Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1: Mikropartikel und

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Diplomarbeit
Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1: Mikropartikel und
Thrombingeneration
eingereicht von
Maximilian Leberl
Mat. Nr.:0433341
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der gesamten Heilkunde
(Dr.med.univ.)
an der
Medizinischen Universität Graz
ausgeführt an der
Univ. Klinik für Kinder und Jugendheilkunde
Klinische Abteilung für Allgemeine Pädiatrie
unter der Anleitung von
Prof.Dr. Wolfgang E. Muntean
und
Ass.Dr.In Christina Cimenti
Graz, am
Maximilian Leberl
1
Eidesstattliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde
Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die
den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich
gemacht habe.
Graz, am
Maximilian Leberl
2
Gleichheitsgrundsatz
Aus Gründen der besseren Lesbarkeit und Verständlichkeit der Diplomarbeit, wird im
Folgenden das generische Maskulin verwendet, welches sich gleichermaßen auf männliche und weibliche Personen bezieht.
3
Die Hämostase bei Diabetes mellitus Typ 1:
Mikropartikel und Thrombingeneration
Maximilian Leberl
22. August 2011
Inhaltsverzeichnis
1 Danksagung
6
2 Zusammenfassung
2.1 Hintergrund . .
2.2 Methodik . . .
2.3 Ergebnisse . . .
2.4 Schlussfolgerung
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7
7
7
7
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8
8
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8
3 Abstract
3.1 Background
3.2 Method . .
3.3 Results . . .
3.4 Conclusion .
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4 Glossar
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5 Einführung in die Thematik
5.1 Diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Pathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.4 Typ 1 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5 Typ 2 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.6 Folgeerkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7 Hämostase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Mikropartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Rolle in der Hämostase . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Kalibrierte Automatisierte Thrombingenerationsmessung
5.3.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.2 Form des Thrombogramms . . . . . . . . . . . . .
5.3.3 Eine neue Sicht der Hämostase? . . . . . . . . . .
5.3.4 Thrombozytenarmes Plasma (PPP) . . . . . . . .
4
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6 Intention und Ziele der Studie
6.1 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Studiendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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7 Material und Methoden
7.1 Reagenzien und Substrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2 Blutabnahme und Aufbereitung für thrombozytenarmess Plasma
7.3 MP Bestimmung mittels ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4 KAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.5 Blutglukose-,Hba1c, TAT und F1+2-Bestimmung . . . . . . . .
7.6 Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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(PPP)
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8 Ergebnisse und Resultate
8.1 Vergleich: Diabetesgruppe mit Kontrollgruppe . . . . . . . . . . . . . .
8.2 Altersvergleich der Diabetikergruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3 Korrelationsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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40
9 Diskussion
9.1 Mikropartikel und Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.2 Thrombingeneration und Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.3 Zusammenfassung der Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
46
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55
Literatur
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5
1 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei all jenen bedanken, die mir mit Rat
und Tat zur Seite gestanden sind.
Ein großes Dankeschön geht an meine beiden Betreuer Univ.-Prof. Dr. Wolfgang E.
Muntean und Ass Dr.in Christina Cimenti, die immer schnell erreichbar waren und
mit ihrem Fachwissen maßgeblich zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben.
Ich danke auch all meinen Freunden und meiner Familie für die fachliche und seelische
Unterstützung.
Besonders möchte ich mich bei Franzi, Gerald und Klaus für ihre umfangreiche Hilfe
bedanken.
6
2 Zusammenfassung
2.1 Hintergrund
Vaskuläre Komplikationen stellen einen Großteil der diabetischen Komplikationen dar.
Mikrovaskuläre Veränderungen und Hyperglykämien stehen dabei in Zusammenhang
mit Endothelzellschäden und Hyperkoagulabilität.
In einigen Studien zeigte sich, dass Mikropartikel in Erkrankungen mit vaskulärer Beteiligung erhöht sind. Des weiteren gibt es Hinweise, dass sie über prokoagulatorische
Wirkung einen katalysierenden Effekt auf vaskuläre Erkrankungen haben.
Derzeit gibt es keine Möglichkeit die individuelle Overallfunction der Hämostase zu
messen. Da Thrombin eine Schlüsselrolle in der Hämostase spielt, birgt die Thrombingenerationsmessung das Potential die gesamte individuell Overallfunction der Hämostase
einer Person zu erfassen. Ziel dieser Studie war die Bestimmung der Thombingeneration
und Mikropartikel im Plasma von Kindern und Jugendlichen Typ 1 Diabetikern.
2.2 Methodik
Das Patientenkollektiv besteht aus 112 Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen zwischen
0 und 19 Jahren und einer alters- und geschlechtsgematchten Kontrollgruppe. Die
Mikropartikel(MP)-Konzentration und Thrombingeneration wurden mittels ELISA und
Kalibrierter-Automatisierter-Thrombingeneration(KAT) erhoben. Es wurden die Diabetiker mit der Kontrolle verglichen und die 0-9 jährigen Diabetiker mit den 10-19
Jährigen. Weiters wurde eine Korrelationsanalyse zwischen dem Hba1c und der Blutglukose mit der MP-Konzentration und den Thrombingenerationsparametern bei der
Diabetikergruppe durchgeführt.
2.3 Ergebnisse
Im Vergleich der Diabetesgruppe mit der Kontrollgruppe kam es zu einer signifikanten Verringerung von Lag-Time, ttPeak und ETP nach Aktivierung mit 5 pM TF als
auch im TF freien MP-Reagenz. Die Diabetikergruppe wurde nochmals aufgeteilt in
0-9 Jährige und 10-19 Jährige und miteinander verglichen. Dabei beobachteten wir bei
der Gruppe der 10-19 Jährigen eine nicht signifikanten Erhöhung des Peak und ETP
mit einer Verringerung von ttPeak und Lag-Time. Die Hba1c- und die Blutglukosewerte wurden in der Diabetesgruppe mit den KAT Parametern in beiden Reagenzien
einer Korrelationsanalyse unterzogen. Dabei kam es zu einer statistisch signifikanten
Korrelation des Peak und ETP mit Hba1c in beiden Reagenzien.
2.4 Schlussfolgerung
Zusammenfassend konnten wir mit der KAT bei Typ 1 Diabetikern von 0-19 Jahren
nachweisen, dass hyperglykämische Zustände zu einer Imbalance der Hämostase bei
Typ 1 Diabetikern führen. Die KAT und MP bergen das Potential in sich sinnvolle
Ergänzung für die Diagnostik vaskulärer Erkrankungen zu sein.
7
3 Abstract
3.1 Background
Vascular complications are one of the major issues in diabetes patients. Microvascular
alteration and hyperglycemia are in a close relation to endothelial cell dysfunction and
hypercoagulability.
Studies have provided evidence that microparticles are higher in persons with vascular
diseases than without. Further evidence indicates that microparticles could play a role
in the progression of vascular diseases.
At the moment there is no clinical test available, measuring the whole individual overall
function of the haemostasis. Because of the key role of thrombin, thrombingeneration could be such a tool. The aim of this study was to evaluate microparticles and
thrombingeneration in the plasma of juvenile diabetes patients.
3.2 Method
The patients group consisted of 112 type 1 diabetes patients between 0-19 years without
diabetic complications and of a compared group of 94 healthy persons matched in
age and sex. The MP concentration and the thrombin generation were measured via
ELISA and Calibrated-Automated-Thrombingeneration(CAT). The diabetes patients
were compared with the control group. The 0-9 years old were compared with the 1019 years old in the diabetes group. Further on, a correlation analysis was performed
between the Hba1c and the glucose level in the blood in relation to MP concentration
and the thrombin generation in the diabetes group.
3.3 Results
Comparing the diabetes group with the control group, we discovered a significant reduction of the lag time, ttpeak and ETP after activation via 5 pM of TF and also in
the TF free MP-sample.
In comparison of the age divided diabetes groups there was a non-significant increase of
the peak and ETP with a reduction of ttpeak and lag time. In the correlation analysis,
there was a significant correlation between peak and ETP with Hba1c in both samples.
3.4 Conclusion
With the help of CAT within the type 1 diabetes patients between 0 and 19 years of
age, we proved that a hyperglycemic status results in an imbalance of the haemostasis.
CAT and MP have the potential to be a valuable addition for the diagnosis of vascular
disease.
8
4 Glossar
a2MT a2-Makroglobulin
AT Antithrombin
KAT Kalibrierte-Automatisierte-Thrombingeneration
Ca Kalzium
CaCl Kalziumchlorid
CRP C-reaktives-Peptid
DCCT Diabetes-Control-and-Complication-Trial
DMSO Dimethylsulfoxid
ELISA Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay
EMP endotheliale Mikropartikel
ETP endogenes Thrombinpotential
F1+F2 Prothrombinfragment F1 + F2
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl-Ethan-Sulfonsäure]
HLA Humanes-Leukozytäres-Antigen
KHK koronare Herzkrankheit
LDL Low-Density-Lipoprotein
LMP leukozytäre Mikropartikel
MHC Histokompatibilitätskomplex
MI Myokardinfarkt
MMP monozytäre Mikropartikel
MP Mikropartikel
NaCl Natriumchlorid
NO Stickstoff
OGTT oraler Glukosetoleranztest
PAI-1 Plasminogen-Activator-Inhibitor-1
PAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit
PFA-100 platelet function analyzer
PMP thrombozytäre Mikropartikel
9
PPP thrombozytenarmes Plasma
PRP thrombozytenreiches Plasma
PT Prothrombinzeit
aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit
TAFI Thrombin aktivierter Fibrinolyse Inhibitor
TAT Thrombin-Antithrombin-Komplex
TF Tissue-Faktor
TIA tranisiente ischämische Attacke
ITP idopathische thrompozytopenische Purpura
TMP Annexin-V positive Mikropartikel
TFPcA Tissue-Faktor-Procoagulant-Activity
TFPI Tissue-Faktor-Pathway-Inhibitor
TM Thrombomodulin
TPA Tissue-Plasminogen-Activator
UKPDS United-Kingdom-Prospective-Diabetes-Study
vWF Von Willebrand Faktor
VTE venöse Thrombembolien
10
5 Einführung in die Thematik
5.1 Diabetes mellitus
5.1.1 Einleitung
Als Diabetes mellitus bezeichnet man eine heterogene Gruppe metabolischer Erkrankungen, die als Gemeinsamkeit eine Hyperglykämie aufweisen und abhängig von ihrer
Ätiologie Störungen in den glukoseregulierenden Prozessen verursachen. Die Hyperglykämie ist die Folge einer in unterschiedlicher Ausprägung vorliegenden Störung der
Insulinsekretion, Glukoseverwertung oder Glukoseproduktion. Dies führt in weiterer
Folge, durch die andauernde Belastung des Organismus mit erhöhten Glukosespiegeln
im Blut, zu Veränderungen an vielen Organsystemen, wie Nephropathie, Neuropathie,
Retinopathie und kardiovaskulärer Erkrankungen[1].
Die Zahl der Erkrankten nimmt in westlichen Industrieländern sowie global zu und
damit auch ihre Folgen. Daher bekommt die Erkrankung auch volkswirtschaftliche
Bedeutung, weil die durch Diabetes bedingte Morbidität und Mortalität in der Gesellschaft auch steigt. Für einige Erkrankungen ist Diabetes schon die führende Ursache. Als Beispiel werden in den USA und Deutschland terminales Nierenversagen,
Erblindung und atraumatische Amputationen von Extremitäten am häufigsten durch
Diabetes verursacht[1].
Man unterscheidet verschiedene Formen des Diabetes. Die Klassifikation dieser Formen
erfolgt nicht mehr wie früher einmal anhand des Erkrankungsalters und der Behandlungsform, sondern anhand der zur Hyperglykämie führenden Prozesse. Die Erklärung
dafür liegt in der Zunahme des in jungen Jahren auftretenden Typ 2 Diabetes und der
Therapiemöglichkeit dieser Form mit Insulin oder Insulinanaloga. Dies unterstreicht
auch die Bedeutung der Hyperglykämie als zentrales Merkmal für Diabetes. Man kann
Diabetes grob in Typ 1 Diabetes und Typ 2 Diabetes unterscheiden. Dann gibt es noch
weitere Formen, die jedoch anteilsmäßig nur eine geringe Rolle spielen[1].
Der wesentliche Unterschied zwischen Typ 1 und Typ 2 Diabetes liegt im Insulin.
Während bei Typ 1 Diabetes die Produktion von Insulin nicht mehr ausreicht um den
Blutglukosespiegel zu regulieren, ist diese bei Typ 2 Diabetikern nicht der entscheidende Faktor. Bei der heterogenen Erkrankungsform des Typ 2 Diabetes kommt es zur
Störung der Blutglukoseregulationsprozesse im Sinne einer Insulinresistenz, gestörten
Insulinsekretion und vermehrten Glukoseproduktion[1].
5.1.2 Epidemiologie
Die Prävalenz des Diabetes mellitus steigt weltweit an, wobei dabei die Form des Typ
2 Diabetes stärker betroffen ist. Aufgrund von Beobachtungen des Anstiegs der weltweiten Diabetesprävalenz von 1985 mit 30 Millionen auf 177 Millionen im Jahre 2000
gehen Schätzungen von 360 Millionen Diabetikern weltweit im Jahr 2030 aus. Der
Geschlechtsunterschied in der Prävalenz von Diabetikern ist annähernd gleich in der
Altersgruppe von über 20 Jährigen (10,5 % Männer zu 8,5 % Frauen) und steigt bei
den über 60 Jährigen bei den Männer deutlich im Vergleich zu Frauen an. Die Inzidenzraten von Typ 1 und Typ 2 Diabetes sind weltweit geographisch unterschiedlich
und wahrscheinlich von der unterschiedlichen Verbreitung von HLA-Allelen in verschiedenen ethnischen Gruppen entscheidend mitbeeinflusst. Dabei weisen für Typ 1
11
Diabetiker die skandinavischen Länder die höchste Rate auf (jährliche Inzidenz von
35 pro 100.000 in Finnland), die geringsten Raten werden im pazifischen Raum beobachtet( Japan und China 1 bis 3 pro 100.000). Die USA bzw. Nordeuropa liegen im
Mittelfeld (17 pro 100.000)[1].
Schätzungen gehen von Diabetes als der fünfthäufigsten Todesursache weltweit aus.
Die Prävalenz von Typ 2 Diabetes ist auf Pazifikinseln am höchsten und in Russland
am geringsten[1]. Die WHO geht von einem Anstieg der Diabetesprävalenz in Europa
von 33 Millionen im Jahr 2000 auf 48 Millionen im Jahr 2030 aus [2].
Abbildung 1: weltweite Prävalenz, WHO
Epidemiologische Daten zu Österreich wurden aus dem Österreichischen Diabetes Bericht 2004[3] entnommen. Dabei war die Inzidenz für Typ 1 Diabetiker im Alter bis zu
14 Jahren in einem Zeitraum von 10 Jahren (1989-99) signifikant um 2,1 % pro Jahr
angestiegen. Die Inzidenz betrug über diesen Zeitraum 12,4 pro 100.000. Im Vergleich
dazu wiesen Typ 2 Diabetiker unter 15 Jahre eine Inzidenzrate von 0,25 pro 100.000
auf. Weiters wurde bei Typ 1 Diabetikern im Geschlechtsvergleich eine leicht höhere
Inzidenz des männlichen Geschlechts festgestellt[4]. In einer anderen durchgeführten
Erhebung in Oberösterreich (1994-1996) bei Typ 1 Diabetikern bis zu 30 Jahren war
das männliche Geschlecht von über 20 Jährigen im Verhältnis 2,25 :1 häufiger betroffen als das altersentsprechende weibliche Geschlecht [5]. Außerdem gibt es im Osten
von Österreich ein deutlich höheres Risiko an Typ 1 Diabetes zu erkranken als im
Westen[6, 7].
12
Die WHO schätzt die Diabetesprävalenz in Österreich auf 2,1 % und 130.000 betroffene
Österreicher. Sehr auffallend dabei ist, dass die Prävalenz der Frauen um 5 % höher
als die der Männer ist. Ersichtlich wird auch, dass der Hauptteil der Diabetiker schon
im fortgeschrittenen Alter ist. Dabei sind 42 % der Diabetiker 45-64 Jahre alt und 53
% über 64 Jahre alt [8].
Eine neuere Studie von Schober et al. [9] untersuchte die Inzidenz von Diabetes im
Zeitraum von 1999-2007 in Österreich bei unter 15 Jährigen. In diesem Zeitraum wurden 1857 Neuerkrankungen initial als Typ 1 Diabetes erhoben, dies waren 94,5 % aller
erhobenen Neuerkrankungen. Von den 44 Patienten, die als nicht klassifizierbar galten,
konnte im weiteren Verlauf (0,4 - 9 Jahre) bei 24 Typ 1 Diabetes nachgewiesen werden. Durchschnittlich erkrankten 209 Patienten pro Jahr an Typ 1 Diabetes und die
Inzidenzrate über diesen Zeitraum betrug 14,9/100 000. Es wurde auch ein statistisch
signifikanter konstanter Anstieg der Inzidenz nachgewiesen mit einer Steigerung um
0,81/100 000 Fällen oder anders ausgedrückt 5,7 % pro Jahr.
5.1.3 Pathogenese
5.1.4 Typ 1 Diabetes
Patienten mit Typ 1 Diabetes charakterisiert eine verminderte Insulinproduktion und
daher einen Mangel dieses Regulatormoleküls. Dafür verantwortlich sind eine genetische Prädisposition dieser Patienten, immunologische Prozesse und umweltbedingte
Einflüsse, die zu einem Untergang der insulinproduzierenden Betazellen des Pankreas
führen[1].
Die Zerstörung des Pankreas beruht dabei in den meisten Fällen auf einem autoimmunologischen Prozess, der durch gegen die Betazellen gerichtete Antikörper vermittelt
wird. Bei einer kleinen Anzahl von meist afroamerikanisch oder asiatischer Herkunft
entstammenden Betroffenen fehlt dieser Marker. Daher vermutet man, haben bei diesen Patienten unbekannte, nicht immunologisch vermittelte Prozesse einen wesentlichen
Anteil an der Entstehung des Insulinmangels[1].
