Die pathophysiologische Rolle zytotoxischer Granzym B
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Universitätsklinikum Ulm Institut für Transfusionsmedizin und Immungenetik (IKT) Direktor: Prof. Dr. med. Hubert Schrezenmeier Die pathophysiologische Rolle zytotoxischer Granzym B-sezernierender B-Zellen bei malignen Erkrankungen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Sabine Katharina Charlotte Brüggemann aus Tübingen 2016 Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Bernd Jahrsdörfer 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Thomas Barth Tag der Promotion: 27. April 2017 Diese Doktorarbeit enthält Abbildungen und Inhalte, die zum Teil an anderer Stelle veröffentlicht wurden: Immunology and Cell Biology 2012 M. Hagn, K. Sontheimer, K. Dahlke, S. Brueggemann, C. Kaltenmeier, T. Beyer, S. Hofmann, O. Lunov, T. F. E. Barth, D. Fabricius, K. Tron, G. U. Nienhaus, T. Simmet, H. Schrezenmeier and B. Jahrsdörfer, Human B cells differentiate into granzyme Bsecreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help, Immunology and Cell Biology, 90:457-467, 2012. Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis III 1 Einleitung 1 1.1 Die Rolle von B-Zellen im menschlichen Immunsystem . . . . . . . . . 1 1.2 Granzym B und dessen Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.3 Die Bedeutung von IL-21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 Material und Methoden 9 2.1 Verwendete Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2.1 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2.2 Isolation von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut . . . . 21 2.2.3 B-Zell-Isolation mittels Magneten . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.2.4 Primäres Tumorgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2.5 Co-Kulturen und Zellstimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.2.6 Messung der IC50 einzelner Granzym B-Inhibitoren . . . . . . . 25 I Inhaltsverzeichnis 2.2.7 Durchflusszytometrie: Prinzip und Färbungen . . . . . . . . . . 26 2.2.8 Konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.2.9 Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3 Ergebnisse 3.1 33 Zytotoxischer Effekt von ARH-77 B-Zellen auf verschiedene Tumorzelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 II 33 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch verschiedene GrB-Inhibitoren 37 3.2.1 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch Granzym B-Inhibitor Ac-IEPD-CHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.2.2 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch SMI8 . . . . . . . . . 39 3.2.3 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch Granzym B-Inhibitor II 41 3.2.4 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch einen Cumarininhibitor 43 3.3 Zytotoxischer Effekt von Nabelschnur-B-Zellen auf Tumorzelllinien . . . 46 3.4 B-Zell-Infiltration in primärem Tumorgewebe . . . . . . . . . . . . . . . 48 4 Diskussion 49 4.1 GrB+ B-Zellen und ihr zytotoxisches Potential bei malignen Erkrankungen 49 4.2 GrB-Inhibitoren und die Hemmung des zytotoxischen Effekts . . . . . . 53 4.3 Mögliche weitere Funktionen GrB+ B-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . 56 5 Zusammenfassung 59 6 Literaturverzeichnis 61 Abkürzungsverzeichnis ACK Ammoniumchlorid-Kalium-Hydrogenkarbonat ADCC Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität anti-BCR Antikörper gegen den B-Zell Rezeptor APC Antigen-präsentierende Zelle BCR B-Zell-Rezeptor Bcl-6 B-Zell-Leukämie-6 BID BH3 interacting domain death agonist Bim Bcl-2 interacting mediator of cell death Breg regulatorische B-Zelle BSA Bovines Serumalbumin CD Cluster of Differentiation CLL Chronisch lymphatische Leukämie CML chronisch myeloische Leukämie CTL zytotoxische T-Zelle DC dendritische Zelle DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Deoxyribonucleic Acid EBV Epstein-Barr-Virus ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay F-12K Kaighn’s Modification of Ham’s F-12 Medium III FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FGFR Rezeptor des Fibroblasten-Wachstumsfaktors FHL Familiäre hämophagozytische Lymphohistiozytose FITC Fluoresceinisothiocyanat γc γ-Kette GraB cell Granzym B-exprimierende regulatorische B-Zelle GrB Granzym B GvHD Graft-versus-Host-Reaktion Hsp Hitzeschockprotein IC50 mittlere inhibitorische Konzentration ICAD Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease IDO Indolamin-2,3-Dioxygenase Ig Immunglobulin IL Interleukin JAK Januskinase KHCO3 Kaliumhydrogencarbonat MACS Magnetic Activated Cell Sorting M6PR Mannose-6-Phosphat Rezeptor moDC Monozyten-abgeleitete dendritische Zelle Na2 EDTA Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge NH4 Cl Ammoniumchlorid NK-Zelle natürliche Killerzelle NKT-Zelle natürliche Killer-T-Zelle PARP Poly-ADP-Ribose-Polymerase PBS Phosphate Buffered Saline pDC plasmazytoide dendritische Zelle IV PE Phycoerythrin PerCP Peridinin-chlorophyll protein complex PI Propidiumiodid PI-9 Proteinase-Inhibitor 9 PS Phosphatidylserin RA Rheumatoide Arthritis RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur SEM Standard error of the mean SLE Systemischer Lupus erythematodes SMI Small Molecule Inhibitor Socs Suppressor of cytokine signaling SSC Side Scatter STAT Signal Transducer and Activator of Transcription TCR T-Zell-Rezeptor TfH Follicular helper T cell TLR Toll-Like-Rezeptor Tr1 IL-10-secreting type 1 regulatory T cell Treg regulatorische T-Zelle vWF von-Willebrandt-Faktor V Kapitel 1 Einleitung 1.1 Die Rolle von B-Zellen im menschlichen Immunsystem Die Funktion des menschlichen Immunsystems beruht auf zwei unterschiedlichen Mechanismen, einerseits der angeborenen oder auch unspezifischen Immunabwehr und andererseits der adaptiven, spezifischen Immunabwehr. Zu den wichtigsten Zellen des angeborenen Immunsystems gehören neben den aus der myeloischen Stammzelle hervorgehenden Zellen, zu denen die Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen und dendritischen Zellen gehören, auch die aus der lymphatischen Stammzelle hervorgehenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Im adaptiven Immunsystem spielen hingegen vor allem B- und T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle [118]. B-Lymphozyten sind durch typische Oberflächenantigene gekennzeichnet. Durch die Expression von unterschiedlichen Oberflächenmerkmalen wie Immunglobulinen (Ig) und Cluster of Differentiation (CD) lassen sie sich in verschiedene Subtypen einteilen. CD19, ein Co-Rezeptor für den Antigen-Rezeptor, wird von allen B-Zellen exprimiert und kann zu deren Identifizierung genutzt werden [156]. Eine besondere Subpopulation von B-Zellen ist durch das Zelloberflächenprotein CD5 gekennzeichnet. Die CD5+ 1 Einleitung 2 B-Zellen machen beim gesunden erwachsenen Menschen hierbei ca. 5% aller B-Zellen aus. Sie gelten als Produzenten natürlicher IgM-Antikörper und kommen vor allem in der Flüssigkeit von Pleura- und Peritonealhöhle vor, sowie in fetalem Nabelschnurblut. Die genaue Funktion dieser Subpopulation ist derzeit noch nicht abschließend geklärt und Gegenstand aktueller Forschungen [45, 67, 13, 87, 101]. Die Hauptaufgabe der B-Zellen im Rahmen der adaptiven Immunantwort besteht in der Differenzierung zu einer Antikörper-sezernierenden Plasmazelle. Zusätzlich sind BZellen in der Lage, Antigene zu präsentieren sowie Zytokine, unter anderem Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-12, zu bilden [66, 128]. B-Zellen werden ein Leben lang im Knochenmark gebildet und durchlaufen dort auch den größten Teil ihrer Entwicklung. Im Rahmen dieser Reifung kommt es zu einer Umlagerung und Expression der Immunglobulingene, bzw. des B-Zell-Rezeptors. Als Ergebnis dieses Prozesses entsteht eine unreife B-Zelle, welche den Antigenrezeptor IgM auf ihrer Zelloberfläche exprimiert. Über negative Selektion werden in diesem Stadium stark autoreaktive, unreife B-Zellen beseitigt. Dieser Mechanismus ist entscheidend für die Selbsttoleranz, deren Verlust zu Autoimmunität führen kann. Die unreifen B-Zellen, welche nicht über die negativen Selektionsprozesse eliminiert wurden, entwickeln sich weiter zu reifen B-Zellen, welche auf ihrer Zelloberfläche zusätzlich durch IgD gekennzeichnet sind und in die lymphatischen Organe migrieren [117, 35, 55, 131, 132]. In den sekundären lymphatischen Organen können die reifen B-Zellen durch den Kontakt mit spezifischen Fremd-Antigenen aktiviert werden. Zwar können einzelne Antigene T-Helferzellen-unabhängig B-Zellen aktivieren, im allgemeinen wird aber neben dem Antigen eine Stimulation durch eine T-Helferzelle zur weiteren Differenzierung benötigt [122, 106]. Hierbei sorgt neben verschiedenen Zytokinen, wie IL-4 oder IL-10, vor allem die Interaktion zwischen CD40 und CD40-Ligand für eine weitere Proliferation und Entwicklung hin zu einer antikörperproduzierenden Plasmazelle [30, 91, 163]. Im Verlauf der Immunantwort reifen aktivierte B-Zellen im Keimzentrum durch somatische Hypermutation und Selektion zu Plasmazellen mit hoch affinen Antikörpern heran, welche die Fähigkeit zum Isotypwechsel innehaben. Ein geringer Teil dieser Einleitung 3 B-Zellen entwickelt sich nicht hin zu einer Plasmazelle, sondern zu einer langlebigen B-Gedächtniszelle [94, 76, 25, 85]. Im Rahmen der humoralen Immunantwort führen nun die sezernierten Antikörper entweder zur Neutralisierung des Pathogens oder zu dessen Elimination durch phagozytische Zellen und Proteine des Komplementsystems. Neben der humoralen Immunantwort, in welcher die B-Zellen die wichtigste Funktion besitzen [131], spielt auch die zellvermittelte Apoptose eine entscheidende Rolle innerhalb des Immunsystems. Zu den wichtigsten zytotoxischen Leukozyten zählen neben den zytotoxischen T-Zellen (CTL) der erworbenen Immunabwehr auch die NKZellen und NKT-Zellen der angeborenen Immunabwehr [92, 168, 4, 15]. Diese KillerLymphozyten spielen eine Schlüsselrolle bei der Elimination von Tumorzellen und infizierten Zellen [138]. 1.2 Granzym B und dessen Funktionen Granzym B (GrB) ist ein wichtiger Bestandteil der zytotoxischen Granula der CTL und NK-Zellen [124, 95]. Es kann von diesen zytotoxischen Zellen auf Zielzellen übertragen werden und in ihnen Apoptose auslösen [70]. Es gehört neben den Granzymen A, H, K und M zu den 5 bislang bekannten humanen Granzymen [59]. GrB ist eine Serinprotease, deren Gen auf dem Chromosom 14q11.2 liegt [84], die 32 kDA groß ist und welche Peptide bevorzugt nach Aspartat spaltet [129]. Im Rahmen der Biosynthese gelangt GrB als inaktives Proenzym in den Golgi-Apparat, wo es an Mannose 6-Phosphat gekoppelt wird, um anschließend zu den Lysosomen transportiert zu werden [57]. In diesen zytotoxischen Granula wird GrB nun nach Abspaltung des N-terminalen Dipeptids durch Cathepsin C aktiviert [144]. Der saure pH innerhalb des Lysosoms vermindert die proteolytische Aktivität des GrB [32]. Um die zytotoxischen Granula auf die Zielzelle zu übertragen, bildet die zytotoxische Zelle eine immunologische Synapse mit der Zielzelle, in welche die zytotoxischen Granula abgegeben werden [75, 23, 21]. Für die Aufnahme von GrB in die Zielzelle scheint Perforin, Einleitung 4 welches zusammen mit GrB den Hauptbestandteil der zytotoxischen Granula bildet, eine wichtige Rolle zu spielen. Auf welche Weise Perforin die Aufnahme von GrB unterstützt ist jedoch noch nicht abschließend geklärt [32, 20]. Beim ursprünglichen Modell wurde davon ausgegangen, dass Granzyme durch Perforin-vermittelte Poren in das Zytoplasma der Zelle gelangen [110, 161]. Diese Theorie wird aber gemeinhin nicht mehr als zutreffend angesehen. Eine andere Theorie besagt, dass Granzyme unabhängig von Perforin mittels Endozytose in die Zielzelle gelangen und dort durch Perforin in das Zytoplasma der Zielzelle gelangen [49]. In einem weiteren überarbeiteten Modell wird vermutet, dass Perforin so kleine Löcher in der Zellmembran verursacht, dass diese lediglich einen Calcium-Einstrom erlauben, welcher wiederum zur Aktivierung einer zellulären Membranantwort und einer schnellen Endozytose von Granzymen, Perforin und weiteren, an der Zelloberfläche gebundenen Substanzen führt. Aus dem entstehenden Endosom erfolgt dann eine Perforin-vermittelte Freisetzung der Granzyme in das Zytoplasma der Zelle [82, 158, 157]. Neben Perforin kann die Aufnahme von GrB jedoch auch über den Kationen-unabhängigen Mannose-6-Phosphat Rezeptor [112, 52, 165, 64, 2] oder das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) [58] erfolgen. Verschiedene