Aus der Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Viszeral-, Thorax
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Aus der Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Viszeral-, Thorax-, und Gefäßchirurgie der Klinik und Poliklinik für Chirurgie, (Direktor Univ.-Prof. Dr. med. C.-D. Heidecke) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Thema: Parameter der Tumorprogression von humanen Pankreaskarzinomzellen unter Katecholaminexposition in vitro und therapierbare Effekte von chronischem Stress auf murine Pankreaskarzinome in vivo Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2016 vorgelegt von: Speerforck, Sven geb. am: 22.07.1984 in: Itzehoe ii Dekan: 1. Gutachter: 2. Gutachter: Ort, Raum: Tag der Disputation: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur Prof. Dr. med. Wolfram v. Bernstorff Prof. Dr. med. Holger Scholz Greifswald, Universitätsmedizin, Raum O 0.65 /O 0.66 08.08.2016 iii 1 EINLEITUNG 1 1.1 PANKREASKARZINOM 1 1.1.1 EPIDEMIOLOGIE UND INZIDENZ 1 1.1.1.1 Kennzahlen und Bedeutung 1 1.1.1.2 Risikofaktoren 2 1.1.2 TUMORBIOLOGIE 2 1.1.2.1 Die Familie der Matrix-Metalloproteinasen 4 1.1.2.1.1 Matrix-Metalloproteinase-2 (Gelatinase A) 5 1.1.2.1.2 Matrix-Metalloproteinase-9 (Gelatinase B) 6 1.1.2.1.3 Matrix-Metalloproteinase-2 und -9 im Pankreaskarzinom 7 1.1.3 KLINIK 9 1.1.4 DIAGNOSTIK UND STAGING 10 1.1.5 THERAPIE 11 1.1.6 PROGNOSE 12 1.1.7 MAUSMODELLE 13 1.2 STRESS 14 1.2.1 SYMPATHISCH ADRENAL-MEDULLÄRE ACHSE (SAM) 15 1.2.1.1 Struktur und Wirkungen der SAM-Achse 15 1.2.1.2 Transmitter und Rezeptoren 16 1.2.2 STRESS UND NEOPLASIE 19 1.2.2.1 Klinik – Beeinflussen psychologische Faktoren die Entstehung oder Progression einer Tumorerkrankung? 19 1.2.2.2 Neuroendokrinologische Modulation der Karzinomprogression 20 2 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 26 3 MATERIAL UND METHODEN 27 3.1 IN-VITRO-UNTERSUCHUNGEN 27 3.1.1 ZELLKULTUR 27 3.1.2 GELATINASE-ASSAY 28 3.1.2.1 Testprinzip 28 3.1.2.2 Etablierung der Methode 28 3.1.2.3 Material und Methode 30 iv 3.1.3 MATRIX-METALLOPROTEINASE-2 ELISA 32 3.1.3.1 Testprinzip 32 3.1.3.2 Material und Methode 32 3.1.4 MATRIX-METALLOPROTEINASE-9 ELISA 33 3.1.4.1 Testprinzip 33 3.1.4.2 Material und Methode 34 3.1.5 MIGRATIONS-ASSAY 35 3.1.5.1 Testprinzip 35 3.1.5.2 Material und Methode 36 3.1.6 INVASIONS-ASSAY 38 3.1.6.1 Testprinzip 38 3.1.6.2 Material und Methode 39 3.1.6.2.1 Invasion 39 3.1.6.2.2 Zellquantifizierung 40 3.1.7 BROMDESOXYURIDIN (BRDU)-ASSAY 41 3.1.7.1 Testprinzip 41 3.1.7.2 Material und Methode 42 3.2 IN-VIVO-UNTERSUCHUNGEN 44 3.2.1 GRUNDLAGEN 44 3.2.2 TUMORIMPLANTATION 45 3.2.2.1 Narkose 45 3.2.2.2 Implantationsprotokoll 46 3.2.2.2.1 Vorbereitung der tumorinduzierenden Injektionslösung 46 3.2.2.2.2 Laparotomie und Injektion 46 3.2.3 STRESSMODEL 47 3.2.3.1 Methode und Art des Stressors 47 3.2.3.2 Stressquantifizierung 48 3.2.4 AUSWERTUNG 49 3.2.4.1 Magnetresonanztomographie (MRT) 49 3.2.4.1.1 Untersuchungsprotokoll 49 3.2.4.1.2 Bildauswertung und Volumetrie 50 3.2.4.2 Exploration 52 3.2.5 EXPERIMENTELLER AUFBAU DER TIERVERSUCHE 54 3.2.5.1 Überlebensanalyse 54 3.2.5.2 Tumorprogression im MRT 55 3.2.5.3 Überlebensanalyse mit Propranololtherapie 55 3.2.5.4 Tumorprogression im MRT mit Propranololtherapie 56 v 3.2.6 MATRIX-METALLOPROTEINASE-9 ELISA EX-VIVO PROBEN 56 3.2.6.1 Probengewinnung und Aufbereitung 56 3.2.6.2 Material und Methode 57 3.3 STATISTIK 58 4 ERGEBNISSE 59 4.1 IN-VITRO-UNTERSUCHUNGEN 59 4.1.1 GELATINASE-ASSAY 59 4.1.2 MATRIX-METALLOPROTEINASE-2 ELISA 61 4.1.3 MATRIX-METALLOPROTEINASE-9 ELISA 62 4.1.4 MIGRATIONS-ASSAY 63 4.1.5 INVASIONS-ASSAY 67 4.1.6 BROMDESOXYURIDIN (BRDU)-ASSAY 67 4.2 IN-VIVO-UNTERSUCHUNGEN 69 4.2.1 STRESSVALIDATION 69 4.2.2 ÜBERLEBENSANALYSE 72 4.2.3 TUMORPROGRESSION IM MRT 74 4.2.4 MATRIX-METALLOPROTEINASE-9 ELISA EX-VIVO PROBEN 76 4.2.5 THERAPIE MIT PROPRANOLOL 76 4.2.5.1 Überlebensanalyse mit Propranololtherapie 77 4.2.5.2 Tumorprogression im MRT mit Propranololtherapie 78 5 DISKUSSION 79 5.1 IN VITRO 79 5.2 IN VIVO 82 6 ZUSAMMENFASSUNG 87 7 LITERATURVERZEICHNIS 88 8 ANHANG 105 vi Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Ø Σ Χ © AUC BrdU BSA CIT CREB DNA ECM ELISA EMT FA FBS FGF FoV HBSS HNPCC HPLC i.p. ISO KI MAC MAPK MIPAV MMP MO MPO MRT NE NIH NN o.g. OR PBS PDGF PI PNS POD RNA ROI RT s.c. SAM SD SEM SNS SSS TE Durchmesser Standardabweichung einer Zufallsvariablen (Sigma) Wahrscheinlichkeitsverteilung (Chi) Patentrechtlich geschützter Markenname Area Under the Curve 5-Brom-2'-desoxyuridin Bovines Serumalbumin Center for Information Technology cAMP response element-binding protein Deoxyribonucleic acid Extracellular-Matrix Enzyme-linked immunosorbent assay Epitheliale mesenchymale Transition Flip-Angle Fetales bovines Serum Fibroblast Growth Factor Field of View Hank’s Balanced Salt Solution Hereditäres non-polypöses kolorektales Karzinom High Performance Liquid Chromatography Intraperitoneal Isoproterenol Konfidenz-Intervall Minimale Alveoläre Konzentration von Inhalationsanästhetika Mitogen-Activated Protein Kinase Medical Image Processing and Visualization Matrix-Metalloproteinase Monate Meerrettichperoxidase Magnetresonanztomografie Norepinephrin (Noradrenalin) National Institutes of Health Nebenniere Oben genannt Odds Ratio Phosphat Buffered Saline Platelet derived Growth Factor Propidiumiodid Parasympathisches Nervensystem Peroxidase Ribonucleic acid Region of Interest Raumtemperatur Subkutan Sympathisch adrenal-medulläre Achse Schichtdicke Standard error of the mean / Standardfehler des Mittelwerts Sympathisches Nervensystem Stress Severity Score Time of Echo vii TGF TR TV Transforming Growth Factor Time of Relaxation Tumorvolumen 1 1 Einleitung 1.1 Pankreaskarzinom Das duktale Adenokarzinom ist der mit Abstand häufigste Tumor des Pankreas (90 % aller Pankreastumoren). Weiterhin kommen das benigne mikrozysistische Adenom (1 %), das potentiell maligne muzinöse Zystadenom (2 %) und das maligne Azinuszellkarzinom (1 %) regelmäßig vor [1]. Während es bei dem duktalen Adenokarzinom des Pankreas in den letzten Jahren einige Fortschritte im Verständnis der Molekularbiologie, im Tumor-Staging und in der Therapie früher Tumorstadien zu verzeichnen gab, bleibt der Fortschritt auf den Gebieten der Prävention, der Früherkennung und der Therapie fortgeschrittener Tumorerkrankungen minimal. Das duktale Pankreaskarzinom ist nach wie vor eine der tödlichsten humanen Tumorentitäten und stellt den Arzt weiterhin vor große interdisziplinäre Herausforderungen. 1.1.1 Epidemiologie und Inzidenz 1.1.1.1 Kennzahlen und Bedeutung In Deutschland erkrankten 2010 16.080 Menschen an einem Bauchspeicheldrüsenkarzinom (8.020 Männer und 8.060 Frauen), während 15.487 Menschen an den Folgen der Tumorerkrankung starben (7.537 Männer, 7.950 Frauen). Obwohl das Pankreaskarzinom 2010 lediglich 3,2 % (Männer) bzw. 3,6 % (Frauen) aller Krebserkrankungen in Deutschland abbildete, war es für 6,4 % (Männer) bzw. 7,9 % (Frauen) aller krebsbedingten Todesfälle verantwortlich und ist damit die viert häufigste Krebstodesursache beider Geschlechter. Das mittlere Erkrankungsalter der Männer lag bei 71 Jahren, das der Frauen bei etwa 75. Das Lebenszeitrisiko der Tumorerkrankung liegt für beide Geschlechter bei etwa 1,6 %. Die altersstandardisierten Erkrankungs- und Sterberaten sind für Männer und Frauen etwa gleich hoch (1.1.6). Während diese Raten für Männer seit den 1980er Jahren in etwa konstant blieben, stieg bei dem weiblichen Geschlecht sowohl die Neuerkrankungs- als auch die Sterberate leicht an. Deutschland-Kennzahlen nach Robert-Koch-Institut, Berlin [2]. Einleitung 2 1.1.1.2 Risikofaktoren Trotz bedeutender Erkenntnisgewinne in der Karzinogenese [3, 4], bleibt die endgültige Ätiologie dieser speziellen Tumorerkrankung schwer zu fassen. Die bedeutendsten gesicherten Risikofaktoren stellen ein hohes Lebensalter, Geschlecht (Männer > Frauen) und das Rauchen dar [5]. Raucher haben Metaanalysen zufolge ein um 75 % erhöhtes Risiko gegenüber Nichtrauchern, an einem Pankreaskarzinom zu erkranken (OR 1,74 (0,95 KI 1,61 -1,87)). Erst nach 10 Jahren Rauchabstinenz wird das Risikoniveau eines Nichtrauchers erreicht [6]. Das Rauchen ist der einzige Risikofaktor mit entsprechender Evidenz kausaler Zusammenhänge. Das Karzinomrisiko steigt mit der Rauchdosis und verlängerter Exposition [7]. Während das Risiko für Zigarrenkonsumenten ebenfalls erhöht scheint (OR 1,6 (0,95 KI 1,2 -2,3)), haben Pfeifen- und Schnupftabakkonsumenten kein erhöhtes Risiko [8]. Alkoholkonsum wurde als tumorfördernd lange kontrovers diskutiert, inzwischen gilt der Einfluss als wahrscheinlich [9]. Weitere Risikofaktoren sind Adipositas, Diabetes Mellitus Typ 2 und die chronische Pankreatitis [5, 10]. Auch genetische Faktoren spielen eine wichtige Rolle. Das hereditäre Pankreaskarzinom ist vermutlich für etwa 2 – 3 % der Neuerkrankungen verantwortlich [11]. Eine positive Familienanamnese führt in etwa zu einer Verdopplung des Risikos und prädiziert 5 – 10 % der Pankreaskarzinominzidenz. Auch seltenere Syndrome wie die hereditäre Pankreatitis, das HNPCC, die Ataxia teleangiectatica, das Peutz-Jeghers Syndrom und der familiäre Brustkrebs beeinflussen das Risiko der Tumorerkrankung [12–14]. In jüngerer Vergangenheit wurde über ein erhöhtes Karzinomrisiko der Blutgruppen A, B oder AB verglichen mit der Blutgruppe 0 berichtet [15]. 1.1.2 Tumorbiologie Da bei einer zukunftsweisenden effizienten Bekämpfung der bösartigen Tumoren der Bauchspeicheldrüse der fundamentalen Kenntnis der sehr komplexen und teilweise noch unbekannten Tumorbiologie eine entscheidende Rolle zukommt, sollen einige der wesentlichen Zusammenhänge im Folgenden kurz geschildert werden. Wie viele andere Krebsentitäten resultiert das duktale Pankreaskarzinom regelmäßig aus einer Akkumulation verschiedener Mutationen. Als Korrelat dieser über einen definierten Zeitraum akquirierten Mutationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen wurde ein Modell der Karzinogenese von einem normal Einleitung 3 differenzierten duktalen Drüsenepithel, über intraepitheliale Neoplasien bis hin zum invasiven Karzinom entwickelt (Abb. 1). Abb. 1, Karzinogenese des duktalen Pankreaskarzinoms aus [3]. Normales duktales Vorläuferstadien Drüsenepithel (PanINs) bis entartet zum über invasiven eine Serie Karzinom histologisch (links nach definierter rechts). Die Überexpression von Her-2/neu und die Punktmutationen im K-ras Gen treten relativ früh, die Inaktivierung des p16 Gens in einem intermediären Stadium und die Inaktivierung von p53, DPC4 und BRCA2 relativ spät auf [3]. Bekannte Mutationen bieten vielversprechende Ansatzpunkte für das Verständnis molekularer Zusammenhänge und künftige Therapieoptionen. So lässt sich beispielsweise in rund 85 % aller duktalen Pankreaskarzinome eine aktivierende Punktmutation des K-ras Gens und in 95 % aller Karzinome eine inaktivierende, relativ spät auftretende Mutation des p16 Tumorsuppressor Gens finden [16–18]. Der gesamte genetische Hintergrund des Pankreaskarzinoms scheint jedoch sehr heterogen zu sein und individuelle Therapieoptionen erforderlich zu machen [19]. Im Gegensatz zu einem gut charakterisierten genetischen Hintergrund der Neoplasie, bleiben wesentliche molekulare Mechanismen weiter unvollständig verstanden. Diese bedingen die besonders aggressive Natur der Tumorprogression. Unter den extrem vielfältigen molekularen Komponenten der Tumorprogression [20] fanden unlängst vor allem die Pankreaskarzinomstammzellen (1) und die dichte Stromaformation während der sog. Desmoplastischen Reaktion (2) Beachtung: (1) Die 2007 identifizierte Population der Pankreaskarzinomstammzellen (CD 24+, CD 44+, CD 133+) repräsentiert 1 – 5 % aller Tumorzellen. Sie ist durch Einleitung 4 uneingeschränkte Selbsterneuerung sowie die Möglichkeit erhöhter Differenzierung (asymmetrische Teilung) und eine Resistenz gegenüber Radiound Chemotherapie gekennzeichnet [21, 22]. (2) Nach der Sekretion von Zytokinen wie TGFβ1, PDGF und FGF kommt es unter der Tumorprogression zu der sog. Desmoplastischen Reaktion, einem äußerst komplexen Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und Tumorstroma aus Extrazellulärer Matrix (Kollagen I / III, Laminin, Fibronectin etc.) und pankreatischen Sternzellen (PSC), Fibroblasten, Endothelzellen, immunreaktiven Zellen und Adipozyten [23–25]. Dieses Stroma-Mikromilieu ist also keinesfalls nur als mechanische Barriere zu begreifen, sondern stellt vielmehr ein dynamisches Kompartiment dar, welches für Tumorformation und –progression, Invasion und Metastasierung von geradezu herausragender Bedeutung ist [24]. In diesem Mikromilieu der ständigen stromalen Reorganisation ist die Expression sog. Matrix-Metalloproteinasen von entscheidender Bedeutung [26–28]. 1.1.2.1 Die Familie der Matrix-Metalloproteinasen Neben den Serinproteasen (beispielsweise Plasminogenaktivatoren, Plasmin, Cathepsin G, Leukozytenelastase) und den für Metastasierungsprozesse wichtigen Cysteinproteinasen (Cathepsin B, Cathepsin L) stellen die Matrix-Metalloproteinasen (MMP) die dritte Hauptklasse der ECM-abbauenden Proteasen dar [29]. Die Familie der Matrix-Metalloproteinasen besteht aus 23 bekannten humanexprimierten strukturell verwandten Enzymen. Sie wurden 1962 erstmals beschrieben [30] und gehören zur Familie der Zink-abhängigen Endopeptidasen. Matrix-Metalloproteinasen spielen eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen wie z.B. Gewebestrukturierung, Embryogenese und Organentwicklung [31], Entzündungsprozessen und erworbener Immunität [32], Arthritis und kardiovaskulären Erkrankungen [33, 34] sowie Malignomen [35]. Der generelle strukturelle Aufbau der Mehrzahl der Enzyme dieser Familie enthält im Wesentlichen 4 Domänen [35]. Alle MMPs haben eine Signalpeptidsequenz, die bei Eintritt des Translationsproduktes in das endoplasmatische Retikulum verloren geht und eine Prodomäne, die über Interaktion einer Thiolgruppe die katalytische Domäne (Zn2+) inhibieren kann und nach Aktivierung ebenfalls verloren geht. Diese Aktivierung des Zymogens erfolgt meist intrazellulär durch Furin-ähnliche Proteasen Einleitung 5 oder extrazellulär durch andere MMPs (-1, -2, -3, -7) oder Serinproteasen wie Plasmin [36]. Zusätzlich zu den erwähnten Domänen besitzt die Mehrzahl der Enzyme eine C-terminale Domäne (hemopexin-like region), die über eine Gelenkregion mit dem katalytischen Zentrum verbunden ist und für die Komplexbildung der Zymogene mit dem spezifischen Inhibitor zuständig ist. Aufgrund der destruktiven MMP-Eigenschaften ist leicht zu verstehen, dass die Physiologie eine Reihe unspezifischer Proteinase-Inhibitoren (α2-Makroglobulin, α1- ProteinaseInhibitor, α1-Chymotrypsin) und spezifischer MMP-Inhibitoren (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP) 1-4) bereithält [35]. So ist die finale MMP-Aktivität als Summe eines komplexen Regelkreises aus Gen-Expression, zellinterner Kompartimentierung, Zymogenaktivierung und der Interaktion mit Inhibitoren zu interpretieren. Die Enzyme lassen sich prinzipiell in sekretierte (MMP-1, -2, -3 -7, -8, 9, -10, -11, -12, -13, -19, -20, -21, -22, -27, -28) und membranständige (MMP-14, 15, -16, -17, -23, -24, -25) Proteine unterteilen [35]. Matrix-Metalloproteinasen degradieren nicht nur Extrazellulär-Matrix bei Tumorprogression und Metastasierung [37], sondern nehmen auch entscheidenden Einfluss auf die Zellbiologie körpereigener und maligner Zellen durch Beeinflussung verschiedener Signaltransduktionswege [35]: Im Tumormilieu erleichtern sie beispielsweise die Invasion [37] und die Formation sog. metastatischer Nischen. Hier herrscht ein komplexes Zusammenspiel mit inflammatorischen und hämatopoetischen Progenitorzellen [38]. Weiterhin orchestrieren sie die tumorbedingte Inflammation (proteolytische Zytokinalteration; [32]) und regulieren Apoptose und Proliferation (Aktivierung v. TGF-β / Proteolyse von FASL; [39–41]. Auch sind sie elementare Voraussetzung einer suffizienten Neoangiogenese (Bioverfügbarkeit von VEGF; [42, 43]) und können sogar durch lokale Überexpression von MMP-3, -7 und -14 genetische Instabilität und Tumorformation bedingen [44]. Die MMP-2 und MMP-9 haben zusätzlich zu den o.g. Domänen eine weitere Gelatinbindende Domäne und spielen daher eine besondere Rolle. Sie sollen im Folgenden genauer erläutert werden. 1.1.2.1.1 Matrix-Metalloproteinase-2 (Gelatinase A) Die humane MMP-2 wird als 72 kDa schweres Zymogen mit o.g. Peptidstruktur (1.1.2.1) sezerniert. Sie kann Kollagen IV spalten und scheint eine entscheidende Einleitung 6 Rolle bei Invasion und Metastasierung durch die Basalmembran zu spielen. Die spezifische Inhibition des Zymogens kann nur durch Komplexbildung mit TIMP-2 erfolgen. Die aktivierte Form kann über eine nicht-kovalente Bindung an das katalytische Zentrum im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 von TIMP-1, TIMP-2 und TIMP-3 inhibiert werden [45]. Die MMP-2 ist oftmals im tumorumgebenden Stroma der invasiven Front überexprimiert und häufig mit Bindegewebszellen wie Fibroblasten oder Sternzellen, als auch mit Neutrophilen, Makrophagen oder Monozyten assoziiert [46, 47]. So ist die Bindung von Integrinen durch die Hemopexin-Domäne der MMP-2 eine essentielle Voraussetzung der mesenchymalen Zellinvasion [48]. Eine Überexpression fand sich in einer Vielzahl menschlicher Karzinome beispielsweise beim Pankreaskarzinom (1.1.2.1.3), beim Kolonkarzinom [49], beim Magenkarzinom [50], beim Blasenkarzinom [51], beim Prostatakarzinom [52], beim Schilddrüsenkarzinom [53], beim Mammakarzinom [55] und beim ovariellen Karzinom [47]. Auch in jüngerer Zeit wurde in einigen Studien eine Korrelation von TNM-Stadien und Metastasierungspotential verschiedener Tumorentitäten mit der MMP-2 Expression nachgewiesen [52, 55, 56]. 1.1.2.1.2 Matrix-Metalloproteinase-9 (Gelatinase B) Hinsichtlich ihrer Regulation und Struktur ist die 92 kDa schwere MMP-9 das komplexeste Mitglied der Familie der Matrix-Metalloproteinasen. Sie wurde erstmals vor fast 25 Jahren im Sekret von Alveolarmakrophagen nachgewiesen [57]. Sie ist, wie die MMP-2, eine Typ IV-Kollagenase und wird in ähnlicher Weise durch den spezifischen Inhibitor TIMP-2 gehemmt. Sie spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle während der Tumorprogression [58]. Ihre Expressionslokation ist nicht so stark stromaler Natur (vgl. MMP-2) und variiert je nach Tumorentität (vgl. 1.1.2.1.3). Sie findet sich häufig am tumor-stromalen Übergang der invasiven Front und ist regelmäßig mit inflammatorischen Zellen assoziiert [59]. Die MMP-9 Expression nimmt mit dem Abstand von Tumorzellen ab [51]. Die komplexe Rolle der MMP-9 in der Tumorprogression ist durch eine Vielzahl tumorbiologischer Mechanismen bedingt, von denen einige im Folgenden kurz erläutert werden sollen: In Neoplasien kann das Oberflächenprotein CD44 als eine Art Andock-Molekül für die MMP-9 fungieren und so proteolytische Aktivität an die Zellmembran binden. Dieser CD44/Gelatinase B Komplex ist mit Invasion und Angiogenese in vivo Einleitung 7 verknüpft [60]. Auch das an mutierten Zellen tumorfördernd wirkende TGF-β wird durch den o.g. Komplex bioaktiviert [40]. Durch die MMP-9 induzierte Proteolyse seines in der Extrazellulärmatrix gebundenen Bindeproteins (LTBP-1) wird die Bioaktivität von TGF-ß zusätzlich gesteigert [61]. Auch während der Angiogenese kommt der MMP-9 durch die Steigerung der Bioverfügbarkeit von VEGF (Angiogener Switch; [42]) und als elementarer Schritt der Vaskulogenese in vivo [62] eine herausragende Bedeutung proteolytischer Aktivität zu. des Dufour et katalytischen al. berichteten sogar Zentrums gänzlich eine von unabhängige Migrationserleichterung epithelialer Zellen durch die Hemopexin-ähnliche Domäne des Proteins [63]. Eine zur MMP-2 vergleichbare Überexpression fand sich ebenfalls in einer Vielzahl von humanen Karzinomen wie zum Beispiel im Pankreaskarzinom (1.1.2.1.3), im Magenkarzinom [56], im Blasenkarzinom [51], im Schilddrüsenkarzinom [53], im Prostatakarzinom [64, 65], im ovariellen Karzinom [47], im Brustkarzinom [55] und im Kolonkarzinom [66]. Unter anderem wurden für das Neuroblastom [67, 68], das Blasenkarzinom [51], das Schilddrüsenkarzinom [69] und das Prostatakarzinom [65] signifikante Korrelationen des MMP-9 Expressionsniveaus mit Tumorprogression und Metastasierungsverhalten gefunden. Unlängst fand die MMP-9 zunehmend Bedeutung als Markerprotein verschiedener Pathologien. Jüngst ließ sich so beispielsweise ein signifikant erhöhter Serumspiegel in Patienten mit einem Pankreaskarzinom (1.1.2.1.3), mit einem Kolonkarzinom [70], mit systemischer Sklerose [71] und mit einem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus [72] feststellen. Auch das Magenkarzinom kann zu einer signifikanten Differenz der Plasmaspiegel führen [73]. Provatopoulou et al. konnten sogar eine signifikante Korrelation der plasmatischen MMP-9 Konzentration mit der Aggressivität eines Mammakarzinoms feststellen [74]. Offersen et al. beobachteten eine signifikante Korrelation der MMP-9 Konzentration im Urin mit reduzierter Prognose des Blasenkarzinoms [75]. 