Bei den restlichen Patienten ist die Insulinproduktion von Geburt an über einen längeren Zeitraum von Monaten bis Jahren normal, bevor es zu einer Zerstörung der
Betazellen kommt. Dieser Prozess dauert unterschiedlich lange und weist daher interindividuell eine große Spanne der Geschwindigkeit des Untergangs der Zellen auf. Als
Trigger für den autoimmunologischen Prozess werden infektiöse oder umweltbedingte
Reize angenommen[1].
Von Viren, besonders Coxsackie und Rötelnviren, sowie Kuhmilchexposition und der
Aufnahme von Nitrosoharnstoffen wird angenommen, dass sie zu solchen Triggern zählen. Bisher konnte jedoch noch nicht eindeutig belegt werden, dass diese Umweltfaktoren den genetisch prädisponierenden autoimmunologischen Prozess begünstigen. Erst
bei einer Zerstörung der Betazellen von 80 % kommt es zu einer relevanten Verminderung der Insulinproduktion, wodurch der Blutglukosespiegel nicht mehr kontrolliert
werden kann[1].
Diese Phase geht meist einher mit Lebenssituationen, in denen ein erhöhter Insulinbedarf besteht, wie Pubertät oder Infektionen, um zwei klassische Beispiele zu nennen.
Diese Phase wird gefolgt von einer Phase, in der nur wenig Insulin zur Therapie benötigt wird, und am Ende werden die letzten Betazellen von Autoantikörpern zerstört.
Es tritt ein vollständiger Insulinmangel auf[1].
13
In über 74% dieser Patienten und in 5 bis 10% bei Typ 2 Diabetikern mit Erstmanifestation sind Inselzellautoantikörper nachweisbar. Jedoch ist bis jetzt noch nicht ganz
geklärt, weshalb diese spezifisch Betazellen zerstören. Der einzige aus Antigenen erklärbare spezifische Autoimmunprozess gegen Betazellen ist der gegen Insulin, alle anderen,
wie Glutaminsäure-Decarboxylase, Phogrin und ICA-512, sind nicht spezifisch für diese
Zellen[1].
Ein weiterer spannender Aspekt ist, dass die Transplantation von Inselzellen aus gesunden eineiigen Zwillingen in den Erkrankten zu einer neuerlichen Erhöhung der Autoimmunantwort führt. Daher scheinen die Betazellen von gesunden und erkrankten
Patienten nicht krankheitsrelevant unterschiedlich zu sein. Die Spezifität der Antikörperreaktion gegen Betazellen kann auch nicht auf diesem Weg beantwortet werden.
Es scheint so als würde es bei der genetischen Prädisposition einen nicht unbeträchtlichen Einfluss von modifizierenden Faktoren geben, der die Krankheitsentwicklung
bestimmt, weil die Konkordanzrate bei eineiigen Zwillingen lediglich zwischen 30 und
70 % liegt, konträr zu der des Typ 2 Diabetes[1].
Der wichtigste derzeit identifizierte genetische Einfluss geht von Polymorphismen der
HLA Region auf Chromosom 6 aus, welche zu 40 - 50% das genetische Risiko dieser
Erkrankung mitbestimmen. Diese Region kodiert für die MHC-Klasse-II Moleküle und
ist dadurch über den Einfluss auf die T-Zellimmunantwort entscheidend in autoimmunologische Prozesse involviert[1].
Die bekanntesten und häufigsten Haplotypen bei Typ 1 Diabetikern sind der des HLADR3 und HLA-DR4. Jedoch entwickeln die meisten Patienten mit diesen Haplotypen
keinen Typ 1 Diabetes. Ebenso weisen Verwandte ersten Grades ein sehr geringes Risiko
auf ebenfalls an Typ 1 Diabetes zu erkranken[1].
14
5.1.5 Typ 2 Diabetes
Im Vergleich zu Typ 1 Diabetes beruht die Entstehung des Typ 2 Diabetes aus einem
Zusammenspiel von Insulinresistenz und abnormer Insulinsekretion. Die Mehrheit der
Studien weisen darauf hin, dass es zuerst zu einer Insulinresistenz kommt, dann im
weiteren Verlauf zu einer Insulinsekretionsstörung und erst durch das Vorhandensein
beider Faktoren sich ein Diabetes entwickeln kann. Insgesamt ist diese These jedoch
sehr umstritten[1].
Auf die erhöhten Glukosespiegel reagiert der Körper mit vermehrter Insulinausschüttung. Nach einiger Zeit reagieren die Effektorzellen von Insulin mit vermehrter Resistenz gegenüber diesen hohen Insulinspiegel und es entsteht die sogenannte Insulinresistenz[1].
Das bedeutet wiederum, dass die Insulinwirkung an den Zielorganen, vor allem Leber,
Muskel und Fettgewebe deutlich abnimmt. Da eigentlich genügend Insulin vorhanden
wäre um den Blutzucker zu normalisieren, es aber durch die reduzierte Insulinwirkung
an den peripheren Zielorganen dazu nicht imstande ist, spricht man von einem relativen
Insulinmangel[1].
Zu Beginn dieses Prozesses wird die Glukosetoleranz und damit der Blutzuckerspiegel
durch eine vermehrte Produktion von Insulin durch pankreatische Betazellen kompensiert. Erst bei Erniedrigung der kompensatorisch erhöhten Insulinprokution der Betazellen kommt es in weiterer Folge zu einer gestörten Glukosetoleranz mit Erhöhung
des postprandialen Blutzuckerspiegels. Dieser Prozess schreitet weiter voran bis es zu
einem erhöhten Nüchternblutzuckerspiegel und schließlich zum völligen Sistieren der
Insulinsekretion durch Betazellen kommt[1].
Gleichzeitig kommt es während dieses Prozesses zu einer vermehrten hepatischen Glukoseproduktion, weil die Gluconeogenese durch die Insulinresistenz der Leber nicht
mehr unterdrückt werden kann und der Blutzuckerspiegel ansteigt. Man vermutet,
genetische Faktoren sind für den Rückgang der Insulinsekretion verantwortlich. Die
genauen Gründe dafür sind jedoch unklar[1].
Im Vergleich zu Typ 1 Diabetikern dürfte hier die Genetik einen größeren Anteil zur
Entwicklung der Erkrankung beitragen, da die Konkordanz bei eineiigen Zwillingen
zwischen 70 und 90 % beträgt. Außerdem steigt das Erkrankungsrisiko für Typ 2 Diabetes auf 40 %, wenn beide Elternteile erkrankt sind. Neben der Genetik beeinflussen
auch noch andere Lifestyle- und Umweltfaktoren die Erkrankung, wie die körperliche
Aktivität, das Körpergewicht und die Ernährung[1].
Besonders häufig leiden Typ 2 Diabetiker auch an Adipositas vom zentralen Typ und
weisen daher eine größere Diskrepanz zwischen Hüft-Taillen Umfang auf, was wiederum
einen entscheidenden Parameter für kardiovaskuläre Folgeerkrankungen darstellt[1].
15
5.1.6 Folgeerkrankungen
Die diabetogenen Spätfolgen sind für die hohe Morbidität und Mortalität der Erkrankung verantwortlich und sind auf die dauerhaft erhöhten Blutglukosespiegel zurückzuführen. Die Folgeerkrankungen entwickeln sich langsam über Jahre hinweg, währenddessen die Patienten meist asymptomatisch bleiben[1].
Symptome treten erst häufig in der zweiten Erkrankungsdekade in Erscheinung. Dabei
sind vaskuläre Komplikationen die häufigsten. Man kann sie in mikro- und makrovaskulär unterteilen. Die bekanntesten Vertreter der mikrovaskulären Komplikationen
sind Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie und die der makrovaskulären sind koronare Herzkrankheit (KHK) beziehungsweise periphere arterielle Verschlusskrankheit
(PAVK)[1].
Bisher ist noch nicht geklärt, auf welchen pathophysiologischen Prozess im Detail diese
Spätschäden zurückzuführen sind oder ob in unterschiedlichen Organen unterschiedliche pathophysiologische Prozesse für die Entstehung dieser verantwortlich sind. Obwohl
bei mikrovaskulären Komplikationen die chronische Hyperglykämie für die Spätfolgen
verantwortlich ist, gibt es noch nicht genau bekannte Faktoren, die das Auftreten von
Spätkomplikationen mitbeeinflussen[1].
Es werden hier auch genetische Prädispositionen vermutet, denn einige Patienten ohne
wesentliche Unterschiede der Stoffwechsellage zu anderen Diabetikern entwickeln trotz
langjähriger Erkrankung keine Spätfolgen im Sinne einer Retinopathie oder Nephropathie[1].
Patienten mit Diabetes mellitus erblinden 25 mal häufiger als Nicht-Diabetiker und
haben nach 20 Jahren Erkrankung in fast allen Fällen eine nicht proliferative Retinopathie. Ungefähr 20 bis 40 % der Diabetiker erkranken an einer diabetischen Nephropathie, daher sind Diabetiker in Deutschland derzeit die größte Gruppe von Patienten, die
eine Behandlung mit Nierenersatzverfahren benötigen. Oder anders ausgedrückt, Diabetes ist die häufigste Ursache für einen persistierenden Verlust der Nierenfunktion[1].
Bei der Nephropathie gibt es drei wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Diabetes Formen.
In Typ 2 Diabetikern kann die Mikro- und Makroalbuminurie schon bei Diagnosestellung durch den längeren asymptomatischen Verlauf auftreten.
Sie sind meist mit arterieller Hypertonie vergesellschaftet.
Bei Typ 2 Diabetikern wird die Nephropathie häufiger als bei Typ 1 Diabetikern
durch andere Erkrankungen wie arterieller Hypertonie, Herzinsuffizienz und Infektionen mitverursacht[1].
Die diabetische Nephropathie korreliert wie die anderen mikrovaskulären Spätfolgen
mit der Dauer des Diabetes als auch mit der Blutzuckerspiegeleinstellung und tritt in
50% der Fälle mit langjährigem Diabetes auf[1].
Der Diabetes-Control-and-Complication-Trial (DCCT) beobachtete, dass eine Verbesserung der diabetischen Stoffwechsellage alle drei mikrovaskulären Erkrankungen reduziert. Im Detail wurde die diabetische Retinopathie um 39 %, die Mikroalbuminurie um
39 % und die Neuropathie um 60 % reduziert. Eine verbesserte Blutzuckereinstellung
gemessen an HbA1c mit unterschiedlichen Spiegel deutet darauf hin, dass es auf jedem
Niveau positive Auswirkungen gibt[1].
Weiters weist auch die United-Kingdom-Prospective-Diabetes-Study (UKPDS) auf diesen Nutzen hin, weil eine Reduktion des HbA1c um einen absoluten Prozentpunkt mit
einer Reduktion mikrovaskulärer Komplikationen um 35 % einhergeht[1].
Die makrovaskulären Komplikationen sind in Patienten mit Diabetes auch erhöht, vor
16
allem bei Typ 2 Diabetikern. Sie sind sogar so stark erhöht, dass die American Heart
Association Diabetes als einen Hauptrisikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen
definiert hat[1].
In der Framinghamstudie konnte gezeigt werden, dass kardiovaskuläre Ereignisse signifikant häufiger auftreten als bei Patienten ohne diese Erkrankung. Darunter Fallen die
PAVK, KHK, der Myokardinfarkt und der plötzliche Herztod. Diese erhöhte kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität scheint aus einem Zusammenspiel der langjährigen
Hyperglykämie und anderen spezifischen Risikofaktoren, wie Dyslipidämie und arterieller Hypertonie bedingt zu sein. Die beiden letzt genannten treten auch häufiger in
Diabetes mellitus Typ 2 auf. Daher kann dieser Umstand auch daran mitbeteiligt sein,
dass diese Folgeerkrankungen häufiger mit Typ 2 Diabetes assoziiert sind[1].
In der UKPDS wurde außerdem beobachtet, dass mikro- und makrovaskuläre Komplikationen durch eine strenge Blutdruckeinstellung signifikant verringert werden konnten.
In der DCCT wiesen die intensiviert behandelten Patienten (6,5 Jahre durchschnittliche
Behandlungszeit) eine Reduktion um 42 bis 47 % der nicht tödlichen kardiovaskulären
Ereignisse ohne Schlaganfall auf[1].
Weiters ergaben sich im Vergleich zu den nicht intensiviert Behandelten bei Kombination aller diabetischen Komplikationen 15,3 Jahre zusätzliche Jahre ohne signifikante
mikrovaskuläre oder neurologische Komplikationen. Dies hebt die besondere Bedeutung
von Hyperglykämie in der Erkrankung hervor [1].
5.1.7 Hämostase
In den Artikeln von Carr ME [10], Alzahrani [11], Lemkes et al[12], Grant[13] und denen
einiger anderer im Text gekennzeichneter Autoren finden sich folgende Aussagen.
Wie oben aufgeführt, ist das Gefäßsystem bei zahlreichen Folgeerkrankungen von Diabetikern betroffen. Die hohe Morbidität und Mortalität bei Diabetikern ist hauptsächlich auf diese mikro- und makrovaskulären Komplikationen zurückzuführen. Das Risiko
eines Diabetikers atherothrombotische Ereignisse zu erleiden ist sehr hoch. Das spiegelt
sich wider einerseits in der Tatsache, dass Diabetes ein Risikofaktor für Schlaganfall
ist [14] und andererseits das Risiko atherothrombotischer Komplikationen zu erleiden
dem einer an ischämischer Herzerkrankung leidenden Person ohne Diabetes entspricht
[15].
Calles et al. [16] zeigten sogar, dass thrombotische Komplikationen, die zu einem Tod
bei Typ 2 Diabetikern führen, mit 80 % sehr häufig sind und sogar 75% dieser Tode
alleine auf kardiovaskuläre Ereignisse zurückzuführen sind. Damit sind sie die Haupttodesursache bei Diabetikern.
Im folgenden Text wird auf die Veränderungen der Hämostase im Bezug auf Gerinnungsfaktoren, wichtigen natürlichen Antikoagulantien und die Auswirkungen von
Blutglukosespiegeln auf die Fibrinolyse bei Diabetes eingegangen.
Bei konventionellen Gerinnungstests wie der Prothrombinzeit(PT) und der aktivierten
partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) gibt es widersprüchliche Beobachtungen. Acang
und Jalil [17] haben eine Verkürzung der Werte in ihrer Probandengruppe gemessen.
Hingegen beobachtet Collier et al.[18] ein Jahr zuvor konträr dazu eine regelrechte PT
bei Diabetikern ohne Insulintherapie in ihrer Studie.
Bei den Studien, die in Verbindung mit dem Nachweis von Blutgerinnungsfaktoren
durchgeführt wurden, scheint die Datenlage derzeit klarer zu sein. Nachdem durch
Kontaktaktivierung Faktor XIa gebildet wird, wird er über die Leber in einem Komplex
17
mittels a1 Antitrypsin ausgeschieden. Dieser Komplex findet sich gehäuft in Diabetikern
und korreliert in einer Studie auch mit Lipoprotein-a-Spiegel[19, 20].
Eine Reduktion der Halbwertszeit wie bei Diabetikern spiegelt einen vermehrten Verbrauch von Fibrinogen in der Blutgerinnung wider[21, 22].
Bei Diabetikern sind auch zahlreiche Blutgerinnungsfaktoren erhöht, wie Faktor I, VII,
VIII, XI, XII, von Willebrand Faktor(vWF) und Tissue Factor(TF)[17, 23, 18, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30]. Dies spricht für eine Gerinnungsveränderung bei Diabetikern hin
zu einer Hyperkoagulabilität und damit auch einer Beteiligung an den thrombotischen
Komplikationen.
Dies kann anhand der erhöhten Fibrinogenspiegel (Faktor I) gezeigt werden. Sie sind
ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen und steigen in mikround makrovaskulären Komplikationen an [31, 32, 33].
Des weiteren weisen erhöhte Fibrinogen-Spiegel in Typ 1 Diabetikern auf ein Fortschreiten der Verkalkung der Koronargefässe und in Typ 2 Diabetikern auf einen stumme
myokardiale Ischämie hin[34, 35]
Bei Diabetespatienten findet man des weiteren auch Veränderungen der Spiegel von
körpereigenen gerinnungshemmenden Substanzen. Antithrombin (AT) ist eine dieser
Substanzen. Es wird in der Leber synthetisiert und ist ein wesentlicher Bestandteil zur
Gerinnungshemmung in der Hämostase. Besonders durch die Inhibierung von Faktor Xa
und IIa(Thrombin) aber auch durch Inhibierung von Faktor IXa,XIa und XIIa wird
dieser Effekt vermittelt. In unterschiedlichen Studien wurden dabei unterschiedliche
Spiegel bei Diabetikern beobachtet.
In einer neuen Studie wurden im Normbereich liegende Spiegel erhoben [24], während
in einigen älteren Studien erhöhte und erniedrigte Spiegel gemessen wurden.
Ein weiteres wichtiges Antikoagulans ist Protein C. Es wird ebenso wie AT in der Leber
synthetisiert und zirkuliert als inaktive Vorstufe im Blut. Durch Interaktion zwischen
Thrombin und Thrombomodulin kommt es zu seiner Aktivierung. Anschließend wird
es durch Inhibitoren wie a2 Makroglobulin wieder gesenkt. Protein C ist dabei für die
Regulation von Faktor V und VIII in der Blutgerinnung von entscheidender Bedeutung.
Reverter et al. [27] beobachteten eine Erhöhung von Thrombomodulin bei diabetischen
Patienten mit Mikroangiopathie. Dagegen fanden ältere Studien eine Erniedrigung von
Protein C bei Patienten mit Typ 1 Diabetes und normale a2 Makroglobulin Werte bei
Diabetikern [36, 37].
Der Tissue-Faktor-Pathway-Inhibitor (TFPI) kontrolliert die Aktivität von Faktor VII.
