Biomaterialien

Biomaterialien
Oberflächenbehandlung
Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.
1
Oberflächenbehandlung
• Diskrete Grenzfläche (Interface) zwischen Implantat und
Wirtsgewebe
• Das Biomaterial soll biokompatibel und ohne toxische Wirkung
sein
• Das Biomaterial soll (idealerweise) spezifische biologische,
chemische und strukturelle Informationen den Zellen übermitteln
• Diese Signale sollen den Gewebsaufbau steuern, in etwa analog
zur Zell-Matrix und zur Zell-Zell-Wechselwirkung
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Oberflächenbehandlung
• Diskrete Grenzfläche (Interface) zwischen Implantat und
Wirtsgewebe
• Das Biomaterial soll biokompatibel und ohne toxische Wirkung
sein
• Das Biomaterial soll (idealerweise) spezifische biologische,
chemische und strukturelle Informationen den Zellen übermitteln
• Diese Signale sollen den Gewebsaufbau steuern, in etwa analog
zur Zell-Matrix und zur Zell-Zell-Wechselwirkung
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Oberflächenbehandlung
cLSM-Aufnahme einer natürlichen explantierten Herzklappe
Endothelzellen auf
der Oberfläche
Myofibroblasten
darunter
Die Auskleidung mit einer kompletten Endothelzellschicht kann mit der
Besiedlung eines aus Myofibroblasten bestehenden Biomaterials verglichen
werden  Zell-Zell-Wechselwirkung
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Oberflächenbehandlung
Herausforderungen liegen darin,
• Verständnis dafür zu entwickeln, wie Zellen auf verschiedene
molekulare und morphologische Signale reagieren und eine
Vielzahl von ihnen zu einer Antwort zusammenfassen  Biologie
• die Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und den Zellen
so zu steuern, dass die Zellen spezifisch und voraussagbar
reagieren
 Biologie/Werkstoffwissenschaft
• das dafür geeignete Biomaterial mit entsprechend modifizierten
Oberflächen zu entwickeln  Werkstoffwissenschaft
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Oberflächenbehandlung
Die Oberflächenenergie: Energie, die zum Aufbrechen der
chemischen Bindungen notwendig ist, wenn eine neue
Oberfläche eines Festkörpers oder einer Flüssigkeit
erzeugt wird [J/m²]
M. Geetha et al. / Progress in Materials Science 54 (2009) 397–425
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Oberflächenbehandlung
Teilung und Vermehrung der Zellen
Zellzahl/Viabilitäts-/Proliferationstests
(MTT, WST, Alamar Blue etc./Lactat Dehydrogenase LDH/ DNA)
Ausbildung des erforderlichen Zelltyps aus
pluripotenten Stammzellen,
z.B. aus hMSC: Chondrozyten, Adipozyten,
Osteoblasten u.a.
(Differenzierungstests, z.B. Alkalische
Phosphatase für Osteoblasten)
Ausbildung einer zell- und gewebstypischen Extrazellulären Matrix:
z.B. Kollagene, nichtkollagene Proteine
einschließlich:
Calcifizierung, Mineralisation
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Oberflächenbehandlung
Möglichkeiten der Oberflächenmodifizierung I
1. (Unmodifizierte Oberfläche)
2. Überzug, Beschichtung
•
•
•
adsorbierte Oberflächenschichten (Gas, Lösemittel, Proteine)
Lacke
Metallisierung
3. Gradierte Werkstoffe mit besonderer Oberfläche
•
•
Ionenimplantation
assymetrische Gele und Membranen
4. Langmuir-Blodgett-Layers, Self-Assembled Monolayers
5. Oberflächenaktive Komponenten aus der Volumen-Phase
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Oberflächenbehandlung
Möglichkeiten der Oberflächenmodifizierung II
6. Oberflächenchemische und elektrochemische Reaktionen
•
•
Silanisierung
Oxidation
7. Aufrauhung
•
•
•
Strahlen
Ätzen
Plasmasprayen
8. Mikro- und Nanostrukturierung
9. Multischichtfilme (Polyelektrolyte)
10.Beschichtung mit Biomolekülen
11.Kombination verschiedener Verfahren
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9
Oberflächenbehandlung
500 µm
Fibroblasten auf einem mit Kunstoff beschichteten Glasträger. Die Zellen
siedeln dort, wo der Kunststoff mit einem Laser ablatiert wurde.
