Theermann_Dissertation 11.09.2011 - nbn
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zum Einfluss von Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf Aminosäuren und Biogene Amine im Pansensaft (in vitro) INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) vorgelegt von Sarah Theermann Leer (Ostfriesland) Hannover 2011 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Dr. M. Höltershinken Klinik für Rinder Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein 2. Gutachter: PD Dr. S. Leonard-Marek Tag der mündlichen Prüfung: 22.08.2011 „Das erste, das der Mensch im Leben vorfindet, das letzte, wonach er die Hand ausstreckt, das kostbarste, was er im Leben besitzt, ist die Familie.“ Adolph Kolping Meiner Familie und Torben Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen präsentiert: 65. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie - Posterbeitrag Göttingen, 15. – 17.02.2011 THEERMANN, S., N. GRESNER, K. EICKEN, H. BOLLWEIN, M. HÖLTERSHINKEN In vitro studies on the effects of grass silage containing low true protein on γ-Aminobutyric Acid (GABA) in bovine ruminal fluid 12th Middle European Buiatric Congress - Vortrag Pula/Kroatien, 18. – 22.05.2011 THEERMANN, S., N. GRESNER, A. WICHERN, H. BOLLWEIN, M. HÖLTERSHINKEN In vitro studies on the effects of grass silage containing low true protein on γ-Aminobutyric Acid (GABA) in bovine ruminal fluid Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ......................................................................................................................- 1 - 2. Schrifttum .....................................................................................................................- 2 2.1 Einleitung ...............................................................................................................- 2 - 2.1.1 2.2 RUSITEC-Untersuchungen............................................................................- 2 GABA.....................................................................................................................- 3 - 2.2.1 Biochemie.......................................................................................................- 3 - 2.2.2 Metabolismus .................................................................................................- 4 - 2.2.2.1 GABA-Shunt..............................................................................................- 4 - 2.2.2.2 GAD (EC Nr. 4.1.1.15) ..............................................................................- 5 - 2.2.2.3 GABA-T (EC Nr. 2.6.1.19)........................................................................- 8 - 2.2.2.4 SSADH (EC Nr. 1.2.1.24)........................................................................- 10 - 2.3 GABA im Pflanzenstoffwechsel ..........................................................................- 11 - 2.3.1 Gehalte, Nachweise in Pflanzen...................................................................- 11 - 2.3.2 Ausgangsstoff Glutamat ...............................................................................- 12 - 2.3.3 GABA-Akkumulation als Antwort auf Stressoren......................................- 13 - 2.3.4 Wirkung von GABA und Aufgaben des GABA-Shunts..............................- 16 - 2.4 Vorkommen von GABA in Futtermitteln ............................................................- 19 - 2.4.1 GABA-Gehalte verschiedener Futtermittel..................................................- 19 - 2.4.2 Proteinabbau.................................................................................................- 23 - 2.4.2.1 Proteingehalte von Pflanzen.....................................................................- 24 - 2.4.2.2 Proteolyse .................................................................................................- 25 - 2.4.2.3 Einfluss verschiedener Behandlungsverfahren ........................................- 26 - 2.5 GABA im Pansen .................................................................................................- 33 - 2.5.1 Intraruminale Abbaubarkeit .........................................................................- 33 - 2.5.2 Ruminale Resorption....................................................................................- 36 - Fazit..............................................................................................................................- 38 2.6 3. Auswirkungen auf den Organismus .....................................................................- 39 - 2.6.1 GABA im Organismus – zentrale Wirkungen .............................................- 39 - 2.6.2 GABA im Organismus – periphere Wirkungen ...........................................- 41 - 2.6.3 GABA beim Wiederkäuer............................................................................- 42 - 2.6.4 Chronische Effekte.......................................................................................- 43 - Eigene Untersuchungen .............................................................................................- 44 - 3.1 Versuchsziel .........................................................................................................- 44 - 3.2 Material und Methodik.........................................................................................- 44 - 3.2.1 Herkunft der Proben (RUSITEC-System)....................................................- 44 - 3.2.2 Probenentnahme ...........................................................................................- 45 - 3.2.3 Probenlagerung und -aufbereitung ...............................................................- 47 - 3.3 Analytik ................................................................................................................- 47 - 3.3.1 Prinzip der HPLC .........................................................................................- 47 - 3.3.2 HPLC-Verfahren mit chemischer Derivatisierung.......................................- 48 - 3.3.3 Analytisches Verfahren ................................................................................- 49 - 3.3.4 HPLC-Anlage, Geräte und Chemikalien......................................................- 49 - 3.3.4.1 HPLC-Anlage...........................................................................................- 49 - 3.3.4.2 Sonstige Geräte und Laborzubehör ..........................................................- 52 - 3.3.4.3 Vermessungen von Standardreihen ..........................................................- 54 - 3.3.4.4 Vermessung von RUSITEC-Proben.........................................................- 59 - 3.3.4.5 Überprüfung der Methode........................................................................- 61 - 3.4 4. Statistische Auswertung .......................................................................................- 63 - Ergebnisse ...................................................................................................................- 65 4.1 Aminosäuren und Biogenen Aminen im Pansensaft in vitro ...............................- 65 - 4.1.1 Cystein..........................................................................................................- 66 - 4.1.2 Arginin .........................................................................................................- 69 - 4.1.3 Serin .............................................................................................................- 71 - 4.1.4 Aspartat ........................................................................................................- 73 - 4.1.5 Glutamat .......................................................................................................- 75 - 4.1.6 Threonin .......................................................................................................- 77 - 4.1.7 Glycin ...........................................................................................................- 79 - 4.1.8 Alanin ...........................................................................................................- 81 - 4.1.9 Tyrosin .........................................................................................................- 83 - 4.1.10 Prolin ............................................................................................................- 85 - 4.1.11 Valin .............................................................................................................- 87 - 4.1.12 Phenylalanin .................................................................................................- 89 - 4.1.13 Isoleucin .......................................................................................................- 91 - 4.1.14 Leucin...........................................................................................................- 93 - 4.1.15 Lysin.............................................................................................................- 95 - 4.1.16 GABA...........................................................................................................- 97 - 5. 4.1.17 Indolessigsäure ...........................................................................................- 101 - 4.1.18 Citrullin ......................................................................................................- 103 - 4.1.19 Histamin .....................................................................................................- 105 - 4.1.20 Agmatin ......................................................................................................- 107 - 4.1.21 Serotonin ....................................................................................................- 109 - Diskussion .................................................................................................................- 113 5.1 Intentionen der Arbeit ........................................................................................- 113 - 5.2 Kritische Betrachtungen der Versuchsanstellung ..............................................- 113 - 5.2.1 Das RUSITEC-System ...............................................................................- 113 - 5.2.2 Die verwendeten Futtermittel.....................................................................- 113 - 5.2.3 Beurteilung der verwendeten Analysemethode..........................................- 114 - 5.2.4 Beurteilung der Probenlagerung und Aufbereitung ...................................- 115 - 5.3 Auswahl und Kritik der Parameter.....................................................................- 115 - 5.3.1 Verwendete Parameter ...............................................................................- 115 - 5.3.2 Kritik der Parameter ...................................................................................- 116 - 5.3.2.1 5.4 Bestimmungen freier Aminosäuren und Biogener Amine in vitro ........- 116 - Auswirkungen von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißanteilen…..- 119 - 5.4.1 Proteinogene Aminosäuren ........................................................................- 119 - 5.4.1.1 Glycin .........................................................................................................- 120 - 5.4.1.2 Prolin ..........................................................................................................- 123 - 5.4.1.3 Lysin...........................................................................................................- 125 - 5.4.2 Die nicht-proteinogene Aminosäure GABA ..............................................- 127 - 5.4.3 Biogene Amine...........................................................................................- 132 - 5.4.3.1 Serotonin ................................................................................................- 132 - 5.5 Abschließende Wertung .....................................................................................- 133 - 5.6 Ausblick .............................................................................................................- 137 - 6. Zusammenfassung....................................................................................................- 138 - 7. Summary ...................................................................................................................- 139 - 8. Schrifttumsverzeichnis.............................................................................................- 140 - 9. Anhang ......................................................................................................................- 172 9.1 Futtermittelanalysen ...........................................................................................- 172 - 9.2 FMOC-Anleitung ...............................................................................................- 175 - 9.3 Überprüfung der Methode..................................................................................- 177 - 9.3.1 Präzision in Serie........................................................................................- 177 - 9.3.2 Wiederfindungsrate ....................................................................................- 180 - 9.3.3 Messgenauigkeit durch Doppelmessungen ................................................- 188 - 9.4 Wertetabellen Ergebnisteil .................................................................................- 193 - 9.4.1 Aminosäuren und Biogenen Aminen im Pansensaft in vitro .....................- 193 - 9.4.2 Vergleich der mittleren Konzentrationen als Differenzberechnung ..........- 264 - 9.5 10. GABA-Versuche ................................................................................................- 274 - 9.5.1 Kurzversuch RUSITEC..............................................................................- 274 - 9.5.2 Grasversuche ..............................................................................................- 275 - Danksagung...........................................................................................................- 277 - Abkürzungsverzeichnis α-KGDH Ala Arg AS Asn Asp CaM Cys DABA Diss. ER FAD FlFS FM FMOC GABA GABA-T GAD GDH GDP GH GHB Gln Glu Gly GOGAT GS GTP His HPLC IAA Ile kDa Leu LH Lys MDa MAX Met MIN α-KetoglutaratDehydrogenase Alanin Arginin Aminosäure Asparagin Asparaginsäure Calmodulin Cystein 2,4-Diaminobuttersäure Dissertation Endoplasmatisches Retikulum Flavinadenindinukleotid (oxidiert) flüchtige Fettsäuren Futtermittel 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl γ-Aminobuttersäure GABA-Transaminase Glutamat-Decarboxylase Glutamat-Dehydrogenase Guanidindiphosphat Wachstumshormone γ-Hydroxybuttersäure Glutamin Glutamat Glycin Glutamat-Synthase Glutamat-Synthetase Guanidintriphosphat Histidin High Pressure Liquid Chromatography Indolessigsäure Isoleucin kilo Dalton Leucin Luteinisierendes Hormon Lysin Mega Dalton Maximum Methionin Minimum Min. min. N NAD+ NADH NADP+ NADPH NPAA NPN OPA p pH Phe Pro PRL RUSITEC Ser SSA SSADH ssp. Tab. Thr Trp TSH TS Tyr uS UV Val ZNS % < > = ± ↓ ↑ Minute mindestens Stickstoff Nicotinamidadenindinukleotid (oxidiert) Nicotinamidadenindinukleotid (reduziert) Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (oxidiert) Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (reduziert) NichtproteinogeneAminosäuren Nicht-Protein-Stickstoff Orthophthal-Aldehyd Signifikanz negativer dekadischer Logarithmus der H+Konzentration Phenylalanin Prolin Prolactin Rumen SIMulation TEChnique Serin Succinylsemialdehyd SSA-Dehydrogenase subspezies Tabelle Threonin Tryptophan Thyreoidea Stimulierendes Hormon Trockensubstanz Tyrosin ursprüngliche Substanz Ultraviolett Valin Zentrales Nervensystem Prozent kleiner als größer als ist gleich plus/minus Abfall Anstieg Einleitung 1. Einleitung In den vergangenen Jahren wurden bei Grassilagen des ersten Schnitts mit auffälligen Reineiweißanteilen (in Prozent vom Rohprotein) auch bei unauffälliger Sensorik hohe Konzentrationen der nicht-proteinogenen Aminosäure γ-Aminobuttersäure (GABA) und Biogener Amine, sowie bestimmter proteinogener Aminosäuren gefunden. Diese Silagen standen im Zusammenhang mit verlustreichen Erkrankungen in Milchviehherden, insbesondere das vermehrte Auftreten unspezifischer Krankheitssymptome wie erhöhte Milchzellzahlen, vermehrt Lahmheiten und Labmagenverlagerungen, verringerte Fruchtbarkeit, Festliegen bis hin zu plötzlichen Todesfällen wurde beobachtet (EICKEN 2005a). Die Genese der Erkrankung ist weitgehend unbekannt, jedoch konnte gezeigt werden, dass ein Absetzen der Silage, z.T. mit Zulage von Sojaschrot, zu einer raschen Verbesserung des Gesundheitsstatus der erkrankten Herden führte. Aus diesem Grund wird eine nutritive Genese der Erkrankung vermutet (EICKEN 2005a). Insbesondere steht die Untersuchung von Veränderungen der Eiweißfraktion in den Silagen im Vordergrund des Interesses, da die vermutlich krankmachenden Silagen insbesondere bezüglich dieses Parameters Abweichungen zeigten (GAST 2010; GRESNER 2011). Bereits in einer früheren Arbeit aus der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden vergleichend Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißanteilen im künstichen Pansen RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique) inkubiert. Ziel dieser Untersuchungen war es unter anderem, Auswirkungen auf die Proteinspiegel im Pansen zu untersuchen (GRESNER 2011). Die Ergebnisse dieser Studie deuteten aufgrund der Veränderungen im Proteinstoffwechsel (Aminosäurenzusammensetzung, Ammoniakkonzentration) darauf hin, dass die Fermentation von Silagen mit auffälligen Reineiweißanteilen zu einer Verschiebung der Mikroorganismenpopulation im künstlichen Pansensystem RUSITEC führte. Da ein Großteil der möglicherweise beeinflussten Mikroorganismen in den Aminosäurestoffwechsel eingreift, waren die Konzentrationen der proteinogenen Aminosäuren in der Fermenterflüssigkeit jetzt von besonderem Interesse. Im Unterschied zur Arbeit von GRESNER (2011) wurde für die Analyse jedoch eine wesentlich empfindlichere Analysemethode verwendet ( 9-Fluorenylmethyl-oxycarbonyl = FMOC-Derivatisierung vs. Orthophthal-Aldehyd = OPA-Derivatisierung). Von EICKEN1 wurden auch erhöhte Gehalte an Biogenen Aminen und der nichtproteinogenen Aminosäure GABA in der originären Silage als mögliche Ursache für verlustreiche Erkrankungen in Milchviehherden angegeben. Gerade GABA stellt als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter (ROBERTS u. FRANKEL 1951) eine Substanz von außerordentlicher biologischer Potenz dar, deren mögliche Auswirkungen auf die Gesundheit des Wiederkäuers immer wieder kontrovers diskutiert wurden und werden (BUCHANAN-SMITH u. PHILLIP 1984; DAWSON u. MAYNE 1997). Aus diesen Gründen sollten in der vorliegenden Studie Fermenterproben, die bei den oben genannten Untersuchungen asserviert worden waren, auf ihre Konzentrationen an proteinogenen Aminosäuren, Biogenen Aminen sowie der nicht-proteinogenen Aminosäure GABA untersucht werden. 1 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn K. Eicken, Hannover am 13. März 2009 -1- Schrifttum 2. Schrifttum 2.1 Einleitung Nach Entdeckung und Isolierung der γ-Aminobuttersäure (GABA) in verschiedenen pflanzlichen und tierischen Organismen vor über 50 Jahren wandte sich das wissenschaftliche Interesse schnell besonders der physiologischen Funktion im Säugetierorganismus zu (SCHALES et al. 1946). Erst in den letzten Jahren wurden verschiedene Forschungsgruppen (u.a. SHELP et al. 1999; KINERSLEY u. TURANO 2000; BOUCHÉ u. FROMM 2004) auf die Bedeutung der γ-Aminobuttersäure in Pflanzen aufmerksam, die bis dato eher als unbedeutender Metabolit des Pflanzenstoffwechsels angesehen wurde. Immer wieder findet GABA im Zusammenhang mit der Antwort der Pflanze auf biotische und abiotische Stressoren Erwähnung (HILKER u. MEINERS 2010). Vermehrte Forschungen in diesem Bereich erwägen sogar eine Funktion als Transmitter in der Pflanze (BOUCHÉ et al. 2003), analog zur Rolle von GABA im tierischen Organismus. Aufgrund ihres Vorkommens im Pflanzenreich ist GABA folglich auch eine Futterkomponente unserer Rinder. Doch trotz des Wissens über die Bedeutung von GABA im Organismus sind Folgen einer oralen Langzeitaufnahme, die z.T. beträchtliche Mengen ausmachen kann (BOND et al. 1984), wenig bekannt. Die hier durchgeführte Analyse von asservierten RUSITEC-Proben soll helfen, mehr über die ruminalen Auswirkungen zu erfahren. 2.1.1 RUSITEC-Untersuchungen Aus dem Pansenlabor der Rinderklinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover sind bis dato mehrere mit dem RUSITEC-System (künstlicher Pansen) erstellte Arbeiten hervorgegangen (SCHIRMER 1990; KRAKOW 1992; BECKER 1994; MAIWORM 1994; PLITT 1995; BRÖCKER 1996; MAURUSCHAT 1996; ELIAS 1999; MITTROWANN 1999; HÖHLING 2000; JASPER 2000; TIADEN 2000; WENDELKEN 2000; RATHJENS 1999; HÜBNER 2001; JANSON 2001; WULFF 2001; KRAUSE 2002; MÜLLER - ÖZKAN 2002; CHAWANIT 2003; GAST 2010). Die Autoren griffen in der Ausarbeitung des Schrifttums zu diesen Arbeiten jeweils spezielle Aspekte des ruminalen Stoffwechsels auf, um am Ende der Versuchsreihe die Kenntnisse über metabolische Abläufe im Pansen vervollständigen und umfassend auf den neuesten wissenschaftlichen Stand bringen zu können. -2- Schrifttum 2.2 GABA 2.2.1 Biochemie Die γ-Aminobuttersäure (syn. GABA, γ-Aminobutyrat, γ-Aminobutyric acid, Piperidinsäure, 4-Aminobuttersäure) liegt als nicht-proteinogene Aminosäure im Pool der freien Aminosäuren verschiedenster Organismen, vom Einzeller bis zum Säugetier, vor (UENO 2000; CHO et al. 2007). Strukturell besteht GABA aus einem Skelett von vier Kohlenstoffatomen, das am dritten Kohlenstoffatom nach dem Carboxylkohlenstoffatom aminiert ist. Dies ist ein wesentlicher Unterschied zu anderen Aminosäuren, deren Aminierung stets an der α-Position erfolgt. In der Regel liegt GABA als Zwitterion vor. Abb. 2.2.1: Strukturformel von GABA Der Nachweis von GABA in Pflanzen gelang bereits vor mehr als 60 Jahren (STEWARD et al. 1949). Im tierischen Organismus wird GABA die Rolle als „major inhibitory neurotransmitter“ zugeschrieben (ROBERTS u. FRANKEL 1951). Die Entstehung verläuft über die α-Decarboxylierung von L-Glutamat. Katalysiert wird diese Reaktion durch das pyridoxalphosphatabhängige Enzym Glutamat-Decarboxylase (GAD, EC Nr. 4.1.1.15), das in Tieren, Bakterien und Pflanzen gleichermaßen vorkommt (UENO 2000). Bei der Aktivierung des Enzyms spielen die Bindung von Ca2+ an Calmodulin und die Präsenz freier H+-Ionen eine Schlüsselrolle. Abb. 2.2.2: Entstehung von GABA durch Decarboxylierung von L-Glutamat -3- Schrifttum 2.2.2 Metabolismus 2.2.2.1 GABA-Shunt Die Bereitstellung von GABA erfolgt in Pflanzen und Tieren hauptsächlich durch den sog. GABA-Shunt, einen alternativen Weg zur Synthese von Succinat im Zitratzyklus, der im Wesentlichen über Glutamat läuft. Dabei kommt drei Enzymen eine Schlüsselrolle zu: Glutamat-Decarboxylase (GAD), GABA-Transaminase (GABA-T, EC Nr. 2.6.1.19) und Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (SSADH, EC Nr. 1.2.1.24). Ein geringer Anteil des GABA-Gehalts wird auch durch den Katabolismus von 4-Guanidinobuttersäure zu GABA und Harnstoff, als Nebenprodukt der anaeroben Glycolyse (BRAY et al. 2000), sowie den Abbau von Putreszin über Pyrrolin zu GABA (SLOCUM et al. 1984) bereitgestellt. Der GABA-Shunt läuft vermehrt unter anaeroben Bedingungen ab und bedient sich des unter diesen Umständen im Zytosol anflutenden Substrats α-Ketoglutarat (IGAMBERDIEV u. HILL 2009). Zunächst kommt es zur Aminierung oder Transaminierung von α-Ketoglutarat zu Glutamat durch Glutamat-Dehydrogenase (GDH) oder anderer Aminotransferasen. Katalysiert durch das Enzym Glutamat-Decarboxylase (GAD) wird Glutamat zu GABA decarboxyliert und anschließend durch die GABA-Transaminase (GABA-T) zu Succinatsemialdehyd (SSA) transaminiert. Die irreversible Oxidation von Succinatsemialdehyd zu Succinat, unter Generierung eines NADH, wird schließlich katabolisiert durch die Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase (SSADH). Dabei stellt dieser Weg eine energetisch ungünstigere Variante dar, da im Zitratzyklus ein NADH und ein ATP entstehen (vgl. Abb. 2.2.3). Prinzipiell wird der GABA-Shunt durch die Verfügbarkeit seiner Substrate, α-Ketoglutarat, Adenylat, NAD+, NADH und CoA, reguliert (DRY u. WISKICH 1985). Nur das Verständnis von chemischen Eigenschaften und Wechselwirkungen zwischen GABA und den verschiedenen Enzymsystemen ermöglichen eine fundierte Betrachtung von möglichen Beeinflussungen von physiologischen Prozessen im Gesamtorganismus Rind durch GABA-haltiges Grundfutter. Insbesondere diese Enzymsysteme liegen im Focus des folgenden Abschnitts. -4- Schrifttum Abb. 2.2.3: Ineinandergreifen von Zitratzyklus und GABA-Shunt (PRELL 2003) 2.2.2.2 GAD (EC Nr. 4.1.1.15) Das vom Säugetier bis zum einzelligen Organismus vorkommende Enzym GlutamatDecarboxylase (GAD) katalysiert die Entstehung von GABA und CO2 aus L-Glutamat (ROBERTS u. FRANKEL 1951). Strukturell besteht das Enzym aus einer unterschiedlichen Anzahl von Subeinheiten (meist zwei oder sechs), deren Größe je nach untersuchter Spezies ebenfalls variiert. Untersuchungen zum Nachweis und zur strukturellen Charakterisierung von GAD in verschiedensten Spezies wurden von mehreren Arbeitsgruppen durchgeführt und sind in der folgenden Tabelle (Tab. 2.2.1) zusammengefasst. Insgesamt gelang der Enzymnachweis in einer großen Anzahl von Organismen, vom Bakterium bis zum Warmblüterorganismus. -5- Schrifttum Tab. 2.2.1: GAD-Nachweise in verschiedenen Spezies Reich Plantae Bacteria Animalia Art Mungobohne Kürbis Tomate Petunie Gerste Schaumkresse Tabak E. coli L. brevis Str. pneumoniae Neurospora crassa Bacillus Kakerlake Heuschrecke Biene Fliege Maus Ratte Schwein Mensch Katze Huhn Autor/Jahr KULKARNI u. SOHONIE 1956; BONE 1959 MATSUMOTO et al. 1986 GALLEGO et al. 1995 BAUM et al. 1993 INATOMI u. SLAUGHTER 1975 ZIK et al. 1998 YUN u. OH 1998 GALE 1946; FONDA 1985 UENO et al. 1997 GARCIA u. LOPEZ 1995 HAO u. SCHMIT 1991 FOERSTER u. FOERSTER 1973 BAXTER u. TORRALBA 1975 STAPELTON et al. 1989; EMSON et al. 1974 FOX u. LARSEN 1972 LANGCAKE u. CLEMENTS 1974 WU et al. 1976 BLINDERMANN et al. 1979; SPINK et al. 1987 DENNER et al. 1987 SPINK et al. 1985; CHOI u. CHURCHICH 1986 BLINDERMANN et al. 1978 CHU u. METZLER 1994 GOTTLIEB et al. 1986 Die Regulation der enzymatischen Reaktion wird durch die Substratverfügbarkeit von L-Glutamat, sowie des Cofaktors Pyridoxalphosphat und dem sauren pH-Optimum der GAD erreicht. Stark diskutiert wird in diesem Zusammenhang auch die Rolle freier Ca2+- und H+-Ionen. In vivo zeigte sich durch Vorgänge, die in einer höheren Substratverfügbarkeit resultierten, ein deutlicher Anstieg des GABA-Levels (STRAUSBAUCH u. FISCHER 1970). Zu diesen Vorgängen gehören verminderte Glutaminsynthese, reduzierte Proteinsynthese oder erhöhter Proteinabbau. Dies ist hier von besonderer Bedeutung, da bei Grassilagen mit auffälligen Reineiweißanteilen unter anderem auch eine Veränderung der Proteinfraktion durch gesteigerten Proteinabbau vermutet wurde. Der GAD-Spiegel selbst wird über Transkription oder post-transkriptionale Prozesse reguliert (JOLLES-BERGERET u. CHARTON 1971). Pflanzliche GAD In Pflanzen und Pflanzengeweben kommt GAD ubiquitär vor (SCHALES et al. 1946). GADAktivität wurde in den unterschiedlichsten Gewebetypen nachgewiesen, darunter auch Mesophyllzellen, Blütenblätter und embryonale Gewebe. Das pH-Optimum liegt bei pH 5,8 (SNEDDEN et al. 1996). Bemühungen um den Nachweis der GAD-Aktivität in pflanzlichen Geweben werden in der folgenden Tabelle (Tab. 2.2.2) zusammengestellt. -6- Schrifttum Tab. 2.2.2: Nachweis der GAD-Aktivität in verschiedenen Geweben pflanzlichen Ursprungs Gewebe Blatt Wurzeln Embryonales Gewebe Isolierte Mesophyllzellen Blütenblätter Knollen Fruchtfleisch Autor/Jahr STREETER u. THOMPSON 1972a WALLACE et al. 1984 TSHUSHIDA u. MURAI 1987 CHEN et al. 1994 SNEDDEN et al. 1996 BAUM et al. 1996 INATOMI u. SLAUGHTER 1975 REGIANNI et al. 1993 LING et al. 1994 CHEN et al. 1994 SNEDDEN et al. 1996 INATOMI u. SLAUGHTER 1975 GALLESCHI et al. 1977 SHELP u. TUIN 1994 SNEDDEN et al. 1996 SNEDDEN et al. 1992 BAUM et al. 1993 CHEN et al. 1994 SNEDDEN et al. 1996 SATYA NARAYAN u. NAIR 1985 MATSUMOTO et al. 1986 Strukturell besteht das Enzym aus 500 Aminosäureresten und verfügt über eine typische CaCalmodulin-Bindungsstelle am c-terminalen Ende als α-helikale Struktur mit positiv geladenen Aminosäureresten (YUAN u. VOGEL 1998). Maximale Enzymaktivität zeigt sich bei pH 5,8, nur geringe Aktivität hingegen bei pH 7 im Zytosol (STREETER u. THOMPSON 1972b; SATYA NARAYAN u. NAIR 1985; TSHUSHIDA u. MURAI 1987; SNEDDEN et al. 1992; JOHNSON et al. 1996). Physiologischerweise liegt der pH-Wert jedoch im neutralen Bereich von 7 – 7,5 (SATYA NARAYAN u. NAIR 1985; HAO u. SCHMIT 1991). Es liegt also die Vermutung nahe, dass erst durch Ansäuerung des Zytosols eine optimale Enzymaktivität erreicht wird und deshalb die Verfügbarkeit von H+-Ionen bei der Regulation eine Rolle spielt. Da sowohl die Ca2+-Gehalte im Zytosol, als auch der pH-Wert durch verschiedene abiotische und biotische Stressoren beeinflusst werden, liegt ein Zusammenhang zwischen Stress, Steigerung der Enzymaktivität und GABA-Akkumulation nahe. Bakterielle GAD Die Basisstruktur der bakteriellen GAD ähnelt der der pflanzlichen. Im Gegensatz dazu ist die GAD etwa von E. coli aufgrund ihrer fehlenden Calmodulin-Bindungsstelle nicht in der Lage, Ca-Calmodulin zu binden. Das Enzym besteht aus sechs identischen Untereinheiten (E. coli) mit je einem Pyridoxalphosphat an der aktiven Seite und zeigt optimale Aktivität bei pH- -7- Schrifttum Werten von 4,0 – 4,5 (O`LEARY et al. 1970; FONDA 1972). Obwohl L-Glutamat das bevorzugte Substrat darstellt, ist die GAD von E. coli auch in der Lage, γ-Methylen-DLGlutamat, Threo-β-hydroxy-DL-Glutamat und L-Homocysteinsulfinat zu verstoffwechseln (UENO 2000), jedoch kein D-Glutamat. Die physiologische Bedeutung des Enzyms ist bisher noch nicht geklärt. Es wird aber eine Beteiligung an der Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Werts unter sauren Bedingungen vermutet (GALE 1946). GAD bei Insekten Insbesondere im Nervengewebe von Insekten konnten hohe GAD-Aktivitäten nachgewiesen werden (CHEN u. WIDMER 1968; CHUDE et al. 1979; STAPLETON et al. 1989). Diese Feststellung lässt für GABA auf eine Funktion als Transmitter, ähnlich der Funtion beim Säugetier, schließen. GAD bei Säugetieren GAD konnte in den verschiedensten peripheren Geweben im Säugetierorganismus nachgewiesen werden; unter anderem auch in der Leber (ERDÖ u. KISS 1986). Das pHOptimum liegt im neutralen Bereich von pH 7 (WU et al. 1973). Zwei unterschiedliche GADIsoenzyme, die sich auch in ihrer funktionellen Rolle unterscheiden, wurden bisher entdeckt (ERLANDER et al. 1991; KARLSEN et al. 1991; BU et al. 1992). Besonders hohe Enzymaktivitäten wurden in β-Zellen des Pankreas gefunden (OKADA et al. 1976; GILON et al. 1991). In diesem Zusammenhang wird GABA zum einen als Signalmolekül, zum anderen als Regulator der Proteinbiosynthese oder als Energielieferant diskutiert. 2.2.2.3 GABA-T (EC Nr. 2.6.1.19) Die Transaminierung von GABA zu Succinylsemialdehyd (SSA) wird durch das pyridoxalphosphatabhängige Enzym GABA-Transaminase (GABA-T) katalysiert, dessen pHOptimum eher im alkalischen Bereich (pH 8 – 10) bei Temperaturen von 30 bis 55°C liegt (SHELP 1995). Somit kann davon ausgegangen werden, dass die im Pansen des Rindes üblichen Bedingungen zumindest keinen schädigenden Effekt auf dieses Enzym des GABAKatabolismus haben. Bei der Reaktion handelt es sich um einen reversiblen Vorgang, der sich im Mitochondrium abspielt (BREITKREUZ u. SHELP 1995; VAN CAUWENBERGHE et al. 2002). Es ist also ein Mechanismus notwendig, der den Übergang von GABA in die Mitochondrien ermöglicht. Einen Überblick über die Reaktion liefert die Abbildung 2.2.4. Bereits in den 60er Jahren wurden zwei unterschiedliche Arten von GABA-T identifiziert, die GABA-TK und die GABA-TP. Bei der GABA-TK dient α-Ketoglutarat als Aminoakzeptor und es entsteht Glutamat, bei der GABA-TP hingegen dient Pyruvat als Akzeptor der Aminogruppe und es entsteht Alanin (DIXON u. FOWDEN 1961; STREETER u. THOMPSON 1972b; WALLACE et al. 1984). -8- Schrifttum Abb. 2.2.4: Reaktionswege der GABA-Transaminase -9- Schrifttum Im Säugetierorganismus wurde bisher ausschließlich GABA-TK nachgewiesen, in Pflanzen hingegen kommen beide Formen vor (SHELP et al. 1999). Es wird vermutet, dass beide Formen auch unterschiedliche Funktionen im Pflanzenorganismus übernehmen. Bei in vitro-Untersuchungen wurde eine Präferenz für Pyruvat gegenüber α-Ketoglutarat beobachtet. Auch bei in vivo-Versuchen unter Sauerstoffmangel kam es zu einer massiven Anflutung von Alanin, was vermuten lässt, dass unter diesen Umständen ebenfalls vermehrt Pyruvat verstoffwechselt wird (BOWN u. SHELP 1989; MIYASHITA et al. 2007). Als Inhibitoren dieses Enzyms wurden auch die im Pansen vorkommenden Substanzen Butyrat und Propionat identifiziert. Bei Säugetieren wurde GABA-T im Zentralen Nervensystem und verschiedenen peripheren Geweben nachgewiesen, unter anderem auch in Thrombozyten. Ihre Enzymaktivität in peripheren Geweben ist mit Ausnahme der Leber jedoch wesentlich geringer, als im Gehirn (ERDÖ 1985). 2.2.2.4 SSADH (EC Nr. 1.2.1.24) Das mitochondrial entstandene SSA wird schließlich in einem letzten Schritt des GABAShunts zu Succinat oxidiert. Katalysiert wird diese irreversible Reaktion durch das Enzym Succinatsemialdehyddehydrogenase (SSADH). Dabei wird ein NAD verbraucht und ein NADH entsteht. Succinat wird schließlich in den Zitratzyklus eingeschleust. In Pflanzen liegt ihr pH-Optimum im leicht alkalischen Bereich von pH 9. In den meisten Organismen ist die SSADH in den Mitochondrien lokalisiert (BREITKREUZ u. SHELP 1995). Eine der wenigen Ausnahmen ist Hefe, bei der das Enzym zytosolischer Natur zu sein scheint (COLEMAN et al. 2001). Im Säugetierorganismus konnte das Enzym, wie auch die GABA-T, im Gehirn, in der Leber und anderen peripheren Geweben nachgewiesen werden (ERDÖ u. KISS 1986). Die Regulation der Enzymtätigkeit findet über verschiedene Mechanismen statt. Eine Akkumulation von NADH, ATP und ADP wirkt sich hemmend aus (BUSCH u. FROMM 1999). Flutet SSA im Mitochondrium an, kommt es zu einer Feedbackinhibition über GABAT (SHELP 1995; BUSCH u. FROMM 1999; VAN CAUWENBERGHE u. SHELP 1999). In Situationen, in denen eine Pflanze Stress ausgesetzt ist, verschieben sich die Verhältnisse zwischen NADH:NAD+ sowie ADP:ATP zugunsten von NADH bzw. ADP. Entsprechend spielt der GABA-Shunt besonders in Stresssituationen eine Rolle. Alternativ kann SSA auch durch eine Reduktion zu γ-Hydroxybutyrat (GHB) umgesetzt werden (BREITKREUZ et al. 2003). Vor allem scheint dieser Weg unter Bedingungen, wie Sauerstoff- oder Lichtmangel eine Rolle zu spielen (ALLAN et al. 2003; FAIT 2005), was auch durch eine Akkumulation von GHB in der Pflanze bei Überflutung und Sauerstoffmangel bewiesen wurde (BREITKREUZ et al. 2003). Im Gehirn ist es möglich, über eine GHB-Reduktase SSA zu generieren. Unter normalen Umständen macht GHB im Säugetiergehirn etwa 0,2 % der Menge von GABA als Ursprungssubstanz aus und wird durch neuronale Depolarisation freigesetzt (MAITRE et al. 1999). Die pharmakologische Wirkung besteht in einer Hemmung der Dopaminfreisetzung über spezifische GHB-Rezeptoren (SNEAD 2000; ANDRIAMAMPANDRY et al. 2003), evtl. aber auch über GABA-Rezeptoren, für die GHB einen schwachen Agonisten darstellt. - 10 - Schrifttum Im Säugetier scheint die Rolle von GHB als Neurotransmitter gesichert. Auch eine Beteiligung bei verschiedenen Krankheitsbildern (z.B. Ketose des Rindes) kann nicht ausgeschlossen werden, da es sich bei der GHB um eine Ketonkörpervorstufe handelt. Hingegen ist die Rolle im pflanzlichen Organismus weiterhin unklar. Gesicherte Forschungsergebnisse zeigen bisher einen Anstieg der Produktion als Antwort auf Sauerstoffmangel durch Überflutung der gesamten Pflanze (BREITKREUZ et al. 2003). 2.3 GABA im Pflanzenstoffwechsel Obwohl schon in den 40er Jahren GABA sowohl in niederen, als auch in höheren Pflanzen nachgewiesen wurde (SCHALES et al. 1946), war die Rolle im Pflanzenstoffwechsel lange unklar. Gesichert scheint, dass GABA eine wichtige Rolle in der Antwort der Pflanze auf biotischen und abiotischen Stress spielt (HILKER u. MEINERS 2010). Des Weiteren wird eine Beteiligung bei der zytoplasmatischen pH-Regulation, der Pflanzenentwicklung und -abwehr, der Osmoregulation, sowie eine Funktion als Stickstoffspeicher und Signalmolekül diskutiert. Das Vorkommen und die Gehalte von GABA im Pflanzenorganismus beeinflussen die Verfügbarkeit von GABA über pflanzliches Material für das Tier und damit letztendlich die mögliche Aufnahmemenge über das Futter. 2.3.1 Gehalte, Nachweise in Pflanzen Im Pflanzenreich ist GABA ubiquitär verbreitet und macht z.T. eine der Hauptkomponenten im Pool der freien Aminosäuren aus (CHUNG et al. 1992). Typischerweise sind ihre Gehalte im Pflanzengewebe gering und bewegen sich in Bereichen zwischen 0,03 – 3,6 µmol/g Frischmasse (MACPHERSON u. SLATER 1959; SELMAN u. COOPER 1978; RHODES et al. 1986; KISHINAMI 1987; FOUGERE et al. 1991). Ein GABA-Nachweis gelingt sowohl in intaktem Gewebe, als auch in isolierten Zellen und im Xylemsaft (CHUNG et al. 1992). Die folgende Tabelle (Tab. 2.3.1) soll einen Überblick über die GABA-Gehalte in den verschiedenen Pflanzenspezies geben. Tab. 2.3.1: GABA-Konzentration in verschiedenen Pflanzenspezies: Spezies Dt. Weidelgras Lolium perenne Grasmischungen Konzentration in µmol/g uS 0,37 – 0,73 Autor/Jahr SYNGE 1951a 0,07 – 0,14 MACPHERSON u. SLATER 1959 RHODES et al. 1986 KISHINAMI 1987 Tomate 0,55 Karotte, Mais, Erdnuss, 0,23 – 2,64 Raute, Soja, Tabak Luzerne 0,04 – 0,9 Medicago sativa uS = ursprüngliche Substanz FOUGERE et al. 1991 - 11 - Schrifttum 2.3.2 Ausgangsstoff Glutamat Bereits 1961 untersuchten DIXON u. FOWDEN den Metabolismus von GABA in Pflanzen und identifizierten als Ursprungssubstanz Glutamat, das mit Hilfe der GAD zu GABA decarboxyliert wird. Glutamat stellt neben Aspartat und Glutamin eine der drei Hauptaminosäuren in der Pflanze dar, die zusammen etwa 70 % der freien Aminosäuren ausmachen. Glutamat und Glutamin spielen eine Schlüsselrolle bei der Nitrat-Assimilation der Pflanze. Da Pflanzen über keinen Ausscheidungsmechanismus für anorganischen Stickstoff verfügen, muss dieser verstoffwechselt oder in ungefährlicher Form gespeichert werden. In den beiden Aminosäuren Glutamin und Glutamat wird Stickstoff zu sog. „sink tissues“ transportiert, in denen dieser dann gespeichert wird (TURGEON 1989). Benötigt wird Stickstoff insbesondere für die Proteinsynthese z.B. im Wachstum, Abwehrmechanismen, Reproduktion (CORRUZI u. LAST 2000). Bestimmte Umweltsituationen können zu einem Anstieg von Glutamat und Glutamin führen, dazu gehören gesteigerter Proteinabbau, Hemmung der Glutaminsynthese oder Glutamin- bzw. Glutamat-Zusatz (SNEDDEN u. FROMM 1999). Glutamat entsteht durch die Übertragung der Aminogruppe von Glutamin auf α-Ketoglutarat aus dem Zitratzyklus, das das Kohlenstoffgerüst liefert. Katalysiert wird diese Reaktion durch das Enzym Glutamat-Synthase (EC Nr. 1.4.1.13, syn. GOGAT), das in den Plastiden lokalisiert ist (COSCHIGANO et al. 1998). Aus einem Mol Glutamin entstehen dabei zwei Mol Glutamat. Ein weiteres Enzym, die Glutamin-Synthethase (EC Nr. 2.7.7.42, GS), katalysiert die ATP-abhängige Aminierung von Glutamat zu Glutamin. Beide Reaktionen sind voneinander abhängig und bilden zusammen den GS/GOGAT-Zyklus zur Assimilation von Stickstoff. Die Substrate fungieren dabei als Inhibitoren des jeweils anderen Reaktionsweges (negativer Feedbackmechanismus). Ein weiteres Enzym, das im Zusammenhang mit Glutamat Erwähnung finden sollte, ist die Glutamat-Dehydrogenase (GDH, EC Nr. 1.4.1.2). Sie hat eine Sonderstellung innerhalb der Enzyme inne, da sie sowohl die Biosynthese, als auch den Katabolismus von Glutamat katalysiert. Neben Transport- und Speicherungsform von Stickstoff dient Glutamat als Ursprungssubstanz für die Synthese verschiedener Aminosäuren, wie Prolin, Glutamin, Histidin sowie Arginin und spielt damit auch für die Proteinbiosynthese eine entscheidende Rolle. Zugleich stellt Glutamat das Ausgangssubstrat für die Synthese von Chlorophyllen und Cytochromen dar (HELD u. PIECHULLA 2008). Eine weitere Möglichkeit der Umsetzung von Glutamat ist die Synthese von GABA im Zytosol. Auf die Bedeutung von GABA für physiologische und pathologische Vorgänge in der Pflanze wird im weiteren Verlauf dieses Abschnitts näher eingegangen. Der GABA-Abbau findet über eine Desaminierung durch pflanzeneigene Transaminasen statt. DIXON u. FOWDEN (1961) postulierten aufgrund der Lokalisation der Enzyme eine Regulation über die Balance zwischen der intrazellulären Transportrate von Glutamat und GABA selbst. Da Glutamat in den Mitochondrien synthetisiert wird (BONE 1959), ist es notwendig, das Substrat ins Zytosol zu transportieren, wo GAD lokalisiert ist. Ebenso muss GABA selbst wieder in die Mitochondrien zurück transportiert werden, um hier durch Transaminasen zu Succinatsemialdehyd (SSA) abgebaut werden zu können. - 12 - Schrifttum Die Lokalisationen der Reaktionsschritte werden durch Abbildung 2.3.1 dargestellt. Abb. 2.3.1: 2.3.3 GABA-Katabolismus in der Pflanzenzelle GABA-Akkumulation als Antwort auf biotische und abiotische Stressoren Zur Akkumulation von GABA in Pflanzen, die verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wurden liegt eine Reihe von Literatur vor. Tabelle 2.3.2 soll als Überblick über die vorhandenen Forschungsergebnisse dienen. - 13 - Schrifttum Tab. 2.3.2: GABA-Gehalte in Pflanzenzellen unter Stressbedingungen Stressor Spezies GABAGehalte Dunkelheit Gemeiner Schwimmfarn 4,8 ± 0,4 bis Salvinia natans, 7,6 ± 0,5 µmol/g TM Großer Algenfarn Azolla filiculoides (Blätter) Tomate 0,8 – 3,6 µmol/g uS Sauerstoffmangel Anoxie Ansäuerung des Zytosols Garten Rettich Raphanus sativus - Grüner Tee, Sojabohne - Schaumkresse Arabidopsis Tee (Blätter) Reis (Wurzeln) Reis (Wurzeln) - Schneckenklee Medicago truncatula Reis - Spargel (Mesophyllzellen) Karottenzellsuspension Wasserstress Tomate (Blätter, Wurzeln) 1,46 – 2,87 µmol/g uS 2,68 ± 0,11 µmol/g uS 6,15 ± 0,29 µmol/g uS 1,15 – 34,83 nmol/106 Zellen 3,0 ± 0,65 bis 7,21± 0,38 µmol/g uS - Bemerkung/ Steigerungsrate 2fache Steigerung der GABA-Synthese Autor/Jahr 2facher Anstieg der GABASynthese 27facher Anstieg, simultaner Anstieg von GABA und Alanin gleichzeitig Verlust von Glutamat* gleichzeitig Verlust von Glutamat* 5,6fache Steigerung 5facher Anstieg 2facher Anstieg, Aktivierung der Ca-CaM abhängigen GAD gleichzeitig Verlust von Glutamat* 11facher Anstieg, gleichzeitig Verlust von Glutamat 1,2 bis 9,5facher Anstieg (je nach Behandlung) 2facher Anstieg SELMAN u. COOPER 1978 - - 14 - LÄHDESMÄKI 1968 STREETER u. THOMPSON 1972a ALLAN et al. 2003 BREITKREUZ et al. 2003 TSHUSHIDA u. MURAI 1987 REGGIANI et al. 1988 AURISANO et al. 1995a RICOULT et al. 2005 KATO-NOGUCHI u. OHASHI 2006 CRAWFORT et al. 1994 CARROLL et al. 1994 BOLARIN et al. 1995 Schrifttum Fortsetzung Tab. 2.3.2: GABA-Gehalte in Pflanzenzellen unter Stressbedingungen Wasserstress Luzerne Gleichzeitiger Verlust von GIROUSSE et al. 1996 Glutamat* Kälte Spargel (Mesophylzellen) vermittelt durch CHOLEWA et al. 1997 Calciumanstieg im Zytosol Gerste, Weizen 0,385 ± 0,028 bis 58facher Anstieg, gleichzeitig MAZZUCOTELLI et al. 2006 0,688 ± 0,057 µmol/g uS Verlust von Glutamat - Glutamat Schaumkresse Arabidopsis Augenbohne Vigna ungulculata Spargel Ammoniak Mechanische Verletzung Mechanische Verletzung Dunkelheit Phytohormone Insektenbefall Osmotischer Stress - Hitzeschock KAPLAN et al. 2007 0,379 – 3,242 µmol/g uS gleichzeitig Verlust von Glutamat* 64facher Anstieg in 2 h - Steigert GABA-Synthese * Reis 5,01 – 34,01 µmol/g uS Sojabohne (Blätter) Sojabohne (Blätter) 0,83 ± 0,06 bis 2,15 ± 0,11 µmol/g uS 0,14 – 1,94 µmol/g uS 14facher Anstieg, Steigert GABA-Synthese Reaktion innerhalb von 30 Sekunden 27facher Anstieg Innerhalb von 5 Min 30fache Steigerung CHUNG et al 1992; SNEDDEN et al. 1992; CHOLEWA et al. 1997 KISHINAMI 1987 Wurzelkulturen - - FORD et al. 1996 Tabakblätter Nicotiana tabacum Weizen 0,042 ± 0,011 bis 1,123 ± 0,123 µmol/g uS - 94facher Anstieg, ohne Beschädigung der Pflanze gleichzeitig Verlust von Glutamat* gleichzeitig Verlust von Glutamat* BOWN et al. 2002 Schaumkresse Arabidopsis * keine Steigerungsrate angegeben - - 15 - MAYER et al. 1990 RAMPUTH u. BOWN 1996 WALLACE et al. 1984 BARTYZEL et al. 2003 FAIT et al. 2005 Schrifttum Durch Stress finden zwei Schlüsselreaktionen in der Pflanze statt: zum einen kommt es zur Anreicherung von Ca2+-Ionen im Zytosol, zum anderen zur Ansäuerung. Beides sind Schlüsselereignisse bei der GABA-Synthese, da erst durch die Bindung von Ca-CaM an das Enzym GAD eine Konformationsänderung ausgelöst wird, die letztendlich zur Aktivierung führt. Die Aktivität wiederum wird über das pH-Optimum reguliert, das mit pH 5,8 deutlich im sauren Bereich liegt. Jede Ansäuerung im Zytoplasma führt somit zur Steigerung der GABA-Synthese und zur Verringerung der Transaminierung, woraus eine GABAAkkumulation resultiert. Eine Erklärung für die Ansäuerung könnte die Anhäufung von Laktat unter Stressbedingungen sein (ROBERTS et al. 1984, 1985). Untersuchungen an Maispflanzen, die unterschiedlichen Stressoren ausgesetzt wurden, haben gezeigt, dass die Freisetzung von Ca2+-Ionen hauptsächlich aus den Mitochondrien erfolgt (SUBBAIAH et al. 1998). Obwohl GABA bisher in jedem untersuchten Pflanzengewebe nachgewiesen werden konnte, postulierten WALLACE et al. bereits 1984 die Möglichkeit der Sequestrierung von GABA in Organellen, was auch durch spätere Untersuchungen unterstützt wurde. Da Analysen von CHUNG et al. (1992) eine Häufung von GABA im Zytosol (50 % der gesamten nachgewiesenen Menge) ergaben, folgerten sie daraus, dass GABA entweder sequestriert in Organellen vorliegt, oder der GABA-Efflux limitiert wird. Der physiologischen Bedeutung von GABA für die Pflanze und insbesondere auch dem GABA-Shunt widmet sich der folgende Abschnitt. 