Dissertation Ariane Dienst FINALx

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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I
Hämatologie und Onkologie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek
Funktionelle Charakterisierung und präklinische Evaluierung des
rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF zur selektiven
Okklusion von Tumorblutgefäßen und Optimierung der Effektorfunktion via Molecular Modelling
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Ariane Dienst
aus Krefeld
promoviert am 12. Juni 2013
Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I
Hämatologie und Onkologie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek
Funktionelle Charakterisierung und präklinische Evaluierung des
rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF zur selektiven
Okklusion von Tumorblutgefäßen und Optimierung der Effektorfunktion via Molecular Modelling
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Ariane Dienst
aus Krefeld
promoviert am 12. Juni 2013
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2013
Druck: Hundt Druck GmbH, Köln
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg
1. Berichterstatter:
Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert
2. Berichterstatter:
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. M. Koch
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden
Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes
habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin / eines Promotionsberaters in
Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher
oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 01.10.2012
1
2
Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau
Dr. med. C. Gottstein größtenteils von mir selbst ausgeführt worden. Einige Experimente wurden mit Unterstützung von Frau Dr. med. C. Gottstein und der biologisch-technischen Assistentin Frau M. Unruh durchgeführt.
Die histologische und immunhistologische Aufarbeitung erfolgte durch die biologischtechnische Assistentin Frau M. Unruh bzw. durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der
Universität zu Köln. Die histologische Auswertung wurde von Frau Dr. med. C. Gottstein und
Herrn Professor Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln) vorgenommen.
3
4
Danksagung
Mein Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Andreas Engert.
Besonders bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. med. Claudia Gottstein für die Überlassung
des interessanten Themas dieser Arbeit und die hervorragende Betreuung. Ich danke ihr für die
unermüdliche Unterstützung in scheinbar aussichtslosen Situationen, für die Bereitschaft mir
jederzeit mit hilfreichen Ratschlägen, Ideen und Denkanstößen zur Seite zu stehen und für die
Möglichkeit der Teilnahme an wissenschaftlichen Kongressen. Des Weiteren bedanke ich mich
bei ihr für die Durchsicht und hilfreichen Anmerkungen zum Manuskript dieser Arbeit. Insbesondere nach ihrem Umzug in die USA und der damit verbundenen Ferne zwischen uns weiß
ich das Zustandekommen dieser Arbeit sehr zu schätzen.
Ganz herzlich möchte ich mich beim gesamten Team der Arbeitsgruppe für die freundliche
Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbereitschaft bedanken. Mein Dank gilt Maike Unruh, Frau Dr.
Andrea Grunow, Aiko Ferrari, Jana Seiffert, Samir Tawadros und Berit Rabausch.
Des Weiteren bedanke ich mich bei den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie, Herrn Professor Dr. med. J. Fries und Tanja Roth, für die histologisch Aufarbeitung und Auswertung der
Organschnitte.
Mein Dank gilt nicht zuletzt meinen Eltern, die mich während meiner gesamten Ausbildung
unterstützten und ohne deren Hilfe und Rückhalt mein Studium und die Promotion wohl kaum
möglich gewesen wären. Außerdem bedanke ich mich bei Roland Schmidt, der immer für mich
da war und mir die Freiräume gegeben hat, die ich für die Arbeit an dieser Promotion benötigte.
5
6
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1
Einleitung
19
1.1
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.3.4
Angiogenese
Tumor-Angiogenese
Antiangiogenetische Therapie
Inhibition von Wachstumsfaktoren: Bevacizumab
Direkte Endothelzellinhibitoren: Endostatin
Inhibitoren von Integrinen: Cilengitide
Hindernisse bei der klinischen Entwicklung von AngiogeneseInhibitoren
Zielgerichtete antivaskuläre Agenzien
Vaskulär disruptive Agentien (VDAs)
Selektive Vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs)
Biochemische Konstrukte
Rekombinante Fusionsproteine
VCAM-1
Gerinnungsbiologie
Die Gerinnungsaktivierung
Tissue Factor (TF) und Truncated Tissue Factor (tTF)
TF-Expression auf Zellen
Zirkulierender TF
TF-Signaling
Faktor VII
Der FVIIa/TF-Komplex
Der prokoagulatorische Status bei Krebspatienten
Fragestellung
Herstellung des rekombinanten SVOA anti-VCAM-tTF-Prototyps
und funktionelle Charakterisierung in vitro und in vivo
Untersuchung der molekularen Mechanismen der Koagulationsinduktion von TF-Fusionsproteinen und Verbesserung der
Effektorfunktion via Molecular Modelling
19
20
20
21
22
22
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.2.1
1.4.2.2
1.5
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.2.1
1.6.2.2
1.6.2.3
1.6.3
1.6.4
1.6.5
1.7
1.7.1
1.7.2
23
24
25
27
28
28
32
34
34
35
36
37
38
39
39
41
42
42
42
2
Material und Methoden
45
2.1
2.1.1
2.1.1.1
2.1.1.2
2.1.1.3
2.1.1.4
2.1.1.5
2.1.1.6
2.1.1.7
Material
Reagenzien / Chemikalien
Koagulationsfaktoren
Molekularbiologische Reagenzien
Sequenzierungsprimer (Oligonukleotide/Primer)
Das Expressionsplasmid pswc4
Andere Reagenzien
Selbst hergestellte Puffer und Lösungen
Reagenzien- Kits
45
45
45
45
46
47
47
48
49
7
8
2.1.2
2.1.3
2.1.3.1
2.1.3.2
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.2
2.2.1
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.1.3
2.2.1.4
2.2.1.5
2.2.1.6
2.2.1.7
2.2.1.8
2.2.1.9
2.2.1.10
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.4.1
2.2.4.2
2.2.4.3
2.2.4.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.2.8
2.2.8.1
2.2.8.2
2.2.9
2.2.9.1
2.2.9.2
2.2.9.3
2.2.10
2.2.10.1
Antikörper
Zellkultur-Materialien
Zelllinien
Zellkulturmedien und Zusätze
Bakterienstämme (Escherichia coli)
Geräte
Verbrauchsmaterial
Versuchstiere
Methoden
Molekularbiologische Techniken
DNA-Präparation mittels QIAGEN Plasmid Mini-, Midi- und
Maxi-Kit
DNA-Restriktionsspaltung
DNA-Extraktion: QIAEX II Agarose Gel Extraktion
DNA-Präzipitation
Bestimmung der DNA-Konzentration mittels AbsorptionsSpektrometrie
Sequenzanalyse
Primer-Duplex Insertion
Polymerasekettenreaktion zur Herstellung der tTF-Fragmente und
der längeren Linker
Ligation PCR- und Restriktionsfragmente in Expressionsplasmid
Hitzeschock-Transformation
Proteinexpression
Proteinaufreinigung
Protein-Analyse
Protein-Konzentrationsbestimmung mittels Biuret-Reaktion
Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer und
Gelelektrophorese
Gelfiltration und Endotoxinbestimmung
SDS-Gel-Elektrophorese mit dem Phast-System
Western-Blot
Durchflusszytometrie
Affinitätsmessung mit dem Biacore®-System
Koagulationstests
Zellfreier Koagulationstest
Zellgebundener Koagulationstest
Zellkultur
Kultivierung der Zellen
Ablösen der adhärenten Zellen
Bestimmung der Zellzahl
Tierversuche
Therapeutische in vivo Experimente mit anti-VCAM-1-tTF
9
49
50
50
51
52
52
53
53
53
53
53
54
54
55
55
56
56
57
58
58
59
60
60
60
60
61
61
63
63
64
65
65
65
66
66
66
66
66
67
10
2.2.11
2.2.12
Proteinstruktur-Homologie-Modelling
Statistische Analyse
68
68
3
Ergebnisse
70
3.1
Herstellung und Charakterisierung des rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF
Proteinexpression und Aufreinigung
Biochemische Charakterisierung
Funktionelle Charakterisierung in vitro
Bindungsstudien
Koagulations-Induktion
Therapeutische Studien in vivo mit rekombinantem Fusionsprotein
Kurzzeit-Experimente
Langzeit-Experimente
Verträglichkeit des Fusionsproteins
Molekulare Mechanismen der Koagulationsinduktion durch tTFFusionsproteine
Einfluss von Phospholipiden
Einfluss der elektrischen Ladung der Endotheloberfläche
Testung von Saponin
Testung von LPS
Testung verschiedener H2O2-Konzentrationen mit und ohne
Phospholipide
Einfluss anderer Gerinnungsfaktoren auf die FaktorX-Aktivierung
Testung von Faktor IX
Testung der Faktor VII-Aktivierung
Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation
Andere Faktoren
Testung unterschiedlicher Zellmengen
Testung verschiedener Inkubationszeiten
Verbesserung der Effektorfunktion durch optimierte dreidimensionale Ausrichtung des tTF-Moleküls zur ZellmembranOberfläche (Molecular Modelling)
Vorhersage der Proteinstruktur mit dem SWISS-Model
Klonierungsstrategie für Fusionsprotein-Varianten
Klonierung der neuen Fusionsprotein-Varianten
Modifikation der Linker
Modifikation des tTF-Anteils
Einfügen des MK27-scFv
Expression und Aufreinigung der neuen Fusionsprotein-Varianten
In-vitro-Charakterisierung der neuen Fusionsprotein-Varianten
Bindung
Koagulations-Induktion
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.3.1
3.1.3.2
3.1.4
3.1.4.1
3.1.4.2
3.1.4.3
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.2
3.2.2.3
3.2.3
3.2.3.1
3.2.3.2
3.2.4
3.2.5
3.2.5.1
3.2.5.2
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.3.1
3.3.3.2
3.3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.5.1
3.3.5.2
11
70
70
70
72
72
73
75
75
77
82
88
88
90
90
92
93
95
95
96
98
100
100
100
102
103
103
104
104
105
108
109
111
111
112
12
3.3.6
Vergleichende Analyse der neuen Fusionsproteine
113
4
Diskussion
122
4.1
4.2
Charakterisierung des Prototyps
Verbesserung der Effektorfunktion durch Molecular Modelling
122
129
5
Zusammenfassung
132
6
Literaturverzeichnis
134
7
Vorabveröffentlichung von Ergebnissen
150
8
Lebenslauf
151
13
14
Abkürzungsverzeichnis
Å
Angström
aa
Aminosäuren
Aqua dest.
Aqua destillata
BED
biologisch effektive Dosis
BSA
bovines Serumalbumin
C
Celsius
CD
Cluster of Differentiation
CEP
Circulating Endothelial Progenitors
ddH20
doppelt destilliertes Wasser
ddNTP
Didesoxyribonukleosid-Triphosphate
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DLT
Dosis-limitierende Toxizität
DMXAA
5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosid-Triphosphate
ED-B
Extra Domain-B (von Fibronektin)
EGF
Epidermal-Growth-Factor (-artige Domäne)
EGR-1
Early Growth Response-1
FAA
Flavone Acetic Acid (Flavonoide)
Fab
Fragment antigen binding
FACS
Fluorescence activated cell sorting
FCS
Fötales Kälberserum
FGF
Fibroblast Growth Factor
g
Erdbeschleunigung
Gla
(γ-)Carboxyglutaminsäure (-reiche Domäne)
GM-CSF
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
HBDt
Heparin Binding Domain
H&E
Hämatoxylin & Eosin
HGF
Hepatocyte Growth Factor
HIF
Hypoxia-Inducible Transcription Factor
His
Histidin
HUVEC
Human Umbilical Vein Endothelial Cells
ICAM
Intercellular Adhesion Molecule
IGF
Insulin-like Growth Factor
IgG
Immunglobulin G
15
IL
Interleukin
IP-10
Interferon-inducible Protein-10
Kb
Kilobase
kDa
Kilodalton
KT
Koagulationstest
LPS
Lipopolysaccharide
M
Mol
µg
Mikrogramm
MHC
Major Histocompatibility Complex
ml
Milliliter
mM
Millimol
MMP
Matrix-Metalloproteinase
MTD
maximal tolerierte Dosis
MTID
minimale Ziel-hemmende Dosis
ng
Nanogramm
NGF
Nerve Growth Factor
NF- κB
nukleärer Transkriptionsfaktor κB
NiNTA
Nickel-Nitrilotriessigsäure
NK
Natürliche Killer (-Zellen)
nm
Nanometer
NSCLC
Non Small Cell Lung Cancer (Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom)
OmpA
Outer Membrane Protein-A
PAR-2
Protease-activated-Receptor-2
PBS
Phosphate buffered Saline
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PECAM
Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule
PL
Phospholipide
PS
Phosphatidylserin
PSMA
Prostata-spezifisches Membran-Antigen
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
scFv
single chain variable fragment
SCID
Severe Combined Immunodeficiency
SDS-PAGE
Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
sec
Sekunden
SPR
Surface Plasmone Resonance
16
SVOA
Specific Vascular Occluding Agents (Spezifische vaskuläre Okklusion induzierende Agenzien)
TBE
TRIS-Borat-EDTA (-Puffer)
TF
Tissue Factor
TFPI
Tissue Factor Pathway Inhibitor
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor-α
tTF
trunkierter Tissue Factor
USPIO
Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide
V
Volt
VCAM-1
Vascular Cell Adhesion Molecule-1
VDA
Vaskulär disruptive Agentien
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor
VLA-4
Very Late Antigen-4
Vs.
versus
VTA
Vascular Targeting Agent (zielgerichtetes antivaskuläres Agenz )
ZKT
Zell-Koagulationstest
17
18
1
Einleitung
1.1
Angiogenese
Ein entscheidender Faktor für das Überleben von Zellen in einem Organismus ist die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen und der Abtransport von Abfallprodukten über die Blutgefäße. Da die maximale Diffusionsstrecke für Sauerstoff bei 100-200 µm liegt, wird dieser kritische Abstand der Zellen zu den Kapillargefäßen in normalen Geweben in der Regel nicht
unterschritten (Carmeliet 2000). Damit ein Gewebeverband diese Größe überschreiten kann,
müssen neue Blutgefäße generiert werden. Diesen Prozess nennt man Vaskulo- und Angiogenese. Er wird reguliert durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht von pro- und antiangiogenetischen Faktoren.
Die Vaskulogenese ist definiert als die de-novo-Formation neuer Blutgefäße aus endothelialen
Vorläuferzellen (Madeddu 2005). Diese spielt eine wesentliche Rolle bei der Embryogenese
und bei der postnatalen Neovaskularisation, die durch Verletzung, Ischämie oder Krebs getriggert wird. Die endothelialen Progenitoren stammen beim Embryo aus dem Mesoderm und bei
der postnatalen Angiogenese aus dem Knochenmark. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ist ein zentraler Wachstumsfaktor in der Vaskulo- und Angiogenese.
Als Angiogenese im engeren Sinne bezeichnet man die Entstehung neuer Gefäße durch Aktivierung existierender Endothelzellen, die proliferieren und migrieren. Dabei unterscheidet man
Aussprossen und Intussuszeption (Teilen eines Gefäßes in mehrere Tochtergefäße). Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung verschiedener physiologischer und pathologischer Bedingungen, wie zum Beispiel bei der endometrialen Proliferation während des
weiblichen Reproduktionszyklus, bei der Wundheilung, bei der postischämischen Regeneration
und auch beim Tumorwachstum. Die Angiogenese läuft in verschiedenen Phasen ab: (I) Vasodilatation und Extravasation von Plasmaproteinen, die ein provisorisches Gerüst für migrierende
Endothelzellen bilden; (II) Destabilisierung des Gefäßes und Unterbrechung der interzellulären
Kontakte zwischen den Endothelzellen und Ablösung von der Basalmembran unter Mitwirkung
von extrazellulären Matrix-Metalloproteinasen (MMPs); (III) Migration von Endothelzellen und
Formation eines Gefäßstranges mit anschließender Bildung eines Lumens; (IV) Stabilisierung
und Remodellierung der neu geformten Gefäße in ein dreidimensionales Netzwerk; und (V)
Regression überflüssiger Mikrogefäße.
Im Rahmen einer reduzierten Perfusion wird durch die resultierende Hypoxämie intrazellulärer
HIF (Hypoxia-Inducible Transcription Factor) stabilisiert, der die Generierung verschiedener
endothelialer Wachstumsfaktoren induziert.
Schlüsselmoleküle der physiologischen und pathophysiologischen Angiogenese sind VEGF und
Angiopoeitine. Weitere endotheliale Wachstumsfaktoren sind FGF (Fibroblast Growth Factor),
19
HGF (Hepatocyte Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor), Neurotrophine wie z.B.
NGF (Nerve Growth Factor), Chemokine wie z.B. GM-CSF (Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor) und Transkriptionsfaktoren wie z.B. EGR-1 (Early Growth Response-1).
Neben den Angiogenese-stimulierenden Faktoren gibt es auch hemmende Substanzen. Als
wichtigster Vertreter sei hier das Thrombospondin-1 zu nennen.
1.2
Tumor-Angiogenese
1971 beschrieb Folkman die Abhängigkeit des Tumorwachstums und der Metastasierung von
der Angiogenese (Folkman 1971). Den Beweis dieses Prinzips führten Gimbrone et al. 1972 in
folgendem Experiment: Tumorfragmente wurden in die Kornea von Kaninchenaugen implantiert, also in einen Ort, der normalerweise nicht vaskularisiert ist. Die Implantate führten innerhalb weniger Tage zum Einsprießen neuer Kapillaren aus dem Limbus, um die expandierenden
Tumoren zu vaskularisieren. Wurden die Kapillaren physikalisch am Erreichen des Implantates
gehindert, so führte dieses zu einer Hemmung des Tumorwachstums. Der Durchmesser dieser
Tumoren erreichte dann nur 0,4 mm.
Hanahan und Weinberg fassten die grundlegenden Eigenschaften von Krebszellen zusammen
und hoben die Fähigkeit zur Induktion von Angiogenese als eines der Wesensmerkmale von
Krebs hervor. Die anderen Unterscheidungsmerkmale von Tumorzellen zu normalen Zellen sind
autonome Wachstumssignale, Resistenz gegenüber wachstumshemmenden Signalen, Umgehung der Apoptose, unlimitiertes replikatives Potenzial und Fähigkeit zur Gewebsinvasion und
Metastasierung (Hanahan 2000).
Tumore können generell nur bis zu einer Größe von 1-2 mm wachsen, ohne ein eigenes Gefäßnetzwerk zu induzieren. Ein weiteres Wachstum erfordert Angiogenese. Diesen Schritt bezeichnet man als „angiogenic switch“ (Hanahan 1996). Dabei wird das Gleichgewicht, das zwischen
Angiogenese-induzierenden und Angiogenese-hemmenden Faktoren herrscht, verschoben. Ein
Mechanismus hierzu ist die veränderte Gentranskription. So findet man zum Beispiel in vielen
Tumoren eine erhöhte VEGF- und FGF-Expression im Vergleich zum normalen Gewebe. In
anderen Tumoren ist die Expression von Thrombospondin-1 herunterreguliert.
1.3
Antiangiogenetische Therapie
Die Beobachtung, dass ein Entfernen des Primärtumors oft in einer vermehrten Metastasenbildung resultiert, führte zur Entdeckung der natürlich vorkommenden Angiogeneseinhibitoren
Angiostatin und Endostatin (O’Reilly 1994). Eine Anwendung natürlicher oder synthetischer
Angiogeneseinhibitoren zur Behandlung von Tumoren und Prävention von Metastasen erschien
daher plausibel. Ein Vorteil der antiangiogenetischen Therapie sollte die verringerte Toxizität
20
im Vergleich zu Chemotherapeutika sein. Ein anderes Motiv, die Gefäße statt der Tumorzellen
ins Visier zu nehmen, war, dass man unter Umständen die Entwicklung der ChemotherapieResistenz umgehen könnte, da Endothelzellen als nicht-maligne Zellen genetisch stabiler sind
als Tumorzellen (Verheul 2005). Es stellte sich jedoch heraus, dass auch antiangiogenetische
Substanzen zu einer Resistenzbildung führen können, da die Verabreichung in der Regel über
viele Jahre erfolgt (Azam 2010). Weitere Vorteile der antiangiogenetischen Therapie sind: die
direkte Zugänglichkeit der Tumorendothelzellen für die intravenös verabreichten Substanzen;
der verstärkende Effekt des Verschlusses eines einzelnen Gefäßes, da eine einzelne Kapillare
eine Vielzahl von Tumorzellen mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt; und des Weiteren sollte
sich diese Strategie auf verschiedenste Tumorentitäten anwenden lassen, da deren Blutgefäße im
Allgemeinen dieselben morphologischen und biochemischen Eigenschaften aufweisen (Thorpe
2000).
Es findet sich eine Vielzahl antiangiogenetischer Substanzen in der klinischen Erprobung und
Anwendung. Grundsätzlich lassen sich die antiangiogenetischen Substanzen nach ihrem Wirkungsmechanismus in vier Gruppen einteilen: (1) Inhibitoren der Signalwege von Wachstumsfaktoren; (2) direkte Inhibitoren des endothelialen Zellzyklus; (3) Substanzen, die in die endotheliale Zelladhäsion eingreifen, wie zum Beispiel Integrininhibitoren; und (4) andere
Substanzen. Ich möchte im Folgenden nur auf einzelne Beispiele für die ersten drei Gruppen
eingehen.
1.3.1
Inhibition von Wachstumsfaktoren: Bevacizumab
Bevacizumab ist ein humanisierter anti-VEGF-Antikörper. VEGF ist ein PhosphotyrosinkinaseRezeptor, dessen Aktivierung unter anderem zur Proliferation, Migration und Überleben von
Endothelzellen führt. In präklinischen Experimenten zeigte der murine Vorläuferantikörper in
der Monotherapie eine Hemmung des Tumorwachstums und der Metastasierung in verschiedenen Tumormodellen, darunter Brust-, Kolon- und Nierentumoren. Des Weiteren führte der Antikörper zu einer reduzierten Tumorvaskularität und zu einer erhöhten Perfusion der verbleibenden Blutgefäße. Diese Normalisierung der Tumorgefäße könnte theoretisch die Verabreichung
konventioneller Therapeutika erleichtern (Jain 2005).
In einer großen Phase-III-Studie mit über 800 Patienten mit fortgeschrittenem Kolonkarzinom
wurde die Kombinationstherapie (Irinotecan, 5-Fluorouracil, Leukovorin und Bevacizumab)
gegen die alleinige Chemotherapie getestet. Mit der Kombinationstherapie verbesserte sich das
Gesamtüberleben statistisch signifikant von 15,6 Monaten auf 20,3 Monate (Hurwitz 2004).
Ebenso verbesserten sich das Gesamtansprechen (34,8 % versus 44,8 %) und die Dauer des
Ansprechens (7,1 versus 10,4 Monate). Diese Studie führte zur Zulassung von Bevacizumab als
erster Angiogeneseinhibitor. Die häufigsten Nebenwirkungen von Bevacizumab sind Hyperten-
21
sion, Proteinurie, Thrombosen, gastrointestinale Blutungen und Leukopenie. Die Substanz wird
heute als Standard in der Firstline-Kombinationstherapie des fortgeschrittenen kolorektalen
Karzinoms, des Bronchialkarzinoms (NSCLC), des metastasierten Mammakarzinoms und des
metastasierten Nierenzellkarzinoms eingesetzt (Jackson 2008, Socinski 2007, Bukowski 2010)
und ist in den USA darüber hinaus zugelassen für die Behandlung des Glioblastoms. Des Weiteren werden Studien mit Bevacizumab bei Patienten mit Kopf-und-Hals-Tumoren (Seiwert
2008), Pankreaskarzinomen (Burris 2008) und anderen Entitäten durchgeführt.
Weitere zugelassene Tyrosinkinase-Inhbitoren mit antiangiogenetischem Potenzial sind Erlotinib, Sorafenib und Sunitinib.
1.3.2
Direkte Endothelzellinhibitoren: Endostatin
Endostatin wurde 1997 von Folkman als natürlich vorkommende antiangiogenetische Substanz
identifiziert. In-vitro-Studien mit Endostatin belegten eine Hemmung der Proliferation und Migration von Endothelzellen, eine Induktion der epithelialen Apoptose und einen ZellzyklusArrest. Endostar® ist ein rekombinantes humanes Endostatin, welches in China entwickelt und
hauptsächlich dort in verschiedenen Studien bei Lungenkarzinomen und anderen soliden Tumoren in Kombination mit einer Chemotherapie getestet wurde (Han 2011, Li 2010, Zhou 2011,
Zhao 2011). In der randomisierten, Placebo-kontrollierten Studie von Han et al. wurden 126
Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom entweder mit Paclitaxel/Carboplatin plus Placebo oder mit Paclitaxel/Carboplatin plus Endostatin behandelt. Dabei
zeigte sich ein signifikant verbessertes Ansprechen (39,3 % versus 23 %) für die EndostatinGruppe. Die Unterschiede im Progressions-freien Überleben und im Gesamt-Überleben erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Bemerkenswert ist, dass eine auf dem ASCO 2005
präsentierte Phase-III-Studie (Sun 2005), die für Endostar® gegen Placebo in Kombination mit
Cisplatin/Vinorelbin bei fast 500 Patienten mit fortgeschrittenem, nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom ein hochsignifikant verbessertes Ansprechen ergeben hatte, bisher nicht als englischsprachige Vollpublikation erschienen ist (Möhle 2010). Diese Studie führte zur Zulassung von
Endostar® in China für die Behandlung nicht-kleinzelliger Bronchialkarzinome.
1.3.3
Inhibitoren von Integrinen: Cilengitide
Cilengitide ist ein Inhibitor der endothelialen Oberflächenrezeptoren ανβ3 und ανβ5 (Friess
2006). Diese Integrine dienen der Adhäsion von Endothelzellen an der extrazellulären Matrix.
Im Tiermodell führte Cilengitide zur Hemmung von Tumorwachstum. In ersten Phase-I-Studien
bei Patienten mit refraktären Gehirntumoren und malignen Gliomen zeigte die Substanz eine
Wirkung (MacDonald 2008, Nabors 2007). In einer Phase-II-Studie bei Patienten mit fortge-
22
schrittenem Pankreaskarzinom, die Gemcitabin plus Cilengitide mit Gemcitabin allein verglich,
konnte kein signifikanter Unterschied im Gesamt-Überleben, Progressions-freien Überleben
oder Gesamt-Ansprechen zwischen den beiden Gruppen gesehen werden (Friess 2006). Aktuell
wird Cilengitide in einer Phase-III-Studie bei Patienten mit neu diagnostiziertem Glioblastom
untersucht (Stupp 2010).
1.3.4
Hindernisse bei der klinischen Entwicklung von Angiogenese-Inhibitoren
Bei der Einführung der Angiogenese-Inhibitoren in die klinische Praxis gibt es immer noch
zahlreiche Hürden zu überwinden (Verheul 2005). Zunächst galt es zu akzeptieren, dass solche
Substanzen zu keiner schnellen und kompletten Remission führen. Ziel ist es vor allem, ein
Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern. Das Design klinischer Studienprotokolle zur Evaluation von Chemotherapeutika kann nicht unverändert übernommen werden. In den klassischen
Protokollen für Chemotherapie-basierte Phase-I- und Phase-II-Studien wurde eine mindestens
25%ige Reduktion des Tumorvolumens zur Fortführung der Studien verlangt. Bei Studien zu
Angiogenese-Inhibitoren akzeptiert man eine 20%ige Progression der Erkrankung als Stable
Disease. Traditionelle Phase-I-Studien dienen der Findung der maximal tolerierten Dosis
(MTD) und der Dosis-limitierenden Toxizität (DLT), da für herkömmliche Chemotherapeutika
eine direkte Korrelation zwischen Dosis, Aktivität und Toxizität existiert (Sarmiento 2008). Für
antiangiogenetische Substanzen gibt es hingegen keine lineare Beziehung zwischen Dosis und
Aktivität, jedoch steigt die Toxizität mit der Dosis. Es wurde vorgeschlagen, durch pharmakokinetische Studien einen sogenannten Ziel-Effekt zu identifizieren, um die biologisch effektive
Dosis (BED) bzw. die minimale Ziel-hemmende Dosis (MTID) und das optimale Behandlungsschema zu finden. Des Weiteren wurden neue Methoden zur Evaluation der Medikamentenaktivität eingeführt, so zum Beispiel die Quantifizierung von angiogenen Wachstumsfaktoren,
Messung der Tumorperfusion durch dynamische kontrastverstärkte Kernspintomographie und
Quantifizierung der zirkulierenden Endothelzellen. Keine dieser Methoden kann aber verlässlich
ein Ansprechen vorhersagen, so dass für Phase-II- und Phase-III-Studien das GesamtÜberleben, die Zeit bis zum Progress und das Progressions-freie Überleben sinnvolle Endpunkte
darstellen. Für Phase-III-Studien mit antiangiogenetischen Substanzen spielt auch die Selektion
der Patienten eine bedeutende Rolle. Die molekulare Charakterisierung des Tumors könnte in
Zukunft ein wichtiges Stratifikations-Merkmal sein. Ein weiteres Problem im Studiendesign ist,
dass Patienten mit großer Tumormasse, mit zahlreichen chemotherapeutischen Vortherapien
und einer Chemotherapie-refraktären Erkrankung wahrscheinlich kaum von einer antiangiogenetischen Therapie profitieren werden. Möglicherweise ist deshalb eine Evaluation der antiangiogenetischen Substanzen in einem adjuvanten Setting ein guter Ansatz.
23
1.4
Zielgerichtete antivaskuläre Agenzien
Das Konzept der zielgerichteten antivaskulären Agenzien (Vascular Targeting Agents, VTAs)
wurde in den frühen 80er Jahren von Juliana Denekamp vorgestellt (Denekamp 1982). Der Unterschied der VTAs zu den antiangiogenetischen Substanzen besteht darin, dass nicht die Ausbildung neuer Gefäße verhindert wird, sondern dass auch bestehende Tumorblutgefäße angegriffen werden. Diese Medikamente wirken daher auch bei Tumoren, die bereits ein ausgereiftes
Gefäßnetz gebildet haben. VTAs verursachen einen Gefäßverschluss und konsekutiv eine Ischämie und Nekrose im Tumor. Sie wirken schneller als Angiogeneseinhibitoren, sind nicht für
eine chronische Gabe konzipiert und könnten daher mit einer verringerten Resistenzbildung
einhergehen.
In einer Proof-of-Principle-Studie zu diesem Ansatz wurde im Mausmodell durch Transfektion
ein experimenteller Tumorendothelmarker geschaffen, an den ein Ricin-konjugierter Antikörper
binden konnte, was dann zur Okklusion der Gefäße mit konsekutivem Tumorregress führte
(Burrows 1993). In nachfolgenden Studien fand man einen auf Tumorblutgefäßen selektiv hochregulierten Marker, das Endoglin, welches als Ziel für ein Immuntoxin (Konjugat aus Antikörper und intrazellulär wirkendem Toxin) diente (Burrows 1995). Andere Arbeitsgruppen verwendeten dann Konjugate von VEGF und Diphtherietoxin (Arora 1999), Endoglin und Ricin
(Matsuno 1999) oder CD44-Antikörper und dem Zytostatikum Neocarcinostatin (Tsunoda
1999). Für diese Konstrukte konnte im Tiermodell eine Antitumoraktivität nachgewiesen werden.
VTAs verursachen das charakteristische Muster einer ausgedehnten zentralen Nekrose in experimentellen Tumoren, die sich bis auf 95% der Tumormasse belaufen kann. In der Peripherie
verbleibt jedoch meist eine schmale Randzone mit lebenden Tumorzellen. Dies ist dadurch zu
erklären, dass die Tumorzellen im Randgebiet von normalen Blutgefäßen (mit)versorgt werden,
welche auf die VTAs nicht ansprechen, aber wiederum für konventionelle Therapeutika zugänglich sind. Auf dieser Grundlage kann man sich einen synergistischen Effekt vorstellen, wenn
man VTAs mit Chemotherapeutika kombiniert. Der vitale Ring von Tumorzellen nach VTATherapie stellt ein zentrales Problem dieser Medikamentengruppe dar, da die Tumoren von diesen Zellen ausgehend sehr schnell nachwachsen können. Es gibt mittlerweile vermehrt Anhaltspunkte dafür, dass dieses aggressive Neuwachstum durch Vaskulogenese unterstützt wird, das
heißt von einwandernden endothelialen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (Daenen 2009).
Dementsprechend konnte im Tierversuch eine Hemmung der Vaskulogenese die Ausdehnung
dieses vitalen Rings drastisch verkleinern.
Man unterscheidet zwei Untergruppen von VTAs: Vaskulär disruptive Agentien (VDAs) und
spezifische vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs). Die Mehrzahl der VDAs ist
24
nicht mit einem spezifischen Liganden versehen, sondern macht sich die pathophysiologischen
Unterschiede zwischen dem Endothel normalen Gewebes und dem des Tumorgewebes zu Nutze. Solche Unterschiede, die das Tumorendothel auszeichnen, sind beispielsweise eine erhöhte
Proliferationsrate, eine erhöhte Permeabilität und die Abhängigkeit des Tubulin-Zytoskelettes
zur Aufrechterhaltung der Zellform. Im Gegensatz hierzu binden Liganden-gerichtete VTAs
selektiv an Moleküle, die vermehrt oder ausschließlich auf Tumorblutgefäßen exprimiert sind.
1.4.1
Vaskulär disruptive Agentien (VDAs)
VDAs sind entweder Mikrotubuli-destabilisierende Substanzen oder Flavonoide (Hinnen 2007).
Erstere binden an die Colchicin-Bindungsstelle des endothelialen Tubulins, woraufhin es zur
Depolymerisation der Mikrotubuli kommt. Die Zerstörung des Zytoskeletts führt zu einer Konfirmationsänderung der Endothelzellen und daraufhin zu einer Reduktion des Blutflusses in den
Gefäßen. Des Weiteren konnte für einen typischen Vertreter dieser Gruppe, das Combretastatin
A4 Phosphat (CA4P), gezeigt werden, dass zusätzlich der VE-Cadherin/β-Catenin-Komplex
zerstört wird. Dadurch kommt es zur Lösung von Zell-Zell-Kontakten, welches zum Einen eine
Permeabilitätssteigerung verursacht, was den interstitiellen Druck erhöht und zur weiteren Reduktion des Blutflusses führt. Zum Anderen resultiert die Exposition der Basalmembran in einer
Aktivierung der Koagulationskaskade mit nachfolgender Thrombusbildung. In diese Gruppe der
Mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen fallen folgende Moleküle: das bereits erwähnte
Combretastatin A4 Phosphat, AVE8062, ZD6126, ABT-751, MN-029 und TZT-1027. Diese
Substanzen befinden sich alle in der klinischen Prüfung. Beispielhaft möchte ich auf die veröffentlichten Studien mit ABT-751 eingehen.
ABT-751 ist ein Sulfonamidmolekül, welches über den oben bereits erwähnten Wirkungsmechanismus zur Depolymerisation der Mikrotubuli der Endothelzellen führt. Es kann in oraler
Form verabreicht werden und hat in verschiedenen Tumormodellen eine signifikante AntitumorAktivität gezeigt. In verschiedenen Phase-I-Studien mit Patienten mit soliden Tumoren und
akuten Leukämien bzw. myelodysplastischen Syndromen zeigten sich folgende häufigste Nebenwirkungen: Ileus, Obstipation, abdominelle Schmerzen, Dehydrierung und Müdigkeit. In
einer Studie mit 39 Patienten mit soliden Tumoren erreichte ein Patient eine Minor Response
und vier Patienten eine Stable Disease für mindestens sechs Monate (Hande 2006). In einer
Phase-II-Studie mit 35 Patienten mit fortgeschrittenem, Taxan-refraktärem Bronchialkarzinom
(NSCLC) erreichte ein Patient eine partielle Remission, die auch 567 Tage nach der initialen
Dokumentation noch anhielt (Mauer 2008). Die mediane Zeit bis zur Tumorprogression bzw.
das Gesamtüberleben betrugen 2,1 bzw. 8,4 Monate. Diese Ergebnisse sind vergleichbar zu
anderen Substanzen, die bei diesem Patientenkollektiv als wirksam gelten.
25
Die zweite Gruppe der VDAs sind die Flavonoide FAA (Flavone Acetic Acid) und DMXAA
(5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid). FAA ist ein synthetisches Flavonoid, welches in experimentellen Tumoren eine beeindruckende Aktivität zeigte, sich jedoch in Tumorpatienten als zu
toxisch erwies. Dies führte zu der Entwicklung des FAA-Analoges DMXAA, das auch als
ASA404 oder Vadimezan bezeichnet wird. Flavonoide haben einen dualen Wirkmechanismus
mit sowohl direkter als auch indirekter antivaskulärer Aktivität (McKeage 2010). Zum Einen
induzieren diese Substanzen direkt die Apoptose von Tumor-Endothelzellen. Das Absterben der
Endothelzellen führt zur Exposition der Basalmembran, zur Ruptur der Tumor-Blutgefäße und
zur Extravasation von Erythrozyten in das umliegende Gewebe. Zum Anderen verursachen
Flavonoide indirekt eine Tumor-Gefäßschädigung, indem sie die intratumorale Konzentration
von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), anderer Zytokine, wie Interferon-γ und Interferoninducible Protein-10 (IP-10), und Stickstoffmonoxid erhöhen. Dabei scheint TNF-α die wichtigste Rolle zu spielen. Es induziert den Kollaps von Blutgefäßen, führt zu einer gesteigerten
vaskulären Permeabilität und reduziert den Tumor-Blutfluss. Es gibt außerdem Hinweise, dass
Flavonoide die Phosphorylierung des Inhibitors des nukleären Transkriptionsfaktors κB (NFκB) stimulieren, was zur Aktivierung der NF- κB-gesteuerten Gentranskription führt. Dadurch
kommt es wahrscheinlich zur Umorganisation des Zytoskelettes mit der daraus resultierenden
Änderung der Endothelzellkonfirmation. Es wurden mehrere Phase-I-Studien mit Patienten mit
refraktären soliden Tumoren veröffentlicht (u.a. Jameson 2003, Rustin 2003, McKeage 2006).