Arbeitsgruppen einschließlich unserer eigenen konnten zeigen, dass GrB auch ohne die Anwesenheit von Perforin in Zielzellen aufgenommen werden und in diesen Apoptose auslösen kann [63, 2]. Nachdem GrB in das Zytoplasma der Zielzelle gelangt ist, kann es durch direkte oder indirekte Aktivierung von Caspasen Apoptose in der Zielzelle auslösen [38]. Einerseits kann die Apoptose direkt über die Aktivierung von Caspasen erfolgen, insbesondere durch Spaltung der Pro-Caspasen 3 und 8 [10, 108], andererseits auch indirekt durch die Aktivierung von BID (BH3 interacting domain death agonist). Caspase 3 scheint hierbei die Hauptrolle zu spielen [100]. Über die Prozessierung verschiedener zellulärer Substrate, unter anderem von PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase) und ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease), ist aktivierte Caspase 3 in der Lage, in der Zielzelle die Apoptose einzuleiten [68, 48]. Caspase 8 wiederum kann sowohl Caspase 3 aktivieren als auch BID spalten [93, 1] . BID, bei welchem es sich ebenfalls Einleitung 5 um ein Substrat von GrB handelt, ist auch an der Aktivierung der Caspasen-Kaskade beteiligt. Es führt in Mitochondrien zu einer Freisetzung von Cytochrom C [66] und zur Ausbildung des sog. Apoptosoms, welches seinerseits eine weitere Caspasenaktivierung und Apoptose auslöst [3, 11]. GrB wird nicht ausschließlich in zytotoxischen Leukozyten exprimiert, sondern auch von Zellen, welche keine signifikanten Mengen an Perforin bilden und auch nicht zu den klassischen zytotoxischen Zellen zählen. Zu diesen Zellen gehören unter anderem Keratinozyten [12, 69], Sertoli-Zellen des Hodengewebes [72], Synzytiotrophoblasten [72], Chondrozyten des Gelenkknorpels [5], basophile Granulozyten [160], Mastzellen [152] sowie plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs) [134, 78, 22] und B-Zellen [77]. Da diese Zellen kein oder kaum Perforin exprimieren, gelangt ein größerer Teil des von ihnen produzierten GrB in den Extrazellulärraum statt ins Zytoplasma von Zielzellen. Neben der intrazellulären Wirkung von GrB rücken daher auch immer mehr dessen extrazelluläre Aktivitäten in den Fokus der Forschung [145, 136]. So konnte schon gezeigt werden, dass GrB unter anderem dazu in der Lage ist, Kollagen IV, Fibronectin, Vitronectin und Laminin, welche Bestandteile der Extrazellulärmatrix sind, zu spalten [28, 50, 33]. Der dabei entstehende Verlust der Zell-Matrix-Verbindung kann hierbei zur Apoptose von Endothelzellen führen (Anoikis), sowie möglicherweise auch die Migration von Tumorzellen und Lymphozyten hemmen [28]. Des weiteren wurde gezeigt, dass GrB in der Lage ist, Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen zu spalten [170, 51], was möglicherweise eine GrB-bedingte immunsupressive Wirkung auf regulatorische T-Zellen und plasmazytoide dendritische Zellen erkären könnte [54, 41]. Über die proteolytische Spaltung des Rezeptors des Fibroblasten-Wachstumfaktors-1 (FGFR-1) scheint GrB auch eine wachstumshemmende Wirkung auszuüben [99], ein Einfluss auf die Blutgerinnung ist über die Proteolyse des von-Willebrandt-Faktors (vWF) und von Plasmin denkbar [26, 113]. Im Rahmen der rheumatoiden Arthritis (RA) scheint GrB über die Spaltung von Aggrecan beim Verlust des Gelenkknorpels mitzuwirken [50, 155, 88, 53]. Zusätzlich ist GrB in der Lage, den Acetylcholin-Rezeptor zu spalten, was eine mögliche Beteilung bei der Entstehung der Myasthenia Gravis Einleitung 6 vermuten lässt [29]. Darüber hinaus scheint GrB auch bei anderen Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes (SLE) [19] und der systemischen Sklerose [139] eine Rolle zu spielen, da auch bei diesen Patienten erhöhte Serumspiegel an GrB nachgewiesen werden konnten. Nachdem GrB weit vielfältigere Funktionen als bisher gedacht einnimmt, gibt es noch eine Vielzahl offener Fragen bezüglich seiner Rolle im menschlichen Organismus, welche einer Klärung durch weitergehende Forschung bedürfen. 1.3 Die Bedeutung von IL-21 Das kürzlich entdeckte Interleukin-21 (IL-21) gehört zu den Typ-I Zytokinen und hat pleiotrope Effekte auf eine große Zahl von Zellen des Immunsystems [123, 148]. Es gehört zusammen mit IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15 zu der Gruppe von Zytokinen, die in ihrem Rezeptorkomplex eine γ-Kette aufweisen (common-γ-chain-Familie) [135, 107, 6]. Die Hauptproduzenten von IL-21 sind CD4+ -T-Zellen, Th17 -Zellen und NKT-Zellen [147, 36, 123]. Die Signaltransduktion erfolgt über den IL-21-Rezeptor, welcher aus der IL-21R-Kette und der common-γ-chain besteht [149]. Die intrazelluläre Signalweiterleitung (siehe auch Abbildung 1) erfolgt hierbei über die Aktivierung der Januskinasen (JAK) JAK-1 und JAK-3, welche wiederum die STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) Proteine STAT-1, STAT-3 und STAT-5 phosphorylieren [6, 172, 40]. Neben dem JAK-STAT-Signalweg sind in Abbildung 1 die wesentlichen biologischen Wirkungen von IL-21 auf verschiedene Zellen des Immunsystems dargestellt [37]. In dieser Arbeit liegt das Hauptaugenmerk auf den Auswirkungen von IL-21 auf BZellen. Die Wirkung scheint dabei stark von zusätzlichen Signalen abzuhängen, unter anderem von Toll-Like-Rezeptor (TLR)-Agonisten, der Stimulation des B-ZellRezeptors (BCR) und der Bindung des CD40-Liganden an CD40. Hierbei gibt es drei verschiedene Möglichkeiten. IL-21 kann erstens, in der Abwesenheit von sowohl B-Zell- Einleitung 7 Rezeptorstimulation als auch T-Zell-Hilfe, oder durch die gleichzeitige Stimulation eines TLR-Agonisten zur Apoptose der B-Zelle führen [79, 109, 147]. Des weiteren kann IL21 zusammen mit Co-Stimulation des CD40-Rezeptors und der Stimulation des BCR oder des TLR die Differenzierung der B-Zelle zu einer langlebigen B-Gedächtniszelle oder einer Antikörper-bildenden Plasmazelle fördern [147, 148, 47]. Drittens kann sich die B-Zelle in Abwesenheit eines CD40-Ligand-Stimulus mittels IL-21 zu einer GrBsezernierenden B-Zelle differenzieren [62, 63]. Abbildung 1: Schematische Darstellung des IL-21 Signalweges und dessen wesentliche biologische Wirkungen auf verschiedene Zielzellen [37] Abkürzungen: ADCC (Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität), Bcl-6 (B-Zell-Leukämie-6), Bim (Bcl-2 interacting mediator of cell death), Breg (regulatorische B-Zelle), CD (Cluster of Differentiation), CTL (Zytotoxische T-Zellen), DC (dendritische Zelle), γc (γ-Kette), GrA/B (Granzym A/B), IL (Interleukin), JAK (Januskinasen), NK (natürliche Killerzelle), Socs (Suppressor of cytokine signaling), STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), Tfh (Follicular helper T cell ), Tr1 (IL-10-secreting type 1 regulatory T cell ), Treg (regulatorische T-Zelle) Einleitung 1.4 8 Zielsetzung dieser Arbeit Wie bereits zu Beginn beschrieben gehört die Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen zu den wichtigsten Aufgaben der B-Zellen. Regulatorische bzw. zytotoxische Eigenschaften wurden hingegen erst in den letzten Jahren näher in Betracht gezogen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass IL-21 GrB und GrBbedingte Apoptose in malignen B-Zellen von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie auslösen kann [77]. Zudem sind CD5+ B-Zellen von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes und B-Zellen gesunder Probanden in der Lage, GrB zu bilden. Dies konnte auch bei kürzlich geimpften Probanden nach Stimulation mit dem viralen Antigen und IL-21 beobachtet werden [62, 60]. Neueste Ergebnisse zeigen hierbei, dass der CD40-Ligand bestimmt, ob sich die B-Zelle nach IL-21-Stimulation zu einer Plasmazelle [47, 121] oder, in seiner Abwesenheit, zu einer GrB-sezernierenden B-Zelle entwickelt [63]. In der vorliegenden Arbeit wurde speziell der zytotoxische Effekt von IL-21-stimulierten GrB-sezernierenden B-Zellen auf unterschiedliche Tumorzelllinien untersucht. Zudem erfolgte in diesem Zusammenhang die Untersuchung verschiedener GrB-Inhibitoren. Neben einigen Wirkstoffinhibitoren wurde dabei auch die Wirkweise eines neuen GrB-spezifischen Small Molecule Inhibitors (SMI) genauer charakterisiert. Kapitel 2 Material und Methoden Im ersten Teil des Kapitels (Kapitel 2.1) sind die verwendeten Materialien und Geräte dieser Doktorarbeit aufgelistet. Im zweiten Teil (Kapitel 2.2) werden die einzelnen Methoden näher erläutert. 2.1 Verwendete Materialien Geräte und Laborbedarf Tabelle 1: Verwendete Geräte und Laborbedarf Geräte und Laborbedarf Hersteller BD-Medimachine 6 BD Biosciences, Heidelberg, D Bildteiler: OptoSplit II Cairn Research, Faversham, UK Durchflusszytometer (FACScan) BD Immunzytometrische Systeme, Heidelberg, D Dynatech MR 7000 ELISA Reader Dynatech, Deckendorf, D ELISA-Platten MaxiSorp Nunc-immuno module, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, DK EMCCD Kamera: DV-887 Andor, Belfast, UK 9 Material und Methoden Geräte und Laborbedarf 10 Hersteller Eppendorf-Gefäße Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, D FACS-Röhrchen Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, D Feinwaage Sartorius AG, Göttingen, D FlowJo Software (Version 8.7.1) Tree Star, Ashland, OR, USA Handschuhe (Latex, Puderfrei) Ansell Healthcare, Brüssel, B ibiTreat ® -chamber-slide ibidi GmbH, Martinsried, D IBM SPSS Statistics (Version 21.0) IBM, New York, NY, USA ImageJ Software (Version 1.4) NIH, Bethesda, MD, USA Inkubator Memmert GmbH, Schwabach, D Inkubator Thermo Forma Inc., Whaltham, MA, USA Invertiertes Mikroskop: Axio Zeiss, Göttingen, D Observer Konfokaler Scankopf: CSU10 Yokogawa, Tokyo, JPN Kühlschrank Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach an der Riss, D Lichtmikroskop (CK-2) Olympus, Hamburg, D LS MACS Trennsäulen Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Magnetrührer (IKAMAG Rec G) IKA Labortechnik, Staufen, D Microsoft Office 2010 Microsoft, Redmond, WA, USA MidiMACS Seperator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Mikroskop-Inkubator PeCon GmbH, Erbach, D Milli Q Wasseraufbereitungssystem Millipore, Bredford, MA, USA Multiwell Kulturplatten (96-well BD Biosciences, Heidelberg, D Rundboden, Flachboden) Ölimmersionsobjektiv: UPlanSApo Olympus, Hamburg, D x60/1.35 Pipetten für Pipettierhilfe (Falcon) BD Biosciences, Heidelberg, D Pipettenspitzen Eppendorf AG, Hamburg, D Material und Methoden 11 Geräte und Laborbedarf Hersteller Pipettierhilfe (Pipetboy comfort/acu) Integra Biosciences, Fernwald, D Polypropylen-Falcon-Röhrchen BD Biosciences, Heidelberg, D (15ml/50ml) Schüttelgerät (Vortex-Genie 2) Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY Schüttler (HS250 basic) IKA Labortechnik, Staufen, D Schüttler (The BellyDancer) Stovall Life Science, Greensboro, NC, USA Schüttler (WT16) Biometra GmbH, Göttingen, D Skalpell Braun, Melsung, D Spannungsgeber (PowerPac 300) BioRad Laboratories, Hercules, USA Spritzen Braun, Melsung, D Sterilbank BDK, Luft und Steriltechnik GmbH, Sonnenbühl, D Vacutainer® Multiple Sample Luer BD Biosciences, Heidelberg, D Adapter Vacutainer® Röhrchen (Na-Heparin BD Biosciences, Heidelberg, D 170 I.U.) Vakuum-Pumpe: Vacuum Regulator, BioRad Laboratories, Hercules, USA Pump Flow Rate 900cu ft/min Vernichtungsbeutel Sarstedt AG &Co, Nümbrecht, D Wasserbad Julabo Innovate Temperature Technology, Seelbach, D Zählkammer (Neubauer) Brand, Wertheim, D Zellkulturflasche 25 bis 175 cm2 Sarstedt AG &Co, Nümbrecht, D Zentrifuge (4K15) Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, D Zentrifuge (Micromax) IEC - International Equipment Company, Chattanooga, USA Zentrifuge (Rotina 48 RS) HettichLab, Tuttlingen, D Material und Methoden 12 Chemikalien und Reagenzien Tabelle 2: Chemikalien und Reagenzien Substanz Hersteller 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)- Invitrogen Life Technologies GmbH, Ethansulfonsäure Darmstadt, D (HEPES) Acrylamid 4K-Lösung AppliChem GmBH, Darmstadt, D Aktives rekombinantes humanes GrB ALEXIS Biochemicals, AXXORA, Lörrach, D AIM-V Medium Gibco BRL, Grand Island, New York, USA Ammoniumchlorid (NH4 Cl) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D B Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D Biocoll Trennlösung Biochrom AG, Berlin, D Bovines Serumalbumin (BSA) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D Chromogenes GrB-Substrat ALEXIS Biochemicals, AXXORA, Ac-IEPD-pNA Lörrach, D Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat Merck KGaA, Darmstadt, D (Na2 EDTA) DNAse Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PAA The Cell