UVB vermittelte DNA-Schäden und Immunsuppression in humanen

Aus der Universitäts-Hautklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg/Br.
UVB vermittelte DNA-Schäden und Immunsuppression
in humanen dendritischen Zellen
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2001
von Ute Stefani Haaga
geboren in Stuttgart
Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. Martin Schumacher
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. Jan C. Simon
2. Gutachter:
PD Dr. med. Joachim Kühr
Jahr der Promotion: 2002
Meinen Eltern gewidmet
ABKÜRZUNGEN
ABKÜRZUNGEN
[3H]-AdR
Tritium-Adenosin
[3H]-TdR
Tritium-Thymidin
CD
Differenzierungsgruppe („cluster of differentiation“)
CHS
Kontakthypersensitivität
CPD
Cyclobutandimer
cRPMI
Zellkulturmedium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DTH
Immunreaktion vom Spättyp (Typ IV)
EDTA
Äthylendiamintetraessigsäure (Chelatbildner)
ELISA
Enzym-Immunoassay („enzyme-linked-immunosorbent-assay“)
FACS
Fluoreszenz-aktivierter-Zell-Sortierer
Fc
konstante Region eines IgG Antikörpermoleküls
FCS
fetales Kälberserum
FITC
Fluorescein-Isothiozyanat; Fluoreszenzfarbstoff
GM-CSF
Granulozyten/Makrophagen Kolonien stimulierender-Faktor
hDZ
humane dendritische Zelle
HLA
menschliches Leukozyten Antigen
hTZ
humane T-Zelle
ICAM
Adhäsionsmolekül („intracellular adhesion molecule“)
IFN
Interferon
IL
Interleukin
LZ
Langerhanszelle
MACS
Magnet-aktivierte-Zell-Sortierung
MECLR
gemischte Epidermalzellen/Lymphozytenreaktion
MHC
großer Histokompatibilitätskomplex
MLR
gemischte Lymphozytenreaktion
PBMC
mononukleäre Zellen im Blut
PBS
Puffer mit phosphorsaurem Salz
pdApdA
Adenosindinukleotid
PHA
Phytohämagglutinin
ABKÜRZUNGEN
PI
Propidiumjodid, Fluoreszenzfarbstoff
PRL
photoreaktivierendes Licht
PS
Photosomenâ (Liposomen mit Photolyase von A. nidulans)
pTpT
Thymidindinukleotid
PUVA
Psoralen plus UVA
RNA
Ribodesoxynukleinsäure
RNAse
Ribodesoxynuklease
T4N5
Endonuklease V aus Phage T4
TAE
Puffer aus Tris, Essigsäure und EDTA
TE
Puffer aus Tris und EDTA
Th1
Helferzellen der Gruppe 1
TNF
Tumornekrose-Faktor
UVA
Ultraviolette Strahlung der Wellenlänge 320-400 nm
UVB
Ultraviolette Strahlung der Wellenlänge 290-320 nm
UVC
Ultraviolette Strahlung der Wellenlänge 250-290 nm
UVR
Ultraviolette Strahlung
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1.
EINLEITUNG
1
1.1
Einfluß von UV-Strahlung auf antigenpräsentierende Zellen der Haut
1
1.2
Photobiologie von UV-induzierten DNA-Schäden
2
1.3
1.4
Die Rolle von DNA-Schäden und Reparatur in antigenpräsentierenden Zellen
Humane dendritische Zellen (hDZ) aus dem Blut als Modell für
antigenpräsentierende Zellen der Haut
7
8
2.
PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG
9
3.
MATERIAL UND METHODEN
10
3.1
Medien und Puffer
10
3.2
Reagenzien
11
3.3
Antikörper
12
3.4
Zellisolation
13
3.5
Zellkultur
15
3.6
UVB- und UVA1-Bestrahlung der hDZ
15
3.7
Inkubation der hDZ mit Photosomenâ und Photoreaktivierung
16
3.8
Gewinnung von genomischer DNA aus hDZ
16
3.9
Nachweis von UV-induzierter Schädigung in genomischer DNA durch ELISA
18
3.10
In vitroProliferationsassays
19
3.11
Immunfluoreszenzfärbungen und Durchflußzytometrie
20
3.12
Zell-Zyklus-Analysen mit Durchflußzytometrie
21
3.13
Zellzahlbestimmungen
21
3.14
Zytokinbestimmungen mit ELISA
22
4.
ERGEBNISSE
23
4.1
Einfluß von UVB- und UVA1-Bestrahlung auf die antigenpräsentierende
Funktion von hDZ
23
4.2
Induktion von CPD in hDZ nach UVB- und UVA1-Bestrahlung
24
4.3
Einfluß von Photosomenâ auf die Vitalität von hDZ in vitro
26
4.4
Reparatur von CPD in der DNA von hDZ
27
4.5
4.6
Effekte von PhotosomenÒ auf die antigenpräsentierende Funktion von mit UVB
bestrahlten hDZ
29
3
Einfluß von pTpT auf das Proliferationsverhalten von hTZ im [ H]-Thymidinassay
31
4.7
Einfluß von pTpT auf das Proliferationsverhalten von hTZ im [3H]-Adenosinassay
35
4.8
Einfluß von pTpT auf den Zellzyklus von proliferierenden hTZ
37
4.9
Einfluß von pTpT auf die Zellzahl von proliferierenden hTZ
39
4.10
Einfluß von pTpT auf die IL-2-Sekretion von proliferierenden hTZ
42
4.11
Einfluß von pTpT auf die Expression von Oberflächenmolekülen hDZ
44
5.
DISKUSSION
45
5.1
UVB- und UVA1-Bestrahlung führt zu einer Inhibition der antigenpräsentierenden
Funktion von hDZ in vitro
45
5.2
UVB- und UVA1-Bestrahlung führt zur Induktion von CPD in der DNA von hDZ
5.3
Reparatur mit Photosomen® in vitro führt zu einer Reduktion von CPD
50
in der DNA von UVB geschädigten hDZ
52
5.4
Reparatur von CPD in vitro führt nicht zur Wiederherstellung
antigenpräsentierenden Funktion von mit UVB geschädigten hDZ
der
54
5.5
In vitro Effekte von pTpT auf die Immunfunktion von hDZ und hTZ
59
5.6
Ausblick
64
6.
ZUSAMMENFASSUNG
66
7.
LITERATUR
67
DANKSAGUNGEN
LEBENSLAUF
EINLEITUNG
1
1.
EINLEITUNG
1.1
Einfluß von UV-Strahlung auf antigenpräsentierende Zellen der Haut
Ultraviolette Strahlung (UVR), wie sie im natürlichen Sonnenlicht vorkommt, besitzt
neben positiven Eigenschaften (körperliches Wohlbefinden, Vitamin-D-Synthese) auch
negative Folgen für die menschliche Gesundheit. Diese können sich in Sonnenbrand,
vorzeitiger Hautalterung, Kataraktbildung und der Induktion von Hautkrebs äußern. Zusätzlich
entdeckte man vor ungefähr 20 Jahren, daß UV-Photonen mit der Haut interagieren und
dadurch die Aktivität des Immunsystems beeinflußen. Dies bedeutete, daß UVR nicht nur
normale Zellen in Krebszellen verwandeln kann, sondern daß die entarteten Zellen nun auch
nicht mehr durch das UV-geschwächte Immunsystem eliminiert werden können. Erste
Hinweise auf die immunsuppressive Wirkung von UVB-Strahlen lieferten Untersuchungen im
Mausmodell von Kripke et al. (1974) über die Antigenität von UVB-induzierten Hauttumoren.
Diese stark antigenen Tumoren wurden abgestoßen, wenn sie auf ein syngenes unbestrahltes
Tier transplantiert wurden und wuchsen ungehemmt in bestrahlten Tieren, was auf eine
systemische UVB-induzierte Immunsuppression hinwies. Diese Suppression war zusätzlich
durch Lymphozyten der Milz von bestrahlten Mäusen auf unbestrahlte Tiere übertragbar
(Daynes und Spellmann 1977).
In späteren Studien wurden vor allem an Kontakthypersensitivitätsreaktionen (CHS-Reaktion)
im Tiermodell die Effekte von UVB-Strahlung untersucht. Man unterscheidet dabei zwei
Modelle der Immunsuppression:
Beim Modell der systemischen Immunsuppression wird eine hohe UVB-Dosis von 10-50 kJ/m2
appliziert (High-Dose-Modell). Es entwickelt sich eine Suppression der CHS-Reaktion
unabhängig vom Auftragungsort des Haptens, die vom Auftreten spezifischer Suppressor-TZellen begleitet wird (Kripke 1990). In diesem Modell sind antigenpräsentierende Zellen nicht
betroffen (Lynch et al. 1983, Kripke und McClendon 1986).
Das andere Modell ist die sogenannte lokale Immunsuppression, bei der die Haut mit einer
niedrigen UVB-Dosis von 100-200 J/m2 bestrahlt wird (Low-Dose-Modell). In diesem Modell
entwickelt sich nur eine Suppression der CHS-Reaktion wenn das Hapten direkt auf die
bestrahlte Haut appliziert wird. Eine entscheidende Rolle bei der lokalen Form (Low-doseModell) der Immunsuppression spielen antigenpräsentierende Zellen.
EINLEITUNG
2
Die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis sind die Langerhanszellen (LZ).
Bei der Entstehung einer CHS-Reaktion kommt ihnen eine zentrale Rolle zu. Nach Aufnahme
des Antigens wandern diese Zellen in die regionalen Lymphknoten und stimulieren naive TZellen (Kripke et al. 1990). UV-Bestrahlung in vivo führt zu einer reduzierten CHS-Antwort,
sowie zu einer morphologischen Alteration und Reduktion von LZ in der Epidermis (Toews et
al. 1980). Cruz et al. identifizierte LZ der Haut als funktionelles Ziel der UV-induzierten
Immunmodulation. Er beobachtete, daß isolierte haptenbeladene LZ bei intravenöser
Readministration eine CHS-Reaktion induzierten, während bestrahlte haptenbeladene LZ
Toleranz induzierten (Cruz et al. 1989). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die
verabreichten LZ wieder in die Haut zurückwanderten und je nach UVB-Erfahrung Toleranz
oder CHS induzierten (Cruz et al. 1990). Stingl et al. (1981) konnte dieselbe reduzierte CHSReduktion nach in vitro Bestrahlung dieser Zellen erreichen. Die in vitro bestrahlten LZ sind in
ihrer Fähigkeit, Th-1-Zellen zu aktivieren beeinträchtigt (Simon et al. 1990) und sie induzieren
in letzteren eine langanhaltende antigenspezifische Toleranz (Simon et al. 1991). Auch LZ, die
nach Bestrahlung und Haptenbeladung aus der Epidermis in die regionalen Lymphknoten
ausgewandert sind können nach Readministration keine CHS-Reaktion mehr auslösen.
(Okamoto et al. 1984, Saijo et al. 1995, Vink et al. 1996). In in vitro Systemen wurde mit
humanen Epidermalzellen und aufgereinigten Langerhanszellsuspensionen, anhand einer
Proliferationsreduktion
in
der
MLR
und
MECLR,
eine
Beeinträchtigung
der
allostimulatorischen Fähigkeit nach UVB-Bestrahlung nachgewiesen (Austad und Braathen
1985, Cooper et al. 1985, Weiss et al. 1995, Rattis et al. 1995). Richters et al. (1995) konnte
eine ähnliche Reduktion der allostimulatorischen Fähigkeit mit in vivo bestrahlten und aus der
Epidermis ausgewanderten antigenpräsentierenden Zellen zeigen.
1.2
Photobiologie von UV-induzierten DNA-Schäden
Wichtig für das genaue Verständnis der UV-induzierten Immunsuppression sind die
molekularen Veränderungen, die an einer Zelle nach Bestrahlung auftreten. Allgemein
anerkannt ist die Annahme, daß biologische Effekte durch UVR nur dann eintreten, wenn sie
von einem Photorezeptor in der Haut absorbiert wird. Dieser wandelt danach die Energie in ein
biochemisches Signal um. Dieses Signal ist dann verantwortlich für die Veränderungen auf
zellulärer Ebene wie z.B. Wachstum, Expression kostimulatorischer Moleküle und
EINLEITUNG
3
Zytokinsekretion, die schließlich zur Modulation der Immunantwort führt. Eine einheitliche
Meinung über die Identität des verantwortlichen Photorezeptors gibt es jedoch nicht. Mehrere
Moleküle in der Haut können UV-Strahlen absorbieren. Dazu zählen die zellulären Strukturen
wie DNA (Sage 1993), ungesättigte Membranlipide der Zellmembranen (Black 1987), die
durch
Radikalbildung
oxidative
DNA-Schädigungen
(Beehler
et
al.
1992)
oder
Lipidperoxidationsreaktionen hervorrufen, welche wiederum intrazelluläre Signalkaskaden
aktivieren (Devary et al. 1993, Simon et al. 1994, Caceres-Dittmar et al. 1995). Weiterhin kann
UV-Licht von der im Stratum corneum vorliegenden Trans-Urokaninsäure absorbiert werden,
was zu deren Umwandlung in Cis-Urokaninsäure führt. Cis-Urokaninsäure besitzt
immunsuppressive Eigenschaften (Noonan und DeFabo 1992).
Photobiologische Veränderungen des Immunsystems werden durch Wellenlängen des
elektromagnetischen Spektrums induziert, die im Bereich von UV (200-400 nm) und
sichtbarem Licht (400-760 nm) liegen. Die hauptsächliche Quelle von Strahlung dieser
Wellenlängen, ist die Sonne. Ultraviolettes Licht wird in drei Hauptgruppen unterteilt: UVC
(200-290 nm), UVB (290-320 nm) und UVA, unterteilt in UVA1 (340-400 nm) und UVA2
(320-340 nm). Der erste Schritt einer photobiologischen Antwort ist die Absorption von
Photonen durch einen Photorezeptor. Die Energie des Photons wird auf den
Photorezeptor
übertragen und verändert dadurch dessen Molekülstruktur. Diese neu entstandenen Moleküle
werden als Photoprodukte bezeichnet. Jeder Photorezeptor besitzt aufgrund seiner molekularen
Struktur ein spezifisches Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum. Bei der
Identifizierung von Photorezeptoren wird häufig das Aktionsspektrum einer photobiologischen
Antwort verwendet. Ideal ist es, wenn das Aktionsspektrum dem Absorptionsmaximum eines
Photorezeptors entspricht. DNA absorbiert elektromagnetische Strahlung im Bereich von 230300 nm, weshalb UVC und UVB-Strahlung hauptsächlich für die DNA-Schädigungen
verantwortlich ist. Es können allerdings auch längerwellige Strahlen DNA-Schäden induzieren,
da die Photonenenergie von anderen Photorezeptoren auf die DNA übertragen werden kann. In
der DNA bilden sich in einer Photoadditionsreaktion zwischen zwei Pyrimidinbasen eines
Stranges am häufigsten Cyclobutandimere (CPD) (Abb. 1) aus. Ein weiteres wichtiges
Photoprodukt dieser zwei Basen ist das 6-4-Photoprodukt und dessen Isomerform, das DewarPhotoprodukt (Deering und Setlow 1963, Freeman et al. 1989). Mit der Entwicklung von
monoklonalen Antikörpern gegen CPD oder 6-4-Photoprodukte konnten beide Typen
EINLEITUNG
unabhängig voneinander detektiert
4
und Aussagen über Reparaturmechanismen gemacht
werden (Mizuno et al. 1991, Mori et al. 1991, Nakagawa 1998).
Um die Anzahl an Mutationen durch DNA-Schäden zu verringern hat die Zelle spezifische
Reparaturmechanismen entwickelt. Man unterscheidet drei Formen von DNA-Reparatur. Die
wichtigste ist die Exzisionsreparatur. Hier werden mit Hilfe verschiedener zelleigener Enzyme
die Photoprodukte aus der DNA herausgeschnitten und durch neue Nukleotide ersetzt. Der
zweite Typ ist die sogenannte Postreplikationsreparatur, bei der neusynthetisierte
Tochterstränge als Vorlage für unreplizierte Abschnitte mit Photoläsionen verwendet werden.
Die dritte Form, die photoenzymatische Reparatur, wird durch das Enzym Photolyase
katalysiert, welches FADH2 und Pterin enthält. Der Mechanismus der Photoreaktivierung ist in
Abb. 2 dargestellt. Das Enzym erkennt in einem lichtunabhängigen Schritt die Dimere und
bindet an das geschädigte Dinukleotid. Durch Aktivierung mit UVA-Licht der Wellenlänge
365-400 nm wird ein Elektron an das Dimer abgegeben, was zu einer Monomerisierung der
beiden Thymidinbasen führt. (Sancar 1990).
Durch die Möglichkeit der Isolierung von Photolyasen aus Hefen, Coli-Bakterien oder
Blaualgen konnten anhand exogener Zugabe des Enzyms detailierte Aussagen über die DNAReparatur durch Photoreaktivierung gewonnen werden (Wood et al. 1989, Roza et al. 1990,
Mizuno et al. 1991, Mori et al. 1991). Die Photoreaktivierung von Pyrimidindimeren wurde in
einer großen Anzahl von Mikroorganismen und Tieren (Ley 1985) gefunden. Obwohl es einige
Veröffentlichungen über diese Art von Reparatur in menschlicher Haut gibt (Sutherland et al.
1980,Eggset et al. 1983, Ogut et al. 1989), ist die Rolle der Photoreaktivierung in höheren
Säugetieren immer noch umstritten. Alcalay et al. (1990) konnte keinen Anhalt für das
Vorhandensein eines photoenzymatischen Reparaturmechanismus in menschlichen LZ finden.
EINLEITUNG
5
Abb. 1:
Bildung von Photoprodukten in der DNA nach UV-Bestrahlung
Nach UV-Bestrahlung kann es zwischen zwei benachbarten Thymidinbasen zur Bildung von
Photoprodukten kommen. Am häufigsten entsteht das Cyclobutandimer bei dem sich zwischen
zwei benachbarten Thymidinbasen eine Cyclobutanringstruktur ausbildet. Weniger häufig ist
das 6-4-Photoprodukt dessen Bildung mehr Energie benötigt. (modifiziert nach einer
Abbildung aus Scientific American, Science & Medicine 5/6 /98)
EINLEITUNG
6
Abb. 2:
Mechanismus der enzymatischen Photoreaktivierung
Die Photolyase erkennt die durch UV-Strahlung induzierten Cyclobutandimere in der DNA und
bindet sich in einem lichtunabhängigen Schritt an diese. Nach Absorption von sichtbarem Licht
mit der Wellenlänge von 365-400 nm durch das Enzym wird ein Elektron an das Dimer
abgegeben. Dies führt zu einer Rückführung des Dimeres in die ursprüngliche Nukleotidform.
(modifiziert nach BA Gilchrest, Photodamage)
EINLEITUNG
1.3
7
Die Rolle von DNA-Schäden und Reparatur in antigenpräsentierenden Zellen
Die ersten Studien,daß DNA-Schäden in Form von CPD in die systemische und lokale
Immunsuppression involviert sind, wurden an Monodelphis domestica (südamerikanische
Opossumart) von Applegate et al. (1989) durchgeführt. Zellen dieses Beuteltieres enthalten
eine Photolyase, die CPD reparieren kann. Die enzymatische Photoreaktivierung verhinderte
sowohl die systemische als auch die lokale Suppression einer CHS-Reaktion. In
unterschiedlichen
Ansätzen
wurde
gezeigt,
daß
in
Liposomen
verpackte
DNA-
Reparaturenzyme DNA-Schäden an UVB-exponierter Maushaut in vivo entfernen können.