2.3.4 Wirkung von GABA und Aufgaben des GABA-Shunts So viele Erkenntnisse in der Vergangenheit zur Bedeutung von GABA für den Säugetierorganismus gewonnen wurden, so unsicher bleibt die Rolle in der Pflanze. Aufgrund der fehlenden gesicherten Forschungsergebnisse, sollen im Folgenden die wichtigsten Hypothesen zur Funktion von GABA und dem GABA-Shunt in Pflanzen dargestellt werden. pH-Regulation Diverse Studien diskutieren die Rolle von GABA bei der Kurzzeit-Regulation des intrazellulären pH-Werts (REGGIANI et al. 1988; MENEGUS et al. 1989; SNEDDEN et al. 1992; CRAWFORD et al. 1994). In Bakterien spielt der GABA-Shunt eine Rolle bei der Säureresistenz (CASTANIECORNET et al. 1999); wird E. coli einem sauren Medium ausgesetzt, wird GAD aktiviert. Glutamat wird decarboxiliert und ein Proton verbraucht. Dabei entstehende GABA wird schließlich aus den Zellen transportiert. Da dieses Enzym in Pflanzen durch saure pH-Werte aktiviert wird (SNEDDEN et al. 1996) und GABA als Antwort auf Ansäuerung des Zytosols anflutet (SHELP et al. 1999), ist es durchaus denkbar, dass der GABA-Shunt eine Rolle in der pH-Regulation im Zytosol spielt. Umgehung des Zitratzyklus α-Ketoglutarat aus dem Kohlenstoffgerüst von Glutamat tritt in den Zitratzyklus ein und wird durch α-Ketoglutarat-Dehydrogenase zu Succinyl-CoA decarboxyliert, dann weiter zu Succinat abgebaut, katalysiert durch die Succinyl-CoA-Synthetase. Reguliert wird diese - 16 - Schrifttum Reaktionskette durch die Substratverfügbarkeit. In Stresssituationen, insbesondere bei Sauerstoffstress, kann es zur Schädigung der beiden beteiligten Enzyme kommen. Der GABA-Shunt bietet eine Möglichkeit, diese Enzymkette zu umgehen und dennoch Succinat zu produzieren. Dies bestätigten auch Untersuchungen von POPOVA et al. (1995) an Weizen und Maispflanzen, bei denen eine Hemmung des mitochondrialen Elektronentransports zu einer erhöhten Umsetzung von α-Ketoglutarat durch den GABA-Shunt führte. Insbesondere durch Stressfaktoren wird dieser Stoffwechselweg gefördert. Es wird angenommen, dass im Stress produzierte GABA zum Teil nach der Stresssituation als Substrat dem Zitratzyklus zugeführt wird und somit als Kohlenstoffquelle dient (SNEDDEN u. FROMM 1999). Der Nachteil dieser Reaktion liegt in der Ausbeute: der Zitratzyklus liefert ein NADH und ein ATP, wohingegen der GABA-Shunt kein ATP liefert und somit einen energetisch ungünstigeren Weg darstellt (Abb. 2.2.3). Schutz gegen oxidativen Stress In Untersuchungen von BOUCHÉ et al. (2003) an Arabidopsis-Mutanten, die nicht in der Lage waren SSADH zu bilden, wurde festgestellt, dass diese Pflanzen wesentlich empfindlicher auf Umweltstress reagieren. Insbesondere UV-Licht und Hitze führten zu nekrotischen Läsionen der Blätter und erhöhtem Untergang der Zellen. BOUCHE et al. (2003) nahmen an, dass diese Mutanten nicht in der Lage sind H2O2 zu beseitigen. Im letzten Schritt des GABA-Shunts, werden sowohl NADH als auch Succinat der Atmungskette bereitgestellt. Damit werden wesentliche Schritte des Zitratzyklus umgangen. Die Enzyme, die diese Zwischenschritte katalysieren, werden unter oxidativem Stress abgebaut (SWEETLOVE et al. 2002). COLEMAN et al. (2001) vermuten, dass der Abbau von GABA und die damit verbundene Umgehung dieser Schritte, die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffzwischenprodukten unter oxidativem Stress verhindern. Insektenabwehr Durch mechanische Stimulation oder Verletzung der Pflanze erhöhen sich die GABA-Gehalte (RAMPUTH u. BOWN 1996) und sogar Insekten, die ohne jede Verletzung der Pflanze über ein Blatt krabbeln verursachen einen Anstieg (BOWN et al. 2002; HILKER u. MEINERS 2010). Daher wird ein Zusammenhang zwischen der Akkumulation von GABA und der Insektenabwehr vermutet. Es gibt Anzeichen dafür, dass durch Insekten aufgenommene GABA die normale Entwicklung von Insekten beeinflusst (SHELP et al. 1999; SNEDDEN u. FROMM 1999; HILKER u. MEINERS 2010). Tabak-Mutanten mit erhöhten GABAGehalten scheinen eine erhöhte Resistenz gegenüber Insekten zu zeigen (MCLEAN 2003; MACGREGOR et al. 2003). Kohlenstoff-Stickstoff-Balance Der Großteil des pflanzlichen anorganischen Stickstoffs liegt in Form von Glutamat vor, das wiederum den Ausgangspunkt für die Synthese der meisten Aminosäuren und auch von GABA darstellt. Die Produktion von GABA ist eng verbunden mit der Substratverfügbarkeit und der GAD-Aktivität. Umstände, die hohe Gehalte von Glutamat verursachen, wie forcierter Proteinabbau, Hemmung von Glutaminsynthese oder -abbau, führen häufig zur GABA-Akkumulation (WALKER et al. 1984). - 17 - Schrifttum Hohe GABA-Gehalte wurden in verschiedenen Pflanzengeweben nachgewiesen und die Konzentration steigt drastisch als Antwort auf unterschiedliche Stressoren (SHELP et al. 1999; SNEDDEN u. FROMM 1999). Ferner ist ein Wachstum von Arabidopsis auf einem Medium möglich, das als einzige Stickstoffquelle GABA enthält (BREITKREUZ et al. 1999). Demzufolge ist GABA am Stickstoffmetabolismus und eventuell auch an der Speicherung oder dem Transport von Stickstoff beteiligt. Über den GABA-Shunt ist es möglich, Kohlenstoff aus Glutamat aufzunehmen, in den Zitratzyklus einzuschleusen und GABA als nichttoxische Stickstoffquelle zu verwenden. Pflanzen können auf verminderte Stickstoffgehalte reagieren und daraufhin die Aufnahme und den Abbau adäquat regulieren (FORDE 2002). Vermutlich spielen verschiedene Signalmoleküle bei diesem Vorgang eine Rolle; diskutiert wird neben Glutamin, Zuckern oder anderen Aminosäuren auch GABA. Osmoregulation Forschungsergebnisse zeigen, dass Prolintransporter in Tomatenpflanzen und Arabidopsis auch in der Lage sind GABA zu transportieren (SCHWACKE et al. 1999); z.T. induziert durch Wasser- oder Salzstress (RENTSCH et al. 1996). Diese Prolin-GABA-Transporter können organische Osmolyte transportieren, die auch als „compatible solutes“ bezeichnet werden. Die hochlöslichen Osmolyte können im Zytoplasma akkumulieren und in hohen Konzentrationen vorliegen, ohne zelluläre Aktivitäten zu stören. Im Gegenteil, Untersuchungen weisen darauf hin, dass sie sogar eine Schutzfunktion innehaben, wenn die Pflanze einem Wasserdefizit ausgesetzt ist (BRAY et al. 2000). Vermutlich tragen diese Substanzen dazu bei, die Ionenkonzentrationen in Zellorganellen und dem Zytosol und damit den Turgor der Pflanzenzelle konstant zu halten. Signalmolekül In Tieren ist die Rolle von GABA als „major inhibitory neurotransmitter“ gesichert. Ebenso könnte GABA aber auch ein Signalmolekül in Pflanzen sein (KINNERSLEY u. TURANO 2000; BOUCHÉ 2003). Möglicherweise gibt es eigene Rezeptoren für GABA in Pflanzen, oder GABA ist in der Lage an Glutamat-Rezeptoren zu binden (LACOMBE et al. 2001). Im tierischen Organismus wirkt GABA über die Bindung an GABAA-, GABAB- oder GABAC-Rezeptoren im Gehirn auf Ionenkanäle, die durch Öffnung oder Schluss zu einer Verschiebung der Ionenzusammensetzung führen. Da Rezeptoren auch in niederen Organismen festgestellt wurden (RICHMOND u. JORGENSEN 1999), scheinen diese wesentlich weiter verbreitet zu sein, als ursprünglich angenommen. Obwohl bisher keine homologen Gene für GABA-Rezeptoren in Pflanzen nachgewiesen werden konnten, gibt es durchaus Ähnlichkeiten in einzelnen Genabschnitten, die aber weiterer Untersuchungen bedürfen (LACOMBE et al. 2001). Vermutlich stehen diese Gene im Zusammenhang mit dem Transport von Kationen, um den Eintritt von Ca2+ in die Pflanzenzelle zu vermitteln (DAVENPORT 2002; KANG u. TURANO 2003). Der Zusammenhang zwischen intrazellulärem Calciumlevel und der Antwort auf Stress wurde bereits im vorigen Abschnitt besprochen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass gesicherte Erkenntnisse für eine Beteiligung der GABA an der pflanzlichen Stressantwort bestehen (siehe auch Tab. 2.3.2). Unklar ist jedoch - 18 - Schrifttum auch weiterhin die genaue Bedeutung des GABA-Shunts und der Akkumulation von GABA in Pflanzenzellen durch unterschiedlichste Behandlungen, so dass auch in Zukunft auf diesem Gebiet Forschungen notwendig sind. Es ist jedoch anzunehmen, dass die Bedeutung von GABA für die Pflanze wesentlich höher ist, als bisher vermutet. 2.4 Vorkommen von GABA in Futtermitteln Bereits in den frühen 50er Jahren identifizierten verschiedene Arbeitsgruppen GABA als normale Hauptkomponente der NPN-Fraktion im Gewebe höherer Pflanzen (WESTALL 1950a; STEWARD et al. 1951; SYNGE 1951a). Insbesondere von Bedeutung war hierbei die Entwicklung neuer chromatographischer Nachweismethoden, die erst eine Detektion der hochlöslichen GABA ermöglichten. Die Existenz in Pflanzen impliziert, dass GABA auch in den daraus gewonnenen Futtermitteln in einer z.T. nicht unerheblichen Menge vorkommt und von Herbivoren aufgenommen wird. Man vermutete, dass in der Pflanze durch die irreversible Decarboxylierung von Glutamat durch mikrobielle Enzyme GABA entsteht. Diese Annahme wurde jedoch im Laufe der Jahre widerlegt, da GABA ebenso in Mikroorganismen-freiem Material gebildet wird, und somit pflanzliche Enzyme die Hauptrolle spielen (OHSHIMA et al. 1979). Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen dem Proteinabbau und der Akkumulation von GABA in der Silage ergeben sich aus Beobachtungen von KEMBLE (1956), der feststellte, dass die Enzymaktivität im Pflanzenmaterial innerhalb von 2 – 5 Tagen nach der Silierung auf nicht-messbare Bereiche abfällt. OHSHIMA u. MCDONALD (1978) ermittelten durch C14-Untersuchungen eine GABA-Syntheserate aus Glutamat von 80 % innerhalb der ersten vier Stunden nach Einsilierung des Materials. Im Laufe der Jahre durchgeführte Untersuchungen zeigten signifikante Unterschiede im GABA-Gehalt der untersuchten Futtermittel, abhängig von der Spezies, dem Wachstumsstadium, äußeren Einflüssen und der Art der Konservierung. Von besonderer Bedeutung scheint hierbei das Ausmaß der abgelaufenen Proteolyse zu sein (OHSHIMA 1979). 2.4.1 GABA-Gehalte verschiedener Futtermittel Durch verbesserte Labormethoden war es möglich, auch GABA-Gehalte in bearbeitetem Material, wie Silage oder Heu, zu erfassen und zu einem Vergleich mit Frischfuttergehalten heranzuziehen. Dabei zeigte sich durchweg eine Erhöhung der GABA-Konzentration bei Silierung. Die Konzentrationen in frischem Grünfutter sind gering, variieren jedoch mit unterschiedlichen Umweltfaktoren. So fanden BOND et al. (1984) bei Untersuchungen von Rohrschwingel-Gräsern (Festuca arundinacea) Werte von 0,8 µg/mg bis hin zu 13 µg/mg TS, letztere bei Gräsern, die mit dem Pilz Epichloe typhina infiziert wurden. Doch auch der Anteil der NPN-Fraktion, zu der auch GABA gehört, beeinflusst die GABA-Gehalte im Pflanzenmaterial und lässt sich über das Stickstoffangebot regulieren. WINTERS et al. führten 2004 Untersuchungen an Weißklee (Trifolium repens) im frühen Blütestadium durch, wobei die Stickstoffdüngung jeweils variiert wurde. Es zeigte sich, dass GABA-Gehalte von 9,6 – 11 mmol/kg TS in frischem Material und Konzentrationen von 17,4 – 37,9 mmol/kg TS in der entsprechenden Silage erreicht wurden. Diese Ergebnisse decken sich mit denen von MACPHERSON u. SLATER (1959) sowie OHSHIMA et al. (1979). Bei Letzteren wurden - 19 - Schrifttum die GABA-Werte in frischem Material von Luzerne (Medicago sativa), Weidelgras (Lolium multiflorum) der jeweiligen Silage gegenübergestellt. Nach der Silierung waren die Gehalte 9fach (Luzerne) bzw. 10fach (Weidelgras) erhöht. MACPHERSON u. SLATER (1959) untersuchten den Effekt der Silierung bei zwei verschiedenen Gräsern (Weidelgrasmischung erster Schnitt bzw. Grasmischung ohne Weidelgras später Schnitt) und beobachteten eine Steigerung um das 18 (später Schnitt, 1 Wo. nach Einsilierung) bzw. das 23fache (9 h nach Einsilierung). Untersuchungen von Mikroorganismen-freiem Gras zeigten hier ähnliche Ergebnisse, so dass davon auszugehen ist, dass die Bildung durch pflanzliche Enzyme katabolisiert wird. Eine mögliche Erklärung für den deutlichen Anstieg von GABA durch den Siliervorgang ist die fortschreitende Proteolyse, bei der die nötigen Substrate zur GABA-Synthese, Glutamin bzw. Glutamat, entstehen. In diesem Zusammenhang sollte bedacht werden, dass es sich bei den geschnittenen Pflanzen um noch lebende Organismen handelt, die durchaus in der Lage sind, als Stressantwort innerhalb der ersten Stunden nach dem Schnitt GABA in den Zellen zu akkumulieren, solange entsprechende Substrate zur Verfügung stehen und die Enzymaktivität im Milieu gewährleistet ist. Die folgende Tabelle (Tab. 2.4.1) gibt einen Überblick zu den gemessenen GABA-Gehalten. Tab. 2.4.1: Gegenüberstellung der GABA-Gehalte in Futtermitteln (frisch vs. Siliert) Autor/Jahr SYNGE 1951a MACPHERSON u. SLATER 1959 HUGHES 1969 BARRY et al. 1978b OHSHIMA et al. 1979 BOND et al. 1984 DAWSON u. MAYNE 1996, 1997 WINTERS et al. 2004 TS = Trockensubstanz Frischfutter 0,45 mg/ml Pflanzenpesssaft 0,1 – 0,2 % total N Silage - 0,76 – 0,86 g Aminosäuren N/ 100g total N 0,71 – 0,66 g/16g N 0,8 – 13,0 µg/mg TS - 8 – 12 g/kg TS 3,46 – 4,69 g Aminosäuren N/ 100g total N 6,48 – 6,61 g/16g N 0,07 – 3,15 g/kg TS 9,6 – 11 mmol/kg TS N = Stickstoff 17,4 – 37,8 mmol/kg TS - = nicht untersucht > 2 % total N Einen Hinweis aus der Praxis auf den Zusammenhang zwischen GABA-Konzentrationen in der Silage und der Gehalte an Rohprotein bzw. Reineiweiß liefern auch die umfangreichen Analyseergebnisse von Grassilagen der Firma Evonik aus den Jahren 2000 und 2001 (EICKEN2). Die wesentlichen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (Tab. 2.4.2) wiedergegeben. 2 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn K. Eicken, Hannover am 23. Februar 2010 - 20 - Schrifttum Tab. 2.4.2: Analysenergebnisse von 96 Grassilagen aus Norddeutschland (2000 u. 2001) TS g/kg Rp g/kg TS RE in % vom Rp GABA g/kg TS Mittelwert 454 202 48,2 5,87 Grassilagen 1. Schnitt (n=96) Median MAX MIN Standardabweichung 462 638 232 103 205 282 141 33,1 46,0 73,0 20,0 8,80 5,63 11,9 1,61 2,18 Die folgenden Graphen (Abb. 2.4.1 – 2.4.3) stellen die Korrelationen zwischen GABAGehalten und verschiedenen weiteren Charakteristika der Silagen jeweils als Punktewolke dar, Trendlinien wurden zur besseren Übersicht eingefügt. Bei genauerer Betrachtung der Graphen zeigen sich Korrelationen zwischen den Gehalten an GABA und Trockenmasse, dem Rohprotein- und Reineiweißanteil. Diese Daten deuten auf drei mögliche Schlussfolgerungen hin: 1. Ein höherer Trockenmassegehalt hat einen hemmenden Einfluss auf die Bildung von GABA. Möglicherweise verringert das limitierte Wasserangebot die Aktivität der Proteasen, die die Substrate zur GABA-Synthese bereitstellen (Abb. 2.4.1). 2. Ein höherer Rohproteingehalt ist positiv mit der GABA-Menge korreliert. Wahrscheinlich führt ein höherer Proteingehalt im Zuge der Proteolyse zu einer größeren Menge an gebildeten Substraten für die Synthese von GABA, insbesondere Glutamin und Glutamat (Abb. 2.4.2). 3. Eine deutlich negative Korrelation besteht zwischen dem prozentualen Anteil des Reineiweißes am Rohprotein und der GABA-Menge. Der Reineiweißanteil lässt Rückschlüsse auf das Ausmaß der Proteolyse zu, da mit fortschreitendem Proteinabbau weniger Reineiweiß und ein größerer Anteil an nicht löslichem Protein entsteht. Weniger Reineiweiß bedeutet mehr Proteolyse und damit mehr freie AS, die zur GABA-Bildung herangezogen werden können (Abb. 2.4.3). - 21 - Schrifttum TS (g/kg uS) Abb. 2.4.1: GABA-Gehalte in g/kg TS in Abhängigkeit vom Trockensubstanzgehalt verschiedener Grassilagen (n=96) aus den Jahren 2000 und 2001 Abb. 2.4.2: GABA-Gehalte in g/kg TS in Abhängigkeit vom Rohproteingehalt verschiedener Grassilagen (n=96) aus den Jahren 2000 und 2001 - 22 - Schrifttum r²=0,35 Abb. 2.4.3: GABA-Gehalte in g/kg TS in Abhängigkeit vom Reineiweißanteil (in % v. Rp) verschiedener Grassilagen (n=96) aus den Jahren 2000 und 2001, r=0,59 Hier wurde eine etwas modifizierte Darstellung zur Verdeutlichung der Zusammenhänge gewählt und zwei Orientierungslinien eingefügt. Die horizontale Linie bei 5 g GABA/kg TS steht für den von uns postulierten GABA-Grenzwert „5“, die senkrechte Linie bei 50 % Reineiweiß beschreibt die Grenze, unterhalb derer vermehrt klinische Symptome durch die Verfütterung der Silagen auftraten. Durch diese Darstellungsform ergibt sich eine 4-FelderTafel, die es erlaubt, anhand eines GABA-Wertes den Reineiweißanteil einer Silage, definiert durch den Parameter „Reineiweiß in % vom Rohprotein“, abzuschätzen. Weiterhin ist es möglich damit indirekt auf das Risikopotenzial der Grassilage für die Verursachung der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ zu schließen (s. auch Kap. 5.5.5). Die Schätzung des Reineiweißanteils durch den bekannten GABA-Wert kann hier von großem Nutzen sein, da die Methoden zur Reineiweißbestimmung sehr störanfällig, zeit- und kostenintensiv sind. Wenn es hier möglich ist, durch einen Schnelltest GABA in der Silage zu Quantifizieren, könnte dies eine kostengünstige und praktikable Lösung für die Praxis sein. Auf diesem Gebiet wird zurzeit weiter geforscht, um insbesondere auch die Korrelation zwischen GABAGehalt und Reineiweißanteil zu sichern. 2.4.2 Proteinabbau In zahlreichen Untersuchungen zeigte sich, dass die Bildung von GABA in hohem Maße sowohl von der Zusammensetzung des originären Pflanzenmaterials, als auch von der Behandlung abhängt. Eine besondere Rolle spielen hierbei alle Vorgänge, die in der Lage sind, die Proteolyse zu beeinflussen, da diese die Substrate zur GABA-Synthese liefert. Der Abbau von Proteinen, Aminosäuren und anderen stickstoffhaltigen Bestandteilen, besonders - 23 - Schrifttum während der Silierung, ist darüber hinaus auch von größter Wichtigkeit für die Verwertung des Futters durch den Wiederkäuer (OHSHIMA u. MCDONALD 1978). 2.4.2.1 Proteingehalte von Pflanzen Schon im originären Pflanzenmaterial gibt es große Unterschiede bezüglich des Proteingehalts und der Proteinzusammensetzung. Hierbei ist es notwendig, auf die Unterschiede zwischen Rohprotein und Reineiweiß hinzuweisen. Bei der Ermittlung des Rohproteingehalts wird pauschal der gemessene Stickstoff mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Hingegen umfasst der Begriff Reineiweiß lediglich die fällbare Proteinfraktion. Dem besseren Verständnis dient die folgende Abbildung (Abb. 2.4.4). Rohprotein A A Bezeichnung A B1 B2 B3 C Reineiweiß B1 B2 B3 Proteinfraktion NPN (Nicht-Protein-Stickstoff) inkl. GABA pufferlösliches Reineiweiß pufferunlösliches Reineiweiß zellwandgebundenes lösliches Reineiweiß zellwandgebundenes unlösliches Reineiweiß C Enzymatischer Abbau schnell variabel variabel bis langsam unverdaulich Abb. 2.4.4: Darstellung der Rohproteinfraktionen in Futtermitteln (nach LICITRA et al. 1996) Im Mittel entfallen in der Grassilage nur etwa 64 % des Rohproteins auf das Reineiweiß; die Differenz machen freie Aminosäuren, Amine und einfache Peptide der NPN-Fraktion aus (COENEN et al. 1994). Daraus folgt, dass ein höherer Reineiweißanteil vom Rohprotein auf eine höhere Proteinqualität des Futtermittels schließen lässt. In Heu werden Werte von 70 – 80 % erreicht oder sogar überschritten. Untersucher des Instituts für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover ermittelten in Grassilagen durchschnittliche Rohproteingehalte von 191 ± 33 g/kg TS und Reineiweißgehalte von 105 ± 33 g/kg TS (COENEN 2004). Ein niedriger Reineiweißanteil geht mit Verlusten an „intakten“ Proteinen und einem Anstieg der nicht fällbaren Proteinfraktion und freien Aminosäuren einher (GRESNER 2011), letzteres wird im Zusammenhang mit der Akzeptanz (Siliertes < Getrocknetes, DULPHY u. VAN OS 1996), der Synchronizität der ruminalen Abbau- und Synthesevorgänge sowie negativen Auswirkungen auf mikrobielle Systeme und Schleimhaut diskutiert. In Grassilagen korreliert die Summe der Aminosäuren außerdem deutlich negativ mit dem Reineiweißanteil (COENEN et al. 1994). Hieraus ergibt sich, dass die Proteinqualität einer Silage allein durch den Rohproteingehalt nur unzureichend bewertet werden kann. - 24 - Schrifttum Frisches Gras verfügt zumeist über eine typische einheitliche Zusammensetzung und enthält mehr als 80 % Reineiweiß und weniger als 5 % freie Aminosäuren (KINGSTON-SMITH et al. 2008). Der lösliche Proteingehalt ändert sich in Abhängigkeit von der Wachstumsphase: Gehalte von 14,1 mg/g uS in juvenilem Gras, von 11,4 mg/g uS in maturem Gras und 5,6 mg/g uS (grün) bzw. 3,0 mg/g uS (gelb) in seneszentem Gras wurden ermittelt (BEHA et al. 2002), wobei der sinkende Proteingehalt auf eine steigende Aktivität der Pflanzenproteasen zurückgeführt wird. Des Weiteren enthalten Leguminosen im Allgemeinen mehr Protein als Gräser. Auch eine intensivere Belichtung führt über gesteigerte Photosyntheseraten zu einem Anstieg des Proteingehalts in der Pflanze (VAN SOEST et al. 1978). Auf abiotischen Stress reagiert die Pflanze mit einer Verringerung der Proteinsynthese (MADHAVA RAO et al. 2006), DNA-Fragmentierung, Autolyse der Proteine und Proteolyse (KINGSTON-SMITH et al. 2008) die insgesamt den Proteingehalt verringern. Die dabei entstehenden Proteinabbauprodukte, u.a. GABA und Biogene Amine, stehen häufig im Verdacht, nicht nur die Futtermittelqualität, sondern auch die Futteraufnahme negativ zu beeinflussen. 2.4.2.2 Proteolyse In Silagen machen freie Aminosäuren typischerweise mehr als 25 % des Gesamtstickstoffgehalts aus (KINGSTON-SMITH et al. 2008). Die sich ergebende Differenz zum geringen Gehalt im Ursprungsmaterial ist nur durch ausgeprägte proteolytische Vorgänge zu erklären. Die Verluste ergeben sich insbesondere in der ersten Woche nach dem Schnitt (KEMBLE 1956). Durch den Abbau von Proteinen durch Pflanzenproteasen entstehen u. a freie Aminosäuren, stickstoffhaltige Säuren wie GABA, Ammoniak, Amine und andere Substanzen (BARRY et al. 1978b; MCDONALD 1982; PAPADOPOULOS u. MCKERSIE 1983). Dabei scheint es im Besonderen auch auf die Qualität des Ausgangsmaterials und die Durchführung der Silierung selbst anzukommen, da der Proteinabbau in nach DLG-Schlüssel qualitativ minderwertigen Silagen in größerem Umfang stattfindet. HUGHES postulierte bereits 1969 einen Zusammenhang zwischen GABA und dem Umfang der Proteolyse, da er in den „schlechten“ Silagen deutlich höhere GABA-Gehalte nachweisen konnte. Ebenfalls beachtenswert ist die Tatsache, dass proteolytische Prozesse in Heu und insbesondere in der Silage um ein vielfaches höher sind, als in gefriergetrocknetem Ausgangsmaterial (GRABBER 2009). Diese Beobachtung deckt sich mit denen aus der Praxis. Eine dominierende Rolle nehmen bei diesen Vorgängen die Pflanzenproteasen ein (OHSHIMA et al. 1979; MCDONALD 1982; PAPADOPOULOS u. MCKERSIE 1983; BEHA et al. 2002). Die in Silagen gesteigerte Proteolyse (COENEN 2004) lässt sich über verschiedene Mechanismen erklären: Zum einen gehören die Steigerung der Proteolyse und die Verringerung der Proteinsynthese zur physiologischen Antwort der Pflanze auf abiotischen Stress (MADHAVA RAO et al. 2006; KINGSTON-SMITH et al. 2008). Als Hauptstressor kann in diesem Fall der Wasserentzug angesehen werden, der durch zwei Ereignisse verursacht wird. Zum Einen den Schnitt und damit die Eröffnung von Phloem und Xylem und zum Anderen das Anwelken des Silierguts insbesondere bei geöffneten Stomata (ausführliche Informationen siehe Dissertation GAST 2010, Kap. 2.2.4). Zusätzlich häuft sich Laktat im pflanzlichen Gewebe an - 25 - Schrifttum (ROBERTS et al. 1984, 1985), was zur Erniedrigung des pH-Wert führt. Viele Proteasen zeigen bei leicht sauren pH-Werten (5 – 6) optimale Aktivität (MCDONALD 1982; VIERSTA 1996). Zum anderen werden durch Stressfaktoren - erhöhte Sonneneinstrahlung, oxidative Prozesse, Denaturierung - vermehrt fehlerhafte Proteine gebildet, die per se die Proteaseaktivität erhöhen (KINGSTON-SMITH 2008). Weiterhin ist nicht auszuschließen, dass es durch den Siliervorgang selbst, zur Verletzung der Pflanzenzellen und zur Freisetzung von Proteasen aus den pflanzlichen Kompartimenten kommt. Diese Proteasen sind nun in der Lage, unkontrolliert Proteine abzubauen und damit zur Anflutung von Proteinabbauprodukten beizutragen. Zwischen Heu und Silage bestehen bezüglich der Proteolyse Unterschiede. Gemessen am Gehalt der entstehenden NPN-Verbindungen (GRABBER 2009) läuft sie im Heu in wesentlich geringerem Umfang ab. Auch die bereits angesprochene Veränderung des Verhältnisses zwischen Rohprotein und Reineiweiß lässt sich auf eine gesteigerte Proteolyse in der Silage zurückführen. Intensive UV-Einstrahlung bei der Heutrocknung und ein nicht ausreichender Wassergehalt des Gewebes (COENEN 2004) verringern die Proteolyse hier ebenso, wie ein Mangel an Energie. MCDONALD berichtete 1982 von einer Beendigung der Proteolyse bei einem Trockenmassegehalt von 40 %, konnte aber den von MACPHERSON (1952a) ermittelten minimal nötigen pH-Wert von 4,3 nicht bestätigen. Bei der weiteren Betrachtung der Proteolyseaktivität innerhalb der verschiedenen Silagen, zeigte sich, dass auch bestimmte Behandlungsmethoden, insbesondere Anwelken und Säurebehandlungen, einen großen Einfluss auf die Konzentration von Proteinabbauprodukten im fertigen Futtermittel haben können. 2.4.2.3 Einfluss verschiedener Behandlungsverfahren Untersucher des Instituts für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover fanden einen direkten Zusammenhang zwischen Trockensubstanzgehalt und pH-Wert mit dem Reineiweißanteil des Rohproteins, d.h. ein steigender Trockensubstanzgehalt durch intensiveres Anwelken und ein zunehmender pH-Wert sind mit einer Erhöhung des Reineiweißgehalts assoziiert (COENEN 2004). Aus diesem Grund beschäftigt sich der folgende Abschnitt mit dem Einfluss der verschiedensten Behandlungsverfahren auf Proteinabbauvorgänge in der Silage. Anwelkgrad Im Allgemeinen gibt es unterschiedliche Verfahrensweisen für die Silagegewinnung: entweder die direkte Silierung frisch geschnittenen Materials, oder die Einsilierung nach einer Anwelkphase. Für die Praxis wird in der Regel die Silierung nach einer Anwelkphase von ein bis zwei Tagen empfohlen, wobei eine Zeitspanne von zwei Tagen keinesfalls überschritten werden sollte (WEISSBACH 2002). Bei der direkten Silierung kommt es nach der Ernte zu einem intensiven Proteinabbau während der ersten Tage. Innerhalb von 12 bis 24 Stunden steigt der Anteil der NPN-Fraktion von weniger als 20 % auf über 40 % (BRADY 1960; BERGEN et al. 1974; KEMBLE 1956). Umfangreiche Untersuchungen bezüglich der verschiedenen Anwelkverfahren wurden bereits von MACPHERSON u. SLATER (1959) sowie MCDONALD (1982) angestellt und ein - 26 - Schrifttum Trockenmassegehalt von 30 % als vorteilhaft für den weiteren Silierprozess, sowie dessen Ergebnis erkannt. MACPHERSON u. SLATER (1959) analysierten die Gehalte von Stickstoff, Glutamin, Glutamat, GABA, Asparagin, Asparaginsäure und Pyrrolidoncarboxylsäure in frischem und unterschiedlich behandeltem Gras. Außerdem wurden zwei verschiedene Gräser bzw. Wachstumsstadien betrachtet. Insbesondere bemerkenswert waren in dieser Studie die Unterschiede zwischen „trockenem Anwelken“ und „feuchtem Anwelken“. Wesentliche Ergebnisse der Untersuchung werden in der folgenden Tabelle (Tab. 2.4.3) wiedergegeben. Tab. 2.4.3: Analyseergebnisse nach MACPHERSON u. SLATER (1959) in Gras während der Konservierung, ausgedrückt in % des Gesamtstickstoffgehalts des ursprünglichen Materials (bzw. für Glutamin in % des N/2-Gehaltes) Junges Weidelgras, erster Schnitt (Mai) Frisches Gras Trocken angewelkt 24h Trocken angewelkt 48h Feucht angewelkt 24h Feucht angewelkt 48h 24h feucht, dann 24h trocken Silage, 9h Silage, 24h Silage, 48h Silage, 72h Gräsermischung, Folgeschnitt (Oktober) Frisches Gras Trocken angewelkt 72h 72h feucht, dann 72h trocken Silage, 1 Woche Silage 5 Wochen Trockenmasse % Löslicher N 22,7 71,4 9,1 11,7 0,34 0,30 1,01 0,44 0,10 0,76 76,4 11,8 0,30 0,43 0,73 23,3 18,5 0,80 1,57 0,11 23,6 28,0 1,46 1,58 0,05 73,1 21,8 0,70 0,55 0,63 - 30,6 65,1 75,1 77,5 0,20 0,34 - 0,39 1,63 - 2,30 2,83 2,93 2,94 Trockenmasse % Löslicher N Glutamin Glutamat GABA 19,3 58,5 9,8 31,9 0,20 1,60 1,00 0,38 0,20 0,45 74,6 44,3 2,10 0,48 0,36 - 68,0 69,5 0,20 0 1,86 1,84 3,60 3,40 - 27 - Glutamin (N/2) Glutamat (N) GABA (N) Schrifttum Weitere Analysen Trockenmasse % - Löslicher N Glutamin Glutamat GABA Feldsilage 67,2 0 1,75 3,85 Inkubiertes 61,7 0,82 0,45 2,40 mikroorganismenfreies Gras, 11 Tage Anmerkung: „Trocken angewelkt“: unter diesen Versuchsbedingungen vermindert sich der Feuchtigkeitsgehalt innerhalb kurzer Zeit rapide „Feucht angewelkt“: unter diesen Versuchsbedingungen wird ein hoher Feuchtigkeitsgehalt lange aufrechterhalten Auffällig sind besonders die Geschwindigkeit, in der GABA gebildet wird (< 24 h) und der parallele schnelle Abfall des Glutamats. Vergleicht man das „trocken angewelkte“ mit dem „feucht angewelkten“ Material, so zeigt sich in letzterem Fall keine GABA-Bildung, aber eine solche von Glutamin. Bei „trocken angewelkten“ Proben verhält es sich genau andersherum. Wurde das Gras erst „feucht angewelkt“ und anschließend getrocknet, fand die Bildung von GABA während der Trocknung statt. Der Schnitt führt nicht sofort zum Absterben der Pflanze, im Gegenteil, die Pflanze strebt danach, alle lebenswichtigen Funktionen so lange wie möglich aufrecht zu erhalten. In erster Linie entsteht durch den Schnitt ein massiver Wasserentzug, der durch Schluss der Stomata zur Verringerung der Evaporation gegenreguliert wird. Außerdem kommt es schnell zum Abbau von Proteinen (s.o.), wodurch freie Aminosäuren wie Glutamin und Glutamat entstehen, die als Substrate für die GABA-Synthese dienen. Mit dem Schluss der Stomata verändert sich auch der Stoffwechsel der Pflanze; u.a. werden massiv Ca2+ und Laktat in den Zellen angeflutet, die beide eine Aktivierung des GABA-bildenden Enzyms GAD begünstigen (siehe Abschnitt 2.2). Des Weiteren spielt GABA wahrscheinlich in der Pflanzenzelle auch eine wichtige Rolle als Signalmolekül, das etwa durch die Verletzung oder die mechanische Belastung der Pflanze massiv akkumuliert wird. Eine ausführliche Untersuchung zu Auswirkungen verschiedener Anwelkgrade wurde auch von MCDONALD im Jahre 1982 durchgeführt. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit Ergebnisse anderer Autoren zusammengefasst. Hierbei wurde allerdings nicht der GABAGehalt erfasst, sondern lediglich der Gehalt an Protein-N und NPN. Da diese Parameter jedoch Rückschlüsse auf das Ausmaß der Proteolyse zulassen, sollen im Folgenden auch die Ergebnisse dieser Untersuchungen kurz beschrieben werden. - 28 - Schrifttum Tab. 2.4.4: Veränderungen der stickstoffenthaltenden Bestandteile in Weidelgras (Lolium sp.) während der Anwelkphase (nach MACPHERSON 1952b aus MCDONALD 1982) Trockenmasse g/kg frisch 24h angewelkt 24h feucht angewelkt 48h angewelkt 48h feucht angewelkt Tab. 2.4.5: NH3-N g/kg total N Amino-N g/kg total N Amid-N g/kg total N 200 400 220 Protein-N g/kg total N 790 660 600 4 8 8 38 84 100 14 40 52 570 250 660 530 8 14 100 125 50 70 Veränderungen der stickstoffenthaltenden Bestandteile in Rotklee während der Anwelkphase (nach MCDONALD 1982) Trockenmasse g/kg Frisch 24h angewelkt 48h angewelkt 72h angewelkt getrocknet 199 311 378 813 884 Trockenmasse g/kg Frisch 24h angewelkt 48h angewelkt 72h angewelkt getrocknet 100 128 197 409 778 Total N Protein-N g/kg TM g/kg total N Blätter 55,9 862 56,1 836 56,3 776 55,9 760 55,8 737 Total N Protein-N g/kg TM g/kg total N Stiele 27,3 626 25,9 598 26,2 542 26,8 500 27,1 524 - 29 - NPN g/kg total N Freie AS g/kg total N 138 164 224 240 263 41 55 75 57 63 NPN g/kg total N Freie AS g/kg total N 374 402 458 500 476 132 147 164 104 73 Schrifttum Tab. 2.4.6: Stickstoffträger und pH-Werte in Abhängigkeit vom Trockenmassegehalt (nach MCDONALD 1982) in Rotklee Trockenmasse in g/kg 150 200 250 300 350 400 Protein-N in g/kg total N 302 319 350 384 370 447 Ammonium-N in g/kg total N 101 102 85 93 95 85 pH 4,18 3,99 3,88 4,04 4,04 4,18 Betrachtet man alle Ergebnisse im Vergleich, so kann man eine deutliche Abhängigkeit des Proteinabbaus von den Anwelkbedingungen erkennen. Insbesondere bei der Gegenüberstellung von „angewelkt“ und „feucht angewelkt“ (vgl. Tab 2.4.4). Durch Bedingungen, die ein Trocknen des Schnittguts verlangsamen, liegt ein geringerer Trockenmassegehalt vor (< 400 g/kg TS) und zugleich findet eine verstärkte Proteolyse statt, die sich durch den erhöhten Gehalt von freien Aminosäuren und einen geringeren Proteinengehalt manifestiert. Dies erklärt sich dadurch, dass bei optimalen Trocknungsbedingungen durch die limitierte Verfügbarkeit von Wasser die Pflanzenproteasen nicht ihre maximale Aktivität entwickeln können und schließlich sogar geschädigt werden. Wenn nun durch eine in geringerem Umfang ablaufende Proteolyse keine Substrate für die GABA-Synthese entstehen, so wird es auch nicht in großem Umfang zur Akkumulation von GABA kommen. Allerdings wiesen Untersuchungen von MCDONALDS u. EDWARDS (1976) darauf hin, dass ein Anwelken die Pflanzenproteasen nicht zu inhibieren scheint. Unter Praxisbedingungen ist bei Grassilage ein Anwelken bis zu einem Trockenmassegehalt von 30 bis 45 % üblich. Säurezusatz zum Siliergut Werden Futtermittel zur Konservierung ohne chemische Additiva siliert, kann es zu einem schwerwiegenden Proteinabbau durch pflanzliche Enzyme kommen (KEMBLE 1956). Um diesem Proteinabbau und damit dem Verlust an Futterwert zu entgehen, wurden verschiedene chemische Zusätze während der Silierung getestet. Insbesondere der Einsatz von Säuren fand breite Anwendung. OHSHIMA et al. (1979) untersuchten die Veränderungen der Stickstoffkomposition während der Silierung von Weidelgras und Luzerne und verglichen darüber hinaus die Gehalte von Aminosäuren, Biogenen Aminen und auch GABA in unbehandelter und behandelter Silage. Die Behandlung bestand bei diesem Versuchsaufbau in der Verwendung von Ameisensäure (85 %, 3,20 g/kg) und Formalin (40 %, 7,37 g/kg). Wesentliche Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (Tab. 2.4.7) dargestellt. - 30 - Schrifttum Tab. 2.4.7: Zusammensetzung von Originalmaterial und Silagen mit und ohne weitere Behandlung (nach OHSHIMA et al. 1979) % Trockenmasse Glutamat (g/16gN) Glutamin (g/16gN) GABA (g/16gN) Luzerne Originalmaterial Kontrollsilage 14,0 12,0 ± 0,2 0,15 0,24 ± 0,10 0,09 0,04 ± 0,01 0,71 6,48 ± 0,29 Behandelte Silage 13,9 ± 0,1 0,38 ± 0,01 0,17 ± 0,10 0,38 ± 0,03 % Trockenmasse Glutamat (g/16gN) Glutamin (g/16gN) GABA (g/16gN) Weidelgras Originalmaterial Kontrollsilage 16,1 14,3 ± 0,1 0,08 0,39 ± 0,01 0,05 Spuren 0,66 6,61 ± 0,13 Behandelte Silage 16,2 ± 0,1 0,15 ± 0,00 0,05 ± 0,00 0,53 ± 0,08 Die o.a. Daten von OHSHIMA et al. (1979) zeigen in der Summe aus Protein-, Peptid-, Amino- und Amid-N einen höheren Proteinverlust in unbehandelter Silage nach einer Silierdauer von 90 Tagen. In der behandelten Silage konnten etwa 90 % des originären Proteins erhalten werden, hingegen bei der unbehandelten Silage lediglich 58 % (Luzerne) bzw. 83 % (Weidelgras). Anhand der Daten ergeben sich aber auch Hinweise darauf, dass eine Behandlung die GABA-Bildung vermindern oder sogar verhindern kann. Ein Jahr zuvor berichteten OHSHIMA u. MCDONALD (1978) bereits über die positive Wirkung von Ameisensäure und Formaldehyd. Sie führten den Effekt darauf zurück, dass besonders Formaldehyd - weniger Ameisensäure - die Proteolyse und die Desaminierung inhibiert. Des Weiteren reagiert Formaldehyd mit Glutamin, indem sich inter- und intramolekulare Brücken bilden. Eventuell fällt dadurch eine weitere Verwendung von Glutamin als Substrat für die Glutamat- und damit für die GABA-Synthese aus. Der weitaus wichtigste Effekt scheint die Absenkung des pH-Werts durch den Säurezusatz zu sein. MACPHERSON (1952a) verband eine Absenkung des pH-Werts mit einer Verringerung der Proteaseaktivität und postulierte gar einen minimal erforderlichen pH von 4,3. Untersuchungen von MCDONALD (1982) bestätigten zwar einen Einfluss des pH-Werts auf die Proteolyse und konnten bei pH-Werten unter 5 deren deutlichen Rückgang feststellen, jedoch nicht den Minimal-pH bestätigen. Hier war noch bei pH 4 eine Proteolyse zu erkennen. Es ist jedoch unstrittig, dass die Aktivität der pflanzlichen Proteasen in dem Maß abnimmt, wie sich der pH-Wert vom Optimum 6 (MCDONALD 1982) entfernt. Untersuchungen zum Einfluss von Ameisensäure und Formaldehyd wurden auch von BARRY et al. (1978a, 1978b) durchgeführt. Unbehandelte Silage zeichnete sich durch einen umfangreichen Proteinabbau, die Bildung von Ammoniak, Essigsäure und GABA und wenig Laktat aus. Sowohl der Zusatz von acht Litern 35 %igem Formaldehyd, als auch der Zusatz von 1½ L, 3 L oder 6 L 85 %iger Ameisensäure pro Tonne ursprünglicher Substanz wirkte sich hemmend auf den Proteinabbau und die Kohlenstofffermentation aus. - 31 - Schrifttum Die wichtigsten Ergebnisse der Silageanalysen werden in der folgenden Tabelle (Tab. 2.4.8) dargestellt. Tab. 2.4.8: GABA-Gehalte (in g GABA-N/ 100 g total N) in Luzerne und unterschiedlich behandelten Silagen (nach BARRY et al. 1978b) „FlailSynthesesteigerung „Precision- Synthesesteigerung in % harvested“ in % chopped“ Originalmaterial 0,86 0,76 Unbehandelt 4,69 + 478,2 3,46 + 344,2 Formaldehyd 1,42 + 83,3 0,99 + 35,7 Ameisensäure wenig 4,33 + 365,8 2,03 + 153,0 mittel 3,55 + 287,6 1,37 + 78,1 viel 2,09 + 139,0 0,88 + 16,2 Anmerkung: „Flail-harvested“: beim Erntevorgang wird das Material zugleich gedroschen und gehäckselt „Precision-chopped“: beim Erntevorgang wird das Material in einem ersten Schritt gehäckselt und anschließend vermischt (Vgl. CHARMLEY u. FIRTH 2004) Insbesondere die Behandlung mit Formaldehyd zeigt sich hier als wirksame Methode, um die Bildung von GABA zu verhindern. Doch auch der Zusatz von Ameisensäure verringert die GABA-Synthese in Abhängigkeit von der zugesetzten Menge. Zwar ist der Zusatz von Additiva in der Silagegewinnung auch heute schon gängige Praxis, jedoch nicht gezielt zur Verhinderung der GABA-Akkumulation. Mikroorganismen Eine weitere Möglichkeit der Silagebehandlung stellt der Zusatz von Mikroorganismen, vor allem Milchsäurebakterien, dar. Bei den verwendeten Bakterien unterscheidet man zwischen homofermentativen und heterofermentativen Stämmen. Erstere produzieren aus Glucose ausschließlich Milchsäure, letztere zusätzlich Essigsäure und in geringem Umfang auch 1,2-Propandiol. Durch den Einsatz von homofermentativen Milchsäurebakterien erhofft man sich eine rasche Vergärung der Substrate, Reduzierung der flüchtigen Fettsäuren, Hemmung säureempfindlicher Gärschädlinge, rasche Unterdrückung der Konkurrenzflora, ökonomischeren Verbrauch von Zucker und eine Verringerung der Verluste durch den Eiweißabbau. Tatsächlich kann durch den Zusatz von Milchsäurebakterien sowohl eine Absenkung des pHWerts im Vergleich zu Kontrollsilagen (PAHLOW et al. 2003), als auch eine Verringerung des Rohproteinabbaus (WINTERS et al. 2001) erreicht werden. Beides dürfte sich entsprechend positiv auf die GABA-Gehalte des Futters auswirken, da zum einen in saurem Milieu die Synthese in geringerem Umfang abläuft und zum anderen weniger Substrate zur Verfügung stehen, wenn die Proteolyse gehemmt wird. - 32 - Schrifttum Bei der Unterdrückung der Konkurrenzflora spielen besonders Clostridien eine entscheidende Rolle. Aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens im Boden enthalten Silagen immer einen Anteil von Clostridien, in besonderem Maße bei Verschmutzung (u.a. durch zu tiefen Schnitt). Dominieren in der Silage diese buttersäurebildenden Bakterien, entstehen als Hauptabbauprodukte der Aminosäuren vor allem α- und γ-Aminobuttersäure und die Biogenen Amine Histamin, Tyramin, Cadaverin und Putreszin (OHSHIMA u. MCDONALD 1978). Sowohl die Buttersäure selbst, als auch die entstehenden Abbauprodukte wirken sich negativ auf die Silagequalität aus und werden darüber hinaus als Verursacher verschiedener negativer Effekte auf die Tiere diskutiert. Eine direkte Beeinträchtigung der GABA-Synthese könnte durch den Einsatz bestimmter Milchsäurebakterien erfolgen, die in der Lage sind L-Glutamat in D-Glutamat umzusetzen. Diese Reaktion wird katabolisiert durch das Enzym Glutamat Racemase, das in verschiedenen Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus fermentum oder Pediococcus pentosaceus (GALLO et al. 1993) nachgewiesen wurde. Die Decarboxylierung von L-Glutamat zu GABA wird durch das Enzym Glutamat-Decarboxylase (GAD) herbeigeführt, welches jedoch nur LGlutamat verwenden kann (UENO 1997). Wird das Ausgangssubstrat L-Glutamat zu nichtnutzbarem D-Glutamat umgesetzt, müsste sich schon hier eine Möglichkeit zur Hemmung der GABA-Synthese ergeben. Gesicherte wissenschaftliche Untersuchungen zur Wirksamkeit liegen jedoch bisher nicht vor. Auf der anderen Seite ist aber auch nachgewiesen, dass bestimmte in der Silage vorkommende Mikroorganismen, wie etwa Lactobacillus brevis (UENO et al. 1997) oder Lactobacillus buchneri (CHO et al. 2007), in der Lage sind GABA zu bilden. Aufgrund der beschränkten Substratverfügbarkeit und –erreichbarkeit, kann jedoch davon ausgegangen werden, dass dies nur einen geringen additiven Effekt auf die gesamte im Futter vorhandene GABA-Menge hat. Es ist nicht auszuschließen, dass künftig die verschiedenen Behandlungsmethoden insbesondere der Zusatz von chemischen und biologischen Additiva - wesentlich gezielter und in wesentlich größerem Umfang bei der Silagegewinnung zur Verhinderung der GABAAkkumulation eingesetzt werden. 2.5 GABA im Pansen Auch wenn bisher ein Vorkommen von GABA in Futtermitteln, vor allem Silagen, nachgewiesen wurde, so ist dies noch kein Beweis für eine schädigende Wirkung auf den Organismus. Jeder Organismus, in besonderem Maße jedoch der Wiederkäuer, verfügt über Abwehrmechanismen, die in der Lage sind, bestimmte Stoffe aus der Nahrung zu eliminieren. Zu diesen Mechanismen gehören neben Enzymausstattung und mikrobiologischen Vorgängen auch chemische Vorgänge und mechanische Barrieren, wie Pansenschleimhaut und Pansenwand. Deshalb beschäftigt sich der folgende Abschnitt mit dem Metabolismus aufgenommener GABA während der physiologischen Verdauungsvorgänge im Pansen. 2.5.1 Intraruminale Abbaubarkeit Die Betrachtung der Abbaubarkeit von GABA gestaltet sich insofern schwierig, da bisher zwar umfangreiche Untersuchungen zum Katabolismus von Aminosäuren und Proteinen im - 33 - Schrifttum Pansen vorliegen, jedoch kaum zu den sog. nicht-proteinogenen-Aminosäuren (NPAA), zu denen auch GABA gehört. α-Aminosäuren, die über die Nahrung in den Pansen gelangen, werden i.d.R. zur korrespondierenden α-Ketosäure und Fettsäuren (CORLEY 1926) bzw. Ammoniak (NOLAN et al. 1973) abgebaut. Der Abbau beginnt mit der Abspaltung der Aminogruppe am ersten Kohlenstoffatom. Als mögliche Abbauwege für GABA postulierte CORLEY (1926) die reduktive Desaminierung unter Buttersäurebildung, die α-Oxidation unter β-Alaninbildung, die β-Oxidation unter Glycinbildung oder die γ-Oxidation unter Bildung von Succinylsäure. Abb. 2.5.1: mögliche Wege im GABA-Abbau schematisiert (nach CORLEY 1926) Aminosäuren und Peptide werden im Pansen relativ schnell abgebaut: Untersuchungen von MANGAN (1982) zeigten Halbwertszeiten von acht Minuten für Arginin bis 56 Minuten für Lysin (im Mittel 19 Minuten). Die geringen Konzentrationen freier Aminosäuren im Pansen, die durch verschiedene Autoren bestätigt wurden (PORTUGAL 1966; NOLAN et al. 1973; CHALUPA 1975; BRÖCKER 1996), lassen auf einen schnellen Katabolismus schließen. Dabei sind die Abbauraten der verschiedenen Aminosäuren keinesfalls gleich, sondern unterscheiden sich deutlich voneinander (VON KEYSERLINK et al. 1998). LEWIS u. EMERY (1962) teilten die freien Aminosäuren nach ihrer Abbaubarkeit in drei Gruppen ein: 1. 2. 3. schneller und fast vollständiger Abbau (47 – 100%) intermediäres Verhalten weniger rascher und umfangreicher Abbau (8 – 37%) Serin, Cystein, Asparaginsäure, Threonin und Arginin Glutamat, Phenylalanin, Lysin, Cystin Tryptophan, Methionin, Alanin, δ-Aminovaleriansäure, Valin, Isoleucin, Ornithin, Histidin, Glycin, Prolin, Hydroxyprolin Sie beschränkten ihre Untersuchungen nicht nur auf die klassischen α-Aminosäuren, sondern bezogen auch die δ-Aminovaleriansäure, wie GABA eine NPAA, in ihre Betrachtungen ein. Ferner unterschieden sie zwischen verschiedenen Chiralitäten. Im Bezug auf die Abbaubarkeit von D- bzw. L-Enantiomeren, stellten sich die Aminosäuren heterogen dar. Bei Serin und - 34 - Schrifttum Tryptophan wurden beide Formen in gleichem Maße abgebaut, hingegen fand bei Asparaginsäure, Lysin, Threonin und Phenylalanin kein Abbau der D-Form statt. Diese bemerkenswerte Beobachtung zeigt deutlich, dass der Aminosäurenabbau ein hochspezifischer Prozess ist, der gar zwischen nahezu identischen Molekülen zu unterscheiden vermag. Diese besondere Spezifität könnte auch beim GABA-Abbau von Bedeutung sein. Die Rolle der Mikroorganismen beim Aminosäureabbau wird kontrovers diskutiert. Einige Autoren konnten durch Versuche mit radioaktiv-markierten Aminosäuren zeigen, dass deren direkte Aufnahme durch Mikroorganismen von untergeordneter Bedeutung zu sein scheint (PORTUGAL u. SUTHERIA 1966; NOLAN u. LENG 1972). Auf der anderen Seite stellt der Pansen ein hochkomplexes Ökosystem mit 300 – 400 verschiedenen Spezies dar (KINGSTON-SMITH et al. 2008), die durchaus in der Lage sind, freie Aminosäuren und Peptide als Stickstoff- und Energiequelle zu verwenden (CHEN u. RUSSEL 1988). Auch von COLE (1992) wurde berichtet, dass GABA und Biogene Amine schnell durch Pansenmikroorganismen abgebaut werden. Eventuell kann es durch Adaptation der Mikroorganismen an hohe GABA-Gehalte im Futter zu einem gesteigerten Abbau kommen. Einen Hinweis hierauf liefert die Betrachtung der strukturell ähnlich aufgebauten 2,4Diaminobuttersäure (DABA). Im Pansen von Schafen konnte ein Bakterium nachgewiesen werden, dass in der Lage ist, dieses neurotoxische Molekül zu degradieren. Durch die Adaptation an DABA im Futter konnte sich dieses Bakterium über Selektionsprozesse stark vermehren. Insgesamt wurde geschlossen, dass allein durch die Selektion bestimmter Pansenbakterien antinutritive Faktoren aus dem Futter entfernt werden können (PENG et al. 2007). Es ist anzunehmen, dass ähnliche Selektionsprozesse auch stattfinden, wenn das Futter mit GABA angereichert ist. Eine sehr ausführliche Besprechung zur Abbaubarkeit von Aminosäuren und Peptiden im Pansen findet sich bei CHALUPA (1975), sowie in den Dissertationen von BRÖCKER (1996) und GRESNER (2011) aus diesem Institut. Untersuchungen zu Vorkommen oder Schicksal von GABA im Pansen sind nicht sehr zahlreich, obwohl Berichte bereits hohe maximale Gehalte von 15 bzw. 73,6 µmol/100 mL in der Pansenflüssigkeit nachwiesen (WRIGHT u. HUNGATE 1967; MATSUMOTO et al.1984). WRIGHT u. HUNGATE (1967) untersuchten die Gehalte von freien Aminosäuren, einschließlich GABA und δ-Aminovaleriansäure, in unterschiedlich behandelter Pansenflüssigkeit in Abhängigkeit vom Zeitabstand zur letzten Fütterung. Wesentliche Ergebnisse sollen in der folgenden Tabelle (Tab. 2.5.1) dargestellt werden. Tab. 2.5.1: GABA-Gehalte in µmol/L in unterschiedlichen Fraktionen der Pansenflüssigkeit (WRIGHT u. HUNGATE 1967) Zeit in Min. nach der Fütterung Behandlung 0 60 120 200 D 0 60 50 RL 0 80 56 60 UF 8 28 D = Diffusat der Pansenflüssigkeit (Zusatz einer Salzlösung) RL = angesäuerte und geklärte Pansenflüssigkeit (Zusatz von Schwefelsäure) UF = Ultrafiltrat der Pansenflüssigkeit (nach Durchtritt durch eine Dialysemembran) - 35 - 400 16 6 Schrifttum Die leicht erniedrigten Werte im zellfreien Ultrafiltrat der Pansenflüssigkeit könnten darauf zurückzuführen sein, dass GABA zu einem geringen Teil auch intrazellulär vorliegt. Außerdem vermuteten die Autoren eine Zerstörung der mikrobiellen Zellwände durch den Zusatz von Schwefelsäure, wodurch mikrobielle Aminosäuren in die Probenflüssigkeit übertreten konnten. Die Untersuchungen von MATSUMOTO et al. (1984) dienten der Analyse der freien Aminosäuren, abhängig von der Applikation einer antimikrobiell wirksamen Substanz (Monensin) über das Futter. Die Pansenflüssigkeit wurde in dieser Versuchsanordnung doppelt durch Gaze gefiltert, 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand bis zur Analyse tiefgefroren. Hierbei ergaben sich die folgenden Werte (Tab. 2.5.2). Tab. 2.5.2: Kontrolle Monensin GABA-Gehalte in Abhängigkeit von der Monensinapplikation (MATSUMOTO et al. 1984) in der Pansenflüssigkeit (in µmol/L) 0 54 44 Zeit nach der Fütterung in Stunden 1 2 4 598 614 158 599 736 88 6 47 48 Da die Resultate nur leichte Unterschiede aufweisen, ist dies ein Hinweis für eine untergeordnete Rolle des mikrobiellen GABA-Abbaus, sofern man davon ausgeht, dass durch Monensin alle GABA-abbauenden Mikroorganismen beeinträchtigt wurden. Ebenso lässt sich aus den Daten schließen, dass GABA aus dem Futter in den Pansen gelangt und hier innerhalb von sechs Stunden nahezu vollständig entfernt wird. 2.5.2 Ruminale Resorption Neben der ruminalen Abbaubarkeit von GABA, ist die Resorption von Bedeutung für das Tier. Auch auf diesem Gebiet gibt es nahezu keine Erkenntnisse zur GABA-Aufnahme über die Pansenwand. Dennoch können Untersuchungen zur Resorptionsfähigkeit von anderen Aminosäuren im Pansen wertvolle Hinweise liefern. Zahlreiche Experimente belegen, dass freie Aminosäuren aus dem Pansen resorbiert werden und diese einen Teil der Stickstoffabsorption aus dem Verdauungstrakt ausmacht. COOK et al. untersuchten 1965 das Resorptionsverhalten von elf sauren und neutralen Aminosäuren in vitro sowie in vivo. Bei der in vitro-Untersuchung von Glycin konnte eine Resorption nachgewiesen werden. Bei den in vivo-Untersuchungen wurden Schafen intraruminal verschiedene Aminosäuren einzeln oder als Gemisch appliziert und die Differenz zwischen der totalen Amino-N Konzentration zwischen arteriellem und venösem Blut auf der einen und Pansenflüssigkeit auf der anderen Seite gemessen. Innerhalb von 30 Min. nach Glycin- und Alanin-Applikation stieg die Konzentration im Blut auf das sechsfache, bei Aspargin- und Glutamin-Applikation um das vierfache. Daraus schlossen die Untersucher, dass etwa 350 µmol Amino-N in 30 Minuten absorbiert werden können. Bei den Aminosäuren Glutamat, Leucin, Isoleucin und Asparaginsäure zeigte sich lediglich ein moderater Anstieg, Alaninund Valinkonzentrationen blieben konstant. Im Ergebnis konnte eine Resorption der meisten Aminosäuren nachgewiesen werden. Es wurde die Möglichkeit diskutiert, dass die Aminosäuren miteinander um Absorptionsmechanismen konkurrieren. Allerdings übersteigen - 36 - Schrifttum die verwendeten Konzentrationen die unter natürlichen Bedingungen in der Nahrung herrschenden Konzentrationen um ein Vielfaches. Ebenfalls Untersuchungen zur Resorption von freien Aminosäuren aus dem Pansen von Schafen wurden von LEIBHOLZ (1971a, b) durchgeführt. In der ersten Versuchsanordnug in vivo, in einer weiteren in vitro. Im Unterschied zu COOK et al. (1965) wurden jedoch Konzentrationen verwendet, die denen in der natürlichen Nahrung entsprachen. Um eine Verfälschung der Ergebnisse durch mikrobiellen Abbau zu verhindern, wurden die Pansen gewaschen und antibiotisch behandelt. Die intraruminale Infusion der Aminosäuren wurde einzeln oder als Gemisch aus vielen Aminosäuren vorgenommen. Auch hier war die Absorption von freien Aminosäuren nachzuweisen, wenn auch in wesentlich geringerem Umfang als bei COOK et al. (1965). Die Resorbierbarkeit schwankte zwischen den einzelnen Aminosäuren von 0 bis 50 %, wobei insgesamt die verzweigtkettigen Aminosäuren in höherem Maße resorbiert wurden. Insgesamt wurde bemerkt, dass etwa sechs Prozent der totalen Stickstoffabsorption aus dem Pansen in Form von α-Amino-Stickstoff aufgenommen werden. Die Resorption lag damit deutlich unter der Resorption von Aminosäuren aus dem Darm, was eventuell auf eine geringere Rezeptordichte oder eine geringere Effizienz schließen lässt. Ebenso wie bei COOK et al. (1965) zeigte sich eine Verringerung der Resorption bei Anwesenheit weiterer Aminosäuren, woraus LEIBHOLZ (1971 a, b) den Mechanismus einer kompetetiven Hemmung herleitete. Des Weiteren konnte auch gezeigt werden, dass nicht alle Aminosäuren in gleichem Umfang zu einer Resorptionsdepression führen. Diese lag für Histidin z.B. bei 10 - 50 %, wobei Glutamat und verzweigtkettige Aminosäuren eine wesentlich geringere Depression hervorriefen, als Methionin, Arginin und Glycin. Ein weiteres Indiz für einen spezifischen Resorptionsmechanismus liefert die Betrachtung der Enantiomere. Es zeigte sich, dass L-Histidin in wesentlich größerem Umfang resorbiert wird, als D-Histidin. Dies deckt sich mit Beobachtungen bei Monogastriern, da auch hier die Resorption spezifisch für L-Aminosäuren ist. In einem weiteren Experiment wurde festgestellt, dass es sich bei der Resorption von Aminosäuren aus dem Pansen um einen energieverbrauchenden Prozess handelt. Da die Gehalte an freien Aminosäuren z.T. die im Blut überstiegen, wurde die Beteiligung einer passiven Diffusion diskutiert. In in vitro-Versuchen wurde geklärt, dass sie offenbar nur eine untergeordnete Rolle spielt (COOK et al. 1965; LEIBHOLZ 1971a, b). Die folgende Tabelle (Tab. 2.5.3) gibt einen Überblick zu Untersuchungen zur Resorptionsfähigkeit von Aminosäuren aus dem Pansen. - 37 - Schrifttum Tab. 2.5.3: Ruminale Aminosäureresorption – eine Übersicht Autor/Jahr Untersuchte Parameter ANNISON 1956 α-Amino-N Untersuchte Tierart Ergebnis Schaf (in vivo) TSUDA 1956 Schaf (in vivo) Kein Anstieg der α-Amino-NKonzentration im Blut nach Infusion von Caseinhydrolysat Keine Resorption von Glycin aus dem Pansen Nach intraruminaler Infusion hoher Aminosäuremengen, deutlicher Anstieg von αAmino-N im Blut Resorption von Aminosäuren aus dem Pansen abhängig von der Konzentration Signifikante Resorption freier Aminosäuren aus dem Pansen Glycin DEMAUX et al. α-Amino-N 1961 Schaf (in vivo) COOK et al. 1965 α-Amino-N Ziege (in vivo/in vitro) Rind (in vivo) LEIBHOLZ 1971a, b Aminosäuren: Ala, Arg, Asp, Cystin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, Val Schaf (in vivo/in vitro) Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine deutliche Resorption von freien Aminosäuren aus dem Pansen stattfindet und es sich dabei um einen höchstspezifischen und energieabhängigen Vorgang handelt, der noch weiterer Erforschung bedarf. Forschungsbedarf besteht auch im Bezug auf die Resorption von GABA aus dem Pansen. Es kann jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass eine solche stattfindet – in welchem Umfang und unter welchen Bedingungen, vermögen nur weitere Untersuchungen, evtl. auch unter Einbeziehung von in vivo- und Markeruntersuchungen, zu klären. Fazit Das Verhalten von GABA im Pansen ist nur in geringem Umfang Gegenstand bisheriger Forschungen gewesen, weshalb sich wenige gesicherte Aussagen hierzu machen lassen. Insgesamt weisen jedoch die Untersuchungen an anderen Aminosäuren darauf hin, dass GABA zum Teil im Pansen bereits degradiert und zum Teil über die Pansenwand resorbiert werden könnte. Inwiefern diese beiden Vorgänge sich durch äußere Umstände, wie Futterkomposition, Fütterung oder Erkrankungen modifizieren lassen, kann ebenfalls nur aus Untersuchungen zu anderen Aminosäuren geschlossen werden. So führt etwa ein höheres Angebot von löslichen Proteinen mit dem Futter zu einem gesteigerten Abbau von Aminosäuren durch Mikroorganismen (EL-SHAZLY 1952). LEIBHOLZ et al. (1971b) konnten beweisen, dass es bei hungernden Schafen zu einer - 38 - Schrifttum Steigerung der Resorptionsfähigkeit um 200 % kommt, was von den Autoren auf die Verdünnung der Pansenwand und damit der Barriere zwischen intra- und extraruminalem Raum zurückgeführt wurde. Weiterhin können aber auch Erkrankungen eine Rolle spielen. So führen ruminale Alkalosen oder Azidosen zu Veränderungen im Pansenmilieu und -zotten, die wiederum Auswirkungen auf Resorption und Abbaubarkeit haben werden. Dabei können für den Abbau verantwortliche Enzyme in ihrer Aktivität beeinträchtigt oder sogar geschädigt werden, zum anderen wiesen schon LEIBHOLZ et al. (1971a, b) auf die Beeinflussbarkeit der Resorption durch den pH-Wert hin. Ebenfalls von Bedeutung werden alle Erkrankungen sein, die zu einer Veränderung der Passagegeschwindigkeit der Ingesta führen. Hier sind insbesondere Pansenatonie und –stenosen erwähnenswert. Des Weiteren können auch Vorgänge von Bedeutung sein, die die Resorptionsfläche beeinträchtigen, etwa dadurch, dass sie zu einer Veränderung der Pansenzottenanzahl und – größe oder Traumata führen. Hier spielt die Fütterung, bzw. Zusammensetzung des Futters eine große Rolle, aber auch bestimmte Erkrankungen, wie die Pansenazidose oder Ruminitiden verschiedener Genese, die in unseren Milchviehherden vorkommen. Letztlich führen alle Erkrankungen, die mit Inappetenz einhergehen zu einer Veränderung im natürlichen Ablauf der Verdauung, sei es über chemische, mechanische oder mikrobiologische Vorgänge, und damit auch zu einem veränderten GABA-Metabolismus. Unabhängig von den Spekulationen bezüglich ruminaler Abbaubarkeit und Resorption, beschäftigt sich der folgende Abschnitt mit der Wirkung von GABA auf den Säugetierorganismus. 