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Research Collection
Doctoral Thesis
The physical properties and chemical applications of penicillin
acylase and myrosinase
Author(s):
Pessina, Antonio
Publication Date:
1990
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-000592532
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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v>» -,-r
1 5. Mai 1990
yrfi-f
Diss. ETH No. 9130
THE PHYSICAL PROPERTIES AND CHEMICAL APPLICATIONS
OF
PENICILLIN ACYLASE AND MYROSINASE
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the
degree
of
Doctor of Natural Sciences
presented by
ANTONIO PESSINA
Dipl.
Chem. ETH
born the 31
Citizen of
accepted
on
August
1962
Ligornetto (Tl)
the recommendation of
Prof. Dr. P.L. Luisi, examiner
Prof. Dr. J.R. Bourne, co-examiner
Zürich 1990
ETHICS ETH-BIB
11
Abstract
In the first part of the present dissertation the
with the enzyme
Penicillin
phenyl
penicillin acylase
acylase is able
acetic acid and
a
enzymatic
synthesis
amide bond
studied.
was
synthesize amide bonds e.g. through the coupling of
to
dipeptide. This
catalyzed by
is not the natural reaction
penicillin acylase, in fact the natural reaction involves the hydrolysis of the side
chain of the
enzyme
specificity
functional
The
penicillin molecule. This study iUustrates again
similarity
specificity
high
analogs
of
with the
both
amino component
is very
be extended to
can
and almost
acetic
acid
well
as
or
similarity
give
phenyl
acetic acid,
acid
can
be used
on
Phenylalanine,
Substrate. Some
as
which have
acid
residues
of the type
(X)
such
bulky residues,
bulky
of
as
e.g.
can
X-Y is
fairly important.
glycyl, seryl, alanyl
thyrosyl
act as
type of dipeptides has
an
For
out
synthesis carried
and
dipeptides
(but
not amino
or
are
methionyl
Tyr-OEt
or
In
fact
dipeptides
act as
can
to notice that the first amino acid residue
amino acid esters like
type Gly-X
structural
reaction. On the side of the amino
no
tripeptides
dipeptide
also
are
some
acids with the free
interesting
specificity
the
esters
Substrates. It is
a
the side of the
case
trans-3-hexenoic
as
some
an
Substrate.
component the specificity is rather low, i.e. amino acids
carboxyl group),
in which
Compounds having
acyl component and
only phenyl acetic
Substrates, whereas phenylglycine
with
of
studied. It was found that in the first
was
phenyl
original (natural)
the side of the
on
larger family
a
a case
(X) of
a
small
with
Substrates, whereas dipeptides with
are
not Substrates. On the
Met-OEt
are
Substrates. All
contrary
dipeptides
Substrates, the second amino acid residue (Y) of this
influence
in
only
on
the
aqueous buffer
yield.
using phenylacetic
acid
as
acyl
component the yields of the enzymatic coupling varied from about 10% for SerOMe
or
GlyAsp,
OEt. Penicillin
to about 25% for
acylase
D-amino acid and
of these reactions
can
catalyze also
dipeptides containing
are
lower when
dipeptides containing only
to the enzyme
GlyLeu
or
the
SerTyr,
about 70% for Met-
coupling of phenylacetic acid with
D-amino acids
compared
or to
(L-X-D-Y type).
The
or
with
presumably
due
to those with L-amino acids
L-amino acids. The lower
yields
are
yields
catalytic activity, which is affected by the configuration
at the
C(a)
12
of the concerned amino acid.
In the second part of the dissertation the enzyme
present in the mustard seeds (Sinapis alba L),
In
myrosinase,
was
glucosinolates.
Their
thiocyanates,
depending
hydrolysis produces
isothiocyanates,
the
on
purified and characterized.
Concanavalin
A
subsequentiy
by
This
step
the
of
by
gel electrophoresis
well
as
presented
a
as
microheterogeneity
5.05-5.15. This is not
typical
for
was
0.714
After
and the
judged by
analyzed by
when
3-4
isoenzymes
often
surprising because glycoproteins
in the
present
Myrosinase
physically characterized.
E1%(280nm,1cm)
was
as
due to small Variation in the sugar content.
this method
and
7.
