Beeinflussung der antiviralen Antikörperproduktion durch
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Beeinflussung der antiviralen Antikörperproduktion durch differentielle Stimulation der angeborenen Immunantwort mit viralen Oberflächenproteinen Dissertation Zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Prof. Dr. med. Klaus Überla Vorgelegt von Rebecca Carine Juliane Heß Bochum, Mai 2017 „Die Wasser fragen dich“, verkündete Fuchur, „ob du alle Geschichten, die du in Phantásien begonnen hast, auch zu Ende geführt hast.“ „Nein“, sagte Bastian, „eigentlich keine.“ Fuchur horchte eine Weile. Sein Gesicht nahm einen bestürzten Ausdruck an. „Sie sagen, dann wird dich die weiße Schlange nicht durchlassen. Du musst zurück nach Phantásien und alles zu Ende bringen.“ „Alle Geschichten?“ stammelte Bastian, „dann kann ich nie mehr zurück. Dann war alles umsonst.“ Fuchur lauschte gespannt. „Was sagen sie?“ wollte Bastian wissen. „Still!“ sagte Fuchur. Nach einer Weile seufzte er und erklärte: „Sie sagen, es ist nicht zu ändern, es sei denn, es fände sich jemand, der diese Aufgabe für dich übernimmt.“ „Aber es sind unzählige Geschichten“, rief Bastian, „und aus jeder kommen immer neue. So eine Aufgabe kann niemand übernehmen.“ „Doch“, sagte Atréju … – Michael Ende, Die Unendliche Geschichte Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................................. I Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................. V Zusammenfassung........................................................................................................................ 1 1 Einleitung .................................................................................................................... 3 1.1 HIV und AIDS ......................................................................................................................... 3 1.1.1 1.1.2 Aufbau und Diversität von HIV .............................................................................................. 3 Das Env-Protein ..................................................................................................................... 4 1.1.2.1 1.1.2.2 Synthese und Struktur ........................................................................................................... 5 Glykosylierung ....................................................................................................................... 5 1.1.3 1.1.4 Pathogenese .......................................................................................................................... 7 Impfstoffentwicklung ............................................................................................................ 9 1.1.4.1 1.1.4.2 1.1.4.3 1.1.4.4 Herausforderungen bei der Entwicklung eines Impfstoffs.................................................... 9 Klinische Studien zur Wirksamkeit von Impfstoffen ........................................................... 10 Das Ergebnis der RV144-Studie ........................................................................................... 11 Die Immunreaktion auf HIV-Env in Mäusen ........................................................................ 12 1.2 Induktion und Polarisierung einer Immunantwort ............................................................. 13 1.2.1 Einflussnahme auf die Reaktion des angeborenen Immunsystems.................................... 14 1.2.1.1 1.2.1.2 1.2.1.3 Toll-Like-Rezeptoren (TLR) .................................................................................................. 14 C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLR) ........................................................................................... 17 Andere Pattern recognition receptors ................................................................................. 19 1.2.2 Die Polarisierung der adaptiven Immunreaktion ................................................................ 20 1.2.2.1 1.2.2.2 Die Polarisierung von CD4+-T-Helferzellen .......................................................................... 20 Klassenwechsel und Hypermutation von B-Zellen .............................................................. 22 1.3 Zielsetzung........................................................................................................................... 23 2 Material und Methoden ............................................................................................. 24 2.1 Material ............................................................................................................................... 24 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 Chemikalien und Reagenzien .............................................................................................. 24 Verbrauchsgegenstände...................................................................................................... 26 Instrumente ......................................................................................................................... 26 Nukleinsäuren ..................................................................................................................... 28 2.1.4.1 2.1.4.2 Plasmide .............................................................................................................................. 28 Oligonukleotide ................................................................................................................... 30 2.1.5 2.1.6 2.1.7 2.1.8 2.1.9 2.1.10 Standards ............................................................................................................................. 31 Peptide ................................................................................................................................ 31 Antikörper ........................................................................................................................... 31 Enzyme ................................................................................................................................ 32 Kits ....................................................................................................................................... 33 Puffer und Medien .............................................................................................................. 33 I Inhaltsverzeichnis 2.1.10.1 2.1.10.2 2.1.10.3 2.1.10.4 Puffer und Medien für molekularbiologische Methoden ................................................... 34 Puffer und Medien für proteinbiochemische Methoden .................................................... 34 Puffer und Medien für zytologische Methoden .................................................................. 35 Puffer und Medien für immunologische Methoden ........................................................... 36 2.1.11 2.1.12 2.1.13 Bakterien ............................................................................................................................. 37 Eukaryotische Zelllinien ....................................................................................................... 37 Tiere..................................................................................................................................... 37 2.2 Methoden ............................................................................................................................ 38 2.2.1 Molekularbiologische Methoden ........................................................................................ 38 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.4 2.2.1.5 2.2.1.6 2.2.1.7 2.2.1.8 Isolation von Plasmid-DNA .................................................................................................. 38 Bestimmung von DNA-Konzentrationen ............................................................................. 38 Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen ......................................................................... 38 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................ 38 Gelelution ............................................................................................................................ 39 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ....................................................................................... 39 Ligation von DNA-Fragmenten ............................................................................................ 40 Transformation von Bakterien ............................................................................................ 40 2.2.2 Proteinbiochemische Methoden ......................................................................................... 40 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.4 2.2.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................................ 40 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen...................................................................... 41 Western-Immunoblotting ................................................................................................... 41 Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen ............................................. 42 Bestimmung von Proteinkonzentrationen .......................................................................... 42 2.2.3 Zytologische Methoden....................................................................................................... 42 2.2.3.1 2.2.3.2 Kultivierung von 293T-Zellen............................................................................................... 42 Transfektion von Zellen ....................................................................................................... 43 2.2.4 Immunologische Methoden ................................................................................................ 43 2.2.4.1 2.2.4.2 2.2.4.3 2.2.4.4 2.2.4.5 2.2.4.6 2.2.4.7 2.2.4.8 2.2.4.9 2.2.4.10 Immunisierung von Mäusen ................................................................................................ 43 Serumgewinnung................................................................................................................. 44 Gewinnung von Lymphozyten ............................................................................................. 44 In-vitro-Restimulierung von Lymphozyten .......................................................................... 44 Intrazelluläre Zytokinfärbung .............................................................................................. 45 Zytokinspezifischer ELISA .................................................................................................... 46 Antigenspezifischer ELISA.................................................................................................... 46 IFNα-Luciferase-Assay ......................................................................................................... 47 Zellbasierter CLR-Bindungsassay ......................................................................................... 47 Proteinbasierter CLR-Bindungsassay ................................................................................... 47 3 Ergebnisse ................................................................................................................. 49 3.1 Die Immunantwort auf HIV-Env im Vergleich zu RSV-F und IAV-HA als Fusionsproteine mit p24 ....................................................................................................................................... 49 3.1.1 3.1.2 3.1.3 Konstruktion der DNA-Impfstoffe ....................................................................................... 49 Expressionsnachweis ........................................................................................................... 50 Immunisierung mit p24-Fusionsproteinen .......................................................................... 52 3.1.3.1 3.1.3.2 Humorale Immunantwort ................................................................................................... 53 Zelluläre Immunantwort ..................................................................................................... 57 II Inhaltsverzeichnis 3.2 Mechanismen der angeborenen Immunität als mögliche Ursache .................................... 62 3.2.1 3.2.2 Der Einfluss der Fusionsproteine auf die Produktion von IFNα .......................................... 62 Untersuchung der Abhängigkeit der Immunantwort von Signalkaskaden der Pattern Recognition Receptors ......................................................................................................... 64 3.2.2.1 3.2.2.2 Immunisierung von MyD88/TRIF-Doppel-Knock-Out-Mäusen ........................................... 64 Immunisierung von Card9-Knock-Out-Mäusen................................................................... 66 3.2.3 Untersuchung der Bindung der viralen Oberflächenproteine an C-Typ- Lektinrezeptoren 67 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 Zell-basierter Assay ............................................................................................................. 68 Aufreinigung der Oberflächenproteine aus Zellkulturüberständen.................................... 69 Bindungsassay mit aufgereinigten Proteinen ..................................................................... 71 3.3 Der Einfluss struktureller Eigenschaften von Env................................................................ 72 3.3.1 Die variablen Domänen von Env ......................................................................................... 72 3.3.1.1 3.3.1.2 Herstellung von trunkierten Env-Konstrukten .................................................................... 72 Die Immunantwort gegen trunkierte Varianten von Env .................................................... 74 3.3.2 Die Glykosylierung von C2V3 ............................................................................................... 78 3.3.2.1 3.3.2.2 Herstellung eines deglykosylierten V3-Konstruktes............................................................ 78 Immunisierung mit einem deglykosylierten V3-Konstrukt ................................................. 79 4 Diskussion ................................................................................................................. 83 5 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 91 Lebenslauf ................................................................................................................................106 Danksagung ..............................................................................................................................107 III Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis % Prozent °C Grad Celsius Abb. Abbildung ADCC Antibody-dependent cellular cytotxicity ADCP Antibody-dependent cellular phagocytosis ADCVI Antibody-dependent cell-mediated viral inhibition AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome AK Antikörper ANOVA analysis of variance APZ Antigen präsentierende Zellen Asn Asparagin bnAbs Broadly neutralizing antibodies bp Basenpaar BSA Bovines Serumalbumin BZR B-Zellrezeptor CD Cluster of differentiation CRD Carbohydrate-Recognition-Domäne CLR C-Typ-Lektin-Rezeptoren Da Dalton DAMP Damage-associated molecular patterns DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleinsäuretriphosphat dsRAD dsRNA-spezifische Adenosin-Deaminase dsRNA doppelsträngige RNA DZ Dendritische Zellen ECL Enhanced chemoluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Env Envelope-Protein F Fusionsprotein I Abkürzungsverzeichnis FACS Fluorescence activated cell sorting Fc Fragment crystallizable FCS Fetal calf serum g Gramm g Schwerebeschleunigung Gag Group antigen GST Glutathion-S-Transferase h Stunde HA Hemagglutinin HAART hochaktive antiretrovirale Therapie HBSS Hank’s buffered salt solution HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure HHV Humanes Herpesvirus His Histidin HIV Humanes Immundefizienzvirus HRP Horseradish peroxidase IAV Influenza-A-Virus ICS Intracellular cytokine staining i.d.R. in der Regel IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin i.p. intraperitoneal i.m. intramuskulär ITAM Immunoreceptor tyrosin-based activation motif ITIM Immunoreceptor tyrosin-based inhibition motif iTreg induzierte regluatorische T-Helferzelle k Kilo kb Kilobasenpaare KO Knock-out L Liter LB lysogeny broth µ micro m milli II Abkürzungsverzeichnis m Meter M molar mDZ myeloide Dendritische Zelle MHC major histocompatibility complex min Minute MSM Man who have sex with men MWCO Molecular Weight Cut Off MyD88 myeloid differentiation primary response protein 88 n nano Na Natrium Nef Negative regulatory factor Ni Nickel NK Natürliche Killerzelle NLG N-linked glycosylation NLR NOD-Like-Rezeptoren ns nicht signifikant OD optische Dichte OLG O-linked glycosylation PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAMP pathogen-associated molecular patterns PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction pDZ plasmazytoide Dendritische Zelle PEI Polyethylenimin PNGS potential N-linked glycosylation sites Pol Polymerase Pro Prolin PKR Proteinkinase R PRR pattern recognition receptors PWID People who inject drugs RER Raues Endoplasmatischen Retikulum RNA Ribonukleinsäure RLR RIG-1-like-Rezeptoren ROS reactive oxygen species III Abkürzungsverzeichnis RSV Respiratorisches Syncytialvirus RT Raumtemperatur RT Reverse Transkriptase s Sekunde SDS Natriumdodecylsulfat Ser Serin s.g. so genannt SIGLEC Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins TAE Tris-Acetat-EDTA TBE Tris-Borat-EDTA TEMED Tetramethylethylendiamin Thr Threonin TFH Follikulären T-Helferzellen TGF Tissue Growth Factor TIR Toll-IL-1R-Domäne TLR Toll-Like-Rezeptoren TMB Tetramethybenzidin tPA tissue-type plasminogen activator TRIF TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β UV Ultraviolett v/v volume to volume V Volt vs. versus w/v weight to volume WB Western-Immunoblotting wt Wildtyp z.B. zum Beispiel IV Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Struktur des Humanen Immundefizienz-Virus 1. ...................................................................... 4 Abb. 2: Glykosylierung an Asparagin-Seitenketten. .............................................................................. 7 Abb. 3: Typischer Verlauf einer HIV-Infektion....................................................................................... 8 Abb. 4: Vergleich der Verhältnisse von IgG2a zu IgG1 bei DNA-Immunisierung mit RSV-F, IAV-HA und HIV-Env, sowie dem Strukturprotein Gag von HIV. ................................................................ 13 Abb. 5: TLR-Signalkaskaden. ................................................................................................................ 15 Abb. 6: Signalkaskaden der C-Typ-Lektinrezeptoren. ......................................................................... 18 Abb. 7: Aufbau der zur Immunisierung verwendeten Plasmide. ........................................................ 50 Abb. 8: Expressionskontrolle der Fusionsproteine aus den hergestellten Plasmiden. ....................... 51 Abb. 9: Zeitlicher Ablauf der DNA-Immunisierung. ............................................................................. 52 Abb. 10: Humorale Immunantwort gegen die Oberflächenproteine und das jeweils fusionierte p24 nach der Boost-Immunisierung in Balb/c-Mäusen. ................................................................ 53 Abb. 11: Humorale Immunantwort gegen die Oberflächenproteine und das jeweils fusionierte p24 nach der Boost-Immunisierung in C57BL/6-Mäusen. ............................................................. 54 Abb. 12: Humorale Immunantwort gegen Oberflächen- und p24-Teil der Fusionsproteine nach BoostImmunisierung. ....................................................................................................................... 56 Abb. 13: TH1-CD4+-T-Zellantwort nach zwei Immunisierungen mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden. ............................................................................................................................... 58 Abb. 14: CD8+-T-Zell-Antwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden. ............................................................................................................................... 59 Abb. 15: TH2-CD4+-T-Zellantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden im ersten Immunisierungsversuch an Balb/c-Mäusen. ......................................... 60 Abb. 16: TH2-CD4+-T-Zellantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden im zweiten Immunisierungsversuch an Balb/c-Mäusen. ...................................... 61 Abb. 17: Produktion von IFNα als Reaktion auf die Inkubation mit Fusionsproteinen. ........................ 63 Abb. 18: Humorale Immunantwort von MyD88/TRIF-/--Mäusen. ......................................................... 65 Abb. 19: Humorale Immunantwort von Card9-/--Mäusen. .................................................................... 66 Abb. 20: Bindungsstudie von hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen an membranständige virale Oberflächenproteine............................................................................................................... 68 Abb. 21: Aufreinigung von löslichen Oberflächenproteinen aus Zellkulturüberstand. ........................ 70 Abb. 22: Bindung von hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen an lösliche virale Oberflächenproteine. ....... 71 Abb. 23: Aufbau der Expressionsplasmide für trunkierte Varianten von Env. ...................................... 72 V Abbildungsverzeichnis Abb. 24: Expressionsnachweis der trunkierten Env-Konstrukte. .......................................................... 73 Abb. 25: Humorale Immunantwort gegen trunkierte Varianten von HIV-Env und das jeweils fusionierte p24. ....................................................................................................................... 74 Abb. 26: Analyse der Korrelation der Verhältnisse von IgG2a zu IgG1 und der jeweiligen Farbdichte der zugehörigen Bande im Western Blot der Expressionsanalyse. ........................................ 75 Abb. 27: TH1-Zytokinantwort nach zwei Immunisierungen mit verkürzten Versionen von gp140 exprimierenden Plasmiden. .................................................................................................... 76 Abb. 28: TH2-Zytokinantwort zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung mit trunkierten Varianten des Env-Proteins. .................................................................................................... 77 Abb. 29: Expressionskontrolle des in C2 und V3 deglykosylierten Expressionsplasmids V3NQ. .......... 79 Abb. 30: Humorale Immunantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein exprimierenden Plasmiden. .................................................................................................... 80 Abb. 31: TH2-Zytokinantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Expressionsplasmiden................ 81 VI Zusammenfassung Zusammenfassung Nach wie vor ist kein wirksamer Impfstoff gegen HIV verfügbar. Von den bisherigen Immunisierungsstudien konnte nur der RV144-Versuch einen schwachen Impfschutz von 31,2 % erzielen, der im Zusammenhang mit einer erhöhten Induktion von Env-spezifischem IgG3 stand. Eine Analyse der älteren VAX003-Studie zeigte hingegen, dass vor allem IgG4 induziert wurde. In dieser Studie konnte kein Schutz vor einer Ansteckung erzielt werden. Während IgG3 bei Menschen eine sehr hohe Kapazität besitzt, Fc-vermittelte sekundäre Immunfunktionen auszulösen, hat IgG4 vergleichsweise dazu nur eine geringe Fähigkeit. Bei Mäusen werden dieselben Eigenschaften den Subklassen IgG2a mit einer hohen Kapazität bzw. IgG1 mit einer niedrigen Kapazität zugesprochen. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass Immunisierungen mit dem Oberflächenprotein von HIV, HIVEnv, auf Protein- oder DNA-Basis ebenfalls verstärkt die Antikörpersubklasse mit geringer Fcvermittelnder Fähigkeit, IgG1, induzieren, während Immunisierungen mit strukturell ähnlichen Oberflächenproteinen von anderen Viren, z.B. dem Fusionsprotein des Respiratorischen Syncytialvirus, RSV-F, oder dem Hemagglutinin von Influenza A, IAV-HA, eine mengenmäßig ausgeglichene Antwort hervorrufen. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus zu ergründen, der zu der IgG1-lastigen Antwort auf HIV-Env führt. Eine vergleichende Immunisierung mit Expressionsplasmiden für HIV-Env, IAV-HA und RSV-F, jeweils fusioniert mit dem Capsidprotein p24 von HIV, zeigte sowohl, dass gegen HIV-Env mehr IgG1 als IgG2a gebildet wurde, während gegen die anderen Oberflächenproteine jeweils ungefähr gleich große Mengen gebildet wurden, als auch, dass sich das Ungleichgewicht auf die Antwort gegen das fusionierte p24 übertrug. Daraus war zu schließen, dass der Effekt bereits bei Aufnahme des Antigens durch Zellen des angeborenen Immunsystems zum Tragen kam. Die unausgeglichene Immunantwort wurde zudem von erhöhten Konzentrationen von TH2-Zytokinen begleitet. Es wurden verschiedene Mechanismen der angeborenen Immunantwort als mögliche Ursachen für den hier beobachteten Effekt in Betracht gezogen. Da IFNα zu einem frühen Zeitpunkt Einfluss auf die Prägung der adaptiven Immunreaktion nimmt, wurde in einem in-vitro-Ansatz mit Splenozyten eines IFNα-Reporterstammes die IFNα-Reaktion auf die hier verwendeten Fusionsproteine untersucht. Es zeigten sich jedoch keine Unterschiede in der Höhe der IFNα-Produktion. Weil Antigene über Pattern Recognition Receptors (PRR) in Antigen präsentierenden Zellen (APZ) aufgenommen werden und die Art des jeweiligen PRR ebenfalls Einfluss auf die Ausrichtung der Immunantwort nimmt, wurden zwei Knock-Out-Stämme immunisiert. Dem einen Stamm fehlten die Signalproteine MyD88 und TRIF der Toll-Like-Rezeptor-Signalkaskade (TLR). Dem anderen Stamm fehlte das Signalprotein Card9 der C-Typ-Lektinrezeptor-Signalkaskade (CLR). Während sich bei den 1 Zusammenfassung Mäusen ohne TLR-Signalkaskade kein Unterschied im Ergebnis der Immunisierung im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen zeigte, war die Immunantwort bei den Mäusen ohne CLR-Signalkaskade auf das HIVEnv-Protein ausgeglichener als bei den Wildtyp-Mäusen. Damit konnte eine Beteiligung der CLRSignalkaskade an dem Mechanismus nachgewiesen werden. Die Beteiligung der CLR wurde weiter untersucht. In zwei verschiedenen Ansätzen wurde die Bindung einer Reihe von CLR an die hier untersuchten viralen Oberflächenproteine getestet. Es konnte jedoch keine differentielle Bindung der Proteine an die verschiedenen Rezeptoren nachgewiesen werden. Eine weitere Immunisierung mit DNA-Plasmiden, die schrittweise verkürzte Versionen von HIV-Env in Fusion mit p24 exprimierten, zeigte, dass die Entstehung der unausgeglichenen Immunantwort von der C2V3-Region des Proteins anhängig ist: Ein Konstrukt, dem diese Region fehlte, führte im Verlauf der Immunisierung zu einem ausgewogenen Verhältnis von IgG1 zu IgG2a ohne Ausbildung eines TH2Phänotyps. Aufgrund der bereits gezeigten Card9-Abhängigkeit des Effekts wurde die Glykosylierung im Bereich C2V3 des Env-Proteins als Auslöser der unausgeglichenen Immunantwort in Erwägung gezogen und eine weitere Immunisierung mit einem Konstrukt durchgeführt, das in C2V3 nicht glykosyliert war. Mit diesem Konstrukt wurde ebenfalls eine ausgeglichene Immunreaktion erzielt. Damit wurde nachgewiesen, dass die Glykosylierung des Env-Proteins in C2V3 der Auslöser für die Mehrproduktion von IgG1 ist. Das Signalprotein Card9 und damit ein von Card9 abhängiger, bislang unbekannter Rezeptor sind an der Ausbildung des Effekts beteiligt. So konnten mit dieser Arbeit grundlegende Mechanismen nachgewiesen werden, die an der Entstehung der Immunantwort gegen HIV-Env beteiligt sind. Dadurch wurden sinnvolle Ansatzpunkte für die weitere Erforschung des beschriebenen Effekts und für die Optimierung zukünftiger Immunisierungsstrategien gegen HIV aufgezeigt. 