Immunhistochemisches Profil von adenoidzystischen und

Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
Institut für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. R. Büttner
Immunhistochemisches Profil von adenoidzystischen und
mukoepidermoiden Speicheldrüsenkarzinomen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Mirko Meszelinsky
aus Leverkusen
promoviert am 04. Juni 2014
Gedruckt von der Druckerei Werbe-Schmiede - Leverkusen
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu
Köln 2014
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg
1. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. G. Arnold
2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. K.-B. Hüttenbrink
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige
Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt
habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind
als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von Herrn Privatdozent Dr. med. G.
Arnold erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch
genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Disseration stehen
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Unterschrift
Köln, den 11.12.2013
Die in dieser Arbeit zugrunde liegenden Patientenfälle wurden gemeinsam von
Privatdozent Dr. med. G. Arnold und mir ausgewählt.
Die
in
dieser
Arbeit
angegeben
mikroskopischen
Schnitte
und
immunhistochemischen Färbungen wurden von Mitabeitern des Labors des
Zentrums für Pathologie Essen Mitte angefertigt.
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden mikroskopischen Auswertungen der Färbungen
sind von mir selbst nach entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. med.
G. Arnold durchgeführt worden.
Die statistische Bearbeitung der Daten sind von mir selbst mit Unterstützung von
Herrn Dr. rer. medic. J. Franklin angefertigt worden.
Die in der Arbeit verwendeten Fotoaufnahmen sind von mir selbst nach
entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. med. G. Arnold angefertigt
worden.
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. med. G. Arnold, der mir als
Mitglied der Fakultät für Medizin der Universität zu Köln die Möglichkeit gegeben hat,
meine Dissertation unter seiner Aufsicht erstellen zu dürfen. Neben der Überlassung
des Themas hat vor allem seine stets freundliche und unermüdliche Unterstützung
zur Durchführung und Fertigstellung der Arbeit beigetragen.
Dem ehemaligen und dem aktuellen Direktor des Instituts für Pathologie der
Universität zu Köln, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes bzw. Herrn
Universitätsprofessor Dr. med. R. Büttner, danke ich für die Möglichkeit, das in
Paraffin
eingebettete
Patienten-Archivmaterial
für
die
durchgeführten
mikroskopischen Schnitte zu verwenden.
Dem ehemaligen Oberarzt der HNO-Klinik der Universität zu Köln und jetzigem
Direktor der HNO-Klinik der Universität Jena, Herrn Professor Dr. med. O. GuntinasLichius, danke ich für die Übermittlung von Patientendaten für die Auswahl des
Tumormaterials der vorliegenden Arbeit.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Universität zu
Köln danke ich für die freundliche Unterstützung und Anleitung beim Finden und
Zurücksortieren des verwendeten Archivmaterials.
Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Pathologie Essen Mitte danke
ich
für
die
Durchführung
der
mikroskopischen
Schnitte
sowie
der
immunhistochemischen Färbungen.
Nicht zuletzt danke ich meiner lieben Familie und allen voran meiner Ehefrau Ceren.
Durch
die
nicht
enden
wollenden
Motivationsgespräche,
Ratschläge
und
Aufmunterungen sowie durch Entlastung von anderen Aufgaben habe ich die Kraft
und Zeit für das Verfassen der Arbeit gefunden. Ich habe Eure Geduld so manches
Mal auf die Probe gestellt.
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis:
Abkürzungsverzeichnis
1
Einleitung.............................................................................................................1
1.1
Mukoepidermoidkarzinom ............................................................................1
1.1.1
Definition ...............................................................................................1
1.1.2
Epidemiologie........................................................................................1
1.1.3
Lokalisation ...........................................................................................2
1.1.4
Klinik .....................................................................................................2
1.1.5
Therapie und Ausblick...........................................................................3
1.2
Adenoidzystisches Karzinom .......................................................................3
1.2.1
Definition ...............................................................................................3
1.2.2
Epidemiologie/Lokalisation....................................................................4
1.2.3
Klinik .....................................................................................................4
1.2.4
Histologie/Grading.................................................................................4
1.2.5
Therapie und Prognose.........................................................................5
1.3
Her-2/neu (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ......................................................................................6
1.4
EGFR (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ......................................................................................7
1.5
C-KIT (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ......................................................................................8
1.6
Ki67 (MIB1) (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ....................................................................................10
1.7
BCL 2 (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ....................................................................................11
1.8
CD 34 (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome) ....................................................................................12
1.9
Fragestellung..............................................................................................13
2 Material und Methode........................................................................................15
2.1
Untersuchungsgut ......................................................................................15
2.1.1
Zusammensetzung des Patientenguts ................................................15
2.1.2
Alters- und Geschlechtsverteilung.......................................................18
2.1.3
Durchgeführte Färbungen ...................................................................18
2.2
Immunhistochemie .....................................................................................19
2.2.1
Verwendete Antikörper:.......................................................................20
2.2.2
Her2, Herceptest .................................................................................21
2.3
Auswertung der immunhistochemischen Präparate ...................................22
2.4
Statistische Auswertung .............................................................................24
2.5
Material und Gerätelisten ...........................................................................25
2.5.1
Lösungen und Puffer (67) ...................................................................25
2.5.2
Färbekits und –lösungen .....................................................................25
2.5.3
Verwendete Geräte .............................................................................27
3 Ergebnisse ........................................................................................................28
3.1
C-KIT..........................................................................................................31
3.2
BCL 2 .........................................................................................................35
3.3
CD34 ..........................................................................................................37
3.4
MIB1 / Ki67.................................................................................................41
3.5
EGFR .........................................................................................................44
3.6
Her 2 ..........................................................................................................46
4
5
6
7
3.7
Korrelation der Ki67-Expression und der Expression von C-KIT bzw.
BCL-2 ...................................................................................................................50
Diskussion .........................................................................................................53
4.1
Diskussion zur Alters- und Geschlechtsverteilung der MEC und ACC .......53
4.2
Primärlokalisation der Tumoren..................................................................53
4.3
Diskussion Grading und Studiengröße.......................................................54
4.4
HER 2: Bedeutung der Expression in MEC und ACC ................................56
4.5
EGFR: Bedeutung der Expression in MEC und ACC .................................61
4.6
C-KIT: Bedeutung der Expression in MEC und ACC..................................64
4.7
MIB 1 (Ki67): Bedeutung der Expression in MEC und ACC .......................69
4.8
BCL 2: Bedeutung der Expression in MEC und ACC .................................71
4.9
CD 34: Bedeutung der Expression in MEC und ACC.................................75
4.10 Korrelation der proliferativen Aktivität und der C-KIT-Überexpression .......76
4.11 Korrelation der proliferativen Aktivität und der BCL-2-Überexpression ......77
Zusammenfassung ............................................................................................78
Literaturverzeichnis ...........................................................................................82
Lebenslauf:........................................................................................................99
Abkürzungsverzeichnis:
A. dest.
Aqua destillata
ACC
Adenoidzystisches Karzinom
AFIP
Armed Forces Institute of Pathology
BCL-2
B-Cell-Lymphoma 2
C-KIT
Rezeptor Protein Kinasen
CD
Cluster of differentiation
d.
der
DAB
Diaminobenzidintetrahydrochlorid
Dest.
destilliert
Diagn.
Diagnose
DIC
Dendritische interstitielle Zellen
Diff.
Differenziert
EGFR
Epidermal Growth Factor Receptor
E-R-L
Epitop-Retrival-Lösung
Expr.
Expression
GIST
Gastrointestinale Stromatumoren
HE
Hämalaun-Eosin
HER-2
Human Epidermal Growth Factor Receptor Typ 2
J.
Jahr/-en
Lsg.
Lösung
M
Mol
MEC
Mukoepidermoid Karzinom
Min
Minuten
pos.
Positiv
QM
Qualitäts Management
TBS
tris buffered saline
u.
und
Vergr.
Vergrößerung
Vol.
Volume
WHO
World Health Organisation
ZNS
Zentrales Nervensystem
ZPEM
Zentrum für Pathologie Essen Mitte
Einleitung
1
1
Einleitung
Maligne Speicheldrüsentumoren sind selten im Vergleich zu anderen malignen
Neoplasien. So beträgt ihr Anteil an allen malignen Kopf-Hals-Neoplasien nur 5%
und ihr Anteil an allen Karzinomen nur 0,5% (169). In der vorliegenden
Untersuchung
sind
daher
die
beiden
häufigsten
Speicheldrüsenkarzinome
untersucht worden. Das Mukoepidermoidkarzinom (MEC) macht etwa 25 – 30 % und
das
adenoidzystische
Karzinom
(ACC)
zwischen
11,8
%
-
25
%
aller
Speicheldrüsenkarzinome aus (45) (97) (149) (169).
Das adenoidzystische Karzinom fällt insbesondere durch sein langsames Wachstum,
seine hohe Lokal-Rezidivrate (16 – 85 %) und sein perineurales Wachstum auf (97).
Sowohl das MEC (5;186) als auch das ACC (40;186) zeigen ein nicht zufrieden
stellendes Ansprechen auf konventionelle Chemotherapie, daher erscheint es nötig,
mehr über die Tumorbiologie zu erfahren, um Ansätze für eine Molekulartherapie zu
finden.
1.1
Mukoepidermoidkarzinom
1.1.1 Definition
Das Mukoepidermoidkarzinom (MEC) gehört zur Gruppe der malignen epithelialen
Tumoren. Es besteht aus schleimproduzierenden, epidermoiden, intermediären und
klaren Zellen und weist häufig eine zystische Bauweise auf. Es wird auf Grundlage
der vorliegenden
differenzierte,
morphologischen und zytologischen Eigenschaften in hoch
intermediär
differenzierte
und
niedrig
differenzierte
Subtypen
untergliedert, wobei die hoch differenzierten Subtypen den geringsten und die
niedrig differenzierten Subtypen den größten Malignitätsgrad aufweisen.
1.1.2 Epidemiologie
Das Mukoepidermoidkarzinom stellt die am häufigsten vorkommende Karzinomform
der Speicheldrüsen dar. Von den verschiedenen Tumorregistern werden leicht
unterschiedliche Häufigkeiten angegeben. So beträgt sein Anteil an allen
Speicheldrüsenkarzinomen laut Speicheldrüsenregister Hamburg 25% (149) und laut
2
Einleitung
Armed Forces Institute of Pathology (AFIP) 29% (45). Bezogen auf alle benignen
und malignen Speicheldrüsentumoren beträgt sein Anteil im AFIP 15,5%.
Der Tumor hat seinen Altersgipfel in der 3. – 7. Lebensdekade und kommt beim
weiblichen Geschlecht häufiger vor (60%) (149). Das Durchschnittsalter von allen
Patienten des AFIP-Registers beträgt 47 Jahre bei einem Altersbereich von 8 bis 92
Jahren (45).
1.1.3 Lokalisation
Die Mehrzahl der MEC entsteht in den großen Speicheldrüsen. Laut dem
Speicheldrüsenregister Hamburg beträgt der Anteil zirka 55%, wobei 49% die
Parotis, 4,5% die Submandibularis und 2% die Sublingualis befallen (180;181). Das
AFIP (45) gibt an, dass 53% der Tumoren ihren Ursprung in den großen
Speicheldrüsen nehmen. Die Verteilung bezogen auf die einzelnen Drüsen zeigt sich
wie folgt: 45,7% Parotis; 7% Submandibularis; 1% Sublingualis; 21% kleine
Gaumenspeicheldrüsen sowie 19% in abnehmender Häufigkeit in der buccalen
Mucosa, Ober- und Unterlippen, retromolare Region und Zunge.
1.1.4 Klinik
In den großen Speicheldrüsen, wie der Parotis oder der Submandibularis, bildet der
Tumor typischerweise einzelne schmerzlose unregelmäßig begrenzte Massen in der
präauriculären bzw. submandibulären Region (45). Die Dauer der Anamnese, bevor
die Erstdiagnose gestellt wird, ist sehr variabel. So konnte an AFIP-Daten (64) zu
234 Patienten eine durchschnittliche Dauer der Anamnese von 1,5 Jahren gezeigt
werden. Mehr als die Hälfte der Patienten waren sich 6 Monate oder weniger ihres
Tumors bewusst, jedoch bemerkten 34 von 234 Patienten schon mehr als 3 Jahre
vor Diagnose eine Schwellung; bei 5 der untersuchten Patienten umfasste die
Zeitspanne sogar mehr als 25 Jahre. Auch andere Untersuchungen konnten sehr
lang andauernde Tumoranamnesen von 20 Jahren und mehr beschreiben (1;74;171).
Zweidrittel der untersuchten Patienten sind asymptomatisch. Die anderen zeigen
Symptome wie Empfindlichkeit, Schmerz, Dysphagie, Kiefersperre, Drainage des
ipsilateralen Ohres und Facialisparesen. Etwa 7% der Patienten erleben ein rapides
Zunehmen der Tumorgröße mit anschließender stiller Latenzzeit.
Einleitung
Die
3
klinische
Symptomatik
der
mukoepidermoiden
Karzinome
der
kleinen
Speicheldrüsen unterscheidet sich stark von der der großen Speicheldrüsen. Häufig
zeigen sie das Bild einer benignen neoplastischen und entzündlichen Läsion. Viele
Tumoren,
insbesondere
die
des
Gaumens,
sind
fluktuierende,
bläuliche
Schwellungen mit glatter Oberfläche und gleichen daher einer Mukozele. Andere
Beispiele haben eine margenta Färbung, die vaskuläre oder melaninhaltige Läsionen
suggerieren. Wieder andere nässen durch eine schmale Öffnung in der Mukosa und
imitieren damit einen drainierenden dentalen Abszess. Sehr selten findet man auch
eine granulierte oder auch papilläre Oberfäche (45). In den AFIP Daten sind zirka
40% der Patienten ohne die klinische Symptomatik, die Schmerzen, Dysphagie,
Parästhesie, Ulzerationen, Zahntaubheit sowie Blutungen umfasst (14). Bei den
Läsionen des Gaumens kann man zusätzlich im Röntgenbild Erosionen des darunter
liegenden Knochens erkennen.
1.1.5 Therapie und Ausblick
Die Therapie besteht in der chirurgischen Entfernung mit oder ohne neck-dissection.
Je nach Ausbreitung und Differenzierungsgrad wird die unterstützende, bei
inoperablen Fällen auch die alleinige Bestrahlung eingesetzt (19;51;68;177). Die
unterstützende konventionelle Chemotherapie zeigte bisher nur suboptimale
Ansprechraten von kurzer Dauer bei hoher Toxizität (5;186). Daher ist es nötig, mehr
über Tumorbiologie und die für die Tumorprogression mutmaßlich bedeutenden
Rezeptoren zu erfahren, weil sich dadurch eventuell neue Therapieziele auf
Rezeptorebene und prognostisch bedeutsame Marker ergeben.
1.2
Adenoidzystisches Karzinom
1.2.1 Definition
Das adenoidzystische Karzinom (ACC) ist ein maligner epithelialer Tumor, der am
häufigsten in den Speicheldrüsen vorkommt. Er zeichnet sich durch langsames
Wachstum, Ausbildung von Fernmetastasen und aggressive Infitration des
umliegenden Gewebes – vor allen Dingen perineural und perivaskulär – aus.
Hierdurch kommt es sehr häufig nach langen Jahren zu Lokalrezidiven.
4
Einleitung
1.2.2 Epidemiologie/Lokalisation
Die
Häufigkeit
der
adenoidzystischen
Speicheldrüsenkarzinome
variiert
Karzinome
innerhalb
bezogen
der
auf
alle
unterschiedlichen
Speicheldrüsenregister von 11,8% (Armed Forces Institute of Pathology), 13,6%
(Speicheldrüsen-Register Hamburg) und 20% (169).
In Bezug auf die Geschlechtsverteilung überwiegt leicht das weibliche Geschlecht.
Die Häufigkeit in den unterschiedlichen Speicheldrüsen beträgt: Parotis 31,2%,
Submandibularis
14,6%,
Sublingualis
4,7%,
kleine
Gaumen-
und
Mund-
Speicheldrüsen 49,4%. Es kommt am häufigsten innerhalb der 5. – 7. Lebensdekade
vor. (Speicheldrüsenregister Hamburg)
1.2.3 Klinik
Das Auftreten eines ACC fällt am häufigsten durch eine langsam zunehmende
Schwellung in der paraaurikulären oder submandibulären Region auf. Kleinere
Tumoren sind häufig verschieblich, wobei größere meist mit der Haut oder tiefer
liegenden umgebenden Geweben verwachsen sind. Druckschmerzhaftigkeit oder
lokale Parästhesien sind meist schon Ausdruck einer Nerveninfiltration (45; 149).
1.2.4 Histologie/Grading
Anhand des histologischen Baumusters lassen sich 3 Subtypen unterscheiden.
Meistens kommen in einem Tumor alle 3 Subtypen nebeneinander vor, wobei in der
Regel ein Subtyp überwiegt, nach dem dann auch die Zuordnung vorgenommen
wird (117;148).
Der tubuläre Subtyp zeigt Tubuli, deren Lichtung von einreihig angeordneten
basaloiden Zellen gangartig umsäumt wird. Außen werden diese Zellen von flachen
modifizierten Myoepithelzellen umgeben. In den Lumina lässt sich meist PASpositives Sekret nachweisen. Das Tumor-Stroma ist von einer desmoplastischhyalinen Struktur (149).
Der kribriforme Subtyp ist der häufigste Bautyp und kommt in 45% der Fälle vor. Er
besteht aus isomorphen Tumorzellen, die unterschiedlich große Zellnester bilden.
Diese werden siebartig von unterschiedlich großen Spalträumen, ähnlich einem
Schweizer Käse, durchsetzt. Diese Spalträume sind Pseudozysten, welche von
modifizierten abgeflachten Myoepithelzellen begrenzt werden und Proteoglykane
Einleitung
5
sowie Basalmembranmaterial enthalten. Neben diesen Pseudozysten kommen auch
echte kleine Zysten vor, die von gangartigen kubischen Zellen gebildet werden. Die
Lumina dieser Zysten enthalten sekretorisches Material (149).
Der solide (basaloide) Subtyp kommt am seltensten vor und ist aus soliden
Zellnestern aufgebaut, welche teils von drüsenartigen kleinen Formationen
durchsetzt sind und zentrale Nekrosen aufweisen. Die eigentlichen Tumorzellen sind
sehr klein, basophil, die Zellkerne sind hyperchromatisch und dicht. Weiterhin weist
dieser Subtyp zahlreiche Mitosen auf, welche in den anderen beiden Typen kaum
beobachtet werden (149).
Die einzelnen Bautypen korrelieren mit der Aggresivität, so weist der tubuläre Subtyp
den niedrigsten, der solide Sybtyp den höchsten Malignitätsgrad auf. Die
Tumorzellen aller Subtypen zeigen eine eindeutige Stromainvasion, insbesondere
wächst der Tumor entlang der Nervenscheiden und entlang vaskulärer Strukturen.
Teilweise ist das fibröse Stroma hyalinartig umgewandelt (149).
1.2.5 Therapie und Prognose
Chirurgische Tumorresektion mit adjuvanter Bestrahlung stellt die wichtigste
Therapieoption dar. Trotz guter lokaler Therapieergebnisse mit diesen beiden
Therapiepfeilern treten in 40 % der Fälle Fernmetastasen auf (170).
Es
wurden
bereits
viele
verschiedene
Kombinationen
von
Chemo-
und
Molekulartherapeutika zur Behandlung des ACC untersucht. Jedoch konnten bisher
nur geringe Ansprechraten im Rahmen von klinischen Studien nachgewiesen
werden (40;186).
Der Grund der nicht zufrieden stellenden Ergebnisse ist der Mangel an Verständnis
der biologischen Mechanismen der Tumorprogression in ACC. Ziel dieser Arbeit ist
es daher, mehr über die mutmaßlich bedeutsamen Rezeptoren und Stromazellen zu
erfahren, um möglicherweise Ansätze für neue Therapieoptionen auf Rezeptorebene
und prognostisch bedeutsame Immunhistochemie-Marker zu finden.