1.1.2.1.3 Matrix-Metalloproteinase-2 und -9 im Pankreaskarzinom Aufgrund der Entität-immanenten Metastasierung mit vaskulärer und perineuraler Invasion durch die Basalmembran und der desmoplastischen Reaktion spielen die MMP-2 und -9 beim Pankreaskarzinom eine entscheidende Rolle. Einleitung 8 Eine Überexpression beider Proteasen wurden u.a. mittels In-situ-Hybridisation und Zymografie in humanen Pankreaskarzinomen nachgewiesen [76, 77]. Obwohl zunächst eine Tumorspezifität der MMP-2 [77] vermutet wurde, konnte eine Expression auch in der chronischen Pankreatitis (64,3 %) und in physiologischem Gewebe (30,8 %) nachgewiesen werden [76, 78]. In jedem Fall ist sie tumorcharakterisierender als die MMP-9 und für die desmoplastische Reaktion von größter Bedeutung. Das MMP-2-Expressionsniveau wies weiterhin eine negative Korrelation mit dem Differenzierungsgrad [79] und eine positive Korrelation mit stromalen Bereichen der desmoplastischen Reaktion auf, während die MMP-9 eher eine Kolokalisation mit Tumorzellen aufwies [76]. Die venöse Infiltration als Grundlage hepatischer Metastasierung korreliert im Pankreaskarzinom mit einer lokalen Überexpression von MMP-2 und -9 [80] und in Nacktmäusen konnte ein signifikanter Einfluss der MMP-2 und -9 Expression auf das hepatische Metastasierungsverhalten von Pankreaskarzinomzellen beobachtet werden [81]. Die MMP-2-Expression humaner Karzinomzelllinien kann durch TGF-β stimuliert werden [82, 83] und korreliert mit dem Invasionspotential [28]. Auch die strahleninduzierte Invasionssteigerung humaner Pankreaskarzinomzelllinien scheint MMP-2 vermittelt zu sein [84, 85]. Die MMP-2 ist also für die aggressive und prognostisch ungünstige Natur der desmoplastischen Reaktion des humanen Pankreaskarzinoms in hohem Maße mitverantwortlich. Die Bedeutung der MMP-9 für den in Pankreasinseln beobachteten angiogenen Switch [42] wird durch eine transgen forcierte MMP-9-Expression mit konsequenter Vaskulogenese in murinen Pankreaskarzinomzellen unterstrichen [86]. Für diesen angiogenen Switch im Pankreaskarzinom postulierten Bausch et al. sogar eine VEGF unabhängige und fast gleichrangige Bedeutung der MMP-9 aus neutrophilen Granulozyten [87]. Auch für eine gesteigerte Invasionsfähigkeit nach Aktivierung eines EMT-induzierenden Transkriptionsfaktors in humanen Pankreaskarzinomzellen wurde als hauptsächlicher Mechanismus die vermehrte Expression der MMP-9 verantwortlich gemacht [88]. Eine Inhibition des Hedgehog-Signalweges hat in Pankreaskarzinomzelllinien eine Reduktion der MMP-9 abhängigen Invasion zur Folge [89]. Weiterhin wurde eine Studie mit signifikanter Korrelation von immunhistochemisch determinierter MMP-9 Expression humaner Pankreaskarzinome (N = 36) mit Lymphknotenbeteiligung und dem Auftreten von Einleitung 9 Fernmetastasen publiziert [90]. Die MMP-9 ist also in vielfältige, komplexe und oftmals direkt Tumorzell-assoziierte Mechanismen eingebunden und für die Tumorprogression von entscheidender Bedeutung. Die Idee der Matrix-Metalloproteinasen als Tumormarker zur Verbesserung der äußerst problematischen Früherkennung (vgl. 1.1.4) liegt auf der Hand. So sind die Matrix-Metalloproteinasen-2 (91,6 % aller Karzinome) und -9 (82,4 % aller Karzinome) im Pankreassekret signifikant überexprimiert [91, 92]. Signifikante Konzentrationsunterschiede von MMP-9 im Serum wurden 2002 erstmals in pankreaskarzinomtragenden Hamstern beobachtet [93]. Nachdem Studien über signifikante Serumkonzentrationen von MMP-9 und TIMP-1 bei humaner Pankreaskarzinomdetektion und Prognosekorrelation [92, 94] veröffentlicht wurden, zeigte ein Vergleich von Sensitivität, Spezifität und AUC keine Überlegenheit zu CA19-9 [95]. Aufgrund ihrer herausragenden Bedeutung erscheint eine therapeutische Inhibition der MMPs bei gegebener therapeutischer Frustration bei der Behandlung eines fortgeschrittenen Krankheitsstadiums (vgl. 1.1.5) verlockend. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden Studien mit Batimastat (BB-94), Marimastat (British Biotech, Oxford, England), AG3340 (Agouron, New York, USA) und BAY 12-9566 (Bayer, Leverkusen, Deutschland) durchgeführt. Während Phase-II-Studien einen moderaten Überlebensvorteil (CA19-9-Selektion des Patientenkollektivs) zeigten [96, 97], musste eine große Phase-III-Studie (BAY 12-9566) aufgrund eines dramatisch verschlechterten Gesamtüberlebens (3,74 mo vs. 6,59 mo) unter additionaler Therapie mit MMP-Inhibitoren abgebrochen werden [98]. Es wurde angemerkt, dass die Behandlung eines derart fortgeschrittenen Krankheitsstadiums mit MMPInhibitoren nur bedingt möglich sei [99]. Neue Inhibitoren befinden sich in der Entwicklung [100]. 1.1.3 Klinik Die Patienten stellen sich je nach Tumorstadium und Lokalisation des Pankreaskarzinoms mit unterschiedlicher und meist unspezifischer Symptomatik vor. 65% der bösartigen Geschwulste manifestieren sich im Pankreaskopf (Abb. 2) und führen regelmäßig zu einem hochverdächtigem schmerzlosen Obstruktionsikterus [101]. Ausstrahlende Rückenschmerzen können als Indikatoren einer retroperitonealen Infiltration gewertet werden. Tumormanifestationen im Corpus- Einleitung 10 oder Caudabereich werden oft erst sehr spät durch unspezifische persistierende Schmerzen des Abdomens oder Rückens symptomatisch. In seltenen Fällen können Pankreastumoren auch eine duodenale Obstruktion oder einen gastrointestinalen Blutabgang bedingen. Zudem sollte bei Erstmanifestation einer akuten Pankreatitis (in Folge des Obstruktionsikterus) oder eines Diabetes mellitus ein kausales Tumorgeschehen abgeklärt werden. Systemische Manifestationen wie Appetitlosigkeit, Asthenie und ein signifikanter Gewichtsverlust begleiten die Tumorprogression regelmäßig. Abb. 2, duktales Adenokarzinom des Pankreaskopfes. A: Operationspräparat eines Pankreaskopfkarzinoms (weißer Pfeil) [10]. B: Pankreaskopfkarzinom (weißer Pfeil) in einer koronaren Sequenz mittels Computertomografie. Der Tumor ummauert die Portalvene und repräsentiert ein weit fortgeschrittenes Tumorstadium [101]. 1.1.4 Diagnostik und Staging Entscheidendes Instrument der Verdachtsdiagnose Pankreaskarzinom ist zunächst die anamnestische Evaluation der in 1.1.3 genannten Symptome, da der körperliche Untersuchungsbefund (evtl. Ikterus, periphere Lymphadenopathie, Hepatomegalie oder Aszites) und das Routinelabor zunächst oft unauffällig sind. Nach Bestimmung gastroenterologischer Laborparameter (Amylase, Lipase, alkalische Phosphatase, γGT, Bilirubin, Transaminasen, HB, CA 19-9) kann eine orientierende Sonografie des Abdomens erfolgen (Metastasierung, Aszites) [10]. Es ist zu beachten, dass die Bestimmung des unspezifischen Tumormarkers Carbohydrat-Antigens 19-9 lediglich zur Verlaufsdokumentation, jedoch keinesfalls für ein Screening geeignet ist [20]. Die erste Methode der Wahl für Diagnose, Tumorstaging und initiale Evaluation der Resektabilität stellen schnittbildgebende Untersuchungen wie die Einleitung 11 Computertomografie dar [102]. Die Kontrastmittel-CT erlaubt bereits eine valide Prädiktion der operativen Resektabilität in 80 - 90 % der Fälle [103]. Erscheint der Pankreastumor in der Schnittbildgebung resektabel, ist keine histologische Abklärung vor OP erforderlich. Bei zweifelhaften Befunden stellen die Endosonografie, die retrograde Cholangiopankreatikografie Magnetresonanzcholangiopankreatografie (ERCP) (MRCP) auch oder aufgrund die immanenter Möglichkeiten zur Probenentnahme und Palliation (Stent) hervorragende Alternativen dar. Die gleichzeitige Stenose des Ductus Pancreaticus und des Ductus Choledochus („Double-duct-sign“) gilt bei ERCP und MRCP als pathognomisch für das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Tumorcharakteristik Stadium Medianes Überleben (mo) Tumor auf Pankreas beschränkt, ≤ 2 cm in größter Dimension IA 24,1 Tumor auf Pankreas beschränkt, ≥ 2 cm in größter Dimension IB 20,6 Tumor nicht mehr auf Pankreas beschränkt aber erreicht nicht Truncus IIA 15,4 Metastasierung in regionale Lymphknoten IIB 12,7 Tumor erreicht Truncus coeliacus oder A. mesenterica superior III 10,6 Fernmetastasen IV 4,5 coeliacus oder A. mesenterica superior Tabelle 1, Staging des Pankreaskarzinoms mit korrelierendem medianem Überleben. Modifiziert nach [20]. 1.1.5 Therapie Die Therapie des Pankreaskarzinoms sollte multidisziplinär in Schwerpunktzentren erfolgen, vor Allem aufgrund der deutlich reduzierten perioperativen Sterblichkeit [104]. Eine Behandlung in Studien ist wünschenswert. Bei Patienten mit lokal kurabel resezierbarem Tumorstadium bleibt die Operation Methode der Wahl [105]. Die Tumorresektion kann je nach Tumorlokalisation als partielle Pankreatikoduodenektomie, Pankreaslinksresektion, Pankreaskorpusresektion oder totale Pankreatektomie erfolgen. Hierbei ist auch aus Gründen pathologischer Beurteilbarkeit auf die minimale Entfernung von 12 – 15 Lymphknoten und tumorfreie Resektionsränder zu achten. Nach Resektion sollte eine adjuvante Chemotherapie mit Gemcitabin allein oder mit Gemcitabin in Kombination mit Fluoruracil-basierter Einleitung 12 Radiochemotherapie erfolgen. Vielversprechende neoadjuvante Therapiekonzepte werden evaluiert [20, 106]. Die Therapie der lokal fortgeschrittenen Tumorerkrankung (Stadium III, IV) ist nach derzeitigem Wissenstand palliativer Natur. Es zeigte sich eine Prognoseverbesserung unter Radiochemotherapie mit Gemcitabin [107]. Die Mehrheit der Patienten mit einem Pankreaskarzinom hat bereits Metastasen oder wird im Laufe ihrer Tumorkarriere Metastasen entwickeln. Auch für diese Patientenpopulation konnte ein Vorteil durch Chemotherapie mit Gemcitabin beobachtet werden [107]. Als eine additive Substanz mit kleinem, aber statistisch signifikantem Überlebensvorteil konnte der EGFR-Inhibitor Erlotinib mit wirksamkeitsindizierendem Ekzem identifiziert werden [108]. Aufgrund der häufigen aktivierenden K-ras Mutationen (EGFR-Downstream) der Tumorzellen, einer enormen Toxizität und des schwachen Überlebensvorteils sollte die additive Gabe von Erlotinib stets individuell überprüft werden. Aufgrund aktueller Studien erscheint ebenfalls die additive Gabe platinbasierter Chemotherapeutika oder von Fluoropyramidin [20], sowie von nab-Paclitaxel [109] sinnvoll. Bei guten funktionellen Reserven kann u.U. eine Zweitlinien-Chemotherapie mit moderatem Effekt angeboten werden. Eine Palliation der Tumorkomplikationen, beispielsweise eine Entlastung der Cholestase mittels Stent in der ERCP, ist stets in Erwägung zu ziehen. Eine zufriedenstellende Standardtherapie des fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms existiert derzeit also in keinerlei Hinsicht. 1.1.6 Prognose Als Konsequenz der unzureichenden Therapieoptionen liegt die mittlere durchschnittliche Wahrscheinlichkeit aller Pankreaskarzinompatienten, 5 Jahre nach Diagnosestellung noch am Leben zu sein, bei unter 5 %. Das mediane Überleben nach Tumorstadien ist in Tabelle 1 aufgeführt. Bösartige Neubildungen der Bauchspeicheldrüse gehören zu den malignen Erkrankungen, deren Frühsymptome selten und unspezifisch sind. Weniger als 20 % aller Patienten sind bei Erstdiagnose überhaupt noch potentiell kurabel resezierbar [20]. Zudem finden sich unter der OP in 70 % der Fälle prognostisch ungünstige Progressionscharakteristiken wie eine perineurale Infiltration und Lymphknotenmetastasen [10]. Weitere sicher ungünstige Prognoseparameter sind Einleitung 13 ein hoher Tumorgrad, großes Tumorvolumen, hohe präoperative CA-19-9Serumspiegel, persistierend hohe postoperative CA 19-9 Spiegel, tumorpositive Resektionsränder und schwere postoperative Komplikationen [20, 110]. Bei lokal fortgeschrittener oder systemischer Erkrankung (Stadium III / IV) ist die Prognose des medianen Überlebens noch schlechter (vgl. Tabelle 1). Die relative 5-Jahres-Überlebensrate nach der Diagnose eines Pankreaskarzinoms lag in Deutschland im Jahr 2010 bei beiden Geschlechtern bei etwa 8% [2]. Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms ist also nach wie vor mit einer äußerst dramatischen Perspektive verknüpft. 1.1.7 Mausmodelle In den letzten Jahren wurden einige murine Modelle zum experimentellen Studium des Pankreaskarzinoms etabliert [111]. Diese Mausmodelle nutzen meist einen immunkompromittierten Organismus (NOD-SCID / Non-Obese Diabetic Severe Combined Immunodeficiency). In diesen Modellen lässt sich die Tumorformation/progression humaner Pankreaskarzinomzelllinien subkutan [112, 113] oder orthotop [114, 115] untersuchen. Da die Auswirkungen eines chronischen Stresserlebens auf die Tumorprogression nur in einem funktionierenden Immunsystem korrekt abgebildet werden können, scheinen syngene Modelle für derartige Versuchsprotokolle sinnvoll zu sein. So können auch syngen erzeugte murine Karzinomzelllinien wie Panc02 [116, 117] oder 6606PDA [118] orthotop in den jeweiligen Organismus injiziert werden. Die Zelllinie 6606PDA wurde von Tuveson et al. aus Mist1-KrasG12D-Knock-In-Mäusen isoliert. Mist1 ist ein Basistranskriptionsfaktor, der während der Pankreasentstehung zur korrekten Strukturierung des azinären Drüsengewebes exprimiert wird. Als Konsequenz lässt sich eine karzinomgenerierende Überexpression von KrasG12D bereits in jüngeren, undifferenzierteren Zellen beobachten. Die Allel-tragenden Mäuse entwickelten regelmäßig ein invasives, metastasierendes Pankreaskarzinom und vereinzelt ein hepatozelluläres Karzinom. Zuletzt wurde ein syngenes Tumormodell im immunkompetenten Versuchstier mit adäquater Imitation humaner Progression und Histologie beschrieben [119]. Einleitung 14 1.2 Stress Stress beschreibt eine vielschichtige und hochkomplexe Adaptationsreaktion des Organismus auf externe Einflüsse (Abb. 3A). Da eine Dissertationsschrift einer allumfassenden Abhandlung wichtiger Mechanismen und Facetten dieses Phänomens keinesfalls gerecht werden würde, werden im Folgenden nur die für diese Arbeit relevanten „Stressmechanismen“ (vgl. Abb. 3B) erörtert und aktuelle Entwicklungen auf dem relevanten Gebiet des neuroendokrinen Einflusses auf maligne Formation und Progression im Allgemeinen und auf das Pankreaskarzinom im Speziellen besprochen. Abb. 3, Stresssyndrom nach Selye (A) und Konvergenzprinzip (B) mod. nach [120]. A: Selye definierte die Stressantwort bereits 1936 als ein generelles Reaktionsmuster unter erhöhter Belastung, dessen Dynamik sich in 3 Phasen gliedert: Alarmphase mit Wahrnehmung des Stressors und schneller Adaptation der Körperfunktionen (SAM- / HPA-Achse, vgl. 1.2.1.1); Widerstandsphase mit Gegenreaktion; Erschöpfungsphase bei chronischem Stress mit unkontrollierbaren Stresswirkungen. Für die Betrachtung der Auswirkungen eines Stresserlebens sind vor allem die Phasen des Widerstandes und der Erschöpfung relevant. B: Auf Zellebene konvergieren neuronale, hormonelle und physisch/chemische Stresssignale oft auf die gleichen Signal- und Effektorsysteme mit entsprechenden Proteinkinasen (PK) und Transkriptionsfaktoren (TF). So kann ein ähnliches Spektrum an Stressreaktionen leicht realisiert werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Parameter dieser vielfältigen Wechselwirkungen sind mittels roten Rechtecks markiert. Einleitung 15 1.2.1 Sympathisch adrenal-medulläre Achse (SAM) Die sympathisch adrenal-medulläre Achse ist für die vorliegende Arbeit bei der Übermittlung von Stresssignalen von essenzieller Bedeutung und soll im Folgenden dargestellt werden. Die SAM-Achse besteht aus dem sympathischen Nervensystem (SNS) und dem Nebennierenmark (NNM) und bildet gemeinsam mit dem parasympathischen Nervensystem (PNS) und dem Darmnervensystem das autonome oder vegetative Nervensystem. Dieses Nervensystem innerviert die glatte Muskulatur aller inneren Organe, das Herz, verschiedene Drüsen und das lymphatische Gewebe und regelt so wichtigste Körperfunktionen. Unter normalen Bedingungen überwiegt der trophotrope Parasympathikus („rest and digest“), während der ergotrope Einfluss des Sympathikus („fight and flight“) bei Belastung (Stressoren) aktiviert wird [124]. Weitere neuroendokrine Regelkreise der biologischen Stressantwort sind die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA), das Arginin- Vasopressin-System (AVP), das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS), die Schilddrüsenachse und die Wachstumshormonachse [120]. 1.2.1.1 Struktur und Wirkungen der SAM-Achse Die SAM-Achse dient einer schnellen unmittelbaren Vermittlung von Stressreaktionen. Neuzeitlich relevante psychoemotionale Stressoren dieser Achse sind beispielsweise alltagstypische Situationen wie Konkurrenz- oder Termindruck, Mobbing, Verkehrsteilnahme oder andere konfliktbeladene Umstände. So ist auch eine Aktivierung der SAM-Achse unter perioperativen Umständen nach Erstdiagnose eines Pankreaskarzinoms anzunehmen. Auch für Nagetiere wie Ratten wurden ähnliche SAM relevante psychoemotionale Stressoren wie Feindkonfrontation, Immobilisation, überfüllte Käfige sowie eine neue Umgebung identifiziert [121]. Evolutionsbiologisches Ziel der neuronal meist über Norepinephrin und plasmatisch hauptsächlich über Adrenalin vermittelten Stressreaktion ist eine global katabole und ergotrope Stoffwechsellage mit schneller Bereitstellung physischer Reaktionsfähigkeit. Die Struktur der SAM-Achse ist in Abb. 4 veranschaulicht. Einleitung 16 Abb. 4, Struktur der SAM-Achse nach [120]. Stressoren aktivieren über zentralnervöse Zentren, wie das limbische System oder den Hypothalamus (sezerniert CRH, Corticotropin releasing hormone), den Locus coeruleus (LC) und das sympathische Nervensystem, dessen Neuronen nach Umschaltung in Ganglien an den Synapsen der Zielorgane vor allem Noradrenalin (Norepinephrin) freisetzen. Das Nebennierenmark stellt entwicklungsgeschichtlich ein Ganglion dar (vom sympathischen Nervensystem innerviertes Nervengewebe) und sezerniert neben ATP und endogenen Opioiden (Enkephaline und Dynorphine zur Schmerzbewältigung) unter Stressbedingungen zu 20 % Norepinephrin und zu 80 % Adrenalin direkt in den Blutkreislauf. So ist eine systemische Distribution der Neurotransmitter (auch im Tumormilieu) gewährleistet. Je nach Stressorenniveau kann die Plasmakonzentration dieser Signalmoleküle bis auf das 10fache ansteigen [122]. 1.2.1.2 Transmitter und Rezeptoren Die Effekte der SAM-Achse werden hauptsächlich über die Monoamine Norepinephrin und Adrenalin vermittelt. Weitere Vertreter dieser Gruppe mit vielfältigen zentralnervösen Wirkungen sind Dopamin, das Indolamin Serotonin und das Imidazolderivat Histamin. Die Biosynthese der Katecholamine erfolgt im Gehirn, in den chromaffinen Zellen der Nebennierenrinde und im sympathischen Nervensystem aus L-Tyrosin. Das L-Tyrosin wird durch die Tyrosinhydroxylase zu L- Einleitung DOPA 17 (Dihydroxy-Phenylalanin) hydroxiliert und dann durch die DOPA- Decarboxylase zu Dopamin weiterentwickelt. Dopamin wird im Folgenden durch die Dopamin-β-Hydroxylase zu Norepinephrin umgesetzt. Durch Demethylierung mittels der Phenylethanolamin-N-Methyltransferase entsteht aus Norepinephrin das Adrenalin [120]. Der Abbau der Katecholamine erfolgt über Oxidation zu Aldehyden durch die Monoaminooxidase (MAO) an der äußeren Mitochondrienmembran oder an der postsynaptischen Membran sowie durch Methylierung mittels der Catechol-orthomethyltransferase (COMT) an der postsynaptischen Membran [120]. Die Effekte dieser Transmitter werden unter Stressexposition an Endorganen über spezielle Adrenorezeptoren (α1-2 und β1-3) vermittelt. Während die Wechselwirkung mit dem α1-Rezeptor über ein heterotrimeres G-Protein (GS) eine Aktivierung der membranständigen Phospholipase C mit ansteigendem intrazellulärem Inositoltriphosphat (Ca2+-Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum) zur Folge hat, wirken alle genannten β-Rezeptoren über ein aktivierendes heterotrimeres G-Protein (GS) stimulierend auf die membranständige Adenylatcyclase. Diese synthetisiert aus ATP zyklisches AMP (cAMP) und anorganisches Diphosphat. Je nach zytosolischer Konzentration an cAMP wird die Proteinkinase A durch 2 cAMPMoleküle aktiviert und phosphoryliert eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine (Variation der Stressantwort mit Zelltyp), unter anderem den wichtigen Transkriptionsfaktor CREB (cAMP-response element binding protein). Dieser regelt eine Vielzahl intrazellulärer Prozesse und ist aufgrund seiner vielseitigen Ansteuerungsmechanismen wie Calcium-Calmodulin-abhängige Kinasen und Wachstumsfaktoren über MAP-Kinasen ein weiteres Beispiel für Signalkonvergenz (vgl. 1.2). Eine Eigentümlichkeit der katecholaminergen Signaltransduktion stellt der α2-Rezeptor dar. Über ein inhibitorisches G-Protein (Gi) ist er in der Lage, die Adenylatzyklase (β-Rezeptoren) zu hemmen und so ein negatives Feedback zu erzeugen. Eine Inhibition dieses Rezeptors erleichtert die katecholaminerge Signaltransduktion [123]. Einleitung 18 Die ß-Rezeptoren unterscheiden sich vorrangig also nicht durch intrazelluläre Transduktion, sondern in Molekularstruktur und Rezeptoraffinität (vgl. Tabelle 2) α < β2 Adrenalin α >>> β2 Norepinephrin α1 Adrenalin ≥ Norepinephrin α2 Adrenalin ≥ Norepinephrin β1 Adrenalin = Norepinephrin β2 Adrenalin >>> Norepinephrin Tabelle 2, Relative Wirksamkeit von Adrenalin und Norepinephrin an α- und βRezeptoren nach [124]. Die gezeigte Affinität der Neurotransmitter ist in physiologischem Kontext nicht konstant, sondern variiert mit Transmitterkonzentration. In Kohärenz zum ergotropen „Fight and Flight“-Prinzip (1.2.1) wirkt die SAM-Achse so (nach [124]) durch: - α1-Rezeptoren auf die glatte Gefäßmuskulatur (Kontraktion ↑), das Herz (Kontraktilität ↑), die glatte Muskulatur des Magen-Darm-Traktes (Motilität ↓), die Leber (Glykogenolyse ↑); - α2-Rezeptoren auf die pankreatischen β-Zellen (Insulin ↓), die Thrombozyten (Aggregation ↑); - β1-Rezeptoren auf das Herz (positiv inotrop, chronotop und dromotrop), die Niere (Renin ↑), das Fettgewebe (Lipolyse ↑); - β2-Rezeptoren auf die glatte Gefäßmuskulatur (Relaxation ↑), die Bronchien (Dilatation ↑), die Leber (Glykogenolyse ↑), die Skelettmuskulatur (Glykogenolyse ↑); - β3-Rezeptoren auf das Fettgewebe (Lipolyse ↑). In Regulationskreisen des ZNS hat Norepinephrin eine dem Adrenalin übergeordnete Bedeutung und Verhaltensaktivierung führt zu [125]. einer Vigilanzsteigerung Beispielsweise kommt es und allgemeiner bei chronischer Stressexposition zu einer kompensatorischen Verminderung der Rezeptordichte und einer Norepinephrin-Produktionserschöpfung der Neuronen, was mit depressiver Symptomatik korrelieren kann [126]. In gesunden Individuen liegt die mittlere Plasmakonzentration bei etwa 8 (10)-10 mol/l [127]. Einleitung 19 Das in dieser Arbeit verwendete Stimulans zur Stresssimulation in vitro, Isoproterenol, ist ein Adrenalin-ähnlicher selektiver Agonist am β1- / β2-Rezeptor und weist im Gegensatz zum Norepinephrin keinerlei Aktivität an α-Rezeptoren auf. Das Norepinephrin-Derivat Isoproterenol wurde 1943 als Sympathomimetikum von Boeringer Ingelheim entwickelt und in der Affinität zu β1- / β2-Rezeptoren optimiert. Diese β-Rezeptoren können durch den unselektiven Betablocker Propranolol ohne intrinsische Aktivität inhibiert werden. Propranol wurde als erster Beta- Adrenorezeptorblocker in den 1960er Jahren von James Whyte Black entwickelt (Nobelpreis für Medizin, 1988). 