2.6 Auswirkungen auf den Organismus GABA beeinflusst den Organismus sowohl über zentrale, als auch über periphere Rezeptoren. Da jedoch bei der oralen Aufnahme im Wesentlichen keine Passage der Blut-Hirn-Schranke erfolgt, wird insbesondere den peripheren Wirkungen hier eine höhere Bedeutung beigemessen. Nichtsdestotrotz werden auch die zentralen Wirkungen angesprochen. 2.6.1 GABA im Organismus – zentrale Wirkungen GABA gehört zu den vier häufigsten Neurotransmittern im ZNS. An mehr als 80 % aller Synapsen stellt sie die Transmitter und ist somit der wichtigste inhibitorische Transmitter im Gehirn. Sowohl GABAA- als auch GABAB-Rezeptoren wurden im Gehirn nachgewiesen. GABA ist unter anderem beteiligt an der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Hemmung sowie Erregung im ZNS und verstärkt hierbei Beruhigung, Narkose und Schlaf. - 39 - Schrifttum Die Wirkung von GABA wird in der folgenden Abbildung (Abb. 2.6.1) schematisch dargestellt. Abb. 2.6.1: Gleichgewichtslage der wichtigsten Neurotransmitter, schematisiert (nach EBERT et al. 2006) Bei Untersuchungen zur Auswirkung von GABA auf das ZNS injizierte MORLEY (1980) die Substanz direkt ins ZNS von Ratten. Er beobachtete einen Doppeleffekt auf die Futteraufnahme, abhängig vom Ort der Applikation: ihre Steigerung konnte über Hemmung des ventromedialen Sättigungszentrums ausgelöst werden, ihre Verringerung über eine Hemmung des lateralen hypothalamischen dopaminergen Systems. Nach Meinung des Großteils der Wissenschaftler ist die Blut-Hirnschranke im Allgemeinen relativ inpermeabel für GABA (UNGEMACH 2006). Die Unüberwindbarkeit der Bluthirnschranke wird durch ABDOU et al. (2006) in Frage gestellt. Hier wurde Patienten eine Dosis von 100 – 200 mg GABA einmalig oral appliziert und die Auswirkungen bei Stresssituationen untersucht. Es zeigte sich, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere Stressempfindlichkeit und eine geringere Empfindung von Angstzuständen erreicht werden konnte, die auf zentrale Effekte hindeuten. Weiterhin untersuchten CHO et al. 2007 den Effekt von GABA in Lebensmitteln und diskutierte unter anderem auch einen positiven Effekt bei der Regulation neuronaler Störungen. Avermectine Einen weiteren Hinweis liefern die Symptome, die im Zusammenhang mit Intoxikationen durch Medikamente beobachtet wurden, die in den GABA-Stoffwechsel eingreifen. In diesem Zusammenhang spielen besonders die Avermectine eine herausragende Rolle. Sie greifen auf dreierlei Wegen in den GABA-Stoffwechsel ein: 1. in hohen Konzentrationen wird die präsynaptische Freisetzung von GABA erhöht 2. die Affinität der Rezeptoren für GABA wird erhöht 3. die Affinität der Bindungsstelle für Benzodiazepine am GABA-Rezeptorkomplex wird erhöht - 40 - Schrifttum Von Intoxikationen betroffen sind insbesondere Neugeborene und Tiere, deren BlutHirnschranke aufgrund eines genetischen Defekts eine erhöhte Durchlässigkeit für GABA aufweist (ABDOU et al. 2006). Symptome sind zentralnervöser Natur, wie Ataxie, Somnolenz, Tremor, bis hin zu komatösen Zuständen. Diese Symptome decken sich auch mit von EICKEN (2005a) bei der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ festgestellten Symptomen. 2.6.2 GABA im Organismus – periphere Wirkungen Der Leber kommt innerhalb des GABA-Stoffwechsels eine besondere Funktion zu, da hier aktive GABA-Transportprozesse den Gehalt von GABA im Blut regulieren. GABA akkumuliert in den Hepatozyten. Wird die Aufnahmekapazität überschritten oder werden Hepatozyten durch Erkrankungen geschädigt, flutet GABA im Serum an (ERDÖ 1985; MINUK 2000). Die massive Akkumulation von GABA in den Hepatozyten kann sogar Ursache eines Leberversagens sein (ERDÖ 1985). GABA wird im Pankreas zusammen mit Insulin von den β-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der Hemmung der Glucagon-Freisetzung durch Glukose. Dies geschieht über die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren in den α-Zellen des Pankreas (RORSMAN et al. 1989). Weiterhin hat GABA Auswirkungen auf den Hormonhaushalt des Säugetierorganismus. Über Wechselwirkungen mit Rezeptoren in Hypophyse und Hypothalamus reguliert sie die Produktion von ACTH, GH, TSH, LH und PRL (GAMEL-DIDELON et al. 2002). Auch die Fortpflanzung wird durch GABA beeinflusst. Sie steigert am Ovar den Blutfluss, die Östradiol-Sekretion und verringert die Progesteron-Produktion (ERDÖ 1985). Bei der Befruchtung spielt die Interaktion von GABA mit GABAA- und GABAB-Rezeptoren eine entscheidende Rolle für die Akrosomenreaktion der Spermien. Ferner hat GABA Effekte auf den Gastrointestinaltrakt. Beim Monogastrier wird von einer gesteigerten Gastrinproduktion, sowie einer Modulation der Kontraktilität berichtet (ERDÖ 1985). Hier könnte insbesondere die GABA-Menge eine Rolle spielen, die über den Weitertransport des Chymus in tiefere Abschnitte des Gastrointestinaltrakts gelangt. In der Niere sind hohe GABA-Gehalte zu messen, was deren Bedeutung für die renale Funktionen nahe legt. Tatsächlich konnten durch GABA-Applikation positive Effekte auf Versuchstiere mit akutem Nierenversagen erzielt werden (KIM et al. 2004). Eine antihypertensive Wirkung von GABA wurde von verschiedenen Autoren beobachtet. Sie scheint hier eine Schlüsselrolle über die Beeinflussung des Barorezeptorreflexes und die Kontrolle der sympathischen vasomotorischen Aktivität und damit eine blutdrucksenkende Wirkung zu haben (ZHANG u. MIFFLIN 1998; GORDON u. SVED 2002; SHIZUKA et al. 2004). Die Forschungen in diesem Bereich sind jedoch keineswegs abgeschlossen. Immer wieder werden neue Auswirkungen von GABA auf periphere Gewebe entdeckt, und es werden eine Beteiligung im Protein- und Energiemetabolismus, sowie bei Wachstum und Differenzierung und verschiedenste Organsysteme diskutiert (ERDÖ 1985; GAMEL-DIDELON 2002; KIM et al. 2004). - 41 - Schrifttum 2.6.3 GABA beim Wiederkäuer Untersuchungen von GABA beim Wiederkäuer sollten insbes. klären, ob GABA als antinutritiver Stoff im Futter, vorwiegend Silagen, einen negativen Effekt auf Futteraufnahme hat. Diese Vermutung stützt sich auf die Beobachtungen in der Praxis, wonach die Aufnahme von siliertem Futter 3 – 5 % geringer ist, als von vergleichbarem frischen oder als Heu konserviertem Material. (DULPHY u. VAN OS 1996). Früh standen Fermentationsprodukte im Verdacht, diese Depression zu verursachen, da insbesondere bei geringer Konservierungsqualität ein hohes Angebot von Fermentationsprodukten und Proteinabbauprodukten sowie stickstoffhaltigen Säuren (z.B. GABA) besteht. Als bereits in den frühen 80er Jahren GABA als eine der Haupt-N- Komponenten in Silagen identifiziert (MCDONALD 1982) und ein Zusammenhang zwischen GABA und der Futteraufnahme vermutet wurde, (MORLEY 1980) begannen Untersuchungen zur Beeinflussung der Futteraufnahme durch GABA. BUCHANAN-SMITH u. PHILLIP (1984) arbeiteten mit Schafen, denen bis zu 40 g GABA einmalig direkt in den Pansen infundiert wurde. Sie beobachteten eine Verringerung der Futteraufnahme, die bis zu vier Stunden anhielt und schlussfolgerten, dass flüchtige Substanzen, wie GABA, über einen postingestativen Mechanismus die Futteraufnahme bei Wiederkäuern beeinflussen können. Untersuchungen von COLE (1992) konnten jedoch diese Beobachtungen nicht stützen. Hier wurden bis zu 24 g/kg TS direkt in den Pansen von Bullen infundiert, ohne Auswirkung auf die Futteraufnahme. Er vermutete einen schnellen Abbau von GABA und Biogenen Aminen durch Pansenmikroorganismen. Ähnliches berichten DAWSON u. MAYNE (1996, 1997). Sie konnten zeigen, dass weder eine intraruminale Infusion von 2, 4 oder 6 g/kg TS über drei Tage, noch eine von 6 g/kg TS über zwei Wochen die Futteraufnahme von Bullen beeinflussten. Ebenso konnten VAN OS et al. (1996) einer Kombination von etwa 5 g/kg TM GABA mit Biogenen Aminen keinen Effekt attestieren. DULPHY u. VAN OS fassten 1996 zusammen, dass wahrscheinlich kein Zusammenhang zwischen GABA im Futter und der Futteraufnahme besteht, da die bisher positiven Ergebnisse (BUCHANAN-SMITH u. PHILLIP 1984) mit einem Vielfachen der natürlichen Futterkonzentration erzielt wurden. Dem kann jedoch nicht uneingeschränkt zugestimmt werden, da mittlerweile in der Praxis Gehalte von 5 g GABA/kg TS und mehr in Silagen gefunden wurden, woraus sich für eine 650 kg schweren Milchkuh bei reiner Silagefütterung eine tägliche Aufnahme von über 100 g GABA pro Tag über einen Zeitraum von bis zu mehreren Wochen ergeben würde. In der folgenden Tabelle (Tab. 2.6.1) sind die Ergebnisse der erwähnten Untersuchungen zusammengefasst. - 42 - Schrifttum Tab. 2.6.1: GABA-Effekte auf die Futteraufnahme Autor/Jahr Versuchstiere BUCHANAN- Schafe SMITH u. PHILLIP 1984 COLE 1992 Bullen Versuchsablauf Applikation Dosis Intraruminale 40 g GABA Infusion Ergebnis Dauer einmalig Intraruminale Infusion bis zu 24 g GABA/kg TS DAWSON u. Bullen MAYNE 1996 Intraruminale Infusion 2, 4, o. 6 g GABA/kg TS VAN OS et al. Schafe 1996 Silagezusatz DAWSON u. Bullen MAYNE 1997 Intraruminale Infusion 2,7 g Amine, 3 g NH3 u. 5 g GABA/kg TS 6 g GABA /kg TS im Futter 2.6.4 - 3d, 8 h/d - 2 Wo Depression der Futteraufnahme bis zu 4h Keine signifikante Reduktion der Futteraufnahme Kein signifikanter Effekt Kein signifikanter Effekt Kein signifikanter Effekt Chronische Effekte All diese Untersuchungen zu GABA beim Wiederkäuer arbeiteten mit relativ niedrigen Dosierungen über relativ kurze Zeiträume. Geht man von heute möglichen Bedingungen aus (EICKEN3), so nehmen Tiere GABA über die Schadsilagen längerfristig (> 100 Tage) und in hohen Dosierungen auf. Ob sich hieraus eine chronische Toxizität über Akkumulation ergibt, bleibt unklar. Aufgrund der Beobachtungen in der Praxis scheint es jedoch sinnvoll, über Feldversuche die Auswirkungen von Langzeitapplikationen hoher Tagesdosen GABA zu prüfen. Es ist vorstellbar, dass aus solchen Bedingungen Bestandserkrankungen hochleistender Herden resultieren können. Aufgrund der schnellen Erholung nach Absetzen der Silagen und Supplementierung von Reineiweiß in Form von Sojaschrot kann man einen Zusammenhang zwischen Erkrankungen und den Inhaltstoffen vermuten. Hierbei gilt es herauszufinden, welche Inhaltstoffe als Ursache in Betracht kommen. Allerdings kann ein Absetzten der verursachenden Silage nach eigenen Erfahrungen (HÖLTERSHINKEN4) lediglich zu einer Erholung des Bestandes führen, wenn diese nicht länger als vier Wochen verfüttert wurde. 3 4 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn K. Eicken, Hannover am 12. März 2010 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn M. Höltershinken, Hannover am 14. Februar 2011 - 43 - Eigene Untersuchungen 3. Eigene Untersuchungen 3.1 Versuchsziel Versuchsziel war die Überprüfung der Auswirkungen der Verfütterung von Grassilagen mit auffälligen Reineiweißanteilen auf die in vitro-Fermentationsvorgänge im Pansensaft, insbesondere auf Biogene Amine und freien Aminosäuren, einschließlich der γ-Aminobuttersäure (GABA). Die hierzu genutzte HPLC-Analyse nach 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-(FMOC)-Derivatisierung stellte ein neues Analyseverfahren dar, wodurch es möglich sein sollte, in der sehr komplexen Matrix „Pansensaft“ den Großteil der natürlich vorkommenden freien Aminosäuren und Biogenen Amine zu identifizieren und quantifizieren. 3.2 Material und Methodik 3.2.1 Herkunft der Proben (RUSITEC-System) Die untersuchten Fermenterproben entstammten 17 Läufen, die im Jahr 2009 mit dem RUSITEC-System (RUmen SImulation TEChnique) im Pansenlabor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt wurden. Es handelt sich hierbei um ein Pansensimulationsmodell vom Typ des geschlossenen semi-kontinuierlichen Durchflusssystems, das 1977 von CZERKAWSKI und BRECKENRIDGE entwickelt wurde und das invitro-Versuche über mehrere Wochen ermöglicht. Nähere Angaben zu Aufbau und Funktionsweise sind der Dissertation GAST (2010) zu entnehmen. Kurzbeschreibung RUSITEC Bei „Neustart“ eines Laufs wurde Pansensaft eines Spendertiers in den künstlichen Pansen eingebracht, um den natürlichen Gehalt an Mikroorganismen auch im Modellsystem zu erzielen, da diese im Organismus für einen Großteil der Verdauungsvorgänge verantwortlich sind. Grundsätzlich wurden die zu untersuchenden Futtermittel (10,5g TS Heu bzw. Silage und 3,4g Kraftfutter) täglich manuell in einen Futterbeutel eingegeben, der sich wiederum im Innenbehälter eines sog. Fermenters befand. Durch ein temperiertes Wasserbad konnte die physiologische Temperatur von 38 – 40°C im Pansen aufrechterhalten werden. Die Kontraktionen des Pansens wurden durch einen Motor mit Hubstange simuliert. Da im Wiederkäuerorganismus abgeschluckter Speichel eine wichtige Rolle als Puffersubstanz spielt, wurde diese Rolle im Modellsystem von künstlich hergestellten „Speichel“ übernommen, der in das System geleitet wurde. Insgesamt liefen sechs Fermenter zeitgleich, wobei jeweils zwei dieselbe Beladung erfuhren. Ein Lauf umfasste insgesamt 28 Tage. Auf die Einlauf- und Kontrollphase mit Heufütterung von neun Tagen, folgte die Zulagephase (zehn Tage). Während der Zulagephase wurden Grassilageproben in das System eingebracht, die dort für jeweils 48 Stunden verblieben. Nach dem Ablauf der Zulagephase wurde im Rahmen einer Regenerationsphase wiederum mit - 44 - Eigene Untersuchungen Heufütterung über neun Tage überprüft, ob das System in der Lage ist, zu seinem Ausgangszustand zurückzufinden. Neben Heu bzw. Silage wurde in jeden Fermenter eine definierte und gleichbleibende Menge Kraftfutter gegeben, um die natürlichen Bedingungen im Pansen weitestgehend auch im künstlichen System zu erzeugen. Futtermittel Als Futtermittel dienten verschiedene Silagen, die anhand ihres prozentualen Reineiweißanteils und dem Auslösen von klinischen Symptomen in Milchviehbetrieben in die Gruppen „Schadsilagen“ und „Kontrollsilagen“ eingeteilt wurden. Weiterhin kamen Heu und Kraftfutter zum Einsatz, die in Menge und Beschaffenheit der üblichen Ration für Milchvieh in Laktation entsprachen (näheres hierzu siehe Dissertation GAST 2010). Alle Futterkomponenten wurden vor Versuchsbeginn in den für den gesamten Versuchsraum benötigten Mengen entnommen und bei Raumtemperatur (Heu und Kraftfutter) bzw. bei -18 °C (Silagen) gelagert. Weiterführende Informationen und insbesondere Analyseergebnisse der Futtermittel befinden sich im Anhang (Kapitel 9.1). 3.2.2 Probenentnahme Die Probenentnahme (10 mL Pansensaft) für die Analyse von Biogenen Aminen und Aminosäuren aus dem RUSITEC-Fermenter erfolgte jeweils an Tag 0, 7 und 8, sowie am 11., 12., 13. und am 16. bis 21. Tag des Versuchs und schließlich an den Tagen 26 bis 28 (Regenerationsphase) jeweils vor Beladung. Insgesamt wurden in allen 17 Läufen mehr als 1500 Proben aus den Fermentern entnommen. Tabelle 3.2.1 gibt einen Überblick über die Probenahmezeitpunkte, sowie die Einteilung des Versuchs in verschiedene Phasen. - 45 - Eigene Untersuchungen Tab. 3.2.1: Probeentnahmezeitpunkte während eines Versuchslaufs Phase Inhalt der Futterbeutel nach der täglichen Beladung Versuchstag Probennahme B Einlauf e B l e a u d t u e n l g 1 H H H H H H H H H S S S S S S S S S S H H H H H H H H H H 2 P Kontrolle Zulage Regeneration H H H H H H H H H S S S S S S S S S S H H H H H H H H H 0 1 X - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 X 8 X 9 - 10 - 11 X 12 X 13 - 14 - 15 - 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 X 22 - 23 - 24 - 25 - 26 X 27 X 28 X H: Heu + Kraftfutter S: Silage + Kraftfutter P: Pansensaftinokulum des Spendertieres X: Probennahme -: keine Probennahme - 46 - Eigene Untersuchungen Wie anhand Tabelle 3.2.1 zu erkennen ist, ergibt sich eine Verschiebung des Messzeitpunkts unmittelbar vor dem Futterbeutelwechsel. Zu Beginn der Zulagephase wurden an Tag 9 Silagen in das RUSITEC-System eingebracht, am Ende der Zulagephase wurde an Tag 19 einer der beiden Futterbeutel mit Heu befüllt. Da die Futterbeutel 48 Stunden im RUSITECSystem verblieben, wurden die Effekte durch den Futterwechsel erst an den Tagen 11 bzw. 21 messbar. 3.2.3 Probenlagerung und -aufbereitung Die Proben wurden sofort nach Entnahme aus dem Fermenterüberstand mit 100 µL Sulfosalicylsäure (30 %ig) zur Proteinfällung und mit 10 µL der Substanz Norvalin (salzsaure D-Norvalinlösung) als internem Standard versetzt, 45 Minuten bei 4 °C inkubiert, anschließend zentrifugiert (22.000 xg 10 Min., 4°C; Fa. Hermle, Typ ZK 401 mit Winkelkopfrotor, Wehningen, Deutschland) und bis zur weiteren Untersuchung in 1 mL Portionen bei -18°C tiefgefroren. Während der Probenaufbereitung wurden die Proben bei Zimmertemperatur (ca. 21°C) aufgetaut und anschließend zehn Minuten bei 7000 xg zentrifugiert (4°C) um möglichst alle verbliebenen Schwebstoffe, die die Messung stören könnten, zu entfernen. Analysiert wurde anschließend der Überstand. Zur Vermessung wurden schließlich 80 µL aus dem Überstand der Probe entnommen, mit 75 µL eines Kalium-Borat-Puffers und mit 5 µL einer 2,5 M NaOH-Lösung versetzt, um einen pH von optimal 10,2 zu erhalten. Die eigentliche Untersuchung erfolgte nach der FMOC-Derivatisierung per HPLC. 3.3 Analytik 3.3.1 Prinzip der HPLC Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) eignet sich zur Analyse sowohl fester, als auch löslicher Substanzgemische. Aufgrund von Wechselwirkungen mit der stationären Phase (physikalische und chemische Adsorption, z. B. van-der-Waals-Kräfte; Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, SCHWEDT 1994) ergeben sich für die Einzelkomponenten unterschiedliche Retentionszeiten bis zum Verlassen der Trennsäule. Diese räumliche und zeitliche Separierung aufgrund bestimmter physikalischer und/oder chemischer Eigenschaften ermöglicht erst die exakte Erfassung über einen Detektor. Zum Schutz der Trennsäule vor Verunreinigungen durch komplexe Matrices, wie etwa Pansensaftproben, werden häufig Vor- und Sättigungssäulen verwendet. Mit der HPLC ist es möglich, komplexe Substanzgemische zu trennen und Stoffkomponenten qualitativ oder quantitativ mit Hilfe von geeigneten Detektoren zu bestimmen (ACED u. MÖCKEL 1991). - 47 - Eigene Untersuchungen 3.3.2 HPLC-Verfahren mit chemischer Derivatisierung In der Chromatographie verwendet man die chemische Derivatisierung zur Bestimmung von Substanzen, die an sich nicht chromatographier- und detektierbar sind (KIRSCHBAUM 1995) oder auch um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Durch die Derivatisierung kann auch eine Steigerung der Hydrophobizität der Aminoverbindungen erreicht werden (KIRSCHBAUM 1995), wodurch deren Trennung erleichtert wird. Es gibt grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren zur chemischen Derivatisierung von Aminen, die Nachsäulenderivatisierung und die Vorsäulenderivatisierung. Bei der auch in dieser Arbeit verwendeten Vorsäulenderivatisierung (pre-column derivatization) werden die bereits derivatisierten Amine chromatographisch getrennt (KIRSCHBAUM 1995). Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Cl) Im Jahr 1983 setzten EINARSSON et al. FMOC-Cl erstmals zur Analyse von Aminosäuren ein. Abb. 3.3.1 Schematische Darstellung der Derivatisierungsreaktion 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid reagiert schnell und vollständig sowohl mit primären als auch mit sekundären Aminogruppen zu stabilen, fluoreszierenden Carbamaten (vgl. Abb. 3.3.1). Die Reaktion, bei der HCl abgespalten wird, läuft im leicht alkalischen Milieu innerhalb von 30 Sekunden bis drei Minuten ab (BETNÉR u. FÖLDI 1986; GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990; KIRSCHBAUM u. LUCKAS 1994). HARDUF et al. (1988) und BETNÉR und FÖLDI (1988) berichten über die gute Stabilität der entstehenden Derivate. Auch EINARSSON et al. (1983) zeigten, dass die Derivatisierungsprodukte von zwanzig untersuchten Aminosäuren eine hohe Stabilität aufweisen, mit Ausnahme des Derivatisierungsprodukts von Histidin. Ein weiterer Vorteil der Methode ist die hohe Empfindlichkeit mit einer Nachweisgrenze im femtomolaren Bereich (EINARSSON et al. 1983; BETNÉR u. FÖLDI 1988; COHEN u. STRYDOM 1988; GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990). Aus diesem Grunde ist diese Reaktion auch gut für die Vorsäulenderivatisierung von Aminoverbindungen geeignet (KIRSCHBAUM 1995). Im Gegensatz zu ortho-Phtaldialdehyd (OPA, GRESNER 2011) ist FMOC-Cl selbst fluoreszierend. Um eine quantitative Reaktion zu ermöglichen, muss es im Überschuss eingesetzt werden (BETNÉR u. FÖLDI 1988). Überschüssiges FMOC-Cl und fluoreszierende - 48 - Eigene Untersuchungen Nebenprodukte dürfen die Analyse der fluoreszierenden Aminderivate nicht durch Koelution stören. Da jedoch die derivatisierten Aminosäuren und das FMOC-Cl-Reagenz annähernd übereinstimmende Exzitations- und Emissionsspektren sowie auch übereinstimmende Retentionszeiten aufweisen (GUSTAVSSON u. BETNÉR 1990), muss das unverbrauchte FMOC-Cl nach dem Derivatisierungsvorgang wieder entfernt werden (COHEN u. STRYDOM 1988; SCHUSTER 1988; FÜRST et al. 1990). BETNÉR u. FÖLDI (1988) versuchten, den FMOC-Cl-Überschuss mit Adamantanamin (ADAM) zu entfernen, indem es nach der Aminosäurenderivatisierung dem Derivatisierungsansatz zugegeben wurde. Auch im Rahmen dieser Arbeit wurde Adamantanamin (ADAM) zur Entfernung des FMOC-Cl-Überschusses verwendet. Die Durchführung der Analysen basierte im Wesentlichen auf der Anleitung der Fa. Maisch (Ammerbruch, Deutschland, siehe Anhang) zur Analyse von Aminoverbindungen nach FMOC-Cl-Derivatisierung mit einer speziellen ReproSil-FMOC-H Säule, die entsprechend den speziellen Anforderungen modifiziert wurde (Anleitung siehe Anhang 9.2). 3.3.3 Analytisches Verfahren Im Zuge dieser Arbeit war es notwendig, während einer Vorversuchsphase eine Methode zu etablieren, die es ermöglichte, Biogene Amine und Aminosäuren reproduzierbar und in ausreichender Sensitivität in der komplexen Matrix Pansensaft zu detektieren. Als Grundlage diente die Anleitung der Fa. Maisch (Ammerbuch, Deutschland). Die in der folgenden Tabelle (Tab. 3.3.1) aufgeführten Parameter ließen sich schließlich anhand eines geeigneten Gradientensystems nach FMOC-Derivatisierung mittels HPLC analysieren. Tab. 3.3.1: Übersicht über die untersuchten Parameter (Dimension = µmol/L) Parameter Aminosäuren Alanin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Histidin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin, Valin, GABA, DABA 3.3.4 Biogene Amine Serotonin, Histamin, Agmatin, Citrullin, Indolessigsäure HPLC-Anlage, Geräte und Chemikalien 3.3.4.1 HPLC-Anlage Die Bestimmung der Konzentrationen von Biogenen Aminen und Aminosäuren fand mittels einer HPLC-Anlage, bestehend aus folgenden Komponenten, statt: - 49 - Eigene Untersuchungen Abb. 3.3.2: HPLC-Anlage Tab. 3.3.2: Legende zu Abb. 3.3.2 Legendensymbol a b c d e f g h i j k Einheit Fluoreszenzdetektor Autoinjektor Säulenofen Hauptsäule Vorsäule Sättigungssäule Kontrolleinheit Pumpe Puffervorrat Degaser Auswertung Bezeichnung, Hersteller Shimadzu® RF-10AXL FLUORESCENCE DETECTOR, Shimadzu, Duisburg, Deutschland Shimadzu® Sil-9A Auto Injector, Shimadzu, Duisburg, Deutschland Shimadzu® CTO-10AS VP Column Oven, Shimadzu, Duisburg, Deutschland ReproSil FMOC 5µm 250x4mm, Dr. Maisch® GmbH, Ammerbruch, Deutschland ReproSil FMOC 5µm 250x4mm 10 VSK, Dr. Maisch® GmbH, Ammerbruch, Deutschland ReproSil Sättigungssäule 33x4mm, Dr. Maisch® GmbH, Ammerbruch, Deutschland Shimadzu® CBM-20A prominence COMMUNICATION BUS MODULE, Shimadzu Shimadzu® LC-20AT prominence LIQUID CHROMATOGRAPH, Shimadzu 5 bzw. 2 L Flaschen, Schott Duran 01123828, Schott, Mainz, Deutschland Sykam® S 7505 Vakuum Degaser, Sykam®, Fürstenfeldbruck, Deutschland Software: Shimadzu® LC-10 (bis Lauf 8 Tag 20), Shimadzu, Duisburg, Deutschland Shimadzu® LC-Solution (ab Lauf 8 Tag 21), Shimadzu, Duisburg, Deutschland - 50 - Eigene Untersuchungen Durch eine Reihe von Vorversuchen wurde der optimale Gradient zur Auftrennung des Pansensafts ermittelt (s. Tab. 3.3.4). Ziel waren eine optimale Trennschärfe der Peaks, eine möglichst gute Integrierbarkeit, kurze Analysezeiten und sparsamer Umgang mit den zur Verfügung stehenden Chemikalien. Die Höhe eines integrierbaren Peaks muss hierbei mindestens die Höhe des dreifachen Basislinienrauschens überschreiten. Verwendet wurden jeweils die Eluenten A und B (Zusammensetzung siehe Tab. 3.3.3), die sich insbesondere in ihrer Polarität unterschieden. Die verwendeten Eluenten wurden aus einem Natriumacetatpuffer (50 M, pH 4,2) und Acetonitril (HPLC-grade, Chem-Lab Art. CL000174-2500) hergestellt. Tab. 3.3.3: HPLC-Eluentenzusammensetzung Substanz Natriumacetat-Puffer Eluent (Puffer) A Eluent (Puffer) B Zusammensetzung 2,5 L Aqua bidest. mit 7,8 mL 96 %iger Essigsäure versetzen und mit 5 M Natronlauge pH 4,2 einstellen Natriumacetat-Puffer : Acetronitril (8:2) Natriumacetat-Puffer : Acetronitril (2:8) Die Eluenten wurden dem System durch die Pumpe in unterschiedlichen Konzentrationen zugeleitet, beginnend mit 0 % Eluent B und 100 % Eluent A und einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute. Im Laufe der Zeit wurde die Konzentration des Eluenten B erhöht, bis zur Minute 50, ab der ausschließlich Puffer B vom System verwendet wurde. Nach Minute 60 wurde das System wieder auf Eluent A umgestellt, um sämtliches Material regelrecht von der Säule zu „waschen“. Insgesamt wurde die Dauer einer Messung auf 70 Minuten festgelegt. Im Folgenden wird das verwendete Gradientensystem dargestellt (Tab. 3.3.4 und Abb. 3.3.3). Tab. 3.3.4: Verwendetes Gradientensystem Zeit in Minuten Flussrate in mL % Puffer B 0,01 1 0 35 1 40 40 1 60 45 1 70 50 1 100 55 1 100 60 1 100 60,01 1 0 70 1 STOP - 51 - Eigene Untersuchungen Konzentration Puffer B (%) Konzentration Puffer B (%) Gradientensystem 100 75 50 25 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zeit (Min) Abb. 3.3.3: Gradientensystem graphische Darstellung Die Flussrate wurde am 15.10.2009 zugunsten einer besseren Trennung auf 1,2 mL pro Minute erhöht. Durch dieses Gradientensystem ergeben sich Chromatogramme mit spezifischen Retentionszeiten für jede Substanz, deren Konzentration über die Peakfläche (= Flächenintegral) quantifizierbar ist. 3.3.4.2 Sonstige Geräte und Laborzubehör Tab. 3.3.5: Verwendete Gerätschaften Bezeichnung Autosamplerfläschchen Deckel für Autosamplerfläschchen Septen Pufferflaschen Feinwaage Artikel und Hersteller Art. CD0821010, Fa. Poeck Analytik-Zubehör GmbH, Langen, Deutschland Art. GVWP01300, Fa. Millipore, Billerica, MA, USA BP 221 S, Fa. Sartorius, Göttigen, Deutschland 5 bzw. 2 L Flaschen, Schott Duran, Art. 01123828, Schott, Mainz, Deutschland Sartorius handy U120-XD2, Sartorius, Göttigen, Deutschland Sonstige (Bechergläser, Messkolben, Glasröhrchen, Lamellenstopfen etc.) - 52 - Eigene Untersuchungen Tab. 3.3.6: Zusammensetzung der verwendeten Reagenzien Reagenz DerivatisierungsPufferlösung Bezeichnung, Zusammensetzung Kaliumborat-Puffer, Borsäure, Kaliumchlorid, Natriumhydroxid, pH 11, Art. HC 827346 Aminosäurenstandard AS-Standard (Sigma A-2161) Konzentration 25 nmol/ml (=25µmol/L) je AS, Cystein 12,5 nmol/ml, enthält zudem NH3 ADAM-Lösung 45,6 mg Adamantanamin (Art.-Nr. A 1260) in 3 mL Boratpuffer und 3 mL Aceton (40 mM) FMOC-Reagenz FMOC-Cl 2,5 mM gelöst in Aceton, Art.Nr. 23184 Acetonitril Acetonitril für die Flüssigkeitschromatographie, Art. 9017 Essigsäure Essigsäure 100% (Eisessig), Art. 2500 NaOH 5 M, Art. HC 945059 HCl 5 M, Art. 109058 Sulfosalicylsäure 5-Sulfosalicylic Acid, Art. S-0640 Histamin Histamin-Hydrochlorid, Art. H-7250 Serotonin Serotonin-Hydrochlorid, Art. H-9523 DABA Agmatin DL-2,4 Diaminobutyric acid dihydrochloride, Art. D 3758 γ-Aminobutyric acid dihydrochloride, Art. A 5835 Agmatin, Art. A 7127 Citrullin Citrullin, Art. C 7629 Indolessigsäure Indolessigsäure, Art. I 375-0 Methanol Methanol, HPLC Gradient, Art. ONU 1230 salzsaure D-Norvalinlösung, Art. N 7377 GABA Norvalin - 53 - Hersteller Fa. Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma, St. Louis, MO, USA Fa. J. T. Baker®, Phillipsburg, NJ, USA Fa. Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland Fa. Merck® KGaA, Darmstadt, Deutschland Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich® , St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich® , St. Louis, MO, USA Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma®, St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA Carlo Erba Reactifs, Val de reuil, Frankreich Sigma®, St. Louis, MO, USA Eigene Untersuchungen 3.3.4.3 Vermessungen von Standardreihen Im Anschluss an die Ermittlung des Gradientensystems wurde mit der Vermessung von Standards zur Ermittlung der optimalen Standardzusammensetzung und des Verteilungskoeffizienten begonnen. Gearbeitet wurde hierbei mit folgendem Derivatisierungsansatz: 80 µL Probe bzw. verdünnte Standardlösung + 75 µL Boratpuffer + 5 µL 2,5M NaOH ↓ + 160 µL FMOC-Reaktionslösung ↓ 60 Sekunden stehen lassen ↓ 200 µL ADAM-Lösung zugeben ↓ 60 Sekunden warten ↓ Verdünnung mit 280 µL Eluent A ↓ 5 Minuten warten ↓ 30 µL auf die HPLC-Säule injizieren. Lediglich die Herstellung der Standardlösung und der Ansatz mit Kaliumborat-Puffer, sowie Natronlauge erfolgten manuell, die weiteren Schritte wurden durch einen Autoinjektor (Shimadzu® Sil-9A Auto Injector) durchgeführt. Nachdem die Probe die Trennsäule durchlaufen hatte, kam es zur Vermessung über den Fluoreszenzdetektor, dessen elektronisches Signal schließlich über eine spezielle Software in Chromatogramme umgewandelt wurde. Als Software zur Auswertung stand während der Vorversuche bis einschließlich zur Vermessung von Lauf 8 Tag 20 die Shimadzu® LC-10 zur Verfügung, die anschließend durch die anwenderfreundlichere und weniger störanfällige Shimadzu® LCSolution ersetzt wurde. Abbildung 3.3.4 zeigt ein Beispielchromatogramm für die Vermessung eines Standards. - 54 - Ile Leu Serotonin Val Phe NOR GABA Met/NH3 Pro Lys Tyr Ala Gly Agmatine Histamin Ser IAA Cys 250 Asp Glu Thr Arg Citrullin 750 500 FMOC mV 1000 Detector A:Ex:263nm,Em:310nm DABA/His Eigene Untersuchungen 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 Abb. 3.3.4: Chromatogramm bei der Vermessung eines Standards Nach ersten Standardmessungen (n=6) ergaben sich folgende Variationskoeffizienten (in %): Verteilungskoeffizienten Variationskoeffizienten 20000000 1,56 18000000 16000000 Flächenintegral 14000000 12000000 10000000 2,78 2,09 8000000 6000000 20,03 4000000 2000000 2,82 2,38 2,58 2,47 1,63 1,35 18,68 2,38 18,04 1,10 8,95 13,74 17,15 9,81 29,90 15,08 3,13 Abb. 3.3.5: Variationskoeffizienten der ersten Standardmessungen - 55 - di n is ti sin u. H Ly D A BA on in Se ro t Le uc in Ph en ya la ni n Is ol eu ci n al in or va lin N V M et hi on in A BA G Pr ol in Ty ro si n lan in A ly ci n G lu ta m at Th re on in H ist am in G sp ar ta t A Se rin n rg in i A Cy sti n 0 65.0 min Eigene Untersuchungen Nach ersten Standardmessungen (n=6) ergaben sich die in der Abb. 3.3.5 dargestellten Variationskoeffizienten (in %). Jede der sechs Säulen pro detektierter Substanz entspricht hierbei einer Standardmessung. Die Höhe der Säule entspricht dem Flächenintegral. Die Zahl oberhalb jeder Säulengruppe bezeichnet den Variationskoeffizienten der entsprechenden Substanz, der durch den Vergleich von sechs aufeinanderfolgenden Messungen ermittelt wurde. Es zeigte sich, dass die Variationskoeffizienten bei etwa 60 % der untersuchten Aminosäuren unter 10 % lagen, lediglich Alanin, Methionin, Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Serotonin warteten mit größeren Unterschieden auf, so dass sich für sie ein entsprechend höherer Variationskoeffizient ergab. Insgesamt konnte eine Steigerung der Stabilität der gemessenen Werte der Aminosäuren Alanin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Threonin, Tyrosin und Valin bei weiteren Wiederholungsmessungen (Tab. 9.3.1) beobachtet werden, während Serin, GABA und DABA/His durch diese Wiederholungsmessungen in ihren Variationskoeffizienten auf > 10% (bis zu 30%) anstiegen. Insgesamt konnte eine Steigerung der Stabilität der gemessenen Werte bei weiteren Wiederholungsmessungen beobachtet werden (Tab. 9.3.1). Die ermittelten Variationskoeffizienten waren verleichbar mit jenen, die von GRESNER (2011) für die OPA-Methode ermittelt werden konnten (2,20 – 20,1%). Zwar war es durch die Verwendung der FMOC-HPLC möglich auch geringste Konzentrationen zu detektieren, jedoch resultierte dies nicht in einer Verbesserung der Empfindlichkeit, verglichen mit der OPA-Methode. Für die FMOC-HPLC mussten die Retentionszeiten der einzelnen Analyten mit Hilfe eines Standards und entsprechender Zulage, sowie Einzelmessungen ohne weitere Zusätze ermittelt werden. Hierbei war es durchaus möglich, dass eine Substanz nicht nur einen Peak, sondern mehrere erzeugte. Insbesondere war dies der Fall bei der Vermessung der Biogenen Amine Histamin und Serotonin. Vermutlich ist der Grund für diese Besonderheit in der außerordentlichen Instabilität und schnellen Bildung von Abbauprodukten zu suchen. Dennoch war es möglich, über Verdünnungsreihen zu zeigen, dass die Fläche eines bestimmten Peaks sich proportional zur Konzentration verhielt. Dieser Peak wurde letztlich als sog. Indikatorpeak für die Kalibration genutzt. Als geeignete Standardzusammensetzung ergab sich die Folgende: Standardlösung 80 µL 40 µL 10 µL 10 µL 2,5 µL 5 µL 5 µL 2,5 µL 2,5 µL 2,5 µL Kaliumborat-Puffer Amino-Acid-Solution Sigma AS-2161 Histamin-Lösung Serotonin-Lösung GABA/DABA-Lösung Norvalin-Lösung Sulfosalicylsäure (30%ig) Agmatin-Lösung Citrullin-Lösung Indolessigsäure-Lösung (gelöst in Eluent B) - 56 - Eigene Untersuchungen Aus der oben aufgeführten Zusammensetzung der Stabdardlösung, ergeben sich die folgenden Konzentrationen für den Standard: Analyt Alle Aminosäuren (excl. L-Cystein) L-Cystein GABA DABA Serotonin Histamin Norvalin Sulfosalicylsäure Agmatin L-Citrullin 3-Indolessigsäure Konzentration in µmol/L 12,5 6,25 15,2 8,2 574,8 49,3 15,6 1475,1 27,4 35,6 35,6 Weiterhin war die Vermessung von Standards in unterschiedlichen Verdünnungsstufen notwendig zur Kalibration der Software. Aufgrund der größeren Genauigkeit wurde eine 5-Punkt-Kalibration verwendet, die in regelmäßigen Abständen auf ihre Genauigkeit überprüft wurde. Ferner wurde die Stabilität der Derivatisierungsansätze unter verschiedenen Lagerungsbedingungen überprüft (siehe Tab. 3.3.7). Da es in allen Fällen z.T. zu erheblichen Abweichungen von den Analyseergebnissen im frischen Standard kam, wurden die Derivatisierungsansätze täglich frisch angesetzt. Aufgrund der fehlenden Kühlung des Autoinjektors und der langen Analysezeiten ist aber davon auszugehen, dass lagerungsbedingte Abweichungen der Analysenergebnisse insbesondere bei den Ansätzen, die lange im Autosampler verweilten, auftraten. Die Veränderungen sind vermutlich denen nach Lagerung bei 21°C (7 h) vergleichbar und betragen daher je nach Substanz 0,62 – 10,4 %. Auch während der Messungen lief immer eine bestimmte Anzahl von Standards in verschiedenen Verdünnungsstufen mit. Die Laufzeit von 70 Minuten pro Messung erlaubte es, etwa 18 Analysen pro Tag durchzuführen. - 57 - Eigene Untersuchungen Tab. 3.3.7: Veränderungen der Standardkonzentration durch Lagerungsbedingungen Substanz IAA Cys Arg Ser Asp Glu Citrullin Thr Histamin Gly Agmatin Ala Tyr Pro GABA Val Phe Ile Leu Serotonin Lys Standard 35,6 6,25 12,5 12,5 12,5 12,5 35,6 12,5 49,3 12,5 27,4 12,5 12,5 12,5 15,2 12,5 12,5 12,5 12,5 575 12,5 Lagerung 4°C 7 h 35,8 5,60 13,8 12,2 13,4 13,5 39,2 13,6 49,9 13,6 29,8 13,4 13,1 12,6 15,1 13,4 13,3 13,3 13,4 607 13,5 Konzentration in µmol/L Abweichung Lagerung Abweichung Lagerung Abweichung in % 21°C 7 h in % -18°C 7 h in % ≈ 0,62 33,0 ↓ 7,22 33,4 ↓ 6,26 ↓ 10,4 5,08 ↓ 18,7 4,26 ↓ 31,8 ↑ 10,0 12,1 ↓ 2,88 11,0 ↓ 12,0 ↓ 2,08 9,69 ↓ 22,5 7,33 ↓ 41,4 ↑ 6,88 11,9 ↓ 4,80 11,0 ↓ 11,8 ↑ 7,92 11,6 ↓ 7,12 11,4 ↓ 8,56 ↑ 10,1 34,6 ↓ 2,84 30,3 ↓ 14,8 ↑ 8,40 11,8 ↓ 5,28 11,1 ↓ 11,2 ↑ 1,34 48,0 ↓ 2,56 31,5 ↓ 36,1 ↑ 8,40 11,9 ↓ 4,80 10,1 ↓ 18,9 ↑ 8,87 27,2 ≈ 0,88 22,1 ↓ 19,5 ↑ 6,96 11,8 ↓ 5,36 10,6 ↓ 14,9 ↑ 4,72 12,2 ↓ 2,72 10,1 ↓ 19,6 ≈ 0,72 12,3 ↓ 1,52 9,86 ↓ 21,1 ≈ 0,86 14,5 ↓ 4,87 11,3 ↓ 25,9 ↑ 7,04 11,9 ↓ 4,64 10,3 ↓ 17,4 ↑ 6,56 12,0 ↓ 3,92 10,0 ↓ 19,9 ↑ 6,56 11,9 ↓ 4,80 9,55 ↓ 23,6 ↑ 7,28 11,9 ↓ 5,04 8,63 ↓ 31,0 ↑ 5,60 569 ↓ 1,01 382 ↓ 33,5 ↑ 8,32 11,7 ↓ 6,64 10,1 ↓ 19,6 - 58 - Eigene Untersuchungen 3.3.4.4 Vermessung von RUSITEC-Proben Zur Vermessung der RUSITEC-Proben wurden diese aufgearbeitet (s. 3.2.3) und ein Derivatisierungsansatz hergestellt. Die ersten Messungen dienten insbesondere der Feststellung, ob eine weitere Probenverdünnung notwendig wäre. Weder dürfen die entstehenden Peaks den maximalen Messbereich des Detektors von (1000 mV) überschreiten, noch dürfen sie kleiner sein, als das dreifache Basislinienrauschen. Folgende Abbildung (Abb. 3.3.6) stellt ein typisches Chromatogramm für die Vermessung einer Pansensaftprobe dar. - 59 - Phe Lys Cys 1000 FMOC mV Detector A:Ex:263nm,Em:310nm Met/NH3 Eigene Untersuchungen 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 30.0 35.0 40.0 Abb. 3.3.6: Chromatogramm bei der Vermessung einer Pansensaftprobe (aus RUSITEC) - 60 - DABA/His Leu Serotonin Ile NOR GABA Ala Gly 25.0 Pro 0 Tyr Arg Ser 250 Asp Glu Thr 500 Histamin 750 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min Eigene Untersuchungen Schon die Vermessung der ersten Proben zeigte eine massive Überlagerung des Peaks für Methionin mit dem für Ammoniak, die auch durch wiederholte Veränderung des Gradientensystems nicht zu verhindern war. Diese Besonderheit trat vermutlich aufgrund der im Pansensaft höheren Konzentration von Ammoniak (verglichen mit dem Standard) auf. Untrennbare Überlagerungen der Peaks traten ebebenfalls bei DABA und Histidin auf. Dennoch war es möglich, über den etablierten Gradienten alle in Tab. 3.3.1 aufgeführten Substanzen mit Ausnahme von Methionin, DABA und Histidin zu analysieren. Beim Vergleich zwischen Standardmessung und Probe fällt insbesondere der Bereich gegen Ende der Messung ins Auge, da hier die Probe erheblich mehr Peaks aufweist, als der Standard. Dies ist durch die außerordentliche Komplexität der Matrix Pansensaft zu erklären, die sicherlich noch eine Fülle von weiteren Substanzen enthält, die im Standard fehlen. Aus diesem Grund wurde auch während der Messungen immer wieder versucht, das Spektrum der detektierbaren Substanzen zu erweitern. So erklärt sich auch, dass die Biogenen Amine Citrullin, Agmatin und Indolessigsäure erst ab Lauf 8 detektiert wurden. Auch bei Untersuchung der Pansensaftproben wurde die Genauigkeit der Messmethode über Wiederholungsmessungen und Verdünnungsreihen überprüft. 3.3.4.5 Überprüfung der Methode Präzision in Serie Um die Präzision in Serie zu überprüfen, wurden aus einer Standardlösung bzw. einer Probe zehn resp. fünf Derivatisierungsansätze hergestellt und vermessen. Die jeweiligen Messergebnisse wurden tabellarisch ausgewertet (Vgl. Tab. 9.3.1 und 9.3.2 im Anhang). Der VK der Präzision liegt für die Summe der gemessenen Parameter bei der Standardvermessung zwischen 1,3 und 12,7 %. Nur für DABA/His ist er auf 30,7 % erhöht, was vermutlich der deutlichen Überlagerung beider Peaks und damit der ungenügenden Quantifizierung geschuldet ist. Für die Vermessung der Pansensaftproben, liegt der VK der Präzision für die Summe der gemessenen Parameter teilweise deutlich höher, zwischen 1,1 und 96,4 %, maximal auch hier der VK von DABA/His (159 %). Wiederfindungsrate Zur Überprüfung der Wiederfindungsrate wurden sowohl Standards, als auch Proben in unterschiedlichen Verdünnungsstufen vermessen. Zusätzlich sollte auf diese Weise ermittelt werden in welcher Verdünnung die jeweilige Substanz noch nachweisbar ist. Die im Standard bzw. der Probe der ersten Verdünnungsstufe (1:1) gemessenen Werte wurden hierbei als Referenzwert (=100 %) definiert und die weiteren Messergebnisse mit diesem Referenzwert ins Verhältnis gesetzt. Die jeweiligen Messergebnisse wurden tabellarisch ausgewertet (Vgl. Tab. 9.3.2.1 bis 9.3.2.4 im Anhang). Bei der Vermessung des ersten Standards waren bis zur Verdünnungsstufe 1:8 alle Substanzen detektierbar, bei einer weiteren Verdünnung auf 1:16 konnten Indolessigsäure, - 61 - Eigene Untersuchungen Serin und Agmatin nicht mehr nachgewiesen werden. Die Wiederfindungsraten lagen bis auf wenige Ausnahmen (Prolin und DABA/Histidin) nah an den zu erwartenden Werten. Bei der Vermessung des zweiten Standards waren bis zur Verdünnungsstufe 1:8 alle Substanzen detektierbar, bei 1:16 konnten Serin und Agmatin nicht mehr nachgewiesen werden. Die Wiederfindungsraten lagen bis auf Serin und GABA nahe den zu erwartenden Werten. Bei der Vermessung der ersten RUSITEC-Probe (Lauf 16 Tag 17 Fermenter 4) waren Serin, Histamin, Agmatin und GABA nicht nachweisbar (Anhang Tab. 9.3.2.3). Ohne Verdünnung der Probe (1:1) waren alle Substanzen detektierbar, schon bei einer Verdünnung von 1:2 waren jedoch Indolessigsäure, Cystein, Tyrosin und Isoleucin nicht mehr nachweisbar. Bei weiterer Verdünnung waren Leucin (1:4) bzw. Prolin, Phenylalanin, Serotonin und Lysin nicht mehr zu messen. In der stärksten Verdünnung (1:16) konnten Aspartat, Glycin, Alanin, Valin und Norvalin (interner Standard) nicht erfasst werden, DABA/Histidin, Citrullin, Arginin und Glutamat waren sogar hier noch ohne weiteres detektierbar. Die Wiederfindungsraten wichen z.T. stark von den zu erwartenden Werten ab. Lediglich die Wiederfindungsraten bei Citrullin und Prolin waren zufriedenstellend. Bei der Vermessung der zweiten RUSITEC-Probe (Lauf 11 Tag 8 Fermenter 2) waren wiederum Substanzen, wie Histamin, Agmatin, GABA und Isoleucin nicht nachweisbar (Anhang Tab. 9.3.2.4). Ohne weitere Verdünnung der Probe (1:1) waren alle weiteren Substanzen detektierbar, bei einer Verdünnung von 1:2 galt dies nicht mehr für Indolessigsäure und Cystein, bei 1:4 für Tyrosin und Leucin. Bei weiterer Verdünnung fehlten Aspartat, Prolin, Valin, Phenylalanin, Serotonin und Lysin (1:8) bzw. Threonin, Glycin und Norvalin im Chromatogramm. DABA/Histidin, Citrullin, und Arginin waren sogar in der stärksten Verdünnung noch ohne weiteres zu messen. Die Wiederfindungsraten wichen z.T. stark von den zu erwartenden Werten ab. Bei einer Proben- bzw. Standardmenge von 80 µL lagen die Wiederfindungsraten bei Standardvermessungen mit wenigen Ausnahmen sehr nah an den zu erwartenden Werten. Lediglich bei sehr starker Verdünnung (1:16) gab es deutliche Abweichungen. Die Wiederfindungsrate bei Standardvermessungen kann damit als zufriedenstellend bezeichnet werden. Bei den RUSITEC-Proben wichen die Wiederfindungsraten z.T. erheblich von den „Sollwerten“ ab. Insbesondere Verdünnungen über 1:4 schienen die Sicherheit der Messungen zu stören. Somit ist die Wiederfindungsrate bei der Probenvermessung nur bedingt als zufriedenstellend zu bezeichnen. Einige Substanzen, wie etwa Serin, GABA, Agmatin, Histamin und Isoleucin, wurden in den zwei zufällig gewählten Proben nicht nachgewiesen. Messgenauigkeit durch Doppelmessungen Für die Überprüfung der Messgenauigkeit wurden vier Proben bzw. Standards jeweils doppelt vermessen. Die jeweiligen Messergebnisse wurden tabellarisch ausgewertet (Vgl. Tab. 9.3.3.1 bis 9.3.3.2 im Anhang). Die Variationskoeffizienten lagen bei Standardvermessungen zwischen 0,03 und 18,1 %. Eine Ausnahme stellte der Variationskoeffizient von DABA/His dar, der bei den Messungen von Standard 1 und 3 deutlich höher (Max. 75,8 %) lag. Berücksichtigt man die Schwierigkeiten - 62 - Eigene Untersuchungen bei der Kalibration durch Überlagerung beider Peaks, lässt sich insgesamt eine zufriedenstellende Messgenauigkeit feststellen. Die Variationskoeffizienten der Probenvermessungen liegen zwischen 0,19 und max. 81,4 %. Sie sind höher als bei den Standards, was sicherlich durch Verunreinigungen in der komplexen Matrix begünstigt wurde. Als besonders gering stellte sich die Messgenauigkeit für Cystein, Histamin, Isoleucin und GABA dar. Hier ließ sich durch die gegebenen Versuchsparameter keine ausreichende Messgenauigkeit erreichen. Allerdings lag die in den Proben zu erwartende GABA-Konzentration um den Faktor 100 niedriger, als jene im Standard und somit in einem sehr niedrigen Konzentrationsbereich. 