2 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 HIV und AIDS Das erworbene Immunschwächesyndrom (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) wurde erstmals 1981 im Zusammenhang mit einer seltenen Form der Lungenentzündung (Pneumonia Pneumocystis jirovecii) beschrieben, die bis dahin nur bei stark immunsupprimierten Menschen beobachtet worden war, hier jedoch bei sonst scheinbar völlig gesunden Individuen auftrat1. Es folgten genaue Untersuchungen des Krankheitsbildes sowie die Aufnahme epidemiologischer Daten. Dabei wurde festgestellt, dass die Krankheit gehäuft in großen Städten wie New York oder Los Angeles auftrat und verstärkt mit (männlicher) Homosexualität assoziiert war2. Da AIDS jedoch auch vermehrt anderen bei Konsumenten intravenös verabreichter Drogen, heterosexuellen Männern und Frauen oder auch Haitianern auftrat, konnten andere in Betracht gezogene Gründe, wie eine allgemein immunschwächende Wirkung von Sperma3, ausgeschlossen werden. Bald vermutete man eine virale Infektionskrankheit4. 1983 gelang es erstmals, ein Virus aus Patientenproben AIDS-erkrankter Personen zu isolieren, das mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden konnte und sich schließlich als der gesuchte Erreger erwies5. Seit 1986 wird dieses Virus als Humanes ImmundefizienzVirus (HIV) bezeichnet. 1.1.1 Aufbau und Diversität von HIV HIV ist ein Lentivirus der Familie der Retroviren, von dem bislang zwei Arten, HIV-1 und HIV-2, bekannt sind. Dabei trägt nur HIV-1 zur weltweiten Pandemie bei. Das Virus hat einen Durchmesser von ungefähr 100 nm. Es besteht aus einer Lipid-Doppelmembran, die aus der Membran der Wirtszelle stammt. Direkt mit der Membran assoziiert, liegen die Matrixproteine (p17) vor, die zudem das einzige virale Oberflächenprotein Envelope (Env) in der Membran verankern. Innerhalb des Virus liegt das kegelförmige, aus p24-Proteinen bestehende Capsid, das die beiden genomischen RNA-Stränge sowie die drei viralen Enzyme Reverse Transkriptase (RT), Protease und Integrase umschließt. Die RNAStränge werden wiederum vom Nucleocapsid umhüllt, das aus p7-Proteineinheiten aufgebaut ist. Die drei strukturbildenden Proteine p24, p17 und p7 sind Untereinheiten des Gag-Vorläuferproteins, das während der Reifung des HIV-Partikels nach der Abschnürung von der Wirtszelle von der viralen Protease geschnitten wird6 (Abb. 1). 3 Einleitung 1 Abb. 1: Struktur des Humanen Immundefizienz-Virus 1. HIV wird aufgrund seiner hohen genetischen Variabilität in Gruppen und Subtypen unterteilt. Von HIV-1 existieren bislang die Gruppen M, N, O und P, die auf vier unabhängige Übertragungsereignisse von Schimpansen bzw. Gorillas auf Menschen zurückzuführen sind7. Durch phylogenetische Analyse konnten die Gruppen in neun Subtypen, A-D, F-H, J und K, unterteilt werden8. Die hohe genetische Variabilität kommt durch die RT zustande, die die genomische RNA des Virus bei Infektion einer Zelle in DNA umschreibt. Diese DNA wird wiederum von der Integrase in die genomische DNA der Wirtszelle integriert. Während der reversen Transkription treten allerdings immer wieder Fehler beim Ablesen der Information auf, die von der RT nicht korrigiert werden können. Zusätzlich kommt es zu Rekombinationsereignissen zwischen den beiden viralen genomischen RNASträngen. Auf diese Weise mehrt sich die Zahl an Mutationen während eines Replikationszyklus des Virus9,10. 1.1.2 Das Env-Protein Das Env-Protein von HIV ist ein heterotrimeres Protein, das sich auf der Oberfläche des Virus befindet und der Bindung an und der Fusion mit Wirtszellen dient. Die Bindung erfolgt hierbei an den CD4-Rezeptor, der u.a. auf CD4+-T-Helferzellen vorkommt. Der initialen Bindung folgt ein Konformationswechsel des Trimers, bei dem weitere Bindungsstellen für einen Korezeptor gebildet und exponiert werden11,12. Dabei handelt es sich, je nach Virusstamm, um die Chemokinrezeptoren CCR5 oder CXCR4, bei manchen Stämmen auch um beide13. Der Bindung an den Korezeptor folgt schließlich eine weitere Umlagerung des Proteins, die zur Fusion mit der Membran der Zielzelle führt14. 4 Einleitung 1 1.1.2.1 Synthese und Struktur Die Protomere des Trimers werden als gp160-Vorläuferprotein am Rauen Endoplasmatischen Retikulum (RER) exprimiert, wo auch die Trimeriserung der Vorläuferproteine stattfindet15,16. Die Trimere durchwandern auf dem Weg zur Zellmembran den Golgi-Apparat, wobei die Untereinheiten von Furin oder Furin-ähnlichen Proteasen an einem hochkonservierten Motiv in die Untereinheiten gp120 und gp41 geschnitten werden, die anschließend nicht-kovalent miteinander verbunden vorliegen17. Nach Erreichen der Zellmembran wird das Trimer schnell wieder von derselben Zelle endozytotisch aufgenommen18. Zusammen mit dem Vorgang, der als shedding bezeichnet wird und bei dem es zu einer Trennung der nur schwach miteinander verbundenen gp120-Untereinheiten von den gp41-Untereinheiten kommt, führt dies zu einer relativ geringen Menge von 7–14 Env-Proteinen auf einem fertigen Viruspartikel19,20. Die gp120-Untereinheit ist in fünf konstante und fünf variable Abschnitte unterteilt. Die konstanten C-Regionen (C1–C5) sind genetisch konserviert und stellen das strukturelle und funktionale Grundgerüst des Proteins dar. So sind z.B. C1, C3 und C4 an der Bindung des CD4-Rezeptors beteiligt21– 23 . Im Gegensatz zu den C-Regionen sind die variablen V-Regionen (V1–V5) einem starken Wandel unterzogen, der aus der fehlerhaften Replikation der RT resultiert. Konservierte Cysteine führen zur Ausbildung von Schleifen, die Sekundärstrukturen wie z.B. β-Faltblätter aufweisen können24. Diese Schleifen, auch V-Loops genannt, bilden die äußere Schicht des Proteins25,26. Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen haben in diesen Regionen weniger negative Folgen für das Virus, da sie nur indirekten Einfluss auf die Struktur und Funktion des Proteins nehmen. Stattdessen ergeben sich Vorteile, da eine fortlaufende Veränderung dieser exponierten Proteinregionen die Anpassung einer Immunantwort erschwert27. 1.1.2.2 Glykosylierung Glykosylierungen stellen eine von mehreren Möglichkeiten dar, auf die ein Protein, abgesehen von seiner Aminosäuresequenz, verändert werden kann. Diese Modifikationen dienen der Strukturintegrität des Proteins, der Signalübertragung oder der Anpassung an unterschiedliche chemikalische Milieus, wobei z.B. eine Glykosylierung eine erhöhte Löslichkeit in wässriger Umgebung bewirkt. Auf der Oberfläche von Zellen dienen sie der Identifikation durch andere Zellen, z.B. denen des Immunsystems, oder der Verankerung in der extrazellulären Matrix28,29. Glykosylierungen treten an Asparagin-, Serin- oder Threonin-Seitenketten eines Proteins auf, wobei die Asparagin-Glykosylierung als N-Glykosylierung und die von Serin oder Threonin als O-Glykosylierung (O-linked glycosylation, OLG) bezeichnet wird. Bei der N-Glykosylierung (N-linked glycosylation, NLG) wird im RER noch während der Translation des Proteins, eine Glykan-Grundstruktur 5 Einleitung 1 bestehend aus zwei N-Acetylglukosaminen sowie mehreren Mannose- und Glukose-Einheiten durch das Enzym Oligosaccharyltransferase von einem in der RER-Membran verankerten Dolichol auf das naszierende Protein übertragen. Dabei werden ausschließlich Asparagine glykosyliert, die in einer definierten Sequenz (Asn-X-Ser/Thr, X≠Pro) vorliegen30. Im Gegensatz zur NLG wird für die OLG, die zudem erst im Golgi-Apparat vollzogen wird, keine spezifische Sequenz benötigt. Datenbankanalysen haben jedoch gezeigt, dass bevorzugt Serine und Threonine in prolinreichen Umgebungen glykosyliert werden31. Proteine mit NLG-Modifizierungen werden auf dem Weg vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und auf dem Weg durch den Golgi bis zur Zellmembran weiter prozessiert, wobei zunächst Glukose- und Mannosereste entfernt werden, um später von einer Vielzahl verschiedener Transferasen durch N-Acetylglukosamin, N-Acetylgalaktosamin, Galaktose und Fucose ersetzt zu werden. Dabei entsteht eine verzweigte, komplexe Struktur von miteinander verbundenen Zuckern, an deren Enden Sialylsäurereste gebunden werden. Neben der komplexen Form kommen die unvollständig prozessierte Oligomannoseform und die Hybridform vor, die eine Mischform der komplexen und der Oligomannoseform darstellt (Abb. 2). Bei Env haben Glykosylierungen ebenso wie die hohe genetische Variabilität der V-Domänen einen negativen Einfluss auf die Ausbildung einer Immunantwort gegen HIV. Die Glykane machen etwa 50 % der Gesamtmasse des Proteins aus, wobei N-Glykosylierungen den größten Anteil haben32,33. Mit einer variierenden Anzahl von 20–35 potentiell glykosylierbaren Asparaginen (potential N-linked glycosylation sites, PNGS) ist Env im Vergleich mit anderen viralen Oberflächenproteinen ungewöhnlich stark glykosyliert34. Diese starke Glykosylierung schirmt große Teile des Proteins ab und verhindert dadurch die Erkennung des Proteins durch das Immunsystem, da die Glykanstrukturen sich nicht von denen körpereigener Proteine unterscheiden35. So wurde gezeigt, dass das Entfernen bestimmter konservierter Glykane zu einer erhöhten Neutralisierung des Virus durch Antiseren und breit neutralisierende Antikörper (broadly neutralizing antibodies, bnAbs) führt36–38. Aufgrund ihrer hohen Dichte und der damit einhergehenden sterischen Behinderung der entsprechenden Transferasen werden die Glykane im Golgi-Apparat nur unvollständig prozessiert, sodass die meisten Glykane in der Form von Oligomannose vorliegen39. 6 Einleitung 1 Abb. 2: Glykosylierung an Asparagin-Seitenketten. Precursor, Oligomannose und Core glycan stellen die drei Vorläuferstufen einer NLG dar. Die vier Strukturen auf der rechten Seite der Abbildung zeigen hingegen verschiedene Arten, auf die eine vollständig prozessierte Glykosylierung aufgebaut sein kann. Die Abbildung wurde modifiziert nach (Goettig 2016)40. Trotz der hohen Variabilität der V-Regionen gibt es auch hier Abschnitte, die stark konserviert sind, wie beispielsweise eine PNGS in V3, die im Gegensatz zur Mehrheit der anderen PNGS von Env komplex glykosyliert vorliegt41–46. Diese Glykosylierung hat u.a. Einfluss auf den Tropismus des Virus, da sie die Nettoladung der V3-Region verändert und damit zu einer Bindungsaffinität zu CXCR4 oder zu CCR5 beiträgt47. 1.1.3 Pathogenese Das von einer Infektion mit HIV ausgelöste AIDS ist eine Erkrankung des Immunsystems, in deren Verlauf es zur schrittweisen Zerstörung desselben kommt. Durch den fehlenden Immunschutz kommt es im Endstadium der Krankheit zu einer Reihe von sogenannten opportunistischen Infektionen, von denen immunkompetente Menschen im Normalfall nicht befallen werden und die bei AIDS-Erkrankten zum Tod führen. Dazu gehören u.a. das Kaposi-Sarkom, das durch eine Infektion mit dem Humanen Herpesvirus-8 (HHV-8) ausgelöst wird, Mykosen, z.B. mit Candida albicans, oder die bereits erwähnte Pneumonie durch den Erreger Pneumocystis jirovecii 48. CD4+-T-Helferzellen werden über den CD4-Rezeptor mit HIV infiziert. Nach dem Eindringen des Virus in die Zelle wird die virale RNA von der RT in DNA umgeschrieben Diese DNA wird in den Zellkern transportiert und in das Genom der Wirtszelle integriert. Die Transkription der betroffenen Genomsequenz führt zur Replikation des Virus, wodurch die Zelle schließlich abstirbt. Die initiale Infektion von Zellen, die einen CD4-Rezeptor tragen, führt zu den für eine virale Infektion typischen Symptomen wie Fieber, Schwäche, Kopf- und Gelenkschmerzen. Häufig verläuft die Primärinfektion aber auch weitestgehend symptomlos und bleibt so unbemerkt. In dieser Phase der Erkrankung kommt es zu einer Immunreaktion, die vor allem von zytotoxischen CD8+-T-Zellen vermittelt wird. Diese 7 Einleitung 1 erkennen und zerstören virusinfizierte Zellen, sodass es nicht nur zur Eindämmung der Virusreplikation kommt, sondern vor allem auch zu einem starken Abfall der Zahl an CD4+-T-Helferzellen. Aus diesem Grund können die Zellen ihrer vermittelnden Rolle bei der Entstehung einer humoralen Immunantwort nicht ausreichend nachkommen. Zwar werden Antikörper gegen HIV gebildet, diese erreichen jedoch selten neutralisierende Qualität. Durch die rasche Mutation des Virus kann es zudem der humoralen Immunreaktion leicht entkommen. Die Integration in das Wirtsgenom führt außerdem nicht immer zu einer unmittelbaren Replikation des Virus, sodass das Virus viele Jahre unerkannt als Provirus in infizierten Zellen verbleiben kann. Erst wenn eine Zelle bei einer durch eine andere Infektion hervorgerufene Immunreaktion aktiviert wird, beginnt das Virus zu replizieren 49–51. Weil zudem die zur Infektion einer Zelle benötigten Rezeptoren CD4 und CCR5 bzw. CXCR4 nicht exklusiv auf THelferzellen exprimiert werden, kommt es zusätzlich zu einem Befall verschiedener anderer Zelltypen des Immunsystems wie Makrophagen und Dendritischen Zellen (DZ)52,53. Da Makrophagen durch virale Infektionen kaum geschädigt werden und zudem als tissue resident macrophages sehr langlebig sein können54, werden sie neben den Gedächtnis-CD4+-T-Helferzellen als Hauptreservoir für HIV angesehen55. Abb. 3: Typischer Verlauf einer HIV-Infektion. Die Abbildung stammt aus (Lewis 2014)56. Durch die Eindämmung der Virusreplikation kommt es schließlich zu einer Latenzphase, die auch unbehandelt viele Jahre andauern kann und in der die Betroffenen symptomfrei sind. Bei sog. Elite 8 Einleitung 1 Controllers ist die Viruslast schließlich auch ohne weitere Medikation nicht mehr nachzuweisen57. Die Latenzphase kann durch den Einsatz von hochaktiver antiretroviraler Therapie (HAART) sogar auf viele Jahrzehnte gestreckt werden. Während dieser Zeit repliziert das Virus permanent, wird jedoch vom Immunsystem weitestgehend in Schach gehalten. Dennoch kommt es zu einem steten Abfall der Zahl von CD4+-T-Helferzellen. Wenn schließlich eine kritische Grenze der Anzahl unterschritten wird, beginnt das Immunsystem zu kollabieren und opportunistische Infektionen nehmen Überhand. Damit ist das finale dritte Stadium der Infektion, erreicht: AIDS (Abb. 3). 1.1.4 Impfstoffentwicklung Zurzeit sind weltweit ungefähr 36,7 Millionen Menschen mit HIV infiziert. Es wird geschätzt, dass das Virus seit Beginn der Epidemie mehr als 35 Millionen Todesopfer gefordert hat58. Weltweite Kampagnen zur Aufklärung über die möglichen Übertragungswege (ungeschützter Geschlechtsverkehr oder der gemeinsame Gebrauch von Injektionsbesteck) sowie die Senkung der Viruslast und damit der Ansteckungsgefahr bei bereits Infizierten konnten die Pandemie zwar eindämmen, die weitere Ausbreitung von HIV jedoch nicht gänzlich verhindern. Nach wie vor kommt es zu einer Zahl von weltweit 2,1 Millionen Neuansteckungen pro Jahr58. Da die Entwicklung einer medikamentösen Behandlung, die zu einer vollständigen Heilung und damit zur Befreiung des Organismus von allen viralen Reservoirs führt, erhebliche Schwierigkeiten bereitet, ist die Entwicklung eines Impfstoffs, der eine Ansteckung von vornherein verhindert, von entscheidender Bedeutung. 1.1.4.1 Herausforderungen bei der Entwicklung eines Impfstoffs Die verschiedenen Eigenschaften des HI-Virus erschweren die Entwicklung eines protektiven Impfstoffs erheblich. So hat HIV eine hohe Mutationsrate, da die RT, die die virale genomische RNA in DNA umschreibt, keine Replikationsfehler erkennt. Durch die rasante Mutation verändern sich während einer Infektion laufend die dem Immunsystem zugänglichen und damit immundominanten Epitope, sodass eine ständige Anpassung der erworbenen Immunantwort nötig ist. Konservierte und damit für die Struktur und Funktion des Virus unentbehrliche Epitope sind hingegen kaum zugänglich. Dazu kommt, dass HIV mit Env nur über ein einziges Oberflächenprotein verfügt, das zudem in einer geringen Anzahl von 7–14 Trimeren auf der Oberfläche vorliegt19,20. Die starke Glykosylierung des Proteins trägt weiter dazu bei, dass konservierte Epitope nicht erkannt werden können59. Die hohe Mutationsrate im Organismus bedingt zudem eine hohe Diversität von Stämmen und Subtypen des Virus, die z.B. die des Influenza-Virus übersteigt, gegen das jedes Jahr ein neuer Impfstoff entwickelt werden muss. Da bei einer herkömmlichen Immunisierung jedoch meist nur eine begrenzte Anzahl von Epitopen zur Verfügung gestellt werden kann, ist es kaum möglich, hier für einen breiten Schutz zu 9 Einleitung 1 sorgen. Hinzu kommt die schnelle Integration des Virus in das Wirtsgenom und die damit verbundene Bildung von Reservoirs, die bereits Stunden nach der Infektion stattfinden kann. Um eine Infektion zu verhindern, müssten also bereits zum Zeitpunkt des Eintritts des Virus in den Organismus Mechanismen zur Verfügung stehen, die das Virus erkennen und neutralisieren. Eine Möglichkeit stellen dabei die bnAbs dar. Diese Antikörper erkennen eben jene gut geschützten, konservierten Epitope und können so eine Infektion von vornherein verhindern. Während einer Infektion entwickeln sie sich jedoch erst etwa zwei Jahre nach der Ansteckung und das auch nur bei etwa 10–50 % der Patienten60. Bislang ist es nicht möglich, bnAbs gezielt durch eine Immunisierung zu induzieren. Da eine solche sterile Immunität unter Umständen nicht zu erreichen ist, stellt eine Immunisierung, die eine Infektion zwar nicht verhindern, einen Ausbruch der Krankheit jedoch unterdrücken könnte, eine weitere Möglichkeit dar. 1.1.4.2 Klinische Studien zur Wirksamkeit von Impfstoffen Aktuell gibt es sechs klinische Studien zur Wirksamkeit von Impfstoffen gegen HIV. Die versuche konzentrierten sich zunächst darauf, durch die Immunisierung eine Ansteckung mit HIV zu verhindern. Aus diesem Grund wurde ein Ansatz gewählt, der zu einer humoralen, neutralisierenden Antwort führen sollte, getestet in zwei Studien: VAX003 und VAX004. Hierfür wurde monomeres (VAX004) bzw. bivalentes gp120 (VAX003) in einer Formulierung mit Alum benutzt. Studienteilnehmer der VAX004, die in Nordamerika und den Niederlanden durchgeführt wurde, waren in erster Linie Männer, die Sex mit Männern haben (Men who have sex with men, MSM). In der VAX003-Studie wurden hingegen injizierende Drogenkonsumenten (People who inject drugs, PWID) rekrutiert. Allerdings konnte in beiden Studien weder ein Schutz vor Infektion noch ein langsamerer Fortschritt der Krankheit nach Ansteckung in der Gruppe der immunisierten Personen festgestellt werden61–63. Dennoch wurde bereits in der nachfolgenden Auswertung der Studie festgestellt, dass die Rate der Ansteckung mit HIV negativ mit dem Auftreten von durch Antikörper vermittelte, zellabhängige Virusinhibition (antibodydependent cell-mediated virus inhibition, ADCVI) korrelierte64. Dieser Effekt zählt, wie auch die durch Antikörper vermittelte, zellabhängige Zytotoxizität (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), zu den sekundären Immunfunktionen von Antikörpern. Die Stärke und Effizienz dieser Mechanismen ist dabei in erster Linie von der durch die Immunantwort induzierte, vorherrschende Antikörpersubklasse abhängig, da die Affinität des Fc-Teils unterschiedlicher Antikörpersubklassen zu den Fc-Rezeptoren auf den Zellen variiert, die die entsprechende Reaktion auslösen65,66 (s. 1.1.4.3). Da es jedoch zunächst nicht möglich schien, einen Impfschutz durch das Provozieren einer humoralen Immunantwort zu generieren, wurde in den nächsten Studien versucht, eine zelluläre Immunantwort hervorzurufen. Hierfür wurden replikationsinkompetente adenovirale Vektoren des 10 Einleitung 1 Typs Ad5 verwendet, die die viralen Gene gag, pol und nef exprimierten. Mit einer solchen Immunisierung sollte die zelluläre Infektion mit HIV simuliert werden, um so eine Antwort der zytotoxischen T-Zellen auszulösen. Die STEP-Studie in den USA sowie die parallel gestartete PhambiliStudie in Südafrika, die mit diesen Vektoren durchgeführt wurden, mussten allerdings frühzeitig gestoppt werden, da die Impfung keinen Schutz vor einer Infektion erbrachte, und sogar die Inzidenz bei unbeschnittenen Männern bzw. Männern mit bereits vorliegender Immunität gegen den verwendeten adenoviralen Vektor erhöhte67,68. Obwohl der Impfstoff in der Lage war, eine HIVspezifische CD8+-T-Zellantwort zu induzieren, konnte diese die Teilnehmer der Studie weder vor einer Ansteckung schützen noch die Viruslast nach einer Ansteckung signifikant senken67,69. Interessanterweise hatten die CD8+-T-Zellen dennoch Auswirkung auf die Art der Viren, die zu einer Ansteckung führten, da diese sich explizit in der genetischen Sequenz der Proteine unterschieden, die in dem adenoviralen Impfstoff kodiert waren70. Eine weitere Studie verfolgte einen Ansatz, bei dem nach einer initialen Immunisierung (Prime) mit sechs DNA-Plasmiden, die Nef, Gag und Pol sowie Env-Proteine von drei Subklassen von HIV exprimierten, eine verstärkende Immunisierung (Boost) mit dem gleichen Ad5-Vektor wie in der Stepund Phambili-Studie durchgeführt wurde. Der Ad5-Vektor exprimierte hier neben Gag-Pol auch verschiedene Env-Varianten aus den Untergruppen A, B und C. Allerdings wurde auch diese Studie frühzeitig eingestellt, da die Immunisierung keinen Nutzen brachte71. 1.1.4.3 Das Ergebnis der RV144-Studie Die sechste und bislang einzige als erfolgreich zu bewertende Studie war die RV144-Studie, die in Thailand an Männern und Frauen zwischen 18 und 30 Jahren durchgeführt wurde, deren Hauptrisiko die Übertragung durch heterosexuellen Geschlechtsverkehr war72. Die Prime-Immunisierung bestand hier aus einem rekombinanten Vogelpocken-Vektor, der die Proteine Env, Gag, Protease und die Transmembranregion von gp41 exprimierte (ALVAC-HIV), während der Boost mit demselben ProteinImpfstoff (AIDSVAX B/E) durchgeführt wurde, der bereits beim VAX003 benutzt worden war61,72. Die Intention-to-treat-Analyse zeigte hierbei einen Schutz von 60,5 % nach 12 Monaten, der auf 31,2 % nach weiteren 30 Monaten zurückging. Obwohl nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass die Immunisierung dieser Studie weniger neutralisierende Antikörper induziert hatte als die der VAX003Studie, ergaben Korrelationsanalysen, dass sich der vermittelte Schutz dennoch mit großer Wahrscheinlichkeit auf Antikörper zurückführen ließ und deshalb die Qualität der Antikörper eine entscheidende Rolle spielen müsse73,74. Tatsächlich zeigten weiterführende Analysen, dass in der VAX003-Studie hauptsächlich IgG1, IgG2 und vor allem IgG4 induziert worden war, während sich die RV144-Studie durch die Induktion von IgG3-Antikörpern auszeichnete75. 11 Einleitung 1 Die IgG-Subklassen unterscheiden sich strukturell und durch unterschiedliche Glykosylierung des Fc-Teils, die zu einer unterschiedlichen Affinität sowohl zum C1q-Protein des Komplementsystems wie auch zu einer unterschiedlichen Affinität zu den verschiedenen Fc-Rezeptoren von Effektorzellen des Immunsystems führt76. Während die antikörpervermittelte Aktivierung des Komplementsystems zur Lyse eines von Antikörpern gebundenen Pathogens führt, hat die Bindung an die Fc-Rezeptoren, die auf fast allen Zellen des Immunsystems zu finden sind, unterschiedliche Folgen, je nachdem auf welcher Zelle der Rezeptor sich befindet oder ob er aktivierend bzw. inhibierend ist66. Während beispielsweise die Bindung von aktivierenden Fc-Rezeptoren auf Makrophagen die antikörpervermittelte Phagozytose (antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP) zur Folge hat, löst die Bindung an die Rezeptoren auf Natürlichen Killerzellen die antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität aus (antibody-dependent cellular cytotxicity, ADCC). Die unterschiedliche Affinität der Subklassen hat zur Folge, dass sie die jeweiligen Immunfunktionen unterschiedlich stark vermitteln. IgG3 hat dabei zusammen mit IgG1 die höchste Affinität zu den aktivierenden Fc-Rezeptoren und damit das größte Potential, Effektorfunktionen wie ADCC auszulösen65. IgG4 hingegen hat eine sehr viel geringere Affinität zu den aktivierenden Rezeptoren und wird mit einer rascheren Progression einer HIV-Infektion hin zu AIDS assoziiert77,78. Die Fähigkeit der Impfstoffkombination, ADCC zu vermitteln, konnte zudem bereits während des Phase-I/II-Stadiums der Studie gezeigt werden79. Aufgrund der höheren Wirksamkeit der in RV144 verwendeten Impfstoffkombination ist deshalb davon auszugehen, dass die Qualität der induzierten humoralen Immunantwort in Bezug auf die Fähigkeit, sekundäre Effektorfunktionen zu vermitteln, maßgeblichen Einfluss auf den Impfschutz hat. 1.1.4.4 Die Immunreaktion auf HIV-Env in Mäusen Im Kontext der Ergebnisse der RV144-Studie erscheint es sinnvoll zu versuchen, mit einer Immunisierung eine möglichst starke, dauerhafte IgG3-Antwort gegen HIV-Env zu generieren. Bisherige Immunisierungsstudien in Mäusen haben jedoch gezeigt, dass ein solches Vorhaben Herausforderungen birgt. Denn während bei Menschen IgG3 die höchste Affinität zu Fcγ-Rezeptoren hat und infolge dessen das höchste Potential besitzt, sekundäre, zellvermittelte Immuneffekte wie ADCC, ADCP und ADCVI auszulösen, kommt in Mäusen dieselbe Eigenschaft den IgG2a-Antikörpern zu66. Dabei ist eine von IgG2a dominierte Immunreaktion gleichzeitig mit einer Th1-Antwort verknüpft. Eine Immunisierung mit HIV-Env, sei es auf Protein- oder DNA-Basis, führt in Mäusen jedoch ohne weitere Modifikationen zu einer TH2-Reaktion, die von einer Prävalenz von IgG1 begleitet wird80–82. Das ist insofern bemerkenswert, da IgG1 im Vergleich zu IgG2a nicht nur etwa zehnmal stärker an den inhibitorischen Fc-Rezeptor FcγRIIb als an den aktivierenden Gegenrezeptor FcγRIII bindet und damit 12 Einleitung 1 weniger starke sekundäre Immunfunktionen auslöst66, sondern zudem belegt wurde, dass IgG1 allgemein weniger Schutz vor viralen Infektionen bietet83–85. Eine weitere Studie hat gezeigt, dass diese Reaktion spezifisch für HIV-Env ist, da Immunisierungen mit den strukturell vergleichbaren Oberflächenproteinen Hemagglutinin des Influenza-A-Virus (IAVHA) sowie dem Fusionsprotein des Respiratorischen Syncytialvirus (RSV-F) zu Reaktionen führten, bei denen IgG2a und IgG1 in gleichen Mengen gebildet wurde86. Ein direkter Vergleich der Daten zeigt, dass sich das Verhältnis von IgG2a zu IgG1 bei einer Immunisierung mit Env signifikant von dem bei Immunisierungen mit RSV-F, IAV-HA oder HIV-Gag unterscheidet (Abb. 4). Abb. 4: Vergleich der Verhältnisse von IgG2a zu IgG1 bei DNA-Immunisierung mit RSV-F, IAV-HA und HIV-Env, sowie dem Strukturprotein Gag von HIV. Die Daten für RSV-F und IAV-HA stammen aus (Stab et al., 2013)86, die Daten für HIV-Env und HIV-Gag aus (Storcksdieck et al., 2015)87. Die waagerechten Linien entsprechen dem geometrischen Mittel. Die statistische Auswertung erfolgte durch einen Kruskal-Wallis-Test gefolgt von einem Dunnschen Post-Test (** = p<0,01). Weiterhin zeigte eine Immunisierungsstudie mit unterschiedlichen Varianten von HIV-Env, die entweder membranständig oder löslich als Monomer oder als Trimer vorlagen, dass die Quartärstruktur von Env keinen Einfluss auf die Qualität der induzierten humoralen Immunantwort hat88. 