Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1: Mikropartikel und
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Diplomarbeit Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1: Mikropartikel und Thrombingeneration eingereicht von Maximilian Leberl Mat. Nr.:0433341 zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der gesamten Heilkunde (Dr.med.univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt an der Univ. Klinik für Kinder und Jugendheilkunde Klinische Abteilung für Allgemeine Pädiatrie unter der Anleitung von Prof.Dr. Wolfgang E. Muntean und Ass.Dr.In Christina Cimenti Graz, am Maximilian Leberl 1 Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, am Maximilian Leberl 2 Gleichheitsgrundsatz Aus Gründen der besseren Lesbarkeit und Verständlichkeit der Diplomarbeit, wird im Folgenden das generische Maskulin verwendet, welches sich gleichermaßen auf männliche und weibliche Personen bezieht. 3 Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1: Mikropartikel und Thrombingeneration Maximilian Leberl 22. August 2011 Inhaltsverzeichnis 1 Danksagung 6 2 Zusammenfassung 2.1 Hintergrund . . 2.2 Methodik . . . 2.3 Ergebnisse . . . 2.4 Schlussfolgerung . . . . 7 7 7 7 7 . . . . 8 8 8 8 8 3 Abstract 3.1 Background 3.2 Method . . 3.3 Results . . . 3.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Glossar 9 5 Einführung in die Thematik 5.1 Diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.3 Pathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.4 Typ 1 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5 Typ 2 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.6 Folgeerkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7 Hämostase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Mikropartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2 Rolle in der Hämostase . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Kalibrierte Automatisierte Thrombingenerationsmessung 5.3.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2 Form des Thrombogramms . . . . . . . . . . . . . 5.3.3 Eine neue Sicht der Hämostase? . . . . . . . . . . 5.3.4 Thrombozytenarmes Plasma (PPP) . . . . . . . . 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 11 11 11 13 13 15 16 17 20 20 21 23 23 26 27 28 6 Intention und Ziele der Studie 6.1 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 Studiendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 29 30 7 Material und Methoden 7.1 Reagenzien und Substrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 Blutabnahme und Aufbereitung für thrombozytenarmess Plasma 7.3 MP Bestimmung mittels ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4 KAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5 Blutglukose-,Hba1c, TAT und F1+2-Bestimmung . . . . . . . . 7.6 Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (PPP) . . . . . . . . . . . . . . . . 30 30 30 31 31 31 32 8 Ergebnisse und Resultate 8.1 Vergleich: Diabetesgruppe mit Kontrollgruppe . . . . . . . . . . . . . . 8.2 Altersvergleich der Diabetikergruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3 Korrelationsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 32 37 40 9 Diskussion 9.1 Mikropartikel und Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2 Thrombingeneration und Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3 Zusammenfassung der Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 46 49 55 Literatur 57 5 1 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei all jenen bedanken, die mir mit Rat und Tat zur Seite gestanden sind. Ein großes Dankeschön geht an meine beiden Betreuer Univ.-Prof. Dr. Wolfgang E. Muntean und Ass Dr.in Christina Cimenti, die immer schnell erreichbar waren und mit ihrem Fachwissen maßgeblich zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben. Ich danke auch all meinen Freunden und meiner Familie für die fachliche und seelische Unterstützung. Besonders möchte ich mich bei Franzi, Gerald und Klaus für ihre umfangreiche Hilfe bedanken. 6 2 Zusammenfassung 2.1 Hintergrund Vaskuläre Komplikationen stellen einen Großteil der diabetischen Komplikationen dar. Mikrovaskuläre Veränderungen und Hyperglykämien stehen dabei in Zusammenhang mit Endothelzellschäden und Hyperkoagulabilität. In einigen Studien zeigte sich, dass Mikropartikel in Erkrankungen mit vaskulärer Beteiligung erhöht sind. Des weiteren gibt es Hinweise, dass sie über prokoagulatorische Wirkung einen katalysierenden Effekt auf vaskuläre Erkrankungen haben. Derzeit gibt es keine Möglichkeit die individuelle Overallfunction der Hämostase zu messen. Da Thrombin eine Schlüsselrolle in der Hämostase spielt, birgt die Thrombingenerationsmessung das Potential die gesamte individuell Overallfunction der Hämostase einer Person zu erfassen. Ziel dieser Studie war die Bestimmung der Thombingeneration und Mikropartikel im Plasma von Kindern und Jugendlichen Typ 1 Diabetikern. 2.2 Methodik Das Patientenkollektiv besteht aus 112 Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen zwischen 0 und 19 Jahren und einer alters- und geschlechtsgematchten Kontrollgruppe. Die Mikropartikel(MP)-Konzentration und Thrombingeneration wurden mittels ELISA und Kalibrierter-Automatisierter-Thrombingeneration(KAT) erhoben. Es wurden die Diabetiker mit der Kontrolle verglichen und die 0-9 jährigen Diabetiker mit den 10-19 Jährigen. Weiters wurde eine Korrelationsanalyse zwischen dem Hba1c und der Blutglukose mit der MP-Konzentration und den Thrombingenerationsparametern bei der Diabetikergruppe durchgeführt. 2.3 Ergebnisse Im Vergleich der Diabetesgruppe mit der Kontrollgruppe kam es zu einer signifikanten Verringerung von Lag-Time, ttPeak und ETP nach Aktivierung mit 5 pM TF als auch im TF freien MP-Reagenz. Die Diabetikergruppe wurde nochmals aufgeteilt in 0-9 Jährige und 10-19 Jährige und miteinander verglichen. Dabei beobachteten wir bei der Gruppe der 10-19 Jährigen eine nicht signifikanten Erhöhung des Peak und ETP mit einer Verringerung von ttPeak und Lag-Time. Die Hba1c- und die Blutglukosewerte wurden in der Diabetesgruppe mit den KAT Parametern in beiden Reagenzien einer Korrelationsanalyse unterzogen. Dabei kam es zu einer statistisch signifikanten Korrelation des Peak und ETP mit Hba1c in beiden Reagenzien. 2.4 Schlussfolgerung Zusammenfassend konnten wir mit der KAT bei Typ 1 Diabetikern von 0-19 Jahren nachweisen, dass hyperglykämische Zustände zu einer Imbalance der Hämostase bei Typ 1 Diabetikern führen. Die KAT und MP bergen das Potential in sich sinnvolle Ergänzung für die Diagnostik vaskulärer Erkrankungen zu sein. 7 3 Abstract 3.1 Background Vascular complications are one of the major issues in diabetes patients. Microvascular alteration and hyperglycemia are in a close relation to endothelial cell dysfunction and hypercoagulability. Studies have provided evidence that microparticles are higher in persons with vascular diseases than without. Further evidence indicates that microparticles could play a role in the progression of vascular diseases. At the moment there is no clinical test available, measuring the whole individual overall function of the haemostasis. Because of the key role of thrombin, thrombingeneration could be such a tool. The aim of this study was to evaluate microparticles and thrombingeneration in the plasma of juvenile diabetes patients. 3.2 Method The patients group consisted of 112 type 1 diabetes patients between 0-19 years without diabetic complications and of a compared group of 94 healthy persons matched in age and sex. The MP concentration and the thrombin generation were measured via ELISA and Calibrated-Automated-Thrombingeneration(CAT). The diabetes patients were compared with the control group. The 0-9 years old were compared with the 1019 years old in the diabetes group. Further on, a correlation analysis was performed between the Hba1c and the glucose level in the blood in relation to MP concentration and the thrombin generation in the diabetes group. 3.3 Results Comparing the diabetes group with the control group, we discovered a significant reduction of the lag time, ttpeak and ETP after activation via 5 pM of TF and also in the TF free MP-sample. In comparison of the age divided diabetes groups there was a non-significant increase of the peak and ETP with a reduction of ttpeak and lag time. In the correlation analysis, there was a significant correlation between peak and ETP with Hba1c in both samples. 3.4 Conclusion With the help of CAT within the type 1 diabetes patients between 0 and 19 years of age, we proved that a hyperglycemic status results in an imbalance of the haemostasis. CAT and MP have the potential to be a valuable addition for the diagnosis of vascular disease. 8 4 Glossar a2MT a2-Makroglobulin AT Antithrombin KAT Kalibrierte-Automatisierte-Thrombingeneration Ca Kalzium CaCl Kalziumchlorid CRP C-reaktives-Peptid DCCT Diabetes-Control-and-Complication-Trial DMSO Dimethylsulfoxid ELISA Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay EMP endotheliale Mikropartikel ETP endogenes Thrombinpotential F1+F2 Prothrombinfragment F1 + F2 HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl-Ethan-Sulfonsäure] HLA Humanes-Leukozytäres-Antigen KHK koronare Herzkrankheit LDL Low-Density-Lipoprotein LMP leukozytäre Mikropartikel MHC Histokompatibilitätskomplex MI Myokardinfarkt MMP monozytäre Mikropartikel MP Mikropartikel NaCl Natriumchlorid NO Stickstoff OGTT oraler Glukosetoleranztest PAI-1 Plasminogen-Activator-Inhibitor-1 PAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit PFA-100 platelet function analyzer PMP thrombozytäre Mikropartikel 9 PPP thrombozytenarmes Plasma PRP thrombozytenreiches Plasma PT Prothrombinzeit aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit TAFI Thrombin aktivierter Fibrinolyse Inhibitor TAT Thrombin-Antithrombin-Komplex TF Tissue-Faktor TIA tranisiente ischämische Attacke ITP idopathische thrompozytopenische Purpura TMP Annexin-V positive Mikropartikel TFPcA Tissue-Faktor-Procoagulant-Activity TFPI Tissue-Faktor-Pathway-Inhibitor TM Thrombomodulin TPA Tissue-Plasminogen-Activator UKPDS United-Kingdom-Prospective-Diabetes-Study vWF Von Willebrand Faktor VTE venöse Thrombembolien 10 5 Einführung in die Thematik 5.1 Diabetes mellitus 5.1.1 Einleitung Als Diabetes mellitus bezeichnet man eine heterogene Gruppe metabolischer Erkrankungen, die als Gemeinsamkeit eine Hyperglykämie aufweisen und abhängig von ihrer Ätiologie Störungen in den glukoseregulierenden Prozessen verursachen. Die Hyperglykämie ist die Folge einer in unterschiedlicher Ausprägung vorliegenden Störung der Insulinsekretion, Glukoseverwertung oder Glukoseproduktion. Dies führt in weiterer Folge, durch die andauernde Belastung des Organismus mit erhöhten Glukosespiegeln im Blut, zu Veränderungen an vielen Organsystemen, wie Nephropathie, Neuropathie, Retinopathie und kardiovaskulärer Erkrankungen[1]. Die Zahl der Erkrankten nimmt in westlichen Industrieländern sowie global zu und damit auch ihre Folgen. Daher bekommt die Erkrankung auch volkswirtschaftliche Bedeutung, weil die durch Diabetes bedingte Morbidität und Mortalität in der Gesellschaft auch steigt. Für einige Erkrankungen ist Diabetes schon die führende Ursache. Als Beispiel werden in den USA und Deutschland terminales Nierenversagen, Erblindung und atraumatische Amputationen von Extremitäten am häufigsten durch Diabetes verursacht[1]. Man unterscheidet verschiedene Formen des Diabetes. Die Klassifikation dieser Formen erfolgt nicht mehr wie früher einmal anhand des Erkrankungsalters und der Behandlungsform, sondern anhand der zur Hyperglykämie führenden Prozesse. Die Erklärung dafür liegt in der Zunahme des in jungen Jahren auftretenden Typ 2 Diabetes und der Therapiemöglichkeit dieser Form mit Insulin oder Insulinanaloga. Dies unterstreicht auch die Bedeutung der Hyperglykämie als zentrales Merkmal für Diabetes. Man kann Diabetes grob in Typ 1 Diabetes und Typ 2 Diabetes unterscheiden. Dann gibt es noch weitere Formen, die jedoch anteilsmäßig nur eine geringe Rolle spielen[1]. Der wesentliche Unterschied zwischen Typ 1 und Typ 2 Diabetes liegt im Insulin. Während bei Typ 1 Diabetes die Produktion von Insulin nicht mehr ausreicht um den Blutglukosespiegel zu regulieren, ist diese bei Typ 2 Diabetikern nicht der entscheidende Faktor. Bei der heterogenen Erkrankungsform des Typ 2 Diabetes kommt es zur Störung der Blutglukoseregulationsprozesse im Sinne einer Insulinresistenz, gestörten Insulinsekretion und vermehrten Glukoseproduktion[1]. 5.1.2 Epidemiologie Die Prävalenz des Diabetes mellitus steigt weltweit an, wobei dabei die Form des Typ 2 Diabetes stärker betroffen ist. Aufgrund von Beobachtungen des Anstiegs der weltweiten Diabetesprävalenz von 1985 mit 30 Millionen auf 177 Millionen im Jahre 2000 gehen Schätzungen von 360 Millionen Diabetikern weltweit im Jahr 2030 aus. Der Geschlechtsunterschied in der Prävalenz von Diabetikern ist annähernd gleich in der Altersgruppe von über 20 Jährigen (10,5 % Männer zu 8,5 % Frauen) und steigt bei den über 60 Jährigen bei den Männer deutlich im Vergleich zu Frauen an. Die Inzidenzraten von Typ 1 und Typ 2 Diabetes sind weltweit geographisch unterschiedlich und wahrscheinlich von der unterschiedlichen Verbreitung von HLA-Allelen in verschiedenen ethnischen Gruppen entscheidend mitbeeinflusst. Dabei weisen für Typ 1 11 Diabetiker die skandinavischen Länder die höchste Rate auf (jährliche Inzidenz von 35 pro 100.000 in Finnland), die geringsten Raten werden im pazifischen Raum beobachtet( Japan und China 1 bis 3 pro 100.000). Die USA bzw. Nordeuropa liegen im Mittelfeld (17 pro 100.000)[1]. Schätzungen gehen von Diabetes als der fünfthäufigsten Todesursache weltweit aus. Die Prävalenz von Typ 2 Diabetes ist auf Pazifikinseln am höchsten und in Russland am geringsten[1]. Die WHO geht von einem Anstieg der Diabetesprävalenz in Europa von 33 Millionen im Jahr 2000 auf 48 Millionen im Jahr 2030 aus [2]. Abbildung 1: weltweite Prävalenz, WHO Epidemiologische Daten zu Österreich wurden aus dem Österreichischen Diabetes Bericht 2004[3] entnommen. Dabei war die Inzidenz für Typ 1 Diabetiker im Alter bis zu 14 Jahren in einem Zeitraum von 10 Jahren (1989-99) signifikant um 2,1 % pro Jahr angestiegen. Die Inzidenz betrug über diesen Zeitraum 12,4 pro 100.000. Im Vergleich dazu wiesen Typ 2 Diabetiker unter 15 Jahre eine Inzidenzrate von 0,25 pro 100.000 auf. Weiters wurde bei Typ 1 Diabetikern im Geschlechtsvergleich eine leicht höhere Inzidenz des männlichen Geschlechts festgestellt[4]. In einer anderen durchgeführten Erhebung in Oberösterreich (1994-1996) bei Typ 1 Diabetikern bis zu 30 Jahren war das männliche Geschlecht von über 20 Jährigen im Verhältnis 2,25 :1 häufiger betroffen als das altersentsprechende weibliche Geschlecht [5]. Außerdem gibt es im Osten von Österreich ein deutlich höheres Risiko an Typ 1 Diabetes zu erkranken als im Westen[6, 7]. 