Liposomen, die das Exzisionreparaturenzym T4 Endonuklease V (T4N5) enthalten, konnten die
Rate der Dimerentfernung bei sofortiger Applikation auf UVB-exponierte Maushaut erhöhen
(Yarosh et al. 1990). Diese Behandlung verhinderte die UV-induzierte Suppression der CHSReaktionen im systemischen Modell (Kripke et al. 1992). Weitere Studien zeigten, daß DNASchäden für die Freisetzung von immunregulatorischen Zytokinen wie IL-10 (Nishigori et al.
1996) und TNF-a verantwortlich sind (Kibitel et al. 1998). In einem anderen Ansatz wurde der
direkte Einfluß von DNA-Schädigungsprodukten in Form von Thymidindinukleotiden (pTpT)
auf die Freisetzung von TNF-a untersucht. Leverkus et al. (1997) konnte bei Inkubation einer
Zellkultur mit pTpT eine erhöhte Freisetzung von TNF-a beobachten. Cruz et al. (1998)
induzierte in vivo in der Maushaut durch intrakutane Applikation von pTpT eine erhöhte TNFa Freisetzung. Außerdem konnte er im lokalen System durch pTpT-Auftragung auf die
Maushaut eine Suppression der CHS-Reaktion erreichen.
Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der Beinträchtigung von
antigenpräsentierenden Zellen und DNA-Schäden zeigte Applegate et al. (1989) die durch eine
enzymatische Photoreparatur die von Toews et al. (1980) gezeigte Depletion von LZ und die
lokale Immunsuppresion verhindern konnte. Einen Nachweis, daß UVB-Bestrahlung in LZ
DNA-Schäden induziert, erbrachten Studien, in denen DNA-Schäden an epidermalen LZ und
an dendritischen Zellen in regionalen Lymphknoten nachgewiesen wurden (Yarosh et al. 1994,
Kripke et al. 1995, Vink et al. 1996). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die DNAgeschädigten Zellen in ihrer Fähigkeit eine CHS-Reaktion in vivo zu induzieren beeinträchtigt
sind (Wolf et al. 1995, Kripke et al. 1996, Vink et al. 1996). Es gibt bisher wenig in vitro Daten
über antigenpräsentierende Zellen mit nachgewiesenen DNA-Schäden und ihre Fähigkeit TZellen zu stimulieren. Vink et al. (1997) konnte in vitro an syngenen murinen T-Zellen, die mit
DNA-geschädigten dendritischen Zellen aus regionalen Lymphknoten stimuliert waren, eine
EINLEITUNG
8
Reduktion der IFN-g Sekretion nachweisen. Im humanen System zeigte Kremer et al. (1997),
daß aus der Epidermis ausgewanderte dendritische Zellen mit DNA-Schäden keine
Beeinträchtigung der allostimulatorischen Fähigkeit aufweisen.
1.4
Humane dendritische Zellen (hDZ) aus dem Blut als Modell für
antigenpräsentierende Zellen der Haut
Die in der Haut vorkommenden LZ stammen aus dem Knochenmark und gehören zur
Familie der dendritischen Zellen. Dendritische Zellen fungieren als professionelle
antigenpräsentierende Zellen und kommen in allen Geweben außer im Gehirn vor (Romani und
Schuler 1992). Sie besitzen eine charakteristische dendritische Morphologie und exprimieren
viele MHC-II-Moleküle und wenige Marker aus der Monozyten-Makrophagenlinie auf ihrer
Oberfläche. Sie zeigen alle eine große Fähigkeit zur Stimulation von ruhenden T-Zellen in
Proliferationsassays wie der MLR (Romani, Schuler 1992). Die am besten untersuchten
dendritischen Zellen sind die in den suprabasalen Schichten der Epidermis gelegenen LZ. Sie
sind für die Auslösung einer primären T-Zell-Antwort von großer Bedeutung. Nach Aufnahme
des Antigens wandern die LZ über die afferenten Lymphbahnen in die regionalen
Lymphknoten, wo sie das Antigen über ihre MHC-II-Komplexe an naive T-Zellen präsentieren
(Simon et al. 1992). Durch die Fähigkeit naive T-Zellen zu stimulieren, haben LZ eine große
Bedeutung
bei
der
Entstehung
von
Kontaktallergien
und
der
Abstoßung
von
Hauttransplantaten (Silberberg et al. 1976, Toews et al. 1980, Cruz et al.1990).
Die Anreicherung von LZ aus der Epidermis ist sehr aufwendig, und es lassen sich aufgrund
des geringen Anteils an der Gesamtpopulation in der Epidermis (2-4 %) nur geringe Zellzahlen
erzielen (Dittmar 1994). Seit kurzem ist es möglich dendritische Zellen aus Monozyten des
Blutes zu generieren. Durch einen Zytokincocktail aus GM-CSF und IL-4 erfolgt eine
Umwandlung bzw. Reifung zu dendritischen Zellen ( Romani et al. 1996). Mit dieser Methode
lassen sich humane dendritische Zellen (hDZ) in hoher Reinheit und Zellzahl generieren.
Da LZ Teil des dendritischen Zellsystems sind und aus Monozyten generierte hDZ stark MHCII und B-7-2-Moleküle exprimieren (Stingl, Bergstresser 1995) werden aus dem Blut generierte
dendritische Zellen als Modell für antigenpräsentierende Zellen der Haut verwendet.
EINLEITUNG
2.
9
PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG
UVB-Bestrahlung führt zu einer Immunsuppression und zur Schädigung zellulärer
DNA in Form von Cyclobutandimeren und 6-4-Photoprodukten. Die durch UV-Bestrahlung
induzierten DNA-Schäden besitzen eine Schlüsselrolle bei der Modulation der Immunantwort.
Eine entscheidende Rolle bei der UVB bedingten Immunsuppression in der Haut nehmen die
Änderungen an antigenpräsentierenden Zellen wie Langerhanszellen und dendritischen Zellen
ein. Es gibt Hinweise, daß DNA-Schäden für die beeinträchtigte Funktion bestrahlter
antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sind. Diese Hypothese wird vor allem aus Daten
gestützt, die aus Experimenten muriner in vivo Systeme stammen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einem definierten humanen in vitro System die
Hypothese zu überprüfen, ob DNA-Schäden für die beeinträchtigte Immunfunktion von
antigenpräsentierenden Zellen verantwortlich sind. Hierbei interessierten folgende Fragen:
1.
Werden in hDZ durch UV-Bestrahlung DNA-Schäden induziert ?
2.
Welcher Zusammenhang besteht zwischen DNA-Schäden und der Fähigkeit von hDZ
eine T-Zell-Antwort zu induzieren?
3.
Kann durch eine enzymatische Photoreparatur von DNA-Schäden in hDZ deren
Immunfunktion wieder hergestellt werden?
4.
Sind Thymidindinukleotide der Mediator für die immunsuppressiven Wirkungen
von UVB auf hDZ und hTZ?
MATERIAL UND METHODEN
3.
Material und Methoden
3.1
Medien und Puffer
10
1. Kulturmedium (cRPMI): „RPMI 1640“ (PAA Laboratories, Linz, Österreich) mit 10 %
Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS; PAA Laboratories), 1 % L-Glutamin (Gibco,
Paisley, Schottland) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco)
2. MACS-Puffer: PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco) mit 5 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure
(EDTA; Sigma, Deisenhofen) und bovinen Serumalbumin (BSA; Sigma); pH 7,2 (Merck,
Darmstadt)
3. TAE- Elektropherese- Puffer (50x): 3 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris; Merck),
57,1 ml 99,8 %ige Essigsäure (Riedel-de Haën, Seelze) und 50 mM EDTA in Aqua bidest; pH
7,8
4. Verdauungspuffer: 100 mM NaCl (Merck), 1 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethan
(Tris, Merck), 25 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA; Sigma) und 0,5 %
Natriumlaurylsulfat (SDS; Carl Roth, Karlsruhe) in Aqua bidest, pH 8 und 0,1 mg/ml
Proteinase K ( Boehringer, Mannheim)
5. DNA-Extraktionslösung: 25: 24: 1 Roti- Phenol (Carl-Roth)/Chloroform (Trichlormethan,
Riedel-de Haën)/ Isoamylalkohol ( Merck)
6. TE-Puffer: 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris, Merck) und 1 mM
Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA; Sigma,) in Aqua bidest; pH 8 (Merck)
7. DNA- ELISA Waschpuffer: PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco) mit 0,05 % Tween 20 (Fluka
Chemika, Buchs)
8. Phosphat- Citrat- Puffer: Phosphat- Citrat- Puffer Tabletten (PCB; Sigma) in Aqua bidest
9. Glucosepuffer: 1 g Glucose (Merck) in 1 l PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco)
10. Propidiumjodid (PI) Färbelösung: 10 ml Glucosepuffer mit 1000 Units RNase A und 0,5
ml 20x PI-Lösung (Sigma)
11. Erythrozytenlysepuffer: 0,15 M Ammoniumchlorid (Sigma), 1 mM Kaliumkarbonat
(Merck), 0,1 mM Natrium-EDTA (Sigma) in 800 ml Aqua bidest, pH 7,2-7,4
MATERIAL UND METHODEN
3.2
11
Reagenzien
radioaktiv markiertes [Methyl 3H]-Thymidin ([3H]-TdR) und radioaktiv markiertes [Methyl
3
H]-Adenosin ([3H]-AdR) stammen von Amersham, Inc. Braunschweig. Trypanblau für die
Vitalfärbung in der Neubauerzählkammer von Boehringer, Mannheim. Ficoll-Paque für
Dichtezentrifugation stammen von Pharmacia, Uppsala, Schweden. Phytohämagglutinin (PHA)
(Sigma). p(dT)2-Ammonium Salz Dinukleotid (50 Units) und p(dA)2-Ammonium Salz
Dinukleotid (50 Units) (The Midland Certified Reagant Company, Texas, USA).
MATERIAL UND METHODEN
3.3
12
Antikörper
Sämtliche Antikörper und Färbereagenzien sind in den Tabellen 1-2 zusammengefaßt
Tabelle 1.
primäre Antikörper:
Spezifität Klon
Isotyp
Fluorochrom Herkunft
CD115
2-4A5-4
rIgG1
3
CD14
RM052
mIgG2
2
CD1a
B17.20.9
mIgG2a
2
CD28
CD28.2
mIgG1
2
CD3
UCHT-1
mIgG1
2
CD40
628.5
mIgG1
3
CD54
84H10
mIgG1
2
CD80
BB1
mIgM
1
CD83
HB15a
mIgG2b
2
CD86
p2.2
mIgG2b
1
CD95
DX2
mIgG1
2
HLA-DR
L234
mIgG2a
FITC
1
IgG1
679.1Mc7
mIgG1
FITC
2
HLA-
HB145
mIgG1
4
OKM1
mIgG1
4
DR/DQ
CD11b
TDM-2
Mori et al. 1991
1
Pharmingen, Hamburg
3
Calbiochem, Bad Soden
2
Coulter Immunotech, Hamburg
4
ATCC, Rockville, MD, (USA)
MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 2.
13
Sekundär- und Tertiärreagenzien
Spezifität
Fluorochrom
Konjugat
Herkunft
Ziege-anti-Maus IgG H+L
Microbeads
1
Schaf-anti-Maus IgG H+L
Dynalbeads
2
Ziege-anti-Maus IgG H+L
Biotin
3
Streptavidin
Peroxidase
3
Ziege-anti-Maus IgG H+L
FITC
3
Ziege-anti-Ratte IgG H+ L
FITC
3
Schaf-anti-Maus IgG H+L
1
Miltenyi, Bergisch-Gladbach
2
Dynal, Hamburg
3
Dianova, Hamburg
3.4
Zellisolation
3
3.4.1 Gewinnung von mononukleären Zellen (PBMC)
Ein Leukozytenkonzentrat („Buffy coat“) von einem gesunden, humanen Spender wurde durch
Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgetrennt.
Dabei wurde das Leukozytenkonzentrat im Verhältnis 1:1 mit PBS w/o Ca2+/Mg2+ vermischt
und jeweils 30 ml dieser Suspension auf 15 ml Ficoll-Paque überschichtet. Um die Zellen
aufzutrennen wurden sie 25 Minuten lang mit 1400 Upm bei 21 °C zentrifugiert. Die
mononukleären Zellen (PBMC) lagerten sich in der Interphase des Gradienten ab und wurden
mit der Pipette abgenommen. Zur vollständigen Elimination noch verbleibender Erythrozyten
wurde das Pellet 2 Minuten mit Erythrozytenlyselösung inkubiert und anschließend über ein
Zellfilter gegeben. Vor der weiteren Verarbeitung wurde das Zellpellet mit den mononukleären
Zellen 2x mit PBS gewaschen.
MATERIAL UND METHODEN
14
3.4.2 Markierung der CD14-positiven Zellen
Die PBMC wurden in einem verschließbaren 14 ml-Röhrchen (Falcon) in 2 ml MACS-Puffer
aufgenommen und mit 50 ml CD14-Antikörper auf einem Rüttler für 45 Minuten bei 4 °C
inkubiert. Daraufhin wurde 2x mit PBS gewaschen, zentrifugiert und das Zellpellet in 2 ml
MACS-Puffer resuspendiert. Nun wurden die Zellen mit 50 ml
Ziege-anti-Maus-IgG-
Microbeads unter gleichen Bedingungen inkubiert, anschließend mit MACS-Puffer gewaschen,
zentrifugiert und in 5 ml MACS- Puffer resuspendiert
3.4.3 Anreicherung der CD 14-positiven Zellen über MACS
Die Anreicherung erfolgte bei 4 °C. Die VS+ Säule wurde in den MACS-Magneten (beides
Miltenyi) eingesetzt und zunächst mit 5 ml MACS-Puffer gewaschen. Zur Gewinnung einer
Einzelzellsuspension wurden die Zellen durch ein Zellsieb (30 mm Maschenweite; Miltenyi)
auf die Säule aufgetragen. Die Negativfraktion aus unmarkierten Zellen, die nicht magnetisch
in der Säulenmatrix festgehalten wurden, lief durch und wurde in einem sterilen 14 mlRöhrchen gesammelt. Aus ihr wurden später die T-Zellen isoliert. Die Säule wurde noch 2x mit
jeweils 5 ml MACS-Puffer gewaschen, um eine möglichst reine Positivfraktion zu erhalten.
Anschließend wurde die Säule aus dem Magneten genommen und die spezifisch über
Microbeads in der Matrix festgehaltenen Zellen unter Druck mit 5 ml Puffer in ein neues
steriles Röhrchen gespült. Diese Zellen bildeten die Positivfraktion. Beide Fraktionen wurden
herunterzentrifugiert und in cRPMI aufgenommen. Nun wurden die Zellen in der
Neubauerkammer ausgezählt. Die Zellzahl pro ml Ausgangslösung ergab sich aus folgender
Formel:
gezählte Zellen aus vier Feldern mit jeweils 12 Quadranten geteilt durch 4 x 10.000 =
Zellzahl/ml.
Die Ausbeute aus einem „buffy coat“ lag bei ca. 15-30 x 106 Zellen.
3.4.4 T-Zell-Isolation
Aus der Negativfraktion nach der MACS-Separation wurden 30 x 106 PBMC in 1 ml PBS mit
5 % FCS aufgenommen. Sie wurden mit 1 ml HB 145-Überstand (anti-HLA-DR/-DQ) und 1
ml OKM1-Überstand (anti-CD11b) 45 Minuten lang bei 4 °C auf einem Rüttler inkubiert.
MATERIAL UND METHODEN
15
Danach wurde gewaschen, in 1 ml PBS/5 % FCS resuspendiert und mit 375 ml Schaf-antiMaus IgG Dynalbeads für 45 Minuten bei 4 °C auf einem Rüttler inkubiert. Nach dem
Waschen wurde das Zellpellet in 5 ml PBS mit 5 % FCS aufgenommen und 3 Minuten lang in
den Magnetständer gestellt. Der Überstand mit den darin enthaltenen unmarkierten T-Zellen
wurde mit einer Pipette abgesaugt, wieder in den Magnetständer gestellt und nochmals neu
abgenommen. Die T-Zellen wurden gewaschen, in cRPMI aufgenommen und in der
Neubauerkammer gezählt.
3.5
Zellkultur
Die isolierten CD14-positiven Zellen wurden in 12 ml cRPMI aufgenommen. Um sie zu
dendritischen Zellen (hDZ) ausreifen zu lassen, wurde ihnen humanes GM-CSF (Leukomax
400â, Sandoz AG, Nürnberg) in einer Konzentration von 8000 Einheiten/ml Medium und
humanes rekombinantes IL-4 (Genzyme, Rüsselsheim) in einer Konzentration von 500
Einheiten/ml Medium zugegeben. Nun wurde die Zellsuspension in einer 6-Loch-Platte
(Greiner, Frickenhausen) zu jeweils 2 ml auspipettiert und im Brutschrank bei 37 °C und 5 %
CO2 kultiviert. Am vierten Tag wurden nochmals cRPMI, GM-CSF und IL-4 dazugegeben.
3.6
UVB- und UVA-Bestrahlung der hDZ
Die reifen hDZ wurden an Tag 6 geerntet und mit PBS 2x gewaschen, um Reste von Phenolrot
des Mediums vor der Bestrahlung vollständig zu entfernen. Danach wurden 5 x 105 Zellen in 3
ml PBS auf 35 mm2 Plastikpetrischalen (Falcon) ausplattiert. Als UVB-Quelle dienten vier
ungefilterte Fluoreszenzröhren TL-12 (Philips, Hamburg), die fest in einem Abstand von 46 cm
über der Bestrahlungsfläche montiert waren. Die Emission der Fluoreszenzröhren zeigte ein
breites Strahlenspektrum im Wellenlängenbereich zwischen 250 und 400 nm, mit einem
Maximum bei 313 nm. Vor der Bestrahlung wurde eine Dosimetrie mit einem UV-Meter (IL1700) durchgeführt. Die Zellen wurden mit Niedrigbestrahlungsdosen von 100 J/m2 und 200
J/m2 UVB bestrahlt. Für die UVA-Bestrahlung wurden die Zellen auf Eis mit einer UVA1Lampe (UVASUN 5000, Mutzhaas, München, 340-400 nm) mit 50 J/cm2 und 100 J/cm2 in
einem Abstand von 30 cm bestrahlt. Die Dosimetrie erfolgte hier mit einem UV-Meter der Fa.
MATERIAL UND METHODEN
16
Waldmann (Villingen-Schwenningen). Danach wurden die Zellen sofort von den Platten
gewaschen und in cRPMI aufgenommen.
3.7
Inkubation der hDZ mit Photosomenâ und Photoreaktivierung
Die bestrahlten und unbestrahlten Zellen als Negativkontrolle, wurden in cRPMI aufgenommen
und in einer 24-Loch-Platte zu jeweils 1 ml auspipettiert und mit Liposomen, welche eine
Photolyase von Anacystis nidulans enthalten (Photosomenâ,Yarosh, AGI Dermatics, Freeport,
NY, USA), in einer Konzentration von 100 µl/ml für eine Stunde bei 37 °C im Dunkeln
inkubiert. Danach wurden die Zellen 2x in PBS gewaschen und wieder in 3 ml PBS auf 35
mm2 Petrischalen ausplattiert. Die Zellen wurden unter einem PUVA 180 Gerät (Waldmann)
mit F8TS/PUVA-Röhren (Sylvania, Waldmann, 340-400 nm) mit 5 kJ/m2 bestrahlt, danach
abgenommen und in der Neubauerzählkammer gezählt. Es wurde jeweils ein Teil der Zellen für
den DNA-ELISA, ein anderer Teil für die Proliferationsexperimente verwendet.