Die häufigsten Nebenwirkungen waren Harninkontinenz, visuelle Störungen, Hypertonie, Konfusion, Tremor und transiente QT-Zeit-Verlängerung. In zwei der Studien konnte jeweils eine
partielle Remission beobachtet werden (n = 46 bzw. 63 Patienten). In drei randomisierten Phase-II-Studien (Gabra 2006, McKeage 2008, Pili 2007) wurde DMXAA bei Patienten mit Bronchial-, Ovarial- und Prostatakarzinomen mit konventionellen Chemotherapeutika kombiniert. In
der Studie von McKeage et al. wurden Patienten mit unbehandeltem fortgeschrittenem Bronchialkarzinom (NSCLC) entweder mit der Standardtherapie (Carboplatin und Paclitaxel) allein
oder in Kombination mit DMXAA behandelt. Dabei zeigte sich ein verbessertes Ansprechen
(31 vs. 22 %), eine verlängerte Zeit bis zum Progress (5,4 vs. 4,4 Monate) und ein verbessertes
medianes Überleben (14,0 vs. 8,8 Monate) für die DMXAA-Kombinationstherapie.
Es wurden zwei große randomisierte Phase-III-Studien durchgeführt: ATTRACT-1, die
DMXAA in Kombination mit Paclitaxel und Carboplatin als First-Line-Therapie bei NSCLC im
Stadium IIIB/IV untersuchte, und ATTRACT-2, mit DMXAA in Kombination mit Chemotherapie als Second-Line-Therapie für fortgeschrittene NSCLC. Die beiden Studien wurden 2010
gestoppt, nachdem die Interims-Analysen zeigten, dass die primären Endpunkte eines verbesserten Überlebens nicht erreicht wurden (Lara 2011 und Novartis-Homepage 2010).
26
1.4.2
Selektive Vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs)
SVOAs erzeugen eine lokale Gerinnungsaktivierung und verschließen hierdurch selektive Gefäßbetten. Die Selektivität wird über einen Liganden-vermittelten Targeting-Mechanismus erreicht. Für die Tumortherapie werden zum Beispiel Antikörper oder Peptide, die selektiv an
Marker oder antigene Strukturen der Tumorblutgefäße binden, eingesetzt (Thorpe 2004). Vaskuläre Tumormarker sind Moleküle, die selektiv auf dem Tumorendothel hochreguliert sind. In
den letzten Jahren wurde eine Vielzahl solcher Moleküle identifiziert: Moleküle der Angiogenese und des vaskulären Umbaus; Zell-Adhäsions-Moleküle, die durch inflammatorische Zytokine
induziert werden können; physiologischerweise intrazellulär lokalisierte Moleküle, die auf der
Oberfläche von Tumorendothel lokalisiert werden konnten; und Moleküle, die mit den prothrombotischen Veränderungen des Tumorendothels einhergehen. In der Tab. 1.1 sind einige
Beispiele angeführt.
Tab. 1.1:
Oberflächenmoleküle, die selektiv auf Tumorendothel hochreguliert sind (modifiziert
nach Thorpe 2004 und Stevens 2008)
Klasse
Tumorendothel-Marker
Angiogenese/vaskulärer Umbau
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) -Rezeptor
αvβ3-Integrine
PSMA-1 (Prostata-spezifisches Membran-Antigen)
CD44-related Antigen (TES-23)
Fibronectin ED-B Domain
Endoglin
Endosialin (TEM1, Tumor Endothel Marker)
Matrix-Metallo-Proteinasen (MMP2, MMP9)
Aminopeptidase N (CD13)
Robo4
VCAM-1 (CD106)
E-Selektin
Interleukin-11-Rezeptor
Phosphatidylserin
Tissue Factor
Annexin A1
Nucleolin
Zelladhäsion/Inflammation
Prothrombotische Faktoren
Intrazelluläre Antigene, die auf Tumorendothel lokalisiert sind
An die Targeting-Einheit der SVOAs wird ein Effektormolekül, wie trunkierter Tissue Factor
(tTF), gekoppelt, das die Okklusion der Tumorblutgefäße vermittelt. Daneben können auch
Effektoren anderer Klassen durch Liganden-gerichtete VTAs selektiv am Tumorendothel lokalisiert werden: Toxine, zytotoxische Substanzen, Apoptose induzierende Agenzien, Zytokine oder
Radioisotope (Thorpe 2004).
27
1.4.2.1
Biochemische Konstrukte
Huang et al. (Huang 1997) setzten erstmalig trunkierten Tissue Factor (tTF) mit einem gegen
ein Antigen auf Tumorblutgefäßen gerichteten Antikörper ein. tTF ist der extrazelluläre Anteil
des Tissue Factors, welcher per se nicht an Membranen binden kann, und somit seine Kofaktorfunktion im extrinsischen Tenasekomplex (siehe unter 1.6) nicht erfüllen kann. Erst durch
Kopplung an einen spezifisch an die Endothelzelloberfläche bindenden Antikörper wird die
Fähigkeit zur Koagulationsinduktion wieder hergestellt. In dieser wegweisenden Arbeit diente
ein artifiziell induziertes Tumorzellantigen (MHC-Klasse-II-Antigen I-Ad) als Ziel. Die Arbeitsgruppe präparierte einen bispezifischen Antikörper, der auf der einen Seite I-Ad bindet und
auf der anderen Seite ein Epitop des tTF. Mit diesem Antikörper-tTF-Konstrukt wurden Mäuse
mit subkutanen Neuroblastomen behandelt. Nach 30 Minuten waren alle Tumorblutgefäße
thrombosiert. Nach 4 Stunden waren erste Tumorzellschäden zu sehen. Nach 24 Stunden zeigte
der Tumor eine fortgeschrittene Nekrose und nach 72 Stunden war die gesamte zentrale Region
des Tumors nekrotisch. 38 % der mit dem Koaguligand behandelten Mäuse zeigten eine komplette Regression des Tumors, bei 24 % konnte eine Größenreduktion um mehr als 50 % gesehen werden.
Nachdem der prinzipielle Beweis erbracht war, dass tTF in Kombination mit einem spezifischen
membranbindenden Liganden einen selektiven Gefäßverschluss auslösen kann, konjugierte
dieselbe Arbeitsgruppe um Philip E. Thorpe tTF an einen Antikörper gegen einen klinisch relevanten Tumorendothelzellmarker (Ran 1998): VCAM-1 ist ein Antigen, welches auf Tumorblutgefäßen überexprimiert ist (siehe 1.5). tTF wurde hierbei kovalent an den Antikörper
gebunden. Das Konstrukt wurde an einem Xenograft-Mausmodell mit subkutanen Tumoren aus
einer humanen Hodgkin-Zelllinie (L540) getestet. Neun von 15 Mäusen, die behandelt wurden,
zeigten eine mehr als 50%ige Größenreduktion des Tumors.
1.4.2.2
Rekombinante Fusionsproteine
Ein Problem bei biochemischen Konstrukten ist, dass die genaue Lokalisation der chemischen
Kopplung im Antikörper nur begrenzt kontrolliert werden kann. Chemische Kopplungsmethoden basieren meist auf einer Bindung an Amingruppen (wie in Lysin oder Arginin) oder an Sulfhydrylgruppen (wie in Cystein). Diese variieren in verschiedenen Antikörpern, so dass Lokalisation und Anzahl der Effektoren von Antikörper zu Antikörper unterschiedlich ist. Wie in
Abschnitt 1.7 genauer besprochen, kann dies einen großen Einfluss auf die Effektivität TFbasierter Medikamente haben. Im Gegensatz hierzu erlaubt die rekombinante Herstellung von
Fusionsproteinen eine einfache Produktion von definierten homogenen Proteinen mittels stan-
28
dardisierter molekularbiologischer Methoden. Gezielte Veränderungen der Struktur sind auf
DNA-Ebene möglich (Molecular Modelling).
Um SVOAs rekombinant herstellen zu können, wurde daher ein Klonierungs- und ExpressionsSystem entwickelt, welches modular aufgebaut ist und die rekombinante Herstellung von Fusionsproteinen mit Liganden gegen Tumorgefäßmarker ermöglicht (Gottstein 2001). Als Ligand
wurden sogenannte scFv (single chain variable fragment) Antikörper verwendet, das heißt Antikörper, welche lediglich aus der variablen Region der leichten und schweren Kette von Immunglobulin bestehen, und mit einem synthetischen Linker verbunden sind (siehe Abb. 1.1). Mit
diesem System wurden
rekombinante
Immuntoxine
und
SVOAs
gegen
Endoglin,
VEGF:VEGFR-Komplex und VCAM-1 hergestellt, welche in vitro funktionell aktiv waren und
in Pilotversuchen in vivo eine spezifische Koagulation von Tumorgefäßen auslösten.
Abb. 1.1:
Strukturen verschiedener Antikörper-Formate. (A) Immunglobulin-G-Antikörper, (B)
Fab-Fragment und (C) single chain Fv-Fragment (scFv). VH, variable Region der schweren Kette; VL,
variable Region der leichten Kette; CH, konstante Region der schweren Kette; CL, konstante Region der
leichten Kette. (Smith 2004)
Analog hierzu benutzten Nilsson et al. im Folgenden die ED-B-Domäne des Fibronektins als
antigene Zielstruktur (Nilsson 2001). Sie stellten ebenfalls ein scFv-tTF-Fusionsprotein her,
welches in verschiedenen Tumormausmodellen eine komplette Remission bei 30 % der Mäuse
verursachte. Dies war ein unerwartetes Ergebnis, da Fibronektin ein extravaskuläres, extrazelluläres Matrixprotein ist, welches also nicht zu einer intravasalen Gerinnungsinduktion beitragen
kann. Bei den subkutan gelegenen Tumoren sah man ein bis zwei Stunden nach Injektion des
scFv-tTF-Fusionsproteins makroskopisch eine Schwarzfärbung. Dieser makroskopische Befund
tritt auch bei Endotoxin-induzierten hämorrhagischen Thrombosen auf, welche entweder durch
29
hohe Dosen Endotoxin oder durch geringe Dosen Endotoxin in Kombination mit tTF hervorgerufen werden können (Philipp 2003).
Liu et al. verwendeten das Prostata-spezifische Membran-Antigen (PSMA) als Target (Liu
2002). Ein Streptavidin-TF-Protein wurde dabei in Kombination mit einem Biotin-Komplex
verabreicht, der einen Inhibitor der katalytischen Bindungsstelle des PSMA enthält, welcher
selektiv an PSMA bindet. Es wurden Xenograft-Mausmodelle mit Prostatatumoren behandelt.
Die mit dem Konjugat behandelten Tiere zeigten im Durchschnitt eine 70%ige Reduktion der
Tumormasse. Eine Kombinationstherapie mit niedrig-dosiertem liposomalem Doxorubicin und
dem Konjugat konnte für die behandelten Tiere einen signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zu der nur mit Doxorubicin behandelten Gruppe zeigen. Eine Hürde bei der Auswertung
von anti-PSMA-Agenzien ist das Fehlen eines geeigneten Mausmodells, da PSMA auf Tumorgefäßen der Maus nicht exprimiert wird (Arap 2002). In dieser Studie wurden PSMA-positive
Tumorzellen verwendet, welche sich zum Teil in die Gefäßwand einbauen und so ein Mosaik
von Mausendothelzellen und PSMA-positiven Tumorzellen bilden (Prinzip der Vasculogenic
Mimicry, Hendrix 2003).
Hu et al. testeten drei verschiedene tTF-Fusionsproteine im Mausmodell auf ihre Wirksamkeit
(Hu 2003): chTNT-3/tTF, das an DNA bindet, welche in degenerativen Tumoranteilen exponiert wird; chTV-1/tTF, das an Fibronektin auf der Tumorgefäß-Basalmembran bindet, und
RGD/tTF, das ebenfalls an Fibronektin – allerdings auf der luminalen Seite – bindet. Das letztere Konstrukt setzte erstmals ein Peptid anstelle eines Antikörpers ein. Die mit chTNT-3/tTF und
chTV-1/tTF behandelten Tumore waren um mehr als 50 % kleiner als die in der Kontrollgruppe.
RGD/tTF zeigte keine signifikante Hemmung des Tumorwachstums.
Die Arbeitsgruppe um Mesters generierte ebenfalls tTF-haltige rekombinante Fusionproteine
mit einem RGD-Peptid als Targeting-Faktor (Kessler 2005), und im Folgenden dann mit einem
zweiten Peptid: GNGRAHA (Bieker 2009, Schwöppe 2010). Das NGR-haltige Peptid bindet
spezifisch an eine Isoform der Aminopeptidase N (APN, CD13), dessen Expression auf Endothelzellen humaner und muriner Tumoren hochreguliert ist. Nach mehrfacher Injektion in
Xenograft-Tumoren-tragende Mäuse (A549, humanes Adenokarzinom der Lunge und HT1080,
humanes Fibrosarkom), kam es zu einer signifikanten Wachstumsverzögerung der Tumoren.
Um die Gewebsperfusion der behandelten Tumoren zu quantifizieren, verwendete die Arbeitsgruppe ein bildgebendes Verfahren mittels Magnet-Resonanz-Tomographie nach Injektion von
ultrakleinen supramagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (USPIO). Dabei konnte eine signifikant reduzierte Perfusion der behandelten Tumoren gemessen werden. Das tTF-NGR-Konstrukt
wurde schließlich erstmals in minimalen Dosierungen an zwei Tumor-Patienten im Endstadium
(fortgeschrittenes Cholangiokarzinom und metastasiertes Adenokarzinom der Lunge) getestet.
Die Tumoren dieser Patienten zeigten mit dem USPIO-MRT-Verfahren eine 25%ige bzw.
18%ige Reduktion des perfundierten Tumorvolumens. Bei guter Tolerabilität des Proteins
30
musste die Therapie aufgrund von progredienten Erkrankungen abgebrochen werden. Drei weitere Patienten mit Tumorerkrankungen im Endstadium (Mesotheliom, Multiples Myelom mit
extramedullären Manifestationen und metastasierter Keimzelltumor) wurden noch mit dem tTFNGR behandelt und zeigten eine gute Verträglichkeit dieser Substanz.
El-Sheikh et al. klonierten später ein tTF-basiertes rekombinantes Fusionsprotein mit der Heparin-bindenden Domäne von VEGF, genannt HBDt, als Targeting-Einheit (El-Sheikh 2005).
Mittels Bindungsstudien und konfokaler Mikroskopie konnte eine selektive Bindung des Konstruktes an einen trimolekularen Komplex aus Chondroitin-C-Sulfat-Proteoglykan, Neuropilin-1
und VEGF-Rezeptor-2, der in angiogen aktiven Stellen von Tumoren hochreguliert ist, nachgewiesen werden. Dabei konnte in vitro eine Hemmung des Wachstums der endothelialen Sprossen von Tumoren gezeigt werden. Die Arbeitsgruppe präparierte mit einem FluoreszenzFarbstoff markierte Tumorzellen in Agarose-haltige Sphäroide, die in Mäuse mit einer dorsalen
Rückenhaut-Kammer implantiert wurden. Nach intravenöser Applikation des HBDt.tTF konnte
mittels intravitaler Mikroskopie innerhalb von drei bis vier Minuten eine Thrombusbildung in
den Tumorblutgefäßen beobachtet werden. Dabei wurde die Wirksamkeit des HBDt.tTF durch
den Zusatz von FVIIa gesteigert und so die Menge der eingesetzten Substanz um bis zu 80 %
reduziert. Um den Effekt des HBDt.tTF auf das Tumorwachstum zu untersuchen, wurde Mäusen, die Tumoren einer Mammakarzinom-Zelllinie in einer dorsalen Rückenhaut-Kammer enthielten, zweimal im Abstand von vier Tagen das Konstrukt injiziert. Die Tumorgröße reduzierte
sich innerhalb von einer Woche nach der Behandlung um ungefähr 90 %.
Die zuvor genannten tTF-basierten Fusionsproteine wurden alle als antineoplastisch wirksame
Substanzen konzipiert. Huang et al. klonierten ein chimäres Protein, welches aus tTF und Annexin V, einem Phosphatidylserin (PS) bindenden Protein, besteht (Huang 2006). Ziel war es,
die hämostatische Wirksamkeit dieses Proteins im Rahmen von vaskulären Verletzungen nachzuweisen. Dabei zeigte sich in vitro bei niedrigen Konzentrationen des Proteins eine prokoagulatorische Wirkung, hingegen bei höheren Konzentrationen eine antikoagulatorische. Dieses
Phänomen wurde darauf zurückgeführt, dass die prokoagulatorische Wirkung sich nur dann
entfalten kann, wenn genügend PS-Bindungsstellen für die anderen notwendigen Gerinnungsfaktoren FVII/VIIa, FX, FVIII, FIX, FV und FII verfügbar sind. Experimente mit Heparinbehandelten Mäusen konnten zeigen, dass die zuvor verlängerte Schwanz-Blutungszeit nach
intravenöser Behandlung mit dem tTF-AnnexinV wieder signifikant verkürzt wurde. Neben
dem Einsatz als hämostatisch wirksames Agenz im Rahmen von Blutungen ist aber auch eine
Anwendung als antineoplastisch wirksame Substanz denkbar, da PS – in Abwesenheit von vaskulären Verletzungen – auch einen selektiven Tumorendothel-Marker darstellt.
31
1.5
VCAM-1
Da VCAM-1 in der vorliegenden Arbeit als Zielantigen benutzt wurde, wird es in diesem Abschnitt genauer beschrieben. VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule), auch als CD106
definiert, ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie (Petruzzelli 1999). In dieser Familie
ist eine Gruppe von Adhäsions-Molekülen zusammengefasst, die eine oder mehrere C2-TypImmunglobulin-artige, extrazelluläre Domänen enthalten. Diese sind charakterisiert durch zwei
Cystein-Moleküle, zwischen denen 55-75 Aminosäuren liegen. Sie spielen eine wichtige Rolle
in der Entwicklung des Nervensystems, bei der Immunantwort und in der embryonalen Entwicklung. Durch die Vermittlung der Zelloberflächenerkennung werden Zellverhalten und
Zellaktivität beeinflusst. In diese Kategorie fallen auch die Zelladhäsionsmoleküle PECAM-1
(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule), MAdCAM-1 (Mucosal Vascular Addressin Cell
Adhesion Molecule) und ICAM-1 bis -5 (Intercellular Adhesion Molecules). Diese finden sich
normalerweise auf Endothelzellen, wo sie die Leukozytenmigration durch die Gefäßwand regulieren und als Ankerstellen für sich entwickelndes Endothel im Rahmen der Angiogenese dienen.
VCAM-1 ist ein transmembranäres Glykoprotein, welches aus 715 Aminosäuren besteht und ein
Molekulargewicht von 100-110 kDa aufweist. Es enthält je nach Splice-Variante sechs oder
sieben C2-Typ-Immunglobulin-Domänen (siehe Abb. 1 .2).
Abb. 1.2: VCAM-1/ICAM-1/PECAM-1 Molekülstruktur (Williams 1988).
Als Hauptligand für VCAM-1 wurde α4β1 (auch VLA-4) identifiziert (Cook-Mills 2011). α4β1
bindet außerdem an Fibronektin, Heparin und JAM-B (Junction Adhesion Molecule B). Neben
32
α4β1 gibt es weitere Liganden für VCAM-1, wie α4β7 und αdβ2. Diese Integrine werden von Eosinophilen, Basophilen, Lymphozyten, Mastzellen und Monozyten exprimiert.
VCAM-1 wurde auf folgenden Zellen nachgewiesen: aktivierte Neurone (Birdsall 1992), glatte
Muskelzellen (Ardehali 1995), Fibroblasten (Meng 1995), Makrophagen (Kupffer-Zellen) (van
Oosten 1995), dendritische Zellen (Huang 1995), Oozyten (Campbell 1995), Sertoli-Zellen
(Riccioli 1995), Endothelzellen (Sano 1995) und Knochenmark-Stromazellen (Juneja 1993).
VCAM-1-positives Endothel findet sich nach Kuzu et al. allerdings nur vereinzelt in wenigen
Geweben, wie Schilddrüse, Hoden und Thymus (siehe Tab. 1.2). Yoong et al. fanden zusätzlich
in der Leber VCAM-1-exprimierende Endothelzellen (Yoong 1997). Im Gegensatz zu konstitutionell exprimierten Adhäsionsmolekülen, wie zum Beispiel ICAM, ist VCAM induzierbar und
seine Expression wird durch verschiedene Zytokine, wie IL-1, TNF-α, IL-4 und IL-13, außerdem durch Lipopolysaccharide und Thrombin stimuliert (Petruzzelli 1999).
Tab. 1.2: VCAM-1-Expression auf normalem Gefäßendothel (Kuzu 1993).
Gewebe
ICAM-1
VCAM-1
MUC-18
E-Selectin
P-Selectin
Niere
+ s,m,l,f,w
-
+ s,m,f,w
-
-
Leber
+ s,m,v
-
+ s**,m,v
-
+ m,v
Lunge
+ s,m,v,w
-
+ s,m,v,w
-
+ m,l,v
Nebenniere
+ s,m,v
-
+ s,f
-
+ m,l,v,w
Schilddrüse
+ s,m,v
+ s,f
+ s,m,v
+ s,m,v,w
+ m,l,f,v
Hoden
+ m,l,f
+ m,l,w
+ s,m,v
-
+ l,m,f,v
Lymphknoten
+ HEV,s*,m,w
-
+ s,HEV
+ HEV,m,v
+ HEV,m
Tonsillen
+ m,HEV,v
-
+ s,HEV
+ HEV,s,m
+ HEV,m
Thymus
-
+ HEV
+ s,HEV,w,v
-
+ HEV,m
Milz
+ s,m,l,f
-
+ s,v
-
+ m,l,w
ZNS
+ s,m,w
-
+s
-
+ s,m,v,w
Plexus choroideus
+ s,m,l,v,f
-
+ s,m,v
-
+ s,m,l,w,v
Pankreas
+ s,m,v,w
-
+ m,v
-
+ m,f
Magen
+ s,m,l,v
-
+s
-
+ m,l,v
Kolon
-
-
+ s,v,w
-
+ s,m,w,v
Skelettmuskel
+ m,f
-
+ m,v
-
+m
Herz
+ s,m,w,v,f
-
+ s,m,w,f
-
-
Endometrium
+ s,m,l
-
+s
-
+ m,l
Plazenta
+ s,m,l,v
-
+ s,m
-
+ m,l,v
Nabelschnur
+v
-
-
-
+
s: kleine Gefäße, Kapillaren und Sinus; s**: Lebersinusoidepithel nicht gelabeled; s*: mit Endothel ausgekleidete
Lymphknoten-Sinus waren ungefärbt; m: mittelgroße Gefäße, Venolen und Arteriolen; l: große Gefäße, Arterien und
Venen; HEV: High endothelial venules; v: variabel; w: schwach; f: nur wenige Gefäße waren gefärbt; ZNS: Zentrales
Nervensystem.
33
Bei verschiedenen nicht-tumorösen Erkrankungen, bei denen entzündliche Veränderungen eine
Rolle spielen, wurde eine vermehrte VCAM-1-Expression nachgewiesen: Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Systemischer Lupus erythematodes und Multiple Sklerose (McMurray 1996), Arteriosklerose (Blankenberg 2003) und bakterielle Infektionen (Golias 2007).
Die bestuntersuchte Funktion von VCAM-1 ist seine Rolle bei der Extravasation von Leukozyten. Insbesondere vermittelt die Bindung von α4β1 an VCAM-1 eine feste Adhäsion der Leukozyten an der Gefäßwand, nach dem Rollen und vor der Diapedese der zweite Schritt bei der
Extravasation der Zellen (Petri 2006).
VCAM-1 wurde mit immunhistochemischen Methoden auf dem Gefäßendothel unterschiedlicher
Tumoren nachgewiesen: Hodgkin-Lymphome (Christiansen 1998), Non-Hodgkin-
Lymphome und hyperplastische Lymphknoten (Renkonen 1992), Milz und Lymphknoten bei
Patienten mit B-CLL (Christiansen 1998), Nicht-Kleinzellige Bronchialkarzinome (Staal-van
den Brekel 1996), maligne Melanome (Jonjic 1992), hepatozelluläre Karzinome (Yoong 1997),
kolorektale Karzinome, Magenkarzinome (Ding 2003), undifferenzierte nasopharyngeale Karzinome und maligne epitheliale Tumoren (Ruco 1994).
1.6
Gerinnungsbiologie
1.6.1
Die Gerinnungsaktivierung
Die klassische Kaskadentheorie der Blutgerinnung, bei der es zur sequentiellen Aktivierung der
Gerinnungsfaktoren kommt, was zur Bildung des Prothrombinase-Komplexes (FXa/FVa), zur
Bildung von aktivem Thrombin und schließlich zur Fibrin-Polymerisation führt, wird heutzutage durch eine physiologischere Betrachtung ersetzt (Weber 2006). In der Kaskadentheorie wurden zwei Aktivierungswege, das extrinsische und das intrinsische System, unterschieden.
Grundlage hierfür bildeten laborchemische Gerinnungsuntersuchungen, die aber nur sehr unzureichend die Mechanismen der Gerinnung in vivo widerspiegeln. „Nach heutigen Vorstellungen
verläuft die Blutgerinnung nicht über zwei parallel bzw. konvergent verlaufende Aktivierungswege, sondern findet als zeitliche Abfolge von drei nacheinander folgenden Gerinnungsphasen
statt“: Initiationsphase, Vorbereitungsphase und Propagationsphase (Weber 2006). Mann hebt
dabei die Bildung der drei zentralen Vitamin-K-abhängigen Enzymkomplexe, extrinsischer
Xase-Komplex (auch als Tenase-Komplex bezeichnet), intrinsischer Xase-Komplex und Prothrombinase-Komplex, hervor (Mann 2003).
In der Initiationsphase der Blutgerinnung kommt es durch eine Endothelverletzung zur Reaktion
zwischen dem an der Innenseite der Zellmembran lokalisierten TF und im Blut zirkulierendem
FVIIa. Dieser FVIIa-TF-Komplex, auch als extrinsischer FXase-Komplex bezeichnet, katalysiert die Aktivierung von FIX und FX (siehe Abb. 1.3), wobei der Letztere das effektivere Sub-
34
strat darstellt und als membrangebundener FXa seinerseits ebenfalls zur FIX-Aktivierung beiträgt. In dieser Phase der Gerinnung wird die Bildung von Thrombin durch die Hemmung von
FXa und FVIIa durch TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) noch gebremst. Der membrangebundene FXa aktiviert aber kleinste Mengen von Prothrombin zu Thrombin, die allerdings zur
Bildung eines Thrombus nicht ausreichen. Dieses initiale Thrombin dient in der Vorbereitungsphase als Aktivator für Thrombozyten, FV und FVIII. FVIIIa bildet dann zusammen mit FIXa
auf der aktivierten Thrombozytenmembran den intrinsischen FXase-Komplex, welcher dann
zum hauptsächlichen Aktivator für FX wird. FXa formiert sich in der Propagationsphase zusammen mit FVa auf der aktivierten Thrombozytenmembran zur sogenannten Prothrombinase,
die Prothrombin in Thrombin konvertiert. Die Prothrombinase ist dabei 300.000-mal effektiver
in der Prothrombin-Aktivierung als FXa. Thrombin vermittelt schließlich die Spaltung von Fibrinogen und FXIII und somit die Entstehung eines Thrombus aus unlöslichem Fibrin.
Abb. 1.3:
1.6.2
Die drei zentralen Vitamin-K-abhängigen Gerinnungskomplexe (Mann 2003).
Tissue Factor (TF) und Truncated Tissue Factor (tTF)
Der Tissue Factor (TF), auch als CD142 beschrieben (im deutschen Sprachgebrauch: Gewebsfaktor oder Thromboplastin), ist das Initiatormolekül der Blutgerinnung. Dabei handelt es sich
um ein glykosyliertes transmembranäres Protein, das aus 263 Aminosäuren besteht (Morrissey
2001). Das Molekulargewicht beträgt 29.593 für das reine Polypeptid und 45.000 für das glykosylierte Protein. Der extrazelluläre Anteil besteht aus 219, der transmembranäre Anteil aus 23
und der intrazelluläre Anteil aus 31 Aminosäuren (siehe Abb. 1.4).
35
Abb. 1.4:
Die molekulare Struktur des Tissue Faktors. Zeichnung von C. Gottstein.
TF wurde ursprünglich als Gewebsbestandteil identifiziert, der durch Zugabe zu Plasma die
Gerinnungskaskade aktiviert - daher der Name (Broze 1985). Er wurde erstmals 1985 aufgereinigt und im Folgenden wurde seine DNA sequenziert. Drake et al. formulierten 1989 die Hypothese, dass TF um die Blutgefäße eine „hämostatische Hülle“ ausbildet, die die Gerinnung nach
einer Verletzung des Gefäßes initiiert (Drake 1989).
Als „truncated Tissue Factor“ (tTF, auch „soluble Tissue Factor“ = sTF) wird die extrazelluläre
Domäne des TF bezeichnet. Sie besteht aus zwei Fibronektin-Typ-III-Domänen mit insgesamt
219 Aminosäuren (Morrissey 2001). Die Gerinnungs-induzierende Aktivität von trunkiertem TF
ist 10.000-mal niedriger als die des kompletten TF. Schon früher zeigten Paborsky et al., dass
der von seinem intrazellulären und transmembranären Anteil befreite tTF nach kovalenter
Kopplung an einen Phosphatidylinositol-Anker wieder seine volle Wirksamkeit erlangt, da er
durch die Bindung an die Zellmembran wieder in Kontakt zu den notwendigen negativ geladenen Phospholipiden tritt (Paborsky 1991). Der Membrananker ist essentiell für die volle proteolytische Aktivität im Zusammenspiel mit FVIIa. Dabei scheint die Beschaffenheit dieses Membranankers keine Rolle zu spielen. Es entstand die Idee, die transmembranäre Domäne durch
einen Liganden zu ersetzen, der spezifisch an Endothelzellen bindet und so durch den Kontakt
zur Zellmembran die Gerinnungs-induzierende Aktivität des tTF wieder herzustellen.
1.6.2.1
TF-Expression auf Zellen
TF wird als integrales Membranprotein von verschiedenen Zellen exprimiert: Fibroblasten und
glatten Muskelzellen der vaskulären Adventitia, Epithelzellen von Organkapseln und Körperoberflächen, Astrozyten des Gehirns, Alveolarzellen der Lunge, Trophoblasten der Plazenta und
36
kardiale Myozyten (Mackman 2004). Diese streng extravaskuläre Expression von TF bildet eine
protektive prokoagulatorische Hülle um das Gefäßsystem, welche fähig ist, das Gerinnungssystem zu aktivieren, wenn die Integrität der Gefäße unterbrochen wird.
Des Weiteren sieht man eine verstärkte TF-Expression auf verschiedenen Zellen nach Stimulation mit unterschiedlichen Agenzien. So exprimieren Monozyten und Makrophagen vermehrt
TF nach Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen (Eilertsen 2004).
Eine pathologische TF-Expression sieht man auf aus Makrophagen hervorgegangenen Schaumzellen und auf glatten Muskelzellen in arteriosklerotischen Plaques, auf verschiedenen Tumorzellen und auf zirkulierenden Makrophagen in Patienten mit gramnegativer Endotoxämie (Eilertsen 2004).
In Blutgefäßen ist TF wie oben beschrieben vorwiegend auf Zellen der Adventitia und Media
lokalisiert. Auf normalen Endothelzellen konnte TF nicht nachgewiesen werden. Bestimmte
pathologische Bedingungen, wie zum Beispiel invasiver Brustkrebs, können aber eine Expression von TF auf Endothelzellen induzieren, welche zu thrombogenem Potenzial führt (Contrino
1996).
In Tiermodellen wurde eine durch Lipopolysaccharide (LPS) stimulierte TF-Expression auf
Endothelzellen in vivo nachgewiesen (Drake 1993); diese wird allerdings kontrovers diskutiert.
Eilertsen schreibt, als mögliche Erklärung für den nachgewiesenen TF, diesen eher Mikropartikeln aus Monozyten zu, die an aktiviertes Endothel binden (Eilertsen 2004). Dennoch konnte in
in-vitro-Studien eine TF-Expression nach LPS-Stimulation von Endothelzellkulturen nachgewiesen werden (Parry 1995, Brox 1984).
1.6.2.2
Zirkulierender TF
In den letzten Jahren wurden verschiedene widersprüchliche Studien veröffentlicht, die sich mit
dem Vorhandensein, der Konzentration und der funktionellen Aktivität von zirkulierendem TF –
als lösliches Protein, als Bestandteil von Mikropartikeln und auf bzw. in verschiedenen Blutzellen – beschäftigen (Butenas 2009). Die dabei im Blut gesunder Probanden gemessenen Konzentrationen bewegen sich in sehr unterschiedlichen Größenordnungen, was wohl darauf zurück
zu führen ist, dass validierte und verlässliche Assays für die Messung von TF und dessen Aktivität fehlen.
Zirkulierender TF spielt möglicherweise eine wichtige Rolle in der Ätiologie verschiedener
Erkrankungen. Erhöhte Konzentrationen wurden beispielsweise bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, Meningokokkensepsis, disseminierter intravasaler Gerinnung, AntiphospholipidAntikörper-Syndrom und Sichelzellerkrankung nachgewiesen. Eine besondere Rolle scheinen
hierbei TF-reiche Mikropartikel zu spielen. Diese prokoagulanten Mikropartikel stammen von
37
Thrombozyten, Monozyten, Endothelzellen oder auch Tumorzellen (Morel 2006). Sie werden in
geringen Konzentrationen auch im Blut gesunder Probanden nachgewiesen. Jedoch unterscheiden sich die Mikropartikel, die unter pathologischen Bedingungen gefunden werden, von denen
gesunder Menschen. So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mikropartikel bei kardiovaskulären Erkrankungen eine Rolle bei der Dysregulation des Gefäßtonus spielen, wohingegen
Mikropartikel gesunder Probanden keinen Effekt auf die Gefäße haben. Untersuchungen zur
Rolle von Mikropartikeln beim Diabetes mellitus haben gezeigt, dass deren Phänotyp und prokoagulantes Potenzial je nach Typ des Diabetes und glykämischer Kontrolle variieren. Bei Patienten mit schlecht kontrolliertem Blutzucker konnte eine hohe prokoagulante Aktivität der Mikropartikel nachgewiesen werden.
Butenas et al. diskutierten das umstrittene Thema des im Englischen sogenannten „encryptiondecryption process“, also des Encodierungs-Decodierungs-Prozesses (Butenas 2009). Die Lyse
TF-positiver Zellen bewirkt einen signifikanten Anstieg der TF-Aktivität. Dies führte zu der
These, dass TF in zwei Zuständen existiert: ein Zustand niedriger Aktivität (auch als encodierte
Form bezeichnet) und ein Zustand hoher Aktivität (auch als decodierte Form bezeichnet). Beide
Formen binden FVII und FVIIa. Ein möglicher Mechanismus der Decodierung ist die Interaktion mit Phosphatidylserin. Dieses negativ geladene Phospholipid befindet sich normalerweise an
der Innenseite der Membran und tritt bei Zerstörung dieser an die Zelloberfläche.
1.6.2.3
TF-Signaling
Neben seiner Funktion im Gerinnungssystem spielt TF auch eine Rolle in der KrebsPathogenese (Schaffner 2009). So vermittelt der TF-VIIa-Komplex die Aktivierung des Protease-activated-Receptor (PAR) 2, was über Induktion einer Reihe von proangiogenetischen und
immunmodulierenden Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren zu Veränderungen der
Tumorumgebung, angiogenetischen Stimulation, Hemmung der Apoptose und TumorzellMigration führt.
Studien von Garnier et al. konnten einen Zusammenhang zwischen onkogenen Ereignissen,
Angiogenese und der gesteigerten Expression von TF auf verschiedenen Arten von Tumorzellen
zeigen (Garnier 2010). TF-blockierende Antikörper hemmten dabei das Tumorwachstum, die
Angiogenese und das Anwachsen des Tumors nach Injektion von tumorigenen Zellen. Es wurde
die Hypothese aufgestellt, dass der TF-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Formation der
vaskulären Nische für die sogenannten Tumor-initiierenden Zellen, auch als Krebs-Stammzellen
bezeichnet, spielt.
In Bezug auf die vorliegende Dissertation ist zu erwähnen, dass hier nur der extrazelluläre Anteil des TF verwendet wurde, so dass dabei kein TF-Signaling zu erwarten ist.
38
1.6.3
Faktor VII
FVII ist ein glykosyliertes Plasmaprotein, dessen Polypeptidkette aus 406 Aminosäuren besteht
und ein Molekulargewicht von 50.000 Da aufweist (Morrissey 2001). Er besteht aus mehreren
Domänen: eine γ-Carboxyglutaminsäure-reiche Domäne (Gla-Domäne), ein hydrophober oder
aromatischer Anteil, zwei Epidermal-Growth-Factor-artige Domänen (EGF-Domänen) und eine
Serin-Protease-Domäne. Die Gla-Domäne verleiht dem FVII die Fähigkeit, an Membranen zu
binden, die negativ geladene Phospholipide enthalten, wobei diese Bindung abhängig ist von
Calciumionen. Die Aktivierung von FVII erfolgt durch Proteolyse einer einzelnen Peptidbindung. Während FVII aus einer einzelnen Polypeptidkette besteht, besteht FVIIa aus zwei Polypeptidketten, die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.
