Molekulare Analyse des Immunsuppressivums

Molekulare Analyse des Immunsuppressivums Cyclosporin A
Aus der Medizinischen Klinik 1 mit Poliklinik
des Universitätsklinikums Erlangen
Direktor: Prof. Dr. med. M. Neurath
Der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Thomas Gerlach
aus
Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. Markus Neurath
Gutachter:
PD Dr. Benno Weigmann
Tag der mündlichen Prüfung:
11.März 2015
Meinen Eltern
und
meiner Schwester
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ....................................................................................................... IV
Hintergrund und Ziele .............................................................................................. IV
Methoden ................................................................................................................... IV
Ergebnisse .................................................................................................................. V
Schlussfolgerung ....................................................................................................... V
Abstract .......................................................................................................................... VI
Background and aims .............................................................................................. VI
Methods ..................................................................................................................... VI
Results ..................................................................................................................... VII
Conclusion ............................................................................................................... VII
1. Einleitung ..................................................................................................................... 1
1.1 Morbus Crohn ....................................................................................................... 1
1.1.1 Definition und Epidemiologie des Morbus Crohn .................................... 1
1.1.2 Klinischer Verlauf .......................................................................................... 1
1.1.3 Therapie des Morbus Crohn ....................................................................... 2
1.2 Colitis ulcerosa ..................................................................................................... 3
1.2.1 Definition und Epidemiologie der Colitis ulcerosa ................................... 3
1.2.2 Klinischer Verlauf der Colitis ulcerosa ....................................................... 3
1.2.3 Therapie der Colitis ulcerosa ...................................................................... 4
1.3 Das Immunsuppressivum Cyclosporin A ......................................................... 5
1.3.1 Cyclosporin A im klinischen Alltag.............................................................. 5
1.3.2 Stellenwert von Cyclosporin A in der Therapie chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen........................................................................ 6
1.3.3 Wirkmechanismus von Cyclosporin A ....................................................... 8
1.4 Die Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ................... 9
1.4.1 Genetische Suszeptibilität ........................................................................... 9
1.4.2 Beeinflussung des Risikos durch Umweltfaktoren ................................ 12
1.4.3 Infektiöse Ursache...................................................................................... 14
1.4.4 Veränderungen der mikrobiellen Darmflora ........................................... 15
1.4.5 Störung des intestinalen Epithels ............................................................ 15
1.4.6 Störungen der Zytokinbalance ................................................................. 16
2. Zielsetzung der Arbeit.............................................................................................. 20
3. Material und Methodik ............................................................................................. 21
3.1 Material ................................................................................................................ 21
3.1.1 Geräte .......................................................................................................... 21
3.1.2 Medikamente ............................................................................................... 22
3.1.3 Kommerzielle Fertigkits ............................................................................. 22
I
Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Primärantikörper ......................................................................................... 22
3.1.5 Sekundärantikörper .................................................................................... 23
3.1.6 PCR Primer ................................................................................................. 23
3.1.7 Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 24
3.1.8 Substanzen.................................................................................................. 25
3.1.9 Tiere .............................................................................................................. 27
3.1.10 Software ..................................................................................................... 27
3.1.11 Pufferlösungen und Mischungen ........................................................... 28
3.2 Methodik .............................................................................................................. 30
3.2.1 RNA Isolierung aus murinem Gewebe und kultivierten Zellen ............ 30
3.2.2 Transkription der murinen mRNA in cDNA (Reverse Transkriptase
PCR) ....................................................................................................................... 30
3.2.3 Transkription der humanen mRNA in cDNA ........................................... 31
3.2.4 β- Actin PCR ................................................................................................ 31
3.2.5 Quantitative PCR ........................................................................................ 32
3.2.6 Immunhistofluoreszenz .............................................................................. 32
3.2.7 Hämatoxylin-Eosin Färbung ..................................................................... 33
3.2.8 Proteinisolierung für Western Blot ........................................................... 34
3.2.9 Herstellung eines 2D- Gels für Western Blot ......................................... 34
3.2.10 Gelelektrophorese .................................................................................... 35
3.2.11 Blottingvorgang ......................................................................................... 35
3.2.12 Zellisolation mononukleärer Milzzellen ................................................. 36
3.2.13 Isolierung von Lamina propria Zellen .................................................... 36
3.2.14 Isolierung von intraepithelialen Zellen .................................................. 37
3.2.15 Durchflusszytometrie ............................................................................... 37
3.2.16 Statistik ...................................................................................................... 38
3.2.17 Patientenkollektiv ..................................................................................... 38
3.2.18 Versuchstiere ............................................................................................ 39
3.2.19 Versuchsablauf murines Colitis Modell ................................................. 39
3.2.20 Gewinnung des Gewebematerials ........................................................ 40
4. Ergebnisse ................................................................................................................ 41
4.1 Analyse des Patientenkollektivs ...................................................................... 41
4.1.1 Histologische Charakterisierung des Patientenkollektivs .................... 41
4.1.2 Immunhistochemische Charakterisierung immunkompetenter Zellen
in der Mukosa des Patientenkollektivs .............................................................. 42
4.1.3 Quantitative PCR Analyse des Patientenkollektivs hinsichtlich der
Expression der durch Cyclosporin A regulierten Proteine.............................. 45
II
Inhaltsverzeichnis
4.1.4 Direkter Proteinnachweis in der Immunhistofluoreszenz ..................... 48
4.2 Analyse der Cyclosporin A Therapie im murinen Colitis Modell ................. 51
4.2.1 Analyse des endoskopischen Scores...................................................... 51
4.2.2 Analyse des Gewichtsverlaufs.................................................................. 52
4.2.3 Analyse des histopathologischen Scores ............................................... 53
4.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung immunkompetenter Zellen
in der Mukosa von C57BL/6 Mäusen ................................................................ 54
4.2.5 Zytokinanalyse mittels qPCR bei Balb/c Mäusen.................................. 55
4.2.6 Zytokinanalyse mittels quantitativer PCR bei C57BL/6 Mäusen ....... 58
4.2.7 Analyse des Zytokinprofils bei C57BL/6 Mäusen mittels beads
mediierter durchflusszytometrischer Untersuchung........................................ 64
4.2.8 Direkter Proteinnachweis mittels Western Blot Analyse bei C57BL/6
Mäusen .................................................................................................................. 66
4.3 Simulation von Cyclosporin A-Patienten im Colitis Modell itk defizienter
Mäuse ......................................................................................................................... 67
4.3.1 Analyse des endoskopischen Scores...................................................... 67
4.3.2 Analyse des Gewichtsverlaufs.................................................................. 68
4.3.3 Analyse des histopathologischen Scores ............................................... 69
4.3.4 Zytokinanalyse mittels quantitativer PCR von itk defizienten Mäusen
................................................................................................................................. 69
4.3.5 Analyse des Zytokinprofils bei itk-defizienten Mäusen mittels beads
mediierter durchflusszytometrischer Untersuchung........................................ 71
5. Diskussion ................................................................................................................. 73
5.1 Fragestellung ...................................................................................................... 73
5.2 Der Transkriptionsfaktor t-bet .......................................................................... 73
5.3 Interleukin-13 ...................................................................................................... 74
5.4 Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen (NFATc1)............................................. 75
5.5 Cyclophilin A ....................................................................................................... 77
5.6 Interleukin-2 induzierende T-Zell Kinase (itk) ................................................ 79
5.7 Vav1 ..................................................................................................................... 81
5.8 Resümee ............................................................................................................. 83
6. Literaturverzeichnis.................................................................................................. 85
7. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... 113
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ............................................................... 115
9. Danksagung ............................................................................................................ 116
III
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Während beim Morbus Crohn eine Cyclosporin A Therapie eher eine untergeordnete
Rolle spielt, wird der Einsatz bei der Colitis ulcerosa sowohl beim steroidrefraktären
Schub als auch beim schweren Schub mit gleichzeitig bestehenden Kontraindikationen
für Glucocorticoide empfohlen. Auch wenn das initiale Ansprechen der Patienten auf
eine Cyclosporin A Therapie hoch ist, ist im Langzeitverlauf eine abnehmende
Ansprechrate zu beobachten, so dass eine Kolektomie in rund der Hälfte der Fälle
nicht mehr verhindert werden kann. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, einen
prädiktiven Marker für ein eventuelles Ansprechen für Cyclosporin A zu finden, um bei
CED-Patienten unnötige Nebenwirkungen und Therapieverzögerungen zu vermeiden.
Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe einer Analyse der durch Cyclosporin A beeinflussten
Faktoren eventuelle prädiktive Faktoren für ein Ansprechen von Cyclosporin A zu
entdecken. Weiter sollen diese Faktoren bezüglich neuer Therapiestrategien bei
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bewertet werden.
Methoden
Mit Hilfe des Oxazolon Colitis Modells wurde bei C57BL/6, Balb/c und itk defizienten
Mäusen
eine
therapeutische
Intervention
mit
Cyclosporin
A
getestet.
Der
therapeutische Erfolg wurde mit Hilfe von miniendoskopischen und histologischen
Scorings festgestellt. Mittels quantitativer PCR und Western Blot Analyse der
Transkriptionsfaktoren und Enzyme t-bet, IL-13, NFATc1, Cyclophilin A, itk und vav1
sollte eine durch Cyclosporin A veränderte Expression dieser Faktoren aufgedeckt
werden. Dazu wurde sowohl die Expression in entzündeten und nicht entzündeten
Kolonbereichen als auch in isolierten Milz- und intestinalen Epithelzellen analysiert.
Weiterhin wurde mittels durchflusszytometrischer Analyse ein Zytokinprofil von
C57BL/6 und itk defizienten Mäusen erstellt.
Die Transkriptionsfaktoren und Enzyme Cyclophilin A, NFATc1, itk und vav1 wurden in
einem Patientenkollektiv mittels quantitativer PCR und immunhistochemischer Analyse
näher untersucht. Für die quantitative PCR Analyse stand ein Kollektiv von 17 Morbus
Crohn und 16 Colitis ulcerosa Patienten zur Verfügung, welches mit 7 Kontrollpatienten
verglichen wurde. Für die immunhistochemischen Untersuchungen stand ein
Patientenkollektiv von 9 Morbus Crohn und 9 Colitis ulcerosa Patienten zur Verfügung,
welches mit 9 Kontrollpatienten verglichen wurde.
IV
Zusammenfassung
Ergebnisse
Sowohl bei Balb/c als auch bei C57BL/6 Mäusen wurde mit Hilfe des therapeutischen
Oxazolon Colitis Modells durch die Gabe von Cyclosporin A ein signifikant verminderter
endoskopischer und histophatologischer Score im Kolon nachgewiesen. Ferner zeigten
itk defiziente Mäuse im Vergleich zu WT-Mäusen einen signifikant niedrigeren
endoskopischen und histophatologischen Score im Kolon. Weiter war in der
quantitativen PCR und in der Western Blot Analyse erkennbar, dass Cyclosporin A die
Expression der Transkriptionsfaktoren und Enzyme NFATc1, t-bet, IL-13, itk und vav1
supprimieren kann. Dies war zum Teil unabhängig vom genetischen Hintergrund der
Mäuse. Weiter wurde in der quantitativen PCR Analyse eine in unbehandelten
Kontrollmäusen erhöhte Expression von Cyclophilin A festgestellt. Dabei zeigten die mit
Oxazolon behandelten Mäuse eine im Vergleich zu den mit Cyclosporin A behandelten
Mäusen stärkere Cyclophilin A-Expression. Bei itk defizienten Mäusen wurde wiederum
eine im Vergleich zu WT- Mäusen stark verminderte Cyclophilin A-Expression
beobachtet. Außerdem zeigte sich bei itk defizienten Mäusen eine im Vergleich zu WTMäusen signifikant niedrigere vav1-Expression, welche durch die Gabe von
Cyclosporin A signifikant supprimiert werden konnte.
Schließlich konnte man sowohl in der quantitativen PCR Analyse als auch in der
immunhistochemischen Analyse des Patientenkollektivs eine im Vergleich zu den
Kontrollpatienten
erhöhte
Expression
der
Transkriptionsfakotren
und
Enzyme
Cyclophilin A, NFATc1, itk und vav1 erkennen. Die Expression war hierbei abhängig
von der festgestellten Entzündungsstärke bei den Patienten.
Schlussfolgerung
Durch eine genau Analyse der durch Cyclosporin A
beeinflussten Faktoren im
vorliegenden Oxazolon Colitis Modell und nachfolgend im Patientenkollektiv ist es zum
einen möglich, neue therapeutische Angriffspunkte in der Therapie chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen zu entdecken, zum anderen ist es möglich, prädiktive
Marker zu erkennen, welche eine Cyclosporin A Therapie in Zukunft sicherer und
effizienter machen würden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Cyclophilin A als
auch NFATc1 als prädiktive Marker einer Cyclosporin A Therapie identifiziert. Weiter
konnte durch den Einsatz von itk defizienten Mäusen im Oxazolon Colitis Modell der
Nutzen von spezifischen itk-Inhibitoren für die Therapie von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen bekräftigt werden.
V
Abstract
Abstract
Background and aims
While cyclosporine A therapy in Crohn´s disease plays a minor part, it´s use in
ulcerative colitis is recommended for steroid-refractory and massive exacerbation as
well as with coexisting contraindications for glucocorticoids. Although the initial
response to cyclosporine A is high, in long term treatment a decreasing response rate
can be observed, so that a colectomy in about half the cases can not be prevented.
Therefore it is necessary to find a predictive marker for a possible response to
cyclosporine A, to save IBD patients from unnecessary side effects and treatment
hesitation. The aim of this work is to use an analysis of the factors influenced by
cyclosporine A to detect any predictive factors for response of cyclosporine A.
Furthermore, these factors should be evaluated with regard to new therapeutic
strategies in inflammatory bowel disease.
Methods
Using the model of oxazolone-mediated experimental colitis model a therapeutic
intervention with cyclosporine A was tested in C57BL/6, BALB/c and itk deficient mice.
Therapeutic success was found with the help of miniendoscopic and histological
scoring. By quantitative pcr and western blot analysis of the transciptionfactors and
enzymes t -bet, IL-13, nfatc1, cyclophilin A, itk and vav1 a cyclosporine A altered
expression of these factors should be revealed. Therefore the expression in inflamed
and non-inflamed colon as well as in isolated splenic and intestinal epithelial cells was
analyzed. Furthermore, a cytokine profile of C57BL/6 and itk deficient mice was
created by flow cytometric analysis.
The transcriptionfactors and enzymes cyclophilin A, nfatc1, itk and vav1 were
examined in a group of patients using quantitative pcr and immunohistochemical
analysis. A cohort of 17 Crohn's disease and 16 ulcerative colitis patients, which was
compared with seven control patients, was available for quantitative pcr analysis. For
the immunohistochemical studies a group of patients 9 Crohn's disease patients and 9
ulcerative colitis patients, which was compared with 9 control patients, was available.
VI
Abstract
Results
In both Balb/c and in C57BL/6 mice, in the colon a significantly reduced
histophatologic- and endoscopic score was detected using the therapeutic oxazolone
colitis model by administration of cyclosporine A. Furthermore, itk deficient mice
showed a significantly lower endoscopic and histophatologic score in the colon
compared to WT mice. Further, in the quantitative pcr and the western blot analysis
was seen, that cyclosporine A supresses the expression of the transcriptionfactors and
enzymes nfatc1, t -bet , IL- 13,itk and vav1. This was partly independent of the genetic
background of the mice. Further was determined by quantitative pcr analysis, that the
expression of cyclophilin A in untreated control mice was increased. The oxazolone
treated mice showed also a greater cyclophilin A expression compared to the mice
treated with cyclosporine A. In turn, itk deficient mice had greatly reduced cyclophiline A
expression compared to WT mice. And itk deficient mice also had significantly lower
vav1 expression compared to WT mice, which was even significantly suppressed by
the administration of cyclosporine A.
Finally the expression of the transcriptionfactors ans enzymes cyclophiline A, nfatc1, itk
and vav1 was increased both in quantitative PCR analysis as well as in
immunohistochemical analysis in patient population compared to the control patients.
The expression was dependent on the observed strength of inflammation in patients.
Conclusion
By a precisely analysis of the cyclosporine A affected factors in the available oxazolone
colitis model and subsequently in the patient population, it is possible to discover new
therapeutic targets in the treatment of inflammatory bowel disease, on the other hand,
it is possible to identify predictive markers, that would make cyclosporine a therapy
safer and more efficient in the future. In the present work, both cyclophiline A and
nfatc1 were identified as predictive marker of cyclosporine A therapy. Furthermore,
through the use of itk deficient mice in oxazolone-mediated experimental colitis model,
the benefit of specific itk inhibitors for the treatment of inflammatory bowel disease can
be affirmed.
VII
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Morbus Crohn
1.1.1 Definition und Epidemiologie des Morbus Crohn
Der Morbus Crohn (MC) ist eine der Hauptformen chronisch entzündlicher
Darmerkrankungen (CED). Er ist definiert als eine sich diskontinuierlich transmural
ausbreitende chronische Entzündung des gesamten Magen-Darm-Traktes mit
Prädilektionsstelle im ileocoecalen Übergang212. Die Folgen dieser sich in der
Histologie als granulomatös manifestierenden Entzündung307 sind mitunter Strikturen
und Fisteln212. Die Inzidenz des MC in Deutschland wird in der aktuellsten Studie mit
4,8/ 100.000 Einwohner angegeben; sie ist in den letzten Jahren stabil geblieben. Mit
dem Alter nimmt sie ab, so dass das Prädispositionsalter für MC zwischen dem 15. und
24. Lebensjahr liegt. Dabei zeigen Frauen ein um 30 % erhöhtes Risiko für MC282.
Außerdem weisen diverse Studien auf eine Zunahme der Inzidenz von etwa 80 % in
nördlichen Ländern hin256.
Die
Prävalenz
in
Deutschland
wird
zwischen
120-200/100.000
Einwohner
angegeben122.
1.1.2 Klinischer Verlauf
Die Symptomatik des MC hängt sowohl vom Befallsmuster als auch vom Grad der
Entzündung ab. Die typische Symptomatik des MC beinhaltet am häufigsten
chronische Diarrhoen, Bauchschmerzen sowie Gewichtsverlust. Daneben können sich
aber auch perianale Blutungen, Fisteln, Fieber und extraintestinale Manifestationen wie
etwa
Arthralgien, Dermatosen oder das Auftreten einer primär sklerosierenden
Cholangitis zeigen225.
Die Evaluierung der klinischen Aktivität des Morbus Crohn erfolgt mit Aktivitätsindizes.
Die bekanntesten sind der Crohn´s disease activity index (CDAI), der HarveyBradshaw-Index (HBI) sowie der Van-Hees-Index 23,111,291.
Der MC zeigt insgesamt ein sehr heterogenes Befallsmuster des kompletten
Gastrointestinaltraktes, welches sich im weiteren Verlauf der Erkrankung teilweise
ändern kann. Bei Erstdiagnose wird am häufigsten ein Befall des terminalen Ileums
beobachtet, gefolgt von einem kompletten Befall des Kolons sowie dem gleichzeitigen
Befall des Ileums und des Kolons. Im weiteren Verlauf kann der alleinige Befall des
Kolons sich zu einem gleichzeitigen Befall des Ileums ausweiten. Der übrige Verlauf
1
Einleitung
scheint
aber
über
Gastrointestinaltraktes
die
Jahre
(GIT)
ist
stabil
zu
insgesamt
bleiben.
Ein
seltener168.
Befall
Weiter
des
oberen
scheint
das
Befallsmuster bei Erstdiagnose einen Einfluss auf die spätere Verlaufsform zu haben.
So wird ein ileales Befallsmuster eher mit einem später strikturierenden Verlauf
assoziiert. Ein penetrierend fistelnder Verlauf geht offensichtlich zudem mit einer hohen
Anzahl an akuten Schüben einher169. Grundsätzlich werden beim MC anhand der
Wien-Klassifikation 3 unterschiedliche Verlaufsformen unterschieden91. Dabei zeigen
13 % der Patienten einen strikturierenden, 47 % einen penetrierenden und 40 % weder
einen strikturierenden noch einen penetrierenden Verlauf50.
Beim MC ergibt sich eine vergleichsweise günstige Prognose im Krankheitsverlauf,
was sich auch in der kontroversen Studienlage bezüglich der Mortalität niederschlägt.
In einer Metaanalyse aus 13 Publikationen konnte in 7 Studien eine leicht erhöhte
Mortalität festgestellt werden, in den übrigen Publikationen zeigte sich jedoch keine im
Vergleich zur Vergleichspopulation
erhöhte Mortalitätsrate sowie eine aggregierte
39
Standardmortalitätsrate von 1,52 . Eine neuere Analyse kommt mit einer aggregierten
Standardmortalitätsrate von 1,39 zu einem ähnlichen Ergebnis64. Der Rückgang der
Mortalitätsrate in neueren Studien könnte nicht zuletzt auch auf die Therapiefortschritte
der modernen Medizin zurückzuführen sein.
Weiter sollte das für MC-Patienten erhöhte Risiko für Karzinome des GIT im klinischen
Verlauf berücksichtigt werden. Hier zeigt sich vor allem ein erhöhtes Risiko für
Kolonkarzinome und Karzinome des terminalen Ileums68,20. Ein möglicherweise
erhöhtes Risiko für extraintestinale Karzinome wird kontrovers diskutiert. In einer
Studie konnte lediglich ein erhöhtes Risiko für Plattenepithelkarzinome der Haut
gefunden werden69.
1.1.3 Therapie des Morbus Crohn
Die oberste Zielsetzung in der Therapie des MC sollte die Remissionsinduktion mit
anschließender Remissionserhaltung sein. Im Idealfall erfolgt die Therapie hierbei
interdisziplinär, was anhand der Komplexität der zu berücksichtigenden Faktoren wie
u.a. Befallsmuster, klinische Situation, Krankheitsaktivität, Ansprechen auf Steroide,
extraintestinale Manifestationen und der speziellen klinischen Verlaufsform deutlich
wird121. Sie richtet sich nach der aktuellen S3 Leitlinie „Diagnostik und Therapie des
Morbus Crohn“. Dabei stellt Budesonid bei gering oder mäßig aktivem MC das Mittel
der Wahl dar. Bei einem schweren Schub sollte auf systemische Glucocorticoide
zurückgegriffen werden, die bei fehlendem Ansprechen durch Azathioprin bzw.
2
Einleitung
6-Mercaptopurin ergänzt werden sollten. Der Einsatz von TNFα sollte allerdings
therapierefraktären schweren Schüben vorbehalten bleiben122.
Eine ernstzunehmende, wenn auch seltene Komplikation stellt der fulminante Schub
bei MC dar. Hier zeigt sich eventuell eine Wirksamkeit von Cyclophosphamid260, 247.
1.2 Colitis ulcerosa
1.2.1 Definition und Epidemiologie der Colitis ulcerosa
Die Colitis ulcerosa (CU) ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung allein des
Kolons, die sich vornehmlich - von distal nach proximal zunehmend - in einem
kontinuierlichen und symmetrischen Entzündungsmuster manifestiert, welches auf
Mukosa und Submukosa beschränkt ist80. Die Inzidenz der CU wird in Deutschland mit
3,9/100.000 Einwohner mit einem Inzidenzgipfel um das 16.-24. Lebensjahr
angegeben, wobei die Altersverteilung gleichmäßiger als beim MC zu sein scheint208.
Doch offensichtlich gibt es auch bei der CU - wie auch beim MC - bezüglich der
Inzidenz ein Nord-Süd Gefälle. Allerdings ist dieses weniger stark ausgeprägt. Weiter
ist im Gegensatz zum MC bei Männern ein erhöhtes Risiko für CU erkennbar256. Die
Prävalenz der CU wird je nach Studie zwischen 37–246/100.000 Einwohner
angegeben166.
1.2.2 Klinischer Verlauf der Colitis ulcerosa
Auch wenn die klinische Symptomatik der CU vielgestaltig ist, stellt die blutige Diarrhoe
in Kombination mit Abgang von Schleim und abdominellen Schmerzen das
Leitsymptom der CU dar17. Weiter kann es im klinischen Verlauf zu einem
Gewichtsverlust und anämischen Symptomen kommen103.
Extraintestinale Manifestationen treten bei der CU insgesamt seltener auf als beim MC.
Jedoch sind einzelne Manifestationen wie die primär sklerosierende Cholangitis sowie
Manifestationen an den Augen wie Iritis und Uveitis häufiger als beim MC zu
beobachten21.
Wie beim MC ist auch der klinische Verlauf bei der CU durch Schübe gekennzeichnet,
welche sich sowohl akut als auch fulminant präsentieren können und im weiteren
Verlauf in teils ausgedehnte Remissionen übergehen. Eine einheitliche Definition der
jeweiligen Verlaufsform existiert aber noch nicht103.
Sowohl die Symptomatik selbst als auch deren Schwere scheinen von der Ausdehnung
des
intestinalen
Befalls
abzuhängen17.
Anhand
der
Montreal
Klassifikation
unterscheidet man - bezogen auf das intestinale Befallsmuster - eine Proktitis (E1),
3
Einleitung
eine Linksseitenkolitis (E2) und eine extensive Kolitis (E3)242. Weiter besteht auch bei
der CU die Möglichkeit einer zusätzlichen Ileitis, welche auch als „BackwashIleitis“ bezeichnet wird2.
Die Einschätzung der Aktivität und Schwere der CU ist - wie beim MC auch - anhand
zahlreicher Klassifikationssysteme möglich. So erlaubt beispielsweise die oben
erwähnte Montreal Klassifikation auch eine Schweregradeinteilung der Erkrankung242.
Ein in der Praxis verbreiteteres Klassifikationssystem stellt der Mayo Score
dar,
welcher
dem
sich
aus
der
Stuhlfrequenz,
der
rektalen
Blutbeimengung,
endoskopischen Befund und der Aktivitätsbeurteilung durch den behandelnden Arzt
zusammensetzt154. Auch wenn die meisten Klassifikationssysteme ihren Weg in die
tägliche klinische Praxis noch nicht gefunden haben, ermöglichen sie in zahlreichen
klinischen Studien eine exaktere Einschätzung des Behandlungserfolges58.
Das Risiko für kolorektale Karzinome ist bei CU-Patienten erhöht und hängt unter
anderem auch von der Dauer der Erkrankung ab. So steigt einer Metaanalyse zufolge
das Karzinomrisiko nach einer Erkrankungsdauer von 10 Jahren um 2%, nach 20
Jahren um 8% und nach 30 Jahren um 18%65. Ältere Studien kamen bereits zu
ähnlichen Ergebnissen165. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass eine starke
Entzündung, ein junges Alter bei Erstdiagnose und das männliche Geschlecht das
Risiko für Kolonkarzinome zusätzlich erhöhen137.
Ähnlich dem MC zeigt auch die CU eine nur geringe Einschränkung der
Lebenserwartung.
So
wird
in
einer
Metaanalyse
die
aggregierte
Standardmortalitätsrate für CU mit 1,1 angegeben, wobei das Mortalitätsrisiko in den
ersten Jahren nach Diagnosestellung am höchsten war136.
1.2.3 Therapie der Colitis ulcerosa
Die Therapie der CU orientiert sich am Schweregrad der Entzündung, die Einteilung
der Schwere erfolgt anhand der Truelove-Kriterien284.
Während bei der distalen Colitis mit gering- bis mäßiggradiger Aktivität die topische
Anwendung von 5-Aminosalizylaten die Therapie der Wahl darstellt, wird diese bei
einer ausgedehnten Colitis mit gering- bis mäßiggradiger Aktivität um die orale
Applikation von 5- Aminosalizylaten ergänzt116.
Die schwere Form der CU wird im Falle einer lediglich distalen Ausdehnung mit oralen
Glucocorticoiden
therapiert,
wohingegen
eine
ausgedehnte
Lokalisation
mit
intravenösen Glucocorticoiden behandelt wird. In jenem Fall ist auch der Einsatz von
Cyclosporin und Infliximab gerechtfertigt, wenn ein Ansprechen auf intravenöse
4
Einleitung
Glucocorticoide ausbleibt120. Im weiteren Verlauf ist aber meist eine Kolektomie mit
ileoanaler Pouchanlage indiziert59.
1.3 Das Immunsuppressivum Cyclosporin A
1.3.1 Cyclosporin A im klinischen Alltag
Cyclosporin A ist ein Immunsuppressivum, welches bereits in den frühen 70er Jahren
des vorigen Jahrhunderts aus dem Schlauchpilz Tolypocladium inflatum isoliert werden
konnte36,27. Es handelt sich dabei um eine neutrale und durch zyklische Anordnung
lipophile Peptidstruktur, die aus insgesamt 11 Aminosäuren zusammengesetzt ist und
eine molare Masse von 1202,6 g/mol besitzt28.
Cyclosporin A wird hauptsächlich in der Transplantationsmedizin angewandt, wodurch
zum einen das Risiko einer Transplantatabstoßung verringert und zum anderen die
mittlere Überlebenszeit transplantierter Patienten entscheidend verbessert werden
konnten262. Die weiteren Indikationen sind neben dermatologischen Manifestationen
wie die schwere Psoriasis73, das Pyoderma Gangraenosum286 oder die atopische
Dermatitis248 hauptsächlich Erkrankungen aus dem autoimmunen Formenkreis wie
steroidrefraktäre
Glomerulonephritiden177
und
Myasthenia
gravis194
sowie
Erkrankungen aus dem rheumatoiden Formenkreis wie etwa die rheumatoide
Arthritis302.
In der klinischen Erprobung ist außerdem der Einsatz von topikalem Cyclosporin A in
der Behandlung von trockenen Augen42. Außerdem wird vermutet, dass Cyclosporin A
zum einen eine präventive Wirkung in der Therapie der kardialen Hypertrophie
besitzt192, zum anderen könnte Cyclosporin A eine neuroprotektive Wirkung in der
Behandlung des Schädel-Hirn Traumas haben266.
Die wichtigste Nebenwirkung von Cyclosporin A ist seine Nephrotoxizität, die in der
Langzeitbehandlung zu einer irreversiblen interstitiellen Fibrose führen kann35. Weitere
häufige Nebenwirkungen, welche eine umgehende Dosisreduktion erfordern, sind die
Entwicklung einer Cholestase, das Auftreten eines Tremors, einer Diarrhoe oder einer
Gingivahyperplasie sowie die Erhöhung des arteriellen Blutdrucks. Seltener wurde von
Pankreatitiden,
Hyperglykämien,
Blutbildungsstörungen berichtet
Enzephalopathien,
Myopathien
und
263
.
Cyclosporin A wird bevorzugt oral verabreicht, was in der Praxis eine sehr variable
Bioverfügbarkeit zur Folge hat289. Eine höhere Bioverfügbarkeit wird einerseits durch
einen starken First-Pass-Effekt in der Leber304, andererseits durch einen über das
Glykoprotein - P erhöhten intestinalen Efflux verhindert83. Eine intravenöse Applikation
5
Einleitung
ist bei oraler Unverträglichkeit ebenfalls möglich, jedoch zeigte sich hierbei ein
erhöhtes Risiko für einen anaphylaktischen Schock294.
Cyclosporin
A
unterliegt
CytochromP450 3A4
einer
starken
Metabolisierung
durch
das
Enzym
316
, weshalb eine gleichzeitige Einnahme von beispielsweise
Grapefruitsaft, ein potenter Hemmer jenes Enzyms, zu einem erhöhten Cyclosporin ASpiegel und einer damit verbundenen erhöhten Toxizität führen kann25. Somit ist auch
jedes andere Medikament, welches zu einer Induktion oder Inhibition von
CytochromP450 3A4 führt, in der Lage, den Cyclosporin A-Spiegel zu erhöhen oder im
umgekehrten Fall zu erniedrigen.
Das Wissen über die spezifische Pharmakokinetik von Cyclosporin A, welche durch
eine stark variable Bioverfügbarkeit und eine enge therapeutische Breite geprägt ist,
bedingt im klinischen Alltag ein verlässliches therapeutisches Drug Monitoring (TDM).
Ein
zu
niedriger
Cyclosporin
A-Spiegel
erhöht
zum
Beispiel
in
der
Transplantationsmedizin das Risiko einer Transplantatabstoßung, wohingegen ein zu
hoher Cyclosporin A-Spiegel mit einer vermehrten Toxizität einhergeht138. Neben einer
Cyclosporin A-Spiegelbestimmung nach festen Schemata ist eine regelmäßige
Kontrolle der Cholestaseparameter und Transaminasen genauso erforderlich wie eine
Kontrolle der Kreatinin Clearence263.
1.3.2 Stellenwert von Cyclosporin A in der Therapie chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen
Cyclosporin A
ist in der Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen
besonderen klinischen Konstellationen vorbehalten. Während es in der Therapie der
CU einen festen Platz hat, ist der Einsatz bei MC noch eher experimenteller Natur.
Der Einsatz von Cyclosporin A ist derzeit kein Bestandteil der aktuellen Leitlinie zur
Therapie des MC122. In Studien konnte gezeigt werden, dass Cyclosporin A in niedriger
Dosierung zwar einen Vorteil in der Behandlung therapieresistenter Fisteln besitzt 66, in
niedriger Dosierung jedoch nicht im Stande ist, eine dauerhafte Remission zu
induzieren180,261. Lediglich in einer höheren Dosierung zeigte sich eine Verbesserung
der Symptomatik, die jedoch nach Absetzen von Cyclosporin A persistierte66.
In der Leitlinie zur Therapie der CU hingegen wird der Einsatz von Cyclosporin A
sowohl beim schweren steroidrefraktären Schub als auch beim schweren Schub mit
gleichzeitig bestehenden Kontraindikationen für Glucocorticoide empfohlen59. Die
Dosis ist abhängig von der Nierenfunktion und sollte bei uneingeschränkter Kreatinin
Clearance bei 4mg/kg Körpergewicht liegen120. Die häufigsten Nebenwirkungen in
6
Einleitung
dieser Dosierung sind vor allem das Auslösen von Parästhesien, Cephalgien, einer
Hypertension, Nierenschädigungen sowie einer Hypomagnesämie, was wiederum die
Ursache von Krampfanfällen sein kann237.