3.8
Gewinnung von genomischer DNA aus hDZ
3.8.1 Zellyse und Verdau
Die bestrahlten und mit Photosomen behandelten Zellen wurden 2x mit eisgekühltem PBS
gewaschen und bei 1000 Upm abzentrifugiert. Nach vorsichtigem Abkippen des Überstandes
wurde das Zellpellet in 300 µl Verdauungspuffer resuspendiert und in 1,5 ml EppendorffHütchen (Eppendorff GmbH, Hamburg) überführt. Es folgte eine 12-18 stündige Inkubation bei
50 °C unter Schütteln im Thermoblock.
3.8.2 Extraktion der Nukleinsäuren
Der Zellverdau wurde mit 300µl DNA-Extraktionslösung versetzt und für 10 min bei 5000
U/min abzentrifugiert. Danach wurde die sich über dem Phenol gebildete wässrige Phase mit
den Nukleinsäuren vorsichtig in ein neues 1,5 ml Eppendorff- Hüttchen transferiert. Um die
Reinheit der Extraktion zu erhöhen, wurde die Extraktion noch einmal wie oben wiederholt.
MATERIAL UND METHODEN
17
3.8.3 Purifikation der DNA
Die aus der letzten Extraktion gewonnene wässrige Phase wurde in ein 2 ml EppendorffHütchen pipettiert, und es wurden 150 µl 7,5 M Ammoniumacetat (Merck) und 600 µl Ethanol
100 % (Mallinkrodt Baker, Deventer, Holland) dazugegeben. Damit wurde eine Präzipitation
der in der wässrigen Phase angereicherten DNA erreicht. Die Präzipitation in Anwesenheit der
hohen Salzkonzentration reduziert die Menge an vorhandener RNA in der Probe.
Die präzipitierte DNA wurde bei 17.000 Upm für 20 Minuten abzentrifugiert, das Pellet einmal
mit Ethanol 70 % (Mallinkrodt Baker) gewaschen und nochmals abzentrifugiert. Das Ethanol
wurde vorsichtig mit einer Pipette abgenommen. Das verbleibende Pellet wurde an der Luft auf
einem Ständer für 1 h getrocknet. Danach wurde die DNA in 20 µl TE-Puffer gelöst und bei
Raumtemperatur auf einem Rüttler für 1 h geschüttelt, um die Auflösung zu erleichtern.
3.8.4 Messung der DNA- Konzentration
Von der in TE-Puffer gelösten DNA wurden 2 µl mit 500 µl Aqua bidest verdünnt in eine
Meßküvette übertragen und die Absorption mit einem Extinktionsgerät (UV VIS Spekol,
Zeiss) 260 nm bestimmt. Die Konzentration an DNA pro Ansatz ergab sich aus folgender
Formel:
c in µg/µl =
3.8.5
Absorption bei 260 nm x Verdünnungsfaktor
e x d
e = 20 d = 1
RNAse Verdau der Proben
Die Proben wurden anschließend mit 3 µl RNAse A (Boehringer) in einer Konzentration von
10 µg/ml für 1 h bei 37 °C inkubiert, um noch verbleibende RNA-Reste vollständig zu
entfernen.
3.8.6 Darstellung der Reinheit der Proben mittels Gelelektropherese
Vor der Verwendung der DNA im ELISA wurden die Proben auf einem Agarosegel auf ihre
Reinheit überprüft. Dabei wurde jeweils 500 ng jeder Probe und ein Kilobasen DNA-Marker
(Pharmacia Biotech, Freiburg) auf ein 1 %iges Agarosegel (Gibco) aufgetragen und in der
Gelelektrophoresekammer bei 90 mV laufen gelassen. Als Laufpuffer wurde TAE-Puffer
verwendet. Danach wurde das Gel aus der Elektropheresekammer entfernt und für 30 min in
ein Bad mit Ethidiumbromid (Serva, Heidelberg) gelegt. Das in die DNA eingelagerte
Ethidiumbromid wurde mit einer UV-Lampe (E.A.S.Y RH3, Herolab, Wiesloch) sichtbar
MATERIAL UND METHODEN
18
gemacht und photographisch dokumentiert. Danach wurde die Absorption der einzelnen
Banden mittels E.A.S.Ystore®-Software (Herolab, Wiesloch) nochmals prozentual bestimmt
und als Korrekturfaktor in die Konzentrationsberechnung miteinbezogen.
3.9
Nachweis von UV induzierter Schädigung in genomischer DNA durch ELISA
Die aus den hDZ gewonnene DNA wurde nun auf 96-Loch-Flachbodenmikrotiterplatten
aufgetragen. Um eine optimale Haftung der DNA auf den Platten zu ermöglichen, wurden
spezielle Mikrotiterplatten aus Polyvinylchlorid (Dynatech, Denkendorf) verwendet. Diese
Platten wurden mit Protaminsulfat (Sigma, Deisenhofen) in einer Konzentration von 10 mg/ml
für 2 h vorinkubiert und danach 5x mit PBS gewaschen. Die DNA Proben wurden auf eine
Endkonzentration von 800 ng/ml mit PBS verdünnt und denaturiert. Die Denaturierung erfolgte
durch zweiminütiges Erhitzen auf 95 °C auf einem Thermoblock und anschließendes
Abschrecken im Eisbad. Danach wurden die vorbereiteten DNA-Proben auf die Platte
aufgetragen (200 ng/50 ml/Vertiefung) und für 16 h über Nacht bei 37 °C getrocknet. Nach
dem Trocknen der Platten, wurden sie nochmals 5x mit PBS mit 0,05 % Tween 20 (Fluka
Chemika, Buchs, Schweiz) gewaschen. Um unspezifische Bindungen des TDM-2-Antikörpers
an die DNA abzublocken, wurden die Platten mit einer 1 %igen FCS in PBS-Lösung (150 µl/
Vertiefung) für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Danach wurde wieder 5x mit PBS 0,05 %
Tween 20 gewaschen. Anschließend wurden die Platten mit jeweils 100 µl/Vertiefung TDM-2Antikörper in einer Konzentration von 1:1000 für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert und 5x mit
PBS 0,05 % Tween 20 gewaschen. Nach dem Waschschritt wurden jeweils 100 µl/Vertiefung
eines Biotin-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers in einer Konzentration von 1:10.000
auf die Platten aufgetragen und wieder bei 37 °C für 90 Minuten inkubiert. Nach 5
Waschschritten mit PBS 0,05 % Tween 20 wurden die Platten mit 50 µl/Vertiefung
Peroxidase-konjugierten Streptavidin in einer Konzentration von 1:10.000 für 60 Minuten bei
Raumtemperatuer auf einem Rüttler inkubiert und danach 2x mit PBS 0,05 % Tween 20 und 3x
mit Phosphat-Citrat-Puffer gewaschen. Die Substratlösung wurde kurz vor der Verwendung aus
10 ml Phosphat-Citrat-Puffer und einer Tablette 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidindihydrochlorid
(TMBD; Sigma) und 2 ml Wasserstoffperoxid- Lösung 30 % (Fischer, Saarbruecken) frisch
hergestellt und jeweils 100 µl in die Vertiefungen gegeben. Durch die Reaktion der an das
Streptavidin gekoppelte Peroxidase mit dem Substrat kommt es zu einem blauen Farbumschlag
MATERIAL UND METHODEN
19
der ursprünglich farblosen Lösung. Nach 30 Minuten Inkubation auf einem Rüttler im Dunkeln
wurde die Enzym-Substrat-Reaktion mit jeweils 50 µl H2S04 2N abgestoppt, wodurch die blaue
Färbung in einen gelben Farbton umschlägt. Danach wurde die Absorption der Verfärbung bei
450 nm im ELISA-Reader (Dynatech MR5000, Dynatech, Denkendorf) abgelesen. Die
einzelnen Proben wurden dann anhand der absoluten Absorption miteinander verglichen.
3.10
In vitro Proliferationsassays
Die Fähigkeit von hDZ, eine Proliferation in allogenen, d.h. genetisch differenten humanen TZellen (hTZ) zu induzieren, wurde in der „mixed lymphocyte reaction” (MLR) untersucht. Die
MLR ahmt eine Transplantatabstoßungsreaktion nach. Die dendritischen Zellen präsentieren
ihre MHC-Komplexe an allogene T-Lymphozyten, die daraufhin zur klonalen Proliferation
angeregt werden (dabei kommt es nur zur einer Aktivierung von T-Lymphozyten, wenn sich
die MHC-Komplexe von dendritischen Zellen und T-Lymphozyten unterscheiden). Die Stärke
der Proliferation wird durch den Einbau von radioaktivem [3H]-TdR in die DNA der
proliferierenden T-Lymphozyten gemessen. Je stärker der Einbau von [3H]-TdR, umso stärker
ist die Proliferation der T-Lymphozyten. Die funktionellen Fähigkeiten der hDZ, nach
unterschiedlicher UV-Bestrahlung und Photosomenbehandlung allogene hTZ zur Proliferation
anzuregen, wurden hierzu untersucht und miteinander verglichen. Die Zellen wurden in cRPMI
resuspendiert, mit der Neubauerkammer gezählt und auf 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatten
(Costar, Cambridge, MA, USA) nach folgendem Schema pipettiert:
15.000 hDZ als Stimulatorzellen wurden mit 150.000 allogenen hTZ als Responderzellen in
200 µl cRPMI zusammengegeben. Als Kontrollen wurden hTZ alleine (Negativkontrolle) und
hTZ mit PHA (2 µl/200 µl) als Stimulatormitogen untersucht. Es wurden jeweils fünf Ansätze
der gleichen Zusammensetzung verwendet. Die Mikrotiterplatten wurden für 5 Tage im
Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 5 Tagen wurde den Zellen [3H]-TdR (1
µCi/Ansatz) zugegeben und für weitere 16 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden
die Zellen mittels eines Filtermate Harvesters 196 (Packard, Meriden, CT, USA) geerntet. Das
in
die
Zellen
eingebaute
[3H]-TdR
wurde
nach
Zugabe
von
20
µl/Vertiefung
Szintillationsflüssigkeit (Packard, Meriden) im Beta-Counter von Packard (Packard, Meriden)
gemessen. Aus drei Messwerten wurde der Mittelwert und die Standardabweichung (SD)
MATERIAL UND METHODEN
20
bestimmt. In diesem Versuchsaufbau sind allein die hDZ für die Antigenpräsentation der
Transplantationsantigene verantwortlich.
Eine direkte Stimulation hTZ ohne die Induktion durch eine Stimulatorzelle kann mit einer
direkten Stimulation des T-Zell-Rezeptors (CD3-Molekül) durch anti-CD3-Antikörper und
einer Stimulation des CD28-Moleküls mit anti-CD28 Antikörper erreicht werden. Damit ein
vollständiges Proliferationssignal an die T-Zelle erfolgen kann, müssen die beiden primären, an
den T-Zell-Rezeptor gekoppelten Antikörper mit einem sekundären anti-Fc-Antikörper
kreuzvernetzt werden. Nur durch diese Koppelung der beiden primären Antikörper kann ein
vollständiges Signal an die T-Zelle weitergegeben werden, die dann mit klonaler Proliferation
antwortet. In diesem von Stimulatorzellen unabhängigen System können direkte Einflüße der
Dinukleotide auf das Proliferationsvermögen von hTZ untersucht werden. Hierbei wurden
jeweils 150.000 hTZ in 200 µl cRPMI in 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatten (Costar,
Cambridge) auspipettiert und mit jeweils 1µl anti-CD3-Antikörper, anti-CD28-Antikörper und
Schaf-anti-Maus-FcAntikörper versetzt. Als Negativkontrolle wurden hTZ alleine untersucht.
Die Platten wurden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und nach unterschiedlichen
Zeitpunkten mit [3H]-TdR (1µCi/Ansatz) oder [3H]-AdR (1 µCi/Ansatz) gepulst und für
weitere 16 h im Brutschrank inkubiert. Das Ernten der Platten erfolgte nach dem gleichen
Protokoll wie bei der MLR.
3.11
Immunfluoreszenzfärbungen und Durchflußzytometrie
Die Durchflußzytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der
Grundlage von Streulicht und Fluoreszenzeigenschaften. Es können simultan die relative
Zellgröße, die Granularität und zwei bis drei verschiedene Fluoreszenzfarben erfaßt werden.
Die Fluoreszenzsignale entstehen durch Lichtemission markierter Antikörper, welche die zu
analysierenden
Zell-Epitope
erkennen.
Als
Totfarbstoffe
werden
Substanzen
wie
Propidiumjodid (PI) verwendet. Diese Farbstoffe passieren die Zellmembranen toter Zellen und
binden an DNA sowie doppelsträngige RNA. Damit wird die geschädigte Zelle anfärbbar und
kann von vitalen Zellen abgegrenzt werden.
Um
den
Einfluß
von
Thymidindinukleotiden
(pTpT)
auf
die
Expression
von
Oberflächenmarkern hDZ zu untersuchen, wurde eine Doppelfärbung (Vitalfärbung und
Anfärbung eines Zelloberflächenantigens) durchgeführt. Hierzu wurde an Tag 4 jeweils 100
MATERIAL UND METHODEN
21
µM pTpT und als Kontrolle 100 µM pdApdA in das Kulturmedium der Zellen zugegeben.
Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden die Zellen aus den Kulturplatten entnommen
und 2x mit PBS gewaschen. Pro Ansatz wurden 1 x 105 Zellen in 100 µl PBS verwendet. Nach
Zugabe der entsprechenden Primärantikörper in einer Konzentration von 10 µg/ml wurden die
Zellen für 45 Minuten lang bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert. Danach wurden die Zellen einmal
mit PBS gewaschen und mit dem Fluorescein-markierten Antikörper unter den gleichen
Bedingungen inkubiert. Daraufhin wurde nochmals gewaschen und die toten Zellen mit PI in
einer Konzentration von 1 µg/ml markiert. Es wurden pro Probe 10.000 Zellen
durchflußzytometrisch im FACScan (Becton-Dickinson, Heidelberg) gemessen. In die
Auswertung mittels CellQuest®-Software (Becton-Dickinson) gelangten nur vitale Zellen.
3.12
Zell-Zyklus-Analysen mit Durchflußzytometrie
Die Analyse des Zell-Zyklus in hTZ wurde anhand einer Färbung der nukleären DNA mit PI
und nachfolgender Bestimmung des DNA-Gehaltes im Durchflußzytometer untersucht. Dabei
wurden jeweils 150.000 hTZ in 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatten mit anti-CD3Antikörper, anti-CD28-Antikörper und anti-Fc-Antikörper zur Proliferation angeregt und mit
100 µM pTpT inkubiert. Als Negativkontrollen dienten unstimulierte Zellen und Zellen, die
mit 100 µM pdApdA inkubiert wurden. Als Positivkontrolle dienten Zellen, die mit 50 µg/ml
Mitomycin bei 37 °C für 20 Minuten vorinkubiert wurden. Die Zellen wurden nach 24 h, 48 h,
72 h und 96 h von den Platten geerntet und 2x mit Glucosepuffer gewaschen. Nach Zählung der
Ansätze wurden jeweils 3 x 106 Zellen in 1 ml in ein Eppendorff-Hütchen überführt und bei
1400 Upm bei 4 °C für 10 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und
dem verbleibende Pellet unter kräftigem vortexen tropfenweise 1 ml eisgekühltes 70 %iges
Ethanol zupipettiert. Die Proben wurden nun über Nacht bei 4 °C fixiert.
Nach der Fixation wurden die Proben bei 3000 Upm 5 Minuten abzentrifugiert und das Ethanol
abgenommen. Danach wurde das Pellet nochmals gevortext und mit 200 µl PI-Färbelösung in
einer Konzentration von 50 µg/ml für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
Es wurden pro Probe 15.000 Zellen durchflußzytometrisch im FACScan (Becton Dickinson)
analysiert.
MATERIAL UND METHODEN
3.13
Für
22
Zellzahlbestimmungen
die
Bestimmung
der
absoluten
Anzahl
an
hTZ nach
der
Inkubation
mit
Thymidindinnukleotiden, wurden jeweils 100.000 hTZ pro Vertiefung in eine 96-LochRundbodenmikrotiterplatte in 200 µl cRPMI ausplattiert und mit monoklonalen Antikörpern
direkt über ihren T-Zell-Rezeptor (CD3-Molekül) und das CD28-Molekül stimuliert. Wie bei
den [3H]-TdR wurden die Zellen mit 1 µl anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc- Antikörper
versetzt. Nach 4 und 6 Tagen wurden die Zellen geerntet. Um die Zellen voneinander zu lösen,
wurden sie in einer 5 mM EDTA-Lösung gewaschen. Danach wurden die Zellen in einem
Eppendorff-Hütchen mit einer Trypanblaulösung verdünnt (1:200) und codiert.
Die Auszählung erfolgte in einer Neubauerzählkammer unter dem Lichtmikroskop.
3.14
Zytokinbestimmungen mit ELISA
Für die Zytokinbestimmung bei der Untersuchung der Effekte von Dinukleotiden auf
proliferierende hTZ, wurden 200.000 hTZ in 200 µl cRPMI mit jeweils 1µl anti-CD3Antikörper, anti-CD28-Antikörper und anti-Fc-Antikörper für 24 h, 48 h, 72 h und 96 h bei 37
°C inkubiert und die Überstände vorsichtig abgenommen und gesammelt. Die Überstände
wurden mit einem ELISA-Kit (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, USA) auf IL-2
untersucht.
ERGEBNISSE
23
4.
ERGEBNISSE
4.1
Einfluß von UVB- und UVA1-Strahlung auf die antigenpräsentierende Funktion
von hDZ
Um die Effekte von UVB auf die Zellfunktion von hDZ zu untersuchen, wurden
bestrahlte hDZ als Stimulatorzellen in einer primären „mixed lymphocyte reaction“ (MLR)
eingesetzt. Ihre Immunfunktion wurde getestet, indem ihre Fähigkeit geprüft wurde, ruhenden
allogenen T-Zellen Transplantationsantigene zu präsentieren und diese zur Proliferation
anzuregen. Dazu wurden hDZ nach Abnahme aus der Zellkultur mit unterschiedlichen Dosen
UVB und UVA1 bestrahlt und gezählt. 15.000 bestrahlte hDZ wurden mit 150.000 über
Dynalbeads angereicherten allogenen hTZ für 6 Tage inkubiert und die Proliferation über die
[3H]-TdR-Aufnahme gemessen. Als Nachweis für die Reinheit der T-Lymphozytenpopulation
wurden T-Lymphzyten alleine und mit PHA als Stimulatormitogen mituntersucht. Die
unbestrahlten hDZ zeigen als höchstes Ergebnis bei 15.000 Stimulatorzellen eine [3H]-TdRAufnahme von 85.000 Dcpm. Die Zellen, die mit 100 J/m2 UVB bestrahlt worden waren,
zeigen eine Reduktion der Radioaktivität um 80 %, bei einer [3H]-TdR-Aufnahme von 16.000
Dcpm (Abb. 1). Bei Zunahme der Bestrahlungsdosis auf 200 J/m2 zeigt sich eine Reduktion der
T-Zellproliferation um 94 %, bei einer [3H]-TdR-Aufnahme von 5.000 Dcpm. Bei den mit
UVA1 bestrahlten Zellen läßt sich eine Verminderung der T-Zell-Proliferation bei 50 J/cm2 um
18 % feststellen, bei 100 J/cm2 vermindert sie sich um 41 % (Abb. 1). T-Zellen, die alleine
inkubiert wurden, zeigen keine signifikante Proliferation.
Dieses Experiment zeigt, daß hDZ dosisabhängig durch UV-Bestrahlung in ihrer Fähigkeit
allogene hTZ zur Proliferation anzuregen, beeinträchtigt werden. UVB-Bestrahlung führt dabei
zu einer vielfach stärkeren Hemmung als UVA1-Bestrahlung.
