tonischen und tonisch-klonisch generalisierten Anfällen, Mikrozephalie sowie Bewegungsstörungen untersucht. Als Beispiel dient hier Patientin 11, bei der sich die Epilepsie im 3. Lebensmonat manifestierte und zunächst aus BNS-Krämpfen bestand. Später veränderte sich die Epilepsie zu tonischen und myoklonischen Anfällen. EEGBefunde zeigten bei der Patientin eine Hypsarrhythmie. Die Patientin hat eine Mikrozephalie und eine dystone und spastische Bewegungsstörung. 42 Ergebnisse Im Laufe der genetischen Untersuchungen wurden die 20 kodierenden Exons des CDKL5-Gens bei allen 34 Patienten mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert, sofern Mutationen im CDKL5-Gen nicht im Vorfeld ausgeschlossen worden waren (Pat.1, 3, 8, 10, 27). In der vorliegenden Arbeit wird Bezug auf das CDKL5-Transkript ENST00000379989 der Datenbank ensembl.org genommen. Überprüft wurde die Spezifität der PCR durch Agarose-Gelelektrophorese wie beispielhaft für die Exons 6-8 des CDKL5-Gens in Abbildung 1 gezeigt. Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel M: Längenstandard (100 bp DNA-Ladder); ▼:Leerkontrolle Nach der 30minütigen elektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte bei 120 mA sind die Fragmente, welche die Exons 6,7 und 8 beinhalten, erkennbar. Ihre Länge beträgt zwischen 200 und 400bp, wie am Längenstandard M zu erkennen. Die Länge der Fragmente, in denen die Exons 6,7 und 8 enthalten sind, liegt entsprechend bei 290, 297 und 282 bp wie durch die Primer festgelegt wurde. Bei den Patienten 18, 20 und 23 zeigte sich im Exon 17 im CDKL5-Gen in der Sequenzierung die Veränderung c.2372A>C. Bei Probe 18 liegt sie in heterozygoter, bei den Proben liegt sie 20 und 23 in homozygoter Form vor. Dabei handelt es sich um den bekannten Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP) rs35478150. Diese Veränderung ist eine Missense-Veränderung, da der Basenaustausch zum Codon CCA anstelle von CAA führt. Dadurch wird im Protein die Aminosäure Glutamin durch Prolin ersetzt. Die Veränderung c.2372A>C hat jedoch laut SNP-Datenbank keine Auswirkungen auf die Funktion des Proteins und kommt auch bei gesunden Kontrollen vor. Abbildung 2 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Chromatogramm. 43 Ergebnisse Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens. Links: Der Sequenzausschnitt der Proben 18, 20 und 23 zeigt den Basenaustausch c.2372A>G im Exon 17 des CDKL5-Gens. Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz. Exon 14 des CDKL5-Gens bei dem Patienten 9 (männlich) ließ sich mittels PCR, trotz unterschiedlicher PCR-Bedingungen nicht amplifizieren. Bei der Patientin 35 zeigte sich die Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im Intron 16 des CDKL5-Gens in heterozygotem Zustand. Abbildung 3 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Elektropherogramm. Die Patientin wurde 2009 von Dr. med. Tilman Polster (Neuropädiatrie, EpilepsieZentrum Bethel) klinisch untersucht. Bei der Patientin besteht eine schwere psychomotorische Retardierung und eine therapieresistente Epilepsie. Während der Schwangerschaft kam es zu frühzeitiger Wehentätigkeit, die Geburt erfolgte per Sectio in der 38+5 Schwangerschaftswoche. Das Geburtsgewicht betrug 3940 g (90.-95.Pz.), die Geburtslänge 55 cm (96.Pz) und der Kopfumfang 36 cm (90.Pz.). Bereits nach der Geburt bestanden Fütterungsprobleme. Zeitgleich mit dem Beginn der Epilepsie im dritten Lebensmonat fiel eine Entwicklungsverzögerung auf. Nach dem ersten Anfall traten über eine Zeitspanne von neun Monaten täglich 5-7 Anfälle auf. Die Anfälle bestanden aus unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und klonischer sowie generalisiert tonisch-klonischer Symptomatik. Die Patientin entwickelte eine muskuläre Hypotonie und stereotype Handbewegungen. Sie ist schwer psychomotorisch retardiert. Die Epilepsie ist unter der Gabe von Lamotrigin und Oxcarbazepin therapieresistent. Im Alter von 4 ½ Jahren zeigte das Mädchen keinerlei Sprachentwicklung. Freies Laufen ist seit dem Alter von 3 8/12 Jahren möglich. Es besteht eine Gangataxie. 44 Ergebnisse In der Kernspintomographie finden sich links eine frontale kortikale Dysplasie sowie bilateral eine verzögerte Myelinisierung. Das EEG zeigt eine generalisierte und links frontale und links zentrale intermittierende Verlangsamung sowie multifokale epilepsietypische Potentiale in Form von „sharp-waves“ und „poly-spikes“. Im Vorfeld wurden molekulargenetische Untersuchungen im Hinblick auf ein AngelmanSyndrom sowie ein Rett-Syndrom durchgeführt, welche sich unauffällig zeigten. Eine Array-CGH Untersuchung zeigte sich ebenfalls unauffällig. Die Familienanamnese ist unauffällig. Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens Links: Sequenzausschnitt mit der heterozygoten Austausch17-1G>A bei Probe 35 Mitte: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei der Mutter der Patientin. Rechts: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei dem Vater der Patientin. Um die Relevanz der bei der Patientin 35 gefundenen Veränderung zu klären, wurde bei den Eltern das Exon 17 des CDKL5-Gens einschließlich der Exon-Intron-Übergänge sequenziert. Bei den Eltern der Patientin zeigte die Sequenzanalyse des Exon 17 des CDKL5-Gens keine Abweichung von der Wildtypsequenz. Der Austausch 17-1G>A ist somit bei der Patientin de novo entstanden. 3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens Bei Patienten mit Hyperventilationsepisoden, postnataler Wachstumsretardierung, kraniofazialen Dysmorphien sowie stereotypen Bewegungen der Hände und Auffälligkeiten im MRT des Schädels wurde zunächst eine Analyse des TCF4-Gens durchgeführt. Der Phänotyp von Patient 4 erinnert an Patienten mit Mutationen im TCF4-Gen. Neben einer früh beginnenden Epilepsie hat er eine breite Mundspalte und breite Zahnzwischenräume, führt Waschbewegungen der Hände aus und steckt häufig die 45 Ergebnisse Hände oder Finger in den Mund. Mehrmals am Tag treten bei ihm Hyperventilationsepisoden auf. Die 20 kodierenden Exons des TCF4-Gens wurden bei allen 34 Patienten der Studie mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. In der vorliegenden Arbeit wird Bezug auf das TCF4-Transkript ENST00000398339 der Datenbank esembl.org genommen. Bei 34 der 34 sequenzierten Proben (100%) wurde im Exon 0 des TCF4-Gens der Einzelnukleotid-Polymorphismus rs611326 mit der Veränderung c.28G>C, gefunden. Hierbei handelt es sich um eine Normvariante. Alle Patienten waren homozygot für das Allel c.28G>C Mittlerweile wird jedoch in der Datenbank dbSNP die Base Cytosin anstelle von Guanin als Referenz angeben. Abbildung 4 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Elektropherogramm sowie die Angaben der Datenbanken. Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens Links: Sequenzausschnitt mit dem SNP c.28G>C in homozygotem Zustand. Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 0 des TCF4-Gens zeigt die Sequenz aus der Datenbank db SNP. Bei 20 der 34 Patienten (59%) wurde im Exon 19 die Veränderung c.2226A>G, bekannt als SNP rs8766 gefunden. 6 Patienten (18%) sind homozygot für die Veränderung und 14 Patienten (41%) sind heterozygot für das Allel c.2226A>G. Bei der Veränderung handelt es sich um eine stille Mutation. Somit führt sie zu keiner Änderung in der Aminosäuresequenz des Proteins. Die Sequenzausschnitte sind Abbildung 5 zu entnehmen. 46 Ergebnisse Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens Links: Der Sequenzausschnitt der homozygoten SNP-Variante G/G im TCF4-Gen. Mitte: Der Sequenzausschnitt der heterozygoten SNP-Variante A/G im TCF4-Gen. Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Variante A/A in homozygotem Zustand. 3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens In der vorliegenden Arbeit wurde die DNA aller 13 männlichen Patienten auf Mutationen und Deletionen im ARX-Gen hin untersucht, da heterozygote Frauen keinen erkennbaren Phänotyp zeigen. Patienten mit Mutationen und Deletionen im ARX-Gen zeigen eine große klinische Variabilität. Daher wurden keine besonderen Kriterien für die Wahrscheinlichkeit für eine ARX-Veränderung ausgearbeitet. Bei den Untersuchungen mittels PCR und anschließender Sequenzierung zeigte sich keine Abweichung vom Wildtyp des ARX-Gens. 3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens Bislang gibt es nur wenige beschriebene männliche Patienten Veränderungen im SLC9A6-Gen. Der Phänotyp und seine Variabilität sind bislang noch wenig bekannt. Den Patienten mit Veränderungen in den anderen untersuchten Genen sind die globale psychomotorische Entwicklungsretardierung mit Ataxie, eine Mikrozephalie und eine meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie sowie eine fehlende Sprachentwicklung gemeinsam. Für die Wahrscheinlichkeit für eine SLC9A6Veränderung wurden keine besonderen Kriterien ausgearbeitet. Die 16 kodierenden Exons des SLC9A6-Gens wurden bei 32 Patienten dieser Studie mittels PCR und Sequenzierung untersucht. Das Exon 14 ließ sich bei der Patientin 31 mittels PCR nicht amplifizieren. Im Exon 15 des SLC9A6-Gens des Patienten 23 zeigte sich der bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismus c.1755C>T (rs2307131). Durch den Basenaustausch entsteht das Codon AGT anstelle von AGC. Es gibt keine Veränderung in der 47 Ergebnisse Aminosäuresequenz des Proteins, da es sich um eine stille Mutation handelt. In Abbildung 6 ist der entsprechende Ausschnitt aus dem Chromatogramm dargestellt. Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens Links: Sequenzausschnitt mit dem homozygoten SNP c.1755C>T bei Patient 23. Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 15 des SLC9A6-Gens zeigt die Wildtyp-Sequenz. Im Exon 1 des SLC9A6-Gens zeigte sich bei der Patientin 14 der Basenaustausch c.25G>T in heterozygotem Zustand. Die Abbildung 7 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Chromatogramm. Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens. Links: Der Sequenzausschnitt der Probe 14 zeigt die Veränderung c.25G>T im Exon 1 des SLC9A6-Gens. Mitte: Der Ausschnitt zeigt die Sequenz der Mutter, die ebenfalls die Veränderung c.25G>T im Exon 1 des SLC9A6-Gens trägt. Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz des Vaters im Exon 1 des SLC9A6-Gens. Der Basenaustausch im Exon 1 führt zu dem Codon TCA anstelle von GCA in der Wildtypsequenz. Im Protein wird deshalb an der Position 9 die Aminosäure Alanin durch Serin ersetzt (p.A9S). Um die Relevanz der gefundenen Veränderung beurteilen zu können, wurde Exon 1 des SLC9A6-Gens bei den Eltern der Patientin sequenziert. 48 Ergebnisse Bei der Mutter fand sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens ebenfalls die Veränderung c.25G>T(p.A9S). Bei dem Vater zeigte sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens keine Abweichung von der Wildtypsequenz. Außerdem wurden Untersuchungen zur XInaktivierung bei der Patientin und ihrer Mutter durchgeführt. Bei der Patientin zeigte sich ein Inaktivierungsmuster von 69:31 und bei der Mutter ein X-Inaktivierungsmuster von 60:40. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich keine relevante Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut. 3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen Im Anschluss an die Sequenzanalysen wurden alle DNA-Proben mit der MLPAMethode auf Duplikationen und Deletionen in den Exons der Gene CDKL5, ARX und TCF4 hin untersucht. Zum Zeitpunkt der Laborarbeit lag kein MLPA-Kit für das SLC9A6-Gen vor. Bei den Proben 8, 9 und 33 war die DNA-Qualität für das MLPA-Kit P189-B1 (CDKL5und ARX-Gen) nicht ausreichend und es konnte auch nach erneuter Verdünnung der Stock-DNA kein Ergebnis für diese drei Proben erzielt werden. Bei der Probe 4 lag dieses Problem ebenfalls bei der Anwendung des MLPA-Kits P075-A1(TCF4-Gen) vor. Im MLPA-Kit P075-A1 sind neben den Sonden für das TCF4-Gen auch Sonden für das FOXG1-Gen enthalten. Veränderungen im FOXG1-Gen sind für die kongenitale Variante des Rett-Syndroms verantwortlich. Bei der Patientin 32 zeigte sich eine Deletion des FOXG1-Gens. Im Bereich des TCF4-Gens zeigte sich keine Veränderung. Die Abbildung 8 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Elektropherogramm. Bei der Mutter und dem Vater zeigten die Untersuchungen ein unauffälliges Ergebnis, somit liegt bei den Eltern keine Deletion im FOXG1-Gen vor. Damit ist die Deletion bei der Patientin de novo aufgetreten. Parallel zu den Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurde im Institut für Humangenetik in Kiel bei der Patientin 32 eine Array-CGHAnalyse durchgeführt, in welcher sich ebenfalls bei der Patientin eine 1,894451 Mb große Deletion in der Chromosomenregion 14q12 zeigte. Die Deletion enthält das Gen FOXG1. 49 Ergebnisse Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen Oben: Die Sonden für das FOXG1-Gen wurden bei Probe 32 nicht amplifiziert. Die fehlenden Sonden sind durch die blauen Balken markiert. Unten links: Bei der Mutter wurden alle Sonden des TCF4-Gens sowie des FOXG1-Gens amplifiziert. Unten rechts: Beim Vater der Patientin 32 wurden ebenfalls alle Sonden des TCF4-Gens sowie des FOXG1-Gens amplifiziert. 