Culture Company, (PBS) Pasching, A Dulbecco’s Modified Eagles Medium PAA The Cell Culture Company, (DMEM) Pasching, A Dynabeads Invitrogen Life Technologies GmbH, Darmstadt, D Ethanol Merck KGaA, Darmstadt, D Material und Methoden 13 Substanz F-12K Medium Hersteller PAA The Cell Culture Company, Pasching, A Fetal Calf Serum (FCS) Gold PAA The Cell Culture Company, Pasching, A Handdesinfektionsmittel Desomed, Freiburg, D Aseptoman® Pur Kalimhydrogencarbonat (KHCO3 ) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Natriumchlorid (NaCl) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Natronlauge (NaOH) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Paraformaldehyd Merck KGaA, Darmstadt, D PBS (10x) Invitrogen Life Technologies GmbH, Darmstadt, D Penicillin/Streptomycin PAA The Cell Culture Company, Pasching, A RPMI 1640 - Medium PAA The Cell Culture Company, Pasching, A Sterofundin Braun, Melsungen, D TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)- USB Europe GmbH, Staufen im Breisgau, propan-1,3-diol) D Triton X-100 Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Trypanblau Biochrom AG, Berlin, D Trypsin PAA The Cell Culture Company, Pasching, A Material und Methoden 14 Substanz Tween 20 Hersteller Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D X-VIVO Medium Lonza, Basel, CH Zellstimulatoren und Inhibitoren Tabelle 3: Zellstimulatoren und Inhibitoren Substanz Hersteller 3,4-Dichloroisocumarin Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, D Affini Pure F(ab’)2 Fragment Goat Jackson ImmunoResearch Laboratories, Anti-Human IgA+IgG+IgM Inc., West Grove, PA, USA (H+L)(anti-BCR) Ac-IEPD-CHO-Inhibitor American Peptide Company, Sunnyvale, (Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO) CA, USA Caspase-8 Inhibitor II Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, D Recombinant human Interleukin-2 PeproTech GmbH, Hamburg, D (IL-2) Recombinant human Interleukin-21 BioSource, Camarillo, CA, USA (IL-21) Small Molecule Inhibitor 8 (SMI8) SciFinder, CAS, Columbus, OH, USA Antikörper und Farbstoffe für Durchflusszytometrie Tabelle 4: Antikörper und Fluorochrome Substanz Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat Hersteller BD Biosciences, Heidelberg, D (FITC) CD19 R-Phycoerythrin (PE) BD Biosciences, Heidelberg, D Material und Methoden 15 Substanz Hersteller CD19 Peridinin-chlorophyll protein BD Biosciences, Heidelberg, D complex (PerCP) CellMask Deep Invitrogen, Carlsbad, CA, USA Red -Membranfärbung Diluent C Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D GranToxiLux fluorogenes Granzym Oncoimmunin Inc., Gaithersburg, MD, B Substrat USA PKH-26 Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Propidiumiodid (PI) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, München, D Puffer und Lösungen Tabelle 5: Puffer und Lösungen Puffer / Lösung ACK Lyse-Puffer: Substanz 0,15 M NH4 Cl, 1 mM KHCO3 , 0,1 mM Na2 EDTA, MilliQ (Reinstwasser) Annexin V-Bindungspuffer: 500 ml Sterofundin 5 ml 1M HEPES Blockier-Puffer (Zellisolation): PBS 0,5 % Tween 20 1 % BSA Material und Methoden 16 Puffer / Lösung Substanz Fixations-Puffer: 20 g Paraformaldehyd 250 ml MilliQ 5 ml 1 M NaOH 50 ml 10x PBS GrB-Aktivitäts-Assay-Puffer: 0,05 M TRIS 0,15 M NaCl 0,01 % Triton X-100 pH 8 MACS-Puffer: 1 l PBS 0.5 % BSA 2 mM EDTA pH 7,2 Zellen Die in dieser Doktorarbeit verwendeten Zelllinien sind in nachfolgender Tabelle (Tabelle 6) aufgeführt: Tabelle 6: Zelllinien Zelllinie Hersteller Zervixkarzinom: HeLa (CCL-2) ATCC-LGC Standards GmbH, Wesel, D Prostatakarzinom: PC3 (CRL-1435) ATCC-LGC Standards GmbH, Wesel, D Mammakarzinom: MM439 Universitätsfrauenklinik, Ulm, D EBV-transformierte B-Zellen: ATCC-LGC Standards GmbH, Wesel, D ARH-77 (CRL-1621) Material und Methoden 17 Neben Zelllinien wurden in dieser Doktorarbeit auch primäre menschliche Blut- und Gewebeproben verwendet. Die Spende der Blut- und Gewebeproben erfolgte freiwillig nach ausführlicher Aufklärung. Ein entsprechendes Ethikvotum der Universität Ulm wurde vor Beginn der Untersuchungen erteilt. Die Blutproben stammten aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums Ulm und wurden im Rahmen von Sectiones caesareae nach Abnabelung des Kindes aus der Nabelschnur mit 20 ml-Spritzen abgenommen und sofort steril in heparinisierte Vakutainer überführt. Die Tumorgewebeproben stammten aus der Klinik für Urologie, Universitätsklinikum Ulm. Tumorproben wurden direkt nach der Operation in mit Eis gekühltem Medium (25 ml AIM-V und 400 µl Heparin) für den Transport gelagert. 2.2 2.2.1 Methoden Zelllinien Um die zytotoxischen Eigenschaften von Granzym B-produzierenden B-Zellen auf Tumorzellen zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Zelllinien durchgeführt. Als Zielzellen für den zytotoxischen Effekt wurden die Tumorzelllinien HeLa, PC3 und MM439 verwendet. Die Zellen der ARH-77 Zelllinie dienten hierbei als Effektorzellen, da sie in Pilotexperimenten als hochpotente GrB-Produzenten identifiziert wurden. HeLa Bei HeLa-Zellen (siehe Abbildung 2) handelt es sich um eine Zelllinie, welche aus einem Zervixkarzinom etabliert wurde. Die Zellen wachsen adhärent und wurden bei 37◦ C und einem CO2 Gehalt von 5 % in einer Zellkulturflasche mit 175 cm2 Grundfläche angezogen. Als Kulturmedium wurde RPMI-1640 (RPMI) verwendet, welches mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS) und 1 % Penicillin und Streptomycin versetzt wurde. Ein Medienwechsel erfolgte alle 2-3 Tage. Ein Passagieren der Zellen erfolgte alle 5 bis 7 Tage bei einem Flächenbewuchs >90 %. Material und Methoden 18 Abbildung 2: Lichtmikroskopische Abbildungen von HeLa-Zellen [8] Links sind die Zellen in geringer, rechts in hoher Dichte dargestellt. Die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit Trypsin versetzt. Das Trypsin zerstört die Oberflächenmoleküle, welche für die Adhärenz der Zellen benötigt werden. Nach 2 bis 3 Minuten (min) bei 37◦ C lösten sich die Zellen durch leichtes Klopfen gegen die Flasche. Durch Zugabe von FCS-haltigem Medium wurde das Trypsin inaktiviert. Im Anschluss wurden die Zellen durch mehrmaliges Aufund Abpipettieren suspendiert und 0,5-1·106 Zellen in die Kulturflasche zurückgegeben. Um HeLa-Zellen zu konservieren, wurden die Zellen wie beim Passagieren trypsiniert und anschließend in einer Konzentration von 2·106 Zellen pro ml in RPMI mit 20 % FCS gegeben. 1 ml der Zellsuspension wurde zusammen mit 50 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 1,5 ml Kryoröhrchen eingefroren. Zum Einfrieren wurden die Zellen zunächst für 24 h bei -80◦ C und anschließend bei -196 ◦ C in flüssigem Stickstoff gelagert. Um die Zellen in den Kryoröhrchen schnell aufzutauen, wurden diese unter warmes Wasser gehalten und in vorgewärmtes Medium überführt. Anschließend wurden die Zellen in kleinen (25 cm2 ) und mittleren (75 cm2 ) Zellkulturflaschen angezogen und nach 2 Wochen in große (175 cm2 ) Zellkulturflaschen überführt. Material und Methoden 19 PC3 Bei PC3-Zellen (siehe Abbildung 3) handelt es sich um Prostatatumorzellen, welche aus einem Prostataadenokarzinom gewonnen wurden. Die Zellen wachsen adhärent und wurden bei 37◦ C und einem CO2 Gehalt von 10 % in einer Zellkulturflasche mit 175 cm2 angezogen. Zum Kultivieren der Zellen wurde Kaighn’s Modification of Ham’s F-12(F12K) Medium, welches mit 10 % FCS und 1 % Penicillin und Streptomycin versetzt war, verwendet. Ein Medienwechsel erfolgte alle 2-3 Tage. Abbildung 3: Lichtmikroskopische Darstellung von PC3-Zellen [9] Links sind die Zellen in geringer, rechts in hoher Dichte dargestellt. Das Passagieren der Zellen erfolgte analog zu den HeLa-Zellen. Das Trypsin wirkte 5 min auf die Zellen ein, bevor dessen Wirkung mit FCS-haltigem Medium abgestoppt wurde. In eine neue Kulturflasche wurden zwischen 1-2·106 Zellen zurückgegeben. Die Kryokonservierung und das Auftauen der Zellen erfolgte analog zu den HeLa-Zellen. MM439 Bei der MM439-Zelllinie handelt es sich um Mammakarzinomzellen. Diese Zellen wachsen ebenfalls adhärent und wurden wie die HeLa-Zellen bei 37◦ C und einem CO2 Gehalt von 5 % in einer Zellkultur Flasche mit 175 cm2 angezogen. Als Medium wurde Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) verwendet, welches mit 10 % FCS und 1 % Material und Methoden 20 Penicillin und Streptomycin versetzt war. Das Passagieren der Zellen erfolgte alle 8-12 Tage. Die Einwirkzeit von Trypsin lag bei 5-7 min. Von den resuspendierten Zellen wurden 3-4·106 Zellen zurück in eine neue Kulturflasche gegeben. Die Kryokonservierung und das Auftauen der Zellen erfolgte analog zu den HeLa-Zellen. ARH-77 Bei ARH-77-Zellen (siehe Abbildung 4) handelt es sich um nicht adhärente, EBVtransformierte B-Zellen aus einer B-Zell-Leukämie, welche aus peripherem Blut gewonnen wurden. In den Experimenten wurden die Zellen dieser Zelllinie als Effektorzellen eingesetzt. Kultiviert wurden die ARH-77-Zellen in RPMI, welches mit 10 % FCS und 5 % Penicillin und Streptomycin versetzt war. Die Zellkulturflasche mit 75 cm2 wurde senkrecht im Brutschrank bei 37◦ C und einem CO2 Gehalt von 5 % gelagert. Abbildung 4: Lichtmikroskopische Abbildung von ARH-77-Zellen [7] Links sind die Zellen in geringer, rechts in hoher Dichte dargestellt. Da es sich bei ARH-77 um Suspensionszellen handelt, mussten die Zellen beim Passagieren nicht mit Trypsin behandelt werden. Das Medium wurde von den Zellen abzentrifugiert und 1 · 106 Zellen wurden in eine neue Kulturflasche zurückgegeben. Bis auf den Trypsinisierungsschritt wurden die ARH-77-Zellen auf die gleiche Weise wie HeLa-Zellen kryokonserviert und aufgetaut. Material und Methoden 2.2.2 21 Isolation von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Für die Gewinnung der B-Zellen aus Nabelschnurblut wurden zuerst die mononukleären Zellen unter sterilen Bedingungen durch eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Blutproben wurden hierfür mit PBS im Verhältnis 1:5 verdünnt. In 50 mlFalcon-Röhrchen wurden nun 15 ml 37◦ C warmes Ficoll gegeben, welches vorsichtig mit 35 ml des verdünnten Blutes überschichtet wurde. Die Falcon-Röhrchen wurden nun vorsichtig zentrifugiert (Zentrifuge Sigma 4K15C, 1000 g, 20◦ C, 15 min, niedrige Beschleunigung und Bremsung). Durch das Zentrifugieren trennen sich die einzelnen Blutbestandteile aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte voneinander, wodurch verschiedene Schichten entstehen (siehe Abbildung 5). Abbildung 5: Prinzip der Dichtegradientenzentrifugation [115] Das verdünnte Blut wird über das Ficoll geschichtet und zentrifugiert (links). Erythrozyten und Granulozyten haben eine höhere Dichte als Ficoll und sammeln sich am Boden. Zwischen der Plasma- und der Ficollschicht sammelt sich ein weißer Ring aus mononukleären Zellen, welcher mit der Pipette abgenommen werden kann (rechts). Die mononukleären Zellen sammeln sich dabei zwischen Ficoll und Plasma und bilden dort einen weißlichen Ring, wohingegen sich die roten Blutzellen am Boden des Gefäßes ansammeln. Die mononukleären Zellen wurden nun in ein neues 50 ml-Falcon- Material und Methoden 22 Röhrchen überführt, mit PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (Zentrifuge Sigma 4K15C, 520 g, 20◦ C, 10 min). Um die verbleibenden roten Blutzellen zu entfernen, wurden die Zellen nun zweimal für jeweils 7 Minuten mit 5 ml Ammoniumchlorid KaliumHydrogencarbonat (ACK)-Lyse-Puffer versetzt, um die Erythrozyten zu lysieren. Zwischen den einzelnen Lysierungsschritten erfolgte ein Abstoppen der Lyse durch Zugabe von 40 ml PBS und eine erneute Zentrifugation (Zentrifuge Hettich Rotina 48RS, 400 g, 4◦ C für 7 min). Nach Beendigung der Lyse wurden die Zellen in 50 ml PBS resuspendiert und mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Neubauer-Zählkammer Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 25 µl der Zelllösung mit 25 µl Trypanblau gemischt. Diese Mischung wurde mit Hilfe einer Pipette unter das Deckglas der NeubauerZählkammer gegeben. Vor dem Pipetieren wurde sichergestellt, dass Newtonsche Ringe zu sehen waren und das Deckglas somit korrekt auflag. Die äußeren 4 Quadranten wurden nun ausgezählt. Das Volumen eines Quadrates beträgt hierbei genau 0,1 µl. Somit ergibt sich für die Berechnung der Zellzahl folgende Formel: x x 10000 Zellen ·2= ·2· = 4 · 0, 1 µl 4 ml ml (1) Dabei bezeichnet x die Anzahl der gezählten Zellen in der Neubauer-Zählkammer, der Faktor 2 berücksichtigt die zur Zählung der Zellen notwendige Verdünnung mit Trypanblau. 