ERGEBNISSE
hDZ
hTZ
24
UVB
UVA
(J/m2)
(J/cm2)
PHA
+
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
100
-
-
+
+
200
-
-
+
+
-
50
-
+
+
-
100
-
Antigenpräsentierende Funktion (MLR)
0
50
[3H]-TdR-Einbau
(cpm x
100
10-3 ± SD)
Abb. 1: UVB- und UVA1-Bestrahlung von hDZ führt zu einer dosisabhängigen
Einschränkung ihrer Fähigkeit, allogene hTZ zu stimulieren
hDZ wurden mit Dosen von 100 J/m2 und 200 J/m2 UVB und 50 J/cm2 und 100 J/cm2 UVA1 in
vitro bestrahlt. Jeweils 15.000 dieser Zellen wurden mit 150.000 allogenen hTZ pro Ansatz
inkubiert. Als Positivkontrolle wurden unbestrahlte hDZ mit allogenen hTZ inkubiert. Nach 5
Tagen wurden die Zellen mit [3H]-TdR versetzt und nach weiteren 16 h wurde die Proliferation
der hTZ über den [3H]-TdR-Einbau durch Szintillationsszintigraphie im Beta-Counter
gemessen. Die Ergebnisse sind als delta cpm x 10-3 ± SD von Dreifachbestimmungen
angegeben.
4.2
Induktion von CPD in hDZ nach UVB- und UVA1-Bestrahlung
UV-Strahlen werden in der Zelle hauptsächliche durch die DNA absorbiert. Die dort
vorhandenen Purin- und Pyrimidinbasen nehmen elektromagnetische Strahlung im Bereich von
230-300 nm auf, welche sich mit dem Wellenlängenbereich von UVB-Strahlung (290-320 nm)
deckt. Durch die starke Absorption von UV-Strahlung in der zellulären DNA bilden sich durch
die elektromagnetische Energie der Photonen in den benachbarten Basen spezifische
Photoprodukte. Die biologisch bedeutsamsten Photoprodukte sind die Cyclobutandimere
(CPD) und die 6-4-Photoprodukte. Um zu überprüfen, ob sich durch in vitro Bestrahlung mit
UVB und UVA1 in der DNA von hDZ spezifische Photoprodukte erzeugen lassen, wurde
ERGEBNISSE
25
DNA aus den bestrahlten hDZ mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen CPD (TDM-2Antikörper), der spezifisch an die CPD binden kann, im ELISA untersucht. Im Gegensatz zur
unbestrahlten Kontrolle läßt sich eine Induktion bei 100 J/m2 UVB-Bestrahlung nachweisen
(Abb. 2). Es zeigt sich eine Absorption bei 450 nm von 0,46 mit signifikanter Steigerung bei
200 J/m2 auf 0,66 (P = <0,001). Bei Bestrahlung mit UVA1 zeigt sich nur eine geringe
Induktion von CPD in den Zellen. Bei 50 J/cm2 UVA1-Bestrahlung wird nur eine geringe
Erhöhung der Absorption bei 450 nm erreicht und zwar auf 0,08. Bei 100 J/cm2 läßt sich eine
Absorption von 0,15 bei 450 nm nachweisen (P = <0,001).
Dieses Experiment macht deutlich, daß in hDZ nach in vitro Bestrahlung eine Schädigung in
der DNA in Form von CPD auftritt. Die Anzahl der CPD hängt dabei von der
Bestrahlungsdosis ab, die auf die Zellen eingewirkt hat. Außerdem zeigt sich, daß durch
UVA1-Bestrahlung im Vergleich zur UVB-Bestrahlung eine deutlich geringere Anzahl an CPD
in der DNA gebildet werden.
hDZ-DNA
UVB
2
(J/m )
UVA1
CPD-Bildung (ELISA)
(J/cm2)
+
-
-
+
100
-
+
200
-
+
-
50
+
-
100
0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1
A b s o r p t io n b e i 4 5 0 n m ± S D
Abb. 2:
Dosisabhängige CPD-Induktion in hDZ nach UVB- und UVA1-Bestrahlung
hDZ wurden mit 100 J/m2 und 200 J/m2 UVB und 50 J/cm2 und 100 J/cm2 UVA1 bestrahlt,
deren genomische DNA isoliert und im DNA-ELISA mit einem CPD spezifischen Antikörper
(TDM-2) untersucht. Die Ergebnisse sind als absolute Absorption bei 450 nm ± SD von
Zweifachmessungen angegeben.
ERGEBNISSE
4.3
26
Einfluß von Photosomenâ auf die Vitalität von hDZ in vitro
Bevor die Wirkung von Photosomenâ auf hDZ untersucht werden konnte, war es
erforderlich, etwaige zytotoxische Effekte auf die Zellen auszuschließen. Daher wurden hDZ
für unterschiedlich lange Zeiträume mit einer Konzentration von 100 µl/ml einer
Photosomensuspension inkubiert. Die Zellen wurden in cRPMI mit den Photosomenâ bei 37
°C für 1 h, 2 h, 3 h inkubiert. Weiterhin wurden zum Nachweis der Wirkungen einer längeren
Inkubationsdauer die Zellen über Nacht für insgesamt 16 h mit den Photosomen inkubiert.
Weitere Bestimmungen von längerfristigen Inkubationszeiten wurden nicht durchgeführt, da
für die nachfolgenden Experimente mit den Photosomen nur Inkubationszeiten von einer
Stunde relevant waren. Nach Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen mit Propidiumjodid
(PI) angefärbt und auf ihre Vitalität in der Durchflußzytometrie untersucht. Die Abb. 3 zeigt ein
repräsentatives Experiment einer Vitalitätsprüfung aus drei unabhängigen Experimenten. Bei
einer Inkubationszeit von 1 h, die genau der Inkubationszeit im Reparaturversuch entspricht,
läßt sich kein bedeutender Vitalitätsverlust nachweisen. Die unbehandelten Zellen zeigen eine
Vitalität von 99 %. Die mit Photosomenâ inkubierten Zellen haben eine Vitalität von 94 %
(Abb. 3). Auch bei einer Inkubationsdauer von 2 h und 3 h läßt sich kein bedeutender
Vitalitätsverlust nachweisen. Bei einer Inkubation von 16 h zeigt sich mit einem Anteil von 82
% an vitalen Zellen eine Reduktion der Vitalität um 17 %. (Abb. 3).
Durch diese Vitalitätsüberprüfung im Durchflußzytometer wird deutlich, daß die im
nachfolgenden Experiment verwendete Konzentration von 100 µl/ml Photosomenâ bei einer
Inkubationsdauer von 1 h keinen Einfluß auf die Vitalität der hDZ besitzt.
% an PI-negativen hDZ
ERGEBNISSE
27
100
75
50
hDZ allein
hDZ PS
25
0
1h
2h
3h
16 h
Inkubationsdauer
Abb. 3:
Einfluß von Photosomenâ (PS) auf die Vitalität hDZ in vitro
Es wurden 10.000 Zellen pro Probe im FACScan analysiert. Die Vitalität der Zellen wurde über
eine Propidiumjodid (PI)-Färbung in einer Konzentration von 1µg/ml bestimmt. Dargestellt ist
auf der y-Achse der prozentuale Anteil an PI negativen hDZ aus Doppelbestimmungen.
4.4
Reparatur von CPD in der DNA von hDZ durch Photosomen®
Die in der DNA von hDZ durch UVB-Strahlen entstandenen CPD können durch
enzymatische Photoreaktivierung wieder repariert werden. Hierbei bindet sich das in den
Photosomenâ enthaltene Enzym Photolyase in einer lichtunabhängigen Reaktion an die Dimere
und monomerisiert nach Aktivierung mit langwelligem Licht (Wellenlänge 300 nm) die
kovalent verbundenen benachbarten Thymidinbasen. Um zu überprüfen, ob die im ELISA
festgestellten CPD in hDZ durch eine solche enzymatische Photoreaktivierung wieder entfernt
werden können, wurden die Zellen mit UVB bestrahlt und anschließend mit 100 µl/ml
Photosomenâ inkubiert. Danach wurde die in den Photosomenâ vorhandene Photolyase mit
Breitspektrum-UVA als sogenanntes photoreaktivierendes Licht aktiviert und die DNA aus den
ERGEBNISSE
28
Zellen isoliert. Die CPD in der DNA wurden wieder im ELISA dargestellt. Die unbestrahlten
Zellen
(Kontrolle)
zeigen
eine
Absorption
bei
450
nm
von
0,035,
was
der
Hintergrundsabsorption in der Leerkontrolle entspricht. (Abb. 4). Auch die Behandlung mit
photoreaktivierendem
Licht,
Photosomenâ
alleine,
photoreaktivierenden
Licht
und
Photosomenâ zeigt keinen Unterschied in der Absorption bei 450 nm. Hingegen ist eine
deutliche Induktion von CPD-Photoläsionen bei mit 100 J/m2 UVB bestrahlten Zellen
nachweisbar. Hier beträgt die absolute Absorption bei 450 nm 0,47. Die Behandlung von
bestrahlten Zellen mit Photosomenâ alleine führt zu keinem Rückgang an CPD-Photoläsionen.
Nach zusätzlicher Aktivierung der Photolyase mit photoreaktivierendem Licht wird eine
Reduktion der CPD-Photoläsionen um 54 % von 0,48 auf 0,259 (Abb. 4) gemessen. Bei den
mit 200 J/m2 bestrahlten Zellen läßt sich eine stärkere Induktion an CPD nachweisen. Die
Absorption bei 450 nm lag hier bei 0,65. Bei zusätzlicher Aktivierung der Photolyase mit
photoreaktivierendem Licht wird eine deutliche Reduktion der Photoprodukte um 92 %
gemessen und zwar von 0,65 auf 0,05.
Die Anzahl der UVB induzierten CPD-Photoläsionen kann durch Zugabe des Reparaturenzyms
Photolyase und anschließende Photoaktivierung wieder reduziert werden.
ERGEBNISSE
29
Abb. 4:Reduktion von UVB induzierten CPD in hDZ nach Behandlung mit Photosomenâ
hDZ wurden mit 100 J/m2 und 200 J/m2 UVB bestrahlt und anschließend mit Photosomenâ
(PS) für 60 Minuten inkubiert und mit photoreaktivierendem Licht (PRL) mit einer Dosis von
50 J/cm2 bestrahlt. Danach wurde die DNA aus den Zellen isoliert und in einem DNA-ELISA
auf CPD-Photoläsionen untersucht. Es wurde die Intensität des Farbumschlages im
Absorptionsgerät gemessen. Die Ergebnisse sind als absolute Absorption bei 450 nm ± SD von
Zweifachmessungen angegeben.
4.5
Effekte von Photosomenâ auf die antigenpräsentierende Funktion von mit UVB
bestrahlten hDZ
Im folgenden Experiment wurde untersucht, ob sich die nach UVB-Bestrahlung in hDZ
reduzierte Funktion, allogene hTZ zu stimulieren, nach Behandlung mit dem Reparaturenzym
Photolyase wiederherstellen läßt. Dazu wurden aus den gleichen Zellansätzen, die auch für den
CPD-Nachweis im DNA-ELISA verwendet wurden, jeweils Zellen entnommen und in einer
„mixed lymphocyte reaction“ (MLR) untersucht. Jeder Zellansatz wurde gezählt und jeweils
15.000 dieser Zellen als Stimulatorzellen mit 150.000 allogenen hTZ für 5 Tage inkubiert. Die
Abb. 5 zeigt ein repräsentatives Experiment der Stimulation von ruhenden allogenen hTZ
durch bestrahlte und mit Photosomenâ behandelte hDZ. Die unbestrahlten hDZ zeigen bei
15.000 Stimulatorzellen eine [3H]-TdR-Aufnahme von 72.000 Dcpm. Die Zellen, die mit 100
ERGEBNISSE
30
J/m2 UVB bestrahlt worden waren, weisen eine Hemmung von 30 % bei einer [3H]-TdRAufnahme von 51.000 Dcpm auf. Die mit Photosomenâ alleine und mit Photosomenâ und
photoreaktivierendes Licht behandelten Kontrollen zeigen die gleiche [3H]-TdR-Aufnahme von
50.000 Dcpm. Bei den mit 200 J/m2 UVB bestrahlten Zellen findet sich eine Hemmung der
antigenpräsentierenden Funktion um 60 % bei einer [3H]-TdR-Aufnahme von 29.000 Dcpm.
Die
aktivierten
Photosomenâ
führen
aber
nicht
zu
einer
Wiederherstellung
der
antigenpräsentierenden Funktion der UVB bestrahlten hDZ.
Dieses Experiment macht deutlich, daß die mit UVB bestrahlten hDZ durch eine Reparatur
ihrer CPD-Photoläsionen in der DNA ihre funktionelle Aktivität in der MLR nicht
wiedererlangen. Die durch UVB-Bestrahlung in den hDZ induzierte Immunsuppression ist
durch eine Reparatur der CPD-Photoläsionen nicht wiederherzustellen.
ERGEBNISSE
31
Abb. 5:
Mit Photosomenâ behandelte hDZ können die durch Bestrahlung
induzierte Hemmung der antigenpräsentierenden Funktion nicht wiederherstellen:
hDZ aus den Zellansätzen, die für den Nachweis von CPD-Photoläsionen im DNA-ELISA
gewonnen wurden, wurden mit jeweils 150.000 hTZ pro Ansatz inkubiert. Als Positivkontrolle
wurden unbestrahlte hDZ mit hTZ inkubiert. Es wurden Zellen mit Photosomenâ alleine (PS),
mit photoreaktivierenden Licht alleine (PRL) und mit Photosomenâ und photoreaktivierendem
Licht (PP) behandelt. Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit [3H]-TdR versetzt und nach
weiteren 16 h wurde die Proliferation im Beta-Counter gemessen. Die Ergebnisse sind als delta
cpm x 10-3 ± SD von Dreifachbestimmungen angegeben.
4.6
Einfluß von pTpT auf das Proliferationsverhalten von hTZ im [3H]Thymidinassay
Als Modell für DNA-Schädigungsprodukte wurden Thymidinnukleotide (pTpT)
verwendet, um die nach UV-Bestrahlung auftretenden immunmodulatorischen Effekte gezielt
zu untersuchen. Thymidindinukleotide sind in ihrem Aufbau den Cyclobutandimeren
(CPD) ähnlich, da es sich jeweils um zwei verbundene Thymidinbasen handelt. In diesem
Versuchsaufbau sollten die Thymidindinukleotide einen DNA-Schaden in der Zelle imitieren.
Dabei interessierten vor allem die Effekte dieser Schädigungsprodukte auf die Zellfunktion und
die Expression von Oberflächenmolekülen. Unter der Annahme, daß nach UV-Bestrahlung in
ERGEBNISSE
der
DNA
der
32
Zellen
keine
Adenosindimere
entstehen,
wurden
als
Kontrolle
Adenosindinukleotide (pdApdA) verwendet.
Als erstes wurde untersucht, ob die Zugabe von Thymidindinukleotiden in eine von hDZ
stimulierte „mixed lymphocyte reaction“ (MLR), eine UVB induzierte Hemmung der T-ZellProliferation imitieren kann. Dazu wurden jeweils 15.000 hDZ als Stimulatorzellen mit
150.000 allogenen hTZ als Responderzellen für 5 Tage inkubiert. In einen Ansatz wurde pTpT
in einer Konzentration von 100 µM pro Vertiefung hinzupipettiert und für die gesamten 5 Tage
im Medium der MLR belassen. Als Kontrolle diente ein Ansatz mit 100 µM pdApdA.
Gleichzeitig wurden als Kontrolle mit UVB bestrahlte hDZ in einer Dosis von 100 J/m2 und
200 J/m2 als Stimulatorzellen verwendet. Die Abb. 6A zeigt ein repräsentatives Experiment aus
vier unabhängigen Experimenten. Es lässt sich bei den mit pTpT inkubierten Zellen ein
deutlicher Rückgang der Proliferation von hTZ feststellen. Auch die bestrahlten hDZ führen zu
einem ein dosisabhängigen Rückgang der T-Zell-Proliferation. Die Kontrolle mit den
unbehandelten Zellen weist eine [3H]-TdR-Aufnahme von 80.000 Dcpm auf (Abb. 6A). Die
Zellen, die mit 100 µM pTpT behandelt worden waren, zeigen eine Reduktion der
antigenpräsentierenden Funktion von 80 % auf 10.000 Dcpm. Die mit pdApdA inkubierten
Zellen weisen eine Proliferation von 70.000 Dcpm auf. T-Zellen, die alleine inkubiert worden
waren, zeigen keine Proliferation (Abb. 6A).
In diesem Experiment wird deutlich, daß pTpT alleine eine ähnliche Hemmung der T-ZellProliferation induzieren kann wie UVB bestrahlte hDZ.
Nach dem Rückgang der Proliferation unter Zugabe von pTpT in der von hDZ induzierten
MLR interessierte nun, ob dieser Proliferationsrückgang ein direkter Effekt von pTpT auf die
hTZ ist, oder über die hDZ vermittelt wird. Dies erfolgte durch eine Direktstimulation von hTZ
über deren T-Zell-Rezeptor (CD3) und einer gleichzeitigen Kostimulation über das CD28Molekül. Um eine vollständiges Signal zu erreichen, wurden die Antikörper mit einem
weiteren gegen Fc-Anteile gerichteten Antikörper kreuzvernetzt. In diesem Versuchsansatz
wurden 200.000 hTZ in 200 µl Medium direkt mit jeweils 1µl anti-CD3-Antikörper, antiCD28-Antikörper und anti-Fc-Antikörper stimuliert. Es wurden verschiedene Konzentrationen
von pTpT und pdApdA als Negativkontrolle verwendet und zwar in den folgenden
Konzentrationen: 40 µM, 30 µM, 20 µM, 15 µM, 10 µM.
Die Abb. 6B zeigt ein repräsentatives Experiment aus drei unabhängigen Experimenten einer
Direktstimulation von hTZ über ihren T-Zell-Rezeptor. Die stimulierten hTZ ohne Zugabe von
ERGEBNISSE
33
Dinukleotiden weisen eine [3H]-TdR Aufnahme von 300.000 Dcpm auf. Die Zellen, die mit der
höchsten Konzentration von pTpT von 40 µM inkubiert worden waren, zeigen eine deutlich
verringerte [3H]-TdR Aufnahme von 20.000 Dcpm. Die [3H]-TdR Aufnahme korreliert dabei
indirekt mit der zugebenen Konzentration an pTpT und nimmt stufenweise bis zur geringsten
Konzentration von 10 µM pTpT zu. Die Zellen, die mit pdApdA inkubiert worden waren,
zeigen hingegen keine signifikante Hemmung der Proliferation.
Dieses Experiment macht deutlich, daß die Dinukleotide pTpT einen hemmenden Einfluß auf
die Proliferation von direkt stimulierten hTZ haben. Bei Inkubation mit dem Kontrollnukleotid
pdApdA zeigt sich hingegen kein Einfluß auf die T-Zell-Proliferation.
ERGEBNISSE
34
hDZ hTZ
UVB
PHA
hTZ-Proliferation (MLR)
pTpT pdApdA
100
200
-
+
+
+
+
+
-
100
-
+
+
+
+
+
+
+
100
-
+
1
50
100
[3H]-TdR-Einbau (cpmx 10- ± SD)
aCD3+aCD28 hTZ
pdApdA
pTpT µM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
A.
40
30
20
15
10
-
hTZ-Proliferation (aCD3+aCD28)
40
30
20
15
10
1
200
[3H]-TdR-Einbau ( cpmx 10-3 ± SD)
400
B.
Abb. 6A/B Reduktion der Proliferation von hTZ nach Zugabe von pTpT bei
Stimulation mit hDZ und Direktstimulation
hTZ wurden mit allogenen hDZ bzw. mit anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc-Antikörper direkt
stimuliert, mit unterschiedlichen Konzentration von pTpT und pdApdA als Kontrolle für 5
Tage inkubiert und mit [3H]-TdR versetzt. Nach 16 h wurde die Proliferation der hTZ über den
[3H]-TdR-Einbau durch Szintillationsszintigraphie im Beta-Counter gemessen. Die Ergebnisse
sind als Dcpm 10-3 ± SD von Dreifachbestimmungen ausgegeben.