3.4 Statistische Auswertung Die gewonnenen Daten wurden in dem Datenverarbeitungsprogramm EXCEL 7.0® (Programm Winstat, Winstat für EXCEL) und dem Statistikprogramm SPSS®-StatistikProgramm (SPSS-PC-Inc Chicago®) verarbeitet. Zunächst wurde eine deskriptive Statistik zur Ermittlung von Mittelwerten ( x ) und Standardabweichung (s) für Kontrollsilage und Schadsilagen durchgeführt. Mittelwerte der Konzentrationen der einzelnen Substanzen an den einzelnen Versuchtagen für einzelne Schad- und Kontrollsilagen wurden für die verschiedenen Laufgruppen in Einzeldarstellungen gezeigt (Kap. 9.4; Abb. 9.4.1 ff.). Zur Berechnung wurden grundsätzlich 15 Läufe (Lauf 2 – 13 und 16 – 18) herangezogen. Die bei den jeweiligen Fermenterpaaren (Kontrollsilage bzw. Schadsilagen) zum gleichen Zeitpunkt anfallenden Messergebnisse wurden zum arithmetischen Mittel zusammengefasst (Vgl. Tab. 3.4.1) Weiterhin wurden die unter vergleichbaren Bedingungen erhobenen Messwerte (Zeitpunkt und Silagezulage identisch) einer Laufgruppe zum zweiten arithmetischen Mittel zusammengefasst (Vgl. Tab. 3.4.2). Tab. 3.4.1: Fermenterpaare zur Ermittlung des ersten arithmetischen Mittels Fermenter 1+2 3+4 5+6 Inhalt Kontrollsilage Schadsilage 1 Schadsilage 2 Tab. 3.4.2: Laufgruppen zur Ermittlung des zweiten arithmetischen Mittels Laufgruppe I II III IV V Läufe 2, 3, 4 5, 6, 7 8, 9, 10 11, 12, 13 16, 17, 18 Fermenter 1+2 K-01 K-01 K-01 K-01 K-01 Eingesetzte Silage Fermenter Fermenter 3+4 5+6 S-02 S-04 S-05 S-07 S-08 S-09 S-10 S-11 S-13 S-12 Im Anschluss wurde ein verbundener zweiseitiger t-Test durchgeführt um den Vergleich innerhalb der Gruppierungen zu testen. - 63 - Eigene Untersuchungen Zum Vergleich zwischen Schadsilagen und Kontrollen wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit den Faktoren Gruppe (Schadsilage vs. Kontrolle) und Phase durchgeführt. Die gesamte 28tägige Versuchsdauer wurde hierfür in die Phasen Einlauf (Tage 0 – 3), Kontrolle (Tage 4 – 9), Zulage I (Tage 10 – 14), Zulage II (Tage 15 – 19), Regeneration I (Tage 20 – 25) und Regeneration II (Tage 26 – 28) unterteilt. Die Zulage- und Regenerationsphase wurde unterteilt, da in den Darstellungen der Parameter in diesen Versuchsphasen unterschiedliche z. T. gegensätzliche Verläufe erkennbar sind (s. Kap. 9.4.1). Falls der Faktor Gruppe (Kontrolle vs. Schadsilage) signifikante Unterschiede (p < 0,05) ergab, wurde ein gruppierter zweiseitiger t-Test (inkl. Levene’s-Test auf Varianzhomogenität) für die einzelnen Phasen durchgeführt, mit dem Ziel, zu erkennen, in welcher Phase signifikante Unterschiede zwischen Kontrollen und Schadsilagen auftraten. Diese Ergebnisse wurden für jeden untersuchten Parameter graphisch im Boxplot dargestellt. Eine weitere Auswertung erfolgte durch die Erstellung von Differenzberechnungen. Hierfür wurden wiederum die Mittelwerte aller mit Schadsilagen bzw. Kontrollsilagen beladenen Fermenter jedes Versuchstags miteinander verrechnet (gruppierter zweiseitiger t-Test inkl. Levene’s-Test auf Varianzhomogenität). Anschließend wurde die prozentuale Differenz zwischen den mit Schad- bzw. Kontrollsilagen beladenen Fermentern ermittelt und graphisch dargestellt (Abb. 4.1.1). Insbesondere wurden hier auch die ergänzenden Kontrollen (K-14 bis K-16 u. K-18, K-20 u. K-21) aus den Läufen 14 und 15 berücksichtigt. Die für die statistischen Auswertungen erhobenen Parameter (Mittelwerte, Standardabweichungen und p-Werte) können den Tabellen 9.4.1.1 bis 9.4.2.20 des Anhangs (Kap. 9) entnommen werden. - 64 - Ergebnisse 4. Ergebnisse Die RUSITEC-Läufe wurden in verschiedene Phasen unterteilt, beginnend mit der Beladung an Tag 0, darauf folgend die Einlaufphase bis Tag 3, der Kontrollphase von Tag 4 bis 9 und der Zulagephase von Tag 10 bis Tag 19; bis Tag 28 schließt sich die Regenerationssphase an (vgl. Kap. 3.3). In der Ergebnisbeschreibung werden die Ergebnisse einer Laufgruppe (umfasst drei Läufe; s. Tab. 4.1) zu einer Grafik je analysierter Substanz zusammengefasst, wobei jeweils die Mittelwerte aus den Fermenterergebnissen je Tag dargestellt werden. Da in der Laufgruppe 5 ab Tag 20 andere Rahmenbedingungen vorlagen (Vitamin-E-Zulage), wurde auf die Darstellung dieser Werte verzichtet. Tab. 4.1: Laufgruppe I II III IV V Ergänzende Kontrollen Laufgruppen und Silageeinsatz (Lauf 2 bis 18), sowie Anzahl der gleich beladenen Fermenter (Summe der Fermenter mit Kontrollsilagen n=42; mit Schadsilagen n=60) Läufe 2, 3, 4 5, 6, 7 8, 9, 10 11, 12, 13 16, 17, 18 14 15 Fermenter 1 + 2 K-01 n=6 K-01 n=6 K-01 n=6 K-01 n=6 K-01 n=6 K-14 n=2 K-18 n=2 Silageeinsatz Fermenter 3 + 4 S-02 n=6 S-05 n=6 S-08 n=6 S-10 n=6 S-13 n=6 K-15 n=2 K-20 n=2 Fermenter 5+6 S-04 n=6 S-07 n=6 S-09 n=6 S-11 n=6 S-12 n=6 K-16 n=2 K-21 n=2 4.1 Konzentrationen von Aminosäuren und Biogenen Aminen im Pansensaft in vitro Zur Verdeutlichung der prozentualen Unterschiede zwischen Kontrollsilage- und Schadsilageeinsatz in der Zulage, wurde eine graphische Darstellungsweise gewählt (s. Abb. 4.1.1). Insbesondere wurden hier auch die Läufe 14 und 15 berücksichtigt, die ausschließlich der Vermessung ergänzender Kontrollen (K-14-16, K-18, K-20, K-23) dienten. Es wurde aus allen erfassten Schadsilagen (n=60) und allen Kontrollsilagen (n=42) jeweils das arithmetische Mittel je Analyt für jeden Versuchstag ermittelt. Anschließend wurden diese beiden Werte gegeneinander subtrahiert und die prozentuale Abweichung dargestellt. Dabei entsprechen die mittleren Konzentrationen der Kontrollsilagenzulage der Nulllinie, prozentuale Abweichungen nach oben oder nach unten stellen höhere bzw. niedrigere Werte in den Versuchen mit Schadsilagezulage dar. Diese Art der Darstellung wird im Folgenden als „Differenzberechnung“ bezeichnet. In der Boxplotdarstellung war es möglich bei der Gegenüberstellung der Ergebnisse der Schad- und Kontrollsilagenzulage verschiedene Gruppen zu bilden (Abb. 4.1.3). Es ergeben sich fünf Gruppen, die jeweils eine bestimmte Phase im Versuchsablauf umfassen. Hier wurden die arithmetischen Mittelwerte der Tage in einer Phase jeweils für Schad- und Kontrollsilagezulage ermittelt. Dargestellt wurden im Boxplott Mittelwerte, 1. und 3. Quantil und die jeweilige Standardabweichung. - 65 - Ergebnisse Veränderungen der Konzentrationen in einzelnen Fermentern bei unterschiedlicher Beladung wurden ebenfalls graphisch dargestellt (im Folgenden „Einzeldarstellungen“). Hierbei wurde zur Vereinfachung eine einheitliche Darstellungsweise gewählt, die sich lediglich in der Skalierung der y-Größenachse zwischen den unterschiedlichen Analyten unterscheidet (s. Abb. 4.1.2). Aufgrund der geringen Anzahl signifikanter Unterschiede zwischen einzelnen Fermentern, wurden diese nicht in den graphischen Darstellungen dargestellt, sondern im Text erwähnt.Nacheinander werden proteinogene Aminosäuren, nicht-proteinogene Aminosäuren und Biogene Amine besprochen. Diese Ergebnisse befinden sich aufgrund ihres Umfangs im Anhang (Kap. 9.4; Abb. 9.4.1 ff.), Tabelle 4.2.2 fasst jedoch die wichtigsten Ergebnisse aus den Einzeldarstellungen zusammen. 4.1.1 Cystein Differenzberechnung Die prozentualen Unterschiede in den Cysteinkonzentrationen (Abb. 4.1.1) aller mit Schadsilagen beladenen Fermentern gegenüber den Kontrollfermentern waren in der Zulagephase größer (+ 150 %) und an den Tagen 21 und 26 höher. Während der Einlaufphase und gegen Ende der Regenerationsphase konnten geringere (- 25 %) Konzentrations unterschiede gegenüber den Kontrollsilagen erfasst werden. - 66 - Ergebnisse Tägliche prozentuale Veränderungen der Cysteinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.1) Abb. 4.1.1: Prozentuale Cysteinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Schadsilagen > Kontrollsilagen Kontrollsilagen > Schadsilagen Boxplot Auch in der Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.2) ist erkennbar, dass in den Zulagephasen I und II alle Schadsilagen höhere mittlere Cysteingehalte in der Fermenterflüssigkeit verursachten, als alle Kontrollen. Auffällig war hier auch die hohe Standardabweichung für Schadsilagen, besonders während der Zulagephase II. - 67 - Ergebnisse Abb. 4.1.2 Boxplotdarstellung der Cysteinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage < 0,1: Tendenz (*) < 0,05: Signifikanz : < 0,05 schwach signifikant * < 0,01 signifikant ** < 0,001 hoch signifikant *** Einzeldarstellungen Bei Zulage einzelner Schadsilagen (Abb. 9.4.1.1) konnten lediglich bei S-08, S-09 während der gesamten Zulagephase und bei S-02 und S-04 nur zu Beginn der Zulagphase höhere Konzentrationen gegenüber der Kontrolle (K-01) beobachtet werden. - 68 - Ergebnisse 4.1.2 Arginin Differenzberechnung Bei Betrachtung der prozentualen Argininunterschiede (Abb. 4.1.3), konnten zu Beginn unter Schadsilageeinfluss geringere Argininkonzentrationen gemessen werden, jedoch schwanken diese im weiteren Verkauf stark (+ 75 bis - 25%). Nach Zulagenende lagen die Argininkonzentrationen in allen Fermentern bei Schad- und Kontrollsilagenzulage enger als zu Versuchsbeginn beieinander (Schadsilageeinatz: ca. + 20 % gegenüber Kontrollsilagen). Tägliche prozentuale Veränderungen der Argininkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.2) Abb. 4.1.3: Prozentuale Argininunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.4) zeigt, dass in der Kontroll- und Zulagephase I und II die Argininkonzentrationen bei Kontrollsilageneinsatz höher waren, als bei Schadsilageeinsatz. In den Regenerationsphasen I und II zeigen wiederum die Fermenter mit Schadsilageneinsatz deutlich höhere Konzentrationen, als die Kontrollen. - 69 - Ergebnisse Abb. 4.1.4 Boxplotdarstellung der Argininkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Innerhalb der Laufgruppen (Abb. 9.4.1.2) konnten deutlich höhere Argininkonzentrationen bei den Schadsilagezulagen S-09 und S-12 im Vergleich zu K-01 gemessen werden, hieraus resultierten auch die Schwankungen am Tag 12 in der Differenzberechnung (Abb. 4.1.3). Die Konzentration in Fermentern mit S-09 lagt an den Tagen 16 und 17 deutlich oberhalb der Konzentration bei K-01 (p<0,05). - 70 - Ergebnisse 4.1.3 Serin Differenzberechnung Über die gesamte Versuchsdauer waren die Serinkonzentrationen in den mit Schadsilage beladenen Fermentern geringer, als in den Kontrollfermentern (Abb. 4.1.5). Besonders deutlich war dies am Zulagenbeginn (Tag 11) und an deren Ende (Tag 19; Schadsilagen: - 70 %) der Fall. Nach Absetzen der Silage näherten sich die Seringehalte bis Versuchsende in allen Fermentern den Kontrollwerten an. Tägliche prozentuale Veränderungen der Serinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.3) Abb. 4.1.5: Prozentuale Serinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Serinkonzentration in der Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.6) zeigt im Vergleich zwischen Kontrollen und Fermentern mit Schadsilagezulage deutliche Unterschiede. Schon während der Kontrollphase lagen die Konzentrationen bei Kontrollfermentern deutlich höher. In beiden Zulagephasen konnten hier ebenfalls deutlich höhere Serinkonzentrationen bei Kontrollsilagenzulage ermittelt werden. In den Regenerationsphasen widerum zeigten sich kaum Konzentrationsunterschiede zwischen beiden Gruppen. - 71 - Ergebnisse Abb. 4.1.6 Boxplotdarstellung der Serinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Nur geringe Unterschiede waren zwischen den einzelnen Silagen messbar (Abb. 9.4.1.3). Auffällig war jedoch die Laufgruppe 5, mit deutlich geringeren Serinkonzentrationen unter S13-Zulage, im Vergleich zur Kontrolle K-01. Statistische Unterschiede bestanden nur in Laufgruppe 4 zwischen den Zulagen von K-01 und S-11 (Tag 11: p<0,05; Tag 12 u. 13 p<0,1). Die hohen Seringehalte in den Fermentern der ergänzenden Kontrollen (Werte s. 9.4.2.3) bewirkten die negativen Abweichungen zwischen den Ergebnissen der Differenzberechnung (Abb. 4.1.5) und den Ergebnissen der Einzelläufe (Kap. 9.4.1). - 72 - Ergebnisse 4.1.4 Aspartat Differenzberechnung Der Einfluss der Schadsilagen (Abb. 4.1.7) ist sofort nach Beladung erkennbar (Tag 11 – 16; 70 %). Einzig an den Tagen 17 und 20 war die Konzentration bei Schadsilageneinsatz ggr. Höher. An Tag 17 resultierte diese Erhöhung vermutlich aus den Einzelwerten der Schadsilagen S-02, S-04 und S-05; jene an Tag 20 vermutlich aus der hohen Konzentration, die bei S-04 an diesem Tag ermittelt werden konnte. Tägliche prozentuale Veränderungen der Aspartatkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.4) Abb. 4.1.7: Prozentuale Aspartatunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.8) aller Kontrollen im Vergleich zu Fermentern mit Schadsilagezulage zeigt Unterschiede in der Aspartatkonzentration während der Kontroll- und Zulagephase I. Die Aspartatkonzentration in den Kontrollfermentern lag hier höher, als jene in den Schadsilagefermentern. In beiden Zulagephasen und der Regenerationsphase II waren hingegen die Konzentration in den Fermentern nahezu identisch. - 73 - Ergebnisse Abb. 4.1.8: Boxplotdarstellung der Aspartatkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Die Aspartatunterschiede zwischen den einzelnen Fermentern in den Laufgruppen (Abb. 9.4.1.4) waren gering. Lediglich bei Zulage von S-02, S-04, S-05 und S-07 zeigten sich tendenziell am Zulagenbeginn höhere Konzentrationen als bei K-01-Gabe. - 74 - Ergebnisse 4.1.4 Glutamat Differenzberechnung Die mittleren Glutamatkonzentrationen (Abb. 4.1.9) unter Schadsilageneinfluss lagen bis einschließlich Tag 20 unterhalb der Werte für die Kontrollsilagen. Dieser Unterschied war besonders während der Zulagephase ausgeprägt (- 30 % an Tag 13). Lediglich zum Versuchsende (Tag 21 bis 27) überstiegen die Konzentrationen bei Schadsilagen- jene bei Kontrollsilageneinsatz. Tägliche prozentuale Veränderungen der Glutamatkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.5) Abb. 4.1.9: Prozentuale Glutamatunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Mit Ausnahme der Regenerationsphasen zeigt die Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.10) eine ggr. höhere Glutamatkonzentration in den Fermentern mit Kontrollsilagezulage, im Vergleich zu den Fermentern, die mit Schadsilagen beladen wurden. In den Regenerationsphasen war dies umgekehrt. - 75 - Ergebnisse Abb. 4.1.10 Boxplotdarstellung der Glutamatkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Nur geringe Unterschiede zeigten sich in einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.5). Bei Zulage von S-05 bis S-11 lag die Glutamatkonzentration leicht unterhalb der Werte für K-01-Zulage. Einzig unter Schadsilage S-13 wurde an Tag 11 (Zulagenbeginn) ein höherer Gehalt als im Kontrollfermenter (K-01) gemessen. - 76 - Ergebnisse 4.1.5 Threonin Differenzberechnung Die mittleren Threoninkonzentrationen lagen während der gesamten Versuchsdauer bei Schadsilagezulage unterhalb der Konzentrationen der Kontrollen (Abb. 4.1.11). Besonders deutlich war dies an den Tagen 13 bis 19 (Zulagenende) zu erkennen. Während der Erholungsphase wurden die Unterschiede geringer. Tägliche prozentuale Veränderungen der Threoninkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 –13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.6) Abb. 4.1.11: Prozentuale Threoninunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Threoninkonzentrationen im Boxplot (Abb. 4.1.12) lagen in allen Phasen des Versuchs in den Kontrollfermentern deutlich höher, als in den Fermentern mit Schadsilagebeladung. Besonders deutlich war der Unterschied zwischen beiden Gruppen während der Kontroll- und Zulagephase (p<0,01). - 77 - Ergebnisse Abb. 4.1.12 Boxplotdarstellung der Threoninkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Bei den einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.6) lagen die erfassten Threoninkonzentrationen unter Schadsilageeinsatz geringgradig unterhalb den Vergleichswerten der K-01-Zulage. Dieser Effekt war am Zulagenende deutlicher ausgeprägt, als zu Beginn (Tage 11 – 13). - 78 - Ergebnisse 4.1.6 Glycin Differenzberechnung Insgesamt zeigten sich bei Schadsilageneinsatz in der Differenzberechnung (Abb. 4.1.13) deutlich geringere Glycinkonzentrationen (bis – 50 %), als bei den Kontrollsilagegaben. Während der Zulagephase waren zwischen einzelnen Versuchstagen extreme Konzentrationsschwankungen unter Schadsilageneinfluss zu erkennen (± 40 %). Tägliche prozentuale Veränderungen in den Glycinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.7) Abb. 4.1.13: Prozentuale Glycinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Im Boxplot (Abb. 4.1.14) zeigt sich, dass die Glycinkonzentrationen in allen Phasen in den Kontrollen höher waren, als in den Fermentern mit Schadsilageneinsatz, besonder während der Kontroll- und Zulagephase I, sowie der Regenerationsphase I (p<0,05). In der Regenerationsphase II unterschieden sich die Glycinkonzentrationen beider Gruppen kaum. - 79 - Ergebnisse Abb. 4.1.14 Boxplotdarstellung der Glycinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Die Glycinkonzentrationen in den einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.7) zeigten bei Silagezulage sehr unterschiedliche Verläufe: während der Großteil der eingesetzten Schadsilagen (S-02, S-04, S-10, S-12 und S-13) keine Veränderungen hervorrief, lagen die Konzentrationen bei S-05- und S-11-Zulage unterhalb und jene bei S-07- und S-08-Zulage oberhalb der Werte für K-01. Statistische Unterschiede zeigte ein Vergleich zwischen K-01Zulage und S-05-Zulage an Tag 18 (p<0,1) und Tag 19 (p<0,05). - 80 - Ergebnisse 4.1.7 Alanin Differenzberechnung Die Alaningehalte in mit Schadsilage beladenen Fermentern wiesen in der prozentualen Differenzberechnung (Abb. 4.1.15), mit Ausnahme von Tag 0 (Beladung), eine geringere Konzentration auf, als die Kontrollfermenter. Besonders deutlich waren die Unterschiede während der Zulagephase (bis zu - 55 % an Tag 13). In der Erholungsphase reduzierten sich diese Unterschiede deutlich (Tag 26 bis 28 - 25 % unterhalb der Kontrollfermentergehalte). Tägliche prozentuale Veränderungen der Alaninkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.8) Abb. 4.1.15: Prozentuale Alaninunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.16) zeigt, dass die Alaninkonzentrationen in allen Phasen in den Kontrollen höher waren, als in den Fermentern mit Schadsilageneinsatz. In der Kontrollphase waren die Unterschiede der Alaninkonzentrationen zwischen beiden Gruppen geringer ausgeprägt. - 81 - Ergebnisse Abb. 4.1.16 Boxplotdarstellung der Alaninkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Die Laufgruppen (Abb. 9.4.1.8) zeigten bei einzelnen Schadsilagen (S-05, S-08, S-09, S-10, S-11) verringerte Alaninkonzentrationen während der Zulagephase gegenüber K-01-Zulage auf; hingegen zeigten insbesondere S-02, S-04, S-07, S-13 und S-12 kaum Unterschiede im Vergleich zu K-01. - 82 - Ergebnisse 4.1.8 Tyrosin Differenzberechnung In der prozentualen Differenzberechnung (Abb. 4.1.17) schwankten die mittleren Tyrosinkonzentrationen z.T. beträchtlich zwischen den einzelnen Versuchstagen (bis zu 30 %), waren gegenüber den Kontrollen jedoch immer niedriger. Der größte Unterschied zeigte sich zu Zulagenbeginn (Tag 12, 13; bis zu – 72 %). Am Ende und insbesondere während der Erholungsphase verringerten sich die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, sowie die Schwankungen zwischen den Versuchstagen. Tägliche prozentuale Veränderungen der Tyrosinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.9) Abb. 4.1.17: Prozentuale Tyrosinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Im Boxplot (Abb. 4.1.18) zeigen sich deutliche Unterschiede zwischen den Tyrosinkonzentrationen während der Zulagephase I (p<0,01) und II (p<0,05), aber auch während der Kontrollphase (p<0,05). Fermenter mit Schadsilagebeladung zeigten hier deutlich niedrigere Konzentrationen in der Fermenterflüssigkeit, als die Kontrollen. In der Regenerationsphase II waren diese nahezu identisch. - 83 - Ergebnisse Abb. 4.1.18 Boxplotdarstellung der Tyrosinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Im Vergleich zwischen den einzelnen Schadsilagen und der Kontrolle K-01 (Abb. 9.4.1.9) zeigten sich kaum Tyrosinunterschiede. Lediglich unter S-10- und S-11-Einfluss konnten in der ersten Zulagephasenhälfte höhere und in der zweiten Hälfte geringere Konzentrationen gegenüber K-01 gemessen werden. - 84 - Ergebnisse 4.1.10 Prolin Differenzberechnung Mit Einsetzen der Schadsilagezulage fiel die mittlere Prolinkonzentration in der prozentualen Differenz (Abb. 4.1.19) im Vergleich zu den Kontrollen kontinuierlich ab und erreichte an Tag 18 einen Tiefstwert von - 50,2 %. Erst nach fünf Tagen Regenerationsphase näherte sich der Gehalt unter Schadsilagenzulage wieder den Kontrollgehalten an. Tägliche prozentuale Veränderungen der Prolinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.10) Abb. 4.1.19: Prozentuale Prolinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Im Boxplot (Abb. 4.1.20) zeigten sich zwischen den einzelnen Fermentationsphasen beider Gruppen deutlichen Unterschiede bezüglich der Prolinkonzentration insbesondere in der Kontrollphase (Schadsilagen > Kontrollen; p<0,05). Während der Zulagephase II (p<0,01) und der Regenerationsphase I hingegen, kehrt sich diese Situation um. In der Zulagephase I und Regenerationsphase II waren die Konzentrationen annähernd identisch. - 85 - Ergebnisse Abb. 4.1.20: Boxplotdarstellung der Prolinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen In einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.10) zeigten sich geringere Prolinkonzentrationen im Vergleich zur K-01 in der Zulagephase (S-04, S-05, S-07 und S-09). Signifikante Unterschiede waren zu erkennen: K-01 und S-04 gegen Ende der Zulagephase (Tag 19 – 21; p<0,1) und in der Zulagephase zwischen K-01 und S-09 (Tag 18 – 19; p<0,05). - 86 - Ergebnisse 4.1.9 Valin Differenzberechnung Schon in der Einlauf- und Kontrollphase zeigten sich geringere Valinkonzentrationen in Fermentern mit Schadsilageneinsatz in der Differenzberechnung (Abb. 4.1.21), verglichen mit den mittleren Konzentrationen aller Kontrollen. Zu Zulagenbeginn verstärkte sich dies deutlich, so dass Unterschiede von bis zu – 42,5 % (Tag 11) erfasst wurden. Auch waren starke Schwankungen zwischen den einzelnen Versuchstagen zu erkennen. Zum Zulagenende verringerte sich dieser Effekt jedoch und insbesondere in der Erholungsphase näherten sich die Konzentrationen einander an, so dass an Tag 28 kaum prozentuale Unterschiede zwischen Schadsilagen- und Kontrollsilageneinsatz bestanden. Tägliche prozentuale Veränderungen in den Valinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte 9.4.2.11) Abb. 4.1.21: Prozentuale Valinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Ergebnisdarstellung im Boxplot (Abb. 4.1.22) zeigt, dass in der Kontrollphase und den Zulagephasen die mittleren Valinkonzentrationen in den Kontrollfermentern höher waren, als in den Schadsilagefermentern. Hingegen waren während der Regenerationsphase I und II die Konzentrationen bei Schadsilageeinsatz höher. - 87 - Ergebnisse Abb. 4.1.22 Boxplotdarstellung der Valinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Wurden die Silagen jedoch einzeln in den Laufgruppen (Abb. 9.4.1.11) miteinander verglichen, so ergab sich ein anderes Bild: die Zulagen von S-07 – S-09 bzw. S-13 bewirkten deutlich höhere Valinkonzentrationen in der Fermenterflüssigkeit gegenüber K-01; S-02, S-05 und S-11 hingegen zeigten besonders zum Zulagenbeginn geringere Gehalte als K-01. - 88 - Ergebnisse 4.1.10 Phenylalanin Differenzberechnung Tägliche prozentuale Veränderungen der Phenylalaninkonzentration (Abb. 4.1.23) zeigten bei Schadsilageneinsatz ab Tag 8 eine mittlere Konzentration unterhalb der Kontrollen, diese Differenz vergrößerte sich unter Schadsilageneinfluss (bis zu - 59,5 %). Mit Ausnahme von Tag 21 waren die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen am Ende der Erholungsphase nicht sehr deutlich ausgeprägt (± 4 – 9 %). Tägliche prozentuale Veränderungen der Phenylalaninkonzentrationen in allen mit Schad- (S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.12) Abb. 4.1.23: Prozentuale Phenylalaninunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Auffällig ist hier in der Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.24), dass die Phenylalaninkonzentration in den Kontrollen in allen Phasen, mit Ausnahme der Regenerationsphase II, deutlich höher war, als in den Schadsilagefermentern. In der Regenerationsphase I waren diese Unterschiede besonders deutlich ausgeprägt (p<0,05). - 89 - Ergebnisse Abb. 4.1.24: Boxplotdarstellung der Phenylalaninkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Vergleiche einzelner Silagezulagen in den Laufgruppen (Abb. 9.4.1.12) mit der jeweiligen Kontrolle (nur K-01, ohne ergänzende Kontrollen) ergaben eine andere Aussage: lediglich in der S-05-Zulagephase wurden geringere Phenylalaninkonzentrationen gegenüber der K-01Zulage erfasst. S-02 und S-04 verursachten besonders zu Beginn einen Konzentrationsanstieg, hingegen S-08, S-09, S-12 und S-13 während der gesamten Zulagephase. - 90 - Ergebnisse 4.1.11 Isoleucin Differenzberechnung In der prozentualen Differenzberechnung (Abb. 4.1.25) zeigten sich insgesamt deutliche Unterschiede der mittleren Isoleucinkonzentrationen, die fast + 200 % bei Schadsilageneinsatz erreichen. Während der Zulagephase stiegen die Konzentrationen bei Schadsilageneinsatz, verglichen mit den Kontrollen, insbesondere zum Ende hin deutlich an. Bis Tag 21 glichen sich die Konzentrationen beider Gruppen wieder an und schwankten in der Erholungsphase um bis zu 50 %. Tägliche prozentuale Veränderungen der Isoleucinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – 13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte 9.4.2.13) Abb. 4.1.25: Prozentuale Isoleucinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplots (Abb. 4.1.26) für die Isoleucinkonzentrationen während der unterschiedlichen Fermentationsphasen zeigen deutliche Unterschiede. Zu Beginn des Versuchs, während der Kontrollphase, zeigten Fermenter mit Schadsilageneinsatz annähernd identische Konzentrationen, wie jene mit Kontrollsilageneinsatz. Mit Beginn der Silagezulage lagen die Konzentrationen der Schadsilagefermenter höher und blieben es auch, bis zum Ende der Regenerationsphase II, wenn auch letztere Phase geringer ausgeprägte Differenzen aufzeigte. - 91 - Ergebnisse Abb. 4.1.26 Boxplotdarstellung der Isoleucinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Im Vergleich zur K-01-Zulage zeigten sich in den einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.13) nur geringe Unterschiede zwischen einzelnen Schadsilagen und der Kontrolle. An einzelnen Tagen waren kurzfristige Konzentrationsanstiege zu messen (S-05, S-08, S-11). - 92 - Ergebnisse 4.1.12 Leucin Differenzberechnungen Die Darstellung der prozentualen Differenzen (Abb. 4.1.27) zeigt, dass vom Beginn des Versuchs, bis zum Zulagenende an Tag 20 die Leucinkonzentration in den Fermentern mit Schadsilagen geringer war, als in den Kontrollen. Auch hier zeigten sich deutliche Schwankungen, besonders während der Erholungsphase (Tag 20 u. 27) Die größten Unterschiede (ca. - 30 %) wurden am Zulagenbeginn (Tag 8), -ende (Tag 19) und am letzten Versuchstag (Tag 28) ermittelt. Tägliche prozentuale Veränderungen in den Leucinkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.14) Abb. 4.1.27: Prozentuale Leucinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.28) der Leucinkonzentrationen zeigt zu Beginn des Versuchs höhere Konzentrationen in den Kontrollfermentern, im Vergleich zu den Fermentern mit Schadsilageeinsatz. In der Zulagephase I und der Regenerationsphase I waren die Konzentrationen in den Schadsilagefermentern etwas höher. Die Regenerationsphase II wiederum wies nahezu identische Konzentrationen bei beiden Gruppen auf. - 93 - Ergebnisse Abb. 4.1.28 Boxplotdarstellung der Leucinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Bei der Darstellung der einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.14) zeigten die Schadsilagen S-08, S-11 und S-13 im Vergleich zur Kontrollsilage während der Zulagephase kurzfristig höhere Konzentrationen. - 94 - Ergebnisse 4.1.13 Lysin Differenzberechnung Die mittleren prozentualen Veränderungen der Lysinkonzentrationen (Abb. 4.1.29) zeigen zu Versuchsbeginn (bis Tag 8) unter Schadsilageeinsatz etwa 25 % niedrigere Gehalte gegenüber den Kontrollsilagen. Unmittelbar mit Zulagenbeginn (Tag 11) verstärkten sich diese Unterschiede, so dass hier Differenzen von - 51,3 % für die Schadsilagenfermenter ermittelt werden konnten. Ab Zulagephasenmitte (Tag 16) verringerten sich diese Unterschiede stetig, auch an Tag 28 lagen die Werte der Schadsilagefermenter 30 % unterhalb der Kontrollen. Tägliche prozentuale Veränderungen der Lysinkonzentrationen in allen mit Schad- (S02 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.15) Abb. 4.1.29: Prozentuale Lysinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplotdarstellung (4.1.30) zeigt während der Kontroll- und Zulagephase I deutliche Unterschiede bezüglich der Lysinkonzentration zwischen Kontrollen und Fermentern mit Schadsilagen (Kontrollen > Schadsilagen). In der Zulagephase II waren die Konzentrationen annähernd identisch, während in der Regenerationsphase die Lysinkonzentrationen in Fermentern mit Schadsilagebeladung niedriger waren. - 95 - Ergebnisse Abb. 4.1.30: Boxplotdarstellung der Lysinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Im Vergleich zur K-01-Zulage lagen die Lysinkonzentrationen in den einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.15) während der Zulagephase bei S-08 bis S-13 deutlich höher, bei S-02 und S-04 besonders in der ersten Hälfte der Zulage. Die Ergebnisse der statistischen Auswertung (s. Kap. 9.4.1) zeigten im Vergleich zwischen S-02, S-04, S-09 bzw. S-10 und K-01 signifikante Unterschiede in der Zulagephase (insbes. Tag 11 - 16). - 96 - Ergebnisse 4.1.14 GABA Differenzberechnung Die prozentuale Differenzberechnung (Abb. 4.1.31) zeigt schon in der Einlauf- und Kontrollphase mittlere höhere GABA-Konzentrationen in Fermentern, die später mit Schadsilagen beladen wurden (+ 58,1 %). Am Zulagenbeginn verstärkten sich diese Unterschiede und wurden besonders deutlich an den Tagen 13 bis 18 (bis zu + 380 %). Am Zulagenende verringerten sich die Unterschiede, so dass in der Regenerationsphase unter Schadsilageeinsatz zuerst leicht erhöhte Konzentrationen gegenüber den Kontrollen, die sich allerdings bis Tag 28 wieder deutlich vergrößerten (+ 162 %), messbar waren. Tägliche prozentuale Veränderungen der GABA-Konzentrationen in allen mit Schad(S-02 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.16) Abb. 4.1.31: Prozentuale GABA-Unterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. - 97 - Ergebnisse Boxplot Insgesamt zeigen sich im Boxplot (Abb. 4.1.32) ausgeprägte Unterschiede zwischen den GABA-Konzentrationen in Schadsilagefermentern und Kontrollen. Während der gesamten Versuchsdauer wiesen Schadsilagefermenter z.T. deutlich höhere GABA-Konzentrationen auf, als die Kontrollen. Besonders ausgeprägt waren diese Unterschiede während der Zulagephase I (p<0,01) und II (p<0,1). Aber auch in den Regenerationsphasen war dies sichtbar, bei insgesamt geringeren GABA-Konzentrationen. Auffällig sind auch hier die großen Standardabweichungen, besonders während der Zulagephase in den Fermentern mit Schadsilageeinsatz. Einzelne Fermenter zeigten hier extrem hohe GABA-Konzentrationen. Abb. 4.1.32: Boxplotdarstellung der GABA-Konzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. - 98 - Ergebnisse Einzeldarstellungen Die einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.16) zeigen, dass einzelne Schadsilagen in der Zulagephase eine erhöhte GABA-Konzentration gegenüber den jeweiligen Kontrollen in der Fermenterflüssigkeit verursachten (S-04, S-05, S-07, S-08). Signifikante Unterschiede zeigten sich im Vergleich zwischen der Zulage von K-01 und S-07 (Tag 19 u. 20; p<0,05). Jedoch schwankten die Konzentrationen in der Zulagephase zwischen den einzelnen Tagen deutlich. Tab. 4.1.1: GABA-Gehalte der verwendeten Silagen in g/kg TS und mittlere Konzentrationen in der Fermenterflüssigkeit während der Zulagephase der entsprechenden Silage (in µmol/L) Silagebezeichnung K-01 K-14 K-15 K-16 K-18 K-20 K-23 Mittelwert Kontrollen S-02 S-04 S-05 S-07 S-08 S-09 S-10 S-11 S-12 S-13 Mittelwert Schadsilagen GABA-Gehalt der Silage (g/kg TS) 4,77 3,07 3,51 4,54 3,50 3,04 3,53 3,71 GABA-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit (µmol/L) 3,74 0,13 0,79 1,52 0,02 0,35 0,11 0,95 7,27 4,70 8,31 5,85 7,87 7,32 6,25 5,92 5,88 7,21 6,66 4,33 8,47 19,3 9,41 8,29 6,44 1,62 0,93 0,29 0,33 5,94 Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland) GABA-Gehalte der eingesetzten Silagen Eingesetzte Silagen wurden vor ihrem Einsatz im RUSITEC auf ihren GABA-Gehalt untersucht (Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland). Zur Ermittlung einer eventuellen Korrelation wurden diese Ergebnisse wurden mit den Fermenterergebnissen in Bezug gesetzt (Abb. 4.1.32.1). Es ergab sich eine deutlich positive Korrelation (r = 0,61) zwischen den GABA-Gehalten in der Silage und in der Fermenterflüssigkeit. - 99 - Ergebnisse GABA-Korrelation zwischen Fermenterflüssigkeit (Tage 10-19) und Silagegehalt in Silage (g/kg TS) GABAGABA in Silage g/kg TS 10.00 8.00 r = 0.61 6.00 4.00 2.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 GABA in Fermenterflüssigkeit (µmol/L) Abb. 4.1.32.1: Korrelation zwischen den GABA-Gehalten der eingesetzten Silage (Schadsilagen vs. Kontrollsilagen ) und der Fermenterflüssigkeit während der Zulagephase (Tage 10 – 19) - 100 - Ergebnisse 4.1.15 Indolessigsäure Differenzberechnung In der Differenzberechnung (Abb. 4.1.33) lag die Indolessigsäurekonzentration bei Schadsilageeinsatz zu Zulagenbeginn an den Tagen 11 bis 17 um bis zu 64,2 % niedriger, als die der Kontrollen. Am Zulagenende kehrte sich diese Situation um und an den Tagen 18 und 19 wurden bei den Schadsilagen höhere Werte erfasst, als in den Kontrollen. Nach Zulagenende glichen sich die Werte bis Tag 28 einander an, lagen jedoch in den Schadsilagen deutlich unterhalb der Kontrollsilagenwerte. Tägliche prozentuale Veränderungen der Indolessigsäurekonzentrationen in allen mit Schad- (S-08 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.17) 25 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag -25 % -50 -75 -100 Abb. 4.1.33: Prozentuale Indolessigsäureunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Boxplotdarstellungen (Abb. 4.1.34) der Indolessigsäurekonzentrationen in den Fermentern mit Schadsilageeinsatz und Kontrollen zeigen ein heterogenes Bild. In der Kontrollphase konnte Indolessigsäure in den Kontrollen kaum nachgewiesen werden, hingegen konnten Konzentrationen bis zu 9,45 µmol/L in den Schadsilagefermentern detektiert werden. In der Zulage- und Regenerationsphase lag die Indolessigsäurekonzentration in den Kontrollen z.T. sehr deutlich oberhalb der Konzentration in den Schadsilagefermentern. Am Ende des Versuchs, während der Regenerationsphase II, verringerten sich diese Konzentrationsunterschiede deutlich. Besonders auffällig war hier die enorme Standardabweichung der Konzentrationen während der Zulagephase II bei Kontrollsilageeinsatz. - 101 - Ergebnisse Abb. 4.1.34: Boxplotdarstellung der Indolessigsäurekonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen In der Laufgruppe 5 (Abb. 9.4.1.17) lag die Indolessigsäurkonzentration bei S-12- bzw. S-13Zulage besonders in der zweiten Hälfte der Zulagephase deutlich unterhalb der Werte, die bei K-01-Zulage erreicht wurden. - 102 - Ergebnisse 4.1.16 Citrullin Differenzberechnung Die mittlere Citrullinkonzentration bei den Schadsilagen lag in der Differenzberechnung (Abb. 4.1.35) zu jeder Zeit während der Versuchsdauer unterhalb der erfassten Konzentration bei den Kontrollsilagen. Die stärksten Unterschiede wurden an den Tagen 13 bis 17 während der Zulage und an Tag 21 erreicht; hier unterschieden sie sich um bis zu 70,7 %. Gegen Versuchsende verringerten sich diese Unterschiede stetig. Tägliche prozentuale Veränderungen der Citrullinkonzentrationen in allen mit Schad(S-08 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.18) Abb. 4.1.35: Prozentuale Citrullinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplots (Abb. 4.1.36) für die Citrullinkonzentration zeigen unabhängig von der Gruppe starke Standardabweichungen. Deutliche Unterschiede konnten zwischen Kontrollen und Schadsilagefermentern schon während der Kontrollphase ermittelt werden (p<0,05), letztere zeigten hier detlich geringere Konzentrationen. Auch während der restlichen Versuchsphasen lag die Citrullinkonzentration in den Kontrollfermentern z.T. deutlich höher (Rgegenerationsphase I; p<0,001). Besonders während der Regenerationsphase II am Ende der Versuchsdauer waren geringere Unterschiede zu detektieren. - 103 - Ergebnisse Abb. 4.1.36 Boxplotdarstellung der Citrullinkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Bei den Laufgruppen 4 und 5 (Abb. 9.4.1.18) zeigten die einzelnen Schadsilagen im Vergleich zu K-01 lediglich geringe Unterschiede in der Citrullinkonzentration. S-12 und S13 führten tendenziell zu niedrigeren Konzentrationen in der Zulagephase, S-10 und S-11 zu höheren Citrullingehalten in der Fermenterflüssigkeit. - 104 - Ergebnisse 4.1.17 Histamin Differenzberechnung Die mittleren Histaminkonzentrationen in der Differenzberechnung (Abb. 4.1.37) sanken bei Schadsilageeinsatz zu Zulagenbeginn (insbes. Tag 12) deutlich unter die der Kontrollen. Am Zulagephasenende (Tag 17 – 20) stiegen sie wieder an und lagen etwa + 210 % oberhalb der Kontrollenkonzentrationen. Während der Erholungsphase unterschieden sich beide Zulagegruppen lediglich im Bereich von ± 20 %. Tägliche prozentuale Veränderungen der Histaminkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.19) Abb. 4.1.37: Prozentuale Histaminunterschiede zwischen Schad- und Kontrollsilagen; es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=10) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=7) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt, restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Im Boxplot (Abb. 4.1.38) lagen die mittleren Histaminkonzentrationen in den Zulage- und Regenerationsphasen in Schadsilagefermentern höher, als in den Kontrollen. In der Zulagephase II war die Konzentration in Schadsilagefermentern höher, was sich bis zum Ende der Versuchsdauer verstäkte. Letztere Phase wies bei Schadsilagefermentern eine besonders starke Standardabweichung auf. In einzelnen Fermentern konnten extrem hohe Histaminkonzentrationen und starke Schwankungen selbiger erfasst werden. - 105 - Ergebnisse Abb. 4.1.38: Boxplotdarstellung der Histaminkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Bei den auswertbaren Laufgruppen (Abb. 9.4.1.19) waren bis Tag 16 der Zulagephase keine Unterschiede messbar. Ab Tag 18 zeigten Fermenter mit S-08- und S-11-Zulage höhere Histaminkonzentrationen, als jene mit Zulage von K-01 (max. + 800 % bzw. + 400 %). - 106 - Ergebnisse 4.1.18 Agmatin Differenzberechnung In der prozentualen Differenzberechnung (Abb. 4.1.39) schwankte die mittlere Agmatinkonzentration bei Schadsilageneinsatz deutlich im Vergleich zu den Kontrollen, insbesondere gegen Zulagenende an Tag 18 (± 1365 %). Diese starke Abweichung zwischen der mittleren Konzentration bei Schad- und Kontrollsilageneinsatz lässt sich durch die hohe Agmatinkonzentration erklären, die bei S-11-Zulage ermittelt werden konnte (Abb. 4.1.59), es handelt es sich hierbei um einen stark abweichenden Einzelwert (Ausreißer). Zu Beginn des Versuchs und am Ende (Tag 28) lagen beide Konzentrationen sehr nah beieinander (± 20 %). Tägliche prozentuale Veränderungen der Agmatinkonzentrationen in allen mit Schad(S-08 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 9.4.2.20) Abb. 4.1.39: Prozentuale Agmatinunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot Die Boxplots (Abb. 5.1.40) zeigen während der Kontroll- und Zulagephase I, sowie der Regenerationsphase I höhere mittlere Agmatinkonzentrationen in den Kontrollen. In der Zulagephase II und der Regenerationsphase II unterschieden sich die mittleren Agmatinkonzentrationen beider Gruppen kaum. Zu beachten ist in diesem Fall auch die hohe Streuung der Einzelwerte, die sich auch in einer ausgeprägten Standardabweichung manifestiert. - 107 - Ergebnisse Abb. 4.1.40: Boxplotdarstellung der Agmatintkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Unterschiede zwischen einzelnen Silagezulagen und der Kontrolle K-01 ließen sich bei der Darstellung der einzelnen Laufgruppen (Abb. 9.4.1.20) nicht erkennen. - 108 - Ergebnisse 4.1.19 Serotonin Differenzberechnung In der Darstellung der prozentualen Veränderungen (Abb. 4.2.41) lagen bis Tag 13 die mittleren Serotoninkonzentrationen der Schadsilagefermenter zunächst leicht, dann deutlich oberhalb der Konzentrationen in der Kontrollgruppe. Einzig an Tag 16 wurden bei den Schadsilagen geringere Konzentrationen, als in den Kontrollen gemessen. Am Zulagenende und bis einschließlich Tag 21 zeigten sich starke Schwankungen, die bis zu 90 % betragen können. Auch hier lagen die Konzentrationen bei den Schadsilagen höher, als bei den Kontrollen. In der Erholungsphase verringerten sich zwar die Schwankungen, die Konzentrationen bei den Schadsilagen blieben jedoch unverändert hoch gegenüber den Kontrollen. Tägliche prozentuale Veränderungen der Serotoninkonzentrationen in allen mit Schad(S-02 – S-13) gegenüber allen mit Kontrollsilagen (K-01, K-14 – 16, K-19 – 21) beladenen Fermentern (Werte Tab. 4.2.21) Abb. 4.1.41: Prozentuale Serotoninunterschiede der Schadsilagen- gegenüber der Kontrollsilagenzulage (0-Linie); es wurden jeweils die Mittelwerte der Schadsilagen (n=60) mit den Mittelwerten der Kontrollsilagen (n=42) verrechnet und als prozentuale Differenz dargestellt. Restliche Legende s. Abb. 4.1.1. Boxplot In der Boxplotdarstellung (Abb. 4.1.42) konnten insbesondere in der Kontrollphase extrem hohe Serotoninkonzentrationen erfasst werden. Die mittlere Konzentration in den Kontrollfermentern lag hier niedriger, als in den Fermentern mit Schadsilageeinsatz. Während der Zulagephase waren in den Fermentern mit Schadsilageeinsatz höhere Konzentrationen zu erfassen. Insgesamt nahmen die Serotoninkonzentrationen zum Ende des Versuchs hin ab. In der Regenerationsphase waren die Konzentrationen in den Kontrollfermentern ggr. höher, als in den Fermentern mit Schadsilageeinsatz. - 109 - Ergebnisse Abb. 4.1.42: Boxplotdarstellung der Serotoninkonzentrationen der Schadsilagenzulage im Vergleich zur Kontrollsilagenzulage. Restliche Legende s. Abb. 4.1.2. Einzeldarstellungen Zwischen Schad- und Kontrollsilagenzulage waren in den Laufgruppen (Abb. 9.4.1.21) lediglich geringfügige Unterschiede zu verzeichnen. Die Zulage von S-04, S-12 und S-13 bewirkte höhere Serotoninkonzentrationen in der Fermenterflüssigkeit, im Vergleich zur K01. Besonders deutliche Unterschiede zeigten sich im Vergleich von K-01- und S-13-Zulage an den Tagen 13 (p<0,05), bzw. 16,17, 19 und 20 (p<0,1). - 110 - Ergebnisse Zusammenfassung Nach den Konzentrationsveränderungen während der Silagegabe in den Differenzberechnungen lassen sich zwei Hauptgruppen unterscheiden: die erste kleinere Gruppe umfasst alle Substanzen, deren Konzentration in den Fermentern mit Schadsilagen gegenüber jenen mit Kontrollsilagen höher ist; in der zweiten Gruppe, die die meisten proteinogenen Aminosäuren umfasst, liegen die Konzentrationen in den Fermentern unter Schadsilageeinfluss gegenüber allen Kontrollen niedriger. Gruppe 1: Serotonin, Isoleucin, GABA, Cystein, Aspartat, Glycin Gruppe 2: Serin, Glutamat, Threonin, Alanin, Tyrosin, Prolin, Valin, Phenylalanin, Lysin, Leucin, Indolessigsäure, (Citrullin) Die Konzentrationen von Leucin, Arginin und Citrullin liegen in den Schadsilagefermentern gegenüber den Kontrollen generell niedriger, und zeigen insbesondere in der Differenzberechnung hohe Schwankungen. Die Histaminkonzentration ist bei Schadsilageeinsatz im Vergleich zu den Kontrollen in der ersten Hälfte der Zulagephase leicht erniedrigt und in der zweiten Hälfte deutlich höher. - 111 - Ergebnisse Anhand der Konzentrationsveränderungen unter Silagegabe konnte für die einzelnen Schadsilagen gegenüber der jeweiligen Kontrolle K-01 zusammenfassend die folgende Tabelle (Tab. 4.2.1) erstellt werden, basierend auf den Darstellungen der Einzelsilagen (Abb. 9.4.1.1 ff.). Tab. 4.2.1 Aminosäuren Cys Arg Ser Asp Glu Thr Gly Ala Tyr Pro Val Phe Ile Leu Lys GABA Veränderungen der Substanzkonzentrationen während der Zulage der einzelnen Schadsilagen im Vergleich zur jeweiligen K-01-Zulage Silagen der Zulagephase S-02 S-04 S-05 S-07 S-08 S-09 S-10 S-11 ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ≈ ↑ ≈ ≈ ≈ ↑↑ ≈ ≈ ↑↑ ↑ ≈ ≈ ≈ ≈ ↑ ↑ ↑ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ↓ ↓ ≈ ≈ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑↑ ≈ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ≈ ↓ ↓ ↓ ↓ ≈ ↑ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ↑ ≈ ↓ ↓ ≈ ≈ ↓ ≈ ↓ ↓ ↑↑ * ↑ ↑↑ ↑↑ ≈ ≈ ↑↑ ↑↑ * * ↑↑ ↑ ≈ ↑ ↑ ↑ ↑ ≈ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ≈ ↑ ≈ ≈ ↑ ≈ ≈ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ≈ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑ ↑ ≈ Biogene Amine Indolessigsäure n.d. n.d. n.d. n.d. Citrullin n.d. n.d. n.d. n.d. Histamin ≈ ≈ ≈ ≈ Agmatin n.d. n.d. n.d. n.d. ≈ ↑ ≈ ≈ * * Serotonin ↑ ggr. Steigerung ↓ ggr. Verringerung ↑↑ mgr. Steigerung ↓↓ mgr. Verringerung ↑↑↑ hgr. Steigerung ↓↓↓ hgr. Verringerung Leere Felder: keine Auswertung möglich Fettdruck: ausführliche Besprechung in der Diskussion - 112 - ≈ ≈ * ↑ ↑ ≈ * ≈ ≈ * n.d. S-13 ≈ ≈ ↓↓ ≈ ↑ ↓ ≈ ↓ ≈ ≈ ↑ ↑ S-12 ≈ ↑↑ ≈ ≈ ≈ ↓ ≈ ↑ ↑ ≈ ↑ ↓ ≈ ↓ ≈ ≈ ≈ ≈ ↑ ↑↑ ↑ gleichbleibend heterogen nicht detektiert Diskussion 5. Diskussion 5.1 Intentionen der Arbeit Ziel dieser Arbeit war es Veränderungen von freien Aminosäuren, Biogenen Aminen und insbesondere GABA im Pansensaft in vitro bei Einsatz von Grassilagen mit auffälligem Reineiweißanteil vom Rohprotein zu erfassen. Ferner sollten Ursprung, Metabolisierung und Wirkungen einiger dieser biologisch wirkungsvollen Substanzen auf den Organismus besprochen werden um eventuelle Zusammenhänge mit der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ aufzudecken. Hierzu wurde die Analytik der zu untersuchenden Stoffe im Panseninhalt mit Hilfe der FMOC-Derivatisierung und anschließender HPLC-Trennung etabliert. 5.2 Kritische Betrachtungen der Versuchsanstellung 5.2.1 Das RUSITEC-System Die verwendeten Fermenterproben entstammen 17 RUSITEC-Läufen, die in den Jahren 2008 und 2009 im Pansenlabor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt wurden. Eine ausführliche kritische Betrachtung dieses Systems und der Versuchsläufe findet sich in der Dissertation von GAST (2010). 5.2.2 Die verwendeten Futtermittel Heu und Kraftfutter entsprachen den üblicherweise in der Praxis eingesetzten Futtermitteln (Futtermittelanalysen Kap. 9.1). Kontrollsilagen wurden definiert als Silagen, die keine Krankheiten in Milchviehbetrieben verursacht haben und den postulierten Mindestwert von 50 % für den Reineiweißanteil (RE) vom Rohprotein (Rp; EICKEN5) nicht unterschritten (excl. K-14). Die Reineiweißanteile der Kontrollsilagen lagen zwischen 67,3 % und 49,8 % RE in % vom Rp. Allen Schadsilagen war das Auftreten von Symptomen der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ in Betrieben gemein, sowie ein Reineiweißanteil von weniger als 50 % vom Rohprotein (excl. S-08, S-12). Die folgende Tabelle (Tab. 5.1) gibt einen Überblick über die verwendeten Silagen, geordnet absteigend nach ihrem prozentualen Reineiweißanteil. 5 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn K. Eicken, Hannover am 23. Februar 2011 - 113 - Diskussion Tab. 5.1: Ranking der Silagen nach ihrem RE in % vom Rp und Angabe von NH3 in % vom Rp und freie AS (fAS) in % der Gesamt-AS (gAS). Rang Silage RE % v. Rp NH3 % Rp fAS % gAS 1 67,3 1,80 17 K-20 2 59,7 2,55 38 S-08* 3 58,5 2,76 23 S-12* 4 57,1 1,98 24 K-15 5 55,5 2,05 26 K-18 6 54,2 1,91 29 K-23 7 51,5 2,46 27 K-16 8 50,5 2,48 32 K-01 9 49,8 2,20 27 K-14* 10 43,8 2,27 37 S-04 11 42,6 3,06 39 S-07 12 42,0 k. A. 44 S-05 13 40,8 k. A. 45 S-02 14 39,8 2,81 38 S-11 15 39,1 5,60 31 S-09 16 34,1 2,75 43 S-13 17 33,4 3,18 46 S-10 *: Schad- und Kontrollsilagen mit abweichendem Reineiweißgehalt (> 50 bzw. < 50 % v. Rp) fAS-Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland); NH3- u. RE-Analyse durch das Institut für Tierernährung (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) Das Ranking in der Tabelle 5.1 zeigt deutlich einen Zusammenhang zwischen dem RE-Anteil und dem Anteil an freien Aminosäuren (fAS) an den gesamten Aminosäuren (gAS): Sinkt der RE-Anteil, so steigt der Anteil der freien Aminosäuren deutlich an und umgekehrt (mit Ausnahme von S-08 und S-09). Dies deckt sich auch mit den Erhebungen von GRESNER (2011). 5.2.3 Beurteilung der verwendeten Analysemethode (FMOC-Derivatisierung und HPLC) Die in dieser Arbeit verwendete FMOC-Derivatisierung stellt eine Verbesserung zur OPAMethode dar, die in der Dissertation von GRESNER (2011) zur Aminosäureanalytik identischer Proben verwendet wurde. Gegenüber der OPA-Methode traten folgende Probleme nicht oder vermindert auf: vermehrtes Auftreten von Störpeaks, starke Verschiebungen der Retentions-zeiten einzelner Substanzen, Überlagerungen von Analyten, hohe Variationskoeffizienten in der Serie, relativ hohe Nachweisgrenze der Substanzen (GRESNER 2011). Bei der FMOC-Derivatisierung handelt es sich um eine sog. Vorsäulenderivatisierung, von Vorteil sind die Möglichkeit zu längeren Reaktionszeiten sowie der geringe Verbrauch an - 114 - Diskussion Derivatisierungsreagenz. Der während der Derivatisierung und anschließenden Bindung des FMOC-Überschusses durch ADAM entstehende FMOC-OH Störpeak, störte aufgrund seiner relativ späten Retentionszeit kaum und diente sogar zur Orientierung (Beschriftung als FMOC; Abb. 3.3.4) während der Integration der Chromatogramme. Anhand der Chromatogramme zeigt sich auch die sehr gute Trennung der Substanzen, sowohl im Standard, als auch bei der Vermessung der Fermenterproben. Die hohe Automatisierbarkeit der HPLC-Analytik beschränkte die manuelle Vorbereitung auf Probenansatz, Standard- und Pufferherstellung. Die weiteren Zusätze von Derivatisierungsreagenzien wurde durch einen Autoinjektor (Shimadzu® Sil-9A Auto Injector, Shimadzu, Duisburg, Deutschland) durchgeführt. Die geringe Nachweisgrenze im femtomolaren Bereich, die gute Trennung der Substanzen in Standard und Proben, sowie die hohe Messgenauigkeit (Kap. 3.3.4.5) zählen zu den besonderen Vorteilen dieser Methode. Insgesamt stellt die HPLC somit ein Verfahren dar, das sich gut für die Analyse von freien Aminosäuren und Biogenen Aminen auch in komplexen Matrices, wie Fermenterflüssigkeit, eignet. 5.2.4 Beurteilung der Probenlagerung und Aufbereitung Die Lagerung der deproteinisierten und aufgearbeiteten Fermenterproben erfolgte bei -18°C. Die Zeitspanne zwischen Einlagerung und Vermessung betrug z.T. mehr als ein Jahr. Leider konnten auch nach intensiver Literaturrecherche keine Untersuchungen zur Stabilität von Aminosäuren und Biogenen Aminen im Pansensaft bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen gefunden werden. VAN EIJK et al. (1994) postulieren für deproteinisierte Serumproben eine Lagerung bei -70°C über 24 Wochen ohne nennenswerte Veränderungen der Aminosäurekonzentrationen. Entsprechende Lagerungsbedingungen und eine zügigere Vermessung könnten auch bei deproteinisierten Fermenterproben einen Aminosäureabbau verhindern. Weiterhin kann es während der Lagerung durch Sauerstoffeinwirkung zu Veränderungen der Proteinstruktur, die ebenfalls die Konzentrationen von Aminosäuren und Biogenen Aminen beeinflussen, kommen (ÖZMEN6). Um endgültig eine Bewertung der Stabilität von Fermenterproben unter bestimmten Bedingungen vornehmen zu können, sind weitergehende Untersuchungen notwendig. 5.3 Auswahl und Kritik der Parameter 5.3.1 Verwendete Parameter Zur Kontrolle der Stabilität der Fermentationsvorgänge im RUSITEC-System wurden Parameter die den Kohlenhydrat- und Stickstoffstoffwechsel beschreiben erfasst, zu denen unter anderem pH-Wert, Gaszusammensetzung und –menge gehörten (näheres s. Diss. GAST 2010). Mittels HPLC-Analytik war es möglich in einem Standardgemisch und aus der Fermenterflüssigkeit freie Aminosäuren und Biogene Amine zu analysieren. Zu den freien Aminosäuren gehören die proteinogenen Aminosäuren Cystein, Arginin, Serin, Aspartat, 6 Laut persönlicher Mitteilung von Frau Dipl. Chem. S. Özmen, Hannover am 20. November 2010 - 115 - Diskussion Glutamat, Threonin, Glycin, Alanin, Tyrosin, Prolin, Valin, Phenylalanin, Isoleucin, Leucin und Lysin sowie die nicht-proteinogene Aminosäure GABA. Innerhalb der Gruppe der Biogenen Amine war es möglich Histamin und Serotonin in allen Läufen, sowie Indolessigsäure, Agmatin und Citrullin ab Lauf 8 zu erfassen. Mit dem verwendeten Gradientensystem gelang es hingegen nicht die Substanzen Putreszin, Cadaverin, Tryptamin und Tryptophan zu analysieren. 