Untersuchungen zum Biosyntheseweg von

Untersuchungen zur Didesmethylmensacarcin-Biosynthese
unter besonderer Berücksichtigung der Funktion von
MsnO8
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Sarah Maier
aus Bad Säckingen
2014
Dekan:
Prof. Dr. Bernhard Breit
Vorsitzende des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Thorsten Koslowski
Referent:
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent:
Prof. Dr. Oliver Einsle
Drittprüfer:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Datum der Promotion:
26.06.2014
Publikationsliste und Tagungsbeiträge
Wissenschaftliche Publikationen
S. Maier, T. Pflüger, S. Loesgen, K. Asmus, E. Broetz, T. Paululat, A. Zeeck, S. L.A. Andrade, A.
Bechthold, Insights into the bioactivity and epoxide formation in mensacarcin by MsnO8.
ChemBioChem 15, 749-56 (2014).
Tagungsbeiträge
Vorträge
The biosynthesis of mensacarcin and the function of MsnO8, Internationale DPhGDoktorandentagung, Wuppertal, 2014.
MsnO8 and the biosynthesis of mensacarcin from Streptomyces bottropensis, PhD-Seminar,
Freiburg 2013.
Further insights into the biosynthesis of mensacarcin and the role of MsnO8, 3. GenBioCom
Clustermeeting, Freudenstadt 2012.
Poster
S. Maier, T. Pflüger, A. Erber, K. Heßelbach, T. Paululat, S. L.A. Andrade, A. Bechthold, The
biosynthesis of mensacarcin and the function of the new luciferase-like monooxygenases MsnO4
and MsnO8, DPHG Annual meeting, Freiburg i. Br. 2013.
S. Maier, T. Pflüger, K. Heßelbach, T. Paululat, S. L.A. Andrade, A. Bechthold, Mensacarcin
biosynthesis and the role of MsnO8 in epoxide formation, 1st European Conference on Natural
Products:Research and Application, Frankfurt a. M. 2013.
S. Maier, T. Pflüger, S. L.A. Andrade, T. Paululat, A. Bechthold, Msno8 – A new luciferase-like
monooxygenase involved in epoxide formation in mensacarcin biosynthesis, Tag der Forschung,
Freiburg i. Br. 2013.
S. Maier, T. Pflüger, S. L.A. Andrade, T. Paululat, A. Bechthold, Elucidation of the function of
luciferase-like monooxygenses involved in the mensacarcin and rishirilide A biosynthesis, 25.
Irseer Naturstofftage, Irsee 2013.
S. Maier, T. Pflüger, U. Hardter, S. L.A. Andrade, A. Bechthold, Novel insights into the function of
oxygenases involved in the mensacarcin biosynthesis, Actinobacteria within soil, Münster 2012.
S. Maier, T. Pflüger, S. L.A. Andrade, A. Bechthold, The biosynthesis of mensacarcin and the
importance of MsnO8, Industrial Compounds and Natural Products Research (ICNPR), New York
2012.
S. Maier, T. Pflüger, S. L.A. Andrade, A. Bechthold, A new luciferase-like monooxygenase involved
in mensacarcin biosynthesis, Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie (VAAM
Workshop), Bonn 2011.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ....................................................................................... 15
2
Einleitung ..................................................................................................... 17
2.1
Polyketide ............................................................................................................................ 17
2.2
Die Polyketidsynthase vom Typ II ...................................................................................... 20
2.3
Die minimale PKS-ergänzenden Enzyme ........................................................................... 22
2.4
2.5
3
2.3.1
Ketoreduktasen .................................................................................................................... 22
2.3.2
Cyclasen und Aromatasen ................................................................................................... 25
Post-modifizierende Enzyme .............................................................................................. 26
2.4.1
Transferasen ........................................................................................................................ 26
2.4.2
Oxidoreduktasen.................................................................................................................. 27
2.4.3
Flavoenzyme ....................................................................................................................... 27
Mensacarcin......................................................................................................................... 29
2.5.1
Der PKS II-Metabolit Mensacarcin ..................................................................................... 29
2.5.2
Die Mensacarcin-Biosynthese ............................................................................................. 30
2.5.3
Biologische Aktivität von Mensacarcin .............................................................................. 31
2.6
Mycothiol–Biosynthese und Funktion ................................................................................ 33
2.7
Die Biosynthese von F420 ..................................................................................................... 36
2.8
Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................................... 38
Material und Methoden .............................................................................. 39
3.1
Labor- und Analysengeräte ................................................................................................. 39
3.2
Chemikalien, Medienbestandteile, Enzyme, Kits und Verbrauchsmaterialien ................... 40
3.3
3.2.1
Chemikalien und Medienbestandteile ................................................................................. 40
3.2.2
Antibiotika ........................................................................................................................... 43
3.2.3
Enzyme und Kits ................................................................................................................. 44
3.2.4
Verbrauchsmaterialien......................................................................................................... 45
Puffer und Lösungen ........................................................................................................... 46
3.3.1
Antibiotika-Lösungen .......................................................................................................... 46
3.3.2
Puffer zur Plasmidisolierung aus E. coli.............................................................................. 46
Inhaltsverzeichnis
3.4
3.5
3.6
3.3.3
Puffer zur Isolierung von genomischer DNA aus Streptomyces spp. .................................. 47
3.3.4
Puffer und Lösungen zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese............................................... 47
3.3.5
Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen ................................................................... 48
3.3.6
Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE Gelelektrophorese .............................................. 48
3.3.7
Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen ..................................................................... 49
3.3.8
Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion ............................................................................... 50
3.3.9
Puffer zur Proteinaufreinigung ............................................................................................ 50
3.3.10
Lösungen für FGD/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays .......................................................... 50
3.3.11
Lösungen für MsnO3/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays ...................................................... 51
3.3.12
Puffer und Lösungen zur Isolierung und Reingung von F 420 ............................................... 51
3.3.13
Puffer und Lösungen zur Herstellung von PASM-5052 Autoinducing-Medium ................ 52
3.3.14
Fließmittel für die Dünnschichtchromatografie .................................................................. 53
3.3.15
Laufmittel für die analytische und präparative HPLC ......................................................... 53
Nährmedien ......................................................................................................................... 54
3.4.1
Nährmedien zur Kultivierung von E. coli ........................................................................... 54
3.4.2
Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp.-Stämmen ......................................... 54
Bakterienstämme ................................................................................................................. 55
3.5.1
E. coli-Stämme .................................................................................................................... 55
3.5.2
Streptomyces spp.-Stämme .................................................................................................. 56
Plasmide und Vektoren ....................................................................................................... 56
3.6.1
In dieser Arbeit verwendete Plasmide und Vektoren .......................................................... 56
3.6.2
In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren ................................................................ 57
3.7
Software, Datenbanken und Internetservices ...................................................................... 59
3.8
Molekularbiologische Methoden ......................................................................................... 60
3.8.1
Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse ......................................................................... 60
3.8.2
DNA-Aufreinigung durch Alkoholische Fällung ................................................................ 60
3.8.3
Plasmidminipräparation....................................................................................................... 60
3.8.4
Plasmidmidipräparation....................................................................................................... 60
3.8.5
Isolierung genomischer DNA aus Streptomyceten.............................................................. 60
3.8.6
Analyse und Isolierung von DNA über Agarose-Gelelektrophorese .................................. 61
3.8.7
Restriktion von DNA .......................................................................................................... 61
3.8.8
Ligation ............................................................................................................................... 61
3.8.9
Polymerase-Kettenreaktion ................................................................................................. 62
Inhaltsverzeichnis
3.9
3.8.10
Kolonie-PCR mit E. coli-Kolonien als Matrize .................................................................. 63
3.8.11
DNA Sequenzierung ........................................................................................................... 63
3.8.12
In dieser Arbeit verwendete Primer ..................................................................................... 64
Mikrobiologische Methoden ............................................................................................... 67
3.9.1
Kultivierung von E. coli ...................................................................................................... 67
3.9.2
Herstellung von E. coli Dauerkulturen ................................................................................ 67
3.9.3
Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen ............................................................ 67
3.9.4
Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen ............................................................ 67
3.9.5
Hitzeschock-Transformation von E. coli ............................................................................. 68
3.9.6
Elektroporation .................................................................................................................... 68
3.9.7
Blau-Weiß Selektion ........................................................................................................... 68
3.9.8
Kultivierung von Streptomyces spp. .................................................................................... 68
3.9.9
Herstellung von Streptomyces spp.-Dauerkulturen ............................................................. 69
3.9.10
Kultivierung von Streptomyces spp. zur Produktion und Isolierung von Naturstoffen ....... 69
3.9.11
Intergenerische Konjugation ............................................................................................... 69
3.10 Erstellung von Plasmiden .................................................................................................... 70
3.10.1
Erstellung der Komplementierungsplasmide ....................................................................... 70
3.10.2
Erstellung der Konstrukte pSETermE*-fbiA und pTESbFbiABC* .................................... 71
3.10.3
Klonierung von Plasmiden für die Proteinproduktion in E. coli ......................................... 71
3.10.4
Erstellung des Inaktivierungsplasmids pKCXY02∆mshA .................................................. 72
3.11 Geninaktivierungen in Streptomyces .................................................................................. 72
3.11.1
Geninaktiverung mittels Redirect®-Methode ..................................................................... 72
3.11.2
Geninaktivierung durch Doppelcrossover ........................................................................... 73
3.12 Proteinbiochemische Methoden .......................................................................................... 74
3.12.1
Testexpression ..................................................................................................................... 74
3.12.2
Überproduktion von Proteinen in LB-Medium ................................................................... 74
3.12.3
Testexpression und Überexpression von MsnO8 in Autoinducing-Medium....................... 75
3.12.4
Zellaufschluss für Proteinreinigung .................................................................................... 75
3.12.5
Affinitätschromatographie ................................................................................................... 75
3.12.6
Gelfiltration ......................................................................................................................... 76
3.12.7
Aufkonzentrierung von Proteinlösungen ............................................................................. 76
3.12.8
SDS-PAGE .......................................................................................................................... 76
3.12.9
Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen ............................................................... 76
3.12.10 In vitro Enzymaktivitätsassays ............................................................................................ 77
Inhaltsverzeichnis
3.13 Methoden zur Aufreinigung von F420 .................................................................................. 78
3.13.1
Zellaufschluss für die Reinigung von F420 ........................................................................... 78
3.13.2
Reinigung über DEAE FF Anionenaustauschersäule .......................................................... 78
3.13.3
Reinigung über MonoQ-Anionenaustauschersäule ............................................................. 79
3.14 Isolierung, Aufreinigung und Analyse von Naturstoffen aus Streptomyces spp. ................ 79
4
Isolierung von Naturstoffen aus Streptomyces spp. ............................................................. 79
3.14.2
Analytik von Naturstoffen ................................................................................................... 81
3.14.3
Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie ................................................................. 82
Ergebnisse .................................................................................................... 83
4.1
4.2
4.3
4.4
5
3.14.1
Inaktivierungsexperimente zur Untersuchung der Didesmethylmensacarcin-Biosynthese. 83
4.1.1
Inaktivierung der Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und MsnO11 ..................................... 84
4.1.2
Inaktivierung von msnH7 - ein Gen mit unbekannter Funktion .......................................... 96
4.1.3
Komplementierung der Mutante S. albus x Cos2∆O2......................................................... 99
4.1.4
Inaktivierung der NADH-abhängigen Flavinreduktase MsnO3 ........................................ 101
Untersuchungen zur Biosynthese von Msn-KP2 und Msn-KP2a ..................................... 109
4.2.1
Inaktivierung der Mycothiol-Biosynthese ......................................................................... 109
4.2.2
Produktionsanalyse der mshA-Inaktivierungsmutante S. albus∆mshA Cos2∆O8 x pKR1 110
Reinigung und Kristallisation der Luciferase-like Monooxygenase MsnO8 .................... 112
4.3.1
Heterologe Expression und Aufreinigung von MsnO8 ..................................................... 112
4.3.2
Produktion von Selenomethionin-haltigem MsnO8 .......................................................... 115
4.3.3
Kristallstruktur von MsnO8 ............................................................................................... 116
Entwicklung eines Zwei-Komponenten Enzymassays für MsnO8 ................................... 120
4.4.1
Heterologe Expression und Reinigung von FGD .............................................................. 121
4.4.2
Isolierung von F420............................................................................................................. 124
4.4.3
Zwei-Komponenten Enzymassay mit FGD und MsnO8 ................................................... 126
4.4.4
Heterologe Expression und Reinigung von MsnO3 .......................................................... 128
4.4.5
Enzymassay mit MsnO3 .................................................................................................... 131
4.4.6
Zwei-Komponenten Enzymassay mit MsnO3 und MsnO8 ............................................... 131
Diskussion .................................................................................................. 135
5.1
Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin ...................................... 135
5.1.1
Die Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und MsnO11 ........................................................ 137
5.1.2
Die Funktion von MsnH7 .................................................................................................. 143
Inhaltsverzeichnis
5.1.3
Die Komplementierung von MsnO2 ................................................................................. 143
5.1.4
Die NADH-abhängige Flavinreduktase MsnO3 ................................................................ 144
5.1.5
Die Biosynthese von Didesmethylmensacarcin ................................................................ 146
5.2
Einfluss von Mycothiol auf die Bildung von MSN-KP2 und MSN-KP2a........................ 148
5.3
Charakterisierung von MsnO8 .......................................................................................... 150
5.3.1
Produktion und Reinigung von MsnO8 ............................................................................. 150
5.3.2
Enzymassay ....................................................................................................................... 150
5.3.3
Kristallstruktur von MsnO8 ............................................................................................... 153
6
Literaturverzeichnis.................................................................................. 155
7
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 167
8
Anhang ....................................................................................................... 173
8.1
Optimierte DNA-Sequenz von FGD ................................................................................. 173
8.2
Proteinsequenz von MsnO8............................................................................................... 173
8.3
Proteinsequenz von MsnO3............................................................................................... 173
8.4
Plasmidkarten .................................................................................................................... 174
8.5
8.4.1
Plasmid zur Geninaktivierung ........................................................................................... 174
8.4.2
Plasmide zur Komplementierung ...................................................................................... 174
8.4.3
Plasmidkarte von pTESb*FbiABC .................................................................................... 177
8.4.4
Plasmide zur heterologen Überexpression von Proteinen in E. coli .................................. 177
NMR-Spektren .................................................................................................................. 180
8.5.1
1D- und 2D-NMR Spektren von Msn-SM2 ...................................................................... 180
8.5.2
1D- und 2D-NMR Spektren von Msn-SM3 ...................................................................... 183
8.5.3
1D-NMR Spektren von Msn-SM4 .................................................................................... 185
Danksagung ...................................................................................................... 187
Bildungsgang ................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Der Sekundärstoff Mensacarcin wird neben den Rishiriliden A und B von Streptomyces bottropensis
Goe C4/4 produziert. Mensacarcin wird durch eine Polyketidsynthase vom Typ II gebildet und weist
neben dem dreigliedrigen Ringsystem einen sehr hohen Oxygenierungsgrad auf. Besondere
Strukturmerkmale dieser Substanz sind die beiden Epoxidgruppen, welche maßgeblich zur
Cytotoxizität beitragen. Geninaktivierungsexperimente weisen daraufhin, dass diese Gruppen durch
die Luciferase-like Monooxygenasen MsnO4 und MsnO8 eingeführt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion des Proteins MsnO8 eindeutig nachgewiesen. So konnte
ein in vitro Aktivitätsassay entwickelt werden, welcher belegt, dass dieses Enzym die Epoxidierung
der Seitenkette katalysiert. Der Einbau des Sauerstoffatoms erfolgt dabei in das α,β-ungesättigte Keton
Dideoxymensacarcin. Um weitere Informationen über MsnO8 zu gewinnen, wurde das gereinigte
Protein kristallisiert und die Proteinstruktur aufgeklärt.
Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der für die Epoxidierung
benötigte Cofaktor FMN durch die NADH-abhängige Flavinreduktase MsnO3 reduziert und dann für
die Reaktion bereitgestellt wird. Die Inaktivierung von msnO3 auf dem Cosmid Cos2 und die
anschließende heterologe Expression im Wirt Streptomyces albus J1074 führte zur Akkumulation der
Intermediate Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5. Die Substanz Msn-SM3 wird auch von der Mutante
S. albus x Cos2∆O2 gebildet und ist unter Msn-UH bekannt. Die Struktur von Msn-SM4 ist noch nicht
vollständig gelöst, es handelt sich hierbei aber höchst wahrscheinlich um dieselbe Substanz wie bei
der Inaktivierung von msnO4. Sowohl msnO2 als auch msnO4 codieren für Luciferase-like
Monooxygenasen, welche FMN-abhängig sein könnten. Dass es sowohl durch die Inaktivierung der
Luciferase-like Monooxygenasen, als auch durch die Flavinreduktase zur Akkumulation derselben
Intermediate kommt, kann ein Hinweis darauf sein, dass MsnO3 reduziertes FMN für alle drei
Luciferase-like Monooxygenasen MsnO2, MsnO4 und MsnO8 zur Verfügung stellt.
Ein weiterer Gegenstand dieser Arbeit war die Aufklärung der genauen Funktion der drei
Ketoreduktasen
des
Didesmethylmensacarcin-Biosynthesegenclusters.
Nach
erfolgreicher
Inaktivierung der Gene msnO1, msnO10 und msnO11 auf dem Cosmid Cos2, welche für
Ketoreduktasen codieren, wurde die Sekundärstoffproduktion der Mutanten mittels HPLC/ESI-MS
untersucht. Hierbei führte die Produktion von Cos2∆O1 im heterologen Wirt S. albus zur
Akkumulation von Msn-KH1, während die Produktion von Cos2∆O10 zu Msn-SM1 und Msn-SM2
bzw. die Produktion von Cos2∆O11 zu keinem nachweisbaren Produkt führte. Diese Ergebnisse legen
nahe, dass alle drei Ketoreduktasen an der Stabilisierung der minimalen PKS beteiligt sind und zudem
essentiell für die richtige Zyklisierung der Polyketidkette sind. Ungewöhnlich in diesem
Zusammenhang ist, dass es durch die Inaktivierung von msnO11 zum vollständigen Erliegen der
Biosynthese kommt. Bisherige Untersuchungen an PKS II-Systemen zeigten, dass Ketoreduktasen
15
Zusammenfassung
zwar die Faltung und die Kettenlänge eines Polyketids beeinflussen können, aber nicht, dass sie
notwendig für die Produktion der Polyketidkette sind.
16
Einleitung
2 Einleitung
2.1
Polyketide
In der Natur findet man eine Vielzahl an Naturstoffen mit unterschiedlichsten chemischen Strukturen
und biochemischen Eigenschaften. Eine große Familie dieser Naturstoffe wird aus den Polyketiden
gebildet, die eine wertvolle Quelle an bioaktiven Molekülen darstellen.1 In dieser Substanzklasse
findet man unter anderem Polyene, Makrolide, Polyether oder Polyphenole. Einige dieser Moleküle
dienen als Pigmente, Virulenzfaktoren oder zur Verteidigung gegen andere Mikroorganismen, von den
meisten ist die eigentliche Funktion in der Natur aber unbekannt. Ein Großteil dieser Stoffe wird durch
gram-positive Bodenbakterien der Ordnung Actinomycetales gebildet.2 Aus medizinischer Sicht
spielen Polyketide eine wichtige Rolle, da sie in vielen medizinischen Bereichen als Arzneistoffe
eingesetzt werden können.2 Klinische Anwendung finden zum Beispiel die Zytostatika Bleomycin,
Daunorubicin und Mitomycin C, die Antibiotika Erythromycin, Tetracyclin und Vancomycin und die
Immunsuppressiva Rapamycin und Tacrolismus.2–4 Auf der Suche nach neuen oder pharmakologisch
besser wirksamen Arzneistoffen und zur Entwicklung neuer Medikamente, zum Beispiel gegen
Krebserkrankungen, Pathogene und resistente Bakterien oder Pilze ist die Naturstoffklasse der
Polyketide eine wichtige Bezugsquelle für Leitstrukturen.5 Durch neue molekularbiologische
Methoden ist es möglich, die Polyketidbiosynthese zu manipulieren und genauer zu untersuchen.1 Aus
den Erkenntnissen dieser Untersuchungen wird es möglich sein, neue Arzneistoffe durch die
kombinatorische Biosynthese zu gewinnen, welche verbesserte Eigenschaften besitzen.6
Polyketide werden durch Polyketidsynthasen (PKS) gebildet. Die Biosynthese zeigt Ähnlichkeiten zur
Fettsäurebiosynthese, welche durch die Fettsäuresynthase (FAS) katalysiert wird. Ähnlich wie die
FAS sind auch die PKS multifunktionelle Enzyme, welche wiederholte Kettenverlängerungen
katalysieren und anschließend Modifizierungen durchführen.7 Die Variation der Kettenlänge, die Wahl
der Starter- und Verlängerungseinheiten und die verschiedenen Modifizierungen führen zu einer
enormen Vielfalt an natürlich vorkommenden Polyketiden. Zur Kettenverlängerung werden einfache
Bausteine wie Acetyl-CoA bzw. Malonyl-CoA verwendet, welche durch die Ketosynthase (KS) über
eine Claisen-Kondensation miteinander verknüpft werden. Im Anschluss können diese Grundgerüste
über weitere Enzyme modifiziert werden. Bekannte Modifizierungen sind C-, O- und NGlykosylierungen, Alkylierungen, Hydroxylierungen und Epoxidierungen.8 In den letzten Jahrzehnten
wurden PKS unter anderem durch genetische Manipulationen intensiv untersucht. Dabei zeigte sich,
dass sich die PKS in mindestens drei Gruppen einteilen lassen, wobei die verschiedenen PKS zum Teil
auch kombiniert vorliegen. Die verschiedenen PKS-Typen sind in Tabelle 2-1 gelistet.5 In Bakterien
sind die Gene für die minimale PKS und die ergänzenden oder modifizierenden Proteine zusammen
codiert und bilden ein PKS-Biosynthesegencluster. Zusätzlich zu den Genen für diese
strukturgebenden Enzyme gibt es auch Gene für die Regulation der Expression und Produktion, für
Resistenzmechanismen und Transporter.
17
Einleitung
Tabelle 2-1 Überblick und Vorkommen der verschiedenen PKS Typen.5,9
PKS Typ
Verlängerungseinheiten
Organismen
Typ I (nicht-iterativ)
ACP, verschiedene
Verlängerungseinheiten
Bakterien
Typ I (iterativ)
ACP, Malonyl-CoA
überwiegend Pilze, einige
Bakterien
Typ II (iterativ)
ACP, Malonyl-CoA
Bakterien
Typ III (iterativ)
Acyl-CoA, Malonyl-CoA
meist in Pflanzen, einige
Bakterien und Pilze
PKS-NRPS Hybride
ACP, Malonyl-CoA, AS
Bakterien und Pilze
PKS vom Typ I sind Multienzymkomplexe, welche modular aufgebaut sind. Jedes dieser Module
besitzt verschiedene katalytische Domänen.10 Dabei gibt es in jedem Modul mindestens eine KS-, eine
Acyltransferase (AT)- und eine Acyl-Carrier-Protein (ACP)-Domäne. Zusätzlich kommen
prozessierende Domänen wie Ketoreduktase (KR)-, Dehydratase (DH)- oder Enoylreduktase (EN)Domänen vor. Jedes dieser Module ist für den Einbau einer einzigen Verlängerungseinheit und die
darauffolgende Prozessierung verantwortlich.
Abbildung 2-1 Funktionsweise einer nicht-iterativen PKS vom Typ I am Beispiel der Biosynthese von
Erythromycin A.11 Die 6-Deoxyerythronoilid B Synthase (DEBS) ist eine PKS vom Typ I und katalysiert die PolyketidBiosynthese von Erythromycin A. Die terminale TE-Domäne beendet diese und setzt das Polyketid nach der Zyklisierung
frei.
18
Einleitung
Am Ende wird die Polyketidkette durch eine Thioesterase (TE)-Domäne freigesetzt und häufig auch
zyklisiert.12 Die Funktionsweise der nicht-iterativen PKS vom Typ I ist am Beispiel der Biosynthese
von Erythromycin A in Abbildung 2-1 dargestellt.11
PKS vom Typ II sind iterativ und bestehen aus einzelnen Enzymen mit individuellen Aufgaben,
welche einen Multienzymkomplex bilden. Dieser katalysiert die Biosynthese der Polyketidkette,
welche erst nach dem letzten Verlängerungszyklus weiter umgesetzt wird. Dabei kommt es zu zwei
oder mehr Zyklisierungen und nachfolgend zur Aromatisierung. Als Produkte entstehen aromatische
Polyketide wie zum Beispiel Tetracenomycin, Actinorhodin oder Mensacarcin.13,14 Die Biosynthese
letzteres wurde in dieser Arbeit untersucht. Der genaue Ablauf der Biosynthese von aromatischen
Polyketiden wird in einem separaten Kapitel (siehe Kapitel 2.2) beschrieben.
Die dritte Gruppe der PKS (Typ III) kommen in Pflanzen vor, wurde aber auch in einigen Bakterien
und Pilzen gefunden.15,16 Die bakteriellen PKS vom Typ III gehören zur Superfamilie der ChalkonSynthasen (CHS) oder Stilben-Synthasen (STS).17 Diese Enzyme sind sowohl strukturell als auch
mechanistisch sehr verschieden im Vergleich zu den PKS vom Typ I und Typ II. Typ III PKS
bestehen aus Homodimeren, welche häufig Cinnamoyl-CoA als Startereinheit verwenden und dieses
iterativ durch Malonyl-CoA verlängern.18 Das besondere an PKS vom Typ III ist, dass sie freie CoAThioester als Verlängerungseinheiten verwenden und unabhängig von einem Acyl-Carrier-Protein
arbeiten.11 Funa et al. entdeckten das CHS-homologe Protein RppA in Streptomyces griseus, welches
für dessen rot-braune Pigmentierung verantwortlich ist. Inkubation von RppA mit Malonyl-CoA führt
zur Produktion von 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen (THN), welches zu Flaviolin oxidiert wird.
Dieses ist ein Vorläufer des Pigments Melanin.16 Als Beispiel für eine bakterielle Typ III-PKS ist
RppA, die 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen-Synthase (THNS) von S. griseus, in Abbildung 2-2
dargestellt.16
Abbildung 2-2 Funktionsweise einer bakteriellen PKS vom Typ III am Beispiel der Biosynthese von Flaviolin. 11 RppA
ist eine PKS vom Typ III und katalysiert die Polyketid-Biosynthese von 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen. Nach Freisetzung
wird dieses durch Luftsauerstoff zu Flaviolin, einem Melanin-Vorläufer, oxidiert.
19
Einleitung
2.2
Die Polyketidsynthase vom Typ II
Der wichtigste Bestandteil eines PKS-Clusters vom Typ II ist die minimale PKS. Diese ist
verantwortlich für die Synthese einer langen Polyketidkette, welche an ein Acyl-Carrier-Protein
gebunden ist. Die minimale PKS vom Typ II ist analog zur Typ II Fettsäuresynthase (FAS) aufgebaut
und besteht aus einzelnen Enzymen.19 Ihre Bestandteile sind zwei Ketosynthase-Einheiten
(Heterodimer KSα/KSβ) und das Acyl-Carrier-Protein. Die Ketosynthase katalysiert die iterative
Kondensation von Malonyl-CoA-Verlängerungseinheiten an die Polyketidkette. Die Reaktion findet
dabei aber nur an der KSα-Untereinheit statt, da die KSβ-Untereinheit durch eine Mutation im
katalytischen Zentrum inaktiviert ist. Die Funktion der KSβ-Untereinheit wurde lange Zeit diskutiert.
Durch gezielte Mutationen konnten Tang et al. zeigen, dass diese Untereinheit maßgeblich für die
Länge der Polyketidkette verantwortlich ist.20 Deshalb wird diese Untereinheit häufig auch Chain
Lenght Factor (CLF) genannt. Zusätzlich können weitere Enzyme wie Ketoreduktasen (KR), Cyclasen
(CYC) oder Aromatasen (ARO) die Kettenlänge beeinflussen.5,21
Abbildung 2-3 Synthese eines Dekaketids für die Produktion von Tetracaenomycin (tcm) durch die tcm minimale
PKS. Als erstes wird das Acyl-Carrier-Protein (ACP) mit Malonyl-CoA beladen. Anschließend erfolgt die Übertragung
dieser Verlängerungseinheit auf die wachsende Polyketidkette, welche an die Ketosynthase gebunden ist. Nach der ClaisenKondensation, welche unter Abspaltung von CO2 erfolgt, wird die verlängerte Kette wieder von ACP zurück auf die
Ketosynthase übertragen. Die um zwei Kohlenstoffatome längere Kette rutscht anschließend tiefer in den Tunnel, welcher
durch die Ketosynthase-Untereinheiten gebildet wird. Nach neun Verlängerungszyklen hat die Polyketidkette das Ende des
Tunnels erreicht und der erste Ringschluss wird katalysiert.11
Am Anfang der Polyketidsynthese wird das Acyl-Carrier-Protein mit der Startereinheit beladen, meist
handelt es sich hierbei um eine Acetateinheit, welche durch Decarboxylierung aus Malonyl-CoA
gebildet wird. Andere Startereinheiten können entweder durch eine zusätzliche Ketosynthase (KSIII)
oder durch eine Acyl-CoA Ligase und eine Acyltransferase übertragen werden. Anschließend wird die
Startereinheit durch die iterative Kondensation von Malonyl-CoA verlängert. Die Polyketidkette
20
Einleitung
wächst dabei in einem hydrophoben Tunnel, welcher durch die beiden Untereinheiten der
Ketosynthase gebildet wird. Dieser schützt die reaktive Polyketidkette vor spontanen intramolekularen
Reaktionen und verhindert so eine falsche Zyklisierung der Kette. Eine schematische Darstellung der
Polyketidsynthese ist am Beispiel der minimalen PKS des Tetracenomycin-Clusters (tcm) in
Abbildung 2-3 gezeigt.11
PKS können unterschiedlich lange Polyketidketten synthetisieren, so wird durch die minimale PKS
des Actinorhodin-Clusters (act) ein Oktaketid gebildet während andere PKS Dekaketide
(Tetracenomycin), Dodekaketide (Hedamycin) oder sogar Pentadekaketide (Frederikamycin) bilden.21
Die Länge der gebildeten Polyketide wird dabei unter anderem durch die Länge des Tunnels
beeinflusst. So konnten Tang et al. zeigen, dass gezielte Mutationen in der ActKSβ-Untereinheit,
welche den Tunnel vergrößern oder verkleinern, zu einer Verlängerung bzw. einer Verkürzung der
synthetisierten Polyketidkette führt.20 Da die meisten PKS Polyketide mit einem Ringschluss zwischen
C-7 und C-12 oder C-9 und C-14 produzieren, wurde postuliert, dass die KS auch den ersten
Ringschluss katalysiert.22 Dies geschieht, sobald die Polyketidkette das Ende des Tunnels erreicht hat.
Da Ketoreduktasen, Aromatasen oder Cyclasen ebenfalls die Kettenlänge oder den Ringschluss
beeinflussen können, wird vermutet, dass diese Enzyme mit dem Acyl-Carrier-Protein interagieren
und so die Lage der Kette im Tunnel beeinflussen können. Wird dadurch beispielsweise verhindert,
dass die Kette vollständig in den Tunnel rutscht, sind weitere Elongationszyklen notwendig, damit die
Polyketidkette das Ende erreicht. Dies führt dazu, dass eine längere Kette synthetisiert wird.22
Die Ketoreduktasen, Aromatasen und Cyclasen werden auch als die minimale PKS-ergänzenden
Enzyme bezeichnet und sind in den PKS-Komplex eingebunden. Sie tragen dazu bei, dass das
entstehende Produkt sowohl eine definierte Kettenlänge, als auch ein bestimmtes Zyklisierungsmuster
aufweist. Dabei katalysieren sie Reaktionen am Substrat, welches kovalent an das Acyl-CarrierProtein gebunden ist. Enzyme wie Methyltransferasen, Oxidoreduktasen, Glykosyltransferasen oder
auch manche Cyclasen sind sogenannte post-modifizierende oder tailoring Enzyme. Diese katalysieren
Reaktionen am freien Substrat, sobald dieses vom PKS-Komplex freigesetzt wurde. Die minimale
PKS-ergänzenden und modifizierdenden Enzyme werden in den Kapiteln 2.3 und 2.4 beschrieben.
21
Einleitung
2.3
Die minimale PKS-ergänzenden Enzyme
Die strukturelle Vielfalt der aromatischen Polyketide kommt nicht nur durch die unterschiedliche
Kettenlänge der synthetisierten Polyketide und die verschiedenen Startereinheiten zustande, sondern
wird auch durch eine Vielzahl an verschiedenen PKS-ergänzenden Enzymen beeinflusst. So können
Ketoreduktasen, Aromatasen und Cyclasen die Grundstruktur beträchtlich verändern.
2.3.1 Ketoreduktasen
Ketoreduktasen gehören zur Familie der short-chain Dehydrogenasen (SDR)23 und können die
Struktur eines Polyketids beeinflussen, indem sie den stereospezifischen Hydridtransfer von NAD(P)H
auf eine Ketogruppe katalysieren. Im Gegensatz zu den Ketoreduktasen der FAS, welche unspezifisch
die Ketogruppen nach jedem Verlängerungsschritt reduzieren, sind Ketoreduktasen aus PKS-Clustern
sehr spezifisch. Wie die akkurate Regio- und Stereospezifität erreicht wird, ist allerdings noch nicht
vollständig geklärt. In den meisten PKS II-Clustern codiert mindestens ein Gen für eine
Ketoreduktase. Diese ist häufig spezifisch für die Reduktion der C-9 Ketogruppe.24 Sehr gut
untersuchte Beispiele hierfür sind die ActKR aus dem Actinorhodin-Cluster oder HedKR aus dem
Hedamycin-Cluster.25,26 Durch die Expression der minimalen PKS des Actinorhodin-Clusters in Anund Abwesenheit der ActKR konnte gezeigt werden, dass Ketoreduktasen auch die richtige
Zyklisierung einer Polyketidkette beeinflussen können. So zyklisiert die Polyketidkette ohne ActKR
spontan entweder zwischen C-7/C-12 oder C-10/C-15 zu SEK4 bzw. SEK4b, während bei der
Co-Expression von ActKR Mutactin und EM18 gebildet werden, die eine Zyklisierung zwischen
C-7/C-12 aufweisen (siehe Abbildung 2-4).27,28 Ähnliche Ergebnisse lieferte auch die Expression der
minimalen PKS des Hedamycin-Clusters zusammen mit HedKR und HedE (ARO/CYC). Zusätzlich
konnten Javidpour et al. zeigen, dass HedKR die Länge der gebildeten Polyketidkette beeinflussen
kann. So wurden bei der Co-Expression der minimalen PKS mit HedE und HedKR vier Produkte,
bestehend aus drei unterschiedlich langen Polyketidketten (24, 22, 8 Kohlenstoffatome) erhalten. Die
Co-Expression ohne HedKR zeigte hingegen, dass Polyketide bestehend aus 24, 22, 10, 8 und 6
Kohlenstoffatomen gebildet wurden.26
22
Einleitung
Abbildung 2-4 Expression der minimalen PKS des Actinorhodin-Clusters (act) mit ActKR. Durch die Co-Expression
der minimalen PKS mit ActKR wird Mutactin und EM18 gebildet, welche beide die richtige Zyklisierung des ersten Ringes
aufweisen. Bei der alleinigen Expression der minimalen PKS wird, durch die spontane Zyklisierung zwischen C-7/C-12 oder
C-10/C-15, SEK4 und SEK4b gebildet.25
Einen großen Beitrag zum Verständnis der Funktion von Ketoreduktasen aus aromatischen PKSClustern leisteten Korman et al. durch die Co-Kristallisation von ActKR mit NADP+ und NADPH.
