Dissertation fertig

Beeinflussung der Strahlenreaktion der
Mundschleimhaut durch Lovastatin:
Tierexperimentelle Untersuchungen (Maus)
Dissertationsschrift
zur Erlangung eines doctor medicinae (Dr. med.)
der medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
vorgelegt von
Stefanie Klinkicht-Bormann
geb. Büttner
aus Löbau
Dresden 2013
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. vet. et rer. medic. habil. Wolfgang Dörr
2. Gutachter:
___________________________________________
Tag der mündlichen Prüfung:
_________________
_________________________________________
Vorsitzender der Promotionskommission
Inhaltsverzeichnis
Seite
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................. 4
1
EINLEITUNG................................................................................................................. 6
2
LITERATURÜBERSICHT.............................................................................................. 9
2.1
Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich ............................................................. 9
2.2
Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren....................................................................11
2.2.1
Chirurgische Therapie.......................................................................................11
2.2.2
Strahlentherapie................................................................................................11
2.2.3
Zytostatische Therapie......................................................................................14
2.2.4
Kombinierte Radiochemotherapie .....................................................................14
2.3
Nebenwirkungen der Strahlentherapie..................................................................14
2.3.1
Frühe Strahlenfolgen.........................................................................................15
2.3.2
Späte (chronische) Strahlenfolgen ....................................................................16
2.3.3
Konsekutive Späteffekte....................................................................................17
2.4
Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich .............................................17
2.4.1
Frühreaktionen..................................................................................................17
2.4.2
Spätfolgen.........................................................................................................19
2.5
Radiogene Mucositis enoralis ...............................................................................20
2.5.1
Pathogenese und zeitlicher Verlauf ...................................................................20
2.5.2
Klassifizierungssysteme ....................................................................................22
2.5.3
Inzidenz und klinische Bedeutung .....................................................................25
2.5.4
Prophylaxe und Therapie ..................................................................................26
2.6
Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut .....................................30
2.6.1
Humane Mundschleimhaut................................................................................30
2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen ................................................30
2.6.1.2 Proliferationskinetik .......................................................................................31
2.6.2
Murine Mundschleimhaut ..................................................................................31
2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus.......................31
2.6.2.2 Proliferationskinetik .......................................................................................32
2.7
Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis ....................33
2.7.1
Maus .................................................................................................................33
2.7.2
Hamster ............................................................................................................34
2.7.3
Ratte .................................................................................................................34
2.8
Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit ......................................................35
2.8.1
Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept..............................35
2.8.2
Recovery (Erholung) .........................................................................................36
2.8.3
Repopulierung...................................................................................................37
2.8.4
Redistribution ....................................................................................................38
2.8.5
Reoxygenierung................................................................................................39
2.8.6
Volumeneffekt ...................................................................................................39
2.9
Lovastatin................................................................................................................40
2.9.1
Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin .............................................................41
2.9.2
Pharmakodynamik und Pharmakokinetik ..........................................................42
2.9.3
Nebenwirkungen ...............................................................................................42
2.9.4
Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) .....................................44
1
2.10
3
3.1
Zielstellung der vorliegenden Arbeit .....................................................................45
MATERIAL UND METHODEN .....................................................................................46
Versuchstiere ..........................................................................................................46
3.2
Bestrahlung.............................................................................................................47
3.2.1
Bestrahlungsanlagen ........................................................................................47
3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung..................................................................................47
3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung ............................................................................48
3.2.2
Dosimetrie.........................................................................................................48
3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung..................................................................................48
3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung ............................................................................49
3.3
Durchführung der Bestrahlung..............................................................................49
3.3.1
Perkutane Schnauzenbestrahlung ....................................................................49
3.3.2
Lokale Zungenbestrahlung................................................................................50
3.4
Beurteilung der Strahlenreaktion ..........................................................................51
3.5
Beschreibung der durchgeführten Experimente ..................................................52
3.5.1
Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) ................................................................53
3.5.2
Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E)..............................................................53
3.5.3
Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) .........................................54
3.6
Statistische Auswertung ........................................................................................54
3.6.1
Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen .......................................................54
3.6.2
Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis ........................................55
3.6.3
Analyse der histologischen Parameter ..............................................................55
3.7
4
4.1
Histologische Untersuchungen .............................................................................55
ERGEBNISSE ..............................................................................................................57
Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L)...........................................................57
4.2
Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) .................................................................58
4.2.1
Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus)................................................58
4.2.2
Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion ..........................58
4.3
Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) ................60
4.3.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz ................................................................60
4.3.2
Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion ........................................................61
4.4
Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0)..............62
4.4.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz ................................................................62
4.4.2
Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion ........................................................62
4.5
Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X).....................63
4.5.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz ................................................................64
4.5.2
Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion ..............................................................65
4.6
Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) ..................66
4.6.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz ................................................................66
4.6.2
Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion ..............................................................67
4.7
Histologische Untersuchungen .............................................................................68
4.7.1
Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der
Zungenunterseite (H0 und H1) ..........................................................................69
4.7.1.1 Zellzahlen......................................................................................................69
4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke ..............................................................................71
4.7.2
Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2)......................................................71
4.7.2.1 Zellzahlen......................................................................................................71
2
4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke ..............................................................................71
4.7.3
Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe...............................75
4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) .............................................75
4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) .............................................76
5
DISKUSSION ...............................................................................................................79
5.1
Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis.................................79
5.2
Zungenepithel der Maus als Tiermodell ................................................................80
5.2.1
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen...........................................80
5.2.2
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ...................................................................81
5.2.3
Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung ............82
5.3
Applikation von Lovastatin ....................................................................................82
5.3.1
Dosierung .........................................................................................................82
5.3.2
Verträglichkeit ...................................................................................................83
5.4
Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch
Lovastatin................................................................................................................83
5.4.1
Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung..........................................................83
5.4.2
Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung ...............................................84
5.5
Histologische Untersuchungen .............................................................................85
5.5.1
Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung ........................................86
5.5.2
Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe ...................................87
5.5.3
Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe ...................88
5.6
Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von
Normalgeweben durch Statine...............................................................................88
5.7
Mögliche Wirkmechanismen von Statinen............................................................90
5.7.1
Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion ...........................90
5.7.2
Beeinflussung der Entzündungsreaktion ...........................................................92
5.7.3
Beeinflussung der Gefäßreaktion ......................................................................93
5.8
Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe..........................................94
6
AUSBLICK ...................................................................................................................95
7
ZUSAMMENFASSUNG ...............................................................................................96
8
SUMMARY ...................................................................................................................99
9
THESEN.....................................................................................................................102
10
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................104
11
TABELLENVERZEICHNIS.........................................................................................106
12
LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................107
13
ANHANG....................................................................................................................127
DANKSAGUNG .................................................................................................................131
ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS ...........................132
ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN .............................133
3
Abkürzungsverzeichnis
ACE-Hemmer
Angiotensin Converting Enzyme-Hemmer
Acetyl-CoA
Acetyl-CoenzymA
ASORS
Arbeitsgemeinschaft Supportive Maßnahmen in der Onkologie, Rehabilitation und Sozialmedizin der deutschen Krebsgesellschaft
AZ
Aktenzeichen
CLE
Consequential late effects
Cox2
Cyclooxygenase2
CTC
Common Toxicity Criteria / Common Terminology Criteria
CTC AEv4.0
Common Terminology Criteria for Adverse Events Version 4.0
DEGRO
Deutsche Gesellschaft für Radioonkologie e.V.
Destatis
Statistisches Bundesamt Deutschland
DNA
Desoxyribonucleic Acid
E. coli
Escherichia coli
ED50
Effektive Dosis, bei der bei 50 % der Tiere ein Effekt (Ulzeration) zu
erwarten ist
EDIM
murines Rotavirus
EGFR
Epidermal Growth Factor Receptor
FSU
Functional Sub Unit
GM-CSF
Granolozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
GDP/GTP
Guanosindiphosphat/Guanosintriphosphat
GEKID
Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V.
GTP/GDP
Guanosintriphosphat/ Guaninbisphosphat
HDL
High Density Lipoprotein
HE
Hämatoxylin-Eosin
HMG-CoA
3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA
IBDQ-B
Inflammatory Bowel Disease Questionnaire – Bowel
IGF-I
Insulin-like Growth Factor
IL
Interleukin
IFN-γ
Interferon-γ
KG
Körpergewicht
KGF
Keratinocyte Growth Factor
LCM
Virus der lymphozytären Choriomeningitis
LDL
Low Density Lipoprotein
LENT
Late Effects in Normal Tissues
LQ-Modell
Linear-Quadratisches Modell
MAD
Murines Adenovirus
4
MASCC/ISOO
Multinational Association of Supportive Care in Cancer/ International
Society of Oral Oncology
MCMV
Murines Cytomegalie-Virus
MCP1
Monocyte Chemoattractant Protein-1
MEZ/MESZ
Mitteleuropäische Zeit/Mitteleuropäische Sommerzeit
MHV
Murines Hepatitis-Virus
MPV
Murines Pneumonie-Virus
mRNA
messenger-Ribonucleic Acid
MVM
Minute Virus of Mice
NCI
National Cancer Institute
NF-κB
Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells
NO
Stickstoffmonoxid
OMAS
Oral Mucositis Assessment Scale
Q10
Coenzym-Q10
Reo3
Reovirus Typ 3
ROS
Reactive Oxygen Species
RTOG/EORTC
Radiation Therapy Oncology Group/European Organisation for
Research and Treatment of Cancer
SAS
Statistical Analysis System
SD
Standard Deviation (Standardabweichung)
SOMA
Subjective, Objective, Management and Analytic Categories
SPF
spezifiziert pathogenfrei
σ
Standardabweichung der ED50 gemäß Probit-Analyse
TGF-α
Transforming Growth Factor-α
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
T1/2
Halbwertzeit
UICC
Union Internationale Contre le Cancer
UV
Ultraviolett
WHO
World Health Organisation
5
EINLEITUNG
1 Einleitung
Tumorerkrankungen (26,8 %) stellten im Jahr 2011 nach den Erkrankungen des HerzKreislaufsystems (40,2 %) die zweithäufigste Todesursache in Deutschland dar [Destatis
2012]. Dabei sind bösartige Neubildungen die bedeutendste Todesursache in den mittleren
Lebensjahren [Destatis 2012]. 2008 standen in Deutschland Tumoren des Kopf-HalsBereiches bei den Männern an 8. Stelle und bei den Frauen an 17. Stelle der Todesursachen
[RKI und GEKID 2012]. Aufgrund von Neubildungen des Mund- und Rachenraumes verstarben im Jahr 2011 insgesamt 4064 Männer und 1322 Frauen [Destatis 2012].
In Deutschland erkrankten 2010 mehr als 12000 Personen neu an Kopf-Hals-Tumoren, wobei Männer (9849 Fälle) ca. dreimal häufiger betroffen waren als Frauen (3344 Fälle). Das
mittlere Erkrankungsalter lag im sechsten Lebensjahrzehnt. Die relativen 5-JahresÜberlebensraten betrugen für Männer 44 % und für Frauen 59 %, wobei die günstigsten
Überlebensraten bei Tumorerkrankungen der Lippen mit 90 % und die ungünstigsten bei
Rachentumoren mit 30-40 % festgestellt werden konnten [RKI und GEKID 2012].
Die Ätiologie von Kopf-Hals-Tumoren ist multifaktoriell, jedoch sind Alkohol- und Tabakkonsum als Hauptrisikofaktoren anzunehmen. Es spielen aber auch virale Infektionen (z.B. humane Papillomviren), der berufliche Umgang mit bestimmten Schadstoffen (Asbest, chromund nickelhaltige Farben und Lacke, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe), eine
schlechte Mundhygiene, ein geschwächtes Immunsystem und chronische Verletzungen der
Schleimhaut durch, z.B. schlecht sitzende Zahnprothesen, Zahnklammern oder scharfe
Zahnkanten, eine Rolle [RKI und GEKID 2012, Wagner et al. 2012].
Als Therapieoptionen stehen die drei Hauptsäulen Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie zur Verfügung. Je nach Tumorlokalisation, -ausdehnung und -entität sowie Begleiterkrankungen des Patienten müssen die Therapiemöglichkeiten individuell geprüft und festgelegt werden. Bei der Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren kommt der Strahlentherapie
eine besondere Bedeutung zu. Jeder zweite Patient erhält im Laufe seiner Behandlung eine
Radiotherapie, häufig in Kombination mit operativen Maßnahmen und/oder Chemotherapie
[Bootz und Howaldt 2008, Appold et al. 2009]. Die Behandlung kann dabei in kurativer als
auch palliativer Absicht durchgeführt werden.
Aufgrund des invasiven Wachstums der meisten Malignome muss bei einer kurativen Zielsetzung eine möglichst hohe Strahlendosis im Tumor angestrebt werden. Es müssen beträchtliche Anteile gesunden Gewebes in das Hochdosisvolumen einbezogen werden [Dörr
2010, Schmidt et al. 2010]. Letztere befinden sich innerhalb des Tumors, in dessen Randbereichen mit vermuteter Infiltration, in den Sicherheitssäumen der Bestrahlung (Bewegungs-,
Lagerungsunsicherheiten), sowie in den Ein- und Austrittskanälen der Strahlung [Dörr 2010].
Dies führt dazu, dass bei Strahlenbehandlungen in kurativer Absicht immer ein bestimmtes
6
EINLEITUNG
Risiko für das Auftreten radiogen bedingter Nebenwirkungen akzeptiert werden muss [Dörr
und Herskind 2012]. Frühe Strahlenfolgen treten dabei innerhalb von 90 Tagen nach Behandlungsbeginn auf, später auftretende Nebenwirkungen werden als chronische Strahlenfolgen bezeichnet [Dörr 2009b].
Die radiogene Mucositis enoralis ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung
der Radiotherapie von Kopf-Hals-Tumoren, welche in verschiedenen Schweregraden bei
nahezu jedem Patienten auftritt [Dörr 2009c, Dörr et al. 2010, Hannemann 2011]. Bei einer
konventionellen Bestrahlung mit 5x2 Gy/Woche kommt es bereits zu Beginn der zweiten
Behandlungswoche zu einer Rötung und Schwellung der Mundschleimhaut. Anschließend
bilden sich lokale Erosionen, welche im weiteren Verlauf in eine konfluierende, pseudomembranöse Mukositis übergehen [Dörr et al. 2010]. Diese Veränderungen der Mundschleimhaut entstehen ca. 9 Tage nach Applikation einer Schwellendosis von 20 Gy und
heilen nach Beendigung der Strahlentherapie meist vollständig aus [van der Schueren et al.
1990, Dörr et al. 2010].
Die schmerzhafte Mucositis enoralis, im Zusammenspiel mit Xerostomie und Geschmacksveränderungen, ist der dominierende Faktor für die Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes und der Lebensqualität von Patienten während bzw. kurz nach einer onkologischen Therapie [Dörr et al. 2010, Hannemann 2011]. Sie ist die häufigste Ursache für Therapieunterbrechungen und infolge dessen verantwortlich für eine drastisch verminderte Tumorheilungschance [Dörr et al. 2009, 2010, Overgaard et al. 2010]. Außerdem erhöht die orale Mukositis das Risiko für das Auftreten von späten Strahlenfolgen im Sinne von konsekutiven
Späteffekten [Dörr et al. 2010]. Die radiogen bedingten Veränderungen der Mundschleimhaut sind jedoch auch von sozioökonomischer Bedeutung. Kostenschätzungen gehen von
mehreren Tausend Euro pro Patient aus, welche durch die orale Mukositis zusätzlich verursacht werden [Elting et al. 2007, Murphy 2007, Dörr et al. 2008, Sonis 2011].
Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze zur Prophylaxe und Therapie der
Mucositis enoralis fand bisher noch kein spezifisches Konzept Eingang in die klinische Praxis
[Dörr et al. 2009, Dörr und Herskind 2012]. Als allgemeine Massnahmen können eine optimale Mundhygiene, Mundspülungen, eine adäquate Schmerzbehandlung und, bei Auftreten
einer Infektion, eine antibiotische bzw. antimykotische Therapie empfohlen werden. Einen
neuen Ansatzpunkt stellt der 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Inhibitor
Lovastatin dar. Durch eine Bestrahlung werden verschiedene Signaltransduktionskaskaden
beeinflusst. Statine besitzen neben ihrer Cholesterol senkenden Wirkung eine Vielzahl weiterer Eigenschaften, sogenannte pleiotrope Effekte. Sie nehmen Einfluss auf die posttranslationale Modifikation kleiner GTPasen, wie das Rho- und Ras-System, welche eine wichtige
Rolle bei der Zellkommunikation, der Proteinbiosynthese, der Organisation des Zytoskeletts,
7
EINLEITUNG
der Zellteilung, des Zellüberlebens und der Beeinflussung von Immunantwort und Entzündungsreaktionen spielen [Knox et al. 2005, Ostrau et al. 2009].
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Lovastatin auf die Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis bei ein- und zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung untersucht werden. Dafür wurde das etablierte Tiermodell der Zungenunterseite der Maus verwendet [Dörr
1987, 1997b]. Klinischer Endpunkt war das Auftreten einer Ulzeration der Schleimhaut, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC beim Menschen. In weiterführenden histologischen Untersuchungen erfolgte die genauere Quantifizierung der epithelialen Zellzahlen und Schichtdicken.
8
LITERATURÜBERSICHT
2 Literaturübersicht
2.1
Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich
Zu den Tumoren im Kopf-Hals-Bereich gehören bösartige Neubildungen des Mund- und Rachenraums, der Nase und der Nasennebenhöhlen sowie des Kehlkopfes [Argiris et al. 2008].
Je nach Ursprungsgewebe können Karzinome, Lymphome und Sarkome unterschieden
werden. Bei den von den Schleimhäuten ausgehenden Tumorerkrankungen handelt es sich
fast ausschließlich um Plattenepithelkarzinome [RKI und GEKID 2012]. Insgesamt machen
Tumoren des oberen Aerodigestivtraktes ca. 7 % aller Malignom-Erkrankungen aus. Die Anzahl an Neuerkrankungen betrug 2009 in Deutschland 9849/Jahr bei Männern und 3344/Jahr
bei Frauen [RKI und GEKID 2012]. Bezogen auf 100.000 Einwohner ergibt sich für die männliche Bevölkerung eine Inzidenz von 19,5 und für die weibliche Bevölkerung von 5,7. Dies
zeigt das Männer dreimal häufiger betroffen sind als Frauen [GEKID 2009]. Zum Zeitpunkt
der Diagnose sind Männer durchschnittlich 61 Jahre und Frauen 66 Jahre alt. Unter 40 Jahren treten kaum Erkrankungen auf. Die relativen 5-Jahres-Überlebensraten betrugen im Mittel für Männer 44 % und für Frauen 59 %, wobei Lippenkrebs mit über 90 % die günstigsten
und Rachenkrebs mit 30-40 % die ungünstigsten Überlebensraten aufweist [RKI und GEKID
2012]. An bösartigen Neuerkrankungen im Kopf-Hals-Bereich verstarben im Jahr 2010 in
Deutschland insgesamt 1.169 Frauen und 3.813 Männer. Die Mortalität beträgt damit bei der
männlichen Bevölkerung 7,4/100.000 und bei der weiblichen Bevölkerung 1,8/100.000 Einwohner [GEKID 2009].
Die Ätiologie dieser bösartigen Neubildungen ist multifaktoriell. Zu den auslösenden Faktoren gehören vor allem regelmäßiger Nikotin- und Alkoholkonsum. Dabei erkranken insbesondere Raucher bis zu sechsmal häufiger als Nichtraucher, wobei die Kombination von Nikotinabusus mit Alkoholkonsum das Risiko nochmals verstärkt. Der orale Genuss von Tabak
(z.B. Kautabak) führt ebenfalls zu einer Erhöhung des Risikos, an Kopf-Hals-Tumoren zu
erkranken [GEKID 2009, RKI und GEKID 2012]. Weiterhin werden virale Infektionen (z.B.
Epstein-Barr-Virus und humaner Papillomavirus, vor allem die Subtypen 16, 18, 33), der berufliche Umgang mit bestimmten Schadstoffen (Asbest, chrom- und nickelhaltige Farben und
Lacke, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe), schlechte Mundhygiene, ein geschwächtes Immunsystem und chronische Verletzungen der Schleimhaut, durch z.B.
schlecht sitzende Zahnprothesen, Zahnklammern oder scharfe Zahnkanten, als ätiologische
Faktoren diskutiert [Preuss et al. 2011, RKI und GEKID 2012, Wagner et al. 2012].
9
LITERATURÜBERSICHT
Tumoren im Kopf-Hals-Bereich bedingen in der Frühphase der Erkrankung keine oder nur
wenige Symptome. So werden als Erstsymptom häufig zervikale Lymphknotenmetastasen
festgestellt. Oftmals werden je nach Tumorlokalisation, z.B. bei Kehlkopftumoren, eine länger
anhaltende Heiserkeit, bei Rachentumoren Schluckbeschwerden oder bei Tumoren im
Mundbereich ein Fremdkörpergefühl erst als Spätsymptom diagnostiziert.
Die Wahl der Therapiemodalität(en) erfolgt auf der Basis von Größe und Ausdehnung des
Primärtumors sowie eventuell vorhandenen Metastasen. Tumorausdehnung (T), Lymphknotenbefall (N) und Metastasierung (M) begründen die TNM-Klassifikation der UICC (Union
Internationale contre le Cancer) zur Einteilung der Karzinome (Tabelle 1) [Sobin et al. 2010].
Der Differenzierungsgrad (Grading) der Neubildungen wird von G1 (gut differenziert) bis G4
(undifferenziert) eingeteilt.
Tabelle 1: Einteilung der Kopf-Hals-Tumoren nach der TNM-Klassifikation [Sobin et al. 2010]
Abkürzung
T
Tx
(Primärtumor=
T0
Größe)
Tcis
T1
T2
T3
Klassifikation
T4a
T4b
N
(Node=
Regionärer
Lymphknotenbefall)
N0
N1
N2a
N2b
N2c
N3
M
(Metastasis=
Fernmetastasen)
Mx
M0
M1
Beschreibung
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
kein Anhalt für Primärtumor
Carcinoma in situ
Tumor <2 cm
Tumor 2-4 cm
Tumor >4 cm
Primärtumor infiltriert Nachbarstrukturen z.B. Knochen, Nerven, Muskel
Primärtumor infiltriert Nachbarstrukturen z.B: Schädelbasis,
A. carotis interna (potentiell inoperabel)
keine regionären Lymphknotenmetastasen
Metastase in solitärem ipsilateralem Lymphknoten,
≤ 3 cm in der Ausdehnung
Metastase in solitärem ipsilateralem Lymphknoten,
3-6 cm in der größten Ausdehnung
Metastase in multiplen ipsilateralem Lymphknoten,
≤ 6 cm in der größten Ausdehnung
Metastasen in bi- und kontralateralen Lymphknoten,
≤ 6 cm in der größten Ausdehnung
Metastase(n) in Lymphknoten, > 6 cm in der größten
Ausdehnung
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
keine Fernmetastasen
Fernmetastase(n)
10
LITERATURÜBERSICHT
2.2
Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren
Als Therapieoptionen für bösartige Neubildungen des Kopf-Hals-Bereiches stehen operative
Verfahren, Strahlentherapie und Chemotherapie zur Verfügung, welche allein oder kombiniert eingesetzt werden können. Bei T1-Tumoren und im vorderen Bereich der Mundhöhle
gelegenen T2-Tumoren ist oft eine alleinige operative Behandlung ausreichend. Alle anderen
Patienten sollten zusätzlich zu den operativen Verfahren eine Strahlentherapie, eventuell in
Kombination mit einer Chemotherapie, erhalten [Appold et al. 2009, Bootz und Howaldt
2008]. Neuere Behandlungsstrategien zielen auf bestimmte metabolische Eigenschaften der
Tumoren, wie die Überexpression von Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren, ab („molekulares Targeting“). Ein Beispiel ist die Hemmung des Epidermal Growth Factor Rezeptor
mittels Antikörpern. Aufgrund von Tumorgröße, -lokalisation und –typ sowie Begleiterkrankungen müssen für jeden Patienten die Therapiemöglichkeiten individuell geprüft und festgelegt werden, um eine optimale Behandlung zu gewährleisten.
2.2.1
Chirurgische Therapie
Bei kurativer Zielsetzung wird eine Resektion des Tumorgewebes einschließlich vorhandener
Lymphknotenmetastasen im Gesunden angestrebt (R0-Resektion) [Bessell et al. 2011]. Die
Grenzen der Operabilität (Resektabilität) werden durch Ausdehnung und Lokalisation des
Primärtumors sowie eventuell vorhandener Lymphknotenmetastasen bestimmt. Insbesondere bei ausgedehnten Tumorresektionen können funktionelle Defizite sowie kosmetische Beeinträchtigungen im Wundgebiet entstehen, die in der Folge mit Hilfe verschiedener rekonstruktiver Verfahren korrigiert werden müssen [Gellrich et al 2004, Argiris et al 2008].
Lymphknotenmetastasen werden mittels selektiver oder radikaler Neck Dissection uni- oder
bilateral saniert [Forastiere et al. 2001, Argiris et al. 2008, Bessell et al. 2011]. Im Rahmen
einer palliativen Behandlungsstrategie kann die chirurgische Tumorreduktion zu einer Verminderung bzw. vollständigen Beseitigung von Symptomen und dadurch eine Besserung der
Lebensqualität erzielt werden [Bachmann et al. 2004, Appold et al. 2009].
2.2.2
Strahlentherapie
Als weitere, sehr effektive Therapieoption steht die Strahlentherapie zur Verfügung. Diese
kann als alleinige Therapie durchgeführt oder mit chirurgischen Maßnahmen und/oder Zytostatika kombiniert werden. Eine präoperative Radiotherapie dient der Reduktion der Tumormasse und dem Erreichen der Operabilität. Bei postoperativen Bestrahlungsprotokollen sollen verbliebene makro- (R2-Resektion) oder mikroskopische Tumorreste (R1-Resektion) be11
LITERATURÜBERSICHT
handelt werden [Budach et al. 2001, Bootz und Howaldt 2008, Appold et al. 2009, Kuhnt und
Janich 2010]. Die perkutane Radiotherapie von Tumoren im Kopf-Hals-Bereich findet in der
Regel als fraktionierte Bestrahlung statt. Dabei werden verschiedene Fraktionierungsprotokolle verwendet. Eine Übersicht zeigt Tabelle 2.
Tabelle 2: Nomenklatur typischer Fraktionierungsprotokolle [Herrmann et al. 2006]
Fraktionierungsprotokolle
konventionell
hyperfraktioniert
akzeleriert
akzeleriert-hyperfraktioniert
moderat-hypofraktioniert
hypofraktioniert
Dosis pro
Fraktion (Gy)
1,8 - 2,0
< 1,8
1,8 - 2,0
< 1,8
2<x<3
>3
Fraktionen pro
Woche
5
>5
>5
>5
5
variabel
Wochendosis
(Gy)
9 - 10
9 - 10
> 10
> 10
10 < x < 15
variabel
Die konventionelle Fraktionierung wird mit Einzeldosen von 1,8 bis 2,0 Gy an 5 Tagen pro
Woche durchgeführt. Die Wochendosis beläuft sich damit auf 9 – 10 Gy. Der Gesamtbehandlungszeitraum beträgt 6 bis 7 Wochen, sodass am Ende der Bestrahlung eine Gesamtdosis von 60 – 70 Gy erreicht wird. Dieses Bestrahlungsschema stellt das Standardmodell in
der Strahlentherapie dar [Herrmann et al. 2006].
Das Ziel der akzelerierten Fraktionierung ist die Verkürzung der Gesamtbehandlungsdauer.
Damit sollen Regenerationsprozesse der Tumorzellen innerhalb der Gesamtbestrahlungszeit
vermindert werden. Dies wird durch die Verabreichung mehrerer Fraktionen pro Tag oder
Bestrahlung am Wochenende erreicht. Gegenüber der konventionellen Fraktionierung bleiben bei der reinen Akzelerierung Gesamtdosis und Dosis pro Fraktion unverändert. Die Verkürzung der Gesamtbehandlungszeit bringt jedoch ein verstärktes Auftreten von frühen Nebenwirkungen mit sich, sodass die Gesamtdosis bei diesen Bestrahlungskonzepten in der
Regel gesenkt werden muss [Overgaard et al. 2010].
Eine weitere Variante der Akzelerierung ist die begleitende Boost-Bestrahlung. Hierbei wird
neben der konventionellen Bestrahlung in den letzten 2 – 2,5 Wochen täglich eine zusätzliche Fraktion, meist auf ein verkleinertes Volumen, appliziert. Dadurch kann ebenfalls eine
Verkürzung der Gesamtbehandlungsdauer erreicht werden [Dörr et al. 1996].
Bei der hyperfraktionierten Bestrahlung werden eine größere Anzahl kleinerer Fraktionen mit
Dosen zwischen 1,0 und 1,8 Gy appliziert. Gesamtdosis und Gesamtbehandlungszeit bleiben gegenüber der konventionellen Fraktionierung unverändert. Durch die Reduktion der
Dosis pro Fraktion werden spätreagierende Normalgewebe aufgrund ihrer besseren Erholungskapazität (siehe 0) gegenüber Tumorgeweben bevorzugt geschont [Dörr et al. 1996].
Üblicherweise wird in der klinischen Praxis die Gesamtdosis gleichzeitig um 15 – 20 % er12
LITERATURÜBERSICHT
höht. Dies führt zu einer Verbesserung der lokoregionären Kontrolle, jedoch auch zu einem
verstärkten Auftreten von frühen Strahlenfolgen. Da letztere die Ursache für konsekutive
Spätfolgen (siehe 2.3.3) sein können, kann durch die Erhöhung der Gesamtdosis der positive Effekt der Verminderung der Dosis pro Fraktion teilweise oder ganz aufgehoben werden
[Horiot et al. 1997, Bourhis et al. 2006].
Die akzelerierte Hyperfraktionierung gewinnt zunehmend an klinischer Bedeutung. Durch
mehrere Fraktionen pro Tag bzw. Bestrahlung an den Wochenenden, bei gegenüber der
konventionellen Bestrahlung verringerten Einzeldosen, wird die Gesamtbehandlungsdauer
verkürzt und die Strahlentherapie damit intensiviert [Herrmann et al. 2006]. Dadurch sollen
die Vorteile beider Bestrahlungskonzepte verbunden werden. Um die Regeneration des
Normalgewebes zu gewährleisten, sollte bei hyperfraktionierten Bestrahlungsprotokollen
zwischen den einzelnen Fraktionen mindestens 6 h liegen.
Bei der moderaten Hypofraktionierung ist die Anzahl der Fraktionen gegenüber dem konventionellen Bestrahlungsschema geringer, die Einzeldosis mit mehr als 2 Gy pro Fraktion jedoch höher. Eine Dosis von 2 bis 3 Gy wird als moderate Hypofraktionierung bezeichnet.
Aufgrund der höheren Dosen pro Fraktion können Spätreaktionen verstärkt werden [Dörr et
al. 1996, van Oorschot 2009, 2011]. Die Gesamtbehandlungsdauer sowie die Gesamtdosis
sind verringert. Aufgrund der häufiger auftretenden chronischen Strahlenfolgen wird die hypofraktionierte Bestrahlung hauptsächlich unter palliativen Gesichtspunkten angewendet.
Als kurative Therapie werden im so genannten „Manchester-Protokoll“ jeweils 3 Gy pro Fraktion und eine daraus resultierende Gesamtdosis von 40-50 Gy über 3 Wochen appliziert.
Weitere Anwendungsgebiete der moderaten Hypofraktionierung sind die präoperativen Bestrahlung sowie die Behandlung von Tumoren mit einer hohen Erholungskapazität, wie Melanome [Chang et al. 2006], Prostatakarzinome [Coote et al. 2009, Arcangeli 2011, Leborgne
et al. 2012, Thomson et al. 2012] und Mammatumoren [Whelan 2008, Thomssen et al. 2011,
Freedman et al. 2012, Tsang et al. 2012]. Außerdem werden Vorteile dieses Bestrahlungsprotokolles für die Therapie von Lungentumoren und Gehirnmetastasen diskutiert
[Schlienger et al. 2010, Ko et al. 2011].
Bei der Brachytherapie werden, im Gegensatz zur oben beschriebenen externen Bestrahlung, umschlossene radioaktive Strahler direkt im oder in unmittelbarer Nähe des Tumors
positioniert. Dies kann als intrakavitäre, intraluminale oder interstitielle Strahlentherapie erfolgen. Bei der intrakavitären (z.B. Uterus) und intraluminalen (z.B. Ösophagus) Brachytherapie werden die radioaktiven Strahler mit Hilfe von Applikatoren in vorhandene körpereigene
Hohlräume eingebracht. Bei der interstitiellen Therapie erfolgt die Implantation der radioakti13
LITERATURÜBERSICHT
ven Quellen („Seeds“) direkt in das zu bestrahlende Gewebe [Pötter et al. 2010]. Dadurch
kann eine hohe lokale Strahlendosis erreicht und aufgrund des starken Dosisabfalls zur Umgebung das Auftreten von Nebenwirkungen verringert werden [van der Kogel 2009]. Die Brachytherapie kann im Rahmen der Behandlung von bösartigen Tumoren der Prostata, des
Uterus, der Vagina, der Mamma und der Haut eingesetzt werden [Sturdza et al. 2009, Meyer
et al. 2010]. Bei der Therapie von kleinen Kopf-Hals-Tumoren wie z.B. Tumoren der Lippe,
der Zunge und des Mundbodens, hat sich das interstitielle Verfahren als wirksam erwiesen.
Durch die Brachytherapie kann dabei eine bessere Schonung der Kieferknochen und der
Zähne erreicht sowie das Risiko der Entstehung einer Osteoradionekrose vermindert werden
[Meyer et al. 2010].
2.2.3
Zytostatische Therapie
Alleinige Chemotherapien werden nur unter palliativen Gesichtspunkten angewandt. Dadurch kann eine höhere Lebensqualität erreicht werden. Durch die Kombination verschiedener Chemotherapeutika können höhere Remissionsraten erzielt werden, jedoch ohne eine
signifikante Verbesserung der Überlebensraten. Eine neoadjuvant durchgeführte Induktionstherapie kann zu einer deutlichen Reduzierung der Tumormasse führen und dadurch eine
operative Resektion eines zunächst inoperablen Tumors ermöglichen. Es ist jedoch zu beachten, dass die verschiedenen Chemotherapeutika eine Vielzahl von möglichen Nebenwirkungen aufweisen, sodass insbesondere beim Einsatz von Kombinationstherapien Nutzen
und Risiken individuell abzuwägen sind [Gellrich et al. 2004, Bootz und Howaldt 2008, Appold et al. 2009, Pignon et al. 2009, Spengler 2009].
2.2.4
Kombinierte Radiochemotherapie
Bei der kombinierten Radiochemotherapie soll die additive Wirkung beider Therapiestrategien am Tumor genutzt werden. Die systemisch wirkende Chemotherapie kann mikroskopische Fernmetastasen inaktivieren [Pötter et al. 2010]. Die Kombinationstherapie führt jedoch
zu einer Verstärkung der Nebenwirkungen [Hu et al 2007, Matzinger et al. 2009].