1.6.4
Abb. 1.5:
Der FVIIa/TF-Komplex
Die Röntgen-Kristallstruktur des FVIIa/TF-Komplexes. TF = Tissue Factor, F1 und F2
= Fibronektin-TypIII-Domänen, VIIa = Serin-Protease-Domäne des FVIIa, E1 und E2 = EGF-artige
Domäne des FVIIa, G = Gla-Domäne des FVIIa (Morrissey 2001)
Die kristalline Struktur des FVIIa/TF-Komplexes wurde bis auf 2 Å aufgelöst (Morrissey 2001).
FVII ist ein langgestrecktes Protein, welches großflächig mit TF in Kontakt tritt (siehe Abb. 1
.5). Dabei liegen die Haupt-Kontaktstellen des TF in den beiden Fibronektin-Typ-III-
Domänen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass gewisse Domänen (hauptsächlich die erste
EGF-Domäne des FVIIa) wichtig sind zur Stabilisierung der Bindung, während andere (hauptsächlich die Protease-Domäne des FVIIa) wichtig sind für die allosterische Aktivierung des
FVIIa.
39
Die ermittelte kristalline Struktur des FVIIa/TF-Komplexes deckte auf, wie dieser sich auf der
Zellmembran lokalisiert: Die Gla-Domäne befindet sich am C-Terminus des FVIIa-Moleküls
und ist dafür verantwortlich, dass der FVIIa sowohl mit der Membranoberfläche als auch mit
dem TF reversibel interagieren kann. Der C-Terminus von TF befindet sich intrazellulär. In dem
kompletten TF-Molekül ist dieser Teil über eine kurze Linkersequenz mit dem Membrananker
verbunden.
Abb. 1.6:
Positionierung des aktiven Zentrums von FVIIa. FI = Fluoreszenz-Farbstoff, der an das
aktive Zentrum von FVIIa bindet (Morrissey 2001)
Mittels der Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Methode konnte die exakte Position des aktiven Zentrums des FVIIa zur Zellmembran ermittelt werden (siehe Abb. 1
.6). Dabei zeigte
sich, dass dieses sich 83Å über der Membran positioniert, wenn FVIIa alleine auf der Membran
bindet. Im FVIIa/TF-Komplex nähert sich das aktive Zentrum des FVIIa bis auf 75 Å an die
Membranoberfläche. So scheint der TF die Position und Orientierung des aktiven Zentrums des
FVIIa zu verändern. Dieses Positionieren von Serin-Proteasen und ihren Substraten ist wohl
eine wesentliche Rolle von membrangebundenen Protein-Cofaktoren. Interessanterweise befindet sich in dem FVIIa/TF-Komplex das aktive Zentrum von FVIIa, bei dem die Gla-Domäne
entfernt wurde, auf derselben Höhe wie bei intaktem FVIIa. Dieses legt nahe, dass TF alleine in
der Lage ist, das FVIIa-Molekül zu positionieren. Es ist denkbar, dass auch umgekehrt trunkierter TF durch den vollständigen Faktor VIIa auf der Membranoberfläche gerinnungsaktiv positioniert werden kann (Philipp 2003).
Freier FVIIa katalysiert die proteolytische Aktivierung seiner Substrate FIX und FX extrem
langsam (Morrissey 2001). Wenn FVIIa an TF bindet, der in Phospholipid-Vesikel inkorporiert
ist, wird seine Aktivität je nach Substrat um das 20- bis 100-fache verstärkt.
40
1.6.5
Der prokoagulatorische Status bei Krebspatienten
Thromboembolische Ereignisse stellen eine wichtige Komplikation von Krebs dar und sind ein
entscheidender Faktor in der Morbidität und Mortalität dieser Erkrankung (Lip 2002). Die
Symptome des prothrombotischen Status von Krebspatienten reichen von asymptomatischen
pathologischen Gerinnungstests bis hin zu massiven Thromboembolien und disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC).
Vor über 150 Jahren postulierte Virchow, dass drei Faktoren, die sogenannte Virchow-Trias, die
Thrombusbildung begünstigen: Veränderungen der Blutzusammensetzung (Hyperkoagubiliät),
Veränderungen des Blutflusses und Endothelalterationen.
Das Gerinnungssystem befindet sich normalerweise in einem Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Inhibierung von Thrombozyten, prokoagulatorischen, antikoagulatorischen und fibrinolytischen Faktoren. Ein prothrombotischer Status des Gerinnungssystems kann durch einen
Überschuss an prokoagulatorischen Faktoren, wie TF, Fibrinogen oder Plasminogen-AktivatorInhibitor, oder einen Mangel an antikoagulatorischen Faktoren, wie Antithrombin III, Protein C
und S oder Gewebsplasminogen-Aktivator, hervorgerufen werden. Diese Veränderungen wurden in unterschiedlichen Studien bei Krebspatienten nachgewiesen. Eine besondere Rolle in der
pathologischen Blutzusammensetzung bei Tumorpatienten scheinen TF-tragende Mikropartikel
zu spielen (Zwicker 2008). Diese entstehen nach Stimulation oder Apoptose von Thrombozyten,
Leukozyten und Endothelzellen, oder stammen direkt von Tumorzellen. Neben der prokoagulatorischen Wirkung des TF kommt es auf den Mikrovesikeln zur Externalisation von normalerweise auf der Membraninnenseite lokalisiertem Phosphatidylserin, welches als anionische Oberfläche die Bindung und katalytische Konversion von Gerinnungsfaktoren fördert.
Verschiedene Arbeiten in Tier-Xenograft-Modellen haben in Tumorblutgefäßen Veränderungen
der Blutflusseigenschaften nachgewiesen. So wurden Flussumkehr, Staupunkte, abnormale Verzweigungsmuster und der Einbau von Tumorzellen in die Gefäßwand gesehen.
Endothelzellen können unter dem Einfluss inflammatorischer Zytokine, wie Tumornekrosefaktor (TNF) oder Interleukin-1, prothrombotisch werden. Diese Zytokine supprimieren die endotheliale fibrinolytische Aktivität, verstärken die Produktion von Interleukin-1, vonWillebrand-Faktor und Protein C und vermindern die Thrombomodulin-Produktion. Des Weiteren fördern sie die endotheliale Expression von TF, E-Selektin und Plättchen-aktivierender Faktoren. Einige Zytokine, wie zum Beispiel TNF-α, sowie reaktive Sauerstoffmoleküle und in
vitro Hydrogenperoxid und Saponin induzieren eine Phosphatidylexternalisation auf Endothelzellen (Ran 2002). Tumorblutgefäße weisen eine gesteigerte Permeabilität auf, was eine Verlangsamung des Blutflusses und von daher eine höhere Thrombosewahrscheinlichkeit nach sich
zieht.
41
Insgesamt lässt sich zusammenfassen, dass Tumorendothelzellen eine Koagulation besser unterstützen als normale Endothelzellen, was für den in dieser Arbeit verwendeten Ansatz den Vorteil einer zusätzlichen Spezifität hat. Des Weiteren besteht bei soliden Tumoren oft das Problem
einer systemischen Hyperkoagulabilität. Wäre es möglich, diese systemisch zirkulierenden prothombotischen Faktoren an einer Stelle (im Tumor) für die Gerinnungsinduktion einzusetzen, so
könnte man sich durch den Verbrauch dieser Faktoren eine verminderte systemische Koagulabilität erhoffen.
1.7
Fragestellung
Vor dem oben genannten Hintergrund sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen bearbeitet werden:
1.7.1
Herstellung des rekombinanten SVOA anti-VCAM-tTF-Prototyps und
funktionelle Charakterisierung in vitro und in vivo
Zu Beginn der Arbeiten waren noch keine ausführlichen in vivo Daten zu dem rekombinanten
anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein vorhanden. Effizienz und Nebenwirkungen dieses Konstruktes
sollten detailliert in einem Tumormodell untersucht werden, um dies als Ausgangspunkt für
Struktur-Funktionsanalysen entsprechender Mutanten zu verwenden.
1.7.2
Untersuchung der molekularen Mechanismen der Koagulationsinduktion
von TF-Fusionsproteinen und Verbesserung der Effektorfunktion via
Molecular Modelling
Der Ansatz einer therapeutischen Gerinnungsinduktion erfordert ein hohes Maß an Selektivität
und Kontrollierbarkeit, da off-target Gerinnungsinduktion in normalen Gefäßen zu ernsthaften
Nebenwirkungen wie z.B. Schlaganfall, Herzinfarkt oder Organversagen führen kann. Daher ist
es unabdingbar, die genauen Triggermechanismen für die Gerinnungsinduktion zu verstehen
und zu kontrollieren. Das ursprüngliche Design Liganden-gekoppelter TF-Konstrukte zielt darauf ab, TF in Zellmembran-Nähe zu bringen. Sobald der Ligand einen Bindungspartner auf der
Gefäßoberfläche findet – und nur dann – sollte es zur Gerinnungsinduktion kommen. Die Vorergebnisse insbesondere von D. Neri (Nilsson 2001) und C. Gottstein (Philipp 2003) lassen aber
auch einen anderen Schluss zu. Möglicherweise dient der Ligand nur dazu, die lokale Konzentration an TF zu erhöhen, und die eigentliche Bindung an die Membran erfolgt über andere,
unspezifische Faktoren, wie z.B. Faktor VIIa via Gla-Domäne (siehe Kap. 1.6.4).
42
Grundsätzlich sind also zwei Szenarien denkbar, in welchen die Kopplung von tTF an den Antikörper eine Koagulationsinduktion des tTF ermöglicht:
1. „Liganden-vermittelte Komplexbildung“: Das resultierende Fusionsprotein bindet an VCAM1 und bringt tTF in ausreichende Nähe der Membran, woraufhin sich ein extrinsischer Tenasekomplex bildet. In diesem Szenario ist die Anwesenheit des Antikörpers zur Bildung des Tenasekomplexes erforderlich (siehe Abb. 1.7 A).
2. „ Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung“: Das resultierende Fusionsprotein bindet an
VCAM-1, dissoziiert dann aber wieder, und die membranständige Bindung des Tenasekomplexes erfolgt vorrangig über Faktor VIIa. In diesem Falle würde der Antikörper dazu dienen, eine
lokale Konzentrationserhöhung des Fusionsproteins zu bewirken, wäre aber für die Bildung des
Tenasekomplexes nicht unbedingt erforderlich (siehe Abb. 1.7 B).
Bei der zweiten Hypothese wären unter Umständen klinische Nebenwirkungen zu erwarten,
sobald sich eine erhöhte Konzentration von Fusionsprotein in einem prokoagulatorisch aktivierten Gefäß befindet, auch durch passives (= Liganden-unabhängiges) Targeting.
Abb. 1.7:
Hypothetische Möglichkeiten der Bindung des anti-VCAM-tTF: (A) Liganden-
vermittelte Komplexbildung mit Bindung über das scFv an VCAM-1 oder (B) Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung mit Bindung über die Gla-Domäne des Faktor VIIa
Im zweiten Teil der Arbeit sollten die Triggermechanismen und strukturellen Voraussetzungen
für eine effiziente Koagulationsinduktion untersucht werden. Diese Analysen sollten dann dem
Design einer Struktur mit verbesserter Effektorfunktion dienen. Wie weiter oben bereits erwähnt, ist die Ausrichtung des TF und des FVIIa auf der Zellmembran von besonderer Bedeutung. Daher sollten verschiedene Varianten mit verlängerten Linkern und verlängerten transmembranären Anteilen des tTF generiert werden, um die Positionierung des Moleküls zu
optimieren (siehe Abb. 1.8).
43
Abb. 1.8:
Modelle zur Positionierung des Tenase-Komplexes. (A) Optimale Position des TF im
natürlich vorkommenden Tenase-Komplex, (B) Hypothetisch suboptimale Position des tTF im ursprünglichen Konstrukt des anti-VCAM-tTF und (C) Verbesserte Position des tTF durch Modifikation von Linker und transmembranärem Anteil des tTF. Zeichnung von C. Gottstein, modifiziert.
44
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Reagenzien / Chemikalien
Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Reagenzien und Chemikalien von den Firmen Sigma-Aldrich (Steinheim, D), Roth (Karlsruhe, D), Merck (Darmstadt, D) und Boehringer (Mannheim, D) bezogen und hatten die Qualitätsstufe „pro analysis“.
2.1.1.1
Koagulationsfaktoren
Koagulationsfaktor VII, human
Calbiochem, CA, USA
Enzyme Research Lab., South Bend, USA
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Koagulationsfaktor VIIa, human
Enzyme Research Lab., South Bend, USA
Humaner Faktor IX
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Koagulationsfaktor X, human
Calbiochem, CA, USA
Koagulationsfaktor Xa, human
Amersham Biosciences, Piscataway, USA
2.1.1.2
Molekularbiologische Reagenzien
1 Kb DNA Ladder
Gibco BRL, Karlsruhe, D
10 mM dNTP Mix
Fermentas, Ontario, Kanada
100 bp DNA Ladder
Invitrogen, Karlsruhe, D
100 mM dTTP Solution, PCR Grade
Invitrogen, Karlsruhe, D
BSA für den Restriktionsverdau
New England BioLabs, Beverly, USA
DNA Quantitation Standards
Gibco BRL, Karlsruhe, D
Glycogen
Boehringer Mannheim, Mannheim, D
10X Puffer 1 und 2 für den Restriktionsverdau New England BioLabs, Beverly, USA
Restriktionsenzym Hind III
New England BioLabs, Beverly, USA
Restriktionsenzym Kpn I
New England BioLabs, Beverly, USA
Restriktionsenzym Sac I
New England BioLabs, Beverly, USA
Restriktionsenzym Xba I
New England BioLabs, Beverly, USA
T4 DNA Ligase mit Ligationspuffer
Roche, Mannheim, D
Polynukleotidkinase
New England Biolabs, Beverly, USA
Polymerase und Reaktionspuffer: Expand
Roche, Mannheim, D
45
High Fidelity PCR-System
2.1.1.3
Sequenzierungsprimer (Oligonukleotide/Primer)
Oligonukleotide wurden nach Angabe von der Firma MWG/Eurofins (Ebersberg, D) synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der Primer sind in der Tab. 2.1 angegeben.
Tab. 2.1: Nukleotidsequenzen der Primer
Primername
Sequenz
Für tTF-Verlängerungs-PCR
TTF 220 For
TTF 221 For
TTF 222 For
TTF 223 For
TTF 224 For
TTF 225 For
TTF 226 For
TTF 227 For
TTF 228 For
TTF BackKpn
5’-CCA CCT GAG CTC TTA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA CAC AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA
TTC-3’
5’-CCA CCT GAG CTC TTA TAC CAC AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT
GAA TTC-3’
5’-CCG GGG TAC CTC AGG CAC TAC AAA TAC T-3’
Für Primer-Duplex-Insertion zur Modifizierung der Linker
pswc10-DuA
pswc10-DuC
pswc11-DuA
pswc11-DuB
pswc12-DuA
pswc12-DuC
pswc13-DuA
pswc13-DuB
pswc14-DuA
pswc14-DuB
5’-CTA GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGC GGT GGC GGT AC-3’
5’-CGC CAC CGC CGT GAT GGT GAT GGT GAT GCT-3’
5’-CTA GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA
GGT AC-3’
5’-CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CGT GAT GGT GAT GGT GAT GCT-3’
5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT AC-3’
5’-CGC CAC CGC CCT-3’
5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA GGT AC-3’
5’-CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CCT-3’
5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA GGT TCA GGT GGA GGT GGT
AC-3’
5’-CAC CTC CAC CTG AAC CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CCT-3’
Für Reamplifizierung längerer Linker
Linker Back
Linker For
5’-TTG ACG GTA CCG GCG GCG GTT CC-3’
5’-TTG ACG GTA CCC GAG CCG CCA CCG CCA GA-3’
Für Sequenzierung
C24
N20
N26seq
CTG TAT CAG GCT GAA AAT CTT CTC
CAA GGA CGA CGA TGA CAA GC
CAT CAT AAC GGT TCT GGC AAA TAT
46
2.1.1.4
Das Expressionsplasmid pswc4
Abb. 2.1: Expressionsvektor pswc4 (modifiziert nach Gottstein 2001)
Die Generierung des Expressionsplasmids pswc4 ist in Gottstein 2001 beschrieben. Das Plasmid enthält zwischen HindIII und XbaI eine Klonierungsstelle für das scFv. Es folgt eine kurze
Linkersequenz, die für 6 x His kodiert. Das tTF-Gen ist umrahmt von den beiden Schnittstellen
für SacI und KpnI. Des Weiteren enthält das Expressionsplasmid noch eine ompALeadersequenz für Sekretion in das Periplasma und ein Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion rekombinanter Bakterien. Die FLAG-Sequenz und die 6 x His Sequenz dienen zur Detektion und Aufreinigung.
2.1.1.5
Andere Reagenzien
Agar Noble
Difco, Detroit, USA
Agarose
Peqlab, Erlangen, D
Bacto-Hefeextract
Difco, Detroit, USA
Bacto-Trypton
Difco, Detroit, USA
BenchMark Prestained Protein Ladder
Invitrogen, Karlsruhe, D
Kaleidoscope Prestained Standard
Bio-Rad, München, D
Entwickler ECL für Filme (Western Blot)
Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA
Leupeptin
Roche, Mannheim, D
Membrane-Blocking Reagent
Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA
NaCl 0,9 %
Delta-Pharma, Pfullingen, D
47
Ni2+-NTA-Matrix
QIAGEN, Valencia, CA, USA
Prestained Protein Ladder, 10-180 kDa
Fermentas, Ontario, Kanada
S-2765
Chromogenix, Mailand, Italien
2.1.1.6
Selbst hergestellte Puffer und Lösungen
Calcium-Puffer
50 mM Tris-HCl (pH = 8,1)
150 mM NaCl
2 mg/ml BSA
5 mM CaCl2
DEPC-behandeltes Wasser
Destilliertes Wasser mit
0.1% (v/v) Diethylpyrocarbonat für mindestens eine Stunde bei 37 oC inkubieren, und
dann autoklavieren
Ethidium-Bromid-Agarose
30 ml 0,5 x TBE (s.u.)
0,5 µl Ethidium-Bromid (10mg/ml wässrige
Stammlösung)
0,8-1,5 % (w/v) Agarose
FACS-Puffer
PBS (s.u.)
0,02 % NaN3
0,2 % BSA
Glycin-Puffer
10 mM Glycin (pH = 1,5)
Laufpuffer Gelelektrophorese 4x Laemmli
5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 6,8)
4 ml Glycerol
8 ml 10 % SDS
2 ml 0,1 % Bromphenolblau
Ad 20 ml H2O
PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
8,4 mM Na2HPO4
1,4 mM KH2HPO4
PBS-T 0,5 %
PBS (s.o.) + 0,5 % Tween
LB-Medium
10 g NaCl
10 g Bacto-Trypton
5 g Hefeextrakt
Ad 1000 ml H2O (pH = 7,4)
48
LB-Agar
1000 ml LB-Medium (s.o.)
15 g Bacto-Agar
TBE-Puffer
54 g Tris-Aminomethan
27,5 g Borat
20 ml 0,5 M EDTA-Lösung (pH = 8) aus
Ethylendiamintetraacetat-Dinatriumsalz
Ad 1000 ml H2O
TES
500 mM Sucrose
200 mM Tris-HCl (pH = 7,4)
0,5 mM EDTA
Ad 1000 ml H2O
Sämtliche Kulturmedien für Bakterien wurden bei 121° C und 2 bar für 20 Minuten autoklaviert. Nach Bedarf wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 100µg/ml Ampicillin zugesetzt.
2.1.1.7
Reagenzien- Kits
Amine-Coupling-Kit
Biacore, Uppsala, Schweden (BR-1000-50)
DC Protein Assay
Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA (5000120)
Sequenzierungskit Abi-Prism Big Dye Termi-
Applied Biosystems (4303149) Applied Bio-
nator v3.1
systems, CA, USA
DNA Präparationskits: Mini, Midi, Maxi
Qiagen, Hilden, D (27104, 12143, 12162)
DNA Gelextraktionskit Qiaex II
Qiagen, Hilden, D (20021)
Super Signal Western Blot Chemilumineszenz
Pierce, Rockford, USA (34079)
Substrat
2.1.2
Antikörper
Anti-FLAG M1 Antibody
IBI-Kodak, Rochester, USA
Anti-FLAG M2 Antibody
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Donkey anti-Sheep/Goat IgG, Fluorescein-
Serotec, Oxford, UK
konjugiert
Intraglobin CP, human
Biotest, Dreieich, D
Mouse anti-Rat IgG, Fluorescein-konjugiert
Jackson Immuno Research, Pennsylvania,
49
USA
Mouse anti-Rat IgG, Peroxidase-konjugiert
Jackson Immuno Research, Pennsylvania,
USA
Rat anti-Mouse IgG, Peroxidase-konjugiert
Jackson Immuno Research, Pennsylvania,
USA
Recombinant Mouse VCAM-1/CD106 Fc
R&D Systems, Wiesbaden, D
Chimera
Sheep anti-Human Tissue Factor IgG
Affinity Biologicals, Ontario, Kanada
rabbit-anti-human-Fc
Dianova, Hamburg, D
anti-Maus-VCAM-1, MK271
ATCC, Manassas, USA
anti-human-VCAM-1, 1G11B1
Chemicon, Temecula, USA
2.1.3
Zellkultur-Materialien
2.1.3.1
Zelllinien
Name:
Ursprung:
Spezies:
Bezug:
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)
Endothelzellen aus Nabelschnurvenen
Mensch
PromoCell, Heidelberg, D
Name:
Ursprung:
Spezies:
Referenzen:
Bezug:
2F2B
Endothelzellen aus Lymphknoten, SV40-transformiert
Maus
O´Connell 1990
ATCC (American Type Culture Collection)
CRL-2168
Antigenexpression: VCAM-1, konstitutionell
Name:
Ursprung:
Spezies:
Referenzen:
Bezug:
Antigenexpression:
b.End3
Endothelzellen aus Gehirn
Maus
Williams 1989
Zur Verfügung gestellt von Dr. B. Engelhardt, Max-Planck-Institut, Bad
Nauheim (aktuelle Adresse: Universität Bern, Schweiz)
VCAM-1, Zytokin-induziert
Name:
Ursprung:
Spezies:
Referenzen:
Bezug:
L540rec
Patient mit Hodgkin-Lymphom
Mensch
Diehl 1981
Instituts-eigen
Name:
Ursprung:
ECV 304 / T24
Ursprünglich beschrieben als humane Endothelzellinie. Die Zuordnung
wurde revidiert, da die Zellen eine genetische Übereinstimmung mit der
Blasenkarzinom-Zellline T24 und somit einen epithelialen Ursprung
50
Spezies:
Referenzen:
Bezug:
Antigenexpression:
Name:
Ursprung:
aufweisen (Keratinozyten).
Mensch
Takahashi 1990
Suda 2001
ATCC (American Type Culture Collection)
CRL-1998
VCAM-1, konstitutionell
Colo677
Ursprünglich beschrieben als humanes kleinzelliges Bronchialkarzinom,
später jedoch revidiert als humanes multiples Myelom (Derivat der Zellinie RPMI-8226).
Stammt von einer axillären Lymphknoten-Metastase eines 39-jährigen
Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC) aus dem Jahr
1989; mittels DNA-Fingerprinting und zytogenetischer Analyse konnte
jedoch eine Kontamination mit der Zelllinie RPMI-8226 nachgewiesen
werden. Diese Zelllinie wurde 1966 etabliert aus dem peripheren Blut
eines 61-jährigen Mannes mit multiplem Myelom (IgG lambda).
Mensch
www.dsmz.de (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)
DSMZ, Braunschweig, D
Spezies:
Referenzen:
Bezug:
Während viele humane Tumoren eine gute VCAM-1-Expression auf ihrem Gefäß-Endothel
zeigen, findet man in Mäusen nur wenige Tumoren, die eine ausreichende VCAM-1-Expression
haben. So exprimieren primär humane Hodgkin-Tumoren VCAM-1 auf ihren Blutgefäßen
(Renkonen 1992, Christiansen 1998). Im Gegensatz dazu war die VCAM-1-Expression in den
Xenograft-Tumoren aus der L540rec-Zelllinie nur gering (Dienst 2005). Nur nach vorheriger
Injektion von LPS (Lipopolysaccharid, Endotoxin) ergab sich eine ausreichende VCAM-1Expression. In Colo677-Myelom-tragenden Mäusen zeigen sich immerhin etwa 30% der Blutgefäße positiv für VCAM-1.
2.1.3.2
Zellkulturmedien und Zusätze
Endothelial Cell Basal Medium 2
PromoCell, Heidelberg, D
Supplement Pack / Endothelial Cell
PromoCell, Heidelberg, D
Fetales Rinderserum 2%
Epidermal Growth Factor 5 ng/ml
Hydrocortison 0,2 µg/ml
Vascular Endothelial Growth Factor 0,5 ng/ml
Basic Fibroblast Factor 10 ng/ml
R3 IGF-1 20 ng/ml
Ascorbinsäure 1µg/ml
Heparin 22,5 µg/ml
RPMI-Medium
Gibco BRL, Karlsruhe, D
Trypanblau-Lösung
Gibco BRL, Karlsruhe, D
51
HBSS
Gibco BRL, Karlsruhe, D
FCS (fötales Kälberserum)
Gibco BRL, Karlsruhe, D
Trypsin-EDTA
Gibco BRL, Karlsruhe, D
2.1.4
Bakterienstämme (Escherichia coli)
HB101
Zur Verfügung gestellt von Dr. Sally Ward,
University of Texas Southwestern Medical
Center, Dallas TX, USA
TG-1
Zur Verfügung gestellt von Dr. Sally Ward,
University of Texas Southwestern Medical
Center, Dallas, TX, USA
XL1-Blue Supercompetent Cells
2.1.5
Stratagene, CA, USA
Geräte
Autoklav Varioklav 400 EV
Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D
Biacore 2000
Biacore, Uppsala, Schweden
Elektrophorese-Kammer DNA
Gibco BRL, Karlsruhe, D
ELISA-Reader Immunoreader NJ-2000
Nunc, Wiesbaden, D
FACScan Durchflusszytometer
Becton Dickinson, Heidelberg, D
Fein-Waage
Sauter, Ebingen, D
Film-Entwickler
AGFA, Mortsel, Belgien
Gel-Dokumentationssystem Eagle Eye
Stratagene, CA, USA
Inkubator Zellkultur
Heraeus, Herrenberg, D
Lichtmikroskop
Zeiss, Oberkochen, D
Mikroskope (aufrecht, invers)
Leica, Solms, D
Mikrozentrifuge 5415 C
Eppendorf, Hamburg, D
Phast System® Separations- und Kontrollein- Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D
heit
Reaktionsgefäß-Schüttelinkubator
Eppendorf, Hamburg, D
Schüttelinkubator Innova 4400
New Brunswick Scientific, Eppendorf, Hamburg, D
Sicherheitswerkbank Heraeus HS 12/2
Heraeus, Herrenberg, D
Spektral-Photometer
Shimadzu, Duisburg, D
Thermocycler Primus 96 Plus
MWG-Biotech, Ebersberg, D
52
Vortex Genie Mixer
Scientific Industries, Bohemia, NY, USA
Waage
Sartorius, Göttingen, D
Wasserbad WB-10
Memmert, Schwabach, D
Zentrifuge Sorvall RC-5B
Sorvall, Du Pont, Newton, USA
2.1.6
Verbrauchsmaterial
48- und 96-Well-Mikrotiter-Platten
Nunc, Wiesbaden, D
Blotting-Filterpapier
Schleicher & Schuell, Dassel, D
Blotting-Membran Hybond C Extra
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D
CM5-Sensorchip
Biacore, Uppsala, Schweden
Dialyseschläuche Spectra/Por
Spectrum, Garden, USA
Film für Western Blot
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D
Spritzenfilter Millex-GV13 Filter Unit 0,22 µm
Millipore, Bedford, USA
Das Verbrauchsmaterial für die Zellkultur-Arbeiten wurde von den Firmen Greiner (Solingen,
D), Falkon/Becton-Dickinson (Heidelberg, D), Nunc (Wiesbaden, D) und Sarstedt (Nümbrecht,
D) bezogen.
2.1.7
Versuchstiere
SCID-Mäuse
Instituts-eigene Zucht oder von Charles River WIGA, Sulzfeld, D
CD1-Nacktmäuse
Charles River WIGA, Sulzfeld, D
2.2
Methoden
2.2.1
Molekularbiologische Techniken
Die Klonierungsstrategien sind im Ergebnisteil (Kap. 3.3.2) aufgeführt.
2.2.1.1
DNA-Präparation mittels QIAGEN Plasmid Mini-, Midi- und Maxi-Kit
Das Prinzip der DNA-Präparation und Aufreinigung bei den Plasmid-Präparationskits besteht in
der alkalischen Lyse von plasmidtragenden Bakterien, mit nachfolgender Bindung der DNA an
immobilisierte Silikonpartikel in Anwesenheit von chaotropischen Salzen. Nach Waschschritten
wird die DNA dann mit reinem Wasser oder einem geeigneten Puffer eluiert.
Das Qiagen Miniprep-Kit wurde zur Präparation der DNA nach Transformationen eingesetzt.
Die DNA wurde aus 1,5 ml Übernachtkulturen, die von einzeln gepickten Bakterienklonen
53
stammten, nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und in 50 µl Tris-aminomethanpuffer (110 mM, pH=8.0) eluiert.
Die Qiagen Midi- und Maxi-Prep-Kits wurden zur Amplifizierung von Plasmid-DNA, die als
Ausgangsmaterial für Klonierungen oder Proteinexpressionen eingesetzt wurde, benutzt. 500 ml
Übernachtkulturen wurden gemäß Herstellerangaben lysiert und die DNA nach Vorschrift präpariert.
2.2.1.2
DNA-Restriktionsspaltung
Die Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA wurde auf unterschiedlichen Ebenen des Klonierungsprozesses durchgeführt. Sie diente zum Einen zur Gewinnung von scFv-DNA für die Klonierung aus dem bereits im Labor vorhandenen Plasmid pswc4-MK27 (präparatives Gel). Zum
Anderen wurde die DNA aus Mini- oder Maxi-Präparationen zur Kontrolle auf das Vorhandensein des zuvor klonierten Fragmentes geprüft (analytisches Gel). Die Restriktionsenzyme
schneiden die DNA an einer für jedes Enzym spezifischen Stelle. Dabei wird aus dem Plasmid
wie weiter oben auf der Plasmidkarte ersichtlich (siehe Abb. 2.1) durch paarweisen Verdau mit
HindIII und XbaI bzw. SacI und KpnI das scFv- bzw. das tTF-Gen ausgeschnitten. Die DNARestriktionsfragmente werden dann in einem 0,8%igen (Plasmide) bzw. 1,5%igen (Fragmente)
Agarose-Ethidiumbromid-Gel bei 75 V nach ihrer Größe aufgetrennt und mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid angefärbt, unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht und fotografisch
dokumentiert.
Reaktionsansatz für analytische Ansätze:
DNA aus Miniprep
5 µl
100X BSA
0,15 µl
10X Puffer 1 oder 2
1,5 µl
Restriktionsenzym 1
0,1 µl
Restriktionsenzym 2
0,1 µl
Aqua dest.
8,15 µl
Inkubation:
2 Stunden bei 37 °C im Wasserbad
Inaktivierung:
20 min bei 65 oC im Wasserbad (optional)
Für präparative Ansätze wurden entsprechend höhere Mengen eingesetzt.
2.2.1.3
DNA-Extraktion: QIAEX II Agarose Gel Extraktion
Zum Aufreinigen von DNA nach PCR bzw. Restriktionsspaltung wurde die DNA auf einem
Agarosegel aufgetrennt (siehe Kap 2.2.1.2), die entsprechenden Banden ausgeschnitten und
54
mittels des QIAEX-II-Agarose-Gel-Extraktions-Kits der Firma QIAGEN nach Angaben des
Herstellers präpariert. Das Kit beruht auf dem Prinzip der Bindung von DNA an suspendierte
Silikapartikel in Anwesenheit von chaotropischen Salzen. Die Partikel werden nach Auflösung
des Gels und Bindung der DNA an Silika abzentrifugiert, gewaschen und die DNA mit Wasser
oder einem geeigneten Puffer eluiert. Die Elution erfolgte hier mit 2 x 20 µl Wasser für die Molekularbiologie, da die DNA direkt weiter verarbeitet wurde.
2.2.1.4 DNA-Präzipitation
Die Präzipitation der DNA dient der Konzentrierung und Aufreinigung, z.B. vor dem Laden
größerer Mengen DNA auf ein Gel oder nach Ligation.
Ansatz:
1 Vol. DNA
1/10 Vol. 3M NaOAc, pH=5.2
1 µl Glycogen (20mg/ml)
2,5 Vol. EtOH 100 %
Die Präzipitation erfolgte bei -20 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Reaktionsgefäße
30 min bei 4 °C und 16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Präzipitat mit 70%igem EtOH gewaschen. Es folgte eine 5-minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur. Der Überstand wurde abgenommen und das Präzipitat leicht luftgetrocknet. Es folgte die
Resuspension in 50 µl ddH2O.
2.2.1.5
Bestimmung der DNA-Konzentration mittels Absorptions-Spektrometrie
Das bei einer Wellenlänge von 260 nm absorbierte ultraviolette Licht ist der NukleinsäureKonzentration direkt proportional. Die Nukleinsäure-Konzentration errechnet sich nach Lambert-Beer (siehe Formel 1) aus der optischen Dichte bei 260 nm (OD260 nm), der Verdünnung und
einem für DNA, RNA bzw. Oligonukleotide spezifischem Extinktionskoeffizienten. Für doppelsträngige DNA wurde ein Extinktionskoeffizient von 50 mgcmL-1 und für einzelsträngige Oligonukleotid-DNA von 20 mgcmL-1 verwendet. Aus dem Verhältnis der OD260 nm und der OD280
nm
erhält man eine Aussage über die Reinheit bzw. Proteinkontamination der Probe.
Formel 1: Lambert-Beer Gesetz
A=εxcxd
wobei A die Absorption oder optische Dichte bei der betreffenden Wellenlänge, ε der Extinktionskoeffizient, c die Konzentration und d die Schichtdicke der Küvette ist.
55
2.2.1.6
Sequenzanalyse
Die Sequenzierungsreaktionen wurden mithilfe des ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits durchgeführt. Das Kit enthält eine optimierte Mischung aus dNTPs, ddNTPTerminatoren mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (vier je nach Terminator verschiedene Dichlororhodamin-Akzeptor-Farbstoffe, welche durch Carboxyfluorescein angeregt werden), Polymerase, MgCl2 und PCR-Reaktionspuffer. In einer PCR-Reaktion wurde die DNA
amplifiziert und mithilfe des Kits nach der Sanger-Kettenabbruchmethode fluoreszenzmarkiert.
Die elektrophoretische Auftrennung und Bestimmung der DNA-Sequenz wurde im Anschluss
durch das „Zentrum für molekulare Medizin der Universität zu Köln“ (ZMMK) durchgeführt.
Die Auswertung erfolgte mit der Software Vector NTI®.
PCR-Sequenzierungsreaktion:
Reaktionsansatz: 0,5 µg DNA (entspricht ca. 5 µl eines Mini-Preps)
1 µl Sequenzier-Primer (10 µM)
Aqua dest. ad 16 µl
4 µl Big Dye ddNTP Terminator-Mix
Inkubation:
35 Zyklen im Thermocycler (10 s 96 °C, 5 s 50 °C, 4 min 60 °C)
Fällung:
wie unter Kap. 2.2.1.4 beschrieben, jedoch ohne Glycogen und für 5 min bei
RT
2.2.1.7
Primer-Duplex Insertion
Um Linker verschiedener Länge zwischen dem scFv- und dem tTF-Gen einzufügen, wurde eine
Primer-Duplex Insertion durchgeführt. Die Primersequenzen sind in Tab. 2.1 in Kapitel 2.1.1.3
aufgeführt. Für die Primer-Duplex Insertion wurden phosphorylierte Primer und dephosphorylierte Plasmide verwendet. Als ATP-Quelle diente Ligationspuffer.
2.2.1.7.1
Phosphorylierung der Oligonukleotid-Primer
Reaktionsansatz: 10 µl Primer
2 µl 10X Ligationspuffer
0,5 µl Polynukleotidkinase
7,5 µl DEPC-behandeltes Wasser
Inkubation:
30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad
Inaktivierung:
5 Minuten bei 80 °C im Wasserbad
56
2.2.1.7.2
Annealing der Oligonukleotid-Primer
Reaktionsansatz: je 2 µl der komplementären Oligonukleotid-Primer aus obigem
Phosphorylierungsansatz
1 µl TM-Puffer (500 mM Tris pH = 8,0; 100 mM MgCl2)
5 µl DEPC-behandeltes Wasser
Inkubation:
5 Minuten bei 80 °C im Wasserbad, dann über mehrere Stunden auf
Raumtemperatur abkühlen lassen
2.2.1.7.3
Ligation der Primer-Duplexe in das Expressionsplasmid
Reaktionsansatz:
100 ng pswc4 (linearisiert durch Restriktionsspaltung mit XbaI und KpnI, im
Gel aufgereinigt)
5 µl Oligonukleotid-Primer aus obiger Annealing-Reaktion
1,5 µl Ligationspuffer
1 µl Ligase
4,5 µl ddH2O
Inkubation:
über Nacht bei 16 °C
2.2.1.8
Polymerasekettenreaktion zur Herstellung der tTF-Fragmente und der längeren
Linker
Die verschieden langen tTF-Fragmente wurden ausgehend von dem im Labor vorhandenen
pswc4-MK27-Plasmid mittels Hot-Start-PCR hergestellt.