U-mg'1
a
on
by analytical ultracentrifugation.
pl region
volume
to
pure
was
focusing; the lEF-gels revealed the presenee of
Charge paueidispersity
5
increased up to 70
isoelectric
The extinction
as
etc.
gel filtration
a
ränge
factor 80 to 115. The enzyme
However the pure enzyme
purified by
amines
affinity chromatography
pH
the
in
activity of myrosinase
a
an
followed
was
chromatofocusing
purity increased by
native and SDS
products such
of
oxazolidine-2-thiones,
nitriles,
purification consisted
column.
chromatofocusing
variety
a
hydrolysis conditions.
The first step of the
but
glycoprotein
myrosinase is the enzyme responsible for the hydrolysis of the
nature
specific
a
was
10"3
x
glycoproteins.
found to be 14.5 and the
m3-kg"1,
a
isopotential partial
rather low value for
The molecular
weight
globular proteins
of the enzyme in the native
conformation is 135100 Dalton and in the unfolded conformation the enzyme is
weight 71700
divided in two, very similar if not identical, subunits of molecular
Dalton.
CD
indicates
spectroscopy
guanidinium
chloride with
that
conformation between 2.5 and 4M. Below
of about 2M
and
myrosinase is
irreversibly
denaturated
a
chloride concentration
guanidinium
appreciably denatured, above 5M
not
denatured. The
by
between the folded and the unfolded
midpoint
a
is
myrosinase
it is
of the CD data indicate that
analysis
contains about 19% of a-helix and 35%
ß-sheet,
completely
myrosinase
being
the rest of the structure
conformationally aperiodic.
The last
chapter shows
simultaneous
extraction
extraction of oil is
the
of
application
oil
possible
whereas the extraction of the
and
at w0
of AOT/isooctane microemulsion for the
glucosinolates
>
0
(w0
=
from
oilrape seeds. The
[H20]/[Surfactant],
glucosinolates is complete only
at
molar
w0=25
ratio),
or
30.
13
Kurzfassung
Im ersten Teil der
vorliegenden
Acylase
Dissertation wurde die durch Penicillin
katalysierte enzymatische Amidbindungsynthese untersucht.
Penicillin
Amidbindung
ist
jedoch
zwischen
der
Spezifität
Amidbindungen verknüpfen kann, z.B. die
das
Phenylessigsäure
essigsäure
Aminokomponente untersucht.
Spezifität
als Substrat
säurederivate
und
auch
werden kann.
trans-3-Hexensäure
und
Phenylalanin
Phenylessigsäure haben,
zu
Auf der Seite der
Acylkomponente,
Aminokomponente
Substrate
sind
Spezifität
ziemlich
einige Dipeptide
ist
jedoch
es
zu
sind Substrate,
Met-Y)
ist:
während
sind nicht Substrate;
Falle der
Gly-Y-Dipeptide
Dipeptide
da sowohl
(x)
mit
eines
als
Dipeptides
(wie Gly-Y, Ser-Y
oder Ala-
(wie z.B. Tyr-Y oder
grossem Rest
oder Met-OEt sind
Tyr-OEt
gering,
akzeptiert.
Carboxylgruppe),
erste Aminosäurerest
mit kleinem Rest
Dipeptide
strukturelle
als Substrate wirken können. Interessant
Tripeptide
bemerken, dass der
(X-Y) ziemlich wichtig
Y)
und
Penicillin
von
einige
die
dagegen,
Aminosäureester (aber nicht Aminosäuren mit der freien
auch
Phenyl¬
Lediglich einige Phenylessig-
werden nicht als Substrate
ist die
als
Man hat dabei beobachtet,
hoch ist und dass fast ausschliesslich
eingesetzt
Phenylglycin
Änlichkeiten
katalysiert das Enzym die
der Reaktion wurde sowohl auf der Seite der
dass im ersten Fall die
Diese Reaktion
Dipeptid.
und einem
in der Seitenkette von Penicillin.
Amidbindung
auch auf der Seite der
Acylase;
Enzym,
nicht die natürliche Reaktion. In der Natur
Hydrolyse
Die
ist ein
Acylase
dagegen Substrate.
hat der zweite Aminosäurerest
(Y) lediglich
Im
einen
Einfluss auf die Ausbeute.
Die
Ausbeuten
der
Phenylessigsäure
als
Synthesen
GlyAsp,
im
Met-OEt.
von
Phenylessigsäure
enthalten
wässrigem Puffer
Acylkomponente
Ser-OMe oder
Falle
in
ca.
von
GlyLeu
oder
ca.