ActKR bildet ein Homotetramer, dessen Monomere eine typische Rossman-Faltung aufweisen. Jedes
Monomer bindet dabei einen Cofaktor, wobei sich durch den Austausch von NADP+ durch NADPH
keine strukturellen Änderungen ergeben.29 Diese Bindung ist in allen SDRs hoch konserviert. Der
größte Unterschied zu Ketoreduktasen aus der FAS besteht aus einem 10 Aminosäuren langen
Einschub zwischen den Helices α6 und α7, welcher durch Sequenzvergleiche auch in anderen
Ketoreduktasen aus aromatischen PKS-Clustern gefunden wurde. Docking-Experimente mit dem
Acyl-Carrier-Protein lassen vermuten, dass dieser Bereich von Monomer A und C die Bindestelle des
Acyl-Carrier-Proteins darstellt. Weitere Docking-Experimente mit einem Polyketid zeigen, dass das
zyklisierte Substrat optimal in die Substrat-Bindetasche passt. Die C-9 Ketogruppe ist dann so
positioniert, dass ein Hydrid regio- und stereospezifisch übertragen werden kann.29,30 In Abbildung 2-5
ist das katalytische Zentrum von ActKR dargestellt. Dieses besteht aus vier gebundenen
Wassermolekülen, NADPH und den Aminosäuren N114, S144, Y157 und K161. Wasserstoffbrücken
existieren zwischen den Aminosäuren Y157, K161, der Ribose von NADPH, sowie zwischen S144,
Y157 und dem Substrat. Letztere bilden das sogenannte Oxyanionloch. Die vier Wassermoleküle sind
fest an die Aminosäuren N114 und K161 gebunden und spielen eine wichtige Rolle in der
Reprotonierung von Y157 (proton-relay mechanism). Nach dem Hydridtransfer von NADPH auf das
Substrat wird das entstandene Alkoholat durch das Oxyanionloch stabilisiert bis schließlich ein Proton
von Y157 übertragen wird. Darauffolgend wird Y157 durch eine umfangreiche Protonenübertragung
23
Einleitung
wieder protoniert, welche die 2-Hydroxygruppe, Lysin und schließlich die vier gebundenen
Wassermoleküle einschließt.29
Abbildung 2-5 Katalytische Tetrade der vorgeschlagenen Protonen-Übertragung bei der Reduktion der C-9
Ketogruppe durch ActKR. Das aktive Zentrum besteht aus vier H2O-Molekülen (nicht alle gezeigt), NADPH und der
katalytischen Tetrade (N114, S144, Y157 und K161). Wasserstoffbrücken sind in türkis dargestellt.30
Javidpour et al. konnten nachfolgend die Struktur von HedKR lösen und zeigen, dass das Enzym nicht
spezifisch ein Substrat mit einer bestimmten Kettenlänge reduziert. Sowohl Polyketidketten aus 16als auch aus 24-Kohlenstoffatomen werden durch HedKR reduziert. Außerdem zeigten DockingExperimente, dass die spezifische C-9 Reduktion die Zyklisierung des ersten Ringes zwischen C-7 und
C-12 voraussetzt.26
In vielen Clustern gibt es nicht nur Gene, welche für C-9 Ketoreduktasen codieren, sondern
zusätzliche Gene für ähnliche, aber ungewöhnliche Ketoreduktasen, wie beispielsweise BenL, eine
C-19 Ketoreduktase aus dem Benastatin-Cluster.31 Lackner et al. konnten zeigen, dass sowohl das
Zyklisierungsmuster als auch die Regiochemie der Ketoreduktion durch einen Sequenzvergleich der
Ketoreduktasen voraussagbar ist. Durch eine phylogenetische Analyse von Ketoreduktasen mit
bekannter und unbekannter Funktion konnte gezeigt werden, dass sich die typischen Ketoreduktasen
entsprechend ihrer Regioselektivität und dem Zyklisierungsmuster in mindestens vier verschiedene
Gruppen einteilen lassen.24 Die Gruppe IV beinhaltet spezifische C-9 Ketoreduktasen von
Benzoisochromanchinonen wie Actinorhodin und Granaticin, Anthracyclinen wie Aklacinomycin und
Angucyclinen wie Jadomycin und Urdamycin. C-17 Ketoreduktasen aus der Anthracyclin-Biosynthese
bilden die Gruppe II, während die Gruppe III C-15 Ketoreduktasen aus der Biosynthese der
Angucyclin-Antibiotika beinhaltet. Die Gruppe I besteht aus C-19 Ketoreduktasen, welche
24
Einleitung
fünfgliedrige Ringsysteme reduzieren. Diese bildet eine Superfamilie zusammen mit Gruppe II und
Gruppe III.24
2.3.2 Cyclasen und Aromatasen
In Typ II PKS-Clustern sind bis zu drei Cyclasen codiert. Dies, kombiniert mit den relativ langen
Polyketidketten, führt zu einer enormen Vielfalt an möglichen Zyklisierungsmustern. Neben Cyclasen
tragen häufig auch Aromatasen zur Zyklisierung bei. Diese Enzyme dehydratisieren zyklische
Alkohole und führen so zur Bildung von Aromaten.21 Obwohl die Cyclasen eine sehr heterogene
Gruppe bilden und sich sowohl in der Sequenz, als auch in der Proteinstruktur stark unterscheiden,
katalysieren sie alle spezifische Aldolkondensationen und funktionieren dabei ähnlich wie Chaperone.
Die Aromatisierung des entstehenden Rings wird schließlich durch Aromatasen unterstützt.5
Manchmal werden beide Reaktionen auch von demselben Enzym katalysiert, wie zum Beispiel in der
Biosynthese von R1128. Hierbei wird die Bildung des ersten aromatischen Rings durch die ARO/CYC
ZhuI und die Bildung des zweiten Rings durch die CYC ZhuJ katalysiert.32 Die richtige Zyklisierung
des ersten Rings wird außerdem durch die minimale PKS und, falls vorhanden, durch die
Ketoreduktase stark beeinflusst. So führen unvollständige PKS II-Systeme zu spontanen
Zyklisierungen der Polyketidkette mit verschiedenen Kettenlängen und Zyklisierungsmustern. 33 Dies
zeigt, dass diese Enzyme hoch organisiert und aufeinander abgestimmt arbeiten müssen, um ein
definiertes
Produkt
zu
generieren.21
Durch
weitere
gezielte
Geninaktivierungs-
und
Co-Expressionsexperimente konnte gezeigt werden, dass jede Zyklisierung durch eine bestimmte
Cyclase katalysiert wird.34–36 So ist beispielsweise eine Cyclase für die Bildung des zweiten Rings und
eine für die Bildung des dritten Rings verantwortlich. Im Biosynthesegencluster von Tetracenomycin
sind drei Cyclasen codiert. Shen et al. erforschten diese und konnten die CYC TcmJ der ersten, TcmN
der zweiten und TcmI der letzten Zyklisierung zuordnen. Interessanterweise ist das Substrat für TcmN
und TcmJ an das Acyl-Carrier-Protein gebunden, während TcmI die letzte Zyklisierung am freien
Substrat katalysiert. Zudem stellten sie die Hypothese auf, dass TcmJ und TcmN wesentliche
Bestandteile des PKS-Komplexes sind und dadurch falsche Zyklisierungen verhindern, aber auch zu
einer effizienteren Polyketid-Produktion führen.34–36 Je nach Zusammenarbeit der minimalen PKS,
Ketoreduktasen und Cyclasen können die entstehenden Ringsysteme in verschiedene Gruppen
eingeordnet werden. So entstehen unter anderem Anthracycline, Benzoisochromanchinone,
Tetracycline, Angucycline oder sogar fünfgliedrige Ringsysteme.5
25
Einleitung
2.4
Post-modifizierende Enzyme
Post-modifizierende Enzyme arbeiten, nachdem das Polyketid vom PKS-Komplex freigesetzt wurde.
Das entstandene Polyketid kann weiter zyklisiert werden, C-C Bindungen können gebrochen werden
oder Umlagerungen können stattfinden. Am Ende der Biosynthese werden die Polyketide meist noch
weiter modifiziert, wodurch die enorme Substanzvielfalt noch vergrößert wird. Außerdem haben diese
Modifizierungen auch einen großen Einfluss auf die pharmakologischen und pharmakodynamischen
Eigenschaften der gebildeten Naturstoffe. Übliche Modifikationen sind hierbei Glykosylierungen,
Alkylierungen, Hydroxylierungen und Epoxidierungen. Durch die nachträgliche Einführung dieser
funktionellen Gruppen können neue Stereozentren entstehen, sie können die Hydrophilie verändern
und auch die biologische Aktivität stark beeinflussen.5,8,21
2.4.1 Transferasen
Das zyklisierte Polyketid wird vom PKS-Komplex freigesetzt und kann dann durch weitere Enzyme
modifiziert werden. Häufig werden zusätzliche Gruppen eingebracht, zum Beispiel durch
Methyltransferasen oder Glykosyltransferasen. Diese können sowohl auf Sauerstoff-, Stickstoff- oder
auch direkt auf Kohlenstoffatome übertragen werden.8
Methyltransferasen aus PKS-Clustern verwenden häufig S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) als
Cofaktor, seltener wird auch Biotin oder Tetrahydrofolat verwendet.37 Ein Beispiel für drei SAMabhängige O-Methyltransferasen sind TcmN, TcmO und TcmP, welche mehrere Methylierungen in
der Biosynthese von Tetracenomycin C in Streptomyces glauescens katalysieren.38 Ebenfalls SAMabhängig sind die Methyltransferasen MtmMI und MtmMII aus dem Mithramycin-Cluster. MtmMI
katalysiert die O-Methylierung, während MtmMII ein Beispiel für eine C-Methyltransferase
darstellt.37 Neben Methylierungen an der Kernstruktur gibt es auch Enzyme, welche angehängte
Zuckerreste methylieren können, wie beispielsweise OleY in der Biosynthese von Oleandomycin in
Streptomyces antibioticus.39
Glykosyltransferasen übertragen aktivierte Zuckerreste auf ein Polyketid, welches Aglykon genannt
wird. Zuckerreste spielen eine bedeutende Rolle bei der Bioaktivität von vielen Naturstoffen. So
konnten beispielsweise Vilches et al. zeigen, dass Oleandomycin durch die Verknüpfung mit Glucose
deutlich an antibiotischer Aktivität gegen Micrococcus luteus verliert. Da die verantwortliche
Glykosyltransferase im Zellextrakt von S. antibioticus, dem Oleandomycin-Produzenten, enthalten
war, postulierten Vilches und seine Mitarbeiter einen Resistenzmechanismus. Dieser Mechanismus
soll den produzierenden Stamm durch Glykosylierung des gebildeten Oleandomycins schützen und
dazu führen, dass der Zuckerrest erst außerhalb der Zelle durch ein zweites Enzym wieder entfernt
wird.40 Ein gegenteiliges Beispiel stellt Landomycin A aus Streptomyces cyanogenus S136 dar. Durch
die Hexasaccharidkette, welche durch die vier Glykosyltransferasen LanGT1, LanGT2, LanGT3 und
LanGT4 gebildet wird, kann eine deutliche Steigerung der Zytotoxizität erreicht werden.41
26
Einleitung
2.4.2 Oxidoreduktasen
Die häufigsten post-PKS Modifikationen werden durch Oxidoreduktasen katalysiert. Diese Gruppe
beinhaltet Oxygenasen, Oxidasen, Peroxidasen, Reduktasen und Dehydrogenasen. Diese Enzyme
führen entweder sauerstoffhaltige Guppen ein oder oxidieren bzw. reduzieren vorhandene
sauerstoffhaltige Guppen. Monooxygenasen und Dioxygenasen verwenden molekularen Sauerstoff um
Hydroxy- und Epoxygruppen bzw. letztere Peroxogruppen einzuführen. Oxidasen und Peroxidasen
können sowohl Sauerstoff einführen als auch Dehydrierungsreaktionen katalysieren. Sie unterscheiden
sich lediglich durch den verwendeten Elektronenakzeptor. So verwenden Oxidasen molekularen
Sauerstoff, während Peroxidasen Wasserstoffperoxid gebrauchen.8
2.4.3 Flavoenzyme
Eine spezielle Gruppe post-modifizierender Enzyme bilden die Flavoenzyme. Diese sind in der Lage
molekularen Sauerstoff durch einen reduzierten Flavin-Cofaktor zu aktivieren und dadurch Sauerstoff
in ein Molekül einzuführen.42 Dabei können Flavoenzyme eine Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen
regio- und/oder enantioselektiv katalysieren, wie zum Beispiel Hydroxylierungen, Epoxidierungen
und Baeyer-Villiger-Oxidationen.43
Flavin-abhängige Enzyme können basierend auf Sequenzähnlichkeiten, spezifischen Sequenzmotiven
und strukturellen Eigenschaften in sechs Untergruppen (A-F) eingeteilt werden. Gruppe A und B
bilden FAD-abhängige Enzyme, welche durch ein einzelnes Gen codiert sind und entweder eine oder
zwei Dinukleotid-Binde-Domänen (Rossman-Faltung) aufweisen. Die Gruppen C-F bilden
Multikomponenten-Monooxygenasen, welche aus einer Monooxygenase und einer Reduktase
bestehen. Die Monooxygenase wird dabei durch ein oder zwei Gene codiert, während für die
Reduktase nur ein Gen vorliegt. Die meisten Flavoenzyme (Gruppe A,B, D-F) sind FAD-abhängig,
lediglich Gruppe C beinhaltet FMN-abhängige Enzyme.43 Der wohl bekannteste Vertreter dieser
Gruppe ist die bakterielle Luciferase, welche durch die Oxidation von langkettigen Aldehyden in der
Lage ist, Licht zu emittieren. Die Struktur der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi wurde 1995
aufgeklärt und besteht aus zwei Untereinheiten, welche beide eine TIM-Barrel Faltung aufweisen.44,45
Diese Struktur ist ebenfalls ein entscheidendes Merkmal der Gruppe C.
Unabhängig von der Struktur der Flavoenzyme kann die katalysierte Reaktion in zwei Halbreaktionen
aufgeteilt werden. Als Erstes findet die reduktive Halbreaktion statt, wobei der Flavin-Cofaktor durch
die Monooxygenase (Gruppe A,B) oder die Reduktase (Gruppe C-F) mittels NADH oder NADPH
reduziert wird. Anschließend reagiert der reduzierte Cofaktor mit Sauerstoff und das reaktive
Intermediat Flavin-4a-hydroperoxid entsteht. Dieses kann in der zweiten reoxidativen Halbreaktion
auf vier verschiedene Arten reagieren. Erstens kann es spontan Wasserstoffperoxid freisetzen,
wodurch wieder das oxidierte Flavin entsteht. Zweitens kann die schwache O-O Bindung gespalten
werden, um ein Sauerstoffatom auf ein elektronenreiches Substrat zu übertragen. Drittens kann das
27
Einleitung
Flavin-4a-hydroperoxid durch eine Halogenase zu einem HOCl-Intermediat umgewandelt werden, um
Substrate zu halogenieren und viertens kann das Peroxyflavin auch als Nucleophil in Baeyer-VilligerReaktionen reagieren. Ob das Peroxyflavin als Nucleophil oder Elektophil reagiert, hängt vor allem
davon ab, ob es protoniert oder deprotoniert vorliegt. Dies kann durch die Aminosäuren der
Bindetasche, welche in der Nähe des C-4a-Atoms liegen, moduliert werden.46
In der Biosynthese aromatischer Polyketide findet man sowohl Flavin-abhängige Hydroxylasen,
Baeyer-Villiger Monooxygenasen als auch Epoxidasen. Ein gut untersuchtes Beispiel für eine
Hydroxylase ist PgaE. Dieses Enzym ist FAD-abhängig und katalysiert die Hydroxylierung an C-12 in
der Biosynthese von Gaudimycin C.47,48 Durch Flavoenzyme katalysierte Baeyer-Villiger-Oxidationen
wurden unter anderem in der Biosynthese von Mithramycin und Griseorhodin identifiziert.49–51 Diese
Reaktionen sind besonders eindrucksvoll, da sie durch C-C Bindungsspaltungen und Umlagerungen zu
neuen einzigartigen Strukturen führen können. Ebenfalls von besonderer Bedeutung ist die Einführung
von Epoxiden, da diese die biologische Aktivität eines Naturstoffs erheblich beeinflussen können.
Häufig werden diese Epoxidgruppen durch Cytochrom P450-abhängige Enzyme eingeführt, allerdings
können diese Reaktionen auch von Flavin-abhängigen Enzymen katalysiert werden. Das wohl
bekannteste Beispiel in diesem Zusammenhang ist die Squalen-Monooxygenase, welche eine
terminale Doppelbindung in Squalen epoxidiert. Aber auch in PKS II-Clustern wurden Flavinabhängige Enzyme identifiziert, welche Epoxide einführen können. So konnte für die ZweiKomponenten Monooxygenase ActVA-ORF5/ActVB aus dem Actinorhodin-Cluster in vitro eine
Epoxidierungsaktivität nachgewiesen werden.52 Interessanterweise katalysiert dieses Enzym in vivo
aber die Hydoxylierung von Dihydrokalafungin als letzten Schritt in der Actinorhodin-Biosynthese.53–
55
Ein weiteres Beispiel ist die vermutlich FAD-abhängige Monooxygenase HedG aus dem
Hedamycin-Cluster. Es wurde postuliert, dass dieses Enzym an der Bisepoxidierung der Seitenkette
beteiligt ist. Allerdings besitzt das Cluster auch ein Cytochrom P450-abhängiges Enzym HedR,
welches diese Reaktionen ebenfalls katalysieren könnte.56
28
Einleitung
2.5
Mensacarcin
Aus einer Bodenprobe, welche in der Nähe der Göttinger Nordmensa gesammelt wurde, konnte der
Stamm Streptomyces bottropensis Goe C4/4 isoliert werden. Dieser fiel bei einem Circulardichroismus
(CD)-Screening durch die Produktion einer sehr CD-aktiven Substanz auf. Dabei handelte es sich um
die zytotoxisch und zytostatisch wirksame Substanz Mensacarcin.57 Durch das Screening einer
Cosmid-Bibliothek des Stammes S. bottropensis konnten drei PKS II-Gencluster identifiziert werden.
Das msn-Cluster, welches für die Biosynthese von Mensacarcin verantwortlich ist, das rsl-Cluster für
die Rishirilid-Biosynthese und schließlich das msc-Cluster. Dieses codiert wahrscheinlich für ein
Sporenpigment.58
2.5.1 Der PKS II-Metabolit Mensacarcin
Mensacarcin
zeichnet
sich
durch
seine
aromatische
Grundstruktur
und
seinen
hohen
Oxygenierungsgrad aus. Es besitzt ein trizyklisches Dekaketid-Grundgerüst, welches aus zehn
Acetateinheiten aufgebaut ist. Nennenswert sind dabei auch die insgesamt neun Stereozentren und die
zwei Epoxidgruppen. Durch Fütterungsexperimente mit isotopmarkierten [1,2-13C2]- und [1-13C]Acetateinheiten konnten Yan et al. belegen, dass Mensacarcin durch eine PKS vom Typ II gebildet
wird. Außerdem konnten durch Fütterungsexperimente mit L-[Methyl-13C]-Methionin und
Kultivierung unter [O2]-Atmosphäre weitere Erkenntnisse über die Biosynthese gewonnen werden.
Durch diese Experimente konnte belegt werden, dass die Methylierung der Hydroxygruppen an C-9
und C-10 durch das Methylierungsmittel S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) erfolgt. Des Weiteren
konnte gezeigt werden, dass die Sauerstoffatome an C-2, C-4, C-4a/C-10a, C-5 und C-12/C-13 aus
Luftsauerstoff stammen.58
Abbildung 2-6 Ergebnis der Fütterungsexperimente mit verschiedenen isotopmarkierten Vorläufermolekülen. 58 Es
konnte gezeigt werden, dass die gesamte Polyketidkette von Mensacarcin aus Acetateinheiten aufgebaut ist. Zudem wurde
nachgewiesen, welche Sauerstoffatome von molekularem Sauerstoff abstammen. Auch die Herkunft der Methylgruppen aus
S-Adenoysl-L-Methionin konnte belegt werden.
29
Einleitung
2.5.2 Die Mensacarcin-Biosynthese
Durch Screening einer Cosmid-Bibliothek konnten drei PKS II-Cluster gefunden werden. Durch die
heterologe Expression des Cosmids Cos2 in Streptomyces albus J1074 konnte das Cluster dieses
Cosmids der Mensacarcin-Biosynthese zugeordnet werden. Allerdings produzierte der Stamm nicht
wie erwartet Mensacarcin, sondern das Vorläufermolekül Didesmethylmensacarcin (DDMM). Dieses
unterscheidet sich von Mensacarcin lediglich durch das Fehlen der zwei Methylgruppen an den
Hydroxygruppen in Position C-9 und C-10. Durch eine Sequenzierung und eine nachfolgende
Sequenzanalyse des Cosmids konnten 34 offene Leserahmen (open reading-frames, ORFs)
identifiziert werden, welche 23 Strukturgene und zwei Regulatorgene beinhalten. Des Weiteren
wurden neun Gene postuliert, welche für putative Proteine mit noch unbekannter Funktion codieren.
Gene für die SAM-Regeneration und den Methyltransfer fehlen auf dem Cosmid und sind
wahrscheinlich der Grund für die Produktion von DDMM im heterologen Wirt.58 Durch nachfolgende
Genexpressionsanalysen und Inaktivierungsexperimente konnte das ursprünglich auf 36,7 kb
postulierte Cluster um 10 kb verkürzt werden. Diese Verkürzung war möglich, da die Inaktivierung
der ersten fünf Gene msnH0-msnH4, welche für hypothetische Proteine codieren, keinen Einfluss auf
die DDMM-Biosynthese hatte.59 U. Hardter und K. Probst inaktivierten im Rahmen ihrer Promotionen
weitere Gene, welche für Luciferase-like Monooxygenasen (msnO2, msnO4 und msnO8),
Anthronoxygenasen (msnO5, msnO6 und msnO7) und Oxidoreduktasen (msnO9) codieren. Durch die
heterologe Expression der Inaktivierungskonstrukte und die Analyse der neuen Intermediate konnte
ein möglicher Biosyntheseweg für DDMM postuliert werden.59,60 Dieser ist in Abbildung 2-7
dargestellt.
30
Einleitung
Abbildung 2-7 Postulierter Biosyntheseweg für Didesmethylmensacarcin.59,60
Die Inaktivierungen der Gene msnO5, msnO6 und msnO9 führten zur Akkumulation desselben
Intermediats, welches sich unter anderem durch die fehlende Seitenkette von DDMM unterscheidet.
Dadurch konnte den entsprechenden Enzymen keine eindeutige Funktion zugeordnet werden. Auch
für MsnO7 konnte die Funktion nicht eindeutig geklärt werden, da die Inaktivierung lediglich zu einer
geringeren DDMM-Produktion führte. Mehr Aufschluss über die DDMM-Biosynthese lieferten die
Inaktivierungen der Gene, welche für die Luciferase-like Monooxygenasen codieren. Demnach könnte
MsnO2 die Doppelbindung zwischen C-12 und C-13 einführen, welche nachfolgend durch MsnO8
epoxidiert wird, während MsnO4 die Epoxidierung der Kernstruktur katalysiert.59,60
2.5.3 Biologische Aktivität von Mensacarcin
Mensacarcin zeichnet sich durch seine zytotoxische und zytostatische Aktivität aus, welche
vergleichbar mit dem des klinisch angewandten Doxorubicins ist.57 Dabei zeigte Mensacarcin in
Aktivitätsstudien nicht nur Aktivität gegen die Zelllinien HMO 2 (Magenadenocarcinom), HEP G2
(Lebercarcinom) und MCF 7 (Mammacarcinom) sondern auch gegen die multiresistente Zelllinie
KATO III (Koloncarcinom). Zur Untersuchung des Wirkmechanismus wurden Aktivitätsstudien mit
verschiedenen Mensacarcin-Derivaten durchgeführt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die
antitumorale Wirkung stark von der Epoxidgruppe der Seitenkette abhängt und sich mit abnehmender
Elektrophilie der Seitenkette verringert. So nimmt die Aktivität in der Reihenfolge Mensacarcin
(Epoxid), Deoxymensacarcin (Olefin) zu Mensacarcindiol (Diol) ab. Derivate wie Mensapyran oder
31
Einleitung
Mensafuran, in welchen die Seitenkette durch eine Ringstruktur fixiert ist, zeigten sogar keine
Aktivität mehr. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde ein möglicher Wirkmechanismus postuliert.
Demnach ist es sehr wahrscheinlich, dass Stickstoff-haltige Moleküle wie DNA oder Proteine durch
die Epoxidfunktion alkyliert werden.61 Da aber auch Deoxymensacarcin eine schwache
Antitumoraktivität aufweist, wurde zusätzlich zur alkylierenden Wirkung eine Interkalation in die
DNA postuliert. Da Mensacarcin ein annähernd planares Grundgerüst aufweist, könnte sich die
Substanz, ähnlich wie Doxorubicin, in die DNA-Doppelhelix interkalieren und so die Replikation und
Transkription verhindern.62 Ein sowohl alkylierender als auch interkalierender Mechanismus wurde
auch für Hedamycin nachgewiesen. Das planare Grundgerüst von Hedamycin interkaliert so in die
DNA, dass die Aminozuckerreste in der kleinen Furche zu liegen kommen und die Seitenkette mit den
zwei Epoxiden in der großen Furche. Das terminale Epoxid der Hedamycinseitenkette reagiert dabei
mit N-7 von Guanin.63
32
Einleitung
2.6
Mycothiol–Biosynthese und Funktion
Die Aminosäure Cystein ist universell in allen Zellen vorhanden und notwendig für die
Proteinbiosynthese. Da freies Cystein sehr anfällig für die metallkatalysierte Autoxidation ist,
wodurch toxische reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) entstehen, wird es in
vielen Organismen in Form von Glutathion (GSH) gelagert. Dieses ist weniger anfällig für die
Autoxidation und schützt die Zelle zudem vor oxidativem Stress. Actinobakterien haben einen anderen
Weg entwickelt, sich zu schützen und produzieren stattdessen das stabilere Mycothiol (MSH, AcCysGlcN-INS), welches analoge Funktionen zu GSH besitzt.64 Die Autoxidation von MSH erfolgt 7 mal
langsamer im Vergleich zu GSH und sogar 30 mal langsamer im Vergleich zu freiem Cystein. 65 Die
Biosynthese von MSH ist komplexer als die von GSH und wurde erst im Laufe des letzten Jahrzehnts
teilweise aufgeklärt.
Abbildung 2-8 Schematische Darstellung der MSH-Biosynthese.66
Eine schematische Übersicht der MSH-Biosynthese ist in Abbildung 2-8 dargestellt. Vier der fünf
benötigten Proteine sind bisher bekannt und genauer untersucht worden. Im ersten Schritt der
Biosynthese wird GlcNAc-InsP aus UDP-GlcNAc und Inositolphosphat (Ins-P) durch die Mycothiol-
33
Einleitung
Glykosyltransferase MshA gebildet.67,68 Als nächstes erfolgt eine Dephosphorylierung durch eine noch
nicht identifizierte Phosphatase, welche als MshA2 bezeichnet wird. Durch eine darauffolgende
Deacetylierung durch MshB entsteht GlcN-Ins.69 Die ATP-abhängige Ligation von Cystein an Glc-Ins
wird durch das Enzym MshC katalysiert.70 Im letzten Schritt der Biosynthese wird die Aminogruppe
von Cystein durch MshD acetyliert, wodurch schließlich MSH gebildet wird.71
Alle bekannten Gene der MSH-Biosynthese wurden im Modellorganismus Mycobacterium smegmatis
inaktiviert und die Mutanten genauer analysiert. Diese sind sensitiver gegenüber oxidativem Stress,
zum Beispiel durch Wasserstoffperoxid, aber auch gegen Antibiotika wie Rifamycin oder
Streptomycin und alkylierende Substanzen.67,72–74 Dies zeigt, dass MSH oder MSH-abhängige Enzyme
die Zellen vor oxidierenden Substanzen und Toxinen schützen. Dass MSH auch zur Entgiftung von
Antibiotika dient, zeigen Mercaptursäurederivate von Ansamycin, Naphthochinon und anderen
Antibiotika,
welche
in
Kulturüberständen
gefunden
wurden.75
Auch
bei
den
DDMM-
Inaktivierungsmutanten S. albus Cos2∆O4 x pKR1 und S. albus Cos2∆O8 x pKR1 kam es zur
Akkumultion von DDMM-Intermediaten mit einem N-Acetylcysteinrest (Msn-KP2, Msn-KP2a und
Msn-KP3).59 Ob dieser Rest aus dem Mycothiol-abhänigen Entgiftungsweg stammt, ist Gegenstand
dieser Arbeit. In Abbildung 2-9 ist die Entgiftung durch MSH vereinfacht dargestellt.
Abbildung 2-9 Vereinfachte Darstellung der Entgiftung von Toxinen durch MSH. 76
Die Entgiftung durch MSH wurden von Newton et al. am Beispiel der alkylierenden Substanz
Monobromobiman (mBBr) genauer untersucht, welche Zellen durch aktive Diffusion penetriert. Das
in den Zellen in millimolaren Mengen vorkommende MSH reagiert sehr schnell mit der Substanz und
34
Einleitung
bildet das MSH-S-Konjugat MSmB. Ob diese Reaktion spontan oder Enzym-katalysiert abläuft, ist
noch nicht eindeutig geklärt. Das entstandene Produkt wird sofort durch eine MSH S-Konjugat
Amidase (Mca) in GlcN-Ins und AcCySmB gespalten. Das Mercaptursäurederivat wird dann von der
Zelle in das Medium abgegeben und der GlcN-Ins Rest wird zur Regeneration von MSH verwendet.76
35
Einleitung
2.7
Die Biosynthese von F420
Der Cofaktor F420 wurde erstmals 1972 aus methanogenen Archaeen isoliert und wurde wegen seiner
intensiven
Absorption
bei
420 nm
F420
genannt.77
Strukturell
ist
F420
durch
sein
Isoalloxazinchromophor sehr ähnlich zu anderen Flavinen wie FMN oder FAD. Sein niedriges
Elektronenpotential (-360 mV) ist aber eher mit NADH (-320 mV) vergleichbar. Der Cofaktor ist
essentiell für viele Enzyme aus dem Energiestoffwechsel oder der Antibiotikabiosynthese in
methanogenen Archaeen, Actinobakterien und Cyanobakterien.77–79 F420-abhängige Enzyme konnten
in der Biosynthese von Lincomycin und Tetracyclin gefunden werden und es wird postuliert, dass
auch an der Biosynthese von Mitomycin C und Kasugamycin F420-abhängige Enzyme beteiligt sind.80–
83
Abbildung 2-10 Biosynthese von F420. Die Abbildung wurde von Bashiri et al. übernommen und mit neueren
Forschungserkenntnissen ergänzt.84,85
36
Einleitung
Die Biosynthese von F420 ist bisher noch nicht vollständig geklärt, vermutlich werden aber sechs
Enzyme benötigt. Die FO-Synthase, welche in Archaeen und Cyanobakterien aus den Untereinheiten
CofG und CofH zusammengesetzt ist, wird in Actinobakterien als einzelnes bifunktionelles Enzym
FbiC gebildet.86 Dieses verbindet 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion aus der FlavinBiosynthese mit Tyrosin.85 Dabei entsteht der eigentlich reaktive Teil (FO) von F420. Dieser konnte
auch schon in E. coli durch die Überexpression der FO-Synthase produziert werden.79 Auf FO wird
L-Lactyl-2-diphospho-5`-guanosin
(LPPG) durch die 2-Phospho-L-lactat-Transferase FbiA bzw. CofD
übertragen.87 Im letzten Schritt der Biosynthese werden bis zu sieben Glutamatreste an den Lactatrest
angehängt. Die Art der Verknüpfung und die Länge des Glutamatschwanzes variieren dabei je nach
Organismus. So werden beispielsweise in Methanococcus jannaschii zwei Glutamatreste durch CofE
an F420-0 γ-verknüpft und anschließend erfolgt die α-Anknüpfung eines dritten Glutamatrestes durch
das homologe Enzym CofF.88 In M. smegmatis dagegen kann das Enzym CofE bis zu fünf
γ-verknüpfte Glutamatreste an F420-0 anhängen.89 Ungeklärt ist bislang noch ein Schritt in der
Biosynthese von LPPG. Es konnte gezeigt werden, dass L-Lactaldehyd aus der Lactatbiosynthese
durch CofA zu L-Lactat reduziert wird.90 Im nächsten Schritt wird dieses zu 2-Phospho-L-lactat
umgesetzt, wobei für diese Reaktion noch kein Enzym identifiziert werden konnte. CofC katalysiert
schließlich die Verknüpfung von GTP mit 2-Phospho-L-lactat zu LPPG unter Freisetzung von
Diphosphat.91
37
Einleitung
2.8
Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Luciferase-like Monooxygenase MsnO8 aus dem DDMM-Cluster
charakterisiert werden. Hierfür sollte das Protein in Escherichia coli produziert und anschließend
aufgereinigt werden. Zum eindeutigen Nachweis der Funktion sollte ein in vitro Aktivitätsassay
entwickelt werden. Außerdem sollte die Proteinstruktur in Kooperation mit T. Pflüger gelöst werden,
um weitere Einblicke in das katalytische Zentrum und die Cofaktor- und Substratbindetasche zu
erhalten.
Des Weiteren sollte die Biosynthese des Sekundärstoffs DDMM untersucht und weiter aufgeklärt
werden. Insbesondere sollte die Funktion der Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und MsnO11
analysiert werden. Hierfür sollten die entsprechenden Gene mittels Redirect® Technology auf dem
Cosmid Cos2 inaktiviert werden. Die Reinigung und Strukturaufklärung der akkumulierten
Intermediate im heterologen Wirt S. albus sollte zur Aufklärung der DDMM-Biosynthese beitragen.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit sollte auf der Aufklärung der Funktion der Proteine MsnO3 und
MsnH7 liegen. Die Inaktivierung von msnO3 sollte einen Hinweis darauf geben, welchem Protein der
DDMM-Biosynthese MsnO3 reduziertes FMN liefert. Das Gen msnH7 codiert für ein Protein mit
unbekannter Funktion. Die Inaktivierung des Gens und die Analyse der entsprechenden Mutante
S. albus Cos2∆H7 x pKR1 sollte deshalb im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt werden.
38
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1
Labor- und Analysengeräte
Tabelle 3-1: Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller und Herkunftsort.
Labor-/Analysengeräte
Hersteller und Herkunftsort
Äkta FPLC
GE Healthcare (Freiburg, D)
Agarosegel-Elektrophoresekammer und
Zubehör
GE Healthcare (Freiburg, D)
HPLC/ESI-MS analytisch: Agilent 1100
Serie, automatischer Probengeber G1313A,
Säulenofen G1316A, quaternäre Pumpe
G1311A, DAD G1315B, QuadrupolMassendetektor G1946D, ESI-Quelle
Agilent (Waldbronn, D)
PCR Geräte: Mastercycler Epgradient
Eppendorf (Hamburg, D)
GeneAmp® PCR System 9700
Applied Biosystems (Darmstadt, D)
pH-Meter
Schott Instruments GmbH (Mainz, D)
Protein-Elektrophorese-Kammer (vertikal):
Biorad Laboratories GmbH (München, D)
Mini-PROTEAN mit Zubehör und
Spannungsgeber PAC3
SE 600 Elektrophoresekammer mit Zubehör
und Spannungsgeber
Hoefer (Freiburg, D)
Spektrometer Ultrospec 2100 pro
Amersham Pharmacia (Oldendorf, D)
UV-Transilluminator Image Master VDS zur
Geldokumentation (312 nm)
Amersham Pharmacia (Oldendorf, D)
Vacuum-Concentrator BA-VC-300 U
Helmut Saur Laborbedarf (Reutlingen, D)
Vortex Reax top
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG
(Schwabach, D)
Wasser-Filteranlage
Millipore (Billerica, USA)
Zentrifuge 5415 R: Minireaktionsgefäße
1,5 mL; 2 mL
Eppendorf (Hamburg, D)
39
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-1 : Verwendeten Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller und Herkunftsort.
Labor-/Analysengeräte
Hersteller und Herkunftsort
Zentrifuge Avanti J-6000
Beckmann Coulter (Krefeld, D)
Zentrifuge Rotina 35 R: Falcon Tubes 15 mL;
50 mL
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
(Tuttlingen, D)
3.2
Chemikalien, Medienbestandteile, Enzyme, Kits und
Verbrauchsmaterialien
3.2.1 Chemikalien und Medienbestandteile
Tabelle 3-2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und Herkunftsort.
Substanz
Hersteller und Herkunftsort
Acrylamid-Lösung
Roth (Karlsruhe, D)
Agar-Agar
Roth (Karlsruhe, D)
Agarose GTQ
Roth (Karlsruhe, D)
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Roth (Karlsruhe, D)
Anorganische Salze zur Herstellung von
Puffern, Medien und Lösungen
Sigma-Aldrich (Deisenhofen, D);
Merck (Darmstadt, D);
Roth (Karlsruhe, D)
Bäckerhefe
Alnatura GmbH (Bickenbach, D)
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Galaktopyranosid
(X-Gal)
AppliChem GmbH (Darmstadt, D)
Bromphenolblau
Roth (Karlsruhe, D)
Bovines Serumalbumin (BSA)
Promega (Mannheim, D)
CASO Bouillon
Roth (Karlsruhe, D)
Coomassie Brilliant Blue G-250
Roth (Karlsruhe, D)
Coomassie Brilliant Blue R-250
Serva (Heidelberg, D)
40
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und
Herkunftsort.
