Abbildung 9: Einfluss des in vitro-Eluats auf den Kalziumtransienten

Aus dem Funktionsbereich für kardiologische Forschung beziehungsweise dem
kardiologischen Forschungslabor
(Leiter: Univ. - Prof. Dr. med. Stefan Felix)
Der Klinik für Kardiologie, Inner Medizin
(Direktor: Univ.- Prof. Dr. med. Stefan Felix)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema:
Unterscheidung kardiodepressiver Antikörper bei der dilatativen
Kardiomyopathie, die bei der Immunadsorption entzogen werden
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Humanmedizin
(Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2013
vorgelegt von:
Wunderle, Lydia
geb. am: 31. August 1976
in: Darmstadt
Dekan: Prof. Dr. Rainer Biffar
1. Gutachter: Prof. S. Felix
2. Gutachter: Prof. K. Stangl
Ort, Raum: Greifswald, Klinik für Innere Medizin B, Seminarraum O 0.88
Tag der Disputation: 09.12.2013
2
1. Inhaltsverzeichnis
2. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
4
3. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS
6
4. EINLEITUNG
8
4.1. HERZINSUFFIZIENZ UND DILATATIVE KARDIOMYOPATHIE
8
4.1.1. DEFINITION, ÄTIOLOGIE, PATHOMECHANISMEN
8
4.1.2. INZIDENZ, SYMPTOMATIK UND DIAGNOSTIK BEI DER DCM
10
4.1.3. THERAPIE
11
4.2. ZELLULÄRE GRUNDLAGEN VON KONTRAKTION UND RELAXATION
12
4.3. PATHOPHYSIOLOGISCHE GRUNDSÄTZE BEI DER HERZINSUFFIZIENZ BZW. DER DILATATIVEN
KARDIOMYOPATHIE
14
4.4. IMMUNMECHANISMEN BEI DILATATIVER KARDIOMYOPATHIE
16
4.5. IMMUNADSORPTION BEI DILATATIVER KARDIOMYOPATHIE
19
5. AUFGABENSTELLUNG
22
6. MATERIAL UND METHODEN
23
6.1. PATIENTEN UND VERWENDETE MATERIALIEN
23
6.1.1. PUFFER, CHEMIKALIEN, LÖSUNGEN
23
6.1.2. PATIENTEN
24
6.2. KLINISCHE METHODEN
25
6.2.1. IMMUNADSORPTIONSTHERAPIE
25
6.2.2. IMMUNADSORPTIONSVERFAHREN BZW . ISOLIERUNG DER ANTIKÖRPER IN VIVO
26
IMMUNADSORPTION
28
6.2.3. INVASIVES HÄMODYNAMISCHES MONITORING
28
6.3. EXPERIMENTELLE METHODEN
29
6.3.1. ISOLIERUNG DER ANTIKÖRPER IN VITRO
29
6.3.2. ISOLIERUNG DER KARDIOMYOZYTEN VON ADULTEN RATTEN
31
6.3.4. ENZYMATISCHE ISOLATION
33
6.3.5. ZÄHLUNG DER KARDIOMYOZYTEN
34
6.3.6. BESCHICHTUNG DER KAMMERTRÄGER MIT ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN UND DEREN
FÄRBUNG
34
1
6.3.7. MESSUNGEN AM FLUORESZENZMIKROSKOP
34
6.3.7.1. Aufbau des Mikroskops
34
6.3.7.2. Messung des Kalziumtransienten und der Kontraktilität
36
6.3.7.3. Auswertung
37
6.3.7.4. Eichung des Mikroskop-Systems
37
6.3.7.4.1. Kalibrierung in vivo
37
6.3.7.4.2. Kalibrierung in vitro
39
6.4. INTERAKTIONSVERSUCHE ZWISCHEN IN-VITRO-ELUAT UND VERSCHIEDENEN MEDIKAMENTEN
40
6.4.1. INTERAKTIONSVERSUCHE MIT METOPROLOL (ß-REZEPTOREN-BLOCKER)
40
6.4.2. INTERAKTIONSVERSUCHE MIT ATROPIN (MUSKARINERGER REZEPTORENBLOCKER)
40
6.4.3. INTERAKTIONSVERSUCHE MIT BROMO-CAMP
40
6.5. STATISTIK
41
7. ERGEBNISSE
42
7.1. DIE IMMUNADORPTIONSTHERAPIE DER DCM-PATIENTEN
42
7.2. FUNKTIONALITÄTSTESTS DER IN-VITRO-ADSORBIERTEN ANTIKÖRPER AN ISOLIERTEN
RATTENKARDIOMYOZYTEN
43
7.3. EINTEILUNG DES PATIENTENKOLLEKTIVES ENTSPRECHEND DES KARDIODEPRESSIVEN
EINFLUSSES DER IN-VITRO-ELUATE
46
7.4. VERGLEICH VON KARDIODEPRESSIVITÄT UND KLINISCHEN BEFUNDEN
47
7.5. PHARMAKOLOGISCHE BEEINFLUSSUNG DES KARDIODEPRESSIVEN EFFEKTES
52
7.5.1. EINFLUSS VON METOPROLOL AUF DIE KARDIODEPRESSIVE W IRKUNG DES IN VITRO-ELUATS
53
7.5.2. EINFLUSS DES PARASYMPATHOLYTIKUMS ATROPIN AUF DIE KARDIODEPRESSIVE W IRKUNG
DES IN VITRO-ELUATS
55
7.5.3. EINFLUSS VON BROMO-CAMP AUF DIE KARDIODEPRESSIVE W IRKUNG DES IN VITRO-ELUATS
57
8. DISKUSSION
60
8.1. KARDIODEPRESSIVE FAKTOREN BEI DER IMMUNADSORPTION BZW. BEI DER IN
VITRO-ADSORPTION
60
8.2. KARDIOTROPE AUTOANTIKÖRPER BEI DER DCM
63
8.2.1. ß1-AUTOANTIKÖRPER
63
8.2.2. AUTOANTIKÖRPER GEGEN DEN MUSKARINERGEN (M2) REZEPTOR
64
2
8.2.3. AUTOANTIKÖRPER GEGEN DAS ADP/ATP-TRANSLOKATORPROTEIN
64
8.2.4. AUTOANTIKÖRPER GEGEN DIE SR-CA2+-ATPASE
65
8.2.5. KOMPLEMENT
66
8.3. VERGLEICH VON KARDIODEPRESSIVITÄT UND KLINISCHEM BEFUND
66
8.4. LIMITATION UND AUSBLICK
70
9. ZUSAMMENFASSUNG
71
10. LITERATURVERZEICHNIS
73
11. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
89
12. LEBENSLAUF
90
13. DANKSAGUNG
91
3
2. Abkürzungsverzeichnis
ACE
Angiotensin converting enzyme
ANOVA
Analysis of variance
AT-II
Angiotensin II
ADP
Adenosindiphosphat
ATP
Adenosintriphosphat
BDM
2,3-Butanedione Monoxime
BSA
Bovines Serum Albumin
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
CFT
Calcium-free-tyrode (Kalziumfreie Lösung)
Da
Dalton
DCM
Dilatative Kardiomyopathie
DMSO
Dimethylsulfoxid
EF
Ejektionsfraktion
Fura-2-AM
Fura-2 pentakis(acetoxymethyl)ester
HC
high Calcium (Kalziumreiche Kalibrierungslösung)
HEPES
Hydroxy-Ethyl-Piperazin-Ethan-Sulfonsäure
HI
Herzindex
HLA
human leucocyt antigen
IA
Immunadsorption
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IP3
Inositoltrisphosphat
ISFC
International Society and Federation of Cardiology
4
M
mol/l
MWCO
molecular weight cut off
NTA
Nitrilotriacetic Acid
NYHA
New York Heart Association
PBS
Phoshat gepufferte Salzlösung
rfu
relative fluorescence units
SR
sarkoplasmatisches Retikulum
SVI
Schlagvolumenindex
TNF
Tumornekrosefaktor
VP
Versuchspuffer
5
3. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kalziumhomöostase der Myokardzelle
Abbildung 2: Eluatwirkung in Bezug auf den Kalziumtransienten und Kontraktilität an
isolierten Rattenkardiomyozyten
Abbildung 3: Zeitlicher Ablauf der Immunadsorption
Abbildung 4:Prinzip der Immunadsoptionssäulen (Ig Therasorb®)
Abbildung 5: Schema der Immunadsorption
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Antikörper-Screening-Methode
Abbildung 7: Die Langendorff-Perfusionsanlage
Abbildung 8: Die optimale Lage der Perfusionkanüle in der Aorta (IA)
Abbildung 9: Einfluss des in vitro-Eluats auf den Kalziumtransienten und die
Kontraktilität von Rattenmyozyten.
Abbildung 10: Pearson-Korrelation zwischen Kalziumtransient und Kontraktilität.
Abbildung
11:
Schematische
Darstellung
der
Vorgehensweise
bei
der
Gruppeneinteilung des DCM-Patientenkollektivs.
Abbildung
12:
Kalziumtransient
und
Kontraktilität
gemessen
mittels
Fluoreszenzmikroskopie an Rattekardionmyozyten nach Behandlung
mit in vitro-Eluaten.
Abbildung 13: Darstellung des Verlaufs des Herzindex in dem DCM-PAtientenkollektiv
vor und nach Immunadsorption.
Abbildung
14:
Herzindex
in
den
Subgruppen
(Kardiodepressiv
und
Nicht
Kardiodepressiv) vor und nach unterschiedlichen Phasen der
Immunadsorptionsbehandlung.
Abbildung
15:
Darstellung
des Verlaufs
des
Schlagvolumenindex
in
dem
DCM-Patientenkollektiv vor und nach Immunadsorption.
Abbildung 16: Schlagvolumindex in den Subgruppen (Kardiodepressiv und Nicht
Kardiodepressiv) vor und nach unterschiedlichen Phasen der
Immunadsorptionsbehandlung.
Abbildung
17:
Differenz
des
Schlagvolumenindex
in
den
Subgruppen
(Kardiodepressiv und Nicht Kardiodepressiv) nach dem ersten
Immunadsorptionszyklus (Abbildung A) und nach dem vierten
Immunadsorptionszyklus (Abbildung B)
6
Abbildung 18: Schematische Darstellung des G-Protein gekoppelten Signalwegs der
Adrenorezeptoren.
Abbildung
19:
Einfluss
des
β1-Adrenorezeptorblockers
Metoprolol auf
den
Kalziumtransienten in isolierten Rattenkardiomyozyten.
Abbildung 20: Einfluss des β1-Adrenorezeptorblockers Metoprolol auf die Kontraktilität
isolierter Rattenkardiomyozyten.
Abbildung 21: Einfluss von Atropin auf die Änderung des Kalziumtransienten in
Rattenkardiomyozyten.
Abbildung 22: Einfluss von Atropin auf die Änderung der Kontraktilität in
Rattenkardiomyozyten.
Abbildung
23:
Einfluss
von
BromocAMP
auf
den
Kalziumtransienten
in
Rattenkardiomyozyten
Abbildung
24:
Einfluss
von
Bromo-cAMP
auf
die
Kontraktilität
von
Rattenkardiomyozyten in Gegenwart von kardiodepressiv wirkenden in
vitro Eluaten
7
4. Einleitung
Thema dieser Promotionsarbeit ist die Beeinflussung der Kontraktilität und der
intrazellulären Kalziumkonzentration von Rattenkardiomyozyten durch Antikörper von
Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie (DCM). Diese Befunde wurden mit den
hämodynamischen Veränderungen während der Immunadsorption dieser Patienten
verglichen. In der Einleitung wird näher auf diese Thematik eingegangen,
Hintergründe und Grundlagen verdeutlicht, sowie die Aufgabenstellung erläutert.
4.1. Herzinsuffizienz und Dilatative Kardiomyopathie
4.1.1. Definition, Ätiologie, Pathomechanismen
Nach der koronaren Herzkrankheit ist die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) eine der
häufigsten Ursachen für eine Herzinsuffizienz (EPICAL-Studie, Zahnrad et al. 1999,
Pecini et al. 2010). Die Herzinsuffizienz definiert sich als Mangelperfusionszustand der
Peripherie, aufgrund der Unfähigkeit des Herzens die nötige Blutmenge zum
Stoffwechsel von Geweben und Organen auszuwerfen, obwohl es ausreichende
Blutvolumina und Füllungsdrücke erhält.
Laut WHO-Kriterien ist die DCM eine Erkrankung des Herzens, die sich vor allem
durch eine eingeschränkte systolische Funktion des Myokards und einer Dilatation des
Herzens (meist linksventrikulär) auszeichnet. Früher beschränkte sich der Begriff
Kardiomyopathie
ätiologisch
auf
idiopathische
Herzmuskelerkrankungen
(WHO-Report, 1988). Nach der neuen WHO/ ISFC- Klassifikation (Richardson et al.
1996) umfasst sie auch spezifische Kardiomyopathien, die unter hämodynamischen
und auch unter pathogenetischen Gesichtspunkten definiert werden. So zeigen sich
diese spezifischen Kardiomyopathien klinisch oft als Dilatative Kardiomyopathie.
Die spezifischen Kardiomyopathien umfassen:
o familär bzw. genetisch determinierte Kardiomyopathien (ca. 20 %);
o ischämische Kardiomyopathien (myokardiale Dysfunktion durch Remodeling);
o valvuläre Kardiomyopathie (die Funktionsstörung überschreitet die durch Vitien
zu erwartende Dysfunktion);
o hypertensive Kardiomyopathie;
o medikamentös-toxische Formen;
o peripartale Kardiomyopathien;
8
o Kardiomyopathien bei endokrinen Erkrankungen (z.B. Muskeldystrohien,
Myotonien);
o inflammatorische
Kardiomyopathien
(durch
virale
und
immunologische
Mechanismen);
Um noch genauer auf den letzten Punkt der Aufzählung einzugehen, kann man einen
möglichen ätiologischen Zusammenhang zwischen Myokarditis und DCM sehen, da
bei einem Teil der DCM-Patienten der molekularbiologische Nachweis einer
persistierenden enteroviralen Infektion des Herzmuskels (Bowles et al. 1989,
Schultheiss et al. 1998; Schultz et al. 2009) gelingt, die Rückschlüsse auf eine bereits
abgelaufene Myokarditis, die sich zu einer DCM entwickelte, zulässt. Auch geht man
immer mehr davon aus, dass die Dilatative Kardiomyopathie ein Folgezustand der
Myokarditis ist.
Auslöser bzw. mikrobielles Agens akuter Myokarditiden sind meist kardiotrope Viren –
vor allem Coxsackie-Viren der Gruppe B (O`Conell et al. 1985; Rutschow et al. 2010).
Die mikrobielle Infektion ruft zunächst eine Immunantwort hervor, die sich sowohl
humoraler als auch zellulärer Effektormechanismen bedient. Im Laufe der Infektion
kann es unter anderem nach dem Prinzip des molekularen Mimikry – zu autoimmunen
Reaktionen gegen das eigene Herzmuskelgewebe kommen (Maisch et al. 1993;
Schwimmbeck et al. 1993; Kallellis-Opara et al. 2007). Diese Autoreaktivität kann für
die Entwicklung aus einer akuten Virus-Myokarditis über eine chronische Myokarditis
zur DCM verantwortlich sein (Das et al. 1985; Voigt et al. 2010). So konnte man
feststellen,
dass
sich
–
während
der
überwiegende
Anteil
der
akuten
Virusmyokarditiden ohne Residuen ausheilt - bei einem Teil der Patienten entweder
unmittelbar oder nach einer Latenzzeit aus einer akuten Virus-Myokarditis eine
chronische Myokarditis mit progredienter Herzinsuffizienz unter dem Bild einer DCM
entwickelte (Martino et al. 1994, Zhao et al. 2009, Yoshikawa et al. 2009). Auch im
Tierversuch konnte der Übergang von akuter Myokarditis in eine DCM bewiesen
werden (Matsumori et Kawai, 1982, Harding et al. 2010). Der Nachweis von
gebundenen Immunglobulinen von IgG, IgM, IgA in Myokardbiopsien sowie auch von
zirkulierenden
Antikörpern
im
Blut
spricht
ebenfalls
für
eine
sekundäre
Immunpathogenese (Maisch et al. 1993, Staudt et al. 2010).Bisher konnte eine
Vielzahl möglicher relevanter Autoantikörper bei der DCM beschrieben werden:
9
o gegen die Epitope des Sarkolemms (Kalziumkanal, Beta-Rezeptoren,
muskarinerge Rezeptoren);
o gegen kontraktile Proteine (Myosin);
o gegen die extrazelluläre Matrix;
o gegen mitochondriale sowie sarkoplasmatische Antigene (siehe hierzu auch
Kapitel: Immunpathologie bei der DCM);
4.1.2. Inzidenz, Symptomatik und Diagnostik bei der DCM
Die DCM hat eine Inzidenz von 5-10 und eine Prävalenz von 36,5 pro 100.000
Einwohner. Sie betrifft vorwiegend Männer (m:w ⇒ 2-4:1) im mittleren Alter zwischen
20 und 50 Jahren (70%) (De Maria et al. 1993). Ca. 20% der Patienten weisen eine
familiäre Häufung auf (Michels et al. 1992; Lakdawala et al. 2010). Die Symptomatik
der Patienten – als klinische und hämodynamische Befunde dient meist der Grad der
linksventrikulären Funktionseinschränkung – weist eine große Variabilität auf. So
können die Reduktion der Auswurffraktion, die pathologisch- physikalischen Befunde
und die linksventrikuläre Dilatation so gering sein, dass der Patient asymptomatisch
bleibt, während andere Patienten unter belastungs(un)abhängiger Dyspnoe,
körperlicher Schwäche, thrombembolischen Komplikationen, Zeichen der Angina
pectoris (infolge erhöhter Wandspannung und relativer koronarer Minderperfusion),
erhöhtem Venendruck, Stauungsleber und Ödemen leiden.
Hämodynamische und morphologische Kennzeichen der Betroffenen sind starke linksund rechtsventrikuläre Dilatation mit erhöhtem endsystolischen und enddiastolischen
Ventrikelvolumen sowie deutlich erhöhte Füllungsdrücke und relative Mitral- oder
Trikuspidalinsuffizienz bei reduziertem Ruheherzminutenvolumen (Johnson et
Palacios, 1982, Park et al. 2010).
Da die Zweijahresmortalität bis zu 35% beträgt, ist die DCM eine der ungünstigsten
Erkrankungen in Bezug auf die Prognose (Hofmann et al. 1988; Lenardo et al. 1994;
Pecini et al. 2010).
Erst nach dem Ausschluss anderer Herzerkrankungen fällt die Diagnose DCM. Als
wichtigste Screeninguntersuchung ist die Echokardiographie anzusehen, jedoch
müssen
zur
ausreichenden
Untersuchungverfahren
Sicherstellung
durchgeführt
werden,
d.h.
der
Diagnose
invasive
Herzkatheteruntersuchung,
10
Koronarangiographie und Endokardbiopsie (zur Abgrenzung einer Myokarditis)
(Figulla et al, 1992; Sigusch et al. 1998; Thomas et al. 2009).
4.1.3. Therapie
Die Therapieansätze bei der DCM sind zur Zeit der der Herzinsuffizienz sehr ähnlich
bzw. identisch. Grundsätzlich erfolgt die Therapie – wie bei anderen herzinsuffizienten
Patienten - zunächst rein symptomatisch.
Die
konservativ-medikamentöse Therapie der DCM bedient sich folgender
Medikamente für Herzinsuffizienzpatienten: ACE-Hemmer, Digitalis, Spironolacton,
Nitrate und Diuretika. Eine Verbesserung der Mortalität bei der DCM kann durch
Beta-Blocker erzielt werden (Waagstein et al. 1992).
Als Maßnahme zur Prävention des plötzlichen Herztodes stehen bei der DCM die
Implantation eines Defibrilators/ Kardioverters oder der Einsatz von Klasse
III-Antiarrhythmika (v.a. Amiodaron) zur Verfügung.
Leider sind chirugische Therapieverfahren, wie dynamische Kardiomyoplastie oder die
Ventrikelreduktionplastik
nach
Batista,
bei
der
DCM
nicht
besonders
erfolgsversprechend, so dass die Herztransplantation oft die letzte therapeutische
Alternative zur Behandlung der DCM darstellt. Obwohl die DCM die häufigste
Indikation für eine Herztransplantation darstellt (Manolio et. al. 1992; Wexler et al.