Als Kofaktoren werden dabei Faktor Xa und TF gebraucht. Dieser TFPI scheint auch
erhöht in Diabetikern mit Nephropahtie zu sein[38].
Weiters weisen bei Diabetikern die Thrombozyten eine abnormale Funktion im Sinne
einer Hyperreaktivität auf und die erhöhten Gerinnungsfaktoren können auch mit verminderter Fibrinolyse einhergehen[39].
Wie schon zuvor mehrmals erwähnt weisen Diabetiker als ein entscheidendes Merkmal eine Hyperglykämie, mehr oder minder konstant auf. Nachdem Diabetes einen
prothrombotischen Zustand vermittelt, der mit zahlreichen Veränderungen von Hämostaseparametern einhergeht, ist trotzdem noch zu klären, welche Rolle eine Hyperglykämie dabei spielt. Die konstante, also chronische, Hyperglykämie ist für die Entstehung
des Großteils der Folgeerkrankungen von Diabetikern verantwortlich. Ein Marker, um
solche konstant erhöhten Blutglukosespiegel zu messen, ist der HbA1c Wert.
18
In einer Studie wurde der Zusammenhang von hohem HbA1c mit einem Fibrinolysemarker in Typ 2 Diabetikern beobachtet. In dieser Studie wurden dazu 91 Patienten mittels metabolischer Parameter, unter anderem Hba1c und auf PlasminogenActivator-Inhibitor-1(PAI-1)-Spiegel hin untersucht. PAI-1 kann als Marker für Koronarsklerose bei Diabetikern herangezogen werden. Anschließend wurden die Patienten in zwei Gruppen entweder mit Glipizide oder Metformin behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass sehr hohe Konzentrationen von HbA1c ( im Mittel von 10%)
mit einer deutlichen Steigerung des PAI-1 einhergingen und beide Medikamente unabhängig voneinander die PAI-1-Werte verringerten. Daher wird dieser Effekt nicht
auf eine medikamentenspezifische Wirkung zurückgeführt, sondern auf eine Verringerung der Hyperglykämie. Weitere Studien unterstützen diese Beobachtungen und
untermauern die bekannte Hypofibrinolyse mit verlängerter Clot Lyse Zeit in Typ 2
Diabetikern[40, 41, 42, 43, 44].
Andere Studien haben auch diese Relation mit PAI-1 in einem Kollektiv von Typ 1 Diabetikern untersucht. In dieser Patientengruppe kann die Auswirkung der hyperglykämischen Zustände in Diabetikern besonders gut untersucht werden, da bei ihnen andere
übliche Risikofaktoren wie Adipositas, Hypertonie und andere metabolische Komplikation entsprechend dem Altersgipfel der Erkrankung häufig fehlen. Daher können die
Ergebnisse leichter diesen spezifischeren hyperglykämischen Effekten zugeordnet werden.
Eine Langzeitstudie über 18 Jahre untersuchte die Auswirkung von Hba1c auf die
Fibrinolyse gemessen an PAI-1. Dabei konnten die Ergebnisse in Typ 1 Diabetikern
auch bestätigt werden. Der Mittelwert des Hba1c betrug bei diesem Patientenkollektiv
8% und ging ebenfalls mit erhöhten PAI-1-Spiegeln einher, sowie mit einer Verringerung
von Tissue Plasminogen Activator (TPA)[45].
TPA wirkt katalytisch auf die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin und trägt
so ebenfalls zur Fibrinolyse bei. Allerdings gibt es auch, wenn auch in geringerer
Menge, Studien in denen sich Parameter der Fibrinolyse, wie Thrombin-aktivierterFibrinolyse-Inhibitor (TAFI), in beiden Diabetes Formen nicht von gesunden Probanden unterscheiden[41, 46].
Es wurde auch in mehreren Studien eine Korrelation von Plasmaglukosespiegel und
Fibrinogen gefunden, wobei es den Anschein hat, als würde Fibrinogen auch durch die
Blutglukosespiegel mitbeeinflusst und verändert. Obwohl in diesen Studien auch eine
verbesserte Blutzuckereinstellung durch Insulin nicht unbedingt mit einer Verringerung
der Werte einhergeht und daher noch Restzweifel bestehen bleiben [47, 48, 49, 50].
Eine weitere Forschergruppe untersuchte den Effekt von Glukose- und Insulinspiegel auf
verschiedene Parameter der Blutgerinnung, darunter auch Tissue Factor Procoagulant
Activity (TFPcA). Dabei wurden die TFPCA-Spiegel deutlich durch eine Normalisierung der Blutzuckerwerte reduziert. Andererseits führte Insulin alleine auch zu einer
TFPCA Erhöhung. Den höchsten Anstieg an TFPCA konnte jedoch in der Kombination von erhöhten Blutzuckerwerten und Insulinwerten beobachtet werden. Dies ging
sogar mit erhöhten Werten von Thrombin-Antithrombinkomplex (TAT) und Prothrombin Fragment 1+2 (F1+2) als klassische Aktivierungsmarker der Gerinnung einher [23].
In einer anderen Studie sind auch Parameter zur Bestimmung der Thrombin Generation in Typ 2 Diabetikern mit Hyperglykämie erhöht [51] und unterstützen diese
Assoziation.
Gibt es auch in einzelnen Untersuchungen eine kontroversielle Datenlage, lässt sich
19
doch zusammenfassend eine hämostaseologische Imbalance im Sinne eines prothrombotischen Zustands bei Diabetespatienten zeigen. Dies passt auch sehr gut zu den
bekannten atherothrombotischen Komplikationen bei Diabetes, als auch zu der kürzlich durchgeführten Metaanalyse in der gezeigt wurde, dass Diabetes als unabhängiger
Risikofaktor für venöse Thrombembolien (VTE) gilt[52]. Insgesamt scheint der Hyperglykämie und dem Insulin eine Schlüsselrolle in diesem Prozess zuzukommen, jedoch
sind die Mechanismen nicht restlos geklärt und es bedarf noch weiterer Studien diese
zu erforschen.
5.2 Mikropartikel
5.2.1 Einführung
Mikropartikel (MP) sind schon seit längerem bekannt und wurden erstmals als „platelet dust“ 1967 von Wolf beschrieben[53]. Wie durch den Namen schon zu vermuten ist,
handelt es sich um sehr kleine Teilchen, meistens wird in Studien die Größenordnung
von unter einem Mikrometer aufgeführt [54, 55, 56, 57]. Ein neuer Review aus dem
Jahre 2010 definiert sie jedoch etwas weiter in der Größenordnung von 0,05 bis 1,5
Mikrometer[58]. MP sind als Vesikel zu betrachten, die aus verschiedenen Ursprungszellen stammen und an ihrer Oberfläche bestimmte Membranproteine ihrer Ursprungszellen präsentieren und so diesen auch zuordenbar sind. Die Ursprungszellen sind von
einer Phospholipiddoppelschicht umgeben und ermöglichen so eine Interaktion mit ihrer Umgebung und eine Reaktion auf sie umgebende Reize.
Dabei scheint in der Interaktion mit ihrer Umgebung den Phospholipiden eine zentrale Rolle in der Kommunikation zuzukommen. Thrombozyten besitzen als ein Beispiel
eine asymmetrische Verteilung von Phospholipiden an ihrer Plasmamembran, welche
sich nach Zellaktivierung oder Apoptose verändert. In diesem Fall befinden sich Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidyletholamin und Sphingomyelin in der
doppelschichtigen Phospholipidmembran. In Ruhe befindet sich das neutral geladenen
Phosphatidylcholin und Sphingomyelin im äußeren Anteil der Membran und die beiden
negativ geladenen im Inneren. Durch Aktivierung der Zelle und Apoptose treten die
beiden negativ geladenen Phospholipide an die Oberfläche. Somit tragen sie zur MP
Freisetzung bei [54, 55, 58].
MP selbst sind in physiologische Regulationsprozesse der Hämostase involviert (5.2.2).
Die genauen Mechanismen zur Freisetzung, Regulation und Interaktion von MP liegen
jedoch noch weitgehend im Dunklen. Des weiteren ist es noch nicht geklärt, ob sie als
Initiatoren, Folgeerscheinungen oder beides in pathologischen Prozessen fungieren. Als
gesichert gilt, dass sie in einigen pathologischen Prozessen erhöht sind.
Neben dem bekannten Einfluss von MP auf die Hämostase weisen immer mehr Studien
auf eine Rolle in verschiedensten pathologischen Prozessen hin, wie zum Beispiel Diabetes mellitus, Koronare Herzkrankheit, Dyslipidämie, Hypertonie, Krebs, Niereninsuffizienz, Präeklampsie [59, 60, 61, 55, 62].
Die Konzentration von MP im Blut ist auch abhängig vom Alter, jedoch bleiben sie im
Erwachsenenalter stabil [63]. Die sich im Blut befindlichen MP stammen aus Thrombozyten, Erythrozyten, Leukozyten, Endothelzellen und eventuell sogar Megakaryozyten.
Anteilsmäßig am häufigsten finden sich von Thrombozyten stammende MP. Von diesen MP erwartete man sich einen besonders großen Einfluss. Erst darauffolgend wurden
nach und nach weitere MP aus anderen Ursprungszellen untersucht. Ein detaillierteres
20
Verständnis von MP im Zusammenhang mit diversen pathologischen Prozessen eröffnet
uns einerseits eine neue Möglichkeit für Diagnostik und Monitoring des Verlaufs von
Erkrankungen und andererseits vielleicht auch neue Therapiestrategien für Erkrankungen [55, 64, 58]. Derzeit ist jedoch der technische und finanzielle Aufwand zur Messung
der einzelnen MP-Konzentrationen zu groß, um es routinemäßig in der medizinischen
Versorgung einsetzen zu können. Es besteht hier noch Bedarf für eine Weiterentwicklung.
5.2.2 Rolle in der Hämostase
Wie Diamant ausführt braucht es für eine Aktivierung der Gerinnung Kalziumionen,
zirkulierende Gerinnungsfaktoren und eine spezielle Membranoberfläche. Wie schon
eingangs erwähnt sind Thrombozyten von einer Phospholipidmembran umgeben und
ihre negative geladene Phospholipide treten bei Aktivierung an die Oberfläche. Durch
die Abschnürung ihrer Vesikel und damit der Bildung von MP enthalten jene auch diese Phospholipide. Somit entsteht die benötigte Oberfläche zur Gerinnungsaktivierung.
Unter Beisein von Kalziumionen binden die negativen G1a Domänen der Gerinnungsfaktoren an die Phospholipide der MP. Dadurch kann zur Bildung von Tenase- und
Prothrombinasekomplexen beigetragen werden [54].
Weiters kann angeführt werden, dass von Thrombozyten stammende Mikropartikelmembranen (PMP) unter Laborbedingungen die Thrombinbildung stärker fördern als
die Membran der Thrombozyten selbst. Aber nur wenn eine Korrektur des Oberflächeneinheitsareals erfolgt. Das könnte durch die höhere Anzahl an Bindungsstellen für
Gerinnungsfaktoren Va, VIIIa und IXa der MP pro Einheit der Membranoberfläche als
bei Thrombozyten erklärbar werden [54].
Faktor VIII ist ein Kofaktor im Tenase Enzym Komplex. Faktor Va und Faktor Xa
bilden den Prothrombinase Komplex. Es wurde nachgewiesen, dass PMP für alle drei
Faktoren an ihrer Oberfläche Rezeptoren besitzen [65, 66, 67].
Wie Nomura vorschlägt, können daher PMP für längere Zeit als aktivierte Thrombozyten von der Ferne in die Gerinnung eingreifen[68].
Weiters haben PMP eine 50 bis 100 fach höhere spezifische gerinnungsfördernde Aktivität als aktivierte Thrombozyten[69, 70].
Unter Fibrinolyse von Myokardinfarkten korrelierte eine geringere TFPI Dichte an der
Oberfläche von MP mit einer durch TF mediierten Blutgerinnung[71].
Auch werden von MP-Aggregaten Sauerstoffradikale gebildet, die zur Inaktivierung
von TFPI führen könnten[72]. Eine weitere Studie konnte zeigen, dass MP über Faktor
VII beziehungsweise TF abhängige und unabhängige Mechanismen zur Blutstillung
beitragen[73, 74, 75, 76, 77].
PMP haben auch die Fähigkeit die Aktivierung von Protein C zu erhöhen. Somit
tragen sie zur Inhibierung der Gerinnungsfaktoren Va und VIIa bei, wodurch sie die
Thrombinbildung verhindern könnten [78].
Des weiteren finden sich an der Oberfläche von MP TFPI und Protein C, somit könnten
sie zusätzlich gerinnungshemmende Eigenschaften aufweisen[71, 79]. Höhere Konzentrationen von TF beinhaltenden zirkulierenden MP könnten unter Umständen zu einem
Ungleichgewicht zwischen TFPI und TF führen und so zur vermehrten Blutgerinnung
beitragen [71, 56].
PMP interagieren über GPIIb/IIIa Rezeptoren mit der subendothelialen Matrix und
binden an Thrombin aktivierte Endothelzellen (EC) und haben auch die Fähigkeit mit
21
gelöstem Fibrinogen zu interagieren. So könnten sie zu einem GPIIb/GPIIIa-Bridging
führen und zu einer weiteren Thrombozytenadhäsion beitragen[64, 80].
Wie Diamant berichtete hatte die klinische Situation der Patienten in einigen Studien
einen großen Einfluss auf das Ergebnis der Gerinnung unter Laborbedingungen [54].
Dafür führte er das Beispiel von zwei Studien an. Einerseits wurde gezeigt, dass Antikörper gegen Faktor VII oder TF in Patienten mit Meningokokkensepsis und disseminierter intravasaler Gerinnung die Thrombinbildung unterbinden konnten [81]. Anderseits konnte mit keinem dieser Antikörper das gleiche Resultat in gesunden Probanden
erreicht werden[54].
Es ist noch nicht klar, ob MP auch im menschlichen Körper so reagieren wie unter
Laborbedingungen, jedoch scheint es als würden sie auch in vivo klinisch relevant sein.
Es konnten wie von Diamant[54] angeführt mehrere Gründe dafür gefunden werden.
Erstens wurde nachgewiesen, dass MP in vitro die Blutgerinnung unterschiedlicher
Patientengruppen fördert[74, 81, 82].
Zweitens, dass erhöhte Werte von in vivo Gerinnungsmarkern wie Prothrombin Fragment F1+ F2 und Thrombin-Antithrombin-Komplex mit MP vorkommen, die TF an
ihrer Oberfläche präsentieren.
Drittens, dass thrombembolische Komplikationen einhergehen mit einer erhöhten Anzahl von MP[83, 84, 85, 86].
Viertens, in äußerst seltenen Erkrankungen mit einer verlängerten Blutgerinnung, konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an zirkulierenden MP erniedrigt ist [87, 88, 89].
Als ein Beispiel dafür kann das Scott Syndrom herangezogen werden. Auf den von
Thrombozyten stammenden MP findet man wie schon in der Einführung erwähnt Phosphatidylserin. Jedoch beinhalten nicht nur diese, sondern auch von Monozyten, Leukozyten und Endothelzellen stammende Mikropartikel(MMP,LMP,EMP)dieses Phospholipid an ihrer Oberfläche [61].
PMP können mit ihren Glykoproteinen, die als Rezeptoren dienen, an passende Liganden binden und somit gerinnungsfördernd wirken [90]. Weiters können PMP noch an
gelöstes und gebundenes Fibrinogen binden und mit Thrombozyten aggregieren[91].
Zirkulierende MP können auch weitere Moleküle an ihrer Oberfläche präsentieren, welche zur Gerinnung beitragen, wie vWF und E-Selectin [92].
MMP können über P-Selectin an aktivierte Thrombozyten binden und könnten daher
an der Entstehung von Thrombosen mitbeteiligt sein [93].
22
5.3 Kalibrierte Automatisierte Thrombingenerationsmessung
5.3.1 Einführung
In den Artikeln von Hemket et al.[94, 95, 96, 97] finden sich folgende Aussagen.
Die Bestimmung einer Thrombingeneration ist keine neue Errungenschaft. Sie wurde schon in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts angewandt wie in der Studie von
Macfarlane und Biggs [98].
Aufgrund der aufwändigen und technisch schwierigen Messmethode wurde dieses Verfahren bisher nur selten angewandt. Ein geübter Laborangestellter braucht bei der
herkömmlichen Subsampling Technik ungefähr eine Stunde um ein bis vier Thrombogramme darzustellen. Mit der neu entwickelten Messmethodik von Hemker et al. können im Vergleich dazu durch Automatisierungsprozesse bis zu 100 Proben pro Stunde
ausgewertet werden[97, 96].
Damit stehen der Forschung neue Möglichkeiten zur Verfügung um die Rolle des Thrombins in diversen Prozessen der Hämostase oder anderen Erkrankungen zu untersuchen.
Besonders im Bereich der Hämostase ergibt sich eine neue Alternative zu den herkömmlichen Methoden.
Die Messung der Thrombingenerierung, dem Schlüsselenzym der Hämostase reflektiert nicht nur Einzelfaktoren sondern die „Overall-Function“. Die größte Menge des
gebildeten Thrombins tritt erst nach der Lag-Time auf, der Zeitspanne, die in der
Routinediagnostik mittels apTT erfasst wird [98].
Daher stellt sich die Frage, welche Rolle dieser Anteil des Thrombin im menschlichen
Körper spielt und an welchen pathophysiologischen Prozessen er beteiligt ist. Faktorenmangelzustände, KHK oder gerinnungsaktive Medikamente und ihr Einfluss auf die
Thrombingeneration sind derzeit Gegenstand aktueller Untersuchungen.
Nachdem wie schon dargestellt Thrombin eine Schlüsselrolle in der Gerinnung spielt,
birgt die Thrombingenerationsmessung das Potential in sich eine Abschätzung der gesamten Gerinnung zu geben, welche es in einem einzelnen Verfahren bisher noch nicht
gibt. Derzeit existieren für verschiedene Aspekte der Gerinnung verschiedene Tests.
