Charakterisierung der durch Tet(O) vermittelten Resistenz
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Naturwissenschaftliche Fakultät II der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Charakterisierung der durch Tet(O) vermittelten Resistenz gegenüber Tetrazyklinen Diplomarbeit aus dem Institut für Mikrobiologie, Biochemie und Genetik der naturwissenschaftlichen Fakultät II Dozent: Prof. Dr. Wolfgang Hillen vorgelegt von Linda Wenzel aus Essen Erlangen, April 2004 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis............................................................................. IV 1. Zusammenfassung............................................................................. 1 2. Einleitung 2.1 Tetracycline..................................................................................... 2 2.2 Resistenzmechanismen............................................................... 4 2.2.1 Efflux-Mechanismen................................................................ 5 2.2.2 Ribosomale Schutzproteine (RSPs) ....................................... 7 2.2.3 Zielsetzung.............................................................................13 3. Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien .......................................................................... 14 3.1.2 Verbrauchsmittel ................................................................... 15 3.1.3 Geräte ................................................................................... 15 3.1.4 Kommerzielle Reagenziensätze, Standards.......................... 16 3.1.5 Enzyme, Proteine ................................................................. 17 3.1.6 Oligonukleotide...................................................................... 17 3.2 Bakterienstämme......................................................................... 19 3.3 Verwendete und konstruierte Plasmide ................................ 20 3.4 Medien und Puffer 3.4.1 Bakteriennährmedien ............................................................ 21 3.4.2 Lösungen, Puffer und Standards .......................................... 22 3.5 Molekularbiologische Methoden 3.5.1 Methoden mit Nukleinsäuren Isolierung von Plasmid-DNA.................................................. 23 Ethanol-Fällung ..................................................................... 23 PEG-Fällung.......................................................................... 24 I Inhaltsverzeichnis DNA-Gelelektrophorese......................................................... 24 Elution von DNA aus Agarosegelen....................................... 24 Direkte Aufreinigung von PCR-Produkten..............................25 Sequenzierung von DNA .......................................................25 Restriktionsspaltung von DNA .............................................. 25 Dephosphorylierung von 5´-DNA-Enden............................... 25 Ligation von DNA-Fragmenten ..............................................26 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).........................................26 PCR-Analyse (Kolonie-PCR).......................................26 Fehler-PCR nach Leung.............................................. 27 3.5.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen ................................. 27 3.5.3 Transformation von E. coli DH5α .......................................... 28 3.5.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli DH5α........................ 28 3.5.5 Elektroporation von E.coli DH5α............................................ 29 3.5.6 Methoden der Anzucht von Bakterien.................................... 29 3.5.7 Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität in E.coli................ 29 3.5.8 Anlegen einer Kryo-Kultur von E.coli..................................... 31 3.5.9 Überstempeln von Bakterienkulturen (Samtkissen-Methode) 31 4. Ergebnisse 4.1 Mutagenese der Domäne IV des ribosomalen Schutzproteins TetO 4.1.1 Strategie.................................................................................32 4.1.2 Konstruktion des TetO-Expressionssystems pWH946.......... 33 4.1.3 Mutantengemisch-Klonierung von dIV-Mutanten................... 37 4.1.4 Retransformation der tetO-dIV-Mutanten in E. coli BL21 und Analyse auf Gewinn von Tigecyclinresistenz.........40 4.1.5 Kontrolltransformation von E. coli BL21 mit dIV-Mutanten zur Überprüfung auf Erhalt der Tetracyclinresistenz............. 41 II Inhaltsverzeichnis 4.2 Überprüfung der stromaufwärts-Sequenz vor tetO auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin 4.2.1 Strategie.................................................................................43 4.2.2 Konstruktion des Reporterplasmids pWH947........................ 44 4.2.3 Konstruktion des Kontrollsystems pWH948........................... 47 4.2.4 Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität von E. coli DH5α pWH947 pWH230 und des Kontrollsystems E. coli DH5α pWH948 pWH230.................................................................. 49 4.2.5 Klonierung von Fragmenten des tetO-stromaufwärtsBereichs vor lacZ in pCB302b und Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität......................................................... 51 4.2.6 Konstruktion von pWH947∆200 und Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität......................................................... 55 5. Diskussion 5.1 Mutation der TetO-Domäne IV 5.1.1 Motivation...............................................................................61 5.1.2 Diskussion der Mutagenese von TetO................................... 61 5.1.3 Ausblick..................................................................................64 5.2 Überprüfung der Sequenz stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin 5.2.1 Motivation...............................................................................66 5.2.2 Diskussion der Analyse der Sequenz stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Aktivität............................................. 66 5.2.3 Ausblick..................................................................................69 6. Literaturverzeichnis.......................................................................... 70 III Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Allgemeine Abkürzungen: % (w/v) Massenprozent aa-tRNA Aminoacyl-tRNA Abb. Abbildung AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C. Campylobacter d- Desoxy- dIV Domäne IV-kodierender Bereich DIV Domäne IV DMG- 9-N,N-dimethylglycylamido DMG-DMDOT DMG-6-demethyl-6-deoxytetracyclin DMG-MINO DMG-Minocyclin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid) dNTPs Desoxynukleotidtriphosphate E. Escherichia EDTA Ethylendiamin-N,N-N‘,N‘-Tetra Essigsäure (-acetic acid) EF- Elongationsfaktor EtOH Ethanol et al. et alii (Lateinisch: "und andere") GDP Guanosindiphosphat GTP Guanosintriphosphat I Internet IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid IR palindromische Sequenz (inverted repeat) Kap. Kapitel LB Luria-Bertani (Medium) MCS vielfache Klonierungsstelle (multiple cloning site) IV Abkürzungsverzeichnis mod. modifiziert Mol Stoffmenge (6,022 x 1023 Teilchen) mRNA messenger-RNA (Boten-RNA) mut Mutante oDx Optische Dichte bei Wellenlänge x nm ONPG o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid otr Oxytetracyclin p. a. zur Analyse (pro analysi) PCje C. jejuni-Promotor PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PEco E. coli-Promotor PEG Polyethylenglykol R Resistenz/resistent RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) rpm Umdrehungen pro Minute (rotations per minute) rRNA ribosomale RNA RSP ribosomale(s) Schutzprotein(e) SB Super Broth (Medium) SD Shine-Dalgarno Tab. Tabelle Tc Tetracyclin tetO Gen der Resistenzdeterminante Tet(O) TetO Protein der Resistenzdeterminante Tet(O) Tet(O) Resistenzdeterminante Tet(O) tetOup stromaufwärts-Sequenz vor tetO TGC Tigecyclin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan tRNA Transport-/Transfer-RNA UE Untereinheit üN(K) über Nacht (Kultur) üT(K) über Tag (Kultur) UV Ultraviolett VE voll entsalzt wt Wildtyp x geschnitten V Abkürzungsverzeichnis Tab. 6.1 Einheiten Ω Ohm °C Grad Celsius Da Dalton F Farad g Gramm h Stunde (hour) l Liter M Molar (mol/l) m Meter min Minute S Sedimentationskoeffizient s Sekunde U Unit im Kontext Enzymaktivität bzw. Enzymmenge V Volt Tab. 6.2 Tab. 6.3 Vorsätze Nukleotide k kilo (103) A Adenosin m milli (10-3) C Cytosin µ mikro (10-6) G Guanosin n nano(10-9) T Thymidin p piko (10-12) U Uracil VI Abkürzungsverzeichnis Tab 6.4 Aminosäuren-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung (1969) A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin L Leu Leucin W Trp Tryptophan K Lys Lysin Y Tyr Tyrosin VII Zusammenfassung 1. Zusammenfassung Der massive medizinische Einsatz des Antibiotikums Tetracyclin führte zur Entwicklung zahlreicher Resistenzen in pathogenen Mikroorganismen. Die am besten untersuchten Resistenzmechanismen sind Efflux des Antibiotikums und die ribosomalen Schutzproteine (RSP). Da gegen das neue Glycylcyclinderivat Tigecyclin (TGC) die meisten bekannten Tetracyclin-Resistenzmechanismen wirkungslos sind, gilt es als vielversprechend. Es konnte jedoch bereits durch Mutagenese der Efflux-Determinante Tet(A) eine schwache TGC-Resistenz gefunden werden. Das erste Projekt der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Mutagenese des RSPs TetO aus Campylobacter jejuni, welches Resistenz gegen Tetracyclin (Tc) vermittelt. TetO bindet an das Ribosom und induziert dort eine Konformationsänderung, die Tc aus seiner Bindetasche freisetzt. Der Resistenzmechanismus wird maßgeblich von der Domäne IV des Proteins bestimmt, die sich in nächster räumlicher Nähe zur TcBindetasche befindet. Es wurde überprüft ob durch ungerichtete Mutagenese der Domäne IV von TetO eine TGC-resistente Mutante erhalten werden kann. Ein Mutantengemisch von 85000 Kandidaten mit einzelnen Basenaustauschen wurde in einer genetischen Selektion auf TGC-Resistenz vielfach abgedeckt. Eine TGCresistente TetO-Mutante wurde nicht isoliert. Entweder reicht ein einzelner Basenaustausch für einen Resistenzgewinn nicht aus, oder TetO bindet nicht stabil genug an das Ribosom, um das stärker als Tc bindende TGC aus der Bindestelle freizusetzen. Hier bietet sich ein Ansatz zur Mutagenese einer anderen, für die Bindung an das Ribosom wichtigen Domäne des Proteins an. Im zweiten Projekt wurde die Sequenz stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin untersucht. Für die Resistenzdeterminante Tet(M) ist bereits bekannt, dass die stromaufwärts gelegene Sequenz die Expression des Proteins durch Attenuation in Gegenwart von Tetracyclin reguliert. Die Sequenzen stromaufwärts vor tetO und tetM weisen einen hohen Grad an Sequenzidentität auf. In diesem Teil der Arbeit konnte durch Promotorfusionen mit dem Reportergen lacZ nachgewiesen werden, dass auch die Expression von TetO durch die Anwesenheit von Tetracyclin reguliert wird. Sie erfolgt dosisabhängig durch eine Steigerung der Expressionsrate in Anwesenheit steigender Konzentrationen von Tetracyclin. Als regulatorisch aktiver Bereich konnte der nichttranslatierte Bereich zwischen dem E. coli-Promotor und dem Startkodon des Gens identifiziert werden. 1 Einleitung 2. Einleitung 2.1 Tetracycline Die Breitbandantibiotika-Klasse der Tetracycline (Abb. 2.1) wurde Mitte des 20. Jahrhunderts entdeckt. Tetracycline besitzen ein breites Wirkungsspektrum gegen viele Gram-positive und Gram-negative pathogene Bakterien sowie Chlamydien, Mycoplasmen, Rickettsien und einige protozoische Parasiten mit relativ geringen Nebenwirkungen auf höhere Abb. 2.1 Tetracyclin [aus: Chopra, Roberts 2001] Eukaryoten [Chopra & Roberts, 2001]. Daher wurden Tetracycline vielfach in der Bekämpfung von humanpathogenen Organismen, in der Krankheitsvorbeugung, der Tiermedizin und als wachstumsfördernde Substanzen in der Tierzucht eingesetzt [Chopra & Roberts, 2001]. Durch die häufige Verwendung von Tetracyclinen entwickelten sich in vielen Mikroorganismen Resistenzmechanismen, aufgrund derer der Einsatz des Antibiotikums drastisch eingeschränkt werden musste. Es war die Entwicklung neuer Tetracyclinanaloga notwendig, welche in der Lage sein sollten, diese Resistenzmechanismen zu umgehen, ohne die Wirkung auf tetracyclinsensitive Organismen zu verlieren. Dies führte zur Entwicklung von mittlerweile drei Generationen von Tetracyclinen. Die zuerst entdeckten Tetracycline waren Chlortetracyclin und Oxytetracyclin als Stoffwechselprodukte von Streptomyces aureofaciens beziehungsweise Streptomyces rimosus [Chopra & Roberts, 2001]. Es folgten die Tetracycline der zweiten Generation, zu denen Minocyclin (Abb. 2.2) Abb. 2.1 Minocyclin [mod. aus: Chopra, Roberts 2001] und Doxycyclin zählen [Cunha et al., 1982]. Die neueste Gruppe der Tetracycline sind die Glycylcycline [Testa et al., 1993; Sum et al., 1994; Barden et al., 1994], die auch als Tetracycline der dritten Generation bezeichnet werden [Chopra, 2001]. Glycylcycline besitzen eine N-alkyl-glycylamido-Substitution an Position C9 des Grundgerüsts verschiedener Tetracyclinderivate [Chopra, 2001]. Ein Vertreter der Glycylcycline ist das in dieser Arbeit verwendete 9-t-Butylglycyl-amido-Derivat des Minocyclins, TBG-MINO oder GAR-936 (Abb. 2.3) [Petersen et al., 1999; Sum & Petersen 1999], welches kürzlich den Namen Tigecyclin erhielt [Hunter & Castaner, 2001; Zahnel et al., 2004]. Dieses Derivat wurde nach empirisch gewonnenen Daten 2 Einleitung synthetisiert, da außer dem Wirkort Ribosom heutigen Tag antibiotische mus von seinen molekularer bis der zum genaue WirkmechanisTetracyclin und Derivaten auf Ebene nicht Abb. 2.3 9-(t-Butylglycylamido)-minocyclin (Tigecyclin = TGC) [aus: Chopra, Roberts 2001] aufgeklärt ist. Tigecyclin durchläuft zurzeit klinische Studien der Phase III [Guay, 2004] und gilt als das vielversprechendste neue Glycylcyclin [Zahnel et al., 2004]. Es bindet wie die anderen Glycylcycline an die gleichen Bindestellen im Ribosom wie Tetracyclin und scheint dort sogar effektiver zu binden als Tetracyclin [Bauer et al., 2004, Bergeron et al., 1996]. Ebenso wie gegen die anderen Glycylcycline sind bei diesem Derivat die häufigsten Tetracyclin-Resistenzmechanismen wirkungslos [Bergeron et al., 1996; Johnson, 2000; Petersen et al., 1999; Sum & Petersen,1999]. Tetracycline passieren die äußere Membran Gram-negativer Organismen durch die OmpF- und OmpC-Porinkanäle als Komplex mit einem zweifach positiv geladenen Metall-Kation [Schnappinger & Hillen, 1996; Chopra et al., 1992]. Es wird diskutiert, dass dieser Komplex im Periplasma dissoziiert und Tetracyclin ungeladen durch die Cytoplasmamembran diffundiert [Sigler et al., 2000]. Analog gelangt das Antibiotikum durch die Cytoplasmamembran Gram-positiver Bakterien [Nikaido & Thanassi, 1993]. In der Zelle bindet Tetracyclin als Tetracyclin-Metallion-Komplex an die 30SUntereinheit (UE) in 70S-Ribosomen, verhindert eine Bindung der Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) an das Ribosom und blockiert so die Proteinsynthese der Zelle [Chopra, 1985; Pioletti et al., 2001; Spahn & Prescott, 1996]. Die Hauptinteraktion von Tetracyclin mit dem Ribosom wird durch die ribosomale 16S rRNA der 30S-UE vermittelt. Die Röntgen-Kristallstrukturen der 30S UE des Ribosoms mit gebundenem Tetracyclin zeigen zwei [Brodersen et al., 2000] beziehungsweise sechs [Pioletti et al., 2001] Bindestellen für Tetracyclin in der 16S rRNA. Hierbei zeigt eine Bindestelle, welche durch Helix 34 und eine innere Schleife von Helix 31 gebildet wird, den höchsten Besetzungsgrad mit Tetracyclin und wird deshalb als primäre TetracyclinBindestelle bezeichnet [Brodersen et al., 2000; Pioletti et al., 2001]. Diese Daten unterstützen die biochemisch gewonnenen Erkenntnisse über die primäre Bindestelle von Tetracyclin am Ribosom [Bauer et al., 2004, Moazed & Noller, 1987]. Außerdem wurden auch Kontakte von den Proteinen S4, S7, S9 und S17 der 30S UE mit 3 Einleitung Tetracyclin nachgewiesen [Pioletti et al., 2001]. Möglicherweise sind für die Blockierung der Bindung der Aminoacyl-tRNA nicht nur sterische Effekte, sondern auch eine durch Tetracyclin induzierte Konformationsänderung des Ribosoms verantwortlich [Brodersen et al., 2000; Noah et al., 1999]. Diese durch die herkömmlichen Tetracycline hervorgerufene Hemmung der Proteinsynthese wirkt sich bakteriostatisch aus, da die Bindung an das Ribosom reversibel erfolgt und die Bakterien nicht lysiert, sondern an Wachstum und Teilung gehindert werden. Die Wirkung des Glycylcyclins Tigecyclin ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Tetracyclinen bakterizid [Projan, 2000]. 