Reaktionsansatz für tTF-PCR:
Mix A:
4 µl pswc4 1:100 (12 ng)
4 µl 20 µΜ Back-Primer (tTF-Back-Kpn)
4 µl 20 µΜ Forward-Primer (tTF220-228)
40 µl ddH2O
Mastermix B (pro Ansatz):
10 µl Nukleotide (2 mM)
27.2 µl ddH2O
10 µl RB (Expand High Fidelity PCR Buffer)
0,8 µl Polymerase
Die Reaktionsansätze wurden im Thermocycler bei 96 °C für 5 min denaturiert. Dann wurde
das Gerät auf Annealing-Temperatur (55-60 °C) gebracht und 12 µl des Mastermixes hinzu
gegeben. Anschließend wurden 35 Zyklen unter den folgenden Bedingungen gefahren:
5 Zyklen:
94 oC
30 sec
57
55/60 oC
30 sec
72 oC
30 sec
o
30 sec
30 Zyklen: 94 C
o
57 C
30 sec
72 oC
30 sec
72 oC 5 min, 4 oC unendlich
Analog wurden unterschiedlich lange Linker amplifiziert (pswc17-19), das Ausgangsmaterial
war das im Labor vorhandene Plasmid pswc4-390 (80 ng), die Primer waren Linker-For und
Linker-Back.
2.2.1.9
Ligation PCR- und Restriktionsfragmente in Expressionsplasmid
Um die neuen Expressionsplasmide herzustellen, wurden zunächst die tTF-kodierenden PCRProdukte in die Expressionsplasmide, welche nach der Primer-Duplex-Insertion bzw. PCRFragment-Klonierung verschiedene Linker enthielten, ligiert. Im Anschluss wurde jeweils das
MK27 scFv (ausgeschnitten vom Plasmid pswc4-MK27) in die resultierenden Plasmide ligiert.
Reaktionsansatz:
20 ng Plasmid für tTF-Ligation bzw. 15 ng für scFv-Ligation
34 ng tTF-DNA bzw. 28 ng scFv-DNA
1,5 µl 10X Ligationspuffer
1 µl Ligase
ddH2O ad 15 µl
Inkubation:
über Nacht bei 16 °C
2.2.1.10 Hitzeschock-Transformation
2.2.1.10.1 Herstellung von LB-Ampicillin-Platten
Die LB-Ampicillin-Platten dienen der Selektionierung von Bakterien, die nach der Transformation das gewünschte Plasmid in sich tragen, auf welchem sich ein Ampicillin-Resistenz-Gen
befindet. Autoklavierter LB-Agar wurde in der Mikrowelle zum Schmelzen gebracht. Nach
Abkühlung auf 50 oC wurde das Selektivantibiotikum Ampicillin in einer finalen Konzentration
von 100 µg/ml zugegeben und der Agar steril in 10 cm große Petrischalen pipettiert. Nach Erstarren wurden die Platten bei 4 °C gelagert.
58
2.2.1.10.2 Hitzeschock
Chemokompetente E.coli-Bakterien des Stammes XL1-Blue (für Klonierungen) oder TG1 bzw.
HB101 (für Protein-Expressionen) wurden auf Eis aufgetaut. 100 µl der Bakteriensuspension
wurden mit 50 ng der zu transformierenden DNA versetzt und 30 Minuten auf Eis inkubiert.
Nach einem Hitzeschock von 45 Sekunden bei 41,5 °C wurden die Zellen erneut für 2 Minuten
auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 800 µl LB-Medium zugegeben und die Zellen für mindestens 45 Minuten bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgefäß 10
Minuten bei 3000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment vorsichtig mit 200
µl LB-Medium resuspendiert. Je 50 µl und 150 µl dieser Suspension wurden auf LBAmpicillin-Selektionsplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die anschließende Lagerung erfolgte bei 4 °C.
2.2.2
Proteinexpression
Für den Ansatz der Vorkultur wurde eine Kolonie der zuvor transformierten TG1- bzw. HB101Bakterien in 5 ml LB-Medium für 4 Stunden (ggf. länger) bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zu
einer photometrisch bestimmten optischen Dichte bei 600 nm (OD600nm) von 0,3-0,5 angezogen. Mit 250 µl dieser Vorkultur wurde dann in einem 2-Liter-Erlenmeyerkolben die Hauptkultur beimpft, die 500 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml Endkonzentration) und Glucose
(1% Endkonzentration) enthielt. Diese wurde über Nacht bei 30 °C und 200 Upm in einem
Schüttelinkubator herangezogen und am darauffolgenden Tag bei 37 °C bis zu einer OD600nm
von 0,6 weiter kultiviert. Wenn am nächsten Morgen die gewünschte OD600nm von 0,6 noch
nicht erreicht war, wurde die Temperatur des Inkubators auf 37 °C erhöht. Anschließend wurden die Hauptkulturen zweimalig in LB-Medium gewaschen. Das Sediment wurde in 500 ml
Expressionsmedium überführt (LB mit finalen Konzentrationen von 100 µg/ml Ampicillin, 4
µM Leupeptin zur Proteolyseinhibition und 50 µM IPTG zur Induktion der Proteinexpression).
Nach einstündiger Inkubation bei 24 °C im Schüttelinkubator wurden die Kulturen bei 4 °C
zentrifugiert. Die Isolation des Periplasmas erfolgte durch einen osmotischen Schock in TES.
Dazu wurde das Sediment in 20 ml eisgekühltem TES vorsichtig resuspendiert und dann 30
Minuten auf Eis inkubiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 600 g und 4 °C wurde der
Überstand 10 Minuten bei 16000 g klar zentrifugiert und direkt anschließend zur Aufreinigung
auf die Ni-NTA-Chromatographiesäulen geladen. Das Sediment wurde in 20 ml TES 20 % auf
Eis resuspendiert und erneut 30 Minuten inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 16000
g wurde auch dieser Überstand auf die Säulen geladen.
Die Proteinexpressionen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA).
Für die Expression von tTF wurde ein Denaturierungs-Renaturierungsprotokoll angewandt,
welches von Maike Unruh durchgeführt wurde, und deshalb hier nicht näher beschrieben ist.
59
2.2.3
Die
Proteinaufreinigung
Aufreinigung
der
gewonnenen
Proteine
erfolgte
durch
eine
Ni-NTA-
Affinitätschromatographie. Dabei bindet das Proteinkonstrukt, welches ein Histidin-Tag enthält
(6 x Histidin), an die Nickelionen der Chromatographie-Matrix. Die Elution erfolgt durch das
Histidin-Analog Imidazol.
Hierzu wurden Säulen mit 0,75 ml Bettvolumen in PBS äquilibriert. Das Periplasma-Isolat wurde unmittelbar im Anschluss an die Zentrifugation auf die Säule gegeben. Nach vollständiger
Ladung der Säule wurde diese 30 Minuten mit PBS gewaschen. Die Eluation des Proteins erfolgte mit 100 mM Imidazol. Dabei wurden 10 Fraktionen á 1 ml aufgefangen. Nach Bestimmung des Proteingehaltes (siehe 2.2.4.1) und Auswahl der proteinhaltigen Fraktionen, wurden
diese vereinigt und zur Entfernung des Imidazols über Nacht bei 4 °C gegen PBS dialysiert. Die
Proteine wurden mit Hilfe eines Spritzenfilters sterilisiert und anschließend bei 4 °C gelagert.
Für Proteine, die im Tierversuch eingesetzt wurden, wurde zur Steigerung der Reinheit und
Entfernung von LPS ein zweiter Reinigungsschritt mittels einer S200-Sephadex-Gelfiltration,
ggf. ergänzt durch ein spezifisches Endotoxin-Affinitätsgel, durchgeführt. Dieses erfolgte durch
Maike Unruh und ist hier deshalb nicht weiter beschrieben.
2.2.4
Protein-Analyse
2.2.4.1
Protein-Konzentrationsbestimmung mittels Biuret-Reaktion
Zur Identifikation der proteinhaltigen Fraktionen aus der Säulenaufreinigung wurde das DCProtein-Assay (Bio-Rad) verwendet. Dieses Assay basiert auf einem modifizierten Lowry-Test.
Das Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Dieser reduziert das Folin-Reagenz, welches dadurch eine blaue Farbe entwickelt, die photometrisch bestimmt wird und proportional der Proteinkonzentration ist.
50 µl jeder Fraktion wurden in eine Kunststoffküvette pipettiert. Nach der Zugabe von 20 µl
Reagenz A (alkalische Cu2+-Tartrat-Lösung) und 1000 µl Reagenz B (Folin-Reagenz) erfolgte
eine fünfminütige Inkubationszeit. Die Absorption wurde anschließend in einem Photometer bei
690 nm gemessen. Es wurden die Fraktionen vereinigt, deren Extinktion > 0,010 war.
2.2.4.2
Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer und Gelelektrophorese
Die Konzentrationsbestimmung der gepoolten Proteine erfolgte mittels eines UVSpektrometers. Aus der ermittelten Absorption bei 278 nm und Division durch den Extinktionskoeffizienten (ε0.1% = 1.2 g cm-1L-1) wurde nach Lambert-Beer (Formel 1) die Gesamtproteinkonzentration berechnet. Um die spezifische Proteinkonzentration zu bestimmen, wurde
60
zusätzlich eine SDS-Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung durchgeführt (siehe Kap. 2.2.4.4). Die Fraktion des spezifischen Proteins wurde mit der Gesamtkonzentration multipliziert, um die spezifische Proteinkonzentration zu erhalten.
2.2.4.3
Gelfiltration und Endotoxinbestimmung
Proteine, die im Tierversuch eingesetzt wurden, wurden auf Endotoxingehalt geprüft. Hierzu
wurde ein Standard LAL (Limulus-Amöbozyten-Lysat)-Test von Maike Unruh (BTA) durchgeführt (siehe Dienst 2005 für Details).
2.2.4.4
SDS-Gel-Elektrophorese mit dem Phast-System
Für die elektrophoretische Auftrennung und Anfärbung der Proteine wurde das Phast-System
der Firma Amersham Biosciences verwendet. Dieses System ermöglicht eine automatisierte
Protein-Elektrophorese und anschließende Färbung. Es besteht aus einer Trenn-Kontrolleinheit
für die Systemkontrolle und Elektrophorese und aus einer Entwicklungseinheit für die automatisierte Färbung. Die Elektrophorese wird auf einer thermostatischen Platte ausgeführt, die Temperaturen zwischen 0 °C und 70 °C erzeugt. Es können zwei Gele gleichzeitig verwendet werden. Die Trennvorrichtung besteht aus zwei positiv geladenen Anoden und einer negativ
geladenen Kathode für jedes Gel. Die Proben wurden 1:1 mit einem Laufpuffer verdünnt und
mit Hilfe eines Plastikkammes auf das Gel (Polyacrylamid-Gradientengel 4-15 %) aufgebracht.
Durch Starten des entsprechenden Programms an der Kontrolleinheit wurden die Gele automatisch separiert.
Die Entwicklungseinheit besteht aus einer Färbekammer mit Halterung für zwei Gele. Über
mehrere Anschlüsse können die entsprechenden Färbereagenzien mittels einer pneumatischen
Pumpe in die Kammer und aus der Kammer heraus gepumpt werden. Außer für den WesternBlot wurden alle Gele mit einer Coomassie-Blau-Lösung durch Starten des entsprechenden
Programms angefärbt. Die an die Färbekammer angeschlossenen Lösungen setzten sich wie
folgt zusammen:
Lösung I: Farbstoff
Coomassie Stock IA
5 Tabletten Blue R in 400 ml Aqua dest., 10 Minuten mischen
600 ml Methanol hinzufügen
Lösung mit Faltenfilter filtern
61
Coomassie Stock IB
20%ige Essigsäure in Aqua dest.
Lösung IA und IB wurden zu gleichen Teilen gemischt.
Lösung II: Entfärber
300 ml Methanol
100 ml Eisessig
600 ml Aqua dest.
Lösung III: Konservierung
50 ml Glycerol
100 ml Eisessig
850 ml Aqua dest.
Die Elektrophoresen und Färbungen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA).
Programme für Protein-Gelelektrophorese
A) Separationsprogramm:
4-15% SDS Gradientengel
Sample appl Down
Sample appl up
Step 2.1
Step 2.2
Step 2.3
Step 2.4
2.1
2.1
250V
250V
250V
50V
0001
0010
10mA
1mA
10mA
0.1 mA
3W
3W
3W
0.5W
15 oC
15 oC
15 oC
15 oC
1 Vh
1 Vh
80 Vh
0 Vh
B) Entwicklerprogramm:
Coomassie-Blau-Färbung
Step 1.1
Step 1.2
Step 1.3
Step 1.4
Step 1.5
Lösung
1
0.1 % Coomassie Blue,
30% MetOH, 10% HAc
2
30% MetOH, 10% HAc
2
30% MetOH, 10% HAc
2
30% MetOH, 10% HAc
3
5% Glycerol, 10% HAc
IN
1
OUT
0
8 min
50 oC
2
2
2
9
0
0
0
0
5 min
8 min
10 min
5 min
50 oC
50 oC
50 oC
50 oC
62
2.2.5
Western-Blot
Der Western-Blot ist ein Verfahren, bei dem Proteine zunächst in einem Gel nach ihrer Größe
elektrophoretisch aufgetrennt werden. Danach werden die Proteine auf eine NitrocelluloseMembran übertragen, auf der sie immobilisiert werden. Anschließend können die Proteine
durch Bindung geeigneter Antikörper-Enzymkonjugate und nachfolgender Inkubation mit Chemilumineszenz-, Fluoreszenz- oder chromogenen Substraten sichtbar gemacht werden.
Die Proteine wurden mit Hilfe des Phast-Systems elektrophoretisch in einem Gel aufgetrennt
und dann bei 70 °C mittels kapillären Hitzetransfers auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen durch 1% Membrane-Blocking Reagent blockiert. Die Membran wurde dann in 1 µg/ml des Primär-Antikörpers (muriner antiFLAG-Antikörper M2, im Antikörperverdünnungspuffer PBS-T mit 1% BSA und 10% FCS)
für mindestens 45 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T wurde die Membran mit 0,2 µg/ml des Sekundär-Antikörpers (rat-anti-mouse-IgG-Peroxidase in Antikörperverdünnungspuffer) gefärbt. Zur Detektion wurde die Membran 3 Minuten in Luminol-Lösung (aus
Supersignal Western Blot Kit) inkubiert. Luminol ist ein Chemilumineszenz-Substrat für Peroxidase. Die Chemilumineszenz wurde anschließend mit dem Entwicklungsgerät auf einem
lichtempfindlichen Film (Kodak) sichtbar gemacht. Die Protein-Banden können durch Vergleich mit einem vorgefärbten Protein-Größenstandard identifiziert werden.
Die Western Blots wurden zum Teil von Andrea Grunow (Biologin) durchgeführt.
2.2.6
Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie oder auch FACS (Fluorescence activated cell sorter)-Analyse ist ein
Verfahren zur Quantifizierung von Zellen oder Partikeln aufgrund ihrer relativen Größe, Granularität oder Fluoreszenz-Intensität (Renz 2009) mit Hilfe von Laserstrahlung. Dabei passieren
die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung als Einzelzellstrom einen Laserstrahl. Dieser
wird in Abhängigkeit von Größe und Granularität in verschiedene Richtungen gestreut. Nach
Markierung von Antigenen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern können die Zellen außerdem aufgrund ihrer Fluoreszenz-Intensität differenziert werden.
Mit Hilfe der FACS-Analyse wurde die Bindungsfähigkeit des scFv-Anteils der Fusionsproteine
an VCAM-1 auf 2F2B-Zellen getestet. Es wurden 2 x 105 Zellen pro Röhrchen eingesetzt. Die
Zellen wurden zweimal mit je 500 µl FACS-Puffer gewaschen. Das Sediment wurde in 10
µg/ml Primär-Antikörper (150 nM Fusionsprotein in FACS-Puffer) resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit je 500 µl FACS-Puffer
gewaschen und mit dem Sekundär-Antikörper (sheep-anti-human-tTF, 10 µg/ml) 30 Minuten
auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen erfolgte die Zugabe des Fluoresceinisothiocya-
63
nat-markierten Antikörpers (donkey anti-sheep-FITC, Serotec STAR88F, 1:200), der 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert wurde. Nach zweimaligem Waschvorgang wurden die Proben
in 500 µl FACSpuffer mit 2 µl Propidiumjodid (Endkonzentration 4 µg/ml) resuspendiert. Anschließend erfolgte die Messung im FACS-Gerät. Die Auswertung erfolgte anhand der Fluoreszenz-Histogramme. Es wurden Negativ- (Zellen ohne Primär-Antikörper) und PositivKontrollen (MK271-IgG, Markierung mit anti-rat-FITC) mitgeführt.
Die FACS-Analysen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA).
2.2.7
Affinitätsmessung mit dem Biacore®-System
Das Verfahren zur Ermittlung der Affinität von Molekülen beruht auf der optischen Methode
der Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Surface Plasmone Resonance, SPR). Zur Affinitäts-Bestimmung eines Antikörpers wird das entsprechende Antigen auf einem Sensorchip immobilisiert (Hermey 2010). Der Sensorchip besteht aus Glas und einer sehr dünnen Goldschicht,
auf der eine Dextranschicht aufgebracht ist, an die das Antigen kovalent gebunden wird. Über
den Sensorchip wird kontinuierlich Puffer gespült. Der im Puffer enthaltene Antikörper bindet
an das Antigen und dissoziiert anschließend wieder. Die Interaktionen der Moleküle können in
Echtzeit beobachtet werden. Dabei wird der Brechungsindex des Lichtes, das auf den Sensor
trifft, kontinuierlich gemessen. Der Brechungsindex hängt ab von der Masse der an die Dextranschicht gebundenen Moleküle.
Die Auswertung der Messungen erfolgte mit Hilfe der BiaEvaluation-Software. Dabei wird ein
Sensorgramm erstellt, in dem die Veränderung des Resonanzwinkels (Resonanzeinheiten = RU)
gegen die Zeit aufgetragen ist. Dabei entspricht 1 RU einer Änderung um 0,0001 °, was mit
einer Zunahme der Oberflächenkonzentration auf dem Sensorchip von 1 pg/mm² korrespondiert.
In dieser Arbeit wurden 5000 RU eines rabbit-anti-human-Fc-Antikörper auf einem CM5Sensorchip immobilisiert. Dazu wurde das Amine-Coupling-Kit nach Vorschrift des Herstellers
verwendet. Dann wurde ein chimäres Protein aus murinem VCAM-1 und humanem FcFragment mit 400 RU aufgebracht. Das anti-VCAM-1-tTF-Fusionsprotein wurde mit ansteigenden Konzentrationen von 0,5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml und 20 µg/ml und
einer Flussgeschwindigkeit von 30 µl/Minute injiziert. Die Flusszellen wurden mit GlycinPuffer regeneriert. Eine leere Flusszelle ohne immobilisiertes VCAM-1 diente als NegativKontrolle. Die Bindungskurven wurden mit der BiaEvaluation-Software 3.1 analysiert. Die
SPR-Sensogramme wurden unter der Annahme einer homogenen 1:1 Assoziation (LangmuirBindungsmodell) angepasst.
Die Messung und Auswertung der Biacore-Daten wurde mit Hilfe von Aiko Ferrari und Claudia
Gottstein durchgeführt.
64
2.2.8
Koagulationstests
2.2.8.1
Zellfreier Koagulationstest
Die in-vitro Koagulations-Aktivität der Fusionsproteine wurde in einem zellfreien Zwei-PhasenKoagulationstest analysiert, der die Faktor X-Aktivierung misst.
Zunächst wurde ein sogenannter Koagulationsmix aus 10 nM Faktor VIIa, 5µM Phosphatidylserin und 15 µM Phosphatidylcholin in Calciumpuffer auf Eis hergestellt. Zwischen den einzelnen
Pipettierschritten wurden die hydrophoben Bestandteile durch ständiges Mischen auf einem
Vortex-Mischer in Suspension gehalten. Je 100 µl/Well des Koagulationsmixes wurden in 96Well-Platten pipettiert. Dann wurden je 10 µl des in Calciumpuffer verdünnten Fusionsproteins
(je 10 und 20 nM in Doppelbestimmungen) hinzugefügt. tTF wurde als Positiv-Kontrolle und
Calciumpuffer als Negativ-Kontrolle eingesetzt. Die Platte wurde zugedeckt für 5 Minuten bei
37 °C inkubiert. Dann wurden 50 µl Faktor X (entspricht einer finalen Konzentration von 30
nM/L) pro Well pipettiert. Nach weiteren 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden
100 µl S2765 (verdünnt in EDTA-Puffer, pH = 8,0) pro Well hinzugefügt, was einer finalen
Konzentration von 0,3 mM/L entspricht. Der entstandene Faktor Xa hydrolysiert das chromogene Substrat S2765, welches die chromophore Gruppe p-Nitroanilin freisetzt, dessen Farbe gemessen werden kann. Die Messung erfolgte nach 3 Minuten in einem Photometer bei 405 nm
(Absorptionsmaximum für das Substrat) minus die Absorption bei 650 nm (Hintergrund).
2.2.8.2
Zellgebundener Koagulationstest
Die Optimierung und Etablierung des zellgebundenen Koagulationstests ist Bestandteil dieser
Arbeit und wird detailliert im Ergebnis-Teil beschrieben.
Es wurden verschiedene Zelllinien (2F2B, HUVEC, Bend3, ECV304) in verschiedenen Konzentrationen (meist 1-5 x 104 Zellen/Well) in 48-Well-Zellkultur-Platten gesät. Diese wurden 24
bis 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach erfolgte eine mikroskopische Kontrolle auf Sterilität
und Unversehrtheit der Zellen. Das Zellkultur-Medium wurde entfernt und die Zellen dann 1
Stunde bei Raumtemperatur mit 150 µl des zu untersuchenden Fusionsproteins (Konzentrationen zwischen 1 und 100 nM, verdünnt in Zellkultur-Medium) inkubiert. Als Negativ-Kontrollen
dienten tTF und Zellkultur-Medium oder HBSS. Es folgten drei Waschschritte mit je 300 µl
Calciumpuffer. Dann wurden je 100 µl Koagulations-Mix/Well (Calciumpuffer mit 10 nM FVIIa, 50 nM FIX (optional), 200 nM FX und 20 µM Phospholipide (optional)) hinzugefügt. Die
Platten wurden für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 90 µl je Probe in 96Well-Platten überführt. Es wurden 100 µl/Well des chromogenen Substrates S2765 (verdünnt in
EDTA-Puffer, pH = 8) für eine Endkonzentration von 0,3 mM hinzugefügt. Die Messung bei
405-650 nm erfolgte nach 1 und 3 Minuten Inkubationszeit.
65
2.2.9
Zellkultur
2.2.9.1
Kultivierung der Zellen
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in Kulturflaschen mit einer Kulturfläche von 175 cm². Bei konfluentem Wachstum wurden die Zellen neu
passagiert. HUVEC-Zellen wurden in Endothelial Cell Basal Medium 2 kultiviert. 2F2B-,
ECV304-, Bend3- und L540-Zellen wurden in RPMI-Medium mit Zusatz von 10% FCS kultiviert.
2.2.9.2
Ablösen der adhärenten Zellen
Die adhärenten Zellen wurden zunächst mit Ca++- und Mg++-freiem PBS (Phosphate-BufferedSaline: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) gewaschen. Nach dreiminütiger Inkubation mit 2X Trypsin/EDTA-Lösung bei 37 °C wurden die Zellen abgelöst und
zum Entfernen des Trypsins abzentrifugiert.
2.2.9.3
Bestimmung der Zellzahl
Zur Ermittlung der Zelldichte wurden 50 µl der Zellsuspension mit 150 µl Trypanblau angefärbt. Die Zählung erfolgte dann mikroskopisch in einer Neubauer-Kammer.
2.2.10 Tierversuche
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Instituts-Richtlinien durchgeführt und
folgten den Empfehlungen der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS). Die Mäuse
wurden in einer abgeschlossenen Anlage mit dem Hygiene-Status „spezifisch und opportunistisch Pathogen-frei“ (SOPF) gehalten. Dabei wird die Luft gefiltert und mit Überdruck in der
Anlage gehalten. Die Mäuse waren in einem separaten luftgefilterten Regal in MikroisolatorKäfigen untergebracht. Der Hygienestatus der Tiere wurde regelmäßig von einem externen Labor überprüft. Der Zugang zu der Anlage war beschränkt. Alle von außerhalb kommenden Mäuse wurden von zertifizierten Anbietern mit adäquaten Gesundheitszeugnissen bezogen. Ein Teil
der Mäuse stammte aus der eigenen Zucht, welche in demselben Raum in Isolatoren und Mikrofilter-Käfigen untergebracht war. Wir verwendeten weibliche Mäuse mit einem Alter von 4-5
Wochen und einem Gewicht von 20-25 Gramm. In einem Experiment war die Hälfte der Mäuse
männlich. Diese wurden gleichmäßig auf die verschiedenen Behandlungsarme aufgeteilt.
Alle Tierexperimente wurden mit Hilfe von Maike Unruh (BTA) und Samir Tawadros (Tierpfleger) durchgeführt. Die histologische und immunhistologische Aufarbeitung erfolgte durch
66
Maike Unruh bzw. durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Universität zu Köln. Die
histologische Auswertung erfolgte durch Frau Dr. med. Claudia Gottstein und Herrn Professor
Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln).
2.2.10.1 Therapeutische in vivo Experimente mit anti-VCAM-1-tTF
2.2.10.1.1 Kurzzeit-Experimente
Es wurden 30 SCID-Mäusen bzw. 72 CD1-Nacktmäusen jeweils 107 L540rec- (HodgkinLymphom) bzw. Colo677-Zellen (multiples Myelom) subkutan an der rechten Flanke injiziert.
Dabei entwickelten 90 % der SCID-Mäuse, die mit L540rec-Zellen behandelt wurden, und 73 %
der Nacktmäuse, die mit Colo677-Zellen behandelt wurden, sichtbare Tumoren. Nachdem die
Tumoren nach ein bis zwei Wochen eine tastbare Größe entwickelt hatten, wurden sie täglich
mit einer Schieblehre in drei Ebenen vermessen. Die messenden Personen waren gegenüber den
Behandlungsarmen verblindet. Für jedes einzelne Experiment wurden die Messungen immer
von derselben Person durchgeführt. Die Tumor-Volumina wurden mit der Formel π/6 × a × b ×
c berechnet. Bei einer Tumorgröße von 150-300 µl wurden Gruppen von 6 bis 13 Mäusen 20 µg
des anti-VCAM-1-tTF in 400 µl NaCl 0,9 % oder eine äquimolare Menge eines KontrollReagenzes (10µg tTF, 10 µg scFv oder NaCl 0,9 %) in eine Schwanzvene injiziert. Bei den
Lymphom-tragenden Mäusen wurden den Proben vor Injektion 500 ng LPS hinzugefügt, um die
VCAM-1-Expression in den Tumorgefäßen zu induzieren. Da LPS die Gerinnung beeinflussen
kann, wurden in allen Fällen die gleichen Mengen LPS im Behandlungs- und im Kontrollarm
eingesetzt. Die Tiere wurden nach der Injektion bezüglich klinischer Zeichen von Toxizität zu
festgelegten Zeitpunkten beurteilt (nach 5, 10, 15, 30, 60 und 120 Minuten und nach 1, 2 und 3
Tagen). Drei Tage nach der Behandlung wurden die Tiere mit einer Äther-Überdosis terminiert
und es wurde eine Autopsie durchgeführt. Tumor und Organe (Herz, Lunge, Gehirn, Leber,
Niere, Milz, Dünndarm und Pankreas) wurden für die histologische Aufarbeitung entnommen.
Hierzu wurden die Gewebsproben in 3%igem Formalin (in PBS) fixiert und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) oder immunhistochemisch
angefärbt. Diese Arbeiten wurden im Institut für Pathologie der Universität zu Köln (Professor
Dr. med. J. Fries und Tanja Roth) oder durch Maike Unruh (BTA) durchgeführt.
Es wurden mehrere Schnitte von jedem Tumor lichtmikroskopisch analysiert. Der prozentuale
Anteil der Gewebsnekrose bezogen auf die Gesamtfläche des Schnittes wurde lichtmikroskopisch und zum Teil mit Hilfe eines Densitometrie-Scans bestimmt.
Die Organe (Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Milz, Dünndarm und Pankreas) jeder Maus aus
den Kurzzeit-Experimenten wurden lichtmikroskopisch auf Thrombosen und Nekrosen untersucht. Die Anzahl thrombotischer oder nekrotischer Ereignisse pro Gewebsschnitt wurde doku-
67
mentiert. Die histologische Beurteilung wurde von zwei verschiedenen Untersuchern, Frau Dr.
med. Claudia Gottstein und Herrn Professor Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln), unabhängig voneinander durchgeführt.
2.2.10.1.2 Langzeit-Experimente
SCID-Mäusen (n = 40) wurden subkutan L540rec-Zellen und Nacktmäusen (n = 64) wurden
subkutan Colo677-Zellen, wie bereits für die Kurzzeit-Experimente beschrieben (siehe Kap.
2.2.10.1.1), injiziert. Es entwickelten sich Tumoren bei 91 % der L540rec/SCID-Mäuse und bei
69 % der Colo677/Nacktmäuse. Sobald die Tumor-Volumina 200-250 µl erreicht hatten, wurden fünf bis zehn Mäuse pro Gruppe an den Tagen 0, 4, 8 und 12 (für Lymphom-tragende Mäuse) oder an den Tagen 0, 4 und 8 (für Myelom-tragende Mäuse) intravenös mit 20 µg antiVCAM-1-tTF in 400 µl NaCl 0,9 % oder äquimolaren Mengen eines Kontroll-Reagenzes (10
µg tTF, 10 µg scFv oder NaCl 0,9 %) behandelt. Bei den Lymphom-tragenden Tieren wurden
allen zu injizierenden Reagenzien 500 ng LPS hinzugefügt. In dem Colo677/Myelom-Modell
wurden zwei weitere Gruppen mit einer Kombinationsbehandlung mit dem Fusionsprotein und
Doxorubicin, welches nachgewiesen eine gute in-vivo-Wirksamkeit gegen Colo677-Zellen hat,
oder Doxorubicin alleine behandelt. Diesen Mäusen wurden 8 mg/kg Doxorubicin an den Tagen
0, 7 und 11 zusätzlich zum Fusionsprotein oder der Kontrolle intravenös injiziert. Alle Tiere
wurden täglich auf klinische Zeichen von Toxizität untersucht und regelmäßig gewogen. Sie
wurden insgesamt zwei Wochen und die Mäuse mit regredienten Tumoren drei Wochen beobachtet. Die Tumoren wurden täglich wie bereits für die Kurzzeit-Experimente beschrieben
(siehe Kap. 2.2.10.1.1) gemessen. Die Tiere wurden durch eine Ether-Überdosis terminiert. Die
Tumoren wurden entfernt und in Paraffin eingebettet.
2.2.11
Proteinstruktur-Homologie-Modelling
Es wurde versucht, die dreidimensionale Proteinstruktur der Fusionsproteine mit Hilfe des
SWISS-Models zu analysieren. Dabei handelt es sich um ein Web-basiertes Programm, welches
in einer Datenbank nach homologen Proteinen sucht, deren dreidimensionale Struktur bekannt
ist, um so die Struktur des betreffenden Proteins vorherzusagen (Arnold 2005).
2.2.12
Statistische Analyse
Die statistische Analyse für die in-vivo-Experimente wurde durchgeführt, um die NullHypothese zu testen, dass es zwischen den verschiedenen Behandlungsarmen keinen Unter-
68
schied in Tumorvolumina, Tumorgewicht und Anteil der Nekrose gibt. Für die KurzzeitExperimente wurde der prozentuale Anteil der Tumornekrose analysiert. Die Mittelwerte des
Nekrose-Anteils von sechs bis 13 Mäusen pro Behandlungsarm wurden mit Hilfe des MannWhitney-U-Tests miteinander verglichen. Für die Langzeit-Experimente wurden die Mittelwerte
der Tumorvolumina aller Behandlungsarme (jeweils fünf bis zehn Mäuse) ebenfalls mit dem
Mann-Whitney-U-Test miteinander verglichen. Die 95%-Konfidenzintervalle für die Unterschiede der Mittelwerte der Tumorvolumina wurden mit der normalen Approximationsmethode
berechnet. Für die Analysen wurde die Software SPSS Version 11.0 verwendet. Die statistischen Auswertungen erfolgten mit Hilfe des Instituts für Medizinische Statistik, Informatik und
Epidemiologie.
69
3
Ergebnisse
3.1
Herstellung und Charakterisierung des rekombinanten Fusionsproteins
anti-VCAM-tTF
3.1.1
Proteinexpression und Aufreinigung
Die Expressionsvektoren pswc4-MK271 (für Expression des anti-VCAM-1-tTF Fusionsproteins), pswc5-MK271 (für Expression des MK271 scFv-Antikörpers) und pswc7 (für Expression von tTF) waren im Labor vorhanden und wurden für die Proteinexpression verwendet. Es
wurden in Zusammenarbeit mit Maike Unruh (BTA) und Berit Rabausch (Praktikantin) mehrere
Chargen hergestellt, um ausreichend Protein für die in vivo Experimente zu gewinnen. Jede
Einzelcharge wurde vor dem Poolen biochemisch und funktionell analysiert (siehe unten).
3.1.2
Biochemische Charakterisierung
Die mittels Affinitäts-Chromatographie aufgereinigten Proteine wurden auf einem SDSPolyacrylamid-Gel (Gradient 4-15 %) aufgetrennt und nach Coomassie angefärbt, um so den
Reinheitsgrad zu bestimmen. Die Proteine zeigten bei der Analyse die erwarteten molekularen
Massen: 60 kDa für das Fusionsprotein, 30 kDa für tTF und 27 kDa für das scFv (siehe Abb.
3.1). Der Reinheitsgrad für das spezifische rekombinante Protein lag nach dem ersten Reinigungsschrit typischerweise bei 5-30% für das Fusionsprotein, bei 30-60% für das scFv, und bei
80-100% für tTF. Nach dem zweiten Reinigungsschritt (S200-Sephadex-Gelfiltration, nur für
Proteine die im Tierversuch eingesetzt wurden) lag der Reinheitsgrad bei 80-100%.
Abb. 3.1:
SDS-PAGE nach Coomassie-Färbung. (A) anti-VCAM-tTF (P781), (B) tTF (P703), (C)
scFv (P748). Pfeile: spezifisches Protein. Größenstandard: Invitrogen Benchmark.
70
Anhand eines Protein-Größenstandards wurde die betreffende Bande identifiziert und deren
Intensität im Verhältnis zu den anderen Banden, die Verunreinigungen mit unspezifischen Proteinen entsprechen, abgeschätzt. Anschließend erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels
UV-Spektrometer. Durch Multiplikation mit dem Reinheitsgehalt wurde der spezifische Proteingehalt errechnet. Ein repräsentatives Absorptionsspektrum ist in Abb. 3.2 dargestellt
Abb. 3.2:
Proteinkonzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer. Probe: anti-VCAM-tTF
P781. Das Absorptionsspektrum zeigt das erwartete Maximum bei 278 nm.
Die Identität der Proteine wurde mittels Western Blot bestätigt. Abb. 3.3 zeigt einen Western
Blot nach dem NiNTA-Reinigungsschritt und nach dem S200-Gelfiltrationsschritt.
Abb. 3.3:
Western Blot des Fusionsproteins anti-VCAM-tTF. (1) Größenstandard Bio-Rad Kalei-
doscope Prestained, (2) nach NiNTA-Aufreinigung, dünne Pfeile bei 30 und 60 kDa: freier tTF, Monomer
und Dimer, (3) nach Aufreinigung mit S200-Gelfiltation. Dicker Pfeil: spezifisches Protein. Detektion mit
murinem anti-tTF-Antikörper.
71
Für die Tierexperimente wurden die Konzentrationen des Endotoxins LPS, welches als bakterielle Verunreinigung auftritt, mittels eines LAL (Limulus Amöbozyten Lysat)-Assays bestimmt.
Die Endotoxin-Werte lagen initial bei 300 pg/µg für das Fusionsprotein, bei 7 pg/µg für tTF und
bei 90 pg/µg für das scFv, später für alle Proteine immer unter 3 pg/ml. Die genannten Analysen wurden vornehmlich durch Maike Unruh (BTA) durchgeführt.
3.1.3
Funktionelle Charakterisierung in vitro
3.1.3.1
Bindungsstudien
3.1.3.1.1
FACS-Analysen
Die Bindungsfähigkeit des scFv-Anteils der anti-VCAM-tTF-Fusionsproteine wurde durchflusszytometrisch auf 2F2B-Zellen analysiert. Dabei zeigte das Protein wie erwartet eine gute
Bindung an die VCAM-1-exprimierenden Zellen (siehe Abb. 3.4).
Abb. 3.4:
FACS-Analyse des anti-VCAM-tTF auf 2F2B-Zellen. Gestrichelte Linie: Zellen ohne
Antikörper bzw. nur mit Sekundär-Antikörper. Durchgezogene Linie: Probe. (Dienst 2005)
3.1.3.1.2
Bindungskinetik mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz
Das anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 15
und 300 nM auf den Biacore-Chip gegeben. Dabei wurde das Antigen VCAM-1 in einer niedrigen Dichte immobilisiert, so dass ein Bindungsverhältnis von 1:1 angenommen werden konnte.