12 Die WHO schätzt die Diabetesprävalenz in Österreich auf 2,1 % und 130.000 betroffene Österreicher. Sehr auffallend dabei ist, dass die Prävalenz der Frauen um 5 % höher als die der Männer ist. Ersichtlich wird auch, dass der Hauptteil der Diabetiker schon im fortgeschrittenen Alter ist. Dabei sind 42 % der Diabetiker 45-64 Jahre alt und 53 % über 64 Jahre alt [8]. Eine neuere Studie von Schober et al. [9] untersuchte die Inzidenz von Diabetes im Zeitraum von 1999-2007 in Österreich bei unter 15 Jährigen. In diesem Zeitraum wurden 1857 Neuerkrankungen initial als Typ 1 Diabetes erhoben, dies waren 94,5 % aller erhobenen Neuerkrankungen. Von den 44 Patienten, die als nicht klassifizierbar galten, konnte im weiteren Verlauf (0,4 - 9 Jahre) bei 24 Typ 1 Diabetes nachgewiesen werden. Durchschnittlich erkrankten 209 Patienten pro Jahr an Typ 1 Diabetes und die Inzidenzrate über diesen Zeitraum betrug 14,9/100 000. Es wurde auch ein statistisch signifikanter konstanter Anstieg der Inzidenz nachgewiesen mit einer Steigerung um 0,81/100 000 Fällen oder anders ausgedrückt 5,7 % pro Jahr. 5.1.3 Pathogenese 5.1.4 Typ 1 Diabetes Patienten mit Typ 1 Diabetes charakterisiert eine verminderte Insulinproduktion und daher einen Mangel dieses Regulatormoleküls. Dafür verantwortlich sind eine genetische Prädisposition dieser Patienten, immunologische Prozesse und umweltbedingte Einflüsse, die zu einem Untergang der insulinproduzierenden Betazellen des Pankreas führen[1]. Die Zerstörung des Pankreas beruht dabei in den meisten Fällen auf einem autoimmunologischen Prozess, der durch gegen die Betazellen gerichtete Antikörper vermittelt wird. Bei einer kleinen Anzahl von meist afroamerikanisch oder asiatischer Herkunft entstammenden Betroffenen fehlt dieser Marker. Daher vermutet man, haben bei diesen Patienten unbekannte, nicht immunologisch vermittelte Prozesse einen wesentlichen Anteil an der Entstehung des Insulinmangels[1]. Bei den restlichen Patienten ist die Insulinproduktion von Geburt an über einen längeren Zeitraum von Monaten bis Jahren normal, bevor es zu einer Zerstörung der Betazellen kommt. Dieser Prozess dauert unterschiedlich lange und weist daher interindividuell eine große Spanne der Geschwindigkeit des Untergangs der Zellen auf. Als Trigger für den autoimmunologischen Prozess werden infektiöse oder umweltbedingte Reize angenommen[1]. Von Viren, besonders Coxsackie und Rötelnviren, sowie Kuhmilchexposition und der Aufnahme von Nitrosoharnstoffen wird angenommen, dass sie zu solchen Triggern zählen. Bisher konnte jedoch noch nicht eindeutig belegt werden, dass diese Umweltfaktoren den genetisch prädisponierenden autoimmunologischen Prozess begünstigen. Erst bei einer Zerstörung der Betazellen von 80 % kommt es zu einer relevanten Verminderung der Insulinproduktion, wodurch der Blutglukosespiegel nicht mehr kontrolliert werden kann[1]. Diese Phase geht meist einher mit Lebenssituationen, in denen ein erhöhter Insulinbedarf besteht, wie Pubertät oder Infektionen, um zwei klassische Beispiele zu nennen. Diese Phase wird gefolgt von einer Phase, in der nur wenig Insulin zur Therapie benötigt wird, und am Ende werden die letzten Betazellen von Autoantikörpern zerstört. Es tritt ein vollständiger Insulinmangel auf[1]. 13 In über 74% dieser Patienten und in 5 bis 10% bei Typ 2 Diabetikern mit Erstmanifestation sind Inselzellautoantikörper nachweisbar. Jedoch ist bis jetzt noch nicht ganz geklärt, weshalb diese spezifisch Betazellen zerstören. Der einzige aus Antigenen erklärbare spezifische Autoimmunprozess gegen Betazellen ist der gegen Insulin, alle anderen, wie Glutaminsäure-Decarboxylase, Phogrin und ICA-512, sind nicht spezifisch für diese Zellen[1]. Ein weiterer spannender Aspekt ist, dass die Transplantation von Inselzellen aus gesunden eineiigen Zwillingen in den Erkrankten zu einer neuerlichen Erhöhung der Autoimmunantwort führt. Daher scheinen die Betazellen von gesunden und erkrankten Patienten nicht krankheitsrelevant unterschiedlich zu sein. Die Spezifität der Antikörperreaktion gegen Betazellen kann auch nicht auf diesem Weg beantwortet werden. Es scheint so als würde es bei der genetischen Prädisposition einen nicht unbeträchtlichen Einfluss von modifizierenden Faktoren geben, der die Krankheitsentwicklung bestimmt, weil die Konkordanzrate bei eineiigen Zwillingen lediglich zwischen 30 und 70 % liegt, konträr zu der des Typ 2 Diabetes[1]. Der wichtigste derzeit identifizierte genetische Einfluss geht von Polymorphismen der HLA Region auf Chromosom 6 aus, welche zu 40 - 50% das genetische Risiko dieser Erkrankung mitbestimmen. Diese Region kodiert für die MHC-Klasse-II Moleküle und ist dadurch über den Einfluss auf die T-Zellimmunantwort entscheidend in autoimmunologische Prozesse involviert[1]. Die bekanntesten und häufigsten Haplotypen bei Typ 1 Diabetikern sind der des HLADR3 und HLA-DR4. Jedoch entwickeln die meisten Patienten mit diesen Haplotypen keinen Typ 1 Diabetes. Ebenso weisen Verwandte ersten Grades ein sehr geringes Risiko auf ebenfalls an Typ 1 Diabetes zu erkranken[1]. 14 5.1.5 Typ 2 Diabetes Im Vergleich zu Typ 1 Diabetes beruht die Entstehung des Typ 2 Diabetes aus einem Zusammenspiel von Insulinresistenz und abnormer Insulinsekretion. Die Mehrheit der Studien weisen darauf hin, dass es zuerst zu einer Insulinresistenz kommt, dann im weiteren Verlauf zu einer Insulinsekretionsstörung und erst durch das Vorhandensein beider Faktoren sich ein Diabetes entwickeln kann. Insgesamt ist diese These jedoch sehr umstritten[1]. Auf die erhöhten Glukosespiegel reagiert der Körper mit vermehrter Insulinausschüttung. Nach einiger Zeit reagieren die Effektorzellen von Insulin mit vermehrter Resistenz gegenüber diesen hohen Insulinspiegel und es entsteht die sogenannte Insulinresistenz[1]. Das bedeutet wiederum, dass die Insulinwirkung an den Zielorganen, vor allem Leber, Muskel und Fettgewebe deutlich abnimmt. Da eigentlich genügend Insulin vorhanden wäre um den Blutzucker zu normalisieren, es aber durch die reduzierte Insulinwirkung an den peripheren Zielorganen dazu nicht imstande ist, spricht man von einem relativen Insulinmangel[1]. Zu Beginn dieses Prozesses wird die Glukosetoleranz und damit der Blutzuckerspiegel durch eine vermehrte Produktion von Insulin durch pankreatische Betazellen kompensiert. Erst bei Erniedrigung der kompensatorisch erhöhten Insulinprokution der Betazellen kommt es in weiterer Folge zu einer gestörten Glukosetoleranz mit Erhöhung des postprandialen Blutzuckerspiegels. Dieser Prozess schreitet weiter voran bis es zu einem erhöhten Nüchternblutzuckerspiegel und schließlich zum völligen Sistieren der Insulinsekretion durch Betazellen kommt[1]. Gleichzeitig kommt es während dieses Prozesses zu einer vermehrten hepatischen Glukoseproduktion, weil die Gluconeogenese durch die Insulinresistenz der Leber nicht mehr unterdrückt werden kann und der Blutzuckerspiegel ansteigt. Man vermutet, genetische Faktoren sind für den Rückgang der Insulinsekretion verantwortlich. Die genauen Gründe dafür sind jedoch unklar[1]. Im Vergleich zu Typ 1 Diabetikern dürfte hier die Genetik einen größeren Anteil zur Entwicklung der Erkrankung beitragen, da die Konkordanz bei eineiigen Zwillingen zwischen 70 und 90 % beträgt. Außerdem steigt das Erkrankungsrisiko für Typ 2 Diabetes auf 40 %, wenn beide Elternteile erkrankt sind. Neben der Genetik beeinflussen auch noch andere Lifestyle- und Umweltfaktoren die Erkrankung, wie die körperliche Aktivität, das Körpergewicht und die Ernährung[1]. Besonders häufig leiden Typ 2 Diabetiker auch an Adipositas vom zentralen Typ und weisen daher eine größere Diskrepanz zwischen Hüft-Taillen Umfang auf, was wiederum einen entscheidenden Parameter für kardiovaskuläre Folgeerkrankungen darstellt[1]. 15 5.1.6 Folgeerkrankungen Die diabetogenen Spätfolgen sind für die hohe Morbidität und Mortalität der Erkrankung verantwortlich und sind auf die dauerhaft erhöhten Blutglukosespiegel zurückzuführen. Die Folgeerkrankungen entwickeln sich langsam über Jahre hinweg, währenddessen die Patienten meist asymptomatisch bleiben[1]. Symptome treten erst häufig in der zweiten Erkrankungsdekade in Erscheinung. Dabei sind vaskuläre Komplikationen die häufigsten. Man kann sie in mikro- und makrovaskulär unterteilen. Die bekanntesten Vertreter der mikrovaskulären Komplikationen sind Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie und die der makrovaskulären sind koronare Herzkrankheit (KHK) beziehungsweise periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK)[1]. Bisher ist noch nicht geklärt, auf welchen pathophysiologischen Prozess im Detail diese Spätschäden zurückzuführen sind oder ob in unterschiedlichen Organen unterschiedliche pathophysiologische Prozesse für die Entstehung dieser verantwortlich sind. Obwohl bei mikrovaskulären Komplikationen die chronische Hyperglykämie für die Spätfolgen verantwortlich ist, gibt es noch nicht genau bekannte Faktoren, die das Auftreten von Spätkomplikationen mitbeeinflussen[1]. Es werden hier auch genetische Prädispositionen vermutet, denn einige Patienten ohne wesentliche Unterschiede der Stoffwechsellage zu anderen Diabetikern entwickeln trotz langjähriger Erkrankung keine Spätfolgen im Sinne einer Retinopathie oder Nephropathie[1]. Patienten mit Diabetes mellitus erblinden 25 mal häufiger als Nicht-Diabetiker und haben nach 20 Jahren Erkrankung in fast allen Fällen eine nicht proliferative Retinopathie. Ungefähr 20 bis 40 % der Diabetiker erkranken an einer diabetischen Nephropathie, daher sind Diabetiker in Deutschland derzeit die größte Gruppe von Patienten, die eine Behandlung mit Nierenersatzverfahren benötigen. Oder anders ausgedrückt, Diabetes ist die häufigste Ursache für einen persistierenden Verlust der Nierenfunktion[1]. Bei der Nephropathie gibt es drei wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Diabetes Formen. In Typ 2 Diabetikern kann die Mikro- und Makroalbuminurie schon bei Diagnosestellung durch den längeren asymptomatischen Verlauf auftreten. Sie sind meist mit arterieller Hypertonie vergesellschaftet. Bei Typ 2 Diabetikern wird die Nephropathie häufiger als bei Typ 1 Diabetikern durch andere Erkrankungen wie arterieller Hypertonie, Herzinsuffizienz und Infektionen mitverursacht[1]. Die diabetische Nephropathie korreliert wie die anderen mikrovaskulären Spätfolgen mit der Dauer des Diabetes als auch mit der Blutzuckerspiegeleinstellung und tritt in 50% der Fälle mit langjährigem Diabetes auf[1]. Der Diabetes-Control-and-Complication-Trial (DCCT) beobachtete, dass eine Verbesserung der diabetischen Stoffwechsellage alle drei mikrovaskulären Erkrankungen reduziert. Im Detail wurde die diabetische Retinopathie um 39 %, die Mikroalbuminurie um 39 % und die Neuropathie um 60 % reduziert. Eine verbesserte Blutzuckereinstellung gemessen an HbA1c mit unterschiedlichen Spiegel deutet darauf hin, dass es auf jedem Niveau positive Auswirkungen gibt[1]. Weiters weist auch die United-Kingdom-Prospective-Diabetes-Study (UKPDS) auf diesen Nutzen hin, weil eine Reduktion des HbA1c um einen absoluten Prozentpunkt mit einer Reduktion mikrovaskulärer Komplikationen um 35 % einhergeht[1]. Die makrovaskulären Komplikationen sind in Patienten mit Diabetes auch erhöht, vor 16 allem bei Typ 2 Diabetikern. Sie sind sogar so stark erhöht, dass die American Heart Association Diabetes als einen Hauptrisikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen definiert hat[1]. In der Framinghamstudie konnte gezeigt werden, dass kardiovaskuläre Ereignisse signifikant häufiger auftreten als bei Patienten ohne diese Erkrankung. Darunter Fallen die PAVK, KHK, der Myokardinfarkt und der plötzliche Herztod. Diese erhöhte kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität scheint aus einem Zusammenspiel der langjährigen Hyperglykämie und anderen spezifischen Risikofaktoren, wie Dyslipidämie und arterieller Hypertonie bedingt zu sein. Die beiden letzt genannten treten auch häufiger in Diabetes mellitus Typ 2 auf. Daher kann dieser Umstand auch daran mitbeteiligt sein, dass diese Folgeerkrankungen häufiger mit Typ 2 Diabetes assoziiert sind[1]. In der UKPDS wurde außerdem beobachtet, dass mikro- und makrovaskuläre Komplikationen durch eine strenge Blutdruckeinstellung signifikant verringert werden konnten. In der DCCT wiesen die intensiviert behandelten Patienten (6,5 Jahre durchschnittliche Behandlungszeit) eine Reduktion um 42 bis 47 % der nicht tödlichen kardiovaskulären Ereignisse ohne Schlaganfall auf[1]. Weiters ergaben sich im Vergleich zu den nicht intensiviert Behandelten bei Kombination aller diabetischen Komplikationen 15,3 Jahre zusätzliche Jahre ohne signifikante mikrovaskuläre oder neurologische Komplikationen. Dies hebt die besondere Bedeutung von Hyperglykämie in der Erkrankung hervor [1]. 5.1.7 Hämostase In den Artikeln von Carr ME [10], Alzahrani [11], Lemkes et al[12], Grant[13] und denen einiger anderer im Text gekennzeichneter Autoren finden sich folgende Aussagen. Wie oben aufgeführt, ist das Gefäßsystem bei zahlreichen Folgeerkrankungen von Diabetikern betroffen. Die hohe Morbidität und Mortalität bei Diabetikern ist hauptsächlich auf diese mikro- und makrovaskulären Komplikationen zurückzuführen. Das Risiko eines Diabetikers atherothrombotische Ereignisse zu erleiden ist sehr hoch. Das spiegelt sich wider einerseits in der Tatsache, dass Diabetes ein Risikofaktor für Schlaganfall ist [14] und andererseits das Risiko atherothrombotischer Komplikationen zu erleiden dem einer an ischämischer Herzerkrankung leidenden Person ohne Diabetes entspricht [15]. Calles et al. [16] zeigten sogar, dass thrombotische Komplikationen, die zu einem Tod bei Typ 2 Diabetikern führen, mit 80 % sehr häufig sind und sogar 75% dieser Tode alleine auf kardiovaskuläre Ereignisse zurückzuführen sind. Damit sind sie die Haupttodesursache bei Diabetikern. Im folgenden Text wird auf die Veränderungen der Hämostase im Bezug auf Gerinnungsfaktoren, wichtigen natürlichen Antikoagulantien und die Auswirkungen von Blutglukosespiegeln auf die Fibrinolyse bei Diabetes eingegangen. Bei konventionellen Gerinnungstests wie der Prothrombinzeit(PT) und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) gibt es widersprüchliche Beobachtungen. Acang und Jalil [17] haben eine Verkürzung der Werte in ihrer Probandengruppe gemessen. Hingegen beobachtet Collier et al.