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10
Oberflächenbehandlung
Flaches Substrat
(Biomaterial, z.B. Titan)
adsorbierte Proteinschicht,
gegebenenfalls
mit vorbereiteter
künstlicher EZM
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Oberflächenbehandlung
Direkte Beeinflussung der Genregulation durch die Oberfläche
Veränderung des Genexpressionsmusters (und damit der Proteinbiosynthese) der Zelle nach Kontakt mit extrazellulären Proteinen,
um den Aufgaben der Osseointegration zu entsprechen
 „homing“, Adhärenz, Proliferation, Differenzierung, biosynthetische
Aktivitäten u.a. Integrin-Expression („Rückkopplung“)
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Oberflächenbehandlung
Direkte Beeinflussung der Genregulation durch die Oberfläche
Integrin-Expression („Rückkopplung“):
Die Zellen können auf veränderte Oberflächen mit veränderter
Integrinausstattung (Typ, Anzahl, Verteilung) reagieren und sich
so an die Situation anpassen
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Oberflächenbehandlung
• Das Biomaterial kommt zunächst über seine Oberfläche mit der
biologischen Umgebung in Kontakt
• Die biologische Umgebung besteht nicht primär aus den Zellen
des umgebenden Gewebes, sondern aus Blut mit den einzelnen
Bestandteilen
 Die mit den initialen Adsorbenzien (Proteine, Ionen, GAGs)
beschichtete Oberfläche tritt mit dem Umgebungsgewebe in
Wechselwirkung
• Die adsorbierten Proteine, Ionen, GAGs sind die Vermittler der
Wechselwirkung zwischen den Zellen des Umgebungsgewebes und
dem Biomaterial, bzw. sind in in der Lage, solche zu binden
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Oberflächenbehandlung
erste Sekunden
5 Minuten
ab 20 Minuten
irreversibel
reversibel
kompetitiv

M. Geetha et al. / Progress in Materials Science 54 (2009) 397–425
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Oberflächenbehandlung - Proteine
Adhäsionsproteine,
Wachstumsfaktoren, Chemokine,
Thrombozyten, Fibrin
irreversibel
reversibel
kompetitiv

Verdrängung
kleinerer
initial
adsorbierter
Proteine
durch größere
(VromannEffekt)
Ausreichend feste
Anbindung
erreichen
Versch. Konformationen:
von intakt bis komplett
denaturiert
Adsorption oder
Denaturierung
verhindern
Oberflächenbehandlung
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Oberflächenbehandlung - Proteine
Ausreichend feste
Anbindung
erreichen
Adsorption oder
Denaturierung
verhindern
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Oberflächenbehandlung
• Die Oberflächen von Biomaterialien müssen in der Lage sein,
„entscheidende Substanzen“ zu binden und später abzugeben
(Fänger- und Aktivatorstrukturen oder -oberflächen)
• Im Falle der Osseointegration bedeutet das, dass die wichtigen
knochenbildenden Zellen (Vorläuferzellen der Osteoblasten 
humane mesenchymale Stammzellen hMSC)
– angelockt werden („homing“)
– adhärieren
– proliferieren
– in die gewünschte Richtung differenzieren
– die notwendige biosynthetische Aktivität (z.B. Kollagenbildung,
Mineralisation) leisten
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Oberflächenbehandlung
Dazu ist eine ausreichende Anzahl und die richtige Verteilung von
• Adhäsionsmolekülen (z.B. Fibronectin, Vitronectin)
• Chemokinen (lösen Chemotaxis, d.h. Zellbewegung aus)
• Wachstumsfaktoren und Cytokinen
(zusammengefasst Mediatoren)
auf der Biomaterialoberfläche notwendig
Diese können
1. vor der Implantation in-vitro an die Oberfläche gebunden werden
(wobei die initiale Proteinadsorption unterdrückt werden muss)
2. durch die geeignete Biomaterialoberfläche in-vivo gebunden
(gefangen) und den Zellen präsentiert (aktiviert) werden
 Fänger- und Aktivatorstruktur, -oberfläche
Dazu dienen u.a. Glukosaminoglykane (GAG) bzw. Proteoglykane
(PG) oder analoge Strukturen
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Oberflächenbehandlung
Amorphe extrazelluläre Substanzen: Kohlenhydrate, an
ein Protein gebunden
Kohlenhydrate: Glukosaminoglykane (GAGs)
GAG + Protein = Proteoglykan (PG)
Protein
GAG
Hyaluronsäure
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Proteoglykane (Beispiele)
Proteoglykan
Seitenketten
(Zahl/Protein)
Gewebe, Zellen
Subzelluläre