2009) bleibt diese Behandlungsform durch die begrenzte Anzahl an Spenderherzen
nur einer kleinen Minderheit vorbehalten.
Gerade die experimentelle Forschung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, neue
Therapiekonzepte zur Behandlung der DCM zu finden: Eine mögliche kausale
Therapie stellt als Basis die Theorie der autoreaktiven Kardiomyopathie dar, die sich
zum Beispiel aus einer viral bedingten Myokarditis entwickelt. So könnte in der akuten
Phase eine antivirale Therapie erfolgreich sein, während das chronische autoimmun
geprägte
Krankheitsbild
-
nach
Ausschluß
einer
Viruspersistenz
-
einer
immunmodulatorischen oder immunsupressiven Therapie zugänglich wäre (Maisch et
al. 1995). Studien über immunsuppressive Therapien haben gezeigt, dass keine
klinischen wie auch hämodynamischen Verbesserungen bei den Patienten auftraten
(Mason et al.1995, Wojnicz et al. 2001), während bei immunmodulatorischen
Therapien, z. B. mit Immunglobulinen u. Hyperimmunglogulinen günstige Effekte bei
akuten Myokarditiden und akuten Kardiomyopathien beschrieben wurden.
11
Außerdem wurde als weitere immunmodulatorische Option bei Patienten mit schwerer
DCM durch eine Immunadsorption hämodynamische Verbesserungen erzielt (Dörffel
et al. 1997; Felix et al. 2000, Staudt et Felix, 2005), so dass auf diesem
Forschungsgebiet neue Erkenntnisse gewonnen werden müssen.
4.2. Zelluläre Grundlagen von Kontraktion und Relaxation
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kalziumhomöostase der Myokardzelle
Wichtig für die Funktion der Myokardzelle ist die intrazelluläre Kalziumkonzentration.
Während jedes Kontraktions- und Relaxationszyklus kommt es synchron zu den
Polaritätsänderungen an der Zellmembran zu Konzentrationsänderungen des
intrazellulären Kalziums um ca. zwei Zehnerpotenzen. An diesen transienten
Veränderungen sind Proteine des Sarkolemms und des sarkoplasmatischen
Retikulums
beteiligt:
Entlang
transversaler
Tubuli
(T-Tubuli)
gelangt
das
Aktionspotential der sarkoplasmatischen Membran der Myokardzelle in das Innere der
Zelle. Im Bereich der T-Tubuli öffnet es spannungsabhängige L-Typ-Kalziumkanäle
(Dihydropyridinrezeptoren).
Außer
den
L-Typ-Ca2+-Kanälen
existieren
auch
T-Typ-Ca2+-Kanäle, die sich pharmakologisch, elektrisch und vor allem anzahlmäßig
von den L-Typ-Ca2+-Kanälen unterscheiden (Hess, 1988, Fallon et al. 2009,) und
deshalb hier nicht weiter besprochen werden, da der überwiegende Einstrom der
Ca2+-Ionen über den L-Typ-Ca2+-Kanal abläuft (siehe hierzu auch Abbildung 1).
12
Die T-Tubuli stehen im engen Kontakt zu den terminalen Zysternen des
sarkoplasmatischen Retikulums (SR), so dass das einströmende extrazelluläre Ca2+
die Freisetzung weiterer Ca2+-Ionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum durch
Ryanodin-empfindliche
Ca2+-Kanäle
(Ca2+-triggert
triggert
Ca2+-release).
Das
Phänomen der Kalzium-induzierten Kalzium-Freisetzung vermittelt die Kopplung
zwischen elektrischem Aktionspotential und der nachfolgenden mechanischen
Kontraktion der Herzmuskelzelle. Dabei wird der Kontraktionsvorgang wie folgt
ausgelöst:
Die Interaktion der Myofilamentproteine wird durch die Erhöhung der intrazellulären
Ca-Konzentration
gesteuert.
Sie
bewirkt
eine
Konformationsänderung
des
Troponinkomplexes, so dass die Querbrückenbindung zwischen Aktin und Myosin
ermöglicht wird, was zur Folge hat, dass sich die Aktin- und Myosinfilamente
gegeneinander verschieben, was die Kontraktion darstellt. Die Verkürzung und
Kraftentwicklung jeder einzelnen Herzzelle führt so im Verband zur Kontraktion des
Herzmuskels und somit zum Auswurf des Schlagvolumens.
Zur darauffolgenden diastolischen Erschlaffung bzw. Füllung des Ventrikels kommt es
auf molekularer Ebene durch Inaktivierung der Aktin-Myosin-Interaktion. Dies wird
bewirkt durch den Abfall des intrazellulären Ca2+-Gehalts, der zu einer Dissoziation
des
Ca2+-Troponinkomplexes
führt.
Die
Senkung
der
intrazellulären
Ca2+-Konzentration erfolgt einerseits durch Auswärtstransport der Ca2+-Ionen mittels
sarkolemmaler Ca2+-ATPase (Carafoli, 1988, Lukyanenko et al. 2001) und
Na2+-Ca2+-Austauscher (Mullins, 1977, Reuter et al. 2005) in den Extrazellulärraum,
andererseits
durch
Sequestrierung
der
Ca2+-Ionen
in
die
Vesikel
des
sarkoplasmatischen Retikulums. Der letztgenannte Mechanismus ist durch Katalyse
der membranständigen Ca2+-ATPase (SERCA) zu 80-90% für den Abfall des
intrazellulären Kalziums verantwortlich (Negrette et al. 1993). Als Modulator der
SERCA kommt dem Phospholamban eine wichtige Rolle zu (Koss et Kranias, 1996,
Waggoner et al. 2009). Interessant ist auch, dass wieder aufgenommenes Ca2+ im SR
für die nächste Depolarisation zur Verfügung steht, wohingegen das nach extrazellulär
ausgeschiedene Ca2+ in der Zelle nicht mehr verfügbar ist.
Sowohl die Anflutung von Kalziumionen, wie auch die Reduzierung ihrer
intrazellulären Konzentration unterliegt viefältiger Modulation: So bewirken neuronale,
humorale
und
parakrine
Faktoren
eine
Rezeptor-vermittelte-Aktivierung
von
13
membranständigen
Enzymem
(Adenylatzyclase)
bzw.
Ionenkanälen
(z.
B.
L-Typ-Ca-Kanal). Über membranständige Signaltransduktionswege kommt es zur
Bildung/ Anreicherung von second messengers, wie Kalziumionen, zyclischen
Nukleotiden (cAMP, cGMP), Phosphoinositolen und Diacylglyceriden:
a) Die Stimulierung sarkolemmaler ß-Adrenozeptoren führt zur G-Protein
vermittelten Aktivierung der Adenylatzyklase, was zur vermehrten Bildung von
cAMP aus ATP führt, während die Stimmulierung muskarinerger Rezeptoren
über inhibitorische G-Proteine zum Abfall des cAMP-Spiegels führt.
b) α1-
Rezeptoren,
Endothelin-
oder
Angiotensinrezeptoren
können
die
Aktivierung des Inositolphoshat-Stoffwechsels stimulieren, was schliesslich zur
Modulation von Ca
2+ -
regulierenden Prozessen durch Phosphorilierung mittels
Proteinkinase führt (Karczewski et al. 1993, McConnell et al. 2009). So wird
durch Phosphorilierung des Phospholamban z. B. die Aktivität der Ca-ATPase
gesteigert (Tada et Katz, 1982, Waggoner et al. 2009, van Dijk et al. 2009), so
dass eine Verkürzung der Systole durch Beschleunigung der Relaxation bewirkt
wird.
c) Die cAMP abhängige Phosphorilierung des L-Typ-Ca2+-Kanals erhöht seine
Öffnungswahrscheinlichkeit und die durchschnittliche Öffnungsdauer, was
einen vermehrten Einstrom von Trigger-Ca2+ bedingt, wodurch eine verstärkte
Ausschüttung von Ca2+ durch Ryanodin-empfindliche Ca2+-Kanäle des
endoplasmatischen Retikulums ausgelöst wird (Reuter et al. 1989, Alloatti et al.
2004).
Die gestörte Kontraktilität der Myokardzelle bei der DCM könnte theoretisch ihre
Ursache in jedem einzelnen Glied der Kalziumregulation haben.
4.3. Pathophysiologische Grundsätze bei der Herzinsuffizienz bzw. der
Dilatativen Kardiomyopathie
Untersuchungen haben bewiesen, dass gerade zelluläre Defekte für den
Funktionsverlust des Ventrikels bei insuffizienten Herzen verantwortlich sind, und
gerade bei der DCM kommt es zu zellulären und molekularen Veränderungen in den
Myozyten und dem interstitiellen Gewebe. Solche Defekte zeigen sich in Aufbau und
Funktion
der
kontraktilen
Proteine,
der
Kalziumhomöostase,
des
Signaltransduktionsweges und des Energiestoffwechsels.
14
Die
kontraktilen
Proteine
weisen
bei
DCM-Patienten
oft
verschiedenste
pathophysiologische Veränderungen auf. Studien bewiesen, dass der Myosingehalt
bei DCM um 20% (Hasenfuss et al.1993, Konno et al. 2003) und die
Mg-ATPase-Aktivität (Pagani et al.1988) abnimmt, sich die Aktin-Myosin-Interaktion
pro Zeit verringert (Hasenfuss et al. 1992) oder eine Reduktion der regulatorischen
Myosin-Leichtkette 2 vorliegt (Margossion et al. 1992, van Dijk et al. 2009).
Natürlich können die nicht mehr physiologischen Funktionen der kontraktilen Proteine
auch auf einer Veränderung ihrer Kalzium-Empfindlichkeit beruhen. Dazu bietet die
Literatur verschiedene Ergebnisse und Anhaltspunkte. Die Bandbreite reicht von
erhöhter (Schwinger et al. 1994, Fernanddez-Velasco et al. 2009) über unveränderter
(Gwathmey et al.1990) zu verringerter Kalzium-Sensitivität (Vahl et al. 1997) der
kontraktilen Proteine.
Wie schon im Abschnitt ``Zelluläre Grundlagen von Kontraktion und Relaxation´´
verdeutlicht, hängt die Aktivität der Myofibrillen entscheidend von der zytosolischen
Ca2+-Konzentration ab, so dass Veränderungen der Kalziumhomöostase zu
diastolischen und systolischen Funktionsstörungen am insuffizienten menschlichen
Herzen beitragen. Die insuffiziente Myokardzelle leidet unter einem verlangsamten
diastolischen Kalzium-Abfall, was eine erhöhte diastolische Kalzium-Konzentration
bedingt, und so ein verlängertes Aktionspotential zu Folge hat.
Verantwortlich für die gestörte Kalzium-Homöostase könnte auf molekularer Ebene die
Abnahme der Expression der sarkolemmalen L-Typ-Ca-Kanäle sein (Takahashi et al.
1992, Maturana et al. 2009). Außerdem konnte tierexperimentiell eine gestörte
Kopplung zwischen dem L-Typ-Ca2+-Kanal und dem Ryanodinrezeptor des SR bei
Myokardinsuffizienz (Gomez et al. 1997, Shannon, 2009) festgestellt werden, wobei
kein Einfluss direkt auf die Ryanodinrezeptorexpression nachgewiesen werden konnte
(Meyer et al. 1995).
Am insuffizienten menschlichen Myokard ist die Wiederaufnahme des Kalziums in das
SR gestört (Pieske et al. 1995; Schwinger et al.1994; Frascarelli et al. 2009), was
schließlich zu einer herabgesetzten Kalziumverfügbarkeit bzw. Kalziumverarmung der
Zelle führt, und den Bowditch-Effekt bei schwerer DCM (fehlende physiologische
Steigerung der Kontraktilität bei Frequenzanstieg) erklärt (Pieske et al. 1996; Lakatta,
2004). Durch Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels könnten bei der DCM
Veränderungen in der systolischen und diastolischen Funktion auftreten, z. B.
15
Störungen in der Funktion der Mitochondrien (Lentz et al. 1978; Elas et al. 2008) und in
der Bereitstellung energiereicher Phosphate.
Ersichtliche Unterschiede zwischen gesundem und insuffizientem Myokard zeigen
sich im ß-adrenergen Signaltransduktionssystem. Je nach Schweregrad der
Herzinsuffizienz kommt es zur Abnahme der Dichte (Down-Regulation) und
Internalisierung von ß-Rezeptoren. Bei der DCM betrifft dies selektiv den
ß1-Rezeptorsubtyp (Steinfath et al. 1991). Zusätzlich kommt es zu einer Zunahme des
inhibitorischen Guaninnukleotid-bindenden Proteins in der Zellmembran (Neumann et
al. 1988) und damit zur einer weiteren Abnahme der Adenylatzyklasestimmulierbarkeit
mit folgender Reduktion von cAMP in den Myozyten. Dieses Phänomen führt aufgrund
der
verminderten
Proteinkinase
A
vermittelten
Phosphorilierung
von
Funktionsproteinen zu Störungen im Bereich der elektromechanischen Kopplung (bei
L-Typ-Ca2+-Kanälen, Ryanodinrezeptoren, Phospholamban und Troponin).
4.4. Immunmechanismen bei Dilatativer Kardiomyopathie
Wie schon zu Beginn der Einleitung angedeutet, können immunvermittelte Einflüsse
auf die Myokardzelle schädigend wirken, wobei entweder eine reversible Schädigung
vorliegen kann, oder chronisch der Untergang der Zelle induziert wird. Humorale wie
auch zelluläre Mechanismen können dabei gestört sein und somit pathogen wirken
(Maisch et al. 1983; Kallwellis-Opara et al. 2007). Gerade im Bereich der
zellvermittelten Immunität bei DCM-Patienten können verschiedenste Störungen
festgestellt werden:
a) verminderte Surpressor-T-Zellaktivität (Fowles et al.1979; Eckstein et al. 1982);
b) erniedrigte Natural-Killerzellaktivität (Anderson et al. 1982; Smalcelj et al. 1991);
c) gesteigerte
zielzellspezifische
Lymphozytentoxizität
gegenüber
isolierten
Herzmuskelzellen (Sanderson et al. 1985; Bozkurt et al. 2001);
Nicht nur die zelluläre Immunität kann bei der DCM gestört sein, auch viele der oben
beschriebenen pathophysiologischen Dysfunktionen der Zelle können durch humorale
Faktoren beeinflusst, wenn nicht sogar verursacht werden. Zytokine, als auch
besonders Autoantikörper, spielen hierbei eine wichtige Rolle. Zytokine sind zum
einen essentielle Marker der Immunantwort bei Herzinsuffizienz, einschließlich der
DCM. Sie haben Bedeutung bei der Genese oder Progression der Herzinsuffizienz,
besonders nekrotischer und apoptotischer Zelluntergang, myokardiale Fibrose und
16
Depression der myokardialen Funktion spielen dabei eine Rolle (Shan et al. 1997; Chu
et al. 2010). Gerade Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) sind möglicherweise je nach
Schweregrad im Plasmaspiegel erhöht (Torre-Amione et al. 1996; Ahmad et al. 2010;
Hein et al. 2009). In in-vitro-Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass
TNF-α negativ inotrope Effekte auf isolierte Katzenkardiomyozyten hat, verbunden mit
einem Abfall des Kalziumtransienten (Yokoyama et al. 1993). Klinisch führt eine
wiederholte Infusion von TNF-α zu einer dauerhaften Abnahme der Inotropie und
schließlich zu einer DCM (Hegewish et al. 1990; Awad et al. 2010).
Neben den Zytokin-Wirkungen auf die Myokardzelle spielen bei der DCM eine Vielzahl
von Autoantikörpern gegen ein großes Spektrum von extra- und intrazellulären
myokardialen Antigenen eine Rolle. Einen kleinen Ausschnitt soll die folgende Liste
über Strukturen verdeutlichen, gegen die Autoantikörper gerichtet sind:
a) G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, wie z. B. ß1-adrenerge Rezeptoren
(Wallukat et Wollenberger, 1987; Limas et al.1989; Liu et al. 2008) oder
muskarinerge Rezeptoren (Fu et al. 1993; Liu et al. 2002; Yu et al. 2009);
b) Kalziumkänale (Schultheiss et al. 1988; Kühl et al.1991; Karnabi et al. 2010);
c) Kontraktile Proteine: wie Myosin (Caforio et al. 1992; Mascaro-Blanco et al.
2008), Aktin (Latif et al.1993; Buse et al. 2008), oder Tropomyosin (Latif et al.
1991);
d) Mitochondriale
Proteine
(Buse
et
al.
2008):
wie
z.B.
der
Adenin-Nukleotid-Translokator (Schultheiss et Bolte, 1985), das M7-Antigen
(Klein
et
al.
1984),
oder
die
E2-Untereinheit
des
Ketosäuredehydrogenase-Komplexes (Ansari et al. 1994);
e) Hitzeschockproteine (Latif et al. 1993, Kim et al, 2009);
f) Epitope der extrazellulären Matrix, wie z. B. Laminin (Wolff et al. 1989, Zhao et
al. 2009);
Bei Patienten mit DCM konnte eine erhöhte Expression von HLA-Klasse-II-Antigenen
(Ansari et al. 1991, Mahjoub et al. 2010) bzw. eine erhöhte Frequenz von
HLA-Klasse-II-Phänotypen auf Kardiomyozyten gefunden werden (Carlquist et al.
1990, Portig et al. 2009). Die oben genannten Befunde korrelieren nicht nur mit dem
Auftreten bestimmter Autoantikörper (Limas et al. 1990, Kim et al, 2009). Man konnte
durch Untersuchungen von Familienmitgliedern von DCM-Patienten feststellen, dass
diese zu 20% auch Antikörper und erhöhte linksventrikuläre Diameter aufwiesen. Man
17
nahm an, dass Autoantikörper frühe Marker für ein mögliches Erkrankungsrisiko seien
(Caforio et al. 1994, Kim et al, 2009), jedoch konnte von Maisch et al. bewiesen
werden, dass auch bei gesunden Personen Autoantikörper in niedrigen Titern, z.B.
nach viralen Infektionen, vorhanden sind, obwohl pathologische Folgen ausblieben.
Der agonistisch wirkende Autoantikörper gegen den ß-Rezeptor wurde bei Patienten
mit
DCM
und
Myokarditis
im
Serum
gefunden,
während
Hypertoniker,
Herzinfarkt-Patienten und Gesunde keine Autoantikörper gegen diesen Rezeptor
ausbilden (Wallukat et Wollenberger, 1987; Magnusen et al. 1990, Limas et al. 1989,
Liu et al. 2008, Liu et al. 2002). Durch pharmakologische Interaktionsversuche konnte
sich herausstellen, dass diese Autoantikörper spezifisch gegen den ß1-Rezeptor
gerichtet sind und ß2- sowie α-Rezeptoren unbeeinflußt bleiben (Wallukat et
Wollenberger, 1987, Liu et al. 2008). Weiterhin wurde an neonatalen kultivierten
Rattenkardiomyozyten
ein
positiver
chronotroper
Effekt
durch
den
ß1-selektiven-Antikörper festgestellt, der auch die Wirkung von Isoprenalin minderte
(Wallukat et Wolenberger, 1987, Christ et al. 2006). Die Desensibilisierung der
Myozyten wurde bei ß1-Antikörpern im Gegensatz zu Isoprenalin nicht festgestellt.
Wenn man diese Erkenntnisse nun auf die Klinik anwendet, kommt man zu der
Annahme, dass die Effekte der ß1-Antikörper einerseits die Überstimmulierung der
Myozyten durch einen erhöhten endokrinen Katecholaminspiegel bei der DCM
blockieren, andererseits durch kontinuierliche Stimulierbarkeit der ß-Rezeptoren zu
einer elektrophysiologischen Imbalance mit Tachykardie und Arhythmien führen
(Magnussen et al. 1996, Yu et al. 2009).