1.2 Induktion und Polarisierung einer Immunantwort Die humorale Immunantwort ist neben der zellulären Immunantwort Teil der erworbenen Immunität und bezieht sich auf die immunaktiven Bestandteile des Blutes und der interstitiellen Flüssigkeiten. Sie wird in erster Linie von Antikörpern vermittelt, die ihrerseits von Plasma-B-Zellen sekretiert werden. Bis das geschieht, durchläuft die Immunreaktion verschiedene Stadien, die mit der allgemeinen Entzündungsreaktion beginnen, die mit dem Eindringen des Pathogens in den Organismus einhergeht, und der Reaktion des angeborenen Immunsystems fortgesetzt werden. Die Aufnahme und Zerstörung der Pathogene sowie die anschließende Präsentation von Bestandteilen dieser Pathogene durch Zellen des angeborenen Immunsystems führt zur Aktivierung der erworbenen Immunität und schließlich zu einer auf das jeweilige Pathogen spezifisch zugeschnittenen Immunreaktion. Dabei 13 Einleitung 1 erstreckt sich die Spezifität nicht nur auf die Produktion neutralisierender Antikörper, sondern beinhaltet auch grundlegende Entscheidungen über die Art der Immunreaktion im Hinblick auf Polarisierung der CD4+-T-Helferzellen. Dabei werden unterschiedliche Expressionsmuster aktiviert, die die Funktionalität der T-Helferzellen verändern (siehe Abschnitt 1.2.2.1). Je nach Polarisation sekretieren die T-Helferzellen unterschiedliche Zytokine, die wiederum auf die anderen Zelltypen des erworbenen Immunsystems einwirken. Dabei haben sie nicht nur Einfluss auf das Verhältnis der an der Immunreaktion beteiligten Zellen, insbesondere der zytotoxischen CD8+-T-Zellen und B-Zellen, sondern bestimmen auch die von diesen Zellen vermittelte Immunantwort. So führt eine TH1Polarisation der CD4+-T-Helferzellen beispielsweise zu einer verstärkten Aktivierung der zytotoxischen CD8+-T-Zellen und einem Klassenwechsel der von B-Zellen produzierten Antikörper hin zu IgG2a, während eine TH2-Polarisation verstärkt B-Zellen aktiviert und die Produktion von IgG1 hervorruft. Im Laufe der Induktion einer humoralen Immunantwort gibt es verschiedene Mechanismen, die diese Polarisation beeinflussen können und im Folgenden näher beleuchtet werden sollen. 1.2.1 Einflussnahme auf die Reaktion des angeborenen Immunsystems Auf das Eindringen eines Pathogens in den Organismus folgt i.d.R. eine Entzündungsreaktion, die sowohl durch das Pathogen selbst als auch durch beschädigte Zellen, z.B. bei einer mechanischen Verletzung des Gewebes, ausgelöst wird. Diese wird von spezialisierten Zellen des Immunsystems vermittelt, die in der Lage sind, anhand von wiederkehrenden molekularen Mustern Pathogene oder absterbende Zellen zu erkennen. Diese molekularen Muster sind bei Pathogenen die Strukturen, die wegen ihrer grundlegenden Funktion für die entsprechenden Pathogene evolutionär hoch konserviert sind. So wurde eine koevolutionäre Anpassung des angeborenen Immunsystems ermöglicht, das solche pathogen-assoziierten molekularen Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) anhand einer Reihe von Rezeptoren (pattern recognition receptors, PRR) zu erkennen vermag, von denen bislang vier große Familien identifiziert wurden. Jede der Familien und jeder Rezeptor innerhalb dieser Familien besitzt eine gewisse Spezifität für bestimmte Muster, sodass bereits an dieser Stelle Einfluss auf die nachfolgende Immunreaktion ausgeübt wird. Dabei spielt auch die Art der Zelle eine Rolle, von der das Pathogen mithilfe der PRR erkannt wird, da die PRR unterschiedlich auf die einzelnen Zelltypen verteilt sind. 1.2.1.1 Toll-Like-Rezeptoren (TLR) TLR sind in weiten Teilen des Tierreichs in verschiedenen Formen verbreitet. Sie konnten sogar in Fadenwürmern identifiziert werden89. In Säugetieren wurden bislang 13 paraloge TLR identifiziert, die eine große Bandbreite verschiedener PAMP erkennen können90. Während Menschen über zehn 14 Einleitung 1 verschiede TLR verfügen, die sich auf der Oberfläche bzw. auf der Innenseite endosomaler Vesikel von Zellen des angeborenen Immunsystems befinden, kommen Mäuse sogar auf zwölf. Jeder TLR erkennt eine eigene Gruppe von PAMP, darunter neben strukturellen Bestandteilen der Zellwände von Pathogenen auch Nukleinsäuren, die z.B. aus Viren stammen können. TLR reagieren auch auf nicht-pathogene Substanzen wie organismuseigene DNA, die z.B. nach einer Verletzung des Gewebes frei im interstitiellen Raum vorliegen kann. In diesem Fall wird, wie auch nach Bindung eines PAMP, eine Immunreaktion hervorgerufen, die zur Reinigung des Gewebes von Zelltrümmern führt und zur Wundheilung beiträgt91. Bei einer Infektion mit HIV spielen vor allem die endosomalen Rezeptoren TLR7 und TLR8 eine Rolle, die die genomische RNA des Virus erkennen, sowie die Rezeptoren TLR2 und TLR4, die HIV-Env binden können92,93. Allen Ektodomänen der TLR ist eine Leucine-Rich-Repeat-Domäne gemeinsam, die eine spulenartige Struktur formt. Darüber hinaus ist jede Ektodomäne der Bindung ihres spezifischen PAMPs evolutionär angepasst. Die Bindung eines Pathogens an einen der TLR führt häufig zu einer Heterodimerisierung von zwei TLR, die die intrazellulär liegenden Toll-IL-1R-Domänen (TIR) in direkten Kontakt bringt. Die so aktivierten Domänen rekrutieren das Adapterprotein myeloid differentiation primary response protein 88 (MyD88). Diese Reaktion ist bei allen TLR gleich – mit Ausnahme des TLR4, der MyD88 indirekt über ein weiteres Adapterprotein, MAL, bindet, sowie TLR3, der seine Signale über das Adaptorprotein TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β (TRIF) weiterleitet (Abb. 5)94. Abb. 5: TLR-Signalkaskaden. An die TLR-Adaptorproteine MyD88 und TRIF reihen sich weitere Adaptorproteine und Proteinkinasen, die im letzten Schritt zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie NFκB führen. Die verwendete Grafik stammt aus (Beutler 2004)90. 15 Einleitung 1 Die an die Adaptorproteine anschließende Signalkaskade führt zu einer je nach Zelltyp unterschiedlichen Veränderung der Transkription und Translation. So werden im Fall einer Gewebeverletzung mit eindringenden Pathogenen TLR auf Stromazellen aktiviert, was zur Produktion von antimikrobiellen Peptiden sowie von Zytokinen und Chemokinen führt, die Immunzellen aus dem umliegenden Gewebe und dem Blutkreislauf anlocken95,96. Bei Leukozyten führt eine Aktivierung der TLR im Allgemeinen zu einer Aktivierung der betreffenden Zelle, was z.B. bei Neutrophilen zur Produktion von zytotoxischen reaktiven Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species, ROS) und inflammatorischen Zytokinen führt97. Bei vielen Zellen führt die Aktivierung der TLR-Signalkaskaden zur Ausschüttung des inflammatorischen Zytokins IFNα98. Dieses dient der Aktivierung weiterer Immunzellen, wobei die Bindung von IFNα an den IFNA-Rezeptor eine Feedback-Schleife auslöst, die zu weiterer Produktion von IFNα führt99. Die Induktion von IFNα gehört zu den wichtigsten antiviralen Reaktionen der angeborenen Immunität, da es z.B. Natürliche Killerzellen dazu anregt, mit Viren infizierte Zellen abzutöten100,101. Des Weiteren induziert die Bindung von IFNα die Expression von IFN-stimulierten Genen, die z.B. Virusreplikation zu unterdrücken vermögen102. Außerdem kann IFNα zu einer verstärkten Aktivierung von DZ und Monozyten führen und in DZ die Sekretion von IL-12p70 bis zu einem gewissen Punkt verstärken, was zu einer TH1-Polarisation führt103. Eine exzessive Ausschüttung von IFNα Kann jedoch auch den gegenteiligen Effekt haben und die Produktion von IL-12p70 unterdrücken104. DZ nehmen als professionelle Antigen präsentierende Zellen (APZ) eine zentrale Rolle in der Vermittlung einer erworbenen Immunreaktion ein. Neben anderen PRR exprimieren sie je nach Subtyp ein unterschiedliches Muster von TLR. So exprimieren in Mäusen alle DZ-Subtypen die TLR 1, 2, 4, 6, 8 und 9, während den murinen plasmazytoiden DZ (pDZ) beispielsweise TLR3 fehlt, das in anderen Subtypen jedoch vorhanden ist105. Bereits der DZ-Subtyp hat Einfluss auf die Art der im Folgenden exprimierten Zytokine. So konnte gezeigt werden, dass aus dem Blut isolierte humane pDZ, die mit den künstlichen TLR7-Liganden Imiquimod und R-848 inkubiert wurden, vermehrt IFNα ausschütteten, während auf dieselbe Weise isolierte myeloide DZ (mDZ) IL-12 produzierten106. Darüber hinaus hat der TLR, an den ein Pathogen bindet, selbst entscheidenden Einfluss auf die Art des von der Effektorzelle produzierten Zytokins und damit auch auf die darauf folgende Polarisation der von der DZ aktivierten T-Zelle. Dabei folgt die Polarisation aus der Kombination verschiedener Zytokine, die auf die betreffende T-Zelle einwirken107. So führt die Bindung von entsprechenden Antagonisten an die Rezeptoren 3, 4, 5, 7 und 9 zu einer TH1-Polarisation108–111, während die Bindung an die Rezeptoren 1, 2 und 6 einen TH2-Phänotyp begünstigt109,110,112,113. Es wurde z.B. gezeigt, dass die Bindung an TLR4 und TLR5 die Produktion von IL-12p70 auslöst und damit im Folgenden eine TH116 Einleitung 1 Zellpolarisation begünstigt, während die Bindung an TLR2 die Produktion von IL-12 unterdrückt und damit eine TH2-Ausrichtung der adaptiven Immunantwort fördert110,114. 1.2.1.2 C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLR) Lektine sind eine in der Natur weitverbreitete Klasse von Proteinen, die Zuckerstrukturen binden können. Die größte Klasse von Lektinen stellen die C-Typ-Lektine mit 17 Unterklassen dar, bei denen die Bindung eines Kohlenhydrats von Ca2+ abhängig ist. Diese spielen u.a. in der angeborenen Immunantwort eine Rolle, da sie, ebenso wie die TLR, mikrobielle Strukturen erkennen und so als PRR dienen können. Die Bindung von Pathogenen an CLR führt in der Regel zur rezeptorvermittelten Aufnahme des Pathogens in die betreffende Zelle. Das spielt vor allem bei Makrophagen und DZ eine wichtige Rolle, da beide die Pathogene nicht nur in ihre Bestandteile zerlegen, sondern sie in Form von kurzen Peptiden auf MHC-Rezeptoren präsentieren. Wie alle C-Typ-Lektine verfügen die CLR über eine Ektodomäne mit mindestens einer CarbohydrateRecognition-Domäne (CRD), die ein durch Aminosäureseitenketten komplexiertes Ca2+ enthält115. Intrazellulär verfügen viele Rezeptoren über ein Bindungsmotiv namens Immunoreceptor tyrosinbased activation motif (ITAM), das die Bindung von Syk, einer Tyrosin-Kinase, ermöglicht. Die damit einhergehende Phosphorylierung von Syk und Syk-Substraten führt zur Rekrutierung eines Proteinkomplexes, der neben Bcl10 und MALT-1 auch das Adapterprotein CARD9 enthält. Der entstehende Komplex begünstigt wiederum die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie NFκB, NFAT und AP-1, die z.B. die Transkription proinflammatorischer Zytokine kontrollieren. Im Gegensatz zum ITAM verfügen andere CLR über das inhibitorische ITIM (Immunoreceptor tyrosin-based inhibition motif), das die Bereitschaft der Zelle zur Aktivierung und Reifung senkt. Wieder andere CLR geben ihre Signale unabhängig von ITAM oder ITIM weiter und sind deshalb auch nicht von CARD9 abhängig (Abb. 6)116. 17 Einleitung 1 Abb. 6: Signalkaskaden der C-Typ-Lektinrezeptoren. Exemplarisch für die möglichen aktivierenden Signalwege sind Dectin-1 (HemITAM), Dectin-2 und Mincle (ITAM-coupled) sowie DC-SIGN (ITAM-unabhängig) inklusive einiger bekannter Bindungspartner abgebildet. Die Abbildung stammt aus (Mayer et al. 2016)116. Bei einer Infektion mit HIV spielen CLR eine entscheidende Rolle. Über das stark glykosylierte Env binden HIV-Partikel z.B. an den CLR DC-SIGN. Auf diese Weise können sie entweder auf der Oberfläche der Zelle bzw. in Exosomen verbleiben und die Zelle auf diese Weise als Vehikel benutzen (in-transTransmission)117,118 oder sie können DZ infizieren, die CD4+ sind (cis-Transmission)119,120. In beiden Fällen trägt die DZ das Virus dann vom Ort der Infektion zu den Lymphknoten. Dort kann es sich dann weiter ausbreiten, da in diesen Regionen CD4+-T-Helferzellen in großer Konzentration vorhanden sind. Abgesehen von DC-SIGN wurde auch die Bindung von Env an ein anderes Lektin, den MannoseRezeptor, experimentell nachgewiesen, der im Gegensatz zu DC-SIGN vor allem auf Makrophagen zu finden ist. In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Bindung von HIV-Env an den Mannose-Rezeptor, aber auch an DC-SIGN, die Zytokin-Sekretion der entsprechenden Zellen verändert und diese IL-10 zu produzieren beginnen121. Eine andere Studie zeigte, dass die Bindung von Env zu einer verminderten Produktion von IL-12 führt122. Beide Effekte begünstigen die Entstehung einer TH2-Polarisierung der anschließenden adaptiven Immunreaktion. Die Beteiligung der CLR an der resultierenden Zytokinproduktion der APZ ist dabei häufig mit einer Beeinflussung der Signalkaskaden von anderen PRR – meist TLR – verbunden. So konnte gezeigt werden, dass die gleichzeitige Bindung an de Mannose-Rezeptors und den TLR4 zu einer TH2-Antwort führt, während die Bindung von TLR4 allein eine TH1-Antwort zur Folge hat123. Ein anderes Beispiel für 18 Einleitung 1 eine solche Beeinflussung geben die Rezeptoren MICL und DCIR, die beide über eine inaktivierende intrazelluläre ITIM-Domäne verfügen und damit in der Lage sind, die Aktivierung einer DZ über andere PRR zu unterdrücken124,125. Andere CLR wiederum vermitteln ohne weitere Interaktion mit anderen PRR eine Aktivierung der DZ und eine anschließende Polarisierung von T-Helferzellen. So führt z.B. die Bindung an Dectin-2 zu einer TH2-Antwort126, während die Bindung an Dectin-1 eine TH1-Reaktion begünstigt127. 1.2.1.3 Andere Pattern recognition receptors Neben den TLR und den CLR gibt es weitere Gruppen von PRR, die an der Rezeption von PAMP und DAMP (Damage-associated molecular patterns) beteiligt sind. Eine große Familie dieser PRR stellen die NOD-Like-Rezeptoren (NLR) dar. Diese Rezeptoren liegen intrazellulär vor, wo sie verschiedene bakterielle PAMP erkennen können – z.B. in Form von Peptidoglykanen. Sie können aber auch DAMP erkennen, die aus zytologischen Stressreaktionen entstehen. Nachdem ein PAMP gebunden wurde, dimerisieren NLR und bilden so eine molekulare Plattform, die zur Assemblierung von Signalkomplexen und der Bindung von Effektormolekülen dienen. Damit sind sie z.B. an der Initialisierung des Inflammasoms beteiligt, dessen Aktivierung zur Ausschüttung von IL-1β führt, einem stark proinflammatorischen Zytokin128. Die intrazellulären RIG-1-Like-Rezeptoren (RLR) erkennen hingegen einzel- und doppelsträngige RNA und sind damit wichtig für die Erkennung von RNA-Viren wie Hepatitis C oder Influenza. Nach der Bindung von RNA multimerisieren die Rezeptoren und initiieren eine Signalkaskade, die zu einem antiviralen Status der angeborenen Immunität und vor allem zur Ausschüttung von Typ-1-Interferonen führt129. Im Gegensatz zu den NLR und den RLR werden die Sialylsäure bindenden SIGLEC (Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins) nicht in erster Linie zu den PRR gezählt, obwohl einige der in Menschen bekannten 14 Mitglieder dieser Rezeptorfamilie durchaus zu einer proinflammatorischen Reaktion beitragen können130. Sialylsäure findet sich an der Spitze von komplexen Glykanen, die sich auf der Oberfläche von körpereigenen Zellen befinden. Aus diesem Grund dienen die SIGLEC in erster Linie der Selbsterkennung. Da die Rezeptoren zudem sehr kurz sind, werden sie in der Regel von Glykanen auf derselben Zelloberfläche überragt, sodass es selten zu Zell-Zell-Bindungen kommt. Die meisten SIGLEC haben eine intrazelluläre ITIM-Domäne und wirken deshalb inhibitorisch. Dieser Umstand wird von bestimmten Pathogenen ausgenutzt, da die gleichzeitige Bindung eines Pathogens an einen TLR und an ein SIGLEC zu einer Unterdrückung des Signals des TLR führen kann131,132. Außerdem wird die Bindung von Glykanen an SIGLEC von Pathogenen wie HIV benutzt, um z.B. die Infektion von Makrophagen zu erleichtern133. 19 Einleitung 1 1.2.2 Die Polarisierung der adaptiven Immunreaktion Die Bindung eines Pathogens an PRR führt zu dessen Aufnahme in die betreffende Zelle und deren Aktivierung. Im Fall von DZ wird das Pathogen innerhalb eines Endosoms verdaut. Die Bestandteile werden in Form kurzer Peptide auf MHCII-Komplexe geladen, die anschließend auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden. Durch die Aktivierung der Zelle wird die Expression dieser MCHII-Komplexe gesteigert. Zusätzlich kommt es zu einer vermehrten Expression der kostimulatorischen Membranproteine CD80 und CD86, die für die Aktivierung von T-Zellen benötigt werden. Die gesenkte Expression von Chemokinrezeptoren spezifisch für das inflammatorische Chemokin CCR6 und die gesteigerte Expression von Rezeptoren spezifisch für das lymphatische Chemokin CCR7 führen dazu, dass die aktivierte DZ den Entzündungsherd verlässt und in den nächstgelegenen Lymphknoten einwandert134,135. Dort trifft sie auf naive CD4+-T-Helferzellen, die beginnen, mit der DZ zu interagieren. Nur wenn eine CD4+-T-Helferzelle über einen T-Zellrezeptor trägt, der über genügend Affinität zu den präsentierten Peptid-MHCII-Komplex verfügt, kann eine stabile Verbindung hergestellt werden, und die DZ ist in der Lage, die naive T-Zelle zu aktivieren. Die beiden zur Aktivierung der Zelle benötigten Signale sind zum einen die Bindung des T-Zellrezeptorkomplexes an den MHCII-Komplex und zum anderen die Bindung des Kofaktors CD28 an die kostimulatorischen Moleküle CD80 oder CD86 auf der Oberfläche der APZ. Zytokine, die an die entsprechenden Rezeptoren der T-Helferzelle binden, liefern das dritte Signal, das maßgeblich zur Differenzierung der Zelle beiträgt. 1.2.2.1 Die Polarisierung von CD4+-T-Helferzellen Die Zytokine, die während der Aktivierung durch die DZ an die entsprechenden Zytokinrezeptoren der CD4+-T-Helferzelle binden, bestimmen im Folgenden das Expressionsmuster und damit die Differenzierung der Zelle. Dabei sind verschiedene Polarisierungen möglich. Durch die gleichzeitige Bindung von IL-12 während der Aktivierung wird beispielsweise eine TH1-Polarisierung eingeleitet. Dabei wird durch die Bindung von IL-12 an den IL-12-Rezeptor ein JAK-STAT-Signalweg ausgelöst, der zur Expression des Transkriptionsfaktors T-bet führt. Dieser dient als Schlüsseltranskriptionsfaktor und steuert die weitere Differenzierung der Zelle in TH1-Richtung, während gleichzeitig die Expression anderer Schlüsseltranskriptionsfaktoren unterdrückt wird136. Ausdifferenzierte TH1-Zellen zeichnen sich durch eine hohe Produktion von IFNγ aus, das auch autokrin wirkt und die Expression von IFNγ weiter verstärkt137. Darüber hinaus unterstützt IFNγ die Immunreaktion auf intrazelluläre Pathogene wie Viren und bestimmte Bakterien, indem es u.a. Natürliche Killerzellen (NK) aktiviert, die wiederum infizierte Zellen abtöten können. Makrophagen werden durch IFNγ in einen verstärkt mikrobiziden Zustand versetzt. Zudem induziert die Bindung von IFNγ in vielen Zelltypen die Transkription einer 20 Einleitung 1 langen Reihe intrazellulärer Faktoren wie z.B. der durch doppelsträngige RNA (dsRNA) induzierbaren Proteinkinase R (PKR) oder die dsRNA-spezifische Adenosin-Deaminase (dsRAD), die antiviral wirken138. Eine TH2-Polarisierung wird ebenso wie die TH1-Polarisierung durch eine Aktivierung von naiven CD4+-T-Helferzellen durch DZ erreicht. Das Zytokin, das entscheidend zu dieser Form der Differenzierung beiträgt, ist IL-4. Anders als IL-12 scheint es jedoch nicht von DZ bereitgestellt zu werden, weshalb weitere Mechanismen in Betracht gezogen werden, die eine TH2-Polarisierung begünstigen können139,140. Einige Studien legen nahe, dass eine TH2-Polarisierung durch die Stärke des Signals der T-Zellrezeptoren beeinflusst wird. So zeigte ein in vitro-Versuch, dass die Stimulation einer CD4+-T-Zellantwort mit geringen Dosen eines Peptids eine TH2-Antwort induziert, während eine hohe Dosierung desselben Peptids eine TH2-Polarisierung unterdrückt141. Eine andere Studie, in der die immunstimulatorische Wirkung von Komponenten eines Extrakts aus Eiern von Schistosoma mansoni untersucht wurde, legte den Schluss nahe, dass bestimmte Antigene einen dämpfenden Einfluss auf die Interaktion von DZ mit T-Helferzellen haben können und auf diese Weise eine TH2-Polarisierung herbeiführen142. Wenn die TH2-Polarisierung eingeleitet ist, produzieren die T-Helferzellen den Schlüsseltranskriptionsfaktor GATA-3, der die Differenzierung weiter unterstützt. Neben IL-4, das wie IFNγ autokrin verstärkend auf die Polarisierung, aber auch auf andere Effektorzellen wirkt, produzieren TH2-Zellen außerdem IL-5 und IL-13. Diese Zytokine wirken in den entzündeten Geweben rekrutierend und aktivierend auf Effektorzellen wie Eosinophile, aber auch auf Epithelzellen und Zellen der glatten Muskulatur143. Die Immunreaktion, die durch diese zusammenwirkenden Effekte hervorgerufen wird, dient in erster Linie der Bekämpfung extrazellulärer Parasiten144,145, ist jedoch auch der Grund für allergische Reaktionen und kann im Fall von allergischem Asthma lebensbedrohliche Züge annehmen146. Neben den hier ausgeführten Polarisationen sind weitere Differenzierungen möglich. So können T-Helferzellen auch unter dem Einfluss von TGFβ und IL-6 während der Stimulation des T-Zellrezeptors zu TH17-Zellen polarisiert werden. Diese Zelllinie wird von dem Schlüsseltranskriptionsfaktor RORγt kontrolliert und exprimiert in erster Linie das Zytokin IL-17. TH17-Zellen dienen der Bekämpfung von Infektionen mit extrazellulären Bakterien und Pilzen. Eine Stimulation naiver T-Helferzellen mit TGFβ in der Abwesenheit von IL-6 kann auch zur Entwicklung von induzierten regulatorischen T-Helferzellen (iTreg) führen, die durch das Ausschütten von TGFβ und vor allem IL-10 dämpfend auf alle Immunreaktionen wirken und so ihr Überschießen verhindern sollen141,147. T-Helferzellen, die solcherart polarisiert werden, wandern aus den Lymphknoten in das periphere Gewebe, wo die von ihnen ausgeschütteten Zytokine Einfluss auf die Bekämpfung der Infektion nehmen. Follikuläre T-Helferzellen (TFH) hingegen, die eine weitere Form der Polarisation darstellen, verbleiben in den Lymphknoten. Wie die anderen Unterarten von CD4+-T-Helferzellen werden auch die TFH von DZ geprägt148. Dabei wird durch das Einwirken von IL-6 und IL-21 die Expression des 21 Einleitung 1 Schlüsseltranskriptionsfaktors Bcl-6 angeregt, der wiederum die Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 auslöst149,150. Dieser befähigt die TFH, sich innerhalb der Lymphknoten von der T-Zellzone weg hin zu den B-Zellfollikeln zu bewegen, wo sie durch pathogenaktivierte B-Zellen durch verschiedene Mechanismen bei ihrer Reifung und Anpassung an das Pathogen unterstützen148,151,152. 1.2.2.2 Klassenwechsel und Hypermutation von B-Zellen Bevor B-Zellen in den B-Zellfollikeln von Lymphknoten weiter heranreifen können, müssen sie im peripheren Gewebe auf ein Pathogen getroffen sein, an das sie mit ihrem B-Zellrezeptor (BZR) spezifisch binden können. Der BZR entsteht während der Reifung von B-Zellvorläufern im Knochenmark, wo in einem enzymgesteuerten, zufallsbasierten Prozess bestimmte Gensegmente der Proteinketten, aus denen dieser Rezeptor besteht, neu arrangiert werden. Durch diesen Vorgang entsteht eine enorme Bandbreite verschiedener BZR, die eine Vielzahl von Antigenen erkennen können. Bindet die Zelle über den BZR ein solches Antigen, wird der BZR samt Antigen internalisiert. Das Antigen wird wiederum nach Prozessierung wie bei DZ auf MHCII-Komplexen präsentiert. Gleichzeitig beginnt die B-Zelle chemotaktisch in Lymphknoten einzuwandern, wo sie den Kontakt zu TFH sucht. Eine TFH, die durch dasselbe Antigen aktiviert wurde, kann die B-Zelle durch Interaktion mit ihrem MHCII-Komplex aktivieren. Dieser Vorgang führt zur Proliferation, Hypermutation und zum Klassenwechsel der B-Zelle. Die Hypermutation stellt eine verfeinerte Anpassung an das betreffende Antigen dar. Dabei wird der Genlocus des B-Zellrezeptors erneut mutiert, wobei diejenigen B-Zellen positiv selektioniert werden, deren resultierender Rezeptor eine höhere Affinität zum Antigen aufweist als zuvor153. Der Klassenwechsel führt schließlich zur Produktion von Antikörpern. Der BZR, der eine membrangebundene Form eines Antikörpers darstellt, wird dabei erneut mutiert, wobei der bis zu diesem Zeitpunkt membranständige Teil des Rezeptors ausgetauscht wird. Die dafür zur Verfügung stehenden Gensegmente bestimmen im Folgenden die Klasse der von der Zelle produzierten Antikörper, z.B. IgA, IgE, IgG1 oder IgG2a/b. Der Klassenwechsel wird dabei von Zytokinen beeinflusst, die von der TFH bereitgestellt werden, wobei TH1-Zytokine einen Klassenwechsel zu IgG2a und TH2-Zytokine einen Klassenwechsel zu IgG1 begünstigen. 22 Einleitung 1 1.3 Zielsetzung Eine Immunisierung von Mäusen mit HIV-Env, sei es mit Proteinen oder DNA, ruft eine TH2-lastige Antwort hervor, bei der weniger IgG2a als IgG1 gebildet wird. Mit einer gleichartigen Immunisierung mit den viralen Oberflächenproteinen RSV-F und IAV-HA, die Env in Aufbau und Struktur ähneln, wird hingegen eine TH1-Antwort hervorgerufen, bei der sich IgG1 und IgG2a im Gleichgewicht befinden. Wie die Ergebnisse nicht nur der RV144-Studie gezeigt haben, ist die Art der induzierten Antikörperklasse wichtig für die vermittelte Schutzfunktion eines Impfstoffs. Ziel dieser Arbeit ist deshalb herauszufinden, welche Mechanismen der andersartigen Immunreaktion gegen HIV-Env zugrunde liegen. Um den Grund für die TH2-lastige Immunantwort zu finden, soll zunächst der unmittelbare Einfluss des Env-Proteins auf ein zweites, an Env fusioniertes Protein mittels DNA-Immunisierung untersucht werden. Unter der Annahme, dass die fusionierten Proteine von derselben APZ aufgenommen und gleichzeitig präsentiert werden, kann Einsicht über den Zeitpunkt gewonnen werden, an dem sich der Einfluss von Env auf die Richtung der Immunantwort auszuwirken beginnt. Folgend werden verschiedene Mechanismen der angeborenen Immunität untersucht, die einen Einfluss auf die Polarisierung einer Immunreaktion nehmen können. Im Fokus stehen dabei die Auswirkung von Env auf die IFNα-Produktion von Splenozyten, der Einfluss der Signalweitergabe durch TLR und CLR sowie die Bindung von Env an verschiedene CLR im Vergleich mit RSV-F und IAV-HA. Schließlich wird der Einfluss der Struktur von Env auf die Immunreaktion überprüft, indem das Protein schrittweise verkürzt und gegebenenfalls durch Mutation an Schlüsselpositionen verändert wird. Damit ergeben sich nicht nur Möglichkeiten für zukünftige Modifikationen eines Impfstoffes, sondern es lassen sich auch weitere Rückschlüsse auf den zugrunde liegenden Mechanismus ziehen. 