2.3
Nebenwirkungen der Strahlentherapie
Bei jeder Bestrahlung muss trotz optimaler Technik ein Zielvolumen mit therapeutischen Dosen exponiert werden, welches deutlich größer als das eigentliche Tumorvolumen ist und
anteilig sogar mehr Normalgewebe enthalten kann. Die Ursache dafür ist, dass sich sowohl
14
LITERATURÜBERSICHT
im Tumor (Gefäß- und Bindegewebe], in dessen Umgebung („Sicherheitsabstand“ der Bestrahlungsplanung) als auch im Ein- und Austrittskanal der Strahlung Normalgewebe befinden. Dadurch können Nebenwirkungen auftreten, welche oft dosislimitierend für die Behandlung sind [Herrmann et al. 2006, Dörr 2009b].
Die Normalgewebsreaktionen können in frühe (akute) und späte (chronische) Strahlenfolgen
eingeteilt werden, entsprechend Zeitpunktes des ersten Auftretens. Strahlenfolgen, die innerhalb der ersten 90 Tage nach Radiotherapie diagnostiziert werden, repräsentieren frühe
Nebenwirkungen. Erst Monate bis Jahre später treten chronische Strahlenfolgen auf, welche
meist irreversibel sind und progredient verlaufen. Zu den konsekutiven Strahleneffekten gehören diejenigen chronischen Nebenwirkungen, welche sich in Abhängigkeit von frühen Nebenwirkungen entwickeln [Dörr 2009b].
2.3.1
Frühe Strahlenfolgen
Typische frühe (akute) Strahlenfolgen treten in Geweben mit hohem Zellumsatz (Mausergewebe, wie z.B. Knochenmark, Mund- und Darmschleimhaut) auf. Diese besitzen eine, hierarchische Proliferationsorganisation von der Stammzelle über begrenzt teilungsfähige Transitzellen bis hin zu reifen postmitotischen Funktionszellen mit einer begrenzten Lebensdauer (
Abbildung 1). Die Stammzellen führen dabei im ungestörten Zustand asymmetrische Teilungen durch, aus denen jeweils eine neue Stammzelle und eine Transitzelle hervorgehen. Es
besteht ein präzise reguliertes Gleichgewicht zwischen dem fortwährenden Zellverlust funktionstüchtiger, postmitotischer Zellen, im Falle der Mundschleimhaut durch mechanische oder
chemische Beanspruchung an der Oberfläche, und der permanenten Zellproduktion durch
Stammzellen in der Germinativschicht [Dörr 2010, 2009b].
Die Ursache für frühe Strahlenreaktionen liegt in der Abnahme der Anzahl postmitotischer,
funktionstüchtiger Zellen. Dies beruht jedoch nicht auf einer direkten Strahlenschädigung
dieser Zellen, sondern auf der strahleninduzierten Hemmung der Zellneubildung im Stammzellkompartiment. Aufgrund des unbeeinträchtigten, physiologischen Zellverlustes, kommt es
zu einer Verminderung der Anzahl funktionstüchtiger, postmitotischer Zellen (Hypoplasie)
[Dörr und Herskind 2012]. Die Latenzzeit, welche den Zeitraum zwischen einer Strahlenexposition und dem klinischen Effekt beschreibt, wird deshalb durch die Umsatzzeit definiert
und ist gewebespezifisch, jedoch über weite Bereiche dosisunabhängig. Schweregrad und
Dauer früher Strahlenfolgen stehen dagegen in direktem Zusammenhang mit der Anzahl
überlebender Stammzellen und sind somit dosisabhängig.
15
LITERATURÜBERSICHT
Abbildung 1: Proliferative Struktur von Umsatzgeweben: Grundlage der Zellproduktion sind
Stammzellen, welche sich in je eine Stammzelle und eine Transitzelle teilen können (asymmetrische Stammzellteilung). Transitzellen können eine begrenzte Anzahl weiterer Teilungen
durchführen, bevor sie zu postmitotischen Funktionszellen differenzieren. Danach kommt es
entsprechend der natürlichen Lebensdauer zum Zelltod. Die Umsatzzeit, d.h. die Zeit, in welcher alle Zellen einmal ausgetauscht werden, ist für die verschiedenen Gewebe spezifisch.
Frühe Strahlenreaktionen sind reversibel. Die Regeneration erfolgt durch überlebende
Stammzellen im Bestrahlungsvolumen oder durch einwandernde, proliferationsfähige Zellen
aus den Randgebieten. Dabei können aus einer Stammzelle durch symmetrische Teilung
zwei Tochterstammzellen entstehen, welche erst nach Erreichen der ursprünglichen Anzahl
wieder in eine asymmetrische Teilung übergehen [Dörr und Herrmann 2009, Dörr 2009b].
2.3.2
Späte (chronische) Strahlenfolgen
Chronische Strahlenfolgen treten erst Monate bis Jahre nach der Radiotherapie auf und sind
meist irreversibel. Dabei sind die zugrunde liegenden Mechanismen deutlich komplexer als
bei frühen Strahlenreaktionen. Im Vordergrund der strahleninduzierten Veränderungen stehen organspezifische Parenchymzellen, Fibroblasten und Gefäßendothelzellen. Letztendlich
resultieren u.a. Fibrose, Zerstörung von Kapillaren und Teleangiektasien. Es kommt schließlich zum Funktionsverlust des betroffenen Gewebes innerhalb des bestrahlten Volumens.
Die Latenzzeit chronischer Strahlenfolgen ist invers abhängig von der Strahlendosis, d.h. je
höher die Dosis ist, desto kürzer ist die Latenzzeit bis zum Auftreten klinischer Symptome
[Herrmann et al. 2006, Dörr 2009b, 2010].
16
LITERATURÜBERSICHT
2.3.3
Konsekutive Späteffekte
Bei konsekutiven Späteffekten (Consequential late effects, CLE) handelt es sich um eine
Sonderform von späten Strahlenfolgen, die aufgrund von frühen Nebenwirkungen im gleichen Gewebe bzw. Organ entstehen. Durch den Verlust der Schutz- und Barrierefunktion
von Oberflächenepithelien gegenüber mechanischen und chemischen Einflüssen im Rahmen der Akutreaktionen, entstehen durch zusätzliche Noxen indirekt weitere Schäden an
den Zielstrukturen für die generischen Spätreaktionen. Schweregrad und Dauer früher Strahlenreaktionen beeinflussen dadurch das Auftreten von späten Strahlenfolgen. Dies konnte
z.B. bei Mundschleimhaut, Darm und Harnblase beobachtet werden [Dörr und Hendry 2001,
Dörr 2009b, Schmidt et al. 2010, Dörr und Herskind 2012].
2.4
Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich
Bei Bestrahlungen im Kopf-Hals-Bereich sind häufig eine Vielzahl von normalen Strukturen
betroffen. Als Nebenwirkungen der Radiotherapie können Mukositis der Mundschleimhaut,
Radiodermatitis, Xerostomie, Veränderungen des Geschmacks- und Geruchssinn oder Innenohrschwerhörigkeit, aber auch Strahleneffekte an den Zähnen, Osteoradionekrosen und
Trismus (Kieferklemme) auftreten. Die Mucositis enoralis, als zentrales Thema der vorliegenden Arbeit, wird in Kapitel Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden. umfassend dargestellt. Hier sollen weitere Nebenwirkungen kurz umrissen werden. In Bezug auf
prophylaktische und therapeutische Maßnahmen sei auf aktuelle Übersichten [Feyer und
Ortner 2009, Davis et al. 2011] oder die entsprechenden Leitlinien der Fachgesellschaften
verwiesen [DEGRO (Stand 2006), ASORS (Stand 2008), MASCC/ISOO (Stand 2011)].
2.4.1
Frühreaktionen
Frühreaktionen der Haut treten zu Beginn der 3. Behandlungswoche auf. Es zeigen sich zunächst eine Epilation mit zunehmender Hauttrockenheit sowie Rötung (Erythem) und Ödem
[Dörr 2009b, Holler et al. 2009, Adamietz 2011]. Anschließend folgt eine trockene Schuppung (desquamative Radiodermatitis), welche in eine exsudative Radiodermatitis übergehen
kann. Diese Hautreaktionen treten bevorzugt in mechanisch besonders beanspruchten Arealen auf und können durch eine zusätzliche Chemotherapie oder UV-Exposition noch weiter
verstärkt werden [Adamietz 2011]. Während die Schädigung der Schweißdrüsen reversibel
ist, bleiben Talgdrüsen in ihrer Funktion häufig beeinträchtigt [Dörr et al. 2005b, 2009, Ulrich
2008, Dörr 2009b, Haagen et al. 2010].
17
LITERATURÜBERSICHT
Die Speicheldrüsen, insbesondere die Ohrspeicheldrüse (Parotis) werden bei Behandlung
von Kopf-Hals-Tumoren regelmäßig mit bestrahlt. Dabei sind besonders die serösen Drüsenanteil sehr strahlensensibel. Begleitet von einer Entzündungsreaktion kommt es zum
Untergang des Drüsengewebes. Ursache ist eine strahlenbedingte Modulation der intrazellulären Signaltransduktion. Histopathologisch zeigt sich, neben dem Verlust der serösen Azini,
eine Dilatation der Speicheldrüsengänge, eine Aggregation von Plasmazellen und Lymphozyten sowie eine milde Fibrose. Bereits nach Applikation einer relativ geringen Strahlendosis
von 10–15 Gy (Kumulativdosis) kommt es zu einer deutlich verminderten Speichelproduktion. Die funktionellen Konsequenzen sind umso größer, je mehr Drüsenvolumen bestrahlt
wurde und je höher die Strahlendosis insgesamt war. Die verminderte Speichelproduktion
und die erhöhte Viskosität sind erste Zeichen für die Entwicklung einer chronischen Xerostomie. Die Veränderungen in der Speichelproduktion führen insbesondere beim Schlucken, Essen, Sprechen und dem Tragen von Zahnprothesen zu Beeinträchtigungen. Die
Radioxerostomie wird von vielen Patienten als die größte Einschränkung ihrer Lebensqualität
nach der Therapie empfunden [Maurer 2010]. Eine Erholung des Drüsengewebes, auch
wenn dies Monate bis Jahre dauern kann, ist jedoch möglich [Kuhnt et al. 2005, Grötz et al.
2008, Rotter et al. 2008, Deasy et al. 2010, Dörr et al. 2010, Stock et al. 2010].
Die Geschmacksrezeptoren befinden sich in den entsprechenden Papillen der Zungenoberseite. Unter der Radiotherapie kommt es zu einer direkten Zerstörung der Geschmacksknospen und/oder der innervierenden Nervenfasern. Zudem spielt die gleichzeitig auftretende
Xerostomie durch die fehlende Spülfunktion eine entscheidende Rolle. Klinisch kommt es
innerhalb der ersten 3 Behandlungswochen zu einer Störung, Verminderung und/oder einem
vollständigen Verlust des Geschmacksempfindens. Dabei fallen die Geschmacksqualitäten
in der Reihenfolge bitter, salzig, sauer und zuletzt süß aus. Diese Veränderungen können
auch ohne Therapie innerhalb einiger Wochen regredient sein. Häufig bestehen jedoch für
längere Zeiträume noch Geschmacksveränderungen [Dörr et al. 2007, 2008, Kamprad et al.
2008, Dörr 2009b].
Der Geruchssinn kann ebenfalls bereits unter der Strahlentherapie beeinträchtigt werden.
Dabei wird die Geruchsdiskrimination beeinflusst, während Geruchserkennung und die
Schwellen meist unbeeinflusst sind. Verstärkend wirkt sich dabei die radiogene Mukositis im
Bereich der Nasen- und Nasennebenhöhlen aus [Dörr et al. 2005b, Hölscher et al. 2005].
Als akute Strahlenfolge am Ohr tritt am häufigsten eine Otitis media auf, welche nach Beendigung der Strahlentherapie meist spontan ausheilt. Während der Radiotherapie kann es
jedoch auch zu einer Hörminderung kommen, welche in der Frühphase durch eine gestörte
Luftleitung aufgrund der Schleimhautreaktion begründet sein kann. Später können durch
eine Gefäß- und Nervenschädigung direkte Strahleneffekte am Innenohr auftreten. Abhängig
18
LITERATURÜBERSICHT
von der applizierten Dosis sind zunächst die höheren Frequenzen betroffen, erst später die
tieferen Frequenzen [Herrmann et al. 2002, 2006, Dörr 2009b].
2.4.2
Spätfolgen
Späte Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich betreffen vor allem die Zähne und die Kieferknochen. Außerdem sind chronische Xerostomie, Schleimhautatrophien sowie Fibrosen von
Bedeutung. Strahlenwirkungen an Muskulatur und Kiefergelenk manifestieren sich als Trismus.
An den Zähnen kann sich in Folge der Radiotherapie eine Strahlenkaries zeigen. Indirekte
Ursache sind Veränderungen in der Zusammensetzung und der Menge des Speichels (Radioxerostomie), wenn die Speicheldrüsen mit im Bestrahlungsfeld liegen [Al-Nawas und
Grötz 2011]. Dadurch ist die physiologische Selbstreinigung beeinträchtigt und es zeigen
sich Veränderungen der Mundflora, welche besonders das Wachstum von azidogenen und
kariogenen Bakterien (Streptococcus mutans, Laktobazillen) fördern. Als direkte Strahlenursache kommt es zunächst zu einer Degeneration der Odontoblastenfortsätze, mit anschließender Obliteration der Dentinkanälchen sowie Veränderungen des Dentins. Als Folge dieser verminderten Stoffwechselleistung entstehen Defekte an der Schmelz-Dentin-Grenze.
Dabei sind sowohl der komplette Verlust deckender Schmelzanteile als auch Veränderungen
im Demineralisierungsverhalten möglich, welche eine geringere Widerstandsfähigkeit gegenüber äußeren Einflüssen zur Folge haben. Es können verschiedene Schweregrade der
Strahlenkaries von Grad 1 (Glanzverlust, Verfärbungen) bis Grad 4 (Zerstörung der Zahnkrone) unterschieden werden. Die radiogene Karies ist nicht schmerzhaft, sodass regelmäßige zahnärztliche Kontrollen essentiell sind. So können bereits frühe Veränderungen erkannt, optimal behandelt und Spätfolgen vermieden werden. [Grötz et al. 2001, 2008, Dörr et
al. 2005b, 2008, 2010].
Als chronische Strahlenfolge kann es auch zu Radionekrosen im Bereich von mitbestrahlten
Knochen (bevorzugt Unterkiefer) kommen. Dabei ist die infizierte Osteoradionekrose (IORN)
die schwerste, lokale Komplikation nach einer Radiotherapie im Kopf-Hals-Bereich. Die Inzidenz klinisch manifester Veränderungen liegt bei ca. 5 %. Die Pathogenese ist dabei sehr
komplex. Es spielen strahleninduzierte Gefäßveränderungen und die daraus resultierende
Hypovaskularitität und Hypoxie eine entscheidende Rolle. Außerdem kann es durch eine
direkte radiogene Avitalisierung, im Sinne eines direkten Osteozytentods, zum Knochenabbau und zur Fibrose kommen. Die Mandibula ist dabei deutlich häufiger betroffen, da fehlende Kollateralkreisläufe und eine dichtere Knochenstruktur eine insgesamt schlechtere Vaskularisation bedingen. Das Auftreten einer Osteoradionekrose hängt sowohl von der Strahlendosis als auch von der Größe des bestrahlten Knochenvolumens ab. Auslöser einer IORN
19
LITERATURÜBERSICHT
sind meist Sekundärinfektionen. Dabei breiten sich Infektionserreger über lokale Eintrittspforten, wie Weichteilnekrosen oder nach operativen Eingriffen an der atrophischen Schleimhaut, im vorgeschädigten Knochen ungehindert aus. Klinisch kommt es nach teilweise jahrelanger Beschwerdefreiheit zu einer schmerzhaften, persistierenden Knochenwunde mit Fistelbildung zur Haut/Schleimhaut ohne Sekundärheilung. [Teng und Futran 2005, Studer et al.
2006, Dörr et al. 2008, Grötz et al. 2008, 2009, Al-Nawas und Grötz 2011]].
Als weitere Spätfolge kann ein Trismus (arthrogene oder extraartikuläre Kieferklemme) auftreten. Dabei handelt es sich um eine Behinderung der Mundöffnung, welche bei bis zu 50 %
der Patienten mit einer Tumorerkrankung im Kopf-Hals-Bereich vorkommt [Jeremic et al.
2011, Lee et al. 2011]. Diese kann als direkte Auswirkung der Tumorerkrankung oder infolge
der durchgeführten onkologischen Therapie, wie Operationen im Bereich der Kaumuskulatur
sowie Bestrahlung der Kiefergelenke oder der Kaumuskulatur, auftreten [Bensadoun et al.
2010]. Aufgrund der stark eingeschränkten Mundöffnung kommt es neben der Verminderung
der Lebensqualität der Patienten auch zu Problemen bei der onkologischen Nachsorge sowie der zahnärztlichen und kieferorthopädischen Betreuung [Dörr et al. 2008, 2010].
2.5
Radiogene Mucositis enoralis
2.5.1
Pathogenese und zeitlicher Verlauf
Die Pathogenese der radiogenen Mucositis enoralis ist ein komplexer Prozess mit Beteiligung mehrerer Zellpopulationen: Epithelzellen, Fibroblasten, Endothelzellen der Kapillaren
und Makrophagen [Dörr et al. 2007, Dörr 2009b]. Die Strahlenreaktion wird dabei durch die
radio- und/oder chemotherapieinduzierte Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)
initiiert, welche direkt oder indirekt zu Schäden an der DNA führen. Dadurch werden verschiedene Transkriptionsfaktoren aktiviert, welche wiederum zu einer Aktivierung bzw. Modulation einer Vielzahl von Signalkaskaden führen. Innerhalb kürzester Zeit kommt es im
Gefäßendothel, der Gefäßmedia und den Makrophagen zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie Interleukin-1α oder Tumornekrosefaktor α. Außerdem sind die
Prostaglandinsynthese und die Aktivität der Stickoxidsynthetase gesteigert. Die Pathogenese
der eigentlichen Epithelreaktion ist dabei typisch für ein Umsatzgewebe (siehe 2.3.1). Aufgrund der Strahlenwirkung kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen eingeschränkter
Zellneubildung und unbeeinflusstem Zellverlust. Folge ist eine progressive Zelldepletion (Hypoplasie) bis zum vollständigen Verlust des Epithels (Ulzeration) [Dörr et al. 2005b, 2008,
2009, Dörr 2010, Dörr und Herskind 2012].
20
LITERATURÜBERSICHT
Der Verlauf der Mucositis enoralis kann in vier Phasen untergliedert werden: die initiale
vaskuläre Phase, die epitheliale Phase, die ulzerativ-bakterielle Phase und die Heilungsphase [Dörr et al. 2009]. Bei konventioneller Bestrahlung mit 5x2,0 Gy/Woche kommt es bereits
zu Beginn der zweiten Behandlungswoche zur Rötung, vermehrten Gefäßzeichnung und
Ödembildung der Mundschleimhaut im bestrahlten Areal (Gefäßreaktion). In der dritten Woche beginnt die epitheliale Phase zunächst mit lokalen Erosionen, welche im Verlauf zu einer
konfluierenden, pseudomembranösen Mukositis übergehen können (Abbildung 2). Die
Pseudomembran besteht dabei aus Fibrin sowie Zell- und Hornresten. Diese Veränderungen
der Mundschleimhaut entstehen ca. 9 Tage nach Applikation einer Schwellendosis von
20 Gy [van der Schueren et al. 1990, Denham et al. 1996]. Der zeitliche Verlauf ist dabei
auch von der Lokalisation abhängig. So konnte festgestellt werden, dass sich akute Reaktionen der Schleimhaut im Oropharynx schneller entwickeln als im Hypopharynx [Denham et al.
1996]. Ab der vierten Behandlungswoche sind bei den meisten Patienten ulzerative Läsionen
zu beobachten (ulzerativ-bakterielle Phase), wobei die maximale Ausprägung der Mukositis
in der 5. Bestrahlungswoche erreicht wird. Dabei sind zum Zeitpunkt der maximalen klinischen Symptome unter den Pseudomembranen aus Fibrin bereits Regenerationsprozesse
im Gange [Dörr et al. 2005b, 2008]. Im weiteren Verlauf zeigt sich keine weitere Progredienz
dieser Strahlenreaktion. Innerhalb 4 – 6 Wochen nach Therapieende kommt es in der Regel
zur vollständigen Reepithelialisierung (Heilungsphase). Die Schleimhaut kann jedoch noch
für längere Zeit und auch im chronischen Verlauf aufgrund der gestörten Versorgungssituation blass und atrophisch aussehen [Dörr et al. 2008].
Abbildung 2: Klinisches Bild einer konfluenten, pseudomembranösen Mukositis Grad 3 nach
RTOG/EORTC
Die konfluierende Mucositis enoralis stellt sich als großflächige, von einer weißlichen Pseudomembran bedeckte, Schleimhautläsion umgeben von einem Erythem dar [Dörr W, mit Erlaubnis].
21
LITERATURÜBERSICHT
2.5.2
Klassifizierungssysteme
Zur Klassifikation von Strahlenfolgen stehen eine Reihe etablierter Bewertungssysteme zur
Verfügung. Sie dienen sowohl der Dokumentation unerwünschter Nebenwirkungen der
Strahlentherapie, als auch der Kontrolle der Effektivität von prophylaktischen und therapeutischen Maßnahmen. Dabei benutzen alle Klassifizierungssysteme eine Abstufung in 6
Schweregrade: 0 - keine Beschwerden, 1 - leichte Symptome, 2 - deutliche Symptome, 3 ausgeprägte Beschwerden, 4 - lebensbedrohliche Symptome, 5 – letale Nebenwirkungen
[Dörr et al. 2009b]. Ergänzend kann eine Fotodokumentation der aufgetretenen Strahlenfolgen durchgeführt werden.
Das System der Radiation Therapy Oncology Group/European Organisation for Research
and Treatment of Cancer (RTOG/EORTC-System) ist besonders für die Routinedokumentation im klinischen Alltag geeignet. Dabei werden sowohl klinische Symptome als auch therapeutische Maßnahmen erfasst [Trotti 2002, Seegenschmidt 2006]. Die Dokumentation früher
Nebenwirkungen der Mundschleimhaut zeigt Tabelle 3.
Tabelle 3:
RTOG/EORTC-Klassifikation für die Mucositis enoralis
[Seegenschmiedt 1998]
Schweregrad
Kriterium
0
keine Veränderungen
mildes Erythem, Beläge, geringe Schmerzen, keine
1 "leicht"
Analgetika nötig
fleckförmige, mäßig schmerzende Mukositis, milde
2 "deutlich"
Analgetika nötig
Konfluierende, fibrinöse Mukositis, starke Schmerzen,
3 "ausgeprägt"
starke Analgetika nötig
Hämorrhagien, Ulzera, Nekrosen, parenterale Ernäh4 "lebensbedrohlich"
rung nötig
5 "letal"
Tod des Patienten durch die Mukositis
Dieses System wurde durch Maciejewski et al. [1991] modifiziert (Tabelle 4), um neben dem
Schweregrad auch die flächige Ausdehnung der Mukositis zu dokumentieren. Gegenüber
der ursprünglichen RTOG/EORTC-Klassifikation wurde jedoch gleichzeitig auch die Sensitivität verändert, sodass bei Verwendung dieser Systeme stets die Quelle angegeben werden
sollte, um Verwechslungen und Fehlinterpretationen vorzubeugen [Riesenbeck und Dörr
1998].
22
LITERATURÜBERSICHT
Tabelle 4:
Modifizierte RTOG/EORTC-Klassifikation der oralen Mukositis
[Maciejewski et al. 1991]
Grad
Kriterium
Ausdehnung der Reaktion
(in Prozent der bestrahlten
Fläche)
0
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Keine Reaktion
Mildes Erythem
Mildes Erythem
Schweres Erythem
Schweres Erythem
Fokale Mukositis
Fokale Mukositis
Konfluente Mukositis
Konfluente Mukositis
< 50 %
> 50 %
< 50 %
> 50 %
< 50 %
> 50 %
< 50 %
> 50 %
Weitere Klassifizierungssysteme werden von der World Health Organisation (WHO 1979)
und vom National Cancer Institute (NCI 1983) der USA in Form der Common Terminology/Toxicity Criteria (CTC) erstellt. Die Beurteilung der Mundschleimhaut ist als Unterpunkt im
Gastrointestinaltrakt eingeschlossen und umfasst eventuell auftretende Beeinträchtigungen
der Nahrungsaufnahme mit [Riesenbeck und Dörr 1998]. Die CTCAEv4.03 (Stand 2010) des
NCI wird aufgrund ihres Umfangs bevorzugt für die Dokumentation im Rahmen von Studien
eingesetzt. Eine Übersicht der Klassifizierungssysteme der WHO und des NCI für die orale
Mukositis gibt Tabelle 5.
Tabelle 5:
Quelle
Klassifizierungssysteme der WHO und des NCI (CTCAEv4.03) für die orale
Mukositis [WHO 1979; NCI 2010]
Grad 0
Grad 1
Grad 2
Grad 3
Tiefe UlzeErythem,
ration;
Ulzeration;
Keine
Erythem,
WHO (1979)
nur flüssige
Veränderung Entzündung feste NahNahrung
rung möglich
möglich
Konfluente
fibrinöse
Fleckige,
Erythem,
Mukositis,
CTCAEv4.03
serosanguinEntzündung,
Keine
Ulzeration,
NCI
öse MukosiVeränderung evtl.
Schmerzen,
(Stand 2010)
tis, evtl.
Schmerzen
die AnalgeSchmerzen
tika benötigen
Grad 4
Orale
Ernährung
nicht
möglich
Nekrose,
tiefe Ulzera
oder Hämorrhagie;
parenterale
Ernährung
Tabelle 6 zeigt ein weiteres, detailliertes Klassifizierungssystem nach Dische [1988], welches
Riesenbeck und Dörr [1998] veröffentlichten. Dabei werden sowohl objektive morphologische
Veränderungen als auch subjektive Empfindungen des Patienten mit erfasst. Unter den obligaten Bewertungskriterien werden verschiedene Schweregrade für Schluckschmerzen,
Schluckstörungen, Erythem, Mukositisverteilung und Ulzeration vergeben. Zusammen mit
23
LITERATURÜBERSICHT
einer Reihe von fakultativen Bewertungskriterien kann eine äußerst exakte Dokumentation
erstellt werden, die sich besonders zur Erfolgsbewertung präventiver und symptomatischer
Maßnahmen im Rahmen gezielter klinischer Studien zur Mucositis enoralis eignet.
Zusätzlich werden noch verschiedene weitere Schemata etabliert, welche sich speziell auf
therapiebedingte Veränderungen an der Mundschleimhaut beziehen. Dazu zählt OMAS (Oral
Mucositis Assessment Scale) [Sonis et al. 1999, 2004]. Dieser ist jedoch nur zur Dokumentation chemotherapieinduzierter Reaktionen der Mundschleimhaut geeignet, da verschiedene
Lokalisationen in der Mundhöhle beurteilt werden, unabhängig davon, ob diese bestrahlt
wurden [Dörr et al. 2009]. Eine Übersicht gibt Tabelle 7.
Tabelle 6:
Klassifikation der radiogenen Mukositis enoralis nach Dische [veröffentlicht in
Riesenbeck und Dörr 1998]
Obligate Kriterien
Bewertung
Schluckschmerzen
0 - keine, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - schwer
Schluckstörungen
0 - keine, 1 - leichte
2 - erschwertes Schlucken, weiche Kost nötig
3 - stark erschwertes Schlucken, Flüssigkost nötig
4 - sehr starke Schluckbeschwerden bei flüssiger Nahrung
Erythem
Ulzeration
Verteilung der Mukositis
Fakultative Kriterien
0 - keine, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
0 - keine, 1 - oberflächlich, 2 - tiefe Gewebsanteile betroffen
3 - knöcherne Anteile betroffen, 4 - Fistelbildung
0 - keine, 1- fleckig, 2 - konfluierend
Bewertung
Mukositisfläche
Membrantyp der Mukositis
Ödem
Grad der Dehydrierung
0 - 100 % der bestrahlten Schleimhaut
0 - ohne Membran, 1- dünn, 2 - mittel, 3 - dick
0 - kein Ödem, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
0 - keine Dehydrierung, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
0 - keine, 1 - Nasen-Magen-Sonde,
Grad der Intervention
2 - iv. Flüssigkeitszufuhr, 3 - iv. Ernährung, 4 - andere
Atrophie der Mukosa
0 - keine Atrophie, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
Blässe der Mukosa
0 - keine Blässe, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
0 - keine, 1 - kleiner 1 cm², 2 - 1 bis 4 cm²,
Teleangiektasien
3 - größer 4 cm²
Schleimhautulzerationen
0 - 100 % der bestrahlten Schleimhaut
Tiefe der Ulzeration
0 - 100 % der bestrahlten Schleimhaut
Zusätzliche Nekrose
0 - 100 % der bestrahlten Schleimhaut
Geschmacksbeeinträchtigung 0 - keine, 1 - teilweise, 2 - vollständig
Verlorene Behandlungstage xx Tage
Mundtrockenheit
0 - keine, 1 - leicht, 2 - mäßig, 3 - stark
24
LITERATURÜBERSICHT
Tabelle 7:
OMAS-Klassifikation (Oral Assessment Scale) nach Sonis et al. [2004]
OMAS (Oral Mucositis Assessment Scale)
Erythem
0 - keines, 1 - gering, 2 - ausgeprägt
Ulzeration/Pseudomembran 0 - keine, 1 - <1 cm², 2 - 1-3cm, 3 - >3 cm²
Vorliegen einer Infektion
Lokal , non-oral, systemisch
Ober-/Unterlippe, rechte/linke Wange,
Lokalisationen
rechte/linke/seitliche/zentrale Zunge,
Mundboden, weicher/harter Gaumen
2.5.3
Inzidenz und klinische Bedeutung
Frühe Veränderungen der Mundschleimhaut gehören zu den häufigsten und dosislimitierenden Nebenwirkungen der Radio- und/oder Chemotherapie von Malignomen im Kopf-HalsBereich. Die Inzidenz der Mucositis enoralis – in verschiedenen Schweregraden - liegt bei
kurativer Therapie bei nahezu 100% [Elting et al. 2008, Dörr et al. 2009, Peterson et al.
2011, Sonis 2011]. Das Ausmaß der oralen Mukositis ist dabei von therapeutischen und patientenbezogenen Faktoren abhängig. Bei der Radiotherapie sind wesentliche Einflussgrößen die applizierte Gesamtdosis, die Gesamtbehandlungsdauer, eine kombinierte Radiochemotherapie und, in Bezug auf die klinischen Konsequenzen, die Feldlokalisation [VeraLlonch et al. 2006, Feyer und Steingräber 2008, Dörr et al. 2009, Wygoda et al. 2009, Eilers
und Million 2011]. Rauchen, Alkoholkonsum, mangelnde Zahn-/ Mundhygiene, HIVInfektionen, und Kollagenosen zählen zu den patientenbezogenen Risikofaktoren [Lalla et al.
2008, Dörr et al. 2009, Dörr und Dörr 2011]. Außerdem können durch die Streuung der
Strahlung an metallhaltigen Zahnfüllungen und Zahnersatz. Dosisspitzen an der Schleimhaut
von bis zu 190 % auftreten. Dadurch kann an den betroffenen Stellen eine schwere Mukositis ausgelöst werden [Reitemeier et al. 2002, Dörr et al. 2009]. Die Ausprägung der Mukositis
beeinflusst ebenfalls das Risiko für das Auftreten chronischer Strahlenfolgen im Sinne konsekutiver Späteffekte wie Nekrosen, chronischer Ulzerationen oder Fibrosen [Dörr und
Hendry 2001, Dörr et al. 2009, Rosenthal und Trotti 2009].
Die Veränderungen der Mundschleimhaut sind der dominierende Faktor für die Beeinträchtigung der Lebensqualität während oder kurz nach einer onkologischen Therapie [Armstrong
und McCaffrey 2006, Hahn und Krüskemper 2007, Elting et al. 2008, Dörr et al. 2009, 2010,
Oskam et al. 2010, Hannemann 2011]. Die Mukositis führt aufgrund der Schmerzhaftigkeit
und im Zusammenhang mit Xerostomie und Geschmacksveränderungen zu Beeinträchtigungen in der Ernährung der Patienten. Folge können Dehydration, Gewichtsverlust und
Mangelerscheinungen sein. Häufig ist eine Behandlung mit Opioidanalgetika und nicht selten
auch eine Sonden- oder parenterale Ernährung notwendig. [Murphy 2007, Dörr et al. 2007a,
2009].
25
LITERATURÜBERSICHT
Funktionell kann durch die Veränderungen in der Epithelschicht die Barrierefunktion nicht
aufrechterhalten werden. Dadurch können Erreger leichter eindringen (z.B. Candida albicans) und sekundäre Infektionen bis hin zu lebensgefährlichen septischen Zuständen auslösen.
Die Mucositis enoralis ist die häufigste Ursache für Therapieunterbrechungen. Dadurch sinken jedoch die Heilungschancen drastisch [Herrmann und Baumann 2005, Rosenthal 2007,
Dörr et al. 2009, 2010, Overgaard et al. 2010].
Neben den klinischen Aspekten sind auch sozioökonomische Gesichtpunkte von Bedeutung.
Mit zunehmenden Schweregrad der Mucositis enoralis steigen die Behandlungskosten. Elting et al. [2007] ermittelten Kosten von 1700 – 6000 $ pro Patient entsprechend der Ausprägung der Mundschleimhautveränderungen. Obwohl sich diese Werte nicht direkt auf das
deutsche Gesundheitswesen übertragen lassen, muss jedoch eine vergleichbare Größenordnung angenommen werden [Elting et al. 2007, Murphy 2007, Dörr et al. 2008, Sonis
2011]. Die Verminderung der Schleimhautreaktion der Mundhöhle ist somit ein wichtiger Ansatzpunkt zur Erfolgsverbesserung der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren.
2.5.4
Prophylaxe und Therapie
Für die Prophylaxe und Therapie der oralen Mukositis existieren eine Vielzahl an experimentellen und klinischen Behandlungsansätzen. Eine spezifische und in der klinischen Routine
etablierte Behandlungsstrategie existiert bisher jedoch nicht [Dörr et al. 2009, Dörr und
Herskind 2012]. Hier sollen nur positive klinische Ansätze zur Prophylaxe und Therapie der
Mucositis enoralis kurz zusammengefasst werden. Für eine detaillierte Darstellung sei auf
die aktuellen Leitlinien der Fachgesellschaften DEGRO [Stand 2006], MASCC [Stand 2006],
ASORS [Stand 2008] bzw. aktuelle Übersichtsarbeiten [Rosenthal und Trotti 2009, Dörr et al.