Lokalisation
Aggrecan
Chonroitinsulfat (100)
Keratansulfat (30)
Knorpel
Komplex mit
Hyaluronsäure
Fibromodulin
Keratansulfat (4)
Kollagenes
Bindegewebe
bindet
Kollagenfibrillen
Decorin
Chondroitinsulfat (1)
Kollagenes
Bindegewebe
bindet
Kollagenfibrillen
Biglycan
Keratansulfat (2)
Kollagenes
Bindegewebe
perizelluläre Matrix
Versican
Chondroitinsulfat (20-25)
Wand von
Blutgefäßen
bindet
Hyaluronsäure
Perlecan
Heparansulfat (3)
Basallamina
Bindet Laminin
Syndecan
Heparansulfat (3)
Keratansulfat (1)
Dermatansulfat (1)
Plasmamembran
von Epithelzellen
Epithelium
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Collagen buffer A
Collagen with 25 µg/ml
decorin, buffer A
Collagen with 25 µg/ml
chondroitin sulfate,
buffer A
Collagen buffer B
Collagen with 25 µg/ml
decorin, buffer B
Collagen with 25 µg/ml
chondroitin sulfate,
buffer B
S Bierbaum, T. Douglas, T. Hanke, D. Scharnweber et al. J Biomed Mater Res 77A (2006) 551–562
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Proteoglykane (Beispiele)
M. Wollenweber, MBZ
Wintersemester 2012/13
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Oberflächenbehandlung  RGD
Adhäsionsmoleküle sind Proteine, die die Adhäsion von Zellen an und in der
EZM sowie ihre Bewegung darin ermöglichen (z.B. Fibronectin,
Vitronectin), Abk. CAM (cell adhesion molecules)
Fibronectin und Vitronectin
•
•
Glycoproteine mit mehreren Domänen und Bindungsstellen für eine breite
Palette von Komponenten der EZM
wichtig für die Verankerung von Zellen in der EZM durch die Integrine
Fibronectin
Arginin-Glycin-Asparagin (RGD)
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Oberflächenbehandlung  RGD
RGD-Peptide werden statt des Proteinmoleküls verwendet:
• 1982 wurde die komplette Aminosäuresequenz des Adhäsionsfragmentes von Fibronektin dargestellt
• Von diesen 108 Aminosäuren erwies sich eine Sequenz aus
lediglich drei Aminosäuren als unabdingbar für das
Zustandekommen einer Zellanheftung:
• die Arginin-Glycin-Asparagin-Sequenz (RGD)
• Ebenso wurde gezeigt, daß keine
der drei Aminosäuren ersetzt
werden konnte, wollte man
die Funktion erhalten.
 RGD auf Titan
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Oberflächenbehandlung  RGD
Ti6Al4V
Phosphonat
•
•
•
Ti6Al4V als Biomaterial
Cyclo(-RGDfK[-tetraphosphonyl-lysyllysyl-diamido-heptaethyleneglycolyl])
mit 4 Phosphat-Gruppen
Einbau in die Titanoxidschicht durch
anodische Polarisation
Distanz der Liganden ist wichtig
R. Beutner, D. Scharnweber et al., TU Dresden
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Oberflächenbehandlung  RGD
E. de Beus and K. Jacobson Cell Motility and the Cytoskeleton 41 (1998) 126±137
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Oberflächenbehandlung  RGD
A-Alan; D-Asparaginsäure; E-Glutaminsäure; G-Glycin; H-Histidin; I-Isoleucin; K-Lysin; L-Leucin; NAsparagin; R-Arginin; Q-Glutamin; S-Serin; V-Valin; Y-Tyrosin;
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Oberflächenbehandlung  RGD
A-Alan; D-Asparaginsäure; E-Glutaminsäure; G-Glycin; H-Histidin; I-Isoleucin; K-Lysin; L-Leucin; NAsparagin; R-Arginin; Q-Glutamin; S-Serin; V-Valin; Y-Tyrosin;
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Oberflächenbehandlung  TiN
Verhältnis Breite zu Höhe von
Kollagenfibrillen mittels AFM
gemessen
T Hanke, C. Wolf-Brandstetter, D. Scharnweber
Das Verhältnis von Breite zu Höhe der Fibrillen ist Ausdruck des Kräftegleichgewichts zwischen der adsorptiven Wechselwirkung der Fibrille mit der
Substratoberfläche und der internen Stabilisierung der Fibrille durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen
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Oberflächenbehandlung  TiN
8
7,5
7
6,5
6
5,5
hydrophob
5
4,5
4
hydrophil
3,5
3
Referenz
TiN LS 90
TiN NEn
TiN PI
TiN PII2
DLC
T Hanke, C. Wolf-Brandstetter, D. Scharnweber
•
•
•
•
Änderung der Oberflächenenergien des Titans durch oberflächliche
Erzeugung von TiN
Vergleich mit Reintitan und einer dichten Kohlenstoffschicht
TiN durch Plasma-Immersions-Ionen-Strahlen (TiN PI, TiN PII2)
und Laserumschmelzen in 90%er Stickstoffatmosphäre (TiN LS 90*)
DLC, diamond like carbon duch Magnetronsputtern.