Substanz
Hersteller und Herkunftsort
Desoxynukleotide (dNTPs)
Promega (Mannheim, D);
NEB (Ipswich, USA)
Dextrin
Roth (Karlsruhe, D)
Dinatriumethylendiamintetraessigsäure
(EDTA)
Roth (Karlsruhe, D)
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Roth (Karlsruhe, D)
Essigsäure/ Eisessig
Roth (Karlsruhe, D)
Ethidiumbromid
Roth (Karlsruhe, D)
FMN
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Glucose-6-phosphat
Roth (Karlsruhe, D)
Glycerin
Roth (Karlsruhe, D)
Glycin
Roth (Karlsruhe, D)
HCl
Roth (Karlsruhe, D)
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
(IPTG)
Roth (Karlsruhe, D)
Imidazol
Roth (Karlsruhe, D)
Kaliumacetat
Roth (Karlsruhe, D)
1 kb-Leiter NEB
NEB (Ipswich, USA)
LB-Medium (Lennox)
Roth (Karlsruhe, D)
D-Mannitol
Roth (Karlsruhe, D)
Methylenblau
Merck (Darmstadt, D)
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
(MOPS)
Roth (Karlsruhe, D)
NADH
Roth (Karlsruhe, D)
NaCl
Roth (Karlsruhe, D)
41
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und
Herkunftsort.
Substanz
Hersteller und Herkunftsort
NaOH
Roth (Karlsruhe, D)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Roth (Karlsruhe, D)
PageRuler, prestained
Fermentas, Fisher Scientific (Schwerte, D)
PageRuler, unstained
Fermentas, Fisher Scientific (Schwerte, D)
Protein Leiter, unstained
Fermentas, Fisher Scientific (Schwerte, D)
Quick Load® PCR DNA Leiter
NEB (Ipswich, USA)
Saccharose
Südzucker (Mannheim, D)
L-Selenomethionin
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Sojamehl, vollfett
W. Schoenenberger GmbH (Magstadt, D)
Soytone
Bectors, Dickinson and Company (Sparks,
USA)
N, N, N´,N´-Tetramethylethan-1,2-diamin
(TEMED)
Roth (Karlsruhe, D)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)
Roth (Karlsruhe, D)
TRIS-HCl
Roth (Karlsruhe, D)
Xylencyanol
Merck (Darmstadt, D)
42
Material und Methoden
Tabelle 3-3: Verwendete organische Lösungsmittel sowie deren Hersteller und Herkunftsort.
Substanz
Hersteller und Herkunftsort
Acetonitril (HPLC grade)
Roth (Karlsruhe, D)
Chloroform
Roth (Karlsruhe, D
Dichlormethan
Roth (Karlsruhe, D)
Dimethylformamid (DMF)
Roth (Karlsruhe, D)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Roth (Karlsruhe, D)
Essigsäureethylester
Roth (Karlsruhe, D)
Ethanol
Roth (Karlsruhe, D)
Isopropanol
Roth (Karlsruhe, D)
Methanol
Roth (Karlsruhe, D)
3.2.2 Antibiotika
Tabelle 3-4: Verwendete Antibiotika sowie deren Hersteller und Herkunftsort.
Substanz
Hersteller und Herkunftsort
Ampicillin, Natriumsalz
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Apramycinsulfat
AppliChem (Darmstadt, D)
Fosfomycin, Dinatriumsalz
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Hygromycin B
Roth (Karlsruhe, D)
Kanamycinsulfat
Roth (Karlsruhe, D)
Spectinomycin
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Tetracyclin
Roth (Karlsruhe, D)
43
Material und Methoden
3.2.3 Enzyme und Kits
Tabelle 3-5: Verwendete Enzyme sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Enzym
Hersteller und Herstellungsort
DNA-Restriktionsendonukleasen, Puffer je nach
Enzym, BSA
NEB (Ipswich, USA);
Promega (Mannheim, D)
DNase
NEB (Ipswich, USA)
Catalase
Sigma-Aldrich (Seelze, D)
Lysozym aus Hühnereiweiß
Fluka (Taufkirchen, D)
Pfu-Polymerase (5 U),
eigene Herstellung
Pfu-Polymerasepuffer 10-fach
eigene Herstellung
Proteinase K
Promega (Mannheim, D)
RNase A
Qiagen (Hilden, D)
Taq-Polymerase (5 U),
eigene Herstellung
Taq-Polymerasepuffer 10-fach
eigene Herstellung
T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase Puffer 10-fach Promega (Mannheim, D)
Tabelle 3-6: Verwendete Kits sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Kit
Hersteller und Herstellungsort
PureYieldTM Pasmid Midiprep System Kit
Promega (Mannheim, D)
Wizard®Plus SV Miniprep Kit
Promega (Mannheim, D)
Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kit
Promega (Mannheim, D)
44
Material und Methoden
3.2.4 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 3-7: Verwendete Verbrauchsmaterialien sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Bezeichnung
Hersteller und Herstellungsort
Affinitätschromatographiesäule 5 mL HisTrap™
FF
GE Healthcare UK Ltd
(Buckinghamshire, UK)
DC-Fertigplatten Adamant UV254
Macherey-Nagel (Düren, D)
Gelfiltrationssäule HiLoad™ 16/60 Superdex
200
GE Healthcare UK Ltd
(Buckinghamshire, UK)
Ionentauscher HiPrep™ DEAE FF 16/60
GE Healthcare UK Ltd
(Buckinghamshire, UK)
1,5 mL und 2 mL Reaktionsgefäße
Roth (Karlsruhe, D)
Rotilabo®-Petrischalen, Durchmesser 10 cm
Roth (Karlsruhe, D)
Rotilabo®-Spritzenfilter, 0,45 µm, PVDF
Roth (Karlsruhe, D)
Rotilabo®-Spritzenfilter, steril, 0,2 µm, PVDF
Roth (Karlsruhe, D)
Vivaspin MWCO 30000
Sartorius (Göttingen, D)
Save-Lock Tubes 2 mL
Eppendorf (Hamburg, D)
Sephadex LH 20
Amersham Pharmacia Biotech AB
(Uppsala, SWE)
15 mL und 50 mL Zentrifugenröhrchen mit
Deckel
Roth (Karlsruhe, D)
45
Material und Methoden
3.3
Puffer und Lösungen
3.3.1 Antibiotika-Lösungen
Die in Tabelle 3-8 angegebenen Antibiotikalösungen wurden durch einen Porenfilter (0,22 µm)
sterilfiltriert und als Stammlösungen bei -20 °C gelagert.
Tabelle 3-8: Verwendete Antibiotikalösungen.
Antibiotikum
Lösungsmittel
Konzentration der
Stammlösung
Endkonzentration im
Medium
Ampicillin
H2Obidest
100 mg/mL
100 µg/mL
Apramycin
H2Obidest
100 mg/mL
50 µg/mL
Chloramphenicol
EtOH
25 mg/mL
25 µg/mL
Fosfomycin
H2Obidest
200 mg/mL
200 µg/mL
Hygromycin B
H2Obidest
50 mg/mL
50 µg/mL
Kanamycin
H2Obidest
100 mg/mL
100 µg/mL
Spectinomycin
H2Obidest
50 mg/mL
50 µg/mL
Tetracyclin
EtOH
12,5 mg/mL
12,5 µg/mL
3.3.2 Puffer zur Plasmidisolierung aus E. coli
Tabelle 3-9: Puffer zur Plasmidisolierung aus E. coli mittels alkalischer Lyse.
Bezeichnung
Bestandteile
P1
TRIS-HCl
50 mM
EDTA
10 mM
RNase A
100 µg/mL
NaOH
200 mM
SDS
1 % (m/V)
Kaliumacetat
3M
P2
P3
46
Anmerkung
auf pH 8,0 einstellen,
RNase A vor Gebrauch zugeben,
bei 4 °C lagern
auf pH 5,2 einstellen
Material und Methoden
3.3.3 Puffer zur Isolierung von genomischer DNA aus
Streptomyces spp.
Tabelle 3-10: Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Streptomyces spp.
Bezeichnung
Bestandteile
Anmerkung
SET-Puffer
TRIS-HCl
20 mM
EDTA
25 mM
NaCl
75 µg/mL
LysozymLösung
Lysozym
50 mg/mL
SDS-Lösung
SDS
1 % (m/V)
NaCl-Lösung
NaCl
5 mM
auf pH 8,0 einstellen
in SET-Puffer gelöst
3.3.4 Puffer und Lösungen zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Tabelle 3-11: Puffer und Lösungen zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Bestandteile
50 x TAE-Puffer
TRIS
2M
EDTA
0,05 mM
Eisessig
52,2 mL
Ladepuffer
Agarose-Lösung
Anmerkung
Bromphenolblau 0,25 % (m/V)
mit Eisessig auf pH 8,0
einstellen
in TE-Puffer pH 7,6 lösen
Saccharose
40 % (m/V)
Agarose
0,7 % (m/V)
in 1 x TAE-Puffer lösen,
bei 60 °C lagern
10 µg/mL
vor Licht geschützt lagern
Ethidiumbromid- Ethidiumbromid
Färbelösung
47
Material und Methoden
3.3.5 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen
Tabelle 3-12: Puffer zur Herstellung kompetenter Zellen
Bezeichnung
Bestandteile
Anmerkung
MgCl2-Lösung
MgCl2
100 mM
autoklavieren, bei 4 °C lagern
CaCl2-Lösung
CaCl2
100 mM
autoklavieren, bei 4 °C lagern
CaCl2-GlycerinLösung
Glycerin
15 % (m/V)
autoklavieren, bei 4 °C lagern
CaCl2
100 mM
Glycerin-Lösung
Glycerin
10 % (m/V)
autoklavieren, bei 4 °C lagern
3.3.6 Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE Gelelektrophorese
Tabelle 3-13: Puffer für die SDS-PAGE-Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Bestandteile
Laufpuffer
TRIS
25 mM
SDS
0,1 % (m/V)
Glycin
19,2 mM
Sammelgelpuffer TRIS
Anmerkung
0,5 M
SDS
0,4 % (m/V)
TRIS
1,5 M
SDS
0,4 % (m/V)
APS-Lösung
APS
10 % (m/V)
2x Ladepuffer
DTT
100 mM
SDS
5 % (m/V)
Glycerin
10 % (m/V)
TRIS
60 mM
Trenngelpuffer
Bromphenolblau Spatelspitze
Coomassie Blue
Coomassie Blue
0,5 % (m/V)
Färbelösung
EtOH
50 % (V/V)
Essigsäure
10 % (V/V)
48
auf pH 8,3 einstellen
auf pH 6,8 einstellen
auf pH 8,8 einstellen
auf pH 6,8 eingestellt
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-13: Puffer für die SDS-PAGE-Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Bestandteile
Anmerkung
Entfärbelösung
EtOH
25 % (V/V)
Essigsäure
10 % (V/V)
Tabelle 3-14: Bestandteile des Trenn- und Sammelgels.
Bezeichnung
Bestandteile
15 % Trenngel
Acrylamid Lösung
2,5 mL
Trenngelpuffer
1,25 mL
H2O
1,25 mL
APS-Lösung
50 μL
TEMED
50 μL
Acrylamid Lösung
0,5 mL
Trenngelpuffer
0,625 mL
H2O
1,375 mL
APS-Lösung
25 μL
TEMED
2,5 μL
6 % Sammelgel
Anmerkung
APS und TEMED werden zuletzt
zugegeben. Das gegossene Gel wird
mit Isopropanol überschichtet bis es
auspolymerisiert ist.
APS und TEMED werden zuletzt
zugegeben.
3.3.7 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen
Tabelle 3-15 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen.
Bezeichnung
Bestandteile
Anmerkung
SaccharoseLösung
Saccharose
25 % (m/V)
zur Herstellung von Streptomyces spp.
Dauerkulturen
Glycerin-Lösung
Glycerin
15 % (V/V)
zur Herstellung von E. coli
Dauerkulturen
49
Material und Methoden
3.3.8 Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion
Tabelle 3-16 Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion.
Bezeichnung
Bestandteile
Anmerkung
IPTG-Lösung
IPTG
2 mM
es wurden 20 μL pro LB-Platte
verwendet
X-Gal-Lösung
X-Gal
10 mg/mL
in DMF gelöst; es wurden 20 μL pro
LB-Platte verwendet
3.3.9 Puffer zur Proteinaufreinigung
Tabelle 3-17: Puffer zur Proteinaufreinigung.
Bezeichnung
Bestandteil
Anmerkung
Lysepuffer
TRIS
50 mM
auf pH 8,0 einstellen
NaCl
300 mM
Imidazol
10 mM
TRIS
50 mM
NaCl
300 mM
Imidazol
500 mM
TRIS
20-50 mM
NaCl
150-300 mM
Elutionspuffer
Gelfiltrationspuffer
auf pH 8,0 einstellen
auf pH 7,5-8,0 einstellen
3.3.10 Lösungen für FGD/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays
Tabelle 3-18: Lösungen für FGD/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays.
Bezeichnung
Bestandteil
Anmerkung
Assaypuffer
TRIS
50 mM
NaCl
200 mM
auf pH 7,5 einstellen
Deoxymensacarcin-Lösung
Deoxymensacarcin 12 mM
F420-Lösung
F420
23 μM
gelöst in Assaypuffer
Glucose-6-phosphat-Lösung
Glucose-6phosphat
50 mM
gelöst in Assaypuffer
50
gelöst in Methanol
Material und Methoden
3.3.11 Lösungen für MsnO3/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays
Tabelle 3-19: Lösungen für MsnO3/MsnO8 in vitro Aktivitätsassays.
Bezeichnung
Bestandteil
Anmerkung
Assaypuffer
TRIS
50 mM
NaCl
200 mM
auf pH 7,5 einstellen
DeoxymensacarcinLösung
Deoxymensacarcin 12 mM
gelöst in Methanol
NADH-Lösung
NADH
10 mM
gelöst in Assaypuffer
FMN-Lösung
FMN
2 mM
gelöst in Assaypuffer
Catalase-Lösung
Catalase
12 000 U/mL
gelöst in Assaypuffer
3.3.12 Puffer und Lösungen zur Isolierung und Reingung von F420
Tabelle 3-20: Puffer zur Isolierung und Reinigung von F420
Bezeichnung
Bestandteil
Anmerkung
Lysepuffer
TRIS
50 mM
auf pH 7,5 einstellen
NaCl
30 mM
TRIS
50 mM
NaCl
50 mM
ElutionspufferDEAE
TRIS
50 mM
NaCl
2M
ElutionspufferMonoQ
HCl
100 mM
Ladepuffer-DEAE
auf pH 7,5 einstellen
auf pH 7,5 einstellen
51
Material und Methoden
3.3.13 Puffer und Lösungen zur Herstellung von PASM-5052
Autoinducing-Medium
Tabelle 3-21: Puffer und Lösungen zur Herstellung von PASM-5052 Autoinducing-Medium.92
Bezeichnung
Bestandteil
4000 x
SpurenelementLösung
FeCl3 x 6 H2O
50 mM
CaCl2 x 2 H2O
20 mM
MnCl2 x 4 H2O
10 mM
ZnSO4 x 7H2O
10 mM
CoCl2 x 6 H2O
2 mM
CuCl2 x 2 H2O
2 mM
NiCl2 x 6 H2O
2 mM
Na2MoO4 x 2 H2O
2 mM
Na2SeO3
2 mM
H3BO3
2 mM
KH2PO4
1,25 M
NaHPO4 x 2 H2O
1,25 M
(NH4)2SO4
0,625 M
Glycerin
25 % (V/V)
Glucose
2,5 % (m/V)
α-Lactose
10 % (m/V)
1000 x Mg2+
MgSO4 x 7 H2O
2M
20 x Aminosäuren
15 Aminosäuren:
je 4 g/L
25 x NPS
50 x 5025
Anmerkung
G, A, V, L, I, S, T,
P, D, E, Q, R, H, F,
W
52
Asparagin x H2O
4 g/L
Lysin x H2O
4 g/L
L-Methionin
0,2 g/L
gelöst in 60 mM HCl
autoklaviert
autoklaviert
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-21:Puffer und Lösungen zur Herstellung von PASM-5052 Autoinducing-Medium.
Bezeichnung
Bestandteil
5000 x VitaminLösung
Thiaminhydrochlorid
Anmerkung
0,5 % (m/V)
(Vitamin B1)
Cobalamin
0,5 mM
(Vitamin B12)
80 x SeMet
L-Selenomethionin
10 g/L
3.3.14 Fließmittel für die Dünnschichtchromatografie
Tabelle 3-22: Fließmittel für die Dünnschichtchromatografie.
Bezeichnung
Bestandteile
Fließmittel
0,3 %
CH2Cl2
900 mL
Methanol
100 mL
Essigsäure
3 mL
3.3.15 Laufmittel für die analytische und präparative HPLC
Tabelle 3-23: Fließmittel für die analytische und präparative HPLC.
Bezeichnung
Bestandteile
Fließmittel A
Acetonitril
0,5 %
Fließmittel B
sterilfiltriert
Essigsäure
H2O
0,5 %
Anmerkung
sterilfiltriert
Essigsäure
53
Material und Methoden
3.4
Nährmedien
3.4.1 Nährmedien zur Kultivierung von E. coli
Tabelle 3-24: Verwendete Nährmedien zur Kultivierung von E. coli.
Bezeichnung
Bestandteile
LB
LB-Medium
Anmerkung
20 g
Trockenpulver
PASM-5052
H2Obidest
ad 1000 mL
25 x NPS
12 mL
Autoinducing- 30 x 5052
Medium92
20 x Aminosäuren
10 mL
verwendet zur Kultivierung von
E. coli
verwendet für die Produktion
von Selenomethionin-haltigem
MsnO8 in E. coli
15 mL
50 x Biotin
6 mL
1000 x Mg2+
0,3 mL
5000 x Vitamine
0,06 mL
4000 x Spurenelemente
0,075 mL
80 x SeMet/Met-Lösung
3,75 mL
H2Obidest
253 mL
3.4.2 Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp.Stämmen
Tabelle 3-25: Verwendete Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp..
Bezeichnung
Bestandteile
TSB
CASO Bouillon
30 g
H2Obidest
ad 1000 mL
Sojamehl, vollfett
20 g
D-Mannitol
20 g
H2Obidest
ad 1000 mL
MS
54
Anmerkung
verwendet zur Kultivierung von
Streptomyces spp.
pH auf 7,3 einstellen;
verwendet zur intergenerischen
Konjugation
nach dem Autoklavieren 10 mL
einer sterilfiltrierten 1 M MgCl2Lösung zugeben
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-25: Verwendete Nährmedien zur Kultivierung von Streptomyces spp..
Bezeichnung
Bestandteile
DNPM
Dextrin
40,0 g
Soytone
7,5 g
Bäckerhefe
5,0 g
MOPS
21,0 g
H2Obidest
ad 1000 mL
3.5
Anmerkung
pH auf 6,8 einstellen;
verwendet zur Produktion von
Naturstoffen aus Streptomyces
spp.
Bakterienstämme
3.5.1 E. coli-Stämme
Tabelle 3-26: In dieser Arbeit verwendete E. coli-Stämme.
Stamm
Verwendung
Genotyp
Referenz
E.coli
ET12567 x
pUZ8002
Konjugation
F-, dam-13::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR,
zij-202 ::Tn10, recF143, galK2,
GalT22, ara-14, lacY1, xyl-5, leuB6,
thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78,
mtl-1, glnV44
93
E. coli XL1Blue
Klonierung
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,
supE44, relA1, lac [F´ proAB
lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
Stratagene
E. coli DH5α
Klonierung
F-, φ80/lacZ∆M15, ∆(lacZYAargF)U169, recA1, endA1 hsdR17(rk-,
mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96,
relA1
Invitrogen
E. coli
Rosetta™ 2
Proteinproduktion F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)
pRARE2 (CamR)
Novagen
E. coli
BL21Star™
(DE3)
Proteinproduktion F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131
(DE3)
Invitrogen
E. coli BL21
(DE3) pLysS
Proteinproduktion F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)
pLysS (CamR)
Invitrogen
E. coli BL21
Codon Plus
RP x pL1SL2
Proteinproduktion F- ompT hsdSB (rB-mB-) dcm+ TetR gal
endA Hte [argU proL CamR]
94,95
55
Material und Methoden
3.5.2 Streptomyces spp.-Stämme
Tabelle 3-27: In dieser Arbeit verwendete Streptomyces spp.-Stämme.
Stamm
Eigenschaft
Referenz
Streptomyces albus J1074
Wirt zur heterologen Expression
96
Streptomyces albus∆mshA
Mutante von S. albus J1074;
Inaktivierung des Gens mshA
diese
Arbeit
3.6
Plasmide und Vektoren
3.6.1 In dieser Arbeit verwendete Plasmide und Vektoren
Tabelle 3-28: In dieser Arbeit verwendete Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor Beschreibung
Resistenz
Referenz
pOJ436
integrativer λ-Cosmidvektor
Apramycin
97
Cos2
das Cosmid enthält das
Biosynthesecluster von DDMM
Apramycin
98
Cos2∆O8MK
msnO8 ist inaktiviert, das Cosmid
enthält jedoch die SpectinomycinResistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
59
Cos2∆O8
msnO8 ist inaktiviert
Apramycin,
Spectinomycin
59
pUWL-H-tnp
Expressions- und Konjugationsvektor
pUWLoriT mit tnp, hph statt thior
Carbenicillin,
Hygromycin
99
pKR1
Komplementierungsplasmid für die
Mutante Cos2ΔR1
Carbenicillin,
Hygromycin
59
pBADαβγ
enthält die Gene für die λ-Red/ET
Rekombination und ein
temperatursensitives Replikon
Tetracyclin
100
pKCXY02
Suizidplasmid, enthält das Gen gusA
Apramycin
101
pLERE-SpecoriT
Klonierungsvektor
Spectinomycin Kobylyanskyy,
nicht publiziert
56
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-28: In dieser Arbeit verwendete Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor Beschreibung
Resistenz
Referenz
pTESb
integrativer Vektor (ΦC31)
Apramycin
102
pCDF-Duet
Klonierungsverktor
Spectinomycin Novagen
pEX-A-fgd
Klonierungsvektor, enthält das
synthetisierte Gen fgd
Ampicillin
Eurofins
pSERM*
integrativer Vektor (ΦC31), mit
ermE*-Promotor
Apramycin
T. Heitzler,
nicht publiziert
pET28a(+)
Expressionsplasmid zur
Proteinproduktion mit N- und Cterminalem His6-Tag
Kanamycin
Novagen
pET21a(+)
Expressionsplasmid zur
Proteinproduktion mit C-terminalem
His6-Tag
Ampicillin
Novagen
pBluescript II
(pBSK-)
Klonierungsvektor
Ampicillin
Invitrogen
3.6.2 In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren
Tabelle 3-29: In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor
Beschreibung
Resistenz
pET28a-O8-NHT
Expressionsvektor, enthält das Gen msnO8 mit
N-terminalem His6-Tag
Kanamycin
pET21a-O8-CHT
Expressionsvektor, enthält das Gen msnO8 mit
C-terminalem His6-Tag
Ampicillin
pET28a-fgd-NHT
Expressionsvektor, enthält das Gen fgd mit
N-terminalem His6-Tag
Kanamycin
pET28a-O3-NHT
Expressionsvektor, enthält das Gen msnO3 mit
N-terminalem His6-Tag
Kanamycin
pKCXY02∆mshA
Inaktivierungsvektor, enthält homologe Bereiche
von mshA und eine Spectinomycin-Kassette
Apramycin,
Spectinomycin
pSETermE*fbiA
enthält den ermE* Promotor gefolgt von fbiA, der
Promotor und das Gen wird von lox-sites flankiert
Apramycin
57
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-29: In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor
Beschreibung
Resistenz
pTESb*fbiA
enthält den ermE* Promotor und das fbiA Gen
Apramycin
pTESb*fbiAB
enthält den ermE* Promotor und die Gene
fbiA und fbiB
Apramycin
pTESb*fbiABC
enthält den ermE* Promotor und die Gene
fbiA und fbiB und fbiC
Apramycin
pBSK-fbiA
Klonierungsvektor mit fbiA
Ampicillin
pBSK-fbiB
Klonierungsvektor mit fbiB
Ampicillin
pBSK-fbiC
Klonierungsvektor mit fbiC
Ampicillin
Cos2∆O1MK
msnO1 ist inaktiviert, das Cosmid enthält
jedoch die Spectinomycin-Resistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
Cos2∆O1
msnO1 ist inaktiviert
Apramycin
Cos2∆O3MK
msnO3 ist inaktiviert, das Cosmid enthält
jedoch die Spectinomycin-Resistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
Cos2∆O3
msnO3 ist inaktiviert
Apramycin
Cos2∆H7MK
msnH7 ist inaktiviert, das Cosmid enthält
jedoch die Spectinomycin-Resistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
Cos2∆H7
msnH7 ist inaktiviert
Apramycin
Cos2∆O10MK
msnO10 ist inaktiviert, das Cosmid enthält
jedoch die Spectinomycin-Resistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
Cos2∆O10
msnO10 ist inaktiviert
Apramycin
Cos2∆O11MK
msnO11 ist inaktiviert, das Cosmid enthält
jedoch die Spectinomycin-Resistenzkassette
Apramycin,
Spectinomycin
Cos2∆O11
msnO11 ist inaktiviert
Apramycin
pKO2R1
Komplementierungsplasmid, enthält das Gen
msnO2 und das SARP-Regulatorgen msnR1
Hygromycin
pKO3R1
Komplementierungsplasmid, enthält das Gen
msnO3 und das SARP-Regulatorgen msnR1
Hygromycin
58
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-29: In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren.
Plasmid/Vektor
Beschreibung
Resistenz
pKR1H7
Komplementierungsplasmid, enthält das Gen
msnH7 und das SARP-Regulatorgen msnR1
Hygromycin
pKO10R1
Komplementierungsplasmid, enthält das Gen
msnO10 und das SARP-Regulatorgen msnR1
Hygromycin
pKO11R1
Komplementierungsplasmid, enthält das Gen
msnO11 und das SARP-Regulatorgen msnR1
Hygromycin
3.7
Software, Datenbanken und Internetservices
Tabelle 3-30: In dieser Arbeit verwendete Software, Datenbanken und Internetservices.
Bezeichnung
Hersteller/Anbieter
BLAST103
National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine, National Institutes of
Health, Bethesda, USA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi
ChemStation Rev. A.09.03
Agilent Technologies (Waldbronn, D)
Clone Manager 7
Scientific and Educational Software (Cary, USA)
ClustalW2104
http://www.ebi.ac.uk
Empower® 2002 Waters
Corporation
Waters (Milford, USA)
ExPASy105
Swiss Institute of Bioinformatics
Phylogeny.fr106
www.phylogeny.fr
PubMed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
PyMOL
Schrödinger, Inc. (Portland, USA)
Schmelztemperatur-Rechner
http://www.iit-biotech.de/iit-cgi/oligo-tm.pl
SWIFT II
GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, UK)
UNICORN Control Software
GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, UK)
59
Material und Methoden
3.8
Molekularbiologische Methoden
3.8.1 Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse
Die alkalische Lyse wurde abgewandelt nach einem Protokoll von Sambrook et al. durchgeführt.107
Hierfür wurde eine E. coli-Einzelkolonie gepickt und in 6 mL LB-Medium überführt. Die Kultur
wurde über Nacht bei 37 °C und 180 rpm inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet
(1 min, 13200 rpm) und in 200 μL Puffer P1 resuspendiert. Nach 10 minütiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurden die Zellen mit 200 μL Puffer P2 versetzt und mehrfach invertiert. Nach
weiteren 5 min wurden 200 μL Puffer P3 zugegeben und 10 min auf Eis inkubiert. Durch einen
Zentrifugationsschritt (13200 rpm, 20 min, 4 °C) wurden Proteine und genomische DNA abgetrennt.
Die Fällung der plasmidischen DNA erfolgte anschließend durch Zugabe von 400 μL kaltem
Isopropanol. Die Mischung wurde gevortext und die DNA abzentrifugiert (13200 rpm, 25 min, 4 °C).
Das Pellet wurde schließlich mit 200 μL 70 %-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNA
wurde in 20 μL H2Obidest. aufgenommen und bei -20 °C gelagert.
3.8.2 DNA-Aufreinigung durch Alkoholische Fällung
Die DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumenanteil Puffer P3 und 1 Volumenanteil Isopropanol versetzt
und gevortext. Nach 20 minütiger Inkubation auf Eis wurde die ausgefallene DNA abzentrifugiert
(13200 rpm, 20 min, 4 °C) und mit 200 μL 70 %-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde
anschließend getrocknet und in H2Obidest. gelöst.
3.8.3 Plasmidminipräparation
Zur Sequenzierung wurden kleine DNA-Mengen mit hohem Reinheitsgrad benötigt. Hierfür wurde die
Plasmid-DNA mit Hilfe des Wizard®Plus SV Miniprep Kits gereinigt. Die Plasmidisolierung erfolgte
dabei nach den Angaben des Herstellers.
3.8.4 Plasmidmidipräparation
Um größere Mengen Plasmid-DNA zu isolieren, wurde eine E. coli-Einzelkolonie in 100 mL LBMedium überführt und über Nacht kultiviert. Die plasmidische DNA wurde mittels PureYield™
Midiprep System (siehe Tabelle 3-6) von Promega gereinigt. Die Plasmidisolierung erfolgte dabei
nach Angaben des Herstellers.
3.8.5 Isolierung genomischer DNA aus Streptomyceten
Die Isolierung genomischer DNA aus S. albus und dessen Mutanten erfolgte nach einem Protokoll von
Kieser et al..3 Um genomische DNA zu isolieren, wurden 10 mL TSB-Medium mit einer
Streptomycetenkolonie beimpft und bei 28 °C, 180 rpm über Nacht inkubiert. 2 mL dieser Kultur
60
Material und Methoden
wurden abzentrifugiert (13200 rpm, 2 min, 4 °C). Das Pellet wurde mit 500 μL SET-Puffer und 10 μL
Lysozym-Lösung versetzt, mehrmals invertiert und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Anschließend
erfolgte die Zugabe von 14 μL Proteinase K-Lösung und 50 μL SDS-Lösung. Nach erneuter
Inkubation bei 60 °C für max. 1 h wurde die nun klare Lösung mit 200 μL NaCl-Lösung und 500 μL
Phenol/Chloroform versetzt und 2 min kräftig geschüttelt. Durch Zentrifugation (13200 rpm, 10 min,
4 °C) wurden die Phasen getrennt. Die wässrige Phase (oben) wurde in ein neues 1,5 mL
Eppendorfgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 500 μL kaltem Isopropanol gefällt. Die
DNA wurde abzentrifugiert (13200 rpm, 10 min, 4 °C) und das Pellet zweimal mit 500 μL Ethanol
(70 % (V/V)) gewaschen. Das Pellet wurde für 15 min bei 60 °C getrocknet und der Rückstand in
100 μL H2Obidest. aufgenommen. Die Bestandteile der einzelnen Lösungen sind in Tabelle 3-10
angegeben.
3.8.6 Analyse und Isolierung von DNA über AgaroseGelelektrophorese
Um ein DNA-Fragment nach einer PCR zu isolieren oder um die Fragmentgrößen nach einem
Restriktionsverdau zu kontrollieren, wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Hierfür
wurde die DNA-Lösung mit Ladepuffer gemischt und in die Taschen eines 0,7 % igen (m/V)
Agarosegels pipettiert. Zur Größenabschätzung wurde in eine weitere Tasche eine 1 kb-DNA-Leiter
pipettiert. Die Auftrennung der DNA erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 100 V. Das Gel
wurde nach erfolgter Auftrennung für 10 min in einem Ethidiumbromid-Färbebad inkubiert und
anschließend wurden die DNA-Banden mittels UV-Transilluminator detektiert. Die zu isolierenden
Banden wurden unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des Kits
Wizard® SV Gel und PCR Clean-up System (siehe Tabelle 3-6) von Promega isoliert.
3.8.7 Restriktion von DNA
Die Restriktion von DNA erfolgte durch Restrikionsendonucleasen, welche nach Herstellerangaben
verwendet wurden. Für einen analytischen Verdau wurde ein Gesamtvolumen von 10 μL gewählt, für
einen präparativen Verdau 50 μL. Nach einer Inkubationszeit von 1,5 h bei 37 °C wurde der Verdau
über ein Agarosegel kontrolliert bzw. aufgereinigt (siehe Kapitel 3.8.6). Erfolgte ein zweiter Verdau
wurde das erste Enzym mit Hilfe des Wizard® SV Gel und PCR Clean-up System Kits entfernt.
3.8.8 Ligation
Ligationen wurde mittels T4-DNA-Ligase nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Für die
Ligation wurde eine Ansatzgröße von 13 μL gewählt. Der geschnittene Vektor und das Insert wurden
in einem Verhältnis von 1:5 gemischt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde der
gesamte Ligationsansatz über Hitzeschock-Transformation in E. coli eingebracht.
61
Material und Methoden
3.8.9 Polymerase-Kettenreaktion
Um eine Inaktivierung zu kontrollieren oder um ein DNA-Fragment zu amplifizieren wurde eine PCR
durchgeführt. Für einen Standard-PCR-Ansatz wurde ein Volumen von 50 μL gewählt. Die
verwendeten Primer wurden von Eurofins MWG Operon (Hamburg, D) oder biomers.net GmbH
(Ulm, D) bezogen.
Tabelle 3-31: Reaktionsansatz für eine Standard-PCR.
Bestandteil
Volumen
DNA
1 µL
forward-Primer (10 µM)
1 µL
20 pmol
reverse-Primer (10 µM)
1 µL
20 pmol
dNTP-Mix (10 mM)
1 µL
je Nukleotid 20 mmol
DMSO
5 - 10 µL
Puffer (10x)
5 µL
H2Obidest.
ad 49 µL
Polymerase
1 µL
62
Stoffmenge/Enzymmenge
ca. 5 U
Material und Methoden
Tabelle 3-32: Standard PCR-Programm.
Temperatur
Dauer
98 °C
30 sec
98 °C
30 sec
65 – 55 °C
45 sec
72 °C
1 min/kbp für Taq-Polymerase
Cyclen
10 x
2 min/kbp für Pfu-Polymerase
98 °C
30 sec
60 °C
45 sec
72 °C
1 min / kbp für Taq-Polymerase
15 x
2 min / kbp für Pfu-Polymerase
72 °C
10 min
4 °C
Lagerung
3.8.10 Kolonie-PCR mit E. coli-Kolonien als Matrize
Um eine Ligation zu überprüfen wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Hierfür wurde anstelle von
DNA eine E. coli Kolonie in den PCR-Ansatz gegeben. Die E. coli Kolonie wurde mit einem sterilen
Zahnstocher gepickt und direkt in den PCR-Ansatz überführt.
3.8.11 DNA Sequenzierung
Einige Plasmide wurden durch Sequenzierung überprüft. Hierfür wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe
des Wizard®Plus SV Minipreps Kits aufgereinigt und anschließend wurde die DNA-Konzentration
über UV-Absorption ermittelt. Die Probe wurde entsprechend den Angaben von GATC Biotech AG
(Konstanz, D) verdünnt und zur Sequenzierung an GATC verschickt.
63
Material und Methoden
3.8.12 In dieser Arbeit verwendete Primer
Tabelle 3-33: Verwendete Primer und deren Schnittstellen. Die unterstrichenen Sequenzbereiche markieren die
Restriktionsschnittstelle.
Bezeichnung
Sequenz
Restriktionsschnittstelle
F_NdeI_O8
TATTACATATGGTGAAACTGTCGGTGGTCGAGCAGG
NdeI
R_XhoI_O8*
TTATACTCGAGTCACCGGGGGGTCAGCTC
XhoI
R_XhoI_O8
TTATACTCGAGCCGGGGGGTCAGCTCG
XhoI
F-NdeI-O3
TATTACATATGCCCACCGGCACCACCACC
NdeI
R-XhoI-O3
TTATACTCGAGTCACGACGCGTTCCTCTCGG
XhoI
F_HB1_MshA
TATAGAATTCCAGGACGCGCTGCGCAAGCTGGTCTG
AGC
EcoR1
R_HB1_MshA
TATATCTAGATACGCTCCCACCATGGCTGACACCCC
GTCC
XbaI
F_HB2_MshA
TATATCTAGAGAGTCCGTCGGGGCACACGGGTGC
XbaI
R_HB2_MshA
TATAATGCATGTCCGACGGGGACCATAGCGGTTGG
NsiI
F_Kontr MshA
TCGATCAGGTGCTGGAACGCCTC
R_Kontr MshA
CGTCGTACTGGCGCAGCACGTTGG
RedETO8-f
CCGGATCGACCTGGGCATCGGCCGCGCCAACCGCGT
CAACATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
NdeI
RedETO8-r
TGTCCATCTCCGCCACGGCGAGATCGGCCGGCGGCA
GCACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
NdeI
CheckO8-f
CGAGATGACCGCCTACAAC
CheckO8-r
AGGAGTGGTACCGGATGAC
ermE*-gusA-F
CGGCTAGCACTGCAAATACGGGTTGTGGGCACAA
NheI
F-fbiA
TATATCTAGACTGGAGCGGTCCGCGACCACC
XbaI
R-fbiA
TATAGATATCGAAGGCGGGTGCGGCGCTCACG
EcoRV
F-fbiB
TATAGATATCCGTCCTGGACGACCTGCGCGGC
EcoRV
64
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-33: Verwendete Primer und deren Schnittstellen. Die unterstrichenen Sequenzbereiche
markieren die Restriktionsschnittstelle.