1.2.2 Stress und Neoplasie Die Idee, dass psychologische Faktoren die Entstehung oder Progression von Tumorerkrankungen beeinflussen könnten, ist sehr alt. Bereits im Jahre 200 n. Chr. beobachtete der griechische Arzt und Anatom Galen v. Pergamon, dass melancholische Frauen eher empfänglich für Knoten in der Brust wären als „sanguine“ Geschlechtsgenossen [128]. 1.2.2.1 Klinik – Beeinflussen psychologische Faktoren die Entstehung oder Progression einer Tumorerkrankung? Die epidemiologische Evaluation eines kausalen Zusammenhanges zwischen psychosozialem Stress und Tumorgenese / Tumorprogression ist äußerst schwierig. Hinsichtlich der Karzinogenese ist das auslösende Ereignis einer tumorinduzierenden Mutation nur schwer nachzuweisen, da ein auslösender Stressor aufgrund konvergierender Mutationsendpunkte verschiedener Stresseinflüsse und langer Latenzzeiten oft nicht sicher zugeordnet werden kann. Weiterhin stellen sich individuelles Erleben und Bewertung eines Stressors stets als subjektive, schwer zu validierende Parameter dar, die leicht durch andere Parameter, sogenannte Störfaktoren wie beispielsweise Lebensstil, Umweltfaktoren, Alter und Geschlecht, überlagert werden können [129]. Dalton et al. hielten mit Hilfe einer umfassenden Metaanalyse einen generellen Zusammenhang zwischen einschneidenden Lebensereignissen (früher Tod eines Elternteils, Tod des Partners, Scheidung, Tod eines Kindes, Kriegs- oder Umweltkatastrophen) und einer Tumorgenese für eher unwahrscheinlich (OR 0,95 – 1,18; [129]). Bei der Betrachtung einzelner Einleitung 20 Tumorentitäten ergeben sich jedoch höhere Wahrscheinlichkeiten eines kausalen Zusammenhanges: Brustkarzinome (OR 0,8 - 2,6), Lymphome (OR 1,47 - 2,56) und Melanome (OR 1,71 - 4,62) [129]. So wurden neben einem Zusammenhang zwischen beruflichem Stresserleben und der Inzidenz von Ösophaguskarzinomen [130] einige signifikante Zusammenhänge zwischen psychosozialem Stress und der Tumorgenese für das relativ gut untersuchte Brustkarzinom berichtet [131–133]. Weitere Metaanalysen und Übersichtsarbeiten beurteilten vorhergehende Studien eher kritisch und fanden keine eindeutige Assoziation zwischen einschneidenden Lebensereignissen und dem Risiko für Brustkrebs oder andere Entitäten [134, 135]. Auch für den Zusammenhang von Tumorgenese und Persönlichkeitsmerkmalen gibt es keine ausreichende Evidenz [136, 137]. Für das Pankreaskarzinom wurden bis dato keine entsprechenden Zusammenhänge untersucht. Trotz einiger Berichte über signifikante Zusammenhänge sind die akquirierten Daten zu inkonsistent und die Auswirkungen psychischer Faktoren auf die Tumorgenese bisher zu wenig präzise darstellbar, um valide Aussagen hinsichtlich eines Einflusses psychosozialer Stressoren auf die Karzinogenese zu treffen [120, 138]. Im Kontrast zur Tumorentstehung kann eine Progressionssteigerung einer Tumorerkrankung unter dem Einfluss psychosozialer Stressoren verlässlicher vorhergesagt werden [139–141]. Daten von Patienten mit vorbestehender Tumorerkrankung zeigen, dass Diagnose und Behandlung einen enormen Stressor darstellen und dass eine eher depressive Coping-Strategie mit Hoffnungs- und Hilflosigkeit zu einer beschleunigten Krankheitsprogression mit verschlechterter Prognose führen kann [128, 140]. In Kohärenz haben Optimismus [142] und sozialer Rückhalt [143] einen protektiven Effekt mit einhergehender Prognoseverbesserung. Studien zu einer telebasierten psychologischen Intervention in der Krebsnachsorge werden evaluiert [144]. Neben einer Interaktion mit stressinduziertem Gesundheitsverhalten (Rauchen, Insomnie, Alkoholkonsum, Adipositas; [145]) wurden für diese Beobachtungen in der letzten Dekade zunehmend molekulare Mechanismen identifiziert [138, 140, 146], von denen die relevanten im Folgenden kurz erläutert werden sollen. 1.2.2.2 Neuroendokrinologische Modulation der Karzinomprogression Die stressinduzierten Mechanismen mit Beeinflussung der Karzinomprogression sind extrem vielfältig [140]. So kann Prolaktin unter anderem die Proliferationsfähigkeit Einleitung 21 von Mammakarzinomen stimulieren [147], während Oxytocin und Dopamin zu einer Proliferationsinhibition epithelialer Tumoren führen können [148]. Auch für Thyroxin wurden protektive Effekte bei der Tumorprogression beschrieben [149]. Die Expression onkogener Viren kann neuroendokrin moduliert werden [150] und es kommt unter anderem zu einer stressinduzierten Immunsuppression [151]. Obwohl die oben genannten Mechanismen bei der stressvermittelten Tumorprogression von großer Bedeutung sind, wird der Fokus im Folgenden auf die für diese Arbeit relevanten Auswirkungen der Katecholamine gelegt (Abb. 5). Die noch nicht aufgeführten Glukokortikoide verfügen unter anderem über wichtige synergistische Katecholamin-Effekte [152] und ihr Expressionsgrad variiert mit einer zirkadianen Arrhythmie [153]. Während eine kurzfristige Katecholaminfreisetzung dem unter 1.2.1 besprochenem Prinzip der Ergotropie Rechnung trägt, kann chronischer Stress zu einer ausdauernden Katecholaminexposition aller Organe mit progressionsfördernden Veränderungen im Tumormikromilieu führen [138, 146, 154]. Einleitung 22 Abb. 5, Katecholamin-Effekte auf Karzinome (übersetzt aus [138]). Die zentrale Stressreaktion führt zu einer peripheren Katecholaminfreisetzung aus Nebenniere und sympathischen Nervenenden. Katecholamine können die Tumorbiologie über eine Vielzahl unlängst entdeckter Mechanismen beeinflussen. Diese Veränderungen umfassen eine Alteration genetischer Reparaturmechanismen, ein verstärktes Tumorwachstum, gesteigerte Zellmigration oder Invasion (MMPs) und eine Erleichterung der Angiogenese durch Expressionssteigerung proangiogener Wachstumsfaktoren. Zusammenfassend schaffen Katecholamine also ein die Tumorprogression begünstigendes Mikromilieu. Die in Abb. 5 geschilderten Katecholamin-Effekte auf die Tumorprogression haben ein breites In-vitro-Fundament in der Grundlagenforschung. Hinsichtlich des Pankreaskarzinoms postulierten Schuller et al. sogar eine zentrale Rolle der Neurotransmitterrezeptoren im Pankreaskarzinom [155, 156] mit komplexem autokrinem Regelkreis [157] und möglichen therapeutischen Implikationen [158]. Für duktale Pankreaskarzinomzelllinien wurde eine Proliferationsregulation über BetaAdrenorezeptoren [159] bei autokriner Katecholaminausschüttung [157] vermutet und eine Steigerung der Proliferationsaktivität unter adrenerger Stimulation postuliert [160, 161]. Zhang et al. fanden Hinweise für die Hemmung der Proliferation von Einleitung 23 Pankreaskarzinomzelllinien durch Propranolol über eine Apoptoseinduktion [162] und zeigten einen G1/S-Phasen-Arrest im mitotischen Zellzyklus [163]. Auch für Tumorzellen des Mammakarzinoms ließ sich eine Proliferationssteigerung unter adrenerger Stimulation nachweisen [122]. Weiterhin führt Norepinephrin zu einer mit Propranolol inhibierbaren Migrationssteigerung von Colonkarzinomzellen [164]. Mittlerweile gibt es ein gutes Evidenzniveau einer Invasionssteigerung durch eine Expressionssteigerung von MMP-2 / -9 unter Stimulation mit Isoproterenol oder Norepinephrin. So zeigten Brustkarzinomzellen eine Phospholipase C vermittelte Migrationssteigerung unter Stimulation mit Norepinephrin [165]. Für ovarielle und nasopharyngeale Karzinomzelllinien wurde eine durch Propranolol inhibierbare Expressionssteigerung von MMP-2 und MMP-9 mit gesteigertem Invasionspotential unter Stimulationsbedingungen nachgewiesen [166, 167]. Auch für Pankreaskarzinomzelllinien wurde eine Norepinephrin-induzierte und mit Propranolol inhibierbare Invasion mit erhöhten MMP-2 / -9 und VEGF Konzentrationen berichtet [168, 169]. Die Inhibition dieses Invasionspotentials erfolgt u.a. über den Transkriptionsfaktor CREB Expressionssteigerung von [170]. In MMP-7 Magenkarzinomzelllinien (über AP-1 und konnte STAT3) eine unter Stimulationsbedingungen beobachtet werden [171]. Auch die Angiogenese scheint durch eine stimulierbare VEGF-Expression im Ovarkarzinom [172], im Nasopharynxkarzinom [167], im Mammakarzinom [173], im malignen Melanom [174, 175] und im Pankreaskarzinom [168] erleichtert zu sein. Weiterhin haben stressinduzierte Veränderungen der Zellbiologie vermutlich auch ein epigenetisches Korrelat [176]. Einleitung Das relativ 24 konsistente Bild der vorliegenden In-vitro-Studien findet eine Entsprechung in einigen In-vivo-Modellen. Diese finden sich in Tabelle 3. Stressor Organis Entität Lokalisation Effekt auf Tumorwachstum Referenz Mamma subkutan vermehrtes Wachstum unter [177] mus Fixation Ratte Stress Konfront Ratte Mamma ation Wasser Isolation Ratte Maus Mamma Ehrlich intravenöse vermehrte Lungenmetastasierung Injektion nach Konfrontation intravenöse vermehrte Lungenmetastasierung Injektion nach Schwimmstress intraperitoneal vermehrtes Wachstum unter [178] [179] [180] Isolation Fixation Maus Haut orthotop vermehrte Inzidenz, Größe und [181] Dichte von Plattenepithelkarzinomen nach UV-Exposition Fixation Maus Ovar intraperitoneal vermehrtes Wachstum unter [182] Stress in athymalen Nacktmäusen, Angiogenesinhibition durch Propranolol (subkutan) Norepi- Maus Prostata Oberschenkel nephrin vermehrte [183] Lymphknotenmetastasierung nach Norepinephrininjektion (subkutan) in athymalen Nacktmäusen, Inhibition durch Propranolol (subkutan) OP Maus Ovar intraperitoneal vermehrtes Wachstum nach [184] Laparotomie in athymalen Nacktmäusen, Inhibition durch Propranolol (subkutan) Sozialer Maus Pankreas subkutan Stress vermehrtes Wachstum nach [156, 185] sozialem Stress, Inhibition durch GABA und Celecoxib Isoprote- Maus Pankreas subkutan renol Vermehrtes Tumorwachstum nach [161] Isoproterenolinjektion (intraperitoneal), Inhibition durch Propranolol (intraperitoneal) OP Maus Colon Portalvenen- / Kein Zusammenhang zwischen Milzinjektion Häufigkeit von Lebermetastasen [186] und Größe des chirurgischen Traumas Tabelle 3, relevante in-vivo Studien der Tumorprogression unter chronischem Stress modifiziert nach [140]. Einleitung 25 Eine israelische Arbeitsgruppe um Ben-Eliyahu konnte zeigen, dass das Rezidiv freie Überleben nach primärer Tumorresektion eines Mammakarzinom oder eines malignen Melanoms im Tierversuch durch perioperative Immunstimulation mit CpG-C (bakterielles und virales DNA-Motiv) und / oder Betarezeptorblockade mit Propranol signifikant gesteigert wird [187]. Auch für das Pankreaskarzinom gibt es tierexperimentelle Hinweise einer tumorpräventiven Wirkung von Propranolol [188]. Eine eventuelle klinische Relevanz oben genannter Ergebnisse ist derzeit nicht ausreichend evaluiert. Nachdem Lutgendorf et al. auch die MMP-9-Expression von Makrophagen mittels Norepinephrin in vitro steigern konnten, zeigte dieselbe Arbeitsgruppe eine signifikante Korrelation des MMP-9-Expressionsniveaus der tumorinternen Verfassung CD68+-Makrophagen der Patienten. Die mit der zuvor MMP-9-Expression evaluierten war bei psychischen depressiven (höchstsignifikant) und bei aktuell oder in den letzten 6 Monaten gestressten (hochsignifikant) Patienten deutlich erhöht [189]. In der Folge zeigte dieselbe Arbeitsgruppe, dass die Norepinephrin-Konzentration in humanen ovariellen Karzinomen nicht nur bei Tumorprogression (hochsignifikant) und abnehmendem Differenzierungsgrad (höchstsignifikant) zunahm, sondern auch negativ mit dem Maß an sozialer Unterstützung korrelierte [190]. Auch wenn ein Stresserleben für sich genommen wahrscheinlich kein Malignom initiiert, so implizieren die vorliegenden In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse, gerade vor dem Hintergrund einer individualisierten Medizin, eine Integration einer individuellen bio-behavioralen Komponente in neue Therapiekonzepte. 26 2 Zielstellung der Arbeit Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms konfrontiert sowohl den Patienten als auch den behandelnden Arzt regelhaft mit einer katastrophalen Prognose (1.1.6). Beide sind also von noch so kleinen therapeutischen Fortschritten abhängig, auch wenn diese mit einer Vielzahl unerwünschter Arzneimittelwirkungen einhergehen (vgl. Erlotinib-Therapie; 1.1.5). In der zweiten Hälfte der vergangenen Dekade rückten zunehmend die Auswirkungen von chronischem Stress auf die Progression von Tumorerkrankungen in den Fokus der Aufmerksamkeit (1.2.2). Während für einige Tumorentitäten nachteilige Auswirkungen von chronischem Stress postuliert wurden, ist ein entsprechender Zusammenhang bei der Progression des oft mit infauster Prognose verbundenen Pankreaskarzinoms erst in jüngerer Vergangenheit zunehmend untersucht (1.2.2.2). Stresslimitierende Verfahren wie beispielsweise Pharmako – oder Psychotherapie mit breiter Evidenzbasis hätten das Potential einer einfachen, effektiven und bereits evaluierten Therapieoption. Die Stressreaktion eines Organismus ist ein komplexer und vielschichtiger Adaptationsprozess (1.2). Diese Arbeit fokussiert daher auf die gut untersuchte und unkompliziert experimentell zu validierende sympathisch adrenal-medulläre Achse (SAM, 1.2.1). Um die Auswirkungen chronischen Stresses auf die Progression eines Pankreaskarzinoms zu untersuchen, umfasst diese Arbeit zwei verschiedene laborexperimentelle Ansätze. In vitro sollte das Migrations-, Invasions- und Proliferationsverhalten von Pankreaskarzinomzellen unter Stimulation mit Stresshormonen der SAM-Achse charakterisiert werden. Weiterhin sollte nicht nur die Expression, sondern auch die Aktivität einiger der für die Tumorprogression essentiellen Enzyme (MatrixMetalloproteinasen, 1.1.2.1) unter Stimulationsbedingungen untersucht werden. Eine mögliche Reversibilität dieser Effekte unter Einsatz des klinisch zugelassenen Pharmakons Propranolol sollte ebenfalls evaluiert werden. In vivo sollten die Auswirkungen von chronischem Stress auf das Tumorwachstum und die Mortalitätsprognose in einem immunkompetenten Mausmodell eines neu etablierten orthotopen Pankreaskarzinoms untersucht werden. Die Tumorprogression sollte mittels magnetresonanztomografischer Verfahren evaluiert werden. Potentielle therapeutische Effekte von Propranolol sollten ebenfalls untersucht werden. 27 3 Material und Methoden 3.1 In-vitro-Untersuchungen 3.1.1 Zellkultur Die humanen Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1, MIA PaCa-2, BxPc-3 [191], die aus einer Metastase isolierte humane Pankreaskarzinomzelllinie Colo-357 [192] und die murine Zelllinie 6606PDA [118] wurden in dem CO2 Wasser Inkubator „US Autoflow” (Nuaire, Plymouth, USA) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Als Kulturmedien wurden RPMI (+ L-Glutamin, Gibco, Carlsbad, USA) für die Zelllinien Panc-1, MIA PaCa-2, BxPc-3 und Colo-357 oder DMEM (+ Pyruvat/4,5 g/l DGlucose, Gibco, Carlsbad, USA) für die Zelllinie 6606PDA unter Zusatz von 10 % fetalem Rinderserum (FBS, PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland) und 100 U/ml Penicillin mit 100 µg/ml Streptomycin (PenStrep, Gibco, Carlsbad, USA) genutzt. Die Kultur erfolgte in gewebekulturbehandelten 10 cm Kulturschalen (Millipore, Darmstadt, Deutschland). Zur Passage wurden die Zellen nach Waschung mit 10 ml PBS (PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland) in 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung (Invitrogen, Carlsbad, USA) für 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach Resuspension in 10 ml RPMI-Medium + 10 % fetalen Rinderserum wurde die Zellsuspension bei 250 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in 10 ml RPMI-Medium + 10 % fetalen Rinderserum resuspendiert. Das Teilungsverhältnis betrug je nach Konfluenz 1:4 bis 1:7. Es wurden also 2,5 ml bis 1,4 ml der Zellsuspension in einer neuen 10 cm Kulturschale mit 10 ml RPMIMedium + 10 % fetalen Rinderserum ausgesät. Zellzählungen wurden mit einer standardisierten Neubauer-Zählkammer (LO – Laboroptik GmbH, Friedrichsdorf, Deutschland) durchgeführt. In Voruntersuchungen wurde die Expression von β-2-Adrenorezeptoren in humanen Pankreaskarzinomzelllinien, in humanen Pankreaskarzinomgeweben ex situ und in der murinen Zelllinie 6606PDA nachgewiesen [193]. Mykoplasmentests wurden halbjährlich mit dem Venor Gem-Kit (Biochrom, Berlin, Deutschland) durchgeführt. Material und Methoden 28 3.1.2 Gelatinase-Assay 3.1.2.1 Testprinzip Durch die Versuchsanordnung wurde die In-vitro-Aktivität der Matrix- Metalloproteinasen-2 und -9 bestimmt. Hierzu wurde fluoreszenzkonjugierte Gelatine (DQ Gelatine von Schweinehaut; Invitrogen, Carlsbad, USA) genutzt, die sich molekülspezifisch von o.g. Matrix-Metalloproteinasen (Gelatinase A und B) spalten ließ. Die nach definiertem Zeitraum t emittierte Fluoreszenz korrelierte mit dem Aktivitätsgrad der Proteinasen und ließ unter Verwendung einer geeigneten Positivkontrolle Rückschlüsse auf absolute sowie relative Änderungen des Aktivitätsniveaus in Zellkulturüberständen nach Stimulation zu. Für diesen Assay wurde das EnzChek Experimental Protocol (Invitrogen, Carlsbad, USA) wie folgt modifiziert. 3.1.2.2 Etablierung der Methode Um einen zuverlässigen und reproduzierbaren Test mit geeignet hoher Sensitivität auf der Basis des EnzCheck®-GelatinaseAssayProtokolls (Invitrogen, Carlsbad, USA) zu entwickeln, galt es zunächst, vorhandene Variablen zu definieren und zu eliminieren. Die sechs wesentlichen Einflussfaktoren (Positivkontrolle, Stimulationszeit, Anzahl der Zellen, Inkubationsdauer, Menge der Gelatine und Reaktionsumgebung) sollen im Folgenden kurz dargestellt werden: Der Erstellung eines validen Testprotokolls ist Wahl und Aktivität der adäquaten Positivkontrolle elementar immanent. Als solche wurde die vom Hersteller der Gelatine empfohlene Kollagenase von Clostridium histolyticum (17449, Serva, Heidelberg, Deutschland) genutzt. Die Reaktionskinetik der eingesetzten Kollagenase erwies sich als verlässlicher Quantifizierungsparameter (Abb. 6). Bei der, in zwei Vorversuchen auf 10-4 U/ml und 10-5 U/ml bestimmten Kontrollaktivität, zeigte sich nach Inkubationszeit t ein in etwa identes Fluoreszenzniveau mit den genutzten Zellüberständen. Da es sich um eine neu zu etablierende Methode handelte, wurde dieses gemessene Fluoreszenzniveau zusätzlich mit Zellkulturüberständen aus MMP-2 und -9 exprimierenden humanen endometrialen Stromazellen (siehe 3.1.2.3) validiert. Die für die Fluoreszenzmessung optimale Konzentration an aktiven Matrix-Metalloproteinasen-2 und -9 in den Material und Methoden 29 Zellkulturüberständen wurde unter Berücksichtigung der Stimulationszeit und der ausplatierten Zellmenge definiert. Um Sensitivität und Spezifität dieses Testes zu erhöhen, war es wichtig, die unspezifische Fluoreszenz durch Optimierung des Inkubationszeitraumes fluoreszenzkonjugierten nach Zugabe Gelatine zu einer definierten minimieren. Wählte Menge der man den Inkubationszeitraum zu lang, sank die durch unspezifische Spaltung der Gelatine bedingte Spezifität des Testes gerade unter Berücksichtigung der vorliegenden niedrigen Proteinkonzentrationen im Zellüberstand auf ein nicht mehr aussagekräftiges Niveau herab. Wählte man den Inkubationszeitraum hingegen zu kurz, nahm folgerichtig die Differenzierbarkeit der einzelnen Proteinkonzentrationen stark ab. Ähnlich verhielt es sich zu der Menge der genutzten konjugierten Gelatine. So führte beispielsweise eine höhere Gelatinekonzentration folgerichtig zu einer verbesserten Trennungsschärfe bei hochsignifikant differenten MMP- Konzentrationen, während die Sensitivität für die Detektion kleinerer Unterschiede verloren ging. Für eine weitere Minimierung der unspezifischen Fluoreszenz erwies es sich während der Protokolletablierung als notwendig, eine möglichst serumfreie Reaktionsumgebung zu schaffen. Eine Versuchsumgebung mit 10 % des fetalen Rinderserums resultierte in einer erhöhten Ergebnisvarianz, die intrazelluläre reproduzierbare Expressionsvergleiche gänzlich unmöglich machte (Daten nicht gezeigt). Unter Berücksichtigung der genannten Variablen galt es, in diesem Versuchsaufbau eine reproduzierbare Testumgebung zu schaffen, um eine verlässliche Generierung valider Daten zu gewährleisten. Material und Methoden 30 Kollagenase Clostridium hystolyticum Fluoreszenz 20000 0,1 U / ml 0,01 U / ml 0,001 U / ml 0,0001 U / ml 15000 10000 5000 0 0 50 100 Zyklen a 70 s Abb. 6, Enzymkinetik der Kollagenase von Clostridium hystolyticum unter Versuchsbedingungen. Die Spaltung der fluoreszenzkonjugierten Gelatine resultierte in einem der jeweiligen Enzymaktivität adäquaten Fluoreszenzniveau. Die Kinetikanalyse erfolgte über 2,33 h in einem Fluoreszenzmikroplattenleser. 