6
1.3
Einleitung
Her-2/neu (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
Das Her-2/neu Proto-Onkogen, auch bekannt als c-erbB-2, befindet sich auf dem
Chromosom
17q
und
kodiert
für
ein
an
der
Zelloberfläche
gelegenes
transmembranäres Glykoprotein, das 185-kD schwer ist und Protein-Tyrosin-KinaseAktivität besitzt (8;134). Es gehört damit zur Gruppe der Proteinkinasen. Dies sind
Enzyme, die eine Schlüsselrolle in der Regulation zahlreicher Abläufe der
Zellbiologie spielen. So regulieren sie die Apoptose, die Zell-Zyklus Progression, die
Differenzierung, die Entwicklung und vieles mehr. Eine Dsyregulation von
Proteinkinasen findet sich bei einer Vielzahl von Krankheiten so wie Krebs, Diabetes,
autoimmunologische, kardiovaskuläre, entzündliche und neurale Fehlsteuerungen
(34). Die Her2-Proteinkinase gehört als einer von vier transmembranären
Rezeptoren zur epidermal growth factor receptor family. Im Gegensatz zu den
anderen Mitgliedern besitzt das Her2-Protein keinen bekannten Liganden, es kann
jedoch Heterodimere mit jedem anderen der Her-Proteine bilden und dadurch die
nachfolgende Signal-Transduktions-Kaskade beeinflussen (136). Eine Her 2/neu
Onkogen-Verstärkung und die damit einhergehende Überexpression wurde in vielen
malignen
Neoplasien,
so
zum
Beispiel
der
Mamma,
des
Ovars,
des
Gastrointestinaltraktes sowie der Speicheldrüsen nachgewiesen (71;138;150;188).
Insbesondere bei den Mamma-Karzinomen ist die Überexpression gut untersucht.
Hier konnte eine Korrelation von starker Expression mit schlechterer Prognose sowie
einer Resistenz gegen zytotoxische Stoffe nachgewiesen werden. (152;162) Die
augenscheinliche Bedeutung der Überexpression des Her 2/neu-Rezeptors in der
Progression von Mamma-Karzinomen führte zu der Empfehlung einer spezifischen
Immuntherapie gegen ebendiesen Rezeptor (32;161;162). Herceptin (Trastuzumab;
Gentech, San Francisco, CA, USA), ein humanisierter monoklonaler Antikörper
gegen die extrazelluläre Domäne des Her2/neu-Proteins, wurde in einer Reihe von
klinischen Multicenter-Studien als first-line Therapeutikum bei metastasiertem, Her2überexprimierendem Mamma-Karzinom untersucht (17;33;128;163). Die Ergebnisse
dieser Studien zeigten, dass Herceptin als Monotherapie (17;33) und in Kombination
mit anderen Chemotherapeutika (128;163) eine höhere Remissionsrate und eine
längere Remissionsdauer induziert als eine Therapie ohne Hercetptin.
Einleitung
7
Die Expression des Her2-Rezeptors in Speicheldrüsenkarzinomen wurde zwar
schon in einigen Studien untersucht, zeigte aber stark kontroverse Ergebnisse. Beim
adenoidzystischen Karzinom wurde eine Überexpression bei 0% (61;102) bis 50%
(60;89) und teilweise sogar bis 100% (154) der Patienten beschrieben. Die Raten
der Überexpression des Her2-Rezeptors beim Mukoepidermoidkarzinom reichen von
in 0% (173) bis 38% (139) der Fälle.
Diese kontroversen Daten und das Vorhandensein einer spezifischen Therapie
gegen den Rezeptor lassen es sinnvoll erscheinen, die Bedeutung des Her2/neuRezeptors für das adenoidzystische Karzinom und das Mukoepidermoid-Karzinom
erneut zu überprüfen bzw. zu verifizieren. Hierbei sollen insbesondere die
Unterschiede der Expression unter besonderer Berücksichtigung der einzelnen
Differenzierungsgrade der Tumoren untersucht werden.
1.4
EGFR (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
Der Epidermal growth factor receptor (EGFR) ist einer der vier ProteinkinaseRezeptoren der menschlichen EGF Rezeptor (HER-) Familie und wird daher auch
HER 1 genannt. Die HER-Familie gehört zu den am besten erforschten Zell-SignalKaskade Familien (144). Proteinkinasen sind Enzyme, die eine Schlüsselrolle in
nahezu jedem Bereich der Zellbiologie wie zum Beispiel der Apoptose, dem ZellZyklus, der Differenzierung, der Immunantwort und der Transskription spielen. Viele
Krankheiten wie z.B. Diabetes, Krebs, autoimmunologische, kardiovaskuläre,
entzündliche und neurale Fehlsteuerungen hängen mit einer Dysregulation von
Proteinkinasen zusammen (34). Weil die Veränderungen der Gene, die die
Proteinkinasen kodieren, zu einer Induktion von Krebs führen können, werden diese
Gene auch Protoonkogene genannt.
Viele Neoplasien sind mit der EGF-Rezeptor-Aktivierung vergesellschaftet, welche
durch Rezeptor-Mutation, Überexpression, oder EGF-Rezeptor-Stimulation durch
Überproduktion von Wachstumsfaktoren entstehen kann.
Aufgrund der Bedeutung der EGF Rezeptoren für die Tumorentstehung und progression wurden bereits erfolgreich Antikörper gegen die Rezeptor-Oberfläche
8
Einleitung
zur Therapie maligner Erkrankungen wie der nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome
oder den Plattenepithelkarzinome der Kopf/Hals-Region eingesetzt (4;25).
Die Bedeutung der EGFR-Überexpression beim MEC und ACC ist bislang nicht
ausreichend erforscht worden und zeigt teilweise kontroverse Ergebnisse (61;196).
Daher ist es nötig, die Rate der Überexpression des EGFR bei diesen beiden
Karzinomen in Abhängigkeit von dem Tumorgrad erneut zu untersuchen.
1.5
C-KIT (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
Das C-KIT-Protein (CD117) ist ein transmembranöser Tyrosinkinase-Rezeptor mit
einem molekularen Gewicht von 145 – 165 kD. Es wird durch das C-KIT ProtoOnkogen kodiert und ist strukturell mit dem platelet-derived growth factor receptor
sowie mit dem colony simulatory factor receptor verwandt (87). Seine Aktivierung
geschieht durch den natürlichen Liganden stem cell factor (SCF). Dieser unterstützt
seine Dimerisierung und Autophosphorylisierung in die spezifischen Tyrosinresiduen
Tyr576 sowie Tyr719. Abwärts vom C-KIT werden multiple Komponenten einer
Signal-Transduktions-Kaskade aktiviert. Diese Kaskade spielt eine wichtige Rolle in
der zellulären Transformation und Differenzierung der Zelle, welche Proliferation,
Überleben, Adhäsion und Chemotaxis beinhaltet (101). C-KIT wird in einer Reihe
von normalen Zellentwicklungswegen inklusive der Hämatopoese und der
Spermatogenese exprimiert (84;201). Weiterhin wird die C-KIT-Aktivierung für die
normale Migration und Entwicklung von Keimzellen und Melanozyten benötigt (121).
In normalem menschlichem Gewebe wird C-KIT in Mastzellen, interstitiellen Zellen
von Cajal, Melanozyten, Epithelzellen der Brust sowie einigen anderen Zelltypen
exprimiert (96). Die Überexpression dieses Rezeptors wurde in einer Reihe von
malignen Neoplasien wie den gastrointestinalen Stroma-Tumoren (65), der
myeloischen
Leukämie,
den
testikulären
Stammzelltumoren
(100),
den
Endometriumkarzinomen, den papillären und follikulären Schilddrüsen-Karzinomen
(100), den renalen und hepatischen Angiomyolipomen (106), dem Synovialsarkom,
dem Osteosarkom sowie dem Ewing-Sarkom (164) nachgewiesen. Mehrere Autoren
haben ebenfalls beschrieben, dass das C-KIT-Protein in dem adenoid-zystischen
Karzinom
(ACC) nachweisbar ist,
allerdings
sind
in
den Studien
häufig
Einleitung
9
unterschiedliche Färbekits und unterschiedliche Auswertungskriterien verwendet
worden, die zu kontroversen Ergebnissen führten. Der Anteil der C-KIT-positiven
Tumorzellen in ACC’s schwankt zwischen 65% (194) und 100% (129).
Die Expression von C-KIT wurde im (MEC) bisher nur sehr selten untersucht. In der
Studie von Jeng YM et. al. (87) waren 19/19 der untersuchten mucoepidermoiden
Karzinome negativ für die C-KIT Expression. Allerdings wurde in dieser Studie nicht
angegeben, welchen Differenzierungsgrad die untersuchten Fälle aufwiesen.
Für die Neoplasieforschung ist der C-KIT Rezeptor deshalb so interessant, weil man
ihn pharmakologisch selektiv hemmen kann. Dies gelingt zum Beispiel mit dem CKIT Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib mesylate (auch als STI 571 bekannt). Er hemmt
wirkungsvoll die Tyrosinkinasen vom ABL-Typ, den platelet-derived growth factor
receptor (PDGFR) und wie schon gesagt den C-KIT-Rezeptor (24;42;43;75;107;125).
In einer randomisierten Studie von 1105 Patienten, die an einer neu diagnostizierten
chronisch myeloischen Leukämie erkrankt sind, hat sich gezeigt, dass Imatinib einer
Therapie mit Interferon und Cytarabin deutlich überlegen ist. Die Vorteile liegen in
einer intensiveren hämatologischen sowie cytogenetischen Antwort, einer besseren
Verträglichkeit und einer verminderten Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer
Progression in Form einer akzelerierten Phase oder einer Blastenkrise (125).
Imatinib ist heute für die normale Therapie der CML zugelassen. Auch in einer Reihe
anderer Tumoren, welche C-KIT oder PDGFR exprimieren, wurde die Wirkung von
Imatinib untersucht; allerdings wurden sehr unterschiedliche Ergebnisse gefunden.
Eine signifikante Regression der Erkrankung unter der Imatinib-Therapie konnte in
mehr als der Hälfte der Patienten mit nicht resezierbaren und/oder metastatischen
Gastrointestinalen Stroma Tumoren (GIST) erreicht werden (35). Im Gegensatz dazu
konnte in einer Phase II Studie bei der Behandlung von 19 Patienten mit einem
kleinzelligen Bronchialkarzinom keine objektivierbare Antwort auf die ImatinibTherapie beobachtet werden (168).
Für das adenoidzystische Karzinom (ACC) der Speicheldrüsen ist der C-KIT
Rezeptor interessant, weil die bisherigen Erfolgsraten der Behandlung des ACC mit
konventioneller zytotoxischer Chemotherapie eher mäßig waren. Bislang ist die
chemotherapeutische Bekämpfung des ACCs nur im Rahmen von kleineren Studien
und clinical trials untersucht worden. So konnten in kleineren klinischen Studien für
die zytotoxischen Zytostatika Fluorouracil, Anthracycline, Platinverbindungen,
10
Einleitung
Paclitaxel und Vinorelbin beim ACC nur Ansprechraten von 15 – 30% erreicht
werden (6;7;77;175;190;191).
Wie aus den oben beschriebenen Ausführungen zu erkennen ist, gibt es Indizien,
dass die Überexpression des C-KIT Rezeptors eine Rolle bei der Proliferation des
adenoidzystischen
Karzinoms
spielt.
Allerdings
sind
die
in
der
Literatur
beschriebenen Beobachtungen (12;13;26;29;44;47;52;87) zum Teil kontrovers und
größtenteils an sehr kleinen Patientengruppen durchgeführt worden.
Es ist daher das Ziel dieser Studie, weitere Klarheit über die Rolle von C-KIT beim
adenoidzystischen sowie beim mukoepidermoiden Karzinom der Speicheldrüsen zu
gewinnen. Dazu untersucht diese Arbeit systematisch, nach Differenzierungsgraden
unterteilt und semiquantitativ bewertet, die Expression des C-KIT Rezeptors in den
beiden zuvor beschriebenen Karzinomen. Außerdem soll untersucht werden, ob es
einen Unterschied in der Expression von C-KIT zwischen Primärtumoren und
Rezidiven gibt.
1.6
Ki67 (MIB1) (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
Es gibt verschiedene immunhistochemische Methoden, mit denen über die Detektion
von Zellkern-Antigenen die proliferative Aktivität von Geweben gemessen werden
kann. Das Ki-67-Antigen ist wahrscheinlich das bekannteste dieser Antigene (58).
Ki-67 ist ein nukleäres Antigen, nicht-Histon-Protein, das außer in der G0-Phase in
allen Phasen des Zellzyklus (G1,S,G2, Mitose) präsent ist (57). Zahlreiche Studien
haben
eine
Korrelation
Zellproliferationsfraktion
von
zwischen
Geweben
der
Ki-67
Expression
nachgewiesen
und
der
(143;146;156).
Eine
unmittelbare diagnostische und prognostische Aussagekraft der Ki-67 Expression ist
bereits für viele menschliche Tumoren nachgewiesen worden (22;55;72). Es
existieren verschiedene immunhistochemische Antikörper zum Nachweis des Ki-67Antigens. MIB1 ist ein Antikörper, der in der Lage ist, das Ki-67-Antigen auch in
Formalin-fixierten und Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten nachzuweisen
(56;91).
Beim Mukoepidermoid-Karzinom (158), beim Acinuszell-Karzinom (159) und beim
adenoidzystischen Karzinom (47;48;76;123;145) konnte bereits ein Zusammenhang
Einleitung
11
zwischen der mit Hilfe der MIB1-Markierung ermittelten Proliferationsrate eines
Tumors und dem klinischem Verlauf nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Untersuchung soll ebenfalls der Zusammenhang zwischen
Differenzierung (Tumorgrad) und Expressionsrate untersucht werden. Weiterhin soll
die Expressionsrate von Ki-67 als Maß für die Aggressivität verwendet werden, um
festzustellen, ob ein Zusammenhang zwischen Ki-67-Expression und der Expression
der Protooncogene C-KIT und BCL-2 besteht.
1.7
BCL 2 (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
BCL-2 (Abkürzung für englisch: B-cell lymphoma 2) ist das erste identifizierte Protein
bzw. auch das dazugehörige Gen einer Gruppe von menschlichen Genen, die an der
Regulation der Apoptose beteiligt sind. Insgesamt gehören 25 Proteine/Gene zu
dieser BCL2-Gen-Familie. Einige Gene fördern (BAX, BAD, BAK, BOK und andere)
die anderen verhindern (BCL-2, BCL-X, BCl-W usw.) die Apoptose und damit den
programmierten Zelltod. Man vermutet, dass diese Funktion über die Induktion oder
Hemmung der Freisetzung von Cytochrom-C in das Zytosol, wo es Kaspasen
aktiviert, ausgeübt wird (28).
Weil Mutationen in diesen Apoptose regulierenden Genen ihre Steuerungswirkung
aufheben und schließlich auch die Entstehung von Tumoren zur Folge haben
können, bezeichnet man diese Gene auch als Proto-Onkogene. So entsteht
beispielsweise die Überexpression des BCL-2-Gens in B-Lymphozyten durch eine
t(14;18)-Translokation in mehr als 85% der follikulären Non-Hodgkin-Lymphome mit
der Folge der neoplastischen Zellexpansion. Überexpression des BCL-2-Gens
wurde auch in anderen Tumoren, so zum Beispiel dem Prostatakarzinom und oralen
Tumoren gefunden (109;157).
BCL-2
kann
die
Apoptose,
die
zum
Beispiel
durch
Chemotherapeutika,
Gammastahlung, zytotoxische Zytokine, Tumornekrose-Fraktor-α u.a. induziert wird,
verhindern. Daraus resultiert eine gewisse Chemotherapieresistenz von BCL-2positiven Tumoren (140;200).
Interessanterweise können die Proteine der BCL-2-Familie nicht nur die Apoptose
inhibieren, sondern haben auch einen inhibitorischen Effekt auf die Zellproliferation.
12
Einleitung
So hat BCL-2 auch eine antiproliferative Wirkung. Die Ursachen für diese
gegensätzlichen Effekte sind bisher ungeklärt (141).
Ziel dieser Untersuchung ist es, den Grad der Überexpression des BCL-2-Proteins in
Abhängigkeit
vom
histologischen
Subtyp
bei
den
beiden
genannten
Speicheldrüsenkarzinomen zu untersuchen, um den eventuellen Einfluss der
Apoptose-Hemmung für die Progression dieser Tumoren erfassen zu können.
Weiterhin soll untersucht werden, ob es Unterschiede in der BCL-2-Expression von
Rezidivtumoren gegenüber den Primärtumoren gibt.
1.8
CD 34 (Molekulare Grundlage, prognostische bzw. therapeutische
Bedeutung für Karzinome)
CD 34 ist der Name eines Proteins und des dazugehörigen Gens, das zur Gruppe
der Cluster of differentiation Moleküle gehört. Es ist ein Oberflächen-Glykoprotein,
das
als
Zell-Zell
Adhäsionsfaktor
funktioniert
und
auf
hämatopoietischen
Vorläuferzellen exprimiert wird (183). Die Funktion der Zelladhäsion ist wichtig für
das sogenannte Leukozyten homing & binding (16).
Es wird außerdem auf vaskulärem Endothel und vaskulären Tumoren, dendritischen
(interstitiellen) Zellen, in gastrointestinalen Stromatumoren, solitär-fibrösen Tumoren
des Weichgewebes, epitheloiden Sarkomen, Dermatofibrosarkomen und dem
Endoneurium sowie einigen Nervenscheidentumoren exprimiert (16;120) (183;193).
Weiterhin ist bekannt, dass CD34-positive dendritische interstitielle Zellen (DIC)
unterstützend bei der normalen Gewebsausreifung mitwirken und so bei der
Tumorentwicklung mitwirken können (120;193). CD34-positive Stromazellen sind in
der Lage, ein Milieu zu schaffen, welches bei der Hämatopoese im Knochenmark
und der Reifung von Hautanhangsgebilden wichtig ist. Die gleichen Stromazellen
wirken aber auch bei der Entwicklung vieler verschiedener Tumoren mit.
Insbesondere für Hauttumoren ist dies schon umfangreich nachgewiesen worden
(94;130;155;176;183).
Zuvor hatten schon L. Soma, V. A. LiVolsi et al. (166) herausgefunden, dass
dendritische interstitielle Zellen (CD34+) im umgebenden Tumorrandgebiet von
benignen und malignen Speicheldrüsentumoren vorkommen und offenbar für die
Einleitung
13
infiltrative Tumorausdehnung eine Rolle spielen. Es wurden jedoch nur 5 adenoidzystische und 2 mucoepidermoide Karzinome untersucht.
Das Vorkommen CD34 positiver Zellen im Karzinomrandgebiet soll nun an einem
größeren
Patientenkollektiv
und
auch
in
Abhängigkeit
vom
histologischen
Ausprägungstyp untersucht werden, um auf deren Rolle beim Tumorwachstum oder
bei der –weiterentwicklung rückschließen zu können.Hierbei soll auch untersucht
werden, ob Rezidive ein anderes CD34-positives Randstrome haben als die
Primarien.
1.9
Fragestellung
Das MEC und das ACC sind die beiden häufigsten Speichldrüsenmalignomtypen.
Bislang sind die Steuerungsfaktoren für die Tumorprogression bei diesen
Karzinomen noch nicht ausreichend bekannt. Daher stehen zurzeit außer der
chirurgischen Resektion bislang keine erfolgversprechenden neo-/adjuvanten
Therapien
zur
Verfügung.
Immunhistochemische
Untersuchungen
an
Speicheldrüsenkarzinomen haben bereits erste interessante Erkenntnisse zur
Tumorbiologie
geliefert.
Untersuchung
wurden
Die
genauen
bereits
im
Fragestellungen
Zusammenhang
und
mit
Ziele
den
dieser
einzelnen
immunhistochemischen Markern genannt und sollen im Folgenden noch einmal
zusammenfassend dargestellt werden.
Liegt bei den beiden Carcinomtypen eine therapeutisch relevante Überexpression
von Her-2/neu, EGFR und/oder C-KIT vor und bestehen eventuell Unterschiede
zwischen den einzelnen Differenzierungsgraden oder zwischen Primärtumoren und
Rezidivtumoren.
Lässt sich ein relevanter Unterschied in der Ki-67 Expression als Maß für die
proliferative Aktivität zwischen den beiden Kazinomtypen und den einzelnen
Differenzierungsgraden feststellen?
14
Einleitung
Liegt bei einem oder beiden Carcinomtypen eine BCL-2-Überexpression vor und
ergeben sich evtl. Unterschiede zwischen den verschiedener Differenzierungsgraden
der betreffenden Karzinomtypen?