50 Diskussion 4. Diskussion Im Rahmen der Dissertation habe ich mich mit der Frage beschäftigt, wie häufig Veränderungen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 für schwer behandelbare oder therapieresistente frühkindliche Epilepsien und mentale Retardierung ursächlich sind. Hierzu untersuchte ich die DNA-Proben von 34 nicht verwandten Patienten mit frühkindlicher Epilepsie und mentaler Retardierung. Bei einer Patientin wurde eine in der Literatur bislang nicht beschriebene de novo Mutation im CDKL5-Gen identifiziert. Bei einer weiteren Patientin wurde mittels MLPA eine Deletion des Gens FOXG1 identifiziert, die ebenfalls in einer diagnostisch durchgeführten ArrayCGH-Untersuchung nachgewiesen wurde. 4.1. Diskussion des Phänotyps Die 34 Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz Deutschland, sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Neben der Einsendung einer Blutprobe oder bereits extrahierter DNA wurde der im Anhang enthaltene Fragebogen ausgefüllt. Die Patienten wurden von Ärzten und Humangenetikern untersucht und beurteilt. Sieben Patienten wurden im Institut für Humangenetik der Universität Lübeck untersucht und in die Studie aufgenommen. Die Kriterien für die Aufnahme waren eine frühbeginnende schwer behandelbare oder therapieresistente Epilepsie und mentale Retardierung unterschiedlicher Ausprägung. Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt. Dadurch entstand eine sowohl phänotypisch als auch ätiologisch heterogene Kohorte. Weitere Einschränkungen hätten faziale Dysmorphiezeichen, respiratorische Auffälligkeiten oder Bewegungsstörungen sein können. Es wurden jedoch bewusst keine weiteren Einschränkungen für die Aufnahme in die Studie gewählt, um herauszufinden, ob es weitere Symptome oder Zeichen bei Patienten mit den untersuchten Krankheitsbildern gibt. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob es bislang unbekannte Symptome, die mit dem Phänotyp assoziiert sind, gibt. Die Patienten, bei denen im Rahmen meiner Dissertation eine Genveränderung diagnostiziert wurde, zeigen einen Phänotyp, der mit den neuesten Erkenntnissen der Literatur vereinbar ist. In der Zusammenschau der Befunde des Fragebogens wird ersichtlich, dass der Phänotyp vorwiegend neurologisch und weniger dysmorphologisch definiert wurde. Der Stellenwert der dysmorphologischen Zeichen nimmt bei den untersuchten Patienten eher eine kleine Rolle ein. Manchmal zeigt sich jedoch aufgrund des hohen Wiedererkennungswertes ein starker Hinweis auf ein Krankheitsbild. 51 Diskussion 4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde In dieser Arbeit wurden die kodierenden Anteile der Gene CDKL5, TCF4 und SLC9A6 bei allen Patienten sowie das ARX-Gen bei allen männlichen Patienten im Hinblick auf Mutationen, Deletionen und Duplikationen hin untersucht. Um größere exonale Duplikationen und Deletionen auszuschließen, wurden im Anschluss die Sequenzierung MLPA-Untersuchungen der Gene CDKL5, ARX und TCF4 durchgeführt. Für das Gen SLC9A6 stand zum Zeitpunkt der Laborarbeit kein kommerziell erhältliches MLPA-Kit zur Verfügung. 4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen Bei der Untersuchung des CDKL5-Gens konnte im Exon 17 bei insgesamt drei von 29 untersuchten Proben der Einzelnukleotid-Austausch c.2372A>C (p.Q791P), in der Datenbank dbSNP unter der Nummer rs35478150 geführt wird, identifiziert werden. Der Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde von Tao bereits bei gesunden Kontrollpersonen in der Literatur beschrieben (Tao et al., 2004) und hat mit hoher Wahrscheinlichkeit keine klinische Relevanz. In der japanischen Population wird der Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,012 für die Variante A/C heterozygot angegeben. Eine Untersuchung im Raum Houston, Texas, ergab eine Häufigkeit von 0,012 für die Variante A/A homozygot (NCBI db SNP, 2009a). Bislang fehlen Angaben zu großen Populationsstudien in der europäischen Bevölkerung. Der Polymorphismus liegt in der untersuchten Gruppe häufiger vor als er in den Populationsstudien ermittelt wurde. Daraus lässt sich schließen, dass das Kollektiv bezüglich des genetischen Hintergrundes verschieden ist. Am ehesten ist dies mit der geringen Fallzahl sowie der europäischen Population zu begründen. Bei Patient 9 ließ sich das Exon 14 im CDKL5-Gen mittels PCR nicht amplifizieren. Mit der MLPA-Untersuchung konnte aufgrund der mangelhaften DNA-Qualität kein Untersuchungsergebnis und damit eine Kontrolle des Befundes erzielt werden. Leider war es nicht möglich, eine neue Blutprobe des Patienten zu erhalten. Es gibt zwei mögliche Ursachen für die nicht mögliche Amplifikation des Exons 14 bei Patient 9. Die erste Möglichkeit besteht in einer hemizygoten Deletion des Exon 14 im CDKL5-Gen. Diese Vermutung ließe sich mittels der MLPA-Methode bestätigen. Dann wären alle Sonden für das Exon 14 des CDKL5-Gens deletiert. Leider stand uns keine neue Blutprobe zur Verfügung, um diese Hypothese zu bestätigen. Andererseits könnte eine Sequenzvariation im Bereich der Primerbindungsstelle vorliegen. Somit könnte der PCR-Primer nicht binden und es entstünde kein PCRProdukt. Würde hingegen ein anderer Primer mit einer anderen Bindungsstelle 52 Diskussion verwendet werden, wäre ermittelbar, ob dann ein PCR-Produkt entsteht. Auch diese Möglichkeit ließe sich mittels MLPA-Methode bestätigen. Exon 14 würde dargestellt werden, da die Sonden für das Exon 14 anders als für die Primer für die PCR liegen. Aus den Vorbefunden des Patienten 9 geht hervor, dass bei ihm zum Zeitpunkt der Datenerhebung eine seit dem zweiten Lebensjahr bestehende unter Valproat kontrollierte myoklonische Epilepsie mit einzelnen fiebergebundenen Anfällen und eine moderate mentale Retardierung besteht. Bei der Mutter besteht eine juvenile myoklonische Epilepsie und zwei Cousinen mütterlicherseits sowie ein Kind einer der Cousinen sind ebenfalls an Epilepsie erkrankt. Typische Merkmale von Patienten mit pathogenen Veränderungen im CDKL5-Gen sind jedoch die früh, meist vor dem sechstem Lebensmonat beginnende Epilepsie, die sich zu einer komplexen überwiegend therapieresistenten epileptischen Enzephalopathie entwickelt, Bewegungsstörungen, eine schwere geistige Behinderung, Hypotonie und stereotype Handbewegungen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al., 2009, Tao et al., 2004, Weaving et al., 2004). Der Phänotyp von Patienten 9 ist mit einer pathogenen Veränderung im CDKL5-Gen wenig vereinbar und eine Veränderung im CDKL5-Gen als Ursache für das klinische Bild des Patienten ist eher als unwahrscheinlich anzunehmen. Bei Patientin 35 zeigte sich in der Sequenzanalyse des CDKL5-Gens der heterozygote Austausch eines Basenpaares im Intron 16, ein Basenpaar entfernt von Exon 17. Bislang wurde diese Veränderung nicht in der Literatur beschrieben. Jedoch wurden bereits sehr ähnliche Sequenzvariationen als sogenannte Splice-Site-Mutationen im CDKL5-Gen nachgewiesen (Weaving et al., 2004; Evans et al., 2005; Archer et al., 2006). Die in der Literatur beschriebenen Veränderungen liegen wie die bei Patientin 35 identifizierte Veränderung jeweils ein Basenpaar vor Beginn eines Exons des CDKL5-Gens. Das Onlineprogramm "Mutation T@ster" klassifiziert diese Veränderung als mutmaßlich pathologisch aufgrund der Veränderung innerhalb der Splice-Site, die wahrscheinlich zu einem cdkl5-Protein führt, in welchem das Exon 17 fehlt, (http://www.mutationtaster.org/). In der Zusammenschau mit dem klinischen Phänotyp (siehe 3.2.1.1) und den erhobenen unauffälligen Befunden bei den Eltern der Patientin ist davon auszugehen, dass es sich bei der Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im CDKL5-Gen um eine pathogene Mutation handelt, welche bei der Patientin 35 de novo entstanden ist und als Ursache für ihre Symptomatik anzusehen ist. Wie bei vielen Patienten, von denen in der Literatur berichtet wurde, wurde bei der Patientin 35 zunächst ein Rett-Syndrom ausgeschlossen und hinsichtlich des Angelman-Syndroms kein pathologischer Befund erhoben. Die Patientin zeigt mit der 53 Diskussion frühbeginnenden therapieresistenten Epilepsie, der schweren psychomotorischen Retardierung, einer muskulären Hypotonie, stereotypen Handbewegungen, keinerlei Sprachentwicklung und einer Gangataxie die typischen Symptome von Patienten mit CDKL5-Mutationen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al., 2009, Tao et al., 2004, Weaving et al., 2004). Castrén et al. zeigten, dass Patienten mit CDKL5Mutationen eine in den ersten sechs Lebensmonaten beginnende Epilepsie aufweisen wie es bei Patientin 35 zutrifft. Dies unterscheidet sie von Patienten mit einem durch MECP2-Mutationen verursachten Rett-Syndrom (Castrén et al., 2011). Bei einigen Patienten mit CDKL5-Mutationen wurden wie bei unserer Patientin Veränderungen im Schädel-MRT beschrieben (Córdova-Fletes et al., 2010, Liang et al., 2011). Andere Autoren beschreiben, dass Patienten mit CDKL5-Mutationen keine Veränderungen im MRT des Schädels aufweisen (Archer et al., 2006, Artuso et al., 2010 Erez et al., 2009). Bei Patientin 35 besteht aufgrund der MRT-Befunde der Verdacht auf eine fokale kortikale Dysplasie links. Die Beschreibungen des elektroklinischen Bildes von Patienten mit pathogenen Veränderungen im CDKL5-Gen sind in der Literatur vielfältig. Sie umfassen infantile Spasmen (Kalscheuer et al., 2003), eine myoklonische Enzephalopathie (Buoni et al., 2006) und eine in drei Stadien verlaufende Enzephalopathie (Bahi-Buisson et al., 2008b). Die Patientin entwickelte im dritten Lebensmonat eine Epilepsie mit unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und klonischer sowie generalisiert tonischklonischer Symptomatik. Von einem ähnlichen Bild berichten Melani et al., die elektroklinische Befunde im ersten Lebensjahr von Patienten mit CDKL5-Mutationen untersucht haben (Melani et al., 2011). Das Langzeit-EEG der Patientin 35 zeigte im Alter von 3 ½ Jahren eine generalisierte und links frontal bzw. links zentral intermittierende Verlangsamung, multifokale epilepsietypische Potentiale in Form von Sharp-Waves und Polyspikes. Im Alter von vier Jahren zeigt sich bei ihr ein Bild aus infantilen Spasmen, Absencen, tonische Anfälle mit Nickbewegungen des Kopfes sowie längere tonische Anfälle. Das interiktale EEG der Patientin 35 zeigt im Alter von 4 Jahren eher generalisierte Auffälligkeiten bei häufigen infantilen Spasmen. Ein klares Bild mit drei Phasen in der Entwicklung der epileptischen Enzephalopathie ist bei der Patientin bislang nicht beschrieben. Bahi-Buisson et al. beschrieben zwölf Patienten mit initial normaler Hintergrundaktiviät und sich im Alter von sechs Monaten bis drei Jahren anschließender Verschlechterung im EEG (Bahi-Buisson et al., 2008b.) Liang et al. identifizierten bei 5% der männlichen und 14% der weiblichen Patienten mit epileptischer Enzephalopathie pathogene Veränderungen im CDKL5-Gen (Liang et al., 54 Diskussion 2011). Die Patienten dieser Studie wurden wie bei Liang et al. aufgrund ihrer epileptischen Enzephalopathie bestehend aus therapieresistenter oder schwer behandelbarer Epilepsie und moderater bis schwerer Entwicklungsverzögerung untersucht. 4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen Bislang wurden über 100 pathogene TCF4- Veränderungen in der Literatur mit beschrieben, es sind jedoch keine genauen Daten zur Prävalenz oder Inzidenz vorhanden. Rosenfeld et al. untersuchten während einer 17-monatigen Untersuchung 13186 Proben von Patienten mit geistiger Behinderung mittels Array-CGH und konnten insgesamt sieben Personen identifizieren, die eine Deletion, welche das TCF4-Gen einschloss, trugen. Davon ausgehend schätzen die Autoren die Häufigkeit des PittHopkins-Syndroms für den US-Bundesstaat Washington auf 1:34000-1:41000 (Rosenfeld et al., 2009). Bei der Untersuchung des TCF4-Gens wurde in dieser Studie bei 20/34 Patienten (59%) im Exon 19 der Einzelnukleotid-Austausch c.2226A>G (rs8766) nachgewiesen. 