2.2 Resistenzmechanismen Als die Tetracycline Anfang der 50er Jahre als Antibiotika in der Humanmedizin eingeführt wurden, konnten so gut wie keine tetracyclinresistenten Organismen isoliert werden [Levy, 1984]. Erst nach intensiver Nutzung der damals neuen Antibiotikaklasse in Medizin, Tierzucht und Landwirtschaft fanden sich in vielen Gram-positiven und Gram-negativen Spezies Resistenzen gegen Tetracycline [Chopra & Roberts, 2001]. Es wird vermutet, dass die Verbreitung der Resistenzen durch lateralen Streptomyces Gentransfer stattgefunden aus hat den Tetracyclinproduzenten [Benveniste & Davies, der 1973], Gattung da diese natürlicherweise gegen das von ihnen produzierte Antibiotikum resistent sein müssen. Bisher wurden vier verschiedene Mechanismen der Tetracyclinresistenz (tet-Gene) klassifiziert: (1) 22 Efflux-Determinanten, hiervon zwei für Oxytetracyclin (otr-Gene) [I-Roberts, 2004], (2) 11 Resistenzen durch Schutz des Ribosoms, hiervon eins für Oxytetracyclin [I-Roberts, 2004], (3) 2 Resistenzen durch enzymatischen Abbau des Antibiotikums [Diaz-Torres et al., 2003; Speer et al., 1991] und (4) 2 Resistenzen durch Mutation in der ribosomalen 16S RNA [Gerrits et al., 2002; Ross et al., 1998; Trieber & Taylor, 2002]. Die am weitesten verbreiteten Mechanismen sind Efflux des Antibiotikums und ribosomale Schutzproteine. Diese werden im Folgenden vorgestellt, im besonderen Hinblick auf die in dieser Arbeit behandelten ribosomalen Schutzproteine. 4 Einleitung 2.2.1 Efflux-Mechanismen Die am besten untersuchten Tetracyclin-Resistenzmechanismen sind die EffluxProteine [Chopra & Roberts, 2001]. Es sind mittlerweile 20 verschiedene tet-Gene und zwei otr-Gene bekannt, die für membranständige Efflux-Pumpen codieren [IRoberts, 2004]. Efflux-Gene sind in Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien verbreitet und werden aufgrund ihrer Übereinstimmungen in der AS-Sequenz in sechs Gruppen eingeteilt [McMurry & Levy, 2000]. Die meisten Vertreter gehören der ersten und zweiten Gruppe an: Die erste Gruppe beinhaltet 13 Klassen [Chopra & Roberts, 2001; I-Roberts, 2004; Tauch et al., 2002]. Die Aminosäuresequenzen der Efflux-Proteine (TetA-Proteine) dieser Determinanten sind zu 41-78 % identisch [Chopra & Roberts, 2001]. Alle Efflux-Systeme der ersten Gruppe wurden ausschließlich in Gram-negativen Spezies gefunden, mit Ausnahme von Tet(Z) und Tet(33); diese wurden im Gram-positiven Corynebacterium glutamicum entdeckt [Tauch et al., 2000]. Alle dieser Gruppe angehörigen TetA-Proteine besitzen 12 vorgeschlagene Transmembranhelices [Chopra & Roberts, 2001]. Der zweiten, hauptsächlich in Gram-positiven Organismen vorkommenden Gruppe von Efflux-Determinanten gehören Tet(K) und Tet(L) an. Die TetA-Proteine dieser Gruppe sind zu ungefähr 60% identisch und besitzen 14 vorgeschlagene Transmembranhelices [Chopra & Roberts, 2001]. Die übrigen Efflux-Systeme gehören den anderen vier Gruppen an und sind vergleichsweise gering vertreten [Chopra & Roberts, 2001]. Die Efflux-Systeme vermitteln Tetracyclinresistenz durch Reduktion der Tetracyclinkonzentration in der Zelle [Schnappinger & Hillen, 1996]. Das Antibiotikum wird als Komplex mit einem zweiwertigen Metall-Kation durch ein spezifisches Antiporter-System aus der Zelle ausgeschleust, im Gegenzug wird ein Proton eingeschleust [Schnappinger & Hillen, 1996; Yamaguchi et al., 1990]. Die Regulation der Expression der TetA-Proteine unterscheidet sich in Gramnegativen und Gram-positiven Bakterien. In Gram-negativen Organismen wird die Expression in Abwesenheit von Tetracyclin von einem durch Tetracyclin induzierbaren Repressor-Protein (TetR) unterdrückt. Dieses Protein bildet ein Dimer und bindet im uninduzierten Zustand an zwei Tandem-tet-Operatoren, die sich zwischen dem tetA- und dem tetR-Gen befinden [Hillen & Berens, 1994]. Wird der Tet-Repressor vom Tetracyclin-Metallkation-Komplex gebunden, löst er sich von den Operatoren, so dass eine Expression von TetA und TetR erfolgt [Hillen & Berens, 1994]. In Gram-positiven Organismen ist die Expression des TetA-Proteins zwar 5 Einleitung auch induzierbar [Khan & Novick, 1983; Ohnuki et al., 1985; Schwarz et al., 1992; Sloan et al., 1994], jedoch wurde kein Repressor-Protein gefunden [Roberts, 1996; Schnappinger & Hillen, 1996]. Bei tet(K) und tet(L) scheint die Expression durch translationelle Attenuation reguliert zu werden [Roberts, 1996; Schwarz et al., 1992]. In Untersuchungen, ob Glycylcycline Aktivität gegen Organismen mit Efflux-Pumpen besitzen, konnte gezeigt werden, dass alle bisher daraufhin untersuchten Glycylcycline einschließlich Tigecyclin aktiv sind gegen E. coli-Stämme mit den Efflux-Systemen tet(A)-tet(D) und gegen Staphylococcus aureus mit dem EffluxSystem tet(K) [Petersen et al., 1999; Sum et al., 1994; Testa et al., 1993]. Für Pseudomonas aeruginosa [Dean et al., 2003] und Proteus mirabilis [Visalli et al., 2003] konnte jedoch festgestellt werden, dass sie von Natur aus bereits eine geringere Empfindlichkeit gegenüber dem Glycylcyclin Tigecyclin aufweisen. Diese leichte Resistenz ist auf deren Efflux-Systeme zurückzuführen, die nicht für ein Antibiotikum spezifisch sind, sondern den Efflux verschiedener Antibiotika bewirken [Dean et al., 2003; Visalli et al., 2003]. In Salmonella konnte außerdem eine Mutante isoliert werden, die aufgrund eines mutierten Efflux-Proteins eine geringere Empfindlichkeit gegenüber den Glycylcyclinen 9-N,N-dimethylglycylamido(DMG)-6demethyl-6-deoxytetracyclin (DMG-DMDOT) und DMG-MINO aufwies [Tuckman et al., 2000]. Für die Resistenzdeterminanten Tet(D) und Tet(B) wurde außerdem festgestellt, dass DMG-DMDOT in der Lage ist, TetR zu induzieren und eine Expression des jeweiligen Efflux-Proteins zu veranlassen [Orth et al., 1999; Someya et al., 1995]. Für TetR(B) wurde dies auch für Tigecyclin nachgewiesen [C. Krüger, persönliche Mitteilung]. Die Efflux-Pumpe TetA(B) selbst erkennt das Antibiotikum jedoch nicht als Substrat, so dass kein Efflux stattfindet [Someya et al., 1995]. 6 Einleitung 2.2.2 Ribosomale Schutzproteine Den zweiten, weiter Resistenzmechanismus verbreiteten, neben den aber weniger Effluxproteinen bilden gut die untersuchten ribosomalen Schutzproteine (RSP). Die Resistenz gegen Tetracyclin durch Schutz des Ribosoms stammt wahrscheinlich aus Gram-positiven Bakterien [Doyle et al., 1991; Sougakoff et al., 1987; Taylor et al., 1992] und hat sich durch horizontalen Gentransfer in Gram-positiven und Gramnegativen Organismen verbreitet [Salyers et al., 1990; Taylor, 1986]. Bisher sind 11 Klassen von RSP-Determinanten bekannt [Chopra & Roberts, 2001; IRoberts, 2004], von diesen sind Tet(M) [Burdett, 1993; Burdett, 1996] und Tet(O) am besten charakterisiert [Taylor & Courvalin, 1988; Taylor et al., 1998; Connell et al., 2003]. Als erste Resistenzdeterminante gegen Tetracyclin, welche nicht auf Efflux des Antibiotikums beruht, wurde Tet(M) aus Staphylococcus identifiziert [Burdett et al., 1982; Burdett, 1986; Burdett, 1991; Martin et al., 1986]. Wenig später wurde in Campylobacter jejuni Tet(O) charakterisiert [Manavathu et al., 1988; Manavathu et al., 1990; Taylor et al., 1987]. Alle RSP weisen untereinander hohe Ähnlichkeit auf, welche sich besonders auf den aminoterminalen Bereich bezieht. Die meisten RSP zeigen hier eine Ähnlichkeit von 60% [Ridenhour et al., 1996]. Die Aminosäuresequenzen von TetO und TetM sind zu 76% ähnlich [Manavathu et al., 1988]. Das aminoterminale Ende der beiden Proteine, welches aus 150 AS besteht und die GTP-bindende Domäne enthält, weist sogar eine Sequenzidentität von 81,3 % auf [Manavathu et al., 1988]. Beide Resistenzdeterminanten sind in Gram-positiven und Gram-negativen Organismen zu finden, wobei Tet(O) hauptsächlich in den Gram-negativen Bakterien Campylobacter jejuni und Campylobacter coli zu finden ist [Taylor & Chau, 1996]. Allen RSP gemeinsam ist eine signifikante Sequenzähnlichkeit mit den Elongationsfaktoren EF-G und teilweise EF-Tu [Sanchez-Pescador et al., 1988; Trieber et al., 1998], von denen sie sich möglicherweise evolutionär ableiten [Connell et al., 2003]. Während sich die Ähnlichkeit der RSP mit EF-Tu nur auf die GTPbindende Domäne bezieht [Trieber et al., 1998], beläuft sich die Sequenzähnlichkeit von TetM und TetO mit EF-G auf 51% [Spahn et al., 2001]. Es wurde jedoch gezeigt, dass zumindest TetM nicht als alternativer Elongationsfaktor dienen kann [Burdett, 1991; Burdett, 1996]. Die größte Ähnlichkeit mit den Elongationsfaktoren auf der 7 Einleitung Ebene der Aminosäuresequenz hat das RSP OtrA aus Streptomyces rimosus, dem Produzenten von Oxytetracyclin [Chopra & Roberts, 2001; Doyle et al., 1991]. RSP vermitteln Resistenz gegenüber Tetracyclin, Doxycyclin und Minocyclin durch Freisetzung des Antibiotikums aus der Bindestelle am Ribosom [Connell et al., 2003]. Ebenso wie die Elongationsfaktoren sind die RSP G-Proteine, deren Funktion von der Hydrolyse von GTP zu GDP und anorganischem Phosphat abhängig ist [Burdett, 1996; Taylor et al., 1995; Trieber et al., 1998]. Ob die aus diesem Prozess gewonnene Energie dazu benötigt wird, des Antibiotikum aus der Bindestelle freizusetzen, oder ob sie vom RSP benötigt wird, um das Ribosom wieder zu verlassen, ist noch nicht geklärt [Burdett, 1996; Trieber et al., 1998]. Auch die Bindestelle der RSP am Ribosom stimmt größtenteils mit derjenigen von EF-G überein [Dantley et al., 1998; Spahn et al., 2001; Trieber et al., 1998]. Im Folgenden soll das RSP TetO und dessen Resistenzmechanismus genauer vorgestellt werden, da dieses Protein in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Das ribosomale Schutzprotein TetO besteht aus 639 AS und besitzt ein Molekulargewicht von 72,3 kDa [Sougakoff et al., 1987; Taylor et al., 1987; Taylor & Chau, 1996]. Die in dieser Arbeit untersuchte Resistenzdeterminante stammt aus dem Gram-negativen Bakterium Campylobacter jejuni [Manavathu et al., 1988]. Die durch TetO vermittelte Resistenz gegen Tetracyclin äußert sich in der Freisetzung des Antibiotikums aus dessen Bindestelle [Spahn et al., 2001] bei gleichzeitiger Verhinderung der erneuten Bindung von Tetracyclin durch Induktion einer entsprechenden Konformationsänderung im Ribosom [Connell et al., 2002]. Es werden zwei Mechanismen diskutiert, durch welche TetO ein durch Tetracyclin blockiertes Ribosom von einem translatierenden unterscheidet: Zum einen scheint ein durch Tetracyclin blockiertes Ribosom mit unbesetzter Aminoacyl-tRNABindestelle ein bevorzugtes Substrat für TetO zu sein [Connell & Trieber et al., 2003]. Zum anderen kann TetO möglicherweise die durch Tetracyclin hervorgerufene Konformationsänderung des Ribosoms erkennen [Connell & Trieber et al., 2003]. Gegen die zweite Hypothese spricht jedoch, dass die An- oder Abwesenheit von Tetracyclin keinen Effekt auf die Bindung von TetM an das Ribosom hat [Dantley et al., 1998]. Im normalen Translationszyklus bindet der ternäre Komplex aus EF-Tu, AminoacyltRNA (aa-tRNA) und GTP an das Ribosom. Nach der Hydrolyse von GTP zu GDP und anorganischem Phosphat befindet sich das Ribosom im Prätranslokations8 Einleitung Stadium mit gebundener aa-tRNA und Peptidyl-tRNA in den entsprechenden Bindestellen des Ribosoms. Es bildet sich spontan die Peptidbindung zwischen der an der Peptidyl-tRNA hängenden Polypeptidkette und der Aminosäure der aa-tRNA. Anschließend bindet EF-G mit GTP am Ribosom und bewirkt die Translokation unter Hydrolyse von GTP. Bei einer Blockade des Translationszyklusses durch Tetracyclin bindet das Antibiotikum an seiner Bindestelle in der 30S UE und blockiert die aa-tRNABindestelle des Ribosoms. Der ternäre Komplex aus EF-Tu, aa-tRNA und GTP bindet an das Ribosom, eine Hydrolyse von GTP findet statt, jedoch erfolgt keine Bindung der aa-tRNA an der aa-tRNA-Bindestelle und die Proteinsynthese wird nicht fortgesetzt. Ist eine Resistenz durch TetO gegeben, bindet das Protein an der Bindestelle von EF-G an das Ribosom und induziert eine Konformationsänderung. Dadurch wird Tetracyclin freigesetzt und der Translationszyklus kann mit der Bindung des ternären Komplexes aus EF-Tu, aa-tRNA und GTP wieder aufgenommen werden (Abb.2.4) [Spahn et al., 2001]. 9 Einleitung e k j d c i f h g Legende: TetO Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) EF-Tu Peptidyl-tRNA EF-G Deacylierte tRNA Tetracyclin Ribosom: Aminoacyl-tRNA-Bindestelle Peptidyl-tRNA-Bindestelle Exit-Stelle 50S UE 30S UE Abb. 2.4 Modell der durch TetO vermittelten Tetracyclinresistenz im Translationszyklus [in Anlehnung an Spahn et al., 2001] Normaler Translationszyklus ohne Tetracyclin (c-g): c Ribosom mit gebundener Peptidyl-tRNA und deacylierter tRNA d EF-Tu-aa-tRNA-GTP bindet Ribosom e aa-tRNA wird unter Hydrolyse von GTP an das Ribosom gebunden f Bildung der Peptidbindung g EF-G-GTP bindet Ribosom und bewirkt Translokation unter Hydrolyse von GTP Blockade des Translationszyklusses durch Tetracyclin (h + i): h Tetracyclin bindet an Bindestelle in 30S UE und blockiert A-Site des Ribosoms i EF-Tu-aa-tRNAGTP bindet an das Ribosom, Hydrolyse von GTP, keine Bindung der aa-tRNA Freisetzung von Tetracyclin vom Ribosom durch Translationszyklus (j+k) 10 TetO und Rückkehr zum normalen Einleitung Analog zu den Elongationsfaktoren wird der Proteinkörper von TetO in fünf Domänen unterteilt: Die Domäne G bindet GTP und interagiert mit der 50S UE des Ribosoms, die Domänen I-V interagieren mit der 30S UE [Spahn et al., 2001]. PeptidyltRNA 30S UE EF-G a TetO b TetO c Abb. 2.5 Kryo-Elektronenmikroskop-Strukturaufnahmen von EF-G und TetO bei Bindung an die 30S UE des Ribosoms a 30S UE mit gebundenem EF-G; b 30S UE mit gebundenem TetO und Peptidyl-tRNA; c Ausschnitt der 30S UE im Bändermodelll mit gebundenem TetO, Domänen von TetO sind mit weißen Buchstaben gekennzeichnet. Domäne I ist in Darstellung c verdeckt, mit G und G' ist die GTP-bindende Domäne bezeichnet. Hier wird die Position der Domäne IV relativ zur primären Tetracyclin-Bindestelle verdeutlicht. Farbliche Markierungen des Bändermodells: gelb, Helix 18; hellblau, Helix 31; pink Helix 34; blau, Protein S12; grün, Tetracyclin [aus: Spahn et al., 2001] Wie oben schon erwähnt, bindet TetO an die gleiche Bindestelle wie EF-G an das Ribosom (Abb. 2.5 a+b). Der signifikante Unterschied von EF-G und TetO zeigt sich dabei in der Position der Domäne IV: Für EF-G wurde bereits gezeigt, dass die Domäne IV weit in die Aminoacyl-tRNA-Bindestelle des Ribosoms ragt, und ihre Spitze mit der gebundenen tRNA überlappt [Agrawal et al., 1998; Agrawal et al., 1999]. Bei TetO ragt diese Domäne nicht so weit in die Aminoacyl-tRNA-Bindestelle [Spahn et al., 2001]. Im Gegensatz zu EF-G nähert sich die Spitze der Domäne IV von TetO der primären Tetracyclin-Bindestelle (Abb. 2.5 c) [Brodersen et al., 2000; Spahn et al., 2001]. Es ist daher wahrscheinlich, dass der funktionelle Unterschied von TetO und EF-G, nämlich im einen Fall die Vermittlung der Tetracyclinresistenz, im anderen Fall die Vermittlung der Translokation, auf der Orientierung der Domäne IV bei der Bindung an das Ribosom beruht [Connell et al., 2003; Spahn et al., 2001]. Aus der veränderten Lage der Domäne IV bei TetO resultiert außerdem auch eine kleine Veränderung der Lage der Domäne V [Spahn et al., 2001]. Dass die RSP die gleiche Bindestelle wie EF-G besetzten, hat noch unter einem anderen Gesichtspunkt Relevanz. Für TetM wurde gezeigt, dass das Protein eine 11 Einleitung höhere Affinität zum Ribosom besitzt, als EF-G [Dantley et al., 1998]. Aufgrund dieser Tatsache bewirkt eine hohe Konzentration dieser Proteine in der Zelle eine Blockade der Translation [Burdett, 1996; Dantley et al., 1998; Wang & Taylor, 1991]. Es ist daher notwendig und sinnvoll, dass die Expression reguliert erfolgt, damit Zellen ohne Anwesenheit von Tetracyclin nicht im Wachstum beeinträchtigt werden. Für tetM wurde eine Regulation der Expression bereits nachgewiesen [Su et al., 1992]. Im stromaufwärts liegenden Bereich vor tetM konnten palindromische Sequenzen (inverted repeats) identifiziert werden [Martin et al., 1986, Su et al., 1992], welche in Anwesenheit von Tetracyclin die Expression von TetM durch transkriptionelle Attenuation regulieren [Su et al., 1992]. Durch einen Vergleich der stromaufwärts liegenden Sequenzen der Leserahmen von tetO und tetM konnte gezeigt werden, dass diese Bereiche eine noch höhere Ähnlichkeit aufweisen, als die Leserahmen selbst [Taylor, 1986; Wang & Taylor, 1991]. Außerdem wurde bisher gezeigt, dass außer dem Promotor der Bereich stromaufwärts vor tetO für die Expression der Tetracyclinresistenz in E. coli unbedingt erforderlich ist [Wang & Taylor, 1991]. Wie die Expression von TetO reguliert wird, ist jedoch noch nicht bekannt. Das bisher am meisten auf Resistenz gegen Glycylcycline untersuchte RSP ist TetM. In E. coli, Enterococcus faecium und Staphylococcus aureus wurde gezeigt, dass es keine Resistenz gegen die bisher daraufhin untersuchten Glycylcycline vermittelt [Bergeron et al., 1996; Testa et al., 1993]. Auch gegen das neueste Glycylcyclin Tigecyclin wird durch TetM keine Resistenz vermittelt [Petersen et al., 1999; Sum et al., 1994]. TetO wurde bisher ebenfalls auf eine Wirksamkeit gegen die Glycylcycline DMG-DMDOT, DMG–doxycyclin und Tigecyclin untersucht, es konnte jedoch auch hier keine Resistenz festgestellt werden [Bergeron et al., 1996; G. Bauer, nicht publizierte Daten]. 