2.2.3 B-Zell-Isolation mittels Magneten Um Experimente mit hochreinen B-Zellen durchführen zu können, wurden aus mononukleären Nabelschnurzellen (siehe Kapitel 2.2.2) die B-Zellen mit Hilfe des B-Zell- Isolationskits II von Miltenyi Biotec gewonnen. Nach Protokoll des Herstellers wurden die Zellen in PBS gewaschen und in Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)-Puffer (20 µl auf 107 Zellen) resuspendiert. Nicht-B-Zellen wie T-Zellen, NK-Zellen, dendritische Material und Methoden 23 Zellen, Granulozyten und Erythrozyten wurden durch einen Cocktail aus Antikörpern gegen Cluster of Differentiation CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 und CD235a (Glycophorin A) markiert (5 µl Biotin Antikörper auf 107 Zellen). Die Zellen wurden in ein neues Gefäß überführt und für 10 Minuten bei 4◦ C inkubiert. Anschließend wurden MACS-Puffer (15 µl auf 107 Zellen) und Anti-Biotin markierte paramagnetische Mikrobeads (10 µl auf 107 Zellen) hinzugefügt. Die Zellen wurden in ein neues Gefäß überführt und für weitere 15 Minuten bei 4◦ C inkubiert. Zum Schluss wurden die Zellen mit MACS-Puffer (1-2 ml auf 107 Zellen) gewaschen (Zentrifuge Hettich Rotina 48RS, 400 g, 4◦ C für 7 min). Der Überstand wurde abgenommen und das Zellpellet in MACSPuffer (500 µl auf 108 Zellen) resuspendiert. Die B-Zellen wurden nun durch negative Selektion gewonnen, indem die Zellsuspension auf eine magnetische Auftrennungssäule der Größe LS gegeben wurde. Die magnetischen Biotin-markierten Nicht-B-Zellen bleiben an der Stahlwollematrix der Säulen hängen, wohingegen die unmarkierten B-Zellen einfach durch die Säule hindurchfließen und darunter aufgefangen werden können. Die gesammelten B-Zellen wurden in AIM-V Medium überführt. Die Reinheit der isolierten B-Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt, indem die Zellen mit anti-CD19 PE markiert wurden (siehe Kapitel 2.2.7.2). Im Allgemeinen lag die Reinheit der B-Zellen bei >99 %. 2.2.4 Primäres Tumorgewebe Als Gewebeprobe wurde ein Nierentumor aus der urologischen Universitätsklinik Ulm verwendet. Die Tumorprobe wurde in einer Petrischale mit 4-5 ml X-VIVO-Medium, welches mit 0,08 mg/ml DNAse versetzt war, steril in 2-3 mm2 große Stücke geschnitten. 4-5 dieser Stücke wurden zusammen mit 1,5 ml X-VIVO Medium (DNAse versetzt) in ein Medicon gegeben und für 30-45 s in der Medimachine zerkleinert. Um die verbliebenen Erythrozyten zu entfernen, wurde die Zellsuspension mit Lysepuffer für 7 min behandelt. Die Lyse wurde mit 20 ml X-VIVO Medium abgestoppt. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation der Zellen bei 400 g für 7 min. Mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer Material und Methoden 24 wurden die Zellen gezählt und anschließend in Medium mit der gewünschten Versuchskonzentration gelöst. Zum Nachweis einer B-Zell-Infiltration im Tumorgewebe wurde der Oberflächenmarker CD19 mittels Durchflusszytometrie auf den Zellen untersucht. Die Markierung der Zellen erfolgte wie in Kapitel 2.2.7.2 beschrieben. 2.2.5 Co-Kulturen und Zellstimulation Bei den Experimenten mit den Zelllinien wurden die Tumorzellen in Co-Kultur mit ARH-77-Zellen in einer 96-well -Kulturplatte (200 µl/well ) bei 37◦ C und einem CO2 Gehalt von 5 % für 3 Tage inkubiert. Das Verhältnis der Zellen in der Co-Kultur betrug 5 ARH-77-Zellen auf 1 Tumorzelle. In einem well befanden sich somit 2, 5·105 Effektorzellen (ARH-77) zusammen mit 5 · 104 Tumorzellen. In den Kontrollproben ohne ARH77-Zellen befanden sich 5 · 104 Tumorzellen. Die Zellen wurden jeweils in ihrem eigenen Medium zur Co-Kultur hinzugefügt und entsprechend des Versuchsansatzes zu Beginn entweder mit IL-21, IL-2 oder gar nicht stimuliert. Die zur Hemmung des zytotoxischen Effekts eingesetzten Inhibitoren wurden in unterschiedlichen Konzentrationen zu Beginn des Experiments zu den Zellen gegeben und gegebenfalls während der Inkubation an Tag 1 und Tag 2 erneut hinzugefügt (Caspase-8 Inhibitor II, 3,4-Dichloroisocumarin). An Tag 3 wurden die Zellen dann in FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)-Röhrchen überführt und das Überleben der Zellen mittels Annexin V/PI Färbung (siehe Kapitel 2.2.7.4) gemessen. Zur Unterscheidung der Zellen in der Durchflusszytometrie (siehe Kapitel 2.2.7.1) wurden die Tumorzellen vor der Co-Kultur mit PKH-26 (siehe Kapitel 2.2.7.3) angefärbt. Tabelle 7: Endkonzentrationen der Zellstimulantien (BCR = B-Zell-Rezeptor) Reagenz Endkonzentration Recombinant human Interleukin-2 (IL-2) 100 U/ml (10 ng/ml) Recombinant human Interleukin-21 (IL-21) 50 ng/ml Material und Methoden Reagenz Affini Pure F(ab’)2 Fragment Goat 25 Endkonzentration 6,5 µg/ml Anti-Human IgA+IgG+IgM (H+L)(anti-BCR) 3,4-Dichloroisocumarin 10 µM, 20 µM Ac-IEPD-CHO-Inhibitor 5 µM, 10 µM (Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-CHO) Caspase-8 Inhibitor II 5 µM, 10 µM Small Molecule Inhibitor 8 (SMI8) 5 µM, 10 µM, 20 µM Für die Experimente mit Nabelschnur-B-Zellen wurden die B-Zellen zunächst in Zellkulturflaschen (25 cm2 ) für 3 Tage entsprechend der Versuchsansätze mit IL-21 und anti-BCR, mit anti-BCR alleine oder gar nicht stimuliert. Zu Beginn der Co-Kultur wurden die Zellen erneut auf die selbe Weise stimuliert. Die verwendeten Endkonzentrationen der Stimulantien und Hemmstoffe sind Tabelle 7 zu entnehmen. 2.2.6 Messung der IC50 einzelner Granzym B-Inhibitoren Für die Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50 ), also der Konzentration, bei der eine halbmaximale Inhibition erfolgt, wurde ein Granzym B-Aktivitäts-Assay durchgeführt, welcher anschließend mittels einer Probit-Analyse in SPSS ausgewertet wurde. Granzym B-Aktivitäts-Assay Um die Effekte unterschiedlicher funktioneller Inhibitoren auf die Aktivität von Granzym B (GrB) zu bestimmen, wurde ein Aktivitäts-Assay mit aktivem rekombinanten humanem GrB durchgeführt. Für dieses aktive rekombinante GrB ist festgelegt, dass eine Einheit 1 nmol des chromogenen Substrats Ac-IEPD-pNA pro Minute bei 25◦ C in Assay-Puffer bei pH 8 hydrolisiert. Für die Messung wurden auf einer ELISA (Enzyme- Material und Methoden 26 Linked Immunosorbent Assay)-Platte 100 µl rekombinantes GrB (100 ng/ml) in jedes well gegeben und die einzelnen Inhibitoren in unterschiedlichen Konzentrationen (100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 µM) hinzugefügt. Nach Zugabe des Substrats (200 µM) wurde die Platte sofort sowie nach 30, 60, 90 und 120 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur (RT) mit einem ELISA-Reader bei 405 nm analysiert. Die untere Nachweisgrenze für das chromogene GrB Substrat lag bei 15,625 pg/ml. Mit den so erhaltenen Werten konnte die IC50 bestimmt werden. Die Berechnung erfolgte mit der Probit Analyse von SPSS. 2.2.7 Durchflusszytometrie: Prinzip und Färbungen Die Durchflusszytometrie ist eine Methode der Zellanalyse, mit welcher Zelleigenschaften auf Einzelzellebene analysiert und untersucht werden können. Dies ermöglicht das Zuordnen der Zellen zu einzelnen Populationen. 2.2.7.1 Funktionsweise Das Durchflusszytometer saugt für die Analyse das Zellgemisch an, wodurch es zu einem laminaren Strom aus Zellen kommt. Durch Passieren eines Laserstrahls verursacht jede einzelne Zelle Streulicht. Die Intensität bzw. Unterbrechungsdauer des Vorwärtsstreulichts ist hierbei abhängig von der Größe der Zelle, die Intensität des Seitwärtsstreulichts von der Granularität der Zelle. Die Ablenkung des Lichtes wird mittels verschiedener Detektoren gemessen. Zur Unterscheidung der Zellen können diese auch mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt werden. Es können dabei bestimmte Antigene auf der Zelloberfläche durch fluoreszierende Antikörper markiert werden (siehe Kapitel 2.2.7.2) oder auch die ganze Zellmembran (siehe Kapitel 2.2.7.3). Bei den mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Zellen wird der Farbstoff durch den Laserstrahl angeregt und ebenfalls mit einem Detektor gemessen (siehe Abbildung 6). Die so erhaltenen Daten wurden mit der FlowJo Software ausgewertet (siehe Kapitel 2.2.7.5). Material und Methoden 27 Abbildung 6: Funktionsweise des Durchflusszytometers [116] Um bestimmte Zellen zu identifizieren, können diese mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden (Bild oben). Die Zellen werden in einem laminaren Strom in das Durchflusszytometer gesogen. Beim Passieren des Lasers wird durch Ablenkung des Laserstrahls die Größe, Granularität und Fluoreszenz über Detektoren bestimmt (Bild unten). Diese Daten werden dann mit Hilfe eines Computers ausgewertet. 2.2.7.2 Markierung mit einem Oberflächenmarker Zur Untersuchung der Reinheit der B-Zellen (siehe Kapitel 2.2.3) oder des Nachweises von B-Zellen (siehe Kapitel 2.2.4) wurde eine Zellsuspension von 200 µl in FACSRöhrchen gegeben. Die Zellen wurden mit 2 µl Phycoerythrin(PE)-konjugierten antiCD19-Antikörpern für 15 min im Dunkeln bei RT inkubiert, anschließend mit 3 ml PBS gewaschen und zentrifugiert (Zentrifuge Hettich Rotina 48RS, 400 g, 4◦ C für 7 min). Der Überstand in den FACS-Röhrchen wurde abgenommen und die Probe im Durchflusszytometer gemessen (siehe Kapitel 2.2.7.1). Material und Methoden 2.2.7.3 28 Färbung der Zellen mit PKH-26 Um die Zellen bei der Durchflusszytometrie (s. Kapitel 2.2.7.1) voneinander zu unterscheiden, wurden bei den Experimenten mit den Zelllinien die Tumorzellen mit PKH26 angefärbt, wodurch sie von den ungefärbten ARH-77- bzw. Nabelschnur-B-Zellen leicht zu unterscheiden waren. Die adhärenten Zellen wurden für die Färbung mit einem Schaber aus der Flasche gelöst und mit dem Medium zusammen zentrifugiert (Zentrifuge Hettich Rotina 48RS, 400 g, 4◦ C für 7 min). Alle weiteren Waschschritte mit der Zentrifuge erfolgten unter den selben Bedingungen. Die ARH-77-Zellen wurden mit der Pipette aus der Kulturflasche entnommen und wie die adhärenten Zellen ebenfalls abzentrifugiert. Für die Färbung wurden meist 1 · 107 Zellen verwendet. Bei anderen Zellzahlen wurden die Reagenzien der Zellzahl entsprechend angepasst. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand komplett abgenommen und die Zellen in 250 µl Diluent C gelöst. Nun wurden die Zellen in ein 15 ml-Gefäß überführt, in dem sich schon weitere 250 µl Diluent C und 6 µl PKH-26 befanden. Die Zellen wurden nun 8 min bei RT inkubiert. Mit 10 ml RPMI-Medium wurde die Färbereaktion abgebrochen. Nach 1 min wurde das Gefäß mit PBS auf 15 ml aufgefüllt und die Zellen anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt und die Zellen im verbleibenden Rest gelöst und in ein 50 ml Gefäß überführt. Das Gefäß wurde auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und die Zellen danach erneut zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zwei Mal wiederholt. Anschließend wurden die Zellen in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Das PBS wurde nun von den Zellen abzentrifugiert und die Zellen mit ihrem Medium in der gewünschten Zellkonzentration gelöst. Zur Überprüfung der Färbung wurde eine ungefärbte Probe mit einer gefärbten Probe im Durchflusszytometer überprüft. Die Anzahl der gefärbten Zellen lag bei den Experimenten >99,7 %. 2.2.7.4 Annexin V/PI Färbung Wenn eine Zelle in Apoptose geht kommt es zu einer Translokation des Phospholipids Phosphatidylserin (PS) von der Innenseite der Plasmamembran auf die Außenseite Material und Methoden 29 [104]. Annexin V ist ein Ca2+ -abhängiges PS-bindendes Protein. Kommt es nun bei einer Zelle zum Zelltod, so kann Annexin V an PS binden und der gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff ist im Durchflusszytometer nachweisbar. Propidiumiodid (PI) ist in der Lage, die defekte Zellmembran bei einer toten Zelle zu durchdringen und im Innern der Zelle an die DNA zu binden. Die so angefärbten Zellen sind ebenfalls im Durchflusszytometer nachweisbar. Durch diese Kombinationsfärbung können nun lebendige (Annexin V und PI negativ (neg)) Zellen von toten Zellen unterschieden werden [164]. Für die Apoptosemessung wurden die Zellen aus ihrer 96-well -Platte mit einer Pipette gelöst und in FACS-Röhrchen überführt. Die einzelnen Röhrchen wurden mit je 2 ml Annexin V-Bindungspuffer gewaschen und zentrifugiert (Zentrifuge Hettich Rotina 48RS, 400 g, 4◦ C für 7 min). Der Überstand wurde bis auf einen kleinen Überrest abgesaugt. Zur Lösung des Zellpellets wurden die Zellen in der restlichen Flüssigkeit suspendiert. In jedes Röhrchen wurden nun 2 µl Annexin V gegeben und mit der Zellsuspension vermischt. Die Proben wurden nun für 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert und anschließend erneut mit Annexin V-Puffer gewaschen und zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut abgesaugt und die Zellen mit dem verbleibenden Überstand gemischt. Direkt vor der durchflusszytometrischen Messung wurde zu den Proben jeweils 3 µl PI gegeben. 