ERGEBNISSE
35
4.7
Einfluß von pTpT auf das Proliferationsverhalten von hTZ im [3H]Adenosinassay
Um die Mechanismen des Proliferationsrückganges durch das Dinukleotid pTpT im
[3H]-Thymidin-Assay
zu
prüfen,
wurde
die
Proliferation
der
hTZ
mit
anderen
Zellproliferationsnachweisen analysiert.
Als erstes wurde überprüft, ob durch die Zugabe von [3H]-Adenosin zu mit pTpT inkubierten
hTZ eine ähnliche Proliferationshemmung wie im [3H]-Thymidinassay erzielt werden kann.
Hierbei wurden wieder direkt mit anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc- Antikörper stimulierte
hTZ bzw. mit hDZ stimulierte hTZ mit den Dinukleotiden pTpT und pdApdA in einer
Konzentration von 100 µM versetzt. Nach 5 Tagen wurde den Zellen [3H]-AdR hinzugegeben
und nach weiteren 16 h wurde die Proliferation der Zellen anhand des [3H]-AdR-Einbaus im
Beta-Counter gemessen. Bei den durch hDZ stimulierten hTZ lag die Proliferation bei den mit
pTpT inkubierten T-Zellen nach Zugabe von [3H]-AdR bei 213.000 Dcpm.(Abb. 7A). Sie
entspricht somit genau der Proliferation von unbehandelten Zellen. Im Gegensatz zu den
vorherigen Experimenten zeigt sich ein Rückgang des [3H]-AdR-Einbaus um 60 % in den mit
pdApdA inkubierten Zellen (Abb. 7A). In den mit UVB bestrahlten hDZ zeigt sich wieder wie
im [3H]-Thymidinassay ein deutlicher Rückgang der Proliferation von 33 % bei 100 J/m2 UVB
und von 70 % bei 200 J/m2 UVB.
Bei den mit Antikörpern direkt stimulierten T-Zellen liegt die Proliferation der mit pTpT
inkubierten hTZ bei Zugabe von [3H]-AdR bei 174.000 Dcpm, was der Proliferation der
unbehandelten stimulierten hTZ entspricht. Es war also keine Proliferationshemmung bei den
mit pTpT inkubierten Zellen nachzuweisen. Auch hier zeigt sich im Gegensatz zu den
vorherigen Experimenten ein Rückgang des [3H]-AdR-Einbaus um 94 % in den mit pdApdA
inkubierten Zellen (Abb. 7B).
Als direkte Kontrolle wurden gleich behandelte hTZ mit [3H]-TdR versetzt. Hier ergibt sich
wieder Rückgang der T-Zell-Proliferation um 86 % bei den mit pTpT inkubierten Zellen (Abb.
7B). Die mit dem Kontrollnukleotid pdApdA inkubierten Zellen zeigen jedoch keine
Verminderung des [3H]-TdR-Einbaus.
Sowohl die direkt stimulierten hTZ, als auch die durch hDZ stimulierten T-Zellen weisen
keinen Unterschied in der Proliferation zu den unbehandelten Zellen auf. Dafür zeigt sich in
diesen Experimenten ein Rückgang der Proliferation bei den mit pdApdA inkubierten Zellen.
ERGEBNISSE
36
Damit wird deutlich, daß die pTpT Dinukleotide in diesen Versuchsansätzen keinen Einfluß
auf die Proliferation von stimulierten hTZ besitzen. Dafür zeigt sich ein Rückgang im Einbau
von [3H]-AdR in den mit den pdApdA Dinukleotiden behandelten Zellen.
Abb.7 A/B: hTZ, die mit pTpT und pdApdA inkubiert worden sind, zeigen
unterschiedliche Einbauverhalten bei Zugabe von [3H]-AdR bzw. [3H]-TdR
hTZ wurden in einem Ansatz mit allogenen hDZ (A) oder direkt mit 1µl anti-CD3-, anti-CD28und anti-Fc-Antikörper (B) stimuliert. Es wurden jeweils 100 µM pTpT und 100 µM pdApdA
verwendet. Nach 5 Tagen wurde den Zellen [3H]-AdR gegeben. In dem Versuchsansatz mit den
direkt stimulierten T-Zellen wurden die Zellen mit [3H]-TdR gepulst. Die Ergebnisse sind als
delta cpm x 10-3 ± SD von Dreifachbestimmungen angegeben.
ERGEBNISSE
4.8
37
Einfluß von pTpT auf den Zellzyklus von proliferierenden hTZ
Im folgenden wurde die Untersuchung der Zellproliferation mit einer Analyse des
Zellzyklus wiederholt. Hierbei wird die DNA in den hTZ mit Propidiumjodid (PI) angefärbt.
Anhand des absoluten DNA-Gehaltes in den Zellen können nun Aussagen über die Verteilung
der Zellen in den einzelnen Phasen des Zellzyklus gemacht werden.
Bei den unstimulierten hTZ befinden sich alle Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus. Bei den
stimulierten Zellen befinden sich 20 % in der S-Phase und 18 % in der G2-M Phase. Bei den
mit pTpT behandelten Zellen findet sich bei unterschiedlichen Zeitpunkten (Abb. 8A) und
Konzentrationen (Abb. 8B) kein signifikanter Unterschied. Auch bei pdApdA waren keine
Unterschiede sichtbar. Eine Analyse der Sub-G1-Population weist keine signifikanten
Unterschiede zwischen den mit pTpT, pdApdA und unbehandelten Zellen auf. Damit ist auch
eine vermehrte Apoptose der hTZ nach Inkubation mit Dinukleotiden auszuschließen.
Es läßt sich somit kein Einfluß von pTpT auf den Zellzyklus von proliferierenden hTZ
feststellen.
ERGEBNISSE
38
Abb. 8A:
Die Zellzyklusphasen von proliferierenden hTZ werden durch
unterschiedliche Inkubationszeiten mit pTpT und pdApdA nicht signifikant verändert
hTZ wurden mit anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc-Antikörper direkt stimuliert. Unstimulierte
hTZ- und mit Mitomycin vorbehandelte hTZ dienten als Kontrolle. Es wurden jeweils 100 µM
pTpT und pdApdA bei Beginn der Kultur hinzugegeben. Nach unterschiedlichen Zeitpunkten
wurden die Zellen fixiert und ihre DNA mit Propidiumjodid (PI) angefärbt. Die Analyse des
DNA-Gehaltes erfolgte im FACScan. Die Ergebnisse sind auf der y-Achse als Anzahl an PIpositiven Zellen in % angegeben.
ERGEBNISSE
39
Abb. 8B:
Die Zellzyklusphasen von proliferierenden T-Zellen werden durch
Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von pTpT und pdApdA nicht
beeinflußt
Mit anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc-Antikörper stimulierte hTZ wurden mit
unterschiedlichen Konzentrationen an pTpT und pdApdA für 5 Tage inkubiert. Nach Fixation
der Zellen und Anfärbung mit Propidiumjodid (PI) erfolgte die Analyse des DNA-Gehaltes der
Zellen im FACScan. Die Anzahl der Zellen in %/Zellzyklusphase ist auf der y-Achse
dargestellt.
4.9
Einfluß von pTpT auf die Zellzahl von proliferierenden hTZ
Um einen weiteren Nachweis zu erbringen, ob es sich bei der Proliferationshemmung
im [3H]-Thymidinassay um eine Inhibition der hTZ handelt, wurden jeweils drei Ansätze mit
direkt stimulierten hTZ mit Trypanblau angefärbt und im Lichtmikroskop ausgezählt. Auch
hier wurden 100.000 Zellen mit anti-CD3-, anti-CD28-und anti-Fc-Antikörper für 7 Tage
inkubiert und mit jeweils 100 µl pTpT versetzt. Als Kontrollen dienten wie bei den
Zellzyklusuntersuchungen wieder unstimulierte Zellen und mit pdApdA inkubierte Zellen. Die
ERGEBNISSE
40
Zellzahl wurde nach 4 und 6 Tagen bestimmt. Nach 4 Tagen liegt die Zellzahl der
unstimulierten hTZ bei 100.000 Zellen pro Ansatz. Die Zellzahl der mit pTpT inkubierten
Zellen liegt bei 250.000 Zellen pro Ansatz, was der Zellzahl der stimulierten und der mit
pdApdA inkubierten hTZ entspricht (Abb. 9A). Nach 6 Tagen läßt sich bei unstimulierten hTZ
eine Zellzahl von 50.000 bestimmen. hTZ, welche mit pTpT inkubiert worden sind, liegen bei
400.000 Zellen pro Ansatz, was leicht über der Zellzahl von stimulierten und mit pdApdA
inkubierten Zellen liegt.
Somit hat die Inkubation der proliferierenden hTZ mit pTpT keinen signifikanten Einfluß auf
die Zellzahl.
ERGEBNISSE
41
Abb. 9A/B: Proliferierende hTZ, die mit pTpT und pdApdA inkubiert worden sind,
zeigen keine Unterschiede in der Zellzahl
hTZ wurden mit anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc-Antikörper stimuliert. hTZ alleine dienten
als Kontrolle. Es wurden jeweils 100 µM pTpT und pdApdA bei Beginn der Kultur
hinzugegeben. An Tag 4 und 6 wurden die Zellen entnommen, mit Trypanblau gefärbt und im
Lichtmikroskop in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Die Ergebnisse sind als Zellzahl
pro Ansatz ± SD von Dreifachbestimmungen angegeben.
ERGEBNISSE
4.10
42
Einfluß von pTpT auf die IL-2-Sekretion von proliferierenden hTZ
Als letzter Proliferationsnachweis wurde in einem Zytokin-ELISA untersucht, ob sich
bei den mit pTpT inkubierten proliferierenden hTZ Unterschiede in der IL-2-Konzentration
nachweisen lassen. Stimulierte T-Zellen werden einerseits aktiviert, in die G1-Phase des
Zellzyklus einzutreten und gleichzeitig wird die Synthese von IL-2 induziert. IL-2 vermittelt
nach Bindung an seinen Rezeptor die Progression der T-Zelle durch die Phasen des Zellzyklus.
Da nicht proliferierende T-Zellen auch kein IL-2 produzieren, kann mit Bestimmung der IL-2Konzentration in den Überständen von T-Zellen eine Proliferationsreduktion nachgewiesen
werden. Hierzu wurden Überstände aus den für die Zellzyklusanalysen verwendeten direkt
stimulierten hTZ benutzt. Die Überstände wurden nach 24 h, 48 h, 72 h und 96 h aus den
Vertiefungen abgenommen und auf ihren IL-2-Gehalt untersucht. Es zeigte sich bei 48 h, 72 h
und 96 h nur ein geringer, nicht bedeutender Rückgang des IL-2-Gehaltes bei den mit pTpT
und pdApdA behandelten Zellen.
Auch dieses Ergebnis zeigt, daß die IL-2-Sekretion von proliferierenden Zellen durch die
Zugabe von pTpT nicht beeinflußt wird.
ERGEBNISSE
43
Abb. 10A-D: Einfluß von pTpT auf die IL-2-Produktion von proliferierenden hTZ
Überstände von direkt stimulierten hTZ (anti-CD3-, anti-CD28- und anti-Fc-Antikörper) und
inkubiert mit pTpT bzw. pdApdA (100 µM), wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten in
einem Zytokin-ELISA auf ihren IL-2-Gehalt ananlysiert. Die Ergebnisse sind auf der x-Achse
als pg/ml aus Doppelbestimmungen angegeben.
ERGEBNISSE
4.11
44
Einfluß von pTpT auf die Expression von Oberflächenmolekülen von hDZ
Um
die
Effekte
von
Thymidindinukleotiden
auf
membrangebundene
Oberflächenmoleküle von hDZ wie MHC-Peptide, kostimulatorische Moleküle und
Adhäsionsmoleküle zu untersuchen, wurden mit pTpT und pdApdA vorinkubierte hDZ im
FACScan analysiert. Die Analyse der Oberflächenmoleküle erfolgte nach Vorinkubation von
24 h, 48 h und 72 h. Zur Färbung wurden folgende monoklonale Antikörper gegen
Oberflächenmoleküle verwendet:
anti-ICAM-1, anti-HLA-DR, anti-CD83, anti-CD115, anti-CD1a, anti-CD40, anti-CD95, antiB7-1, anti-B7-2. Danach wurde ein sekundärer FITC-konjugierter Antikörper gefärbt. Als
Vitalmarker wurde Propidiumjodid verwendet
Es zeigt sich in diesem Experiment, daß es bei keiner der unterschiedlichen Inkubationszeiten
zu einer Veränderung im Oberflächenmuster von hDZ nach Inkubation mit den Dinukleotiden
pTpT und pdApdA kommt.
DISKUSSION
45
5.
DISKUSSION
5.1
UVBund
UVA1-Bestrahlung
führt
zu
antigenpräsentierenden Funktion von hDZ in vitro
einer
Inhibition
der
UVB-Strahlung besitzt immunsuppressive Eigenschaften auf die menschliche Haut. Für
eine Modulation der Immunantwort müssen die UV-Strahlen immunkompetente Zellen der
Haut beeinflussen. Die wichtigsten in der Epidermis vorkommenden Immunzellen sind die zu
den dendritischen Zellen gehörenden LZ. Sie sind für die Präsentation von Antigen an naive TZellen verantwortlich. Mehrere Studien in murinen und humanen Systemen haben gezeigt, daß
durch UVB-Bestrahlung der Haut die Fähigkeit, der in der Epidermis residierenden
antigenpräsentierenden Zellen eine CHS-Reaktion zu induzieren, beeinträchtigt wird (Toews et
al. 1980; Cruz et al. 1989; Cooper et al. 1992, Tie et al. 1995). Diese Veränderung der
antigenpräsentierenden Funktion zeigte sich auch experimentell in in vitro Systemen. Die
Fähigkeit von in vivo oder ex vivo bestrahlten Epidermalzellsuspensionen allogene oder
antigenspezifische T-Zellen zu stimulieren, ist reduziert (Stingl et al. 1981, Aberer et al. 1982,
Cooper et al. 1985, Tang und Udey 1991). Die genauen Mechanismen, die zu dieser
Veränderung der antigenpräsentierenden Funktion vor allem im humanen System führen, sind
noch nicht vollständig geklärt.
In dieser Arbeit wurde der Effekt von in vitro applizierter UVB- und-UVA1-Strahlung auf
hochreine Populationen von aus dem Blut gewonnenen hDZ untersucht. Diese aus
Blutmonozyten differenzierte Subspezies der dendritischen Zellen, ähneln den LZ der
Epidermis. Beide zeigen Eigenschaften unreifer dendritischer Zellen, die insbesondere durch
eine hohe Fähigkeit zur Endozytose und eine im Gegensatz zu reifen dendritischen Zellen noch
geringe antigenpräsentierende Kapazität (Sallusto und Lanzavecchia 1994, Stossel et al. 1990).
Deshalb kann man bei vorliegendem Modell davon ausgehen, daß die Ergebnisse dieser Arbeit
mit aus differenzierten Blutmonozyten gewonnenen hdZ, sich mit Einschränkungen auf die
Situation in vivo übertragen läßt. Es ist somit wahrscheinlich, daß naive LZ ein grundsätzlich
ähnliches Verhalten nach UV-Exposition zeigen, gemessen anhand der Fähigkeit, allogene hTZ
in der MLR zu stimulieren. Die Untersuchungen wurden in diesen definierten in vitro
Systemen durchgeführt, um die Wirkungen von UV-Strahlung auf antigenpräsentierende Zellen
losgelöst, von den komplexen Geschehnissen in der menschlichen Haut, zu betrachten und die
größtmöglichste Konstanz beeinflußender Parameter zu gewährleisten.
DISKUSSION
46
Es konnte gezeigt werden, daß in vitro UVB-Bestrahlung hDZ in ihrer Fähigkeit, eine allogene
T-Zellantwort in der MLR zu induzieren, stark beeinträchtigt. Es kommt dosisabhängig zu
einer verminderten T-Zellproliferation nach Stimulation mit UV bestrahlten hDZ. Dabei führt
die Bestrahlung mit UVB zu einer stärkeren Minderung der Immunfunktion von hDZ als
UVA1-Bestrahlung.
Die Verminderung der Proliferationsrate von T-Zellen in der MLR durch mit UVB bestrahlte,
humane antigenpräsentierende Zellen mit den in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Bestrahlungsdosen
nachweisen.
konnten
Beim
andere
Vergleich
Arbeitsgruppen
der
Ergebnisse
in
ähnlichen
muss
man
Versuchsaufbauten
unterschiedlichen
Bestrahlungsverhältnisse und die Art der verwendeten antigenpräsentierenden Zellen achten.
Czernielewski et al. bestrahlte Epidermalzellsuspensionen mit 200 J/m2 UVB und setzte sie
dann in eine allogene MECLR ein. Es zeigte sich eine 50 %ige Reduktion der TZellproliferation in der allogenen MECLR (Czernielewki et al. 1984). Vergleichbare
Ergebnisse mit in vitro bestrahlten Epidermalzellen zeigte Austad und Braathen sowohl im
allogenen als auch im autologen System (Austad und Braathen 1985). Auch bei in vivo
bestrahlten Epidermalzellen läßt sich eine Reduktion der T-Zellproliferation in der autologen
MECLR erzielen (Räsänen et al. 1989).
Um die direkten Auswirkungen von UVB auf antigenpräsentierende Zellen in der MECLR zu
untersuchen, wurden in anderen Studien aufgereinigte LZ als Stimulatorzellen für T-Zellen
verwendet. Cooper et al. zeigte, daß UVB bestrahlte LZ, angereichert durch selektive
„Panning“ Technik, nicht mehr in der Lage sind, allogene T-Zellen zu stimulieren (Cooper et
al. 1985). Ähnliche Funktionsverluste in der MLR erzielte Richters et al. mit aus Hautbiopsien
migrierten Zellen, welche nach Analyse der Oberflächenmarkern als antigenpräsentierende
Zellen der Haut identifiziert werden konnten (Richters et al. 1996).
Aus diesen beiden Experimenten kann jedoch nicht geschlossen werden, daß UVB einen
direkten Effekt auf die Funktion antigenpräsentierender Zellen der Haut besitzt, da die Zellen
erst nach in vivo oder ex vivo Bestrahlung von Hautproben isoliert worden sind. In der
Epidermis vorhandene, bestrahlte Keratinozyten könnten ebensogut durch Freisetzung von
löslichen Faktoren die antigenpräsentierenden Zellen beeinflußt haben. Studien mit in vitro
UVB bestrahlten aufgereinigten LZ führten Weiss et al. und Rattis et al. durch. Rattis et al.
konnte eine dosisabhängige Reduktion der allostimulatorischen Funktion von LZ zeigen, die
über Gradienten aufgereinigt wurden (Rattis et al. 1995). Weiss et al. zeigte eine Reduktion der
DISKUSSION
47
allostimulatorischen Funktion von LZ bei Bestrahlung mit 200 J/m2 UVB , die über Gradienten
aus Epidermalzellsuspensionen gewonnen wurden (Weiss et al 1995).
Ergänzt wurden diese Ergebnisse durch Beobachtungen die ergaben, daß die Aufregulation der
beiden kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 durch UVB Bestrahlung auf LZ inhibiert
wird (Weiss et al. 1995). Auch Rattis et al. zeigte eine verminderte Expression von B7-1 und
B7-2 auf bestrahlten humanen LZ. Diese Beobachtungen an isolierten in vitro bestrahlten LZ
lassen darauf schließen, daß die Beinträchtigung der antigenpräsentierenden Funktion
unabhängig von der Produktion löslicher Faktoren durch Epidermalzellen ist.