[18] ein Jahr zuvor konträr dazu eine regelrechte PT bei Diabetikern ohne Insulintherapie in ihrer Studie. Bei den Studien, die in Verbindung mit dem Nachweis von Blutgerinnungsfaktoren durchgeführt wurden, scheint die Datenlage derzeit klarer zu sein. Nachdem durch Kontaktaktivierung Faktor XIa gebildet wird, wird er über die Leber in einem Komplex 17 mittels a1 Antitrypsin ausgeschieden. Dieser Komplex findet sich gehäuft in Diabetikern und korreliert in einer Studie auch mit Lipoprotein-a-Spiegel[19, 20]. Eine Reduktion der Halbwertszeit wie bei Diabetikern spiegelt einen vermehrten Verbrauch von Fibrinogen in der Blutgerinnung wider[21, 22]. Bei Diabetikern sind auch zahlreiche Blutgerinnungsfaktoren erhöht, wie Faktor I, VII, VIII, XI, XII, von Willebrand Faktor(vWF) und Tissue Factor(TF)[17, 23, 18, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30]. Dies spricht für eine Gerinnungsveränderung bei Diabetikern hin zu einer Hyperkoagulabilität und damit auch einer Beteiligung an den thrombotischen Komplikationen. Dies kann anhand der erhöhten Fibrinogenspiegel (Faktor I) gezeigt werden. Sie sind ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen und steigen in mikround makrovaskulären Komplikationen an [31, 32, 33]. Des weiteren weisen erhöhte Fibrinogen-Spiegel in Typ 1 Diabetikern auf ein Fortschreiten der Verkalkung der Koronargefässe und in Typ 2 Diabetikern auf einen stumme myokardiale Ischämie hin[34, 35] Bei Diabetespatienten findet man des weiteren auch Veränderungen der Spiegel von körpereigenen gerinnungshemmenden Substanzen. Antithrombin (AT) ist eine dieser Substanzen. Es wird in der Leber synthetisiert und ist ein wesentlicher Bestandteil zur Gerinnungshemmung in der Hämostase. Besonders durch die Inhibierung von Faktor Xa und IIa(Thrombin) aber auch durch Inhibierung von Faktor IXa,XIa und XIIa wird dieser Effekt vermittelt. In unterschiedlichen Studien wurden dabei unterschiedliche Spiegel bei Diabetikern beobachtet. In einer neuen Studie wurden im Normbereich liegende Spiegel erhoben [24], während in einigen älteren Studien erhöhte und erniedrigte Spiegel gemessen wurden. Ein weiteres wichtiges Antikoagulans ist Protein C. Es wird ebenso wie AT in der Leber synthetisiert und zirkuliert als inaktive Vorstufe im Blut. Durch Interaktion zwischen Thrombin und Thrombomodulin kommt es zu seiner Aktivierung. Anschließend wird es durch Inhibitoren wie a2 Makroglobulin wieder gesenkt. Protein C ist dabei für die Regulation von Faktor V und VIII in der Blutgerinnung von entscheidender Bedeutung. Reverter et al. [27] beobachteten eine Erhöhung von Thrombomodulin bei diabetischen Patienten mit Mikroangiopathie. Dagegen fanden ältere Studien eine Erniedrigung von Protein C bei Patienten mit Typ 1 Diabetes und normale a2 Makroglobulin Werte bei Diabetikern [36, 37]. Der Tissue-Faktor-Pathway-Inhibitor (TFPI) kontrolliert die Aktivität von Faktor VII. Als Kofaktoren werden dabei Faktor Xa und TF gebraucht. Dieser TFPI scheint auch erhöht in Diabetikern mit Nephropahtie zu sein[38]. Weiters weisen bei Diabetikern die Thrombozyten eine abnormale Funktion im Sinne einer Hyperreaktivität auf und die erhöhten Gerinnungsfaktoren können auch mit verminderter Fibrinolyse einhergehen[39]. Wie schon zuvor mehrmals erwähnt weisen Diabetiker als ein entscheidendes Merkmal eine Hyperglykämie, mehr oder minder konstant auf. Nachdem Diabetes einen prothrombotischen Zustand vermittelt, der mit zahlreichen Veränderungen von Hämostaseparametern einhergeht, ist trotzdem noch zu klären, welche Rolle eine Hyperglykämie dabei spielt. Die konstante, also chronische, Hyperglykämie ist für die Entstehung des Großteils der Folgeerkrankungen von Diabetikern verantwortlich. Ein Marker, um solche konstant erhöhten Blutglukosespiegel zu messen, ist der HbA1c Wert. 18 In einer Studie wurde der Zusammenhang von hohem HbA1c mit einem Fibrinolysemarker in Typ 2 Diabetikern beobachtet. In dieser Studie wurden dazu 91 Patienten mittels metabolischer Parameter, unter anderem Hba1c und auf PlasminogenActivator-Inhibitor-1(PAI-1)-Spiegel hin untersucht. PAI-1 kann als Marker für Koronarsklerose bei Diabetikern herangezogen werden. Anschließend wurden die Patienten in zwei Gruppen entweder mit Glipizide oder Metformin behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass sehr hohe Konzentrationen von HbA1c ( im Mittel von 10%) mit einer deutlichen Steigerung des PAI-1 einhergingen und beide Medikamente unabhängig voneinander die PAI-1-Werte verringerten. Daher wird dieser Effekt nicht auf eine medikamentenspezifische Wirkung zurückgeführt, sondern auf eine Verringerung der Hyperglykämie. Weitere Studien unterstützen diese Beobachtungen und untermauern die bekannte Hypofibrinolyse mit verlängerter Clot Lyse Zeit in Typ 2 Diabetikern[40, 41, 42, 43, 44]. Andere Studien haben auch diese Relation mit PAI-1 in einem Kollektiv von Typ 1 Diabetikern untersucht. In dieser Patientengruppe kann die Auswirkung der hyperglykämischen Zustände in Diabetikern besonders gut untersucht werden, da bei ihnen andere übliche Risikofaktoren wie Adipositas, Hypertonie und andere metabolische Komplikation entsprechend dem Altersgipfel der Erkrankung häufig fehlen. Daher können die Ergebnisse leichter diesen spezifischeren hyperglykämischen Effekten zugeordnet werden. Eine Langzeitstudie über 18 Jahre untersuchte die Auswirkung von Hba1c auf die Fibrinolyse gemessen an PAI-1. Dabei konnten die Ergebnisse in Typ 1 Diabetikern auch bestätigt werden. Der Mittelwert des Hba1c betrug bei diesem Patientenkollektiv 8% und ging ebenfalls mit erhöhten PAI-1-Spiegeln einher, sowie mit einer Verringerung von Tissue Plasminogen Activator (TPA)[45]. TPA wirkt katalytisch auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin und trägt so ebenfalls zur Fibrinolyse bei. Allerdings gibt es auch, wenn auch in geringerer Menge, Studien in denen sich Parameter der Fibrinolyse, wie Thrombin-aktivierterFibrinolyse-Inhibitor (TAFI), in beiden Diabetes Formen nicht von gesunden Probanden unterscheiden[41, 46]. Es wurde auch in mehreren Studien eine Korrelation von Plasmaglukosespiegel und Fibrinogen gefunden, wobei es den Anschein hat, als würde Fibrinogen auch durch die Blutglukosespiegel mitbeeinflusst und verändert. Obwohl in diesen Studien auch eine verbesserte Blutzuckereinstellung durch Insulin nicht unbedingt mit einer Verringerung der Werte einhergeht und daher noch Restzweifel bestehen bleiben [47, 48, 49, 50]. Eine weitere Forschergruppe untersuchte den Effekt von Glukose- und Insulinspiegel auf verschiedene Parameter der Blutgerinnung, darunter auch Tissue Factor Procoagulant Activity (TFPcA). Dabei wurden die TFPCA-Spiegel deutlich durch eine Normalisierung der Blutzuckerwerte reduziert. Andererseits führte Insulin alleine auch zu einer TFPCA Erhöhung. Den höchsten Anstieg an TFPCA konnte jedoch in der Kombination von erhöhten Blutzuckerwerten und Insulinwerten beobachtet werden. Dies ging sogar mit erhöhten Werten von Thrombin-Antithrombinkomplex (TAT) und Prothrombin Fragment 1+2 (F1+2) als klassische Aktivierungsmarker der Gerinnung einher [23]. In einer anderen Studie sind auch Parameter zur Bestimmung der Thrombin Generation in Typ 2 Diabetikern mit Hyperglykämie erhöht [51] und unterstützen diese Assoziation. Gibt es auch in einzelnen Untersuchungen eine kontroversielle Datenlage, lässt sich 19 doch zusammenfassend eine hämostaseologische Imbalance im Sinne eines prothrombotischen Zustands bei Diabetespatienten zeigen. Dies passt auch sehr gut zu den bekannten atherothrombotischen Komplikationen bei Diabetes, als auch zu der kürzlich durchgeführten Metaanalyse in der gezeigt wurde, dass Diabetes als unabhängiger Risikofaktor für venöse Thrombembolien (VTE) gilt[52]. Insgesamt scheint der Hyperglykämie und dem Insulin eine Schlüsselrolle in diesem Prozess zuzukommen, jedoch sind die Mechanismen nicht restlos geklärt und es bedarf noch weiterer Studien diese zu erforschen. 5.2 Mikropartikel 5.2.1 Einführung Mikropartikel (MP) sind schon seit längerem bekannt und wurden erstmals als „platelet dust“ 1967 von Wolf beschrieben[53]. Wie durch den Namen schon zu vermuten ist, handelt es sich um sehr kleine Teilchen, meistens wird in Studien die Größenordnung von unter einem Mikrometer aufgeführt [54, 55, 56, 57]. Ein neuer Review aus dem Jahre 2010 definiert sie jedoch etwas weiter in der Größenordnung von 0,05 bis 1,5 Mikrometer[58]. MP sind als Vesikel zu betrachten, die aus verschiedenen Ursprungszellen stammen und an ihrer Oberfläche bestimmte Membranproteine ihrer Ursprungszellen präsentieren und so diesen auch zuordenbar sind. Die Ursprungszellen sind von einer Phospholipiddoppelschicht umgeben und ermöglichen so eine Interaktion mit ihrer Umgebung und eine Reaktion auf sie umgebende Reize. Dabei scheint in der Interaktion mit ihrer Umgebung den Phospholipiden eine zentrale Rolle in der Kommunikation zuzukommen. Thrombozyten besitzen als ein Beispiel eine asymmetrische Verteilung von Phospholipiden an ihrer Plasmamembran, welche sich nach Zellaktivierung oder Apoptose verändert. In diesem Fall befinden sich Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidyletholamin und Sphingomyelin in der doppelschichtigen Phospholipidmembran. In Ruhe befindet sich das neutral geladenen Phosphatidylcholin und Sphingomyelin im äußeren Anteil der Membran und die beiden negativ geladenen im Inneren. Durch Aktivierung der Zelle und Apoptose treten die beiden negativ geladenen Phospholipide an die Oberfläche. Somit tragen sie zur MP Freisetzung bei [54, 55, 58]. MP selbst sind in physiologische Regulationsprozesse der Hämostase involviert (5.2.2). Die genauen Mechanismen zur Freisetzung, Regulation und Interaktion von MP liegen jedoch noch weitgehend im Dunklen. Des weiteren ist es noch nicht geklärt, ob sie als Initiatoren, Folgeerscheinungen oder beides in pathologischen Prozessen fungieren. Als gesichert gilt, dass sie in einigen pathologischen Prozessen erhöht sind. Neben dem bekannten Einfluss von MP auf die Hämostase weisen immer mehr Studien auf eine Rolle in verschiedensten pathologischen Prozessen hin, wie zum Beispiel Diabetes mellitus, Koronare Herzkrankheit, Dyslipidämie, Hypertonie, Krebs, Niereninsuffizienz, Präeklampsie [59, 60, 61, 55, 62]. Die Konzentration von MP im Blut ist auch abhängig vom Alter, jedoch bleiben sie im Erwachsenenalter stabil [63]. Die sich im Blut befindlichen MP stammen aus Thrombozyten, Erythrozyten, Leukozyten, Endothelzellen und eventuell sogar Megakaryozyten. Anteilsmäßig am häufigsten finden sich von Thrombozyten stammende MP. Von diesen MP erwartete man sich einen besonders großen Einfluss. Erst darauffolgend wurden nach und nach weitere MP aus anderen Ursprungszellen untersucht. Ein detaillierteres 20 Verständnis von MP im Zusammenhang mit diversen pathologischen Prozessen eröffnet uns einerseits eine neue Möglichkeit für Diagnostik und Monitoring des Verlaufs von Erkrankungen und andererseits vielleicht auch neue Therapiestrategien für Erkrankungen [55, 64, 58]. Derzeit ist jedoch der technische und finanzielle Aufwand zur Messung der einzelnen MP-Konzentrationen zu groß, um es routinemäßig in der medizinischen Versorgung einsetzen zu können. Es besteht hier noch Bedarf für eine Weiterentwicklung. 5.2.2 Rolle in der Hämostase Wie Diamant ausführt braucht es für eine Aktivierung der Gerinnung Kalziumionen, zirkulierende Gerinnungsfaktoren und eine spezielle Membranoberfläche. Wie schon eingangs erwähnt sind Thrombozyten von einer Phospholipidmembran umgeben und ihre negative geladene Phospholipide treten bei Aktivierung an die Oberfläche. Durch die Abschnürung ihrer Vesikel und damit der Bildung von MP enthalten jene auch diese Phospholipide. Somit entsteht die benötigte Oberfläche zur Gerinnungsaktivierung. Unter Beisein von Kalziumionen binden die negativen G1a Domänen der Gerinnungsfaktoren an die Phospholipide der MP. Dadurch kann zur Bildung von Tenase- und Prothrombinasekomplexen beigetragen werden [54]. Weiters kann angeführt werden, dass von Thrombozyten stammende Mikropartikelmembranen (PMP) unter Laborbedingungen die Thrombinbildung stärker fördern als die Membran der Thrombozyten selbst. Aber nur wenn eine Korrektur des Oberflächeneinheitsareals erfolgt. Das könnte durch die höhere Anzahl an Bindungsstellen für Gerinnungsfaktoren Va, VIIIa und IXa der MP pro Einheit der Membranoberfläche als bei Thrombozyten erklärbar werden [54]. Faktor VIII ist ein Kofaktor im Tenase Enzym Komplex. Faktor Va und Faktor Xa bilden den Prothrombinase Komplex. Es wurde nachgewiesen, dass PMP für alle drei Faktoren an ihrer Oberfläche Rezeptoren besitzen [65, 66, 67]. Wie Nomura vorschlägt, können daher PMP für längere Zeit als aktivierte Thrombozyten von der Ferne in die Gerinnung eingreifen[68]. Weiters haben PMP eine 50 bis 100 fach höhere spezifische gerinnungsfördernde Aktivität als aktivierte Thrombozyten[69, 70]. Unter Fibrinolyse von Myokardinfarkten korrelierte eine geringere TFPI Dichte an der Oberfläche von MP mit einer durch TF mediierten Blutgerinnung[71]. Auch werden von MP-Aggregaten Sauerstoffradikale gebildet, die zur Inaktivierung von TFPI führen könnten[72]. Eine weitere Studie konnte zeigen, dass MP über Faktor VII beziehungsweise TF abhängige und unabhängige Mechanismen zur Blutstillung beitragen[73, 74, 75, 76, 77]. PMP haben auch die Fähigkeit die Aktivierung von Protein C zu erhöhen. Somit tragen sie zur Inhibierung der Gerinnungsfaktoren Va und VIIa bei, wodurch sie die Thrombinbildung verhindern könnten [78]. Des weiteren finden sich an der Oberfläche von MP TFPI und Protein C, somit könnten sie zusätzlich gerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen[71, 79]. Höhere Konzentrationen von TF beinhaltenden zirkulierenden MP könnten unter Umständen zu einem Ungleichgewicht zwischen TFPI und TF führen und so zur vermehrten Blutgerinnung beitragen [71, 56]. PMP interagieren über GPIIb/IIIa Rezeptoren mit der subendothelialen Matrix und binden an Thrombin aktivierte Endothelzellen (EC) und haben auch die Fähigkeit mit 21 gelöstem Fibrinogen zu interagieren. So könnten sie zu einem GPIIb/GPIIIa-Bridging führen und zu einer weiteren Thrombozytenadhäsion beitragen[64, 80]. Wie Diamant berichtete hatte die klinische Situation der Patienten in einigen Studien einen großen Einfluss auf das Ergebnis der Gerinnung unter Laborbedingungen [54]. Dafür führte er das Beispiel von zwei Studien an. Einerseits wurde gezeigt, dass Antikörper gegen Faktor VII oder TF in Patienten mit Meningokokkensepsis und disseminierter intravasaler Gerinnung die Thrombinbildung unterbinden konnten [81]. Anderseits konnte mit keinem dieser Antikörper das gleiche Resultat in gesunden Probanden erreicht werden[54]. Es ist noch nicht klar, ob MP auch im menschlichen Körper so reagieren wie unter Laborbedingungen, jedoch scheint es als würden sie auch in vivo klinisch relevant sein. Es konnten wie von Diamant[54] angeführt mehrere Gründe dafür gefunden werden. Erstens wurde nachgewiesen, dass MP in vitro die Blutgerinnung unterschiedlicher Patientengruppen fördert[74, 81, 82]. Zweitens, dass erhöhte Werte von in vivo Gerinnungsmarkern wie Prothrombin Fragment F1+ F2 und Thrombin-Antithrombin-Komplex mit MP vorkommen, die TF an ihrer Oberfläche präsentieren. Drittens, dass thrombembolische Komplikationen einhergehen mit einer erhöhten Anzahl von MP[83, 84, 85, 86]. Viertens, in äußerst seltenen Erkrankungen mit einer verlängerten Blutgerinnung, konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an zirkulierenden MP erniedrigt ist [87, 88, 89]. Als ein Beispiel dafür kann das Scott Syndrom herangezogen werden. Auf den von Thrombozyten stammenden MP findet man wie schon in der Einführung erwähnt Phosphatidylserin. Jedoch beinhalten nicht nur diese, sondern auch von Monozyten, Leukozyten und Endothelzellen stammende Mikropartikel(MMP,LMP,EMP)dieses Phospholipid an ihrer Oberfläche [61]. PMP können mit ihren Glykoproteinen, die als Rezeptoren dienen, an passende Liganden binden und somit gerinnungsfördernd wirken [90]. Weiters können PMP noch an gelöstes und gebundenes Fibrinogen binden und mit Thrombozyten aggregieren[91]. Zirkulierende MP können auch weitere Moleküle an ihrer Oberfläche präsentieren, welche zur Gerinnung beitragen, wie vWF und E-Selectin [92]. MMP können über P-Selectin an aktivierte Thrombozyten binden und könnten daher an der Entstehung von Thrombosen mitbeteiligt sein [93]. 22 5.3 Kalibrierte Automatisierte Thrombingenerationsmessung 5.3.1 Einführung In den Artikeln von Hemket et al.