2.2.7.5 Auswertung der Ergebnisse Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie wurden mit Hilfe des Computerprogramms FlowJo ausgewertet. Für die Auswertung wurden zunächst die Zellen ausgewählt, bei denen der Anteil der lebenden Zellen von Interesse war. Diese Zellen waren vor der Co-Kultur mit PKH-26 angefärbt worden (siehe Kapitel 2.2.7.3). In der FlowJoAuswertung war bei diesen Zellen die Intensität der Fluoreszenz höher als bei den ungefärbten Zellen, wodurch diese Zellen eindeutig als PKH-26-positive Zellen markiert werden konnten (siehe Abbildung 7). Nachdem die PKH-26-positiven Zellen ausgewählt wurden, wurden diese nun mittels Material und Methoden 30 Abbildung 7: Exemplarische Auswertung einer Co-Kultur mittels der FlowJo Software Auf der Y-Achse ist das Seitwärtsstreulicht (SSC) aufgetragen, auf der XAchse die Intensität der Fluoreszenz. Bei der Auswertung der Ergebnisse werden zuerst die Zellen ausgewählt, welche PKH-26-positiv sind (roter Kasten). Annexin V/PI-Färbung beurteilt. Wie in Kapitel 2.2.7.4 beschrieben, werden durch Annexin V die früh-apoptotischen Zellen markiert und durch PI die spät-apoptotischen bzw. die nekrotischen Zellen. Bei den Annexin V und PI negativen Zellen handelt es sich somit um lebende Zellen (siehe Abbildung 8). Die Markierung der CD19-positiven Subpopulation erfolgte analog zum Gating der PKH-26-Zellen. 2.2.8 Konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurde die Interaktion zwischen ARH-77- und HeLa-Zellen in Echtzeit beobachtet. Der Versuchsaufbau bestand hierbei aus einem invertierten Mikroskop (Axio Observer, Zeiss) mit einem Ölimmersionsobjektiv (UPlanSApo x60/1.35, Olympus, Hamburg, D) und einem konfokalen Scankopf (CSU10, Yokogawa, Tokyo, JPN), einem Mikroskop-Inkubator (PeCon GmbH, Erbach, D) einem Material und Methoden 31 Abbildung 8: Analyse des Zellüberlebens der PKH-26-positiven Zellen mit der Annexin V/Propidiumiodid (PI) Färbung Durch die Färbung mit Annexin V und PI können lebendige Zellen (grün) von früh-apoptotischen- (rot) und nekrotischen-/spät-apoptotischen Zellen (schwarz) unterschieden werden. Bildteiler (OptoSplit II, Cairn Research, Faversham, UK) sowie einer EMCCD Kamera (DV-887, Andor, Belfast, UK). Die Bildverarbeitung erfolgte mittels der ImageJ Software (Version 1.4, NIH, Bethesda, MD, USA). Die ARH-77-Zellen wurden für 24 bzw. 36 h in der Gegenwart von IL-21 (50 ng/ml) vorstimuliert (1·106 Zellen/ml, 200 µl/well). Anschließend erfolgte die Oberflächenfärbung mit 5µl anti-CD19 Peridinin-chlorophyll protein complex (PerCP) für 15 min. Die so angefärbten Zellen wurden gewaschen, zentrifugiert und in RPMI resuspendiert. 1 · 105 anti-CD19 PerCP gefärbte ARH-77-Zellen wurden in ibiTreat ® -chamber-slides gegeben, in welchen sich schon 2, 5 · 104 immobilisierte HeLa Zellen befanden, deren Membranen zuvor mit CellMask Deep Red -Membranfärbung (5 µ/ml Medium) angefärbt worden waren. Die HeLa-Zellen wurden hierbei für 5 min mit dem Farbstoff inkubiert und anschließend fünfmal mit jeweils 100 µl PBS vorsichtig gewaschen. Die ARH-77/HeLa Co-Kultur mit den für 24 h vorstimulierten ARH-77-Zellen wurde für weitere 16 h zusammen mit IL-21 (50 ng/ml) inkubiert, bevor sie nach Zugabe von 50 µl GranToxiLux für 3 h mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie beobachtet Material und Methoden 32 wurde. Die Co-Kultur aus ARH-77/HeLa-Zellen, welche die für 36 h vorinkubierten ARH-77-Zellen enthielt, wurde hingegen sofort mit 50 µl GranToxiLux angefärbt und für eine Zeitdauer von 14 h beobachtet. 2.2.9 Statistik Die Daten der wiederholten Experimente sind als Mittelwert +/- Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. Die statistische Signifikanz von Unterschieden wurde durch den paarigen oder unpaarigen, zweiseitigen Student’s t-Test für gleiche oder ungleiche Varianzen berechnet. p-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen und mit einem * gekennzeichnet, p-Werte <0,01 wurden als hochsignifikant angesehen und mit ** gekennzeichnet. Die statistischen Berechnungen und die graphischen Abbildungen wurden mit Hilfe von Microsoft Office Excel 2010 und Microsoft Office Powerpoint 2010 erstellt. Kapitel 3 Ergebnisse In vorausgehenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass das Zytokin Interleukin-21 (IL-21) eine wesentliche Rolle bei der Expression von Granzym B (GrB) in B-Zellen spielt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung dieser GrB-positiven (GrB+ ) B-Zellen im Rahmen von malignen Erkrankungen näher untersucht. Kapitel 3.1 befasst sich hierbei mit dem zytotoxischen Effekt von ARH-77 B-Zellen auf verschiedene Tumorzelllinien. Die Hemmung des zytotoxischen Effekts durch unterschiedliche GrB-Inhibitoren wird in Kapitel 3.2 behandelt. In Kapitel 3.3 wird der zytotoxische Effekt von NabelschnurB-Zellen auf verschiedene Tumorzelllinien gezeigt, die B-Zell-Infiltration in primärem Tumorgewebe ist Gegenstand von Kapitel 3.4. 3.1 Zytotoxischer Effekt von ARH-77 B-Zellen auf verschiedene Tumorzelllinien Zu Beginn wurde der zytotoxische Effekt von Granzym B-produzierenden B-Zellen auf Tumorzellen untersucht. Hierfür wurden Zellen der Zelllinie ARH-77 (EBV-transformierte B-Zellen) mit verschiedenen Tumorzelllinien inkubiert. Zur Unterscheidung der Zellpopulationen wurden die Tumorzellen vor Beginn des Experiments mit PKH- 33 Ergebnisse 34 26 angefärbt. Die Effektorzellen (ARH-77) wurden in einer Konzentration von 5:1 zu den Zielzellen (Tumorzellen) gegeben. Die Zellen wurden gemeinsam in einer 96-well Kulturplatte inkubiert und mit bzw. ohne IL-21 (50 ng/ml) stimuliert. Nach 3 Tagen wurde die Apoptose der Zielzellen bestimmt. Hierfür wurden die Co-Kulturen mit Annexin V/PI angefärbt und mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 9: Zytotoxischer Effekt von GrB+ B-Zellen bei Tumorzelllinien 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5 · 104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (Tumorzellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. In den IL-21-stimulierten Co-Kulturen kam es bei den Mammakarzinomzellen (MM439) zu einem signifikanten, bei den Zervixkarzinom-Tumorzellen (HeLa) und ProstataTumorzellen (PC3) sogar zu einem hochsignifikanten Anstieg der apoptotischen Zellen (siehe Abbildung 9). Keinen proapoptotischen Effekt konnte man hingegen in den Kontrollen sehen, in welchen die Effektorzellen (ARH-77) anstelle von IL-21 mit dem verwandten, aber nicht GrB-induzierenden IL-2 behandelt oder in denen die Zielzellen Ergebnisse 35 alleine kultiviert wurden. Es zeigte sich jedoch im Vergleich zu den allein aus HeLaZellen bestehenden Monokulturen eine insgesamt reduzierte Viabilität der HeLa-Zellen, welche sich mit ARH-77-Zellen in einer Co-Kultur befanden. Dies ist auf eine deutlich bessere Nährstoffversorgung und eine geringere Zelldichte in den Monokulturen zurückzuführen und sollte daher keinen Einfluss auf die Tendenz der Versuchsergebnisse haben. Exemplarisch sind die Kontrollen der Experimente zwischen HeLa-Zellen und ARH-77-Zellen in Abbildung 10 dargestellt. Für die einzelnen Co-Kulturen wurden jeweils mindestens 3 unabhängige Experimente durchgeführt. Abbildung 10: Negativkontrollen des zytotoxischen Effekts am Beispiel von HeLa-Zellen 5 · 104 PKH-26-gefärbte Zielzellen (HeLa-Zellen) wurden zusammen mit 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77), beziehungsweise ohne diese, inkubiert. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) oder IL-2 (100 U/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, ** bedeutet p < 0,01. Ergebnisse 36 Abbildung 11: Konfokalmikroskopische Aufnahmen der Interaktion von GrBsezernierenden ARH-77-Zellen mit Tumorzellen [63] (a) Anti-CD19 PerCP gefärbte ARH-77-Zellen wurden für 24 h in der Gegenwart von Interleukin-21 (IL-21) vorinkubiert (1 · 106 Zellen/ml). 1 · 105 dieser anti-CD19 PerCP gefärbten ARH-77-Zellen (violett) wurden dann auf ein ibiTreat ® -chamber-slide zu 2, 5 · 104 immobilisierten HeLa-Zellen gegeben, welche zuvor mit CellMask Deep Red -Membranfärbung (rot) angefärbt wurden. Anschließend wurden die Zellen für weitere 16 h inkubiert, bevor GranToxiLux fluorogenes GrB-Substrat (grün) hinzugefügt wurde und die Zellen für 3 h mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie beobachtet wurden. (b) ARH-77-Zellen wurden für 36 h in Gegenwart von IL-21 vorinkubiert (1 · 106 Zellen/ml). 1 · 105 dieser ARH-77-Zellen wurden gewaschen, mit anti-CD19 PerCP (blau) angefärbt und zu 2, 5 · 104 , mit CellMask Deep Red -Membranfärbung angefärbten HeLa-Zellen (rot) auf ein ibiTreat ® -chamber-slide gegeben. Zum Schluss wurde GranToxiLux fluorogenes Granzym B-Substrat (gelb) hinzugefügt. Die konfokale Mikroskopie wurde für 14 h durchgeführt. Die weißen Pfeile zeigen eine HeLa-Zelle, welche durch GrB+ ARH-77-Zellen angegriffen wird. Ergebnisse 37 Um nun die Interaktion zwischen den GrB+ ARH-77-Zellen und HeLa-Zellen sichtbar zu machen, wurde eine Co-Kultur aus ARH-77- und HeLa-Zellen mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie und der Zugabe eines fluoreszierenden GrB-Substrates beobachtet. Zur Unterscheidung der Zellen wurden die ARH-77-Zellen einerseits mit anti-CD19 PerCP angefärbt und die HeLa-Zellen ihrerseits mit CellMask Deep Red Membranfärbung. Das enzymatisch aktive GrB wurde mit Hilfe von GranToxiLux , einem fluorogenen GrB-Substrat sichbar gemacht. Abbildung 11(a) zeigt, wie eine ARH77-Zelle (violett) enzymatisch aktives GrB (grün) in eine HeLa-Zelle (rot) transferieren. In Abbildung 11(b) sieht man nun wie der Angriff durch GrB+ ARH-77-Zellen (blau, gelb) zur apoptotischen Schrumpfung einer HeLa-Zelle (rot, weißer Pfeil) führt. 3.2 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch verschiedene GrB-Inhibitoren Um die Wirkung dieses zytotoxischen Effekts eindeutig auf B-Zell-sezerniertes GrB zurückzuführen, wurden im folgenden verschiedene Experimente zur spezifischen Hemmung der GrB-Wirkung durchgeführt. 3.2.1 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch Granzym BInhibitor Ac-IEPD-CHO Zu Beginn wurde der bekannte GrB-Inhibitor Ac-IEPD-CHO zur Hemmung des zytotoxischen Effekts bei den Experimenten eingesetzt. Bei diesem Wirkstoff handelt es sich um einen reversiblen, zellpermeablen GrB Inhibitor. Die Zellkulturen wurden wieder in einer 96-well -Platte angesetzt und mit IL-21 stimuliert. Die Zellzahlen und Stimulantienkonzentrationen entsprachen hierbei den Versuchen zum Nachweis des zytotoxischen Effekts in Kapitel 3.1. Zu den mit IL-21 stimulierten Co-Kulturen wurde nun der Ac-IEPD-CHO-Inhibitor in den Konzentrationen 5 µM und 10 µM hinzugefügt. Ergebnisse 38 Nach 3 Tagen wurde das Überleben der Zielzellen durch Annexin V/PI-Färbung gemessen. Der prozentuale Anteil der nicht-apoptotischen Zellen war in den Proben mit Inhibitor signifikant höher als in den Proben ohne Inhibitor. Abbildung 12: Hemmung des zytotoxischen Effekts bei Tumorzellen durch den GrB-Inhibitor Ac-IEPD-CHO 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5 · 104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (Tumorzellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen des Substrat-Inhibitors Ac-IEPD-CHO hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. Tendentiell zeigte sich hierbei eine Konzentrationsabhängigkeit (siehe Abbildung 12). Die als Kontrolle durchgeführten Experimente mit IL-2 sowie ohne Effektorzellen zeigten keine Erhöhung der lebendigen Zellen in Gegenwart des Inhibitors. Ergebnisse 3.2.2 39 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch SMI8 Um eine noch spezifischere Hemmung der GrB-Wirkung zu erzielen, wurde ein Small Molecule Inhibitor (SMI8) [120] verwendet, welcher gezielt auf die Bindungsstelle des GrB angepasst wurde. Abbildung 13: Bestimmung der IC50 von SMI8 bzw. Ac-IEPD-CHO Die Bestimmung der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50 ) erfolgte mittels eines GrB-Aktivitäts-Assay. Mittels Probit Analyse (SPSS) wurde aus den gewonnenen Daten die IC50 des Small Molecule Inhibitors ermittelt (links). Zum Vergleich erfolgte auch eine Bestimmung der IC50 von Ac-IEPD-CHO (rechts). Um die Wirkungsweise näher zu spezifizieren, wurde die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC50 ) von SMI8 mit Hilfe eines GrB-Aktivitäts-Assay