Lassen sich CD-34 positive Zellen im Tumorrandstroma der beiden Carcinomtypen
nachweisen? Gibt es dabei Unterschiede zwischen den beiden Karzinomtypen und
den unterschiedlichen Differenzierungsgraden? Verhalten sich die Rezidive anders
als die Primarien.
Material und Methode
2
2.1
15
Material und Methode
Untersuchungsgut
2.1.1 Zusammensetzung des Patientenguts
Für die Untersuchungen wurde Archivmaterial des Institutes für Pathologie der
Universität zu Köln sowie des Zentrums für Pathologie Essen-Mitte verwendet. Es
enthielt Speicheldrüsenkarzinome von Patienten, die in den Jahren 1985 – 2003 an
der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Universität zu Köln bzw. der
Universitätsklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Kliniken Essen-Mitte
operiert wurden. Bei den untersuchten Fällen handelt es sich um 28 adenoidzystische
Karzinome
(ACC)
(8
aus
Essen
und
20
aus
Köln)
und
22
Mucoepidermoidkarzinome (MEC) (6 aus Essen und 16 aus Köln). Von 7 Patienten
mit ACC und von einem Patienten mit einem MEC konnte ein Rezidiv mituntersucht
werden.
Von den 28 adenoidzystischen Karzinomen stammen 20 aus Primärkarzinomen der
Glandula Parotis, 4 aus den kleinen Speicheldrüsen und bei 4 Fällen ließ sich die
Lokalisation
des
Primärkarzinoms
anhand
der
Archivangaben
nicht
mehr
nachvollziehen.
Von den 22 Mukoepidermoidkarzinomen waren 16 Fälle in der Glandula Parotis, ein
Fall in der Glandula Submandibularis, ein Fall in den kleinen Speicheldrüsen
lokalisiert. Bei 4 Fällen ließ sich die Lokalisation des Tumors nicht mehr
nachvollziehen.
Von sämtlichen Patientenfällen lag formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes
Tumorgewebe vor. Von diesem Gewebe wurden am Zentrum für Pathologie EssenMitte mit dem Mikrotom histologische Präparate angefertigt und mit der Routine HEFärbung angefärbt, um die histopathologischen Subtypen bestimmen und jeweils
einen repräsentativen Tumorblock finden zu können. Die Karzinome wurden nach
der WHO-Klassifikation entsprechend klassifiziert und dabei jeweils 3 Subtypen
zugeordnet. Bei den MEC wurde hierzu der von Auclair, Goode und Ellis (14; 64)
entwickelte und etablierte Grading-Score verwendet. Dieser Grading-Score (siehe
Tabelle 2.1.1) hat sich als sehr nützlich erwiesen, da er direkt mit der Prognose
16
Material und Methode
korreliert (14; 64). Dies konnte auch von Guzzo et al. (68) in einer klinischpathologischen Nachbeobachtung von 108 Patienten nachgewiesen werden.
Hoch differenziert ist gleichbedeutend mit Grad 1, intermediär differenziert mit Grad
2 und niedrig differenziert mit Grad 3.
Tabelle 2.1.1:
Parameter und Punktwerte zum Grading der MEC: Nach Auclair et al (14; 64)
Parameter
Parameter Punktwert
Intrazystische Komponente < 20%
+2
Nerveninvasion vorhanden
+2
Nekrose vorhanden
+3
4 oder mehr Nekrosen pro 10 high power fields
+3
Anaplasie
+4
Grade
Gesamtpunktwert
Hochdifferenziert
0–4
Intermediärdifferenziert
5–6
Niedrigdifferenziert
≥7
Auch die ACC wurden dem überwiegendem Bautyp entsprechend in die drei
Gruppen eingeteilt: Tubulärer (Grad 1), kribriformer (Grad 2) und solider (Grad 3)
Bautyp. Die histopathologische Einteilung beider Karzinome erfolgte zusammen mit
Herrn PD Dr. med. G. Arnold.
Tabelle 2.1: Übersicht über das Patientenkollektiv (R= Rezidiv)
Fallnr.
Diag.
Histol. Subtyp
Geschlecht/Alter
Lokalisation
A1
ACC
kribriform
W/52
Parotis
A2
ACC
kribriform
W/79
Parotis
A3
ACC
kribriform
W/46
Parotis
A4
ACC
kribriform
W/56
kleine Speicheldrüsen
A5
ACC
kribriform
W/74
Parotis
A6
ACC
kribriform
W/47
Parotis
A6 R
ACC
kribriform
W/47
LK Rezidiv nach 10 J.
A7
ACC
kribriform
W/74
Parotis
A7 R
ACC
kribriform
W/74
Parotis, Rezidiv nach 4 J.
Material und Methode
17
Fallnr.
Diag.
Histol. Subtyp
Geschlecht/Alter
Lokalisation
A8
ACC
kribriform
M/67
unbekannt
A9
ACC
kribriform
W/64
Parotis
A10
ACC
kribriform
M/59
Parotis
A10 R
ACC
kribriform
M/59
Parotis, Rezidiv nach 7 J.
A11
ACC
kribriform
W/52
Parotis
A12
ACC
kribriform
M/41
Parotis
A12 R
ACC
kribriform
M/41
Parotis, Rezidiv nach 2 J.
A13
ACC
kribriform
W/76
kleine Speicheldrüsen
A14
ACC
kribriform
W/27
unbekannt
A15
ACC
kribriform
W/59
Parotis
A16
ACC
kribriform
M/79
Parotis
A17
ACC
tubulär
W/58
Parotis
A17 R
ACC
tubulär
W/58
Parotis, Rezidiv nach 5 J.
A18
ACC
tubulär
W/69
kleine Speicheldrüsen
A19
ACC
tubulär
W/60
Parotis
A20
ACC
tubulär
M/50
unbekannt
A21
ACC
tubulär
W/39
Parotis
A22
ACC
solide
M/36
Parotis
A23
ACC
solide
W/50
Parotis
A23 R
ACC
solide
W/50
Parotis, Rezidiv nach 1 J.
A24
ACC
solide
W/59
Parotis
A25
ACC
solide
W/64
Parotis
A25 R
ACC
solide
W/64
Parotis, Rezidiv nach 2 J.
A26
ACC
solide
W/58
unbekannt
A27
ACC
solide
M/55
Parotis
A28
ACC
solide
W/56
kleine Speicheldrüsen
M1
MEC
hochdiff.
W/42
Parotis
M2
MEC
hochdiff.
M/26
kleine Speicheldrüsen
M3
MEC
hochdiff.
W/52
Parotis
M4
MEC
hochdiff.
W/48
Parotis
M5
MEC
hochdiff.
M/51
Parotis
M6
MEC
hochdiff.
W/73
unbekannt
M7
MEC
hochdiff.
W/57
Parotis
M8
MEC
hochdiff.
W/49
Parotis
18
Material und Methode
Fallnr.
Diag.
Histol. Subtyp
Geschlecht/Alter
Lokalisation
M9
MEC
hochdiff.
W/42
unbekannt
M10
MEC
hochdiff.
W/46
unbekannt
M11
MEC
hochdiff.
W/14
Parotis
M12
MEC
hochdiff.
W/66
Parotis
M13
MEC
hochdiff.
W/38
Parotis
M13 R
MEC
hochdiff.
W/38
Parotis, Rezidiv nach 1 J.
M14
MEC
hochdiff.
W/53
Parotis
M15
MEC
hochdiff.
M/66
Parotis
M16
MEC
hochdiff.
W/46
Parotis
M17
MEC
intermediär- differenziert
M/47
unbekannt
M18
MEC
intermediär- differenziert
W/64
Parotis
M19
MEC
intermediär- differenziert
W/47
Parotis
M20
MEC
intermediär- differenziert
W/24
Parotis
M21
MEC
niedrigdiff.
W/69
Parotis
M22
MEC
niedrigdiff.
W/61
Submandibularis
2.1.2 Alters- und Geschlechtsverteilung
Die 28 ACC waren bei 8 männlichen und 20 weiblichen Patienten mit einem
mittleren Alter von 57 Jahren operiert worden. Die 22 MEC waren bei 4 Männern und
18 Frauen mit einem mittleren Alter von 49 Jahren aufgetreten. Zur Alter- und
Geschlechtsverteilung siehe Tabelle 2.1.2.
Karzinomtyp
Männlich
Weiblich
Alter
ACC
7
21
27 – 79 Jahre
MEC
4
18
14 – 73 Jahre
2.1.3 Durchgeführte Färbungen
Standard HE; Immunhistochemische Färbungen: Her 2/neu, EGFR, C-KIT Protein
(CD 117), BCL 2 Protein, Ki 67 Protein (MIB 1 Antigen) und CD 34.
Material und Methode
19
2.2
Immunhistochemie
Die
durchgeführten
immunhistochemischen
Färbungen
wurden
nach
der
Streptavidin-Biotin-Komplex Methode (Dako Real™ Detection System, Alkaline
Phosphatase/RED,
Rabbit/Mouse)
durchgeführt.
Das
Grundprinzip
aller
Immunfärbungen ist daher gleich. Auf die spezifischen Unterschiede wird nach der
allgemeinen Beschreibung des Prinzips hingewiesen. Die Rezepturen sind aus dem
QM Handbuch des ZPEM entnommen.
Es wurden 3 µm dünne Gewebe-Schnitte von jedem Fall angefertigt und auf Super
Frost Plus® Objektträger (Gerhard Menzel GmbH) aufgezogen und über Nacht im
Brutschrank bei 58°C getrocknet. Zusätzlich wurden Kontrollschnitte mit angefertigt
(Tab. 2.2.2). Als Negativkontrolle wurde jeweils 1 Päparat ohne Primärantikörper bei
der immunhistochemischen Inkubation mitgeführt.
Zunächst mussten die Schnitte entparaffiniert werden. Hierzu erfolgte zweimal ein 20
minütiges Xylolbad und dann wurde das Gewebe in einer absteigenden Alkoholreihe
(10 Minuten 100%, 5 Minuten 96%, 5 Minuten 70% Alkohol) rehydriert. Danach
wurden die Schnitte gründlich mit destilliertem Wasser vom Alkohol befreit und
anschließend in TBS-Puffer zwischengelagert.
Für einige Antikörper war eine Vorbehandlung nötig, um das Antigen freizulegen.
Dies wird in Tabelle 2.2.1 beschrieben.
Die in der Tabelle 2.2.1 verwendeten Primärantikörper wurden von Hand aufgetropft
und inkubiert.
Bei der eigentlichen immunhistochemischen Inkubation wurde zunächst im 1. Schritt
die überschüssige Feuchtigkeit abgeklopft und abgetupft. Anschließend wurde der
Primärantikörper oder das negative Kontrollreagenz so aufgetropft, dass die Probe
vollständig bedeckt ist. Die Probe wurde 30 min inkubiert und danach mit DAKO
Waschpuffer abgespült und in ein Pufferbad gestellt.
Im 2. Schritt wurde ebenso die überschüssige Feuchtigkeit abgeklopft und abgetupft
bevor genügend Lösung A des DAKO Real™ Detection Systema (Link, biotinylierter
sekundärer Antikörper) aufgetropft wurde, so dass die Probe vollständig bedeckt war.
Hiernach wurde die Probe 20 - 30 min inkubiert und danach wie im 1. Schritt gespült.
20
Material und Methode
Im 3. Schritt wurde nach dem Abtupfen der überschüssigen Feuchtigkeit genügend
Lösung B (Streptavidin Alkalische Phosphatase) aufgetropft, bis die Probe
vollständig bedeckt war. Die Inkubationszeit betrug 25 Minuten, wonach wie in
Schritt 1 gespült und mit Puffer bedeckt wurde.
Im 4. Schritt
wurden die Schnitte nach dem Abtupfen der überschüssigen
Feuchtigkeit in frisch angesetzter Substrat-Chromogen-Lösung (siehe Abschnitt.
2.5.2)
für 5-10 Minuten inkubiert bis eine ausreichende Färbung erreicht war.
Schließlich wurde die Probe mit destilliertem Wasser abgespült.
Im Schritt 5 wurde die Probe auf dem Objektträger mit wässriger Hämalaunlösung
für 1 min gefärbt und für 5 Min. in warmem Wasser gebläut.
Nach der aufsteigenden Alkoholreihe und 5 minütigem Xylolbad erfolgte dann
abschließend die Eindeckung in synthetischem Neutralbalsam (Medite Pertex) im
Medite Eindeckautomaten (Medite GmbH, Burgdorf).
2.2.1 Verwendete Antikörper:
Tabelle 2.2.1 Verwendete Antikörper mit Vorbehandlung und Verdünnung
Antikörper
BCL-2
MIB-1
CD-34
C-KIT
(CD117)
Her-2
EGFR
Vorbehandlung
Hersteller/Clone
2 min Kochen im Schnell- Dako Cytomation/ 124 Monoclonal Mouse
Anti-Human
kochtopf in Citratpuffer
2 min Kochen im Schnell- DAKO Cytomation / A4502 polyklonaler
Kaninchenantikörper
kochtopf in Citratpuffer
Immunotech / QBEND 10
MBL International / Recombinant
Human CD117,
40 min Kochen in Epitop- DAKO
Cytomation
/
polyklonaler
Kaninchenantikörper
Retrieval-Lösung
Inkubation für 10 Minuten DAKO Cytomation/ H 11
mittels
ChemMate
Proteinase K-Lösung
Tabelle 2.2.2 Verwendete Positivkontrollen
Antikörper
BCL-2
MIB-1
CD-34
C-KIT
Her-2
EGFR
Verwendete Positivkontrolle
Tonsille
Haut
Endothel
Melanom
Mammakarzinom
Haut
Verdünnung
1 : 40
1 : 100
vorverdünnt
1 : 200
vorverdünnt
1 : 200
Material und Methode
21
2.2.2 Her2, Herceptest
Der Herceptest™ der Firma Dako ist ein fertiger KIT zur Durchführung der Her2(cerb2) immunhistochemischen Reaktion. Die Inkubation erfolgte nach folgendem
Rezept, das nach den Herstellerempfehlungen (67) erstellt wurde und dem
Qualitätsmanagement Handbuch des ZPEM entnommen wurde:
Epitop-Retrieval-Lösung (E-R-L) auf Epitop-Retrieval-Lösung (Flasche 7) : 1:10
95-99
Grad
Celsius
entparaffinierte
Schnitte
erhitzen, verdünnen
min 100 ml E-R-L Konzentrat + 900 ml A. dest
40
hineingeben. 20 Min in der Lösung bei
Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit Waschpuffer (Flasche 8) : 1:10 verdünnen
Waschpuffer spülen.
5
min
inkubieren
100 ml Pufferkonzentrat + 900 ml A. dest.
mit
Peroxidase-
Blocker (Flasche 1)
Mit Waschpuffer spülen
30
min
inkubieren
mit
dem
Primärantikörper
(Flasche
2)
bzw.
Negativkontrolle
(Flasche 4).
Mit Waschpuffer spülen.
30
min
inkubieren
mit
Vitalisierungsreagenz (Flasche 3).
Mit Waschpuffer spülen.
10 min inkubieren mit DAB-Substrat- DAB-Substrat-Chromogen-Lösung
Chromogen-Lösung (Flasche 5+6).
(Flasche 5+6) :
Spülen mit A. dest.
1 ml gepuffertes Substrat (Flasche 5)
+ 1 Tropfen DAB-Chromogen (Flasche 6)
kurz vor Gebrauch ansetzen
1
min
gegenfärben
mit
Mayers
Hämalaun.
Spülen 5 min in warmem Wasser
Aufsteigende
Eindecken.
Alkoholreihe,
Xylol,
22
Material und Methode
Alle Reagenzien - außer E-R-L - sollten bei Gebrauch Raumtemperatur haben.
2.3
Auswertung der immunhistochemischen Präparate
Die Auswertung erfolgte mikroskopisch von mir nach vorheriger Anleitung und
anschließender Kontrolle von Herrn PD Dr. med. G. Arnold.
Die Auswertung von Her 2/neu erfolgte nach den Kriterien des DAKO Hercep-Test™,
einem semiquantitativen Verfahren. Zunächst wurde unter 10-facher Vergrößerung
nach repräsentativen Tumorabschnitten mit Färbereaktion gesucht. Wenn gefärbte
Tumorzellen vorhanden waren, dann wurde in diesen Abschnitten unter 20-facher
Vergrößerung die Anzahl positiver Tumorzellen in Prozent und die Färbeintensität
(schwach, moderat oder stark) abgeschätzt. Allerdings wurde nur die membranäre
Färbung als positiv gewertet. Dabei wurde unterschieden, ob eine komplette oder
inkomplette Membranfärbung vorliegt. Aus den Ergebnissen der semiquantitativen
Abschätzung wurde dann folgender Score gebildet:
Tab. 2.3.1: Dako Herceptest Score
Score
Färbemuster
0
Keine Färbung oder Membranfärbung in < 10% der Tumorzellen
1+
Schwache, kaum sichtbare und inkomplette Membranfärbung in ≥ 10% der
Tumorzellen
2+
Schwach bis moderate komplette Membranfärbung in ≥ 10% der Tumorzellen
3+
Starke komplette Membranfärbung in ≥ 10% der Tumorzellen
Die Scorwerte 0 und 1+ wurden in Analogie zu dem etablierten Verfahren beim
Mammakarzinom als negativ, der Wert 2+ als schwach positiv und 3+ als stark
positiv
gewertet.
Für
den
Dako-Score
2+
war
wie
beim
Mamma-
und
Magenkarzinom üblich – eine in-situ-Hybridisierung zur Überprüfung der Her-2Überexpression auf Genebene vorgesehen.
Die
Auswertung
der
EGFR-Färbereaktion
erfolgte
entsprechend
der
Herstellerangaben (DAKO EGFR pharmDx-Test™) ebenfalls semiquantitativ unter
20-facher Vergrößerung in repräsentativ gefärbten Tumorabschnitten. Es wurde die
Material und Methode
23
Anzahl membranär gefärbter Tumorzellen prozentual abgeschätzt und die
Färbeintensität (schwach, moderat und stark) erfasst und analog zum Herceptest™
sowie zu bereits publizierten Ergebnissen von Ettl et al. (48) und Shang et al. (153)
wurde für die Bildung des folgenden Scores nur die membranäre Färbung in mehr
als 10% der Tumorzellen als positiv gewertet, da die zytoplasmatische Färbung laut
Hersteller als unspezifisch gilt. Weiterhin wurden nur die Scores 2+ und 3+ als
Überexpression gewertet.
Tab. 2.3.2: EGFR-Score
Score
Färbemuster
0
Keine Färbung oder Membranfärbung in < 10% der Tumorzellen
1+
Schwache, kaum sichtbare Membranfärbung in ≥ 10% der Tumorzellen
2+
Schwach bis moderate, komplett-zirkuläre Membranfärbung in ≥ 10% der Tumorzellen
3+
Starke, komplett-zirkuläre Membranfärbung in ≥ 10% der Tumorzellen
Die Auswertung von Ki67 (MIB1) und BCL-2 erfolgte unter 40-facher Vergrößerung
im Lichtmikroskop unter Verwendung eines Messraster-Okulars (25 gleich große
quadratische Zellen in einem Feld von 100 mm²). Hierbei wurde von je 3
repräsentativen Tumorabschnitten der prozentuale Anteil positiver (rotgefärbte
Zellkerne) Tumorzellen von 1000 Tumorzellen ausgezählt und der Mittelwert der 3
Ergebnisse gebildet. Das Ergebnis wurde in ganzen Prozentzahlen angegeben.
Die
Auswertung
von
C-KIT
erfolgte
ebenfalls
semiquantitativ,
indem
die
Färbeintensität in 3 Stufen und die Prozentzahl positiv gefärbter Tumorzellen
abgeschätzt wurde. Anschließend wurde ein Score (Tab. 2.3.3) bestimmt, der bereits
bei Went et al. (194) Anwendung fand. Als positiv wurden nur Tumorzellen gewertet,
die eine Zellmembran- oder eine Zellmembran- und Zytoplasmafärbung aufwiesen.
Reine Zytoplasmafärbung wurde als falsch positiv und somit negativ gewertet.
Als Überexpression wurden nur die Score Werte 2+ und 3+ gewertet.