In einer Studie wurde dokumentiert, dass Cyclosporin A in der Behandlung des
schweren Schubes auch als Mittel der ersten Wahl eingesetzt werden kann57.
Das Ansprechen der Patienten auf eine Therapie mit Cyclosporin A im schweren
Schub ist zwar initial hoch, jedoch zeigte sich, dass eine Kolektomie in rund der Hälfte
der Fälle nicht zu verhindern ist und die Abstände der Remissionen immer kürzer
wurden, was auch auf eine beobachtete verminderte Ansprechrate für Cyclosporin A
im Verlauf zurückzuführen ist38. Aus den Beobachtungen des Langzeitverlaufs ist
ersichtlich, dass die Ansprechrate von Cyclosporin A über den beobachteten Zeitraum
kontinuierlich abnimmt. So sprachen in einer Studie initial 83,7 % der Patienten auf
eine Therapie mit Cyclosporin A an. Nach bereits 6 Monaten konnte eine Kolektomie
bei 25 % der zuvor auf Cyclosporin A gut ansprechenden Patienten nicht mehr11, nach
7 Jahren sogar nur noch bei etwa 12 % der Patienten verhindert werden190.
Im klinischen Alltag ergibt sich daraus die Notwendigkeit, prädiktive Faktoren zu
eruieren, die ein Ansprechen auf Cyclosporin A zuverlässig anzeigen können. Somit
würden
einer
Patienten, welche nicht auf eine Cyclosporin A-Therapie ansprechen, von
rascheren
Entscheidung
zur
Kolektomie
profitieren.
Auch
könnten
Nebenwirkungen der Cyclosporin A-Therapie vermieden und gleichzeitig unnötige
Therapiekosten eingespart werden.
Als prädiktive Faktoren, von denen einige auch ein vermindertes Ansprechen von
Glucocorticoiden anzeigen können19, wurden für ein fehlendes Ansprechen von
Cyclosporin A bisher eine erhöhte Herzfrequenz, ein erhöhtes C-reaktives Protein, der
Nachweis von schweren Läsionen in der Koloskopie37, eine Thrombyozytose, eine
Hypalbuminämie und ein erhöhtes Alter dokumentiert127. Interessanterweise verringert
eine bisherige Therapie mit dem Immunsuppressivum Azathioprin190 ebenso die
Ansprechrate für Cyclosporin A wie eine bereits zuvor stattgefundene Therapie mit
Cyclosporin A127. Diese Tatsache könnte darauf hindeuten, dass die immunmodulative
Wirkung von Cyclosporin A einen Einfluss auf dessen spätere Wirksamkeit hat. Der
genaue Wirkmechanismus von Cyclosporin A bei CED-Patienten ist noch nicht
abschließend geklärt. Die Entschlüsselung der pharmakodynamischen Eigenschaften
von Cyclosporin A könnte aber auch, bedingt durch die unterschiedliche Wirkung bei
MC- und CU-Patienten, einen Hinweis auf die unterschiedliche Pathogenese chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen geben.
So findet möglicherweise durch Cyclosporin A bei CU-Patienten ein Wechsel der Th2
7
Einleitung
dominierten Immunantwort hin zu einer Th1 dominierten Immunantwort statt, wie er bei
MC-Patienten häufiger vorzukommen scheint33. Zwar beeinflusst Cyclosporin A
hauptsächlich die T-Zellantwort, jedoch zeigte sich, dass ebenso die Chemotaxis
neutrophiler Leukozyten gehemmt wird, wie es hauptsächlich für die Pathogenese der
CU relevant zu sein scheint22.
1.3.3 Wirkmechanismus von Cyclosporin A
Die immunsuppressive Wirkung wird hauptsächlich durch eine potente Hemmung der
T-Zellaktivität vermittelt29. So konnte etwa nachgewiesen werden, dass Cyclosporin A
nicht nur T-Helfer Zellen über eine Reduktion von Interleukin 1 hemmt8, sondern auch
die Induktion von T-Zellen über eine Verminderung von Interleukin 2 verhindert61.
Zudem scheint es zum einen in B-Zellen zu einer Hemmung der TNFα Produktion zu
kommen267, zum anderen kommt es in basophilen Leukozyten zu einer verminderten
Zytokinausschüttung43.
Interagiert ein Ligand mit dem T-Zellrezeptor, werden unter normalen Bedingungen
zahlreiche Kaskaden aktiviert, die unter anderem zu einem gesteigerten Ca2+ Influx
führen, worüber schließlich das Schlüsselenzym Calcineurin - eine Serin-Threonin
Phosphatase - induziert wird51. Calcineurin ist nun im Stande, den nukleären Faktor
aktivierter T-Zellen (NFAT) über eine Dephosphorylierung zu aktivieren176. Dadurch
kommt es einerseits zu einer Translokation des NFAT in den Zellkern222 und
andererseits zu einer Erhöhung der Affinität des NFAT für DNA, wodurch erst eine
Bindung an die Promotorregion des Interleukin 2 Gens ermöglicht wird214. Die Folge ist
eine erhöhte Expression von Interleukin 2.
Die lipophile Struktur von Cyclosporin A ermöglicht eine Penetration der Zelle und ein
anschließendes Binden an dessen intrazellulären Rezeptor Cyclophilin A, welcher
allgemein auch als Immunophilin bezeichnet wird109. Der entstandene Komplex aus
Cyclosporin A und Cyclophilin A ist nun im Stande, die Calcineurinphosphatase zu
hemmen160, wodurch eine Aktivierung des NFAT verhindert wird, was eine verminderte
Expression von Interleukin 2 zur Folge hat.
Aus dem molekularen Wirkmechanismus von Cyclosporin A lassen sich schließlich
neue Erkenntnisse bezüglich des komplexen Zusammenspieles unterschiedlicher
Signalkaskaden aktivierter T-Zellen gewinnen.
8
Einleitung
1.4 Die Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
1.4.1 Genetische Suszeptibilität
Die Hypothese einer genetischen Suszeptibilität für MC konnte durch Zwillingsstudien
bekräftigt werden. So variiert die Konkordanz in monozygoten Zwillingen zwischen 2050% und für dizygote Zwillinge zwischen 0-7%108,206,280,287. Einer dänischen Studie
zufolge weisen nahezu 20 % der CED-Patienten eine positive Familienanamnese
hinsichtlich eines MC oder einer CU auf24. Das relative Risiko eines Verwandten ersten
Grades, ebenfalls an MC zu erkranken, wird mit 36,5 % angegeben240. Einen
differenzierteren Blick ermöglicht eine Studie von Ornholm et al., in der das relative
Risiko für CU für einen Verwandten ersten Grades eines MC-Patienten mit 3,9 % und
das relative Risiko für MC für einen Verwandten ersten Grades eines CU-Patienten mit
1,8 % angegeben wird207. Daraus lässt sich eine genetische Prädisposition für die
Pathogenese der CED vermuten.
In zahlreichen genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) konnten diverse Genloci
identifiziert werden, die im Zusammenhang mit der Pathogenese der CED stehen.
Das HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) listet aktuell neun verschiedene
Genloci auf, welche nach ihrem Entdeckungszeitpunkt als inflammatory bowel
dissease (IBD) 1-9 bezeichnet werden1. Eine besondere Bedeutung kommt dabei dem
bisher am besten untersuchten IBD 1 Gen zu, welches auch als NOD2 Gen oder
CARD15 Gen bezeichnet wird und auf dem Chromosom 16 lokalisiert ist130,203. Eine
Mutation des NOD2 Gens ist vermehrt mit
einem illealen MC assoziiert, der
symptomatisch mehrheitlich mit Strikturen einhergeht153. Daraus lässt sich ableiten,
dass es durchaus unterschiedliche Subgruppen von MC-Patienten gibt91. Als
Risikofaktoren
für
Polymorphismen
die
Entwicklung
eines
MC
werden
drei
unterschiedliche
angegeben: Eine Frame- Shift Mutation sowie zwei Missense
Mutationen. Alle drei Polymorphismen führen zu einer Veränderung der C-teminalen
Domäne des NOD2 Proteins130,203. In der initialen Studie wird das relative Risiko für
die Entwicklung eines MC im heterozygoten Fall mit 3 %, im homozygoten Fall mit
38 % und im kombinierten heterozygoten Fall mit 44 % angegeben130. NOD2 Proteine
werden unter anderem in Makrophagen, Paneth - Zellen, dendritischen Zellen,
intestinalen Epithelzellen sowie auch in T-Zellen exprimiert288,295,272,118,107. Der
intrazelluläre Rezeptor NOD2 erkennt normalerweise über eine leucinreiche Domäne
MDP, welches sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien zu finden
ist269,146. Dies wiederum führt zu einer Aktivierung von NF-κB, wodurch in den Paneth
Zellen des Darms die Expression von antimikrobiellen Komponenten wie etwa
9
Einleitung
Defensinen
– im
speziellen Defensin 5/6 - gesteigert
wird298.
Die NOD2
Polymorphismen reduzieren die Fähigkeit, NF-κB zu aktivieren, was zu einem
vermehrten Überleben von Bakterien und somit auch vermutlich zu einem chronischen
Entzündungsprozess führt203. Es konnte in einer aktuellen Studie dokumentiert werden,
dass NOD2 KO Mäuse - bedingt durch eine erhöhte intestinale Permeabilität sowie
verringerte antimikrobielle Kapazität - einerseits unter keimfreien Aufzuchtbedingungen
eine erhöhte Suszeptibilität für eine intestinale Entzündung zeigen, andererseits konnte
aber auch beobachtet
werden, dass NOD2 KO Mäuse bei einer spezifischen
bakteriellen Rekolonisation oder externen probiotischen Therapie eine im Vergleich
niedrigere Suszeptibilität für eine intestinale Entzündung aufweisen196.
Ein weiteres Gen für einen intrazellulären Rezeptor und Aktivator von NF-κB ist das
NOD1 Gen oder CARD4 Gen133, welches sich auf dem Chromosom 7 befindet241. Der
Rezeptor erkennt Peptidoglykanderivate von intrazellulären gramnegativen Bakterien41.
Ein Polymorphismus des NOD 1 Gens ist vor allem mit der früh manifesten Form des
MC assoziiert181. In einer Studie von Netea et al. konnte aufgezeigt werden, dass eine
Stimulation des NOD 1 Rezeptors bei gleichzeitigem Vorliegen eines MCSuszeptibilitätspolymorphismus keine Zytokinexpression in peripheren mononukleären
Immunzellen auslöste197.
Auch Polymorphismen in extrazellulären Rezeptoren stehen in Verbindung mit der
Pathogenese des MC. So können Polymorphismen im TLR 4 Gen einerseits zu einer
erhöhten
genetischen
Suszeptibilität
für
MC
führen210,
andererseits
können
Polymorphismen im TLR 5 Gen aber auch zu einer gewissen Protektion beitragen96.
Toll-like Rezeptoren befinden sich unter anderem an der Oberfläche von intestinalen
Epithelzellen und spielen nicht nur eine entscheidende Rolle in der Erkennung der
mikrobiotischen Darmflora, sondern tragen auch zur Aufrechterhaltung der intestinalen
Epithelhomöostase bei221. So erkennt beispielsweise der Toll - like - Rezeptor 4 als
pathogen assoziiertes molekulares Muster (PAMP) Lipopolysacharide aus der
Zellmembran von gramnegativen Bakterien und leitet in der Folge eine Signalkaskade
ein, die zur Beseitigung des pathogenen Bakteriums führt147. Auch wenn der genaue
Stellenwert des TL4 Rezeptors noch nicht vollständig geklärt ist, so zeigen Studien,
dass bei MC-Patienten die Expression von TL4 Rezeptoren signifikant erhöht ist40. Die
wahrscheinlich protektierende Wirkung des TLR 5 Gen - Polymorphismus leitet sich
womöglich von einer loose- of -function Punktmutation ab96. Das dominierende Antigen
des TL5 Rezeptors ist das in vielen beweglichen Bakterien vorhandene Proteinmolekül
Flagellin, welches hauptsächlich am Aufbau der Flagellen beteiligt ist113. In Colitis
Mausmodellen konnte Flagellin als ein potentes Antigen in der Pathogenese des MC
10
Einleitung
eruiert werden164.
Des Weiteren werden mit dem illealen MC single nucleotid Polymorphismen
im
ATG16L1 Gen auf dem Chromosom 2 in Verbindung gebracht86, 218, 229. Das ATG16L1
Protein wird vor allem in intestinalen Epithelzellen, Leukozyten und der Milz exprimiert
und spielt eine wichtige Rolle in der Autophagozytose86. Eine Mutation im ATG16L1
Gen führt demzufolge nicht nur zu
einer gestörten Phagozytose von Viren und
Bakterien und damit zu einer gestörten Immunantwort, sondern auch zu einer
Beeinträchtigung der Apoptose, was wiederum in eine Dysbalance des GIT mündet229.
Polymorphismen im IL-23 Rezeptor Gen auf dem Chromosom 1 haben wiederum
neben einem induzierenden100,230 auch einen protektiven Einfluss204,63 auf die Genese
des MC. Der IL-23 Rezeptor wird hauptsächlich an der Oberfläche von Zellen des
Immunsystems, wie etwa T-Zellen, NK-Zellen oder antigenpräsentierenden Zellen
exprimiert315,205. Der Rezeptor interagiert mit dem Interleukin-23, welches womöglich
die Produktion von Interleukin-17 durch Th17 Zellen triggern kann293,4. MC-Patienten
zeigen neben einem erhöhtem IL-17 Spiegel auch einen erhöhten IL-23 Spiegel in der
Darmmukosa246. Zudem korreliert der IL-23 Rezeptor Genotyp mit der Funktion von
Th17 Zellen und ihrer Produktion von Interleukin-22245. Der Interleukin-23 Rezeptor und
seine Expression auf Th17 Zellen
scheinen somit ein Schlüsselfaktor in der
Pathogenese des MC zu sein, woraus sich auch neue therapeutische Strategien
ableiten lassen298.
Hinsichtlich der genetischen Suszeptibilität für MC wurden in zahlreichen Studien
weitere Genloci identifiziert. So zeigt auch das IBD 5 Gen auf dem Chromosom 5 eine
starke Assoziation mit der früh manifesten Form des MC228; außerdem wurden bei den
im IBD 5 Locus befindlichen Genen OCTN1 sowie OCTN2 nicht nur eine genetische
Suszeptibilität, sondern auch eine Assoziation mit der Schwere des klinischen Verlaufs
von MC-Patienten festgestellt216.
Eine CED-Assoziation von Polymorphismen mit dem ABCB1 Gen, welches das P Glykoprotein 1 kodiert und als ATP-abhängiger Transporter für den Efflux von
Xenobiotika sorgt, wird schon seit längerem vermutet124. So entwickeln nicht nur
ABCB1 KO Mäuse spontan eine Colitis211, es zeigen auch diverse Polymorphismen
eine Prädisposition für MC217. Weitere kürzlich entdeckte Polymorphismen betreffen
das
mit
einer
erhöhten
gastrointestinalen
Permeabilität
einhergehende
DLG5 Gen265, 201 sowie das T-Zellen Supressorgen CTLA4126.
Genetische Polymorphismen in der IBD3 Region auf dem Chromosom 6 betreffen das
HLA System und sind vor allem mit einem erhöhten Risiko für CU, insbesondere bei
Männern79, und in geringerem Maße für MC assoziiert264. Eine starke Assoziation
11
Einleitung
wurde dabei zwischen Polymorphismen im HLADRB1*0103 Allel und dem Auftreten
eines schweren Verlaufs der CU nachgewiesen233. Dieser Polymorphismus scheint bei
CU-Patienten mit besonders distal gelegenen Kolonaffektionen einherzugehen5.
Die
Vielzahl
der
unterschiedlichen
genetischen
Polymorphismen
und
deren
unterschiedliche Auswirkungen zeigen zum einen die Komplexität der Pathogenese
chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, aber auch die Multifaktorialität der
Erkrankung. So stellt ein einziger Polymorphismus zwar einen Risikofaktor oder auch
protektiven Faktor dar, kann aber alleine nicht die Pathogenese erklären. Insofern
liefern auch zahlreiche Studien den Hinweis auf eine komplexe Interaktion der
einzelnen Polymorphismen verschiedener Genloci untereinander53,92,184.
1.4.2 Beeinflussung des Risikos durch Umweltfaktoren
In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass aktive Raucher ein signifikant
niedrigeres Risiko haben, eine CU zu entwickeln. So wird das Quotenverhältnis in der
Literatur zwischen 0,13-0,7 angegeben257,159. Es konnte nachgewiesen werden, dass
bereits eine passive Zigarettenrauchexposition in der Kindheit zu einem um 50 %
niedrigeren Risiko führt, im späteren Leben eine CU zu entwickeln238. Der Grund für
den protektiven Effekt des Rauchens ist noch nicht völlig geklärt. Diskutiert wird unter
anderem eine unter Nikotinexposition gesteigerte Mucinproduktion im Kolon78, eine bei
aktuellen Rauchern durch Darmbiopsien festgestellte signifikant niedrigere Interleukin
1β und Interleukin 8 Konzentration254 sowie eine durch Kohlenstoffmonoxidexposition
ausgelöste Verbesserung der mikrovaskulären Durchblutung im Kolon112. Ehemalige
Raucher zeigen wiederum ein deutlich erhöhtes Risiko, eine CU zu entwickeln, wobei
das Risiko auch von der früheren Intensität des Rauchens abzuhängen scheint257,159.
Weiter beeinflusst möglicherweise das Rauchen auch den klinischen Verlauf der CU.
So gaben in einer Studie 14 von 30 CU-Patienten sowohl nach Steigerung als auch
nach Wiederaufnahme des Zigarettenkonsums eine Verbesserung der Symptomatik
an234. Gestützt wird diese Beobachtung durch Studien, die bei Rauchern einen
niedrigeren Bedarf an Glucocorticoiden und Azathioprin, eine niedrigere Rate an
Krankenhausaufenthalten
nachweisen
sowie
eine
geringere
Notwendigkeit
zur
Kolektomie
185,30
. Die sich daraus ableitende Therapieoption wird kontrovers diskutiert.
So bestätigten Therapieversuche über
transdermale Nikotinapplikation zwar die
vorangegangenen Beobachtungen hinsichtlich einer Besserung der Symptomatik219,
eine
höhere
Remissionsrate277
oder
gar
eine
Glucocorticoiden konnten aber nicht nachgewiesen werden
12
Überlegenheit
278
.
gegenüber
Einleitung
Im Gegensatz zur CU stellt Rauchen allerdings einen Riskofaktor für die Entwicklung
eines MC dar. So wird das Quotenverhältnis in einer die Jahre 1980 bis 2006
betreffenden Metaanalyse mit 1,76 angegeben172. Auch scheint das Rauchen den
klinischen Verlauf von MC-Patienten negativ zu beeinflussen. So dokumentiert eine
Studie, dass das Risiko eines MC-Schubes ab einem täglichen Zigarettenkonsum von
15 Zigaretten signifikant erhöht ist49. Der negative Einfluss zeigt sich auch in einem
höheren Bedarf an Glucocorticoiden48, in einer erhöhten Inzidenz von Fisteln und
operativen Interventionen158 sowie einer postoperativ erhöhten Rezidivrate308. Dagegen
scheint das Einstellen des Zigarettenkonsums einen positiven Effekt auf den klinischen
Verlauf hinsichtlich der geringeren Inzidenz von Exazerbationen und des geringeren
Bedarfs an Glucocorticoiden zu haben47. Somit sollte bei der Therapie des MC auch
eine Motivation zur Nikotinkarenz Berücksichtigung finden.
Einen ebenfalls protektiven Einfluss auf die Pathogenese der CU hat möglicherweise
die Appendektomie. In einer Metaanalyse konnte ein Quotenverhältnis von 0,312
ermittelt werden148. Weiter scheint
eine Appendektomie in der Vorgeschichte den
Krankheitsverlauf der CU positiv zu beeinflussen, was sich zum einen in einer
geringeren Ausprägung von Symptomen und einem ebenfalls geringeren Verbrauch an
Immunsuppressiva und zum anderen in einer signifikant niedrigeren Inzidenz von
Kolektomien bemerkbar macht220,195.
Im Gegensatz zur CU wird der
Appendektomie ein negativer Effekt auf die
Pathogenese des MC zugeschrieben, was aber kontrovers diskutiert wird. So hängen
offensichtlich auch das Risiko für die Entwicklung eines MC sowie der Einfluss auf den
klinischen Verlauf nicht nur von Parametern wie dem Geschlecht oder dem Alter bei
Erstdiagnose, sondern auch vom klinischen Imponieren der Appendizitis ab7.
Ebenfalls kontrovers wird der Einfluss von oralen Kontrazeptiva diskutiert. Hier lässt
sich eine geringe Assoziation mit dem Risiko für die Entwicklung eines MC ablesen102.
Das frühkindliche häusliche Umfeld scheint einen Einfluss auf das Risiko zu haben, im
späteren Leben eine CED zu entwickeln. So birgt beispielsweise ein niedriger
sozioökonomischer Status ein um das 3fach erhöhtes Risiko, an
einer CED zu
erkranken67. Bei näherer Betrachtung der häuslichen Hygieneverhältnisse fällt ein
Zusammenhang zwischen der Inzidenz von MC und dem Vorhandensein einer
Warmwasserleitung sowie einem abgetrennten Badezimmer im elterlichen Haus auf 94.
Dies könnte auch eine Erklärung für die steigende Inzidenz von MC in den
Industriestaaten
sein.
Weiter
gibt
es
in
Staaten
mit
einer
hohen
Säuglingssterblichkeitsrate eine niedrigere Inzidenz an CED als in Staaten mit einer
niedrigeren Säuglingssterblichkeitsrate188. Nicht sicher geklärt ist, ob Stillen einen
13
Einleitung
protektiven Einfluss auf die Pathogenese der CED hat. So zeigen einige Studien eine
geringe negative Korrelation zwischen dem Stillen und dem späteren Auftreten von
MC; dies konnte aber in anderen Studien nicht bestätigt werden226,98.
Einen in der Literatur umstrittenen Risikofaktor im Speziellen für die Entwicklung des
MC stellen zudem eine hohe Inzidenz von frühkindlichen Infekten sowie die vermehrte
Einnahme von Antibiotika dar306.
Des Weiteren wird in einigen Studien als Risikofaktor für die Entwicklung einer CED
der vermehrte Konsum von Zucker224 sowie von gesättigten und ungesättigten
Fettsäuren93 genannt, was in anderen Studien aber nicht nachgewiesen werden
konnte135. Ähnlich verhält es sich bei der Studienlage zu Obst und faserreichem
Gemüse als vermeintlichem protektiven Faktor224. Es könnte hier aber eine statistische
Verzerrung vorliegen, da CED-Patienten ohnehin vermehrt auf Zucker als rasche
Energiequelle zurückgreifen sowie während eines Schubes auf faserreiches Gemüse
gänzlich verzichten. Diese Vermutung wird auch durch die Tatsache gestützt, dass
darauf abgestimmte Diätmaßnahmen als Schubprophylaxe keinerlei Nutzen für den
einzelnen Patienten erbrachten227.
1.4.3 Infektiöse Ursache
Die relative Nähe des klinischen Erscheinungsbildes der CED mit der klinischen
Manifestation einer akuten GIT- Infektion lässt die Vermutung eines infektiösen Agens
als Ursache der CED aufkommen. Bereits in sehr frühen Studien wurde versucht, die
Symptomatik der CU auf bestimmte Keime zurückzuführen, was durch eine bei
CU-Patienten
im
Vergleich
zu
Kontrollpatienten
höhere
Bakterienzahl
von
beispielsweise Diplostreptokokken, Bacteroides necrophorum oder Bacteroides fragilis
bewiesen werden sollte. Entsprechend darauf abgestimmte Vakzine brachten dennoch
keine entscheidende Besserung der Symptomatik145.
Als infektiöses Agens für die Pathogenese des MC wurde auch lange Zeit das
Mykobakterium avium paratuberculosis vermutet. Eine Isolation des Erregers und ein
entsprechender DNA Nachweis gelangen sowohl bei MC-Patienten als auch bei
Kontrollpatienten105,34. Versuche, mittels einer Therapie mit Tuberkulostatika zumindest
eine Besserung der Symptomatik zu erzielen, scheiterten jedoch279.
Weiter wurde in Studien eine Assoziation von enteroinvasiven Escherichia coli
Bakterien mit dem Auftreten der illealen Form des MC nachgewiesen54. Der genaue
Stellenwert dieser Beobachtung ist noch nicht völlig verstanden232.
Ein möglicherweise bestehender Zusammenhang zwischen einer durch perinatale
14
Einleitung
Infektion ausgelösten Masernviruspersistenz in der Darmmukosa296 oder gar der
Masernimpfung281 und dem Auftreten von CED konnte trotz langer Vermutung ebenfalls
nicht endgültig bewiesen werden56,97.
1.4.4 Veränderungen der mikrobiellen Darmflora
In den letzten Jahren wurde der Fokus mehr auf die mikrobiologische Darmflora als
mögliche Ursache der CED gelenkt. Erste Hinweise darauf lieferten zum einen die
Symptomatik von CED-Patienten günstig beeinflussende Antibiotikatherapie268 und zum
anderen unter probiotischer Therapie erzielte Erfolge in der Prophylaxe von CED
Komplikationen99. Untermauert werden diese Beobachtungen schließlich auch durch
Tiermodelle, in denen unter keimfreier Aufzuchtbedingung auch eine Verhinderung von
chronischen Entzündungsprozessen gezeigt werden konnte252,274.
Die
Tatsache,
dass
bei
CED-Patienten
ein
unterschiedliches
bakterielles
Kolonisationsmuster gefunden wurde, haben diese Feststellungen erhärtet. So haben
CED-Patienten nicht nur eine signifikant höhere Anzahl an Bakterien, sondern zeigen
auch eine bakterielle Kontamination der inneren Mucinschicht bis hin zur invasiven
Kontamination der Mucosa, welche sich bei Kontrollpatienten nahezu keimfrei
darstellte270. Uneinigkeit herrscht in der Literatur noch über eine mögliche Korrelation
von Kontamination und Grad der Entzündung250,270.
Weiter konnte ein signifikanter Unterschied in der Speziesdiversität gefunden werden.
So zeigen MC-Patienten im Vergleich zu CU-Patienten eine um bis zu 70 % reduzierte
Speziesdiversität173,209.
1.4.5 Störung des intestinalen Epithels
Die
Ursache
dieser
angeführten
Beobachtungen
könnte
eine
intestinale
Barrierestörung sein, welche vor allem bei MC-Patienten nachgewiesen wurde276.
Diese Barrierestörung könnte durch eine Funktionsbeeinträchtigung der Paneth-Zellen
entstanden sein, welche im Darm unter anderem maßgeblich an der Produktion von
antibakteriellen Defensinen beteiligt sind. Tatsächlich zeigen MC-Patienten eine
verminderte Konzentration an Defensinen299, was sich in einem reduzierten
antimikrobiellen Schutzfilm äußert202.
Ein weiterer Grund für die erhöhte bakterielle Kontamination könnte auch in einer
Differenzierungsstörung der Becherzellen liegen, welche vor allem in der Pathogenese
der CU eine wichtige Rolle zu spielen scheinen95. Eine von einer Störung der
15
Einleitung
Becherzellen ausgehende verminderte Produktion von antibakteriellen Muzinen könnte
somit einen inflammatorischen Prozess begünstigen. So zeigten MUC2 defiziente
Mäuse im Vergleich zu
höhergradige Entzündung
Wildtyp Mäusen im DSS Mausmodell schneller eine
290
.
Die vermehrte bakterielle Kontamination könnte aber auch einen Autoimmunprozess im
Sinne
einer
verminderten Toleranz
gegenüber
der
körpereigenen
Darmflora
62
begünstigen .
1.4.6 Störungen der Zytokinbalance
CED-Patienten zeigen sowohl eine gesteigerte Aktivierung des angeborenen als auch
des erworbenen Immunsystems. So konnte in immunhistochemischen Untersuchungen
der Darmmukosa eine vermehrte Rekrutierung von Makrophagen bei CED-Patienten
nachgewiesen werden, welche im entzündeten Bereich signifikant häufiger die
Oberflächenmarker L1 sowie CD 68 trugen235. Weiter zeigte das Zytokinprofil dieser
Zellen eine vermehrte Produktion von TNFα und Interleukin 1α sowie 1β. Trotzdem
sprachen CD14 positive Makrophagen noch weiterhin auf die deaktivierenden Zytokine
IL-10 und IL-4 mit einer verminderten Zytokinausschüttung an236. Vor wenigen Jahren
konnte zudem eine neue Untergruppe von Makrophagen identifiziert werden, welche
sowohl Oberflächenmerkmale von Makrophagen als auch von dendritischen Zellen
exprimieren. Diese Zellen können größere Mengen an proinflammatorischen
Zytokinen, wie etwa TNFα, IL-6 oder IL-23, produzieren und fanden sich signifikant
häufiger bei MC-Patienten. Ebenso scheinen diese Zellen speziell bei MC-Patienten im
Vergleich zu Kontroll- oder CU-Patienten noch höhere Mengen an Zytokinen zu
produzieren. Darüber hinaus regt die Zytokinausschüttung Lamina propria Zellen zur
Produktion
von
IFNγ
an,
wodurch
Makrophagenuntergruppe getriggert wird
eine
weitere
Differenzierung
dieser
139
.
Die Bedeutung der Makrophagen in der Pathogenese der CED wird auch in Studien
dargelegt, welche im Mausmodell zeigen konnten, dass eine Depletion von lokalen
Makrophagen des Darm-Traktes die Entwicklung einer Colitis verhindern kann297.
Im Gegensatz dazu scheint der Einfluss dendritischer Zellen auf die Pathogenese der
CED geringer zu sein. So konnten zwar bei CED-Patienten eine Aktivierung sowie eine
erhöhte Oberflächenexpression mikrobieller Rezeptoren gefunden werden, was
wiederum zu einer vermehrten Produktion von IL-6 und IL-12 führt. Der genaue
Stellenwert der dendritischen Zellen in der Pathogenese der CED bleibt aber unklar110.
Des Weiteren führen die CED zu
Veränderungen im erworbenen Immunsystem.
16
Einleitung
Schon in älteren Studien konnten sowohl bei CU- als auch bei MC-Patienten eine
erhöhte Antikörperproduktion – vor allem von IgA - sowie eine unterschiedliche
Antikörperdiversität nachgewiesen werden171,170. Während bei CU-Patienten in den
Subklassen von IgG im Vergleich zu Kontrollpatienten besonders IgG1 erhöht war,
zeigte sich bei MC-Patienten eine Erhöhung von IgG1, IgG2 und IgG3251.
Die Bedeutung von T Zellen für die Pathogenese der CED offenbart sich zum einen
aufgrund der Erfolge in der Behandlung der CU mit dem auf T- Zellen gerichteten
Immunsuppressivum Cyclosporin A und zum anderen aufgrund der Erfolge bei MC
durch Antikörpertherapie gegen einige von Th1 Zellen produzierten Interleukine174,156.
Anhand des exprimierten Zytokinprofiles unterscheidet man zwischen einer Th1 und
einer Th2 gerichteten Immunantwort. So konnte man bei MC-Patienten eher eine Th1
gerichtete Immunantwort nachweisen, welche sich vor allem durch eine erhöhte
Produktion von IFNγ und IL-12 auszeichnet215. Bei CU-Patienten vermutet man
hingegen eher eine Th2 gerichtete Immunantwort, die sich wiederum durch eine
erhöhte Produktion von IL-5 und IL-13 auszeichnet, welche als starke Effektoren im
Stande sind, die intestinale Barriere durch Induktion von Apoptose in intestinalen
Epithelzellen zu zerstören114,87. Diese Einordnung erlaubt aber keine strikte
Kategorisierung. Vielmehr zeigt sich im Mausmodell ein fließender Übergang zwischen
einer Th1 und einer Th2 vermittelten Immunantwort15.
Weiter wurde in Studien bei CED-Patienten eine gesteigerte Produktion von IL-17
nachgewiesen, welches von Th17 Zellen exprimiert wird85. Die Untersuchung der sich
daraus
ableitenden
Interleukinsignalwege
beschränkt
sich
in
der
Literatur
vordergründig auf MC-Patienten, bei denen eine Subgruppe von Th17-Zellen gefunden
wurde. Diese Subgruppe kann sowohl IL-17 als auch das für die Th1 Antwort typische
IFNγ produzieren. Allerdings verminderte eine Stimulation dieser Zellen mit IL-12 die
Produktion von IL-17 bei gleichzeitiger vermehrter Expression von IFNγ9. Erkenntnisse
aus Tiermodellen zeigen, dass jene Th17-Zellen durch das IL 2 gehemmt151, aber auch
in Abwesenheit des intrazellulären Rezeptors RORγT
vermehrt induziert werden
können134. Ähnlich verhält es sich bei der Untersuchung des IL-21 Signalweges: Bei
MC-Patienten kam es im Vergleich zu CU-Patienten sowie Kontrollpatienten zu einer
vermehrten Expression von IL-21. Dabei scheint es bei einer Blockierung von IL-21 zu
einer Verminderung der Expression von IFNγ zu kommen187. Speziell bei MC-Patienten
wurde nachgewiesen, dass das IL-21 an der Reifung der Th1 vermittelten
Immunantwort über den Transkriptionsfaktor t-bet maßgeblich beteiligt ist76. Des
Weiteren konnte gezeigt werden, dass die der IL-12 Familie angehörigen Interleukine
IL-23 und IL-27 ebenfalls bei MC-Patienten höher exprimiert werden246. Aus
17
Einleitung
entsprechenden Studien lässt sich erkennen, dass mikrobielle Antigene gramnegativer
Bakterien - wie etwa PAMPS - IL-12 abhängig zu einer vermehrten Expression von IL23 und IL-27 beitragen. Somit könnte diese Zytokinexpression als ein Trigger der Th1
vermittelten Immunantwort bei CED fungieren259.