Zur Wirkungsweise von UVA auf die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen gibt es
wenig Untersuchungen. Baadsgaard et al. konnte nachweisen, daß es nach UVB und UVCBestrahlung, aber nicht nach UVA Bestrahlung zu einer Induktion einer makrophagenähnlichen
Population von antigenpräsentierenden Zellen kommt, die vor allem autologe T-Lymphozyten
der Suppressorgruppe stimulieren und deshalb zu einer Immunsuppression führen (Baadsgaard
et al. 1988). Er zeigte an humanen Epidermalzellsuspensionen, daß direkt nach UVABestrahlung in die MECLR eingesetzte Zellen eine vergleichbare Reduktion der TZellproliferation wie nach UVB-Bestrahlung erzielen (Baadsgaard et al. 1989). Weiterhin
konnte er zeigen, daß nach 3 Tagen die antigenpräsentierende Funktion nicht nur
wiederhergestellt war, sondern auch leicht erhöht war. Daraus postulierte er, daß sich die
antigenpräsentierenden Zellen nach UVA-Bestrahlung wieder schneller erholten und dass es im
Gegensatz zu UVB-Bestrahlung nicht zu einer Induktion von makrophagenähnlichen
antigenpräsentierenden Zellen komme. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Reduktion der
T-Zellproliferation bei mit UVA bestrahlten hDZ, die direkt nach der Bestrahlung in die MLR
eingesetzt worden sind, ist deutlich geringer als bei den mit UVB bestrahlten Zellen. Somit
konnte die von Baadsgard et al. erreichte ähnliche Reduktion bei UVB und UVA bestrahlten
antigenpräsentierenden Zellen nicht bestätigt werden. Diese unterschiedliche Beeinträchtigung
der antigenpräsentierenden Funktion nach UVA-Bestrahlung könnte durch die Art der
antigenpräsentierenden Zellen bedingt sein. Während in dieser Arbeit eine reine Population von
aus dem Blut generierten hDZ in vitro mit UVA bestrahlt wurden, verwendete Baadsgaard et
al. aus Punch-Biopsien gewonnene in vivo bestrahlte antigenpräsentierende Zellen aus der
Haut. Diese aus den Punch-Biopsien gewonnenen antigenpräsentierenden Zellen unterliegen
hierbei noch Einflüssen von den anderen in der Haut vorkommenden Zellen. In großer Anzahl
in der Epidermis vorhandene Zellen sind die Keratinozyten. Es ist bekannt, daß diese nach
DISKUSSION
48
UVB-Bestrahlung bestimmte Zytokine vermehrt exprimieren, und somit zu einer
Beeinträchtigung der Immunfunktion antigenpräsentierender Zellen führen (Rivas and Ullrich
1992). Im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen, könnte man sich
somit vorstellen, daß die bei Baadsgard et al. verstärkte Hemmung der antigenpräsentierenden
Funktion nach UVA-Bestrahlung, durch einen zusätzlichen immunmodulierenden Effekt von
aus Keratinozyten sezernierten Zytokinen erreicht wird. Es gibt Hinweise, daß es nach UVABestrahlung von humanen Keratinozyten zu einer Veränderung der Balance von bestimmten
Zytokinen kommt (Kondo and Jimbow 1998). Dieses veränderte Zytokinmuster könnte für die
veränderte Immunfunktion der antigenpräsentierenden Zellen verantwortlich sein.
Es gibt bisher wenige Erkenntnisse über die Wirkungen von UVB auf aus dem Blut generierte
hDZ. Young et al. konnte eine Inhibition der allostimulatorischen Funktion von hDZ Zellen
nachweisen (Young et al. 1993). Allerdings benötigte er dazu sehr hohe Bestrahlungsdosen im
Bereich
von
1500-3000
J/m2.
Er
interpretierte
die
Notwendigkeit
dieser
hohen
Bestrahlungsdosen zum Erreichen eines Effektes mit einer höheren Resistenz von aus dem Blut
stammenden hDZ. Die in dieser Arbeit für eine Hemmung der allostimulatorischen Funktion
notwendigen Bestrahlungsdosen bei aus dem Blut stammenden hDZ sind bedeutend geringer
und scheinen mit den Ergebnissen von Young et al. nicht übereinzustimmen. Eine mögliche
Erklärung für diese Diskrepanz könnte durch unterschiedliche Bestrahlungsbedingungen
gegeben sein. Die in dieser Arbeit für die Bestrahlung verwendete Zellzahl pro Petrischale ist
deutlich geringer als die von Young et al., was darauf hinweisen könnte, daß dort die UVBStrahlen weniger Zellen schädigen konnten, da nur ein geringer Anteil der Strahlung die untere
Zellage erreicht.
Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Hemmung der T-Zellproliferation nach Inkubation mit
UVB bestrahlten dendritischen Zellen stimmen somit mit den bisher gezeigten Ergebnissen an
antigenpräsentierenden Zellen überein.
Es ist unwahrscheinlich, daß der inhibitorische Effekt von UVB-Bestrahlung einen
zytotoxischen Effekt auf die antigenpräsentierenden Zellen darstellt. Es konnte in anderen
Arbeitsgruppen sowohl an bestrahlten humanen Epidermalzellen, isolierten LZ und an aus dem
Blut stammenden dendritischen Zellen bis 48 Stunden nach Bestrahlung kein signifikanter
Vitalitätsverlust der bestrahlten Zellen im Vergleich zu unbestrahlten Zellen nachgewiesen
werden (Austad und Braathen 1985, Rattis et al. 1995, Young et al. 1993). Auch in
Vorversuchen zu dieser Arbeit konnte in der FACS-Analyse gezeigt werden, daß UVB-
DISKUSSION
49
Strahlung in der Höhe bis 200 J/m2 keinen signifikanten Vitalitätsverlust bei den aus dem Blut
stammenden dendritischen Zellen bewirkt.
Der Mechanismus der Inhibition kann darin bestehen, daß entweder ein Signal an die T-Zelle
übermittelt wird, das deren Proliferation verhindert oder das Fehlen eines Signals zu einer
unzureichenden Stimulation der T-Zellen führt. Letzteres Modell konnte durch die Arbeiten
von Simon et al. über die Induktion von Toleranz in murinen T-Zellen durch UVB bestrahlte
LZ bestätigt werden. Die darin in Th1-Zellen erzeugte Anergie wurde durch das Fehlen eines
kostimulatorischen Signals erklärt (Simon et al. 1991). Über verminderte Expression von den
beiden kostimulatorischen Molekülen B7-1 und B7-2 berichten mehrere Autoren (Weiss et
al.1995 , Rattis et al. 1995, Young et al.1993). Ergänzt wurden diese Ergebnisse durch
Beobachtungen durch Weiss et al., der durch die Zugabe von anti-CD28-Antikörper in die
MLR das fehlende Signal ersetzen konnte und die durch nach UVB-Bestrahlung entstandene
Proliferationshemmung wieder teilweise rekonstituieren konnte (Weiss.et al.1995). Da keine
vollständige Rekonstitution erfolgte, müssen für die Inhibition der T-Zellproliferation noch
andere Mechanismen verantwortlich sein.
Ein möglicher Mechanismus wäre die verminderte Sekretion von immunstimulierenden
Zytokine wie das IL-12, oder die erhöhte Sekretion von immunhemmenden Zytokinen wie das
IL-10 durch antigenpräsentierende Zellen. Über die Sekretion dieser Zytokine durch UVbestrahlte antigenpräsentierende Zellen gibt es bisher wenig Untersuchungen. Kang et al.
konnte nachweisen, daß es nach in vivo UVB-Bestrahlung zu einer vermehrten Sekretion von
IL-10 durch makrophagenähnliche antigenpräsentierende Zellen (CD11 b+) kommt (Kang et
al.1994). In einer weiterführenden Studie zeigte er, daß es in diesen Zellen nach Bestrahlung zu
einer erhöhten IL-10/IL-12 Ratio kommt, während diese in den noch in der Epidermis
verbleibenden LZ nicht verändert wird (Kang et al. 1998). Auf dem Hintergrund, daß es nach
UB-Bestrahlung zu einer vermehrten Auswanderung von LZ aus der Epidermis kommt erklärte
er die durch UVB-induzierte Immunsuppression der Epidermis nach Bestrahlung anhand eines
verändertes Gleichgewicht der beiden Zytokine IL-10 und IL-12 zu Gunsten von IL-10. Es gibt
bisher
keine
Untersuchung
über
die
Zytokinsekretion
von
in
vitro
bestrahlten
antigenpräsentierenden Zellen. Zum Zeitpunkt der experimentellen Arbeiten standen
kommerzielle Bestimmungsmethoden zum Nachweis dieser Zytokine, die mit überschaubarem
Aufwand durchführbar gewesen wären, nicht zur Verfügung. Deshalb kann die Übertragung
DISKUSSION
50
der oben skizzierten immunologischen Hypothesen auf ein in vitro Modell nur im Rahmen der
verfügbaren Literatur diskutiert werden.
Die Veränderung die nach UV-Bestrahlung an einer antigenpräsentierenden Zelle auftritt und
zu deren funktioneller Beeinträchtigung führt, muß durch einen Photorezeptor getriggert
werden. Als Strukturen der Zelle die für UVB-Strahlung empfänglich sind kommen DNA
sowie Zellmembranmoleküle wie beispielsweise ungesättigte Membranlipide in Betracht.
Es
gibt
Anhaltspunkte,
daß
DNA-Schäden
für
die
funktionelle
Beeinträchtigung
antigenpräsentierender Zellen nach UVB-Kontakt eine entscheidende Rolle spielen (Applegate
et al. 1989).
5.2
UVB- und UVA1-Bestrahlung führt zur Induktion von CPD in der DNA von hDZ
UVB-Strahlung kann von zellulärer DNA absorbiert werden und zur Bildung von
Cyclobutandimeren (CPD) zwischen benachbarten Thymidinbasen führen. Applegate et al.
konnte durch enzymatische Photoreparatur nachweisen, daß auch in antigenpräsentierenden
Zellen der Haut CPD gebildet werden. Sie konnte durch enzymatische Photoreparatur von CPD
die durch UVB entstehende Depletion von LZ in der Epidermis verhindern (Applegate et al.
1989).
In der vorliegenden Arbeit interessierte die Frage, ob sich in hDZ nach in vitro UVB- und
UVA-Bestrahlung CPD nachweisen lassen. Es zeigte sich eine dosisabhängige Induktion von
CPD nach Bestrahlung mit UVB. UVA-Bestrahlung führte nur zu einer sehr geringen
Induktion von CPD.
Dieser Nachweis von CPD im ELISA in der DNA von hDZ nach UVB-Bestrahlung deckt sich
mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen die mit denselben Nachweismethoden gearbeitet
haben. In zwei Studien, in welchen isolierte Kälberthymus-DNA mit UVB in unterschiedlichen
Dosen von 25-100 J/m2 bestrahlt wurde, konnten im ELISA mit dem TDM-2-Antikörper
ähnliche Resultate erzielt werden (Mori et al. 1991, Mizuno et al. 1990). Der Unterschied
zwischen den genannten Versuchen und der vorliegenden Arbeit bestand darin, daß isolierte
DNA direkt mit UVB bestrahlt wurde, während in dieser Arbeit die vitalen Zellen mit UVB
bestrahlt wurden.
DISKUSSION
51
Nakagawa et al. bestrahlte humane Fibroblasten und untersuchte die durch Phenolextraktion
gewonnene DNA im ELISA mit dem TDM-2-Antikörper auf CPD (Nakagawa et al. 1998). Mit
dieser Methode, die der in der vorliegenden Arbeit angewandten Methode entspricht, konnten
auch hier CPD detektiert werden. Allerdings lag die Wellenlänge der Bestrahlung bei 254 nm
bereits im UVC-Bereich, während sie in dieser Arbeit im UVB- bzw. UVA1-Bereich lag.
Der in dieser Arbeit gezeigte Nachweis von CPD in der DNA von hDZ im DNA-ELISA deckt
sich somit mit den Ergebnissen der oben dargestellte Arbeitsgruppen, die mit dem TDM-2Antikörper ähnliche Resultate zeigen konnten.
Untersuchungen an humanen Immunzellen auf CPD führte Clingen et al. an T-Lymphozyten
durch. Als Nachweismethode wurde der H3 Antikörper verwendet, der wie der TDM-2Antikörper spezifisch für CPD ist. Die Bindung wurde in einer speziellen Immunfärbereaktion
sichtbar gemacht. Auch hier ließen sich CPD in T-Lymphozyten nach UVB-Bestrahlung
nachweisen (Clingen et al. 1995).
Mit der Frage, ob sich in antigenpräsentierenden Zellen der Haut nach UVB-Bestrahlung CPD
detektieren lassen beschäftigte sich Sontag et al. im murinen System. Sie bestrahlte Maushaut
in vivo und suchte danach in den abfließenden Lymphknoten nach Dimer-positiven Zellen. Sie
verwendete den schon von Clingen et al. benutzen H3 Antikörper gegen CPD (Sontag et al.
1995). Dadurch war es möglich, Dimer positive Zellen von den restlichen Lymphknotenzellen
zu unterscheiden. Es zeigte sich, daß sich in den Lymphknoten je nach Zeitpunkt
unterschiedliche Anzahlen an Dimer-positiven Zellen nachweisen ließen. Die phänotypische
Analyse der Zellen ergab, daß es sich um stark MHC-II positive Zellen handelt. Eine
Doppelfärbung mit H3 und NLDC 145 Antikörper (Langerhanszellmarker) ergab, daß es sich
bei den Zellen um LZ aus der Epidermis handelte. Es hatten sich somit CPD in
antigenpräsentierenden Zellen der Haut gebildet (Sontag et al. 1995).
Vink et al. erbrachte im gleichen System den Nachweis, daß die Dimer-positiven
antigenpräsentierenden Zellen im Lymphknoten aus der Epidermis stammen, indem er sie
gleichzeitig mit FITC markierte. Er konnte zeigen, daß die Anzahl an Dimer-positiven Zellen
an Tag 1 nach UVB-Bestrahlung höher ist als an Tag 4 (Vink et al. 1996).
Die in dieser Arbeit dargestellte Induktion von CPD in antigenpräsentierenden Zellen nach
UVB-Bestrahlung deckt sich somit mit den Ergebnissen von Vink et al.. Die Ergebnisse
können allerdings nicht direkt miteinander verglichen werden, da es sich bei den Arbeiten im
murinen System um eine in vivo Bestrahlung der Zellen handelt. Außerdem muß beachtet
DISKUSSION
52
werden, daß sich Ergebnisse aus dem Maussystem nicht exakt auf die Verhältnisse im humanen
System übertragen lassen.
Eine Studie im humanen System zur Induktion von CPD in LZ führte Kremer et al. durch. Sie
bestrahlte humane Epidermispräparate ex vivo mit UVB und analysierte die spontan
migrierenden Zellen auf CPD mit der von Vink et al. verwendeten immunhistochemischen
Färbung in Zytospinpräparationen. Da es sich um reine Epidermalpräparate handelt, müssen die
spontan migrierenden Zellen LZ sein. Es zeigte sich hier eine dosisabhängige Induktion von
CPD in den LZ. Sowohl die Anzahl an positiven Zellen als auch die Intensität der CPDFärbung nahm von 200 J/m2 auf 800 J/m2 zu (Kremer et al. 1997). Die in dieser Arbeit gezeigte
dosisabhängige Steigerung der CPD-Induktion in hDZ bei 200 J/m2 deckt sich somit mit der
von Kremer et al. gezeigten UVB dosisabhängigen Steigerung der Anzahl an CPD-positiven
Zellen und der Intensität der CPD-Färbung.
Diese Arbeit unterstützt somit die Hypothese, daß UVB in antigenpräsentierenden Zellen
DNA-Schäden induzieren kann.
Auch hier muß beachtet werden, daß es sich um unterschiedliche Bestrahlungbedingungen
handelt. In dieser Arbeit wurde erstmals die Induktion von CPD in humanen
antigenpräsentierende Zellen gezeigt, die in vitro bestrahlt wurden und dann auf DNA-Schäden
in Form von CPD untersucht wurden.
Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte geringe Induktion von CPD nach UVA1-Bestrahlung
kann damit erklärt werden, daß die Absorptionsfähigkeit von DNA, und im Besonderen von
Pyrimidinnukleotiden, für UVA mit ansteigender Wellenlänge stark abnimmt (Deering und
Setlow 1963). Deshalb sind UV-Strahlen längerer Wellenlänge weniger effektiv bei der
Bildung von Photoprodukten in der DNA (Freeman et al. 1989).
Die in dieser Arbeit verwendete UVA1-Strahlung enthält die besonders langwelligen Anteile
des UV-Spektrums und führt somit zu einer geringen Induktion von CPD in der zellulären
DNA.
5.3
Behandlung mit Photosomen® in vitro führt zu einer Reduktion von CPD in der
DNA von UVB geschädigten hDZ
DNA-Schädigungen in Form von CPD können mit Hilfe von spezifischen
Reparaturenzymen wieder monomerisiert werden. In der vorliegenden Arbeit interessierte die
DISKUSSION
53
Frage, ob durch Photoreparatur der geschädigten hDZ in vitro eine Rückgang der CPD im
ELISA nachweisbar ist.
Zuerst mußte untersucht werden, ob die verwendete Konzentration an PhotosomenÒ und die
Dauer der Inkubation zytotoxische Effekte auf die hDZ besitzt. Anhand des PI-Einbaus im
FACScan, konnte nachgewiesen werden, daß die im Reparaturversuch verwendete
Konzentration und Expositionsdauer keinen zytotoxischen Effekt auf hDZ besitzt (Abb. 3).
Es zeigte sich in dieser Arbeit, daß die Behandlung mit PhotosomenÒ und photoreaktivierenden
Licht die CPD-Schäden in den dendritischen Zellen reduzieren kann (Abb. 4). Die Reduktion
lag hier im Bereich zwischen 54 und 92 %. Vink et al., der eine Photoreparatur nach dem
gleichen Protokoll und der gleichen Photolyase von Anacystis nidulans durchführte zeigte
Reduktionen von Dimer-positiven Lymphknotenzellen, die im Bereich zwischen 30 und 67 %
lagen. Der prozentuale Rückgang der Dimer-positiven Zellen ist bei Vink et al. geringer als in
den Ergebnissen dieser Arbeit. Diese Differenz kann durch die unterschiedliche Anzahl von
Zellen, die bei der Inkubation verwendetet werden erklärt werden. Außerdem bestimmt Vink et
al. die Anzahl der Dimer-positiven Zellen während im hier verwendeten DNA-ELISA die DNA
von allen Zellen isoliert, gepoolt und dann auf ihren Gehalt an CPD untersucht wird. Auch die
für den CPD-Nachweis verwendeten Antikörper können verschiedene Spezifitäten für die
Photoprodukte aufweisen. Vergleichbare Reduktionen von CPD an isolierter DNA im ELISA
mit dem TDM-2-Antikörper erhielt Mori et al. In dieser Studie wurde die Photoreparatur
allerdings nicht an vitalen Zellen durchgeführt, sondern an bereits isolierter KälberthymusDNA. Außerdem verwendete er eine aus E.coli isolierte Photolyase (Mori et al. 1991).
Ein
direkter
Vergleich
der
Photoreparatur
ist
aufgrund
der
unterschiedlichen
Versuchsbedingungen schwierig, jedoch unterstützt die vorliegende Arbeit die Hypothese, daß
sich durch in vitro Photoreparatur mit PhotosomenÒ und photoreaktivierendem Licht die nach
UVB entstandenen DNA-Schäden wieder reparieren lassen.