Weiters können herkömmliche Gerinnungstests nicht das thrombotische Risiko einer
unbekannten Ursache oder hämostatischer Veränderungen milder Ausprägung abschätzen.
Wie Roschitz et al. [99] in einer Studie feststellten, eignen sich PFA-100 (platelet function analyzer) und aPPT nicht zur routinemäßigen präoperativen Erfassung einer präexistenten Blutungsneigung, sondern sollte erst bei Verdacht auf Gerinnungsdefekte
eingesetzt werden.
Hier soll in keinem Fall die Leistung der herkömmlichen Gerinnungstests geschmälert
werden, viel mehr soll gezeigt werden, dass es im Bereich der Hämostase noch immer keine adäquate Darstellung der Prozesse gibt und es daher noch Bedarf für die
Entwicklung von Methoden zur Diagnose, Kontrolle und Therapie in diesen Bereichen
gibt.
Die Thrombingeneration kann prinzipiell in thrombozytenarmen Plasma (PPP), thrombozytenreichem Plasma (PRP) und Vollblut bestimmt werden. Mit jedem Schritt, in
dem weitere Aspekte der Hämostase in die Untersuchung eingeschlossen werden, wird
die Aussage repräsentativer für die Situation in vivo. Jedoch nimmt der technische
Aufwand zur Bestimmung zu und unsere Fähigkeit des analytischen Verständnisses
ab.
Die ursprünglichen Bestimmungsmethoden wie bei Biggs et al. [98] wurden per Hand
23
mit wenig automatisierten Prozessen durchgeführt und waren daher sehr aufwändig.
Das Beifügen eines chromogenen Substrates von Thrombin, also einer Vorstufe eines
Farbstoffes der bei Aktivierung sich in einen Farbstoff verwandelt, ermöglichte es die
Probenzeit automatisch und die Thrombinaktivität halbautomatisch zu erheben. Daher
konnte der Aufwand reduziert werden und mehrere Untersuchungen nebeneinander
durchgeführt werden.
Damit das Areal unter der Thrombogrammkurve, auch als endogenes Thrombinpotential (ETP) bezeichnet, dem umgewandelten Thrombinsubstrat entspricht, muss es in
größeren Mengen zugefügt werden, weil die Konzentration von freiem Thrombin im
Plasma durch Inaktivierung und anderen Interaktionsprozessen sehr schnell abnimmt.
Die konstante Thrombinaktivität ermöglicht es daher nicht den Substanzverbrauch zu
messen. Eine Möglichkeit dies trotzdem zu erreichen, ist a2-Makroglobulin zu verwenden. Es bindet Thrombin und bildet einen Komplex (a2MT), so dass es zu keiner
weiteren Spaltung von physiologischen Substraten kommt. Dadurch kann das Problem
des Substratverbrauchs gelöst werden (siehe unten).
A2MT und das freie Thrombin bilden hier die gesamte amidolytische Aktivität während der Thrombingeneration. Die Geschwindigkeit der Bildung von a2MT kann herangezogen werden um die Konzentration von Thrombin widerzuspiegeln und ist daher
proportional mit dem ETP.
Als nächstes ist es wichtig eine chromogene Substanz zu finden, die auch in gerinnendem
Plasma korrekt gemessen werden kann. Einige dieser Substanzen hemmen die Thrombinbildung durch ihre Bindung so sehr, dass die Thrombingenerierung nicht mehr mit
den Prozessen in vivo gleichgesetzt werden kann. Diese Wirkung erreichen sie als starke Thrombininhibitoren und indem thrombinabhängige Prozesse in der Hämostase und
Feedback Regulationsprozesse verfälscht werden.
Es gibt jedoch chromogene Substrate, die nur unwesentlich mit der Thrombinbildung
interferieren. Sie verdrängen aber plasmatische Antithrombine und verlängern das ETP
durch eine verlangsamte Inaktivierung. Daher wird der Abfall von Thrombin dadurch
verlängert. Dieser Effekt kann durch Berechnungen und Kalkulationen ausgeglichen
werden.
Jetzt ist es möglich, die Thrombingeneration anhand eines photometrischen Signals
zu messen. Diese Messung ist abhängig von der optischen Dichte des Plasmas. Dieses
wiederum verändert sich mit Eintritt der Gerinnung. Daher müssen bei Messungen mit
chromogenen Substraten fibrinogenfreies und thrombozytenfreies Plasma verwendet
werden.
Da Fibrinogen und Thrombozyten essentielle Bestandteile der Gerinnung sind, führt es
auch zu einer Verringerung der Aussagekraft für in vivo Prozesse. Durch die Verwendung einer fluoreszierenden Substanz spielt die Trübung des Substrats keine wesentliche
Rolle mehr.
Jedoch entstehen wieder neue Hindernisse wie der „Inner-Filter-Effekt“. Damit wird
bezeichnet, dass das gemessene Signal nicht nur von der Konzentration des gebildeten
Fluoreszenzsubstrats abhängt, sondern auch noch von anderen Licht absorbierenden
Molekülen. Besonders problematisch wird dies im Plasma. Es gibt eine große Variationsbreite des gemessen Signals zwischen Plasma und Puffer ( 65 %) und selbst zwischen
zwei Plasmen ( 15 %)[100, 101]. Daher kann die Standardisierung der Reaktionsgeschwindigkeit nicht durch einen Vergleich erfolgen. Deshalb gibt es auch keinen fixen
Faktor mit dem das gemessene Signal multipliziert werden muss, um aus dem ETP die
tatsächliche Konzentration des Thrombins zu gewinnen.
24
Das gemessene Signal reagiert des weiteren auch sehr sensitiv auf plasmatische Farbveränderungen wie bei minimaler Hämolyse, das Alter der verwendeten Lichtquelle und
vieles mehr. Daher muss jede Probe individuell mit dem gleichen Plasma kalibriert werden. Es wird jedem Plasma einer Probe in einer zweiten Probe eine festgelegte Konzentration von konstanter Thrombinaktivität beigefügt. Als Kalibrator hierfür wird a2MT
herangezogen. Daher kann der Kalibrierungsfaktor von der gebildeten Kurve abgelesen
werden und so auf die Thrombingeneration in der anderen Probe geschlossen werden.
Diese Automatisierung ermöglicht eine weniger aufwändigere und damit leichtere beziehungsweise zeitsparendere Bestimmung der Thrombingenerierung.
Der Unterschied der KAT zu vorherigen Methoden liegt in der eben dargestellten Kalibrierung. Durch sie wurde erkannt, dass die Kalibrierungskonstante nicht linear ist,
sondern durch den Substratverbrauch und Inner-Filter-Effekt und damit durch die
Menge des Fluoreszenzsubstrats zu jedem Messpunkt unterschiedlich ist und ein eigener Kalibrierungsfaktor für jeden dieser Zeitpunkte herangezogen werden muss.
Die Thrombingenerationsmessung scheint auch altersabhängig zu sein. Wie Haidl et al.
[102] in ihrer Studie nachgewiesen haben.
Dazu wurden jeweils drei Gruppen von Kindern und Jugendlichen zu einer erwachsenen
Gruppe mittels KAT verglichen. Es wurde nach dem Alter eingeteilt: die erste Gruppe
bestand aus 0,5 bis 6 Jährigen. Die zweite aus 7 bis 10 Jährigen und die letzte aus 12
bis 17 Jährigen. Die Gruppe der Erwachsenen wurde nochmals in junge Erwachsene
von 18 bis 35 Jahren und ältere Erwachsene von über 35 Jahren unterteilt.
Alle drei Gruppen hatten im Vergleich zu den Erwachsenen ein signifikant verringertes
ETP. Die Lag-Time war in den ersten beiden Gruppen signifikant länger als die der
Erwachsenen. Es gab außerdem signifikante Unterschiede zwischen den beiden Erwachsenen Gruppen. Das Alter der Patienten korrelierte mit dem ETP und Peakwert und
die Lag-Time wies eine negative Korrelation auf. Daher haben sie gezeigt, dass die
Thrombingeneration auch altersabhängig ist.
Die in Kindern physiologisch vorkommenden verringerten Prothrombinspiegel und erhöhten Antithrombinspiegel werden von ihnen als eine Erklärung für das verminderte
ETP bei Kindern und Jugendlichen herangezogen. Falls ein erhöhtes ETP ein Risikofaktor für Thrombose ist, könnte das ETP die während des Lebens erworbenen Risikofaktoren widerspiegeln.
Dies zeigt, dass Alter ein nicht zu übersehender Einflussfaktor auf die Thrombingeneration ist und in der Analyse miteinbezogen werden sollte.
Die Probandengruppe in unserer Studie besteht auch aus Kindern und Jugendlichen
von 0 bis zu 19 Jahren. Daher würden der Einfluss von zusätzlich über die Jahre
akkumulierter Risikofaktoren reduziert und der unmittelbare Effekt von Diabetes auf
die Thrombingeneration in diesen Probanden ersichtlicher.
25
5.3.2 Form des Thrombogramms
Im Folgenden wird hier die Kurve des Thrombogramms nach Hemker et al. [94, 97, 95]
beschrieben (Beispiel Abb. 2 [103]).
Es kann grundsätzlich in drei verschiedene Phasen eingeteilt werden: erstens die LagTime, zweitens die Produktionsphase und drittens die Rückbildungsphase. Die Grundstruktur der drei Phasen und damit die Form des Thrombogramms sind unabhängig
von der Messmethode und den Experimentbedingungen.
Am Beginn in der Lag-Time kommt es nur zu einer geringen Produktion von Thrombin,
jedoch wird gleichzeitig mit den kleinsten Spuren von Thrombin auch Fibrin gebildet.
Am Ende dieser ersten Phasen kommt es zur Gerinnung, daher ist auch die Blutgerinnungszeit ein guter Parameter um die Lag-Time abzuschätzen und umgekehrt. In dieser
Phase der geringen Thrombingenerierung kommt es zur Vorbereitung auf einen rapiden
Thrombinanstieg durch Aktivierung einzelner oder mehrerer der Faktoren V,VIII, XI
und der Thrombozyten [104, 105].
Die erste Phase und die zweite Phase müssen getrennt voneinander betrachtet werden,
weil ihnen anscheinend zwei verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. Ein angeführtes Beispiel ist das Lupus-Antikoagulans („LAC-Paradoxon“). Es erhöht einerseits die
Dauer der Lag-Time, damit auch die Blutgerinnungszeit. Andererseits kommt es trotzdem zu einer vermehrten Thrombingeneration. Daher kann auch durch Ergebnisse aus
der Lag-Time nicht automatisch auf die Produktionsphase geschlossen werden.
Nach der Lag-Time kommt es zu einem massiven und rapiden Anstieg des Thrombins
bis zu einem Spitzenwert (Peak). Die Inaktivierung von Thrombin durch die plasmatischen Antithrombine erfolgt kontinuierlich von Beginn der ersten Thrombinkonzentration in der Lag-Time bis zum Ende des Thrombogramms. Die Geschwindigkeit der
Inaktivierung ist dabei abhängig vom auftretenden Thrombin und ist zum Zeitpunkt
des Thrombinpeak gleich der Thrombinproduktion. Von da an nimmt die Inaktivierung
überhand und während des Thrombinrückgangs kommt es irgendwann zum Stopp der
Thrombinproduktion.
Abbildung 2: Form des Thrombogramms
Das ETP ist das Areal unter der Kurve und entspricht dem gesamten gebildeten Thrombin. Der Hauptteil des Thrombins wird, wie schon besprochen, in der zweiten und
dritten Phase gebildet und daher nehmen diese Phasen den größten Einfluss auf das
ETP. Das ETP ist ein neuer und sehr wichtiger Parameter im Thrombogramm. Wie
beim LAC Paradoxon schon erwähnt, ist das ETP erhöht und die Blutgerinnungszeit
verkürzt, jedoch scheint es, als würde das ETP für die thrombotische Tendenz verant26
wortlich zu sein, wie bei diesen Patienten. Andererseits ist die Thrombingenerierung
bei Patienten mit Gerinnungsfaktorenmangel auch erniedrigt. Ein mitbestimmender
Grund für den Zusammenhang von ETP und erhöhter Blutungstendenz könnte sein,
dass die Höhe des gebildeten Thrombins auch die Stärke der Fibrinolyse über die Bildung des thrombinaktivierten Fibrinolyse Inhibitors mitbestimmt [106].
5.3.3 Eine neue Sicht der Hämostase?
Wie Hemker et al. [94] darstellt gibt es verschiedene Sichtweisen im Bezug auf die
Gerinnung im menschlichen Körper. Einerseits das vorherrschende Schema, dass als
initialen Schritt der Gerinnung Thrombozyten den Gewebedefekt verschließen und in
weiterer Folge die Gerinnungskaskade in Gang gesetzt wird. Es werden Faktor XI, IX,
VIII und X aktiviert. Faktor Xa mit Va wandelt dann Prothrombin unter Einfluss
von Ca2+ in Thrombin um und dieses spaltet Fibrinogen zu Fibrinogenmonomeren.
Dadurch entsteht ein Fibrinnetz, welches die Thrombozyten fest verankert und ein
Gerinnungsthrombus entsteht. Der erste Schritt wird von der Blutungszeit erfasst und
der zweite durch die Blutgerinnungszeit.
Dieses „Lehrbuchwissen“, begründet sich auf der Beobachtung, dass es in bestimmten
Erkrankungen Unterschiede zwischen den beiden gemessenen Zeiten gibt. Hämophiliepatienten haben zwar eine normale Blutungszeit aber eine verlängerte Blutgerinnungszeit und bei Thrombozytopenie oder -pathie Patienten ist es umgekehrt.
Andererseits gab es auch schon früher andere Beobachtungen, welche in eine andere
Richtung wiesen und die gängige Meinung in Frage gestellt haben. Als Beispiel dafür
wird der Einfluss von oralen Antikoagulantien und Heparin auf die Blutungszeit herangezogen. Bei einer Überdosierung dieser Medikamente ist die Thrombingenerierung
(= Thrombingeneration) betroffen und gleichzeitig kommt es zu einer Verlängerung
der Blutungszeit. Weiters beziehen sie sich auf Experimente der Furiegruppe. In diesem bildet sich nach 10 bis 15 Sekunden nach einem gesetzten Mikrotrauma in kleinen
Gefäßen bei Mäusen Fibrin [107]. Bei optimaler Konzentration von TF (Quick) gerinnt Plasma erst nach 12 Sekunden. Daher müsste in diesem Experiment Thrombin
schon gleichzeitig mit den Thrombozytenaggregaten aufgetreten sein. Von dieser Beobachtung ausgehend ziehen sie den Schluss, dass Thrombozyten und plasmatische
Gerinnung nicht strikt voneinander zu trennen sind und schon von Beginn an miteinander zu einer Hämostase führen. Sie bekräftigen ihre Aussage, indem sie darauf
hinweisen, dass es bisher kaum Studien gab, die die klassische Lehrmeinung unterstützen und in ihrer experimentellen Anordnung keine Trennung von Thrombozyten und
plasmatischer Gerinnung durchführten.
Üblicherweise wurden Thrombozyten in antikoaguliertem Blut oder plasmatische Gerinnung in thrombozytenfreiem Plasma untersucht. In Studien, in denen beides anwesend ist, gibt es zahlreiche Interaktionen. Dafür werden mehrere Indizien erwähnt.
Erstens wurde Thrombin als stärkster Thrombozytenaktivator nachgewiesen [108] und
zweitens besitzen, wie im Kapitel MP schon erwähnt, Thrombozyten Phospholipide an
ihrer Membranoberfläche, die zu einer Thrombingenerierung führen [109]. Diese Interaktion stellt wohl eine der wichtigsten positiven Feedbackregulationen in der Hämostase dar und ist daher mitverantwortlich für ein schnelles Stoppen einer Blutung. Als
nächstes wird die Vereinbarkeit mit der zuvor erwähnten Beobachtung bei Hämophilie
Patienten ausgeführt. Hier gibt es Hinweise[109, 110], dass die Thrombingeneration in
einem Faktor VIII und IX unabhängigen Weg gebildet wird, weil sie anfänglich auch
durch zirkulierenden TF getriggert werden konnte[94]. Hemker et al. weisen weiters auf
27
Studien hin, die auch Anhaltspunkte liefern, dass die klare Abgrenzung zwischen dem
Ursprung arterieller und venöser Thrombosen im Sinne von Thrombozytenaggregation und plasmatischer Gerinnung abgeschwächt zu betrachten ist. Es könnte sich eher
um ein und die gleiche Ursache im Sinne einer gesamten hämostatischen Imbalance
handeln.
Die Erfassung der Thrombingeneration und im speziellen die KAT tragen das Potential
einer Messung der gesamten Gerinnung in sich. Man kann daher auch im sogenannten
PRP die oben genannte Interaktion zwischen Thrombozyten und plasmatischer Gerinnung miteinbeziehen. Zudem ist auch eine Bestimmung der individuellen Gerinnung
möglich.
5.3.4 Thrombozytenarmes Plasma (PPP)
In dem Artikel von Hemker et al.[94] und denen einiger anderer im Text gekennzeichneter Autoren finden sich folgende Aussagen. Da ein Großteil der gerinnungsfördernden
Phospholipide auf der Oberfläche von Thrombozyten vorkommt, müssen sie in PPP
beigefügt werden. Sie sind von wesentlicher Bedeutung für die Bildung von Prothrombinase durch Faktor Xa und Va[111] und Tenase durch IXa und VIIIa[112]. Wenn
jedoch einmal eine Thrombingeneration in PPP auch ohne hinzugefügte Phospholipide
ausgelöst werden kann, ist das meist auf Verunreinigung mit Thrombozytenteilchen
zurückzuführen. Die beigefügte Menge der Phospholipide beträgt 4µM.