Verstärkt wird diese Vermutung durch Erkenntnisse aus Tiermodellen, welche das
Interleukin 23 als Schlüsselfaktor in der immunologischen Pathogenese der CED
ausmachen, woraus sich wiederum neue Therapiestrategien ableiten ließen129. So
konnte auch gezeigt werden, dass IL-23 unabhängig von IL-12 zu einer spezifischen
Stimulation von bestimmten Gedächtnis T-Zellen führt, welche daraufhin zur
Produktion der proinflammtorischen IL-17 und IL-6 angeregt werden310.
Dem hier induzierten IL-17 wird auch eine regulatorische Komponente in der
Aufrechterhaltung der intestinalen Barriere zugeschrieben144.
Speziell bei CU-Patienten konnte hinsichtlich der Th2 vermittelten Immunantwort und
der daraus resultierenden vermehrten Expression von IL-13 eine starke Beteiligung
von natürlichen Killerzellen nachgewiesen werden. So scheinen atypische Lamina
propria T-Zellen, die Oberflächenmarker von natürlichen Killerzellen tragen, wie auch
reguläre natürliche Killerzellen an der gesteigerten IL-13 Produktion beteiligt zu sein87.
In Mausmodellen wurde der Einfluss von regulatorischen T-Zellen, einer weiteren
Untergruppe der T-Zellen, auf die CED-Pathogenese untersucht. Dabei verhinderte der
Transfer regulatorischer T-Zellen in SCID Mäusen das Auftreten einer Colitis46, und
regulatorische T-Zellen konnten eine im Mausmodell bereits aufgetretene Colitis
lindern191. Bei CU-Patienten konnte eine im Vergleich zu Kontrollpatienten gesteigerte
Expression von FOXP3 positiven regulatorischen T-Zellen sowohl im entzündeten als
auch im nicht entzündeten Gewebe nachgewiesen werden312. Interessanterweise
wurde in einer Studie festgestellt, dass regulatorische T-Zellen zwar im entzündeten
Bereich bei CED-Patienten höher als im nicht entzündeten Bereich exprimiert werden,
der Anstieg aber bei Patienten mit einer Divertikulitis im Vergleich zu Kontrollpatienten
signifikant geringer ausfällt. Es scheint also bei CED-Patienten auch keine
Beeinträchtigung der regulatorischen T-Zellen im Sinne eines Defektes vorzuliegen,
eher ist vermutlich die periphere Generierung neuer regulatorischer T-Zellen
beeinträchtigt, da auch im peripheren Blut ein Schrumpfen des regulatorischen TZellen Reservoirs festgestellt wurde, während sich dieses im Falle der Divertikulitis
vergrößerte179.
Noch wenig untersucht ist die Rolle von regulatorischen B-Zellen, die bei CEDPatienten erst kürzlich untersucht wurden, und die möglicherweise eine negative
Assoziation bei MC-Patienten haben. Die genaue Bedeutung und Auswirkung dieser
18
Einleitung
Erkenntnis müsste in weiteren Studien näher geprüft werden56.
19
Zielsetzung
2. Zielsetzung der Arbeit
In der hier vorliegenden Arbeit soll mit Hilfe eines Colitis Mausmodells der
Wirkmechanismus des Immunsuppressivums Cyclosporin A näher untersucht werden.
Dabei sollen außerdem eventuelle Beeinflussungen durch einen Th1 oder Th2
gerichteten genetischen Hintergrund aufgedeckt werden. Die im Mausmdodell durch
Cyclosporin A regulierten Proteine sollen weiterhin in einem Patientenkollektiv von MCund CU-Patienten näher analysiert werden. Um Einflüsse durch unterschiedlich stark
ausgeprägte Entzündungsformen zu vermeiden, werden die Patienten anhand ihres
pathologischen Scorings in Gruppen unterteilt. Die so gefundenen Proteine sollen im
Kontext der aktuellen Forschung hinsichtlich einer verbesserten Cyclosporin A
Therapie bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bewertet
werden. Hierbei liegt die Zielsetzung zum einen in einer besseren Identifizierung von
Non-Respondern, zum anderen in einem verbesserten Therapie Monitoring. Mit Hilfe
von gendefizienten Mäusen sollen außerdem neue Therapiestrategien bezüglich einer
zielgerichteteren Therapie ergründet werden.
20
Material und Methodik
3. Material und Methodik
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Abzug
Köttermann Uetze/Hänigsen
Agarose Gelgießeinrichtung
Peqlab Erlangen
Analysewaage
Ohaus Nänikon Schweiz
Autoklav
Systec Wettenburg
Bio Photometer (Proteine)
Eppendorf Hamburg
Blot Kammer
Bio-Rad Hercules USA
Chirurgische Pinzette
F.S.T. Heidelberg
Chirurgische Schere
F.S.T. Heidelberg
CO2- Brutschrank
Thermo Scientific Rockford
USA
Dewargefäß
KGW Isotherm Karlsruhe
Elektrophorese Kammer Agarose
Peqlab Erlangen
Elektrophorese Power supply Agarosegel
Peqlab Erlangen
Elektrophorese Kammer für Western Blot
Bio-Rad Hercules USA
Electrophoresis power supply Western blot
Bio-Rad Hercules USA
Eppizentrifuge
Hettich Tuttlingen
FACS Gerät
BD Heidelberg
Feinwaage
Sartorius Göttingen
Gefrierschrank -80°C
Thermo Scientific Rockford
USA
Heizblockthermomixer
Eppendorf Hamburg
Immunfluoreszenzmikroskop
Olympus Hamburg
Kryotom
Leica Solms
Kugelmühle MM300
Reetsch Haan
Kühlschrank -20°C
Liebherr Strullendorf
Kühlschrank +4°C
Liebherr Strullendorf
Magnetrührer
Ikamag Staufen
Mikroskop
Nikkon Düsseldorf
Miniendoskop
Karl Storz Tuttlingen
Multifuge
Thermo Scientific Rockford
USA
Nanodrop
Thermo Scientific Rockford
USA
Neubauer Zählkammer
Carl Roth Karlsruhe
PCR Thermocycler
Peqlab Erlangen
21
Material und Methodik
PH- Meter
Ino Lab Weilheim
Picofuge
Stratagene San Diego USA
Pipettierhilfe
Integra Biosciences Fernwald
Realtime PCR Detection System
Bio-Rad Hercules USA
Röntgenfilmkassette
Kodak Rochester USA
Rotator MACSmix
Miltenyi Bergisch Gladbach
Sauerstoffgerät
Eickenmeyer Tuttlingen
Sigma Delta Vaporiser
Eickemeyer Tuttlingen
Sterilwerkbank
Thermo Scientific Rockford
USA
Tierhaarschneider
Braun Kronberg/Taunus
Tierwaage
Denver Instruments Bohemia
USA
Transilluminator
Peqlab Erlangen
Vortexter
Hecht Assistent Sondheim
Western Blot Entwicklungsmaschine
AGFA Mortsel Belgien
Mikrowelle
Severin Sundern
3.1.2 Medikamente
Amphotericin B
Sigma Aldrich St. Louis USA
Cyclosporin A
Novartis Nürnberg
Gentamycin
Sigma Aldrich St. Louis USA
Isofluran
Abbott Green Oaks USA
Ketamin
Ratiopharm Ulm
Streptomycin
PAA Cölbe
Xylazin
Bayer Leverkusen
3.1.3 Kommerzielle Fertigkits
cDNA Synthese Kit (I-script)
Bio-Rad Hercules USA
Nucleospin RNA II
Macherey+ Nagel Düren
SensiFAST SYBR No-ROX Kit
Bioline Luckenwalde
Strepavidin/Biotin Blocking Kit
Vector Burlingame USA
Signal Amplifikation System
Perkin Elmer Waltham USA
Mouse Cytokine 13 flow Cytomix
e-bioscince San Diego USA
3.1.4 Primärantikörper
CD11b Maus anti human Biotin markiert
Clone: IRCF44 1:100
BioLegend San Diego USA
22
Material und Methodik
CD11c Maus anti human Clone: 3.9 1:100
BioLegend San Diego USA
CD4 human anti Maus Clone: H129,19 1:200
BioLegend San Diego USA
CD4 Maus anti human IgG Polyklonal 1:25
Caltag Laboratories
Buckingham, UK
Cyclophilin A Hase anti human/Maus polyklonal
Cell Signaling Danvers USA
Western Blot: 1:1000 Immunhistofluoreszenz: 1:100
F4/80 Ratte anti human Clone: 6A545 1:50
Santa Cruz Dallas USA
Itk Maus anti human mAB Polykonal
Western Blot 1:1000
Cell Signaling Danvers USA
Itk Hase anti human/Maus sc-1697
polyklonal IgG 1:25
Santa Cruz Dallas USA
NFAT2 Hase anti Maus/human IgG
Western Blot 1:1000
Cell Signaling Danvers USA
Vav1 Hase anti Maus/human polyklonal Western
Blot 1:1000 Immunhistofluoreszenz: 1:25
Cell Signaling Danvers USA
β- aktin HRP C4 IgG2b Western Blot 1:1000
Santa Cruz Dallas USA
3.1.5 Sekundärantikörper
Pferd anti Maus HRP markiert IgG
Immunhistofluoreszenz : 1:200
Immunoreagents Raleigh USA
Pferd anti Maus HRP markiert IgG
Western Blot: 1:200
Cell Signaling Danvers USA
Schwein anti Ziege IgG(H+L) Biotin markiert
Immunhistofluoreszenz: 1:200
Caltag Laboratories
Buckingham, UK
Streptavidin Dylight 549
Immunhistofluoreszenz: 1:400
KP Gaithersburg USA
Ziege anti Hase HRP markiert IgG (H+L)
Western Blot 1:3000
Cell Signaling Danvers USA
Ziege anti Ratte Biotin markiert
Immunhistofluoreszenz: 1:200
BioLegend San Diego USA
β- Actin C4 (HRP) Maus monoclonal IgG1
Western Blot: 1:5000
Santa Cruz Dallas USA
3.1.6 PCR Primer
18sRNA human hs_RRN18S_1_SG
Transkript: X03205 (1869 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Beta Actin Primer 1
Sequenz:
5´-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3´
Metabion Martinsried
Beta Actin Primer 2
Sequenz:
5´-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3´
Metabion Martinsried
23
Material und Methodik
IL13 Maus Mm_Il13_1_SG IL13
Transkript: NM_008355 (1217 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Itk human Hs_ITK_1_SG
Transkript: NM_005546 (4366 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Itk Maus ItkMm_Itk_1_SG
Transkript: NM_010583 (4000 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
NFATc1 human Hs_NFATC1_1_SG
Transkript: NM_006162 (4762 bp)
NM_172387 (4621 bp)
NM_172388 (3671 bp)
NM_172389 (4336 bp)
NM_172390 (3140 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
NFATc1 Maus NFATc1Mm_Nfatc1_1_SG
Transkript: NM_001164109 (4000 bp)
NM_001164110 (4000 bp)
NM_001164111 (4000 bp)
NM_001164112 (4000 bp)
NM_016791 (4000 bp)
NM_198429 (4000 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Ppia human Hs_PPIA_1_SG
Transkript: NM_001008741 (498 bp)
NM_021130 (2276 bp)
NM_203430 (1796 bp)
NM_203431 (1707 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Ppia Maus_Ppia_1_SG
Transkript: NM_008907 (736 bp)
XR_105433 (736 bp)
XR_106634 (736 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
T-bet Maus Mm_Tbx21_1_SG
Transkript: NM_019507 (2552 bp)
XM_977626 (2367 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Vav1 human VAV1_1_SG
Transkript: NM_005428 (2888 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
Vav1 Maus Mm_Vav1_1_SG
Transkript: NM_001163816 (4051 bp)
NM_011691 (4168 bp)
XM_980079 (2867 bp)
Quiagen Venlo Niederlande
3.1.7 Verbrauchsmaterialien
100bp DNA ladder
Fermentas St. Leon- Rot
96 Well Platte qPCR
Peqlab Erlangen
Bepanthen Augen- und Nasensalbe
Bayer Leverkusen
CD4(L3T4) Microbeads Maus
Miltenyi biotec Bergisch
Gladbach
CL-Xposure Film Western Blot
Thermo Scientific Rockford
USA
24
Material und Methodik
Cryomolds Tissue Tec
Sakura Torrance USA
Deckgläser
Marienfeld Lauda-Königshofen
Einmalskalpelle steril
Sarstedt Nürmbrecht
Einmalpipetten
Sarstedt Nürmbrecht
Einweghandtücher
SCA Hygienic Products
Mannheim
Eppendorf Reaktionsgefäße
Eppendorf Hamburg
FACS-Röhrchen
BD Heidelberg
Falcon Röhrchen
Sarstedt Nürmbrecht
Fettstift
Science Service München
Kämme- Agarose PCR
Peqlab Erlangen
Kämme- Western Blot
Bio-Rad Hercules USA
Kanülen
BD Heidelberg
Katheter Certofix
Braun Melsungen
Kunstoffpipettenspitzen (mit Filter)
Starlab Hamburg
MACS Separation Columns 25 LS
Miltenyi biotec Bergisch
Gladbach
Microtom Einmalklingen
Leica Solms
Nitrilhandschuhe
Hartmann Heidenheim
Nitrocellulose Transfermembran
Bio-Rad Hercules USA
Objektträger
Diagonal Münster
Precision Plus Protein Dual Color Standard
Bio-Rad Hercules USA
Superfrost Objektträger
Thermo Scientific Rockford
USA
Tuberkulinspritze
Braun Melsungen
Whatman- Papier Western Blot
Hartenstein Würzburg
Zellfilter
BD Heidelberg
Zellkulturflaschen + Zellplatten Cellstar
Greiner Bio One Frickenhausen
3.1.8 Substanzen
Aceton
Carl Roth Karlsruhe
Affinity Script Buffer
Agilent Technologies Santa
Clara USA
Affinity Script Reverse Transkriptase
Agilent Technologies Santa
Clara USA
Ambion RNA later
Life technologies Carlsbad USA
APS
AppliChem Darmstadt
Bovine serum albumin (BSA)
Sigma Aldrich St. Louis USA
Bradford
Carl Roth Karlsruhe
25
Material und Methodik
CD28 Antikörper Hamster anti Maus IgG1 37.51
Selbst hergestellt
CD3 Antikörper Hamster anti Maus IgG1 145-2C11
Selbst hergestellt
Compete Mini Proteaseinhibitor
Roche Mannheim
DNAse
Macherey + Nagel Düren
DTT
Agilent Technologies Santa
Clara USA
EDTA Solution
Carl Roth Karlsruhe
Entellan
Merck Darmstadt
Eosin
Merck Darmstadt
Ethanol
Carl Roth Karlsruhe
Ethidiumbromid (EtBr)
Merck Darmstadt
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Carl Roth Karlsruhe
Fetales Kälberserum (FCS)
PAA Cölbe
Flüssigstickstoff
Linde München
Gibco HBSS
Life technologies Carlsbad USA
Gibco PBS
Life technologies Carlsbad USA
Gibco Trypanblau
Life technologies Carlsbad USA
Glycerin
Carl Roth Karlsruhe
H2O2
Carl Roth Karlsruhe
Hämalaun
Carl Roth Karlsruhe
HCl
Carl Roth Karlsruhe
Histofix 4%
Carl Roth Karlsruhe
Invitrogen HOECHST
Life technologies Carlsbad USA
Ionomycin
Sigma Aldrich St. Louis USA
Isopropanol
Carl Roth Karlsruhe
Kryo Einbettmedium Tissue Tec
Sakura Torrance USA
Kulturmedium IMDM
PAA Cölbe
Ladepuffer Western Blot
Carl Roth Karlsruhe
Mammalian Protein Extraktion Puffer
Thermo Scientific Rockford
USA
Methanol
Carl Roth Karlsruhe
Milchpulver
Carl Roth Karlsruhe
Mowol
Carl Roth Karlsruhe
NaCl
Carl Roth Karlsruhe
Natriumacid
Carl Roth Karlsruhe
Natriumcitrat
Carl Roth Karlsruhe
Olivenöl
Sigma Aldrich St. Louis USA
Oxazolon
Sigma Aldrich St. Louis USA
26
Material und Methodik
Permeabilitätspuffer
e-bioscince San Diego USA
PMA
Sigma Aldrich St. Louis USA
Proteinpuffer
Thermo Scientific Rockford
USA
Red Taq PCR
Sigma Aldrich St. Louis USA
RNAse freies Wasser
Macherey + Nagel Düren
Rotiphorese PAA
Carl Roth Karlsruhe
SDS
Carl Roth Karlsruhe
Superscript Reverse Transkriptase
Agilent Technologies Santa
Clara USA
SYBR Green
Bioline Luckenwalde
TEMED
AppliChem Darmstadt
TRIS Base
Carl Roth Karlsruhe
TWEEN
Merck Darmstadt
Verdaulösung
Roche Mannheim
Western Blotting Substrat
Thermo Scientific Rockford
USA
Xylol
Merck Darmstadt
β- Mercaptoethanol
Merck Darmstadt
3.1.9 Tiere
Balb/c Mäuse
The Jackson Laboratory
Ban Harbor USA
C57BL/6 Mäuse
The Jackson Laboratory
Ban Harbor USA
Itk -/- Mäuse
Prof. Wilfried Ellmeier Institut
für Immunologie Medizinische
Universität Wien
Tierfutter
Altromin Lage
Tierkäfig
Techniplast Hohenpeißenberg
Tierstreu
Rettenmeier Wilburgstetten
Trinkflasche
Techniplast Hohenpeißenberg
3.1.10 Software
CFX Manager
Bio-Rad Hercules USA
Excel 2010
Microsoft
Graph Pad 5
Prism 5
Image J
Wayne Rasband
Scenalyzer Live
Andreas Winter
27
Material und Methodik
3.1.11 Pufferlösungen und Mischungen
Proteinblock
PBS (1x)
1 % BSA
10 % Fetales Kälber Serum (FCS)
Western Blot Transferpuffer (10x)
30,25g 25mM Tris Base PH 8,8
144g 192mM Glycin
ad 1000ml H2O
Mowiol
6g Glycerin
2,4 g Mowol
6ml H2O
Schüttler bei Raumtemperatur
12ml 0,2 M TRIS (pH 8,5)
Schüttler bei 53°C
Zentrifugieren bei 5000 rpm für 20 Minuten
0,1 % DABCO
ACK- Puffer
NH4Cl 4,15 g
KHCO3 0,5 g
EDTA 0,18 g
500ml H2O
Western Blot Laufpuffer (10x)
30,3g 25mM Tris Base PH 8,8
144,2g 192mM Glycin
10,0g 0,1% SDS
ad 1000ml H2O
Blotting Puffer
100ml 10 x Transferpuffer
200ml Methanol
ad 1000ml H2O
TBS
9g NaCl
100ml TRIS
900ml H2O
TBST
500ml TBS
250µl TWEEN
Milchpulver-Block
1000ml TBST
50g Milchpulver
28
Material und Methodik
Stripping Puffer
7,5g Glycin
500ml H2O
ad pH 2,8
TAE Puffer (50 x )
242 g TRIS
57,1ml Essigsäure
100ml 0,5 EDTA
ad 1000ml H2O
MACS Puffer
1 x PBS
3 % FCS
2mM EDTA
Oxazolon (Sensibilisierung)
Aceton/Olivenöl 4:1
3 % Oxazolon
Oxazolon (Provokation)
PBS/Ethanol 1:1
1% Oxazolon
Cyclosporin A
1880 µl PBS (steril)
20 µl Cyclosporin A
Ketamin/Xalazin (5ml)
3,4ml PBS
1,2ml Ketamin
0,4ml Xylazin
29
Material und Methodik
3.2 Methodik
3.2.1 RNA Isolierung aus murinem Gewebe und kultivierten Zellen
Die Isolation der RNA aus murinem Gewebe erfolgte mit dem oben erwähnten Kit der
Firma Macherey + Nagel. Dazu wurde zunächst das Gewebe durch Zusatz von 350 µl
Lysepuffer sowie 3,5 µl β-Mercaptoethanol in einer mechanischen Kugelmühle für 2
Minuten lysiert. Zur Reduktion der Viskosität und Entfernung von Zelltrümmern wurde
anschließend das Lysat auf einen NucleoSpin Filter gegeben und 1 Minute lang bei
1090 rpm zentrifugiert. Um ein anschließendes Binden der RNA auf einer dafür
vorgesehenen Membran zu ermöglichen, wurde das nun homogene Lysat mit 350 µl
70%igem Ethanol
versetzt. Danach konnte das Lysat auf eine spezielle
Siliziummembran gegeben und bei 1090 rpm 30 Sekunden lang zentrifugiert werden.
Die RNA befand sich jetzt auf der Membran. Bevor die DNA, welche sich ebenfalls auf
der Membran befand, durch eine DNAse verdaut werden konnte, musste die Membran
durch die Zugabe von 350 µl MDP (Membrane Desalting Puffer) entsalzt und durch
anschließendes Zentrifugieren für eine Minute bei 1090 rpm getrocknet werden,
wodurch die nachfolgende DNA Verdauung effektiver wurde. Die DNAse wurde zuvor
im Verhältnis 1:10 mit einem Reaktionspuffer vermischt. Davon wurden 95µl auf die
nun getrocknete Siliziummembran gegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen und Trocknen der Siliziummembran konnte die
RNA mit 60 µl RNAse freiem Wasser und Zentrifugieren für 1 Minute bei 1090 rpm
eluiert werden. Bei jeder Isolation wurde die Reinheit photometrisch durch den
Quotienten aus 260/280 kontrolliert.
3.2.2 Transkription der murinen mRNA in cDNA (Reverse Transkriptase
PCR)
Für die cDNA Synthese wurden 100ng der isolierten murinen mRNA eingesetzt. Zu
jedem Ansatz wurden 1µl Random- Hexamerprimer und 1µl dNTP-Mix zugegeben.
Anschließend wurde der Ansatz mit RNAse freiem Wasser auf insgesamt 14,5µl
aufgefüllt. Um die Hairpinstrukturen der RNA aufzulösen, erfolgte eine Inkubation des
Ansatzes für 5 Minuten.
Nach Hinzufügen von 2µl zehnfachem Strata Script RT-Puffer und 2µl 0,1M DTT wurde
der Ansatz bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, um ein Binden der
Hexamerprimer an die RNA zu ermöglichen. Danach wurden zu jedem Ansatz 0,5µl
30
Material und Methodik
des Enzyms Superscript gegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 1 Stunde bei
42°C und 15 Minuten bei 72°C wurden wieder die Reinheit und Menge der
umgeschriebenen cDNA photometrisch bestimmt.
3.2.3 Transkription der humanen mRNA in cDNA
Für die Transkription der humanen Proben wurde der iScript™ cDNA Synthese Kit der
Firma Bio-Rad verwendet. Dazu wurden 100ng der isolierten humanen mRNA
eingesetzt. Zu jedem Ansatz wurden 4µl 5x iScript reaction mix und 1µl iScipt Reverse
Transkriptase pipettiert. Anschließend wurde jeder Ansatz mit RNAse freiem Wasser
auf ein Gesamtvolumen von 20µl aufgefüllt. Der Ansatz wurde daraufhin nach
folgendem Protokoll inkubiert: 5 Minuten bei 25°C, 30 Minuten bei 42°C und 5 Minuten
bei 85°C.
Danach wurden wieder photometrisch die Reinheit und Menge der synthetisierten
cDNA gemessen.
3.2.4 β- Actin PCR
Nach jedem Transkriptionsvorgang wurde die cDNA-Qualität mittels einer β-Actin PCR
bestimmt. Dazu wurden zu jedem Ansatz 1µl der umgeschriebenen cDNA, je 1,5µl
zweier β-Actin Primer für Leitstrang und Gegenstrang, 5µl des Reaktionsmixes Taq
Master und 11µl RNAse freies Wasser gegeben. Anschließend erfolgte nach festem
Protokoll eine Inkubation bei 110°C mit nachfolgendem Abkühlen auf 95°C für 5
Minuten. Die Quantifizierung der DNA erfolgte dann in 25 Zyklen nach folgendem
Protokoll: Denaturierung der DNA bei 93°C für 30 Sekunden, Primerhybridisierung bei
58°C für 30 Sekunden und Elongation des Stranges bei 72°C für 1 Minute.
Der komplette Ansatz wurde anschließend mit 3,33µl eines Gelladepuffers aufgefüllt
und vermischt. Für die
β-Actin Elektrophorese wurde ein 2 %iges Agarose Gel
verwendet. Dazu wurden für ein entsprechendes Gel 2g Agarose mit 100ml 1x TAE
Puffer erhitzt. Als Fluoreszenzfarbstoff wurden in jedes Gel 3µl Ethidiumbromid
pipettiert. Der mit dem Gelladepuffer versetzte Ansatz wurde nun einzeln in je eine
Agarosegelkammer pipettiert. Zur nachfolgenden Größenbestimmung der Banden
wurden immer 7µl eines Größenstandards in eine separate Kammer pipettiert. An die
Gelkammer wurde nun für 20 Minuten eine Spannung von 200 Volt angelegt. Die
Banden konnten daraufhin unter UV Beleuchtung sichtbar gemacht und mit einer
Kamera dokumentiert werden.
31
Material und Methodik
3.2.5 Quantitative PCR
Die quantitative PCR wurde mithilfe des oben angegebenen SensiFAST SYBR NoROX Kits der Firma Bioline durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug hierfür
insgesamt 20µl. Es setzte sich aus 2µl eines jeweiligen Primers, 10µl des
Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green, 1µl cDNA und 7µl RNAse freiem Wasser
zusammen. Pipettiert wurde als Doppelbestimmung in eine Standard 96 well Platte.
Die cDNA wurde der β-Actin PCR entsprechend verdünnt. Um die relative Expression
des zu messenden Gens zu erhalten, erfolgte bei jeder Messung eine zusätzliche
Bestimmung eines Referenzgens. Bei jeder Messung wurde eine Wasserprobe
durchgeführt, welche eine Verunreinigung der verwendeten Reagenzien mit cDNA
ausschließen sollte. Die Amplifikation fand in einem Cycler nach folgendem Protokoll
statt: Initialer Aktivierungsschritt bei 95°C für 3 Minuten, anschließend 44 Zyklen mit
einer Schmelztemperatur von 95°C für 2 Sekunden, einer Anlagerungstemperatur von
60 °C für 20 Sekunden und einer Synthesetemperatur von 72°C für 1 Sekunde. Um die
Schmelzkurve erstellen zu können, wurden für das vollständige Schmelzen des
Doppelstranges die Proben bei 95°C für 1 Minute erhitzt. Die Doppelstrangbildung
erfolgte bei 65°C für 5 Sekunden und das langsame Schmelzen schließlich bei 95°C.
Die Auswertung erfolgte mithilfe der Software „CFX Manager“ der Firma Bio-Rad. Die
Genexpression wurde in Relation zu der gemessenen Menge des verwendeten
Referenzgens 18sRNA gesetzt, welches im Kolongewebe konstant exprimiert wird. Die
relative mRNA-Expression wurde nach der Delta – Delta - CT Methode mit
nachfolgender Formel berechnet:
Relative mRNA- Expression = 2^- [ct(ZytokinKontrolle) – ct(Zytokinbehandelt) + ct(18sRNA behandelt) –
ct(18sRNAKontrolle)].
Der ct- Wert ist dabei als die Anzahl an Amplifikationen definiert, bei welchen das
emittierte Fluoreszenzsignal einen vorher festgelegten Schwellenwert übersteigt.
3.2.6 Immunhistofluoreszenz
Das tiefgefrorene Gewebe wurde mithilfe eines Mikrotoms in 2µm dünne Schichten
geschnitten. Anschließend wurde es auf speziell beschichtete Objektträger gelegt. Alle
Schnitte wurden zunächst bei -80°C kryokonserviert.
32
Material und Methodik
Für die Immunhistofluoreszenz wurde das Gewebe zunächst 15 Minuten in einer
phosphatgepufferten 4 %igen Formaldehydlösung
fixiert. Anschließend wurden die
Schnitte dreimal in PBS gewaschen. Daraufhin erfolgte für 20 Minuten eine
Blockierung der endogenen Peroxidase in einer feuchten Kammer mit Methanol und
3%igem H2O2. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit einem
Fettstift umrandet, um ein Überfließen des Primärantikörpers zu verhindern. Vor dem
Auftragen des Primärantikörpers wurden Biotin und Avidin für jeweils 15 Minuten
blockiert. Um eine weitere unspezifische Bindung des Primärantikörpers zu verhindern,
wurde für 30 Minuten ein Proteinblock aufgetragen. Nach erneutem dreimaligem
Waschen mit PBS konnte der Primärantikörper in seiner entsprechenden Verdünnung
auf das Gewebe pipettiert werden. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C. Am
nächsten Tag wurde der übrige Primärantikörper durch sorgfältiges dreimaliges
Waschen in PBS entfernt. Danach wurde der Sekundärantikörper in seiner
entsprechenden
Verdünnung pipettiert. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten
Kammer bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Anschließend wurde der übrige
Sekundärantikörper durch dreimaliges Waschen im PBS entfernt. Nun wurde in
Dunkelheit ein an Streptavidin gekoppelter fluoreszenter Farbstoff auf die Schnitte
pipettiert und anschließend für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS erfolgte für 5 Minuten
eine Kernfärbung des Gewebes mit dem Fluoreszenzfarbstoff HOECHST 33342.
Anschließend wurden die Schnitte 5 Minuten lang in PBS gewaschen und nach
sorgfältigem Trocknen mit Polyvinylalkohol eingedeckelt.
Die Färbung des murinen Gewebes erfolgte gemäß Protokoll mit dem oben genannten
Tyramid Signal Amplifikation Kit.
Für die intrazelluläre Färbung mit itk und ppia wurden sowohl der Primärantikörper als
auch der Sekundärantikörper in ihrer entsprechenden Verdünnung in einen
Permeabilitätspuffer pipettiert.
Auf jedem Schnitt wurde eine Negativkontrolle durchgeführt, um eine unspezifische
Bindung des Sekundärantikörpers auszuschließen. Von jedem Schnitt wurden 3-5
zufällige Bereiche ausgezählt und daraus der Mittelwert gebildet.
3.2.7 Hämatoxylin-Eosin Färbung
Von jedem Gewebe wurde zur Einschätzung der Gewebequalität und der Stärke der
Entzündung eine Hämatoxylin-Eosin Färbung angefertigt. Die Färbung wurde anhand
eines standardisierten Protokolls durchgeführt. Nach dem Auftauen der Schnitte
33
Material und Methodik
erfolgte für 5 Minuten eine Kernfärbung mit unverdünntem Hämalaun. Die Schnitte
wurden anschließend 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser differenziert. Es
folgte eine Färbung des Zytoplasmas für 5 Minuten mit unverdünntem Eosin. Nach
kurzem Spülen mit Leitungswasser wurde das Gewebe in einer aufsteigenden
Alkoholreihe dehydriert. Daraufhin wurden die Schnitte für 5 Minuten in eine
Xylollösung getaucht, wodurch Paraffinreste endgültig entfernt werden konnten. Zum
Eindeckeln der Schnitte wurde Polyvinylalkohol verwendet.
Die murinen Kolon - Schnitte wurden mit Hilfe des Mikroskops und eines
histopathologischen Scores ausgewertet72.
3.2.8 Proteinisolierung für Western Blot
Die Isolierung der Proteine erfolgte durch den oben genannten Proteinextraktionspuffer
gemäß Anleitung. Um eine Degradierung der Proteine zu verhindern, wurden in
entsprechender Verdünnung sowohl ein Proteaseinhibitorcocktail als auch eine EDTA Pufferlösung pipettiert. Das Gewebe wurde dann für 2 Minuten in einer mechanischen
Kugelmühle lysiert. Anschließend wurde es bei 4°C und 1200rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde nachfolgend vorsichtig abpipettiert. Die Proteinmenge wurde mithilfe
des
Bradford-Tests
bestimmt.
Dazu
wurden
in
eine
Messküvette
1µl
des
Proteinüberstandes, 200µl Coomassie-Brillant-Blau und 800µl Wasser gegeben. Nach
einem sorgfältigen Durchmischen wurde der Extinktionskoeffizient photometrisch bei
595 nm bestimmt.
20µg der bestimmten Proteinmenge wurden mit Wasser auf Volumen von 15µl
aufgefüllt und anschließend mit 5µl eines Ladepuffers versetzt. Vor dem Beladen der
Kammern mussten die Proteine bei 95°C für 5 Minuten denaturiert werden.
3.2.9 Herstellung eines 2D- Gels für Western Blot
Für den Western Blot wurden 10% SDS Gele verwendet, die zuvor eigens gegossen
wurden. Jedes Gel bestand aus einem Trenngel und einem Sammelgel. Für das
Trenngel wurden 1,25ml 40%iges Acrylamid, 2,75 ml Wasser, 50µl SDS, 0,9 ml 2
molarer TRIS Puffer sowie 37,6µl 10%iges APS und 7,5µl TEMED pipettiert, zwei für
die Polymerisation des Acrylamid benötigte Katalysatoren. Nach dem Erstarren des
Trenngels wurde die Oberfläche mit 70%igem Isopropanol geglättet, das anschließend
wieder abgegossen werden konnte. Auf das feste Trenngel konnte nun das Sammelgel
aufgetragen werden. Dafür wurden 126,2µl 40%iges Acrylamid, 155µl 1 molarer TRIS
34
Material und Methodik
Puffer, 0,93 ml Wasser, 6,25µl 10 %iges APS und 5µl TEMED verwendet. In das
flüssige Sammelgel wurde anschließend ein Kamm mit 15 Kammern gesteckt.
3.2.10 Gelelektrophorese
Die Proteinproben und ein Standard wurden vorsichtig in die Taschen der Gele
pipettiert. Anschließend wurden die Gele in eine Elektrophorese - Kammer gestellt und
mit Laufpuffer angefüllt. Dieser wurde aus 30,3 g 25mM TRIS, 144,2 192mM Glycin
und 10,0g 0,1 %igem SDS hergestellt und anschließend auf 1000ml mit Wasser
aufgefüllt. Vor dem Befüllen der Elektrophorese - Kammer erfolgte daraus eine 1:10
Verdünnung. An die Elektrophorese wurde daraufhin für 90 Minuten eine 120 V
Spannung angelegt. Die negativ geladenen Proteine wanderten nun entlang des
Gradienten zur Anode. Es folgte eine regelmäßige Kontrolle der Lauffront durch die im
Ladungspuffer enthaltene Bromphenolblaubande.