23 Material und Methoden 2 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 2-Propanol J. T. Baker Acrylamid-Llösung 30 % (Mix 37, 5:1) AppliChem Agar AppliChem Agarose Roth Aluminiumsulfat AppliChem Ampicillin-Na AppliChem β-Mercaptoethanol AppliChem Bovines Serumalbumin Sigma Bromphenolblau Fluka Calciumchlorid J. T. Baker Coomassie Brillant Blau Serva DMSO J. T. Baker EDTA Merck Essigsäure VWR Ethanol Sigma-Aldrich Ethidiumbromid AppliChem FCS Gibco Glycerin J. T. Baker Glycin Roth Harnstoff J. T. Baker Hefeextrakt AppliChem HEPES AppliChem Imidazol Alfa Aesar Isofluran CP-Pharma Kanamycinsufat AppliChem Ketamin CP-Pharma Luminol-Na Sigma Magermilchpulver Heirler 24 Material und Methoden Magnesiumchlorid J.T. Baker Methanol Sigma-Aldrich Monensin-Na Sigma Natriumazid AppliChem Natriumcarbonat J. T. Baker Natriumchlorid J. T. Baker Natriumhydrogencarbonat J. T. Baker Natriumhydroxid J. T. Baker Natriumhypochlorit AppliChem ortho-Phosphorsäure J. T. Baker p-Cumarinsäure Sigma Paraformaldehyd Riedel-de Haën Penicillin-Streptomycin Gibco Polyethylenimin Aldrich Saccharose J. T. Baker Saponin Sigma SDS AppliChem TAE 50x AppliChem TBE 5x AppliChem TEMED Merck Trizma base Sigma Trypton AppliChem Tween-20 AppliChem Wasser B. Braun Wasserstoffperoxid J. T. Baker Xylavet CP-Pharma 2 25 Material und Methoden 2 2.1.2 Verbrauchsgegenstände Blot-Papier Macherey-Nagel Einwegpipetten, 5 mL, 10 mL, 25 mL Greiner Bio One Filterpapier, gefaltet Macherey-Nagel Hämatokrit-Kapillaren, heparinisiert, 10 µL Hirschmann Laborgeräte Kulturgefäß, Plastik, 13 mL Sarstedt Mikrotiter-/Multiwellplatten mit 6, 24, 48 oder 96 wells Falcon, Greiner Bio One, Nunc, Sarstedt Ni-Sepharose Excel GE Healthcare Nitrocellulosemembran, 0,45 µm GE Healthcare Pipettenspitzen, 10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL Starlab Reaktionsgefäße, 0,2 mL, 1,5 mL, 2 mL, 15 mL, 50 mL Greiner Bio One Reaktionsgefäße, 5 mL Eppendorf Spritzen, 0,5 mL, 1 mL, 5 mL, 20 mL, 50 mL B. Braun, BD Medical, Henry Schein, Terumo Sterilfilter für Spritzen, 0,2 µm, 0,45 µm Sarstedt UV-Küvetten, Einweg BRAND Zellkulturflaschen, 25 cm2, 75 cm2, 175 cm 2 Greiner Bio One Zellschaber TPP Zellsieb BD Falcon Zentrifugationskonzentratoren, 10 000, 30 000, 50 000, 100 000 MWCO Sartorius 2.1.3 Instrumente Alphaimager HP Protein Simple Analysewaage SBA31 Scaltec Autoklav 75S/135S H+P Labortechnik BioPhotometer Eppendorf Durchflusszytometer FACS Canto II BD Biosciences Eismaschine AF 100 Scotsman Elektrophorese-System PerfectBlue PeqLab 26 Material und Methoden 2 Elektrophorese-Systeme Mini Protean 3 und Tetra Cell Bio-Rad Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100 Zeiss Hitzesterilisator T6420 Heraeus Inkubator Aerotron Infors HT Inkubator Hera Cell 240 Heraeus Inkubator HS 12 Heraeus Inkubator Unitron Infors HT Kühlschrank Bosch, Siemens Luminometer Hamamatsu Photonics Magnetrührer RCT standard IKA Mikroplattenluminometer Orion Berthold Detection Systems Mikroplattenlesegerät Sunrise Tecan Mikroplattenwaschgerät Wellwash 4 MK2 Thermo Scientific Mikroskop TMS-F Nikon MikrowelleR-22A Sharp pH-Meter pH211 HANNA instruments Pipettierer Pipetus Hirschmann Laborgeräte Präzisionswaage SPB63 Scaltec Rührschüttler Centomat SII B. Braun Biotech International Rührschüttler DRS12 Neolab Rührschüttler IKA-Vibrax-VXR IKA Rührschüttler Polymax 1040 Heidolph Rührschüttler REAX 2000 Heidolph Rührschüttler Roller Drum Bellco Glass, Inc. Rührschüttler UZUSIO VTX-3000L LMS Rührschüttler Vortex Genie 2 Scientific Industries Rührschüttler Vortex Genius 3 IKA Spannungsgeber E853 Consort Spannungsgeber PowerPack P25 Biometra Stickstofftank Cryosystem 6000 MVE Thermocycler PTC-100 MJ Research Thermocycler PTC-200 MJ Research Thermomixer Comfort Eppendorf 27 Material und Methoden Tiefkühlschrank -20 °C AEG, Bosch, Liebherr, Siemens Tiefkühlschrank V86-500.1 Ewald Innovationstechnik GmbH Tiefkühlschrank -86C VIP series Sanyo Tiefkühlschrank ULT -86 Thermo Forma Volumenpipetten, variabel Thermo Scientific Wasserbad Breda Scientific Wasserbad 1086 GFL Zellzähler Z2 Beckman Coulter Zentrifuge 5417C Eppendorf Zentrifuge 5810R Eppendorf Zentrifuge 6K15 Sigma Zentrifuge Allegra X-15C Beckman Coulter Zentrifuge Avanti J-25 Beckman Zentrifuge Rotina 420R Hettich Zentrifugen 2 2.1.4 Nukleinsäuren 2.1.4.1 Plasmide pCD-Fsyn: codonoptimiertes Expressionsplasmid für das Protein RSV-F unter der Kontrolle des CMV-Promotors. Das Plasmid diente als Vorlage für die Klonierung des Immunisierungsplasmids pV-FoTM-p24. pCD-FsynED-myc-decahis: codonoptimiertes Expressionsplasmid für das Protein RSV-F zur Überexpression in Zellkultur. Zusätzlich zum myc-Tag wurde für eine optimierte Aufreinigung eine Linkersequenz und ein verlängerter His-Tag mit zehn Histidin-Resten eingefügt. pConBgp140G/CD: codonoptimiertes Expressionsplasmid für ein membranständiges HIV-1 consensus clade B gp140, das mit der zytosolischen sowie Transmembrandomäne von VSV-G fusioniert wurde. Die Expression unterliegt der Kontrolle des CMV-Promotors. pConBgp160UNCopt: codonoptimiertes Expressionsplasmid für HIV-1 consensus clade B gp160. Die Furinschnittstelle wurde durch den Austausch zweier Arginine gegen jeweils ein Serin unterbrochen. Das Plasmid diente als Donor für gp120 und gp140 für die Erstellung der Immunisierungsplasmide pVgp120-p24 und pV-gp140-p24. pDsRed: Expressionsplasmid für das Rot fluoreszierende Protein von Discosoma sp. Die Expression unterliegt der Kontrolle des CMV-Promotors. 28 Material und Methoden 2 pFsyn-tra-VSV-Gsyn: Expressionsplasmid für eine membranständige Version von RSV-F. Das exprimierte Protein enthält die Transmembrandomäne von RSV-F, die zytosolische Domäne wurde jedoch durch die von VSV-G ersetzt. pGreenLantern (pGL): Expressionsplasmid für das Grün Fluoreszierende Protein (GFP). Die Expression unterliegt der Kontrolle des CMV-Promotors. pVax1: ein Plasmid, das für die Entwicklung von DNA-Impfstoffen gestaltet wurde. Neben dem CMV-Promotor enthält es die Polyadenylierungssequenz des Bovinen Wachstumshormons (Invitrogen). pV-FoTM-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein F-p24. F stammt aus dem Plasmid pCI-Fsyn und wurde ohne die Transmembrandomäne kloniert, sodass ein lösliches Translationsprodukt entstand. pV-gp120-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein gp120-p24. gp120 wurde aus dem Plasmid pConBgp160UNCopt kloniert. pV-gp140-decahis: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Protein gp140 zur Expression und Aufreinigung aus Zellkulturüberstand. Für eine optimierte Aufreinigung wurden eine Linkersequenz und ein verlängerter His-Tag mit zehn Histidin-Resten eingefügt. pV-gp140-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein gp140-p24. gp140 wurde aus dem Plasmid pConBgp160UNCopt kloniert. pV-gpV1V2-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein V1V2p24. V1V2 ist eine Variante von gp140, die hinter der zweiten variablen Domäne V2 endet. pV-gpV3-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein V3-p24. V3 ist eine Variante von gp140, die hinter der dritten variablen Domäne V3 endet. pV-gpV3NQ-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein V3-p24. V3NQ ist eine Variante von gp140, die hinter der dritten variablen Domäne V3 endet. Im Bereich von C2 und V3 wurden alle für Asparagin kodierenden Codons gegen für Glutamin kodierende Codons ausgetauscht. pV-gpV4-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein V4-p24. V4 ist eine Variante von gp140, die hinter der vierten variablen Domäne V4 endet. pV-gpV5-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein V5-p24. V5 ist eine Variante von gp140, die hinter der fünften variablen Domäne V5 endet. pV-HAoTM-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Fusionsprotein HA-p24. HA stammt aus dem Plasmid pV-HA(PR8)opt-OLLA und wurde ohne die Transmembrandomäne kloniert, sodass ein lösliches Expressionsprodukt entstand. 29 Material und Methoden 2 pV-HAoTM-decahis: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Protein HA zur Expression und Aufreinigung aus Zellkulturüberstand. Für eine optimierte Aufreinigung wurde eine Linkersequenz und ein verlängerter His-Tag mit zehn Histidin-Resten eingefügt. pV-HA(PR8)opt-OLLA: codonoptimiertes Expressionsplasmid für IAV-HA des H1N1-Stammes A/Puerto Rico/8/1934. Das Plasmid diente als Donor für gp140 für die Erstellung des Immunisierungsplasmids pV-HAoTM-p24. pV-mDEC-HIVp24a: Expressionsplasmid für das Fusionsprotein mDEC-p24 unter der Kontrolle des CMV-Promotors. Dieses Plasmid diente als Donor für p24 der in dieser Arbeit verwendeten Immunisierungsplasmide. pV-tpa-p24: das Plasmid pVax1 mit einer Expressionskassette für das Protein p24. Um eine effektive Sekretion des Proteins zu erreichen, wurde es mit der der Signalsequenz des Gewebespezifischen Plasminogenaktivators (tissue-type plasminogen activator) fusioniert. 2.1.4.2 Oligonukleotide Alle verwendeten Oligonukleotide wurden bei Biomers in Auftrag gegeben und werden hier in 5‘3‘-Orientierung dargestellt. Sense HAoTM/FoTM ACTTAAGCTTGCCACCATG Antisense HAoTM GCCGGAATTCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGTAGATGCCCA TGCTCTCCA Antisense FoTM GCCGGAATTCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGTTGGTGGTGC TCTTGCCGG Sense gp140 GATCAAGCTTCCACCATGCGCGTGAAGGGCATCCG Antisense gp140 GCCGGAATTCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCCTTGATGTACCA CAGCCAGT Antisense gp120 GGCGGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGCTCTTCTCGCTCTGCACCA Sense tPA ACTTAAGCTTGCCACCATGGACGCCATGAA Antisense tPA CGCCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGCTAGCGCTGGGGCTCACAA Sense FsynEDhis10 CCGGTAGCGGAAGCGGGTCCGGCTCCGGCAGCGGAAGCGGGTCCGGCTCCG GCTCCGGCAGCGGACATCACCATCACCACCATCATCACCATCACTAGGTTT Antisense FsynEDhis10 AAACCTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGATGGTGATGTCCGCTGCCGGAGCC GGAGCCGGACCCGCTTCCGCTGCCGGAGCCGGACCCGCTTCCGCTA Sense HAoTMhis10 GATCCAGCGGAAGCGGGTCCGGCTCCGGCAGCGGAAGCGGGTCCGGCTCCG GCTCCGGCAGCGGACATCACCATCACCACCATCATCACCATCACTAGC 30 Material und Methoden 2 Antisense TCGAGCTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGATGGTGATGTCCGCTGCCGGAGC HAoTMhis10 CGGAGCCGGACCCGCTTCCGCTGCCGGAGCCGGACCCGCTTCCGCTG Antisense V5 GATCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGATCTCGGTGTCGTTGTTGT Antisense V4 GATCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGCAGGGCAGGGTGATGGTGT Antisense V3 GATCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGCAGTGGGCCTGGCGGATGT Antisense V1V2 GATCGGATCCCCCTCCCCCGGAGCCGCCGCAGGAGATCAGGCGGTAGG 2.1.5 Standards Für die Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten wurden die Größenstandards GeneRuler 100 bp bzw. GeneRuler 1 kb (beide Fermentas/Thermo Scientific) eingesetzt. Als Größenstandard für die SDS-PAGE bzw. für den Westernblot wurde der Größenstandard Precision Plus Protein Dual Color Standard (Bio-Rad) verwendet. 2.1.6 Peptide Gag MHC I AMQMLKETI Gag MHC II (1) PVGEIYKRWIILGLN Gag MHC II (2) SPEVIPMFSALSEGA Env MHC II GVPVWKEATTTLFCASDAKA F MHC II GWYTSVITIELSNIKE HA MHC II SFERFEIFPKE 2.1.7 Antikörper Antikörper Reaktivität Klonalität Wirt Konjugation Quelle α-CD107a Maus monoklonal Ratte AlexaFluor488 eBioscience α-CD16/32 Maus monoklonal Ratte - BD Biosciences α-CD28 Maus monoklonal Hamster - BD Biosciences α-CD3 Maus monoklonal Hamster - BD Biosciences α-CD4 Maus monoklonal Ratte PerCP-eFluor710 eBioscience α-CD8 Maus monoklonal Ratte Pacific Blue BD Biosciences α-F/HA RSV-F/IAV-HA polyklonal Maus - eigene Abteilung α-gp120 HIV-1 polyklonal Ziege - Acris 31 Material und Methoden 2 α-His Polyhistidin monoklonal Maus - Invitrogen α-IFNγ Maus monoklonal Ratte PE eBioscience α-Ig Maus polyklonal Kaninchen HRP Dako α-Ig Mensch monoklonal Maus FITC eBioscience α-Ig Mensch monoklonal Maus HRP Invitrogen α-Ig Ziege polyklonal Kaninchen HRP Dako α-IgG1 Maus monoklonal Ratte HRP BD Biosciences α-IgG2a Maus monoklonal Ratte HRP BD Biosciences α-IL-2 Maus monoklonal Ratte APC BD Biosciences α-p24 HIV-1 monoklonal Maus - NIH AIDS reagent program α-TNFα Maus monoklonal 2.1.8 Enzyme Alle Enzyme wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt. Restriktionsendonukleasen New England Biolabs Expand-High-Fidelity DNA-Polymerase Roche 32 Material und Methoden 2 2.1.9 Kits Methode Kit Hersteller DNA-Ligation DNA Ligation Kit Ver. 2.1 TaKaRa ELISA Ready-SET-Go! ELISA Kit eBioscience Gelelution Nucleospin gel extraction and Macherey-Nagel PCR clean-up kit Luciferase-Assay Bright-Glo Luciferase Assay Promega System Plasmidisolierung RotiPrep Plasmid MINI Roth Plasmidisolierung JETstar 2.0 Plasmid Purification Genomed MAXI Kit Plasmidisolierung NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel Proteinkonzentration Coomassie Plus Protein Assay Thermo Scientific Reagent Western Blot ChemiGlow West Alpha Innotech 2.1.10 Puffer und Medien Die verwendeten Puffer wurden grundsätzlich mit entmineralisiertem Wasser hergestellt. Für Methoden, bei denen eine hohe Reinheit gefragt war, wurde zum Ansetzen der Puffer steriles Wasser der Firma B. Braun Melsungen AG eingesetzt. Wegen des umfassenden Einsatzes in allen Bereichen ist die Zusammensetzung der konzentrierten PBS-Vorratslösung hier gesondert aufgeführt. DPBS, 10x (Gibco) KCl 26,7 mM KH2PO4 14,7 mM NaCL 1,38 mM Na2HPO4 80,6 mM pH 7,4 33 Material und Methoden 2.1.10.1 2 Puffer und Medien für molekularbiologische Methoden LB-Medium DNA-Ladepuffer Harnstoff 4M Hefeextraxt 5 g/L Saccharose 50 % (w/v) Trypton 10 g/L EDTA 0,1 M NaCl 5 g/L Bromphenolblau 0,1 g pH 7 LB-Agar Ampicillin oder 100 µg/mL Kanamycin 50 µg/mL TAE, 50x (Applichem) Agar 1,5 % (w/v) In LB-Medium EDTA 0,05 M Essigsäure 1M Tris 2M pH 8,5 TBE, 5x (Applichem) SOC-Medium (Invitrogen) Borsäure 0,445 M Trypton 2 % (w/v) EDTA 0,1 M Hefeextrakt 0,5 % (w/v) Tris 0,445 M NaCl 10 mM pH 8,3 KCl 2,5 mM MgCl2 10 mM MgSO4 10 mM Glukose 20 mM pH 7,0 2.1.10.2 Puffer und Medien für proteinbiochemische Methoden Aufreinigungspuffer Blockpuffer PBS WB-Waschpuffer Imidazol 20 mM Coomassie, kolloidal Coomassie Brillant Blau Magermilchpulver 5 % (w/v) Elutionspuffer 0,02 % (w/v) PBS 34 Material und Methoden Aluminiumsulfat 5 % (w/v) Imidazol Ethanol 10 % (v/v) Proteaseinhibitor-Mix ortho-Phosphorsäure 2 % (v/v) (Roche) Entfärber 2 500 mM SDS-Probenpuffer Ethanol 10 % (v/v) Tris 150 mM ortho-Phosphorsäure 2 % (v/v) Glycerin 30 % (v/v) SDS 1,2 % (w/v) Bromphenolblau 0,018 ‰ (w/v) β-Mercaptoethanol 15 % (v/v) Transferpuffer Tris 2 mM Glycin 15,2 mM Methanol 20 % (v/v) Tris/Glycin Tris/HCl 6,8 Tris 0,5 M mit HCl auf pH 6,8 Tris 2,5 mM Glycin 19 mM SDS 0,1 % (w/v) Tris/HCl WB-Waschpuffer Tris 2M PBS Mit HCl auf pH 8,8 Tween-20 2.1.10.3 0,1 % (v/v) Puffer und Medien für zytologische Methoden Vollmedium (DMEM) Medium für Transfektion und Aufreinigung: DMEM (Invitrogen) DMEM (Invitrogen) + FCS (Gibco) 10 % (v/v) + Penicillin-Streptomycin (Gibco) 1 % (v/v) + Penicillin-Streptamycin (Gibco) 1 % (v/v) 10x Trypsin-EDTA (Invitrogen) NaCl 147 mM EDTA 4,8 mM Trypsin 5 g/mL 35 Material und Methoden 2.1.10.4 2 Puffer und Medien für immunologische Methoden Bicarbonatpuffer ACK-Lysepuffer (Lonza) NH4Cl 150 mM Na2CO3 0,1 M KHCO3 10 mM NaHCO3 0,1 M EDTA 0,01 mM pH 9,5 ECL-Lösung ELISA-Waschpuffer Lösung A: PBS Tris/HCl pH8,6 0,1 M Luminol 250 mg/L Lösung B: p-Cumarinsäure Tween-20 0,05 % FACS-Puffer 1,1 mg/mL PBS in DMSO BSA 0,5 % (w/v) Arbeitslösung: NaN3 1 mM Lösung A + 1 % Lösung B HBSS (Invitrogen) + 0,01 % H2O2 (v/v) KCl 5,33 mM KH2PO4 0,44 mM Lektinpuffer NaHCO3 4,17 mM FACS-Puffer NaCl 137,93 mM CaCl2 5 mM Na2HPO4 0,34 mM MgCl2 5 mM D-Glucose 5,55 mM Permeabilisierungpuffer R10 FACS-Puffer RPMI 1640 (Invitrogen) Saponin 1 % (w/v) FCS (Gibco) 10 % (v/v) HEPES 10 mM L-Glutamin (Gibco) 2 mM Penicillin-Streptomycin 1% (Gibco) β-Mercaptoethanol 50 µM 36 Material und Methoden 2 2.1.11 Bakterien Stamm Genotyp Hersteller DH5α supE44 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 New England Biolabs 2.1.12 Eukaryotische Zelllinien HEK 293T (ATCC CRL-3216): humane embryonale Nierenepithelzellen, die mit dem Adenovirus Typ5 tranduziert wurden. Zusätzlich exprimiert diese Zelllinie das Large T Antigen des Simian-Virus 40 (SV40). 2.1.13 Tiere Alle Tiere wurden in einem S2-Tierstall gehalten, wo sie in separat belüfteten Käfigen freien Zugang zu Futter und Wasser hatten. Vor Beginn eines Experiments hatten die Tiere mindestens eine Woche Zeit, sich an die veränderten Bedingungen des neuen Stalls zu gewöhnen. Alle Tiere wurden entsprechend der Richtlinien der Federation for Laboratory Animal Science Association (FELASA) und in Übereinstimmung mit der deutschen Gesetzgebung sowie nach den Richtlinien des Instituts behandelt. BALB/cJRj: Weibliche, sechs bis acht Wochen alte Tiere wurden bei Janvier (Frankreich) erworben. C57BL/6JRj: Weibliche, sechs bis acht Wochen alte Tiere wurden bei Janvier (Frankreich) erworben. MyD88/TRIF-/-: Die Tiere entstammten der Zucht von Prof. Dr. Carsten Kirschning (Essen). Diesen Mäusen fehlen sowohl das MyD88- als auch das TRIF-Protein, sodass alle von den TLR stammenden Signale nicht an den Zellkern weitergeleitet werden können. Card9-/-: Die Tiere entstammen der Zucht von Prof. Dr. Bernd Lepenies (Hannover). Diesen Tieren fehlt das Card9-Protein, in dem verschiedene Signalkaskaden, die in erster Linie von Rezeptoren der CLR-Familie stammen, zusammenlaufen. Mx2: transgene Tiere mit einem Luciferase-Gen unter Kontrolle des Mx2-Promotors. 37 Material und Methoden 2 2.2 Methoden 2.2.1 Molekularbiologische Methoden 2.2.1.1 Isolation von Plasmid-DNA Die Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen wurde in verschiedenen Größenordnungen mit jeweils entsprechenden Kits nach Angaben des jeweiligen Herstellers durchgeführt. Name Größenordnung Volumen der Kultur endotoxinfrei Hersteller RotiPrep Plasmid Mini 2 mL Nein Roth 300 mL Nein Genomed 300 mL Ja Macherey-Nagel MINI JETstar 2.0 Plasmid Maxi Purification MAXI Kit NucleoBond Xtra Maxi Maxi EF 2.2.1.2 Bestimmung von DNA-Konzentrationen Zur Bestimmung der Konzentration von Plasmid-DNA in Lösung wurde die Extinktion der Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260) mit einem Biophotometer (Eppendorf) gemessen. Dafür wurden die Proben so verdünnt, dass eine OD260 zwischen 0,1 und 1,5 erreicht wurde, um im linearen Bereich des Assays zu bleiben. Ein Wert von 1 entsprach dabei einer DNA-Konzentration von 50 µg/mL. 2.2.1.3 Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen Zur Identifikation von Plasmiden oder zur Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung wurde DNA mit ein bis zwei Restriktionsendonukleasen behandelt. Alle verwendeten Nukleasen wurden über New England Biolabs bezogen und gemäß der Herstellerangaben eingesetzt. 2.2.1.4 Agarose-Gelelektrophorese Agarose-Gelelektrophorese wurde eingesetzt, um DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen. Hierfür wurde 1 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer erhitzt, bis sie vollständig gelöst war. Für die Auftrennung von kleinen Fragmenten (100–300 bp) wurde statt TAE-Puffer TBE-Puffer eingesetzt. 38 Material und Methoden 2 Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 50 °C wurde die Lösung mit Ethidiumbromid versetzt, sodass eine Endkonzentration von 1 µg/mL erreicht wurde. Die Agaroselösung wurde anschließend in eine Gelkammer gegossen. Um die gewünschte Anzahl von Taschen zu formen, wurde ein Kamm hineingesteckt. Nach Aushärten des Gels wurde die Kammer entsprechend mit TAE- oder TBE-Puffer gefüllt. Die DNA-Proben wurden mit einem Sechstel des Gesamtvolumens DNA-Ladepuffer versetzt und in die Geltaschen gefüllt. Um später die Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente bestimmen zu können, wurde zusätzlich in eine der Taschen ein DNA-Größenstandard aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 120–140 V durchgeführt. Anschließend wurden die DNA-Banden unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 306 nm auf einem Alpha Imager (Alpha Innotech/Protein Simple) sichtbar gemacht. 2.2.1.5 Gelelution Wenn die per Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente zur Klonierung weiter verwendet werden sollten, wurde das Gel einer längerwelligen UV-Srahlung mit 365 nm ausgesetzt, um die Gefahr von Schädigung der DNA zu minimieren. Die Gelstücke mit den gesuchten DNA-Fragmenten wurden aus dem Gel ausgeschnitten und gewogen. Anschließend wurde eine Gelelution mit dem „Nucleospin gel extraction and PCR-Cleanup kit“ (Machrey-Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. 2.2.1.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Poymerase-Kettenreaktion wurde eingesetzt, um DNA-Abschnitte spezifisch zu amplifizieren. Dafür wurden Oligonukleotide (Primer) so gestaltet, dass sie komplementär zum Anfang (5‘3‘) bzw. zum Ende (3‘5‘) des DNA-Abschnitts waren. Zu Beginn der Kettenreaktion wurde die DNA bei 95 °C denaturiert, sodass sich im folgenden Schritt bei 55–65 °C die Primer an den DNA-Abschnitt anlagern konnten. Die anschließende Kettenverlängerung durch die anwesende DNA-Polymerase erfolgte bei einer Temperatur von 72 °C. Durch Primer mit überhängenden Sequenzen am 5‘- oder 3‘-Ende konnten zusätzliche Sequenzen in den amplifizierten DNA-Abschnitt eingefügt werden, die z.B. dem Einführen zusätzlicher Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen dienten. PCR wurden allgemein nach folgendem Schema durchgeführt: 39 Material und Methoden 2 Ansatz: PCR-Programm: 1 µL DNA-Vorlage (ca 100 ng) Schritt: Temperatur: Dauer: 5 µL PCR-Puffer, 5x initiale Denaturierung 95 °C 2 min 1 µL dNTP-Mix (je 10 µM) Denaturierung 95 °C 45 s 5 µL Primer I (10 µM) Anlagerung 55–65 °C 45 s 5 µL Primer II (10 µM) Kettenverlängerung 72 °C 1 min/kb 0,5 µL DNA-Polymerase Finale Kettenverlängerung 72 °C 10 min Ad 50 µL H2O Lagerung 4 °C - 2.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten DNA-Fragmente, die einer Restriktion mit Endonukleasen oder einer PCR entstammten, wurden durch eine Ligation zu vollständigen Plasmiden zusammengefügt. Hierfür wurde das DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (TaKaRa) nach Angaben des Herstellers verwendet. Der Ligationsansatz wurde für mindestens 1 h bei 16 °C inkubiert. 2.2.1.8 Transformation von Bakterien Zur Vervielfältigung von Plasmid-DNA wurde diese mit der Hitzeschock-Methode in einen geeigneten E.coli-Stamm (DH5α) eingebracht. Hierfür wurden die Bakterien zusammen mit dem betreffenden Plasmid für 30 min bei 4 °C inkubiert, bevor sie für 1 min einer Temperatur von 42 °C ausgesetzt wurden. Nach dem Hitzeschock wurden die Bakterien unmittelbar wieder auf Eis gelegt. Nach 2 min wurden 200 µL SOC-Medium hinzugegeben und die Bakterien für 1 h bei 37 °C geschüttelt, bevor sie auf einer Agar-LB-Platte mit dem für das Plasmid spezifischen Antibiotikum ausgestrichen wurden. 2.2.2 Proteinbiochemische Methoden 2.2.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Mit einer SDS-PAGE können Proteine der Größe nach aufgetrennt werden. Dafür wurden die Proteinproben zunächst in SDS-Probenpuffer aufgenommen, bevor sie für 5–15 min auf 95 °C erhitzt wurden. So wurden Tertiär- und Sekundärstrukturen der enthaltenen Proteine aufgelöst. Durch das im Probenpuffer enthaltene Mercaptoethanol wurden außerdem vorhandene Disulfidbrücken reduziert. Anschließend wurden die Proben auf ein diskontinuierliches Polyacrylamidgel aufgetragen, das aus einem Trenngel mit 10 % Acryl-/Bisacrylamidanteil in Tris/HCl mit einem pH-Wert von 8,8 und einem Sammelgel mit 4,2 % Acryl-/Bisacrylamidanteil in Tris/HCl mit einem pH von 6,8 bestand. Zur 40 Material und Methoden 2 annähernden Bestimmung der Proteinmasse wurde zusätzlich ein Proteingrößenstandard (Bio-Rad) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in einer Mini-Protean-3- oder Tetracell-Kammer (beide Bio-Rad) in Tris/Glycin-Puffer bei einer konstanten Spannung von 140 V durchgeführt, bis die Bromphenolblau-Front das untere Ende des Gels erreicht hatte. 2.2.2.2 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen Proteinbanden in einem SDS-Gel wurden mit kolloidalem Coomassie unspezifisch angefärbt. Dafür wurde das Sammelgel entfernt und das Trenngel zunächst dreimal 10 min lang mit Wasser gespült, um überschüssiges SDS aus dem Gel herauszuwaschen. Anschließend wurde das Gel unter Schwenken für mindestens 1 h bei Raumtemperatur (RT) in kolloidaler Coomassie-Lösung inkubiert. Zum Anfärben schwächerer Proteinbanden wurde die Inkubationszeit auf bis zu 16 h bei 4 °C verlängert. Nicht gebundenes Coomassie wurde anschließend durch Inkubation mit einer Entfärber-Lösung entfernt. 2.2.2.3 Western-Immunoblotting Mit der Immunoblotting-Methode wurden Proteine aus einem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um die Proteine anschließend mittels Antikörperdetektion spezifisch detektieren zu können. Dafür wurden zunächst Trenn- und Sammelgel getrennt und das Trenngel luftblasenfrei auf einer Nitrocellulosemembran platziert. Gel und Membran wurden von beiden Seiten mit je einem Blatt Blotpapier und jeweils einem Schwamm bedeckt. Blotpapiere und Schwämme waren in Transfer-Puffer getränkt. Alle Schichten wurden gemeinsam in einer Blotkassette fixiert, die anschließend so in einer Mini-Blot-Transferzelle (Bio-Rad) platziert wurde, dass die Membran der Anode gegenüberlag. Die Blotkammer mit der Transferzelle und einer Kühleinheit wurde vollständig mit Transferpuffer gefüllt. Der anschließende Proteintransfer wurde bei einer konstanten Spannung von 100 V für 1 h durchgeführt. Danach wurde die Membran entnommen. Die freien Bindungsstellen für 1 h bei RT in Blockpuffer abgesättigt. Darauf folgte die Inkubation mit einem gegen das gewünschte Protein gerichteten Antikörper gelöst in Blockpuffer für 1–2 h bei RT oder für 16 h bei 4 °C. Anschließend wurde die Membran fünfmal für je 5 min mit WB-Waschpuffer gewaschen, bevor sie für 1–2 h bei RT in einer Antikörperlösung inkubiert wurde, die gegen den Fc-Teil des ersten Antikörpers gerichtet war. Nach fünf weiteren Waschschritten wurden die Proteinbanden unter Zugabe des Chemi-Glow-WestChemolumineszenz-Substrats (Protein Simple) in einem Luminometer (Hamamatsu Photonics) detektiert. 41 Material und Methoden 2 2.2.2.4 Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen Für die Expression und Aufreinigung rekombinanter Proteine wurden 293T-Zellen mit den Plasmiden pCD-FsynED-myc-decahis, pV-HAoTM-decahis oder pV-gp140-decahis transient transfiziert (siehe unten). Bereits während der Transfektion wurde das Zellkulturmedium gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Nach 48 h wurden die Überstände geerntet und enthaltene Zellrückstände mit einer Zentrifugation für 10 min bei 940x g bei 4 °C abgetrennt. Die Überstände wurden in 50-mLReaktionsgefäße überführt und mit in Aufreinigungspuffer äquilibrierter Ni2+-Sepharose (GE Healthcare) versetzt. Anschließend wurden die Überstände über Nacht bei 4 °C mit der Sepharose unter Schwenken inkubiert. Die Sepharose wurde am nächsten Tag durch Zentrifugation für 2 min bei 1000x g vom Durchlauf abgetrennt. Anschließend wurde die Sepharose mit Aufreinigungspuffer jeweils 1 min gewaschen, wobei die Extinktion bei 280 nm des Puffers nach jedem Waschschritt überprüft wurde. Die Sepharose wurde so lange gewaschen, bis die Extinktion wieder den Leerwert von unverbrauchtem Aufreinigungspuffer erreicht hatte. Danach wurde die Sepharose viermal für je 1 min mit Elutionspuffer inkubiert. Der Elutionspuffer wurde dabei jeweils von der Sepharose durch Zentrifugation getrennt und dekantiert. Die Elutionsfraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration mit einem Cut-Off von 10 kDa konzentriert, wobei gleichzeitig das enthaltene Imidazol durch den Austausch des Puffers gegen PBS entfernt wurde. 2.2.2.5 Bestimmung von Proteinkonzentrationen Die Bestimmung von Proteinkonzentrationen wurde mit dem Coomassie Plus Protein Assay (Thermo Scientific) entsprechend der Angaben des Herstellers durchgeführt, wobei das MikroplattenVerfahren genutzt wurde. Die Proben wurden mit einem Sunrise Plate Reader der Firma Tecan bei einer Wellenlänge von 550 nm analysiert. 2.2.3 Zytologische Methoden 2.2.3.1 Kultivierung von 293T-Zellen Die in dieser Arbeit verwendete Zelllinie 293T wurde in Zellkulturflaschen (Greiner Bio One) mit einer Grundfläche von 25 cm2, 75 cm2 oder 175 cm2 in einer feuchten Atmosphäre mit einem CO2Gehalt von 5 % bei einer Temperatur von 37 °C kultiviert. Alle zwei bis drei Tage wurden die Zellen aufgeteilt und mit frischem Vollmedium versetzt. Dafür wurde zunächst das verbrauchte Medium entfernt, die Zellen mit 5–10 mL sterilem PBS gespült und anschließend mit 2–3 mL einer Trypsin/EDTA-Lösung (Gibco) bedeckt, um die Zellen vom Flaschenboden zu lösen. Diese Reaktion 42 Material und Methoden 2 wurde durch die Inkubation bei 37 °C unterstützt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Medium bis auf ein Gesamtvolumen von 5–10 mL gestoppt und die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren in Suspension gebracht. Anschließend wurde die Suspension vollständig aufgenommen und 0,5–3 mL entweder zurück in die bereits benutzte Flasche oder in eine neue Flasche überführt. Daraufhin wurde die Kultur bis zu einem Gesamtvolumen von 5–20 mL mit frischem Vollmedium versetzt. Für eine langfristige Lagerung wurden die Zellen in Vollmedium mit einem DMSO-Anteil von 10 % resuspendiert, auf 2-mL-Kryoröhrchen verteilt und zunächst bei -80 °C eingefroren. Nach einer Gewöhnungsphase von mindestens 24 h wurden die Zellen dann in die Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks überführt. Zum Ansetzen einer frischen Kultur wurden die Zellen aufgetaut und unmittelbar 1:10 mit Vollmedium verdünnt. Die Zellen wurden dann für 6 min bei 400x g und 4 °C sedimentiert und anschließend in Vollmedium ausgesät. 