24
Material und Methode
Tab. 2.3.3: C-KIT-Score
Score
Färbemuster
0
Keine Membanfärbung von Tumorzellen vorhanden
1+
Schwache Membranfärbung in < 60% der Tumorzellen oder
Moderate Färbung in < 30% der Tumorzellen
2+
Schwache Membranfärbung in ≥ 60% der Tumorzellen oder
Moderate Färbung in 30 – 79 % der Tumorzellen oder
Starke Färbung in < 30% der Tumorzellen
3+
Moderate Färbung in ≥ 80% der Tumorzellen oder
Starke Färbung in ≥ 30% der Tumorzellen
Bei der Beurteilung von CD 34 wurden die positiv gefärbten dendritischen
interstitiellen Zellen (DIC) des Tumorrandstromas beobachtet und gewertet.
Dendritische interstitielle Zellen sind dünne elongierte Zellen mit spärlichem
Cytoplasma. Auch der Zellkern ist dünn und elongiert und enthält dichtes Chromatin
mit kaum abgrenzbaren Nukleolen. Der Score wurde nach der Anzahl der CD34positiven dendritischen Zellen im Tumorrandstroma vergeben.
Tab. 2.3.4: CD-34-Score
Score
Färbemuster
0
Keine CD-34-positive DIC
1+
Wenig CD-34-positive DIC
2+
Mäßig viele CD-34-positive DIC
3+
Viele CD-34-positive DIC
2.4
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS Statistics Student
Version 17.0.
Zunächst wurde eine deskriptive Statistik durchgeführt. Die Ergebnisse der
Immunhistochemischen Marker wurden mit dem pathohistologischen Grading
korreliert. Hierbei wurde für C-KIT, EGFR, Her2 und CD34 der Exakte Test nach
Fischer, für BCL und Ki67 der Jonckheere-Terpstra-Test verwendet.
Schließlich wurde für die Korrelation der Anzahl Ki67-positiver Zellen mit der
Expression von BCL2 der Spearman-Rho-Korrelationskoeffizient und für die
Material und Methode
25
Korrelation d. Ki-67-Werte und der C-KIT-Expression der Kruskal-Wallis-Test
verwendet.
2.5
Material und Gerätelisten
Sämtliche Rezepturen sind aus dem QM Handbuch des ZPEM entnommen (67).
2.5.1 Lösungen und Puffer (67)
Citratpuffer:
Stammlösung A (0,1 M Zitronensäure: 21,01 g Citronensäure-Monohydrat in 1000 ml
A. dest.)
Stammlösung B (0,1 M Natriumcitrat: 29,41 g Natriumcitrat-Dihydrat in 1000 ml A.
dest.)
Ansatz für 1 l Citratpuffer :
18 ml Stammlösung A +
82 ml Stammlösung B +
900 ml A. dest.
TBS-Puffer:
100 ml aus TBS-Stammlsg.
+900 ml A. dest.
+1 ml Tween 20 Lsg. (erst nach dem Umkringeln des Gewebsschnittes auf dem
Objektträger mit dem Fettstift dazugeben)
pH auf 7,4-7,6 einstellen (mit Säure pH runter, mit Base pH rauf)
TBS-Stammlsg.:
6,1 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan
+37 ml 1 M Salzsäure
+8,8 g Natriumchlorid
+1000 ml A. dest.
ph auf 7,4-7,6 einstellen
2.5.2 Färbekits und –lösungen
Streptavidin-Biotin-Komplex-KIT:
DAKO REAL™ Detection System, Alkaline Phosphatase/RED Code No. K 5005
Kaninchen/Maus
(Hersteller: DakoCytomation, Glostrup, Dänemark)
26
Material und Methode
Reagenzien
Flasche
Menge
Spezifikation
A
1 x 90 ml
Link, Biotinylierter Sekundärer Antikörper (gebrauchsfertig)
B
1 x 90 ml
Streptavidin Alkalische Phosphatase (gebrauchsfertig) :
C-G
Reagenzien zum Ansetzen des Farbstoffs s. beiliegende Tabelle
Tabelle 2.5.2: Ansatz Farbstoff Chromogen
Endvolumen ml
1,00 ml
2,00 ml
5,00 ml
10,00 ml
AP-Substrat - Puffer
1,00 ml
2,00 ml
5,00 ml
10,00 ml
Chromogen Red 1
40 ul
80 ul
200 ul
400 ul
Chromogen Red 2
40 ul
80 ul
200 ul
400 ul
Chromogen Red 3
40 ul
80 ul
200 ul
400 ul
Levamisol
5 ul
10 ul
25 ul
1 Tropfen
Hämalaun nach Mayer :
2000 ml Aqua dest.
dazu 5 g Hämatoxylin, gut mischen
250 g Chloralhydrat
5 g Citronensäure kristallin
1 g Natriumjodat
50 g Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat (Kalialaun)
alles gut mischen und aufkochen lassen,
später 3000 ml Aqua dest. dazugeben und noch mal kurz aufkochen lassen.
Mindestens 4 Wochen reifen lassen!
Eosin :
10 g Erythrosin B
1000 ml Aqua dest.
Material und Methode
27
2.5.3 Verwendete Geräte
Gerät
Hersteller
Mikroskop
Leica DMLB
Rasterzählokular
Leitz
Mikroskop Kamera
Nikon DS Fi 1
Eindeckautomat
Medite GmbH, Burgdorf, Germany
28
3
Ergebnisse
Ergebnisse
Alters- und Geschlechtsverteilung
Bei den 28 ACC handelte es sich um 8 männliche und 20 weibliche Patienten mit
einem mittleren Alter von 57 Jahren. Von den 22 MEC sind 4 bei Männern und 18
bei Frauen mit einem mittleren Alter von 49 Jahren aufgetreten. Zur Alter- und
Geschlechtsverteilung siehe Tabelle 3.1.
Tab. 3.1. Alters und Geschlechtsverteilung ACC und MEC
Karzinomtyp
Männlich
Weiblich
Alter
ACC
8
20
27 – 79 Jahre
MEC
4
18
14 – 73 Jahre
Die
meisten
der
untersuchten
Speicheldrüsenkarzinome
stammen
von
Primärtumoren der Parotis. Die nachfolgenden 2 Tabellen zeigen eine Übersicht
über die Ursprungslokalisationen der untersuchten Fälle.
Tab. 3.2.Ursprungs-Ort der untersuchten Fälle ACC
Häufigkeit
Gültig
Parotis
Prozent
20
71,4
kleine Speicheldrüsen
4
14,3
unbekannt
4
14,3
28
100,0
Gesamt
Tab. 3.2.Ursprungs-Ort der untersuchten Fälle MEC
Häufigkeit
Gültig
Parotis
Prozent
16
72,7
Submandibularis
1
4,5
kleine Speicheldrüsen
1
4,5
unbekannt
4
18,2
22
100,0
Gesamt
Die nachfolgende Tabelle zeigt eine Übersicht über sämtliche untersuchten Fälle mit
klinischen und histologischen Daten sowie den Ergebnissen sämtlicher Immunhisto-
Ergebnisse
29
chemischer Färbungen. Die einzelnen untersuchten Parameter und ihre Bewertungskriterien werden nachfolgend detailliert besprochen.
Tabelle 3.3 Übersicht klinisch-histologische Daten und Ergebnisse der Färbungen (R= Rezidiv)
Fall
nr.
Diag.
Histol.
Subtyp
Geschlecht
/Alter
Lokalisation
C-KIT
MIB1
%
EGFR
Her 2
A1
A2
A3
ACC
ACC
ACC
kribriform
kribriform
kribriform
W/52
W/79
W/46
Parotis
Parotis
Parotis
2
0
1
90
70
85
2
2
1
24
17
5
0
0
3
0
1
1
A4
ACC
kribriform
W/56
1
85
1
4
0
1
A5
A6
A6
R
A7
A7
R
A8
A9
A10
A10
R
A11
A12
ACC
ACC
kribriform
kribriform
W/74
W/47
3
2
85
75
2
3
15
5
0
0
0
0
ACC
kribriform
W/47
0
85
1
12
0
1
ACC
kribriform
W/74
2
75
2
15
0
0
ACC
kribriform
W/74
2
95
1
15
0
1
ACC
ACC
ACC
kribriform
kribriform
kribriform
M/67
W/64
M/59
2
2
2
90
80
95
2
3
2
27
12
13
1
0
1
1
0
1
ACC
kribriform
M/59
1
98
2
21
0
0
ACC
ACC
kribriform
kribriform
W/52
M/41
1
///////
95
95
3
2
12
24
2
0
1
0
A12
R
ACC
kribriform
M/41
///////
98
0
34
1
0
A13
ACC
kribriform
W/76
0
100
1
9
0
0
A14
A15
A16
A17
ACC
ACC
ACC
ACC
kribriform
kribriform
kribriform
tubulär
W/27
W/59
M/79
W/58
unbekannt
Parotis
Parotis
Parotis
2
2
1
2
80
95
80
90
3
3
3
2
14
39
12
16
0
1
0
0
1
1
0
1
A17
R
ACC
tubulär
W/58
Parotis,
Rezidiv n. 5 J.
3
95
3
16
0
1
A18
ACC
tubulär
W/69
3
95
1
52
3
1
A19
ACC
tubulär
W/60
Parotis
1
75
3
3
1
1
A20
ACC
tubulär
M/50
unbekannt
0
A21
A22
A23
A23
R
A24
A25
A25
R
A26
A27
ACC
ACC
ACC
tubulär
solide
solide
W/39
M/36
W/50
2
2
2
ACC
solide
W/50
3
ACC
ACC
solide
solide
W/59
W/64
ACC
solide
W/64
ACC
ACC
solide
solide
W/58
M/55
Parotis
Parotis
Parotis
Parotis,
Rezidiv n. 1 J.
Parotis
Parotis
Parotis,
Rezidiv n. 2 J.
unbekannt
Parotis
0
1
///////
2
0
95
85
98
2
2
1
11
32
72
0
0
0
1
0
1
98
2
68
0
1
3
0
90
65
2
0
36
10
0
0
0
0
0
70
1
13
2
0
2
1
95
0
0
1
22
11
0
0
1
1
A28
ACC
solide
W/56
2
95
2
51
0
1
kleine
Speicheldrüsen
Parotis
Parotis
LK Rezidiv
nach 10 J.
Parotis
Parotis,
Rezidiv n. 4 J.
unbekannt
Parotis
Parotis
Parotis,
Rezidiv n. 7 J.
Parotis
Parotis
Parotis,
Rezidiv n. 2 J.
kleine
Speicheldrüsen
kleine
Speicheldrüsen
kleine
Speicheldrüsen
BCL-2 CD 34
%
30
Ergebnisse
Fall
nr.
Diag.
Histol.
Subtyp
Geschlecht
/Alter
Lokalisation
C-KIT
MIB1
%
EGFR
Her 2
M1
MEC
hochdiff.
W/42
Parotis
1
0
3
7
0
1
M2
MEC
hochdiff.
M/26
0
0
0
7
3
1
M3
MEC
hochdiff.
W/52
Parotis
0
0
1
5
2
0
M4
MEC
W/48
Parotis
0
35
1
8
0
0
M5
MEC
M/51
Parotis
0
0
3
4
2
1
M6
MEC
W/73
unbekannt
0
5
1
3
1
1
M7
MEC
W/57
Parotis
0
0
1
1
0
1
M8
MEC
W/49
Parotis
0
40
2
12
3
1
M9
MEC
W/42
unbekannt
0
0
0
10
2
1
M10
MEC
W/46
unbekannt
0
0
1
11
0
0
M11
MEC
W/14
Parotis
0
0
0
23
2
0
M12
MEC
W/66
Parotis
0
10
2
10
3
1
M13
MEC
W/38
Parotis
0
0
2
9
0
1
M13
R
MEC
W/38
Parotis,
Rezidiv nach 1
J.
0
0
1
16
0
0
M14
MEC
W/53
Parotis
/////
0
0
13
2
1
M15
MEC
M/66
Parotis
0
0
1
7
1
0
M16
MEC
W/46
Parotis
0
0
1
3
3
0
M17
MEC
intermediärdifferenziert
M/47
unbekannt
0
0
1
32
2
0
M18
MEC
intermediärdifferenziert
W/64
Parotis
0
0
0
9
3
1
M19
MEC
intermediärdifferenziert
W/47
Parotis
0
0
2
10
3
1
M20
MEC
intermediärdifferenziert
W/24
Parotis
0
0
3
10
2
0
M21
MEC
niedrigdiff.
W/69
Parotis
0
0
1
51
3
0
M22
MEC
niedrigdiff.
W/61
Submandibularis
0
0
2
73
3
3
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
hochdiff.
kleine
Speicheldrüsen
BCL-2 CD 34
%
In unserem Patientengut zeigte sich für die ACCs folgende Häufigkeit der
verschiedenen histopathologischen Subtypen: 57% (16/28) kribriform, 18% (5/28)
tubulär und 25% (7/28) solide. Bei den MECs entsprechen 73% (16/22) dem
Ergebnisse
31
hochdifferenzierten, 18% (4/22) dem intermediär differenzierten und 7 % (2/22) dem
niedrigdifferenzierten Subtyp.
3.1
C-KIT
Für das C-KIT Protein zeigten 23 von 27 (85%) untersuchten ACC eine positive
Expression. 4 von 27 zeigten keine C-KIT-Expression. Ein Fall wurde von der C-KIT
Statistik ausgeklammert, da hier trotz mehrfacher Wiederholung die C-KIT Färbung
nicht
gelang
(keine
C-KIT
positiven
Mastzellen
als
interne
Kontrolle
im
Stromagewebe). Eine Überexpression (siehe Abb. 3.1.1 bis 3.1.2) mit einer Intensität
von Grad 2 oder 3 (mäßig oder stark) zeigten 17 von 27 (= 63 %). Bei der
Auswertung fiel auf, dass die C-KIT positiven Zellen überwiegend ductal
differenzierten Zellen mit blasigem Kern, mäßig weitem Zytoplasma und betonten
Nukleolen entsprachen.
Die nachfolgenden Tabellen zeigen die C-KIT Expression in Abhängigkeit vom
Subtyp/Differenzierungsgrad.
C-KIT Kreuztabelle ACC
C-KIT Expression
Grad
1 (tubulär)
% innerhalb Grad
2 (kribriform)
% innerhalb Grad
3 (solide)
% innerhalb Grad
Gesamt
0
1
2
3
Gesamt
1
1
2
1
5
20 %
20 %
40 %
20 %
18,5 %
2
4
8
1
15
13,3 %
26,7 %
53,3 %
6,7 %
55,6 %
1
1
4
1
7
14,3 %
14,3 %
57,1 %
14,3 %
25,9 %
4
6
14
3
27
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
Tab. 3.1.1 Kreuztabelle: C-KIT Expression bei ACC in Abhängigkeit vom Grad
Es
konnte
kein
statistisch
relevanter
Unterschied
der
unterschiedlichen
histologischen Subtypen in Bezug auf die C-KIT Expression festgestellt werden. Der
Exakte Test nach Fischer ergab einen p-Wert von 0,981 und ist somit nicht
signifikant.
32
Abb. 3.1.1 C-KIT bei tubulärem ACC, 200x Vergrößerung (Originalgröße)
Abb. 3.1.2 C-KIT bei solidem ACC, 200x Vergrößerung (Originalgröße)
Ergebnisse
Ergebnisse
33
Die nachfolgende Abbildung 3.1.3 veranschaulicht die Stärke der C-KIT-Expression
bei den verschiedenen histologischen Subtypen graphisch.
Abb. 3.1.3 (schwarzer Balken = Median, Punkt = Ausreißer mit Fallnummer.; Sternchen =
Extremwerte mit Fallnummer)
Von den 21 untersuchten MEC (ein Fall wurde wegen wiederholt nicht adäquater
Färbbarkeit des Gewebes ausgeklammert) zeigte lediglich eines eine schwach
positive C-KIT-Expression. Auf die weitere statistische Untersuchung beim MEC
wurde daher verzichtet. Abb. 3.1.4 zeigt die fehlende C-KIT-Expression beim MEC.
34
Ergebnisse
C-KIT Kreuztabelle MEC
C-KIT Expression
Grad
0
1
2
3
Gesamt
1 (hochdifferenz.)
14
1
0
0
15
% innerhalb Grad
93,3 %
6,7 %
0%
0%
71,4 %
4
0
0
0
4
100 %
0%
0%
0%
19 %
2
0
0
0
2
100 %
0%
0%
0%
9,5 %
20
1
0
0
21
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
2 (intermediär diff.)
% innerhalb Grad
3 (niedrig differenz.)
% innerhalb Grad
Gesamt
Tab. 3.1.2 Kreuztabelle: C-KIT Expression bei MEC in Abhängigkeit vom Grad
Abb. 3.1.4 Fehlende C-KIT-Expression beim hochdiff. MEC in 200x Vergrößerung
(Originalgröße)
Von den untersuchten 8 Rezidiven (7 ACC/1 MEC Rezidiv) musste das Rezidiv des
bereits ausgeklammerten ACC Primarius ebenfalls ausgeklammert werden. Somit
zeigten von den 5 positiven ACCs mit Rezidiv 2 Fälle eine Reduktion, ein Fall ein
Ergebnisse
35
Gleichbleiben und 2 Fälle eine Steigerung des C-KIT-Scores. Die Rezidive zweier CKIT negativer Primarii (1x MEC, 1x ACC) verhielten sich ebenfalls negativ.
3.2
BCL 2
Die ACC zeigen eine hohe Expression von BCL-2 (siehe Abb. 3.2.1 und Abb. 3.2.2).
Von den 28 untersuchten Fällen zeigen 26 (92,9%) eine BCL 2-Expression in mehr
als 70 % der Tumorzellen (Mittelwert von 82,77). Auffällig ist, dass die BCL-2
positiven Zellen überwiegend ductalen Zellen mit blasigem Kern, mäßig weitem
Zytoplasma und betonten Nukleolen entsprachen.
Die MEC zeigen hingegen nur in 4 von 22 Fällen eine regionale BCL-2-Expression
(siehe Abb.3.2.3), wobei nur 2 von 22 Fällen (9,1%) eine BCL-2-Expression in mehr
als 25% der Tumorzellen zeigen. Es fällt auf, dass alle BCL2 exprimierenden MEC
dem hochdifferenzierten Typ (Grad 1) angehören.
Abb. 3.2.1 BCL-2-Expression beim kribriformen ACC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
36
Ergebnisse
Abb. 3.2.2 Expression von BCL-2 beim soliden ACC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
Abb. 3.2.3 Expression von BCL-2 beim hochdiff. MEC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
Ergebnisse
37
ACC
MEC
Abbildung 3.2.4 Expression von BCL-2 in Abhängigkeit vom Tumortyp und Grad
Die Abbildung 3.2.4 veranschaulicht graphisch, dass nahezu alle ACC unabhängig
vom Grade (histologischen Subtyp) eine hohe BCL-2-Expression zeigen. Mit dem
Jonckheere-Terpstra-Test
kann
hier
kein
signifikanter
Unterschied
(exakte
Signifikanz 2-seitig 0,797, exakte Signifikanz 1-seitig 0,398) zwischen den
einzelnen histologischen Subtypen festgestellt werden. Ebenso besteht bei den MEC
kein signifikannter Unterschied bei der BCL-2-Expression in Bezug auf den
Tumorgrad (exakte Signifikanz 2-seitig 0,344, exakte Signifikanz 1-seitig 0,249).
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab in 6 Fällen eine
ansteigende und in 2 Fällen eine gleich bleibende Expression von BCL-2.
3.3
CD34
Wie die nachfolgenden Kreuztabellen 3.3.1 und 3.3.2 und das Balkendiagramm
3.3.3 verdeutlichen, zeigen 26 von 28 (=92,9%) der untersuchten ACC, jedoch nur
17
von
22
(=77%)
der
untersuchten
MEC
eine
CD34-Expression
des
38
Ergebnisse
Tumorrandstromas. Weiterhin fällt auf, dass alle ACC vom Grad 1 u. 2 sowie alle
MEC vom Grad 3 positiv reagieren (siehe Abb. 3.3.4 und Abb. 3.3.5).