5.3.2 Kritik der Parameter 5.3.2.1 Bestimmungen freier Aminosäuren und Biogener Amine im Pansensaft in vitro Variationskoeffizienten in der Serie bei Standardvermessung lagen größtenteils unter 20 % bzw. 10 % (vgl. Tab. 9.3.1) und somit in einem zufriedenstellenden Bereich. Bei der Fermenterprobenvermessung lagen die Variationskoeffizienten deutlich höher (vgl. Tab 9.4.2), insbesondere bei Indolessigsäure (77,6 %), Aspartat (58,2 % bzw. 84,1 %), Tyrosin (85,3 % bzw. 83,2 %) und Phenylalanin (8,03 % bzw. 96,4 %) konnten sehr hohe Variationskoeffizienten ermittelt werden. Aufgrund dessen ist die Aussagekraft der Ergebnisse für diese Substanzen eingeschränkt. Allerdings können die hohen Variationskoeffizienten für die Fermenterprobenvermessungen aus den 28tägigen RUSITEC-Läufen nicht bestätigt werden. Die üblicherweise bei hohen Variationskoeffizienten auftretenden starken Konzentrationsschwankungen von Versuchstag zu Versuchstag konnten hier nicht beobachtet werden (Bsp. Abb. 9.4.1.5). Nicht ausgeschlossen werden können in diesem Zusammenhang Einflüsse durch die spezifische Säule, die bei der Überprüfung der Methode zum Einsatz kam. Die Serotonin-Kalibration im Standard war problemlos möglich, der VK lag hier bei 10,1 % (Tab. 9.3.1). Auch die Präzision in Serie bei Vermessung der RUSITEC-Proben war zufriedenstellend (Tab. 9.3.2). Dennoch konnte Serotonin während der Versuche nicht immer detektiert werden, z.T. in ungewöhnlich hohen Konzentrationen (bis > 450 µmol/L) verglichen mit den anderen Substanzen. Insbesondere waren diese hohen Konzentrationen an Tag 0 zu verzeichnen. Eine mögliche Erklärung ist das Vorhandensein einer Substanz mit gleicher Retentionszeit in den Fermenterproben aus dem RUSITEC. Auf die Darstellung der Ergebnisse von Histidin und DABA wurde verzichtet, da es mit den gewählten Gradientensystemen nicht möglich war diese Peaks voneinander zu trennen. Überlagerungen traten ebenfalls bei Methionin und Ammoniak auf, weshalb auch diese Ergebnisse nicht dargestellt wurden. Abb. 5.3.1: Überlagerung der Peaks von Methionin und NH3 bei einer Retentionszeit von 32,7 Min. (Ausschnitt aus einem Chromatogramm der Standardvermessung) - 116 - Diskussion Insgesamt waren die ermittelten Konzentrationen (vgl. Tab. 5.2 und 5.3) für Aminosäuren und Biogene Amine in der Fermenterflüssigkeit realistisch, verglichen mit den Ergebnissen von LEIBHOLZ (1969), BRÖCKER (1996), VELLE et al. (1997), VOLDEN et al. (2002), BRITO et al. (2006) und GRESNER (2011). Zu beachten ist hierbei, dass die Probenentnahme 23 h nach der Beladung im nüchternen Zustand (der Pansenpopulation) stattfand und ferner in vitro gemessene Konzentrationen häufig geringer auszufallen, als jene in vivo (GRESNER 2011). Bereits LEIBHOLZ (1971a, b) beschrieb einen Zusammenhang zwischen dem Fütterungszeitpunkt und der Konzentration freier Aminosäuren im Pansen. Auch die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen dies, da die Konzentrationen die an Tag 0 (3 h nach erstmaliger RUSITEC-Beladung) ermittelt wurden häufig stark abweichen (sowohl positiv als auch negativ; s. Tab. 5.2). Weiterhin ist ein Zusammenhang zwischen der Fütterungsart und der AS-Konzentration im Pansensaft beschrieben worden (LEIBHOLZ 1969). Auch die hier ermittelten Gehalte unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Fütterung (Silage oder Heu). Häufig konnten Unterschiede zwischen den verschiedenen Fermentern schon während der Einlauf- und Kontrollphase beobachtet werden, obwohl hier beide Fermentergruppen eine identische Heubeladung erfahren haben. Dies lässt darauf schließen, dass ganz erhebliche Fermentereinflüsse eine Rolle spielen und bei der Beurteilung der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. Untersuchungen zum Vorkommen und dem Gehalt von Biogenen Aminen im Pansensaft gibt es wenige. Die gemessenen Histaminkonzentrationen in der Fermenterflüssigkeit entsprechen annähernd denen von TVIET et al. (1992) postulierten Gehalten. SULTANA et al. (2001) geben als untere Nachweisgrenze (RP-HPLC) für Citrullin im Pansensaft 0,65 µmol/L an. Eine weitere Erklärung für Abweichungen innerhalb der in der Literatur beschriebenen Aminosäuregehalte im Pansensaft sowie zu den eigenen Ergebnissen, sind die unterschiedlichen Analysemethoden und Probenaufbereitungen, die zur Anwendung kamen (GRESNER 2011). Schon zwischen den Analysen identischer Proben per HPLC nach FMOC oder OPA-Derivatisierung (GRESNER 2011) lassen sich deutliche Unterschiede (insbes. Aspartat Glutamat, Threonin; s. Tab 5.2) erkennen. Die Werte für die FMOC-Methode ergeben sich aus dem arithmetischen Mittel aller Silagen und der ermittelten Standardabweichung der Ergebnisse für die einzelnen Läufe an einem bestimmten Tag des Versuchs (Tag 0) oder einer Versuchsphase (Heu + Kraftfutter: Einlauf- und Kontrollphase + Regenerationsphase, Silage + Kraftfutter: Silagezulagephase). - 117 - Diskussion Tab. 5.2: Aminosäuregehalte in der Fermenterflüssigkeit (µmol/L) in Abhängigkeit von der Fütterung im Vergleich zu anderen Analysemethoden (OPA-HPLC, GRESNER 2011) Threonin Prolin Lysin Alanin Serin Glycin Phenylalanin Glutamat Valin Arginin Tyrosin Cystein Aspartat Leucin Isoleucin Tag 0 19,3 ± 20,5 9,69 ± 4,37 13,7 ± 12,7 4,04 ± 2,37 0,82 ± 0,58 1,50 ± 1,13 44,1 ± 48,3 16,6 ± 11,3 3,77 ± 1,48 1,23 ± 0,85 5,17 ± 6,36 12,4 ±15,3 2,05 ± 1,29 3,52 ± 2,24 28,9 ± 35,7 GABA 11,9 ± 17,2 Tab. 5.3: Eigene Untersuchungen (FMOC) Silagezulage + KF Heu + KF 26,9 ± 11,3 27,5 ± 9,82 23,4 ± 13,3 12,3 ± 7,64 21,4 ± 14,6 13,9 ± 5,27 12,0 ± 18,9 9,96 ± 4,79 9,23 ± 8,66 5,65 ± 4,96 7,86 ± 2,49 4,81 ± 2,85 5,21 ± 3,73 3,15 ± 2,07 5,11 ± 2,19 6,73 ± 2,88 5,05 ± 3,52 5,08 ± 2,09 4,56 ± 2,82 4,47 ± 3,06 4,15 ± 4,06 6,27 ± 5,49 3,62 ± 4,87 1,08 ± 4,17 2,38 ± 2,95 2,02 ± 1,25 1,69 ± 2,27 1,29 ± 1,54 1,38 ± 1,93 0,65 ± 1,53 2,89 ± 3,07 GRESNER 2011 (OPA) 0,73 – 3,50 2,57 – 10,4 1,03 – 5,20 2,50 – 11,0 13,1 – 32,3 0,64 – 2,84 1,43 – 5,84 0,24 – 1,08 3,22 – 14,0 0,15 – 0,94 0,08 – 0,88 1,42 ± 0,49 Biogene Amine in der Fermenterflüssigkeit (µmol/L) in Abhängigkeit von der Fütterung Serotonin Agmatin Histamin Indolessigsäure Citrullin Tag 0 446 ± 429 3,64 ± 1,00 60,7 ± 85,8 3,08 ± 1,62 Silagezulage + KF 90,5 ± 74,4 17,6 ± 18,0 11,5 ± 16,7 5,32 ± 4,41 3,53 ± 2,28 - 118 - Heu + KF 137 ± 39,6 8,24 ± 7,67 22,9 ± 16,3 3,82 ± 1,80 2,73 ± 1,49 Diskussion 5.4 Auswirkungen von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißanteilen auf Aminosäuren und Biogene Amine im Pansensaft (in vitro) 5.4.1 Proteinogene Aminosäuren Insgesamt liegen freie Aminosäuren im Pansensaft in Konzentrationen von 2 - 25 µmol/L vor (BRÖCKER 1996). Die Ergebnisse der Aminosäureanalytik unterliegen allerdings verschiedenen Einflussfaktoren, hierbei insbesondere der Versuchsanstellung. Konzentrationsangaben schwanken entsprechend stark, je nach Literatur zwischen 0 und bis zu 2000 µmol/L (MATSUMOTO et al. 1984). Ein wesentlicher Faktor ist das System, hier zeigen in vitro-Systeme häufig niedrigere Konzentrationen, als in vivo ermittelt werden (CHALUPA 1976; GRESNER 2011). Des Weiteren spielen Tierart, Zeitpunkt und Art der Fütterung, Aufarbeitung und Entnahme der Proben, sowie das Analysesystem eine große Rolle. Bei der Untersuchung von Pansenflüssigkeit bei Schafen, fanden REMOND et al. (2000) im Gegensatz zum Rind hohe Konzentrationen freier Aminosäuren (bis zu 2,14 mM/L Glycin; entspricht 2140 µmol/L). Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen Art und Zeitpunkt der Fütterung bzw. nüchternen Tieren und der Aminosäurekonzentration in Pansen ermittelt werden (LEIBHOLZ 1969; VELLE et al. 1997; VOLDEN et al. 2002; BRITO et al. 2006). Dies konnte auch in dieser Arbeit bestätigt werden (s. Tab. 5.2). Insgesamt liegen die Konzentrationen der freien Aminosäuren bei nüchternen Tieren deutlich unterhalb der postprandial ermittelten Konzentrationen. Entnahme und Aufarbeitung der Proben können ebenfalls zu einer Beeinflussung der AS-Konzentrationen im Pansensaft führen. Insbesondere ist hier zu beachten, dass entnommene Proben möglichst schnell inaktiviert werden müssen, um einem fortschreitenden enzymatischen Ab- und Umbau vorzubeugen. Vergleicht man die Resultate von angesäuertem Pansensaft und Ultrafiltraten, so zeigen letztere häufig geringere Konzentrationen, da diese ausschließlich die Fraktion der extrazellulären Aminosäuren repräsentieren (WRIGHT u. HUNGATE 1967). Doch auch wenn der Vergleich mit anderen Autoren schwierig ist, so schmälert dies nicht die Aussagekraft dieser Arbeit, da diese insbesondere zum Ziel hatte, Konzentrationsveränderungen über einen bestimmten Zeitraum bei Verwendung unterschiedlicher Silagen zu bestimmen. Hierbei werden die Ergebnisse desselben Systems und identischer Probenmatrix miteinander in Beziehung gesetzt um bestimmte Verläufe und Dynamiken darzustellen. Grundsätzlich können freie Aminosäuren im Pansen mikrobiellen oder nutritiven Ursprung sein, wobei letztere einen geringeren Anteil ausmachen (NOLAN u. DOBOS 2005). Mikrobiell entstandene Aminosäuren werden i.d.R. rasch und vollständig abgebaut oder dienen der mikrobiellen Proteinsynthese. Bei schnellem Proteinabbau kann jedoch die Kapazitäten der Mikroorganismen überschritten werden und insbesondere bei Energiemangel kann es zur Akkumulation von AS kommen (WALLACE 1996, 1997). Beim Vergleich zwischen den Aminosäuremustern einzelner Silagen und der Fermenterflüssigkeit konnten kaum Übereinstimmungen gefunden werden (GRESNER 2011). Da die Probenahme ca. 23 h nach der letzten Beladung stattgefunden hat, ist deshalb eine schnelle und umfangreiche Metabolisierung der Aminosäuren zu unterstellen. Bereits CHALUPA (1976) postulierte Abbaugeschwindigkeiten der freien AS von 0,1 bis 0,9 mmol/h. Des Weiteren kommt es bei der gewählten Versuchsanstellung zu einem Austausch von 0,28 mL Fermenterflüssigkeit mit speichelähnlichem Puffer pro Minute, insgesamt also 386 mL in 23 - 119 - Diskussion Stunden (Zeitraum zwischen Beladung und Probennahme). Bei einer unterstellten sofortigen homogenen Verteilung in der Fermenterflüssigkeit (insgesamt 800 mL), kann davon ausgegangen werden, dass ein geringer Anteil (ca. 0,035 % ≙ 0,28 von 800) der Substanzen auf diese Weise pro Minute in den Überstand gelangt. Bei einem Zeitraum von 23 h zwischen Beladung und Probennahme (≙ 1380 Minuten) befinden sich zum Zeitpunkt der Probennahme 62 % der ursprünglich eingesetzten Menge jeder beliebigen Substanz in der Fermenterflüssigkeit7. Ausgeprägte Unterschiede, zwischen der Zulage von Schad- und Kontrollsilagen ließen sich für Glycin, Prolin und Lysin ermitteln (vgl. Tab. 4.2.1). Sonstige Unterschiede der Konzentration der untersuchten proteinogenen Aminosäuren in der Fermenterflüssigkeit bei Zulage der unterschiedlichen Silagen waren gering ausgeprägt. 5.4.1.1 Glycin Glycin ist die strukturell einfachste α-Aminosäure und gehört zur Gruppe der neutralen, aliphatischen Aminosäuren (BUDDECKE 1980). In der vorliegenden Arbeit konnten in der Fermenterflüssigkeit Glycingehalte zwischen 0,15 und 18,4 µmol/L detektiert werden. Verglichen mit den Ergebnissen von WRIGHT u. HUNGATE (1967), BRÖCKER (1996), VELLE et al. (1997) und GRESNER (2011) liegen diese Werte in einem realistischen Bereich. Während der Zulagephase konnte im Vergleich zur K-01 bei der Zulage einiger Schadsilagen (S-02, S-04, S-07, S-08 und S-10) ein leichter Anstieg der Glycinkonzentration verzeichnet werden (Tab. 4.2.1). Werden in der Differenzberechnung alle Kontrollen allen Schadsilagezulagen gegenübergestellt, so lassen sich in der Zulagephase hohe Schwankungen bis zu 40 % erkennen (Abb. 4.1.14). Eine mögliche Erklärung für diese starken Schwankungen ist der Zeitpunkt der Probenahme, da diese jeweils nur einmal pro Versuchstag durchgeführt wurde und somit eine Momentaufnahme darstellt. Herkunft LEIBHOLZ (1969) postulierte eine signifikant positive Korrelation zwischen der Glycinzulage im Futter und den gemessenen Konzentrationen freien Glycins im Pansensaft bei Schafen. Entsprechend könnte das freie Glycin in der Fermenterflüssigkeit z.T. aus dem Futter stammen. Um in dieser Arbeit einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Glycingehalt der Fermenterflüssigkeit und dem Glycingehalt der eingesetzten Silage aufzuzeigen, wurden die Gehalte des freien Glycins in den verwendeten Silagen vorab mittels Ninhydrin-Methode (Fa. Evonik) ermittelt und in der folgenden Tabelle (Tab. 5.4) dargestellt. 7 Für die Berechnung wurde die allgemein gültige Formel für Zinseszinsberechnungen mit Kn = K0 * [ (p/100) + 1]n zugrunde gelegt; Kn entspricht der Endmenge abzüglich der ausgetauschten Menge; K0 entspricht dem absoluten Anfangsgehalt pro 800 mL Fermenterflüssigkeitsvolumen; p entspricht der prozentual pro Minute ausgespülten Menge; n entspricht der Anzahl der Minuten. Bei Einsatz der festen Größen ergibt sich die folgende Formel: Kn = K0 * [(-0,035/100) + 1]1380 = K0 * 0,62 - 120 - Diskussion Tab. 5.4: Glycingehalte der verwendeten Silagen in % vom Rohprotein in aufsteigender Reihenfolge (Ergebnisse der Fa. Evonik), Reineiweiß- und Rohproteingehalte Silagebezeichnung S-09 S-02 S-07 K-01 S-10 S-04 S-11 S-13 S-05 S-08 S-12 Glycinanteil RE in % Rohproteinanteil Glycingehalt in % v. Rp v. Rp in % d. TS in g/kg TS 0,37 39,1 13,6 0,50 0,62 40,8 14,4 0,89 0,64 42,6 14,2 0,91 0,65 50,5 14,3 0,93 0,68 33,4 15,4 1,05 0,72 43,8 15,0 1,08 0,74 39,8 16,0 1,18 0,83 34,1 17,3 1,44 0,86 42,0 19,2 1,65 0,94 59,7 18,7 1,76 1,08 58,5 23,6 2,55 Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland) Ein direkter Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der Fermenterflüssigkeit und jenen der Ursprungssilagen konnte nicht ermittelt werden. Insgesamt konnte beim Wechsel von Heu zu Silage jedoch ein Anstieg des Glycins in der Fermenterflüssigkeit festgestellt werden. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von HENDRICKX et al. (1972), wonach die Rationsgestaltung, in diesem Fall der vermehrte Einsatz von Silage, einen wesentlichen Einfluss auf Glycingehalte im Pansensaft hat. Obwohl Glycin auch in den eingesetzten Silagen in bemerkenswerten Konzentrationen vorliegt, ist ein nur hieraus resultierender Anstieg der Glycinkonzentration im Pansensaft unwahrscheinlich. Dafür spricht auch, dass es keinen statistischen Zusammenhang zwischen dem Glycingehalt in der eingesetzten Silage und der Fermenterflüssigkeit gibt. Geringste Glycinanteile werden in der Schadsilage S-09 (0,37 % v. Rp) ermittelt, höchste in S-12 (1,08 % v. Rp). Fermenterproben bei Zulage von S-09, S-12 und K-01 zeigen jedoch annähernd identische Glycinkonzentrationen. Der Glycinanteil in der Kontrollsilage K-01 rangiert mit 0,65 % v. Rp im unteren Drittel. Vermutlich ist das freie Glycin im Pansen, zum größten Teil mikrobiellen Ursprungs (NOLAN u. DOBOS 2005). Glycin kann bei der Fermentation von Threonin durch Peptostreptococcus sp., C. sticklandii und C. aminophilum entstehen (CHEN u. RUSSEL 1988). In der vorliegenden Arbeit lagen die Threoninkonzentrationen bei Schadsilagezulage im Fermenter ggr. unterhalb der Konzentration bei Kontrollsilagenzulage. Es ist somit durchaus vorstellbar, dass ein Teil des Glycins auch durch die Fermentation von Threonin entstanden ist. Veränderungen des Glycingehalts in der Fermenterflüssigkeit resultieren vermutlich hauptsächlich aus einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation und/oder – effektivität. Veränderungen bezüglich der Mikroorganismenpopulation unter Schadsilageneinfluss wurden auch in der Arbeit von GAST (2010) beschrieben. In der Erholungsphase (Heubeladung) konnte in allen Laufgruppen ein Rückgang der Glycinkonzentration auf ursprüngliche Werte beobachtet werden (Abb. 4.1.13). Da dieser Rückgang z.T. schon ab Mitte der Silagezulage erfolgt, lässt sich folgern, dass es im in vitro-Modell zu einer raschen Adaption der Mikroorganismen an die veränderten Bedingungen kommt. - 121 - Diskussion Abbau und mögliche Resorption Die Abbaurate von freiem Glycin im Pansen liegt nach WRIGHT u. HUNGATE (1967) bei 0,014 – 0,24 mmol/L pro Minute; hierbei werden bis zu 60 % bereits innerhalb der ersten 120 Sekunden mikrobiell abgebaut. Hauptabbauprodukte von Glycin sind CO2, Essigsäure und NH3. Nur ein geringer Anteil wird in mikrobielles Protein eingebaut (WRIGHT u. HUNGATE 1967). Freies Glycin wird über die Pansenwand transportiert, die Abbaurate von 0 – 50 % wird durch steigende Konzentration, sowie bei Zulage im nüchternen Zustand noch erhöht (LEIBHOLZ 1971a, b). Glycin kann durch verschiedenste Mikroorganismen im Pansen sowohl genutzt, als auch abgebaut werden. Gemischte bovine Pansenmikroorganismenpopulationen (WRIGHT u. HUNGATE 1967; SAUER et al. 1975), sowie M. elsdenii (ALLISON u. PEEL 1971) sind in der Lage freies Glycin im Pansen zu Serin und Alanin umzubauen. Letztere zeigten ebenfalls geringere Konzentrationen bei Schadsilagezulage. Eine wichtige Rolle beim Abbau von Aminosäuren spielen auch bakterielle Desaminasen (HÖLTERSHINKEN 1990). Weiterhin weisen Untersuchungen von COOK et al. (1965) darauf hin, dass in vivo die Resorption von Glycin eine bedeutende Rolle spielt. Hier konnte nach intraruminaler Glycinapplikation bereits nach 30 Minuten eine Steigerung der Blutgehalte um das Sechsfache ermittelt werden. Für die Wiederkäuerfütterung hat Glycin wahrscheinlich als nicht-essentielle Aminosäure keine herausragende Bedeutung, da schon die mikrobielle Produktion den Bedarf deckt (BRÖCKER 1996). Abb. 5.4.1: Möglicher Glycinmetabolismus im Pansen - 122 - Diskussion 5.4.1.2 Prolin Da es sich bei Prolin um eine der wenigen heterozyklischen Aminosäuren handelt, deren Nachweis nicht ohne weiteres möglich ist, sind Hinweise zum Vorkommen im Pansensaft rar. Hier zeigt sich abermals der Vorteil der FMOC-Derivatisierung, die es erlaubt auch heterozyklische Aminosäuren sicher zu detektieren. So konnten in der Fermenterflüssigkeit Prolingehalte zwischen 4,12 µmol/L und 66,0 µmol/L detektiert werden. Ermittelte Werte von VELLE et al. (1997) liegen ebenfalls in diesem Bereich. Die Ergebnisse der RUSITEC-Läufe zeigten einen leichten Prolinanstieg in der Fermenterflüssigkeit beim Wechsel von der Heu- zur Silagezulage (excl. S-04), insbesondere in der zweiten Hälfte der Zulagephase. Die höchsten Prolinveränderungen (+100 % bis +150 %) wurden hier bei Zulage der Schadsilagen S-12 und S-13 beobachtet. In der Erholungsphase wurden in allen Läufen wieder die Ausgangswerte erreicht (Kap. 9.4.1). Auch hier hat die Rationsgestaltung (Heu vs. Grassilage) den deutlichsten Effekt auf den Prolingehalt im Pansensaft. Werden die Ergebnisse aller Läufe mit Kontroll- bzw. Schadsilagezulage verglichen, so zeigen letztere in der Zulagephase um bis zu 50 % geringere Prolingehalte (Abb. 4.1.19). In der Erholungsphase näherten sich die Konzentrationen nur langsam an und an Tag 28 lagen die Prolinkonzentrationen in den Schadsilagen noch unterhalb jenen in den Kontrollsilagen. Herkunft Um Zusammenhänge zwischen Prolingehalten in Fermenterflüssigkeit und eingesetzter Silage zu erkennen, wurden wiederum die Gehalte des freien Prolins in den verwendeten Silagen vorab mittels Ninhydrin-Methode (Fa. Evonik) ermittelt (Tab. 5.5). Tab. 5.5: Prolingehalte der verwendeten Silagen in % vom Rohprotein in aufsteigender Reihenfolge (Ergebnisse der Fa. Evonik), Reineiweiß- und Rohproteingehalte Silagebezeichnung S-09 S-02 S-04 S-13 S-07 S-08 S-10 K-01 S-11 S-05 S-12 Prolinanteil RE in % Rohproteinanteil Prolingehalt in % v. Rp v. Rp in % d. TS in g/kg TS 0,33 39,1 13,6 1,41 0,79 40,8 14,4 1,14 0,86 43,8 15,0 1,29 0,88 34,1 17,3 1,52 0,93 42,6 14,2 1,32 0,94 59,7 18,7 1,76 0,94 33,4 15,4 1,45 1,02 50,5 14,3 1,46 1,12 39,8 16,0 1,79 1,34 42,0 19,2 2,57 1,41 58,5 23,6 3,33 Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland) - 123 - Diskussion Ein direkter Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der Fermenterflüssigkeit und jenen der Ursprungssilagen konnte nicht erkannt werden. Besonders hohe Prolingehalte wurden in den Schadsilagen S-11, S-05 und S-12 erfasst. Die Prolingehalte im Fermenter waren besonders bei Zulage der eingesetzten Silagen S-12 und S-13 hoch (bis zu 66,0 µmol/L), obwohl der Prolinanteil der S-13 selbst lediglich in der unteren Hälfte rangiert und bei S-12 der Maximalwert ermittelt wurde (Tab. 5.5). Eine mögliche Erklärung ist hier die unterschiedliche Herkunft des Prolins. Möglicherweise wird bei den Silagen mit hohen Prolinanteilen erst dieses genutzt, wo hingegen es bei Silagen mit geringen Prolinanteilen früher zu einer Neusynthese und Nutzung des neu synthetisierten Prolins kommt. Am Ende stellt sich ein Gleichgewicht ein. Möglicherweise sind aber weitere Einflüsse, wie eine Verschiebung der Mikroorganismenflora, wie sie auch bei GAST (2010) beschrieben wurde, für den Prolinanstieg verantwortlich, wodurch letztendlich zu erklären wäre, dass S-12 und S13 besonders hohe Prolingehalte in der Zulagephase bewirken. Die Fütterung kann insbes. bei Prolin zu einem starken Anstieg von bis zu +1000 % führen (nach 1 h), schon zwei Stunden nach der Fütterung werden jedoch wieder niedrige Werte ermittelt (VELLE et al. 1997). Ein Einfluss des Beladungsvorgangs selbst kann bei dieser Versuchsanstellung nahezu ausgeschlossen werden, da die Entnahme der Proben etwa 23 Stunden nach der Beladung erfolgte. Auch die in vivo-Zulage einzelner Aminosäuren beeinflusst den ruminalen Prolingehalt. So führen bei Fütterungsversuchen die Zulagen von Arginin, Glutamin und besonders Isoleucin zu erhöhten Prolingehalten im Pansen (VELLE et al. 1997). Wird Prolin selbst der Ration zugesetzt, so nimmt der scheinbare Abbau mit steigender Dosis deutlich ab (von 60 % auf 20 % bei 75 bis 600 mmol Zulage; VELLE et al. 1997). In der intakten Pflanze gehört Prolin, wie auch GABA zu den wichtigsten Substanzen, die als Antwort auf verschiedensten Stress in der Pflanze akkumulieren, wie z.B. Trockenheit, hohe Salzgehalte, UV-Strahlung und extreme Temperaturen (BATES et al. 1973; HARE u. CRESS 1997; ASHRAF u. FOOLAD 2007). Setzt man voraus, dass die ursprüngliche Pflanze einer Stresssituation ausgesetzt wurde, so ist eine Akkumulation auch in der hieraus gewonnenen Silage denkbar. Im Vergleich mit den GABA-Ergebnissen der Silagen (Kap. 5.5.5) zeigt sich jedoch keinerlei Zusammenhang zwischen den GABA- und Prolingehalten der untersuchten Silagen. Laut einer Studie von DOBOS und NOLAN (2005), entstammt freies Prolin im Pansen hauptsächlich den Mikroorganismen. Möglicherweise wird erst freies Prolin aus der Silage verstoffwechselt und wenn diese Prolinquelle zur Neige geht, kommt es zur Prolinneusynthese. Dies würde auch erklären, warum sich ein höheres Prolinangebot negativ auf die Prolinneusynthese auswirkt (ONODERA et al. 1997). Abbau Bei Verwendung gemischter Rationen, bestehend aus Maissilage, Luzerneheu und Konzentratkomponenten, geben BACH u. STERN (1999) eine Prolinabbaurate von 55,8 % an. Freies Prolin wird von vielen ruminalen Mikroorganismen genutzt: P. byrantii, S. ruminantium, Sc. bovis, Ruminococcus-Spezies und Eubact. pyruvativorans (ATASOGLU et al. 1998; 1999; WALLACE et al. 2004, GRESNER 2011). Ein Prolinanstieg in der Fermenterflüssigkeit bei Verwendung bestimmter Silagen kann somit besonders aus Veränderungen der Populationen o.g. Mikroorganismen resultieren. Anhand der Nukleobasenkonzentration in der Fermenterflüssigkeit konnte GAST (2010) jedoch nur einen - 124 - Diskussion geringen Einfluss der Schadsilagen auf die Bakterienpopulation ermitteln. LUMPP8 konnte durch gesteigerte Konzentrationen der flüchtigen Fettsäuren einen Zusammenhang zur selektiven Förderung bestimmter Bakterienspezies, wie etwa Eubact. pyruvativorans (s.o.), herstellen. 5.4.1.3 Lysin Lysin ist eine der wenigen Aminosäuren, die auch für den Wiederkäuer zu den erstlimitierenden Aminosäuren für Wachstum, Milchproduktion und Leistung zählt (SCHWAB et al. 1976; IBURG 1993). Lysingehalte zwischen 5,71 und 70,0 µmol/L konnten in der Fermenterflüssigkeit detektiert werden. Bei VELLE et al. (1997) steigt der Lysingehalt im Pansen eine Stunde nach der Fütterung von 10 bzw. 12 auf 61 bzw. 35 µmol/L. Damit liegen die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte in einem vergleichbaren Bereich. Mit Ausnahme der letzten Laufgruppe (Läufe 16 - 18) zeigte sich in den Einzeldarstellungen ein Anstieg der Lysinkonzentration beim Wechsel von der Heu- zur Silagebeladung (Abb. 9.4.1.15). Besonders ausgeprägt war dieser Effekt bei der Zulage der S-08 und S-09 (Kap. 9.4.1). In der Erholungsphase waren die Werte vergleichbar mit den Ausgangswerten. Der Vergleich zwischen allen Schadsilagen und allen Kontrollen zeigt, dass die Lysingehalte bei Schadsilagezulage insbesondere zu Beginn deutlich geringer waren (Abb. 4.1.29). Auch nach der Zulagephase blieben die Lysingehalte in allen Fermentern niedrig. Herkunft Die freien Lysinanteile in den verwendeten Silagen wurden vorab mittels Ninhydrin-Methode (Fa. Evonik) ermittelt und in der folgenden Tabelle (Tab. 5.6) dargestellt. Tab. 5.6: Lysingehalte der verwendeten Silagen in % vom Rohprotein in aufsteigender Reihenfolge (Ergebnisse der Fa. Evonik), Reineiweiß- und Rohproteingehalte Silagebezeichnung S-09 S-10 S-11 S-07 K-01 S-04 S-02 S-13 S-05 S-12 S-08 Lysinanteil RE in % Rohproteinanteil Lysingehalt in % v. Rp v. Rp in % der TS in g/kg TS 0,32 39,1 13,6 0,44 0,56 33,4 15,4 0,86 0,57 39,8 16,0 0,91 0,58 42,6 14,2 0,82 0,58 50,5 14,3 0,83 0,60 43,8 15,0 0,90 0,64 40,8 14,4 0,92 0,84 34,1 17,3 1,45 0,87 42,0 19,2 1,67 0,94 58,5 23,6 2,22 1,00 59,7 18,7 1,87 Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland) 8 Laut persönlicher Mitteilung von Frau L. Lumpp, Hannover am 27. Januar 2011 - 125 - Diskussion Ein direkter Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der Fermenterflüssigkeit und jenen der Ursprungssilagen konnte nicht ermittelt werden. Ein Anstieg der Lysinkonzentration im Fermenter beim Wechsel zur Silagebeladung resultierte vermutlich nicht aus den Lysinanteilen der originären Silagen. Obwohl beispielsweise S-08 den höchsten Anteil und S-09 den niedrigsten Anteil an Lysin aufweist (vgl. Tab. 5.6), führten beide Silagen zu einem Anstieg der Lysinkonzentration in der Fermenterflüssigkeit. Protozoenprotein enthält besonders viel Lysin (KORHONEN et al. 2002), so ist ein Zusammenhang zwischen der Protozoenpopulation und den Veränderungen der Lysinkonzentration naheliegend. GAST (2010) konnte einen Anstieg der Protozoenpopulation beim Wechsel zur Silagezulage verzeichnen, der deutlich geringer bei Schadsilagegabe ausfiel; besonders deutlich war dieser Effekt bei der Schadsilage S-09. In der Zulagephase verursachte allerdings gerade diese Schadsilage deutliche Anstiege der Lysinkonzentration. Ebenfalls einen deutlichen Anstieg der Lysinkonzentration im Fermenter verursachte die Zulage der Schadsilage S-08. Ein Zusammenhang zu den Untersuchungen von GAST (2010) ist auch hier erkennbar. Gerade S-08 führte zu einem Anstieg der Bakterienmasse im Fermenter, so dass der Anstieg der Lysinkonzentration möglicherweise durch eine selektive Förderung lysinproduzierender Mikroorganismen bedingt sein könnte. Hieraus lässt sich schließen, dass ein Anstieg der Lysinkonzentration vermutlich nicht allein auf einen Anstieg der Protozoenpopulation zurückzuführen ist, sondern auf Veränderungen der gesamten Pansenflora. Abbau Lysin im Pansen ist intensiven Ab- und Umbauprozessen unterworfen. Die Abbaugeschwindigkeit im Pansen liegt bei 0,2 – 0,3 mM/h in vitro bzw. 0,51 mM/h in vivo (CHALUPA 1976) bei Abbauraten von 47 bis 100 % (LEWIS u. EMERY 1962). Bei Grassilagefütterung werden von VON KEYSERLINGK et al. (1998) Abbauraten von 56,5 % in vivo ermittelt. Entsprechend kann davon ausgegangen werden, dass Lysin aus der Silage bereits nach kurzer Zeit vollständig abgebaut wurde und zum Zeitpunkt der Probenahme nicht mehr anteilig ins Gewicht fällt. Lysin wird zum Teil direkt in bakterielles Protein eingebaut (NILI u. BROOKE 1995). Als Aufnahmemechanismen spielen Diffusion und Carrier eine große Rolle (VAN KESSEL u. RUSSELL 1992). Zu den mikrobiellen Abbauprodukten gehören neben Essig-, Butter- und Propionsäure, Laktat sowie Ammoniak (CHEN u. RUSSEL 1988), die Biogenen Amine Cadaverin und Putreszin (TAKATSUKA et al. 1999) und α-Aminovalerat (LEWIS u. EMERY 1962). Während der durchgeführten Versuche veränderten sich die Essig- und Propionsäurekonzentrationen kaum, hingegen stieg die n-Buttersäureproduktion bei Schadsilagezulage um bis zu 40 % an (LUMPP9). Gesteigerte Ammoniakkonzentrationen konnten insbesondere bei Zulage von S-04 und S-05 erfasst werden (GRESNER 2011). Allerdings zeigen die eigenen Untersuchungen gerade bei Zulage der Schadsilage S-04 nur einen mgr. Anstieg der Lysinkonzentration in der Fermenterflüssigkeit im Vergleich zu K-01. Erst im Vergleich zwischen den Zulagen aller Schad- und Kontrollsilagen waren die Lysinkonzentrationen im Fermenter bei Schadsilageneinsatz vermindert. 9 Laut persönlicher Mitteilung von Frau L. Lumpp, Hannover am 12. Januar 2011 - 126 - Diskussion Bedeutung Obwohl das Rind durch symbiontische Mikroorganismen weitgehend unabhängig von einer oralen Aminosäurezufuhr ist (ALLISON 1969), konnte insbesondere für Lysin eine Verbesserung von Wachstum und Milchproduktion bei Supplementierung festgestellt werden (IBURG 1993). Veränderungen der Lysinkonzentration im Pansen durch Schadsilagefütterung könnten somit direkt Auswirkungen auf die Leistungsfähigkeit der Tiere haben. Abb. 5.3.3: 5.4.2 Möglicher Lysinmetabolismus im Pansen Die nicht-proteinogene Aminosäure GABA In der Fermenterflüssigkeit konnten GABA-Gehalte zwischen 0,02 µmol/L und 42,2 µmol/L detektiert werden (Kap. 9.4.1). Vergleicht man diese Werte mit denen von WRIGHT u. HUNGATE (1967) bzw. MATSUMOTO et al. (1984) unter in vivo Bedingungen, liegen diese zwar in einem niedrigen aber durchaus vergleichbaren Konzentrationsbereich (Tab. 5.7). Die Differenz zwischen den Ergebnissen der eigenen Untersuchungen und jenen von anderen Autoren, erklärt sich dadurch, dass sowohl bei WRIGHT u. HUNGATE (1967) als auch bei MATSUMOTO et al. (1984) maximale Konzentrationen ein bis zwei Stunden nach der Fütterung ermittelt werden konnten (Probenziehung in den eigenen Untersuchungen 23 h ppr.) und die Ergebnisse der AS-Analytik in vivo etwa 1,5x höher sind, als in vitro (CHALUPA 1976). Weiterhin verwendeten WRIGHT u. HUNGATE (1967) die Dünnschichtchromatographie mit Ninhydrin. Diese Methode zeigt verglichen mit der FMOCHPLC und der LCMS/MS-Analytik deutlich differierende Ergebnisse, auch bei identischen Proben (ÖZMEN10). 10 Laut persönlicher Mitteilung von Frau Dipl. Chem. S. Özmen, Hannover am 16. Dezember 2010 - 127 - Diskussion Tab. 5.7: Gegenüberstellung der GABA-Konzentrationen (Max/Min) im Pansensaft aus der Literatur und eigenen Untersuchungen Spezies in vitro / in vivo Probenahme Substrat und Aufarbeitung Analysesystem Ergebnisse Umrechnung in µmol/L WRIGHT u. HUNGATE 1967 Rind in vivo 0 – 400 Min nach der Fütterung Pansensaft; angesäuert, Diffusat und Ultrafiltrat Dünnschichtchromatographie (Ninhydrin) 0,006 – 0,08 µmol/mL 6 – 80 µmol/L MATSUMOTO et al. 1984 Rind in vivo 1 – 6 h nach der Fütterung Pansensaft; doppelt Gaze-gefiltert, zentrifugiert HPLC Eigene Untersuchungen Rind in vitro 23 h nach der Beladung Fermenterflüssigkeit; angesäuert und zentrifugiert FMOC HPLC 4,4 – 61,4 µmol/100 mL 0,02 – 42,2 µmol/L 44 – 614 µmol/L 0,02 – 42,2 µmol/L Bei der Betrachtung der einzelnen RUSITEC-Läufe fällt auf, dass besonders die Silage S-05 zu extremen GABA-Schwankungen (z.T. >1000 %) zwischen den einzelnen Versuchstagen in der Fermenterflüssigkeit führt. Doch auch der Einsatz der K-01, sowie anderer Schadsilagen führte in der Zulagephase zu deutlichen (S-07, S-08) bzw. moderaten (S-04, S-10, K-01) Konzentrationsänderungen. Durch Differenzberechnung aus allen Schad- bzw. Kontrollsilagen kann die deutlich erhöhte GABA-Konzentration während der Schadsilagezulage gegenüber den Kontrollen (bis zu + 380 %, Abb. 4.1.31) aufgezeigt werden. Auch hier ist nach Beendigung der Zulage innerhalb eines Tages eine Angleichung zwischen den unterschiedlichen Zulagegruppen zu erkennen. Ein Großteil der untersuchten Schadsilagen führte zu signifikant höheren GABAKonzentrationen in der Fermenterflüssigkeit. Herkunft Um auch im Fall von GABA die Zusammenhänge zwischen eingesetzter Silage und Fermenterflüssigkeit zu klären, wurden die GABA-Gehalte vorab ermittelt (NinhydrinMethode, Fa. Evonik) und in der folgenden Tabelle (Tab. 5.8) dargestellt. - 128 - Diskussion Tab. 5.8: GABA-Gehalte der verwendeten Silagen in % vom Rohprotein in aufsteigender Reihenfolge (Ergebnisse der Fa. Evonik), Reineiweiß- und Rohproteingehalte Silagebezeichnung S-12 K-01 S-04 S-11 S-10 S-07 S-13 S-08 S-05 S-02 S-09 GABA-Anteil RE in Rohproteinanteil GABA-Gehalt in % v. Rp % v. Rp in % TS in g/kg TS 2,49 58,5 23,6 5,88 3,05 50,5 14,3 4,36 3,13 43,8 15,0 4,70 3,70 39,8 16,0 5,92 4,06 33,4 15,4 6,25 4,12 42,6 14,2 5,85 4,17 34,1 17,3 7,21 4,21 59,7 18,7 7,87 4,33 42,0 19,2 8,31 5,05 40,8 14,4 7,27 5,38 39,1 13,6 7,32 Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab® (Evonik Industries AG, Essen, Deutschland) Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Silagen weisen im Vergleich zu anderen Aminosäuren (s. Kap. 5.4.1) hohe absolute GABA-Gehalte von 4,36 g/kg TS (K-01) bis 8,31 g/kg TS (S-05) auf. Es konnte gezeigt werden, dass der GABA-Gehalt der K-01 unterhalb von 5 g/kg TS liegt, die GABA-Gehalte aller Schadsilagen (excl. S-04) hingegen über 5 g/kg TS. Wird hier die GABA-Vierfeldertafel (Abb. 2.4.2) zugrunde gelegt, kann für die Schadgrassilagen auf einen auffälligen Reineiweißanteil (in % v. Rp) und damit indirekt auf ein mögliches Gefährdungspotenzial geschlossen werden. Bei der täglich eingestezten Silagemenge im RUSITEC-Fermenter (8 g TS) würden sich bei angenommener sofortiger homogener Verteilung in der Fermenterflüssigkeit Konzentrationen zwischen 294,80 µmol/L (K-20) und 854,34 µmol/L (S-08) (Tab. 5.9) ergeben. Tab. 5.9: tägliche GABA-Zufuhr über den Futterbeutelwechsel (Tag 9 bis Tag 19) in µmol/L Fermenterflüssigkeit bei Einsatz von 8 g der jeweiligen Silage (TS) Silagebezeichnung K-01 K-14 K-15 K-16 K-18 K-20 K-23 GABA-Input in µmol/L 762,57 297,71 340,38 440,26 339,41 294,80 342,32 Silagebezeichnung S-04 S-07 S-08 S-09 S-10 S-11 S-12 S-13 - 129 - GABA-Input in µmol/L 508,15 604,15 854,34 798,10 665,24 628,39 614,82 776,76 Diskussion Anders als bei den meisten proteinogenen Aminosäuren ist eine mikrobielle Herkunft unwahrscheinlich. Zwar ist eine Vielzahl von Mikroorganismen in der Lage GABA aus Glutamat zu synthetisieren, jedoch wurde das dafür notwendige Enzym GAD bisher nicht in Pansenmikroorganismen nachgewiesen (s. Kap. 2.2.2.2). Der Ursprung der GABA-Menge in der Fermenterflüssigkeit ist damit hauptsächlich nutritiv über die eingesetzten Silagen. Die deutlich positive Korrelation (r= 0,61) zwischen den GABA-Gehalten der Silagen und jenen in der Fermenterflüssigkeit (Abb. 4.1.32.1) stützt diese Vermutung. Abbau Möglicherweise sind die starken Schwankungen der GABA-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit in der Zulagephase ein Ausdruck für ablaufende Adaptionsmechanismen bzw. die Übersteigung der GABA-Abbaukapazitäten. Da nach Beendigung der Zulage bei allen Laufgruppen eine Rückkehr zu den niedrigeren GABA-Gehalten der Heuzulage beobachtet werden kann, scheinen Veränderungen der GABA-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit durch den Einsatz der Silagen reversibel zu sein (Kap. 9.4.1). Da die Schadsilagen im Mittel auch höhere GABA-Gehalte aufweisen, liegt die Vermutung nahe, dass es durch die erhöhte Zufuhr zu einer Erschöpfung der Abbaukapazitäten und damit einer Akkumulation in der Fermenterflüssigkeit kommt. Letztere könnte wiederum zu einer selektiven Förderung GABA-abbauender Mikroorganismen und damit einer Adaption mit gesteigertem Abbau führen, was letztendlich zu den starken Schwankungen zwischen den einzelnen Versuchstagen führen könnte. MATSUMOTO et al. (1984) berichten in vivo zwar von einer untergeordneten Rolle der Mikroorganismen im GABA-Abbau, jedoch sind aufgrund der Versuchsanstellung Diffusions- und Resorptionsmechanismen über die Pansenwand oder der Weitertransport von Ingesta ausgeschlossen. Allerdings könnte durch den konstanten Austausch von Puffer gegen Fermenterflüssigkeit allein auf diesem Wege bis zu 40 % der eingebrachten GABA-Menge aus der Fermenterflüssigkeit entfernt werden (Vgl. Kap. 5.4.1). Endgültig lässt sich die Frage nach dem Verbleib von GABA in vivo anhand dieser Versuchsanstellung nicht klären. Kurzversuche GABA-RUSITEC Die über Literatur verfügbaren Informationen zum Abbau von GABA im Pansen sind widersprüchlich. Daher wurde ein Kurzversuch im RUSITEC durchgeführt (s. Kap. 9.5.1), aus dem sich zwei Hypothesen folgern lassen: 1. GABA-Gehalte im Fermenter sind direkt abhängig von der zugelegten Menge 2. GABA wird bei einmaliger Zulage unter in vitro-Bedingungen unabhängig von der Dosierung bei Fermentation unverdächtiger Silagen innerhalb von 48 h nahezu vollständig abgebaut Ein linearer Zusammenhang zwischen zugegebener GABA-Menge und wieder gefundenen GABA-Gehalten konnte nicht dargestellt werden (Abb. 9.5.1). Die in vitro Abbaukapazität von GABA war offensichtlich mit den extrem hohen GABA-Zulagen (bis zu 20 g/d) noch - 130 - Diskussion nicht überfordert, so konnte 48 h nach der GABA-Zugabe dieses kaum noch in der Fermenterflüssigkeit nachgewiesen werden. Ob in vivo hohe GABA Mengen schnell über die Pansenwand resorbiert werden und damit am Tier wirken können, kann mit dieser Versuchsanstellung jedoch nicht geprüft werden. Grasversuche Das Vorkommen von GABA in Pflanzen, konnte an Hand der Literatur (Kap 2.4.1) gezeigt werden. Unklar blieb jedoch welche Umweltbedingungen möglicherweise zur erhöhten GABA-Bildung führen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Grasversuche durchgeführt, mit dem Ziel die Auswirkungen verschiedenster Belastungsbedingungen, insbesondere in der Anwelkphase, auf den GABA-Gehalt aufzuzeigen. Das Gras (handelsübliche Mähweide) wurde unter definierten Bedingungen angesät, unter speziellen Neonröhren (Osram L Biolux 58W/965) 30 Tage aufgezogen und anschließend geschnitten. Bei den Versuchen wurden circadiane Rhythmik, Einfluss von Düngemitteln, sowie verschiedene Anwelkbedingungen die, auch unter üblichen Bedingungen vorkommen können, getestet (s. Kap. 9.5.2). Tab. 5.9: Übersicht GABA-Bildung im Gras unter verschiedenen Belastungsbedingungen gegenüber einer unbehandelten Kontrolle Behandlung Anwelken Schnitt bei Licht, 4 h Anwelken bei 35 – 45°C unter der Glühlampe Schnitt bei Dunkelheit, 4 h Anwelken bei 22°C im Dunkeln Schnitt bei Dunkelheit, 4 h Anwelken bei 13 - 15°C im Dunkeln Schnitt feucht, bei Dunkelheit, 4 h feucht Anwelken bei 13 - 15°C im Dunkeln Schnitt bei Licht, 4 h Anwelken unter Tageslichtlampe (40°C, Heizplatte) Schnitt bei Licht, 4h Anwelken bei 22°C und Tageslicht (Fenster) Anwelken + Handelsüblicher Streudünger Düngung Nur KCl Schnitt und Schnitt um 7:00 Uhr sofortige Schnitt um 9:00 Uhr Vermessung Schnitt um 11:00 Uhr Schnitt um 13:00 Uhr Schnitt um 15:00 Uhr ↑: wenig ↑↑: mittelmäßig ↑↑↑: viel - 131 - GABA-Bildung ↑↑↑ ↑↑↑ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑ Diskussion Die Ergebnisse (Tab. 5.9) zeigen deutlich welchen starken Einfluss selbst kleinste Veränderungen, wie Düngung, Feuchtigkeitsgehalt, Tageszeit beim Schnitt und Lichtverhältnisse, auf den GABA-Gehalt haben können, obwohl auch hier aufgrund der geringen Wiederholungen die Aussagekraft sicherlich eingeschränkt ist. Diese Versuche zeigen, dass es möglich sein kann, durch bestimmte Erntebedingungen den GABA-Gehalt des Silierguts signifikant zu verringern. Bedeutung Falls die GABA-Konzentration durch erhöhte Silagegehalte im Pansen ansteigt und Abbaumechanismen überlastet werden, könnte es durchaus zu einer Resorption aus dem Pansen oder nachgeschalteten Bereichen des Gastrointestinaltrakts kommen. Obwohl ein Abbau noch im Pansen wahrscheinlich ist, kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine dauerhafte GABA-Zufuhr zu einer verstärkten Resorption führt. Ob und in welchem Umfang GABA selbst oder eventuelle Reaktionsprodukte an der Genese der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ beteiligt sind, kann nur durch Folgeuntersuchungen geklärt werden. 5.4.3 Biogene Amine Das Vorkommen und die Bedeutung von Biogenen Aminen im Pansensaft werden immer wieder kontrovers diskutiert, insbesondere gilt dies für Histamin. Eine ausführliche Besprechung Biogener Amine im Pansen, findet sich in den Dissertationen von HÖLTERSHINKEN (1990) und BRÖCKER (1996). In der vorliegenden Arbeit war es möglich die Biogenen Amine Indolessigsäure, Citrullin, Histamin, Agmatin und Serotonin in der Fermenterflüssigkeit zu detektieren. Hierbei konnten lediglich für Serotonin aussagekräftige Ergebnisse erzielt werden, da andere Biogene Amine z.T. nicht, oder nur in Spuren detektierbar waren und hier keine Auswirkungen durch die Zulage von Silagen mit unterschiedlichen Reineiweißanteilen gefunden werden. 5.4.3.1 Serotonin Die ermittelten Serotoningehalte in der Fermenterflüssigkeit lagen zwischen 8,98 und 517 µmol/L, wobei hier nur die Tage 7 bis 28 berücksichtigt wurden, da insbesondere die Ergebnisse an Tag 0 (frisches Inokulum des Spendertieres nach 3 h Fermentation) stark abwichen. In der Literatur sind Vergleichswerte für den Serotoningehalt im Pansensaft in vitro oder in vivo nicht beschrieben. Serotonin ist in der Natur weit verbreitet und wird durch eine Vielzahl höherer Pflanzen, aber auch Mikroorganismen wie E. coli und Hefen produziert (PARK et al. 2008), sowie von enterochromaffinen Zellen des Säugetierorganismus. Es ist also durchaus denkbar, dass sowohl ein Serotonineintrag über das Futter, als auch eine Produktion durch Mikroorganismen stattgefunden hat. Da der vorliegende Versuch unter in vitro-Verhältnissen durchgeführt wurde, ist eine Herkunft aus enterochromaffinen Zellen auszuschließen. Vergleicht man die Veränderungen der Serotoninkonzentration während der Versuchsdauer bei Einsatz der verschiedenen Silagen, so zeigt sich in den ersten beiden Laufgruppen bei Silageeinsatz (Schad- und Kontrollsilagen) ein deutlicher Rückgang der Serotonin- - 132 - Diskussion konzentration, im Vergleich zur Heubeladung (Kap. 9.4.1). Bei den Laufgruppen 3 – 5 bleiben die Serotoningehalte der Fermenterflüssigkeit relativ konstant. Im Vergleich zur K-01 -Zulage liegen die Serotoningehalte bei S-05 und S-07 niedriger, bei S-02, S-04, S-10 und S11 leicht und bei S-08, S-09, S-13 und S-12 deutlich höher. Die Differenzberechnung zeigt in der ersten Hälfte der Zulage deutlich erhöhte Gehalte bei Schadsilagezulage, in der zweiten Hälfte der Zulage starke Schwankungen (Abb. 4.1.41). Der Ursprung des Serotonins in der Fermenterflüssigkeit kann grundsätzlich nutritiv oder mikrobiell sein. Da keine Ergebnisse zur Serotoninkonzentration in den verwendeten Silagen vorlagen, kann dies nur in weiterführenden Untersuchungen geklärt werden. Fraglich ist jedoch auch aufgrund der hohen Standardabweichungen und Variationskoeffizienten (vgl. Kap. 3.3.4.3), ob die FMOC-HPLC als Methode zur Serotoninbestimmung geeignet ist. Des Weiteren scheinen die ermittelten Konzentrationen im Vergleich zu den Konzentrationen anderer Aminosäuren und Biogener Amine äußerst hoch, weshalb auch nicht ausgeschlossen werden kann, dass weitere Substanzen und Abbauprodukte eine ähnliche Retentionszeit aufweisen und somit den „echten“ Serotoninpeak maskieren. 5.5 Abschließende Wertung Fasst man die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zusammen, so ergeben sich die folgenden Effekte auf proteinogene Aminosäuren, GABA und Biogene Amine im Pansensaft in vitro, bei Verwendung von Silagen mit auffälligen Reineiweißgehalten: 1. Die Konzentration freier Aminosäuren in der Fermenterflüssigkeit wird durch den Einsatz von Schadsilagen mit auffälligen Reineiweißanteilen nur ggr. beeinflusst. Lediglich drei der gemessenen Aminosäuren zeigen tendenzielle Veränderungen bezüglich ihrer Konzentration (Prolin, Glycin und Lysin). 2. GABA-Gehalte in der Fermenterflüssigkeit werden durch Schadsilagen positiv beeinflusst (Anstieg bei Schadsilagenzulage). 3. Die Gehalte der erfassten Biogenen Amine zeigten keine oder nur leichte (Serotonin) Veränderungen im Vergleich zwischen Schadsilagen und Kontrollsilagen. Die folgenden Abbildungen (Abb. 5.3.4 u. Abb. 5.3.5) zeigen Übersichten zu möglichen Stoffwechselwegen für die untersuchten Aminosäuren und Biogenen Amine unter Schadgrassilageeinfluss unter Einbeziehung der Ergebnisse von GRESNER (2011), LUMPP11 und GAST (2010). 11 Laut persönlicher Mitteilung von Frau L. Lumpp, Hannover am 23. Oktober 2010 - 133 - Diskussion Abb. 5.3.4: Mögliche Stoffwechselwege der untersuchten Aminosäuren und Biogenen Amine im Pansensaft unter Schadgrassilageeinfluss (im Vergleich zum Einsatz der Kontrollsilagen), unter Einbeziehung der Ergebnisse von LUMPP (*), GRESNER (**) und GAST (***) - 134 - Diskussion Abb. 5.3.5: Auswirkungen von Schadgrassilagen auf die Pansenfermentation (in vitro) im Vergleich zur Kontrollsilage unter Einbeziehung der Ergebnisse von LUMPP (*), GRESNER (**) und GAST (***) (↑: Zunahme; ↑↑: starke Zunahme; (↓): geringgradige Abnahme; ↓: Abnahme; - : keine nennenswerte Veränderung) - 135 - Diskussion Insgesamt findet durch die Verwendung von sog. Schadgrassilagen mit auffällig niedrigem Reineiweißanteil ein stärkerer Input freier Aminosäuren und Proteolyseprodukte (GRESNER 2011) statt. Die durch die Silage in das System eingebrachten freien Aminosäuren und Peptide werden schnell abgebaut (MATSUMOTO et al. 1984). Veränderungen in der Nährstoffzufuhr bedingen wiederum Veränderungen in der Mikroorganismenpopulation im Pansen. Untersuchungen von GAST (2010) zeigten bei Schadsilagebeladung eine Verringerung der Protozoenanzahl, sowie einen Anstieg der Bakterienmasse. Weiterhin konnte LUMPP13 einen Zusammenhang zwischen dem Anstieg der längerkettigen flüchtigen Fettsäuren (bes. n- und i- Buttersäure, n- und i-Valeriansäure und Hexansäure) und der selektiven Förderung bestimmter AS-abbauender Bakterienspezies (Megasphera elsdenii, Eubacterium limosum, Eubacterium pyruvativorans) herstellen. GRESNER (2011) und LUMPP12 berichten auch von einem Anstieg der Ammoniak- und CH4-Konzentration bei Einsatz der Schadsilagen im RUSITEC. Erhöhungen der Gas- und Ammoniakmenge deuten auf eine Erhöhung der Proteolyten-aktivität hin; CH4 entsteht unter anderem zusammen mit verzweigtkettigen flüchtigen Fettsäuren bei der Desaminierung von Aminosäuren (LUMPP13). Diese erhöhte Proteolyse-aktivität führt dazu, dass ein Großteil der hier untersuchten Aminosäuren (Serin, Aspartat, Glutamat, Threonin, Alanin, Tyrosin, Prolin, Valin, Phenylalanin, Lysin) in der Fermenterflüssigkeit geringere Konzentrationen bei Schadsilagezulage aufwiesen und gleichzeitig typische Abbauprodukte, wie Essigsäure, Buttersäure, Propionsäure, Laktat und Ammoniak, anfluten. Die Unterschiede bei Beladung mit Schad- oder Kontrollsilagen bezüglich der Aminosäurekonzentrationen in der Fermenterflüssigkeit waren jedoch größtenteils kaum oder nur geringgradig ausgeprägt. Wahrscheinlich ist davon auszugehen, dass im RUSITEC-System 23 h nach der Beladung eine Art Gleichgewichtszustand herrscht. Das heißt, dass die Zusammensetzung der freien AS in der Fermenterflüssigkeit weitestgehend unabhängig von der Zufuhr an Proteinen, Peptiden und Aminosäuren ist. Je nach Verfügbarkeit werden vermehrt freie Aminosäuren genutzt, oder Peptide, was jeweils zu einer selektiven Förderung bestimmter Bakterienspezies führt. Dies deckt sich auch mit älteren Untersuchungen von PURSER u. BUECHLER (1966) sowie HARRISON et al. (1973), wonach das AS-Angebot im Dünndarm weitgehend unabhängig von der Futterzusammensetzung ist, da marginale und fehlende AS durch mikrobielle Umbauprozesse und Neusynthese im Pansen ergänzt werden. Veränderungen der Bakterienpopulation und damit deren Stoffwechselprodukte im Pansen erscheinen jedoch kaum so tiefgreifender Natur zu sein, dass ein direkter Zusammenhang zur „Faktorenerkrankung Milchviehherde“, mit ihren z.T. drastischen Auswirkungen auf den Organismus, denkbar ist. Bei GABA konnten die Untersuchungen hingegen zeigen, dass hier ein Zusammenhang zwischen dem Reineiweißanteil des zugeführten Futters und dem GABA-Gehalt in der Fermenterflüssigkeit vorliegen könnte. Obwohl von einer nahezu vollständigen Abbaubarkeit im Pansen ausgegangen wird (MATSUMOTO et al. 1984), bewirkten Schadsilagenzulagen z.T. erhöhte GABA-Gehalte in der Fermenterflüssigkeit. Diese können prinzipiell via Pansenwand resorbiert werden. Denkbar ist aber auch ein Adaptionsmechanismen, ähnlich dem, der für DABA bereits nachgewiesen werden konnten (PENG et al. 2007). Ein Vergleich aller Mittelwerte aus Fermentern mit Schad- gegen Kontrollsilagegabe zeigt einen raschen 12 13 Laut persönlicher Mitteilung von Frau N. Gresner und Frau L. Lumpp, Hannover am 28. Januar 2011 Laut persönlicher Mitteilung von Frau L. Lumpp, Hannover am 15. Januar 2011 - 136 - Diskussion Anstieg der GABA-Konzentration nach Schadsilagenzulage (Abb. 4.1.31) innerhalb von zwei Tagen. Die Unterschiede flachen jedoch ab Tag 17, d.h. noch vor Zulagenende ab. Dies könnte auf eine Adaption der Mikroorganismen hindeuten. Ebenfalls auf eine Adaption deutet der durchgeführte GABA-Kurzversuch hin, bei dem es offensichtlich innerhalb von 48 h zu einem vollständigen Abbau von GABA kam. Ob jedoch bei einer langfristigen Fütterung von Silagen mit hohen GABA-Gehalten chronische Effekte zu einer Schädigung des Tieres direkt im Pansen oder durch Resorption ins Blut auftreten können, ist bisher ungeklärt. Selbst wenn GABA letzendlich nicht als krankmachendes Agens nachgewiesen werden konnte, so sind erhöhte Gehalte in den Grassilagen mit auffälligen Reineiweißanteilen dennoch ein guter Ansatz für einen weiteren Grassilage-Qualitätsindikator. Daher sollte die Datenlage der Vierfeldertafel (Abb. 2.4.2) weiter verbessert werden. In der vorliegenden Arbeit war es nicht möglich grundlegende Veränderungen im Gehalt an Biogenen Aminen in der Fermenterflüssigkeit zu ermitteln. Konzentrationen von Serotonin und Agmatin lagen bei Schadsilagezulage ggr. höher, als bei Kontrollsilagenzulage. Die Serotoninkonzentration war ab Tag 13 extremen Schwankungen unterworfen (Abb. 4.1.41), die durchaus ein Ausdruck überlasteter Abbaukapazitäten sein könnten. Die Histaminkonzentrationen waren bis zur Mitte der Zulagephase bei Schadsilagezulage niedriger, in der Folge hingegen höher (Abb. 4.1.37). Eventuell können hier bei längerfristiger Schadsilagezulage Abbaukapazitäten überschritten werden. Beim Wechsel zur Heuzulage verringerten sich die Konzentrationen der untersuchten Biogenen Amine unabhängig von der vorherigen Silagezulage. Insgesamt zeigen sich nur geringe Veränderungen bezüglich der Konzentration Biogener Amine in der Fermenterflüssigkeit. Der Gehalt der untersuchten Biogenen Amine Histamin, Serotonin, Citrullin, Indolessigsäure und Agmatin im Pansensaft scheint somit nicht zu den auslösenden Faktoren für die „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ zu zählen. Dabei sollte beachtet werden, dass es sinnvoll sein könnte andere hochpotente Biogene Amine weitergehend zu untersuchen, die häufig als typische Proteolyseprodukte in Silagen gefunden werden und die nicht mittels des verwendeten Gradientensystems erfasst werden konnten (z.B. Putreszin, Cadaverin). 