18% der Patienten haben die Variante G/G homozygot und 41% haben die Variante A/G heterozygot. Angaben zur Häufigkeit in der europäischen Population des SNPs fehlen bislang. In einer gemischten afroamerikanischen-kaukasischen Population wird der Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,133 für die homozygote Variante A/A angeben, die heterozygote Variante A/G hat eine Häufigkeit von 0,469. Der Polymorphismus ist damit in der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gruppe in der heterozygoten Variante A/G etwas seltener als in der gemischten Population. Allerdings liegen Daten zu mehreren Populationen vor, in denen die Varianten in unterschiedlicher Verteilung vorkommen. Die Populationen sind jedoch nicht näher beschrieben (NCBI db SNP, 2009b). Der Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde 2007 von Brockschmidt et al. bei einer Patientin mit einer 0,5 Mb umfassenden Mikrodeletion auf Chromosom 18q21.2, welche das 5„-Ende des TCF4-Gens umfasste, in heterozygoter Form nachgewiesen. Bei den gesunden Eltern lag die heterozygote Variante A/G beziehungsweise die homozygote Variante A/A vor (Brockschmidt et al., 2007). Die Veränderung hat keine klinische Relevanz, da es sich um eine stille Mutation handelt und sie in der gesunden Kontrollpopulation vorkommt. Zwei Patienten (Patient 2 und 4) dieser Gruppe erfüllten die von Zweier et al. definierten Kriterien für das Pitt-Hopkins-Syndrom-Screening. Wenigstens zwei der drei folgenden Auffälligkeiten sollten zutreffen: schwere mentale Retardierung, Auffälligkeiten bei der Atmung sowie die für ein Pitt-Hopkins-Syndrom typischen 55 Diskussion fazialen Dysmorphiezeichen (Zweier et al., 2007). Bei beiden Patienten wurden die häufigen Ursachen für das klinische Erscheinungsbild ausgeschlossen, eine pathogene TCF4-Veränderung tragen beide ebenfalls nicht. Dies stützt die Aussage von Kalscheuer et al. (Kalscheuer et al., 2008). Die Autoren nehmen an, dass TCF4Mutationen in einem weitaus variableren Phänotyp resultieren als bis heute bekannt ist. Die Variabiliät erkläre sich in der zugrunde liegenden Veränderung des TCF4-Gens und des resultierenden Proteins. Bei einem zumindest teilweise funktionellen Protein treten weniger schwere Auswirkungen auf den Phänotyp auf. Zudem wurden kürzlich homozygote sowie compound-heterozygote Veränderungen in den Genen CNTNAP2 und NRXN1 als mögliche Ursache für eine dem Pitt-HopkinsSyndrom ähnelnde schwere Entwicklungsverzögerung mit früh beginnender Epilepsie identifiziert (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009), die autosomal rezessiv vererbt wird. 4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen Mutationen im SLC9A6-Gen wurden bislang nur bei männlichen Patienten beschrieben. Dabei sind Frauen gesunde Anlageträgerinnen oder sie haben Lernschwierigkeiten und Verhaltensauffälligkeiten (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008). Angaben über die Häufigkeit von Patienten mit Mutationen im SLC9A6-Gen bei Patienten mit Epilepsie gibt es bislang nicht. Fichou identifizierte einen männlichen Patienten mit der Variante c.25G>T und dem daraus resultierenden Aminosäuretausch Alanin zu Serin im Protein (Fichou et al., 2009). Bei Alanin an der Position 9 des Proteins handelt es sich um eine höchst konservierte Aminosäure bei Säugern, was für die wichtige Rolle in der Proteinfunktion spricht (Fichou et al., 2009). Die bei der Patientin 14 im Exon 1 des SLC9A6-Gens gefundene maternal vererbte Missense-Veränderung c.25G>T führt zum Aminosäureaustausch p.A9S im gebildeten Protein. Das Vorhersageprogramm "Mutation T@ster" nimmt keine Beeinträchtigung der Proteinfunktion an und die Veränderung wird als Polymorphismus eingestuft. Um die Relevanz der gefundenen Veränderung bei der Patientin 14 im SLC9A6-Gen weiter abzuklären, wurde zunächst das Exon 1 bei den Eltern der Patientin sequenziert, wobei sich bei der gesunden Mutter ebenfalls die Veränderung c.25.G>T(p.A9S) fand. In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass Veränderungen auf dem X-Chromosom, die üblicherweise nicht zu einer klinischen Symptomatik bei Frauen führen, eine klinische Bedeutung bekommen. Dies geschieht im Falle eines verschobenen XInaktivierungsmusters. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich keine relevante Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut. 56 Diskussion Nach der Synopse der erhobenen Befunde im SLC9A6-Gen sowie der Untersuchung des X-Inaktivierungsmusters ist davon auszugehen, dass es sich bei der Veränderung c.25G>T im SLC9A6-Gen um einen Polymorphismus handelt, der für die Symptomatik der Patientin nicht ursächlich ist. Bei der Patientin 31 ließ sich das Exon 14 im SLC9A6-Gen mittels PCR nicht amplifizieren. Eine homozygote Deletion des Exons 14 ist als höchst unwahrscheinlich anzunehmen. Homozygote Deletionen im SLC9A6-Gen wurden in der Literatur bislang nicht beschrieben. Um der Ursache für diesen Befund auf den Grund zu gehen, könnte man theoretisch eine quantitative PCR-Untersuchung oder eine hochauflösende ArrayCGH-Untersuchung durchführen. Eine Alternative wäre das Design anderer Primer für Exon 14 bzw. für den Intron-Exon Übergang, um Veränderungen in der Primerbindungsstelle auszuschließen. Leider war es im Rahmen der Arbeit nicht möglich, diesen Fragen nachzugehen. 4.3. Diskussion der Methoden In dieser Arbeit habe ich mehrere molekulargenetische Untersuchungsmethoden wie PCR mit anschließender Sequenzierung sowie Sequenzanalyse und MLPA angewandt. Die DNA-Sequenzierung erfasst Mutationen in den untersuchten Genabschnitten, sie umfasst jedoch keine quantitative Beurteilung des Genmaterials und damit keine Duplikationen oder Deletionen in heterozygotem Zustand. Im Anschluss wurden die MLPA-Untersuchungen durchgeführt, bei der es sich um eine Methode zur relativen, quantitativen Darstellung von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in nur einem Ansatz handelt. Mit ihr werden Duplikationen, Deletionen und heterozygot vorliegende Punktmutationen erfasst. Bei der PCR mit anschließender Sequenzierung und MLPA handelt sich generell um gut etablierte und verlässliche Methoden, die lange Anwendung in der Praxis finden. Mögliche Mutationen in regulatorischen Elementen der Gene wurden nicht untersucht und können daher nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurden die 5„-und 3„untranslatierten Regionen (UTR) nicht auf Veränderungen gescreent. Eine alternative Herangehensweise zur Identifikation von Deletionen ganzer Exons oder Gene wäre die quantitative PCR von jedem Exon oder die Array-CGH-Methode. Als problematisch gestaltete sich die Anfälligkeit der MLPA-Methode für Verunreinigungen. Die zu untersuchende DNA wurde teilweise im hiesigen Institut für Humangenetik aus Vollblut extrahiert, teilweise wurde die bereits extrahierte DNA eingesendet. In den verschiedenen Einsende-Laboren werden unterschiedliche Reagenzien zur Extraktion der DNA verwendet. Gerade bei in externen Laboren 57 Diskussion extrahierter DNA gestaltete sich die Durchführung der MLPA-Methode als schwierig und führte dazu, dass es teilweise leider nicht möglich war, Befunde zu erheben. Bei etwa 80-90% der klinisch diagnostizierten, komplexen durch genetische Veränderungen verursachten Krankheiten wird heute die zugrunde liegende GenVariation nicht gefunden, da im Rahmen der bislang üblichen „Gen-für-Gen“Sequenzierung nach Sanger wegen der hohen Kosten und des großen Zeitaufwandes häufig nur wenige Gene untersucht werden können. Die Methode der üblichen „Gen-für-Gen“-Sequenzierung nach Sanger stößt an Kapazitätsgrenzen bei einer Syntheselänge von über 1000-1200 bp nach dem spezifischen Primer. Im Rahmen des Humanen Genom Projektes wurde die sogenannte „Shot-Gun“-Sequenzierung entwickelt, mit der es möglich ist, längere Fragmente zu sequenzieren (Venter et al., 2003). Das Prinzip der „Parallel“Sequenzierung, welches bei der „Shot-Gun“-Sequenzierung angewandt wird, gilt auch bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung („Next Generation Sequencing“), die in jüngster Zeit entwickelt wurde. Sie ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung aller kodierenden Sequenzen der menschlichen Gene innerhalb von nur sieben Tagen, was auch als Exom-Sequenzierung bezeichnet wird. (Biskup, 2010). Zur Diagnostik von Erkrankungen, die Veränderungen in unterschiedlichen Gene ausweisen, bietet sich die gleichzeitige Sequenzierung mehrerer für diese Krankheit in Betracht kommender Gene an. Dazu werden im Rahmen der HochdurchsatzSequenzierung Diagnostik-Panels genutzt, mit denen sämtliche für eine Krankheit in Frage kommenden Gene zugleich auf einer Sequenzierplattform gezielt sequenziert und anschließend ausgewertet werden (Zhang et al., 2011). So gibt es inzwischen bereits ein Diagnostik-Panel zur Identifikation genetischer Ursachen von Epilepsie (Biskup, 2010) und mentaler Retardierung. Diese Technik stand bei Beginn meiner Dissertation noch nicht zur Verfügung. Sie bietet sich für die Patienten dieser Studie an, da es sich um eine unspezifische heterogene Gruppe handelt. Für die „Whole-Exome“- und „Whole-Genome“-Sequenzierung ist jedoch zu bedenken, dass durch die noch schnellere Hochdurchsatz-Sequenzierung auch neue, bis jetzt nicht zu beantwortende Fragen aufkommen können. Dazu gehören die Sequenzvariationen, die gefunden werden, deren Bedeutungen bislang nicht bekannt sind sowie belastende Zufallsbefunde mit schwerwiegenden Konsequenzen für Patienten und ihre Angehörigen. Es besteht ebenso die Möglichkeit, dass trotz der Hochdurchsatz-Sequenzierung vieler Gene die Ursache für die Erkrankung nicht gefunden wird. Mittlerweile etabliert sich das „Next Generation Sequencing“ auch in der Praxis zur Sequenzierung neuer Gene sowie genomweiter Resequenzierungs- oder 58 Diskussion Methylierungs-Analysen. Deshalb weckt diese neue Methode Hoffnung auf höhere Aufklärungsquoten genetisch bedingter Erkrankungen und ist zudem auf eine effizientere, kostengünstigere und schnellere Art und Weise als bislang möglich. Die Wahrscheinlichkeit, dass die genetische Ursache von Epilepsien mit Hilfe dieser Methoden gefunden wird, erhöht sich dadurch deutlich. 4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den Vorbefunden Bei drei Patienten lagen auffällige Array-CGH-Analysen aus Untersuchungen in auswärtigen Laboren vor. Bei Patient 5 und seiner phänotypisch gesunden Mutter ist ein Abschnitt von etwa 74kb auf dem Chromosom 10 deletiert. In diesem Abschnitt ist das PCDH15-Gen enthalten. Veränderungen des Gens sind mit der autosomalrezessiven Form des Usher-Syndroms Typ I assoziiert. Das Usher-Syndrom geht mit einer früh einsetzenden Innenohrschwerhörigkeit und einem später einsetzenden Verlust des Sichtfeldes einher. Damit ist der Befund aus der Array-CGH-Untersuchung nicht ursächlich für das klinische Erscheinungsbild des Patienten, bei dem eine myoklonische Epilepsie seit dem zweiten Lebensjahr, eine schwere mentale Retardierung, häufige Lachanfälle und der Verlust erworbener Fähigkeiten im Vordergrund stehen. Bei Patientin 8 wurde mit der Array-CGH-Untersuchung eine etwa 130kb große Deletion auf dem X-Chromosom nachgewiesen. Ob die Veränderung bei dem Vater oder der Mutter des Patienten ebenfalls vorliegt, ist nicht bekannt. In dem deletierten Bereich liegt das Gen KIAA2022. Cantagrel et al. beschreiben zwei miteinander verwandte männliche Patienten mit einer Inversion auf die X-Chromosom, bei denen sich einer der beiden Bruchpunkte innerhalb des KIAA2022-Gens befindet. Neben anderen Auffälligkeiten zeigten die beiden Patienten eine Entwicklungsverzögerung, infantilen Autismus, eine schwere mentale Retardierung sowie eine fehlende Sprachentwicklung. Die Konduktorinnen dieser familiären Inversion werden als klinisch unauffällig beschrieben (Cantagrel et al., 2004). Dass ein Zusammenhang dieser Deletion und der klinischen Symptomatik der Patientin besteht, ist zum jetzigen Zeitpunkt als unwahrscheinlich anzunehmen. 4.5. Weitere Differentialdiagnosen Bei 2 von 34 untersuchten Patientinnen und Patienten mit einer schwer behandelbaren oder therapieresistenten Epilepsie und mentaler Retardierung konnte die zugrunde liegende genetische Ursache im Rahmen meiner Arbeit gefunden werden. 59 Diskussion Viele der Gene, deren Veränderung zu den in dieser Arbeit beschriebenen Krankheitsbildern führen, sind bislang nicht bekannt. Zudem gibt es viele Gene, die oder deren Produkte miteinander agieren. Pathogene Veränderungen bzw. Deletionen des FOXG1-Gens sind für die kongenitale Variante des Rett-Syndroms verantwortlich (Ariani et al., 2008; Bahi-Buisson et al., 2010; Le Guen et al., 2011; Kortüm et al., 2011). Zum klinischen Erscheinungsbild gehören laut Kortüm et al. postnatale Wachstumsverzögerung mit Mikrozephalie, eine schwere geistige Behinderung mit verzögerte oder ausbleibender Sprachentwicklung, Defiziten im Sozialverhalten, Bewegungsstörungen wie Stereotypien und Dyskinesien, Epilepsie, Schlafstörungen, Episoden mit häufigem Weinen, wiederholte Aspirationen sowie ein gastroösophagealer Reflux. Die Untersuchung des FOXG1-Gens bietet sich bei Patienten mit mentaler Retardierung, erworbener Mikrozephalie, frontaler Pachygyrie oder Hypoplasie des Corpus Callosum (Kortüm et al., 2011) sowie nach Ausschluss von Veränderungen im MECP2-Gen und im CDKL5-Gen an (Philippe et al., 2010). Die EEG-Ableitungen zeigen ein multifokales Muster mit „spikes“ und „sharp waves“ mit gelegentlicher paroxysmaler Aktivität (Ariani et al., 2008). Der klinische Phänotyp überschneidet sich teilweise mit dem des Angelman-Syndroms, des Rett-Syndroms, des Pitt-Hopkins-Syndroms und den SLC9A6-assoziierten Syndromen. Dennoch unterscheidet sich die Symptomatik durch Dyskinesien, Auffälligkeiten im MRT und darin, dass es keine Rückschritte in der Entwicklung sowie keine respiratorischen Arrhythmien gibt, vom Rett-Syndrom (Kortüm et al., 2011; Le Guen et al., 2011). Die Tatsache, dass bei einer der Patientinnen während der Untersuchungen für die vorliegende Arbeit die Deletion des FOXG1-Gens mittels Array-CGH-Analyse identifiziert wurde und durch MLPA bestätigt wurde, zeigt, dass Veränderungen im FOXG1-Gen bzw. Deletionen des Gens bei männlichen und weiblichen Patienten mit den charakteristischen Merkmalen auf jeden Fall differentialdiagnostisch in Betracht kommen. Unlängst wurde die Haploinsuffizienz des MEF2C-Gens (Le Meur et al., 2010) durch Deletion als Ursache für ein ähnliches Krankheitsbild mit schwerer mentaler Retardierung, Fehlen der expressiven Sprache, muskuläre Hypotonie, stereotypen Handbewegungen, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und einer Epilepsie identifiziert. MEF2C kodiert für ein Protein, welches in der Neurogenese eine wichtige Rolle der Regulation der exzitatorischen Synapsen einnimmt (Barbosa et al., 2008). Im Rahmen einer weiteren Dissertation, die im Institut für Humangenetik Lübeck verfasst wurde, wurde die DNA der Patienten dieser Studie mittels Sequenzierung und MLPA