3.1.2.3 Material und Methode In diesem Assay wurden die etablierten Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1, Colo357 und die murine Zelllinie 6606PDA untersucht. Von der zu untersuchenden Zelllinie wurden 24h vor Versuchsbeginn 20.000 Zellen pro Loch in einer 96-Lochplatte (Millipore, Massachusetts, USA) bis zur Adhärenz in RPMI-Medium + 10 % fetalem Rinderserum ausplattiert. Nachfolgend wurden die Zellen für 12 h in 100 µl serumfreiem DMEM Medium mit 1 µmol Isoproterenol (ISO, 16504, SIGMA, St. Louis, USA), 1 µmol Noradrenalin (Norepinephrin, NE, A7257, SIGMA, St. Louis, USA) oder 1 µmol ISO + 1 µmol Propranolol (P0884, SIGMA, St. Louis, USA) bzw. 1 µmol NE + 1 µmol Propranolol erneut inkubiert. Vor dem Start des eigentlichen Assays wurde durch Verwendung eines titrierten, dem zu Grunde liegenden Protokoll folgend, 1x Reaktionpuffers (10x - 50 ml von 0.5M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl², 2 mM Natriumazid, pH 7,6) jedes Loch unter Beachtung der erforderlichen Konzentrationen der im Folgenden genannten Versuchskomponenten auf 200 µl Gesamtvolumen ergänzt: Material und Methoden 31 Leerprobe 100 µl serumfreies RPMI Medium Untersuchungsprobe 100 µl serumfreier Zellkulturüberstand + adhärente Zellen Positivkontrolle 10-5 U/ml finale Konzentration Kollagenase von Clostridium histolyticum (17449, Serva). Es wurden 263,2 mg (0,76 U/mg) gelöst in 10 ml Aqua dest. (20 U/ml), danach aliquotiert und bei – 20C° gelagert. Vor Gebrauch wurde dies adäquat in 1x „Reaction Buffer“ verdünnt Biologische Für 12h mit DMEM/F12 Medium + 2,5 % FBS inkubierter Positivkontrolle Zellkulturüberstand aus endometrialen Stromazellen (S080820, S080813B, S080522; Universitätsklinik Dank und an Poliklinik Dr. med. Herbert für Frauenheilkunde Fluhr, und Geburtshilfe, Greifswald). Zellkulturen endometrialer Stromazellen exprimieren die Matrix-Metalloproteinasen-2 und -9 in ihrem Zellkulturüberstand auf einem konstanten Niveau [194–196], daher stellt ihr Überstand eine valide biologische Positivkontrolle dar MMP-Inhibitor 1 mM finale Konzentration Phenanthrolinmonohydrat Ligand) als des Komplexbildners (Phenanthren-Derivat, unspezifischer Inhibitor von 1,10- zweizähniger Metalloproteasen (320056, Sigma, St. Louis, USA). Es wurden 9,9 mg 1,10Phenanthrolin (180,2 g/Mol) in 25 µl Ethanol gelöst (2,2 M) und adäquat in 1x „Reaction Buffer“ verdünnt Fluoreszenzkonjugierte 50 µg/ml finale Konzentration der Gelatine („DQ Gelatine from pig Gelatine skin, flourescein conjugate“, D12054, Invitrogen, Carlsbad, USA). Es wurde 1 mg Gelatine in 1 ml Aqua dest. gelöst (1mg/ml) und adäquat verdünnt in 1x „Reaction Buffer“. Zugabe als letztes Teilelement unter Verwendung einer Mehrkanalpipette (Bender Med. Systems, San Diego, USA) Tabelle 4, Versuchsaufbau des Gelatinase-Assay. Alle o.g. Versuchskomponenten wurden in mindestens doppelter bzw. drei- bis achtfacher (Zellkulturüberstände) Kontrolle untersucht. Nach Zugabe der Gelatine lief die Reaktion für 6h bei Raumtemperatur unter strengstem Lichtschutz ab. Das resultierende Fluoreszenzniveau wurde in einem Fluoreszenzmikroplattenleser bei einer Exzitation von 495 nm und einer maximalen Emission von 515 nm quantifiziert. Alle angegebenen Fluoreszenzemissionen stellen Differenzen aus Untersuchungsprobe und Leerprobe dar. Die statistische Analyse des basalen Material und Methoden 32 Aktivitätsniveaus erfolgte mittels zweiseitigem-ein-Proben t-Test (hypothetischer Wert 0), die statistische Analyse unter Stimulationsbedingungen mit einem zweiseitigen t-Test. Die Graphen fassen 5 unabhängige Versuchsansätze mit 3fachen intraexperimentellen Kontrollen zusammen. Die grafische Darstellung enthält Plots des Standardfehlers des Mittelwertes. 3.1.3 Matrix-Metalloproteinase-2 ELISA 3.1.3.1 Testprinzip Zur MMP-2 Proteinquantifizierung im Zellkulturüberstand wurde der „Quantikine Human/Mouse/Rat MMP-2 (total) Immunoassay” von R&D Systems (DMP200, Minneapolis, USA) angewandt. Der Assay nutzte die quantitive „Sandwich“-EnzymImmunoassaytechnik. Die genutzte Mikrotiterplatte wurde mit polyklonalen Antikörpern beschichtet, die sowohl das 72kDa schwere Proenzym für die MMP-2, als auch dessen aktivierte Form (66kDa) (vgl. 1.1.2.1.1) detektierte. Diese immobilisierten Antikörper banden das MMP-2 aus Kontrollen und Proben als Antigen. Nach gründlichem Waschen werden wiederum enzymkonjugierte (hier: Meerrettichperoxidase, MPO) polyklonale Antikörper gegen MMP-2 hinzugefügt. Nach erneutem Auswaschen von unspezifisch gebundenem Enzym erfolgte die Zugabe eines Substrates (hier: Wasserstoffperoxid), dessen Umsatz durch Farbumschlag (hier: Tetramethylbenzidin) angezeigt wurde und somit proportional zur gebundenen MMP-2-Menge war. Der Farbumschlag wurde dann unter Zugabe von Schwefelsäure gestoppt und in einem Mikroplattenleser quantifiziert. 3.1.3.2 Material und Methode In diesem Assay wurden wiederum die etablierten Pankreaskarzinomzelllinien Panc1 und Colo-357 untersucht. Als eine biologische Positivkontrolle diente wiederum der Zellkulturüberstand humaner endometrialer Stromazellen (vgl. 3.1.2.3). Der Gewinn von Zellkulturüberständen erfolgte orientierend am Gelatinase-Assay (vgl. 3.1.2.3) unter Zusatz von 10 % fetalem Rinderserum. Die Durchführung des ELISA orientierte sich strikt an dem vorgeschlagenen Protokoll von R&D Systems. Nach Lösen des lyophilisierten MMP-2 Standards in 1 ml Aqua dest. (100 ng/ml) wurde dieser siebenfach mit dem „Calibrator Diluent RD5-32” in einer Material und Methoden 33 Verdünnungsreihe von 50 ng/ml bis 0,78 ng/ml für eine Log-Log-Standardkalkulation verdünnt. Als Leerprobe fungierte ausschließlich der „Calibrator Diluent RD5-32”. Nach Zugabe von 100 µl „Assay Diluent RD1-74“ in jedes Loch der antikörperbeschichteten Mikrotiterplatte, wurden entsprechend 50 µl Leerprobe, Standard, Zellkulturüberstand oder biologische Positivkontrolle hinzugefügt. Nach 2h Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Mikroplattenschüttler bei 500 rpm wurde jedes Loch mit 4 x 400 µl Waschpuffer gewaschen. Nach Zugabe von 200 µl des polyklonalen Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpers gegen die MMP-2 („MMP2-Conjugate“) erfolgte erneut eine Inkubation für 2h auf dem o.g. Mikroplattenschüttler. Während jedes Loch erneut mit 4 x 400µl Waschpuffer gewaschen wurde, ließ sich die Substratlösung aus volumenäquivalenter Mischung von Wasserstoffperoxid („Color Reagent A“) und Tetramethylbenzidin („Color Reagent B“) vorbereiten. Nach Zugabe von je 200 µl der vorbereiteten Substratlösung lief die Reaktion für 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz ab. Nach Ablauf der Zeit erfolgte die Zugabe von 50 µl 1M Schwefelsäure („Stop Solution“) zum Stopp der Reaktion. Die optische Dichte wurde sofort in einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 450nm und einer Wellenlängenkorrektur bei 540 nm bestimmt. Die Interpolation der Standardkurve und die Berechnung gemessener Konzentrationen erfolgten mit der Software Softmax Pro 4.6 (Molecular Devices, 2003, Sunnyvale, USA, lizensiert für AG Lerch). Alle gezeigten Messwerte wurden unter Kalibrierung und berücksichtigter Verdünnung generiert. Der intraexperimentelle Varianzkoeffizient lag bei 24,4 % - 33,4 %. Die statistische Analyse des basalen Aktivitätsniveaus erfolgte mittels zweiseitigem-ein-Proben tTest (hypothetischer Wert 0). Der Graph fasst 2 unabhängige Versuchsansätze mit 2-fachen intraexperimentellen Kontrollen zusammen. Die grafische Darstellung enthält Plots des Standardfehlers des Mittelwertes. 3.1.4 Matrix-Metalloproteinase-9 ELISA 3.1.4.1 Testprinzip Die MMP-9 Quantifizierung im Zellkulturüberstand erfolgte mit dem „Human MMP-9 ELISA“ von Bender MedSystems (BMS2016/2CE, San Diego, USA). Der Assay detektiert sowohl die latente (92 kDa) als auch die aktive (83 kDa) Form der humanen MMP-9. Ähnlich zu den MMP-2 Bestimmungen (vgl. 3.1.3.1) nutzt der Material und Methoden 34 Assay die sog. quantitive „Sandwich“-Enzym-Immunoassaytechnik, wobei sich jedoch die konjugierten Enzyme unterscheiden. Die genutzte Mikrotiterplatte wurde mit polyklonalen Antikörpern gegen MMP-9 beschichtet. Diese immobilisierten Antikörper banden die MMP-9 aus Kontrollen und Proben als Antigen. Nach gründlichem Waschen wurden wiederum enzymkonjugierte (hier: Biotin) polyklonale Antikörper hinzugefügt, welche ebenfalls die MMP-9 als Antigen erkannten und eine andere Bindungsstelle des Moleküls besetzten („Sandwich“). Nach erneutem Auswaschen von unspezifisch gebundenem Enzym erfolgt die Zugabe von an Streptavidin gebundener Meerrettichperoxidase. Das Streptavidinmolekül war in der Lage, mit je einer seiner vier identischen Untereinheiten eine nichtkovalente Bindung zu einem Biotinmolekül auszubilden, welche zu den stärksten bekannten Bindungen dieser Art zu zählen ist [197]. Nach Entfernen von ungebundener Meerrettichperoxidase durch erneute Waschung erfolgte die Zugabe eines Substrates (hier: Tetramethylbenzidin), dessen Umsatz durch Farbumschlag angezeigt wurde und somit proportional zur zuvor immobilisierten MMP-9 Menge war. Der Farbumschlag wurde dann unter Zugabe von Phosphorsäure gestoppt und in einem Mikroplattenleser quantifiziert. 3.1.4.2 Material und Methode In diesem Assay wurden ebenfalls die etablierten Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1 und Colo-357 untersucht. Als eine biologische Positivkontrolle diente wiederum der Zellkulturüberstand humaner endometrialer Stromazellen (vgl. 3.1.2.3). Der Gewinn von Zellkulturüberständen erfolgte orientierend am Gelatinase Assay (vgl. 3.1.2.3) unter Zusatz von 10 % fetalem Rinderserum. Die Durchführung des ELISA`s orientierte sich strikt an dem vorgeschlagenen Protokoll von Bender MedSystems. Nach Lösen des lyophilisierten MMP-9 Standards in 300 µl Aqua dest. (30 ng/ml) wurde dieser siebenfach mit dem Reaktionspuffer (1% Tween 20, 10% BSA in PBS) in einer Verdünnungsreihe von 15 ng/ml bis 0,23 ng/ml für eine 5-ParameterStandardkalkulation verdünnt. Als Leerprobe Reaktionspuffer. Vor Beginn des Versuchs fungierte ausschließlich der wurden die Proben aus den Zellkulturüberständen im Verhältnis von 1:25 mit dem Reaktionspuffer verdünnt. Nach einem ersten Waschschritt aller Löcher mit 2 x 400 µl Waschpuffer (1% Tween 20 in PBS) wurden 90 µl Reaktionspuffer und 10 µl des verdünnten Zellüberstandes Material und Methoden (Gesamtverdünnung 35 1:250) in jedem Loch der antikörperbeschichteten Mikrotiterplatte vermischt. Die Zugabe von 100µl des jeweiligen Standards erfolgte unverdünnt. Abschließend wurden 50 µl des zuvor 1:100 mit Reaktionspuffer verdünnten Biotin-Konjugats (Polyklonaler biotinkonjugierter Antikörper gegen MMP9) in jedes Well hinzugefügt. Nach 2h Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Mikroplattenschüttler bei 100 rpm wurde jedes Loch mit 2 x 400 µl Waschpuffer gewaschen und 100 µl des zuvor 1:200 verdünnten Streptavidin- Meerrettichperoxidase Konjugats hinzugefügt. Dann erfolgte erneut eine Inkubation bei Raumtemperatur für 1h auf dem o.g. Mikroplattenschüttler bei 100 rpm. Nach einem Waschschritt mit 2 x 400µl Waschpuffer wurden 100 µl der Substratlösung (Tetramethylbenzidin) in jedes Loch gegeben. Die Substratreaktion lief bis zu einer optischen Dichte von 0,65 des 15 ng/ml Standards bei 620nm (4 Minuten Bestimmungsintervall) und wurde dann unter Zugabe von 100 µl 1M Phosphorsäure gestoppt. Die optischen Dichten wurden sofort in einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die Interpolation der Standardkurve und die Berechnung gemessener Konzentrationen erfolgte mit der Software Softmax Pro 4.6. Alle gezeigten Messwerte wurden unter Kalibrierung und berücksichtigter Verdünnung generiert. Der intraexperimentelle Varianzkoeffizient lag bei 16,35 % (Panc-1) – 57,69 % (Colo-357). Die statistische Analyse des basalen Aktivitätsniveaus erfolgte mittels zweiseitigem-ein-Proben t-Test (hypothetischer Wert 0), die statistische Analyse unter Stimulationsbedingungen mit einem zweiseitigen t-Test. Die Graphen fassen 3 unabhängige Versuchsansätze mit 2fachen intraexperimentellen Kontrollen zusammen. Die grafische Darstellung enthält Plots des Standardfehlers des Mittelwertes. 3.1.5 Migrations-Assay 3.1.5.1 Testprinzip Der Migrations-Assay (auch „In-vitro-Wounding-“ oder „Scratch-Assay“) diente der Beurteilung der Migrationsfähigkeit einer Zellkultur unter definierten Bedingungen. Zunächst wurde die Proliferationsfähigkeit einer konfluenten Zellkultur durch Einsatz eines zytotoxischen Antibiotikums (hier: Mitomycin-C) bei noch intakter Zellintegrität inhibiert. Folgend fügte man der adhärenten Zellschicht eine kontrollierte und reproduzierbare Läsion („Scratch“) zu. Die Migrationsfähigkeit einzelner Zellverbände Material und Methoden in diese Läsion wurde 36 unter verschiedenen Versuchsbedingungen (hier: Stimulationsansätze) in genormten Zeitintervallen (hier: 12h) unter einem Mikroskop beobachtet und quantifiziert. 3.1.5.2 Material und Methode In diesem Assay wurde das Migrationsverhalten der Zelllinien Panc-1, Colo-357 und MIA PaCa-2 (vgl. [168]) unter Stimulation mit Isoproterenol (ISO, 16504, SIGMA, St. Louis, USA), Noradrenalin (NE, A7257, SIGMA, St. Louis, USA) und Propranolol (P0884, SIGMA, St. Louis, USA) untersucht. Zunächst wurde jedes Loch einer 12-Lochplatte (Millipore, Massachusetts, USA) mit einem Gravurgerät in 4 äquivalente horizontale Zonen unterteilt (Abb. 7A). 24h vor Versuchsbeginn wurden 200.000 Zellen / Loch der zu untersuchenden Zelllinie in 2 ml RPMI-Medium + 10 % fetalem Rinderserum bis zur konfluenten Adhärenz ausplatiert. Die Proliferation der Tumorzellen wurde durch 2h Inkubation der Zellen in 500 µl 10 µg/ml Mitomycin-C (M4287, SIGMA, St. Louis, USA) bei 37° C inhibiert. Das zytotoxische Antibiotikum Mitomycin-C interkalierte zwischen zwei Strängen der DNA, in dessen Folge die DNA-Stränge kovalent miteinander verbunden wurden. So wurde eine Dissoziation der DNA-Stränge erschwert und eine Replikation war nicht mehr möglich. 5 Minuten vor Ende der Inkubationszeit wurden zwei senkrechte, möglichst parallele Läsionen mit einer 200µl Pipettenspitze in der Zellkultur gesetzt. Die Zellen wurden dann mit 2 ml PBS (GIBCO, Carlsbad, USA) vorsichtig gewaschen und für 48h mit 1µM Isoproterenol, 1 µM Noradrenalin oder 1µM Isoproterenol + 1µM Propranolol in RPMI-Medium + 10 % fetalem Rinderserum inkubiert. In einem 12h-Intervall wurde ein mikroskopisches Foto von zuvor definierter Stelle der Läsion (grafisch markiert durch horizontale Zonennummerierung und vertikale Läsionen, vgl. Abb. 7A) akquiriert und das Stimulans erneuert. Um eine quantifizierende Beurteilung der Migrationsfront sicher zu stellen, wurde diese auf jedem Foto bei identer Vergrößerung durch schwarze Pixel (RGB) in PhotoPaint12 (Corel, Ottawa, Kanada) markiert (Abb. 7B). Der prozentuale Anteil der schwarzen Pixel an der Gesamtpixelzahl wurde mittels eines Histogramms errechnet und diente als ein repräsentativer, numerisch quantifizierbarer Parameter für das jeweilige Fortschreiten der Migrationsfront. Diese Evaluationstechnik war Grundlage der in Abb. 20 gezeigten statistischen Aufbereitung. Material und Methoden 37 Abb. 7, Objektivierung und Evaluation des Migrations-Assay. A: Zur reproduzierbaren Identifizierung des fotografierten Läsionsbereichs genutzte Skizze (im Uhrzeigersinn um 90° verdreht). Die Markierung der horizontalen Linien (1-3) erfolgte mittels Gravurgerät vor Beginn des Assays, die zwei senkrechten, welligen Linien symbolisieren die zwei gesetzten Läsionen. Die Lokalisation des 0h Fotos wurde markiert und zu den folgenden Zeitpunkten wieder aufgesucht. B: Evaluation der Migrationsfront mit Photo Paint 12. Die Migrationsfront wurde nach abgebildetem Schema mit schwarzen Pixeln belegt. Die schwarzen Pfeile im Histogramm weisen auf den entsprechenden Spitzenwert schwarzer Pixel (760018 Pixel) in ausreichender Entfernung zur restlichen Farbkomposition (*) des Bildes hin. Da das gezeigte Bild insgesamt 1.420.032 Pixel (grauer Pfeil) enthält, ergibt sich ein Anteil der Migrationsfront von 53,5 %. Der durchgeführte Migrations-Assay diente einer ersten Orientierung zur Evaluation der Zellmobilität unter Stimulationsbedingungen. Alle gezeigten Statistiken basieren auf der relativen Zunahme der Migrationsfront in Richtung der artifiziellen Läsion innerhalb von 48 h von einem als 0 definierten Läsionsdurchmesser aus. Die relative Angabe der Progression der Zellfront (nach (X h Wert – 0 h Wert) / (100 – 0 h Wert)) erschien sinnvoll, da die Manipulation der Zellkultur mit einer 200 µl Pipettenspitze in einem nicht genau reproduzierbaren Läsionsdurchmesser resultiert. So verzerren absolute Daten eine eventuelle Migrationsbeschleunigung. Auf eine SignifikanzTestung der akquirierten Daten wurde bewusst verzichtet, da ein Scratch-Assay dieser Art aufgrund methodisch immanenter Variabilität und Bias-Behaftung nach Meinung des Autors, lediglich einen verlässlichen, aber nur ersten visualisierten Hinweis auf etwaige Mobilitätsveränderungen unter Stimulationsbedingungen geben sollte. Eine genauere Beschreibung dieser Eigenschaften auf Signifikanzniveau, Material und Methoden 38 kann dann durch den Einsatz validerer und besser reproduzierbarer Methoden erreicht werden (vgl. 3.1.6.2 und 1.1.1). Nach Meinung des Autors suggeriert hier die Angabe eines Signifikanz-Niveaus eine nicht zutreffende Methodenvalidität. 3.1.6 Invasions-Assay 3.1.6.1 Testprinzip In einem klassischen Invasionsassay [198, 199] wurde die poröse Membran eines Zellkultureinsatzes zunächst mit definierter Menge eines biologischen Materials (z.B. Matrigel, Kollagen 1) beschichtet. Diese Materialschicht diente der Simulation verschiedener biologischer Barrierensysteme (z.B. Basalmembran) und unterteilte den Versuchsaufbau in ein oberes und unteres Kompartiment. Nach der Migration („Invasion“) der in das obere Kompartiment ausgesäten Tumorzellen durch die artifizielle Barriere hafteten diese an der Unterseite des Zellkultureinsatzes (Abb. 8). Nach einem bestimmten Zeitintervall konnte der prozentuale Anteil der invadierten Zellen lichtmikroskopisch oder unter Benutzung anderer Methoden quantifiziert werden. Da das Durchbrechen der Basalmembran für die Progression einer Tumorerkrankung von entscheidender Bedeutung ist (vgl. 1.1.2), war es wichtig diesen Schritt der Tumoretablierung unter verschiedenen Versuchsbedingungen zu untersuchen. Abb. 8, Skizze des Invasions-Assays aus [200]. Die Membraneinsätze wurden mit Matrigel (grau) beschichtet. Anschließend wurden die Tumorzellen in das obere Kompartiment ausgesät und die invadierten Zellen nach 48h unter Trypsination der Membranunterseite quantifiziert. Material und Methoden 39 3.1.6.2 Material und Methode 3.1.6.2.1 Invasion Um das Invasionsverhalten durch eine Basalmembran unter Stimulation zu simulieren, wurde ein Matrigelinvasionsassay [201] mit der Pankreaskarzinomzelllinie Colo-357 durchgeführt. Die Zelllinien wurden 24h vor Versuchsbeginn mit PBS gewaschen und in serumfreiem RPMI Medium erneut inkubiert. So sollte eine möglichst deutliche Migrationsreaktion auf den genutzten Rinderserum-Gradienten zwischen oberem und unterem Versuchskompartiment erreicht werden. Die Zellkultureinsätze mit einer Porengröße von 8 µm aus Polycarbonat für 12Lochplatten (140656, NUNC, Schwerte, Deutschland) wurden am Tag vor Versuchsbeginn nach Waschen mit serumfreiem RPMI Medium mit 200 µl in PBS zu 200 µg/ml verdünntem Matrigel (“Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix, Basement Membrane” , BD Bioscience, New Jersey, USA) bei streng eingehaltenen 4 °C auf Eis beschichtet und für 1h bei 37 °C inkubiert. Matrigel ist ein gelatinöses Proteingemisch, welches aus murinen Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Sarkomen gewonnen wird und aufgrund seines Reichtums an Laminin und Kollagen IV oft zu Studien der Invasionsfähigkeit von Krebszellen an der Basalmembran genutzt wurde [201]. Nach Abnahme des unpolymerisierten Matrigels, wurde erneut vorsichtig mit serumfreiem RPMI Medium gewaschen und die polymerisierte Matrigelschicht über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Folgend wurden 200.000 Tumorzellen / Zellkultureinsatz in 500µl RPMI-Medium unter Zusatz von 1 % fetalem Rinderserum und 1 µM Isoproterenol oder 1 µM ISO + 1 µM Propranolol auf die polymerisierte Matrigelschicht in das obere Kompartiment ausgesät. Das untere Kompartiment wurde für die ersten 2h mit 600 µl serumfreiem RPMI Medium (um zunächst eine gewisse Adhärenz zu ermöglichen) und folgend mit 600µl Medium unter Zusatz von 10% fetalem Rinderserum angefüllt. Die Zellen wurden so für 48h inkubiert, wobei das Stimulans enthaltende RPMI Medium + 1 % fetales Rinderserum des oberen Kompartiments alle 24h erneuert wurde. Nach vorsichtigem Waschen der Zellkultureinsätze mit PBS, wurden deren Unterseiten in 500 µl 0,125 % TrypsinEDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) in neuen Löchern für 7 min bei 37 °C inkubiert, so dass die invadierten Zellen an der Unterseite des Einsatzes im Trypsin gelöst werden konnten. Adhärente Zellen auf dem Boden des Zellkulturkompartimentes im unteren Kompartiment wurden aufgrund schlechter Reproduzierbarkeit verworfen. Die Material und Methoden 40 trypsinierte Zellsuspension wurde bei 2000g für 2 Minuten zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das erhaltene Zellpellet bei -80 °C eingefroren. 