12 Einleitung 2.3 Zielsetzung Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Projekte: Das erste Projekt beschäftigte sich mit dem Resistenzmechanismus des ribosomalen Schutzproteins TetO, von welchem bisher noch keine Mutante bekannt ist, die eine Resistenz gegen Glycylcycline vermittelt [Bergeron et al., 1996]. Dem Projekt lag die Annahme zugrunde, dass die Resistenzvermittlung gegen Tetracyclin maßgeblich von der Domäne IV des Proteins abhängt [Spahn et al., 2001]. In diesem Teil der Arbeit sollte gezeigt werden, ob es möglich ist, durch Mutagenese des TetO-Proteins in Domäne IV eine Mutante zu finden, die E. coli Resistenz gegenüber dem dieser Arbeit verwendeten Glycylcyclin Tigecyclin vermittelt [Petersen et al., 1999]. Das zweite Projekt beschäftigte sich mit der Regulation der Expression von TetO. Es wurde bereits für den Bereich stromaufwärts des Leserahmens des ribosomalen Schutzproteins TetM gezeigt, dass dieser die Expression von TetM in Gegenwart von Tetracyclin durch Attenuation reguliert [Su et al., 1992]. Da die stromaufwärts-Sequenzen vor tetO und tetM eine hohe Ähnlichkeit aufweisen [Wang & Taylor, 1991], sollte in diesem Teil der Arbeit geprüft werden, ob auch die Expression von TetO durch die Anwesenheit von Tetracyclin im Medium reguliert wird. Im Falle einer möglichen Regulation sollte dieser Effekt auf einen kleineren Bereich der Sequenz eingeengt werden. 13 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien Häufig verwendete Chemikalien sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Weitere Chemikalien in p.a. Qualität wurden von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma (München) bezogen. Chemikalie Bezugsquelle Adenosintriphosphat (ATP) Roche, Mannheim Agar Oxoid, England Agarose Merck, Darmstadt Ampicillin Roth, Karlsruhe Bromphenolblau Roth, Karlsruhe Calciumchlorid (CaCl2) Roth, Karlsruhe Chloroform Merck, Darmstadt Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) peqLab, Erlangen Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth, Karlsruhe Erythromycin Sigma, USA Essigsäure Roth, Karlsruhe Ethanol Merck, Darmstadt Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe Formamid, deionisiert Sigma, USA Glaswolle Serva, Heidelberg Glyzerin Merck, Darmstadt Hefeextrakt Oxoid, England Isopropanol Merck, Darmstadt Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid (IPTG) peqLab, Erlangen Kaliumchlorid (KCl) Roth, Karlsruhe Kanamycin Sigma, USA Magnesiumchlorid (MgCl2) Roth, Karlsruhe Manganchlorid (MnCl2) Sigma, USA ß-Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe MOPS Roth, Karlsruhe Natriumacetat (NaAc) Roth, Karlsruhe 14 Material und Methoden Natriumcarbonat (Na2CO3) Roth, Karlsruhe Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Roth, Karlsruhe Natriumhydroxid (NaOH) Roth, Karlsruhe o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG) AppliChem, Darmstadt Polyethlenglycol (PEG) 6000 bzw. 4000 Roth, Karlsruhe Tetracyclin Sigma, USA Tigecyclin Wyeth Research, USA Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Roth, Karlsruhe Trypton Oxoid, England Xylencyanol Fluka, Buchs 3.1.2 Verbrauchsmittel Verbrauchsmittel Bezugsquelle Äkta-Röhrchen Schott Duran, Jena Cellstar PP-Röhrchen (15 ml und 50 ml) Greiner, Nürtingen Elektroporationsküvetten 2mm EquiBio, England TM Einmal-Küvetten Ultravette mikro Greiner, Nürtingen Eppendorf Reaktionsgefäße (2 ml; 1,5 ml) Eppendorf, Hamburg Filterpapier Whatman, England Kryoröhrchen (2 ml) Nalge Nunc, Dänemark Kunststoffpipettenspitzen Greiner, Nürtingen Kunststoffspritzen Braun, Melsungen PCR-Reaktionsgefäße Perkin Elmer, USA Petrischalen Greiner, Nürtingen Reagenzgläser Schott Duran, Jena Sterilfilter (0,2 und 0,45 µm Porengröße) Schleicher und Schüll, Dassel UV-Küvetten Brand, Wertheim 3.1.3 Geräte Gerät Bezugsquelle Autoklav Deutsch und Neumann Biofuge A centrifuge Heraeus Christ, Osterode Biofuge fresco Heraeus Christ, Osterode Centrifuge J21B Beckmann, München 15 Material und Methoden Feinwaage Sartorius analytic Sartorius, Göttingen Gelelektrophoreseapparaturen FAU, Erlangen-Nürnberg Glaspipetten Brand, Wertheim Heizblock Dri Block DB3 Techne, England Kühlzentrifuge Avanti_ J-25 Beckman, München Magnet-Heizrührer IKA Labortechnik, Staufen Minifuge RF Heraeus Christ, Osterode pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin Rotationsschüttler G-25 New Brunswick, Neu-Isenburg Sequenzierer ABI Prism 310 Genetic Analyzer Perkin Elmer, Weiterstadt Spannungsnetzgerät TN 300-120 Heinzinger, Rosenheim Speed-Vac Zentrifuge Bachofer, Reutlingen Spektralphotometer Novaspec II Pharmacia, Freiburg Thermocycler Gene Amp PCR-System 2400 Perkin Elmer,Weiterstadt UV-Schirm 245 nm, 366 nm Vetter, Wiesloch Videokamerasystem Geldoc 2000 Biorad, München Wasservollentsalzungsanlage Millipore, Frankreich Vortexer IKA Labortechnik, Staufen 3.1.4 Kommerzielle Reagenziensätze, Standards System Bezugsquelle Anwendung DNA-Leitermix peqLab, Erlangen Bestimmung des Molekulargewichts von DNAFragmenten in Agarosegelen MassRuler TM MBI-Fermentas, St.- Bestimmung der DNA-Menge Leon-Rot in Agarosegelen Nucleobond AX 100 Macherey-Nagel, Düren Plasmidpräparation NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel, Düren Plasmidpräparation NucleoSpin Extract Macherey-Nagel, Düren DNA-Elution aus Agarosegelen und Aufreinigung von PCR-Produkten puReTaq™Ready-To-Go™ PCR beads Amersham, USA 16 PCR Material und Methoden Puffer für Restriktionsendonucleasen und modifizierende Enzyme Terminations-Mix New England Biolabs, Verdau und Modifikation von Frankfurt am Main DNA Perkin-Elmer, Weiterstadt DNA-Sequenzierung 3.1.5 Enzyme, Proteine Protein/Enzym Referenz BSA (Bovine serum albumin) Sigma, München Pwo-DNA-Polymerase peqlLab, Erlangen Restriktionsendonukleasen New England Biolabs, Frankfurt am Main Shrimp alkalische Phosphatase Roche, Mannheim Taq-DNA-Polymerase Pharmacia, Freiburg T4-DNA-Ligase New England Biolabs, Frankfurt am Main Roche, Mannheim 3.1.6 Oligonukleotide Die im folgenden aufgeführten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech, Ebersberg bezogen und nach Angaben des Herstellers in H2OMillipore gelöst. Oligoukleotid Sequenz (5' → 3') Verwendungszweck TetO_NdeI_f TGA AAA TAA TTA ACT Sequenzierung von tetO TAG GCA TTC TetO_BamHI_r TetO_XhoI_f TetO_XhoI_r CGG GAT CCC TAA CTT Amplifikation des DIV- GTG AAC ATA TGC CG kodierenden Bereichs von tetO GCC ATC CTC GAG GAA Amplifikation des DIV- AAA TAT C kodierenden Bereichs von tetO GAT ATT TTT CCT CGA Sequenzierung von tetO GGA TGG C TetO_XbaI_f GCT CTA GAA ATA AGA Amplifikation des nicht DIV- AGG AGA TAC ATA TGA kodierenden Bereichs von tetO AAA TAA TTA ACT TAG GCA TCC 17 Material und Methoden TetO_XhoI_BamHI_r TetO_Seq1_r CGG GAT CCG ATA TTT Amplifikation des DIV- TTC CTC GAG GAT GGC kodierenden Bereichs von tetO GGA GCA TCA TGA TAC Sequenzierung von tetO GCC CG TetO_Seq2_f GCA GGG GCT GTA Sequenzierung von tetO TGG ATG G TetO_Seq3_r CGT TGA TGA ATA AAA Sequenzierung von tetO TTT ACT GG TetO_Seq4_r GGG TCT GTG CCT GTA Sequenzierung von tetO TGC C pUC18_EcoRI_f CGA CTC TAG AGG ATC Amplifikation des tetO- CCC stromaufwärts-Bereichs aus pAT51 LacZ_EcoRI_r LacZ_EcoRI_rneu tetOup_100 CGA ATT CCC TTT CAT Amplifikation des tetO- GTA ATT TTC CTC CTA stromaufwärts-Bereichs aus TC pAT51 CGA ATT CCC TTT CAT Amplifikation von Teilen des GTG ATT TTC TTC CTA tetO-stromaufwärts-Bereichs TC aus pAT51 CGG GAT CCG TGT TTT Amplifikation der letzten 100 bp GGG GCT ATT GG des tetO-stromaufwärtsBereichs aus pAT51 tetOup_200 CGG GAT CCG AAC AAA Amplifikation der letzten 200 bp AAG TAG CAG TCC des tetO-stromaufwärtsBereichs aus pAT51 tetOup_300 CGG GAT CCC TTG ACA Amplifikation der letzten 300 bp AAT AAA GGG TTA AG des tetO-stromaufwärtsBereichs aus pAT51 tetOup_400 CGG GAT CCG TAA AAC Amplifikation der letzten 400 bp TTG GAA ATT ATT TTT G des tetO-stromaufwärtsBereichs aus pAT51 tetOup_500 CGG GAT CCC AAA TTT Amplifikation der letzten 500 bp CAA AGG AAG ACT TG des tetO-stromaufwärtsBereichs aus pAT51 18 Material und Methoden tetOup_1000 Pbla_lacZ_EcoRI CGG GAT CCC TAA TAA Amplifikation der letzten 1000 ATG ATT ATA TTA AAT bp des tetO-stromaufwärts- TAA G Bereichs aus pAT51 CTG AAT TCC CTT TCA Amplifikation des bla- TAC TCT TCC TTT TTC Promotors aus pBR322 AAT ATT Pbla_BamHI_r tetO_PacI_f CGG GAT CCC CGC ATT Amplifikation des bla- AAA GCT TAT CG Promotors aus pBR322 GCT ATG AAA CAA ATA Amplifikation des 700bp- ATT TAA TTA A Fragments mit PEco des tetOstromaufwärts-Bereichs tetO_PEco_r tetO_PCje_f GGG CAT AAA AAT ACC Amplifikation des 700bp- CAG TGC TAA TTA TAT Fragments mit PEco des tetO- TCC TTA ACC C stromaufwärts-Bereichs GGG TTA AGG AAT ATA Amplifikation des 300bp- ATT AGC ACT GGG TAT Fragments mit PCje- TTT TAT GCC C Transkriptiosstart des tetOstromaufwärts-Bereichs tetO_Bsu36I_r GTG CAT CTG CCA GTT Amplifikation des 300bp- TGA G Fragments mit PCjeTranskriptiosstart des tetOstromaufwärts-Bereichs 3.2 Bakterienstämme Bakterienstamm Relevante Eigenschaften Referenz E. coli DH5α recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rk-, mk+); Sambrook et al. relA1, supE44, Φ80∆lacZ∆M15, ∆ (lacZYA- (1989) argF)U169 E. coli BL21(DE3) hsdS, gal (λcIts857, ind1, Sam7, nin5, Sambrook et al. lacUV5-T7 gene 1) (1989) 19 Material und Methoden 3.3 Verwendete und konstruierte Plasmide Plasmid pAT51 Relevante Eigenschaften ErR, Tra-, Mob+, lacZα+ oriR pUC, oriR Referenz Trieu-Cuot et al. (1991), pAMβ1, MCS pUC18 Sougakoff et al. (1987) pUC18-Derivat, enthält 4 kb-EcoRIFragment aus pAT221(tetO mit dazugehörigem 5’-nichtkodierenden Bereich) in pUC18 MCS pBR322 ApR, TcR Bolivar et al. (1977) pCB302b ApR, lacZ, galK Schneider & Beck (1987) pET3c pBR322-Derivat, T7 gene 10 promoter Rosenberg et al. (1987) (Pf10),T7 gene 10 translation start (S10), T7 transcription terminator, oriR pMB1 pMSTetOHN10 pBR322-Derivat, TetO Überexpression, Connel & Trieber et al. lacR (2003) pWH230 pWH510_lacJq_Ptac_tetO Gesine Bauer pWH946 pET3c_tetO, enthält tetO-Leserahmen mit Kap.4.1.2 XhoI-Schnittstelle 5’ von Domäne IVkodierender Region pWH947 pCB302b_tetOup , enthält 5’- Kap. 4.2.2 nichtkodierenden Bereich von tetO vor lacZ pWH947100 , pCB302b_tetOup-Derivate 100- 500 und pWH947200 , 1000, enthalten Abschnitte des 5’- pWH947300 , nichtkodierenden Bereichs von tetO vor pWH947400 , lacZ Kap. 4.2.5 pWH947500 , pWH9471000 pWH947∆200 pCB302b_tetOup-Derivat mit 5’- Kap. 4.2.6 nichtkodierendem Bereich von tetO vor lacZ, ∆200 bp -10-Region PEco Transskriptionsstart PCje pWH948 pCb302b_Pbla, enthält Promotor des βLactam-Antibiotikaresistenzgens vor lacZ 20 Kap. 4.2.3 Material und Methoden 3.4 Medien und Puffer 3.4.1 Bakteriennährmedien Bakterienmedien wurden mit VE-Wasser (voll entsalzt; Hausanlage) angesetzt und im Dampfkochtopf für 20 min bei 120°C, 2 bar autoklaviert. LB (Luria-Bertani) Medium: 1 % (w/v) Trypton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) NaCl SB (Super Broth) Medium : 3 % (w/v) Trypton 2 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) MOPS → mit NaOH auf pH 7 eingestellt Fakultative Zusätze Dem Grundmedium wurde bei der Herstellung von Festmedium vor dem Autoklavieren 1,5 % (w/v) Agar zugesetzt. Hitzelabile fakultative Zusätze wurden Flüssigmedien nach Erkalten, Festmedien nach Abkühlen auf etwa 50°C zugegeben. IPTG : Endkonzentration 0,1 mM ; wurde für eine 1000 fach konzentrierte Stammlösung H2OMillipore gelöst Antibiotika: Antibiotika wurden in 1000fach konzentrierten Stammlösung angesetzt und bei -20°C gelagert. Ampicillin und Tetracyclin wurden in 70% Ethanol gelöst. Erythromycin und Kanamycin wurden in Wasser aufgenommen und anschließend mit Sterilfiltern der Porengröße 0,2 µm sterilfiltriert. Die Antibiotika wurden in folgenden Endkonzentrationen verwendet: Ampicillin 100 µg/ml Erythromycin 150 µg/ml Kanamycin 30 µgml Tetracyclin verschiedene Konzentrationen in µg/ml Tigecyclin verschiedene Konzentrationen in µg/ml Tetracyclin- und Tigecyclinlösungen wurden immer frisch angesetzt und nie länger als einen Tag aufbewahrt, da diese Antibiotika sehr licht- und wärmeempfindlich sind. 21 Material und Methoden 3.4.2 Lösungen, Puffer und Standards CaCl2-kompetente E. coli : 0,1 M CaCl2 gelöst in H2OMillipore, autoklaviert DNA-Gelektrophorese : DNA-Farbmarker: 0,05 % (w/v) Bromphenolblau 0,05 % (w/v) Xylencyanol 50 % (w/v) Glycerin 0,1 mM EDTA in 1 x TAE-Puffer 10 x TAE (1l) : 0,4 M Tris-Base 10 mM EDTA (pH 8,0) 11,4 ml Essigsäure Für analytische Gele wurde der Puffer mit H2OVE, für präparative Gele mit H2OMillipore angesetzt Agarose-Gel (0,8-3%): 0,8-3% (w/v) Agarose Lösungsmittel 1x TAE-Puffer (mit H2OVE für analytische Gele, mit H2OMillipore für präparative Gele) Größenstandards für die Gelelektrophorese: Zur Größenbestimmung doppelsträngiger DNA-Fragmente wurde bei Gelelektrophoresen ein Molekulargewichtsstandard aufgetragen. Damit konnte die Fragmentgröße der zu analysierenden DNA abgeschätzt werden. Massenstandard für Agarosegele (MassRulerTM) In jeder Bande ist eine definierte DNA Masse enthalten, anhand derer die Masse unbekannter DNA-Fragmente ungefähr abgeschätzt wurde. In 20 µl der StandardLösung sind folgende Fragmente in entsprechenden Mengen enthalten: 10000 bp / 8000 bp / 6000 bp / 5000 bp / 4000 bp / 3000 bp / 2500 bp / 2000 bp / 1500 bp / 1031 bp / 900 bp / 800 bp / 700 bp / 600 bp / 500 bp / 400 bp / 300 bp / 200 bp / 100 bp / 80 bp 200 ng / 150 ng / 120 ng / 100 ng / 80 ng / 60 ng / 50 ng / 40 ng / 32ng / 200 ng / 180 ng / 150 ng / 140 ng / 120 ng / 200 ng / 80 ng/ 60 ng / 40 ng/ 20 ng / 15 ng 22 Material und Methoden Molekulargewicht-Standard für Agarosegele (peQGOLD Leiter-Mix) 10000 bp / 8000 bp / 6000 bp / 5000 bp / 4000 bp / 3500 bp / 3000 bp / 2500 bp / 2000 bp / 1500 bp / 1200 bp / 1031 bp / 900 bp / 800 p / 700 bp / 600 bp / 500 bp / 400 bp / 300 bp / 200 bp / 100 bp Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität in E. coli: 5 x Z-Puffer: 60 mM Na2HPO4 40 mM NaH2PO4 10 mM KCl 1 mM MgCl2 50 mM β-Mercaptoethanol 1M Na2CO3: gelöst in H2OVE, autoklaviert ONPG-Lösung : 4 mg/ml ONPG in 1 x Z-Puffer 3.5 Molekularbiologische Methoden 3.5.1 Methoden mit Nukleinsäuren Isolierung von Plasmid-DNA Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte über kommerzielle AnionenaustauscherSäulchen. Für kleinere Mengen wurde das Kit NucleoSpin Plasmid verwendet. Die DNA wurde nach Vorschrift des Herstellers (Macherey & Nagel, 1998) gereinigt und mit je 50 