auf 60 Diskussion Veränderungen im MEF2C-Gen hin untersucht. In dieser Kohorte fand sich keine Veränderung im MEF2C-Gen. Wie bereits in Abschnitt 4.2., der Diskussion der molekulargenetischen Befunde, erwähnt, wurden homozygote bzw. heterozygote Veränderungen der Gene CNTNAP2 sowie NRXN1 als Ursache für das Pitt-Hopkins-like Syndrom 1 bzw 2 identifiziert (Gregor et al., 2011). Im Gegensatz zum Pitt-Hopkins-Syndrom liegen keine charakteristischen fazialen Dysmorphiezeichen vor. Die Patienten sind meist schwer geistig behindert und haben in der Regel eine eingeschränkte Sprachentwicklung. Ebenso werden bei zwei Patienten mit heterozygoten Defekten des CNTNAP2-Gens Verlust der Sprache und der Rückschritte der motorischen Entwicklung mit Beginn der Epilepsie beschrieben (Gregor et al., 2011). Es besteht eine Diskrepanz zwischen der schweren Sprachentwicklungsstörung und der relativ milden Verzögerung der motorischen Entwicklung im Vergleich zu Patienten mit klassischem Pitt-HopkinsSyndromen oder auch Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen. Bei allen Patienten mit heterozygoten CNTNAP2- Veränderungen besteht eine früh beginnende Epilepsie (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009). Im Vergleich zu Patienten mit Veränderungen der im Rahmen dieser untersuchten Arbeit haben die Patienten keine Mikrozephalie, sondern sind in Relation zum Gesamtkörpermaß eher makrozephal (Strauss et al., 2006). Dieser Aspekt stellt somit einen wichtigen differentialdiagnostischen Faktor dar. Ebenso sind Auffälligkeiten in der Atmung, fokale zerebrale Malformationen sowie Verhaltensauffälligkeiten wie autistische Züge und stereotype Bewegungen beschrieben. Eine weitere Differentialdiagnose ist das durch pathogene Veränderungen im ZEB2Gen verursachte Mowat-Wilson-Syndrom, welches Gemeinsamkeiten mit dem PittHopkins-Syndrom aufweist. Dazu gehören schwere mentale Retardierung und ähnliche charakteristische Gesichtszüge. Variable Symptome sind Corpus-Callosum-Agenesie, Epilepsie, angeborene Herzfehler, Mikrozephalie, Kleinwuchs, Hypotonie und Morbus Hirschsprung (Garavelli und Mainardi, 2007). Eine wichtige Rolle nimmt außerdem die Array-CGH-Analyse als Screeningmethode ein. Bei 20/34 der Patienten wurde im Vorfeld bzw. während der Studie eine ArrayCGH-Analyse durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse werden häufig Veränderungen gefunden, die bislang nicht als für ein Erkrankungsbild ursächlich beschrieben wurden. In den deletierten oder duplizierten Regionen sind meist so viele Gene enthalten, dass ein Zusammenhang der Veränderung mit den Symptomen wahrscheinlich ist. So findet sich bei Kindern mit mentaler Retardierung und unauffälliger konventioneller Chromosomenanalyse in etwa 10% eine Mikroaberration, die den Phänotyp erklärt (Sagoo et al., 2009). Mittels Array-CGH-Untersuchungen wurden Kandidatengene 61 Diskussion identifiziert, deren Veränderung ein ähnliches Krankheitsbild verursachen wie Mutationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6. 4.6. Ausblick Betrachtet man diese Studie rückblickend, so fällt auf, dass die Kohorte mit 34 Patienten zu anderen großen Untersuchungen in diesem Bereich im Vergleich recht klein ist. Aus Kapazitätsgründen war es jedoch nicht möglich, eine größere Gruppe zu untersuchen. Es ist denkbar, dass mehr ursächliche Mutationen in einer nach strengeren Kriterien definierten Kohorte gefunden worden wären. Darauf wurde bewusst verzichtet, um herauszufinden, ob die in der Literatur beschriebenen Phänotypen variabler sind als bisher angenommen. Dazu ist eine Kohorte notwendig, für die die Einschlusskriterien nicht so strikt gehalten sind, bislang nicht bekannte Merkmale der Krankheitsbilder zu identifizieren. Epilepsie ist ein häufiges Krankheitsbild in der humangenetischen Sprechstunde und für mehr als die Hälfte der Epilepsien wurde bereits eine genetische Ursache gefunden (Pal et al., 2010). Dennoch sollte bedacht werden, dass die genetischen Ursachen für Epilepsie sehr heterogen und vielfältig sind. Während der experimentellen Phase meiner Dissertation erhöhte sich die Zahl der Gene, deren Veränderungen eine Epilepsie verursachen, beträchtlich. Die Einführung des „Next-Generation-Sequencing“ wird in nächster Zeit zu deutlich höheren Aufklärungsquoten beitragen. Zudem ist davon auszugehen, dass viele weitere Gene in nächster Zeit identifiziert werden, die im Zusammenhang mit Epilepsie und geistiger Behinderung stehen. Bei dieser Kohorte würden sich Untersuchungen mit einem sogenannten „EpilepsiePanel“ mittels „Next-Generation-Sequencing“ geradezu anbieten, da es sich um eine unspezifische heterogene Gruppe handelt. 62 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Häufigkeit von Mutationen, Deletionen und Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 bei Patienten mit frühbeginnender Epilepsie und mentaler Retardierung zu untersuchen. Zudem sollte nach Möglichkeit das klinische Erscheinungsbild von Patienten mit Veränderungen in den untersuchten Genen genauer definiert werden. Grundlage der Untersuchungen waren DNA-Proben von 34 Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung. Die Patienten zeigten neben der frühbeginnenden Epilepsie und der mentalen Retardierung verschiedene Auffälligkeiten. Viele der Patienten hatten eine muskuläre Hypotonie, Fütterungsprobleme in der Säuglingszeit und entwickelten später Bewegungsstörungen wie Ataxie und Dyskinesien und stereotype Handbewegungen. Die Epilepsie war meist schwer behandelbar bzw. therapieresistent. Die EEGs waren überwiegend hochgradig pathologisch und wiesen auf ein übergeordnetes Krankheitsbild hin. Die kranialen MRTs zeigten sich ebenfalls zu einem Großteil auffällig, wenn auch unspezifischer. Die klinischen, radiologischen und genetischen Vorbefunde der Patienten wurden im Rahmen dieser Arbeit ausgewertet und bewertend zusammengefasst. Anschließend wurden die DNA-Proben der Patienten mittels Sanger-Sequenzierung und MLPA auf Mutationen, Deletionen und Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und hin untersucht. Die kodierenden Abschnitte des SLC9A6-Gens wurden bei allen Proben nur mittels Sanger-Sequenzierung analysiert. In dieser Studie wurde bei einer Patientin eine pathogene Mutation im CDKL5-Gen gefunden. Durch die MLPA-Untersuchung wurde bei einer weiteren Patientin eine Deletion des FOXG1-Gens identifiziert. Beide Phänotypen der Patienten sind mit den in der Literatur beschriebenen Phänotypen vereinbar. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist zu betonen, dass bei der Untersuchung von DNA auf Veränderungen in den oben genannten Genen darauf geachtet werden sollte, dass häufige Ursachen für eine schwere mentale Retardierung und eine frühbeginnende Epilepsie im Vorfeld ausgeschlossen werden sollten. Dazu gehören das Rett-Syndrom sowie das Angelman-Syndrom. Veränderungen in den analysierten Genen stellen insgesamt eine seltene Ursache für frühbeginnende Ursache für Epilepsie und mentale Retardierung dar. 63 Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis 1. Alfradique I, Vasconcelos M (2007) Juvenile myoclonic epilepsy. Arq Neuropsiquiatr. 65(4-B):1266-1271. 2. American Psychiatric Association (1994) Task force on DSM-IV: diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM IV. Washington, DC: American psychiatric association. 3. Amiel J, Rio M, de Pontual L, Redon R, Malan V, Boddaert N, Plouin P, Carter NP, Lyonnet S, Munnich A, Colleaux L (2007) Mutations in TCF-4, encoding a class I basic helix-loop-helix transcription factor, are responsible for Pitt-Hopkins syndrome associated with autonomic dysfunction. Am J Hum Genet. 80:988-993. 4. Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY (1999) Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23:185-188. 5. Angelman H (1965) 'Puppet children'. A report on three cases. Dev Med Child Neurol. 7: 681-688. 6. Archer HL, Evans J, Edwards S, Colley J, Newbury-Ecob R, O'Callaghan F, Huyton M, O'Regan M, Tolmie J, Sampson J, Clarke A, Osborne J (2006) CDKL5 mutations cause infantile spasms, early onset seizures, and severe mental retardation in female patients. J Med Genet. 43:729-734. 7. Ariani F, Hayek G, Rondinella D, Artuso R, Mencarelli MA, Spanhol-Rosseto A, Pollazzon M, Buoni S, Spiga O, Ricciardi S, Meloni I, Longo I, Mari F, Broccoli V, Zappella M, Renieri A (2008) FOXG1 is responsible for the congenital variant of Rett Syndrome. Am J Hum Genet. 83:89-93. 8. Armani R, Archer H, Clarke A, Vaseduvan P, Zweier C, Ho G, Williamson S, Cloosterman D, Yang N, Christodoulou J (2012) Transcription Factor 4 and Myocyte Enhancer Factor 2C mutations are not common causes of Rett Syndrome. Am J Hum Genet. 158A:713-719. 9. Artuso R, Mencarelli MA, Polli R, Sartori S, Ariani F, Pollazzon M, Marozza A, Cilio MR, Specchio N, Vigevano F, Vecchi M, Boniver C, Dalla Bernardina B, Parmeggiani A, Buoni S, Hayek G, Mari F, Renieri A, Murgia A (2010) Early-onset seizure variant of Rett syndrome: Definition of the clinical diagnostic criteria. Brain Dev. 32:17-24. 10. Asher YJT, Scaglia F (2012) Molecular bases and clinical spectrum of early infantile epileptic encephalopathies. Eur J Med Genet. 55:299-306. 11. Bahi-Buisson N, Nectoux J, Rosas-Vargas H, Milh M, Boddaert N, Girard B, Cances C, Ville D, Afenjar A, Rio M, Héron D, N'guyen Morel MA, Arzimanoglou A, Philippe C, 64 Literaturverzeichnis Jonveaux P, Chelly J, Bienvenu T (2008a) Key clinical features to identify girls with CDKL5 mutations. Brain 131:2647-2661. 12. Bahi-Buisson N, Kaminska A, Boddaert N, Rio M, Afenjar A, Gérard M, Giuliano F, Motte J, Héron D, Morel MA, Plouin P, Richelme C, des Portes V, Dulac O, Philippe C, Chiron C, Nabbout R, Bienvenu T. (2008b) The three stages of epilepsy in patients with CDKL5 mutations. Epilepsia 49(6):1027-1037. 13. Bahi-Buisson N, Nectoux J, Girard B, van Esch H, de Ravel T, Boddaert N, Plouin P, Rio M, Fichou Y, Chelly J, Bienvenu T (2010) Revisiting the phenotype associated with FOXG1 mutations: two novel cases of congenital Rett variant. Neurogenetics 11:241-249. 14. Barbosa AC, Kim MS, Ertunc M, Adachi M, Nelson ED, McAnally J, Richardson JA, Kavalali ET, Monteggia LM, Bassel-Duby R, Olson EN (2008) MEF2C, a transcription factor that facilitates learning and memory by negative regulation of synapse numbers and function. Proc Natl Acad Sci USA. 105: 9391-9396. 15. Bienvenu T, Poirier K, Friocourt G, Bahi N, Beaumont D, Fauchereau F, Ben Jeema L, Zemni R, Vinet MC, Francis F, Couvert P, Gomot M, Moraine C, van Bokhoven H, Kalscheuer V, Frints S, Gecz J, Ohzaki K, Chaabouni H, Fryns JP, Desportes V, Beldjord C, Chelly J. (2002) ARX, a novel Prd-class-homeobox gene highly expressed in the telencephalon, is mutated in X-linked mental retardation. Hum Mol Genet. 11: 981-991. 16. Biskup S (2010) Hochdurchsatz-Sequenzierung in der Humangenetischen Diagnostik. J Lab Med. 34:305-309. 17. Brockschmidt A, Todt U, Ryu S, Hoischen A, Landwehr C, Birnbaum S, Frenck W, Radlwimmer B, Lichter P, Engels H, Driever W, Kubisch C, Weber RG (2007) Severe mental retardation with breathing abnormalities (Pitt-Hopkins syndrome) is caused by haploinsufficiency of the neuronal bHLH transcription factor TCF4. Hum Mol Genet. 16:1488-1494. 18. Bruni O, Ferri Sleep disturbances in Angelman syndrome: a questionnaire study.R, D'Agostino G, Miano S, Roccella M, Elia M (2004) Brain Dev. 26:233-240. 19. Buoni S, Zannolli R, Colamaria V, Macucci F, di Bartolo RM, Corbini L, Orsi A, Zappella M, Hayek J (2006) Myoclonic encephalopathy in the CDKL5 gene mutation. Clin Neurophysiol.117:223-227. 20. Cantagrel V, Lossi AM, Boulanger S, Depetris D, Mattei MG, Gecz J, Schwartz CE, Van Maldergem L, Villard L (2004) Disruption of a new X linked gene highly expressed in brain in a family with two mentally retarded males. J Med Genet. 41:736-742. 21. Carouge D, Host L, Aunis D, Zwiller J, Anglard P (2010) CDKL5 is a brain MeCP2 target gene regulated by DNA methylation. Neurobiol Dis. 38:414-424. 65 Literaturverzeichnis 22. Castrén M, Gaily E, Tengström C, Lähdetie J, Archer H, Ala-Mello S (2011) Epilepsy caused by CDKL5 Mutations. Eur J Paediatr Neurol. 15:65-69. 23. Chelly J, Khelfaoui M, Francis F, Chérif B, Bienvenu T (2006) Genetics and pathophysiology of mental retardation. Eur J Hum Genet. 14:701-713. 24. Christianson AL, Stevenson RE, van der Meyden CH, Pelser J, Theron FW, van Rensburg PL, Chandler M, Schwartz CE (1999) X-linked severe mental retardation, craniofacial dysmorphology, epilepsy, ophthalmoplegia, and cerebellar atrophy in a large South African kindred is localized to Xq24-q27. J Med Genet. 36:759-766. 25. Clayton-Smith J, Laan L (2003) Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. J Med Genet. 40: 87–95. 26. Conti V, Marini C, Gana S, Sudi J, Dobyns WB, Guerrini R (2011) Corpus callosum agenesis, severe mental retardation, epilepsy, and dyskinetic quadriparesis due to a novel mutation in the homeodomain of ARX. Am J Med Genet. 155A:892-897. 27. Córdova-Fletes C, Rademacher N, Müller I, Mundo-Ayala JN, Morales-Jeanhs EA, García-Ortiz JE, León-Gil A, Rivera H, Domínguez MG, Kalscheuer VM (2010) CDKL5 truncation due to a t(X;2)(p22.1;p25.3) in a girl with X-linked infantile spasm syndrome. Clin Genet. 77(1):92-96. 28. Dagli A, Buiting K, Williams CA (2012) Molecular and Clinical Aspects of Angelman Syndrome. Mol Syndromol. 