CD34 Kreuztabelle ACC
Grad
CD 34
0
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
2
Anzahl
% innerhalb des Grades
3
Anzahl
% innerhalb des Grades
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
2
3
Gesamt
0
0
2
2
0%
0%
28,6%
7,1%
2
3
2
7
40,0%
18,8%
28,6%
25,0%
2
7
3
12
40,0%
43,8%
42,9%
42,9%
1
6
0
7
20,0%
37,5%
0%
25,0%
5
16
7
28
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Kreuztabelle 3.3.1: CD34 Expression bei ACC in Abhängigkeit vom Grad
CD34 Kreuztabelle MEC
Grad
CD 34
0
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
2
Anzahl
% innerhalb des Grades
3
Anzahl
% innerhalb des Grades
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
2
3
Gesamt
4
1
0
5
25,0%
25,0%
0%
22,7%
7
1
1
9
43,8%
25,0%
50,0%
40,9%
3
1
1
5
18,8%
25,0%
50,0%
22,7%
2
1
0
3
12,5%
25,0%
0%
13,6%
16
4
2
22
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Kreuztabelle 3.3.2: CD34 Expression bei MEC in Abhängigkeit vom Grad
Ergebnisse
39
Abb. 3.3.4 CD34-positives Stroma und DIC (siehe Kap. 2.3.)beim kribriformen ACC in 200x
Vergrößerung (Originalgröße)
Abb. 3.3.5 CD34-positives Stroma und DIC (siehe Kap. 2.3.) beim intermediärdiff. MEC in 100x
Vergrößerung (Originalgröße)
40
Ergebnisse
Tumortyp ACC
Tumortyp MEC
Balken-Diagramm 3.3.3
Das Balkendiagramm zeigt, dass die ACC im Gegensatz zu den MEC eher einen
Trend zu stärkerer CD34-Expression zeigen. Weiterhin besteht keine Korrelation
Ergebnisse
41
zwischen dem Tumorgrad und der CD34-Expression. Der Exakte Test nach Fischer
ergibt bei den ACC einen p-Wert von 0,207 und bei den MEC einen p-Wert von
0,955.
Nebenbefundlich fällt bei der Auswertung der Fälle auf, dass kleineTumorballen in
der Regel mehr umgebendes CD34-positives Stroma zeigen als große Tumorballen.
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab in 3 Fällen eine
ansteigende, in 4 Fällen eine abfallende und in einem Fall einen gleich bleibenden
Expressionsscore von CD34.
3.4
MIB1 / Ki67
Von den 28 untersuchten ACC musste ein Fall wegen zu geringer Anzahl an
vorhandenen Tumorzellen in dem ausgewählten Block ausgeklammert werden. Die
untersuchten 27 Fälle adenoid zystischer Karzinome zeigen einen großen
Unterschied in der Anzahl an Ki67-positiven Zellen. Die Werte reichen von 3 bis 72
% positive Tumorzellen bei einem Mittelwert von 20,85 (siehe Abb. 3.4.1).
Die untersuchten 22 Fälle mukoepidermoider Karzinome zeigen ebenfalls eine große
Spannbreite an Ki67 positiven Zellen. Die Werte reichen von 1 bis 73 % positive
Tumorzellen bei einem Mittelwert von 14,45. (Siehe Abb. 3.4.2)
Die folgende Abbildung 3.4.3 zeigt mittels Boxplot graphisch die Prozentzahl MIB1positiver Zellen in Abhängigkeit vom histologischen Grad und Tumortyp.
Bei der statistischen Untersuchung (Jonckheere-Terpstra-Test) der Unterschiede der
Tumorgrade in Bezug auf die Anzahl Ki67-positiver Zellen zeigt sich bei den ACC
kein signifikanter Unterschied (exakte Signifikanz 2-seitig 0,137; exakte Signifikanz
1-seitig 0,068). Die MECs zeigen im Gegensatz zu den ACCs eine signifikant höhere
Anzahl Ki67-positiver Zellen mit steigendem Tumorgrade. Der Jonckheere-TerpstraTest zeigt eine exakte Signifikanz von 0,007 (2-seitig) bzw. 0,004 (1-seitig).
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab in 5 Fällen eine
ansteigende, in 2 Fällen eine gleich bleibende und in einem Fall eine fallende Anzahl
von Ki67-positiven Tumorzellen.
42
Ergebnisse
Abb. 3.4.1 Expression von MIB1 beim soliden ACC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
Abb. 3.4.2 Expression von MIB1 beim niedrigdiff. MEC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
Ergebnisse
43
Tumortyp ACC
Tumortyp MEC
Abbildung 3.4.3 Expression von MIB1/Ki67 in Abhängigkeit vom Tumortyp und Grad (schwarzer Balken =
Median, Punkt = Ausreißer mit Fallnummer)
44
3.5
Ergebnisse
EGFR
Von den 28 untersuchten adenoid-zystischen Karzinomen zeigen 20 (71%) keine
EGFR-Expression. Lediglich 4 von 28 (14,2%) zeigen, wie in der folgenden
Kreuztabelle 3.5.3 ersichtlich, eine Überexpression (2+/3+) von EGFR (Abb. 3.5.1).
EGFR Kreuztabelle ACC
Grad
EGFR
0
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
2
Anzahl
% innerhalb des Grades
3
Anzahl
% innerhalb des Grades
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
2
3
Gesamt
2
11
7
20
40,0%
68,8%
100,0%
71,4%
1
3
0
4
20,0%
18,8%
0%
14,3%
1
1
0
2
20,0%
6,3%
0%
7,1%
1
1
0
2
20,0%
6,3%
0%
7,1%
5
16
7
28
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Kreuztabelle 3.5.3: EGFR Expression bei ACC in Abhängigkeit vom Grad
Es
konnte
kein
statistisch
relevanter
Unterschied
der
unterschiedlichen
histologischen Subtypen in Bezug auf die EGFR-Expression festgestellt werden. Der
Exakte Test nach Fischer ergab einen p-Wert von 0,314 und ist somit nicht
signifikant.
Die 22 untersuchten MEC-Fälle zeigen eine deutlich höhere Expression von EGFR
als die ACC (Abb. 3.5.2). Die nachfolgende Kreuztabelle 3.5.4 verdeutlicht, dass
15/22 (=68,2%) eine Überexpression von EGFR (2+ und 3+) zeigen. Jedoch auch
bei den MEC konnte kein statistisch relevanter Unterschied der unterschiedlichen
histologischen Subtypen in Bezug auf die EGFR Expression festgestellt werden. Der
Exakte Test nach Fischer ergab einen p-Wert von 0,514 und ist somit nicht
signifikant.
Ergebnisse
45
EGFR Kreuztabelle MEC
Grad
EGFR
0
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
2
Anzahl
% innerhalb des Grades
3
Anzahl
% innerhalb des Grades
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
2
3
Gesamt
5
0
0
5
31,3%
0%
0%
22,7%
2
0
0
2
12,5%
0%
0%
9,1%
5
2
0
7
31,3%
50,0%
0%
31,8%
4
2
2
8
25,0%
50,0%
100,0%
36,4%
16
4
2
22
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Kreuztabelle 3.5.4: EGFR Expression bei MEC in Abhängigkeit vom Grad
Abb. 3.5.1 Überexpression von EGFR beim kribrif. ACC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
46
Ergebnisse
Abb. 3.5.2 Überexpression von EGFR beim hochdiff. MEC in 400x Vergrößerung (Originalgröße)
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und einem MEC ergab in 2 Fällen einen
ansteigenden und in einem Fall einen fallenden EGFR-Score. Bei den EGFRnegativen Primarien blieben die Rezidive ebenfalls EGFR negativ.
3.6
Her 2
Wie die nachfolgende Kreuztabelle 3.6.1 verdeutlicht, zeigen 12 von 28 (42,9%)
untersuchten ACCs keine Expression von Her 2 (Score 0). Die 16 restlichen ACCs
sind lediglich fleckförmig mit Her-2 tingiert (Abb. 3.6.2) und weisen einen Scorewert
von 1+ auf. Somit entsprechen sie ebenfalls einer negativen Her-2-Überexpression.
Eine immunhistochemische Überexpression (Score 3+) konnte bei keinem der ACCs
nachgewiesen werden. Somit zeigte der Exakte Test nach Fischer auch keinen
signifikanten Unterschied (p=0,516) der histologischen Bautypen in Bezug auf die
Her-2-Expression.
Ergebnisse
47
Kreuztabelle Her2/neu ACC
Grad
Her2/neu
0
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
2
3
Gesamt
1
8
3
12
20,0%
50,0%
42,9%
42,9%
4
8
4
16
80,0%
50,0%
57,1%
57,1%
5
16
7
28
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Kreuztabelle 3.6.1: Her 2/neu Expression bei ACC in Abhängigkeit vom Grad
Das nachfolgende Boxplotdiagramm (3.6.3.) zeigt graphisch noch einmal die
Verteilung der Her2/neu-Expression bei ACCs unterteilt nach den 3 Tumorgraden.
Tumortyp ACC
Graphik 3.6.3.
Die nachfolgende Kreuztabelle 3.6.4 zeigt bei 21 von 22 (95%) untersuchten MEC
keine Überexpression von Her 2, wobei neumal ein Scorwert 0 und zwölfmal ein
Scorewert 1+ vorlag. Lediglich ein highgrade MEC (geringdifferenziert) zeigte eine
starke (=3+) Her 2/neu-Expression (Abb. 3.6.5.). Somit zeigte der Exakte Test nach
48
Ergebnisse
Fischer auch keinen signifikanten Unterschied (p=0,144) der histologischen
Bautypen in Bezug auf die Her-2-Expression.
Kreuztabelle Her 2/neu
Grad
Her2/neu
0
1
2
3
Gesamt
6
2
1
9
37,5%
50,0%
50,0%
40,9%
10
2
0
12
62,5%
50,0%
0%
54,5%
0
0
1
1
% innerhalb des Grades
0%
0%
50,0%
4,5%
Anzahl
16
4
2
22
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
Anzahl
% innerhalb des Grades
1
Anzahl
% innerhalb des Grades
3
Gesamt
Anzahl
% innerhalb des Grades
Kreuztabelle 3.6.4: Her 2/neu Expression bei MEC in Abhängigkeit vom Grad
Das nachfolgende Boxplotdiagramm (3.6.6.) zeigt graphisch noch einmal die
Verteilung der Her 2/neu-Expression bei MECs unterteilt nach den 3 Tumorgraden.
Tumortyp MEC
Graphik 3.6.6.
Ergebnisse
Abb. 3.6.2 Schwach positive Expression von Her-2/neu beim kribriformen ACC in 400x
Vergrößerung (Originalgröße)
Abb. 3.6.5 Überexpression Dako-Score 3+ von Her-2/neu beim niedrigdiff. MEC in 400x
Vergrößerung (Originalgröße)
49
50
Ergebnisse
Da in unserem Untersuchungsgut bei den ACC und MEC kein DAKO-Score 2+
(schwache Positivität) vorkam, konnte auch eine in-situ-Hybridisierung zur
Validierung der Her-2-Überexpression verzichtet werden.
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab 2 mal einen von 0 auf
1+ ansteigenden, 2 mal einen sinkenden (von Score 1+ auf 0) und 4 mal einen
gleich bleibenden DAKO-Her 2/neu-Score. Da die Unterschiede im Dako-Score
zwischen dem Primarius und dem Rezidiv
die Scorwerte 0 und 1, also eine
Negativität der Her-2-Überexpression betreffen, sind sie bedeutungslos. Ein Shift
von Her-2/neu-Negativität im Primarius zu Her-2-Überexpression beim Rezidiv kam
nicht vor.
3.7
Korrelation der Ki67-Expression und der Expression von C-KIT bzw.
BCL-2
Bei der Untersuchung der Korrelation zwischen der Anzahl Ki-67 positiver
Tumorzellen und der Expression des Protooncogens BCL-2 zeigt sich in dem
folgenden Diagramm 3.7.1 ein linear steigender Zusammenhang bei den adenoidzystischen Karzinomen. Der Spearman-Rho-Korrelationskoeffizient beträgt für BCL2: 0,462 bei einer 2-seitigen Signifikanz von 0,015.
Das Diagramm zeigt einen scheinbar negativen linearen Zusammenhang zwischen
BCL-2-Expression bei steigender Anzahl Ki67-positiver Tumorzellen bei den MEC.
Jedoch zeigt die Berechnung des Spearman-Rho-Korrelationskoeffizienten keinen
statistisch relevanten Zusammenhang (2-seitige Signifikanz von 0,855) bei den
MECs.
Ergebnisse
51
ACC
MEC
ACC: R² Linear= 0,113
MEC: R² Linear= 0,011
Diagramm 3.7.1: Korrelation von BCL-2 und Ki-67 bei ACC und MEC
Weiterhin
wurde
der
Zusammenhang
zwischen
der
Anzahl
Ki67-positiver
Tumorzellen und der Expression von C-KIT untersucht. Die Untersuchung wurde
jedoch auf die ACCs beschränkt, da nur 1 von 21 untersuchten MECs überhaupt CKIT positiv war.
Graphisch ist der Zusammenhang in einem Boxplotdiagramm (3.7.2.) dargestellt.
Das Diagramm zeigt, dass die ACCs mit einer starken C-KIT-Expression auch eine
durchschnittlich höhere
Anzahl an Ki67-positiven Tumorzellen
haben. Der
Zusammenhang bestätigt sich bei der statistischen Korrelationsanalyse. Der
Kruskal-Wallis-Test zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied der Gruppen mit
keiner, geringer, mäßiger und starker C-KIT-Expression bei der Expression von
MIB1 (Ki67). Die Asymptotische Signifikanz beträgt 0,009.
52
Ergebnisse
Tumortyp: ACC
Diagramm 3.7.2 (schwarzer Balken = Median, Punkt = Ausreißer mit Fallnummer.; Sternchen =
Extremwerte mit Fallnummer)
Diskussion
4
53
Diskussion
Bei der vorliegenden Untersuchung wurde eine Fülle von Einzelbefunden erhoben.
Der
besseren
Übersichtlichkeit
wegen
werden
diese
nach
verschiedenen
Themenkomplexen gegliedert besprochen.
4.1
Diskussion zur Alters- und Geschlechtsverteilung der MEC und ACC
In dieser Studie zeigt sich bei der Auswertung der Geschlechtsverteilung ein
Überwiegen von weiblichen Patienten mit 75% bei den ACCs und mit 81% bei den
MECs. Der Frauenanteil unseres Patientengut liegt etwas über dem der großen
Speicheldrüsenregister: Der Anteil an Frauen liegt laut Armed Forces Institute of
Pathology (AFIP) und des Speicheldrüsenregisters Hamburg sowohl für die MECs
als auch für die ACCs bei 60%.
Das Durchschnittsalter unseres Patientenguts liegt für die ACCs bei 57 Jahren. Dies
passt zu den Angaben des AFIP (Altersgipfel in der 4.-6. Lebensdekade) und denen
des Speicheldrüsenregisters Hamburg (Altersgipfel in der 5.-7. Lebensdekade).
Ebenso verhält es sich bei den MEC, wo wir ein Durchschnittsalter unseres
Patientenguts von 49 Jahren ermittelt haben. Das Armed Forces Institute of
Pathology
gibt
hier
ein
Durchschnittsalter
von
47
Jahren
und
das
Speicheldrüsenregister Hamburg einen Altersgipfel in der 5. – 7- Lebensdekade an.
Zusammenfassend kann man, abgesehen vom etwas erhöhten Frauenanteil, von
einer repräsentativen Alters- und Geschlechtsverteilung der Tumoren unseres
Patientenguts ausgehen.
4.2
Primärlokalisation der Tumoren
Unsere Untersuchung beinhaltet zu 71% ACCs, die in der Parotis entstanden sind.
Dies ist häufiger als in der Literatur beschrieben. So sind entsprechend des
Speicheldrüsenregisters Hamburg 50 % und des Armed Forces Institute of
Pathology (AFIP) 55% der ACCs in den großen Speicheldrüsen lokalisiert.
54
Diskussion
Auch bei den MECs unserer Untersuchung entstammt der Großteil (77,2 %) den
großen Speicheldrüsen. Dies ist ebenfalls geringfügig häufiger als in der Literatur
beschrieben. So beträgt der Anteil der von den großen Speicheldrüsen
entspringenden MECs im Speicheldrüsenregister Hamburg 55% und im Armed
Forces Institute of Pathology (AFIP) 53%.
Ein möglicher Grund dafür, dass die meisten unserer untersuchten Karzinome ihren
Ursprung in den großen Speicheldrüsen haben, könnte sein, dass die Mehrzahl der
Fälle (72 %) in der HNO Universitätsklinik Köln operiert wurden, wo wegen der
Reputation als Zentrum für Parotischirurgie tendenziell eher Karzinome der großen
Speicheldrüsen operiert werden.
4.3
Diskussion Grading und Studiengröße
Bei der Auswertung der Häufigkeitsverteilung der histologischen Karzinom-Subtypen
zeigt sich, dass die Gruppen unterschiedlich groß sind. Die Mehrheit der ACC (57 %)
sind vom kribriformen Typ und die Mehrheit der MEC (73%) vom hochdifferenzierten
Typ. Dies passt zu den Angaben über die Häufigkeitsverteilung innerhalb der
Literatur. Wie aus den nachfolgenden Tabellen 4.1.1 und 4.1.2. ersichtlich ist,
machen die kribriformen ACCs und die hochdifferenzierten MECs auch in anderen
Untersuchungen den größten Anteil der untersuchten Fälle aus.
Die kleine Studiengröße mit 28 ACCs und 22 MECs hat zur Folge, dass beim
Vergleich
der
einzelnen
immunhistochemischen
histologischen
Marker
Subtypen
unterschiedlich
große
in
Bezug
Gruppen
auf
die
miteinander
verglichen werden müssen. So beinhaltet beim MEC die Gruppe niedrig
differenzierter MECs nur 2 Fälle. Untersuchungen zur Korrelation der Färbeintensität
mit dem Tumorgrad könnten somit durch solitäre „Ausreißer“ falsche Ergebnisse
liefern.
Die Inhomogenität der einzelnen Gruppen liegt an der unterschiedlichen Häufigkeit
der Karzinom-Subtypen innerhalb der Tumorentitäten. So kommen auch im
Speicheldrüsenregister Hamburg das kribriforme ACC und das hochdifferenzierte
MEC deutlich häufiger als die anderen Subdifferenzierungen vor.
Die
kleine
Studiengröße
ist
durch
das
allgemein
seltene
Auftreten
von
Speicheldrüsenkarzinomen bedingt. Die bislang veröffentlichten Studien verfügen
Diskussion
55
über die gleiche Problematik der geringen Studiengröße und der unterschiedlichen
Häufigkeit der 3 Tumorgrade wie die nachfolgenden Tabellen 4.3.1 und 4.3.2
verdeutlichen.
Quelle
tubulär
kribriform
solide
Studiengröße
19 %
41 %
41 %
37
12,5 %
75 %
12,5 %
24
Ettl et al. 2008 (48)
20 %
44 %
36 %
25
Freier et al. 2005 (52)
20 %
47 %
33 %
55
Gibbons et al. 2001 (61)
0
83 %
17 %
6
Norberg-Spaak et al.
56 %
26 %
17 %
30
Fujita et al 1999 (54)
23 %
65 %
11,7 %
77
Holst et al. 1999 (81)
20 %
60 %
20 %
30
20 – 30 %
45 %
20 %
Ohne Angabe
18 %
57 %
25%
28
Luukkaa et al. 2009
(105)
Sequeiros-Santiago et
al. 2009 (151)
1999 (122)
Seifert: Oralpathologie
Band I 1996
Eigene
Tab. 4.3.1: Literaturangaben zur Häufigkeitsverteilung der histolologischen Subtypen beim ACC
Quelle
Hochdiff.
Intermediär-
Niedrigdiff.
Studiengröße
diff.
Luukkaa et al. 2009
67 %
6%
28 %
18
Ettl et al. 2008 (48)
27 %
67 %
7%
15
Pires et al 2004 (133)
35 %
15 %
28 %
173
(105)
bei 22 % kein
Grading möglich
Nguyen et al 2003 (119)
50 %
21 %
12 %
42
Weed et al. 2003 (192)
39 %
21 %
39%
28
Gibbons et al. 2001 (61)
41 %
14 %
45 %
22
Yin et al 2000 (198)
37 %
35 %
28 %
71
Cho et al. 1997 (30)
20 %
48 %
32 %
25
56
Diskussion
Quelle
Hochdiff.
Intermediär-
Niedrigdiff.
Studiengröße
diff.