[94, 95, 96, 97] finden sich folgende Aussagen. Die Bestimmung einer Thrombingeneration ist keine neue Errungenschaft. Sie wurde schon in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts angewandt wie in der Studie von Macfarlane und Biggs [98]. Aufgrund der aufwändigen und technisch schwierigen Messmethode wurde dieses Verfahren bisher nur selten angewandt. Ein geübter Laborangestellter braucht bei der herkömmlichen Subsampling Technik ungefähr eine Stunde um ein bis vier Thrombogramme darzustellen. Mit der neu entwickelten Messmethodik von Hemker et al. können im Vergleich dazu durch Automatisierungsprozesse bis zu 100 Proben pro Stunde ausgewertet werden[97, 96]. Damit stehen der Forschung neue Möglichkeiten zur Verfügung um die Rolle des Thrombins in diversen Prozessen der Hämostase oder anderen Erkrankungen zu untersuchen. Besonders im Bereich der Hämostase ergibt sich eine neue Alternative zu den herkömmlichen Methoden. Die Messung der Thrombingenerierung, dem Schlüsselenzym der Hämostase reflektiert nicht nur Einzelfaktoren sondern die „Overall-Function“. Die größte Menge des gebildeten Thrombins tritt erst nach der Lag-Time auf, der Zeitspanne, die in der Routinediagnostik mittels apTT erfasst wird [98]. Daher stellt sich die Frage, welche Rolle dieser Anteil des Thrombin im menschlichen Körper spielt und an welchen pathophysiologischen Prozessen er beteiligt ist. Faktorenmangelzustände, KHK oder gerinnungsaktive Medikamente und ihr Einfluss auf die Thrombingeneration sind derzeit Gegenstand aktueller Untersuchungen. Nachdem wie schon dargestellt Thrombin eine Schlüsselrolle in der Gerinnung spielt, birgt die Thrombingenerationsmessung das Potential in sich eine Abschätzung der gesamten Gerinnung zu geben, welche es in einem einzelnen Verfahren bisher noch nicht gibt. Derzeit existieren für verschiedene Aspekte der Gerinnung verschiedene Tests. Weiters können herkömmliche Gerinnungstests nicht das thrombotische Risiko einer unbekannten Ursache oder hämostatischer Veränderungen milder Ausprägung abschätzen. Wie Roschitz et al. [99] in einer Studie feststellten, eignen sich PFA-100 (platelet function analyzer) und aPPT nicht zur routinemäßigen präoperativen Erfassung einer präexistenten Blutungsneigung, sondern sollte erst bei Verdacht auf Gerinnungsdefekte eingesetzt werden. Hier soll in keinem Fall die Leistung der herkömmlichen Gerinnungstests geschmälert werden, viel mehr soll gezeigt werden, dass es im Bereich der Hämostase noch immer keine adäquate Darstellung der Prozesse gibt und es daher noch Bedarf für die Entwicklung von Methoden zur Diagnose, Kontrolle und Therapie in diesen Bereichen gibt. Die Thrombingeneration kann prinzipiell in thrombozytenarmen Plasma (PPP), thrombozytenreichem Plasma (PRP) und Vollblut bestimmt werden. Mit jedem Schritt, in dem weitere Aspekte der Hämostase in die Untersuchung eingeschlossen werden, wird die Aussage repräsentativer für die Situation in vivo. Jedoch nimmt der technische Aufwand zur Bestimmung zu und unsere Fähigkeit des analytischen Verständnisses ab. Die ursprünglichen Bestimmungsmethoden wie bei Biggs et al. [98] wurden per Hand 23 mit wenig automatisierten Prozessen durchgeführt und waren daher sehr aufwändig. Das Beifügen eines chromogenen Substrates von Thrombin, also einer Vorstufe eines Farbstoffes der bei Aktivierung sich in einen Farbstoff verwandelt, ermöglichte es die Probenzeit automatisch und die Thrombinaktivität halbautomatisch zu erheben. Daher konnte der Aufwand reduziert werden und mehrere Untersuchungen nebeneinander durchgeführt werden. Damit das Areal unter der Thrombogrammkurve, auch als endogenes Thrombinpotential (ETP) bezeichnet, dem umgewandelten Thrombinsubstrat entspricht, muss es in größeren Mengen zugefügt werden, weil die Konzentration von freiem Thrombin im Plasma durch Inaktivierung und anderen Interaktionsprozessen sehr schnell abnimmt. Die konstante Thrombinaktivität ermöglicht es daher nicht den Substanzverbrauch zu messen. Eine Möglichkeit dies trotzdem zu erreichen, ist a2-Makroglobulin zu verwenden. Es bindet Thrombin und bildet einen Komplex (a2MT), so dass es zu keiner weiteren Spaltung von physiologischen Substraten kommt. Dadurch kann das Problem des Substratverbrauchs gelöst werden (siehe unten). A2MT und das freie Thrombin bilden hier die gesamte amidolytische Aktivität während der Thrombingeneration. Die Geschwindigkeit der Bildung von a2MT kann herangezogen werden um die Konzentration von Thrombin widerzuspiegeln und ist daher proportional mit dem ETP. Als nächstes ist es wichtig eine chromogene Substanz zu finden, die auch in gerinnendem Plasma korrekt gemessen werden kann. Einige dieser Substanzen hemmen die Thrombinbildung durch ihre Bindung so sehr, dass die Thrombingenerierung nicht mehr mit den Prozessen in vivo gleichgesetzt werden kann. Diese Wirkung erreichen sie als starke Thrombininhibitoren und indem thrombinabhängige Prozesse in der Hämostase und Feedback Regulationsprozesse verfälscht werden. Es gibt jedoch chromogene Substrate, die nur unwesentlich mit der Thrombinbildung interferieren. Sie verdrängen aber plasmatische Antithrombine und verlängern das ETP durch eine verlangsamte Inaktivierung. Daher wird der Abfall von Thrombin dadurch verlängert. Dieser Effekt kann durch Berechnungen und Kalkulationen ausgeglichen werden. Jetzt ist es möglich, die Thrombingeneration anhand eines photometrischen Signals zu messen. Diese Messung ist abhängig von der optischen Dichte des Plasmas. Dieses wiederum verändert sich mit Eintritt der Gerinnung. Daher müssen bei Messungen mit chromogenen Substraten fibrinogenfreies und thrombozytenfreies Plasma verwendet werden. Da Fibrinogen und Thrombozyten essentielle Bestandteile der Gerinnung sind, führt es auch zu einer Verringerung der Aussagekraft für in vivo Prozesse. Durch die Verwendung einer fluoreszierenden Substanz spielt die Trübung des Substrats keine wesentliche Rolle mehr. Jedoch entstehen wieder neue Hindernisse wie der „Inner-Filter-Effekt“. Damit wird bezeichnet, dass das gemessene Signal nicht nur von der Konzentration des gebildeten Fluoreszenzsubstrats abhängt, sondern auch noch von anderen Licht absorbierenden Molekülen. Besonders problematisch wird dies im Plasma. Es gibt eine große Variationsbreite des gemessen Signals zwischen Plasma und Puffer ( 65 %) und selbst zwischen zwei Plasmen ( 15 %)[100, 101]. Daher kann die Standardisierung der Reaktionsgeschwindigkeit nicht durch einen Vergleich erfolgen. Deshalb gibt es auch keinen fixen Faktor mit dem das gemessene Signal multipliziert werden muss, um aus dem ETP die tatsächliche Konzentration des Thrombins zu gewinnen. 24 Das gemessene Signal reagiert des weiteren auch sehr sensitiv auf plasmatische Farbveränderungen wie bei minimaler Hämolyse, das Alter der verwendeten Lichtquelle und vieles mehr. Daher muss jede Probe individuell mit dem gleichen Plasma kalibriert werden. Es wird jedem Plasma einer Probe in einer zweiten Probe eine festgelegte Konzentration von konstanter Thrombinaktivität beigefügt. Als Kalibrator hierfür wird a2MT herangezogen. Daher kann der Kalibrierungsfaktor von der gebildeten Kurve abgelesen werden und so auf die Thrombingeneration in der anderen Probe geschlossen werden. Diese Automatisierung ermöglicht eine weniger aufwändigere und damit leichtere beziehungsweise zeitsparendere Bestimmung der Thrombingenerierung. Der Unterschied der KAT zu vorherigen Methoden liegt in der eben dargestellten Kalibrierung. Durch sie wurde erkannt, dass die Kalibrierungskonstante nicht linear ist, sondern durch den Substratverbrauch und Inner-Filter-Effekt und damit durch die Menge des Fluoreszenzsubstrats zu jedem Messpunkt unterschiedlich ist und ein eigener Kalibrierungsfaktor für jeden dieser Zeitpunkte herangezogen werden muss. Die Thrombingenerationsmessung scheint auch altersabhängig zu sein. Wie Haidl et al. [102] in ihrer Studie nachgewiesen haben. Dazu wurden jeweils drei Gruppen von Kindern und Jugendlichen zu einer erwachsenen Gruppe mittels KAT verglichen. Es wurde nach dem Alter eingeteilt: die erste Gruppe bestand aus 0,5 bis 6 Jährigen. Die zweite aus 7 bis 10 Jährigen und die letzte aus 12 bis 17 Jährigen. Die Gruppe der Erwachsenen wurde nochmals in junge Erwachsene von 18 bis 35 Jahren und ältere Erwachsene von über 35 Jahren unterteilt. Alle drei Gruppen hatten im Vergleich zu den Erwachsenen ein signifikant verringertes ETP. Die Lag-Time war in den ersten beiden Gruppen signifikant länger als die der Erwachsenen. Es gab außerdem signifikante Unterschiede zwischen den beiden Erwachsenen Gruppen. Das Alter der Patienten korrelierte mit dem ETP und Peakwert und die Lag-Time wies eine negative Korrelation auf. Daher haben sie gezeigt, dass die Thrombingeneration auch altersabhängig ist. Die in Kindern physiologisch vorkommenden verringerten Prothrombinspiegel und erhöhten Antithrombinspiegel werden von ihnen als eine Erklärung für das verminderte ETP bei Kindern und Jugendlichen herangezogen. Falls ein erhöhtes ETP ein Risikofaktor für Thrombose ist, könnte das ETP die während des Lebens erworbenen Risikofaktoren widerspiegeln. Dies zeigt, dass Alter ein nicht zu übersehender Einflussfaktor auf die Thrombingeneration ist und in der Analyse miteinbezogen werden sollte. Die Probandengruppe in unserer Studie besteht auch aus Kindern und Jugendlichen von 0 bis zu 19 Jahren. Daher würden der Einfluss von zusätzlich über die Jahre akkumulierter Risikofaktoren reduziert und der unmittelbare Effekt von Diabetes auf die Thrombingeneration in diesen Probanden ersichtlicher. 25 5.3.2 Form des Thrombogramms Im Folgenden wird hier die Kurve des Thrombogramms nach Hemker et al. [94, 97, 95] beschrieben (Beispiel Abb. 2 [103]). Es kann grundsätzlich in drei verschiedene Phasen eingeteilt werden: erstens die LagTime, zweitens die Produktionsphase und drittens die Rückbildungsphase. Die Grundstruktur der drei Phasen und damit die Form des Thrombogramms sind unabhängig von der Messmethode und den Experimentbedingungen. Am Beginn in der Lag-Time kommt es nur zu einer geringen Produktion von Thrombin, jedoch wird gleichzeitig mit den kleinsten Spuren von Thrombin auch Fibrin gebildet. Am Ende dieser ersten Phasen kommt es zur Gerinnung, daher ist auch die Blutgerinnungszeit ein guter Parameter um die Lag-Time abzuschätzen und umgekehrt. In dieser Phase der geringen Thrombingenerierung kommt es zur Vorbereitung auf einen rapiden Thrombinanstieg durch Aktivierung einzelner oder mehrerer der Faktoren V,VIII, XI und der Thrombozyten [104, 105]. Die erste Phase und die zweite Phase müssen getrennt voneinander betrachtet werden, weil ihnen anscheinend zwei verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. Ein angeführtes Beispiel ist das Lupus-Antikoagulans („LAC-Paradoxon“). Es erhöht einerseits die Dauer der Lag-Time, damit auch die Blutgerinnungszeit. Andererseits kommt es trotzdem zu einer vermehrten Thrombingeneration. Daher kann auch durch Ergebnisse aus der Lag-Time nicht automatisch auf die Produktionsphase geschlossen werden. Nach der Lag-Time kommt es zu einem massiven und rapiden Anstieg des Thrombins bis zu einem Spitzenwert (Peak). Die Inaktivierung von Thrombin durch die plasmatischen Antithrombine erfolgt kontinuierlich von Beginn der ersten Thrombinkonzentration in der Lag-Time bis zum Ende des Thrombogramms. Die Geschwindigkeit der Inaktivierung ist dabei abhängig vom auftretenden Thrombin und ist zum Zeitpunkt des Thrombinpeak gleich der Thrombinproduktion. Von da an nimmt die Inaktivierung überhand und während des Thrombinrückgangs kommt es irgendwann zum Stopp der Thrombinproduktion. Abbildung 2: Form des Thrombogramms Das ETP ist das Areal unter der Kurve und entspricht dem gesamten gebildeten Thrombin. Der Hauptteil des Thrombins wird, wie schon besprochen, in der zweiten und dritten Phase gebildet und daher nehmen diese Phasen den größten Einfluss auf das ETP. Das ETP ist ein neuer und sehr wichtiger Parameter im Thrombogramm. Wie beim LAC Paradoxon schon erwähnt, ist das ETP erhöht und die Blutgerinnungszeit verkürzt, jedoch scheint es, als würde das ETP für die thrombotische Tendenz verant26 wortlich zu sein, wie bei diesen Patienten. Andererseits ist die Thrombingenerierung bei Patienten mit Gerinnungsfaktorenmangel auch erniedrigt. Ein mitbestimmender Grund für den Zusammenhang von ETP und erhöhter Blutungstendenz könnte sein, dass die Höhe des gebildeten Thrombins auch die Stärke der Fibrinolyse über die Bildung des thrombinaktivierten Fibrinolyse Inhibitors mitbestimmt [106]. 5.3.3 Eine neue Sicht der Hämostase? Wie Hemker et al. [94] darstellt gibt es verschiedene Sichtweisen im Bezug auf die Gerinnung im menschlichen Körper. Einerseits das vorherrschende Schema, dass als initialen Schritt der Gerinnung Thrombozyten den Gewebedefekt verschließen und in weiterer Folge die Gerinnungskaskade in Gang gesetzt wird. Es werden Faktor XI, IX, VIII und X aktiviert. Faktor Xa mit Va wandelt dann Prothrombin unter Einfluss von Ca2+ in Thrombin um und dieses spaltet Fibrinogen zu Fibrinogenmonomeren. Dadurch entsteht ein Fibrinnetz, welches die Thrombozyten fest verankert und ein Gerinnungsthrombus entsteht. Der erste Schritt wird von der Blutungszeit erfasst und der zweite durch die Blutgerinnungszeit. Dieses „Lehrbuchwissen“, begründet sich auf der Beobachtung, dass es in bestimmten Erkrankungen Unterschiede zwischen den beiden gemessenen Zeiten gibt. Hämophiliepatienten haben zwar eine normale Blutungszeit aber eine verlängerte Blutgerinnungszeit und bei Thrombozytopenie oder -pathie Patienten ist es umgekehrt. Andererseits gab es auch schon früher andere Beobachtungen, welche in eine andere Richtung wiesen und die gängige Meinung in Frage gestellt haben. Als Beispiel dafür wird der Einfluss von oralen Antikoagulantien und Heparin auf die Blutungszeit herangezogen. Bei einer Überdosierung dieser Medikamente ist die Thrombingenerierung (= Thrombingeneration) betroffen und gleichzeitig kommt es zu einer Verlängerung der Blutungszeit. Weiters beziehen sie sich auf Experimente der Furiegruppe. In diesem bildet sich nach 10 bis 15 Sekunden nach einem gesetzten Mikrotrauma in kleinen Gefäßen bei Mäusen Fibrin [107]. Bei optimaler Konzentration von TF (Quick) gerinnt Plasma erst nach 12 Sekunden. Daher müsste in diesem Experiment Thrombin schon gleichzeitig mit den Thrombozytenaggregaten aufgetreten sein. Von dieser Beobachtung ausgehend ziehen sie den Schluss, dass Thrombozyten und plasmatische Gerinnung nicht strikt voneinander zu trennen sind und schon von Beginn an miteinander zu einer Hämostase führen. Sie bekräftigen ihre Aussage, indem sie darauf hinweisen, dass es bisher kaum Studien gab, die die klassische Lehrmeinung unterstützen und in ihrer experimentellen Anordnung keine Trennung von Thrombozyten und plasmatischer Gerinnung durchführten. Üblicherweise wurden Thrombozyten in antikoaguliertem Blut oder plasmatische Gerinnung in thrombozytenfreiem Plasma untersucht. In Studien, in denen beides anwesend ist, gibt es zahlreiche Interaktionen. Dafür werden mehrere Indizien erwähnt. Erstens wurde Thrombin als stärkster Thrombozytenaktivator nachgewiesen [108] und zweitens besitzen, wie im Kapitel MP schon erwähnt, Thrombozyten Phospholipide an ihrer Membranoberfläche, die zu einer Thrombingenerierung führen [109]. Diese Interaktion stellt wohl eine der wichtigsten positiven Feedbackregulationen in der Hämostase dar und ist daher mitverantwortlich für ein schnelles Stoppen einer Blutung. Als nächstes wird die Vereinbarkeit mit der zuvor erwähnten Beobachtung bei Hämophilie Patienten ausgeführt. Hier gibt es Hinweise[109, 110], dass die Thrombingeneration in einem Faktor VIII und IX unabhängigen Weg gebildet wird, weil sie anfänglich auch durch zirkulierenden TF getriggert werden konnte[94]. Hemker et al. weisen weiters auf 27 Studien hin, die auch Anhaltspunkte liefern, dass die klare Abgrenzung zwischen dem Ursprung arterieller und venöser Thrombosen im Sinne von Thrombozytenaggregation und plasmatischer Gerinnung abgeschwächt zu betrachten ist. Es könnte sich eher um ein und die gleiche Ursache im Sinne einer gesamten hämostatischen Imbalance handeln. Die Erfassung der Thrombingeneration und im speziellen die KAT tragen das Potential einer Messung der gesamten Gerinnung in sich. Man kann daher auch im sogenannten PRP die oben genannte Interaktion zwischen Thrombozyten und plasmatischer Gerinnung miteinbeziehen. Zudem ist auch eine Bestimmung der individuellen Gerinnung möglich. 