2:100-112. 29. Elia M, Falco M, Ferri R, Spalletta A, Bottitta M, Calabrese G, Carotenuto M, Musumeci SA, Lo Giudice M, Fichera M (2008) CDKL5 mutations in boys with severe encephalopathy and early-onset intractable epilepsy. Neurology. 71(13):997-999. 30. Erez A, Patel AJ, Wang X, Xia Z, Bhatt SS, Craigen W, Cheung SW, Lewis RA, Fang P, Davenport SL, Stankiewicz P, Lalani SR (2009) Alu-specific microhomologymediated deletions in CDKL5 in females with early-onset seizure disorder. Neurogenetics. 10:363-369. 31. Evans JC, Archer HL, Colley JP, Ravn K, Nielsen JB, Kerr A, Williams E, Christodoulou J, Gécz J, Jardine PE, Wright MJ, Pilz DT, Lazarou L, Cooper DN, Sampson JR, Butler R, Whatley SD, Clarke AJ (2005) Early onset seizures and Rettlike features associated with mutations in CDKL5. Eur J Hum Genet. 13:1113-1120. 32. Fichou Y, Bahi-Buisson N, Nectoux J, Chelly J, Héron D, Cuisset L, Bienvenu T (2009) Mutation in the SLC9A6 gene is not a frequent cause of sporadic Angelman-like syndrome. Eur J Hum Genet. 17:1378-1380. 33. Fisher RS, van Emde Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, Engel J Jr (2005) Epileptic seizures and epilepsy: Definitions proposed by the International League against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46:470-472. 66 Literaturverzeichnis 34. Fiumara A, Pittalà A, Cocuzza M, Sorge G (2010) Epilepsy in patients with Angelman syndrome. Ital J Pediatr. 36:31. 35. Garavelli L, Mainardi PC (2007) Mowat Wilson Syndrom. Orphanet J Rare Dis. 2:42. 36. Garbern JY, Neumann M, Trojanowski JQ, Lee VM, Feldman G, Norris JW, Friez MJ, Schwartz CE, Stevenson R, Sima AA (2010) A mutation affecting the sodium/proton exchanger, SLC9A6, causes mental retardation with tau deposition. Brain. 133:13911402. 37. Gardiner M (2005) Genetics of ididopathic generalized epilepsies. Epilepsia. 46(Suppl.):15-S20. 38. Gécz J, Cloosterman D, Partington M (2006) ARX: a gene for all seasons Curr Opin Genet Dev. 3:308-316. 39. Gilfillan GD, Selmer KK, Roxrud I, Smith R, Kyllerman M, Eiklid K, Kroken M, Mattingsdal M, Egeland T, Stenmark H, Sjøholm H, Server A, Samuelsson L, Christianson A, Tarpey P, Whibley A, Stratton MR, Futreal PA, Teague J, Edkins S, Gecz J, Turner G, Raymond FL, Schwartz C, Stevenson RE, Undlien DE, Strømme P (2008) SLC9A6 Mutations Cause X-linked Mental Retardation, Microcephaly, Epilepsy, and Ataxia, a Phenotype Mimicking Angelman Syndrome. Am. J. Hum. Genet. 82:1003-1010. 40. Glaze DG, Percy AK, Skinner S, Motil KJ, Neul JL, Barrish JO, Lane JB, Geerts SP, Annese F, Graham J, McNair L, Lee HS (2010) Epilepsy and the natural history of Rett syndrome. Neurology. 74:909-12. 41. Gregor A, Albrecht B, Bader I, Bijlsma EK, Ekici AB, Engels H, Hackmann K, Horn D, Hoyer J, Klapecki J, Kohlhase J, Maystadt I, Nagl S, Prott E, Tinschert S, Ullman R, Wohlleber E, Woods G, Reis A, Rauch A, Zweier C (2011) Expanding the clinical spectrum associated with defects in CNTNAP2 and NRXN1. BMC Medical Genetics. 12:106. 42. Hagberg B, Hagberg G (1997) Rett syndrome: epidemiology and geographical variability. Eur Child Adolesc Psychiatry.6:5-7. 43. Hay Jr. W, Levin M, Sondheimer J, Deterding R (2007) Current Diagnosis & Treatment in Pediatrics. 18 Ausgabe. Lange Medical Books/Mc Graw-Hill. New York. 44. Jackman C, Horn ND, Molleston JP, Sokol DK (2009) Gene associated with seizures, autism, and hepatomegaly in an Amish girl. Pediatr Neurol 40:310-313. 45. Kalscheuer VM, Tao J, Donnelly A, Hollway G, Schwinger E, Kübart S, Menzel C, Hoeltzenbein M, Tommerup N, Eyre H, Harbord M, Haan E, Sutherland GR, Ropers HH, Gécz J (2003) Disruption of the serine/threonin kinase 9 gene causes severe Xlinked infantile spasms and mental retardation. Am J Hum Genet. 72:1401-1411. 67 Literaturverzeichnis 46. Kalscheuer VM, Feenstra I, Van Ravenswaaij-Arts CM, Smeets DF, Menzel C, Ullmann R, Musante L, Ropers HH (2008) Disruption of the TCF4 gene in a girl with mental retardation but without the classical Pitt-Hopkins syndrome. Am J Hum Genet. 146A:2053-2059. 47. Kerr A, Stephonson J (1986) A study of the natural history of Rett syndrome in 23 girls. Am J Med Genet. 1:77-83. 48. Kishino T, Lalande M, Wagstaff J (1997) UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nat Genet. 15:70-73. 49. Kitamura K, Yanazawa M, Sugiyama N, Miura H, Iizuka-Kogo A, Kusaka M, Omichi K, Suzuki R, Kato-Fukui Y, Kamiirisa K, Matsuo M, Kamijo S, Kasahara M, Yoshioka H, Ogata T, Fukuda T, Kondo I, Kato M, Dobyns WB, Yokoyama M, Morohashi K (2002) Mutation of ARX causes abnormal development of forebrain and testes in mice and Xlinked lissencephaly with abnormal genitalia in humans. Nat Genet. 32:359-369. 50. Kortüm F, Das S, Flindt M, Morris-Rosendahl DJ, Stefanova I, Goldstein A, Horn D, Klopocki E, Kluger G, Martin P, Rauch A, Roumer A, Saitta S, Walsh LE, Wieczorek D, Uyanik G, Kutsche K, Dobyns WB (2011) The core FOXG1 syndrome phenotype consists of postnatal microcephaly, severe mental retardation, absent language, dyskinesia, and corpus callosum hypogenesis. J Med Genet. 48:396-406. 51. Kozinetz CA, Skender ML, MacNaughton N, Almes MJ, Schultz RJ, Percy AK, Glaze DG (1993) Epidemiology of Rett Syndrome: a population-based registry. Pediatrics. 91:445-450. 52. Le Guen T, Bahi-Buisson N, Nectoux J, Boddaert N, Fichou Y, Diebold B, Desguerre I, Raqbi F, Daire VC, Chelly J, Bienvenu T (2011) A FOXG1 mutation in a boy with congenital variant of Rett syndrome. Neurogenetics. 12:1-8. 53. Le Meur N, Holder-Espinasse M, Jaillard S, Goldenberg A, Joriot S, Amati-Bonneau P, Guichet A, Barth M, Charollais A, Journel H, Auvin S, Boucher C, Kerckaert JP, David V, Manouvrier-Hanu S, Saugier-Veber P, Frébourg T, Dubourg C, Andrieux J, Bonneau D (2010) MEF2C haploinsufficiency caused by either microdeletion of the 5q14.3 region or mutation is responsible for severe mental retardation with stereotypic movements, epilepsy and/or cerebral malformations. J Med Genet. 47:22-29. 54. Liang JS, Shimojima K, Takayama R, Natsume J, Shichiji M, Hirasawa K, Imai K, Okanishi T, Mizuno S, Okumura A, Sugawara M, Ito T, Ikeda H, Takahashi Y, Oguni H, Imai K, Osawa M, Yamamoto T (2011) CDKL5 alterations lead to early epileptic encephalopathy in both genders. Epilepsia. 52:1835-1842. 55. Lindsay K, Bone I, Fuller G (2010) Epilepsy. In Neurology and Neurosurgery Illustrated. 5. Auflage. Churchill Livingstone. Philadelphia. S. 92-105. 68 Literaturverzeichnis 56. Marsh E, Fulp C, Gomez E, Nasrallah I, Minarcik J, Sudi J, Christian SL, Mancini G, Labosky P, Dobyns W, Brooks-Kayal A, Golden JA (2009) Targeted loss of Arx results in a developmental epilepsy mouse model and recapitulates the human phenotype in heterozygous females. Brain.132:1563-1576. 57. Matsuura T, Sutcliffe JS, Fang P, Galjaard RJ, Jiang YH, Benton CS, Rommens JM, Beaudet AL (1997) De novo truncating mutations in E6-AP ubiquitin-protein ligase gene (UBE3A) in Angelman syndrome. Nat Genet. 15:74-77. 58. Mei D, Marini C, Novara F, Bernardina BD, Granata T, Fontana E, Parrini E, Ferrari AR, Murgia A, Zuffardi O, Guerrini R (2010) Xp22.3 genomic deletions involving the CDKL5 gene in girls with early onset epileptic encephalopathy. Epilepsia. 51:647-54. 59. Melani F, Mei D, Pisano T, Savasta S, Franzoni E, Ferrari AR, Marini C, Guerrini R (2011) CDKL5 gene-related epileptic encephalopathy: electroclinical findings in the first year of life. Dev Med Child Neurol. 53:354-360. 60. Moretti P, Zoghbi HY (2006) MeCP2 dysfunction in Rett Syndrome and related disorders. Curr Opin Genet Dev. 16:276-281. 61. MRC-Holland (2011) MRC Holland. Abgerufen am 18. Juni 2011 von http://www.mrcholland.com 62. Mülhardt, C (2006) Die Standard-PCR. In: Der Experimentator Molekularbiologie/ Genomics. 5.Auflage. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag. München. S.80-91. 63. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51:263-273. 64. ncbi db SNP (2009a) Entrez db SNP. Abgerufen am 20. Juni 2011 von http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=35478150 65. ncbi db SNP (2009b) Entrez db SNP. Abgerufen am 20. März 2012 von http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=8766 66. Noh GJ, Asher YJT, Graham Jr JM (2012) Clinical review of genetic epileptic encephalopathies. Eur J Med Genet. 55:281-298. 67. Numata M, Petrecca K, Lake N, Orlowski J (1998) Identification of a mitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem. 273:6951-6959. 68. Pal DK, Pong AW, Chung WK (2010) Genetic evaluation and counseling for epilepsy. Nat Rev Neurol. 6:445-453. 69. Partington MW, Mulley JC, Sutherland GR, Hockey A, Thode A, Turner G (1988) Xlinked mental retardation with dystonic movements of the hands. Am J Med Genet. 30:251-262. 69 Literaturverzeichnis 70. Peippo MM, Simola KO, Valanne LK, Larsen AT, Kähkönen M, Auranen MP, Ignatius J (2006) Pitt-Hopkins syndrome in two patients and further definition of the phenotype. Clin Dysmorphol. 15:47-54. 71. Philippe C, Amsallem D, Francannet C, Lambert L, Saunier A, Verneau F, Jonveaux P (2010) Phenotypic variability in Rett syndrome associated with FOXG1 mutations. J Med Genet. 47:59-65. 72. Pintaudi M, Baglietto MG, Gaggero R, Parodi E, Pessagno A, Marchi M, Russo S, Veneselli E (2008) Clinical and electroencephalographic features in patients with CDKL5 mutations: two new Italian cases and review of the literature. Epilepsy Behav. 12:326-31. 73. Pitt D, Hopkins I (1978) A syndrome of mental retardation, wide mouth and intermittent overbreathing. Aust Paediatr J. 14:182-184. 74. Proud VK, Levine C, Carpenter NJ (1992) New X-linked syndrome with seizures, acquired micrencephaly, and agenesis of the corpus callosum. Am J Med Genet. 43:458-466. 75. Rett A (1966) Über ein eigenartiges hirnatrophisches Syndrom bei Hyperammoniamie in Kindesalter. Med Wschr. 116:723-738. 76. Rademacher N, Hambrock M, Fischer U, Moser B, Ceulemans B, Lieb W, Boor R, Stefanova I, Gillessen-Kaesbach G, Runge C, Korenke GC, Spranger S, Laccone F, Tzschach A, Kalscheuer VM (2011) Identification of a novel CDKL5 exon and pathogeneic mutations in patients with severe mentale retardation, early-onset seizures and Rett-like features. Neurogenetics. 12:165-167. 77. Ravn K, Roende G, Duno M, Fuglsang K, Eiklid KL, Tümer Z, Nielsen JB, Skjeldal OH (2011) Two new Rett syndrome families and review of the literature: expanding the knowledge of MECP2 frameshift mutations. Orphanet J Rare Dis. 6:58. 78. Ropers HH (2006) X-linked mental retardation: many genes for a complex disorder. Curr Opin Genet Dev. 16:260-269. 79. Rosenfeld JA, Leppig K, Ballif BC, Thiese H, Erdie-Lalena C, Bawle E, Sastry S, Spence JE, Bandholz A, Surti U, Zonana J, Keller K, Meschino W, Bejjani BA, Torchia BS, Shaffer LG (2009) Genotype-phenotype analysis of TCF4 mutations causing PittHopkins syndrome shows increased seizure activity with missense mutations. Genet Med. 11:797-805. 80. Russo S, Marchi M, Cogliati F, Bonati MT, Pintaudi M, Veneselli E, Saletti V, Balestrini M, Ben-Zeev B, Larizza L (2009) Novel mutations in the CDKL5 gene, predicted effects and associated phenotypes. Neurogenetics. 10:241-250. 81. Sagoo GS, Butterworth AS, Sanderson S, Shaw-Smith C, Higgins JP, Burton H (2009) Array CGH in patients with learning disability (mental retardation) and congenital 70 Literaturverzeichnis anomalies: updated systematic review and meta-analysis of 19 studies and 13,926 subjects. Genet Med. 11:139-146. 82. Salvador-Carulla L, Reed GM, Vaez-Azizi LM, Cooper SA, Martinez-Leal R, Bertelli M, Adnams C, Cooray S, Deb S, Akoury-Dirani L, Girimaji SC, Katz G, Kwok H, Luckasson R, Simeonsson R, Walsh C, Munir K, Saxena S (2011) Intellectual developmental disorders towards a new name, definition and framework for "mental retardation/intellectual disability" in ICD-11. World Psychiatry. 10:175-180. 83. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci. 74:5463-5467. 84. Sartori S, Di Rosa G, Polli R, Bettella E, Tricomi G, Tortorella G, Murgia A. (2009) A novel CDKL5 mutation in a 47, XXY boy with the early-onset seizure variant of Rett syndrome. Am J Med Genet. 149A:232-236. 85. Schalock R, Borthwick-Duffy SA, Bradley VJ, Buntinx WHE, Coulter D., Craig EM, Gomez SC, Lachapelle Y, Luckasson R, Reeve A, Shogren KA, Snell ME, Spreat S, Tassé MJ, Verdugo-Alonso MA, Wehmeyer M, Yeager MH (2010) Intellectual Disability: Definition, Classification, and Systems of Supports. 11 Ausgabe. American Association on Intellectual and Developmental Disabilities. Washington. 86. Scheffer IE, Wallace RH, Phillips FL, Hewson P, Reardon K, Parasivam G, Stromme P, Berkovic SF, Gecz J, Mulley JC (2002) X-linked myoclonic epilepsy with spasticity and intellectual disability: mutation in the homeobox gene ARX. Neurology. 59:348356. 87. Scheinert P (1997) Primerdesign und Wahl stringenter Reaktionsbedingungen. Bio Techniques. 4:52-54. 88. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 30:e57. 89. Schroer RJ, Holden KR, Tarpey PS, Matheus MG, Griesemer DA, Friez MJ, Fan JZ, Simensen RJ, Strømme P, Stevenson RE, Stratton MR, Schwartz CE (2010) Natural History of Christianson syndrome. Am J Med Genet. 152A:2775-2783. 90. Sherr EH (2003) The ARX story (epilepsy, mental retardation, autism, and cerebral malformations): one gene leads to many phenotypes. Curr Opin Pediatr. 15:567-571. 