Speicheldrüsenregister
55 %
25 %
20%
327
AFIP
81 %
8%
11 %
377
Eigene
73 %
18 %
7%
22
Hamburg 1965 - 1992
Tab. 4.3.2: Literaturangaben zur Häufigkeitsverteilung der histolologischen Subtypen beim MEC
Wie die in der Tabelle aufgelisteten Literaturangaben verdeutlichen, ist unser
Studienkollektiv in Bezug auf die Größe und die prozentuale Verteilung der
einzelnen Grade, abgesehen von dem zu geringen Anteil an niedrig differenzierten
MECs, durchaus mit den bereits veröffentlichten Studien zu vergleichen. Ziel unserer
Studie war es primär, an einem kleinen Kollektiv Parameter zu ermitteln, die für die
Tumorbiologie wichtig sind, um in einer späteren zweiten Analyse die relevanten
Parameter an einem größeren Kollektiv zu untersuchen.
4.4
HER 2: Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Das Protooncogen Her-2 ist von Studien zu Mammakarzinomen bestens bekannt.
Seine Inhibition durch das Medikament Herceptin hat in der Therapie der
Mammakarzinome große Bedeutung gewonnen. So konnten zahlreiche
Studien
zeigen, dass bei Her-2-Überexpression eine Monotherapie mit Herceptin (17;33) und
eine Kombinationstherapie mit anderen Chemotherapeutika (128;163) eine höhere
Remissionsrate und eine längere Remissionsdauer induzieren.
Ziel dieser Untersuchung war es, die Her-2-Überexpression an MEC und ACC zu
untersuchen und mit dem histologischen Tumorgrad zu korrelieren, um mehr über
die Bedeutung dieser Protoonkogens bei den Speicheldrüsenkarzinomen zu
erfahren und Rückschlüsse auf Therapieoptionen zu ziehen. Weiterhin hat unseres
Wissens bislang keine Studie Rezidivfälle mituntersucht und mit den Primarien
verglichen.
Bei unserem Patientengut zeigte sich keine Her-2-Überexpression (DAKOHerceptest-Score 2+ & 3+) bei den 28 untersuchten ACCs und lediglich in einem Fall
Diskussion
57
eine Überexpression (5 %) bei den 22 untersuchten MECs. In der Literatur (Tab.
4.4.1 & Tab. 4.4.2.) findet man kontroverse Angaben zur Überexpression von Her-2.
Quelle
ACCs
in
%
mit
Her-2
Anzahl Patienten
Überexpression
Locati et al 2009* (102)
0
60
Ettl et al. 2008* (48)
36 % *
25
Glisson et al. 2004* (63)
4%
70
Dori et al. 2002 (41)
16 %
32
Gibbons et al. 2001 (61)
0
6
Cho et al. 1999 (30)
17 %
30
Karja et al. 1999 (89)
58 %
103 verschiedene
Speicheldrüsenkarzinome
Shintani et al. 1995 (154)
100 %
16
Sugano et al. 1992 (173)
0
Unbekannt
Kernohan et al. 1991 (90) 5
19
Eigene
28
0 %*
Tab. 4.4.1: Übersicht Anzahl ACC mit Her-2 Überexpression verschiedener Autoren
* Überexpression nur bei Fällen mit 2+ oder 3+ komplette Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen.
(DAKO-Herceptest Score 2+ und 3+).
Quelle
MECs
in
%
mit
Her-2
Anzahl Patienten
Überexpression
Locati et al 2009* (102)
0
5 (nur Grad 3)
Ettl et al. 2008 (48)
13 % *
15
Shang et al. 2008* (153)
4 %*
46
Glisson et al. 2004* (63)
21 %*
14
Pires et al. 2004 (133)
80%
173
Gibbons et al. 2001 (61)
14 %
22
Cho et al. 1997 (30)
36 %
25
Press et al. 1994 (139)
38 %
58
Sugano et al. 1992 (173)
0%
Unbekannt
Kernohan et al. 1991 (90) 17 %
6
Eigene
22
5 %*
Tab. 4.4.2: Übersicht Anzahl MEC mit Her-2 Überexpression verschiedener Autoren
* Überexpression nur bei Fällen mit 2+ oder 3+ komplette Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen
(DAKO-Herceptest Score 2+ und 3+).
58
Diskussion
Im Vergleich zu unseren Zahlen berichten die meisten Autoren (abgesehen von
Shang et al. und Sugano et al.) über deutlich größere Raten an Her-2Überexpression. Die Unterschiede sind teilweise durch die sehr kleinen Fallzahlen
sämtlicher vorhandener Studien zu erklären, die dadurch kein repräsentatives
Patientengut darstellen. Weitere Unterschiede liegen bei den verwendeten
Antikörpern, Färbemethoden, Art und Länge der Fixation, Vorbehandlung der
Gewebeschnitte,
Immunhistochemie-Reagenzien
und
insbesondere
den
Auswertungskriterien. So bewerteten Press et al.(139) jegliche feststellbare Färbung
auch von einer kleinen Anzahl an Tumorzellen als positiv für Überexpression.
Dagegen verwendeten Glisson et al. (63) und Ettl et al. 2008 (48) in ihreren Studien
– wie wir – die an Mammacarcinomen entwickelten Herceptest-Bewertungskriterien
und fanden so deutlich weniger positive Reaktionen.
Des weiteren konnte in unserer Untersuchung bei den beiden Karzinomtypen keine
statistisch signifikannte Korrelation zwischen einer Her-2-Überexpression und dem
histologischen Tumor-Subtyp gefunden werden, obwohl der einzige Fall mit
Überexpression vom Grad 3+ bei einem niedrigdifferenzierten MEC zu finden war. In
unserem Untersuchungsgut waren allerdings nur 2 niedrig diff. MECs enthalten,
wobei das andere niedrig diff. MEC keine Her-2-Über-Expression zeigte. Wegen der
sehr
geringen
Anzahl
an
niedrig
differenzierten
MEC
sind
unsere
Untersuchungsbefunde für die Her-2-Expression bei niedrig differenzierten MEC
nicht als repräsentativ anzusehen.
Einige Untersuchungen konnten eine Korrelation zwischen dem histologischen
Tumorgrad bei den MECs und der Her-2-Über-Expression nachweisen (47;86;119).
Andere Autoren konnten eine Korrelation zwischen Her-2-Überexpression und
schlechtem outcome bei Patienten mit MEC nachweisen (119;139;192), wobei Press
et al. (136) jegliche Membranfärbung bereits als Überexpression werteten. Cho et al.
fanden ein kürzeres rezidivfreies Intervall bei Her-2 überexprimierenden ACCs (n=30)
(31), wobei in dieser Studie nicht die gleichen Auswertungskriterien verwendet
wurden.
Demgegenüber
konnten
Ettl
et
al.
(47),
die
die
gleichen
Auswertungskriterien wie wir benutzten bei 15 untersuchten MEC keine Korrelation
einer Her-2-Über-Expression und der Prognose finden.
Diskussion
59
Unterschiede in der Frequenz der Her-2-Überexpression finden sich auch bei den
Mammakarzinomen. So zeigten vergleichende Untersuchungen von Press et al.
(137) bei Biopsien von Mammakarzinomen unterschiedliche Sensitivitätsraten in
Abhängigkeit von der verwendeten Technik zur Demaskierung des Epitops vor dem
Aufbringen des Primärantikörpers. Ebenso zeigte Frischmaterial deutlich höhere
Positivitätsraten
Untersuchung
als
formalinfixiertes
verwendet
wurde.
Gewebe,
Auch
in
der
welches
auch
Sensitivität
bei
und
unserer
Spezifität
verschiedener kommerziell erhältlicher Antikörper findet sich ein Grund für die
variierenden Überexpressionsraten bei Mammakarzinomen (112;137). Bei den
Speicheldrüsenkarzinomen kommt für den Vergleich der Daten verschiedener
Arbeitsgruppen erschwerend hinzu, dass für sie anders als beim Mamma- oder
Magen-Karzinom
noch
kein
allgemein
anerkanntes
organspezifisch
und
therapiebezogen validiertes immunhistochemisches Auswertungssystem besteht.
Unsere Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab 2 mal einen von
0 auf 1+ ansteigenden, 2 mal einen sinkenden (von Score 1+ auf 0) und 4 mal einen
gleich bleibenden DAKO-Her 2/neu-Score. Da die Unterschiede im Dako-Score
zwischen dem Primarius und dem Rezidiv
die Scorwerte 0 und 1, also eine
Negativität der Her-2-Überexpression betreffen, sind sie bedeutungslos. Ein Shift
von Her-2/neu-Negativität im Primarius zu Her-2-Überexpression beim Rezidiv kam
nicht vor. Unseres Wissens hat bislang keine Studie die Her-2-Expression der
Primarien mit der Her-2-Expression der Rezidive verglichen.
Das in unserer Studie verwendete semiquantitative immunhistochemische Testkit
(Hercep-Test®) wird bereits regelhaft zur Bestimmung des Her-2/neu-Status bei
Mammakarzinomen eingesetzt und ist hierfür in den USA als Testkit zugelassen.
(66). Als Testverfahren vor einer geplanten Therapie mit Trastuzumab (Herceptin®)
hat die Immunhistochemie als einfaches und gut reproduzierbares semiquantitatives
Verfahren große Bedeutung erlangt (15;27;50). Aus diesem Grund wurde der
Hercep-Test® in unserer Untersuchung verwendet.
Der Anti-Her 2/Erb-B2-Antikörper Trastuzumab (Herceptin®) entfaltet seine Wirkung,
indem er die Heterodimerbildung zwischen Her 2/neu und dem EGF-R blockiert und
dadurch mit der Signaltransduktion von Her 2/neu interferiert. Ein natürlicher Ligand
60
Diskussion
konnte für Erb-B2 bisher nicht nachgewiesen werden. Durch diese Blockade der
Signaltransduktion vermittelt Trastuzumab in Her2/neu überexprimierenden Zellen
eine Wachstumshemmung und sensibilisiert diese Zellen für die Apoptoseinduktion,
z. B. durch Chemotherapeutika (38).
Die Studienlage spiegelt eine uneinheitliche Meinung über die Bedeutung der
Expression des Her-2-Onkogens in den Speicheldrüsenkarzinomen vom Typ der
ACC und der MEC wider. Die Bedeutung von Her-2/neu und den daraus
resultierenden therapeutischen Möglichkeiten wird kontrovers diskutiert.
Unseres Erachtens ist ein molekulartherapeutischer Ansatz analog zu den
Mammakarzinomen (46;163;195) aufgrund der seltenen Überexpression (2+ & 3+)
bei den ACCs und MECs der Speicheldrüsen eher wenig Erfolg versprechend. Erste
Hinweise hierfür finden sich in klinischen Studien. In einer Phase-II-Studie von 2003
zur Herceptintherapie zeigte von den 14 eingeschlossenen Patienten mit
metastasierten Speicheldrüsenkarzinomen (davon 3 MECs und 2 ACCs) und Her-2Überexpression gerade mal ein Patient mit MEC ein partielles Ansprechen der
Therapie; die Studie wurde im Verlauf abgebrochen (69). Eine weitere Phase-IIStudie zu Lapatinib, einem EGFR und Her-2-Rezeptor-Hemmer, konnte bei 40
Patienten mit Speicheldrüsenkarzinomen (mit 20 ACC und 2 MEC) kein TherapieAnsprechen zeigen (3). Eine Studie, in der selektiv der therapeutische Effekt von
Herceptin bei immunhistochemisch Her-2/neu-über-exprimierenden (im Sinne des
DAKO-Score 3+) MECs
untersucht wurde – dies wäre in Analogie zu den
Erfahrungen beim Mamma-Karzinom sinnvoll – liegt unseres Wissens derzeit noch
nicht vor.
Möglicherweise bietet aber die Kombination von Herceptin mit konventionellen
Chemotherapeutika einen neuen Therapieansatz selektiv bei den wenigen Her-2überexprimierenden Speicheldrüsenkarzinomen. Erste Hinweise dazu findet man
bereits in der Literatur (70;103).
Weitere klinische Studien sind nötig, um ein genaueres Bild von der Bedeutung der
Anti-Her-2-Rezeptortherapie zu bekommen.
Diskussion
4.5
61
EGFR: Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Das Protoonkogen EGFR ist bereits bei vielen verschiedenen Arten von Carcinomen
untersucht worden. Hierzu gehören Kopf-/Hals-, Bronchial-, Mamma-, Ovarial-,
kolorektale, renale, Harnblasen und ZNS-Karzinome (92). Die existierenden Studien
zu ACC und MEC haben meist kleine Fallzahlen und präsentieren teils kontroverse
Ergebnisse, daher war es nochmals nötig, systematisch die EGFR-Expression in
Abhängigkeit vom histo-pathologischen Grad zu untersuchen. Weiterhin sind
unseres Wissens bislang keine Rezidivfälle mituntersucht und mit den Primarien
verglichen worden.
In unserer Untersuchung wurde eine Überexpression von EGFR bei beiden
Karzinomarten beobachtet, jedoch wurde eine deutlich höherere Frequenz bei den
MEC gefunden. In den folgenden beiden Tabellen werden die eigenen Ergebnisse
den Daten, die in der Literatur zu finden sind, gegenübergestellt.
Quelle
% mit EGFR Überexpression
Anzahl Patienten
Dahse et al. 2009 (36)
96 %
25
(davon 64% 3+ in > 10% der
Zellen)
Monteiro et al. 2009 (114)
11% *
19
Sequeiros-Santiago
0%
21
Locati et al. 2009 (102)
77 %*
60 (nur Grad 3 Karzinome)
Ettl et al. 2008 (47)
36 % **
25
2009 (151)
Sørensen et al. 2006* 77 %*
13
(167)
Vered et al. 2002 (189)
85 %
27
Gibbons et al. 2001 (61)
0
6
Shintani et al. 1995 (154)
0
16
Kusafuka 1991 (95)
2%
49
Eigene
14 %*
28
Tab. 4.5.1: Übersicht Anzahl ACC mit EGFR-Überexpression verschiedener Autoren
* Überexpression: Fälle mit moderater bis starker kompletter Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen
(Dako-Score 2+ und 3+).
** Überexpression: Fälle mit starker kompletter Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen (Dako-Score 3+ )
62
Diskussion
Quelle
% mit EGFR Überexpression
Anzahl Patienten
Dahse et al. 2009 (36)
90 %
10
(davon 44% 3+ in > 10% der
Zellen)
Monteiro et al. 2009 (114)
64 %*
14
Locati et al. 2009 (102)
100 %*
5 (nur Grad 3 Karzinome)
Ettl et al. 2008 (47)
53 % **
15
Shang et al. 2008 (153)
67 % *
46
Sørensen et al. 2006 78 %*
9
(167)
Gibbons et al. 2001 (61)
68%
22
Yamada et al. 1989 (196)
25 %
108
verschiedene Speicheldrüsen-
karzinome
Eigene
68 %*
22
Tab. 4.5.2: Übersicht Anzahl MEC mit EGFR-Überexpression verschiedener Autoren
* Überexpression nur bei Fällen mit 2+ oder 3+ komplette Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen.
** Überexpression nur bei Fällen 3+ komplette Membranfärbung in mindestens 10% der Zellen
Sowohl unsere Daten als auch die Daten der Literatur zeigen, dass EGFR deutlich
häufiger bei MEC als bei ACC überexprimiert wird. Die Anzahl EGFR exprimierender
Karzinome passt zu einigen der bereits veröffentlichten Studien. Andere Studien
(Dahse et al 2009, Locati et a. 2009, Sørensen et al. 2006 und Vered et al. 2002)
beschreiben deutlich höhere Expressionsraten sowohl beim ACC als auch beim
MEC. Bei einigen der vorhandenen Studien wurde die Überexpression unsauber
bzw.
nicht
exakt
definiert,
sondern
jegliche
positive
Färbung
(auch
Zytoplasmafärbung) als Überexpression gewertet (siehe Tab. 4.5.1 und Tab. 4.5.2).
Wir konnten bei beiden Karzinomarten keine Korrelation zwischen der EGFRExpression und dem histologischen Grad finden. Dies steht im Einklang mit
Sorensen et al. 2006 (167) und im Gegensatz zu einigen anderen Untersuchungen,
die dies ebenfalls untersucht haben.
So korreliert in einer Studie an 101 Speicheldrüsenkarzinomen (25 ACC und 15
MEC) die Überexpression von EGFR (3+) mit einer schlechten Prognose (47).
Eine weitere Untersuchung an 16 MEC konnte eine Korrelation zwischen EGFRÜberexpression und dem histologischen Tumorgrad bzw. einer schlechten Prognose
feststellen (83). Monteiro et al. 2009 (114) fanden zwar eine Korrelation der EGFRExpression mit dem histologischem Tumorgrad, nicht jedoch mit der Prognose.
Diskussion
63
Die Unterschiede in der Frequenz der EGFR exprimierenden Karzinome und der
Korrelation von EGFR-Expression und Tumorgrad in unserer Untersuchung im
Vergleich zu anderen bereits publizierten Studien sind möglicherweise dadurch zu
erklären, dass die anderen Untersuchungen eine Korrelation an einem Mischkollektiv
aus verschiedensten Speicheldrüsenkarzinomen statistisch untersucht haben. Wir
haben jedoch eine Korrelation nur innerhalb der Karzinomarten einzeln untersucht.
Weitere mögliche Faktoren sind die kleinen Fallzahlen unserer und sämtlicher
vorhandener Studien sowie Unterschiede bei den verwendeten Antikörpern, den
Färbemethoden,
den
Immunhistochemie-Reagenzien
und
den
Auswertungsmethoden.
Unsere Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC zeigt nur bei einem
soliden ACC einen Shift von einer fehlenden Überexpression (Score 0) auf eine
leichte Überexpression (Score 2+). Die restlichen Rezidive zeigen wie auch die
Primarien keine Überexpression (Score 0 & 1+) von EGFR.
Allen Studien und unserer Untersuchung gemeinsam ist eine hohe EGFRÜberexpressionsrate bei den mukoepidermoiden Karzinomen. Dies spricht für die
Bedeutung des EGFR bei den MEC und macht den Rezeptor zu einem möglichen
Ziel einer Karzinomtherapie.
Für den EGF-Rezeptor konnte bereits früh gezeigt werden, dass die Hemmung der
Ligandenbindung einen Wachstumsarrest in Zellen mit konstitutiv aktiviertem EGFR
auslöst. Ein solcher blockierender monoklonaler Antikörper, Cetuximab, zeigt eine
Wirksamkeit in der Monotherapie, insbesondere aber in Kombination mit Radiound/oder Chemotherapie in Phase-I/II-Studien bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren
oder Kolonkarzinomen. Cetuximab bindet an die Domäne III des EGFR und hemmt
hierdurch die Bindung von Liganden und die für die Rezeptorbindung wichtige
Homodimerisierung des Rezeptors (38).
Cetuximab hemmt dosisabhängig die Proliferation menschlicher Tumorzellen. Diese
Hemmung der Proliferation bewirkt einen Arrest des Zellzyklus in der G1-Phase
und/oder einen Anstieg der Apoptose. Außerdem hemmt Cetuximab die Produktion
des vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) und somit die Angiogenese
(73).
64
Diskussion
Daneben
existieren
weitere
Möglichkeiten
einer
EGFR-Inhibition
mittels
Tyrosinkinase-Inhibitoren (z.B. Gefitinib, Erlotinib), radioaktiv markierten Antikörpern
und
Immuntoxinen,
die
in
Kombination
mit
anderen
Therapieformen
wie
konventioneller Strahlentherapie eingesetzt werden könnten (37;110;187). Der
Tyrosinkinaseinhibitor
Gefitinib
konnte
in
einer
Phase-II-Studie
an
28
Speicheldrüsenkarzinomen (darunter 19 ACCs und 2 MECs) bei 68% der Patienten
eine Stabilisierung der Erkrankung erreichen (62).
Die Hemmung des EGF-Rezeptors kann zelluläre Erholung nach Stahlentherapie
inhibieren und die Strahlentherapie damit wirkungsvoller gestalten (93). Die
kombinierte Hemmung des EGF-Rezeptors sowie des Her-2- bzw. des VEGFRezeptors bietet weitere molekulartherapeutische Ansatzmöglichkeiten. Erste
Studien auf diesem Gebiet haben bereits interessante Ergebnisse gezeigt
(3;110;199). Weitere Studien sind jedoch nötig.
4.6
C-KIT: Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Die Überexpression der Tyrosinkinase C-KIT wurde bisher in GISTs (gastrointestinal
stromal tumors) (80), der Uvea (9), kleinzelligen Lungenkarzinomen (118), nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen (132), akuten myeloblastischen Leukämien (85),
Mammakarzinomen (78;118), Keimzelltumoren des Hodens (118) (172) und
Glioblastomen
(99) gefunden.