Andere Antikörper, die die Funktion von Kardiomyozyten beeinflussen können, sind
z.B. Autoantikörper gegen den muskarinergen (M2)-Rezeptor, der mit einer Prävalenz
von 39% bei DCM-Patienten vorkommt. Dieser Autoantikörper besitzt ähnliche Effekte
wie der muskarinerge Agonist Carbachol (Fu et al. 1993, Liu et al. 2002). An
neonatalen kultivierten Rattenkardiomyozyten führen sie zu einer negativen
Chronotropie, inhibieren die Isoprenalin-induzierte Erhöhung des second messengers
cAMP und sind durch Atropin antagonisierbar. Durch in-vivo-Versuche an Ratten
konnte dosisabhängig die Beeinträchtigung der Herzfunktion durch Reduktion der
Herzfrequenz, der Auswurffraktion und des systolischen Ventrikeldrucks durch den
Autoantikörper gegen den M2-Rezeptor erkannt werden. Gegen das mitochondriale
ADP/ ATP-Translokatorprotein konnten Autoantikörper bei 95% der DCM-Patienten
18
nachgewiesen werden (Schultheiss et. al. 1985, Buse et al. 2008). Die Aufgabe des
Nukleotid-Translokatorproteins
besteht
normalerweise
im
Austausch
von
synthetisiertem ATP aus den Mitochondrien ins Zytosol gegen ADP, das wiederum in
den Mitochondrien wieder rephosphoriliert wird. Der Autoantikörper gegen das
ADP/ATP-Translokatorprotein blockt den Transport des ATPs und hemmt somit die
myokardiale Energiebereitsstellung (Schultze et al. 1990). Eine Studie bewies, dass
die Antikörper gegen das ADP/ATP-Translokatorprotein mit dem L-Typ-Ca2+-Kanal
kreuzreagieren
und
eine
Erhöhung
des
Kalzium-Einwärtsstroms
bewirken
(Schultheiss et al. 1986, Kühl et al. 1991, Buse et al. 2008).
Bei der Initiation der DCM können die verschiedenen Antikörper schließlich auch eine
Rolle spielen: Immunisiert man Kaninchen mit synthetischen antigenen Peptiden,
korrespondierend zu den Epitopen des ß1- und muskarinergen Rezeptors, kommt es
zur Autoantikörperbildung und zu strukturellen Veränderungen an den Herzen im
Sinne einer DCM (Matsui et al.1997, Liu et al. 2008, Liu et al. 2002, Warraich et al.
2006). Auch die Immunisierung von bestimmten Mäusestämmen mit kardialem Myosin
führt zum Auftreten von Antimyosinantikörpern, die eine Myokarditis auslösen (Neu et
al. 1987, Mascaro-Blanco et al. 2008). In anderen tierexperimentiellen Studien konnte
durch
Immunisierung
von
Mäusen
mit
den
gereinigten
herzspezifischen
SR-CA2+-ATP´ase-Antigen von Kaninchen eine Kardiomyopathie hervorgerufen
werden (Sharif et al. 1994). Durch die o.g. Studien am Patienten und im
Tierexperiment kann man grundsätzlich die Aussage rechtfertigen, dass humorale und
zelluläre Immunmechanismen möglicherweise eine pathophysiologische Bedeutung
bei der Initiation und Entwicklung bzw. Progression der DCM haben.
4.5. Immunadsorption bei dilatativer Kardiomyopathie
Eine entscheidende Rolle bei vielen Autoimmunerkrankungen kommt den Antikörpern
bzw. Autoantikörpern zu, die der erkrankte Organismus bildet und sich damit selbst
schadet. Diese Antikörper, als pathogenetisch bedeutsame Substanz, versucht man
seit Mitte der 70er Jahre durch extrakorporale Therapieverfahren, wie Plasmapherese
und Immunadsorption, direkt aus dem aus dem Blutkreislauf zu entfernen (Schneider,
1998, Trimpert et al. 2010, Herda et al. 2010). Im Bereich der Plasmapherese zeigte
sich, dass zirkulierende Immunkompexe wie auch auch Autoantikörper in
19
Abhängigkeit vom ausgetauscheten Plasmavolumen reduziert werden können. Je
nachdem wie bedeutsam diese Immunkomplexe für die Entwicklung und Prognose der
Erkrankung sind, konnten bei den Patienten positive Ergebnisse erzielt werden.
Während bei der Plasmapherese das vom Blut separierte Plasma durch geeignete
Lösungen ersetzt wird, kommen bei der Immunadsorption Säulen zum Einsatz, mit
deren Hilfe Antikörper und Immunkomplexe aus dem Plasma des jeweiligen Patienten
entfernt werden und das gereinigte Plasma wieder reinfundiert wird.
Bei Autoimmunerkrankungen, wie z.B. die Myasthenia gravis (Shibuya et al.1994),
dem systemischen Lupus erythematodes (Palmer et al. 1988) oder dem Goodpasture
Syndrom (Bygren et al. 1985) wurde die Immunadsorption schon erfolgreich
angewendet. Aufgrund der Tatsache, dass bei der DCM auch Antikörper eine
pathophysiologische Rolle spielen, wurde 1997 in einem Pilotprojekt von Dörffel et al.
bei Dilatativer Kardiomyopathie eine Immunadsorptionstherapie durchgeführt.
Ergebnis
war
eine
akute
Herzinsuffizienzsymptomatik
Verbesserung
und
eine
der
Hämodynamik,
signifikante
sowie
Reduktion
der
des
ß1-Autoantikörpertiters im Serum. In einer anschließenden randomisierten Studie
(Felix et al. 2000, Trimpert et al. 2010, Herda et al. 2010) wurden die längerfristigen
Effekte der Immunadsorption bei DCM versus einer Kontrollpatientengruppe ohne
Immunadsorption erfasst. In der Immunadsorptionsgruppe stiegen der Herz- und
Schlagvolumenindex, sowie die Ejektionsfraktion, während in der Kontrollgruppe keine
signifikanten Änderungen festgestellt werden konnten.
Parallel dazu wurden in der vorausgehenden Studie (Felix et al.2002, Trimpert et al.
2010, Herda et al. 2010), die die Thematik dieser Arbeit mitbedingt, an isolierten
Rattenkardiomyozyten,
die
bei
der
Immunadsorption
entfernten
Antikörper
(Antikörper-Eluat) auf ihre Effekte getestet. Dabei wurde herausgefunden, dass das
Eluat den intrazellulären Kalziumstoffwechsel (d.h. die systolischen und diastolischen
Kalziumveränderungen)
und
die
Kontraktilität
der
Kardiomyozyten
negativ
beeinflusste (kardiodepressiver Effekt des Antikörper-Eluats). Weiterhin konnte man
einen Zusammenhang zwischen dem Entzug der kardiodepressiven Antikörper und
den hämodynamischen Profiten der immunadsorbierten DCM-Patienten herstellen. Es
zeigte sich eine Korrelation zwischen dem Anstieg des Herzindex und der
Eluatwirkung des jeweiligen Patienten am 1. Tag des ersten Zyklus der
Immunadsorption (zum Therapieschema der Immunadsorption siehe bitte Kapitel
20
5.2.1.), was bedeutete, dass das Eluat der Patienten, die schon vom ersten Tag der
Immunadsorption beträchtlich profitierten, die deutlichsten kardiodepressiven Effekte
an den isolierten Rattenkardiomyozyten zeigte. Im Umkehrschluss bedeutete dies,
dass für die Patienten mit stark kardiodepressiv wirkenden Antikörpen zur akuten
hämodynamischen Verbesserung eine Immumadsorption Erfolg versprechend muss.
Abbildung 2: Eluatwirkung in Bezug auf den Kalziumtransienten und Kontraktilität an isolierten
Rattenkardiomyotyten im Vergleich zur Herzindexverbesserung der DCM-Patienten während der
Immunadsorption (Felix, Staudt et al. 2002)
Auf dieser Erkenntnis basierend baut die Thematik dieser Promotionsarbeit auf, die im
folgenden Abschnitt ”Aufgabenstellung” erläutert wird.
21
5. Aufgabenstellung
Bei der Immunadsorption von DCM-Patienten führt die Entfernung der pathologischen
Antikörper zu einer Verbesserung der Hämodynamik. Jedoch zeigten sich deutliche
Unterschiede in der Ausprägung der Verbesserung der hämodynamischen Parameter.
Da aus der Anamnese und den klinischen Untersuchungsergebnissen keine
eindeutige
Prognose
Therapieverfahren
für
dieses
gemacht
kosten-
werden
und
kann,
personalaufwendige
mußte
eine
invasive
prognostische
Screeningmethode experimentiell aufgebaut werden. Auf dieser Grundlage entstand
die Thematik dieser Promotionsarbeit, die sich mit dem Screening der inotropen
Effekte von Antikörpern aus dem Plasma von DCM-Patienten beschäftigt, um so
mögliche Aussagen über den hämodynamischen Benefit der Immunadsorption zu
machen: Mit wenigen Millilitern Plasma der zu adsorbierenden Patienten wurde eine
der Immunadsorption gleichenden in-vitro-Adsorption durchgeführt. Das dabei
gewonnene Antikörper-in-vitro-Eluat konnte nun auf seine Effekte an isolierten
Rattenkardiomyozyten überprüft werden. Die Kardiomyozyten wurden hierfür
feldstimuliert, und ihr intrazellulärer Kalziumtransient bzw. ihre Kontraktilität nach
Beladung mit einem Ca-sensitiven-Fluoreszenzfarbstoff am Fluoreszenz-Mikroskop
gemessen. Darüber hinaus wurden auch Interaktionversuche zwischen in-vitro-Eluat
und verschiedenen Rezeptorblockern durchgeführt, um eventuelle Wirkungsweisen
des
Antikörpereluats
bezüglich
des
G-Protein-Signaltransduktionsweges
herauszufinden.
22
6. MATERIAL UND METHODEN
Das in-vitro-Eluat wird mittels eines in vitro Verfahrens, das der Immunadsorption
nachempfunden wurde, aus dem Plasma von 29 Patienten mit Dilatativer
Kardiomyopathie
gewonnen,
um
am
Fluoreszenzmikroskop
an
isolierten,
feldstimmulierten, adulten Rattenkardiomyozyten auf dessen Beeinflussung bezüglich
der Kontraktilität und des intrazellulären Kalziums der Zellen getestet zu werden. Bei
den Patienten wird anschließend eine Immunadsorptionstherapie durchgeführt.
Dieses Kapitel geht näher auf die einzelnen Arbeitsschritte und Kriterien dieser Studie
ein.
6.1. Patienten und verwendete Materialien
6.1.1. Puffer, Chemikalien, Lösungen
Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen Puffer (Funktion siehe 5.3.1. und 5.3.2)
Substanzen
Perfusion
Versuchs Trispuffer
Glycin-HCl Hersteller
(mM)
s-puffer
-puffer
Glycin
-
-
-
200
Merck
NaCl
110
117
-
-
Merck
KCl
2,6
2,8
-
-
Merck
MgCl2
-
0,6
-
-
Merck
MgSO4
1,2
-
-
-
Merck
KH2PO4
1,2
1,2
-
-
Merck
CaCl2
-
1,2
-
-
Merck
HEPES
25
10
-
-
Merck
TRIS
-
-
1000
-
Sigma
Glucose
11
20
-
-
Merck
eingestellter
7,4
7,3
8,0
2,8
pH-Wert
mit NaOH
mit NaOH mit HCl
mit HCl
In Tabelle 1 sind die Zusammensetzungen der in dieser Arbeit verwendeten
Pufferlösungen und die Namen der Hersteller enthalten, von denen die Substanzen
bezogen wurden (Merck, Darmstadt, Germany und Sigma-Aldrich, Deisenhofen,
Germany). Die Puffer wurden steril filtriert und im Kühlschrank bei 4° Celcius gelagert.
23
Weitere
verwendete
Chemikalien,
Wirkstoffe
und
deren
Hersteller
sind in Tabelle 2 enthalten:
Tabelle 2: Übersicht über verwendete Chemikalien und Wirkstoffe
Substanzen
Hersteller
Atropin
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
Bromo cAMP
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
BSA
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
Kollagenase Typ CLS II
Worthington, Freehold, NJ, USA
DMSO
Merck, Darmstadt, Germany
Fura-2-AM
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
Harbor, Bio-Products, Norwood, MA,
Laminin
USA
Metoprolol
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
Life Technologies, Simi Valley, CA,
PBS
USA
Pluronic
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
Sepharose
(Immunadsorber Ig Therasorb)
Thiopental (Trapanal ®)
Baxter, Munich, Germany
Byk Gulden, Konstanz, Germany
6.1.2. Patienten
In die Studie wurden 29 Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie eingeschlossen.
Einschlusskriterien waren:
 Fortgeschrittene linksventrikuläre Dysfunktion (linksventrikuläre Ejektionsfraktion
<30% ) sowie deutliche Einschränkung der hämodynamischen Parameter
(Herzindex <2,5 l/min/m2 und Schagvolumenindex <35 ml/m2);
 Klinische Symptomatik entsprechend einer therapieresistenten chronischen
Herzinsuffizienz der NYHA-Stadien III und IV; Diese Parameter wurden
angiokardiographisch bzw. echokardiographisch bestimmt.
 Stabile
Medikation
für
mindestens
drei
Monate
vor
Beginn
der
Immunadsorptionstherapie (ACE-Hemmer, AT1-Rezeptorantagonisten, Digitalis,
24
Diuretika, Nitrate). Beta-Blocker gehörten bei allen Patienten schon mindestens
sechs Monate vor Studienbeginn zur Standarttherapie.
Von der Studie ausgeschlossen wurden Patienten mit Verdacht auf chronischen
Alkoholismus, aktive Infektionskrankheiten, Tumorerkrankungen (u. U. Neoplasien),
Herzinsuffizienz aufgrund anderer Erkrankungen, wie koronarer Herzerkrankung
(wurde bei den Patienten dieser Studie mittels Koronarangiographie ausgeschlossen),
Hypertonie oder Herzvitien. Bei allen Patienten wurden vor Studienbeginn
Endokardbiopsien (Sigusch et al. 1998) entnommen, um eine akute Myokarditis
auszuschliessen. Die Gewinnung der Biopsien erfolgte unter standartisierter Methodik
(Fowles et Manson,1982) aus dem rechten Septum interventrikulare, wobei die
Biopsien etwa die Größe von 2 mm³ hatten. Das Durchschnittsalter der Patienten lag
bei ungefähr 52 ± 1,85 Jahren, während die mittlere Erkrankungsdauer bei ca. 5
Jahren lag. Allen Patienten wurde ca. 10-14 Tagen vor der Immunadsorption Blut
abgenommen, das für die unten beschriebenen in vitro-Versuche genutzt wurde.
6.2. Klinische Methoden
6.2.1. Immunadsorptionstherapie
Nachdem
die
Voruntersuchungen
(u.a.
Echokardiographie,
Angiographie,
Endokardbiopsie, siehe oben) abgeschlossen waren, wurden die Patienten zur
Immunadsorptionstherapie
entweder
auf
eine
Intensivtherapiestation
der
Medizinischen Klinik und Poliklinik der Charité Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie,
Pneumologie oder auf die Kardiologische Wacheinheit der Klinik für Innere Medizin B
der Universität Greifswald aufgenommen und während der Behandlungzeit
immobilisiert.
Die Immunadsorptionsbehandlung wurde, wie auch die folgende Abbildung
verdeutlichen möchte, nach einem einheitlichen Zeitplan bzw. Schema durchgeführt:
Es wurde an drei aufeinanderfolgendenTagen (ab der zweiten Sitzung an zwei Tagen)
im Abstand von vier Wochen über drei Monate eine Immmunadsorption mit
nachfolgender Immunglobulin-Substitution durchgeführt.
25
Abbildung 3: Zeitlicher Ablauf der Immunadsorption
6.2.2. Immunadsorptionsverfahren bzw. Isolierung der Antikörper in vivo
Um die Immunglobuline bzw. das Antikörpergemisch aus dem Plasma der
DCM-Patienten zu entfernen, wurde unter anderem ein Immunadsorber Ig Therasorb
(Baxter, Munich, Germany) verwendet. Mit einer Flussrate von etwa 30 ml pro Minute
wurde den Patienten über einen peripheren venösen Zugang Blut entnommen, und
das
Plasma
in
einem
primären
Trennverfahren
mit
Hilfe
von
Mirasorb
Plasmapheresesystem (Dialyse Technik, Ettlingen, Deutschland) und Hemaplex-BT
9000/B Plasmafilter (Dideco, Mirandola, Italien) separiert.
Nachdem das Plasma über die Immunadsorptionssäule geführt wurde, konnte es
den Patienten wieder reinfundiert werden. Die Immunadsorptionssäulen beinhalten
Sepharose-Cl-4B-Suspension, an die gegen humanes Immunglobulin gerichtete
Antikörper vom Schaf gebunden sind. Diese polyklonalen Schafsantikörper binden
spezifisch IgG, IgA, IgM und Immunkomplexe aus dem Plasma. Da das
Immunadsorptions-System zwei parallele Säulen besitzt, kann abwechselnd die eine
Immunglobuline aus dem Plasma adsorbieren, während die andere regeneriert wird.
So können bei einem Plasmafüllungsvolumen von 100 ml pro Säule bei jeder
Immunadsorption
fünf
Liter
Plasma
durch
die
Säulen
gefiltert
werden.
Die Regeneration der Säulen erfolgte in vier aufeinanderfolgenden Schritten:
26
zuerst einer Spülung mit Natriumchlorid, dann der Elution der Antikörper mit
Glycinhydrochlorid (pH = 2,8) und anschließend der Aufbereitung der Säulen mit
Phosphatpuffer (pH = 7,2) und Natriumchlorid. Die eluierten Antikörper (nachfolgend
Eluat genannt) mit Glycin-HCl wurden in Fraction-Bags aufgefangen und anschließend
mit Hilfe von TRIS-Puffer auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert.
Plasmazulauf
Fc-gekoppelte
Sterilfilter
polyklonale
Tropfplatte
Schafantikörper
gegen humanes
Immunglobulin
Sepharose CL-4B
Sinterplatte
Glasgehäuse
Antikörperbeschichtung
Abbildung 4:Prinzip der Immunadsoptionssäulen (Ig Therasorb®)
27
NaCl
Glycin PB
HCl
Spülpumpe
Primärtrennung
Plasma-
Plasmapumpe 1
Filter
Blutpumpe
Heparin
Säule
1
2
Immunadsorption
Plasmapumpe 2
Abfall
Säule 1: Beladen
Säule 2: Regenerieren
Abbildung 5: Schema der Immunadsorption
6.2.3. Invasives hämodynamisches Monitoring
Die hämodynamischen Parameter der DCM-Patienten wurden im Verlauf der
Immunadsorptionstherapie mit Hilfe eines Swan-Ganz-Einschwemmkatheters (durch
Rechtherzkatheterisierung) untersucht. Unter radiologischer Kontrolle wurde nach
Punktion der rechten Vena jugularis der Katheter zentralwärts über die Vena cava
superior, rechten Vorhof und Ventrikel in die Pulmonalarterie vorgeführt. Diese
Position ermöglicht – bei Insufflation des entständigen Ballons und Okklusion eines
Pulmonalarterienastes- die Registrierung des intrakapillären pulmonalen Druckes,
auch Wedge-Druck genannt. Außerdem beinhaltet das Kathetersystem durch mehrere
Lumina und einen am distalen Ende des Katheters befindlichen Temperatursensor die
Möglichkeit
zur
Bestimmung
des
Herzzeitvolumens
mittels
der
Thermodilutionsmethode. Die Registrierung der intravasalen Druckwerte im rechten
Vorhof,
rechen
Ventrikel,
der
Pulmonalarterie
sowie
des
pulmonalen
Kapillarstromgebiets wurde über Anschluss der entsprechenden Lumina des
Katheters an hierfür geeignete Drucktransducer ermöglicht. Von den erhobenen Daten
konnten die hämodynamischen Werte wie Herzindex und Schlagvolumen rechnerisch
abgeleitet werden.
28
6.3. Experimentelle Methoden
6.3.1. Isolierung der Antikörper in vitro
Um die Antikörper bzw. das in-vitro-Eluat für die Versuche an isolierten
Rattenkardiomyozyten schon vor der Immunadsorption aus dem Plasma der Patienten
zu gewinnen, wurde ein in vitro-Modell der Immunadsorption entwickelt, mit dem die
Antikörper in Anlehnung an die in der Klinik durchgeführten Immunadsorptionen
extrahiert werden konnten. Dazu reichten schon kleinste Mengen Plasma aus (ca.
5-10ml). Da die Immmunadsorption auf der kovalenten Bindung von humanen
Immunglobulinen durch polyklonale Schafsantikörper, die an Sepharose-Cl-4B
gebunden sind, beruht, wurde die Sepharose aus den Immunadsorptionssäulen
(Immunadsorber IG Therasorb) für das in vitro-Modell verwendet. Zur Herstellung der
in-vitro-Immunadsorptionssäule wurde zunächst die Sepharose (5 ml) vorsichtig in
Empty-Econo-PAC-Disposable-Chromatography-Columns
(Biorad,
Munich,
Germany) gefüllt und mit einem oberen und unteren Filter abgedichtet. Dann konnte
mit der in-vitro-Adsorption begonnen werden, indem die Sepharose in drei Schritten
mit
jeweils
6
ml
physiologischer
Kochsalzlösung
gewaschen
wurde,
um
Restsubstanzen aus der Sepharose zu spülen (in Anlehnung an einen der oben
beschriebenen
Regenerationsschritte
der
Immunadsorptionssäulen).