bestimmt. Wie in Kapitel 2.2.6 beschrieben wurde sowohl für SMI8 als auch zum Vergleich für AcIEPD-CHO ein Aktivitäts-Assay durchgeführt. Die Analyse der Daten erfolgte mittels Probit-Analyse anhand von SPSS. Wie in Abbildung 13 dargestellt, ergab sich für Ac-IEPD-CHO eine IC50 von 1,43 µM bei einem SEM von 0,248, für die IC50 von SMI8 ergab sich ein Wert von 9,445 µM mit einem SEM von 0,963. Auf Basis dieser Messungen wurden für die nachfolgenden Experimente Konzentrationen zwischen 5 und 20 µM SMI8 verwendet. Die Zellen wurden analog zu den Experimenten zum Nachweis des zytotoxischen Effekts Ergebnisse 40 behandelt (siehe Kapitel 3.1). Zu den einzelnen Versuchsansätzen wurde in aufsteigender Konzentration der SMI hinzugefügt. Wie im Balkendiagramm 14 abgebildet sieht man eine signifikante Verringerung der Apoptose sowohl bei den HeLa-Zellen als auch bei den PC3-Zellen. Abbildung 14: Hemmung des zytotoxischen Effekts bei Tumorzellen durch SMI8 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5 · 104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (Tumorzellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden nun noch unterschiedliche Konzentrationen von SMI8 hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose durch Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. Bei einer Konzentration von 5 µM kam es sowohl bei HeLa-Zellen als auch bei PC3Zellen zu einer verminderten Apoptose. Die Erhöhung der Konzentration von SMI8 auf 10 µM führte lediglich bei PC3-Zellen zu einer weiteren Verringerung der Apoptose, bei HeLa-Zellen war keine Veränderung beobachtbar. Neben den dargestellten Konzentrationen von SMI8 wurden auch Experimente mit einer noch höheren Konzentration (20 µM) durchgeführt, welche aber zu keiner signifikanten Verbesserung des Ergebnisse 41 Überlebens der Zielzellen führten, sondern eher zu einer Verringerung (Daten nicht dargestellt), vermutlich durch direkte Toxizität des Reagenz. 3.2.3 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch Granzym BInhibitor II Im Verlauf der Hemmversuche wurden auch Experimente mit GrB-Inhibitor II durchgeführt. Die Versuchsansätze und der Ablauf der Experimente entsprachen hierbei den Versuchen mit SMI8 (Kapitel 3.2.2) sowie Ac-IEPD-CHO (Kapitel 3.2.1). Abbildung 15: Hemmung des zytotoxischen Effekts von ARH77-Zellen auf HeLaZellen durch GrB-Inhibitor II 2, 5·105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5·104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (HeLa-Zellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen des irreversiblen GrB-Inhibitors II hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. Bei GrB-Inhibitor II handelt es sich um einen irreversiblen Substratinhibitor von GrB. Ergebnisse 42 Zu Beginn des Experiments wurde GrB-Inhibitor II in einer Konzentration von 5 µM bzw. 10 µM zu den Versuchsansätzen hinzugefügt. Um eine ausreichende Wirkung des Hemmstoffs zu gewährleisten, wurde an Tag 1 und 2 des Experiments jeweils die selbe Menge an GrB-Inhibitor II wie zu Beginn des Experiments hinzugefügt. An Tag 3 erfolgte die Messung der Zielzellapoptose. In Abbildung 15 sind die Ergebnisse mit HeLa-Zellen dargestellt. Das Balkendiagramm gibt in Prozent die viablen Zellen nach 3 Tagen Inkubation an. In den Co-Kulturen, die mit IL-21 stimuliert wurden, zeigt sich eine konzentrationsabhängige signifikante Erhöhung der viablen Zellen bei Zugabe von GrB-Inhibitor II im Vergleich zu den Zellen, zu denen kein Hemmstoff hinzugefügt wurde. Ein konzentrationsabhängiger Effekt zeigte sich auch in den Proben, welche nicht mit IL-21 stimuliert wurden. Hier kam es ebenfalls zu einer signifikanten Verbesserung des Überlebens der HeLa-Zellen. Die prozentuale Steigerung der lebenden Zellen fiel in diesen Proben jedoch niedriger aus als bei den IL-21-stimulierten Proben. Die prozentuale Steigerung der überlebenden Zellen betrug hierbei bei einer Konzentration von 5 µM 28,9 % und bei 10 µM 50,2 %. Im Vergleich dazu betrug die prozentuale Steigerung der überlebenden Zellen bei den nicht mit IL-21 stimulierten Proben bei einer Inhibitorkonzentration von 5 µM lediglich 17,4 %, bei einer Inhibitorkonzentration von 10 µM nur 27,8 %. Die selbe Versuchsreihe wurde auch mit PC3-Zellen durchgeführt. In Abbildung 16 sind die Ergebnisse dargestellt. Bei den IL-21-stimulierten Proben zeigte sich erneut eine signifikante Erhöhung der lebenden Zellen nach Zugabe des Hemmstoffes. Die prozentuale Steigerung lag mit 5 µM bei 24,2 % und mit 10 µM bei 38,8 %. Im Vergleich hierzu kam es bei den Medien-Kontrollproben nur bei Zugabe von 5 µM des Inhibitors zu einer signifikanten Steigerung des Überlebens. Die prozentuale Steigerung lag dabei nur bei 8,1 %, während sie mit 10 µM Konzentration lediglich 7,8 % erreichte. Ergebnisse 43 Abbildung 16: Hemmung des zytotoxischen Effekts von ARH-77-Zellen auf PC3Zellen durch GrB-Inhibitor II 2, 5·105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5·104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (PC3-Zellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen des irreversiblen GrB-Inhibitors II hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. 3.2.4 Hemmung des zytotoxischen Effekts durch einen Cumarininhibitor Um weitere Möglichkeiten der GrB-Hemmung zu erproben, wurden auch Versuche mit 3,4-Dichlorisocumarin durchgeführt. Dieser Wirkstoff hemmt Serinproteasen und blockiert dadurch auch die Wirkung von GrB. Die Experimente wurden ebenfalls mit HeLa- und PC3-Zellen durchgeführt. Die verwendeten Inhibitorkonzentrationen betru- Ergebnisse 44 gen hierbei 10 bzw. 20 µM. Zu den Co-Kulturen wurde wieder jeweils zu Beginn sowie an den Folgetagen die entsprechenden Konzentrationen des Hemmstoffes hinzugefügt (siehe auch Kapitel 3.2.3). Abbildung 17: Hemmung des zytotoxischen Effekts von ARH-77-Zellen auf HeLa-Zellen durch einen Cumarininhibitor 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5 · 104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (HeLa-Zellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen des Cumarininhibitors hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in Anoder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. In Abbildung 17 sind die Ergebnisse für die HeLa-Zellen dargestellt. In den mit IL21 stimulierten Proben kam es zu einer signifikanten Verbesserung des Überlebens der Zellen durch Zugabe des Hemmstoffes. Der prozentuale Zuwachs der überlebenden Zellen belief sich dabei im Fall einer Hemmstoffkonzentration von 10 µM auf 21,8 %, bei 20 µM auf 28,8 %. Bei den Medien-Proben, welche nicht mit IL-21 behandelt wurden, zeigte sich bei der geringeren Konzentration ebenfalls ein signifikanter Zuwachs der Ergebnisse 45 überlebenden Zellen, welcher mit einer prozentualen Zunahme von 17,9 % geringer als bei den mit IL-21 stimulierten Zellen ausfiel. Abbildung 18: Hemmung des zytotoxischen Effekts von ARH-77-Zellen auf PC3Zellen durch einen Cumarininhibitor 2, 5 · 105 Effektorzellen (ARH-77) wurden zu 5 · 104 PKH-26-gefärbten Zielzellen (PC3-Zellen) gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Zu den Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen des Cumarininhibitors hinzugefügt. Nach 3 Tagen Inkubation in Anoder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. Das analog mit PC3-Zellen durchgeführte Experiment zeigte nur für die mit IL-21 behandelten Kulturen ein signifikantes Ergebnis. Durch steigende Konzentration des Hemmstoffes kam es zu einer Zunahme der überlebenden Zellen (siehe Abbildung 18). Bei den reinen Mediumproben ergab sich durch Zugabe des Inhibitors keine signifkante Änderung der Zielzellapoptose. Ergebnisse 3.3 46 Zytotoxischer Effekt von Nabelschnur-B-Zellen auf Tumorzelllinien Zu Beginn dieser Doktorarbeit wurde der zytotoxische Effekt von GrB-sezernierenden B-Zellen auf Tumorzellen gezeigt. Für diese Experimente wurden EBV-transformierte B-Zellen der ARH-77-Zelllinie als Effektorzellen verwendet. Es konnte bereits gezeigt werden, dass menschliche CD5+ Nabelschnur-B-Zellen ebenfalls in der Lage sind, GrB zu bilden. In den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurde der zytotoxische Effekt dieser CD5+ B-Zellen auf maligne Tumorzelllinien untersucht. Zur Gewinnung der CD5+ B-Zellen wurden direkt nach Abnabelung des Kindes circa 30-50 ml Blut aus der Nabelschnur abgenommen und in Heparin beschichtete Vacutainer überführt. Das so gewonnene Blut wurde im Labor unter sterilen Bedingungen mit Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) im Verhältnis 1:5 verdünnt. Mit Hilfe einer Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (siehe Kapitel 2.2.2) wurden die mononukleären Zellen aus dem Nabelschnurblut gewonnen. Aus diesen mononukleären Zellen wurden nun die für das Experiment benötigten, hochreinen B-Zellen mit Hilfe des BZell-Isolationskit II von Milteny durch negative Selektion gewonnen. Die Reinheit der isolierten B-Zellen wurde durchflusszytometrisch nach anti-CD19 PE Markierung bestimmt. Die Reinheit der B-Zellen betrug dabei durchweg > 99 % (siehe auch Kapitel 2.2.3). Bevor die Nabelschnur-B-Zellen zu den Tumorzellen gegeben werden konnten, wurden diese für 3 Tage entsprechend des Versuchsansatzes vorstimuliert. Die so vorstimulierten B-Zellen wurden nun zu den PKH-26-gefärbten Tumorzellen gegeben. Die Stimulation erfolgte mit einer IL-21-Konzentration von 50 ng/ml sowie 6,5 µg/ml anti-BCR. Aufgrund unterschiedlicher Anzahlen an gewonnenen B-Zellen nach der Isolation wurden in den Co-Kulturen unterschiedliche Verhältnisse von B-Zellen:Tumorzellen verwendet. Es wurden hierbei Co-Kulturen mit Verhältnissen zwischen 15:1 bis 25:1 angesetzt. Man konnte zwischen den Experimenten keine vom Verhältnis abhängigen Effekte sehen, wodurch diese Experimente zusammengefasst und gemeinsam ausgewertet wurden. Als Ergebnisse 47 Kontrolle wurden die Co-Kulturen nur mit anti-BCR stimuliert. Hierbei zeigte sich kein Effekt bezogen auf das Überleben der Tumorzellen im Vergleich zu der unstimulierten Co-Kultur (Daten nicht gezeigt). Abbildung 19: Zytotoxischer Effekt von Nabelschnur-B-Zellen auf verschiedene Tumorzelllinien Entsprechend vorstimulierte CD5+ Nabelschnur-B-Zellen wurden zu PKH26-gefärbten Tumorzellen in einem Verhältnis von 15-25 B-Zellen auf 1 Tumorzelle gegeben. Das Endvolumen in der 96-well -Kulturplatte lag jeweils bei 200 µl. Nach 3 Tagen Inkubation mit Stimulation von anti-BCR (6,5 ng/ml) und in An- oder Abwesenheit von IL-21 (50 ng/ml) wurden die Zellen geerntet und die Zielzellapoptose mittels Annexin V/PI-Färbung und FACS-Analyse gemessen. Die Balkendiagramme zeigen den durchschnittlichen prozentualen Anteil der nicht-apoptotischen Zielzellen nach 3 Tagen wie abgebildet an. Die Fehlerbalken entsprechen dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes, * bedeutet hierbei p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01. Bei den so durchgeführten Experimenten wurde mit Hilfe der Annexin V/PI-Färbung das Überleben der Tumorzellen nach 3 Tagen Co-Kultur gemessen. Wie in Abbildung 19 dargestellt, zeigte sich sowohl bei den HeLa- als auch bei den PC3-Zellen eine leichte Reduktion der lebenden Zellen in den IL-21 + anti-BCR stimulierten Co-Kulturen. Diese erreichte jedoch nur bei den Experimenten mit PC3-Zellen eine schwache Signifikanz. Ergebnisse 3.4 48 B-Zell-Infiltration in primärem Tumorgewebe Als Pilotexperiment erfolgte das Screening von Tumorgewebe auf Infiltration von BZellen. Aus einem Nierentumor, welcher aus der urologischen Universitätsklinik Ulm stammte, wurden sowohl Zellen aus makroskopisch sichtbarem Tumorgewebe als auch aus gesundem Gewebe gewonnen. Die Gewebeproben wurden manuell unter sterilen Bedingungen zerkleinert. Im Anschluss wurde mittels der BD-Medimachine aus den Gewebestücken eine Zellsuspension gewonnen. Abbildung 20: B-Zell Infiltration in nativem Nierentumorgewebe Zellen aus Nierentumorgewebe und normalem Nierengewebe wurden mittels einer BD-Medimachine in Zellsuspension gebracht. Die Zellen der einzelnen Zellsuspensionen wurden für die durchflusszytometrische Analyse mit anti-CD19 PE markiert. In einem Punktdiagramm sind die untersuchten Zellen dargestellt. Die Zellen innerhalb der Markierung wurden als CD19positiv gewertet. Im linken Bild ist die gewonnene Zellsuspension aus dem Nierentumor dargestellt, im rechten sind die Zellen des angrenzenden Normalgewebes gezeigt. Nachdem die Zellsuspension von verbleibenden Erythrozyten gereinigt worden war, wurden die Zellen in X-VIVO-Medium resuspendiert. Um B-Zellen im Tumorgewebe nachzuweisen, wurden die Zellen mit anti-CD19-Antikörpern angefärbt und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie in Abbildung 20 dargestellt, zeigte sich im Tumorgewebe eine B-Zell-Infiltration. Der Anteil der B-Zellen lag hierbei bei 25,1 %, im Bereich des gesunden Nierengewebes bei lediglich 2,57 %. Kapitel 4 Diskussion 4.1 GrB+ B-Zellen und ihr zytotoxisches Potential bei malignen Erkrankungen Killer-Lymphozyten wie zytotoxische T-Zellen (CTL) und natürliche Killerzellen (NKZellen) sezernieren Perforin und Granzyme aus ihren zytotoxischen Granula in die immunologischen Synapsen und leiten dadurch die Zerstörung ihrer Zielzellen ein. Dies gilt als entscheidender Mechanismus im Kampf des Immunsystems gegen virus-infizierte Zellen und Tumorzellen [95, 138, 56, 151]. Die Granzyme, insbesondere Granzym B, führen hierbei durch direkte und indirekte Aktivierung intrazellulärer Caspasen schnell und effizient zur Apoptose der Zielzellen [39, 1, 103, 3, 11, 154]. Perforin, ein Ca2+ abhängiges porenbildendes Protein spielt hierbei eine entscheidende Rolle bei der Freisetzung der Granzyme in das Zytoplasma der Zielzelle [127, 49, 143, 166]. In aller Regel ist für die Granula-vermittelte Zytotoxizität von Killer-Lymphozyten Perforin unentbehrlich. Genetisch veränderte Mäuse ohne Perforin haben gravierende Immundefekte, ebenso wie Menschen mit einem kompletten oder inkompletten Verlust der Perforinfunktion, der sogenannten familiären hämophagozytischen Lymphohistiozytose (FHL) [83, 150, 167, 162, 81]. 