72
Abb. 3.5:
Biacore-Analyse der Bindung von α-mCD106-tTF an immobilisiertes VCAM-1. Die
Kurven von oben nach unten zeigen die Bindung des Fusionsproteins in Konzentrationen von 20 µg/ml,
10 µg/ml, 5 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml und 0,5 µg/ml. (Dienst 2005)
Die Assoziationsrate des Fusionsproteins betrug 9,2 x 104 x mol-1 x Sekunde-1 und die Dissoziationsrate 1,5 x 103 x Sekunde-1. Daraus resultierte eine Dissoziationskonstante von 16 nM.
3.1.3.2
Koagulations-Induktion
Die Koagulations-Aktivität des Fusionsproteins wurde gemessen, in dem die Fähigkeit des tTFAnteils, Faktor X zu Faktor Xa zu aktivieren, bestimmt wurde. Dazu wurde zunächst der zellfreie Koagulationstest verwendet. Der tTF-Anteil in dem Fusionsprotein zeigte eine ähnliche
Aktivität wie freies tTF, welches als Positiv-Kontrolle diente. In dem zellgebundenen Koagulationstest wurde neben der Faktor X-Aktivierung auch die Bindung an die VCAM-1 tragenden
2F2B-Zellen getestet. Da freies tTF nicht oder nur minimal unspezifisch an die Zellen bindet,
wurde es in diesem als Test Negativ-Kontrolle verwendet. Die Proben wurden in beiden Tests in
Konzentrationen von 1 nM bis 50 nM eingesetzt.
Abb. 3.6:
Zellfreier Koagulationstest mit anti-VCAM-tTF (schwarze Punkte) und freiem tTF als
Positiv-Kontrolle (weiße Punkte). Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS)
von Dreifachbestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen die 95%-Konfidenzintervalle. (Dienst 2005)
73
Abb. 3.7:
Zellgebundener Koagulationstest mit anti-VCAM-tTF (schwarze Punkte) und freiem
tTF als Negativ-Kontrolle (weiße Punkte). Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund
HBSS) von Dreifachbestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen die 95%-Konfidenzintervalle. (Dienst 2005)
Das Fusionsprotein zeigte eine Konzentrations-abhängige Faktor X-Aktivierung sowohl im
zellfreien als auch im zellgebundenen Koagulationstest. Der zellgebundene Koagulationstest
testet sowohl die Funktionsfähigkeit des tTF- als auch des scFv-Anteils.
Die Bindung des Fusionsproteins war antigenspezifisch, da sie durch Zugabe von freiem MK27Antikörper inhibiert werden konnte (siehe Kap. 3.2.4) und da antigennegative humane Zellen
keine Koagulation induzierten (Abb. 3.8).
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 067
0.000
0.000
2F2B
0.000
Bend3 -LPS
0.000
Bend3 +LPS
ECV304
0.000
HUVEC
0.000
Abb. 3.8:
P503
Zellgebundener Koagulationstest mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein zur Tes-
tung der Bindungsspezifität auf verschiedenen Zelllinien. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte
(minus Hintergrund HBSS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler
des Mittelwertes.
Bend3-Zellen sind murine Endothelzellen, welche VCAM-1 nach Stimulation mit LPS verstärkt exprimieren. Diese Zellen wurden zum Einen unstimuliert und zum Anderen nach Zugabe
74
von LPS (125 µg/ml, 4 Stunden Inkubation bei 37 °C) eingesetzt. Als Negativ-Kontrollen wurden des Weiteren die Zelllinien ECV304 (humane Keratinozyten) und HUVEC (humane Endothelzellen) verwendet.
3.1.4
Therapeutische Studien in vivo mit rekombinantem Fusionsprotein
3.1.4.1
Kurzzeit-Experimente
Bei diesem Versuch wurde das Fusionsprotein Gruppen von 6 bis 13 Mäusen mit XenograftTumoren – Hodgkin-Lymphome und Myelome – einmalig in eine Schwanzvene injiziert
(Dienst 2005). Der Anteil der Nekrose im Tumor wurde drei Tage später durch eine histologische Analyse mehrerer Schnitte von jedem Tumor bestimmt. In den Tumoren der Mäuse, die
mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein behandelt wurden, sah man thrombosierte Blutgefäße
und große Nekrose-Areale im Tumor. Dabei wurde die Thrombose definiert als Verschluss eines Blutgefäßes durch eine Fibrin-haltigen Pfropf. Eine bloße Erythrozyten-Aggregation wurde
nicht als Thrombose gewertet.
75
Abb. 3.9:
Histologische Analyse der Xenograft-Tumoren nach Kurzzeit-Behandlung mit dem
Fusionsprotein (FP) anti-VCAM-tTF oder Kontrollen (NaCl, tTF, scFv). Paraffin-Schnitte nach
H&E-Färbung. (A-D) L540rec-Tumoren (Hodgkin-Lymphom). (A) 10-fache Vergrößerung eines Tumors
von einer mit dem FP plus LPS behandelten Maus. Hier verbleibt nur noch ein kleiner Bereich mit vitalen
Tumorzellen am linken Rand des Tumors (dunkler angefärbt). (B) 40-fache Vergrößerung desselben
Schnittes. Neben der vitalen Randzone links sieht man eine inflammatorische Demarkationszone (weißer
Pfeil), rechts daneben nekrotisches Tumorgewebe mit Fibrin-Thromben (schwarze Pfeile). (C) Nekrotisches Tumorgewebe (links) von einer mit tTF plus LPS behandelten Maus. Der Pfeil zeigt auf einen Fibrin-Thrombus. (D) Tumorgewebe von einer Maus aus dem Kontrollarm (NaCl plus LPS). Hier sieht man
zahlreiche Mitosefiguren als Zeichen einer hohen Proliferationsrate. (E-H) Colo677-Tumoren (Myelom).
(E) Tumor von einer mit dem Fusionsprotein behandelten Maus. Das helle Areal zeigt einen Bereich mit
nekrotischem Tumorgewebe. Der Pfeil zeigt auf einen Fibrin-Thrombus. (F) Der Tumor einer Maus aus
dem tTF-Kontroll-Arm zeigt eine schmale subkapsuläre Nekrose (Pfeil). (G) Der Tumor einer Maus aus
dem scFv-Kontroll-Arm zeigt mikrofokale Nekrosen (Pfeil) innerhalb vitalen Tumorgewebes. (H) Tumor
einer Maus aus dem NaCl-Kontroll-Arm mit einer kleinen fokalen Nekrose (Pfeil). (Dienst 2005)
76
Tab. 3.1: Quantifizierung der Tumor-Nekrose in Xenograft-Tumoren nach Behandlung mit
dem Fusionsprotein oder Kontrollen (Kurzzeit-Experimente). (Dienst 2005)
Tumor / Behandlungsgruppe
Anzahl
% Nekrose
P* vs Kontrolle
P* vs Fusi-
Mäuse
Mittelwert (95%KI)
anti-VCAM-tTF + 500 ng LPS
6
74 (55 - 93)
0,001
tTF + 500 ng LPS
8
41 (24 – 58)
0,005
Vehikel + 500 ng LPS
13
13 (4 – 22)
anti-VCAM-tTF
12
26 (16 – 36)
0,003
tTF
8
9 (2 – 16)
0,8
0,01
anti-VCAM (scFv)
11
11(7 – 15)
0,2
0,01
Vehikel
10
8 (2 – 14)
onsprotein
L540rec Hodgkin-Lymphom
0,001
0,001
Colo677 SCLC
0,003
* P aus zweiseitigem Mann-Whitney-U-Test, KI = Konfidenzintervall
Es gab einen gewissen Anteil an Nekrosen in den Kontroll-Tumoren, welcher aber wesentlich
geringer war als der Anteil bei den mit Fusionsprotein behandelten Mäusen. In den LymphomModell waren bis zu 90 % des Tumors nekrotisch (Mittelwert = 74 %, 95 %-Konfidenzintervall
= 55 bis 93). Diese Ergebnisse waren statistisch hoch signifikant (p=0.001). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten (Philipp 2003), führte auch die Behandlung mit tTF plus
LPS zu statistisch signifikanter Erhöhung des Nekroseanteils (p=0.005). Jedoch war das Fusionsprotein wirksamer und auch der Unterschied zur tTF-Gruppe war hoch signifikant
(p=0.001). In dem Myelom-Modell waren bis zu 50 % des Tumors nekrotisch (Mittelwert = 26
%, 95 %-Konfidenzintervall = 16 bis 36). In diesem Modell zeigte nur die Behandlungsgruppe
mit Fusionsprotein eine statistisch signifikante Erhöhung des Nekroseanteils.
3.1.4.2
Langzeit-Experimente
In den Langzeit-Experimenten wurde die Verzögerung des Tumorwachstums nach multiplen
Injektionen mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein untersucht. Dabei wurden die gleichen
Xenograft-Modelle wie in den Kurzzeit-Experimenten verwendet. In beiden Modellen wurde
das Tumorwachstum durch die Injektionen mit dem Fusionsprotein verlangsamt. In dem Lymphom-Modell wurde durch Zugabe von niedrig dosiertem LPS in allen Behandlungsgruppen die
VCAM-1-Expression hochreguliert. In diesem Modell war das Tumorwachstum in der mit Fusionsprotein und LPS behandelten Gruppe signifikant langsamer (FP/L, Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 486 µl) als in den Kontrollgruppen, die mit dem Vehikel NaCl (Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 701 µl; Differenz = 215 µl, 95%-KI = -65 – 495, MannWhitney P = 0,02) oder scFv und LPS (Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 847 µl;
Differenz = 361, 95%-KI = 189 – 533, Mann-Whitney P = 0,005) behandelt wurden. Die Tumo-
77
ren der mit FP/L behandelten Mäuse waren zwar kleiner als die der mit tTF/L behandelten Mäuse, eine statistische Signifikanz der Unterschiede der Tumorvolumina konnte aber aufgrund der
geringen Fallzahl nicht erreicht werden.
Wenn man den gesamten zweiwöchigen Beobachtungszeitraum betrachtet, zeigten in dem Colo677-Modell nur die mit Fusionsprotein und Doxorubicin (FP/D) oder mit Doxorubicin allein
(D) behandelten Mäuse ein signifikant verlangsamtes Tumorwachstum im Vergleich zu den
Kontrollen. Nach der zweiten Behandlung mit dem Fusionsprotein waren die Tumorvolumina in
der Gruppe mit der Kombinations-Behandlung kleiner als die in den Gruppen, die mit dem Fusionsprotein oder Doxorubicin allein behandelt wurden. Der Vergleich der Tumorgrößen in den
Gruppen mit der Kombinationsbehandlung bzw. mit der Einzelsubstanz-Behandlung durch den
Mann-Whitney-U-Test zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied an den Tagen 5-7. Die
mittleren Tumorvolumina an Tag 5 lagen bei 224 µl für die FP/D-behandelten Tiere und bei 574
µl für die mit dem Vehikel (NaCl) behandelten Tiere (Differenz = 350 µl, 95%-KI = 194 – 506
µl, Mann-Whitney P = 0,02), bei 454 µl für den FP-Arm (Differenz im Vergleich zum FP/DArm = 230 µl, 95%-KI 90 – 370, Mann-Whitney P = 0,02) und bei 285 µl für den D-Arm (Differenz im Vergleich zum FP/D-Arm = 61 µl, 95%-KI = -3 – 119, Mann-Whitney P = 0,04).
Eine Varianzanalyse, die die FP-, die FP/D-, die D- und die Vehikel-Gruppe miteinander verglich, zeigte, dass sowohl das Fusionsprotein allein als auch Doxorubicin allein im Vergleich
zum Vehikel zu einer statistisch signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums führten (P =
0,04 für FP und P = 0,001 für D).
Neben der Verlangsamung des Tumorwachstums zeigten einige Tumoren in der FP-Gruppe und
in der FP/D-Gruppe einen Regress. Ein Tumor von acht im FP-Arm, zwei von sieben Tumoren
im FP/D-Arm und keiner von 22 Tumoren in den Kontroll-Armen (Vehikel, tTF und scFv) zeigten einen fast vollständigen Regress, das heißt, sie erreichten ein Volumen von weniger als 50
µl. Innerhalb des dreiwöchigen Beobachtungszeitraumes kam es bei diesen Tumoren nicht wieder zu einem Rückfall. Im D-Arm hatte eine Maus am Ende des Experiments nur noch einen
kleinen Tumor von 56 µl.
Die histologische Analyse des regredienten Tumors aus dem FP-Arm zeigte einen nekrotischen
Kern und eine vitale Randzone, wie es typisch ist für Vascular-Targeting-Substanzen. Die Zellen in der Randzone zeigten jedoch nicht die Charakteristika von Tumorzellen, sondern ähnelten
morphologisch Makrophagen. Die immunhistologischen Färbungen für Tumormarker (bcl-2
und Vimentin) und für Makrophagenmarker (F4/80) bestätigten, dass die Tumorzellen fast ausschließlich im nekrotischen Kern lagen und die vitale Randzone hauptsächlich aus Makrophagen bestand. Ähnlich verhielt es sich mit den regredienten Tumoren aus dem Kombinationsarm
(FP/D), allerdings sah man hier etwas mehr vitale Tumorzellen in der Randzone. In dem kleinen
Tumor aus dem Doxorubicin-Arm waren kaum Makrophagen sichtbar und in der Randzone
fanden sich noch viele bcl-2- und Vimentin-positive vitale Tumorzellen.
78
Tab. 3.2: Statistische Analyse der Tumorvolumina nach Behandlung mit Fusionsprotein allein oder in Kombination mit LPS oder Doxorubicin. (Dienst 2005)
Tag 0 (vor Behandlung)
Tumor/Behandlungsgruppe
Anzahl
Mittelwert
P╪ vs
Mäuse
(95%-KI)
Vehikel
anti-VCAM-tTF + LPS
8
194 (185 – 204)
0,75
LPS
5
198 (177 – 220)
tTF + LPS
8
anti-VCAM (scFv) + LPS
Vehikel
Tag 3 oder 5*
P╪ vs FP§
Woche 2
Mittelwert
P╪ vs
P╪ vs
(95%-KI)
Vehikel
FP§
-
168 (138 – 197)
0,01
-
0,88
0,71
232 (163 – 301)
1,00
195 (185 – 206)
0,83
0,92
198 (170 – 225)
5
222 (180 – 263)
0,46
0,11
8
208 (180 – 235)
-
anti-VCAM-tTF + Doxorubicin
7
233 (215 – 252)
anti-VCAM -tTF
8
Doxorubicin
Mittelwert (95%-KI)
P╪ vs
P╪ vs
Vehikel
FP§
486 (413 – 559)
0,02
-
0,4
561 (200 – 923)
0,54
0,41
0,07
0,12
565 (412 – 719)
0,45
0,36
235 (202 – 268)
0,77
0,003
847 (624 – 1069)
0,11
0,005
0,75
235 (192 – 278)
-
0,01
701 (423 – 979)
-
0,02
0,85
-
224 (212 – 235)
0,001
-
135 (93 – 177)
0,001
-
222 (196 – 247)
0,10
0,25
454 (311 – 597)
0,29
0,002
1278 (779 – 1777)
0,29
0,008
7
233 (214 – 253)
0,44
0,80
285 (218 – 352)
0,001
0,04
165 (109 – 220)
0,001
0,40
tTF
6
219 (203 – 235)
0,06
0,12
563 (424 – 701)
0,83
0,003
1405 (861 – 1949)
0,19
0,003
anti-VCAM (scFv)
6
238 (205 – 271)
0,43
0,95
459 (364 – 553)
0,22
0,002
Nicht auswertbar ╫
-
-
Vehikel
10
248 (220-277)
-
0,85
574 (421 – 727)
-
0,001
1909 (1174 – 2644)
-
0,001
L540rec Hodgkin-Lymphom
79
Colo677 SCLC
* Für die Colo677-Tumoren ist aufgrund des anderen Behandlungsschemas Tag 5 gezeigt
╪ P aus Mann-Whitney-U-Test, zweiseitig
§ Vergleich zu α-mCD106-tTF plus LPS für L540rec-Tumoren bzw. zu α-mCD106-tTF + Doxorubicin für Colo677-Tumoren
╫ Nicht auswertbar, da die großen Tumoren durch andere Mäuse in den Käfigen teilweise zerstört wurden
FP = Fusionsprotein, KI = Konfidenzintervall, Vehikel = NaCl 0,9%
Abb. 3.10:
Wachstum der L540rec- (Hodgkin) bzw. Colo677-Xenograft-Tumoren (Myelom) nach
Langzeit-Behandlung mit dem Fusionsprotein anti-VCAM-tTF bzw. den Kontrollen. Datenpunkte
bezeichnen den Mittelwert plus Standardabweichung der jeweiligen Behandlungsgruppe. (A) L540recTumoren, Behandlung der Mäuse mit Vehikel-Kontrolle (0,9 % NaCl; N), mit 20 µg anti-VCAM-tTF
plus 500 ng LPS (FP/L), mit 10 µg tTF plus 500 ng LPS (T/L) oder mit 500 ng LPS (L); (B) Großes Diagramm: Die Mäuse wurden behandelt mit der Vehikel-Kontrolle (0,9 % NaCl; N), mit 20 µg anti-VCAM
-tTF (FP), mit 8 mg/kg Doxorubicin (D) oder mit 20 µg anti-VCAM-tTF plus 8 mg/kg Doxorubicin
(FP/D). Kleines Diagramm: Vergrößerung der Tumorwachstums-Kurven für D und FP/D mit Behandlungsschema; die Pfeile zeigen die Behandlungstage (modifiziert nach Dienst 2005).
80
Abb. 3.11:
Nacktmaus vor (links) und drei Wochen nach (rechts) der Behandlung mit dem Fusi-
onsprotein anti-VCAM-tTF. Rechts sieht man makroskopisch einen fast vollständigen Regress des
Colo677-Xenograft-Tumors drei Wochen nach der Behandlung
Abb. 3.12:
Histologische Analyse des Colo677-Tumorgewebes nach makroskopischem Regress
durch Behandlung mit dem Fusionsprotein anti-VCAM-tTF. (A-C) H&E-Färbung. (A) Die 20-fache
81
Vergrößerung zeigt eine zentrale Nekrose mit einem vitalen Rand. In den höheren Vergrößerungen (B
100-fach und C 400-fach) sieht man rechts unten nekrotische Zellen. (D-F) Tumorschnitte mit einer Färbung für bcl-2 als Marker für die Colo677-Zellen. (D) Die kleine Vergrößerung zeigt die Anfärbung der
Tumorzellen im Zentrum (rotbraun), nicht aber in der Randzone. (E) Der nekrotische Kern (untere Hälfte) zeigt die Färbung für bcl-2. (F) In der größten Vergrößerung sieht man kleine Zellverbände vitaler
Tumorzellen (links), daneben das nekrotische Areal (rechts). (G-I) Tumorschnitte mit einer Färbung für
Vimentin ebenfalls als Marker für die Colo677-Zellen. (G) Die kleinste Vergrößerung zeigt die positive
Färbung (rotbraun) der Tumorzellen im nekrotischen Zentrum. (H) In der mittleren Vergrößerung sieht
man in der unteren Hälfte die angefärbten Tumorzellen des Nekrose-Areals. (I) Kleine Zellverbände
vitaler Tumorzellen (links oben) neben dem nekrotischen Areal (rechts unten). (J-L) Tumorschnitte mit
Färbung für den Makrophagen-Marker F4/80. Die meisten Zellen in der vitalen Randzone des Tumors
sind keine Tumorzellen, sondern Makrophagen (braune Färbung). (M-O) Tumorschnitte mit einem Negativkontroll-Antikörper. (Dienst 2005)
3.1.4.3
Verträglichkeit des Fusionsproteins
3.1.4.3.1
Klinische Beobachtungen
Die Mäuse wurden zu vordefinierten Zeitpunkten (5, 10, 15, 30, 60 und 120 Minuten, danach
täglich) nach der Behandlung auf klinische Zeichen von Toxizität untersucht. Abgesehen von
einer leicht verminderten Bewegungs-Aktivität 10 Minuten nach der Injektion in allen Behandlungsarmen, was möglicherweise auf die Zunahme des Zirkulations-Volumens zurück zu führen
ist, wurden weder in den Kurzzeit- noch in den Langzeit-Experimenten klinische Zeichen für
Toxizität des Fusionsproteins beobachtet. Mäuse, die mit einem LPS-haltigen Regime behandelt
wurden zeigten eine leichte Hypoaktivität und milde Diarrhoen. In den Langzeit-Experimenten
zeigte eine von den neun Mäusen, die mit tTF plus LPS behandelt wurden, einen Gewichtsverlust und einen Abfall der Leukozyten und Thrombozyten. Dieses Tier starb nach der dritten
Behandlung. Von den 14 Mäusen, die ein Doxorubicin-haltiges Regime erhielten, entwickelten
acht (57 %) Diarrhoen, Gewichtsverlust und eine Epidermiolyse an mechanisch beanspruchten
Hautstellen. Einen Gewichtsverlust von mehr als 10 % verglichen mit dem Ausgangsgewicht
wurde in einer von neun Lymphom-tragenden Tieren, die mit tTF plus LPS behandelt wurden,
und in einer von fünf Lymphom-tragenden Tieren, die mit scFv und LPS behandelt wurden,
beobachtet. Bei den Myelom-tragenden Mäusen wurde ein Gewichtsverlust von mehr als 10 %
bei fünf von sieben Mäusen aus dem Doxorubicin-Arm und bei drei von sieben Mäusen aus
dem Kombinationsarm (Fusionsprotein plus Doxorubicin) beobachtet. Alle anderen Tiere zeigten ein stabiles Körpergewicht.
82
3.1.4.3.2
Histologische Analyse der Organe
Die histologischen Schnitte der wichtigsten Organe wurden lichtmikroskopisch hinsichtlich
Thrombosen und Nekrosen untersucht (Dienst 2005). In keinem der untersuchten Organe wurden Nekrosen gefunden. Es zeigten sich einzelne thrombotische Ereignisse mit Extravasation
von Erythrozyten in den Lungen (ein bis drei Thrombosen im gesamten Organschnitt) in einigen
Mäusen. Solche Ereignisse wurden in allen Behandlungsarmen gefunden und sind möglicherweise durch die Injektion und/oder durch den prokoagulanten Status bedingt, der durch den
Tumor verursacht wird. Gelegentlich wurden kleine Fibrin-Thromben in den Schnitten von
Niere, Leber, Pankreas und Herz aus allen Behandlungsarmen gesehen, allerdings zeigten diese
Ereignisse - im Gegensatz zu denen in den Lungen – keine damit verbundene Gewebsreaktion.
Das Fehlen einer solchen Gewebsreaktion ist ein Hinweis darauf, dass das Ereignis post mortem
auftrat und somit als Artefakt zu werten ist. Alle anderen Organe waren frei von Nekrosen und
Thrombosen.
83
Abb. 3.13:
Histologie der Organe nach Paraffin-Einbettung und Färbung nach Hämatoxylin &
Eosin. (A) Herz, (B) Lunge, der Pfeil zeigt hier auf ein Fibrin-Gerinnsel mit leichten hämorrhagischen
Veränderungen im benachbarten Gewebe, (C) Leber, der Pfeil zeigt hier auf ein kleines Fibrin-Gerinnsel
ohne umgebende Gewebsreaktion, (D) Niere, (E) Gehirn, (F) Dünndarm, (G) Pankreas, (H) Milz. In keinem der Organe konnten Nekrosen gesehen werden.
84
Tab. 3.3: Anzahl der Mäuse mit thrombotischen Ereignissen (T) oder Nekrosen (N) in den Organen*. (Dienst 2005)
Behandlungsgruppe
(Anzahl der Mäuse)
Herz
Lunge
Gehirn
Leber
Niere
Milz
Dünndarm
Pankreas
Andere╫
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
T
N
α-CD106-tTF + LPS (6)
-
-
2
-
-
-
2
-
1
-
-
-
-
-
1
-
ND
ND
tTF + LPS (8)
-
-
4
-
-
-
4
-
-
-
-
-
-
-
-
-
ND
ND
Vehikel + LPS (13)
-
-
1
-
-
-
4
-
-
-
-
-
-
-
-
-
ND
ND
α-CD106-tTF (12)
1
-
7
-
-
-
2
-
1
-
-
-
-
-
3
-
-
-
tTF (8)
1
-
3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2
-
ND
ND
α-CD106 (11)
1
-
4
-
-
-
2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
ND
ND
Vehikel (10)
-
-
6
-
-
-
2
-
1
-
-
-
-
-
2
-
ND
ND
L540rec (HL)
Colo677 (SCLC)
85
* Durch histologische Analyse mehrerer H&E-gefärbter Schnitte pro Organ bestimmt. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die Anzahl von Mäusen, bei denen nekrotische Ereignisse detektiert wurden. Dabei wurden nur einzelne Foki, in der Regel zwischen ein und drei pro gesamtem Organschnitt, gesehen.
╫ Andere Organe: Kolon, Haut, Muskulatur, Nebenniere, Ovar, Harnblase
- = weder Thrombosen noch Nekrosen
ND = nicht durchgeführt
In Zusammenschau aller vorliegenden Befunde wurde das Fusionsprotein sehr gut toleriert,
wenn es allein verabreicht wurde. Die multiplen Gaben von LPS und hochdosiertem Doxorubicin waren toxisch, so dass in zukünftigen Kombinations-Behandlungen eine weniger toxische
Substanz bzw. eine geringere Dosis eingesetzt werden sollte.
3.1.4.3.3
Laborparameter
Um auch geringe Veränderungen der systemischen Gerinnung zu beobachten, wurden die Anzahl der Blutzellen (Hämoglobin, Leukozyten und Thrombozyten) und verschiedene Gerinnungs-Parameter (Thrombin-Antithrombin-Komplex, Antithrombin III und lösliches Fibrin)
bestimmt (siehe Tab. 3.4) (Dienst 2005). Diese Analysen wurden ausschließlich durch Maike
Unruh durchgeführt und sind hier aus Gründen der Vollständigkeit aufgeführt. Die verwendeten
Methoden wurden veröffentlicht (Unruh 2005). Dabei wurde das Blut im Rahmen der Sektion
drei Tage nach Behandlung durch eine Vena-cava-Punktion gewonnen. Um auch frühe Veränderungen zu sehen, wurden diese Parameter auch 15 Minuten, 30 Minuten, 4 Stunden und 24
Stunden (jeweils in drei Mäusen) nach der Behandlung gemessen. Bis auf einen leichten und
reversiblen Abfall von Antithrombin III und Hämoglobin nach 30 Minuten in den mit dem Fusionsprotein behandelten Mäusen, lagen die Laborparameter im zuvor ermittelten Referenzbereich. Somit wurde in diesem Modell durch die Behandlung mit dem Fusionsprotein keine systemische Aktivierung des Gerinnungssystems induziert.
86
Tab. 3.4: Laborparameter der behandelten Mäuse aus den Kurzzeit-Experimenten* (modifiziert nach Dienst 2005).
Behandlungsgruppe
Hämoglobin [g/dl]
Leukozyten [n/µl]
Thrombozyten [1000/µl]
TAT-Komplex [ng/ml]
Antithrombin III [%]
Lösliches Fibrin [%
Mittelwert (SD)
Mittelwert (SD)
Mittelwert (SD)
Mittelwert (SD)
Mittelwert (SD)
positive Mäuse]
Range = 14-16
Range = 1000-5000
Range = 400-800
< 20
Range = 70-130
≤ 33
anti-VCAM-tTF/LPS 72 h
15,6 (0,2)
2200 (566)
819 (202)
4,7 (1,2)
83 (16)
ND
tTF/LPS 72 h
14,9 (1,1)
2056 (897)
675 (233)
19,5 (21,9)
77 (12)
ND
ND
ND
ND
10,8 (9,6)
94 (15)
ND
anti-VCAM-tTF 15 Min.
16,2 (1,3)
2333 (473)
638 (22)
9,0 (5,0)
70 (4)
0
anti-VCAM-tTF 30 Min.
13,0 (1,9)
1617 (558)
737 (104)
3,3 (2,5)
69 (24)
0
anti-VCAM-tTF 4 h
14,3 (0,2)
1867 (382)
747 (360)
5,3 (4,2)
86 (1)
33
anti-VCAM-tTF 24 h
14,2 (0,1)
2667 (858)
528 (167)
1,3 (0,6)
77 (14)
0
anti-VCAM-tTF 72 h
14,8 (1,3)
3783 (2545)
715 (246)
4,3 (5,1)
74 (15)
17
tTF 72 h
15,2 (0,5)
1993 (789)
708 (211)
4,0 (4,0)
80 (9)
13
anti-VCAM 72 h
14,3 (0,9)
2914 (1009)
605 (127)
5,3 (4,5)
78 (18)
9
Vehikel 72 h
14,9 (0,8)
2300 (871)
581 (173)
4,0 (4,4)
84 (15)
40
Unbehandelte Mäuse
L540rec (HL)
Vehikel/LPS 72 h
Colo677 (Myelom)
87
* Behandlungsgruppen: anti-VCAM-tTF, tTF und Vehikel (NaCl). Die Daten repräsentieren die Mittelwerte von jeweils drei bis elf Mäusen.
ND = nicht durchgeführt
SD = Standardabweichung
3.2
Molekulare Mechanismen der Koagulationsinduktion durch tTF-Fusionsproteine
3.2.1
Einfluss von Phospholipiden
Typischerweise wird die Aktivität von löslichem (extrazellulärem) Tissue Factor in vitro nach
Rekonstitution in Phospholipiden getestet, damit dieser sich auf einer LipidmembranOberfläche orientieren kann. Bei unserem Ansatz wäre anzunehmen, dass Phospholipide nicht
zwingend notwendig sind, da eine Assoziation mit der Membran durch die Antikörperbindung
hergestellt wird. Es wurde daher getestet, in wie weit die Zugabe von Phospholipiden die Koagulationsinduktion von TF-basierten Fusionsproteinen verbessert.
ZKT 088
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.001
0.000
0.000
0.000
FXa-Generation [OD 405nm]
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 075
P817
HBSS
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
P948
0.000
HBSS
0.000
0.000
0.000
mit PL
Abb. 3.14:
0.000
ohne PL
mit PL
ohne PL
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von Phospholipiden (PL).
Die Diagramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: für ZKT 075 P817 (antiVCAM-tTF), 30 nM, und für ZKT 088 P948 (anti-VCAM-tTF), 30 nM, Negativ-Kontrolle HBSS. Die
Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Es zeigte sich, dass die Werte für das Fusionsprotein und die Negativ-Kontrolle nach Zugabe
von Phospholipiden entweder gleich bleiben (ZKT 075) oder unspezifisch erhöht sind (ZKT
088). Die Zunahme der Extinktionen im ZKT 088 ist als unspezifisch zu bewerten, da sich
gleichzeitig auch die Extinktionen der Negativ-Kontrolle HBSS erhöhen. Das Verhältnis von
Fusionsprotein zu HBSS bleibt in etwa gleich. Auszuschließen wäre hier noch, dass die bloße
Anwesenheit der Phospholipide die Absorption bei 405 nm erhöht. Dies ist aber nicht der Fall,
da bei Betrachtung von kinetischen Messungen (hier nicht dargestellt) mit Zunahme der Inkubationszeit des chromogenen Substrates auch die Messwerte zunehmen. Zusammenfassend ist
festzustellen, dass in Anwesenheit der Phospholipide zwar teilweise eine vermehrte Koagulation
induziert wird, jedoch das Fusionsprotein auch ohne Phospholipide eine gute Koagulationsin-
88
duktion hervorruft. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Membranassoziation des tTF über den
Antikörper hergestellt wird.
Ein wichtiger Aspekt bei der klinischen Anwendung dieses Fusionsproteins wäre die Frage, in
wieweit das Vorhandensein von PL-haltigen Mikropartikeln im Blut der Patienten eine Kontraindikation für die Behandlung mit TF-haltigen Medikamenten darstellt. Dazu wurde folgende
Analyse retrospektiv durchgeführt und die Daten von zwei Koagulationstests fusioniert. Nach
Zugabe von PL sieht man, analog zu oben, sowohl bei den beiden Fusionsproteinen als auch bei
den Negativ-Kontrollen tTF und HBSS einen Signalzuwachs. Berechnet man den Quotienten
der Proben mit zu ohne PL (P948 1,4, P944 1,2, tTF 1,3 und HBSS 1,4), so sieht man, dass das
der Signalzuwachs bei TF (dem Analog zu ungebundenem Fusionsprotein in einer klinischen
Anwendung) im Verhältnis nicht größer ist als bei der Puffer-Negativ-Kontrolle. Die Zugabe
von TF führt also nicht zu einer Steigerung der unspezifischen Reaktion, die durch die PL alleine verursacht wird. Dies lässt den vorsichtigen Schluss zu, dass das Vorhandensein von Mikropartikeln nicht notwendigerweise eine Kontraindikation für eine Therapie mit TF-basierten
Fusionsproteinen darstellt. Um diese Fragestellung genauer zu beleuchten, wäre es von Interesse, Mikropartikel von Patienten in einem analogen in vitro Assay zu untersuchen.
ZKT 88/89
FXa-Generation [OD 405nm]
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
ohne PL
0.000
mit PL
0.000
0.000
0.000
P948
Abb. 3.15:
P944
tTF
HBSS
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von Phospholipiden (PL).
Die Diagramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P948 und P944 (antiVCAM-tTF), jeweils 30 nM, Negativ-Kontrollen: tTF, 30 nM, und HBSS. Die Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler des Mittelwertes.
89
3.2.2
Einfluss der elektrischen Ladung der Endotheloberfläche
Die Koagulationsfaktoren II, VII. IX und X besitzen eine Proteindomäne, welche Vitamin-Kabhängig posttranslational carboxyliert wird, die sogenannte γ-Carboxy-Glutamic-acid-reiche
Region, oder Gla-Domäne. Gla-Domänen binden calciumabhängig bevorzugt an negativ geladene Oberflächen. In der Zellmembran werden negativ geladene Phospholipide, wie z.B. Phosphatidylserin, durch einen aktiven Mechanismus in der inneren Schicht der Membrandoppelschicht gehalten. Ran et al. (Ran 2002) beschrieben eine Reihe von Substanzen, welche eine
Umlagerung solcher anionischer Phospholipide in das äußere Blatt hervorrufen (Phosphatidylserin-Externalisierung). Zu diesen Substanzen gehören u.a. Saponin, LPS und Wasserstoffperoxid
(H2O2).
Der Einfluss einer negativen Membranoberfläche wurde hier nur indirekt getestet, indem die
Zellen vor dem eigentlichen Koagulationstest mit Substanzen inkubiert wurden, welche eine
Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen, und somit eine negative Ladung auf der Endotheloberfläche induzieren. Es ist allerdings anzumerken, dass alle verwendeten Substanzen
auch andere Auswirkungen auf Zellen, unabhängig von der Ladungsänderung, haben.
3.2.2.1
Testung von Saponin
Saponin ist eine Mischung aus Terpenoid-Molekülen und Glycosiden. Bedingt durch den amphiphilen Charakter setzt es die Oberflächenspannung herab und wirkt auf Membranlipide
emulgierend. Durch Interaktion mit dem Cholesterin der Zellmembran führt es zur Permeabilisierung von Zellmembranen (Francis 2002). Im zellgebundenen Koagulationstest wurde das
Saponin verwendet, um zu testen, ob eine gesteigerte Externalisierung von Phosphatidylserin
die Funktionsfähigkeit der Fusionsproteine zu verbessert. Dabei wurden die Zellen nach der
Inkubation mit den Fusionsproteinen mit 2 % (ZKT 007) bzw. mit 0,2 % Saponin (ZKT 008)
bei Raumtemperatur inkubiert. Der Hintergrund (PBS) wurde hier nicht von den Probenwerten
abgezogen, sondern als separate Säulen dargestellt.
90
FXa-Generation [OD 405-650 nm]
ZKT 007
0.000
0.000
0.000
0.000
mit Saponin
0.000
ohne Saponin
0.000
0.000
0.000
P217
Abb. 3.16:
tTF Pool
PBS
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von 2 % Saponin. Die Dia-
gramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P217 (anti-VCAM-tTF), 100 nM,
Negativ-Kontrollen: tTF und PBS. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
FXa-Generation [OD 405-650 nm]
ZKT 008
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
mit Saponin
ohne Saponin
P217
Abb. 3.17:
P225
tTF Pool
PBS
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von 0,2 % Saponin. Die
Diagramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P217 und P255 (anti-VCAMtTF), jeweils 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Im ZKT 007 (Abb. 3.16) kommt es durch die Zugabe von 2 % Saponin zu einer deutlichen Erhöhung der gemessenen Extinktionen im Vergleich zu den Proben ohne Saponin. Allerdings ist
dieser Effekt in demselben Ausmaß sowohl bei dem Fusionsprotein als auch bei den NegativKontrollen tTF und PBS zu beobachten, weshalb diese Reaktion als unspezifisch zu bewerten
und am ehesten durch Freisetzung prokoagulatorischer Substanzen nach Zelltod zu erklären ist.
91
Im ZKT 008 (Abb. 3.17) zeigte sich kein signifikanter Unterschied nach Zugabe von 0,2 %
Saponin im Vergleich zu unbehandelten Proben.
3.2.2.2
Testung von LPS
Unsere Arbeitsgruppe hatte in einer früheren Arbeit gezeigt, dass LPS im zellgebundenen Test
zu einer Verbesserung der Koagulationsfähigkeit von mit FVIIa präkomplexiertem tTF führt
(Philipp 2003). Dieses Resultat konnte hier bestätigt werden. tTF alleine, d.h. ohne vorherige
Komplexbildung mit FVIIa, zeigte hingegen keine erhöhte Koagulation, obwohl im Koagulationsmix FVIIa enthalten ist (siehe Abb. 3.18). Der Unterschied beruht darauf, dass Faktor VIIa
die Bindung von tTF auf aktiviertem Endothel vermittelt, wobei nicht präkomplexierter tTF
alleine nicht binden kann und im Waschschritt entfernt wird. Die Koagulationsinduktion durch
das Fusionsprotein wurde jedoch durch LPS nicht erhöht (siehe Abb. 3
.19).