3.2.11 Blottingvorgang
Die im Gel anhand ihres Molekulargewichts aufgetrennten Proteine wurden
anschließend im semi-dry Verfahren geblottet. Dazu wurden zunächst die für den
Blottingvorgang benötigte Nitrocellulose-Membran sowie 4 Lagen Filterpapier im zuvor
angesetzten Blotting- Puffer für 2 Minuten inkubiert. Danach wurde die Blottingkammer
mit zur Anode hin gerichteter Membran aufgebaut. Dazu wurden zuerst 2 Lagen
Filterpapier in die Kammer gelegt. Darauf wurde vorsichtig unter Vermeidung von
Luftblasen das Gel auf die Membran aufgebracht. Schließlich wurden nochmals 2
Lagen Filterpapier auf die Membran gelegt. Die Laufzeit betrug bei 45mA 35 Minuten.
Nach dem Blotten wurde die Membran für 5 Minuten in TBST gewaschen und danach
für 2 Stunden bei Raumtemperatur in Milchpulver-TBST geblockt, um eine
unspezifische Bindung der Antikörper zu verhindern.
Die Membran wurde dann mit dem Primärantikörper in entsprechender Verdünnung
über Nacht bei 4°C in Milchpulver-TBST inkubiert. Am nächsten Tag musste die
Membran dreimal für 10 Minuten in TBST gewaschen werden. Anschließend wurde die
Membran für 2 Stunden mit dem Sekundärantikörper inkubiert.
Nach erneutem dreimaligem Waschen in TBST wurde die Membran in eine
Röntgenkassette
transferiert
und
mit
einer
ECL-
Entwicklerlösung
nach
Herstellerangaben inkubiert. Die Membran wurde dann mit einem Röntgenfilm in einer
Dunkelkammer entwickelt.
35
Material und Methodik
Für einen weiteren Immunoblot musste der zuvor gebundene Antikörper von der
Membran entfernt werden. Dazu wurde die Membran zunächst dreimal in TBST
gewaschen und anschließend für 15 Minuten im Stripping- Puffer inkubiert.
Anschließend konnte nach dreimaligem Waschen in TBST erneut ein Primärantikörper
aufgetragen werden.
3.2.12 Zellisolation mononukleärer Milzzellen
Für die CD4+ Milzzellisolation wurden Milzorgane aus frisch präparierten, mit
Oxazolon/Cyclosporin A behandelten Tieren entnommen und mit dem MACS-System
gemäß Protokoll aufgereinigt. Dafür wurden die Milzorgane mit einem sterilen
Objektträger zerrieben und zur weiteren Zellvereinzelung über ein 100µm Zellsieb in
ein 50 ml Falcon gegeben. Mit der Milzzellsuspension wurde eine ACK Lyse
durchgeführt, welche die Erythrozyten eliminiert. Dafür wurden die Zellen bei 1300 rpm
für 5 Minuten abzentrifugiert und anschließend in 3 ml eiskaltem ACK Lysepuffer
resuspendiert. Nach einer Inkubation von 1 Minute platzten dabei die Erythrozyten.
Zum Abstoppen der Reaktion wurde das Falcon mit kaltem PBS aufgefüllt und die
Zellen erneut abzentrifugiert. Je nach Zellzahl wurden pro 106 Zellen 90 µl MACS
Puffer und 10µl MACS beads hinzugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit den
beads im Kühlschrank bei 8°C für 15 Minuten inkubiert. Nach dem Binden der beads
wurden die Zellen mit MACS-Puffer gewaschen und bei 1300 rpm für 5 Minuten
abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml MACS Puffer resuspendiert und über eine
LS-Separation Säule (MACS Systems) gegeben. Dabei wurden die mit beads
versetzten Zellen paramagnetisch an die Metallkügelchen in der Säule gebunden,
während CD4- Zellen durch die Säule gespült wurden. Die CD4+ Zellpopulation konnte
dann mit einem Stempel aus der Säule gedrückt und in der Neubauer Zählkammer
gezählt werden. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2,5 x 106 /ml in IMDM Medium
ausgesät, welches mit Penicillin und Streptomycin versetzt wurde. Anschließend
wurden die Zellen mit anti CD3 und anti CD28 Antikörpern stimuliert und bei 37°C und
5% CO2 inkubiert. Zur Bestimmung der Zytokinkonzentration wurde der Überstand
nach 48Stunden abgenommen und mittels beads basiertem F.A.C.S. Assay untersucht.
3.2.13 Isolierung von Lamina propria Zellen
Die Lamina propria Zellen wurden aus dem Darm frisch präparierter, mit
Oxazolon/Cyclosporin A behandelter Mäuse isoliert301. Zunächst wurde der Darm in
36
Material und Methodik
calcium- und magnesiumfreiem HBSS-Puffer gewaschen. Anschließend fand eine
Inkubation für 8 Minuten bei 37°C in HBSS Puffer statt, der 30mM EDTA enthielt.
Durch Vortexen und Filtern mit einem 100µm Zellsieb wurde die epitheliale Zellschicht
entfernt. Das nun von Epithelzellen befreite Gewebe wurde mit 5 ml einer
Verdaulösung für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Verdaulösung setzte sich aus
4%igem FCS, 0,5 mg/ml Kollagenase D,
50 U/ml DNase I und 50 U/ml Dispase
zusammen. Anschließend wurde das Gewebe
dreimal durch ein 100µm Zellsieb
gegeben und die Verdaulösung durch die Zugabe von fetalem Kälberserum im
Verhältnis 1:1 inaktiviert. Die Zellen konnten nun mit einer Dichte von 2,5 x 106 /ml in
IMDM bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO2 kultiviert werden. Dem Nährmedium
wurde Streptavidin, Penicillin, Gentamycin und Amphotericin hinzugegeben. Die
Stimulation der Zellen erfolgte mit PMA und Ionomycin in einer Konzentration von
1µg/ml.
Die Überstände wurden jeweils nach 24 Stunden und 48 Stunden abgenommen und
mit Hilfe der Cytomixmethode untersucht.
3.2.14 Isolierung von intraepithelialen Zellen
Der Darm frisch präparierter, mit Oxazolon/Cyclosporin A behandelter Mäuse wurde
zunächst in kleine Stücke zerteilt. Anschließend wurden die Darmstücke in ein 50ml
Falcon gegeben und in HBSS mit 30mM EDTA Lösung für 8 Minuten bei 37°C
Schütteln inkubiert. Durch kräftiges Vortexen konnten die Zellen vom Darm abgelöst
werden, da EDTA die Zell- Zell- Verbindungen auflöst. Die Zellen befanden sich nun im
Überstand. Der sorgfältig abgenommene Überstand wurde daraufhin bei 2500 rpm für
5 Minuten abzentrifugiert. Die Zellen konnten anschließend im oben erwähnten
Lysepuffer aufgenommen und die mRNA-Expression mittels RT- PCR Analyse
gemessen werden149.
3.2.15 Durchflusszytometrie
Die Zytokinprofile der Milzüberstände und der Lamina propria Überstände wurden mit
dem oben angegebenen Mouse Cytokine 13 flow Cytomix Kit der Firma e-bioscince
untersucht.
Durchführung und Auswertung erfolgten nach Protokoll. Bei jeder
Auswertung wurden eine Standardverdünnung und eine Leerkontrolle durchgeführt.
Die
fluoreszenzmarkierten
beads
wurden
37
zuvor
mit
dem
zu
messenden
Material und Methodik
Zytokinantikörper beschichtet und anschließend mit 25µl der zu messenden Probe
versetzt. Nachfolgend wurde ein biotinkonjugierter Sekundärantikörper für 2 Stunden
hinzugegeben. Um schließlich ein messbares Fluoreszenzsignal zu emittieren, wurde
die Lösung unter ständigem Lichtschutz für eine Stunde mit dem Fluoreszenz
Streptavidin-Phycoerythrin
inkubiert.
Die
Messung
erfolgte
an
einem
Durchflusszytometer.
3.2.16 Statistik
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistik Programms Graph Pad 5 und Excel
2010. Die Prüfung auf statistische Signifikanz wurde mit dem gepaarten zweiseitigen
Student´s t-test durchgeführt. Eine Signifikanz der getesteten Gruppen lag demnach
bei p- Werten<0,05 vor und wurde in den Graphen mit einem Stern gekennzeichnet;
p-Werte<0,01 wurden mit zwei und p-Werte<0,001 mit drei Sternen gekennzeichnet.
Dargestellt ist dabei immer der Mittelwert. Die Fehlerbalken geben in den Graphen die
Standardabweichung an.
3.2.17 Patientenkollektiv
Für die qPCR Analyse stand ein Patientenkollektiv von 33 Patienten zur Verfügung.
Darunter waren 17 MC-Patienten und 16 CU-Patienten. Von den Patienten waren 12
weiblich und 21 männlich. Das Durchschnittsalter der MC-Patienten betrug 34,29
(±12,14) Jahre, das Durchschnittsalter der CU-Patienten 43,75 (±14,61) Jahre. Für die
Einteilung in Gruppen war der Pathoscore der Patienten maßgeblich, welcher sich aus
der Histologie ergab. Zusätzlich wurden Proben von 7 Kontrollpatienten verwendet.
Von den Kontrollpatienten waren 4 weiblich und 3 männlich, das Durchschnittsalter
dieser Kontrollpatienten betrug 44,86 (±19,95) Jahre.
Alle Proben lagen bereits in Form von isolierter mRNA vor. Die Entnahme der Proben
erfolgte mittels endoskopisch gesicherter Biopsie. Dabei stammten bei den
MC-Patienten 10 Proben aus dem terminalen Ileum, 4 Proben aus dem Kolon
sigmoideum, 2 Proben aus dem Zäkum und eine Probe aus dem Kolon ascendens. Bei
den CU-Patienten stammten 10 Proben aus dem Kolon sigmoideum, 5 Proben aus
dem Rektum und eine Probe aus dem Kolon descendens.
Bei den Kontrollpatienten wurden 3 Proben aus dem Kolon sigmoideum, 2 Proben aus
dem Kolon descendens, eine Probe aus dem Kolon transversum und eine Probe aus
dem Ileum entnommen.
38
Material und Methodik
Für die immunhistochemische Analyse stand ein Patientenkollektiv von 18 Patienten
zur Verfügung. Darunter waren 9 MC-Patienten und 9 CU-Patienten. Das
Durchschnittsalter der MC-Patienten betrug 37,43 (±11,53), das Durchschnittsalter der
CU-Patienten 45,41 (±13,80) Jahre. Von den Patienten waren 11 weiblich und 7
männlich. Zusätzlich wurden Proben von 9 Kontrollpatienten verwendet, wovon 5
weiblich und 4 männlich waren. Das Durchschnittsalter dieser Patienten betrug
73 (±22,46) Jahre.
3.2.18 Versuchstiere
Die Durchführung der Tierversuche erfolgte nach den gesetzlichen Bestimmungen und
wurde antragsgemäß von der Regierung von Mittelfranken genehmigt.
Die Versuchstiere waren zwischen 6 und 12 Wochen alt. Die Versuche schlossen 78
Mäuse ein. Von diesen waren 21 weiblich und 57 männlich. 7 Mäuse waren itk -/Mäuse, 71 Mäuse gehörten dem Stamm C57BL/6 an. Aus Vorversuchen wurden
weitere 12 Mäuse eingeschlossen, welche zwischen 8 und 12 Wochen alt waren. Von
diesen waren 4 itk -/- Mäuse und 8 Balb/c Mäuse, die von der Firma Jackson bezogen
wurden.
Die Tiere wurden im Tierstall der Medizinischen Klinik 1 unter Standardbedingungen
bei einem 12 - stündigen Hell - Dunkel Rhythmus gehalten. Die Raumtemperatur lag
dabei konstant bei 24°C, die Luftfeuchtigkeit bei 75% . Futter und Wasser standen ad
libitum zur Verfügung.
3.2.19 Versuchsablauf murines Colitis Modell
Für die Induktion einer therapeutischen Colitis wurde das Hapten Oxazolon72
verwendet. Die Durchführung geschah modifiziert nach bereits beschriebenen
Versuchen70,26.
Die Mäuse wurden in entsprechende Versuchsgruppen eingeteilt. Mäuse aus der
Cyclosporin A - Gruppe wurden zunächst für zwei Tage mit 0,5mg Cyclosporin A i.p.
behandelt. Die Applikation fand alle 24 Stunden statt. Am dritten und vierten Tag
erfolgte bei allen Tieren in Ketamin/Xylazin Narkose (Ketamin: 120 mg/kg KG; Xylazin:
20mg kg/KG)eine Sensibilisierung mit 150 µl 3%igem Oxazolon, welches mit einer
Pipette auf das rasierte Abdomen gegeben wurde. Bis zur Provokation der Colitis
wurden die Mäuse aus der Cyclosporin A - Gruppe weiterhin alle 24 Stunden mit 0,5mg
Cyclosporin A i.p. behandelt. Die Provokation erfolgte in Ketamin/Xylazin Narkose
39
Material und Methodik
(Ketamin: 120 mg/kg KG; Xylazin: 20mg kg/KG) fünf Tage nach Sensibilisierung durch
Applikation von 150µl 1%igem Oxazolon rektal. Hierfür wurde ein Polyethylenkatheter
verwendet.
Alle
Mäuse
wurden
24
Stunden
nach
Provokation
mit
einem
hochauflösenden Miniendoskop in Isoflurannarkose koloskopiert. Der Grad der
Entzündung wurde mit Hilfe des M.E.I.C.S. Score(murine endoscopic index of colitis
severity) festgestellt, welcher sich aus den Parametern Granularität, Fibrinexsudation,
Vaskularität, Stuhlbeschaffenheit und Transluzenz des Darms zusammensetzt310.
Alle Mäuse wurden alle 24 Stunden gewogen. Die Tötung der Tiere erfolgt 24 Stunden
nach Provokation der Colitis durch zervikale Dislokation.
3.2.20 Gewinnung des Gewebematerials
Für die Präparation des Kolons und der Milz wurden die Tiere über eine mediane
Laparotomie eröffnet. Die Extraktion des Rektums wurde über einen Beckenschnitt
durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Teil des Kolons 1 cm ab Zäkum präpariert.
Anschließend erfolgte die Präparation der Milz durch Anheben des linken
Leberlappens. Weiter wurde Blut über eine Herzpunktion entnommen.
Die Kolonstücke wurden zunächst in ein Einbettmedium gegeben und anschließend in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Milz wurde für die spätere Isolierung von
Milzzellen in einem Kulturmedium aufbewahrt.
Das über Herzpunktion gewonnene Blut wurde für 10 Minuten bei 4°C mit 3000rpm
zentrifugiert und das Serum anschließend vorsichtig abpipettiert. Bis zur weiteren
Verarbeitung wurde das Serum anschließend bei -80°C gelagert.
40
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Analyse des Patientenkollektivs
4.1.1 Histologische Charakterisierung des Patientenkollektivs
Um einen Überblick über das jeweilige pathognomonische Entzündungsmuster zu
haben, wurden zunächst alle Schnitte des Patientenkollektivs histologisch begutachtet.
Hier zeigte sich bei der Gruppe der MC-Patienten das typische Bild einer
disproportionierten transmuralen Entzündung, welche bis tief in die Submukosa reichte.
Weiter fanden sich bei über der Hälfte der Patienten die für den MC ebenfalls typischen
Granulome186. Die Gruppe der CU-Patienten wies nur eine Entzündung der Tela
Mukosa auf. Zusätzlich fand sich ein Verlust der Becherzellen. Die Schnitte der
Kontrollpatienten waren durchwegs entzündungsfrei (Abbildungen 1-3).
SM
SM
LMM
LP
LMM
200 x
LP
*
100 x
200 x
Abbildung 1: Zu sehen ist das Bild einer transmuralen Entzündung der Lamina propria (LP)
bis tief in die Submukosa (SM). Dabei wird die Lamina muscularis mucosae (LMM)
durchbrochen. Unten rechts ist ein für den MC typisches nichtverkäsendes
Epitheloidzellgranulom zu sehen (*).
TM
LP
*
*
LP
200 x
100
Laminax propria
Abbildung 2: Die vornehmlich in der
(LP) vorherrschende Entzündung ist
typisch für die CU. Hier zeigen sich auch vereinzelt Kryptenabszesse (*). Die Tunica muscularis
(TM) stellt sich entzündungsfrei dar.
41
Ergebnisse
LEM
LP
100 x
200 x
Abbildung 3: Die Kontrollpatienten zeigten eine intakte Lamina epithelialis mucosae (LEM) mit
vielen Becherzellen (
) sowie eine entzündungsfreie Lamina propria (LP).
4.1.2 Immunhistochemische Charakterisierung immunkompetenter Zellen
in der Mukosa des Patientenkollektivs
Mit Hilfe immunhistochemischer Analysen des Patientenkollektivs sollen das komplexe
Netzwerk und das Zusammenspiel immunkompetenter Zellen untersucht werden.
Hierfür
wurde das Gewebe auf CD4+ Zellen, CD11b+ Zellen, CD11c+ Zellen sowie
F4/80+ Zellen geprüft.
Hierbei zeigte sich bei MC-Patienten (MW = 58.38 ± 3.980) und CU-Patienten (MW =
54.73 ± 3.732) eine im Vergleich zu den Kontrollpatienten (MW = 28.76 ± 3.265)
signifikant (p < 0,0001) erhöhte Anzahl CD4+ Zellen (Abbildung 4).
Ähnliche Ergebnisse waren auch in den übrigen Färbungen zu sehen. So hatten
MC-Patienten (MW = 45.73 ± 3.450) nicht nur im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW =
12.13 ± 1.127), sondern auch im Vergleich zu CU-Patienten (MW = 26.18 ± 2.375) eine
signifikant (p < 0,0001) erhöhte Anzahl CD11b+ Zellen (Abbildung 5).
Die Anzahl CD11c+ Zellen war sowohl bei MC-Patienten (MW = 51.28 ± 2.776) als
auch bei CU-Patienten (MW = 55.82 ± 3.388) im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW =
20.49 ± 1.983) signifikant (p < 0,0001) erhöht (Abbildung 6).
Schließlich zeigte sich sowohl bei MC-Patienten (MW = 17.08 ± 1.589) als auch bei
CU-Patienten (MW = 18.22 ± 1.861) eine im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW =
5.556 ± 0.4919) signifikant (p < 0,0001) erhöhte Anzahl F4/80+ Zellen (Abbildung 7).
Daraus war ersichtlich, dass das untersuchte Patientenkollektiv eine signifikant erhöhte
Anzahl immunologischer Zellen – wie etwa T-Zellen, Monozyten, dendritische Zellen
oder Makrophagen - aufwies.
42
Ergebnisse
N
Negativkontrolle
100 x
100 x
Lokalisation
***
CU
MC
***
100 x
100 x
100 x
100 x
Abbildung 4: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine CD4+ Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die extrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
N
Negativkontrolle
100 x
100 x
Lokalisation
MC
100 x
100 x
CU
***
*** ***
100 x
100 x
Abbildung 5: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine CD11b+ Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die extrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
43
Ergebnisse
N
Negativkontrolle
100 x
100 x
Lokalisation
CU
MC
***
***
100 x
100 x
100 x
100 x
Abbildung 6: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine CD11c+ Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die extrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
N
Negativkontrolle
100 x
100 x
Lokalisation
Lokalisation
1:100
***
MC
100 x
100 x
CU
***
100 x
100 x
Abbildung 7:Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine F4/80+ Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die extrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
44
Ergebnisse
4.1.3 Quantitative PCR Analyse des Patientenkollektivs hinsichtlich der
Expression der durch Cyclosporin A regulierten Proteine
Die Darmbiopsien der Patienten wurden jeweils in 3 Gruppen unterteilt. Maßgeblich
war
hierfür
der
histopathologische
Score.
Somit
konnte
eine Analyse
der
Genexpression sowohl in Remission, bei mäßiger Entzündungsaktivität sowie bei
starker Entzündungsaktivität erfolgen. Untersucht wurde sowohl auf die direkt durch
Cyclosporin A beeinflussten Proteine Cyclophilin A und NFATc1 als auch auf die durch
T-Zell Induktion aktivierten und durch Cyclosporin A zusätzlich regulierten Proteine itk
und vav1.
Die Expressionsanalyse des Cyclophilin A (ppia) erbrachte zunächst ein heterogenes
Bild. So zeigte sich bei den MC-Patienten mit mäßiger (MW = 993.9 ± 99.14) und
starker Entzündungsaktivität (MW = 1707 ± 321.5) eine im Vergleich zu den
Kontrollpatienten (MW = 680.3 ± 70.57) signifikant (p = 0,0396; p = 0,0142)erhöhte
ppia-Expression. Die Expression bei Patienten in Remission war zwar auch erhöht,
jedoch nicht signifikant.
CU-Patienten mit mäßiger Entzündungsaktivität (MW = 2601 ± 680.0) hatten eine im
Vergleich zu den Kontrollpatienten erhöhte ppia-Expression.
Weiter ergab ein Vergleich der unterschiedlichen Gruppen eine signifikant (p = 0,0277)
erhöhte ppia-Expression bei MC-Patienten mit starker Entzündungsaktivität im
Vergleich zu MC-Patienten mit mäßiger Entzündungsaktivität. Außerdem war die
ppia- Expression bei CU-Patienten mit mäßiger Entzündungsaktivität im Vergleich zu
MC-Patienten mit mäßiger Entzündungsaktivität
signifikant (p = 0,0277) erhöht
(Abbildung 8).
*
*
*
*
*
Abbildung 8: ppia-Expression im Patientenkollektiv (N = Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn;
CU = Colitis ulcerosa).
45
Ergebnisse
Die Expressionsanalyse der Tyrosin Kinase itk lieferte bei MC-Patienten ebenfalls ein
heterogenes Bild. Zwar war bei mäßiger (MW = 2.529 ± 0.5898) und starker
Entzündungsaktivität (MW = 1.655 ± 0.3268) eine signifikant (p = 0,0148;p = 0,0198)
erhöhte Expression im Vergleich zu Kontrollpatienten ( MW = 0.5989 ± 0.2069) zu
erkennen, jedoch war die Expression bei mäßiger Entzündung höher als bei starker
Entzündungsaktivität.
Dies
könnte
ein
Hinweis
auf
eine
bei
MC-Patienten
unregelmäßige itk-Expression sein. Auch könnte die bei MC-Patienten transmurale
Entzündung eine raschere Abheilung verhindern.
CU-Patienten
zeigten
-
wie
zuvor
beschrieben
-
eine
mit
steigender
Entzündungsaktivität ansteigende itk-Expression. Bei mäßiger (MW = 1.940 ± 0.4417)
und starker Entzündungsaktivität (MW = 2.540 ± 0.4861) war die itk-Expression
signifikant (p = 0,0171; p = 0,0035) erhöht.
Weiter war eine signifikant (p = 0,0342) erhöhte itk-Expression bei CU-Patienten mit
starker Entzündungsaktivität im Vergleich zu CU-Patienten in Remission zu sehen(MW
= 0.8490 ± 0.3807). Der Vergleich aller anderen Gruppen erbrachte keinen
signifikanten Unterschied( Abbildung 9).
*
*
*
**
*
Abbildung 9: itk-Expression im Patientenkollektiv (N = Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU
= Colitis ulcerosa).
Bei
der
Expressionsanalyse
des
NFATc1 konnte
schließlich
mit
steigender
Entzündungsaktivität eine vermehrte NFATc1-Expression nachgewiesen werden.
So hatten MC-Patienten bei starker Entzündungsaktivität (MW = 4.434 ± 0.8409) eine
im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW = 2.090 ± 0.545) signifikant (p = 0,0340) erhöhte
NFATc1-Expression. Bei mäßiger Entzündung zeigte sich jedoch keine signifikant ( p =
46
Ergebnisse
0,0649) erhöhte NFATc1-Expression.
CU-Patienten dagegen hatten sowohl bei mäßiger (MW = 4.529 ± 0.8006) als auch bei
starker Entzündungsaktivität (MW = 6.816 ± 1.767) eine signifikant (p = 0,0146; p =
0,0257)erhöhte NFATc1-Expression (Abbildung 10).
Beim Vergleich der verschiedenen Krankheitsaktivitäten war kein weiterer signifikanter
Unterschied zu sehen.
*
*
*
Abbildung 10: Expression des NFATc1 im Patientenkollektiv (N = Kontrollpatient; MC = Morbus
Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
Ein ähnliches Bild zeigte sich auch bei der vav1-Expressionsanalyse. Sowohl bei MCPatienten als auch bei CU-Patienten konnte mit vermehrter Entzündungsaktivität ein
Anstieg der vav1-Expression nachgewiesen werden. So hatten MC-Patienten bei einer
mäßigen (MW = 5.817 ± 0.7958) und bei starker Entzündungsaktivität (MW = 6.595 ±
1.151) eine im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW = 2.480 ± 0.5753) signifikant (p =
0,0058; p = 0,0057) erhöhte vav1-Expression. Auch CU-Patienten zeigten bei mäßiger
(MW = 6.692 ± 1.152) und starker Entzündungsaktivität (MW = 11.66 ± 2.446) eine im
Vergleich zu Kontrollpatienten signifikant (p = 0,0050; p = 0,0010) erhöhte
vav1- Expression.
Ein differenzierter Vergleich der einzelnen Gruppen ergab zudem eine signifikante (p =
0,0191) Erhöhung von vav1 bei CU-Patienten mit starker Entzündungsaktivität im
Vergleich zu CU-Patienten in Remission (MW = 3.561 ± 0.7159). Im Übrigen waren bei
den unterschiedlichen Gruppen keine signifikanten Unterschiede zu erkennen
(Abbildung 11).
47
Ergebnisse
**
**
*
**
**
Abbildung 11: Expression des Protoonkogens vav1 im Patientenkollektiv. (N = Kontrollpatient;
MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa).
4.1.4 Direkter Proteinnachweis in der Immunhistofluoreszenz
Mit Hilfe der Immunhistofluoreszenz wurden die Proteine ppia, itk, NFATc1 und vav1
direkt nachgewiesen und im Patientenkollektiv weiter untersucht.
Hierbei wurde sowohl bei den MC - Patienten (MW = 8,143 ± 3,078) als auch bei den
CU – Patienten (MW = 7,857 ± 3,078) eine im Vergleich zu den Kontrollpatienten (MW
= 2,571 ± 1,618) signifikant (p = 0,0012; p = 0,0017) erhöhte Anzahl ppia+ Zellen
sichtbar(Abbildung 12).
Ähnliches ergab auch der Nachweis der übrigen Faktoren. So zeigten MC- Patienten
(MW = 5.667 ± 1.542) und CU-Patienten (MW = 8.500 ± 1.668) eine im Vergleich zu
Kontrollpatienten (MW = 0.8333 ± 0.4014) signifikant (p = 0,0012;p = 0,2408)erhöhte
Anzahl ppia+ Zellen ( Abbildung 13).
Auch konnte sowohl bei MC-Patienten (MW = 153.0 ± 37.17) als auch bei
CU-Patienten (MW = 98.33 ± 13.17) eine im Vergleich zu Kontrollpatienten (MW =
65.88 ± 4.121) signifikant (p = 0,0266; p = 0,0413)erhöhte Anzahl NFATc1+ Zellen
nachgewiesen werden (Abbildung 14).
Schließlich zeigte sich ebenfalls eine signifikant (p < 0,0001; p < 0,0001) erhöhte
Anzahl vav1+ Zellen bei MC-Patienten (MW = 32.10 ± 4.510) und bei CU-Patienten
(MW = 27.90 ± 3.770) im Vergleich zu den Kontrollpatienten (MW = 3.857 ± 0.9368)
(Abbildung 15).
Somit konnte gezeigt werden, dass die durch Cyclosporin A beeinflussten Faktoren
48
Ergebnisse
ppia, NFATc1, itk und vav1 im Patientenkollektiv signifikant erhöht waren.
N
Negativkontrolle
200 x
200 x
Lokalisation
MC
200 x
200 x
CU
**
200 x
200 x
*
Abbildung 12: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine ppia Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die intrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa; N = 7).
N
Negativkontrolle
200 x
200 x
Lokalisation
MC
200 x
CU
**
200 x
**
200 x
200 x
Abbildung 13: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine itk Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die intrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa; N = 7).
49
Ergebnisse
N
Negativkontrolle
200 x
200 x
Lokalisation
*
MC
200 x
CU
*
200 x
200 x
200 x
Abbildung 14: Zu sehen ist exemplarisch für jede Gruppe eine NFATc1 Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die intrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa; N = 7).
N
Negativkontrolle
200 x
200 x
Lokalisation
MC
200 x
200 x
CU
***
200 x
200 x
***
Abbildung 15: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine vav1 Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die intrazelluläre Färbung deutlich (N =
Kontrollpatient; MC = Morbus Crohn; CU = Colitis ulcerosa; N = 7).
50
Ergebnisse
4.2 Analyse der Cyclosporin A Therapie im murinen Colitis Modell
4.2.1 Analyse des endoskopischen Scores
Die oben beschriebenen Erkenntnisse konnten nun zwecks detaillierter Analyse mit
Hilfe des murinen Colitis Modells verwendet werden. Gleichzeitig wurden durch
unterschiedliche Mausstämme Einflüsse des genetischen Hintergrundes getestet. Die
Mäuse der Oxazolon und Cyclosporin A-Gruppe wurden nach dem im Kapitel 3.2.19
beschriebenen Schema behandelt. Die Mäuse wurden einen Tag nach OxazolonProvokation endoskopiert, um den Grad der Entzündung feststellen zu können. Hierfür
war die makroskopische Endoskopiebefundung maßgeblich (Abbildung 16).
Es wurde festgestellt, dass mit Cyclosporin A behandelte WT- Mäuse (MW = 3.778 ±
0.6432) eine signifikant (P < 0,0001) schwächere Entzündung hatten als Mäuse ohne
Cyclosporin A Behandlung (MW = 8.594 ± 0.4615) (Abbildung 17). Diese Beobachtung
war unabhängig vom genetischen Hintergrund, da auch mit Cyclosporin A behandelte
Balb/c Mäuse (MW = 2.750 ± 0.6614) im Vergleich zu rein mit Oxazolon behandelten
Balb/c Mäusen (MW= 8.000 ± 0.9354) eine signifikant (p = 0,0038) schwächere
Entzündung zeigten (Abbildung 17).
Oxazolon
BL/6
Balb c
Cyclosporin A
Abbildung 16: Die Endoskopieaufnahmen zeigen einen Unterschied in der Entzündungsstärke.
Die Darmwand der Oxazolon ist stark verdickt. Zudem sind eine deutliche Fibrinexsudation
sowie Gefäßarrosion zu sehen.
51
Ergebnisse
**
***
Abbildung 17: Gezeigt ist das endoskopische Scoring bei Balb/c und BL/6 Mäusen. Links:
Gezeigt wurde das Ergebnis eines Versuchs (N = 8) Rechts: Gezeigt wurde das repräsentative
Ergebnis aus 4 Versuchen (N = 34) (O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
4.2.2 Analyse des Gewichtsverlaufs
Jede Maus wurde während des Versuchs täglich gewogen. Anhand der Gewichtskurve
ließ sich ein Gewichtsverlust in den unterschiedlichen Gruppen erkennen. So zeigte
sich einen Tag nach Oxazolon Provokation bei den zusätzlich mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen (MW = 92.83 ± 0.5718) ein im Vergleich zu den ausschließlich mit
Oxazolon behandelten Mäusen (MW = 88.72 ± 1.109) signifikant
(p = 0,0026)
geringerer Gewichtsverlust (Abbildung 18).
Oxazolon
**
S
Oxazolon + Cyclosporin A
P
Abbildung 18: Dargestellt ist das repräsentative Ergebnisse aus 3 Versuchen mit BL/6 Mäusen
(S = Sensibilisierung; P = Provokation).
52
Ergebnisse
Die Gewichtsanalyse der Balb/c Mäuse ergab keine signifikanten Ergebnisse. Mit
Cyclosporin A behandelte Balb/c Mäuse hatten einen insgesamt leicht geringeren
Gewichtsverlust (Abbildung 19).
Oxazolon
Oxazolon + Cyclosporin A
Abbildung 19: Dargestellt ist das Ergebnis nach Provokation aus 2 Versuchen mit Balb/c
Mäusen.
4.2.3 Analyse des histopathologischen Scores
Zur weiteren Einschätzung der Entzündungsaktivität wurden die entnommenen
Darmpräparate histologisch untersucht. Hier zeigte sich bei den ausschließlich mit
Oxazolon behandelten BL/6 Mäusen (MW = 5.000 ± 0.4410) im Vergleich zu den
zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten BL/6 Mäusen (MW = 3.545 ± 0.2073) ein
Cyclosporin A
100 x
Oxazolon
signifikant (p = 0,0053) höherer histopathologischer Score (Abbildung 20).
100 x
**
Abbildung 20: Die mit Cyclosporin A behandelten BL/6 Mäuse zeigen deutlich weniger
Zellmigration. Auch findet sich eine geringere Ödembildung bei noch intakter Kolonmorphologie
(O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
53
Ergebnisse
Balb/c Mäuse, welche zusätzlich mit Cyclosporin A behandelt wurden (MW = 1.800 ±
0.3742), hatten ebenfalls im Vergleich zu den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen (MW = 4.800 ± 0.6633) einen signifikant (p = 0,0043) geringeren
Oxazolon
Cyclosporin A
histopathologischen Score (Abbildung 21).
**
100 x
100 x
Abbildung 21: Die mit Cyclosporin A behandelten Balb/c Mäuse zeigen insgesamt eine
geringere Zellmigration. Auch findet sich eine geringere Ödembildung bei intakter
Kolonmorphologie (O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
4.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung immunkompetenter Zellen
in der Mukosa von C57BL/6 Mäusen
Zur besseren Beurteilung des Entzündungsinfiltrates wurde das Gewebe anschließend
mit dem T-Zell spezifischen Marker CD4 immunhistologisch analysiert.