5.6 Ausblick Im Ergebnis dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen dem Aminosäuregehalt und Biogenen Aminen im Pansensaft und der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ unwahrscheinlich ist. Einzig das erhöhte Vorkommen von GABA, sowohl in den Schadsilagen, als auch in der Fermenterflüssigkeit könnte einen Hinweis auf eine Beteiligung dieser Substanz darstellen. Auf diesem Gebiet erscheinen weiterführende Untersuchungen (chronische Effekte, Verhältnisse in vivo, Markeruntersuchungen zum Verbleib) durchaus lohnenswert. Weiterhin könnten Untersuchungen klären, ob der GABAGehalt in Silagen, auch im Hinblick auf die Entwicklung von Schnelltests, als Indikator für die Wahrscheinlichkeit des Auftretens der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ geeignet ist. - 137 - Zusammenfassung Theermann, S. (2011): Untersuchungen zum Einfluss von Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf Aminosäuren und Biogene Amine im Pansensaft (in vitro) 6. Zusammenfassung Grassilagen mit auffälligen Reineiweißanteilen (RE) im Verhältnis zum Rohprotein (Rp) wurden in den vergangenen Jahren immer wieder in Zusammenhang mit massiven gesundheitlichen Problemen bei Milchrindern gebracht. Da bei diesen Silagen teilweise hohe Konzentrationen von Aminosäuren und Biogenen Aminen nachgewiesen worden waren, wurde mit Hilfe des Langzeitinkubationssystems RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique) in vitro die Auswirkung der Zugabe dieser Silagen auf die Gehalte von Aminosäuren, insbesondere GABA, und Biogenen Aminen im Pansensaft untersucht. Insgesamt wurden Fermenterproben aus 17 RUSITEC-Läufen (à 28 Tage), bei denen zehn Schadsilagen (RE/Rp < 50 % und/oder Zusammenhang mit gesundheitlischen Problemen in Milchviehbetrieben) und sieben Kontrollsilagen (RE/Rp > 50 % und/oder kein Zusammenhang mit gesundheitlischen Problemen in Milchviehbetrieben) in der Zulagephase des Versuchs (10 Tage) verwendet wurden, untersucht. In der Einlauf- und Kontrollphase (8 Tage), sowie der Regenerationsphase (10 Tage) wurde jeweils Heu inkubiert. Mit Hilfe der Fluorenylmethyloxycarbonyl(FMOC)-Derivatisierung mit anschließender HPLC wurden die Aminosäuren und Biogenen Amine quantifiziert. Bei den Aminosäuren zeigten nur Prolin und Glycin bei der Fermentation von allen Schadsilagen im Vergleich zu allen Kontrollsilagen um bis zu 50 % (p < 0,05) bzw. ca. 23 % (p < 0,05) geringere Konzentrationen in der Fermenterflüssigkeit. Die Gehalte an Biogenen Aminen unterschieden sich nicht (p > 0,05) in Abhängigkeit von der Art der Silagen. Die Schadsilagen wiesen im Mittel um 79,5 % höhere GABA-Gehalte auf als die Kontrollsilagen (Tab. 4.1.1; Analyse durch EVONIK DEGUSSA-Amino Lab®; Evonik Industries AG, Essen, Deutschland). Auch während der Inkubation im RUSITEC waren die GABA-Spiegel in der Fermenterflüssigkeit bei Einsatz der Schadsilagen im Mittel um den Faktor 6 höher als bei den Kontrollsilagen. Zwischen den GABA-Gehalten der eingesetzten Silagen und den Konzentrationen in der Fermenter-flüssigkeit während der Zulagephase bestand eine positive Korrelation (r=0,61; p < 0,05). Die Ergebnisse der vorliegenden Studien zeigen, dass von den untersuchten Aminosäuren und Biogenen Aminen nur GABA nach der Zugabe von einigen Schadsilagen deutlich erhöht war. Da GABA biologisch hochpotent ist und erhöhte Spiegel im Körper zentralnervös dämpfend, sowie u.a. auf periphere Rezeptoren in der Leber wirken, könnte diese Substanz für die erhöhte Inzidenz von gesundheitlichen Problemen nach der Fütterung mit Silagen mit einem erniedrigten Reineiweißanteil verantwortlich sein. Diese Hypothese ist jedoch anhand von klinischen Studien zu überprüfen. - 138 - Summary Theermann, S. (2011): In vitro studies on the effects of grass silage containing conspicuous true protein contingent on amino acids and biogenic amines in bovine ruminal fluid. 7. Summary Grass silages with true protein (TP) content < 50% in the crude protein (CP) are considered to cause severe non-infectious dairy herd diseases in Holstein Friesian and consequently high economic losses in the northern part of Germany. Symptoms were described as follows: high incidences of cases with a high milk cell count, disturbances of fertility, digestive disorders, abomasal displacements, downer cow syndrome up to sudden death. As it was shown that a low TP content is accompanied by noticible changes in amino acid composition and content of biogenic amines, we wanted to determine the occurrence of these substances in rumen fluid in vitro using the RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique). In total, fermenter fluid samples from 17 RUSITEC runs (à 28 days), using ten silages with TP/CP < 50 % and seven control silages with TP/CP > 50 % in the silage addition period (10 days), were investigated. In the adaptation period (8 days) and the recovering period (10 days) hay was fermented. Samples were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) after fluorenylmethyl-oxycarbonyl-(FMOC)-derivatisation. Remarcable differences during fermentation of “faulty silages” (with TP/CP < 50 % or connected with non-infectious dairy herd diseases) compared to “control silages” (with TP/CP > 50 % or without connection with non-infectious dairy herd diseases) were detectable only in proline and glycine; during the silage addition period concentrations were up to 50 % (p < 0.05) respectively 23 % (p < 0.05) lower. There was no difference between the content of biogenic amines fermenting the different silages (p > 0.05). Faulty silages showed higher mean GABA-contents (+ 79.5 %) than control silages (Tab. 4.1.1; EVONIK DEGUSSAAmino Lab®; Evonik Industries AG, Essen, Germany). This was also seen during the incubation in the RUSITEC. Mean GABA-concentrations in fermenter fluid were six times higher using faulty silages compared to control silages (p < 0.05). There was a positive correlation between silage content and fermenter fluid concentration of GABA during the silage addition period (r=0.61; p < 0.05). In this study, the results for amino acids and biogenic amines show that addition of some silages with low true protein content affected only GABA-concentrations in ruminale fluid (RUSITEC) considerably. GABA is a major inhibitory neurotransmitter with depressant effects on central nervous system and could also affect peripher liver receptors; therefore, it could be the reason for a higher incidence of severe and costly herd diseases in dairy cows after feeding grass silages with low true protein content. This hypothesis will have to be proven in clinical studies. - 139 - Schrifttumsverzeichnis 8. Schrifttumsverzeichnis ABDOU, A. M., S. HIGASHIGUCHI, K. HORIE, M. KIM, H. HATTA u. H. 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Die erste Gruppe umfasste die sog. „Schadsilagen“ mit einem Reineiweißgehalt unter 50 % vom Rohprotein, die zu Krankheitssymptomen wie allgemeiner Schwäche, Beeinträchtigung des intermediären Stoffwechsels (Gebärmutter: Nachgeburtsverhaltung, Ausfluss, Sterilität; Euter: erhöhte Zellzahlen, Stoffwechsel-störungen: Ketose, Hypocalcämie; Lahmheiten; Labmagenverlagerungen, EICKEN 2004) verminderter Fruchtbarkeit, Festliegen oder sogar Todesfällen innerhalb der Bestände geführt haben. Im Einzelfall wurden auch solche Silagen zu den „Schadsilagen“ gezählt, die nur eines der o.a. Kriterien erfüllten (S-08 und S-12). Die Silagen wurden am Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover analysiert (Ergebnisse siehe Tab. 9.1.1). Die zweite Gruppe, definiert als „Kontrollsilagen“ hatte einen Reineiweißgehalt über 50 % vom Rohprotein. Ihre Verfütterung war ohne klinische Ausfälle im Betrieb geblieben. Eine dieser Silagen (K-01) wurde als Kontrollsilage in 15 RUSITEC-Läufen eingesetzt. Als ergänzende Kontrollen wurden in zwei weiteren Läufen sechs weitere Kontrollsilagen eingesetzt (Lauf 14: K-14 bis -16, Lauf 15: K-18, K-20 und K-23). Ergebnisse der Nährstoffanalysen des Instituts für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden in den Tabellen 9.1.1 und 9.1.2 zusammengefasst. - 172 - Anhang Tab. 9.1.1 Nährstoffanalyse der verwendeten Schadsilagen Nährstoffe Einheiten Lauf (TS) 2-4 Lauf 5-7 Lauf 8 – 10 Lauf 11 - 13 Lauf 16 - 18 S02 S04 S05 S07 S08 S09 S10 S11 S13 S12 Rohasche g/kg 110 85,0 126 103 105 119 85,4 98,2 99,6 96,4 Rohprotein g/kg 174 180 231 178 221 156 180 188 277 207 Reinprotein g/kg 71,0 78,9 97,0 75,8 132 61,0 60,1 74,8 162 70,6 Reineiweiß % von Rp 40,8 43,8 42,0 42,6 59,7 39,1 33,4 39,8 34,1 58,5 Rohfett g/kg 34,3 41,0 41,7 31,5 45,1 29,1 32,6 37,7 37,9 39,1 Rohfaser g/kg 280 278 205 273 227 327 290 258 218 254 NDF g/kg 520 496 433 520 395 610 543 523 491 481 ADF g/kg 318 296 262 310 247 385 333 325 273 292 4,37 4,57 k.A. 4,90 3,98 5,35 5,25 4,16 4,53 4,94 pH Trockensubstanz g/kg uS 321 446 365 410 304 413 451 329 445 509 NfE* g/kg uS 129 186 145 170 122 152 185 138 180 187 NEL** MJ/kg 6,45 6,56 7,17 6,53 7,13 5,78 6,45 6,81 7,20 6,75 * N-freie Extraktstoffe, Rechenwert; Netto-Energie Laktation, Rechenwert - 173 - Anhang Tab. 9.1.2 Nährstoffanalyse der verwendeten Kontrollsilagen Nährstoffe Einheiten (TS) Lauf 2-13 u. 16-18 Lauf 14 K-01 K-14 K-15 K-16 K-18 K-20 K-23 Lauf 15 Rohasche g/kg 109 89,1 97,6 107 106 k.A. k.A. Rohprotein g/kg 165 164 203 198 164 150 155 Reinprotein g/kg 83,3 81,7 116 102 90,9 101 84,0 Reineiweiß % von Rp 50,5 49,8 57,1 51,5 55,4 67,3 54,2 Rohfett g/kg 34,1 32,8 35,3 42,1 35,3 k.A. k.A. Rohfaser g/kg 250 275 246 262 264 k.A. k.A. NDF g/kg 494 563 527 554 533 k.A. k.A. ADF g/kg 305 321 286 310 311 k.A. k.A. 4,83 5,3 5,17 4,83 5,47 5,83 4,00 pH Trockensubstanz g/kg uS 472 579 615 439 569 693 412 NfE* g/kg 209 255 257 171 245 - - NEL** MJ/kg 6,65 6,45 6,71 6,57 6,43 - - *N-freie Extraktstoffe, Rechenwert; **Netto-Energie Laktation, Rechenwert Heu und Kraftfutter entsprachen in Menge und Beschaffenheit der üblichen Ration für Milchvieh in Laktation (näheres hierzu siehe Dissertation GAST 2010). Alle Futterkomponenten wurden vor Versuchsbeginn in den für den gesamten Versuchsraum benötigten Mengen entnommen und bei Raumtemperatur (Heu und Kraftfutter) bzw. bei -18 °C (Silagen) gelagert. - 174 - Anhang 9.2 FMOC-Anleitung Applikation-Broschüre Nr.5 Bestimmung von primären und sekundären Aminosäuren durch Vorsäulenderivatisierung mit FMOC/ADAM Derivatisierungsreaktion von Aminosäuren mit FMOC Für die Aminosäuren-Analytik können je nach Anwendungsgebiet unterschiedliche Methoden eingesetzt werden. Heutzutage stehen mehrere sehr empfindliche HPLC-Methoden zur Verfügung. Die Vorsäulenderivatisierung durch 9-Flurenylmethyloxycarbon-chlorid (FMOC-Cl) ist eine weit verbreitete, empfindliche Derivatisierungsmethode für primäre und sekundäre Aminosäuren und Amine. Die FMOC-Reagenzien sind sehr stabil und mehrere Wochen haltbar. Auch die FMOCAminosäuren selbst sind im Gegensatz zu OPA-Aminosäuren sehr stabil. Die Derivatisierung kann deshalb auch gut manuell durchgeführt werden. Ein Vorteil der FMOC-Methode ist, dass auch Cysteinderivate und sekundäre Aminosäuren wie Prolin und Hydroxyprolin mit hoher Empfindlichkeit erfasst werden. Die Nachweisgrenze liegt im unteren pico-Molbereich. Ein Nachteil der FMOC-Methode ist, dass das Reagenz selbst fluoresziert und durch das unpolare ADAM (Adamantanamin) wieder entfernt werden muss. Trotzdem ist ein relativ kleiner FMOC-OH Peak im Chromatogramm unvermeidlich. Ein weiterer Nachteil ist, dass FMOC-Cystin und FMOC-Tryptophan nur eine sehr geringe Fluoreszenz zeigen und mit UV gemessen werden müssen. Die FMOC-Methode ist nicht nur für Proteinhydrolysate, sondern nach entsprechender Probenvorbereitung (Enteiweißung mit 5-Sulfosalicylsäre (50mg/ml), Zentrifugation, Filtration) auch zur Analyse von physiologischen Proben geeignet. Die Derivatisierung besteht aus folgenden 3 Schritten: - 175 - Anhang 1.) Derivatisierungs-Ansatz zusammenmischen (40 µl Probe, 40 µl Boratpuffer, 80 µl FMOC und evtl. Interner Standard) und 60 Sekunden warten 2.) 100 µl ADAM-Lösung zugeben zum Wegderivatisieren von überschüssigem FMOC (60 Sekunden warten). 3.) Verdünnung mit 140 µl Eluent A und 5 min. warten 9 µl von dieser derivatisierten Probe werden auf die HPLC-Säule injiziert. (Bei niedrigen Aminosäurengehalten kann das Injektionsvolumen vergrößert werden. Unter diesen Standardbedingungen beträgt der Verdünnungsfaktor der Probe genau 1:10 HPLC-Trennung Die Auftrennung der FMOC-Aminosäuren erfolgt auf der speziellen RP-Säule „ReproSilFMOC, 5 µl (250x4.0mm)“ mittels eines Gradienten bei 40°C. Das Injektions-Volumen beträgt im Regelfall 10 µl. Ein Lauf dauert ca. 1 Stunde. Detektion: 263 nm (Anregung), 310nm (Emission) Gradientenverlauf: 0 min. 35 min. 45 min. 50 min. 55 min. 0%B 40 % B 70 % B 100 % B 100 % B Lieferumfang des FMOC-H Kits: Bestell-Nr.: FMOC/ADAM-Kit, komplett fmoc.00 ReproSil-FMOC-H Säule, 5µm (250 x 4 mm) Sättigungssäule (40 x 4 mm), komplett (Einbau zw. Pumpe und Injektor) FMOC-Vorsäulenkartuschen, 10 St (5 x 4.0 mm), oder kleinerer iD Vorsäulenkartuschen-Halter für 5 mm VSK FMOC-Reagenz, 1gr. (2,5 mM-Lösung ansetzen mit Aceton/Boratpuffer) Adamantanamin-HCl, 1gr, 12,5 mM-Lösung ansetzen mit Aceton/Boratpuffer Borsäure, 20 gr., gepulvert L-Norvalin, 100 mg, als interner Standard L-AS-Standard, 4x1 ml fmoc.s2504 ss.s0404 fmoc.v0004 81.00 fm2.03 fmoc.04 bo.20 fmoc.01 as.17 (17 AS+NH3;Hydrolysatstanderd 2,5 nMol/µl bei Cystin 1,25 nMol/µl) (22 L-Aminosäuren (je 100 mg) (Ala, Arg, Asn, Asp, Cystein, Cystin, Glu, Gln, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val) - 176 - as.22e Anhang Optional Arbeitsanleitung für FMOC-Methode Broschüre 5-FMOC Weiterführende Literatur zur FMOC-Methode: 1.) B. Gustavsson, I. Betner, J. Chromatogr., 507, 67-7, 1990 2.) A. Maisch, J. Maier-Rosenkranz, A. Kupka, P. Földi, LaborPraxis 4, 48-56, 1995 3.) A. Maisch, Labo 10, 37-40, 1996 (mit freundlicher Genehmigung der Fa. Dr. A. Maisch, Tübingen, Deutschland) 9.3 Überprüfung der Methode 9.3.1 Präzision in Serie Folgenden Tabellen (Tab. 9.3.1 und 9.3.2) stellen die jeweiligen Messergebnisse gegenüber und geben Auskunft über die Streuungswerte (Mittelwert x , Standardabweichung s und Variationskoeffizient VK). - 177 - Anhang Tab. 9.3.1: Präzision in Serie (10fach Messungen Standard) Messung (Konzentration in µmol/L) Substanz 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 IAA 46,30 48,01 45,73 43,50 44,18 50,17 40,56 48,36 48,72 50,44 Cys 3,25 3,29 3,11 2,84 3,18 3,79 3,65 3,86 3,23 3,59 Arg 15,18 14,15 14,29 14,80 14,81 13,43 14,51 14,88 13,89 13,66 Ser 13,47 10,29 9,53 8,97 9,72 12,20 10,16 10,41 9,84 11,42 Asp 10,99 10,53 10,62 10,72 11,19 10,71 11,41 11,82 11,55 10,86 Glu 12,16 11,20 11,20 11,49 11,31 12,26 13,80 14,25 14,04 13,18 Citrullin 24,09 26,07 25,42 25,57 25,55 24,00 25,84 26,68 24,82 24,95 Thr 23,77 23,53 23,65 24,46 23,89 24,91 28,27 28,92 27,69 26,68 Histamin 22,29 23,92 20,94 21,63 21,03 20,61 18,23 20,68 16,46 19,81 Gly 12,56 12,51 12,06 12,00 12,52 11,72 11,38 12,01 11,10 11,16 Agmatin 45,43 45,43 41,42 46,27 43,25 42,18 47,88 48,46 44,00 42,52 Ala 11,58 11,59 11,61 11,92 11,86 12,29 13,45 13,91 12,91 12,68 Tyr 10,21 9,69 9,41 9,51 9,94 8,45 9,30 8,84 8,14 7,94 Pro 44,94 46,14 44,74 44,83 45,76 46,18 46,33 46,22 45,40 46,04 GABA 6,98 6,91 6,77 4,71 6,79 7,38 8,21 8,40 7,47 7,59 Met/NH3 2,61 2,56 2,83 2,16 2,74 2,67 2,54 2,59 2,60 2,67 Val 13,07 12,98 12,78 13,11 13,09 13,41 14,56 14,96 13,54 13,70 NOR 16,58 16,58 17,96 19,79 20,37 18,04 19,69 20,32 18,35 18,55 Phe 17,93 18,01 17,28 17,75 17,80 17,46 18,41 18,94 17,18 17,71 Ile 11,39 11,33 11,02 11,32 11,32 11,59 12,52 12,90 11,59 11,84 Leu 10,89 10,81 10,55 10,87 10,78 11,06 11,93 12,34 11,21 11,26 Serotonin 507,45 510,19 479,64 493,99 496,65 420,23 424,19 421,02 412,64 408,65 DABA/His 0,78 3,58 5,63 5,71 5,14 7,27 8,57 9,12 8,82 8,25 Lys 13,89 14,87 13,55 14,80 13,85 12,09 13,45 14,62 12,94 13,20 - 178 - x 46,60 3,38 14,36 10,60 11,04 12,49 25,30 25,58 20,56 11,90 44,68 12,38 9,14 45,66 7,12 2,60 13,52 18,62 17,85 11,68 11,17 457,46 6,29 13,73 s 3,00 0,31 0,55 1,30 0,41 1,17 0,80 1,99 1,96 0,52 2,29 0,79 0,73 0,59 0,97 0,17 0,68 1,33 0,50 0,56 0,53 41,05 2,53 0,83 VK 5,94 8,65 4,00 11,39 3,80 8,84 3,22 7,48 9,91 4,68 5,38 6,20 9,18 1,29 12,73 6,22 4,95 7,16 2,82 4,73 4,71 10,05 30,73 6,32 Anhang Tab.9.3.2: Präzision in Serie (5fach Messungen RUSITEC-Proben) Lauf 13 Tag 7 Fermenter 6 Substanz s 2 3 4 5 1 x IAA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Cys 0,02 0,16 0,21 0,30 0,15 0,17 0,09 Arg 1,86 2,30 2,72 2,87 3,05 2,56 0,43 Ser 14,22 19,71 23,82 25,65 27,88 22,25 4,83 Asp 0,90 0,88 1,33 0,00 1,64 0,95 0,55 Glu 4,27 4,62 6,17 6,81 7,30 5,83 1,19 Citrullin 1,96 2,47 2,87 3,37 2,93 2,72 0,48 Thr 28,65 28,99 39,01 43,42 6,54 29,32 12,75 Histamin 1,39 0,77 1,08 1,03 0,73 1,00 0,24 Gly 2,79 2,40 3,47 3,75 3,92 3,27 0,58 Agmatin 2,81 2,86 0,68 2,86 3,05 2,45 0,89 Ala 5,52 5,29 6,52 7,05 7,64 6,40 0,89 Tyr 5,68 6,78 8,99 0,00 0,00 4,29 3,66 Pro 10,74 10,22 10,95 11,81 13,22 11,39 1,05 GABA 0,10 0,10 0,09 0,09 0,08 0,09 0,01 Val 2,10 1,99 2,35 2,46 2,74 2,33 0,27 NOR 42,90 41,58 47,34 49,32 52,64 46,76 4,08 Phe 2,11 2,00 2,23 2,27 2,53 2,23 0,18 Ile 0,14 0,07 0,12 0,05 0,10 0,10 0,03 Leu 0,68 0,62 0,71 0,61 0,63 0,65 0,04 Serotonin 46,98 51,18 52,10 44,66 44,83 47,95 3,14 DABA/His 2,86 2,46 2,45 3,33 3,36 2,89 0,40 Lys 6,09 9,99 5,04 5,46 6,03 6,52 1,78 VK 55,08 16,74 21,70 58,24 20,45 17,52 43,47 23,90 17,71 36,24 13,89 85,34 9,21 7,83 11,49 8,72 8,03 33,47 6,08 6,54 13,75 27,23 - 179 - Lauf 9 Tag 12 Fermenter 3 1 2 3 4 5 5,75 6,20 16,37 16,79 0,00 1,41 1,48 2,96 2,71 2,37 8,74 8,84 9,33 10,20 10,02 11,80 12,49 13,09 14,93 14,22 2,63 2,54 0,00 0,00 3,55 4,95 5,20 5,63 5,57 5,05 5,55 5,20 5,39 4,56 4,57 7,92 9,73 10,76 11,71 14,09 0,56 0,42 0,59 0,23 0,35 4,52 4,54 5,22 6,56 7,35 3,86 3,38 4,39 5,79 5,70 4,80 5,03 5,40 5,54 5,86 6,46 7,45 1,02 1,15 1,22 9,12 9,71 9,78 13,05 14,57 0,01 0,02 0,02 0,04 0,04 5,11 5,27 5,42 6,19 6,64 29,94 32,68 34,13 36,77 39,86 1,57 1,61 1,66 1,63 9,14 0,43 0,37 0,38 0,43 0,44 0,70 0,75 0,79 0,74 0,73 72,69 71,33 73,06 73,62 71,90 4,38 4,85 4,53 4,08 89,69 12,40 12,98 13,70 17,57 20,09 x 9,02 2,19 9,43 13,31 1,74 5,28 5,05 10,84 0,43 5,64 4,62 5,32 3,46 11,25 0,03 5,73 34,68 3,12 0,41 0,74 72,52 21,51 15,35 s 6,55 0,63 0,60 1,13 1,47 0,27 0,41 2,05 0,13 1,13 0,97 0,37 2,87 2,16 0,01 0,59 3,40 3,01 0,03 0,03 0,82 34,09 2,98 VK 72,59 28,91 6,33 8,52 84,12 5,16 8,20 18,94 30,63 20,10 21,01 7,03 83,05 19,19 43,96 10,25 9,82 96,40 7,55 3,59 1,13 158,52 19,43 Anhang 9.3.2 Wiederfindungsrate Zur Überprüfung der Wiederfindungsrate wurden sowohl Standards, als auch Proben in unterschiedlichen Verdünnungsstufen vermessen. Zusätzlich sollte auf diese Weise ermittelt werden in welcher Verdünnung die jeweilige Substanz noch nachweisbar ist. Die im Standard bzw. der Probe der ersten Verdünnungsstufe (1:1) gemessenen Werte wurden hierbei als Referenzwert (= 100 %) definiert und die weiteren Messergebnisse mit diesem Referenzwert ins Verhältnis gesetzt. In Spalte „Soll“ ist die jeweils zu erwartende Wiederfindungsrate in % aufgelistet. Standard 1 Tab. 9.3.2.1: Wiederfindungsraten bei Standardvermessung (Substanz nicht nachweisbar gekennzeichnet mit *) VerMesswerte in µmol/L dünnung IAA Cys Arg Ser 37,0 4,47 12,9 12,6 1:1 18,4 3,16 6,32 6,77 1:2 6,63 1,64 2,67 3,52 1:4 3,41 0,76 1,31 0,97 1:8 * 0,23 0,56 * 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Asp Glu Soll IAA Cys Arg Ser Asp Glu 9,88 10,4 100 100 100 100 100 100 100 4,93 5,97 50 49,7 70,6 49,0 53,8 49,9 57,6 2,05 2,33 25 17,9 36,60 20,7 27,9 20,7 22,5 0,85 1,04 12,5 9,19 17,0 10,2 7,70 8,65 10,0 0,22 0,38 6,25 0,00 5,18 4,32 0,00 2,27 3,67 * nicht messbar - 180 - Anhang Ver- Messwerte in µmol/L Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 dünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 CitrulHistAgCitrulHistAglin Thr amin Gly matin Ala Soll lin Thr amin Gly matin Ala 23,3 24,0 37,07 13,03 47,6 12,1 100 100 100 100 100 100 100 11,9 12,8 21,2 6,56 21,7 6,50 50 51,0 53,5 57,0 50,4 45,6 53,6 25 23,4 22,5 30,2 24,5 16,9 25,6 5,47 5,40 11,2 3,19 8,01 3,10 2,96 2,70 5,84 1,66 2,40 1,82 12,5 12,7 11,3 15,8 12,7 5,05 15,0 1,60 1,28 2,16 0,59 * 1,09 6,25 6,86 5,35 5,81 4,55 0,00 8,97 VerWiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Messwerte in µmol/L dünnung Tyr Pro GABA Val NOR Phe Soll Tyr Pro GABA Val NOR Phe 11,6 46,0 8,45 14,4 20,1 18,9 100 100 100 100 100 100 100 1:1 3,96 * 4,08 7,13 9,80 10,1 50 34,2 * 48,3 49,5 48,8 53,5 1:2 1,93 * 1,74 3,10 4,18 5,14 25 16,6 * 20,6 21,6 20,8 27,3 1:4 1,19 3,02 0,71 1,41 1,91 3,13 12,5 10,2 6,57 8,45 9,79 9,52 16,6 1:8 0,78 0,10 0,21 0,45 0,66 1,62 6,25 6,73 0,22 2,44 3,16 3,30 8,60 1:16 - 181 - Anhang VerMesswerte in µmol/L dünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 Ile Leu Serotonin 15,2 12,9 515 6,28 6,18 197 2,77 2,64 85,6 1,29 1,19 43,2 0,46 0,39 24,8 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 DABA /His Lys 0,94 16,2 0,85 6,83 6,27 2,81 3,14 1,38 1,54 0,60 Soll Ile Leu Serotonin 100 100 100 100 50 41,2 47,9 38,3 25 18,2 20,4 16,6 12,5 8,48 9,23 8,40 6,25 3,02 3,05 4,82 DABA /His Lys 100 100 91,1 42,3 668 17,4 334 8,54 164 3,72 Standard 2 Tab. 9.3.2.2: Wiederfindungsraten bei Standardvermessung VerWiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Messwerte in µmol/L dünnung IAA Cys Arg Ser Asp Glu Soll IAA Cys Arg Ser Asp Glu 41,4 4,38 13,2 15,7 11,6 10,8 100 100 100 100 100 100 100 1:1 20,8 3,34 6,85 6,97 6,93 6,50 50 50,2 76,2 51,7 44,5 60,0 60,5 1:2 7,73 1,61 2,95 1,25 2,09 2,52 25 18,7 36,7 22,3 7,97 18,1 23,4 1:4 4,96 0,87 1,62 0,20 1,33 1,17 12,5 12,0 19,8 12,2 1,30 11,5 10,9 1:8 0,58 0,36 6,25 3,92 9,04 6,31 * 4,98 3,39 1,62 0,40 0,84 * 1:16 - 182 - Anhang Ver- Messwerte in µmol/L Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 dünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 CitrulHistAgCitrulHistAglin Thr amin Gly matin Ala Soll lin Thr amin Gly matin Ala 24,9 24,8 38,1 14,9 48,6 13,2 100 100 100 100 100 100 100 13,7 14,2 21,3 8,12 21,4 7,92 50 54,8 57,5 56,0 54,6 44,0 60,0 25 22,9 21,4 27,4 19,1 13,8 24,7 5,71 5,29 10,4 2,85 6,71 3,26 3,54 2,84 5,46 1,62 2,14 2,12 12,5 14,2 11,5 14,3 10,8 4,41 16,1 2,15 1,08 1,92 0,82 * 1,29 6,25 8,62 4,36 5,04 5,49 * 9,76 VerWiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Messwerte in µmol/L dünnung Tyr Pro GABA Val NOR Phe Soll Tyr Pro GABA Val NOR Phe 11,8 49,3 8,26 14,7 19,6 19,2 100 100 100 100 100 100 100 1:1 4,59 24,1 4,15 7,99 10,2 10,8 50 38,9 49,0 50,3 54,3 52,3 56,3 1:2 2,01 8,72 1,62 3,28 4,39 5,48 25 17,0 17,7 19,6 22,3 22,4 28,6 1:4 2,01 8,72 1,62 3,28 4,39 5,48 12,5 3,73 0,80 1,67 2,18 3,51 28,6 1:8 0,85 0,78 0,25 0,69 0,89 2,31 6,25 7,24 1,59 3,06 4,71 4,53 12,1 1:16 - 183 - Anhang VerMesswerte in µmol/L dünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Ile Leu Serotonin 12,7 12,7 537 6,75 6,92 214 2,93 2,90 96,4 1,48 1,47 53,4 0,67 0,63 32,9 DABA /His Lys 25,5 13,5 14,6 7,83 5,74 3,05 3,24 1,66 1,50 0,78 Soll Ile Leu Serotonin 100 100 100 100 50 53,2 54,5 39,9 25 23,0 22,9 17,9 12,5 11,7 11,7 9,93 6,25 5,26 4,94 6,12 DABA /His Lys 100 100 57,1 58,2 22,5 22,7 12,7 12,3 5,89 5,78 Lauf 16 Tag 17 Fermenter 4 Tab. 9.3.2.3: Wiederfindungsraten bei RUSITEC-Probenvermessung (Substanz nicht nachweisbar gekennzeichnet mit *) VerMesswerte in µmol/L dünnung IAA Cys Arg Ser 4,77 2,26 3,26 * 1:1 * * 1,41 * 1:2 * * 0,16 * 1:4 * * 2,09 * 1:8 * * 0,18 * 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Asp 3,89 1,11 0,36 1,49 * Glu Soll IAA 5,49 100 100 8,13 50 * 0,17 25 * 0,70 12,5 * 0,69 6,25 * - 184 - Cys 100 * * * * Arg Ser 100 * 43,2 * 4,88 * 64,1 * 5,57 * Asp Glu 100 100 28,6 148 9,16 3,03 38,2 12,7 * 12,6 Anhang VerMesswerte in µmol/L dünnung Citrul- Thr Histlin amin 3,79 13,4 * 1:1 1,55 2,35 * 1:2 1,98 * * 1:4 0,99 5,55 * 1:8 0,49 * * 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Gly AgAla matin 6,27 * 7,54 2,31 * 3,35 0,29 * 1,01 0,03 * 0,82 * * * VerMesswerte in µmol/L dünnung Tyr Pro GABA Val NOR Phe 0,66 31,2 * 4,44 45,1 5,70 1:1 * 2,14 20,1 3,23 * 14,0 1:2 * 5,64 * 0,27 2,58 0,66 1:4 * * * 0,00 0,63 * 1:8 * * * * * * 1:16 Soll 100 50 25 12,5 6,25 Citrul- Thr Histlin amin 100 100 * 40,9 17,6 * 52,3 * * 26,3 41,5 * 13,0 * * Gly 100 36,8 4,61 0,43 * AgAla matin * 100 * 44,4 * 13,3 * 10,9 * * Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Soll Tyr Pro GABA Val NOR Phe 100 100 100 * 100 100 100 50 * 44,8 * 48,2 44,5 56,7 25 * 18,0 * 6,00 5,73 11,7 12,5 * * * * 1,40 * 6,25 * * * * * * VerMesswerte in µmol/L dünnung Ile Leu Serotonin DABA/His Lys 0,40 0,96 33,1 1,92 22,7 1:1 * 0,20 59,9 2,12 8,61 1:2 * * 16,5 1,41 2,57 1:4 * * * 0,93 * 1:8 * * * 0,91 * 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Soll Ile Leu Serotonin DABA/His Lys 100 100 100 100 100 100 50 * 20,5 181 111 38,0 25 * * 49,9 73,5 11,3 12,5 * * * 48,5 * 6,25 * * * 47,4 * - 185 - Anhang Lauf 11 Tag 8 Fermenter 2 Tab. 9.3.2.4: Wiederfindungsraten bei RUSITEC-Probenvermessung (Substanz nicht nachweisbar gekennzeichnet mit *) VerMesswerte in µmol/L dünnung IAA Cys Arg Ser 21,49 2,59 5,19 28,6 1:1 * * 0,54 * 1:2 * * 0,16 2,31 1:4 * * 0,24 0,51 1:8 * * 0,18 0,17 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Asp 2,55 0,08 0,36 * * Glu Soll IAA Cys Arg Ser 4,93 100 100 100 100 100 0,89 50 * * 10,3 * 0,17 25 * * 3,07 * * 12,5 * * 4,57 * 0,69 6,25 * * 3,50 * VerMesswerte in µmol/L dünnung Citrul- Thr Hist- Gly Aglin amin matin 1,89 36,1 * 3,79 * 1:1 0,41 13,6 * 1,04 * 1:2 1,48 14,9 * 0,50 * 1:4 0,99 5,55 * 0,03 * 1:8 0,49 * * * * 1:16 Asp Glu 100 100 3,20 18,0 14,0 3,37 * * * 14,1 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Ala 3,63 2,24 0,72 0,82 * Citrul- Thr Hist- Gly AgAla Soll lin amin matin 100 100 100 * 100 * 100 50 21,9 37,6 * 27,5 * 61,6 25 78,4 41,2 * 13,1 * 19,7 12,5 52,7 15,4 * 0,70 * 22,7 6,25 26,1 * * * * * - 186 - Anhang VerMesswerte in µmol/L dünnung Tyr Pro GABA Val NOR Phe 9,41 6,60 * 2,47 39,7 2,89 1:1 2,48 0,00 * 1,26 19,4 1,67 1:2 * 0,45 * 0,32 2,56 0,86 1:4 0,63 * * * * * 1:8 * * * * * * 1:16 Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 Soll Tyr Pro GABA Val NOR Phe 100 100 100 * 100 100 100 50 26,4 0,00 * 51,0 48,9 57,7 25 * 6,76 * 12,8 6,46 29,6 12,5 * * * * 1,59 * 6,25 * * * * * * VerMesswerte in µmol/L Wiederfindungsrate (%) bezogen auf 1:1 dünnung Ile Leu Serotonin DABA/His Lys Soll Ile Leu Serotonin DABA/His Lys * 0,32 21,8 9,23 6,06 100 * 100 100 100 100 1:1 * 0,01 198 6,20 1,52 50 * 1,59 908 67,2 25,0 1:2 * * 28,4 1,47 0,33 25 * * 131 16,0 5,41 1:4 * * * 0,93 * 12,5 * * * 10,1 * 1:8 * * * 0,91 * 6,25 * * * 9,84 * 1:16 - 187 - Anhang 9.3.3 Messgenauigkeit durch Doppelmessungen Für die Überprüfung der Messgenauigkeit wurden vier Proben bzw. Standards jeweils doppelt vermessen. In den folgenden Tabellen sind die Messergebnisse, sowie Streuungsparameter (Mittelwert x , Standardabweichung s, Verteilungskoeffizient VK) dargestellt. Tab. 9.3.3.1: Doppelmessungen von Standards Konzentration in µmol/L Substanz Standard 1 Wdh. 1 IAA 46,3 45,7 Cys 3,25 3,11 Arg 15,2 14,3 Ser 13,5 9,53 Asp 11,0 10,6 Glu 12,2 11,2 Citrullin 24,1 25,4 Thr 23,8 23,7 Histamin 22,3 20,9 Gly 12,6 12,1 Agmatin 45,4 41,4 Ala 11,6 11,6 Tyr 10,2 9,41 Pro 44,9 44,7 GABA 6,98 6,77 Val 13,1 13,0 NOR 16,6 18,0 Phe 17,9 17,3 Ile 11,4 11,0 Leu 10,9 10,6 Serotonin 508 480 DABA/His 0,78 5,63 Lys 13,9 13,6 - 188 - Streuungsparameter s VK x 46,0 0,28 0,62 3,18 0,07 2,08 14,7 0,45 3,04 11,5 1,97 17,1 10,8 0,18 1,69 11,7 0,48 4,12 24,8 0,66 2,68 23,7 0,06 0,25 21,6 0,68 3,13 12,3 0,25 2,02 43,4 2,01 4,62 11,6 0,02 0,16 9,81 0,40 4,05 44,8 0,10 0,22 6,87 0,10 1,48 12,9 0,15 1,15 17,3 0,69 4,00 17,6 0,32 1,84 11,2 0,19 1,68 10,7 0,17 1,59 494 13,9 2,82 3,20 2,43 75,8 13,7 0,17 1,24 Anhang Konzentration in µmol/L Streuungsparameter Substanz Standard 2 Wdh. 2 s VK x IAA 50,4 50,2 50,3 0,13 0,26 Cys 3,59 3,79 3,69 0,10 2,71 Arg 13,7 13,4 13,6 0,11 0,84 Ser 11,4 12,2 11,8 0,39 3,30 Asp 10,9 10,7 10,8 0,07 0,66 Glu 13,2 12,3 12,7 0,46 3,62 Citrullin 25,0 24,0 24,5 0,48 1,95 Thr 26,7 24,9 25,8 0,88 3,42 Histamin 19,8 20,6 20,2 0,40 1,97 Gly 11,2 11,7 11,4 0,28 2,42 Agmatin 42,5 42,2 42,4 0,17 0,40 Ala 12,7 12,3 12,5 0,20 1,58 Tyr 7,94 8,45 8,20 0,25 3,10 Pro 46,0 46,2 46,1 0,07 0,14 GABA 7,59 7,38 7,49 0,10 1,38 Val 13,7 13,4 13,6 0,14 1,05 NOR 18,6 18,0 18,3 0,26 1,41 Phe 17,7 17,5 17,6 0,12 0,71 Ile 11,8 11,6 11,7 0,13 1,07 Leu 11,3 11,1 11,2 0,10 0,89 Serotonin 409 420 414 5,79 1,40 DABA/His 8,25 7,27 7,76 0,49 6,28 Lys 13,2 12,1 12,6 0,55 4,36 Substanz IAA Cys Arg Ser Asp Glu Citrullin Thr Histamin Gly Agmatin Ala Tyr Konzentration in µmol/L Standard 3 Wdh. 3 48,4 48,0 3,86 3,29 14,9 14,2 10,4 10,3 11,8 10,5 14,3 11,2 26,7 26,1 28,9 23,5 20,7 23,9 12,0 12,5 48,5 45,4 13,9 11,6 8,84 9,69 - 189 - Streuungsparameter s VK x 48,2 0,17 0,36 3,57 0,29 8,07 14,5 0,37 2,52 10,4 0,06 0,57 11,2 0,64 5,75 12,7 1,52 12,0 26,4 0,30 1,15 26,2 2,69 10,3 22,3 1,62 7,25 12,3 0,25 2,04 46,9 1,52 3,23 12,8 1,16 9,08 9,26 0,42 4,54 Anhang Fortsetzung Konzentration in µmol/L Substanz Probe 1 Wdh. 1 Pro 46,2 46,1 GABA 8,40 6,91 Val 15,0 13,0 NOR 20,3 16,6 Phe 18,9 18,0 Ile 12,9 11,3 Leu 12,3 10,8 Serotonin 421 510 DABA/His 9,12 3,58 Lys 14,6 14,9 Streuungsparameter s VK x 46,2 0,04 0,10 7,65 0,74 9,70 14,0 0,99 7,09 18,5 1,87 10,2 18,5 0,46 2,49 12,1 0,78 6,46 11,6 0,77 6,63 466 44,6 9,58 6,35 2,77 43,6 14,8 0,12 0,84 Konzentration in µmol/L Substanz Standard 4 Wdh. 4 IAA 43,5 44,2 Cys 2,84 3,18 Arg 14,8 14,8 Ser 8,97 9,72 Asp 10,7 11,2 Glu 11,5 11,3 Citrullin 25,6 25,6 Thr 24,5 23,9 Histamin 21,6 21,0 Gly 12,0 12,5 Agmatin 46,3 43,3 Ala 11,9 11,9 Tyr 9,51 9,94 Pro 44,8 45,8 GABA 4,71 6,79 Val 13,1 13,1 NOR 19,8 20,4 Phe 17,8 17,8 Ile 11,3 11,3 Leu 10,9 10,8 Serotonin 494 497 DABA/His 5,71 5,14 Lys 14,8 13,9 Streuungsparameter s VK x 43,8 0,34 0,77 3,01 0,17 5,55 14,8 0,00 0,02 9,35 0,38 4,03 11,0 0,23 2,13 11,4 0,09 0,78 25,6 0,01 0,04 24,2 0,28 1,17 21,3 0,30 1,41 12,3 0,26 2,14 44,8 1,51 3,38 12,0 0,03 0,26 9,73 0,21 2,21 45,3 0,47 1,03 5,75 1,04 18,1 13,1 0,01 0,07 20,1 0,29 1,46 17,8 0,03 0,15 11,3 0,00 0,03 10,8 0,05 0,43 495 1,33 0,27 5,43 0,29 5,27 14,3 0,47 3,29 - 190 - Anhang Tab. 9.3.3.2: Doppelmessungen von RUSITEC-Proben Konzentration in µmol/L Streuungsparameter Substanz Probe 1 Wdh. 1 s VK x IAA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Cys 0,02 0,16 0,09 0,07 81,4 Arg 1,86 2,30 2,08 0,22 10,5 Ser 14,2 19,7 17,0 2,75 16,2 Asp 0,90 0,88 0,89 0,01 0,98 Glu 4,27 4,62 4,45 0,17 3,93 Citrullin 1,96 2,47 2,21 0,26 11,6 Thr 28,7 29,0 28,8 0,17 0,57 Histamin 1,39 0,77 1,08 0,31 29,0 Gly 2,79 2,40 2,60 0,19 7,40 Agmatin 2,81 2,86 2,83 0,02 0,84 Ala 5,52 5,29 5,41 0,11 2,09 Tyr 5,68 6,78 6,23 0,55 8,81 (Pro 10,7 10,2 10,5 0,26 2,51 GABA 0,10 0,10 0,10 0,00 0,69 Val 2,10 1,99 2,04 0,05 2,67 NOR 42,9 41,6 42,2 0,66 1,56 Phe 2,11 2,00 2,06 0,06 2,77 Ile 0,14 0,07 0,10 0,03 33,5 Leu 0,68 0,62 0,65 0,03 5,31 Serotonin 47,0 51,2 49,1 2,10 4,27 DABA/His 2,86 2,46 2,66 0,20 7,54 Lys 6,09 9,99 8,04 1,95 24,3 Substanz IAA Cys Arg Ser Asp Glu Citrullin Thr Histamin Gly Agmatin Ala Tyr Konzentration in µmol/L Probe 2 Wdh. 2 5,75 6,20 1,41 1,48 8,74 8,84 11,8 12,5 2,63 2,54 4,95 5,20 5,55 5,20 7,92 9,73 0,56 0,42 4,52 4,54 3,86 3,38 4,80 5,03 6,46 7,45 - 191 - Streuungsparameter s VK x 5,97 0,23 3,81 1,45 0,03 2,39 8,79 0,05 0,60 12,2 0,34 2,82 2,59 0,05 1,84 5,08 0,13 2,52 5,38 0,18 3,26 8,83 0,90 10,2 0,49 0,07 14,4 4,53 0,01 0,21 3,62 0,24 6,65 4,91 0,12 2,37 6,96 0,50 7,17 Anhang Fortsetzung Konzentration in µmol/L Substanz Probe 4 Wdh. 4 Pro 9,12 9,71 GABA 0,01 0,02 Val 5,11 5,27 NOR 29,9 32,7 Phe 1,57 1,61 Ile 0,43 0,37 Leu 0,70 0,75 Serotonin 72,7 71,3 DABA/His 4,38 4,85 Lys 12,4 13,0 Streuungsparameter s VK x 9,42 0,29 3,13 0,02 0,01 27,6 5,19 0,08 1,55 31,3 1,37 4,37 1,59 0,02 1,19 0,40 0,03 7,64 0,73 0,02 3,15 72,0 0,68 0,94 4,62 0,23 5,06 12,7 0,29 2,31 Konzentration in µmol/L Substanz Probe 3 Wdh. 3 IAA 0,00 0,00 Cys 0,30 0,15 Arg 2,87 3,05 Ser 25,7 27,9 Asp 0,00 1,64 Glu 6,81 7,30 Citrullin 3,37 2,93 Thr 43,4 6,5 Histamin 1,03 0,73 Gly 3,75 3,92 Agmatin 2,86 3,05 Ala 7,05 7,64 Tyr 0,00 0,00 Pro 11,8 13,2 GABA 0,09 0,08 Val 2,46 2,74 NOR 49,3 52,6 Phe 2,27 2,53 Ile 0,05 0,10 Leu 0,61 0,63 Serotonin 44,7 44,8 DABA/His 3,33 3,36 Lys 5,46 6,03 Streuungsparameter s VK x 0,00 0,00 0,23 0,07 31,8 2,96 0,09 2,97 26,8 1,11 4,16 0,82 0,82 7,05 0,24 3,42 3,15 0,22 7,10 25,0 18,4 73,8 0,88 0,15 16,8 3,84 0,08 2,10 2,96 0,10 3,33 7,34 0,29 4,01 0,00 0,00 12,5 0,70 5,62 0,09 0,00 5,03 2,60 0,14 5,46 51,0 1,66 3,26 2,40 0,13 5,58 0,08 0,02 31,3 0,62 0,01 1,98 44,6 0,09 0,19 3,34 0,02 0,53 5,74 0,28 4,96 - 192 - Anhang Konzentration in µmol/L Substanz Probe 4 Wdh. 4 IAA 16,4 16,8 Cys 2,96 2,71 Arg 9,33 10,2 Ser 13,1 14,9 Asp 0,00 0,00 Glu 5,63 5,57 Citrullin 5,39 4,56 Thr 10,8 11,7 Histamin 0,59 0,23 Gly 5,22 6,56 Agmatin 4,39 5,79 Ala 5,40 5,54 Tyr 1,02 1,15 Pro 9,78 13,1 GABA 0,02 0,04 Val 5,42 6,19 NOR 34,1 36,8 Phe 1,66 1,63 Ile 0,38 0,43 Leu 0,79 0,74 Serotonin 73,1 73,6 DABA/His 4,53 4,08 Lys 13,7 17,6 Streuungsparameter s VK x 16,6 0,21 1,27 2,84 0,12 4,39 9,76 0,44 4,47 14,0 0,92 6,53 0,00 0,00 0,00 5,60 0,03 0,56 4,98 0,41 8,26 11,2 0,48 4,24 0,41 0,18 43,0 5,89 0,67 11,4 5,09 0,70 13,7 5,47 0,07 1,29 1,08 0,07 6,21 11,4 1,64 14,3 0,03 0,01 40,3 5,80 0,39 6,68 35,5 1,32 3,72 1,65 0,01 0,74 0,41 0,03 6,79 0,76 0,02 2,79 73,3 0,28 0,38 4,31 0,22 5,14 15,6 1,94 12,4 9.4 Wertetabellen Ergebnisteil 9.4.1 Konzentrationen von Aminosäuren und Biogenen Aminen im Pansensaft in vitro In den folgenden Tabellen sind Mittelwerte ( x ), die zur Erstellung der Graphen im Ergebnisteil (Kap. 4.1) verwendet wurden dargestellt. Des Weiteren enthalten die Tabellen Informationen über die Anzahl der für die Berechnung einbezogenen Werte(n) und die Standardabweichung (s). Unterschiede zwischen der Kontrolle und den Zulagen bzw. den Zulagen untereinander ergeben sich aus den p-Werten. Hierbei wurden p-Werte, die auf eine Signifikanz (p<0,05) bzw. eine Tendenz (p<0,1) hindeuten fett dargestellt. - 193 - Anhang Tab. 9.4.1.1: Indoleesigsäure Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Indolessigsäure in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Kontrolle Zulage 1 Zulage 2 n 0 0 0 0 0 0 0 2 2 1 0 0 0 0 0 x 1.31 2.02 0.10 s 0.37 0.74 n 0 0 0 0 0 2 0 4 2 0 1 0 0 0 0 s x 0.43 0.07 2.79 1.12 0.94 0.11 1.80 n 0 1 0 2 2 2 2 2 2 2 0 1 1 0 0 x s p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.12 1.97 1.18 4.83 7.17 7.84 3.57 5.86 0.67 0.11 1.03 1.36 1.71 0.60 1.25 0.00 0.30 0.14 0.35 0.16 0.13 3.05 1.14 Indolessigsäure in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Kontrolle Zulage 1 Zulage 2 p-Werte n 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 1 1 2 2 x 3.12 3.12 4.23 4.75 5.04 4.27 s 0.23 0.40 1.90 0.71 n 0 0 0 1 2 1 2 3 2 2 0 0 1 2 0 x 8.88 8.56 0.36 0.33 4.05 8.35 6.34 4.24 3.50 s 7.57 0.07 3.34 0.21 1.13 0.04 - 194 - n 0 0 0 1 1 0 1 2 3 2 0 0 1 2 1 x s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 3.60 0.50 0.01 1.91 27.0 5.82 3.86 4.21 3.67 0.06 38.5 0.06 0.00 0.21 0.53 0.06 0.06 0.30 0.65 0.49 0.45 0.56 0.26 Anhang Indolessigsäure in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 0 0 0 0 4 6.17 3.22 4 5.93 3.05 2 11.3 1.42 2 12.9 3.39 2 10.7 2.59 2 8.45 1.14 Zulage 1 n s x 0 0 1 7.61 0 0 2 5.59 0.38 2 4.78 0.45 1 6.04 2 4.91 0.09 2 5.20 0.83 2 4.07 0.37 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 0 0 2 6.19 1.65 1 4.84 2 5.93 1.32 0.06 0.07 0.70 4 6.02 0.63 0.41 0.64 0.11 4 6.19 2.19 0.10 2 7.46 0.68 0.19 0.21 0.13 4 7.45 0.88 0.26 0.25 0.28 4 6.42 1.25 0.15 0.05 0.22 Tab. 9.4.1.2: Cystein Cystein in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 5 6 4 6 6 6 6 6 5 6 6 Kontrolle s x 6.80 7.45 2.96 3.15 2.64 2.48 5.80 8.33 7.26 14.4 9.18 12.7 1.46 1.08 2.42 2.64 4.14 4.30 1.83 0.90 3.13 3.17 2.05 2.87 2.36 3.33 2.84 3.05 0.90 0.12 n 4 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 5 5 6 Zulage 1 s x 6.80 7.45 3.03 3.00 1.73 1.44 2.91 3.13 10.0 20.1 11.3 22.1 2.42 0.26 2.74 2.85 5.21 6.93 3.22 3.66 3.33 3.37 2.23 3.54 7.87 15.7 0.84 0.25 1.16 0.23 - 195 - n 4 6 6 6 6 5 6 4 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.80 7.45 2.59 2.80 0.48 0.53 0.69 1.80 1.20 0.20 0.20 0.71 2.67 4.34 0.25 0.34 0.85 17.5 25.8 0.34 0.37 0.53 13.6 26.9 0.34 0.34 0.36 1.38 0.58 0.50 0.46 0.27 6.07 9.68 0.72 0.59 0.63 7.49 9.23 0.37 0.21 0.26 3.19 4.64 0.39 0.54 0.98 2.89 4.65 0.33 0.87 0.74 4.97 7.00 0.93 0.28 0.22 1.38 0.96 0.53 0.57 0.43 0.83 0.25 0.19 0.20 0.88 1.11 0.34 0.05 0.18 0.80 Anhang Cystein in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 5 5 6 6 6 6 5 4 5 5 4 6 6 6 Kontrolle s x 0.54 0.00 0.43 0.14 0.53 0.26 0.97 0.76 1.00 0.55 1.05 0.66 0.87 0.49 0.64 0.32 0.71 0.39 0.55 0.14 0.45 0.10 0.33 0.07 0.37 0.10 0.41 0.06 0.39 0.07 n 2 5 5 6 6 6 6 6 6 4 4 4 5 6 5 Zulage 1 s x 0.54 0.00 0.56 0.29 0.40 0.14 0.82 0.72 0.51 0.36 0.53 0.39 0.54 0.25 0.52 0.31 0.36 0.12 0.40 0.18 0.30 0.04 0.64 0.59 0.42 0.07 0.66 0.55 0.43 0.10 n 2 4 4 5 6 5 6 6 4 5 4 4 4 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.54 0.00 0.15 0.69 0.02 0.44 0.18 0.64 0.11 0.17 0.55 0.30 0.04 0.04 0.03 2.05 1.42 0.00 0.09 0.04 1.90 1.53 0.02 0.07 0.04 2.42 1.71 0.05 0.06 0.03 1.28 0.81 0.65 0.38 0.20 1.07 0.74 0.09 0.64 0.11 1.17 0.78 0.10 0.03 0.01 1.04 0.48 0.07 0.00 0.00 0.98 0.05 0.33 0.15 0.78 0.54 0.19 0.48 0.54 0.88 0.46 0.12 0.35 0.48 0.44 0.44 0.16 0.20 0.69 0.78 0.42 0.09 Cystein in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 1 4 3 5 5 4 4 4 6 4 4 6 5 6 3 Kontrolle s x 39.8 5.83 6.77 5.71 0.23 0.04 20.7 29.2 0.35 0.23 4.66 5.63 4.69 7.86 6.20 9.21 9.43 7.93 22.5 28.8 0.60 0.35 0.09 0.26 0.42 0.22 0.16 0.28 0.01 n 2 1 2 4 5 4 3 4 4 2 0 4 3 3 5 Zulage 1 s x 39.8 5.83 0.34 0.05 0.23 0.00 17.2 19.6 0.31 0.41 5.62 6.77 12.0 15.9 11.1 10.7 11.7 10.5 23.0 28.0 0.31 0.04 0.26 0.42 0.53 0.25 0.28 0.05 0.38 0.13 - 196 - n 2 2 3 3 3 3 2 4 4 2 1 6 5 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 39.8 5.83 3.30 5.30 0.49 0.14 0.18 0.08 0.96 0.65 0.50 5.44 4.58 0.71 0.33 0.02 5.66 7.14 0.94 0.46 10.5 4.42 0.36 0.08 0.90 15.9 9.02 0.22 0.01 0.62 12.7 6.60 0.66 0.73 0.33 9.36 4.69 0.24 0.31 0.22 4.55 3.87 0.59 0.15 0.35 0.38 0.22 0.18 0.23 0.66 0.09 0.79 0.55 0.29 0.96 0.20 0.12 0.78 0.59 0.63 0.29 0.01 0.49 0.34 0.54 Anhang Cystein in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 1 4 3 5 5 4 4 4 6 4 4 6 5 6 3 Kontrolle s x 0.00 0.02 0.06 0.02 0.07 0.53 0.15 0.88 0.24 0.47 0.41 0.39 0.23 1.78 0.56 1.31 0.63 0.85 0.36 0.70 0.70 4.17 6.00 0.60 0.40 0.79 0.31 0.52 0.44 n 2 1 2 4 5 4 3 4 4 2 0 4 3 3 5 Zulage 1 s x 0.00 0.00 0.48 0.27 0.37 0.81 0.57 0.96 0.79 0.38 0.25 0.41 0.51 1.13 1.06 1.09 0.94 0.44 0.32 2.02 0.98 0.55 0.14 3.54 0.12 0.40 0.20 n 2 2 3 3 3 3 2 4 4 2 1 6 5 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.00 0.00 0.08 0.09 0.09 0.12 0.08 0.23 0.11 0.54 0.10 0.33 0.28 0.40 0.84 0.44 0.21 0.16 0.07 0.79 0.11 0.48 0.17 0.06 0.94 0.53 0.38 0.36 0.31 0.48 0.04 0.15 2.09 3.46 0.51 0.75 0.65 0.62 0.19 0.69 0.69 0.04 3.30 4.78 0.42 0.32 0.80 0.45 0.28 0.37 0.87 0.10 0.53 0.22 0.02 0.46 0.95 0.47 0.54 0.16 0.99 0.31 Cystein in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 5 4 3 5 4 5 4 4 3 4 Kontrolle s x 15.1 0.00 0.39 0.30 0.61 0.53 1.62 1.34 1.15 1.59 2.51 1.65 3.74 2.58 1.09 0.46 1.33 0.50 5.27 4.33 5.33 4.59 n 2 3 4 3 3 5 6 2 4 3 4 Zulage 1 s x 15.1 0.00 0.43 0.06 0.47 0.48 0.68 0.55 0.67 0.60 0.73 0.45 0.85 0.25 0.89 0.13 0.58 0.59 0.70 0.08 0.45 0.15 - 197 - n 2 4 5 2 3 4 6 2 2 5 5 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 15.1 0.00 0.29 0.26 0.92 0.34 0.11 0.40 0.49 0.84 0.68 0.89 3.14 0.25 0.18 0.05 0.01 3.85 2.01 0.13 0.46 0.17 2.13 0.80 0.15 0.77 0.05 2.49 1.02 0.08 0.50 0.01 3.71 0.99 0.53 0.05 0.14 2.61 0.14 0.01 0.13 0.04 1.42 2.54 0.49 0.19 0.08 1.57 3.07 0.18 0.21 0.63 Anhang Tab. 9.4.1.3: Arginin Arginin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle s n x 0 6 3.26 1.35 5 4.16 1.16 6 3.96 1.35 5 4.01 1.38 6 5.11 1.58 5 2.72 0.71 6 3.41 0.83 6 3.50 2.38 6 3.65 1.21 6 3.29 1.03 6 2.64 1.04 6 2.66 0.97 6 3.81 2.26 6 2.99 0.53 Zulage 1 n s x 0 5 2.85 1.00 6 2.88 0.82 6 3.60 0.94 5 2.94 2.12 5 5.32 2.09 6 2.64 1.40 6 2.89 1.39 6 3.87 2.25 6 3.44 1.57 6 2.45 0.33 6 4.04 2.86 5 2.14 1.13 5 3.31 0.88 6 4.08 1.81 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 6 2.83 1.51 0.26 0.55 0.71 6 2.57 0.64 0.10 0.04 0.43 5 3.40 1.20 0.54 0.51 0.64 6 6.60 3.50 0.06 0.08 0.00 5 6.64 5.32 0.23 0.36 0.47 4 2.41 1.17 0.94 0.43 0.54 6 2.88 0.92 0.41 0.43 0.98 6 3.51 1.53 0.51 0.99 0.62 5 2.50 1.03 0.71 0.16 0.08 6 4.73 1.74 0.14 0.16 0.03 6 3.18 2.37 0.24 0.58 0.09 5 2.62 0.99 0.66 0.97 0.07 6 2.83 0.83 0.52 0.41 0.25 5 5.23 2.51 0.13 0.14 0.70 Arginin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 4 6 4 4 5 6 6 5 4 6 6 6 Kontrolle s x 0.65 0.09 1.97 1.17 2.42 0.95 2.89 1.43 2.57 1.68 3.14 0.76 1.63 0.48 3.68 2.82 5.10 3.85 5.17 4.13 4.54 3.71 5.12 2.64 3.69 3.61 4.30 2.43 5.22 1.97 n 4 4 4 6 5 6 4 6 6 5 5 4 5 6 4 Zulage 1 s x 0.65 0.09 2.39 1.40 2.33 0.88 1.64 0.85 2.34 0.86 1.57 0.87 2.35 0.53 5.01 4.51 5.31 4.99 6.28 5.66 5.58 4.33 5.65 2.62 4.37 3.09 4.89 3.31 5.15 1.91 - 198 - n 4 5 5 5 5 6 3 6 5 5 4 4 4 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.65 0.09 1.42 0.87 0.18 0.55 0.28 2.28 0.97 0.92 0.42 0.04 2.64 1.43 0.14 0.27 0.22 3.52 1.88 0.61 0.02 0.13 2.60 1.99 0.12 0.48 0.37 2.69 0.92 0.46 0.27 0.49 5.68 4.43 0.92 0.19 0.16 6.74 5.51 0.69 0.12 0.00 4.30 4.15 0.54 0.84 0.91 6.79 4.16 0.04 0.10 0.98 5.59 3.29 0.35 0.37 0.92 5.78 4.02 0.76 0.33 0.56 3.51 3.00 0.65 0.25 0.44 5.70 2.74 0.69 0.53 0.57 Anhang Arginin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 5 2.04 0.45 5 1.28 0.72 6 4.54 2.30 6 4.29 2.90 6 2.98 1.34 6 4.50 1.62 6 5.38 5.44 6 3.10 1.50 5 3.60 2.06 6 3.85 1.78 6 4.10 1.91 6 3.72 1.64 6 3.50 1.31 6 4.08 1.75 Zulage 1 n s x 0 6 1.81 1.02 5 1.22 0.69 6 3.17 1.15 6 2.74 0.63 6 2.91 3.37 6 5.66 3.70 6 3.42 1.76 6 5.65 6.27 6 2.60 1.23 6 5.00 2.92 6 4.21 2.08 6 4.88 1.27 6 4.15 0.26 6 4.73 1.24 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 6 2.07 0.55 0.68 0.44 0.53 6 0.96 0.69 0.31 0.33 0.68 6 8.02 5.87 0.15 0.15 0.06 5 8.14 6.98 0.20 0.32 0.17 6 6.41 3.71 0.95 0.07 0.14 6 9.95 4.91 0.56 0.02 0.17 6 13.8 6.06 0.47 0.02 0.01 6 12.9 13.1 0.38 0.14 0.35 6 7.22 6.67 0.48 0.33 0.19 6 5.25 3.36 0.44 0.40 0.52 6 4.11 1.84 0.89 0.99 0.84 6 4.90 1.78 0.17 0.33 0.97 5 3.59 0.47 0.31 0.84 0.12 6 4.25 1.14 0.26 0.76 0.49 Arginin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 1.36 0.21 3.49 2.13 3.40 1.71 5.85 1.95 4.78 1.19 3.61 1.21 2.52 0.91 4.02 1.65 4.52 0.80 3.67 1.29 2.95 1.00 4.03 3.43 3.38 1.25 4.34 1.32 3.81 1.93 n 4 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 1.36 0.21 3.00 1.62 3.35 1.66 4.17 0.77 3.68 1.42 2.33 0.55 2.71 1.10 3.74 1.63 3.42 0.95 2.67 1.37 2.91 1.21 3.44 2.08 4.74 0.78 3.35 1.83 4.08 1.60 - 199 - n 4 5 6 6 5 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.36 0.21 0.18 0.18 0.18 3.21 1.24 0.35 0.99 0.32 3.55 0.81 0.55 0.88 0.83 3.37 1.33 0.13 0.09 0.08 2.98 1.06 0.17 0.02 0.49 2.79 0.71 0.18 0.21 0.27 2.16 1.01 0.65 0.62 0.47 2.79 1.03 0.71 0.05 0.04 6.28 7.18 0.06 0.57 0.38 2.77 0.96 0.24 0.14 0.86 3.05 0.71 0.93 0.83 1.00 3.62 1.07 0.66 0.71 0.77 3.93 0.94 0.20 0.11 0.63 4.61 0.94 0.18 0.51 0.18 4.09 1.78 0.46 0.46 0.98 Anhang Arginin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 6 6 6 6 5 4 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 1.02 0.00 2.99 1.15 3.01 1.13 4.72 2.73 5.46 2.30 3.96 2.29 5.39 2.16 5.74 2.18 5.13 0.92 4.01 2.60 3.31 1.99 16.9 20.4 11.2 12.9 5.14 2.73 5.40 3.27 n 2 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 1.02 0.00 2.69 0.51 3.36 1.47 3.72 1.69 3.85 1.11 3.81 1.40 3.97 1.03 6.31 5.29 6.34 3.04 4.99 2.23 4.29 2.52 11.9 14.7 15.8 21.8 5.49 2.39 12.0 14.6 n 2 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.02 0.00 2.57 0.84 0.70 0.37 0.16 2.89 0.74 0.72 0.85 0.43 5.15 2.70 0.17 0.39 0.11 5.29 2.51 0.07 0.65 0.11 4.41 1.51 0.85 0.61 0.23 16.5 29.7 0.21 0.39 0.34 24.1 38.7 0.59 0.36 0.32 6.38 5.69 0.47 0.09 0.97 3.59 2.46 0.07 0.68 0.10 3.70 2.16 0.17 0.45 0.29 19.1 20,0 0.14 0.82 0.42 16.8 22.8 0.34 0.26 0.40 4.01 1.83 0.97 0.05 0.02 4.85 2.61 0.22 0.15 0.21 Tab. 9.4.1.4: Serin Serin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 3 7.68 8.80 2 8.44 0.86 2 5.21 1.65 3 4.61 3.15 4 16.1 9.00 2 5.57 0.21 3 4.83 3.16 1 19.42 0 0 3 7.84 8.73 1 3.79 . 