3.1.6.2.2 Zellquantifizierung Für eine objektive und reproduzierbare Quantifizierung der invadierten Zellen wurde der DNA-basierte Ansatz des CyQuant NF Cell Proliferation Assay Kit (C35006, Invitrogen, Carlsbad, USA) genutzt. Dieser Ansatz basiert auf einem mit der DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff und setzt eine proportionale Beziehung der durch das Fluoreszenzniveau repräsentierten DNA-Menge und der absoluten Zellzahl voraus. Es ist zu beachten, dass erst Fluoreszenz emittiert wird, wenn es aufgrund der DNA-Interkalation zu einer Änderung der Proteinkonformation gekommen ist. Die zu quantifizierenden Zellpellets wurden in 100 µl HBSS (Invitrogen, Carlsbad, USA) resuspendiert und je 50 µl der Zellsuspension in einem Loch einer 96Lochplatte zur Doppelbestimmung analysiert. Nach Zugabe von 50 µl des zuvor 1:250 in HBSS verdünnten interkalierenden Fluorochroms („Color Dye Reagent A“), wurde die Mikrotiterplatte für 45 min bei 37 °C in Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurde das konstante Fluoreszenzniveau als Korrespondenz zur absoluten Zellmenge der Proben in einem Fluoreszenzmikroplattenauslesegerät bei einer Exzitation von 485 nm und einer maximalen Emission von 530 nm quantifiziert. Um diese Quantifizierung der Zellen verlässlich zu gestalten, wurden entsprechende Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Zelllinie von 105 Zellen / 100µl bis 1563 Zellen / 100µl hergestellt. Diese dienten im geschilderten Verfahren der Kalkulation der Standardkurve und ermöglichten so die Ermittlung absoluter Zellzahlen aus den gemessenen Fluoreszenzwerten (Abb. 9). Die Berechnungen aus der Interpolation der Standardkurve erfolgten mit der Software Softmax Pro 4.6. Material und Methoden 41 Abb. 9, Standardkurve von Colo-357 zur Quantifizierung invadierter Zellen. Eine zur Zellquantifizierung genutzte lineare Standardkurveninterpolation der Zelllinie Colo-357 in Softmax Pro 4.6. Die Abszisse zeigt die Anzahl der Zellen, die Ordinate die gemessene Fluoreszenzemission. Pearson-Korrelation r² = 0,993. Die statistische Analyse unter Stimulationsbedingungen erfolgte mit einem zweiseitigen t-Test. Der Graph fasst 3 unabhängige Versuchsansätze mit 3-fachen intraexperimentellen Kontrollen zusammen. Die grafische Darstellung enthält Plots der Standardabweichung. 3.1.7 Bromdesoxyuridin (BrdU)-Assay 3.1.7.1 Testprinzip Um das Proliferationsverhalten Stimulationsbedingungen zu der untersuchen, Pankreaskarzinomzelllinien wurde ein unter Pyrimidinanalogon inkorporierender Ansatz mit kolorimetrischer Quantifizierung unter Benutzung des „Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)“ von ROCHE (11647229001, Berlin, Deutschland) gewählt. Während die Tumorzellen mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) inkubiert wurden, wurde dieses bei Neusynthese von DNA anstelle des Desoxythymidins (Abkömmling der Pyrimidin-Nukleobase Thymin) in die Doppelhelix-Struktur inkorporiert. Ein verlässliches Ergebnis dieses Versuches setzt ein proportionales Verhältnis der Material und Methoden 42 inkorporierten BrdU-Menge zur Menge an neusynthetisierter DNA voraus. Bei der anschließenden Fixierung der Zellen wurde ebenfalls die DNA denaturiert, um sie den nun genutzten monoklonalen Antikörpern (Maus) gegen BrdU leichter zugänglich zu machen. Diese BrdU-spezifischen Antikörper waren Peroxidase-konjugiert, welche nach entsprechend gründlicher Waschung das Substrat (Tetramethylbenzidin) umsetzten. Die aus dieser Reaktion resultierende Änderung der optischen Dichte war der Menge neusynthetisierter DNA äquivalent und konnte in einem Mikroplattenlesegerät quantifiziert werden. Der Test korrelierte in Sensitivität und Spezifität laut Herstellerangaben eng mit dem [3H]-Thymidin- Inkorporationsprinzip, stellte aber eine ungefährlichere, nicht radioaktive Alternative dar. 3.1.7.2 Material und Methode In obig erklärtem Versuchsaufbau wurden die Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1, Colo-357, MIA PaCa-2, BxPc-3 und die murine Zelllinie 6606PDA auf Änderung ihres Proliferationsverhaltens unter Stimulation mit 1 µmol Isoproterenol, 1 µmol Noradrenalin oder 1 µmol ISO + 1 µmol Propranolol bzw. 1 µmol NE + 1 µmol Propranolol untersucht. 12 h vor Versuchsbeginn wurden zunächst 10.000 Zellen / Loch in RPMI-Medium + 10 % fetales Rinderserum auf einer 96-Lochplatte bis zur Adhärenz ausplatiert. Dann wurde jedes Loch der adhärenten, nicht konfluenten Tumorzellen zunächst mit 100µl serumfreiem RPMI-Medium, das jeweilige Stimulans enthaltend, für 12 h inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde das Stimulans in 90 µl / Loch erneuert und unter Zugabe von 10 µl der zuvor 1:100 mit Zellkulturmedium verdünnten BrdU-Lösung (10mM) wurde eine finale BrdU-Konzentration im einzelnen Loch von 10 µM für ein weiteres 12 h Inkubationsintervall erreicht. Zu Versuchsbeginn wurde der Zellüberstand dekantiert und die adhärenten Zellen für 30 min bei Raumtemperatur unter Zugabe von 200 µl /Well „FixDenat-Solution“ fixiert. Der lyophilisierte Peroxidase-konjugierte BrdU-spezifische Antikörper wurde in 1,1 ml Aqua dest. rekonstituiert und vor Gebrauch 1:100 in „Antibody-Dilution Solution“ verdünnt. Nach Zugabe von 100 µl / Loch der verdünnten Antikörperlösung wurde die Platte bei Raumtemperatur für 90 min inkubiert. Nach dreimaliger Waschung jedes Lochs mit 300 µl PBS wurden 100 µl der Substratlösung (Tetramethylbenzidin) in jedes Loch hinzugefügt. Diese durch Änderung der Material und Methoden 43 optischen Dichte angezeigte Substratumsatzreaktion war der neusynthetisierten DNA-Menge proportional. Die Farbumschlagsreaktion wurde nicht gestoppt und in einem Mikroplattenleser bei 370 nm und einer Referenzwellenlänge von 492 nm alle 5 Minuten erfasst. Die optimale (maximale Trennschärfe) Umsatzzeit lag je nach Zelllinie bei 10 - 20 Minuten. Für jede Zelllinie wurden Leerproben (unspezifische Bindung von BrdU ohne Zellkörper) und Hintergrundkontrollen (unspezifische Bindung des Peroxidase-konjugierten Antikörpers an Zellstrukturen ohne BrdUInkubation) angefertigt. Die mit der Software Softmax Pro 4.6 ermittelten Dichtewerte wurden jeweils als relative Änderung ihrer versuchsinternen Kontrolle erfasst. Die statistische Analyse unter Stimulationsbedingungen erfolgte mit einem zweiseitigen gepaarten t-Test. Die statistische Analyse erfolgte hier im sog. gepaarten t-Test, da identische Versuchsansätze mit geringfügig unterschiedlicher Inkubationszeit in die statistische Analyse einflossen. Die Graphen fassen 2 (Zelllinie BxPc-3) – 5 (Zelllinie 6606PDA) unabhängige Versuchsansätze mit 3-fachen intraexperimentellen Kontrollen zusammen. Die grafische Darstellung enthält Plots des Standardfehlers des Mittelwertes. Material und Methoden 44 3.2 In-vivo-Untersuchungen Alle Tierversuche wurden aufgrund des sehr arbeits- und zeitintensiven Designs gemeinsam mit Florian Seubert durchgeführt. 3.2.1 Grundlagen Alle Tierversuche wurden in speziell ausgestatteten Räumen der BioTechnikum Greifswald GmbH (Walther-Rathenau-Str. 49a, 17489 Greifswald; Geschäftsführer Dr. Wolfgang Blank) unter Kooperation mit Mitarbeitern der Abteilung für Versuchstierkunde (verantwortet durch Frau Prof. Klöting) durchgeführt und vom Landesministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Forsten und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern genehmigt (LALLF M-V TSD/7221.3-1.1-056/06). Die antragsgerechte Durchführung der Tierversuche wurde durch den verantwortlichen Antragssteller Dr. med. L. I. Partecke engmaschig begleitet und beaufsichtigt. Für die Experimente wurden ausschließlich männliche C57BL/6N Mäuse von Charles River (Bad Sulzfeld, Deutschland) genutzt. Alle Mäuse waren zu Versuchsbeginn zwischen 6-8 Wochen alt und wogen 19 – 23 g. Der Gewichtsverlauf wurde durch wöchentliches Wiegen dokumentiert. Zur Akklimatisierung und Etablierung einer käfigeigenen Sozialstruktur (beispielsweise zur Reduktion von Verbiss) wurden die Mäuse direkt nach Ankunft in entsprechende Versuchsgruppen randomisiert und für mindestens 14 d unter definierten Bedingungen (Raumtemperatur 21 °C, relative Luftfeuchtigkeit 50 % – 60 % und Hell / Dunkel Rhythmus von 12 h/12 h) in pathogenarmer Umgebung gehalten. Maximal wurden 7 Tiere in einem Käfig gehalten. Alle Tiere wurden mit Futter und filtriertem Wasser ad libitum versorgt. Zur Fütterung wurde artgerechtes Spezialfutter für Mäusezucht verwendet: V1126-00 ssniff M-Z (ssniV Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland), zusammengesetzt aus Rohprotein 22,1 %, Rohfett 4,5 %, Rohfaser 3,9 %, Rohasche 6,7 %, Calcium 1%, Phosphor 0,7 % und Natrium 0,25 %. Als Zusatzstoffe waren die Vitamine A, C, D3, E und Kuper(II)-sulfat Pentahydrat enthalten. Material und Methoden 45 3.2.2 Tumorimplantation Um eine valide Beurteilung des Stresseinflusses auf die Tumorprogression zu gewährleisten, wurde unter adäquater Anästhesie ein murines orthotopes Adenokarzinom des Pankreaskopfes bei voller Immunkompetenz implantiert. 3.2.2.1 Narkose Um die nötige Laparotomie mit anschließender Tumorimplantation schmerzfrei, sicher und reproduzierbar durchzuführen, bedurfte es einer zuverlässigen, bewusstseinsmanipulierenden und muskelrelaxierenden Analgesie. Es wurde eine intraperitoneale Injektionsnarkose mit 87 mg / kg Ketamin (Ketanest S©, Pfizer, Berlin, Deutschland) und 13 mg / kg Xylazinhydrochlorid (Rompun©, Bayer, Leverkusen, Deutschland) in isotonischer 0,9 % NaCl-Lösung durchgeführt. Das absolute intraperitoneale Injektionsvolumen betrug 250 µl. Das Cyclohexanderivat dissoziatives Ketamin Anästhetikum mit wurde aufgrund seiner Herz-Kreislaufstimulation Eigenschaften als ausgewählt. Die Wirkmechanismen des Ketamins sind teilweise unklar und sehr vielfältig. Neben einer leicht agonistischen Wirkung an Opioid- und Gamma-AminobuttersäureRezeptoren (GABA), entfaltet es vor allem eine antagonistische Wirkung am NMethyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA) und führt so unter anderem zu einer Hemmung der NMDA-abhängigen Acetylcholinfreisetzung, bei erschwerter Rückresorption von Katecholaminen wie Noradrenalin und Dopamin am synaptischen Spalt. So gewährleistet es eine adäquate Hypnose und Analgesie unter weitgehend intakten Schutzreflexen und findet aufgrund seiner relativ einfachen Handhabung vor Allem in der Notfallmedizin Anwendung [202]. Das Xylazinhydrochlorid ist ein in der Veterinärmedizin weit verbreiteter zentraler und peripherer α-2-Adrenorezeptor-Agonist. So wirkt es stark sedierend mit ausgeprägter Hypnose und sorgt neben einer leichten zentralen Muskelrelaxation für eine je nach Tierart unterschiedlich ausgeprägte Analgesie [203]. Material und Methoden 46 3.2.2.2 Implantationsprotokoll 3.2.2.2.1 Vorbereitung der tumorinduzierenden Injektionslösung Für die Implantation wurde eine subkonfluente 6606PDA Zellpopulation einer 10 cm Zellkulturschale (BD Bioscience, New Jersey, USA) genutzt. Diese wurde zweimal mit PBS gewaschen, anschließend mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung geerntet, in serumfreiem DMEM resuspendiert, mittels Tryphanblau auf Viabilität (> 95 %) überprüft und gezählt (vgl. 3.1.1). Zur Herstellung der tumorinduzierenden Injektionslösung wurden 1,6 x 10 6 Tumorzellen in 80 µl PBS und 80 µl MatrigelTM (BD Bioscience, New Jersey, USA) bei 4 °C resuspendiert. Während der Resuspension ist unter allen Umständen auf ein luftblasenfreies Vorgehen bei gleichmäßiger Durchmischung zu achten. Das genutzte Matrigel (vgl. 3.1.6.2.1) ist auf Eis (4 °C) flüssig und polymerisiert nach Injektion in den Pankreaskopf (ab 10 °C) zu einer biologisch aktiven BasalmembranMatrix. Diese Matrix beinhaltet die zur Anheftung epithelialer Tumorzellen nötigen Molekularstrukturen Initialstadiums und der gewährleistet Tumorprogression die nötige und Integrität vermeidet während eine des artifizielle Tumordissemination [204]. 3.2.2.2.2 Laparotomie und Injektion Die zu injizierende Maus wurde narkotisiert (siehe 3.2.2.1) und in Rückenlage mittels Klebestreifen fixiert. Nach Durchführung einer ca. 1,5 cm langen rechts betonten Oberbauchlaparotomie wurde der Pankreaskopf unter Verschiebung des Dünndarmes und Preluxation mittels eines sterilen Wattetupfers dargestellt. Für die nun folgende Injektion der Tumorzellen wurde ein gekühlter fein skalierter elektrischer Mikroinjektor (Hamilton Syringe, Reno, USA) mit einer 27 Gauge (Außendurchmesser nach ISO/DIN 9626 von 0,40 mm) Kanüle genutzt. Je Versuchstier wurden nach Infiltration des Pankreaskopfes 2 x 105 Tumorzellen in 20 µl der vorbereiteten Injektionslösung (3.2.2.2.1) langsam injiziert (Abb. 10). Aus einer vorbereiteten Tumorsuspension wurden maximal sieben Tiere injiziert. Um eine artifizielle peritoneale Tumordissemination zu vermeiden, wurde der Injektionskanal nach Herausziehen der Kanüle für ca. 30 s mittels eines sterilen Wattetupfers komprimiert. Nach Reposition des Pankreas und Darmes wurden Peritoneum und Material und Methoden 47 Haut in einer einschichtigen und resorbierbaren Naht (4/0, Catgut, Markneukirchen, Deutschland) vernäht. Eine adäquate Analgesie erfolgte vor Narkose-Ende mit 0,1 mg / kg Buprenorphin subkutan. Abb. 10, Injektion muriner 6606PDA Zellen in den Pankreaskopf. Gezeigt ist die Injektion der vorbereiteten Tumorsuspension in den bereits dargestellten Pankreaskopf (Pfeil) unter Verschiebung des Darmes in einer laparotomierten C57BL/6N Maus. 3.2.3 Stressmodel 72 h nach der Tumorinduktion wurden die Mäuse der Stressgruppe regelmäßigem chronischem Stress exponiert und die Auswirkungen auf den individuellen Organismus quantifiziert. 3.2.3.1 Methode und Art des Stressors Unter der Prämisse, eine konstante und objektiv reproduzierbare Stressumgebung ohne Adaptionsmöglichkeit (chronisch) zu schaffen, wurde ein an Balb-c Mäusen etabliertes Stressmodel [121] mit akustischer und räumlicher Komponente gewählt und entsprechend modifiziert. Die akustische Komponente lieferte ein ultrahohe Frequenzen emittierender Apparat zur Schädlingsbekämpfung (75616, Isotronic, Horb, Deutschland). Die Frequenzemission (15,5 KHz – 19,5 KHz) und Lautstärkeregelung (0 dB – 35 dB) erfolgte zur Adaptionsverringerung randomisiert. Um räumlichen Stress zu simulieren, wurden die Mäuse der Stressgruppe in 50 ml Polypropylen-Röhrchen (BD Bioscience, New Jersey, USA) verbracht. Diese waren Material und Methoden 48 mit ausreichend Löchern versehen, sodass eine problemlose Ventilation und Wärmeabgabe gewährleistet waren. Der Schwanz wurde zu keiner Zeit eingeklemmt und konnte frei bewegt werden. Die Stressoren wurden täglich in zwei Sitzungen von 2 h appliziert (8 – 10 Uhr und 16 – 18 Uhr). Zwischen den Sitzungen hatten alle Versuchstiere Futter- und Wasserzugang ad libitum. Um akustische, visuelle oder olfaktorische Stressoren auszuschließen, wurden die Kontrolltiere in einem separaten Raum untergebracht. 3.2.3.2 Stressquantifizierung Als entscheidender Parameter zur Stressevaluation wurde das Tierverhalten mit dem von Kiank et al. 2005 etablierten Stress Severity Score (SSS) nach entsprechender Modifizierung beurteilt. Im Wesentlichen maß der „Score“ die 5 verschiedenen Parameter Urin (1-6), Kot (1-6 / Verdopplung bei Diarrhö), Beschaffenheit des Fells (1-2 / 1 bei nassem Fell), Lethargie (1-6) und Muskeltonus (1-3) mit der in Klammern angegebenen gewichteten Zahlwertskala konnten interindividuelle Summenbildung zur Intensitätsabschätzung. Unterschiede des Durch Stresserlebens zuverlässig dokumentiert und ein konstantes Stressniveau über Kontrollniveau sichergestellt werden (Abb. 23). Das Scoring der Maus erfolgte nach Entnahme aus den genutzten Röhrchen während einer 2 minütigen Beobachtungsperiode im eigenen Käfig. Die Entsprechungen der Zahlenwerte einzelner Parameter können dem Dokumentationsprotokoll (Anhang I) entnommen werden. Die statistische Analyse des „Stress Severity Score“ unter Stressbedingungen erfolgte mittels zweiseitigen Mann Whitney Test. Die grafische Darstellung enthält Plots der Standardabweichung (Abb. 23). Weiterhin untersuchte unsere Arbeitsgruppe zur Stressverifizierung unter den in 3.2.3.1 genannten Versuchsbedingungen das Serum-Kortisol mittels ELISAVerfahren [193], das Expressionsniveau der Tyrosinhydroxylase im Westernblot als Parameter der Katecholaminausschüttung [193], die Expression verschiedener Zytokine als Maß der stressbedingten Immunsuppression [193] und den transversalen Durchmesser der Glandula adrenalis in koronarer Bildebene im MRT (vgl. Abb. 12). Die statistische Analyse der Nebennierenvolumina unter Stressbedingungen erfolgte mit einem zweiseitigen t-Test. Die grafische Darstellung enthält Plots der Standardabweichung (Abb. 24). Material und Methoden 49 3.2.4 Auswertung Im Folgenden wird der Prozess der Datenakquise mittels Magnetresonanztomografie und chirurgischer Exploration geschildert. 3.2.4.1 Magnetresonanztomographie (MRT) Die MRT stellt eine valide (3.2.4.1.2), sicher reproduzierbare und objektive Methode zur morphologischen Beurteilung pankreatischer Prozesse auf einem Zeitstrahl dar [205, 206]. So können Versuchstierzahlen signifikant reduziert und valide wissenschaftliche Daten gewonnen werden. Für eine sichere und nachvollziehbare Beurteilung einer eventuellen Tumorprogression im Verlauf ist die MRT die aktuelle Methode der Wahl. 3.2.4.1.1 Untersuchungsprotokoll Um den Fortschritt der Tumorprogression zuverlässig zu beurteilen und eventuelle Differenzen in Stresserleben und Kontrollumgebung zu detektieren, wurden die operierten Tiere zu vorab definierten Messzeitpunkten (0) unter Verwendung spezieller Transportkäfige in den Vorraum des genutzten Hochfeld-Kleintier-MRT (ClinScan, 7.0 Tesla, 290 mTesla / m Gradientenfeldstärke, Bruker, Karlsruhe, Deutschland) verbracht. Jedes Tier wurde in einer eigens vom Bauhof der Universität Greifswald angefertigten atmosphärisch isolierten Kunststoff-Box mit Gaseinleitung narkotisiert. Die Gaseinleitung von 3 % Isofluran© (Baxter, Unterschleißheim, Deutschland) im O2Gemisch erfolgte bei 3 l / min bis zur tiefen Bewusstlosigkeit des Versuchstieres. Isofluran gehört zu den halogenierten Ethern und ist mit einer relativ schnellen Anflutungszeit (MAC 1,2 %; vgl. N2O „Lachgas“ MAC 105 %), einem Katecholaminsensibilisierenden negativ inotropen Effekt (vgl. Bradykardie unter halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Halothan) und fast fehlender renaler und hepatischer Toxizität (vgl. „Halothanhepatitis“) das Anästhetikum der Wahl [202]. Falls Blutentnahmen der Tiere vorgesehen waren (0) wurde jetzt retrobulbär mit zuvor mittig zerbrochenen heparinisierten Mikrokapillarpipetten (Marienfeld-Superior, Lauda-Königshofen, Deutschland) punktiert und das Blut in Serumröhrchen (BD Vacutainer SST II Advance, Greiner bio-one, Kremsmünster, Österreich) bei 4 °C bis Material und Methoden 50 zur Zentrifugierung (10 min, 3500 rpm) gesammelt. Der Serumüberstand wurde bei 20 °C gelagert. Anschließend wurden die Mäuse in Bauchlage unter ständiger Anästhesie (1 % - 1,5 % Isofluran© in O2, 1 l / min – 1,5 l / min) in einer Ganzkörper-Maus Spule (Bruker) gescannt. Um die Vitalfunktionen und das Wohlergehen der Tiere während der Untersuchung zu überwachen, wurden EKG, Atemfrequenz und Temperatur abgeleitet. Zur Vermeidung von Bewegungsartefakten erfolgte eine Respirationsausgelöste Sequenzakquise. Die Akquisitionszeit der Aufnahmen betrug 20 min – 25 min. Nach 2 Lokalisationssequenzen, die der Orientierung im Versuchstier und der Lokalisation in X, Y und Z Ebene dienten, wurde ein FoV („Field of View“) definiert, welches den kranialen Teil der unteren Extremität, das komplette Abdomen und den kaudalen Teil beider Lungenflügel umfasste. Es folgte die hochauflösende Akquise T2 gewichteter Bildserien in Koronar- und Transversal-Ebene (Koronar: TR („Time of Relaxation“): ca. 1200 ms; TE („Time of Echo“): 41.0 ms; FA („Flip-Angle“): 180°; FoV („Field of view“): 42 mm x 42 mm; Matrix: 240 x 320; 24 Schichten, Schichtdicke: 0,7 mm, Akquisitionszeit: ca. 15 min; Transversal: TR: ca. 1250 ms; TE: 41.0 ms; FA: 180°; FoV: 40 mm x 40 mm; Matrix: 240 x 320; 24 Schichten, Schichtdicke: 0,7 mm, Akquisitionszeit: ca. 10 min). 