Die
herausgewaschenen, von der Sepharose separierten Substanzen wurden verworfen.
Die gewaschene Sepharose konnte nun mit ca. 6ml Plasma der DCM-Patienten
beschickt
werden.
Während
des
Durchlaufs
konnten
die
Fc-gebundenen
Schafsantikörper an die Immunglobuline des Patientenplasmas binden. Anschließend
wurde die Sepharose wieder mit physikalischer Kochsalzlösung gewaschen, um die
nicht gebundenen Antikörper und andere Plasmabestandteile zu entfernen. Es folgte
eine Inkubationsphase der Sepharose mit Glycin-HCl, wobei sich durch die
pH-Verschiebung auf pH = 2,8 die Bindung zwischen den humanen und den
Schafsantikörpern löste. Die gelösten Antikörper (in-vitro-Eluat) wurden in einem
Behälter aufgefangen und mit Tris-Puffer auf einen physiologischen pH-Wert
eingestellt.
Bevor dieses in-vitro-Eluat für die experimentellen Versuche an isolierten
Rattenkardiomyzyten zur Verfügung stand, musste es erst noch gegen Versuchspuffer
nach folgendem Modus dialysiert werden: Die Dialyse erfolgte 8 Stunden bei 1:100
und anschliessend 20 Stunden bei 1:1000 (Eluat : Versuchspuffer), dabei wurde eine
29
Dialysemembran (Spectra/ Por Biotech) mit einem Molekulargewichtsfilter (MWCO)
von 100.000 Dalton verwendet. Nach insgesamt 28 Stunden Dialyse wurde das Eluat
30 Minuten bei 56° C in einem Wasserbad erhitzt, um Komplementfaktoren zu
deakivieren.
Im Zentrallabor der Universität Greifswald wurde schliesslich die ImmunglobulinG-konzentration des Eluats bestimmt, um für die mikroskopischen Versuche mit
isolierten Rattenkardiomyozyten auf eine einheitliche IgG-Konzentration von 300 mg/L
mit Versuchspuffer verdünnt zu werden.
27 Patienten mit DCM
Screening der Antikörper :
Blutabnahme
(ca. 7-14 Tage vor IA)
Miniadsorption
bzw.
in vitro-Adsorption
Dialyse mit anschließender
IgG-Bestimmung
Funktionalitätsmessung
des gewonnenen Eluats
an Rattencardiomyozyten
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Antikörper-Screening-Methode
30
6.3.2. Isolierung der Kardiomyozyten von adulten Ratten
Begasung
oberes
Reservoir
Z
A
Z
Säule
Höhe: 90 cm
mit
integrierter
Blasenfalle
A
Schraubventil
Auffangbecher
Rollerpumpe
Z
A
Heiz-Pump-Kreislauf:
Z = Zulauf
A = Ablauf
Abbildung 7: Die Langendorff-Perfusionsanlage
Um isolierte Kardiomyozyten von adulten Ratten zu gewinnen, wurde eine modifizierte
Langendorff-Perfusionsapparatur verwendet (Powell et al.1980; Piper,1992). Diese
Langendorff-Anlage bot während der gesamten Isolation eine konstante Temperatur
von 37° C und war in der Lage, durch einen verschließbaren Auffangbecher als eine
Art Klimakammer zu fungieren. Außerdem konnte man mit ihrer Hilfe vor und während
der Isolation den in ihr verwendeten Puffer mit Carbogen (95 % O2, 5 % CO2)
begasen. Im oberen Reservoir befand sich die Perfusions-/ Enzymlösung, die über
eine 90 cm hohe, gewärmte Säule mit einem Luftfänger, auch Blasenfalle genannt, in
31
Verbindung stand. An dieser Säule war eine Kanüle angebracht, über die das Herz,
nachdem es aus der Ratte extrahiert worden war, perfundiert wurde.
Die Anordnung bzw. der Aufbau erzeugten einen Druck von 90 cm Wassersäule, der
durch die Flussregulierung gesteuert werden konnte. Unterhalb des Herzens befand
sich ein Auffangbehälter, der einerseits zur Rezirkulation des Perfusats, andererseits
durch Verschluss des Bechers zur konstanten Umgebungstemperatur von 37° C für
das Herz diente.
6.3.3. Organentnahme
Für
die
Versuche
wurden
180-200
g
schwere
erwachsene
weibliche
Albino-Shoe-Wistar-Ratten aus der Tierzuchtanlage Schönwalde, Berlin, Germany,
verwendet, deren durchschnittliches Alter ungefähr bei 56 Tagen lag.Durch eine
intraperitoneale Injektion von 75-125 mg Thiopental wurden die Ratten anästhesiert,
und nach der Überprüfung der Reflexlosigkeit wurde zügig der Thorax eröffnet bzw.
das Herz mitsamt Mediastinalinhalt explantiert.
A. subclavia
A. carotis dextra
Kanüle
A. anonymica
IA
Abbildung 8: Die optimale Lage der Perfusionkanüle in der Aorta (IA)
Danach wurde das Herz in eine mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlöung gefüllte
Petrischale gegeben. In dieser Schale schlug das Herz kurzzeitig noch sehr kräftig und
trieb Blut aus dem Kapillarbett und den Ventrikeln. So konnte eine Thrombosierung
innerhalb der Vorhöfe und Ventrikel sowie der Koronargefässe verhindert werden.
Nach einigen Sekunden sistierte die Herzaktion in der kalten Salzlösung, und man
konnte nach Abtrennung des mediastinalen Gewebes die Aorta unmittelbar hinter dem
32
Thymus finden. Mit Hilfe von zwei Pinzetten wurde das Ende der Aorta leicht
aufgedehnt und schliesslich zur enzymatischen Isolation des Herzens über die Kanüle
(oben beschrieben) der Langendorff-Anlage gezogen.
6.3.4. Enzymatische Isolation
Die Aorta des gerade explantierten Rattenherzen wurde gerade soweit über die
Kanüle der Langendorff-Anlage gezogen, bis sie den Abgang des Truncus anonymous
passiert hat (siehe hierzu Abbildung). Die Kanüle sollte also die Gefäße des
Aortenbogens verschließen, durfte aber weder die Koronarien verlegen, noch die
Aortenklappe penetrieren. In dieser Position konnte nun die Aorta mit einer Ligatur
fixiert werden. Anschließend wurde das Herz mit ungefähr 2 Tropfen Perfusionspuffer
pro sec präperfundiert (10 ml/min). Dieser Präperfusionsschritt diente zum
Auswaschen des restlichen Blutes aus dem Herzen und der Reduktion des
extrazelluären
Kalziumspiegels.Unmittelbar
vor
dem
Experiment
wurde
die
Kollagenase (355 U/ mg) gelöst, und zwar in 20 ml Perfusionspuffer mit Zusatz von
22,5 µl einer einmolaren Kalzium-Stammlöung und 174 mg BSA. Nachdem das
System auf Reperfusion umgestellt und die 20 ml konzentrierte Kollagenaselösung
zum oberen Reservoir hinzugegeben wurde, konnte das Herz für weitere 27 Minuten
mit einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro sec perfundiert werden. Die
gleichmässige Perfusion des Herzens konnte man während der Isolation an seiner
homogenen Färbung erkennen. Durch die Begasung des Perfusionspuffers mit
Carbogen
ab
30
Minuten
vor
dem
Versuch
wurde
eine
ausreichende
Sauerstoffversorgung des Herzens sichergestellt. Danach wurde das Herz von der
Perfusionsapparatur genommen und mit Hilfe von zwei Skalpellen in ca. 1x1x1 mm
grosse Stücke geschnitten. Das zerkleinerte Herz wurde sodann in einen dafür
vorbereiteten Glasbecher gegeben, der mit 20 ml begasten Reperfusionspuffer gefüllt
war. Während einer 10 –15-minütigen Inkubationszeit wurde die Verdauung von Zeit
zu Zeit unter dem Mikroskop beurteilt. Schließlich wurde die Zellsuspension durch ein
Nylonsieb (200 µM) dekantiert und in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Nach
anfänglichem
Abzentrifugieren
der
Enzymlösung
wurden
die
Zellen
in
Perfusionspuffer mit steigendem Kalzium-Gehalt von 200 µM und 500 µM gewaschen
und endlich in 10 ml Versuchspuffer aufgenommen.
33
6.3.5. Zählung der Kardiomyozyten
Vorgenommen
wurde
die
Zählung
der
Kardiomyozyten
in
einer
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer. Dabei wurde die Anzahl der Myozyten sowie das
Verhältnis von intakten zu defekten Zellen bestimmt. Die durchschnittliche Anzahl von
intakten Rattenkardiomyozyten lag pro Isolation bei 600.000 - 900.000 Zellen.
6.3.6. Beschichtung der Kammerträger mit isolierten Kardiomyozyten und deren
Färbung
Die Kardiomyozyten wurden nach der Isolation in die Kammerträger (Nalgene Nunc
Int. Corp. Naperville, IL, USA) eingefüllt. Die Kammern wurden vorher eine Stunde
lang mit 10 µg/cm² Laminin inkubiert. Pro Kammer wurden ca. 1000 Zellen, gelöst in
500 ml Versuchspuffer, eingesetzt und dann für 60 min zum Anheften stehen lassen.
Der Versuchspuffer wurde anschliessend durch eine Färbelösung ersetzt. Diese
Färbelösung enthielt 0,1 % DMSO, 0,025 % Pluronic, 0,2 % BSA und 1 µm Fura-2-AM
(Pentakisacetoxymetthylester, Sigma, Deisenhofen, Germany) , wobei Fura-2-AM ein
zellmembranpermeabler
Farbstoff
ist,
der
zur
Messung
des
intrazellulären
Kalziumtransienten dient. Durch seine veresterte, lipophile Struktur kann er durch die
Zellmembran in die Zelle difundieren, wo er von intazellulären Esterasen in zwei polare
Produkte gespalten wird, so dass ein Wiederaustritt verhindert wird. Mit dieser
Färbelösung wurden die Zellen 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem
Schwenktisch (30/min) inkubiert. Danach wurde die Lösung aus den Kammern
abgesaugt und ein bis zwei Mal mit 1000 µl Versuchspuffer gewaschen. Nach
Einstellung eines Kammervolumen von 500 µl Versuchspuffer konnten die Zellen am
Fluoreszenzmikroskop untersucht werden.
6.3.7. Messungen am Fluoreszenzmikroskop
6.3.7.1. Aufbau des Mikroskops
Die isolierten Rattenkardiomyozyten wurden mit Hilfe eines DM-IRB-Mikroskops
(Leika, Germany) untersucht, das mit einer Fluoreszenzlicht-Anlage und einer hochauflösenden Kamera (Myocam, IonOptix, Milton, USA) ausgestattet war. Durch einen
Zellstimulator (Myopacer, IonOptix, Milton, USA) wurden die Zellen zu gleichmäßigen
Kontraktionen angeregt, die man, wie auch den Kalziumtransienten, online registrieren
34
konnte. Die Mikroskop-Anlage war in der Lage durch eine reale zweidimensionale
Auflösung eine scharfe Abbildung in einer Zellebene zu ermöglichen, wobei
Strukturen, die außerhalb des Focus lagen, nicht in der Abbildung berücksichtigt
wurden. Das Präparat in der Brennebene wurde von einer Punktlichtquelle belichtet,
wobei die für die Beleuchtung des Fluoreszenzfarbstoffes (Fura-2-AM) geeignete
Wellenlänge mittels Eingangssperrfilter ausgewählt wurde. Fura-2-AM hat zwei
verschiedene
Adsorptionsmaxima,
das
eine
Adsorptionmaximum
liegt
in
kalziumgebundener Form bei 335 nm vor (während der Kontraktion der Zelle erhöht),
während das andere Adsorptionsmaximum bei 362 nm in der kalziumfreien Form
detektiert (in der Relaxation) werden kann (Kao et al. 1994). Der Lichtstrahl traf von der
Strahlenquelle aus auf einen dichromatischen Teilerspiegel, der nur die Passage des
Lichts bis zu einer bestimmten Wellenlänge ermöglicht, Licht oberhalb dieser
Wellenlänge wurde reflektiert. Das mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Objekt emittierte
nun längerwelliges Licht, das durch das Objektiv und den für diese Wellenlänge
eingestellten dichromatischen Teilerspiegel zu einem Punktlichtdetektor gelenkt
wurde, der nur Licht, das innerhalb der Focusebene lag, miteinbezog. Um die
Objektfläche darstellen zu können, wurde diese von der Kamera bzw. Myocam erfasst.
Die Emissionsintensität dieser Fläche wurde mit einem Photomultiplier gemessen, um
dann elektronisch zu einem Transienten zusammengefasst zu werden. Die
Fluoreszenzemission wurde mit UV-Licht bei Wellenlängen von 360nm und 380 nm
gemessen, um die kalzium- und konrationabhängige Fluoreszenz der Zellen zu
bestimmen. Die Bildfrequenzrate wurde mit 60 Bildern pro Sekunde (640 × 120 Pixel)
detektiert. Die Mikroskop-Anlage war mit einem hierfür entwickelten Software- bzw.
Computersystem (Analyze bzw. Aquire von IonOptix, Milton, USA) verbunden, das zur
Online-Registrierung und Speicherung der Zellängenveränderungen und des
Kalziumtransienten diente. Während der Online-Registrierung konnte man folgende
Qualitäten messen bzw. direkt beobachten und abspeichern:
a) length: Restrierung der Zell-Länge und deren Schwankungen während der
Kontraktionen der eingestellten Zelle;
b) Numerator:
Registrierung
der
kontraktionsabhängigen
Schwankungen
(systolisch und diastolisch) des gebundenen intrazellulären Kallziums (mißt bei
360 nm);
35
c) Denominator: Registrierung der kontraktionsabhängigen Schwankungen des
ungebunden intrazellulären Kalziums (mißt bei 380 nm);
d) Ratio: Registrierung des Verhältnisses zwischen gebundenem (Numerator) und
ungebundenem
(Denominator)
Kalzium
während
jeder
Kontraktion
(Kalziumtransient);
6.3.7.2. Messung des Kalziumtransienten und der Kontraktilität
Die Experimentierkammer mit der isolierten Einzelzelle wurde in den Strahlengang des
Mikroskops eingebracht. Die Zellen wurden über eine Pumpe kontinuierlich mit einer
Flussrate von 2ml/ min mit Versuchspuffer umspült, wobei die Konfiguration des Zuund Abflusses der Kammer trotzdem ein Kammervolumen von 500 µl aufrecht erhielt.
Die elektrische Stimulation der Zellen erfolgte über Elektroden, die in die Experimentierkammer eingebracht wurden und mit einer Frequenz von 1 Hz, einer Impulsdauer
von 5ms und einer Spannung von 4-8 mV arbeiteten.
Die Messung des Kalziumtransienten und der Zellkontraktilität wurde jeweils an einer
Zelle pro Kammer durchgeführt. Dabei wurde mittels konventioneller Durchlichtmikroskopie eine intakte Zelle ausgesucht, und zu Beginn der Messung das
Fluoreszenzlicht in den Strahlengang eingekoppelt. Als intakte Zellen wurden Zellen
mit möglichst rechteckiger Form, geraden Rändern, gleichmäßigen Kontraktionen und
stabilen Kalziumtransienten herausgesucht. Der Effekt des Antikörper-Eluates auf den
Kalziumtransienten wurde als prozentuale Änderung der Fura-2-AM-Fluoreszenz
(relative fluorescence units => rfu) registriert.
Die Mikroskopierversuche wurden nach folgendem Modus durchgeführt und
wiederholt: Nach der Aufzeichnung der Basisdaten der Zelle für 10 Sekunden
(960 Bilder, 8 Kontraktionen) wurde das Eluat (verdünnt mit Versuchspuffer auf eine
Konzentration von 300 mg/ ml, siehe oben) über das Pumpsystem zugeführt.
Nach 110 Sekunden Messpause wurde der Kalziumtransient und die Zellverkürzung
erneut für 10 Sekunden bestimmt (Akut-Messung). Anschließend wurde nach
abermals 110 Sekunden die 2-Minuten-Messung für 10 Sekunden durchgeführt, die
nach 170 Sekunden (5-Minuten-Messung) nochmals wiederholt wurde.
Kalziumtransient und Zellverkürzung wurden für jede Messung gemittelt und die
Mittelwerte für die Auswertung verwendet. Die Änderung des Kalziumtransienten und
der Zellverkürzung wurden so prozentual zu den Basalwerten erhoben.
36
6.3.7.3. Auswertung
Die Auswertung der Messungen erfolgte mit Hilfe des Analyze-Programms (IonOptix,
Milton, USA), wobei der Kalziumtransient sowie die Kontraktilitätsveränderungen der
Zelle graphisch als auch tabellarisch dargestellt werden konnten. Besonderes
Interesse
galt
vor
allem
dem
systolischen
wie
auch
dem
diastolischen
Kalziumtransienten (in rfu) und der absoluten Zellverkürzung (in µm).
Die Messwerte, wie auch die Mittelwerte der einzelen Messungen (Akut-Messung,
2-Minuten-Messung, 5-Minuten-Messung) und die prozentualen Veränderungen des
Transienten und der Kontraktilität wurden in Microsoft-Excel-Datein transferiert und
gespeichert.
6.3.7.4. Eichung des Mikroskop-Systems
In regelmäßigen Abständen wurde zur Überprüfung der Mikroskopanlage bzw. ihrer
wellenlängenabhängigen
Detektoren
eine
Kalibrierung
durchgeführt.
Zwei
verschiedene Methoden wurden hierbei etabliert: während die in vivo-Kalibrierung mit
funktionstüchtigen
Kardiomyozyten
durchgeführt
wurde,
konnte
bei
der
in
vitro-Kalibrierung auf Zellen verzichtet werden, da hierbei die intrazellulären
kontraktionsabhängigen
Kalziumschwankungen
durch
Lösungen
mit
unterschiedlichem Kalziumgehalt simuliert wurden.
6.3.7.4.1. Kalibrierung in vivo
Vor Beginn der in vivo Kalibrierung wurden zunächst die dafür benötigten Puffer
angesetzt, deren Grundbestandteil eine kalziumfreie Lösung (CFT) in der folgenden
Zusammensetzung war.
Tabelle 3: Chemikalien zur Herstellung der kalziumfreien Lösung (CFT)
Chemikalie
NaCl
Molarität
135 mM
KCl
4 mM
MgCl2
1mM
HEPES
NaH2PO4
BDM
10 mM
0,33mM
40mM
37
Nachdem die Lösung steril filtriert war, wurden mit der CFT die verschiedenen
Lösungen zur Bestimmung der Kalibrierungsparameter hergestellt:
(A) CFT (40 ml);
(B) CFT + 10 µM Ionomycin (in DMSO gelöst) + 1mM EGTA (120 ml);
(C) CFT +10µM Ionomycin (in DMSO gelöst) + 4mM CaCl 2 (40 ml);
(D) CFT + 10 µM Digitonin +1mM EGTA (40 ml);
Die Kardiomyozyten, die nach oben beschriebenen Schema (siehe Kapitel 5.3.4.)
isoliert wurden, konnten nun mit 1 µM Fura 2, gelöst in CFT (gleiche
Adsorptionsmaxima wie Fura-2-AM, jedoch durch hydrophilen Charakter nicht
zellmembrangängig) gefärbt werden.
Zu Beginn der in vivo Kalibrierung wurde eine funktionsfähige Zelle in den
Strahlengang des Mikroskops eingebracht, und diese ca. 10 Minuten mit CFT (A) über
die Pumpanlage gespült, um eventuelle Kalziumrückstände, verursacht durch
Zelltrümmer oder Rückstände in der Pumpanlage, zu beseitigen. Anschliessend wurde
die Zelle für 40 Minuten mit (B) umspült, um in regelmäßigen Abständen für 10
Sekunden zu messen, bis die Ratio konstant blieb. Ionomycin nimmt dabei eine
wichtige Rolle ein. Es erhöht die Permeabilität der Zellmembran für Kalziumionen.