2 12.8 6.47 0 Zulage 1 n s x 0 2 7.10 0.30 1 7.67 2 6.73 0.53 2 2.88 2.96 1 31.6 2 6.30 0.19 1 5.41 0 3 13.1 8.09 0 4 8.25 10.6 2 13.3 5.88 1 6.60 0 - 200 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 3 11.0 8.19 0.01 0.07 0.22 2 8.65 0.72 3 9.95 1.60 0.51 0.08 0.13 4 9.42 3.15 0.43 0.36 0.23 2 18.9 10.8 0.02 2 13.7 3.98 0.24 0.20 0.24 1 2.54 0 3 3.54 3.10 0.05 0 4 13.0 12.5 0.86 0.42 0.36 3 6.22 5.30 0.07 2 14.7 0.28 0.75 1 10.8 Anhang Serin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 1 2.87 1 7.55 3 7.96 6.28 1 7.32 1 12.4 0 0 0 0 1 0.77 0 0 0 0 Zulage 1 n s x 0 3 6.12 3.35 1 6.84 1 2.50 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2.86 1 2.73 0 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 0 2 6.97 0.21 2 17.8 0.99 0 0 0 0 0 0 0 1 1.40 1 1.01 0 0 Serin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 6 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 0.29 0.24 3.71 1.77 3.68 2.37 4.27 2.50 5.99 5.89 5.01 2.41 2.07 1.33 2.24 1.22 2.57 1.51 2.81 1.49 3.14 1.41 2.57 1.82 5.09 2.15 4.59 1.45 4.88 0.89 n 4 5 4 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 0.29 0.24 2.69 2.29 2.53 2.52 3.27 3.04 7.87 11.02 2.46 1.36 2.59 1.84 2.45 0.97 2.26 0.91 1.95 1.54 2.22 1.42 2.04 1.53 3.45 1.04 5.82 4.67 4.10 2.59 - 201 - n 4 4 5 6 6 6 6 6 5 6 6 5 6 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.29 0.24 1.93 0.89 0.67 0.54 0.81 2.36 2.72 0.71 0.98 0.90 3.61 3.50 0.97 0.16 0.16 3.94 1.41 0.68 0.89 0.67 3.36 1.75 0.09 0.27 0.21 2.21 1.40 0.42 0.93 0.28 2.32 1.14 0.46 0.34 0.11 1.84 1.45 0.64 0.43 0.73 2.39 1.35 0.48 0.64 0.66 2.53 1.34 0.24 0.26 0.59 2.88 1.62 0.43 0.30 0.25 3.07 2.22 0.06 0.10 0.50 2.44 2.31 0.93 0.80 0.53 4.26 1.28 0.09 0.29 0.47 Anhang Serin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 1.36 0.21 3.49 2.13 3.40 1.71 5.85 1.95 4.78 1.19 3.61 1.21 2.52 0.91 4.02 1.65 4.52 0.80 3.67 1.29 2.95 1.00 4.03 3.43 3.38 1.25 4.34 1.32 3.81 1.93 n 4 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 1.36 0.21 3.00 1.62 3.35 1.66 4.17 0.77 3.68 1.42 2.33 0.55 2.71 1.10 3.74 1.63 3.42 0.95 2.67 1.37 2.91 1.21 3.44 2.08 4.74 0.78 3.35 1.83 4.08 1.60 n 4 5 6 6 5 6 6 6 6 6 5 6 6 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.36 0.21 3.21 1.24 0.56 0.28 0.23 3.55 0.81 0.81 0.79 0.30 3.37 1.33 0.19 0.03 0.04 2.98 1.06 0.46 0.08 0.03 2.79 0.71 0.48 0.06 0.77 2.16 1.01 0.38 0.42 0.35 2.79 1.03 0.14 0.13 0.63 6.28 7.18 0.21 0.01 0.90 2.77 0.96 0.39 0.17 0.89 3.05 0.71 0.44 0.86 0.33 3.62 1.07 0.31 0.81 0.54 3.93 0.94 0.91 0.34 0.78 4.61 0.94 0.06 0.92 0.31 4.09 1.78 0.95 0.57 0.65 Serin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 5 10.8 5.56 5 13.1 9.23 6 22.2 17.6 4 33.8 10.5 5 21.2 8.69 5 29.8 13.0 5 22.0 12.1 6 31.5 20.7 4 23.0 25.6 4 21.2 5.99 Zulage 1 n s x 0 3 8.87 1.52 4 12.2 8.09 6 14.6 8.97 5 14.9 4.21 5 14.4 5.46 6 11.3 2.54 5 11.2 2.27 6 13.4 3.08 4 15.2 8.81 4 14.2 6.32 - 202 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 4 8.39 5.50 0.50 0.50 0.12 5 9.29 3.70 0.92 0.44 0.43 6 24.9 21.2 0.11 0.74 0.21 4 30.9 9.69 0.02 0.69 0.10 6 23.4 14.4 0.17 0.70 0.40 5 20.4 17.1 0.03 0.17 0.32 4 26.9 23.2 0.21 0.81 0.31 6 20.8 13.8 0.11 0.21 0.29 4 17.2 18.6 0.54 0.80 0.86 4 20.1 6.85 0.31 0.87 0.10 Anhang Tab. 9.4.1.5: Glutamat Glutamat in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 5 5 5 5 4 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 20.6 22.5 11.8 14.6 10.7 10.2 7.80 5.99 2.97 2.23 5.89 6.47 3.61 1.04 3.38 0.71 6.12 5.33 5.97 5.65 7.69 6.06 8.14 8.29 8.67 8.57 10.7 8.94 4.56 0.43 n 4 5 6 6 5 5 6 4 6 5 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 20.6 22.5 13.1 13.1 10.2 9.69 9.02 9.92 2.63 2.41 3.61 1.67 3.04 0.70 3.18 0.15 5.82 5.05 7.11 4.33 5.36 3.46 6.65 6.58 11.3 11.0 13.1 9.64 5.13 2.08 n 4 6 6 5 6 5 6 5 6 5 6 6 5 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 20.6 22.5 12.0 12.8 0.95 0.84 0.81 12.2 11.3 0.62 0.19 0.06 8.74 6.60 0.40 0.40 0.46 3.74 3.12 0.62 0.26 0.03 4.32 2.26 0.55 0.69 0.39 5.01 5.63 0.15 0.60 0.47 4.38 0.88 0.65 0.04 0.02 6.31 3.64 0.59 0.82 0.52 5.90 2.10 0.80 0.93 0.57 5.16 1.95 0.30 0.45 0.92 7.62 6.45 0.89 0.96 0.72 9.85 9.92 0.59 0.92 0.41 11.9 8.95 0.18 0.09 0.86 8.15 6.86 0.53 0.27 0.42 Glutamat in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 5 6 6 5 4 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 16.3 17.3 9.82 7.02 9.13 6.33 4.71 2.59 9.07 9.73 4.17 2.35 4.00 1.63 3.13 1.73 2.68 1.41 2.34 1.51 4.28 5.10 6.22 7.75 4.95 2.37 3.77 2.89 3.29 1.96 n 4 5 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 16.3 17.3 8.14 5.77 4.79 2.03 7.38 6.04 4.18 3.82 2.96 1.43 3.17 2.40 5.10 5.70 2.11 1.02 1.97 0.49 1.92 0.98 5.96 6.18 4.31 1.92 5.13 5.99 3.04 1.56 - 203 - n 4 6 5 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 4 Zulage 2 s x 16.3 17.3 7.02 5.56 10.3 12.2 2.57 1.24 3.82 1.69 5.72 1.58 3.31 1.98 3.26 1.78 3.75 2.25 7.11 9.29 3.99 1.96 9.68 11.99 4.73 1.44 6.64 4.15 3.79 1.84 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.99 0.17 0.39 0.31 0.53 0.11 0.29 0.07 0.89 0.35 0.96 0.24 0.39 0.67 0.37 0.87 0.06 0.21 0.33 0.96 0.33 0.02 0.29 0.91 0.61 0.84 0.25 0.26 0.37 0.43 0.08 0.87 0.05 0.90 0.43 0.05 0.31 0.04 0.56 0.61 0.79 0.00 Anhang Glutamat in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 4 6 6 5 6 6 6 5 6 6 5 6 6 Kontrolle s x 34.0 8.03 6.46 4.19 9.89 7.35 6.85 2.79 6.01 2.67 6.29 2.56 7.02 2.01 9.54 5.11 7.05 2.02 9.72 2.47 7.26 2.27 5.56 3.36 3.52 3.26 3.80 4.32 7.92 4.95 n 6 5 5 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 34.0 8.03 7.67 4.15 13.2 9.04 6.36 3.09 5.03 1.63 5.26 2.14 5.86 2.04 7.91 1.50 4.72 1.48 6.46 3.82 3.54 1.24 3.42 2.26 3.99 4.04 5.35 6.26 6.46 3.71 n 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 34.0 8.03 8.19 4.16 0.25 0.17 0.93 11.5 10.7 0.71 0.97 0.33 3.99 1.36 0.42 0.01 0.02 5.12 1.75 0.35 0.26 0.94 7.36 6.49 0.38 0.73 0.45 5.74 2.14 0.33 0.33 0.93 6.66 1.83 0.43 0.15 0.06 5.25 1.29 0.03 0.10 0.40 8.09 5.06 0.22 0.08 0.54 6.08 4.64 0.02 0.57 0.17 3.43 1.37 0.12 0.10 0.99 5.06 6.34 0.32 0.22 0.42 6.43 7.88 0.56 0.36 0.22 9.33 7.09 0.14 0.34 0.12 Glutamat in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 x 11.5 4.52 4.38 6.81 5.78 5.41 2.63 5.20 5.81 4.41 2.74 3.93 5.96 7.75 4.36 Zulage 1 s n 4.02 3.96 3.08 3.25 2.88 2.99 1.11 2.43 0.90 1.93 2.01 2.04 2.32 1.74 2.40 4 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 6 4 6 6 x 11.5 3.77 3.86 5.04 5.22 2.79 2.50 4.79 4.88 2.89 1.81 3.59 7.90 5.08 5.12 Zulage 2 s n 4.02 1.83 3.40 2.60 2.62 1.31 2.12 1.14 1.71 1.61 0.54 1.67 1.10 3.08 1.64 4 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 - 204 - x 11.5 6.82 4.94 4.11 4.14 3.52 2.18 3.74 5.86 2.45 1.97 3.41 6.63 7.32 5.24 s 4.02 3.88 3.16 2.28 3.34 2.15 1.85 2.12 6.08 1.26 1.33 1.36 1.87 1.03 2.07 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.49 0.59 0.00 0.46 0.02 0.86 0.69 0.09 0.13 0.21 0.47 0.38 0.05 0.33 0.36 0.09 0.04 0.16 0.03 0.54 0.31 0.99 0.05 0.41 0.35 0.22 0.84 0.17 0.10 0.56 0.32 0.31 0.16 0.67 0.33 0.74 0.29 0.75 0.57 0.65 0.37 0.78 Anhang Glutamat in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 x 0.84 3.94 4.43 11.4 5.68 3.70 5.88 3.25 4.02 5.28 5.50 Zulage 1 s n 0.78 1.95 2.60 12.0 2.14 3.36 2.91 2.15 1.99 3.96 1.94 4 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 x 0.84 3.42 4.26 15.7 5.51 4.46 4.83 2.49 3.66 6.55 6.62 Zulage 2 s n 0.78 1.72 2.20 18.2 2.60 3.09 1.70 1.35 1.86 1.81 2.42 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 x 0.84 2.50 3.92 11.3 5.07 5.06 4.74 3.31 3.59 5.62 6.66 s 0.78 1.21 2.53 12.4 2.04 1.93 2.36 0.54 1.44 1.94 1.95 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.49 0.90 0.51 0.79 0.44 0.47 0.62 0.79 0.30 0.44 0.06 0.62 0.93 0.52 0.34 0.29 0.96 0.74 0.84 0.39 0.06 0.49 0.57 0.65 0.57 0.92 0.15 0.86 0.28 0.93 Tab. 9.4.1.6: Citrullin Citrullin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 0 0 2 0.51 0.16 1 1.84 0 0 1 3.20 0 0 2 1.28 0.75 4 1.38 0.83 5 1.38 0.99 4 1.75 0.35 2 2.24 0.12 Zulage 1 n s x 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1.99 0.55 4 1.46 0.75 4 1.20 0.61 5 2.24 1.32 5 1.66 0.88 4 1.62 1.13 - 205 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 1 0.59 0 2 6.29 3.42 0.24 2 15.9 2.30 0 0 0 0 0 4 1.59 0.70 0.71 0.74 0.67 4 1.36 0.91 0.64 0.94 0.61 5 2.35 0.75 0.19 0.06 0.75 4 1.80 0.82 0.79 0.12 0.42 3 1.48 1.13 0.05 0.23 0.00 Anhang Citrullin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 2 2.86 0.17 2 1.36 1.58 6 3.51 2.28 3 1.89 1.62 2 2.03 0.11 3 1.47 0.60 6 2.12 0.78 6 2.78 0.41 6 1.81 1.03 6 2.76 1.78 4 2.68 2.42 3 1.44 0.64 4 1.47 0.37 4 4.80 4.76 Zulage 1 n s x 0 4 2.65 2.95 1 2.12 6 3.30 1.10 5 3.74 1.22 4 2.77 0.62 4 1.75 0.93 6 3.21 0.92 6 2.90 1.03 6 2.33 1.47 6 2.68 0.96 4 3.04 2.90 2 1.60 0.15 3 0.90 0.39 4 4.33 3.78 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 3 1.64 0.82 0.56 0.62 4 2.08 0.09 0.63 4 2.86 0.96 0.78 0.06 0.30 4 2.25 0.69 0.07 0.65 0.18 4 2.91 0.44 0.22 0.09 0.37 4 2.09 0.92 0.35 0.42 0.31 6 1.79 0.67 0.10 0.41 0.02 6 7.50 13.9 0.82 0.45 0.46 6 2.12 0.87 0.46 0.50 0.61 6 2.92 2.69 0.86 0.90 0.81 4 2.97 2.38 0.63 0.01 0.93 4 1.30 0.72 0.66 0.65 0.32 4 1.24 0.78 0.10 0.69 0.18 4 5.39 5.30 0.42 0.13 0.27 Citrullin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 6 5 6 4 6 6 6 Kontrolle s x 1.00 0.09 4.93 2.26 4.85 2.10 4.98 3.42 5.16 1.67 4.11 2.11 5.69 2.04 6.52 4.22 6.06 3.45 4.29 2.64 3.14 1.06 n 4 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 Zulage 1 s x 1.00 0.09 4.29 2.47 3.89 2.08 3.76 1.92 3.79 1.73 4.21 1.85 4.07 0.92 3.84 1.56 5.23 1.63 4.23 0.63 3.16 0.39 - 206 - n 4 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.00 0.09 4.59 2.22 0.51 0.60 0.82 4.66 1.70 0.47 0.81 0.27 4.25 2.99 0.21 0.58 0.61 5.45 1.83 0.15 0.78 0.06 5.86 1.10 0.54 0.22 0.14 4.45 2.55 0.10 0.26 0.76 5.16 1.24 0.27 0.69 0.24 5.09 1.23 0.49 0.51 0.75 4.93 0.86 0.94 0.49 0.07 3.93 0.27 0.98 0.12 0.00 Anhang Tab. 9.4.1.7 Threonin Threonin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 5 6 4 5 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 3.40 0.54 15.2 12.1 15.7 11.8 11.1 8.17 12.8 11.2 16.0 13.6 5.98 7.65 13.1 11.8 22.1 6.46 21.4 3.10 18.0 4.30 19.8 5.09 23.8 5.32 24.2 9.55 20.8 5.44 n 4 5 6 6 4 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 3.40 0.54 16.4 14.8 11.8 8.96 12.4 9.94 15.7 9.94 13.3 9.58 8.99 8.61 17.8 8.74 20.3 5.70 19.1 5.19 13.8 6.18 14.0 5.85 13.8 12.6 17.8 9.74 20.2 11.1 n 4 5 6 6 6 4 5 6 6 5 6 6 5 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.40 0.54 10.9 9.33 0.40 0.28 0.16 12.0 8.54 0.11 0.05 0.83 9.77 7.82 0.43 0.45 0.07 15.2 11.3 0.98 0.49 0.83 14.3 13.2 0.58 0.62 0.56 6.66 4.98 0.45 0.45 0.95 14.5 8.29 0.49 0.94 0.27 18.7 4.66 0.24 0.18 0.39 15.0 4.25 0.22 0.03 0.17 11.6 5.18 0.16 0.14 0.50 12.8 5.23 0.15 0.08 0.69 19.5 2.94 0.19 0.31 0.21 14.4 10.6 0.31 0.24 0.33 15.0 8.25 0.93 0.30 0.19 Threonin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 5 6 6 6 5 5 6 6 6 4 6 6 6 Kontrolle s x 1.81 0.75 22.9 2.84 20.2 3.28 27.4 5.92 20.1 11.3 24.6 9.61 22.5 7.32 23.0 8.17 24.3 7.05 25.8 5.56 19.7 5.45 22.7 4.65 28.0 8.33 28.8 8.53 27.9 2.79 n 6 5 6 5 6 6 6 6 6 5 6 4 5 6 5 Zulage 1 s x 1.81 0.75 23.7 3.65 22.5 6.89 24.4 8.79 22.3 6.97 19.5 9.83 21.3 8.57 16.8 5.84 18.3 6.83 16.8 7.23 16.7 6.86 20.0 3.92 28.4 7.51 26.4 12.3 27.8 3.53 - 207 - n 6 6 5 4 6 6 6 6 5 6 6 5 5 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.81 0.75 23.3 1.81 0.77 0.80 0.93 22.6 3.42 0.15 0.17 0.67 18.9 17.3 0.25 0.28 0.29 23.1 5.66 0.75 0.66 0.79 24.6 4.22 0.26 0.99 0.25 27.4 5.74 0.76 0.03 0.01 25.1 9.50 0.02 0.95 0.00 32.3 4.53 0.00 0.06 0.01 24.8 11.0 0.08 0.73 0.21 26.5 7.05 0.31 0.03 0.02 17.5 11.4 0.28 0.63 0.59 26.6 6.85 0.33 0.98 0.98 27.6 8.86 0.45 0.24 0.71 29.4 1.67 0.92 0.67 0.92 Anhang Threonin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 6 5 6 5 Kontrolle s x 4.36 0.00 33.2 20.5 20.1 20.1 42.2 23.5 42.2 21.1 42.9 21.8 50.9 16.8 31.8 27.0 27.4 21.2 71.8 45.8 56.3 26.3 56.9 34.9 35.9 29.6 36.5 23.2 54.2 20.0 n 2 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 4.36 0.00 30.5 21.3 19.0 19.6 37.8 24.6 35.4 10.4 37.0 21.1 43.1 17.8 32.7 26.6 21.8 17.1 29.7 13.9 28.4 26.0 43.7 35.6 42.5 30.8 41.3 20.9 46.9 28.9 n 2 6 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 5 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 4.36 0.00 38.6 20.9 0.72 0.27 0.46 18.5 16.1 0.36 0.43 0.84 34.5 19.5 0.49 0.07 0.39 44.5 18.4 0.32 0.63 0.38 31.7 19.8 0.14 0.10 0.34 32.0 28.0 0.04 0.12 0.29 28.8 20.6 0.94 0.68 0.37 33.7 12.6 0.21 0.49 0.07 30.9 17.7 0.10 0.17 0.82 28.6 30.6 0.03 0.02 0.97 34.6 24.9 0.20 0.01 0.21 36.3 24.6 0.93 0.66 0.17 37.4 25.5 0.34 0.70 0.31 49.8 26.8 0.95 0.68 0.57 Threonin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 46.5 25.5 23.7 7.48 25.9 13.3 19.8 6.54 21.4 6.24 34.6 26.2 21.9 12.6 38.1 20.6 25.8 13.5 28.1 17.5 29.9 12.7 28.1 3.91 34.7 9.16 43.6 13.5 32.9 14.4 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 46.5 25.5 19.0 5.71 25.7 9.71 16.6 2.30 16.8 2.97 19.3 5.74 23.5 11.7 29.4 10.5 20.9 11.6 17.3 11.2 23.1 5.41 25.5 6.59 36.8 9.05 30.2 5.82 28.0 11.7 - 208 - n 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 46.5 25.5 19.4 7.90 0.11 0.16 0.97 14.5 2.24 0.95 0.12 0.06 17.2 4.01 0.29 0.50 0.71 16.8 2.80 0.07 0.18 0.98 17.7 10.8 0.25 0.07 0.66 18.2 8.59 0.74 0.14 0.16 30.8 12.4 0.12 0.19 0.58 25.3 14.3 0.13 0.88 0.04 19.7 9.17 0.20 0.09 0.63 25.3 12.6 0.11 0.54 0.70 25.6 3.67 0.40 0.02 0.98 32.4 10.1 0.67 0.38 0.51 23.6 14.5 0.10 0.07 0.19 30.2 13.3 0.31 0.65 0.26 Anhang Threonin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 5 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 40.3 24.6 39.5 10.6 43.8 15.7 37.0 19.9 39.1 17.8 33.7 14.8 38.1 19.1 32.0 14.1 37.6 8.8 47.3 34.9 44.7 29.1 n 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 40.3 24.6 31.3 15.5 36.8 14.2 30.2 18.9 30.0 20.7 33.7 17.5 35.6 10.3 31.9 4.36 39.3 3.47 56.3 35.4 50.5 37.8 n 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 40.3 24.6 33.7 15.2 0.36 0.44 0.85 40.0 13.1 0.43 0.60 0.37 28.5 16.1 0.18 0.07 0.07 26.8 10.6 0.10 0.14 0.70 32.5 7.32 1.00 0.83 0.81 30.2 9.03 0.73 0.33 0.34 27.4 5.19 0.95 0.49 0.15 30. 6 3.94 0.73 0.18 0.01 45.2 31.1 0.23 0.84 0.03 47.4 31.2 0.40 0.64 0.38 Tab. 9.4.1.8: Histamin Histamin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 4 4 2 3 4 2 3 6 6 5 6 5 4 6 Kontrolle s x 40.6 0.00 34.1 56.2 7.34 2.63 6.40 1.92 11.9 5.91 14.5 9.48 56.2 70.6 6.24 1.99 5.44 1.70 6.96 3.46 6.18 2.96 5.59 1.53 5.75 0.41 5.08 3.07 7.82 3.08 n 2 3 4 4 4 5 3 5 6 5 5 6 5 5 5 Zulage 1 s x 40.6 0.00 7.01 2.08 5.28 1.11 6.34 1.42 10.5 8.24 8.89 9.47 5.86 2.04 7.07 1.05 7.22 2.32 6.41 1.79 13.0 8.90 4.78 1.66 5.88 1.57 19.5 25.2 9.59 2.84 - 209 - n 2 3 6 4 6 5 5 5 6 6 6 5 4 6 5 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 40.6 0.00 8.20 2.86 0.24 0.35 0.54 8.37 6.14 0.33 0.58 0.25 10.3 4.47 0.98 0.60 0.08 14.7 12.9 0.40 0.15 0.16 9.79 6.87 0.62 0.86 0.58 6.21 3.23 0.51 0.94 7.53 2.25 0.86 0.26 0.63 6.22 1.70 0.16 0.45 0.54 6.40 2.96 0.60 0.81 0.80 23.1 16.9 0.25 0.15 0.09 4.17 2.39 0.54 0.25 0.62 6.65 1.21 0.11 0.29 0.46 25.6 29.9 0.43 0.38 0.35 51.8 71.1 0.22 0.23 0.25 Anhang Histamin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 4 6 5 6 3 3 5 5 6 5 6 4 4 x 31.3 3.66 3.24 5.22 18.8 4.82 7.55 4.37 4.52 4.28 60.3 2.72 2.28 36.4 143 Zulage 1 s n 23.3 2.04 2.03 5.20 31.1 4.46 3.88 1.54 0.73 1.92 142 1.20 1.05 66.1 162 6 5 4 5 5 5 6 5 6 4 6 3 3 5 3 x 31.3 3.19 2.96 51.5 8.08 6.35 7.32 8.71 4.91 8.23 147 3.10 3.29 32.0 179 Zulage 2 s n 23.3 2.77 1.85 66.4 6.15 4.88 4.22 5.62 3.45 4.81 354 0.58 1.62 65.1 162 6 3 3 5 3 4 4 6 5 6 5 4 3 4 4 x 31.3 4.52 4.38 5.45 7.67 6.07 5.38 4.11 4.84 6.60 1.66 1.87 2.78 3.91 148 s 23.3 3.02 2.69 4.20 3.70 5.29 1.68 1.93 1.62 7.40 0.66 0.75 1.17 1.00 170 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.13 0.95 0.17 0.45 0.82 0.01 0.03 0.44 0.11 0.62 0.83 0.70 0.96 0.72 0.48 0.58 0.70 0.40 0.95 0.16 0.10 0.59 0.52 0.37 0.39 0.43 0.40 0.61 0.69 0.08 0.17 0.26 0.81 0.01 0.10 0.94 0.69 0.01 0.24 0.06 0.40 0.50 Histamin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 4 4 2 x 224 15.4 21.3 33.7 6.15 6.28 7.13 31.6 5.39 4.19 6.85 63.8 45.0 43.0 29.0 Zulage 1 s n 0.00 19.0 1.44 2.38 0.57 0.48 0.76 40.7 1.66 4.17 0.38 4.57 34.7 26.9 4.28 2 2 2 4 3 2 2 4 3 4 4 2 4 4 2 x 224 3.50 21.6 16.1 6.44 3.43 4.91 3.32 35.1 28.7 25.7 35.4 65.9 31.5 35.7 Zulage 2 s n 0.00 0.03 1.24 14.4 0.50 0.48 0.27 3.09 36.9 29.5 24.3 4.65 15.6 13.7 10.0 2 2 2 4 3 2 2 2 2 3 4 2 4 3 2 - 210 - x 224 2.02 26.8 30.0 5.50 3.95 2.86 3.49 9.62 8.16 32.1 40.4 62.1 41.9 32.8 s 0.00 0.51 5.82 11.6 4.99 1.00 0.33 0.01 7.83 7.20 22.3 0.14 27.5 24.6 0.23 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.54 0.92 0.53 0.21 0.15 0.20 0.39 0.52 0.55 0.70 0.00 0.20 0.54 0.35 0.49 0.48 0.31 0.10 0.11 0.22 0.64 0.29 0.09 0.07 0.76 0.41 0.14 0.35 0.35 0.15 0.71 0.01 0.42 0.50 0.53 0.11 0.38 0.71 0.46 0.75 Anhang Histamin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 1 0 0 0 Kontrolle s x 3.40 0.00 29.7 5.06 27.9 5.63 28.5 3.30 28.7 5.53 27.7 13.2 20.4 5.11 4.07 0.12 2.68 0.33 1.98 1.36 2.28 n 2 2 2 2 2 3 4 2 2 2 0 2 0 0 0 Zulage 1 s x 3.40 0.00 29.3 5.06 24.1 2.19 17.4 1.09 20.4 2.85 12.2 10.5 7.65 7.57 10.1 0.52 5.47 0.31 3.98 0.28 1.00 1.07 n 2 1 3 3 3 5 4 2 3 3 2 2 1 0 0 Zulage 2 s x 3.40 0.00 33.4 19.6 16.8 12.1 9.02 23.9 8.87 9.12 10.03 9.70 5.83 13.3 1.66 28.4 31.9 6.07 4.27 0.52 0.55 1.01 0.96 0.31 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.01 0.62 0.09 0.14 0.54 0.31 0.05 0.00 0.23 0.84 0.22 0.09 0.45 0.38 0.09 0.19 0.17 0.03 0.95 0.19 0.60 0.22 0.16 0.30 0.13 Histamin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 3 3 5 5 2 5 4 5 4 4 x 4.47 1.77 3.24 3.38 2.59 2.28 3.96 1.84 3.87 3.00 2.60 Zulage 1 s n 5.20 0.37 1.33 2.08 1.27 0.31 2.17 1.53 1.44 1.04 0.29 6 3 5 6 5 3 5 4 6 3 5 x 4.47 1.82 2.08 4.97 2.85 2.82 2.23 5.73 4.05 3.23 1.60 Zulage 2 s n 5.20 0.04 0.78 2.07 1.35 1.05 1.02 2.64 1.98 1.31 1.41 6 4 2 4 5 2 5 4 4 3 1 - 211 - x 4.47 1.63 2.59 4.82 5.17 1.36 6.15 9.35 3.32 2.35 2.98 s 5.20 0.74 0.43 3.26 2.92 1.96 8.05 9.47 1.52 2.00 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.29 0.29 0.12 0.42 0.28 0.12 0.02 0.42 1.00 0.31 0.77 0.98 0.42 0.27 0.76 0.27 0.64 0.76 0.07 0.02 0.38 0.39 0.71 0.34 0.38 0.00 0.50 Anhang Tab. 9.4.1.9: Glycin Glycin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 5 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 1.27 0.08 4.40 0.67 4.43 0.54 4.87 0.29 5.74 0.91 7.01 1.94 4.94 2.76 6.07 0.94 5.69 1.28 6.84 1.01 4.74 1.16 4.91 1.06 3.31 1.46 4.07 1.06 4.39 1.24 n 4 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 4 6 Zulage 1 s x 1.27 0.09 4.19 0.94 3.92 0.58 4.41 1.20 5.34 1.57 6.47 1.44 6.77 2.39 5.52 0.64 5.95 1.89 5.61 0.74 3.72 2.23 4.41 1.40 2.96 1.76 4.32 0.98 4.73 0.90 n 4 6 6 5 6 4 5 6 6 6 5 5 5 4 5 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.27 0.09 0.39 0.39 4.22 0.92 0.70 0.63 0.94 4.09 0.41 0.24 0.08 0.69 5.19 1.71 0.45 0.66 0.53 6.41 1.97 0.60 0.44 0.08 6.88 1.95 0.75 0.50 0.70 8.94 8.09 0.25 0.53 0.68 5.78 0.77 0.18 0.75 0.61 5.53 0.95 0.58 0.52 0.50 5.46 2.66 0.08 0.30 0.88 3.81 2.63 0.24 0.52 0.32 3.72 1.29 0.28 0.11 0.34 3.67 0.49 0.68 0.46 0.22 3.96 0.28 0.99 0.97 0.75 4.30 1.35 0.27 0.32 0.53 Glycin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 5 6 5 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 1.42 0.97 4.74 1.85 3.69 0.98 7.24 2.07 8.21 4.05 6.83 2.80 8.23 4.66 8.07 4.83 6.25 2.19 7.48 2.86 5.13 2.13 4.15 0.81 4.78 1.07 5.00 1.54 5.37 1.58 n 6 6 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 4 Zulage 1 s x 1.42 0.97 4.38 1.11 3.65 0.81 14.7 13.3 5.75 1.87 4.65 3.06 6.20 3.79 14.0 22.0 4.88 1.62 4.80 1.51 3.99 0.81 5.07 2.07 4.63 1.14 5.19 1.95 6.60 2.46 - 212 - n 6 6 5 6 6 6 6 6 5 6 6 6 5 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.42 0.97 4.51 1.57 0.42 0.53 0.77 4.38 0.76 0.97 0.06 0.03 7.37 1.32 0.25 0.90 0.25 6.70 2.36 0.11 0.44 0.21 7.85 3.89 0.00 0.32 0.01 7.91 4.51 0.29 0.61 0.25 9.05 4.87 0.49 0.06 0.58 9.76 4.98 0.09 0.28 0.07 8.25 3.35 0.01 0.25 0.04 5.77 1.24 0.27 0.35 0.01 4.03 0.51 0.31 0.60 0.27 4.79 0.52 0.61 0.58 0.38 5.08 1.48 0.51 0.49 0.27 6.55 3.01 0.42 0.57 0.98 Anhang Glycin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 4 6 4 6 6 6 6 5 6 4 3 1 3 x 3.16 3.69 1.19 7.05 9.04 8.45 10.7 8.17 9.33 12.6 8.77 7.48 0.40 0.24 4.67 Zulage 1 s n 1.67 2.24 0.29 4.22 2.65 1.01 1.60 6.69 1.56 4.61 2.55 1.48 0.47 4 4 4 5 4 5 6 6 6 4 4 4 2 1 4 3.56 x 3.16 4.43 1.33 6.82 8.31 9.29 12.2 13.2 9.02 11.8 8.19 7.43 0.60 0.49 4.11 Zulage 2 s n 1.67 2.46 0.59 4.93 1.30 2.20 2.88 5.38 4.84 5.10 0.54 2.36 0.46 4 4 4 4 3 6 6 5 5 4 4 4 1 0 4 4.09 s x 3.16 5.49 1.95 5.79 10.4 8.87 8.39 7.68 9.87 10.3 8.39 6.78 0.62 1.67 2.70 0.91 4.63 2.77 3.65 3.67 4.15 2.10 2.91 2.77 1.70 4.85 5.39 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.67 0.71 0.40 0.64 0.38 0.37 0.27 0.84 0.82 0.56 0.98 0.47 0.20 0.19 0.28 0.14 0.78 0.30 0.76 0.46 0.66 0.67 0.64 0.61 0.47 0.36 0.36 0.48 0.04 0.15 0.66 0.51 0.89 0.70 0.44 0.31 0.51 Glycin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 0 2 7.99 0.06 2 4.99 1.58 3 7.55 6.41 3 7.54 6.54 2 13.8 0.27 2 10.9 0.18 4 7.36 3.85 4 9.40 1.24 2 9.61 0.06 6 6.54 2.95 6 6.32 2.35 4 7.15 5.24 2 9.89 1.64 4 8.80 1.07 Zulage 1 n s x 0 2 4.42 0.32 2 6.24 0.80 2 10.4 0.22 2 13.6 1.05 2 8.03 0.50 2 13.5 1.34 4 8.17 2.31 4 8.47 1.23 4 5.31 3.80 6 5.45 0.77 6 5.90 3.14 2 9.90 1.43 2 7.83 0.14 4 7.18 1.39 - 213 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 2 7.06 2.67 0.03 0.71 0.43 2 2.66 1.19 0.27 0.08 0.05 2 5.13 0.36 0.79 0.25 0.05 1 6.86 0.09 2 5.81 0.83 0.06 0.03 0.25 2 8.11 0.84 0.19 0.16 0.18 4 7.47 1.97 0.70 0.95 0.40 5 10.9 5.64 0.39 0.60 0.38 4 4.73 0.82 0.36 0.03 0.78 6 5.74 2.78 0.34 0.65 0.81 6 6.41 2.84 0.66 0.85 0.67 4 5.92 2.22 0.65 0.51 0.23 2 4.07 4.99 0.35 4 8.32 1.99 0.14 0.64 0.44 Anhang Glycin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 4 6 6 5 5 6 4 4 Kontrolle s x 0.15 0.00 5.08 1.36 5.86 2.41 7.46 1.45 9.00 2.82 5.07 4.69 9.07 3.78 7.72 3.06 9.98 1.85 8.92 3.06 8.72 1.14 n 2 5 6 4 6 6 6 6 6 4 4 Zulage 1 s x 0.15 0.00 5.03 1.35 6.00 1.90 6.72 1.40 7.30 3.01 7.09 3.40 8.48 1.03 6.92 3.12 8.11 1.48 10.58 1.94 6.90 1.00 n 2 6 6 4 6 6 5 6 6 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.15 0.00 4.82 1.28 0.53 0.58 0.15 6.00 2.47 0.90 0.86 0.99 7.04 0.89 0.38 0.48 0.37 7.85 2.25 0.03 0.39 0.61 8.37 1.94 0.27 0.13 0.39 10.0 3.04 0.63 0.49 0.20 18.4 23.5 0.63 0.42 0.28 7.66 1.48 0.12 0.05 0.38 8.49 1.49 0.42 0.63 0.15 8.10 0.91 0.06 0.31 0.01 Tab. 9.4.1.10 Agmatin Agmatin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 2 2 0 2 0 0 1 0 0 0 1 4 4 4 Kontrolle s x 2.93 0.00 17.6 1.19 16.3 1.23 29.9 11.4 41.4 1.01 12.5 12.4 13.2 14.0 13.8 14.1 n 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 1 1 4 5 4 Zulage 1 s x 2.93 0.00 19.1 0.22 15.8 1.37 14.0 19.1 23.3 5.81 1.96 0.03 15.8 15.6 16.3 17.4 15.1 17.9 - 214 - n 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 3 1 4 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 2.93 0.00 25.2 9.72 0.37 0.43 0.55 18.3 3.02 0.12 0.36 0.27 32.8 3.68 0.45 31.8 5.78 0.68 0.72 0.49 1.70 0.34 16.1 14.7 12.7 1.10 18.7 17.3 14.0 0.16 0.30 0.21 0.25 0.29 0.48 0.85 0.73 0.16 Anhang Agmatin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 3 2 2 3 2 2 0 1 0 1 5 6 Kontrolle s x 3.04 2.85 0.69 0.48 10.8 9.25 19.8 14.4 26.2 1.64 25.2 1.20 14.5 12.3 0.33 0.02 0.69 0.04 1.31 0.18 1.03 1.07 1.09 0.91 n 4 4 6 4 4 2 2 4 4 2 2 0 2 6 2 Zulage 1 s x 3.04 2.85 2.80 2.37 4.94 7.25 11.6 12.7 11.8 12.7 23.8 6.96 20.9 4.82 1.09 0.89 1.64 0.81 0.70 0.84 0.88 0.16 0.12 0.70 0.76 0.08 0.63 1.05 n 4 4 6 4 4 2 2 4 5 2 2 0 3 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.04 2.85 0.92 0.77 0.15 0.48 0.30 7.13 9.75 0.20 0.44 0.17 10.9 11.4 0.08 0.09 0.46 9.81 9.72 0.01 0.07 0.33 26.0 1.18 0.85 0.73 0.69 20.0 0.41 0.97 0.81 0.83 0.66 0.28 0.64 0.62 0.30 26.6 35.1 0.58 0.28 0.39 0.70 0.17 1.00 0.84 1.10 0.96 3.68 0.68 0.96 5.82 0.75 0.89 0.11 0.28 0.52 0.49 0.71 0.93 Agmatin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 2 4.96 0.00 0 0 2 3.43 2.29 0 0 1 3.20 0 0 2 42.1 23.4 2 28.4 18.4 Zulage 1 n s x 2 4.96 0.00 0 1 1.17 2 7.68 1.26 0 0 0 0 0 2 61.1 8.39 2 61.0 8.09 - 215 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 2 4.96 0.00 0 0 2 5.11 2.22 0.11 0.02 0.16 0 0 1 0.43 1 0.71 0 2 56.8 7.35 0.33 0.62 0.77 2 54.7 9.65 0.33 0.15 0.70 Anhang Tab. 9.4.1.11 Alanin Alanin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 6 5 6 4 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 6.64 0.00 7.95 1.58 11.6 2.61 7.57 1.66 8.92 1.82 7.85 2.61 6.52 4.84 5.84 4.06 4.94 5.34 5.37 3.12 6.51 5.47 6.08 7.80 3.06 2.62 5.96 3.83 5.35 3.16 n 2 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 6.64 0.00 7.77 3.66 9.85 1.68 8.82 3.23 6.69 1.76 5.53 2.59 5.34 2.11 6.99 5.26 5.71 4.23 6.00 3.20 3.42 1.97 5.09 7.57 2.00 1.07 5.73 2.50 5.19 2.96 n 2 6 6 6 6 5 5 6 6 5 6 6 5 6 6 Zulage 2 s x 6.64 0.00 10.2 3.33 11.1 2.35 7.75 3.16 7.71 2.56 6.72 1.51 8.91 12.47 3.91 2.97 3.00 1.33 2.87 2.93 3.30 2.39 3.83 2.98 2.08 1.53 3.51 1.67 4.21 2.61 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.81 0.27 0.46 0.07 0.20 0.68 0.80 0.20 0.60 0.14 0.84 0.46 0.59 0.86 0.18 0.43 0.91 0.53 0.65 0.57 0.20 0.33 0.33 0.07 0.46 0.50 0.15 0.34 0.00 0.28 0.61 0.06 0.35 0.57 0.12 0.10 0.03 0.90 0.66 0.83 0.17 0.56 Alanin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 5 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 2.36 1.63 11.1 3.62 6.22 3.01 15.5 5.78 10.7 6.15 9.49 2.91 10.2 7.02 12.3 9.88 10.9 6.98 10.9 9.38 7.56 5.22 8.59 7.20 9.84 7.65 10.5 6.19 8.24 2.31 n 6 6 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 2.36 1.63 8.81 2.42 8.39 5.07 23.6 23.3 7.02 1.10 5.39 1.94 4.59 2.81 15.0 25.1 6.55 5.25 4.79 3.18 5.61 4.85 8.97 9.32 9.74 7.56 8.70 5.90 7.50 3.59 - 216 - n 6 6 5 6 5 6 6 6 5 6 6 6 6 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 2.36 1.63 10.2 5.45 0.29 0.72 0.52 9.76 4.50 0.26 0.15 0.17 14.5 6.68 0.72 0.89 0.45 9.66 3.42 0.21 0.94 0.21 12.0 6.52 0.02 0.41 0.05 8.35 4.32 0.06 0.78 0.01 10.9 6.50 0.67 0.35 0.65 13.7 7.86 0.01 0.39 0.01 12.0 9.27 0.23 0.76 0.06 14.8 12.1 0.35 0.12 0.05 4.56 2.58 0.83 0.32 0.37 11.6 5.63 0.94 0.19 0.27 13.6 7.96 0.48 0.30 0.25 11.0 3.99 0.82 0.27 0.30 Anhang Alanin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 5 6 6 6 6 6 5 6 5 6 4 5 4 6 Kontrolle s x 6.79 0.59 22.7 7.45 10.5 7.54 20.3 12.1 19.6 6.83 21.2 11.9 22.7 5.60 17.6 11.2 18.5 7.07 19.1 4.42 14.9 10.8 18.5 5.43 8.88 9.42 16.0 15.0 18.4 12.3 n 4 6 5 6 6 5 6 6 5 6 4 4 4 4 6 Zulage 1 s x 6.79 0.59 18.4 18.3 14.2 8.10 16.1 11.9 11.7 4.53 15.6 9.05 12.3 2.98 17.0 7.25 8.92 3.57 14.0 9.92 7.13 1.31 13.8 5.69 17.3 17.2 16.2 15.2 22.2 15.5 n 4 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.79 0.59 37.9 34.6 0.81 0.16 0.17 19.3 14.0 0.38 0.06 0.15 16.2 6.55 0.22 0.27 0.96 17.6 4.15 0.07 0.49 0.07 14.0 6.10 0.01 0.31 0.44 14.3 4.84 0.00 0.11 0.55 15.5 4.57 0.66 0.69 0.66 9.69 4.70 0.03 0.03 0.53 13.1 5.03 0.61 0.22 0.37 5.99 4.93 0.54 0.31 1.00 7.79 4.40 0.21 0.03 0.25 13.5 12.8 0.26 0.43 0.18 12.8 12.9 0.85 0.21 0.34 16.7 12.4 0.38 0.44 0.26 Alanin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 3.27 0.00 8.13 7.14 5.37 4.86 8.68 4.52 10.2 8.18 16.4 19.5 13.7 15.8 10.3 6.06 14.1 5.78 9.91 7.17 10.0 7.86 9.51 3.13 11.8 7.65 9.31 6.58 9.63 6.75 n 2 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 3.27 0.00 5.77 4.18 5.49 2.57 7.28 3.50 9.07 4.25 4.48 1.47 10.0 13.2 9.46 2.23 8.55 2.33 6.49 2.94 5.50 1.94 8.34 5.23 10.2 2.92 4.63 3.75 7.27 3.02 - 217 - n 2 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.27 0.00 12.4 7.93 0.46 0.26 0.12 10.5 9.45 0.79 0.66 0.27 7.47 7.91 0.43 0.70 0.96 4.23 2.23 0.74 0.16 0.01 5.88 2.92 0.19 0.25 0.44 4.61 1.88 0.10 0.21 0.36 7.46 3.86 0.66 0.16 0.10 10.0 5.89 0.15 0.30 0.61 4.51 2.68 0.24 0.17 0.17 5.56 3.60 0.26 0.32 0.97 6.02 3.28 0.35 0.00 0.05 6.44 3.80 0.30 0.15 0.36 4.46 4.22 0.04 0.23 0.94 6.73 4.14 0.29 0.29 0.71 Anhang Alanin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 4 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 1.15 0.27 6.74 2.16 7.51 2.56 10.1 2.67 8.19 3.32 3.96 2.97 8.16 2.54 9.89 3.44 9.95 2.68 5.72 5.01 4.05 2.82 n 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 1.15 0.27 7.02 3.04 8.58 4.29 8.06 0.86 6.34 2.19 5.49 2.55 7.91 2.45 6.74 3.38 9.25 2.92 9.36 7.68 7.55 8.52 n 6 6 6 4 6 6 0 0 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.15 0.27 8.81 3.10 0.88 0.29 0.40 13.2 6.05 0.41 0.08 0.13 7.62 1.80 0.30 0.04 0.70 8.51 4.79 0.17 0.92 0.43 7.33 2.63 0.28 0.15 0.31 0.86 0.37 0.37 0.02 0.38 0.36 6.92 3.58 0.41 0.01 0.00 7.94 7.12 0.31 0.51 0.09 10.3 6.86 0.42 0.16 0.46 Tab. 9.4.1.12: Tyrosin Tyrosin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 2 2 1 0 2 1 3 4 2 1 1 0 0 0 Kontrolle s x 0.67 0.00 0.47 0.17 1.04 0.15 0.83 1.05 1.82 0.74 4.15 0.72 0.33 1.38 0.05 0.70 3.80 0.48 n 2 1 2 1 0 3 0 4 4 2 0 1 0 0 0 Zulage 1 s x 0.67 0.00 0.25 1.14 0.26 1.34 0.57 0.45 1.60 4.16 0.62 1.58 4.25 0.51 1.31 - 218 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 2 0.67 0.00 1 0.59 0 0.79 2 1.22 0.03 0 2 0.81 0.29 0.65 3 1.34 1.47 3 1.59 1.08 0.49 0.43 0.74 4 4.22 3.23 0.99 0.95 0.93 3 3.71 4.93 0.90 0.84 0.43 1 4.64 2 1.50 0.35 0 0 2 15.05 0.00 Anhang Tyrosin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 2 1 4 5 3 2 3 4 5 2 2 5 4 3 x 0.77 1.05 0.52 4.91 0.91 0.55 0.59 0.71 0.76 0.65 0.51 0.47 0.40 0.54 0.56 Zulage 1 s n 0.53 0.02 4 2 2 3 5 2 3 3 6 2 3 3 4 6 2 8.24 0.51 0.38 0.06 0.27 0.63 0.34 0.23 0.21 0.14 0.16 0.27 x 0.77 0.74 0.55 1.17 1.34 0.39 0.80 2.14 0.65 0.81 0.63 0.54 0.51 0.56 0.94 Zulage 2 s n 0.53 0.26 0.06 0.42 0.89 0.09 0.23 1.96 0.48 0.80 0.35 0.24 0.38 0.31 0.01 4 2 3 4 4 4 3 6 3 5 2 3 4 4 1 x 0.77 0.68 0.67 0.80 0.42 0.48 0.80 0.74 0.66 0.63 0.69 0.49 0.47 0.57 0.21 s 0.53 0.25 0.14 0.48 0.06 0.09 0.13 0.38 0.34 0.30 0.46 0.09 0.20 0.22 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.37 0.31 0.45 0.20 0.84 0.17 0.09 0.25 0.22 0.68 0.51 0.76 0.56 0.65 0.27 0.39 0.89 0.06 0.02 0.67 0.15 0.60 0.99 0.47 0.15 0.70 0.89 0.03 0.62 0.72 0.86 0.27 Tyrosin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 5 0 4 5 4 6 4 5 5 5 5 5 5 4 Zulage 1 x 1.19 2.95 s n 0.85 3.86 0.80 1.02 1.02 1.01 12.6 1.27 0.99 0.90 7.95 13.2 13.3 4.59 0.56 0.66 0.66 0.59 22.8 0.51 0.83 0.68 9.45 12.3 13.1 3.62 4 2 2 5 4 3 5 6 6 5 6 4 6 5 6 x 1.19 0.91 0.93 0.68 1.18 0.88 1.05 0.90 6.25 0.91 2.28 6.37 11.4 8.86 2.81 Zulage 2 s n 0.85 0.79 1.02 0.64 0.44 0.70 0.68 0.64 13.4 0.75 2.60 5.55 13.9 8.88 3.15 4 4 2 6 5 5 6 6 6 6 5 3 5 4 5 - 219 - x 1.19 0.72 0.31 0.73 0.90 0.72 1.21 1.36 0.87 1.07 6.06 9.03 14.2 11.6 3.79 s 0.85 0.66 0.17 0.79 0.79 0.69 0.49 0.32 0.73 0.69 6.43 6.44 13.0 14.8 3.65 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.50 0.29 0.31 0.64 0.79 0.63 0.49 0.38 0.40 0.24 0.39 0.18 0.81 0.45 0.31 0.23 0.77 0.14 0.47 0.39 0.47 0.64 0.37 0.20 0.54 0.74 0.49 0.21 0.43 0.34 0.67 0.08 0.38 0.49 0.22 0.24 0.83 0.39 0.14 Anhang Tyrosin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 3 3 5 6 5 5 6 6 6 6 6 5 5 6 Kontrolle s x 6.55 3.70 18.2 14.5 17.7 0.92 12.4 7.66 13.2 10.1 14.0 11.0 8.57 5.03 3.46 2.92 2.34 1.02 3.93 2.52 6.42 3.26 9.98 1.48 8.58 3.13 10.7 3.62 6.06 4.48 n 6 4 5 5 6 5 4 6 6 5 6 5 4 4 4 Zulage 1 s x 6.55 3.70 16.2 12.2 13.0 6.64 10.1 3.00 10.1 3.78 6.04 4.80 7.01 5.10 2.98 2.14 2.29 0.95 4.40 2.59 7.82 1.53 12.2 2.08 8.68 3.88 8.92 3.37 7.64 6.91 n 6 3 5 5 5 6 5 6 6 6 6 6 5 4 5 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.55 3.70 15.5 7.08 0.47 0.26 0.16 19.2 13.2 0.79 0.68 0.12 11.0 4.30 0.45 0.46 0.59 10.8 4.87 0.33 0.31 0.95 8.39 6.79 0.08 0.34 0.04 6.79 4.86 0.17 0.19 0.74 7.59 1.73 0.29 0.00 0.00 5.48 4.72 0.93 0.09 0.14 7.45 2.16 0.88 0.00 0.02 7.04 2.35 0.39 0.73 0.38 12.4 2.15 0.05 0.04 0.84 13.2 5.19 0.18 0.08 0.25 13.6 1.40 0.02 0.32 0.02 8.21 4.43 0.17 0.09 0.66 Tyrosin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 4 4 3 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 16.7 2.75 7.31 6.78 9.36 6.92 8.46 7.19 15.0 8.18 4.02 2.76 5.45 3.89 7.07 8.09 4.92 3.52 3.20 2.46 7.73 4.34 n 4 3 3 4 4 5 6 5 6 6 4 Zulage 1 s x 16.7 2.75 9.31 6.99 18.3 18.2 13.3 10.0 11.2 5.07 7.05 3.59 9.36 2.64 4.46 3.82 5.63 3.95 3.34 2.47 8.98 2.02 - 220 - n 4 3 4 4 4 6 6 4 5 6 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 16.7 2.75 7.94 5.65 0.91 0.33 0.46 7.87 7.50 0.38 0.35 0.35 17.5 14.1 0.15 0.10 0.28 11.9 7.80 0.44 0.30 0.90 7.55 3.95 0.18 0.23 0.75 9.18 0.31 0.04 0.07 0.87 6.54 3.26 0.80 0.21 0.95 6.88 3.39 0.67 0.26 0.81 4.66 2.76 0.62 0.05 0.16 9.18 1.31 0.22 0.10 0.73 Anhang Tab. 9.4.1.13 Prolin Prolin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 5 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 x 11.0 8.93 15.3 11.7 15.6 20.1 19.1 23.5 20.9 28.6 20.5 16.2 12.9 12.3 13.7 Zulage 1 s n 3.60 1.80 11.8 2.66 5.13 5.79 6.79 4.38 7.58 5.81 5.79 6.00 3.54 6.61 4.54 4 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 x 11.0 9.75 8.36 10.9 13.7 16.7 23.4 18.5 20.0 21.8 20.8 19.1 13.2 13.2 14.7 Zulage 2 s n 3.60 3.91 2.52 3.12 6.13 3.02 14.1 4.42 8.75 2.28 3.72 5.05 7.78 4.71 6.29 4 6 6 6 6 5 5 6 6 6 5 5 5 6 6 x 11.0 10.2 9.48 11.4 16.4 16.4 13.3 12.3 13.3 12.7 14.4 10.9 10.5 11.9 13.6 s 3.60 2.45 2.09 2.87 4.79 2.79 4.41 1.13 4.45 7.26 2.27 4.26 3.83 3.50 5.19 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.51 0.21 0.49 0.16 0.44 0.47 0.09 0.32 0.08 0.92 0.36 0.90 0.70 0.47 0.06 0.28 0.85 0.38 0.50 0.13 0.00 0.00 0.01 0.09 0.04 0.17 0.86 0.92 0.98 0.57 0.62 0.01 0.91 0.16 0.02 0.01 0.02 0.01 0.02 0.71 0.27 0.28 Prolin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 x 16.1 8.47 7.18 18.4 15.8 11.7 21.3 20.9 19.8 22.4 13.5 10.3 12.5 13.7 14.4 Zulage 1 s n 7.76 3.30 2.51 8.72 7.36 6.28 8.65 10.3 13.5 8.96 4.33 3.70 3.62 3.06 5.48 6 6 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 x 16.1 9.45 9.47 22.7 15.7 14.6 18.9 19.0 13.6 14.2 11.4 12.7 11.1 12.5 14.2 Zulage 2 s n 7.76 4.32 3.40 17.4 5.33 9.46 11.0 12.0 6.84 8.78 5.41 4.66 2.95 2.82 4.31 6 6 6 6 6 6 6 4 5 6 6 6 6 5 4 - 221 - x 16.1 9.50 10.4 20.3 17.2 12.3 19.1 24.1 23.1 19.3 15.7 13.9 15.2 16.5 15.2 s 7.76 3.53 3.15 6.14 5.17 5.43 4.67 10.1 6.57 5.31 6.25 3.83 6.33 3.57 3.56 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.22 0.39 0.49 0.96 0.17 0.99 0.17 0.18 0.00 0.30 0.20 0.56 0.53 0.57 0.21 0.02 0.40 0.72 0.63 0.79 0.18 0.85 0.34 0.38 0.06 0.32 0.19 0.27 0.96 0.10 0.68 0.48 0.42 0.93 0.32 0.05 0.22 0.04 0.72 0.22 0.15 0.86 Anhang Prolin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 4 6 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 6.04 4.26 8.26 2.39 7.24 1.56 11.4 1.70 17.0 9.08 19.5 9.63 27.8 7.10 20.1 17.8 23.0 6.62 35.6 16.8 19.6 7.46 11.7 9.00 5.52 6.55 5.96 7.07 9.48 6.29 n 6 4 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 6.04 4.26 10.8 4.13 9.56 3.01 14.5 5.63 15.9 5.74 19.0 11.6 24.5 7.03 27.6 10.9 20.2 11.1 26.7 9.05 14.6 10.3 14.9 11.7 9.80 11.8 11.6 12.7 15.7 12.1 n 6 4 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.04 4.26 13.0 3.01 0.19 0.05 0.09 11.0 2.75 0.02 0.00 0.24 14.1 6.67 0.16 0.35 0.78 17.7 8.40 0.61 0.86 0.62 16.1 5.94 0.76 0.15 0.25 19.3 9.65 0.15 0.01 0.05 19.1 5.23 0.43 0.87 0.07 13.7 3.37 0.41 0.01 0.18 16.9 6.69 0.28 0.03 0.05 14.0 11.4 0.46 0.37 0.77 10.2 6.90 0.25 0.40 0.12 9.28 10.9 0.18 0.16 0.34 9.70 10.9 0.23 0.19 0.40 10.9 6.26 0.17 0.46 0.21 Prolin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 4.12 4.01 6.83 4.00 5.34 2.33 12.8 9.52 11.1 10.6 11.1 10.8 13.2 17.9 24.2 14.5 27.5 4.82 19.2 16.5 18.2 8.32 15.8 5.47 17.4 13.3 17.3 9.13 16.8 6.51 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 4.12 4.01 5.75 2.07 7.67 4.28 11.8 11.5 11.3 15.2 5.76 5.67 11.9 14.9 24.7 13.0 22.7 7.49 23.8 16.5 16.4 6.37 10.6 7.10 16.9 4.58 13.5 3.96 12.5 3.83 - 222 - n 6 5 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 4.12 4.01 7.91 4.51 0.36 0.63 0.26 6.29 3.97 0.06 0.63 0.60 5.84 4.43 0.82 0.13 0.20 5.50 4.81 0.96 0.24 0.84 10.2 9.16 0.22 0.85 0.42 9.76 6.52 0.53 0.63 0.72 21.0 10.1 0.88 0.31 0.17 19.4 11.1 0.18 0.16 0.59 16.8 5.41 0.49 0.68 0.28 16.6 8.21 0.57 0.71 0.95 16.7 7.30 0.03 0.57 0.08 10.9 6.56 0.30 0.23 0.32 14.0 5.83 0.19 0.39 0.87 12.5 4.66 0.07 0.02 0.99 Anhang Prolin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 6 6 6 4 6 5 4 Kontrolle s x 11.3 8.48 14.8 4.05 17.1 5.62 33.6 13.7 51.5 14.7 37.3 20.3 51.7 25.2 45.5 27.2 64.4 26.6 49.8 13.7 50.4 19.2 n 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 11.3 8.48 18.3 6.82 26.3 16.3 32.4 11.4 40.3 9.54 39.9 11.0 53.3 12.3 39.7 15.5 43.5 16.0 66.0 32.4 62.2 44.4 n 4 6 6 6 6 6 6 6 6 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 11.3 8.48 18.0 9.06 0.22 0.45 0.92 21.5 5.43 0.28 0.13 0.51 37.1 14.8 0.82 0.56 0.28 47.6 15.0 0.23 0.72 0.38 45.8 13.6 0.83 0.51 0.12 54.7 31.9 0.90 0.86 0.88 41.3 20.5 0.40 0.53 0.72 46.3 13.3 0.06 0.08 0.44 43.7 6.71 0.42 0.82 0.75 45.4 16.0 0.10 0.36 0.22 Tab. 9.4.1.14 GABA GABA in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 3 2 2 2 2 3 3 2 3 2 3 3 2 4 Kontrolle s x 6.85 0.00 1.85 0.30 2.34 0.21 2.82 0.54 3.50 0.16 3.29 0.49 4.14 1.34 4.04 1.07 8.91 2.46 5.10 0.86 6.92 0.62 3.66 1.57 2.57 1.50 1.97 0.07 3.99 1.92 n 2 2 2 2 2 2 4 2 2 2 2 3 2 3 4 Zulage 1 s x 6.85 0.00 1.66 0.00 2.21 0.07 3.83 0.01 3.17 0.30 4.07 1.50 4.64 1.71 5.85 3.74 5.35 3.98 3.37 1.17 7.00 0.40 2.17 0.62 1.58 0.08 3.56 2.81 4.17 3.03 - 223 - n 2 2 2 3 2 2 4 3 2 3 2 2 3 3 3 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.85 0.00 1.69 0.55 0.61 0.32 0.94 2.46 0.00 0.64 0.56 0.13 10.7 7.86 0.23 0.54 0.58 4.41 0.01 0.18 0.07 0.10 5.49 2.38 0.68 0.35 0.70 16.2 23.1 0.37 0.42 0.41 5.76 0.48 0.53 0.06 0.91 9.84 1.28 0.58 0.46 0.44 6.88 0.32 0.15 0.15 0.15 8.41 7.46 0.68 0.81 0.82 1.55 1.17 0.58 0.56 0.48 2.69 1.48 0.23 0.72 0.59 5.16 2.69 0.66 0.55 5.07 2.33 0.79 0.20 0.81 Anhang GABA in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 5 4 4 6 4 4 5 6 5 4 4 4 Kontrolle s x 0.26 0.05 2.17 0.69 2.01 0.08 2.88 1.53 2.65 1.86 13.7 22.0 2.56 0.79 3.30 1.25 3.92 1.88 5.91 4.83 5.36 5.12 2.21 1.09 2.65 0.29 2.21 0.59 2.48 0.90 n 4 4 3 4 4 6 5 4 4 5 6 4 4 4 3 Zulage 1 s x 0.26 0.05 1.83 0.37 2.31 0.37 39.9 44.5 2.08 1.06 42.2 65.9 1.94 0.92 27.9 51.5 2.82 0.98 17.9 27.0 5.26 5.39 3.05 1.88 2.35 0.91 2.30 0.75 2.70 0.96 n 4 4 2 4 6 6 5 5 4 5 5 4 3 3 2 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.26 0.05 2.14 0.47 0.37 0.85 0.15 2.73 0.24 0.50 0.28 5.03 3.39 0.20 0.49 0.19 3.21 1.55 0.43 0.05 0.08 36.8 59.6 0.27 0.55 0.77 3.05 1.67 0.03 0.48 0.03 4.05 1.83 0.41 0.00 0.43 5.32 2.43 0.18 0.24 0.05 8.39 6.40 1.00 0.03 0.03 6.05 4.49 0.87 0.03 0.00 2.67 1.07 0.65 0.99 0.80 3.08 1.12 0.54 0.62 0.20 2.80 0.98 0.81 0.28 0.48 3.80 0.52 0.82 0.27 0.51 GABA in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 4 4 4 4 4 5 4 5 4 4 4 2 2 2 Kontrolle s x 40.1 0.00 1.08 0.43 0.28 0.30 2.43 2.82 3.20 2.98 3.38 2.69 2.75 2.85 28.8 52.5 2.24 2.42 1.27 1.25 0.34 0.33 0.20 0.29 0.67 0.03 0.68 0.17 0.76 0.04 n 2 3 3 4 4 3 4 4 3 6 5 4 2 2 2 Zulage 1 s x 40.1 0.00 1.42 0.57 0.37 0.32 1.78 1.41 1.94 1.49 2.36 1.48 5.42 7.51 2.43 1.61 40.2 33.0 3.88 4.44 0.30 0.23 0.20 0.20 0.68 0.07 0.53 0.29 0.82 0.11 - 224 - n 2 3 3 4 4 4 4 4 4 6 6 4 2 2 2 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 40.1 0.00 0.75 0.15 0.42 0.03 0.42 0.34 0.28 0.98 0.58 0.57 1.38 0.25 0.69 0.52 0.66 5.99 5.61 0.20 0.12 0.15 6.25 5.33 0.14 0.12 0.11 5.13 3.63 0.49 0.10 0.89 7.57 4.73 0.50 0.09 0.05 15.6 29.3 0.21 0.46 0.41 3.19 2.97 0.93 0.15 0.79 1.19 0.80 0.52 0.15 0.05 0.70 0.82 0.97 0.16 0.21 0.89 0.01 0.90 0.09 0.11 0.34 0.81 0.74 0.97 0.02 0.67 0.13 0.26 Anhang GABA in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 0 2 2 5 4 2 2 6 6 5 5 6 5 5 4 x 0.21 0.19 0.32 0.43 0.25 0.18 0.09 0.18 0.09 0.10 0.30 0.01 0.11 0.07 Zulage 1 s n 0.05 0.06 0.25 0.26 0.03 0.01 0.09 0.16 0.07 0.13 0.49 0.11 0.06 0.05 0 2 2 6 6 4 4 6 6 4 4 6 5 5 6 x 0.02 0.32 0.37 0.56 0.20 0.17 9.61 0.28 0.12 0.20 0.24 0.03 0.08 0.10 Zulage 2 s n x s 0.05 0.06 0.36 0.45 0.10 0.17 23.0 0.08 0.09 0.06 0.31 0.07 0.08 0.05 0 3 3 4 5 2 3 6 5 6 4 5 5 4 6 0.09 0.08 0.16 1.98 0.22 0.10 0.10 3.89 0.06 0.31 0.38 0.13 0.12 0.11 0.11 0.03 0.15 4.21 0.02 0.13 0.10 8.26 0.04 0.47 0.43 0.08 0.07 0.09 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.02 0.31 0.03 0.28 0.80 0.36 0.07 0.46 0.25 0.45 0.35 0.29 0.47 0.21 0.42 0.21 0.70 0.73 0.37 0.54 0.58 0.90 0.05 0.26 0.06 0.04 0.48 0.12 0.24 0.36 0.38 0.09 0.69 0.12 0.00 0.69 0.80 GABA in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 4 4 5 3 6 3 6 5 6 Kontrolle s x 0.55 0.75 0.07 0.06 0.34 0.53 0.31 0.33 0.43 0.55 0.38 0.35 0.59 0.47 0.30 0.04 0.32 0.21 0.16 0.20 0.20 0.14 n 6 5 4 5 4 5 6 5 6 6 6 Zulage 1 s x 0.55 0.75 0.08 0.06 0.13 0.08 0.26 0.23 0.54 0.28 0.40 0.18 0.34 0.10 0.19 0.12 0.35 0.17 0.26 0.16 0.19 0.07 - 225 - n 6 4 4 5 5 6 5 5 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.55 0.75 0.02 0.08 0.83 0.42 0.15 0.17 0.04 0.41 0.58 0.68 0.23 0.29 0.93 0.71 0.69 0.31 0.17 0.92 0.68 0.37 0.32 0.07 0.87 0.71 0.30 0.35 0.20 0.31 0.54 0.88 0.24 0.13 0.38 0.43 0.03 0.34 0.15 0.68 0.81 0.73 0.21 0.12 0.13 0.27 0.32 0.19 0.05 0.93 0.95 0.99 Anhang Tab. 9.4.1.15: Valin Valin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 5 5 6 5 6 5 6 6 6 6 4 5 4 6 Kontrolle s x 5.72 0.00 5.59 4.66 8.12 2.82 7.28 2.45 12.9 9.42 15.2 12.3 6.91 3.46 6.48 3.53 3.64 2.47 5.28 4.60 3.47 3.20 7.96 1.53 6.76 1.06 7.59 1.78 5.18 3.71 n 2 5 6 6 5 5 6 6 6 6 2 3 4 3 6 Zulage 1 s x 5.72 0.00 5.53 2.25 5.73 3.19 4.88 2.38 10.8 9.55 10.3 7.61 7.05 5.39 3.21 0.75 3.77 2.33 5.57 3.45 0.57 0.01 8.19 2.83 5.86 1.47 7.73 1.18 6.09 4.57 n 2 5 6 5 6 5 6 5 6 6 3 3 4 4 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 5.72 0.00 6.25 2.41 0.26 0.78 0.85 6.43 2.77 0.16 0.36 0.15 6.79 5.14 0.03 0.86 0.56 13.0 7.46 0.42 0.64 0.88 10.4 5.93 0.47 0.70 0.97 14.8 19.6 0.08 0.43 0.41 8.27 4.21 0.07 0.69 0.08 3.83 3.21 0.80 0.61 0.91 5.84 6.81 0.89 0.87 0.94 3.13 3.02 0.12 0.19 0.45 5.88 2.91 0.38 0.56 0.32 6.30 0.99 0.55 0.03 0.64 6.63 0.66 0.59 0.30 0.04 5.47 2.75 0.20 0.81 0.66 Valin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 3 2 5 4 6 5 4 5 6 4 4 4 4 4 Kontrolle s x 3.79 0.00 5.57 4.41 7.02 0.75 2.71 3.64 1.57 1.10 1.59 1.21 4.13 4.58 6.01 6.20 4.03 4.49 5.31 4.50 2.15 2.82 4.14 4.13 5.14 5.01 2.99 4.27 1.03 0.32 n 2 3 2 4 4 6 5 4 4 4 4 4 4 4 3 Zulage 1 s x 3.79 0.00 5.81 4.81 6.65 0.24 43.3 50.8 1.28 0.87 2.39 2.53 3.60 4.25 22.9 44.5 3.89 3.40 2.09 3.13 2.65 2.37 4.61 4.35 4.49 4.67 2.87 4.21 0.98 0.79 - 226 - n 2 3 2 4 6 6 4 5 4 4 4 4 4 3 2 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.79 0.00 8.35 0.25 0.52 0.43 0.40 9.55 3.33 0.49 0.54 0.46 5.78 5.86 0.20 0.43 0.19 1.25 0.29 0.21 0.50 0.89 2.49 1.64 0.23 0.14 0.90 5.08 4.79 0.05 0.54 0.05 5.41 5.94 0.48 0.21 0.49 7.94 4.88 0.36 0.20 0.15 6.29 6.02 0.16 0.39 0.24 4.97 4.22 0.64 0.19 0.10 2.81 2.18 0.32 0.28 0.22 4.87 4.43 0.28 0.71 0.73 6.31 4.72 0.97 0.41 0.43 1.52 0.29 0.76 0.40 0.84 Anhang Valin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 5 6 4 5 6 6 5 6 5 6 6 6 5 6 Kontrolle s x 1.29 0.00 4.55 0.85 4.29 2.23 8.82 5.61 5.28 3.91 5.62 1.18 6.36 3.25 27.3 48.1 7.22 2.16 8.30 2.88 5.62 1.55 3.76 0.53 3.74 1.96 3.81 1.20 4.40 1.12 n 2 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 Zulage 1 s x 1.29 0.00 4.76 1.70 4.28 2.24 5.73 1.05 6.11 2.30 6.99 2.59 9.30 4.88 8.98 4.05 123 283 17.0 15.7 4.70 2.57 3.60 1.00 4.51 2.32 4.31 1.94 4.68 1.78 n 2 5 5 6 5 5 6 6 6 6 6 6 4 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.29 0.00 4.76 0.79 0.59 0.67 0.96 4.13 2.08 0.96 0.88 0.86 6.97 5.10 0.37 0.52 0.52 9.13 4.92 0.60 0.41 0.15 8.46 4.07 0.42 0.12 0.04 9.89 5.19 0.07 0.20 0.79 11.8 4.65 0.40 0.48 0.02 10.8 5.13 0.36 0.09 0.38 11.5 8.31 0.21 0.33 0.25 8.40 1.38 0.46 0.01 0.01 4.72 0.56 0.76 0.03 0.10 4.35 2.15 0.11 0.06 0.51 4.62 1.89 0.89 0.48 0.37 4.81 1.80 0.41 0.28 0.61 Valin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 5 6 6 6 6 6 2 6 4 6 6 4 4 5 Kontrolle s x 4.26 5.00 37.0 48.4 10.3 18.7 4.12 3.12 5.11 4.47 4.26 2.75 3.67 1.94 0.72 0.48 2.03 2.34 2.47 3.00 2.53 1.37 4.53 2.87 6.04 3.56 5.92 3.62 5.82 3.67 n 6 6 6 6 6 6 6 3 5 3 6 5 2 4 6 Zulage 1 s x 4.26 5.00 23.0 32.0 3.09 3.35 4.16 3.15 5.21 4.67 3.16 0.92 3.29 2.35 0.36 0.22 1.61 1.52 1.88 1.45 2.03 0.56 3.10 2.18 7.40 0.93 4.33 3.40 5.39 2.39 - 227 - n 6 5 6 6 6 6 6 2 5 4 6 6 4 3 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 4.26 5.00 27.5 36.9 0.19 0.32 0.92 2.50 1.74 0.41 0.37 0.54 2.47 1.71 0.96 0.12 0.05 2.47 2.46 0.83 0.13 0.17 2.26 0.77 0.28 0.13 0.10 2.13 0.68 0.33 0.17 0.34 0.57 0.44 0.46 0.12 0.68 4.49 4.68 0.18 0.44 0.27 1.65 0.16 0.46 0.61 0.85 2.78 3.57 0.30 0.88 0.59 4.39 3.57 0.02 0.80 0.73 4.40 1.86 0.46 0.16 0.31 3.46 2.86 0.01 0.42 0.73 5.25 2.56 0.30 0.15 0.69 Anhang Valin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 5 4 5 6 1 5 3 5 3 4 Kontrolle s x 3.79 4.11 4.41 0.90 5.84 2.68 1.20 1.70 0.31 0.27 0.02 0.76 1.08 0.60 0.42 3.52 4.38 6.04 5.41 7.86 9.38 n 6 4 3 5 4 4 3 4 4 5 3 Zulage 1 s x 3.79 4.11 4.60 2.60 5.84 2.09 4.50 2.77 4.76 5.36 4.26 4.67 0.83 0.44 3.34 3.31 3.10 2.81 4.65 5.69 8.12 7.05 n 6 5 4 3 3 4 3 4 4 5 3 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.79 4.11 3.46 1.25 0.92 0.05 0.68 4.84 1.96 0.80 0.34 0.49 1.50 0.88 0.05 0.46 0.24 0.97 0.36 0.19 0.02 0.54 0.53 0.57 0.53 0.59 0.27 0.25 0.40 0.07 3.01 2.57 0.52 0.48 0.49 2.21 2.15 0.33 0.19 0.24 4.46 4.91 0.55 0.82 0.79 7.74 6.91 0.50 0.50 0.48 Tab. 9.4.1.16: Phenylalanin Phenylalanin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 0 6 6 4 5 6 4 6 5 4 6 4 5 6 3 x 2.90 2.50 5.12 8.17 6.67 2.82 1.93 1.08 0.34 0.49 1.03 0.23 0.85 1.33 Zulage 1 s n 2.78 2.32 2.38 6.85 4.22 2.92 2.34 1.21 0.11 0.31 1.11 0.09 0.88 1.04 0 3 6 4 5 5 5 6 6 6 4 5 4 4 4 x 3.33 2.48 6.61 6.13 15.4 3.04 1.98 0.86 1.81 0.68 0.69 0.19 1.09 0.92 Zulage 2 s n x s 1.91 1.89 2.23 1.97 11.1 3.79 2.28 0.66 3.10 0.41 0.38 0.06 0.93 0.90 0 5 6 4 6 5 4 6 6 5 6 6 4 5 6 3.12 2.71 7.43 12.9 18.4 12.5 1.14 0.78 0.63 1.91 1.55 0.25 1.10 3.64 2.37 2.16 4.21 5.05 11.6 9.70 1.47 0.41 0.08 1.95 2.47 0.07 1.06 4.75 - 228 - p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.33 0.95 0.00 0.60 0.15 0.22 0.87 0.72 0.36 0.58 0.72 0.73 0.41 0.26 0.23 0.23 0.01 0.28 0.10 0.08 0.34 0.41 0.02 0.14 0.35 0.91 0.19 0.46 0.39 0.23 0.03 0.01 0.34 0.08 0.40 0.75 0.40 0.36 0.46 0.79 0.14 0.57 Anhang Phenylalanin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 1 3 6 5 4 2 3 4 4 3 3 4 3 2 Kontrolle s x 1.72 0.00 7.50 2.62 4.20 8.33 8.44 7.93 6.39 8.25 5.33 0.48 0.12 2.28 3.01 3.54 4.04 4.00 4.05 4.75 4.17 2.56 2.07 0.89 0.83 2.00 1.88 3.05 0.51 n 2 3 1 6 5 6 3 4 4 1 2 3 4 3 1 Zulage 1 s x 1.72 0.00 3.19 5.15 12.2 4.21 2.96 6.04 3.23 2.29 2.91 1.14 1.48 4.76 3.53 1.81 1.82 4.37 4.40 0.74 2.59 2.06 1.67 1.73 2.48 1.99 4.39 n 2 1 5 6 3 6 4 4 4 4 4 3 3 2 2 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.72 0.00 0.13 3.29 4.03 0.78 5.66 5.51 0.37 0.42 0.60 11.4 3.62 0.33 0.89 0.12 3.95 3.58 0.14 0.46 0.48 2.56 2.27 0.45 0.60 0.23 2.34 1.98 0.58 0.49 0.31 1.63 1.22 0.23 0.33 0.75 2.62 2.59 0.23 2.15 2.40 0.18 0.20 0.69 3.07 3.16 0.96 0.77 0.62 2.92 3.89 0.28 0.50 0.68 0.23 0.00 0.49 5.23 2.06 0.44 Phenylalanin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 2 2 6 6 5 5 4 6 5 5 3 1 1 1 Kontrolle s x 23.8 26.9 4.21 4.76 6.73 0.69 0.91 0.72 2.11 1.68 1.54 1.61 3.19 3.14 13.3 17.1 1.32 1.09 3.06 4.39 0.97 0.47 0.26 0.19 1.19 2.72 4.62 n 4 2 2 6 5 4 4 4 6 6 5 2 2 2 4 Zulage 1 s x 23.8 26.9 0.74 0.10 6.61 0.37 3.67 2.83 4.26 1.33 3.57 1.35 6.92 1.97 4.79 1.44 16.7 31.0 7.02 7.10 9.25 14.9 0.66 0.49 5.71 0.09 6.56 1.56 4.30 4.46 - 229 - n 4 3 2 6 4 5 5 6 6 6 4 2 3 3 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 23.8 26.9 0.62 0.16 0.50 0.48 0.85 6.02 0.83 0.69 0.09 0.32 4.43 1.70 0.08 0.01 0.66 4.17 3.17 0.16 0.25 0.49 5.48 2.03 0.16 0.06 0.35 4.85 2.88 0.01 0.00 0.40 3.88 3.06 0.43 0.35 0.37 5.67 1.70 0.27 0.00 0.42 4.53 1.51 0.10 0.27 0.38 4.20 0.90 0.32 0.02 0.12 0.26 0.25 0.32 0.15 0.26 4.35 3.21 0.50 4.16 2.54 0.34 1.68 1.36 0.20 Anhang Phenylalanin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-11, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 5 5 6 6 4 4 6 6 6 5 5 5 5 4 Kontrolle s x 28. 