Dieses
Er-
gebnis spricht wiederum ebenfalls dafür, dass die Membranassoziation von tTF über den Antikörper stattfindet. Würde die Bindung über die FVIIa-Gla-Domäne vermittelt, so wäre wie im
ZKT 019 auch im ZKT 010 eine verstärkte Koagulationsinduktion durch Zugabe von LPS zu
erwarten.
ZKT 019
FXa-Generation [OD 405nm]
0.000
0.000
0.000
ohne Stimulation
0.000
+ LPS
0.000
0.000
0.000
tTF + FVIIa
Abb. 3.18:
tTF
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung von LPS. Das Diagramm zeigt die Mit-
telwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: Etox18 (tTF), 100
nM, für tTF + FVIIa Probe mit 100 nM FVIIa präkomplexiert. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
92
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 010
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
ohne LPS
mit LPS
P282
Abb. 3.19:
tTF-Pool
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung von LPS. Das Diagramm zeigt die Mit-
telwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P282 (antiVCAM-tTF), 50 nM und tTF, 50 nM, als Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler
des Mittelwertes.
3.2.2.3
Testung verschiedener H2O2-Konzentrationen mit und ohne Phospholipide
H2O2 ist ebenfalls dafür bekannt, eine Phosphatidylserin-Externalisierung hervorzurufen. Den
24 Stunden alten Kulturen von 2F2B-Zellen wurden unterschiedliche Mengen an H2O2 zugesetzt
und für weitere 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Vor Testbeginn wurde der Zustand der Zellen
mikroskopisch kontrolliert. Die Testreihe wurde parallel mit und ohne Zugabe von Phospholipiden (Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin) durchgeführt.
ZKT 073
mit PL
FXa-Generation [OD 405nm]
0.001
0.001
0.000
P719
0.000
HBSS
0.000
P719 minus HBSS
0.000
0.000
1 µM
H2O2
Abb. 3.20:
25 µM
H2O2
50 µM 1000 µM 5000 µM
H2O2
H2O2
H2O2
Testung verschiedener H2O2-Mengen mit Zusatz von Phospholipiden. Das Diagramm
zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P719 (anti-VCAM-tTF), 100 nM, HBSS als
Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
93
ZKT 073
ohne PL
FXa-Generation [OD 405nm]
0.001
0.001
0.000
P719
0.000
HBSS
0.000
P719 minus HBSS
0.000
0.000
1 µM
H2O2
Abb. 3.21:
25 µM
H2O2
50 µM 1000 µM 5000 µM
H2O2
H2O2
H2O2
Testung verschiedener H2O2-Mengen ohne den Zusatz von Phospholipiden. Das Dia-
gramm zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P719 (anti-VCAM-tTF), 100 nM,
HBSS als Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Bei der Testreihe mit Phospholipiden (Abb. 3
.20) zeigten sich sowohl für das Fusionspro-
tein als auch für die Negativ-Kontrollen (tTF, hier nicht dargestellt, und HBSS) gesteigerte Extinktionen bei Zugabe von bis zu 50 µM H202. Ab 1000 µM H202 kam es wieder zu abnehmenden Extinktionen. Die Berechnung der Differenz zwischen Fusionsprotein und HBSS als
Hintergrund ergab in dieser Testreihe keine Verbesserung der Koagulationsinduktion durch die
Zugabe von H202. Die Zunahme der Extinktionen muss als unspezifische Reaktion bewertet
werden, da diese ebenso bei Medium und TF-Kontrollen auftrat.
Bei der mikroskopischen Kontrolle der Zellkulturen zeigte sich, dass es mit zunehmenden H2O2Mengen zur Zerstörung der Zellen kam. Dies wurde sichtbar durch Ablösen der Zellen, Vakuolenbildung oder Veränderungen der Zellform. Bei 1000 µM H2O2 zeigten sich mehr als 90 %
der Zellen zerstört. Hierdurch wurde prothrombotisches Material freigesetzt, welches wahrscheinlich die Erhöhung der Werte verursachte. Waren die Zellen so beschädigt, dass sie im
Waschschritt verloren gingen, verringerten sich die Werte für eine Koagulationsinduktion. In
manchen Experimenten wurde auch bei niedrigen H2O2-Konzentrationen eine verringerte Koagulationsinduktion beobachtet. Diese Unterschiede könnten auf unterschiedliche H2O2Präparationen (Zusatzstoffe, Stabilisatoren) zurückführbar sein. Dies wurde jedoch nicht systematisch untersucht.
Phospholipide milderten die toxische Wirkung von H2O2, entweder direkt durch Membranstabilisation, oder indirekt durch Auffangen eines Teils der H2O2-Moleküle.
94
Bei der Testreihe ohne Phospholipide (Abb. 3.21) kam es ebenso sowohl beim Fusionsprotein
als auch bei den Negativ-Kontrollen zu einer Steigerung der Extinktionen durch Zugabe von bis
zu 50 µM H202. Bei größeren Mengen H202 sah man auch hier – bedingt durch die toxische
Wirkung und den Verlust von Zellen - wieder eine Abnahme der Extinktionen. Nach Abzug des
Hintergrundes zeigte sich bei dieser Testreihe jedoch eine deutlich verbesserte Koagulationsinduktion für das Fusionsprotein bei Zugabe von 50 µM H202 im Vergleich zu 1 µM H202 (0,205
versus 0,055).
Diese deutliche Verbesserung der Koagulation konnte bei einer Wiederholung dieses Tests so
nicht bestätigt werden. Dort zeigte sich lediglich eine gering verbesserte, manchmal sogar eine
verminderte Koagluationsinduktion bei Zugabe von 50 µM H202. Möglicherweise spielte hier
auch die Verwendung unterschiedlicher H202-Chargen eine Rolle. Einige Testreihen wurden
dann mit 25 µM H202 und ohne die Zugabe von Phospholipiden durchgeführt. Schließlich wurde
die Verwendung von H202 bei dem Koagulationstest aber wieder verlassen, da die toxische Wirkung auf die Zellen, die Freisetzung von prothrombotischem Material und das Ablösen der Zellen von der Platte als zu unkontrollierbar erschienen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass drei verschiedene Substanzen, die erhöhte Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen (Ran 2002) und damit die negative Ladung auf der
Membranoberfläche erhöhen, die Koagulationsinduktion der Fusionsproteine nicht oder nur
geringfügig verbesserten. Dies stützt die These, dass Koagulationsinduktion vorrangig vom
Antikörperanteil abhängig ist.
3.2.3
Einfluss anderer Gerinnungsfaktoren auf die FaktorX-Aktivierung
3.2.3.1
Testung von Faktor IX
Standardmäßig sind in Koagulationsmixen zur Bestimmung von Koagulationsinduktion die
Gerinnungsfaktoren VIIa, IX und X enthalten. Da hier ausschließlich die Faktor X-Aktivierung
gemessen wurde, ist ein Zusatz von Faktor IX nicht notwendig. Es wäre jedoch möglich, dass
ein Zusatz von Faktor IX die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa kompetitiv inhibiert, da in
beiden Fällen der TF-VIIa-Komplex das Enzym und den Kofaktor für diese Reaktion liefert.
Um dies zu testen, wurden zwei verschiedene Koagulations-Mixe mit 10 nM Faktor VIIa, 200
nM Faktor X und 20 µM Phospholipiden hergestellt, wovon der eine zusätzlich 50 nM Faktor
IX enthielt, der andere nicht. Es ergab sich kein Unterschied im Hinblick auf die Faktor XaGenerierung in den getesteten Konzentrationsbereichen.
95
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 012
0.001
0.001
0.000
0.000
ohne FIX
0.000
mit FIX
0.000
0.000
P282
Abb. 3.22:
P292
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener Koagulations-Mixe. Das
Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P282
und P292 (anti-VCAM-tTF), jeweils 10 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
3.2.3.2
Testung der Faktor VII-Aktivierung
Morrissey beschrieb, dass auch durch den TF-VIIa-Komplex Faktor VII zu VIIa aktiviert werden kann, wobei er postulierte, dass ein TF-VIIa-Komplex mit einem TF-VII-Komplex interagiert (Morrissey 2001). Es wurde zunächst eine Konzentrationsreihe mit Faktor VIIa für die
Faktor X-Generierung durchgeführt, und dann Faktor VII, mit verschiedenen Mengen Faktor
VIIa eingesetzt. Hierbei ergab sich folgendes unerwartete Resultat:
Mix Nummer
1
2
3
4
5
6
7
0,5 µg/ml FVIIa
0,1 µg/ml FVIIa
0,01 µg/ml FVIIa
0,5 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII
0,1 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII
0,01 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII
2 µg/ml FVII
96
ZKT 013
FXa-Generation [OD 405nm]
0.001
Mix 1
0.001
Mix 2
0.000
Mix 3
0.000
Mix 4
0.000
Mix5
0.000
Mix 6
Mix 7
0.000
P282
Abb. 3.23: Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener FVII- und FVIIaKonzentrationen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von ZweifachBestimmungen. Probe P282 (anti-VCAM-tTF), 50 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des
Mittelwertes.
Während Faktor VIIa wie erwartet konzentrationsabhängig die Faktor X-Aktivierung unterstützte (Säulen 1-3), konnte auch bei Zugabe von Faktor VII ohne jeden Faktor VIIa-Zusatz eine
signifikante Menge von Faktor Xa erzeugt werden. Hinzufügen einer geringen Menge Faktor
VIIa verbesserte die Koagulationsinduktion nicht, vielmehr zeigte sich ein Trend zu einer verminderten Faktor X-Aktivierung. Dieses unerwartete Ergebnis ist am ehesten dadurch zu erklären, dass das Faktor VII-Präparat schon eine geringe Menge an Faktor VIIa enthielt und eine
weitere Zugabe von Faktor VIIa tTF-Stellen blockierte, die sonst für die weitere Aktivierung
von Faktor VII zur Verfügung ständen. Wir konnten diese Annahme stützen, indem Faktor VIIPräparationen unterschiedlicher Hersteller untersucht wurden. Tatsächlich fand sich keine Aktivierung mit Faktor VII alleine, wenn dieser von einem anderen Hersteller bezogen wurde (siehe
Abb. 3.24). In diesem Fall verbesserte die Zugabe einer sehr geringen Menge an Faktor VIIa zu
Faktor VII die Gerinnungsinduktion deutlich, was den Schluss nahe legt, dass auch Faktor VII
zu VIIa aktiviert werden kann. Dies ist von Bedeutung, da unter normalen Umständen nur sehr
geringe Mengen an Faktor VIIa im Blut zirkulieren und dieser Faktor für eine Koagulationsinduktion durch den Tenasekomplex (TF, Faktor VIIa und die Substrate Faktor VII, Faktor IX
oder Faktor X) limitierend sein kann.
97
Mix Nummer
1
2
3
4
FVIIa
0,01 µg/ml
0,01 µg/ml
FVII Fa. Enzyme Res.
2 µg/ml
2 µg/ml
-
FVII Fa. Calbiochem
2 µg/ml
2 µg/ml
ZKT 134
FXa-Generation [OD 405nm]
0.000
0.000
0.000
Mix 1
0.000
Mix2
0.000
Mix 3
0.000
Mix 4
0.000
P1011
0.000
Abb. 3.24:
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener FVII- und FVIIa-
Konzentrationen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von ZweifachBestimmungen. Probe: P1011 (anti-VCAM-tTF), 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler
des Mittelwertes.
3.2.4
Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation
In der Einleitung (siehe Kap. 1.7.2) wurden die beiden Szenarien erläutert, in welchen die
Kopplung von tTF an den Antikörper eine Koagulationsinduktion des tTF ermöglicht: die Liganden-vermittelte Komplexbildung und die Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung.
Der zellgebundene Koagulationstest besteht aus zwei Phasen, der Bindungs- und der Koagulationsphase (dazwischen ein Waschschritt). Beide können unabhängig voneinander durch freien
Liganden inhibiert werden, so dass der Einfluss des Liganden (scFv-Antikörpers) auf diese beiden Prozesse getrennt analysiert werden kann.
Es wurden daher Experimente durchgeführt, in denen freier Ligand (MK271-IgG, anti-MausVCAM-1-Antikörper) entweder in der Bindungsphase oder in der Koagulationsphase zugegeben wurde. Als Negativkontrolle für den freien Liganden wurde ein irrelevantes IgG (Intraglobin®, humanes unspezifisches Immunglobulin G) eingesetzt. Die Antikörper wurden für die Inhibierung der Bindungsphase in verschiedenen Konzentrationen (5 nM bis 5000 nM) verwendet
und den Proben mit dem Fusionsprotein (5 nM) entweder in der Bindungsphase (Abb. 3.25)
oder in der Koagulationsphase (Abb. 3.26) des Tests hinzugefügt. Für die Inhibierung der Koagulationsphase wurden die Antikörper in 66-fachem molaren Überschuss eingesetzt.
98
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 056
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Abb. 3.25:
Zellgebundener Koagulationstest mit Inhibierung von anti-VCAM-tTF durch Im-
munglobulin (Ig) und MK27 (anti-mVCAM-1-Antikörper) in der Bindungsphase, FP = Fusionsprotein ohne Antikörper-Zugabe. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Dreifach-Bestimmungen. Probe: P522 (anti-VCAM-tTF), 5 nM. Die Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler des Mittelwertes.
Wie zu erwarten findet durch das unspezifische Immunglobulin keine Inhibierung des Fusionsprotein statt. Durch den spezifischen Antikörper MK27 lässt sich die Bindung des Fusionsproteins in der Bindungsphase vollständig inhibieren.
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 076
0.001
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
ohne Ak
Abb. 3.26:
MK27
Ig
Zellgebundener Koagulationstest mit Inhibierung von anti-VCAM-tTF durch Zugabe
der Antikörper (Ak) Immunglobulin (Ig) und MK27 (anti-VCAM-1-Antikörper) im Überschuss in
der Koagulationsphase. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium)
von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P797 (anti-VCAM-tTF), 50 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
In der Koagulationsphase war ebenfalls eine Inhibierung um ca. 50% zu beobachten.
99
3.2.5
Andere Faktoren
3.2.5.1
Testung unterschiedlicher Zellmengen
Es wurde des Weiteren nachgewiesen, dass die Koagulationsinduktion zellabhängig ist, und
nicht etwa auch auf der Oberfläche der Zellkulturplatten stattfinden kann. Hierzu wurden Zellen
in verschiedenen Konzentrationen ausgesät, wobei sich nur bei den höheren Konzentrationen
ein kontinuierlicher Zellrasen entwickelte. Dazu wurden 5 x 10³, 1 x 104, 2,5 x 104, 5 x 104 und
1 x 105 2F2B-Zellen pro Loch eingesetzt und 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. 5 x 104 und
1 x 10 5 Zellen pro Loch zeigten bei der mikroskopischen Kontrolle einen konfluenten Zellrasen. Bei den geringeren Zellmengen lagen die Zellen noch einzeln ohne Kontakt zu den Nachbarzellen. Wie erhofft, nahm die Koagulationsaktivität mit wachsender Zellzahl zu (Abb. 3.27)
und es wurden keine Artefakte durch Binden der Koagulationsproteine an die Zellkulturplatte
beobachtet (siehe Abb. 3.28 und Abb. 3.29). Da Zellen nach Erreichen der Konfluenz abzusterben beginnen, und dann prothrombotisches Material freisetzen können, wurden die Zellen in
den nachfolgenden Tests in der höchstmöglichen nicht konfluenten Zellzahl, d.h. mit 2,5 x 104
pro Loch eingesetzt.
FXa-Generation [OD 405nm]
ZKT 087
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
5.000 Zellen
10.000 Zellen
25.000 Zellen
50.000 Zellen
100.000 Zellen
P947
Abb. 3.27:
Testung verschiedener Zellmengen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hinter-
grund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P947 (anti-VCAM-tTF), 30 nM. Die
Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
3.2.5.2
Testung verschiedener Inkubationszeiten
Es wurden verschiedene Inkubationszeiten für die Proben (jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C) und für den Koagulations-Mix (jeweils 1 Stunde oder 15 Minuten
bei 37 °C) getestet. Dabei wurde auch die Zelllinie ECV304 eingesetzt, die kein VCAM-1 ex-
100
primiert, um bei der Inkubation über Nacht möglicherweise entstehende unspezifische Bindungen an die Zelloberfläche zu erkennen. Zu diesem Zwecke wurde bei der Darstellung im Diagramm das Zellkultur-Medium nicht wie sonst als Hintergrund von den Probenwerten abgezogen, sondern als separate Säulen dargestellt.
Tab. 3.5: Test-Bedingungen ZKT 046
Test-Bedingungen
#1
#2
#3
#4
Inkubation Probe
1 h RT
1h RT
4 °C über Nacht
4 °C über Nacht
Inkubation Koagulations-Mix
1 Std. 37 °C
15 Min. 37 °C
1 Std. 37 °C
15 Min. 37 °C
ZKT 046
FXa-Generation [OD 405nm]
0.000
0.000
0.000
0.000
P470
0.000
tTF
0.000
Medium
0.000
0.000
2F2B #1
Abb. 3.28:
2F2B #2 ECV304 #1 ECV304 #2
ohne
Zellen #1
ohne
Zellen #2
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung der Inkubation mit unterschiedlichen
Zeiten und Temperaturen auf 2F2B-Zellen, ECV304-Zellen und zellfrei. Das Diagramm zeigt die
Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P470 (anti-VCAM-tTF), 50 nM, Negativ-Kontrollen:
tTF, 50 nM, und Zellkultur-Medium. Testbedingungen #1 und #2 (1 Stunde Inkubation für Bindungsphase) siehe Tabelle oben. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
101
ZKT 046
FXa-Generation [OD 405nm]
0.002
0.001
0.001
0.001
P470
0.001
tTF
0.001
Medium
0.000
0.000
0.000
2F2B #3
Abb. 3.29:
2F2B #4 ECV304 #3 ECV304 #4
ohne
Zellen #3
ohne
Zellen #4
Zellgebundener Koagulationstest zur Testung der Inkubation mit unterschiedlichen
Zeiten und Temperaturen auf 2F2B-Zellen, ECV304-Zellen und zellfrei. Das Diagramm zeigt die
Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P470 (anti-VCAM-tTF), 50 nM, Negativ-Kontrollen:
tTF, 50 nM, und Zellkultur-Medium. Testbedingungen #3 und #4 (über Nacht Inkubation für Bindungsphase) siehe Tabelle oben. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Die Probeninkubation über Nacht (Test-Bedingung #3 und #4, siehe Abb. 3.29) führte zu sehr
hohen Extinktionen sowohl beim Fusionsprotein als auch bei den Negativ-Kontrollen tTF und
Medium. Die mikroskopische Kontrolle der Zellen zeigte, dass diese zum Teil nicht mehr intakt
waren, was größere Mengen prothrombotischen Materials freisetzt. Dies erklärt auch die relativ
hohen Extinktionen bei der ECV304-Zellinie, die hier als Negativ-Kontrolle eingesetzt wurde.
Der Hintergrund (Zellkultur-Medium) wurde bei diesem Test nicht von den Probenwerten subtrahiert, da er gerade bei der Inkubation über Nacht sehr hohe Extinktionen zeigte, was ebenfalls
als unspezifische Reaktion durch freigesetztes prothrombotisches Material zu erklären ist. Die
Testung ohne Zellen wurde durchgeführt, um potenzielle unspezifische Bindungen an das Plastik der Platten auszuschließen. Die besten Ergebnisse brachte eine einstündige Probeninkubation
in Kombination mit einer einstündigen Inkubation des Koagulationsmixes (Test-Bedingung #1,
siehe Abb. 3.28). Diese Inkubationszeiten wurden für die weiteren Analysen verwendet.
3.3
Verbesserung der Effektorfunktion durch optimierte dreidimensionale
Ausrichtung des tTF-Moleküls zur Zellmembran-Oberfläche (Molecular
Modelling)
Zur Verbesserung der Effektivität des vorhandenen Prototyps des anti-VCAM-tTFFusionsproteins sollte die Hypothese überprüft werden, dass die Positionierung und Ausrichtung des aktiven Zentrums von FVIIa im FVIIa/TF-Komplex (siehe Kap. 1.6.4) durch
102
Molecular Modelling weiter verbessert werden kann. Um die dreidimensionale Ausrichtung zur
Membran zur verbessern, wurden neue Konstrukte entworfen. Diese sollten zunächst in silico
getestet werden, dann rekombinant hergestellt und in funktionellen Assays ausgewertet werden.
3.3.1
Vorhersage der Proteinstruktur mit dem SWISS-Model
Es wurde versucht, die dreidimensionale Molekülstruktur des Fusionsproteins mit Hilfe des
SWISS-Models hervorzusagen. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des Proteins in das Programm eingegeben (http://swissmodel.expasy.org/). Für den scFv- und den tTF-Anteil konnten
die in Abb. 3.30 gezeigten Homologiestrukturen ermittelt werden.
Abb. 3.30:
Mit Hilfe des SWISS-Models ermittelte Homologiestrukturen für scFv und tTF
Da für die verschiedenen Linker-Sequenzen jedoch keine homologen Proteine in der Datenbank
existierten, konnte das vollständige Protein leider nicht dargestellt werden. Daher wurden alle
Konstrukte rekombinant hergestellt und in Koagulations-Assays getestet.
3.3.2
Klonierungsstrategie für Fusionsprotein-Varianten
Ausgangsmaterial war das Plasmid pswc4, welches eine Peptidsequenz von HHHHHH als Linker zwischen dem jeweiligen scFv und tTF enthält, wobei tTF den extrazellulären Anteil von TF
(Aminosäuren 1-219) darstellt.
Das Ziel war, Varianten mit verschiedenen Linkerlängen (mit und ohne Histidin) und Varianten
mit leicht verlängertem tTF (maximal neun der 24 Aminosäuren des Transmembrananteils zusätzlich) sowie alle möglichen Kombinationen hiervon herzustellen. Da das hier zu verwendete
scFv eine Restriktionsstelle für KpnI enthält, konnte das scFv erst nach Klonierung von Linkerund tTF-Varianten eingesetzt werden. Deshalb wurde zunächst der 6H-Linker durch die neuen
Linker ersetzt, entweder mittels Primer-Duplex-Insertion oder durch Klonierung eines Linker-
103
PCR-Fragmentes. Die Zwischenprodukte wurden sequenziert. Dann wurde jeweils das tTFFragment ausgeschnitten und durch die neuen tTF-PCR-Fragmente ersetzt. Nach Sequenzierung
der Zwischenprodukte wurde schließlich das scFv MK271, welches aus einem vorhandenen
Plasmid ausgeschnitten wurde, in diese Plasmide eingesetzt.
Abb. 3.31:
Klonierungs-Schema. (A) Ausschneiden des alten Linkers und Einsetzen der neuen Lin-
ker-Varianten (Livar), (B) Ausschneiden des alten tTF und Einsetzen der neuen tTF-Varianten, (C) Einsetzen des MK271-scFv. Schwarze Balken = Restriktions-Schnittstellen, HX = Klonierungsstelle für
MK271-scFv (H = Restriktionsschnittstelle für HindIII, X = Restriktionsschnittstelle für XbaI).
3.3.3
Klonierung der neuen Fusionsprotein-Varianten
3.3.3.1
Modifikation der Linker
Der Linker zwischen scFv und tTF im Originalkonstrukt besteht aus sechs Histidin-Molekülen.
Durch Veränderung dieser Linkersequenz sollte das Molekül beweglicher werden und der tTF-
104
Anteil näher an die Zellmembran heran kommen. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Sequenzen
der erhaltenen Linker.
Tab. 3.6: Modifizierte Linker (sortiert in aufsteigender Länge)
Plasmidbezeichnung
Linkersequenz
Interner Code
pLi3
XbaI -Gly3-KpnI
pswc12
pLi5
XbaI -Gly4-Ser-KpnI
pswc17
pLi6H
XbaI-His6-KpnI
pswc4
pLi8
XbaI -Gly4-Ser-Gly3-KpnI
pswc13
pLi9H
XbaI -His6-Gly3-KpnI
pswc10
pLi13
XbaI -Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly3-KpnI
pswc14
pLi13H
XbaI -His5-Gly4-Ser-Gly3-KpnI
pswc15
pLi14H
XbaI -His6-Gly4-Ser-Gly3-KpnI
pswc11
pLi19
XbaI -Gly4-Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-KpnI
pswc18
pLi51
XbaI -Gly4-Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly-
pswc19
Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4- Ser-Gly-Thr-Gly3Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-KpnI
3.3.3.2
Modifikation des tTF-Anteils
Wie in Kapitel 1.6.2 beschrieben, ist der Membrananker des TF essentiell für die volle proteolytische Aktivität im Zusammenspiel mit FVIIa. Bei unserem Fusionsprotein wurde die Bindung
des Membranankers durch die Bindung des scFv an VCAM-1 ersetzt. Da das scFv jedoch aufgrund seiner Größe (ca. 50 Å) am N-Terminus fusioniert wurde, postulierten wir, dass eine geringfügige Verlängerung des tTF-Anteils am C-Terminus einen besseren Kontakt zur Zellmembran herstellen würde. Die TF-Verlängerung durfte jedoch nicht zu lang ausfallen, da sonst
eine unspezifische Membraninsertion begünstigt würde. Daher wurden maximal die ersten neun
Aminosäuren des transmembranären Anteils von TF angefügt. Es wurden neun Varianten des
tTF mit 220-228 Aminosäuren (tTF220-228) hergestellt (siehe Tab. 3.7, Seite 108).
Abb. 3.32 zeigt die Plasmide mit den neuen Linkern nach dem enzymatischen Verdau mit SacI
und KpnI, der das 219aa tTF-Fragment freisetzt, zur Überprüfung der Intaktheit der KpnIRestriktionsstelle.
105
Abb. 3.32:
Analytisches Gel mit pswc10-15/MK271 nach Restriktionsenzym-Verdau mit SacI
und KpnI zur Überprüfung der KpnI-Restriktionsstelle. Marker: links Invitrogen 100 bp DNA Ladder,
rechts GIBCO 1 Kb DNA Ladder.
Abb. 3.33: Präparatives Gel der neuen Plasmide nach Restriktionsenzym-Verdau mit KpnI und
SacI zur Vorbereitung der Ligation mit der neuen tTF-DNA. Links GIBCO 1 Kb DNA Ladder, rechts
Invitrogen 100 bp DNA Ladder
Die unterschiedlich langen tTF-Fragmente wurden mittels PCR-Reaktion hergestellt (Abb.
3.34), und dann in die linearisierten Plasmide kloniert. Anschließend wurden aus den klonierten
Bakterien Einzelkulturen angelegt und jeweils ein DNA-Miniprep angefertigt. Die Minipreps
wurden durch einen Restriktionsverdau mit SacI und KpnI auf Vorhandensein des Fragmentes
überprüft (Abb. 3.35).
106
Abb. 3.34: Agarose-Gel zur Überprüfung der PCR-Amplifikate. Von links nach rechts: tTF220228. Jeweils ganz außen: Invitrogen 100 bp Ladder.
Abb. 3.35: Restriktionsenzym-Verdau von Minipreps mit KpnI und SacI zur Kontrolle des tTFInserts. Spur 1: Invitrogen 100 bp Ladder. Spur 2-20: verschiedene Minipreps der neuen Konstrukte.
Spur 5-7: Minipreps mit fehlendem tTF-Insert.
Das Endresultat waren 10 Expressionsplasmide mit unterschiedlich langen Linkern, die jeweils
10 verschiedene tTF-Fragmente enthielten. Die Sequenzen für die verlängerten tTF-Fragmente
wurden überprüft und sind in Tab. 3.7 dargestellt.
107
Tab. 3.7: Neue tTF-Sequenzen mit 220-228 Aminosäuren
tTF 220
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA
glu phe arg glu ile
tTF 221
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC
glu phe arg glu ile phe
tTF 222
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC
glu phe arg glu ile phe tyr
tTF 223
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC
glu phe arg glu ile phe tyr ile
tTF 224
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT
glu phe arg glu ile phe tyr ile ile
tTF 225
Nukleotidsequenz:
AS :
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA
glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly
tTF 226
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT
glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala
tTF 227
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT GTG
glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala val
tTF 228
Nukleotidsequenz:
AS:
GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT GTG GTA
glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala val val
3.3.3.3
Einfügen des MK27-scFv
Aus dem vorhandenen Expressionsplasmid pswc4/MK271 wurde mittels Restriktionsenzymverdau mit HindIII und XbaI das MK271-scFv herausgeschnitten, auf einem 1,5%igen AgaroseGel aufgetrennt und die scFv-Bande ausgeschnitten. Die neuen Expressionsplasmide wurden
ebenfalls mit HindIII und XbaI verdaut, um die Insert-Stelle für das scFv zu öffnen. Auch hier
erfolgte eine Aufreinigung auf einem Agarosegel mit anschließender Exzision der entsprechenden Plasmid-Banden.
Die DNA wurde dann aus dem Gel extrahiert. Die DNA-Konzentrationen wurden in einem analytischen Gel bestimmt und so eingestellt, dass die molare Plasmid-Insert-Ratio für die folgende
Ligation bei 1:10 lag. Die scFv-DNA wurde nun mittels Ligation in die neuen Plasmide kloniert. Aus den klonierten Bakterien wurden DNA-Minipreps hergestellt und durch einen Rest-
108
riktionsenzym-Verdau mit HindIII und XbaI auf das Vorhandensein des scFv-Inserts überprüft
(siehe Abb. 3.36).
Abb. 3.36:
Restriktionsenzym-Verdau von Minipreps mit HindIII und XbaI zur Kontrolle des
scFv-Inserts. Spur 1: Invitrogen 100 bp Ladder. Spur 2-11: Verdau der Minipreps
Des Weiteren wurde eine Gensequenzierung der Minipreps durchgeführt. Aus den Minipreps
mit der korrekten DNA-Sequenz (bzw. auch aus solchen mit stummen Mutationen) wurden nun
Maxipreps gewonnen, welche für die Proteinexpressionen eingesetzt wurden. Zwei der Konstrukte enthielten eine konservative Mutation (pLi8-T221: Arg Lys; pLi13H-T225: Val Ala) und wurden ebenfalls für die Proteinexpression verwendet.
3.3.4
Expression und Aufreinigung der neuen Fusionsprotein-Varianten
Aus Gründen der Kapazität der Schüttelinkubatoren und der Zentrifugen konnten maximal elf
Proteine gleichzeitig exprimiert werden. Es wurde pro Protein jeweils 1 L Bakterienkultur angezogen. Die Ausbeute betrug nach NiNTA-Aufreinigung typischerweise 100-300 µg Gesamtprotein und 5-40 µg spezifisches Protein. Zur Bestimmung der spezifischen Proteinkonzentration
wurden die Proteine im Spektrophotometer bei 278 nm vermessen (siehe Abb. 3.37), sowie
mittels SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und nach Coomassie gefärbt (Abb. 3.38).
109
Abb. 3.37:
Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer. Probe P2000 (pLi51-
T222).
Abb. 3.38:
SDS-PAGE der Fusionsproteine P1008-1011 nach Coomassie-Färbung. (1) Größen-
standard Invitrogen BenchMark Protein Ladder, (2) P1008 (pLi8-T225), (3) P1009 (pLi8-T226), (4)
P1010 (pLi8-T228), (5) P1011 (pLi6H -T219). Die Banden der Fusionsproteine sieht man bei 60 kDa.
Das Fusionsprotein hat eine Größe von 60 kDa. Die Banden bei 45kDa repräsentieren ein Bakterienprotein, welches ebenfalls an NiNTA bindet und eine bekannte Kontamination ist. Die
Banden bei 27/30kDa sind wahrscheinlich auf Zerfallsprodukte des Fusionsproteins zurückzuführen (scFv und tTF nach Proteolyse in der Linkerregion). Da der Reinheitsgrad der spezifischen Proteine teilweise nur 5 % betrug, war die Abschätzung der spezifischen Proteinkonzentration dementsprechend ungenau.
Die Identität der neuen Fusionsproteine wurde stichprobenhaft per Western Blot bestätigt.
110
Abb. 3.39:
Western Blot der Fusionsproteine. (1) Bio-Rad Kaleidoscope Protein Ladder, (2-4) tTF
als Mengenstandard eingesetzt 32 ng, 16 ng, 4 ng, (5) pLi6H, (6) pLi9H, (7) pLi14H, (8) pLi3, (9) pLi8,
(10) pLi13, (11) pLi13H, (12) Protein Ladder. Die Banden der Fusionsproteine sind bei 60 kDa zu erkennen (Pfeil). Die Banden bei 30 kDa in Spur 5,6 und 11 sind tTF-Monomere, in Spur 5 darüber tTFDimere.
3.3.5
In-vitro-Charakterisierung der neuen Fusionsprotein-Varianten
3.3.5.1
Bindung
Die Bindungsfähigkeit der neuen Fusionsproteine wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die FACS-Auswertung erfolgte anhand der Histogramme der Fluoreszenz. Dabei ist auf
der x-Achse die Fluoreszenz-Intensität und auf der y-Achse die Zellzahl aufgetragen. Bei nicht
ausreichender Bindungsfähigkeit der Konstrukte wurden diese verworfen und neu hergestellt.
Beispielhaft seien hier einige FACS-Histogramme aufgeführt.
Abb. 3.40:
FACS-Auswertung zur Bindungsfähigkeit der neuen Konstrukte. Dünne Linie: Zellen
ohne Antikörper bzw. nur mit Sekundär-Antikörper, dicke Linie: Proben, x-Achse: FluoreszenzIntensität, y-Achse: Zellzahl
Im Vergleich zur Positivkontrolle zeigte sich eine ähnlich gute Bindungsfähigkeit der hier beispielhaft gezeigten Proteine P2000 und P1026.
111
3.3.5.2
Koagulations-Induktion
Die Koagulationsfähigkeit der neuen Proteine wurde im zellfreien und im zellgebundenen Koagulationstest analysiert. Dabei wurde jeder Test mindestens einmal wiederholt. In der Abb. 3.41
und Abb. 3.42 sieht man repräsentative Beispiele.
Faktor Xa-Generation [OD 405 nm]
KT 316
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Abb. 3.41:
Zellfreier Koagulationstest der neuen Konstrukte. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte
(minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Proben siehe unten, 20 nM. Die Fehlerbalken
zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Proben:
P1126
P1117
P1118
P1119
P1120
P1121
P1122
P1123
P1124
P1125
pLi6H +T219 (Originalkonstrukt)
pLi6H +T220
pLi6H +T221
pLi6H +T222
pLi6H +T223
pLi6H +T224
pLi6H +T225
pLi6H +T226
pLi6H +T227
pLi6H +T228
112
Faktor Xa-Generation [OD 405 nm]
ZKT 156
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Abb. 3.42:
Zellgebundener Koagulationstest der neuen Konstrukte. Das Diagramm zeigt die Mit-
telwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Proben siehe oben, 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
3.3.6
Vergleichende Analyse der neuen Fusionsproteine
Um Variationen der Funktionalität aufgrund von unterschiedlichen Expressionsbedingungen
auszuschließen, wurden die Proteine nur innerhalb einer Expressionsreihe im Koagulationstest
miteinander verglichen. Die zellfreien Assays (KT) wurden mit Doppelbestimmungen und die
zellgebundenen Assays (ZKT) mit Dreifachbestimmungen durchgeführt. Beim zellgebundenen
Koagulationstest wurden 100 nM des Proteins eingesetzt, bei den zellfreien Tests 10 nM und 20
nM, wobei hier die Ergebnisse für 20 nM gezeigt sind. Jeder Test wurde mindestens einmal
wiederholt. Die Balkendiagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund, PBS beim zellfreien und tTF beim zellgebundenen Test) der Faktor Xa-Generation als x-fachen Wert über
dem Originalkonstrukt pLi6H-T219 (pswc4+tTF219).
Aufgrund der ungenauen Proteinbestimmung und der Schwierigkeit, die Vielzahl von Einflussfaktoren (Zellviabilität, Vorhandensein von Phospholipiden in Form von Zelldebris, EndotoxinVerunreinigungen, Proteinreinheit, Dimerbildungen etc.) immer genau konstant zu halten, war
die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nicht optimal. Da 76 verschiedene Proteine jeweils zweibis dreimal exprimiert wurden und für jedes exprimierte Protein vier bis sechs Assays in Zweifach- oder Dreifachbestimmung durchgeführt wurden, konnten nur Methoden angewandt werden die mit einem hohen Durchsatz kompatibel waren. Auf der anderen Seite erlaubte die hohe
Anzahl an Datenpunkten zumindest Trends zu erkennen. Dabei wurde auf eine Verbesserung
der Koagulationsinduktion im zellgebundenen Assay bei nicht erhöhter oder verminderter Aktivität im zellfreien Koagulationstest geachtet. Erhöhte Aktivität im zellfreien Koagulationstest
113
wurde als eine höher als angenommene Proteinkonzentration interpretiert. In der Zusammenschau der Daten ergab sich bei dieser Auswertungsweise der Trend, dass Fusionsproteine mit
längeren Linkern (19 oder 51 Aminosäuren statt sechs Aminosäuren) und unter den Proteinen
mit längeren Linkern solche mit leicht verlängertem tTF (insbesondere 222 Aminosäuren, zum
Teil auch 226 Aminosäuren statt ursprünglich 219 Aminosäuren) eine verbesserte Koagulationsinduktion hervorriefen. Einige Testreihen, die diese Beobachtung stützen, sind in den Abbildungen Abb. 3.43 bis Abb. 3.46 gezeigt.