Es wurde bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäusen (MW = 51.30 ±
4.752) eine im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäusen (MW
= 34.87 ± 3.477) eine signifikant (p = 0,0071) höhere Anzahl CD4+ Zellen festgestellt
(Abbildung 22).
54
Ergebnisse
Cyclosporin A
Oxazolon
Negativkontrolle
Lokalisation
100 x
100 x
**
100 x
100 x
Abbildung 22: Dargestellt ist exemplarisch für jede Gruppe eine CD4+ Färbung mit der
dazugehörenden Negativkontrolle. Oben rechts wird die extrazelluläre Färbung deutlich
(O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
4.2.5 Zytokinanalyse mittels qPCR bei Balb/c Mäusen
Zunächst wurde bei Balb/c Mäusen, welche eine der CU ähnliche Th2 gerichtete
Immunantwort besitzen, die Genexpression der durch Cyclosporin A regulierten
Faktoren getestet.
Dazu wurde zunächst die Expression des Th2 spezifischen IL13 gemessen, welches
bei der Immunantwort der Oxazolon-Colitis eine führende Rolle übernimmt115.
Hierbei zeigte sich zwar deutlich, dass IL13 bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen (MW = 2.227 ± 0.3338) im Vergleich zu den zusätzlich mit
Cyclosporin A behandelten Mäusen (MW= 1.269 ± 0.3735) erhöht ist. Eine Signifikanz
(p = 0,1045) war hier aber nicht nachweisbar (Abbildung 23).
55
Ergebnisse
Abbildung 23: Expression von IL13 im Kolon von Balb/c Mäusen (O = Oxazolon; C =
Cyclosporin A).
Weiter wurde die Expression der zuvor im Patientenkollektiv gemessenen Faktoren
ppia, itk, NFATc1 und vav1 getestet.
Hier zeigte sich eine signifikante (p = 0,0032) Erhöhung von ppia bei den zusätzlich mit
Cyclosporin A behandelten Mäusen (MW = 625.6 ± 15.48) im Vergleich zu den
ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäusen (MW = 540.2 ± 9.296). Auch konnte
eine signifikante (p < 0.0001) Erhöhung von ppia bei den Kontrollmäusen
(MW = 1539 ± 103.1) im Vergleich zu den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen festgestellt werden (Abbildung 24).
***
**
Abbildung 24:
Cyclosporin A).
Expression von ppia im Kolon von Balb/c Mäusen (O = Oxazolon; C =
56
Ergebnisse
Die itk-Expressionsanalyse zeigte bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen (MW = 1.284 ± 0.08883) im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen (MW = 0.2944 ± 0.08432) eine signifikant (p= 0,0002) erhöhte
itk-Expression, was ebenfalls die humanen Ergebnisse zum Teil bestätigt (Abbildung
25).
Abbildung 25:
***
Expression von itk im Kolon von Balb/c Mäusen (O = Oxazolon; C =
Cyclosporin A).
Auch wurde bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäusen (MW = 7.485 ±
1.424) im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäusen (MW =
4.427 ± 0.4873) eine nicht signifikant (p = 0,0885)
erhöhte NFATc1-Expression
beobachtet (Abbildung 26).
Abbildung 26: Expression von NFATc1 im Kolon von Balb/c Mäusen (O = Oxazolon; C =
Cyclosporin A).
57
Ergebnisse
Schließlich wurde noch die vav1-Expression analysiert. Hierbei zeigte sich eine nicht
signifikant (p = 0,2831) erhöhte vav1-Expression bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten
Mäusen (Abbildung 27).
Abbildung 27:
Expression von vav1 im Kolon von
Balb/c Mäusen (O = Oxazolon; C =
Cyclosporin A).
4.2.6 Zytokinanalyse mittels quantitativer PCR bei C57BL/6 Mäusen
Wie bei den Balb/c Mäusen wurde nun die Genexpression auch bei den BL/6 Mäusen
analysiert. Diese zeichnen sich durch eine dem MC ähnliche Th1 gerichtete
Immunantwort aus.
Wie oben beschrieben erfolgte zunächst eine Analyse der IL13-Expression.
Hier zeigte sich bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäusen (MW =
19.23 ± 11.47) im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäusen
(MW = 6.121 ± 1.271) eine erhöhte IL13-Expression. Gleichzeitig erfolgte bei jeder
Maus eine Kontrolle der Expression in einem nicht entzündeten Kolon. Auch hier wurde
bei
den
ausschließlich
mit
Oxazolon
behandelten
Mäusen
im
entzündeten
Kolonbereich eine im Vergleich zum nicht entzündeten Bereich (MW = 5.843 ± 1.977)
erhöhte (p = 0,3714) IL13-Expression festgestellt (Abbildung 28).
58
Ergebnisse
Abbildung 28: Expression von IL-13 im Kolon von BL/6 Mäusen (EB = entzündeter Bereich;
NEB= nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
Die NFATc1 Expressionsanalyse zeigte bei den zusätzlich mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen eine signifikante (p = 0,0306) NFATc1 Erhöhung im entzündeten
Bereich (MW = 19.46 ± 3.088/ NEB = 9.560 ± 2.807). Die übrigen Gruppen zeigten
keine Signifikanz (Abbildung 29).
*
Abbildung 29: Expression von NFATc1 im Kolon von BL/6 Mäusen (EB = entzündeter Bereich;
NEB = nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
59
Ergebnisse
Zusätzlich wurde die t-bet Genexpression bestimmt, da t-bet für eine Th1 gerichtete
Immunantwort eine wichtige Rolle spielt101. Hier zeigten sich allerdings keine
signifikanten Ergebnisse (Abbildung 30). Dennoch war ein ähnlicher Trend wie bei der
oben beschriebenen NFATc1-Expressionsanalyse zu beobachten.
Abbildung 30: Expression von t-bet im Kolon von BL/6 Mäusen (EB = entzündeter Bereich;
NEB = nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
Die weitere Analyse von ppia ergab keine Signifikanz. Zwar bestätigte sich der Trend
einer unter Oxazolon vermehrten Expression.
Der Unterschied zwischen den
einzelnen Gruppen fiel allerdings deutlich geringer aus als bei den übrigen
untersuchten Zytokinen (Abbildung 31).
Abbildung 31: Expression von ppia im Kolon von BL/6 Mäusen (EB = entzündeter Bereich;
NEB = nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
60
Ergebnisse
Die itk-Expressionsanalyse lieferte zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. So zeigte
sich zwar bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäusen im entzündeten
Bereich (MW = 1.787 ± 0.3097) eine im Vergleich zum nicht entzündeten Bereich (MW
= 0.7780 ± 0.2278) signifikante (p = 0,0499) itk- Expressionserhöhung, jedoch war
diese im entzündeten Bereich der zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäuse
(MW = 2.882 ± 0.7482) leicht höher als bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen (Abbildung 32).
*
Abbildung 32: Expression von itk im Kolon von BL/6 Mäusen (EB = entzündeter Bereich; NEB
= nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
Einen deutlichen Unterschied der untersuchten Gruppen ergab schließlich die
vav1-Expressionsanalyse: Das entzündete Gewebe (MW = 12.55 ± 3.303) der
zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäuse zeigte eine im Vergleich zum nicht
entzündeten Gewebe (MW =
4.754 ± 1.401) signifikant (p = 0,0343) erhöhte
vav1- Expression. Auch die vav1-Expression im entzündeten Gewebe (MW = 30.88 ±
10.22) der ausschließlich mit Oxazolon behandelten Mäuse war im Vergleich zum nicht
entzündeten Gewebe (MW = 7.783 ± 1.908) signifikant (p = 0,0346) erhöht (Abbildung
33).
61
Ergebnisse
*
*
Abbildung 33: Expression von vav1 im Kolon von BL/6 Mäusen. (EB = entzündeter Bereich;
NEB = nicht entzündeter Bereich; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
Die Mäuse wurden anhand ihrer Entzündungsstärke in Gruppen zusammengefasst.
Ein Entzündungsscore von 0-5 wurde dabei als leicht entzündet, Entzündungsscores
zwischen 6-9,5 als mittel und Werte zwischen 10-15 als stark entzündet definiert. So
konnte man bei den stark entzündeten, ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen (MW = 52.03 ± 24.17) im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen eine signifikant (p = 0,0047) höhere vav1-Expression feststellen
(Abbildung
34).
Diese
Ergebnisse
bestätigen
auch
die
vorangegangenen
vav1-Expressionsanalysen des Patientenkollektivs.
**
Abbildung 34: Unterschied der vav1-Expression im Kolon von BL/6 Mäusen anhand der
angegebenen Entzündungsstärke (O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
62
Ergebnisse
Ebenso wurden die isolierten Milzzellen hinsichtlich der genetischen ppia-, itk- und
vav1-Expression
analysiert.
zusammengefasst. Es wurde
Hierbei
wurden
die
Mäuse
eines
Versuchs
bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäusen eine
erhöhte itk-, vav1- und ppia- Expression festgestellt (Abbildung 35).
Abbildung 35: Dargestellt ist die vav1-, ppia- und itk-Expression in Milzzellen. Dabei wurden
mehrere Mäuse in die zwei angegebenen Gruppen eingeteilt (n = 10)(O= Oxazolon; C =
Cyclosporin A).
Die isolierten Epithelzellen wurden ebenfalls hinsichtlich der genetischen ppia-, itk- und
vav1-Expression
analysiert.
Die
Mäuse
eines
Versuchs
wurden
wieder
zusammengefasst. Es zeigte sich auch hier bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten
Mäusen eine erhöhte itk-, vav1- und ppia- Expression (Abbildung 36).
63
Ergebnisse
Abbildung 36: Dargestellt ist die vav1-, ppia- und itk-Expression in intestinalen Epithelzellen
eines Versuchs. Dabei wurden mehrere Mäuse in die 2 angegebenen Gruppen eingeteilt (n =
10). Oben links ist das Ergebnis der Lamina propria Analyse für ppia zu sehen (O = Oxazolon;
C= Cyclosporin A).
4.2.7 Analyse des Zytokinprofils bei C57BL/6 Mäusen mittels beads
mediierter durchflusszytometrischer Untersuchung
Die Milz-, LP- und Serumüberstände wurden hinsichtlich ihres Zytokinprofils mit Hilfe
der beads mediierten durchflusszytometrischen Untersuchung analysiert.
Hier ergab die Untersuchung der Serumüberstände eine nicht signifikant erhöhte
Expression der Interleukine 1α, 4, 5, 6 bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten
Mäusen (Abbildung 37).
Die Analyse der Milzüberstände zeigte bei allen untersuchten Zytokinen eine nicht
signifikant erhöhte Interleukinexpression in der Gruppe der ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäuse (Abbildung 38).
64
Ergebnisse
Die LP- Überstände zeigten schließlich bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen eine nicht signifikant erhöhte Zytokinexpression der Interleukine
2, 5, 10, 13, 22 (Abbildung 39).
BL/6 O + C
BL/6 O
Abbildung
37:
Zytokinprofil
der
analysierten
Serumüberstände
(O=Oxazolon;
C=Cyclosporin A).
BL/6 O
BL/6 O + C
Abbildung 38: Zytokinprofil der analysierten Milzüberstände. Rechts ist die Messung bei 24
Stunden dargestellt (O= Oxazolon; C= Cyclosporin A).
65
Ergebnisse
BL/6 O
BL/6 O + C
BL/6 C
Abbildung 39: Zytokinprofil der analysierten LP-Überstände (O= Oxazolon; C= Cyclosporin A).
4.2.8 Direkter Proteinnachweis mittels Western Blot Analyse bei C57BL/6
Mäusen
Der Proteinnachweis erfolgte mittels Western Blot. Hierbei zeigte sich im entzündeten
Darmgewebe der Mäuse eine im Vergleich zum nicht entzündeten Gewebe stärkere
Proteinexpression bei itk, vav1, NFATc1 und ppia. Weiter zeigte sich bei itk und vav1
eine stärkere Proteinexpression bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten Mäusen
(Abbildung 40).
itk (72 kDa)
vav 1 (95 kDa)
ppia (18kDa)
NFATc1 (140 kDA)
Beta- actin (43 kDa)
NEB
EB
C+O
O
C+O
O
C +O
O
C+O
O
C+O
O
Abbildung 40: Gezeigt ist das repräsentative Ergebnis aus 3 Western Blots bei BL/6 Mäusen
(C= Cyclosporin A; O= Oxazolon; NEB= nicht entzündeter Bereich; EB= entzündeter Bereich).
66
Ergebnisse
4.3 Simulation von Cyclosporin A-Patienten im Colitis Modell itk
defizienter Mäuse
4.3.1 Analyse des endoskopischen Scores
Wie in Kapitel 1.3.3 beschrieben, bindet Cyclosporin A zunächst an Cyclophilin A. Es
konnte gezeigt werden, dass dieser Komplex aus Cyclosporin A und Cyclophilin A die
T-Zell Kinase itk hemmen kann32, was zu einer komprimierten T- Zell Funktion führt. So
sollten itk -/- Mäuse durch eine beeinträchtigte T-Zell Funktion einen Schutz vor
entzündlichen Erkrankungen haben. Nachfolgend wurde mit Hilfe von itk -/- Mäusen
versucht, die Interaktion zwischen itk und vav1 im therapeutischen Colitis Modell näher
zu untersuchen.
Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass itk defiziente Mäuse (MW = 1.438 ±
0.4057) im Vergleich zu den ausschließlich mit Oxazolon behandelten WT Mäusen
(MW = 8.594 ± 0.4615) einen signifikant (p < P<0.0001) geringeren Entzündungsscore
aufwiesen (Abbildung 41). Die zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten itk defizienten
Mäuse (MW = 1.000 ± 0.5000) zeigten im Vergleich zu den ausschließlich mit
Oxazolon behandelten itk defizienten Mäusen zudem einen nicht signifikant
erniedrigten Entzündungsscore (Abbildung 42).
O+C
Itk KO
WT
Oxazolon
Abbildung 41: Im Vergleich zu den WT Mäusen zeigen die itk defizienten Mäuse eine intakte
Kolonschleimhaut; weder Fibrinexsudation noch erhöhte Gefäßpermeabilität sind erkennbar
(O = Oxazolon; C = Cyclosporin A; WT = Wildtyp).
67
Ergebnisse
***
***
Abbildung 42: Abgebildet sind das endoskopische Scoring der WT- und itk defizienten Mäuse
(WT = Wildtyp; O = Oxazolon; C = Cyclosporin A).
4.3.2 Analyse des Gewichtsverlaufs
Der Gewichtsverlauf der itk -/- Mäuse zeigte einen im Vergleich zu den WT Mäusen
nicht signifikant geringeren Gewichtsverlust. Mäuse, welche zur Kontrolle nur
Cyclosporin A gespritzt bekommen hatten, zeigten sogar eine geringe, nicht
signifikante Gewichtszunahme (Abbildung 43).
A
A
A
A
Messungen
S
P
Abbildung 43: Dargestellt ist das Ergebnis aus 2 Versuchen. N = 2 pro Gruppe (P =
Provokation S = Sensibilisierung; WT = Wildtyp).
68
Ergebnisse
4.3.3 Analyse des histopathologischen Scores
Zur weiteren Einschätzung der Entzündungsaktivität wurden die Kryoschnitte itk defizienter Mäuse mittels HE- Färbung histologisch untersucht. Hier zeigte sich bei den
ausschließlich mit Oxazolon behandelten itk defizienten Mäusen (MW =
1.750 ±
0.2500) im Vergleich zu den ausschließlich mit Oxazolon behandelten WT-Mäusen
(MW = 5.000 ± 0.4410) ein signifikant (p = 0,0007) höherer histopathologischer Score.
Weiter wurde bei den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten itk defizienten Mäusen
(MW = 2.000 ± 0.4082) im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin behandelten
WT-Mäusen (MW = 3.545 ± 0.2073) ein signifikant (p =0,0028) geringerer
histopathologischer Score deutlich (Abbildung 44).
Itk KO O + C
100 x
Itk KO Oxazolon
***
100 x
**
Abbildung 44: Die itk defizienten Mäuse zeigen eine intakte Mukosa mit sehr geringer
Ödembildung(O = Oxazolon; C = Cyclosporin A; WT = Wildtyp).
4.3.4 Zytokinanalyse mittels quantitativer PCR von itk defizienten Mäusen
Zunächst wurde die ppia-Expression bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten
itk defizienten Mäusen analysiert. Cyclophilin hemmt - wie bereits beschrieben zusammen mit Cylosporin A die T-Zell Kinase itk. In Abwesenheit von Cyclosporin A
und itk konnte eine deutlich geringere ppia-Expression im Vergleich zu WT - Mäusen
69
Ergebnisse
nachgewiesen werden (Abbildung 45). Itk defiziente Kontrollmäuse (MW= 2148 ±
277.5) hatten im Vergleich zu BL/6 Kontrollmäusen (MW= 358.4 ± 36.33) eine
signifikant (p = 0,0029) geringere ppia-Expression.
**
Abbildung 45: Zu sehen ist die ppia-Expression im Kolon der WT- und itk-defizienten Mäuse
(O = Oxazolon; C = Cyclosporin A; WT = Wildtyp).
Anschließend wurde die vav1-Expression sowohl bei den zusätzlich mit Cyclosporin A
als auch bei den zusätzlich mit Oxazolon behandelten itk-defizienten Mäusen
analysiert. Hierbei zeigte sich bei den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten
itk-defizienten Mäusen (MW = 0.2895 ± 0.2679) im Vergleich zu den ausschließlich mit
Oxazolon behandelten Mäusen (MW = 1.399 ± 0.1447) eine signifikant (p = 0,0270)
geringere vav1-Expression (Abbildung 46). Zudem war die vav1-Expression
defizienter Mäuse signifikant (p = 0,0104) niedriger als bei unbehandelten
itkWT-
Mäusen (MW = 8.917 ± 1.083) (Abbildung 47). Somit konnte gezeigt werden, dass
zwar die vav1-Expression unabhängig von Cyclosporin A bei itk defizienten Mäusen im
Vergleich zu WT-Mäusen gehemmt ist, aber unter Behandlung mit Cylosporin A noch
weiter gehemmt werden kann.
70
Ergebnisse
*
Abbildung 46: Zu sehen ist die vav1-Expression im Kolon von itk defizienten Mäusen (O =
Oxazolon; C = Cyclosporin A).
*
*
*
*
Abbildung 47: Dargestellt ist die vav1-Expression im Kolon itk defizienter Mäuse im Vergleich
zur vav1-Expression im Kolon der WT- Mäuse (O = Oxazolon; C = Cyclosporin A; WT =
Wildtyp).
4.3.5 Analyse des Zytokinprofils bei itk-defizienten Mäusen mittels beads
mediierter durchflusszytometrischer Untersuchung
Abschließend wurde das Zytokinprofil bei itk defizienten Mäusen ausgewertet. Hierbei
zeigte sich ein uneinheitliches Bild. Es konnte in LP-Zellen zwar bei den ausschließlich
mit Oxazolon behandelten Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen eine erhöhte IL13- und IL5-Expression nachgewiesen werden
(Abbildung 48). Die Analyse der Milzüberstände zeigte aber in den untersuchten
71
Ergebnisse
Behandlungsgruppen keine unterschiedliche Zytokinexpression (Abbildung 49).
A
Abbildung 48: Analyse des Zytokinprofils in den isolierten LP-Zellen nach 48 Stunden.
A
A
Abbildung 49: Analyse des Zytokinprofils in den isolierten Milzzellen nach 48 Stunden.
72
Diskussion
5. Diskussion
5.1 Fragestellung
Ziel dieser Arbeit waren das Entdecken von neuen Prognosemarkern für eine
verbesserte Cyclosporin A Therapie bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
sowie das Entdecken von neuen Faktoren, die eine zielgerichtetere Therapie chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen erlauben. Nachfolgend sind die untersuchten
Faktoren - diskutiert im aktuellen wissenschaftlichen Kontext - einzeln aufgeführt.
5.2 Der Transkriptionsfaktor t-bet
Der Transkriptionsfaktor t-bet gehört zu der Familie der t-box Transkriptionsfaktoren.
Diese Gruppe spielt eine wichtige Rolle in der Organogenese. T-box Mutationen sind
folglich mit zahlreichen kongenitalen Missbildungen assoziiert189. T-bet wird zum
großen Teil in Th1 Zellen exprimiert und übernimmt durch Transkriptionsinduktion des
Interleukins Interferon γ eine tragende Rolle bei der Differenzierung jener Th1 Zellen271.
Dies geschieht unter anderem über eine Rekrutierung von Methyltransferasen, welche
die Chromatinstruktur der T Helfer Zellen verändern und die direkte Transkription des
Interferon γ Gens durch t-bet ermöglichen183. Zusätzlich wird durch die nun veränderte
Chromatinstruktur ein Binden anderer Transkriptionsfaktoren wie etwa NFATc1
möglich13. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass t-bet indirekt die Th2
Differenzierung supprimiert, indem es eine Bindung von GATA 3 - ein für die Th2
Differenzierung erforderlicher Transkriptionsfaktor - an die Promoterregion wichtiger
Th2 Interleukine verhindert132. Weitere andere Regulationsmechanismen, wie zum
Beispiel eine indirekte Transkriptionshemmung des Interleukin 17 oder eine direkte
Transkriptionshemmung des für eine negative Immunregulation wichtigen Proteins
PD-1, unterstreichen den Stellenwert des Transkriptionsfaktors t-bet für die
Immunregulation152,140. Dies spiegelt sich auch in der Tatsache wider, dass t-bet
Polymorphismen
mit
einigen Autoimmunerkrankungen
wie
etwa
dem
Lupus
erythematosus, dem Asthma bronchiale oder der Colitis ulcerosa assoziiert
wurden90,213,311. Der genaue Stellenwert des Transkriptionsfaktors t-bet bei CED konnte
mit Hilfe von Mausmodellen näher beleuchtet werden. Hierbei wurde eine protektive
Funktion von t-bet im DSS- Colitismodell vermutet. T-bet defiziente Mäuse entwickelten
in einer Studie von Garrett et al. eine im Vergleich zu WT-Mäusen starke Colitis.
Außerdem entwickelten t-bet defiziente Mäuse, welche auf dem Hintergrund von
73
Diskussion
immundefizienten RAG2 Mäusen gezüchtet worden waren, eine spontane Colitis, die
durch einen besonders schweren und penetrierenden Verlauf gekennzeichnet war und
durch das Interleukin TNFα gefördert wurde. Auch wurden nach 3 Monaten bei 50 %
der Mäuse intestinale Epitheldysplasien festgestellt. Da t-bet defiziente Mäuse, welche
nicht auf einem immundefizienten Hintergrund gezüchtet worden waren, keine
spontane
Colitis
entwickelten,
mussten
immunregulatorische
Zellen
für
die
Unterdrückung der Colitis verantwortlich sein. Nach dem Transfer regulatorischer TZellen in immun- und t-bet defiziente Mäuse kam es schließlich zu einer Remission der
Colits90. Die genaue Rolle des Transkriptionsfaktors t-bet in der Pathogenese der CED
ist noch nicht abschließend geklärt. Schließlich wurde bei MC-Patienten, welche eine
Th1
gerichtete
Immunantwort
Transkriptionsfaktors t-bet
zeigen,
eine
erhöhte
Expression
des
nachgewiesen199. Diese Tatsache konnte auch durch
andere Studien belegt werden, wobei eine erhöhte t-bet-Expression nur bei
MC-Patienten und nicht bei CU-Patienten gefunden wurde178. Eine t-bet Hemmung
durch einen spezifischen Inhibitor würde folglich eine Therapieoption darstellen300. So
wurde etwa gezeigt, dass t-bet durch Cyclosporin A gehemmt werden konnte157.
In dieser Arbeit konnte bei den ausschließlich mit Oxazolon behandelten WT- Mäusen
im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin A behandelten WT-Mäusen eine
erhöhte t-bet-Expression nachgewiesen werden. Dies würde zum einen für eine
erfolgreiche Hemmung von t-bet durch Cyclosporin A sprechen, zum anderen aber
auch die erhöhte t-bet-Expression bei einer durch Oxazolon ausgelösten starken
Entzündung
zeigen. Jedoch konnte in einer Studie von Neurath et al. bei
Colitismodellen, die auf einer Th2 gerichteten Immunantwort beruhen, keine erhöhte tbet Aktivität nachgewiesen werden199.
5.3 Interleukin-13
IL-13 ist - wie auch IL-4, mit dem es strukturverwandt ist, und IL-5 - ein Zytokin aus der
Th-2 Familie26. Zahlreiche Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems,
wie etwa CD4 Zellen, Mastzellen und NK-Zellen, können IL-13 produzieren87,258,283.
Eine Induktion der IL-13 Transkription erfolgt durch den Transkriptionsfaktor GATA3231.
Eine Suppression geschieht über Zytokine wie Interferon α, wodurch auch eine
therapeutische Intervention ermöglicht wird141. IL-13 kommt
durch Stimulation von
Becherzellen, vermehrter Rekrutierung von Eosinophilen sowie Induktion von IgE eine
wichtige Rolle in der intestinalen Immunabwehr parasitärer Infektionen zu16. Eine
Dysregulation, welche zu einer pathologisch erhöhten IL-13 Produktion führt, ist jedoch
74
Diskussion
mit zahlreichen Krankheitsbildern wie etwa dem Asthma bronchiale163, der eosinophilen
Ösophagitis317 und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert. Hierbei
wurde vor allem eine Assoziation mit der Colitis ulcerosa87 und der Bildung von
perianalen Fisteln beim Morbus Crohn gefunden244. Somit spielt IL-13 eine wichtige
Rolle in der intestinalen Immunantwort. So wurde beobachtet, dass IL-13 durch eine
erhöhte Produktion von IL-10 eine von Th-17 Zellen bestimmte Infektion unterdrücken
kann200. Auch in der vorliegenden Arbeit zeigten Mäuse, welche ausschließlich mit
Oxazolon behandelt wurden, in ihrem Zytokinprofil eine im Vergleich zu den zusätzlich
mit Cyclosporin A behandelten Mäusen erhöhte IL-13 und IL-10 Produktion, während
IL-17 nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Gestützt wird die protektive Funktion
auch durch Studien, in denen bei mit IL-13 vorbehandelten Mäusen ein Schutz vor
einer ischämieinduzierten intestinalen Entzündung beobachtet wurde74. In einer Studie
von Heller et al. wurde allerdings auch ein direkter Effekt des IL-13 auf die intestinale
Epithelfunktion gezeigt. Wie in der vorliegenden Arbeit auch wurde bei mit Oxazolon
behandelten Mäusen eine erhöhte IL-13 Produktion dokumentiert, wobei diese bei
Balb/c Mäusen niedriger ausfiel. Weiter ergab sich auch, dass IL-13 durch eine erhöhte
Expression von Claudin -2 die Permeabilität der intestinalen Epithelschranke erhöht.
Die nachfolgende Zellmigration zur Schließung des Epitheldefektes war ebenfalls unter
IL-13 vermindert114. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass IL-13 sowohl über
seinen direkten Einfluss auf die intestinale Epithelschranke als auch über seinen
indirekten Effekt in der Aktivierung antiinflammatorischer Zytokine eine wichtige Rolle in
der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmkrankheiten einnimmt. Dies wird auch
in einer Studie von Mannon et al. bei CU-Patienten deutlich, welche im Vergleich zu
MC- und Kontrollpatienten eine erhöhte Produktion von IL-13 aufwiesen. Bei einem
Therapieversuch von CU-Patienten mit Interferon β wurde bei Patienten, welche nicht
auf eine Therapie mit Interferon β ansprachen, keine Veränderung in ihrem IL-13
Spiegel beobachtet, während CU-Patienten, die auf eine Therapie mit Interferon β
ansprachen, eine signifikante Reduktion von IL-13 aufwiesen175.
5.4 Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen (NFATc1)
NFATc1 oder NFAT2 ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Aktivität durch die Calcium
abhängige Phosphatase Calcineurin reguliert wird und der an der Genexpression
bestimmter Interleukine wie etwa Interleukin 2 beteiligt ist 89. Bisher konnten 5
verschiedene Gene identifiziert werden167, die nach der entsprechenden Nomenklatur
von Hoey et al. als NFAT1-5 bezeichnet werden119. Diese Transkriptionsfaktoren sind
75
Diskussion
unter anderem an der Reifung des Immunsystems und schließlich der Aktivierung von
T-Zellen beteiligt. Weiter konnte eine Beteiligung von NFAT an der Organogenese des
Herzens150 sowie der Differenzierung von Adipozyten125 und Keratinozyten239
nachgewiesen werden. NFATc1 existiert in der phosphorylierten Form im Zytoplasma
und transloziert nach Dephosphorylierung durch Calcineurin in den Zellkern, wo es an
die
Promotorregion
diverser
Zytokine
wie
IL-2
bindet.
Dephosphorylierung ist ein intrazellulärer Anstieg der Ca
2+
Signal
für
die
123
Konzentration
. NFATc1
wird in nahezu allen Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems wie
Makrophagen, Mastzellen, dendritischen Zellen, NK-Zellen und B-Zellen exprimiert253.
Hierbei scheint NFAT besonders an der Regulation einer adäquaten Immunantwort
beteiligt zu sein. So konnte etwa gezeigt werden, dass in dendritischen Zellen die
Aktivierung des nukleären Faktors aktivierter T-Zellen über CD14 zur Ödembildung einem Schlüsselereignis im inflammatorischen Prozess - führt313. Außerdem ist NFAT
an antiinflammatorischen Signalwegen dendritischer Zellen beteiligt314 und kann über
eine Hochregulierung von IL-10 inflammatorische Prozesse hemmen106. Jedoch wurde
auch beobachtet, dass unter Aktivierung des NFAT-Signalweges in Makrophagen eine
durch vermehrte Expression von proinflammatorischen Zytokinen beschleunigte starke
Colitis im Mausmodell auftrat162. Gestützt wird diese Beobachtung auch durch eine
erhöhte NFATc1-Expression bei Patienten, welche an einer rheumatoiden Arthritis
litten309. Die Induktion von NFATc1 kann durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A
verhindert werden. So würde sich NFATc1 als prädiktiver Marker für ein Ansprechen
einer Cyclosporin A Therapie anbieten. Ebenso wäre NFATc1 als Monitoringparameter
einer Cyclosporin A Therapie denkbar. Hier konnte erst kürzlich in einer Studie von
Brandt et al. gezeigt werden, dass die NFATc1-Aktivitätsanalyse ein geeigneter
Parameter ist, um die bei Patienten individuell unterschiedliche Cyclosporin A
Pharmakodynamik abzuschätzen. In kombinierter Messung mit dem IL-2 scheint eine
individuelle Dosisfindung ebenfalls möglich31. In einer Studie von Shih et al. wurde eine
starke Assoziation zwischen NFATc1 Aktivität und CU-Krankheitsaktivität gefunden,
was die Möglichkeit, NFATc1 als prädiktiven Therapiefaktor zu verwenden, weiter
unterstreicht255. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls in der quantitativen PCR
Analyse
bei
CU-Patienten
eine
im
Vergleich
zu
MC-Patienten
erhöhte
NFATc1- Expression festgestellt, welche mit steigender Krankheitsaktivität stärker
ansteigt als bei MC-Patienten. Dies konnte durch die immunhistochemische Analyse
zwar
nicht
bestätigt
werden,
jedoch
wird
in
der
Literatur
die
alleinige
immunhistochemische NFATc1 Analyse als pädiktiver Marker einer Cyclosporin A
Therapie nicht eindeutig empfohlen275.
76
Diskussion
Sowohl die mit Cyclosporin A behandelten Balb/c Mäuse als auch die mit Cyclosporin A
behandelten C57BL/6 Mäuse zeigten im Vergleich zu den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten Mäusen eine geringere NFATc1-Expression in der quantitativen PCR
Analyse. Bei den C57BL/6 Mäusen konnte zudem eine signifikant niedrigere
NFATc1-Expression im nicht entzündeten Bereich gefunden werden. Der direkte
Proteinnachweis mittels Western Blot lieferte hier ähnliche Ergebnisse. In den
durchflusszytometrischen Untersuchungen konnten weiter die Ergebnisse von Brandt
et al. im vorliegenden Mausmodell bestätigt werden. Sowohl in Milzzellen als auch in
LP-Zellen wurde eine erhöhte IL-2 Konzentration bei den ausschließlich mit Oxazolon
behandelten C57BL/6 Mäusen im Vergleich zu den zusätzlich mit Cyclosporin
behandelten C57BL/6 Mäusen gefunden.
Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit könnte also auch NFATc1 als
zukünftiger klinischer Parameter einer Cyclosporin A Therapie in Frage kommen.
5.5 Cyclophilin A
Cyclophilin A ist eine Peptidyl Prolyl Isomerase (Ppia), welche an gebundenen
Proteinen durch Katalysieren einer cis-trans Konversion eine Konformitätsänderung
bewirkt104. Dadurch ist Cyclophilin A im Stande, andere Proteine zu blockieren und
nachgeschaltete Protein-Protein Interaktionen zu regulieren. So konnte in einer Studie
von Brazin et al. gezeigt werden, dass Cyclophilin A die für die T-Zellaktivierung
wichtige Kinase itk hemmt32. In der hier vorliegenden Untersuchung wurde bei itk
defizienten Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen eine signifikant niedrigere
Cyclophilin A-Expression beobachtet. Eine niedrige itk-Expression könnte demnach
über einen negativen Rückkopplungsmechanismus ebenfalls eine verminderte
Cyclophilin A Expresssion zur Folge haben. Cyclophilin A findet sich in hoher
Konzentration sowohl im Zytoplasma als auch besonders im Zellkern10. Die Aktiviät der
Peptidyl Prolyl Isomerase kann durch Binden des Immunsuppressivums Cyclosporin A
vermindert werden. Der Komplex aus Cyclophilin A und Cyclosporin A bindet an
Calcineurin, dessen Serin Threonin Phosphatase dadurch blockiert wird160. Somit ist
auch eine Dephosphorylierung von NFAT durch Calcineurin nicht mehr möglich222. Der
immunsuppressive Effekt von Cyclosporin A beruht folglich auf einer Hemmung von
Calcineurin und nicht auf einer Hemmung von Cyclophilin A. Dies wird auch durch eine
Studie von Colgan et al. gestützt, worin gezeigt werden konnte, dass Ppia -/- Mäuse
spontan eine Blepharitis mit erhöhtem Serum Immunglobulin E im Sinne einer
allergischen Reaktion entwickelten, welche sowohl mit einer erhöhten Produktion von
77
Diskussion
Th2 Interleukinen als auch einem erhöhten Serum IgE Spiegel assoziiert werden
konnte. Es wurde weiter vermutet, dass Cyclophilin A ähnlich Cyclosporin A einen
immunregulatorischen Effekt besitzt44. Diese Beobachtungen spiegeln sich auch in der
vorliegenden Arbeit wider. Balb/c Mäuse aus der Kontrollgruppe hatten sowohl im
Vergleich zu den mit Cyclosporin behandelten Mäusen als auch im Vergleich zu
unbehandelten
Kontrollmäusen
eine
signifikant
niedrigere
ppia-Expression.
