Hannah-Lena Obermann

Aus dem Institut für Immunologie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Stefan Bauer
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in der angeborenen
Immunantwort und das Potential von
cholesterolkonjugierter RNA als Adjuvans
Philipps
Universität
Marburg
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt
von
Hannah-Lena Obermann
aus Fritzlar
Marburg. 2014
http://d-nb.info/1055914323
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
viii
KAPITEL 1 - EINLEITUNG
1.1 Das Iminunsystem
1.1.1 Das angeborene Immunsystem
1.2 Pattern Recognition Rezeptoren (PRR)
1.2.1 Toll-like Rezeptoren
1.2.1.1 Liganden und Expression der TLR
1.2.1.2 Endosomale TLR
1.2.1.3 Signalwege der TLR
1.2.1.4 Regulation der TLR7 und TLR9 Signalkaskade in
pDC
1.2.2 Zytosolische PRR
1.3 RNA/DNA-Hybride
1.3.1 Virale RNA/DNA-Hybride
1.3.2 Mitochondriale RNA/DNA-Hybride
1.3.3 RNA/DNA-Hybride und Autoimmunität
1.4 TLR-basierte Adjuvanten
1.5 Zielsetzung
KAPITEL 2 - MATERIAL
2.1 Geräte
2.2 Chemikalien
2.3 Reagenzien
2.4 Puffer
2.5 Medien und Zellkultur
2.6 Bakterien
2.7 Medien Bakterienkultur
2.8 Kits
1
1
2
4
5
7
9
10
12
14
16
16
20
21
21
24
26
26
28
30
31
32
34
34
34
iv
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
2.15
2.16
Antikörper
Stimulanzien
Primer
Viren
Mausstämme
Zelllinien
Verbrauchsmaterialien
Software
.•
KAPITEL 3 - METHODEN
3.1 Molekularbiologische Methoden
35
37
38
39
39
39
40
41
42
42
3.1.1 PCR
42
3.1.2 Genomextraktion aus E. coK-Kulturen
43
3.1.3 Genomextraktion aus gereinigten Mitochondrien
44
3.1.4 Messung von Nukleinsäure-Konzentrationen
45
3.1.5 Herstellung doppelsträngiger Nukleinsäuren
45
3.1.6 Schmelzkurvenanalyse von doppelsträngigen Nukleinsäuren . . 46
3.1.7 Polyaciylainidgelelektrophorese (PAGE)
47
3.2 Biochemische Methoden
48
3.2.1 Aufreinigung von TLR-hlgG-Fc-Fusionsproteinen
48
3.2.2 BCA-Assay
49
3.2.3 SDS-Polyaciylainidgelelektrophorese (SDS-PAGJ3)
49
3.2.4 Bindungsstudie
50
3.2.5 Enzyme-Linked-ImmunoSorbent-Assay (ELISA)
51
3.2.5.1 Zytokin-ELISA
51
3.2.5.2 Nukleinsäure-ELISA
54
3.2.5.3 TLR-hlgG-Fc-Pusionsprotein-ELISA
56
3.3 Zellkultur
57
3.3.1 Zellzählung
57
3.3.2 Isolation von Periplieral Blood Mononuclear Cells
58
3.3.3 Präparation von murinem Knochenmark
59
3.3.4 Kultivierung und Differenzierung von Flt3L-Kulturen
3.3.5 Stimulation von primären Zellen
3.3.6 Retrovirale Infektion von primären Zellen
3.3.7 Transfektion von primären Zellen mit cholesterolkonjugierten
Nukleinsäuren
3.3.8 Arbeiten mit Zelllinien
60
60
61
62
62
3.4 Durchflusszytometrie
3.4.1 Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie
3.5 Immunfluoreszenzfärbung
3.6 Mitochondrienaufreinigung aus HEK-Zellen
63
63
64
65
KAPITEL 4 - ERGEBNISSE
67
4.1 Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in der angeborenen Immunität . 67
4.1.1 Synthetische RNA/DNA-Hybride induzieren eine Immunant­
wort in humanen PBMC
67
4.1.2 TLR9 detektiert synthetische RNA/DNA-Hybride
74
4.1.3 RNA/DNA-Hybride des HCMV-Genoms sind fiir die Induk­
tion einer Immunreaktion nicht ausschließlich verantwortlich . 80
4.1.4
RNA/DNA-Hybride des Mitocliondrien-Genoms sind für die
Induktion einer Immunantwort nicht essentiell
4.1.5 Nukleinsäuren des RNaseH-defiziente E.co/i-Stamms MIC2067
zeigen im Vergleich zum Wildtyp-Stamin kein verändertes Sti­
mulationspotential in Flt3L-DC
4.1.6 RNA/DNA-Hybride sind in retrovirusinflzierten Flt3L-DC nach­
weisbar
4.1.7 Mo-MuLV inhibiert die CpG2216-induzierte Sezernierung von
IFNa
4.2 Das Potential cliolesterolkonjugierter RNA40 als Adjuvans
4.2.1
4.2.2
80
82
86
87
90
Cholesterolkonjugierte einzelsträngige RNA40 induziert keine
antivirale Immunantwort
90
Cholesterolkonjugierte doppelsträngige RNA40 induziert eine
Iminunantwort in Flt3L-DC und wird von TLR7 detektiert . . 92
KAPITEL 5 - DISKUSSION
97
5.1 Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in der angeborenen Immunität . 97
5.1.1 Synthetische RNA/DNA-Hybride induzieren eine Iinmunantwort über TLR9 •
99
5.1.2 RNA/DNA-Hybride als Bestandteil verschiedener Genome sind
5.1.3
nicht primär für die Einleitung einer Immunantwort verant­
wortlich
102
RNA/DNA-Hybride sind in retrovirusinflzierten FU3L-DC nach­
weisbar, die retrovirale Infektion leitet aber keine antivirale
Immunantwort ein
105
vi
5.2 Das Potential cholesterolkonjugierter RNA40 als Adjuvans
107
5.2.1 Cholesterolkonjugierte doppelsträngige RNA40 induziert eine
Immunantwort in Flt3L-DC und wird über TLR7 detektiert . 109
5.3 Ausblick
111
5.3.1 Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in der angeborenen Im­
munantwort
112
5.3.2 Das Potentiell cholesterolkonjugierter RNA40 als Adjuvans . . 114
ZUSAMMENFASSUNG
116
SUMMARY
118
LITERATURVERZEICHNIS
120
AKADEMISCHE LEHRER
139
DANKSAGUNG
140