Auch
bei einigen
Speicheldrüsenkarzinomen
(adenoidzystische-, Azinuszell-, polymorphe low-grade-, epithelial-myoepithelialeKarzinome,
Karzinosarkom,
Karzinom
aus
pleomorphen
Adenom,
lymphoepithelioma-ähnliche und Basalzell-Adenokarzinome) wurde bereits eine
Überexpression von mehreren Autoren beschrieben (12;44;48;87), jedoch ohne
dabei die histologischen Subtypen zu differenzieren. Außerdem variieren die
Expressionsraten und die Auswertungskriterien in den genannten Arbeiten deutlich –
so werteten z.B. Edwards et al 2003 eine reine Zytoplasmafärbung in mehr als 10 %
der Tumorzellen als Überexpression. Daher war das Ziel dieser Arbeit, noch einmal
systematisch die Expression des C-KIT-Rezeptors bei MECs und ACCS nach
Differenzierungsgraden unterteilt und semiquantitativ bewertet zu untersuchen.
Außerdem hat unseres Wissens bislang keiner die Expression der Rezidivfälle mit
den Primarien verglichen.
Diskussion
65
Am besten untersucht ist eine C-KIT-Überexpression an soliden Stromatumoren des
Gastrointestinaltraktes (GIST). Bei diesen gehört der kompetitive Hemmer der
Tyrosinkinase Imatinib (STI571, Glivec®) schon zu den etablierten Therapieoptionen.
Imatinib
ist
ein
Tyrosinkinase-Inhibitor,
der
den
C-KIT-Tyrosinkinase-
Oberflächenrezeptor blockiert (2). Ebenfalls auf C-KIT ansprechende Inhibitoren sind
PKC412 (Midostaurin) und PTK 787 (Vatalanib), die sich noch in der Entwicklung
bzw. Testung befinden (21).
Bei der Untersuchung von C-KIT konnten wir eine deutliche Überexpression (siehe
Kap. 2.3.) bei den ACC und keine bei den MEC erkennen. Weiterhin bestand die CKIT Expression der ACCs bevorzugt in den luminale Zellen; dies steht im Einklang
mit Penner et al. (129), die schlussfolgerten, dass die übrigen, myoepithelialen
Tumorzellen somit kein C-KIT exprimieren. Interessanterweise findet sich eine CKIT-Expression sowohl bei den tubulären, kribriformen als auch den soliden
(entdifferenzierten) ACCs. Die soliden ACCs zeigen mit 71 % im Vergleich zu den
tubulären/kribriformen mit 60% eine etwas größere C-KIT-Überexpressionsrate.
Dieser Unterschied ist zwar statistisch nicht signifikant, spricht jedoch für die
mögliche Bedeutung von C-KIT für das aggressivere Verhalten der soliden ACCs.
Die nachfolgende Tabelle gibt eine Übersicht der bislang veröffentlichten C-KITÜberexpressionsraten im Vergleich zu unserer Untersuchung.
Quelle
% mit C-KIT Überexpression
Anzahl Patienten
Sequeiros-Santiago
57 % *
24
Locati et al. 2009 (102)
65 %*
54
Ettl et al. 2008 (48)
92 %*
25
Sørensen et al. 2006 92 %*
18
2009 (151)
(167)
Andreadis et al. 2006 79 % *
14
(12)
Beltran et al. 2006 (20)
58 %*
12
Aslan et al. 2005 (13)
78 %
45
Went et al. 2004
56 %*
52
(194)
66
Diskussion
Quelle
% mit C-KIT Überexpression
Anzahl Patienten
Edwards et al 2003 (44)
100
15
%
(aber
nur
Cytoplasmafärbung in > 5% d. Zellen)
Penner 2002 (129)
89
%*
(aber
nur
9
Cytoplasmafärbung in > 25% der
Zellen)
Jeng et al. 2000* (87)
60 %*
25
Holst et al. 1999* (81)
56 %
30
Eigene*
63% *
27
Tab. 4.6.1: Übersicht Anzahl ACC mit C-KIT-Überexpression verschiedener Autoren
* moderate bis starke Überexpression
Quelle
% mit C-KIT-Überexpression
Anzahl Patienten
Locati et al. 2009 (102)
0*
5 (nur Grad 3)
Ettl et al. 2008 (48)
40 %*
15
Sørensen et al. 2006 22 %*
9
(167)
Andreadis et al. 2006 0*
3
(12)
Went et al. 2004 (194)
0*
5
Jeng et al. 2000 (87)
0 %*
19
Eigene
0 %*
21
Tab. 4.6.2: Übersicht Anzahl MEC mit C-KIT-Überexpression verschiedener Autoren
* moderate bis starke Überexpression
Unsere Ergebnisse stimmen bestens mit Went et al. überein, weil wir die gleichen
Auswertungskriterien (nur Berücksichtigung der Membranfärbung bei der Mehrzahl
der Tumorzellen; siehe Kap. 2.3.) und den gleichen Primärantikörper (DAKO A4502)
verwendet
haben.
Die
meisten
der
übrigen
Untersuchungen
zur
C-KIT-
Überexpression zeigen eine etwas höhere C-KIT-Überexpressionsrate als unsere
Untersuchung. Der Trend mit einer deutlich höheren Frequenz der Überexpression
bei den ACC im Vergleich zu den MEC stimmt jedoch mit der Literatur überein. Die
teilweise vorhandenen Unterschiede unserer Überexpressionsraten im Vergleich zur
Literatur liegen vor allem an Unterschieden bei der Auswertung und Bewertung einer
Überexpression. So werteten einige Autoren auch eine reine Zytoplasmafärbung als
positiv. Auch die Kriterien für eine moderate oder starke Überexpression variieren.
Die Auswertungskriterien (siehe Kap. 2.3.) von Went et al. (Überexpression bedeutet:
Schwache Membranfärbung in ≥ 60% oder moderate Membranfärbung in ≥ 30%
Diskussion
67
oder starke Membranfärbung ≥10% der Tumorzellen) überzeugten uns am meisten
und wurden daher für unsere Auswertung verwendet. Weitere Unterschiede im
Vergleich
zur
Literatur
Antikörperverdünnung,
liegen
bei
Färbemethoden,
den
verwendeten
Art
und
Antikörpern,
Länge
der
der
Fixation,
Entparaffinierung, Vorbehandlung der Gewebeschnitte und ImmunhistochemieMethode.
Unterschiedliche
Expressionsraten
bei
Anwendung
verschiedener
Primärantikörper konnten Mino et al. (111) nachweisen. Bei einem Vergleich der
Ki67-Antikörper H300 und A4502 zeigte sich bei den 66 untersuchten ACCs in 52%
bzw. 71% der Fälle eine C-KIT-Überexpression.
Eine Korrelation zwischen der C-KIT-Expression und dem histopathologischen Grad
konnten wir nicht finden. Dies passt zu den Ergebnissen von Sorensen et. al. 2006
(167). Diese Autoren konnten genau wie Aslan et al. (13) keine Korrelation der
Überexpression von C-KIT zum Gesamtüberleben finden. Im Gegensatz dazu
zeigten Host et al. (81) eine Korrelation zwischen dem soliden histopathologischen
ACC-Subtyp und einer C-KIT-Überexpression. Demgegenüber fanden Freier et al.
(52) eine signifikant niedrigere C-KIT-Expression bei den soliden ACCs im Vergleich
zu den kribriformen/tubulären ACCs. Ebenso wiesen Ettl et al. (48) eine negative
Korrelation der C-KIT-Überexpression mit der Prognose nach, das heißt die
aggressiveren Karzinome zeigen einen Verlust der C-KIT-Expression. Im Gegensatz
dazu konnten Bell et al. 2010 (18) eine Korrelation zwischen C-KIT-Expression und
schlechtem
3-Jahres-Überleben
feststellen.
Diese
teilweise
gegensätzlichen
Befunde dürften auf die oben erwähnten Unterschiede in der immunhistochemischen
Methodik und der Auswertungskriterien zurückzuführen sein.
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und einem MEC ergab, dass der C-KITScore in 3 Fällen gleich bleibend, in 2 Fällen steigend und in 2 Fällen fallend war.
Somit verhält sich die C-KIT Expression bei den Rezidiven eher indifferent. Ein
Trend ist nicht zu erkennen. Das passt zu den Ergebnissen von Aslan et al.(13), die
keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen C-KIT-Expression und
Lokalrezidiv oder Fernmetastasen finden konnten.
Die hohe Rate der C-KIT-Überexpression bei den ACC legt den Schluss nahe, dass
eine Inhibition des C-KIT-Pathways eine sinnvolle Therapieoption darstellen könnte.
Erste Untersuchungen zur Wirksamkeit von Imatinib ergaben jedoch divergierende
68
Diskussion
Ergebnisse. Eine Phase-II-Studie (Hotte et al. 2005) zu Imatinib aus dem MargaretHospital in Chicago (82) konnte an 16 nicht resezierbaren und C-KIT positiven ACCs
keinen klinischen Effekt feststellen. Ebenso konnten Pfeffer et al. (131) an 10
Patienten mit ACC der Hals/Kopf-Speicheldrüsen unter Imatinib-Therapie keine
objektive Ansprechrate feststellen. Demgegenüber konnte eine Phase-II-Studie aus
dem Beaujou Universitäts-Krankenhaus in Frankreich (Faivre et al. 2005) an 6
Patienten mit pulmonal metastasiertem ACC mit einer Imatinib-Therapie in 3 Fällen
einen stationären Krankheitsverlauf ohne Progress und in einem Fall
eine
objektivierbare Ansprechrate nachweisen (49).
Die unterschiedlichen Ergebnisse einer Imatinib-Therapie liegen möglicherweise an
dem Grad der C-KIT-Überexpression, so wurden in der Phase-II-Studie von Faivre et
al. 2005 nur Patienten mit starker C-KIT-Überexpression eingeschlossen, bei Hotte
et al. 2005 zeigten jedoch gerade mal 4 von 16 eingeschlossenen Patienten eine CKIT-Überexpression. Die insgesamt fehlende oder geringe Wirksamkeit einer
Imatinib-Therapie bei den ACCs könnte aber auch daran liegen, dass es nicht über
eine aktivierende Mutation (gain of function) im Exon 11 (Juxtamembran-Domäne)
wie bei den GIST (80;98) oder über eine Mutation im Exon 17 (Thyrosin-Kinase
Domäne) wie bei den Mast-Zell-Tumoren (104) zu der Überexpression kommt. So
konnten weder Holst et al. 1999 (81) noch Y.M. Jeng et al. 2000 (87) eine der
relevanten, zuvor genannten Mutationen bei den C-KIT-positiven ACCs nachweisen.
Die C-KIT-Überexpression scheint somit durch Hochregulation und nicht durch
Mutation vermittelt zu sein.
Aber auch die Kombination von Imatinib mit anderen Chemotherapeutika kann eine
sinnvolle Alternative sein. So konnten Bruce et al.(23) an einer ACC-Zellkultur einen
synergistischen Effekt bei der Kombination von Imatinib und Cisplatin feststellen.
Eine nachfolgende Phase-II-Studie zur Kombinationstherapie von Imatinib und
Cisplatin bei 28 metastasierten ACCs (Kopf-Hals-Region) konnte bei 5 Patienten
zumindest eine partielle Therapieantwort in der
18
F-Fluordesoxyglucose- Positronen-
Emissions-Tomographie (FDG-PET) und eine Krankheitsstabilisierung bei insgesamt
19 Patienten nachweisen (59). Dies sind interessante erste Ergebnisse zu den
therapeutischen Möglichkeiten einer C-KIT-Inhibition bei den ACCs. Es werden aber
weitere und vor allem größere klinische Studien benötigt, um eine sichere Aussage
über den Effekt von Imatinib bei den ACCs treffen zu können.
Diskussion
4.7
69
MIB 1 (Ki67): Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Das Ki-67-Antigen ist das bekannteste Antigen zur immunhistochemischen Messung
der proliferativen Akitivät von Gewebe (58).
Der Mittelwert der Ki67-Expression unserer Untersuchung war bei den ACC mit
20,85 (±16,7) geringgradig höher als bei den MEC mit 14,45 (±17,1). Die
nachfolgende Tabelle gibt eine Übersicht der bereits veröffentlichten Ergebnisse im
Vergleich zu der vorliegenden Untersuchung.
Quelle
Mittlerer Ki67-Färbeindex in %
Vacchi-Suzzi et al. 2010 50% haben >15% Ki67 pos. Tumorzellen
Studiengröße n =
2
(182)
Saghravanian et al. 2009 22,5 ± 9,2
10
(142)
Vargas et al. 2008 (185)
13.10 ± 9.18
13
Beltran et al. 2006 (20)
3,71
12
Alves et al. 2004 (11)
40 % haben >5% Ki67 pos. Tumorzellen
15
Hirabayashi 1999 (79)
10,7
28
Nordgard et al. 1997 (123)
5,2
44
Skalova et al. 1997 (160)
24
20
Murakami et al. 1992 (115)
18,4
4
Eigene
20,85± 16,7
27
Tab. 4.7.1: Übersicht mittlere Ki67-Expression bei ACC verschiedener Autoren
Quelle
Mittlerer Ki67-Färbeindex in %
Studiengröße
n=
Vacchi-Suzzi et al. 2010 29 % haben >15% Ki67 pos. Tumorzellen
7
(182)
Miyabe et al. 2009 (113)
14,4
101
Vargas et al. 2008 (185)
5.21 ± 4.47
10
Van Heerden et al. 2005 22,2
21
(184)
Alves et al. 2004 (11)
47,7% haben >5% Ki67 pos. Tumorzellen
15
Pires et al. 2004 (133)
34,1
173
Murakami et al. 1992 (115)
14
1
Eigene
14,45± 17,1
22
Tab. 4.7.2: Übersicht mittlere Ki67-Expression bei MEC verschiedener Autoren
70
Diskussion
Bei den ACC konnten wir keinen statistisch signifikannten Unterschied der 3
Tumorgrade in Bezug auf die Proliferationsrate (Jonckhere Terpstra exakte
Signifikanz 1-seitig: 0,068) feststellen. Dies passt zu einer Untersuchung von Vargas
et al. 2008 (185). Vergleicht man jedoch nur die soliden ACCs mit den nicht soliden
Subtypen (kribriforme und tubuläre zeigen eine ähnliche mittlere Proliferationsrate),
so zeigten die soliden ACCs eine höhere Proliferationsrate als die vorgenannten.
Dies passt zu bereits publizierten Studien (123;147), die ebenfalls eine höhere
Proliferationsrate bei den soliden ACCs im Vergleich zu den anderen Subtypen
feststellen konnten.
Bei den MEC zeigten unsere Daten eine statistisch signifikante Korrelation der
Proliferationsrate (gemessen an der Anzahl Ki67 positiver Tumorzellen) und dem
Tumorgrad. Dies korreliert gut mit den bereits publizierten Untersuchungen (119)
(126) (184) (198). Die nachfolgende Tab. 4.7.3. zeigt die durchschnittliche
Proliferationsrate der einzelnen Tumorgrade.
Demnach nimmt mit steigendem Malignitätsgrad auch der Prozentsatz an Ki67positiven Tumorzellen zu (Jonckhere Terpstra exakte Signifikanz 2-seitig: 0,007),
auch dies passt gut zu bereits publizierten Studien (158;179;184).
Ränge
Ki67
a
Ränge
Grad
N
Mittlerer Rang
1
4
12,63
2
16
3
7
Gesamt
27
a. Tumortyp = ACC
b
Grad
N
Mittlerer Rang
1
16
9,53
12,44
2
4
14,38
18,36
3
2
21,50
Gesamt
22
Ki67
b. Tumortyp = MEC
Tab. 4.7.3. Mittlere Ränge der Anzahl Ki67 positiver Zellen der einzelnen Tumorgrade
In der Literatur finden sich zahlreiche retrospektive Untersuchungen, die eine
Korrelation zwischen dem Ki67-Färbeindex und der Prognose oder dem rezidivfreien
Intervall bei Speicheldrüsenkarzinomen nachweisen konnten.
Ettl et al. fanden in einer klinisch-histologischen retrospektiven Untersuchung an
Speicheldrüsenmalignomen (inkl. ACC und MEC) heraus, dass die Expression des
Proliferationsmarkers Ki67 in mehr als 30% der Zellen der stärkste negative
prognostische Faktor ist (48). Weitere Untersuchungen konnten eine Korrelation
Diskussion
71
zwischen dem Ki67-Färbeindex und der Prognose bzw. dem Rezidivfreien Intervall
finden (123;133;158;174;178;179;182).
Unsere Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab keine eindeutige
Tendenz. Die Rezidive zeigen sowohl eine höhere als auch eine gleich bleibende
oder niedrigere Proliferationsaktivität als die Primarii. Eine Korrelation der
Proliferationsaktivität mit der Prognose oder dem rezidivfreien Intervall ist aufgrund
fehlender klinischer Daten im Rahmen unserer Untersuchung nicht möglich. Man
kann
lediglich
feststellen,
dass
auch
Primärtumoren
mit
niedriger
Proliferationsaktivität Rezidive aufweisen können.
4.8
BCL 2: Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Das BCL-2-Gen gehört zu einer Gruppe von menschlichen Genen, die an der
Regulation der Apoptose beteiligt sind. Einige Gene dieser Gruppe fördern (Bax,
BAD, Bak, Bok und andere) und die anderen verhindern (BCL-2, Bcl-x, BCl-W usw.)
die Apoptose und damit den programmierten Zelltod (28).
Weil Mutationen in diesen Apoptose regulierenden Genen schwere Folgen für das
Tumorwachstum und schließlich auch die Entstehung von Tumoren zur Folge haben
können, bezeichnet man diese Gene auch als Proto-Onkogene. So entsteht die
Überexpression des BCL-2-Gens in B-Lymphozyten durch t(14;18) Translokation in
mehr als 85% der follikulären non-Hodgkin-Lymphome mit der Folge der
neoplastischen Zellexpansion. Überexpression des BCL-2-Gens wurde auch in
anderen Tumoren, so zum Beispiel dem Prostatakarzinom und oralen Tumoren
gefunden (109) (157).
Ziel dieser Untersuchung war es, die Expression von BCL-2 bei den ACCs und
MECs der Speicheldrüsen zu untersuchen und mit bereits veröffentlichten
Ergebnissen zu vergleichen. Weiterhin hat unseres Wissens bislang nur eine Studie
(135) Rezidivfälle mit untersucht und mit den Primarien verglichen.
Unsere Untersuchung ergab einen sehr hohen BCL-2-Expressions-Index bei den
ACCs. Die positiven Fälle zeigen eine hohe Anzahl an gefärbten Tumorzellen (65 –
72
Diskussion
98%). Dies steht im Einklang mit den meisten der vorliegenden Studien (siehe Tab.
4.5.1).
Anzahl positive Fälle
Anzahl
Bewertungsschwelle
Patienten
positive Tumorzellen
5
≥ 20
al. 90 %
21
≥ 30
51%
39
> 10 %
al. 18 %
22
unbekannt
Norberg-Spaak et al. 55 %
31
≥ 25 %
77
unbekannt
4
unbekannt
9
Stark bis sehr stark
Quelle
Al-Rawi et al. 2010 100 %
(10)
Carlinfante
et
2005 (26)
Jia et al. 2004 (88)
Preisegger
et
2001 (135)
2000 (122)
Fujita et al 1999 (54)
30 %
Yanez et al. 1999 100 %
(197)
Soini et al. 1998 (165)
66 %
positiv
Eigene
93 %
28
≥ 25 %
Tab. 4.5.1 Übersicht Anzahl BCL-2 positiver Fälle bei ACC verschiedener Autoren
Quelle
Anzahl positive Fälle
Al-Rawi et al. 2010 67 %
Anzahl
Bewertungsschwelle
Patienten
positive Tumorzellen
3
≥ 30 %
16
unbekannt
(10)
Zyada et al. 2009 75 %
(202)
Pires et al. 2004 (133)
63 %
173
≥ 5%
Yin et al. 2000 (198)
51 %
71
≥ 25 %
3
unbekannt
Yanez et al 1999 67 %
(197)
Soini et al. 1998 (165)
20 %
10
moderat positiv
Eigene
9%
22
≥ 25%
Tab. 4.5.2 Übersicht Anzahl BCL-2 positiver Fälle bei MEC verschiedener Autoren
Diskussion
Weiterhin
73
konnte
bei
unserer
Untersuchung
kein
statistisch
relevanter
Zusammenhang zwischen dem histologischen Tumorgrad und der Intensität der
BCL-2-Expression (Anzahl positiver Tumorzellen) bei den ACCs nachgewiesen
werden. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Carlinfante et al. 2005 (26) sowie
Norberg-Spaak et al. 2000 überein (122).