91. Shoubridge C, Fullston T, Gécz J (2010) ARX spectrum disorders: making inroads into the molecular pathology.Hum Mutat. 31:889-900. 92. Slater HR, Bruno DL, Ren H, Pertile M, Schouten JP, Choo KH (2003) Rapid, highthroughput prenatal detection of aneupoidy using a novel quantitative method (MLPA). J Med Genet. 40:907-916. 71 Literaturverzeichnis 93. Strauss KA, Puffenberger EG, Huentelmann MJ, Gottlieb S, Dobrin SE, Parod JM, Stephan DA, Morton DH (2006) Recessive symptomatic focal epilepsy and mutant contactin-associated protein-like 2. N Engl J Med 354:1370-1377. 94. Strømme P, Mangelsdorf ME, Scheffer IE, Gécz J (2002) Infantile spasms, dystonia, and other X-linked phenotype caused by mutations in Aristaless related homeobox gene, ARX. Brain Dev. 24:266-268. 95. Strømme P, Dobrenis K, Sillitoe RV, Gulinello M, Ali NF, Davidson C, Micsenyi MC, Stephney G, Ellevog L, Klungland A, Walkley SU (2011) X-linked Angelman-like syndrome caused by Slc9a6 knockout in mice exhibits evidence of endosomallysosomal dysfunction. Brain.134:3369-3383. 96. Suri M (2005) The phenotypic spectrum of ARX mutations. Dev Med & Child Neur. 47:133-137. 97. Tao J, Van Esch H, Hagedorn-Greiwe M, Hoffmann K, Moser B, Raynaud M, Sperner J, Fryns JP, Schwinger E, Gécz J, Ropers cHH, Kalscheuer VM. (2004). Mutations in the X-linked Cyclin-Dependent Kinase-Like 5 (CDKL5/STK9) Gene Are Associated with Severe Neurodevelopmental Reatardation. Am J Hum Genet.75:1149-1154. 98. Takano K, Lyons M, Moyes C, Jones J, Schwartz CE. (2010). Two percent of patients suspected of having Angelman syndrome have TCF4 mutations. Clin Genet. 78:282288. 99. Todt H (2004). Epilepsie. In C. Speer, & M. Gahr, Pädiatrie. 2.Auflage. Springer Medizin Verlag. Heidelberg. S. 281-292. 100. Turner G, Partington M, Kerr B, Mangelsdorf M, Gecz J (2002) Variable expression of mental retardation, autism, seizures, and dystonic hand movements in two families with an identical ARX gene mutation. Am J Med Genet. 112:405-411. 101. Van Esch H, Jansen A, Bauters M, Froyen G, Fryns JP (2007) Encephalopathy and bilateral cataract in a boy with an interstitial deletion of Xp22 comprising the CDKL5 and NHS genes. Am J Med Genet. 143A:364-369. 102. Venter JC, Levy S, Stockwell T, Remington K, Halpern A (2003) Massive parallelism, randomness and genomic advances. Nat Genet. 33:219-227. 103. Weaving LS, Christodoulou J, Williamson SL, Friend KL, McKenzie OL, Archer H, Evans J, Clarke A, Pelka GJ, Tam PP, Watson C, Lahooti H, Ellaway CJ, Bennetts B, Leonard H, Gécz J (2004) Mutations of CDKL5 cause a severe neurodevelopmental disorder with infantile spasms and mental retardation. Am J Hum Genet. 75:10791093. 104. Whalen S, Héron D, Gaillon T, Moldovan O, Rossi M,Devillard F, Giuliano F, Soares G, Mathieu-Dramard M, Afenjar A, Charles P, Mignot C, Burglen L, Van Maldergem L, Piard J, Aftimos S, Mancini G, Dias P, Philip N, Goldenberg A, Le 72 Literaturverzeichnis Merrer M, Rio M, Josifova D, Van Hagen JM, Lacombe D, Edery P, Dupuis-Girod S, Putoux A, Sanlaville D, Fischer R, Drévillon L, Briand-Suleau A, Metay C, Goossens M, Amiel J,Jacquette A, Giurgea I (2012) Novel Comprehensive Diagnostic Strategy in Pitt-Hopkins Syndrome: Clinical Score and Further Delineation of the TCF4 Mutational Spectrum. Hum Mutat. 33:64-72. 105. Williams C (2005) Neurological Aspects of the Angelman syndrome. Brain Dev. 27:88-94. 106. Zabranski S (2007) Krankheiten der innersekretorischen Drüsen und Wachstumsstörungen. In F. Sitzmann. Pädiatrie 3. Ausgabe. Georg Thieme Verlag. Stuttgart. S.198-229. 107. Zhang J, Chiodini R, Badr A, Zhang G (2011) The impact of next-generation sequencing on genomics. J Genet Genomics. 38:95-109. 108. Zhu X, Li M, Pan H, Bao X, Zhang J, Wu X (2010) Analysis of the parental origin of de novo MECP2 mutations and X chromosome inactivation in 24 sporadic patients with Rett syndrome in China. J Child Neurol. 25:842-848. 109. Zupanc ML (2009) Clinical Evaluation and Diagnosis of Severe Epilepsy Syndromes of Early Childhood. J Child Neurol. 24(8S):6S-14S. 110. Zweier C, Peippo MM, Hoyer J, Sousa S, Bottani A, Clayton-Smith J, Reardon W, Saraiva J, Cabral A, Gohring I, Devriendt K, de Ravel T, Bijlsma EK, Hennekam RC, Orrico A, Cohen M, Dreweke A, Reis A, Nurnberg P, Rauch A (2007) Haploinsufficiency of TCF4 causes syndromal mental retadation with intermittent hyperventilation (Pitt-Hopkins Syndrome). Am J Hum Genet. 80:994-1001. 111. Zweier C, Sticht H, Bijlsma EK, Clayton-Smith J, Boonen SE, Fryer A, Greally MT, Hoffmann L, den Hollander NS, Jongmans M, Kant SG, King MD, Lynch SA, McKee S, Midro AT, Park SM, Ricotti V, Tarantino E, Wessels M, Peippo M, Rauch A (2009) Further delineation of Pitt-Hopkins syndrome: phenotypic and genotypic description of 16 novel patients. J Med Genet. 45:738-744. 112. Zweier C, de Jong EK, Zweier M, Orrico A, Ousager LB, Collins AL, Bijlsma EK, Oortveld MA, Ekici AB, Reis A, Shenk A, Rauch A (2009) CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85(5):655-66. 73 Anhänge 7. Anhänge 7.1. Informationsblatt zur Studie INFORMATIONSBLATT für Eltern zum Forschungsprojekt „Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“ Sehr geehrte Eltern, bei Ihrem Kind bestehen eine geistige Behinderung und eine Epilepsie. Trotz umfangreicher Diagnostik wurde die Ursache dieser Symptomatik bislang nicht gefunden. In jüngster Zeit wurden einige neue Gene gefunden, deren Veränderungen eine geistige Behinderung und eine Epilepsie verursachen. Es handelt sich um die Gene SLC9A6, FOXG1, TCF4, ARX und CDKL5. Im Rahmen der hier aufgeführten Studie werden wir bei Patienten mit geistiger Behinderung und Epilepsie ungeklärter Ursache eines oder mehrere der o.g. Gene auf Veränderungen hin untersuchen. Dabei ist es möglich, dass bei einem Teil dieser Patienten eine Genveränderung gefunden wird und somit ein besseres Verständnis für das jeweilige Krankheitsbild möglich ist. Wir würden uns freuen, wenn Sie durch die molekulargenetische Analyse einer DNAProbe von Ihrem Kind und ggf. von Ihnen zur Durchführung dieser Studie beitragen würden. Bevor Sie sich entscheiden, an diesem Forschungsprojekt teilzunehmen, sollten Sie dieses Informationsblatt aufmerksam lesen und eventuell verbleibende Fragen mit Ihrem Arzt in Ruhe besprechen. Für die Studie werden lediglich Blutproben (ca. 5-10 ml Blut) von Ihrem Kind und ggf. von Ihnen benötigt. Das Risiko einer Blutentnahme ist aus medizinischer Sicht gering. Gelegentlich kann es zu einem Hämatom (blauer Fleck), zu einer Thrombophlebitis (oberflächliche Venenentzündung) oder ganz selten zu einer Nervenverletzung kommen. Die bei Ihnen und Ihrem Kind entnommenen Proben werden kodiert, so dass für die beteiligten Wissenschaftler im Labor keine Rückschlüsse auf die Person möglich sind (sogenannte Pseudonymisierung). Die Kodierung und Lagerung der Proben erfolgen am Institut für Humangenetik. Es ist eine Befristung der Nutzung sowohl der Proben als auch der daraus gewonnenen Daten auf 25 Jahre vorgesehen. Neben der Asservierung (Lagerung) und Untersuchung der DNA-Proben ist auch eine möglichst detaillierte Erfassung klinischer Daten Ihres Kindes (einschließlich fotographischer Aufnahmen in einzelnen Fällen) vorgesehen. 74 Anhänge Sollten weitere Personen aus Ihrer Familie betroffen sein, würden wir gerne Kontakt zu ihnen aufnehmen. Für das Projekt wären dann ein Stammbaum sowie Blutproben von weiteren Familienmitgliedern sehr wünschenswert. Durch die Teilnahme leisten Sie und Ihre Angehörigen möglicherweise einen großen Beitrag, dass die Ursachen von geistiger Behinderung mit Epilepsie besser aufgeklärt und verstanden werden. Eine Veröffentlichung der Forschungsergebnisse in Fachzeitschriften oder auf Kongressen unter Verwendung vollständig anonymisierter Daten soll nach Abschluss der Untersuchungen erfolgen. Es werden alle Richtlinien des Datenschutzes dafür eingehalten. Trotz aller Sorgfalt bei unseren wissenschaftlichen Arbeiten möchten wir betonen, dass Untersuchungen im Rahmen von Forschungsprojekten grundsätzlich nicht den Qualitätsanforderungen genügen können, die routinemäßig durchgeführte Tests erfüllen müssen. Sollten sich bei diesen Untersuchungen sichere Ergebnisse zum Krankheitsbild Ihres Kindes ergeben, so haben Sie das Recht auf eine eingehende Beratung. Daher können Sie ausdrücklich angeben, ob Sie in einem solchen Fall eine Kontaktaufnahme von unserer Seite wünschen oder nicht. Aus dem Projekt entstehen weder für Sie noch für Ihre Krankenkasse Kosten. Die Teilnahme an dieser Studie ist freiwillig. Sie können jederzeit Ihr Einverständnis zur Teilnahme widerrufen, ohne dass dadurch Nachteile für Sie oder Ihr Kind entstehen. Nach Beendigung Ihrer Teilnahme werden keine weiteren Daten bei Ihnen oder Ihrem Kind erhoben. Alle bisherigen Daten werden unwiderruflich anonymisiert, d. h. sie können nicht mehr anhand der Daten identifiziert werden. Die gesammelten Daten setzen sich zusammen aus den Namen, den Geburtsdaten, der Adresse, dem einsendenden Arzt und dem medizinischen Befund Ihres Kindes. Für die Beteiligung Ihres Kindes an dieser Studie möchten wir Ihnen sehr herzlich danken. Für Rückfragen stehen wir Ihnen telefonisch oder persönlich gerne zur Verfügung. Mit freundlichen Grüßen Prof. Dr. med. G. Gillessen-Kaesbach Dr. med. Irina Stefanova Ärztin für Kinderheilkunde und Humangenetik Ärztin 75 Anhänge 7.2. Einwilligungserklärung der Studie EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG zur Aufbewahrung und Verwendung von genetischem Untersuchungsmaterial für Forschungszwecke Den beigefügten Text (Informationsblatt zum Forschungsprojekt „Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“) habe ich gelesen, zur Kenntnis genommen und eine Kopie erhalten. Ich bin über das Vorhaben, eine Probe von mir und meinem Kind für die Erforschung genetischer Ursachen von mentaler Retardierung in Kombination mit einer Epilepsie zu verwenden, durch Herrn/Frau ………………………………………………………… ausführlich aufgeklärt worden. Ich stimme der Nutzung von pseudonymisierten Proben von mir und meinem Kind für wissenschaftliche Zwecke freiwillig zu. Ich stimme auch der Veröffentlichung der in der Studie erhobenen Daten in vollständig anonymisierter Form zu. Ferner bin ich damit einverstanden, dass die Ärzte am Institut für Humangenetik Einsicht in für die Studie relevante medizinische Vorbefunde meines Kindes erhalten dürfen. Kodierung und Lagerung der Proben erfolgen im Institut für Humangenetik und unterliegen der ärztlichen Schweigepflicht sowie den Richtlinien des Datenschutzes. Dritte erhalten keinen Einblick in Originalunterlagen. Mir ist bekannt, dass ich meine Zustimmung sowohl zur Aufbewahrung der Proben als auch der daraus gewonnenen Daten jederzeit ohne Angabe von Gründen widerrufen kann, ohne dass mir oder meinem Kind dadurch Nachteile im Hinblick auf die Behandlung oder das Verhältnis zu den behandelnden Ärzten entstehen. In diesem Falle werden sowohl die DNA-Proben als auch die daraus gewonnenen personenbezogenen Daten umgehend vernichtet. Die Blutproben von mir und meinem Kind stelle ich für die Erforschung genetischer Ursachen von mentaler Retardierung und Epilepsie unter Schutz eines Pseudonyms zur Verfügung und erlaube die Nutzung für 25 Jahre. Sollten sich aus der Analyse der pseudonymisierten Probe ein für die Gesundheit meines Kindes wichtiger Befund ergeben, so ist eine Kontaktaufnahme seitens der Ärzte des Institutes für Humangenetik □ erwünscht □ nicht erwünscht. 76 Anhänge Ort und Datum ………………………………………………….. Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Kindes …………..…… Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Mutter …………...…… Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Vaters ………………... Adresse der Eltern und des Kindes: …………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………. Unterschrift d. Mutter…..………..…….Unterschrift d. Vaters …...………………………… …………….…………………………………………………..………………………………… Name oder Stempel des Arztes/der Ärztin Unterschrift des/der behandelnden Arztes/Ärztin 77 Anhänge 7.3. Fragebogen der Studie FRAGEBOGEN zur Erfassung klinischer und diagnostischer Daten bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung zum Projekt „Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“ Name des Patienten……………………………………………………………………… Geburtsdatum……………………………….…… Geschlecht: □ männlich □ weiblich Betreuender Arzt / Einsender …………………………………………………………… Schwangerschaft Erkrankungen der Mutter oder andere Komplikationen………………………………. Medikamenteneinnahme……………………Alkohol, Nikotin, Drogen:………………. Entbindung Art der Entbindung………………………SSW bei Entbindung……….………………. Gewicht……………….…Länge………………………………………………………….. KU…………...……………APGAR……………………………………………………….. Neugeborenen- und Säuglingszeit Fütterungsprobleme? □ nein □ ja Muskeltonus? □ normal □ herabgesetzt □ erhöht Sonstiges………………………………………..………………………………………… Entwicklung Motorisch: Ist freies Laufen möglich? □ nein □ ja und zwar seit …………………………………. Expressive Sprache: □ keine □ einzelne Wörter □ Mehrwortsätze □……………….. Sprachverständnis: □ schlecht □ einzelne Aufforderungen □ gut □…………………. Wachstum: aktuelle Körpermaße vom (Datum ) oder mit (Alter) …………………… Gewicht…………………………… Größe……………………………………Kopfumfang ………………………………….. War/ist ein Verlust erworbener Fähigkeiten feststellbar? □ nein □ ja Mentale Retardierung: □ mild □ moderat □ schwer Epilepsie: besteht seit:……………………………………………………………………………... Art der Anfälle…………………………………………………………………………... Therapieresistent? □ nein □ ja Therapie…………………………………………………………………………………. Bestehen kraniofaziale Dysmorphiezeichen? □ nein □ ja und zwar ..