Unbehandelte C57BL/6 Mäuse zeigten ebenfalls im Vergleich zu Mäusen der
Kontrollgruppe eine erhöhte ppia-Expression.
Allerdings konnte
bei Mäusen der
Kontrollgruppe ein Trend zu einer erhöhten ppia-Expression beobachtet werden.
Dieser Trend wird auch anhand der
Milzzellen
deutlich.
Eine
ppia-Expressionsanalyse
Beeinflussung
der
in LP -Zellen und
ppia-Expression
durch
den
unterschiedlichen genetischen Hintergrund kann folglich nicht ausgeschlossen werden.
In einer weiteren Studie von Colgan et al. wurde bei ppia -/- Mäusen eine erhöhte
Cyclosporin A Resistenz beobachtet. Außerdem wurde gezeigt, dass für die
Wirksamkeit von Cyclosporin A eine hohe Cyclophilin A Konzentration in der Zelle
vorhanden sein muss45. Dies konnte auch durch die vorliegende Arbeit bestätigt
werden, da sowohl unbehandelte Balb/c Kontrollmäuse als auch unbehandelte
C57BL /6 Kontrollmäuse eine signifikant höhere Cyclophilin A Konzentration aufwiesen.
Es sollte nicht unerwähnt bleiben, dass in der Studie von Colgan et al. auch vermutet
wurde, dass bei höheren Cyclosporin A Konzentrationen trotz ppia Defizienz eine
immunsuppressive Wirkung weiterhin vorhanden war. Dies legt den Verdacht nahe,
dass bei höheren Cyclosporin A Konzentrationen auch andere Cyclophiline wie etwa
Cyclophilin B über ein Binden von Cyclosporin A dessen immunsuppressive Wirkung
ermöglichen können6. Durch die zum einen hohe Expression von Cyclophilin A in jeder
Zelle und die zum anderen starke Bindungsaffinität zu Cyclosporin A könnte sich
Cyclophilin A als prädiktiver Marker für ein Ansprechen einer Cyclosporin A Therapie
eignen. In Bezug auf die Ergebnisse von Colgan et al. könnte eine niedrige
Cyclophilin
A-Expression
demnach
eine
mögliche
Cyclosporin
A
Resistenz
vorhersagen. In der vorliegenden Arbeit wurde im Gegensatz zum murinen Modell bei
Kontrollpatienten eine im Vergleich zu MC-und CU-Patienten signifikant erniedrigte
Cyclophilin A-Expression beobachtet. Dabei zeigten CU-Patienten mit mäßiger
Entzündung eine im Vergleich zu MC-Patienten mit mäßiger Entzündung signifikant
höhere Cyclophilin A-Expression. Insgesamt deuten die Ergebnisse aber auf eine
aktivitätsunabhängige Expression hin. Hierfür könnten aber auch - bedingt durch die
insgesamt hohe Expressionsstärke -
interindividuelle Unterschiede ursächlich sein.
Der direkte Proteinnachweis mittels Immunhistochemie zeigte ebenfalls eine signifikant
78
Diskussion
erhöhte Cyclophilin A-Expression bei MC- und CU-Patienten im Vergleich zu
Kontrollpatienten. Die Cyclophilin A-Expression bei CU-Patienten war dabei im
Vergleich zu MC-Patienten leicht höher. Diese Tatsache konnte in einer Studie von Kim
et al. ebenfalls beobachtet werden143.
5.6 Interleukin-2 induzierende T-Zell Kinase (itk)
Itk gehört zu der Familie der Tec Kinase und wird in zahlreichen Zellen des
Immunsystems, wie T-Zellen, Mastzellen und NK- Zellen, exprimiert18. Itk wird nach TZell Stimulation durch Phosphorylierung aktiviert117 und spielt über Aktivierung der
Phospholipase C eine wichtige Rolle in der T-Zell Antwort161. So konnte in Studien
nachgewiesen werden, dass zum einen itk defiziente CD4+ T-Zellen eine geringere
Th2 gerichtete Immunantwort zeigen82 und zum anderen itk defiziente Mäuse - bedingt
durch eine schwächere T-Zell Selektion im Thymus - eine geringere Anzahl peripherer
CD4+ T-Zellen aufweisen243. Dabei wurde beobachtet, dass die Th2 gerichtete
Immunantwort in itk defizienten CD4+ T-Zellen nicht nach einer primären Stimulation,
sondern erst nach einer erneuten Stimulation beeinträchtigt ist12, während die Th1
gerichtete Immunantwort nicht tangiert ist82. Auch in der hier vorliegenden Arbeit
zeigten itk defiziente Mäuse im Vergleich zu WT - Mäusen in CD4+ T-Zellen aus der
Milz eine geringere Zytokinkonzentration in den für die Th2 gerichteten Immunantwort
wichtigen Effektorzytokinen IL-2 und IL-4. Erwähnenswert ist gleichzeitig aber auch,
dass die Expression der Zytokine IL-5 und IL-13 in LP-Zellen bei itk defizienten
Mäusen höher war als in LP-Zellen von WT- Mäusen. Weiter wurden in Studien bei itk
defizienten Mäusen ein fast vollständiges Fehlen von NK-Zellen88 sowie eine
verminderte Degranulation von Mastzellen nachgewiesen81. Aus diesen Gründen
müssten itk defiziente Mäuse eine Resistenz gegen durch Allergene induzierte
Krankheitsbilder aufweisen. In einer Studie von Ferrara et al. konnte demnach bei itk
defizienten Mäusen im Asthma Modell eine verminderte bronchiale Hyperreagibilität
nachgewiesen werden75. Infolgedessen sollten itk-defiziente Mäuse im Oxazolon
induzierten Colitismodell protektiert sein. In der vorliegenden Arbeit konnte schließlich
gezeigt werden, dass itk defiziente Mäuse im Vergleich zu WT- Mäusen tatsächlich
sowohl einen signifikant geringeren Entzündungsscore als auch einen signifikant
geringeren histopathologischen Score aufweisen. Ein protektiver Einfluss von
Cyclosporin A bei itk defizienten Mäusen konnte hier allerdings nicht nachgewiesen
werden. In einer Studie von Bachmann et al. wurde zwar gezeigt, dass itk defiziente
Mäuse für virale Infektionen anfälliger sind14, jedoch wurde auch in der hier
79
Diskussion
vorliegenden Arbeit bei itk defizienten Mäusen selbst in nicht keimfreier Aufzucht keine
verminderte Lebenszeit oder Einschränkung der Fertilität festgestellt. Daraus lässt sich
schließen, dass eine vollständige itk Defizienz mit Vitalität einhergeht. Dies eröffnet die
Möglichkeit
zur
Entwicklung
neuer
zielgerichteter
Therapiestrategien
gegen
inflammatorische Erkrankungen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Rolle
von itk im Colitis Modell mit Mäusen von unterschiedlichem genetischem Hintergrund
näher untersucht. So konnte zwar für die mit Cyclosporin A behandelten Balb/c Mäuse
im Vergleich zu den mit Oxazolon behandelten Kontrollmäusen
eine signifikant
niedrigere itk-Expression beobachtet werden, jedoch war es nicht möglich, diese
Beobachtung bei C57BL/6 Mäusen nachzuweisen. Dennoch zeigte sich hier bei den
mit Oxazolon behandelten Kontrollmäusen eine signifikant geringere itk-Expression im
nicht entzündeten Bereich des Kolons. Bei den mit Cyclosporin A behandelten C57BL/6
Mäusen war die itk-Expression im nicht entzündeten Kolonbereich nicht signifikant
erniedrigt. Dagegen zeigte die
weitere Analyse der CD4+ T-Zellen aus Milz- und
Epithelzellen bei den mit Cyclosporin A behandelten C57BL/6 Mäusen im Gegensatz
zu den eben erwähnten Ergebnissen eine leicht niedrigere itk-Expression. Diese
Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass zum einen der genetische
Hintergrund hinsichtlich einer Th1 oder Th2 gerichteten Immunantwort und zum
anderen die variable Anzahl an unterschiedlichen Zellpopulationen einen Einfluss auf
die itk-Expression haben. Dies würde bedeuten, dass eine Therapie mit
itk -
Inhibitoren bei Th2 gerichteten T-Zell dominierten Immunerkrankungen wie der Colitis
ulcerosa durchaus Erfolg versprechend sein könnte. Gestützt wird diese These durch
Beobachtungen des in dieser Arbeit vorliegenden Patientenkollektivs. So konnte in der
quantitativen PCR bei CU-Patienten eine mit dem Entzündungsgrad annähernd linear
ansteigende itk-Expression beobachtet werden, welche bei einem hohen und mittleren
Entzündungsgrad auch im Vergleich zu Kontrollpatienten signifikant erhöht war. MCPatienten hatten zwar ebenfalls bei einem mittleren und hohen Entzündungsgrad im
Vergleich zu Kontrollpatienten eine signifikant erhöhte itk-Expression, allerdings zeigte
sich die höchste itk-Expression bereits bei einem mittleren Entzündungsgrad. Die
Analyse
der
Proteinexpression
mittels
Immunhistochemie
ergab
sowohl
bei
MC-Patienten als auch bei CU-Patienten eine im Vergleich zu Kontrollpatienten
signifikant höhere itk-Expression. Hier konnte aber zudem auch bei CU-Patienten eine
im Vergleich zu MC-Patienten signifikant erhöhte
itk-Expression nachgewiesen
werden. CU-Patienten könnten also von einer itk inhibierenden Therapie profitieren.
Itk-Mutationen bei Menschen wurden in Studien mit einer erhöhten Suszeptibilität für
schwer verlaufende Ebstein-Barr Virus Infektionen in Verbindung gebracht128.
80
Diskussion
Außerdem scheint itk eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der HIV Infektion zu
spielen223. In einer Studie von Hussain et al. fand man aber bislang nur bei sehr
wenigen Patienten itk-Mutationen131. Dementsprechend befindet sich die Entwicklung
selektiver itk-Inhibitoren bisher erst im Anfangsstadium292. Durch das breite
Anwendungsgebiet
bei
Autoimmunerkrankungen
könnten
sich
aber
selektive
itk- Inhibitoren als vielversprechende Therapieansätze erweisen.
5.7 Vav1
Vav1 ist ein 95-kD großes Protoonkogen, welches erstmals durch seine Beteiligung an
der Transformation von Fibroblasten entdeckt wurde142. Zusammen mit den bisher
isolierten Proteinen vav2 und vav3 gehört es zu der Familie der vav-Proteine249,193.
Diese Proteinfamilie trägt über eine homologe Domäne einen GTP Austauschfaktor,
welcher nachfolgend im Stande ist, Rho-GTPasen zu aktivieren3. Während vav2 und
vav3 ubiquitär exprimiert werden249,193, wird vav1 hauptsächlich in hämatopoetischen
Zellen exprimiert142. Dabei scheint vav1 im gleichen Maße wie itk auch entscheidend
sowohl an der T-Zell Differenzierung als auch an der T-Zell Aktivierung beteiligt zu sein.
So wird vav1 genau wie itk auch nach Stimulation von T-Zellen über Phosphorylierung
aktiviert52,117. Weiter präsentieren vav1 defiziente Mäuse einen ähnlichen Phänotyp wie
itk defiziente Mäuse285,155. So ergab sich, dass zum einen vav1 defiziente Mäuse eine
verminderte Anzahl peripherer T-Zellen besitzen, zum anderen vav1 defiziente T-Zellen
nach Stimulation eine starke Reduktion der Proliferation und Zytokinproduktion
zeigen273. Dies konnte nur bei vav1 defizienten Zellen beobachtet werden; vav2 oder
vav3 defiziente Mäuse hatten eine normale T-Zell Differenzierung84. Allerdings muss
hier auch erwähnt werden, dass Mäuse, welche defizient für alle drei vav-Proteine sind,
eine nahezu vollständige Reduktion peripherer T-Zellen zeigen, was für einen
Kompensationsmechanismus durch die Proteine vav2 und vav3 sprechen könnte84.
Der entscheidende Faktor für die T-Zell Antwort scheint aber vav1 zu sein. Die
Ähnlichkeit von vav1 mit der Kinase itk legt zudem die Vermutung nahe, dass im
Colitismodell ähnliche Ergebnisse für vav1 wie für itk beobachtet werden. In der
vorliegenden Arbeit ergab sich, dass sowohl mit Cyclosporin A behandelte Balb/c
Mäuse als auch mit Cyclosporin A behandelte C57BL/6 Mäuse eine niedrigere
vav1- Expression hatten. Es war zudem sowohl bei den mit Cyclosporin A behandelten
C57BL/6 Mäusen als auch bei den mit Oxazolon behandelten C57BL/6 Kontrollmäusen
eine signifikant erhöhte vav1-Expression im entzündeten Bereich des Kolons im
Vergleich zum nicht entzündeten Bereich des Kolons zu beobachten. Die
81
Diskussion
vav1- Expression im entzündeten Kolonbereich war bei den Mäusen im Colitismodell
insgesamt höher als bei unbehandelten C57BL/6 Mäusen. Die alleinige Gabe von
Cyclosporin A hatte dabei nur geringe Auswirkungen auf die vav1-Expression. Diese
Ergebnisse konnten auch in der vav1-Expressionsanalyse von CD4+ T-Zellen aus Milzund Epithelzellen bestätigt werden. Der direkte Proteinnachweis mittels Western Blot
konnte die quantitativen PCR Ergebnisse ebenfalls verifizieren. Zu beobachten war
aber auch, dass die Höhe der vav1-Expression stark vom Entzündungsscore der
Mäuse abhängt und bei massiv entzündeten Mäusen stärker ansteigt. Ausgehend von
dieser Analyse wurden die Mäuse anhand ihres Entzündungsgrads in drei
verschiedene Gruppen eingeteilt. Ein Score ≤ 5 wurde dabei als niedrig, ein Score
zwischen 6-9,5 als mittel und ein Score ≥ 10 als hoch definiert. So zeigte sich bei
einem mittleren Entzündungsscore der mit Oxazolon behandelten Kontrollmäuse noch
keine unterschiedliche vav1-Expression im Vergleich zu den mit Cyclosporin A
behandelten Mäusen mit niedrigem Entzündungsscore. Dagegen hatten mit Oxazolon
behandelte Kontrollmäuse, welche einen starken Entzündungsscore aufwiesen, eine
signifikant höhere vav1-Expression als mit Cyclosporin A behandelte Mäuse, welche
einen niedrigen Entzündungsscore hatten. Vav1 kann folglich durch Cyclosporin A
supprimiert werden. Außerdem scheint vav1 erst bei sehr starken Entzündungen stark
exprimiert zu werden. Diese Schlussfolgerungen sollten sich schließlich auch bei den
vav1 Analysen im Patientenkollektiv bestätigen. Sowohl bei MC-Patienten als auch bei
CU- Patienten konnte im Vergleich zu Kontrollpatienten eine signifikant erhöhte
vav1-Expression festgestellt werden. Außerdem zeigte sich bei CU-Patienten im
Vergleich zu MC-Patienten eine mit dem Entzündungsscore insgesamt stärker
ansteigende
vav1-Expression.
So
hatten
CU-Patienten
mit
einem
hohen
Entzündungsscore eine im Vergleich zu CU-Patienten in Remission signifikant erhöhte
vav1-Expression.
In
der
nachfolgenden
immunhistochemischen
vav1-Analyse
bestätigte sich, dass sowohl bei MC-Patienten als auch bei CU-Patienten eine
signifikant erhöhte vav1-Expression zu beobachten war.
Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass vav1 genau wie die Kinase
itk auch bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vermehrt
exprimiert wird. Der Zusammenhang zwischen vav1 und der Kinase itk ist allerdings
bislang noch nicht völlig geklärt. Zwar wurde in einer Studie von Finkelstein et al. in itk
defizienten Zellen eine normale Phosphorylierung von vav1 nachgewiesen77, allerdings
konnte in einer Studie von Dombroski et al. auch gezeigt werden, dass in itk
defizienten T-Zellen die vav1 Rekrutierung und die daraus resultierende T-Zell Rezeptor induzierte Actin- Polymerisierung der T-Zellen vermindert sind60. In der hier
82
Diskussion
vorliegenden Arbeit wurde bei itk defizienten Mäusen eine stark erniedrigte
vav1-Expression gemessen. Diese war bei den mit Oxazolon behandelten itk
defizienten
Mäusen
sogar
signifikant
niedriger
als
bei
den
unbehandelten
Kontrollmäusen. Interessanterweise war die vav1-Expression bei itk defizienten
Mäusen, welche zusätzlich mit Cyclosporin A behandelt wurden, signifikant niedriger
als bei itk defizienten Mäusen, die nur mit Oxazolon behandelt wurden. Diese
Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass die vav1-Expression zwar durch eine itk
Defizienz stark supprimiert wird, aber zusätzlich noch von anderen, durch Cyclosporin
A beeinflussten Proteinen, wie etwa NFATc1 oder Cyclophilin A, abzuhängen scheint.
So konnte in einer Studie von Wu et al. gezeigt werden, dass eine starke
vav1- Expression indirekt die Aktivierung von NFATc1 induzieren kann305. Da aber die
vav1-Expression durch eine Hemmung von itk am stärksten beeinflusst werden kann,
würde eine Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen mit selektiven itk–
Inhibitoren auch die vav1-Expression beeinflussen.
5.8 Resümee
Der Einsatz von Cyclosporin A in der Therapie der chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen hat sich vor allem für schwere Schübe bei CU-Patienten
bewährt120. Bedingt durch die schweren Nebenwirkungen einer Cyclosporin A Therapie
ergibt sich die Notwendigkeit, eventuelle Non-Responder noch vor einer Cyclosporin A
Gabe zu entdecken, wodurch ein unnötiges Verzögern von rettenden chirurgischen
Maßnahmen verhindert werden könnte. So würde sich zum Beispiel die Bestimmung
von Cyclophilin A oder NFATc1 als prädiktiver Marker für ein Ansprechen einer
Cyclosporin A Therapie eignen45,31.
Das Zusammenspiel der durch Cyclosporin A beeinflussten Faktoren ist insgesamt
sehr komplex. Allein bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Faktoren wurden
zahlreiche Wechselwirkungen beschrieben. So konnte in Studien etwa gezeigt werden,
dass itk über einen Kinase unabhängigen Weg vermehrt das Protoonkogen vav1
rekrutieren kann60. Vav1 wiederum scheint die Aktivität von NFATc1 induzieren zu
können305. Die DNA Bindungsaffinität von NFATc1 kann durch ein Fehlen von
Cyclophilin A stark erhöht werden44. Cyclophilin A wiederum kann die itk Aktivität
hemmen32.
Eine
niedrige
t-bet-Expression einher
itk-Expression
geht
dagegen
mit
einer
erhöhten
182
.
Die genaue Untersuchung dieses Wechselspiels wird in Zukunft auch zu einer
zielgerichteteren Therapie von chronisch entzündlichen Erkrankungen führen. In der
hier vorliegenden Arbeit konnte die Hemmung der T-Zell Kinase itk als ein mögliches
83
Diskussion
neues Therapieziel bekräftigt werden292. Ob die hoffnungsvollen Ergebnisse aus dem
murinen Modell auch einen wirklichen Vorteil für die Patienten bringen werden, müssen
weitere klinische Studien zeigen.
84
Literaturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
1
HUGO Gene Nomenclature Committee Home Page | HUGO Gene Nomenclature
Committee. Im Internet: http://www.genenames.org/; Stand: 04.06.2012
2
Abdelrazeq AS, Wilson TR, Leitch DL, Lund JN, Leveson SH. Ileitis in ulcerative
colitis: is it a backwash? Dis Colon Rectum 2005; 48: 2038–2046
3
Adams JM, Houston H, Allen J, Lints T, Harvey R. The hematopoietically expressed
vav proto-oncogene shares homology with the dbl GDP-GTP exchange factor, the
bcr gene and a yeast gene (CDC24) involved in cytoskeletal organization.
Oncogene 1992; 7: 611–618
4
Aggarwal S, Ghilardi N, Xie M, Sauvage FJ de, Gurney AL. Interleukin-23
promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of
interleukin-17. J Biol Chem 2003; 278: 1910–1914
5
Ahmad T, Armuzzi A, Neville M, Bunce M, Ling K, Welsh KI, Marshall SE, Jewell
DP. The contribution of human leucocyte antigen complex genes to disease
phenotype in ulcerative colitis. Tissue Antigens 2003; 62: 527–535
6
Allain F, Denys A, Spik G. Cyclophilin B mediates cyclosporin A incorporation in
human blood T-lymphocytes through the specific binding of complexed drug to the
cell surface. Biochem J 1996; 317 ( Pt 2): 565–570
7
Andersson RE, Olaison G, Tysk C, Ekbom A. Appendectomy is followed by
increased risk of Crohn's disease. Gastroenterology 2003; 124: 40–46
8
Andrus L, Lafferty KJ. Inhibition of T-cell activity by cyclosporin A. Scand J Immunol
1981; 15: 449–458
9
Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, Maggi L, Liotta F, Mazzinghi B, Parente E,
Fili L, Ferri S, Frosali F, Giudici F, Romagnani P, Parronchi P, Tonelli F, Maggi E,
Romagnani S. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med
2007; 204: 1849–1861
10 Arevalo-Rodriguez M, Heitman J. Cyclophilin A is localized to the nucleus and
controls meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell 2005; 4: 17–29
11 Arts J, D'Haens G, Zeegers M, van Assche G, Hiele M, D'Hoore A, Penninckx F,
Vermeire S, Rutgeerts P. Long-term outcome of treatment with intravenous
cyclosporin in patients with severe ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 2004; 10:
73–78
12 Au-Yeung BB, Katzman SD, Fowell DJ. Cutting edge: Itk-dependent signals
required for CD4+ T cells to exert, but not gain, Th2 effector function. J Immunol
2006; 176: 3895–3899
85
Literaturverzeichnis
13 Avni O, Lee D, Macian F, Szabo SJ, Glimcher LH, Rao A. T(H) cell differentiation is
accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat
Immunol 2002; 3: 643–651
14 Bachmann MF, Littman DR, Liao XC. Antiviral immune responses in Itk-deficient
mice. J Virol 1997; 71: 7253–7257
15 Bamias G, Martin C, Mishina M, Ross WG, Rivera-Nieves J, Marini M, Cominelli F.
Proinflammatory effects of TH2 cytokines in a murine model of chronic small
intestinal inflammation. Gastroenterology 2005; 128: 654–666
16 Bancroft AJ, McKenzie AN, Grencis RK. A critical role for IL-13 in resistance to
intestinal nematode infection. J Immunol 1998; 160: 3453–3461
17 Baumgart DC, Sandborn WJ. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and
established and evolving therapies. Lancet 2007; 369: 1641–1657
18 Berg LJ, Finkelstein LD, Lucas JA, Schwartzberg PL. Tec family kinases in T
lymphocyte development and function. Annu Rev Immunol 2005; 23: 549–600
19 Bernal I, Manosa M, Domenech E, Garcia-Planella E, Navarro M, Lorenzo-Zuniga
V, Cabre E, Gassull MA. Predictors of clinical response to systemic steroids in
active ulcerative colitis. Dig Dis Sci 2006; 51: 1434–1438
20 Bernstein CN, Blanchard JF, Kliewer E, Wajda A. Cancer risk in patients with
inflammatory bowel disease: a population-based study. Cancer 2001; 91: 854–862
21 Bernstein CN, Blanchard JF, Rawsthorne P, Yu N. The prevalence of extraintestinal
diseases in inflammatory bowel disease: a population-based study. Am J
Gastroenterol 2001; 96: 1116–1122
22 Bernstein CN, Shanahan F. Cyclosporine and inflammatory bowel disease: still
more questions. Gastroenterology 1995; 108: 943–945
23 Best WR, Becktel JM, Singleton JW, Kern F, JR. Development of a Crohn's disease
activity index. National Cooperative Crohn's Disease Study. Gastroenterology
1976; 70: 439–444
24 Binder V. Genetic epidemiology in inflammatory bowel disease. Dig Dis 1998; 16:
351–355
25 Bistrup C, Nielsen FT, Jeppesen UE, Dieperink H. Effect of grapefruit juice on
Sandimmun Neoral absorption among stable renal allograft recipients. Nephrol Dial
Transplant 2001; 16: 373–377
26 Boirivant M, Fuss IJ, Chu A, Strober W. Oxazolone colitis: A murine model of T
helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. J Exp Med 1998;
188: 1929–1939
27 Borel JF. History of the discovery of cyclosporin and of its early pharmacological
86
Literaturverzeichnis
development. Wien Klin Wochenschr 2002; 114: 433–437
28 Borel JF, Feurer C, Gubler HU, Stahelin H. Biological effects of cyclosporin A: a
new antilymphocytic agent. Agents Actions 1976; 6: 468–475
29 Borel JF, Feurer C, Magnee C, Stahelin H. Effects of the new anti-lymphocytic
peptide cyclosporin A in animals. Immunology 1977; 32: 1017–1025
30 Boyko EJ, Perera DR, Koepsell TD, Keane EM, Inui TS. Effects of cigarette
smoking on the clinical course of ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol 1988; 23:
1147–1152
31 Brandt C, Liman P, Bendfeldt H, Mueller K, Reinke P, Radbruch A, Worm M,
Baumgrass R. Whole blood flow cytometric measurement of NFATc1 and IL-2
expression to analyze cyclosporine A-mediated effects in T cells. Cytometry A
2010; 77: 607–613
32 Brazin KN, Mallis RJ, Fulton DB, Andreotti AH. Regulation of the tyrosine kinase Itk
by the peptidyl-prolyl isomerase cyclophilin A. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:
1899–1904
33 Bretscher PA, Havele C. Cyclosporin A can switch the immune response induced
by antigen from a humoral to a cell-mediated mode. Eur J Immunol 1992; 22: 349–
355
34 Bull TJ, McMinn EJ, Sidi-Boumedine K, Skull A, Durkin D, Neild P, Rhodes G,
Pickup R, Hermon-Taylor J. Detection and verification of Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from
individuals with and without Crohn's disease. J Clin Microbiol 2003; 41: 2915–2923
35 Busauschina A, Schnuelle P, van der Woude FJ. Cyclosporine nephrotoxicity.
Transplant Proc 2004; 36: 229S-233S
36 Bushley KE, Raja R, Jaiswal P, Cumbie JS, Nonogaki M, Boyd AE, Owensby CA,
Knaus BJ, Elser J, Miller D, Di Y, McPhail KL, Spatafora JW. The Genome of
Tolypocladium inflatum: Evolution, Organization, and Expression of the Cyclosporin
Biosynthetic Gene Cluster. PLoS Genet 2013; 9: e1003496
37 Cacheux W, Seksik P, Lemann M, Marteau P, Nion-Larmurier I, Afchain P, Daniel F,
Beaugerie L, Cosnes J. Predictive factors of response to cyclosporine in steroidrefractory ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 2008; 103: 637–642
38 Campbell S, Travis S, Jewell D. Ciclosporin use in acute ulcerative colitis: a longterm experience. Eur J Gastroenterol Hepatol 2005; 17: 79–84
39 Canavan C, Abrams KR, Mayberry JF. Meta-analysis: mortality in Crohn's disease.
Aliment Pharmacol Ther 2007; 25: 861–870
40 Cario E, Podolsky DK. Differential Alteration in Intestinal Epithelial Cell Expression
87
Literaturverzeichnis
of Toll-Like Receptor 3 (TLR3) and TLR4 in Inflammatory Bowel Disease. Infection
and Immunity 2000; 68: 7010–7017
41 Chamaillard M, Hashimoto M, Horie Y, Masumoto J, Qiu S, Saab L, Ogura Y,
Kawasaki A, Fukase K, Kusumoto S, Valvano MA, Foster SJ, Mak TW, Nuñez G,
Inohara N. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan
containing diaminopimelic acid. Nat Immunol 2003; 4: 702–707
42 Chung YW, Oh TH, Chung SK. The effect of topical cyclosporine 0.05% on dry eye
after cataract surgery. Korean J Ophthalmol 2013; 27: 167–171
43 Cirillo R, Triggiani M, Siri L, Ciccarelli A, Pettit GR, Condorelli M, Marone G.
Cyclosporin A rapidly inhibits mediator release from human basophils presumably
by interacting with cyclophilin. J Immunol 1990; 144: 3891–3897
44 Colgan J, Asmal M, Neagu M, Yu B, Schneidkraut J, Lee Y, Sokolskaja E, Andreotti
A, Luban J. Cyclophilin A regulates TCR signal strength in CD4+ T cells via a
proline-directed conformational switch in Itk. Immunity 2004; 21: 189–201
45 Colgan J, Asmal M, Yu B, Luban J. Cyclophilin A-deficient mice are resistant to
immunosuppression by cyclosporine. J Immunol 2005; 174: 6030–6038
46 Cong Y, Weaver CT, Lazenby A, Elson CO. Bacterial-reactive T regulatory cells
inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. J Immunol 2002; 169:
6112–6119
47 Cosnes J, Beaugerie L, Carbonnel F, Gendre JP. Smoking cessation and the
course of Crohn's disease: an intervention study. Gastroenterology 2001; 120:
1093–1099
48 Cosnes J, Carbonnel F, Beaugerie L, Le Quintrec Y, Gendre JP. Effects of cigarette
smoking on the long-term course of Crohn's disease. Gastroenterology 1996; 110:
424–431
49 Cosnes J, Carbonnel F, Carrat F, Beaugerie L, Cattan S, Gendre J. Effects of
current and former cigarette smoking on the clinical course of Crohn's disease.
Aliment Pharmacol Ther 1999; 13: 1403–1411
50 Cosnes J, Cattan S, Blain A, Beaugerie L, Carbonnel F, Parc R, Gendre J. Longterm evolution of disease behavior of Crohn's disease. Inflamm Bowel Dis 2002; 8:
244–250
51 Crabtree GR. Generic signals and specific outcomes: signaling through Ca2+,
calcineurin, and NF-AT. Cell 1999; 96: 611–614
52 Crespo P, Schuebel KE, Ostrom AA, Gutkind JS, Bustelo XR. Phosphotyrosinedependent activation of Rac-1 GDP/GTP exchange by the vav proto-oncogene
product. Nature 1997; 385: 169–172
88
Literaturverzeichnis
53 Csongei V, Jaromi L, Safrany E, Sipeky C, Magyari L, Farago B, Bene J, Polgar N,
Lakner L, Sarlos P, Varga M, Melegh B. Interaction of the major inflammatory bowel
disease susceptibility alleles in Crohn's disease patients. World J Gastroenterol
2010; 16: 176–183
54 Darfeuille-Michaud A, Boudeau J, Bulois P, Neut C, Glasser A, Barnich N, Bringer
M, Swidsinski A, Beaugerie L, Colombel J. High prevalence of adherent-invasive
Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology
2004; 127: 412–421
55 Davis RL, Kramarz P, Bohlke K, Benson P, Thompson RS, Mullooly J, Black S,
Shinefield H, Lewis E, Ward J, Marcy SM, Eriksen E, Destefano F, Chen R.
Measles-mumps-rubella and other measles-containing vaccines do not increase
the risk for inflammatory bowel disease: a case-control study from the Vaccine
Safety Datalink project. Arch Pediatr Adolesc Med 2001; 155: 354–359
56 Defendenti C, Sarzi-Puttini P, Grosso S, Croce A, Senesi O, Saibeni S, Bollani S,
Almasio PL, Bruno S, Atzeni F. B lymphocyte intestinal homing in inflammatory
bowel disease. BMC Immunol 2011; 12: 71
57 D'Haens G, Lemmens L, Geboes K, Vandeputte L, van Acker F, Mortelmans L,
Peeters M, Vermeire S, Penninckx F, Nevens F, Hiele M, Rutgeerts P. Intravenous
cyclosporine versus intravenous corticosteroids as single therapy for severe
attacks of ulcerative colitis. Gastroenterology 2001; 120: 1323–1329
58 D'Haens G, Sandborn WJ, Feagan BG, Geboes K, Hanauer SB, Irvine EJ, Lemann
M, Marteau P, Rutgeerts P, Scholmerich J, Sutherland LR. A review of activity
indices and efficacy end points for clinical trials of medical therapy in adults with
ulcerative colitis. Gastroenterology 2007; 132: 763–786
59 Dignass A, Preiss JC, Aust DE, Autschbach F, Ballauff A, Barretton G, Bokemeyer
B, Fichtner-Feigl S, Hagel S, Herrlinger KR, Jantschek G, Kroesen A, Kruis W,
Kucharzik T, Langhorst J, Reinshagen M, Rogler G, Schleiermacher D, Schmidt C,
Schreiber S, Schulze H, Stange E, Zeitz M, Hoffmann JC, Stallmach A. Updated
German guideline on diagnosis and treatment of ulcerative colitis, 2011. Z
Gastroenterol 2011; 49: 1276–1341
60 Dombroski D, Houghtling RA, Labno CM, Precht P, Takesono A, Caplen NJ,
Billadeau DD, Wange RL, Burkhardt JK, Schwartzberg PL. Kinase-independent
functions for Itk in TCR-induced regulation of Vav and the actin cytoskeleton. J
Immunol 2005; 174: 1385–1392
61 Dos Reis GA, Shevach EM. Effect of cyclosporin A on T cell function in vitro: the
mechanism of suppression of T cell proliferation depends on the nature of the T cell
89
Literaturverzeichnis
stimulus as well as the differentiation state of the responding T cell. J Immunol
1982; 129: 2360–2367
62 Duchmann R, Kaiser I, Hermann E, Mayet W, Ewe K, Zum Meyer Buschenfelde
KH. Tolerance exists towards resident intestinal flora but is broken in active
inflammatory bowel disease (IBD). Clin Exp Immunol 1995; 102: 448–455
63 Duerr R, Taylor K, Brant S, Rioux J, Silverberg M, Daly M, Steinhart A, Abraham C,
Regueiro M, Griffiths A, Dassopoulos T, Bitton A, Yang H, Targan S, Datta L,
Kistner E, Schumm L, Lee A, Gregersen P, Barmada M, Rotter J, Nicolae D, Cho J.