µl NE-Puffer (Kit NucleoSpin Extract) vom Säulchen eluiert. Für größere Mengen wurde das Kit Nucleobond Ax100 verwendet. Die DNA wurde ebenfalls nach Angaben des Herstellers (Macherey & Nagel, 1998) gereinigt und nach der Elution von der Säule mit Isopropanol gefällt. Das Präzipitat wurde in 100µl H2OMillipore aufgenommen. Die DNA-Menge wurde hier jeweils durch spektralphotometrische Messung der Nucleinsäurekonzentration bestimmt. Ethanol-Fällung Die DNA-Fällung erfolgte durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaAc, pH 6,5 und 2-3 Volumen 99,8 %igem Ethanol. Nach 2h Inkubation bei –20 °C wurde die DNA durch Zentrifugation (1h; 13000 rpm; 4 °C) in der Tischkühlzentrifuge sedimentiert. Das 23 Material und Methoden Sediment wurde mit 70 %igem Ethanol gewaschen, 10 min in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet und in H2OMillipore aufgenommen. PEG-Fällung Die DNA-Fällung erfolgte durch Zugabe von 1/2 Volumen 30 %igem PEG in 1,5 M NaCl. Nach 1h Inkubation in Eiswasser wurde die DNA durch Zentrifugation (1h; 13000 rpm; 4 °C) in der Tischkühlzentrifuge sedimentiert. Das Sediment wurde mit 70 %igem und Ethanol gewaschen, 10 min in der Vakuum-Zentrifuge getrocknet und in H2OMillipore aufgenommen. DNA-Gelelektrophorese Zur Größen- und Konzentrationsabschätzung sowie zur präparativen Auftrennung von Nukleinsäuren wurden Gelelektrophoresen durchgeführt [Maniatis, 1982]. Für Agarosegele wurde eine Agarosekonzentration von 0,8 % - 3 % (w/v) Agarose in 1 x TAE verwendet. Als Laufpuffer diente 1 x TAE, die angelegte Spannung lag zwischen 70 (präparative Gele) und 150 Volt (analytische Gele). Die DNA-Lösungen wurden mit 1/5 Volumen DNA-Farbmarker versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Zur Detektion der Nucleinsäuren wurden die Gele 10-15 min im EthidiumbromidWasserbad (0,5 µg/ml) gefärbt, kurz im Wasserbad entfärbt und unter UV-Durchlicht (254 nm, kurzwelliges UV) kontrolliert und photographiert. Aus präparativen Gelen wurde die DNA zunächst unter UV-Durchlicht (366 nm, langwelliges UV) ausgeschnitten, anschließend wurde die Präparation unter UV-Durchlicht (254 nm, kurzwelliges UV) kontrolliert und fotografiert. Elution von DNA aus Agarosegelen Die Elution von DNA-Fragmenten wurde aus 0,8-3 %igen (w/v) Agarosegelen mittels NucleoSpin Extract (Macherey & Nagel, 1998) oder Glaswolle-Beads [Mülhardt, 1999] aus eigener Herstellung durchgeführt. Die gewünschte DNA-Bande wurde mit einem sterilen Skalpell unter möglichst kurzzeitiger UV-Bestrahlung (366 nm) aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß bzw. in GlaswolleBeads überführt. Die DNA-Elution über NucleoSpin Extract erfolgte entsprechend der Anleitung des Herstellers (Macherey & Nagel, 1998). Im letzten Schritt wurde die DNA mit 50 µl NE-Puffer vom Säulchen eluiert. Die DNA-Elution in Glaswolle-Beads erfolgte durch Zetrifugieren (10 min; 5000 rpm; RT). Mit der so erhaltenen, stark verdünnten DNA-Lösung wurde eine je nach Größe des zu eluierenden DNA24 Material und Methoden Fragments eine EtOH- bzw. PEG-Fällung durchgeführt. Das Sediment wurde in 3050 µl H2OMillipore aufgenommen. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden in 0,8 - 3 %igen Agarosegelen auf Konzentration und Reinheit überprüft. Direkte Aufreiniging von PCR-Produkten Die direkte Aufreinigung von PCR-Produkten aus dem PCR-Ansatz wurde mittels NucleoSpin Extract (Macherey & Nagel, 1998) entsprechend der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Im letzten Schritt wurde die DNA mit 25 µl NE-Puffer vom Säulchen eluiert. Sequenzierung von DNA Grundlage des angewendeten Verfahrens ist die Kettenabbruchreaktion nach Sanger [Sanger et al., 1977]. Als Terminatoren der Sequenzierreaktion dienten unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide, die als „Terminationsmix“ bezogen wurden. Die Durchführung der Sequenzierreaktion erfolgte leicht modifiziert nach den Empfehlungen des Herstellers (Perkin Elmer, USA). Analysiert wurden die Produkte der Sequenzierreaktion mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Restriktionsspaltung von DNA Die Restriktion von DNA mit Endonukleasen wurde in den vom Hersteller empfohlenen Puffersystemen durchgeführt. Die Menge an Enzym und die Inkubationsdauer richteten sich nach der eingesetzten DNA-Menge und der Anzahl der Schnittstellen im Plasmid. Das Gesamtvolumen des Restriktionsansatzes betrug mindestens das Zehnfache des Enzymvolumens. Die Inaktivierung der Enzyme wurde, falls möglich, nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Größe der erhaltenen DNA-Fragmente wurde in 0,8 – 3 %igen Agarosegelen kontrolliert oder erhaltene DNA-Fragmente aus 0,8 – 3 %igen Agarosegelen eluiert. Dephosphorylierung von 5´-DNA-Enden Um die Religation von linearisierten Vektoren mit kompatiblen Enden zu verhindern, wurden die Phosphatgruppen an deren 5’-Enden mit Shrimp alkalischer Phosphatase abgespalten. Die Durchführung erfolgte nach Anleitung des Herstellers. 25 Material und Methoden Ligation von DNA-Fragmenten DNA-Fragmente können mit Hilfe der T4-DNA-Ligase kovalent verknüpft werden, sofern die Enden kompatibel sind. In die Ligation wurden jeweils 50 - 100 ng (Mutantengemisch-Klonierung: 300 ng) Vektor mit Insert im molaren Verhältnis von 1:1 bis 1:6 eingesetzt. Die Ligationsansätze wurden nach Anleitung des Herstellers (New England Biolabs, Frankfurt am Main) pipettiert und 4 h bei 15°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase (Pwo, Taq für fehlerhafte PCR und wenn mit Pwo kein Produkt erhalten wurde) wird ein DNA-Fragment (Matrize) zwischen zwei Oligonukleotiden definierten, vervielfältigt. an Die Strang und Gegenstrang Reaktionsfolge besteht hybridisierenden aus wiederholter, hitzeinduzierter Trennung des DNA-Doppelstrangs, Oligonukleotid-Hybridisierung und zuletzt der DNA-Synthese. Je nach Oligonukleotid wurde eine entsprechende Hybridisierungstemperatur geschätzt. PCR-Ansatz: PCR-Lauf: 25 pmol 3’-Oligonukleotid 95 °C 5 min 25 pmol 5’-Oligonukleotid 95 °C 30 s 1x Pufferbedingungen verwendeter 45-56 °C 1 min 72 °C 1 min Polymerase entsprechend 100 ng Matrizen-DNA 25-35 Zyklen 4 °C 25 pmol dNTP’s 1U entsprechender Polymerase PCR-Analyse (Kolonie-PCR) Zur Identifizierung von positiven Kandidaten einer Ligation wurde die Methode der Kolonie-PCR eingesetzt. Hierzu wurden puReTaq™Ready-To-Go™ PCR beads verwendet. Als Template wurde direkt je eine Kolonie möglicherweise positiver Transformanden eingesetzt, welche mit einem sterilen Zahnstocher von der Platte gepickt, im Taq-Bead resuspendiert und entsprechenden Antibiotikum vereinzelt wird. 26 anschließend auf LB mit dem Material und Methoden PCR-Ansatz: 1 puReTaq™Ready-To-Go™ PCR bead 25 pmol 5’-Oligonukleotid des Inserts 25 pmol 3’-Oligonukleotid des Inserts ad 25 µl H2OMillipore 1 Bakterienkolonie Ö PCR-Programm entsprechend der Hybridisierungstemperatur der Oligonukleotide und der Länge des zu amplifizierenden Produkts Fehler-PCR nach Leung Um fehlerhafte PCR-Produkte für die Mutagenese der TetO-Domäne IV zu erhalten, wurde die modifizierte Fehler-PCR nach Leung [Leung et al. 1989] durchgeführt, wobei in vier verschiedenen Ansätzen je eines der vier Desoxynukleotide in limitierender Menge und Manganchlorid zur Erhöhung der Fehlerhäufigkeit der TaqPolymerase eingesetzt wurde. PCR-Ansatz: 120 ng ptetO (120ng/µl) 50 pmol TetO_XhoI_f 50 pmol TetO_BamHI_r 5 µl 10x Taq-Puffer 1 µl Taq-Polymerase 5 µl 5 mM MnCl2 5 µl dNTP-Mix* *dNTP-Mix: 3 dNTPs 10 mM ad 50 µl H2OMillipore 1 dNTP 2 mM Ö PCR-Programm entsprechend der Hybridisierungstemperatur der Oligonukleotide und der Länge des zu amplifizierenden Produkts 3.5.2 Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen Die Transformationen wurden mit Calciumchlorid-kompetenten E. coli DH5α bzw. E. coli BL21-Zellen durchgeführt. Hierfür wurden 500 ml LB-Medium mit 5 ml einer E. coli DH5α bzw. BL21 üN-Kultur beimpft, bei 37 °C unter Schütteln inkubiert und, sobald die Kultur eine oD600 von 0,4 aufwies, für 1 h auf Eis gehalten. Alle weiteren Schritte wurden auf Eiswasser durchgeführt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation sedimentiert (5 min; 5000 rpm; 4 °C) und mit 250 ml kaltem 0,1 M 27 Material und Methoden CaCl2 gewaschen und wiederum zentrifugiert. Anschließend wurden sie in 50 ml kaltem 0,1 M CaCl2 aufgenommen und mindestens 1 h auf Eis inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde auf 15 % Glycerin eingestellt und je 1 ml in EppendorfGefäße aliquotiert. Diese wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C gelagert. 3.5.3 Transformation CaCl2-kompetenter E. coli DH5α bzw. BL21 Die Transformation von E. coli DH5α wurde nach einer modifizierten Anleitung von Hanahan [Hanahan, 1985] durchgeführt. Zu 25 - 100 ng DNA (z. B. Ligationsansatz) wurden 200 µl kompetente Zellen gegeben und 1 h auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 90 s bei 42 °C hitzebehandelt, 10 min auf Eis abgekühlt und nach Zugabe von je 800 µl LB-Medium 1 h im Thermoschüttler bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 100 µl und der Rest der Suspension auf LB-Festmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. 3.5.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli DH5α Die in dieser Arbeit verwendeten elektrokompetenten E.coli DH5α wurden von Olga Danilchenko im Rahmen ihrer praktischen Tätigkeit am Lehrstul für Mikrobiologie hergestellt. Es wurde wie folgt vorgegangen: 10 ml SB-Medium wurde mit einer frisch vereinzelten Kolonie E. coli DH5α angeimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Aus der üNK wurden 2,5 ml in 500 ml SBMedium mit 10 ml 20% Glukose und 5 ml MgCl2 überimpft und für ca. 4h bei 37°C geschüttelt bis zu einer OD600 von ca. 0,7. Anschließend wurden die Zellen für 15 min auf Eis abgekühlt und 20 min bei 4000 rpm und 4°C in der Beckman-Zentrifuge sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen zweimal im halben Kulturvolumen eiskaltem 10%igen Glycerin durch Zentrifugieren bei 4000 rpm, 4°C für 20 min gewaschen. Der Überstand wurde jeweils verworfen und das Zellpellet nocheinmal in 25 ml 10%igem Glycerin gewaschen, in ein eiskaltes Cellstar PPRöhrchen überführt und für 15 min bei 3500 rpm und 4°C in der Heraeus-Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Pellet im Rückfluss resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen sofort auf je 200 µl in Eppendorf-Reaktionsgefäße aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt. Die Resuspendierungsschritte wurden jeweils auf Eis vorgenommen. 28 Material und Methoden 3.5.5 Elektroporation elektrokompetenter E.coli DH5α Zur Transformation des Gemischs von TetO-DIV-Mutanten wurde die Methode der Elektroporation gewählt, da diese erheblich höhere Transformationsraten zeigt als die Transformation CaCl2-kompetenter Zellen. Für die Transformation durch Elektroporation wurden die zu transformierenden Ligationsansätze zunächst mit PEG gefällt, um Salze und Enzyme aus der DNALösung zu entfernen. Anschließend wurde die DNA in je 10 µl H2OMillipore aufgenommen. Dieser Zwischenschritt hat sich als sinnvoll erwiesen, da die Erfahrung gemacht wurde, dass Ligase im Elektroporations-Ansatz die Aufnahme der DNA in die Zellen behindert (siehe Kap. 4.1.3). Zu 10 µl DNA-Lösung wurden 40 µl elektrokompetente E.coli DH5α gegeben und 30 s auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine eiskalte Elektroporationsküvette (2mm gap) überführt und durch leichtes Aufklopfen der Küvette gleichmäßig am Küvettenboden verteilt. Die Küvette wurde trockengerieben, um einen Kurzschluss an den Kontakten zu vermeiden. Die Elektroporation erfolgte bei 200Ω, 2,5 kV und 25 µF. Die Zeit des konstanten Stromflusses betrug hier immer zwischen 3,9 und 4,7 s. Nach der Elektroporation wurde die Küvette mit insgesamt 2 ml LBMedium (auf 37°C vorgewärmt) ausgespült und die erhaltene Zell-Suspension sofort für 45 min-1h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 50 und 100 µl auf LB mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. Mit dem Rest der Suspension wurden 20 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum als üNK angeimpft, die Plasmide wurden mit NucleoSpin Plasmid präpariert. Nach Auszählung wurden die ausplattierten Kandidaten mit je 2x 2ml LB-Medium von den Platten abgeschwemmt und die Plasmide ebenfalls mit NucleoSpin Plasmid präpariert. 3.5.6 Anzucht von Bakterien Zur Anzucht von Übertagkulturen (üTK) wurden Bakterien im gewünschten Volumen LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum bei 37°C auf dem Rotationschüttler bis zur erforderlichen Zelldichte inkubiert. Übernachtkulturen (üNK) wurden 10-16h inkubiert. 3.5.7 Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität in E.coli Zur Bestimmung des regulatorischen Effekts der tetO-stromaufwärts-Sequenz auf die Expression des nachfolgenden Gens in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen Tetracyclin wurde die β-Galaktosidaseaktivität nach der modifizierten Methode von 29 Material und Methoden Miller [Miller, 1972] gemessen. Das Enzym β-Galaktosidase katalysiert dabei die Umsetzung des farblosen Substrats o-Nitrophenyl-β-D-Galacto-Pyranosid (ONPG) zum gelben o-Nitrophenol. Die nach einer bestimmten Zeit detektierbare Gelbfärbung ist ein Maß für die β-Galaktosidase-Aktivität. Es wurde wie folgt vorgegangen: Pro Kandidat und Kontrollstamm wurden drei frisch vereinzelte Kolonien in je 4 ml LB-Medium mit den entsprechenden fakultativen Zusätzen (Antibiotika, IPTG) überimpft und über Nacht bei 37°C schütteln gelassen. Aus der Übernachtkultur wurden je 40 µl in 4 ml LB-Medium mit den entsprechenden fakultativen Zusätzen überimpft und bei 37°C bis zu einer optischen Dichte (oD) von ungefähr 0,4 schütteln gelassen. Bei Erreichen der gewünschten oD wurden die Kulturen für 30 min-2h auf 4°C abgekühlt. Anschließend wurde die oD jeder Kultur bei 600 nm gemessen und je 20-200 µl (= x) der Kultur aus der Küvette in ein Äkta-Glasröhrchen mit folgendem Ansatz gegeben: 200 µl 5x Z-Puffer 800 – x LB-Medium 2 Tropfen Chloroform Es wurden mehrere Röhrchen mit demselben Ansatz ohne Zellen als Blindwerte mitgeführt. Die Ansätze wurden kräftig gevortext und 30 min bei 28°C im Wasserbad inkubiert. Zum Starten der Reaktion wurde im 15s-Takt zu jeder Probe 200 µl frisch angesetzter ONPG-Lösung (4 mg/ml in 1x Z-Puffer) zugegeben und gevortext. Die Proben wurden weiter auf 28°C inkubiert, bis eine leichte Gelbfärbung der Lösung zu beobachten war. Zum Stoppen der Reaktion wurde im 15s-Takt zu jeder Probe 500 µl 1M Na2CO3-Lösung gegeben und gevortext. Zum Absetzen des Chloroforms wurden die Proben 20 min stehen gelassen. Anschließend wurde die Lösung ohne das Chloroform in eine Einmal-Küvette überführt und die Absorption bei 420 und 550 nm bestimmt. Die Blindwerte wurden hierbei als Referenz eingesetzt. Die Aktivitätseinheiten nach Miller wurden nach folgender Formel berechnet: 1U= oD420 – 1,75 x oD550 x 1000 oD600 x V x t dabei sind: oD420: Absorption von o-Nitrophenol V: Probenvolumen in ml oD550: Absorption der Zelltrümmer t: Reaktionszeit in min oD600: Zelldichte der Kultur 30 Material und Methoden 3.5.8 Anlegen einer Kryo-Kultur von E. coli Zum Anlegen einer Kryo-Kultur von E. coli in 10% DMSO wurden 4 ml einer üNK des entsprechenden Stammes mit 444 µl DMSO auf 10% DMSO eingestellt, in ein …..ml Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt. 3.5.9 Überstempeln von Bakterienkulturen durch die Samtkissenmethode Zur exakten Übertragung von Bakterienkolonien von einer LB-Platte auf eine neue Platte mit dem auf Resistenzgewinn/ -verlust zu prüfenden Antibiotikum wurde die bewachsene Platte kurz auf einen mit einem sterilen Samttuch bezogenen Bleiblock gedrückt, am Plattenrand zur Orientierung gekennzeichnet und aufbewahrt. Anschließend wurde die neue Platte ebenfalls leicht auf das Samtkissen gedrückt, am Plattenrand zur Orientierung gekennzeichnet und bei 37°C über Nacht inkubiert. Für jede neue Platte wurde das Samttuch gegen ein steriles gewechselt. 