5.3.4 Thrombozytenarmes Plasma (PPP) In dem Artikel von Hemker et al.[94] und denen einiger anderer im Text gekennzeichneter Autoren finden sich folgende Aussagen. Da ein Großteil der gerinnungsfördernden Phospholipide auf der Oberfläche von Thrombozyten vorkommt, müssen sie in PPP beigefügt werden. Sie sind von wesentlicher Bedeutung für die Bildung von Prothrombinase durch Faktor Xa und Va[111] und Tenase durch IXa und VIIIa[112]. Wenn jedoch einmal eine Thrombingeneration in PPP auch ohne hinzugefügte Phospholipide ausgelöst werden kann, ist das meist auf Verunreinigung mit Thrombozytenteilchen zurückzuführen. Die beigefügte Menge der Phospholipide beträgt 4µM. Bei Konzentrationen von TF über 10pM werden die auf Faktor VIII, IX und XI basierenden Mechanismen der Gerinnung umgangen. Mit einer Konzentration von 2 bis 5 pM wird die Konzentration von Faktor VIII und IX eine bestimmende Einflussgröße aber nicht Faktor XI. Dessen Einfluss spielt bei geringeren Konzentrationen von unter 1 pM eine wichtige Rolle [113]. Die Inhibierung von ETP durch TM ist entscheidend von der TF Konzentration mitbeinflusst. Denn TM braucht TF als Interaktionspartner um überhaupt zur Aktivierung von Protein C beitragen zu können. Daher wird bei niedrigerer TF Konzentration auch der Anteil an TM abnehmen, der die Thrombingeneration hemmt und so auf 50 % hält. Bei Konzentrationen von über 10pM TF wird Thrombin so schnell generiert, dass es zu keiner ausreichenden Inhibierung von TM kommt. Trotz TF und TM Beimengung bleibt dies aber nur eine Annäherung und damit ein künstliches Konstrukt an die Situation in vivo, weil beide im gleichen Medium gelöst sind. In vivo ist TF in der Membran von Wunden zu finden und TM im intakten Endothel der Gefäße und damit getrennt voneinander. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist abhängig von chemischen Interaktionen und wird daher nicht durch Diffusion bestimmt. Aber zurzeit ist ein Versuchsaufbau, der diese zwei Faktoren miteinschließt, technisch noch nicht umsetzbar [94, 96]. Zusätzlich sollte beachtet werden, dass Nabelschnurplasma niedrigere Spiegel an TFPI und Antithrombin enthält. Dadurch kommt es im Vergleich mit Erwachsenenplasma bei gleicher TF Konzentration zu einer stärkeren Thrombingenerierung in Nabelschnurplasma, weil das Protein C System seine antikoagulative Wirkung nicht wie in Erwachsenen entfalten kann[114]. Weitere Bestimmungsmethoden sind die schon erwähnten in PRP und Whole Blood. Wobei jedes eine weitere Annäherung an die in vivo Situation ist. 28 6 Intention und Ziele der Studie Vaskuläre Folgeerkrankungen stellen eine häufige und wichtige Komplikation bei Diabetikern dar. Mikrovaskuläre Veränderung stehen dabei in Zusammenhang mit Endothelzellschädigung und Hyperkoagulabilität. MP sind in prokoagulatorische Prozesse involviert und bei verschiedenen vaskulären Erkrankungen erhöht, wie akutem Koronarsyndrom, thrombembolischen Erkrankungen oder Diabetes mellitus Typ 2. Dies könnte durch ihre prokoagulatorische Wirkung zu einem Fortschreiten der vaskulären Schädigung führen[115, 68]. Auf die Thrombingenerierung konnte bisher nur auf indirekte Weise von Gerinnungsparametern, wie F1+2 und TAT, geschlossen werden. Mit der Weiterentwicklung und Automatisierung der Technik zur direkten Messung der Thrombingeneration durch Hemker et al., ist es möglich diese mittels KAT auch direkt individuell nachzuweisen. Thrombin spielt eine Schlüsselrolle in der Hämostase und spiegelt einen Großteil dieser wider. Somit birgt die KAT das Potential einer Bestimmung der individuellen hämostatischen Balance[94]. Bisher konnte eine Studie bei Typ 2 Diabetikern eine Veränderung der Hämostase mittels KAT nachweisen[116]. Im Rahmen dieser Studie wollen wir untersuchen, ob in Patienten mit Typ 1 Diabetes im Kindes- und Jugendalter im Vergleich zu einer alters- und geschlechtsgematchten Kontrollgruppe Veränderungen in der MP-Konzentration und der Thrombingeneration bestehen, sowie ein Zusammenhang dieser mit Blutzuckerwerten besteht. Zusätzlich werden F1+2 und TAT als herkömmliche Marker der Gerinnungsaktivierung gemessen. Der Vorteil in dieser Patientenpopulation liegt in der geringeren Ausprägung der Komorbiditäten und dem Fehlen von chronischem Alkohol- und Nikotinabusus. Mit dem zusätzlichen Ausschluss von PatientInnen, die an diabetischen Folgeerkrankungen leiden, können die Auswirkungen von Typ 1 Diabetes auf das Gerinnungssystem unmittelbarer untersucht werden. 6.1 Fragestellung Hypothese: Patienten mit Typ 1 Diabetes im Kindes- und Jugendalter weisen signifikant erhöhte MP-Konzentrationen und Thrombingenerationsparameter auf im Vergleich zu Personen einer gesunden Kontrollgruppe. Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter der Typ 1 Diabetiker weisen eine positive Korrelation mit Blutzuckerwerten auf. Nullhypothese Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter weisen keinen signifikanten Unterschied bei Typ 1 Diabetikern im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe auf. Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter der Typ 1 Diabetiker weisen keine Korrelation mit Blutzuckerwerten auf. 29 6.2 Studiendesign Alle Diabetespatienten, die an der Ambulanz für Endokrinologie der Uni-Klinik für Kinder- und Jugendheilkunde Graz betreut werden, erscheinen zu jährlichen routinemäßigen Kontrolluntersuchungen. Während dieser werden die Patienten gemeinsam mit ihren Erziehungsberechtigten über die mögliche Teilnahme an unserer Studie informiert. Bei Interesse erfolgt ein ausführliches Aufklärungsgespräch über Art, Ablauf und Zweck der Studie sowie das Aushändigen und Besprechen der schriftlichen Information und der Einwilligungserklärung. Während dieser Studie wird durch die alljährliche routinemäßige Blutabnahme, keine zusätzliche Blutabnahme nötig. Es wird im gleichen Zug für die Studie maximal 6 ml venöses Citratblut entnommen. 7 Material und Methoden 7.1 Reagenzien und Substrate Fluopuffer enthält 20 mmol per Liter HEPES und 60 mg per ml Rinderserumalbumin (Sigma, St Louis, MO). Der Arbeitspuffer enthält 140 mmol per Liter NaCL (Merck, Darmstadt,Deutschland), 20 mmol pro Liter HEPES und 5 mg per ml Humanserumalbumin (Sigma). Das fluorogene Substrat Z-Gly-Gly-Arg-Amino-Methyl-Coumarin (Bachem, Bubendorf, Schweiz) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) von Sigma aufgelöst. Kalziumchlorid stammt von Merck . Das 5 pmol TF/L und 4 µmol Phospholipid/L enthaltende PPP sowie das TF freie MP-Reagenz mit dem gleichen Phospholipidgehalt wurde aus den Niederlanden bezogen (Thrombinsocope BV, Maastrich). Der ZYMUPHEN MP Activity Kit wurden von HYPHEN BioMed (ZAC Neuville Universite France) bezogen. 7.2 Blutabnahme und Aufbereitung für thrombozytenarmess Plasma (PPP) Die zur Blutabnahme benutzen Laborröhrchen (3ml) stammten von S-Monovette aus Sarstedt und enthielten 0.30ml 0.106 M Tri-Natrium-Citratlösung. Nach einer sauberen Blutabnahme an der Vena cephalica mittels einer 21 Gauge Nadel, ohne Blutstauung, wird das Citratblutröhrchen mit dem Blut der Probanden sofort in das Labor zur weiteren Aufbereitung geschickt. Die Aufbereitung erfolgte innerhalb einer Stunde. Zur Analyse des Blutbildes vor und nach der Herstellung des PPP wurde der Sysmer KX 21 Cell Counter verwendet. Mit der zweiten Messung nach Herstellung des PPP kann eine unerwünschte Verunreinigung mit Thrombozytenteilchen überprüft werden. Für die Herstellung des PPP, wurde das Blut der Probanden für 20 Minuten bei 1550 x g und Raumtemperatur ohne Unterbrechung zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und der Rest in aliquote Teile aufgeteilt (1ml), anschließend wird es schockgefroren (snap-frozen) und bei -80 Grad Celsius für die weiteren Analysen gelagert. 30 7.3 MP Bestimmung mittels ELISA Mittels Zymuphen MP Activity Kit kann die prokoagulative Aktivität von MP in humanem Plasma nachgewiesen werden. Dazu werden die verdünnten Proben in die Öffnungen der Mikroplatten gegeben, welche Annexin V und Streptavidin enthalten. MP binden , falls sie in der Probe vorhanden sind, Annexin V. Die Phospholipidoberfläche der MP ermöglicht einer Faktor Xa-Va Mischung im Beisein von Kalzium und Thrombininhibitoren die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin. Daher gibt es einen direkten Zusammenhang zwischen dem gemessenen Thrombin und Phospholipiden, die Phospholipidkonzentration ist der limitierende Faktor. Um MP zu erhalten wurde PPP bei 37 Grad Celsius aufgetaut und für 2 Minuten bei 1300 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Zur Fertigstellung der Proben wurde vorgegangen wie in der Herstellung beschrieben. Die MP-Konzentration wurde als Phophatidylserin Äquivalent in nM angegeben. 7.4 KAT Zur Messung der Thrombingeneration wird unter Standardbedingungen die KAT nach Hemker et al. eingesetzt[97]. Diese Methode basiert auf einer Umwandlung von Thrombin spezifischem Substrat Z-Gly-Gly-Arg-amino-methyl-coumarin. Es wurde für jedes Experiment ein Substrat aus 2625 µl Fluopuffer und 300 µl von 1 mol/L CaCl2 Lösung gemischt und für 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dann wird 75 µl der FluoDMSO untergemischt und für weitere 10 Minuten inkubiert. Die so entstandene klare Lösung wurde als FluCa bezeichnet. Die Thrombingenerierung jeder Probe wurde anhand der Herstellerempfehlung in PPP gemessen. Für jeden Probanden wurden zwei verschiedene Aktivierungsreagenzien genommen. Einmal mit einem TF Gehalt von 5 pm im PPP und einmal ohne TF-Zusatz im MP-Reagenz, beide enthalten 4 µm Phospholipide. Durch das Fehlen von TF in letzterem wird die Aktivierung der Thrombingeneration auf TF aus MP zurückgeführt. Die Messung wird so sensitiver auf MP. 80 µl von der Plasmaprobe und 20 µl des Aktivierungsreagenz wurden in eine Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wurde anschließend in den Fluorometer (Fluoroskan Ascent, Thermolabsytem OY, Helsinki, Finnland) gegeben und die Messung begann durch automatische Dispensierung von 20 µl des FluCa, welches das fluoreszierende Substrat enthält. Ein Thrombin Kalibrator wurde benutzt um die Variation zwischen den Proben und der Instrumente zu korrigieren. Die Reaktion des Plasma wurde durch TF auf den beiden zuvor dargestellten Wegen gestartet. Die Ergebnisse wurden mittels Analysesoftware von Thrombinoscope BV evaluiert. 7.5 Blutglukose-,Hba1c, TAT und F1+2-Bestimmung Die Analyse der venösen Blutproben zur Bestimmung der Blutglukose,Hba1c, TAT und F1+2- Werte erfolgte auf der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendheilkunde.Die Blutglukose wurde maschinell mittels HemoCueB-Glukosephotometer (Angelholm, Schweden) erhoben. Der Hba1c wurde maschinell mittels DCA 2000 Analyzer (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Deutschland) bestimmt. Zur Messung der TAT und F1+2 Werte wurden die ELISA-Systeme Enzygnost TAT und Enzygnost F1+2 (Dede Behring, Marburg, Deutschland) benutzt. Die venösen Blutbproben stammten ausschließlich aus der Diabetikergruppe. 31 7.6 Patienten Das Patientenkollektiv besteht aus 112 Typ 1 Diabetikern zwischen 0 und 19 Jahren, die zur routinemäßigen Kontrolle an der endokrinologischen Ambulanz der UniKlinik für Kinder- und Jugendheilkunde der Meduni Graz erscheinen. Nach Genehmigung der Ethikkommission (EKNO:21-480exD9/10) wird von allen einzuschließenden PatientInnen eine schriftliche Einwilligungserklärung ihrer Erziehungsberechtigten eingeholt. Einschlusskriterien waren das Alter zwischen 0-19 Jahre und die Typ 1 Form des Diabetes. Ausschlusskriterien waren fehlendes Einverständnis und diabetische Folgeerkrankungen. Insgesamt wurden während der ohnehin für die alljährliche Kontrolle benötigten Blutabnahme maximal 6 ml Citratblut ausschließlich zu Studienzwecken entnommen. Diese wurden mit einer alters- und geschlechtsgematchten Kontrollgruppe bestehend aus 94 Probanden verglichen. 8 Ergebnisse und Resultate 8.1 Vergleich: Diabetesgruppe mit Kontrollgruppe Im Vergleich der 112 Personen umfassenden Diabetesgruppe mit der aus 94 Personen besthenden Kontrollgruppe kam es zu einer signifikanten Verringerung von Lag-Time, ttPeak und ETP sowohl nach Aktivierung mit 5 pM TF als auch im TF freien MPReagenz. Diabetesgruppe Bei der Diabetikergruppe beträgt im TF beinhaltenden Reagenz der Mittelwert des ETPs 1351,83 nM ∗ min, die Standardabweichung 238,90 nM ∗ min und der Standardfehler 22,57 nM ∗ min. Die Lag-Time, der ttPeak und TAT waren nicht Normalverteilt und wurden nicht mittels T-Test sonder mittels Man-Whitney-U-Test berrechnet (Abb. 4). Im TF freien Reagenz beträgt der Mittelwert des ETPs bei den Diabetikern 1321,45 nM ∗ min, die Standardabweichung 230,99 nM ∗ Min und der Standardfehler 21,83 nM ∗ min (Abb. 5). Die Lag-Time wies einen Mittelwert von 6,50 min, eine Standardabweichung von 1,20 min und einen Standardfehler von 0,11 min auf. Die ttPeak hatte einen Mittelwert von 8,01 min, eine Standardabweichung von 1,22 min und einen Standardfehler von 0,12 min.(Tabelle 1) Kontrollgruppe Die Kontrollgruppe wies im TF beinhaltenden Reagenz einen Mittelwert des ETPs von 1441,35 nM ∗ min, eine Standardabweichung von 325,70 und einen Standardfehler von 33,59 auf. Im TF freien Reagenz beträgt der Mittelwert des ETPs 1402,52 nM ∗ min, die Standardabweichung 298,22 nM ∗ min und der Standardfehler 31,09 nM ∗ min. Die Lag-Time hatte einen Mittelwert von 7,06 min, eine Standardabweichung von 1,57 min und einen Standardfehler von 0,16 min. Die ttPeak wies einen Mittelwert von 8,60 min, eine Standardabweichung von 1,59 min und einen Standardfehler von 0,17 min auf. (Tabelle 1) 32 T-Test und Levene-Test Der Levene-Test der Varianzengleichheit wies eine Signifkanz von <0,001 fürs ETP im TF freien Reagenz auf. Im TF beinhaltenden Reagenz betrug die Signifikanz fürs ETP 0,006, für die Lag-Time 0,021 und für die ttPeak 0,024. Beim T-Test zeigte sich für das ETP im TF freien Reagenz eine Signifikanz von 0,028 und im TF beinhaltenden Reagenz von 0,034. Die Signifikanz der Lag-Time im TF freien Reagenz betrug 0,05, die des ttPeaks 0,04. (Tabelle 2 und Tabelle 3) Mann-Whitney-U-Test Im Vergleich der beiden Gruppen war ein Unterschied der Lag-Time und des ttPeaks mit einer Signifikanz von <0,001 im TF beinhaltenden Reagenz erkennbar. Die TAT Werte wiesen eine Signifikanz von 0,042 auf. Hingegen kam es zu keinem Signifikanten Unterschied in der Verteilung der MP und F1+2 zwischen der Diabetes und Kontrollgruppe.