Im Vergleich zur vorliegenden Literatur konnten wir nur einen sehr geringen Anteil an
BCL-2-Expression bei den MECs finden (siehe Tab. 4.5.2). Nur 2 von 22 Fällen
zeigten eine BCL-2-Expression. Daher lässt sich auch kein signifikanter Unterschied
der verschiedenen Tumorgrade in Bezug auf die Intensität der BCL-2-Expression
nachweisen. Die Unterschiede bei der BCL-2-Expression im Vergleich zur Literatur
sind sicherlich durch unterschiedliche Bewertungsschwellen und die meist kleineren
Studiengrößen
und
Gesamterkrankten
die
dadurch
bedingt.
fehlende
Weitere
repräsentative
Faktoren
könnten
Abbildung
der
unterschiedliche
Vorbehandlungsmethoden, Immunhistochemie-Methoden und Primärantikörper sein.
Trotz fehlender Korrelation der BCL-2-Expression zum Tumorgrad fällt auf, dass die
BCL-2-positiven MECs alle Grade-I-Karzinome sind. Dies passt zu einer
Untersuchung von Yin et al. 2000. Hier konnte eine negative Korrelation des BCL-2Färbeindex und des Tumorgrades bei MECs sowie eine längere Überlebensrate bei
BCL-2 positiven MECs nachgewiesen werden (198). Ebenso fanden Pires et al.
2004 eine Korrelation zwischen höherer BCL-2-Expression und besserer Prognose
bei 125 MECs (133).
Abweichend hiervor zeigten Al-Rawi et.al. in ihrer immunhistochemischen Analyse
von
Speicheldrüsentumoren
die
höchste
BCL-2-Expression
bei
Grad
III
adenoidcystischen Karzinomen und die niedrigste BCL-2-Expression bei Grad I MEC
(10). Allerdings sind Kritikpunkte dieser Studie, dass nur 3 MECs und 5 ACCs
untersucht wurden. Weiterhin gilt es zu bedenken, dass es mehrere unterschiedliche
histologische Gradingsysteme für dier MECs gibt und dass in dieser Studie nicht
angegeben ist, nach welchem Gradingsystem die MECs klassifiziert wurden.
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab 6 mal eine
ansteigende und 2 mal eine gleich bleibende Expression von BCL-2, wobei ein
negatives MEC negativ blieb und bei einem ACC-Rezidiv angesichts einer BCL-2-
74
Diskussion
Expression von 98% der Tumorzellen keine Steigerung mehr möglich war.
Insgesamt zeigt sich somit eine deutliche Tendenz zur Steigerung der BCL-2Expression bei Rezidivtumoren. Dies steht im Gegensatz zu einer Untersuchung von
Preisegger et al. 2001, die keinen Unterschied oder Trend der Veränderung bei 4
Rezidiven von ACCs finden konnten (135). Allerdings fand diese Gruppe insgesamt
eine geringe Anzahl an BCL-2 positiven ACCs. Weitere Unterschiede liegen in der
kleineren Anzahl von Rezidiven, der Immunhistochemie-Methode (Labelled (Strept)Avidin-Biotin-Methode versus Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-PhosphataseKomplex Methode) und den Auswertungskriterien, wobei nicht mitgeteilt wurde, wie
eine BCL-2-Positivität des Tumors in dieser Studie definiert wurde.
Im Rahmen unserer Auswertung fiel auf, dass die BCL-2 positiven Tumorzellen bei
den ACCs in der Mehrzahl der Fälle Lichtungsnah gelegene, duktal anmutende
Tumorzellen waren. Bei den MEC waren die BCL-2 positiven Zellen immer
epidermoide Zellen, wohingegen die mucoiden Epithelzellen immer negativ waren.
Dies passt zu bereits publizierten Untersuchungen (197;202). Interessanterweise
wird BCL-2 normalerweise auf ductalen epithelialen Zellen von allen exokrinen
Drüsen ausgebildet (53). Die vermehrte Expression von BCL-2 auf den luminal
gelegenen Zellen bei den ACCs und den epidermoiden Zellen bei den MECs spricht
für eine erhöhte Apoptoseresistenz dieser Zellen.
Erste molekulartherapeutische Medikamente, die die BCL-2-Funktion unterdrücken,
wurden bereits gefunden. Ein Antisense-Medikament mit dem Namen Oblimersen
(G3139) wurde bereits entwickelt, um am BCL-2-Gen anzugreifen. AntisenseMedikamente sind kurze RNA-Sequenzen, die über eine Bindung an die mRNA
diese inaktivieren und dadurch die Proteinerstellung verhindern. Die Proliferation von
humanen Lymphomzellen konnte in-vitro durch Antisense-RNA inhibiert werden (39).
Erste erfolgreiche Ergebnisse zeigten sich bereits im Rahmen von Phase I/II/IIIStudien
für
Lymphome
bei
der
Addition
von
Oblimersen
zusätzlich
zur
konventionellen Chemotherapie (108;124).
Andere Inhibitoren der BCL-2-Protein-Familie wurden bereits gefunden und sind
Bestandteil der aktuellen Forschung.
Bei den ACC scheint der BCL-2-Signalweg einen viel versprechenden Ansatz
darzustellen, um in der molekularen Therapie den Einsatz von niedermolekularen
Diskussion
75
BCL-2-Antagonisten zu verwenden. In der Monotherapie von Bronchialkarzinomen,
Leukämien und Lymphomen zeigt ABT-737 bereits eine eindrucksvolle Aktivität
(127).
Die hohe BCL-2-Expressionsrate in allen histologischen Sub-Typen der ACCs, ohne
dass Grade I und II Karzinome eine signifikant geringere Expression zeigen, spricht
dafür, das dieses Protoonkogens bereits bei den frühen Stadien der Karzinogenese
von Bedeutung zu sein scheint, indem die Apoptose gehemmt wird. Passend dazu
konnte bei den ACCs bereits eine inverse Korrelation der BCL-2-Expression zum
Apoptose-Index gefunden werden (88). Therapiestudien zur Wirksamkeit der zuvor
erwähnten Inhibitoren des BCL-2-Signalweges bei Speicheldrüsenkarzinomen fehlen
nach unserem Wissen bislang.
Bei den MEC spricht die deutlich geringere Expressionsrate für eine geringere oder
fehlende Bedeutung des Protoonkogens BCL-2 bei der Karzinogenese.
Die Karzinogenese ist jedoch ein multifaktorieller Prozess, daher sind weitere
Studien zur Untersuchung anderer, die Tumorentstehung beeinflussender Faktoren
zu eruieren.
4.9
CD 34: Bedeutung der Expression in MEC und ACC
Das CD34-Antigen wird auf vaskulärem Endothel, Gefäßtumoren, interstitiellen
dentritischen Zellen (DIC), Endoneurium, Gastrointestinalenstromatumoren, solitären
fibrösen Tumoren, epitheloiden Sarkomen, Dermatofibrosarkomen und einigen
peripheren Nervenscheiden-Tumoren exprimiert (16;120;183;193). CD34-positive
Stromazellen wirken unterstützend bei der Differenzierung und Proliferation von
unreifen Zellen in normalem und tumorösem Gewebe (120;193). Diese Zellen
wurden bereits mit der Entstehung zahlreicher Tumoren in Verbindung gebracht
(94;116;130;155;176;183).
interstitiellen
Es
existieren
kaum
dendritischen
Zellen
im
Studien
zu
CD34-positiven
Tumorrandgebiet
bei
Speicheldrüsenkarzinomen. Lediglich L. Soma, V. A. LiVolsi et al. (166) konnten
dendritische interstitielle Zellen (CD34+) im umgebenden Tumorrandgebiet von
benignen und malignen Speicheldrüsentumoren nachweisen. Insbesondere die
benignen Speicheldrüsentumoren wiesen eine große Anzahl an CD34-positiven
76
Diskussion
Stromazellen in der Tumorkapsel auf. Im Gegensatz dazu zeigten nur 2 von 5
adenoid-zystischen und nur eins von 2 mucoepidermoiden Karzinomen ein stark
CD34-positives Randstroma. Unseres Wissens hat bislang keine Studie die
Rezidivfälle mituntersucht und mit den Primarien verglichen.
Unsere Auswertung zeigt bei 19 von 28 ACCs (67,9 %) und bei 8 von 22 MECs
(36,4 %) mäßig bis viele CD34 positive, die Tumorzellen umgebende DIC im
Tumorrandstroma. Gar keine CD34-positiven Stroma-Zellen finden sich bei 2 von 28
ACCs und bei 5 von 22 MECs. Im Unterschied zu der Studie von L. Soma, V. A.
LiVolsi et al. (166) zeigt unsere Untersuchung mehr CD34-positives Randstroma bei
den ACC als bei den MEC. Die Unterschiede zu der Untersuchung von Soma et al.
2001 dürften vor allem mit der kleinen Studiengröße bei Soma et al. (unsere: 28
ACC und 22 MEC, Soma: 5 ACC und 2 MEC), aber auch mit der Verwendung
anderer primärer Antikörper (Soma et al.: Becton-Dickinson, San Jose, CA; unsere:
Immunotech / QBEND 10) zusammenhängen.
Die Untersuchung der Rezidive von 7 ACCs und 1 MEC ergab ein indifferentes
Ergebnis. Es fielen sowohl eine Steigerung als auch eine Reduktion oder ein
Gleichbleiben der CD-34-Expression auf. Ein Trend war nicht zu erkennen.
Unsere Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass die CD34-positiven DICs
eine Rolle bei der Entstehung oder dem Wachstum der ACCs und der MECs der
Speicheldrüsen spielen dürften, weil man sie in der Mehrzahl der untersuchten Fälle
findet.
Die
unterschiedlichen
signifikannten
Unterschied
Differenzierungsgrade
in
der
Menge
der
zeigten
jedoch
CD34-positiven
keinen
Zellen
im
Tumorrandstroma. Weiterhin scheint die Menge an CD34-positiven Zellen im
Tumorrandstroma keine Bedeutung für die Rezidivbildung zu haben. Weitere
Studien
sind
nötig,
um
die
Pathophysiologie
der
Stromareaktion
der
Speicheldrüsenkarzinome zu verstehen.
4.10 Korrelation der proliferativen Aktivität und der C-KIT-Überexpression
Beim Vergleich der C-KIT-Expression mit der Ki67-Expression zeigt sich eine
statistisch signifikant höhere Proliferationsaktivität der stark C-KIT-positiven ACCs.
Da eine höhere Proliferationsaktivität für eine höhere Aggressivität spricht, kann man
Diskussion
folgern, dass C-KIT ein wichtiger Faktor für die Aggressivität
77
der ACCs ist.
Demzufolge macht eine Hemmung dieser Tyrosinkinase zur adjuvanten Therapie
der ACCs Sinn.
Wegen der fehlenden Überexpression von C-KIT bei den MECs wurde die
Korrelation von C-KIT mit Ki67 nicht für diesen Speicheldrüsentumor untersucht.
4.11 Korrelation der proliferativen Aktivität und der BCL-2-Überexpression
Bei adenoid-zystischen Karzinomen konnte eine signifikante positive Korrelation
zwischen der Proliferationsrate (Ki67-Expression) und der Expression des Apoptose
hemmenden Protooncogens BCL-2 nachgewiesen werden.
Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Zunahme der Proliferationsaktivität bei
den ACCs über eine Hemmung der Apoptose erreicht wird.
Bei den MECs scheint ein anderer Faktor für die erhöhte Proliferationsaktivität
verantwortlich zu sein, denn hier zeigt unsere Untersuchung keinen signifikanten
Zusammenhang zwischen Ki67- und BCL-2-Expression.
78
5
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Maligne Speicheldrüsentumoren gehören zu den seltenen Neoplasien und haben
nur einen Anteil von 5% an allen Kopf-Hals-Neoplasien. Das mukoepidermoide und
das adenoidzystische Karzinom (ACC) stellen die beiden häufigsten Typen von
Speicheldrüsenkarzinomen
dar.
Beide
Karzinomtypen
zeigen
eine
nicht
zufriedenstellende Ansprechrate auf konventionelle Chemotherapie. Das Ziel dieser
Arbeit war es, anhand etablierter immunhistochemischer Marker mehr über die
Tumorbiologie zu erfahren, um mögliche Ansätze zur Molekulartherapie zu finden.
Archivmaterial von 28 Patienten mit einem adenoidzystischen Karzinom und von 22
Patienten mit einem mukoepidermoiden Karzinom (MEC) der Speicheldrüsen wurde
verwendet, um die folgenden Immunhistochemiefärbungen durchzuführen: Her-2
neu, EGFR, C-KIT, Ki-67, BCL-2-Gen und CD-34. Unter dem Mikroskop wurde nach
quantitativen bzw. semiquantitativen Methoden die Expression ermittelt und
anschließend statistisch mit dem histopathologischen Grading korreliert. Zusätzlich
wurde von 7 Patienten mit adenoidzystischem und von einem Patienten mit einem
mukoepidermoiden
Karzinom
das
Tumor-Rezidiv
in
Bezug
auf
die
immunhistochemische Expression untersucht und mit dem Primarius verglichen.
Schließlich wurde die Anzahl Ki-67-positiver Tumorzellen mit der Expression von
BCL-2 sowie C-KIT korreliert (Spearman-Rho-Korrelationskoeffizient).
Lediglich ein MEC, jedoch kein ACC zeigte eine Her-2-Überexpression (DakoHerceptest-Score 2+ & 3+). Eine Korrelation mit dem histopathologischen Grade
konnte nicht festgestellt werden. Die Rezidive verhielten sich indifferent in Bezug auf
den Färbe-Score und ein Shift von Her-2-Negativität beim Primarius zu Her-2Überexpression beim Rezidiv wurde nicht beobachtet. Unsere Ergebnisse stehen
teilweise im Gegensatz zur Literatur, in der zwischen 0 – 100 % der ACC und
zwischen 0 – 80 % der MEC eine Her-2-Expression zeigten. Allerdings differieren die
Auswertungsmethoden stark. So werteten einige Autoren jegliche feststellbare
Färbung und nicht nur die Überexpression als positive Fälle. Mögliche Unterschiede
im Patientengut, den verwendeten Primärantikörpern, Färbemethoden, in Art und
Länge der vorherigen Fixation (bei sämtlichen Studien wurde Archivmaterial
verwendet)
und
der
Vorbehandlung
der
Gewebeschnitte
können
zu
den
Zusammenfassung
79
abweichenden Befundergebnissen beigetragen haben. Insgesamt scheint die
Hemmung durch Herceptin von Her-2 zur Therapie der ACC und MEC aufgrund der
geringen Rate an Überexpression nicht für die Tumorgruppen als ganzes, sondern
nur für positiv getestete individuelle Fälle erfolgsversprechend zu sein.
Eine EGFR-Überexpression ließ sich bei 4 von 28 (14,2%) ACCs und 15 von 22
(68,2%) MECs nachweisen. Bei beiden Karzinomen korrelierte die Expressionsrate
nicht mit dem histopathologischen Malignitätsgrad. Die Rezidive zeigten bis auf eine
Ausnahme einen höheren EGFR-Score als die Primarii. Die vorliegenden
Ergebnisse passen zu einigen der bereits veröffentlichten Studien. So findet man
auch in der Literatur deutlich höhere EGFR-Expressionsraten beim MEC als beim
ACC. EGFR könnte aufgrund der hohen Überexpressionsraten bei den MEC ein
wirksames Ziel der Molekulartherapie sein, da bereits Medikamente zur selektiven
EGFR-Hemmung exisitieren.
Eine C-KIT Überexpression zeigten 17 von 27 (= 63 %) ACCs (ein Fall wurde
ausgeklammert) und keines der untersuchten 21 MECs (ein Fall wurde
ausgeklammert).
Es
konnte
kein
statistisch
relevanter
Unterschied
der
unterschiedlichen histologischen Subtypen in Bezug auf die C-KIT Expression
festgestellt werden. 4 Tumorrezidive zeigten einen gleich bleibenden, 2 einen
geringeren und 2 einen höheren Expressionsscore als die Primarii, es zeigt sich
somit keine klare Tendenz. Unsere Ergebnisse sind mit der Mehrheit der bereits
veröffentlichten Studien vereinbar. C-KIT scheint eine wichtige Rolle in der
Tumorbiologie der ACCs im Gegensatz zu den MECs zu spielen. Die
pharmakologisch-selektive C-KIT-Inhibition könnte bei den ACCs eine interessante
Therapieoption sein.
Die Anzahl an Ki67 positiven Zellen zeigte eine große Schwankung. Die Werte
reichten beim ACC von 3 bis 72 %, Mittelwert von 20,85, und beim MEC von 1 bis 73
%, Mittelwert von 14,45. Nur bei den MEC korrelierte die Anzahl positiver
Tumorzellen mit dem histopathologischen Grad. Vergleicht man jedoch nur die
soliden mit den übrigen ACC so zeigten die soliden eine durchschnittlich höhere
Anzahl Ki-67-positiver Tumorzellen. Die Rezidive zeigten ebenfalls tendenziell eine
größere Anzahl Ki-67-positiver Tumorzellen. Hieraus kann man schließen, dass die
80
Zusammenfassung
Ki-67-Expressionsrate einen guten Indikator für die Aggressivität der Karzinome
darstellt.
26 von 28 ACCs (92,9%) zeigten eine BCL 2-Expression in mehr als 70 % der
Tumorzellen wohingegen nur 2/22 MECs eine Expression in mehr als 25% der
Zellen zeigten. Statistisch bestand kein signifikanter Unterschied bei der BCL-2Expression in Bezug auf den histopathologischen Tumorgrad. Unsere Ergebnisse
bei den ACC stehen im Einklang mit der Literatur. Unsere geringere Anzahl an
Überexpression bei den MEC steht im Gegensatz zur Literatur. Unterschiede sind
durch die Auswertungsmethoden, Studiengröße, die verwendeten Primärantikörper,
Färbemethoden und die Vorbehandlung der Gewebeschnitte bedingt. Die Rezidive
hatten tendenziell mehr BCL-2-positive Tumorzellen als die Primarii. Bei den ACC
scheint
die
pharmakologische
Hemmung
des
BCL-2-Signalweges
ein
vielversprechender Ansatz zu sein.
Bei 26
von 28
(92,9%) adenoidzystischen und
nur 17 von
22
(77%)
mukoepidermoiden Karzinomen ließ sich CD-34-positives Stroma nachweisen.
Hierbei zeigten kleine Tumorballen mehr CD-34-positives Stroma als große
Tumorballen. Es bestand keine Korrelation zwischen dem histopathologischen
Tumorgrad und Menge an positivem Stroma. Die Rezidive verhielten sich indifferent.
CD-34 positives Tumor-Rand-Stroma scheint eine Rolle bei den ACC und MEC zu
spielen, auch wenn die Menge des CD34-positiven Stromas nicht mit dem
histologischen Malignitätsgrad korreliert. In der Literatur ist CD-34-positives TumorRand-Stroma bislang nur in einer Studie untersucht worden, allerdings sind in dieser
Studie nur 5 ACC und 2 MEC untersucht worden. Weitere Studien sind notwendig.
Die Anzahl Ki-67-positiver Tumorzellen korreliert nur beim ACC mit der Expression
von BCL-2 und C-KIT. Mit steigender Anzahl an Ki-67-positiven Tumorzellen steigt
auch der C-KIT-Score bzw. die Anzahl BCL-2-positiver Zellen. Da eine höhere
Proliferationsaktivität (Ki67-Expression) für eine höhere Aggressivität spricht, kann
man schlussfolgern, dass C-KIT bei den ACC ein wichtiger Faktor für die
Aggressivität bedeutet und eine pharmakologische Hemmung Sinn macht. Die
höhere Proliferationsaktivität scheint bei den ACC über eine Hemmung der Apoptose
erreicht zu werden, da das Apoptose hemmende Protein BCL-2 positiv mit der Ki-67-
Zusammenfassung
81
Expression korreliert. Bei den MEC scheint somit weder C-KIT noch BCL-2 eine
Rolle bei der Aggressivität bzw. Tumorproliferation zu spielen. Weitere Studien sind
zur Bestätigung unserer Thesen notwendig.
82
6
Literaturverzeichnis
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Lebenslauf:
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Lebenslauf:
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Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
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