Die Behandlung mit PhotosomenÒ alleine ergab keine signifikante Reduktion der
Photoläsionen. Dies stimmt mit der chemischen Funktionsweise der Photolyasen überein, da
erst nach Aktivierung des Enzyms eine Abgabe des Elektrons an das Dimer erfolgen kann
(Sancar 1990). Auch Vink et al. konnte keine signifikante Reduktion der Dimer positiven
Zellen nach alleiniger Behandlung mit PhotosomenÒ aufzeigen (Vink et al. 1997).
Die erfolgreiche Reduktion von CPD-Läsionen in der DNA von UVB geschädigten Zellen
erfordert also eine Aktivierung der Photolyase mit langwelligem Licht im UVA-Bereich.
DISKUSSION
54
Somit konnte gezeigt werden, daß in aus dem Blut generierten hDZ eine enzymatische
Photoreparatur von durch UVB entstandenen CPD-Läsionen im ELISA gelingt.
5.4
Reparatur von CPD in vitro führt nicht zur Wiederherstellung
antigenpräsentierenden Funktion von mit UVB geschädigten hDZ
der
UVB-Strahlung führt zu einer Einschränkung der funktionellen Aktivität von hDZ. Hier
wurde dies an der reduzierten Fähigkeit, allogene hTZ in der MLR zur Proliferation anzuregen
untersucht. Im Zusammenhang mit den in hDZ nach UVB-Bestrahlung nachweisbaren DNASchäden stellt sich die Frage, inwieweit diese DNA-Schäden für den Verlust der
antigenpräsentierenden Funktion verantwortlich sind.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die in der allogenen MLR sichtbare Reduktion der TZellproliferation (Abb. 1) nach Stimulation mit UVB bestrahlten hDZ im Zusammenhang mit
den im DNA-ELISA nachgewiesenen DNA-Schäden in Form von CPD stehen (Abb. 4).
Hierfür wurde nach der enzymatischen Photoreparatur ein Teil der Zellen für die Darstellung
von CPD im DNA-ELISA verwendet. Der andere Teil wurde in einer allogenen MLR als
Stimulatorzellen eingesetzt. Damit sollte gleichzeitig in den Zellen das Ausmaß der DNASchäden und deren funktionelle Kapazität analysiert werden. Nur so war es möglich Aussagen
über den Zusammenhang zwischen DNA-Schäden und deren funktioneller Fähigkeit zu treffen.
Es zeigte sich in dieser Arbeit auch, daß trotz deutlicher Reduktion der CPD durch Behandlung
mit Photolyase und photoreaktivierendem Licht in den Stimulatorzellen kein Anstieg der TZellproliferation zu verzeichnen war (Abb. 5). Daraus kann gefolgert werden, daß in diesem
System die enzymatische Photoreparatur der DNA-Schäden allein nicht ausreichend ist, um die
funktionelle Aktivität der UVB geschädigten hDZ wiederherzustellen.
Dieses Ergebnis scheint anderen Studien zu widersprechen, in denen es Hinweise auf einen
möglichen Zusammenhang zwischen UVB induzierten DNA-Schäden und beeinträchtigter
Stimulationsfähigkeit von antigenpräsentierenden Zellen gibt. Diese Studien wurden vor allem
in vivo im murinen System durchgeführt. Hierbei ließ sich nachweisen, daß sich nach
Reparatur von DNA-Schäden in der Haut mit dem Exzisionsreparaturenzym T4N5 die
Inhibition der CHS-Reaktion verhindern ließ (Kripke et al. 1996). Das Enzym T4N5 schneidet
die durch UVB in der DNA von Zellen entstandenen Photoprodukte heraus und führt somit zu
einer Reparatur dieser Schäden. Vink et al. erweiterte dieses Modell, indem er eine Reduktion
von DNA-Schäden in antigenpräsentierenden Zellen der Haut mit einer Wiederherstellung ihrer
antigenpräsentierenden Funktion in Beziehung setzte. Er untersuchte die antigenpräsentierende
DISKUSSION
55
Funktion von geschädigten Lymphknotenzellen anhand der Induktion einer CHS-Reaktion. Es
zeigte sich, daß die DNA geschädigten Lymphknotenzellen in ihrer Fähigkeit, eine CHSReaktion zu induzieren stark beeinträchtigt sind. Die Reparatur der antigenpräsentierenden
Zellen durch Auftragen von T4N5 auf die Maushaut führte zu einer Wiederherstellung der CHSReaktion (Vink et al. 1996).
Erstaunlicherweise war eine Inhibition der CHS-Reaktion nur mit an Tag 4 nach Bestrahlung
gewonnenen Zellen möglich, obwohl die Anzahl der Dimer-positiven Zellen an Tag 1
bedeutend höher war. Dies könnte bedeuten, daß die DNA-Schädigung keinen direkten
Hinweis auf das Ausmaß der Funktionsbeinträchtigung geben kann. Vink et al. erklärte diese
Diskrepanz damit, daß die Beeinträchtigung der antigenpräsentierenden Funktion sich erst nach
Ablauf einer gewissen Zeit entwickelt. Diese Hypothese kann allerdings mit in vitro
Ergebnissen, die aus dem humanen System gewonnen worden sind, nicht unterstützt werden.
So konnte Czernialewski et al. zeigen, daß die durch UVB induzierte beeinträchtigte
Stimulationsfähigkeit von Epidermalzellen in der allogenen MECLR nach 3 Tagen wieder
reversibel war. Die T-Zellproliferation war nach 3 Tagen wieder auf den Wert von
unbestrahlten Epidermalzellen angestiegen (Czernialeswki et al. 1984). Auch Räsanen et al.
konnte eine Wiederherstellung der Stimulationsfähigkeit von Epidermalzellen nach 3 und 7
Tagen in der autologen MECLR beobachten (Räsanen et al. 1989). Diese Unterschiede weisen
auf die Schwierigkeit hin, die Ergebnisse funktioneller Assays aus dem murinen und dem
humanen System miteinander zu vergleichen.
Außerdem könnte auch die Tatsache, daß es sich einmal um in vivo Experimente und einmal
um in vitro Experimente handelt, zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Die Diskrepanz der
Ergebnisse dieser Arbeit mit den Ergebnissen der Studien von Kripke et al. und Vink et al.
könnte sich demnach damit erklären lassen, daß die Systeme zu unterschiedlich sind. So
könnten in den in vivo Modellen noch andere Faktoren, wie die Zytokinsekretion von UV
bestrahlten Keratinozyten einen Einfluß auf die antigenpräsentierende Funktion gehabt haben.
Im Modell der systemischen Immunsuppression wurde nachgewiesen, daß DNA-Schädigung in
Keratinozyten zur Sekretion von IL-10 führt (Rivas und Ullrich 1992, Nishigori 1996). IL-10
führt zu einer Hemmung der IFN-γ Sekretion durch Th1-Zellen und kann sich suppressiv auf
die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen auswirken (Ullrich 1994). Weiterhin hemmt
IL-10 die Sekretion des immunstimulierenden Zytokins IL-12 in LZ, welches zur Induktion
einer Th1-Antwort führt (D’Andrea et al. 1993). Im Modell der lokalen Immunsuppression gibt
DISKUSSION
56
es Anhaltspunkte, dass TNF-α als Mediator der Immunsuppression eine entscheidende Rolle
besitzt. TNF-α lässt sich nach UVB-Bestrahlung in der Epidermis nachweisen und führt zur
einer Beeinträchtigung der Aktivität und Funktion von LZ (Moodycliffe et al. 1994).
Zum Ausschluß dieser indirekten Effekte von UVB auf antigenpräsentierende Zellen
untersuchte Vink et al. in einer weiteren Studie im murinen System, ob durch in vitro
Photoreparatur
antigenpräsentierender
DNA-geschädigter
Zellen
aus
den
regionalen
Lymphknoten eine Wiederherstellung der CHS-Reaktion möglich ist (Vink et al. 1997). Es
zeigte sich, daß es durch in vitro Photoreparatur zu einer 50 %igen Reduktion von Dimerpositiven Zellen und zu einer 100 %igen Wiederherstellung der CHS-Reaktion kommt.
Außerdem konnte er nachweisen, daß es durch enzymatische Photoreparatur nicht zu einer
systemischen Induktion von T-Suppressorzellen kommt. Er untersuchte weiterhin die
Sekretion
von
FITC-geprimten
antigenpräsentierenden
Zellen
aus
autologen
dem
T-Zellen
Lymphknoten.
IFN-g-
nach
Stimulation
mit
Nach
Behandlung
der
Lymphknotenzellen mit Photolyase und photoreaktivierendem Licht kam es zu einer 83 %igen
Wiederherstellung der IFN-g Sekretion der T-Zellen verglichen mit bestrahlten unbehandelten
Stimulatorzellen. Anhand dieser Ergebnisse konnte er die Hypothese bekräftigen, daß es einen
direkten
Zusammenhang
zwischen
DNA-Schäden
und
der
Beeinträchtigung
der
Immunfunktion antigenpräsentierender Zellen gibt. Für die beeinträchtige Funktion scheinen
nicht nur indirekte Effekte durch bestrahlte geschädigte Keratinozyten verantwortlich zu sein,
sondern allein die direkte DNA-Schädigung der antigenpräsentierende Zelle.
Diese Hypothese kann von der vorliegenden Arbeit nicht bekräftigt werden, da es zu keiner
Wiederherstellung der antigenpräsentierenden Funktion in der allogenen MLR nach
enzymatischer Photoreparatur kam.
Die von Vink et al. gezeigte Studie ist die einzige Studie, die sich mit der in vitro
Photoreparatur von antigenpräsentierenden Zellen beschäftigt (Vink et al. 1997). Die von ihm
angewandte Methode der enzymatischen Photoreaktivierung läßt sich mit jener der
vorliegenden Arbeit vergleichen. Allerdings gibt es auch hier einige Unterschiede, die bei der
Klärung der unterschiedlichen Ergebnisse von Bedeutung sein könnten. Es handelt sich
wiederum um zwei verschiedene Systeme, die sich nicht direkt miteinander vergleichen lassen.
Die biologische Relevanz der Dimere könnte in Mauszellen im Vergleich zu humanen Zellen
unterschiedlich sein.
DISKUSSION
57
Mit DNA-Schäden in humanen LZ beschäftigte sich Kremer et al. Sie konnte nachweisen, daß
trotz DNA-Schäden in LZ aus bestrahlten Epidermispräparaten, deren Stimulationsfähigkeit
nicht beeinträchtigt ist. Sie setzte dabei HLA-DR positive Zellen, die aus bestrahlten
Epidermispräparaten spontan migriert waren in eine allogene MLR ein. Interessanterweise
konnte sie keine Beeinträchtigung der allostimulatorischen Fähigkeit von bestrahlten LZ
feststellen. Dies scheint mit den Ergebnissen dieser Arbeit und den Ergebnissen von in vitro
Studien mit bestrahlten LZ nicht übereinzustimmen (Weiss et al., Rattis et al., Richters et al.).
Mögliche Erklärungen hierfür wären, daß Kremer et al. nur HLA-DR positive Zellen
verwendete, die aus den Epidermispräparaten migriert waren. Es könnte sein, daß die noch zur
Migration fähigen LZ auch nicht dermaßen geschädigt waren, daß ihre antigenpräsentierende
Funktion beeinträchtigt war. Sowohl die Fähigkeit zur Migration und die Fähigkeit zur
Stimulation von T-Zellen ist also vom Grad der Schädigung abhängig. Es besteht die
Möglichkeit, daß ein Teil der in der Haut vorkommenden LZ trotz UVB-Bestrahlung nicht in
ihrer Fähigkeit zur Migration und Aktivierung von allogenen T-Zellen beeinträchtigt sind, da
sie eine höhere UVB-Resistenz aufweisen. Da in diesen Zellen eindeutig Thymidindimere in
der DNA nachweisbar waren, könnte dies ein Hinweis sein, daß es bei der Aktivierung von
allogenen
T-Zellen
in
vitro
keinen
Zusammenhang
zwischen
DNA-Schäden
und
beeinträchtigter antigenpräsentierender Funktion gibt. Die in der vorliegenden Arbeit mit einem
vergleichbaren System gezeigten Ergebnisse würden diese Hypothese unterstützen.
Es ist ebenfalls denkbar, daß diese Zellen sich in einem autologen in vivo System anders
verhielten. So könnte es in einem autologen in vivo System auch bei diesen Zellen einen von
Vink et al. gezeigten Zusammenhang zwischen DNA-Schäden und antigenpräsentierender
Funktion geben (Vink et al. 1997). Man kann sich vorstellen, daß bei der Aktivierung von
antigenspezifischen autologen T-Zellen in vivo, wie sie bei der CHS-Reaktion abläuft andere
Mechanismen von Bedeutung sind als bei der Alloaktivierung in vitro. Bei der von Vink
gezeigten Wiederherstellung der IFN-g-Sekretion von stimulierten T-Zellen nach Inkubation
mit photoreparierten antigenpräsentierenden Zellen handelt es sich allerdings um ein in vitro
System. Dieses System läßt sich mit der in dieser Arbeit verwendeten allogenen MLR-Reaktion
vergleichen, da beide System von eventuellen in vivo Einflüßen unabhängig sind. Eine
Erklärung für die dennoch unterschiedlichen Ergebnisse ist, daß es sich bei Vink et al. um ein
autologes System handelt. Bei dem in dieser Arbeit und bei Kremer et al. verwendeten System
handelt es sich beides Mal um ein allogenes System.
DISKUSSION
58
So könnte der Beeinträchtigung der allostimulatorischen Fähigkeit von antigenpräsentierenden
Zellen ein anderer Mechanismus zugrunde liegen als der Stimulationsfähigkeit im autologen
System. Hinweise darauf gibt eine Studie von Kim et al. (Kim et al. 1998). Er untersuchte die
Suppression von DTH-Reaktionen auf C. albicans, Alloantigen und die Suppression der CHSReaktion auf DNFB. Hierbei zeigte er, daß die Reparatur von DNA-Schäden mit dem
Exzisionsenzym T4N5 zwar in der Reaktion auf C.albicans wiederhergestellt werden konnte,
daß aber diese Reparatur keinen Einfluß auf die Reaktion auf Alloantigen hatte. Dies kann
damit erklärt werden, daß unterschiedliche Mechanismen für die Unterdrückung der
Immunfunktion sowohl im autologen System als auch im allogenen System verantwortlich
sind. Somit wäre es möglich, daß DNA-Schäden im allogenen System keine Auswirkung auf
die antigenpräsentierende Funktion haben, während diese im autologen System von
entscheidender Bedeutung sind.
Weiterhin konnte Kim et al. aufzeigen, daß die für die Entwicklung einer Suppression
notwendige UV-Wellenlänge und Dosis von der Art der Immunantwort abhängig ist. Beim
Vergleich der durch UVB entstandenen Effekte ist es somit wichtig, auf die Art der
verwendeten UV-Bestrahlungsgeräte und auf die Art des immunologischen Assays zu achten.
Auch Hurks et al. wies darauf hin, daß die Inhibition von MECLR -Reaktionen von der Art der
Bestrahlungsquelle abhängig ist und daß unterschiedliche Ergebnisse oftmals durch die
Verwendung unterschiedlicher Bestrahlungsgeräte erklärbar sind (Hurks et al. 1995).
Dies erklärt wiederum die doch häufig unterschiedlichen Ergebnisse aus den Studien, in denen
die Effekte von UVB auf das Immunsystem untersucht worden sind, und weist auf die
Schwierigkeiten hin , die beim Vergleich dieser Studien auftreten können.
Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse sprechen dafür, daß die nach UVB-Bestrahlung
sichtbare Beeinträchtigung der antigenpräsentierenden Funktion in einem allogenen in vitro
System nicht in Zusammenhang steht mit den in hDZ nachgewiesenen CPD. Für die Alteration
von antigenpräsentierenden Zellen scheint in diesem System der Mechanismus der DNASchädigung keine entscheidende Rolle zu spielen. Bleibt zu klären, welches Molekül in der
antigenpräsentierenden Zelle von biologischer Relevanz ist. In Frage kämen hierbei eine
Zellmembranschädigung und eine von DNA-Schäden unabhängige Genaktivierung. Es wurde
bereits gezeigt, daß durch UVB-Strahlung diese Effekte vermittelt werden können (Devary et
DISKUSSION
59
al. 1993, Simon et al. 1994, Caceres-Dittmar 1995). Ob diese Effekte in antigenpräsentierenden
Zellen von Bedeutung sind muß in weiteren Studien geklärt werden.
5.5
In vitro Effekte von pTpT auf die Immunfunktion von hDZ und hTZ
Ultraviolette Strahlung führt zur Bildung von Thymidindimeren in der zellulären DNA.
Es konnte gezeigt werden, daß exogene Zugabe von Thymidindinukleotiden (pTpT) die Effekte
von UVB auf Zellen simulieren kann. Hierzu gehören die nach Inkubation mit pTpT
auftretende gesteigerte Melanogenese in Melanozyten, die gesteigerte Expression von
Tyrosinase und die Steigerung von UVR induzierter DNA-Reparatur in humanen Hautzellen
(Eller et al. 1996, Eller et al. 1997, Pedeux et al. 1998). Hinweise auf einen möglichen
Zusammenhang zwischen einer Simulation von UVB induzierten immunsuppressiven
Einflüßen durch pTpT lieferte Leverkus et al., der zeigen konnte, daß die Expression von TNFa in einer humanen Plattenepithelkarzinomlinie nach Inkubation mit pTpT deutlich gesteigert
war (Leverkus et al. 1997).
In der vorliegenden Arbeit interessierte besonders die Frage, ob sich durch die exogene Zugabe
von pTpT ein inhibitorischer Effekt auf hDZ oder hTZ simulieren läßt, ähnlich dem, der nach
einer UVB-Bestrahlung feststellbar ist. Als Kontrolle diente das Dinukleotid pdApdA, da
Adenosinbasen nicht durch UVB dimerisiert werden. Es zeigte sich hierbei, daß es durch
Zugabe von pTpT in einer mit [3H]-TdR gepulsten MLR zu einem 90 %igem Rückgang der TZellproliferation nach Stimulation mit hDZ kommt (Abb. 6A). Dieser Effekt ließ sich auch bei
einer Direktstimulation von T-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28
nachweisen. Die Reduktion der T-Zellproliferation korrelierte dabei indirekt mit der
Konzentration an zugegebenem Dinukleotid (Abb. 6B). In beiden Experimenten zeigte sich
keine Beeinflußung der T-Zellproliferation bei Inkubation mit dem Kontrollnukleotid pdApdA.
Dieses Ergebnis läßt auf einen inhibitorischen Effekt von pTpT auf die T-Zellproliferation
schließen. Der immunsuppressive Einfluß von UVB läßt sich somit durch exogene Zugabe von
pTpT simulieren. Dieses Ergebnis deckt sich mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, in
welchen anhand eines in vitro Proliferationsassays der Einfluß von pTpT auf die
Zellproliferation dargestellt wurde. Magnoni et al. inkubierte humane Keratinozyten mit pTpT
und untersuchte den Einfluß auf die Zellproliferation im [3H]-Thymidinassay. Sie zeigte einen
DISKUSSION
60
Rückgang der Zellproliferation um 80 % in den mit pTpT inkubierten Zellen (Magnoni et al.
1997).
Anhand dieser Resultate könnte auf einen antiproliferativen Effekt der Thymidindinukleotide
geschlossen werden. Interessanterweise konnte sich dieser Proliferationsrückgang im [3H]Adenosinassay nicht bestätigen (Abb. 7A/B). Hier konnte sich bei Inkubation mit dem
Dinukleotid pTpT kein Rückgang der T-Zellproliferation nachweisen lassen. Stattdessen kam
es hier zu einem Rückgang der T-Zellproliferation bei Inkubation mit dem Kontrollnukleotid
pdApdA. Dieses Ergebnis war unabhängig von der Art der T-Zellstimulation. Sowohl bei den
mit hdZ stimulierten hTZ, als auch bei den direktstimulierten hTZ wurde ein Rückgang der
Proliferation bei pdApdA deutlich.