Durch EGTA wird so freigewordenes Kalzium gebunden und kann nicht mehr von
Fura-2 gebunden werden. Die gemittelten Messungen mit (B) dienten zur Berechnung
für Rmin. Schliesslich wurde der Zelle über die Pumpanlage (C) zugeführt, bis eine
konstante Ratio gemessen werden konnte (zur Bestimmung von Rmax). Der
Background wurde mit (D) gemessen.
Mit den so erhaltenen Messwerten konnten nun die Variablen Rmax, Rmin, Sb2 und
Sf2, wie folgt, berechnet werden, und als Eichdaten im IonOptix-Analyze-Programm
gespeichert werden:
a) Rmax = (Numerator von (C)) – Numerator des Backgrounds ) / (Denominator von
(C) – Denominator des Backgrounds )
b) Rmin = Berechnung entsprechend Rmax nur mit (B) statt (C)
c) Sb2 = Denominator von (C) – Denominator des Backgrounds
d) Sf2 = Denominator von (B) – Denominator des Backgrounds
38
6.3.7.4.2. Kalibrierung in vitro
Im Gegensatz zur in vivo Kalibrierung, die einen hohen Zeitaufwand sowie
funktionsfähige isolierte Rattenkardiomyozyten benötigt, kam die in vitro Kalibrierung
ohne
Zellmaterial
und
ohne
Pumpsystem
aus.
Außer
eines
laminierten
Vierkammerträgers und Versuchspuffer wurden folgende Kalibrierungs-Lösungen
benötigt:
Tabelle 4: Zusammensetzung der in vitro Kalibrierungs-Lösungen
High Calcium (HC)
Zero Calcium (ZC)
Chemikalie
Molarität
Molarität
KCl
150 mM
150 mM
NaCl
10 mM
10 mM
MgCl 2
3 mM
3 mM
HEPES
10 mM
10 mM
Fura2
1µm
1 µM
EGTA
0
10 mM
CaCl 2
1 mM
0
pH-Wert
7,4
7,4
Der laminierte Vierkammerträger wurde nach folgendem Schema gefüllt und im
Strahlengang des Mikroskops gemessen:
a) Kammer 1: 500 µl Zero Calcium (ZC)
b) Kammer 2: 500 µl High Calcium (HC)
c) Kammer 3: 500 µl Versuchspuffer
d) Kammer 4: 500 µl Versuchspuffer
Die Zero Calcium-Kammer wurde im Mikroskop einstellt für 10 sec messen. Diese
Messung diente zur Rmin -Bestimmung. Danach wurde eine Versuchspuffer-Kammer
in
die
Mikroskopebene
Background-Bestimmung
für
verschoben
den
und
wieder
Rmin-Werte).Schließlich
gemessen
wurde
die
(zur
High
Calcium-Kammer zur Rmax-Bestimmung gemessen, während die letzte Messung mit
Kammer 4 zur Background-Messung für Rmax nötig war.
Durch nachfolgende Berechnungen erhielt man die gesuchten Eichwerte für das
IonOptix-Analyze-Programm:
39
a) Rmax = (Numerator von HC – Numerator von Background HC) / (Denominator von
HC – Denominator von Background HC);
b) Rmin = Berechnung entsprechend Rmax;
c) Sb2 = Denominator von HC – Denominator von Background HC;
d) Sf2 = Denominator von ZC – Denominator von Background ZC
6.4.
Interaktionsversuche
zwischen
in-vitro-Eluat
und
verschiedenen
Medikamenten
Um Hinweise auf die Wirkungsweise der Antikörper bzw. deren Rezeptorstrukturen im
in-vitro-Eluat zu erhalten, wurden Interaktionsversuche zwischen in-vitro-Eluaten von
vier ausgewählten Patienten (aus der kardiodepressiven Gruppe, siehe unten) und
Metoprolol, Atropin und Bromo-cAMP am Fluoreszenzmikroskop durchgeführt.
6.4.1. Interaktionsversuche mit Metoprolol (ß-Rezeptoren-Blocker)
Um die ß-Rezeptoren der isolierten Rattenkardiomyozyten zu blockieren, wurden 5
Minuten vor der Messung die Zellen mit Metoprolol vorinkubiert, wobei Metoprolol in
einer Konzentration von 10 µmol im Versuchspuffer vorlag. Eine Basalmessung wurde
durchgeführt und anschließend das Patienten-in-vitro-Eluat (mit Versuchspuffer +
Metoprolol auf 300 mg/l verdünnt) nach oben beschriebenen Modus durch die
Pumpanlage den Zellen zugeführt und gemessen.
6.4.2. Interaktionsversuche mit Atropin (muskarinerger Rezeptorenblocker)
Zur Blockierung des muskarinerger Rezeptors bediente man sich Atropins in einer
Konzentration von 30 µmol in Versuchspuffer. Auch bei diesen Versuchen wurden die
Zellen 5 Minuten mit Atropin in Versuchspuffer vorinkubiert. Nach der Basalmessung
wurden schließlich wie oben beschrieben die in-vitro-Eluate der drei DCM-Patienten
gemessen.
6.4.3. Interaktionsversuche mit Bromo-cAMP
Durch einen intrazellulären Überschuss an cAMP, der in unserer Versuchsreihe durch
Vorinkubation der Zellen 20 Minuten vor der Messung mit Bromo-cAMP (250µmol/l) in
40
Versuchspuffer erreicht wurde, sollte das Ausmaß des Einflusses der in-vitro-Eluate
der drei DCM-Patienten auf die Adenylatzyklase bestimmt werden. Nach der
Vorinkubationszeit wurde nach schon genanntem Modus gemessen.
6.5. Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung der GraphPadPrimsTM
Software. Zum Vergleich von zwei unabhängigen Stichproben wurde der ungepaarte,
zweiseitige studentischer t-Test angewendet, von einer Normalverteilung der Proben
wurde nicht ausgegeangen. Beim Vergleich mehrer Stichproben wurde der
Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender PostHoc Analyse verwendet. P-Werte unter
0.05 wurden als statistisch signifikant erachtet.
41
7. Ergebnisse
In diesem Kapitel werden die Veränderungen der hämodynamischen Parameter der
Patienten
mit
Dilatativer
Immunadsorptionstherapie
Kardiomyopathie
aufgezeigt
und
während
mit
des
den
Verlaufs
der
Ergebnissen
der
in-vitro-Funktionalitätstests, die an isolierten feldstimmulierten Rattenkardiomyozyten
durchgeführt wurden, verglichen. Weiterhin werden auch die Ergebnisse der
Interaktionsversuche zwischen in-vitro-Eluat und verschiedenen Medikamenten
bezüglich der Charakterisierung der Antikörperspezifität im Eluat dargestellt.
7.1. Die Immunadorptionstherapie der DCM-Patienten
Es wurden insgesamt 29 Patienten in die Studie eingeschlossen, 28 männliche
Patienten und eine weibliche Patientin. Das mittlere Alter der Patienten betrug
52 ± 1,85 Jahre und die durchschnittliche Krankheitsdauer lag bei 5 ± 0,81 Jahren.
Außerdem erfüllten alle Patienten, die unter 5.1.2. geforderten Kriterien. Die
Ejektionsfraktion lag im Mittel bei 25,28 ± 1,87 Prozent.
Von diesen Patienten (29), wurde in dem Zeitraum 7 bis 14 Tage vor Beginn der
Immunadsorptionstherapie Plasma abgenommen, und damit eine in-vitro-Adsorption
durchgeführten,
die
daraus
gewonnenen
Antikörper
wurden
an
isolierten
Rattenkardiomyozyten mittels Fluoreszenzmikroskop getestet. Als Vergleichsgruppe
dienten 45 Kontrollpatienten, die sich in Alter und Geschlecht nicht von den
DCM-Patienten unterschieden, jedoch keine DCM aufwiesen.
In
einmonatigen
Abständen
wurden
bei
allen
29
DCM-Patienten
vier
Immunadsorpionszyklen durchgeführt, wobei im ersten Zyklus an drei, in den
folgenden an zwei Tagen eine Immunadsorption durchgeführt wurde, bei der ca. 8000
ml Plasma adsorbiert wurden. Die hämodynamischen Parameter wie Herzindex und
Schlagvolumenindex wurden vor und nach dem ersten bzw. letzen Zyklus für jeden
Patienten bestimmt und dokumentiert. Der mittlere Herzindex lag zu Beginn der Studie
bei 2,2 ± 0,1 l/min/m2, während der Schlagvolumenindex 30,6 ± 1,2 ml/m2 betrug. Im
gesamten Kollektiv zeigten sich im Gehalt des Plasmas, des in-vitro-Eluats und des
in-vivo-Eluats an Gesamtprotein, Albumin, IgG, IgM und IgA keine Unterschiede.
42
7.2. Funktionalitätstests der in-vitro-adsorbierten Antikörper an isolierten
Rattenkardiomyozyten
Um die Effekte des in-vitro-Eluats am Fluoreszenzmikroskop untersuchen zu können,
mussten funktionsfähige isolierte Rattenkardiomyozyten bereitgestellt werden. Bei der
Isolation aus einem Rattenherzen wurde eine Zellausbeute von 600.000 –900.000
Zellen erreicht, wobei höchst reine Herzmuskelfraktionen gewonnen wurden, so dass
störende Effekte anderer Zellen in der Kammer ausgeschlossen werden konnten. Pro
Kammer, in der ca. 1000 Zellen fixiert waren, wurde nur eine Zelle herausgesucht und
für die weiteren Messung verwendet. Wichtige Auswahlkriterien für eine zur Messung
geeignete Zelle waren: eine deutliche Querstreifung, möglichst gerade Zellgrenzen,
das heißt keine blasige oder granulierte Zellmembran und eine durchschnittliche
Länge von 70-120 µm. Weiterhin durfte die Zelle unstimmuliert keine spontanen
Kontraktionen zeigen.
Zu Beginn und zum Ende jeder Messreihe wurde durch Voruntersuchungen gezeigt,
dass die zu messenden Zellen ca. 10 Minuten konstant stimulierbar blieben, d.h. dass
weder Kalziumtransient noch Kontraktilität im Verlauf der 10 Minuten spontan zu- oder
abnahmen. Mit Hilfe des vorliegenden Isolationsprotokolls konnten genügend solcher
Zellen für die Messungen bereitgestellt werden.
Um die Zellen während der Messungen zu schonen bzw. um eventuellen
Schädigungen ( z.B. durch Bleicheffekte) der Zellen durch die Bestrahlung mit dem
Fluoreszenzlicht vorzubeugen, wurde zwischen den einzelnen Messintervallen das
Fluoreszenzlicht mit Hilfe mehrerer Shutter ausgeblendet.
Die Wirkung des in-vitro-Eluats auf isolierte Rattenkardiomyozyten wurde einerseits
mittels Messung des Kalziumtransienten (Differenz zwischen systolischem Kalzium
und diastolischem Kalziumgehalt der Zelle) und andererseits durch Messung der
Kontraktilität (Zellverkürzung) untersucht. Verwendet wurde hierzu eine online
Fluoreszenzmikroskopie welche die Änderungen des Kalziumgehaltes und der
Zelllänge registriert und aufzeichnet. Die isolierten Rattenkardiomyozyten wurden
zunächst feldstimuliert, und der Kalziumtransient und die systolische Zellverkürzung
nach Beladung mit einem Ca2+ -sensitiven Fluoreszenzfarbstoff (Fura-2-AM)
gemessen. Die basalen Messungen der Kontraktionsamplitude der isolierten
Rattenkardiomyozyten ergab eine mittlere Kontraktionsamplitude von 8,24 ± 0,5 %.
Die relative Fluoreszenzeinheiten (rfu) erfasst durch die Fura-2-AM-Fluoreszenz
43
zeigten bei der Messung des basalen Kalziumtransienten einen mittleren diastolischen
Wert von 31,3 ± 2,1rfu (Mittelwert ± STABW), welche in der systolischen Phase auf
einen Wert von 80,1 ± 4,8 rfu (Mittelwert ± STABW), anstiegen.
Die Registrierung des Kalziumtransienten sowie der Zellverkürzung erfolgte basal
sowie nach Superperfusion des in-vitro-Eluats aus Kontroll- und DCM-Patienten.
Das jeweilige in-vitro-Eluat wurde hierzu unmittelbar vor der Messung mit
Versuchspuffer so verdünnt, dass die Zellen stets mit einer IgG-Konzentration im
Eluat-Versuchspuffer-Gemisch von 300 mg/ l beschickt wurden. So konnte
sichergestellt werden, dass für jeden Patienten das Eluat in der gleichen
IgG-Konzentration gemessen wurde, um so die Ergebnisse der Patienten
untereinander vergleichen zu können. Die Effekte der Eluate stellten sich innerhalb
von 2 Minuten nach Superperfusion ein (Akut-Messung) und erreichten danach einen
steady state oder hatten im weiteren Verlauf der Messung eine so deletäre Wirkung
auf die Zellen, dass eine Hyperkontraktilität mit nachfolgender Zellschrumpfung und
völliger Unstimmulierbarkeit der Zellen beobachtet werden konnte. Die Messungen der
in-vitro-Eluate eines Patienten wurden immer an mehreren Tagen durchgeführt und
wiederholt, um Schwankungen in der Zellstabilität, Fluoreszenz, Anfärbbarkeit der
Zellen, Antikörperansprechbarkeit ausschließen und ausgleichen zu können.
Nachfolgend wurden die prozentuale Veränderungen der beiden Parameter zu den
entsprechenden Basalwerten der zu untersuchenden Kardiomyozyten bestimmt.
Der Einfluss der in vitro-Eluate aus Kontroll- und DCM-Patienten ergab die in
Abbildung 8 dargestellten Ergebnisse. Es zeigte sich ein statistisch signifikante
Reduktion des Kalziumtransienten in DCM-Patienten (Mittelwert ± STABW; 88.72 ±
2.641; n=29, studentischer t-Test, p=0.0001) im Vergleich zu Kontrollpatienten (99.15
± 0.9793; n=50). Ähnliche Ergebnisse fanden sich bei der Messung der zellulären
Kontraktilität in Gegenwart des in vitro-Eluats. Die zelluläre Kontraktilität wurde erfasst
durch digitale Messung der Zelllängenänderung. Diese ergab für DCM Patienten eine
mittlere Änderung der Kontraktilität im Vergleich zum Basalwert von (Mittelwert ±
STABW; 83.36 ± 2.672; n=29, studentischer T-test, p=0.000015, Abbildung 9) im
Vergleich zu Kontrollpatienten (95.27 ± 1.437; n=50).
44
B
150
Kontraktilität
[% des Ausgangswerte]
150
*
125
100
75
50
*
125
100
75
D
C
M
Ko
nt
ro
lle
D
n
C
M
-P
at
ie
nt
en
-P
at
ie
nt
en
50
Ko
nt
ro
lle
n
Kalziumtransient
[% des basalen Ausgangswertes]
A
Abbildung 9: Einfluss des in vitro-Eluats auf den Kalziumtransienten und die Kontraktilität von
Rattenmyozyten.
Untersucht wurde der Kalziumtransient mittels fluoreszenzmikroskopischer Erfassung des Farbstoffes
Fura-2-AM erfasst wurde der Einfluss im Vergleich zur basalen Kontraktilität der perfusions-naiven
Zellen (A). Zudem wurde der Einfluss auf die Kontraktilität der Rattenmyozyten mittels
Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. Dargestellt sind neben den Einzelwerten Mittelwerte und
Standardabweichung. * p< 0.05, studentischer T-Test.
Die nachfolgende Auswertung zeigten eine deutliche Korrelation der beiden
Parameter (Kalziumtransient und Kontraktilität) bei Behandlung der Rattenmyozyten
mit den in vitro-Eluaten der DCM-Patienten (Pearson r = 0,6648; 95%
Konfidenzintervall 0.3942 bis 0.8293; Pearson Korrelation p<0,001) und der
Kontrollpatienten (Pearson r = 0,5839; 95%-Konfidenzintervall 0.3648 bis 0.7418;
B
150
Kontrollpatienten
125
100
75
50
50
75
100
125
150
Kontraktilität
[% des basalen Ausgangswertes]
Kalziumtransient
[% des basalen Ausgangswertes]
A
Kalziumtransient
[% des basalen Ausgangswertes]
Pearson Korrelation p<0.001). Siehe hierzu auch Abbildung 10.
150
DCM-Patienten
125
100
75
50
25
50
75
100
125
150
Kontraktilität
[% des basalen Ausgangswertes]
Abbildung 10: Pearson-Korrelation zwischen Kalziumtransient und Kontraktilität.
Dargestellt ist die Beziehung zwischen den beiden Parametern in Kontrollpatienten (A) und
DCM-Patienten (B)
45
7.3. Einteilung des Patientenkollektives entsprechend des kardiodepressiven
Einflusses der in-vitro-Eluate
29 Patienten mit DCM
Screening der Antikörper
Kardiodepressive Gruppe
Nicht depressive Gruppe
(n=19)
(n=10)
Immunadsorption
mit subsequenter IgG-Gabe
(4 Cyclen)
Herzindex-Bestimmung und -Vergleich
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Gruppeneinteilung des
DCM-Patientenkollektivs.
Bei der Untersuchung des Einflusses der DCM-in vitro-Eluate auf die Kontraktilität und
den Kalziumtransienten fielen deutliche Unterschiede in der Beeinflussung der
Rattenkardiomyozyten auf, daher wurde das Patientenkollektiv nachfolgend wie in
Abbildung 11 dargestellt in Patienten mit kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten
und Patienten mit nicht kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluat unterteilt. Als
Grundlage dieser Gruppeneinteilung diente eine Reduktion des Kalziumtransienten
und der Kontraktilität um mindestens 10% im Vergleich zur basalen Messung. Sie ist
Grundlage nachfolgender klinischer Betrachtungen im Rahmen dieser Studie.
In der als kardiodepressiv charakterisierten Gruppe wurden auf diese Weise 19
Patienten zusammengefasst, welche im Mittel eine Reduktion des Kalziumtransienten
auf 81,9 ± 2,9 % (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p<0,001, Abbildung 12 A)
und eine Reduktion der Kontraktilität auf 76,8 ± 2,9 % (Mittelwert ± STABW;
Kruskal-Wallis-Test, p<0,001, Abbildung 12 B) der Ausgangskontraktilität aufwiesen.
In der ursprünglichen DCM Patientenkohorte findet sich demnach eine Subpopulation
(insgesamt 10 Patienten) welche im Vergleich zur Kontrollgruppe keinen signifikanten
46
Effekt
auf
den
Kalziumtransienten
Kruskal-Wallis-Test,
p>0,05)
oder
(Mittelwert ± STABW,
die
Kontraktilität
101,6 ± 2,54 %;
(Mittelwert ± STABW,
94,7 ± 9,27 %; Kruskal-Wallis-Test; p>0,05) aufweisen. Es scheint erwähnenswert,
dass unter Anwendung des 10%-Algorithmus zur Selektion auch bei der
Kontrollgruppe die in vitro-Eluate von 3 Individuen (6% der Kontrollpopulation) einen
signifikanten Effekt auf die Kontraktilität (80.40 ± 5.76 %) und den Kalziumtransienten
(74.65 ± 3.88 %) der rattenkardiomyozyten zeigten.
140
B
Kontraktilität
[% des Ausgangswerte]
n.s.
*
120
*
100
80
*
*
120
100
80
60
K
ar
di
od
N
ep
ic
re
ht
ss
-K
ar
iv
di
od
ep
re
ss
iv
K
on
tr
ol
le
-K
ar
di
o
de
pr
es
s
re
ss
i
od
ep
tr
ol
N
ic
ht
K
ar
di
K
on
n.s.
140
iv
v
60
le
Kalziumtransient
[% des Ausgangswertes]
A
Abbildung 12: Kalziumtransient und Kontraktilität gemessen mittels Fluoreszenzmikroskopie an
Rattekardionmyozyten nach Behandlung mit in vitro-Eluaten.