Bezeichnung
Sequenz
Restriktionsschnittstelle
R-fbiB
TATTAGATCTCAGCGACATCTCGCGGCTCTGAG
BglII
F-fbiC
ATATAGATCTGTCAACGACTGACCGGGGCCGCACC
BglII
R-fbiC
TATAGAATTCCGAGCCCGCCACGCCCTGACC
EcoRI
Red F msnO1
GGAATCGGATTCGCCTACGACGAAGAAGGGGGCGG
CGTGCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
NdeI
Red R msnO1
GACCCTGCGGCGGACCCGTCTCCGGGGCGTTTCACC
TCACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
NdeI
O1Kontr-F
CCAGCCACGGGCCGTCGGGCTTCACG
O1Kontr-R
GTCCTCCTGGCAGCACAACCGCAGC
Red F msnO10
GGGGGAGCCGACACATGTCCGAGGAGTCATCGCACC NdeI
ATGCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
Red R msnO10
TTCCCTCCTTGGCCATCTCTTCGATTACTCCGTCCGT
CACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
O10Kontr-F
ACTGCGGGTCTCCCTCGGCACCACG
O10Kontr-R
GATTCGCTCATCCGGTCGTC
KO10-f
TATATAAGCTTCCTGCTCATCCCATGACCCTGCC
HindIII
KO10-r
TATAGGATCCTTCCCTCCTTGGCCATCTCTTCG
BamHI
Red F msnO11
AATCTGGCATGAGCGAGCCGGGAGTACACCATGGCT
GATCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
NdeI
Red R msnO11
CATCTCTGTACGGCGTTCCTCTGCGACGCGGTCGGCT NdeI
CACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
O11Kontr-F
ACGGAGTAATCGAAGAGATGGCC
O11Kontr-R
CCAGATCCGTATCCGCTCCGAC
KO11-f
TATATAAGCTTATCGTCAACAGGCATTTGTCCATAG
HindIII
KO11-r
TATAGGATCCTACGACATCTCTGTACGGCGTTCCTC
BamHI
NdeI
65
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 3-33: Verwendete Primer und deren Schnittstellen. Die unterstrichenen Sequenzbereiche
markieren die Restriktionsschnittstelle.
Restriktionsschnittstelle
Bezeichnung
Sequenz
Red F msnH7
GACCTCCTGACGGCACGCCACACGAGGAGAATCCCC NdeI
ATGCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
Red R msn H7
ACGGGCCGCCCAGCCCAGGCTGATGTTGTGGCCAGC
ACCCATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
H7Kontr-F
CCAAGCTCGATAATCACCCATCC
H7Kontr-R
CGTACCCAACTGGACGCAATGG
KR1-F
TATATAAGCTTGAGAAGGCGGCTATGCGGAT
HindIII
KH7-R
TATATACTAGTCGGAAGATGCCCCGGTCGATGTTCC
SpeI
Red F msnO3
ACCGGCACCACCACCGGCACTGTCGACGCTTCCCTC
TTCCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
NdeI
Red R msnO3
ATTTCACGACGCGTTCCTCTCGGGAAGGAGCTTCAG
GTACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
NdeI
O3Kontr-F
GCCGTACCTGCTCAGACAAC
O3Kontr-R
TCTGGTACGCCCAGAACTCC
KO3-F
ATCTATCGATGACCCCGTCCACCACATCATCG
ClaI
KO3-R
TATAAAGCTTGCCGAATTTCACGACGCGTTCCTC
HindIII
KR1-F
TATATAAGCTTGAGAAGGCGGCTATGCGGAT
HindIII
KR1-R
CTCATACTAGTGATTCTCCTCGTGTGGCGTG
SpeI
KO2-F
TATCATCGATCTGCTCTACCACCGCCGTTCG
ClaI
KO2-R
TATGAAGCTTGAGGTCGCCCAGTCCGAGTGC
HindIII
66
NdeI
Material und Methoden
3.9
Mikrobiologische Methoden
3.9.1 Kultivierung von E. coli
Die Kultivierung von E. coli erfolgte in LB-Medium. Hierfür wurde ein steriles Reagenzglas mit 5 mL
LB-Medium oder ein 300 mL Erlenmeyerkolben mit 100 mL LB-Medium befüllt und mit den
entsprechenden Antibiotika versetzt. Das Medium wurde entweder mit einer E. coli-Kolonie von einer
LB-Agarplatte beimpft oder mit 50 μL einer E. coli-Dauerkultur. Anschließend wurden diese bei
37 °C, 180 rpm über Nacht inkubiert.
3.9.2 Herstellung von E. coli Dauerkulturen
Nach erfolgter Transformation wurde von einigen E. coli-Kulturen eine Dauerkultur angelegt. Hierfür
wurde eine Übernachtkultur abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen
und das Pellet in 10 %-iger Glycerin-Lösung resuspendiert. Die Dauerkultur wurde bei -20 °C gelagert
und zur Inokulierung von Übernachtkulturen verwendet.
3.9.3 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen
Zur Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen wurde ein Aliquot kompetenter Zellen
verwendet um eine Übernachtkultur anzuimpfen. Nach 16 h Inkubation bei 37 °C, 180 rpm wurden
vier Kolben mit 100 mL LB-Medium mit jeweils 3 mL der Übernachtkultur beimpft und anschließend
bei 37 °C, 180 rpm inkubiert. Ab diesem Zeitpunkt wurde regelmäßig die optische Dicht bei 600 nm
gemessen. Bei einer OD600 = 0,5 wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 °C)
geerntet. Alle weiteren Schritte wurden unter sterilen Bedingungen und auf Eis durchgeführt. Die
verwendeten Lösungen sind in Tabelle 3-12 angegeben. Das Zellpellet wurde auf Eis in 30 mL kalter
MgCl2-Lösung resuspendiert und erneut abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, 4 °C). Danach wurde der
Überstand verworfen und das Pellet in 20 mL eiskalter CaCl2-Lösung aufgenommen. Die
Zellsuspension wurde für 20 min auf Eis inkubiert und anschließend erneut zentrifugiert (5000 rpm,
10 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 15 mL eiskalter, glycerinhaltiger
CaCl2-Lösung
aufgenommen.
Die
Zellsuspension
wurde
sofort
in
vorgekühlte
Eppendorfreaktionsgefäßen zu je 150 μL aliquotiert und bei -80 °C bis zur HitzeschockTransformation aufbewahrt.
3.9.4 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen
Zur Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen wurde ein Aliquot kompetenter Zellen
verwendet, um eine Übernachtkultur anzuimpfen. Nach 16 h Inkubation bei 37 °C, 180 rpm wurden
vier Kolben mit 100 mL LB-Medium mit jeweils 3 mL der Übernachtkultur beimpft und anschließend
bei 37 °C, 180 rpm inkubiert. Ab diesem Zeitpunkt wurde regelmäßig die optische Dicht bei 600 nm
67
Material und Methoden
gemessen. Bei erreichen einer OD600 = 0,5 wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 rpm, 10 min,
4 °C) geerntet. Alle weiteren Schritte wurden unter sterilen Bedingungen und auf Eis durchgeführt.
Die verwendete Lösung ist in Tabelle 3-12 angegeben. Das Zellpellet wurde zweimal mit je 20 mL
eiskalter 10 %-iger Glycerinlösung gewaschen und danach in 15 mL eiskalter 10 %-iger
Glycerinlösung
aufgenommen.
Die
Zellsuspension
wurde
sofort
in
vorgekühlte
Eppendorfreaktionsgefäße zu je 150 μL aliquotiert und bei -80 °C bis zur Elektroporation aufbewahrt.
3.9.5 Hitzeschock-Transformation von E. coli
Ein Aliquot CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen wurde mit 2-10 μL DNA versetzt und 30 min auf Eis
inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 °C, 45 sec wurden die Zellen erneut für 2 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 500 μL LB-Medium versetzt und bei 37 °C, 180 rpm
für 1 h inkubiert. Die Zellen wurden auf eine LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika
ausplattiert und bei 37 °C für 16 h inkubiert.
3.9.6 Elektroporation
Ein Aliquot elektrokompetenter E. coli-Zellen wurde mit 2-10 μL DNA versetzt und für 15 min auf
Eis inkubiert. Der Ansatz wurde in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit einem
Elektrodenabstand von 1 cm überführt. Die Transformation erfolgte bei einer angelegten Spannung
von 1,8 kV für 5 ms mit dem E. coli Pulser™. Anschließend wurden die Zellen sofort mit 1 mL LBMedium versetzt und für 1,5 h bei 37 °C, 180 rpm inkubiert. Die Zellen wurden nach der
Inkubationszeit auf eine LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und bei 37 °C für
16 h inkubiert.
3.9.7 Blau-Weiß Selektion
Für einige Klonierungen wurde das PCR-Produkt zuerst in einen Klonierungsvektor mit lacZ-Gen
kloniert. Hierfür wurde die PCR mit der Pfu-Polymerase durchgeführt, um blunt ends am PCRFragment zu erhalten. Anschließend wurde das Fragment aufgereinigt und in den mit EcoRV
linearisierten Klonierungsvektor pBSK- kloniert. Zur Selektion richtiger Transformanden wurde die
LB-Agarplatte mit 20 μL IPTG-Lösung und 20 μL X-Gal-Lösung (Tabelle 3-16) überschichtet.
Anschließend wurde auf die trockene Platte der Transformationsansatz ausplattiert und bei 37 °C für
16 h inkubiert. Die weißen Kolonien wurden gepickt und wie unter Kapitel 3.9.1 beschrieben
kultiviert.
3.9.8 Kultivierung von Streptomyces spp.
Die Kultivierung von Streptomyces spp. erfolgte in 100 mL bis 300 mL Erlenmeyerkolben mit
Schikane und Metallspirale. Die Kolben wurden mit TSB-Medium und Antibiotika-Lösungen
68
Material und Methoden
beschickt und mit einer Streptomyces spp. Einzelkolonie von einer TSB-Agarplatte oder mit 100 μL
einer Streptomyces Dauerkultur beimpft. Die Kulturen wurden anschließend für drei Tage bei 28 °C,
180 rpm inkubiert.
3.9.9 Herstellung von Streptomyces spp.-Dauerkulturen
Zur Herstellung einer Streptomyces-Dauerkultur wurden 25 mL TSB-Medium mit einer Einzelkolonie
inokuliert und für zwei Tage bei 28 °C, 180 rpm inkubiert. Das Mycel wurde abzentrifugiert
(5000 rpm, 10 min, 4 °C), mit TSB-Medium gewaschen und anschließend in 10 mL 25 %-iger
Saccharose-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde bei -20 °C gelagert und zur Beimpfung
von Streptomyces Kulturen verwendet.
3.9.10 Kultivierung von Streptomyces spp. zur Produktion und
Isolierung von Naturstoffen
Zur Produktion von DDMM und dessen Derivate wurde eine Vorkultur von S. albus Cos2 x pKR1
bzw. dessen Mutante, wie unter Kapitel 3.9.8 beschrieben, angezogen. Für die Produktion wurden
jeweils 100 mL DNPM-Medium in 300 mL Erlenmeyerkolben mit Schikane und Metallspirale mit
1 mL der entsprechenden Vorkultur beimpft. Die Produktionskultur wurde anschließende je nach
Versuch für drei bis sieben Tage bei 28 °C, 180 rpm inkubiert.
3.9.11 Intergenerische Konjugation
Plasmide und Cosmide wurden mittels intergenerischer Konjugation in S. albus eingebracht. Hierfür
wurde ein abgewandeltes Protokoll nach Kieser et al. verwendet.3 Als Donor wurde der
methylierungsdefiziente Stamm E.coli ET 12567 verwendet, welcher das RP4-Derivat pUZ8002
enthält. Dieses ermöglicht den Transfer der Plasmide und Cosmide auf artfremde Organismen.
3.9.11.1 Vorbereitung des Donorstammes
CaCl2-kompetente E.coli ET12567 x pUZ8002 Zellen wurden mit dem zu übertragenden Plasmid oder
Cosmid transformiert, auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Um
zu gewährleisten, dass das Plasmid pUZ8002 nicht verloren geht, wurde mit Kanamycin selektiert.
Zusätzlich wurde mit einem weiteren Antibiotikum die Aufnahme des zu übertragenden Plasmids oder
Cosmids sichergestellt. Mit einer einzelnen Kolonie wurden 50 mL flüssiges LB-Medium inokuliert
und über Nacht bei 37 °C, 180 rpm inkubiert. Die Kultur wurde am nächsten Tag abzentrifugiert
(10 min, 5000 rpm, 4 °C) und das Pellet mit dem Rezipienten vermengt.
3.9.11.2 Vorbereitung des Rezipienten
25 mL TSB-Medium wurden mit einer S. albus-Dauerkultur beimpft und über Nacht bei 28 °C im
Schüttler inkubiert. Pro Konjugationsansatz wurde 1 mL dieser Kultur abzentrifugiert (1 min,
69
Material und Methoden
13200 rpm, 4 °C) und zweimal mit jeweils 1 mL TSB-Medium gewaschen. Das Pellet wurde
anschließend in 1 mL TSB-Medium resuspendiert.
3.9.11.3 Konjugation
Die E. coli-Zellen wurden mit den gewaschenen S. albus-Zellen vermengt, großflächig auf MSAgarplatten ausgestrichen und bei 28 °C inkubiert. Bei der Übertragung von Plasmiden wurden die
Agarplatten nach 6 h, bei Cosmiden nach 16 h, zur Selektion mit 1.5 mL H2O, Fosfomycin und dem
entsprechenden Antibiotikum überschichtet. Die getrocknete Platte wurde für 3-4 Tage bei 28 °C
inkubiert, bis Exkonjuganden zu sehen waren. Diese wurden gepickt und auf neue TSB-Platten
überführt.
3.10 Erstellung von Plasmiden
3.10.1 Erstellung der Komplementierungsplasmide
3.10.1.1 Erstellung der Plasmide pKO10R1 und pKO11R1
Die Gene msnO10 und msnO11 wurden mit den Primern KO10-F, KO10-R beziehungsweise KO11-F
und KO11-R amplifiziert und über die Restriktionsschnittstellen BamHI und HindIII in den
linearisierten Vektor pUWL-H-tnp kloniert. In die resultierenden Konstrukte pKO10 und pKO11
wurde, über die Schnittstellen BamHI und SpeI, das Regulatorgen msnR1 kloniert. Das Gen wurde
zuvor über die Primer SARP-f und SARP-r amplifiziert und mit BglI und SpeI verdaut. Als Template
diente für alle PCR-Reaktionen das Cosmid Cos2.
3.10.1.2 Erstellung der Plasmide pKO3R1 und pKO2R1
Zur Erstellung der Konstrukte pKO3R1 und pKO2R1 wurde das Regulatorgen msnR1 mit den Primern
pKR1-F und pKR1-R amplifiziert und über die Schnittstellen HindIII und SpeI in den Vektor pUWLH-tnp kloniert. Anschließend wurden die Gene msnO3 und msnO2 mit den Primern KO3-F, KO3-R
beziehungsweise KO2-F und KO2-R amplifiziert und in das Plasmid pUWL-H-R1 kloniert. Hierfür
wurden sowohl die PCR-Produkte als auch das Plasmid mit ClaI und HindIII verdaut. Als Template
diente für alle PCR-Reaktionen das Cosmid Cos2.
3.10.1.3 Erstellung von pKR1H7
Da das Gen msnH7 im msn-Cluster direkt vor dem Regulatorgen msnR1 lokalisiert ist, wurden beide
Gene zusammen amplifiziert. Hierfür wurden die Primer KR1-F und KH7-R verwendet und als
Template das Cosmid Cos2. Für die Klonierung wurden das PCR-Produkt und der Vektor pUWL-Htnp mit HindIII und SpeI geschnitten. Nach der Ligation wurde das Konstrukt pKR1H7 erhalten.
70
Material und Methoden
3.10.2 Erstellung der Konstrukte pSETermE*-fbiA und
pTESbFbiABC*
Für die Amplifizierung der Gene fbiA, fbiB und fbiC wurde genomische DNA aus S. albus gewonnen.
Die Gene wurden mit der Pfu-Polymerase über PCR amplifiziert und aufgereinigt. Für die PCR
wurden die Primerpaare F-fbiA/R-fbiA, F-fbiB/R-fbiB und F-fbiC/R-fbiC verwendet. Anschließend
wurden die PCR-Produkte direkt in den mit EcoRV linearisierten Klonierungsvektor pBSK- ligiert.
Nach der Transformation konnten positive Einzelkolonien über Blau-Weiß-Selektion (siehe Kapitel
3.9.7) identifiziert werden.
Zur Erstellung des Plasmids pSETermE*fbiA wurde das Gen fbiA über die Restriktionsschnittstellen
XbaI und EcoRV aus dem Vektor pBSK-fbiA ausgeschnitten und in den Vektor pSERM* kloniert.
Das Plasmid pTESbFbiABC* wurde erstellt, indem die Gene fbiB und fbiC über die Schnittstellen
EcoRV/BglII und BglII/EcoRI in das Plasmid pTESb kloniert wurden. Abschließend wurde das Gen
fbiA zusammen mit dem starken Promotor ermE* vor das Gen fbiB kloniert. Hierfür wurde eine PCR
durchgeführt. Die Amplifizierung erfolgte durch die Primer ermE*-gusA-F und R-fbiA. Als Template
diente das zuvor erstellte Konstrukt pSETermE*-fbiA. Das Konstrukt pTESbFbiBC wurde mit
XbaI/EcoRV linearisiert und das PCR-Fragment mit NheI/EcoRV geschnitten und anschließend in den
geöffneten Vektor kloniert.
3.10.3 Klonierung von Plasmiden für die Proteinproduktion in E. coli
Da für die Kristallisation Proteine in hoher Reinheit und hoher Konzentration eingesetzt werden
müssen, wurde MsnO8 in E. coli überproduziert und daraus aufgereinigt. Außerdem wurden auch die
Proteine FGD und MsnO3 für Enzymassays in E. coli überproduziert und aufgereinigt. Um die
Produktion zu steuern und um Affinitätstags anzuhängen, wurden die codierenden Gene in die
speziellen Proteinexpressionsvektoren pET28a(+) bzw. pET21a(+) kloniert.
3.10.3.1 Klonierung von pET28a-O8-NHT
Zur Produktion und Aufreinigung von MsnO8 wurde das codierende Gen msnO8 in den
Proteinexpressionsvektor pET28a(+) kloniert. Hierfür wurde das Gen mit dem Primerpaar
F_NdeI_O8/R_XhoI_O8* und dem Template Cos2 über PCR amplifiziert. Das gereinigte PCRProdukt und der Vektor pET28a(+) wurden mit XhoI und NdeI geschnitten und anschließend ligiert.
Das Plasmid pET28a-O8-NHT, mit N-terminalen His6tag wurde durch Kontrollverdau und
Sequenzierung überprüft.
3.10.3.2 Klonierung von pET28a-O8-CHT
Um zu testen, ob MsnO8 mit N-oder C-terminalem His6tag besser produziert wird, wurde ein zweites
Konstrukt mit C-terminalem His6tag kloniert. Hierfür wurde das Gen msnO8 mit dem Primerpaar
F_NdeI_O8/R_XhoI_O8 und dem Template Cos2 über PCR amplifiziert. Das gereinigte PCR-Produkt
71
Material und Methoden
und der Vektor pET21a(+) wurden mit XhoI und NdeI geschnitten und anschließend ligiert. Das
Plasmid pET21a-O8-CHT wurde durch Kontrollverdau und Sequenzierung überprüft.
3.10.3.3 Klonierung von pET28a-fgd-NHT
Das Gen fgd aus M. smegmatis wurde dem Codongebrauch von E. coli angepasst und von Eurofins
synthetisiert. Außerdem wurde direkt vor das Startcodon eine NdeI-Schnittstelle und hinter das
Stoppcodon eine XhoI-Schnittstelle eingeführt. Das Gen wurde im Vektor pEX-A-fgd geliefert. Zur
Klonierung von pET28a-fgd-NHT wurde das Gen fgd mit den Restiktionsenzymen NdeI und XhoI
ausgeschnitten und in den, mit den gleichen Enzymen, geöffneten Vektor pET28a(+), ligiert. Das
Plasmid pET28a-fgd-NHT wurde durch Kontrollverdau und Sequenzierung überprüft.
3.10.3.4 Klonierung von pET28a-O3-NHT
Zur Produktion von MsnO3 wurde das codierende Gen msnO3 über PCR amplifiziert. Hierfür wurde
das Primerpaar F_NdeI_O3/R_XhoI_O3 und das Template Cos2 verwendet. Das gereinigte PCRProdukt und der Vektor pET28a(+) wurden mit XhoI und NdeI geschnitten und anschließend ligiert.
Das Plasmid pET28a-O3-NHT wurde ebenfalls durch Kontrollverdau und Sequenzierung überprüft.
3.10.4 Erstellung des Inaktivierungsplasmids pKCXY02∆mshA
Zur Inaktivierung der Mycothiol-Biosynthese im Genom von S. albus wurde das Gen mshA durch
Insertion einer Spectinomycin-Resistenzkassette ersetzt. Hierfür wurde ein Inaktivierungskonstrukt
erstellt, welches homologe DNA-Bereiche upstream und downstream vom Zielgen mshA trug. Diese
2,5 kb langen Rekombinationsabschnitte wurden so gewählt, dass sie einen geringen Teil des
Genanfangs bzw. des Genendes enthielten. Beide Bereiche wurden über PCR amplifiziert und über die
Schnittstellen EcoRI/XbaI bzw. XbaI/NsiI in das Suizidplasmid pKCXY02 kloniert. Für die
Amplifizierung
wurden
die
Primerpaare
F_HB1_MshA/R_HB1_MshA
beziehungsweise
R_HB2_MshA/R_HB2_MshA verwendet. Als Template wurde genomische DNA aus S. albus
eingesetzt. Zwischen diese homologen Bereiche wurde eine Spectinomycin-Resistenzkassette kloniert,
um das Plasmid pKCXY02∆mshA zu erhalten. Die Resistenzkassette wurde zuvor aus dem Vektor
pLERE über NheI/SpeI ausgeschnitten und in das, mit XbaI, linearisierte Suizidplasmid ligiert.
3.11 Geninaktivierungen in Streptomyces
3.11.1 Geninaktiverung mittels Redirect®-Methode
Um ein Gen auf dem Cosmid Cos2 zu inaktivieren, wurde die Redirect®-Methode verwendet.108
Hierbei wird die Inaktivierung des Gens in E. coli durchgeführt. Dafür wird zunächst ein lineares
Fragment benötigt, die sogenannte Resistenzkassette. Diese ist folgendermaßen aufgebaut: in der
72
Material und Methoden
Mitte befindet sich das Spectinomycin-Gen, flankiert von jeweils einer NdeI-Schnittstelle. Des
Weiteren wird das Gen vor und hinter der NdeI-Schnittstelle von homologen Bereichen (je 39 Basen)
des zu inaktivierenden Gens umgeben. Diese Kassette wurde über PCR hergestellt unter Verwendung
von PCR-Primern, welche die NdeI Schnittstelle und die homologen Bereiche enthielten. Das
erhaltene PCR-Fragment wurde über Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und isoliert.
Für die Inaktivierung wurden E. coli DH5α-Zellen mit dem Plasmid pBADαβγ und dem Cosmid Cos2
transformiert. Das Plasmid pBADαβγ enthält neben den Genen für die λ-Red Funktion, redα, redβ und
redγ auch ein Tetracyclin-Resistenzgen und ein hitzesensitives Replikon. Eine Kolonie wurde in 5 mL
LB-Medium unter Zusatz von Apramycin und Tetracyclin über Nacht bei 28 °C, 180 rpm angezogen.
Mit 3 mL dieser Vorkultur wurden 100 mL LB-Medium inokuliert. Durch Zugabe von 1 mL frischer
Arabinose-Lösung (1 M) wurde die Expression des λ-Red-Operons induziert. Die Zellen wurden bei
28 °C, 180 rpm bis zu einer OD600nm = 0,4 inkubiert und anschießend elektrokompetent gemacht, wie
unter Kapitel 3.9.4 beschrieben. In diese Zellen wurde die Spectinomycin-Resistenzkassette
schließlich durch Elektroporation eingebracht. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Agarplatten,
welche Apramycin und Spectinomycin enthielten, ausplattiert und bei 37 °C inkubiert. Die erhaltenen
Kolonien wurden gepickt, neu ausgestrichen und zur Inokulierung einer 5 mL Kultur verwendet. Die
Cosmid-DNA wurde anschließend isoliert und die Inaktivierung mittels PCR kontrolliert.
Um polare Effekte zu vermeiden, wurde die Resistenzkassette anschließend durch Restriktion mit
NdeI entfernt. Die geschnittene DNA wurde über Alkoholfällung gereinigt, ligiert und über
Hitzeschock-Transformation in E.coli XL1-Blue–Zellen überführt. Die erhaltenen Kolonien wurden
zur Selektion auf Apramycin- und Apramycin/Spectinomycin-haltigen Agarplatten ausgestrichen. Die
Entfernung der Spectinomycinkassette war erfolgreich, wenn die Zellen spectinomycinsensitiv waren.
Zusätzlich wurde die Inaktivierung über eine Kontroll-PCR überprüft.
3.11.2 Geninaktivierung durch Doppelcrossover
Das Inaktivierungsplasmid pKCXY02∆mshA wurde wie unter Kapitel 3.10.4 beschrieben kloniert.
Das fertige Konstrukt wurde über intergenerische Konjugation (siehe Kapitel 3.9.11) in S. albus
eingebracht. Der Konjugationsansatz wurde mit Spectinomycin und Apramycin überschichtet, um eine
Singelcrossover-Mutante zu erhalten. Für ein Doppelcrossover-Ereignis wurde eine Einzelkolonie in
50 mL Spectinomycin-haltigem TSB-Medium angezogen und mehrfach passagiert. Hierfür wurde
jeweils 1 mL der vorherigen Passage in 50 mL frisches TSB-Medium überführt und für 24 h, 28 °C,
180 rpm inkubiert. Nach 10 Passagen wurde eine Verdünnungsreihe (1:10 bis 1:1010) in TSB-Medium
hergestellt und auf Spectinomycin-haltigen TSB-Agarplatten ausgestrichen. Die erhaltenen
Einzelkolonien wurden auf den Verlust der Apramycinresistenz getestet, indem sie auf Apramycinund Spectinomycin-haltige TSB-Agarplatten überführt wurden.
73
Material und Methoden
Von den apramycinsensitiven und spectinomycinresistenten Kolonien wurde die genomische DNA
isoliert (siehe Kapitel 3.8.5) und über PCR überprüft, ob es sich um Doppelcrossover-Mutanten
handelt. Hierfür wurden die Primer F_Kontr MshA und R_Kontr MshA (siehe Kapitel 3.8.12)
verwendet.
3.12 Proteinbiochemische Methoden
3.12.1 Testexpression
Für die Proteinkristallisation und Aktivitätsassays wurden die Proteine heterolog in E. coli produziert.
Hierfür
wurden
zuvor
einige
Testexpressionen
durchgeführt,
um
die
optimalen
Produktionsbedingungen herauszufinden. Bei diesen Expressionstests wurden sowohl unterschiedliche
E. coli-Stämme, als auch unterschiedliche IPTG-Konzentrationen (0,1-1,0 mM) zur Induktion der
Proteinproduktion getestet. Hierfür wurden E. coli BL21 (DE3) pLysS-, E. coli BL21Star™ (DE3)und E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2-Zellen mit dem jeweiligen Expressionsvektor
transformiert und auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen. Mit jeweils einer Einzelkolonie wurden
10 mL LB-Medium beimpft und bei 37 °C, 180 rpm für 16 h im Schüttelturm inkubiert. Anschließend
wurden jeweils dreimal 100 mL LB-Medium mit den entsprechenden Selektionsantibiotika versetzt
und mit jeweils 2 mL der Vorkultur inokuliert. Die Kulturen wurden bis zu einer optischen Dichte von
OD600nm = 0,6 bei 28 °C, 180 rpm inkubiert und dann mit einer IPTG-Lösung versetzt, um die
Proteinproduktion zu induzieren. Ab diesem Zeitpunkt wurde jede Stunde eine 1 mL Probe
entnommen, abzentrifugiert und das Pellet bei -20 °C gelagert. Außerdem wurde die optische Dichte
OD600nm gemessen. Zur Analyse wurden die Proben standardisiert, indem die Pellets in jeweils 20 μL
H2O pro 0,1 OD600nm resuspendiert wurden. Jeweils 10 μL dieser Zellsuspensionen wurden mit 10 μL
SDS-Ladepuffer gemischt, 10 min bei 95 °C inkubiert und zur Analyse auf eine SDS-PAGE
aufgetragen
3.12.2 Überproduktion von Proteinen in LB-Medium
Für eine Expression im großen Maßstab wurde eine 100 mL LB-Vorkultur für 16 h bei 37 °C, 180 rpm
inkubiert. Anschließend wurden 14 Kolben mit jeweils 250 mL LB-Medium mit je 7 mL der
Vorkultur beimpft und bei 28 °C, 180 rpm inkubiert. Bei einer OD600nm = 0.6 wurde durch Zugabe
einer IPTG-Lösung die Überexpression induziert. 3,5 h nach der erfolgten IPTG-Induktion wurden die
Zellen durch Zentrifugation (5000 rpm, 4 °C, 20 min) geerntet. Der Überstand wurde verworfen und
das Zellpellet bis zur Aufreinigung bei -20 °C gelagert.
74
Material und Methoden
3.12.3 Testexpression und Überexpression von MsnO8 in
Autoinducing-Medium
Um L-Selenomethionin anstelle von L-Methionin in MsnO8 einzubringen, wurden die Zellen in
L-Selenomethionin-haltigem
Autoinducing-Medium kultiviert. Hierfür wurden 100 mL LB-Medium
mit E. coli BL21 (DE3) pLysS x pET28a-O8-NHT-Zellen inokuliert und bei 37 °C, 180 rpm inkubiert.
Nach 16 h wurden die Zellen abzentrifugiert (5000 rpm, 4 °C, 10 min) und mit 10 mL Wasser
gewaschen. Fünf Kolben mit je 200 mL Autoinducing Medium (siehe Kapitel 3.4.1) wurden mit 1 mL
Zellsuspension beimpft und bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde regelmäßig die optischen Dichte
bei 600 nm gemessen. Sobald eine optischen Dichte OD600nm = 1,5 erreicht wurde, wurden die Zellen
für 48 h in einen kühleren Zellkulturschüttler (20 °C) inkubiert. Die Zellernte erfolgte durch
Zentrifugation bei 5000 rpm, 4 °C, 20 min. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet bis zur
Aufreinigung des Proteins bei -20 °C gelagert.
Vor einer Anzucht im großen Maßstab, wurde durch eine Testexpression überprüft, ob das Protein in
Autoinducing-Medium produziert wird. Hierfür wurden 200 mL Autoinducing-Medium mit 7 mL
einer Vorkultur inokuliert und L-Methionin anstelle von L-Selenomethionin zugesetzt. In
regelmäßigen Abständen wurde die optische Dichte bei 600 nm gemessen und Proben für die Analyse
mittels SDS-PAGE entnommen. Die Analyse erfolgte wie unter Kapitel 3.12.1 beschrieben.
3.12.4 Zellaufschluss für Proteinreinigung
Das Zellpellet wurde auf Eis aufgetaut und in der vierfachen Menge Lysepuffer resuspendiert.
Anschließend wurden die Zellen mittels French-Pressure Zelle (40 K) bei einem Druck von 8001000 psi aufgeschlossen. Die Suspension wurde mit 10 μL DNase versetzt und für 15 min auf Eis
inkubiert. Danach wurden die unlöslichen Zellbestandteile durch Zentrifugation (10000 rpm, 4 °C,
1 h) abgetrennt. Der Überstand, welcher die cytosolischen Proteine enthielt, wurde via
Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt.
3.12.5 Affinitätschromatographie
Die zu reinigenden Proteine wurden mit einem Hexahistidin-Tag produziert, damit diese über eine
Ni2+-NTA-Affinitätschromatographiesäule
und
dem
ÄKTA-FPLC
(Fast
Protein
Liquid
Chromatographie)-System von GE Healthcare aufgereinigt werden konnten. Hierfür wurde die
Proteinlösung nach dem Zellaufschluss über einen Superloop mit einer Flussgeschwindigkeit von
0,5 mL/min auf eine 5 mL HisTrap FF Säule geladen, welche zuvor mit Lysepuffer equilibriert wurde.
Die Säule wurde anschließend stufenweise mit 5-15 % Elutionspuffer (Flussrate: 2 mL/min)
gewaschen. Das gewünschte Protein konnte anschließend mit 50 % Elutionspuffer in hoher Reinheit
eluiert werden. Das gesamte Eluat wurde fraktioniert gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert.
75
Material und Methoden
Die 50 % Fraktionen wurden vereinigt und auf 1 mL aufkonzentriert. Die weitere Aufreinigung über
eine Gelfiltrationssäule wurde sofort im Anschluss an die Affinitätschromatographie durchgeführt.
3.12.6 Gelfiltration
Um kleinere Verunreinigungen und aggregiertes Protein zu entfernen wurde die aufkonzentrierte
Proteinlösung nach der Affinitätschromatographie über eine Gelfiltrationssäule (HiLoad 16/60
Superdex 200 prep grade) am ÄKTA-FPLC-System gereinigt. Hierfür wurde die Lösung auf 1 mL
aufkonzentriert. Um Präzipitat zu entfernen wurde die Proteinlösung zentrifugiert (14000 rpm, 10 min,
4 °C) bevor sie auf die equilibrierte Säule geladen wurde. Die Injektion und die Auftrennung der
Probe erfolgte bei einem konstanten Fluss von 0,5 mL/min. Das Eluat wurde fraktioniert gesammelt
und mittels SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen mit monomerem oder dimerem Protein wurden
vereinigt und auf 5-10 mg/mL aufkonzentriert. Das gereinigte Protein wurde entweder sofort zur
Proteinkristallisation verwendet oder bei -80 °C gelagert, bis es für Enzymassays verwendet wurde.
3.12.7 Aufkonzentrierung von Proteinlösungen
Zur Aufkonzentrierung von Proteinlösungen wurde eine Ultrafiltration durchgeführt. Hierzu wurde die
Lösung in einen Vivaspin 20 Konzentrator (Sartorius AG) mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa
gefüllt. Die Aufkonzentrierung erfolgte durch Zentrifugation bei 5000 rpm (4 °C), bis die gewünschte
Endkonzentration von 5-10 mg/mL erreicht wurde.
3.12.8 SDS-PAGE
Um die Proben nach der Testexpression oder um die Reinheit von Proteinen nach der Aufreinigung zu
analysieren wurde eine SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
durchgeführt.109 Hierfür wurden die Proben 1:1 mit Ladepuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C
erhitzt. Anschließend wurden 10-20 μL der Proben auf eine SDS-PAGE aufgetragen und durch
anlegen einer Spannung von 150 V für 1,5 h aufgetrennt. Um die Proteinbanden sichtbar zu machen
wurde das Gel in Coomassieblau-Färbelösung erhitzt und inkubiert. Nach 1 h wurde das Gel in
Entfärbelösung gelegt um überschüssige Farbe zu entfernen.
3.12.9 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
Um die Konzentration einer Proteinlösung zu bestimmen wurde die Absorption bei 280 nm gemessen.
Über das Lambert-Beersche Gesetz konnte dadurch die Konzentration berechnet werden. Der molare
dekadische Extinktionskoeffizient der Proteine wurde hierfür anhand der Primärsequenz über ExPASy
berechnet.
76
Material und Methoden
3.12.10 In vitro Enzymaktivitätsassays
Zum Nachweis, dass die Epoxidgruppe in der Seitenkette von Mensacarcin von dem Enzym MsnO8
eingeführt wird und um den richtigen Cofaktor für MsnO8 zu finden, wurde ein Enzymassay
entwickelt.
3.12.10.1 Enzymassay mit F420 und FGD
MsnO8 benötigt für die Einführung der Epoxidgruppe einen reduzierten Flavin-Cofaktor. Um zu
testen, ob MsnO8 F420-abhängig ist, wurde F420 mit dem gereinigten Enzym FGD unter Verbrauch von
Glucose-6-phosphat reduziert. Zu diesem Ansatz wurde anschließend das postulierte Substrat
Deoxymensacarcin und das gereinigte Enzym MsnO8 zugegeben. Die Zusammensetzung des
Enzymassays ist in Tabelle 3-34 angegeben. Nach einer Inkubation von 2 h-16 h wurde die Reaktion
durch Zugabe von 300 μL Essigsäureethylester gestoppt und ausgeschüttelt. Die organische Phase
wurde abgenommen und der Reaktionsansatz wurde erneut mit 200 μL Essigsäureethylester extrahiert.