114
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
KT 297 (Expressionsreihe P1021-1030)
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
KT 273 (Expressionsreihe P953-952)
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
KT 307 (Expressionsreihe P1070-1080)
Abb. 3.43:
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
Vergleich der Koagulationsinduktion im zellfreien Koagulationstest für verschiedene
TF-Längen mit dem 19 aa langen Linker. Daten aus drei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Die neuen Konstrukte zeigten im zellfreien Test im Vergleich zum Originalkonstrukt (= Kontrolle) eine verminderte oder ähnliche Aktivität, daher sind
Erhöhungen im zellgebundenen Koagulationstest (nächste Abbildung) eher eine Folge der dreidimensionalen Ausrichtung als eines Konzentrationsunterschiedes.
115
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 128 (Expressionsreihe P1021-1030)
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0.000
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 83 (Expressionsreihe P944-953)
0.003
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 113 (Expressionsreihe P1070-1080)
0.003
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000
-0.001
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 115 (Expressionsreihe P1070-1080)
Abb. 3.44:
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000
Vergleich der Koagulationsinduktion im Zell-Koagulationstest für verschiedene TF-
Längen mit dem 19 aa langen Linker. Daten aus drei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme
116
zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen
den Standardfehler des Mittelwertes. Die neuen Konstrukte induzierten teilweise zwei- bis dreimal mehr
Faktor Xa, insbesondere Konstrukte mit der TF-Länge 222aa.
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
KT 296 (Expressionsreihe P1034-1043)
0.003
0.002
0.002
0.001
0.001
0.000
Faktor Xa-Generation [Vielfaches
über Kontrolle]
KT 282 (Expressionsreihe P1045-1053)
Abb. 3.45:
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
*
Vergleich der Koagulationsinduktion im zellfreien Koagulationstest für verschiedene
TF-Längen mit dem 51 aa langen Linker. Daten aus zwei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Auch hier fand sich für die neuen Konstrukte im Vergleich zum Originalkonstrukt eine verminderte oder nur leicht erhöhte Aktivität.
* In dieser Expressionsreihe fehlt pLi51-T224, da die Kultur nicht angewachsen ist.
117
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 125 (Expressionsreihe P1034-1044)
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0.000
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 148 (Expressionsreihe P1034-1044)
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
-0.005
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 106 (Expressionsreihe P1045-1054)
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
*
Faktor Xa-Generation
[Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 121 (Expressionsreihe P1045-1054)
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0.000
*
118
Abb. 3.46:
Vergleich der Koagulationsinduktion im Zell-Koagulationstest für verschiedene TF-
Längen mit dem 51 aa langen Linker. Daten aus zwei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Trotz der suboptimalen Reproduzierbarkeit zeigt sich auch hier
ein Trend für die Überlegenheit des Konstruktes mit dem 222 aa langen TF.
* In dieser Expressionsreihe fehlt pLi51-T224, da die Kultur nicht angewachsen ist.
Die beobachteten Trends stehen im Einklang mit der ursprünglich aufgestellten Hypothese, dass
ein längerer Linker dem Protein mehr Spielraum gäbe, um sich korrekt anzuordnen, und ein
leicht verlängerter tTF sich besser an die Zellmembran anlagern würde.
Um dies zu bestätigen, wurde das Protein pLi51-T222 in größerem Maßstab hergestellt und mit
dem Prototyp pLi6H-T219 verglichen. Sowohl zellfreier als auch zellgebundener Koagulationstest wurde dreimal durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.47 dargestellt.
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
0.001
0.001
0.001
0.001
0.000
0.000
0.000
ZKT 141
FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle]
FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle]
ZKT 131
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle]
0.001
0.001
KT 314
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ZKT 157
FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle]
0.001
KT 296
FXa-Generation [Vielfaches über…
Faktor Xa-Generation [Vielfaches…
KT 295
119
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Abb. 3.47:
Zellfreier (KT) und zellgebundener Koagulationstest (ZKT) mit dem Vergleich pLi51-
T222 und pLi6H -T219 (Kontrolle). Daten aus einer Expressionsreihe. KT und ZKT wurden jeweils
dreimal wiederholt. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von DreifachBestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
Abb. 3.47 zeigt in allen Fällen eine bessere Koagulationsinduktion des neuen Konstruktes
pLi51-T222 im zellgebundenen Test (untere Reihe). Die Tatsache, dass im zellfreien Assay
(obere Reihe) keine erhöhte, vielmehr eine leicht verminderte Faktor Xa-Generation beobachtet
wurde, ist vereinbar mit der Interpretation, dass die verbesserte Funktionalität durch eine optimierte Präsentation des Fusionsproteins auf der Zellmembran erreicht wurde.
Es blieb nun noch auszuschließen, dass dieses neue Konstrukt etwa auch unspezifische Koagulation unterstützt. Hierzu wurde das neue Fusionsprotein pLi51-T222 im Vergleich mit dem
Prototyp auf drei verschiedenen Zelllinien getestet: 2F2B-Zellen, die konstitutiv murines
VCAM-1 exprimieren; bEND3-Zellen, in welchen murine VCAM-1-Expression durch LPS
induziert wird; und HUVEC-Zellen, die human sind und kein murines VCAM-1 exprimieren.
Das Resultat ist in Abb. 3.48 dargestellt.
ZKT 158
FXa-Generation [OD 405nm]
0.000
0.000
2F2B
0.000
Bend3 -LPS
Bend3 +LPS
0.000
ECV304
HUVEC
0.000
0.000
pLi6H -T219
Abb. 3.48:
pLi51-T222
Zellgebundener Koagulationstest auf verschiedenen Zelllinien zur Analyse der Spezi-
fität. Proben: pLi51-T222 (neues Konstrukt) und pLi6H -T219 (Kontrolle). Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes.
pLi51-T222 zeigte erneut eine deutlich verbesserte Koagulationsinduktion auf antigenpositiven
Zellen, nicht aber auf antigennegativen Zellen, induzierte also keine vermehrte unspezifische
Gerinnungsaktivierung.
120
Damit ist als Ergebnis dieser Arbeit ein Konstrukt entwickelt worden, welches eine verbesserte
spezifische, antikörpervermittelte Koagulationsinduktion im Vergleich zum Prototyp des antiVCAM-1-tTF aufweist.
121
4
Diskussion
4.1
Charakterisierung des Prototyps
Im ersten Teil der Arbeit wurde das in der Arbeitsgruppe vorhandene Konstrukt des Prototyps
des anti-VCAM-tTF in größeren Mengen rekombinant hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Ziel war es, ein rekombinantes spezifisches Fusionsprotein zu herzustellen, welches
selektiv an luminale Tumorendothelzell-Marker bindet und die Tumorblutgefäße durch Aktivierung des Gerinnungssystems okkludiert (Dienst 2005). Neben der biochemischen und funktionellen Charakterisierung in-vitro wurde die klinische Anwendbarkeit in-vivo im Mausmodell
getestet. Dabei wurde erstmals eine thrombogen induzierte Nekrose und Verzögerung des Tumorwachstums durch ein rekombinantes tTF-basiertes Fusionsprotein, welches über einen Antikörper an einen luminalen Endothel-Marker wie VCAM-1 bindet, gezeigt.
Die in-vitro-Analysen des Fusionsproteins zeigten eine spezifische Bindungsfähigkeit des scFvAnteils an VCAM-1 und die Fähigkeit des tTF-Anteils die Gerinnung durch FXa-Aktivierung
zu induzieren.
Die in-vivo-Effektivität des Fusionsproteins wurde in verschiedenen Mausmodellen getestet. Da
humane Hodgkin-Tumoren eine hohe VCAM-1-Expression aufweisen, wurde diese Entität als
ein Modell ausgewählt. Im Hinblick auf die klinische Anwendung stellen Hodgkin-Patienten
zudem ideale Kandidaten für die Therapie mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein dar, da sie
in der Regel jung sind und somit keine vaskulären Komorbiditäten, wie z.B. Arteriosklerose,
aufweisen. Aufgrund der nur geringen VCAM-1-Expressin in dem L540rec-Xenograft-Modell
musste diese durch Stimulation mit LPS gesteigert werden. Es ist bekannt, dass die wiederholte
Gabe und langfristige Anwendung von LPS durch eine Aktivierung verschiedener Zytokine, wie
z.B. TNF-α, schwerwiegende Auswirkungen auf den Organismus, bis hin zum septischen
Schock, hat (Beutler 1995). Das LPS verursachte auch in dieser Arbeit bei einigen Tieren Toxizität. Aus diesem Grund wurde ein zweites Modell, das Colo677-Myelom-Modell, verwendet,
in welchem die VCAM-1-Expression des Endothels konstitutionell ausreichend hoch ist, so dass
es sich für die Erprobung des Fusionsproteins gut eignet.
Die beste Kontrolle des Tumorwachstums zeigte sich in der Kombinationsbehandlung mit
Doxorubicin und dem Fusionsprotein. Unsere Arbeitsgruppe konnte in einer früheren Arbeit
zeigen, dass LPS Tumorblutgefäße für die Gerinnungsinduktion mit TF-basierten Agenzien
sensibilisieren kann (Philipp 2003). Möglicherweise führt die Behandlung mit Doxorubicin
ebenfalls zu einer Steigerung der Empfindlichkeit des Tumorendothels gegenüber dem Fusionsprotein. Auf die Vorteile der Kombinationstherapie wird weiter unten noch einmal eingegangen.
Neben der Wirksamkeit des Fusionsproteins wurden auch seine Nebenwirkungen untersucht.
Zum Einen erfolgte eine klinische und histologische Beurteilung der Mäuse, zum Anderen wur-
122
den im Rahmen eines weiteren Projektes in der Arbeitsgruppe auch dessen Auswirkungen auf
das Gerinnungssystem untersucht. Diese laborchemischen Analysen verschiedener Komponenten des Gerinnungssystems sind zwar nicht Teil dieser Arbeit gewesen, werden hier aber aufgrund der Vollständigkeit erwähnt. Insgesamt zeigte sich das Fusionsprotein als gut verträglich.
Von hervorragender Bedeutung für die gute Verträglichkeit war die sorgfältige Entfernung von
Endotoxin. Auch mit empfindlichen Methoden ließ sich keine systemische Aktivierung des
Gerinnungssystems feststellen.
In den Kurzzeit-Experimenten wurden die Organe und Tumoren der Mäuse drei Tage nach einer
Injektion mit dem Fusionsprotein histologisch aufgearbeitet und hinsichtlich des Auftretens von
thrombotischen Ereignissen mit nachfolgender Nekrose untersucht. Beide Tumormodelle offenbarten dabei signifikante Tumornekrosen. Die Spezifität der Reaktion zeigte sich durch die Untersuchung der Organe der Mäuse. Hier konnten zwar in einigen Organen, wie Lungen, Nieren
und Pankreas, einzelne thrombosierte Blutgefäße nachgewiesen werden, allerdings keine damit
verbundenen Nekrosen. In den meisten Fällen konnte auch keine umgebende Gewebsreaktion
festgestellt werden, was ein post mortem aufgetretenes Artefakt nahe legt. Diese KurzzeitExperimente können als „proof of principle“ für das anti-VCAM-1-tTF-Fusionsprotein betrachtet werden. Es wurden hier sowohl die Wirksamkeit in Form der Generierung von Thrombosen
mit konsekutiven Nekrosen als auch eine Spezifität für die Tumorblutgefäße nachgewiesen.
In den Langzeit-Experimenten mit dem Lymphom-Modell konnte nach Behandlung mit dem
Fusionsprotein plus LPS eine statistisch signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums im
Vergleich zu den meisten Kontrollen (NaCl und scFv plus LPS) beobachtet werden. Allerdings
erreichte der Vergleich mit der Behandlung mit tTF plus LPS keine statistische Signifikanz, was
wohl zum Einen auf die geringen Fallzahlen zurückzuführen ist.
Zum Anderen konnte unsere Arbeitsgruppe in einer früheren Arbeit zeigen, dass auch tTF zusammen mit LPS durchaus eine Koagulationsinduktion in Tumorblutgefäßen mit nachfolgender
Ausbildung von Nekrosen im Tumor hervorrufen kann (Philipp 2003). Dazu wurde die Hypothese aufgestellt, dass es durch das LPS über TNF-α zu einer gesteigerten Expression von endogenem TF und Phosphatidylserin auf den Tumorendothelzellen kommt. Der injizierte tTF bindet
an im Blut in kleinen Mengen zirkulierenden Faktor VIIa, der dann über seine Gla-Domäne an
die Tumorendothelmembran bindet. Durch die lokale Akkumulation von endogenem TF und
tTF können sich TF-Dimere ausbilden, für die nachgewiesen wurde, dass sie die Autoaktivierung von Faktor VII zu Faktor VIIa fördern können (Donate 2000). Der neu gebildete Faktor
VIIa erlaubt seinerseits nun die Bindung von weiterem tTF. Sowohl der tTF-VIIa-Komplex als
auch der endogene TF induzieren dann die lokale Koagulation. In der genannten Arbeit (Philipp
2003) zeigten die Tumoren drei Tage nach der Behandlung der Mäuse mit LPS bzw. tTF plus
LPS einen Nekroseanteil von 11 % (statistisch nicht signifikant im Vergleich zur NaCl-
123
Kontrolle, 1%) bzw. 33 % (statistisch signifikant). Diese Daten entsprechen in etwa den in den
Kurzzeitexperimenten dieser Arbeit erhobenen Ergebnissen, wo nach Applikation von LPS
versus tTF plus LPS ein Nekroseanteil von 13 % versus 41 % zu beobachten war. Vergleicht
man hierzu die Daten aus den Langzeit-Experimenten dieser Arbeit, so zeigen diese auf den
ersten Blick ein abweichendes Ergebnis. Die Messung der Tumorvolumina zwei Wochen nach
der Behandlung zeigte für LPS einen Mittelwert von 561 µl und für LPS plus tTF 565 µl, also
keinen Unterschied. Betrachtet man jedoch den dritten Tag des Experimentes, so sieht man hier
einen Unterschied für LPS/tTF (Mittelwert 198 µl) im Vergleich zu LPS allein (232 µl). Eine
statistische Signifikanz wird hier nicht erreicht, jedoch ist ein Trend ersichtlich. Der Grund für
diesen nur zu Beginn bestehenden Unterschied ist wahrscheinlich eine vitale Randzone aus Tumorzellen, die beim Fortgang des Experimentes zum Nachwachsen des Tumors beiträgt. Auf
dieses Phänomen der vitalen Randzone wird weiter unten näher eingegangen.
In dem Myelom-Modell zeigten nur die Mäuse, die mit Doxorubicin allein oder mit der Kombination aus Doxorubicin und dem Fusionsprotein behandelt wurden, eine signifikante Wachstumsverzögerung des Tumors. Für die mit Fusionsprotein alleine behandelte Gesamtgruppe
zeigte sich ein Trend zur Verlangsamung des Tumorwachstums. Bei einigen Mäusen, die mit
dem Fusionsprotein allein, Doxorubicin allein oder mit der Kombination behandelt wurden,
konnte sogar eine fast vollständige Rückbildung der Tumoren beobachtet werden. Die histologische Analyse dieser regredienten Tumoren, die mit dem Fusionsprotein behandelt wurden, zeigte das für VTAs charakteristische Muster einer zentralen Nekrose mit einer schmalen vitalen
Randzone. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass diese Randzone zum größten Teil
aus Makrophagen bestand.
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, macht die Kombination eines VTAs mit einem
Chemotherapeutikum grundsätzlich Sinn. Die VTAs wirken am effektivsten an Gefäßen, die
sich im Inneren des Tumors befinden, da hier ein erhöhter interstitieller Druck herrscht, der zum
Kollaps der Blutgefäße beiträgt (Thorpe 2004). Im Gegensatz hierzu wirken direkt gegen die
Tumorzellen gerichtete Substanzen, wie Chemotherapeutika, eher auf die sich schnell teilenden
Zellen in der gut oxigenierten Peripherie des Tumors. Ausschlaggebend ist sicherlich auch die
Auswahl des Kombinationspartners. Einige Chemotherapeutika generieren in Anwesenheit von
Sauerstoff freie Radikale, die zu einer Schädigung der Tumorzell-DNA führen (Trédan 2007).
So wird Doxorubicin durch eine chemische Reduktion zu einem Semiquinon-Radikal, welches
Sauerstoff zu einem Superoxid umwandelt, das wahrscheinlich wesentlich zur Zytotoxizität der
Substanz beiträgt. Da reaktive Sauerstoffspezies eine Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen (Ran 2002) und somit eine prokoagulante Endothelzelloberfläche schaffen, könnte dies
die Sensibilisierung von Gefäßen für VTAs erklären. Es ist durchaus denkbar, dass dieser Effekt
schon bei weitaus geringeren Dosen eintritt, was in zukünftigen Studien getestet werden sollte.
124
Eine wichtige Rolle für die Wirksamkeit des Fusionsproteins spielt der prokoagulante Status in
den getesteten Tumormodellen. Hierbei ist zu bemerken, dass weder das Lymphommodell noch
das Myelommodell vorbestehende Nekrosen aufweisen, im Gegensatz zu Sarkom- und Teratokarzinommodellen, welche typischerweise sehr sensitiv für eine Tumor-selektive Gerinnungsinduktion sind (Nawroth 1988, Nilsson 2001).
Als weiterer Kombinationspartner in der Therapie mit vaskulären Targeting Agenzien (VTAs)
bieten sich Substanzen an, die die Vaskulogenese inhibieren. Zuvor wurde bereits das Problem
der vitalen Randzone des Tumors nach Applikation von VDAs beschrieben. Diese ist im Wesentlichen dafür verantwortlich, dass die Tumoren im Tierversuch nach der Therapie wieder
nachwachsen. Dabei wird zunehmend die Rolle von zirkulierenden endothelialen Progenitorzellen (CEP), welche aus dem Knochenmark rekrutiert werden, als entscheidender Faktor erkannt.
Shaked et al. konnten in mehreren Experimenten zeigen, dass es durch die Therapie mit VDAs
in einer Art Stressreaktion zur Ausschüttung von CEPs aus dem Knochenmark kommt, sich
diese in der Randzone der Tumoren ansiedeln und so wesentlich zum Nachwachsen des Tumors
beitragen (Shaked 2006). Des Weiteren konnten sie zeigen, dass eine vorhergehende Behandlung der Mäuse mit DC101, einem Antikörper der murinen VEGFR-2 neutralisiert, zu einer
signifikanten Reduktion der Größe der vitalen Randzone führte. DC101 inhibiert nicht nur die
Angiogenese sondern auch die Rekrutierung von CEPs aus dem Knochenmark und damit die
Vaskulogenese. Auch eine metronomische Therapie konnte, vermutlich über den gleichen
Wirkmechanismus, die Ausbildung eines vitalen Ringes verhindern (Daenen 2009). Eine Kombinationstherapie von SVOAs und Vaskulogenese-Inhibitoren sollte demnach das Problem der
vitalen Randzone verringern und zu einem erheblich verbesserten Therapieeffekt führen.
Gegen VCAM-1 gerichtete Fusionsproteine wurden im Folgenden in unserer Arbeitsgruppe
auch gegen humanes VCAM hergestellt und in Zusammenarbeit mit Jacques E. Nör (University
of Michigan) in einem humanen Angiogenese-Modell getestet (Dienst 2005). Diese Studie war
nicht Bestandteil dieser Arbeit, soll hier aber dennoch Erwähnung finden. Dabei wurde ein
Mausmodell verwendet, bei dem humane Endothelzellen in einer biologisch abbaubaren Polymer-Matrix zusammen mit humanen Tumorzellen, in diesem Fall Colo677, transplantiert werden. Daraus entwickeln sich Tumoren mit humanen und murinen Blutgefäßen, was immunhistochemisch nachgewiesen wurde. In einer explorativen Studie wurden Gruppen von fünf bis
sechs Mäusen mit dem humanen anti-VCAM-1-tTF bzw. den Kontrollen (NaCl, tTF) behandelt.
Nach drei Tagen zeigten sich bei den behandelten Mäusen signifikant kleinere Tumorvolumina
als bei den Kontroll-Tieren (Mittelwert für das Fusionsprotein 74 µl, für tTF 128 µl und für
NaCl 128 µl). Bei der histologischen Analyse der Tumoren zeigten diese entgegen der Erwartung keine größeren nekrotischen Areale. Möglicherweise wurde das nekrotische Material durch
125
die für dieses Modell typischen Riesenzellen (Makrophagen) abgeräumt. Allerdings zeigte die
immunhistochemische Analyse der Tumoren der mit dem Fusionsprotein bzw. mit tTF behandelten Mäuse Fibrin-Gerinnsel, die Tumoren der mit NaCl behandelten Tiere wiesen diese nicht
auf. Auch wenn es sich hierbei nur eine erste explorative Studie handelte, so zeigt sich doch ein
wesentlicher Vorteil der rekombinanten Antikörper-Fusionsproteine, die gegen ein murines
Antigen gerichtet sind, das homolog auch im Menschen existiert. Durch die modulare Beschaffenheit des von unserer Arbeitsgruppe entwickelten Klonierungs- und Expressionssystems kann
das zuvor im murinen Modell getestete Konstrukt relativ einfach in ein klinisch anwendbares
Protein umgewandelt und im humanen Angiogenesemodell präklinisch evaluiert werden.
Um die Wirksamkeit tTF-basierter Agenzien zu verbessern, ohne deren Nebenwirkungen zu
verstärken, muss man die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen näher betrachten.
Physiologischerweise dient TF in dem membrangebundenen extrinsischen Tenasekomplex als
Kofaktor zur Aktivierung von FVII, FIX und FX. Da tTF seine Fähigkeit zur FVII-Aktivierung
verloren hat, stellt FVIIa einen limitierenden Faktor dar (Neuenschwander 1992). In der oben
bereits erwähnten Arbeit konnten wir zeigen, dass auch tTF in Anwesenheit einer ausreichenden
Menge von FVIIa die Gerinnung induzieren kann (Philipp 2003). FVIIa vermittelt dabei die
Bindung von tTF an die Zellmembran über seine Glutamin-reiche Domäne (Gla-Domäne). So
liegen die Möglichkeiten der Wirksamkeitssteigerung von tTF-basierten Agenzien zum Einen
darin, die notwendigen Mengen an FVIIa zur Verfügung zu stellen. Dieses ist denkbar durch
den Einsatz des tTF-Agenz in einer Umgebung mit vorbestehendem Gefäßschaden und aktiviertem Gerinnungssystem (Philipp 2003, Nilsson 2001, Hu 2003) oder durch die exogene Zufuhr von FVIIa (Liu 2004). Zum Anderen besteht die Möglichkeit, die Fähigkeit des tTF-Agenz
FVII zu FVIIa zu aktivieren, wieder herzustellen. Letzteres erscheint am sinnvollsten, da durch
die Bindung des spezifischen Liganden die Gerinnungskaskade effektiv angestoßen werden
kann. Da die räumliche Anordnung des tTF im Fusionsprotein zur Zellmembran und zum FVIIa
möglicherweise nicht optimal war, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Verbesserung der
Effektorfunktion durch molekulares Modelling angestrebt.
Eine weitere Möglichkeit der Wirksamkeitssteigerung von TF-basierten Fusionsproteinen besteht in der Sensibilisierung des Tumorendothels für die Koagulationsinduktion. Dass sich hierfür beispielsweise LPS eignet, wurde bereits erläutert. Da LPS aber schwerwiegende systemische Nebenwirkungen hervorrufen kann, müsste die Substanz spezifisch im Tumorendothel
lokalisiert werden. Gosk et al. präparierten Immunoliposomen, an die ein anti-VCAMAntikörper gekoppelt ist (Gosk 2008). Für diese Immunoliposomen konnte in in-vivo-Studien
Fluoreszenz-mikroskopisch eine spezifische Akkumulation im Tumorendothel nachgewiesen
werden. Durch Inkorporation von sensibilisierenden Substanzen wie zum Beispiel TNF-α in
solche Liposomen könnte eine lokale Akkumulation des Wirkstoffs in den Tumorblutgefäßen
126
erreicht werden, und so das Tumorendothel selektiv für die Gerinnungsinduktion sensibilisiert
werden.
Die Auswahl von VCAM-1 als Ligand für unser Fusionsprotein erfolgte aufgrund mehrerer
Kriterien. Zielstrukturen für VTAs sollten 1) in ausreichender Menge auf den Endothelzellen
des Tumors exprimiert werden, 2) nur geringe Expression auf normalem Endothel zeigen, 3) auf
der luminalen Seite der Gefäße lokalisiert sein und 4) eine geringe Internalisations-Rate aufweisen. Dabei entsprach das VCAM-1-Molekül den meisten dieser Bedingungen gut. Eine geringe
Expression auf vereinzelten normalen Endothelzellen ist möglicherweise tolerabel, da der prokoagulante Status des Tumor-Endothels einen zusätzlichen Sicherheitsfaktor darstellt. Es gibt
allerdings einige pathologische Bedingungen, wie Inflammation oder Arteriosklerose, wo sowohl VCAM-1 auf normalem Endothel hochreguliert ist, als auch ein gesteigerter prokoagulanter Status herrscht. Es bliebe zu untersuchen, ob unter solchen Umständen die Anwendung des
anti-VCAM-1-tTF weiterhin eine nur für das Tumorendothel spezifische Thrombosierung zeigt.
Bis dahin wären diese Komorbiditäten in klinischen Studien als Ausschlusskriterium zu definieren. Andere Tumorendothelmarker, wie z.B. E-Selektin, PSMA (Prostataspezifisches MembranAntigen), und tTF-Hochregulierung stellen ebenfalls attraktive Ziele für einen VTA-Einsatz dar.
Mit neuen Technologien, wie dem Proteomic Mapping, werden in Zukunft möglicherweise
weitere neue interessante Zielstrukturen identifiziert werden können.
Es gibt mehrere Arbeitsgruppen, die Arbeiten zu tTF-basierten, Liganden-gerichteten VTAs
veröffentlicht haben, worauf in der Einleitung bereits eingegangen wurde. Am weitesten fortgeschritten sind dabei die Arbeiten der Münsteraner Arbeitsgruppe um Wolfgang E. Berdel. Dabei
wird ein Fusionsprotein verwendet, welches aus tTF und dem Peptid GNGRAHA besteht, das
an eine Isoform der Aminopeptidase N (APN, CD13) bindet, deren Expression auf Endothelzellen humaner und muriner Tumoren hochreguliert ist. Ein wesentlicher Vorteil in der Verwendung solch kleiner Peptide als die Zielstruktur bindende Einheit gegenüber Antikörpern ist die
Tatsache, dass sie C-terminal an tTF fusioniert werden können, und somit möglicherweise eine
bessere dreidimensionale Ausrichtung des tTF zur Membranoberfläche erlauben. Bieker et al.
beschreiben zwar einen signifikanten Regress der Xenograft-Tumoren, komplette Remissionen,
wie sie von Nilsson et al. (Nilsson 2001) berichtet wurden, wurden allerdings nur sporadisch
nach subkutanen Injektionen von toxisch hohen Dosen des tTF-NGR erreicht. Dieses wird auf
eine geringere Affinität des NGR zu seiner Zielstruktur im Vergleich zu den AntikörperFragmenten zurückgeführt. Eine statistisch signifikante Reduktion des Tumorwachstums nach
Behandlung mit tTF-NGR wurde erst nach mehrfachen Injektionen (bis zu sieben) erreicht.
Wie in der Einleitung bereits erläutert, besteht bei Krebspatienten zumeist ein prothrombotischer Status mit einem in unterschiedlichem Ausmaß aktivierten Gerinnungssystem. Auf den
127
ersten Blick erscheint es kontraproduktiv in dieser Situation gerinnungsaktivierende Substanzen
zu applizieren. Auf den zweiten Blick könnte aber ausgerechnet diese Strategie hilfreich sein, da
vorstellbar ist, dass durch die lokale Gerinnungsinduktion im Tumor ein Verbrauch an zirkulierenden prokoagulanten Substanzen bewirkt wird, welche sonst zur systemischen Gerinnungsaktivierung beitragen würden. Wie oben bereits erwähnt, konnten wir in unserem Mausmodell
keine systemische Gerinnungsaktivierung nachweisen. Hier ist aber darauf hinzuweisen, dass
das Gerinnungssystem von Mäusen im Vergleich zu dem der Menschen eher zur Fibrinolyse
neigt. Aus diesem Grund ist die im Mausmodell beobachtete ausbleibende Gerinnungsaktivierung durch SVOAs unter Umständen nicht vollständig auf den Menschen übertragbar. Die bereits erwähnte Studie von Bieker et al., in der einige Patienten mit tTF-NGR behandelt wurden,
konnte nur sehr milde und vollständig reversible Veränderungen im Gerinnungssystem, wie
Thrombozytenabfall, Verminderung des α2-Antiplasmins und Abfall von Antithrombin, nachweisen (Bieker 2009). Dieses sind eher Veränderungen, die auf einen vermehrten Verbrauch
und Fibrinolyse hindeuten als auf eine systemische Gerinnungsaktivierung.
Eingangs wurde bereits über die Rolle von TF- und Phosphatidylserin-haltigen Mikropartikeln
beim prothrombotischen Status von Krebspatienten berichtet. Denkbar ist, dass diese Mikropartikel zu einer unspezifischen Steigerung der durch SVOAs verursachten Gerinnungsinduktion
und somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten. Die retrospektive Analyse einiger Daten im Hinblick auf diese Fragestellung erbrachte zwar Hinweise darauf, dass die Phospholipide für die spezifische Koagulationsinduktion des Fusionsproteins keine große Rolle spielen, jedoch lässt sich dadurch eine Bedeutung im klinischen Versuch nicht ausschließen. Da die
vorhandene Menge dieser Mikropartikel von Patient zu Patient unterschiedlich ist, wäre es unter
Umständen sinnvoll, diese im Vorfeld von klinischen Studien zu quantifizieren. Aufgrund der
geringen Größe der Mikropartikel ist ihr durchflusszytometrischer Nachweis nicht einfach, gelingt jedoch mit einer Impedanz-basierten Methode (Furie 2006). Um den Einfluss des Mikropartikel-Status näher zu untersuchen, sollten diese in Koagulationstests wie unter Kapitel 3.2.1
beschrieben getestet werden. .
Grundsätzlich stellt das Konzept der tTF-basierten VTAs eine sehr attraktive Therapie-Strategie
dar, da es sich neben dem spezifischen Targeting durch Antikörper oder Peptide auch den prothrombotischen Status, der bei Tumorpatienten nachgewiesen wurde, zu Nutze macht. Dadurch
wird eine zusätzliche Selektivität der Therapie erzeugt, die mehr Anwendungssicherheit schafft.
Insgesamt rechtfertigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und anderer Arbeitsgruppen
weitere Studien an tTF-basierten VTAs.
128
4.2
Verbesserung der Effektorfunktion durch Molecular Modelling
Die theoretische Grundlage für den zweiten Teil der Arbeit bildete die 2001 erschienene Veröffentlichung von Morrissey „Tissue Factor: An Enzyme Cofactor and a True Receptor“ (Morrissey 2001). Zum Einen wurde darin die Wichtigkeit des Membranankers für die volle proteolytische Aktivität des TF beschrieben. Im Wesentlichen gewährleistet dieser aber den Kontakt
zu den negativ geladenen Phospholipiden der Zellmembran, wobei es keine Rolle zu spielen
scheint, wodurch dieser Kontakt hergestellt wird. Zum Anderen erläuterte Morrissey die Bedeutung der räumlichen Positionierung des aktiven Zentrums von FVIIa im TF/VIIa-Komplex. Aus
der Vorstellung heraus, dass bei dem Prototyp des anti-VCAM-tTF der Kontakt des tTF zur
Zellmembran und die räumliche Ausrichtung des daran gebundenen FVIIa nicht optimal sein
könnten, wurde die Idee entwickelt, das Molekül in seiner Struktur zu verändern. Durch Veränderung der Linkersequenz zwischen dem scFv und dem tTF-Anteil, sollte letzterer die Möglichkeit zur besseren Annäherung an die Zellmembran bekommen und somit auch die Position des
anschließend gebundenen FVIIa optimieren. Durch die Verlängerung des tTF mit Aminosäuren
der transmembranären Domäne sollte ein besserer Kontakt zu den Phospholipiden der Zellmembran hergestellt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 73 neue Fusionsproteine generiert und in vitro charakterisiert.
Ein wesentliches Problem bei der Arbeit stellten die relativ geringen Protein-Ausbeuten bei der
Expression dar. Im Vergleich zu scFv-Antikörpern oder tTF ist das rekombinante tTF-basierte
Fusionsprotein erheblich schwieriger zu exprimieren. Die Abschätzung der Protein-Anteile auf
den Coomassie-Gelen war aufgrund der geringen Konzentration und Reinheit manchmal sehr
schwierig. Es waren daher zahlreiche Wiederholungen der Testreihen notwendig, sowie eine
genaue Analyse aller Faktoren, die auf den Gerinnungstest einen Einfluss haben. Wenn auch die
Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse suboptimal war, so ergab die Auswertung doch gewisse
Trends, die dann im Anschluss durch Herstellung ausgewählter Proteine in größeren Mengen
bestätigt werden konnten. In der Zusammenschau der Daten ergab sich die Tendenz, dass Fusionsproteine mit längeren Linkern (19 oder 51 Aminosäuren statt sechs Aminosäuren) und mit
leicht verlängertem tTF (insbesondere 222 Aminosäuren, z.T. auch 226 Aminosäuren statt ursprünglich 219 Aminosäuren) eine verbesserte Koagulationsinduktion zeigten. Aus diesen Kandidaten wurde das Protein pLi51-T222 ausgewählt, um es in größerem Maßstab im Vergleich
zum Originalkonstrukt zu testen. pLi51-T222 zeigte hierbei reproduzierbar eine verbesserte
Koagulationsinduktion. Diese Ergebnisse unterstützen die ursprünglich aufgestellte Hypothese,
129
dass der verlängerte Linker eine bessere Ausrichtung des Moleküls ermöglichen würde und der
verlängerte tTF-Anteil die Anlagerung an die Zellmembran verbessern würde.
Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, ist es unabdingbar die genaue Molekülstruktur des
anti-VCAM-tTF-Konstruktes und seiner Komplexbildung mit Faktor VIIa aufzudecken. Im
Rahmen dieser Arbeit wurde auch versucht mit dem SWISS-Model die dreidimensionale Molekülstruktur des Fusionsproteins zu evaluieren. Aufgrund nicht vorhandener Homologien gelang
dies leider nicht. Als weitere etablierte Methoden stünden hier die Proteinkristallographie oder
die kernmagnetische Resonanz zur Verfügung. Da es allerdings für das Verständnis der dreidimensionalen Ausrichtung des Moleküls zur Zellmembran-Oberfläche nicht ausreicht, dieses
isoliert zu betrachten, wäre es sinnvoll eine Darstellung zu wählen, die eine Betrachtung des
Moleküls auf der Membran erlaubt, wie die Methode des Fluoreszenz-Resonanz-EnergieTransfers (FRET).
Da eine therapeutische Gerinnungsinduktion potenziell schwerwiegende Nebenwirkungen, wie
Apoplex, Myokardinfarkt oder Organversagen, zur Folge haben könnte, sollten die Mechanismen der Selektivität der Reaktion gut kontrolliert sein. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen
dieser Arbeit versucht, die Triggermechanismen für die Gerinnungsinduktion genauer zu beleuchten. Dazu wurden die beiden Hypothesen der Liganden-vermittelten Komplexbildung und
der Liganden-vermittelten Konzentrationserhöhung formuliert (siehe Fragestellung, Kap. 1.7.2).
Die Ergebnisse zur Untersuchung des Einfluss von Phospholipiden und LPS auf die Koagulationsinduktion durch tTF-Fusionsproteine unterstützen die erstgenannte Hypothese der Ligandenvermittelten Komplexbildung. Dieses Ergebnis ist für einen klinischen Einsatz des Fusionsproteins von Bedeutung, da dieser Reaktionsmechanismus ein geringeres Risiko für unspezifische
Nebenwirkungen bietet.
Bei den Ergebnissen aus den Experimenten zum Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation (siehe Kap. 3.2.4) sahen wir in der Bindungsphase eine fast vollständige Inhibierbarkeit der Koagulationsinduktion durch den kompetitiven Antikörper MK271. Im Gegensatz
dazu ließ sich die Reaktion in der Koagulationsphase nur zu etwa 50 % inhibieren. Hier sollte in
weiter führenden Experimenten die Menge des kompetitiven Antikörpers gesteigert werden, um
so möglicherweise eine komplette Hemmung der Koagulationsinduktion zu erreichen. Dieses
war zum Zeitpunkt des Experimentes aus logistischen Gründen nicht möglich, da die Antikörper-produzierenden Hybridomzellen nur noch geringe Mengen des Antikörpers generierten, was
erst nach Abschluss dieser Arbeit durch Subklonierung korrigiert werden konnte.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch gezielte Modifikationen auf DNA-Ebene und vergleichende Analysen ein anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein generiert, welches im Vergleich zum
Originalkonstrukt eine verbesserte in-vitro-Koagulationsfähigkeit zeigt. Ob sich diese verbesserte Wirksamkeit in vitro auch in einer Steigerung der Nekroseausbildung im Tumor und in
130
einer vermehrten Verlangsamung des Tumorwachstums widerspiegelt, müssen in-vivo-Studien
zeigen.
131
5
Zusammenfassung
Die Hemmung der Tumor-Angiogenese und die Zerstörung bzw. Okklusion des bestehenden
Gefäßsystems von Tumoren sind interessante therapeutische Strategien bei der Behandlung von
Krebserkrankungen. Da hier – im Gegensatz zu den herkömmlichen Chemotherapien - ein anderes Ziel und Wirkungsprinzip verfolgt wird, können solche Ansätze eine sinnvolle Ergänzung
der etablierten Therapieformen sein.