Bei Konzentrationen von TF über 10pM werden die auf Faktor VIII, IX und XI basierenden Mechanismen der Gerinnung umgangen. Mit einer Konzentration von 2 bis
5 pM wird die Konzentration von Faktor VIII und IX eine bestimmende Einflussgröße
aber nicht Faktor XI. Dessen Einfluss spielt bei geringeren Konzentrationen von unter
1 pM eine wichtige Rolle [113].
Die Inhibierung von ETP durch TM ist entscheidend von der TF Konzentration mitbeinflusst. Denn TM braucht TF als Interaktionspartner um überhaupt zur Aktivierung
von Protein C beitragen zu können. Daher wird bei niedrigerer TF Konzentration auch
der Anteil an TM abnehmen, der die Thrombingeneration hemmt und so auf 50 % hält.
Bei Konzentrationen von über 10pM TF wird Thrombin so schnell generiert, dass es
zu keiner ausreichenden Inhibierung von TM kommt.
Trotz TF und TM Beimengung bleibt dies aber nur eine Annäherung und damit ein
künstliches Konstrukt an die Situation in vivo, weil beide im gleichen Medium gelöst
sind. In vivo ist TF in der Membran von Wunden zu finden und TM im intakten
Endothel der Gefäße und damit getrennt voneinander. Die Reaktionsgeschwindigkeit
ist abhängig von chemischen Interaktionen und wird daher nicht durch Diffusion bestimmt. Aber zurzeit ist ein Versuchsaufbau, der diese zwei Faktoren miteinschließt,
technisch noch nicht umsetzbar [94, 96]. Zusätzlich sollte beachtet werden, dass Nabelschnurplasma niedrigere Spiegel an TFPI und Antithrombin enthält. Dadurch kommt
es im Vergleich mit Erwachsenenplasma bei gleicher TF Konzentration zu einer stärkeren Thrombingenerierung in Nabelschnurplasma, weil das Protein C System seine
antikoagulative Wirkung nicht wie in Erwachsenen entfalten kann[114]. Weitere Bestimmungsmethoden sind die schon erwähnten in PRP und Whole Blood. Wobei jedes
eine weitere Annäherung an die in vivo Situation ist.
28
6 Intention und Ziele der Studie
Vaskuläre Folgeerkrankungen stellen eine häufige und wichtige Komplikation bei Diabetikern dar. Mikrovaskuläre Veränderung stehen dabei in Zusammenhang mit Endothelzellschädigung und Hyperkoagulabilität. MP sind in prokoagulatorische Prozesse
involviert und bei verschiedenen vaskulären Erkrankungen erhöht, wie akutem Koronarsyndrom, thrombembolischen Erkrankungen oder Diabetes mellitus Typ 2. Dies
könnte durch ihre prokoagulatorische Wirkung zu einem Fortschreiten der vaskulären
Schädigung führen[115, 68]. Auf die Thrombingenerierung konnte bisher nur auf indirekte Weise von Gerinnungsparametern, wie F1+2 und TAT, geschlossen werden.
Mit der Weiterentwicklung und Automatisierung der Technik zur direkten Messung
der Thrombingeneration durch Hemker et al., ist es möglich diese mittels KAT auch
direkt individuell nachzuweisen. Thrombin spielt eine Schlüsselrolle in der Hämostase
und spiegelt einen Großteil dieser wider. Somit birgt die KAT das Potential einer Bestimmung der individuellen hämostatischen Balance[94]. Bisher konnte eine Studie bei
Typ 2 Diabetikern eine Veränderung der Hämostase mittels KAT nachweisen[116].
Im Rahmen dieser Studie wollen wir untersuchen, ob in Patienten mit Typ 1 Diabetes
im Kindes- und Jugendalter im Vergleich zu einer alters- und geschlechtsgematchten
Kontrollgruppe Veränderungen in der MP-Konzentration und der Thrombingeneration
bestehen, sowie ein Zusammenhang dieser mit Blutzuckerwerten besteht. Zusätzlich
werden F1+2 und TAT als herkömmliche Marker der Gerinnungsaktivierung gemessen. Der Vorteil in dieser Patientenpopulation liegt in der geringeren Ausprägung der
Komorbiditäten und dem Fehlen von chronischem Alkohol- und Nikotinabusus. Mit
dem zusätzlichen Ausschluss von PatientInnen, die an diabetischen Folgeerkrankungen
leiden, können die Auswirkungen von Typ 1 Diabetes auf das Gerinnungssystem unmittelbarer untersucht werden.
6.1 Fragestellung
Hypothese: Patienten mit Typ 1 Diabetes im Kindes- und Jugendalter weisen signifikant erhöhte MP-Konzentrationen und Thrombingenerationsparameter auf im
Vergleich zu Personen einer gesunden Kontrollgruppe.
Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter der Typ 1 Diabetiker
weisen eine positive Korrelation mit Blutzuckerwerten auf.
Nullhypothese Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter weisen keinen signifikanten Unterschied bei Typ 1 Diabetikern im Vergleich zu der gesunden
Kontrollgruppe auf.
Die MP-Konzentration und Thrombingenerationsparameter der Typ 1 Diabetiker
weisen keine Korrelation mit Blutzuckerwerten auf.
29
6.2 Studiendesign
Alle Diabetespatienten, die an der Ambulanz für Endokrinologie der Uni-Klinik für
Kinder- und Jugendheilkunde Graz betreut werden, erscheinen zu jährlichen routinemäßigen Kontrolluntersuchungen. Während dieser werden die Patienten gemeinsam
mit ihren Erziehungsberechtigten über die mögliche Teilnahme an unserer Studie informiert. Bei Interesse erfolgt ein ausführliches Aufklärungsgespräch über Art, Ablauf und
Zweck der Studie sowie das Aushändigen und Besprechen der schriftlichen Information und der Einwilligungserklärung. Während dieser Studie wird durch die alljährliche
routinemäßige Blutabnahme, keine zusätzliche Blutabnahme nötig. Es wird im gleichen
Zug für die Studie maximal 6 ml venöses Citratblut entnommen.
7 Material und Methoden
7.1 Reagenzien und Substrate
Fluopuffer enthält 20 mmol per Liter HEPES und 60 mg per ml Rinderserumalbumin
(Sigma, St Louis, MO). Der Arbeitspuffer enthält 140 mmol per Liter NaCL (Merck,
Darmstadt,Deutschland), 20 mmol pro Liter HEPES und 5 mg per ml Humanserumalbumin (Sigma). Das fluorogene Substrat Z-Gly-Gly-Arg-Amino-Methyl-Coumarin
(Bachem, Bubendorf, Schweiz) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) von Sigma aufgelöst. Kalziumchlorid stammt von Merck . Das 5 pmol TF/L und 4 µmol Phospholipid/L
enthaltende PPP sowie das TF freie MP-Reagenz mit dem gleichen Phospholipidgehalt wurde aus den Niederlanden bezogen (Thrombinsocope BV, Maastrich). Der ZYMUPHEN MP Activity Kit wurden von HYPHEN BioMed (ZAC Neuville Universite
France) bezogen.
7.2 Blutabnahme und Aufbereitung für thrombozytenarmess Plasma (PPP)
Die zur Blutabnahme benutzen Laborröhrchen (3ml) stammten von S-Monovette aus
Sarstedt und enthielten 0.30ml 0.106 M Tri-Natrium-Citratlösung. Nach einer sauberen
Blutabnahme an der Vena cephalica mittels einer 21 Gauge Nadel, ohne Blutstauung,
wird das Citratblutröhrchen mit dem Blut der Probanden sofort in das Labor zur
weiteren Aufbereitung geschickt. Die Aufbereitung erfolgte innerhalb einer Stunde. Zur
Analyse des Blutbildes vor und nach der Herstellung des PPP wurde der Sysmer KX
21 Cell Counter verwendet. Mit der zweiten Messung nach Herstellung des PPP kann
eine unerwünschte Verunreinigung mit Thrombozytenteilchen überprüft werden. Für
die Herstellung des PPP, wurde das Blut der Probanden für 20 Minuten bei 1550 x g
und Raumtemperatur ohne Unterbrechung zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt
und der Rest in aliquote Teile aufgeteilt (1ml), anschließend wird es schockgefroren
(snap-frozen) und bei -80 Grad Celsius für die weiteren Analysen gelagert.
30
7.3 MP Bestimmung mittels ELISA
Mittels Zymuphen MP Activity Kit kann die prokoagulative Aktivität von MP in humanem Plasma nachgewiesen werden. Dazu werden die verdünnten Proben in die Öffnungen der Mikroplatten gegeben, welche Annexin V und Streptavidin enthalten. MP
binden , falls sie in der Probe vorhanden sind, Annexin V. Die Phospholipidoberfläche der MP ermöglicht einer Faktor Xa-Va Mischung im Beisein von Kalzium und
Thrombininhibitoren die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin. Daher gibt es
einen direkten Zusammenhang zwischen dem gemessenen Thrombin und Phospholipiden, die Phospholipidkonzentration ist der limitierende Faktor. Um MP zu erhalten
wurde PPP bei 37 Grad Celsius aufgetaut und für 2 Minuten bei 1300 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Zur Fertigstellung der Proben wurde vorgegangen wie in der
Herstellung beschrieben. Die MP-Konzentration wurde als Phophatidylserin Äquivalent in nM angegeben.
7.4 KAT
Zur Messung der Thrombingeneration wird unter Standardbedingungen die KAT nach
Hemker et al. eingesetzt[97]. Diese Methode basiert auf einer Umwandlung von Thrombin spezifischem Substrat Z-Gly-Gly-Arg-amino-methyl-coumarin. Es wurde für jedes
Experiment ein Substrat aus 2625 µl Fluopuffer und 300 µl von 1 mol/L CaCl2 Lösung gemischt und für 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dann wird 75 µl der
FluoDMSO untergemischt und für weitere 10 Minuten inkubiert. Die so entstandene
klare Lösung wurde als FluCa bezeichnet. Die Thrombingenerierung jeder Probe wurde anhand der Herstellerempfehlung in PPP gemessen. Für jeden Probanden wurden
zwei verschiedene Aktivierungsreagenzien genommen. Einmal mit einem TF Gehalt
von 5 pm im PPP und einmal ohne TF-Zusatz im MP-Reagenz, beide enthalten 4 µm
Phospholipide. Durch das Fehlen von TF in letzterem wird die Aktivierung der Thrombingeneration auf TF aus MP zurückgeführt. Die Messung wird so sensitiver auf MP.
80 µl von der Plasmaprobe und 20 µl des Aktivierungsreagenz wurden in eine Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wurde anschließend in den Fluorometer (Fluoroskan
Ascent, Thermolabsytem OY, Helsinki, Finnland) gegeben und die Messung begann
durch automatische Dispensierung von 20 µl des FluCa, welches das fluoreszierende
Substrat enthält. Ein Thrombin Kalibrator wurde benutzt um die Variation zwischen
den Proben und der Instrumente zu korrigieren. Die Reaktion des Plasma wurde durch
TF auf den beiden zuvor dargestellten Wegen gestartet. Die Ergebnisse wurden mittels
Analysesoftware von Thrombinoscope BV evaluiert.
7.5 Blutglukose-,Hba1c, TAT und F1+2-Bestimmung
Die Analyse der venösen Blutproben zur Bestimmung der Blutglukose,Hba1c, TAT
und F1+2- Werte erfolgte auf der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendheilkunde.Die Blutglukose wurde maschinell mittels HemoCueB-Glukosephotometer (Angelholm, Schweden) erhoben. Der Hba1c wurde maschinell mittels DCA 2000 Analyzer
(Bayer Diagnostics, Leverkusen, Deutschland) bestimmt. Zur Messung der TAT und
F1+2 Werte wurden die ELISA-Systeme Enzygnost TAT und Enzygnost F1+2 (Dede
Behring, Marburg, Deutschland) benutzt. Die venösen Blutbproben stammten ausschließlich aus der Diabetikergruppe.
31
7.6 Patienten
Das Patientenkollektiv besteht aus 112 Typ 1 Diabetikern zwischen 0 und 19 Jahren, die zur routinemäßigen Kontrolle an der endokrinologischen Ambulanz der UniKlinik für Kinder- und Jugendheilkunde der Meduni Graz erscheinen. Nach Genehmigung der Ethikkommission (EKNO:21-480exD9/10) wird von allen einzuschließenden
PatientInnen eine schriftliche Einwilligungserklärung ihrer Erziehungsberechtigten eingeholt. Einschlusskriterien waren das Alter zwischen 0-19 Jahre und die Typ 1 Form
des Diabetes. Ausschlusskriterien waren fehlendes Einverständnis und diabetische Folgeerkrankungen. Insgesamt wurden während der ohnehin für die alljährliche Kontrolle
benötigten Blutabnahme maximal 6 ml Citratblut ausschließlich zu Studienzwecken
entnommen. Diese wurden mit einer alters- und geschlechtsgematchten Kontrollgruppe
bestehend aus 94 Probanden verglichen.
8 Ergebnisse und Resultate
8.1 Vergleich: Diabetesgruppe mit Kontrollgruppe
Im Vergleich der 112 Personen umfassenden Diabetesgruppe mit der aus 94 Personen
besthenden Kontrollgruppe kam es zu einer signifikanten Verringerung von Lag-Time,
ttPeak und ETP sowohl nach Aktivierung mit 5 pM TF als auch im TF freien MPReagenz.
Diabetesgruppe
Bei der Diabetikergruppe beträgt im TF beinhaltenden Reagenz der Mittelwert des
ETPs 1351,83 nM ∗ min, die Standardabweichung 238,90 nM ∗ min und der Standardfehler 22,57 nM ∗ min. Die Lag-Time, der ttPeak und TAT waren nicht Normalverteilt
und wurden nicht mittels T-Test sonder mittels Man-Whitney-U-Test berrechnet (Abb.
4).
Im TF freien Reagenz beträgt der Mittelwert des ETPs bei den Diabetikern 1321,45
nM ∗ min, die Standardabweichung 230,99 nM ∗ Min und der Standardfehler 21,83 nM
∗ min (Abb. 5).
Die Lag-Time wies einen Mittelwert von 6,50 min, eine Standardabweichung von 1,20
min und einen Standardfehler von 0,11 min auf.
Die ttPeak hatte einen Mittelwert von 8,01 min, eine Standardabweichung von 1,22
min und einen Standardfehler von 0,12 min.(Tabelle 1)
Kontrollgruppe
Die Kontrollgruppe wies im TF beinhaltenden Reagenz einen Mittelwert des ETPs von
1441,35 nM ∗ min, eine Standardabweichung von 325,70 und einen Standardfehler von
33,59 auf.
Im TF freien Reagenz beträgt der Mittelwert des ETPs 1402,52 nM ∗ min, die Standardabweichung 298,22 nM ∗ min und der Standardfehler 31,09 nM ∗ min.
Die Lag-Time hatte einen Mittelwert von 7,06 min, eine Standardabweichung von 1,57
min und einen Standardfehler von 0,16 min.
Die ttPeak wies einen Mittelwert von 8,60 min, eine Standardabweichung von 1,59 min
und einen Standardfehler von 0,17 min auf. (Tabelle 1)
32
T-Test und Levene-Test
Der Levene-Test der Varianzengleichheit wies eine Signifkanz von <0,001 fürs ETP im
TF freien Reagenz auf. Im TF beinhaltenden Reagenz betrug die Signifikanz fürs ETP
0,006, für die Lag-Time 0,021 und für die ttPeak 0,024.
Beim T-Test zeigte sich für das ETP im TF freien Reagenz eine Signifikanz von 0,028
und im TF beinhaltenden Reagenz von 0,034.
Die Signifikanz der Lag-Time im TF freien Reagenz betrug 0,05, die des ttPeaks 0,04.
(Tabelle 2 und Tabelle 3)
Mann-Whitney-U-Test
Im Vergleich der beiden Gruppen war ein Unterschied der Lag-Time und des ttPeaks
mit einer Signifikanz von <0,001 im TF beinhaltenden Reagenz erkennbar.
Die TAT Werte wiesen eine Signifikanz von 0,042 auf.