Die Essigsäureethylester-Phasen wurden vereinigt und mittels Speedvac zur Trockene eingeengt. Zur
Analyse mittels HPLC/ESI-MS wurde das Extrakt in 200 μL Methanol aufgenommen, zentrifugiert
(13200 rpm, 10 min) und anschließend mit der Methode mensO4 analysiert.
Tabelle 3-34: Zusammensetzung des Enzymassays mit F420 und FGD.
Bestandteil
Endkonzentration im Assay
F420
15 μM
Glucose-6-phosphat
2,5 mM
Deoxymensacarcin
200-240 μM
FGD
2-4 μM
MsnO8
1-2 μM
3.12.10.2 Enzymassay mit FMN und MsnO3
Um zu testen ob MsnO8 FMN-abhängig ist, wurde FMN mit der gereinigten, NADH-abhängigen
Flavinreduktase MsnO3 reduziert. Zu diesem Ansatz wurde anschließend das postulierte Substrat
Deoxymensacarcin und das gereinigte Enzym MsnO8 gegeben. Die Zusammensetzung des
Enzymassays ist in Tabelle 3-35 angegeben. Nach der Inkubation (2 h-16 h) wurde die Reaktion durch
Zugabe von 300 μL Essigsäureethylester gestoppt und ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde
abgenommen und der Reaktionsansatz erneut mit 200 μL Essigsäureethylester extrahiert. Die
Essigsäureethylester-Phasen wurden vereinigt und mittels Speedvac zur Trockene eingeengt. Zur
77
Material und Methoden
Analyse mittels HPLC/ESI-MS wurde das Extrakt in 200 μL Methanol aufgenommen, zentrifugiert
(13200 rpm, 10 min) und anschließend mit der Methode mensO4 analysiert.
Tabelle 3-35: Zusammensetzung des Enzymassays mit FMN und MsnO3.
Bestandteil
Endkonzentration im Assay
FMN
20-40 μM
NADHred
2,5-5 mM
Deoxymensacarcin
240 μM
Catalase
120 U/mL
MsnO3
0,2-0,5 μM
MsnO8
2-4 μM
3.13 Methoden zur Aufreinigung von F420
3.13.1 Zellaufschluss für die Reinigung von F420
Zur Aufreinigung von F420 wurden S. albus-Zellen in der gleichen Menge Ladepuffer (TRIS/HCl,
pH 7,5) resuspendiert und mit einer Spatelspitze Lysozym versetzt. Nach einer Inkubationszeit von
45 min bei 40 °C wurde die Zellsuspension mehrfach in der Mikrowelle erhitzt, um Proteine
auszufällen. Die unlöslichen Zellbestandteile und ausgefällten Proteine wurden anschließend durch
Zentrifugation (100000 g, 4 °C, 1 h) abgetrennt. Der Überstand wurde in ein neues Falcon überführt
und 1:1 mit Ethanol gemischt um DNA auszufällen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt
(50000 rpm, RT, 1 h) wurde der Überstand am Rotationsverdampfer auf 1/3 des Ausgangvolumens
reduziert. Die eingeengte Lösung wurde zur Reinigung auf eine HiPrep™ DEAE FF 16/60
Anionenaustauschersäule geladen.
3.13.2 Reinigung über DEAE FF Anionenaustauschersäule
Zur Reinigung von F420 wurden die F420–haltige Lösung über Ionenaustauschchromatographie
aufgetrennt. Hierfür wurde die Lösung nach dem Zellaufschluss auf eine mit Ladepuffer-DEAE (siehe
Kapitel 3.3.12) equilibrierte HiPrep™ DEAE FF 16/60 Anionenaustasuchersäule geladen und durch
einen Gradienten mit Elutionspuffer-DEAE (30 % nach 800 mL, Flussrate: 3 mL/min) aufgetrennt. Es
wurden hierbei zwei gelbliche Faktionen erhalten: Fraktion 1 bei 250-290 mM NaCl und Fraktion 2
bei
300-330 mM
NaCl.
Fraktion
Anionenaustauschersäule geladen.
78
2
wurde
zur
weiteren
Reinigung
auf
eine
MonoQ
Material und Methoden
3.13.3 Reinigung über MonoQ-Anionenaustauschersäule
Die F420–haltige Fraktion F2, welche durch Reinigung über eine DEAE FF Anionenaustauschersäule
gewonnen wurde, wurde durch eine MonoQ Säule entsalzt und weiter aufgereinigt. Hierfür wurde die
Probe 1:4 mit MilliQ Wasser verdünnt und auf eine mit MilliQ Wasser equilibrierte MonoQ Säule
geladen. Anschließend wurde mit HCl (100 mM) eluiert (100 % nach 100 mL, Flussrate: 1 mL/min).
Die F420 enthaltenden Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer (60 °C) eingeengt und schließlich
mittels Speedvac getrocknet. Für Co-Kristallisationsexperimente und Enzymassays wurde der
gelbliche Niederschlag in TRIS/HCl, pH 8,0 aufgenommen.
3.14 Isolierung, Aufreinigung und Analyse von
Naturstoffen aus Streptomyces spp.
3.14.1 Isolierung von Naturstoffen aus Streptomyces spp.
Zur Produktion von Naturstoffen wurden die Streptomyceten in DNPM-Medium angezogen. Nach
fünf Tagen wurden die Zellen abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, 4 °C) und der Überstand auf einen
pH-Wert von 4 oder 7 eingestellt. Anschließend wurden die Sekundärstoffe aus dem Überstand
zweimal
mit
dem
gleichen
Volumen
Essigsäureethylester
ausgeschüttelt.
Die
Essigsäureethylesterphasen wurden vereinigt und über einen Cellulosefilter filtriert. Das Extrakt
wurde am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt und bis zur Analyse über HPLC/ESI-MS bei
-20 °C gelagert.
3.14.1.1 Festphasenextraktion
Um
Sekundärstoffe
aufzureinigen
wurde
im
ersten
Schritt
der
Rohextrakt
über
eine
Festphasenextraktion (SPE) aufgetrennt. Dafür wurde die Säule (OasisR HLB20 35 cc (6 g) LB
Extraktion Cartridge) mit 100 mL Methanol equilibriert und anschließend mit einer absteigenden
Methanolkonzentration konditioniert bis zu einer Endkonzentration von 30 % Methanol in H2O. Der
Rohextrakt wurde dann in Methanol gelöst und mit H2O auf einen Methanolgehalt von 30 % verdünnt.
Ungelöste Partikel wurden durch Zentrifugation (5000 rpm, 10 min) abgetrennt. Der lösliche Teil der
Mischung wurde auf die Säule aufgetragen und die Säule mit einem ansteigenden Methanolgradienten
(10 % Schritte, je 100 mL) gewaschen. Jede 100 mL Fraktion wurde dabei separat aufgefangen und
zur Trockene eingeengt. Rückstände die nicht gelöst wurden, wurden in 5 mL des neuen Eluenten
gelöst und vor dem jeweiligen Waschschritt aufgetragen. Alle gesammelten Fraktionen wurden
schließlich mittels HPLC/ESI-MS untersucht.
79
Material und Methoden
3.14.1.2 Präparative Dünnschichtchromatografie
Zur Reinigung der gebildeten Sekundärstoffe wurde im Anschluss an die Festphasenextraktion eine
präparative Dünnschichtchromatographie (DC) durchgeführt. Dafür wurde der Rohextrakt in Methanol
gelöst auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60 F254) aufgetragen. Diese wurde anschließend in einer DCKammer entwickelt (Laufstrecke: 12 cm). Für die Auftrennung wurde ein Laufmittel aus
Dichlormethan/Methanol (9:1 (V/V), 0,1 % Essigsäure) verwendet. Die gewünschte Bande (Rf-Werte:
Msn-SM2: 0,05, Msn-SM3: 0,05, Msn-SM4: 0,23, Msn-SM5: 0,42) wurde mit einem Metallschaber
abgekratzt und mit Methanol extrahiert. Die Methanolphase wurde abgenommen und die Extraktion
wurde solange wiederholt, bis die Methanolphase farblos blieb. Die organischen Phasen wurde
vereinigt und über einen 0,4 μm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt und bis zur
weiteren Reinigung bei -20 °C gelagert.
3.14.1.3 Aufreinigung der isolierten Naturstoffe über Sephadex LH20Säulenchromatographie
Als letzten Reinigungsschritt, nach der Reinigung über SPE und DC, wurde der Metabolit Msn-SM2
durch eine Säulenchromatographie weiter aufgetrennt. Hierfür wurde das Sorbens Sephadex LH 20 in
Methanol inkubiert und anschließend in eine Säule gefüllt. Für die Reinigung wurde das Derivat in
wenig Methanol gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die erhaltenen Fraktionen wurden über einen
0,4 μm-Filter filtriert und mittels HPLC/ESI-MS analysiert.
3.14.1.4 Aufreinigung über präparative HPLC
Um die Substanzen Msn-SM3 und Msn-SM4 weiter aufzureinigen, wurden diese im letzten Schritt
über die präparative HPLC aufgetrennt. Hierzu wurden die Substanzen nach der präparativen DC in
Methanol gelöst und über einen Spritzenfilter (0,45 μm) filtriert. Anschließend wurden pro Lauf 1540 μL dieser Lösung injiziert. Die Auftrennung erfolgt über eine semi-präparative HPLC/ESI-MS
Anlage (Agilent 1100). Zur Auftrennung wurde ein Säulensystem bestehend aus der Vorsäule Zorbax
80 SB C8 (9,4 mm x 15 mm, Partikelgröße 5 μm) und der Hauptsäule Zorbax SB C18 (9,4 mm x
15 mm, Partikelgröße 7 μm) verwendet. Die Detektion der Sekundärstoffe erfolgte über einen
Diodenarray-Detektor (DAD) bei einer Wellenlänge von 254 nm. Beide Derivate wurden über die
Methode SM2prepX aufgereinigt. Die Substanzen wurden manuell gesammelt und zur Trockene
einrotiert. Nachdem die erforderliche Reinheit über HPLC/ESI-MS bestätigt wurde, wurden die
Proben zur Strukturlösung per NMR an Dr. T. Paululat (Universität Siegen) übergeben.
80
Material und Methoden
Tabelle 3-36: Methode SM2prepX, die zur Aufreinigung der Substanzen Msn-SM3 und Msn-SM4 verwendet wurde.
Zeit [min]
Laufmittel A [%]
Laufmittel B [%]
0,00
50,0
50,0
6,00
50,0
50,0
8,00
60,0
40,0
8,50
95,0
5,0
12,00
95,0
5,0
12,10
50,0
50,0
17,00
50,0
50,0
Fluss: 2 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion 254 nm (Ref. 400 nm)
Laufmittel: A: Acetonitril (0,5 % (V/V) Essigsäure), B: H2Obidest (0,5 % (V/V) Essigsäure)
3.14.2 Analytik von Naturstoffen
Die Analyse und Charakterisierung der extrahierten Naturstoffe erfolgte über eine analytische
HPLC/ESI-MS-Anlage (Agilent 1100). Die Auftrennung erfolgte über ein Säulensystem bestehend
aus einer Vorsäule XBridge™ C18 (20 mm x 4,6 mm; Partikelgröße 3,5 μm) und einer Hauptsäule
XBridge™ C18 (100 mm x 4,6 mm; Partikelgröße 3,5 μm). Detektiert wurden die Analyten über einen
Diodenarray-Detektor (DAD) und einen Quadrupol Massendetektor (MSD). Die Ionisierung erfolgte
über eine ESI-Quelle (ElectroSpray Ionization; Parameter siehe Tabelle 3-37). Die Auswertung der
Daten erfolgte mit Hilfe der Software LC/MSD ChemStation Rev. A. 09.03..
Tabelle 3-37: Parameter der ESI-Quelle
Parameter
Einstellungen
MSD Scan von 200-1000 Da
MSD(+), MSD(-) Modus
Drying gas flow
12 L/min
Drying gas temperature
350 °C
Nebulizer pressure
50 psig
Capillary voltage (Vcap positive)
3000 V
Capillary voltage (Vcap negative)
3000 V
81
Material und Methoden
Zur Analyse der Mensacarcinderivate wurde die Methode mensO4 verwendet, welche von K. Probst
entwickelt wurde.58,59 In nachfolgender Tabelle sind die Parameter der Methode und der verwendete
Gradient angegeben.
Tabelle 3-38: Methode mensO4 zur Analyse von Mensacarcin und dessen Derivate.
Zeit [min]
Laufmittel A [%]
Laufmittel B [%]
0
20
80
6
20
80
7
30
70
25
95
5
28
95
5
30
20
80
35
20
80
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 30 °C; Detektion 230 nm (Ref. 400 nm), 254 nm (Ref.
400 nm), 330 nm (Ref. 500 nm), 400 nm (Ref. 600 nm).
Laufmittel: A: Acetonitril (0,5 % (V/V) Essigsäure), B: H2Obidest (0,5 % (V/V) Essigsäure)
3.14.3 Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie
Die Strukturaufklärung der aufgereinigten Naturstoffe erfolgte mittels NMR-Spektroskopie (Nuclear
Magnetic Resonancce) in Kooperation mit Dr. Thomas Paululat von der Universität Siegen. Alle
Spektren wurden auf einer Varian VNMRS-600-Apparatur gemessen. Neben 1D-NMR-Experimenten
wurden auch 2D-NMR-Experimente durchgeführt: COSY (Correlation Spectroscopy), HMBC
(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) und ROESY (Rotating Frame Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy). Alle Experimente, die zur Strukturaufklärung durchgeführt wurden, sind in Tabelle
3-39 angegeben.
Tabelle 3-39: Durchgeführte NMR-Experimente zur Strukturaufklärung der gereinigten Naturstoffe.
Mensacarcinderivat
Lösungsmittel
NMR-Experimente
Msn-SM2
CD3OD
1
Msn-SM3
CD3OD
1
Msn-SM4
CD3OD
1
82
H-NMR, 13C-NMR, 1H/1H-COSY,
1
H/13C-HMBC, ROESY, 1H/15N-HMBC
H-NMR, 13C-NMR, 1H/1H-COSY,
1
H/13C-HMBC, ROESY
H-NMR, 13C-NMR
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1
Inaktivierungsexperimente zur Untersuchung der
Didesmethylmensacarcin-Biosynthese
Der Stamm Streptomyces bottropensis Goe C4/4 wurde von M. Arnold aus einer Erdprobe isoliert,
welche in der Nähe der Göttinger Nordmensa gesammelt wurde. Aus dem Kulturextrakt konnte der
PKS II Metabolit Mensacarcin isoliert werden.110 Um das msn-Cluster zu identifizieren, wurde durch
A. Linnenbrink eine Cosmid-Bibliothek aus der genomischen DNA von S. bottropensis erstellt und
auf PKS II-Cluster gescreent. Hierbei konnte ein großer Teil des msn-Clusters (siehe Abbildung 4-1)
auf dem Cosmid Cos2 lokalisiert werden. In diesem Cluster konnten 34 ORFs gefunden werden. Diese
codieren unter anderem für die minimale PKS, Oxygenasen, Cyclasen und Regulatoren. Dabei wurden
aber auch neun putative Proteine mit unbekannter Funktion annotiert.58
Abbildung 4-1 Bereich des msn-Clusters, welcher auf dem Cosmid Cos2 lokalisiert ist. Die heterologe Expression von
Cos2 in S. albus führt zur Produktion von Didesmethylmensacarcin, einem Intermediat der Mensacarcin-Biosynthese.
Die heterologe Expression des Cosmids Cos2 in S. albus führt zur Produktion von DDMM, einem
unmethylierten Derivat von Mensacarcin.98 Dies liegt vermutlich daran, dass die Gene für den
Transfer von Methylgruppen und die SAM-Regeneration nicht auf dem Cosmid codiert sind.58 Zur
Aufklärung
der
Biosynthese
von
DDMM
wurden
von
K.
Probst
und
U.
Hardter
Geninaktivierungsexperimente durchgeführt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass einige der
putativen Gene (msnH0-H4) nicht an der Biosynthese beteiligt sind und demzufolge das Cluster
deutlich verkürzt werden kann. Zum anderen konnten einigen Oxygenasen eine spezifische Funktion
zugeordnet werden, wodurch ein vorläufiger Biosyntheseweg postuliert werden konnte.59,60 Um den
Biosyntheseweg zu vervollständigen und die Funktion des unbekannten Proteins MsnH7 zu klären,
wurden im Rahmen dieser Arbeit weitere Gene inaktiviert.
83
Ergebnisse
4.1.1 Inaktivierung der Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und
MsnO11
Ketoreduktasen katalysieren die Reduktion einer Ketogruppe zu einem sekundären Alkohol, durch
einen stereospezifischen Hydrogentransfer von NAD(P)H auf eine Ketogruppe, während der
Biosynthese aromatischer Polyketide. Diese Reaktion findet im Anschluss an den ersten Ringschluss
der Polyketidkette statt und führt zu einer bestimmten Konfiguration der Alkoholgruppe. Meist gibt es
im Cluster eines aromatischen Polyketides eine C-9 Ketoreduktase, welche am Ende der
Kettenverlängerung die regiospezifische Aldolkondensation zwischen C-7/C-12 induziert und
anschließend das neunte C-Atom reduziert.10 Neben den häufig vorkommenden C-9 Ketoreduktasen,
wurden in einigen Clustern zusätzliche Ketoreduktasen gefunden. Wie zum Beispiel die C-17
Ketoreduktasen DauE und SnoaF aus dem Daunomycin- (dau) und Nogalamycin-Cluster (sno),
welche die C-17 Ketogruppe stereospezifisch zu einem sekundären Alkohol reduzieren.24,111
Interessanterweise gibt es im msn-Cluster sogar drei Ketoreduktasen, deren Funktionen im Rahmen
dieser Arbeit untersucht werden sollten.
4.1.1.1
Aminosäuresequenz-Analyse der Ketoreduktasen
Die Gene msnO1, msnO10 und msnO11 (Abbildung 4-2) aus dem msn-Cluster wurden von Yan et al.
als Ketoreduktasen annotiert.58 Die Lage der Gene im msn-Cluster ist in Abbildung 4-2 dargestellt.
Die Gene codieren für Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 27 kDa, bestehend aus 248-261
Aminosäuren. MsnO1 wurde als homologes Protein zu BenL einer C-19 Ketoreduktase aus dem
Benastatin-Cluster beschrieben und MsnO11 als homologes Proteine zu ActKR einer C-9
Ketoreduktasen aus dem Actinorhodin-Cluster. Zu MsnO10 konnte allerdings kein homologes
Proteine gefunden werden.58
Abbildung 4-2 Darstellung des Biosynthesegenclusters von Didesmethylmensacarcin. Die rot markierten Gene msnO1,
msnO10 und msnO11 codieren für Ketoreduktasen und wurden im Rahmen dieser Arbeit inaktiviert.
Lackner et al. konnten zeigen, dass sowohl das Zyklisierungsmuster eines Polyketides als auch die
Regiochemie einer Ketoreduktion anhand einer Sequenzanalyse der Ketoreduktase vorhergesagt
werden kann.24 Um weitere Einblicke in die Funktion der Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und
MsnO11 zu erhalten, wurden Sequenzvergleiche mit Ketoreduktasen aus verschieden Typ II PKS84
Ergebnisse
Clustern durchgeführt (siehe Abbildung 4-3). Der Sequenzvergleich und die phylogenetische Analyse
wurden mit dem Online-Tool Phylogeny.fr durchgeführt.106
O
COOH
O
COOMe
OH
O
C-9 KR
OH
O
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
C-13 KR
OH
HO
OH
O
OH
C-15 KR
OR
O
O
OH
O
OH
OR
COOMe
OH
C-17 KR
OH
O
OH
OH
COOH
HO
HO
C-19 KR
OH
O
OH
Abbildung 4-3 Phylogenetischer Stammbaum von verschiedenen Ketoreduktasen.24 FabG aus E. coli wurde als
Outgroup (Wurzel) verwendet.
Ein Sequenzvergleich von MsnO11 mit verschiedenen Ketoreduktasen zeigt eindeutig, dass MsnO11
einen hohen Verwandtschaftsgrad mit bekannten C-9 Ketoreduktasen aufweist. Demzufolge wird
MsnO11 sehr wahrscheinlich die C-9 Ketogruppe während der Biosynthese von DDMM reduzieren.
Obwohl die BLASTp-Analyse von MsnO1 eine sehr hohe Homologie zu BenL ergab, wird MsnO1 im
phylogenetischen Stammbaum eher der Superfamilie der C-15 und C-17 Ketoreduktasen zugeordnet.
Für MsnO10 kann, auch nach dem Vergleich durch die Sequenzanalyse mit bekannten
Ketoreduktasen, keine Funktion vorhergesagt werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass
MsnO10, ebenso wie MsnO1, am wahrscheinlichsten der Superfamilie der C-15 und C-17
Ketoreduktasen zugeordnet werden kann. Um die Funktionen der Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10
und MsnO11 weiter zu untersuchen, wurden Geninaktivierungsexperimente durchgeführt, welche im
Folgenden näher beschrieben werden.
85
Ergebnisse
4.1.1.2
Durchführung der Inaktivierung mittels Redirect®-Methode
Die Gene msnO1, msnO10 und msnO11 wurden auf dem Cosmid Cos2, wie unter Kapitel 3.11.1
beschrieben, mittels Redirect®-Methode inaktiviert. Hierfür wurde das Zielgen durch eine
Resistenzkassette, welche das Spectinomycin-Resistenzgen aadA beinhaltete, ausgetauscht. Zur
Kontrolle der erfolgreichen Rekombination erfolgte eine PCR. Anschließend wurde die
Resistenzkassette über die eingebrachten NdeI-Schnittstellen entfernt, um polare Effekte zu
vermeiden. Nach anschließender Religation und positiver Kontroll-PCR wurden die Cosmide in
S. albus eingebracht, um den Einfluss der Inaktivierung auf die DDMM-Biosynthese zu untersuchen.
Die Inaktivierung des Gens msnO1 wurde mit dem Primerpaar O1Kontr-F/O1Kontr-R überprüft. Nach
Rekombination mit der Resistenzkassette wurde Cos2∆O1MK erhalten, dadurch vergrößerte sich das
PCR-Fragment bei der Kontroll-PCR. Wurde Cos2 als Template für msnO1 verwendet, wurde ein
PCR-Fragment mit einer Größe von 1472 bp amplifiziert. Nach erfolgter Rekombination wurde ein
PCR-Produkt mit einer Größe von 1699 bp erhalten. Durch Entfernung der Resistenzkassette entstand
schließlich Cos2∆O1, mit welchem ein PCR-Produkt mit einer Größe von 738 bp erhalten wurde
(siehe Abbildung 4-4).
Abbildung 4-4 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnO1 auf dem
Cosmid Cos2. Aufgetragen wurden die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Spur 2), Cos2∆O1MK
(Spur 3) und Cos2∆O1 (Spur 4) als Template. Als Größenstandard wurde die 1 kb DNA Leiter (NEB) verwendet (Spur 1).
Die Inaktivierung des Gens msnO10 erfolgte ebenfalls durch Rekombination mit einer
Resistenzkassette, wodurch das Cosmid Cos2∆O10MK entstand. Durch die nachfolgende Entfernung
der Resistenzkassette, über die eingebrachten NdeI-Schnittstellen, entstand das Cosmid Cos2∆O10.
Der Nachweis über die erfolgreiche Inaktivierung erfolgte über PCR mit dem Primerpaar O10KontrF/O10Kontr-R (siehe Abbildung 4-5). Wurde Cos2∆O10MK als Template verwendet, wurde ein
Fragment mit einer Größe von 2320 bp erhalten, während Cos2∆O10 als Template nach Entfernung
86
Ergebnisse
der Resistenzkassette ein Produkt mit einer Größe von 1359 bp ergab. Als Kontrolle wurde Cos2 mit
intaktem msnO10 als Template verwendet. Dies führte zu einem PCR-Produkt mit einer Größe von
2129 bp.
Abbildung 4-5 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnO10 auf dem
Cosmid Cos2. Aufgetragen wurden die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Spur 1), Cos2∆O10MK (Spur
2) und Cos2∆O10 (Spur 3) als Template. Als Größenstandard wurde die 1 kb DNA Leiter (NEB) verwendet (Spur 4).
Der Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnO11 wurde ebenfalls mittels PCR erbracht.
Hierfür wurde das Primerpaar O11Kontr-F/O11Kontr-R verwendet. Durch die Rekombination von
Cos2 mit der Resistenzkassette entstand Cos2∆O11MK. Wurde dies als Template verwendet, dann
wurde ein PCR-Produkt mit einer Größe von 1609 bp gebildet. Cos2∆O11 wurde durch Entfernung
der Resistenzkassette über die eingebrachten NdeI-Schnittstellen erhalten. Die Kontroll-PCR führte
zur Amplifizierung eines Fragmentes mit einer Größe von 541 bp. Dieselbe PCR wurde mit Cos2 als
Template durchgeführt. Durch das intakte Gen msnO11 kam es zur Amplifizierung eines PCRProduktes mit einer Größe von 1409 bp (siehe Abbildung 4-6).
87
Ergebnisse
Abbildung 4-6 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnO11 auf dem
Cosmid Cos2. Aufgetragen wurden die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Spur 2), Cos2∆O11MK (Spur
3) und Cos2∆O11 (Spur 4) als Template. Als Größenstandard wurde die PCR Quick Laod DNA Leiter (NEB) verwendet
(Spur 1).
Die Inaktivierungskonstrukte wurden über intergenerische Konjugation, wie unter Kapitel 3.9.11
beschrieben, in den heterologen Wirt S. albus eingebracht. Zusätzlich wurde das Plasmid pKR1 in den
Stamm eingebracht. Dieses führt zur Überexpression des SARP-Regulatorgens msnR1 aus dem msnCluster. K. Probst konnte zeigen, dass es nur bei der Überexpression des SARP-Regulators zur
Bildung von nachweisbaren Mengen an Biosyntheseintermediaten kommt.59 Die neu entstandenen
Stämme wurden S. albus Cos2∆O1 x pKR1, S. albus Cos2∆O10 x pKR1 und S. albus Cos2∆O11 x
pKR1 genannt. Zur Kontrolle wurde eine Komplementierung durchgeführt um zu zeigen, dass keine
weiteren Gene durch die Inaktivierung beeinflusst wurden. Hierzu wurde in die Stämme S. albus
Cos2∆O10
und
S. albus Cos2∆O11
das
jeweilige
Komplementierungskonstrukt
pKO10R1
beziehungsweise pKO11R1 eingebracht. Die Erstellung des Komplementierungskonstruktes pKO1R1
und die Komplementierung von S. albus Cos2∆O1 wurden von K. Heßelbach im Rahmen ihrer
Diplomarbeit durchgeführt.112
4.1.1.3
Produktionsanalyse von S. albus Cos2∆O1 x pKR1
Um den Einfluss der Inaktivierung von msnO1 zu untersuchen, wurde die Inaktivierungsmutante
S. albus Cos2∆O1 x pKR1 in Produktionsmedium kultiviert, wie unter Kapitel 3.9.10 beschrieben.
Parallel dazu wurde unter denselben Bedingungen der Stamm S. albus Cos2 x pKR1 als
Positivkontrolle und der Stamm S. albus pOJ436 x pKR1 als Negativkontrolle angezogen. Nach vier
Tagen wurde das Produktionsmedium mit Essigsäureethylester extrahiert und das Produktionsprofil
über HPLC/ESI-MS analysiert. Für die Analyse wurde die von K. Probst entwickelte Methode
mensO4 verwendet.59 Die erhaltenen Chromatogramme sowie UV- und MS-Spektren sind in
88
Ergebnisse
Abbildung 4-7 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass der Stamm S. albus Cos2∆O1 x pKR1 nicht
mehr fähig ist, DDMM zu produzieren. Im Vergleich zum Produktionsprofil der Negativkontrolle
konnte aber ein neuer Metabolit, mit einer Retentionszeit von 15,8 min und einem MasseLadungsverhältnis (m/z) von 367,1 im negativen Detektionsmodus, detektiert werden.
Abbildung 4-7 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆O1 x pKR1 und S. albus Cos2 x pKR1. A) Die msnO1 Inaktivierungsmutante ist nicht mehr fähig DDMM (grün
hinterlegt) zu produzieren, allerdings konnte die Produktion eines neuen Sekundärstoffs (Msn-KH1 violett hinterlegt)
nachgewiesen werden. B) Darstellung des UV-Absorptionsspektrums von Msn-KH1 (violett) im Vergleich zu DDMM
(grün). C) MS-Spektrum (negativer Detektionsmodus) von Msn-KH1.
4.1.1.4
Isolierung und Strukturaufklärung von Msn-KH1
Die vom Stamm S. albus Cos2∆O1 x pKR1 produzierte Substanz wurde von K. Heßelbach im
Rahmen ihrer Diplomarbeit isoliert und Msn-KH1 genannt. Außerdem klonierte sie das
Komplementierungskonstrukt pKO1R1 und brachte es in den Stamm S. albus Cos2∆O1 ein. Die
Komplementierung führte zur Wiederherstellung der DDMM-Produktion. Dadurch konnte gezeigt
werden, dass durch die Inaktivierung von msnO1 keine weiteren Gene beeinflusst wurden. Die
89
Ergebnisse
Strukturaufklärung der isolierten Substanz Msn-KH1 wurde von Dr. T. Paululat übernommen und
führte zur Struktur, welche in Abbildung 4-8 dargestellt ist.
Abbildung 4-8 Strukur von Msn-KH1. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O1 zusammen mit dem Plasmid
pKR1 in S. albus führt zur Produktion von Msn-KH1.
Die Struktur von Msn-KH1 ist bereits unter dem Namen SEK43 bekannt und wurde erstmals 1995 von
McDaniel et al. beschrieben.113 Die Substanz wurde aus dem Stamm Streptomyces coelicolor CH999
isoliert nachdem die minimale PKS aus dem Tetracenomycin-Cluster zusammen mit der
Ketoreduktase (ActKR) aus dem Actinorhodin-Cluster und der Aromatase aus dem Griseusin-Cluster
überexprimiert wurde.113
4.1.1.5
Produktionsanalyse von S. albus Cos2∆O10 x pKR1
Nach Inaktivierung des Gens msnO10 wurde das Konstrukt Cos2∆O10 und das Plasmid pKR1 in den
Stamm S. albus eingebracht. Um die Produktion des dadurch entstanden Stammes S. albus Cos2∆O10
x pKR1 zu analysieren, wurde der Stamm für vier Tage in DNPM-Produktionsmedium kultiviert
(siehe 3.9.10). Außerdem wurden zur Kontrolle die Stämme S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus
pOJ436 x pKR1 unter denselben Bedingungen angezogen. Der Kulturüberstand wurde mit
Essigsäureethylester extrahiert und der Rohextrakt über HPLC/ESI-MS (Methode: mensO4)
analysiert. Die erhaltenen Chromatogramme sowie UV- und MS-Spektren sind in Abbildung 4-9
dargestellt. Die Analyse ergab, dass die Inaktivierungsmutante S. albus Cos2∆O10 x pKR1 nicht mehr
in der Lage ist DDMM zu bilden. Obwohl im UV-Absorptionsspektrum ein kleiner Peak bei der
entsprechenden Retentionszeit zu erkennnen war, konnte die Masse von DDMM nicht detektiert
werden. Allerdings konnten zwei neue Intermediate identifiziert werden, deren Signale im
90
Ergebnisse
Chromatogramm mit einer Retentionszeit von 6,1 min und 15,3 min auftreten. Im weiteren Verlauf der
Arbeit wurden diese Substanzen Msn-SM1 und Msn-SM2 genannt.
Abbildung 4-9 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆O10 x pKR1, S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O10 x pKO10R1. A) Die msnO10 Inaktivierungsmutante
ist nicht mehr fähig DDMM (grün hinterlegt) zu produzieren, allerdings konnte die Produktion zweier neuer Sekundärstoffe
(Msn-SM1 türkis hinterlegt und Msn-SM2 violett hinterlegt) nachgewiesen werden. Nach der Komplementierung von
S. albus Cos2∆O10 mit dem Plasmid pKO10R1 konnte die Produktion von DDMM wieder hergestellt werden. B) UVAbsorptionsspektrum von Msn-SM1 (türkis) im Vergleich zu DDMM (grün). C) MS-Spektrum (negativer Detektionsmodus)
von Msn-SM1. D) UV-Absorptionsspektrum von Msn-SM2 (violett) im Vergleich zu DDMM (grün). E) MS-Spektrum
(negativer Detektionsmodus) Msn-SM2.
Für die entsprechenden Signale konnte im negativen Detektionsmodus ein m/z-Wert von 391,2 für
Msn-SM1 und 432,1 für Msn-SM2 ermittelt werden. Das UV-Absorptionsspektrum von Msn-SM1
91
Ergebnisse
zeigt drei Absorptionsmaxima bei 226 nm, 260 nm und 319 nm und ist weitgehend identisch mit dem
von
DDMM.
Die
Substanz
Msn-SM2
hat
im
Vergleich
zu
DDMM
nur
noch
ein
Hauptabsorptionsmaximum bei 249 nm und zwei geringer bei 338 nm und 354 nm.
Um einen Einfluss der Inaktivierung auf die Expression der anderen Gene im Cluster auszuschließen,
wurde der Stamm S. albus Cos2∆O10 mit dem Plasmid pKO10R1 (Kapitel 3.10.1.1) komplementiert.
Durch die Analyse des Produktionsprofiles (Abbildung 4-9) von S. albus Cos2∆O10 x pKO10R1
konnte gezeigt werden, dass der Stamm durch die Komplementierung wieder DDMM produzierte.
4.1.1.6
Isolierung von Msn-SM1 und Msn-SM2
Zur Isolierung von Msn-SM1 und Msn-SM2 wurde der Stamm S. albus Cos2∆O10 x pKR1 in fünf
Litern DNPM-Produktionsmedium angezogen. Der Rohextrakt wurde über Festphasenextraktion
aufgetrennt. Msn-SM1 wurde dabei in der 40 % und in der 50 % Fraktion eluiert und Msn-SM2 in der
80 % Fraktion. Msn-SM1-haltige Fraktionen wurden vereinigt und es wurde versucht eine bessere
Abtrennung über eine zweite Festphasenextraktion zu erreichen. Dabei wurde die Methanol
Konzentration in 5 % Schritten erhöht. Anschließend wurde eine präparative DC durchgeführt. Da
Msn-SM1 sehr hydrophil ist und durch einige andere Substanzen überlagert wurde, konnte sie mit den
zur Verfügung stehenden Methoden nicht in der für die Strukturaufklärung benötigten Reinheit und
Menge gewonnen werden. Die 80 % Fraktion, welche die Substanz Msn-SM2 enthielt, wurde über
präparative DC weiter aufgereinigt. Die entsprechende Bande wurde ausgekratzt und mit Methanol
extrahiert. Anschließend wurde die Probe über eine Sephadex LH 20 Säule von kleineren
Verunreinigungen abgetrennt. Es konnten 7,7 mg Msn-SM2 mit einer Reinheit von über 90 %
gewonnen werden. Die Substanz wurde an Dr. T. Paululat, für die Strukturlösung mittels NMR,
übergeben.
4.1.1.7
Strukturaufklärung von Msn-SM2
Die Struktur von Msn-SM2 wurde in Kooperation mit Dr. T. Pauluat gelöst. Hierfür wurde die
Substanz in CD3OD gelöst und 1H-,
13
C- und 2D-NMR Experimente (1H/1H-COSY, HMBC und
ROESY) durchgeführt. Die gemessenen NMR-Daten sind in Tabelle 4-1 angegeben. Zur Bestätigung
des Schwefelatoms in der postulierten Struktur wurde die exakte molekulare Masse von Msn-SM2
mittels hochauflösendem HR-ESI-MS bestimmt. Daraus ergab sich die Summenformel C20H19NO8S
mit einem m/z-Wert von 434,0901 [M+H]+ im positiven Detektionsmodus. Die Auswertung der
NMR-Daten (siehe Tabelle 4-1) führte schließlich zur Struktur, welche in Abbildung 4-10 dargestellt
ist.
92
Ergebnisse
Abbildung 4-10 Struktur von Msn-SM2. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O10 zusammen mit dem Plasmid
pKR1 in S. albus führt zur Produktion von Msn-SM2.