2009, Barasch und Epstein 2011, Eilers und Million 2011, Lalla und Keefe 2011, Peterson et
al. 2011, Dörr und Herskind 2012, Rodriguez-Caballero et al. 2012] verwiesen.
Allgemeine Maßnahmen
Von Seiten der Strahlentherapie-Planung sollte darauf geachtet werden, dass nur eine möglichst geringe Schleimhautfläche mit moderaten bis hohen Dosen (> 30 Gy) bestrahlt wird.
So können oftmals die Lippen der Patienten, welche eine besonders belastende Schleimhautreaktion entwickeln und große Anteile der Zunge, welches eine Beeinträchtigung des
Geschmacks bedingen kann, aus dem Bestrahlungsfeld ausgeschlossen werden [Dörr et al.
2009, Barasch und Epstein 2011]. Die oben genannten Dosisspitzen durch metallhaltige
Dentallegierungen lassen sich mittels Schleimhautretraktoren („Abstandsschienen“) vermeiden [Reitemeier et al. 2002, Hartmann et al. 2007, Dörr et al. 2008, 2009].
26
LITERATURÜBERSICHT
Desweiteren spielen die Zahn- und Mundhygiene sowohl vor als auch während der Strahlentherapie eine entscheidende Rolle. Weiche und harte Zahnbeläge begünstigen das Auftreten
schwerer Schleimhautreaktionen. Deshalb sollte vor Beginn der Radiotherapie eine gründliche Zahnsanierung erfolgen [Dörr et al. 2009, Rosenthal und Trotti 2009, Bey et al. 2010,
Raber-Durlacher et al. 2010, Al-Nawas und Grötz 2011]. Dadurch können außerdem zahnbzw. kieferchirurgische Eingriffe innerhalb eines Jahres nach Bestrahlung vermieden und
somit das Risiko einer Osteoradionekrose deutlich vermindert werden [Grötz et al. 2009]. Die
Zahnsanierung sollte dabei die Entfernung harter und weicher Beläge, die konsequente Extraktion nicht erhaltungswürdiger Zähne, die konservierende Therapie am Restzahnbestand
inklusive Glättung scharfer Kanten an Zähnen oder Zahnersatz, die chirurgische Sanierung
persistierender Epithelläsionen sowie gegebenenfalls das Abtragen scharfer Knochenkanten,
welche die Integrität der Schleimhaut gefährden könnten, umfassen [Dörr et al. 2009].
Außerdem muss während der Strahlentherapie auf eine optimale Mundhygiene geachtet
werden. Diese sollte, basierend auf einer möglichst täglichen professionellen Mundpflege,
durch regelmäßige Mundspülungen in kurzen Abständen unterstützt werden. Dadurch kann
die Inzidenz schwerer Mukositiden deutlich gesenkt werden. Mehrere klinische Studien haben gezeigt, dass dabei der eigentliche Spülvorgang und weniger die verwendete Spüllösung, von Bedeutung sind. Empfohlen werden kann physiologische Kochsalzlösung, klares
Wasser, Salbei-Sud oder Kamille [Dörr et al. 2007, 2009]. Benzydamin hat analgetische,
anästhetische, antiinflammatorische sowie antiseptische Wirkungen. Mundspülungen mit
Benzydamin sind empfehlenswert, aufgrund des unangenehmen Geschmacks ist jedoch die
Compliance der Patienten eingeschränkt [Elad et al. 2011, Peterson et al.2011, Sonis 2011,
Becker-Schiebe et al. 2012].
Es ist außerdem auf eine Prothesenkarenz von Beginn bis zu 6 Monate nach Beendigung
der Strahlentherapie zu achten. Prothesendruckstellen und schleimhautreizende Haftmittel
begünstigen die Entstehung einer Mukositis. Aufgrund der radiogenen Umbauvorgänge an
Gingiva und Kiefer ist nach diesem Zeitraum meist die Anfertigung einer neuen Prothese
notwendig [Dörr et al. 2009]. Zur Kariesprophylaxe kann Fluorid mittels Fluoridierungsschienen oder Fluorid-Spüllösungen appliziert werden. Dies sollte bereits vor der Therapie begonnen und auch nach Bestrahlungsende konsequent fortgesetzt werden [Dörr et al. 2008, Rosenthal und Trotti 2009].
Bei ihrer Ernährung sollten Patienten auf Alkohol, Nikotin und stark gewürzte, heiße, säurehaltige oder scharfkantige Speisen verzichten. Diese können durch eine zusätzliche mechanische und/oder chemische Reizung eine Schleimhautreaktion verstärken. Es sollte auf eine
ausreichende Ernährung geachtet werden, um einem signifikanten Gewichtsverlust entgegenzuwirken. Bei Patienten mit erhöhtem Mukositisrisiko kann die prätherapeutische Anlage
27
LITERATURÜBERSICHT
einer PEG-Sonde (perkutanes endoskopisches Gastrostoma) notwendig sein [Dörr et al.
2009, Rosenthal und Trotti 2009].
Von essentieller Bedeutung ist die persönliche Betreuung und Motivation der Patienten durch
Ärzte und Pflegepersonal. Dies führt zu einer Verbesserung der Compliance und dadurch zur
Reduktion von Therapieunterbrechungen und zur Senkung des Bedarfs an schmerzstillenden Medikamenten [Hartmann et al. 2007, Dörr et al. 2009]. Die Patienten müssen vor der
Radiotherapie über mögliche Nebenwirkungen, deren Symptome und Behandlungsmöglichkeiten aufgeklärt werden. Ein speziell dafür entwickeltes Merkblatt stellt diese Informationen
dauerhaft zur Verfügung [Herrmann et al. 2002a].
Analgesie
Aufgrund der hohen Schmerzhaftigkeit der Schleimhautreaktion ist die Lebensqualität der
Patienten stark eingeschränkt und die Nahrungsaufnahme beeinträchtigt. Um die TherapieCompliance der Patienten aufrecht zu erhalten und eine ausreichende Ernährung sicher zu
stellen, ist eine adäquate lokale und bei Bedarf systemische Schmerztherapie unverzichtbar
und muss frühzeitig eingeleitet werden. Die Medikation erfolgt dabei entsprechend den allgemeinen Grundsätzen der Schmerztherapie [Bey et al. 2010, Barasch und Epstein 2011,
Eilers und Million 2011, Becker-Schiebe et al. 2012].
Antimikrobielle Maßnahmen
Beim Auftreten von Infektionen durch bakterielle oder fungide Erreger sollte eine antimikrobielle Therapie eingeleitet werden. Eine prophylaktische Gabe ist nicht zu empfehlen. Die
Applikation der Antibiotika bzw. Antimykotika wird zunächst topisch durchgeführt. Bei gravierenderen Krankheitsverläufen ist eine systemische Gabe sinnvoll. Dabei sollte eine gezielte
Antibiose entsprechend der bestimmten Keimflora im Rachenabstrich und Antibiogramm
erfolgen. Bei der relativ häufigen Soor-Stomatitis durch Candida albicans hat sich die topische Gabe von Amphotericin B oder die systemische Behandlung mit Fluconazol bewährt
[Dörr et al. 2009, Barasch und Epstein 2011, Becker-Schiebe et al. 2012]
Weitere klinische Maßnahmen
Bei der Kryotherapie führt eine lokale Kälteapplikation durch Lutschen von Eistabletten zur
Vasokonstriktion. Diese führt zu einer vorübergehenden, lokalen Hypoxie der Schleimhaut
und dadurch zur Schleimhautprotektion. Es können Wasser, Kamille- oder Salbeisud verwendet werden. Die verwendeten Eiswürfel dürfen nicht zu kalt oder scharfkantig sein. Positiver Nebeneffekt ist eine gleichzeitige Schmerzlinderung. Es ist jedoch zu beachten, dass
die Tumordurchblutung unbeeinflusst bleiben muss, um die Wirksamkeit der Strahlentherapie nicht zu beeinträchtigen. Dadurch verbietet sich die Applikation bei oberflächlichen Tu28
LITERATURÜBERSICHT
moren grundsätzlich. Eine vergleichbare Wirkung haben Lokalanästhetika [Lilleby et al.
2006, Bey et al .2010, Raber-Durlacher et al. 2010, Svanberg et al. 2010, Barasch und Epstein 2011].
Bereits vor der Strahlentherapie kann die Proliferation in der Schleimhaut durch die Abtragung oberflächlicher Gewebsschichten stimuliert werden. Dies kann durch eine chemische
Ablation mit milden Adstringenzien (Silbernitratlösung) oder durch eine Laser-Ablation erreicht werden [Arora et al. 2008, Bey et al. 2010, Eilers und Million 2011, Gautam et al.
2012]. Die Laser-Ablation ist jedoch technisch aufwendig und kann dementsprechend nur an
speziell ausgestatteten Zentren durchgeführt werden.
Biologische Konditionierung
Ein weiterer Ansatzpunkt ist die Applikation von Wachstumsfaktoren. Präklinisch wurden
verschiedene Wachstumsfaktoren wie Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin-like Growth
Factor (IGF-I), Transforming Growth Factor α (TGF-α) oder Interleukin-1β (IL-1β) untersucht.
Klinische Untersuchungen dazu stehen jedoch noch aus.
Die subkutane Gabe von Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) hat sich als äußerst wirksam erwiesen. Unter der Wirkung von KGF kommt es in Epithelien zu einer Steigerung der
Zellneubildung, Modulation von Differenzierungsvorgängen sowie Stimulation von DNAReparaturprozessen. Mehrere tierexperimentelle und nachfolgende klinische Studien ergaben eine signifikante Verminderung der auftretenden Mucositis enoralis sowohl bei Ganzkörperbestrahlung vor Stammzelltransplantation [Shayani et al. 2009, Peterson et al. 2011, Sonis 2011] als auch bei der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren [Jaal et al. 2010, Henke
et al. 2011, Le et al. 2011]. Es muss jedoch in weiteren Untersuchungen die Wirksamkeit von
KGF auf epitheliale Tumoren geklärt werden [Dörr et al. 2009].
Grundsätzlich ist ein Eingriff in die Pathogenese der Mucositis enoralis auf jeder Stufe der
zellulären/geweblichen Strahlenwirkung (siehe 2.5.1) denkbar. Dadurch sind eine Vielzahl
von Behandlungsansätzen theoretisch möglich. Aktuelle Forschungen beschäftigen sich mit
dem Einsatz von Radikalfängern, Knochenmarkstammzellen oder Immunmodulatoren [Bey
et al. 2010, Citrin et al. 2010, Dörr 2010]. Weitere, vor allem klinische Untersuchungen zur
Wirksamkeit stehen jedoch in den meisten Fällen noch aus oder erlauben keine definitiven
Aussagen zur Wirksamkeit.
29
LITERATURÜBERSICHT
2.6
Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut
2.6.1
Humane Mundschleimhaut
2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen
Die humane Schleimhaut der Mundhöhle besteht aus einem mehrschichtigen Plattenepithel,
welches über die Basalmembran mit der darunter liegenden Bindegewebsschicht (Lamina
propria) verbunden ist. Die Mundschleimhaut kann dabei in 3 funktionelle Bereiche unterteilt
werden: mastikatorische, spezialisierte und auskleidende Mukosa [Schroeder 2000]. An der
dorsalen Zungenoberfläche (Zungenrücken) befindet sich die spezialisierte Mukosa, welche
für die Tast-, Temperatur- und Geschmacksempfindung zuständig ist. Die Schleimhaut enthält Tastkörperchen, mechanische Papillen (Papillae filliformes) und Geschmackspapillen
(Papillae gustatoriae). Die mastikatorische Mukosa befindet sich in besonders durch die Kaufunktion mechanisch stark beanspruchten Arealen wie Zahnfleisch (Gingiva) und hartem
Gaumen. Sie besteht aus einem vielschichtigen, verhornenden Plattenepithel und ist über
einen ausgeprägten Papillarkörper mit dem darunter liegenden Bindegewebe und dem Knochen verbunden [Schroeder 2000, Squier und Kremer 2001]. Im Gegensatz dazu besteht die
auskleidende Mukosa aus einem mehrschichtigen, unverhornenden Plattenepithel, welches
über eine dünne, elastische Lamina propria weniger stark und verschieblich mit dem darunter liegendem Gewebe verzahnt ist [Welsch 2006]. Lippen, Wangen, Vestibulum oris, Mundboden, Zungenunterseite und weicher Gaumen sind mit auskleidender Mukosa bedeckt.
Histologisch besteht das mehrschichtige Plattenepithel der Mundschleimhaut von basal nach
peripher aus drei Schichten: Stratum basale (Basalzellschicht), Stratum spinosum („Stachelzellschicht“) und Stratum granulosum („Körnerschicht“) [Schroeder 2000, Squier und Kremer
2001]. Diese drei Schichten können als Stratum profundum, welches die kernhaltigen Zellen
beinhaltet, zusammengefasst werden. Im Bereich von verhornenden Epithel befindet sich
apikal als vierte Schicht das Stratum corneum (Keratinschicht), welches dem kernlosen Stratum superficiale entspricht [Dörr 1997b]. Die kubischen Zellen des Stratum basale stehen mit
der Basallamina in Verbindung. Das Stratum basale geht kontinuierlich in das Stratum spinosum über. Diese Schicht besitzt im histologischen Präparat breite Interzellulärspalten, welche
die polyglonalen Zellen mit feinen Zellausläufern überbrücken und am Ende über Desmosomen an die Nachbarzelle anschließen. Die gesamte Zellneubildung erfolgt im Stratum basale
und in den unteren Anteilen des Stratum spinosum. Deshalb werden diese Schichten auch
als Stratum germinativum bezeichnet. Nach apikal schließt sich das Stratum granulosum an.
Diese Zellschicht zeichnet sich durch wenige Lagen weitgehend abgeplatteter Zellen aus.
Die von diesen Zellen gebildete basophile Keratohyalin-Granula dient der Vernetzung der
Keratinfilamente untereinander. Außerdem kommt es zu einer fortschreitenden Desintegration der Zellkerne [Schroeder 2000]. Die nicht proliferierenden Zellen des Stratum spinosum
30
LITERATURÜBERSICHT
und die Zellen des Stratum granulosum bilden die funktionelle Schicht, welche alle postmitotischen kernhaltigen Zellen enthält [Dörr 1997b]. Im Stratum corneum finden sich tote, kernund organellenlose Zellen, die nur noch Keratinfilamente und eine Proteinmatrix enthalten
[Welsch 2006].
2.6.1.2 Proliferationskinetik
Im Mundschleimhautepithel sind je nach Lokalisation unterschiedliche Zellzahlen und Proliferationsraten zu beobachten. Dabei ist in Bereichen mit hohen Zellzahlen auch die Proliferationsrate hoch, wodurch die Umsatzzeit des Epithels für alle Lokalisationen konstant 5-6 Tage
beträgt [Dörr et al. 1995]. Die proliferative Aktivität folgt dabei einer zirkadianen Rhythmik, zu
der jedoch nur wenige Daten vorliegen. Warnakulasuriya und MacDonald [1993] fanden ein
Maximum der DNA-Synthese gegen 22.00 Uhr. Bjarnason et al. [1999] weisen dagegen die
höchste S-Phasenaktivität zwischen 11.00 Uhr und 16.00 Uhr nach. Die Unterschiede könnten auf unterschiedlichen Techniken zur Bestimmung der Zellzyklusphasen oder auf individuellen Einflüssen infolge eines unterschiedlichen Schlaf- oder Essverhaltens der Probanden
zurückzuführen sein [Bjarnason et al. 1999].
2.6.2
Murine Mundschleimhaut
2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus
In dieser Arbeit wird für die strahlenbiologischen Untersuchungen bezüglich der Mucositis
enoralis das Tiermodell der Mäusezunge verwendet. Deshalb soll an dieser Stelle auf die
Eigenschaften der murinen Mundschleimhaut und speziell des Stammes C3H/Neu eingegangen werden.
Die Zunge der Maus ist im Durchschnitt 10 mm lang, 5 mm breit und ca. 1,5 mm dick [Dörr
1987]. Die Gesamtdicke des Epithels beträgt ca. 100 µm [Dörr 1997b]. Der Aufbau der murinen Mundschleimhaut an der Zungenunterseite (Abbildung 3) entspricht dabei grundsätzlich
der auskleidenden humanen Mukosa. Die Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus besteht jedoch aus einem mehrschichtigen, verhornenden Plattenepithel (Abbildung 3). Dieser
Unterschied ist aus strahlenbiologischer Sicht aber vernachlässigbar, da für die Strahlenreaktion Proliferations- und initiale Differenzierungsprozesse die zentrale Rolle spielen und die
terminale Differenzierung (verhornt/unverhornt) nahezu bedeutungslos ist [Dörr 2009]. Zudem zeigt auch die humane Mundschleimhaut unter Strahlentherapie Verhornungsprozesse
[Dörr, pers. Mitteilung].
31
LITERATURÜBERSICHT
1
2
3
4
Abbildung 3: Histologischer Aufbau des mehrschichtigen, verhornenden Plattenepithels der
Zungenunterseite der Maus (Hämatoxylin-Eosin-Färbung)
1: Stratum corneum, 2: Stratum granulosum, 3: Stratum spinosum, 4: Stratum basale
2.6.2.2 Proliferationskinetik
Die unbehandelte murine Mundschleimhaut befindet sich in einem Gleichgewicht zwischen
Zellneuproduktion und Zellverlust. Für einen kontinuierlichen Zellnachschub sorgen die Zellen der Germinativschicht. Wichtigster Proliferationsreiz ist dabei die oberflächliche Zellabschilferung durch mechanische und chemische Beanspruchung (z.B. Nahrungsaufnahme)
[Burholt et al. 1985, Dörr und Kummermehr 1991, Dörr et al. 1993, 1994a, Dörr 1997a]. Dabei zeigt die Proliferationsaktivität des Epithels eine ausgeprägten diurnalen Rhythmus. Die
höchste mitotische Aktivität tritt beim Mäusestamm C3H/Neu um ca. 10 Uhr auf [Dörr und
Kummermehr 1991]. Dem voran geht eine erhöhte DNA-Syntheserate mit einer zeitlichen
Differenz von ca. 8 Stunden [Dörr et al. 1994a].
In der murinen Zungenschleimhaut (Stamm C3H/Neu) werden täglich ca. 85 Zellen pro mm
Epithellänge neu produziert, bei einer Gesamtzellzahl von etwa 430 Zellen pro mm Epithellänge. Die durchschnittliche Umsatzzeit beträgt für die Germinativschicht 3,5 Tage und für
das Gesamtepithel etwa 5 Tage [Dörr 1987, Dörr und Kummermehr 1991]. Die murine Zungenschleimhaut ist diesbezüglich mit der humanen Mundschleimhaut vergleichbar [Dörr et al.
1995].
32
LITERATURÜBERSICHT
2.7
Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis
Bei klinischen Untersuchungen muss naturgemäß die Tumorwirkung der Behandlung im Mittelpunkt stehen. Somit ist die Untersuchung individueller Einflussfaktoren, welche die Reaktion einzelner Normalgewebe, wie der Mundschleimhaut, beeinflussen, nur sehr eingeschränkt möglich. Gleiches gilt für die Testung protektiver Strategien. Deshalb müssen für
strahlenbiologische Untersuchungen geeignete tierexperimentelle Modelle eingesetzt werden. Erste Untersuchungen an Plattenepithelien wurden an der Epidermis von Mäusen, Ratten oder Schweinen durchgeführt. Diese sind aufgrund ihrer Unterschiede der Mundschleimhaut bezüglich anatomischem Aufbau, Biologie und Proliferationskinetik nur eingeschränkt
auf die Mundschleimhaut übertragbar [Dörr 1997]. Deshalb wurden spezifische Tiermodelle
zur Untersuchung der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut entwickelt.
2.7.1
Maus
Erste Untersuchungen zu Strahlenreaktionen an der Mundschleimhaut von Mäusen führten
Goepp und Fitch [1962] durch. Durch die Bestrahlung des Kopfes und den daraus resultierenden Veränderungen der Mundschleimhaut wurde die Futteraufnahme stark beeinträchtigt.
Als Endpunkt der Strahlenreaktion wurde der Tod der Tiere analysiert.
Als weiteres Tiermodell für strahlenbiologische Untersuchungen führten Parkins et al. [1983]
das Modell der Mäuselippe ein. Es wurden Untersuchungen mit Einzeitbestrahlung und fraktionierten Dosen durchgeführt [Ang et al. 1985]. Dabei wurde durch die Bestrahlung der gesamten Mäuseschnauze eine Strahlenreaktion der Lippe induziert, wobei als Endpunkt das
Ausmaß des Erythems und das Auftreten denutativer Läsionen bewertet wurden. Die Mäuselippe besteht jedoch sowohl aus Haut als auch aus Schleimhaut, sodass keine reine
Schleimhautreaktion hervorgerufen wird. Aufgrund der Bestrahlung der gesamten Schnauze
und der daraus resultierenden Strahlenreaktionen war die Nahrungsaufnahme der Tiere teilweise stark behindert, was in Gewichtsverlusten bis zu 40 % resultierte. Eine Beeinflussung
der Strahlenreaktion durch diese Mangelernährung kann nicht ausgeschlossen werden.
Moses und Kummermehr [1986] etablierten das Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite. Hierbei wurde zunächst die gesamte Zunge bestrahlt, was zu nutritiven Beeinträchtigungen durch die auftretenden Strahlenreaktionen führte. Um diesen negativen Parameter
zu minimieren und wiederholte Schleimhautirritationen bei fraktionierter Bestrahlung zu vermeiden, wurde das Tiermodell von Dörr [1987] modifiziert. Bei Behandlungsprotokollen mit
fraktionierter Bestrahlung wurde der gesamte Schnauzenbereich mit Dosen, welche nur zu
einem subklinischen Schaden führen, bestrahlt. Dadurch sind eine wiederholte Vorverlagerung der Zunge mit der Gefahr von zusätzlichen mechanischen Irritationen sowie eine Narkotisierung der Tiere nicht mehr notwendig. Des Weiteren wurde die lokale Bestrahlung zur
33
LITERATURÜBERSICHT
Auslösung klinischer Effekte auf eine Fläche von 3x3 mm² auf der Zungenunterseite eingeschränkt. Dadurch konnte die Beeinträchtigung bei der Nahrungsaufnahme und der damit
assoziierte Gewichtsverlust vermieden [Dörr 1987].
Dieses Modell eignet sich besonders für strahlenbiologische Untersuchung der radiogenen
Mucositis enoralis, da sich die Schleimhaut der Zungenunterseite bezüglich Aufbau und Proliferationskinetik nur geringfügig vom humanen Epithel der Mundschleimhaut unterscheidet
(siehe Kapitel 2.6) [Dörr und Kummermehr 1991, Dörr et al. 1994a]. Dieses modifizierte
Tiermodell wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet.
2.7.2
Hamster
Das Modell der Backentasche des Syrischen Goldhamsters wurde von Sonis et al. [1990] zur
Untersuchung der chemotherapieinduzierten oralen Mukositis vorgestellt. Neuere Studien
befassen sich auch mit Nebenwirkungen der Strahlenexposition, wobei diese zunächst nur
als Einzeldosis [Sonis et al. 2000, Hwang et al. 2005], später auch als fraktionierte Bestrahlung [Ara et al. 2008, Murphy et al. 2008] appliziert wurden. Von Vorteil sind die gute Zugänglichkeit der Hamsterbackentasche sowie die große Fläche zur Beurteilung von Strahlenreaktionen. Der Nachteil dieses Tiermodells besteht darin, dass zur Auslösung einer klinischen Reaktion ein zusätzliches mechanisches Trauma erfolgen muss, welches nur schwer
zu standardisieren scheint.
2.7.3
Ratte
Analog zur Zungenschleimhaut der Maus etablierte Dörr [1987] das Modell der Zungenschleimhaut der Ratte. Dabei ist besonders die Größe der Rattenzunge bezüglich der Ausweitung des Testfeldes und der besseren Beurteilung der Strahlenreaktion von Vorteil. Auch
hier wurden zunächst nur Einzeldosen appliziert, wobei als Endpunkt das Auftreten von Ulzerationen definiert war. Dabei bleibt die klinische Reaktion ebenso auf ein Testfeld an der
Zungenunterseite beschränkt [Rezvani und Ross 2004].
Cassatt et al. [2003, 2005] führten strahlenbiologischen Untersuchungen mit fraktionierten
Behandlungsprotokollen unter Bestrahlung des gesamten Kopfes der Tiere durch. Üḉüncü et
al. [2006] und Lee et al. [2007] verwendeten ebenfalls das Tiermodell der Ratte für Untersuchungen zur Beeinflussung der radiogenen Mukositis. Dabei wurde der gesamte Kopf der
Versuchstiere mit einer Einzeldosis von 15 bzw. 25 Gy bestrahlt. Dabei bestehen Nachteile
entsprechend denjenigen des Mäuselippen-Modells.
34
LITERATURÜBERSICHT
2.8
Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit
Die Einflussfaktoren der Strahlentherapie wurden von Withers [1975] als „4 R der Radiotherapie“ zusammengefasst. Dazu zählen:
•
Recovery (Erholungsvorgänge)
•
Repopulierung
•
Redistribution
•
Reoxygenierung
Steel [2002] führte als fünftes R die Radiosensitivität (intrinsische Strahlenempfindlichkeit)
ein. Dörr und van der Kogel [2009] schlagen das bestrahlte Volumen (Volumeneffekt) als
weiteren Einflussfaktor vor.
2.8.1
Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept
Die spezifische Empfindlichkeit von Zellen bzw. Geweben und Organen gegenüber ionisierender Strahlung wird als intrinsische Strahlenempfindlichkeit bezeichnet [Herrmann et. al
2006].
Stammzellen sind in der Lage sich unbegrenzt zu teilen (Klonogenität) und nach Strahleneinwirkung fähig, Gewebe wieder herzustellen. Durch eine Strahlenexposition geht diese
Klonogenität dosisabhängig verloren. Somit ergibt sich die Strahlenempfindlichkeit von Geweben gegenüber einer Strahlenexposition aus der intrinsischen Strahlenempfindlichkeit der
gewebeeigenen Stammzellen und deren Anzahl [Dörr 2009a]. Derzeit existieren jedoch für
die große Mehrzahl de Gewebe keine spezifischen Marker, mit denen Gewebestammzellen
direkt dargestellt werden können [Dörr 2009a]. In Zellkultur-Untersuchungen sind klonogene
Zellen dadurch definiert, dass sie im Koloniebildungstest Zellverbände mit mehr als 50 neuen
Zellen bilden können. In einigen Geweben konnten klonogene Tests zur indirekten Quantifizierung von Stammzellen etabliert werden (Knochenmark, Darm, Epidermis).
Die Dosisabhängigkeit des Zellüberlebens kann mathematisch mittels des linearquadratischen Modells beschrieben werden [Gleichung {1}, Joiner und Bentzen 2009].
(
− α D + β D2
{1}
)
SF = e
SF entspricht der Überlebensrate (Surviving Fraction), D der applizierten Dosis. Die Parameter α und β sind zell- bzw. gewebetypische Konstanten. Die lineare Komponente αD steht für
direkt zytoletal wirkende Ereignisse, die quadratische Komponente βD² für die Kombination
zweier subletaler Ereignisse, welche nur durch Interaktion zum Zelltod führen. Dabei kommt
es mit einer zunehmenden applizierten Dosis (D) zu einer Verringerung von überlebenden
35
LITERATURÜBERSICHT
Zellen (SF). Die halblogarithmische graphische Darstellung der Überlebensrate in Abhängigkeit von der applizierten Dosis resultiert in einer typischen Schulterkurve des Zellüberlebens.
2.8.2
Recovery (Erholung)
Erholungskapazität
Bei der Applikation von mehreren Fraktionen anstatt einer Einzeitbestrahlung mit der gleichen Gesamtdosis nimmt die Strahlentoleranz der Gewebe zu [Herrmann et al. 2006]. Dieser
so genannte Fraktionierungseffekt beruht darauf, dass subletale Strahleneffekte zeitlich und
räumlich interagieren müssen, um zytoletal zu wirken. Durch intrazelluläre Erholungsprozesse können subletale Strahlenschäden bei einem ausreichend langen Zeitintervall zwischen
den Fraktionen kompensiert werden. Diese stehen dadurch bei einer anschließenden Bestrahlung für eine Interaktion nicht mehr zur Verfügung. Dadurch sinkt gegenüber einer Einzeitbestrahlung die Wirkung bei einer fraktionierten Exposition mit gleicher (Gesamt-)Dosis.
Erholungsvorgänge sind besonders bei spätreagierenden Normalgeweben ausgeprägt. Für
früh reagierende Gewebe und Tumoren sind Erholungsprozesse ebenfalls signifikant nachweisbar, aber von geringerer Bedeutung [Thames und Hendry 1987].
Der Fraktionierungseffekt kann ebenfalls quantitativ durch das linear-quadratische Modell der
Strahlenwirkung beschrieben werden [Gleichung {2}, Joiner und Bentzen 2009]. Der Gesamteffekt E ergibt sich aus der Anzahl n und der Dosis d der applizierten Fraktionen.
{2}
(
E = n⋅ α d + βd2
)
Bei Geweben, bei denen die Bestimmung der Stammzellzahl nicht möglich ist, erfolgt die
Beschreibung des Erholungseffektes durch Gleichung {3}.
{3}
E´=
α

= n ⋅  ⋅ d + d 2 
β
β

E
Der α/β-Wert ist dabei eine gewebespezifische Konstante für die Erholungskapazität. Je höher der α/β-Wert ist, desto geringer ist die Abhängigkeit des Strahleneffektes von Veränderungen der Fraktionsdosis oder Dosisleistung [Dörr 2010]. Ein kleiner α/β-Wert (1-4 Gy)
kennzeichnet einen starken Fraktionierungseffekt mit einer ausgeprägten Erholungskapazität, wie er charakteristisch ist für Spätfolgen einer Strahlenexposition. Der α/β-Wert für die
Zungenschleimhaut der Maus beträgt 10-12 Gy [Dörr et al. 1993, Nickstadt 2000]. Der α/βWert für die Mundschleimhaut des Menschen ist ca. 7 - 10 Gy [Denham et al. 1995]. Erho-
36
LITERATURÜBERSICHT
lungsvorgänge beeinflussen somit die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut, sind
aber von untergeordneter Bedeutung.
Erholungskinetik
Die Erholung folgt üblicherweise einer exponentiellen Kinetik und kann somit durch die
Halbwertzeit T1/2 beschrieben werden. Die Halbwertzeit ist dabei die Zeitdauer, in der 50%
der erholbaren Schäden erholt wurden. Für die Mundschleimhaut der Maus beträgt sie weniger als 1 h [Dörr et al. 1993, Nickstadt 2000]. Für die Mundschleimhaut des Menschen werden längere Halbwertzeiten geschätzt. Klinische Beobachtungen zeigen für einige Spätfolgen (z.B. ZNS) Erholungshalbwertzeiten von 4 bis 5 Stunden oder länger. Daher sollten in
der Klinik Fraktionierungspausen von mindestens 6 bis 8 Stunden eingehalten werden
[Herrmann et al. 2006].
2.8.3
Repopulierung
Als Repopulierung wird die regenerative Antwort von Umsatzgeweben (und Tumoren) auf
eine zeitlich ausgedehnte Strahlentherapie bezeichnet. Sie ist ein wesentlicher Faktor für die
Zunahme der Strahlentoleranz dieser Gewebe mit steigender Gesamtbehandlungszeit. Diese Prozesse setzen mit einer gewebespezifischen Verzögerung ein, welche schwach mit der
Umsatzzeit des jeweiligen Gewebes korreliert [Dörr 2010, 2009a]. Unter täglicher fraktionierter Bestrahlung beginnt die Repopulierung im Zungenepithel der Maus innerhalb der ersten
Behandlungswoche und erreicht in der zweiten Woche ihr Maximum [Dörr 1997b]. Dabei
können wöchentliche Gesamtdosen bis 5 x 3,5 Gy in der zweiten und dritten Woche vollständig ausgeglichen werden [Dörr und Kummermehr 2000, Dörr 2003]. In der humanen
Mundschleimhaut setzen Repopulierungsvorgänge bei täglich fraktionierter Bestrahlung
ebenfalls am Ende der ersten Behandlungswoche ein [Dörr et al. 2002, Dörr 2009a,]. Die
Mundschleimhaut gehört damit zu den Geweben mit einer sehr schnellen regenerativen
Antwort auf Strahlenexposition. Repopulierungsvorgänge sind auch die Grundlage der häufig
beobachteten Abheilung der Mucositis enoralis bereits während der letzten Wochen unter
konventioneller Radiotherapie [Dörr 2009a].
Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Regenerationsvorgänge werden im Modell der
3 A zusammengefasst: Asymmetrieverlust, Akzeleration (Beschleunigung) der Stammzellteilungen und abortive Teilungen [Dörr 1997a]. In unbestrahlten Umsatzgeweben besteht
ein Gleichgewicht zwischen Zellproduktion und Zellverlust. Die Stammzellen führen dabei
asymmetrische Teilungen durch, aus denen jeweils eine Tochterstammzelle und eine Zelle,
die über eventuelle Transitteilungen in die Differenzierung geht, hervorgehen. Dadurch bleibt
die Anzahl an Stammzellen im Gewebe konstant. Die Nichtstammzellen gehen nach ihrer
37
LITERATURÜBERSICHT
physiologisch festgelegten Lebensdauer verloren. Durch eine Bestrahlung kommt es zu einem Verlust von Stammzellen. Um die ursprüngliche Anzahl wieder herzustellen, teilen sich
die verbliebenen Stammzellen in jeweils 2 Tochterstammzellen, was einem symmetrischen
Teilungsmuster entspricht. Dieser Asymmetrieverlust ist ein wesentlicher Mechanismus der
Repopulierung [Dörr 2009a]. Die Akzeleration beschreibt eine beschleunigte Stammzellteilung. Experimentelle Untersuchungen konnten zeigen, dass die mittlere Zellzykluszeit in der
murinen Mundschleimhaut unter Repopulierung 1,4 Tage beträgt [Dörr et al. 1994b], im Vergleich zur normalen Zyklusdauer von 3,5 Tagen [Dörr und Kummermehr 1991, Dörr 1997a].
Außerdem können letal geschädigte Zellen noch eine begrenzte Anzahl an abortiven Teilungen durchführen, bevor sie in die Differenzierung gehen [Dörr et al. 1996]. Diese Zellen haben ihren Stammzellcharakter verloren und sind daher für die Strahlentoleranz des Gewebes
nicht mehr von Bedeutung (siehe 2.8.1). Sie tragen aber wesentlich zur Zellproduktion und
damit zum Erhalt der epithelialen Integrität bei, und spielen somit für die Latenzzeit, d.h. die
Zeit bis zum vollständigen Zellverlust, eine wichtige Rolle [Dörr et al. 1996, Dörr 1997a,
2009a].