Hingegen kam es zu keinem Signifikanten Unterschied in der Verteilung der MP und
F1+2 zwischen der Diabetes und Kontrollgruppe.(Abbildung 3)
Gruppenstatistiken
Gruppe
ETP
nM∗min
Peak
nM
Diabetiker
Kontrolle
Diabetiker
Kontrolle
Lagtime MP Diabetiker
min
ETP MP
nM∗min
Peak MP
nM
ttPeak MP
min
Kontrolle
Diabetiker
Kontrolle
Diabetiker
Kontrolle
Diabetiker
Kontrolle
112
1351,83
Standardfehler
des
Mittelwertes
238,90
22,57
94
1441,35
325,70
33,59
112
373,97
59,54
5,63
94
392,03
63,15
6,51
112
6,50
1,20
,11375
92
7,06
1,57
,16
112
1321,45
230,99
21,83
92
1402,52
298,22
31,09
112
419,01
65,07
6,15
92
436,60
64,80
6,76
112
8,01
1,22
,12
92
8,60
1,59
,17
N
Mittelwert
Standardabweichung
Tabelle 1: Diabetiker vs Kontrolle
33
Test bei unabhängigen Stichproben
Levene-Test der Varianzgleichheit
F
ETP
Varianzen sind gleich
T-Test für die Mittelwertgleichheit
Signifikanz
13,162
T
,000
Varianzen sind nicht gleich
Peak
,001
Varianzen sind gleich
,980
Varianzen sind nicht gleich
Lagtime MP
Varianzen sind gleich
5,454
,021
Varianzen sind nicht gleich
ETP MP
Varianzen sind gleich
7,714
,006
Varianzen sind nicht gleich
Peak MP
,031
Varianzen sind gleich
,860
Varianzen sind nicht gleich
ttPeak MP
Varianzen sind gleich
5,149
,024
Varianzen sind nicht gleich
df
-2,27
204
-2,21
167,36
-2,11
204
-2,10
193,35
-2,93
202
-2,86
168,22
-2,19
202
-2,13
169,12
-1,93
202
-1,93
194,68
-2,97
202
-2,90
168,49
Tabelle 2: Diabetiker vs Kontrolle
Test bei unabhängigen Stichproben
ETP
Peak
Varianzen sind gleich
T-Test für die Mittelwertgleichheit
Mittlere
Standardfehler
Sig. (2-seitig)
Differenz
der Differenz
,024
-89,52
39,42
Varianzen sind nicht gleich
,028
-89,52
40,47
Varianzen sind gleich
,036
-18,06
8,56
Varianzen sind nicht gleich
,037
-18,06
8,61
,004
-,57
,19
Varianzen sind nicht gleich
,005
-,57
,20
Varianzen sind gleich
,030
-81,07
37,06
Varianzen sind nicht gleich
,034
-81,07
37,99
Varianzen sind gleich
,056
-17,59
9,14
Varianzen sind nicht gleich
,056
-17,59
9,13
Varianzen sind gleich
,003
-,59
,20
Varianzen sind nicht gleich
,004
-,59
,20
LagtimeMP Varianzen sind gleich
ETPMP
PeakMP
ttPeakMP
Tabelle 3: Diabetiker vs Kontrolle
34
Test bei unabhängigen Stichproben
T-Test für die
Mittelwertgleichheit
95% Konfidenzintervall der
Differenz
Untere
Obere
ETP
Peak
Varianzen sind gleich
-167,24
-11,80
Varianzen sind nicht gleich
-169,43
-9,62
Varianzen sind gleich
-34,95
-1,18
Varianzen sind nicht gleich
-35,04
-1,09
-,95
-,19
-,96
-,18
Varianzen sind gleich
-154,15
-7,99
Varianzen sind nicht gleich
-156,06
-6,08
Varianzen sind gleich
-35,61
,43
Varianzen sind nicht gleich
-35,61
,42
Varianzen sind gleich
-,97
-,20
Varianzen sind nicht gleich
-,98
-,19
LagtimeMP Varianzen sind gleich
Varianzen sind nicht gleich
ETPMP
PeakMP
ttPeakMP
Tabelle 4: Diabetiker vs Kontrolle
Abbildung 3: Diabetiker vs Kontrolle
35
Abbildung 4: ETP
Abbildung 5: ETP-Mikropartikel
36
8.2 Altersvergleich der Diabetikergruppe
Die Diabetikergruppe wurde nochmals aufgeteilt in 0-9 Jährige und 10-19 Jährige und
miteinander verglichen. Dabei beobachteten wir bei der Gruppe der 10-19 Jährigen
eine nicht signifikante Erhöhung des Peak und ETP mit einer Verringerung von ttPeak
und Lag-time im TF beinhaltende und freiem Reagenz.
Levene-Test und T-Test
Der Levene-Test wies für das ETP eine Signifikanz von 0,31 und für den Peak von 0,07
im TF beihaltenden Reagenz auf.
Im TF freien Reagenz betrug der Signifikanzwert des ETPs 0,14, der des Peaks 0,15,
der der ttPeak 0,26 und der der Lag-Time 0,33.
Im T-Test zeigte sich im TF beinhaltenden Reagenz mit Signifikanzwerten von 0,16
fürs ETP und 0,05 für den Peak kein signifikanter Unterschied. Im TF freien Reagenz
verhielt es sich mit Signifikanzwerten von 0,36 fürs ETP, von 0,14 für den Peak, von
0,33 für die Lag-Time und von 0,32 für die ttPeak ebenso.(Tabelle 6 und 7)
Mann-Whitney-U-Test
Die Lag-Time und der ttPeak im TF freien Reagenz sind mit Werten von 0,378 und
0,146 statistisch nicht signifkant Unterschiedlich in den beiden Altersgruppen. (Abbildung 6)
Gruppenstatistiken
Alter<10
20
1284,27
Standardabweichung
188,05
Alter>9
92
1366,51
246,99
25,75
Alter<10
20
350,76
41,27
9,23
Alter>9
92
379,01
61,84
6,45
Alter<10
20
6,73
1,03
,23
Alter>9
92
6,45
1,24
,13
Alter<10
20
1278,43
165,60
37,03
Alter>9
92
1330,80
242,62
25,29
Alter<10
20
399,49
49,11
10,98
Alter>9
92
423,25
67,52
7,04
Alter<10
20
8,25
1,02
,23
Alter>9
92
7,95
1,26
,13
Alter<10
23
130,02
44,67
9,31
Alter>9
95
138,90
45,52
4,67
Alter
ETP
nM∗min
Peak
nM
Lagtime MP
min
ETP MP
nM∗min
Peak MP
nM
ttPeak MP
min
F1u2
nmol/L
N
Mittelwert
Standardfehler
des Mittelwertes
42,05
Tabelle 5: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM
Gruppenstatistik
Der Mittelwert des ETPs im TF beinhaltenden Reagenz ist in der Gruppe der 0-9
Jährigen mit 1284,27 nM ∗ min im Vergleich zu 1366,51 nM ∗ min in der Gruppe der
10-19 Jährigen erniedrigt.
Ebenso ist der Mittelwet des Peaks im TF beinhaltenden Reagenz mit 350,76 nM der
0-9 Jährigen niedriger als der der 10-19 Jährigen.
37
Im TF freien Reagenz sind die Mittelwerte der jüngeren Diabetiker ebenfalls mit
1278,43 zu 1330,80 nM ∗ min beim ETP und mit 399,49 zu 423,25 nM beim Peak
niedriger als die der älteren Gruppe.
Hingegen ist die Lag-Time und die ttPeak mit 6,73 zu 6,45 min und mit 8,25 zu 7,95
min in der Gruppe der 0-9 Jährigen erhöht. (Tabelle 5)
Test bei unabhängigen Stichproben
Levene-Test der
Varianzgleichheit
F
Signifikanz
ETP
Varianzen
Varianzen
gleich
Peak
Varianzen
Varianzen
gleich
LagtimeMP Varianzen
Varianzen
gleich
ETPMP
Varianzen
Varianzen
gleich
PeakMP
Varianzen
Varianzen
gleich
ttPeakMP Varianzen
Varianzen
gleich
F1u2
Varianzen
Varianzen
gleich
sind gleich
sind nicht
1,06
sind gleich
sind nicht
3,39
sind gleich
sind nicht
,96
sind gleich
sind nicht
2,24
sind gleich
sind nicht
2,08
sind gleich
sind nicht
1,27
sind gleich
sind nicht
,21
,31
,07
,33
,14
,15
,26
,65
Tabelle 6: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM
38
T-Test für die
Mittelwertgleichheit
T
df
-1,40
110
-1,67
34,90
-1,95
110
-2,51
40,08
,97
110
1,09
32,14
-,92
110
-1,17
39,09
-1,49
110
-1,82
36,54
,99
110
1,14
33,10
-,84
116
-,853
33,951
ETP
Varianzen sind gleich
Peak
T-Test für die Mittelwertgleichheit
Mittlere
Standardfehler
Sig. (2-seitig)
Differenz
der Differenz
,16
-82,25
58,68
Varianzen sind nicht gleich
,10
-82,25
49,31
Varianzen sind gleich
,05
-28,25
14,51
Varianzen sind nicht gleich
,02
-28,25
11,26
,33
,29
,30
Varianzen sind nicht gleich
,28
,28850
,26
Varianzen sind gleich
,36
-52,37
57,03
Varianzen sind nicht gleich
,25
-52,37
44,84
Varianzen sind gleich
,14
-23,76
15,97
Varianzen sind nicht gleich
,08
-23,76
13,04
Varianzen sind gleich
,32
,30
,30
Varianzen sind nicht gleich
,26
,30
,26
Varianzen sind gleich
,40
-8,89
10,54
Varianzen sind nicht gleich
,40
-8,89
10,42
LagtimeMP Varianzen sind gleich
ETPMP
PeakMP
ttPeakMP
F1u2
Tabelle 7: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM
Test bei unabhängigen Stichproben
T-Test für die
Mittelwertgleichheit
95% Konfidenzintervall der
Differenz
Untere
Obere
ETP
Peak
Varianzen sind gleich
-198,55
34,05
Varianzen sind nicht gleich
-182,36
17,86
Varianzen sind gleich
-57
,50
Varianzen sind nicht gleich
-51
-5,50
-,30
,88
-,25
,83
Varianzen sind gleich
-165,39
60,65
Varianzen sind nicht gleich
-143,07
38,32
Varianzen sind gleich
-55,40
7,88
Varianzen sind nicht gleich
-50,20
2,68
Varianzen sind gleich
-,30
,90
Varianzen sind nicht gleich
-,24
,83
Varianzen sind gleich
-29,77
12
Varianzen sind nicht gleich
-30,06
12,29
LagtimeMP Varianzen sind gleich
Varianzen sind nicht gleich
ETPMP
PeakMP
ttPeakMP
F1u2
Tabelle 8: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM
39
Abbildung 6: 0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM
8.3 Korrelationsanalyse
Abschließend haben wir die Hba1c- und die Blutglukosewerte in der Diabetesgruppe
mit den KAT Parametern in beiden Reagenzien einer Korrelationsanalyse unterzogen.
Dabei kam es zu einer statistisch signifikanten Korrelation des Peak und ETP mit
Hba1c in beiden Reagenzien.
Abbildung 7: Korrelation: ETP und Hba1c, TF-Reagenz
40
Abbildung 8: Korrelation: Peak und Hba1c, TF-Reagenz
TF Reagenz
Die Korrelation nach Pearson betrug zwischen ETP und Hba1c 0,197 und ist auf einem
Niveau von 0,05 signifikant.
Zwischen Hba1c und dem Peak zeigte sich eine Korrelation von 0,304 nach Pearson
und ist auf einem Niveau von 0,01 signifikant. (Tabelle 9, Abb. 7 und Abb. 8)
TF freie Reagenz
Die Korrelation zwischen Hba1c und dem ETP beziehungsweise dem Peak wies einen
Wert von 0,192 beim ETP und einen Wert von 0,307 beim Peak auf. Die Korrelation
mit dem ETP ist auf einem Niveau von 0,05 und die Korrelation mit dem Peak ist auf
einem Niveau von 0,01 signifikant. (Tabelle 9, 10, Abb. 9 und Abb. 10)
41
Abbildung 9: Korrelation: ETP und Hba1c, TF freies Reagenz
Abbildung 10: Korrelation: Peak und Hba1c, TF freies Reagenz
42
Korrelationen
Hba1c
Hba1c
BZ
1
,346
,000
,197
,037
,304
,001
,192*
,042
119
119
112
112
112
**
,346
,000
1
,067
-,016
,051
,479
,866
,591
119
119
112
112
112
1
**
,815
,000
,942**
,000
N
Signifikanz (2-seitig)
N
ETP
*
,197
,037
,067
112
112
112
112
112
,304
,001
-,016
**
1
,866
,815
,000
,814**
,000
112
112
112
112
112
,192
,042
,051
**
,814
,000
1
,591
,942
,000
**
112
112
112
112
112
,307
,001
-,010
**
,914
,858
,000
**
,897
,000
,915**
,000
112
112
112
112
112
-,073
-,105
,144
,084
,139
Signifikanz (2-seitig)
,444
,269
,131
,376
,142
N
112
112
112
112
112
-,122
-,078
,130
-,158
,069
Signifikanz (2-seitig)
,199
,412
,173
,095
,473
N
112
112
112
112
112
-,151
,030
,124
,047
Signifikanz (2-seitig)
,113
,751
,194
-,244**
,010
N
112
112
112
112
112
-,163
,033
,116
,043
Signifikanz (2-seitig)
,085
,730
,222
-,262**
,005
N
112
112
112
112
112
-,014
-,064
,015
,103
,039
Signifikanz (2-seitig)
,880
,486
,874
,279
,682
N
119
119
112
112
112
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
Peak
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
**
N
ETPMP
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
*
N
PeakMP
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
**
N
Lagtime
ttPeak
LagtimeMP
ttPeakMP
MPnmolL
ETPMP
**
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Peak
*
Signifikanz (2-seitig)
BZ
ETP
**
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
,479
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.
Tabelle 9: BZ=Blutglukose
43
,623
,652
Korrelationen
PeakMP
Hba1c
**
-,122
-,151
,444
,199
,113
112
112
112
112
-,010
-,105
-,078
,030
Signifikanz (2-seitig)
,914
,269
,412
,751
N
112
112
112
112
,858**
,000
,144
,130
,124
,131
,173
,194
112
112
112
112
,897**
,000
,084
-,158
,376
,095
-,244**
,010
112
112
112
112
,915**
,000
,139
,069
,047
,142
,473
,623
112
112
112
112
1
,115
-,025
-,049
,228
,794
,606
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
Peak
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
ETPMP
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
PeakMP
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
Lagtime
ttPeak
LagtimeMP
ttPeakMP
MPnmolL
LagtimeMP
-,073
N
ETP
ttPeak
,307
,001
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
BZ
Lagtime
N
112
112
112
112
Korrelation nach Pearson
,115
1
Signifikanz (2-seitig)
,228
,845**
,000
,491**
,000
N
112
112
112
112
-,025
1
,723**
,000
Signifikanz (2-seitig)
,794
,845**
,000
N
112
112
112
112
-,049
,723**
,000
1
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
,606
,491**
,000
N
112
112
112
112
-,069
**
**
,728
,000
,996**
,000
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
,469
,487
,000
N
112
112
112
112
Korrelation nach Pearson
,070
,162
,028
-,109
Signifikanz (2-seitig)
,461
,087
,771
,251
N
112
112
112
112
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
Tabelle 10: BZ=Blutglukose
44
Korrelationen
ttPeakMP
Hba1c
BZ
ETP
Peak
-,163
-,014
Signifikanz (2-seitig)
,085
,880
N
112
119
Korrelation nach Pearson
,033
-,064
Signifikanz (2-seitig)
,730
,486
N
112
119
Korrelation nach Pearson
,116
,015
Signifikanz (2-seitig)
,222
,874
N
112
112
-,262**
,005
,103
N
112
112
Korrelation nach Pearson
,043
,039
Signifikanz (2-seitig)
,652
,682
N
112
112
-,069
,070
Signifikanz (2-seitig)
,469
,461
N
112
112
,487**
,000
,162
112
112
,728**
,000
,028
112
112
,996**
,000
-,109
112
112
1
-,118
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
ETPMP
PeakMP
Lagtime
Korrelation nach Pearson
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
ttPeak
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
LagtimeMP
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
N
ttPeakMP
MPnmolL
Korrelation nach Pearson
,279
,087
,771
,251
,216
Signifikanz (2-seitig)
112
112
-,118
1
N
MPnmollL
Korrelation nach Pearson
Signifikanz (2-seitig)
,216
N
112
**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.
Tabelle 11: BZ=Blutglukose
45
119
9 Diskussion
Wie schon im Kapitel „Intention und Ziele“ angeführt, wollten wir mittels KAT und
MP-Konzentration überprüfen, ob auch bei Typ 1 Diabetikern zwischen 0-19 Jahren
eine veränderte Gerinnung nachgewiesen werden kann. Durch die geringere Ausprägung von Komorbiditäten und den Ausschluss von chronischem Nikotinkonsum und
Alkoholkonsum kann der prokoagulatorische Effekt von Typ 1 Diabetes unmittelbarer
gemessen werden.
9.1 Mikropartikel und Diabetes
Wir haben uns eine signifikante Erhöhung der MP, sowie deutliche Veränderung der
KAT Parameter erwartet, weil PMP und MMP in Patienten mit Typ 2 Diabetes im
Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht sind [117, 118, 59].
Weiters sind, wie schon im Kapitel 8.2.2 erwähnt, PMP an der Blutgerinnung beteiligt
und wichtig für die Thrombozytenaktivität bei der Gerinnung. Daher könnten erhöhte
Konzentrationen von PMP eine Imbalance der Hämostase hervorrufen und so zu einer
Hyperkoagulabilität beitragen [119, 117].
In Diabetes sind kardiovaskuläre Schäden die häufigste Komplikation. In den nachfolgenden Studien konnten MP eine Rolle in kardiovaskulären pathophysiologischen
Prozessen nachgewiesen werden. Daher scheint es als seien diese pathophysiologischen
Prozesse auch für Diabetiker gültig.
Eine Forschergruppe zeigte, dass PMP an Atherosklerose beteiligt sein könnte, denn unter atherosklerotischen Bedingungen wurden PMP, MMS und EMP vermehrt produziert[117, 120, 121].
In der Entstehung von Atherosklerose ist die Adhäsion der Monozyten an das Endothel ein wichtiger Bestandteil. Zytokine können in diesen Prozess eingreifen und die
Adhäsionsmoleküle für Leukozyten hochregulieren. Solche Zytokine IL-1ß und TNFA werden in vitro bei Stimulation durch PMP von Monozyten und Endothelzellen
vermehrt gebildet.
Es konnte weiters gezeigt werden, dass PMP die Fähigkeit besitzen in die Interaktion
zwischen Endothelzellen und Monozyten einzugreifen, da sie zu einer Erhöhung der
Adhäsionsmoleküle an beiden Zellen führen [68, 122, 123].
Zirkulierende PMP konnten in Patienten mit kompliziertem Diabetes mellitus durch
Thrombozytenaggregationshemmer reduziert werden[54, 124], was weiters nahe legt,
dass sie in der Entstehung von Atherosklerose mitbeteiligt sind.
Durch die Beobachtung der Korrelation zwischen EMP und dem Verlust der Elastizität
von Arterien sowie dem umgekehrten Verhältnis zu Endothel Progenitor Zellen, welche
für die Regeneration von Gefäßen von Bedeutung sind, wird diese Annahme unterstützt
[57].
Auch konnte eine erhöhte Anzahl an EMP bei akutem Koronarsyndrom im Vergleich
zu gesunden Patienten und stabiler Angina Pectoris nachgewiesen werden[84]. EMPThrombozyten Komplexe sind erhöht in koronarer Herzerkrankung[125]. Daraus kann
auf den Status von Gefäßschäden und Entzündung geschlossen werden [56].