Im
13
C-NMR wurden 20 Signale gemessen, wobei fünf Signale im aliphatischen Bereich (δC = 5-
50 ppm) detektiert wurden. Zwei dieser Signale (Position 13 und 20) konnten aufgrund ihrer
Verschiebung (δC = 17,3 ppm und δC = 22,4 ppm) Methylgruppen zugeordnet werden. Des Weiteren
wurden zwölf Signale im ungesättigten Bereich (δC = 100-170 ppm) detektiert. Vier dieser Signale
wurden tieffeldverschoben durch die Bindung an einen phenolischen Sauerstoff. Außerdem wurden
drei weitere Signale mit einer starken Tieffeldverschiebung (δC = 172,7 ppm, 176,8 ppm und
180,2 ppm) detektiert. Zwei dieser Kohlenstoffatome (Position 11 und 17) konnten Carbonsäuren
zugeordnet werden, während das Signal des dritten Kohlenstoffatoms (Position 19) aufgrund einer
Carbonylfunktion ebenfalls tieffeldverschoben ist. Durch die COSY und ROESY-Daten konnten die
Protonen (δH = 7,78 ppm, 7,25 ppm und 6,99 ppm) einem aromatischen Spinsystem und den
entsprechenden Kohlenstoffatomen an den Positionen 6, 7 und 8 zugeordnet werden. Ein weiteres
Wasserstoffatom im aromatischen Bereich (δH = 7,05 ppm) konnte dem Kohlenstoffatom in Positionen
10 zugeordnet werden. Das HMBC-Spektrum zeigt durch 2JCH-Kopplungen, dass eine Methylgruppe
an das Kohlenstoffatom in Positionen 19 und die zweite Methylgruppe an das Kohlenstoffatom in
Position 12 gebunden ist. Die Position des Stickstoffatoms konnte durch 1H/15N-HMBC Messungen
ermittelt werden. Dabei wurden Kopplungen zwischen dem Stickstoffatom und den Protonen der
Methylgruppe an Position 20 und des Ha-Protons an Position 15 detektiert (δN = 127,1 ppm).
93
Ergebnisse
Tabelle 4-1 NMR-Daten von Msn-SM2, gelöst in CD3OD. δH: 600 MHz, δC: 150 MHz, Temperatur = 25 °C. Schwache
Signale sind in Klammern gesetzt.
Pos.
δC
δH (J Hz)
COSY
HMBC
ROESY
1
162,0
-
-
12-H, 13-H2
-
2
108,9
-
-
10-H, 12-H,
15-Ha, 15-Hb
-
3
127,0
-
-
-
-
4
144,0
-
-
10-H
-
5
150,9
-
-
6-H, 10-H
-
5a
126,8
-
-
(6-H), 7-H,
10-H
-
6
115,9
7,78 dd (8,4, 0,8)
7-H, (8-H)
8-H
7-H
7
125,4
7,25 dd (8,4, 7,7)
6-H, 8-H
1
6-H, 8-H
8
112,8
6,99 dd (7,7, 0,8)
(6-H), 7-H
6-H, (7-H)
7-H
9
152,2
-
-
7-H, 8-H
-
9a
114,7
-
-
6-H, (7-H),
8-H, (10-H)
-
10
100,4
7,05 s
-
1
15-Hb, (15-Ha), 16-H,
(20-H3)
11
180,2
-
-
12-H, 13-H3
-
12
42,4
4,34 q (7,4)
13-H
13-H3
13-H3
13
17,3
1,62 d (7,4)
12-H
12-H, 1J
12-H, (15-Hb)
15
37,9
Ha: 3,15 dd (13,7,
3,5)
15-Hb, 16-H 16-H
J
J
15-Ha, 16-H
Hb: 3,40 dd (13,7,
7,2)
Ha: 10-H, 12-H, 15-Hb,
16-H, (20-H3)
Hb: 10-H, 12-H, 13-H3,
15-Ha, 16-H, (20-H3)
16
57,8
4,40 dd (7,2, 3,5)
-
15-Ha, 15-Hb
10-H, 15-Ha, 15-Hb, (20H3)
17
176,8
-
-
15-Ha, 15-Hb,
16-H
-
18
-
-
-
-
-
19
172,7
-
-
16-H, 20-H3
-
20
22,4
1,48 s
-
1
(10-H), 16-H
94
J
Ergebnisse
4.1.1.8
Produktionsanalyse von S. albus Cos2∆O11 x pKR1
Nach erfolgreicher Inaktivierung des Gens msnO11 wurde das Cosmid Cos2∆O11 zusammen mit dem
Plasmid pKR1 in den Stamm S. albus eingebracht. Der dadurch entstandene Stamm S. albus
Cos2∆O11 x pKR1 wurde für vier Tage in DNPM-Produktionsmedium kultiviert. Anschließend
wurde der Kulturüberstand mit Essigsäureethylester extrahiert und mittels HPLC/ESI-MS analysiert.
Zur Kontrolle wurden die Stämme S. albus Cos2 x pKR1 sowie S. albus pOJ436 x pKR1 unter
denselben Bedingungen angezogen. Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abbildung 4-11
dargestellt. Durch die Inaktivierung ist der Stamm S. albus Cos2∆O11 x pKR1 nicht mehr fähig
DDMM zu produzieren. Im Vergleich zur Negativkontrolle konnte allerdings auch kein anderer
Sekundärstoff
detektiert
werden.
Daraufhin
wurde
nach
der
Kultivierung
in
DNPM-
Produktionsmedium auch das Zellpellet untersucht. Auch dabei konnte kein neuer Metabolit
identifiziert werden. Da durch die Inaktivierung auch die Expression anderer Gene beeinflusst werden
kann, wurde eine Komplementierung durchgeführt. Dafür wurde das Komplementierungsplasmid
pKO11R1 in den Stamm S. albus Cos2∆O11 eingebracht. Die Analyse des Produktionsprofiles von
S. albus Cos2∆O11 x pKO11R1 (Abbildung 4-11) zeigte, dass der Stamm wieder DDMM produzierte.
Dadurch wurde bestätigt, dass der vollständige Zusammenbruch der DDMM-Biosynthese nur durch
die Inaktivierung des Gens msnO11 zustande kam.
Abbildung 4-11 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆O11 x pKR1, S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O11 x pKO11R1. Die msnO11 Inaktivierungsmutante
produziert kein DDMM (grün hinterlegt), allerdings konnte auch keine Produktion neuer Sekundärstoffe nachgewiesen
werden. Durch die Komplementierung von S. albus Cos2∆O11 mit dem Plasmid pKO11R1 konnte die Produktion von
DDMM wiederhergestellt werden.
95
Ergebnisse
4.1.2 Inaktivierung von msnH7 - ein Gen mit unbekannter Funktion
Im Gencluster von DDMM konnten neun Gene (msnH0-msnH8) identifiziert werden, welche für
hypothetische Proteine mit noch unbekannter Funktion codieren.58 Durch Transkriptionsanalysen
konnte K. Probst im Rahmen ihrer Dissertation nachweisen, dass die Gene msnH4 und msnH8
während der DDMM-Produktion nicht transkribiert werden. Außerdem konnte sie durch
Geninaktivierungsexperimente zeigen, das die Gene msnH0, msnH1, msnH2, msnH3 und msnH4
beziehungsweise die entsprechenden Proteine, keinen Einfluss auf die DDMM-Biosynthese haben.59
Demzufolge ist nur noch die Funktion der hypothetischen Proteine MsnH5, MsnH6 und MsnH7
ungeklärt.
4.1.2.1
Aminosäuresequenz-Analyse des putativen Proteins MsnH7
Im Gencluster von DDMM codiert das Gen msnH7 (Abbildung 4-12) für ein hypothetisches Protein
mit einer Größe von 32 kDa.58 Über NCBI wurde die Proteinsequenz auf konservierte Bereiche
untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass MsnH7 zur Superfamilie der Abhydrolase_6
(pfam12697) gehört. Diese beinhaltet α,β-Hydrolasen mit unterschiedlichen Funktionen. Ein
Datenbankabgleich mit dem Programm BLASTp zeigte außerdem, dass MsnH7 Homologien zu
Thioesterasen von Streptomyces acidiscabies und Streptomyces sviceus aufweist.
Abbildung 4-12 Darstellung des Biosynthesegenclusters von Didesmethylmensacarcin. Gene, welche für Proteine mit
unbekannter Funktion codieren, sind türkis dargestellt. Das markierte Gen msnH7 wurde im Rahmen dieser Arbeit
inaktiviert.
Thioesterasen katalysieren die Spaltung von Thioestern in Thiole und freie Säuren unter Abspaltung
von Wasser. Diese Reaktion findet zum Beispiel am Ende der Fettsäure-Biosynthese statt. Dabei
katalysiert die Thioesterase die Freisetzung der fertigen Carbonsäure von dem Acyl-Carrier-Protein.
Ebenfalls katalysieren Thioesterase-Domänen dieselbe Reaktion in der Biosynthese von PKS IMetaboliten. In der Biosynthese von PKS II-Metaboliten sind Thioesterasen jedoch nur sehr selten zu
finden. Bekannte Thioesterasen sind zum Beispiel EncL aus dem Enterocin-Cluster114, DpsD aus dem
Daunorubicin-Cluster115, FrenK aus dem Frenolicin-Cluster116 oder ZhuC aus dem R1128 PKS IICluster117. Es konnte gezeigt werden, dass ZhuC und EncL am Anfang der Biosynthese als
Korrekturenzyme dienen. Hierbei hydrolysieren sie falsch beladene Acyl-Carrier-Proteine, welche mit
einer Acetateinheit beladenen sind.118,119 Die Polyketidbiosynthese dieser PKS II-Metabolite, beginnt
96
Ergebnisse
aber im Gegensatz zu Mensacarcin nicht mit einer Acetat-Startereinheit. Um mehr Informationen über
die Funktion von MsnH7 während der Biosynthese von DDMM zu gewinnen, wurde das Gen msnH7
inaktiviert.
4.1.2.2
Durchführung der Inaktivierung von msnH7 mittels Redirect®-Methode
Das Gen msnH7 wurde, wie unter Kapitel 3.11.1 beschrieben, über die Redirect®-Methode inaktiviert.
Hierfür wurde das Cosmid Cos2 mit einer Resistenzkassette rekombiniert. Dadurch entstand das
Cosmid Cos2∆H7MK. Um polare Effekte zu vermeiden, wurde die Resistenzkassette über die
eingebrachten NdeI-Schnittstellen entfernt. Hierdurch entstand das Cosmid Cos2∆H7, welches für die
Produktionsanalyse in S. albus verwendet wurde. Zur Kontrolle der Rekombination und der
Entfernung der Resistenzkassette erfolgte eine Kontroll-PCR mit dem Primerpaar H7KontrF/H7Kontr-R (siehe Abbildung 4-13). Die PCR mit Cos2∆H7MK als Template führte zu einem
Produkt mit einer Größe von 2000 bp, während Cos2∆H7 nur ein PCR-Produkt mit einer Größe von
1039 bp lieferte. Zur Kontrolle wurde die PCR ebenfalls mit Cos2 als Template verwendet, wobei das
intakte Gen msnH7 amplifiziert wurde. Dies führte zu einem PCR-Fragment mit einer Größe von
1816 bp.
Abbildung 4-13 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnH7 auf dem
Cosmid Cos2. Aufgetragen wurden die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Spur 2), Cos2∆H7MK (Spur
3) und Cos2∆H7 (Spur 4) als Template. Als Größenstandard wurde die 1 kb DNA Leiter (NEB) verwendet (Spur 1).
Das Inaktivierungskonstrukt Cos2∆H7 wurde anschließend über intergenerische Konjugation, wie
unter Kapitel 3.9.11 beschrieben, in den heterologen Wirt S. albus eingebracht. Zusätzlich wurde, zur
Überexpression des SARP-Regulatorgens msnR1, das Plasmid pKR1 in den Stamm eingebracht. Der
neu entstandene Stamm wurde S. albus Cos2∆H7 x pKR1 genannt. Eine Komplementierung wurde
durchgeführt um zu kontrollieren, dass durch die Inaktivierung von msnH7 keine weiteren Gene
97
Ergebnisse
beeinflusst wurden. Hierzu wurde das Komplementierungskonstrukt pKR1H7 kloniert und in den
Stamm S. albus Cos2∆H7 eingebracht.
4.1.2.3
Produktionsanalyse der Mutante und der komplementierten Mutante
Um den Einfluss des Gens msnH7 auf die DDMM-Biosynthese zu analysieren, wurde der Stamm
S. albus Cos2∆H7 x pKR1 für vier Tage in DNPM-Produktionsmedium kultiviert und anschließend
das Produktionsprofil analysiert. Hierfür wurde der Überstand mit Essigsäureethylester extrahiert und
über HPLC/ESI-MS analysiert. Als Positiv- und Negativkontrolle wurden die Stämme S. albus Cos2 x
pKR1 und S. albus pOJ436 x pKR1 unter denselben Bedingungen angezogen und ebenfalls mittels
HPLC/ESI-MS analysiert. Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abbildung 4-14 dargestellt. Bei
einer Retentionszeit von 9,8 min ist im Extrakt des Stammes S. albus Cos2∆H7 x pKR1 deutlich ein
Peak erkennbar. Dieser kann durch Vergleich mit Retentionszeit, MS- und UV-Absorptionsspektrum
eindeutig DDMM zugewiesen werden. Weitere neue Intermediate konnten nicht nachgewiesen
werden. Demnach ist das Protein MsnH7 nicht essentiell für die Biosynthese von DDMM, allerdings
wird die Produktionsrate durch die Inaktivierung von msnH7 beeinträchtigt. Wie im Chromatogramm
erkennbar, nimmt die Produktion von DDMM im Vergleich zur Positivkontrolle etwas ab.
Abbildung 4-14 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆H7 x pKR1, S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆H7 x pKH7R1. Sowohl im Extrakt der msnH7
Inaktivierungsmutante als auch im Extrakt der komplementierten Mutante konnte DDMM (grün hinterlegt) nachgewiesen
werden, allerdings in etwas geringerer Konzentration als in der Positivkontrolle. Dies lässt den Schluss zu, dass msnH7 für
die Biosynthese von DDMM nicht essentiell ist, aber zu einer verstärkten Produktion beiträgt.
98
Ergebnisse
4.1.3 Komplementierung der Mutante S. albus x Cos2∆O2
Im Biosynthesegencluster von DDMM codieren drei Gene (msnO2, msnO4 und msnO8) für
Luciferase-like Monooxygenasen (siehe Abbildung 4-15). Nach Geninaktivierungsexperimenten
postulierte K. Probst für die Enzyme MsnO4 und MsnO8 eine spezifische Funktion. MsnO4 ist
demnach für die Epoxidierung der Kernstruktur verantwortlich, während MsnO8 die Epoxidgruppe in
der Seitenkette einführt.59 Zur Aufklärung der Funktion von MsnO2 wurden von U. Hardter
Inaktivierungsexperimente durchgeführt. Die Produktionsanalyse des Cosmids Cos2∆O2 ergab, dass
die Inaktivierungsmutante das Intermediat Msn-UH produziert.60 Die Komplementierung dieser
Mutante wurde im Rahmen dieser Arbeit ausgeführt und sollte zeigen, dass es durch die Inaktivierung
von msnO2 nicht zur Beeinflussung anderer Gene kam.
Abbildung 4-15 Darstellung des Biosynthesegenclusters von Didesmethylmensacarcin. Gene, welche für Oxygenasen
codieren, sind rot dargestellt. Die markierten Gene msnO2, msnO4 und msnO8 codieren für Luciferase-like
Monooxygenasen. Die Komplementierung des Gens msnO2 wurde im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt.
4.1.3.1
Aminosäuresequenz-Analyse von MsnO2
Das Gen msnO2 codiert für ein Protein mit einer Größe von 351 Aminosäuren. Nach Yan et al. besitzt
dieses eine hohe Ähnlichkeit zu Subdomänen der Luciferase von V. harveyi. Über NCBI wurde die
Proteinsequenz auf konservierte Bereiche untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass MsnO2 eine
Domäne der Pfam0296 besitzt und dadurch zur Superfamilie der Flavin-verwendendenMonooxygenasen zugeordnet wird. Diese Familie beinhaltet sowohl Alkansulfonat-Monooxygenasen,
Nitrilotriacetat-Monooxygenasen, Alkanal-Monooxygenasen wie auch TetrahydromethanopterinReduktasen. Eine BLASTp-Analyse ergab, dass MsnO2 Ähnlichkeiten zu MitH aufweist (27%
identische, 40% ähnliche Aminosäuren), einer F420-abhängigen H4MPT Dehydratase aus dem
Mitomycin C-Biosynthesegencluster.
Diese
katalysiert
vermutlich
die
Reduktion
der
C-6
Carbonylfunktion zu einer Methylgruppe.82
4.1.3.2
Produktionsanalyse der Mutante und der komplementierten Mutante
Das Inaktivierungskonstrukt Cos2∆O2, welches von U. Hardter erstellt wurde, wurde über
intergenerische Konjugation, wie unter Kapitel 3.9.11 beschrieben, in den heterologen Wirt S. albus
eingebracht. Zusätzlich wurde zur Überexpression des SARP-Regulatorgens msnR1 das Plasmid
99
Ergebnisse
pKR1 in denselben Stamm eingebracht. Der neu entstandene Stamm wurden S. albus Cos2∆O2 x
pKR1 genannt. Zur Kontrolle der Inaktivierung von msnO2 und zum Ausschluss polarer Effekte
wurde eine Komplementierung durchgeführt. Hierzu wurde das Komplementierungskonstrukt
pKO2R1
kloniert
und
in
den
Stamm
S. albus Cos2∆O2
eingebracht.
Die
Stämme
S. albus Cos2∆O2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O2 x pKO2R1 wurden für fünf Tage in DNPMProduktionsmedium kultiviert und anschließend der Kulturüberstand analysiert, um die erfolgreiche
Komplementierung nachzuweisen. Hierfür wurde nach der Inkubationszeit das Mycel durch
Zentrifugation abgetrennt und der Überstand mit Essigsäureethylester extrahiert. Gleichzeitig wurden
zur Positiv- und Negativkontrolle die Stämme S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus pOJ436 x pKR1
angezogen und ebenfalls analysiert. Die Rohextrakte wurden mittels HPLC/ESI-MS (Methode:
mensO4) auf die Produktion der Sekundärstoffe DDMM und Msn-UH untersucht. Die erhaltenen
Chromatogramme, sowie MS- und UV-Absorptionsspektren sind in Abbildung 4-16 dargestellt.
A)
A [mAU]
S. albus pOJ436 x pKR1
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
A [mAU]
30
t [min]
S. albus Cos2∆O2 x pKR1
300
200
100
0
0
A [mAU]
5
10
15
20
25
30
t [min]
S. albus Cos2 x pKR1
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
A [mAU]
250
S. albus Cos2∆O2 x pKO2R1
200
150
100
50
0
B)
5
10
15
DDMM
Msn-UH
Norm.
500
20
C)
25
30
t [min]
339.1
0
100
80
400
60
300
0
813.4
701.2
217.0
20
100
340.1
40
200
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
400
600
800
m/z
Abbildung 4-16 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆O2 x pKR1, S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O2 x pKO2R1. A) Im Produktionsprofil der
Inaktivierungsmutante von msnO2 konnte die Produktion von Msn-UH (violett hinterlegt) nachgewiesen werden. Nach der
Komplementierung von S. albus Cos2∆O2 mit dem Plasmid pKO2R1 konnte die Produktion von DDMM (grün hinterlegt)
wieder hergestellt werden, allerdings produzierte die Komplementierungsmutante ebenfalls eine geringe Menge Msn-UH
(violett hinterlegt). B) UV-Absorptionsspektrum von Msn-UH (violett) im Vergleich zu DDMM (grün). C) MS-Spektrum
(negativer Detektionsmodus) von Msn-UH.
100
Ergebnisse
Bei der Analyse des Rohextraktes von S. albus Cos2∆O2 x pKR1 konnte bei einer Retentionszeit von
19,8 min Msn-UH nachgewiesen werden. Die Analyse der Komplementierungsmutante S. albus
Cos2∆O2 x pKO2R1 zeigte, dass DDMM durch die Produktion von MsnO2 wieder gebildet wird. Im
Extrakt konnte aber auch eine geringe Menge Msn-UH nachgewiesen werden, weshalb die Analyse
mit verschiedenen Mutanten und nach unterschiedlich langen Produktionszeiten wiederholt wurde.
Die verschiedenen Komplementierungsmutanten produzierten jedoch stets nachweisbare Mengen
Msn-UH. Im Vergleich zu S. albus Cos2∆O2 x pKR1 ging die Produktion von Msn-UH nach der
Komplementierung jedoch zurück.
4.1.4 Inaktivierung der NADH-abhängigen Flavinreduktase MsnO3
4.1.4.1
Aminosäuresequenz-Analyse von MsnO3
Im Biosynthesegencluster von DDMM ist das Gen msnO3 lokalisiert (Abbildung 4-17), welches für
ein Protein mit 173 Aminosäuren codiert.
Abbildung 4-17 Darstellung des Biosynthesegenclusters von Didesmethylmensacarcin. Gene, welche für Oxygenasen
codieren, sind rot dargestellt. Das markierte Gen msnO3 codiert für eine Flavinreduktase und wurde im Rahmen dieser Arbeit
inaktiviert.
Das Protein MsnO3 besitzt laut Yan et al. Ähnlichkeiten zu Gra-orf34, einer Flavinreduktase aus der
Granaticin-Biosynthese.58 Über NCBI wurde die Proteinsequenz auf konservierte Bereiche untersucht.
Dadurch konnte gezeigt werden, dass MsnO3 zur Superfamilie der Flavinreduktasen gehört. MsnO3
besitzt eine FMN-bindende Domäne, welche typisch für NAD(P)H-Flavin Oxidoreduktasen ist. Diese
Gruppe von Enzymen katalysiert die Reduktion von FMN durch NAD(P)H, welches anschließend
durch eine Flavin-abhängige Oxidoreduktase verbraucht wird. Der Transfer des reduzierten FMN kann
dabei entweder durch freie Diffusion erfolgen oder es findet eine direkte Übertragung durch eine
Protein-Protein-Wechselwirkung statt. Das wohl bisher am besten untersuchte Zwei-Komponenten
Enzymsystem ist das der bakteriellen Luciferase. Diese ist FMN-abhängig und besteht aus einer
NADH:FMN Oxidoreduktase und der Luciferase LuxAB. Für das System aus Photobacterium
leiognathi wurde postuliert, dass reduziertes FMN durch freie Diffusion von LuxG auf LuxAB
übertragen wird. Da reduziertes FMN sehr instabil ist, wird angenommen, dass die Affinität von
LuxAB sehr hoch ist und reduziertes FMN sehr schnell bindet um die Reoxidation unter
101
Ergebnisse
H2O2-Abspaltung zu minimieren.120 Für die Systeme aus V. harveyi und Vibrio fischeri wird hingegen
eine direkte enzymvermittelte Übertragung postuliert.121
Im msn-Cluster wurden drei Flavin-abhängige Monooxygenasen annotiert, die wahrscheinlich alle
reduziertes FMN als Cofaktor benötigen. Ob MsnO3 nur für eine der Monooxygenasen oder aber für
alle reduziertes FMN produziert, sollte durch die Inaktivierung von MsnO3 herausgefunden werden.
Es wurde postuliert, dass die msnO3 Inaktivierungsmutante dasselbe Biosyntheseintermediat
produziert wie die entsprechende Mutante mit inaktivierter Monooxygenase, welche von MsnO3
reduziertes FMN verbraucht.
4.1.4.2
Durchführung der Inaktivierung mittels Redirect®-Methode
Das Gen msnO3, welches für eine Flavinreduktase codiert, wurde unter Verwendung der Redirect®Methode (siehe Kapitel 3.11.1) inaktiviert. Durch die erfolgreiche Rekombination mit der
Resistenzkassette wurde das Cosmid Cos2∆O3MK gebildet. Um polare Effekte zu vermeiden, wurde
die Resistenzkassette durch die ebenfalls eingebrachten NdeI-Schnittstellen entfernt. Dadurch entstand
das Cosmid Cos2∆O3. Die erfolgreiche Inaktivierung wurde mittels PCR überprüft (siehe Abbildung
4-18). Hierfür wurde das Primerpaar O3Kontr-F/O3Kontr-R verwendet. Wurde Cos2∆O3MK als
Template verwendet, wurde ein PCR-Produkt mit einer Größe von 1914 bp gebildet, während die
Amplifizierung des intakten Gens in Cos2 ein PCR-Produkt mit einer Größe von 1464 bp lieferte.
Unter Verwendung von Cos2∆O3 als Template wurde ein Fragment mit einer Größe von 953 bp
amplifiziert.
Abbildung 4-18 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung von msnO3 auf dem
Cosmid Cos2. Aufgetragen sind die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Spur 2), Cos2∆O3MK (Spur 3)
und Cos2∆O3 (Spur 4) als Template. Als Größenstandard wurde die 1 kb DNA Leiter (NEB) verwendet (Spur 1).
102
Ergebnisse
Das Inaktivierungskonstrukt wurde anschließend über intergenerische Konjugation, wie unter
Kapitel 3.9.11 beschrieben, in den heterologen Wirt S. albus eingebracht. Zusätzlich wurde zur
Überexpression des SARP-Regulatorgens msnR1 das Plasmid pKR1 in den Stamm eingebracht. Der
neu entstandene Stamm wurde S. albus Cos2∆O3 x pKR1 genannt. Zur Kontrolle wurde eine
Komplementierung durchgeführt. Dadurch wurde nachgewiesen, dass durch die Inaktivierung keine
weiteren Gene beeinflusst wurden. Hierzu wurde das Komplementierungskonstrukt pKO3R1 kloniert
und in den Stamm S. albus Cos2∆O3 eingebracht.
4.1.4.3
Produktionsanalyse der Mutante und der komplementierten Mutante
Der Stamm S. albus Cos2∆O3 x pKR1 wurde für vier Tage in DNPM-Produktionsmedium kultiviert
und der Kulturüberstand analysiert, um den Einfluss der Inaktivierung von msnO3 zu untersuchen.
Hierfür wurde nach der Inkubationszeit das Mycel durch Zentrifugation abgetrennt und der Überstand
mit Essigsäureethylester extrahiert. Gleichzeitig wurden zur Positiv- und Negativkontrolle die Stämme
S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus pOJ436 x pKR1 angezogen und ebenfalls analysiert. Die
Rohextrakte wurden mittels HPLC/ESI-MS (Methode: mensO4) auf gebildete Sekundärstoffe
untersucht. Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abbildung 4-19, sowie die MS- und UVSpektren in Abbildung 4-20 dargestellt. Bei der Analyse des Rohextraktes von S. albus Cos2∆O3 x
pKR1 konnte eine geringe Menge DDMM nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden drei neue
Intermediate mit einer Retentionszeit von 19,8 min, 19,7 min und 20,7 min detektiert. Diese
Substanzen werden im weiteren Verlauf der Arbeit Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 genannt.
103
Ergebnisse
A [mAU]
S. albus pOJ436 x pKR1
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
S. albus Cos2∆O3 x pKR1
A [mAU]
120
100
80
60
40
20
0
-20
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
S. albus Cos2 x pKR1
A [mAU]
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
0
5
10
15
20
A [mAU]
25
30
t [min]
S. albus Cos2∆O3 x pKO3R1
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
Abbildung 4-19 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus pOJ436 x pKR1, S. albus
Cos2∆O3 x pKR1, S. albus Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O3 x pKO3R1. Die msnO3 Inaktivierungsmutante
produziert immer noch eine geringe Menge DDMM (grün hinterlegt), allerdings konnte auch die Produktion mehrerer neuer
Sekundästoffe (Msn-SM3 türkis hinterlegt, Msn-SM4 violett hinterlegt und Msn-SM5 orange hinterlegt) nachgewiesen
werden. Nach der Komplementierung von S. albus Cos2∆O3 mit dem Plasmid pKO3R1 konnte die Produktion von DDMM
wieder verstärkt werden. Außerdem kam es nicht mehr zur Akkumulation der Sekundärstoffe Msn-SM3, Msn-SM4 und
Msn-SM5.
Für die entsprechenden Signale konnte im negativen Detektionsmodus ein m/z-Wert von 339,2 für
Msn-SM3, 484,1 für Msn-SM4 und 321,2 für Msn-SM5 ermittelt werden. Die aufgenommenen
UV-Absorptionsspektren der neu gebildeten Substanzen Msn-SM3 und Msn-SM4 sind identisch und
besitzen drei Hauptabsorptionsmaxima bei 229 nm, 256 mn und 432 nm. Dabei sind die ersten beiden
Maxima im Vergleich zu DDMM hypsochrom verschoben, während das dritte bathochrom verschoben
ist. Die Substanz Msn-SM5 hat im Vergleich zu DDMM nur noch zwei Absorptionsmaxima bei
241 nm und 426 nm.
104
A)
DDMM
Msn-SM3
Norm.
1600
B)
339.2
Ergebnisse
100
80
1400
1200
60
1000
800
400
20
200
701.1
340.2
383.2
40
600
0
0
250
300
350
400
450
500
550
D)
C)
Norm.
DDMM
Msn-SM4
1600
1400
m/z
800
600
400
200
nm
484.1
200
100
80
1200
60
1000
800
20
200
657.2
400
550.1
485.1
40
600
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
F)
E)
Norm.
DDMM
Msn-SM5
1600
1400
1200
200
300
200
300
400
500
600
500
600
700
m/z
321.2
0
100
80
60
200
713.4
20
400
671.2
322.1
339.1
40
600
610.3
800
371.2
381.2
1000
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
400
700
m/z
Abbildung 4-20 UV- und MS-Spektren der Sekundärstoffe Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5, welche von S. albus
Cos2∆O3 x pKR1 produziert wurden. A) UV-Absorptionsspektrum von Msn-SM3 (türkis) im Vergleich zu DDMM
(grün). B) MS-Spektrum (negativer Detektionsmodus) von Msn-SM3. C) UV-Absorptionsspektrum von Msn-SM4 (türkis)
im Vergleich zu DDMM (grün). D) MS-Spektrum (negativer Detektionsmodus) von Msn-SM4. E) UV-Absorptionsspektrum
von Msn-SM5 (orange) im Vergleich zu DDMM (grün). F) MS-Spektrum (negativer Detektionsmodus) von Msn-SM5.
Durch die Komplementierung des Stammes S. albus Cos2∆O3 mit dem Plasmid pKO3R1 entstand der
Stamm S. albus Cos2∆O3 x pKO3R1. Dieser wurde in DNPM-Medium kultiviert und nach vier Tagen
wurde dieses mit Essigsäureethylester extrahiert und mittels HPLC/ESI-MS analysiert. Dadurch
konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Intermediate Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 allein
durch die Inaktivierung von msnO3 zustande gekommen war und nicht durch die Inaktivierung
benachbarter Gene. Das Chromatogramm der Komplementierung ist in Abbildung 4-19 dargestellt.
Die Produktionsrate von DDMM konnte durch die Komplementierung wieder gesteigert werden.
Außerdem kam es nicht mehr zur Akkumulation von Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5.
4.1.4.4
Isolierung von Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5
Zur Isolierung von Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 wurde der Stamm S. albus Cos2∆O3 x pKR1
in fünf Litern DNPM-Produktionsmedium kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von vier Tagen wurde
das Medium extrahiert und der gewonnene Rohextrakt über Festphasenextraktion fraktioniert. Alle
drei Substanzen wurden dabei in der 90 % Methanol-Fraktion eluiert. Im zweiten Reinigungsschritt
105
Ergebnisse
wurden die Substanzen über präparative DC separiert. Die entsprechenden Banden (Msn-SM3: Rf =
0,05; Msn-SM4: Rf = 0,23 und Msn-SM5: Rf = 0,42) wurden ausgekratzt und mit Methanol extrahiert.
Anschließend wurden die Substanzen Msn-SM3 und Msn-SM4 über präparative HPLC aus der
voraufgereinigten Probe isoliert. Für die Reinigung wurde die Methode SM2prepX (siehe Kapitel
3.14.1.4) verwendet. Es konnten 5,5 mg reines Msn-SM3 und 1,5 mg reines Msn-SM4 gewonnen
werden. Da die Substanz Msn-SM5 sehr instabil ist, konnte die Substanz nicht in der benötigten
Reinheit und Menge isoliert werden, um die Struktur per NMR zu lösen.
4.1.4.5
Strukturaufklärung von Msn-SM3
Die Struktur von Msn-SM3 wurde in Kooperation mit Dr. T. Pauluat gelöst. Hierfür wurde die
Substanz in CD3OD gelöst und 1H-, 13C- und 2D-NMR Experimente (HMBC, COSY) durchgeführt.
Die gemessenen NMR-Daten sind in Tabelle 4-2 angegeben. Die Auswertung der NMR-Daten führte
schließlich zur Struktur von Msn-SM3 (siehe Abbildung 4-21).
Abbildung 4-21 Struktur von Msn-SM3. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O3 zusammen mit dem Plasmid
pKR1 in S. albus führt zur Produktion von Msn-SM3.
Die Inaktivierungsmutante von MsnO2 produzierte ein Intermediat (Msn-UH) mit derselben Masse
wie MsnSM3. Dieses wurde von U. Hardter im Rahmen seiner Promotion aufgereinigt und vermessen.
Da nicht ausreichend Substanz vorhanden war, konnte die Struktur von Msn-UH nur anhand von
1
H-NMR Messungen postuliert werden.60 Ein Vergleich der Retentionszeit und der UV- und MS-
Spektren sowie der 1H-NMR-Daten bestätigen, dass es sich bei Msn-UH um dieselbe Substanz wie
Msn-SM3 handelt.
106
Ergebnisse
Tabelle 4-2 NMR-Daten von Msn-SM3, gelöst in CD3OD. δH: 600 MHz, δC: 150 MHz, CD3OD, Temperatur = 25 °C.
Schwache Signale sind in Klammern gesetzt.
Pos.
δC
δH (J Hz)
COSY
HMBC
1
159,9
-
-
(2,38)
2
147,0
-
-
7,64, 2,38
3
136,7
-
7,64, 2,38
4
122,8
7,64 s
(2,38)
2,38
4a
134,4
-
-
-
5
120,8
7,77 dd (7,6, 1,2)
7,73
7,32
6
138,4
7,73 dd (8,4, 7,6)
7,77, 7,31
-
7
125,6
7,31 dd (8,4, 1,2)
7,73
7,77
8
163,4
-
-
7,73, (7,31)
8a
116,8
-
-
7,77, 7,32
9
193,6
-
-
(7,64)
9a
115,2
-
7,64, (2,38)
10
182,4
-
-
7,77, 7,64
10a
134,5
-
-
7,73
11
205,7
-
-
4,33, 1,28
12
54,1
3,07 dd (17,2, 5,2)
3,02, 4,33
4,33, 1,28
3,02 dd (17,2,7,8)
3,07, 4,33
13
64,8
4,33 ddq (7,8 5,2, 6,0)
3,04, 1,28
3,04, 1,26
14
23,7
1,26 d (6,0)
4,33
3,04
15
20,3
2,38 s
(7,64)
7,64, 1J
Im
13
C-NMR wurden 19 Signale gemessen, wobei drei Signale im aliphatischen Bereich (δC = 5-
50 ppm) detektiert wurden. Zwei Signale (Position 14 und 15) konnten aufgrund der chemischen
Verschiebung (δC = 20,3 ppm und 23,7 ppm) Methylgruppen zugeordnet werden. Des Weiteren
wurden zwölf Signale im ungesättigten Bereich (δC = 100-170 ppm) detektiert. Zwei dieser Signale
sind durch die Bindung an einen phenolischen Sauerstoff tieffeldverschoben (δC = 159,9 ppm und
163,4 ppm). Außerdem wurden drei weitere Signale mit einer starken Tieffeldverschiebung (δC =
182,4 ppm, 193,6 ppm und 205,7 ppm) detektiert. Diese Kohlenstoffatome (Position 9, 10 und 11)
107
Ergebnisse
konnten Carbonylfunktionen zugeordnet werden. Durch die COSY und 1H-13C-HMBC-Daten konnten
die Protonen (δH = 7,77 ppm, 7,73 ppm und 7,31 ppm) einem aromatischen Spinsystem und den
entsprechenden Kohlenstoffatomen an den Positionen 5, 6 und 7 zugeordnet werden. Ein weiteres
Wasserstoffatom im aromatischen Bereich (δH = 7,64 ppm) konnte dem Kohlenstoffatom in Position 4
zugeordnet werden. Das HMBC-Spektrum zeigt durch 2JCH-Kopplungen, dass eine Methylgruppe an
das Kohlenstoffatom in Position 3 und die zweite Methylgruppe an das Kohlenstoffatom in Position
13 gebunden ist.
Bei Msn-SM3 handelt es sich eindeutig um ein Zwischenprodukt der DDMM-Biosynthese. Dieser
Rückschluss kann sowohl durch die dreigliedrige Kernstruktur, als auch die Seitenkette gezogen
werden. Der Metabolit unterscheidet sich lediglich durch das Fehlen der Epoxidgruppen und einer
Hydroxylgruppe von DDMM.