2.2.3.2 Transfektion von Zellen Zellen wurden transfiziert, um die Expression der Plasmiden zu überprüfen, die für die Immunisierung der Tiere eingesetzt werden sollten. Weiterhin wurden Zellen für die Aufreinigung von rekombinanten Proteinen transfiziert. Außerdem wurden auf diese Weise Zellen mit membranständigen Proteinen für einen CLR-Bindungsassay erzeugt. Dafür wurden 293T-Zellen so ausgesät, dass sie am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 60–90 % erreichten. Pro 25 cm2 Zellrasen wurden 10 µg Plasmid-DNA in 500 µL serumfreiem DMEM gelöst und durchmischt. Anschließend wurden 15 µL Polyethylenimin (PEI, 1 µg/µL in H2O) hinzugefügt. Die Lösung wurde gründlich durchmischt, bevor sie für mindestens 15 min bei RT inkubiert wurde. In der Zwischenzeit wurde das Medium gegen frisches Vollmedium oder serumfreies Medium (bei Aufreinigungen) ausgetauscht. Anschließend wurde der Transfektionsansatz zu den Zellen gegeben und alles bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert. 2.2.4 Immunologische Methoden 2.2.4.1 Immunisierung von Mäusen Die Plasmid-DNA, die zur Immunisierung von Mäusen zur Verwendung kam, wurde mit einer Konzentration von 0,5 µg/µL in sterilem PBS aufgenommen. DNA-Immunisierungen wurden an Mäusen durchgeführt, die zuvor mit einer Ketamin/Xylazin-Lösung (100 mg/kg und 15 mg/kg) intrapenitonial betäubt worden waren. Zunächst wurden beide Hinterbeine rasiert. Anschließend wurden drei Elektroden (TriGrid Electrode Array, Ichor Medichal Inc.) und eine Spritze, die die Plasmid- 43 Material und Methoden 2 DNA enthielt, in den Musculus Gastrocnemius eingeführt. Pro Bein wurden 30 µL der DNA-Lösung injiziert, gefolgt von je drei Stromstößen von 63 V und einer Dauer von je 40 ms. 2.2.4.2 Serumgewinnung Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurde Mäusen unter Betäubung mit Isofluran Blut durch Punktion des retrobulbären Venenkomplexes mit heparinisierten Glaskapillaren entnommen. Das aufgefangene Blut wurde für 5 min bei 2600x g sedimentiert. Das Blutserum, das den Überstand bildete, wurde in separate Probengefäße überführt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. 2.2.4.3 Gewinnung von Lymphozyten Lymphozyten zur Analyse der zellulären Immunantwort wurden aus der Milz von immunisierten Mäusen gewonnen. Zu diesem Zweck wurden die Tiere getötet, die Milzen entnommen und in je 5 mL HBSS überführt. Aus dem Gewebe wurde eine Einzelzelllösung gewonnen, indem die Milz mit dem Stempel einer 5-mL-Spritze durch ein 70-µm-Zellsieb gerieben wurde. Das Zellsieb wurde anschließend mit 5 mL HBSS gespült und die Zellen aus dem gesamten Volumen von 10 mL anschließend für 6 min bei 400x g sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen in 1 mL ACK-Lysepuffer resuspendiert, um die enthaltenen Erythrozyten zu zerstören. Nach 7 min bei RT wurde die Lyse durch Zugabe von 9 mL HBSS gestoppt, woraufhin die Zellen ein weiteres Mal für 6 min bei 400x g sedimentiert wurden. Schließlich wurde der Überstand verworfen, die Zellen wurden in R10-Medium aufgenommen. 2.2.4.4 In-vitro-Restimulierung von Lymphozyten Zur Analyse der zellulären Immunantwort wurden die aus der Milz gewonnenen Lymphozyten in vitro restimuliert, um die Zytokinproduktion der Zellen entweder durch eine Intrazelluläre Immunfärbung (Intracellular cytokine staining, ICS) oder durch einen zytokinspezifischen ELISA nachzuweisen. Für eine ICS wurden die gewonnenen Lymphozyten mit R10-Medium auf eine Konzentration von 107 Zellen/mL eingestellt und anschließend je 100 µL der Suspension auf die wells einer 96-well-Platte verteilt. Die Zellen wurden durch Zugabe von MHC I- oder MHC II-dominanten Peptiden mit einer Endkonzentration von 5 µg/mL in Anwesenheit von 2 µM Monensin bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 restimuliert. Zur Analyse von CD8+-T-Zellen wurde dem Ansatz ein FITCkonjugierter α-CD107a-Antikörper (1:2000) zugefügt. Für die Analyse von CD4+-T-Zellen war hingegen die Anwesenheit eines α-CD28-Antikörpers (1 µg/mL) nötig. Positivkontrollen wurden durch eine Kombination von α-CD3 (2 µg/mL) und α-CD28 (1 µg/mL) stimuliert. Die Stimuli wurden in 100 µL R10 44 Material und Methoden 2 pro Ansatz angesetzt, sodass das finale Volumen in den wells 200 µL betrug. Nach 6 h Inkubationszeit wurden die Zellen für 2,5 min bei 940x g sedimentiert und einer ICS unterzogen. Zur Analyse der Zellen mit einem zytokinspezifischen ELISA wurden hingegen je 500 µL einer auf 107 Zellen/mL eingestellten Lösung auf eine 24-well-Platte verteilt. Diese Zellen wurden ebenfalls mit 5 µg/µL des jeweiligen Peptids in Anwesenheit von 1 µg/µL α-CD28 restimuliert, wobei die Stimuli ebenfalls in 100 µL/Ansatz vorbereitet wurden, woraus ein Gesamtvolumen von 600 µL/well resultierte. Die Stimulationsansätze wurden für 48 h in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert, bevor die Zellen für 2,5 min bei 940x g sedimentiert wurden. Anschließend wurden die Überstände in frische Reaktionsgefäße überführt und zur Bestimmung der Konzentration der enthaltenen Zytokine einem zytokinspezifischen ELISA unterzogen. 2.2.4.5 Intrazelluläre Zytokinfärbung Restimulierte Splenozyten wurden für 2,5 min bei 940x g und 4 °C sedimentiert, anschließend in 200 µL FACS-Puffer aufgenommen und erneut sedimentiert. Alle folgenden Waschschritte wurden in derselben Weise durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen in 100 µL einer Antikörperlösung aufgenommen, die der Oberflächenfärbung und damit der Identifikation von Zellpopulationen diente. Diese Lösung enthielt mit Fluorophoren konjugierte α-CD4- oder α-CD8-Antikörper sowie einen Farbstoff (Fixable Viability Dye eFluor780) zur Unterscheidung von lebendigen und toten Zellen. Die Färbung erfolgte für 20 min bei RT unter Lichtausschluss und wurde durch Zugabe von 100 µL FACSPuffer/well beendet. Die Zellen wurden sedimentiert und einmal mit FACS-Puffer gewaschen, bevor sie erneut in 100 µL FACS-Puffer aufgenommen wurden. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 100 µL Paraformaldehyd-Lösung (4 %) in PBS fixiert. Dieser Schritt erforderte eine erneute Inkubation bei RT für 20 min. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit je 200 µL FACS-Puffer gewaschen, bevor sie für 10 min durch Aufnahme in 150 µL Permeabilisationspuffer permeabilisiert wurden. Anschließend erfolgte die intrazelluläre Färbung durch Zugabe von 100 µL Antikörperlösung in Permeabilisationspuffer. Die Antikörperlösung enthielt die fluorophorkonjugierten Antikörper α-IFNγ, α-TNFα und α-IL-2. Die Färbung erfolgte für 30 min unter Lichtausschluss bei RT und wurde durch Zugabe von 100 µL Permeabilisationspuffer abgestoppt. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit Permeabilisationspuffer und einmal mit FACS-Puffer gewaschen, bevor sie in 250 µL FACSPuffer aufgenommen und mit einem FACS-Canto-II-Durchflusszytometer analysiert wurden. Die gemessenen Daten wurden mit der Tree Star FlowJo Software (Version 10) verarbeitet. 45 Material und Methoden 2 2.2.4.6 Zytokinspezifischer ELISA Die Zytokinsekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 von in vitro restimulierten Splenozyten wurde mit Ready-SET-Go!-ELISA-Kits der Firma eBioscience nach Angaben des Herstellers analysiert. Für die Assays wurden Mikrotestplatten mit besonders hoher Adsorption (Corning high-binding) verwendet. Die Zellkulturüberstände wurden in 1x ELISA-Diluent verdünnt und über Nacht bei 4 °C auf den mit Capture Antibody beschichteten ELISA-Platten inkubiert. Alle vorgegebenen Waschschritte wurden fünfmal durchgeführt, der letzte hingegen siebenmal. Die finale Farbumschlagreaktion von 3,3‘,5,5‘Tetramethylbenzidin (TMB) wurde mit 1 M ortho-Phosphorsäure abgestoppt. Die Absorption wurde anschließend mit dem Sunrise-Mikroplattenlesegerät (Tecan) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen. 2.2.4.7 Antigenspezifischer ELISA Die humorale Immunantwort gegen die viralen Oberflächenproteine und p24 wurde mittels eines antigenspezifischen ELISAs bestimmt. Hierfür wurden undurchsichtige Mikrotestplatten (96 well) mit den jeweiligen Antigenen beschichtet. Die Antigene, die hierfür genutzt wurden, waren folgende: RSV-F rekombinantes Protein 100 ng/well Sino Biological IAV (HA) inaktivierte Viruspartikel 106/well eigene Arbeitsgruppe gp140-his rekombinantes Protein 100 ng/well eigene Herstellung Gag-GST rekombinantes Protein 150 ng/well eigene Arbeitsgruppe Alle verwendeten Antigene wurden zur entsprechenden Konzentration in Bicarbonatpuffer zur entsprechenden Konzentration verdünnt und zur Beschichtung über Nacht bei 4 °C auf den Mikrotestplatten inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 5 % Magermilchpulver in Waschpuffer für 1 h bei RT gesättigt. Die Platten wurden erneut dreimal gewaschen. Danach wurden die Serumproben in einer Verdünnung von 1:1000 oder 1:10 000 in 100 µL einer 2 % Magermilchlösung auf die Platten aufgetragen. Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei RT wurden überschüssige und unspezifische Antikörper durch dreimaliges Waschen entfernt. Anschließend wurden die gebundenen Antikörper durch Inkubation (1 h, RT) mit 100 µL einer Lösung von α-IgG1-HRP oder α-IgG2a-HRP detektiert. Nach erfolgter Inkubation wurden die Platten fünfmal gewaschen und anschließend 50 µL einer Substratlösung (ECL) aufgetragen. Die Lichtreaktion wurde in einem Mikroplatten-Luminometer (Orion, Berthold Detection Systems) aufgezeichnet. 46 Material und Methoden 2 2.2.4.8 IFNα-Luciferase-Assay Für diesen Assay wurden Splenozyten einer Mx2-Maus mit Zellkulturüberständen von transfizierten 293T-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden 48 h vor Beginn des Versuchs mit Plasmiden für lösliche Proteine transfiziert, sodass sich das sekretierte Protein im Überstand anreicherte. Die Proteinkonzentration wurde erhöht, indem die Überstände unmittelbar vor Beginn des Versuchs durch Ultrazentrifugation mithilfe eines 30-kDa-Cut-Off-Filters eingeengt wurden. Anschließend wurden je 100 µL einer Suspension von Splenozyten (107 Zellen/mL) in R10-Medium mit 100 µL des eingeengten Überstands versetzt und für 24 oder 48 h in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden nach Ablauf der Inkubation für 2,5 min bei 940x g sedimentiert und einmal mit FACSPuffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 100 µL Bright-Glo Lysis Buffer (Promega) resuspendiert und 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 25 µL Bright-Glo Luciferase Substrate (Promega) hinzugefügt und die Lichtreaktion nach Ablauf von 3 min in einem MikroplattenLuminometer (Orion, Berthold Detection Systems) aufgezeichnet. 2.2.4.9 Zellbasierter CLR-Bindungsassay 293T-Zellen wurden mit membranständigen Versionen viraler Oberflächenproteine und pDsRed kotransfiziert. Nach 48 h wurde das Medium verworfen. Die Zellen wurden einmal mit PBS gespült und anschließend durch vorsichtiges Abschaben und Pipettieren in Lektinpuffer aufgenommen. Die Zellen wurden auf eine Mikrotestplatte (2*105 Zellen/well) überführt und für 2,5 min bei 940x g sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen in 100 µL einer Lösung des jeweiligen CLR-Fc (10 ng/µL) in Lektinpuffer aufgenommen und für 30 min bei 4 °C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Lektinpuffer gewaschen, dann in 100 µL α-Ig-FITC (1:1000) in Lektinpuffer aufgenommen und für 20 min bei 4 °C unter Lichtausschluss inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit Lektinpuffer gewaschen, im letzten Schritt in 200 µL Lektinpuffer aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Die Messung erfolgte in einem FACS-Canto-II-Durchflusszytometer (BD Biosciences). 2.2.4.10 Proteinbasierter CLR-Bindungsassay Hochadsorbierende Mikrotest-Platten (Greiner, medium binding half area flat) wurden mit 50 µL einer Lösung von rekombinantem Protein in PBS (20 ng/µL) über Nacht beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten 3x mit ELISA-Waschpuffer gewaschen. Mögliche freie Bindungsstellen wurden anschließend für 2 h mit 1 % BSA in Waschpuffer bei Raumtemperatur gesättigt. Wells, die zuvor nicht beschichtet worden waren und in diesem Schritt mit BSA behandelt wurden, dienten später als Negativ-Kontrolle. Danach wurden 50 µL der jeweiligen hFc-gekoppelten Lektinrezeptoren (10 ng/µL) 47 Material und Methoden 2 aufgetragen und die Platten für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten erneut dreimal gewaschen und 50 µL einer Lösung von α-Ig-HRPAntikörper (1:5000) aufgetragen. Danach wurde erneut dreimal gewaschen. Anschließend wurde die Substratlösung (50 µL/well) aufgetragen. Der darauf folgende Farbumschlag wurde mit 2,5 M Schwefelsäure gestoppt, sobald die Lösung in den wells ein helles Gelb angenommen hatte. Daraufhin wurden die Platten bei einer Wellenlänge von 495 nm mit einem ELISA-Platten-Lesegerät gemessen. Von den gemessenen Werten wurde der Wert eines mit BSA beschichteten und mit dem jeweiligen CLR-Fc inkubierten wells abgezogen. 48 Ergebnisse 3 3 Ergebnisse Eine Immunisierung von Mäusen mit HIV-Env erzielt eine humorale Immunantwort, die sich in der Zusammensetzung der IgG-Subklassen von der Zusammensetzung unterscheidet, die mit einer Immunisierung mit den strukturell vergleichbaren Proteinen RSV-F und IAV-HA erreicht werden kann. Da die Komposition der Subklassen Einfluss auf die Wirksamkeit eines Impfschutzes hat, ist es von Interesse herauszufinden, aus welchem Grund das Oberflächenprotein von HIV eine anders geartete Antwort hervorruft als vergleichbare Proteine. Das führt zum einen zu der Frage, welcher Mechanismus des Immunsystems für die unterschiedliche Reaktion verantwortlich ist, und zum anderen, auf welche Eigenschaft von HIV-Env diese Reaktion zurückgeführt werden kann. 3.1 Die Immunantwort auf HIV-Env im Vergleich zu RSV-F und IAV-HA als Fusionsproteine mit p24 Um den Grund für die andersartige Immunantwort gegen HIV-Env gegenüber der Immunantwort gegen RSV-F oder IAV-HA zu finden, wurden zunächst DNA-Impfstoffe auf Plasmidbasis hergestellt. Diese enthielten Expressionskassetten für Fusionsproteine, die aus je einer Ektodomäne eines der viralen Oberflächenproteine sowie dem HIV-Capsidprotein p24 bestanden (Abb. 7). Mit diesen Plasmiden wurden Mäuse immunisiert. Die induzierte humorale und zelluläre Immunreaktion wurde analysiert. 3.1.1 Konstruktion der DNA-Impfstoffe Die zu untersuchenden Proteine HIV-Env, RSV-F und IAV-HA wurden in löslicher Form ohne die jeweilige membrandurchspannende und intrazelluläre Domäne eingesetzt. So sollte eine in erster Linie humorale Immunantwort provoziert werden. Von HIV-Env wurden zwei Varianten hergestellt: gp120, das nur die gp120-Domäne des HIV-Env exprimierte, sowie gp140, das die gesamte nicht geschnittene Ektodomäne einschließlich des extrazellulären Teils der gp41-Domäne enthielt. Das HIV-Env-Trimer wird durch Interaktionen der gp41-Domänen zusammengehalten. gp140 fehlten diese zum Teil und gp120 vollständig. Deshalb war anzunehmen, dass in beiden Fällen die resultierenden Proteine in monomerer Form vorliegen. Die Fusionierung der Oberflächenproteine an p24 hatte zwei Ziele. Zum einen konnten so für jedes Protein zwei voneinander unabhängige Epitope untersucht werden, von denen mit p24 eines in jedem der Proteine vorlag. Das machte einen direkten Vergleich zwischen den Proteinen möglich. Zum 49 Ergebnisse 3 anderen sollte so erreicht werden, dass Oberflächenprotein und p24 von derselben APZ aufgenommen und präsentiert werden. Sollte der immunmodulatorische Effekt von HIV-Env bereits in dieser frühen Phase der Immunreaktion eintreten, wäre anzunehmen, dass sich dieser Effekt auch auf die Präsentation des fusionierten p24 auswirkt. Ein weiteres Plasmid exprimierte zur Kontrolle ausschließlich p24, das mit einer tPA-Signalsequenz kombiniert wurde, um die Sekretion des Proteins aus der Plasmid exprimierenden Zelle zu erreichen. Die DNA-Sequenzen der viralen Ektodomänen wurden mittels PCR aus Plasmiden amplifiziert, die die Gene für die entsprechenden Volllängenproteine enthielten. Die DNA-Sequenzen wurden nach Behandlung mit spezifischen Endonukleasen in einen pVax-Vektor vor die Sequenz für p24 kloniert. Zwischen den Ektodomänen und p24 befand sich eine Spacer-Region, die für eine ungehinderte Faltung der beiden Teile des Fusionsproteins sorgen sollte. C-terminal befand sich außerdem ein HexaHistidin-Tag (Abb. 7). Abb. 7: Aufbau der zur Immunisierung verwendeten Plasmide. Der verwendete Promotor CMV ist der immediate early Promotor des Zytomegalievirus. F und HA bezeichnen den jeweiligen extrazellulären Part des Fusionsproteins von RSV bzw. des Hemagglutinin von IAV, während gp120 die extrazelluläre Domäne des HIV-Env-Proteins darstellt. gp140 hingegen ist der gesamte extrazelluläre Teil des Env-Proteins, der neben gp120 auch einen Teil von gp41 beinhaltet. 3.1.2 Expressionsnachweis Zur Überprüfung der korrekten Expression und der Sekretion der Proteine wurden zunächst 293TZellen mit den Plasmiden transfiziert. Nach einer Inkubationszeit von 48 h wurden Proben des Zelllysats und des Überstands im Western Blot analysiert. Dabei wurden die Proteine mit Antikörpern detektiert, die spezifisch entweder das virale Oberflächenprotein oder das fusionierte p24 erkennen, um so das Vorhandensein beider Teile der Fusionsproteine zeigen zu können (Abb. 8). Da mit dem AK gegen p24 alle Fusionsproteine detektiert werden können, konnte so auch die Stärke der Expression und Sekretion der Proteine direkt verglichen werden. 50 Ergebnisse 3 Abb. 8: Expressionskontrolle der Fusionsproteine aus den hergestellten Plasmiden. Zum Nachweis der Expression wurden 293T-Zellen mit den Immunisierungsplasmiden sowie einem GFP exprimierenden Kontrollplasmid transfiziert und nach 48 h Proben der Überstände und der Zelllysate genommen. Diese wurden im Anschluss durch SDS-PAGE und Western Blot analysiert, wobei die Überstandsproben in dreifacher Menge im Vergleich zu den Lysatproben aufgetragen wurden. Zum Nachweis aller Proteine auf dem Blot wurde ein gegen p24 gerichteter, monoklonaler Antikörper verwendet (A). Der spezifische Nachweis der beiden Varianten von HIV-Env erfolgte mit einem monoklonalen gp120-Antikörper (B). Zusätzlich wurde ein Blot mit Immunserum von Mäusen durchgeführt, die mit IAV-HA und RSV-F immunisiert worden waren, um beide Proteine in der Expression spezifisch nachzuweisen (C). Bei allen Blots wurde die Bindung des jeweiligen Primärantikörpers durch die Bindung eines gegen den ersten Antikörper gerichteten, HRP-konjugierten Zweitantikörpers nachgewiesen. Der Blot mit Immunserum gegen RSV-F und IAV-HA zeigt Banden in den Spuren, in denen Überstands- und Lysatproben von den entsprechend mit F-p24 und HA-p24 transfizierten Zellen aufgetragen wurden (Abb. 8C). Die Laufhöhe der Banden von ca. 70 kDa (F-p24) und 100 kDa (HA-p24) entspricht den zu erwartenden Größen der Fusionsproteine. Der Blot mit AK gegen HIV-Env zeigt hingegen Banden in den Spuren, in die Proben des Lysats und der Überstände von mit gp120-p24 und gp140-p24 transfizierten Zellen aufgetragen wurden (Abb. 8B). Diese laufen auf der Höhe von ca. 145 kDa (gp120-p24) und 165 kDa (gp140-p24) und entsprechen damit ebenfalls der Größe, die für die Expressionsprodukte zu erwarten gewesen war. Der Blot mit AK gegen p24 zeigt schließlich Banden in allen mit Fusionsprotein beladenen Spuren, die auf der gleichen Höhe liegen, wie in den oberflächenproteinspezifischen Blots, sowie Banden in den Spuren, in denen die Proben der mit p24 transfizierten Zellen aufgetragen wurden (Abb. 8A). Diese Banden zeigen mit ca. 25 kDa ebenfalls eine 51 Ergebnisse 3 Laufhöhe, die mit der zu erwartenden Größe des Proteins übereinstimmt. Damit ist davon auszugehen, dass es sich bei den exprimierten Proteinen nicht nur um die gewünschten Produkte handelt, sondern auch, dass alle Proteine wie gewünscht als Fusionsproteine mit p24 exprimiert werden. Zusätzlich ist dem p24-Blot zu entnehmen, dass alle Proteine in etwa gleich großer Menge produziert werden, da die Banden des Blots innerhalb der Lysatproben ungefähr gleich intensiv sind. F-p24, HA-p24 und gp140-p24 werden zudem jeweils ungefähr gleich stark sekretiert. gp120-p24 und p24 werden ebenfalls ungefähr gleich stark sekretiert, jedoch etwas schwächer als F-p24, HA-p24 oder gp140-p24. Da die Transfektion von Zellen mit den DNA-Impfstoffen in vitro zu einer erfolgreichen Expression aller Fusionsproteine führte, wurden die Plasmide nun zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt. 3.1.3 Immunisierung mit p24-Fusionsproteinen In einem ersten Experiment wurden drei der DNA-Impfstoffe, F-p24, HA-p24 und gp140-p24, eingesetzt, um die in früheren Studien beobachtete86,87 unterschiedliche Immunantwort zu bestätigen und eine mögliche Übertragung auf das fusionierte p24 zu überprüfen. Dafür wurden Gruppen von jeweils sechs Balb/c-Mäusen zweimal in einem Abstand von vier Wochen mit den DNA-Vakzinen mittels intramuskulärer Injektion mit anschließender Elektroporation immunisiert. Nach drei und sechs Wochen wurde die humorale Immunantwort sowohl gegen Oberflächenproteine als auch gegen p24 mit antigenspezifischen ELISAs untersucht, wobei der ELISA nach drei Wochen der allgemeinen Überprüfung der Induktion einer Immunantwort diente. Nach sechs Wochen wurden jeweils die Menge der IgG1- und IgG2a-Antikörper sowie das Verhältnis der Subklassen zueinander analysiert, da dies Auskunft über die Ausrichtung der generellen Immunantwort gibt. Darüber hinaus wurde die Stärke der Produktion TH1- und TH2-assoziierter Zytokine von CD4+-T-Helferzellen sowie die Zytokinproduktion von CD8+-T-Zellen untersucht, um die Immunreaktion weiter zu charakterisieren (Abb. 9). Abb. 9: Zeitlicher Ablauf der DNA-Immunisierung. An Tag 0 und Tag 28 wurden je sechs Balb/c-Mäuse mit 30 µg der Plasmide F-p24, HA-p24, gp120-p24, gp140-p24 oder p24 immunisiert. An Tag 21 und Tag 41 wurde Blut entnommen, um die humorale Immunantwort der Mäuse aus dem Blutserum zu bestimmen. Nach 42 Tagen wurden die Tiere getötet und deren Milzen entnommen, um zusätzlich die T-Zell-Antwort zu analysieren. 52 Ergebnisse 3 3.1.3.1 Humorale Immunantwort Die Immunisierung mit den drei zunächst untersuchten DNA-Impfstoffen F-p24, HA-p24 und gp140-p24 induzierte bei allen Gruppen eine humorale Immunantwort, die sich zwischen den einzelnen Gruppen jedoch hinsichtlich der Verteilung der Subklassen unterschied. Während bei den mit F-p24 immunisierten Tieren mehr IgG2a als IgG1 gebildet wurde, zeigten die mit HA-p24 immunisierten Tiere eine leicht höhere Produktion von IgG1. Demgegenüber hatte die mit gp140-p24 immunisierte Gruppe eine deutliche Mehrproduktion von IgG1 gegenüber IgG2a (Abb. 10A). Das jeweils fusionierte p24 zeigte in der HA-p24-Gruppe und in der gp140-p24-Gruppe eine höhere Induktion von IgG1 gegenüber IgG2a. In der F-p24-Gruppe induzierte das fusionierte p24 einen leichten Überschuss von IgG1 (Abb. 10B). B 5.0 4.5 5 4 Fp2 4 C ** ns 10 * ns 10 IgG2a/IgG1 1 0.1 0.1 p2 4 40 gp 1 A -p 24 4 H gp 1 40 - 24 A -p H Fp2 p2 4 0.01 4 0.01 ns 1 Fp2 IgG2a/IgG1 D ** 100 gp gp H 24 A -p H 6 14 0p2 4 4.0 IgG1 IgG2a 24 5.5 7 14 0p2 4 Antikörper (log RLU/s) 6.0 p24 A -p Oberflächenproteine Fp2 4 Antikörper (log RLU/s) A Abb. 10: Humorale Immunantwort gegen die Oberflächenproteine und das jeweils fusionierte p24 nach der Boost-Immunisierung in Balb/c-Mäusen. Die IgG1- bzw. IgG2a-Immunantworten gegen die Oberflächenproteine bzw. das fusionierte p24 wurden sechs Wochen nach der ersten Immunisierung mit einem antigenspezifischen ELISA bei einer Verdünnung von 1:10000 bestimmt. A und B zeigen die jeweiligen Antikörperantworten als Mittelwert mit Standardfehler, während in C und D das Verhältnis der Subklassen zueinander als geometrisches Mittel dargestellt wird. Die statistische Signifikanz der Unterschiede im geometrischen Mittel wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test gefolgt von Dunn’s Post-hoc-Test bestimmt (n = 5–6; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = nicht signifikant). Die Bildung des Verhältnisses von IgG2a zu IgG1 ermöglichte einen direkten Vergleich der humoralen Immunantworten zwischen den verschiedenen Gruppen (Abb. 10C und 10D). Hier wurde bei den Antworten gegen die Oberflächenproteine ebenfalls deutlich, dass das Verhältnis von IgG2a 53 Ergebnisse 3 zu IgG1 im geometrischen Mittel bei den mit F-p24 immunisierten Tieren einen deutlichen Überschuss von IgG2a zeigte (Abb. 10C). Für die mit HA-p24 immunisierten Tiere lag das Verhältnis zwar bereits auf der Seite von IgG1 und unterschied sich damit signifikant von F. Der Quotient aus IgG2a zu IgG1 der gp140-Gruppe lag jedoch um zwei Größenordnungen niedriger als bei F (Abb. 10C). Auch die entsprechenden Quotienten von IgG2a zu IgG1 bei den an die Oberflächenproteine fusionierten p24-Proteine zeigten signifikante Unterschiede zwischen F-p24 und gp140-p24. Zwischen HA-p24 und gp140-p24 unterschieden sich das geometrische Mittel nicht signifikant, jedoch lag HA-p24 jeweils näher an einem ausgeglichenen Verhältnis von Ig2a zu IgG1 als gp140-p24 (Abb. 10D). Damit zeigte sich ein deutlicher Unterschied in der Immunantwort der Tiere sowohl gegen die viralen Oberflächenproteine, der sich auch auf die fusionierten p24-Proteine übertrug. Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob der beobachtete Effekt spezifisch für den verwendeten Mausstamm ist, weshalb nun statt der Balb/c-Mäuse C57BL/6-Mäuse mit denselben Plasmiden immunisiert wurden (Abb. 11). A B 6 5 4 p2 F- 4 A H 24 -p ns 5 4 p2 F- p 014 4 A H 24 -p gp D ** 10 IgG1 IgG2a 6 24 gp C * 1 0.1 0.01 24 -p 0 4 1 ** 10 IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 p24 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) Oberflächenproteine ns * 1 0.1 0.01 0.001 24 -p F H A 24 -p 4 p2 gp 014 p F- 24 A H 24 -p gp 24 -p 0 4 1 Abb. 11: Humorale Immunantwort gegen die Oberflächenproteine und das jeweils fusionierte p24 nach der Boost-Immunisierung in C57BL/6-Mäusen. Sechs Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die IgG1- bzw. IgG2aImmunantworten gegen die Oberflächenproteine bzw. das fusionierte p24 mit einem antigenspezifischen ELISA bei einer Verdünnung von 1:10000 bestimmt. A und B zeigen die jeweiligen Antikörperantworten als Mittelwert mit Standardfehler, während in C und D das Verhältnis der Subklassen zueinander als geometrisches Mittel dargestellt wird. Die statistische Signifikanz der Unterschiede im geometrischen Mittel wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test gefolgt von Dunn’s Post-hoc-Test bestimmt (n = 5–6; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = nicht signifikant). 