5 30.2 1.08 1.01 0.93 0.51 2.29 1.40 2.41 1.57 3.34 2.86 1.89 1.67 4.51 4.59 2.65 2.44 2.14 1.98 5.29 3.57 8.53 5.45 1.36 0.69 1.44 0.99 4.92 4.01 n 4 6 5 6 6 6 5 6 6 6 6 6 4 4 6 Zulage 1 s x 28.5 30.2 1.21 0.75 1.53 0.94 2.68 1.42 3.27 1.36 1.71 1.09 1.67 0.66 6.23 3.37 2.33 1.39 2.33 3.45 5.94 5.29 7.54 5.75 4.12 3.70 1.76 0.95 1.99 1.12 n 4 4 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 28.5 30.2 1.09 0.75 0.79 0.47 0.44 1.25 1.13 0.07 0.33 0.91 2.44 1.62 0.64 0.88 0.46 2.39 1.44 0.37 0.98 0.24 2.85 2.32 0.34 0.94 0.19 2.26 1.24 0.79 0.34 0.66 6.52 4.25 0.30 0.25 0.78 5.57 5.12 0.66 0.20 0.13 4.41 5.83 0.87 0.42 0.50 4.46 2.52 0.23 0.75 0.39 9.26 7.20 0.78 0.03 0.18 2.09 2.17 0.22 0.37 0.37 3.64 3.45 0.87 0.20 0.27 3.17 0.37 0.36 0.48 0.17 Phenylalanin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 122 6.92 6.34 2.06 6.56 3.17 6.14 4.56 5.97 4.54 7.13 8.87 5.23 5.20 6.18 4.50 8.30 9.85 6.94 5.09 9.34 6.41 n 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 122 6.92 6.70 2.69 5.61 3.68 7.08 3.13 6.87 6.78 11.2 9.76 9.00 6.38 7.22 8.35 13.6 9.28 14.7 6.18 9.94 6.22 - 230 - n 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 122 6.92 5.65 2.11 0.56 0.28 0.28 6.42 3.02 0.29 0.83 0.47 6.17 2.36 0.50 0.99 0.42 9.50 4.96 0.66 0.01 0.10 10.3 6.64 0.18 0.42 0.79 6.79 4.64 0.12 0.53 0.12 10.7 7.68 0.64 0.34 0.14 6.73 8.00 0.13 0.22 0.07 9.01 5.48 0.03 0.53 0.14 9.94 3.94 0.78 0.74 1.00 Anhang Tab. 9.4.1.17: Isoleucin Isoleucin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 6 5 6 5 4 5 4 5 5 5 6 6 Kontrolle s x 77.7 0.00 1.60 2.03 2.38 2.99 1.72 1.90 4.53 8.75 1.40 1.25 0.72 0.31 0.76 0.27 0.59 0.20 0.61 0.09 0.57 0.22 0.60 0.79 0.19 0.08 0.80 0.94 0.25 0.07 n 2 5 6 6 5 5 6 6 6 6 4 4 4 4 6 Zulage 1 s x 77.7 0.00 2.75 3.16 2.26 2.87 1.95 2.34 1.53 1.65 3.25 2.86 0.95 0.32 0.89 0.18 0.81 0.18 0.74 0.14 0.64 0.08 0.42 0.16 0.25 0.08 0.30 0.16 0.33 0.07 n 2 6 6 5 6 5 6 5 6 5 5 4 4 4 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 77.7 0.00 2.28 3.54 0.35 0.62 0.97 1.82 2.65 0.32 0.37 0.39 1.98 1.80 0.71 0.11 0.79 3.22 2.81 0.40 0.52 0.11 3.39 3.72 0.11 0.16 0.93 1.77 3.11 0.01 0.43 0.53 0.88 0.35 0.02 0.21 0.94 0.63 0.09 0.00 0.64 0.06 0.53 0.14 0.28 0.57 0.05 2.32 2.11 0.07 0.31 0.34 0.36 0.20 0.64 0.57 0.05 0.17 0.09 0.03 0.89 0.26 0.24 0.07 0.39 0.87 0.85 1.22 2.24 0.01 0.33 0.37 Isoleucin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 5 6 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 63.9 71.8 0.46 0.54 0.20 0.09 0.68 0.18 0.69 0.34 0.66 0.11 0.75 0.30 0.73 0.40 0.66 0.16 0.75 0.29 0.42 0.12 0.32 0.08 0.39 0.18 0.35 0.22 0.33 0.15 n 4 6 5 6 6 4 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 63.9 71.8 0.43 0.49 0.22 0.04 1.78 3.09 0.36 0.13 0.51 0.13 0.48 0.31 3.67 8.29 0.33 0.12 0.29 0.12 0.28 0.06 0.45 0.35 0.32 0.16 0.38 0.23 0.31 0.25 - 231 - n 4 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 6 6 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 63.9 71.8 0.64 0.66 0.47 0.26 0.27 0.26 0.04 0.71 0.11 0.05 0.74 0.21 0.43 0.64 0.42 0.74 0.22 0.04 0.73 0.00 0.66 0.35 0.04 0.94 0.96 0.79 0.41 0.13 0.41 0.13 0.92 0.33 0.41 0.00 0.44 0.97 0.46 0.00 0.23 0.01 0.90 0.32 0.01 0.12 0.00 0.67 0.11 0.06 0.01 0.00 0.38 0.10 0.36 0.29 0.67 0.38 0.09 0.19 0.87 0.36 0.50 0.20 0.49 0.26 0.43 0.40 0.22 0.94 0.29 0.74 Anhang Isoleucin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 2 2 4 2 2 3 3 3 2 1 2 2 2 3 Kontrolle s x 2.04 0.00 1.66 1.89 0.31 0.05 0.83 0.62 0.62 0.07 0.68 0.12 0.85 0.38 2.76 1.89 0.46 0.53 0.69 0.52 0.19 0.26 0.04 0.11 0.09 0.17 0.11 0.55 0.60 n 2 3 2 4 2 2 4 4 4 3 2 2 2 3 3 Zulage 1 s x 2.04 0.00 0.20 0.14 0.33 0.03 0.35 0.10 0.41 0.02 0.33 0.03 6.19 5.70 10.6 11.6 3.12 3.25 7.91 13.0 0.13 0.08 0.08 0.04 0.30 0.28 0.34 0.38 0.29 0.24 n 2 4 2 2 1 2 2 2 2 3 4 2 2 2 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 2.04 0.00 0.16 0.11 0.47 0.49 0.80 0.43 0.07 0.26 0.38 0.40 0.68 0.07 0.16 0.70 0.06 1.19 0.20 1.41 0.28 0.19 0.10 0.13 1.00 0.36 0.83 0.86 0.69 1.53 0.08 0.41 0.58 0.07 1.63 0.51 0.32 0.09 1.00 0.87 0.32 0.19 1.13 0.72 0.27 0.29 0.12 0.02 0.87 0.33 0.32 0.02 0.39 0.24 0.94 0.19 0.12 0.92 0.75 0.41 0.36 0.39 0.65 0.35 Isoleucin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 6 6 4 4 3 4 3 3 5 3 2 2 Kontrolle s x 0.42 0.31 0.38 0.27 0.26 0.16 0.85 0.77 0.87 0.75 1.63 1.66 3.05 3.46 0.68 0.40 0.57 0.31 0.65 0.06 0.39 0.15 0.48 0.26 0.48 0.19 0.63 0.16 4.59 5.70 n 4 4 6 5 6 4 4 4 4 4 3 4 2 2 2 Zulage 1 s x 0.42 0.31 1.11 1.61 0.47 0.56 0.71 0.41 1.51 1.15 2.03 2.43 1.71 1.93 0.57 0.52 0.52 0.50 0.39 0.40 0.48 0.46 0.47 0.10 0.62 0.14 0.58 0.05 0.33 0.00 - 232 - n 4 4 6 4 5 4 3 2 5 2 3 4 2 2 3 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.42 0.31 0.20 0.31 0.59 0.48 0.44 0.50 0.86 0.32 0.56 0.87 0.41 0.28 0.55 0.13 0.25 1.39 2.47 0.01 0.73 0.85 1.74 1.79 0.54 0.88 0.63 2.23 1.78 0.20 0.26 0.97 0.60 0.02 0.70 0.17 0.04 5.57 10.1 0.69 0.54 0.55 0.57 0.08 0.61 0.62 0.49 0.30 0.09 0.71 0.07 0.08 0.41 0.16 0.31 0.24 0.64 0.42 0.03 0.44 0.57 0.23 3.30 4.07 0.61 0.51 0.51 0.36 0.27 0.48 0.50 0.32 Anhang Isoleucin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle n s x 4 0.57 0.62 0 0 5 0.14 0.10 4 0.44 0.20 3 0.26 0.17 6 0.74 0.95 3 0.25 0.06 6 0.45 0.28 4 0.38 0.28 4 0.18 0.10 Zulage 1 n s x 4 0.57 0.62 0 0 6 8.38 10.17 5 9.81 15.30 5 8.94 12.14 6 0.39 0.13 5 0.46 0.31 6 0.59 0.24 6 0.46 0.21 5 0.25 0.31 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 4 0.57 0.62 0 0 4 0.21 0.20 0.10 0.42 0.09 5 0.31 0.21 0.26 0.65 0.26 6 0.32 0.18 0.43 0.68 0.19 6 0.58 0.36 0.44 0.76 0.15 6 0.53 0.39 0.83 0.45 0.41 6 0.47 0.25 0.31 0.85 0.13 5 0.50 0.37 0.71 0.82 0.95 6 0.28 0.25 0.70 0.38 0.51 Tab. 9.4.1.18: Leucin Leucin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 6 6 6 5 6 5 5 4 6 6 6 5 5 6 Kontrolle s x 6.51 0.00 1.60 2.19 2.18 2.99 1.74 2.06 2.09 3.50 4.61 6.33 0.43 0.17 0.41 0.10 0.20 0.10 0.38 0.11 0.33 0.33 0.71 0.98 0.22 0.06 0.30 0.23 0.22 0.06 n 2 5 6 6 5 5 6 4 4 6 4 6 4 5 6 Zulage 1 s x 6.51 0.00 2.15 2.70 2.25 3.22 1.50 1.69 2.70 4.48 3.55 4.84 0.85 0.28 0.65 0.40 0.50 0.38 0.67 0.36 0.42 0.13 0.82 0.98 0.26 0.08 3.62 7.58 0.26 0.12 - 233 - n 2 6 6 6 6 5 6 5 4 5 5 6 4 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.51 0.00 1.67 2.31 0.38 0.90 0.66 1.96 2.63 0.58 0.24 0.35 1.33 1.00 0.59 0.62 0.73 4.42 5.24 0.25 0.10 0.00 3.47 5.12 0.24 0.23 0.79 1.72 2.42 0.04 0.28 0.44 0.72 0.30 0.33 0.23 0.31 0.89 0.13 0.12 0.00 0.18 0.67 0.23 0.06 0.06 0.63 2.67 2.69 0.99 0.15 0.30 0.54 0.27 0.85 0.63 0.47 0.17 0.06 0.25 0.62 0.40 0.21 0.04 0.39 0.44 0.37 0.30 0.10 0.52 0.17 0.60 Anhang Leucin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 5 6 6 6 5 5 6 6 6 5 4 6 6 Kontrolle s x 5.37 6.04 0.78 0.75 0.50 0.50 1.06 0.69 1.16 0.73 1.15 0.54 0.86 0.48 1.03 0.28 1.00 0.14 1.05 0.31 0.47 0.30 0.42 0.21 0.56 0.23 0.47 0.22 0.51 0.27 n 4 6 5 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 5.37 6.04 0.74 0.60 0.51 0.43 2.89 3.86 0.80 0.51 0.97 0.82 0.90 0.30 5.63 11.8 0.86 0.42 0.89 0.45 0.65 0.42 0.71 0.40 0.46 0.24 0.65 0.37 0.39 0.08 n 4 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 5.37 6.04 0.77 0.74 0.65 0.88 0.68 0.50 0.26 0.30 0.03 0.94 0.99 0.37 0.34 0.83 0.27 1.13 0.63 0.18 0.78 0.14 1.10 0.54 0.44 0.79 0.32 1.17 0.60 0.77 0.08 0.38 1.17 0.34 0.38 0.01 0.39 1.30 0.57 0.43 0.23 0.16 1.19 0.40 0.78 0.26 0.49 0.91 0.21 0.47 0.04 0.05 0.62 0.24 0.25 0.50 0.58 0.63 0.19 0.73 0.76 0.22 0.51 0.25 0.15 0.80 0.48 0.34 0.05 0.48 0.38 0.63 Leucin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 2 4 5 3 5 5 5 3 3 3 2 2 2 Kontrolle s x 1.13 0.83 0.30 0.12 0.52 0.00 1.61 0.92 0.82 0.54 1.14 0.38 0.85 0.66 2.91 4.05 0.81 0.49 1.04 0.49 0.68 0.13 5.21 4.28 5.15 1.95 4.48 0.02 0.49 0.03 n 4 3 2 4 2 3 4 4 4 4 3 1 3 2 2 Zulage 1 s x 1.13 0.83 0.39 0.07 0.47 0.01 0.89 0.26 1.21 0.06 0.69 0.53 2.50 1.05 6.26 5.73 0.63 0.44 3.92 5.75 5.00 7.65 10.1 3.30 2.88 4.30 1.20 0.47 0.06 - 234 - n 4 4 2 4 3 3 4 4 3 5 6 2 3 1 2 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.13 0.83 0.36 0.05 0.52 0.46 0.15 0.69 0.23 0.12 0.49 0.42 0.72 0.70 0.16 0.26 0.61 1.02 1.02 0.19 0.43 1.65 1.12 0.10 0.36 0.14 1.09 0.44 0.14 0.70 0.08 1.49 0.63 0.20 0.17 0.23 1.20 1.45 0.43 0.63 0.42 0.74 0.63 0.44 0.19 0.39 2.11 2.02 0.62 0.41 0.54 7.35 0.81 0.17 4.58 4.00 0.85 0.55 0.34 6.69 0.87 0.74 0.28 0.59 0.45 0.46 Anhang Leucin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 3 2 6 6 4 4 6 6 6 5 6 5 6 4 Kontrolle s x 1.23 0.67 0.67 0.51 0.70 0.13 1.19 0.78 1.09 0.76 0.46 0.27 0.29 0.09 0.70 0.50 0.96 0.24 0.81 0.40 0.30 0.19 0.73 0.40 1.04 0.25 0.65 0.33 0.95 0.07 n 4 4 4 4 6 3 1 6 6 4 6 5 4 4 6 Zulage 1 s x 1.23 0.67 0.36 0.22 0.47 0.40 1.49 0.68 1.37 1.00 0.24 0.27 0.52 0.66 0.41 0.71 0.36 0.60 0.40 0.49 0.40 0.73 0.50 1.05 0.13 0.74 0.18 0.84 0.38 n 4 5 5 4 5 2 3 6 6 4 5 6 6 5 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 1.23 0.67 0.44 0.40 0.28 0.93 0.17 0.41 0.28 0.24 0.04 0.84 0.71 0.42 0.56 0.24 0.08 1.37 2.38 0.35 0.81 0.79 0.65 0.14 0.20 0.18 0.23 0.17 0.39 0.59 0.46 0.31 0.85 0.11 0.24 4.00 8.70 0.23 0.44 0.40 0.41 0.29 0.44 0.16 0.36 0.43 0.46 0.73 0.59 0.64 0.70 0.38 0.64 0.72 0.98 1.11 0.73 0.77 0.41 0.32 0.90 0.64 0.56 0.46 0.33 0.83 0.56 0.55 0.57 0.90 Leucin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 4 6 5 3 6 4 6 6 6 Kontrolle s x 3.35 0.98 0.38 0.10 0.47 0.42 0.61 0.32 1.09 0.62 1.03 0.14 1.29 0.82 0.74 0.47 58.8 90.4 0.76 0.63 0.90 0.24 n 4 4 4 6 4 5 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 3.35 0.98 0.40 0.14 0.44 0.30 2.98 3.73 6.02 9.53 2.24 2.47 1.26 0.25 11.9 17.4 11.9 16.3 1.24 0.46 0.98 0.20 - 235 - n 4 3 4 6 5 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 3.35 0.98 0.14 0.18 0.58 0.16 0.01 0.41 0.32 0.62 0.72 0.57 0.52 0.49 0.16 0.54 0.13 0.86 0.53 0.39 0.37 0.39 0.83 0.21 0.44 0.29 0.28 1.04 0.44 0.95 0.61 0.06 12.3 17.5 0.97 0.57 0.36 12.1 17.5 0.18 0.18 0.70 0.83 0.40 0.03 0.78 0.06 0.83 0.13 0.21 0.47 0.08 Anhang Tab. 9.4.1.19: Serotonin Serotonin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 2 2 2 2 4 2 3 4 2 4 1 3 3 4 Kontrolle s x 981 830 413 5.47 469 35.6 415 4.28 171 228 207 231 9.21 5.28 21.4 22.2 26.0 17.7 23.4 25.1 33.5 28.6 8.20 9.79 2.55 66.6 98.0 10.1 0.37 n 4 2 1 1 3 3 2 2 4 3 2 2 2 3 4 Zulage 1 s x 981 830 455 18.10 493 322 135 221 198 178 7.51 0.68 44.4 0.48 30.0 15.0 22.4 15.9 37.6 44.3 7.31 2.29 9.35 1.75 14.5 1.28 10.6 1.67 n 4 2 2 3 5 3 2 3 3 1 0 2 2 4 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 981 830 410 2.64 0.13 0.40 0.15 518 52.3 0.58 56.4 38.4 225 127 0.56 0.37 0.34 283 88.0 0.30 0.36 0.41 75.7 69.7 0.76 118 92.8 0.27 34.2 21.4 0.09 0.45 0.95 51.9 0.83 6.50 0.87 7.18 3.04 0.81 0.35 11.1 1.13 0.51 0.43 0.05 12.7 2.13 0.49 0.23 0.40 Serotonin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 2 5 5 5 6 5 4 3 4 4 1 2 2 3 4 Kontrolle s x 925 0.00 276 257 273 269 141 136 96.6 70.6 86.1 77.6 23.5 20.5 26.6 13.9 18.8 5.59 23.4 10.3 17.2 28.9 4.58 38.6 2.01 312 252 236 255 n 2 5 5 5 5 6 5 2 2 2 1 1 3 3 4 Zulage 1 s x 925 0.00 277 255 234 212 250 74.2 111 94.9 62.4 81.5 33.2 50.8 10.6 0.53 10.6 0.42 58.3 67.1 13.0 21.7 118 165 234 206 157 173 - 236 - n 2 4 5 5 5 6 3 4 4 3 2 0 3 3 3 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 925 0.00 177 195 0.84 0.27 0.30 256 261 0.50 0.21 0.59 229 250 0.24 0.25 0.60 97.9 82.5 0.26 0.31 0.37 39.8 40.3 0.27 0.21 0.57 17.0 4.80 0.31 0.01 0.20 18.4 3.63 0.41 0.01 19.0 7.04 0.22 0.93 0.12 17.3 3.71 0.53 0.17 20.1 3.04 141 180 283 196 243 232 0.21 0.48 0.19 0.17 0.69 0.35 0.67 0.38 0.29 Anhang Serotonin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Kontrolle Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 4 4 6 5 5 6 5 5 5 3 5 4 5 5 x 106 32.4 24.0 27.8 24.5 39.6 45.7 44.4 69.9 42.3 23.7 74.3 42.3 77.5 83.2 Zulage 1 s n 59.4 24.4 22.3 22.4 14.8 28.5 23.6 25.1 72.0 28.7 15.6 77.6 28.3 56.7 95.5 6 4 5 4 3 2 3 3 4 3 4 4 6 6 6 x 106 61.8 37.8 95.7 138 274 18.8 262 148 8.98 41.7 40.3 105 120 88.6 Zulage 2 s n 59.4 66.7 55.8 101 212 364 6.95 241 270 6.65 25.0 25.3 94.3 114 73.7 6 4 4 5 4 5 5 5 4 6 6 4 5 4 6 x 106 36.7 57.7 107 60.0 42.8 74.3 77.0 13.1 23.3 29.5 34.7 90.0 107 129 s 59.4 20.6 81.4 73.7 48.3 41.2 83.5 85.4 8.41 12.3 13.8 16.8 104 123 136 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.34 0.39 0.35 0.50 0.16 0.08 0.48 0.02 0.68 0.96 0.43 0.48 0.41 0.34 0.38 0.06 0.22 0.80 0.32 0.33 0.26 0.31 0.48 0.13 0.76 0.43 0.37 0.42 0.83 0.28 0.37 0.61 0.21 0.53 0.43 0.32 0.64 0.30 0.56 0.74 0.18 Serotonin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 146 71.1 94.4 82.8 89.9 65.9 131 58.6 115 53.7 84.9 46.2 92.3 66.4 59.0 53.1 44.6 6.60 62.8 48.7 69.3 79.4 136 150 234 264 79.3 76.0 81.8 75.7 n 6 6 6 6 6 2 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 146 71.1 96.4 65. 7 94.7 68.9 122 55.8 123 55.2 105 14.1 99.8 62.5 42.1 48.3 71.8 62.4 82.5 71.8 34.2 13.7 205 254 118 83.0 81.1 86.8 92.8 68.5 - 237 - n 6 5 6 6 6 4 5 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 146 71.1 157 175 0.83 0.38 0.42 129 127 0.31 0.29 0.35 112 53.5 0.60 0.27 0.14 172 212 0.31 0.46 0.55 63.2 26.0 0.62 0.29 0.16 70.9 37.4 0.66 0.99 0.33 46.2 49.8 0.22 0.35 0.14 186 307 0.33 0.32 0.44 34.9 11.9 0.33 0.21 0.15 64.5 64.5 0.32 0.91 0.26 140 151 0.16 0.44 0.18 93.2 71.8 0.40 0.19 0.60 103 75.2 0.77 0.12 0.17 97.3 71.3 0.13 0.05 0.26 Anhang Serotonin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 Kontrolle s x 73.4 31.0 240 159 179 162 115 77.0 89.0 25.7 65.9 22.0 63.6 15.1 80.7 33.8 93.5 50.3 99.7 81.3 126 136 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 73.4 31.0 217 133 108 110 122 111 139 118 177 80.7 155 96.4 160 70.2 93.2 114 166 114 208 144 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 73.4 31.0 168 117 0.46 0.09 0.19 119 127 0.42 0.27 0.84 192 138 0.91 0.39 0.18 115 101 0.29 0.52 0.70 143 59.3 0.04 0.05 0.25 91.6 73.4 0.06 0.37 0.14 49.8 65.8 0.09 0.04 0.04 43.9 58.3 0.10 0.28 0.19 117 74.0 0.07 0.40 0.04 187 124 0.08 0.19 0.21 Tab. 9.4.1.20 Lysin Lysin in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 6 6 6 5 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 23.7 11.1 16.1 3.0 16.9 2.6 17.3 5.02 22.5 6.38 22.0 4.27 12.3 10.8 20.1 22.0 19.7 27.4 16.3 29.9 14.7 18.7 17.2 34.6 18.9 38.7 37.8 44.3 8.19 6.22 n 4 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 5 6 Zulage 1 s x 23.7 11.1 16.8 1.68 16.3 1.89 26.1 8.38 35.3 15. 8 31.8 9.98 17.3 21.1 20.3 20.8 12.9 16.4 12.4 14.8 16.6 21.3 17.7 34.8 30.8 60.8 8.51 6.22 7.80 6.64 - 238 - n 4 6 6 6 6 5 6 6 6 5 5 6 5 6 6 Zulage 2 s x 23.7 11.1 15.7 2.62 17.9 1.77 27.6 15.4 44.0 25.3 44.3 18.9 26.1 25.9 16.3 22.6 9.60 11.6 5.71 8.28 8.74 14.5 33.0 37.2 29.5 58. 7 7.65 6.40 6.47 5.73 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0.75 0.58 0.02 0.07 0.05 0.23 0.98 0.27 0.67 0.17 0.98 0.26 0.17 0.69 0.80 0.26 0.09 0.02 0.04 0.11 0.78 0.21 0.46 0.42 0.25 0.85 0.18 0.59 0.52 0.10 0.65 0.02 0.04 0.28 0.73 0.15 0.24 0.21 0.33 0.88 0.86 0.66 Anhang Lysin in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 4 4 3 6 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 0.29 0.24 3.71 1.77 3.68 2.37 4.27 2.50 5.99 5.89 5.01 2.41 2.07 1.33 2.24 1.22 2.57 1.51 2.81 1.49 3.14 1.41 2.57 1.82 5.09 2.15 4.59 1.45 4.88 0.89 n 4 5 4 6 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 s x 0.29 0.24 2.69 2.29 2.53 2.52 3.27 3.04 7.87 11.02 2.46 1.36 2.59 1.84 2.45 0.97 2.26 0.91 1.95 1.54 2.22 1.42 2.04 1.53 3.45 1.04 5.82 4.67 4.10 2.59 n 4 4 5 6 6 6 6 6 5 6 6 5 6 5 4 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0.29 0.24 1.93 0.89 0.63 0.26 0.33 2.36 2.72 0.58 0.44 0.15 3.61 3.50 0.18 0.45 0.41 3.94 1.41 0.45 0.42 0.42 3.36 1.75 0.04 0.36 0.39 2.21 1.40 0.50 0.68 0.71 2.32 1.14 0.78 1.00 0.82 1.84 1.45 0.36 0.08 0.46 2.39 1.35 0.04 0.08 0.09 2.53 1.34 0.17 0.24 0.17 2.88 1.62 0.02 0.44 0.02 3.07 2.22 0.20 0.28 0.57 2.44 2.31 0.59 0.06 0.18 4.26 1.28 0.51 0.51 0.71 Lysin in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 4 6 6 6 6 5 6 5 6 5 4 5 6 Kontrolle s x 5.76 5.23 14.7 11.4 13.7 14.9 18.5 16.7 29.7 23.1 16.6 13.8 19.5 14.2 25.1 13.6 27.9 24.4 26.7 13.4 22.9 8.23 15.3 8.52 14.5 10.3 12.5 9.31 12.9 4.99 n 6 5 5 6 6 5 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 5.76 5.23 16.7 13.2 11.5 12.6 25.6 22.3 43.7 30.9 48.2 22.6 47.0 29.4 63.1 5.84 70.0 12.7 57.3 25.9 29.6 22.2 15.0 14.6 17.0 9.77 11.7 10.2 16.5 7.56 - 239 - n 6 6 4 6 5 6 6 6 6 6 6 6 5 4 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 5.76 5.23 16.5 13.0 0.37 0.27 0.31 13.9 14.4 0.67 0.78 0.48 17.2 17.5 0.09 0.63 0.01 32.6 12.5 0.23 0.93 0.68 31.3 14.0 0.04 0.02 0.04 45.9 7.99 0.10 0.01 0.92 44.0 8.29 0.00 0.05 0.00 51.1 10.6 0.00 0.16 0.08 49.9 4.18 0.01 0.01 0.47 24.9 17.8 0.60 0.85 0.06 13.9 12.5 0.73 0.79 0.57 13.6 9.94 0.20 0.40 0.75 16.0 8.74 0.46 0.50 0.76 15.6 6.92 0.03 0.22 0.72 Anhang Lysin in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 6.39 1.38 15.0 7.24 12.0 7.34 25.2 4.01 22.6 4.90 25.6 5.98 20.8 6.96 23.5 12.8 28.5 4.14 28.0 8.60 15.6 10.9 14.9 7.24 19.5 7.98 20.4 7.64 20.0 12.5 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 4 6 6 Zulage 1 s x 6.39 1.38 11.8 5.89 15.7 5.52 29.6 4.11 34.7 7.47 31.4 11.0 32.4 15.6 28.2 20.1 36.7 8.63 32.2 21.5 20.4 12.6 15.2 6.19 21.1 7.98 15.2 6.66 19.7 9.05 n 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 6.39 1.38 13.8 8.14 0.26 0.99 0.44 16.1 6.98 0.15 0.48 0.94 32.4 12.3 0.24 0.31 0.49 34.5 9.89 0.01 0.04 0.96 43.3 3.12 0.07 0.00 0.02 35.4 11.6 0.06 0.04 0.63 29.9 21.2 0.52 0.43 0.26 41.9 10.3 0.09 0.04 0.35 34.4 19.6 0.71 0.41 0.84 25.2 16.8 0.04 0.02 0.06 21.4 12.1 0.93 0.05 0.15 17.0 9.30 0.56 0.56 0.51 17.8 9.91 0.09 0.56 0.41 21.9 15.1 0.88 0.28 0.54 Lysin in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag n 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 6 6 6 6 6 6 6 4 6 6 6 Kontrolle s x 32.6 18.2 20.9 7.52 21.1 10.4 11.4 5.28 17.1 8.06 6.26 3.32 7.23 4.87 11.9 8.40 20.8 14.3 18.8 13.3 17.8 12.1 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 1 s x 32.6 18.2 19.8 9.81 19.4 8.81 12.4 6.08 31.2 20.6 6.51 1.11 15.2 17.3 26.0 19.4 17.0 19.0 32.9 22.3 27.3 19.3 - 240 - n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Zulage 2 p-Werte s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 32.6 18.2 21.8 10.1 0.70 0.60 0.59 25.1 10.3 0.76 0.41 0.02 10.2 4.45 0.76 0.70 0.40 22.2 15.1 0.10 0.19 0.14 7.75 6.07 0.86 0.59 0.58 12.4 13.4 0.29 0.33 0.26 18.4 16.0 0.38 0.92 0.28 12.4 14.2 0.39 0.05 0.06 26.9 18.9 0.03 0.11 0.03 25.6 17.4 0.03 0.04 0.49 Anhang Tab. 9.4.1.21 Aspartat Aspartat in Lauf 2, 3 und 4 (K=K-01, Z1=S-02, Z2=S-04) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle s n x 0 6 2,83 1,65 6 2,99 0,37 6 1,84 0,50 5 3,24 1,81 6 3,37 0,99 5 2,11 0,51 6 2,24 0,57 6 1,91 0,48 6 2,28 0,48 4 2,14 0,36 6 2,86 1,10 5 3,12 1,27 6 2,85 1,36 6 3,12 1,57 Zulage 1 n s x 0 5 2,66 0,94 6 2,78 0,91 6 2,22 0,12 5 2,85 0,76 5 4,01 1,32 6 2,51 0,67 6 4,17 3,62 6 1,94 0,28 6 1,82 0,42 2 3,00 1,13 5 2,99 0,92 5 2,13 0,64 4 3,22 1,18 6 3,50 1,65 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 6 2,85 1,27 0,73 0,97 0,31 4 2,67 1,33 0,67 0,63 0,67 4 2,86 0,92 0,11 0,23 0,26 6 3,51 0,92 0,64 0,92 0,26 5 3,69 1,77 0,08 0,51 0,51 6 3,04 2,05 0,18 0,38 0,52 6 3,64 3,46 0,20 0,31 0,41 6 1,66 0,26 0,83 0,11 0,02 6 2,05 1,23 0,20 0,73 0,70 4 7,09 4,20 0,64 0,11 0,65 6 2,18 0,80 0,52 0,22 0,14 5 2,38 0,62 0,44 0,38 0,52 6 2,96 1,20 0,75 0,69 0,92 5 2,15 0,63 0,11 0,32 0,16 Aspartat in Lauf 5, 6 und 7 (K=K-01, Z1=S-05, Z2=S-07) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 n 2 6 5 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 Kontrolle s x 0,87 0,00 2,21 0,53 1,96 0,51 2,16 0,75 2,02 0,99 1,60 0,43 1,50 0,28 1,53 0,37 1,61 0,33 1,70 0,33 1,68 0,75 1,75 0,43 1,89 0,41 1,69 0,17 1,64 0,42 n 2 6 5 5 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 5 Zulage 1 x 0,87 1,60 1,72 5,02 1,43 1,62 1,17 3,96 1,15 1,13 1,34 1,61 1,78 2,30 1,69 s 0,00 0,75 0,22 5,56 0,78 1,43 0,35 5,22 0,21 0,31 0,42 0,37 0,39 0,91 0,63 - 241 - n 2 6 5 5 6 6 6 6 5 5 6 5 6 5 4 Zulage 2 x 0,87 1,62 2,14 3,19 1,71 2,21 1,79 1,86 1,88 1,84 1,79 1,41 1,87 1,61 1,75 s 0,00 0,46 0,44 1,12 0,35 0,81 0,69 0,43 0,40 0,30 0,43 0,51 0,47 0,26 0,57 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0,06 0,18 0,27 0,24 0,98 0,01 0,32 0,00 0,00 0,28 0,62 0,35 0,17 0,79 0,03 0,55 0,05 0,31 0,20 0,39 0,01 0,25 0,69 0,49 0,02 0,89 0,33 0,49 0,91 0,02 0,47 0,35 0,15 0,06 0,36 0,03 0,04 0,06 0,48 0,59 0,24 0,83 Anhang Aspartat in Lauf 8, 9 und 10 (K=K-01, Z1=S-08, Z2=S-09) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle s n x 0 6 0,72 0,18 4 2,26 1,59 6 2,31 2,24 6 1,75 1,54 6 1,11 0,94 6 1,41 0,59 6 1,79 2,06 6 1,54 0,48 5 1,64 0,76 6 1,37 0,67 4 1,19 0,68 2 0,73 0,45 3 0,25 0,13 4 0,52 0,60 Zulage 1 n s x 0 5 0,81 0,40 4 2,03 1,96 6 1,64 1,10 5 0,73 0,56 5 0,76 0,38 6 1,02 0,71 6 1,19 0,63 5 0,86 0,50 6 1,22 0,48 4 1,26 0,27 4 0,85 0,65 2 0,78 0,18 2 0,72 0,10 4 0,62 0,69 Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 6 0,75 0,33 0,45 0,88 0,91 4 3,68 3,96 0,37 0,39 0,28 6 2,61 1,24 0,27 0,66 0,05 5 1,78 0,72 0,11 0,91 0,08 5 1,51 0,47 0,22 0,32 0,00 6 1,70 1,19 0,11 0,44 0,22 6 1,44 0,22 0,43 0,68 0,43 6 1,01 0,41 0,03 0,08 0,57 6 1,95 1,94 0,39 0,38 0,42 4 2,39 1,58 0,49 0,48 0,25 4 0,82 0,28 0,55 0,35 0,92 2 0,70 0,45 0,93 0,05 0,89 3 0,38 0,39 0,25 0,22 0,69 4 1,59 2,15 0,24 0,37 0,39 Aspartat in Lauf 11, 12 und 13 (K=K-01, Z1=S-10, Z2=S-11) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 n 2 2 2 4 4 4 4 5 6 6 3 6 5 6 6 Kontrolle s x 3,23 4,68 0,00 4,51 0,10 3,85 1,95 3,14 2,26 1,83 1,29 0,42 0,16 1,41 0,43 1,48 0,25 1,04 0,56 0,42 0,29 1,20 1,13 2,88 1,64 2,64 1,70 2,11 1,81 n 2 3 3 4 6 4 3 6 6 5 4 6 4 6 6 Zulage 1 x 3,23 2,85 3,44 3,15 2,99 0,53 0,91 1,39 1,80 0,90 0,34 1,23 3,65 2,10 2,24 s 0,00 2,27 2,88 2,21 2,22 0,21 0,25 0,66 0,68 0,45 0,10 1,17 1,93 2,15 1,84 - 242 - n 2 3 4 4 4 4 4 6 5 3 3 6 6 5 6 Zulage 2 x 3,23 3,57 2,74 2,49 2,36 1,03 0,77 0,81 4,57 0,79 0,32 1,35 2,75 2,86 2,38 s 0,00 2,10 1,67 2,11 2,44 0,52 1,07 0,43 7,29 0,20 0,31 1,23 1,81 1,55 2,20 p-Werte K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0,11 0,14 0,10 0,11 0,10 0,11 0,98 0,35 0,48 0,83 0,89 0,27 0,08 0,55 0,97 0,48 0,06 0,13 0,43 0,56 0,01 0,40 0,12 0,62 0,37 0,29 0,91 0,24 0,20 0,69 0,11 0,00 0,26 0,89 0,05 0,45 0,49 0,99 0,35 0,91 0,33 0,58 Anhang Aspartat in Lauf 16, 17 und 18 (K=K-01, Z1=S-13, Z2=S-12) Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrolle s n x 0 5 0,81 0,68 4 1,69 1,49 6 2,13 1,00 6 2,25 1,04 4 2,16 0,87 6 2,76 1,34 4 2,09 0,83 4 2,65 0,87 6 2,12 1,54 6 2,17 0,66 Zulage 1 n s x 0 4 1,00 0,73 5 0,91 0,86 6 2,46 1,75 6 1,93 1,25 5 2,27 1,64 6 1,77 0,69 3 2,07 1,24 4 1,83 0,96 6 2,29 0,55 6 1,90 0,25 - 243 - Zulage 2 p-Werte n s K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 x 0 5 0,96 1,17 0,23 0,31 0,57 4 1,32 1,42 0,35 0,65 0,31 4 2,97 0,47 0,75 0,24 0,93 6 2,18 0,69 0,24 0,88 0,57 6 2,13 0,69 0,69 0,80 0,91 6 22,68 50,50 0,14 0,38 0,35 4 24,44 44,83 0,93 0,39 0,41 4 2,03 0,56 0,40 0,40 0,48 6 2,06 0,46 0,78 0,93 0,46 6 2,02 0,30 0,48 0,63 0,46 Anhang Graphische Darstellung der Ergbnisse (Einzelsilagen), Werte und Signifikanzen sind den o.a. Tabellen zu entnehmen „Einzeldarstellungen“ Veränderungen der Cysteinkonzentration während der Läufe µmol/L 40 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 30 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 40 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 30 20 10 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag 40 Lauf 16 - 18 30 K-01 20 S-13 10 S-12 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Abb. 9.4.1.1: Cysteingehalte (Werte Tab. 9.4.1.2) in den Läufen 2-4, 8-10 und 16-18, restliche Legende s. u. Konzentration in µmol/L Läufe 2-13 und 16-18 im Pansensaft während 28tägiger Inkubation mit: ____ Heu + KF bzw. K-01 + KF während der Zulagephase _ _ _ Heu + KF bzw. entsprechende Schadsilage 1 (s. Tab. 4.1) + KF während der Zulagephase ------ Heu + KF bzw. entsprechende Schadsilage 2 (s. Tab. 4.1) + KF während der Zulagephase Zulagephase - 244 - Anhang µmol/L Veränderungen der Argininkonzentration während der Läufe 25 20 15 10 5 0 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 µmol/L 0 µmol/L 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 0 µmol/L 8 25 20 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 0 µmol/L 7 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 Abb. 9.4.1.2: Arginingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte 9.4.1.3 ) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 245 - 27 28 Tag Anhang µmol/L Veränderungen der Serinkonzentration während der Läufe 30 Lauf 2 - 4 K-01 20 S-02 10 S-04 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 µmol/L 30 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag µmol/L Lauf 11 - 13 30 K-01 S-10 S-11 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 30 µmol/L 27 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 Abb. 9.4.1.3: Seringehalte in den Läufen 2-4, 8-13 und 16-18, (Werte 9.4.1.4) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 246 - 27 28 Tag Anhang Veränderungen der Aspartatkonzentration während der Läufe µmol/L 8 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 6 4 2 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 8 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 6 4 2 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 8 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 6 4 2 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 8 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 6 4 2 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.4: Aspartatgehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.21) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 247 - 28 Tag Anhang Veränderung der Glutamatkonzentration während der Läufe Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 µmol/L 30 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 30 µmol/L 28 Tag 20 10 0 Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 K-01 S-08 S-09 Lauf 8 - 10 30 µmol/L 28 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 K-01 Lauf 11 - 13 30 µmol/L 28 Tag S-10 20 S-11 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 30 µmol/L 27 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.5: Glutamatgehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.5) - 248 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderung der Threoninkonzentration während der Läufe Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 60 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 60 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 µmol/L Lauf 8 - 10 60 40 K-01 S-08 S-09 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 K-01 S-10 S-11 µmol/L Lauf 11 - 13 60 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Tag µmol/L Lauf 16 - 18 60 K-01 S-13 S-12 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Abb. 9.4.1.6: Threoningehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.7) - 249 - Tag Anhang Veränderung der Glycinkonzentration während der Läufe µmol/L 20 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 µmol/L 20 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 20 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-10 S-11 Lauf 11 - 13 15 10 5 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag 20 Lauf 16 - 18 15 K-01 S-13 S-12 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.7: Glycingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.9) - 250 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderung der Alaninkonzentration während der Läufe 25 20 15 10 5 0 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 µmol/L 0 µmol/L 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 25 20 15 10 5 0 26 27 8 11 12 13 16 17 18 19 20 25 20 15 10 5 0 21 26 27 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 28 Tag K-01 S-10 S-11 Lauf 11 - 13 0 28 Tag K-01 S-08 S-09 Lauf 8 - 10 7 28 Tag K-01 S-05 S-07 Lauf 5 - 7 0 µmol/L 8 25 20 15 10 5 0 0 µmol/L 7 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.8: Alaningehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.11) - 251 - 28 Tag Anhang Veränderungen der Tyrosinkonzentration in den Läufen µmol/L 20 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 20 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-08 S-09 Lauf 8 - 10 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-10 S-11 Lauf 11 - 13 15 10 5 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag 20 Lauf 16 - 18 15 K-01 S-13 S-12 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.9: Tyrosingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.12) - 252 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderungen der Prolinkonzentration während der Läufe Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 60 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 60 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 60 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 60 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 60 40 20 0 0 Abb. 9.4.1.10: 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Prolingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.13) - 253 - Anhang Veränderungen der Valinkonzentration in den Läufen µmol/L 20 K-01 S-02 S-04 Lauf 2 - 4 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-05 S-07 Lauf 5 - 7 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-08 S-09 Lauf 8 - 10 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-10 S-11 Lauf 11 - 13 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 20 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 15 10 5 0 0 Abb. 9.4.1.11: 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Valingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.15) - 254 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderungen der Phenylalaninkonzentration 25 20 15 10 5 0 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 µmol/L 0 µmol/L 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 28 Tag 27 Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 0 µmol/L 8 25 20 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 25 20 15 10 5 0 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 0 µmol/L 7 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 25 20 15 10 5 0 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 0 7 Abb. 9.4.1.12: 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Phenylalaningehalte, Läufe 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.16) - 255 - Anhang µmol/L Veränderung der Isoleucinkonzentration während der Läufe 10 8 6 4 2 0 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 µmol/L 0 µmol/L 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 10 8 6 4 2 0 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 10 8 6 4 2 0 27 28 Tag Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 0 µmol/L 7 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 10 8 6 4 2 0 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 Abb. 9.4.1.13: Isoleucingehalte in den Läufen 2-13, (Werte Tab. 9.4.1.17) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 256 - 27 28 Tag Anhang Veränderungen der Leucinkonzentration während der Läufe µmol/L 15 Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 µmol/L 15 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 10 S-05 5 S-07 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 µmol/L 15 21 26 27 28 Tag K-01 S-08 S-09 Lauf 8 - 10 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 15 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 15 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 10 5 0 0 7 Abb. 9.4.1.14: 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Leucingehalte in den Läufen 2-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.18) - 257 - Anhang Veränderungen der Lysinkonzentration während der Läufe K-01 S-02 S-04 µmol/L Lauf 2 - 4 60 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag µmol/L Lauf 8 - 10 60 K-01 S-08 S-09 40 20 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 60 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag µmol/L Lauf 16 - 18 60 K-01 S-13 S-12 40 20 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.15: Lysingehalte in den Läufen 2-4, 8-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.20) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 258 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderung der GABA-Konzentration während der Läufe Lauf 2 - 4 40 K-01 S-02 S-04 30 20 10 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 5 - 7 K-01 S-05 S-07 40 30 20 10 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 8 - 10 40 K-01 30 S-08 20 S-09 10 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 40 30 20 10 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 Abb. 9.4.1.16: GABA-Gehalte in den Läufen 2-13, (Werte Tab. 9.4.1.14) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 259 - 26 27 28 Tag Anhang Veränderungen der Indolessigsäurekonzentration während der Läufe Abb. 9.4.1.17: Indolessigsäuregehalte in den Läufen 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.1) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. Veränderung der Citrullinkonzentration während der Läufe Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 µmol/L 15 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 µmol/L 15 27 28 Tag Lauf 16 - 18 K-01 S-13 S-12 10 5 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.18: Citrullingehalte in den Läufen 11-13 und 16-18, (Werte Tab. 9.4.1.6) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 260 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderung der Histaminkonzentration während der Läufe Lauf 2 - 4 K-01 S-02 S-04 150 100 50 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag µmol/L Lauf 8 - 10 150 K-01 S-08 S-09 100 50 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 11 - 13 K-01 S-10 S-11 150 100 50 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.19: Histamingehalt in den Läufen 2-4 und 8-13, (Werte Tab. 9.4.1.8) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 261 - 28 Tag Anhang µmol/L Veränderung der Agmatinkonzentration während der Läufe Lauf 8 - 10 K-01 S-08 S-09 60 50 40 30 20 10 0 µmol/L 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag Lauf 11 - 13 60 50 40 30 20 10 0 K-01 S-10 S-11 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 Abb. 9.4.1.20: Agmatingehalte in den Läufen 8 – 13, (Werte Tab. 9.4.1.10) restliche Legende s. Abb. 9.4.1.1. - 262 - 27 28 Tag Anhang Veränderung der Serotoninkonzentration während d. Läufe K-01 S-02 S-04 µmol/L Lauf 2 - 4 400 200 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 K-01 S-05 S-07 µmol/L Lauf 5 - 7 400 200 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 28 Tag 27 K-01 S-08 S-09 µmol/L Lauf 8 - 10 400 200 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-10 S-11 µmol/L Lauf 11 - 13 400 200 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Tag K-01 S-13 S-12 µmol/L Lauf 16 - 18 400 200 0 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 Abb. 9.4.1.21: Serotoningehalte in den Läufen 2-13 und 16-18 (Werte Tab. 9.4.1.19) - 263 - 28 Tag Anhang 9.4.2 Vergleich der mittleren Konzentrationen von Kontroll- und Schadsilagen (in µmol/L) als prozentuale Differenzberechnung (mit Standardabweichung s und p-Wert) Tab. 9.4.2.1: Cystein: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 19 22.4 18.5 28 12.4 15.5 -44.4 0.59 7 33 1.71 2.23 39 1.15 1.27 -32.5 0.68 8 32 1.00 0.86 43 0.61 0.62 -38.9 0.62 11 36 4.45 6.77 46 3.60 5.04 -19.1 0.33 12 39 1.69 2.29 46 4.16 5.63 146 0.02 13 40 2.83 2.93 48 4.74 5.18 67.2 0.18 16 36 1.68 1.80 53 3.74 5.50 122 0.05 17 34 1.82 2.09 48 4.03 4.52 122 0.01 18 40 2.56 3.30 51 4.16 4.05 86.4 0.01 19 33 4.04 7.63 43 3.85 6.86 -4.59 0.93 20 35 1.57 1.93 43 1.14 1.21 -27.5 0.79 21 35 1.20 1.47 45 1.75 1.72 46.7 0.02 26 32 0.85 0.75 42 1.58 2.57 85.3 0.12 27 38 1.00 0.87 42 0.54 0.23 -45.9 0.65 28 35 0.48 0.23 45 0.55 0.38 13.6 0.08 Tab. 9.4.2.2: Arginin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage x n s 0 22 20.0 20.8 7 41 2.11 1.04 8 38 2.29 1.14 11 42 3.50 1.63 12 43 3.00 1.90 13 42 2.95 1.45 16 41 2.48 1.94 17 42 3.26 2.20 18 42 3.19 2.01 19 42 2.68 1.92 20 43 2.67 1.65 21 42 2.52 1.97 26 44 2.24 1.48 27 44 2.67 1.67 28 44 2.49 2.03 Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x n Differenz s 20 58 60 60 59 60 56 64 63 58 60 60 57 58 59 1.01 2.49 2.54 3.89 4.21 3.88 5.10 7.06 6.04 4.04 4.37 4.23 4.17 3.78 4.66 - 264 - 0.32 0.56 0.88 1.71 1.88 1.76 4.67 6.82 2.72 1.65 1.36 0.93 1.23 0.70 0.63 -94.9 17.8 10.9 11.1 40.1 31.4 105 117 89.3 50.5 63.7 68.2 86.5 41.5 87.7 0.07 0.24 0.09 0.63 0.63 0.16 0.05 0.01 0.82 0.11 0.53 0.06 0.78 0.09 Anhang Tab. 9.4.2.3: Serin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 12 33 28 36 32 34 31 29 30 27 28 31 31 32 29 5.26 10.8 13.5 18.9 22.7 18.5 10.0 8.91 18.8 16.7 12.1 7.02 7.38 7.99 9.84 4.07 7.49 9.36 16.44 20.0 13.5 10.2 6.91 11.6 12.7 10.1 4.39 4.62 4.12 6.04 Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x n Differenz s 12 38 38 45 32 39 36 35 32 35 36 30 42 38 38 0.82 5.81 6.34 9.08 9.57 12.4 7.67 7.16 7.99 7.35 7.50 4.95 4.83 5.75 5.46 0.62 3.25 3.29 7.64 9.56 11.4 6.80 8.50 7.59 6.57 7.70 4.19 3.75 4.25 2.97 -84.3 -46.1 -53.2 -51.9 -57.8 -32.9 -23.3 -19.6 -57.5 -56.0 -37.8 -29.6 -34.6 -28.0 -44.5 0.73 0.22 0.26 0.13 0.01 0.48 0.01 0.12 0.11 0.06 0.05 0.27 0.17 0.88 0.18 Tab. 9.4.2.4: Aspartat: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 10 0.92 1.33 8 2.05 1.36 122 0.41 7 39 2.36 1.27 53 1.87 1.03 -20.7 0.97 8 35 2.83 0.98 48 2.34 0.89 -17.3 0.25 11 41 2.94 1.32 54 2.86 0.89 -2.6 0.67 12 41 3.16 1.17 49 2.15 0.82 -32.0 0.29 13 40 2.63 1.54 55 1.98 1.16 -24.7 0.56 16 40 1.59 0.76 59 3.74 6.70 136 0.95 17 40 1.48 0.67 58 4.50 7.11 204 0.09 18 42 2.17 0.89 57 1.87 1.03 -13.9 0.49 19 40 2.27 1.07 55 1.61 0.54 -29.2 0.50 20 36 1.25 0.76 49 2.14 1.93 71.9 0.14 21 39 1.19 1.05 58 1.55 0.72 30.2 0.31 26 35 1.35 1.27 52 2.01 0.98 48.7 0.49 27 38 1.26 1.30 51 2.02 1.05 59.9 0.51 28 40 1.18 1.15 56 1.99 0.82 68.0 0.85 - 265 - Anhang Tab. 9.4.2.5: Glutamat: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 28 12.0 11.2 44 16.6 11.5 38.3 0.58 7 42 8.46 3.03 59 7.26 3.46 -14.1 0.46 8 39 9.30 3.42 60 7.92 3.87 -14.9 0.10 11 42 7.95 2.49 60 7.43 3.97 -6.5 0.06 12 42 5.65 1.87 60 4.45 0.90 -21.3 0.60 13 41 5.86 2.37 60 4.51 1.40 -23.0 0.20 16 41 4.13 1.65 60 4.04 1.35 -2.18 0.81 17 40 4.51 2.20 60 4.48 1.70 -0.57 0.05 18 42 5.83 1.84 60 4.60 1.30 -21.2 0.98 19 42 6.28 2.62 57 5.42 2.18 -13.7 0.64 20 42 4.68 2.00 60 4.31 1.94 -7.86 0.05 21 42 4.68 2.24 60 5.47 2.39 16.9 0.45 26 42 4.33 2.39 60 6.72 2.74 55.2 0.37 27 42 4.81 3.20 57 7.61 3.12 58.2 0.38 28 42 4.12 1.95 60 5.78 2.12 40.4 0.59 Tab. 9.4.2.6: Threonin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 36 20.0 16.8 48 19.3 20.9 -3.55 0.34 7 42 39.3 18.7 60 24.7 8.66 -37.1 0.69 8 42 41.8 24.6 60 22.3 9.65 -46.5 0.02 11 42 35.3 15.4 58 23.0 9.52 -34.8 0.82 12 42 27.9 9.92 60 24.7 9.67 -11.7 0.42 13 42 32.4 11.4 59 24.4 8.71 -24.9 0.18 16 41 31.4 15.6 60 24.7 11.4 -21.29 0.22 17 41 32.0 10.2 60 25.5 6.71 -20.32 0.26 18 42 35.2 13.1 60 26.1 7.33 -25.9 0.30 19 42 42.1 17.2 59 27.5 13.6 -34.7 0.27 20 42 34.6 12.9 60 27.2 12.9 -21.4 0.90 21 41 35.0 13.2 60 24.2 10.6 -30.8 0.43 26 42 38.4 11.9 56 29.5 9.51 -23.1 0.50 27 42 40.0 10.8 59 27.3 9.08 -31.6 0.22 28 42 42.2 15.1 60 30.9 12.0 -26.8 0.47 - 266 - Anhang Tab. 9.4.2.7: Glycin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 22 2.31 1.33 32 1.50 1.15 -34.9 0.72 7 38 5.91 1.66 50 4.86 0.87 -17.9 0.07 8 37 5.53 2.55 50 4.02 1.71 -27.2 0.08 11 38 8.69 3.39 48 7.36 3.07 -15.4 0.98 12 37 9.34 2.78 49 7.85 2.47 -16.0 0.02 13 40 9.59 4.05 52 7.33 1.44 -23.5 0.04 16 37 8.99 2.43 54 9.05 2.28 0.64 0.19 17 38 8.57 2.21 59 9.62 4.20 12.3 0.31 18 39 8.24 3.95 59 8.02 2.02 -2.71 0.85 19 33 9.43 2.07 48 7.53 2.68 -20.1 0.72 20 42 7.70 2.23 55 6.00 1.83 -22.0 0.01 21 42 6.01 1.81 56 5.47 1.37 -8.96 0.40 26 39 4.86 2.36 47 4.14 3.01 -14.8 0.63 27 36 5.41 2.94 35 4.42 2.18 -18.2 0.06 28 37 6.15 1.85 49 5.83 1.54 -5.20 0.84 Tab. 9.4.2.8: Alanin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 32 4.32 1.97 40 4.04 2.41 -6.60 0.13 7 42 12.3 5.23 60 12.7 9.50 3.42 0.26 8 42 10.0 3.40 60 11.0 3.81 10.1 0.56 11 41 10.8 4.92 60 11.7 5.57 8.38 0.65 12 42 10.9 4.16 60 8.85 3.69 -18.7 0.01 13 42 10.4 5.76 60 8.24 4.04 -20.5 16 41 9.88 5.88 60 21.2 40.5 115 0.25 17 40 9.53 4.01 60 26.0 49.8 173 0.20 18 42 11.8 3.96 60 8.23 2.88 -30.4 0.01 19 42 10.6 4.55 58 8.10 3.86 -23.4 0.30 20 42 8.04 3.41 60 6.92 3.44 -14.0 0.11 21 42 9.21 4.30 60 7.29 3.20 -20.8 0.17 26 42 8.76 2.94 57 9.11 5.36 3.96 0.80 27 42 10.2 3.07 57 8.71 4.90 -14.3 0.44 28 42 10.4 4.25 60 10.1 6.27 -3.08 0.31 - 267 - Anhang Tab. 9.4.2.9: Tyrosin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 32 29 23 32 32 30 33 33 37 37 31 30 31 32 30 6.42 14.4 16.9 11.6 21.3 13.4 6.62 8.57 5.10 6.44 4.08 10.6 13.1 13.1 12.2 5.47 12.8 13.4 9.5 19.0 13.9 6.15 6.38 4.87 7.36 4.32 7.82 7.63 7.24 9.76 Schadsilagezulage x n s 40 26 29 42 39 41 41 50 52 46 41 37 36 37 37 5.17 5.29 6.89 5.77 5.98 3.29 4.17 2.99 3.71 2.76 5.26 5.47 8.07 7.34 5.52 6.48 6.46 7.99 6.47 5.39 3.47 3.81 2.42 2.42 2.33 3.38 5.19 6.16 5.54 5.20 prozentuale p-Wert Differenz -19.5 -63.2 -59.2 -50.4 -71.9 -75.5 -37.0 -65.1 -27.3 -57.1 28.7 -48.3 -38.4 -44.1 -54.7 0.04 0.73 0.09 0.76 0.95 0.01 0.73 0.01 0.10 0.29 0.10 0.18 0.28 Tab. 9.4.2.10: Prolin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 38 42 42 42 42 42 42 41 42 41 42 42 42 42 42 8.01 8.27 9.27 16.5 20.7 20.1 37.1 37.0 51.5 48.0 41.4 26.5 27.9 24.7 29.1 4.26 2.88 4.40 7.33 12.7 8.04 21.6 19.0 34.4 35.0 26.5 16.7 20.8 16.9 20.2 Schadsilagezulage x n s 52 58 60 60 60 60 60 60 60 58 60 60 60 59 60 - 268 - 9.69 11.3 12.0 18.1 20.1 19.7 24.8 24.7 23.6 26.2 23.2 13.6 12.1 12.9 13.7 4.45 4.07 6.51 10.1 13.2 12.9 16.1 9.29 11.8 16.5 16.8 3.17 2.72 2.00 1.61 prozentuale p-Wert Differenz 21.0 36.2 29.6 10.0 -2.90 -2.33 -33.1 -33.3 -54.3 -45.5 -44.0 -48.6 -56.5 -48.0 -53.0 0.35 0.05 0.42 0.41 0.88 0.66 0.50 0.91 0.04 0.74 0.73 0.39 0.93 0.36 0.31 Anhang Tab. 9.4.2.11: Valin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 30 32 33 31 33 36 34 39 42 34 38 41 29 29 35 7.27 10.2 7.12 4.83 4.22 4.45 2.83 5.91 2.89 4.20 3.94 4.95 5.55 5.57 5.28 4.98 13.1 2.29 3.17 4.83 5.74 2.82 9.83 2.21 2.79 2.12 1.49 1.14 1.75 2.27 Schadsilagezulage x n s 36 50 50 55 55 55 55 55 54 50 47 49 41 43 52 3.77 9.41 5.30 8.61 5.49 5.12 5.66 6.78 16.5 6.08 4.51 4.66 5.27 5.03 4.28 1.51 8.53 2.03 12.3 4.26 3.61 4.57 6.76 37.7 4.78 2.77 1.73 1.13 1.68 1.92 prozentuale p-Wert Differenz -48.1 -7.43 -25.5 78.3 30.2 15.1 100 14.7 472 45.0 14.4 -5.89 -4.99 -9.58 -19.0 0.01 0.75 0.18 0.23 0.63 0.54 0.28 0.46 0.12 0.07 0.19 0.89 0.76 0.47 0.75 Tab. 9.4.2.12: Phenylalanin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 26 34 36 42 42 39 35 38 41 38 39 34 33 35 30 82.3 5.33 6.27 6.89 6.35 7.99 7.59 8.90 9.57 8.55 7.95 7.80 7.11 7.13 8.76 49.4 2.23 3.30 1.80 3.52 5.94 3.69 2.15 5.52 4.17 3.41 3.38 1.99 2.07 1.51 Schadsilagezulage x n s 28 43 49 60 56 59 51 57 59 53 53 49 42 44 47 - 269 - 44.1 2.58 4.81 5.04 6.69 7.52 5.08 4.32 5.57 5.14 5.29 3.20 2.66 2.63 3.17 60.9 3.41 3.91 4.72 2.82 4.70 6.92 7.03 8.98 7.61 5.89 6.45 7.79 7.04 6.91 prozentuale p-Wert Differenz -46.5 -51.6 -23.3 -26.9 5.30 -5.85 -33.1 -51.5 -41.8 -39.9 -33.5 -58.9 -62.5 -63.1 -63.9 0.82 0.07 0.40 0.01 0.93 0.09 0.87 0.23 0.78 0.78 0.06 0.86 0.65 0.19 Anhang Tab. 9.4.2.13: Isoleucin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 16 20 18 33 28 27 31 28 31 25 21 24 18 22 19 28.9 1.03 0.79 0.84 1.43 0.93 1.07 0.82 0.50 0.57 0.35 0.42 0.29 0.49 1.43 38.6 0.70 1.06 0.57 1.74 0.57 0.99 0.90 0.12 0.20 0.17 0.15 0.17 0.28 2.11 Schadsilagezulage x n s 32 41 41 50 51 46 53 50 54 46 48 42 33 31 39 28.9 0.97 0.79 1.72 2.05 2.26 1.61 2.07 1.46 1.32 0.65 0.36 0.35 0.73 0.46 36.4 1.01 0.79 2.44 2.86 2.60 1.72 3.15 1.66 2.32 0.65 0.13 0.13 1.05 0.31 prozentuale p-Wert Differenz 0.00 -5.31 -0.08 103 43.2 144 50.0 153 191 130 85.7 -14.5 18.2 49.3 -68.1 1,00 0.77 0.39 0.02 0.32 0.01 0.13 0.07 0.01 0.25 0.55 0.45 0.07 0.77 0.03 Tab. 9.4.2.14: Leucin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 30 37 33 41 40 36 38 39 41 40 39 39 36 39 38 3.96 0.95 1.02 1.29 0.90 1.48 0.91 1.31 1.35 1.48 0.57 1.31 1.21 1.07 0.58 1.93 0.48 0.60 0.40 0.61 1.32 0.49 0.79 0.81 0.96 0.26 1.73 1.77 1.52 0.24 Schadsilagezulage x n s 36 49 46 56 52 47 52 57 53 52 57 53 52 49 53 - 270 - 3.52 0.74 0.81 1.40 2.09 1.54 1.12 2.13 1.26 1.12 1.45 2.70 1.45 2.20 0.52 2.28 0.65 0.69 0.87 1.77 1.18 0.64 2.38 1.14 1.02 1.46 3.80 1.61 2.38 0.24 prozentuale p-Wert Differenz -11.1 -21.4 -20.8 8.28 131 3.99 23.9 63.2 -6.71 -24.4 154 106 19.6 106 -9.73 0.04 0.23 0.46 0.20 0.03 0.91 0.98 0.04 0.50 0.01 0.68 0.04 0.11 0.12 0.11 Anhang Tab. 9.4.2.15: Lysin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 38 42 39 42 42 42 42 40 42 42 42 42 42 42 42 13.4 22.6 23.9 35.6 43.0 34.3 26.2 25.4 33.8 34.3 16.6 15.5 14.0 15.5 13.9 10.4 12.9 15.3 30.7 36.6 28.0 23.3 17.2 23.1 25.0 7.37 6.30 5.60 10.9 5.93 Schadsilagezulage x n s 52 58 58 60 60 60 60 60 60 59 60 60 58 59 60 13.7 13.7 14.1 18.8 29.0 25.0 23.6 25.1 25.6 25.6 18.3 15.1 16.9 10.6 12.0 12.9 6.62 7.10 10.9 13.7 18.2 16.3 18.3 23.1 19.5 10.3 9.90 10.4 5.43 7.19 prozentuale p-Wert Differenz 2.12 -39.3 -41.3 -47.2 -32.6 -27.1 -9.88 -1.18 -24.3 -25.4 10.5 -2.51 21.0 -31.3 -13.4 0.09 0.40 0.20 0.12 0.80 0.67 0.02 0.01 0.02 0.01 0.01 0.06 0.55 0.05 0.59 Tab. 9.4.2.16: GABA: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 26 36 30 32 29 28 31 31 34 35 29 38 32 27 30 7.51 0.92 0.72 3.33 1.14 3.14 1.73 1.61 2.31 1.91 2.58 1.29 1.47 1.00 1.24 14.5 0.93 0.91 1.32 1.40 4.88 1.66 1.91 3.24 2.50 3.29 1.59 1.34 1.03 1.64 Schadsilagezulage x n s 28 36 32 45 46 44 48 45 45 50 46 43 38 37 39 - 271 - 11.9 1.07 1.11 7.90 3.26 12.2 6.07 9.03 11.9 7.26 2.91 1.37 1.43 1.86 2.22 17.6 0.84 1.14 3.68 1.50 17.0 5.14 8.67 13.2 5.61 3.35 1.15 1.18 1.90 1.97 prozentuale p-Wert Differenz 59.0 17.3 55.2 137 186 289 251 462 414 281 12.6 6.50 -2.99 86.6 78.3 0.18 0.50 0.01 0.02 0.05 0.01 0.07 0.88 0.01 0.07 0.53 0.66 0.50 0.01 0.20 Anhang Biogene Amine Tab. 9.4.2.17: IAA: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag Kontrollsilagezulage Schadsilagezulage prozentuale p-Wert x x n n Differenz s s 0 7 8 11 3 10,3 0,74 5 5,16 9,86 -49,7 12 3 12,1 1,05 3 3,77 10,3 -68,9 13 4 9,37 1,91 2 3,43 1,54 -63,4 16 3 5,62 0,97 3 3,66 11,6 -34,8 17 2 6,91 0,61 3 4,80 0,24 -30,5 18 4 8,12 1,86 1 8,73 7,49 19 4 6,80 3,66 4 6,14 33,7 -9,78 20 4 5,57 2,73 3 4,10 29,3 -26,4 21 1 4,23 2 3,05 0,22 -27,9 26 1 4,75 4 3,08 8,24 -35,1 27 1 5,04 4 3,86 8,33 -23,5 28 1 4,27 2 3,67 8,01 -14,1 Tab. 9.4.2.18: Citrullin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 10 20 20 24 22 18 21 23 24 24 26 26 26 26 24 1.00 2.51 2.56 3.50 4.17 3.67 5.46 5.73 5.51 4.67 4.43 5.02 6.03 5.93 7.01 1.46 1.37 2.77 2.18 2.16 2.46 2.46 2.26 2.32 2.39 2.95 4.40 4.13 3.56 Schadsilagezulage x n s 8 20 19 26 23 20 18 24 24 26 32 28 28 27 27 - 272 - 1.00 2.75 3.19 4.09 6.23 3.94 3.09 3.50 5.18 3.12 2.62 2.14 1.87 1.40 3.21 0.04 1.71 1.30 1.34 5.53 1.44 1.37 1.40 1.88 1.36 0.95 1.00 0.51 0.41 1.96 prozentuale p-Wert Differenz 0.00 9.76 24.4 16.9 49.6 7.43 -43.4 -38.9 -6.0 -33.2 -40.7 -57.3 -68.9 -76.4 -54.3 0.01 0.01 0.01 0.01 0.72 0.01 0.03 0.01 0.34 0.04 0.01 0.45 0.28 0.21 0.40 Anhang Tab. 9.4.2.19: Histamin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 18 19 17 20 20 16 18 21 29 27 21 23 23 18 22 60.7 16.9 12.6 13.4 13.6 11.1 13.8 7.31 4.05 3.59 19.0 14.9 17.7 28.1 31.2 92.7 14.7 11.3 13.9 10.4 10.4 19.8 10.9 1.16 1.90 27.6 27.4 23.7 20.2 56.2 Schadsilagezulage x n s 36 31 37 44 43 37 44 43 46 39 42 42 36 37 35 60.7 9.45 11.8 15.9 10.5 6.39 5.83 7.26 10.9 8.01 27.6 11.5 21.0 25.7 32.5 87.4 11.8 10.0 14.7 6.98 3.52 2.20 3.21 11.2 7.51 46.6 16.4 29.5 13.0 17.4 prozentuale p-Wert Differenz 0.00 -44.1 -6.61 18.7 -22.7 -42.5 -57.8 -0.71 170 123 45.4 -22.9 18.7 -8.64 4.15 1.00 0.02 0.63 0.31 0.07 0.09 0.01 0.12 0.02 0.05 0.67 0.39 0.14 0.73 0.37 Tab. 9.4.2.20: Agmatin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 8 7 5 5 4 2 5 3 4 3 3 3 6 11 13 3.64 9.14 13.5 11.6 28.0 25.2 8.84 20.8 0.69 42.1 14.9 1.01 6.32 6.69 7.12 1.14 12.0 3.92 11.6 2.67 7.97 29.0 19.2 8.68 8.01 8.56 Schadsilagezulage x n s 16 12 17 16 12 4 5 9 9 8 12 7 13 25 18 - 273 - 3.64 12.0 9.46 13.7 19.2 24.9 13.8 0.82 1.64 29.8 20.2 0.19 8.92 7.90 7.67 1.02 12.0 7.29 9.86 10.3 1.54 11.6 0.24 33.7 29.3 0.22 8.24 8.33 8.01 prozentuale p-Wert Differenz 0.00 31.3 -30.0 17.7 -31.6 -1.27 55.9 -96.1 139 -29.3 35.8 -81.5 41.2 18.0 7.77 1.00 0.32 0.06 0.70 0.14 0.31 0.47 0.03 0.16 0.14 0.67 0.52 0.78 0.10 Anhang Tab. 9.4.2.21: Serotonin: prozentuale Differenzberechnung aller Kontroll- und Schadsilagen Tag 0 7 8 11 12 13 16 17 18 19 20 21 26 27 28 Kontrollsilagezulage x n s 36 35 35 37 39 36 37 36 39 36 34 32 35 37 39 369 161 159 142 92.9 96.6 63.6 52.2 57.1 60.1 148 258 356 397 362 366 134 147 117 43.2 53.6 40.4 24.3 30.3 35.1 137 250 354 344 330 Schadsilagezulage x n s 48 46 46 48 51 45 44 46 48 43 42 39 46 50 55 446 437 206 140 205 173 161 83.6 131 44.2 139 91.7 64.4 45.9 82.9 77.7 64.9 60.2 58.2 50.4 112 148.7 65.1 76.9 85.2 50.1 106 75.7 109 86.6 prozentuale p-Wert Differenz 20.8 27.9 28.5 13.2 41.5 43.7 1.19 58.7 13.6 -3.15 -24.3 -74.8 -76.1 -73.2 -69.9 0.50 0.66 0.52 0.54 0.01 0.41 0.09 0.01 0.06 0.01 0.47 0.99 0.01 0.01 0.03 9.5 GABA-Versuche 9.5.1 Kurzversuch RUSITEC Da die in der Literatur angegebenen Informationen z.T. widersprüchlich bezüglich des möglichen Abbaus von GABA im Pansen sind, wurde ein Kurzversuch mit eben dieser Fragestellung durchgeführt. In einem RUSITEC-Lauf mit Kontrollsilagefermentation (K-01) wurden GABA-Mengen von 0 – 20 g/Fermenter (K=0 g, Z10=10 g, Z20=20 g) zugelegt (Reinsubstanz, γ-Aminobutyric acid dihydrochloride, Art. A 5835, Sigma®, St. Louis, MO, USA) und nach 23 h Inkubation Proben aus diesen Fermentern entnommen. Zu Beginn des Versuches konnte GABA nicht nachgewiesen werden (Tag 0), nach Zulage und 23 stündiger Inkubation konnten unter Z20-Zulage 19,1 µmol/L, unter Z10-Zulage noch 2,14 µmol/L detektiert werden. In der Kontrolle (K) wurde GABA in Spuren (max. 0,002 µmol/l) nachgewiesen. Am Versuchsende (nach 48 Stunden Inkubation) wurden in allen Fermentern lediglich geringste GABA Spuren detektiert (max. 0,12 µmol/L). Die Ergebnisse sollen in der folgenden Tabelle (Tab. 9.5.1), sowie der Abbildung 9.5.1 dargestellt werden. - 274 - Anhang Tab. 9.5.1: mittlere GABA-Konzentration (in µmol/L) in der Fermenterflüssigkeit während eines 4tägigen RUSITEC-Laufs bei Zulage unterschiedlicher GABAMengen (K=0 g, Z1=10 g, Z2=20 g) Kontrolle Tag n 0 1 2 3 4 1 2 2 2 2 x 0,00 0,00 0,09 0,04 0,09 s 0,00 0,00 0,10 0,01 0,10 Zulage 1 n 2 2 2 2 x 0,00 0,00 2,14 0,12 0,12 Zulage 2 n s 0,00 0,00 1,38 0,03 0,03 2 2 2 2 x 0,00 0,00 19,1 0,07 0,00 s p-Wert K/Z1 K/Z2 Z1/Z2 0,00 0,00 1,28 0,17 0,00 0,10 0,06 0,71 0,00 0,71 0,31 0,01 0,55 0,03 Im eingesetzten Inokulat des Spendertieres konnte GABA nicht nachgewiesen werden (Tag 0). An Tag 2 (23 h nach GABA-Zulage) ist die Konzentration bei den mit GABA-Zulage beladenen Fermentern deutlich höher, im Vergleich zur Kontrolle. Bei Z1 können Gehalte von 19,1 µmol/L erfasst werden, bei Z1 immerhin 2,14 µmol/L. Doch auch in der Kontrolle ohne GABA-Zulage wurden Spuren gefunden. An den letzten beiden Versuchstagen konnten ebenfalls nur Spuren detektiert werden (max. 0,12 µmol/L). Obwohl dieser Kurzversuch aufgrund seiner begrenzten Anzahl an Wiederholungen (n = 2) sicherlich nur über eine begrenzte statistische Aussagekraft verfügt, liefert er dennoch wichtige Hinweise auf die in vitro-Abbaumechanismen von GABA. Abb. 9.5.1: 9.5.2 graphische Darstellung der mittleren GABA-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit während eines 4tägigen RUSITEC-Laufs, bei Zulage unterschiedlicher GABA-Mengen (K1=0 g, Z1=10 g, Z2=20 g) Grasversuche Eine weitere wichtige Frage, die bisher nur unzureichend geklärt werden konnte, ist die Herkunft von GABA und hierbei insbesondere die Beeinflussungsmöglichkeiten durch bestimmte Produktionstechniken. - 275 - Anhang Zu diesem Zweck wurden wiederum verschiedene Grasversuche durchgeführt, mit dem Ziel die Auswirkungen verschiedenster Bedingungen, insbesondere in der Anwelkphase, auf den GABA-Gehalt aufzuzeigen. Das Gras (handelsübliche Mähweide) wurde unter definierten Bedingungen angesät, unter speziellen Neonröhren (Osram L Biolux 58W/965) 30 Tage aufgezogen und anschließend geschnitten. Bei den Versuchen wurden circadiane Rhythmik, Einfluss von Düngemitteln, sowie verschiedene Anwelkbedingungen die, auch unter üblichen Bedingungen vorkommen können, getestet. Die verschiedenen Anwelkbedingungen wurden in drei aufeinander folgenden Versuchen getestet, wobei das Gras bei Versuch II und III exakt gleichen Bedingungen unterworfen wurde. Dabei wurden die Gräser wie folgt behandelt: - A: Sofortige Vermessung nach dem Schnitt B: Schnitt bei Licht, 4h Anwelken bei 35 – 45°C unter der Glühlampe C: Schnitt bei Dunkelheit, 4h Anwelken bei 22°C im Dunkeln D: Schnitt bei Dunkelheit, 4h Anwelken bei 13 - 15°C im Dunkeln E: Schnitt feucht, bei Dunkelheit, 4h feucht Anwelken bei 13 - 15°C im Dunkeln F: Schnitt bei Licht, 4h Anwelken unter Tageslichtlampe (40°C, Heizplatte) G Schnitt bei Licht, 4h Anwelken bei 22°C und Tageslicht (Fenster) Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (Tab. 9.5.2) dargestellt. Tab. 9.5.2: GABA-Gehalte in g/kg TS im Gras nach unterschiedlichen Behandlungen Behandlung Versuch II Versuch III Mittelwert A 0,05 0,14 0,10 B 2,82 0,02 1,42 C 0,18 3,36 1,77 D 0,57 0,21 0,39 E 1,22 0,36 0,79 F 1,25 2,40 1,83 G 1,29 0,68 0,99 - 276 - Danksagung 10. Danksagung Herrn Univ.-Prof. Dr. H. Bollwein danke ich für die Überlassung des Themas und die Unterstützung und Beratung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Herrn Dr. M. Höltershinken danke ich für die Betreuung. Ich danke meinen Kolleginnen Frau Dr. N. Gresner, Frau TÄ L. Lumpp und Frau Dr. A. Gast für die Durchführung der RUSITEC-Versuche, die als Grundlage dieser Arbeit dienten, sowie Frau TÄ A. Wichern, Frau TÄ A. Irle und Frau Dipl. Chem. S. Özmen für die jederzeit gute und fruchtbare Zusammenarbeit. Bedanken möchte ich mich auch ganz besonders bei Frau E. Cyrol für ihre Hilfe bei der Probenaufbereitung und –messung, sowie der Lösung kleinerer technischer Probleme. Mein Dank gilt auch Herrn J. Senkpiel für seine unkomplizierte und freundliche Art bei der Lösung von technischen Problemen. Den Mitarbeitern des Instituts für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule, sowie der Evonik Degussa AminoLab danke ich für das Erstellen der Futtermittelanalysen. Herrn Dipl.-Math. H. Geerlings danke ich für seine Unterstützung bei der statistischen Auswertung der Untersuchungsergebnisse. Bei der LVM-Versicherung bedanke ich mich herzlich für die gewährte finanzielle Unterstützung. An dieser Stelle gebührt den „Pansengirls“ eine weitere Erwähnung, frei nach dem Motto „Resignieren oder kämpfen, das ist hier die Frage…“. Danke Mädels! Ein ganz besonderer Dank geht an dieser Stelle an meine Familie und Torben, für die wertvolle Unterstützung in wirklich allen, insbesondere auch den nicht-wissenschaftlichen Lebensbereichen, die es mir erst ermöglicht hat diese Arbeit zu beginnen, dranzubleiben und sie am Ende sogar noch fertigzustellen. DANKE für ALLES!!! - 277 -