Repopulierungsprozesse können durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden. Dosisintensität (wöchentliche Dosis) und Behandlungspausen sind von Bedeutung [Dörr 2003]. So
konnte gezeigt werden, dass eine höhere Dosisintensität zu Beginn der Bestrahlung zu einem früheren Einsetzen der Repopulierung führt [Dörr und Kummermehr 1990, Dörr und
Weber-Frisch 1995a, 1995b, Dörr 2003]. In Behandlungspausen, auch an den Wochenenden, nimmt die Repopulierungsleistung im Sinne der Stammzellproduktion dagegen ab und
es stellt sich wieder ein asymmetrisches Zellteilungsmuster ein [Dörr et al. 1994, Dörr 2003].
Die genauen Regulationsmechanismen der Repopulierung sind noch nicht befriedigend geklärt. Der Verlust der Asymmetrie scheint durch autoregulative Prozesse im Stammzellkompartiment beeinflusst zu sein. Demgegenüber ist an der Akzeleration und der Effektivität der
abortiven Teilungen wahrscheinlich die Abnahme der Gesamtzellzahl maßgeblich beteiligt
[Dörr 1997a, 2003, 2009a].
2.8.4
Redistribution
Die Strahlenempfindlichkeit von Zellen ist in den verschiedenen Zellzyklusphasen unterschiedlich. In der G2-Phase und der Mitose liegt eine deutlich höhere Empfindlichkeit vor als
in der G1- oder S-Phase [Herrmann et al. 2006]. Durch eine Bestrahlung werden bevorzugt
die empfindlichen Zellen abgetötet. Dadurch erhöht sich der relative Anteil resistenter Zellen.
Den nächsten Zellzyklus durchlaufen die verbliebenen Zellen nach einem dosisabhängigen
Block am Übergang in die Mitose (G2-Block) synchron. Die darauf folgende Rückverteilung
der Zellen in die verschiedenen Zellzyklusphasen aufgrund von Unterschieden in der Zellzyk38
LITERATURÜBERSICHT
lusdauer wird als Redistribution bezeichnet [Herrmann et al. 2006]. Zellzykluseffekte sind als
Einflussfaktor für die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nicht auszuschließen [Dörr et al.
1993, Dörr 2010].
2.8.5
Reoxygenierung
Der Sauerstoffgehalt von Zellen ist ein maßgeblicher Einflussfaktor auf deren Strahlenempfindlichkeit. Hypoxische Zellen sind um bis zu einem Faktor 3 strahlenresistenter als gut oxygenierte Zellen [Herrmann et al. 2006]. In Tumoren liegen aufgrund der pathologischen Gefäßstruktur, einer möglichen Anämie und der räumlichen Anordnung der Zellen in Relation
zum Gefäßnetz in unterschiedlichen Ausmaß hypoxische Areale vor. Im Rahmen einer fraktionierten Bestrahlung kommt es zu einer Verringerung der Anzahl hypoxischer Zellen und
damit zu einer Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit. Dieser Vorgang wird als Reoxygenierung bezeichnet [Joiner und Wouters 2009, Rockwell et al. 2009]. Dabei spielt die Reduktion
der Anzahl sauerstoffverbrauchender Zellen, die Öffnung temporär verschlossener Gefäße,
eine verbesserte Mikrozirkulation durch sinkenden interstitiellen Druck sowie die Verringerung der Kapillardistanz durch Schrumpfung des Tumors eine Rolle [Baumann et al. 2009].
Aufgrund des nur geringen und konstanten Anteils hypoxischer Zellen in Normalgeweben
spielt die Reoxygenierung für deren Strahlenreaktion keine Rolle [Dörr 2010].
2.8.6
Volumeneffekt
Neben der Dosis spielt auch der bestrahlte Volumenanteil eines Organs für auftretende
Strahlenfolgen eine entscheidende Rolle. Mit der Verbesserung der Qualität der Strahlenapplikation, mit der Konsequenz einer zunehmenden Konformation des Hochdosisvolumens an
das Tumorvolumen, werden zunehmend Inhomogenitäten in der Dosisverteilung innerhalb
der angrenzenden Organe beobachtet [Dörr und van der Kogel 2009]. Nach Withers et al.
[1988] stellt eine funktionelle Untereinheit (FSU, functional sub unit) ein physiologisch abgetrenntes Kompartiment in einem Organ dar. Die FSU können im Gewebe parallel oder in
Serie angeordnet sein. Eine Bestrahlung kann zur Sterilisation der FSU führen. Sind die FSU
seriell angeordnet, wie beispielsweise in Rückenmark, Ösophagus oder Gastrointestinaltrakt,
so fallen aufgrund einer Schädigung einer FSU, alle nachfolgenden Einheiten funktionell aus
und haben so eine klinische Nebenwirkung des gesamten Organs zur Folge [Withers et al.
1988]. Damit ist das Risiko für die Entstehung von Nebenwirkung abhängig von einzelnen
Dosisspitzen (sogenannte „hot spots“) und weniger von der Dosisverteilung und der Gesamtdosis innerhalb des Organs. Bei Organen mit paralell angeordneten FSU, wie Lunge,
Niere oder Leber, wird ein klinischer Effekt dagegen erst beobachtet, wenn eine ausreichend
39
LITERATURÜBERSICHT
große Anzahl an FSU sterilisiert wird. Der Volumeneffekt ist dabei weniger von einzelnen
Dosisspitzen als viel mehr von der Gesamtdosis („mittleren Dosis“) innerhalb des Organs
abhängig. In der Realität ist jedoch kein Gewebe strikt seriell oder parallel aufgebaut.
In der Mundschleimhaut zeigt sich bezüglich der Volumeneffekte ein Zusammenhang zwischen der klinischen Ausprägung der oralen Mukositis und der exponierten Fläche [Bentzen
et al. 2001]. Zudem spielt die Lokalisation der Dosis innerhalb der Mundhöhle eine entscheidende Rolle. Eine signifikante Verminderung der klinischen Konsequenzen der oralen Mukositis kann zum Beispiel durch Ausschluss der Lippen aus dem Hochdosisvolumen erreicht
werden (Dörr und van der Kogel 2009).
2.9
Lovastatin
Zur Beeinflussung der Strahlenreaktion wurde in der vorliegenden Arbeit der CholesterinSynthese-Hemmer Lovastatin verwendet. Lovastatin wird im Körper aus einer inaktiven Vorstufe, welche ein Fermentationsprodukt des Bodenpilzes Aspergillus terreus darstellt, synthetisiert [Liao und Laufs 2005, Knox et al. 2005]. Aufgrund seines natürlichen (nichtsynthetischen) Ursprungs wird es den Typ I-Statinen zugeordnet. Lovastatin besteht aus einem starren hydrophoben Anteil, der die pharmakokinetischen Eigenschaften bestimmt, und dem 3Hydroxy-3-methyl-glutaryl (HMG)-Modul, welches ein Analogon des Substrats für das
Schlüsselenzym der Cholesterolsynthese ist (siehe 2.9.1) [Schachter et al. 2005, Aktories et
al.2009]. Die chemische Strukturformel ist in Abbildung 4 dargestellt.
HMG-Modul
Abbildung 4: Strukturformel von Lovastatin [Alberts 1989]
40
LITERATURÜBERSICHT
2.9.1
Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin
Bei der endogenen Cholesterin-Synthese in der Leber (Abbildung 5) wird in einem vielstufigen Prozess Cholesterol aus Acetyl-CoenzymA (Acetyl-CoA) gebildet. Schlüsselenzym ist
dabei die 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), welche den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Syntheseschritt von 3-Hydroxy-3methyl-glutaryl-CoenzymA (HMG-CoA) zu Mevalonat katalysiert (Schachter 2004, Aktories et
al .2009). Mevalonat wird über Geranyl- und Farnesyl-Zwischenschritte in Cholesterol umgewandelt. Medikamente, die in die Mevalonatsynthese eingreifen und dadurch die Cholesterolbiosynthese inhibieren, werden als Statine bezeichnet. Als hochwirksamer, kompetitiver Hemmstoff der HMG-CoA-Reduktase bindet Lovastatin an die aktive Seite dieses Enzyms und verhindert so die Bindung des Substrats [Schachter 2004, Mutschler 2008]. Die
Bindung des Statins erfolgt dabei kompetetiv und ist reversibel. Verschiedene Mevalonatfolgeprodukte sind Bestandteil von Signaltransduktionskaskaden. Beispiele sind die Geranylund Farnesylfolgeprodukte Rho, Rac, cdc42, Ras, Dolichol, Ubichinon und CoenzymQ-10
(Abbildung 4). Die Beeinflussung dieser Synthesewege ist ursächlich für verschiedene pleiotrope Effekte von Lovastatin [siehe 2.9.4].
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
Acetyl-CoA
HMG-CoAReduktase
Lovastatin
Mevalonat
Geranylpyrophosphat
Ras
Dolichol
Ubichinon
CoenzymQ-10
Rho
Rac
cdc42
Farnesylpyrophosphat
Squalen
Cholesterin
Abbildung 5: Vereinfachte Darstellung der Cholesterinbiosynthese mit Angriffspunkt des
HMG-CoA-Reduktase-Hemmers Lovastatin. Die Synthese von Cholesterin erfolgt über mehrere Zwischenstufen aus Acetyl-CoA. Schlüsselenzym ist die HMG-CoA-Reduktase, welche
den geschwindigkeitsbestimmenden Syntheseschritt katalysiert. Lovastatin hemmt kompetitiv
dieses Enzym [Schachter 2004, Aktories et al. 2009].
41
LITERATURÜBERSICHT
Cholesterin liegt in der Zirkulation hauptsächlich in Form von Low Density Lipoprotein (LDL)
vor. Das Absinken der Konzentration in der Leber führt zu einer Hochregulation der hepatischen LDL-Rezeptoren, wodurch mehr Cholesterin aus der Zirkulation aufgenommen wird.
Damit führt Lovastatin zu einer Abnahme der LDL- und Cholesterinkonzentration im Gefäßsystem. Diese lipidsenkende Wirkung tritt sowohl bei normalen als auch erhöhten Fettstoffwechselwerten auf. Zusätzliche positive Effekte sind die gleichzeitige Erhöhung der HDLund Verringerung der Triglyceridkonzentration [Alberts 1989, Bradford et al. 1994, Daunderer
2002, Wierzbicki et al. 2003, Schachter 2004, Aktories 2009].
2.9.2
Pharmakodynamik und Pharmakokinetik
Lovastatin wird als inaktives Lakton appliziert. Nach oraler Gabe beträgt die Resorptionsrate
nur etwa 40 %, kann jedoch bei gleichzeitiger Nahrungsaufnahme um 50 % erhöht werden
[Aktories et al. 2009]. Lovastatin wird schnell aus dem Magen-Darm-Trakt resorbiert, sodass
bereits nach 4 Stunden die maximale Plasmakonzentration erreicht wird. Bei einmaliger Gabe pro Tag wird nach 2 bis 3 Tagen ein Gleichgewichtszustand erreicht [Alberts 1989,
Schachter 2004, Mutschler 2008].
Lovastatin unterliegt einem Firstpass-Effekt, d.h. nach der gastrointestinalen Resorption erfolgt in der Leber mittels des Isoenzyms CYP3A4 des Cytochroms P450 die Umwandlung
der inaktiven Vorstufe in aktive Formen [Wang et al. 1991, Shitara und Sugiyama 2006, Aktories et al. 2009]. In Folge dessen ist die Bioverfügbarkeit sehr gering, d.h. weniger als 5%
der verabreichten Dosis erreicht den großen Kreislauf in Form von aktiven Inhibitoren. Mehr
als 80 % werden über die Galle und circa 10 % über den Urin ausgeschieden [Alberts 1989,
Knox et al. 2005]. Die Eliminationshalbwertzeit beträgt 3 Stunden [Schachter 2004].
Aktive Formen von Lovastatin sind die β-Hydroxysäure, 6-Hydroxy-, 6-Hydroxy-methyl- und
6-Exomethylenderivate [Aktories et al. 2009]. Aufgrund der lipophilen Eigenschaften ist die
inaktive Vorstufe zu 95 % an Plasmaproteine gebunden [Alberts 1989, Shitara und Sugiyama
2006].
2.9.3
Nebenwirkungen
Lovastatin ist in der üblichen Dosis bis 80 mg pro Tag zur Behandlung von Fettstoffwechselstörungen sehr gut verträglich [MacDonald et al. 1988, Tobert et al. 1990, Thiery et al. 1991,
Bradford et al. 1994]. Als unerwünschte Nebenwirkungen können gastrointestinale Störungen, Kopfschmerzen, Schlafstörungen, Juckreiz, Mundtrockenheit, Überempfindlichkeitsreaktionen, Serumtransaminasenanstiege, Myalgien, Myopathien und Linsentrübungen auftre-
42
LITERATURÜBERSICHT
ten [Tobert 1988, Thiery et al. 1991, Aktories et al. 2009]. Eine Übersicht entsprechend der
Packungsbeilage gibt Tabelle 8 [1A Pharma GmbH 2006].
Myopathien sind mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,01 % relativ selten und nach Absetzen
der Statine reversibel [Tobert et al. 1990, Aktories et al. 2009]. Es kann jedoch dosisabhängig und bei gleichzeitiger Einnahme von Medikamenten, welche ebenfalls durch das Cytochrom P450 umgewandelt werden, im Extremfall zur Rhabdomyolyse kommen [Bradford et al.
1994, Wierzbicki et al. 2003, Schachter 2004]. Als weitere mögliche Nebenwirkung kann eine
periphere Neuropathie auftreten, welche besonders im Beinbereich in Form von Taubheitsgefühlen, brennenden Missempfindungen oder Muskelzucken in Erscheinung treten kann.
Weitere unerwünschte Effekte sind Gedächtnisverlust, Störungen der Sexualfunktion,
Depressionen und Schäden an den Lungenbläschen (interstitielle Lungenkrankheit). Die orale LD50 bei Mäusen beträgt 20 g/kg Körpergewicht [Daunderer 2002].
Tabelle 8:
Nebenwirkungen von Lovastatin entsprechend dem Beipackzettel von
Lovastatin 20 mg [1A Pharma GmbH 2006]
Angabe in
Packungsbeilage
sehr häufig
Häufigkeit bei
behandelten Nebenwirkung
Patienten
> 10 %
keine bekannt
Verstopfung, Durchfall, Blähungen, Magenbeschwerden,
häufig
1-10 %
Bauchschmerzen, Übelkeit, Schwindel, Kopfschmerzen, Muskelschmerzen, Muskelkrämpfe, Verschwommensehen
Müdigkeit, Juckreiz, Sodbrennen, Mundtrockenheit, Verändeselten
0,1-1 %
rungen der Geschmacksempfindung, Schlafstörungen, Schlaflosigkeit
Muskelerkrankungen, Muskelabbau (Rhabdomyolyse), erhöhte Kreatinkinase-Werte (Enzym zur Förderung von Muskelbewegungen), Leberwerteerhöhung, vorübergehende Erhöhung
anderer Blutwerte, Erektionsprobleme, Angstzustände, Depressionen, Überempfindlichkeitsreaktionen, wie Hautausschlag, Hautentzündungen, Nesselsucht, Gesichtsrötung,
Kraftlosigkeit, Reaktionen des Immunsystems in Form von
Anaphylaxie, Gefäßentzündungen, Fieber, Atemnot, Muskelsehr selten 0,01-01 %
entzündungen, Muskelschmerzen, Gelenkentzündungen,
Blutbildveränderungen wie Blutarmut, Zunahme bestimmter
Blutzellen (Eosinophile), Verminderung der weißen Blutkörperchen oder Verminderung der Blutplättchen, Schwäche,
erhöhte Lichtempfindlichkeit, Gelenkschmerzen, Wassereinlagerungen im Gewebe (Ödeme), Atembeschwerden, Schüttelfrost, allgemeines Krankheitsgefühl
Leberentzündungen, Gelbsucht, Erbrechen, Appetitlosigkeit,
ohne
Missempfindungen, Nervenerkrankungen, psychische StörunHäufigkeitsgen wie Angststörungen, Haarausfall, schwere Hautreaktioangabe
nen wie Erythema exsudativum multiforme, Stevens-JohnsonSyndrom und toxisch epidermale Nekrolyse
43
LITERATURÜBERSICHT
2.9.4
Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte)
Effekte, die zunächst keinen Zusammenhang mit der beabsichtigten Wirkung haben, werden
als pleiotrope Effekte bezeichnet. Für Statine sind eine Vielzahl solcher Effekte beschrieben.
Dazu zählen antioxidative, antithrombotische und vaskuloprotektive Wirkungen. Es konnten
eine verbesserte Endothelfunktion durch eine Hochregulation der Stickstoffmonoxid (NO)synthese und eine Stabilisierung atherosklerotischer Plaques festgestellt werden. Antiinflammatorische Effekte und die damit verbundene Reduktion systemischer und vaskulärer
Entzündungen wurden ebenfalls nachgewiesen [Werner et al. 2002, Wierzbicki et al. 2003,
Garcia 2005, Liao und Laufs 2005, Greenwood und Mason 2007, Fritz et al. 2011]. Durch
eine Hemmung der Osteoklastenfunktion in Zusammenhang mit einem verbesserten Knochenaufbau ist eine günstige Beeinflussung der Osteoporose möglich [Werner et al. 2002,
Boucher et al. 2005].
An den pleiotropen Effekten sind vielfältige Vorgänge beteiligt. Mevalonatfolgeprodukte
(Isoprenoide) sind teilweise wichtige Signaltransduktionsmoleküle [Garcia 2005]. Isoprenoide
sind auch Ausgangsprodukte für die Synthese von Ubichinonen (z.B. CoenzymQ-10 (Q-10))
und Dolichol, und spielen eine Rolle bei der Regulation zahlreicher Zellfunktionen mittels
kleiner GTPasen (Guanosintriphosphatasen) der Rho- oder Ras-Familien [Wierzbicki et al.
2003].
Q-10 ist als Coenzym der Atmungskette an der Energiegewinnung in den Mitochondrien der
Zellen beteiligt [Wierzbicki et al. 2003, Knox et al. 2005]. Daneben werden antioxidative Effekte beziehungsweise eine Beteiligung an der Regeneration von Antioxidantien beschrieben. Außerdem wird das Zellwachstum stimuliert und der Zelltod (Apoptose) inhibiert [Crane
2001]. Dolichol besitzt ebenfalls antioxidative Eigenschaften und kann verschiedene Membranfunktionen beeinflussen [Bergamini et al. 2004, Hamadmad und Hohl 2007].
Isoprenoide beeinflussen die posttranslationale Modifikation von GTPasen [Danesh et al.
2003, Garcia 2005, Greenwood und Mason 2007, Hamadmad und Hohl 2007]. Letztere werden nach der posttranslationalen Modifikation aus dem Zytosol in die Membran verlagert.
Dort werden sie durch Phosporylierung aktiviert und leiten so intrazelluläre Signale weiter.
Kleine GTPasen spielen eine wichtige Rolle bei der Zellkommunikation, der Proteinbiosynthese, der Organisation des Zytoskeletts, der Zellteilung, des Zellüberlebens und der Beeinflussung der Immunantwort beziehungsweise von Entzündungsreaktionen [Knox et al. 2005,
Ostrau et al. 2009]. Sie werden in 5 Familien unterteilt: Ras, Rho, Rab, Sar1/Arf und Ran.
Lovastatin beeinflusst durch die Verminderung der Farnesylkonzentration die Rho-Familie
mit den dazugehörigen Untergruppen RhoA, Rac und Cdc42 und durch Verminderung der
Geranylkonzentration die Ras-Familie [Werner et al. 2003, Liao und Laufs 2005, Haydont et
al. 2007b, Greenwood und Mason 2007, Gabrys et al. 2008, Fritz et al. 2011].
44
LITERATURÜBERSICHT
Proapoptotische Effekte konnten nur bei hohen Lovastatinkonzentrationen festgestellt werden. Für niedrigere Konzentrationen, im Bereich der Dosen zur Cholesterinsenkung, spielen
bevorzugt antiapoptotische Effekte eine Rolle [Boucher et al. 2005, Garcia 2005, Nübel et al.
2006, Ostrau et al. 2009]. Antiinflammatorische und immunmodulatorische Effekte resultieren
u.a. aus der Beeinflussung von T-Lymphozyten und Monozyten, der Verminderung der Produktion von Chemo-/Zytokinen und Entzündungsmediatoren wie Interferon-γ (IFN-γ), Tumornekrose-Faktor α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) oder Cyclooxygenase2
(Cox2) [Danesh et al. 2003, Garcia 2005, Chen et al. 2007, Greenwood und Mason 2007,
Ostrau et al. 2009].
Lovastatin vermindert die strahleninduzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB
(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells) und die mRNA-Expression
von Zelladhäsions- sowie proinflammatorischen und profibrotischen Molekülen (u.a. Kollagen
Typ I und III) in einer gewebe- und zeitabhängigen Weise [Nübel et al. 2006, Fritz et al.
2011]. Dabei beeinflusst Lovastatin sowohl akute als auch subchronische Prozesse [Ostrau
et al. 2009].
2.10
Zielstellung der vorliegenden Arbeit
Aufgrund ihrer pleiotropen Effekte zeigen Statine eine vielfältige Beeinflussung der Strahlenreaktionen verschiedener Normalgewebe. Dabei spielen insbesondere die Modulation von
proinflammatorischen und profibrotischen Signalkaskaden und von Zellproliferation und –
differenzierung eine entscheidende Rolle. Da diese Prozesse auch an der Entstehung von
Strahlenreaktionen an der Mundschleimhaut beteiligt sein können (Proliferation), ist eine
Beeinflussung der Mucositis enoralis durch Statine möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde
deshalb der Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Strahlentoleranz
der Mundschleimhaut in einem etablierten Tiermodell der radiogenen Mucositis enoralis
(Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus) quantifiziert. Dafür erhielten die Versuchstiere
Lovastatin in einer Dosierung von 16 mg/kg bei unterschiedlichen Applikationsintervallen in
Kombination mit einer ein- bzw. zweiwöchigen Fraktionierung (5x3 Gy/Woche). Als Endpunkt
wurde die Ulzeration der Schleimhaut quantifiziert. Zusätzliche histologische Untersuchungen umfassten die Charakterisierung verschiedener epithel-morphologischer Parameter für
Behandlungsprotokolle mit zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung und verschiedenen Applikationsschemas von Lovastatin.
45
MATERIAL UND METHODEN
3 Material und Methoden
Das Regierungspräsidium Dresden genehmigte das Versuchsvorhaben „Modifikation der
strahleninduzierten oralen Mukositis (Maus) durch Lovastatin“ unter dem Aktenzeichen
24-9168.11-1-2005-20. Bei der Versuchsdurchführung wurden alle gültigen Tierschutzvorschriften eingehalten.
Die experimentelle Methodik, welche in der vorliegenden Arbeit zum Einsatz kam, wurde
erstmals von Dörr [1987] beschrieben und seither, in der ursprünglichen oder modifizierten
Form, in einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen eingesetzt.
3.1
Versuchstiere
Für die Untersuchungen wurden Mäuse vom Inzuchtstamm C3H/Neu aus der Zucht des Experimentellen Zentrums der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, verwendet. Die Tiere waren zu Versuchsbeginn zwischen 8 und 16 Wochen alt
und wogen durchschnittlich 21 g. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Jede Maus wurde vor Versuchsbeginn durch Ohrmarkierungen individuell gekennzeichnet. Die Tiere wurden unter SPF- (spezifiziert pathogenfreien) Bedingungen gehalten.
Es wurde auf folgende Pathogene getestet: Virologie: MHV, EDIM, MVM, MPV, Sendai,
Theiler, Ektromelie, LCM, MAD, MCMV, Reo3; Bakteriologie: Bordetella bronchiseptica,
Citrobacter rodentium, Clostridium piliforme, Corynebacterium kutscheri, Escherichia coli,
Helicobacter ssp., Pasteurellaceae, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp.,
Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus sp. ß-hämolysierend,
Streptococcus pneumoniae; Parasitologie: Aspiculuris sp., Syphacia sp., Coccidien, Giardia
sp., Spironucleus muris, Trichomonaden, sonstige Flagellaten, Arthropoden.
Ein 12/12-Stunden Hell-Dunkel-Rhythmus mit Wechsel jeweils um 6.00 Uhr bzw. 18.00 Uhr
MEZ/MESZ wurde mit Hilfe eines automatisch gesteuerten Beleuchtungsprogramms gewährleistet. Die Luftfeuchtigkeit in den Haltungsräumen betrug 30 – 50 %, die Temperatur
21 – 24 °C. In jedem Käfig (Makrolon® Größe 3, Fa. Tecniplast Pereg GmbH, Waldkraiburg)
wurden maximal 10 Tiere untergebracht. Als Einstreu wurden Sägespäne (Sniff-Bedding ¾
Faser,
Fa.
Altrogge,
Lage)
verwendet.
Pelletiertes
Standardfutter
Altromin 1326
(Fa. Altrogge, Lage) sowie chloriertes Trinkwasser aus Standard-Kunststoff-Trinkflaschen
wurden ad libitum angeboten.
46
MATERIAL UND METHODEN
3.2
Bestrahlung
Zur Untersuchung der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut wurden zwei unterschiedliche
Bestrahlungstechniken angewendet: Die perkutane Schnauzenbestrahlung zur Applikation
von fraktionierten Dosen und die lokale Bestrahlung der Zungenunterseite. Letztere fand
Einsatz zur Auslösung der klinischen Strahlenreaktion bei der Einzeitbestrahlung sowie als
Testbestrahlung zum Abschluss fraktionierter Bestrahlungsprotokolle. Im nachfolgenden
werden die verwendeten Bestrahlungsanlagen und die Dosimetrie vorgestellt.
3.2.1
Bestrahlungsanlagen
3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung
Die perkutane Bestrahlung wurde mit einer Vollschutz-Röntgenanlage Isovolt 320/13 (Fa.
Seifert Röntgenwerke, Ahrensburg) durchgeführt (Abbildung 6). Die Röhrenspannung betrug
200 kV und der Röhrenstrom 20 mA. Die Filterung der Strahlung erfolgte durch das Berylliumfenster der Röhre und einen Strahlfilter aus 1,0 mm Aluminium und 0,6 mm Kupfer. Der
Fokus-Objekt-Abstand im vertikalen Strahlengang betrug 45,5 cm. Aus dieser Anordnung
ergab sich an der Mäusezunge eine Dosisleistung von 1,07 Gy/min.
1
2
6
3
4
5
Abbildung 6: Röntgenanlage Isovolt 320/13
Die Röntgenröhre (1) befindet sich in einer Vollschutzkammer, deren Tür für die Fotoaufnahme geöffnet wurde. Die Abschirmplatte (2) mit dem Bestrahlungsfenster (3) liegt in
ihrer Halterung (4) oberhalb des Einschubes (5) für die Kunststoffplatte mit den fixierten Versuchstieren. Die Leitung von der Ionisationskammer zur Dosimetrieeinheit (6) ist sichtbar.
47
MATERIAL UND METHODEN
3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung
Zur lokalen Bestrahlung der Zungenunterseite wurde die Weichstrahlröntgenröhre DARPAC
150-MC (Fa. Forward Raytech Ltd., Swindon, U.K.) mit einer Röhrenspannung von 25 kV
und einem Röhrenstrom von 20 mA betrieben (Abbildung 7). Die Filterung der Strahlung erfolgte durch 0,3 mm Aluminium. Der Versuchsaufbau ergab bei einem Fokus-Objekt-Abstand
von 15 cm im vertikalen Strahlengang an der Mäusezunge eine Dosisleistung von
3,78 Gy/min.
1
2
3
Abbildung 7: Weichstrahl-Röntgenanlage DARPAC 150-MC zur lokalen Bestrahlung der
Zungenunterseite
Unterhalb der Röntgenröhre (1) wurde die Halterung (2) für den Aluminiumblock (3) mit dem
Versuchstier (siehe 3.3.2) in definierter Position eingeschoben. Damit befand sich die Zunge
im Zentralstrahl.
3.2.2
Dosimetrie
3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung
Zur Dosimetrie bei der perkutanen Bestrahlung wurde eine Ionisationskammer M 23323 mit
einem Kammervolumen von 0,1 cm³ verwendet, als Dosimeter das Gerät Dosimentor SN4
(beide Geräte Fa. PTW, Freiburg). Die Ionisationskammer wurde in schnauzenäquivalenter
Position im Zentralstrahl positioniert. Die Dosimetrievorrichtung wurde vor jedem Bestrahlungstermin mit Hilfe einer 90Sr-Kontrollvorrichtung entsprechend der Anweisung des Herstellers kalibriert. Die Homogenität der Dosisleistung zwischen den einzelnen Schnauzenpositionen (siehe 3.3.1), die von den Mitarbeitern der Medizinischen Physik der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie regelmäßig geprüft wurde, betrug +/- 3 %.
48
MATERIAL UND METHODEN
Dadurch konnte die Bestrahlungsdosis durch Einstellung der Bestrahlungszeit definiert werden. Nach Ablauf der eingestellten Zeit wurde die Röntgenröhre automatisch abgeschaltet.
3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung
Die Röntgeneinrichtung DARPAC 150-MC diente auch zur Strahlentherapie am Patienten
und war somit in die gesetzlich vorgegebene physikalische Qualitätssicherung der Klinik und
Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie einbezogen. In regelmäßigen Messreihen
mit einer Ionisationskammer M 23342 und dem Dosimeter UNIDOS (beide Geräte Fa. PTW,
Freiburg) wurde für dieses Bestrahlungsgerät ebenfalls eine konstante Dosisleistung nachgewiesen. Auf dieser Basis war es möglich, auch hier die Dosis durch die Vorwahl der Bestrahlungszeit zu definieren.
3.3
Durchführung der Bestrahlung
3.3.1
Perkutane Schnauzenbestrahlung
Zur Schnauzenbestrahlung war keine Anästhesie notwendig. Die Mäuse wurden für die Bestrahlung in Plastikröhren (Innendurchmesser: 28 mm) immobilisiert, die auf einer Kunststoffplatte in zwei parallelen Reihen von je vier Röhren fixiert waren (Abbildung 8). Diese
waren am vorderen Ende mit einer konischen Öffnung (Durchmesser außen 6 mm, innen 10 mm) zur Aufnahme der Schnauzen versehen. Die Tiere wurden durch rückwärtigen
Verschluss der Röhren mit Styroporstopfen am Zurückweichen gehindert. Die Kunststoffplatte wurde in einer Halterung in der Bestrahlungskammer so fixiert, dass sich die Schnauzen
der Tiere im Zentralstrahl befanden. Die Körper der Tiere wurden durch eine 6 mm dicke
Kollimatorplatte aus der Legierung MCP-96 (Fa. HEK Medizintechnik, Lübeck) abgeschirmt,
in der sich ein 18,5x5,5 cm² großes Fenster befand, das den Aluminium-Kupfer-Strahlfilter
enthielt (siehe 3.2.1, Abbildung 6). Das so definierte Bestrahlungsfeld umfasste die Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle und schloss somit die gesamte Zunge
ein.
49
MATERIAL UND METHODEN
1
4
3
2
Abbildung 8: Kunststoffplatte zur Positionierung der Versuchstiere für die Schnauzenbestrahlung
Acht Versuchstiere wurden jeweils parallel bestrahlt. Sie befanden sich in Kunststoffröhren (1), welche auf einer rechteckigen Kunststoffplatte (2) befestigt waren. Die exakte Positionierung der Schnauzen wurde durch konische Bohrungen (3) in der Plexiglasleiste am vorderen Ende der Röhren gewährleistet. Ein Zurückweichen der Versuchstiere wurde durch
Verschluss des hinteren Röhrenendes mittels eins Styroporstopfens (4) verhindert.
3.3.2
Lokale Zungenbestrahlung
Um eine ausreichende Ruhigstellung der Tiere während der lokalen Bestrahlung zu erreichen, wurde Pentobarbital-Natrium (Narcoren®, Fa. Rohne-Merieux GmbH, Laupheim) in
einer Dosis von ca. 60 mg/kg intraperitoneal injiziert. Dadurch erfolgte nach ca. 5 Minuten
eine Immobilisierung der Tiere für ca. 1 Stunde.
Mit Hilfe einer Pinzette wurde bei der narkotisierten Maus die Zunge aus der Mundhöhle vorverlagert und das Tier anschließend in Rückenlage in die zentrale Bohrung (Durchmesser
2,5 cm) eines Aluminiumblocks gelegt. Die Zunge wurde mit der Pinzette vorsichtig durch
eine Öffnung im Dach des Aluminiumblocks (Durchmesser 3 mm) geführt und auf seiner
Oberfläche so mit Klebeband fixiert, dass der Zungenrücken dem Block anlag und die Zungenunterseite exponiert war. Um Zug am Zungengrund mit der Gefahr von Zirkulationsstörungen zu vermeiden, wurde ein Styroporblock unter dem Kopf der Maus platziert. Der Aluminiumblock war, um die Tiere vor Auskühlung zu bewahren auf ca. 35 °C vorgewärmt.
50
MATERIAL UND METHODEN
Die Abschirmung der Zunge erfolgte, bis auf ein zentrales Feld von 3x3 mm², durch ein
1 mm starkes Aluminiumplättchen von 4x2 cm² (Abbildung 9). Dieses war zur Vermeidung
einer Kompression der Zunge an den Seiten um 1 mm erhöht. Der Aluminiumblock mit dem
Versuchstier wurde in eine Halterung an der Röntgenröhre in definierter Weise so positioniert, dass das Bestrahlungsfeld im Zentralstrahl zu liegen kam (siehe 3.2.1, Abbildung 7).
1
1
2
Abbildung 9: Aluminiumblock mit Bestrahlungsfenster und entsprechender Positionierung der
Zunge
Die Bohrung in der Längsachse des Aluminiumblockes mit einem Durchmesser von 25 mm
diente der Aufnahme der Versuchstiere in Rückenlage. Die Zunge der narkotisierten Tiere
wurde vorsichtig mit einer Pinzette durch die Öffnung (1) nach außen geführt und die Zungenoberseite auf doppelseitiges Klebeband fixiert. Die Positionierung des 3x3 mm2 messenden Fensters des Aluminiumplättchens (2) erfolgte zentral über der Zunge.
3.4
Beurteilung der Strahlenreaktion
Zur täglichen Beurteilung der Schleimhautreaktion wurde als Ultrakurznarkotikum Methohexital-Natrium (Brevimytal®, Fa. Lilly, Giessen) in einer Dosierung von ca. 40 mg/kg intraperitoneal injiziert. Nach dem Narkoseeintritt nach 1 bis 1,5 min war eine Ruhigstellung für 3 bis 5
min gegeben.
Die Zunge wurde mit einer Pinzette aus der Mundhöhle vorverlagert ohne das bestrahlte
Schleimhautareal zu berühren und anschließend unter Kunstlicht (Tisch-Halogenlampe) begutachtet. Die Beurteilung erfolgte täglich ab dem Auftreten erster Schleimhautveränderungen (ca. 5. Tag nach der lokalen Bestrahlung) bis zur vollständigen klinischen Abheilung der
Schleimhautläsionen. Als Strahlenreaktionen wurden die in Tabelle 9 dargestellten Veränderungen, d.h. vermehrte Desquamation, Ulzeration und Reepithelialisierung, aufgezeichnet.