31 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1 Mutagenese der Domäne IV des ribosomalen Schutzproteins TetO 4.1.1 Strategie Das ribosomale Schutzprotein TetO vermittelt Tetracyclinresistenz, indem es ans Ribosom bindet und damit die Freisetzung von Tetracyclin (Tc) aus der TcBindetasche veranlasst [Connell et al., 2002]. Dieser Mechanismus vermittelt keine Resistenz gegenüber Glycylcyclinen und es ist bisher noch keine Mutante des Proteins bekannt, welche eine Resistenz gegen Glycylcycline vermittelt [Bergeron et al., 1996]. In diesem Projekt sollte überprüft werden, ob es möglich ist eine Mutante des Proteins zu finden, die E. coli eine Resistenz gegenüber dem Glycylcyclin Tigecyclin (TGC) verleiht [Petersen et al., 1999]. Dem Projekt liegt die Annahme zugrunde, dass die Resistenzvermittlung gegen Tetracyclin maßgeblich von der Domäne IV des Proteins abhängt [Spahn et al., 2001]. Die Domäne IV liegt bei Bindung von TetO ans Ribosom der Tc-Bindetasche am nächsten, wie Kristallstrukturaufnahmen zeigen [Spahn et al., 2001]. Es sollte ein System etabliert werden, in dem TetO kontrolliert exprimiert werden kann. Des Weiteren sollte das System die Möglichkeit bieten, gezielt die Domäne IV-kodierende Region von tetO (dIV) durch Klonierung auszutauschen, um diesen Bereich allein zu mutagenisieren und die so gewonnenen Mutanten auf TGCR-Gewinn oder TcRVerlust zu prüfen. Dies sollte durch Einführung einer zusätzlichen KlonierSchnittstelle als stille Mutation im 3’-Bereich von dIV erfolgen. Die in dIV eingeführten Mutationen sollten zufällig durch fehlerhafte PCR erfolgen. BamHI dIV bla fehlerhafte PCR XhoI pWH946 6500 bp tetO SD XbaI T7-Prom Abb. 4.1 Klonierungsvektor pWH946 Relevante Restriktionsschnittstellen und genetische Marker sind durch Striche, Gene durch Pfeile gekennzeichnet. Mit dIV ist der Bereich des tetO-Genes gekennzeichnet, der durch fehlerhafte PCR mutiert werden sollte. 32 Ergebnisse Der dIV-Bereich kodiert diskontinuierlich für die Domäne IV und für die Domäne V des TetO-Proteins. Eine Mutagenese dieses Bereichs führt also zu Mutationen in beiden Domänen. Als Klonierungsvektor für TetO wurde das Plasmid pET3c [Rosenberg et al., 1987] gewählt (Abb. 4.1). Hier sollte tetO unter Kontrolle des T7Promotors gestellt werden. Zur Expression des Proteins sollte E. coli BL21 mit dem mutagenisierten Plasmid transformiert werden. E. coli BL21 trägt die T7-Polymerase chromosomal codiert unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors, so dass die Expression von TetO in diesem Stamm durch IPTG induzierbar ist. 4.1.2 Konstruktion des TetO-Expressionssystems pWH946 Zur Gewinnung von pWH946 wurden zwei Klonierungs-Schritte durchgeführt (Abb. 4.3, Abb. 4.5) Im ersten Schritt erfolgte die Herstellung des Vektors durch Verdau von pET3c mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI und Elution des 4562 bp umfassenden Vektoranteils aus einem 0,8%igen Agarosegel (Abb. 4.2). Anschließend wurde der Vektor dephosphoryliert. Die XbaI-Restriktionsschnittstelle in pET3c liegt zwischen der -10 -Region des T7-Promotors und der Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz, so dass durch diesen Verdau die SD-Sequenz ausgeschnitten wurde. Mittels PCR mit dem Oligonukleotidpaar TetO_XhoI_BamHI_r und TetO_XbaI_f wurde der Bereich von tetO, welcher nicht mutagenisiert werden sollte, aus dem Plasmid pMSTetOHN10 [Connel & Trieber et al., 2003] amplifiziert, (Abb. 4.3). Hierbei wurde durch das Oligonukleotid TetO_XbaI_f die natürliche XbaI-Schnittstelle mit nachfolgender wiederhergestellter SD-Sequenz aus dem Vektor pET3c eingeführt. Durch das Oligonukleotid TetO_XhoI_BamHI_r wurde an der Grenze zur dIV-kodierenden Region durch die stille Mutation GAA → GAG (beide Kodons kodieren für die Aminosäure Glutaminsäure) eine XhoI-Schnittstelle eingebracht und eine BamHI-Schnittstelle angehängt, um das erste PCR-Produkt in die natürlichen Schnittstellen von XbaI und BamHI im Ausgangsvektor pET3c zu ligieren (Abb.4.3). Das 1200 bp umfassende erste PCR-Produkt wurde aus einem 1,5%igen Agarosegel eluiert, mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und danach mit PEG gefällt (Abb. 4.2). Vektor und Insert wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 ligiert, um das Hilfskonstrukt pET3c_PCR1 zu erhalten. 33 Ergebnisse 1 2 3 Abb. 4.2 Vektor und Insert für Klonierung des Hilfskonstruktes pET3c_PCR1 5000 4000 Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: Vektor pET3c xXbaI xBamHI (4562 bp) Spur 3: Insert PCR1 xXbaI xBamHI (1200 bp) 1200 E. coli DH5α wurde mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert, wobei ein Verhältnis von Transformanden zu Rückliganden von 1:1 erhalten wurde. Eine Kolonie-PCR von 16 Transformanden ergab 7 positive Kandidaten, von denen 2 Kandidaten für einen Probeverdau mit den Restriktionsenzymen BamHI, NdeI, XbaI und XhoI ausgewählt wurden. Die Kandidaten zeigten das erwartete Spaltmuster, so dass einer von ihnen als Vektor für den zweiten Klonierungsschritt eingesetzt wurde. tetO BamHI ptet(O) XbaI T7-Prom TetO_XbaI_f TetO_XhoI_BamHI_r PCR pET3c T7-Prom 4638 bp XbaI SD XhoI BamHI PCR1 x XbaI x BamHI x XbaI x BamHI BamHI Dephosphorylierung Ligation Abb. 4.3 Klonierung des Hilfskonstruktes pET3c_PCR1 Der nicht zu mutiernde Teil von tetO wurde mittels PCR amplifiziert. Über die Oligonukleotide TetO_XhoI_BamHI_r und TetO_XbaI_f wurden die Schnittstellen XbaI, XhoI und BamHI und die im Vektor ausgeschnittene SD-Sequenz eingeführt. Das verdaute PCR-Fragment wurde in den mit XbaI und BamHI restringierten Vektor pET3c ligiert. 34 Ap XhoI PCR1 NdeI pET3c_PCR1 5800 bp SD XbaI T7-Prom Ergebnisse Das Hilfskonstrukt pET3c_PCR1 wurde nacheinander mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI verdaut, um eine gegenseitige Behinderung der Enzyme auszuschließen, da die Schnittstellen der beiden Enzyme nur 16 Nukleotide auseinander liegen. Der 5800 bp umfassende Vektoranteil wurde aus einem 0,8%igen Agarosegel eluiert (Abb.4.4). Anschließend wurde der Vektor dephosphoryliert. Im zweiten Schritt wurde mittels PCR mit dem Oligonukleotidpaar TetO_XhoI_f und TetO_BamHI_r der für die Domäne IV von tetO (dIV) kodierende Bereich aus pMSTetOHN10 amplifiziert (Abb. 4.5). Hierbei wurde durch das Oligonukleotid TetO_XhoI_f an der Grenze zu dIV analog zum ersten PCR-Produkt durch stille Mutation XhoI-Schnittstelle eine eingefügt. Durch das das Oligonukleotid TetO_BamHI_r wurde die am Ende des Leserahmens von tetO liegende natürliche BamHI-Schnittstelle eingeführt, um das zweite PCR-Produkt in das Hilfskonstrukt pET3c_PCR1 zu ligieren (Abb. 4.5). 1 6000 2 3 Abb. 4.4 Vektor und Insert für Klonierung des Klonierungsvektors pET3c_tetO Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: Vektor pET3c_PCR1 xXhoI xBamHI (5800 bp) 700 Spur 3: Insert PCR2 xXhoI xBamHI (700 bp) Das 700 bp umfassende zweite PCR-Produkt wurde aus einem 1,5%igen Agarosegel eluiert, mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut und danach mit PEG gefällt (Abb. 4.4). Vektor und Insert wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 ligiert, um den Expressionsvektor pET3c_tetO zu erhalten. E. coli DH5α wurde mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert, wobei ein Verhältnis von Transformanden zu Rückliganden von 8:1 erhalten wurde. Bei einer Kolonie-PCR von 16 Transformanden waren alle Kandidaten positiv. Drei Kandidaten wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die Sequenzierung ergab, dass alle drei Kandidaten im dIV-kodierenden Bereich bereits eine Punktmutation zeigen. Diese Mutation befindet sich bereits im Template pMSTetOHN10, wie durch Sequenzierung dieses Bereichs gezeigt wurde. Es handelt sich um den Basenaustausch ACC → AAC, die sich in einem Aminosäureaustausch Threonin gegen Asparagin auswirkt. Einer der 35 Ergebnisse sequenzierten Kandidaten wurde ausgewählt und pWH946 genannt. Das erhaltene Konstrukt enthält tetO unter der Kontrolle des T7-Promotors, eine Resistenzdeterminante gegen das Antibiotikum Ampicillin und eine zusätzliche Klonierungsschnittstelle (XhoI) innerhalb von tetO. BamHI XhoI tetO bla pMSTetOHN10 PCR1 pET3c_PCR1 5800 bp TetO_XhoI_f SD TetO_ BamHI_r XbaI PCR T7-Prom XhoI BamHI PCR2 = dIV x XhoI x BamHI x XhoI x BamHI Dephosphorylierung Ligation BamHI dIV bla XhoI pWH946 (pET3c_tetO) tetO 6500 bp SD XbaI T7-Prom Abb. 4.5 Klonierung des Klonierungsvektors pWH946 (pET3c_tetO) Der dVI-kodierende Bereich von tetO wurde mittels PCR amplifiziert. Über die Oligonukleotide TetO_XhoI_f und TetO_BamHI_r wurden die Schnittstellen XhoI und BamHI eingeführt. Das verdaute PCR-Fragment wurde in das mit XhoI und BamHI restringierte Hilfskonstrukt pET3c_tetO ligiert. 36 Ergebnisse 4.1.3 Mutantengemisch-Klonierung von dIV-Mutanten Um die Domäne IV von TetO (dIV) zu mutagenisieren, wurde die zweite PCR wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben mit der Taq-DNA-Polymerase nach dem modifizierten Protokoll von Leung [Leung et al., 1989] durchgeführt. Außer den vier PCR-Ansätzen mit jeweils einem limitierenden Deoxynukleotid wurde ein normaler PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase mitgeführt, um zu testen, ob die bereits bekannte Fehlerhäufigkeit (ein fehlerhaftes Nukleotid pro 1000 bp) der Taq-Polymerase zum Erhalt von Mutanten genügt. Das 700 bp umfassende mutagenisierte PCR-Produkt (Abb. 4.6) wurde aus einem 1,5%igen Agarosegel eluiert, mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut und danach mit PEG gefällt (Abb. 4.6) . Der Klonierungsvektor pWH946 (Kap. 4.1.2) wurde ebenfalls mit BamHI und XhoI geschnitten, der 5800 bp umfassende Vektoranteil aus einem 0,8%igen Agarosegel eluiert und dephosphoryliert (Abb. 4.6). 1 2 3 4 5 6000 6 7 Abb. 4.6 Vektor und Inserts für die MutantengemischKlonierung der dIV-Mutanten. Die limitierten Nukleotide sind mit –A, -C, -G und –T, das durch normale PCR gewonnen Produkt mit N gekennzeichnet. Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: dIV – A xXhoI xBamHI (700 bp) 700 Spur 3: dIV – C xXhoI xBamHI (700 bp) Spur 4: dIV – G xXhoI xBamHI (700 bp) Spur 5: dIV – T xXhoI xBamHI (700 bp) Spur 6: dIV N xXhoI xBamHI (700 bp) Spur 7: Vektor pWH946 xXhoI xBamHI (5800 bp) Vektor und Inserts wurden in 5 Ansätzen jeweils in einem molaren Verhältnis von 1:4 ligiert, wobei in jedem Ansatz ungefähr 300 ng Vektor eingesetzt wurden. Nach der Ligation wurden die Ligationsansätze mit PEG gefällt, da sich in früheren Mutantengemisch-Klonierungen mit anschließenden Kontrollen herausstellte, dass Ligase im Ansatz eine Aufnahme der DNA bei Elektroporation von E. coli DH5α behindert. Anschließend wurde die DNA in elektrokompetente E. coli DH5α durch Elektroporation eingebracht. 37 Ergebnisse Die Gesamtanzahlen an Transformanden jedes Mutantengemischs bei durchschnittlich 1000 Rückliganden sind in Tabelle 4.1 aufgeführt. Von jedem Mutantengemisch wurden je sieben Kandidaten vereinzelt, die Plasmide präpariert und mit den Oligonukleotiden TetO_BamHI_r und TetO_XhoI_f sequenziert. Dadurch wurden ungefähr 90% des mutagenisierten Bereichs abgedeckt. Für 43% der Kandidaten ergaben sich Mutationen (Tab. 4.1, Tab. 4.2). Mutantengemisch Transformanden sequenzierte Mutationen in sequenzierten Kandidaten Kandidaten eine zwei A 46 000 7 2 1 C 48 000 7 2 1 G 39 000 7 4 - T 40 500 7 3 1 N 32 000 7 1 - Tab. 4.1 Transformandenzahlen der TetO-Mutantengemische Aufgeführt sind die Anzahlen der Transformanden jedes Mutantengemischs bei durchschnittlich 1000 Rückliganden pro Mutantengemisch und die Anzahlen an Mutanten aus den sequenzierten Kandidaten. Im N-Mutantengemisch wies nur ein Kandidat eine Basenaustauschmutation auf. Die Verteilung der Mutationen über den sequenzierten Bereich war gleichmäßig (Abb. 4.7). Die Plasmide der Mutantengemische wurden präpariert und Mutantengemische A, C, G, und T für die Retransformation in E. coli BL21 eingesetzt. 38 Ergebnisse gccatcctcgaggaaaaatatcATGTGGAGGCAGAAATAAAAGAGCCTACTGTTATATATA TGGAAAGACCGCTTAGAAAAGCAGAATATACCATCCACATAGAAGTCCCGCCAA ATCCTTTCTGGGCTTCTGTCGGGTTGTCCATAGAGCCGCTCCCTATTGGAAGCG GAGTGCAGTATGAAAGCAGAGTTTCACTTGGATATTTAAATCAAT_CGTTCCAAA ATGCGGTTATGGAGGGGGTTCTTTATGGCTGCGAGCAGGGGCTGTATGGATGG AAAGTGACAGACTGTAAAATCTGTTTTGAATATGGATTGTATTATAGTCCTGTAA GTACCCCCGCAGACTTTCGGCTGCTTTCCCCTATCGTATTGGAGCAGGCTTTAA AAAAAGCAGGGACAGAACTATTAGAGCCATATCTCCACTTTGAAATTTATGCACC GCAGGAATATCTCTCACGGGCGTATCATGATGCTCCAAGGTATTGTGCAGATAT TGTAAGTACTCAGATAAAGAATGACG_AGGTCATTCTGAAAGGAGAAATCCCTG CTAGATGTATTCAAGAATACAGGACCGATTTAACTTATTTCACAAATGGGCAGGG AGTCTGCTTGACAGAGTTAAAAGGATACCAGCCAGCTATTGGTAAATTTATTTGC CAACCCCGCCGCCCGAATAGCCGTATAGATAAGGTTcggcatatgttcacaagttag Abb. 4.7 Mutagenisierter Bereich aus tetO Dargestellt ist die Sequenz des gesamten Domäne IV-kodierenden Bereichs mit den für die Mutagenese und die Sequenzierung eingesetzten Oligonukleotiden (hier in kleiner Schrift markiert). Farblich markierte Basen entsprechen mutagenisierten Basen im: A-Mutantengemisch, CMutantengemisch, G-Mutantengemisch, T-Mutantengemisch, N-Mutantengemisch; sequenzierter Bereich unterstrichen; XhoI-Schnittstelle fett gedruckt 39 Ergebnisse Position der Kandidat Mutation in DNA-Sequenz Mutation Position der wt mut Mutation in AS-Sequenz Aminosäureaustausch wt mut A1 1782 ACT ACC 594 Thr Thr A4 1771 ACC AGC 591 Thr Ser 1692 GAT GAC 564 Asp Asp A6 1389 AGA AGG 463 Arg Arg C2 1721 GAG GGG 574 Glu Gly 1807 TGC CGC 603 Cys Arg C3 1245 GAG GAC 415 Glu Asp C4 1245 GAG GAC 415 Glu Asp G1 1598 ACA GCA 533 Thr Ala G2 1429 GTT ATT 477 Val Ile G5 1415 Baseninsertion mit Verschiebung des Leserahmens G7 1461 CAG CAA 487 Gln Gln N4 1332 TCT TCC 444 Ser Ser T3 1501 TTT GTT 501 Phe Val T5 1373 GTG GCG 458 Val Ala 1721 Baseninsertion mit Verschiebung des Leserahmens T6 1391 GTT GCT 464 Val Ala T7 1864 CGC TGC 621 Arg Cys Tab. 4.2 Resultierende Mutationen aller sequenzierten Mutantengemisch-Kandidaten der tetOMutagenese. Es sind die Mutationen auf DNA- und Aminosäureebene dargestellt.In jedem Mutantengemisch mit Ausnahme von N zeigten 3-4 Kandidaten eine bis zwei Mutationen. mut: Kodon und dazugehörige Aminosäure in der Mutante; wt: Kodon und dazugehörige Aminosäure im Wildtyp 4.1.4 Retransformation der tetO-dIV-Mutanten in E. coli BL21 und Analyse auf Gewinn von Tigecyclinresistenz Für die Analyse auf den Gewinn einer Resistenz gegen Tigecyclin (TGC) wurden zunächst die zur Retransformation verwendeten CaCl2-kompetenten E. coli BL21 auf LB-Festmedium mit den TGC-Konzentrationen 1, 3 und 10 µg/ml ausgestrichen, um das Wachstum von falsch-positiven Kandidaten auszuschließen. Hierbei zeigte sich, dass auf Platten ab 3 µg/ml TGC kein Wachstum mehr stattfindet. E. coli BL21 wurde mit Mutantengemisch-Plasmiden den durch transformiert NucleoSpin und Plasmid jeweils der präparierten gesamte Transformationsansatz auf LB-Festmedium mit 3 µg/ml TGC und 0,1mM IPTG ausplattiert. Pro Mutantengemisch-Transformation wurden 20 µl des Ansatzes auf LB-Festmedium mit 100 µg/ml Ampicillin ausgestrichen, um eine Information über die 40 Ergebnisse auf den Platten ausgebrachte Anzahl Kandidaten zu erhalten. Die Platten wurden insgesamt 3 Tage im Dunkeln bei 37°C bebrütet und das Wachstum jeden Tag kontrolliert. Auf den Tigecyclin-Platten zeigte sich kein Wachstum. Die Abdeckung der Mutantengemische durch die Analyse ist in Tab. 4.3 dargestellt. Mutantengemisch Abdeckung A x 3,4 C x 1,6 G x 13 T x3 R Tab. 4.3 Abdeckung der Mutantengemische durch Analyse auf Gewinn von TGC 4.1.5 Kontrolltransformation von E. coli BL21 mit dIV-Mutanten zur Überprüfung auf Erhalt der Tetracyclinresistenz Um festzustellen, zu welchem Anteil bei einer Mutagenese von dIV die Tetracyclinresistenz (TcR) von dIV-Mutanten erhalten bleibt, wurden CaCl2kompetente E. coli BL21 mit einem Ligationsansatz von Vektor pET3c_tetO mit den tetO-Varianten mit mutagenisierter Domäne IV-kodierender Region transformiert. Die auf LB-Festmedium mit 100 µg/ml Ampicillin erhaltenen Transformanden wurden per Samtkissenmethode auf LB-Festmedium mit den Tetracyclinkonzentrationen 3 µg/ml und 10 µg/ml und je 0,1 mM IPTG überstempelt, um einen möglichen Verlust der Tetracyclinresistenz feststellen zu können. Hierbei wurde zunächst auf die Platte mit der niedrigeren, dann auf diejenige mit der höheren Konzentration des Antibiotikums überstempelt. Zusätzlich wurden die Kandidaten auf LB-Festmedium mit den TGCKonzentrationen 1 µg/ml und 5 µg/ml und je 0,1 mM IPTG übertragen, um einen eventuellen Gewinn einer Tigecyclinresistenz feststellen zu können. Die Zahlen der bei 10 µg/ml Tetracyclin noch tetracyclinresistenten Mutanten sind in Tab. 4.4 aufgeführt. 