Der Risikofaktor Hypertonie für sich genommen ist auch begleitet von einer Erhöhung
von EMP. Die Anzahl an EMP ging sogar mit der Ausprägung der Hypertonie einher,
da sie in Patienten mit schwerer Hypertonie höher waren als mit leichter. Des weiteren
korrelierten PMP, EMP und der Blutdruck[126].
46
EMP sind außerdem noch mit der Elastizität arterieller Gefäße assoziiert. Bei Erniedrigung der Elastizität war die Anzahl der EMP erhöht, auch wenn der Blutdruck sich
normalisierte [57, 127].
In der von uns durchgeführten Studie kam es bei der Gegenüberstellung der Diabetikergruppe mit der Kontrollgruppe zu einem überraschendem Ergebnis. Es konnte kein
Unterschied in der Mikropartikelkonzentration zwischen beiden Gruppen festgestellt
werden. Bisher wurden Veränderungen der MP-Konzentration in Patienten mit Spätfolgen nachgewiesen, wie im Folgenden angeführt.
Bei Patienten mit diabetischen Komplikationen oder diabetischer Retinopathie korrelierte die Höhe der PMP- und MMP-Spiegel mit ihrer Ausprägung [117, 56].
Eine erhöhte Anzahl von EMP konnte in Patienten mit Typ1 Diabetes mit Albuminurie
nachgewiesen werden[128].
In Diabetikern konnten erhöhte Werte von MMP gemessen werden, welche mit CD62P,
CD63, PMP, P-Selektin und Retinopathie korrelieren [129].
PMP werden auch vermehrt in Patienten mit atherosklerotischen Komplikationen und
Retinopathie freigesetzt [60, 57].
Es wurde zusätzlich nachgewiesen, dass die EMP-Spiegel als diagnostisches Kriterium
für das Vorhandensein von Läsionen an Koronargefäßen herangezogen werden können.
Ihre Signifikanz als Prädiktor ist sogar höher als einzelne Risikofaktoren, wie Dauer
der Diabetes Erkrankung, Cholesterinspiegel oder Hypertonie [56, 60].
Jedoch ist noch nicht klar ob diese Ergebnisse auch in vivo gefunden werden. Erhöhte
EMP-Werte bei diabetischen Patienten ohne AP Symptomatik korrelierten mit angiographisch nachgewiesenen Koronargefäßläsionen und können daher zu Identifizierung
dieser Untergruppe von Diabetikern herangezogen werden [56].
Die Anzahl der zirkulierenden EMP in Diabetes war assoziiert mit noch nicht kalzifizierten Plaques und könnte zur Diagnostik von instabilen Plaques verwendet werden
[130]. Zusätzlich bergen EMP auch das Potential ein sinnvoller frühzeitige Screening
Parameter für endotheliale Dysfunktion und endotheliale Schäden bei Diabetikern zu
sein [131].
Wie aus den vorherigen Ausführungen klar wird, kommt es zu einer Erhöhung der
MP bei kardiovaskulären Schäden bei Diabetikern oder zu einer Erhöhung bei schon
manifesten diabetischen Komplikationen.
In der von uns durchgeführten Studie waren diabetische Spätfolgen ein Ausschlußkriterium für die Aufnahme in die Studie, da, wie angeführt, bisherige Erhöhungen der
MP-Konzentration bei Diabetikern in Patientengruppen mit messbaren Gefäßveränderungen nachgewiesen wurden.
Somit könnte der fehlende Unterschied der MP-Konzentration zwischen der Diabetikergruppe und der Kontrollgruppe in der von uns durchgeführten Studie durch das
Fehlen von Spätfolgen erklärbar werden.
Andererseits wurden in dieser Studie keine Untergruppen der MP erhoben, wie EMP
und PMP, welche hauptsächlich bei vaskulären Erkrankungen oder Gerinnungsveränderungen erhöht sind.
Da PMP, wie schon eingangs erwähnt, die größte Gruppe der MP sind, ist es unwahrscheinlich, dass es hier trotz Erhöhung der PMP-Spiegel im Plasma zu keiner Erhöhung
der Gesamtkonzentration der MP kommt.
47
EMP hingegen sind anteilmäßig geringer und könnten trotzdem erhöht sein. Andererseits deutet verkürzte Lag-Time und ttPeak im MP-Reagenz darauf hin, dass es im
Vergleich zu der Kontrollgruppe bei MP zwar keinen signifikanten quantitativen Unterschied, jedoch einen qualitativen Unterschied gibt, der für eine verstärkte Gerinnung
bei Typ 1 Diabetikern spricht.
Hingegen ist das ETP wiederum verringert und spricht gegen einen prokoagulatorische Effekt der MP. Der fehlende Unterschied der MP-Konzentration zwischen beiden
Gruppen würde gegen eine messbare hämostatische Imbalance und gegen vaskulären
Schäden dieser Patientengruppe von jungen Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen sprechen.
Unser Ergebnis deutet eher darauf hin, dass die MP-Konzentration eine Folge von
vaskulären Schädigungen und pathologischen Prozessen ist und erst bei messbar manifesten Dysfunktionen auftritt, wie in den zuvor genannten Studien nachgewiesen.
Weiters spricht unsere fehlende Korrelation von Hba 1c und MP-Konzentration auch
eher für keine katalytische Rolle der MP in der Entstehung der Krankheit.
Hingegen konnte eine Studie Hba1c-Werte und TMP-Konzentrationen korrelieren. Erhoben wurden jeweils getrennt EMP, PMP und Annexin V positive MP im Blut (TMP)
bei Typ1 und Typ 2 Diabetikern im Vergleich zu einer Kontrollgruppe aus gesunden
Probanden.
Dabei wiesen Typ 1 Diabetiker einen erhöhten Spiegel von EMP, PMP und TMP im
Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Dagegen waren bei Typ 2 Diabetikern nur die Anzahl
der TMP erhöht.
Die gerinnungsfördernde Aktivität von TMP war in der gesamten Diabetikergruppe
als auch in der Gruppe von Typ 1 Diabetikern mit dem Hba1c Wert korreliert. Daher könnte TMP ein Hinweis auf eine chronische glykämische Imbalance sein und zur
erhöhten Thrombogenität bei Typ 1 Diabetikern beitragen.
Die EMP-Spiegel waren in Typ 2 Diabetikern zwar auch erhöht, erreichten aber keine
statistische Signifikanz. Die höchsten Werte von EMP wurden in Typ 1 Patienten mit
mikrovaskulären Erkrankungen gemessen. Zusammen mit den erhöhten Werten bei
Albuminurie wurde vermutet, dass EMP als ein Marker für Endothelschäden in dieser
Patientengruppe verwendet werden könnte [128].
Von apoptotischen T-Lymphozyten ausgeschüttete MP können zu einer Downregulation der endothelialen Stickstoff (NO)-Synthetase und zu einer Überexpression von
Caveolin-1 führen, sodass die Endothel abhängige Vasodilatation vermindert ist [132].
Weiters konnten die Reduktion der NO Produktion auch durch MP von h Fas-L mediierten apoptotischen glatten Muskelzellen und deren Reduktion der Freisetzung durch
EMP in Ratten nachgewiesen werden[133].
Eine Korrelation von vaskulärer Dysfunktion und EMP-Spiegel, gemessen als Verlust flussmediierter Vasodilatation und Anstieg der aortalen Pulswellengeschwindigkeit,
konnte in Patienten mit hochgradigem Nierenversagen gezeigt werden [134]. Diese Resultate könnten darauf hinweisen, dass EMP nicht nur als Marker eines Gefäßschadens
oder einer endothelialen Dysfunktion dienen, sondern auch in der Lage sind pathologische Prozesse zu verstärken [55].
Eine Studie konnte weiters nachweisen, dass zirkulierende MP in Patienten mit Diabetes zu einer verringerten Expression der NO-Synthase führen und eine Endotheldysfunktion initiierten [135, 58].
Weiters wurden zu den erhöhten Werten von PMP und MMP in Patienten mit Diabetes
Typ 2 signifikant erhöhte Werte von CD62P- und CD63P-positiven Thrombozyten und
48
E-Selectin gemessen. Die erhöhte Aktivierung von Monozyten könnte auf den Einfluss
von aktivierten Thrombozyten und PMP zurückgeführt werden. Diese aktivierten Monozyten könnten auch zu Endothelzellschäden der Gefäße führen und daher als Marker
für Gefäßschäden in Typ 2 Diabetikern herangezogen werden, besonders bei Diabetikern, die an einer diabetischen Nephropathie leiden [117, 136, 137].
Weiter könnten aktive Thrombozyten zu Mikroembolien über Mikroaggregatbildung
beitragen. Das könnte über eine länger anhaltende Minderperfusion und damit Minderversorgung des Gewebes mit Sauerstoff zu einer Mikroangiopathie im Sinne von
Nephropathie, Neuropathie und Retinopathie führen [138, 117].
Des weiteren finden sich erhöhte MP-Spiegel in Prozessen mit Atherosklerose. Solch
erhöhte MP wurden in Typ 2 Diabetikern im Gegensatz zu gesunden Probanden nachgewiesen. Diabetiker mit hohem Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Spiegel hatten höhere
PMP-Werte als jene mit niedrigem LDL-Spiegel. So könnten PMP zu einer rascheren
Progression von Atherosklerose in Typ 2 Diabetikern beitragen [139].
Eine erhöhte Rate an Apoptose von Endothelzellen könnte die Entwicklung von Atherosklerose in Diabetes beschleunigen. Diese Apoptose ist assoziiert mit einer vermehrten
Monozyten und Thrombozytenaktivierung. Erhöhte Werte von EMP, MMP und PMP
wurden in diesen Patienten gemessen und könnten sich negativ auf die Prognose von
Gefäßerkrankungen durch prothrombotische, adhäsionsfördernde und proinflammatorische Prozesse auswirken [58, 140]. Zusätzlich könnten erhöhte PMP-Spiegel für die
hohe Rate an thrombotischen Komplikationen und Atherosklerose verantwortlich sein
[141, 142, 57].
Weil PMP und aktivierte MP zur Entwicklung von Atherosklerose beitragen können,
scheinen sie zur Einschätzung von Gefäßschäden nützlich zu sein [143]. Daher könnten
in diabetischen Patienten mit mikrovaskulären Erkrankungen diese Marker eingesetzt
werden [58].
Es gibt zahlreiche Hinweise, dass MP auch eine katalytische Wirkung in der Entwicklung von für Diabetiker pathophysiologisch relevanten Prozessen spielen.
Unsere fehlende Korrelation der MP-Konzentration spricht, wie zuvor schon erwähnt,
eher dagegen. Da wir aus methodischen Gründen keine Untergruppen der MP erhoben
haben, können wir nicht ausschließen, dass diese in pathologischen Prozessen involviert
sind, bevor Spätfolgen auftreten und auch sinnvoll für eine frühzeitige Diagnostik sind.
Es ist sicherlich nützlich diese Fragestellung, ob Typ 1 Diabetiker eine Erhöhung der
Untereinheiten der MP aufweisen, in einer weiterführenden Studie zu untersuchen. Unser Ergebnis zeigt nur, dass die gesamte MP-Konzentration in dieser Patientengruppe
nicht erhöht ist.
9.2 Thrombingeneration und Diabetes
Es gibt zurzeit wenige Publikationen, die sich mit dem Thema Diabetes und Thrombingeneration befassen. Meist kommen sie dabei als Nebenthema wie als Risikofaktor vor.
Da die Anzahl an Typ 2 Diabetikern größer ist als an Typ 1 ist es verständlich, dass
es zu letzteren im Zusammenhang mit Thrombingeneration noch weniger Studien gibt.
Die zentralen pathologischen Faktoren, wie Hyperglykämie und auch die Folgeerkrankungen sind in beiden Diabetesformen ähnlich und überschneiden sich. Daher können
Ergebnisse bei Typ 2 Diabetikern auch Hinweise auf Prozesse in Typ 1 Diabetikern
geben.
Tripodi et al. [116] untersuchten, ob eine Imbalance der Gerinnung im Sinne einer
49
Hyperkoagulabilität bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 besteht. Diesbezüglich
wurden auch schon einige Studien durchgeführt, jedoch basierten alle bisher auf Messungen von Einzelfaktoren. Daher entschlossen sich Tripodi et al. die KAT nach Hemker
[96] als Bestimmungsmethode zur Darstellung der gesamten Gerinnung zu wählen. Das
ETP soll die Balance der gerinnungsfördernden und hemmenden Faktoren im Plasma
widerspiegeln.
Eine verkürzte Lag-Time, ein verkürzter Thrombinanstieg, erhöhte ETP-Spiegel und
Thrombinpeak sind Zeichen für eine Hyperkoagulabilität. Das Verhältnis von ETP
und Thrombin Peak mit und ohne Thrombomodulin wurde von ihnen als weiteres
Hyperkoagulabilitätszeichen herangezogen und untersucht.
Alle eben erwähnten Parameter wiesen in dieser Studie Werte auf, die auf eine Imbalance in Richtung einer Hyperkoagulabilität bei Typ 2 Diabetikern im Vergleich zur
Kontrollgruppe hindeuteten.
Eine einzige Ausnahme gab es. Im Beisein von TF und Phospholipiden als Gerinnungstrigger und Abwesenheit von Thrombomodulin waren die ETP-Werte der Typ
2 Diabetiker zwar erhöht, aber nicht statistisch signifikant im Vergleich zu gesunden
Probanden.
Wie Tripodi et al. anführt, kann über die Relation zwischen den gemessenen Werten
mit und ohne Thrombomodulin auf die effiziente Aktivierung von Protein C durch
letzteres geschlossen werden. Daher könnten hohe Werte dieses Verhältnisses, wie bei
diesen Typ 2 Diabetikern, für ein Hyperkoagulabilität sprechen, da Thrombomodulin
weniger Einfluss auf die Gerinnung in ihrem Plasma nehmen kann (Genaues siehe
[116]).
Nebenbei sei erwähnt, dass auch noch weitere Gerinnungstests in der gleichen Studie
mit den gleichen Probanden untersucht worden sind und nur erhöhte Werte von VIII
und Protein C gefunden werden konnten.
Sonst wurden keine weiteren Imbalancen der Gerinnung festgestellt. Daher hat das
Plasma dieser Typ 2 Diabetiker eine Imbalance von gerinnungsfördernden und hemmenden Faktoren aufgewiesen, welche nicht mit herkömmlichen Gerinnungstests aber
mit der Thrombingenerationsmessung erfasst werden konnten.
Diese Hyperkoagulabilität könnte ihrer Meinung nach das erhöhte Risiko an venösen
Thrombembolien erklären und die Thrombingeneration auch an dem erhöhten Atherothromboserisiko beteiligt sein. Somit könnten auch Patienten identifiziert werden,
welche unter Umständen ein erhöhtes Risiko an arterieller und venöser Thrombose
aufweisen und bei denen eine Therapie sinnvoll erscheint[116].
Andererseits deutet dieses Ergebnis, wie schon im vorangegangenen Text erwähnt, darauf hin, dass moderate Gerinnungsveränderungen bei Erkrankungen potentiell durch
diese kontinuierliche Thrombingenerationsmessung erkannt werden könnten, was eine
sinnvolle Ergänzung zu den herkömmlichen Blutgerinnungstests bietet.
Eine weitere Studie von Stepien et al. [144] zeigte Diabetes als unabhängigen Prädiktor
der Thrombingeneration gemessen anhand von TAT und ETP.
Dazu wurden 135 Patienten mit stabiler Angina Pectoris untersucht, die zur koronaren Bypassoperation überwiesen wurden. 44 dieser Patienten waren Diabetiker. Zur
Bestimmung der Thrombingeneration verwendeten sie zwei Methoden.
Einerseits verwendeten sie eine Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) Methode um aus Citratplasma die TAT-Spiegel zu bestimmen, andererseits verwendeten sie
ein PPP und analysierten es mittels KAT.
Eine Analyse der allgemeinen multiplen Regression zeigte: Diabetes ist zusammen mit
50
männlichem Geschlecht als stärkster Prädiktor von TAT-Spiegel in venösem Blut zu
werten.
Bei der KAT waren die stärksten Prädiktoren für den Thrombin Peak Fibrinogen und
männliches Geschlecht in Verbindung mit Diabetes. Hohe CRP-Werte und männliches
Geschlecht zusammen mit Diabetes konnten als Prädiktor für ETP in der Studie herangezogen werden.
Es konnte keine Korrelation zwischen TAT-Spiegeln und Thrombin Peak oder ETP gefunden werden, weil beide Methoden in der Messmethodik zu sehr voneinander abweichen. TAT wird an einzelnen Zeitpunkten gemessen, während KAT über einen längeren
Zeitraum gemessen wird und immer wieder neu kalibriert werden muss. Daher sind sie
schwer miteinander vergleichbar, obwohl sie beide Aufschluss über die Thrombingenerierung geben. Die Parameter der KAT, definiert als Lag-Time, ETP und Thrombin
Peak, korrelierten untereinander.
Zusammenfassend hat diese Studie gezeigt, dass Diabetes ein unabhängiger Prädiktor
für ETP- und TAT-Werte ist. Sie konnten auch zeigen, dass eine Insulin Therapie mit
TAT-Spiegeln assoziiert ist aber nicht mit KAT Parametern[144].
In der von uns durchgeführten Studie ergab die Gegenüberstellung der Diabetikergruppe mit der Kontrollgruppe weitere überraschende Daten. Es kam zu signifikanten
Veränderungen von KAT Parametern. Die Gruppe der Diabetiker wies signifikant verringerte Werte der Lag-Time, des ETPs, der Time-to-Peak (ttPeak) in PPP und erhöhte
Werte von TAT im Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Unsere Ergebnisse zeigen wie bei
Stepien et al. [144] und Tripodi et al. [116] eine mittels KAT messbare Veränderung
der Hämostase auch in jüngeren Typ 1 Diabetikern.
Obwohl wir ein erhöhtes ETP als Zeichen einer vermehrten Thrombinbildung und damit
einer Hyperkoagulabilität erwartet haben, müssen sich unsere Beobachtungen nicht
widersprechen, weil wie schon zuvor erwähnt, der Hauptteil des gebildeten Thrombins
nach der Lag-Time auftritt [94].