Einteilung der in vitro-Eluate anhand des Einflusses auf den Kalziumtransienten (A) und die
Kontraktilität ergab eine Subpopulation bei den DCM-Patienten, welche keine kardiodepressiven
Effekte aufwies. Darstellung der Mittelwerte und der SD, Kruskal-Wallis Test mit nachfolgender Post hoc
Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
7.4. Vergleich von Kardiodepressivität und klinischen Befunden
In nachfolgenden Analysen zum Einfluss der in vivo Immunadsorption auf die
klinischen Symptomatik zeigte sich unter Beibehaltung der in vitro-etablierten
Gruppeneinteilung
hämodynamischen
folgender
Einfluss
Parameter
auf
wurden
hämodynamische
mittels
Parameter.Die
Rechtsherzkatheter
(Swan-Ganz-Einwschwemmkatheter), vor der Immunadsorption (PräIA), nach der
ersten Immunadsorption (Post IA1) und nach der vierten Immunadsorption (Post IA4)
bestimmt. Die Betrachtung des Herzindex (ml/min/m2) in den wie in Abschnitt 6.3.2
47
definierten Subgruppen des DCM-Patientenkollektivs ergab das in Abbildung 13
dargestellte Bild.
Nicht-Kardiodepressive Subgruppe
5
5
4
4
Herzindex
(l/min/m 2 )
Herzindex
(l/min/m 2 )
Kardiodepressive Subgruppe
3
2
1
3
2
1
0
0
Prä IA
Post IA1
Post IA4
Prä IA
Post IA1
Post IA4
Abbildung 13: Darstellung des Verlaufs des Herzindex in dem DCM-PAtientenkollektiv vor und
nach Immunadsorption.
Die Messwerte der Patienten sind in den Abbildungen A und B als Punkte dargestellt die
Verbindungslinien zeigen den jeweiligen zeitlichen Verlauf an
Zusammenfassend zeigte sich, dass der Herzindex in der experimentell als
kardiodepressiv
identifizierten
Subgruppe
schon
nach
dem
1.
Immunadsorptionszyklus (Post IA1) im Mittel von 2,3 ± 0,1 l/min/m2 auf 2,9 ± 0,1
l/min/m2 (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p<0,001, Abbildung 14) zunahm.
Im weiteren Verlauf konnte nach dem vierten Immunadsorptionszyklus (post IA4) eine
Stabilisierung
des
Herzindex
nachgewiesen
werden
(2,98 ± 0,6
l/min/m²
(Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p<0,001, Abbildung 14).
Unter gleichen Bedingungen zeigte sich in der nicht-depressiven Subgruppe keine
signifikante Verbesserung des Herzindex: Vergleichend war der Herzindex im Mittel
während des ersten Immunadsorptionzyklus in dieser Subgruppe von 2,1 ± 0,1
l/min/m2 nur auf 2,3 ± 0,1 l/min/m2, (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p>0,05,
Abbildung 17) gestiegen. Auch nach dem 4. Immunadsorptionszyklus (post IA4) zeigte
sich in der nichtdepressiven Subgruppe.keine Verbesserung des Herzindex (post IA 4:
2,3 ± 0,37 l/min/m2, (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p>0,05, Abbildung 14).
Im Vergleich der beiden Subgruppen untereinander konnten wie in Abbildung 14
sichtbar signifikante Unterschiede der Verbesserung dieses hämodynamischen
Parameters nachgewiesen werden.
48
5
Kardiodepressiv
Nicht-Kardiodepressiv
*
Herzindex
(l/min/m 2 )
4
*
3
*
*
2
1
0
prä IA
post IA1
post IA4
Phase der Behandlung
Abbildung 14: Herzindex in den Subgruppen (Kardiodepressiv und Nicht Kardiodepressiv) vor
und nach unterschiedlichen Phasen der Immunadsorptionsbehandlung.
Dargestellt ist der mittlere Herzindex gemessen vor der ersten Immunadsorption (präIA) nach der ersten
Immunadsorption (post IA1) und nach der vierten Immunadsorption (postIA4). Verglichen werden die
Patienten der beiden Subgruppen. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichung;
Kruskal-Wallis Test mit nachfolgender Post hoc Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; *
p<0.05.
Zudem wurde die Veränderung des Schlagvolumenindex in den beiden Subgruppen
betrachtet. In Abbildung 15 ist der Verlauf des Schlagvolumenindex in den beiden
Patientengruppen für jedes Individuum dargestellt.
Nicht-Kardiodepressive Subgruppe
Kardiodepressive Subgruppe
80
Schlagvolumenindex
[ml/m 2]
Schlagvolumenindex
[ml/m 2]
80
60
40
20
0
60
40
20
0
Prä IA
Post IA1
Post IA4
Prä IA
Post IA1
Post IA4
Abbildung
15:
Darstellung
des
Verlaufs
des
Schlagvolumenindex
in
dem
DCM-Patientenkollektiv vor und nach Immunadsorption.
Die Messwerte der Patienten sind in den Abbildungen A und B als Punkte dargestellt die
Verbindungslinien zeigen den jeweiligen zeitlichen Verlauf an.
In einer detaillierteren Betrachtung zeigte sich bei der reinen Beurteilung der
Schlagvolumindeces kein signifikanter Einfluss auf den Schlagvolumenindex weder in
49
den Patienten der kardiodepressiven Subgruppe im Verlauf noch in der
nichtdepressiven Subgruppe im Verlauf.
So konnte in der kardiodepressiven Gruppe vor dem Beginn des ersten
Immunadsorptionszyklus (prä IA) ein Schlagvolumenindex im Mittel von 32,1 ± 5,0
ml/m2 gemessen werden. Nach dem ersten Immunadsorptionszyklus zeigte sich ein
nicht signifikanter Anstieg in dieser Subgruppe auf 40,5 ± 7,7 ml/m2 (Mittelwert ±
STABW;
Kruskal-Wallis-Test,
p>0,05,
Abbildung
16).
Nach
dem
vierten
Immunadsorptionszyklus (post IA 4) war der Schlagvolumenindex stabil bei 41,1 ± 9,0
ml/m2 (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p>0,05, Abbildung 16). im Vergleich
zur Messung nach dem ersten Immunadsorptionszyklus
Schlagvolumenindex
(ml/m 2 )
Kardiodepressiv
Nicht-Kardiodepressiv
60
*
40
20
0
prä IA
post IA1
post IA4
Phase der Behandlung
Abbildung 16: Schlagvolumindex in den Subgruppen (Kardiodepressiv und Nicht
Kardiodepressiv) vor und nach unterschiedlichen Phasen der Immunadsorptionsbehandlung.
Dargestellt ist der mittlere Schlagvolumindex gemessen vor der ersten Immunadsorption (präIA) nach
der ersten Immunadsorption (post IA1) und nach der vierten Immunadsorption (postIA4). Verglichen
werden die Patienten der beiden Subgruppen. In dieser Darstellungsweise ist aufgrund der Varianz der
patientenbezogenen Basiswerte nur die postIA4-Messung in den Subgruppen signifikant
unterschiedlich. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichung; Kruskal-Wallis Test mit
nachfolgender Post hoc Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
In der nichtdepressiven Subgruppenanalyse des Schlagvolumenindex konnte im
Verlauf des ersten Immunadsoprtionszyklus kein signifikante Verbesserung der reinen
Schlagvolumenindexmessungen nachgewiesen werden: von inital im Mittel (prä IA1)
27,7 ± 8,0 ml/m2 war nach dem ersten Zyklus ein Anstieg auf 31,5 ± 10,0ml/m2
(Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p>0,05, Abbildung 16) nachzuweisen.
Nach dem vierten Immunadsorptionszyklus blieben die Werte dieses Parameters
ebenfalls
im
Mittel
stabil
bei
30,5 ± 9,8ml/m2
(Mittelwert ±
STABW;
50
Kruskal-Wallis-Test,
p>0,05,
Abbildung
16).
Einzig
im
Vergleich
des
Schlagvolumenindex der kardiodepressiven Subgruppe und der nicht depressiven
Subgruppe
bezüglich
der
abschliessenden
Messung
nach
dem
4.
Immundadsorptionszyklus zeigte sich ein signifikanter Unterschied: 41,1 ± 9,0 ml/m2
*
5
5
0
N
ic
N
ic
K
ar
di
od
ep
re
ht
ss
K
ar
iv
di
od
ep
re
ss
iv
0
*
10
od
ep
re
ss
ar
iv
di
od
ep
re
ss
iv
10
15
ht
K
Differenz des Schlagvolumenindex
[Schlagvolumenindex postIA4-präIA1]
15
K
ar
di
Differenz des Schlagvolumenindex
[Schlagvolumenindex postIA-präIA1]
zu 30,5 ± 9,8ml/m2 (Mittelwert ± STABW; Kruskal-Wallis-Test, p<0,05, Abbildung 16).
Abbildung 17: Differenz des Schlagvolumenindex in den Subgruppen (Kardiodepressiv und
Nicht Kardiodepressiv) nach dem ersten Immunadsorptionszyklus (Abbildung A) und nach dem
vierten Immunadsorptionszyklus (Abbildung B)
Dargestellt ist die mittlere Differenz des Schlagvolumenindex nach dem ersten Zyklus Immunadsorption
(Schlagvolumeninmdex postIA1 - Schlagvolumenindex präIA1) und nach der vierten Immunadsorption
(Schlagvolumenindex post IA4 – Schlagvolumenindex präIA1) Verglichen werden die Patienten der
beiden Subgruppen. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichung; * p<0.05, studentischer
t- test.
Aufgrund der Varianz der initialen Schlagvolumenindeces und somit nicht signifikanten
Veränderungen im Verlauf wurden die Differenzen des Schlagvolumenindex nach dem
ersten Immunadsorptionszyklus und nach dem vierten Immundasorptionszyklus in
Bezug auf die Ausgangsmessung bestimmt. Hierbei konnten deutliche Unterschiede in
den Subgruppenanalyse festgestellt werden. In der Abbildung 17A zeigt sich deutlich
ein statistisch signifikanter Anstieg der Schlagvolumenindexdifferenz im Mittel nach
dem
ersten
Immunadsorptionszyklus
der
kardiodepressiven
DCM-Patienten
(Mittelwert ± STABW; 8.4 ± 5.1; n=19, studentischer t-Test, p<0.05) im Vergleich zur
Differenz des Schlagvolumenindex der nicht kardiodepressiven Subgruppe (Mittelwert
± STABW;3,8 ± 3.2; n=10). Ähnliche Ergebnisse fanden sich bei der Bestimmung der
51
Schlagvolumenindexdifferenz am Ende der Therapie (post IA4 –präIA1) in beiden
Subgruppen, wie in Abbildung 17B dargestellt: Auch hier zeigt sich ein signifikanter
Anstieg der Differenz des Schlagvolumenindex in der kardiodepressiven Subgruppe
(Mittelwert ± STABW; 8.9 ± 7.6; n=19, studentischer t-Test, p<0.05) im Vergleich zur
Differenz des Schlagvolumenindex der nicht kardiodepressiven Subgruppe (Mittelwert
± STABW: 2,8 ± 3.5; n=10).
7.5. Pharmakologische Beeinflussung des kardiodepressiven Effektes
Mit dem Nachweis der kardiodepressiven Effekte des in vitro-Eluats und der damit
verbundenen Prädiktion des klinischen Effektes der Immunadsorption sollte in
weiteren Untersuchungen die Frage der pharmakologischen Beeinflussbarkeit
untersucht werden: Eine wichtiger Ansatzpunkt in Kardiomyozyten ist einerseits das
adrenerge
System,
welches
über
einen
Protein
G-gekoppelten
Signaltransduktionsweg Inotropieänderungen vermittelt, andererseits ist unter
anderem auch das muskarinerge System ebenfalls an der Beeinflussung der
Myozytenaktivität beteiligt. Bei bestehender Möglichkeit, dass der kardiodepressive
Effekt des in vitro Eluats über einen Rezeptor vermittelt sein könnte, muesste nach
pharmakologischer Blockierung dieses spezifischen Rezeptors der isolierten
Rattenkardiomyocyten die kardiodepressive Wirkung des Patienten-in vitro-Eluats
nicht auftreten.
Abbildung 18: Schematische Darstellung des G-Protein gekoppelten Signalwegs der
Adrenorezeptoren.
52
Ziel der folgenden Untersuchungen ist es diese mögliche Beeinflussung der
rezeptorvermittelten
Wirkung
des
in
vitro-Eluats
nachzuweisen.
In
diesem
Zusammenhang kann wie in Abbildung 18 schematisch dargestellt eine Beeinflussung
des Protein G gekoppelten Signaltransduktionsweges mit fuer die Wirkung des
Patienten in vitro Eluats möglich sein. Genauso wurde auch eine mögliche
muskarinerge Beeinflussung untersucht.
7.5.1. Einfluss von Metoprolol auf die kardiodepressive Wirkung des in
vitro-Eluats
Nach Wallukat et Wollenberger (1987) lässt sich im Serum von DCM-Patienten ein
β1-agonistisch wirkender Autoantikörper nachweisen, dessen Wirkung durch
ß-Blocker pharmakologisch antagonisiert werden kann. Bei vorhergehenden Studien
zur Immunadsorption konnte ein starker Abfall der im Serum enthaltenen
ß1-Autoantikörper während der Therapie festgestellt werden (Staudt et al.1998). In
Anlehnung an diese vorhergehenden Untersuchungen wurde der Status des
ß1-Autoantikörpers bei allen DCM-Patienten der vorliegenden Studie bestimmt. In der
kardiodepressiven
Gruppe
(n=19)
hatten
7
Patienten
einen
positiven
ß1-Autoantikörpernachweis, während in der nicht-kardiodepressiven Gruppe nur zwei
Patienten ein positives Testergebnis aufwiesen.
Es stellte sich die Frage, ob unabhängig von den oben beschriebenen
β1-Autoantikörpern, β-agonistische Effekte in Kardiomyozyten in Gegenwart des
kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluats beobachtet werden könnten. Verwendet
wurden daher in den weiteren Analysen in vitro-Eluate von Patienten mit negativem
β1-Autoantikörper Status. Untersucht wurde der Einfluss des β1-selektiven
Adrenorezeptorblockers Metoprolol auf die Veränderung des Kalziumtransienten und
die Kontraktilität von isolierten Rattenkardiomyozyten.
53
Veränderung des Kalziumtransient
[% der basalen Aktivität -100%]
Patient 1
-
Patient 2
+
-
+
Patient 3
-
+ Metoprolol [10µM]
0
-5
-10
-15
-20
Abbildung 19: Einfluss des β1-Adrenorezeptorblockers Metoprolol auf den Kalziumtransienten
in isolierten Rattenkardiomyozyten.
Untersucht wurden in vitro-Eluate von DCM-Patienten der kardiodepressiven Subgruppe mit negativem
β1-Autoantikörperstatus. Gemessen wurde der Kalziumtransient mittels Fluoreszenzmikroskopischen
Nachweis von Fura-2-AM. Dargesteltt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung SD von
mindestens 5 Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis Test mit nachfolgender Post hoc
Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
Wie in Abbildung 19 dargestellt fand sich keinerlei Einfluss auf die mittlere Änderung
des Kalziumtransienten in den Rattenmyozyten bei Verwendung des in vitro-Eluats der
drei untersuchten Patienten. Bei Verwendung des in vitro-Eluats von Patient 1 zeigte
sich
eine
mittlere
Änderung
des
Kalziumtransienten
von
-10.88 ± 5.916
(Mittelwert ± STABW) auf -11.04 ± 3.587 in Gegenwart von 10µM Metoprolol
(Abbildung 18). In ähnlicher Wiese fand sich auch kein signifikanter Einfluss in Patient
2 (Mittelwert der Änderung des Kalziumtransienten ± STABW; ohne Metoprolol
-13.74 ± 5.447 mit Metoprolol -14.74 ± 2.406; Kruskal-Wallis-Test, p>0.05) oder
Patient 3 (Mittelwert der Änderung des Kalziumtransienten ± STABW; ohne Metoprolol
-14.52 ± 5.084 mit Metoprolol -13.99 ± 5.520; Kruskal-Wallis-Test, p>0.05).
In ähnlicher Weise blieb auch die Kontraktilität in Gegenwart des β1-selektiven
Adrenorezeptorblockers unbeeinflusst (Abbildung 20). So fand sich bei Verwendung
des in vitro-Eluats von Patient 1zwar eine kardiodepressive Wirkung im Vergleich zur
basalen Kontraktilität der Rattenkardiomyozyten (Mittelwert der Änderung der
Kontraktilität ± STABW; ohne Metoprolol -14.47 ± 4.87) es fand sich jedoch kein
Einfluss durch den Adrenorezeptorblocker (-16.71 ± 8.74). In ähnlicher Weise fand
sich kein Einfluss auf bei Patient 2 (ohne Metoprolol -18.17 ± 6.284; mit Metoprolol
54
-19.98 ± 6.86) oder Patient 3 (ohne Metoprolol -20.19 ± 8.607 mit Metoprolol
-22.94 ± 7.725).
Veränderung der Kontraktilität
[% der basalen Aktivität -100%]
Patient 1
-
+
Patient 2
-
+
Patient 3
-
+ Metoprolol [10µM]
0
-10
-20
-30
Abbildung 20: Einfluss des β1-Adrenorezeptorblockers Metoprolol auf die Kontraktilität
isolierter Rattenkardiomyozyten.
Untersucht wurden in vitro-Eluate von DCM-Patienten der kardioderpessiven Subgruppe mit negativem
β1-Autoantikörperstatus. Gemessen wurde die Kontraktilität mittels Fluoreszenzmikroskopie-basierter
Bestimmung der Zelllänge. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung (SD) von
mindestens 5 Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender Post hoc
Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
7.5.2. Einfluss des Parasympatholytikums Atropin auf die kardiodepressive
Wirkung des in vitro-Eluats
Fu et al. (1998) konnten nachweisen, dass bei DCM-Patienten vorkommende
muskarinerge Autoantikörper durch Atropin antagonisiert werden können. Falls die
kardiodepressiven Effekte der in-vitro-Eluate, die aus der kardiodepressiven Gruppe
stammen, durch die Zugabe/ Anwesenheit von Atropin aufgehoben werden könnten,
könnte man annehmen, dass dieser depressiv wirkende Effekt über den
muskarinergen Rezeptor gesteuert wird. Untersucht wurde zunächst der Einfluss von
kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten auf den Kalziumtransienten isolierter
Rattenkardiomyozyten in Gegenwart des Parasympatholytikums. Wie in Abbildung 21
dargestellt zeigte sich kein signifikanter Effekt von 30µM Atropin auf die gemessene
Änderung des Kalziumtransienten in den 3 untersuchten Patienten. Es scheint
erwähnenswert, dass auch bei dieser experimentellen Studie nur Patienten verwendet
wurden, welche einen negativen β1-Autoantikörperstatus aufwiesen.
55
Bei Verwendung des in vitro-Eluats von Patient 1 zeigte sich eine mittlere Änderung
des
Kalziumtransienten
von
-10.88 ± 5.916
(Mittelwert
der
Änderung
des
Kalziumtransienten ± STABW) auf -12.24 ± 7.376 in Gegenwart von 30µM Atropin
(Abbildung 21). Zudem fand sich auch kein signifikanter Einfluss in Patient 2
(Mittelwert
der
Änderung
des
Kalziumtransienten ± STABW;
mit
Atropin
-13.60 ± 8.044; Kruskal-Wallis-Test, p>0.05) oder Patient 3 (Mittelwert der Änderung
des Kalziumtransienten ± STABW; mit Atropin -10.97 ± 2.342; Kruskal-Wallis-Test,
Veränderung des Kalziumtransient
[% der basalen Aktivität -100%]
p>0.05).
Patient 1
-
+
Patient 2
-
+
Patient 3
-
+ Atropin [30µM]
0
-5
-10
-15
-20
-25
Abbildung 21: Einfluss von Atropin auf die Änderung des Kalziumtransienten in
Rattenkardiomyozyten.
Untersucht wurde der Einfluss von kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten von 3 unterschiedlichen
Patienten mit verglichen wurden die Effekte in Gegenwart von Atropin im Vergleich zu den Effekten
ohne Medikament. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung (SD) von mindestens 5
Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender Post hoc Analyse
mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
Auch die Untersuchung des Einflusses des Parasympatholytikums Atropin auf die
kardioderpessiven Effekte gemessen an der Kontraktilität der behandelten
RAttenkardiomyozyten zeigte keinen statistiasch signifikanten Einfluss. Tatsächlich
variierte die Kontraktilität in Gegenwart von Atropin nicht signifikant im Vergleich zu
den jeweiligen Kontrollen (Abbildung 22). Patient 1 zeigte einen Mittelwert der
Änderung der Kontraktilität in Gegenwart von Atropin von -17.19 ± 10.19 (Mittelwert
± STABW), während Patient 2 und Patient 3 Mittelwerte von 16.67 ± 7.64 bzw.
-16.57 ± 3.371 aufwiesen.