(Abbildung 3) Gruppenstatistiken Gruppe ETP nM∗min Peak nM Diabetiker Kontrolle Diabetiker Kontrolle Lagtime MP Diabetiker min ETP MP nM∗min Peak MP nM ttPeak MP min Kontrolle Diabetiker Kontrolle Diabetiker Kontrolle Diabetiker Kontrolle 112 1351,83 Standardfehler des Mittelwertes 238,90 22,57 94 1441,35 325,70 33,59 112 373,97 59,54 5,63 94 392,03 63,15 6,51 112 6,50 1,20 ,11375 92 7,06 1,57 ,16 112 1321,45 230,99 21,83 92 1402,52 298,22 31,09 112 419,01 65,07 6,15 92 436,60 64,80 6,76 112 8,01 1,22 ,12 92 8,60 1,59 ,17 N Mittelwert Standardabweichung Tabelle 1: Diabetiker vs Kontrolle 33 Test bei unabhängigen Stichproben Levene-Test der Varianzgleichheit F ETP Varianzen sind gleich T-Test für die Mittelwertgleichheit Signifikanz 13,162 T ,000 Varianzen sind nicht gleich Peak ,001 Varianzen sind gleich ,980 Varianzen sind nicht gleich Lagtime MP Varianzen sind gleich 5,454 ,021 Varianzen sind nicht gleich ETP MP Varianzen sind gleich 7,714 ,006 Varianzen sind nicht gleich Peak MP ,031 Varianzen sind gleich ,860 Varianzen sind nicht gleich ttPeak MP Varianzen sind gleich 5,149 ,024 Varianzen sind nicht gleich df -2,27 204 -2,21 167,36 -2,11 204 -2,10 193,35 -2,93 202 -2,86 168,22 -2,19 202 -2,13 169,12 -1,93 202 -1,93 194,68 -2,97 202 -2,90 168,49 Tabelle 2: Diabetiker vs Kontrolle Test bei unabhängigen Stichproben ETP Peak Varianzen sind gleich T-Test für die Mittelwertgleichheit Mittlere Standardfehler Sig. (2-seitig) Differenz der Differenz ,024 -89,52 39,42 Varianzen sind nicht gleich ,028 -89,52 40,47 Varianzen sind gleich ,036 -18,06 8,56 Varianzen sind nicht gleich ,037 -18,06 8,61 ,004 -,57 ,19 Varianzen sind nicht gleich ,005 -,57 ,20 Varianzen sind gleich ,030 -81,07 37,06 Varianzen sind nicht gleich ,034 -81,07 37,99 Varianzen sind gleich ,056 -17,59 9,14 Varianzen sind nicht gleich ,056 -17,59 9,13 Varianzen sind gleich ,003 -,59 ,20 Varianzen sind nicht gleich ,004 -,59 ,20 LagtimeMP Varianzen sind gleich ETPMP PeakMP ttPeakMP Tabelle 3: Diabetiker vs Kontrolle 34 Test bei unabhängigen Stichproben T-Test für die Mittelwertgleichheit 95% Konfidenzintervall der Differenz Untere Obere ETP Peak Varianzen sind gleich -167,24 -11,80 Varianzen sind nicht gleich -169,43 -9,62 Varianzen sind gleich -34,95 -1,18 Varianzen sind nicht gleich -35,04 -1,09 -,95 -,19 -,96 -,18 Varianzen sind gleich -154,15 -7,99 Varianzen sind nicht gleich -156,06 -6,08 Varianzen sind gleich -35,61 ,43 Varianzen sind nicht gleich -35,61 ,42 Varianzen sind gleich -,97 -,20 Varianzen sind nicht gleich -,98 -,19 LagtimeMP Varianzen sind gleich Varianzen sind nicht gleich ETPMP PeakMP ttPeakMP Tabelle 4: Diabetiker vs Kontrolle Abbildung 3: Diabetiker vs Kontrolle 35 Abbildung 4: ETP Abbildung 5: ETP-Mikropartikel 36 8.2 Altersvergleich der Diabetikergruppe Die Diabetikergruppe wurde nochmals aufgeteilt in 0-9 Jährige und 10-19 Jährige und miteinander verglichen. Dabei beobachteten wir bei der Gruppe der 10-19 Jährigen eine nicht signifikante Erhöhung des Peak und ETP mit einer Verringerung von ttPeak und Lag-time im TF beinhaltende und freiem Reagenz. Levene-Test und T-Test Der Levene-Test wies für das ETP eine Signifikanz von 0,31 und für den Peak von 0,07 im TF beihaltenden Reagenz auf. Im TF freien Reagenz betrug der Signifikanzwert des ETPs 0,14, der des Peaks 0,15, der der ttPeak 0,26 und der der Lag-Time 0,33. Im T-Test zeigte sich im TF beinhaltenden Reagenz mit Signifikanzwerten von 0,16 fürs ETP und 0,05 für den Peak kein signifikanter Unterschied. Im TF freien Reagenz verhielt es sich mit Signifikanzwerten von 0,36 fürs ETP, von 0,14 für den Peak, von 0,33 für die Lag-Time und von 0,32 für die ttPeak ebenso.(Tabelle 6 und 7) Mann-Whitney-U-Test Die Lag-Time und der ttPeak im TF freien Reagenz sind mit Werten von 0,378 und 0,146 statistisch nicht signifkant Unterschiedlich in den beiden Altersgruppen. (Abbildung 6) Gruppenstatistiken Alter<10 20 1284,27 Standardabweichung 188,05 Alter>9 92 1366,51 246,99 25,75 Alter<10 20 350,76 41,27 9,23 Alter>9 92 379,01 61,84 6,45 Alter<10 20 6,73 1,03 ,23 Alter>9 92 6,45 1,24 ,13 Alter<10 20 1278,43 165,60 37,03 Alter>9 92 1330,80 242,62 25,29 Alter<10 20 399,49 49,11 10,98 Alter>9 92 423,25 67,52 7,04 Alter<10 20 8,25 1,02 ,23 Alter>9 92 7,95 1,26 ,13 Alter<10 23 130,02 44,67 9,31 Alter>9 95 138,90 45,52 4,67 Alter ETP nM∗min Peak nM Lagtime MP min ETP MP nM∗min Peak MP nM ttPeak MP min F1u2 nmol/L N Mittelwert Standardfehler des Mittelwertes 42,05 Tabelle 5: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM Gruppenstatistik Der Mittelwert des ETPs im TF beinhaltenden Reagenz ist in der Gruppe der 0-9 Jährigen mit 1284,27 nM ∗ min im Vergleich zu 1366,51 nM ∗ min in der Gruppe der 10-19 Jährigen erniedrigt. Ebenso ist der Mittelwet des Peaks im TF beinhaltenden Reagenz mit 350,76 nM der 0-9 Jährigen niedriger als der der 10-19 Jährigen. 37 Im TF freien Reagenz sind die Mittelwerte der jüngeren Diabetiker ebenfalls mit 1278,43 zu 1330,80 nM ∗ min beim ETP und mit 399,49 zu 423,25 nM beim Peak niedriger als die der älteren Gruppe. Hingegen ist die Lag-Time und die ttPeak mit 6,73 zu 6,45 min und mit 8,25 zu 7,95 min in der Gruppe der 0-9 Jährigen erhöht. (Tabelle 5) Test bei unabhängigen Stichproben Levene-Test der Varianzgleichheit F Signifikanz ETP Varianzen Varianzen gleich Peak Varianzen Varianzen gleich LagtimeMP Varianzen Varianzen gleich ETPMP Varianzen Varianzen gleich PeakMP Varianzen Varianzen gleich ttPeakMP Varianzen Varianzen gleich F1u2 Varianzen Varianzen gleich sind gleich sind nicht 1,06 sind gleich sind nicht 3,39 sind gleich sind nicht ,96 sind gleich sind nicht 2,24 sind gleich sind nicht 2,08 sind gleich sind nicht 1,27 sind gleich sind nicht ,21 ,31 ,07 ,33 ,14 ,15 ,26 ,65 Tabelle 6: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM 38 T-Test für die Mittelwertgleichheit T df -1,40 110 -1,67 34,90 -1,95 110 -2,51 40,08 ,97 110 1,09 32,14 -,92 110 -1,17 39,09 -1,49 110 -1,82 36,54 ,99 110 1,14 33,10 -,84 116 -,853 33,951 ETP Varianzen sind gleich Peak T-Test für die Mittelwertgleichheit Mittlere Standardfehler Sig. (2-seitig) Differenz der Differenz ,16 -82,25 58,68 Varianzen sind nicht gleich ,10 -82,25 49,31 Varianzen sind gleich ,05 -28,25 14,51 Varianzen sind nicht gleich ,02 -28,25 11,26 ,33 ,29 ,30 Varianzen sind nicht gleich ,28 ,28850 ,26 Varianzen sind gleich ,36 -52,37 57,03 Varianzen sind nicht gleich ,25 -52,37 44,84 Varianzen sind gleich ,14 -23,76 15,97 Varianzen sind nicht gleich ,08 -23,76 13,04 Varianzen sind gleich ,32 ,30 ,30 Varianzen sind nicht gleich ,26 ,30 ,26 Varianzen sind gleich ,40 -8,89 10,54 Varianzen sind nicht gleich ,40 -8,89 10,42 LagtimeMP Varianzen sind gleich ETPMP PeakMP ttPeakMP F1u2 Tabelle 7: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM Test bei unabhängigen Stichproben T-Test für die Mittelwertgleichheit 95% Konfidenzintervall der Differenz Untere Obere ETP Peak Varianzen sind gleich -198,55 34,05 Varianzen sind nicht gleich -182,36 17,86 Varianzen sind gleich -57 ,50 Varianzen sind nicht gleich -51 -5,50 -,30 ,88 -,25 ,83 Varianzen sind gleich -165,39 60,65 Varianzen sind nicht gleich -143,07 38,32 Varianzen sind gleich -55,40 7,88 Varianzen sind nicht gleich -50,20 2,68 Varianzen sind gleich -,30 ,90 Varianzen sind nicht gleich -,24 ,83 Varianzen sind gleich -29,77 12 Varianzen sind nicht gleich -30,06 12,29 LagtimeMP Varianzen sind gleich Varianzen sind nicht gleich ETPMP PeakMP ttPeakMP F1u2 Tabelle 8: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM 39 Abbildung 6: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM 8.3 Korrelationsanalyse Abschließend haben wir die Hba1c- und die Blutglukosewerte in der Diabetesgruppe mit den KAT Parametern in beiden Reagenzien einer Korrelationsanalyse unterzogen. Dabei kam es zu einer statistisch signifikanten Korrelation des Peak und ETP mit Hba1c in beiden Reagenzien. Abbildung 7: Korrelation: ETP und Hba1c, TF-Reagenz 40 Abbildung 8: Korrelation: Peak und Hba1c, TF-Reagenz TF Reagenz Die Korrelation nach Pearson betrug zwischen ETP und Hba1c 0,197 und ist auf einem Niveau von 0,05 signifikant. Zwischen Hba1c und dem Peak zeigte sich eine Korrelation von 0,304 nach Pearson und ist auf einem Niveau von 0,01 signifikant. (Tabelle 9, Abb. 7 und Abb. 8) TF freie Reagenz Die Korrelation zwischen Hba1c und dem ETP beziehungsweise dem Peak wies einen Wert von 0,192 beim ETP und einen Wert von 0,307 beim Peak auf. Die Korrelation mit dem ETP ist auf einem Niveau von 0,05 und die Korrelation mit dem Peak ist auf einem Niveau von 0,01 signifikant. (Tabelle 9, 10, Abb. 9 und Abb. 10) 41 Abbildung 9: Korrelation: ETP und Hba1c, TF freies Reagenz Abbildung 10: Korrelation: Peak und Hba1c, TF freies Reagenz 42 Korrelationen Hba1c Hba1c BZ 1 ,346 ,000 ,197 ,037 ,304 ,001 ,192* ,042 119 119 112 112 112 ** ,346 ,000 1 ,067 -,016 ,051 ,479 ,866 ,591 119 119 112 112 112 1 ** ,815 ,000 ,942** ,000 N Signifikanz (2-seitig) N ETP * ,197 ,037 ,067 112 112 112 112 112 ,304 ,001 -,016 ** 1 ,866 ,815 ,000 ,814** ,000 112 112 112 112 112 ,192 ,042 ,051 ** ,814 ,000 1 ,591 ,942 ,000 ** 112 112 112 112 112 ,307 ,001 -,010 ** ,914 ,858 ,000 ** ,897 ,000 ,915** ,000 112 112 112 112 112 -,073 -,105 ,144 ,084 ,139 Signifikanz (2-seitig) ,444 ,269 ,131 ,376 ,142 N 112 112 112 112 112 -,122 -,078 ,130 -,158 ,069 Signifikanz (2-seitig) ,199 ,412 ,173 ,095 ,473 N 112 112 112 112 112 -,151 ,030 ,124 ,047 Signifikanz (2-seitig) ,113 ,751 ,194 -,244** ,010 N 112 112 112 112 112 -,163 ,033 ,116 ,043 Signifikanz (2-seitig) ,085 ,730 ,222 -,262** ,005 N 112 112 112 112 112 -,014 -,064 ,015 ,103 ,039 Signifikanz (2-seitig) ,880 ,486 ,874 ,279 ,682 N 119 119 112 112 112 Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N Peak Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ** N ETPMP Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) * N PeakMP Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ** N Lagtime ttPeak LagtimeMP ttPeakMP MPnmolL ETPMP ** Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Peak * Signifikanz (2-seitig) BZ ETP ** Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson ,479 **. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant. *. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant. Tabelle 9: BZ=Blutglukose 43 ,623 ,652 Korrelationen PeakMP Hba1c ** -,122 -,151 ,444 ,199 ,113 112 112 112 112 -,010 -,105 -,078 ,030 Signifikanz (2-seitig) ,914 ,269 ,412 ,751 N 112 112 112 112 ,858** ,000 ,144 ,130 ,124 ,131 ,173 ,194 112 112 112 112 ,897** ,000 ,084 -,158 ,376 ,095 -,244** ,010 112 112 112 112 ,915** ,000 ,139 ,069 ,047 ,142 ,473 ,623 112 112 112 112 1 ,115 -,025 -,049 ,228 ,794 ,606 Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N Peak Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N ETPMP Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N PeakMP Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) Lagtime ttPeak LagtimeMP ttPeakMP MPnmolL LagtimeMP -,073 N ETP ttPeak ,307 ,001 Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) BZ Lagtime N 112 112 112 112 Korrelation nach Pearson ,115 1 Signifikanz (2-seitig) ,228 ,845** ,000 ,491** ,000 N 112 112 112 112 -,025 1 ,723** ,000 Signifikanz (2-seitig) ,794 ,845** ,000 N 112 112 112 112 -,049 ,723** ,000 1 Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ,606 ,491** ,000 N 112 112 112 112 -,069 ** ** ,728 ,000 ,996** ,000 Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ,469 ,487 ,000 N 112 112 112 112 Korrelation nach Pearson ,070 ,162 ,028 -,109 Signifikanz (2-seitig) ,461 ,087 ,771 ,251 N 112 112 112 112 **. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant. Tabelle 10: BZ=Blutglukose 44 Korrelationen ttPeakMP Hba1c BZ ETP Peak -,163 -,014 Signifikanz (2-seitig) ,085 ,880 N 112 119 Korrelation nach Pearson ,033 -,064 Signifikanz (2-seitig) ,730 ,486 N 112 119 Korrelation nach Pearson ,116 ,015 Signifikanz (2-seitig) ,222 ,874 N 112 112 -,262** ,005 ,103 N 112 112 Korrelation nach Pearson ,043 ,039 Signifikanz (2-seitig) ,652 ,682 N 112 112 -,069 ,070 Signifikanz (2-seitig) ,469 ,461 N 112 112 ,487** ,000 ,162 112 112 ,728** ,000 ,028 112 112 ,996** ,000 -,109 112 112 1 -,118 Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ETPMP PeakMP Lagtime Korrelation nach Pearson Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N ttPeak Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N LagtimeMP Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) N ttPeakMP MPnmolL Korrelation nach Pearson ,279 ,087 ,771 ,251 ,216 Signifikanz (2-seitig) 112 112 -,118 1 N MPnmollL Korrelation nach Pearson Signifikanz (2-seitig) ,216 N 112 **. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant. Tabelle 11: BZ=Blutglukose 45 119 9 Diskussion Wie schon im Kapitel „Intention und Ziele“ angeführt, wollten wir mittels KAT und MP-Konzentration überprüfen, ob auch bei Typ 1 Diabetikern zwischen 0-19 Jahren eine veränderte Gerinnung nachgewiesen werden kann. Durch die geringere Ausprägung von Komorbiditäten und den Ausschluss von chronischem Nikotinkonsum und Alkoholkonsum kann der prokoagulatorische Effekt von Typ 1 Diabetes unmittelbarer gemessen werden. 9.1 Mikropartikel und Diabetes Wir haben uns eine signifikante Erhöhung der MP, sowie deutliche Veränderung der KAT Parameter erwartet, weil PMP und MMP in Patienten mit Typ 2 Diabetes im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht sind [117, 118, 59]. Weiters sind, wie schon im Kapitel 8.2.2 erwähnt, PMP an der Blutgerinnung beteiligt und wichtig für die Thrombozytenaktivität bei der Gerinnung. Daher könnten erhöhte Konzentrationen von PMP eine Imbalance der Hämostase hervorrufen und so zu einer Hyperkoagulabilität beitragen [119, 117]. In Diabetes sind kardiovaskuläre Schäden die häufigste Komplikation. In den nachfolgenden Studien konnten MP eine Rolle in kardiovaskulären pathophysiologischen Prozessen nachgewiesen werden. Daher scheint es als seien diese pathophysiologischen Prozesse auch für Diabetiker gültig. Eine Forschergruppe zeigte, dass PMP an Atherosklerose beteiligt sein könnte, denn unter atherosklerotischen Bedingungen wurden PMP, MMS und EMP vermehrt produziert[117, 120, 121]. In der Entstehung von Atherosklerose ist die Adhäsion der Monozyten an das Endothel ein wichtiger Bestandteil. Zytokine können in diesen Prozess eingreifen und die Adhäsionsmoleküle für Leukozyten hochregulieren. Solche Zytokine IL-1ß und TNFA werden in vitro bei Stimulation durch PMP von Monozyten und Endothelzellen vermehrt gebildet. Es konnte weiters gezeigt werden, dass PMP die Fähigkeit besitzen in die Interaktion zwischen Endothelzellen und Monozyten einzugreifen, da sie zu einer Erhöhung der Adhäsionsmoleküle an beiden Zellen führen [68, 122, 123]. Zirkulierende PMP konnten in Patienten mit kompliziertem Diabetes mellitus durch Thrombozytenaggregationshemmer reduziert werden[54, 124], was weiters nahe legt, dass sie in der Entstehung von Atherosklerose mitbeteiligt sind. Durch die Beobachtung der Korrelation zwischen EMP und dem Verlust der Elastizität von Arterien sowie dem umgekehrten Verhältnis zu Endothel Progenitor Zellen, welche für die Regeneration von Gefäßen von Bedeutung sind, wird diese Annahme unterstützt [57]. Auch konnte eine erhöhte Anzahl an EMP bei akutem Koronarsyndrom im Vergleich zu gesunden Patienten und stabiler Angina Pectoris nachgewiesen werden[84]. EMPThrombozyten Komplexe sind erhöht in koronarer Herzerkrankung[125]. Daraus kann auf den Status von Gefäßschäden und Entzündung geschlossen werden [56]. Der Risikofaktor Hypertonie für sich genommen ist auch begleitet von einer Erhöhung von EMP. Die Anzahl an EMP ging sogar mit der Ausprägung der Hypertonie einher, da sie in Patienten mit schwerer Hypertonie höher waren als mit leichter. Des weiteren korrelierten PMP, EMP und der Blutdruck[126]. 