3.2.4.1.2 Bildauswertung und Volumetrie Zur Auswertung der akquirierten MRT-Sequenzen und für eine valide Tumorvolumetrie wurden CIT (Center for Information Technology) und NIH (National Institutes of Health) entwickelte Algorithmen der Software MIPAV (Medical Image Processing and Visualization, 4.0.3, CIT / NIH, 2008) genutzt [207]. Der Tumor wurde zwecks Volumetrie mittels sog. Interessenregionen („Regions of Interest / ROI“) in jeder transversalen Schicht markiert (Abb. 11A). Um die Kompatibilität der genutzten Volumetrie Algorithmen mit dem genutzten MRT-System zu verifizieren, wurde neben adäquater Literatur [208] ein Phantom mit definiertem Volumen unter Verwendung der in 3.2.4.1.1 beschriebenen Sequenzen untersucht (Abb. 11B). So konnte die Akquise valider Volumetriedaten gewährleistet werden. Material und Methoden 51 Abb. 11, Tumorvolumetrie und Ergebnisvalidierung mittels MRT-Phantom. A: In jeder Schicht der transversalen Sequenz, die Tumoranteile zeigte, wurden diese mittels einer Region of Interest (ROI) markiert (rechts). Die oberen Bilder zeigen exemplarisch einen Tumorausläufer (hier: kranial, Schicht 19 / 34, Schichtdicke 0,7 mm), während unten die Schicht des größten transversalen Tumordurchmessers gezeigt ist (Schicht 15 / 34, Schichtdicke 0,7 mm). Alle markierten ROIs ergeben durch Interpolation der Flächen mittels Software (basierend auf einer kubischen Parabelfunktion mit geeigneten Koeffizienten (aix3 + bix2 +cix + d)) das gesuchte Volumen (aus Versuchsreihe III, Maus III / 5, 28 d post Tumorinduktion, Tumorvolumen 199,45 mm3, max. Tumor-Ø 7,13 mm). B: Als MRT-Phantom zur Volumenvalidation wurde ein mit 1000 mm 3 (kalibrierte Pipette) Aqua dest. gefülltes konisches 1,5 ml Röhrchen (Eppendorf, Deutschland) genutzt. Das Markieren mit ROIs erfolgte wie in A beschrieben. Oben : Koronarschnitt (Schicht 9 / 14, SD 0,7 mm). Unten : Transversalschnitt (35 / 45, SD 0,7 mm). Die Interpolation der ROI-Daten von einer Transversalsequenz und zwei Koronarsequenzen ergab eine mittlere Abweichung von 1,8 % von dem zu erwarteten Volumen bei einem errechneten Mittelwert aller Ebenen von 982 mm 3 (σ + / - 27,2 mm3). Eine Rangliste nach Wilcoxon (p = 0,5) ergab keinen signifikanten Unterschied zu einem hypothetischen Wert von 1000 mm3. Die Größenbestimmung der Glandulae adrenales als Aktivitätsparameter der sympathisch-adrenal-medullären-Achse maximalen Durchmesser (Abb. 12). [182] Vor erfolgte dem durch Erfassung Hintergrund einer ihrer kleinen Versuchstieranzahl N und den aus der relativ kleinen Größe der Glandulae (mittlerer Ø 1,8 mm) resultierenden schwierigen Beurteilungsbedingungen (bei Schichtdicke 0,7 mm) müssen diese methodenimmanenten Limitationen bei der Einordnung der Ergebnisse berücksichtigt werden. Die akquirierten Ergebnisse sollten nur in Zusammenschau mit anderen Stressparametern interpretiert werden (vgl. 3.2.3.2, Material und Methoden 52 4.2.1). Aufgrund der beschriebenen Größenverhältnisse ist unter Verwendung des geschilderten Systems eine valide Volumetrie nicht trivial. Die schichtweise Erfassung des maximalen Organdurchmessers erfolgte durch 2 Untersucher und die intra-individuell erfassten Daten gingen als arithmetisches Mittel in die statistische Analyse ein. Abb. 12, MRT-Bildgebung der Glandulae adrenales und Diameterbestimmung. Gezeigt sind die Nebennieren (weißer Pfeil) in koronarer Ebene der MRT-Untersuchung (links). Das adrenale Gewebe ist morphologisch klar abgrenzbar und wurde mittels Messung des maximalen Diameters quantifiziert (rechts) (aus Versuchsreihe III, Maus III/5, 28 d post Tumorinduktion, Schicht 18 (koronar), max. Ø NN 1,77 mm (σ +/- 0,078)). 3.2.4.2 Exploration Nach der Untersuchung im Magnetresonanztomografen wurden die narkotisierten Mäuse je nach Versuchsplanung (0) in ihre ursprünglichen Käfige verbracht, bzw. durch zervikale Dislokation getötet und der folgenden Exploration zugänglich gemacht. Für eine reproduzierbare und untersucherunabhängige Sektion, wurde der Situs einem stringenten Protokoll folgend exploriert (Anhang II). Zunächst wurde der abdominale Situs des in dorsaler Lage fixierten Körpers in Uförmiger Schnittführung eröffnet und fotodokumentiert (Abb. 13A). Falls notwendig, wurden nun Aorta oder Vesica urinaria zur Probengewinnung punktiert. Material und Methoden 53 Um das Hypoxie-sensitive Gewebe der Glandulae adrenales für eine Quantifizierung der Tyrosinhydroxylase im Westernblot zu nutzen, wurden die Drüsen zunächst entfernt und in 1,5 ml Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) in flüssigem N2 Schock gefroren und im Anschluss bei – 80 °C gelagert. Der Tumor wurde unter Erhaltung des Pankreas / Milz Paketes aus der Kurvatur des Duodenums präpariert, wobei eventuelle Infiltrationen anderer Organe Berücksichtigung fanden (gemeinsame Präparation). Das Tumorpaket wurde in PBS gewaschen und fotodokumentiert (Abb. 13B). Abb. 13, Situsübersicht und Tumorpräparation. A: Gezeigt ist die Fotodokumentation eines explorationstypischen Situs abdominalis einer C57BL/6N Maus 14 d nach Tumorimplantation (duktales Adenokarzinom des Pankreaskopfes, schwarzer Pfeil; Corpus pancreaticus, grauer Pfeil; Milz, weißer Pfeil; Duodenum, schwarzer Stern; Leber, grauer Stern; Vesica urinaria, weißer Stern). B: Fotodokumentation (cm) des aus dem Situs präparierten Tumorpaketes (duktales Adenokarzinom des Pankreaskopfes, schwarzer Pfeil; Corpus pancreaticus, grauer Pfeil; Milz, weißer Pfeil). Aus Versuchsreihe III, Maus I/1, Tumorvolumen 238,90 mm3. Das Tumorgewebe wurde isoliert und mittels elektronischer Schiebelehre in 3 Ebenen vermessen ((L)änge, (W)eite und (H)öhe). Das manuell bestimmte Tumorvolumen wurde mit einer etablierten Formel für ellipsoide Tumoren (V = L x W x H x (/6)) errechnet. Dies diente als Grundlage einer Arbeit, die die Validität einer MR-basierten Bildgebung in dem genutzten Tumormodell analysiert [209]. Je nach Endpunktanalyse (0) wurde das Tumorgewebe im Anschluss aufgeteilt (Fixierung in Paraformaldehyd oder Einbettung in Tissue-Tek O.C.T.Compound für Histologie / Immunhistochemie; Verbringung in 15 ml Röhrchen (Falcon BD, New Jersey, USA), Schock-Gefrierung in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei – 80 °C für ELISAProteinanalysen (MMP-9, VEGF) oder mRNA-Quantifizierungen). Material und Methoden 54 Der übrige Situs wurde gründlich makroskopisch auf eventuelle Tumorherde untersucht. Bei Verdacht erfolgte eine Probenentnahme mit histologischer Aufarbeitung und Diagnostik. Besonderheiten wurden dokumentiert. 3.2.5 Experimenteller Aufbau der Tierversuche Bei den beschriebenen Tierversuchen handelt es sich um eine für diese Dissertationsschrift relevante Auswahl von Versuchen und deren Parameter. 3.2.5.1 Überlebensanalyse Um die Auswirkungen eines chronischen Stresserlebens auf die Prognose eines murinen orthotopen duktalen Adenokarzinoms des Pankreas in unserem Tumormodell zu untersuchen, wurde eine Überlebenskurve von 40 C57BL/6NMäusen unter Induktion von chronischem Stress angefertigt. Die Mäuse wurden nach Ankunft in 2 verschiedene Versuchsgruppen randomisiert (Stressgruppe N = 20, Kontrollgruppe N = 20). Tumorinduktion und StressApplikation erfolgten wie bereits beschrieben (3.2.2; 3.2.3). Auszulesende Versuchsendpunkte waren Tod oder prämortales Tumor-Stadium (signifikante Verhaltensänderung Perforation bei abdominaler sehr starken Tumorschmerzen Wandstrukturen). Auf eine oder kanzerogene MR-basierte Evaluation (Narkose, additionaler Stress) wurde zu Gunsten der Datenvalidität verzichtet. Auf eine Sektion oder Probenentnahme wurde aufgrund des nicht klar definierbaren Todeszeitpunktes (12 h Supervisionsintervalle) ebenfalls verzichtet. Die Überlebensraten wurden nach Kaplan-Meier geschätzt (Abb. 25). Hierbei definiert das Ereignis (Tod) das Beobachtungsintervall. Für jedes erreichte Zeitintervall wird die bedingte Wahrscheinlichkeit berechnet, dass das Tier dieses überlebt. Die Gesamtwahrscheinlichkeit, einen bestimmten Zeitpunkt zu überleben, wird als Produkt der entsprechenden bedingten Wahrscheinlichkeiten ausgedrückt. Eine statistische Analyse erfolgte ergänzend mit dem Log-rank (Mantel-Cox) Test (χ2 = 6,66) und dem Gehan-Breslow-Wilcoxon Test (p = 0,0189, χ2 = 5,51). Um einen Zusammenhang der intervallskalierten Parameter „Überleben“ und „Stress Severity Score“ zu untersuchen erfolgte eine lineare Korrelationsanalyse mittels Korrelationskoeffizienten nach Bravais und Pearson (Abb. 26). Der Graph zeigt einen XY-Plot. Material und Methoden 55 3.2.5.2 Tumorprogression im MRT Zur Beurteilung der Tumorprogression unter dem Einfluss von chronischem Stress wurden N = 30 C57BL/6N-Mäuse (3.2.1) in 6 Gruppen zu 5 Tieren randomisiert, in Stress- und Kontrollgruppe aufgeteilt und wie beschrieben operiert (3.2.2) und stressexponiert (3.2.3). Serum- und Tumorproben wurden wie in 3.2.4.2 beschrieben für weitere Analysen gewonnen. Die Versuchsevaluation erfolgte intervallartig nach 21 d und 35 d mittels MRT und Exploration. Am letzten Explorationstag wurden die Tumorvolumina ausschließlich mittels Schieblehre und Formel erfasst. Hauptauslesekriterien für diese Dissertationsschrift waren SSS-Validität, adrenaler Diameter und Tumorprogression im Zeitstrahl und im Vergleich zwischen Kontrollund Stressgruppe. Die statistische Analyse der Tumorvolumina unter Stressbedingungen erfolgte mit einem zweiseitigen t-Test. Die grafische Darstellung enthält Plots der Standardabweichung. 3.2.5.3 Überlebensanalyse mit Propranololtherapie In diesem Versuchsprotokoll wurde die Prognose der tumortragenden C57BL/6NMäuse unter Therapie mit dem unspezifischen Beta-Adrenorezeptorblocker Propranolol untersucht. Es wurden Überlebenskurven von 72 randomisierten Versuchstieren in 4 Gruppen mit je 4 Käfigen angefertigt. Eine (-) PropranololGruppe (N = 18) und eine zu therapierende (+) Propranolol-Gruppe (N = 18) wurden jeweils unter Kontroll- oder Stressbedingungen gehalten. Tumorinduktion und StressApplikation erfolgten wie beschrieben (3.2.2; 3.2.3). Die medikamentöse Behandlung setzte am ersten Tag post OP ein. Sie wurde per os in Leitungswasser durchgeführt. Es sollte eine Menge Propranolol (P0884, SIGMA, St. Louis, USA) von 30 – 60 mg / kg / Tag verabreicht werden. Hierzu wurden 0,5 g / l in 500 ml Leitungswasser gelöst. Der Flaschenwechsel erfolgte alle 72 h. Um eine sensorische Detektion des Medikaments mit Vermeidung der Flüssigkeitsaufnahme zu verhindern, wurde das Wasser aller Gruppen mit 2,5 g Saccharose (S8501, SIGMA, St. Louis, USA) pro 100 ml Leitungswasser gesüßt. Die Propranolol-Applikation (orale Aufnahme und Resorption) wurde durch Wiegen der Flaschen, Herzfrequenzmessung und Propranolol-Bestimmung im Serum überwacht [193]. Auszulesende Versuchsendpunkte waren Tod oder prämortales Tumor-Stadium. Auf eine MR- Material und Methoden 56 basierte Evaluation (Narkose, additionaler Stress) wurde zu Gunsten der Datenvalidität verzichtet. Auf eine Sektion oder Probenentnahme wurde aufgrund des nicht klar definierbaren Todeszeitpunktes (12 h Supervisionsintervalle) ebenfalls verzichtet. Die Überlebensraten wurden erneut nach Kaplan-Meier geschätzt (Abb. 30). Für jede vergleichende Analyse der Überlebenskurven der 4 Versuchsgruppen erfolgte eine weiterführende statistische Analyse: - Überlebenskurve (-) Propranolol: Log-rank (Mantel-Cox) Test (χ2 = 17,91) und Gehan-Breslow-Wilcoxon Test (p = 0,0001, χ2 = 15,03). - Überlebenskurve (+) Propranolol: Log-rank (Mantel-Cox) Test (χ2 = 2,28) und Gehan-Breslow-Wilcoxon Test (p = 0,172, χ2 = 1,87). - Überlebenskurve Stressgruppe: Log-rank (Mantel-Cox) Test (χ2 = 7,63) und Gehan-Breslow-Wilcoxon Test (p = 0,0287, χ2 = 4,78). - Überlebenskurve Kontrollgruppe: Log-rank (Mantel-Cox) Test (χ2 = 0,28). 3.2.5.4 Tumorprogression im MRT mit Propranololtherapie In diesem Versuchsprotokoll wurden unter anderem die Auswirkungen einer Propranolol-Therapie auf die Tumorprogression unter Kontroll- und Stressbedingungen untersucht. Eine (-) Propranolol-Gruppe (N = 8) und eine zu therapierende (+) Propranolol-Gruppe (N = 8) wurden jeweils unter Kontroll- oder Stressbedingungen gehalten. Tumorimplantation, Medikation und Stressorapplikation erfolgten wie beschrieben (3.2.2, 3.2.3 und 3.2.5.3). Zu bestimmende Messgrößen waren u. a. das MR-basierte Tumorvolumen (21 d und 35 d post Induktion) und der MR-basierte maximaler Durchmesser der Glandulae adrenales. Die statistische Analyse der Tumorvolumina unter Stressbedingungen erfolgte mit einem zweiseitigen t-Test. Die grafische Darstellung enthält Plots der Standardabweichung. 3.2.6 Matrix-Metalloproteinase-9 ELISA Ex-vivo Proben 3.2.6.1 Probengewinnung und Aufbereitung Neben Verwendung einer lokalisierenden Immunhistologie im Tumorgewebe [193], wurde die Expression der MMP-9 im Tumorlysat sowie in murinen Seren untersucht (Tumorprogressionsuntersuchungen ohne Therapiearm). Um den MMP-9 Gehalt der Material und Methoden 57 Seren mit nicht tumortragenden Kontrolltieren zu vergleichen, wurden Gewichts- und Alters-äquivalente C57BL/6N Mäuse selektiert. Die Gewinnung der Proben erfolgte wie beschrieben (3.2.4.1.1, 3.2.4.2). Das bei – 80 °C gelagerte Tumorgewebe wurde gelöst und quantifiziert [193]. Aufgrund einer mehrtägigen Havarie des laboreigenen – 80 °C Gefrierschrankes konnte bedauerlicherweise nur ein kleiner Teil der entnommenen Proben auf die Konzentration der Matrix-Metalloproteinase-9 untersucht werden. Aufgrund bereits erfolgter immunhistochemischer Verifizierung [193] und der belastungsintensiven Natur der Experimente, waren in den Augen des Autors jedoch keine additionalen Tierversuche zur Überprüfung eines Einzelnen Parameters zu verantworten. Um das MMP-9-Expressionsniveau der murinen Karzinomzelllinie 6606PDA zu analysieren wurden ebenfalls gewonnene Zellkulturüberstände (3.1.2.3) untersucht. 3.2.6.2 Material und Methode Die MMP-9 Konzentration wurde mit dem „Quantikine Mouse MMP-9 (total) Immunoassay” von R&D Systems (MMPT90, Minneapolis, USA) untersucht. Das Prinzip des Assays entspricht dem unter 3.1.3.1 beschriebenen Versuchsaufbau. Im Gegensatz zu erwähntem Protokoll wurden lediglich mausspezifische polyklonale Antikörper gegen die MMP-9 verwendet, die sowohl die aktive, als auch die latente und die Inhibitor („Tissue inhibitor of metalloproteinase“ / TIMP) - gebundene Proteinkonformationen detektieren können. Nach Lösen des lyophilisierten MMP-9 Standards in 2 ml „Calibrator Diluent RD5-10“ (5 ng/ml) wurde dieser sechsfach mit selbiger Lösung in einer Verdünnungsreihe von 2,5 ng/ml bis 0,078 ng/ml für eine 4-Parameter Standardkalkulation verdünnt. Als Leerprobe fungierte ausschließlich der „Calibrator Diluent RD5-10”. Nach Zugabe von 50 µl „Assay Diluent RD1-34“ in jedes Loch der antikörperbeschichteten Mikrotiterplatte, wurden entsprechend 50 µl Leerprobe, Standard, versuchsinterne Positivkontrolle, Tumorlysat (100 µg / ml Protein) oder Serum (zuvor 1 : 50 mit „Calibrator Diluent RD5-10“ verdünnt) hinzugefügt. Nach 2h Inkubation bei Raumtemperatur wurde jedes Loch mit 4 x 400 µl Waschpuffer gewaschen. Nach Zugabe von 100 µl des polyklonalen Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpers gegen die murine MMP-9 („MMP9 Conjugate“) erfolgte erneut eine Inkubation bei Raumtemperatur für 2h. Während jedes Loch erneut mit 4 x 400µl Waschpuffer gewaschen wurde, ließ sich die Substratlösung aus volumenäquivalenter Mischung Material und Methoden 58 von Wasserstoffperoxid („Color Reagent A“) und Tetramethylbenzidin („Color Reagent B“) vorbereiten. Nach Zugabe von je 100 µl der vorbereiteten Substratlösung lief die Reaktion für 30 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz ab. Nach Ablauf der Zeit erfolgte die Zugabe von 100 µl verdünnter Salzsäure („Stop Solution“) zum Stop der Reaktion. Die optische Dichte wurde sofort in einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 450nm und einer Wellenlängenkorrektur bei 540 nm bestimmt. Die Interpolation der Standardkurve und die Berechnung gemessener Konzentrationen erfolgten mit der Software Softmax Pro 4.6. Die statistische Analyse der MMP-9 Konzentrationen erfolgte mit einem zweiseitigen tTest. Die grafische Darstellung enthält Plots des Standardfehlers des Mittelwertes. 3.3 Statistik Die statistische Analyse aller experimentell gewonnenen Daten und deren grafische Aufbereitung erfolgten, sofern nicht anders gekennzeichnet, mit der Statistiksoftware Graph Pad Prism 5.0 (Graph Pad Software, Inc., San Diego, Kalifornien, USA, 2007). Alle gezeigten Ergebnisse resultieren aus mindestens zweifacher Versuchsdurchführung und wurden auf Signifikanzniveau (p < 0,05) überprüft. Voraussetzung für eine Anwendung eines t-Test (parametrische Verteilung in Gaußverteilung) war u.a. eine nicht signifikante (p > 0,05) Differenz der Varianzen im F-Test. Die genaue Anzahl der Versuchswiederholungen bzw. die Anzahl der Versuchstiere N, die Anzahl versuchsinterner Kontrollen und die genutzten statistischen Tests sind an entsprechender Stelle im Material – und Methodenteil angegeben. 59 4 Ergebnisse 4.1 In-vitro-Untersuchungen 4.1.1 Gelatinase-Assay Zunächst wurde untersucht, ob die untersuchten Zelllinien über eine Grundaktivität an Gelatinase verfügten. Hierbei zeigte sich für die Zelllinien Panc1 (p < 0,001) und Colo-357 (p < 0,001) ein höchstsignifikant nachweisbares Aktivitätsniveau (Abb. 14). Die murine Zelllinie 6606PDA wies keine sicher detektierbare Gelatinasenaktivität im Zellkulturüberstand auf (Daten nicht gezeigt). Fluoreszenzniveau Gelatinasenaktivität *** 3400 3200 *** 1500 *** 1000 500 be rs tä nd e 1 Pa nc ES C -Ü C ol o35 7 0 Abb. 14, mittlere Gelatinasenaktivität im Zellüberstand. Gezeigt ist eine hochsignifikante Gelatinasenaktivität über Leerprobenniveau. Die als biologische Positivkontrolle fungierenden Zellüberstände der endometrialen Stromazellen (ESC), wiesen eine in etwa doppelt so hohe Enzymaktivität auf (vgl. 3.1.2.3). Die Zelllinie Colo-357 wies eine signifikant (p < 0,05) erhöhte Gelatinasenaktivität unter Stimulation mit Isoproterenol auf, welche sich hochsignifikant (p < 0,01) durch den β-Blocker Propranolol, sowie durch 1,10-Phenanthrolin inhibieren ließ (Abb. 15A). Panc1 zeigte unter Stimulation mit Norepinephrin eine signifikante (p < 0,05) Zunahme der Gelatinasenaktivität, welche sich hochsignifikant (p < 0,01) durch 1,10Phenanthrolin inhibieren ließ (Abb. 15B). Ergebnisse 60 Abb. 15, Gelatinasenaktivität unter Stimulationsbedingungen von Colo-357 und Panc1. A: Colo-357 zeigte nach 12h Stimulation mit Isoproterenol eine signifikant gesteigerte Aktivität der Matrix-Metalloproteinasen-2 und -9, welche durch den Betablocker Propranolol, sowie durch den komplexbildenden Metallo-Proteinasen Inhibitor Phenanthrolin hochsignifikant reduziert wurde. B: Das Aktivitätsniveau der Gelatinasen im Zellkulturüberstand der Panc1-Zelllinie konnte durch Norepinephrin signifikant gesteigert werden. Phenanthrolin hatte erneut einen inhibierenden Effekt. Ergebnisse 61 4.1.2 Matrix-Metalloproteinase-2 ELISA Der Zellkulturüberstand der Zelllinien Colo-357 (p < 0,001) und Panc1 (p < 0,01) enthielt eine geringe, aber reproduzierbar detektierbare Menge der MatrixMetalloproteinase-2 (Abb. 16). MMP-2 Basalsekretion ** 50 40 15 10 5 ** Pa nc ol o35 C ES C ** 7 0 1 MMP2 Konz. ng/ml 60 Abb. 16, MMP-2 Basalsekretion in den Zellkulturüberstand von Colo-357 und Panc1. Colo-357 und Panc1 zeigten eine geringe Expression von MMP-2 in den Zellkulturüberstand bei 0,2-1,5 ng/ml, die sich jedoch hochsignifikant über Leerprobenniveau detektieren ließ. Die wiederum als biologische Positivkontrolle genutzten Zellüberstände der endometrialen Stromazellen (ESC) (vgl. 3.1.2.3), wiesen eine hochsignifikante (p < 0,01) Enzymexpression im Bereich von 60 ng / ml auf. Ergebnisse 62 4.1.3 Matrix-Metalloproteinase-9 ELISA Alle untersuchten Zelllinien wiesen ein hochsignifikantes (p < 0,01) Expressionsniveau von MMP-9 im Zellkulturüberstand auf (Abb. 17). MMP-9 Basalsekretion MMP-9 Konz. ng/ml 60 ** * ** 40 20 ES C 7 ol o35 C Pa nc 1 0 Abb. 17, basale MMP-9 Sekretion der untersuchten Zelllinien in den Zellkulturüberstand. Im Vergleich zur Expression der MMP-2 (4.1.2) ließ sich für die MMP-9 eine deutliche Sekretion in den Zellkulturüberstand aller untersuchten Zellkulturen feststellen. Die biologische Positivkontrolle, der ESC-Zell-Überstand (vgl. 3.1.2.3) wies eine, verglichen mit ihrem MMP-2-Gehalt (4.1.2), leicht niedrigere Konzentration an MMP-9 auf. Bei hoher intraexperimenteller Varianz (vgl. 3.1.4.2) ließ sich für die Expression der MMP-9 in den Zellkulturüberstand keine signifikante Expressionssteigerung oder hemmung unter katecholaminergen Stimulationsbedingungen finden (Abb. 18). Ergebnisse 63 Abb. 18, MMP-9 Konzentration im Zellkulturüberstand von Colo-357 und Panc1 unter Stimulationsbedingungen. A: Nach 12h Stimulation mit Isoproterenol zeigte Colo-357 eine gesteigerte Expression der Matrix-Metalloproteinase-9 in den Zellkulturüberstand. Ein Einfluss des Betablockers Propranolol fand sich ebenfalls. Allerdings waren diese Ergebnisse statistisch nicht signifikant (p = 0,16). B: Unter Stimulation mit Norepinephrin fand sich für Panc1 ein deutlicher, wenngleich nicht signifikanter (p = 0,14) Anstieg der Expression der MMP-9 in den Überstand. 