A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel
disease gene. Science 2006; 314: 1461–1463
64 Duricova D, Pedersen N, Elkjaer M, Gamborg M, Munkholm P, Jess T. Overall and
cause-specific mortality in Crohn's disease: a meta-analysis of population-based
studies. Inflamm Bowel Dis 2010; 16: 347–353
65 Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative
colitis: a meta-analysis. Gut 2001; 48: 526–535
66 Egan LJ, Sandborn WJ, Tremaine WJ. Clinical outcome following treatment of
refractory inflammatory and fistulizing Crohn's disease with intravenous
cyclosporine. Am J Gastroenterol 1998; 93: 442–448
67 Ekbom A, Adami HO, Helmick CG, Jonzon A, Zack MM. Perinatal risk factors for
inflammatory bowel disease: a case-control study. Am J Epidemiol 1990; 132:
1111–1119
68 Ekbom A, Helmick C, Zack M, Adami HO. Increased risk of large-bowel cancer in
Crohn's disease with colonic involvement. Lancet 1990; 336: 357–359
69 Ekbom A, Helmick C, Zack M, Adami HO. Extracolonic malignancies in
inflammatory bowel disease. Cancer 1991; 67: 2015–2019
70 Ekstrom GM. Oxazolone-induced colitis in rats: effects of budesonide, cyclosporin
A, and 5-aminosalicylic acid. Scand J Gastroenterol 1998; 33: 174–179
71 Elson CO, Sartor RB, Tennyson GS, Riddell RH. Experimental models of
inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1995; 109: 1344–1367
72 Engel MA, Kellermann CA, Burnat G, Hahn EG, Rau T, Konturek PC. Mice lacking
cannabinoid CB1-, CB2-receptors or both receptors show increased susceptibility
to trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis. J Physiol Pharmacol 2010;
61: 89–97
73 Faerber L, Braeutigam M, Weidinger G, Mrowietz U, Christophers E, Schulze HJ,
Mahrle G, Meffert H, Drechsler S. Cyclosporine in severe psoriasis. Results of a
meta-analysis in 579 patients. Am J Clin Dermatol 2001; 2: 41–47
90
Literaturverzeichnis
74 Farmer DG, Ke B, Shen X, Kaldas FM, Gao F, Watson MJ, Busuttil RW, KupiecWeglinski JW. Interleukin-13 protects mouse intestine from ischemia and
reperfusion injury through regulation of innate and adaptive immunity.
Transplantation 2011; 91: 737–743
75 Ferrara TJ, Mueller C, Sahu N, Ben-Jebria A, August A. Reduced airway
hyperresponsiveness and tracheal responses during allergic asthma in mice
lacking tyrosine kinase inducible T-cell kinase. J Allergy Clin Immunol 2006; 117:
780–786
76 Fina D, Sarra M, Caruso R, Del Vecchio Blanco G, Pallone F, MacDonald TT,
Monteleone G. Interleukin 21 contributes to the mucosal T helper cell type 1
response in coeliac disease. Gut 2008; 57: 887–892
77 Finkelstein LD, Shimizu Y, Schwartzberg PL. Tec kinases regulate TCR-mediated
recruitment of signaling molecules and integrin-dependent cell adhesion. J
Immunol 2005; 175: 5923–5930
78 Finnie IA, Campbell BJ, Taylor BA, Milton JD, Sadek SK, Yu LG, Rhodes JM.
Stimulation of colonic mucin synthesis by corticosteroids and nicotine. Clin Sci
(Lond) 1996; 91: 359–364
79 Fisher SA, Hampe J, Macpherson AJS, Forbes A, Lennard-Jones JE, Schreiber S,
Curran ME, Mathew CG, Lewis CM. Sex stratification of an inflammatory bowel
disease genome search shows male-specific linkage to the HLA region of
chromosome 6. Eur J Hum Genet 2002; 10: 259–265
80 Ford AC, Moayyedi P, Hanauer SB. Ulcerative colitis. BMJ 2013; 346: f432
81 Forssell J, Sideras P, Eriksson C, Malm-Erjefalt M, Rydell-Tormanen K, Ericsson P,
Erjefalt JS. Interleukin-2-inducible T cell kinase regulates mast cell degranulation
and acute allergic responses. Am J Respir Cell Mol Biol 2005; 32: 511–520
82 Fowell DJ, Shinkai K, Liao XC, Beebe AM, Coffman RL, Littman DR, Locksley RM.
Impaired NFATc translocation and failure of Th2 development in Itk-deficient CD4+
T cells. Immunity 1999; 11: 399–409
83 Fricker G, Drewe J, Huwyler J, Gutmann H, Beglinger C. Relevance of pglycoprotein for the enteral absorption of cyclosporin A: in vitro-in vivo correlation.
Br J Pharmacol 1996; 118: 1841–1847
84 Fujikawa K, Miletic AV, Alt FW, Faccio R, Brown T, Hoog J, Fredericks J, Nishi S,
Mildiner S, Moores SL, Brugge J, Rosen FS, Swat W. Vav1/2/3-null mice define an
essential role for Vav family proteins in lymphocyte development and activation but
a differential requirement in MAPK signaling in T and B cells. J Exp Med 2003; 198:
1595–1608
91
Literaturverzeichnis
85 Fujino S, Andoh A, Bamba S, Ogawa A, Hata K, Araki Y, Bamba T, Fujiyama Y.
Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease. Gut 2003;
52: 65–70
86 Fujita N, Itoh T, Omori H, Fukuda M, Noda T, Yoshimori T. The Atg16L complex
specifies the site of LC3 lipidation for membrane biogenesis in autophagy. Mol Biol
Cell 2008; 19: 2092–2100
87 Fuss IJ, Heller F, Boirivant M, Leon F, Yoshida M, Fichtner-Feigl S, Yang Z, Exley
M, Kitani A, Blumberg RS, Mannon P, Strober W. Nonclassical CD1d-restricted NK
T cells that produce IL-13 characterize an atypical Th2 response in ulcerative
colitis. J Clin Invest 2004; 113: 1490–1497
88 Gadue P, Stein PL. NK T cell precursors exhibit differential cytokine regulation and
require Itk for efficient maturation. J Immunol 2002; 169: 2397–2406
89 Garcia-Cozar FJ, Okamura H, Aramburu JF, Shaw KT, Pelletier L, Showalter R,
Villafranca E, Rao A. Two-site interaction of nuclear factor of activated T cells with
activated calcineurin. J Biol Chem 1998; 273: 23877–23883
90 Garrett WS, Punit S, Gallini CA, Michaud M, Zhang D, Sigrist KS, Lord GM,
Glickman JN, Glimcher LH. Colitis-associated colorectal cancer driven by T-bet
deficiency in dendritic cells. Cancer Cell 2009; 16: 208–219
91 Gasche C, Scholmerich J, Brynskov J, D'Haens G, Hanauer SB, Irvine EJ, Jewell
DP, Rachmilewitz D, Sachar DB, Sandborn WJ, Sutherland LR. A simple
classification of Crohn's disease: report of the Working Party for the World
Congresses of Gastroenterology, Vienna 1998. Inflamm Bowel Dis 2000; 6: 8–15
92 Gazouli M, Pachoula I, Panayotou I, Mantzaris G, Chrousos G, Anagnou NP,
Roma-Giannikou E. NOD2/CARD15, ATG16L1 and IL23R gene polymorphisms
and childhood-onset of Crohn's disease. World J Gastroenterol 2010; 16: 1753–
1758
93 Geerling BJ, Dagnelie PC, Badart-Smook A, Russel MG, Stockbrugger RW,
Brummer RJ. Diet as a risk factor for the development of ulcerative colitis. Am J
Gastroenterol 2000; 95: 1008–1013
94 Gent AE, Hellier MD, Grace RH, Swarbrick ET, Coggon D. Inflammatory bowel
disease and domestic hygiene in infancy. Lancet 1994; 343: 766–767
95 Gersemann M, Becker S, Kubler I, Koslowski M, Wang G, Herrlinger KR, Griger J,
Fritz P, Fellermann K, Schwab M, Wehkamp J, Stange EF. Differences in goblet
cell differentiation between Crohn's disease and ulcerative colitis. Differentiation
2009; 77: 84–94
96 Gewirtz AT, Vijay-Kumar M, Brant SR, Duerr RH, Nicolae DL, Cho JH. Dominant-
92
Literaturverzeichnis
negative TLR5 polymorphism reduces adaptive immune response to flagellin and
negatively associates with Crohn's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 2006; 290: G1157-63
97 Ghosh S, Armitage E, Wilson D, Minor PD, Afzal MA. Detection of persistent
measles virus infection in Crohn's disease: current status of experimental work.
Gut 2001; 48: 748–752
98 Gilat T, Hacohen D, Lilos P, Langman MJ. Childhood factors in ulcerative colitis and
Crohn's disease. An international cooperative study. Scand J Gastroenterol 1987;
22: 1009–1024
99 Gionchetti P, Rizzello F, Helwig U, Venturi A, Lammers KM, Brigidi P, Vitali B,
Poggioli G, Miglioli M, Campieri M. Prophylaxis of pouchitis onset with probiotic
therapy: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology 2003; 124:
1202–1209
100 Glas J, Seiderer J, Wetzke M, Konrad A, Torok H, Schmechel S, Tonenchi L, Grassl
C, Dambacher J, Pfennig S, Maier K, Griga T, Klein W, Epplen JT, Schiemann U,
Folwaczny C, Lohse P, Goke B, Ochsenkuhn T, Muller-Myhsok B, Folwaczny M,
Mussack T, Brand S. rs1004819 is the main disease-associated IL23R variant in
German Crohn's disease patients: combined analysis of IL23R, CARD15, and
OCTN1/2 variants. PLoS One 2007; 2: e819
101 Gocke AR, Cravens PD, Ben L, Hussain RZ, Northrop SC, Racke MK, LovettRacke AE. T-bet regulates the fate of Th1 and Th17 lymphocytes in autoimmunity.
J Immunol 2007; 178: 1341–1348
102 Godet PG, May GR, Sutherland LR. Meta-analysis of the role of oral contraceptive
agents in inflammatory bowel disease. Gut 1995; 37: 668–673
103 Göke M.N. Klinik der Colitis ulcerosa. In: Hoffmann JC, Hrsg. Chronisch
entzündliche Darmerkrankungen. Handbuch für Klinik und Praxis ; 94 Tabellen. 2.
Aufl. Stuttgart [u.a.]: Thieme; 2009: 82–86
104 Gothel SF, Marahiel MA. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of
ubiquitous folding catalysts. Cell Mol Life Sci 1999; 55: 423–436
105 Graham DY, Markesich DC, Yoshimura HH. Mycobacteria and inflammatory bowel
disease. Results of culture. Gastroenterology 1987; 92: 436–442
106 Greenblatt MB, Aliprantis A, Hu B, Glimcher LH. Calcineurin regulates innate
antifungal immunity in neutrophils. Journal of Experimental Medicine 2010; 207:
923–931
107 Gutierrez O, Pipaon C, Inohara N, Fontalba A, Ogura Y, Prosper F, Nunez G,
Fernandez-Luna JL. Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial
93
Literaturverzeichnis
cells via nuclear factor-kappa B activation. J Biol Chem 2002; 277: 41701–41705
108 Halfvarson J, Bodin L, Tysk C, Lindberg E, Jarnerot G. Inflammatory bowel disease
in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinical
characteristics. Gastroenterology 2003; 124: 1767–1773
109 Harding MW, Handschumacher RE. Cyclophilin, a primary molecular target for
cyclosporine. Structural and functional implications. Transplantation 1988; 46: 29S35S
110 Hart AL, Al-Hassi HO, Rigby RJ, Bell SJ, Emmanuel AV, Knight SC, Kamm MA,
Stagg AJ. Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory bowel
diseases. Gastroenterology 2005; 129: 50–65
111 Harvey RF, Bradshaw JM. A simple index of Crohn's-disease activity. Lancet 1980;
1: 514
112 Hatoum OA, Binion DG, Otterson MF, Gutterman DD. Acquired microvascular
dysfunction in inflammatory bowel disease: Loss of nitric oxide-mediated
vasodilation. Gastroenterology 2003; 125: 58–69
113 Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S,
Underhill DM, Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is
mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410: 1099–1103
114 Heller F, Florian P, Bojarski C, Richter J, Christ M, Hillenbrand B, Mankertz J, Gitter
AH, Burgel N, Fromm M, Zeitz M, Fuss I, Strober W, Schulzke JD. Interleukin-13 is
the key effector Th2 cytokine in ulcerative colitis that affects epithelial tight
junctions, apoptosis, and cell restitution. Gastroenterology 2005; 129: 550–564
115 Heller F, Fuss IJ, Nieuwenhuis EE, Blumberg RS, Strober W. Oxazolone colitis, a
Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NKT cells. Immunity 2002; 17: 629–638
116 Herrlinger K, Wittig B, Stange EF. Chronic inflammatory intestinal diseases.
Pathophysiology and therapy. Internist (Berl) 2009; 50: 1229-46; quiz 1247
117 Heyeck SD, Wilcox HM, Bunnell SC, Berg LJ. Lck phosphorylates the activation
loop tyrosine of the Itk kinase domain and activates Itk kinase activity. J Biol Chem
1997; 272: 25401–25408
118 Hisamatsu T, Suzuki M, Reinecker H, Nadeau WJ, McCormick BA, Podolsky DK.
CARD15/NOD2 functions as an antibacterial factor in human intestinal epithelial
cells. Gastroenterology 2003; 124: 993–1000
119 Hoey T, Sun YL, Williamson K, Xu X. Isolation of two new members of the NF-AT
gene family and functional characterization of the NF-AT proteins. Immunity 1995;
2: 461–472
94
Literaturverzeichnis
120 Hoffmann R.M. Medikamentöse Therapie in Orientierung an der Klinik: Colitis
ulcerosa. In: Hoffmann JC, Hrsg. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen.
Handbuch für Klinik und Praxis ; 94 Tabellen. 2. Aufl. Stuttgart [u.a.]: Thieme; 2009:
233–245
121 Hoffmann JC, Zeitz M. Treatment of Crohn's disease. Hepatogastroenterology
2000; 47: 90–100
122 Hoffmann J, Preiß J, Autschbach F, Buhr H, Häuser W, Herrlinger K, Höhne W,
Koletzko S, Krieglstein C, Kruis W, Matthes H, Moser G, Reinshagen M, Rogler G,
Schreiber S, Schreyer A, Sido B, Siegmund B, Stallmach A, Bokemeyer B, Stange
E, Zeitz M. S3-Leitlinie „Diagnostik und Therapie des Morbus Crohn”. Im Internet:
http://www.dgvs.de/media/DGVS2008_LL_Morbus_Crohn.pdf; Stand: 26.01.2012
123 Hogan PG, Chen L, Nardone J, Rao A. Transcriptional regulation by calcium,
calcineurin, and NFAT. Genes Dev 2003; 17: 2205–2232
124 Ho G, Moodie FM, Satsangi J. Multidrug resistance 1 gene (P-glycoprotein 170):
an important determinant in gastrointestinal disease? Gut 2003; 52: 759–766
125 Ho IC, Kim JH, Rooney JW, Spiegelman BM, Glimcher LH. A potential role for the
nuclear factor of activated T cells family of transcriptional regulatory proteins in
adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 15537–15541
126 Hradsky O, Dusatkova P, Lenicek M, Bronsky J, Nevoral J, Vitek L, Lukas M,
Zeniskova I, Cinek O. The CTLA4 variants may interact with the IL23R- and NOD2conferred risk in development of Crohn's disease. BMC Med Genet 2010; 11: 91
127 Huaman Rios JW, Casellas Jorda F, Malagelada Benapres JR. Predictive factors of
poor response to intravenous cyclosporine in steroid-refractory ulcerative colitis.
Rev Esp Enferm Dig 2009; 101: 163–171
128 Huck K, Feyen O, Niehues T, Ruschendorf F, Hubner N, Laws H, Telieps T, Knapp
S, Wacker H, Meindl A, Jumaa H, Borkhardt A. Girls homozygous for an IL-2inducible T cell kinase mutation that leads to protein deficiency develop fatal EBVassociated lymphoproliferation. J Clin Invest 2009; 119: 1350–1358
129 Hue S, Ahern P, Buonocore S, Kullberg MC, Cua DJ, McKenzie BS, Powrie F,
Maloy KJ. Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation.
J Exp Med 2006; 203: 2473–2483
130 Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Lesage S, Cezard JP, Belaiche J, Almer S,
Tysk C, O'Morain CA, Gassull M, Binder V, Finkel Y, Cortot A, Modigliani R,
Laurent-Puig P, Gower-Rousseau C, Macry J, Colombel JF, Sahbatou M, Thomas
G. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's
disease. Nature 2001; 411: 599–603
95
Literaturverzeichnis
131 Hussain A, Yu L, Faryal R, Mohammad DK, Mohamed AJ, Smith CIE. TEC family
kinases in health and disease--loss-of-function of BTK and ITK and the gain-offunction fusions ITK-SYK and BTK-SYK. FEBS J 2011; 278: 2001–2010
132 Hwang ES, Szabo SJ, Schwartzberg PL, Glimcher LH. T helper cell fate specified
by kinase-mediated interaction of T-bet with GATA-3. Science 2005; 307: 430–433
133 Inohara N. An induced proximity model for NF-kappaB activation in the Nod1/RICK
and RIP signaling pathways. Journal of Biological Chemistry 2000
134 Ivanov II, McKenzie BS, Zhou L, Tadokoro CE, Lepelley A, Lafaille JJ, Cua DJ,
Littman DR. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation
program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell 2006; 126: 1121–1133
135 Jarnerot G, Jarnmark I, Nilsson K. Consumption of refined sugar by patients with
Crohn's disease, ulcerative colitis, or irritable bowel syndrome. Scand J
Gastroenterol 1983; 18: 999–1002
136 Jess T, Gamborg M, Munkholm P, Sorensen TIA. Overall and cause-specific
mortality in ulcerative colitis: meta-analysis of population-based inception cohort
studies. Am J Gastroenterol 2007; 102: 609–617
137 Jess T, Rungoe C, Peyrin-Biroulet L. Risk of colorectal cancer in patients with
ulcerative colitis: a meta-analysis of population-based cohort studies. Clin
Gastroenterol Hepatol 2012; 10: 639–645
138 Jorga A, Holt DW, Johnston A. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine.
Transplant Proc 2004; 36: 396S-403S
139 Kamada N, Hisamatsu T, Okamoto S, Chinen H, Kobayashi T, Sato T, Sakuraba A,
Kitazume MT, Sugita A, Koganei K, Akagawa KS, Hibi T. Unique CD14 intestinal
macrophages contribute to the pathogenesis of Crohn disease via IL-23/IFNgamma axis. J Clin Invest 2008; 118: 2269–2280
140 Kao C, Oestreich KJ, Paley MA, Crawford A, Angelosanto JM, Ali MA, Intlekofer
AM, Boss JM, Reiner SL, Weinmann AS, Wherry EJ. Transcription factor T-bet
represses expression of the inhibitory receptor PD-1 and sustains virus-specific
CD8+ T cell responses during chronic infection. Nat Immunol 2011; 12: 663–671
141 Kaser A, Molnar C, Tilg H. Differential regulation of interleukin 4 and interleukin 13
production by interferon alpha. Cytokine 1998; 10: 75–81
142 Katzav S, Martin-Zanca D, Barbacid M. vav, a novel human oncogene derived from
a locus ubiquitously expressed in hematopoietic cells. EMBO J 1989; 8: 2283–
2290
143 Kim M, Lee S, Yang S, Song K, Lee I. Differential expression in histologically
normal crypts of ulcerative colitis suggests primary crypt disorder. Oncol Rep 2006;
96
Literaturverzeichnis
16: 663–670
144 Kinugasa T, Sakaguchi T, Gu X, Reinecker HC. Claudins regulate the intestinal
barrier in response to immune mediators. Gastroenterology 2000; 118: 1001–1011
145 Kirsner JB. Historical origins of current IBD concepts. World J Gastroenterol 2001;
7: 175–184
146 Kobayashi KS, Chamaillard M, Ogura Y, Henegariu O, Inohara N, Nunez G, Flavell
RA. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal
tract. Science 2005; 307: 731–734
147 Kopp E, Medzhitov R. Recognition of microbial infection by Toll-like receptors. Curr
Opin Immunol 2003; 15: 396–401
148 Koutroubakis IE, Vlachonikolis IG, Kouroumalis EA. Role of appendicitis and
appendectomy in the pathogenesis of ulcerative colitis: a critical review. Inflamm
Bowel Dis 2002; 8: 277–286
149 Kulkarni MS, Yielding KL. DNA damage and repair in epithelial (mucous) cells and
crypt cells from isolated colon. Chem Biol Interact 1985; 52: 311–318
150 La Pompa JL de, Timmerman LA, Takimoto H, Yoshida H, Elia AJ, Samper E,
Potter J, Wakeham A, Marengere L, Langille BL, Crabtree GR, Mak TW. Role of
the NF-ATc transcription factor in morphogenesis of cardiac valves and septum.
Nature 1998; 392: 182–186
151 Laurence A, Tato CM, Davidson TS, Kanno Y, Chen Z, Yao Z, Blank RB, Meylan F,
Siegel R, Hennighausen L, Shevach EM, O'shea JJ. Interleukin-2 signaling via
STAT5 constrains T helper 17 cell generation. Immunity 2007; 26: 371–381
152 Lazarevic V, Chen X, Shim J, Hwang E, Jang E, Bolm AN, Oukka M, Kuchroo VK,
Glimcher LH. T-bet represses T(H)17 differentiation by preventing Runx1-mediated
activation of the gene encoding RORgammat. Nat Immunol 2011; 12: 96–104
153 Lesage S, Zouali H, Cezard J, Colombel J, Belaiche J, Almer S, Tysk C, O'Morain
C, Gassull M, Binder V, Finkel Y, Modigliani R, Gower-Rousseau C, Macry J, Merlin
F, Chamaillard M, Jannot A, Thomas G, Hugot J. CARD15/NOD2 mutational
analysis and genotype-phenotype correlation in 612 patients with inflammatory
bowel disease. Am J Hum Genet 2002; 70: 845–857
154 Lewis JD, Chuai S, Nessel L, Lichtenstein GR, Aberra FN, Ellenberg JH. Use of the
noninvasive components of the Mayo score to assess clinical response in
ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 2008; 14: 1660–1666
155 Liao XC, Littman DR. Altered T cell receptor signaling and disrupted T cell
development in mice lacking Itk. Immunity 1995; 3: 757–769
156 Lichtiger S, Present DH, Kornbluth A, Gelernt I, Bauer J, Galler G, Michelassi F,
97
Literaturverzeichnis
Hanauer S. Cyclosporine in severe ulcerative colitis refractory to steroid therapy. N
Engl J Med 1994; 330: 1841–1845
157 Li J, Zhou Y, Hu M, Sun W, Xue Z. Impact of cyclosporine A on the expression of Tbet, GATA-3, relevant signal transduction molecules, cytokine and Th1/Th2
balance in patients with chronic aplastic anemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za
Zhi 2010; 18: 1211–1219
158 Lindberg E, Jarnerot G, Huitfeldt B. Smoking in Crohn's disease: effect on
localisation and clinical course. Gut 1992; 33: 779–782
159 Lindberg E, Tysk C, Andersson K, Jarnerot G. Smoking and inflammatory bowel
disease. A case control study. Gut 1988; 29: 352–357
160 Liu J, Farmer JD, JR, Lane WS, Friedman J, Weissman I, Schreiber SL.
Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506
complexes. Cell 1991; 66: 807–815
161 Liu KQ, Bunnell SC, Gurniak CB, Berg LJ. T cell receptor-initiated calcium release
is uncoupled from capacitative calcium entry in Itk-deficient T cells. J Exp Med
1998; 187: 1721–1727
162 Liu Z, Lee J, Krummey S, Lu W, Cai H, Lenardo MJ. The kinase LRRK2 is a
regulator of the transcription factor NFAT that modulates the severity of
inflammatory bowel disease. Nat Immunol 2011; 12: 1063–1070
163 Li X, Howard TD, Zheng SL, Haselkorn T, Peters SP, Meyers DA, Bleecker ER.
Genome-wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/DQ
regions. Journal of Allergy and Clinical Immunology 2010; 125: 328–335.e11
164 Lodes MJ, Cong Y, Elson CO, Mohamath R, Landers CJ, Targan SR, Fort M,
Hershberg RM. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. J Clin
Invest 2004; 113: 1296–1306
165 Lofberg R, Brostrom O, Karlen P, Tribukait B, Ost A. Colonoscopic surveillance in
long-standing total ulcerative colitis--a 15-year follow-up study. Gastroenterology
1990; 99: 1021–1031
166 Loftus E. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: Incidence,
prevalence, and environmental influences. Gastroenterology 2004; 126: 1504–
1517
167 Lopez-Rodriguez C, Aramburu J, Jin L, Rakeman AS, Michino M, Rao A. Bridging
the NFAT and NF-kappaB families: NFAT5 dimerization regulates cytokine gene
transcription in response to osmotic stress. Immunity 2001; 15: 47–58
168 Louis E. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification:
changing pattern over the course of the disease. Gut 2001; 49: 777–782
98
Literaturverzeichnis
169 Louis E, Michel V, Hugot JP, Reenaers C, Fontaine F, Delforge M, El Yafi F,
Colombel JF, Belaiche J. Early development of stricturing or penetrating pattern in
Crohn's disease is influenced by disease location, number of flares, and smoking
but not by NOD2/CARD15 genotype. Gut 2003; 52: 552–557
170 MacDermott RP, Nash GS, Bertovich MJ, Mohrman RF, Kodner IJ, Delacroix DL,
Vaerman JP. Altered patterns of secretion of monomeric IgA and IgA subclass 1 by
intestinal mononuclear cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology
1986; 91: 379–385
171 MacDermott RP, Nash GS, Bertovich MJ, Seiden MV, Bragdon MJ, Beale MG.
Alterations of IgM, IgG, and IgA Synthesis and secretion by peripheral blood and
intestinal mononuclear cells from patients with ulcerative colitis and Crohn's
disease. Gastroenterology 1981; 81: 844–852
172 Mahid SS, Minor KS, Soto RE, Hornung CA, Galandiuk S. Smoking and
inflammatory bowel disease: a meta-analysis. Mayo Clin Proc 2006; 81: 1462–
1471
173 Manichanh C, Rigottier-Gois L, Bonnaud E, Gloux K, Pelletier E, Frangeul L, Nalin
R, Jarrin C, Chardon P, Marteau P, Roca J, Dore J. Reduced diversity of faecal
microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. Gut 2006; 55:
205–211
174 Mannon PJ, Fuss IJ, Mayer L, Elson CO, Sandborn WJ, Present D, Dolin B,
Goodman N, Groden C, Hornung RL, Quezado M, Yang Z, Neurath MF, Salfeld J,
Veldman GM, Schwertschlag U, Strober W. Anti-interleukin-12 antibody for active
Crohn's disease. N Engl J Med 2004; 351: 2069–2079
175 Mannon PJ, Hornung RL, Yang Z, Yi C, Groden C, Friend J, Yao M, Strober W,
Fuss IJ. Suppression of inflammation in ulcerative colitis by interferon-beta-1a is
accompanied by inhibition of IL-13 production. Gut 2011; 60: 449–455
176 Masuda ES, Liu J, Imamura R, Imai SI, Arai KI, Arai N. Control of NFATx1 nuclear
translocation by a calcineurin-regulated inhibitory domain. Mol Cell Biol 1997; 17:
2066–2075
177 Matsumoto H, Nakao T, Okada T, Nagaoka Y, Takeguchi F, Tomaru R, Iwasawa H.
Favorable outcome of low-dose cyclosporine after pulse methylprednisolone in
Japanese adult minimal-change nephrotic syndrome. Intern Med 2004; 43: 668–
673
178 Matsuoka K, Inoue N, Sato T, Okamoto S, Hisamatsu T, Kishi Y, Sakuraba A,
Hitotsumatsu O, Ogata H, Koganei K, Fukushima T, Kanai T, Watanabe M, Ishii H,
Hibi T. T-bet upregulation and subsequent interleukin 12 stimulation are essential
99
Literaturverzeichnis
for induction of Th1 mediated immunopathology in Crohn's disease. Gut 2004; 53:
1303–1308
179 Maul J, Loddenkemper C, Mundt P, Berg E, Giese T, Stallmach A, Zeitz M,
Duchmann R. Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in
inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2005; 128: 1868–1878
180 McDonald JWD, Feagan BG, Jewell D, Brynskov J, Stange EF, Macdonald JK.
Cyclosporine for induction of remission in Crohn's disease. Cochrane Database
Syst Rev 2005: CD000297
181 McGovern DP. Association between a complex insertion/deletion polymorphism in
NOD1 (CARD4) and susceptibility to inflammatory bowel disease. Human
Molecular Genetics 2005; 14: 1245–1250
182 Miller AT, Wilcox HM, Lai Z, Berg LJ. Signaling through Itk promotes T helper 2
differentiation via negative regulation of T-bet. Immunity 2004; 21: 67–80
183 Miller SA, Huang AC, Miazgowicz MM, Brassil MM, Weinmann AS. Coordinated but
physically separable interaction with H3K27-demethylase and H3K4methyltransferase activities are required for T-box protein-mediated activation of
developmental gene expression. Genes Dev 2008; 22: 2980–2993
184 Mirza MM, Fisher SA, King K, Cuthbert AP, Hampe J, Sanderson J, Mansfield J,
Donaldson P, Macpherson AJS, Forbes A, Schreiber S, Lewis CM, Mathew CG.
Genetic evidence for interaction of the 5q31 cytokine locus and the CARD15 gene
in Crohn disease. Am J Hum Genet 2003; 72: 1018–1022
185 Mokbel M, Carbonnel F, Beaugerie L, Gendre JP, Cosnes J. Effect of smoking on
the long-term course of ulcerative colitis. Gastroenterol Clin Biol 1998; 22: 858–862
186 Molnar T, Tiszlavicz L, Gyulai C, Nagy F, Lonovics J. Clinical significance of
granuloma in Crohn's disease. World J Gastroenterol 2005; 11: 3118–3121
187 Monteleone G, Monteleone I, Fina D, Vavassori P, Del Vecchio Blanco G, Caruso
R, Tersigni R, Alessandroni L, Biancone L, Naccari GC, MacDonald TT, Pallone F.
Interleukin-21 enhances T-helper cell type I signaling and interferon-gamma
production in Crohn's disease. Gastroenterology 2005; 128: 687–694
188 Montgomery SM, Pounder RE, Wakefield AJ. Infant mortality and the incidence of
inflammatory bowel disease. Lancet 1997; 349: 472–473
189 Mori AD, Bruneau BG. TBX5 mutations and congenital heart disease: Holt-Oram
syndrome revealed. Curr Opin Cardiol 2004; 19: 211–215
190 Moskovitz DN, van Assche G, Maenhout B, Arts J, Ferrante M, Vermeire S,
Rutgeerts P. Incidence of colectomy during long-term follow-up after cyclosporineinduced remission of severe ulcerative colitis. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4:
100
Literaturverzeichnis
760–765
191 Mottet C, Uhlig HH, Powrie F. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+
regulatory T cells. J Immunol 2003; 170: 3939–3943
192 Mott JL, Zhang D, Freeman JC, Mikolajczak P, Chang SW, Zassenhaus HP.
Cardiac disease due to random mitochondrial DNA mutations is prevented by
cyclosporin A. Biochem Biophys Res Commun 2004; 319: 1210–1215
193 Movilla N, Bustelo XR. Biological and regulatory properties of Vav-3, a new
member of the Vav family of oncoproteins. Mol Cell Biol 1999; 19: 7870–7885
194 Nagane Y, Suzuki S, Suzuki N, Utsugisawa K. Two-year treatment with
cyclosporine microemulsion for responder myasthenia gravis patients. Eur Neurol
2010; 64: 186–190
195 Naganuma M, Iizuka B, Torii A, Ogihara T, Kawamura Y, Ichinose M, Kojima Y, Hibi
T. Appendectomy protects against the development of ulcerative colitis and
reduces its recurrence: results of a multicenter case-controlled study in Japan. Am
J Gastroenterol 2001; 96: 1123–1126
196 Natividad JMM, Petit V, Huang X, Palma G de, Jury J, Sanz Y, Philpott D, Garcia
Rodenas CL, McCoy KD, Verdu EF. Commensal and probiotic bacteria influence
intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice.