4.1.4.6
Strukturaufklärung von Msn-SM4
Die Strukturaufklärung von Msn-SM4 ist noch nicht abgeschlossen. Aus sechs Litern Kultur konnten
1,5 mg reine Substanz gewonnen werden. Diese wurden für NMR-Messungen an Dr. T. Paululat
übergeben. Da die Substanz instabil ist und sich im Sauren schnell zersetzt, konnte die Struktur noch
nicht eindeutig gelöst werden. Erste Untersuchungen, wie ein Vergleich der Retentionszeiten, UVund MS-Spektren weisen aber daraufhin, dass es sich bei Msn-SM4 um dieselbe Substanz wie MsnKP3 handelt. Msn-KP3 wurde aus dem Stamm S. albus Cos2∆O4 x pKR1 isoliert, allerdings wurde
die vorgeschlagene Struktur (Abbildung 4-22) ebenfalls noch nicht bestätigt.59
Abbildung 4-22 Vorgeschlagene Struktur für Msn-KP3 bzw. Msn-SM4. Die heterologe Expression des Cosmids
Cos2∆O4 in S. albus führt zur Produktion von Msn-KP3, während Msn-SM4 bei der heterologe Expression des Cosmids
Cos2∆O3 produziert wird.
Bei der vorgeschlagenen Struktur für Msn-KP3 bzw. Msn-SM4 handelt es sich eindeutig um ein
Intermediat
der
DDMM-Biosynthese.
Lediglich
die
fehlenden
Epoxidgruppen
und
eine
Hydroxygruppe unterscheiden den Metaboliten von DDMM. Der N-Acetylcysteinrest in der
Seitenkette wurde auch schon bei den Metaboliten Msn-KP2 und Msn-KP2a festgestellt und stammt
vermutlich von Mycothiol. Mycothiol dient in Streptomyceten zur Entgiftung und ermöglicht den
Bakterien toxische Substanzen aus der Zelle auszuschleusen.
108
Ergebnisse
4.2
Untersuchungen zur Biosynthese von Msn-KP2 und
Msn-KP2a
DDMM verfügt über zwei Epoxidgruppen welche wahrscheinlich über die Luciferase-like
Monooxygenasen MsnO4 und MsnO8 eingeführt werden. Diese Hypothese stellte K. Probst in ihrer
Dissertation auf, da die Inaktivierung von msnO4 zur Akkumulation von Msn-KP3 und die
Inaktivierung von msnO8 zur Akkumulation von Msn-KP2 und Msn-KP2a (siehe Abbildung 4-23)
führte.59 Msn-KP2 und Msn-KP2a besitzen eine zu DDMM identische Grundstruktur, lediglich die
Seitenkette enthält anstelle des Epoxids einen N-Acetylcysteinrest. Dieser Rest stammt vermutlich aus
dem MSH-abhängigen Entgiftungsweg, durch welchen Actinomyceten in der Lage sind giftige Stoffe
aus der Zelle ins Medium abzugeben.
Abbildung 4-23 Strukturen von DDMM (links) und Msn-KP2/ Msn-KP2a (rechts). Msn-KP2 und Msn-KP2a
unterscheiden sich nur durch das, mit einem Asterisk markierten, Stereozentrum in der Seitenkette.
4.2.1 Inaktivierung der Mycothiol-Biosynthese
MSH übernimmt in Actinomyceten eine der Aufgaben von Glutathion und schützt Zellen unter
anderem vor oxidativem Stress. Durch MSH können hochreaktive Substanzen, wie alkylierende Stoffe
oder freie Radikale, abgefangen werden indem MSH spontan oder Enzym-vermittelt addiert wird.65,122
Anschließend wird das Addukt durch die MSH-Amidase in GlcN-Ins und ein Mercaptursäurederivat
gespalten. Letzteres kann von der Zelle sofort in das Medium abgegeben werden, während der GlcNIns Rest zur Wiederherstellung von MSH verwendet wird. Um die Herkunft des N-Acetylcysteinrests
von Msn-KP2 und Msn-KP2a zu klären, sollte die MSH-Biosynthese vollständig inaktiviert werden.
MSH-Mangelmutanten sind lebensfähig, allerdings weisen sie ein langsameres Wachstum auf und
sind gegen eine Vielzahl von Substanzen sensitiv.72,74 Da aus Geninaktivierungsexperimenten in
M. smegmatis bekannt ist, dass die Inaktivierung des Gens mshA zur vollständigen Inaktivierung der
MSH-Biosynthese führt,67 wurde das homologe Gen durch BLASTp Analyse in S. albus gesucht und
inaktiviert. Hierfür wurde das Inaktivierungskonstrukt pKCXY02∆mshA kloniert (siehe Kapitel
3.10.4) und durch intergenerische Konjugation in S. albus eingebracht. Die Durchführung der
Inaktivierung mittels zweifachem Integrationsereignis erfolgte wie unter Kapitel 3.11.2 beschrieben.
109
Ergebnisse
Abbildung 4-24 Agarosegel der Kontroll-PCR zum Nachweis der Inaktivierung von mshA im Genom von S. albus.
Das PCR-Fragment wurde mit PstI verdaut. Aufgetragen sind die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von
pKCXY02∆mshA (Spur 2), genomischer DNA von S. albus (Spur 3) und genomischer DNA von S. albus∆mshA (Spur 4) als
Matrize. Als Größenstandard wurde die 1 kb DNA Leiter (NEB) verwendet (Spur 1).
Zum Nachweis des erfolgten Single- und Doppelcrossovers wurde genomische DNA isoliert und eine
Kontroll-PCR (siehe Abbildung 4-24) durchgeführt. Durch die Inaktivierung von mshA und somit der
gesamten MSH-Biosynthese veränderte der Stamm seine morphologischen Eigenschaften. Es konnte
sowohl ein langsameres Wachstum, als auch eine geringere Sporulation beobachtet werden.
Verlangsamtes Wachstum wurde ebenfalls bei M. smegmatis festgestellt, sowohl nach der
Inaktivierung von mshA als auch nach der Inaktivierung von mshC.66
4.2.2 Produktionsanalyse der mshA-Inaktivierungsmutante
S. albus∆mshA Cos2∆O8 x pKR1
Nach der erfolgreichen Inaktivierung der MSH-Biosynthese sollte untersucht werde, ob der Stamm die
Produkte Msn-KP2 und Msn-KP2a bilden kann. Zur Produktionsanalyse wurde in den Stamm
S. albus∆mshA das Cosmid Cos2∆O8 eingebracht und als Positivkontrolle das Cosmid Cos2.
Außerdem wurde in beide resultierende Mutanten auch das Plasmid pKR1 eingebracht, um die
Biosynthese von DDMM beziehungsweise der Intermediate zu verstärkern. Die erhaltenen Mutanten
wurden wie unter Kapitel 3.9.10 beschrieben in Produktionsmedium kultiviert und analysiert.
Aufgrund des langsameren Wachstums der Mutanten ist es wahrscheinlich, dass sich der
Produktionszeitpunkt von DDMM oder der Intermediate verschiebt. Daher wurde die Produktion über
einen Zeitraum von 3-7 Tagen im Abstand von 24 h analysiert.
110
Ergebnisse
Abbildung 4-25 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Extrakte von S. albus∆mshA Cos2∆O8 x pKR1,
S. albus∆mshA Cos2 x pKR1 und S. albus Cos2∆O8 x pKR1. Das Signal für DDMM ist grün hinterlegt, Msn-KP2 und
Msn-KP2a sind in türkis dargestellt. Die MSH-Inaktivierungsmutante produziert DDMM, ist aber nicht fähig Msn-KP2 und
Msn-KP2a zu bilden. Ohne MSH ist die msnO8 Inaktivierungsmutante nicht mehr fähig das entstehende Intermediat
auszuschleusen, wodurch die Biosynthese herunterreguliert wird.
Im Produktionsmedium der Mutante S. albus∆mshA Cos2 x pKR1 konnte zu jedem beobachteten
Zeitpunkt DDMM nachgewiesen werden, während im Extrakt von S. albus∆mshA Cos2∆O8 x pKR1
weder Msn-KP2, noch Msn-KP2a nachgewiesen werden konnte. Dies lässt den Schluss zu, dass MSH
nicht für die DDMM-Biosynthese benötigt wird, aber das der N-Acetylcysteinrest wahrscheinlich von
MSH stammt. Es wurden auch keine neuen Biosyntheseintermediate gebildet, wodurch davon
ausgegangen werden kann, dass die Biosynthese vollständig zum Erliegen kommt, da die Zellen durch
das Fehlen von MSH nicht in der Lage sind die entstehenden Zwischenprodukte aus der Zelle zu
exportieren. In Abbildung 4-25 sind die HPLC/ESI-MS-Diagramme der Produktionsanalyse von Tag 5
dargestellt. Zu den Produktionsprofilen der Tage 3, 4, 6 und 7 war kein Unterschied zu erkennen,
weshalb diese hier nicht aufgeführt wurden.
111
Ergebnisse
4.3
Reinigung und Kristallisation der Luciferase-like
Monooxygenase MsnO8
Das DDMM-Biosynthesegencluster enthält unter anderem die Gene msnO2, msnO4 und msnO8,
welche für Luciferase-like Monooxygenasen codieren.58 Geninaktivierungsexperimente und
Produktionsanalysen, welche von K. Probst im Rahmen ihrer Promotion durchgeführt wurden, führten
zur Produktion von Msn-KP2 und Msn-KP2a durch die Mutante S. albus Cos2∆O8 x pKR1. Aufgrund
ihrer Ergebnisse postulierte sie, dass MsnO8 die Epoxidbildung in der Seitenkette von DDMM
katalysiert.59 Diese Epoxidgruppe ist essentiell für die biologische Aktivität von Mensacarcin, 61
weshalb das Protein MsnO8 und die von ihm katalysierte Reaktion genauer analysiert werden sollte.
Zur Charakterisierung von MsnO8 wurde das Protein zunächst aufgereinigt und in Kooperation mit T.
Pflüger kristallisiert, um die Proteinstruktur zu lösen. Außerdem wurde ein Proteinassay zur
Identifikation akzeptierter Substrate und nötiger Cofaktoren für MsnO8 entwickelt.
4.3.1 Heterologe Expression und Aufreinigung von MsnO8
Um die Luciferase-like Monooxygenase biochemisch zu charakterisieren, wurde das Gen msnO8 in
E. coli überexprimiert und das resultierende Protein aufgereinigt. Hierfür wurde das Gen in die
Proteinexpressionsvektoren pET28a(+) und pET21a(+) kloniert und in die Stämm E. coli BL21 (DE3)
pLysS, E. coli BL21Star™ (DE3) und E. coli Rosetta™ 2 eingebracht (siehe Kapitel 3.10.3 und 3.5.1).
Anschließend wurde eine Testexpression, wie unter Kapitel 3.12.1 beschrieben, durchgeführt, um die
optimalen Bedingungen für die Proteinproduktion zu ermitteln. Die Testexpression wurde
anschließend durch eine SDS-PAGE ausgewertet. In Abbildung 4-26 ist die SDS-PAGE der
Testexpression in BL21 pLysS E. coli-Zellen abgebildet. Diese zeigten die höchste Produktion.
Abbildung 4-26 SDS-PAGE der Testexpression von MsnO8 (39 kDa) in BL21 pLysS E. coli-Zellen. Aufgetragen
wurden die Proben zum Zeitpunkt der Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 2), 1 h nach Induktion (Spur 3), 2 h nach Induktion
(Spur 4), 3 h nach Induktion (Spur 5), und 4 h nach Induktion (Spur 6). Als Größenstandard wurde die unstained Protein
Leiter (Fermentas) verwendet (Spur 1).
112
Ergebnisse
Auf dem SDS-Gel ist deutlich zu erkennen, dass es nach der Induktion mit IPTG zu einer verstärkten
Produktion eines Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kDa kommt: eine Größe, die für
das Protein MsnO8 zu erwarten war. Die produzierte Menge an Protein stieg über die Zeit stark an und
erreichte ein Maximum 4 h nach Induktion mit 0,1 mM IPTG in E. coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen und
E. coli BL21Star™ (DE3)-Zellen, unter Verwendung des Konstruktes pET28a-O8-NHT. Da die
Zellen zu diesem Zeitpunkt schon in der stationären Phase ihres Wachstums waren, wurde die
Produktionsanalyse abgebrochen und die Zellen geerntet.
Zur Proteinreinigung von MsnO8 wurde eine Zellzucht durchgeführt, wie unter 3.12.2 beschrieben.
Das Zellpellet wurde unter Verwendung einer French-Pressure Zelle lysiert, feste Bestandteile wie
unlösliche Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und das Protein über eine Ni 2+-NTAAffinitätschromatographiesäule gereinigt (siehe Kapitel 3.12.4 und 3.12.5). Die equilibrierte Ni2+NTA-Säule wurde über einen 150 mL Superloop mit der Proteinlösung beladen und anschließend mit
Lysepuffer gewaschen, bis eine Baseline erreicht wurde. Nach weiteren Waschschritten mit 5 %, 10 %
und 15 % Elutionspuffer (25 mM, 50 mM bzw. 75 mM Imidazol) wurde das saubere Protein MsnO8
mit 50 % Elutionspuffer (250 mM Imidazol) eluiert. Da die Analyse der Proben mittels SDS-PAGE
zeigte, dass die Elution mit 15 % Elutionspuffer die Ausbeute an MsnO8 nicht vermindert, wurde bei
erneuten Aufreinigungen von MsnO8 die Säule nur mit 15 % Elutionspuffer gewaschen. Die Elution
von MsnO8 konnte als scharfer Peak im Elutionschromatogramm beobachtet werden. Abbildung 4-27
zeigt das Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie.
Abbildung 4-27 Elutionschromatogramm der Ni2+-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von MsnO8. In blau
wird die Absorption des Durchlaufs nach der Säule dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. In
grün ist die prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B aufgetragen. Reines MsnO8 wurde mit 50 % Elutionspuffer
eluiert.
113
Ergebnisse
Nach erfolgter Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie wurden die Fraktionen via SDS-PAGE
analysiert. Fraktionen, welche gereinigtes MsnO8 enthielten, wurden vereinigt und aufkonzentriert.
Durch eine weitere Aufreinigung via Gelfiltration wurde anschließend aggregiertes Protein entfernt.
Abbildung 4-28 Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von MsnO8. In blau wird die Absorption
des Durchlaufs nach der Säule dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Die Peaks bei 78 mL
und 82 mL entsprechen dimerem und monomerem MsnO8.
Abbildung 4-28 zeigt das Elutionschromatogramm der Gelfiltration von MsnO8. In diesem sind
deutlich drei Peaks zu erkennen, wobei der Peak bei 40 mL dem Aussschlussvolumen der Säule
entspricht und nur aggregiertes Protein enthält. Des Weiteren sind zwei Peaks bei 78 mL und 82 mL
zu erkennen, welche nach dem Elutionsvolumen dimerem und monomerem MsnO8 zugeordnet
werden konnten.
Abbildung 4-29 SDS-PAGE der Aufreinigung von MsnO8. Aufgetragen wurde eine Probe von MsnO8 nach der
Gelfiltration (Spur 2) zur Überprüfung der Reinheit von MsnO8. Als Größenstandard wurde die unstained Protein Leiter
(Fermentas) verwendet (Spur 1).
114
Ergebnisse
Die Überprüfung der Reinheit der eluierten Fraktionen erfolgte über eine SDS-PAGE (siehe
Abbildung 4-29). Fraktionen, welche reines MsnO8 enthielten wurden vereinigt, aufkonzentriert und
sowohl für Enzymassays als auch für Proteinkristallisationsexperimente verwendet. Mittels UV/VISAbsorptionsmessungen wurde die Konzentration der Proteinlösung, bei einer Wellenlänge von
280 nm, bestimmt. Zur Berechnung wurde das Lambert-Beer`sche Gesetz verwendet unter
Einbeziehung des theoretischen Absorptionskoeffizienten von 36900 M-1cm-1, welcher über ExPASy
berechnet wurde.
Im Rahmen einer Kooperation mit T. Pflüger wurde untersucht, ob ein Gleichgewicht zwischen
monomerem und dimerem Protein besteht. Hierfür wurden beide Peaks getrennt gesammelt und
jeweils eine geringe Probe über eine eine analytische Gelfiltrationssäule analysiert. Die restliche Probe
wurde für 24 h inkubiert. Anschließend erfolgte erneut eine Analyse einer geringen Probe über eine
analytische Gelfiltrationssäule. In allen Fällen zeigte das Elutionschromatogramm dasselbe Verhältnis
zwischen Monomer und Dimer, woraus geschlossen werden kann, dass ein Gleichgewicht zwischen
beiden Formen herrscht. Aus diesem Grund wurde bei erneuten Aufreinigungen von MsnO8, sowohl
für Kristallisationsexperimente als auch für Enzymassays, beide Peaks der Gelfiltration gesammelt
und anschließend vereinigt.
4.3.2 Produktion von Selenomethionin-haltigem MsnO8
Eine Kristallstruktur kann nicht direkt aus einem Beugungsexperiment berechnet werden, da zwar die
Amplituden direkt über das Beugungsexperiment bestimmbar sind, aber nicht die Phasen. Dies ist
unter dem Begriff „Phasenproblem der Röntgenstrukturanalyse“ bekannt. Zur Lösung dieses Problems
gibt es verschiedene Methoden. Die Methode des multiplen isomorphen Ersatzes (multiple
isomorphous replacement, MIR), beruht auf der Anbindung von Schwermetallatomen an die
Proteinmoleküle im Kristall. Durch die Streubeiträge der Schwermetallatome und dem dadurch
entstehenden Unterschied zum nativen Datensatz können die Phasen berechnet werden.123 Nachteil
dieser Methode ist zum einen, dass die Schwermetallatome durch sogenanntes Soaking in einen
nativen Proteinkristall eingebacht werden müssen. Hierbei wird die Kristallstruktur sehr oft gestört,
was
zu einem Verlust der
Streuung führt. Zum anderen
müssen viele
verschiedene
Schwermetallderivate ausprobiert werden, bis ein geeigneter Streuer gefunden wird. Eine weiterere
häufig angewandte Methode ist die des molekularen Ersatzes. Hierbei wird die unbekannte Struktur
mit Hilfe einer sehr ähnlichen, bereits bekannten Struktur gelöst. Da für MsnO8 keine bekannte
Proteinstruktur mit ausreichend hoher Ähnlichkeit gefunden werden konnte, wurde das
Phasenproblem durch Verwendung der Methode der multiplen anomalen Dispersion (MAD) gelöst.
Die Methode funktioniert nur, wenn das Protein ausreichend stark anomal streuende Atome in der
Proteinstruktur aufweist, was dadurch erreicht werden kann, dass die natürlich vorkommende
Aminosäure Methionin durch Selenomethionin ersetzt wird. Da in MsnO8 acht Methionine vorhanden
115
Ergebnisse
sind, ist durch den Austausch zu Selenomethionin mit einem ausreichend starken Signal für die
Phasenberechnung zu rechnen.124
Für den Austausch von Methionin durch Selenomethionin im Protein wurde im Produktionsmedium
Methionin zu einem Großteil durch Selenomethionin ersetzt. Die Zellen wurde hierfür in
Autoinducing-Medium angezogen, da dabei auch die Konzentration der natürlich vorkommenden
Aminosäuren kontrolliert werden kann.92 Bevor eine große Anzucht durchgeführt wurde, erfolgte eine
Testexpression in Autoinducing-Medium. Die Proben der Testexpression wurden anschließend über
eine SDS-PAGE analysiert. Diese zeigte, dass die Zellen unter den gegebenen Bedingungen und in
dem neuen Medium das Protein in ausreichender Menge produzieren. Nachfolgend wurde eine große
Zellzucht durchgeführt, wie in Kapitel 3.12.3 beschrieben. Das Selenomethionin-haltige Protein wurde
anschließend, analog zu nativem apo-MsnO8, aufgereinigt.
4.3.3 Kristallstruktur von MsnO8
Gereinigtes MsnO8 wurde auf eine Konzentration von 5-11 mg/mL ankonzentriert und T. Pflüger für
Kristallisationsversuche übergeben. Initialscreens wurden unter Verwendung der sitting-drop
Diffusionsmethode mit einer Proteinkonzentration von 2-11 mg/mL bei einer Raumtemperatur von
4 °C und 20 °C durchgeführt. Es bildeten sich unter verschiedenen Bedingungen nadelförmige
Proteinkristalle (siehe Abbildung 4-30). Durch die Optimierung des Initialscreens konnten
plättchenförmige Kristalle erhalten werden. Hierfür wurde Proteinlösung (0,3 μL) mit einer
Konzentration
von
5 mg/mL
mit
der
gleichen
Menge
Reservoir-Lösung
(30 %
(m/V)
Polyethylenglycol 3350, 0,2 M NaCl, 3 % (m/V) Glucose und 1 M HEPES, pH 7,5) versetzt.
Abbildung 4-30 Kristalle von apo-MsnO8. Links: erste Kristalle von apo-MsnO8 nach Initialscreening. Rechts: Kristalle
von apo-MsnO8 nach Optimierung der Kristallisationsbedingungen (Bestandteile der Reservoirlösung: 30 % (m/V)
Polyethylenglycol 3350, 0,2 M NaCl, 3 % (m/V) Glucose und 1 M HEPES, pH 7,5). Von den Kristallen wurden Datensätze
mit einer Auflösung von 1,80 Å aufgenommen.
116
Ergebnisse
Durch die Beugungsdaten, welche am Synchrotron (Swiss Light Source, Villigen, Schweiz)
gesammelt wurden, konnte die Kristallstruktur von MsnO8 bei einer Auflösung von 1.80 Å berechnet
werden. Die Beugungsdaten wurden in der Raumgruppe P212121 indiziert, mit zwei Homodimeren in
der asymmetrischen Einheit. Die Größe der Einheitszelle wurde auf a = 85,01 Å, b = 102,90 Å und
c = 160,70 Å bestimmt. Um die Struktur über MAD zu lösen, wurde ein weiterer Datensatz von apoMsnO8 aufgenommen, wobei bei der Anzucht Methionin durch Selenomethionin ersetzt wurde. Der
verwendete anomale Beugungsdatensatz hatte eine Auflösung von 0,97959 Å. Tabelle 4-3 zeigt die
Statistik der aufgenommenen und indizierten Daten.
In die Elektronendichteverteilung konnte MsnO8 eingefügt werden. Durch einen iterativen
Verfeinerungsprozess konnte die Struktur bis zu einem kristallographischen R-Faktor von 18,7 % und
einem freien R-Faktor125 von 22,2 % verfeinert werden. Der durchschnittliche B-Faktor über alle
Proteinatome wurde auf 31,33 Å2 berechnet.
Tabelle 4-3 Statistik zur Datenaufnahme.
Datenindizierung
Auflösungsbereich
49,00 Å -1,80 Å (1,83 Å -1,80 Å)
Reflexe insgesamt
1 719 083
einzigartige Reflexe
130 902
I/Sigma
17,6 (1,3)
Vollständigkeit
100 % (100 %)
Redundanz
13,1 (12,5)
Anomale Vollständigkeit
100 % (100 %)
Anomale Redundanz
6,7 (6,3)
Rmerge
0,107 (2,008)
Rpim
0,044 (0,860)
CC1/2126
0,999 (0,544)
Die Röntgenstrukturanalyse von apo-MsnO8 zeigt, dass das Protein als Homodimer vorliegt (siehe
Abbildung 4-33). Jedes Monomer bildet dabei ein (α,β)8-Tim-Barrel127, bestehend aus acht
β-Faltblättern und acht α-Helices. Die einzelnen β-Faltblätter bilden im Inneren eine Fassstruktur und
117
Ergebnisse
sind jeweils über einen Loop mit α-Helices verbunden. Diese sind außen um die Fassstruktur
angeordnet (siehe Abbildung 4-31).
Abbildung 4-31 Proteinstruktur von apo-MsnO8.61 Dargestellt ist jeweils ein Monomer von oben und von der Seite. Zur
besseren Übersicht ist das Protein in Regenbogenfarben dargestellt, von blau am N-Terminus nach rot am C-Terminus. Das
Protein bildet ein (α,β)8-Tim-Barrel, bestehend aus acht β-Faltblättern im Inneren und acht α-Helices, welche die β-Faltblätter
von außen umgeben.
Die β-Faltblätter und die α-Helices der Fassstruktur sind jeweils über einen kurzen Loop verbunden.
Eine Ausnahme bilden die drei langen Loops (insertion segments, IS) IS1 (Gly106-Asp131), IS2
(Leu144-Pro162) und IS3 (Val223-Ser286). IS1 und IS2 sind zwischen β4/α4 und α4/β5, während sich
der größte Loop IS3 zwischen β7/α7 befindet. Für IS1 konnte, wegen einer schwachen
Elektronendichte, für die Aminosäuren im Bereich von 122-128 nur das Proteinrückgrat modelliert
werden.
Abbildung 4-32 MsnO8 Monomer. Dargestellt ist ein Monomer von apo-MsnO8. Die Loops IS1-IS3 sind farblich
hervorgehoben (IS1 grün, IS2 rot, IS3 blau).
118
Ergebnisse
Die Kristallstruktur von MsnO8 zeigt, dass dieses Enzym als Dimer vorliegt. Dies stimmt mit den
Ergebnissen der durchgeführten Gelfiltrationsexperimenten überein. Durch die Wechselwirkung der
α-Helices II und III, von jedem Monomer, kommt es zur Stabiliserung der Homodimerstruktur.
Zusätzlich gibt es in diesem Bereich Wechselwirkungen des Loops IS2 eines Monomers mit dem
zweiten Monomer. Die Homodimerstruktur von MsnO8 und die stabilisierenden Wechselwirkungen
sind in Abbildung 4-33 dargestellt.
Abbildung 4-33 Homodimerstruktur von MsnO8.61 Die Dimerstruktur wird durch den Loop IS2 und die α-Helices II und
III jedes Monomers stabilisiert. Zur besseren Übersicht wurden diese Bereiche im linken Monomer (blau) rot und im rechten
(schwarz) grün dargestellt.
119
Ergebnisse
4.4
Entwicklung eines Zwei-Komponenten Enzymassays
für MsnO8
Da der N-Acetylcysteinrest in Msn-KP2 und Msn-KP2a aus der MSH-Biosynthese stammt, wurde
postuliert, dass das eigentliche Substrat von MsnO8 das reaktive α,β-ungesättigte Keton
Deoxymensacarcin ist. Somit ist die Luciferase-like Monooxygenase MsnO8 möglicherweise für die
Einführung der Epoxidgruppe in die Doppelbindung verantwortlich. Hierfür benötigt das Enzym
allerdings einen reduzierten Cofaktor. Nach BLASTp Analyse wurde davon ausgegangen, dass
MsnO8 den seltenen Cofaktor F420 verwendet, dies wurde ebenfalls von Yan et al. postuliert.58
Daneben ist F420 auch an einigen Reaktionen bei der Biosynthese von Tetracyclin und Lincomycin
beteiligt.80,81 Deshalb wurde als erstes getestet, ob F420 für die Umsetzung benötigt wird. Hierfür wurde
ein Zwei-Komponenten Testsystem entwickelt, bei welchem reduziertes F420 durch das Enzym FGD
zur Verfügung gestellt wird, wie Abbildung 4-34 zeigt.
Abbildung 4-34 Schematische Abbildung des Zwei-Komponenten Enzymassays mit FGD und MsnO8. FGD katalysiert
die Umwandlung von Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton durch die Reduktion von F420. Das reduzierte F420
wird bei der Epoxidierung von Deoxymensacarcin durch MsnO8 reoxidiert.
FGD ist eine F420-abhängige Glucose-6-phosphat Dehydrogenase aus M. smegmatis und wurde schon
sehr
genau
charakterisiert.
Es
ist
bekannt,
dass
FGD
in vitro
Glucose-6-phosphat
zu
6-Phosphogluconolacton umsetzt und dabei F420 reduziert.128,129 Dieses kann dann von MsnO8
gebunden werden und zur Epoxidierung von Deoxymensacarcin verwendet werden. Das entwickelte
System hat den großen Vorteil, dass F420 nur katalytisch benötigt wird, da es während der Reaktion
immer wieder durch FGD reduziert und bereitgestellt wird. Es setzt allerdings voraus, dass F420 durch
freie Diffusion und nicht durch eine Protein-Protein-Wecheslwirkung übertragen wird, da nicht davon
ausgegangen werden kann, dass MsnO8 mit FGD einen Komplex bilden kann.
120
Ergebnisse
4.4.1 Heterologe Expression und Reinigung von FGD
Für die Entwicklung des Testsystems musste FGD in ausreichender Menge und Reinheit gewonnen
werden. Hierfür sollte das Protein in E. coli Zellen überproduziert und anschließend aufgereinigt
werden. Um die optimale Produktion in E. coli zu gewährleisten, wurde die Gensequenz von fgd aus
M. smegmatis von Eurofins an den Codongebrauch von E. coli angepasst und synthetisiert. Das Gen
wurde anschließend, wie unter Kapitel 3.10.3.3 beschrieben, in den Proteinexpressionsvektor
pET28a(+)
kloniert
und
das
Konstrukt
in
die
Stämme
E. coli BL21 (DE3) pLysS,
E. coli BL21 Star™ (DE3) und E. coli Rosetta™ 2 eingebracht. Durch eine Testexpression wurden die
optimalen Bedingungen für die Proteinproduktion ermittelt. Hierbei wurden sowohl die verschiedenen
Stämme als auch verschiedene IPTG-Konzentrationen für die Induktion getestet. Ab dem Zeitpunkt
der Induktion wurde jede Stunde eine Probe entnommen, welche anschließend über eine SDS-PAGE
analysiert wurde (siehe Abbildung 4-35). E. coli BL21 Star™ (DE3)-Zellen zeigten die höchste
Produktivität bei einer Induktion mit 0,5 mM IPTG. Die stationäre Phase wurde drei Stunden nach
Induktion erreicht, weshalb die Testexpression zu diesem Zeitpunkt beendet wurde.
Abbildung 4-35 Testexpression von FGD (39 kDa) in verschiedenen E. coli-Stämmen. Aufgetragen wurden die Proben
zum Zeitpunkt der Induktion und jeweils 3 h nach Induktion. BL21 pLysS-Zellen zum Zeitpunkt t=0 (Spur 1), 3 h nach
Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 2) und mit 0,5 mM IPTG (Spur 3). BL21 Star-Zellen zum Zeitpunkt t=0 (Spur 4), 3 h nach
Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 5) und mit 0,5 mM IPTG (Spur 6). Rosetta™ 2-Zellen zum Zeitpunkt t=0 (Spur 8), 3 h
nach Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 9) und mit 0,5 mM IPTG (Spur 10). Als Größenstandard wurde der unstained
PageRuler (Fermentas) verwendet (Spur 7).
Zur Aufreinigung von FGD wurde eine große Zellzucht mit 1,5 L LB-Medium unter den optimierten
Bedingungen durchgeführt. Das genaue Vorgehen ist unter Kapitel 3.12.2 beschrieben. Für die
Reinigung wurde das gewonnene Zellpellet lysiert und die cytosolische Fraktion von festen
Bestandteilen abgetrennt. Der lösliche Anteil wurde auf eine, zuvor mit Lysepuffer equilibrierte,
Ni2+-NTA-Affinitätschromatographiesäule geladen. Die Säule wurde anschließend mit Lysepuffer
gewaschen, bis eine Baseline erreicht wurde. Nach stufenweisen Waschschritten mit 5 % (25 mM
121
Ergebnisse
Imidazol), 10 % (50 mM Imidazol) und 15 % (75 mM Imidazol) Elutionspuffer, wurde FGD mit 50 %
Elutionspuffer (250 mM Imidazol) eluiert. Während der Aufreinigung wurden Proben gesammelt und
diese via SDS-PAGE analysiert. Dadurch konnte gezeigt werden, dass FGD in der 50 % Fraktion
schon sehr rein gewonnen wurde. Abbildung 4-36 zeigt das Elutionschromatogramm der Reinigung
von FGD. In diesem ist die Elution von FGD als scharfer Peak zu erkennen.
Abbildung 4-36 Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von FGD. In
blau ist die Absorption des Durchlaufs dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. In grün ist die
prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B aufgetragen. Reines FGD wurde mit 50 % Elutionspuffer eluiert.
Die
gesammelten
FGD-Fraktionen
wurden
vereinigt
und
aufkonzentriert.
Um
kleinere
Verunreinigungen und aggregiertes Protein zu entfernen, wurde die Proteinlösung anschließend über
eine Gelfiltrationssäule weiter aufgereinigt. Das Elutionschromatogramm, welches bei einer
Wellenlänge von 280 nm aufgenommen wurde, zeigt deutlich zwei scharfe Peaks (siehe Abbildung
4-37).
122
Ergebnisse
Abbildung 4-37 Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von FGD. In blau ist die Absorption des
Durchlaufs nach der Säule dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Nach 78 mL wurde FGD
eluiert. Dieses Elutionsvolumen entspricht einer Molekülgröße von etwa 79 kDa und zeigt, dass FGD als Homodimer
vorliegt.
Der zuerst eluierte Peak bei 40 mL entspricht dem Ausschlussvolumen der Säule. Deshalb kann davon
ausgegangen werden, das dieser von aggregiertem Protein stammt. Ein zweiter Peak wurde nach
78 mL eluiert und entspricht einer Größe von etwa 79 kDa, was einem Homodimer von FGD
entspricht. Die einzelnen Fraktionen der Gelfiltration wurden über eine SDS-PAGE analysiert. Die
SDS-PAGE in Abbildung 4-38 zeigt, dass FGD rein gewonnen werden konnte. Die Proteinlösung
wurde auf 11 mg/mL (500 μL) aufkonzentriert, aliquotiert und bei -80 °C gelagert, bis sie für
Enzymassays verwendet wurde.
Abbildung 4-38 SDS-PAGE der Aufreinigung von FGD. Aufgetragen wurden eine Probe von FGD nach der Gelfiltration
(Spur 2, 3). Dadurch konnte gezeigt werden, dass FGD rein gewonnen wurde. Als Größenstandard wurde der unstained
PageRuler (Fermentas) verwendet (Spur 1).
123
Ergebnisse
4.4.2 Isolierung von F420
Für das Testsystem musste F420 aus S. albus gewonnen werden, da es kommerziell nicht erhältlich ist.
Um eine höhere Ausbeute zu erzielen wurden die drei Gene fbiA, fbiB und fbiC der F420-Biosynthese
in das integrative Plasmid pTESb kloniert und das entstandene Plasmid pTESb*FbiABC in den
Stamm S. albus eingebracht (siehe Kapitel 3.10.2). Bashiri et al. konnten zeigen, dass die
Überexpression dieser Gene in M. smegmatis zu einer fünfmal höheren F420-Produktion innerhalb der
Zellen führte.84 Die Reinigung von F420 wurde schon oft in der Literatur beschrieben und erfolgt einem
immer gleichen Prinzip. Die Zellen werden durch Hitze oder organische Lösungsmittel
aufgeschlossen, wobei auch Proteine ausgefällt werden. Anschließend erfolgt die Abtrennung von F420
durch verschiedene chromatographische Methoden. Hierbei wird meist die negative Ladung der
Glutamatreste genutzt, um den Cofaktor über einen Anionentauscher aufzureinigen.84,130,131
Für die Aufeinigung von F420 aus S. albus wurde S. albus pTESb*FbiABC für 24 h bei 28 °C in TSBMedium kultiviert. Das Zellpellet wurde durch Zentrifugation gewonnen und wie in Kapitel 3.13.1
beschrieben aufgeschlossen. Nach erfolgter Abtrennung aller unlöslichen Bestandteile wurde die
lösliche Fraktion auf eine zuvor equilibrierte DEAE FF Anionenaustauschersäule geladen. Die Elution
erfolgte dabei mit einem linearen NaCl-Gradienten. Da eine Absorptionsmessung bei 420 nm an der
ÄKTA FPLC Anlage nicht möglich ist, wurde das Eluat fraktioniert gesammelt und die Absorption
aller Proben am Photometer vermessen. Die Absorptionsmessung und die Elution der Probe ist in
Abbildung 4-39 gezeigt.
Abbildung 4-39 Chromatogramm der Reinigung von F420 über die DEAE FF Anionenaustauschersäule In blau ist die
Absorption des Durchlaufs nach der Säule dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 420 nm gemessen. In grün ist
die prozentuale Konzentration an Elutionspuffer-DEAE aufgetragen. Der Peak bei einem Elutionsvolumen von 120 mL
entspricht Fraktion 2, welche F420 enthält. Die Schulter auf der linken Peakseite entspricht Fraktion 1, welche hauptsächlich
FO, den Grundkörper von F420 enthält.
124
Ergebnisse
Es wurden zwei gelbliche Fraktionen erhalten: Fraktion 1 (250-290 mM NaCl) wurde bei geringerer
NaCl Konzentration eluiert und enthält wahrscheinlich FO und Fraktion 2 (300-390 mM NaCl),
welche bei höherer NaCl Konzentration eluiert wurde, enthält F420. Dies konnte durch Aufnahme eines
UV-Absorptionsspektrums und Vergleich mit Spektren aus der Literatur identifiziert werden.
Abbildung 4-40 UV-Absorptionsspektrum der Fraktion F2.
Zur Entfernung der hohen Salzkonzentration, wurde Fraktion 2 mit MilliQ Wasser verdünnt und auf
eine MonoQ Säule geladen. Die Elution erfolgte anschließend mit einer verdünnten HCl-Lösung
(Elutionspuffer-MonoQ) wie unter Kapitel 3.13.3 beschrieben. Da sich das Absorptionsmaximum von
F420 im Sauren verschiebt, wurde die Absorption bei 380 nm gemessen.