54 Ergebnisse 3 In diesem Versuch wurden ähnliche Beobachtungen wie bei der Immunisierung der Balb/c-Mäuse gemacht: Gegen F und HA waren vergleichbar große Mengen IgG1 und IgG2a produziert worden, wobei sich jeweils nur ein leichter Überschuss IgG1 gebildet hatte (Abb. 11A). In diesem Versuch war der Unterschied in den Verhältnissen von IgG2a zu IgG1 bei F und HA zudem nicht signifikant (Abb. 11C). Die Gruppe, die mit gp140-p24 immunisiert worden war, zeigte hingegen eine deutliche Mehrproduktion von IgG1 (Abb. 11A und 11C). Auch hier übertrugen sich die jeweiligen Verhältnisse der induzierten Antikörpersubklassen auf das jeweils fusionierte p24 (Abb. 11B und 11D). Schließlich wurde die Immunisierung mit Balb/c-Mäusen wiederholt, wobei nun zwei Gruppen jeweils eines der beiden Vergleichsplasmide gp120-p24 und p24 erhielten. Während auch hier die mit F-p24 und HA-p24 immunisierten Gruppen eine nahezu ausgeglichene Immunantwort sowohl gegen das Oberflächenprotein als auch das jeweils fusionierte p24 erkennen ließen, unterschieden sich die Anteile von IgG1 und IgG2a in den beiden mit gp120-p24 und gp140-p24 immunisierten Gruppen. In beiden Fällen wurde die Gesamtantwort von IgG1 dominiert, was sich sowohl in den absoluten Werten für die jeweiligen Subklassen (Abb. 12A) als auch im Verhältnis der Subklassen (Abb. 12C) zeigt. Die Unterschiede zwischen den gegen p24 gerichteten humoralen Immunantworten der einzelnen Gruppen waren bis auf eine Ausnahme nicht signifikant (Abb. 12B und 12D). Nur in der mit gp120-p24 immunisierten Gruppe konnte bei einer erhöhten Anzahl miteinander verglichener Gruppen ein signifikanter Unterschied zwischen dem Verhältnis von IgG1 zu IgG2a der p24-AK zu denen der mit F-p24 immunisierten Gruppe festgestellt werden. Werden die Verhältnisse von IgG2a zu IgG1 der Oberflächenproteine gegen das jeweilige Verhältnis des entsprechenden fusionierten p24 aufgetragen, ergibt sich eine signifikante Korrelation zwischen den Werten (Abb. 12E). Die gleiche Auftragung für die Daten einer Koimmunisierung mit Expressionsplasmiden für HIV-Env und GagPol, bei der die Proteine nicht miteinander fusioniert vorlagen, ergab keine signifikante Korrelation (Abb. 12F). Daraus ergibt sich zum einen, dass die Fusionierung für die Übertragung des Effekts der unausgeglichenen Immunreaktion verantwortlich ist. Weiterhin ergibt sich daraus, dass lösliche Faktoren wie das vorherrschende Zytokinmilieu eine untergeordnete Rolle spielen, da sich ein ähnlicher Übertragungseffekt andernfalls auch im Fall der Koimmunisierung mit Env und Gag gezeigt hätte. 55 Ergebnisse B Oberflächenproteine 7 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) A 6 5 4 4 F 2 -p H 2 -p A 4 4 2 p1 p2 0- g C p24 IgG1 IgG2a 7 6 5 4 4 14 gp p2 0- F- 4 24 p2 H -p A 12 gp D 4 p2 0- ** ns ns IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 10 10 1 0.1 0.01 4 F 4 H 2 -p A 12 4 p2 0- * 1 0.1 gp 14 4 p2 0- F- gp r = 0,7770 p<0,0001 24 H -p A 0 12 gp 24 -p 0 14 gp 0.0 1 0 -1 F-p24 HA-p24 gp120-p24 gp140-p24 -2 -1.5 4 p2 F -1.0 -0.5 Log IgG2a/IgG1 p24 0.0 0.5 Log IgG2a/IgG1 Env Log IgG2a/IgG1 Oberflächenprotein E -3 -2.0 4 p2 4 p2 0- 0.01 2 -p 2 14 gp ns ** 100 3 4 p2 24 -p r = -0,1492 p = 0,4968 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -1 0 1 2 3 Log IgG2a/IgG1 GagPol Abb. 12: Humorale Immunantwort gegen Oberflächen- und p24-Teil der Fusionsproteine nach Boost-Immunisierung. Zwei Wochen nach der Boost-Immunisierung bzw. sechs Wochen nach der Prime-Immunisierung von Balb/c-Mäusen wurde die IgG1- bzw. IgG2a-Antwort gegen die Oberflächenproteine sowie gegen das jeweils fusionierte p24 mit einem antigenspezifischen ELISA untersucht. Die Antikörperantworten sind für die Oberflächenproteine in A und für p24 in B als Mittelwerte mit Standardfehler dargestellt. C und D zeigen das jeweilige Verhältnis von IgG2a zu IgG1 mit geometrischem Mittel und 95%-Konfidenzintervall. Die statistische Signifikanz der Unterschiede im geometrischen Mittel wurde durch den Kruskal-Wallis-Test mit einem anschließenden Dunn’s Post-hoc-Test ermittelt (n = 5–6; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = nicht signifikant). Die lineare Regression bei einer Auftragung der IgG2a/IgG1-Verhältnisse der Oberflächenproteine gegen das jeweils fusionierte p24 (E) ergibt eine Korrelation mit r = 0,7770 und p < 0,0001 (Pearson). Eine entsprechende Auftragung für die IgG2a/IgG1-Verhältnisse von Daten einer Koimmunisierung mit HIV-Env und HIV-GagPol (Daten von Michael Storcksdieck genannt Bonsmann88) ergibt keine signifikante Korrelation (F). 56 Ergebnisse 3 3.1.3.2 Zelluläre Immunantwort Während die Produktion von IgG1 mit einer TH2-Polarisierung assoziiert wird, folgt die Produktion von IgG2a von Plasmazellen im Allgemeinen aus einer TH1-Polarisierung der T-Helferzellen, die mit diesen Zellen interagieren. Deshalb sollte auch die Ausprägung der Polarisierung anhand einer Untersuchung der produzierten Zytokine nach Restimulation der Splenozyten mit den bei Balb/cMäusen immundominanten MHCII-Peptiden des F-, des HA-, des Env- und des p24-Proteins untersucht werden. Dabei wurde die Produktion der mit einer TH1-Antwort assoziierten Zytokine IFNγ, IL-2 und TNFα mit einer intrazellulären Zytokinfärbung analysiert. Es zeigte sich, dass jede immunisierte Gruppe auf das entsprechende stimulierende Peptid reagierte und eine Expression sowohl von IFNγ, IL-2 und TNFα als auch eine Population von polyfunktionellen Zellen zeigte, die gleichzeitig alle drei Zytokine exprimierten (Abb. 13). Die Stärke der Reaktion auf das stimulierende Oberflächenprotein-Peptid ist zwischen den einzelnen Gruppen nicht direkt vergleichbar, da die Affinität der Peptide zu den jeweiligen MHCII- bzw. T-Zellrezeptoren sowie die daraus resultierende Stärke der Stimulation nicht eingeschätzt werden kann. Da jedoch alle Gruppen auf p24 reagieren, ist der Vergleich an dieser Stelle zulässig (Abb. 13D). Hier wird deutlich, dass alle immunisierten Gruppen eine nahezu gleich starke TH1-Reaktion auf den p24-Bestandteil der jeweiligen Fusionsproteine zeigten. Während sich also in der humoralen Immunantwort deutliche Unterschiede in der Verteilung von den TH1- bzw. TH2-assoziierten Antikörper-Subklassen IgG2a bzw. IgG1 zeigten, konnte ein solcher Unterschied in der Analyse der TH1-Zytokinantwort nicht beobachtet werden. Analog zu der CD4+-T-Zellantwort wurde auch die CD8+-T-Zellantwort untersucht, um die Wirkung der DNA-Vakzine auf die zelluläre Immunreaktion zu prüfen. Die Zellen wurden hier mit dem immundominanten MHCI-Peptid von p24 restimuliert, was einen Vergleich aller Gruppen ermöglichte. Zusätzlich zu den genannten TH1-Zytokinen wurde bei dieser Anordnung auch der Degranulationsmarker CD107 untersucht, der anzeigt, ob die untersuchten Zellen zytotoxisch aktiv sind. Allerdings zeigte sich auch hier, dass sich das Ausmaß der Antwort gegen das fusionierte p24Protein nach Restimulation der CD8+-T-Zellen zwischen den Gruppen nicht unterschied (Abb. 14). Die hier gezeigten Daten der intrazellulären Zytokinfärbung sowohl von CD4+- als auch von CD8+-Zellen stammen aus dem zweiten Immunisierungsversuch, der mit Balb/c-Mäusen durchgeführt wurde (siehe 3.1.3.1). Die Ergebnisse bestätigten die Daten der intrazellulären Zytokinfärbung (nicht gezeigt), die an Proben aus dem ersten Immunisierungsversuch durchgeführt wurden. 57 Ergebnisse A 3 F-stimuliert % der CD4 + T-Zellen 0.20 F-p24 HA-p24 gp120-p24 gp140-p24 p24 naive 0.15 0.10 0.05 0.00 IFN + IL-2+ B TNF + IFN + IL-2+ TNF + HA-stimuliert % der CD4 + T-Zellen 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 IFN + IL-2+ C IFN + IL-2+ TNF + TNF + IFN + IL-2+ TNF + TNF + IFN + IL-2+ TNF + Env-stimuliert 0.8 % der CD4 + T-Zellen TNF + 0.6 0.4 0.2 0.0 IFN + IL-2+ D p24-stimuliert % der CD4 + T-Zellen 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 IFN + IL-2+ Abb. 13: TH1-CD4+-T-Zellantwort nach zwei Immunisierungen mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden. Zwei Wochen nach der Boost-Immunisierung der Balb/c-Mäuse wurden die Milzen aller Tiere einer Gruppe (n = 4–6) entnommen und die vereinzelten Splenozyten in vitro mit MHCII-immundominanten Peptiden der jeweiligen Proteine F (A), HA (B), Env (C) oder p24 (D) restimuliert. Durch Färbung mit fluorophorgekoppelten Antikörpern wurden CD4 +-Zellen markiert und die intrazelluläre Expression der TH1-Zytokine IFNγ, IL-2 und TNFα quantifizierbar gemacht. In allen Diagrammen sind die Mittelwerte von 4–6 Proben je Gruppe mit dem jeweiligen Standardfehler abgebildet. Von allen Werten wurden die entsprechenden Werte einer unstimulierten Kultur abgezogen. 58 Ergebnisse 3 p24-stimuliert % der CD8+ T-Zellen 6 F-p24 HA-p24 gp120-p24 gp140-p24 p24 naive 4 2 0 CD107+ IFN + TNF + IL-2+ CD107+ IFN + TNF + IL-2+ Abb. 14: CD8+-T-Zell-Antwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Milzen entfernt, die Splenozyten isoliert und dann in vitro mit dem immundominanten MHCI-Peptid von p24 restimuliert. Anschließend wurden die Zelloberflächen mit α-CD8 und α-CD107 sowie intrazellulär exprimierte Zytokine mit α-IFNγ, α-IL-2 und α-TNFα gefärbt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte mit Standardfehler für 4–6 Proben je Gruppe. Allen ermittelten Einzelwerten wurden die entsprechenden Werte einer unstimulierten Kultur abgezogen. Um zu überprüfen, ob im Gegensatz zur TH1-Antwort eventuelle Unterschiede in der TH2-Antwort bestanden, wurde ein Teil der entnommenen Splenozyten einer 48-stündigen Restimulation unterworfen. Danach wurden die Kulturüberstände mittels Zytokin-ELISA auf die Konzentration der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 sowie des regulatorischen Zytokins IL-10 untersucht. Die Untersuchung wurde wie bereits die intrazelluläre Zytokinfärbung an Proben von Balb/c-Mäusen aus beiden entsprechenden Immunisierungsversuchen in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Dabei wurde beobachtet, dass alle Gruppen nach Restimulation mit dem entsprechenden immundominanten Peptid signifikante Mengen aller hier untersuchten Zytokine produzierten (Abb. 16). Die einzige Ausnahme bildete die mit HA-p24 immunisierte Gruppe, bei der nach Restimulation mit HA-Peptid keine signifikanten Mengen IL-4 nachgewiesen werden konnten (Abb. 16A). Die Produktion besonders von IL-5 und IL-13 schien bei den mit gp120-p24 und gp140-p24 immunisierten Tieren relativ hoch zu sein, auch wenn ein direkter Vergleich mit den anderen Gruppen aufgrund des Versuchsaufbaus nicht möglich ist (Abb. 16B und 16D). Zudem schien sich auch bei den Konzentrationen von IL-5 und IL-13 in den Proben der mit gp140-p24 immunisierten Tiere ein Trend zu einer Mehrproduktion abzuzeichnen, wenn die Proben mit p24 restimuliert wurden (Abb. 15B und 15D). Allerdings waren diese Unterschiede nicht signifikant. 59 Ergebnisse mIL4 (pg/mL) 400 200 100 mIL5 (pg/mL) 200 F-stimuliert ### HA-stimuliert ## Env-stimuliert p24-stimuliert ## 150 100 50 0 300 mIL10 (pg/mL) F-p24 HA-p24 gp140-p24 naive ### 300 0 F-stimuliert ### HA-stimuliert ## Env-stimuliert ### p24-stimuliert * 200 100 0 6000 mIL13 (pg/mL) ### 3 F-stimuliert ### HA-stimuliert ### Env-stimuliert p24-stimuliert ### 4000 2000 0 F-stimuliert HA-stimuliert Env-stimuliert p24-stimuliert Abb. 15: TH2-CD4+-T-Zellantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden im ersten Immunisierungsversuch an Balb/c-Mäusen. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Milzen der immunisierten Tiere entfernt. Die aus den Milzen isolierten Splenozyten wurden mit MHCII-immundominanten Peptiden für 48 h restimuliert. Anschließend wurden mithilfe von ELISA-Kits die Konzentrationen der TH2-Zytokine IL-4 (A), IL-5 (B) und IL13 (D) sowie des regulatorischen Zytokins IL-10 (C) in den Kulturüberständen der Splenozyten bestimmt. Von den ermittelten Konzentrationen wurden die jeweiligen Werte einer nicht stimulierten Population abgezogen. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardfehler von 4–6 Tieren. Die statistische Signifikanz der Zytokininduktion bei den mit p24 stimulierten Gruppen F-p24, HA-p24 und gp140-p24, sowie zwischen allen Gruppen bei den übrigen Stimulanzien wurde mit einem Oneway-ANOVA gefolgt von einem Tukeyschen Post-Test ermittelt (* = p < 0,05 vs. gp140-p24; ** = p < 0,01 vs. gp140-p24; # = p < 0,05 vs. naiv; ## = p < 0,01 vs. naiv; ### = p < 0,001 vs. naiv). 60 Ergebnisse F-p24 HA-p24 gp120-p24 gp140-p24 p24 naive A mIL4 (pg/mL) 50 ### 3 ## ## 40 30 20 10 0 F-stimuliert HA-stimuliert Env-stimuliert p24-stimuliert B mIL5 (pg/mL) 250 ## ### ## # 200 ** 150 ** 100 50 0 F-stimuliert HA-stimuliert Env-stimuliert p24-stimuliert C mIL10 (pg/mL) 500 ### ## ## 400 300 200 100 0 F-stimuliert HA-stimuliert Env-stimuliert p24-stimuliert D mIL13 (pg/mL) 2000 ### ### ### ### * 1500 1000 500 0 F-stimuliert HA-stimuliert Env-stimuliert p24-stimuliert Abb. 16: TH2-CD4+-T-Zellantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein kodierenden Plasmiden im zweiten Immunisierungsversuch an Balb/c-Mäusen. Die Milzen der immunisierten Tiere wurden zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung entfernt. Die aus den Milzen isolierten Splenozyten wurden mit MHCII-immundominanten Peptiden für 48 h restimuliert. Anschließend wurden mithilfe von ELISA-Kits die Konzentrationen der TH2-Zytokine IL-4 (A), IL-5 (B) und IL-13 (D) sowie des regulatorischen Zytokins IL-10 (C) in den Kulturüberständen der Splenozyten bestimmt. Von den ermittelten Konzentrationen wurden die jeweiligen Werte einer nicht stimulierten Population abgezogen. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardfehler von 4–6 Tieren. Die statistische Signifikanz der Zytokininduktion bei den mit p24 stimulierten Gruppen F-p24, HA-p24 und gp140-p24, sowie zwischen allen Gruppen bei den übrigen Stimulanzien wurde mit einem Oneway-ANOVA gefolgt von einem Tukeyschen Post-Test ermittelt (* = p < 0,05 vs. gp140-p24; ** = p < 0,01 vs. gp140-p24; # = p < 0,05 vs. naiv; ## = p < 0,01 vs. naiv; ### = p < 0,001 vs. naiv). 61 Ergebnisse 3 Eine Wiederholung des Versuchs an den Proben des zweiten Immunisierungsversuchs an Balb/cMäusen zeigte jedoch dieselbe Tendenz bei den Werten der mit p24-Peptid restimulierten Splenozyten. Hier lagen die Werte für IL-5 bei den mit F-p24 oder HA-p24 immunisierten Tieren und für IL-13 bei den mit F-p24 immunisierten Tieren signifikant niedriger lagen als bei den mit gp140-p24 immunisierten Tieren (Abb. 16B und 16D). Da die Ausschüttung von TH2-Zytokinen im Allgemeinen mit der Produktion von IgG1 korreliert, stehen diese Ergebnisse im Einklang mit den zuvor bestimmten Verhältnissen der AK-Subklassen. Dabei scheint die Grundlage für die beobachtete Mehrproduktion von IgG1 keine vollständige Verschiebung der Immunreaktion von TH1 zu TH2 zu sein, sondern vielmehr ein zusätzlicher Schub in die TH2-Richtung. Da die Art der von den CD4+-T-Helferzellen produzierten und ausgeschütteten Zytokine maßgeblich durch APZ beeinflusst wird, erschließt sich aus den hier gezeigten Ergebnissen, dass die Ursache für die unterschiedliche humorale Immunantwort auf die verschiedenen viralen Oberflächenproteine bei den Mechanismen der angeborenen Immunität zu suchen ist. 3.2 Mechanismen der angeborenen Immunität als mögliche Ursache Für die Beeinflussung der Polarisation von CD4+-T-Helferzellen kommen eine Reihe von Mechanismen in Frage, von denen einige im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden. 3.2.1 Der Einfluss der Fusionsproteine auf die Produktion von IFNα Das Vorhandensein und die Stärke der IFNα-Antwort bei einer Infektion oder nach einer Immunisierung nimmt Einfluss auf die Ausrichtung der resultierenden adaptiven Immunantwort. Aus diesem Grund wurde die Reaktion von Splenozyten in Form der IFNα-Produktion auf die in dieser Arbeit verwendeten Fusionsproteine untersucht, da eine unterschiedliche Reaktion an dieser Stelle eine mögliche Ursache für die andersartige Immunantwort gegen Env wäre. 62 Ergebnisse 3 Zu diesem Zweck wurden Splenozyten einer Mx2-Maus isoliert. Diese Tiere zeichnen sich durch ein Luciferase-Gen aus, das sich unter der Kontrolle des Mx2-Promotors befindet. Dieser wird durch IFNα aktiviert, sodass eine IFNα-Immunreaktion eine von der Stärke der Reaktion abhängige LuciferaseProduktion nach sich zieht. Diese wiederum kann durch den von Luciferase vermittelten Umsatz von entsprechenden Substraten wie z.B. Luciferin in einer Lichtreaktion sicht- und quantifizierbar gemacht werden. Die Splenozyten wurden mit vorbereitetem konzentriertem Zellkulturüberstand für 24 oder 48 h inkubiert. Der Überstand stammte von 293T-Zellen, die mit den in Abschnitt 1 verwendeten DNAPlasmiden transfiziert worden waren und die die entsprechenden Proteine sekretiert hatten. Nach der Inkubation mit dem proteinhaltigen Überstand wurde die IFNα-Resonanz der Splenozyten analysiert. 48 h 24 h 6 IFN (log RLU/s) IFN (log RLU/s) 6 5 4 5 4 3 3 4 p2 F- 4 p2 0H 14 p g A - 4 p2 4 p2 N IF 4 L pG fiz ns ra nt u t r ie R 10 24 p24 -p A 40 H 1 gp 24 p F- 0 4 4 L rt p2 N pG izie R1 F f I s an tr n u Abb. 17: Produktion von IFNα als Reaktion auf die Inkubation mit Fusionsproteinen. 293T-Zellen wurden mit den Expressionsplasmiden F-p24, HA-p24, gp140-p24 und p24 transfiziert, woraufhin die Zellen die entsprechenden Proteine an den Kulturüberstand abgaben. Als Kontrolle dienten Zellen, die mit einem Expressionsplasmide für IFNα4 oder dem GFPexprimierenden pGL transfiziert wurden, wobei IFNα4 sekretiert und GFP intrazellulär angereichert wurde. Nach 48 h wurden die Überstände mit den darin enthaltenen Proteinen konzentriert. Mit diesen Überständen wurden Splenozyten einer Mx2Maus für 24 h oder 48 h inkubiert. Als zusätzliche Kontrolle wurden drei Ansätze ausschließlich mit frischem R10-Medium inkubiert. Durch die in diesen Zellen durch IFNα induzierte Expression von Luciferase konnte die Produktion von IFNα nach der Inkubation verglichen werden. Dafür wurden die Zellen gewaschen, lysiert und mit einer Luciferase-Substratlösung versetzt. Die Detektion der Lichtreaktion erfolgte im Luminometer. In den Diagrammen sind die Mittelwerte mit Standardfehler aus drei Proben pro Gruppe abgebildet. Während die Zellen, die mit IFNα4-haltigem Überstand inkubiert worden waren, eine deutliche Antwort zeigten, gab es zwischen den übrigen Gruppen keinen Unterschied in der Stärke der Reaktion (Abb. 17). In dem hier verwendeten Versuchsaufbau schien zudem die An- oder Abwesenheit viraler Proteine keinen Einfluss auf das Ausmaß der Reaktion zu haben, da der Überstand der untransfizierten Zellen genau die gleiche Antwort auslöste wie beispielsweise der Überstand, der F-p24 enthielt. Im Vergleich dazu zeigten Splenozyten, die ausschließlich mit frischem R10-Medium inkubiert worden waren, eine deutlich geringere Reaktion. Das deutet darauf hin, dass die generelle Reaktion eher eine Stressreaktion der Zellen darstellt, die durch den höheren Anteil an verbrauchtem Medium ausgelöst wurde. Da in diesem Experiment keine Hinweise auf eine unterschiedliche Reaktion der Splenozyten in Form einer IFNα-Antwort auf die viralen Proteine gefunden werden konnte, wurden weitere 63 Ergebnisse 3 Mechanismen der angeborenen Immunantwort untersucht, die Einfluss auf die Ausrichtung der erworbenen Immunität nehmen können. 3.2.2 Untersuchung der Abhängigkeit der Immunantwort von Signalkaskaden der Pattern Recognition Receptors Die differentielle Bindung von Pathogenen an PRR stellt einen Hauptmechanismus der Polarisierung der resultierenden adaptiven Immunität dar. Deshalb wurden zwei der Hauptfamilien von PRR, die TLR sowie die CLR bezüglich ihres Einflusses auf die Immunantwort gegen die in dieser Arbeit behandelten viralen Oberflächenproteine untersucht. 3.2.2.1 Immunisierung von MyD88/TRIF-Doppel-Knock-Out-Mäusen Die TLR sind, wenn auch in unterschiedlicher Zusammensetzung, auf allen Antigen präsentierenden Zellen vorhanden und werden als hauptverantwortliche Rezeptoren für die Aktivierung dieser Zellen betrachtet. Da der zeitliche Ablauf der Aktivierung dieser Zellen sowie die Stärke des aktivierenden Signals entscheidenden Einfluss auf die Reifung und Prägung sowohl der entsprechenden APZ, als auch auf die anschließend von dieser APZ aktivierten T-Zellen hat, könnte die differentielle Bindung der hier untersuchten Proteine an TLR zu einer unterschiedlichen Ausprägung der CD4+-T-Zellantwort und damit zu einem anderen Verhältnis der Antikörpersubklassen führen. Da die Bindung an TLR zur Auslösung einer Signalkaskade führt, die für alle TLR in den Adaptermolekülen MyD88 und TRIF zusammenläuft90, ist es möglich, durch die Verwendung von Deletionsmutanten für diese beiden Gene die gesamte Signalweitergabe der TLR eines Organismus zu unterbinden. Aus diesem Grund wurde eine Immunisierung von MyD88/TRIF-/--Mäusen 64 Ergebnisse 3 vorgenommen. Hierfür wurden die Plasmide F-p24 und gp140-p24 ausgewählt, die in der vorherigen Immunisierung (s. Abschnitt 3.1.3) den größten Unterschied in der Immunantwort gezeigt hatten. B Oberflächenproteine 8 7 6 5 4 MyD88/TRIF -/- wt F-p24 MyD88/TRIF -/- IgG1 IgG2a 7 6 5 4 3 wt gp140-p24 MyD88/TRIF -/- wt MyD88/TRIF -/- F-p24 C wt gp140-p24 D 100 1 10 0.1 IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 p24 8 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) A 1 0.1 0.01 0.001 MyD88/TRIF -/- F-p24 wt MyD88/TRIF -/- gp140-p24 0.01 0.001 0.0001 wt MyD88/TRIF -/- wt MyD88/TRIF -/- F-p24 wt gp140-p24 Abb. 18: Humorale Immunantwort von MyD88/TRIF-/--Mäusen. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde den KO-Mäusen Blut entnommen, um die IgG1- sowie die IgG2a-Antwort sowohl gegen den das jeweilige virale Oberflächenprotein als auch gegen den fusionierten p24-Teil zu bestimmen. Dabei wurde die relative Stärke der Antworten mit einem antigenspezifischen ELISA bei einer Verdünnung des Serums von 1:1000 analysiert. Die Proben wurden mit Serenproben von in einem unabhängigen Experiment identisch behandelten C57BL/6-Wildtyp-Mäusen (wt) verglichen. In A und B sind die Antikörperantworten als Mittelwerte aus n = 2–3 Proben mit Standardfehler für die Oberflächenproteine (A) und das jeweils fusionierte p24 (B) dargestellt, C und D zeigen die jeweiligen Verhältnisse der Subklassen zueinander mit geometrischem Mittel. Da die Knock-Out-Mäuse aus einem C57BL/6-Stamm gezüchtet worden waren, wurden zum Vergleich Serumproben von C57BL/6-Wildtyp-Mäusen (wt) herangezogen, die in einem separaten Experiment (siehe 3.1.3.1) einer identischen Behandlung unterzogen worden waren. Ähnlich wie die zuvor (s. 3.1.3) verwendeten Balb/c-Mäuse zeigen die C57BL/6-Mäuse nach Immunisierung mit gp140-p24 eine deutliche Mehrproduktion von IgG1 gegenüber IgG2a sowohl gegen das Oberflächenprotein als auch gegen das fusionierte p24 (Abb. 18). Dasselbe ist bei den MyD88/TRIF-Doppel-Knock-Out-Mäusen (MyD88/TRIF-/-) zu sehen. Während gegen das F-Protein und ein daran fusioniertes p24 eine ausgeglichene Immunantwort ausgebildet wird, ist bei den gp140-p24immunisierten Mäusen eine stärkere Ausprägung der IgG1-Antwort im Vergleich zur IgG2a-Antwort zu beobachten, wobei sich die Stärke der Antikörperantwort nicht von der der wt-Mäuse unterscheidet. Daraus lässt sich schließen, dass die den TLR nachgeschalteten Signalkaskaden bei der Ausbildung des Antikörpersubklassen-Verhältnisses als Reaktion auf die hier verwendeten Proteine keine Rolle spielen. 65 Ergebnisse 3 3.2.2.2 Immunisierung von Card9-Knock-Out-Mäusen Die zweite Gruppe von PRR, die durch die Immunisierung von Knock-Out-Mäusen untersucht wurde, waren die CLR. Diese Rezeptoren geben im Falle einer Bindung an ein Pathogen – wie auch die TLR – über den zytoplasmatischen Rezeptoranteil ein Signal weiter, das über eine Kaskade von Proteinen weitergeleitet wird. Für einen großen Anteil der CLR laufen diese Signalkaskaden in dem Protein Card9 zusammen, sodass durch den Einsatz von Card9-Knock-Out-Mäusen (Card9-/-) die Signalweitergabe durch CLR in weiten Teilen – wenn auch nicht vollständig – eingeschränkt werden kann. Card9-/--Mäuse wurden nach dem bisher verwendeten Schema (s. Abb. 9) mit F-p24 und gp140-p24 immunisiert und ihre Immunantwort nach 42 Tagen mit denselben Proben von identisch behandelten wt-Mäusen verglichen, die auch für den Vergleich mit den MyD88/TRIF-/--Mäusen verwendet worden waren. B Oberflächenproteine 8 ns 7 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) A ns ns * 6 5 4 Card9 -/- wt F-p24 Card9 -/- wt 8 7 ns ns IgG1 IgG2a ** * 6 5 4 3 Card9 -/- wt F-p24 gp140-p24 C Card9 -/- wt gp140-p24 D ns * 10 * 10 1 0.1 0.01 0.001 * 100 IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 p24 1 0.1 0.01 Card9 -/- F-p24 wt Card9 -/- wt gp140-p24 0.001 Card9 -/- F-p24 wt Card9 -/- wt gp140-p24 Abb. 19: Humorale Immunantwort von Card9-/--Mäusen. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde den Mäusen Blut entnommen und das Serum auf Antikörper gegen den Oberflächenprotein- und den p24-Teil des jeweiligen Fusionsproteins mittels antigenspezifischem ELISA in einer Verdünnung von 1:1000 untersucht. Die Proben wurden mit denen von in einem unabhängigen Experiment identisch behandelten C57BL6-Wildtyp-Mäusen (wt) verglichen. In A und B sind die relativen Antikörpermengen als Mittelwerte aus n = 5–6 Proben mit Standardfehler für die Oberflächenproteine (A) und das jeweils fusionierte p24 (B) dargestellt, während C und D die jeweiligen Verhältnisse der Subklassen zueinander mit geometrischem Mittel zeigen. Die statistische Signifikanz wurde mittels t-Test untersucht (* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001; **** = p < 0,0001; ns = nicht signifikant). 66 Ergebnisse 3 Anders als bei den MyD88/TRIF-/--Mäusen war hier ein Unterschied zu der humoralen Immunantwort identisch behandelter wt-Mäuse festzustellen (Abb. 19). Während sowohl die wtMäuse als auch die KO-Mäuse eine ausgeglichene Immunantwort sowohl gegen F als auch gegen das an F fusionierte p24 zeigten, bildete sich bei den wt-Mäusen gegen gp140 und das entsprechende p24 eine signifikante Mehrproduktion von IgG1. Bei den KO-Mäusen wurde hingegen weniger IgG1 gebildet als bei den wt-Mäusen, allerdings lag die Produktion immer noch höher als die der IgG2a-Antikörper (Abb. 19A und 19C). Auch bei den in den KO-Mäusen gebildeten Antikörpern gegen das an F fusionierte p24 war das Verhältnis der Subklassen ausgeglichen. Bei den Antikörpern gegen das an gp140 fusionierte p24 wurde weiterhin ein IgG1-Überschuss gegenüber IgG2a festgestellt, der jedoch signifikant geringer war als in den Proben, die von den wt-Mäusen genommen worden waren. Da das Verhältnis der Subklassen in den mit gp140-p24 immunisierten Card9-KO-Mäusen zumindest bei den gegen gp140 gerichteten Antikörpern etwas ausgeglichener ist als bei den identisch behandelten wt-Mäusen, ist eine Beteiligung der über Card9 laufenden Signalkaskaden wahrscheinlich. Da es aber lediglich zu einem unvollständigen Ausgleich der Subklassen kam, ist nicht auszuschließen, dass ein weiterer Mechanismus beteiligt ist. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Funktion von CLR ist die rezeptorvermittelte Aufnahme von Antigenen in die APZ. Deshalb wurden im nächsten Schritt Bindungsstudien mit den hier verwendeten Proteinen und einer CLR-Bibliothek durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte so in Erfahrung gebracht werden, ob ein bestimmter CLR an der Ausbildung des unausgewogenen Antikörperverhältnisses beteiligt ist. 3.2.3 Untersuchung der Bindung der viralen Oberflächenproteine an C-TypLektinrezeptoren Während PRR in erster Linie der Signalweitergabe an die Zelle dienen und eine Bindung an diese Rezeptoren zur Folge hat, dass die Zielzelle aktiviert wird, haben viele der CLR zusätzlich zur Signalweitergabe eine zweite Funktion: die Aufnahme des gebundenen Antigens in die Zelle. Da jedoch verschiedene Zelltypen ein jeweils anderes Set von CLR exprimieren, kann es zu einer unterschiedlich effektiven Aufnahme des Antigens durch unterschiedliche APZ kommen. Da die Art der APZ Einfluss auf die resultierende Polarisierung der CD4+-T-Helferzellen hat, wurde deshalb nachfolgend untersucht, ob eine differentielle Bindung der Oberflächenproteine an verschiedene CLR vorliegen könnte. Hierfür wurden rekombinante murine CLR eingesetzt, deren zytoplasmatische Signaldomäne durch den Fc-Teil eines humanen IgG-AKs ersetzt worden war (CLR-Fc). Der Fc-Teil ermöglichte es bei diesem Versuch, eine mögliche Bindung des betreffenden CLR mithilfe eines gegen den Fc-Teil gerichteten konjugierten Antikörpers nachzuweisen. 