Verwendung
von
10% im Falle
von
und
70%
SerTyr,
ca.
Acylase kann auch die Kopplung zwischen
und D-Aminosäuren oder
(L-X-D-Y-Typ), katalysieren.
jedoch geringer,
variieren zwischen
25% im Falle
Penicillin
unter
Dipeptiden,
welche D-Aminosäuren
Die Ausbeuten dieser Reaktionen sind
als die Ausbeuten mit L-Aminosäuren oder
Dipeptiden,
die
nur
14
L-Aminosäuren enthalten. Die geringere Ausbeute ist sehr warscheinlich durch
die
katalytische
Enzyms, die durch die Konfiguration des C(a)-
Aktivität des
Zentrums des Substrates beeinflusst wird, verursacht.
Im zweiten Teil der Dissertation wurde das
aus
Senfsamen
(Sinapis
In der Natur ist
einer grossen
alba
Myrosinase
L), gereinigt
graphie. Danach
der
Reinigung
Isothiocyanate, Cyanate,
verantwortlich.
usw.
eine Concanavalin A Affinitätschromato¬
war
5-7
durchgeführt. Die
Chromatofokussierung
und der Reinheitsfaktor
stieg
um
Myrosinase stieg
Aktivität von
anfänglich 0.6-0.8 U-mg1
von
auf 70
Enzym bezüglich molekularer Masse
einheitlich
fokussierung (IEF)
eine leichte
lEF-Gelen konnte
kleine
deutete
man
Glykoproteinen
Änderungen
im
E1%(280nm,1cm)
Der
Partialvolumen
zu
jedoch auf
3-4
Isoenzyme
Enzyms
häufig
aufweisen.
Wert
zu
wurde
10'3
x
14.5
m3-kg'\
typisch
Analytische
war.
pl-Bereich
oft der Fall, da sie
ausserordentlich tief ist, aber
des
im
Zuckergehalt,
0.714
oder sogar identisch
Myrosinase
sind.
aus
Das
Isoelektro-
5.05-5.15 nachweisen. Das
eine
ermittelt
Paucidispersität, durch
und
ein Wert, der für
ist für
dass das
Mikroheterogenität hin; auf
Glykoproteine.
das
isopotentielle
globuläre
Das
Proteine
Molekulargewicht
ungefalteten
ist in der nativen Konformation 135100 Dalton. In der
Konformation besteht
U-mg1
80 bis 115.
SDS-Gelelektrophorese und analytische Ultrazentrifugation zeigten,
ist aber bei
Bildung
unter
wurden eine Gelfiltration und anschliessend eine Chromato-
pH-Bereich
im
physikalisch charakterisiert.
wie z.B.
Menge verschiedener Produkte
Der erste Schritt der
nach
und
Glykoprotein
ein
Hydrolyse der Glucosinolate
für die
Nitrile, Amine, Oxazolidin-2-Thione
fokussierung
Enzym Myrosinase,
zwei Untereinheiten, welche sehr ähnlich,
Molekulargewicht
der Untereinheiten
beträgt
71700 Dalton.
Das
Enzym
Myrosinase
Übergang
einer
ist
in
in
Lösung
sehr
Anwesenheit
zwischen der
und der
Konzentration
nicht merkbar denaturiert, über 5M ist das
Analyse
der
CD-Spektren
konnte
Die
CD-Spektroskopie zeigte,
Guanidin-hydrochlorid
von
gefalteten
Guanidin-hydrochlorid
stabil.
man
dass
Der
denaturiert wird.
ungefalteten Konformation liegt
von
2.5-4M. Unter 2M ist
bei
Myrosinase
Enzym vollständig denaturiert. Durch
feststellen, dass Myrosinase
aus ca.
19%
15
a-Helix
und
Konformation
Im
lezten
35%
ß-Faltblatt
besteht.
Rest
liegt
in
einer
aperiodischen
vor.
Kapitel
wurden AOT/Isooktan Mikroemulsionen für die
Extraktion
von
Öl und Glucosinolaten
extraktion
war
möglich
Glucosinolate
Der
war nur
bei
bei
w,>0 (w0
w0=25
aus
=
oder 30
gleichzeitige
Die
Öl-
Extraktion
der
Rapssamen verwendet.
[H20]/[Tensid]),
vollständig.
die