49 Diskussion 50 GrB wird jedoch nicht ausschließlich in zytotoxischen Zellen exprimiert. B-Zellen können unter bestimmten Voraussetzungen ebenfalls GrB sezernieren, ohne dabei Granzym A oder Perforin zu bilden [62]. Die Unfähigkeit Perforin zu bilden, schließt eine Fähigkeit zur Zytotoxizität nicht aus. Bereits 2006 konnte von Jahrsdörfer et al. gezeigt werden, dass maligne B-Zellen der chronisch lymphatischen Leukämie (B-CLL) in der Lage sind, nach IL-21-Stimulation GrB zu sezernieren und GrB-vermittelt Apoptose in benachbarten B-CLL-Zellen auszulösen [77]. Zur näheren Untersuchung des zytotoxischen Potentials von B-Zellen wurde daraufhin eine Vielzahl von B-Zelllinien auf ihre Fähigkeit hin untersucht, GrB zu bilden. Die B-Zelllinie ARH-77 (siehe Kapitel 2.2.1) zeigte eine äußerst starke GrB-Antwort auf Stimulation mit IL-21 im Vergleich zu anderen B-Zelllinien. Ebenso wie in B-Zellen konnte in den B-Zelllinien das dem IL-21 verwandte Zytokin IL-2 keine GrB-Bildung induzieren. Des weiteren wurde gezeigt, dass IL-21 weder zur Bildung noch zur Sekretion von Perforin durch B-Zellen führt [63]. Zur genaueren Beurteilung des zytotoxischen Potentials wurden GrB+ ARH-77-Zellen mit einer Reihe von GrB− Tumorzelllinien einschließlich HeLa-Zellen, PC3-Zellen und MM439-Zellen (siehe Kapitel 2.2.1) co-kultiviert. Da weder B-Zellen noch B-Zelllinien Perforin nach IL-21-Stimulation bilden [62], wurde der Zielzelltod nicht mittels 51 Cr- Release-Assay gemessen, sondern durch Färbung mit Annexin V/Propidiumiodid und nachfolgender durchflusszytometrischer Analyse. Diese Methode erlaubt es, die sich langsam entwickelnde Apoptose zu erfassen, im Gegensatz zur 51 Cr-Release-Assay- Methode, welche in erster Linie die schnelle, meist Perforin-vermittelte Lyse von Zellen detektiert. Wie in Abbildung 9 dargestellt führten die GrB+ ARH-77-Zellen zu einer deutlichen Reduktion viabler Zieltumorzellen. Neben den in den Abbildungen dargestellten Zelllinien (HeLa-Zellen, PC3-Zellen und MM439-Zellen) konnte auch in melanozytären G-361-Zellen Apoptose ausgelöst werden [63]. Hingegen waren Zellen der chronisch myeloischen Leukämie (CML)-Zelllinie K-562 resistent gegenüber der ARH-77-induzierten Zielzellapoptose [63]. K-562-Zellen werden typischerweise zum invitro-Nachweis Perforin-induzierter Lyse durch NK-Zellen eingesetzt. Möglicherweise Diskussion 51 ist daher die Abwesenheit von Perforin in ARH-77-Zellen der Hauptgrund, weshalb die ARH-77-Zellen keine Apoptose in K-562-Zellen auslösen können. Um die Interaktion zwischen ARH-77-Zellen und Tumorzellen zu veranschaulichen, verwendeten wir die konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie in Kombination mit einem fluoreszierenden GrB-Substrat. Hierbei konnten wir zeigen, dass IL-21-stimulierte ARH77-Zellen in der Lage sind, aktives GrB auf HeLa-Tumorzellen zu übertragen, und dass dieser Angriff zu einem apoptotischen Schrumpfen der HeLa-Zellen führte (siehe Abbildung 11 und [63]). Nachdem für die GrB+ ARH-77-Zelllinie ein zytotoxisches, GrB-bedingtes Potential gezeigt werden konnte, wurden nachfolgend auch frisch isolierte humane B-Zellen auf ihr zytotoxisches Potential hin untersucht. Es konnte zuvor bereits gezeigt werden, dass insbesondere CD5+ B-Zellen in der Lage sind, nach Stimulation mit IL-21 und AntiBCR große Mengen an GrB zu bilden [60]. CD5+ B-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der frühen Abwehr von viralen und bakteriellen Infektionen durch Bildung großer Mengen von natürlichen Antikörpern des Typs IgM. Im Rahmen von Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes (SLE) oder der rheumatoiden Arthritis (RA) sind erhöhte Zahlen an CD5+ B-Zellen vorzufinden [45]. Im Gegensatz hierzu können bei gesunden Individuen kaum CD5+ B-Zellen im peripheren Blut nachgewiesen werden [87, 101]. Stattdessen werden sie vor allem in fetalem Nabelschnurblut und in serösen Körperhöhlen gefunden [87, 101]. Wir verwendeten daher CD5+ B-Zellen aus Nabelschnurblut, um auch ihr zytotoxisches Potential näher zu untersuchen. Da Nabelschnurblut eine unabhängige Quelle an CD5+ B-Zellen in gesunden Individuen bildet, wurden die CD5+ B-Zellen aus mononukleären Nabelschnurblutzellen isoliert. Bei der Co-Kultur von CD5+ B-Zellen mit HeLa-Zellen und PC3-Zellen konnte eine Abnahme viabler Tumorzellen mittels FACSAnalyse nachgewiesen werden (siehe Abbildung 19). Bei den PC3-Zellen konnte eine signifikante Reduktion der lebendigen Zellen durch die CD5+ B-Zellen gezeigt werden. Bei den HeLa-Zellen konnte ebenfalls eine Reduktion der lebendigen Zellen gemessen Diskussion 52 werden, wenngleich diese keine statistische Signifikanz erreichte. Der zytotoxische Effekt der CD5+ B-Zellen war viel geringer als bei den ARH-77-Zellen. Daher scheint eine zytotoxische Funktion von CD5+ B-Zellen eher unwahrscheinlich. Stattdessen könnten CD5+ B-Zellen beim Ungeborenen eine regulatorische Rolle spielen, um ein Abstoßen der fetalen Zellen durch das mütterliche Immunsystem zu verhindern. So konnte bereits gezeigt werden, dass das Vorhandensein von regulatorischen TZellen entscheidend für die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber dem Fötus ist [141]. Da inzwischen bekannt ist, dass auch GrB-exprimierende B-Zellen (GraB -Zellen) immunregulatorich aktiv sind [97, 80], könnten auch CD5+ NabelschnurB-Zellen auf ähnliche regulatorische Weise wirken. Eine bisher noch nicht geklärte Frage ist, wie GrB ohne Hilfe des porenformenden Moleküls Perforin in das Zytoplasma der Zielzelle gelangt. Dass GrB Perforin-unabhängig in Zielzellen vordringen kann, ist weitgehend anerkannt [143, 159]. So konnte nicht nur gezeigt werden, dass enzymatisch aktives GrB gekoppelt an einen Anti-MelanomAntikörper (scFvMEL) oder einen Lewis(Y)-bindenden Antikörper Perforin-unabhängig von Zielzellen aufgenommen wird und in diesen zu Apoptose führt [98, 90]. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass GrB über bakterielle Toxine, Hitzeschockproteine (Hsp) oder virale Transportproteine in Zielzellen gelangen kann [49, 24, 58, 126]. Des weiteren scheint auch die endosomale Freisetzung von GrB über Perforin-unabhängige Mechanismen möglich zu sein. Für Poren-bildende bakterielle Toxine [24], virale Transportproteine [142, 49] und Hsp [58] konnte bereits gezeigt werden, dass diese neben der Aufnahme von GrB auch dessen endosomale Freisetzung in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen. Auf Tumorzellen werden vermehrt Hsp, insbesondere Hsp70 exprimiert [34], welche für NK-Zellen als Tumor-selektive Markierung dienen können [114]. Daher erscheint es plausibel, dass auch das von B-Zellen freigesetzte GrB über eine Hsp-vermittelte Aufnahme und Freisetzung in das Zytoplasma der Zielzelle gelangt und in dieser zur Apoptose führt. Nicht zuletzt ist auch der Kationen-unabhängige Mannose-6-Phosphat Rezeptor (M6PR) Diskussion 53 in der Lage, die Aufnahme von GrB in Zellen zu vermitteln [112, 52, 165, 64, 2]. Im Rahmen der T-Zell-Differenzierung hin zu langlebigen CD8+ T-Gedächtniszellen zum Beispiel führt eine hohe Rezeptordichte des M6PR auf CD8+ T-Zellen zu einer deutlich erhöhten GrB-vermittelten Apoptoserate [2]. Im Mikromilieu verschiedener solider Tumore konnte eine Infiltration von B-Zellen gezeigt werden [119]. Wir konnten eine solche B-Zellinfiltration am Beispiel eines soliden Nierentumors nachweisen (siehe Abbildung 20). Im Vergleich zum normalen Nierengewebe war der Anteil der B-Zellen im Tumorgewebe deutlich erhöht. Im Rahmen von späteren Experimenten konnte in unserer Arbeitsgruppe von Lindner et al. gezeigt werden, dass ein Teil der B-Zellen aus der Mikroumgebung solider Tumore GrB exprimiert [97]. Da die Infiltration mit B-Zellen bei gewissen Tumoren mit einer besseren Prognose verbunden ist [140, 96, 133, 111], kann dies auf einen möglichen positiven, zytotoxischen Effekt der B-Zellen auf Tumorzellen zurückgeführt werden. In Kapitel 4.3 erfolgt eine weiterführende Diskussion möglicher Funktionen dieser GrB+ B-Zellen. 4.2 GrB-Inhibitoren und die Hemmung des zytotoxischen Effekts Spezifische Inhibitoren sind wichtige Werkzeuge, einerseits zur Identifizierung spezifischer Substrate und andererseits zur Erkundung von Funktionen in vitro und in vivo. Der einzige bekannte, natürlich vorkommende intrazelluläre Inhibitor von GrB ist Proteinase-Inhibitor 9 (PI-9). PI-9 gehört zu den Serin-Protease-Inhibitoren (Serpinen) und wird von Lymphozyten [153, 14], dendritischen Zellen [71], Mastzellen [17], Endothel- und Mesothelzellen [27] und von weiteren immunprivilegierten Geweben [16, 72] exprimiert. Dieses weit gefächerte Vorkommen von PI-9 legt nahe, dass er nicht nur die Effektorzellen während einer Immunantwort vor der zytotoxischen Wirkung von GrB schützt, sondern auch Helferzellen oder benachbarte Zellen. Die Fähigkeit von Tumoren, resistent gegenüber Immunzellen zu sein, hängt möglicherweise auch von ihrer Diskussion 54 Fähigkeit ab, PI-9 zu bilden, um GrB-induzierte Apoptose zu verhindern [32]. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden verschiedene synthetische GrB-Inhibitoren auf ihr Potential hin untersucht, den zytotoxischen Effekt von GrB-sezernierenden BZellen auf Tumorzellen zu verhindern. Neben dem Substratinhibitor Ac-IEPD-CHO wurde auch GrB-Inhibitor-II, 3,4-Dichloroisocumarin sowie ein neuer, gezielt hergestellter Small Molecule Inhibitor (SMI8) untersucht. Bei Ac-IEPD-CHO handelt es sich um einen Tetrapeptid-Aldehyd-Inhibitor, welcher eine reversible Hemmung von GrB bewirkt. Dieser wurde bereits erfolgreich von Rotonda et al. zur Bestimmung und Untersuchung des GrB-Komplexes eingesetzt [137]. Wie in Abbildung 12 zu sehen, konnte mittels des Inhibitors eine Hemmung der zytotoxischen Wirkung von GrB induziert werden. Das Überleben der Tumorzellen verbesserte sich hierbei signifikant. Dieses Ergebnis untermauert die Behauptung, dass es sich bei dem von B-Zellen ausgeübten zytotoxischen Effekt um GrB-vermittelte Apoptose handelt. Des weiteren wurde die hemmende Wirkung von GrB-Inhibitor-II (Z-Ile-Glu(OMe)Thr-Asp(OMe)-CH2F) sowie die hemmende Wirkung von 3,4-Dichloroisocumarin untersucht. Bei GrB-Inhibitor-II handelt es sich um einen irreversiblen, zellpermeablen Caspase-8- und GrB-Inhibitor. Bei 3,4-Dichloroisocumarin handelt es sich ebenfalls um einen irreversiblen Inhibitor, welcher Mechanismus-basierend Serinproteasen hemmt [130, 65]. Die Ergebnisse der Wirkung des GrB-Inhibitor-II bei den Co-Kulturen zwischen ARH-77-Zellen und HeLa- bzw. PC3-Zellen sind in den Abbildungen 15 und 16 dargestellt. Hierbei zeigte sich eine signifikante Erhöhung der überlebenden Zellen durch Zugabe des Inhibitors, ebenso wie beim Einsatz von 3,4-Dichloroisocumarin (siehe Abbildungen 17 und 18). In den Co-Kulturen zwischen ARH-77 und HeLa bzw. PC3, welche nicht mit IL-21 stimuliert wurden, konnte jedoch ebenfalls ein vermehrtes Überleben der Tumorzellen gemessen werden, welches teilweise ebenfalls signifikant war. Die prozentuale Steigerung der lebenden Zellen war in den IL-21 stimulierten CoKulturen jedoch deutlich ausgeprägter als in den unstimulierten Co-Kulturen. Die Inhibitoren scheinen hierbei durch unspezifische Hemmung proapoptotischer En- Diskussion 55 zyme das Überleben der Zellen zu verbessern. Hierbei spielt sicherlich auch die Hemmung von Caspase-8 eine Rolle, welche ebenfalls von GrB-Inhibitor-II gehemmt wird. Da die ARH-77-Zellen jedoch nur GrB und keine Caspase-8 sezernieren, lässt sich der zusätzliche Hemmeffekt sowohl durch GrB-Inhibitor-II als auch 3,4-Dichloroisocumarin, welcher sich in einer deutlicheren prozentualen Steigerung wiederspiegelt, somit vermutlich ausschließlich auf eine gezielte Hemmung des GrB zurückführen. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Hauptproblem der verwendeten Inhibitoren deren eingeschränkte Spezifität ist. Sie sind zwar prinzipiell in der Lage, die Wirkung von GrB zu hemmen, wirken jedoch auch auf andere Granzyme sowie direkt auf Caspasen ein. Estébanez-Perpiña et al. gelang es im Jahr 2000, humanes GrB zu kristallisieren, um dessen molekulare Struktur näher zu erforschen [46]. Durch die freie Zugänglichkeit der aktiven Zentren von GrB wurde somit der Grundstein für die gezielte Suche nach selektiven Inhibitoren für GrB gelegt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Wirkung eines solchen Small Molecule Inhibitors (SMI) untersucht, welcher auf Grundlage der Struktur von GrB entwickelt wurde (SMI8). Die durch ARH-77-Zellen ausgelöste Apoptose in HeLa- bzw. PC3-Zellen konnte, zumindest teilweise, durch nichttoxische Konzentrationen von SMI8 (IC50 =10 µM, siehe auch Abbildung 13) aufgehoben werden (siehe Abbildung 14). Damit konnten wir zeigen, dass SMI8 prizipiell in der Lage ist, die zytotoxische Funktion von GrB zu hemmen. Dass es zu keiner vollständigen Aufhebung des zytotoxischen Effekts kam, könnte damit zusammenhängen, dass SMI8 selbst einen zytotoxischen Effekt hat oder der SMI und GrB nach der Aufnahme in die Tumorzellen nicht vollständig im gleichen Kompartiment zu liegen kommen. Andererseits könnte es aber auch sein, dass die Bindung zwischen SMI und GrB nicht lange genug andauert, um eine vollständige Hemmung zu bewirken. Grundsätzlich sind solche spezifischen Inhibitoren zur gezielten Erforschung weiterer Substrate von GrB sowie dessen intra- und extrazellulärer Wirkung jedoch äußerst hilfreich, weshalb die Suche nach ihnen weiter vorangetrieben werden sollte. Diskussion 4.3 56 Mögliche weitere Funktionen GrB+ B-Zellen Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde das zytotoxische Potential von GrB+ B-Zellen untersucht (siehe Kapitel 4.1). Diese Fähigkeit zur Zytotoxizität spielt möglicherweise in der frühen Phase der Tumorentstehung oder zu Beginn einer viralen Infektion eine wichtige Rolle. Zu diesem frühen Zeitpunkt sind CD4+ T-Zellen noch nicht vollständig aktiviert und können so über IL-21 ohne Co-Stimulation von CD40 in B-Zellen eine GrB-Produktion induzieren [63]. In diesem Zusammenhang erscheint auch die Rolle von GrB bei der Antigen-Kreuzpräsentation sehr wichtig zu sein. In Mäusen wurde gezeigt, dass GrB eine entscheidende Rolle bei der Phagozytose und Antigen-Kreuzpräsentation durch spezifische Antigen-präsentierende Zellen (APC) spielt [74]. Interessanterweise gibt es drei Typen von APCs, welche sowohl GrB in Abwesenheit von Perforin bilden können als auch in der Lage sind, eine Antigen-Kreuzpräsentation auszuüben [102, 146, 42]. Neben B-Zellen [62] zählen hierzu plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) [134, 78] sowie IFNα-induzierte Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (moDC) [86]. GrB könnte neben der Befähigung der APCs zur Zytotoxizität somit auch eine wichtige Rolle bei der Antigen-Kreuzpräsentation in diesen Zellen spielen [74]. Wie in Kapitel 4.1 erwähnt, sind GrB+ B-Zellen auch in der Mikroumgebung von soliden Tumoren zu finden, zu welchen Brust-, Eierstock-, Cervix-, Kolorektal- und Prostatakrebs zählen. Die nähere Untersuchung dieser GrB+ B-Zellen offenbarte einen CD19+ CD38+ CD1d+ IgM+ CD147+ Phänotyp [97], der Oberflächenantigene beinhaltet, welche als charakteristisch für regulatorische B-Zellen (Breg ) angesehen werden [43, 171, 18]. Zusätzlich exprimieren diese Zellen immunregulatorische Moleküle, zu denen neben GrB unter anderem auch Interleukin-10 (IL-10), Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) und CD25 zählen [97]. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese Bregs in der Lage sind, GrB-abhängig die T-Zell-Proliferation zu unterdrücken [97]. Dies geschieht über den Abbau der T-Zell-Rezeptor (TCR) ζ-Kette, einem bekannten Substrat von GrB [170]. Wie in Voruntersuchungen beschrieben, kann die Infiltration Diskussion 57 von Tumoren mit B-Zellen in manchen Fällen mit einer guten Prognose einhergehen [119, 111, 105, 89], in anderen Fällen scheinen die B-Zellen jedoch eher zu einer Tumorprotektiven Umgebung zu führen [169, 44, 125]. Diese Feststellung wirft die Frage auf, ob diese GrB+ B-Zellen, welche in der Literatur sowohl als zytotoxische Zellen (siehe Kapitel 4.1) [63] als auch als Bregs [97] beschrieben werden, eher zu einer verbesserten Immunantwort gegen den Tumor beitragen oder diese eher verhindern. Vermutlich ist hierbei sowohl die Art des Tumors als auch der Aktivierungszustand weiterer Immunzellen dafür entscheidend, in welchem Maß GrB+ B-Zellen die Antitumor-Immunität beeinflussen können [61]. Die regulatorische Funktion von Bregs scheint aber nicht nur eine Rolle bei der AntiTumor-Immunität zu spielen, sondern steht möglicherweise auch in Zusammenhang mit viralen Infektionen oder systemischen Entzündungsreaktionen wie Autoimmunerkrankungen oder der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD). So wurde erst kürzlich von Chesneau et al. gezeigt, dass GrB+ B-Zellen mit ihren regulatorischen Fähigkeiten eine entscheidende Rolle bei der Langzeittoleranz gegenüber Nierentransplantaten spielen, wobei die Anzahl von GrB+ B-Zellen IL-21-abhängig war. Die B-Zellen hemmen hierbei GrB-abhängig die Proliferation von CD4+ CD25− T-Zellen und führen so zu einer erhöhten Nierentransplantattoleranz [31]. Bei akuten viralen Infektionen wurden ebenfalls bereits erhöhte Mengen an IL-21 im Serum gemessen [173, 73], welche potentiell in B-Zellen die Bildung von GrB induzieren könnten [63, 61, 97, 60, 62, 77]. In diesem Zusammenhang konnte unsere Arbeitsguppe jüngst bei Patienten mit akuter HIVInfektion eine deutlich erhöhte Anzahl an GrB+ B-Zellen nachweisen. Diese sog. GraB cells wirken ebenfalls GrB-abhängig regulatorisch auf die T-Zellfunktion ein [80]. Die durch den Mangel an CD40L verstärkte Entwicklung hin zu GraB cells anstatt zu Plasmazellen trägt dabei möglicherweise auch zur globalen zellulären Immundysfunktion im Rahmen von HIV-Infektionen bei. In Anbetracht dieser Ergebnisse könnte sowohl die Hemmung der GrB-Funktion als auch die Induktion von regulatorischen bzw. zytotoxischen GrB+ B-Zellen im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen von Nutzen sein. Durch entsprechen- Diskussion 58 de pharmakologische Beeinflussung von B-Zellen ex vivo könnten diese als innovatives Zelltherapeutikum weiterentwickelt werden. Auf der anderen Seite könnte aber auch die Hemmung von extrazellulärem GrB aus B-Zellen oder anderen Immunzellen einen therapeutischen Effekt haben, z.B. im Fall von Autoimmunerkrankungen. Somit sollte auch weiterhin besonderes Augenmerk auf der Erforschung neuer Inhibitoren von GrB liegen. GrB-Inhibitoren (siehe auch Kapitel 4.2) könnten, wenn sie selektiv und effizient genug sind, sowohl Anwendung im klinischen Alltag finden, als auch in der Forschung, wo sie möglicherweise ein tieferes Verständnis der Funktionen von GrB erlauben würden. Kapitel 5 Zusammenfassung Die bekannteste Funktion von humanen B-Zellen im Immunsystem besteht in ihrer Differenzierung zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen im Rahmen der humoralen Immunantwort. In den vergangenen Jahren sind jedoch weitere mögliche Eigenschaften von B-Zellen als regulatorische und zytotoxische Zellen in den Fokus des Interesses und der Forschung gerückt. So konnte gezeigt werden, dass B-Zellen nach Stimulation durch Interleukin-21 (IL-21) und des B-Zell-Rezeptors zur Bildung von Granzym B (GrB) in der Lage sind. In der vorliegenden Arbeit wurde speziell der zytotoxische Effekt von IL-21-stimulierten GrB-sezernierenden B-Zellen auf unterschiedliche Tumorzelllinien untersucht. Zudem erfolgte in diesem Zusammenhang die Untersuchung verschiedener GrB-Inhibitoren. Neben einigen Wirkstoffinhibitoren wurde dabei auch die Wirkweise eines neuen GrBspezifischen Small Molecule Inhibitors (SMI8) genauer charakterisiert. Zur Untersuchung des zytotoxischen Potentials wurden Zellen der B-Zelllinie ARH77 als Effektorzellen verwendet, da diese auf Stimulation mit IL-21 eine starke GrBAntwort zeigten. In Co-Kultur mit den Tumorzelllinien HeLa, PC3 und MM439 konnte eine deutliche zytotoxische Wirkung mittels Annexin V/Propidiumiodid-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse gezeigt werden. Mit Hilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie konnte die Übertragung von aktivem GrB von ARH-77- 59 Zusammenfassung 60 Zellen auf HeLa-Zellen und ein daraufhin einsetzendes apoptotisches Schrumpfen von HeLa-Zellen direkt beobachtet werden. Einen ähnlichen Effekt vermuteten wir auch bei CD5+ B-Zellen aus Nabelschnurblut, da diese in Voruntersuchungen ein besonders hohes Potential zur Bildung von GrB zeigten. Entgegen unserer Erwartungen ergab sich jedoch nur eine sehr geringe zytotoxische Wirkung, was möglicherweise eher für eine regulatorische Funktion dieser Zellen im Rahmen der Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber dem Fötus spricht. Für die Forschung und die Medizin spielen spezifische Inhibitoren eine entscheidende Rolle. Der Substrat-Inhibitor Ac-IEPD-CHO konnte eine konzentrationsabhängige Hemmung der zytotoxischen Wirkung von GrB bewirken und dadurch den durch BZellen ausgeübten zytotoxischen Effekt bestätigen. Ebenfalls eine positive hemmende Wirkung zeigten GrB-Inhibitor-II und 3,4-Dichloroisocumarin, welche jedoch auch durch Hemmung unspezifischer proapoptotischer Enzyme das Überleben der Zellen verbesserten. Mit dem gezielt für GrB entwickelten SMI8 waren wir in der Lage, eine starke Hemmung des zytotoxischen Effekts zu bewirken, welche jedoch noch nicht zu dessen vollständiger Aufhebung führte. Da GrB+ B-Zellen sowohl im Rahmen von Autoimmunerkrankungen, viralen Erkrankungen, als auch in der Mikroumgebung von Tumoren eine Rolle zu spielen scheinen, könnte sowohl die Hemmung der GrB-Funktion als auch die Induktion von GrB+ BZellen im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen von Nutzen sein. Die Entwicklung neuer hochselektiver und wirkungsvoller GrB-Inhibitoren könnte hierbei ein wichtiger Schritt sein, da diese sowohl bei der Hemmung von extrazellulärem GrB im klinischen Alltag als auch bei der weiteren Erforschung von GrB und dessen Funktionen zum Einsatz kommen könnten. Kapitel 6 Literaturverzeichnis [1] C. Adrain, B. M. Murphy, and S. J. Martin. Molecular ordering of the caspase activation cascade initiated by the cytotoxic T lymphocyte/natural killer (CTL/NK) protease granzyme B. Journal of Biological Chemistry, 280:4663– 4773, 2005. [2] K. A. Ahmed, L. Wang, P. Griebel, D. D. Mousseau, and J. Xiang. Differential expression of mannose-6-phosphate receptor regulates T cell contraction. Journal of Leukocyte Biology, 98:313–318, 2015. [3] J. B. Alimonti, L. Shi, P. K. Baijal, and A. H. Greenberg. Granzyme B induces BID-mediated cytochrome c release and mitochondrial permeability transition. Journal of Biological Chemistry, 276:6974–6982, 2001. [4] E. Ambrosino, J. A. Berzofsky, and M. Terabe. Regulation of tumor immunity: the role of NKT cells. Expert Opinion on Biological Therapy, 8:725–734, 2008. [5] K. H. ans S. Saito, R. Sasaki, T. Tomatsu, and Y. Toyama. Expression of granzyme B in human articular chondrocytes. 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Auch möchte ich ihm dafür danken, dass er mir einen Forschungsaufenthalt im Ausland sowie die Teilnahme an mehreren Konferenzen ermöglicht hat. Danken möchte ich auch Frau Thamara Beyer für die gute Einarbeitung und Hilfestellung bei meiner Labortätigkeit. Mein größter Dank gilt jedoch meinem Mann und meinen Eltern, durch deren Geduld und Unterstützung diese Arbeit erst möglich geworden ist. Habt vielen Dank für alles!