*Umschmelzprozess war nicht erfolgreich (Ramanspektr.), also TiN LS90=Reintitan
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Oberflächenbehandlung  ODN
Grundlage: Anbindung von DNA (Oligodesoxyribonucleotide – ODN)
an Metalloberflächen
Hybridisierung von DNA mit komplementären
“sticky ends”
5' RP
Au
3'
P P P P P P P P P P P P P P P P P P P
R R R R R R R R R R R R R R R R R R R
3'
R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R
P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P
5'
Adsorption von Thiol-Oligonucleotiden
mit “sticky ends” an Gold
W. Pompe
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Oberflächenbehandlung  ODN
30er Oligodesoxyribonucleotid (ODN) mit Phosphat am 5’-Terminus (ODN-P)
 Immobilisierter Strang (Adsorption + anodische Oxidation)
Fluorescein-markierter komplementarer Oligodesoxyribonucleotid-Strang (15er,
ODN-FS)  mobiler Strang
Faktoren, Mediatoren
R. Beutner, J. Michael, D. Scharnweber et al. TU Dresden
AO
Ti6Al4V
Oxidschicht O
Ti6Al4V
Ti6Al4V
O
Ti6Al4V
Anodisch verdickte Oxidschicht AO
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Oberflächenbehandlung  ODN
Modular Nucleic Acid based Immobilization System for
Biologically Active Molecules (AG Scharnweber)
J. Michael et al. J Biomed Mater Res 80B(2007) 146-55; R. Beutner et al., Biomaterials 30(2009)14, 2774-81;
J. Michael et al., Bioconjugate Chem. 20(2009)4, 710-8.
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Oberflächenbehandlung  µ-Strukturierung
P.M. Kou and J.E.Babensee: J. Biomed Mater Res A: 96 (2011) 239-260
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Oberflächenbehandlung  µ-Strukturierung
M. Bartneck et al. / Acta Biomaterialia 6 (2010) 3864–3872
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Oberflächenbehandlung  µ-Strukturierung
M. Bartneck et al. / Acta Biomaterialia 6 (2010) 3864–3872
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung
Metallisches
Substrat
(Titanlegierung)
Zellbesiedlung (in vitro)
+Proteine (aus
Serum/FKS im
Zellkulturmedium)
anorganische
Beschichtung
(HAP)
oder
biologische
Beschichtungen
(Kollagen,
Mediatoren,
GAGs)
Implantation (in vivo)
Schaft aus
Titanlegierung
+Proteine (aus Blut)
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung
Metallisches
Substrat
(Ti+Oxid)
cLSM Reflexbild
anorganische
Beschichtung
(HAP)
Zellbesiedlung
als in vitro –Test
(Osteoblasten)
cLSM-Bild
REM-Bild
biologische
Beschichtung
(Kollagen)
AFM-Bild
+Proteine (aus
Serum/FKS im
Zellkulturmedium)
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Rauhigkeit
Titan, poliert
Titan, sandgestrahlt
Titan, mit Glasperlen
gestrahlt
Titan, mit Edelkorund
gestrahlt
Titan, plasmagespritzt
Proben: D. Scharnweber, cLSM-Topographiebilder: Th. Hanke, TU Dresden
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Oberflächenbehandlung - Rauhigkeit
gesamt
> 20 µm
< 20µm
< 2 µm
Plasma
Korund
Glasperle
poliert
Sand grob
Sand fein
Implant DD Implant B
9,254
5,575
0,893
0,214
9,018
3,803
4,1
21,858
8,979
5,482
0,7
0,108
8,356
3,046
4,245
21,737
1,882
0,724
0,537
0,14
2,135
1,848
1,68
3,879
0,376
0,236
0,234
0,034
0,386
0,422
0,24
0,469