67 Ergebnisse 3 3.2.3.1 Zell-basierter Assay Zur Untersuchung der Bindung der Oberflächenproteine an die rekombinanten CLR wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Im ersten Ansatz wurden Zellen mit membranständigen Versionen der Oberflächenproteine RSV-F, IAV-HA und HIV-Env transfiziert, deren extrazelluläre Domänen identisch mit den löslichen Proteinen waren, die von den DNA-Vakzinen in Abschnitt 3.1.1 exprimiert wurden. Zusätzlich zu den Oberflächenproteinen wurden die Zellen mit dsRed transfiziert, das das Rot fluoreszierende Protein (DsRed) exprimiert. Auf diese Weise sollten später erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren sein. Die Inkubation der transfizierten Zellen mit den CLR-Fc sollte zu einer Bindung der CLR-Fc an die viralen Oberflächenproteine führen, die anschließend mit einem gegen den Fc-Teil gerichteten fluoreszenzmarkierten AK durchflusszytometrisch nachgewiesen werden sollte. 10000 F/dsRed Env/dsRed HA/dsRed dsRed MFI (FITC) 8000 6000 4000 2000 0 Fc -h 2 ec c hF l C IC M L- Fc c hF D ti ec Fc c hF -h n1 l C 9a c e c in M Fc -h le nR g Si h 3- L1 c hF G M Abb. 20: Bindungsstudie von hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen an membranständige virale Oberflächenproteine. 293TZellen wurden mit membranständigen Versionen der viralen Oberflächenproteine und dem Farbstoff dsRed transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen mechanisch abgelöst, gewaschen und mit den hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen inkubiert. Gebundene Lektine wurden durchflusszytometrisch über die Bindung eines FITC-konjugierten, gegen den Fc-Teil gerichteten Zweitantikörpers detektiert. Es zeigte sich in diesem Versuch, dass zwischen den einzelnen Oberflächenproteinen keine generellen Unterschiede bei der Bindung an die einzelnen Lektine zu beobachten ist. Indes gab es Unterschiede in der Menge jeweils gebundenen Lektins (Abb. 20). Diese lag für Clec9a am höchsten. Da im Jahr 2012 filamentöses Aktin aus beschädigten Zellmembranen als Ligand für CLEC-9A identifiziert wurde154, lässt dies vor allem darauf schließen, dass viele Zellen während des Experiments geschädigt wurden. Da zudem bei allen untersuchten CLR-Fc die Menge an jeweils gebundenem Lektin in den einzelnen Proben ungefähr gleich hoch war und sich vor allem auch nicht bei der Probe unterschied, die ohne virales Oberflächenprotein ausschließlich mit dsRed transfiziert worden war, muss davon ausgegangen werden, dass die CLR-Fc vor allem an andere Bestandteile der Zelloberflächen banden. Da jedoch das Kontrollprotein hFc, das ausschließlich aus dem Fc-Teil des humanen IgG besteht, in keiner Gruppe an die Zellen band, kann zumindest davon ausgegangen 68 Ergebnisse 3 werden, dass die hier beobachteten Bindungen tatsächlich lektinabhängig waren und nicht durch möglicherweise vorhandene Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche zustande kamen. Da die Zellen somit keine geeignete Grundlage zur Präsentation der viralen Oberflächenproteine darstellten, sollten für einen zweiten Ansatz die Oberflächenproteine in aufgereinigter Form eingesetzt werden. 3.2.3.2 Aufreinigung der Oberflächenproteine aus Zellkulturüberständen Für einen weiteren Bindungsassay mit CLR-Fcs mussten die viralen Oberflächenproteine aufgereinigt werden. Die hierfür verwendeten Expressionsplasmide wurden zunächst molekularbiologisch im Sinne der besseren Ausbeute optimiert. So war das für die Expression von RSV-F verwendete Plasmid eine modifizierte Variante eines Expressionsplasmids, das im Rahmen einer früheren Arbeit bereits in der Gruppe etabliert worden war155. Zur effizienteren Aufreinigung wurde hier lediglich der Hexa-His-Tag durch einen Deca-His-Tag ersetzt. Die Expressionsplasmide für IAV-HA und HIV-gp140 entsprachen den Plasmiden, die für die Immunisierung verwendet wurden, wobei hier der p24-kodierende Part samt Hexa-His-Tag ebenfalls durch einen Deca-His-Tag ersetzt wurde. Die Proteine wurden in 293T-Zellen exprimiert und in den Überstand sekretiert. Die Aufreinigung aus dem Überstand erfolgte über den His-Tag mit Ni2+-Sepharose. Die lösliche Variante von RSV-F, FsynED-his10, ist 63 kDa groß. Das Protein enthält eine FurinSchnittstelle, sodass es im Golgi-Apparat in zwei Teile (12 und 54 kDa) geschnitten wird, die nur über zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Da diese durch den Probenpuffer reduziert werden und der His-Tag am größeren der beiden Proteinteile hängt, war auf dem Western Blot auch nur der größere der beiden Teile zu erkennen (Abb. 21). Im Coomassie-Gel ist im konzentrierten Eluat (E. Pool) eine weitere Bande bei ca. 65 kDa zu erkennen. Da sie im Western Blot nicht erscheint, ist anzunehmen, dass es sich hierbei nicht um die ungeschnittene Variante von F, sondern um eine Proteinverunreinigung aus dem Zellkulturüberstand (vermutlich BSA) handelt. Die Aufreinigung von HA ergab ein Protein mit einer Größe von etwas weniger als 75 kDa (Abb. 21C und 21D). Die Coomassie-Färbung zeigte, dass dieses Protein im konzentrierten Eluat im Vergleich mit weiteren verunreinigenden Proteinen in hoher Konzentration vorlag. Der Western Blot mit α-HisAK zeigt weiterhin, dass es sich um das gewünschte Protein handelt, das über einen His-Tag verfügt. Das hier verwendete HA hat nach der Expression eine Größe von ca. 63 kDa, die sich aus der Sequenz der Aminosäuren ergibt. Das Protein verfügt zudem über fünf mögliche Glykosylierungsstellen, von denen sich zwei überlappen. Somit kann der Größenunterschied von theoretischer Größe zur tatsächlich beobachteten erklärt werden, wenn man von einer durchschnittlichen Größe von 2–4 kDa eines komplexen Glykans ausgeht156. 69 Ergebnisse 3 Die Aufreinigung von gp140 (Abb. 21E und 21F) erbrachte ein Protein, dessen Größe im Gel bei etwa 165 kDa lag und das mit leichten Verunreinigungen in konzentrierter Version gewonnen werden konnte. Neben der Größe im Coomassie-Gel wurde die Identität des Proteins auch hier durch einen Western Blot mit α-His-Antikörper bestätigt. Abb. 21: Aufreinigung von löslichen Oberflächenproteinen aus Zellkulturüberstand. Die Proteine RSV-F (A und B), IAV-HA (C und D) sowie HIV-gp140 (E und F) wurden in 293T-Zellen exprimiert und von diesen an den Kulturüberstand abgegeben. Aus diesem wurden die Proteine über den enthaltenen Polyhistidin-Tag mit Ni2+-NTA in einer Affinitätschromatographie herausgefiltert, gewaschen, eluiert und konzentriert (Pool). Die verschiedenen Schritte der Aufreinigung wurden durch SDSPAGE mit anschließender Coomassie-Färbung (A, C und E) oder einem Western Blot (B, D und E) überprüft. Die Western Blots wurden mit einem gegen den His-Tag gerichteten Antikörper und einem entsprechenden HRP-konjugierten Zweitantikörper analysiert. 70 Ergebnisse 3 3.2.3.3 Bindungsassay mit aufgereinigten Proteinen Um die Bindung von CLR an die viralen Oberflächenproteine weiter zu untersuchen, wurden ELISAPlatten mit den aufgereinigten Proteinen (3.2.3.2) beschichtet und anschließend mit den hFcgekoppelten Lektinen inkubiert. Eine mögliche Bindung wurde in einem zweiten Schritt durch einen HRP-konjugierten, gegen den hFc-Teil gerichteten Zweitantikörper nachgewiesen, der eine Farbumschlagereaktion vermittelte. Da die Signalweitergabe durch Card9 vermutlich nicht die einzige Ursache für die Immunreaktion auf Env ist, wurden in diesem Versuch auch CLR wie SIGNR1 berücksichtigt, deren Signalkaskaden Card9 nicht beinhalten. F HA gp140 1.5 E495 1.0 0.5 0.0 G SI L- h N D A C R IG -S C hD N D M L1 C c Le b 12 N G SI 1 R N G SI 3 R N G SI 5 R L1 G M -1 c hF t in ec D Abb. 22: Bindung von hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen an lösliche virale Oberflächenproteine. Aufgereinigte, lösliche, virale Oberflächenproteine wurden auf eine ELISA-Platte geschichtet und mit verschiedenen hFc-gekoppelten C-Typ-Lektinen inkubiert. Die Bindung wurde über einen gegen den hFc-Teil gerichteten, HRP-konjugierten Zweitantikörper detektiert. Die von diesem AK vermittelte Farbumschlagreaktion wurde über die Extinktion bei einer Wellenlänge von 495 nm gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei Proben pro Protein inklusive Standardfehler. Auch hier konnte kein Unterschied im Bindungsverhalten der einzelnen Proteine an das jeweilige Lektin festgestellt werden (Abb. 22). Wenn eine Bindung, wie z.B. an Dectin-1, stattfand, so galt dies für alle untersuchten Proteine. Dabei war die Bindung der Lektine an die Proteine von Lektin zu Lektin unterschiedlich stark. Da jedoch keine differentielle Bindung zwischen den einzelnen Proteinen zu beobachten ist, scheint eine spezifische Bindung, die ein Protein von allen anderen unterscheidet, als Ursache für unterschiedliche Immunreaktion der Mäuse – zumindest für die hier untersuchten CLR – ausgeschlossen werden zu können. Dennoch konnte durch die Immunisierung der Card9-/--Mäuse ein Hinweis auf die Einflussnahme der CLR gefunden werden. 71 Ergebnisse 3 3.3 Der Einfluss struktureller Eigenschaften von Env Das HIV-Env-Protein besteht aus konstanten und variablen Domänen. Während die konstanten Domänen die Struktur und damit die Funktionalität des Proteins bestimmen, ragen die variablen Domänen in schleifenartigen Strukturen, den sogenannten Loops, aus der Kernstruktur des Proteins heraus. Da sie auf diese Weise die immunologisch zugängliche Oberfläche des Proteins bilden, wurde nun ihr Einfluss auf die Immunreaktion untersucht, um auf diese Weise Rückschlüsse auf den zugrundeliegenden Mechanismus zu finden. 3.3.1 Die variablen Domänen von Env 3.3.1.1 Herstellung von trunkierten Env-Konstrukten Zu diesem Zweck wurden vier neue Plasmide konstruiert, die trunkierte Versionen des bislang eingesetzten Env-Proteins kodierten. Dabei wurde die Trunkierung schrittweise durchgeführt, sodass die Konstrukte immer kürzer wurden und jeweils unmittelbar nach einer der variablen Domänen endeten. Zur internen Kontrolle und Vergleichbarkeit mit den bisher verwendeten Plasmiden wurden auch diese Versionen mit p24 fusioniert (Abb. 23). Abb. 23: Aufbau der Expressionsplasmide für trunkierte Varianten von Env. Die trunkierten Varianten wurden so eingeteilt, dass das Protein hinter jeweils einer der variablen Domänen (V1V2–V5) des Proteins endete. Die Plasmide sowie die resultierenden Proteine wurden nach der letzten vollständigen Domäne des entsprechenden Proteins benannt. Wie bei den bisher zur Immunisierung verwendeten Expressionsplasmiden wurden auch die trunkierten Varianten an p24 fusioniert und standen unter der Kontrolle des CMV-Promotors. Zur Überprüfung der korrekten Expression und Sekretion der trunkierten Konstrukte wurden sie in 293T-Zellen transfiziert und Zellkulturüberstände und Zelllysate in einem Western Blot mit einem gegen p24 gerichteten Antikörper nachgewiesen. 72 Ergebnisse 3 Abb. 24: Expressionsnachweis der trunkierten Env-Konstrukte. Zum Nachweis der Expression in eukaryotischen Zellen wurden 293T-Zellen mit den neu erstellten Plasmiden sowie mit einem GFP-exprimierenden Kontrollplasmid transfiziert. Nach 48 h wurden Proben der Überstände sowie der Zelllysate genommen und mit einer SDS-PAGE gefolgt von einem Western Blot analysiert. Dabei wurden die Überstandsproben in dreifacher Menge gegenüber den Lysatproben aufgetragen, um eine gleichmäßige Belichtung zu ermöglichen. Die Detektion erfolgte mit einem α-p24-Antikörper, da jedes der trunkierten Env-Proteine mit p24 fusioniert vorlag. Die roten Rechtecke zeigen den Bereich, der für die densitometrische Analyse verwendet wurde. Der Western Blot erbrachte den Nachweis der Expression aller trunkierten Env-Varianten (Abb. 24). Dabei fiel auf, dass die Lysatproben insgesamt schärfere Banden zeigten, die zudem bei einer etwas geringeren Größe liefen als die entsprechenden Banden der Überstandsproben. Das ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf die unvollständige Glykanprozessierung der Proteine im Lysat zurückzuführen. Die längste Variante, V5-p24, wurde mit einer Größe von etwa 150 kDa exprimiert. Die kürzere Variante V4-p24 war ein wenig kleiner als V5 und lief bei ca. 140 kDa, während die noch kürzere Variante eine Größe von ungefähr 130 kDa hatte. Die kürzeste Variante, V1V2-p24, wurde mit einer Größe von etwa 60 kDa exprimiert. Aufgrund der Unschärfe der Banden konnte nicht verlässlich abgeschätzt werden, ob alle Proteine gleich stark sekretiert wurden. Aus diesem Grund wurden die Banden im Überstand densitometrisch vermessen, um später eine Korrelationsanalyse mit den Daten der humoralen Immunreaktion durchführen zu können. 73 Ergebnisse 3 3.3.1.2 Die Immunantwort gegen trunkierte Varianten von Env Zur Untersuchung der Immunreaktion auf die verkürzten Env-Proteine wurden Gruppen von sechs Mäusen nach dem in Abb. 9 beschriebenen Schema mit den in Abschnitt 3.3.1.1 beschriebenen Plasmiden immunisiert. A B p24 6.0 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) Env 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 V1V2 V3 V4 V5 gp140 C 6.5 6.0 5.5 5.0 V1V2 V3 V4 V5 gp140 p24 V1V2 V3 V4 V5 gp140 p24 D 100 10 10 IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 IgG1 IgG2a 7.0 1 0.1 0.01 V1V2 V3 V4 V5 gp140 1 0.1 0.01 Abb. 25: Humorale Immunantwort gegen trunkierte Varianten von HIV-Env und das jeweils fusionierte p24. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung mit den trunkierten Env-Varianten wurde den Tieren Blut entnommen und aus dem Serum die spezifische Antikörperantwort gegen das Env-Protein (A und C) sowie gegen das fusionierte p24 (B und D) mittels antigenspezifischem ELISA bestimmt. Die absoluten Mengen der jeweiligen Antikörpersubklassen sind für Env und p24 in A und B als Mittelwerte mit Standardfehler dargestellt. C und D zeigen das Verhältnis der Subklassen zueinander mit geometrischem Mittel. Die trunkierten Varianten V5–V3 zeigten dieselbe Tendenz zu einer unausgewogenen humoralen Immunreaktion wie das Volllängenkonstrukt gp140 (Abb. 25A und 25C). Lediglich das kürzeste Konstrukt, V1V2, führte zu einer ausgeglichenen Reaktion, bei der sogar etwas mehr IgG2a als IgG1 gebildet worden war und das Verhältnis der Subklassen nahe 1 lag. Es wird vor allem deutlich, dass sich die Immunreaktion gegen Env in einer Mehrproduktion von IgG1 auszeichnet, da der Level der IgG2a-Antikörper in allen Gruppen ungefähr gleich hoch war (vgl. Abb. 25A). Die Reaktion auf die jeweils fusionierten p24-Proteine zeigte ähnliche Tendenzen, auch wenn diese hier nicht so eindeutig ausfielen wie bei der Immunisierung mit den viralen Oberflächenproteinen F und HA (3.1.3). Die Tiere reagierten in diesem Versuch auf p24 allein mit einer starken Produktion von IgG1, die die Produktion von IgG1 der mit gp140-p24 immunisierten Tiere überstieg. Da jedoch auch die IgG2a-Produktion höher lag, war das Verhältnis insgesamt ausgeglichener. Die Tiere, die mit V1V2-p24 immunisiert worden waren, zeigten ebenfalls eine gegenüber gp14-p24 erhöhte IgG2a-Produktion (Abb. 25B und 74 Ergebnisse 3 25D). Um sicher zu gehen, dass Antikörperproduktion nicht von der Stärke der Expression bzw. der Sekretion der trunkierten Env-Proteine abhängig war, wurden die IgG2a/IgG1-Verhältnisse gegen die gemessene Farbdichte im Expressionsnachweis (Abb. 24) aufgetragen und eine Korrelationsanalyse durchgeführt (Abb. 26). Korrelationsanalyse log IgG2a/IgG1 0.5 r = -0,4949 p > 0,5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Farbdichte Abb. 26: Analyse der Korrelation der Verhältnisse von IgG2a zu IgG1 und der jeweiligen Farbdichte der zugehörigen Bande im Western Blot der Expressionsanalyse. Die Werte wurden mit der Analyse nach Pearson korreliert, die eine Normalverteilung der Werte zugrunde legt. Es ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen den Werten (p > 0,5). Da die Verhältnisse der Subklassen nicht mit der Intensität der Banden und damit nicht mit der Sekretionsstärke korrelierten, ist davon auszugehen, dass kein Zusammenhang zwischen der Ausrichtung der Immunantwort und einer möglicherweise unterschiedlichen Expressions- und Sekretionsstärke der trunkierten Env-Proteine in der Maus besteht. Neben der humoralen Immunantwort wurde nach sechs Wochen ebenso die Reaktion der CD4 +-THelferzellen untersucht. Dabei wurden durch Restimulation der Splenozyten sowohl die TH1- als auch die TH2-Zytokine analysiert. 75 Ergebnisse A V1V1-p24 V3-p24 V4-p24 V5-p24 gp140-p24 p24 naive Env-stimuliert 0.4 % der CD4 + T-Zellen 3 0.3 0.2 0.1 0.0 IFNy+ IL-2+ B TNF + IFN + IL-2+ TNF + TNF + IFN + IL-2+ TNF + p24-stimuliert % der CD4 + T-Zellen 0.3 0.2 0.1 0.0 IFNy+ IL-2+ Abb. 27: TH1-Zytokinantwort nach zwei Immunisierungen mit verkürzten Versionen von gp140 exprimierenden Plasmiden. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Milzen entfernt, die Splenozyten vereinzelt und mit den MHCIIimmundominanten Env- (A) bzw. p24-Peptiden (B) für sechs Stunden restimuliert. Danach wurden die Zellen intrazellulär mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen die TH1-Zytokine IFNγ, IL-2 und TNFα gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. In allen Diagrammen sind die Mittelwerte von 5–6 Proben je Gruppe mit dem jeweiligen Standardfehler abgebildet. Allen Einzelwerten wurden die jeweiligen Werte einer unstimulierten Kultur abgezogen. Wie schon nach der Immunisierung mit den viralen Oberflächenproteinen (vgl. Abb. 13) zeigten sich bei der intrazellulären Zytokinfärbung nach sechsstündiger Restimulation mit immundominanten Peptiden keine Unterschiede zwischen den einzelnen Varianten, auch nicht bei V1V2 (Abb. 27). Die TH1-Reaktion auf alle Varianten des Env-Proteins war somit unverändert. Deutlichere Unterschiede wurden bei der Untersuchung der TH2-Zytokine (Abb. 28) sichtbar. Während es bei den Konstrukten V3–V5 sowie gp140-p24 und p24 zu einer hohen Produktion der TH2Zytokine IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 kam, wurden diese Zytokine in Reaktion auf V1V2 kaum gebildet. Besonders stark war hingegen die Reaktion bei den mit V5-p24 immunisierten Tieren. An dieser Stelle sei angemerkt, dass das immundominante Peptid der CD4+-T-Helferzellen in unmittelbarer Nähe zum 76 Ergebnisse mIL4 (pg/mL) A * * 80 20 mIL5 (pg/mL) Env-stimuliert mIL10 (pg/mL) mIL13 (pg/mL) p24-stimuliert * ** Env-stimuliert p24-stimuliert 100 80 60 40 20 300 * 200 100 0 D V1V2-p24 V3-p24 V4-p24 V5-p24 gp140-p24 p24 naive 40 0 C * 60 0 B 3 1500 Env-stimuliert p24-stimuliert * 1000 500 0 Env-stimuliert p24-stimuliert Abb. 28: TH2-Zytokinantwort zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung mit trunkierten Varianten des Env-Proteins. Nach Entnahme der Milzen wurden die Splenozyten vereinzelt und für 48 h mit immundominanten MHCII-Peptiden restimuliert. Anschließend wurde die Konzentration Zytokine IL-4 (A), IL-5 (B), IL-10 (C) und IL-13 (D) in den Kulturüberständen per Sandwich-ELISA bestimmt. Von den ermittelten Konzentrationen wurden die jeweiligen Werte einer nicht stimulierten Population abgezogen. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 4–6 Proben inklusive Standardfehler. Die statistische Signifikanz der wurde mit einem One-way-ANOVA gefolgt von einem Tukeyschen Post-Test ermittelt (* = p < 0,05; ** = p < 0,01). 77 Ergebnisse 3 N-Terminus des Env-Proteins liegt und somit in V1V2 enthalten ist. Die nicht vorhandene TH2-Reaktion ist somit nicht auf ein Fehlen dieses Peptids zurückzuführen. Auch bei diesem Versuch kam es zu einer tendenziellen Übertragung des Effekts von gp140 bzw. den verkürzten Varianten auf das fusionierte p24. Es konnte in diesem Zusammenhang beobachtet werden, dass die Reaktion auf das an V1V2 fusionierte p24 bei allen Zytokinen außer IL-10 signifikant (IL-4, IL-5) oder zumindest tendenziell (IL-13) niedriger lag als auf die übrigen Konstrukte. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass der Grund für die Immunreaktion gegen Env, die zu einer Mehrproduktion von IgG1 führt, auf eine strukturelle Eigenschaft des Env-Proteins zurückzuführen ist. Diese ist im Bereich der konstanten Region C2 oder der variablen Region V3 zu vermuten, da eine Verkürzung des Proteins um genau diesen Teil zu einer ausgeglichenen Reaktion führt, bei der nicht nur ähnlich viel IgG2a wie IgG1 gebildet wird, sondern zudem auch die TH2Zytokinproduktion deutlich reduziert ist. Da die starke Glykosylierung eines der hervorstechendsten Merkmale des Env-Proteins ist und sich die Art der Glykosylierung von V3 zudem von der anderer Proteindomänen unterscheidet, liegt der Schluss nahe, dass sie auch der Grund für die abweichende Immunreaktion gegen das Env-Protein ist. Deshalb sollte im Folgenden die Glykosylierung von V3 und ihr Einfluss auf die Immunreaktion näher untersucht werden. 3.3.2 Die Glykosylierung von C2V3 3.3.2.1 Herstellung eines deglykosylierten V3-Konstruktes Um den Einfluss der Glykosylierung der C2V3-Region auf die Immunisierung zu untersuchen, wurden die N-Glykosylierungsstellen des V3-Konstrukts so verändert, dass anstelle des erforderlichen Asparagins das strukturverwandte Glutamin exprimiert wurde. Auf diese Weise sollte die initiale Anknüpfung des N-Acetylglucosamins verhindert werden. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde auch dieses Konstrukt als Fusionsprotein mit p24 angelegt (V3NQ-p24). Auch dieses Plasmid wurde zunächst in 293T-Zellen transfiziert, um Expression und Sekretion zu prüfen (Abb. 29). 78 Ergebnisse 3 Abb. 29: Expressionskontrolle des in C2 und V3 deglykosylierten Expressionsplasmids V3NQ. Zum Nachweis der Expression und Sekretion der Proteine wurden 293T-Zellen mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert. Nach 48 h wurden Proben der Überstände und Zelllysate genommen und per SDS-PAGE und Western Blot untersucht. Die Proben der Überstände wurden in dreifacher Menge gegenüber den Lysatproben aufgetragen. Der Blot wurde mit einem gegen den fusionierten p24Teil der Fusionsproteine gerichteten HRP-konjugierten Antikörper entwickelt. Wie im Western Blot zu sehen ist, wurde das in C2V3 deglykosylierte Protein exprimiert und sekretiert. Im Vergleich zum glykosylierten V3 fiel auf, dass es für die mutierte Variante im Gegensatz zur ursprünglichen Variante problemlos möglich war, eine eindeutige Laufhöhe zuzuordnen. Zudem war das deglykosylierte Protein etwas kleiner. Der Grund für beide Beobachtungen sind die fehlenden Glykane, die ansonsten, besonders bei stark glykosylierten Proteinen, für unscharfe Banden sorgen. Da das Protein nicht nur exprimiert und sekretiert wurde, sondern auch die erfolgreiche Deglykosylierung nachgewiesen werden konnte, wurde nun ihr Einfluss in einem Immunisierungsexperiment untersucht. 3.3.2.2 Immunisierung mit einem deglykosylierten V3-Konstrukt Eine Gruppe von sechs Mäusen wurde nach dem bereits etablierten Ablauf immunisiert (s. Abb. 9). Zum Vergleich dienten zwei Gruppen von Mäusen, die entweder mit der ursprünglichen Variante von V3 oder mit dem p24-Expressionsplasmid immunisiert wurden. Nach sechs Wochen wurde die humorale Immunantwort gegen die verwendeten Proteine untersucht (Abb. 30). 79 Ergebnisse A 3 C p24 5.5 Antikörper (log RLU/s) Antikörper (log RLU/s) Env-Proteine * ns 5.0 4.5 4.0 3.5 V3-p24 V3NQ-p24 B IgG1 IgG2a 7.0 6.5 6.0 5.5 V3-p24 D V3NQ-p24 p24 V3NQ-p24 p24 * 100 10 IgG2a/IgG1 IgG2a/IgG1 10 1 0.1 0.01 V3-p24 V3NQ-p24 1 0.1 0.01 V3-p24 Abb. 30: Humorale Immunantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Fusionsprotein exprimierenden Plasmiden. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen und das Serum auf proteinspezifische Antikörper der Subklassen IgG1 und IgG2a untersucht. Hierfür wurden ELISA-Platten mit Env- oder p24-Protein beschichtet, anschließend mit einer Verdünnung der Seren (1:10000) inkubiert und gebundene Antikörper mit gegen den jeweiligen FcTeil gerichteten HRP-konjugierten Zweitantikörpern detektiert. A und C zeigen die jeweiligen Antikörpermengen als Mittelwert mit Standardfehler. B und D bilden das Verhältnis der Subklassen zueinander ab. Die Linie stellt das geometrische Mittel dar. Die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test (A und C; * = p < 0,05; ns = nicht signifikant) bzw. MannWhitney-Test (B und D; * = p < 0,05; ns = nicht signifikant) Mäuse, die mit der deglykosylierten Variante von V3 immunisiert worden waren, zeigten nun ebenfalls eine ausgeglichene Immunantwort, die der Immunantwort der mit V1V2 immunisierten Tiere im vorhergehenden Versuch glich. Die Tiere produzierten signifikant weniger IgG1 als Tiere, die mit dem ursprünglichen V3 immunisiert worden waren; es gab sogar einen leichten Überschuss von IgG2aAntikörpern (Abb. 30A). An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Beschichtung des ELISAs, mit dem die humorlae Immunantwort ausgewertet wurde, mit herkömmlich glykosyliertem gp120 durchgeführt wurde. Durch die veränderte Glykosylierung des aus dem Immunisierungsplasmid resultierenden Proteins entstehen jedoch vermutlich auch Antikörper mit Paratopen gegen Env, die eine geringere Affinität zum herkömmlich glykosylierten gp120 im ELISA haben. Entsprechend konnte die humorale Antwort gegen Env vermutlich nicht vollständig erfasst werden. Allerdings zeigte sich dasselbe Ergebnis auch bei der Antikörperantwort gegen p24. Während sowohl das einzelne p24 als auch das p24, das an V3 fusioniert war, eine stärkere, jedoch nicht signifikante Produktion von IgG1 hervorriefen, zeigten die Tiere eine ausgeglichene Antwort auf das p24, das an V3NQ fusioniert war. Die Glykosylierung hat also einen deutlichen Einfluss auf das Ergebnis der Immunisierung. Der Einfluss erstreckt sich nicht nur auf das Protein selbst, sondern auch auf ein fusioniertes zweites Protein. 80 Ergebnisse 3 A mIL4 (pg/mL) 50 *** ns V3-p24 V3NQ-p24 p24 naive 40 30 20 10 0 Env-stimuliert p24-stimuliert *** * Env-stimuliert p24-stimuliert ns ns B mIL5 (pg/mL) 25 20 15 10 5 0 C mIL10 (pg/mL) 300 200 100 0 Env-stimuliert p24-stimuliert *** ** Env-stimuliert p24-stimuliert D mIL13 (pg/mL) 800 600 400 200 0 Abb. 31: TH2-Zytokinantwort nach zweimaliger Immunisierung mit Expressionsplasmiden. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Milzen entnommen, die Splenozyten vereinzelt und anschließend mit immundominanten MHCII-Plasmiden für 48 h restimuliert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Konzentration der jeweiligen Zytokine IL-4 (A), IL-5 (B), IL-10 (C) und IL-13 (D) in den Kulturüberständen mit einem entsprechenden Sandwich-ELISA gemessen. Von den ermittelten Konzentrationen wurden die jeweiligen Werte einer nicht stimulierten Population abgezogen. Es werden die Mittelwerte aus 4–6 Proben je Gruppe mit dem jeweiligen Standardfehler dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte durch einen OneWay ANOVA gefolgt von Tukey’s Post-Test (*** = p < 0,001; ** = p < 0,01; * = p < 0,05; ns = nicht signifikant). 