……………. 78 Anhänge Besteht/bestand ein gastro-ösophagealer Reflux? □ nein □ ja Bestehen Organfehlbildungen? □ nein □ ja und zwar ............................................ Bestehen stereotype Handbewegungen? □ nein □ ja Besteht eine Bewegungsstörung? □ nein □ ja und zwar ….………………………. Bestehen Hyperventilationszustände? □ nein □ ja Leidet/litt der Patient an häufigen Luftwegsinfekten? □ nein □ ja Sonstiges: ………………………………………………………………………………. Familienanamnese Gibt es Familienmitglieder, die eine ähnliche Symptomatik aufweisen? □ nein □ ja und zwar …………………………………………………………………... Im Vorfeld durchgeführte Diagnostik Chromosomenanalyse (Befund)……………………………………………………… Im Hinblick auf Angelman-Syndrom: □ nicht durchgeführt □ unauffällig □ auffälliger Befund Im Hinblick auf Rett-Syndrom: □ nicht durchgeführt □ unauffällig □ auffälliger Befund Array-CGH-Analyse (od. SNP-Array) …………………………………………......… Weitere molekular- oder zytogenetische Diagnostik: ……………………………… EEG (Befund) ……..…………………………………………………………………… MRT (Befund) ………………………………………………………………………….. Stoffwechseldiagnostik …..…………………………………………………………… Weitere Diagnostik ………………..…………………………………………………… 79 Anhänge 7.4. Reaktionsbedingungen 7.4.1. Das CDKL5-Gen Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide Vorwärts-(F-)Primer Rückwärts-(R-)Primer Ann.- Produkt- 5‘3„ 5‘3„ Temperatur länge (bp) 3 gttcccaccaaccagtgag ggagagtgagacccaaattg 60°C 360 4 gagaagcaatgtcagtatagcag tcagataaggaatgctcaacctg 60°C 219 5 acactctggcttcttgctactctgtcc agtgtctgaccagctagatcc 60°C 265 6 gaagtactcaaagcagaaggtga aagaatcgggcaaatgtgcac 60°C 290 7 gctctgtattggatgaattattctag gacagtaacatgtgaaatactcttaac 60°C 297 8 ctaattagatgctattacagtgatc actcaaaagaatgttcctctacc 60°C 282 9 gcccatgcgagaacagtcattaca gcaaatgacaatagaatcagcag 60°C 280 10 agccttcttttcacatggaac gaacaatgactcaaatactgcag 60°C 389 11 tctgcaacactcacaagcacg gcaggctatggtcacatgtag 60°C 237 12 gactttgtaatgttcttaacgatc ctaattgcatcatttaagcagcc 60°C 281 13-I ttgtgtgtcagctattgaggg ggtatgttgttgttggtgagatc 60°C 284 13-II tgcacaccaaaacctaccaagc gcttttggccttggtcctgtagg 65°C 329 13-III gagtcggcatagctatattgacac gaatggctactgtccatgtgc 65°C 351 13-IV aacgctggactcacgtcgaac accctcatcacatccctcgtac 58°C 357 Exon 14 ctggttatggtcctagttctacc cttatttgtgggagactgggt 60°C 292 15 cataggcaatattgtcatcaatgtg aggcgacagtgtaggtgagaag 60°C 277 16 gaaaagtccatcagtgacttac ggacactaaaaagctcatccaga 58°C 247 17 ttcttcccggctataggaacc actttgattgccaagtgcaaagtg 60°C 301 18 ctcctcttgggtgtggttgc ctcaggacagttactggagag 60°C 254 19 acccagtcacctcacctctaag ccagctgttcagagtaggaag 60°C 387 20 actctggtcaatgggatgtgg gtttcattcagtagtctagggtc 60°C 253 21 tcactgtcaccttggcttcag gtgtggcctgaacatctgcat 60°C 368 22 agaatgcatgtggccttctgctc aaggaaaactcaacctcagcg 65°C 329 Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen Konzentration DNA Hersteller 50 ng/µl a.d. (HPLC) Volumen (in µl) 1,0 Merck 18,9 Puffer 5x Qbiogene 2,5 dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 5 U/µl Qbiogene 0,1 Taq-Polymerase Ansatzvolumen 25 80 Anhänge Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 95°C 5 Min Denaturierung 95°C 30 Sek. Annealing Je nach Exon 30 Sek. Elongation 72°C 1 Min. Elongation 72°C 20 Min. 35 Zyklen Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen Konzentration ExoSAP-Produkt Hersteller ca. 10 ng/µl 2 5x SeqPuffer F- oder R-Primer Volumen (in µl) Applied Biosystems 1,5 Biomers 0,5 Applied Biosystems 1 Biomers 5 10 pmol/µl 2,5x Terminator Mix 1.1 a.d. (HPLC) Ansatzvolumen 10 Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 98°C 4 Min Denaturierung 96°C 20 Sek. Annealing 50°C 15 Sek. Elongation 60°C 4 Min. 25 Zyklen 7.4.2. Das ARX-Gen Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide Exon Vorwärts-(F-)Primer Rückwärts-(R-)Primer Ann.-Temperatur Produkt- 5‘3‘ 5‘3‘ 1 ggcagaaaggcacaaagatcgc gccctgatttggatgtttggtg 55°C 397 2a gtggagaaagaggccaaggcg ctgcgggtggtggcaccggcacc 64°C-62°C-60°C 630 2b aagtcgtaccgcgagaacg cacccttgctcacccaaactac 64°C-62°C-60°C 721 länge (bp) 3 aaatagttggcactccagggg gagagagagagatgggtt 58°C 294 4 aacaacctgaggccaaagagg ctttgacccaacctcagagactg 64°C-62°C-60°C 606 5 tgacctggaaccggttccctg ccaaatggaaacagaggaccagc 55°C 742 81 Anhänge Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen Exon 1 & 5 Konzentration DNA Exon 3 Exon 2a,2b,&4 1,0 2 2 Merck 16,3 17,9 7 Hersteller 50 ng/µl a.d. (HPLC) Volumen (in µl) Puffer 10x Qbiogene 2,5 2,5 5 dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 0,5 0,5 Je 5 M Roche - - 8 F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1 R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1 Roth 2,5 - - Qbiogene 0,2 0,1 0,5 25 25 25 GC-rich resolution DMSO Taq-Polymerase 5 U/µl Ansatzvolumen Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARX-Gens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 95°C 5 Min Denaturierung 95°C 30 Sek. Annealing 55°C 30 Sek. Elongation 72°C 30 Min. Elongation 72°C 7 Min. 35 Zyklen Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 95°C 5 Min Denaturierung 95°C 30 Sek. Annealing 58°C 30 Sek. Elongation 72°C 30 Min. Elongation 72°C 10 Min. 30 Zyklen 82 Anhänge Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des ARXGens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 98°C 3 Min Denaturierung 98°C 40 Sek. Annealing 64°C 1 Min. Elongation 72°C 1 Min. 30 Sek. Denaturierung 98°C 40 Sek. Annealing 62°C 1 Min. Elongation 72°C 1 Min. 30 Sek. Denaturierung 98°C 40 Sek. Annealing 60°C 1 Min. Elongation 72°C 1 Min. 30 Sek. Elongation 72°C 10 Min. 3 Zyklen 3 Zyklen 30 Zyklen Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen Konzentration ExoSAP-Produkt Volumen (in µl) ca. 10 ng/µl 5x SeqPuffer F- oder R-Primer Hersteller 2 Applied Biosystems 1,0 Biomers 0,5 Applied Biosystems 2 Biomers 4,5 10 pmol/µl 2,5x Terminator Mix 1.1 a.d. (HPLC) Ansatzvolumen 10 Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 98°C 4 Min Denaturierung 96°C 20 Sek. Annealing 50°C 15 Sek. Elongation 60°C 4 Min. 25 Zyklen 83 Anhänge 7.4.3. Das SLC9A6-Gen Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide Vorwärts-(F-)Primer Exon Rückwärts-(R-)Primer 5‘3„ 5‘3„ ProduktAnn.-Temperatur länge (bp) 1 gcgcctgtgggtgcgtgtgacctg gaacgtaggccgagcagggcc 60°C 628 2 gagctacagggaactaccgtaag gttgtacagacatatccatttc 55°C 486 3 gcacagtaatgttcttgcctttg gaacagcccatttctgaagtgtc 55°C 284 4 gcatttcatattagcatagcatag cttattacctacgtgaatattg 55°C 299 5 ggattagtcacaaagtactac gtatctaatcatgaattctac 55°C 322 6 ctctcagagtcatctactgag gcctcattcttccaaatgtttc 55°C 298 7 cttgctagccagatacattgcagg gggcaccaaaccctatgcagaac 55°C 524 8 ctgagatttctgtgttagagaagc gatccacttggagcaaaattg 55°C 305 9 cagacaaagcctataatctactgtg gtaaaaaagacttctattttg„ 55°C 252 10 cgtctccacatttgctcccttc gtattcttatgaaccacatac 55°C 352 11 caccatcttgagtgtatagtc gttacatcaagctggcacacgc 55°C 257 12 gaacgtgctttcttgctctg ctggaaagatatccctcaaagtc 55°C 439 13 gtagttgcctgacaatgtatatg ggttgaagtttatagtagattgttttc 55°C 198 14 gcagcctgagtaatagaggtg gtttccttttccacagcactgatg 55°C 442 15 gccctttgctgtcctccgaag cagtgactcatccacagagcag 55°C 289 16 ggactttagactttatcctgagg catgcactgggacttttaggtag 55°C 492 Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des SLC9A6-Gens Konzentration DNA Hersteller 50 ng/µl a.d. (HPLC) Volumen (in µl) 1,0 Merck 18,9 Puffer 5x Qbiogene 2,5 dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 5 U/µl Qbiogene 0,1 Taq-Polymerase Ansatzvolumen 25 84 Anhänge Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6Gens PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 94°C 5 Min Denaturierung 94°C 30 Sek. Annealing 55°C 30 Sek. Elongation 72°C 1 Min. Elongation 72°C 7 Min. 35 Zyklen Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen Konzentration ExoSAP-Produkt Volumen (in µl) ca. 10 ng/µl 5x SeqPuffer F- oder R-Primer Hersteller 1 Applied Biosystems 1,5 Biomers 0,5 Applied Biosystems 1 Biomers 6 10 pmol/µl 2,5x Terminator Mix 1.1 a.d. (HPLC) Ansatzvolumen 10 Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 96°C 1 Min. Denaturierung 96°C 10 Sek. Annealing 60°C 5 Sek. Elongation 60°C 1 Min. 25 Zyklen 85 Anhänge 7.4.4. Das TCF4-Gen Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4-Gen Exon Vorwärts-(F-)Primer Rückwärts-(R-)Primer Taq- Ann.- Produkt- 5‘3„ 5‘3„ Menge Temperatur länge (bp) (in µl) 0 cgaacagtgcccattctcttg gccatggtggccatgggagatc 0,05 55°C 354 1 ccagactaccagtaccatcttctaac ctaatttctgtgtttttagtagagac 0,05 58°C 255 2 ccagtctccaaaaatccgattgtg cctactggtttctagctgaagtg 0,05 55°C 254 3 ctctaagctgtttggtaacagtatg gccaaaaacatacaattgag 0,05 60°C 342 4 ggcaacaggagattaatttgaaac gagaaacacaccttctgtttgtc 0,05 60°C 237 5 ggaggggagaagttttggtagtgg cagaacctctgtctaggacatgg 0,05 60°C 275 6 gagcagtagatgtctgttacctg gtttaaaatgcatcatctaatttag 0,05 55°C 235 7 gtactaacaatcagttgggagg gaagtctccaggctgacaactgag 0,05 60°C 352 8 gtggtatcatctagaagtctttg gataaacgtgctgctctgggcg 0,1 60°C 252 9 cttcttatataagaatggagcttg ctgccccatctgtgacattaag 0,05 55°C 259 10 ggcagtcattttcaagtatatg gagtccttgtgtatatgcatgg 0,05 58°C 312 11 cattgtaaaatagagagttgtgag tgcctaattgctattcagttatg 0,05 55°C 330 12 gtgagtaaatggaccaggaatag gactatatactggaagcttcag 0,1 60°C 331 13 gcgttgacaacttcgtagtttag gagtttccacctacaaaatcagg 0,05 60°C 249 14 catcattgccattgccatttcc ggagagtaaaggagactgaac 0,05 60°C 253 15 catgtatttagaaacacagtgtg gcaacaatagtatctatatctg 0,05 55°C 385 16 catcaggtcctcttggcctctgg agggatgaacaccaagaggctgg 0,05 64°C 301 17 gtctgctggcagccttgcaatc gaatagtttcttcccgttctgttc 0,05 60°C 324 18 gaagaaaacaaagtaatgtagacacc ggaaacaattctttggaatgatgc 0,05 60°C 435 19 gtcagacacgcaagaagagtgc ctgtcaatttgggtgaaattcac 0,1 60°C 317 Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen Konzentration DNA Hersteller 50 ng/µl a.d. (HPLC) Volumen (in µl) 1, Merck je nach Taq-Menge Puffer 5x MP Biomedicals 2,5 dNTPs Je 10 mM MP Biomedicals 0,5 F-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7 R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7 5 U/µl MP Biomedicals je nach Exon Taq-Polymerase Ansatzvolumen 25 86 Anhänge Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen Konzentration ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 5x SeqPuffer F- oder R-Primer Hersteller 1 Applied Biosystems 1,5 Biomers 0,5 Applied Biosystems 0,5 Biomers 6,5 10 pmol/µl 2,5x Terminator Mix 1.1 Volumen (in µl) a.d. (HPLC) Ansatzvolumen 10 Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit Initialisierung 96°C 1 Min. Denaturierung 96°C 10 Sek. Annealing 60°C 5 Sek. Elongation 60°C 1 Min. 25 Zyklen 87 Anhänge 7.5. MLPA-Ansätze Hersteller Volumen (in µl) Hybridisierungsansatz DNA 50 ng/µl a.d. (HPLC) 2 Merck 3 SALSA Proben-Mix MRC-Holland 1,5 MLPA-Buffer MRC-Holland 1,5 Ansatzvolumen 8 µl Ligase-Mix a.d. (HPLC) Merck 25 Ligase-65 Buffer A MRC-Holland 3 Ligase-65 Buffer B MRC-Holland 3 Ligase-65 MRC-Holland 1 Ansatzvolumen Je 32 µl Mix Polymerase-Mix a.d. (HPLC) Merck 5,5 SALSA PCR-Primer MRC-Holland 2 SALSA Enzym-Dilution MRC-Holland 2 MRC-Holland 0,5 Buffer SALSA Polymerase Ansatzvolumen Je 10 µl Mix PCR-Ansatz a.d. (HPLC) 10x SALSA PCR-Buffer Merck 26 MRC-Holland 4 MLPA-Ligationsansatz 10 Polymerase-Mix 10 Ansatzvolumen 50 µl 88 Anhänge 7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte bei Entbindung Pat. Geburtsdatum 1 02.01.1997 2 09.02.1996 Geschlecht ♀ ♀ SSW Gewicht 42 3200 g 34 Kopfumfang Alter 49 cm 37cm (- 1SD) (-1,5 SD) 2090 g 42 cm (-0,4 SD) 3 10.07.2002 ♂ 40+3 3340 g Größe bei Datenerhebung Gewicht Größe Kopfumfang 11 Keine 141 cm 53 cm (+1,3 SD) Jahre Angabe (-0,6 SD) (+0,5 SD) keine Angabe 12,5 41 kg 144 cm 51,5 cm Jahre (-0,6 SD) (-1,7 SD) (-0,9 SD) 16,5 kg 110 cm 48,5 cm 11 29 kg 133 cm 3. Perz. Jahre 10.Perze 3.Perz. (-1,2 SD) 52 cm 37 cm 5 Jahre 4 11.05.1997 ♂ Termin 3200 g 52 cm keine Angabe ntile 5 23.03.2006 ♂ 41+3 4170 g 52 cm 36,5 cm 3,5 15 kg 104 cm 46,7 cm 15kg 91 cm 44 cm (>97.Pz.) (97.Pz.) 65 kg 169 cm keine Angabe 18,2 kg 103 cm 49,2 cm 30kg 118 cm 52 cm (+0,9 SD) (-1,8SD) Jahre 6 7 12.10.2007 26.11.1979 ♀ ♀ 36+6 41+4 2880 g 3950 g 52 cm 56 cm 34,5 cm 38 cm 21 LM 30 (Mikrozephalie) Jahre 8 07.11.2006 ♀ 40 3050 g 51 cm 32 cm 3 Jahre 9 27.05.2002 ♂ 40 3110 g 49 cm 37 cm 7 Jahre 10 02.09.1999 ♀ 36 2770 g 48 cm 31 cm 10 30 kg 137 cm 50 cm 25 kg 155cm Mikrozephalie Jahre 11 29.11.1990 ♀ 36 keine keine Angabe Angabe keine Angabe 19 Jahre 89 Anhänge bei Entbindung bei Datenerhebung Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter 12 09.03.2007 ♂ 40+1 3830 g 51 cm 38 cm 2,5 Gewicht Größe Kopfumfang 14 kg 91 cm 50 cm Jahre 13 16.12.2003 ♂ 41+2 3640 g 53 cm 36 cm 6 Jahre 19,9 kg 109 cm 51,3 cm 14 23.10.2006 ♀ 41 3990 g 55 cm 36 cm 4 Jahre 17,6 kg 105 cm 48 cm (+0,3SD) (-1,7 SD) keine keine keine Angabe Angabe Angabe keine keine Angabe Angabe 13 kg keine (-1,2 SD ) 15 16 17 26.08.2007 12.06.2006 22.01.2005 ♂ ♀ ♀ 39 41 keine 2780 g 3060 g 3070 g (+1,2 SD) 51 cm 53 cm 51 cm (+0,8 SD) 35 cm 33 cm 34 cm (+0,5 SD) 3 Jahre 4 Jahre 6 Jahre Angabe 18 20 17.08.2007 14.08.1980 ♀ ♀ 36 Termin keine Angabe keine Angabe Angabe 2756 g 48,5 cm keine keine Angabe Angabe 32 cm keine Angabe 3 Jahre 29 keine keine Angabe Angabe 47 kg keine Jahre keine Angabe keine Angabe Angabe 21 04.04.2001 ♂ 39 3400 g 50 cm 34,5 cm 8 Jahre 27,2 kg 125,6 cm 51,7 cm 22 05.07.1994 ♂ 41 3420 g 52 cm 36 cm 15 50 kg 184 cm 57 cm Jahre 23 09.12.2002 ♂ 38+1 3470 g 53 cm 35 cm 7 Jahre 27 kg 120 