Inflamm Bowel Dis 2012; 18: 1434–1446
197 Netea MG. The Frameshift Mutation in Nod2 Results in Unresponsiveness Not
Only to Nod2- but Also Nod1-activating Peptidoglycan Agonists. Journal of
Biological Chemistry 2005; 280: 35859–35867
198 Neurath MF. IL-23: a master regulator in Crohn disease. Nat Med 2007; 13: 26–28
199 Neurath MF, Weigmann B, Finotto S, Glickman J, Nieuwenhuis E, Iijima H,
Mizoguchi A, Mizoguchi E, Mudter J, Galle PR, Bhan A, Autschbach F, Sullivan BM,
Szabo SJ, Glimcher LH, Blumberg RS. The transcription factor T-bet regulates
mucosal T cell activation in experimental colitis and Crohn's disease. J Exp Med
2002; 195: 1129–1143
200 Newcomb DC, Boswell MG, Huckabee MM, Goleniewska K, Dulek DE, Reiss S,
Lukacs NW, Kolls JK, Peebles RS, JR. IL-13 regulates Th17 secretion of IL-17A in
an IL-10-dependent manner. J Immunol 2012; 188: 1027–1035
201 Newman WG, Gu X, Wintle RF, Liu X, van Oene M, Amos CI, Siminovitch KA.
DLG5 variants contribute to Crohn disease risk in a Canadian population. Hum
Mutat 2006; 27: 353–358
202 Nuding S, Fellermann K, Wehkamp J, Stange EF. Reduced mucosal antimicrobial
activity in Crohn's disease of the colon. Gut 2007; 56: 1240–1247
101
Literaturverzeichnis
203 Ogura Y, Bonen DK, Inohara N, Nicolae DL, Chen FF, Ramos R, Britton H, Moran
T, Karaliuskas R, Duerr RH, Achkar JP, Brant SR, Bayless TM, Kirschner BS,
Hanauer SB, Nunez G, Cho JH. A frameshift mutation in NOD2 associated with
susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001; 411: 603–606
204 Oliver J, Rueda B, Lopez-Nevot MA, Gomez-Garcia M, Martin J. Replication of an
association between IL23R gene polymorphism with inflammatory bowel disease.
Clin Gastroenterol Hepatol 2007; 5: 977-81, 981.e1-2
205 Oppmann B, Lesley R, Blom B, Timans JC, Xu Y, Hunte B, Vega F, Yu N, Wang J,
Singh K, Zonin F, Vaisberg E, Churakova T, Liu M, Gorman D, Wagner J, Zurawski
S, Liu Y, Abrams JS, Moore KW, Rennick D, Waal-Malefyt R de, Hannum C, Bazan
JF, Kastelein RA. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine, IL-23,
with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity 2000; 13:
715–725
206 Orholm M, Binder V, Sorensen TI, Rasmussen LP, Kyvik KO. Concordance of
inflammatory bowel disease among Danish twins. Results of a nationwide study.
Scand J Gastroenterol 2000; 35: 1075–1081
207 Orholm M, Munkholm P, Langholz E, Nielsen OH, Sorensen TI, Binder V. Familial
occurrence of inflammatory bowel disease. N Engl J Med 1991; 324: 84–88
208 Ott C, Obermeier F, Thieler S, Kemptner D, Bauer A, Scholmerich J, Rogler G,
Timmer A. The incidence of inflammatory bowel disease in a rural region of
Southern Germany: a prospective population-based study. Eur J Gastroenterol
Hepatol 2008; 20: 917–923
209 Ott SJ, Musfeldt M, Wenderoth DF, Hampe J, Brant O, Folsch UR, Timmis KN,
Schreiber S. Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial
microflora in patients with active inflammatory bowel disease. Gut 2004; 53: 685–
693
210 Ouburg S, Mallant-Hent R, Crusius JBA, van Bodegraven AA, Mulder CJJ,
Linskens R, Pena AS, Morre SA. The toll-like receptor 4 (TLR4) Asp299Gly
polymorphism is associated with colonic localisation of Crohn's disease without a
major role for the Saccharomyces cerevisiae mannan-LBP-CD14-TLR4 pathway.
Gut 2005; 54: 439–440
211 Panwala CM, Jones JC, Viney JL. A novel model of inflammatory bowel disease:
mice deficient for the multiple drug resistance gene, mdr1a, spontaneously develop
colitis. J Immunol 1998; 161: 5733–5744
212 Parkes M, Jewell D. Ulcerative colitis and Crohns disease: molecular genetics and
clinical implications. Expert Rev Mol Med 2001; 2001: 1–18
102
Literaturverzeichnis
213 Park JW, Min HJ, Sohn JH, Kim JY, Hong JH, Sigrist KS, Glimcher LH, Hwang ES.
Restoration of T-box-containing protein expressed in T cells protects against
allergen-induced asthma. J Allergy Clin Immunol 2009; 123: 479–485
214 Park J, Yaseen NR, Hogan PG, Rao A, Sharma S. Phosphorylation of the
transcription factor NFATp inhibits its DNA binding activity in cyclosporin A-treated
human B and T cells. J Biol Chem 1995; 270: 20653–20659
215 Parronchi P, Romagnani P, Annunziato F, Sampognaro S, Becchio A, Giannarini L,
Maggi E, Pupilli C, Tonelli F, Romagnani S. Type 1 T-helper cell predominance and
interleukin-12 expression in the gut of patients with Crohn's disease. Am J Pathol
1997; 150: 823–832
216 Peltekova VD, Wintle RF, Rubin LA, Amos CI, Huang Q, Gu X, Newman B, van
Oene M, Cescon D, Greenberg G, Griffiths AM, St George-Hyslop PH, Siminovitch
KA. Functional variants of OCTN cation transporter genes are associated with
Crohn disease. Nat Genet 2004; 36: 471–475
217 Potocnik U, Ferkolj I, Glavac D, Dean M. Polymorphisms in multidrug resistance 1
(MDR1) gene are associated with refractory Crohn disease and ulcerative colitis.
Genes Immun 2004; 5: 530–539
218 Prescott NJ, Fisher SA, Franke A, Hampe J, Onnie CM, Soars D, Bagnall R, Mirza
MM, Sanderson J, Forbes A, Mansfield JC, Lewis CM, Schreiber S, Mathew CG. A
nonsynonymous SNP in ATG16L1 predisposes to ileal Crohn's disease and is
independent of CARD15 and IBD5. Gastroenterology 2007; 132: 1665–1671
219 Pullan RD, Rhodes J, Ganesh S, Mani V, Morris JS, Williams GT, Newcombe RG,
Russell MA, Feyerabend C, Thomas GA. Transdermal nicotine for active ulcerative
colitis. N Engl J Med 1994; 330: 811–815
220 Radford-Smith GL, Edwards JE, Purdie DM, Pandeya N, Watson M, Martin NG,
Green A, Newman B, Florin THJ. Protective role of appendicectomy on onset and
severity of ulcerative colitis and Crohn's disease. Gut 2002; 51: 808–813
221 Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R.
Recognition of Commensal Microflora by Toll-Like Receptors Is Required for
Intestinal Homeostasis. Cell 2004; 118: 229–241
222 Rao A, Luo C, Hogan PG. Transcription factors of the NFAT family: regulation and
function. Annu Rev Immunol 1997; 15: 707–747
223 Readinger JA, Schiralli GM, Jiang J, Thomas CJ, August A, Henderson AJ,
Schwartzberg PL. Selective targeting of ITK blocks multiple steps of HIV
replication. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 6684–6689
224 Reif S, Klein I, Lubin F, Farbstein M, Hallak A, Gilat T. Pre-illness dietary factors in
103
Literaturverzeichnis
inflammatory bowel disease. Gut 1997; 40: 754–760
225 Reinshagen M. Klinik des Morbus Crohn. In: Hoffmann JC, Hrsg. Chronisch
entzündliche Darmerkrankungen. Handbuch für Klinik und Praxis ; 94 Tabellen. 2.
Aufl. Stuttgart [u.a.]: Thieme; 2009: 68–81
226 Rigas A, Rigas B, Glassman M, Yen YY, Lan SJ, Petridou E, Hsieh CC,
Trichopoulos D. Breast-feeding and maternal smoking in the etiology of Crohn's
disease and ulcerative colitis in childhood. Ann Epidemiol 1993; 3: 387–392
227 Riordan AM, Ruxton CH, Hunter JO. A review of associations between Crohn's
disease and consumption of sugars. Eur J Clin Nutr 1998; 52: 229–238
228 Rioux JD, Silverberg MS, Daly MJ, Steinhart AH, McLeod RS, Griffiths AM, Green
T, Brettin TS, Stone V, Bull SB, Bitton A, Williams CN, Greenberg GR, Cohen Z,
Lander ES, Hudson TJ, Siminovitch KA. Genomewide search in Canadian families
with inflammatory bowel disease reveals two novel susceptibility loci. Am J Hum
Genet 2000; 66: 1863–1870
229 Rioux JD, Xavier RJ, Taylor KD, Silverberg MS, Goyette P, Huett A, Green T,
Kuballa P, Barmada MM, Datta LW, Shugart YY, Griffiths AM, Targan SR, Ippoliti
AF, Bernard E, Mei L, Nicolae DL, Regueiro M, Schumm LP, Steinhart AH, Rotter
JI, Duerr RH, Cho JH, Daly MJ, Brant SR. Genome-wide association study
identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in
disease pathogenesis. Nat Genet 2007; 39: 596–604
230 Roberts RL, Gearry RB, Hollis-Moffatt JE, Miller AL, Reid J, Abkevich V, Timms
KM, Gutin A, Lanchbury JS, Merriman TR, Barclay ML, Kennedy MA. IL23R
R381Q and ATG16L1 T300A are strongly associated with Crohn's disease in a
study of New Zealand Caucasians with inflammatory bowel disease. Am J
Gastroenterol 2007; 102: 2754–2761
231 Rogan DF, Cousins DJ, Santangelo S, Ioannou PA, Antoniou M, Lee TH, Staynov
DZ. Analysis of intergenic transcription in the human IL-4/IL-13 gene cluster. Proc
Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 2446–2451
232 Rolhion N, Darfeuille-Michaud A. Adherent-invasiveEscherichia coli in inflammatory
bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2007; 13: 1277–1283
233 Roussomoustakaki M, Satsangi J, Welsh K, Louis E, Fanning G, Targan S,
Landers C, Jewell DP. Genetic markers may predict disease behavior in patients
with ulcerative colitis. Gastroenterology 1997; 112: 1845–1853
234 Rudra T, Motley R, Rhodes J. Does smoking improve colitis? Scand J
Gastroenterol Suppl 1989; 170: 61-3; discussion 66-8
235 Rugtveit J, Brandtzaeg P, Halstensen TS, Fausa O, Scott H. Increased
104
Literaturverzeichnis
macrophage subset in inflammatory bowel disease: apparent recruitment from
peripheral blood monocytes. Gut 1994; 35: 669–674
236 Rugtveit J, Nilsen EM, Bakka A, Carlsen H, Brandtzaeg P, Scott H. Cytokine
profiles differ in newly recruited and resident subsets of mucosal macrophages
from inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1997; 112: 1493–1505
237 Sandborn WJ. Cyclosporine in ulcerative colitis: state of the art. Acta Gastroenterol
Belg 2001; 64: 201–204
238 Sandler RS, Sandler DP, McDonnell CW, Wurzelmann JI. Childhood exposure to
environmental tobacco smoke and the risk of ulcerative colitis. Am J Epidemiol
1992; 135: 603–608
239 Santini MP, Talora C, Seki T, Bolgan L, Dotto GP. Cross talk among calcineurin,
Sp1/Sp3, and NFAT in control of p21(WAF1/CIP1) expression in keratinocyte
differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 9575–9580
240 Satsangi J, Jewell DP, Bell JI. The genetics of inflammatory bowel disease. Gut
1997; 40: 572–574
241 Satsangi J, Parkes M, Louis E, Hashimoto L, Kato N, Welsh K, Terwilliger JD,
Lathrop GM, Bell JI, Jewell DP. Two stage genome–wide search in inflammatory
bowel disease provides evidence for susceptibility loci on chromosomes 3, 7 and
12. Nat Genet 1996; 14: 199–202
242 Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, Colombel J. The Montreal classification of
inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut
2006; 55: 749–753
243 Schaeffer EM, Broussard C, Debnath J, Anderson S, McVicar DW, Schwartzberg
PL. Tec family kinases modulate thresholds for thymocyte development and
selection. J Exp Med 2000; 192: 987–1000
244 Scharl M, Frei S, Pesch T, Kellermeier S, Arikkat J, Frei P, Fried M, Weber A, Jehle
E, Ruhl A, Rogler G. Interleukin-13 and transforming growth factor beta synergise
in the pathogenesis of human intestinal fistulae. Gut 2013; 62: 63–72
245 Schmechel S, Konrad A, Diegelmann J, Glas J, Wetzke M, Paschos E, Lohse P,
Goke B, Brand S. Linking genetic susceptibility to Crohn's disease with Th17 cell
function: IL-22 serum levels are increased in Crohn's disease and correlate with
disease activity and IL23R genotype status. Inflamm Bowel Dis 2008; 14: 204–212
246 Schmidt C, Giese T, Ludwig B, Mueller-Molaian I, Marth T, Zeuzem S, Meuer SC,
Stallmach A. Expression of interleukin-12-related cytokine transcripts in
inflammatory bowel disease: elevated interleukin-23p19 and interleukin-27p28 in
Crohn's disease but not in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 2005; 11: 16–23
105
Literaturverzeichnis
247 Schmidt C, Wittig BM, Moser C, Zeitz M, Stallmach A. Cyclophosphamide pulse
therapy followed by azathioprine or methotrexate induces long-term remission in
patients with steroid-refractory Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther 2006; 24:
343–350
248 Schmitt J, Schmitt N, Meurer M. Cyclosporin in the treatment of patients with atopic
eczema - a systematic review and meta-analysis. J Eur Acad Dermatol Venereol
2007; 21: 606–619
249 Schuebel KE, Bustelo XR, Nielsen DA, Song BJ, Barbacid M, Goldman D, Lee IJ.
Isolation and characterization of murine vav2, a member of the vav family of protooncogenes. Oncogene 1996; 13: 363–371
250 Schultsz C, van Den Berg FM, Kate FW ten, Tytgat GN, Dankert J. The intestinal
mucus layer from patients with inflammatory bowel disease harbors high numbers
of bacteria compared with controls. Gastroenterology 1999; 117: 1089–1097
251 Scott MG, Nahm MH, Macke K, Nash GS, Bertovich MJ, MacDermott RP.
Spontaneous secretion of IgG subclasses by intestinal mononuclear cells:
differences between ulcerative colitis, Crohn's disease, and controls. Clin Exp
Immunol 1986; 66: 209–215
252 Sellon RK, Tonkonogy S, Schultz M, Dieleman LA, Grenther W, Balish E, Rennick
DM, Sartor RB. Resident enteric bacteria are necessary for development of
spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice.
Infect Immun 1998; 66: 5224–5231
253 Shaw KT, Ho AM, Raghavan A, Kim J, Jain J, Park J, Sharma S, Rao A, Hogan
PG. Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation of transcription
factor NFAT1 in stimulated immune cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:
11205–11209
254 Sher ME, Bank S, Greenberg R, Sardinha TC, Weissman S, Bailey B, Gilliland R,
Wexner SD. The influence of cigarette smoking on cytokine levels in patients with
inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 1999; 5: 73–78
255 Shih T, Hsieh S, Hsieh Y, Chen T, Yeh C, Lin C, Lin D, Chiu C. Aberrant activation
of nuclear factor of activated T cell 2 in lamina propria mononuclear cells in
ulcerative colitis. World J Gastroenterol 2008; 14: 1759–1767
256 Shivananda S, Lennard-Jones J, Logan R, Fear N, Price A, Carpenter L, van
Blankenstein M. Incidence of inflammatory bowel disease across Europe: is there a
difference between north and south? Results of the European Collaborative Study
on Inflammatory Bowel Disease (EC-IBD). Gut 1996; 39: 690–697
257 Silverstein MD, Lashner BA, Hanauer SB. Cigarette smoking and ulcerative colitis:
106
Literaturverzeichnis
a case-control study. Mayo Clin Proc 1994; 69: 425–429
258 Smithgall MD, Comeau MR, Yoon BP, Kaufman D, Armitage R, Smith DE. IL-33
amplifies both Th1- and Th2-type responses through its activity on human
basophils, allergen-reactive Th2 cells, iNKT and NK cells. Int Immunol 2008; 20:
1019–1030
259 Smits HH, van Beelen AJ, Hessle C, Westland R, Jong E de, Soeteman E, Wold A,
Wierenga EA, Kapsenberg ML. Commensal Gram-negative bacteria prime human
dendritic cells for enhanced IL-23 and IL-27 expression and enhanced Th1
development. Eur J Immunol 2004; 34: 1371–1380
260 Stallmach A, Wittig BM, Moser C, Fischinger J, Duchmann R, Zeitz M. Safety and
efficacy of intravenous pulse cyclophosphamide in acute steroid refractory
inflammatory bowel disease. Gut 2003; 52: 377–382
261 Stange EF, Modigliani R, Pena AS, Wood AJ, Feutren G, Smith PR. European trial
of cyclosporine in chronic active Crohn's disease: a 12-month study. The European
Study Group. Gastroenterology 1995; 109: 774–782
262 Starzl TE, Klintmalm GBG, Porter KA, Iwatsuki S, Schröter GPJ. Liver
Transplantation with Use of Cyclosporin a and Prednisone. N Engl J Med 1981;
305: 266–269
263 Stichtenroth D.O. Pharmakologie der Substanzgruppen. In: Hoffmann JC, Hrsg.
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen. Handbuch für Klinik und Praxis ; 94
Tabellen. 2. Aufl. Stuttgart [u.a.]: Thieme; 2009: 183–198
264 Stokkers PCF, Reitsma PH, Tytgat GNJ, van Deventer SJH. HLA-DR and -DQ
phenotypes in inflammatory bowel disease: a meta-analysis. Gut 1999; 45: 395–
401
265 Stoll M, Corneliussen B, Costello CM, Waetzig GH, Mellgard B, Koch WA,
Rosenstiel P, Albrecht M, Croucher PJP, Seegert D, Nikolaus S, Hampe J,
Lengauer T, Pierrou S, Foelsch UR, Mathew CG, Lagerstrom-Fermer M, Schreiber
S. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease. Nat
Genet 2004; 36: 476–480
266 Sullivan PG, Sebastian AH, Hall ED. Therapeutic window analysis of the
neuroprotective effects of cyclosporine A after traumatic brain injury. J Neurotrauma
2011; 28: 311–318
267 Sung SS, Jung LK, Walters JA, Chen W, Wang CY, Fu SM. Production of tumor
necrosis factor/cachectin by human B cell lines and tonsillar B cells. J Exp Med
1988; 168: 1539–1551
268 Sutherland L, Singleton J, Sessions J, Hanauer S, Krawitt E, Rankin G, Summers
107
Literaturverzeichnis
R, Mekhjian H, Greenberger N, Kelly M. Double blind, placebo controlled trial of
metronidazole in Crohn's disease. Gut 1991; 32: 1071–1075
269 Sventoraityte J, Zvirbliene A, Franke A, Kwiatkowski R, Kiudelis G, Kupcinskas L,
Schreiber S. NOD2, IL23R and ATG16L1 polymorphisms in Lithuanian patients
with inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2010; 16: 359–364
270 Swidsinski A, Ladhoff A, Pernthaler A, Swidsinski S, Loening-Baucke V, Ortner M,
Weber J, Hoffmann U, Schreiber S, Dietel M, Lochs H. Mucosal flora in
inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2002; 122: 44–54
271 Szabo SJ, Kim ST, Costa GL, Zhang X, Fathman CG, Glimcher LH. A novel
transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell 2000; 100: 655–
669
272 Tada H, Aiba S, Shibata K, Ohteki T, Takada H. Synergistic effect of Nod1 and
Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate
interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect Immun 2005; 73: 7967–7976
273 Tarakhovsky A, Turner M, Schaal S, Mee PJ, Duddy LP, Rajewsky K, Tybulewicz
VL. Defective antigen receptor-mediated proliferation of B and T cells in the
absence of Vav. Nature 1995; 374: 467–470
274 Taurog JD, Richardson JA, Croft JT, Simmons WA, Zhou M, Fernandez-Sueiro JL,
Balish E, Hammer RE. The germfree state prevents development of gut and joint
inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med 1994; 180: 2359–
2364
275 Tauro S, Maccallum S, Groves MJ, Rojnuckarin P, Assanasen T, Feldman AL,
Robson A, Marschalko M, Kini H, Alzolibani AA, Al Robaee A, Al Shobaili HA,
Alfawzan S, Goodlad JR, Kernohan N, Hummel M, Sterry W, Assaf C.
Immunohistochemical localization of cellular NFATc1 does not predict clinical
responses to ciclosporin in subcutaneous panniculitis-like T-cell non-Hodgkin
lymphoma. Br J Dermatol 2010; 162: 887–889
276 Teahon K, Smethurst P, Levi AJ, Menzies IS, Bjarnason I. Intestinal permeability in
patients with Crohn's disease and their first degree relatives. Gut 1992; 33: 320–
323
277 Thomas GA, Rhodes J, Mani V, Williams GT, Newcombe RG, Russell MA,
Feyerabend C. Transdermal nicotine as maintenance therapy for ulcerative colitis.
N Engl J Med 1995; 332: 988–992
278 Thomas GA, Rhodes J, Ragunath K, Mani V, Williams GT, Newcombe RG, Russell
MA, Feyerabend C. Transdermal nicotine compared with oral prednisolone therapy
for active ulcerative colitis. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996; 8: 769–776
108
Literaturverzeichnis
279 Thomas GA, Swift GL, Green JT, Newcombe RG, Braniff-Mathews C, Rhodes J,
Wilkinson S, Strohmeyer G, Kreuzpainter G. Controlled trial of antituberculous
chemotherapy in Crohn's disease: a five year follow up study. Gut 1998; 42: 497–
500
280 Thompson NP, Driscoll R, Pounder RE, Wakefield AJ. Genetics versus
environment in inflammatory bowel disease: results of a British twin study. BMJ
1996; 312: 95–96
281 Thompson NP, Montgomery SM, Pounder RE, Wakefield AJ. Is measles
vaccination a risk factor for inflammatory bowel disease? Lancet 1995; 345: 1071–
1074
282 Timmer A, Breuer-Katschinski B, Goebell H. Time trends in the incidence and
disease location of Crohn's disease 1980-1995: a prospective analysis in an urban
population in Germany. Inflamm Bowel Dis 1999; 5: 79–84
283 Toru H, Pawankar R, Ra C, Yata J, Nakahata T. Human mast cells produce IL-13
by high-affinity IgE receptor cross-linking: enhanced IL-13 production by IL-4primed human mast cells. J Allergy Clin Immunol 1998; 102: 491–502
284 Truelove SC, Witts LJ. Cortisone in ulcerative colitis; final report on a therapeutic
trial. Br Med J 1955; 2: 1041–1048
285 Turner M, Mee PJ, Walters AE, Quinn ME, Mellor AL, Zamoyska R, Tybulewicz VL.
A requirement for the Rho-family GTP exchange factor Vav in positive and negative
selection of thymocytes. Immunity 1997; 7: 451–460
286 Turner RB, Emer JJ, Weill M, Winterfield L, Friedman S, Qureshi AA. Rapid
resolution of pyoderma gangrenosum after treatment with intravenous
cyclosporine. J Am Acad Dermatol 2010; 63: e72-4
287 Tysk C, Lindberg E, Jarnerot G, Floderus-Myrhed B. Ulcerative colitis and Crohn's
disease in an unselected population of monozygotic and dizygotic twins. A study of
heritability and the influence of smoking. Gut 1988; 29: 990–996
288 Uehara A, Fujimoto Y, Fukase K, Takada H. Various human epithelial cells express
functional Toll-like receptors, NOD1 and NOD2 to produce anti-microbial peptides,
but not proinflammatory cytokines. Mol Immunol 2007; 44: 3100–3111
289 van den Borne BE, Landewe RB, Goei The HS, Mattie H, Breedveld FC, Dijkmans
BA. Relative bioavailability of a new oral form of cyclosporin A in patients with
rheumatoid arthritis. Br J Clin Pharmacol 1995; 39: 172–175
290 van der Sluis M, Koning BAE de, Bruijn ACJM de, Velcich A, Meijerink JPP, van
Goudoever JB, Buller HA, Dekker J, van Seuningen I, Renes IB, Einerhand AWC.
Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2 is critical
109
Literaturverzeichnis
for colonic protection. Gastroenterology 2006; 131: 117–129
291 van Hees PA, van Elteren PH, van Lier HJ, van Tongeren JH. An index of
inflammatory activity in patients with Crohn's disease. Gut 1980; 21: 279–286
292 Velankar AD, Quintini G, Prabhu A, Weber A, Hunaeus G, Voland B, Wuest M,
Orjeda C, Harel D, Varghese S, Gore V, Patil M, Gayke D, Herdemann M, Heit I,
Zaliani A. Synthesis and biological evaluation of novel (4 or 5-aryl)pyrazolyl-indoles
as inhibitors of interleukin-2 inducible T-cell kinase (ITK). Bioorg Med Chem 2010;
18: 4547–4559
293 Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ, Locksley RM, Stockinger B. TGFbeta in the
context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17producing T cells. Immunity 2006; 24: 179–189
294 Volcheck GW, van Dellen RG. Anaphylaxis to intravenous cyclosporine and
tolerance to oral cyclosporine: case report and review. Ann Allergy Asthma
Immunol 1998; 80: 159–163
295 Voss E, Wehkamp J, Wehkamp K, Stange EF, Schroder JM, Harder J.
NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human betadefensin-2. J Biol Chem 2006; 281: 2005–2011
296 Wakefield AJ, Pittilo RM, Sim R, Cosby SL, Stephenson JR, Dhillon AP, Pounder
RE. Evidence of persistent measles virus infection in Crohn's disease. J Med Virol
1993; 39: 345–353
297 Watanabe N, Ikuta K, Okazaki K, Nakase H, Tabata Y, Matsuura M, Tamaki H,
Kawanami C, Honjo T, Chiba T. Digestive Diseases and Sciences 2003; 48: 408–
414
298 Wehkamp J, Harder J, Weichenthal M, Schwab M, Schaffeler E, Schlee M,
Herrlinger KR, Stallmach A, Noack F, Fritz P, Schroder JM, Bevins CL, Fellermann
K, Stange EF. NOD2 (CARD15) mutations in Crohn's disease are associated with
diminished mucosal alpha-defensin expression. Gut 2004; 53: 1658–1664
299 Wehkamp J, Salzman NH, Porter E, Nuding S, Weichenthal M, Petras RE, Shen B,
Schaeffeler E, Schwab M, Linzmeier R, Feathers RW, Chu H, Lima H, JR,
Fellermann K, Ganz T, Stange EF, Bevins CL. Reduced Paneth cell alphadefensins in ileal Crohn's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 18129–
18134
300 Weigmann B, Neurath MF. T-bet as a possible therapeutic target in autoimmune
disease. Expert Opin Ther Targets 2002; 6: 619–622
301 Weigmann B, Tubbe I, Seidel D, Nicolaev A, Becker C, Neurath MF. Isolation and
subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic
110
Literaturverzeichnis
tissue. Nat Protoc 2007; 2: 2307–2311
302 Wells G, Tugwell P. Cyclosporin A in rheumatoid arthritis: overview of efficacy. Br J
Rheumatol 1993; 32 Suppl 1: 51–56
303 Wirtz S, Becker C, Blumberg R, Galle PR, Neurath MF. Treatment of T celldependent experimental colitis in SCID mice by local administration of an
adenovirus expressing IL-18 antisense mRNA. J Immunol 2002; 168: 411–420
304 Wu CY, Benet LZ, Hebert MF, Gupta SK, Rowland M, Gomez DY, Wacher VJ.
Differentiation of absorption and first-pass gut and hepatic metabolism in humans:
studies with cyclosporine. Clin Pharmacol Ther 1995; 58: 492–497
305 Wu J, Katzav S, Weiss A. A functional T-cell receptor signaling pathway is required
for p95vav activity. Mol Cell Biol 1995; 15: 4337–4346
306 Wurzelmann JI, Lyles CM, Sandler RS. Childhood infections and the risk of
inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 1994; 39: 555–560
307 Xavier RJ, Podolsky DK. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel
disease. Nature 2007; 448: 427–434
308 Yamamoto T, Keighley MR. The association of cigarette smoking with a high risk of
recurrence after ileocolonic resection for ileocecal Crohn's disease. Surg Today
1999; 29: 579–580
309 Yarilina A, Xu K, Chen J, Ivashkiv LB. TNF activates calcium-nuclear factor of
activated T cells (NFAT)c1 signaling pathways in human macrophages. Proc Natl
Acad Sci U S A 2011; 108: 1573–1578
310 Yen D, Cheung J, Scheerens H, Poulet F, McClanahan T, McKenzie B, Kleinschek
MA, Owyang A, Mattson J, Blumenschein W, Murphy E, Sathe M, Cua DJ,
Kastelein RA, Rennick D. IL-23 is essential for T cell-mediated colitis and promotes
inflammation via IL-17 and IL-6. J Clin Invest 2006; 116: 1310–1316
311 You Y, Zhao W, Chen S, Tan W, Dan Y, Hao F, Deng G. Association of TBX21 gene
haplotypes in a Chinese population with systemic lupus erythematosus. Scand J
Rheumatol 2010; 39: 254–258
312 Yu QT, Saruta M, Avanesyan A, Fleshner PR, Banham AH, Papadakis KA.
Expression and functional characterization of FOXP3+ CD4+ regulatory T cells in
ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 2007; 13: 191–199
313 Zanoni I, Ostuni R, Barresi S, Di Gioia M, Broggi A, Costa B, Marzi R, Granucci F.
CD14 and NFAT mediate lipopolysaccharide-induced skin edema formation in
mice. J Clin Invest 2012; 122: 1747–1757
314 Zanoni I, Ostuni R, Capuano G, Collini M, Caccia M, Ronchi AE, Rocchetti M,
Mingozzi F, Foti M, Chirico G, Costa B, Zaza A, Ricciardi-Castagnoli P, Granucci F.
111
Literaturverzeichnis
CD14 regulates the dendritic cell life cycle after LPS exposure through NFAT
activation. Nature 2009; 460: 264–268
315 Zhang Z, Zheng M, Bindas J, Schwarzenberger P, Kolls JK. Critical role of IL-17
receptor signaling in acute TNBS-induced colitis. Inflamm Bowel Dis 2006; 12:
382–388
316 Zheng S, Tasnif Y, Hebert MF, Davis CL, Shitara Y, Calamia JC, Lin YS, Shen DD,
Thummel KE. CYP3A5 gene variation influences cyclosporine A metabolite
formation and renal cyclosporine disposition. Transplantation 2013; 95: 821–827
317 Zuo L, Fulkerson PC, Finkelman FD, Mingler M, Fischetti CA, Blanchard C,
Rothenberg ME. IL-13 induces esophageal remodeling and gene expression by an
eosinophil-independent, IL-13R alpha 2-inhibited pathway. J Immunol 2010; 185:
660–669
112
Abkürzungsverzeichnis
7. Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Fachbegriff
ABCB1
ATP-binding-casette, sub-family B, Member 1
ACK
Ammonium Chlorid Potassium
ATG16L1
autophagy related 16- Like 1
ATP
Adenosintriphosphat
BL/6
C57BL/6
BSA
Bovines Serum Albumin
CARD
caspase recruited domain family
CD
Cluster of differentiation
cDNA
complementary DNA
CED
Chronisch entzündliche Darmerkrankung
CU
Colitis ulcerosa
DNA
Desoxyribonucleic acid
DSS
Dextran Sodium Sulphate
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
GATA
Trans-acting T-cell specific transcriptionfactor
GIT
Gastrointestinaltrakt
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
IBD
Inflammatory bowel disease
IFNγ
Interferon γ
IgE
Immunglobulin E
IgG
Immunglobulin G
IL
Interleukin
Itk
Interleukin 2 induzierende T-Zell Kinase
KO
Knock Out
LP
Lamina propria
MC
Morbus Crohn
MDP
Muramyl Dipeptid
113
Abkürzungsverzeichnis
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
MUC
Mucin
NFATc1
Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen Calcineurin abhängiger
Faktor 1
NF-κB
Nuklear factor kappa light polypeptide gene enhancer in BZellen
NOD
nucleotide-binding oligomerization domain containing
OCTN
Organic cation transport protein
PBS
Phosphat gepufferte Salzlösung
PCR
Polymerase - Kettenreaktion
PD
programmed cell death
Ppia
peptidyl isomerase A (Cyclophilin A)
qPCR
quantitative Polymerase - Kettenreaktion
RNA
Ribonukleinsäure
RT-PCR
real time Polymerase - Kettenreaktion
SDS
Sodium dodecyl sulfate
TAE
Tris Acetat EDTA Puffer
t-bet
T-box 21
TBS
TRIS gepufferte Salzlösung
TBST
TRIS gepufferte Salzlösung mit TWEEN
TH
T-Helfer Zelle
TLR
toll-like-receptor
TNF
Tumor necrosis factor
TRIS
Trishydroxymethylaminomethan
Vav1
vav1 guanine nucleotide exchange factor
WT
Wildtyp
114
Vorveröffentlichung
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
Im Zuge der Arbeit entstand eine Mitarbeit an folgender Publikation:
Gerlach K, Daniel C, Lehr HA, Nikolaev A, Gerlach T, Atreya R, Rose John S, Neurath
MF, Weigmann B, Transcription factor NFATc2 controls the emergence of colon cancer
associated with IL-6- dependent colitis, Cancer research 2012, 17: 4340 - 50
115
Danksagung
9. Danksagung
Bei der Bearbeitung dieser Arbeit schulde ich vielen Menschen Dank.
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Dr. rer. nat. Benno Weigmann für die Überlassung
des Themas, die exzellente Betreuung und die ständige Motivation zur Fertigstellung
der Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. med. Neurath danke ich für die Schaffung der Rahmenbedingungen,
um diese Arbeit erfolgreich in Angriff nehmen zu können.
Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern der Medizinischen Klinik 1, die mich bei der
Anfertigung dieser Arbeit unterstützt haben.
Herrn Dr. med. Parsch und Herrn Prof. Dr. Agaimy danke ich für die konstruktive
wissenschaftliche Korrespondenz.
Ich hoffe, dass der auf das unabdingbare Maß beschränkte Einsatz der Labormäuse zu
einem erkenntnisreichen wissenschaftlichen Beitrag geführt hat.
Weiter möchte ich mich ganz besonders bei meinen Eltern und meiner Schwester
bedanken, ohne die ich nicht so weit gekommen wäre. Sie haben mir während des
ganzen Studiums und bei der Anfertigung dieser Arbeit stets hilfreich zur Seite
gestanden.
116