46 EMP sind außerdem noch mit der Elastizität arterieller Gefäße assoziiert. Bei Erniedrigung der Elastizität war die Anzahl der EMP erhöht, auch wenn der Blutdruck sich normalisierte [57, 127]. In der von uns durchgeführten Studie kam es bei der Gegenüberstellung der Diabetikergruppe mit der Kontrollgruppe zu einem überraschendem Ergebnis. Es konnte kein Unterschied in der Mikropartikelkonzentration zwischen beiden Gruppen festgestellt werden. Bisher wurden Veränderungen der MP-Konzentration in Patienten mit Spätfolgen nachgewiesen, wie im Folgenden angeführt. Bei Patienten mit diabetischen Komplikationen oder diabetischer Retinopathie korrelierte die Höhe der PMP- und MMP-Spiegel mit ihrer Ausprägung [117, 56]. Eine erhöhte Anzahl von EMP konnte in Patienten mit Typ1 Diabetes mit Albuminurie nachgewiesen werden[128]. In Diabetikern konnten erhöhte Werte von MMP gemessen werden, welche mit CD62P, CD63, PMP, P-Selektin und Retinopathie korrelieren [129]. PMP werden auch vermehrt in Patienten mit atherosklerotischen Komplikationen und Retinopathie freigesetzt [60, 57]. Es wurde zusätzlich nachgewiesen, dass die EMP-Spiegel als diagnostisches Kriterium für das Vorhandensein von Läsionen an Koronargefäßen herangezogen werden können. Ihre Signifikanz als Prädiktor ist sogar höher als einzelne Risikofaktoren, wie Dauer der Diabetes Erkrankung, Cholesterinspiegel oder Hypertonie [56, 60]. Jedoch ist noch nicht klar ob diese Ergebnisse auch in vivo gefunden werden. Erhöhte EMP-Werte bei diabetischen Patienten ohne AP Symptomatik korrelierten mit angiographisch nachgewiesenen Koronargefäßläsionen und können daher zu Identifizierung dieser Untergruppe von Diabetikern herangezogen werden [56]. Die Anzahl der zirkulierenden EMP in Diabetes war assoziiert mit noch nicht kalzifizierten Plaques und könnte zur Diagnostik von instabilen Plaques verwendet werden [130]. Zusätzlich bergen EMP auch das Potential ein sinnvoller frühzeitige Screening Parameter für endotheliale Dysfunktion und endotheliale Schäden bei Diabetikern zu sein [131]. Wie aus den vorherigen Ausführungen klar wird, kommt es zu einer Erhöhung der MP bei kardiovaskulären Schäden bei Diabetikern oder zu einer Erhöhung bei schon manifesten diabetischen Komplikationen. In der von uns durchgeführten Studie waren diabetische Spätfolgen ein Ausschlußkriterium für die Aufnahme in die Studie, da, wie angeführt, bisherige Erhöhungen der MP-Konzentration bei Diabetikern in Patientengruppen mit messbaren Gefäßveränderungen nachgewiesen wurden. Somit könnte der fehlende Unterschied der MP-Konzentration zwischen der Diabetikergruppe und der Kontrollgruppe in der von uns durchgeführten Studie durch das Fehlen von Spätfolgen erklärbar werden. Andererseits wurden in dieser Studie keine Untergruppen der MP erhoben, wie EMP und PMP, welche hauptsächlich bei vaskulären Erkrankungen oder Gerinnungsveränderungen erhöht sind. Da PMP, wie schon eingangs erwähnt, die größte Gruppe der MP sind, ist es unwahrscheinlich, dass es hier trotz Erhöhung der PMP-Spiegel im Plasma zu keiner Erhöhung der Gesamtkonzentration der MP kommt. 47 EMP hingegen sind anteilmäßig geringer und könnten trotzdem erhöht sein. Andererseits deutet verkürzte Lag-Time und ttPeak im MP-Reagenz darauf hin, dass es im Vergleich zu der Kontrollgruppe bei MP zwar keinen signifikanten quantitativen Unterschied, jedoch einen qualitativen Unterschied gibt, der für eine verstärkte Gerinnung bei Typ 1 Diabetikern spricht. Hingegen ist das ETP wiederum verringert und spricht gegen einen prokoagulatorische Effekt der MP. Der fehlende Unterschied der MP-Konzentration zwischen beiden Gruppen würde gegen eine messbare hämostatische Imbalance und gegen vaskulären Schäden dieser Patientengruppe von jungen Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen sprechen. Unser Ergebnis deutet eher darauf hin, dass die MP-Konzentration eine Folge von vaskulären Schädigungen und pathologischen Prozessen ist und erst bei messbar manifesten Dysfunktionen auftritt, wie in den zuvor genannten Studien nachgewiesen. Weiters spricht unsere fehlende Korrelation von Hba 1c und MP-Konzentration auch eher für keine katalytische Rolle der MP in der Entstehung der Krankheit. Hingegen konnte eine Studie Hba1c-Werte und TMP-Konzentrationen korrelieren. Erhoben wurden jeweils getrennt EMP, PMP und Annexin V positive MP im Blut (TMP) bei Typ1 und Typ 2 Diabetikern im Vergleich zu einer Kontrollgruppe aus gesunden Probanden. Dabei wiesen Typ 1 Diabetiker einen erhöhten Spiegel von EMP, PMP und TMP im Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Dagegen waren bei Typ 2 Diabetikern nur die Anzahl der TMP erhöht. Die gerinnungsfördernde Aktivität von TMP war in der gesamten Diabetikergruppe als auch in der Gruppe von Typ 1 Diabetikern mit dem Hba1c Wert korreliert. Daher könnte TMP ein Hinweis auf eine chronische glykämische Imbalance sein und zur erhöhten Thrombogenität bei Typ 1 Diabetikern beitragen. Die EMP-Spiegel waren in Typ 2 Diabetikern zwar auch erhöht, erreichten aber keine statistische Signifikanz. Die höchsten Werte von EMP wurden in Typ 1 Patienten mit mikrovaskulären Erkrankungen gemessen. Zusammen mit den erhöhten Werten bei Albuminurie wurde vermutet, dass EMP als ein Marker für Endothelschäden in dieser Patientengruppe verwendet werden könnte [128]. Von apoptotischen T-Lymphozyten ausgeschüttete MP können zu einer Downregulation der endothelialen Stickstoff (NO)-Synthetase und zu einer Überexpression von Caveolin-1 führen, sodass die Endothel abhängige Vasodilatation vermindert ist [132]. Weiters konnten die Reduktion der NO Produktion auch durch MP von h Fas-L mediierten apoptotischen glatten Muskelzellen und deren Reduktion der Freisetzung durch EMP in Ratten nachgewiesen werden[133]. Eine Korrelation von vaskulärer Dysfunktion und EMP-Spiegel, gemessen als Verlust flussmediierter Vasodilatation und Anstieg der aortalen Pulswellengeschwindigkeit, konnte in Patienten mit hochgradigem Nierenversagen gezeigt werden [134]. Diese Resultate könnten darauf hinweisen, dass EMP nicht nur als Marker eines Gefäßschadens oder einer endothelialen Dysfunktion dienen, sondern auch in der Lage sind pathologische Prozesse zu verstärken [55]. Eine Studie konnte weiters nachweisen, dass zirkulierende MP in Patienten mit Diabetes zu einer verringerten Expression der NO-Synthase führen und eine Endotheldysfunktion initiierten [135, 58]. Weiters wurden zu den erhöhten Werten von PMP und MMP in Patienten mit Diabetes Typ 2 signifikant erhöhte Werte von CD62P- und CD63P-positiven Thrombozyten und 48 E-Selectin gemessen. Die erhöhte Aktivierung von Monozyten könnte auf den Einfluss von aktivierten Thrombozyten und PMP zurückgeführt werden. Diese aktivierten Monozyten könnten auch zu Endothelzellschäden der Gefäße führen und daher als Marker für Gefäßschäden in Typ 2 Diabetikern herangezogen werden, besonders bei Diabetikern, die an einer diabetischen Nephropathie leiden [117, 136, 137]. Weiter könnten aktive Thrombozyten zu Mikroembolien über Mikroaggregatbildung beitragen. Das könnte über eine länger anhaltende Minderperfusion und damit Minderversorgung des Gewebes mit Sauerstoff zu einer Mikroangiopathie im Sinne von Nephropathie, Neuropathie und Retinopathie führen [138, 117]. Des weiteren finden sich erhöhte MP-Spiegel in Prozessen mit Atherosklerose. Solch erhöhte MP wurden in Typ 2 Diabetikern im Gegensatz zu gesunden Probanden nachgewiesen. Diabetiker mit hohem Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Spiegel hatten höhere PMP-Werte als jene mit niedrigem LDL-Spiegel. So könnten PMP zu einer rascheren Progression von Atherosklerose in Typ 2 Diabetikern beitragen [139]. Eine erhöhte Rate an Apoptose von Endothelzellen könnte die Entwicklung von Atherosklerose in Diabetes beschleunigen. Diese Apoptose ist assoziiert mit einer vermehrten Monozyten und Thrombozytenaktivierung. Erhöhte Werte von EMP, MMP und PMP wurden in diesen Patienten gemessen und könnten sich negativ auf die Prognose von Gefäßerkrankungen durch prothrombotische, adhäsionsfördernde und proinflammatorische Prozesse auswirken [58, 140]. Zusätzlich könnten erhöhte PMP-Spiegel für die hohe Rate an thrombotischen Komplikationen und Atherosklerose verantwortlich sein [141, 142, 57]. Weil PMP und aktivierte MP zur Entwicklung von Atherosklerose beitragen können, scheinen sie zur Einschätzung von Gefäßschäden nützlich zu sein [143]. Daher könnten in diabetischen Patienten mit mikrovaskulären Erkrankungen diese Marker eingesetzt werden [58]. Es gibt zahlreiche Hinweise, dass MP auch eine katalytische Wirkung in der Entwicklung von für Diabetiker pathophysiologisch relevanten Prozessen spielen. Unsere fehlende Korrelation der MP-Konzentration spricht, wie zuvor schon erwähnt, eher dagegen. Da wir aus methodischen Gründen keine Untergruppen der MP erhoben haben, können wir nicht ausschließen, dass diese in pathologischen Prozessen involviert sind, bevor Spätfolgen auftreten und auch sinnvoll für eine frühzeitige Diagnostik sind. Es ist sicherlich nützlich diese Fragestellung, ob Typ 1 Diabetiker eine Erhöhung der Untereinheiten der MP aufweisen, in einer weiterführenden Studie zu untersuchen. Unser Ergebnis zeigt nur, dass die gesamte MP-Konzentration in dieser Patientengruppe nicht erhöht ist. 9.2 Thrombingeneration und Diabetes Es gibt zurzeit wenige Publikationen, die sich mit dem Thema Diabetes und Thrombingeneration befassen. Meist kommen sie dabei als Nebenthema wie als Risikofaktor vor. Da die Anzahl an Typ 2 Diabetikern größer ist als an Typ 1 ist es verständlich, dass es zu letzteren im Zusammenhang mit Thrombingeneration noch weniger Studien gibt. Die zentralen pathologischen Faktoren, wie Hyperglykämie und auch die Folgeerkrankungen sind in beiden Diabetesformen ähnlich und überschneiden sich. Daher können Ergebnisse bei Typ 2 Diabetikern auch Hinweise auf Prozesse in Typ 1 Diabetikern geben. Tripodi et al. [116] untersuchten, ob eine Imbalance der Gerinnung im Sinne einer 49 Hyperkoagulabilität bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 besteht. Diesbezüglich wurden auch schon einige Studien durchgeführt, jedoch basierten alle bisher auf Messungen von Einzelfaktoren. Daher entschlossen sich Tripodi et al. die KAT nach Hemker [96] als Bestimmungsmethode zur Darstellung der gesamten Gerinnung zu wählen. Das ETP soll die Balance der gerinnungsfördernden und hemmenden Faktoren im Plasma widerspiegeln. Eine verkürzte Lag-Time, ein verkürzter Thrombinanstieg, erhöhte ETP-Spiegel und Thrombinpeak sind Zeichen für eine Hyperkoagulabilität. Das Verhältnis von ETP und Thrombin Peak mit und ohne Thrombomodulin wurde von ihnen als weiteres Hyperkoagulabilitätszeichen herangezogen und untersucht. Alle eben erwähnten Parameter wiesen in dieser Studie Werte auf, die auf eine Imbalance in Richtung einer Hyperkoagulabilität bei Typ 2 Diabetikern im Vergleich zur Kontrollgruppe hindeuteten. Eine einzige Ausnahme gab es. Im Beisein von TF und Phospholipiden als Gerinnungstrigger und Abwesenheit von Thrombomodulin waren die ETP-Werte der Typ 2 Diabetiker zwar erhöht, aber nicht statistisch signifikant im Vergleich zu gesunden Probanden. Wie Tripodi et al. anführt, kann über die Relation zwischen den gemessenen Werten mit und ohne Thrombomodulin auf die effiziente Aktivierung von Protein C durch letzteres geschlossen werden. Daher könnten hohe Werte dieses Verhältnisses, wie bei diesen Typ 2 Diabetikern, für ein Hyperkoagulabilität sprechen, da Thrombomodulin weniger Einfluss auf die Gerinnung in ihrem Plasma nehmen kann (Genaues siehe [116]). Nebenbei sei erwähnt, dass auch noch weitere Gerinnungstests in der gleichen Studie mit den gleichen Probanden untersucht worden sind und nur erhöhte Werte von VIII und Protein C gefunden werden konnten. Sonst wurden keine weiteren Imbalancen der Gerinnung festgestellt. Daher hat das Plasma dieser Typ 2 Diabetiker eine Imbalance von gerinnungsfördernden und hemmenden Faktoren aufgewiesen, welche nicht mit herkömmlichen Gerinnungstests aber mit der Thrombingenerationsmessung erfasst werden konnten. Diese Hyperkoagulabilität könnte ihrer Meinung nach das erhöhte Risiko an venösen Thrombembolien erklären und die Thrombingeneration auch an dem erhöhten Atherothromboserisiko beteiligt sein. Somit könnten auch Patienten identifiziert werden, welche unter Umständen ein erhöhtes Risiko an arterieller und venöser Thrombose aufweisen und bei denen eine Therapie sinnvoll erscheint[116]. Andererseits deutet dieses Ergebnis, wie schon im vorangegangenen Text erwähnt, darauf hin, dass moderate Gerinnungsveränderungen bei Erkrankungen potentiell durch diese kontinuierliche Thrombingenerationsmessung erkannt werden könnten, was eine sinnvolle Ergänzung zu den herkömmlichen Blutgerinnungstests bietet. Eine weitere Studie von Stepien et al. [144] zeigte Diabetes als unabhängigen Prädiktor der Thrombingeneration gemessen anhand von TAT und ETP. Dazu wurden 135 Patienten mit stabiler Angina Pectoris untersucht, die zur koronaren Bypassoperation überwiesen wurden. 44 dieser Patienten waren Diabetiker. Zur Bestimmung der Thrombingeneration verwendeten sie zwei Methoden. Einerseits verwendeten sie eine Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) Methode um aus Citratplasma die TAT-Spiegel zu bestimmen, andererseits verwendeten sie ein PPP und analysierten es mittels KAT. Eine Analyse der allgemeinen multiplen Regression zeigte: Diabetes ist zusammen mit 50 männlichem Geschlecht als stärkster Prädiktor von TAT-Spiegel in venösem Blut zu werten. Bei der KAT waren die stärksten Prädiktoren für den Thrombin Peak Fibrinogen und männliches Geschlecht in Verbindung mit Diabetes. Hohe CRP-Werte und männliches Geschlecht zusammen mit Diabetes konnten als Prädiktor für ETP in der Studie herangezogen werden. Es konnte keine Korrelation zwischen TAT-Spiegeln und Thrombin Peak oder ETP gefunden werden, weil beide Methoden in der Messmethodik zu sehr voneinander abweichen. TAT wird an einzelnen Zeitpunkten gemessen, während KAT über einen längeren Zeitraum gemessen wird und immer wieder neu kalibriert werden muss. Daher sind sie schwer miteinander vergleichbar, obwohl sie beide Aufschluss über die Thrombingenerierung geben. Die Parameter der KAT, definiert als Lag-Time, ETP und Thrombin Peak, korrelierten untereinander. Zusammenfassend hat diese Studie gezeigt, dass Diabetes ein unabhängiger Prädiktor für ETP- und TAT-Werte ist. Sie konnten auch zeigen, dass eine Insulin Therapie mit TAT-Spiegeln assoziiert ist aber nicht mit KAT Parametern[144]. In der von uns durchgeführten Studie ergab die Gegenüberstellung der Diabetikergruppe mit der Kontrollgruppe weitere überraschende Daten. Es kam zu signifikanten Veränderungen von KAT Parametern. Die Gruppe der Diabetiker wies signifikant verringerte Werte der Lag-Time, des ETPs, der Time-to-Peak (ttPeak) in PPP und erhöhte Werte von TAT im Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Unsere Ergebnisse zeigen wie bei Stepien et al. [144] und Tripodi et al. [116] eine mittels KAT messbare Veränderung der Hämostase auch in jüngeren Typ 1 Diabetikern. Obwohl wir ein erhöhtes ETP als Zeichen einer vermehrten Thrombinbildung und damit einer Hyperkoagulabilität erwartet haben, müssen sich unsere Beobachtungen nicht widersprechen, weil wie schon zuvor erwähnt, der Hauptteil des gebildeten Thrombins nach der Lag-Time auftritt [94]. Zusätzlich war TAT in der Diabetikergruppe erhöht, das wiederum spricht für eine verstärkte Aktivierung von Thrombin. Daher könnte es zwar zu einer Aktivierung des Thrombins kommen, jedoch könnten regulatorische Prozesse dieses rasch inaktivieren, sodass es zu keinem Anstieg des ETPs kommt. Dies kann hier, wie bei den Mikropartikeln auch, auf den Unterschied fehlender Spätfolgen zurückzuführen sein. Bei Stepien et al. [144] handelte es sich um Patienten, die zu einer koronaren Bypassoperation überwiesen wurden und bei Tripodi et al. [116] gab es keinen Ausschluss von Patienten mit Retinopathie. Die Ergebnisse der von uns durchgeführten Studie sprechen auch für eine hämostatische Imbalance bei 0-19 jährigen Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen, die mittels KAT erkannt werden kann. Das bekräftigt die Ergebnisse der beiden zuvor erwähnten Studien. Altersvergleich der Diabetesgruppe Im Vergleich der 0-9 Jährigen mit den 10-19 Jährigen in der Diabetikergruppe konnten wir keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen erkennen. Jedoch waren bei der Diabetikergruppe die Parameter Lag-Time und ttPeak in beiden Reagenzien verringert, sowie ETP, Peak und F1+2 erhöht. Daher scheint ein Unterschied in der Thrombingenerierung nach dem Alter auch bei kindlichen und jugendlichen Typ 1 Diabetikern erkennbar zu werden. Diese Ergebnisse unterstützen die vorherigen Beobachtungen von Haidl et al. [102], der eine Altersabhängigkeit der Thrombingeneration 51 nachweisen konnte. Einfluss der Blutzuckerspiegel auf die Thrombingeneration Die Frage, welchen Einfluss glykämische Zustände auf die Thrombingenerierung in Diabetikern haben, wurde bisher hauptsächlich mit den Thrombinaktivierungsmarkern TAT und F1+2 zu klären versucht. Aoki et al. [51] befassten sich mit der Fragestellung wie sich ein gut oder schlecht eingestellter Blutglukosespiegel in Patienten mit und ohne Komplikationen auf die thrombozytenabhängige Thrombingeneration auswirkt. Dabei wurde als Grenzwert ein HbA1c Wert von 9.0% definiert. Die höchste Thrombingenerierung wiesen Patienten ohne diabetische Komplikationen mit schlechter Einstellung auf, gefolgt von der gut eingestellten Gruppe und der gesunden Gruppe. Signifikante Unterschiede gab es dabei zwischen der gut und schlecht eingestellten Gruppe im Vergleich zu den gesunden Probanden und auch untereinander. Ein Versuch, die gut eingestellte Gruppe anhand eines HbA1c-Grenzwertes von 7.0% nochmals zu unterteilen, ergab jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede. Bei den Patienten mit diabetischen Komplikationen kam es bei der schlecht eingestellten Gruppe ebenfalls zu der höchsten Thrombingenerierung, gefolgt von der gut eingestellten und gesunden Probandengruppe. Jedoch war der Unterschied zwischen den beiden Diabetesgruppen mit Komplikationen untereinander und in Bezug auf die gleiche Gruppe ohne Komplikationen dazu nicht signifikant. Weiters wurden acht Patienten, die Insulin benötigten, untersucht. Bei ihnen waren die Werte zwar erhöht, aber nur signifikant gegenüber der gesunden Kontrollgruppe. In vitro versetzten Aoki et al. [51] auch PRP von gesunden Probanden mit Glukose und konnten einen Anstieg der Thrombingenerierung im Zusammenhang mit der beigefügten Glukosekonzentration beobachten. Daraus folgern sie, dass eine Imbalance im Sinne einer Hyperkoagulabilität bei Diabetikern besteht und ein gut eingestellter Blutzuckerspiegel zu einer Reduktion dieser beitragen kann [51]. Lopez et al. [145] untersuchten in 30 Diabetikern ohne Folgeschäden definiert als Neuropathie, Nephropathie oder Retinopathie, wie sich TAT- und F 1+2-Werte unter guter metabolischer Kontrolle verhalten. Dabei war TAT als einziger Parameter erhöht. Es konnte keine Erhöhung der F1 +2Werte erhoben werden. Daher würde diese Beobachtung allgemein auch für eine Beeinflussung der Gerinnung durch den Blutglukosespiegel und auch durch Folgeerscheinungen, den diabetischen Komplikationen, sprechen. Allerdings sollte dabei nicht außer acht gelassen werden, dass es sich um ein kleines Patientenkollektiv handelt [145]. Eine Studie, in der 58 Patienten mit Insulin-Dependent-Diabetes-mellitus (IDDM) ohne hypo- oder hyperglykämischen Entgleisungen in den vorangegangenen 6 Monaten und ohne Makroangiopathie untersucht wurden, ergab andere Beobachtungen. Dass Follow up in dieser Studie betrug 3 Jahre. Halbjährlich wurden die Patienten auf Makro- und Mikroangiopathie untersucht. In diesem Kollektiv wurde eine deutlich signifikante Erhöhung von F1+2 sowie TAT beobachtet. In dieser Studie wiesen 13 Patienten mikroangiopathische Schäden auf, 8 Patienten hatten eine Retinopathie und 5 weitere eine Mikroalbuminurie. Es gab in den Thrombingenerationsparametern keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen Patienten und jenen ohne Mikroangiopathie. Daher spricht dieses Ergebnis für eine 52 Hyperkoagulabilität ohne signifikanten Einfluss von mikroangiopathischen Schäden und eventuell dadurch auch von Hyperglykämie. Andererseits ist die Patientenzahl hier auch gering und das Patientenkollektiv deutlich jünger als in der Studie von Lopez. Vielleicht könnte dies die Diskrepanz der unterschiedlichen Beobachtungen erklären [146]. Undas et al. [147] untersuchten unter anderem inwieweit Hyperglykämie in Patienten mit akutem Koronarsyndrom zu einer erhöhten Thrombingenerierung beiträgt. Dabei wurden jeweils drei Gruppen zu je 20 Patienten untersucht, die erste Gruppe inkludierte Typ 2 Diabetiker unter Einnahme von Insulin oder oralen Antidiabetika. Die zweite Gruppe(HG) umfasste Patienten ohne Diabetes Anamnese, jedoch mit Serumglukosewerten von über 7mmol pro Liter und in der dritten Gruppe (NG) wurden Patienten mit Serumglukosewerten unter 7mmol pro Liter untersucht. Dabei fanden sie erhöhte TAT- und F1+2-Werte bei der Diabetes Gruppe im Vergleich zur NG. Die Spitzenwerte der TAT Bildung waren nach vaskulären Schäden in den beiden Gruppen mit Hyperglykämie höher als in der mit normalen Blutzuckerwerten. In ihrer Studie konnten sie zusammenfassend zeigen, dass als Reaktion auf vaskuläre Schäden in Patienten mit Diabetes oder erhöhten Serumglukosewerten während akutem Myokardinfarkt (MI) erhöhte Glukosespiegel mit einer vermehrten Produktion von Thrombin einhergeht [147]. Eine andere Studie untersuchte den Einfluss des oralen Glucosetoleranztests (OGTT) von diätetisch behandelten Diabetikern beziehungsweise gesunden Probanden zu je elf Personen auf Prothrombinfragment-F1+2 und TAT. Die Diabetikergruppe hatte eine milde Ausprägung des Diabetes und es konnten keine mikro- oder makrovaskulären Schäden nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigten keine wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen in der Konzentration von F1 + 2 und TAT im Plasma und auch keine Veränderung der Parameter unter OGTT. Diese Studie hatte keine akuten Veränderungen unter Hyperglykämie gefunden. Sie wiesen jedoch auf Cerellio et al. [148] hin, die einen Unterschied in der Konzentration von F1+2 im Plasma unter akuter Hyperglykämie bei gesunden als auch bei an Typ 2 Diabetes erkrankten Patienten nachwiesen. Carmassi et al. [24] konnte erhöhte TATWerte mit HbA1c-Werten bei Diabetikern korrelieren [149]. Eine weitere Studie untersuchte den Einfluss von Insulin und Glukose auf die Gerinnung bei Typ 2 Diabetikern im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe. Unter anderem wurden neben zirkulierendem TFPCA, FVII und FVIII auch TAT und F1+2 bestimmt nach einem Fastenzustand über Nacht von 6 bis 8 Stunden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Typ 2 Diabetiker sich in einer chronischen Imbalance der Gerinnung befinden, die im Sinne einer Thrombose auch klinisch relevant werden kann. Dabei waren TAT und F1+2 bei Erhöhung der Insulinspiegel bei Diabetikern nicht erhöht. Bei gesunden Probanden war nur TAT nach 18 Stunden erhöht. Hingegen kam es zu einem signifikanten Anstieg von TAT und F1+2 in beiden Gruppen, als die Glukose- und Insulinkonzentration durch Glukoseinfusionen gleichzeitig gesteigert wurden. Dazu waren auch noch TFPCA und TF-mRNA erhöht. Dies könnte auf eine mögliche Steigerung des Risikos für thrombotische Ereignisse bei Typ 2 Diabetikern unter einer schlechten glykämischen Kontrolle hinweisen [23]. Rao et al. [150] führten eine Studie aus, in der junge gesunde Probanden von 24 bis 45 Jahren in zwei Gruppen eingeteilt wurden. Die einen wiesen erhöhte Werte von Insulin 53 und Blutglukose auf, die anderen nur von Insulin. Während ihrer Beobachtungen kam es nach 48 Stunden in beiden Gruppen zu keiner signifikanten Erhöhung der F1+2sowie der TAT-Werte. Während ihrer Studie wurde auch ein weiterer Parameter der Hämostase erhoben, den TFPI. Dieser war in der Hyperglykämiegruppe aber nicht in der Hyperinsulinämiegruppe erhöht. Sie vermuteten, dass Hyperglykämie zwar den TF-Pathway aktiviert, aber sofort wieder durch TFPI kontrolliert wird und es so zu keiner weiteren Aktivierung von FX und der Thrombingeneration kommt [150]. Cerellio et al. [151]untersuchten den Einfluss der Therapie der akuten Hyperglykämie und oxidativem Stress auf die Gerinnungsaktivierung in 36 Typ 1 Diabetikern. Ihre Kontrollgruppe bestand aus 12 gesunden Probanden, da die Diabetiker in 3 Gruppen eingeteilt wurden. Die Therapien bestanden dabei aus unterschiedlicher Dauer der Gabe von Insulin zur Therapie der Hyperglykämie und Vitamin C zur Therapie der oxidativen Komponente. Die erste Diabetikergruppe (A) bekam dabei über 24 Stunden Insulin und nach 12 Stunden Vitamin C. Bei der zweiten Gruppe (B) wurden die Therapien getauscht. Die dritte Gruppe (C) bekam beide Therapien über 24 Stunden. Alleine in Gruppe B kam es erst nach 24 Stunden zu einer Normalisierung der Glukosespiegel, in den anderen Gruppen schon nach 12 Stunden. Die Resultate zeigten eine signifikante Erhöhung der F1+2 sowie TAT-Spiegel in allen Diabetespatienten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei kam es in allen Gruppen zu einer signifikanten Reduktion der eben genannten Parameter nach 12 und 24 Stunden. Dabei wies die Gruppe C die deutlichste Reduktion nach 12 Stunden auf, gefolgt von Gruppe B und zuletzt Gruppe A. In weiteren 12 Stunden kam es zu einer weiteren Reduktion bei Gruppe A und B. Nach 24 Stunden gab es keinen Unterschied in den Parametern zwischen allen drei Gruppen. Diese Beobachtungen scheinen einen Hinweis darauf zu geben, dass es neben dem Einfluss von Hyperglykämie auf die Thrombingenerierung auch noch einen anderen unbekannten Mechanismus in Typ 1 Diabetikern geben könnte, der zu einer hämostatischen Imbalance führen kann. Jedoch sollte dieses Ergebnis auch mit einer größeren Probandenzahl durchgeführt werden, um diese Beobachtungen nochmals zu überprüfen und eine bessere Aussagekraft zu erlangen [151]. Die Studien sind schwer zu vergleichen, da die Studiendesigns unterschiedlich sind und die Probandenzahl oft sehr klein ist. Grundsätzlich scheint es jedoch eine hämostatische Imbalance bei Diabetikern zu geben, die auch mittels Thrombingenerationsparameter gemessen werden kann. TF Reagenz In der von uns durchgeführten Studie wird die Fragestellung ob glykämische Zustände die Thrombingeneration mitbeeinflussen mittels KAT untersucht. Dazu wurden zwei glykämische Parameter definiert. Erstens der Blutglukosespiegel als Parameter für einen momentanen Zustand und zweitens der Hba1c als Parameter für einen chronischen Zustand. Dabei korrelierten die Hba1c-Spiegel signifikant mit dem ETP und Peak in PPP. Ferner kam es zu einer nicht signifikanten inversen Korrelation der Lag-Time und des ttPeak. Hingegen wiesen die Bluglukosespiegel keine signifikante Korrelation auf. 54 Daher sprechen die Ergebnisse der von uns durchgeführten Studie für eine Beeinflussung der Hämostase bei kindlich und jugendlichen Typ 1 Diabetikern durch chronische glykämische Zustände, aber nicht durch akute und gehen einher mit Erkenntnissen von Yngen et al. [149], Aoki et al. [51], [145] und Carmassi et al. [24]. Daher könnten hohe Konzentrationen an Hba1c bei dieser Diabetikergruppe zu einer hämostatischen Imbalance im Sinne eines prokoagulatorischen Effekts führen und so zu bekannten Komplikationen des Diabetes auch bei kindlich und jugendlichen Typ 1 Diabetikern beitragen. Hingegen sprechen unsere Resultate dafür, dass akute glykämische Zustände nicht mit der Hämostase korrelieren und daher auch nicht über prokoagulatorische Prozesse für Komplikationen bei Typ 1 Diabetikern verantwortlich sind im Unterschied zu den Ergebnissen von anderen Studien bei Diabetes im Allgemeinen [151, 150, 23, 147, 146]. TF freies Reagenz Weiters korrelierten wir die beiden glykämischen Parameter mit den Messungen der KAT im MP-Reagenz, um den Einfluss von glykämischen Zuständen auf die MP und deren Auswirkung auf die Hämostase darzustellen. Dabei kam es zu den gleichen Resultaten wie im vorherigen Absatz dargestellt. Dies unterstützt weiters die Beobachtung, dass anscheinend chronisch hyperglykämische Zustände mehr Einfluss auf die Hämostase haben als akute. Weiters sprechen unsere Resultate dafür, dass MP einen prokoagulatorischen Effekt im Zusammenhang mit einem steigenden Hba1c vermitteln. Interessanterweise gab es keinen messbaren Effekt von glykämischen Zuständen auf die MP-Konzentration in unserer Studie, wie zuvor schon erwähnt. Daher könnte diese Beobachtung doch dafür sprechen, dass MP einen katalysierenden Effekt in Typ 1 Diabetikern aufweisen. 9.3 Zusammenfassung der Diskussion Zusammenfassend konnten wir mit der KAT bei Typ 1 Diabetikern von 0-19 Jahren nachweisen, dass chronische hyperglykämische Zustände mit der Hämostase von Diabetikern positiv korrelieren und damit hyperglykämische Zustände zu einer Imbalance der Hämostase bei Typ 1 Diabetikern führen. Dabei hängt der prokoagulatorische Einfluss von MP nicht von der Gesamtkonzentration der MP ab, sondern muss qualitativ vermittelt werden. Welche Prozesse dahinter stehen, ist noch nicht geklärt. Es konnte auch ein nicht signifikanter altersabhängiger Effekt der KAT in der Diabetikergruppe beobachtet werden. Bei der Diabetikergruppe kam es zu einer verkürzten Gerinnungszeit und vermehrten Thrombinaktivierung, jedoch kam es zu einem verringerten ETP. Daher scheint es hier eine Veränderung der Gerinnung zu geben, die mittels KAT erkannt werden kann. Es konnte auch keine Erhöhung der MP-Konzentration in unserer Diabetikergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden. 55 Abbildungsverzeichnis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 weltweite Prävalenz, WHO[2] . . . . . . . . . . . . Thrombogramm nach Cimenti et al.[103] . . . . . . Diabetiker vs Kontrolle, Mann-Whitney-U-Test . . ETP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ETP-Mikropartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige, Mann-Whitney-U-Test Korrelation: ETP und Hba1c, TF-Reagenz . . . . . Korrelation: Peak und Hba1c, TF-Reagenz . . . . . Korrelation: ETP und Hba1c, TF freies Reagenz . . Korrelation: Peak und Hba1c, TF freies Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 26 35 36 36 40 40 41 42 42 Diabetiker vs Kontrolle,Gruppenstatistik . . . . . . . Diabetiker vs Kontrolle,Levene und T-Test . . . . . . Diabetiker vs Kontrolle, 2 seitige Signifikanz . . . . . Diabetiker vs Kontrolle, Konfidenzintervall . . . . . . 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Gruppenstatistik . 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Levene und T-Test 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, 2 seitige Signifikanz 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Konfidenzintervall . Korrelationsanalyse 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . Korrelation 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Korrelationsanalyse 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 34 34 35 37 38 39 39 43 44 45 Tabellenverzeichnis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 56 Literatur [1] Deutschsprachige Ausgabe: Dietel M, Suttorp N, Zeitz SA M; Originalausgabe: Fauci, Eugene Braunwald E, Dennis KL, Hauser SL, et al., editors. Harrison Innere Medizin 17.Auflage. ABW Wissenschaftsverlag; 2008. [2] Organisation WHO; World Health Organisation [Hompage im Internet], [Modifiziert 2011 2 2, zitiert Stand 2011 5 14] Available from: http://www.who.int/diabetes/actionnow/en/mapdiabprev.pdf. [3] Rieder A, Rathmanner T, Kiefer I, Dorner T, Kunze M, Schwarz F. Österreichischer Diabetesbericht 2004. [Modifiziert 2010 5 7 zitiert Stand: 2011 5 13]. Österreichische Diabetes Gesellschaft; 2011. 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