Die vermehrte Desquamation beschreibt dabei die verstärkte Bildung von Hornschuppen, die
51
MATERIAL UND METHODEN
Zungenoberfläche wirkt aufgeraut. Als Reepithelialisierung wird die makroskopische Ausheilung der Läsionen bezeichnet.
Für die Dosis-Effekt-Analysen wurde die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld auf der
Zungenunterseite als quantaler Endpunkt festgelegt.
Tabelle 9: Klinische Parameter zur Beurteilung der Strahlenreaktion
Symptom
Keine Veränderung
Desquamation
Ulzeration
Reepithelialisierung
3.5
Bewertung
- ; + ; ++ ; +++
Ja / Nein
Ja / Nein
Beschreibung der durchgeführten Experimente
Als Kontrollversuche dienten sowohl die alleinige Gabe von Lovastatin als auch alleinige
Einzeitbestrahlung. Die Untersuchung der Wirkung von Lovastatin erfolgte mittels unterschiedlichem Applikationsbeginn und -dauer bei ein- bzw. zweiwöchiger Fraktionierung
(5x3 Gy/Woche). Dabei wurde Lovastatin in einer Dosis von 16 mg/kg verwendet. Eine
Übersicht über die durchgeführten Versuche gibt Tabelle 10.
Tabelle 10: Versuchsanordnung
Versuchsnummer
Fraktionierte Bestrahlung
(Tage)
Lokale Bestrahlung
(Tage)
Lovastatingabe
(Tag)
L: Alleinige
Lovastatingabe
Ø
Ø
Ø
0 bis 25
E: Alleinige
Einzeitbestrahlung
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
- 3 bis + 7
-3 bis Ausheilung
aller Ulzerationen
F1: einwöchige
Fraktionierung
F 1-0
F 1-1
0-4
0-4
7
7
F 1-2
0-4
7
F2: zweiwöchige
Fraktionierung
F 2-0
F 2-1
F 2-2
F 2-3
0-4
0-4
0-4
0-4
7 - 11
7 - 11
7 - 11
7 - 11
14
14
14
14
F 2-4
0-4
7 - 11
14
52
Ø
- 3 bis + 4
+ 7 bis + 14
0 bis + 14
0 bis Ausheilung
aller Ulzerationen
MATERIAL UND METHODEN
3.5.1
Alleinige Lovastatingabe (Versuch L)
Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in Wasser für Injektionszwecke (Zulassungsnummer: 42805.00.00) suspendiert. Hierzu wurde je 1 Tablette mit 20 mg Lovastatin mit einem Mörser zerstossen und anschließend mit 6,25 ml Aqua dest. suspendiert, resultierend in
einer Konzentration von 3,2 mg/ml. Für eine Dosis von 16 mg/kg mussten somit 0,05 ml/10g
Körpergewicht appliziert werden.
Die Gabe des Medikaments erfolgte per os mittels Schlundsonde (Art.-Nr. 21.082-261.20,
60 mm, gerade, Fa. Unimed, Lausanne/Schweiz). Dabei wurde die nicht narkotisierte Maus
im Nacken fixiert und die Schlundsonde entlang des Gaumens in Richtung Kehlkopf geführt,
um den Schluckreflex auszulösen (Abbildung 10). Entsprechend des vorher bestimmten Gewichtes erfolgte die Dosierung über eine Spritze mit einem Volumen von 1 ml. Die Tiere erhielten das Medikament täglich um ca. 10 Uhr. Im Versuch L erhielten jeweils 5 Tiere über 25
Tage Lovastatin in einer Dosierung von 16 mg/kg zur Untersuchung der Verträglichkeit.
Währenddessen erfolgten eine tägliche Gewichtskontrolle und eine umtägige Beurteilung
des Allgemeinzustandes und der Zungenschleimhaut.
1
2
Abbildung 10: Schlundsonde (1) mit Einwegspritze (2) und Verabreichung des Medikamentes Lovastatin mit Hilfe dieser Sonde
Zur Applikation von Lovastatin wurden die Tiere im Nacken und im Bereich des Schwanzes
fixiert und anschließend die Sonde entlang des Gaumens Richtung Kehlkopf geführt, um den
Schluckreflex auszulösen.
3.5.2
Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E)
Durch die lokale Einzeitbestrahlung der Zungenunterseite mit gestaffelten Testdosen wurden
die Dosisabhängigkeit und der zeitliche Verlauf der Schleimhautreaktion bestimmt. Es erfolgte die lokale Bestrahlung von 5 Gruppen, bestehend aus jeweils 10 Tieren, mit Dosen von 6,
9, 10, 12 oder 15 Gy und die anschließende Beurteilung und Dokumentation der Schleimhautreaktionen.
53
MATERIAL UND METHODEN
3.5.3
Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F)
Bei einwöchiger Fraktionierung wurde an den Tagen 0-4 täglich um 11 Uhr fraktioniert bestrahlt. An Tag 7 erfolgte ca. 14 Uhr die lokale Bestrahlung der Zungenunterseite mit unterschiedlichen Dosen zur Auslösung des klinischen Effektes. Die fraktionierte Bestrahlung erfolgte in 5 Dosisgruppen mit je 10 Mäusen zur Generierung vollständiger Dosis-EffektKurven. Dieses Bestrahlungsprotokoll ohne weitere Lovastatingabe wurde im Versuch F 1-0
angewendet. Die Versuchstiere erhielten in weiteren Versuchen Lovastatin von Tag -3 bis +7
(F 1-1) und von Tag -3 bis zur Ausheilung aller Ulzerationen (F 1-2) jeweils um 10 Uhr Lovastatin. Die Bestrahlung erfolgte analog zu Versuch F 1-0.
Bei zweiwöchiger Bestrahlung wurde dementsprechend um 11 Uhr mit jeweils 3 Gy bestrahlt. Die lokale Bestrahlung der Zungenunterseite erfolgte am Tag 14 um ca. 14 Uhr,
ebenfalls mit 5 Dosisgruppen von je 10 Mäusen. Dieses Bestrahlungsprotokoll wurde in 5
Versuchsarmen verwendet. Im Versuch F 2-0 erfolgte keine Lovastatingabe. In den weiteren
Versuchen wurde Lovastatin von Tag -3 bis +4 (F 2-1), Tag +7 bis +14 (F 2-2), Tag 0 bis +14
(F2-3) bzw. Tag 0 bis zur Ausheilung aller Ulzerationen (F2-4) jeweils um 10 Uhr appliziert.
3.6
Statistische Auswertung
Als Software zur Datenanalyse diente das Statistical Analysis System SAS [SAS Institute
1990, Schuemer et al. 1990], Version 9.2 TS Level 1 MO (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA,
2002-2008).
3.6.1
Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen
Als quantaler Endpunkt der Strahlenreaktion diente das Auftreten einer Ulzeration im Testfeld auf der Zungenunterseite. Die Dosis-Effekt-Kurven wurden mit Hilfe der Probit-Analyse
(SAS: PROC PROBIT) unter der Annahme einer logarithmischen Verteilung (Logit-Analyse)
und ohne Annahme einer Schwellendosis erstellt. Die wichtigsten Parameter der DosisEffekt-Kurven sind die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration des
Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %Vertrauensbereiche. Der Vergleich von Dosis-Effekt-Beziehungen erfolgte auf der Basis des
Logit-Modells durch Maximum-Likelihood-Analysen unter Verwendung des Likelihood-RatioTests.
54
MATERIAL UND METHODEN
3.6.2
Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis
Um den zeitlichen Verlauf der Strahlenreaktion zu beschreiben, wurden die Parameter Latenzzeit und Ulkusdauer herangezogen. Als Latenzzeit galt das Zeitintervall zwischen lokaler
Bestrahlung und dem Tag der ersten Diagnose einer Ulzeration, als Ulkusdauer die Zeit von
der Erstdiagnose des Ulkus bis zur makroskopischen Reepithelialisierung.
Es wurden die arithmetischen Mittelwerte sowie deren Standardabweichung (SD) bzw. der
Standardfehler des Mittelwertes (SEM) aller reagierenden Tiere einer Dosisgruppe und jedes
Einzelversuchs berechnet. Zur Ermittlung der Dosisabhängigkeit erfolgte eine lineare Regressionsanalyse (SAS: PROC GLM).
3.6.3
Analyse der histologischen Parameter
Um die histologischen Veränderungen quantitativ zu beschreiben, wurden aus allen ausgewerteten Gesichtsfeldern jedes Tieres die arithmetischen Mittelwerte berechnet, und aus
diesen dann die Mittelwerte und Standardabweichungen bzw. Standardfehler für jede Gruppe. Die Zellzahlen wurden auf 1 mm Epithellänge normiert.
3.7
Histologische Untersuchungen
Im Behandlungsprotokoll H1 wurde am Tag 0 mit der Fraktionierung (3 Gy) begonnen und ab
dem folgenden Tag bis Tag 16 jeweils 3 Versuchstieren die Zungen entnommen. An den
Tötungstagen erhielten die Tiere keine Bestrahlung. Eine weitere Gruppe von Tieren erhielt
Lovastatin von Tag 0-14 täglich 10 Uhr ohne Bestrahlung (Versuch H2). In den Versuchen
H3 und H4 wurde das gleiche Bestrahlungsprotokoll wie in Versuch H1 verwendet. Die fraktionierte Bestrahlung wurde an den Behandlungstagen um jeweils 11 Uhr durchgeführt. Die
Applikation von Lovastatin erfolgte um 10 Uhr: im Versuch H3 von Tag 0-14 und im Versuch
H4 von Tag 7-14. Eine Übersicht gibt Tabelle 11.
Tabelle 11: Versuchsübersicht der histologischen Untersuchungen
Gruppe
Kontrolle (H0)
H1
H2
H3
H4
Fraktionierung
Ø
0-4
7 - 11
Ø
0-4
7 - 11
0-4
7 - 11
55
Lovastatingabe
Ø
Ø
0 - 14
0 - 14
7 - 14
MATERIAL UND METHODEN
Die Entnahme der Zungen erfolgte täglich um 10 Uhr bei jeweils 3 Tieren einer Versuchsgruppe. Die Tötung der Tiere erfolgte durch Dislokation des Atlanto-Okzipital-Gelenkes. Anschließend wurde die Zunge mittels einer Schere vom Zungengrund abgetrennt. Danach
wurden die Präparate für mindestens 12 Stunden in neutral gepufferten Formalin fixiert.
Nach der Fixierung wurden die Mäusezungen mittels einer Rasierklinge median geteilt. Anschließend erfolgte die Dehydrierung mit einer aufsteigenden Alkoholreihe (Histokinette, Leica EG 1160, Fa. Leica, Nussloch) und die Einbettung in Paraffin. Mittels des Rotationsmikrotoms 2065 (Fa. Reichert-Jung, Nussloch) wurden Schnitte von 3 µm Dicke angefertigt. Pro
Objektträger wurden 2 Schnitte jeder Zunge aufgebracht. Die angefertigten Paraffinschnitte
wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Einen Überblick über die Arbeitsschritte gibt
Tabelle 12.
Tabelle 12: Arbeitsschritte der Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Dauer
3 x 10 min
jeweils 1 min
1 min
17 min
5-10 min
8 min
kurz Eintauchen
kurz Eintauchen
kurz Eintauchen
Reagenz
Xylol
absteigende Alkoholreihe (Ethanol absolutus, Ethanol absolutus,
Ethanol 96%, Ethanol 96%, Ethanol 70%, Ethanol 40%)
Aqua dest.-Spülung
Mayers Hämalaun (1 g Hämatoxylin in 1 l Aqua destillata, 0,2 g
Natriumjodat, 50 g Aluminiumkaliumsulfat, 50 g Chloralhydrat,
1 g Zitronensäure)
fließendes Leitungswasser
0,5% Eosinlösung (100 ml 1% alkalische Eosinlösung auf 100 ml
Ethanol 96%)
Ethanol 96%
Ethanol absolutus
Xylol
Eindecken mit Entellan (Entellan®neu, Merck KGaA, Darmstadt)
Die Beurteilung des Schleimhautepithels wurde unter einem Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Jena) bei 400-facher Vergrößerung mittels eines quadratischen Zählrasters (4x4 Quadrate)
durchgeführt. Die Seitenlänge eines Quadrates betrug 50 µm. Pro Schnitt wurden mindestens 2 mm Epithellänge ausgewertet. Hierbei wurde die Zahl der kernhaltigen Zellen in der
Funktions- und Germinativschicht ausgezählt. Zur Bestimmung dem Dicken der Germinativ-,
Funktions- und Keratinschicht diente ebenfalls das Zählraster.
56
ERGEBNISSE
4 Ergebnisse
4.1
Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L)
Die Verträglichkeit des Medikaments wurde bei 5 Versuchstieren getestet. Diese erhielten
täglich 16 mg/kg Lovastatin per os über einen Zeitraum von 25 aufeinander folgenden Tagen. Dabei erfolgte täglich eine Gewichtskontrolle und an 3 Tagen der Woche (jeweils Montag, Mittwoch und Freitag) eine Beurteilung der Mundschleimhaut.
Hierbei zeigte sich am 4. Tag eine leichte Schwellung der gesamten Zunge bei allen Versuchstieren, welche insgesamt besser durchblutet erschien und durch mechanische Manipulationen bei der Lovastatingabe leicht verletzlich war. Diese Veränderungen waren nach 2
Tagen jedoch vollständig zurückgegangen. Am 11. Tag zeigten sich die Zungen der Versuchstiere rauer, was aber ebenfalls bis zum nächsten Untersuchungszeitpunkt komplett
rückläufig war.
Bei der täglich durchgeführten Gewichtskontrolle ergab sich eine Reduktion des Körpergewichtes, wobei am 13. Tag die maximale Verringerung auf 91,5 % des Ausgangsgewichtes
festgestellt werden konnte. Nachfolgend schwankte das relative Durchschnittsgewicht zwischen 92 und 95 %. Eine Darstellung des Gewichtsverlaufs zeigt Abbildung 11.
relatives Durchschnittsgewicht (%)
105
100
95
90
85
0
5
10
15
20
25
Tage
Abbildung 11: Relatives Durchschnittsgewicht von 5 Versuchstieren bei alleiniger Gabe von
16 mg/kg Lovastatin an 25 aufeinander folgenden Tagen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
57
ERGEBNISSE
4.2
Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E)
Fünfzig Tiere, aufgeteilt in fünf Dosisgruppen, wurden mit gestaffelten Einzeldosen von 6 bis
15 Gy lokal bestrahlt. Dieser Versuch definierte die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen
Verlauf der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut.
4.2.1
Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus)
Abbildung 12 zeigt die Dosis-Effekt-Kurve für die lokale Einzeitbestrahlung. Diese ist mit einem p-Wert für die Dosisabhängigkeit von 0,0007 gut definiert, der ED50-Wert beträgt
11,5±1,0 Gy.
Ulkusfrequenz (%)
100
80
60
40
20
0
6
8
10
12
14
16
Dosis (Gy)
Abbildung 12: Dosis-Effekt-Kurve der lokalen Einzeitbestrahlung.
Die Punkte stellen die beobachteten Ulkus-Inzidenzen dar. Die Kurve wurde mittels ProbitAnalyse errechnet. Der Fehlerbalken beschreibt die Standardabweichung σ des ED50Wertes. Dieser beträgt 11,5±0,9 Gy.
4.2.2
Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion
Als erste klinische Reaktion zeigten sich 7 bis 8 Tage post radiationem, unabhängig von der
Strahlendosis, in allen Dosisgruppen eine diffuse Rötung und ein Glanzverlust der gesamten
Zungenunterseite. Darauf folgte als zweite Phase die parakeratotische Desquamation des
bestrahlten Testfeldes, die durch eine schuppige Aufrauung der Schleimhautoberfläche imponierte. Am Tag 11 zeigten die ersten Tiere eine typische Glossitis ulcerosa circumscripta
acuta im Testfeld (Abbildung 13).
58
ERGEBNISSE
Abbildung 13: Radiogene Ulzeration der Zungenunterseite.
Die Abbildung zeigt das Bild einer Mucositis ulcerosa circumscripta acuta am Tag 11 nach
lokaler Einzeitbestrahlung. Die Läsion ist streng auf das bestrahlte Testfeld beschränkt. Zur
besseren fotographischen Darstellbarkeit wurde die den Defekt normalerweise bedeckende
Pseudomembran entfernt [Dörr 1997a, mit Erlaubnis].
Die Ulzeration war von einer weißlich schimmernden, glänzenden Pseudomembran bedeckt
und damit gut erkennbar. Ein Maximum an Reagenten wurde an Tag 13 und 14 mit jeweils
17 Tieren festgestellt. In der niedrigsten Dosisgruppe ergaben sich keine Ulzerationen. Nach
dem 13. Tag traten keine neuen Ulzerationen auf. Am 15. Behandlungstag zeigte sich eine
Reepithelialisierungbei den ersten Tieren, bis zum 16. Tag waren alle Ulzerationen
makroskopisch reepithelialisiert. Die Prävalenz von Ulzerationen in den einzelnen Dosisgruppen ist in Abbildung 14 illustriert.
100
9 Gy
10 Gy
12 Gy
15 GY
Ulkusprävalenz (%)
80
60
40
20
0
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Tage nach Testbestrahlung
Abbildung 14: Ulkusprävalenz nach lokaler Einzeitbestrahlung mit gestaffelten Dosen.
Die ersten Tiere reagierten am Tag 11 post radiationem, die meisten Reagenten waren an
den Tagen 13 bis 14 zu beobachten, bis zum Tag 16 waren alle Ulzera reepithelialisiert.
59
ERGEBNISSE
Die Verlaufsanalysen des Versuches E sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Die Latenzzeiten lagen in den einzelnen Dosisgruppen zwischen 12,0 und 12,5 Tagen. Die Ulkusdauer lag
in den Dosisgruppen zwischen 2,5 und 3,2 Tagen. Der Zeitabstand von der Bestrahlung bis
zum erstmaligen Auftreten eines Ulkus (Latenz) und die Ulkusdauer waren dosisunabhängig
(p > 0,05). Sie konnten daher als Durchschnittswert für alle reagierenden Tiere des Versuches zusammengefasst werden. So errechnete sich die mittlere Latenzzeit von 12,2±0,5 d.
Die mittlere Ulkusdauer betrug 3,1±0,6 Tage.
Tabelle 13: Ulkusinzidenz und zeitlicher Verlauf der radiogenen Ulzerationen nach Einzeitbestrahlung mit gestaffelten Testdosen zwischen 6 und 15 Gy.
4.3
Dosis
(Gy)
Anzahl an
Tieren
Anzahl an
Reagenten
Mittlere Latenz
± SD (d)
Mittlere Ulkusdauer
± SD (d)
6
10
0
-
-
9
10
1
12,0 ± 0,5
3,0 ± 0,6
10
10
2
12,5 ± 0,5
2,5 ± 0,6
12
10
5
12,2 ± 0,5
3,2 ± 0,6
15
10
9
12,1 ± 0,5
3,1 ± 0,6
gesamt
50
17
12,2 ± 0,5
3,1 ± 0,6
Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0)
Zur Charakterisierung der Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung wurden 50 Versuchstiere an 5 aufeinander folgenden Tagen (Tag 0-4) mit jeweils 3 Gy perkutan
bestrahlt. An Tag 7 erfolgte die Top-Up-Bestrahlung der Zungenunterseite mit gestaffelten
Dosen zwischen 3 und 12 Gy.
4.3.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz
Die resultierende Dosis-Effekt-Kurve war gut definiert (Abbildung 15). Der p-Wert für die Dosisabhängigkeit der Reaktion betrug p=0,0002. Die ED50 für die Testbestrahlung lag bei
8,6±1,4 Gy mit einem 95 %-Vertrauensbereich zwischen 7,4 Gy und 10,2 Gy.
Gegenüber der Kurve der Einzeitbestrahlung verschob sich diejenige der Top-UpBestrahlung nach einwöchiger Fraktionierung auf der Abszisse nach links, hin zu niedrigeren
Testdosen. Diese Verschiebung resultierte aus der Vorbestrahlung mit 5x3 Gy, die bei dieser
Darstellung der Kurve nicht berücksichtigt wurde.
60
ERGEBNISSE
Anzahl der Reagenten (%)
100
E: Einzeitbestrahlung
F1/0: 5x3 Gy/Woche
80
60
40
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Lokale Dosis (Gy)
Abbildung 15: Dosiseffektkurven bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung im Vergleich zur
Einzeitbestrahlung. Die Fehlerbalken beschreiben die Standardabweichung σ des ED50Wertes.
4.3.2
Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion
Tabelle 14 fasst die Ergebnisse der einzelnen Dosisgruppen für den zeitlichen Verlauf der
Strahlenreaktion zusammen. In der niedrigsten Dosisgruppe traten keine Reagenten auf.
Erste Ulzerationen konnten am 8. Tag nach der Top-Up-Bestrahlung beobachtet werden.
Tabelle 14: Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung
Dosis
(Gy)
Anzahl an
Tieren
Anzahl an
Reagenten
3
10
0
5
10
1
7
10
3
9
10
5
11,5
10
9
gesamt
50
18
1
bezogen auf den Tag der Testbestrahlung
1
Mittlere Latenz
± SD (d)
Mittlere Ulkusdauer
± SD (d)
11,0 ± 0,8
10,0 ± 0,8
10,0 ± 0,8
9,3 ± 0,8
9,7 ± 0,8
4,0 ± 1,1
5,3 ± 1,1
4,6 ± 1,1
6,1 ± 1,1
5,4 ± 1,1
In diesem Versuch ergab sich für die Latenz eine inverse Dosisabhängigkeit (p=0,0125).
Dennoch wurden die Werte für alle Reagenten zusammengefasst; es ergab sich ein Mittelwert von 9,7±0,8 Gy. Die Ulkusdauer war ebenfalls dosisabhängig, mit Werten zwischen 4,0
und 6,1 Tagen (p=0,0199). Der Gesamt-Mittelwert betrug 5,4±1,1 Tage.
61
ERGEBNISSE
4.4
Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0)
Der dritte Kontrollversuch umfasste eine zweiwöchige perkutane Bestrahlung mit je 3 Gy an
jeweils 5 aufeinander folgenden Tagen pro Woche (Tag 0-4 und 7-11). Am 14. Tag erfolgte
eine lokale Bestrahlung der Zungenunterseite mit gestaffelten Dosen (3 bis 12 Gy). Ein Tier
(Testdosis 5 Gy) war aufgrund eines Narkosezwischenfalles verstorben.
4.4.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz
Die Ulkusinzidenz war signifikant dosisabhängig (p = 0,0002). Der ED50-Wert betrug
7,9±1,3 Gy. Die Grenzen für das 95 %-Vertrauensintervall lagen bei 6,7 Gy und 9,3 Gy. Im
Vergleich zur Einzeitbestrahlung war die Dosis-Effekt-Kurve nach links verschoben
(Abbildung 16). Gegenüber der Kurve nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung verringerte sich die ED50 geringfügig, ohne dass dieser Unterschied signifikant war.
Anzahl der Reagenten (%)
100
E: Einzeitbestrahlung
F1/0: 3x5 Gy/Woche
F2/0: 10x3 Gy/2 Wochen
80
60
40
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Lokale Dosis (Gy)
Abbildung 16: Vergleich der Test-Dosiseffektkurven bei Einzeitbestrahlung, einwöchiger und
zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung. Die Fehlerbalken beschreiben die Standardabweichung σ des ED50-Wertes. Bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung zeigte sich keine weitere signifikante Verringerung des ED50-Wertes gegenüber alleiniger einwöchiger Fraktionierung.
4.4.2
Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion
Tabelle 15 fasst die Ergebnisse der einzelnen Dosisgruppen für den zeitlichen Verlauf der
Strahlenreaktion zusammen. In der niedrigsten Dosisgruppe traten keine Reagenten auf.
Erste Ulzerationen konnten am 9. Tag nach der Top-Up-Bestrahlung beobachtet werden. Die
62
ERGEBNISSE
Latenzzeit war invers dosisabhängig (p=0,0191). Die mittlere Latenzzeit für alle Reagenten
betrug 11,3±0,8 Tage. Die Ulkusdauer war ebenfalls signifikant dosisabhängig (p=0,0003).
Dennoch wurden die Dosisgruppen zusammengefasst. Es wurde ein durchschnittlicher Wert
von 4,5±1,0 Tagen ermittelt. Am 17. Tag nach der Testbestrahlung waren alle Läsionen reepithelialisiert.
Tabelle 15: Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung
Dosis
(Gy)
Anzahl an
Tieren
Anzahl an
Reagenten
3
10
0
5
9
2
7
10
4
9
10
6
11,5
10
10
gesamt
49
22
1
bezogen auf den Tag der Testbestrahlung
4.5
1
Mittlere Latenz
± SD (d)
Mittlere Ulkusdauer
± SD (d)
12,0 ± 0,8
11,5 ± 0,8
11,7 ± 0,8
10,8 ± 0,8
11,3 ± 0,8
3,0 ± 1,0
3,8 ± 1,0
4,2 ± 1,0
5,2 ± 1,0
4,5 ± 1,0
Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X)
Zur Untersuchung der Wirkung von Lovastatin bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung
(5x3,0 Gy) erhielten pro Versuchsgruppe 50 Tiere an den Tagen -3 bis +7 (F1/1) oder -3 bis
zur Ausheilung aller Ulzerationen (F1/2) täglich Lovastatin peroral in einer Dosis von
16 mg/kg Körpergewicht. An den Behandlungstagen erfolgte die Lovastatingabe unmittelbar
vor der Bestrahlung. Eine Übersicht über die Ergebnisse dieser Versuchsreihe gibt Tabelle
16.
Tabelle 16: Übersicht über die Ergebnisse bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung mit und
ohne Lovastatingabe. Die Berechnung der ED50-Werte, die Standardabweichung σ und das
95 %-Konfidenz-Intervall sowie des p-Wertes für die Dosisabhängigkeit (p-Dosen) erfolgte
mittels Probit-Analyse. Der Vergleich der Versuche erfolgte mit einem Likelihood-Ratio-Test.
Versuchs- Lovastatin- ED50 σ 95% C.I.
nummer
gabe
(Gy) (Gy)
(Gy)
F1/0
keine
F1/1
-3 bis +7
F1/2
1
8,6
1,5
Mittlere Mittlere
1
PDosis Pvs.Kontrolle Latenz Dauer
±SD(d) ±SD(d)
7,4; 10,2 0,0002
10,1 0,1
2
-
0,999
-3 bis
11,6 0,7 10,4;12,6 0,0026
Ausheilung
-
9,7±0,8 5,4±1,1
0,008
9,5±0,7 3,2±0,6
0,0009
9,6±0,5 3,0±0,0
bezogen auf den Tag der Testbestrahlung
2
Dieser Wert, wie auch das fehlende Konfidenzintervall, resultieren daraus, dass nur ein
Datenpunkt eine Inzidenz zwischen 0 % und 100 % aufwies (10 Gy/30 %).
63
ERGEBNISSE
4.5.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz
Die Dosis-Effekt-Kurven und somit auch die ED50-Werte bei Lovastatingabe waren in beiden
Versuchen im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung (11,5±0,9 Gy) signifikant in den Bereich
höherer Dosen verschoben (Tabelle 16). Die ED50 in Versuch F1/1 betrug 10,1±0,1 Gy, in
Versuch F1/2 11,6±0,7 Gy. Die ED50-Werte der Versuche mit fraktionierter Bestrahlung von
5x3 Gy/Woche sind in Abbildung 17 illustriert.
18
16
5 Fraktionen/1 Woche
Lovastatin: 16 mg/kg
14
ED50 (Gy)
12
*
10
*
8
6
4
2
0
5x3 Gy ohne
Lovastatin
-3 bis +7
-3 bis
Ausheilung
Lovastatin-Applikationsintervall
Abbildung 17: ED50-Werte bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung ohne Lovastatingabe
sowie bei Lovastatingabe von Tag -3 bis +7 und Tag -3 bis zur Ausheilung aller Ulzerationen.
Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung σ der ED50-Werte. Der schraffierte Bereich zeigt den ED50-Wert ± 1σ bei alleiniger Einzeitbestrahlung. Im Vergleich zur alleinigen
fraktionierten Bestrahlung erhöhte die Behandlung mit Lovastatin in beiden Versuchsarmen
die ED50 für die Testbestrahlung signifikant (*: p < 0,05).
Im Versuch F1/1 mit Lovastatingabe von Tag -3 bis +7 wies nur ein Datenpunkt eine Inzidenz
zwischen 0 % und 100 % auf (10 Gy/30%). Die Dosisabhängigkeit betrug 0,999. Dadurch
konnte kein 95%-Konfidenzintervall bestimmt werden. Im Versuch F1/2 war die Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz signifikant (p = 0,0026). Daraus ergab sich ein 95%Vertrauensbereich von 10,4 bis 12,6 Gy.
64
ERGEBNISSE
4.5.2
Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion
Bezüglich der mittleren Latenzzeit ergaben sich in der Kontrolle und bei Lovastatingabe nur
geringe Differenzen (Tabelle 16). Die mittlere Latenzzeit aller reagierenden Tiere war in Versuch F1/1 9,5±0,7 Tage und in Versuch F1/2 9,6±0,5 Tage. Die mittlere Ulkusdauer betrug in
Versuch F1/1 3,2±0,6 Tage und im Versuch F1/2 3,0±0,0 Tage. Damit konnte in beiden Versuchsarmen mit Lovastatingabe eine Verkürzung der Dauer der ulzerativen Läsionen um ca.
2 Tage gegenüber alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche beobachtet werden. In
beiden Versuchen waren alle Ulzerationen am 13. Tag nach der Testbestrahlung reepithelialisiert. Eine graphische Darstellung zeigt Abbildung 18.
60
E
F1/0
F1/1
F1/2
Ulkusprävalenz (%)
50
40
30
20
10
0
6
8
10
12
14
16
Tage nach Testbestrahlung
Abbildung 18: Ulkusprävalenz der Versuche E sowie einwöchiger fraktionierter Bestrahlung
mit und ohne Lovastatingabe
Nach Einzeitbestrahlung reagierten die ersten Tiere am Tag 11, die meisten Reagenten waren an den Tagen 13 bis 14 zu beobachten, bis zum Tag 16 waren alle Ulzera reepithelialisiert. Bei vorangegangener einwöchiger Fraktionierung traten erste Ulzerationen ab Tag 8
auf, welche bis ebenfalls bis zum Tag 16 reepithelialisiert waren. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung waren bezüglich der mittleren Latenzzeit und der mittleren Ulkusdauer nur geringe Unterschiede feststellbar. Erste ulzerative
Läsionen am Tag 9 zu beobachten. Die meisten Reagenten traten an Tag 11 und 12 auf. Die
vollständige Reepithelialisierung erfolgt sowohl im Versuch F1/1 sowie F1/2 bis zum Tag 13.
65
ERGEBNISSE
4.6
Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X)
Zur Untersuchung der Wirkung von Lovastatin bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung
erhielten je 50 Versuchstiere eine Lovastatingabe per os (16 mg/kg Körpergewicht) nach
verschiedenen Schemata (Tabelle 10). Eine Übersicht über die Ergebnisse gibt Tabelle 17.
Tabelle 17: Übersicht über die Ergebnisse bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung mit
und ohne Lovastatingabe. Die Berechnung der ED50-Werte, der Standardabweichung σ und
des 95 %-Konfidenz-Intervalls erfolgte mittels Probit-Analyse.
Mittlere Mittlere
1
P
P
Latenz
Versuchs- Lovastatin- ED50 σ 95% C.I.
Dauer
Dosis
vs. Kontrolle
nummer
gabe
±SD(d) ±SD(d)
(Gy) Gy
(Gy)
1
F2/0
Keine
F2/1
-3 bis +4
7,9 1,3
6,7;9,3
0,0002
-
11,3±0,8 4,5±1,0
12,7 0,9 11,5;14,7 0,0085
<0,0001
8,9±0,4 2,1±0,4
F2/2
+7 bis +14 11,6 0,9 10,6;13,0 0,0011
0,0002
8,3±0,8 2,7±0,8
F2/3
0 bis +14
14,3 1,2 13,1;17,9 0,0084
<0,0001
8,1±0,4 2,6±0,5
F2/4
0 bis Aus12,9 1,3 11,8;14,5 0,0009
heilung
<0,0001
7,2±0,7 2,9±0,8
bezogen auf den Tag der Testbestrahlung
4.6.1
Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz
Die Dosis-Effekt-Kurven aller Versuche mit Lovastatin-Applikation waren gegenüber der Kontrolle in den Bereich höherer Dosen verschoben. Hierbei zeigte sich bei allen Versuchen mit
Lovastatin eine signifikante Veränderung gegenüber dem Kontrollversuch.
Für das Versuchsprotokoll mit Lovastatingabe von Tag +7 bis +14 (F2/2) wurde die niedrigste ED50 mit 11,6±0,9 Gy bestimmt. Bei Behandlung mit Lovastatin von Tag 0 bis 14 über den
gesamten Zeitraum der Fraktionierung (F2/3) konnte die höchste ED50 (14,3±1,2 Gy) ermittelt
werden. Im Versuch F2/1 betrug die ED50 12,7±0,9 Gy, im Versuch F2/4 12,9±1,3 Gy. Eine
Übersicht gibt Abbildung 19.
66
ERGEBNISSE
18
16
10 Fraktionen/ 2 Wochen
Lovastatin: 16 mg/kg
*
14
ED50 (Gy)
*
*
*
12
10
8
6
4
2
ng
0
Au bis
sh
e il
u
bis
+1
4
0
+1
4
bis
+7
bis
+4
-3
10
Lo x3
va G y
sta o
tin hne
0
Lovastatin-Applikationsintervall
Abbildung 19: ED50-Werte bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ohne (weißer Balken) und mit Lovastatinbehandlung (farbige Balken). Auf der Abszisse sind die entsprechenden Behandlungsprotokolle angegeben. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung σ des ED50-Wertes. Die ED50 ± 1σ bei Einzeitbestrahlung wird durch den schraffierten
Bereich dargestellt. Im Vergleich zur alleinigen fraktionierten Bestrahlung erhöhte die Lovastatinbehandlung in allen Versuchsarmen die ED50 für die Testbestrahlung signifikant
(*: p < 0,05).
4.6.2
Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion
Sowohl die mittlere Latenzzeit als auch die mittlere Ulkusdauer waren deutlich kürzer als im
Versuch ohne Lovastatingabe. Die kürzeste mittlere Latenzzeit konnte dabei im Versuch
F2/4 mit 7,2±0,7 Tagen, die längste im Versuch F2/1 mit 8,9±0,4 Tagen festgestellt werden.