cm 52 cm 24 11.12.2007 ♂ 41+2 3260 g 52 cm 34,5 c 3 Jahre keine keine keine Angabe Angabe Angabe 90 Anhänge bei Entbindung bei Datenerhebung Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter Gewicht Größe Kopfumfang 25 10.11.1962 ♀ 14 d 2450 g 49 cm 35 cm 41 Jahre 44 kg 150 cm keine Angabe keine keine keine Angabe 12 Jahre 30 kg 136 kg keine Angabe Angabe Angabe 2890 g 49 cm 35 cm 15 8,7 75 cm 45 cm Monate kg 20 keine keine absteigend Monate Anga Angabe vor Termin 26 27 28 08.04.1999 23.09.2008 22.09.2009 ♀ ♀ ♂ Termin 38+3 Termin keine keine +9 Angabe Angabe keine Angabe be 29 21.04.2009 ♀ 38 3790 g 52 cm 35 cm 7 Monate 8,35 75 cm 43 cm kg 30 15.04.2003 ♂ keine keine keine Angabe Angabe Angabe keine Angabe 9 Jahre 30 kg 119 cm 50cm 31 16.09.2006 ♀ 36 2350 g 45 cm keine Angabe 3 Jahre 16 kg 101 cm 50 cm 32 25.04.2002 ♀ keine 3200 g keine keine Angabe 7 Jahre 18 kg 116 cm 43,5 cm 66 cm 43 cm Angabe 33 34 14.08.2009 09.08.1993 ♀ ♀ 36 40 Angabe 2790 g 3600 g 51 cm keine 35 cm 21 8,9 Monate kg keine Angabe 17 Jahre 60 kg 170 cm 53 cm 36 cm 4 Jahre 16 kg 116 cm keine Angabe Angabe 35 27.10.2005 ♀ 38+5 3940 g 55 cm SSW: Schwangerschaftswoche; d: Tage 91 Anhänge 7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick Alter zum Pat Geburtsdatum Zeitpunkt der Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Evaluation Mentale Retardierung BNS-Krämpfe, seit 11.Lebensjahr tägliche 1 02.01.1997 14 Jahre 3.LM Krampfanfälle, besonders in ACTH, LEV, VNS schwer CLZ, VPA, ACTH schwer STM, FLB, RUF, VNS schwer keine Angabe schwer Einschlafphase Myoklonien im Gesichtsbereich, tonische 3 10.07.2002 5 Jahre 5.LM 4 11.05.1997 11 Jahre 2.LM 5 23.03.2006 3 Jahre 23.LM Myoklonien 6 12.10.2007 21 Monate 1.LM Tonische Anfälle mit Spasmen 7 26.11.1979 30 Jahre 5.LM 10 02.09.1999 10 Jahre 2.LJ 11 29.11.1990 19 Jahre 3.LM 12 09.03.2007 30 Monate 5.LM 15 26.08.2007 3 Jahre 4.LM 16 12.06.2006 4 Jahre 1.LM 17 22.1.2005 6 Jahre 2.LJ 18 17.08.2007 3 Jahre keine Angabe 20 14.08.1980 29 Jahre 4.LM Anfälle, BNS-Anfälle Im 2.LM zyanotischer Kramfanfall, mit 11 Jahren tägliche Krampfanfälle Hypomotorische Anfälle, asymmetrisch PB, ACTH, STM, TPM, LEV, Dexamethason, VPA, VGB, Folsäure schwer OXC, LTG, CLB mild ZNS, VPA, LTG, STM, LEV schwer LEV,VPA, LTG schwer Fokal mit sekundärer Generalisierung LEV, ZNS moderat Tonische Anfälle, Myoklonien VPA, ESM moderat LEV,ZNS,CLB schwer keine Angabe k.A. PB, OXC, ketogene Diät schwer RUF, LEV, ZNS schwer tonische Anfälle BNS-Anfälle, fokale Anfälle BNS-Anfälle, tonische, myoklonische Anfälle Komplex fokale, tonische Anfälle, tonischklonische Anfälle Zuckungen Tonische Anfälle, Myoklonien, tonischklonische Anfälle mit Zyanose BNS-Anfälle 92 Anhänge Alter zum Pat Geburtsdatum Zeitpunkt der Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Evaluation Mentale Retardierung BNS-Anfälle, myoklonische Anfälle, 21 04.04.2001 8 Jahre 9.LM Absencen, tonische Anfälle (Lennox- CLB, LTG, RSP schwer Gastaut-Syndrom) 22 05.07.1994 15 Jahre 4.LM BNS-Anfälle, tonische, tonisch-klonische Anfälle, Absencen, atypische Absencen PLP, STM, VGB, VPA, LTG, OXC, CBZ, PB, PHT, TPM, LEV, RUF, STP, schwer ACTH VPA, LEV, ESM, LTG, STM, TPM, 23 09.12.2002 7 Jahre 4.LM 24 11.12.2007 3 Jahre 7.-8.LM 25 10.11.1962 49 Jahre 3.LM 26 08.04.1999 12 Jahre 18.LM 27 23.09.2008 15 Monate 8.LM BNS-Anfälle 28 22.09.2009 20 Monate 2.LM Multifokale Anfälle 29 21.04.2009 7 Monate 3.LM Fokale Anfälle VPA, VGB schwer 30 15.04.2003 9 Jahre 19.LM Fokale, sekundär generalisierte Anfälle TPM, RUF, LEV schwer 31 16.09.2006 3 Jahre 7.LM VPA, PB moderat 32 25.04.2002 7 Jahre 6.LM Fokal, sekundär generalisiert TPM, CBZ, OXC schwer 33 14.08.2009 21 Monate 5.LM BNS-Krämpfe STM, PLP, VGB, Dexamethason, LEV k.A. 34 09.08.1993 17 Jahre 7.-8.LM Tonisch-klonische, fokale Anfälle TPM, OXC schwer 35 27.10.2005 5 Jahre 3.LM BNS-Krämpfe LTG,OXC schwer Myoklonien, Grand-Mal-Anfälle, Absencen Tonische Anfälle Tonisch-klonische, tonische, komplexpartielle Anfälle CLB, Brom, ZNS VPA, STM, VGB schwer CLB, CBZ, STP schwer Komplex fokale, sekundär generalisierte CBZ,VPA,OXC,TPM, LTG, LEV, PHT, Anfälle LCM Komplex fokale, sekundär generalisierte Anfälle schwer PLP, CLB, VPA,STM, VGB, TPM, Dexamethason PTH, PB, CBZ, TPM, VGB, LEV, CLZ, PLP, Folsäure moderat moderat k.A. 93 Anhänge 7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie Pat. 1 Geburtsdatum 02.01.1997 EEG cMRT Zerebrale Anfallsbereitschaft; komplex fokale Epilepsie mit schlafgebunden Unauffälliger Befund Anfällen 2 09.02.1996 Links fokale, fronto-zentrale epilepsietypische Muster Unauffälliger Befund 3 10.07.2002 Pathologisches iktales EEG mit Dämmerattacken und Versivanfällen des Kopfes Globale Hirnatrophie, fleckförmige bei generalisierter „poly-spike"-Aktivität mit ausgeprägten interiktalen, multifokalen Marklagerläsionen, Arachnoidalzyste und links temporal betonten, epilepsietypischen Mustern 4 11.05.1997 Mittelgradige Allgemeinstörung, flache polymorphe Thetawellen 5-7Hz, über lange Keine Angabe Strecken keine epilepsietypischen Muster. Anfall mit generalisiert irregulären „spike-slow-waves“, linksseitige „polyspike-waves“, rechts eher mehr polymorphe höhere Delta-Wellen 5 23.03.2006 Keine Angabe Atrophie der weißen und grauen Substanz 6 12.10.2007 Irreguläre generalisierte „sharp-waves“ und „poly-spike waves“ Komplexe massive supratentorielle Atrophie, bilaterale Polymikrogyrie, Verkalkungen entlang Sulcus centralis 7 26.11.1979 Bifrontale sharp-waves, fraglich links frontal betont Glioseareal im Gyrus frontalis superior, Zustand nach Entzündung/Trauma 8 07.11.2006 Pathologische Wach-,Dösigkeits- und Schlafableitung mit generalisierten „poly- Unauffällig spike-wave“-Paroxysmen mit klinischen Myoklonien 9 27.05.2002 Leicht abnormes EEG durch relativ raschen und relativ weit nach vorn reichenden Unauffällig Grundrhythmus. Kein pathologischer Befund, keine epilepsietypische Aktivität. 10 02.09.1999 Generalisierte „sharp-wave-Komplexe“ Unauffällig 11 29.11.1990 Lennox- Gastaut- Syndrom („spike-waves-Varianten“) Pachygyrie, inkomplette Lissenzephalie, Balkendysgenesie 12 09.03.2007 Keine Angabe Supratentorielle Hemiatrophie 94 Anhänge Pat. 13 Geburtsdatum 16.12.2003 EEG cMRT Links temporaler Fokus, einzelne fokal beginnende Anfälle; multifokale Inkomplette Rotation der Hippocampi beidseits hypersynchrone Aktivität mit „sharp-waves“, „spike-poly-spike-waves“ beidseits mit wiederholter Generalisierung 14 23.10.2006 Unauffällig Myelinisierungsdefizit 15 26.08.2007 Parietookzipital diskontinuierlicher EEG Status im Schlaf, 70% der Zeit im Wachen, Hirnatrophie Grundrhythmus für das Alter zu langsam, leichte Allgemeinveränderung 16 12.06.2006 Keine Angabe Mäßig ausgeprägte Hirnrindenatrophie, bifrontotemporo-parietal, zunehmende Markatrophie, erweiterte innere Liquorräume 17 22.01.2005 Keine Angabe Keine Angabe 18 17.08.2007 Keine Angabe Reduzierte Myelinisierung, Hirnatrophie frontoparietal 20 14.08.1980 Delta-Herd rechts temporal , seltener links temporal Hirnatrophie, nicht ätiologisch einzuordnen 21 04.04.2001 Fokale und generalisierte „sharp-waves“ und Allgemeinveränderung Betonte äußere Liquorräume, o.p.B. 22 05.07.1994 Lennox- Gastaut-Syndrom mit „sharp-slow-waves” Unauffällig 23 09.12.2002 Generalisierte „sharp-wave“-Komplexe Unauffällig 24 11.12.2007 Keine Angabe Unauffällig 25 10.11.1962 Unregelmäßige Grund-/Hintergrundaktivität, „spike-waves“, „sharp-waves“ Frontal betonte Volumenminderung des bifrontozentral Großhirns und Kleinhirnatrophie 26 08.04.1999 Rechts temporaler bis frontaler Herdbefund Unauffällig 27 23.09.2008 Hypsarrhythmie Milde Atrophie 28 22.09.2009 Multifokale posteriore Prädominanz Progressive cerebrale Atrophie 29 21.04.2009 Epilepsietypische Potentiale Komplexe Hirnfehlbildung, Polymikrogyrie 30 15.04.2003 Isolierte rechts fokale epilepsietypische Muster ohne herdförmige Verlangsamung Keine Angabe bei noch normaler Grundaktivität 31 16.09.2006 2 Foci unabhängig, links und rechts temporo-posterior Myelinisierungsverzögerung bitemporal betont 95 Anhänge Pat. 32 Geburtsdatum 25.04.2002 EEG cMRT Pathologische Verlangsamung, „sharp-waves“ temporal beidseits Hirnatrophie, erweiterte äußere und innere Liquorräume 33 14.08.2009 Hypsarrhythmie Unauffällig 34 09.08.1993 Keine Angabe Keine Angabe 35 27.10.2005 Interiktales EEG zeigte eher generalisierte Auffälligkeiten, nicht lokalisierbar Verdacht auf fokale kortikale Dysplasie links frontal 96 Anhänge 7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen Sequenzanalysen Pat. CDKL 5 1 unauffällig 2 unauffällig 3 unauffällig 4 unauffällig 5 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) 6 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) 7 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) 8 unauffällig 9 Exon 14 nicht amplifizierbar 10 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) 11 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) MLPA TCF 4 ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1 Exon 0: c.28G>C (rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G(rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C (rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) nicht durchgeführt nicht durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig nicht durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig keine Auswertung möglich keine Auswertung möglich unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig keine Auswertung möglich unauffällig unauffällig unauffällig keine Auswertung möglich 97 Anhänge Sequenzanalysen Pat. CDKL 5 12 unauffällig 13 unauffällig 14 unauffällig 15 TCF 4 Exon 0: c.28G>C(rs611326), MLPA ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1 unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 1 Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt c.25G>T(p.A9S) unauffällig unauffällig unauffällig Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig 16 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig 17 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig 18 20 Exon 17: c.2372A>C (rs35478150) Exon 17: c.2372A>C (rs35478150) 21 unauffällig 22 unauffällig 23 Exon 17: c.2372A>C (rs 35478150) 24 unauffällig 25 unauffällig Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C (rs611326) Exon 0: c.28G>C (rs611326) Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C (rs611326) Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht durchgeführt nicht durchgeführt nicht durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig nicht durchgeführt Exon 15: c.1755C>T (rs 2307131) 98 Anhänge Sequenzanalysen Pat. CDKL 5 26 unauffällig 27 unauffällig 28 unauffällig 29 unauffällig 30 unauffällig 31 unauffällig 32 unauffällig 33 unauffällig 34 unauffällig 35 IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) TCF 4 MLPA ARX CDKL5/ARX TCF4/FOXG1 unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Ex. 14 kein PCR- Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Produkt unauffällig unauffällig unauffällig FOXG1-Deletion Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) Exon 0: c.28G>C (rs611326) Exon 0: c.28G>C(rs611326), Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig nicht durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C(rs611326), nicht Exon 19: c.2226A>G (rs8766) durchgeführt Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht durchgeführt SLC9A6 unauffällig unauffällig keine Auswertung möglich unauffällig nicht durchgeführt unauffällig unauffällig nicht durchgeführt unauffällig unauffällig 99 Danksagung 8. Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen bedanken, die an der Entstehung dieser Arbeit beteiligt waren. Mein großer Dank gilt Frau Professor Gillessen-Kaesbach für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und für die Ermöglichung dieser Arbeit. Ebenso möchte ich meiner Betreuerin Frau Dr. Irina Hüning, geb. Stefanova, für die engagierte Betreuung danken, dafür dass sie immer als Ansprechpartnerin erreichbar war und mir vielmehr als nur das Fachgebiet der Dissertation eröffnet hat. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für Humangenetik der Universität Lübeck danke ich für die herzliche Aufnahme und die Unterstützung. Besonderer Dank gilt Frau Heike Böttger und Frau Sabine Purmann, die mich während der experimentellen Phase in die Labortechniken einführten und mir mit kompetenter Unterstützung und unermüdlicher Geduld bei allen Problemen zu Seite standen. Ich danke allen betreuenden Ärzten der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Patienten für die Übersendung der Proben und der klinischen Daten. Meiner Familie danke ich von Herzen für die Ermöglichung meines Medizinstudiums und die Unterstützung während dieser Arbeit. Ich danke dem Evangelischen Studienwerk Villigst e.V. für die Unterstützung meines Studiums und insbesondere Herrn Prof. Knut Berner für die Ermutigung diese Arbeit aufzunehmen. 100 Lebenslauf 9. Lebenslauf 101 Erklärung 10. Erklärung Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009 genehmigt (Aktenzeichen 09-079). Eidesstattliche Versicherung Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe. Ferner versichere ich, dass ich bisher nicht oder gleichzeitig andernorts einen Zulassungsantrag gestellt habe oder die Dissertation vorgelegt habe. Ich habe mich bislang keinem anderen Promotionsverfahren unterzogen. Unterschrift: ……………………………………………….. 102