Fouriertransformation gestattet die Zuordnung der Werte zu bestimmten
Wellenlängen der Oberflächentopographie
Titan,
sandgestrahlt
Titan,
sandgestrahlt
Welligkeit vs. Rauhigkeit
10
9
8
7
Ra/µm
Die Gesamtrauhigkeit
gibt nicht die Rauhigkeiten in den einzelnen
Wellenlängenbereichen
wieder, die z.B. für
Zellbesiedlung wichtig
sein können
gesamt
6
> 20 µm
5
< 20µm
4
< 2 µm
3
2
1
0
D
le
er
sp
la
in
fe
rt
l ie
po
G
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Sa
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an
pl
Im
ob
gr
a
nd
ru
Ko
nd
Sa
m
as
Pl
Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Rauhigkeit
D. Scharmweber, T. Hanke, TU Dresden
John E. Davis, Toronto
Die Rauhigkeit kann zwei alternative Funktionen haben
1. Bessere Wechselwirkung mit initial adsorbierten Proteinen und anderen
Komponenten der EZM aus dem Blut, z.B. Fibronektin (RGD)
(Fänger- und Aktivatorstruktur)  linkes Bild
2. Ankerschicht für künstlich aufgebrachte Schichten, wie z.B. Kollagen I,
das seinerseits notwendige Komponenten, wie z.B. Fibronektin (RGD),
aus dem Blut adsorbiert oder trägt (Vorimmobilisierung)  rechtes Bild
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Rauhigkeit
Rauhigkeit und Topographie der Oberflächen
• bestimmen die Verteilung der Adhäsionsproteine, z.B. Muster und
Abstände der RGD-Peptidsequenzen  wichtig für Ausbildung
fokaler Kontakte (d < 140 nm), Zelladhäsion und –adhärenz
• senden zusammen mit den auf ihnen verteilten Adhäsionsmolekülen sog. haptotakische Signale an die Zellen, die für die
Zelladhärenz vs. –mobilität wichtig sind
• beeinflussen damit erheblich Proliferation und Differenzierung
–
–
z.B. ist die Bindung der ß1 Integrin-Untereinheit an einen Liganden
nötig, damit Pre-Osteoblasten beginnen zu mineralisieren
z.B. wird die Protein-Expression beeinflusst, z.B. erhöht sich auf
rauhen Unterlagen die Kollagen I-Produktion von Osteoblasten
Nachteil direkter Adsorption der Adhäsionsproteine: Die
Konformation der Proteine ist uneinheitlich, z.T. komplett
denaturiert, was sie inaktiviert

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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Kollagen
Kollagene
• Eine „Superfamilie“ sehr stark aufeinander bezogener, doch
genetisch, biochemisch und funktionell unterschiedlicher
extrazellulärer Matrixproteine
• Hauptfunktionen: Struktur (vor allem für Zugfestigkeit verantwortlich), Verankerung der Zellen in der Matrix
• bildet einen extrazellulären Rahmen für die Gewebe aller
multizellulären Organismen
• das häufigste Protein bei Tier und Mensch
• formt üblicherweise supramolekulare Aggregate (Fibrillen,
Filamente, Netzwerke), allein oder gemeinsam mit anderen
Komponenten der EZM
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Kollagen
Kollagen Typ I (links) und Typ III (rechts)-Fibrillen in
dreidimensionalen Kollagenschichten (Kollagen-Gel)
AFM-tapping mode-Bilder der feuchten Schichten
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Mehrstufige Oberflächenbehandlung - Zellen
Primäre Osteoblasten nach 24 Stunden Kulturzeit auf (links)
Kollagen-Typ I und (rechts) -Typ III-Schichten (Kollagen-Gel)
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