Die mittlere Latenzzeit für die Behandlungsprotokolle F2/2 (8,3±0,8 Tage) und F2/3
(8,1±0,4 Tage) lag in diesem Bereich. Für die mittlere Ulkusdauer zeigte sich ein ähnlicher
Trend. Hierbei zeigte sich jedoch im Versuch F2/1 mit 2,1±0,4 Tagen die kürzeste und im
Versuch F2/4 mit 2,9±0,8 Tagen die längste mittlere Ulkusdauer. Die Behandlungsprotokolle
F2/2 (2,7±0,8 Tage) und F2/3 (2,6±0,5 Tage) lagen erneut zwischen diesen Werten. Im Versuch F2/2 waren alle Läsionen am 12. Tag nach der Testbestrahlung, in den anderen Versuchsanordnungen bereits am 11. Tag reepithelialisiert. Eine detaillierte Übersicht gibt
Tabelle 17, eine graphische Darstellung zeigt Abbildung 20.
67
ERGEBNISSE
60
E
F2/0
F2/1
F2/2
F2/3
F2/4
Ulkusprävalenz (%)
50
40
30
20
10
0
4
6
8
10
12
14
16
18
Tage nach Testbestrahlung
Abbildung 20: Ulkusprävalenz des Versuches E sowie der Versuche F2/X mit zweiwöchiger
fraktionierter Bestrahlung mit und ohne Lovastatingabe
Nach Einzeitbestrahlung reagierten die ersten Tiere am Tag 11, die meisten Reagenten waren an den Tagen 13 bis 14 zu beobachten, bis zum Tag 16 waren alle Ulzera reepithelialisiert. Im Versuch F2/0 ergab sich ein ähnlicher Kurvenverlauf. Erste Reagenten waren an
Tag 9 zu beobachten, eine vollständige Reepithelialisierung an Tag 17. In den Versuchsprotokollen mit zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnte gegenüber
dem Kontrollversuch mit alleiniger Fraktionierung eine Verkürzung der mittleren Latenz- und
Ulkusdauer festgestellt werden. Erste ulzerative Läsionen traten an Tag 6 (F2/4), Tag 7
(F2/2) und Tag 8 (F2/1 und F2/3) auf. Mit Ausnahme von Versuch F2/2 (Tag 12) waren alle
Ulzerationen bis zum Tag 11 reepithelialisiert. Die meisten Reagenten konnten je nach Medikamentengabe an Tag 8 bis 10 beobachtet werden.
4.7
Histologische Untersuchungen
Als Kontrolle für die histologischen Untersuchungen dienten 3 Versuchstiere, welche keine
Behandlung erhielten (Versuch H0). Im Behandlungsprotokoll H1 erfolgte eine alleinige fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen. Im Versuch H2 erhielten die Tiere lediglich Lovastatin von Tag 0 -14. In den Versuchen H3 und H4 wurde ebenfalls mit 10x3 Gy/2 Wochen
bestrahlt. Lovastatin wurde im Versuch H3 von Tag 0 -14 und im Versuch H4 von Tag 7-14
appliziert.
68
ERGEBNISSE
4.7.1
Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der
Zungenunterseite (H0 und H1)
Die Histologie der Zungenunterseite von unbehandeltem Epithel wurde bereits in Kapitel
2.7.2. (Abbildung 2) erläutert. Ein histologisches Bild in HE-Färbung der unbehandelten Kontrolle aus den eigenen Untersuchungen sowie der Bestrahlungskontrolle mit 10x3 Gy/2 Wochen von Tag 4 und 11 zeigt Abbildung 21. Die mehrschichtige Gewebestruktur blieb während der fraktionierten Bestrahlung durchgängig erhalten. Es ergaben sich nur geringe Veränderungen in den Dicken der einzelnen Schichten, auch auffällige morphologische Abweichungen der einzelnen Zellen wurden nicht festgestellt.
Kontrolle
Tag 11
Tag 4
Abbildung 21: Histologische Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung (HE-Färbung). Die
linke Abbildung zeigt das histologische Bild der unbehandelten Kontrolle. Die mittlere und
rechte Abbildung entsprechen Tag 4 und 11 der Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen.
4.7.1.1 Zellzahlen
Die Zellzählung im Epithel der Kontrollgruppe ergab im Mittel für die Germinativschicht
602±81 Zellen/mm, für die funktionelle Schicht 213±23 Zellen/mm. Für das unbehandelte
Gesamtepithel ergaben sich daraus 815±101 Zellen/mm. Die Veränderungen der relativen
Zellzahl des Gesamtepithels (A) und der kernhaltigen Schichten (B, C) unter der fraktionierten Strahlungsbehandlung im Vergleich zu diesen Ausgangswerten zeigt Abbildung 22, eine
detaillierte Auflistung der Ergebnisse findet sich in Tabelle 18 im Anhang.
69
ERGEBNISSE
150
125
A
Gesamtepithel
B
Germinativschicht
C
funktionelle Schicht
100
75
50
Relative Zellzahl (%)
25
0
150
125
100
75
50
25
0
150
125
100
75
50
25
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 22: Relative Zellzahlen unter fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen ohne Gabe von Lovastatin (Versuch H1).
Dargestellt sind die relativen Zellzahlen für das Gesamtepithel (A), die Germinativ- (B) und
die funktionelle Schicht (C). Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3
Tieren. Die Zellzahl in der unbestrahlten Kontrolle (±SD) ist durch den schraffierten Bereich
dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3). Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
Mit Beginn der Bestrahlung kam es zu einer Abnahme der mittleren Zellzahl des Gesamtepithels bis zu einem Minimum an Tag 4 (418±10 Zellen/mm). Dies entspricht 51 % der Ausgangszellzahl. In der anschließenden Behandlungspause am Wochenende zeigte sich eine
Zunahme der Zellzahl bis zu Tag 7, die Gesamtzellzahl betrug hier 555±23 Zellen/mm
(68 %). Zu Beginn der 2. Behandlungswoche wurde bis Tag 9 erneut eine Zellzahlverringerung auf minimal 457±23 Zellen/mm (56 %) beobachtet. Bis zum Ende des Untersuchungszeitraums kehrte die Zellzahl auf den Ausgangswert zurück (840±123 Zellen/mm = 103 %).
Die Zellzahlen für die Germinativ- und Funktionsschicht spiegelten in etwa den Verlauf der
Gesamtzellzahl wieder (Abbildung 22).
70
ERGEBNISSE
4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke
Bei der Kontrollgruppe ohne Behandlung war die Dicke der Germinativschicht 17±4 µm, der
funktionellen Schicht 28±9 µm und der Keratinschicht 11±3 µm. Daraus resultiert für das Gesamtepithel eine Dicke von 56±10/µm. Die Veränderungen der Dicke des Gesamtepithels
sowie der einzelnen Schichten bei einer fraktionierten Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen sind in Abbildung 23 dargestellt. Die detaillierten Ergebnisse sind Tabelle 19 im Anhang
zu entnehmen.
Die mittlere Dicke des Gesamtepithels nahm bis zum 5. Tag von 56±10 µm (Tag 0) auf
93±12 µm zu. Dies entspricht 166% des Ausgangswertes. Im Folgenden verringerte sich die
Dicke bis zum 13. Tag auf 70±8 µm (125 %). Nach Abschluss der Bestrahlung zeigte sich
eine Zunahme der Werte bis zu 107±31 µm. Dies entspricht 190 % des Ausgangswertes. Die
einzelnen Schichten folgten im Trend dem Verlauf der Dicke des gesamten Epithels. Der
initiale Anstieg der Gesamtdicke war durch die funktionelle Schicht dominiert, der Anstieg der
zweiten Bestrahlungswoche von der Germinativ- und Keratinschicht.
4.7.2
Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2)
4.7.2.1 Zellzahlen
Abbildung 24 zeigt die Veränderungen der relativen Zellzahl bei alleiniger Lovastatingabe
über 14 Tage ohne Bestrahlung. Eine detaillierte Auflistung der Ergebnisse gibt Tabelle 20
im Anhang. Mit Beginn der Lovastatingabe kam es zu einer Zunahme der Gesamtzellzahlen
bis zum 9. Tag auf 1175±136 Zellen/mm (144 %). Ab dem 10. Behandlungstag lag die mittlere Zellzahl zwischen 120-130 %. Die mittlere Zellzahl am Ende des Behandlungsprotokolls
betrug 978±20 Zellen/mm und lag mit 120% noch über dem Ausgangswert. Der gleiche
Trend ließ sich für die einzelnen Schichten feststellen (Abbildung 24).
4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke
Abbildung 25 zeigt die Veränderungen der relativen Dicke der einzelnen Schichten bei alleiniger Lovastatingabe über 14 Tage ohne Bestrahlung. Eine detaillierte Auflistung der Ergebnisse gibt Tabelle 21 im Anhang. Für das Gesamtepithel ergab sich nach einer initialen Zunahme der Schichtdicke am 1. Behandlungstag auf 73±6 µm (131 %) ein nahezu konstanter
Verlauf mit nur geringen Schwankungen der Schichtdicke zwischen ca. 120-150 %. In den
einzelnen Schichten zeigte sich ein vergleichbarer Verlauf.
71
ERGEBNISSE
400
300
A
Gesamtepithel
B
Germinativschicht
C
funktionelle Schicht
D
Keratinschicht
200
100
0
400
Relative Schichtdicke (%)
300
200
100
0
400
300
200
100
0
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
Tag
10
12
14
16
Abbildung 23: Relative Schichtdicke bei fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen ohne Gabe von Lovastatin (Versuch H1).
Die Schichtdicke des Gesamtepithels (A) wurde als Summe aus Germinativ- (B), Funktions(C) und Keratinschicht (D) bestimmt. Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Die Schichtdicke des Kontrollepithels (±SD) ist durch den schraffierten Balken
dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3). Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
72
ERGEBNISSE
250
200
A
Gesamtepithel
B
Germinativschicht
C
Funktionelle Schicht
150
100
Relative Zellzahl (%)
50
0
250
200
150
100
50
0
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 24: Relative Zellzahlen bei Lovastatingabe von Tag 0-14 ohne Bestrahlung (Versuch H2).
Dargestellt sind die relativen Zellzahlen für das Gesamtepithel (A), die Germinativ- (B) und
die funktionelle Schicht (C). Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3
Tieren. Die relative Zellzahl im Epithel der unbehandelten Kontrolle (±SD) ist durch den
schraffierten Balken dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3). Die
Tage der Lovastatingabe sind über der Abszisse angegeben.
73
ERGEBNISSE
300
250
A
Gesamtepithel
B
Germinativschicht
C
Funktionelle Schicht
D
Keratinschicht
200
150
100
50
0
300
250
Relative Schichtdicke (%)
200
150
100
50
0
300
250
200
150
100
50
0
300
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 25: Relative Schichtdicke bei Lovastatingabe von Tag 0-14 ohne Bestrahlung
(Versuch H2).
Die Schichtdicken wurden für das Gesamtepithel (A), die Germinativ- (B), Funktions- (C) und
Keratinschicht (D) bestimmt. Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3
Tieren. Die relative Schichtdicke der unbehandelten Kontrolle (±SD) ist durch den schraffierten Balken dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3). Die Tage der
Lovastatingabe sind über der Abszisse angegeben.
74
ERGEBNISSE
4.7.3
Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe
Da die einzelnen Schichten und das Gesamtepithel in den Kontrollgruppen vergleichbare
Verläufe bezüglich Zellzahlen und Schichtdicken zeigten, werden hier nur die Werte für das
Gesamtepithel verglichen. Die Einzelwerte für die Schichten sind in den entsprechenden
Tabellen im Anhang (Tabelle 22 bis Tabelle 25) aufgeführt.
4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3)
Den Verlauf der relativen Zellzahlen und der relativen Schichtdicken zeigen Abbildung 26
bzw. Abbildung 27. Die dazugehörigen Werte sind in Tabelle 22 und Tabelle 23 im Anhang
zusammengefasst.
10x3 Gy/2 Wochen Fraktionierung
Frakt. + Lovastatin Tag 0-14
140
Relative Zellzahl (%)
120
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 26: Relative Zellzahlen des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 0 bis 14.
Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Zur Berechnung der
relativen Zellzahlen diente die unbehandelte Kontrolle (815±101 Zellen/mm), welche durch
den schraffierten Balken dargestellt ist. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung
(n=3). Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
Die mittlere Gesamtzellzahl nahm bis zum Tag 3 ab (593±36 Zellen/mm = 72 %) und
schwankte anschließend zwischen 70 und 90 %. Nach Ende der Bestrahlung kam es zu einer Zunahme der Zellzahl bis zu 1005±13 Zellen/mm (123 %) am Tag 16. Es zeigten sich
durchgängig höhere Werte als bei alleiniger fraktionierter Bestrahlung. Die Kurvenverläufe
waren ähnlich. In beiden Versuchsprotokollen kam es nach einem initialen Absinken der Zell75
ERGEBNISSE
zahlen des Gesamtepithels zu einer Stabilisierung der Zellzahlen, bis zu einem anschließenden Anstieg gegen Ende des Versuchszeitraums.
300
10x3 Gy/2 Wochen Fraktionierung
Frakt. + Lovastatin Tag 0-14
Relative Epitheldicke (%)
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 27: Relative Dicken des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 0 bis 14.
Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Zur Berechnung der
relativen Schichtdicke diente die unbehandelte Kontrolle (56±17 µm), welche durch den
schraffierten Balken dargestellt ist. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3).
Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
Die mittlere Dicke des Gesamtepithels nahm zu Beginn des Versuches zu und schwankte
von Tag 2 bis 14 zwischen 130 und 155 %. Nach Ende der Bestrahlung zeigte sich eine Zunahme bis zu Tag 16 mit 94±23 µm (167 %). Insgesamt ließen sich im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen jedoch keine relevanten Unterschiede feststellen.
4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4)
In diesem Protokoll wurde die Lovastatingabe erst am Tag 7 begonnen, sodass der Verlauf
histologischer Veränderungen bis dahin demjenigen der nur bestrahlten Kontrollen entsprechen muss. Eine graphische Darstellung des Verlaufes der Zellzahl zeigt Abbildung 28, der
Schichtdicke Abbildung 29. Die dazugehörigen Werte sind in Tabelle 24 und Tabelle 25 im
Anhang zusammengefasst.
76
ERGEBNISSE
160
10x3 Gy/2 Wochen Fraktionierung
Frakt. + Lovastatin Tag 7-14
140
Relative Zellzahl (%)
120
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 28: Relative Zellzahlen des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 7 bis 14.
Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Zur Berechnung der
relativen Zellzahlen diente die unbehandelte Kontrolle (815±101 Zellen/mm), welche durch
den schraffierten Balken dargestellt ist. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung
(n=3). Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
Nach Beginn der Lovastatingabe am Tag 7 waren die Zellzahlen von Tag 8 bis 13 nahezu
konstant und lagen zwischen 80 und 90 %. Anschließend zeigte sich ein Anstieg bis zum
letzten Versuchstag auf 1160±91 Zellen/mm (142 %). Mit Ausnahme des 11. Behandlungstages lagen alle Werte über den Ergebnissen bei fraktionierter Bestrahlung ohne Medikamentengabe, wobei die Kurvenverläufe ähnlich waren.
Im Vergleich der beiden Behandlungsprotokolle mit fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe waren im Versuch mit Applikation von Tag 7 bis 14 alle Werte signifikant höher als
bei Gabe von Tag 0 bis 14. Die Kurvenverläufe waren ähnlich. Nach relativ konstanten Werten von Tag 8 bis 12, kam es zu einem Zellzahlanstieg gegen Ende der Versuche. Dabei
zeigte sich bei Lovastatingabe ab Tag 7 bereits am letzten Tag der fraktionierten Bestrahlung
(Tag 14) eine Zellzahlzunahme, sodass Werte im Bereich der unbehandelten Kontrollgruppe
erreicht wurden. Bis zum letzten Versuchstag konnte ein Anstieg auf 142 % festgestellt werden.
77
ERGEBNISSE
Relative Schichtdicke (%)
300
10x3 Gy/2 Wochen Fraktionierung
Frakt. + Lovastatin Tag 7-14
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tag
Abbildung 29: Relative Schichtdicke des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 7 bis 14.
Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Zur Berechnung der
relativen Schichtdicke diente die unbehandelte Kontrolle (56±17 µm), welche durch den
schraffierten Balken dargestellt ist. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n=3).
Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
Der Verlauf der Schichtdicke des Gesamtepithels bei Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 und
fraktionierter Bestrahlung zeigte nach einem annähernd konstanten Verlauf von Tag 8 bis 13
mit Werten zwischen 120 und 140% einen Anstieg bis zum Tag 16 auf 92±9 µm (165 %).
Gegenüber der Kontrollgruppe konnten keine relevanten Unterschiede im Verlauf festgestellt
werden.
78
DISKUSSION
5 Diskussion
5.1
Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis
Maligne Tumoren sind in Deutschland die zweithäufigste Todesursache nach den HerzKreislauf-Erkrankungen [Destatis 2012]. Dabei spielen Tumoren im Kopf-Hals-Bereich eine
wichtige Rolle. Die Anzahl der Neuerkrankungen betrug 2006 in Deutschland insgesamt
12.341, wobei Männer ca. dreimal häufiger betroffen waren [GEKID 2006, Statistisches Bundesamt Deutschland 2006, Deutsche Krebsgesellschaft 2009]. Damit stehen diese Tumoren
bezüglich der Häufigkeit bezogen auf alle Krebsneuerkrankungen bei Männern an fünfter
und bei Frauen an fünfzehnter Stelle [RKI und GEKID 2012].
Als Therapieoptionen stehen Chirurgie, Strahlentherapie und zytostatische Chemotherapie
zur Verfügung, welche allein oder kombiniert in kurativer beziehungsweise palliativer Absicht
eingesetzt werden können [Machtey 1997, Gellrich 2004]. Entsprechend dem Ursprungsgewebe und der daraus resultierenden Tumorlokalisation und -ausdehnung sowie patientenbezogenen Faktoren haben sich verschiedene Behandlungskonzepte etabliert. Über die Hälfte
der betroffenen Patienten erhält im Laufe ihrer Behandlung eine Strahlentherapie [Bootz und
Howaldt 2008, Appold et al. 2009]. Dabei wird jedoch nicht nur der Tumor, sondern auch
Normalgewebe innerhalb und in der unmittelbaren Umgebung des Tumors sowie in den Einund Austrittskanälen der Strahlung mit signifikanten Dosen exponiert.
Die Mucositis enoralis ist die häufigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung einer Radiotherapie im Kopf-Hals-Bereich, wobei die Inzidenz, in verschiedenen Schweregraden und
je nach Bestrahlungskonzept, bis 100 % betragen kann [Elting et al. 2008, Dörr 2009c, Dörr
et al. 2010, Oskam et al. 2010, Peterson et al. 2011, Hannemann 2011, Sonis 2011]. Bereits
nach der Applikation einer kumulativen Schwellendosis von 20 Gy bei fraktionierter Bestrahlung treten mit einer Latenzzeit von 9 Tagen konfluente Veränderungen auf [van der Schueren et al. 1990]. Ursächlich ist dabei ein Ungleichgewicht zwischen Zellproduktion und Zelltod, welches sich zunächst als Rötung und Schwellung der Mundschleimhaut im bestrahlten
Bereich darstellt. Im weiteren Verlauf bilden sich fokale, von einer Pseudomembran überzogene Ulzerationen, welche in der 3. bis 4. Behandlungswoche in konfluente Läsionen übergehen [Dörr et al. 2007, 2008, 2010]. Nach Beendigung einer Radiotherapie heilen diese
Ulzerationen gewöhnlich innerhalb weniger Wochen aus (siehe 2.5.1).
Diese Läsionen sind sehr schmerzhaft, sodass Beschwerden beim Sprechen und Schlucken
auftreten sowie die Nahrungsaufnahme teilweise unmöglich wird. Dadurch ist die Lebensqualität der betroffenen Patienten stark beeinträchtigt [Elting et al. 2008, Dörr et al. 2010,
Oskam et al. 2010, Hannemann 2011]. Außerdem kann es durch die eingeschränkte Barrie79
DISKUSSION
refunktion des Epithelgewebes zu Sekundärinfektionen bis hin zu lebensgefährlichen septischen Zuständen kommen. Die Mucositis enoralis ist damit die häufigste Ursache für Therapieunterbrechungen, wobei die Behandlung für eine Ausheilung bis zu vier Wochen pausiert
werden muss [Dörr et al. 2005a, 2007, 2010]. Dies ermöglicht aber auch Regenerationsprozesse im Tumor. Mit der Verlängerung der Gesamtbehandlungszeit kommt es dadurch zu
einer Zunahme der Strahlentoleranz des Tumors und in der Konsequenz zu einer Verminderung der Heilungschancen [Herrmann und Baumann 2005, Herrmann et al. 2006, Dörr et al.
2010]. Außerdem beeinflusst die Mucositis enoralis die Entstehung chronischer Strahlenfolgen im Sinne von konsekutiven Späteffekten. Dies kann Ursache für chronische Ulzerationen, Schleimhautatrophien, Fibrosen und Osteoradionekrosen sein [Dörr und Hendry 2001,
Dörr et al. 2008, 2010].
Die in Folge der oralen Mukositis notwendigen zusätzlichen therapeutischen Maßnahmen,
gegebenenfalls in Verbindung mit einer Hospitalisation, und die Verlängerung der Therapiedauer insgesamt verursachen umfangreiche Kosten [Elting et al. 2007, Murphy 2007, Dörr et
al. 2010, Sonis 2011].
Durch eine Verminderung der Mucositis enoralis wäre es möglich, eine Verbesserung der
Lebensqualität der Patienten unter einer Strahlentherapie zu erreichen. Dadurch können
Therapieunterbrechungen reduziert, die Tumorkontrolle verbessert und im Endeffekt die Heilungschancen erhöht werden. In diesem Sinne wurden bereits eine Vielzahl von Maßnahmen
zur Prophylaxe und Therapie entwickelt und untersucht [siehe Kapitel 2.4.4]. Aktuell ist jedoch kein allgemein anerkanntes Konzept zur Prävention und Behandlung der oralen Mucositis etabliert [Dörr 2009c, 2010, Lalla und Keefe 2011, Peterson 2011]. Der Einfluss von
Statinen zur Blutfettsenkung auf die Ausprägung der Mucositis enoralis ist Inhalt der vorliegenden Arbeit. Nähere Betrachtungen zu Lovastatin und dessen pleiotropen Effekten finden
sich in Kapitel 2.9.
5.2
Zungenepithel der Maus als Tiermodell
5.2.1
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen
Die Zungenunterseite der Maus ist ein etabliertes Modell für strahlenbiologische Untersuchungen an der Mundschleimhaut [Dörr 1987]. Das mehrschichtige Plattenepithel der murinen Mundschleimhaut weist große Ähnlichkeit mit der oralen Mukosa des Menschen auf.
Unterschiede bestehen jedoch in der Keratinisierung. Nur an mechanisch stark beanspruchten Stellen, wie an Gaumen und Gingiva, ist die humane Mukosa verhornt, während die
Mundschleimhaut der Maus orthokeratinisiert [Schroeder 2000]. Da die Strahlenreaktion der
Mundschleimhaut jedoch von Proliferations- und initialen Differenzierungsprozessen domi80
DISKUSSION
niert wird, und von der terminalen Differenzierung (verhornt/unverhornt) des Epithels nahezu
unabhängig ist, ist dieser Unterschied aus strahlenbiologischer Sicht vernachlässigbar [Dörr
1997b]. Zudem finden sich auch in der humanen Mundschleimhaut nach Strahlenexposition
rasch Verhornungsprozesse [Dörr, persönliche Mitteilung].
Die murine und humane Mundschleimhaut sind bezüglich Struktur, Proliferationsverhalten
und Pathogenese der Strahlenreaktion im Wesentlichen vergleichbar [Dörr et al. 1994, Dörr
1997b]. Beide weisen eine zirkadiane Rhythmik der proliferativen Aktivität auf [Warnakulasuriya und MacDonald, 1993, Dörr et al. 1994a, Bjarnason et al. 1999]. Die Umsatzzeit des
Mundschleimhautepithels des Mäusestamms C3H/Neu beträgt ca. 5 Tage [Dörr 1987, Dörr
und Kummermehr 1991]. Dies entspricht der Umsatzzeit der humanen Mukosa [Dörr et al.
1995]. Der zeitliche Verlauf strahleninduzierter Veränderungen ist somit vergleichbar und die
qualitative Übertragung der Untersuchungsergebnisse von muriner Mundschleimhaut auf
den Menschen gerechtfertigt [Dörr 1997b]. Eine quantitative Übertragung ist jedoch nur bedingt möglich und bedarf in jedem Fall der Abklärung in entsprechenden klinischen Untersuchungen.
5.2.2
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
Quantitativer Endpunkt zur Analyse der Strahlenreaktion war in der vorliegenden Arbeit das
Auftreten ulzerativer Epithelläsionen. Die relative Anzahl an Versuchstieren, welche im Testfeld an der Zungenunterseite eine Ulzeration der Schleimhaut aufwiesen, bildete die Grundlage für Dosis-Effekt-Analysen. Die ulzerativen Veränderungen entsprechen einer konfluenten Mucositis (Grad 3) nach RTOG/EORTC. Nickstadt [2000] stellte fest, dass sich bei der
Beurteilung der Ulkusinzidenz zwischen verschiedenen Untersuchern nur geringe Variationen beobachtet werden. Die ED50 (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration zu erwarten ist) betrug in der vorliegenden Arbeit 11,5±1,5 Gy mit einer signifikanten Abhängigkeit
der Ulkusfrequenz von der applizierten Dosis (p = 0,0007). Dieser ED50-Wert zeigte keine
signifikanten Abweichungen zu früheren bzw. parallel durchgeführten Untersuchungen [Nickstadt 2000, Brankovic 2001, Fehrmann 2010, Siegemund 2011].
Als sekundäre Endpunkte wurden die zeitlichen Parameter Ulkusdauer und Latenzzeit ausgewertet. Nach Einzeitbestrahlung wurde in der vorliegenden Arbeit eine mittlere Ulkusdauer
von 3,1±0,6 Tagen und mittlere Latenzzeit von 12,2±0,5 Tage beobachtet. In früheren Untersuchungen wurden ähnliche Ergebnisse ermittelt [Nickstadt 2000, Brankovic 2001]. Es konnte jedoch festgestellt werden, dass die Werte für die mittlere Ulkusdauer und Latenzzeit insgesamt größeren subjektiven Einflüssen durch die einzelnen Untersucher unterliegen. In der
vorliegenden Arbeit wurden alle Beurteilungen ausschließlich durch die Autorin selbst vorgenommen, sodass sich subjektive Einflüsse der Beurteilung der Schleimhaut-Reaktion ledig81
DISKUSSION
lich als systematischer Fehler mit einer Abweichung gegenüber anderen Untersuchungen,
nicht jedoch im Vergleich zu einzelnen Versuchsarmen, manifestieren würde.
5.2.3
Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung
Bei alleiniger fraktionierter Bestrahlung über eine Woche (5x3 Gy) betrug die ED50 für die
anschließende Testbestrahlung 8,6 ±1,4 Gy, über 2 Wochen (10x3 Gy) 7,9±1,3 Gy. Dies
entspricht Werten aus vergleichbaren Untersuchungen an diesem Tiermodell [Dörr et al.
2005a, 2005c, Schmidt 2009, Mammeri 2010]. Gegenüber der Einzeitbestrahlung (ED50
11,5±1,0 Gy) waren die Dosis-Effekt-Kurven für die lokale Testbestrahlung sowohl bei einwöchiger als auch zweiwöchiger Fraktionierung signifikant nach links verschoben. Dies zeigt
den Effekt der fraktionierten Vor-Bestrahlung an der Mundschleimhaut.
Zwischen den Dosis-Effekt-Kurven der lokalen Testbestrahlung nach einer bzw. zwei Wochen konnte jedoch kein signifikanter Unterschied festgestellt werden, trotz der zusätzlichen
Applikation von 5x3 Gy in der zweiten Behandlungswoche. Dies ist auf Repopulierungsvorgänge (2.8.3) zurückzuführen, welche bereits ausführlich beschrieben wurden [Dörr und
Kummermehr 1990, Dörr 1997a, 2003]. Die Latenzzeiten bis zur Ulkusentstehung, bezogen
auf den Tag der Testbestrahlung, waren nach fraktionierter Bestrahlung (5x3 Gy:
9,7±0,8 Tage; 10x3 Gy: 11,3±0,8 Tage) kürzer als nach Einzeitbestrahlung (12,2±0,5 Tage).
Dies stimmt ebenfalls mit den Ergebnissen früherer Untersuchungen an diesem Tiermodell
überein [Nickstadt 2000, Dörr et al. 2005c, Schmidt 2009]. Ursache dafür ist der bereits während der fraktionierten Bestrahlung beginnende Zellverlust. Nach der Test-Bestrahlung wird
dadurch weniger Zeit bis zum kompletten Zellverlust benötigt. Die mittlere Ulkusdauer betrug
bei Einzeitbestrahlung 3,1±0,6 Tage. Bei den fraktionierten Behandlungsprotokollen konnte
bei ein- (5,4±1,1 Tage) und zweiwöchiger (4,5±1,0 Tage) Fraktionierung eine geringe Verlängerung der Ulkusdauer festgestellt werden. Dies wurde ebenfalls durch Schmidt [2009] im
gleichen Tiermodell beschrieben.
5.3
Applikation von Lovastatin
5.3.1
Dosierung
Die Dosierung von Lovastatin in den vorliegenden Untersuchungen richtete sich nach der
empfohlenen Dosierung beim Menschen (70 kg) von 20-40 (max. 80) mg. Unter Berücksichtigung der Körperoberflächenunterschiede, d.h. des metabolischen Körpergewichts, über die
Meeh-Formel [Urban&Fischer 2003] ergibt sich für die Maus (22 g) eine Dosisspanne von
82
DISKUSSION
0,1-0,2 (0,4) mg. Deshalb wurde im vorliegenden Vorhaben eine Dosis von 16 mg/kg, entsprechend einer hohen, aber noch submaximalen Dosierung beim Menschen verwendet.
Wildermuth [2010] untersuchte den Einfluss von Lovastatin auf die Mucositis enoralis nach
Einzeitbestrahlung. Die Tiere erhielten Dosen von 8 mg/kg, entsprechend einer mittleren
Dosierung, bzw. 16 mg/kg. Dabei konnte besonders in den Behandlungsprotokollen mit einer
Applikation von 16 mg/kg ein signifikanter Effekt beobachtet werden.
5.3.2
Verträglichkeit
Die Verträglichkeit des Medikamentes wurde an 5 Versuchstieren getestet, welche täglich
16 mg/kg Lovastatin per os über einen Zeitraum von 25 aufeinander folgenden Tagen erhielten. Dabei konnte eine maximale Gewichtsverringerung bis auf 91,5 % des Ausgangswertes
am Tag 13 festgestellt werden. Dies kann möglicherweise durch gastrointestinale Nebenwirkungen und eine dadurch reduzierte Nahrungsaufnahme erklärt werden.
Vergleichbare Untersuchungen an Mäusen konnten ebenfalls die gute Verträglichkeit von
Lovastatin (10 mg/kg/Tag) belegen [Williams et al. 2004, Ostrau et al. 2009]. Die Medikamentengabe wurde durch die Versuchstiere gut toleriert und es konnten keine unerwünschten Nebenwirkungen festgestellt werden. Gabrys et al. [2008] applizierten 50 mg/kg/Tag über
einen Zeitraum von einem Monat ohne das relevante Nebenwirkungen auftraten. Ein längerer Applikationszeitraum oder höhere Dosen (100-200 mg/kg/Tag) führten jedoch zum Tod
der Mäuse [Gabrys et al. 2008].
5.4
Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch
Lovastatin
5.4.1
Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung
Der Einfluss von Lovastatin auf die Mucositis enoralis bei Einzeitbestrahlung wurde im gleichen Tiermodell durch Wildermuth [2010] unabhängig untersucht. Die Versuchtiere erhielten
jeweils 8 bzw. 16 mg/kg Lovastatin von Tag -3 bis zur Ulzeration, Tag -3 bis zur Ausheilung,
Tag +1 bis zur Ulzeration und Tag +1 bis zur Ausheilung. Außerdem umfasste ein Versuchsarm die Applikation von 16 mg/kg Lovastatin von Tag -10 bis zur Ausheilung der Ulzeration.
In der Dosierung von 8 mg/kg konnte dabei nur in dem Behandlungsarm mit einer Medikamentengabe von Tag -3 bis Heilung der Ulzeration eine signifikante Steigerung der ED50
festgestellt werden. Der zeitliche Verlauf wurde nicht beeinflusst. Die Applikation von Lovastatin in einer Dosierung von 16 mg/kg ergab für die Intervalle Tag +1 bis zur Ulzeration
und Tag -3 bis zur Ausheilung einen signifikanten Anstieg der ED50-Werte. Der zeitliche Ver83
DISKUSSION
lauf war in dieser Dosierung nur bei Lovastatingabe von Tag -10 bis zur Ausheilung der Ulzeration beeinflusst. Für diesen Versuchsarm wurden eine signifikant verkürzte Ulkusdauer
sowie ein gesteigerter ED50-Wert festgestellt. Zusammenfassend konnte ein mukoprotektiver
Effekt von Lovastatin auf die murine Mundschleimhaut nach Einzeitbestrahlung nachgewiesen werden, welcher insgesamt aber nur gering ausgeprägt war. Dabei schien ein direkter
Zusammenhang zwischen der Behandlungsdauer und der Effektivität der Mukoprotektion zu
bestehen.
5.4.2
Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung
In der vorliegenden Untersuchung wurden verschiedene Applikationszeiträume von Lovastatin bei ein- und zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung getestet. In Abbildung 30 sind die
ED50-Werte der einzelnen Versuche vergleichend zusammengestellt. Da aus der Literatur
keine vergleichbaren Untersuchungen bekannt sind, muss sich dieser Abschnitt auf eine
Diskussion der eigenen Ergebnisse beschränken.
Abbildung 30: Übersicht der ED50-Werte aller Einzelversuche.
Dargestellt sind die ED50-Werte der Versuche F1/X (5x3 Gy) und F2/X (10x3 Gy). Ausführliche Angaben sind den Kapiteln 4.2 bis 4.6 zu entnehmen. Die Lovastatinbehandlungsprotokolle sind in den Balken angegeben; Kontrollversuche sind ohne Angabe. Die Fehlerbalken
entsprechen der Standardabweichung σ des ED50-Wertes. Die ED50 ± 1σ bei Einzeitbestrahlung (11,5±1,0 Gy ) wird durch den schraffierten Bereich dargestellt.
84
DISKUSSION
Sowohl bei ein- als auch zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung führte die Gabe von Lovastatin zu einer Verminderung der Schleimhautreaktion. Bei zweiwöchiger Fraktionierung
konnten insgesamt höhere ED50-Werte als bei Fraktionierung über 1 Woche ermittelt werden.
Ein möglicher und wahrscheinlicher Wirkmechanismus ist hier die Stimulation der symmetrischen Stammzellteilungen (siehe 2.8.3) bereits im Verlauf der ersten Bestrahlungswoche.
Dies würde zu einem früheren Einsetzen der Repopulierungsvorgänge und damit zu einem
Repopulierungseffekt bereits nach der ersten Bestrahlungswoche führen. Dieser Stimulationseffekt setzt sich offensichtlich in der zweiten Bestrahlungswoche fort.