41 Ergebnisse Transformanden Rück- Kandidaten mit erhalten R % aus Transformanden mit R liganden gebliebener Tc erhalten gebliebener Tc Lig –A 270 5 212 78,5 Lig –C 296 5 199 67 Lig –G 102 5 71 69,5 Lig –T 199 5 115 58 Lig N 111 5 89 80 Tab. 4.4 Kontrolltransformation von E. coli BL21 mit dIV-Mutanten Dargestellt sind die Zahlen der mutagenisierten Kandidaten, bei denen die Tetracyclinresistenz erhalten blieb. Mit Lig sind die Ligationsansätze mit den unterschiedlich limitierten Nukleotiden gekennzeichnet. Es zeigt sich ein Verlust der Tetracyclinresistenz bei durchschnittlich 30% der mutagenisierten Kandidaten. Der Gewinn einer Resistenz gegen Tigecyclin war nicht festzustellen. Aus Transformation (Trafo) I und II wurden je transformiertem Ligationsansatz von drei Kandidaten mit Verlust der Tetracyclin-Resistenz die Plasmide präpariert, auf Insertion von dIV überprüft und je ein Kandidat mit vorhandenem Insert sequenziert. Es wurden pro Kandidat 1-3 Punktmutationen beziehungsweise Deletionen gefunden (Tab. 4.5). Position der Kandidat Mutation in Mutation Position der wt mut 1324 TGG CGG 1427 GCG 1476 C Mutation in Aminosäureaustausch wt mut 442 Trp Arg GTG 476 Ala Val TGG TGA 492 Trp Stopkodon 1905 TTC TTA 635 Phe Leu G 1663 TAT CAT 554 Tyr His T 1901 Deletion einer Base mit Verschiebung des Leserahmens N 1573 GAG DNA-Sequenz A AAG AS-Sequenz 525 Glu Lys R Tab. 4.5 Mutationen in Kandidaten mit Verlust von Tc in Domäne IV von tetO Es sind die Mutationen auf DNA- und Aminosäureebene dargestellt. mut: Kodon und dazugehörige Aminosäure in der Mutante; wt: Kodon und dazugehörige Aminosäure im Wildtyp 42 Ergebnisse 4.2 Überprüfung des Bereichs stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin 4.2.1 Strategie Es wurde bereits für den Bereich stromaufwärts des Leserahmens des ribosomalen Schutzproteins TetM gezeigt, dass dieser die Expression von TetM in Gegenwart von Tetracyclin durch transkriptionelle Attenuation reguliert [Su et al., 1992]. Die Hierfür erforderlichen palindromischen Sequenzen (inverted repeats) wurden im Bereich stromaufwärts vor tetM und tetO gefunden [Martin et al., 1986, Wang, Taylor 1991], über die Regulation der Expression von TetO ist bisher jedoch noch wenig bekannt. In diesem Projekt sollte geprüft werden, ob die Expression von TetO durch die Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) im Medium reguliert wird. In diesem Falle sollte untersucht werden, ob die Regulation dosisabhängig erfolgt oder ob es sich um eine Alles-oder-nichts-Antwort handelt. Dazu sollte der Bereich stromaufwärts vor tetO (tetOup) vor das promotorlose lacZ-Gen im Vektor pCB302b kloniert (Abb. 4.7) und die β-Galaktosidaseaktivität bei verschiedenen Tetracyclinkonzentrationen bestimmt werden. Des Weiteren sollten durch ein Kontrollkonstrukt mit dem konstitutiven, Tcunabhängigen Promotor der TEM-1-β-Lactamase (Pbla) die Tetracyclin-Spezifität der Signale bestätigt werden. Ein möglicher Effekt sollte auf einen kleineren Bereich der stromaufwärts-Sequenz eingeschränkt werden. BamHI EcoRI tetOup galK E.coli P C. jejuni P EcoRI pWH947 8731 bp bla lacZ EcoRI Abb. 4.2.1 Reporterplasmid pWH947 Relevante Restriktionsschnittstellen und genetische Marker sind durch Striche, Gene durch Pfeile gekennzeichnet. Der mit tetOup bezeichnete Bereich sollte auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin untersucht werden. Promotoren sind durch kleine Pfeile gekennzeichnet. 43 Ergebnisse 4.2.2 Konstruktion des Reporterplasmids pWH947 Die Herstellung des Vektors erfolgte durch Verdau von pCB302b [Schneider, Beck 1987] mit dem Restriktionsenzym EcoRI. Das Plasmid pCB302b enthält zwei EcoRISchnittstellen, wobei die tetO-stromaufwärts-Sequenz (tetOup) in die von lacZ 5’lokalisierte Schnittstelle kloniert werden sollte (Abb. 4.2.1). Die Klonierungsstrategie ist in Abb 4.2.4 dargestellt. Um einen einfach geschnittenen Vektor zu erhalten, wurde das Plasmid mit EcoRI für 5 min bei 37°C mit der Enzymmenge partiell geschnitten, die eine vollständige Restriktion des Plasmids in einer Stunde vermittelt hätte (Abb. 4.2.2). 1 2 3 pCB302b linearisiert 6000 4000 3000 4113 bp Abb. 4.2.2 Partieller 3010 bp Verdau des Vektors pCB302b Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: pCB302b ccc Spur 3: pCB302b x EcoRI Das linearisierte Plasmid wurde aus einem 0,8%igen Agarosegel eluiert und anschließend dephosphoryliert. Durch den EcoRI-Schnitt an der 5’-gelegenen Schnittstelle wurden 13 bp des Leserahmens von lacZ entfernt. Die tetOup-Sequenz wurde mittels PCR aus dem Plasmid pAT51 [Trieu-Cuot et al., 1991] mit dem Oligonukleotidpaar LacZ_EcoRI_r und pUC18_EcoRI_f amplifiziert. Mit Oligonukleotid LacZ_EcoRI_r wurde der deletierte 5’-Bereich von lacZ wiederhergestellt sowie eine EcoRI-Schnittstelle vor dem lacZ-Leserahmen eingeführt. Durch Oligonukleotid pUC18_EcoRI_f wurde der 5’-Bereich von tetOup mit der bereits vorhandenen EcoRI-Schnittstelle aus pAT51 amplifiziert, um tetOup in den Ausgangsvektor pCB302b zu ligieren (Abb. 4.9). Für die PCR wurde die TaqPolymerase eingesetzt. 1 2 3 6000 Abb. 4.2.3 Vektor und Insert der Klonierung von pWH947 Spur 1: peq-DNA-Leitermix 1500 Spur 2: Vektor pCB302b x EcoRI (7123 bp) Spur 3: Insert tetOup xEcoRI (1800 bp) 44 Ergebnisse Das 1200 bp große PCR-Produkt wurde aus einem 1,5%igen Agarosegel eluiert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und mit PEG gefällt. Vektor und Insert wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 ligiert, um das Reporterplasmid pCB302b_tetOup zu erhalten (Abb. 4.2.4). E. coli DH5α wurde mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert, wobei ein Verhältnis von Transformanden zu Rückliganden von 2:3 erhalten wurde. Eine Kolonie-PCR von 20 Transformanden ergab vier positive Kandidaten. Deren Plasmide wurden präpariert und einem Probeverdau mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI und HindIII unterzogen. Hierbei ergab sich für 3 Kandidaten das erwartete Spaltmuster für eine korrekte Orientierung des Inserts an der in lacZ 5’-lokalisierten EcoRI-Schnittstelle. Die Kandidaten wurden durch Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Konstrukt wurde pWH947 genannt. Ein Kandidat wurde für die Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität in An- und Abwesenheit von Tetracyclin eingesetzt. 45 Ergebnisse EcoRI galK 7123 bp lacZ tetO tetOup pCB302b pUC18_EcoRI_ pAT51 LacZ_EcoRI_r PCR bla Wiederhergestellter Bereich von lacZ EcoRI tetOup X EcoRI EcoRI EcoRI x EcoRI Dephosphorylierung Ligation HindIII BamHI EcoRI HindIII galK tetOup E.coli P C. jejuni P EcoRI pWH947 (pCB302b_tet(O)up) 8931 bp lacZ bla EcoRI Abb. 4.2.4 Konstruktion des Reporterplasmids pWH947 (pCB302b_tetOup) Der 5’-stromaufwärts-Bereich von tetO wurde mittels PCR amplifiziert. Über die Oligonukleotide LacZ_EcoRI_r und pUC18_EcoRI_f wurden EcoRI-Schnittstellen und der im Vektor abgeschnittene Teil von lacZ eingeführt. Das verdaute PCR-Fragment wurde in den mit EcoRI restringierten Vektor pCB302b ligiert. 46 Ergebnisse 4.2.3 Konstruktion des Kontrollsystems pWH948 Als Tc-unabhängiger, konstitutiver Kontrollpromotor wurde der Promotor des βLactamase-Genes (Pbla) gewählt. Die Klonierungsstrategie ist in Abb. 4.2.6 dargestellt. Pbla wurde mittels PCR mit dem Oligonukleotidpaar Pbla_lacZ_EcoRI und Pbla_BamHI_r aus dem Plasmid pBR322 [Bolivar et al. 1977] amplifiziert. Analog der Klonierung von pWH947 wurde mit Oligonukleotid Pbla_lacZ_EcoRI der abgeschnittene 5’-Bereich von lacZ wiederhergestellt sowie eine EcoRI-Schnittstelle am 3’-Ende eingeführt. Durch Oligonukleotid Pbla_BamHI_r wurde am 5’-Ende der Pbla-Region eine BamHI-Schnittstelle eingeführt, um den Promotor in den Ausgangsvektor pCB302b einzufügen. Für die PCR wurde die Taq-Polymerase eingesetzt. Die Herstellung des Vektors erfolgte durch Verdau von pCB302b mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI und Elution des 7082bp umfassenden Vektoranteils aus einem 0,8%igen Agarosegel (Abb.4.2.5). Anschließend wurde der Vektor dephosphoryliert. 1 2 3 Abb. 4.2.5 Vektor und Insert tetOup-Klonierung Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: Vektor pCB302b x EcoRI xBamHI (7082 bp) Spur 3: Insert Pbla xEcoRI xBamHI (264 bp) 300 200 100 Pbla (264 bp) Pbla_Fragment 1 Pbla Fragment 2 Das 264 bp umfassende PCR-Produkt wurde aus einem 1,5%igen Agarosegel eluiert, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut (Abb.4.2.5) und mit Ethanol gefällt. Vektor und Insert wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 ligiert, um das Kontrollkonstrukt pCB302b_Pbla zu erhalten (Abb. 4.2.6). E. coli DH5α wurde mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert, wobei ein Verhältnis von Transformanden zu Rückliganden von 30:1 erhalten wurde. Eine Kolonie-PCR von 11 Transformanden 47 Ergebnisse ergab 2 positive Kandidaten. Von beiden Kandidaten wurde das Plasmid präpariert und einem Probeverdau mit BamHI, EcoRI und EcoRV unterzogen. Die Kandidaten zeigten das erwartete Spaltmuster durch Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Konstrukt wurde pWH948 genannt. BamHI EcoRI Pbla pBR322 galK Pbla_BamHI_r pCB302b 7123 bp Pbla_lacZ_EcoRI PCR lacZ Wiederhergestellter Bereich von lacZ Pbla bla BamHI EcoRI x EcoRI x BamHI EcoRI x EcoRI x BamHI Dephosphorylierung Ligation BamHI EcoRV EcoRI Pbla galK EcoRV pWH948 (pCB302b_Pbla) lacZ 7346 bp bla EcoRI Abb. 4.2.6 Konstruktion pWH948 Der bla-Promotor wurde mittels PCR amplifiziert. Über die Oligonukleotide Pbla_lacZ_EcoRI und Pbla_BamHI_r wurden die Schnittstellen für EcoRI und BamHI und der im Vektor abgeschnittene Teil von lacZ eingeführt. Das verdaute PCR-Fragment wurde in den mit EcoRI und BamHI restringierten Vektor pCB302b ligiert. 48 Ergebnisse 4.2.4 Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität von E. coli DH5α pWH947 pWH230 und des Kontrollsystems E. coli DH5α pWH948 pWH230 Vortests mit Übernachtkulturen (ÜNK) von E. coli DH5α pWH947 ergaben, dass diese Kulturen ohne Tetracyclinresistenz nur bis zu einer Tetracyclinkonzentration von 0,5 µg/ml anwachsen. Um einen möglicherweise stärkeren regulatorischen Effekt bei höheren Tetracyclinkonzentrationen beobachten zu können, wurde E. coli DH5α mit Plasmid pWH947 und Plasmid pWH230 kotransformiert. Hierdurch erhalten die Zellen eine mit IPTG induzierbare Tetracyclinresistenz durch das Protein TetO. Der Vorteil in dieser Resistenzdeterminante liegt darin, dass Tetracyclin im Gegensatz zu EffluxResistenzmechanismen in der Zelle verbleibt. Als Kontrolle für die Messung wurde E. coli DH5α ebenfalls kotransformiert mit: pWH948 + pWH230 pCB302b + pWH230 Es wurde die β-Galaktosidaseaktivität des Stamms E. coli DH5α pWH947 pWH230 sowie der Kontrollstämme bei folgenden Tetracyclinkonzentrationen bestimmt: 0; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 und 5 µg/ml (Abb. 4.2.8). Die Resistenz durch TetO wurde durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert. Zur Selektion der pWH947-tragenden Kandidaten wurde dem Medium 100 µg/ml Ampicillin zugesetzt. Die Messung von E. coli DH5α pCB302b pWH230 und E. coli DH5α pWH947 pWH230 wurde zweimal, die Messung von E. coli DH5α pWH948 pWH230 einmal reproduziert. 49 Ergebnisse 2000 pCB302b ß-Gal-Aktivität [U] 1800 1600 pWH948 1400 pWH947 1200 1000 800 600 400 200 5 5 5 4 4 4 3 3 3 2 2 2 1,5 1,5 1 1,5 1 1 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,2 ohne ohne ohne 0 Abb. 4.2.7 Graphische Darstellung der β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen bei 37°C von E.coli DH5α pCB302b / pWH948 / pWH947 pWH230 in An- und Abwesenheit von Tetracyclin. x-Achse: Zahlen bezeichnen die Tetracyclinkonzentration in µg/ml. In E. coli DH5α pWH947 pWH230 induziert der tetO-stromaufwärts-Bereich eine dosisabhängige regulative Antwort auf steigende Tetracyclinkonzentrationen, wobei die Expression der β-Galaktosidase mit steigender Menge an Tetracyclin zunimmt und sich ab einer Konzentration von 1,5 µg/ml Tetracyclin eine Sättigung der Antwort einstellt (Tab. 4.2.1). Für den Kontrollstamm Tc-Konzentration Faktor höherer (µg/ml) β-Gal-aktivität 0,2 1,5 - 2 0,5 3–4 werden. 1 7 – 10 pWH948 pWH230 wies unabhängig von der 1,5 12,5 – 15,5 Tetracyclinkonzentration in etwa die gleiche 2 11,5 – 14 3 9,5 – 11 4 10 - 11,5 5 10,5 E. coli DH5α pCB302b pWH230 konnte keine β-Galaktosidaseaktivität Kontrollstamm β-Galaktosidaseaktivität E. in bestimmt coli der DH5α Größen- ordnung von 100-200 Einheiten (U) auf. Tab. 4.2.1 Die für E. coli DH5α pWH947 pWH230 erhaltenen gemittelten Faktoren höherer βGalaktosidaseaktivität bei verschiedenen Tetracyclinkonzentrationen im Gegensatz zur Kultur ohne Tetracyclin werden hier zusammengefasst. 50 Ergebnisse 4.2.5 Klonierung von Fragmenten des tetO-stromaufwärts-Bereichs vor lacZ in pCB302b und Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität Es wurde gezeigt, dass außer dem Promotor die ersten 300 bp des Bereichs stromaufwärts vor tetO für die vollständige Expression der Tetracyclinresistenz verantwortlich sind [Wang, Taylor 1991]. Ausgehend von dieser Annahme sollte der Effekt auf kleinere Bereiche der tetO-stromaufwärts-Sequenz eingeengt werden, um zu überprüfen, ob sich die Regulation möglicherweise im unmittelbaren Bereich vor dem zu exprimierenden Gen abspielt. Hierzu wurden von tetOup Abschnitte der ungefähren Längen von 100, 200, 300, 400, 500 und 1000 bp 5’-wärts ausgehend vom tetO- Leserahmen amplifiziert. Die in den einzelnen Fragmenten der stromaufwärts-Sequenz Eigenschaften sind in Abb. 4.2.8 dargestellt. vor tetO EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI tetOup enthaltenen 5’ ATG 100 ATG 200 ATG 300 ATG 400 ATG 500 ATG 1000 3’ PEco IR2 PCje IR1 Abb. 4.2.8 Schematische Darstellung der Genetischen Elemente der Fragmente des stromaufwärts-Bereichs von tetO Die Größe der Fragmente ist in bp angegeben. PCje C. jejuni-Promotor; PEco E. coli-Promotor; IR1, IR2 palindromische Sequenzen (inverted repeats); ATG Beginn von lacZ Zur Amplifikation wurde im 3’-Bereich das Oligonukleotid LacZ_EcoRI_rneu verwendet, welches den im Vektor deletierten 5’-Bereich von lacZ wiederherstellt sowie eine EcoRI-Schnittstelle am 3’-Ende einführt. Zur Amplifikation im 5’-Bereich der Fragmente wurden die Oligonukleotide tetOup_100, tetOup_200, tetOup_300, tetOup_400, tetOup_500 und tetOup_1000 verwendet. Durch diese Oligonukleotide wurde am 5’-Ende eines jeden Fragments eine EcoRI-Schnittstelle angefügt, um die Fragmente in den mit EcoRI geschnittenen Vektor pCB302b ligieren zu können (Abb.4.2.9). Die PCR-Produkte wurden aus einem 3%igen Agarosegel eluiert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und mit Ethanol gefällt. Für die PCR wurde Taq-Polymerase eingesetzt. Der Vektor wurde analog der Klonierung von pWH947 (Kap. 4.2.2) über einen partiellen Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI hergestellt. 