Die Resultate beweisen eindeutig eine Abhängigkeit der Inhibition proliferierender T-Zellen
durch die Dinukleotide pTpT und pdApdA von der Art der verwendeten radioaktiv markierten
Pyrimidinbase im Proliferationsassay. Für diesen Effekt könnten kompetitive Mechanismen
verantwortlich gemacht werden. Möglich ist, daß hier die Dinukleotide mit den zugegebenen
radioaktiven Pyrimidinbasen um den Einbau in die DNA in Konkurrenz stehen. Die
proliferierenden Zellen würden hier bevorzugt das Dinukleotid in die DNA einbauen.
Wahrscheinlich würde zuerst eine Spaltung der Dinukleotide mit Hilfe zelleigener Enzyme in
einzelne Nukleotide erfolgen und danach diese fertigen Nukleotide als Bausteine für die DNASynthese verwendet werden. Dadurch würde nun fast keine radioaktiv markierte Pyrimidinbase
in die DNA eingebaut werden, nachweisbar an einem reduzierten Einbau von [3H]-Base. Ein
Rückgang der Radioaktivität bei pTpT und pdApdA in den beiden Proliferationsmethoden
könnte sich hiermit erklären lassen.
Nach diesen Ergebnissen kann somit in diesem System die Zugabe von pTpT die
Immunsuppression durch UVB nicht simulieren.
Zur genaueren Abklärung dieses Effektes war es nun notwendig, die Zellen mit anderen
Zellproliferationsmethoden
zu
untersuchen.
Bei
der
Analyse
des
Zellzyklus
von
proliferierenden T-Zellen im Durchflußzytometer konnte in dieser Arbeit kein Unterschied
zwischen den Kontrollen und den mit pTpT inkubierten hTZ festgestellt werden (Abb. 8A/B).
Sowohl die Analyse der T-Zellen, die pTpT in unterschiedlichen Konzentrationen als auch in
unterschiedlichen Expositionslängen erhielten zeigten keine Änderungen im Zellzyklus.
DISKUSSION
61
Dieses Ergebnis entspricht nicht den in anderen Arbeiten gezeigten Ergebnissen. Allerdings
wurden in diesen Studien keine direkten Analyse des Zellzyklus durchgeführt. Eller et al.
untersuchten die Expression von zwei Genen, die in den Zellzyklus involviert sind. Er konnte
nachweisen, daß die beiden Gene GADD45 und SD11 (p21) nach 24-stündiger Inkubation mit
pTpT aufreguliert werden und für 3 Tage stärker exprimiert werden (Eller et al. 1997). Sowohl
GADD45 als auch SD11 sollen den Übergang der Zellen von der G1-Phase in die S-Phase
verhindern. Bei Analyse des Zellzyklus müßten sich demnach vermehrt Zellen nachweisen
lassen, die in der G1-Phase verbleiben. Dies konnten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
nicht bestätigen. In einer weiteren Studie an humanen Fibroblasten berichtet auch Goukassian
et al. die Aufregulation von p21-mRNA und die stärkere Expression von p21-, p53-, und
PCNA („proliferating cell nuclear antigen)-Protein nach Inkubation mit 100 µM pTpT
(Goukassian et al. 1999). Diese Proteine sind bei der Regulation des Zellzyklus beteiligt und
werden von Zellen nach DNA-Schäden freigesetzt (Eller et al. 1996, Eller et al. 1997). Nach
diesen Ergebnissen müßten sich demnach auch hier bei einer Zellzyklusanalyse Unterschiede
im Zellzyklus feststellen lassen, was in dieser Arbeit bei hTZ nicht nachgewiesen werden
konnte. Eine mögliche Erklärung wäre, daß schnell proliferierende Zellen im Gegensatz zu den
langsamer proliferierenden Zellinien unterschiedlich auf den Einfluß von pTpT reagieren, denn
sowohl Eller et al. als auch Goukassian et al. verwendeten langsam proliferierende Zellinien,
während die in dieser Arbeit verwendeten hTZ eine rasche Progression in den Zellzyklusphasen
aufweisen.
In einer anderen Studie postulierte Magnoni et al., daß es aufgrund einer erhöhten Expression
von p53 im Western Blot nach Inkubation von humanen Keratinozyten mit pTpT zu einem
Zellzyklusarrest in denselben kommt. Außerdem untersuchte sie die Induktion von Apoptose
durch pTpT in einem Tunel-Assay. Sie konnte keinen Anhalt für Apoptose finden und schloß
daraus und aus der erhöhten p53-Expression, daß in diesen Zellen ein Zellzyklusarrest
stattgefunden haben müßte (Magnoni et al. 1997). Auch in dieser Arbeit ließ sich nach Analyse
der Sub-G1-Population in der Zellzyklusanalyse kein Anhalt auf pTpT-induzierte Apoptose
finden. Allerdings konnte wie oben bereits beschrieben auch kein Arrest im Zellzyklus
nachgewiesen werden. Es ist schwierig diese Ergebnisse miteinander zu vergleichen, da die
Nachweismethoden für einen Zellzyklusarrest zu unterschiedlich sind. So schließen Eller et al.
und Magnoni et al. auf einen Zellzyklusarrest aufgrund von Resultaten, die nur indirekt einen
DISKUSSION
62
Zellzyklusarrest aufzeigen. Da in beiden Studien keine DNA-Gehaltsanalyse der Zellen
erfolgte, ist es nicht möglich diese Ergebnisse direkt miteinander zu vergleichen.
In einer anderen Studie untersuchte Pedeux et al. an humanen Melanozyten und Melanomzellen
die Wirkung von pTpT auf die den Zellzyklus (Pedeux et al.1998). Im Gegensatz zu der oben
genannten Arbeit analysierte Pedeux et al. die einzelnen Zellzyklusphasen durch eine Messung
des DNA-Gehaltes der Zellen, was der in dieser Arbeit verwendeten Methode entspricht. Er
konnte nachweisen, daß es in humanen Melanomzellinien zu einem Verharren der Zellen in der
S-Phase kommt. Er verwendete hierbei zwei unterschiedlich schnell proliferierende Zellinien.
In beiden Fällen konnte er nach 24-stündigen Inkubation mit pTpT in einer Konzentration von
50 µM einen Zuwachs an Zellen in der S-Phase nachweisen und zwar von 26 % auf 43 %. Dies
scheint wiederum den Ergebnissen dieser Arbeit zu widersprechen, in der sich kein Anhalt für
ein Verbleiben der hTZ in der S-Phase des Zellzyklus findet. Auch hier könnte man sich diese
Diskrepanz durch die unterschiedlichen Zellen erklären. So könnten hTZ einen anderen
Zellregulationsmechanismus als humane Melanomzellinien besitzen, der durch pTpT nicht
entscheidend beeinflußt werden kann.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die Inkubation von pTpT Auswirkungen auf
die Zellzahl und die Sekretion von IL-2 proliferierender hTZ besitzt. Beide Methoden geben
Aufschluß über den Aktivitätsgrad der T-Zellproliferation. Beim direkten Nachweis der
Zellvermehrung durch Zellzahlbestimmungen gibt die absolute Anzahl der T-Zellen einen
Anhaltspunkt über die Stärke der Zellproliferation, während bei der IL-2-Bestimmung indirekt
über die Sekretion des Zytokins IL-2 auf die Aktivität der T-Zellen geschlossen werden kann.
Mit beiden Nachweismethoden ließ sich nicht belegen, daß es durch die Inkubation mit pTpT
zu einer deutlichen Reduktion im Proliferationsvermögen von hTZ kommt. Bei der
Bestimmung der Zellzahl ließen sich keine Unterschiede bei den unbehandelten Zellen, bei den
mit pdApdA behandelten Kontrollzellen und bei den mit pTpT behandelten Zellen nachweisen
(Abb. 9). Bei der IL-2-Bestimmung läßt sich sowohl bei den mit pTpT als auch mit pdApdA
behandelten Zellen ein geringer Rückgang der IL-2-Proliferation im Vergleich zu den
unbehandelten Zellen erkennen. Dieser leichte Rückgang erklärt aber nicht die starken
Proliferationsrückgänge im (3H)-Thymidinassay (Abb. 10). Diese Ergebnisse decken sich mit
den bisher in dieser Arbeit nachgewiesenen Ergebnissen, in denen es keine Anhaltspunkte für
eine Inhibition der T-Zellproliferation durch pTpT gibt. Allerdings deckt sich dieses Ergebnis
DISKUSSION
63
wiederum nicht mit der von Eller et al. durchgeführten Studie an humanen Keratinozyten-,
Fibroblasten- und Plattenepithelzellkarzinom-Zellinien. Er zeigte einen Rückgang der Zellzahl
um 63 % in humanen Keratinozyten, Fibroblasten und SCCF12-Zellen nach 3 Tagen
Inkubation mit pTpT (Eller et al. 1997). Man könnte dies damit erklären, daß schnell
proliferierende Zellen unterschiedlich auf den Einfluß von pTpT reagieren.
Die in dieser Arbeit gezeigten Resultate weisen also darauf hin, daß die Inkubation mit dem
Dinukleotid pTpT auf die Proliferation von hTZ keinen Einfluß hat. Es läßt sich damit
feststellen, daß pTpT die immunsuppressiven Effekte von UVB in Form einer Inhibition der TZellproliferation nicht simulieren kann.
Um zu untersuchen, ob die Inkubation mit pTpT Auswirkungen auf die Expression von
Oberflächenmolekülen dendritischer Zellen besitzt, wurden die hDZ nach unterschiedlichen
Expositionslängen im FACScan analysiert. Von Interesse waren dabei besonders die Moleküle,
die bei der Stimulation von naiven T-Zellen eine Schlüsselrolle spielen. So kann man sich
vorstellen, daß die Expression kostimulatorischer Moleküle wie B7-1, B7-2 oder ICAM-1 nach
Inkubation mit pTpT beeinträchtigt sind, wie dies nach UVB-Bestrahlung bereits gezeigt wurde
(Weiss et al. 1995, Tang und Udey 1991). In dieser Arbeit konnte sich keine Veränderung der
Expression von Oberflächenmolekülen in hDZ nach Inkubation mit pTpT nachweisen lassen.
Auch dieses Ergebnis spricht dafür, daß die Inkubation von hDZ mit pTpT zu keinem
immunmodulatorischen Effekt führt.
Dieses Ergebnis deckt sich wiederum nicht mit einer Studie, die von Cruz et al. im murinen
System in vivo durchgeführt hat. Er konnte nachweisen, daß es durch Auftragen von pTpT auf
die Maushaut zu einer 70 %igen Inhibition der CHS-Reaktion mit DNFB kommt. Außerdem
konnte er zeigen, daß pTpT in transgenen Mäusen einer Aktivierung des Genes für TNF-a
führt. Allerdings konnte auch mit dem Kontrollnukleotid pdApdA eine mittlere Inhibition der
CHS-Reaktion von 35 % induziert werden (Cruz et al. 1998).
Diese Diskrepanz der Ergebnisse läßt sich damit erklären, daß es sich hierbei wieder um
unterschiedliche Systeme handelt.
In dieser Arbeit hat sich gezeigt, daß auch bei der exogenen Zugabe eines UV-Photoproduktes
in Form eines Thymidindinukleotides kein Einfluß auf die Immunfunktion von hDZ und hTZ
vorhanden ist. Zumindest in diesem in vitro System lassen sich durch Inkubation mit dem
DISKUSSION
64
Dinukleotid pTpT an hDZ keine Veränderungen der antigenpräsentierenden Funktion und
Änderungen in der Expression von Oberflächenmolekülen nachweisen.
Dies entspricht den bereits gezeigten Ergebnissen, die bewiesen haben, daß in einem allogenen
in vitro System DNA-Schäden nicht mit den Funktionsverlust von hDZ in Beziehung stehen.
Auch bei alleiniger Betrachtung von hTZ lassen sich mit Thymidindinukleotiden keine Effekte
auf die T-Zell-Proliferation erzielen.
5.6
Ausblick
Die immunsuppressiven Wirkungen von UV-Strahlung auf die Haut waren in den
letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. Für eine spätere klinische Anwendung
dieser Erkenntnisse ist notwendig, zuerst die zellulären Zielstrukturen und dann die
molekularen Zielstrukturen von UV-Strahlung zu identifizieren. In einigen Arbeiten wurden als
zelluläres Ziel von UV-Strahlen antigenpräsentierende Zellen der Haut identifiziert.
Gleichzeitig
gab
es
Hinweise,
daß
es
einen
Zusammenhang
gibt
zwischen
antigenpräsentierender Funktion und DNA-Schäden. Diese Hinweise führten dazu, daß in
dieser Arbeit die Einflüße von DNA-Schäden auf die Immunfunktion von humanen in vitro
generierten dendritischen Zellen untersucht werden sollten. Die Untersuchung von DNASchäden im Zusammenhang einer eingeschränkten antigenpräsentierenden Funktion läßt an
zwei klinische Einsatzmöglichkeiten denken.
Zum einen könnten die immunsuppressiven Effekte bei der Behandlung von Erkrankungen
eingesetzt werden, bei denen eine Überaktivität der zellulären Immunantwort vorherrscht, wie
z.B. den Allergien. Zum anderen könnte man die immunsuppressiven Effekte durch eine
entsprechende Wiederherstellung der antigenpräsentierenden Funktion verhindern. Dadurch
wäre eine Prävention von UVB-induzierten Hautschäden möglich.
Bisher gibt es wenige Untersuchungen, über die durch UVB induzierten Schädigungen an
humanen in vitro generierten dendritischen Zellen. In der klinischen Anwendung werden aber
gerade diese Zellen in Zukunft stark an Bedeutung gewinnen, da man sich mit Hilfe dieser
Zellen erhofft, in das Immungeschehen eines Organismus entscheiden einzugreifen. So können
große Mengen an Vorläufern dendritischer Zellen aus dem Blut gewonnen werden, in vitro
DISKUSSION
65
ausgereift und nach entsprechender Manipulation (z.B.: Beladung mit Antigenen) dem
Patienten
reinfundiert
werden.
Mögliche
klinische
Einsatzfelder
liegen
im
Transplantationsbereich, bei Allergien, Autoimmunerkrankungen, zur Vakzination und bei der
Tumortherapie. Im Tiermodell ist es bereits möglich eine spezifische Tumorimmunität und
Größenminderung von Tumoren durch eine Vakzination mit dendritischen Zellen, die vorher
mit Tumorantigenen beladen worden sind, zu erreichen (Specht et al. 1997, Song et al. 1997).
Beim Einsatz von dendritischen Zellen in der Behandlung von Allergien müßte man eine
antigenspezifische Anergie in vorhandenen bereits geprägten T-Zellen erreichen. Man kann
sich vorstellen, daß es möglich ist durch in vitro Bestrahlung von hDZ eine veränderte
Kostimulationsfähigkeit zu erzeugen, die dann bei den T-Zellen einen anergischen Zustand
induziert. Für eine erfolgreiche Immuntherapie ist es aber notwendig den genauen
Mechanismus der immunsuppressiven Eigenschaft von UV-Strahlung auf dendritische Zellen
zu klären.
Auch bei der Prävention von UV-induzierten Hautschäden ist es wichtig, den Mechanismus der
UV-induzierten Immunsuppression zu analysieren. So kann man sich vorstellen, daß eine nach
UV-Bestrahlung durchgeführte Reduktion von DNA-Schäden durch Applikation von
Reparaturenyzmen zu einer Wiederherstellung der Immunfunktion führt. Damit ließen sich
eventuelle Spätfolgen der UVB-induzierten Immunsuppression verhindern. Auch hier ist es
notwendig, die Zielstrukturen und immunologischen funktionellen Auswirkungen von UVStrahlung auf das humane Immunsystem der Haut genau zu kennen, um einen Therapieerfolg
zu erzielen.
ZUSAMMENFASSUNG
6.
66
ZUSAMMENFASSUNG
Es ist bekannt, daß UVB-Strahlung die Funktion von antigenpräsentierenden Zellen, d.h. LZ in
der Haut beeinflußt. Der Mechanismus, der zu dieser Funktionsbeeinträchtigung führt ist noch
nicht vollständig geklärt. Es gibt Hinweise, daß UVB induzierte DNA-Schäden in
antigenpräsentierenden Zellen mit der supprimierten Funktion dieser Zellen in Zusammenhang
stehen.
In dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob die durch UVB-Strahlung induzierte Hemmung der
antigenpräsentierenden Funktion von in vitro aus dem Blut generierten humanen dendritischen
Zellen (hDZ) mit DNA-Schäden in Form von Cyclobutandimeren (CPD) in Beziehung steht.
Die Hemmung der antigenpräsentierenden Funktion von hDZ zeigte sich in einer
dosisabhängigen Reduktion ihrer Fähigkeit allogene T-Zellen in einer MLR zur Proliferation zu
stimulieren. In einem ersten Ansatz konnte mit Hilfe eines CPD-spezifischen DNA-ELISA
gezeigt werden, daß UVB-Strahlung in denselben Dosen, die auch zum Funktionsverlust führen
CPD in hDZ induziert. Die UVB-induzierte Bildung von CPD konnte durch die Behandlung
mit Photosomenâ (Photolyase von Anacystis nidulans verpackt in Liposomen) und
photoreaktivierendem Licht wieder repariert werden. Die Reparatur der CPD führte jedoch
nicht zu einer Wiederherstellung der allostimulatorischen Funktion der hDZ.
In einem zweiten Ansatz wurde der Einfluß von DNA-Schädigungsprodukten auf die Funktion
von hDZ in Form von synthetischen Thymidindinukleotiden (pTpT) untersucht, die DNASchäden simulieren können. In hDZ führte die Behandlung mit pTpT jedoch nicht zu einer
Veränderung der Oberflächenmoleküle oder der allostimulatorischen Funktion. Auch auf die
Proliferation im [3H]-Thymidinassay von direkt mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern
stimulierte hTZ hatte die Behandlung mit pTpT keinen Einfluß. Auch die Untersuchung des
Zellzyklus, der Zellzahl und der IL-2-Sekretion zeigten keine pTpT spezifischen Effekte.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß der immunsuppressive Effekt von UVB auf aus
peripherem Blut gewonnenen hDZ nicht durch UVB induzierte CPD-DNA-Schäden vermittelt
wird.
LITERATUR
7.
67
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LEBENSLAUF
Name:
Ute Stefani Haaga
Geburtsdatum/-Ort:
24. Januar 1972 in Stuttgart
Eltern:
Birgit Haaga, geb. Lakner ,CTA und
Rolf-Peter Haaga, Dipl.Ing.
Schulbildung und beruflicher Werdegang:
· September 1978- Juli 1982:.
Grundschule in Schorndorf
· September 1982:
Max-Planck-Gymnasium in Schorndorf
· Juli 1991:
Abitur
· Juli 1991- Juli 1992
Sprachaufenthalt in Genf/Schweiz
· Oktober 1992:
Aufnahme des Medizinstudiums an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg
· August 1994:
Physikum an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
· August 1995:
1.Staatsexamen
Freiburg
· September 1995-Juni 1996:
Studienjahr an
Lyon/Frankreich
· März 1999:
2. Staatsexamen an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
· April 1999:
Hochschulwechsel an die Eberhard-Karls-Universität
Tübingen
· Mai 2000:
3. Staatsexamen
Tübingen
· seit November 2000
Ärztin im Praktikum an der Medizinischen Klinik III der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
an
der
an
der
Albert-Ludwigs-Universität
Université
der
Claude
Bernard
Eberhard-Karls-Universität