5.5
Histologische Untersuchungen
In der vorliegenden Arbeit beträgt die durchschnittliche Zellzahl im unbehandelten Epithel
815±101
Zellen/mm.
Davon
befinden
sich
73 %
in
der
Germinativschicht
(602±81 Zellen/mm). Dörr und Kummermehr [1991] bestimmten in histologischen Untersuchungen die Gesamtzellzahl im Epithel der Schleimhaut der Zungenunterseite von C3H/NeuMäusen mit ca. 430±12 Zellen/mm Epithellänge, von denen 71 % (306±5 Zellen/mm) zur
Germinativschicht gehörten. Bei Fehrmann [2010] betrug die Gesamtzellzahl im unbehandelten Epithel 578±5 Zellen/mm Epithellänge, wobei 75 % zum Stratum germinativum gehörten.
Siegemund [2011] ermittelte ähnliche Werte von 560±9 Zellen/mm Epithellänge für die unbehandelte Kontrolle, von denen 81 % der Germinativschicht zuzuordnen waren.
Alle Untersuchungen wurden am gleichen Mäusestamm C3H/Neu durchgeführt und ergaben, dass sich mindestens zwei Drittel der Epithelzellen im Stratum germinativum befinden.
Die Diskrepanz in den absoluten Zellzahlen zu den Untersuchungen von Dörr und Kummermehr [1991] ist auf unterschiedliche Präparationstechniken (Kunststoff-Einbettung, Schnittdicke 3 µm vs. Paraffineinbettung, Schnittdicke 5 µm in den anderen Arbeiten) zurückzuführen.
Die histologischen Untersuchungen von Dörr und Kummermehr [1991] erfolgten außerdem
in den Tierräumen des GSF-Forschungszentrums München-Neuherberg. Die neueren Versuche als auch die vorliegende Arbeit wurden in den Einrichtungen der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der TU Dresden durchgeführt. Die unterschiedlichen Gesamtzellzahlen könnten damit auch auf unterschiedliche Futterzusammensetzungen und Haltungsbedingungen zurückzuführen sein.
Zur genaueren Untersuchung der Beeinflussung der radiogenen Mucositis enoralis durch
den Cholesterin-Synthese-Hemmer Lovastatin wurden in der vorliegenden Arbeit weiterführende histologische Untersuchungen durchgeführt. Als Kontrolle dienten die ermittelten Werte für die Zellzahlen und die Schichtdicken bei alleiniger fraktionierter Bestrahlung mit insgesamt 10x3 Gy über 2 Wochen (Versuch H1). Die Versuchtiere erhielten zusätzlich eine Me85
DISKUSSION
dikamentengabe von Tag 0 bis +14 im Versuch H3 und von Tag +7 bis +14 im Versuch H4.
Außerdem wurde die alleinige Wirkung einer Lovastatinapplikation von Tag 0 bis +14 (Versuch H2) untersucht. Die Kurvenverläufe aller 4 Behandlungsprotokolle für die Gesamtzell-
1225
150
1020
125
815
100
610
75
405
50
200
25
0
Relative Zellzahl (%)
Mittlere Zellzahl/mm Epithellänge
zahlen zeigt Abbildung 31 im Vergleich.
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tage
10x3 Gy/2 Wochen Fraktionierung
Frakt. + Lovastatin Tag 0-14
Frakt. + Lovastatin Tag 7-14
Lovastatin Tag 0-14
Abbildung 31: Mittlere und relative Zellzahlen des Gesamtepithels für alle 4 Behandlungsprotokolle.
Die Kurvenverläufe ergeben sich als Mittelwert aus jeweils 3 Tieren. Zur Berechnung der
relativen Zellzahlen diente die unbehandelte Kontrolle (815±101 Zellen/mm), welche durch
den schraffierten Balken dargestellt ist. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung
(n=3). Das Bestrahlungsprotokoll ist über der Abszisse angegeben.
5.5.1
Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung
In der vorliegenden Arbeit konnte im Kontrollversuch bis zum 4. Behandlungstag eine Abnahme der mittleren Zellzahl des Gesamtepithels auf 51 % der unbehandelten Kontrolle festgestellt werden. Dies stimmt mit früheren Untersuchungen am gleichen Tiermodell überein
[Dörr und Kummermehr 1990, Dörr 1994, Dörr 1997b, Fehrmann 2010, Schreiber 2012]. In
der folgenden Behandlungspause am Wochenende kam es bis zum Tag 7 zu einer Zunahme
der Zellzahl auf 68 %. Anschließend blieben bis Tag 14, trotz fortgesetzter Bestrahlung, die
mittleren Zellzahlen für das Gesamtepithel zwischen 56 % und 74 %. Am Tag 16 wurde der
86
DISKUSSION
Ausgangswert der unbehandelten Kontrolle erreicht (Abbildung 31). Vergleichbare Studien
am selben Tiermodell zeigten ebenfalls diesen Verlauf [Dörr 1994, 1997b, Fehrmann 2010].
Die mittlere Schichtdicke des Gesamtepithels zeigte einen anderen Verlauf als die mittlere
Zellzahl. Bereits zu Beginn der Versuchsreihe kam es zu einer Zunahme der Epitheldicke,
welche zunächst an Tag 5 mit 166 % des Ausgangswertes ihr Maximum erreichte. Anschließend kam es zu einer kontinuierlichen Reduktion bis Tag 13 auf 125 %. Nach Beendigung
der fraktionierten Bestrahlung nahm die Schichtdicke des Gesamtepithels erneut bis auf
190 % des Ausgangswertes zu. Fehrmann [2010] konnte einen ähnlichen Kurvenverlauf
bestimmen. Bei der Betrachtung der einzelnen Schichten zeigt sich, dass der initiale Anstieg
der Epitheldicke hauptsächlich durch die funktionelle Schicht und der Anstieg in der zweiten
Behandlungswoche durch die Veränderungen in der Germinativ- und Keratinschicht dominiert wurde.
Die Zunahme der Epitheldicke bei reduzierten Zellzahlen in allen Epithelschichten beruht
dabei auf einer Volumenzunahme der verbliebenen Zellen. Dörr [1997b] beschreibt in der
ersten Behandlungswoche bei gleichbleibender Epitheldicke und Reduktion der Zellzahl auf
60-70 % des Ausgangswertes eine Zunahme des Zellvolumens um 130 %. Entsprechend
der Zunahme der Zellzahlen am Ende der Versuchsreihe auf Ausgangsniveau, kommt es
auch bei den Schichtdicken in den letzten Behandlungstagen nochmals zu einer deutlichen
Zunahme. Ähnliche Ergebnisse stellte Fehrmann [2010] fest.
5.5.2
Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe
Die Gabe von Lovastatin bewirkte eine Zunahme der Gesamtzellzahlen bis zum Tag 9 auf
144 % des Ausgangswertes der unbehandelten Kontrolle. Ab dem 10. Behandlungstag bis
zum Ende der Versuchsreihe zeigten sich nur geringe Schwankungen mit Werten zwischen
120-130 %. Am letzten Versuchstag, zwei Tage nach Beendigung der Lovastatinapplikation,
betrug die Gesamtzellzahl immer noch 120 % des Ausgangswertes. Der gleiche Trend ließ
sich für die Germinativ- und funktionelle Schicht feststellen (Abbildung 31). Lovastatin führte
somit zu einer Stimulation der epithelialen Proliferation.
Bei der Schichtdicke des Gesamtepithels ergab sich durch die Gabe von Lovastatin bereits
am Tag 1 eine Zunahme auf 131 % des Ausgangswertes. Danach war ein nahezu konstanter Verlauf mit Werten zwischen 120-150 % zu beobachten. Dieser Trend zeigte sich auch in
den einzelnen Schichten. Die Epitheldicke veränderte sich damit gleichsinnig zu den epithelialen Zellzahlen, ohne dass sich Hinweise auf eine Änderung des Zellvolumens ergaben.
87
DISKUSSION
5.5.3
Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe
Die Zellzahlen des Gesamtepithels bei Lovastatingabe von Tag 0-14 und fraktionierter Bestrahlung waren systematisch höher als bei alleiniger Bestrahlung. Bis zum 3. Behandlungstag kam es zu einer Abnahme der Zellzahl auf 72 %. Anschließend schwankten die bestimmten Gesamtzellzahlen zwischen 70 und 90 % des Ausgangswertes (Abbildung 31).
Die Gesamtdicke nahm bereits am 1. Behandlungstag zu und zeigte bis zum Tag 14 nur
geringe Schwankungen zwischen 130-155 %. Am Ende der Versuchsreihe ergab sich eine
nochmalige Zunahme der Dicke des Gesamtepithels auf 167 % am Tag 16. Im Vergleich zu
den Kontrollversuchen konnten jedoch keine relevanten Unterschiede in der Epitheldicke
festgestellt werden.
Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7-14 ergaben sich für die Gesamtzellzahlen zunächst relativ konstante Werte zwischen 80 und 90 %. Mit Ausnahme von
Tag 11 zeigten die Gesamtzellzahlen bei Lovastatingabe durchgängig signifikant höhere
Werte. Die Dicke des Gesamtepithels entsprach dagegen denjenigen im Kontrollversuch.
Das Vorliegen von, im Vergleich zum Kontrollversuch, höheren Zellzahlen bei gleichzeitig
identischer Epitheldicke zeigt, dass die strahleninduzierte Zunahme des Zellvolumens unter
Lovastatingabe geringer ausgeprägt ist.
Mögliche molekulare Mechanismen als Grundlage für die proliferativen Veränderungen durch
Lovastatin werden in 5.7 diskutiert.
5.6
Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von
Normalgeweben durch Statine
Williams et al. [2004] befassten sich mit Spätfolgen nach einer Lungenbestrahlung. Dabei
wurde im Tiermodell (Maus) eine Dosis von 15 Gy auf die gesamte Lunge appliziert und Lovastatin dreimal wöchentlich ab Beginn der Strahlentherapie bis 8 Wochen postradiationem
verabreicht. Es konnte eine signifikante, chemokinvermittelte Reduktion der Makrophagenund Lymphozytenpopulationen im Entzündungsgebiet sowie eine Reduktion des Kollagengehalts nachgewiesen werden. Es zeigte sich zudem im Sinne einer Tumorwirkung (siehe
5.8) ein positiver Effekt auf die Gesamtüberlebenszeit.
Gaugler et al. [2005] untersuchten in vitro die Wirkung von Statinen auf humane Endothelzellen kleinster Gefäße der Lunge, welche mit Dosen von 5 bis 10 Gy bestrahlt wurden. Dabei
konnten antiinflammatorische und antithrombotische Effekte bis 14 Tage nach Strahlenexposition nachgewiesen werden. Es zeigte sich eine Verminderung proinflammatorischer Zytokine (z.B. Interleukin-6) und Chemokine (z.B. Interleukin-8 (IL-8), Monocyte Chemoattractant
Protein-1 (MCP1)). Außerdem wurden eine Verminderung von interzellulären Adhäsionsmo88
DISKUSSION
lekülen und Transkriptionsfaktoren sowie eine verminderte Adhäsion von Leukozyten und
Thrombozyten an die bestrahlten Endothelzellen nachgewiesen.
Nübel et al. [2006] bestrahlten humane Endothelzellen der Umbilicalvenen in vitro mit 2 bis
20 Gy. Lovastatin in physiologisch relevanten Konzentrationen (1 µmol/l) hatte radioprotektive und antiapoptotische Effekte.
Bei der Entstehung intestinaler Fibrosen nach Radiotherapie spielen GTPasen der RhoFamilie eine entscheidende Rolle [Haydont et al. 2007b]. Haydont et al. [2007a, c] untersuchten die Wirkung von Statinen auf den Darm in vivo (Ratte) sowie auf explantierte Zellen des
Ileums und Colons (Mensch) in vitro. Dabei wurde eine Einzeldosis von 19 Gy appliziert.
Immunhistochemisch konnte eine Hemmung der Rho-Aktivität in den submukösen Mesenchymzellen sowie eine Verminderung von fibrinogenen Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Infolgedessen zeigte sich sowohl in den humanen
Darmzellen als auch im Tierversuch eine verminderte Konzentration von Typ-I-Kollagen und
Fibronektin.
Wang et al. [2007] führten Untersuchungen zur Beeinflussung der Strahlenreaktion des
Darmes mittels Statinen unter fraktionierter Bestrahlung am Tiermodell (Maus, Ratte) durch.
Dabei wurde über 9 Tage ein Teil des Ileums fraktioniert bestrahlt. Durch die Gabe von Statinen konnte eine signifikante Verringerung von Darmwandfibrosen und chronischen
Schleimhautulzerationen festgestellt werden. Histologisch zeigten sich eine verminderte
fibrotische Verdickung der Darmwand, eine geringere Infiltration von neutrophilen Granulozyten und eine Reduktion der Akkumulation von Kollagen Typ-I. Diese Veränderungen waren
assoziiert mit einer Modulation der Rho- und Ras-vermittelten Signalkaskaden.
Ostrau et al. [2009] konnten einen antiinflammatorischen und antifibrotischen Effekt von Lovastatin im Tiermodell (Maus), sowohl für frühe als auch chronische Effekte, zeigen. Dabei
erhielt eine Versuchsgruppe eine Ganzkörperbestrahlung mit 6 Gy und eine zweite eine fraktionierte Bestrahlung mit 2x2,5 Gy. Immunhistochemisch wurde eine gewebe- und zeitspezifische Reduktion der Aktivität von Transkriptionsfaktoren (NF-κB), der mRNA-Expression von
Zelladhäsionsmolekülen sowie proinflammatorischen und profibrotischen Genen (u.a. Kollagen Typ I und III, TNF-α, IL-6, TGF-β) festgestellt.
In einer klinischen Studie untersuchten Wedlake et al. [2012] den Einfluss von Statinen
und/oder ACE-Hemmern auf die Strahlenreaktionen von Normalgeweben während einer
Strahlentherapie im Bereich des Beckens. Dabei wurden gastrointestinale Symptome vor,
jeweils wöchentlich während und 1 Jahr nach der fraktionierten Bestrahlung mittels eines
Fragebogens (Inflammatory Bowel Disease Questionnaire – Bowel (IBDQ-B)) erfasst. Sowohl die Medikation mit Statinen allein als auch in Kombination mit ACE-Hemmern führte zu
einer signifikante Reduktion von frühen gastrointestinalen Symptomen.
89
DISKUSSION
5.7
Mögliche Wirkmechanismen von Statinen
Statine sind potente Inhibitoren der Cholesterolbiosynthese. Es sind jedoch eine Vielzahl
weiterer Effekte von Statinen bekannt, welche sich nicht allein durch ihre lipidsenkende Wirkung erklären lassen. Diese cholesterolunabhängigen oder „pleiotropen“ Effekte umfassen
unter anderem proliferationsmodifizierende, antiinflammatorische und vaskuloprotektive Veränderungen [siehe 2.9.4]. Die genauen Wirkmechanismen neben dem Cholesterolmetabolismus sind jedoch noch nicht vollständig verstanden und bedürfen weiterer Abklärung. Da
Statine jedoch die Isoprenoid- und Cholesterolbiosynthese gleichzeitig beeinflussen, ist es
schwierig zu beurteilen, welchen Anteil der jeweilige Wirkmechanismus an den auftretenden
Veränderungen hat [Quist-Paulsen 2010, Laufs und Adam 2012].
5.7.1
Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion
Eine pleiotrope Wirkung der Statine beruht auf der Hemmung der Isoprenoidsynthese und
der daraus folgenden Reduktion kleiner GTPasen. Der genaue Wirkmechanismus konnte
jedoch noch nicht vollständig geklärt werden.
Isoprenoide beeinflussen die posttranslationale Modifikation von GTPasen und damit eine
Vielzahl nachfolgender Signalkaskaden. Sie sind bei der Zellkommunikation, der Proteinbiosynthese, der Organisation des Zytoskeletts, der Zellteilung, dem Zellüberleben sowie der
Beeinflussung von Immunantwort und Entzündungsreaktionen von Bedeutung [Liao und
Laufs 2005, Greenwood und Mason 2007, Haydont et al. 2007b, Zhou und Liao 2009]. Zu
den kleinen GTPasen gehören insgesamt 5 Untereinheiten: Ras, Rho, Rab, Sar/Arf und Ran
[Aspenström et al. 2004, Ellenbroek und Collard 2007]. Rho-Gene werden in 3 Isoformen
codiert: Rho A, Rho B, Rho C. Dabei sind 3 dazugehörige Untergruppen bekannt (RhoA, Rac
und Cdc42), welche noch weitere Subtypen beinhalten [Aspenström et al. 2004, Jaffe und
Hall 2005, Liao und Laufs 2005, Ellenbroek und Collard 2007, Haydont et al. 2007b, Konstantinopoulos et al. 2007, Heasman und Ridley 2008, Zhou und Liao 2009]. Gene der RasFamilie existieren ebenfalls in 3 Isoformen (H-Ras, K-Ras, N-Ras) [Takai et al. 2001, Brunner et al. 2004, Kim et al. 2005, Konstantinopoulos et al. 2007]. Während der Cholesterolbiosynthese werden Rho-Proteine geranylgeranyliert und Ras-Proteine farnesyliert [Liao und
Laufs 2005, Greenwood und Mason 2007, Haydont et al. 2007b, Bu et al. 2011, Fritz et al.
2011].
Kleine GTPasen der Rho- und Ras-Familie werden zunächst im Zytosol synthetisiert. Anschließend erfolgt durch posttranslationale Modifikation an der funktionellen Gruppe die Verlagerung in die entsprechenden Membranen. Dort liegen sie zunächst als GDP-gebundene
inaktive Form vor. Durch die Phosporylierung wird die aktive Form gebildet, welche das extrazelluläre Signal durch Spaltung von GTP nach intrazellulär weiterleitet [Vojtek und Der
90
DISKUSSION
1998, Takai et al. 2001, Aspenström et al. 2004, Ellenbroek und Collard 2007, Haydont et al.
2007, Konstantinopoulos et al. 2007, Heasman und Ridley 2008].
Rho-GTPasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Organisation des Zytoskeletts und
beeinflussen dadurch eine Vielzahl von zellulären Vorgängen, wie Zellform/-gestalt, Zellpolarität, Migration, Zellproliferation, Zellteilung, Adhäsion und den Vesikeltransport [Jaffe und
Hall 2005, Haydont et al. 2007b, Heasman und Ridley 2008, Wang et al. 2008, Antonopoulos
et al. 2012]. Tight junctions und Desmosomen stehen mit dem Zytoskelett in Verbindung und
sind für die Interaktion der Zellen untereinander notwendig. Rho-GTPasen bestimmen dadurch die Morphologie und Funktionalität epithelialer Gewebe und besitzen eine große Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur [Ellenbroek und Collard 2007].
Rho-Proteine können außerdem auf die Genexpression und -transkription Einfluss nehmen
[Jaffe und Hall 2005, Ellenbroek und Collard 2007, Heasman und Ridley 2008]. Dies ist sowohl für den Ablauf des Zellzyklus als auch für das Zellüberleben bzw. apoptotische Vorgänge wichtig [Aspenström et al. 2004, Ellenbroek et al. 2007]. Kleine GTPasen der Ras-Familie
sind besonders für das Zellwachstum, die Differenzierung und den Beginn des Zellzyklus
durch Phosporylierung von Transkriptionsfaktoren von Bedeutung [Konstantinopoulos et al.
2007, Wang et al. 2008, Antonopoulos et al. 2012]. Durch den Einfluss kleiner GTPasen auf
die Transkription ist eine Erholung von DNA-Schäden, z.B. nach ionisierender Strahlung,
möglich. Dadurch sind sie für die intrinsische Strahlenempfindlichkeit von Zellen mit verantwortlich und spielen eine Rolle bei der Strahlenresistenz von Geweben. Eine vermehrte Ras/Rho-Signaltransduktion in Tumorzellen geht dabei mit einer erhöhten Strahlenresistenz einher [Brunner et al. 2004, Kim et al. 2005]. Membrantransportprozesse werden ebenfalls von
Rho- und Ras-Proteinen beeinflusst. Sie wirken sich dabei auf Phagozytose, Sekretion und
Antigenpräsentation aus [Takai et al. 2001, Haydont et al. 2007b, Konstantinopoulos et al.
2007].
Kleine GTPasen können ihre Aktivität auch gegenseitig regulieren. Dies ist sowohl innerhalb
der gleichen als auch zwischen verschiedenen Subfamilien möglich. Eine gegenseitige Beeinflussung von Ras- und Rho-Proteinen spielt bei verschiedenen biologischen Prozessen
wie der Zelltranskription, der Zellmigration und dem epithelial-mesenchymalen Übergang
eine Rolle [Takai et al. 2001, Ellenbroek und Collard 2007].
Durch die Hemmung der HMG-CoA-Reduktase führt Lovastatin zu einer verminderten Produktion von Mevalonat und dessen Folgeprodukten, wodurch eine Vielzahl von Zellfunktionen beeinflusst werden [siehe 2.9.1 und Abbildung 5].
91
DISKUSSION
5.7.2
Beeinflussung der Entzündungsreaktion
Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist ein komplexer Prozess unter Beteiligung verschiedener Zellpopulationen, u.a. sind Makrophagen für die ablaufende Entzündungsreaktion
von Bedeutung. Makrophagen können dabei sowohl direkt durch die Radiotherapie als auch
indirekt durch proinflammatorische Zytokine aktiviert werden [Dörr et al. 2008, Dörr et al.
2009b]. Außerdem kommt es durch die Strahlentherapie zur Generierung reaktiver Sauerstoffspezies, welche direkt oder indirekt zu Schäden an der DNA führen (siehe 2.5.1). Die
Folge ist eine Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren und Beeinflussung von Signalkaskaden [Dörr und Herskind 2012]. Eine entscheidende Rolle spielen Monozyten, da sie
Entzündungsprozesse durch die Sekretion verschiedener Chemo- und Zytokine unterhalten.
Es konnten bis heute eine Vielzahl dieser Entzündungsmediatoren identifiziert werden [Montecucco et al. 2009]. Ein Schlüsselfaktor ist dabei NF-κB (nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B-cells), welches die Transkription verschiedener proinflammatorischer
Zyto- und Chemokine, wie IL-6 (Interleukin-6), IL-8, IL-1β, TNF-α (Tumornekrose-Faktor α)
oder MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1), fördert [Diomede et al. 2001, Kiener et al.
2001, Wiesbauer et al. 2002, Greenwood und Mason 2007, Wang et al. 2008, Montecucco
und Mach 2009, Kim et al. 2009, Massonnet et al. 2009, Iwata et al. 2012]. NF-κB unterliegt
einer Rho- und Ras-vermittelten posttranslationalen Modifikation [Diomede et al. 2001]. Dabei konnte gezeigt werden, dass Statine sowohl direkt auf die Zytokinfreisetzung aus den
Monozyten als auch indirekt auf NF-κB durch Beeinflussung der Rho- und Ras-GTPasen
wirken können [Diomede et al. 2001, Kim et al. 2009, Quist-Paulsen 2010, Antonopoulos et
al. 2012, Iwata et al. 2012, Kong und Zhu 2012]. Dies wurde jedoch nur bei der Anwendung
von lipophilen Statinen, darunter Lovastatin, festgestellt. Als Ursache wird die bessere passive Diffusion in Zellen und Gewebe angenommen [Kiener et al. 2001]. Veränderungen in NF-
κB werden auch im Rahmen der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut (Maus) und anderer
Epithelien nachgewiesen [Bergmann 2012]
Chemokine (z.B. CCL2, CCL 3, CCL 4) induzieren die Rekrutierung weiterer Entzündungszellen aus dem Blut ins Gewebe und reduzieren die Expression ihrer Rezeptoren auf der
Monozytenmembran. Infolge dessen kommt es zur Leukozytenrekrutierung und differenzierung im entzündeten Gewebe [Montecucco et al. 2009]. Statine vermindern die
CRP-induzierte Erhöhung von Chemokinen [Greenwood und Mason 2007, Montecucco und
Mach 2009, Montecucco et al. 2009, Quist-Paulsen 2010]. Die Migration von Entzündungszellen kann auch auf Ebene der Interaktion zwischen Monozyten und Endothelzellen beeinflusst werden. Statine reduzieren dabei die Expression von Adhäsionsmolekülen wie ICAM
(Intercellular Adhesion Molecule) und LFA (Lymphocyte Function-associated Antigen)
[Greenwood und Mason 2007, Montecucco und Mach 2009, Montecucco et al. 2009, Antonopoulos et al. 2012]. Auch eine vermehrte Expression von ICAM-1 wurde im Rahmen epi92
DISKUSSION
thelialer Strahlenreaktionen nachgewiesen [Jaal et al. 2004, Jaal und Dörr 2005]. Ein weiterer Ansatzpunkt von Statinen zur Beeinflussung der Entzündungsreaktion ist die Inhibierung
von proteolytischen Enzymen in Makrophagen, den Matrix-Metalloproteinasen (z.B. MMP-9).
Dies geschieht wahrscheinlich durch die Blockierung der Prenylation von Ras-GTPasen
[Kiener et al. 2001, Wiesbauer et al. 2002, Kim et al. 2009, Quist-Paulsen 2010, Antonopoulos et al. 2012, Kong und Zhu 2012].
5.7.3
Beeinflussung der GefäßreaktionBereits nach der Applikation der ersten frak-
tionierten Dosen zeigte sich in der vorliegenden Arbeit in dem bestrahlten Areal der Mundschleimhaut eine Gefäßreaktion. Diese ist durch eine vermehrte Gefäßzeichnung, Vasodilatation, erhöhte Gefäßpermeabilität und Ödembildung der Gefäßwände charakterisiert. Als
Folge kommt es in dem umliegenden Gewebe zu einer Minderversorgung mit Sauerstoff und
Nährstoffes, bis hin zur Atrophie [Dörr 2007, Dörr 2009b]. Diese Gefäßreaktion wurde von
Jaal et al. [2010] näher charakterisiert. Statine begünstigen die endotheliale Homöostase
durch verschiedene Eigenschaften. Die Hemmung der Endothelzellaktivierung führt zu einer
verminderten Adhäsion von Entzündungsmediatoren, wie ICAM-1, IL-6, MCP-1 oder IL-8
[Holler et al. 2009]. Statine wirken präventiv auf die Leukozytenadhäsion an das Endothel.
Die Migration von Entzündungszellen in das Gewebe wird dadurch inhibiert [Holler et al.
2009].
Ein weiterer wichtiger Ansatzpunkt ist die endotheliale Stickoxid-Synthetase (eNOS). Durch
die rho-vermittelte Hochregulation der eNOS-Genexpression resultiert eine erhöhte Bioverfügbarkeit von Stickoxid. Dies führt zur Vasodilatation, Hemmung der Leukozytenadhäsion
und Plättchenaggregation sowie verminderten Proliferation glatter Muskelzellen [Laufs et al.
2000, Wassman et al. 2001, Wiesbauer et al. 2002, Greenwood und Mason 2007, Holler et
al. 2009, Antonopoulos et al. 2012].
Reactive oxygen species (ROS) bedingen durch Gefäßzellwachstum, apoptotische Prozesse
und zytotoxische Effekte die endotheliale Dysfunktion. Außerdem stören freie Radikale die
Bioverfügbarkeit von NO [Holler et al. 2009]. Durch die statininduzierte Hemmung der Expression des Angiotensin1-Rezeptors und der NAD(P)H-Oxidase werden weniger ROS gebildet und somit die endotheliale Funktion verbessert [Wassman et al. 2001, Antonopoulos et
al. 2012].
93
DISKUSSION
5.8
Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe
Um Lovastatin zur Prophylaxe und Therapie der Mucositis enoralis klinisch einsetzen zu können, muss eine gleichzeitige Schonung des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Eine
Vielzahl von präklinischen Studien evaluierte die Wirkung von Statinen auf Tumorgewebe.
Dabei wurde u.a. der Einfluss von Statinen auf Tumorzellen von Schilddrüse, Lunge,
Ösophagus, Pankreas, Kolon, Mamma, Ovarien und Prostata sowie die Wirkung bei akuter
myeloischer Leukämie (AML), Neuroblastom und Melanom untersucht. Es konnte gezeigt
werden, dass Statine das Wachstum von Tumorzellen sowohl allein als auch in Kombination
mit Radio- oder Chemotherapie hemmen können [Lewis et al. 2005 Shellman et al. 2005,
Campbell et al. 2006, Sivaprasad et al. 2006, Gbelcova et al. 2008, Glynn et al. 2008, Maksimova et al. 2008, Ogunwobi und Beales 2008, Arnold et al. 2010, Klawitter et al. 2010,
Martirosyan et al. 2010, Park et al. 2010, Wang et al. 2010, Kodach et al. 2011, Sanli et al.
2011, Yang et al. 2011, Zhong et al. 2011]. Osmak [2012] gibt eine Übersicht zu in-vitroStudien der letzten Jahre bezüglich des Einflusses von Statinen auf Tumorzellen. Statine
können die Wirkung von Chemotherapeutika verstärken und auch deren Nebenwirkungen
vermindern.
Rho- und Ras-vermittelte Signalkaskaden spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation einer Vielzahl von Zellfunktionen, wie Membranintegrität, Zelladhäsion, Angiogenese, Zellzyklusablauf oder Zellüberleben, welche für die Entstehung und das Wachstum von Tumorzellen
von Bedeutung sind [Oskam 2012]. In einem Drittel aller Tumoren werden Mutationen der
Ras- und Rho-Proteine nachgewiesen [Takai et al. 2001, Brunner et al. 2004, Ellenbroek und
Collard 2007, Konstantinopoulos et al. 2007, Wang et al. 2008]. Es konnte gezeigt werden,
dass Statine das Tumorwachstum durch Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest hemmen können [Mo und Elson 1999, Wächtershäuser et al. 2001, Shellman et al. 2005, Gabrys
et al. 2008, Maksimova et al. 2008, Arnold et al. 2010, Martirosyan et al. 2010, Sanli et al.
2011]. Außerdem wird unter dem Einfluss von Statinen die Gefäßneubildung und Metastasierung vermindert sowie die Differenzierung von Tumorzellen begünstigt [Vincent et al. 2002,
Wang et al. 2003, Glynn et al. 2008, Arnold et al. 2010, Zhong et al. 2011]. Durch die Hemmung von aktivierten Ras konnte eine Strahlensensibilisierung der Tumorzellen festgestellt
werden [Gupta et al. 2001, Brunner et al. 2004, Kim et al. 2005]. Eine Tumorprotektion durch
die Gabe von Statinen während einer Radio(chemo)therapie erscheint somit nahezu ausgeschlossen.
94
AUSBLICK
6 Ausblick
Die radiogene Mucositis enoralis ist die wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung
einer Strahlentherapie fortgeschrittener Kopf-Hals-Tumoren, welche zu einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes und der Lebensqualität der Patienten führt [Dörr et al.
2010, Oskam et al. 2010, Hannemann 2011]. Sie ist damit die häufigste Ursache für Therapieunterbrechungen mit der Folge von reduzierten Tumorheilungschancen. Außerdem erhöht
sich das Risiko für die Entstehung konsekutiver Spätfolgen [Dörr et al. 2008, 2010]. Die orale
Mukositis hat somit signifikante klinische und sozioökonomische Konsequenzen. Dennoch
konnte bisher, trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Untersuchungen, keine spezifische Strategie zur Prophylaxe und Therapie der Mucositis enoralis etabliert werden [Dörr
2009c, 2010, Lalla und Keefe 2011, Peterson 2011].
Ein möglicher Ansatzpunkt zur Beeinflussung der Strahlenreaktion ist die Applikation von 3Hydroxy-3-methylglutaryl-CoenzymA Reduktase-Inhibitoren. Diese als Statine bezeichneten
Medikamente beeinflussen durch die Hemmung der Cholesterolbiosynthese den Fettstoffwechsel. Die Behandlung mit Statinen führt jedoch zu einer Vielzahl weiterer Effekte, welche
zunächst keinen Zusammenhang mit der beabsichtigten Wirkung haben. Es konnten proliferationssteigernde, antiinflammatorische, proapoptotische sowie vaskuloprotektive Eigenschaften nachgewiesen werden [Liao und Laufs 2005, Greenwood und Mason 2007, Fritz et
al. 2011].
In der vorliegenden Arbeit wurde der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Lovastatin verwendet.
Es konnte in allen Behandlungsprotokollen mit fraktionierter Bestrahlung ein mukoprotektiver
Effekt beobachtet werden. Lovastatin beeinflusst damit signifikant die Strahlentoleranz und
die Zellproduktion der murinen Mundschleimhaut. Dabei scheinen RhoA- und Ras vermittelte
Signaltransduktionswege eine Rolle zu spielen. Der detaillierte Wirkmechanismus ist jedoch
unklar und bedarf weiterer Abklärung. Zudem sollte das Behandlungsprotokoll in weiterführenden präklinischen Untersuchungen optimiert werden. Letztendlich muß der mukoprotektive Effekt der Statine in klinischen Studien geprüft werden.
95
ZUSAMMENFASSUNG
7 Zusammenfassung
Stefanie Klinkicht-Bormann
Beeinflussung der Strahlenreaktion der Mundschleimhaut durch Lovastatin: tierexperimentelle Untersuchungen (Maus)
Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie der Medizinischen Fakultät Carl
Gustav Carus, Universität Dresden
Eingereicht im Februar 2013
133 Seiten, 31 Abbildungen, 25 Tabellen, 292 Literaturangaben, Anhang
Schlüsselwörter: fraktionierte Bestrahlung, orale Mukositis, Lovastatin
Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung der Radio(chemo)therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Sie führt zu einer starken
Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes sowie der Lebensqualität der Patienten. Nicht
selten muss die Strahlentherapie unterbrochen werden, wodurch sich die Tumorheilungschance deutlich reduziert. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze konnte
bisher kein allgemein gültiges Konzept zur Prophylaxe und Therapie der radiogenen Mucositis enoralis in der Klinik etabliert werden.
Die Pathogenese der oralen Mukositis ist komplex. Sie wird durch eine Vielzahl von Faktoren
beeinflusst, darunter verschiedene Signalkaskaden, wie die Rho- und Ras-vermittelte
Signaltransduktion. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit untersuchte deshalb den Einfluss des 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Hemmers Lovastatin, welcher
unter anderem die genannten Signalkaskaden modifiziert, auf die Reaktion der Mundschleimhaut auf fraktionierte Bestrahlung. Ergänzende histologische Untersuchungen sollen
weitere Anhaltspunkte auf den Wirkmechanismus von Lovastatin geben.
Alle Untersuchungen erfolgten am etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus (Inzucht-Stamm C3H/Neu). Die Bestrahlung wurde als fraktionierte, perkuta-
ne Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) mit wöchentlich 5x3 Gy über eine (Tag
0-4) bzw. zwei Wochen (Tag 0-4 und 7-11) durchgeführt. Das Bestrahlungsfeld war dabei so
definiert, dass die gesamte Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle, und
damit die gesamte Zunge, eingeschlossen wurden. Daraus resultierte zunächst nur ein subklinischer Effekt an der Mundschleimhaut. Durch die lokale Testbestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3x3 mm² großen Feldes auf der Zungenunterseite wurde eine klinische Reaktion indiziert. Die lokale Bestrahlung erfolgte mit jeweils 5 gestaffelten Dosisgruppen (jeweils 10 Tiere zur Generierung vollständiger Dosis-Effekt-Kurven (Logit-Analyse).