Zusätzlich war TAT in der Diabetikergruppe erhöht, das wiederum spricht für eine
verstärkte Aktivierung von Thrombin. Daher könnte es zwar zu einer Aktivierung des
Thrombins kommen, jedoch könnten regulatorische Prozesse dieses rasch inaktivieren,
sodass es zu keinem Anstieg des ETPs kommt.
Dies kann hier, wie bei den Mikropartikeln auch, auf den Unterschied fehlender Spätfolgen zurückzuführen sein. Bei Stepien et al. [144] handelte es sich um Patienten, die
zu einer koronaren Bypassoperation überwiesen wurden und bei Tripodi et al. [116]
gab es keinen Ausschluss von Patienten mit Retinopathie.
Die Ergebnisse der von uns durchgeführten Studie sprechen auch für eine hämostatische
Imbalance bei 0-19 jährigen Typ 1 Diabetikern ohne Spätfolgen, die mittels KAT erkannt werden kann. Das bekräftigt die Ergebnisse der beiden zuvor erwähnten Studien.
Altersvergleich der Diabetesgruppe
Im Vergleich der 0-9 Jährigen mit den 10-19 Jährigen in der Diabetikergruppe konnten
wir keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen erkennen. Jedoch waren
bei der Diabetikergruppe die Parameter Lag-Time und ttPeak in beiden Reagenzien verringert, sowie ETP, Peak und F1+2 erhöht. Daher scheint ein Unterschied in
der Thrombingenerierung nach dem Alter auch bei kindlichen und jugendlichen Typ 1
Diabetikern erkennbar zu werden. Diese Ergebnisse unterstützen die vorherigen Beobachtungen von Haidl et al. [102], der eine Altersabhängigkeit der Thrombingeneration
51
nachweisen konnte.
Einfluss der Blutzuckerspiegel auf die Thrombingeneration
Die Frage, welchen Einfluss glykämische Zustände auf die Thrombingenerierung in
Diabetikern haben, wurde bisher hauptsächlich mit den Thrombinaktivierungsmarkern
TAT und F1+2 zu klären versucht.
Aoki et al. [51] befassten sich mit der Fragestellung wie sich ein gut oder schlecht eingestellter Blutglukosespiegel in Patienten mit und ohne Komplikationen auf die thrombozytenabhängige Thrombingeneration auswirkt.
Dabei wurde als Grenzwert ein HbA1c Wert von 9.0% definiert. Die höchste Thrombingenerierung wiesen Patienten ohne diabetische Komplikationen mit schlechter Einstellung auf, gefolgt von der gut eingestellten Gruppe und der gesunden Gruppe. Signifikante Unterschiede gab es dabei zwischen der gut und schlecht eingestellten Gruppe
im Vergleich zu den gesunden Probanden und auch untereinander.
Ein Versuch, die gut eingestellte Gruppe anhand eines HbA1c-Grenzwertes von 7.0%
nochmals zu unterteilen, ergab jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede. Bei
den Patienten mit diabetischen Komplikationen kam es bei der schlecht eingestellten
Gruppe ebenfalls zu der höchsten Thrombingenerierung, gefolgt von der gut eingestellten und gesunden Probandengruppe.
Jedoch war der Unterschied zwischen den beiden Diabetesgruppen mit Komplikationen
untereinander und in Bezug auf die gleiche Gruppe ohne Komplikationen dazu nicht
signifikant.
Weiters wurden acht Patienten, die Insulin benötigten, untersucht. Bei ihnen waren
die Werte zwar erhöht, aber nur signifikant gegenüber der gesunden Kontrollgruppe.
In vitro versetzten Aoki et al. [51] auch PRP von gesunden Probanden mit Glukose und konnten einen Anstieg der Thrombingenerierung im Zusammenhang mit der
beigefügten Glukosekonzentration beobachten. Daraus folgern sie, dass eine Imbalance
im Sinne einer Hyperkoagulabilität bei Diabetikern besteht und ein gut eingestellter
Blutzuckerspiegel zu einer Reduktion dieser beitragen kann [51].
Lopez et al. [145] untersuchten in 30 Diabetikern ohne Folgeschäden definiert als Neuropathie, Nephropathie oder Retinopathie, wie sich TAT- und F 1+2-Werte unter guter
metabolischer Kontrolle verhalten.
Dabei war TAT als einziger Parameter erhöht. Es konnte keine Erhöhung der F1 +2Werte erhoben werden. Daher würde diese Beobachtung allgemein auch für eine Beeinflussung der Gerinnung durch den Blutglukosespiegel und auch durch Folgeerscheinungen, den diabetischen Komplikationen, sprechen. Allerdings sollte dabei nicht außer
acht gelassen werden, dass es sich um ein kleines Patientenkollektiv handelt [145].
Eine Studie, in der 58 Patienten mit Insulin-Dependent-Diabetes-mellitus (IDDM) ohne
hypo- oder hyperglykämischen Entgleisungen in den vorangegangenen 6 Monaten und
ohne Makroangiopathie untersucht wurden, ergab andere Beobachtungen. Dass Follow
up in dieser Studie betrug 3 Jahre. Halbjährlich wurden die Patienten auf Makro- und
Mikroangiopathie untersucht.
In diesem Kollektiv wurde eine deutlich signifikante Erhöhung von F1+2 sowie TAT
beobachtet. In dieser Studie wiesen 13 Patienten mikroangiopathische Schäden auf, 8
Patienten hatten eine Retinopathie und 5 weitere eine Mikroalbuminurie. Es gab in
den Thrombingenerationsparametern keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen
Patienten und jenen ohne Mikroangiopathie. Daher spricht dieses Ergebnis für eine
52
Hyperkoagulabilität ohne signifikanten Einfluss von mikroangiopathischen Schäden und
eventuell dadurch auch von Hyperglykämie.
Andererseits ist die Patientenzahl hier auch gering und das Patientenkollektiv deutlich
jünger als in der Studie von Lopez. Vielleicht könnte dies die Diskrepanz der unterschiedlichen Beobachtungen erklären [146].
Undas et al. [147] untersuchten unter anderem inwieweit Hyperglykämie in Patienten
mit akutem Koronarsyndrom zu einer erhöhten Thrombingenerierung beiträgt.
Dabei wurden jeweils drei Gruppen zu je 20 Patienten untersucht, die erste Gruppe
inkludierte Typ 2 Diabetiker unter Einnahme von Insulin oder oralen Antidiabetika.
Die zweite Gruppe(HG) umfasste Patienten ohne Diabetes Anamnese, jedoch mit Serumglukosewerten von über 7mmol pro Liter und in der dritten Gruppe (NG) wurden
Patienten mit Serumglukosewerten unter 7mmol pro Liter untersucht. Dabei fanden
sie erhöhte TAT- und F1+2-Werte bei der Diabetes Gruppe im Vergleich zur NG. Die
Spitzenwerte der TAT Bildung waren nach vaskulären Schäden in den beiden Gruppen
mit Hyperglykämie höher als in der mit normalen Blutzuckerwerten.
In ihrer Studie konnten sie zusammenfassend zeigen, dass als Reaktion auf vaskuläre
Schäden in Patienten mit Diabetes oder erhöhten Serumglukosewerten während akutem Myokardinfarkt (MI) erhöhte Glukosespiegel mit einer vermehrten Produktion von
Thrombin einhergeht [147].
Eine andere Studie untersuchte den Einfluss des oralen Glucosetoleranztests (OGTT)
von diätetisch behandelten Diabetikern beziehungsweise gesunden Probanden zu je elf
Personen auf Prothrombinfragment-F1+2 und TAT.
Die Diabetikergruppe hatte eine milde Ausprägung des Diabetes und es konnten keine
mikro- oder makrovaskulären Schäden nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigten
keine wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen in der Konzentration
von F1 + 2 und TAT im Plasma und auch keine Veränderung der Parameter unter
OGTT.
Diese Studie hatte keine akuten Veränderungen unter Hyperglykämie gefunden. Sie
wiesen jedoch auf Cerellio et al. [148] hin, die einen Unterschied in der Konzentration
von F1+2 im Plasma unter akuter Hyperglykämie bei gesunden als auch bei an Typ 2
Diabetes erkrankten Patienten nachwiesen. Carmassi et al. [24] konnte erhöhte TATWerte mit HbA1c-Werten bei Diabetikern korrelieren [149].
Eine weitere Studie untersuchte den Einfluss von Insulin und Glukose auf die Gerinnung
bei Typ 2 Diabetikern im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe. Unter anderem
wurden neben zirkulierendem TFPCA, FVII und FVIII auch TAT und F1+2 bestimmt
nach einem Fastenzustand über Nacht von 6 bis 8 Stunden.
Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Typ 2 Diabetiker sich in einer chronischen
Imbalance der Gerinnung befinden, die im Sinne einer Thrombose auch klinisch relevant
werden kann.
Dabei waren TAT und F1+2 bei Erhöhung der Insulinspiegel bei Diabetikern nicht
erhöht. Bei gesunden Probanden war nur TAT nach 18 Stunden erhöht. Hingegen
kam es zu einem signifikanten Anstieg von TAT und F1+2 in beiden Gruppen, als
die Glukose- und Insulinkonzentration durch Glukoseinfusionen gleichzeitig gesteigert
wurden. Dazu waren auch noch TFPCA und TF-mRNA erhöht.
Dies könnte auf eine mögliche Steigerung des Risikos für thrombotische Ereignisse bei
Typ 2 Diabetikern unter einer schlechten glykämischen Kontrolle hinweisen [23].
Rao et al. [150] führten eine Studie aus, in der junge gesunde Probanden von 24 bis 45
Jahren in zwei Gruppen eingeteilt wurden. Die einen wiesen erhöhte Werte von Insulin
53
und Blutglukose auf, die anderen nur von Insulin. Während ihrer Beobachtungen kam
es nach 48 Stunden in beiden Gruppen zu keiner signifikanten Erhöhung der F1+2sowie der TAT-Werte. Während ihrer Studie wurde auch ein weiterer Parameter der
Hämostase erhoben, den TFPI. Dieser war in der Hyperglykämiegruppe aber nicht in
der Hyperinsulinämiegruppe erhöht.
Sie vermuteten, dass Hyperglykämie zwar den TF-Pathway aktiviert, aber sofort wieder
durch TFPI kontrolliert wird und es so zu keiner weiteren Aktivierung von FX und der
Thrombingeneration kommt [150].
Cerellio et al. [151]untersuchten den Einfluss der Therapie der akuten Hyperglykämie
und oxidativem Stress auf die Gerinnungsaktivierung in 36 Typ 1 Diabetikern. Ihre
Kontrollgruppe bestand aus 12 gesunden Probanden, da die Diabetiker in 3 Gruppen eingeteilt wurden. Die Therapien bestanden dabei aus unterschiedlicher Dauer der
Gabe von Insulin zur Therapie der Hyperglykämie und Vitamin C zur Therapie der
oxidativen Komponente.
Die erste Diabetikergruppe (A) bekam dabei über 24 Stunden Insulin und nach 12
Stunden Vitamin C. Bei der zweiten Gruppe (B) wurden die Therapien getauscht. Die
dritte Gruppe (C) bekam beide Therapien über 24 Stunden.
Alleine in Gruppe B kam es erst nach 24 Stunden zu einer Normalisierung der Glukosespiegel, in den anderen Gruppen schon nach 12 Stunden. Die Resultate zeigten
eine signifikante Erhöhung der F1+2 sowie TAT-Spiegel in allen Diabetespatienten im
Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei kam es in allen Gruppen zu einer signifikanten Reduktion der eben genannten Parameter nach 12 und 24 Stunden. Dabei wies die Gruppe
C die deutlichste Reduktion nach 12 Stunden auf, gefolgt von Gruppe B und zuletzt
Gruppe A. In weiteren 12 Stunden kam es zu einer weiteren Reduktion bei Gruppe A
und B. Nach 24 Stunden gab es keinen Unterschied in den Parametern zwischen allen
drei Gruppen.
Diese Beobachtungen scheinen einen Hinweis darauf zu geben, dass es neben dem Einfluss von Hyperglykämie auf die Thrombingenerierung auch noch einen anderen unbekannten Mechanismus in Typ 1 Diabetikern geben könnte, der zu einer hämostatischen
Imbalance führen kann.
Jedoch sollte dieses Ergebnis auch mit einer größeren Probandenzahl durchgeführt werden, um diese Beobachtungen nochmals zu überprüfen und eine bessere Aussagekraft
zu erlangen [151].
Die Studien sind schwer zu vergleichen, da die Studiendesigns unterschiedlich sind und
die Probandenzahl oft sehr klein ist. Grundsätzlich scheint es jedoch eine hämostatische
Imbalance bei Diabetikern zu geben, die auch mittels Thrombingenerationsparameter
gemessen werden kann.
TF Reagenz
In der von uns durchgeführten Studie wird die Fragestellung ob glykämische Zustände
die Thrombingeneration mitbeeinflussen mittels KAT untersucht.
Dazu wurden zwei glykämische Parameter definiert. Erstens der Blutglukosespiegel als
Parameter für einen momentanen Zustand und zweitens der Hba1c als Parameter für
einen chronischen Zustand.
Dabei korrelierten die Hba1c-Spiegel signifikant mit dem ETP und Peak in PPP. Ferner
kam es zu einer nicht signifikanten inversen Korrelation der Lag-Time und des ttPeak.
Hingegen wiesen die Bluglukosespiegel keine signifikante Korrelation auf.
54
Daher sprechen die Ergebnisse der von uns durchgeführten Studie für eine Beeinflussung der Hämostase bei kindlich und jugendlichen Typ 1 Diabetikern durch chronische
glykämische Zustände, aber nicht durch akute und gehen einher mit Erkenntnissen
von Yngen et al. [149], Aoki et al. [51], [145] und Carmassi et al. [24]. Daher könnten
hohe Konzentrationen an Hba1c bei dieser Diabetikergruppe zu einer hämostatischen
Imbalance im Sinne eines prokoagulatorischen Effekts führen und so zu bekannten
Komplikationen des Diabetes auch bei kindlich und jugendlichen Typ 1 Diabetikern
beitragen.
Hingegen sprechen unsere Resultate dafür, dass akute glykämische Zustände nicht mit
der Hämostase korrelieren und daher auch nicht über prokoagulatorische Prozesse für
Komplikationen bei Typ 1 Diabetikern verantwortlich sind im Unterschied zu den Ergebnissen von anderen Studien bei Diabetes im Allgemeinen [151, 150, 23, 147, 146].
TF freies Reagenz
Weiters korrelierten wir die beiden glykämischen Parameter mit den Messungen der
KAT im MP-Reagenz, um den Einfluss von glykämischen Zuständen auf die MP und
deren Auswirkung auf die Hämostase darzustellen. Dabei kam es zu den gleichen Resultaten wie im vorherigen Absatz dargestellt.
Dies unterstützt weiters die Beobachtung, dass anscheinend chronisch hyperglykämische Zustände mehr Einfluss auf die Hämostase haben als akute.
Weiters sprechen unsere Resultate dafür, dass MP einen prokoagulatorischen Effekt
im Zusammenhang mit einem steigenden Hba1c vermitteln. Interessanterweise gab es
keinen messbaren Effekt von glykämischen Zuständen auf die MP-Konzentration in
unserer Studie, wie zuvor schon erwähnt. Daher könnte diese Beobachtung doch dafür
sprechen, dass MP einen katalysierenden Effekt in Typ 1 Diabetikern aufweisen.
9.3 Zusammenfassung der Diskussion
Zusammenfassend konnten wir mit der KAT bei Typ 1 Diabetikern von 0-19 Jahren
nachweisen, dass chronische hyperglykämische Zustände mit der Hämostase von Diabetikern positiv korrelieren und damit hyperglykämische Zustände zu einer Imbalance
der Hämostase bei Typ 1 Diabetikern führen. Dabei hängt der prokoagulatorische Einfluss von MP nicht von der Gesamtkonzentration der MP ab, sondern muss qualitativ
vermittelt werden. Welche Prozesse dahinter stehen, ist noch nicht geklärt.
Es konnte auch ein nicht signifikanter altersabhängiger Effekt der KAT in der Diabetikergruppe beobachtet werden. Bei der Diabetikergruppe kam es zu einer verkürzten
Gerinnungszeit und vermehrten Thrombinaktivierung, jedoch kam es zu einem verringerten ETP. Daher scheint es hier eine Veränderung der Gerinnung zu geben, die
mittels KAT erkannt werden kann.
Es konnte auch keine Erhöhung der MP-Konzentration in unserer Diabetikergruppe im
Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden.
55
Abbildungsverzeichnis
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
weltweite Prävalenz, WHO[2] . . . . . . . . . . . .
Thrombogramm nach Cimenti et al.[103] . . . . . .
Diabetiker vs Kontrolle, Mann-Whitney-U-Test . .
ETP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ETP-Mikropartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0-9 Jährige vs 10-19 Jährige, Mann-Whitney-U-Test
Korrelation: ETP und Hba1c, TF-Reagenz . . . . .
Korrelation: Peak und Hba1c, TF-Reagenz . . . . .
Korrelation: ETP und Hba1c, TF freies Reagenz . .
Korrelation: Peak und Hba1c, TF freies Reagenz . .
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12
26
35
36
36
40
40
41
42
42
Diabetiker vs Kontrolle,Gruppenstatistik . . . . . . .
Diabetiker vs Kontrolle,Levene und T-Test . . . . . .
Diabetiker vs Kontrolle, 2 seitige Signifikanz . . . . .
Diabetiker vs Kontrolle, Konfidenzintervall . . . . . .
0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Gruppenstatistik .
0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Levene und T-Test
0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, 2 seitige Signifikanz
0-9 Jährige vs 10-19 Jährige DM, Konfidenzintervall .
Korrelationsanalyse 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Korrelation 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Korrelationsanalyse 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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34
34
35
37
38
39
39
43
44
45
Tabellenverzeichnis
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
56
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