4.1.4 Migrations-Assay Es zeigte sich für Colo-357 eine deutliche Zunahme der Zellmobilität unter Stimulation mit Isoproterenol, welche erneut durch den Betablocker Propranolol inhibiert werden konnte (Abb. 19 und Abb. 20A). Ergebnisse 64 Abb. 19, Migrations-Assay von Colo-357 über 48 h. Colo-357 zeigte unter Stimulation mit Isoproterenol eine deutlich beschleunigte Migration in die Läsion. Zu beachten sind insbesondere die Migration einzelner Zellverbände nach 12 h, sowie eine deutlich verschmälerte Läsion ab 24 h Stimulationszeit. Das Migrationsverhalten der Tumorzellen konnte durch Zugabe von Propranolol normalisiert, das heißt inhibiert werden. Ergebnisse 65 Für MIA PaCa-02 zeigte sich unter Isoproterenolstimulation eine mit Propranolol inhibierbare beschleunigte Migration der Zellfront, besonders in den letzten 12 h (Abb. 20B). Für Panc1 konnten keine Auswirkungen der Stimulanzien auf die Zellmobilität erfasst werden. Im Vergleich mit Colo-357 und MIA PaCa-2 zeigt sich jedoch eine deutlich schnellere Basalmigration der Tumorzellen (Abb. 20C). Versuchsansätze mit Norepinephrin erbrachten für Panc-1 ebenfalls messbaren Effekte des Stimulans auf die Zellmigration (Daten nicht gezeigt). keine Ergebnisse 66 Abb. 20, relative Entwicklung der Migrationsfront von Colo-357, MIA PaCa-2 und Panc1 über 48 h. A: Die obere Grafik zeigt das Migrationsverhalten von Colo-357 in einer non-linearen Regression (Ein-Phasenmodell, 2 Freiheitsgrade) der relativen Migration in die gesetzte Läsion. Bei 0 h beginnend, zeigt sich ein deutlicher Migrationsvorteil unter Stimulation mit Isoproterenol, der unter Zusatz des Betablockers Propranolol verschwand. Die untere Grafik zeigt das mittlere relative Fortschreiten der Migrationsfront nach 36 h. B: Die obere Grafik zeigt das Migrationsverhalten von MIA PaCa-2 in einer non-linearen Regression der relativen Migration in die gesetzte Läsion. Der Trend einer erleichterten Zellmobilität unter Isoproterenolstimulation ist in den ersten 24 h des Assays schwach ausgeprägt, während die zweiten 24 h einen klaren Migrationsvorteil der Tumorzellen dokumentieren. Dieser ließ sich durch Zugabe von Propranolol inhibieren. Die untere Grafik zeigt das mittlere relative Fortschreiten der Migrationsfront nach 24 h. C: Die obere Grafik zeigt das Migrationsverhalten von Panc1 in einer non-linearen Regression der relativen Migration in die gesetzte Läsion. Sie zeigt keine Beeinflussung des Migrationsverhaltens durch Isoproterenol oder Propranolol. Der Vergleich mit Colo-357 und MIA PaCa-2 zeigt eine eminent schnellere Migration von Panc1. Die untere Grafik zeigt das mittlere relative Fortschreiten der Migrationsfront nach 36 h. Ergebnisse 67 4.1.5 Invasions-Assay Die Zelllinie Colo-357 zeigte unter Stimulation mit Isoproterenol ein signifikant (p < 0,05) gesteigertes Invasionspotential durch die Matrigel-beschichteten Membraneinsätze. Diese stimulationsbedingte Invasion konnte durch den Einsatz des Betablockers Propranolol signifikant (p < 0,05) verringert werden (Abb. 21). Abb. 21, Invasion von Colo-357 unter Stimulationsbedingungen nach 48 h. Nach 48 h Stimulation mit Isoproterenol waren 7,29 % +/- 2,27 (Mittelwert +/- σ) der ausgesäten Colo-357 Zellen (200.000) durch die beschichteten Membraneinsätze invadiert. Diese signifikant vermehrte Invasion konnte durch den Betablocker Propranolol auf Kontrollniveau reduziert werden. 4.1.6 Bromdesoxyuridin (BrdU)-Assay Alle untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien wiesen unter Katecholamineinfluss eine veränderte Neusynthese von DNA auf. Diese wurde durch die Inkorporation des Pyrimidinanalogons 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) während der Neusynthese quantifiziert. Bei Colo-357 wurde die DNA-Synthese durch Isoproterenol höchstsignifikant (p < 0,001) gesteigert und konnte durch den Betablocker Propranolol höchstsignifikant (p < 0,001) reduziert werden (Abb. 22A). Die Neusynthese von DNA der murinen Pankreaskarzinomzelllinie 6606PDA ließ sich nicht so deutlich (1,2 x), aber hochsignifikant (p < 0,01) durch Isoproterenol steigern. Der Effekt des Isoproterenol ließ sich wiederum durch den Betablocker Propranolol hochsignifikant (p < 0,01) inhibieren (Abb. 22B). Die DNA-Neusynthese der übrigen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien Panc1 (p < 0,001), MIA PaCa-2 (p < 0,01), Ergebnisse 68 BxPc-3 (p < 0,05) ließ sich durch Norepinephrin auf signifikantem Niveau steigern (Abb. 22C). Abb. 22, DNA-Neusynthese unter BrdU-Inkorporation von Colo-357, Panc1, MIA PaCA-2, BxPc-3 und 6606PDA nach 24 h Stimulation. Gezeigt ist ein Vielfaches der DNA-Synthese unter Stimulationsbedingungen im Vergleich zu Kontrollen. A: Colo-357 zeigte unter Stimulation mit Isoproterenol eine etwa 1,4 fach so produktive DNASynthese, die durch Propranolol auf das etwa 1,1-Fache reduziert werden konnte. B: 6606PDA zeigte unter Stimulation mit Isoproterenol eine etwa 1,1 fach so produktive DNA-Synthese, die durch Propranolol auf eine 0,7 fache DNA-Synthese reduziert werden konnte. C: Die übrigen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien zeigten unter Stimulation mit Norepinephrin eine ca. 1,6 fach (Panc1), bzw. eine ca. 1,5 fach (MIA PaCa-2, BxPc-3) so produktive DNA-Synthese. Ergebnisse 69 4.2 In-vivo-Untersuchungen Die gewonnenen Daten aus den in 0 beschriebenen Untersuchungen werden im Folgenden themenbasiert dargestellt. 4.2.1 Stressvalidation Um ein chronisches Stresslevel sicher zu dokumentieren wurden verschiedene Stressparameter definiert und überprüft. So ließ sich eine signifikante Expressionssteigerung der Tyrosinhydroxylase unter Stressbedingungen als Maß der durchschnittlichen Katecholaminproduktion des adrenalen Gewebes im Western-Blot nachweisen [193]. Eine Cortisol-Bestimmung in murinen Seren mittels ELISA zeigte signifikant erhöhte Serumspiegel unter Stressbedingungen [193] und es fand sich eine stressinduzierte Immunsuppression mit signifikant verminderter Expression von IL-10, IL-6, MCP-1 und IFN-γ nach Splenozytenstimulation [193]. Weiterhin wurden ein Stress Severity Score unter Kontrollbedingungen und der maximale Diameter der Glandulae adrenales erfasst. Der Stress Severity Score wurde wie beschrieben (3.2.3.2) dokumentiert und gegen nicht gestresste Tiere unter Kontrollbedingungen validiert. Es zeigte sich ein erwartungsgemäß deutlicher Unterschied der Verhaltensbewertung (Abb. 23). Ergebnisse 70 Abb. 23, Scoreverteilung des Stress Severity Score. A: Verteilung unter Kontroll- und Stressbedingungen. Gezeigt ist der über 7 Tage evaluierte SSS an je 6 C67BL/6 Mäusen unter Stress- oder Kontrollbedingungen. Das arithmetische Mittel der gestressten Tiere nach 7 Tagen (16,29, σ +/- 1,42) unterschied sich höchstsignifikant (p < 0,001) von dem dokumentierten Mittelwert der Kontrolltiere (3,65, σ +/- 0,89). N = 6 Tiere B: Gezeigt ist das arithmetische Mittel des SSS je eines Tieres mit 14-tägigen Intervallen im Zeitverlauf. Es zeigt sich eine relativ homogene Verteilung der Werte. Eine eventuelle Adaptation im Zeitstrahl ist nicht erkennbar. Repräsentativ. Aus Tumorprogressionsuntersuchungen. N = 13 Tiere, je 14 SSS-Werte Der maximale Diameter der Glandulae adrenales wurde wie beschrieben (3.2.4.1.2) in den Versuchsreihen zur Erfassung der Tumorprogression erfasst und ausgewertet (Abb. 24). Ergebnisse 71 Abb. 24, maximaler adrenaler Diameter zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf. A: 14 d nach Tumorinduktion ergab sich ein arithmetisches Mittel von 1,71 mm (σ +/- 0,03) für die Kontrollgruppe und ein Mittelwert von 1,96 mm (σ +/- 0,07) für die Stressgruppe. Der Unterschied der adrenalen Diameter war signifikant (p = 0,012). B: 21 d nach Tumorinduktion fand sich in einer anderen Versuchsreihe ähnlich zu B ein arithmetisches Mittel von 1,48 mm (σ +/- 0,09) für die Kontrollgruppe und ein Mittelwert von 1,93 mm (σ +/- 0,04) für die Stressgruppe. Der Unterschied der adrenalen Diameter war hochsignifikant (p = 0,002). C: Auch 28 d nach Tumorinduktion war ein signifikanter (p = 0,015) Unterschied der Diameter detektierbar. Es ergab sich ein arithmetisches Mittel von 1,54 mm (σ +/- 0,09) für die Kontrollgruppe, ein Mittelwert von 1,90 mm (σ +/- 0,07) für die Stressgruppe. D: In einer durchgeführten Versuchsreihe ließ sich 35 d nach Tumorinduktion ein signifikanter (p = 0,040) Unterschied der NN-Diameter messen. Es ergab sich ein arithmetisches Mittel von 1,55 mm (σ +/- 0,11) für die Kontrollgruppe, ein Mittelwert von 1,75 mm (σ +/- 0,15) für die Stressgruppe. N = 5 Tiere Ergebnisse 72 4.2.2 Überlebensanalyse Um die Nullhypothese, dass ein chronisches Stresserleben keine Auswirkungen auf die Überlebenswahrscheinlichkeit eines Organismus mit einem orthotopen duktalen Pankreasadenokarzinom hat, entweder zu verwerfen oder zu verifizieren, wurde eine Kaplan-Meier Überlebenskurve wie beschrieben (3.2.5.1) durchgeführt. Es zeigte sich eine hochsignifikante chronischem Stress bei Verschlechterung einer im Median der um Karzinom-Prognose 18 % relativ unter reduzierten Lebenserwartung (Abb. 25). Vergleichbare Versuchsergebnisse konnten reproduziert werden (4.2.5). % Überlebenswahrscheinlichkeit Überlebenskurve nach Kaplan-Meier 100 Kontrolle Stress 75 50 25 0 0 20 40 60 Tage Abb. 25, Überlebenskomparation nach Kaplan-Meier unter Kontroll- und Stressbedingungen. Der Vergleich der Überlebenszeitwahrscheinlichkeiten nach Tumorimplantation ergab eine hochsignifikante (p = 0,0099) Verschlechterung der Prognose unter chronischen Stressbedingungen. Das mediane Überleben der Kontrollgruppe lag bei 50,0 d, das der gestressten Tiere bei 41,0 d (Ratio 1,22, 0,95-KI (0,682 – 1,76). N = 2 Versuchsgruppen mit je 20 Tieren Eine lineare Korrelationsanalyse der Parameter „Überleben“ und „Stress Severity Score“ zeigte eine schwache, aber signifikante negative Korrelation (Abb. 26). Das Ergebnisse 73 individuelle Stressempfinden hat also in dem Modell einen direkten negativen Einfluss auf die Prognose der Tumorerkrankung. Korrelation von "Überleben" und "Stress Severity Score" 60 Überleben d 50 40 30 20 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Stress Severity Score Abb. 26, Korrelation der Parameter „Überleben“ und „Stress Severity Score“ mit linearer Regression. Aufgetragen ist das arithmetische Mittel des SSS der ersten 30 d (Abszisse) gegen die Überlebenszeit in Tagen (Ordinate) aller Tiere der Überlebensanalyse. Eine lineare Korrelationsanalyse ergab eine schwache, aber signifikante (p = 0,043) negative Korrelation (r = 0,457, 0,95-KI (-0,748 zu – 0,018)) der Parameter. Zur Visualisierung eines linearen Zusammenhanges erfolgte eine lineare Regression (r2 = 0,21) der ausgewerteten Daten. N = 20 Tiere Ergebnisse 74 4.2.3 Tumorprogression im MRT Unter Exposition von chronischem Stress war eine signifikant (p = 0,0417) beschleunigte Tumorprogredienz nach 35 d zu beobachten (Abb. 27B, Abb. 28B). Vergleichbare Versuchsergebnisse konnten reproduziert werden (4.2.5). Abb. 27, murine Tumorlast unter Kontroll- und Stressbedingungen nach 21 d (A) und 35 d (B). A: Nach 21 d ist kein signifikanter (p= 0,71) Unterschied des Tumorvolumens detektierbar. Das arithmetische Mittel der Kontrolltiere lag bei 540,6 mm 3 (σ +/- 219,9), das der gestressten Tiere bei 590,6 mm3 (σ +/- 197,6). B: Nach 35 d zeigte sich ein im Mittel signifikant (p = 0,0417) erhöhtes Tumorvolumen nach der chronischen Stressor-Exposition. Das arithmetische Mittel der Kontrolltiere lag bei 918,3 mm 3 (σ +/- 193,4), das der gestressten Tiere bei 1415,0 mm 3 (σ +/- 415,5). N = 5 Tiere Während die Tumoren der Kontrolltiere zwischen Tag 21 und Tag 35 um den Faktor 1,70 wuchsen, zeigte sich unter Stressbedingungen eine mittlere Volumenprogression um den Faktor 2,40 in den letzten 14 d. Die Effekte eines chronischen Stresserlebens traten in dem genutzten Tiermodell also erst im Verlauf der Tumorerkrankung zu Tage. In der MRT-Bildgebung und nach der Exploration der Mäuse ergab sich kein Anhalt für Metastasierungsprozesse im genutzten Tumormodell. Abb. 28 zeigt das korrelierende Bild der Tumorerkrankung unter Stressbedingungen im Magnetresonanztomografen. Ergebnisse 75 Abb. 28, MRT-Bildgebung der murinen Tumorprogression unter Kontroll- (A) und Stressbedingungen (B). A: Links: Gezeigt ist ein duktales orthotopes Adenokarzinom des Pankreaskopfes (weißer Pfeil) bei maximalem Tumordurchmesser (koronar, Schicht 10 / 24). Mitte: Der Tumor im Verlauf nach dorsal (koronar, Schicht 12 / 24). Rechts: Das Pankreaskarzinom bei maximalem Durchmesser in transversaler Ebene (Schicht 17 / 34). 35 d post Tumorinduktion, Tumorvolumen 617,11 mm3. B: Links: Gezeigt ist wiederum das implantierte Adenokarzinom des Pankreaskopfes (weißer Pfeil) bei maximalem Tumordurchmesser in identischer Schicht (koronar, Schicht 10 / 24). Auffällig sind eine unruhigere Tumormorphologie mit blumenkohlartiger Struktur (identische Explorationseindrücke) und eine überdurchschnittlich große Tumornekrose (schwarzer Stern) als Korrelat einer unzureichenden Nährstoffversorgung bei gesteigerter Proliferationsaktivität. Im Gegensatz zum Tumorvolumen konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen Stresserleben und Tumornekrose jedoch nicht signifikant verifiziert werden Mitte: Der Tumor im Verlauf nach dorsal (koronar, Schicht 12 / 24). Rechts: Das Pankreaskarzinom bei maximalem Durchmesser in transversaler Ebene (Schicht 17 / 34). 35 d post Tumorinduktion, Tumorvolumen 1279,59 mm3. Ergebnisse 76 4.2.4 Matrix-Metalloproteinase-9 ELISA Ex-vivo Proben Die zu untersuchenden Proben wurden wie beschrieben (3.2.6.1) aufbereitet und auf die Konzentration der Matrix-Metalloproteinase-9 untersucht (Abb. 29). Abb. 29, Konzentration der MMP-9 in Serum (A) und Tumorlysat (B) unter Kontrollbzw. Stressbedingungen. A: Die Serumkonzentration der MMP-9 war bei tumortragenden Tieren hochsignifikant (Kontrolle, p = 0,0085) bzw. signifikant (Stress, p = 0,036) im Vergleich zu nicht tumortragenden Tieren erhöht. Weiterhin ließ sich eine deutliche, aber nicht signifikante (p = 0,16) Expressionssteigerung der Matrix-Metalloproteinase in das Serum unter Stressbedingungen detektieren. 21 d nach Tumorinduktion waren noch keine signifikanten Zusammenhänge zu dokumentieren (Daten nicht gezeigt). B: Der MMP-9 Gehalt des Tumorlysates zeigte sich unter Stressbedingungen ebenfalls erhöht, jedoch nicht signifikant (p = 0,35). N = 5 Tiere Untersuchungen der In-vitro-Zellkulturüberstände von 6606PDA erbrachten kein detektierbares Expressionsniveau der murinen MMP-9 (Daten nicht gezeigt). 4.2.5 Therapie mit Propranolol In dem genutzten Tumormodell wurde schließlich die therapeutische Option des nicht-selektiven Beta-Adrenorezeptorblockers Propranolol evaluiert. Hierzu wurden Prognose und Verlauf der Tumorerkrankung bei Kontroll- bzw. Stressbedingungen unter Therapie untersucht. Ergebnisse 77 4.2.5.1 Überlebensanalyse mit Propranololtherapie Bei Tieren mit chronischer Stressexposition zeigte sich ein hochsignifikanter Überlebensvorteil unter Therapie mit Propranolol (Abb. 30). Abb. 30, Überlebensanalyse unter Propranolol-Therapie. A: Der Vergleich der Überlebenszeitwahrscheinlichkeiten nach Tumorimplantation und ohne Propranololtherapie ergab eine höchstsignifikante (p < 0,0001) Verschlechterung der Prognose unter chronischen Stressbedingungen. Das Ergebnis aus Abb. 25 wurde reproduziert. Das mediane Überleben der Kontrollgruppe lag bei 66,0 d, das der gestressten Tiere bei 52,0 d (Ratio 0,79, 0,95-KI (0,268 – 1,308). B: Unter Propranololtherapie ergab die Überlebenszeitanalyse der tumortragenden Tiere keine signifikante (p = 0,137) Verschlechterung der Prognose bei chronischen Stressbedingungen. Das mediane Überleben der Kontrollgruppe lag bei 65,0 d, das der gestressten Tiere bei 59,0 d (Ratio 0,91, 0,95-KI (0,387 – 1,428). C: Verglich man die Überlebenszeitanalyse der tumortragenden Tiere unter chronischer Stressexposition, ergab sich eine hochsignifikante (p = 0,0058) Verbesserung der Prognose unter Propranololtherapie. Das mediane Überleben der mit Propranolol therapierten Versuchstiere lag bei 59,0 d, das der nicht therapierten Tiere bei 52,0 d (Ratio 0,88, 0,95-KI (0,361 – 1,402). D: Bei einem Vergleich der Überlebenswahrscheinlichkeiten der Versuchstiere unter Kontrollbedingungen, ergab sich keine signifikante (p = 0,59) Veränderung der Prognose unter Propranololtherapie. Das mediane Überleben der mit Propranolol therapierten Versuchstiere lag bei 65,0 d, das der nicht therapierten Tiere bei 66,0 d (Ratio 1,02, 0,95-KI (0,495 – 1,536). N = 4 Versuchsgruppen mit je 18 Tieren Ergebnisse 78 4.2.5.2 Tumorprogression im MRT mit Propranololtherapie Eine Therapie mit dem Beta-Adrenorezeptorblocker Propranolol verringerte die Tumorlast in dem genutzten Mausmodell hochsignifikant (Abb. 31). Abb. 31, murine Tumorlast unter Propranololtherapie nach 21 d (A) und 35 d (B). A: Bereits 21 d nach Tumorinduktion zeigte sich eine signifikante (p = 0,029) Verringerung des Tumorvolumens unter Propranololtherapie. Das arithmetische Mittel des Tumorvolumens der gestressten Tiere ohne Therapie lag bei 319,0 mm 3 (σ +/- 148,3), das der gestressten Tiere unter Propranololtherapie bei 146,3 mm 3 (σ +/- 109,0). Für Versuchstiere ohne Therapie zeigte sich nach 21 d ein deutlicher (vgl. Abb. 27 A), aber noch nicht signifikanter (p = 0,08) Einfluss des chronischen Stresserlebnisses auf die Tumorvolumina. B: Die Reduktion des Tumorvolumens unter Propranololtherapie war nach 35 d bei einem arithmetischen Mittel des Tumorvolumens von 798,8 mm3 (σ +/- 319,3) der nicht therapierten Tiere und 247,1 mm 3 (σ +/- 162,1) der therapierten Tiere hochsignifikant (p = 0,009). Das mittlere Tumorvolumen der stressexponierten nicht therapierten Versuchstiere war auch im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (348,4 mm 3 (σ +/- 170,5) signifikant (p = 0,024) erhöht (vgl. Abb. 27 B). N = 8 Tiere 79 5 Diskussion Die dargestellten Ergebnisse geben vielfältige Hinweise auf eine erleichterte Tumorprogression des Pankreaskarzinoms in vitro und in vivo unter chronischen Stressbedingungen: Katecholamine stimulierten die Gelatinase-Aktivität, Migration, Invasion und Proliferation humaner Pankreaskarzinomzellen. In einem immunkompetenten Mausmodell eines Pankreaskarzinoms führte chronischer Stress zu einer erhöhten Tumorlast und einer verschlechterten Überlebensprognose. Diese Effekte waren zumindest partiell durch eine β-Rezeptorblockade reversibel. Die Reduktion von Stresseffekten bei Patienten mit einem Pankreaskarzinom könnte also zukünftig ein adjuvantes Therapieprinzip darstellen. 