56
Veränderung der Kontraktilität
[% der basalen Aktivität -100%]
Patient 1
-
Patient 2
+
-
+
Patient 3
+ Atropin [30µM]
-
0
-5
-10
-15
-20
-25
Abbildung 22: Einfluss von Atropin auf die Änderung der Kontraktilität in
Rattenkardiomyozyten.
Untersucht wurde der Einfluss von kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten von 3 unterschiedlichen
Patienten mit verglichen wurden die Effekte in Gegenwart von Atropin im Vergleich zu den Effekten
ohne Medikament. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung (SD) von mindestens 5
Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender Post hoc Analyse
mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
7.5.3. Einfluss von Bromo-cAMP auf die kardiodepressive Wirkung des in
vitro-Eluats
Durch einen intrazellulären Überschuß an cAMP, der in unserer Versuchsreihe durch
eine 20 minütige Vorinkubation der Zellen mit Bromo-cAMP (250µmol/l) erreicht
wurde, kann der Signaltransduktionsweg, falls er über eine Blockierung der
Adenylatzyklase
gehemmt
wird,
ungestört
weiterlaufen.
Somit
müsste
das
in-vitro-Eluat, wenn es seine kardiodepressiven Effekte über die Blockierung der
Adenylatzyklase bzw. der Umwandlung von ATP in cAMP erreicht, keine oder nur
schwache Wirkung zeigen.
In unseren Tests wurde der kardiodepressive Effekt auf Kontraktilität und
Kalziumtransient der in-vitro-Eluate durch die Anwesenheit und kontinuierliche Zugabe
von Bromo-cAMP nicht verändert, wie in Abbildung 22 dargestellt fand sich kein
signikanter Effekt auf die Wirkung der untersuchten kardiodepressiven in vitro-Eluate
auf den Kalziumtransienten der untersuchten Rattenkardiomyozyten. Bei Patient 1 war
der Kalziumtransient um 10,15 ± 1,56% (Mittelwert ± STABW) vermindert. Ähnliche
Ergebnisse
fanden
sich
bei
Patient
2
(Mittelwert
der
Änderung
des
Kalziumtransienten ± STABW; mit Bromo-cAMP -15,69 ± 6.06; Kruskal-Wallis-Test,
57
p>0.05) und Patient 3 (Mittelwert der Änderung des Kalziumtransienten ± STABW; mit
Veränderung des Kalziumtransient
[% der basalen Aktivität -100%]
Bromo-cAMP -11,97 ± 3.472; Kruskal-Wallis-Test, p>0.05).
Patient 1
-
+
Patient 2
-
Patient 3
+
-
+ Bromo-cAMP
0
-5
-10
-15
-20
Abbildung 23: Einfluss von BromocAMP auf den Kalziumtransienten in Rattenkardiomyozyten
Untersucht wurde der Einfluss von kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten von 3 unterschiedlichen
Patienten. Verglichen wurden die Effekte in Gegenwart von Bromo-cAMP im Vergleich zu den Effekten
ohne Medikament. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung (SD) von mindestens 5
Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender Posthoc Analyse
mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
Veränderung der Kontraktilität
[% der basalen Aktivität -100%]
Patient 1
-
+
Patient 2
-
+
Patient 3
-
+
Bromo-cAMP
0
-5
-10
-15
-20
-25
Abbildung 24: Einfluss von Bromo-cAMP auf die Kontraktilität von Rattenkardiomyozyten in
Gegenwart von kardiodepressiv wirkenden in vitro Eluaten
Untersucht wurde der Einfluss von kardiodepressiv wirkenden in vitro-Eluaten von 3 unterschiedlichen
Patienten auf die Zelllänge von Rattenkardiomyozyten in Gegenwart von Bromo-cAMP im Vergleich zu
den Effekten ohne Medikament. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichung (SD) von
mindestens 5 Messungen an unterschiedlichen Tagen. Kruskal-Wallis-Test mit nachfolgender Post hoc
Analyse mittels Dunn’s multiple comparison test; * p<0.05.
58
In ähnlicher Weise fand sich auch kein Einfluss der 20 minütigen Präinkubation mit
Bromo-cAMP auf den kardiodepressiven Effekt des in vitro-Eluats von Patient 1
(Mittelwert der Änderung der Kontraktilität ± STABW, -9,99 ± 13.35), Patient 2
(Mittelwert der Änderung der Kontraktilität ± STABW, -20.90 ± 1,55) und Patient 3
(Mittelwert der Änderung der Kontraktilität ± STABW, -19,56 ± 6.47) gemessen an der
Kontraktilität der Rattenmyozyten.
59
8. Diskussion
8.1. Kardiodepressive Faktoren bei der Immunadsorption bzw. bei der in
vitro-Adsorption
Die Dilatative Kardiomyopathie ist gekennzeichnet durch eine Dilatation und
Kontraktilitätsstörung des linken oder beider Ventrikel (Richardson et al. 1996, Maron
et al. 2006). Für die bedeutsame Gruppe von Patienten, die unter den Symptomen der
Herzinsuffizienz bei der DCM in unterschiedlicher Ausprägung leiden, gibt es zur Zeit
neben den medikamentös-konservativen Behandlungsmöglichkeiten bei teilweise
mehrjähriger Progredienz der Erkrankung keine befriedigenden Alternativen.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Methoden zur Eingrenzung dieser in ihrem
klinischen Bild doch sehr breit gefächerten Erkrankung getestet (Horn et al. 2006, Kuhl
et al, 2005, Liu et al. 2001). Neben unter anderem immunsupressiven bzw.
virostatischen Therapieformen (Schultheiss et al. 1998, Magnani, 2006, Matsumori et
al. 2010, Yoshikawa et al. 2009) kamen auch immunmodulatorische Verfahren wie die
Immunadsorption zum Einsatz. Dabei konnte durch die Immunadsorption mit
nachfolgender Immunglobulin-G-Substitution bei der DCM hämodynamische und
klinische Verbesserungen der Herzinsuffizienzsymptomatik erzielt werden (Felix et al.
2000, Felix et al. 2002, Trimpert et al. 2010).
Die zugrundeliegenden Mechanismen des Therapie-Erfolgs der Immunadsorption bei
der DCM wurden bisher schon ansatzweise eingegrenzt, jedoch bislang noch nicht
befriedigend aufgeklärt. Gerade weil die Immunadsorption ein sehr kostspieliges
invasives
Verfahren
darstellt,
müssen
mögliche
Wirkungsmechanismen
der
Immunadsorpion, die für die akute und längerfristige hämodynamische Verbesserung
verantwortlich sind, aufgedeckt werden. Der hohe zeitliche, personelle und finanzielle
Aufwand der Immunadsorption sollte deshalb einem gleichwertigen Nutzen, das heißt
einer Verbesserung der Patientensymptomatik, gegenüberstehen.
Die Entwicklung eines experimentiellen Testverfahrens auf der Grundlage der
bisherigen Forschungsergebnisse wurde deshalb dringend notwendig, um die Anzahl
der Therapieversager so gering wie möglich zu halten (Staudt et al. 2004, Staudt et al.
2010).
Diese Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der in-vitro-Adsorption, die der
Immunadsorption
in
vivo
nachempfunden
wurde
und
der
experimentellen
60
Untersuchung
der
dabei
gewonnenen
in-vitro-Eluate
an
isolierten
Rattenkardiomyozyten. Im Zentrum der Beobachtung stand hier der Einfluss des
Eluats auf den intrazellulären Kalziumstoffwechsel (d.h. auf die systolischen und
diastolischen Kalziumveränderungen und auf die Kontraktilität der Kardiomyozyten.
Zur Messung der intrazellulären Kalziumspiegel wurde die Fluoreszenzmikrokopie
eingesetzt. Im Gegensatz zur konfokalen Mikroskopie, die sich eines Lasers als
Strahlenquelle bedient (Williams, 1993, Felix et al. 2002) und dadurch während der
Messung direkt schädigend auf die Zelle bzw. die Stabilität der isolierten Zellen wirkt,
konnte mit der Fluoreszenzmikroskopie (IonOptix-System) eine Methode gefunden
werden, deren negative Einflüsse (Bleicheffekte unter anderem) auf die zu
untersuchenden isolierten Rattenkardiomyozyten vernachlässigbar klein sind.
In Kombination mit Fura-2AM,einem Kalzium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, konnten
die
intrazellulären
Rattenkardiomyozyten
Kalziumveränderungen
detektiert
werden,
um
der
später
feldstimmulierten
mit
Hilfe
des
Ion-Optix-Analyze-Programms in Verbindung mit den parallel dazu ablaufenden
Kontraktionen ausgewertet zu werden.
Die negative Beeinflussung des zytosolischen Kalziumgehalts bzw. der Kontraktilität
der Kardiomyozyten bei Superperfusion mit in-vitro-Eluat der DCM-Patienten der
kardiodepressiven Gruppe stand im Gegensatz zu den Effekten der nichtdepressiven
Gruppe und der Kontrollgruppe, die kaum Einfluss besaßen. Alle in-vitro-Eluate
wurden in einer IgG-Konzentration von 300 mg/l gemessen. Zur Verdünnung wurde
Versuchspuffer verwendet. Bei der Betrachtung der systolischen und diastolischen
Kalziumfluoreszenz
vornehmlich
die
zeigte
sich,
systolische
dass
die
kardiodepressiven
Kalziumkonzentration
reduzierten,
in-vitro-Eluate
während
die
diastolische Kalziumkonzentration unbeeinflusst blieb. Die kardiodepressiven Effekte
setzten akut nach der Superperfusion ein (Schultheiss et al. 1988, Schulze et al.
1990).
Die Frage nach der chemischen Natur des Faktors oder der Faktoren, die diese
kardiodepressiven Effekte verursachen, während die Eluate anderer Patienten mit der
gleichen Erkrankung keine Effekte erzielen, verlangt nach einer Klärung durch nähere
Klassifikation der möglichen Faktoren.
Die Immunadsorption bzw. in-vitro-Adsorption arbeitet schon auf dem Prinzip der
spezifischen Elimination von Antikörpern aus dem Plasma der Patienten. Um die
61
These zu untermauern, dass es sich bei den kardiodepressiven Faktoren um
Antikörper handelt, wurden Versuche mit in-vivo-Eluat und Protein A durchgeführt.
Protein A ist ein Zellbestandteil des Staphylokokkus aureus, der relativ spezifisch
Immunglobuline vom Typ des IgG bindet (Lindemann et al. 1983, Bygren et al. 1985,
Palmer et al. 1988, Bulut et al. 2010). Die mit Protein A eluierten Immunglobuline
zeigten auch kardiodepressive Effekte, so dass man davon ausgehen kann, dass es
sich um zirkulierende Antikörper handelt, die bei der Adsorption entzogen werden.
Untersuchungen des Plasmas vor und nach Immunadsorption zeigten, dass sich der
Plasmaspiegel der Immunglobuline auf 20% des Ausgangsniveaus senkte (Felix et al.
2000, Trimpert et al. 2010). In vivo-Untersuchungen zur Ig-Therasorb-Säule zeigten
Absenkungen des IgG auf 3%, IgA und IgM auf ca. 30% des Ausgangswertes
(Müller-Derlich et al. 1993, Trimpert et al. 2010, Bulut et al. 2010). Natürlich kann nicht
ausgeschlossen werden, dass eine Reihe von Nichtimmunglobulinen unspezifisch bei
der Adsorption entzogen werden. Weitere
Differenzierungen zur Charakterisierung der kardiodepressiven Bestandteile im
in-vitro-Eluat der DCM-Patienten waren angezeigt (Chen et al. 2006).
Nach der in-vitro-Adsorption wurde das Eluat mit einer 100 KDa-Dialysemembran
dialysiert. Der im Dialysat befindliche Anteil des Eluats zeigte die oben beschriebenen
Effekte, so dass man davon ausgehen kann, dass zum einen die kardiodepressiven
Faktoren ein
Molekulargewicht
>100
KDa
haben,
und
zum
anderen die
Kardiomyozyten nicht durch mögliche bei der Adsorption unspezifisch entfernte
herzwirksame Pharmaka, wie zum Beispiel Amiodaron, in ihrer Funktion beeinträchtigt
werden,
was
einen
kardiodepressiven
Effekt
vortäuschen
könnte.
Das
Molekulargewicht dieser Medikamente liegt in der Größenordnung zwischen
0,1-1KDa. Durch die Dialyse gegen Versuchspuffer konnte auch ausgeschlossen
werden, dass die Effekte durch mögliche Elektrolytverschiebungen zustande kamen.
Die Aktivierung von Komplement führt über eine Formierung lytischer Komplexe zur
Zytolyse bzw. Schädigung von Zellen. Um eine mögliche Beteiligung von Komplement
bei den Experimenten auszuschließen, wurde das in-vitro-Eluat zur Inaktivierung der
Komplementfaktoren nach der Dialyse 30 Minuten im Wasserbad bei 56°C erhitzt.
Marker der Immunantwort bei der Herzinsuffizienz unterschiedlicher Ätiologie, auch
der
DCM,
sind
Zytokine.
Konzentrationserhöhungen
des
62
Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-alphas wurden zum Beispiel bei Patienten mit DCM
nachgewiesen (Matsumori et al. 1994, Ahmad et al. 2010)
Auch Korrelationen zwischen den Zytokinkonzentrationen und dem klinischen
Schweregrad der Herzinsuffizienz wurden festgestellt (Torre-Amione et al. 1996, Hein
et al. 2009). Speziell für TNF-α zeigte sich ein kardiodepressiver Effekt auf isolierten
Rattenkardiomyozyten, assoziert mit einem Abfall des Kalziumtransienten (Yokoyama
et al. 1993, Golghaber et al. 1996, Li et al. 2003, Duncan et al. 2007).
Bei der wiederholten Infusion von TNF-α kam es in vivo zur Abnahme der Kontraktilität
und Ausbildung einer DCM (Hegewish et al. 1990, Pagani et al. 1992, Awad et al.
2010).
Die Zytokinkonzentrationbestimmung im Eluat lagen unter der Nachweisgrenze, und
auch bei Untersuchungen des Plasmas vor und nach der Immunadsorption konnten
keine signifikanten Unterschiede der Zytokinkonzentration gemessen werden. Bei der
Immunadsorption wie auch bei der in-vitro-Adsorption werden kaum Zytokine
entzogen und kommen somit als ursächliche Faktoren für den kardiodepressiven
Effekt in der so benannten Gruppe nicht in Frage (Felix et al. 2000).
8.2. Kardiotrope Autoantikörper bei der DCM
Verschiedene
kardiotrope
Autoantikörper
bei
der
DCM
konnten
bisher
wissenschaftlich nachgewiesen werden. Ihre pathophysiologische Bedeutung ist
jedoch noch nicht eindeutig geklärt: So können sie eine aktive Rolle in der Initiation
oder Progression der DCM besitzen oder aber aber als entzündliche Reaktion auf den
Zelluntergang gebildet werden und nur ein Epiphänomen darstellen. Gegen die zweite
Aussage spricht, dass einige Untersuchungen schon zeigten, dass sich eine DCM
aufgrund der Induktion solcher Autoantikörper (Matsui et al. 1997; Liao et al. 1995 –
siehe hierzu auch Kapitel 8.3) entwickelte bzw. eine Elimination der Antikörper zu einer
Verbesserung der Krankheitssymptome führte (Felix et a. 2002, Trimpert et al. 2010).
Auch die funktionelle Beeinflussung von Kardiomyozyten durch verschiedene
Autoantikörper bei der DCM konnte nachgewiesen werden:
8.2.1. ß1-Autoantikörper
ß1-Autoantikörper, die bei der DCM vorkommen, zeigen einen positiven chronotropen
Effekt, der sich durch zugegebene Beta-Rezeptorenblocker und speziell ß1-Blocker
63
antagonisieren läßt (Wallukat et Wollenberger, 1987, Carforio et al. 1992, Jahns et al.
2004, Matsui et al. 2006, Liu et al. 2008, Miao et al. 2006, Chen et al. 2006).
In einer vorausgehenden Studie zur Immunadsorption bei der DCM wurde der
ß1-Autoantikörper
schon
als
Marker
für
die
Effizienz
des
Entzugs
von
Immunglobulinen verwendet. So fiel der ß1-Autoantikörpertiter auf ca. 8% des
Ausgangsniveaus (Felix et al. 2000). Bei allen Patienten dieser Studie wurde deshalb
eine ß1-Autoantikörper-Bestimmung im Serum vor der Immunadsorption durchgeführt,
jedoch waren von insgesamt 29 Patienten nur neun Patienten ß1-Antikörper-positiv. In
der kardiodepressiven Gruppe waren sieben Patienten positiv. Somit ist nicht
vollständig auszuschließen, dass im in-vito-Eluat vorhandene ß1-Autoantikörper eine
mögliche Bedeutung beim Auftreten des kardiodepressiven Effekts haben. Deshalb
wurde in Versuchen zu dieser Arbeit die Wirkung des in-vitro-Eluats unter
Anwesenheit
von
Metoprolol
getestet.
Es
zeigte
sich
jedoch
keine
Wirkungsabschwächung bzw. –verstärkung des kardiodepressiven Effekts, so dass
eine Zuweisung des akuten kardiodepressiven Effekts weitgehend ausgeschlossen
werden kann (Mobini et al, 2003, Matsui et al. 2006).
8.2.2. Autoantikörper gegen den muskarinergen (M2) Rezeptor
Ein weiterer Autoantikörper hinsichtlich der Bedeutung für die in-vitro-Eluat-Wirkung in
der kardiodepressiven Gruppe ist der von Fu et al. beschriebene muskarinerge (M2)
Autoantikörper bei der DCM. Dieser zeigt einen negativ chronotropen Effekt an
neonatalen Rattenkardiomyozyten, der durch Zugabe von Atropin aufgehoben werden
kann (Fu et al. 1993; Wallukat et al. 1999, Matsui et al. 1997). In vivo Untersuchungen
zum Einfluss des muskarinergen Rezeptors bewiesen eine Abnahme des systolischen
Ventrikeldrucks unter M2-Autoantikörpern (Wang et al. 1996, Baba, 2008 ). Durch die
Blockade des muskarinergen Rezeptors durch Atropin in unseren Versuchen konnte
der kardiodepressive Effekt der in-vitro-Eluate der DCM-Patienten nicht beeinflusst
werden, so dass seine Bedeutung im Rahmen der Immunadsorption eher gering
eingeschätzt werden sollte.
8.2.3. Autoantikörper gegen das ADP/ATP-Translokatorprotein
Schließlich kann es zu einer Beeinträchtigung der Funktion der Kardiomyozyten durch
einen Autoantikörper kommen, der gegen das ADP/ATP-Translokatorprotein des
64
Mitochondriums gerichtet ist (Baba et al. 2002, Baba, 2008). Dieser Autoantikörper
zeigt Kreuzreaktionen mit dem L-Typ-Kalziumkanal der Zellmembran (Schultheiss et
al. 1988) und besitzt zytotoxische Wirkung auf isolierte Rattenkardiomyozyten (Kühl et
al. 1991),was sich folgendermaßen ereignet: Nach Zugabe dieser Autoantikörper
kommt es zum Anstieg der Kontraktionsgeschwindigkeit und zu einer deutlichen
Arhythmie der Kontraktionen, bis an den Zellen Granulationen und Blasen gebildet
werden und das Kontraktionsvermögen der Zellen bis zur Kontraktionslosigkeit
abnimmt bzw. die Zellen zugrunde gehen (15-30 Minuten nach Zugabe). Weiter
Untersuchungen
verdeutlichten,
dass
ein
erhöhter
Kalziuminflux
via
L-Typ-Kalziumkanal durch die Beeinflussung des Öffnungsmechanismus durch die
Autoantikörper bedingt sind. Da die cAMP-abhängige Phosphorilierung des
L-Typ-Kalziumkanals seine Öffnungswahrscheinlichkeit und die durchschnittliche
Öffnungsdauer erhöht, setzten wir in unseren Versuchen Bromo-cAMP ein, um einen
Überschuss an cAMP in der Zelle zu erzielen. Die so modulierten Zellen hätten nun,
falls die Autoantikörper maßgeblich am kardiodepressiven Effekt des in-vitro-Eluats
beteiligt sind, nicht oder nur schwach auf das in-vitro-Eluat reagieren müssen.