51 Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 6000 Abb. 4.2.9 Vektor und Inserts tetOup-Fragmente-Klonierung Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: tetOup100 x EcoRI (∼ 100 bp) Spur 3: tetOup200 x EcoRI (∼ 200 bp) Spur 4: tetOup300 x EcoRI (∼ 300 bp) 1000 Spur 5: tetOup400 x EcoRI (∼ 400 bp) Spur 6: tetOup500 x EcoRI (∼ 500 bp) Spur 7: tetOup1000 x EcoRI (∼1000 bp) 500 Spur 8: Vektor pCB302b x EcoRI 400 300 (7123 bp) 200 100 Vektor und Inserts wurden in molaren Verhältnissen wie in Tab. 4.2.2 aufgeführt ligiert, um die pCB302b_tetOup100, Expressiossysteme pCB302b_tetOup200, pCB302b_tetOup300, pCB302b_tetOup400, pCB302b_tetOup500 und pCB302b_tetOup1000 zu erhalten (Abb. 4.2.10). E. coli DH5α wurde jeweils mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert. Die erhaltenen Verhältnisse von Transformanden zu Rückliganden sind in Tab 4.2.2 aufgeführt. Bei einer Kolonie-PCR von jeweils drei Transformanden waren alle Kandidaten positiv. Die Plasmide von je zwei der Kandidaten wurden präpariert und auf einem 1%igen Agarosegel auf die richtige Plasmidgröße überprüft. Daraufhin wurde jeweils ein Kandidat einem Probeverdau mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI unterzogen. Die Kandidaten zeigten das erwartete Spaltmuster und wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die erhaltenen Konstrukte wurden pWH947100, pWH947200, pWH947300, pWH947400, pWH947500 und pWH9471000 genannt. Ligiertes Molares Verhältnis Verhältnis Konstrukt Vektor : Insert Transformanden: Rückliganden pWH947100 1:5 14:1 pWH947200 1:3 7:1 pWH947300 1:2 15:1 pWH947400 1:1 13:1 pWH947500 1:3 30:1 pWH9471000 1:1 24:1 Tab. 4.2.2 Ligations- und Transformationsverhältnisse der tetOup100-1000Klonierung 52 Ergebnisse EcoRI galK LacZ_EcoRI_r tetOup_100 - 1000 pCB302b 7123 bp pAT51 tetO tetOup Wiederhergestellter Bereich von lacZ PCR lacZ tetOup100 bla tetOup200 EcoRI tetOup300 x EcoRI tetOup400 Dephosphorylierung tetOup500 tetOup1000 EcoRI EcoRI x EcoRI Ligation BamHI EcoRI tetOup100-1000 galK EcoRI pWH947100-1000 (pCB302b_tetOup100-1000) 7200-8100 bp lacZ bla EcoRI Abb. 4.2.10 Konstruktion von pWH947100-1000 Die tetOup100-1000-Bereiche wurden mittels PCR amplifiziert. Über die Oligonukleotide tetOup_100-1000 und LacZ_EcoRI_rneu wurden die EcoRI-Schnittstellen für und der im Vektor abgeschnittene Teil von lacZ eingeführt. Das verdaute PCR-Fragment wird in den mit EcoRI restringierten Vektor pCb302b ligiert. 53 Ergebnisse Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität Zur Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität von E. coli DH5α pWH947100-1000 wurde eine Konzentration von 0,5 µg/ml Tetracyclin gewählt, da hier bisher bereits eine deutliche Índuktion der LacZ-Expression messbar war (Abb.4.2.11). Des Weiteren war bei dieser Konzentration des Antibiotikums eine Kultivierung der Zellen noch ohne zusätzliche Tetracyclinresistenz möglich. Als Kontrollstämme dienten E. coli pCB302b und E.coli DH5α pWH947. Die Messung wurde einmal reproduziert. 600 ß-Gal-Aktivität [U] 500 400 ohne Tetracyclin 300 mit Tetracyclin 200 100 pCBup pCBup 1000 500 1000 500 400 400 300 300 200 200 100 100 pCB pCB 0 Abb. 4.2.11 Graphische Darstellung der β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen bei 37°C von E. coli DH5α pCB302b / pWH947100-1000/ pWH947 in An- und Abwesenheit von Tetracyclin Kennzeichung der Stämme: pCB E. coli DH5α pCB302b; 100-1000 E. coli DH5α pWH947100-1000; pCBup E.coli DH5α pWH947 Fragment Faktor höherer β-Gal-aktivität 100 0 200 0 300 3–4 400 3,5 – 5,5 500 6 – 7,5 1000 6,5 – 7,5 tetOup 4-8 Tab. 4.2.2 Die für E. coli DH5α pWH947100-1000 pWH230 erhaltenen gemittelten Faktoren höherer βGalaktosidaseaktivität bei verschiedenen Tetracyclinkonzentrationen im Gegensatz zur Kultur ohne Tetracyclin werden hier zusammengefasst. Die Faktoren des Kontrollstammes E. coli DH5α pWH947 sind unter tetOup aufgeführt. 54 Ergebnisse Für E. coli DH5α pWH947100-1000 sowie für den Kontrollstamm E. coli DH5α pWH947 waren die in Tab. 4.2.2 aufgeführten Faktoren höherer β-Galaktosidaseaktivität im Gegensatz zur Kultur ohne Tetracyclin zu verzeichnen. Bei den Kandidaten mit den Fragmenten von 100 bp und 200 bp war keine Promotoraktivität festzustellen. Ab einer Fragmentlänge von ungefähr 300 bp war bei der Kultur ohne sowie mit Tetracyclin eine Aktivität mit Regulation messbar. Die Promotoraktivität nimmt hier mit zunehmender Fragmentlänge ab, während die Stärke der Regulation leicht zunimmt. 4.2.6 Konstruktion von pWH947∆200 und Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität Der Konstruktion dieser Mutante lag die Absicht zugrunde, die 200 bp lange Sequenz zwischen der -10-Region des E. coli-Promotors und dem Transkriptionsstart des C. jejuni-Promotors von tetOup durch Klonierung zu entfernen. Auf diese Weise sollte geprüft werden, ob der regulative Effekt auf den Bereich zwischen dem E. coliPromotor und dem in E. coli nicht aktiven C. jejuni-Promotor zurückzuführen ist. Die Herstellung des Vektors erfolgte durch Verdau von pWH947 (Kap. 4.2.2) mit den Restriktionsenzymen PacI und Bsu36I, Elution des 7543 bp umfassenden Vektoranteils aus einem 1%igen Agarosegel und anschließender Dephosphorylierung. Zur Gewinnung des tetOup∆200 – Fragments wurde die Methode der ÜberlappungsPCR verwendet (Abb. 4.2.12). Als Matrize wird bei dieser Methode kein Plasmid, sondern es werden zwei überlappende PCR-Produkte eingesetzt. Im ersten Hitzeschritt der PCR denaturieren die PCR-Fragmente. Im Hybridisierungsschritt lagern sich die PCR-Fragmente an überlappenden Enden aneinander an, so dass sie während der Elongationsphase eine durchgehende Matrize für die DNA-Polymerase darstellen Im ersten Schritt wurden mittels PCR die beiden überlappenden PCR-Fragmente gewonnen. Mit dem Oligonukleotidpaar tetO_PacI_f und tetO_PEco_r wurde die 675 bp große tetOup-Sequenz zwischen PacI-Schnittstelle und E. coli-Promotor, amplifiziert. Mit dem Oligonukleotidpaar tetO_PCje_f und tetO_Bsu36I_r wurde die 281 bp große tetOup-Sequenz zwischen Transkriptionsstart des C. jejuni-Promotors und Bsu36I-Schnittstelle amplifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden aus einem 1%igen Agarosegel eluiert. 55 Ergebnisse Im zweiten Schritt wurden die beiden überlappenden PCR-Produkte im molaren Verhältnis von 1:1 als Matrize eingesetzt und mit den beiden Rand-Oligonukleotiden tetO_PacI_f und tetO_Bsu36I_r amplifiziert. Das 968 bp große PCR-Produkt wurde aus einem 1%igen Agarosegel eluiert, mit den Restriktionsenzymen PacI und Bsu36I verdaut und mit PEG gefällt. Für die PCR wurde in jedem Schritt Taq-Polymerase eingesetzt. tetOup PEco lacZ PCje tetO_PacI_f pCB302b_tetOup tetO_Bsu36I_r tetO_PEco_r tetO_PCje_f 1.PCR-Schritt 5’ PCR - Produkt Pac I Bsu36I 3’ PCR - Produkt Hybridisierung der PCR-Produkte an überlappenden Enden tetO_PacI_f tetO_Bsu36I_r 2. PCR-Schritt PEco Transkriptionsstart PCje 3. PCR – Produkt = tetOup∆200 Pac I Bsu36I Abb. 4.2.12 Überlappungs-PCR Im ersten Schritt wurden mittels PCR die Bereiche des E. coli-Promotors und des Transkriptionsstarts des C. jejuni-Promotors amplifiziert. Durch die Oligonukleotide tetO_PacI_f und tetO_PEco_r wurde 5’ des E.coli-Promotors eine PacI-Schnittstelle und 3’ des E.coliPromotors eine zum zweiten PCR-Produkt komplementäre Sequenz eingeführt. Durch die Oligonukleotide tetO_PCje_f und tetO_Bsu36I_r wurde 3’ des Transkriptionsstarts des C. jejuniPromotors eine Bsu36I-Schnittstelle und 5’ des Transkriptionsstarts des C. jejuni-Promotors eine zum ersten PCR-Produkt komplementäre Sequenz eingeführt Im zweiten Schritt wurden die ersten beiden PCR-Produkte als Matrize eingesetzt. Diese lagern sich im Hybridisierungsschritt an den überlappenden Enden (mit “ “ gekennzeichnet) aneinander an. Durch PCR mit den Oligonukleotiden tetO_PacI_f und tetO_Bsu36I_r wurde das Produkt tetOup∆200 mit den Schnittstellen für PacI und Bsu36I und dem E. coli Promotor mit nachfolgendem Transkriptionsstart des C. jejuni-Promotors gewonnen. 56 Ergebnisse 1 2 3 8000 Abb. 4.2.13 Vektor und Insert für Klonierung von pWH947∆200 Spur 1: peq-DNA-Leitermix Spur 2: Vektor pCB302b x PacI xBsu36I (7543 bp) 1031 Spur 3: Insert tetOup∆200 x PacI xBsu36I (962 bp) Vektor und Insert (Abb. 4.2.13) wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 ligiert, um das Konstrukt pCB302b _tetOup∆200 zu erhalten (Abb. 4.2.14). E. coli DH5α wurde mit dem gesamten Ligationsansatz transformiert, wobei ein Verhältnis von Transformanden zu Rückliganden von 4:1 erhalten wurde. Durch Kolonie-PCR von 23 Transformanden ergaben sich 17 positive Kandidaten. Von einem Kandidaten wurde das Plasmid präpariert und einem Probeverdau mit EcoRI, PacI und Bsu36I unterzogen. Der Kandidat zeigte das erwartete Spaltmuster und wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das erhaltene Konstrukt wurde pWH947∆200 genannt. Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität Zur Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität wurde analog Punkt 4.2.4 eine Kotransformation von E. coli DH5α mit den Plasmiden pWH947∆200 und pWH230 durchgeführt. Es wurde die β-Galaktosidaseaktivität des Stamms E. coli DH5α pWH947∆200 pWH230 sowie der Kontrollstämme E. coli DH5α pCB302b pWH230 und E. coli DH5α pWH947 pWH230 bei folgenden Tetracyclinkonzentrationen bestimmt: 0; 0,2; 0,5; 1; 1,5 und 2,5 µg/ml (Abb. 4.2.14). Die Resistenz durch TetO wurde mit IPTG 0,1mM Endkonzentration induziert. Zur Selektion der plasmidtragenden Kandidaten wurde dem Medium 100 µg/ml Ampicillin (für Selektion auf pWH947) und 30 µg/ml Kanamycin (für Selektion auf pWH230) zugesetzt. Die Messung wurde einmal reproduziert. 57 Ergebnisse Pac I galK tetOup∆200 tetOup (Abb. 4.2.12) E.coli P C.jejuni P PEco Transkriptionsstart PCje Bsu36I pWH947 Pac I Bsu36I 8731 bps bla x PacI x Bsu36I lacz x PacI x Bsu36I Dephosphorylierung Ligation EcoRI Pac I tet(O)up∆200 galK E. coli P EcoRI Bsu36I pWH947∆200 (pCB302b_tet(O)up∆200) 8505 bp bla lacZ EcoRI Abb. 4.2.14 Konstruktion von pCB302b_tetOup∆200 Der Bereich tetOup∆200 wurde mittels Überlappungs-PCR amplifiziert (Abb.4.2.12). Das verdaute PCRFragment wurde in den mit PacI und Bsu36I restringierten Vektor pCB302b_tetOup ligiert. 58 Ergebnisse ß-Gal-Ak t iv it ät [U] 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 pCB302b ß-Gal-Ak t iv it ät [U] 1000 900 pWH947∆200 800 pWH947 700 600 500 400 300 200 100 2,5 2,5 2,5 1,5 1,5 1,5 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,2 ohne ohne ohne 0 Abb. 4.2.14 Graphische Darstellung der β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen bei 37°C von E.coli DH5α pCB302b / pWH947∆200 / pWH947 pWH230 in An- und Abwesenheit von Tetracyclin. x-Achse: Zahlen bezeichnen die Tetracyclinkonzentration in µg/ml. E. coli DH5α pWH947∆200 pWH230 wies unabhängig von der Tetracyclinkonzentration in etwa die gleiche β-Galaktosidaseaktivität in der Größenordnung von 5000 Einheiten (U) auf. In E. coli DH5α pWH947 pWH230 induziert der tetO-stromaufwärts-Bereich analog der Messung in Punkt 4.2.4 eine dosisabhängige regulative Antwort auf steigende Tetracyclinkonzentrationen. Eine Sättigung der Antwort war nicht festzustellen. Für den Kontrollstamm E. coli DH5α pCB302b pWH230 konnte keine βGalaktosidaseaktivität bestimmt werden Bei E. coli DH5α pWH947 pWH230 waren die in Tab. 4.2.3 aufgeführten Faktoren höherer β-Galaktosidaseaktivität im Gegensatz zur Kultur ohne Tetracyclin zu verzeichnen. 59 Ergebnisse Tc-Konzentration Faktor höherer (µg/ml) β-Gal-aktivität 0,2 2,5 - 3 0,5 3 - 3,5 1 3,5 - 4 1,5 4,5 2,5 5,5 Tab. 4.2.3 Die für E. coli DH5α pWH947 pWH230 erhaltenen gemittelten Faktoren höherer βGalaktosidaseaktivität bei verschiedenen Tetracyclinkonzentrationen im Gegensatz zur Kultur ohne Tetracyclin werden hier zusammengefasst. 60 Diskussion 5. Diskussion 5.1 Mutation der TetO-Domäne IV 5.1.1 Motivation Ribosomale Schutzproteine (RSP) vermitteln Resistenz gegen Tetracyclin und viele seiner Derivate wie zum Beispiel Minocyclin und Doxycyclin [Connell et al., 2003]. Bisher wurde jedoch kein RSP identifiziert, welches eine Resistenz gegenüber Glycylcyclinen vermittelt [G. Bauer, unveröffentlichte Daten; Bergeron et al., 1996; Petersen et al., 1999; Sum & Petersen, 1999]. Auch Efflux-Determinanten, die Resistenz gegen ein breites Spektrum an Tetracyclinderivaten Resistenz vermitteln, zeigen keine Wirksamkeit gegenüber den Glycylcyclinen [Petersen et al., 1999; Sum et al., 1994; Testa et al., 1993]. Im Efflux-System Tet(A) konnte allerdings durch Mutagenese eine schwache Resistenz gegen Glycylcycline erreicht werden [Tuckman et al., 2000]. Analog dazu wurde in diesem Projekt eine Mutagenese des RSP TetO durchgeführt, um zu überprüfen, ob es möglich ist eine Mutante des Proteins zu finden, die E. coli eine Resistenz gegenüber dem Glycylcyclin Tigecyclin (TGC) verleiht. Zur Mutagenese wurde die Domäne IV gewählt, da diese Domäne der TetracyclinBindestelle bei Bindung an das Ribosom am nächsten liegt [Spahn et al., 2001]. Kann Tigecyclin aus sterischen Gründen nicht von TetO aus der Bindetasche freigesetzt werden, könnte eine Mutation in Domäne IV diesen Effekt aufheben. Eine TGCresistente Mutante erlaubt eine Aussage über die Möglichkeit einer Resistenzentwicklung gegenüber TGC in der medizinischen Anwendung und gibt Einblicke in das unterschiedliche Bindeverhalten von Tetracyclin und Tigecyclin an das Ribosom. 5.1.2 Diskussion der Mutagenese von TetO In dieser Arbeit wurde der Domäne IV-kodierende Bereich von tetO durch fehlerhafte PCR [Leung et al., 1989] mutagenisiert und die erhaltenen Mutanten auf eine Resistenz gegen Tigecyclin überprüft. Dabei konnte kein Gewinn der Resistenz festgestellt werden. Durch die Einführung von Mutationen in die Domäne IV von TetO wurde diejenige Domäne mutagenisiert, die von entscheidender Bedeutung für die Funktion der RSP ist. In diesem Bereich sind die AS-Sequenzen der RSP TetO, TetM und TetS zu 75% 61 Diskussion identisch, was die größte Übereinstimmung in der Sequenz nach der G-Domäne (77%) ist. Insgesamt sind die AS-Sequenzen dieser Proteine zu 52% identisch. Einen weiteren Aspekt für die funktionelle Wichtigkeit der Domäne IV der RSP zeigt ihr Unterschied zur Domäne IV von EF-G. Es wird angenommen, dass die verschiedene Funktion dieser ansonsten sehr ähnlichen Proteine auf der unterschiedlichen Orientierung dieser Domäne bei der Bindung an das Ribosom beruht [Connell et al., 2003; Spahn et al., 2001]. Es wurde bereits gezeigt, dass eine intakte Konformation der Domäne IV von EF-G wichtig für dessen Funktion und Affinität zum Ribosom ist [Martemyanov & Gudkov, 1999]. Gilt das gleiche für TetO, kann eine Mutagenese dieser Region zum Verlust der Funktionalität führen. Die Ergebnisse aus Kapitel 4.1.5 dieser Arbeit zeigen, dass sich bereits der Austausch einer Aminosäure in der betroffenen Region in einem Verlust der Resistenz gegen Tetracyclin auswirken kann. Von 953 untersuchten Mutanten sind insgesamt 292 inaktiv. Die Mutationen, die zu einem Verlust der Tetracyclinresistenz geführt haben, sind in Abbildung 5.1. dargestellt. TETM_STRPN PTVIYMERPLKKAEYTIHIEVPPNPFWASIGLSVSPLPLGSGMQYESSVSLGYLNQSFQN 475 TETS_LACLA PTVIYMERPLKKSEFTIDIEVPPNPFWASIGLSVTPLPLGSGIQYESLVSLGYLNQSFQN 480 TETO_CAMJE PTVIYMERPLRKAEYTIHIEVPPNPFWASVGLSIEPLPIGSGVQYESRVSLGYLNQSFQN 475 **********:*:*:**.***********:***: ***:***:**** ************ TETM_STRPN AVMEGIRYGCEQGLYGWNVTDCKICFKYGLYYSPVSTPADFRMLAPIVLEQVLKKAGTEL 535 TETS_LACLA AVMEGIRYGCEQGLYGWKLTDCKICFKYGLYYSPVSTPADFRMLAPIVLEQAFRKSGTEL 540 TETO_CAMJE AVMEGVLYGCEQGLYGWKVTDCKICFEYGLYYSPVSTPADFRLLSPIVLEQALKKAGTEL 535 *****: **********::*******:***************:*:******.::*:**** TETM_STRPN LEPYLSFKIYAPQEYLSRAYTDAPKYCANIVDTQLKNNEVILSGEIPARCIQEYRSDLTF 595 TETS_LACLA LEPYLSFEIYVPQEYLSRAYNDASKYCANILNTKLKGNEVILIGEIPARCIQEYRNSLTF 600 TETO_CAMJE LEPYLHFEIYAPQEYLSRAYHDAPRYCADIVSTQIKNDEVILKGEIPARCIQEYRNDLTY 595 ***** *:**.********* **.:***:*:.*::*.:**** ************..**: TETM_STRPN FTNGRSVCLTELKGYHVTTGEPVCQPRRPNSRIDKVRYMFNKIT-- 639 TETS_LACLA FTNGRSVCLTELKGYQVTNIKSAFQPRRPNNRIDKVRHMFNKINLH 646 TETO_CAMJE FTNGQGVCLTELKGYQPAIGKFICQPRRPNSRIDKVRHMFHKLA-- 639 ****:.*********: : : ******.******:**:*: Abb. 5.1 Vergleich der Aminosäuresequenz von TetO, TetM und TetS im Bereich der Domäne IV Organismen: TetO Campylobacter jejuni; TetM Streptococcus pneumoniae; TetS Lactococcus lactis. R Die Aminosäuren, deren Mutation zu einem Verlust von Tc geführt hat, sind eingerahmt. Die Linie markiert die Position der Deletion. 62 Diskussion Durch die fehlerhafte PCR wurde im Großteil der Fälle eine Punktmutation in Domäne IV eingeführt. Durch die ungefähr 85000 analysierten Mutanten wurden alle möglichen einfachen Punktmutationen 30fach abgedeckt. Anhand der Tatsache, dass trotz vielfacher Abdeckung der Einzelmutationen keine TGC-resistente Mutante gefunden werden konnte, kann vermutet werden, dass ein einzelner Basenaustausch für den Gewinn einer Resistenz gegen Tigecyclin nicht ausreicht. Eine alternative Erklärung für die fehlende Resistenz von TetO gegen Tigecyclin wäre, dass TGC im Gegensatz zu Tetracyclin eine höhere Affinität zum Ribosom aufweist [Bauer et al., 2004; Bergeron et al. 1996; Projan, 2000]. Möglicherweise bindet es sogar so stark an das Ribosom, dass es aufgrunddessen nicht mehr bakteriostatisch, sondern bakterizid wirkt [Projan, 2000]. Es muss daher die Frage gestellt werden, ob TetO aus sterischen Gründen nicht in der Lage ist, die Freisetzung von Glycylcyclinen zu veranlassen, oder ob die Affinität von TetO zum Ribosom nicht ausreicht, so stabil an das Ribosom zu binden, um die Freisetzung von Glycylcyclinen zu bewirken. In diesem Fall muss überlegt werden, ob eine Mutagenese des Proteins in einer anderen Domäne mit dem Ziel einer höheren Affinität zum Ribosom möglich ist. Für EF-G von Thermus thermophilus konnte die Affinität zu GTP und damit zum Ribosom durch Mutagenese einzelner Aminosäuren der G-Domäne erhöht werden (Abb. 5.2) [Martemyanov et al., 1998; Martemyanov et al., 2001]. In Abbildung 5.2 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener RSP und EF-G im Bereich von Ausschnitten der G-Domäne dargestellt. 