Im ersten Teil der Arbeit wurde das in der Arbeitsgruppe vorhandene Konstrukt des Prototyps
des anti-VCAM-tTF in größeren Mengen rekombinant hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Ziel war es, ein rekombinantes spezifisches Fusionsprotein zu herzustellen, welches
selektiv an luminale Tumorendothelzell-Marker bindet und durch den Effektor Tissue Factor die
Tumorblutgefäße durch Aktivierung des Gerinnungssystems okkludiert. Neben der biochemischen und funktionellen Charakterisierung in-vitro wurde die klinische Anwendbarkeit in-vivo
im Mausmodell getestet. Dabei wurde erstmals eine thrombogen induzierte Nekrose und Verzögerung des Tumorwachstums durch ein rekombinantes tTF-basiertes Fusionsprotein, welches
über einen Antikörper an einen luminalen Endothel-Marker wie VCAM-1 bindet, gezeigt.
In zwei Tumormodellen - dem L540rec-Hodgkin-Lymphom-Modell und dem Colo677Myelom-Modell - induzierte die Behandlung mit dem Fusionsprotein signifikante Tumornekrosen in Kurzzeit-Studien. In den Langzeit-Experimenten mit dem Hodgkin-Lymphom-Modell
konnte nach Behandlung mit dem Fusionsprotein plus LPS eine statistisch signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums im Vergleich zu den meisten Kontrollen (NaCl und scFv plus
LPS) beobachtet werden. In dem Myelom-Modell zeigten nur die Mäuse, die mit Doxorubicin
allein oder mit der Kombination aus Doxorubicin und dem Fusionsprotein behandelt wurden,
eine signifikante Wachstumsverzögerung des Tumors. Bei einigen Mäusen, die mit dem Fusionsprotein allein, Doxorubicin allein oder mit der Kombination behandelt wurden, konnte eine
fast vollständige Rückbildung in einem Teil der Tumoren beobachtet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte der Prototyp des anti-VCAM-tTF durch Molecular Modelling
funktionell verbessert werden. Es wurde die Hypothese getestet, welche annimmt, dass durch
eine veränderte Proteinstruktur des Fusionsproteins die Positionierung des tTF-Anteils zur
Zellmembran und zu den weiteren am extrinsichen Tenasekomplex beteiligten Gerinnungsfaktoren optimiert werden kann. Insbesondere wurde untersucht, ob eine Veränderung der Linkersequenz zwischen dem scFv und dem tTF-Anteil, sowie eine Verlängerung des tTF mit
Aminosäuren der transmembranären Domäne zu verbesserter Koagulationsinduktion führen.
Durch gezielte Modifikationen auf DNA-Ebene wurden verschiedene Varianten des antiVCAM-tTF-Prototyps hergestellt und deren Funktionalität im zellgebundenen Koagulationstest
miteinander verglichen. Ein Konstrukt mit einem auf 51 Aminosäuren verlängerten Linker und
132
einem auf 222 Aminosäuren verlängerten tTF-Anteil zeigte eine verbesserte spezifische Koagulationsinduktion im Vergleich zum Prototyp. Diese Ergebnisse unterstützen die ursprünglich
aufgestellte Hypothese, dass der verlängerte Linker eine bessere Ausrichtung des Moleküls ermöglichen würde und der verlängerte tTF-Anteil die Anlagerung an die Zellmembran verbessern würde.
Grundsätzlich stellt das Konzept der tTF-basierten VTAs eine sehr attraktive Therapie-Strategie
dar, da es sich neben dem spezifischen Targeting durch Antikörper oder Peptide auch den prothrombotischen Status, der bei Tumorpatienten nachgewiesen wurde, zu Nutze macht. Dadurch
wird eine zusätzliche Selektivität der Therapie erzeugt, die mehr Anwendungssicherheit schafft.
Insgesamt rechtfertigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und anderer Arbeitsgruppen
weitere Studien an tTF-basierten VTAs.
133
6
Literaturverzeichnis
1.
Arap W, Kolonin MG, Trepel M, Lahdenranta J, Cardó-Vila M, Giordano RJ,
Mintz PJ, Ardelt PU, Yao VJ, Vidal CI, Chen L, Flamm A, Valtanen H, Weavind
LM, Hicks ME, Pollock RE, Botz GH, Bucana CD, Koivunen E, Cahill D, Troncoso P, Baggerly KA, Pentz RD, Do KA, Logothetis CJ, Pasqualini R (2002). Steps
toward mapping the human vasculature by phage display. Nat Med. Feb;8(2): 1217.
2.
Ardehali A, Laks H, Drinkwater DC, Ziv E, Drake TA (1995). Vascular cell adhesion molecule-1 is induced on vascular endothelia and medial smooth muscle cells
in experimental cardiac allograft vasculopathy. Circulation. Aug 1;92(3): 450-6.
3.
Arndt T (2009). Spezielle Klinisch-chemische Analytik. In: Harald Renz. Praktische Labordiagnostik: Ein Lehrbuch zur Laboratoriumsmedizin, Klinischen Chemie und Hämatologie. Von Gruyter. S. 522f.
4.
Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T (2006). The SWISS-MODEL workspace:
a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. Jan 15;22(2): 195-201.
5.
Arora N, Masood R, Zheng T, Cai J, Smith DL, Gill PS (1999). Vascular endothelial growth factor chimeric toxin is highly active against endothelial cells. Cancer
Res. Jan 1;59(1): 183-8.
6.
Azam F, Mehta S, Harris AL (2010). Mechanisms of resistance to antiangiogenesis
therapy. Eur J Cancer. May;46(8): 1323-32. Review.
7.
Beutler B, Kruys V (1995). Lipopolysaccharide signal transduction, regulation of
tumor necrosis factor biosynthesis, and signaling by tumor necrosis factor itself. J
Cardiovasc Pharmacol. 25 Suppl 2: S1-8. Review.
8.
Bieker R, Kessler T, Schwöppe C, Padró T, Persigehl T, Bremer C, Dreischalück J,
Kolkmeyer A, Heindel W, Mesters RM, Berdel WE (2009). Infarction of tumor
vessels by NGR-peptide-directed targeting of tissue factor: experimental results
and first-in-man experience. Blood. May 14;113(20): 5019-27.
134
9.
Birdsall HH, Lane C, Ramser MN, Anderson DC (1992). Induction of VCAM-1
and ICAM-1 on human neural cells and mechanisms of mononuclear leukocyte adherence. J Immunol. May 1;148(9): 2717-23.
10.
Blankenberg S, Barbaux S, Tiret L (2003). Adhesion molecules and atherosclerosis. Atherosclerosis. Oct;170(2): 191-203.
11.
Brox JH, Osterud B, Bjørklid E, Fenton JW 2nd (1984). Production and availability
of thromboplastin in endothelial cells: the effects of thrombin, endotoxin and platelets. Br J Haematol. Jun;57(2): 239-46.
12.
Broze GJ Jr, Leykam JE, Schwartz BD, Miletich JP (1985). Purification of human
brain tissue factor. J Biol Chem. Sep 15;260(20): 10917-20.
13.
Bukowski RM (2010). Metastatic clear cell carcinoma of the kidney: therapeutic
role of bevacizumab. Cancer Manag Res. Mar 26;2: 83-96.
14.
Burris H 3rd, Rocha-Lima C (2008). New therapeutic directions for advanced pancreatic cancer: targeting the epidermal growth factor and vascular endothelial
growth factor pathways. Oncologist. Mar;13(3): 289-98. Review.
15.
Burrows FJ, Thorpe PE (1993). Eradication of large solid tumors in mice with an
immunotoxin directed against tumor vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. Oct
1;90(19): 8996-9000.
16.
Burrows FJ, Derbyshire EJ, Tazzari PL, Amlot P, Gazdar AF, King SW, Letarte M,
Vitetta ES, Thorpe PE (1995). Up-regulation of endoglin on vascular endothelial
cells in human solid tumors: implications for diagnosis and therapy. Clin Cancer
Res. Dec;1(12): 1623-34.
17.
Butenas S, Orfeo T, Mann KG (2009). Tissue factor in coagulation: Which?
Where? When? Arterioscler Thromb Vasc Biol. Dec;29(12): 1989-96. Review.
18.
Campbell S, Swann HR, Seif MW, Kimber SJ, Aplin JD (1995). Cell adhesion
molecules on the oocyte and preimplantation human embryo. Hum Reprod.
Jun;10(6): 1571-8.
135
19.
Contrino J, Hair G, Kreutzer DL, Rickles FR (1996). In situ detection of tissue factor in vascular endothelial cells: correlation with the malignant phenotype of human breast disease. Nat Med. Feb;2(2): 209-15.
20.
Carmeliet P, Jain RK (2000). Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature.
Sep 14;407(6801): 249-57. Review.
21.
Christiansen I, Sundström C, Enblad G, Tötterman TH (1998). Soluble vascular
cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) is an independent prognostic marker in
Hodgkin's disease. Br J Haematol. Aug;102(3): 701-9.
22.
Christiansen I, Sundström C, Tötterman TH (1998). Elevated serum levels of soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) closely reflect tumour burden in
chronic B-lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. Dec;103(4): 1129-37.
23.
Cook-Mills JM, Marchese ME, Abdala-Valencia H (2011). Vascular cell adhesion
molecule-1 expression and signaling during disease: regulation by reactive oxygen
species and antioxidants. Antioxid Redox Signal. Sep 15;15(6): 1607-38. Review.
24.
Daenen LG, Shaked Y, Man S, Xu P, Voest EE, Hoffman RM, Chaplin DJ, Kerbel
RS (2009). Low-dose metronomic cyclophosphamide combined with vascular disrupting therapy induces potent antitumor activity in preclinical human tumor xenograft models. Mol Cancer Ther. Oct;8(10): 2872-81.
25.
Denekamp J (1982). Endothelial cell proliferation as a novel approach to targeting
tumour therapy. Br J Cancer. Jan;45(1): 136-9.
26.
Diehl V, Kirchner HH, Schaadt M, Fonatsch C, Stein H, Gerdes J, Boie C (1981).
Hodgkin's disease: establishment and characterization of four in vitro cell lies. J
Cancer Res Clin Oncol. 101(1): 111-24.
27.
Dienst A, Grunow A, Unruh M, Rabausch B, Nör JE, Fries JW, Gottstein C (2005).
Specific occlusion of murine and human tumor vasculature by VCAM-1-targeted
recombinant fusion proteins. J Natl Cancer Inst. May 18;97(10): 733-47.
136
28.
Ding YB, Chen GY, Xia JG, Zang XW, Yang HY, Yang L (2003). Association of
VCAM-1 overexpression with oncogenesis, tumor angiogenesis and metastasis of
gastric carcinoma. World J Gastroenterol. Jul;9(7): 1409-14.
29.
Doñate F, Kelly CR, Ruf W, Edgington TS (2000). Dimerization of tissue factor
supports solution-phase autoactivation of factor VII without influencing proteolytic
activation of factor X. Biochemistry. Sep 19;39(37): 11467-76.
30.
Drake TA, Morrissey JH, Edgington TS (1989). Selective cellular expression of
tissue factor in human tissues. Implications for disorders of hemostasis and thrombosis. Am J Pathol. May;134(5): 1087-97.
31.
Drake TA, Cheng J, Chang A, Taylor FB Jr (1993). Expression of tissue factor,
thrombomodulin, and E-selectin in baboons with lethal Escherichia coli sepsis. Am
J Pathol. May;142(5): 1458-70. Erratum in: Am J Pathol 1993 Aug;143(2): 649.
32.
Dreischalück J, Schwöppe C, Spieker T, Kessler T, Tiemann K, Liersch R, Schliemann C, Kreuter M, Kolkmeyer A, Hintelmann H, Mesters RM, Berdel WE
(2010). Vascular infarction by subcutaneous application of tissue factor targeted to
tumor vessels with NGR-peptides: activity and toxicity profile. Int J Oncol.
Dec;37(6): 1389-97.
33.
Eilertsen KE, Østerud B (2004). Tissue factor: (patho)physiology and cellular biology. Blood Coagul Fibrinolysis. Oct;15(7):521-38. Review.
34.
El-Sheikh A, Borgstrom P, Bhattacharjee G, Belting M, Edgington TS (2005). A
selective tumor microvasculature thrombogen that targets a novel receptor complex
in the tumor angiogenic microenvironment. Cancer Res. Dec 1;65(23):11109-17.
35.
Folkman J (1971). Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med.
Nov 18;285(21): 1182-6. Review.
36.
Francis G, Kerem Z, Makkar HP, Becker K (2002). The biological action of saponins in animal systems: a review. Br J Nutr. Dec;88(6): 587-605. Review.
137
37.
Friess H, Langrehr JM, Oettle H, Raedle J, Niedergethmann M, Dittrich C, Hossfeld DK, Stöger H, Neyns B, Herzog P, Piedbois P, Dobrowolski F, Scheithauer W,
Hawkins R, Katz F, Balcke P, Vermorken J, van Belle S, Davidson N, Esteve AA,
Castellano D, Kleeff J, Tempia-Caliera AA, Kovar A, Nippgen J (2006). A randomized multi-center phase II trial of the angiogenesis inhibitor Cilengitide (EMD
121974) and gemcitabine compared with gemcitabine alone in advanced unresectable pancreatic cancer. BMC Cancer. Dec 11;6: 285.
38.
Furie B, Furie BC (2006). Cancer-associated thrombosis. Blood Cells Mol Dis.
Mar-Apr;36(2): 177-81.
39.
Gabra H, AS1404–202 Study Group Investigators (2006). Phase II study of
DMXAA combined with carboplatin and paclitaxel in recurrent ovarian cancer
ASCO Meeting Abstracts 24: 5032.
40.
Garnier D, Milsom C, Magnus N, Meehan B, Weitz J, Yu J, Rak J (2010). Role of
the tissue factor pathway in the biology of tumor initiating cells. Thromb Res.
Apr;125 Suppl 2: S44-50.
41.
Giesen PL, Rauch U, Bohrmann B, Kling D, Roqué M, Fallon JT, Badimon JJ,
Himber J, Riederer MA, Nemerson Y (1999). Blood-borne tissue factor: another
view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. Mar 2;96(5): 2311-5.
42.
Gimbrone MA Jr, Leapman SB, Cotran RS, Folkman J (1972). Tumor dormancy in
vivo by prevention of neovascularization. J Exp Med. Aug 1;136(2): 261-76.
43.
Golias C, Tsoutsi E, Matziridis A, Makridis P, Batistatou A, Charalabopoulos K
(2007). Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules in inflammation focusing on inflammatory heart disease. In Vivo. Sep-Oct;21(5): 757-69. Review.
44.
Gosk S, Moos T, Gottstein C, Bendas G (2008). VCAM-1 directed immunoliposomes selectively target tumor vasculature in vivo. Biochim Biophys Acta.
Apr;1778(4): 854-63.
138
45.
Gottstein C, Wels W, Ober B, Thorpe PE (2001). Generation and characterization
of recombinant vascular targeting agents from hybridoma cell lines. Biotechniques.
Jan;30(1): 190-4, 196, 198 passim.
46.
Han B, Xiu Q, Wang H, Shen J, Gu A, Luo Y, Bai C, Guo S, Liu W, Zhuang Z,
Zhang Y, Zhao Y, Jiang L, Zhou J, Jin X (2011). A Multicenter, Randomized,
Double-Blind, Placebo-Controlled Study to Evaluate the Efficacy of PaclitaxelCarboplatin Alone or with Endostar for Advanced Non-small Cell Lung Cancer. J
Thorac Oncol. Jun;6(6): 1104-9.
47.
Hanahan D, Folkman J (1996). Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. Aug 9;86(3): 353-64. Review.
48.
Hanahan D, Weinberg RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell. Jan 7;100(1): 5770. Review.
49.
Hanahan D, Bergers G, Bergsland E (2000). Less is more, regularly: metronomic
dosing of cytotoxic drugs can target tumor angiogenesis in mice. J Clin Invest.
Apr;105(8): 1045-7.
50.
Hande KR, Hagey A, Berlin J, Cai Y, Meek K, Kobayashi H, Lockhart AC, Medina D, Sosman J, Gordon GB, Rothenberg ML (2006). The pharmacokinetics and
safety of ABT-751, a novel, orally bioavailable sulfonamide antimitotic agent: results of a phase 1 study. Clin Cancer Res. May 1;12(9): 2834-40.
51.
Hendrix MJ, Seftor EA, Hess AR, Seftor RE (2003). Vasculogenic mimicry and
tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nat Rev Cancer. Jun;3(6): 411-21.
Review.
52.
Hinnen P, Eskens FA (2007). Vascular disrupting agents in clinical development.
Br J Cancer. Apr 23;96(8): 1159-65. Review.
53.
Hu P, Yan J, Sharifi J, Bai T, Khawli LA, Epstein AL (2003). Comparison of three
different targeted tissue factor fusion proteins for inducing tumor vessel thrombosis. Cancer Res. Aug 15;63(16): 5046-53.
139
54.
Huang MJ, Osborn L, Svahn J, Schiffer SB, Eliseo L, Zhou LJ, Rhynhart K,
Benjamin CD, Freedman AS (1995). Expression of vascular cell adhesion molecule-1 by follicular dendritic cells. Leuk Lymphoma. Jul;18(3-4):259-64.
55.
Huang X, Molema G, King S, Watkins L, Edgington TS, Thorpe PE (1997). Tumor
infarction in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor vasculature. Science. Jan 24;275(5299): 547-50.
56.
Huang X, Ding WQ, Vaught JL, Wolf RF, Morrissey JH, Harrison RG, Lind SE
(2006). A soluble tissue factor-annexin V chimeric protein has both procoagulant
and anticoagulant properties. Blood. Feb 1;107(3): 980-6.
57.
Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, Cartwright T, Hainsworth J, Heim W,
Berlin J, Baron A, Griffing S, Holmgren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, Ross R,
Kabbinavar F (2004). Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin
for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. Jun 3;350(23): 2335-42.
58.
Jackson C, Cunningham D (2008). Where to position monoclonal antibodies in
first-line treatment of advanced colorectal cancer. Eur J Cancer. Mar;44(5): 65262. Review.
59.
Jain RK (2005). Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. Jan 7;307(5706): 58-62. Review.
60.
Jameson MB, Thompson PI, Baguley BC, Evans BD, Harvey VJ, Porter DJ,
McCrystal MR, Small M, Bellenger K, Gumbrell L, Halbert GW, Kestell P; Phase
I/II Trials Committee of Cancer Research UK (2003). Clinical aspects of a phase I
trial of 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid (DMXAA), a novel antivascular
agent. Br J Cancer. Jun 16;88(12): 1844-50.
61.
Jonjic N, Martìn-Padura I, Pollicino T, Bernasconi S, Jílek P, Bigotti A, Mortarini
R, Anichini A, Parmiani G, Colotta F (1992). Regulated expression of vascular cell
adhesion molecule-1 in human malignant melanoma. Am J Pathol. Dec;141(6):
1323-30.
140
62.
Juneja HS, Schmalsteig FC, Lee S, Chen J (1993). Vascular cell adhesion molecule-1 and VLA-4 are obligatory adhesion proteins in the heterotypic adherence
between human leukemia/lymphoma cells and marrow stromal cells. Exp Hematol.
Mar;21(3): 444-50.
63.
Kessler T, Bieker R, Padró T, Schwöppe C, Persigehl T, Bremer C, Kreuter M,
Berdel WE, Mesters RM (2005). Inhibition of tumor growth by RGD peptidedirected delivery of truncated tissue factor to the tumor vasculature. Clin Cancer
Res. Sep 1;11(17): 6317-24.
64.
Kuzu I, Bicknell R, Fletcher CD, Gatter KC (1993). Expression of adhesion molecules on the endothelium of normal tissue vessels and vascular tumors. Lab Invest.
Sep;69(3): 322-8.
65.
Lara PN Jr, Douillard JY, Nakagawa K, von Pawel J, McKeage MJ, Albert
I,Losonczy G, Reck M, Heo DS, Fan X, Fandi A, Scagliotti G (2011). Randomized
phase III placebo-controlled trial of carboplatin and paclitaxel with or without the
vascular disrupting agent vadimezan (ASA404) in advanced non-small-cell lung
cancer. J Clin Oncol. Aug 1;29(22): 2965-71.
66.
Li Y, Huang XE, Yan PW, Jiang Y, Xiang J (2010). Efficacy and safety of endostar combined with chemotherapy in patients with advanced solid tumors. Asian
Pac J Cancer Prev. 11(4): 1119-23.
67.
Lip GY, Chin BS, Blann AD (2002). Cancer and the prothrombotic state. Lancet
Oncol. Jan;3(1): 27-34. Review.
68.
Liu C, Huang H, Doñate F, Dickinson C, Santucci R, El-Sheikh A, Vessella R,
Edgington TS (2002). Prostate-specific membrane antigen directed selective
thrombotic infarction of tumors. Cancer Res. Oct 1;62(19): 5470-5.
69.
Liu C, Dickinson C, Shobe J, Doñate F, Ruf W, Edgington T (2004). A hybrid fibronectin motif protein as an integrin targeting selective tumor vascular thrombogen. Mol Cancer Ther. Jul;3(7): 793-801.
141
70.
MacDonald TJ, Stewart CF, Kocak M, Goldman S, Ellenbogen RG, Phillips P,
Lafond D, Poussaint TY, Kieran MW, Boyett JM, Kun LE (2008). Phase I clinical
trial of cilengitide in children with refractory brain tumors: Pediatric Brain Tumor
Consortium Study PBTC-012. J Clin Oncol. Feb 20;26(6): 919-24.
71.
Mackman N (2004). Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular
development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Jun;24(6): 1015-22. Review.
72.
Mackman N, Taubman M (2009). Tissue factor: past, present, and future. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Dec:29(12):1986-8. Review.
73.
Matsuno F, Haruta Y, Kondo M, Tsai H, Barcos M, Seon BK (1999). Induction of
lasting complete regression of preformed distinct solid tumors by targeting the tumor vasculature using two new anti-endoglin monoclonal antibodies. Clin Cancer
Res. Feb;5(2): 371-82.
74.
McKeage MJ, Fong P, Jeffery M, Baguley BC, Kestell P, Ravic M, Jameson MB
(2006). 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid in the treatment of refractory tumors: a phase I safety study of a vascular disrupting agent. Clin Cancer Res. Mar
15;12(6): 1776-84.
75.
McKeage MJ, Baguley BC (2010). Disrupting established tumor blood vessels: an
emerging therapeutic strategy for cancer. Cancer. Apr 15;116(8): 1859-71. Review.
76.
Madeddu P (2005). Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration. Exp Physiol. May;90(3):315-26. Review.
77.
Mann KG, Butenas S, Brummel K (2003). The dynamics of thrombin formation.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. Jan 1;23(1): 17-25. Review.
78.
Mauer AM, Cohen EE, Ma PC, Kozloff MF, Schwartzberg L, Coates AI, Qian J,
Hagey AE, Gordon GB (2008). A phase II study of ABT-751 in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. Jun;3(6): 631-6.
79.
McKeage MJ, Von Pawel J, Reck M, Jameson MB, Rosenthal MA, Sullivan R,
Gibbs D, Mainwaring PN, Serke M, Lafitte JJ, Chouaid C, Freitag L, Quoix E
142
(2008). Randomised phase II study of ASA404 combined with carboplatin and
paclitaxel in previously untreated advanced non-small cell lung cancer. Br J Cancer. Dec 16;99(12): 2006-12.
80.
McMurray RW (1996). Adhesion molecules in autoimmune disease. Semin Arthritis Rheum. Feb;25(4): 215-33.
81.
Meng H, Marchese MJ, Garlick JA, Jelaska A, Korn JH, Gailit J, Clark RA,
Gruber BL (1995). Mast cells induce T-cell adhesion to human fibroblasts by regulating intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1
expression. J Invest Dermatol. Dec;105(6): 789-96.
82.
Möhle R (2010). Neue Entwicklungen der antiangiogenen Therapie - Was bringt
die Zukunft? Klinikarzt; 39(1): 34-38.
83.
Morel O, Toti F, Hugel B, Bakouboula B, Camoin-Jau L, Dignat-George
F,Freyssinet JM (2006). Procoagulant microparticles: disrupting the vascular homeostasis equation? Arterioscler Thromb Vasc Biol. Dec;26(12):2594-604. Review.
84.
Morrissey JH (2001). Tissue factor: an enzyme cofactor and a true receptor.
Thromb Haemost. Jul;86(1): 66-74. Review.
85.
Nabors LB, Mikkelsen T, Rosenfeld SS, Hochberg F, Akella NS, Fisher JD, Cloud
GA, Zhang Y, Carson K, Wittemer SM, Colevas AD, Grossman SA (2007). Phase
I and correlative biology study of cilengitide in patients with recurrent malignant
glioma. J Clin Oncol. May 1;25(13): 1651-7.
86.
Nawroth P, Handley D, Matsueda G, De Waal R, Gerlach H, Blohm D, Stern D
(1988). Tumor necrosis factor/cachectin-induced intravascular fibrin formation in
meth A fibrosarcomas. J Exp Med. Aug 1;168(2): 637-47.
87.
Neuenschwander PF, Morrissey JH (1992). Deletion of the membrane anchoring
region of tissue factor abolishes autoactivation of factor VII but not cofactor function. Analysis of a mutant with a selective deficiency in activity. J Biol Chem. Jul
15;267(20): 14477-82.
143
88.
Nilsson F, Kosmehl H, Zardi L, Neri D (2001). Targeted delivery of tissue factor to
the ED-B domain of fibronectin, a marker of angiogenesis, mediates the infarction
of solid tumors in mice. Cancer Res. Jan 15;61(2): 711-6.
89.
Novartis-Homepage. Novartis discontinues ASA404 clinical trial program and
shifts focus to other cancer compounds in early and late stage development.
http://www.novartis.com/newsroom/media-releases/en/2010/1461276.shtml
(Zu-
letzt abgerufen am 24.05.2011)
90.
O´Connell KA, Edidin M(1990). A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of
normal endothelial cells. J Immunol. Jan 15;144(2): 521-5.
91.
O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses M, Lane WS,
Cao Y, Sage EH, Folkman J (1994). Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor
that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell. Oct
21;79(2): 315-28.
92.
Paborsky LR, Caras IW, Fisher KL, Gorman CM (1991). Lipid association, but not
the transmembrane domain, is required for tissue factor activity. Substitution of the
transmembrane domain with a phosphatidylinositol anchor. J Biol Chem. Nov
15;266(32): 21911-6.
93.
Parry GC, Mackman N (1995). Transcriptional regulation of tissue factor expression in human endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. May;15(5): 61221.
94.
Petri B, Bixel MG (2006). Molecular events during leukocyte diapedesis. FEBS J.
Oct;273(19): 4399-407. Review.
95.
Petruzzelli L, Takami M, Humes HD (1999). Structure and function of cell adhesion molecules. Am J Med. Apr;106(4): 467-76. Review.
96.
Philipp J, Dienst A, Unruh M, Wagener A, Grunow A, Engert A, Fries JW,
Gottstein C (2003). Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial
144
cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides. Arterioscler
Thromb Vasc Biol. May 1;23(5): 905-10.
97.
Pili R, Rosenthal M, and AS1404–203 study group investigators (2007). Randomized phase II study of docetaxel with or without DMXAA (AS1404) in hormonerefractory metastatic prostate cancer (HRMPC). ASCO Meeting Abstracts 25:
5115.
98.
Ran S, Gao B, Duffy S, Watkins L, Rote N, Thorpe PE (1998). Infarction of solid
Hodgkin's tumors in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor
vasculature. Cancer Res. Oct 15;58(20): 4646-53.
99.
Ran S, Downes A, Thorpe PE (2002). Increased exposure of anionic phospholipids
on the surface of tumor blood vessels. Cancer Res. Nov 1;62(21): 6132-40.
100.
Renkonen R, Paavonen T, Nortamo P, Gahmberg CG (1992). Expression of endothelial adhesion molecules in vivo. Increased endothelial ICAM-2 expression in
lymphoid malignancies. Am J Pathol. Apr;140(4): 763-7.
101.
Riccioli A, Filippini A, De Cesaris P, Barbacci E, Stefanini M, Starace G,
Ziparo E (1995). Inflammatory mediators increase surface expression of integrin
ligands, adhesion to lymphocytes, and secretion of interleukin 6 in mouse Sertoli
cells. Proc Natl Acad Sci U S A. Jun 20;92(13): 5808-12.
102.
Ruco LP, Stoppacciaro A, Uccini S, Breviario F, Dejana E, Gallo A, De Vincentiis
M, Pileri S, Nicholls JM, Baroni CD (1994). Expression of intercellular adhesion
molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (lymphoepithelioma) and in malignant epithelial tumors. Hum Pathol. Sep;25(9): 924-8.
103.
Rustin GJ, Bradley C, Galbraith S, Stratford M, Loadman P, Waller S, Bellenger
K, Gumbrell L, Folkes L, Halbert G; Phase I/II Trials Committee of Cancer Research UK (2003). 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid (DMXAA), a novel antivascular agent: phase I clinical and pharmacokinetic study. Br J Cancer. Apr
22;88(8): 1160-7.
145
104.
Hermey G (2010). Analyse von Proteinen. In: Schwake M, Hermey G, Mahlke C,
Sommer-Blöchl T. Der Experimentator: Neurowissenschaften. Spektrum Akademischer Verlag, S. 61ff.
105.
Sano H, Nakagawa N, Nakajima H, Yoshida S, Iwamoto I (1995). Role of vascular
cell adhesion molecule-1 and platelet-activating factor in selective eosinophil migration across vascular endothelial cells. Int Arch Allergy Immunol. Aug;107(4):
533-40.
106.
Sarmiento R, Longo R, Gasparini G (2008). Challenges of Antiangiogenic Therapy
of Tumors. In: Figg WD, Folkman J. Angiogenesis. An Integrative Approach from
Science to Medicine. Springer, S. 468f.
107.
Schwöppe C, Kessler T, Persigehl T, Liersch R, Hintelmann H, Dreischalück J,
Ring J, Bremer C, Heindel W, Mesters RM, Berdel WE (2010). Tissue-factor fusion proteins induce occlusion of tumor vessels. Thromb Res. Apr;125 Suppl 2:
S143-50.
108.
Seiwert TY, Cohen EE (2008). Targeting angiogenesis in head and neck cancer.
Semin Oncol. Jun;35(3): 274-85. Review.
109.
Shaked Y, Ciarrocchi A, Franco M, Lee CR, Man S, Cheung AM, Hicklin DJ,
Chaplin D, Foster FS, Benezra R, Kerbel RS (2006). Therapy-induced acute recruitment of
circulating endothelial progenitor cells to tumors. Science. Sep
22;313(5794): 1785-7.
110.
Smith KA, Nelson PN, Warren P, Astley SJ, Murray PG, Greenman J (2004). Demystified...recombinant antibodies. J Clin Pathol. Sep;57(9): 912-7. Review.
111.
Socinski MA, Crowell R, Hensing TE, Langer CJ, Lilenbaum R, Sandler AB, Morris D; American College of Chest Physicians (2007). Treatment of non-small cell
lung cancer, stage IV: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2nd edition). Chest. Sep;132(3 Suppl): 277S-289S.
112.
Staal-van den Brekel AJ, Thunnissen FB, Buurman WA, Wouters EF (1996). Expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 and vascular cell
146
adhesion molecule (VCAM)-1 in non-small-cell lung carcinoma. Virchows Arch.
Apr;428(1): 21-7.
113.
Stevens S, St. Croix B (). Tumor Endothelial Markers. In: Figg WD, Folkman J.
Angiogenesis. An Integrative Approach from Science to Medicine. Springer, S.
336.
114.
Stupp R, Van Den Bent MJ, Erridge SC, Reardon DA, Hong Y, Wheeler H, Hegi
M, Perry JR, Picard M, Weller M (2010). Cilengitide in newly diagnosed glioblastoma with MGMT promoter methylation: Protocol of a multicenter, randomized,
open-label, controlled phase III trial (CENTRIC). J Clin Oncol 28: 15s (suppl; abstr TPS152).
115.
Suda K, Rothen-Rutishauser B, Günthert M, Wunderli-Allenspach H (2001). Phenotypic characterization of human umbilical vein endothelial (ECV304) and urinary carcinoma (T24) cells: endothelial versus epithelial features. In Vitro Cell Dev
Biol Anim. Sep;37(8): 505-14.
116.
Sun Y, Wang J, Liu Y (2005). Results of phase III trial of rh-endostatin (YH-16) in
advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. J Clin Oncol, 2005 ASCO
Annual Meeting Proceedings. Vol 23, No. 16S, Part I of II (June 1 Supplement):
7138.
117.
Takahashi K, Sawasaki Y, Hata J, Mukai K, Goto T (1990). Spontaneous transformation and immortalization of human endothelial cells. In Vitro Cell Dev Biol.
Mar;26(3 Pt 1): 265-74.
118.
Thorpe PE, Ran S (2000). Tumor infarction by targeting tissue factor to tumor vasculature. Cancer J. May;6 Suppl 3: S237-44. Review.
119.
Thorpe PE (2004). Vascular targeting agents as cancer therapeutics. Clin Cancer
Res. Jan 15;10(2): 415-27. Review.
120.
Trédan O, Galmarini CM, Patel K, Tannock IF (2007). Drug resistance and the solid tumor microenvironment. J Natl Cancer Inst. Oct 3;99(19): 1441-54.
147
121.
Tsunoda S, Ohizumi I, Matsui J, Koizumi K, Wakai Y, Makimoto H, Tsutsumi Y,
Utoguchi N, Taniguchi K, Saito H, Harada N, Ohsugi Y, Mayumi T (1999). Specific binding of TES-23 antibody to tumour vascular endothelium in mice, rats and
human cancer tissue: a novel drug carrier for cancer targeting therapy. Br J Cancer.
Dec;81(7): 1155-61.
122.
Unruh M, Grunow A, Gottstein C (2005). Systemic coagulation parameters in mice
after treatment with vascular targeting agents. Thromb J. Dec 10;3: 21.
123.
van Oosten M, van de Bilt E, de Vries HE, van Berkel TJ, Kuiper J (1995). Vascular adhesion molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1 expression on rat
liver cells after lipopolysaccharide administration in vivo. Hepatology. Nov;22(5):
1538-46.
124.
Verheul HM, Pinedo HM (2005). Angiogenesis inhibitors: what is the clinical future? Prog Drug Res.;63: 67-91. Review.
125.
Weber AA, Hohlfeld T, Schrör K (2006). Pharmakologie der Blutgerinnung 2006.
Biospektrum. 12: 35-38.
126.
Williams RL, Risau W, Zerwes HG, Drexler H, Aguzzi A, Wagner EF (1989). Endothelioma cells expressing the polyoma middle T oncogene induce hemangiomas
by host cell recruitment. Cell. Jun 16;57(6): 1053-63.
127.
Yoong KF, Williams A, Hubscher SG, Salmi M, Jalkanen S, Adams DH (1997).
Vascular adhesion protein-1 and intercellular adhesion molecule-1 mediate T-cell
binding to human hepatocellular carcinoma.
Biochem Soc Trans. May;25(2):
257S.
128.
Zhao X, Mei K, Cai X, Chen J, Yu J, Zhou C, Li Q (2011). A randomized phase II
study of recombinant human endostatin plus gemcitabine/cisplatin compared with
gemcitabine/cisplatin alone as first-line therapy in advanced non-small-cell lung
cancer. Invest New Drugs. Jan 12: 235-243
129.
Zhou ZT, Zhou FX, Wei Q, Zou LY, Qin BF, Peng XS (2011). Phase II study of
cisplatin/etoposide and endostar for extensive-stage small-cell lung cancer. Cancer
Chemother Pharmacol. Oct;68(4): 1027-32.
148
130.
Zwicker JI (2008). Tissue factor-bearing microparticles and cancer. Semin Thromb
Hemost. Mar;34(2): 195-8. Review.
149
7
Vorabveröffentlichung von Ergebnissen
Kongressbeitrag (Poster und Vortrag):
Recombinant specific vascular occlusion-inducing proteins against vascular cellular adhesion
molecule-1 are effective in vivo against small cell lung cancer
Gordon Research Conferences, Drug Carriers in Medicine & Biology, 5.-10.9.2004, Big Sky,
Montana, USA
Dienst A, Grunow A, Unruh M, Rabausch B, Nör JE, Fries JW, Gottstein C (2005). Specific
occlusion of murine and human tumor vasculature by VCAM-1-targeted recombinant fusion
proteins. J Natl Cancer Inst. May 18;97(10): 733-47.
150
8
Lebenslauf
Name:
Ariane Dienst
Anschrift:
Venloer Str. 274, 50823 Köln
Geburtsdatum/-ort:
06.02.1975, Krefeld
Staatsbürgerschaft:
deutsch
Familienstatus:
ledig
Arbeitsstelle:
seit 07/2005 beschäftigt als Assistenzärztin in der Klinik für Hämatologie, Onkologie und klinische Immunologie der Universitätsklinik
der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf
Studium:
1998-2004 Studium der Humanmedizin an der Universität zu Köln
2003-2004 Praktisches Jahr in den Kliniken der Stadt Köln, Krankenhaus Merheim und in der Universitätsklinik Köln
04/2005 Approbation als Ärztin
Ausbildung:
1994-1997 Ausbildung zur Medizinisch-technischen Assistentin im
St.Elisabeth-Krankenhaus in Köln
Schule:
1981-1985 Grundschule Mühlenfeld, Kerpen-Sindorf
1985-1991 Leibniz-Gymnasium, Kerpen-Horrem
1991-1994 Liebfrauenschule, Köln
1994 Abitur
151
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