Als quantaler Endpunkt diente das Auftreten einer Ulzeration, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC-Klasifikation. Die Latenzzeit zwischen lokaler Be96
ZUSAMMENFASSUNG
strahlung und Diagnosestellung und die Dauer der Ulzeration bis zur Reepithelialisierung
beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Der Beschreibung des Dosiseffektes
dienten die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration innerhalb des
Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %Vertrauensbereiche.
Für histologische Untersuchungen wurden an 16 aufeinander folgenden Tagen jeweils 3 Tiere einer Versuchsgruppe getötet. Als Kontrolle dienten 3 unbehandelte Tiere. Die Zungen
wurden entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte angefertigt. Anschließend erfolgte die lichtmikroskopische Auswertung von mindestens 2 mm Epithellänge pro
Präparat, wobei die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Funktions- und Germinativschicht
sowie die Dicken der Germinativ-, Funktions- und Keratinschicht bestimmt wurden.
Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in einer Dosierung von 16 mg/kg, entsprechend
der empfohlenen Dosis beim Menschen, appliziert. Die Gabe des in destillierten Wasser
suspendierten Medikamentes, erfolgte täglich per os über eine Schlundsonde. Bei fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche erhielten die Versuchstiere Lovastatin von Tag -3 (bezogen auf den Tag der ersten Fraktion) bis Tag +7 oder bis zur Ausheilung der Ulzerationen.
Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen wurden 4 Behandlungszeiträume von Lovastatin getestet: Tag -3 bis +4, Tag +7 bis +14, Tag 0 bis +14 oder Tag 0 bis zur Heilung der Ulzeration. Für die histologischen Untersuchungen erfolgte eine fraktionierte Bestrahlung mit
10x3 Gy über 2 Wochen. An den Tagen 0-14 bzw. 7-14 wurde Lovastatin verabreicht. Als
Kontrolle dienten die Versuchsgruppen, welche eine alleinige Bestrahlung bzw. Lovastatingabe erhielten.
Zur Testung der Verträglichkeit des Medikamentes erhielten zunächst 5 Versuchstiere einmal täglich 16 mg/kg Lovastatin über einen Zeitraum von 25 Tagen. Dabei konnten keine
wesentlichen unerwünschten Arzneimittelwirkungen beobachtet werden.
Die alleinige Einzeitbestrahlung ergab einen ED50-Wert von 11,5±1,0 Gy mit einer signifikanten Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz (p=0,0007). Die Latenzzeit war 12,2±0,5 Tage, die
Ulkusdauer 3,1±0,6 Tage.
Der ED50-Wert für die alleinige fraktionierte Bestrahlung über 1 Woche war 8,6±1,4 Gy
(p=0,0002). Es wurden für die Latenzzeit 9,7±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 5,4±1,1 Tage
bestimmt. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung
über eine Woche konnte eine signifikante Erhöhung der ED50-Werte gegenüber der alleinigen Fraktionierung festgestellt werden. Bei Medikamentengabe von Tag -3 bis +7 war die
ED50 10,1±0,1 Gy, von Tag -3 bis zur Ausheilung 11,6±0,7 Gy. Die mittleren Latenzzeiten
waren gegenüber der Kontrolle nicht signifikant verändert, es konnte jedoch in beiden Versuchsarmen eine Verkürzung der mittleren Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden.
97
ZUSAMMENFASSUNG
Für die Testbestrahlung nach alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ergab sich
ein ED50-Wert von 7,9±1,3 Gy (p=0,0002). Für die Latenzzeit wurden 11,8±0,8 Tage und für
die Ulkusdauer 4,5±1,0 Tage ermittelt. Die Gabe von Lovastatin führte in allen Behandlungsprotokollen zu einer signifikanten Erhöhung der ED50-Werte: Tag -3 bis +4: 12,7±0,9 Gy; Tag
+7 bis +14: 11,6±0,9 Gy; Tag 0 bis 14: 14,3±1,2 Gy, Tag 0 bis Ausheilung der Ulzeration:
12,9±1,3 Gy. Ebenso wie bei fraktionierter Bestrahlung über eine Woche, konnte eine Verkürzung der Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Außerdem wurde eine Verkürzung der mittleren Latenzzeit von 2,4 Tagen (Medikamentengabe von Tag -3 bis +4) bis
4,1 Tagen (Tag 0 bis zur Ausheilung) gefunden.
Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen konnte für den gesamten Behandlungszeitraum eine gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduzierte Gesamtzellzahl (Minimalwert
Tag 4: 51%) festgestellt werden. Erst am Tag 16 wurde der Ausgangswert wieder erreicht.
Demgegenüber ergab die alleinige Applikation von Lovastatin von Tag 0 bis 14 im Vergleich
zur unbehandelten Kontrolle signifikant höhere Gesamtzellzahlen (Maximalwert Tag 9: 144%
des Ausgangswertes). Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnten gegenüber
der Kontrolle reduzierte, jedoch höhere Gesamtzellzahlen als bei alleiniger Fraktionierung
festgestellt werden. Die Gesamtschichtdicken aller 4 Behandlungsprotokolle ergaben ähnliche Verläufe ohne signifikante Unterschiede.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Applikation von Lovastatin während
fraktionierter Bestrahlung einen mukoprotektiven Effekt aufweist. In allen Behandlungsprotokollen war eine signifikante Erhöhung der isoeffektiven Dosen festgestellt werden. Dabei
scheint der mukoprotektive Effekt umso größer zu sein, je länger die Behandlung mit Lovastatin andauerte. Lovastatin führte zu einer eindeutigen Akumulation der epithelialen
Zellproliferation. Die exakten Wirkmechanismen der Mukoprotektion durch Statine sind jedoch bisher nicht geklärt und bedürfen weitergehender Untersuchungen.
98
SUMMARY
8 Summary
Stefanie Klinkicht-Bormann
Modification of the radiation response of oral mucosa by Lovastatin: preclinical studies in
mice
Department for Radiotherapy and Radiation Oncology of the Faculty of Medicine Carl Gustav
Carus at the University of Technology of Dresden
Submitted February 2013
133 pages, 31 figures, 25 tables, 292 references, appendices
Key words: fractionated irradiation, oral mucositis, Lovastatin
The radiation response of oral mucosa is a frequent and dose-limiting side effect of radio(chemo)therapy of tumours in the head-and-neck region. Oral mucositis substantially impacts on the general condition and the quality of life of the patients. It necessitates treatment
interruptions in a number of patients, with the consequence of a marked reduction of the tumour cure probability. Despite various experimental and clinical approaches, no general
strategy for the prophylaxis or management of radiation-induced oral mucositis has so far
been established in clinical routine.
The pathogenesis of oral mucositis is complex and is influenced by a variety of factors, including miscellaneous signalling cascades, such as rho- and ras-dependent signal transduction. The present preclinical study in experimental animals was hence initiated to characterize the effect of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymeA-reductase inhibitor Lovastatin,
which modulates the latter signalling chains, on the response of oral mucosa to fractionated
irradiation. Accompanying histological studies were performed to illuminate the mechanism
of action of Lovastatin.
All investigations were performed in the mucosa of the lower surface of mouse tongue
(C3H/Neu inbred strain) as an established animal model. Irradiation was administered as
fractionated, percutaneous treatment of the entire snout of the animals (200 kV X-rays). The
protocols comprised the application of 5x3 Gy/week over 1 week (days 0-4) or 2 weeks (days
0-4, 7-11). The treatment volume encompassed the snout of the animals to a plane from the
eyes to the throat, thus including the entire tongue. With snout irradiation, only a subclinical
mucosal effect was induced. Subsequent local test irradiation (25 kV X-rays) yielded a clinically manifest reaction within a 3x3 mm2 test area at the lower tongue surface. Local irradiation was performed in 5 graded dose groups with 10 animals each, in order to generate complete dose-effect curves (logit analyses). For this, mucosal ulceration, corresponding to confluent mucositis grade 3 according to the RTOG/EORTC classification, was analyzed as the
quantal endpoint. The latent time between test irradiation and first ulcer diagnosis and the
99
SUMMARY
ulcer duration until re-epithelialisation served as parameters of the time course of the radiation response. The dose effect was described by ED50 values (dose at which an ulceration
within the test area is expected in 50 % of the animals) and their standard deviation σ or their
95 % confidence intervals.
For histological studies, 3 mice of each experimental group (see below) were sacrificed per
day over a period of 16 days. Three untreated mice served as controls. The tongues were
excised and the sections stained with haematoxylin and eosin. At least 2 mm epithelial length
were examined by standard light microscopy, and the number of nucleated cells in the functional and germinal layers as well as the thickness of the individual epithelial layers was
quantified.
Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching, Germany) was administered at a dose of 16 mg/kg,
according to the recommended dose in patients. The drug was suspended in A. dest. and
applied daily per os via gavage. With fractionated irradiation over 1 week, Lovastatin was
administered from day -3 (before the first fraction) until day 7 or until clinical healing of all
reactions. Fractionated irradiation over 2 weeks was combined with Lovastatin in 4 administration intervals: day -3 to +4, day +7 to +11, day 0 to +14 or day 0 until clinical healing of all
ulcerations. For the histological investigations, irradiation was applied with 10x3 Gy over 2
weeks. Lovastatin was administered on days 0-14 or 7-14, respectively. Groups that received
either radiation alone or Lovastatin alone in similar protocols served as controls.
To test for tolerability of the drug, 5 animals were treated daily with 16 mg/kg Lovastatin over
25 days. No adverse events were observed.
Single dose irradiation alone resulted in an ED50 value of 11.5±1.0 Gy, with a significant
dose dependence of ulcer frequency (p=0.0007). The latent time was 12.2±0.5 d, ulcer duration 3.1±0.6 d.
The ED50 value for test irradiation after fractionated irradiation over 1 week was 8.6±1.4 Gy
(p=0.0002). Latent time was 9.7±0.8 d, ulcer duration 5.4±1.1d. In both protocols with Lovastatin, a significant increase of the ED50 values was observed, with 10.1±0.1 Gy and 11.6±0.7
Gy for drug administration from day -3 to +7 and day -3 to ulcer healing, respectively. The
mean latencies were not significantly different from the control. However, mean ulcer duration was shortened by ca. 2 d.
For test irradiation after 2 weeks of fractionation alone, the ED50 was 7.9±1.3 Gy (p=0.0002).
Mean latency was 11.8±0.8 d, mean ulcer duration 4.5±1.0 d. Lovastatin administration
yielded a significant increase in ED50 values in all experimental protocols, with 12.7±0.9 Gy
for day -3 to +4, 11.6±0.9 Gy for day +7 to +14, 14.3±1.2 Gy for day 0 to +14 and 12.9±1.3
Gy for day 0 until healing. Similar to one week of fractionation, a shortening of ulcer duration
by ca. 2 d was found. Mean latencies were reduced by 2.4 days (drug administration day -3
to +4) to 4.1 days (day 0 to healing).
100
SUMMARY
Epithelial cell numbers were clearly reduced by fractionated irradiation (minimum day 4: 51
% of the control). Original values were not observed before day 16. In contrast, administration of Lovastatin alone significantly increased the total cell numbers in the epithelium
(maximum day 9: 144 % of control). The combination of irradiation and Lovastatin resulted in
total cell numbers that were reduced compared to the control, but markedly higher than with
irradiation alone. No differences were found for epithelial thickness in comparison to irradiation alone.
In conclusion, the administration of Lovastatin during fractionated irradiation showed a substantial mucoprotective effect. Isoeffective doses were significantly increased in all Lovastatin
treatment arms. The longer the interval of drug administration was, the more pronounced
was the effect. Lovastatin yielded a clear stimulation of epithelial cell proliferation. The detailed mechanisms of action of Lovastatin, however, remain unclear and require further investigation.
101
THESEN
9 Thesen
(1)
Die Mucositis enoralis ist die häufigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung
einer Radiotherapie von Kopf-Hals-Tumoren.
(2)
Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist hochgradig schmerzhaft und führt
zu einer massiven Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes und der Lebensqualität der Patienten.Fl
(3)
Dadurch ist die orale Mukositis die häufigste Ursache für Therapieunterbrechungen, welche die Tumorheilungschancen reduzieren. Außerdem werden Sekundärinfektionen und die Ausbildung konsekutiver Späteffekte begünstigt.
(4)
Für die Prophylaxe und Therapie der enoralen Mucositis existieren eine Vielzahl
an experimentellen und klinischen Behandlungsansätzen, wobei bisher kein spezifisches und in der klinischen Routine etabliertes Behandlungskonzept existiert.
(5)
Die Zungenunterseite der Maus ist ein etabliertes und anerkanntes Modell für
strahlenbiologische Untersuchungen zur radiogenen Mucositis enoralis. Als quantitativer Endpunkt für die Dosis-Effekt-Kurven wurde die Schleimhautulzeration
des Zungenepithels analysiert.
(6)
Eine qualitative Übertragung der tierexperimentellen Ergebnisse auf den Menschen ist möglich, da die Strahlenreaktion und die strahlenbiologischen Parameter der murinen und humanen Mundschleimhaut vergleichbar sind.
(7)
Die Pathogenese der radiogenen oralen Mukositis ist ein komplexes Geschehen.
Die Inaktivierung proliferationsfähiger Stammzellen im Stratum germinativum des
Epithels resultiert in einer eingeschränkten Zellneubildung. Infolge des fortbestehenden oberflächlichen Zellverlusts kommt es zu einer progressiven Zellverarmung (Hypoplasie), welche bis zum vollständigen Verlust des Epithels (Ulzeration) führen kann.
(8)
Verschiedene inter- und intrazelluläre Signalkaskaden und Entzündungsprozesse
sowie die Reaktion der Gefässe sind weitere wesentliche Komponenten der
Strahlenreaktion der Mundschleimhaut.
(9)
Der 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Inhibitor Lovastatin ist ein effektives
Medikament zur Behandlung von Fettstoffwechselstörungen, welches sehr gut
verträglich ist. Zusätzlich sind noch eine Vielzahl cholesterolunabhängiger (pleiotroper) Wirkungen beschrieben.
(10)
Lovastatin modifiziert Rho- und Ras-vermittelte Signaltransduktionswege, beeinflusst die Transkription proinflammatorischer Zyto-/Chemokine und begünstigt die
endotheliale Homöostase.
102
THESEN
(11)
Bei täglich fraktionierter Bestrahlung (5x3 Gy/Woche kann durch die Applikation
von 16 mg/kg KG Lovastatin ein mukoprotektiver Effekt beobachtet werden. Dabei spielt die Dauer der Applikation für die Ausprägung der Schleimhautreaktion
eine untergeordnete Rolle. Dennoch nahm der Effekt mit der Dauer der Behandlung mit Lovastatin zu.
(12)
Die Ergebnisse deuten auf eine zeitliche Vorverlagerung und Stimulation epithelialer Regenerationsprozesse (Repopulierung) hin.
(13)
Lovastatin hat zudem eine proliferationsstimulierende Wirkung auf epitheliale Zellen.
(14)
Es sind weiterführende Untersuchungen notwendig, um die genauen Mechanismen, welche für den mukoprotektiven Effekt verantwortlich sind, zu identifizieren.
(15)
Eine tumorprotektive Wirkung der Statine konnte bisher nicht gezeigt werden.
(16)
Die radioprotektive Wirkung von Lovastatin auf die radiogene Mucositis enoralis
sollte in klinischen Studien überprüft werden.
103
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
10 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Proliferative Struktur von Umsatzgeweben ......................................................16
Abbildung 2: Klinisches Bild einer konfluenten, pseudomembranösen Mukositis Grad 3
nach RTOG/EORTC ........................................................................................21
Abbildung 3: Histologischer Aufbau des mehrschichtigen, verhornenden Plattenepithels
der Zungenunterseite der Maus (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) ........................32
Abbildung 4: Strukturformel von Lovastatin ..........................................................................40
Abbildung 5: Vereinfachte Darstellung der Cholesterinbiosynthese ......................................41
Abbildung 6: Röntgenanlage Isovolt 320/13 .........................................................................47
Abbildung 7: Weichstrahl-Röntgenanlage DARPAC 150-MC zur lokalen Bestrahlung
der Zungenunterseite .......................................................................................48
Abbildung 8: Kunststoffplatte zur Positionierung der Versuchstiere für die
Schnauzenbestrahlung.....................................................................................50
Abbildung 9: Aluminiumblock mit Bestrahlungsfenster und entsprechender
Positionierung der Zunge .................................................................................51
Abbildung 10: Schlundsonde mit Einwegspritze und Verabreichung des Medikamentes
Lovastatin mit Hilfe dieser Sonde ..................................................................53
Abbildung 11: Relatives Durchschnittsgewicht von 5 Versuchstieren bei alleiniger Gabe
von 16 mg/kg Lovastatin an 25 aufeinander folgenden Tagen.......................57
Abbildung 12: Dosis-Effekt-Kurve der lokalen Einzeitbestrahlung.........................................58
Abbildung 13: Radiogene Ulzeration der Zungenunterseite..................................................59
Abbildung 14: Ulkusprävalenz nach lokaler Einzeitbestrahlung mit gestaffelten Dosen. .......59
Abbildung 15: Dosiseffektkurven bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung im
Vergleich zur Einzeitbestrahlung. ..................................................................61
Abbildung 16: Vergleich der Test-Dosiseffektkurven bei Einzeitbestrahlung,
einwöchiger und zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung..............................62
Abbildung 17: ED50-Werte bei einwöchiger frakt. Bestrahlung ohne Lovastatingabe
sowie bei Lovastatingabe von Tag -3 bis +7 und Tag -3 bis zur
Ausheilung aller Ulzerationen........................................................................64
Abbildung 18: Ulkusprävalenz der Versuche E sowie einwöchiger fraktionierter
Bestrahlung mit und ohne Lovastatingabe.....................................................65
Abbildung 19: ED50-Werte bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ohne und mit
Lovastatinbehandlung ...................................................................................67
Abbildung 20: Ulkusprävalenz des Versuches E sowie der Versuche F2/X mit
zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung mit und ohne Lovastatingabe ..........68
Abbildung 21: Histologische Veränderungen bei frakt. Bestrahlung (HE-Färbung) ...............69
Abbildung 22: Relative Zellzahlen unter fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2
Wochen ohne Gabe von Lovastatin (Versuch H1). ........................................70
Abbildung 23: Relative Schichtdicke bei fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2
Wochen ohne Gabe von Lovastatin (Versuch H1). ........................................72
Abbildung 24: Relative Zellzahlen bei Lovastatingabe von Tag 0-14 ohne Bestrahlung
(Versuch H2). ................................................................................................73
104
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 25: Relative Schichtdicke bei Lovastatingabe von Tag 0-14 ohne
Bestrahlung (Versuch H2). ............................................................................74
Abbildung 26: Relative Zellzahlen des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 0 bis 14. .............75
Abbildung 27: Relative Dicken des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 0 bis 14. .............76
Abbildung 28: Relative Zellzahlen des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung mit
10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 7 bis 14. .............77
Abbildung 29: Relative Schichtdicke des Gesamtepithels bei fraktionierter Bestrahlung
mit 10x3 Gy/2 Wochen ohne und mit Lovastatingabe von Tag 7 bis 14.........78
Abbildung 30: Übersicht der ED50-Werte aller Einzelversuche. ...........................................84
Abbildung 31: Mittlere und relative Zellzahlen des Gesamtepithels für alle 4
Behandlungsprotokolle..................................................................................86
105
TABELLENVERZEICHNIS
11 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Einteilung der Kopf-Hals-Tumoren nach der TNM-Klassifikation ..........................10
Tabelle 2: Nomenklatur typischer Fraktionierungsprotokolle.................................................12
Tabelle 3: RTOG/EORTC-Klassifikation für die Mucositis enoralis .......................................22
Tabelle 4: Modifizierte RTOG/EORTC-Klassifikation der oralen Mukositis............................23
Tabelle 5: Klassifizierungssysteme für die orale Mukositis ...................................................23
Tabelle 6: Klassifikation der radiogenen Mukositis enoralis nach Dische..............................24
Tabelle 7:OMAS-Klassifikation (Oral Assessment Scale) .....................................................25
Tabelle 8: Nebenwirkungen von Lovastatin ..........................................................................43
Tabelle 9: Klinische Parameter zur Beurteilung der Strahlenreaktion ...................................52
Tabelle 10: Versuchsanordnung...........................................................................................52
Tabelle 11: Versuchsübersicht der histologischen Untersuchungen .....................................55
Tabelle 12: Arbeitsschritte der Hämatoxylin-Eosin-Färbung .................................................56
Tabelle 13: Ulkusinzidenz und zeitlicher Verlauf der radiogenen Ulzerationen nach
Einzeitbestrahlung mit gestaffelten Testdosen zwischen 6 und 15 Gy.................60
Tabelle 14: Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter
Bestrahlung.........................................................................................................61
Tabelle 15: Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion bei zweiwöchiger fraktionierter
Bestrahlung.........................................................................................................63
Tabelle 16: Übersicht über die Ergebnisse bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung
mit und ohne Lovastatingabe. .............................................................................63
Tabelle 17: Übersicht über die Ergebnisse bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung
mit und ohne Lovastatingabe ..............................................................................66
Tabelle 18: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei fraktionierter
Bestrahlung mit 10x3 Gy ohne Lovastatingabe .................................................127
Tabelle 19: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei fraktionierter
Bestrahlung mit 10x3 Gy ohne Lovastatingabe .................................................127
Tabelle 20: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 0-14 ohne Bestrahlung ........................................................................128
Tabelle 21: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei
Lovastatingabe von Tag 0-14 ohne Bestrahlung ...............................................128
Tabelle 22: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 0 bis 14 und fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen............129
Tabelle 23: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei
Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 und Fraktionierung mit 10x3 Gy/2 Wochen ...129
Tabelle 24: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 7 bis 14 und fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen............130
Tabelle 25: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei
Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 und Fraktionierung mit 10x3 Gy/2 Wochen ...130
106
LITERATURVERZEICHNIS
12 Literaturverzeichnis
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126
ANHANG
13 Anhang
Tabelle 18: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy ohne Lovastatingabe
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Zellzahl/mm ± SD
GS
FS
GE
602±81
213±23 815±101
368±13
133±13
502±25
342±13
153±6
495±13
303±28
145±15
448±42
293±10
125±0
418±10
332±8
143±8
475±13
368±19
137±3
505±22
395±22
160±18
555±23
350±18
163±20
513±34
318±19
138±8
457±23
345±51
160±13
505±63
460±110 142±25 602±110
393±33
150±13
543±45
368±48
135±13
503±60
447±12
158±8
605±15
520±84
173±23 693±105
617±86
223±38 840±123
Zellzahl ± SD (%)
GS
FS
GE
100±13
100±11
100±12
61±2
63±6
62±3
57±2
72±3
61±2
50±5
68±7
55±5
49±2
59±0
51±1
55±1
67±4
58±2
61±3
64±1
62±3
66±4
75±8
68±3
58±3
77±9
63±4
53±3
65±4
56±3
57±8
75±6
62±8
76±18
67±12
74±14
65±5
70±6
67±6
61±8
63±6
62±7
74±2
74±4
74±2
86±14
81±11
85±13
102±14
105±18
103±15
Tabelle 19: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy ohne Lovastatingabe
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, KS…Keratinschicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
GS
17±4
19±4
17±1
17±0
18±2
25±4
24±1
24±1
22±4
24±2
24±1
27±2
27±3
24±3
28±3
32±7
36±8
Schichtdicke ± SD [µm]
FS
KS
GE
28±9
11±3
56±10
42±5
13±1
73±9
42±2
14±1
73±2
45±4
16±3
78±7
44±8
17±1
80±10
44±5
24±4
93±12
41±2
24±1
88±4
39±7
21±2
83±9
37±4
19±5
78±12
32±7
23±6
79±14
29±1
21±2
73±2
31±5
21±5
79±10
27±4
19±3
73±6
25±3
21±3
70±8
27±2
20±5
74±9
37±6
26±5
95±18
44±10 27±13
107±31
127
Schichtdicke ± SD (%)
GS
FS
KS
GE
100±24 100±32 100±24 100±17
108±24 151±17 119±5 131±15
100±3 151±6 128±11 131±4
98±0 161±15 150±25 140±12
106±9 160±29 163±5 144±18
142±23 160±19 225±34 167±21
137±7 148±6 222±11 159±7
137±7 141±26 194±20 150±15
127±21 133±13 178±50 140±22
140±13 117±25 213±52 143±26
137±7 104±4 194±22 131±4
154±9 113±19 200±44 143±18
158±15 96±13 175±29 131±10
138±15 90±11 197±25 126±14
160±15 96±6
184±46 133±16
183±42 135±20 247±48 171±32
206±43 159±38 253±124 192±56
ANHANG
Tabelle 20: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe von
Tag 0-14 ohne Bestrahlung
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Zellzahl/mm ± SD
GS
FS
GE
602±81 213±23 815±101
673±19
252±6
925±13
758±85 267±25 1025±106
817±30 270±10 1087±28
725±48 278±13 1003±36
832±79 298±42 1130±119
860±48
300±0
1160±48
828±75 298±40 1127±115
895±54 278±88 1173±142
882±116 293±21 1175±136
758±25 280±25 1038±23
743±45 305±26 1048±61
740±28
298±6
1038±33
730±28 305±13 1035±41
723±34
277±6
1000±30
752±13 277±15 1028±25
728±35 250±26
978±20
Zellzahl ± SD (%)
GS
FS
GE
100±13
100±11
100±12
112±3
118±3
113±2
126±14
125±12
126±13
136±5
127±5
133±3
120±8
131±6
123±4
138±13
140±20
139±15
143±8
141±0
142±6
138±12
140±19
138±14
149±9
131±41
144±17
146±19
138±10
144±17
126±4
131±12
127±3
123±7
143±12
129±7
123±5
140±3
127±4
121±5
143±6
127±5
120±6
130±3
123±4
125±2
130±7
126±3
121±6
117±12
120±2
Tabelle 21: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 0-14 ohne Bestrahlung
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, KS…Keratinschicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Schichtdicke ± STABW [µm]
GS
FS
KS
GE
17±4
28±9
11±3
56±10
28±4
30±4
15±3
73±6
25±2
31±6
14±1
70±8
28±5
30±6
15±3
72±14
26±4
28±1
14±3
68±5
31±3
38±9
17±3
86±15
27±0
36±3
15±3
78±1
30±3
33±7
16±3
79±13
28±2
37±2
18±3
83±5
32±7
38±5
16±4
86±13
27±4
28±7
15±4
69±13
28±5
35±5
18±5
81±10
31±3
37±7
18±4
85±14
24±3
31±4
18±5
73±12
28±4
27±3
14±4
69±9
37±3
39±8
20±2
96±12
26±1
32±1
16±4
75±3
128
Schichtdicke ± STABW (%)
GS
FS
KS
GE
100±24 100±32 100±24 100±17
160±23 108±16 144±24 131±11
144±12 111±22 134±5 126±14
160±29 107±23 138±29 129±25
150±21 100±2 131±28 122±8
177±19 139±31 159±28 155±26
156±0 129±12 141±28 140±2
171±15 120±26 153±27 143±22
163±9 134±6 169±28 150±9
183±42 137±18 153±35 155±23
154±24 101±24 138±33 125±24
162±31 128±10 169±47 146±18
177±19 134±24 166±38 153±24
138±20 111±15 169±43 131±21
162±21 99±9 131±34 125±17
212±17 140±28 191±14 172±21
152±7 117±2 150±38 134±6
ANHANG
Tabelle 22: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe von
Tag 0 bis 14 und fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Zellzahl/mm ± SD
GS
FS
GE
602±81
213±23
815±101
463±19
200±18
663±36
407±63
183±29
590±91
415±26
178±10
593±36
507±32
197±13
703±38
458±51
197±13
655±41
458±19
155±10
613±10
525±41
175±9
700±40
417±45
155±13
572±51
437±46
177±16
613±55
432±29
182±6
613±33
437±24
177±8
613±31
418±33
178±6
597±38
502±60
183±15
685±69
483±10
183±16
667±25
540±61
193±10
733±70
770±17
235±5
1005±13
Zellzahl ± SD (%)
GS
FS
GE
100±13
100±11
100±12
77±3
94±8
81±4
68±10
86±14
72±11
69±4
84±5
73±4
84±5
92±6
86±5
76±8
92±6
80±5
76±3
73±5
75±1
87±7
82±4
86±5
69±7
73±6
70±6
73±8
83±8
75±7
72±5
85±3
75±4
73±4
83±4
75±4
69±5
84±3
73±5
83±10
86±7
84±9
80±2
86±8
82±3
90±10
91±5
90±9
128±3
110±2
123±2
Tabelle 23: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 0 bis 14 und fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, KS…Keratinschicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Schichtdicke ± SD [µm]
GS
FS
KS
GE
17±4
28±9
11±3
56±10
24±1
31±3
12±2
67±4
27±4
41±2
17±1
85±7
25±3
35±11
16±5
75±19
28±1
41±5
21±3
90±8
24±6
36±10
19±5
79±19
24±1
33±2
19±3
77±3
24±4
31±5
23±5
78±12
26±3
32±5
19±3
77±9
30±0
36±5
20±0
86±5
24±2
32±5
19±4
75±7
26±4
28±2
17±1
72±6
27±0
29±4
18±5
74±9
27±4
26±3
18±0
71±6
29±1
31±6
17±1
77±7
31±8
30±3
17±3
78±10
38±9
36±13
20±3
94±23
129
Schichtdicke ± SD (%)
GS
FS
KS
GE
100±24 100±32 100±24 100±17
140±7 113±10 109±14 121±7
154±24 148±6 163±11 153±12
142±17 125±39 150±49 135±34
160±3 149±19 197±25 162±14
140±32 130±36 175±42 142±34
140±7 120±6 181±27 138±6
140±23 112±19 213±48 140±22
150±15 117±15 178±32 139±17
173±0 130±19 188±0 155±10
140±13 114±17 178±34 135±13
150±21 102±15 163±11 129±10
156±0 104±15 172±42 133±15
156±21 95±10 169±0 128±12
165±7 113±22 163±5 139±12
179±46 107±9 163±24 140±17
219±49 129±45 188±25 168±41
ANHANG
Tabelle 24: Mittlere und relative Zellzahlen ± Standardabweichung bei Lovastatingabe von
Tag 7 bis 14 und fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Zellzahl/mm ± SD
GS
FS
GE
602±81
213±23
815±101
480±26
182±8
662±32
530±20
215±13
745±22
495±23
215±5
710±20
480±20
215±13
695±26
478±13
210±13
688±21
463±28
192±15
655±38
643±51
230±10
873±51
697±45
245±10
942±54
842±74
318±20
1160±91
Zellzahl ± SD (%)
GS
FS
GE
100±13
100±11
100±12
80±4
85±4
81±4
88±3
101±6
91±3
82±4
101±2
87±2
80±3
101±6
85±3
79±2
99±6
84±3
77±5
90±7
80±5
107±8
108±5
107±6
116±7
115±5
116±7
140±12
149±9
142±11
Tabelle 25: Mittlere und relative Schichtdicken ± Standardabweichung bei Lovastatingabe
von Tag 7 bis 14 und fraktionierter Bestrahlung mit 10x3 Gy/2 Wochen
GS…Germinativschicht, FS…funktionelle Schicht, KS…Keratinschicht, GE…Gesamtepithel
Tag
0
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Schichtdicke ± SD [µm]
GS
FS
KS
GE
17±4
28±9
11±3
56±10
25±2
31±4
21±3
77±9
28±4
34±6
15±3
77±11
25±2
28±2
15±3
68±4
25±3
27±1
19±2
72±5
27±3
27±3
17±5
71±8
24±3
26±6
16±3
66±10
31±2
32±5
17±7
80±13
32±7
34±11
18±4
84±19
36±4
36±4
19±2
92±9
130
Schichtdicke ± SD (%)
GS
FS
KS
GE
100±24 28±9
11±3
56±10
144±12 113±15 197±25 139±15
163±24 122±22 144±24 139±20
144±12 102±6 138±27 122±7
144±17 99±2 181±14 129±8
158±15 99±9 156±47 128±15
140±19 93±20 150±25 119±17
179±10 116±18 163±62 144±23
187±39 124±40 166±33 152±33
210±23 131±15 181±22 165±16
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Dörr für die Überlassung des Themas,
die Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie die umfassende, zuverlässige und stets freundliche Betreuung während der Durchführung und Anfertigung meiner Promotionsarbeit.
Ich danke der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität für die Erlaubnis der Nutzung
der Einrichtungen sowie für die Zucht, Haltung und Pflege der Mäuse.
Den Mitarbeitern der AG Normalgewebe der „Experimentellen Strahlenbiologie“, insbesondere Frau Dr. Margret Schmidt, gilt mein Dank für die gute Zusammenarbeit und hilfreiche Unterstützung bei der Durchführung der vorliegenden Arbeit.
Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie, die mir das Medizinstudium und diese Promotion ermöglicht hat und mich dabei jederzeit unterstützten.
131
Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens
Technische Universität Dresden
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus
Promotionsordnung vom 24. Juli 2011
1. Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne zulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
2. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
−
Herrn Prof. Dr. med. vet. et rer. medic. habil. Wolfgang Dörr, Klinik und Poliklinik
für Strahlentherapie und Radioonkologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden
−
Frau Dr. rer. nat. Margret Schmidt, AG Normalgewebe der „Experimentellen
Strahlenbiologie“, Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie,
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden
3. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters in
Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
4. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form
einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
5. Die Inhalte dieser Dissertation wurden in folgender Form veröffentlicht: noch nicht
6. Ich bestätige, dass es keine zurückliegenden erfolglosen Promotionsverfahren/erfolglose
Promotionsverfahren gab.
7. Ich bestätige, dass ich die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Technischen Universität Dresden anerkenne.
Dresden, den
Stefanie Klinkicht-Bormann
132
Erklärung zur Einhaltung rechtlicher Vorschriften
Hiermit bestätige ich die Einhaltung der folgenden aktuellen gesetzlichen Vorgaben im
Rahmen meiner Dissertation
das zustimmende Votum der Ethikkommission bei klinischen Studien, epidemiologischen Untersuchungen mit Personenbezug oder Sachverhalten, die das Medizinproduktegesetz betreffen
die Einhaltung der Bestimmungen des Tierschutzgesetzes
Aktenzeichen der Genehmigungsbehörde zum Vorhaben/zur Mitwirkung
AZ 24-9168.11-1-2005-20
die Einhaltung des Gentechnikgesetzes
die Einhaltung von Datenschutzbestimmungen der Medizinischen Fakultät und des
Universitätsklinikums Carl Gustav Carus
Dresden, den
Stefanie Klinkicht-Bormann
133