5.1 In vitro Unter Zellkulturbedingungen zeigten sich nach Stimulation mit Katecholaminen Veränderungen mehrerer Parameter zur möglichen Charakterisierung einer Tumorprogression. So waren die Gelatinasenaktivität, die Fähigkeit zur Migration und Invasion sowie die Proliferationsaktivität signifikant gesteigert. Für Tumorprogression und Metastasen-Biologie stellt die potentielle Degradation einer Basalmembran durch sogenannte Gelatinasen (hier MMP-2, MMP-9) eine entscheidende Fähigkeit dar [37]. Auch wenn eine enzymgebundene Quantifizierung der Matrix-Metalloproteinasen-2 und -9 im Zellkulturüberstand keine signifikanten Unterschiede nach Stimulation aufwies, zeigte sich eine signifikant gesteigerte Gelatinasenaktivität in den zuvor mit Katecholaminen behandelten Zellüberständen und adhärenten Zellen, die versuchsweise durch Propranolol inhibiert werden konnte. Da die MMP-2 überwiegend membranständig und im Tumorstroma expremiert wird [47, 76], war eine sehr geringe, aber verlässlich nachweisbare Enzymkonzentration im Zellkulturüberstand im Vergleich zur MMP-9 und zu einer biologischen Positivkontrolle zu erwarten. Für die MMP-9 ließ sich im Gegensatz hierzu eine auf biologischem Kontrollniveau detektierbare Enzymexpression im Zellkulturüberstand nachweisen. Die deutlich gesteigerte Enzymfreisetzung in den Zellkulturüberstand nach Signifikanzniveau. Die Aktivitätserhöhung lässt Katecholaminexposition für sich die vor erreichte Tumorprogression dem jedoch potentiell Hintergrund der kein relevante komplexen Regulationsmechanismen der Matrix-Metalloproteinasen verstehen [35]. Diese Diskussion 80 werden von einer reinen Enzymquantifizierung nicht erfasst. Weiterhin ist zu berücksichtigen, dass auch die adhärenten Tumorzellen und nicht lediglich der Zellkulturüberstand in die Enzymaktivitätsmessung einbezogen wurden. Daten anderer Arbeitsgruppen lassen bei ausreichender Versuchsgröße eine leichte Sekretionssteigerung in den Zellkulturüberstand nach Stimulation mit Norepinephrin vermuten [168]. Neben dem Aktivitätsgrad der MMP-2 / -9 ist für die Tumorprogression die komplexere Invasionsfähigkeit der Karzinomzellen relevant [198]. Für Tumorentitäten des Ovars [166], des Kolons [164] und der Mamma [165] ist ein erhöhtes Migrations – und Invasionspotential unter Katecholamineinfluss beschrieben worden. Die vorliegende Untersuchung der Zellmigration ohne und mit Kollagenbarriere erbrachte Hinweise auf eine gesteigerte Zellmotilität der untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien unter Stimulationsbedingungen mit Katecholaminen. Während ein sogenannter Migrations-Assay aufgrund immanent eingeschränkter Reliabilität und Validität der Ergebnisse als orientierender und Hypothesengenerierender Versuchsansatz gelten sollte, ließen sich die hier beobachteten Migrationsveränderungen in einem Invasionsassay mit valider Zellquantifizierung verifizieren. Bei Hinweisen auf eine grundsätzlich gesteigerte Migrationsfähigkeit einiger Pankreaskarzinomzelllinien unter Stimulation mit Katecholaminen schien auch die Invasionsfähigkeit durch eine Kollagenmatrix erhöht zu sein. Diese unter Katecholamin-Exposition gesteigerte Invasionsbewegung kann eine biologisch relevante Kombination von gesteigerter Migrationsfähigkeit und Gelatinasenaktivität simulieren und repräsentiert so einen wichtigen zu Grunde liegenden Mechanismus einer vereinfachten Tumorprogression [199]. Dieser Effekt schien ebenfalls durch Propranolol inhibierbar zu sein. Neben dem Kolonkarzinom [164], dem Mammakarzinom [165], dem Ovarialkarzinom [166] und dem Nasopharynxkarzinom [167] gibt es auch für das Pankreaskarzinom Hinweise auf eine Katecholamininduzierte Steigerung des Invasionspotentials [169, 170]. Auch die Proliferationsaktivität ist ein wichtiger Parameter der Tumorprogression. Während Katecholamine die Proliferation nicht mutierter Zellen, wie Keratinozyten, zu inhibieren scheinen und so zu Wundheilungsstörungen unter chronischem Stress führen können [210], scheint CREB (vgl. 1.2.1.2) ein entscheidender Transkriptionsfaktor der Tumorzellproliferation und Apoptoseinhibition zu sein [211]. So kann eine Aktivierung des β2-Rezeptors an Zelllinien des Magenkarzinoms unter Diskussion 81 Nikotinstimulation die Proliferationsrate steigern [212]. Auch für Zellen des oralen Plattenepithelkarzinoms [213] und des Mammakarzinoms [122] wurde eine Proliferationssteigerung unter adrenerger Stimulation beschrieben. Sastry et al. beobachteten eine durch Adrenalin aktivierte cAMP abhängige Proteinkinase, die Karzinomzellen durch BAD-Phosphorylation vor Apoptose schützen kann [214]. Hinweise der vorliegenden Arbeit auf eine vermehrte DNA-Produktion von Pankreaskarzinomzellen unter Stimulation mit Katecholaminen legen eine relevante Steigerung der Proliferationsaktivität nahe. Auch diese schien, zumindest partiell, durch den Betablocker Propranolol reversibel zu sein. Durchgeführte Zellzyklusanalysen bestätigten eine Steigerung der Proliferationsaktivität unter Norepinephrin-Exposition [160]. Weiterhin wurde ein G1/S-Phasen-Arrest im mitotischen Zellzyklus [163] und eine Apoptoseinduktion durch Propranolol [162] postuliert. In diesen Arbeiten kamen jedoch im Vergleich mit der vorliegenden Arbeit deutlich höhere Konzentrationen der Katecholamine (100 fach) zum Einsatz. Auch wenn lokale Transmitterkonzentrationen deutlich höher liegen können, sollten die physiologisch sehr niedrigen Transmitterkonzentration im Blutplasma gesunder Menschen (vgl. 1.2.1.2) bei der Diskussion der biologischen Relevanz dieser Ergebnisse beachtet werden. Weiterhin ist auch das Rezeptorprofil der eingesetzten Substanzen zu bedenken. Das nicht selten zur Stimulation von β-2 Rezeptoren verwendete Noradrenalin [162, 163, 167, 168] weist transmitterimmanent eine lediglich schwache Bindung zum adrenergen β-2 Rezeptor auf [124]. Da eine Blockade der Effekte von Norepinephrin durch das β-1 und β-2 rezeptorspezifische Propranolol unter physiologischen Bedingungen lediglich den β-1 Rezeptor betreffen dürfte, sollten unspezifische Effekte bei einer möglichen Überdosierung der Stimulanzien berücksichtigt werden. Effekte einer therapeutischen Betablockade wurden in dieser Arbeit konzeptionell nur an dem reinen β-Agonisten Isoproterenol untersucht. Die Untersuchungen fokussierten auf messbare und für die Tumorprogression relevante Veränderungen der Tumorbiologie nach β-adrenergerStimulation. Untersuchungen der Signaltransduktion berichten über eine zu Grunde liegende β-2-Rezeptor transduktive Aktivierung des P38/MAPK-Weges [169] und eine inhibierende Wirkung des Propranolol über CREB Transkriptionsfaktoren [170]. Die Ergebnisse legen vielfache und nachteilige Auswirkungen von Katecholaminen auf humane Pankreaskarzinomzellen unter Zellkulturbedingungen hinsichtlich der Tumorprogression nahe und konnten auch mit niedrigeren Konzentrationen Diskussion 82 vermutete Effekte teilweise reproduzieren. Diese Effekte konnten wiedeholt durch eine unspezifische β-Blockade vermieden werden. Auch für die murine Zelllinie 6606PDA [118] konnte eine Proliferationssteigerung unter β-Stimulation nachgewiesen werden. Die biologische Relevanz dieser Ergebnisse wurde in einem immunkompetenten Mausmodell nach orthotoper Tumorimplantation evaluiert. 5.2 In vivo Chronischer Stress hat fatale Auswirkungen auf den menschlichen [120, 215] und murinen [121] Organismus und es wurden vielfältige negative Veränderungen der Tumorbiologie unter chronischem Stress beschrieben [140]. Eine Tumorprogression unter Stresseinfluss wurde in tierexperimentellen Arbeiten für verschiedene Tumorentitäten untersucht (Tabelle 3). Auch für das Pankreaskarzinom sind in vivo Untersuchungen zu den Auswirkungen von chronischem Stress auf die Tumorzellen erfolgt. So wurden eine beschleunigte Tumorprogression im Tiermodell für humane Pankreaskarzinomzelllinien unter Stressbedingungen [156, 185] oder unter Isoproterenolstimulation [161] berichtet. Erweiternd zu einer Volumetrie mittels Schiebelehre nach Situs-Exploration erlauben die erhobenen Daten der vorliegenden Untersuchung zusätzlich eine höchststandardisierte, valide und intervallbasierte Erfassung der Tumorprogression magnetresonanztomografischer Bildgebung. Überlebensanalysen zusätzlich auf mittels Sie deuten hochauflösender mittels aufwendiger eine hohe prognostische Relevanz der beschleunigten Tumorprogredienz hin. Weiterhin ist zu bemerken, dass das genutzte syngene Tumormodell im Gegensatz zu den oben genannten Untersuchungen über einen immunkompetenten Organismus mit orthotoper Tumorlokalisation verfügt [209]. Vor dem Hintergrund der vielschichtigen und elementaren Implikationen der Tumorimmunologie [216, 217] und der stromalen Besonderheiten des Pankreaskarzinoms [24] können so komplexere und realistischere Auswirkungen einer chronischen Stressexposition auf die Tumorprogression in einem voll funktionsfähigen biologischen Organismus untersucht werden. Die Ergebnisse des vorliegenden syngenen und orthotopen murinen Tumormodells zeigen nachhaltig negative Auswirkungen einer chronischen Stressexposition auf die Tumorentwicklung in einem immunologisch voll funktionsfähigen biologischen System. Das Stressniveau der einzelnen Tiere konnte zuverlässig erfasst werden. Bei der Erfassung der maximalen Nebennierendiameter zeigte sich eine signifikante Diskussion 83 Organvergrößerung, die wahrscheinlich auf eine durch chronischen Stress induzierte Hypertrophie der Glukokortikoid-produzierenden Rinde zurückzuführen war [218]. Eine chronische Stressbelastung lag also in einem biologisch relevanten Ausmaß vor. Eine Abnahme dieses Effektes im Zeitstrahl kann als Korrelat eines organspezifischen dauerstimulationsbedingten Erschöpfungszustandes gedeutet werden [121, 193]. Daten zu der prognostischen Relevanz einer gesteigerten Tumorprogression unter chronischen Stressbedingungen in den genutzten Tiermodellen sind bis dato kaum vorhanden. Die Überlebensdauer der tumortragenden Tiere in der vorliegenden Arbeit war unter chronischer Stressexposition signifikant reduziert und das Ausmaß der Stressauswirkungen auf einzelne Tiere korrelierte positiv mit einer Verschlechterung der Prognose der betreffenden Tiere. Die Tumorprogression, magnetresonanztomografisch erfasst als Entwicklung des Tumorvolumens, war unter Stressexposition beschleunigt. Diese Beschleunigung nahm 3 Wochen nach Tumorimplantation noch einmal zu. Diese fatalen prognoselimitierenden Folgen einer chronischen Stressexposition bei vorhandener Tumorerkrankung wurden vermutlich vor allem über β-2- Adrenorezeptoren vermittelt [138, 173, 219, 220]. Als elementare Funktion im „Downstream“ des β-2-Adrenorezeptors wurde in diesem Kontext die Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren GATA1, CREB und ATF durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A identifiziert [221]. Auch eine β-2-Adrenorezeptor vermittelte Inflammation mittels Prostaglandin E2 scheint von großer Bedeutung für Parameter der Tumorprogression zu sein [235]. Für das humane Pankreaskarzinom wurde sogar ein Katecholaminproduktion Adrenorezeptor autokriner Regelkreis beschrieben vermittelten [157]. Auswirkungen mit einer Aufgrund der auf die tumorzelleigenen ungünstigen Tumorbiologie β-2unter Stressbedingungen in vivo lag der Versuch einer therapeutischen Tertiärprävention mit dem unselektiven Beta-Adrenorezeptor-Blocker Propranolol nahe. Mögliche therapeutische Effekte des Propranolols in diesem Kontext wurden in vitro unter Zellkulturbedingungen umfangreich untersucht [166, 168, 170]. Auch veröffentlichte in vivo Studien an anderen Tumorentitäten fanden stresspräventive Effekte von Propranolol [182–184]. Diese Untersuchungen erfolgten allerdings an Tiermodellen an nicht orthotopen Xenotransplantaten und das Propranolol wurde in hoher Dosierung subkutan appliziert. Übertragungen der Ergebnisse dieser Modelle auf Diskussion 84 vollständig immunkompetente biologische Organismen unter einer realdosierten oralen Medikamentenapplikation von Propranolol sind daher nur eingeschränkt möglich. Auch für das Pankreaskarzinom wurden konzeptionell ähnliche Studien veröffentlicht. So berichten Lin et al. von einem vermehrten Tumorwachstum in einem subkutanen Pankreaskarzinomxenotransplantat immuninkompetenter Nacktmäuse nach intraperitonealer Isoproterenolinjektion [161]. Auch hier wurden wirksame tertiärpräventive Effekte von Propranolol beschrieben. Neben den Limitationen des genutzten Modells (Isoproterenol als Stresssimulation, immuninkompetenter Organismus, nicht orthotopes Tumormodell, Volumetrie mittels Schiebelehre) ist bei der Interpretation der Studie zu beachten, dass Propranolol gemeinsam mit Versuchsanordnung Isoproterenol galten die intraperitoneal injiziert Prinzipien bekannten der wurde. In Biodynamik dieser und Bioverfügbarkeit des Pharmakons nicht [222]. Die Evaluation einer realistischen therapeutischen Option und die Überprüfung einer möglichen Antagonisierung der Auswirkungen von Isoproterenol im Tumormilieu waren so kaum möglich. Weiterhin berichteten Al-Wadei et al. sogar von einem primärpräventiven Effekt von Propranolol bei der Tumorgenese eines Pankreaskarzinoms in einem Hamstermodell mit Ethanol-induzierter Pankreatitis [188]. In der vorliegenden Arbeit konnten die beschriebenen Stresseffekte auf die Tumorprogression und die Prognose der Tiere durch einfache orale Administration des Betablockers Propranolol deutlich reduziert werden. Während die Mäuse nach Tumorimplantation ohne Stressexposition mit oder ohne orale Propranololgabe im Mittel etwa 65 Tage lebten, starben Tiere ohne Propranololtherapie unter Stressbedingungen im Mittel nach etwa 52 Tagen. Unter Propranololtherapie verlängerte sich das mittlere Überleben der tumortragenden Tiere unter Stressbedingungen auf etwa 59 Tage. Auch die Tumorprogression ließ sich durch Propranolol nach 35 Tagen volumetrisch auf ein Kontrollniveau reduzieren. Die Quantifizierung der murinen MMP-9 im Serum der Mäuse zeigte für tumortragende Tiere eine signifikant erhöhte MMP-9-Serumspiegelkonzentration. Diese Befunde entsprechen Untersuchungen an Humanseren [70, 94] und sind ein wichtiges Indiz für die Beurteilung der klinischen Relevanz des genutzten Tumormodells. Interessanterweise ließ sich nach Tumorimplantation der murinen 6606PDA-Zellen in einen lebenden Organismus sowohl im Tumorgewebe als auch im Serum eine Erhöhung der MMP-9-Expression nachweisen, während ein Nachweis Diskussion 85 im Zellkulturüberstand zuvor nicht gelang. Dies ist ein weiteres Indiz für die Notwendigkeit der Untersuchung tumorbiologischer Zusammenhänge an möglichst realistischen biologischen Modellen. Eine nicht statistisch signifikante Erhöhung der murinen MMP-9 Konzentration im Serum und im Tumorgewebe unter Stressbedingungen ist am ehesten mit kleiner Fallzahl und hoher Varianz zu erklären (vgl. 3.2.6). Unter anderem könnte die unter Stressbedingungen verschlechterte Prognose der tumortragenden Tiere und die beschleunigte Tumorprogression durch einen erhöhten MMP-9-Serumspiegel Ausdruck finden. Für das humane Pankreaskarzinom [90] und andere Entitäten wie das Mammakarzinom [74], sowie das Blasenkarzinom [75] finden sich Berichte einer Korrelation der MMP-9Konzentration in Tumorgewebe, Serum oder Urin mit einer verschlechterten Prognose der Patienten und mit einer beschleunigten Tumorprogression. Die vorliegenden Ergebnisse der Zellkultur-Untersuchungen an humanen Pankreaskarzinomzelllinien unter Stimulation mit Katecholaminen sind daher offenbar auch für einen immunkompetenten, tumortragenden Organismus relevant. Mit einer diagnosebegleitenden Psychotherapie oder Propranololgabe sind prima facie 2 hypothetische therapeutische Optionen für die Humanmedizin zu diskutieren. Küchler et al. fanden nach 10-Jahren einen signifikanten Überlebensvorteil bei Patienten mit gastrointestinalen Tumoren, die während des stationären Aufenthaltes eine Psychotherapie erhielten [223]. Andere Autoren beurteilen die überwiegende Mehrzahl der Studien zu einer psychischen Intervention in der Karzinomtherapie als methodisch zu beanstanden oder fanden keinen signifikanten Überlebensvorteil nach der Diagnose eines Karzinoms [224–226]. Daher rückte die simple Administration des weit verbreiteten und gut untersuchten unspezifischen Betablockers Propranolol [222] als mögliche therapeutische Option zunehmend in den Fokus. Eine große (N = 2221) Fall-Kontrollstudie erbrachte 2004 eine signifikante Risiko-Reduktion für das Auftreten eines Prostatakarzinoms unter oraler Betablockertherapie [227]. Eine französische Kohortenstudie an kardiovaskulären Patienten (N = 893) über 10 Jahre zeigte eine signifikante relative Risikoreduktion unter oraler Betablockertherapie von 49 % für das Auftreten eines Karzinoms [228]. Eine große populationsbasierte FallKontroll-Studie zeigte bis dato jedoch keine Risikoänderung für das Auftreten eines invasiven Mammakarzinoms bei Frauen zwischen 65 und 79 Jahren [229] oder anderen Karzinomen [230] unter antihypertensiver Therapie. Es ist jedoch zu Diskussion 86 beachten, dass die erwähnten Studien nicht zwischen kardioselektiven (nur β1 Rezeptor) und unselektiven Betablockern unterschieden. Weiterhin wurde lediglich die Tumorinzidenz (primärpräventiver Ansatz) untersucht. Für die Beurteilung einer eventuellen Modulation der humanen Karzinomprogression durch eine Betablockertherapie (tertiärpräventiver Ansatz) findet sich in den letzten Jahren eine zunehmend evidente Grundlage in Form retrospektiver Überlebensanalysen. Eine dänische populationsbasierte Kohortenstudie (N= 4179) fand hierzu ein verbessertes Überleben unter Betablockertherapie bei Auftreten eines malignen Melanoms [231] und eine retrospektive amerikanische Fall-Kontrollstudie (N= 248) zeigte einen deutlichen Überlebensvorteil von Ovarialkarzinom-Patientinnen mit fortgeführter antihypertensiver Betablockertherapie nach erhaltener Tumorresektion und Chemotherapie [232]. Zuletzt fanden Watkins et al. in einer retrospektiven multizentrischen Überlebensanalyse (N= 1425) von Patientinnen mit einem ovariellen Karzinom ein fast doppelt so langes Überleben unter der Therapie mit non-selektiven Beta-Adrenozeptor-Antagonisten im Vergleich zur Therapie mit kardioselektiven Beta-Adrenozeptor-Antagonisten [236]. Vor diesem Hintergrund erscheinen weitere Studien-Initiativen einer tertiärpräventiven Betablocker-Therapie auch für andere Tumorentitäten sinnvoll [139, 233, 234]. Die Autoren einer umfangreichen Übersichtsarbeit um Maya Horowitz halten diesbezüglich die stressintensive perioperative Periode für entscheidend [237]. 87 6 Zusammenfassung Das Pankreaskarzinom ist die zehnthäufigste (Männer) bzw. neunthäufigste (Frauen) Tumorerkrankung in Deutschland. Aufgrund der häufig fatalen Prognose ist es gleichzeitig die vierthäufigste Krebstodesursache in Deutschland. 5 Jahre nach Diagnosestellung sind im Mittel nur noch weniger als 8 % der Betroffenen am Leben. Bei regelhaft fehlenden Frühsymptomen erfolgt die Diagnosestellung häufig in bereits fortgeschrittenen Tumorstadien mit stark begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Da vielfältige Wechselwirkungen von chronischem Stress und beschleunigter Tumorprogression bekannt sind, könnte Stress die äußerst limitierte Prognose des Pankreaskarzinoms noch zusätzlich verschlechtern. Hierzu untersuchte die vorliegende Arbeit den Einfluss von Katecholaminen auf progressionsfördernde Veränderungen der Tumorzellbiologie von Pankreaskarzinomzelllinien in vitro. Untersucht wurden die Expression von MMP-2/9, das Migrations- und Invasionsverhalten der Tumorzellen sowie die Auswirkungen von Katecholaminen auf das Proliferationsverhalten. Um eine mögliche Relevanz dieser Befunde in vivo zu überprüfen wurde die Tumorprogression unter chronischer Stressexposition Tumormodell in an einem syngenen, C57BL/6N Mäusen orthotopen mittels und immunkompetenten Überlebensanalysen und magnetresonanztomografischer Bildgebung untersucht. Schließlich wurde mit Propranolol in vitro und in vivo eine mögliche therapeutische Option evaluiert. Es ergaben sich vielfältige Hinweise für eine durch Stress erleichterte Tumorprogression des Pankreaskarzinoms in vivo und in vitro. Katecholamine stimulieren die Gelatinase-Aktivität, Migration, Invasion und Proliferation humaner Pankreaskarzinomzellen. Chronischer Stress führt in einem immunkompetenten Mausmodell zu erhöhter Tumorlast und verschlechterter Überlebensprognose. Diese Effekte sind zumindest partiell durch eine β-Rezeptorblockade mit Propranolol reversibel. Die vorliegende Untersuchung beschreibt fatale Auswirkungen von chronischem Stress auf die Tumorprogression. Auf Hinweise zu primär- und tertiärpräventiven Effekten von Betablockern bei malignen Grunderkrankungen des Menschen könnten bald adjuvante perioperative Studien mit einer Propranololgabe nach Tumorresektion folgen. 88 7 Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Bianchi L, Riede U (2004) Allgemeine und spezielle Pathologie: 168 Tabellen, 5., komplett überarb. Aufl. Thieme, Stuttgart Robert Koch-Institut (2013) Beiträge zur Gesundheitsberichterstattung des Bundes - Krebs in Deutschland 2009/2010, 9. Aufl., neue Ausg. Gesundheitsberichterstattung für Deutschland. 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Lethargie: Normale Aktivität 0 Punkte Leicht erhöhte explorative Aktivität 1 Punkt erhöhte explorative Aktivität, kurze Putz-Intervalle 2 Punkte Mehr als 10 Putz-Intervalle in den ersten 2 Min. 3 Punkte Putzen nur selten unterbrochen in den ersten 2 Min. 4 Punkte Verminderte explorative Aktivität, selten Putz–Intervalle 5 Punkte Lethargie, keine Aktivität 6 Punkte ____ Muskeltonus: Normaler Muskeltonus 0 Punkte Leicht reduzierter Muskeltonus mit zeitweisem (Sekunden) Plötzliches Fallenlassen des Schwanzes 1 Punkt Reduzierter Muskeltonus mit längeren Intervallen mit Hinterherziehen des Schwanzes und „Watschelgang“ 2 Punkte Erheblich reduzierter Muskeltonus mit einem konstanten Hinterherziehen des Schwanzes und „Watschelgang“ während der ersten 5 Minuten nach zurücksetzen der Maus in den Käfig 3 Punkte ____ Score: ____ Anhang I, Dokumentationsprotokoll der Stresssitzungen. Unter den Identifikationsmerkmalen finden sich die 5 evaluierten Stressparameter mit deskriptiver Legende der numerischen Skalen. Als Modifikationen zu Kiank et al. wurde die Skala des Parameters „Fellbeschaffenheit“ auf 2 reduziert (lediglich grobe Differenzierbarkeit bei nassem Fell möglich / falsch positive Werte) und das Beobachtungsintervall auf Groomingverhalten kann nach 2 min sicher beurteilt werden). 2 Minuten reduziert (Effizienzsteigerung / Anhang 106 Anhang II, Explorationsprotokoll. Gezeigt ist eine Übersichtsgrafik des zur Explorations-Dokumentation genutzten Protokolls. Neben Mausidentifikationsparametern wurden Tumorgröße (Schieblehre, 2 Ebenen) und Lokalisation, Organpathologien (Leber, Lunge, Lymphknoten, Peritoneum) und Besonderheiten (u.a. Tumorform, Aszites, Ileus, Milzgröße) erfasst und skizziert. Die Dokumentation der Befunde diente auch einem subjektiven Vergleich mit der Magnetresonanz-basierten Bildgebung. Für ein exploratives Staging wurden die einzelnen Tumorscores (T, M, P, N) multipliziert.