81 Ergebnisse 3 Neben der humoralen Immunantwort wurde auch die TH2-Antwort der CD4+-T-Helferzellen untersucht (Abb. 31). Auch hier wird deutlich, wie stark der Einfluss der Glykosylierung auf die Immunreaktion ist. Alle betrachteten TH2-Zytokine, IL-4, IL-5 und IL-13 liegen in den Proben von Tieren, die mit V3 immunisiert wurden, in einer signifikant höheren Konzentration vor als in den Proben von V3NQ-Tieren. Dieser Effekt erstreckte sich hier, abgesehen von IL-10 und IL-13, bei denen der Effekt nicht signifikant ist, auch auf das jeweils fusionierte p24. Daraus ergibt sich, dass die Immunreaktion, die von HIV-Env hervorgerufen wird und die sich von der Immunreaktion auf andere virale und strukturell vergleichbare Oberflächenproteine unterscheidet, in dieser Eigenschaft maßgeblich von einer oder mehreren Glykosylierungen in der C2V3-Region beeinflusst wird. 82 Diskussion 4 4 Diskussion Die RV144-Studie hat gezeigt, dass ein Immunschutz gegen HIV mit einer Prävalenz von IgG3-Antikörpern gegen HIV-Env einhergeht, die eine möglichst hohe Aktivität bei Fc-vermittelten, sekundären Immunfunktionen haben75. Immunisierungsstudien in Mäusen haben jedoch gezeigt, dass das Oberflächenprotein von HIV offenbar über Eigenschaften verfügt, die die Bildung von Antikörpern mit dieser Fähigkeit verhindern80,80–82. Da bislang nicht bekannt ist, durch welchen Mechanismus HIVEnv das gelingt, sollte im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkung eines HIV-Env-Impfstoffs auf das Immunsystem von Mäusen im Vergleich mit anderen viralen Oberflächenproteinen untersucht werden. Dabei wurde das Augenmerk vor allem auf die Produktion der Antikörper IgG1 und IgG2a gelegt. Während IgG2a eine ähnlich hohe Kapazität besitzt, Fc-vermittelte sekundäre Immunfunktionen zu induzieren, wie es beim menschlichen IgG3 der Fall ist, gleicht das murine IgG1 in seinen Fähigkeiten eher dem humanen IgG4, dessen vorwiegende Bildung in Immunisierungsstudien nachgewiesen wurde, in denen kein Schutz vermittelt werden konnte65,75,157–159. IgG4 scheint zudem in der Toleranz gegen Antigene eine Rolle zu spielen160,161 und hat genau wie das murine IgG1 eine sehr geringe Affinität zu Fcγ-Rezeptoren158. Zudem wird der Klassenwechsel sowohl zu humanem IgG4 als auch murinem IgG1 im jeweiligen System durch die Zytokine IL-4, IL-10 und IL-13 gefördert162–165, wobei die Produktion dieser Zytokine sowie die Produktion von IgG1 in Mäusen mit einem T H2Phänotyp verknüpft ist166,167. Verschiedene Studien konnten bereits einen Zusammenhang zwischen einer Immunisierung mit HIV-Env auf DNA-oder Proteinbasis und einem TH2-Phänotyp nachweisen80– 82,87 . Mit dieser Arbeit sollten deshalb neben der Auswirkung der Immunisierung auf die murine Immunantwort auch mögliche Ansatzpunkte des Proteins bei der Prägung derselben untersucht und ein möglicher Mechanismus herausgearbeitet werden. Im ersten Schritt wurden Tiere deshalb mit DNA-Konstrukten immunisiert, die jeweils Fusionsproteine bestehend aus den viralen Oberflächenproteinen RSV-F, IAV-HA oder HIV-Env sowie dem Capsid-Protein p24 kodierten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiere auf RSV-F und IAV-HA mit einer ungefähr gleich starken Produktion von IgG1 und IgG2a reagierten. Demgegenüber stand die Reaktion auf HIV-Env, gegen das die Tiere vermehrt IgG1 bildeten. Gleichzeitig spiegelte die Immunreaktion auf das jeweils fusionierte p24 das Verhältnis bis zu einem gewissen Grad wider (Abb. 10). Die Immunreaktion gegen die Oberflächenproteine steht im Einklang mit Studien, die die Immunantwort auf HIV-Env, RSV-F oder IAV-HA sowohl bei Protein- (HIV-Env) als auch bei DNAImmunisierungen (HIV-Env, RSV-F, IAV-HA) untersucht haben80–82,86,87. Die Untersuchung der Polarisierung der CD4+-T-Helferzellen zeigte zudem, dass das veränderte Gleichgewicht der Subklassen auch von einer tendenziell verstärkten Produktion von TH2-Zytokinen begleitet wird (Abb. 16), 83 Diskussion 4 während die Produktion der TH1-Zytokine annähernd gleich ist (Abb. 13). Diese Beobachtung spricht dafür, dass die Immunisierung mit HIV-Env die T-Helferzellen nicht vollständig zu einer reinen TH2-Antwort polarisiert, sondern dass vielmehr eine zusätzliche Population von TH2-polariserten Zellen induziert wird. Da sich die Immunreaktion zudem tendenziell auf das jeweils fusionierte p24 übertragen lässt, liegt die Vermutung nahe, dass die Polarisierung bereits beeinflusst wird, solange das Fusionsprotein noch als Ganzes vorliegt. Da die APZ maßgeblich an der Beeinflussung der T-Helferzellen beteiligt sind, ist es wahrscheinlich, dass sie ihrerseits bei der Aufnahme des Antigens so beeinflusst werden, dass im späteren Verlauf eine TH2-Antwort begünstigt wird. Da eine APZ das Fusionsprotein als Ganzes aufnimmt und nach der Prozessierung Anteile von beiden Proteinen präsentiert, würde dies die Übertragung der Immunreaktion von HIV-Env auf p24 erklären. Da auch eine TH1-polarisierte Population zu existieren scheint, hat die Art der Aufnahme in die APZ vermutlich bereits Einfluss auf die spätere Polarisierung. So könnte eine Erkennung desselben Proteins durch verschiedene Oberflächenrezeptoren, wie z.B. TLR und CLR, in einem Fall eine TH1-, im anderen Fall jedoch eine TH2Polarisation nach sich ziehen. Eine weitere Möglichkeit, die Polarisation einer APZ zu beeinflussen, ist das Mikromilieu, in dem die Aufnahme eines Antigens stattfindet. So ist gezeigt worden, dass IFNα die Entstehung von TH1-polarisierten CD4+-T-Zellen fördert103,168,169. Eine unterschiedlich starke Induktion von IFNα könnte somit einen Hinweis auf den Mechanismus liefern, der zu einer unterschiedlich starken Produktion von IgG1 und IgG2a in mit HIV-Env immunisierten Mäusen führt. Hierfür wurden Splenozyten eines IFNα-Reporterstammes mit Zellkulturüberstanden inkubiert, die die Fusionsproteine F-p24, HA-p24 oder gp140-p24 enthielten. Da IFNα in einer Rückkopplungsreaktion die Produktion von mehr IFNα auslöst, war davon auszugehen, dass bereits die Induktion einer geringen Menge IFNα in den Reporterzellen durch die viralen Oberflächenproteine zu einer deutlichen IFNα-Gesamtantwort führen würde. Allerdings wurde hierbei festgestellt, dass in dem verwendeten Versuchsaufbau die Art der von 293T-Zellen sezernierten Fusionsproteine keinerlei Auswirkung auf die Stärke der IFNα-Produktion der Reporterzellen hatte, da auch Zellkulturüberstand von untransfizierten Zellen die Reporterzellen im gleichen Ausmaß beeinflusste. Ausschließlich die Zellen, die mit dem Überstand von IFNα4 sezernierenden Zellen inkubiert worden waren, zeigten eine deutliche Reaktion, die sich von der anderer Gruppen unterschied (Abb. 17). Da die viralen Oberflächenproteine bei den Lymphozyten somit keine unterschiedliche IFNα-Antwort hervorriefen, ist eine Beteiligung von IFNα an dem Mechanismus, der zu der abweichenden Immunantwort auf HIVEnv führt, als unwahrscheinlich zu betrachten. Eine weitere Möglichkeit der Beeinflussung der nachfolgenden Immunreaktion ist durch die Bindung und Aufnahme eines Antigens durch verschiedene PRR gegeben. Die Bindung eines Antigens an verschieden TLR kann einen TH1- oder TH2-Phänotyp der Immunreaktion bewirken108–111, ebenso 84 Diskussion 4 wie die Bindung an unterschiedliche CLR126,127. Deshalb wurden zwei KO-Stämme untersucht, denen entweder die Signalkaskade der TLR (MyD88/TRIF-/-) oder einer Gruppe der CLR (Card9-/-) fehlten. Das Ergebnis der Immunisierung der KO-Mäuse im Vergleich zum Ergebnis einer Immunisierung von Wildtyp-Mäusen sollte zeigen, ob die betreffenden PRR Einfluss auf die Polarisierung der Immunantwort und damit auf das Verhältnis der Antikörpersubklassen nehmen würden. In anderen Studien wurde die Bindung von HIV-Env an TLR2 und 4 sowie die Bindung von RSV-F an TLR4 nachgewiesen, weshalb sie als beteiligte PRR hier in Betracht gezogen wurden92,93,170. Allerdings zeigte die Immunisierung der MyD88/TRIF-/-, dass zwischen der Reaktion auf F-p24 und gp140-p24 derselbe Unterschied im Hinblick auf das Verhältnis der Antikörpersubklassen bestand wie bei den auf dieselbe Weise immunisierten Wildtyp-Mäusen (Abb. 18). Daraus lässt sich schließen, dass die TLR keinen Einfluss auf die vermehrte Bildung von IgG1 bei den mit Env immunisierten Tieren haben. CLR erkennen anders als TLR vor allem kohlenhydrathaltige Strukturen, wie z.B. glykosylierte Proteine. HIV-Env ist im Gegensatz zu den anderen hier untersuchten viralen Oberflächenproteinen, die nur über 2–4 PNGS verfügen, ausgesprochen stark glykosyliert, weshalb eine Beteiligung der CLR an der Erkennung und Aufnahme des Fusionsproteins erwogen wurde. Tatsächlich ergab die Immunisierung von Card9-defizienten Mäusen eine signifikant geringere Produktion von Envspezifischem IgG1 als bei identisch behandelten Wildtyp-Mäusen, was zu einem fast vollständig ausgeglichenen Verhältnis der Subklassen führte (Abb. 19). Das lässt den Schluss zu, dass einer oder mehrere der Card9-abhängigen CLR an der Erkennung und/oder Aufnahme von HIV-Env in die APZ beteiligt sind. Darüber hinaus scheint die Bindung von HIV-Env an diesen Rezeptoren die Immunantwort auf das Protein maßgeblich zu beeinflussen. Da Card9 beteiligt ist, müssen es ein oder mehrere CLR sein, die über eine ITAM-Domäne verfügen oder intrazellulär mit einem zweiten Protein assoziieren, das eine ITAM-Domäne enthält. So sind ITAM-CLR bekannt, die bei Aktivierung eine TH2-Immunreaktion begünstigen, wie z.B. Dectin-2126. Andere ITAM-CLR können bei gleichzeitiger Stimulation mit anderen Oberflächenrezeptoren zu einer TH2-Ausrichtung der Immunantwort führen. Ein Beispiel dafür ist Dectin-1, das zusammen mit TLR2 diesen Effekt bewirkt171. Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, welche CLR möglicherweise an der Bindung der Fusionsproteine beteiligt waren. Die im ersten Assay verwendete Auswahl beschränkte sich in erster Linie auf Card9-abhängige CLR – mit Ausnahme von MGL, das Card9-unabhängig ist. Die mit einem humanen IgG-Fc fusionierten CLR wurden mit Zellen inkubiert, die RSV-F, IAV-HA oder HIV-Env membranständig exprimierten. Tatsächlich wurden die einzelnen CLR unterschiedlich stark gebunden, wobei jedoch keine Unterschiede bei der Bindungsstärke an die jeweiligen Proteine festgestellt werden konnten (Abb. 20). Die starke Bindung zu Clec9a, die in allen Proben – einschließlich der nur mit dsRed transfizierten – beobachtet wurde, legte jedoch die Vermutung nahe, dass vermehrt 85 Diskussion 4 Zellbestandteile von den CLR gebunden wurden, da Clec9A in erster Linie filamentöses Aktin bindet, das u.a. von beschädigten Zellen freigesetzt wird154. Aus diesem Grund wurden für einen weiteren Versuch zunächst die viralen Oberflächenproteine aufgereinigt, um sie anschließend in einem Bindungsassay unmittelbar mit den CLR inkubieren zu können. Die in einer humanen Zelllinie (293T) produzierten Proteine konnten mit einer zufriedenstellenden Ausbeute und Reinheit gewonnen werden (Abb. 21). Mit den aufgereinigten Proteinen wurden weitere Bindungsstudien durchgeführt, bei denen die Proteine auf eine adsorbierende Oberfläche geschichtet wurden, um sie anschließend mit den CLR-Fc zu inkubieren. In dieses Experiment wurden weitere CLR – wie z.B. das humane DC-SIGN – mit eingeschlossen, da für diesen CLR die Bindung von HIV-Env und auch IAV-HA experimentell mehrfach bestätigt wurde172,173. In Mäusen verfügt dieser Rezeptor über acht Homologe, deren Funktion und Bindungsspektrum teilweise stark von dem des humanen DC-SIGN abweicht. Die höchste funktionelle Ähnlichkeit hat dabei SIGN-R3, gefolgt von SIGN-R5 und SIGN-R1174. Alle drei Homologe wurden hier ebenfalls getestet. Mit dem Bindungstest konnte eine Bindung der untersuchten Proteine an Dectin-1, SIGN-R3, SIGN-5 und hDC-SIGN nachgewiesen werden (Abb. 22). In einem gewissen Ausmaß wurden auch MDL1, SIGN-R1 und MGL1 gebunden. Dabei entspricht die Bindung an die SIGN-R3, SIGN-R5 und hDC-SIGN den Erwartungen, da die Bindung von HIV-Env und IAV-HA bereits in anderen Studien nachgewiesen wurde und SIGN-R3 und SIGN-R5 über ähnliche Bindungsaffinitäten verfügen wie DC-SIGN. Überraschender ist dagegen die Bindung der Proteine an Dectin-1. Dieser CLR bindet in erster Linie β-Glucan, ein Polysaccharid, das z.B. in der Zellwand von Pilzen vorkommt175, interagiert jedoch auch mit einem bisher unbekannten Protein auf T-Lymphozyten176,177, sodass eine vermutlich unspezifische Protein-Protein-Interaktion an dieser Stelle nicht ausgeschlossen werden kann. Da sich jedoch zwischen den Proteinen keine Unterschiede bei den Bindungsaffinitäten ergaben, konnte die Frage nach dem für HIV-Env spezifischen Mechanismus mit diesem Experiment nicht geklärt werden. Obwohl mögliche Kandidaten für eine differentielle Bindung zwischen den Proteinen, wie z.B. SIGN-R3, als Ursache für die unterschiedliche Immunreaktion vermutlich ausgeschlossen werden konnten, standen andere Kandidaten wie der Mannose-Rezeptor für diesen Versuch nicht zur Verfügung. Um dennoch weitere Rückschlüsse auf den der Immunreaktion auf HIV-Env zugrunde liegenden Mechanismus ziehen zu können, sollten in einem weiteren Experiment die Domänen des HIV-EnvProteins identifiziert werden, die für die Ausbildung der unterschiedlichen Immunantwort verantwortlich sind. Dafür wurde das Env-Protein stückweise trunkiert, sodass jedes Konstrukt hinter jeweils einer der variablen Domänen endete. Alle Varianten waren zudem mit p24 fusioniert (Abb. 23). Mit den neuen DNA-Impfstoffen wurden Mäuse nach dem bisherigen Schema immunisiert. Zum 86 Diskussion 4 Vergleich wurde je eine Gruppe mit gp140-p24 und eine Gruppe mit p24 immunisiert. Dabei stellte sich heraus, dass der Überschuss in der IgG1-Produktion, die bereits zuvor bei der Immunisierung mit gp140-p24 beobachtet werden konnte, auch bei den meisten verkürzten Konstrukten auftrat. Lediglich die Gruppe, die mit der kürzesten Variante, V1V2-p24, immunisiert worden war, zeigte ein ausgeglichenes Verhältnis der Antikörpersubklassen, das durch eine verringerte Produktion von IgG1 zustande kam (Abb. 25). Die TH1-Zytokinantwort blieb für alle Konstrukte unverändert gleich stark (Abb. 27), während sich hingegen bei der TH2-Zytokinantwort deutliche Unterschiede zeigten. Hier wurde deutlich, dass die Zytokinproduktion sowohl gegen das Volllängenkonstrukt als auch gegen die verkürzten Konstrukte V5, V4 und V3 deutlich höher lag als die gegen V1V2, das fast überhaupt keine TH2-Zytokinproduktion auslöste (Abb. 28). Daraus kann geschlossen werden, dass die Immunreaktion auf HIV-Env, die sich von der auf andere virale Oberflächenproteine unterscheidet, auf einer strukturellen Eigenschaft des Proteins beruht, die zwischen dem Ende der V1V2-Domäne und dem der V3-Domäne liegt. Denn erst das Entfernen dieses Teils des Proteins führte zu einem Ausgleich der Antikörpersubklassen und zum Ausbleiben einer TH2-Reaktion. Dabei bleibt zunächst ungeklärt, auf welcher strukturellen Ebene des Proteins der Effekt entsteht, wobei die Quartärstruktur, also die Trimerisierung des Proteins, durch Vorarbeiten zu diesem Thema bereits ausgeschlossen werden konnte88. Durch das Fehlen ganzer Domänen wird in erster Linie die Tertiärstruktur des Proteins beeinflusst. Durch diese Beeinflussung wäre es möglich, dass das verkürzte Protein eine vollkommen andere Struktur hat und deshalb durch andere Rezeptoren erkannt wird als das ursprüngliche Protein. Auch in diesem Fall wäre die C2-V3-Domäne für den Effekt verantwortlich. in Hinblick auf die Ergebnisse der Card9-/--Immunisierung ist jedoch eine Beteiligung der posttranslationalen Modifikationen von HIV-Env viel wahrscheinlicher. Da diese Modifikationen in erster Linie in N-Glykosylierungen bestehen, und zudem mit den CLR Rezeptoren, die Glykane erkennen, an der Ausbildung des IgG1-Überschusses und der TH2-gewichteten Immunreaktion beteiligt zu sein scheinen, wurde im letzten Experiment eine Variante von V3-p24 hergestellt, die im Bereich C2V3 keine PNGS mehr enthielt (V3NQ-p24). Tatsächlich produzierten Mäuse, die mit diesem DNAImpfstoff immunisiert worden waren, deutlich weniger IgG1 als Tiere, die mit dem ursprünglichen V3p24-Konstrukt immunisiert worden waren (Abb. 30). Im Vergleich mit der vorhergehenden Immunisierung, die mit den übrigen trunkierten Env-Varianten durchgeführt worden war, zeigten die V3NQ-Tiere die gleiche Immunreaktion wie jene, die mit V1V2-p24 behandelt worden waren. Dies zeigte sich nicht nur in einem ausgeglichenen Verhältnis der Antikörpersubklassen, sondern erstreckte sich auch hier auf eine nahezu nicht vorhandene TH2-Zytokinproduktion (Abb. 31). Dadurch wird deutlich, dass die Glykosylierung im Bereich C2V3 von HIV-Env tatsächlich maßgeblich an der Ausbildung der beobachteten Immunreaktion beteiligt ist. In dem vorliegenden Konstrukt beinhaltet diese Region acht PNGS, von denen sechs vollständig in C2 liegen, eine weitere im Übergang von C2 zu 87 Diskussion 4 V3 und eine in V3. Die in V3 liegende PNGS ist eine konservierte Sequenz, deren Glykosylierung in anderen Studien bestätigt wurde41–46. Interessanterweise ist diese Sequenz eine der wenigen PNGS, die bei HIV-Env komplex glykosyliert vorliegen, während die übrigen PNGS mehrheitlich Oligomannosereste tragen39. Damit sind zwei Möglichkeiten denkbar, wie das Env-Protein mittels seiner Glykosylierungen die Immunreaktion beeinflusst: Zum einen könnten die vielen Oligomannosereste, durch die sich das Protein auszeichnet, zu einer Aktivierung des jeweiligen Zelltyps durch Rezeptoren wie z.B. dem Mannose-Rezeptor führen, die das inflammatorische Milieu u.a. mit der Sekretion von IL-10 beeinflussen können. Zum anderen könnte das komplexe Glykan in V3 für eine Interaktion mit einem inhibitorischen Rezeptorkomplex verantwortlich sein, der in seiner Signalübertragung von Card9 abhängig ist. Da komplexe Glykane an ihren Enden Sialylsäurereste tragen, kämen hierfür verschiedene SIGLECs in Frage, wie z.B. SIGLEC-1, auch bekannt als Sialoadhesin oder CD169. SIGLEC-1 wird – wie auch der Mannose-Rezeptor – hauptsächlich auf Makrophagen exprimiert. Allerdings konnte gezeigt werden, dass seine Expression in der Anwesenheit von Rhinoviren auch in humanen Monozyten induziert wird. In diesem Fall führt seine inhibitorische Aktivität zu einer nur unvollständigen Aktivierung der Monozyten178. Für beide Rezeptoren wurde die Bindung von HIV-Env bereits nachgewiesen121,133,179. Allerdings verfügt keiner der beiden über eine bekannte intrazelluläre Signaldomäne, mit der eine Interaktion mit Signalproteinen – also auch nicht mit Card9 – möglich wäre130,180. Da jedoch dieses Signalprotein an dem hier untersuchten Mechanismus beteiligt zu sein scheint – wie durch die Immunisierung der Card9-/--Tiere gezeigt wurde –, müssen auch andere Rezeptoren in Betracht gezogen werden. Ein solcher Rezeptor müsste in der Lage sein, selektiv HIV-Env zu binden, und über eine intrazelluläre ITAM-Signaldomäne verfügen, die im weiteren Verlauf der Signalkaskade über die Proteinkinase Syk Card9 anspricht. Darüber hinaus müsste der Rezeptor in der Lage sein, das Expressionsmuster der betreffenden Zelle ohne Einwirken weiterer Faktoren wie parakriner Zytokine so zu verändern, dass im Folgenden eine TH2-lastige Immunreaktion entsteht. Ein Rezeptor, auf den alle diese Voraussetzungen zutreffen, ist Dectin-2126. Dieser Rezeptor hat keine eigene ITAM-Signaldomäne, sondern assoziiert bei Bindung eines Liganden mit FcRγ, über dessen ITAM-Domäne dann ein Signal weitergegeben wird. In Mäusen löst die Aktivierung von Dectin-2 z.B. durch den Extrakt von Hausstaubmilben-Allergen einen TH2-Phänotyp unter Beteiligung des cys-Leukotrien-Signalwegs aus126. Da der Rezeptor eine hohe Affinität zu α-Mannan hat, das ebenfalls vom Mannose-Rezeptor und DC-SIGN gebunden wird, ist eine Bindung von HIV-Env über dessen mannosereichen Glykosylierungen denkbar181. Allerdings wurde eine solche Bindung bislang nicht nachgewiesen. Damit wäre folgende mechanistische Grundlage für die Entstehung der für Env spezifischen Immunantwort möglich: Die Glykosylierung des Proteins, insbesondere in der C2V3-Region, würde zu einer Bindung an einen Card9-abhängigen Rezeptor (z.B. Dectin-2) führen, der die APZ aktiviert, jedoch 88 Diskussion 4 im Folgenden eine TH2-Polarisierung der interagierenden CD4+-T-Helferzellen begünstigt. Makrophagen, die durch Bindung des Antigens an den Mannose-Rezeptor oder SIGLEC-1 zur Sekretion von regulatorischem IL-10 angeregt würden, könnten so auf das inflammatorische Umfeld, in dem das Antigen von der APZ aufgenommen wird, einwirken und damit die Reifung und Prägung der APZ zusätzlich beeinflussen. DZ, die unter dem Einfluss von IL-10 aktiviert werden und reifen, sind wiederum kaum in der Lage, eine TH1-Immunreaktion zu induzieren182 Ebenfalls wäre eine zusätzliche Bindung an inhibitorische CLR denkbar, was zu einer verringerten IL-12-Produktion führen könnte. Eine nachfolgende Aktivierung von CD4+-T-Helferzellen in Abwesenheit von IL-12 kann ebenfalls ein Auslöser für eine TH2-Polarisierung sein183,184. Das würde erklären, warum die unausgewogene Immunreaktion in den Card9-/--Tieren nicht vollständig verschwindet, sondern tendenziell erhalten bleibt. Weder der Mannose-Rezeptor noch SIGLEC-1 oder auch CLR mit inhibitorischer ITIM-Domäne geben ihre Signale über Card9 weiter. So wäre die Beeinflussung des inflammatorischen Milieus noch immer möglich. Fehlen jedoch die Glykosylierungen, könnte keiner der beiden Mechanismen greifen. Die Glykosylierung von HIV-Env scheint somit für die im Vergleich zu anderen viralen Oberflächenproteinen unterschiedliche und für einen effektiven Immunschutz höchstwahrscheinlich ungünstige Immunantwort verantwortlich zu sein. Allerdings muss der hier vorgeschlagene Mechanismus zunächst bestätigt werden, bevor Rückschlüsse auf eine Übertragbarkeit auf den menschlichen Organismus gezogen werden können. Neben Bindungstests des Proteins mit den genannten Rezeptoren wären zudem Immunisierungsversuche mit KO-Mäusen, denen einer oder mehrere dieser Rezeptoren fehlen, eine Möglichkeit, den hier vorgeschlagenen Mechanismus zu bestätigen. Darüber hinaus ist noch unklar, welcher Zelltyp letztendlich für die Ausbildung des beobachteten TH2-Phänotyps verantwortlich ist. Zwar spricht die Datenlage für eine Beteiligung eines Card9-abhängigen CLRs wie Dectin-2, jedoch sind diese Rezeptoren nicht allein auf DZ, sondern auch auf Makrophagen und Monozyten zu finden. Es ist damit durchaus im Bereich des Möglichen, dass der hier beschriebene Effekt nicht nur durch die Bindung an verschiedenen Rezeptoren, sondern auch durch die Bindung an ein und denselben Rezeptor auf verschiedenen Zelltypen beeinflusst wird. Da jedoch sowohl der Mannose-Rezeptor als auch SIGLEC-1 und Dectin-2 über humane Homologe verfügen, die zudem in beiden Organismen eine ähnliche Funktion ausüben, ist die Annahme der Übertragbarkeit des vorgeschlagenen Mechanismus auf den humanen Organismus nicht unzulässig. Falls der Mechanismus also tatsächlich auch beim Menschen greifen sollte, ist die Schlussfolgerung verlockend, dass es sich hier um eine weitere Escape-Strategie des HI-Virus handelt. So konnte nicht nur gezeigt werden, dass IgG3-Antikörper neben der hohen Effektivität beim Vermitteln von Fcabhängigen Immunfunktionen auch am besten in der Lage sind, HIV zu neutralisieren185, sondern darüber hinaus auch Hinweise darauf existieren, dass High Controller einen erhöhten Anteil von IgG3 im Vergleich zu Chronic Progressors haben186. Damit würde die ausgeprägte Glykosylierung des 89 Diskussion 4 einzigen Oberflächenproteins des Virus nicht nur für eine effektive Tarnung vor dem menschlichen Immunsystem sorgen, sondern im Fall der Registrierung durch Zellen des angeborenen Immunsystems auch für eine für das Virus weniger gefährliche Ausprägung der adaptiven Immunreaktion. Dafür spricht auch, dass in Studien an Mäusen gezeigt werden konnte, dass das enzymatische Entfernen von Mannoseresten von gp120 zu einer verstärkten TH1-Antwort führte82. Übertragen auf eine mögliche zukünftige Immunisierungsstrategie würde das bedeuten, dass eine Immunisierung mit einem zumindest in Teilen deglykosylierten Env, z.B. als DNA-Impfstoff oder Vektor, einen Vorteil gegenüber den bisherigen Strategien bedeuten könnte. Dafür müsste allerdings genau definiert werden, welche der Glykane für den hier postulierten Mechanismus notwendig sind. Da die Glykane in C2V3 ausschlaggebend waren, um in zwei unabhängigen Versuchen ein ausgeglichenes Verhältnis der Antikörpersubklassen herbeizuführen, liegt es nahe, eine oder mehrere der dort vorhandenen Glykosylierungen als Ursache anzunehmen. Da jedoch in beiden Experimenten DNA-Konstrukte für ein ausgeglichenes Verhältnis sorgten, denen zusätzlich auch die konstanten Regionen C3, C4 und C5 sowie die variablen Domänen V4 und V5 fehlten, kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine kritische Menge von Glykosylierungen für die Ausbildung eines unausgeglichenen Subklassenverhältnisses gegenüber einer einzelnen spezifischen Glykosylierung notwendig ist, die jeweils durch die Verkürzung des exprimierten Env-Proteins bzw. die Mutation der PNGS erreicht wurde. Für die Optimierung eines Impfstoffs wäre es jedoch wünschenswert, wenn tatsächlich eine einzelne Glykosylierung oder zumindest einige wenige Glykane ausschlaggebend wären, da in diesem Fall eine Immunisierung mit einem entsprechenden Konstrukt im Bereich des Möglichen wäre. Sollte jedoch die Menge der Glykane entscheidend sein, würde eine so weitreichende Veränderung des Proteins zwar unter Umständen zu einem Impfschutz mit gewünschter Polarisierung der CD4+-T-Helferzellen führen. Fraglich wäre jedoch, ob die induzierte Immunantwort noch in der Lage wäre, ein natives HI-Virus mit intaktem Glykanschild zu erkennen. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die für HIV-Env spezifische Immunreaktion in Mäusen, die TH2-geprägt ist und sich durch ein unausgewogenes Verhältnis der IgG-Subklassen 1 und 2a auszeichnet, von der Glykosylierung des Proteins in der Region C2V3 abhängig ist. Durch die glykanabhängige Bindung an einen bislang unbekannten Rezeptor an Zellen der angeborenen Immunität wird eine über Card9 führende Signalkaskade ausgelöst, die im Folgenden zu einer TH2Polarisation der CD4+-T-Helferzellen führt. Für den zugrunde liegenden Mechanismus spielen weder TLR noch die Produktion von IFNα eine Rolle. Die erbrachten Hinweise könnten sich bei der Konzeption neuer oder der Verbesserung bereits erprobter Immunisierungsstrategien gegen HIV als nützlich erweisen. 90 Literaturverzeichnis 5 5 Literaturverzeichnis 1. Centers for Disease Control [Hg.]. Pneumocystis pneumonia – Los Angeles. Morbidity and Mortality Weekly Report 30, 250–252 (1981). 2. Centers for Disease Control [Hg.]. Update: acquired immunodeficiency syndrome--United States, 1981-1990. Morbidity and Mortality Weekly Report (1991). 3. Hurtenbach, U. & Shearer, G. M. Germ cell-induced immune suppression in mice. Effect of inoculation of syngeneic spermatozoa on cell-mediated immune responses. 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Ich möchte mich außerdem dafür bedanken, dass ich die Arbeit in Bochum beenden durfte und für das Vertrauen, das Sie mir damit entgegengebracht haben. Herrn Prof. Dr. Raphael Stoll danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens dieser Arbeit. Ein besonderer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Matthias Tenbusch, der meine Arbeit betreut hat und immer ein geduldiger Zuhörer war. Ohne Deine Anleitung, Unterstützung und Kritik hätte diese Arbeit nicht zustande kommen können. Danke auch an Dr. Michael Storcksdieck genannt Bonsmann, der mir im ersten Jahr meiner Doktorarbeit zur Seite gestanden hat, obwohl er alle Hände voll mit seiner eigenen Dissertation zu tun hatte. Ohne Dich wäre ich eine schlechtere Wissenschaftlerin geworden. Bei vielen Versuchen dieser Arbeit wurde ich tatkräftig unterstützt. Mein Dank geht deshalb an Dr. Anne Kolenbrander, Dr. Dennis Lapuente, Dr. André Maaske, und Dr. Viktoria Stab für lange Vormittage in der Zellkultur, noch längere Abende am FACS-Gerät und für die lebhaften Diskussionen, die sich nicht nur um die Ergebnisse gedreht haben. Regina Bütermann und Bettina Tippler danke ich für ihre Hilfe bei Plasmidpräparationen und Western Blots. Ich möchte mich außerdem bei allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern der Virologie bedanken, die für mich die letzten drei Jahre nicht nur im Labor zu einer so schönen Zeit gemacht haben. Mein besonderer Dank geht an André, Anne, Sarah, Vika, Bettina und Bastian. Ohne Euch wäre es Arbeit gewesen. Für das Lesen und Korrigieren dieser Arbeit danke ich Klaus-Peter Heß und David Schulze. Schließlich möchte ich David, meinen Eltern Sabine und Klaus-Peter Heß sowie meiner Schwester Sarah Voß danken. Ihr habt mich zu dem gemacht, was ich bin, habt mich meinen Weg finden lassen und in allem unterstützt. Ohne Eure Liebe und den Halt, den Ihr mir gebt, wäre ich nicht hier.