Trotzdem zeigte sich der kardiodepressive Effekt in unseren Versuchen. Eine
ausschlaggebende Beteiligung dieses Autoantikörpers an den Effekten ist daher
gering einzuschätzen. Der Vergleich der Ergebnisse dieser Arbeit mit den
Beobachtungen von Kühl et al. fällt jedoch auch durch unterschiedliche
Versuchsbedingungen schwer: Kühl et al. adsorbierte die Immunglobuline mittels
Protein A-Sepharose und führte die Experimente mit einer Verdünnung der
IgG-Lösungen von 1:500 und einer Beobachtungszeitspanne von 15-30 Minuten
durch. Im Gegensatz dazu wurde in den Versuchen zu dieser Arbeit mit
Therasorb-Immunadsorptionssäulen-Sepharose gearbeitet, und das gewonnene Eluat
in einer Verdünnung von ca. 1:10 – 1:20 (IgG-Konz.: 300 mg/l) eingesetzt. Es wurden
auch nur die akuten Effekte der ersten zwei Minuten untersucht.
8.2.4. Autoantikörper gegen die SR-Ca2+-ATPase
Unter anderem reguliert die SR-Ca2+-ATPase das intrazelluläre Kalzium und damit
auch die Kontraktilität der Kardiomyozyten. Nach der Immunisierung von Mäusen mit
dem kardialen SR-Ca2+-ATPase-Antigen vom Kaninchen, aber auch durch
65
peritoneale Injektion von Hybridzellen, die monoklonale Antikörper gegen die
SR-Ca2+-ATPase produzieren, konnte das Auftreten einer Kardiomyopathie
beobachtet werden (Sharif et al. 1994, Baba, 2008), so dass man davon ausgehen
kann, dass dieses Enzym über das T-Tubulus-System indirekt in Kontakt steht mit dem
Extrazellulärraum. Deshalb sind akute Einflüsse extrazellulärer Antikörper auf die
intrazelluläre Kalziumregulation nicht auszuschliessen und weitere Untersuchungen
dazu nötig.
8.2.5. Komplement
Einen
weiteren
Schädigungsmechanismus
am
Myokard
stellt
die
komplementabhängige zytotoxische Serumaktivität dar. Einige gegen das Sarkolemm
gerichtete Antikörper bei Myokarditis wirken zytotoxisch, allerdings nur in Gegenwart
von Komplement (Drude et al. 1991, Atkinson et al. 2009). Diese führen zu einer
Verringerung der Kontraktionsfähigkeit der Kardiomyozyten. Derartige Antikörper
kommen
bei
uns
aufgrund
Betracht.Abschließend
muss
Patientenkollektiv
DCM
der
der
Komplementinaktivierung
davon
eine
sehr
ausgegangen
heterogene
jedoch
werden,
nicht
dass
Zusammensetzung
in
das
von
Autoantikörpern aufweist, und möglicherweise verschiedene Autoantikörper in ihrem
multiplen Zusammenspiel für die kardiodepressiven Effekte verantwortlich sind.
8.3. Vergleich von Kardiodepressivität und klinischem Befund
Falls Autoantikörper eine Rolle als auslösender Faktor bei der DCM spielen oder Anteil
an der progredienten funkionellen Beinträchtigung des Myokards haben, müsste deren
Entfernung aus dem Plasma der Patienten zu einer Stabilisierung oder Verbesserung
der Erkrankungssymptome führen. Dieses wurde in mehreren klinischen Studien
festgestellt (Dörfel et al. 1997, Felix et al. 2000, Staudt et al. 2001, Chen et al. 2006,
Trimpert et al. 2010). Andererseits dürften keine Verbesserungen zu erwarten sein,
wenn die Antikörper nur als Marker eines zugrunde liegenden –vielleicht auch
verdeckten- Entzündungsprozesses vorliegen würden. Tatsächlich zeigten die
klinischen Untersuchungen, dass es bei einem Teil der Patienten mit DCM
(kardiodepressive Gruppe, 19 Patienten der Studie) nach der Immunadsorption zu
einer deutlichen klinischen und hämodynamischen Verbesserung im Kurzzeitverlauf
kam, während sich bei anderen Patienten dieser Studie (nicht-depressive Gruppe)
66
keine
Verbesserungssymptome
abzeichneten
(Staudt
et
al,
2004).
Ein
Zusammenhang zwischen dem Entzug der kardiodepressiven Antikörper und den
hämodynamischen Profiten der DCM-Patienten ist somit erklärt, und man kann
Parallelen in der Stärke des Effektes und dem Anstieg des Herzindexes erwarten. In
diesem Kontext wurde deutlich, dass die Patienten, deren in vitro-Eluate starke
kardiodepressive Effekte an isolierten Rattenkardiomyozyten erzielten, beträchtlich
von der Immunadsorption profitierten, was im Umkehrschluss bedeutet, dass diese
Patienten im Plasma zirkulierende Antikörper aufweisen, die das Herz aktiv schädigen
könnten. Weiterhin zeigte sich im Verlauf der Immunadsorptionstherapie in der
kardiodepressiven Gruppe eine deutliche Zunahme des Herzindex während des 1.
Zyklus der Therapie (Doerffel et al. 1997, Staudt et al. 2004) wobei sich die Werte im
weiteren Verlauf der Therapie stabilisierten (Felix et al. 2000, Müller et al. 2000,
Trimpert et al. 2010). Im Gegensatz dazu konnte man nur einen leichten
Herzindexanstieg nach dem 1. Immunadsorptionszyklus in der nicht-depressiven
Gruppe ermitteln, der sich auch im Verlauf der Therapie nicht stabilisierte, sondern
wieder leicht abnahm.
Dies lässt vermuten, dass noch weitere Mechanismen bei der Immunadsorption zum
Tragen kommen und auf die Hämodynamik bzw. deren Stabilität einwirken (Staudt et
al. 2001, Trimpert et al. 2010). So könnte sich der Entzug anderer kardiotroper
Autoantikörper erst nach längerer Zeit klinisch bemerkbar machen. Auch zeigen sich
bei einigen Autoantikörpern hämodynamische und morphologisch Veränderungen erst
nach Wochen, so dass gerade die Ergebnisse der nicht-depressiven Gruppe vielleicht
auf diesem Phänomen beruhen: Eine Immunisierung von Meerschweinchen mit dem
ADP/ATP-Transporter-Protein der Mitochondrienmembran führt bei 11 von 15 Tieren
zur Bildung von Autoantikörpern gegen das ADP/ATP-Translokatorprotein und
innerhalb
von
vier
Monaten
zu
einer
Imbalance
der
myokardialen
Energiebereitstellung, und damit zur Beeinträchtigung der Herzfunktion (Schulze et
al.1989; Schultheiss et al. 1995, Buse et al. 2008). Eine intraperitoneale Injektion von
Antimyosin-Autoantikörpern induziert bei bestimmten Mäusestämmen innerhalb von
drei Wochen eine Autoimmun-Myokarditis (Liao et al. 1995, Mascaro-Blanco et al.
2008). Andererseits könnten so auch die Stabilität der Hämodynamik während der
letzten drei Zyklen bei den profitierenden DCM-Patienten erklärt werden, die unter
67
anderem hervorgerufen sei könnten durch gebremste Effekte anderer entzogener
Autoantikörper, die bei der nicht-depressiven Gruppe nicht vorkommen oder
modifizierte Rezeptor aufweisen. Bei den ansprechenden Patienten konnten auch
immunhistochemische Verändrungen nachgewiesen werden (Staudt et al. 2001).
Zur weiteren Eingrenzung der bei der Immunadsorption eliminierten und zur
Einschränkung der linksventrikulären Ejektionsfraktion führenden Autoantikörper
konnte in einer in 2010 im Clinical Pharmacology and Therapeutics veröffentlichten
Arbeit von Staudt et al. nachgewiesen werden, dass die verschiedenen
Polymorphismen der Fc gamma-Rezeptor IIa eine Role bei der kardialen
Minderfunktion bei der DCM spielen. Da die kardialen Autoantikörper mit ihren
IgG-Fab-Fragment an dem Antigen und mit ihrem IgG-Fcgamma-Fragment an den
Fc-Rezeptor binden, kann durch die Doppelbindung eine Signalkaskade in der Zelle
über 2 Mechanismen in Gang gesetzt werden: einmal über die Bindung des Antigens
am Fab-Fragment , zum anderen über die Bindung an das Fc-gamma-Fragment.
Kardiomyozyten
expremieren
Fcgamma-Rezeptor
IIa
an
der
Sarkolemma.
Fcgamma-Rezeptor IIa abhängige Mechanismen können verantwortlich für den
negativ inotropen Effekt sein. Hierbei zeigte sich das die Allele H131 und R131 einen
unterschiedlichen
Fcgamma-Rezeptor
Einfluss
haben.
So
IIa-GenotypR/R131
Immunadsorptions-Ansprechen
auf
die
konnte
eine
bei
Patienten
mit
einem
signifikant
besseres
echokardiographiosch
bestimmten
linksventrikulären Funktion nachgewiesen werden, als bei Patienten mit dem
Fcgamma-Rezeptor-Genotyp R/H131 oder H/H131. Wenn man diese Erkenntnisse
auf diese Arbeit anwendet, könnte ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen
FCgamma-Rezeptor-Genotypen und der Ausprägung des negativ inotropen Effektes
der Kardiodepressiven Gruppe und der nicht-kardiodepressiven Gruppe bestehn und
geben damit weitere Rückschlüsse auf die Ausprägung und die Ansprechraten der
Immunadsorption bei der heterogenen Gruppe der DCM-Patienten.
Außerdem kann die Gabe von Immunglobulinen, die am Ende jedes Zyklus erfolgte,
beteiligt sein an der hämodynamischen Stabilisierung der Patienten im Verlauf der
Therapie. So gibt die Literatur Hinweise darauf, dass durch die alleinige intravenöse
Hochdosis-Immunglobulingabe positive Effekte bzw. hämodynamische Profite bei der
Myokarditis und akuten Kardiomyopathie (Mc Namara et al. 1997, Warraich et al.
2006) verzeichnet wurden. Leider kann man das Ergebnis nur mit Einschränkungen
68
mit unserer Studie vergleichen, da bei den Patienten dieser Studie eine Myokarditis
ausgeschlossen wurde, also keine aktive Entzündung des Myokards vorlag.
Im Gegensatz zur immunmodulatorischen Therapie, wie die Immunadsorption,
arbeitet Schultheiss et al. mit guten Erfolg mit Virostatika bei der DCM (Kuethe et al.
2009) doch auch hier sind die Einschlusskriterien für die Studien verschieden.
Schlussfolgernd
kann
man
eine
Abhängigkeit
zwischen
Kurzzeiteffekt
der
Immunadsorption und dem Entzug der vorher im in-vitro-Eluat nachgewiesenen
kardiodepressiven
Autoantikörpern
erkennen,
die
jedoch
nicht
bei
jedem
DCM-Patienten vorkommen, bzw. bei den nicht profitierenden Patienten mit den
bisherigen Mitteln der Immunadsorption nicht aus dem Plasma gelöst werden können.
Die klinische Bedeutung des kardiodepressiven Effekts wird umso deutlicher, wenn
man seinen Einfluss auf den intrazellulären Kalziumgehalt betrachtet, der wiederum
eine zentrale Stellung hinsichtlich der Kontraktilität der Kardiomyozyten einnimmt. Der
intrazelluläre
Kalziumgehalt
bzw.
dessen
Konzentrationserniedrigungen
(Beeinträchtigung des Kalziumtransienten) in Zusammenhang mit einer reduzierten
Zellverkürzung durch die kardiodepressiven Autoantikörper könnte ein beteiligter
Mechanismus bei der Kontraktilität des Herzens und damit des klinischen
Erscheinungsbildes der Herzinsuffizienz bei der DCM sein (Schultheiss et al. 1988,
Baba, 2008). Es überstieg die Möglichkeiten dieser Arbeit, die Frage zu klären, ob
Autoantikörper eine Rolle als auslösender Faktor bei der DCM spielen. Auch andere
Mechanismen, die in vivo von Bedeutung sind oder in Beziehung zu den autoimmunen
Mechanismen stehen, müssen in Folgestudien untersucht werden. Diese Arbeit zeigte
jedoch, dass bei einem Teil der DCM-Patienten das humorale Immunsystem, um
genauer zu sein die kardiodepressiven Autoantikörper, eine Rolle bzw. einen Anteil in
der funktionellen Beeinträchtigung des Myokards haben müssen, sonst hätten diese
Patienten nicht von der Immunadsorption profitieren können. So erhält die
Immunadsorption durch den Entzug der kardiodepressiven Autoantikörper ihre
Berechtigung als Therapiealternative bzw. Therapieergänzung bei der DCM, die ihre
Evaluierung durch das vorausgehende in vitro-Screening der Antikörper und den damit
verbundenen Aussagen über die Effektivität der Therapie erfährt.
69
8.4. Limitation und Ausblick
Eine Vielzahl von Autoantikörpern sind bisher bei der DCM beschrieben worden,
wobei die Patienten eine starke individuelle Variabilität in der Zusammensetzung
zeigen. Diese Arbeit vermag es nicht, Aussagen über die Beteiligung eines
spezifischen Antikörpers an den kardiodepressiven Effekten zu treffen. Es war
möglich, die heterogene Gruppe von DCM-Patienten durch das Screening-Verfahren
in zwei Gruppen zu unterteilen, jedoch müssen weitere Untersuchungen an einem
größeren Patientenkollektiv folgen, um genauere Aussagen machen zu können. Von
großem Interesse ist ferner eine weitere Identifizierung einzelner Antikörper im Eluat,
weshalb Western blot-Analysen, elektromikroskopische Untersuchungen, weitere
funtionelle pharmakologische Untersuchungen durchzuführen sind, die durch
Experimente zur Wirkung der Eluate auf andere Gewebe, wie glatte Muskelzellen und
Endothelzellen, noch erweitert werden sollten. Schließlich wurde durch die
in-vitro-Adsorption mit der nachfolgenden Untersuchung des gewonnen Eluats eine
labortechnische Methode etabliert, die man auch zur Entwicklung spezifischerer,
verbesserter Immunadsorptionssäulen nutzen konnte. Das Testen von in-vitro-Säulen,
die mit Sepharose arbeiten, die bestimmte Antikörper aus dem Plasma der
DCM-Patienten ziehen (zum Beispiel verschiedene Subklassen des IgG), könnte
weitere Aussagen zur DCM und zur Verbesserung des Immunadsorptionsverfahren
bei der DCM ermöglichen (Warraich et al, 2002, Staudt et al. 2002, Staudt et al. 2005).
Das Ausmaß und die Beteiligung der Autoantikörper an der Initiation bzw.
Pathogenese der DCM bleibt jedoch immer noch eine der wichtigsten Fragen, die es
zu klären gilt.
70
9. Zusammenfassung
Die Immunadsorption stellt eine zusätzliche Therapieform zur Stabilisierung und
Verbesserung der Herzfunktion bei einem Teil der Patienten mit Dilatativer
Kardiomyopathie dar. Die Untersuchungen der Mechanismen für die möglichen
Veränderungen der Hämodynamik unter der Immunadsorption in Bezug auf die dabei
eliminierten Antikörper ist Thema dieser Arbeit, die sich dabei eines in vitro-Screenings
der Antikörper bediente, das teilweise der Immunadsorption nachempfunden
wurde.Von 29 Patienten mit DCM wurde vor der Immunadsorption Plasma gewonnen,
um
damit
eine
in-vitro-Adsorption,
die
der
Immunadsorption
gleichkommt,
durchzuführen. Die dabei gewonnen in vitro-Eluate (IgG-Konzentration: 300 mg/l)
wurden mittels Fluoreszenzmikroskop auf die Beeinflussung der intrazellulären
Kalziumkonzentration und der Kontraktilität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden,
dass die in-vitro-Eluate von 19 Patienten dieser Studie (kardiodepressive Gruppe) den
Kalziumtransienten
und
Rattenkardiomyozyten
die
Kontraktilität
reduzierten,
DCM-Patienten-in-vitro-Eluate
von
während
(10)
keine
isolierten,
der
oder
feldstimulierten
andere
Teil
kaum
der
Effekte
aufwiesen(nicht-depressive Gruppe). Daraufhin wurde bei allen Patienten eine
Immunadsorptionstherapie
durchgeführt
mit
dem
Ergebnis,
dass
die
im
Fluoreszenzmikroskop beobachteten Effekte der Antikörper in enger Beziehung zu
den hämodynamischen Veränderungen bei der Immunadsorption standen, d. h. die
Patienten, die durch die Beeinträchtigung der isolierten Rattenkardiomyozyten durch
ihre in-vitro-Eluate zur kardiodepressiven Gruppe geordnet wurden, profitierten vom
Entzug dieser durch die Immunadsorption, während die Patienten der nicht
depressiven Gruppe kaum Verbesserung in der Hämodynamik erfuhren. So kann
vermutet
werden,
dass
die
kardiodepressiven
Antikörper
an
der
Funktionseinschränkung des Herzmuskels bei einem Teil der Patienten mit DCM
beteiligt sind, während sie bei anderen Patienten mit DCM nicht auf diese Weise
wirken
bzw.
ihre
Elimination
keine
Vorteile
bringt.
Daraufhin
folgende
Untersuchungen, die die Funktionswege dieser Autoantikörper an den Myozyten
weiter definieren bzw. eingrenzen sollten z.B. über den muscarinergen Rezeptor, über
das ADP/ATP-Translokatorprotein oder die SR-Ca2+-ATPase konnten keine
eindeutige Zuordnung erbringen, deshalb sind weitere
71
Untersuchungen erforderlich, die die Funktionsweise bzw. die Rezeptorstrukturen der
Antikörper klären, die zu der Beeinträchtigung der Funktion der Kardiomyozyten
führen.
72
10. Literaturverzeichnis
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88
11. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass
eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Ort, Datum,
Unterschrift
89
12. Lebenslauf
Name
Geburtsdatum
Geburtsort
Eltern
Anschrift
Lydia Wunderle
31.08.1976
Darmstadt
Bruno Wunderle und Helga Wunderle
Glauburgstr. 27
60318 Frankfurt
deutsch
ledig
8/1983 – 7/1987
Peter-Schöffer-Schule, Gernsheim
Staatsangehörigkeit
Familienstand
Schulbildung
8/1987 – 7/1989
Johannes-Gutenberg-Schule, Gernsheim
8/1989 – 5/1996
Gymnasium Gernsheim
5/1996 Allgemeine Hochschulreife
Studium der Humanmedizin
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
zu Greifswald (10/1996 – 3/2002)
3/1999 Physikum
8/2000 I. Staatsexamen
Johann-Wolfgang-Goethe-Universität in
Frankfurt, Main (4/2002 – 4/2004)
3/2003 II. Staatsexamen
5/2004 III. Staatsexamen
Beruf
Promotion
Ort, Datum,
seit 06/2004 : Assistenzärztin für Innere Medizin
Hämatologie/Onkologie, Uni-Klinikum Frankfurt,
Main
Kardiologisches Forschungslabor
der Inneren Medizin B
Universität Greifswald
Leiter: Prof. Dr. med. St. Felix
17489 Greifswald
Unterschrift
90
13. Danksagung
Für die Überlassung des Themas meiner Doktorarbeit danke ich Herrn Prof. Dr. sc.
med. Stefan Felix. Seine interessanten Fragestellungen und kritischen Anmerkungen
in unseren Forschungsbesprechungen waren wissenschaftlich und persönlich eine
Bereicherung für mich.
Bei Herrn Dr. med. Alexander Staudt möchte ich mich ganz besonders bedanken.
Neben der Organisation der Immunadsorptionstherapien und dem Aufbau des
zellphysiologischen Labors der Inneren Medizin B war er ein hervorragender Lehrer für
mich, der nicht nur jederzeit für Fragen offen war, sondern auch durch seinen
Ideenreichtum und Enthusiasmus motivierend wirkte.
Frau Sandra Geissler und Brita Jenz danke ich für ihre technische Assistenz und ihrer
Hilfe im Labor. In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei Herrn Thomas
Prange für seine praktischen, kameradschaftlichen, wie auch kreativen Tips,
Anregungen und Gespräche während des gemeinsamen Promotionszeit bedanken.
Ferner danke ich Henriette Meyer zu Schwabedissen für ihre gute Freundschaft, die
mich durch viele private und arbeitsbedingte Höhen und Tiefen begleitet hat.
Dank gilt auch meinen Eltern und meinem Onkel, Hans Herget. Sie haben mir durch
uneingeschränkte
Zustimmung,
ihr
Vertrauen
und
nicht
zuletzt
finanzielle
Unterstützung das Medizin-Studium ermöglicht.
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