63 Diskussion TETM_STRPN TETS_LACLA TETO_CAMJE OTRA_STRRM EFG_THETH EFG_ECOLI TETM_STRPN TETS_LACLA TETO_CAMJE OTRA_STRRM EFG_THETH EFG_ECOLI ---------MKIINIGVLAHVDAGKTTLTESLLYNSGAITELGSVDKGTTRTDNTLLERQ ----MEEIKLKIINIGILAHVDAGKTTLTESLLYSSGRIKELGSVDSGTTKTDTMFLERQ ---------MKIINLGILAHVDAGKTTLTESLLYTSGAIAELGSVDEGTTRTDTMNLERQ ---------MNKLNLGILAHVDAGKTSLTERLLHRTGVIDEVGSVDAGTTTTDSMELERQ MAVKVEYDLKRLRNIGIAAHIDAGKTTTTERILYYTGRIHKIGEVHEGAATMDFMEQERE ---ARTTPIARYRNIGISAHIDAGKTTTTERILFYTGVNHKIGEVHDGAATMDWMEQEQE . *:*: **:*****: ** :*. :* ::*.*. *:: * *:: VQAQTRILFHALRKMGIPTIFFINKIDQNGIDLSTVYQDIKEKLSAEIVIKQKVELYPNM VQSQTRILFHALRKMNIPIIFFINKIDQNGINLPDVYQDIKDKLSDDIIIKQTVNLNLKP IQAQTRILFHALQIMKIPTIFFINKIDQEGIDLPMVYREMKAKLSSEIIVKQKVGQHPHI VQPQTRILMRTLRRLGIPTLVFVNKIDRGGARPDGVLREIRDRLTPAAVALSAVADAGTP VEPQSETVWRQAEKYKVPRIAFANKMDKTGADLWLVIRTMQERLGARPVVMQLPIGREDT VQPQSETVWRQANKYKVPRIAFVNKMDRMGANFLKVVNQIKTRLGANPVPLQLAIGAEEH ::.*:. : : . :* : * **:*: * * . :: :* : . 51 56 51 51 60 57 164 169 164 164 173 177 Abb. 5.2 Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener RSP und EF-G im Bereich von Ausschnitten der G-Domäne Organismen: TetM Streptococcus pneumoniae; TetS Lactococcus lactis; TetO Campylobacter jejuni; OtrA Streptomyces rimosus; EF-G THETH Thermus thermophilus; EF-G ECOLI Escherichia coli. Die von Martemyanov et al. mutagenisierten Aminosäuren sind eingerahmt. Durch Mutation an Position 16 wurde eine Aminosäure mutiert, die in den RSP und EF-G identisch ist. Daher wäre es denkbar, dass eine Mutagenese von TetO an dieser Position einen ähnlichen Effekt erzielen würde. Durch die Mutagenese an Position 119 wurde EF-G in dieser Position die saure Aminosäure Glutaminsäure durch das basische Lysin ersetzt. In den RSP befindet sich in dieser Position bereits die basische Aminosäure Arginin. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, dass RSP eine höhere Affinität zum Ribosom aufweisen als EF-G, wie es für TetM bereits nachgewiesen wurde [Dantley et al., 1998]. Möglicherweise hätte eine Mutagenese von TetO in dieser Domäne ähnliche Auswirkungen auf die Affinität dieses Proteins zum Ribosom. 5.1.3 Ausblick Unter dem Aspekt, dass TetO aus sterischen Gründen nicht in der Lage ist, eine Resistenz gegen TGC zu vermitteln, müsste ein Mutantengemisch hergestellt werden, dessen Mutanten multiple Mutationen enthalten. Beispielsweise wäre eine Modifikation des Protokolls der fehlerhaften PCR nach Leung hingehend zu einer höheren Mutationsrate möglich [Leung et al., 1989]. Eine weitere Methode der Mutagenese ist das DNA-Shuffling [Stemmer, Nature 1994; Stemmer, PNAS 1994], kombiniert mit fehlerhafter PCR. Außerdem bietet sich die Möglichkeit der gerichteten Mutagenese mittels PCR mit Mutagenese-Oligonukleotiden, 64 wie sie von Diskussion Martemyanov et al. zur Einführung von Mutationen in die G-Domäne von EF-G verwendet wurde [Martemyanov et al., 1998; Martemyanov et al., 2001]. Wird die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die Affinität von TetO zum Ribosom nicht ausreicht, um das möglicherweise stärker bindende Glycylcyclin aus der Bindestelle freizusetzen, liegt ein neuer Ansatz zur Identifizierung einer tigecyclinresistenten Mutante von TetO in der Mutation der GTP-bindenden Domäne des RSP. Es wäre denkbar, dass eine Mutation in dieser Domäne die Affinität des Proteins zu GTP und damit zum Ribosom erhöht, wie dies schon für EF-G gezeigt wurde [Martemyanov et al., 1998; Martemyanov et al., 2001]. Aufgrund der Bedeutung der zu mutagenisierenden Regionen für die Funktionalität des Proteins ist es nicht auszuschließen, dass es nicht möglich ist, eine glycylcyclinresistente Mutante von TetO zu erhalten. Durch Mutation des Proteins kann die eigentliche Funktion leicht verloren gehen. Außerdem ist ein toxischer Effekt des Proteins bereits bekannt [Wang & Taylor, 1991], und eine Mutation hin zu einer höheren Affinität von TetO zum Ribosom könnte diesen Effekt der Beeinträchtigung des Bakterienwachstums verstärken. Möglicherweise binden aber auch die Glycylcycline zu fest an das Ribosom, als dass TetO, selbst wenn mutagenisiert, in der Lage sein könnte, diese Bindung aufzuheben. 65 Diskussion 5.2 Überprüfung der Sequenz stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin 5.2.1 Motivation Ziel dieses Projektes war, den stromaufwärts vor tetO liegenden Bereich auf eine mögliche regulatorische Funktion in Gegenwart von Tetracyclin zu überprüfen und einen möglicherweise auftretenden Effekt auf den regulatorisch aktiven Bereich in der gesamten stromaufwärts-Sequenz einzugrenzen. Für Tet(M) und Tet(O) wurden palindromische Sequenzen (inverted repeats) im Bereich stromaufwärts der Leserahmen gefunden, welche auf eine Regulation der Expression durch transkriptionelle Attenuation hindeuten [Martin et al., 1986, Wang & Taylor, 1991]. Dieser Regulationsmechanismus wurde für Tet(M) bereits nachgewiesen [Su et al., 1992]. Eine Regulation der Expression dieser Proteine ist wichtig, da die RSP und EF-G um dieselbe Bindestelle am Ribosom konkurrieren [Dantley et al., 1998], und die RSP deshalb in hohen Mengen einen toxischen Effekt auf die Zelle entwickeln können [Dantley et al., 1998; Wang & Taylor, 1991]. Da dieser toxische Effekt sowohl für TetM als auch für TetO beobachtet wird [Dantley et al., 1998; Wang & Taylor, 1991], ist es wahrscheinlich, dass die Expression von TetO ähnlich wie die von TetM reguliert wird. 5.2.2 Diskussion der Analyse der Sequenz stromaufwärts vor tetO auf regulatorische Aktivität In dieser Arbeit wurden Reporterplasmide konstruiert, um eine mögliche regulatorische Funktion der tetO-stromaufwärts-Sequenz in Gegenwart von Tetracyclin zu analysieren. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Expression des Reportergens in Gegenwart von Tetracyclin reguliert wird. Diese Regulation erfolgt dosisabhängig durch eine Steigerung der Expressionsrate in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen Tetracyclin [Kap. 4.3.4, 4.2.6]. Als regulatorisch aktiver Bereich konnte der untranslatierte Bereich zwischen dem E. coli-Promotor und dem Translations-Startkodon des Gens identifiziert werden. Durch die Ergebnisse der Messungen des Kontrollkonstruktes pWH948 konnte ausgeschlossen werden, dass der beobachtete Effekt auf eine eventuelle Stabilisierung der mRNA durch Besetzung mit durch Tetracyclin blockierten Ribosomen zurückzuführen ist [Wei & Bechhofer, 2002]. 66 Diskussion Ein möglicher Mechanismus, der dieser Regulation zugrunde liegen könnte, ist die Attenuation. Dafür spricht, dass bereits gezeigt wurde, dass die Expression des RSP TetM abhängig von der Tetracyclinkonzentration durch transkriptionelle Attenuation reguliert wird [Su et al., 1992]. Da eine Überproduktion von TetM die Translation hemmen kann [Dantley et al., 1998], erlaubt diese Art der Regulation, die Konzentration des Proteins in der Zelle in Anwesenheit des Antibiotikums so niedrig wie möglich und so hoch wie nötig zu halten. Ein weiterer Hinweis für eine Regulation durch Attenuation ist, dass die stromaufwärtsSequenzen der Resistenzdeterminanten Tet(O) und Tet(M) eine sehr hohe Ähnlichkeit aufweisen [Wang & Taylor 1991]. Die für diese Art der Regulation erforderlichen palindromischen Sequenzen (inverted repeats) befinden sich in der stromaufwärtsSequenz von tetO zum Teil im selben Bereich wie bei tetM. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass in Campylobacter jejuni, aus welchem die untersuchte Resistenzdeterminante stammt, der E. coli-Promotor nicht verwendet wird. Wang und Taylor konnten durch Primer-Extension-Analysen feststellen, dass in C. jejuni keine Transkription von diesem Promotor erfolgt [Wang & Taylor, 1991]. Campylobacter verwendet höchstwahrscheinlich den weiter stromabwärts liegenden Campylobacter-Promotor, der sich stark vom E. coli-Promotor unterscheidet [Wang & Taylor, 1991]. In diesem Fall ist eine Regulation durch Attenuation, an der die palindromischen Sequenzen beteiligt sind, nicht möglich, da diese nicht transkribiert werden. Allerdings wurde bis heute nicht gezeigt, ob in C. jejuni überhaupt eine tetracyclinabhängige Regulation der TetO-Expression stattfindet, oder ob es sich dabei um einen E. coli-spezifischen Effekt handelt. Zur Überprüfung, welcher Bereich der stromaufwärts-Sequenz zur Regulation der Expression notwendig ist, wurden Deletionsmutanten konstruiert. Expression sowie Regulation waren erst ab einer Fragmentlänge von 300 bp nachzuweisen [Kap. 4.2.5]. Die Plasmide pWH947100 und pWH947200, welche nur den C. jejuni-Promotor enthalten, zeigten keine Promotoraktivität. Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, dass in E. coli keine Transkription vom C. jejuni-Promotor erfolgt. Dies steht im Gegensatz zu Wang und Taylor, welche in E. coli eine schwache Transkription vom C. jejuni-Promotor aus nachgewiesen haben [Wang & Taylor, 1991]. Außerdem diskutieren Wang und Taylor die palindromischen Sequenzen (inverted repeats) der stromaufwärts-Sequenz als mögliche Transkriptions-Terminationsstrukturen, welche die Transkription von weiter stromaufwärts gelegenen Promotoren in C. jejuni 67 Diskussion verhindern. Die für diese Aussagen relevanten Messungen wurden bei Wang und Taylor in E. coli JM107 durchgeführt. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen jedoch, dass in E. coli DH5α Transkription vom E. coli-Promotor erfolgt: alle Deletionsmutanten mit einer Fragmentlänge von mehr als 300 bp enthalten außer dem C. jejuni-Promotor den E. coli-Promotor und es waren Expression sowie Regulation der Expression nachweisbar [Kap. 4.2.5]. In E. coli ist eine Regulation durch Attenuation aufgrund dieser Ergebnisse nicht auszuschließen, jedoch erscheint eine Regulation dieser Art zumindest ausgehend von den für Tet(M) beschriebenen Sequenzelementen in C. jejuni unwahrscheinlich. Die palindromischen Sequenzen im stromaufwärts-Bereich von tetO könnten auch als Hinweis auf eine Regulation durch einen Riboswitch interpretiert werden [Winkler & Breaker, 2003]. Riboswitch-Systeme benötigen kein intermediäres Sensormolekül wie zum Beispiel Proteine oder tRNA, sondern die RNA-Sequenz selbst dient als Sensoren für kleine Moleküle [Nudler & Mironov, 2004]. Dieser Mechanismus regulierter Genexpression kann auf der Ebene der Transkription wie der Translation erfolgen [Winkler & Breaker, 2003]. Während die transkriptionelle Regulation eher in Gram-positiven Organismen gefunden wurde, kommt die translationelle Regulation häufiger in Gram-negativen Organismen vor [Nudler & Mironov, 2004]. Die Regulation äußert sich in der Ausbildung von Stammschleifen in der mRNA bei Bindung des Induktors, die entweder ein Abbrechen der Transkription oder eine Maskierung der Shine-Dalgarno-Sequenz und damit einer Verhinderung der Translation zur Folge haben [Winkler & Breaker, 2003]. Bisher wurden bis auf eine Ausnahme [Johansen et al., 2003; Nudler & Mironov, 2004] nur Riboswitches identifiziert, welche einen negativen regulatorischen Einfluss auf die Expression ausüben [Winkler & Breaker, 2003]. Es ist bekannt, dass Tetracycline an RNA-Moleküle binden [Berens, 2001; Berens et al., 2001], auch die Bindung von Tetracyclin an das Ribosom erfolgt in erster Linie über die ribosomale RNA [Brodersen et al., 2000; Pioletti et al., 2001]. Möglicherweise bindet Tetracyclin die mRNA von tetO im untranslatierten Bereich und sorgt hier für eine veränderte Ausbildung von Stammschleifen, die eine erhöhte Expressionrate zur Folge hat. Um Informationen darüber zu erhalten, ob es sich um eine Regulation durch einen Riboswitch handeln könnte, wurde überprüft, ob eine Deletion der Sequenz zwischen dem E. coli-Promotor und dem Transkriptionsstart des C. jejuni-Promotors einen 68 Diskussion Einfluss auf die Regulation der Expression hat. Nach Deletion des betreffenden Bereichs war jedoch kein regulatorischer Effekt mehr nachweisbar. Dies kann entweder dadurch erklärt werden, dass der regulatorische Effekt durch den starken E. coli-Promotor maskiert wird, oder dass der regulatorisch aktive Bereich zwischen dem E. coli- und dem C. jejuni-Promotor lokalisiert ist. Dieser Bereich enthält palindromische Sequenzen und schließt daher eine Regulation durch einen Riboswitch nicht aus. Neben der Regulation durch Attenuation oder durch einen Riboswitch kann nicht ausgeschlossen werden, dass es sich möglicherweise um einen anderen Regulationsmechanismus handelt. 5.2.3 Ausblick Um weitere Daten über eine mögliche regulatorische Aktivität der zwischen dem C. jejuni-Promotor und Beginn des Leserahmens von tetO liegenden Sequenz zu bekommen, sollte anstelle des E. coli-Promotors in pWH947∆200 ein schwächerer Promotor kloniert werden. Hierfür bietet sich der Promotor der TEM-1-β-Lactamase (Pbla) an, welcher bereits für das Kontrollkonstrukt in Kapitel 4.2.3 dieser Arbeit verwendet wurde, da er relativ schwach, konstitutiv und tetracyclinunabhängig ist. Des Weiteren können Northern-Blot-Analysen durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob in Abhängigkeit von der Tetracyclindosis die mRNA-Menge zunimmt oder ob sie unabhängig von der Tetracyclinkonzentration gleich bleibt. Diese Analysen können einen Hinweis darauf geben, ob die Regulation auf Transkriptionsoder Translationsebene stattfindet. 69 Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis Agrawal RK, Penczek P, Grassucci RA, Frank J (1998) Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc Natl Acad Sci U S A 95(11):6134-8. Agrawal RK, Heagle AB, Penczek P, Grassucci RA, Frank J (1999) EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. 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Herrn Professor Wolfgang Hillen für die Bereitstellung des interessanten und spannenden Themas meiner Diplomarbeit sowie für seine Diskussionsbereitschaft und konstruktive Kritik. Gesine Bauer, die mich durch alle Höhen und Tiefen meiner Diplomarbeit mit Engelsgeduld, viel Humor und immenser Kompetenz betreut hat. Danke für die Geschichte mit dem Fenster und für die Snickers! Chris Behrens für die vielen tollen Ideen, die Teilzeitbetreuung und die kleinen Gemeinheiten :-). Anke, Barbara, Corina, Martin, Michi, Sabrina, Trixi und der geheimen Schublade für die fabelhafte Stimmung im Labor. Der Mittagsrunde: Christel, Christina, Gesine, Klaus, Matthias, Markus, Matze, Patrick und dem Kren-Meister dafür, dass ich jeden Tag was zu Lachen und was Gutes zu Essen hatte. Den Mitgliedern des Lehrstuhls Mikrobiologie die angenehme Atmosphäre und die Hilfsbereitschaft. Manuela Hanuschik, Hildegard Storck, Frau Leicht, Frau Prell, Frau Wehr und Herrn Dr. Rösch. Josip, ohne den ich nie Chemie verstanden hätte, geschweige denn jetzt da wäre, wo ich bin. Danke, dass du bei mir warst und alles mit mir durchgemacht hast. ihdl. Papa für die tiefgreifenden Gespräche, das Interesse an meiner Arbeit und die vielen lieben Aufmerksamkeiten immer dann, wenn ich sie am nötigsten hatte. Und natürlich für das leckere Essen. Mama für die Wochenenden, die mich immer wieder auf den Boden zurückgeholt haben. Und natürlich für das leckere Essen. My Sisters Sarah und Alex (no elephants for ever). Ich versichere, dass ich die Arbeit ohne fremde Hilfe und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Quellen angefertigt habe. Alle Ausführungen, die wörtlich oder sinngemäß übernommen wurden, sind als solche gekennzeichnet. Erlangen, 21. April 2004 __________________________ (Linda Wenzel)