Abbildung 4-41 Chromatogramm der Reinigung von F420 über eine MonoQ-Anionenaustauschersäule. In blau ist die
Absorption des Durchlaufs dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 380 nm gemessen. In grün ist die prozentuale
Konzentration des Elutionspuffers aufgetragen.
125
Ergebnisse
Im Elutionschromatogramm ist bei einem Elutionsvolumen von 56 mL deutlich ein scharfer Peak
erkennbar. Dieser entspricht F420 und wurde bei einer Konzentration von 17 mM HCl eluiert. Das
Elutionschromatogramm ist in Abbildung 4-41 dargestellt. Die F420-enthaltenden Fraktionen wurden
vereinigt, zur Trockene eingeengt und in Tris/HCl Puffer aufgenommen.
4.4.3 Zwei-Komponenten Enzymassay mit FGD und MsnO8
Für den Zwei-Komponenten Enzymassay wurde zuerst getestet, ob das gewonnene Protein FGD
Aktivität zeigt und die Umsetzung von F420 zu F420H2 katalysiert. Hierfür wurde eine Lösung von
Glucose-6-phosphat mit gereinigtem F420 gemischt und das Enzym FGD zugegeben. Da das
Absorptionsmaxium von F420 redoxabhängig ist und sich bei der Reduktion von 420 nm zu 380 nm
verschiebt, konnte die Reaktion photometrisch bei einer Wellenlänge von 420 nm verfolgt werden.
Die Absorptionsänderung ist in Abbildung 4-42 dargestellt.
Abbildung 4-42 Aktivitätstest von FGD. Gemessen wurde die Abnahme der Absorption von F420 bei 420 nm. Durch die
Umsetzung von Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton durch das Enzym FGD wird F420 reduziert. Durch die
Reduktion von F420 verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Substanz von 420 nm zu 380 nm. Eine Abnahme der
Absorption bei 420 nm ist demzufolge ein Beweis für die Aktivität von FGD.
Durch die Absorptionsänderung konnte gezeigt werden, dass FGD unter den gegebenen
Reaktionsbedingungen, die Umsetzung von F420 zu F420H2 katalysiert. Im nächsten Versuch wurde der
Assay deshalb erweitert und sowohl MsnO8 als auch das postulierte Substrat Deoxymensacarcin (von
Prof. S. Lösgen und Prof. A. Zeeck zur Verfügung gestellt) zugesetzt. Durch die Umsetzung von
Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton durch das Enzym FGD wird F420 zu F420H2 reduziert
und MsnO8 zur Verfügung gestellt. Theoretisch sollte MsnO8 dadurch in der Lage sein,
Deoxymensacarcin zu epoxidieren. Da das Substrat Deoxymensacarcin und das Produkt Mensacarcin
sehr ähnliche Absorptionsmaxima aufweisen, konnte die Reaktion photometrisch nicht bestimmt
126
Ergebnisse
werden. Deshalb wurden die Reaktionsansätze für unterschiedliche Zeitpunkte inkubiert und
anschließend über HPLC/ESI-MS (Methode: mensO4) analysiert. Hierfür wurden die Ansätze, wie
unter Kapitel 3.12.10.1 beschrieben, behandelt.
A)
A [mAU]
Rohextrakt von S. bottropensis
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
A [mAU]
140
t [min]
Enyzmassay
+ FGD
+MsnO8
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
A [mAU]
t [min]
Enzymassay
+FGD
-MsnO8
200
150
100
50
0
0
B)
5
10
mAU
15
Mensacarcin
2000
20
25
t [min]
Deoxymensacarcin
mAU
1750
30
200
1500
150
1250
1000
100
750
500
50
250
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
Abbildung 4-43 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Extrakte des Enzymassays mit FGD und MsnO8.
A) Dargestellt werden zum Vergleich Chromatogramme einer Mensacarcin-Kontolle aus S. bottropensis und als
Negativkontrolle der Enzymassay ohne MsnO8. Das Substrat Deoxymensacarcin ist rot, das Produkt Mensacarcin grün
hinterlegt. B) Mensacarcin und Deoxymensacarcin wurden anhand ihrer UV-Absorptionsspektren identifiziert.
Abbildung 4-43 zeigt das Ergebnis des Enzymassays. Unter keiner der getesteten Bedingungen konnte
ein Umsatz von Deoxymensacarcin zu Mensacarcin beobachtet werden. Dies kann dadurch verursacht
sein, dass Deoxymensacarcin nicht das richtige Substrat für MsnO8 ist, mit F420 der falsche Cofaktor
postuliert wurde oder dass die Übertragung von reduziertem F420H2 nicht schnell genug stattfindet. Um
mehr Informationen über den möglichen Cofaktor zu gewinnen, wurde im nächsten Schritt die einzige
Flavinreduktase im msn-Cluster untersucht werden.
127
Ergebnisse
4.4.4 Heterologe Expression und Reinigung von MsnO3
Das msn-Cluster verfügt über drei Luciferase-like Monooxygenasen, aber lediglich über eine
Flavinreduktase MsnO3. Deshalb wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass diese für alle
Luciferase-like Monooxygenasen den reduzierten Cofaktor bereitstellt. Um zu untersuchen, welcher
Cofaktor durch MsnO3 reduziert wird, sollte dieses Protein aufgereinigt und näher untersucht werden.
Hierfür wurde das Gen msnO3 in den Proteinexpressionsvektor pET28a(+) kloniert und zur
Produktion in verschiedene E. coli-Stämme eingebracht. Die optimalen Produktionsbedingungen
wurden getestet und das Protein anschließend über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und
nachfolgend über Gelfiltration gereinigt. Das rein gewonnene Protein MsnO3 wurde dann über in vitro
Aktivitätsassays weiter untersucht.
Um zuerst die optimalen Produktionsbedingungen für MsnO3 zu finden, wurde eine Testexpression
durchgeführt. Hierfür wurden E. coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen, E. coli BL21Star™ (DE3)-Zellen
und E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2-Zellen mit dem Plasmid pET28-O3-NHT transformiert
und die Produktivität bei verschiedenen IPTG-Konzentrationen getestet. Die Testexpression erfolgte
wie unter Kapitel 3.12.1 beschrieben. Während der Testexpression wurden in regelmäßigen Abständen
Zellproben entnommen und anschließend über eine SDS-PAGE analysiert (siehe Abbildung 4-44).
Abbildung 4-44 SDS-PAGE der Testexpression von MsnO3 (19 kDa) in verschiedenen E coli-Stämmen. Aufgetragen
sind Proben von E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2 zum Zeitpunkt der Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 2), 2 h nach
Induktion (Spur 3), 3 h nach Induktion (Spur 4) und zum Zeitpunkt der Induktion mit 0,5 mM IPTG (Spur 5), 2 h nach
Induktion (Spur 6), 3 h nach Induktion (Spur 7). Proben von E. coli BL21 (DE3) pLysS-Zellen zum Zeitpunkt der Induktion
mit 0,1 mM IPTG (Spur 8), 2 h nach Induktion (Spur 9), 3 h nach Induktion (Spur 10) und zum Zeitpunkt der Induktion mit
0,5 mM IPTG (Spur 11), 2 h nach Induktion (Spur 12), 3 h nach Induktion (Spur 13). Proben von E. coli BL21Star™ (DE3)Zellen zum Zeitpunkt der Induktion mit 0,1 mM IPTG (Spur 14), 2 h nach Induktion (Spur 15), 3 h nach Induktion (Spur 16)
und zum Zeitpunkt der Induktion mit 0,5 mM IPTG (Spur 18), 2 h nach Induktion (Spur 19), 3 h nach Induktion (Spur 20).
Als Größenstandard wurde der unstained PageRuler (Fermentas) verwendet (Spur 1, 17).
Die höchste Proteinproduktion wurde 3 h nach Induktion mit 0,5 mM IPTG in E. coli BL21 Codon
Plus RP x pL1SL2 Zellen nachgewiesen. Darauffolgend wurde eine große Zellzucht unter den
gleichen Bedingungen durchgeführt. Die geernteten Zellen wurden durch eine French-pressure Zelle
aufgeschlossen und nach erfolgter Zentrifugation wurde der lösliche Überstand auf eine Ni2+-NTAAffinitätschromatographiesäule geladen. Die Säule wurde anschließend mit Lysepuffer gewaschen, bis
128
Ergebnisse
eine Baseline erreicht wurde. Durch mehrere Waschschritte mit 5 % (25 mM Imidazol), 10 % (50 mM
Imidazol) und 15 % (75 mM Imidazol) Elutionspuffer wurden stärker an der Säule haftende
Verunreinigungen entfernt und anschließend MsnO3 mit 50 % Elutionspuffer (250 mM Imidazol)
eluiert. Abbildung 4-45 zeigt das Elutionschromatogramm der Reinigung von MsnO3.
Abbildung 4-45 Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von MsnO3. In
blau wird die Absorption des Durchlaufs dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. In grün ist
die prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B aufgetragen.
Das Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie von MsnO3 zeigt, dass bei der
Elution mit 50 % Elutionspuffer ein Protein eluiert wurde (siehe Abbildung 4-45). Eine Analyse der
Probe über eine SDS-PAGE zeigte, dass dieser Peak MsnO3 entspricht.
Um kleinere Verunreinigungen und aggregiertes Protein zu entfernen wurde die MsnO3-Fraktion
aufkonzentriert und über eine Gelfiltrationssäule weiter aufgereinigt. Nach dem Ausschlussvolumen
von 40 mL konnte ein Peak detektiert werden, welcher aggregiertem Protein zugeordnet werden
konnte. Ein zweiter Peak wurde nach 84 mL eluiert und entspricht einer Größe von etwa 20 kDa, was
einem Monomer von MsnO3 entspricht.
129
Ergebnisse
Abbildung 4-46 Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von MsnO3. In blau wird die Absorption
des Durchlaufs nach der Säule dargestellt. Diese wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Der Peak bei einem
Elutionsvolumen von 84 mL entpricht monomerem MsnO3.
Die einzelnen Peaks wurden fraktioniert gesammelt und über eine SDS-PAGE analysiert. Fraktionen
welche reines FGD enthielten wurden anschließend vereinigt. Durch die Durchführung einer
SDS-PAGE konnte gezeigt werden, dass MsnO3 rein gewonnen wurde. Das entsprechende SDS-Gel
ist in Abbildung 4-47 dargestellt.
Abbildung 4-47 SDS-PAGE der Reinigung von MsnO3. Aufgetragen ist eine Probe von MsnO3 nach der Gelfiltration
(Spur 2). Als Größenstandard wurde der prestained PageRuler (Fermentas) verwendet (Spur 1).
Die erhaltene Proteinlösung wurde auf 4 mg/mL (300 μL) aufkonzentriert, aliquotiert und bei -80 °C
gelagert, bis es für Enzymassays verwendet wurde.
130
Ergebnisse
4.4.5 Enzymassay mit MsnO3
Durch ein Enzymassay wurde getestet, ob das gereinigte MsnO3 Aktivität zeigt und ob einer der
Cofaktoren F420 oder FMN reduziert wird. Hierfür wurde eine Lösung von NADH + H+ einmal mit
F420 und einmal mit FMN versetzt und jeweils das Enzym MsnO3 zugegeben. Beide Reaktionen
wurden bei 340 nm verfolgt, da reduziertes NADH im Gegensatz zur oxidierten Form ein
Absorptionsmaximum bei dieser Wellenlänge besitzt. Eine Abnahme der Absorption entspricht
demzufolge dem Verbrauch von NADH und der Reduktion des entsprechenden Cofaktors. Wie in
Abbildung 4-48 gezeigt ist, konnte eine Abnahme der NADH Konzentration in Anwesenheit von
FMN beobachtet werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei MsnO3 um eine NADHabhängige FMN-Reduktase handelt.
Abbildung 4-48 Aktivitätstest von MsnO3. Gemessen wurde die Abnahme der Absorption von NADH bei 340 nm. Rot
dargestellt ist die Negativkontrolle, ohne MsnO3. Die blaue Linie zeigt den Reaktionsverlauf in Anwesenheit von MsnO3.
4.4.6 Zwei-Komponenten Enzymassay mit MsnO3 und MsnO8
Da MsnO3 wahrscheinlich den reduzierten Cofaktor für alle drei Luciferase-like Monooxygenasen des
msn-Clusters bereitstellt, ist MsnO8 möglicherweise FMN-abhängig und katalysiert die Epoxidbildung
unter Verbrauch von FMNH2. Um dies zu testen wurde ein weiteres Testsystem entwickelt, welches in
Abbildung 4-49 dargestellt ist.
131
Ergebnisse
Abbildung 4-49 Schematische Abbildung des Zwei-Komponenten Enzymassays mit MsnO3 und MsnO8. MsnO3
katalysiert die Umwandlung von FMN zu FMNH2 durch die Reduktion von NADH. Das reduzierte FMNH2 kann dann bei
der Epoxidierung von Deoxymensacarcin durch MsnO8 verwendet werden.
Der Assay mit MsnO3 wurde erweitert und sowohl MsnO8 als auch das postulierte Substrat
Deoxymensacarcin zugesetzt. MsnO3 reduziert dabei FMN und überträgt dieses auf MsnO8. MsnO8
sollte dann das Substrat Deoxymensacarcin binden und zu Mensacarcin umsetzen können. Da das
Substrat Deoxymensacarcin und das Produkt Mensacarcin sehr ähnliche Absorptionsmaxima
aufweisen, konnte die Reaktion photometrisch nicht verfolgt werden. Deshalb wurden die
Reaktionsansätze für unterschiedliche Zeitpunkte inkubiert und anschließend über HPLC/ESI-MS
(Methode: mensO4) analysiert. Hierfür wurden die Ansätze, wie unter Kapitel 3.12.10.1 beschrieben,
behandelt. Die Ergebnisse der HPLC/ESI-MS Analyse sind in Abbildung 4-50 dargestellt.
132
Ergebnisse
A)
A [mAU]
1400
Rohextrakt von S. bottropensis
1200
1000
800
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
A [mAU]
Enyzmassay
+ MsnO3
+MsnO8
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
A [mAU]
Enzymassay
+MsnO3
-MsnO8
80
60
40
20
0
0
B)
5
10
mAU
15
25
mAU
Mensacarcin
2000
20
30
t [min]
Deoxymensacarcin
200
1750
1500
150
1250
1000
100
750
500
50
250
0
0
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
200
250
300
350
400
450
500
550
nm
Abbildung 4-50 HPLC/ESI-MS-Diagramme (λ = 254 nm) der Extrakte des Enzymassays mit MsnO3 und MsnO8.
A) Dargestellt sind zum Vergleich Chromatogramme einer Mensacarcin-Kontolle aus S. bottropensis und als
Negativkontrolle der Enzymassay ohne MsnO8. Das Substrat Deoxymensacarcin ist rot, das Produkt Mensacarcin grün
hinterlegt. B) Mensacarcin und Deoxymensacarcin wurden anhand ihrer UV-Absorptionsspektren identifiziert. Durch die
Umsetzung von NADH zu NAD+ durch das Enzym MsnO3, wurde FMN reduziert und dem Enzym MsnO8 zur Verfügung
gestellt. Dadurch ist MsnO8 in der Lage, Deoxymensacarcin zu epoxidieren. Durch die HPLC/ESI-MS Analyse des
Enzymassays konnte die Umsetzung von Deoxymensacarcin zu Mensacarcin eindeutig nachgewiesen werden.
In Abbildung 4-50 ist deutlich zu erkennen, dass in Anwesenheit von MsnO8 die Konzentration von
Deoxymensacarcin stark abnimmt und ein neuer Peak mit einer Retentionszeit von 15,4 min entsteht.
Dieser konnte eindeutig Mensacarcin zugeordnet werden. Durch dieses Assay wurde bewiesen, dass
MsnO8 zum einen eine FMN-abhängige Luciferase-like Monooxygenase ist und zum anderen wurde
die Hypothese bestätigt, dass das α,β-ungesättigte Keton Deoxymensacarcin als Substrat für die
Epoxideinführung durch MsnO8 dient.
133
Ergebnisse
134
Diskussion
5 Diskussion
5.1
Untersuchungen zur Biosynthese von
Didesmethylmensacarcin
Das Cosmid Cos2, welches einen Großteil des msn-Clusters enthält, führt in S. albus zur Produktion
von DDMM (Abbildung 5-1). Durch Geninaktivierungsexperimente sollte die Biosynthese von
DDMM
aufgeklärt werden.
Durch die
Identifizierung und Strukturaufklärung gebildeter
Biosyntheseintermediate, welche durch die Inaktivierung produziert werden, kann den einzelnen
Enzymen eine Funktion zugeordnet werden. Dies trägt maßgeblich zur Aufklärung der DDMMBiosynthese bei.
Abbildung 5-1 Struktur von DDMM und Mensacarcin. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2 in S. albus führt zur
Produktion von DDMM, einem Intermediat in der Mensacarcin-Biosynthese. Dieses unterscheidet sich von Mensacarcin
lediglich durch das Fehlen zweier Methylgruppen.
K. Probst und U. Hardter untersuchten im Rahmen ihrer Promotion die Funktion der
Anthronoxygenasen und der Luciferase-like-Monooxygenasen, dadurch konnten die Enzyme MsnO4
und MsnO8 identifiziert werden, welche die Epoxidgruppen einführen. Außerdem konnte K. Probst
zeigen, dass die ORFs msnH0-H4 nicht zum Biosynthesegencluster gehören und konnte dadurch das
Cluster verkürzen.59,60 Zur weiteren Aufklärung der Biosynthese sollten die Ketoreduktasen und die
postulierte Flavinreduktase inaktiviert und das Produktionsprofil der Mutanten untersucht werden. Des
Weiteren wurde das Gen msnH7 inaktiviert um mögliche Erkenntnisse über dessen Funktion zu
gewinnen. Dieses codiert für ein Protein mit bisher unbekannter Funktion. Um die Arbeit von U.
Hardter zu vervollständigen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit auch die Komplementierung von
S. albus Cos2∆O2 durchgeführt um einen Einfluss der Inaktivierung auf die Produktion anderer, an
der Biosynthese beteiligter, Proteine auszuschließen.
135
Diskussion
Die zu inaktivierenden Gene wurden in E. coli mittels λ-Red/ET-vermittelter Rekombination
inaktiviert und die erfolgte Inaktivierung wurde über eine Kontroll-PCR verifiziert. Die entstandenen
Inaktivierungskonstrukte wurden über intergenerische Konjugation in den heterologen Wirt S. albus
eingebracht und anschließend wurde das Plasmid pKR1 eingeführt. Dieses Plasmid enthält das Gen
msnR1, welches hinter dem starken Promotor ermE* des Vektors lokalisiert ist. Das
Translationsprodukt von msnR1 zählt laut Aminosäurensequenz-Analyse zur Familie der SARPRegulatoren (Streptomyces Antibiotic Regulatory Protein). K. Probst konnte zeigen, dass die
Überexpression dieses positiven Regulatorgens zu einer viermal höheren DDMM-Produktion führt
und Inaktivierungsmutanten nur dadurch nachweisbare Mengen von Biosyntheseintermediaten
produzieren.59
Nach erfolgter Inaktivierung wurden die Inaktivierungsmutanten durch Einführung eines
Komplementierungsplasmids wieder komplementiert, um zu zeigen, dass es nur durch die
Inaktivierung der einzelnen Gene zur Akkumulation der beobachteten Intermediate kam. Das jeweilige
Komplementierungsplasmid enthielt das SARP-Regulatorgen msnR1 und das entsprechende
inaktivierte Gen hinter dem starken Promotor ermE*. Die dadruch entstandenen Mutanten sind in
Tabelle 5-1 aufgelistet.
Tabelle 5-1 Im Rahmen dieser Arbeit inaktivierte Gene und Übersicht der erstellten Inaktivierungsmutanten und der
komplementierten Mutanten.
Inaktiviertes Gen
Bezeichnung Mutante
Gebildetes Intermediat
msnO1
S. albus Cos2∆O1 x pKR1
Msn-KH1
msnO10
S. albus Cos2∆O10 x pKR1
Msn-SM1, Msn-SM2
msnO10
S. albus Cos2∆O10 x pKO10R1
DDMM
msnO11
S. albus Cos2∆O11 x pKR1
-
msnO11
S. albus Cos2∆O11 x pKO11R1
DDMM
msnH7
S. albus Cos2∆H7 x pKR1
DDMM
msnH7
S. albus Cos2∆H7 x pKR1H7
DDMM
msnO3
S. albus Cos2∆O3 x pKR1
Msn-SM3, Msn-SM4, Msn-SM5
msnO3
S. albus Cos2∆O3 x pKO3R1
DDMM
msnO2
S. albus Cos2∆O2 x pKO2R1
DDMM, Msn-UH
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Komplementierung aller gebildeten Mutanten wieder
zu Produktion von DDMM führte. Durch die Isolierung und Strukturlösung der akkumulierten
136
Diskussion
Intermediate konnten Rückschlüsse auf die Funktion der einzelnen Proteine gezogen werden. Die
Ergebnisse der Inaktivierungen werden im Folgenden weiter beschrieben und diskutiert.
5.1.1 Die Ketoreduktasen MsnO1, MsnO10 und MsnO11
Ketoreduktasen sind Enzyme, welche die minimale PKS ergänzen und zur richtigen Faltung der
Polyketidkette beitragen. Sie reduzieren Carbonylgruppen zu sekundären Alkoholen un können
auerdem die Orientierung der Polyketidkette beeinflussen und somit das Zyklisierungsmuster der
entstehenden Sekundärstoffe verändern. Die bisher am besten charakterisierte Ketoreduktase ist die C9 Ketoreduktase ActKR aus dem Actinorhodin-Cluster.132–134 Diese leitet die erste Zyklisierung
zwischen C-7 und C-12 ein und reduziert anschließend spezifisch die C-9 Ketogruppe. Im Cluster von
DDMM wurden drei Gene identifiziert, welche für Ketoreduktasen codieren. Um einen Hinweis auf
die Funktion der einzelnen Ketoreduktasen zu erhalten, wurden die codierenden Gene der
Ketoreduktasen
MsnO1,
MsnO10
und
MsnO11
inaktiviert
und
die
entstandenen
Inaktivierungscosmide zusammen mit dem Regulatorgen msnR1 in S. albus überexprimiert.
Die Inaktivierung der postulierten C-9 Ketoreduktase MsnO11 des msn-Clusters führte zum
vollständigen Erliegen der DDDMM-Biosynthese. Da die Biosynthese durch die Komplementierung,
wie auch bei den anderen Inaktivierungen, wiederhergestellt werden konnte, kann davon ausgegangen
werden, dass die Expression anderer Gene nicht beeinflusst wurde. Dies bedeutet, dass MsnO11
katalytisch oder strukturell essentiell für die Bildung der Polyketidkette sein muss, anderenfalls würde
die Inaktivierung zur Bildung von Shunt-Produkten oder Biosyntheseintermediaten führen. Die
heterologe Expression einiger minimaler PKS-Systeme, wie beispielsweise die minimale PKS aus dem
Tetracenomycin-Cluster oder dem Actinorhodin-Cluster, führte zur Produktion fehlgefalteter
Polyketide wie SEK15, SEK15b und SEK4, SEK4b.27,135 Diese weisen die vollständige Kettenlänge
von 16 beziehungsweise 20 Kohlenstoffatomen auf. Folglich müsste auch die Expression des
Inaktivierungskonstruktes Cos2∆O11 in S. albus zur Akkumulation eines oder mehrerer spontan
zyklisierter Dekaketide führen. Da DDMM ebenso wie Tetracenomycin aus einem Dekaketid gebildet
wird, wurde die Bildung von SEK15 und SEK15b erwartet. Dieses wird bei der alleinigen Expression
der minimalen PKS aus dem Tetracenomycin-Cluster gebildet und weist die erwartete Kettenlänge
von 20 Kohlenstoffatomen auf.27 Die Strukturen von SEK15, SEK15b und SEK4, SEK4b sind in
Abbildung 5-2 dargestellt.
137
Diskussion
Abbildung 5-2 Strukturen von SEK15, SEK15b, SEK4 und SEK4b. SEK15 und SEK15b werden bei der alleinigen
Expression der minimalen PKS des Tetracenomycin-Clusters (tcm) gebildet, während SEK4 und SEK4b bei der alleinigen
Expression der minimalen PKS des Actinorhodin-Clusters (act) gebildet werden. Auch ohne eine C-9 Ketoreduktase sind die
minimalen PKS enzymatisch aktiv und können ein Polyketid mit der vollständigen Kettenlänge synthetisieren.
Die Ergebnisse verschiedener Co-Expressionen von Hybrid-PKS-Komplexen mit und ohne
Ketoreduktasen136 führten zu folgenden Hypothesen: Ketoreduktasen können zum einen Einfluss auf
das Faltungsmuster einer Polyketidkette nehmen, wobei sie aber nicht für die Aktivität der minimalen
PKS notwendig sind. Zum anderen wird die Ketoreduktion der entsprechenden Carbonylfunktionen
erst am Ende der Kettenverlängerung katalysiert.137 Da von S. albus Cos2∆O11 x pKR1 kein Polyketid
produziert wurde, ist MsnO11 wahrscheinlich essentiell für die Biosynthese der Polyketidkette. Bisher
wurde nur eine einzige minimalen PKS vom Typ II beschrieben, welche ohne die entsprechende
Ketoreduktase aus dem Cluster nicht funktionsfähig ist.138 Hierbei handelt es sich um das EnterocinCluster. Hertweck et al. konnten zeigen, dass die minimale PKS dieses Clusters nur zusammen mit der
Ketoreduktase EncD ein Produkt liefert.138 Des Weiteren konnten sie durch die Co-Expression der
minimalen PKS mit inaktiven Varianten von EncD (S148A und S148A/Y161F Punktmutationen)
belegen, dass EncD nicht nur strukturell notwendig ist, sondern auch katalytisch aktiv sein muss.
Daher postulierten sie, dass in diesem PKS II-System die Ketoreduktion der C-9 Position während der
138
Diskussion
Kettenverlängerung katalysiert wird.138 Ob MsnO11 während der Biosynthese der Polyketidkette
ebenfalls eine katalytische oder nur eine strukturelle Rolle spielt, kann erst nach weiteren
Untersuchungen geklärt werden. Hierfür sollten eine oder mehrere Aminosäuren im katalytischen
Zentrum
durch
Punktmutationen
verändert
werden.
Durch
die
Komplementierung
von
S. albus Cos2∆O11 mit der inaktiven Variante von MsnO11 könnte nachgewiesen werden, ob
MsnO11 eine strukturelle oder eine katalytische Funktion während der Kettenverlängerung
übernimmt.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde außerdem die Ketoreduktase MsnO10 inaktiviert und die
entstandene Mutante S. albus Cos2∆O10 x pKR1 analysiert. Im Kulturüberstand konnten zwei neue
Intermediate, Msn-SM1 und Msn-SM2, nachgewiesen werden. Durch eine Festphasenextraktion,
präparative DC und anschließende Säulenchromatographie mit Sephadex konnte Msn-SM2 in
ausreichender Menge und Reinheit gewonnen werden um die Struktur mittels NMR Experimente zu
lösen. Die Struktur ist in Abbildung 5-3 dargestelllt.
Abbildung 5-3 Struktur von Msn-SM2. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O10 in S. albus führt zur
Produktion von Msn-SM2, einem Shunt-Produkt der DDMM-Biosynthese.
Die Substanz Msn-SM2 wurde bisher noch nicht in der Literatur beschrieben. Im Gegensatz zu
DDMM besitzt Msn-SM2 eine stark verkürzte Kettenlänge und weist zudem eine andere Faltung auf.
Während der Faltung muss außerdem eine Umlagerung stattgefunden haben, da die Substanz eine
zusätzliche Methylgruppe besitzt. Eine andere mögliche Erklärung wäre der Einbau der Methylgruppe
durch eine Methyltransferase aus dem Genom von S. albus. Das die Substanz Msn-SM2 eine stark
verkürzte Kettenlänge aufweist, kann ein Hinweis darauf sein, dass MsnO10 die Stabilität des
minimalen PKS-Komplexes beeinflusst. Die verminderte Stabilität oder die veränderte Form des
minimalen PKS-Komplexes könnte zu einem frühzeitigen Kettenabbruch führen. Das freigesetzte
139
Diskussion
Polyketid könnte spontan zyklisieren, Umlagerungen eingehen oder durch Enzyme verändert werden.
Das entstehende Produkt würde in der Zelle immer weiter akkumlieren und dann wahrscheinlich durch
den MSH-abhänigen Entgiftungsweg aus der Zelle ausgeschleust werden. Dies würde den NAcetylcysteinrest erklären, welcher auch schon bei anderen Shunt-Produkten der DDMM-Biosynthese
beobachtet wurde, wie beispielsweise bei Msn-KP2 und Msn-KP2a.59 Da MsnO10 neben seiner
katalytischen Funktion höchst wahrscheinlich auch eine Komplex-stabilisierende Rolle übernimmt,
wäre es sinnvoll die Mutante S. albus Cos2∆O10 mit einer inaktiven Variante von MsnO10 zu
komplementieren. Dadurch könnte erreicht werden, dass die Polyketidkette vollständig gebildet und
eventuell richtig zyklisiert würde. Durch das entstehende Intermediat könnten dann Rückschlüsse auf
die Funktion von MsnO10 gezogen werden, da die entsprechende Carbonylfunktion wahrscheinlich
nicht vollständig reduziert vorläge.
Auch die Inaktivierung der dritten Ketoreduktase MsnO1 aus dem Cluster führte zur Akkumulation
eines fehlgefalteten Intermediates. Im Kulturüberstand des Stammes S albus Cos2∆O1 x pKR1 wurde
der Metabolit Msn-KH1 detektiert. Dieser wurde von K. Heßelbach im Rahmen ihrer Diplomarbeit
isoliert.112 Nach Reinigung über Festphasenextraktion, präparative DC und präparativer HPLC konnte
die Struktur von Msn-KH1 über NMR-Messungen gelöst werden. Diese ist in Abbildung 5-4 gezeigt.
Die Struktur von Msn-KH1 ist schon unter dem Namen SEK43 bekannt und wurde erstmals 1995 von
McDaniel et al. beschrieben.113
Abbildung 5-4 Strukturen von SEK15, RM20b und SEK43. Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O1 in S. albus
führt zur Produktion von Msn-KH1 (SEK43), einem Shunt-Produkt, welches auch bei der Co-Expression der minimale PKS
des Tetracenomycin-Clusters mit einer C-9 Ketoreduktase (ActKR) und einer Aromatase (GrisKR) gebildet wird. Ohne die
Aromatase wird RM20b gebildet, während die alleinige Expression der minimalen PKS zur Produktion von SEK15 führt.
140
Diskussion
SEK43 wurde aus dem Stamm S. coelicolor CH999 isoliert, nachdem die minimale PKS aus dem
Tetracenomycin-Cluster zusammen mit ActKR und der Aromatase aus dem Griseusin-Cluster
überexprimiert wurde. Sowohl der erste Ringschluss zwischen C-7/C-12 als auch die Ketoreduktion
der C-9 Carbonylfunktion wurden richtig katalysiert.113 Die alleinige Expression der minimalen PKS
liefert das Produkt SEK15, während bei der Co-Expression der minimalen PKS mit der Aromatase des
Griseusin-Clusters RM20b gebildet wurde.27 Dies bedeutet, dass die minimale PKS zuerst die
Polyketidkette bildet, welche anschließend spontan zu SEK15 reagieren kann. In Anwesenheit einer
C-9 Ketoreduktase wird die Polyketidkette zusätzlich reduziert und bildet SEK43. Die Aromatisierung
des ersten Rings kann aber nur spontan im Fall der unreduzierten Polyketidkette erfolgen oder im Fall
der reduzierten Polyketidkette durch eine Aromatase.
Im Bezug auf die DDMM-Biosynthese kann daraus geschlossen werden, dass sowohl die C-9
Ketoreduktion als auch der erste Ringschluss und die Aromatisierung schon katalysiert wurde, bevor
MsnO1 enzymatisch aktiv wird. Die C-9 Ketoreduktion wird dabei wahrscheinlich durch MsnO11
katalysiert, da dieses Enzym die höchste Sequenzähnlichkeit zu anderen C-9 Ketoreduktasen aufweist.
Die darauffolgende Dehydratisierung/Aromatisierung wird wahrscheinlich durch MsnC3 katalysiert.
Diese Cyclase weist die höchste Homologie zu ActVII und der Aromatase aus dem Griseusin-Cluster
auf, welche für die Aromatisierung des ersten Rings verantwortlich sind.139,140 Im nächsten Schritt der
Biosynthese muss MsnO1 katalytisch aktiv werden, anderenfalls könnte die Cyclase MsnC2 oder
MsnC1 den zweiten Ringschluss katalysieren und es käme zur Produktion eines anderen
Intermediates. Am besten kann dies durch die Co-Expression der minimalen PKS des msn-Clusters
zusammen mit den verschiedenen Kombinationen aus Ketoreduktasen und Cyclasen belegt werden.
Allerdings kann dadurch noch keine Aussage dazu getroffen werden, zu welchem Zeitpunkt MsnO10
enzymatisch aktiv wird, da es ohne dieses Protein zum frühzeitigen Kettenabbruch kommt. Eine
Möglichkeit dies zu umgehen wäre die Co-Expression der minimalen PKS und den verschiedenen
Kombinationen aus Ketoreduktasen und Cyclasen zusammen mit inaktivem MsnO10. Dadurch kann
eine Stabilisierung des minimalen PKS-Komplexes erreicht werden, was wahrscheinlich zur
Produktion der vollständigen Polyketidkette führt. Der Vergleich des neu enstehenden Intermediates
mit den Produkten der anderen Co-Expressionen kann dann einen Hinweis über die Funktion von
MsnO10 geben.
Die Inaktivierung von MsnO1, MsnO10 beziehungsweise MsnO11 kann durch eine oder mehrere
Punktmutationen des katalytischen Zentrums erreicht werden. Das katalytische Zentrum wird in
ActKR aus den vier Aminosäuren N114, S144, Y157 und K161 gebildet. Diese katalytische Tetrade
ist hochkonserviert und kann durch Sequenzvergleiche mit bekannten Ketoreduktasen auch in MsnO1
und MsnO11 gefunden werden. Nur die Aminosäure N114, welche für den Proton-RelayMechanismus wichtig ist, ist in MsnO10 durch ein Threonin ersetzt. Die Aminosäuren der
katalytischen Tetrade sind in Abbildung 5-5 rot gekennzeichnet.
141
Diskussion
Abbildung 5-5 ClustalW2-Alignment bekannter Ketoreduktasen aus PKS II-Clustern mit den Ketoreduktasen aus
dem DDMM-Cluster. Die Aminosäuren der katalytischen Tetrade sind rot markiert. Vollständig konservierte Aminosäuren
sind mit einem Asterisk gekennzeichent.
Durch eine einzelne Punktmutation in der katalytischen Tetrade kann die Inaktivierung erreicht
werden, während die Struktur des Proteins erhalten bleibt. Dadurch kann dieses seine strukturelle
beziehungsweise seine stabilisierende Aufgabe im PKS-Komplex erfüllen. Für die Ketoreduktase
EncD konnte gezeigt werden, dass die Mutation von S148 zu Alanin zur vollständigen Inaktivierung
führt.138 Diese Punktmutation würde sich auch für die Inaktivierung für MsnO1, MsnO10 und
MsnO11 anbieten.
142
Diskussion
5.1.2 Die Funktion von MsnH7
Im Gencluster von DDMM wurden neun Gene (msnH0-msnH8) annotiert, welche für putative
Proteine codieren. Durch Inaktivierungsexperimente, welche von K. Probst durchgeführt wurden,
konnte gezeigt werden, dass die ersten fünf ORFs (msnH0-msnH4) nicht zum Cluster gehören.
Außerdem konnte sie zeigen, dass msnH8 während der Biosynthese nicht transkribiert wird.58
Demzufolge bleibt nur die Funktion der hypothetischen Proteine MsnH5, MsnH6 und MsnH7 zu
klären.
Im Sequenzvergleich zeigte MsnH7 Homologien zu Thioesterasen. TE-Domänen in PKS I-Clustern
katalysieren beispielsweise die Freisetzung der Polyketide von dem Acyl-Carrier-Protein. In PKS IIClustern sind Thioesterasen hingegen nur selten zu finden. Meist sind sie dabei für die Hydrolyse
falsch beladener Acyl-Carrier-Proteine verantwortlich, wenn die Biosynthese nicht mit einer
Acetateinheit starten soll.118,119 Da das Mensacarcin-Backbone nur aus Acetateinheiten aufgebaut wird,
ist das vorkommen einer Thioesterase sehr ungewöhnlich, weshalb die Funktion des Proteins im
Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht wurde.
Hierfür wurde das Gen msnH7 durch λ-Red/ET-vermittelter Rekombination inaktiviert und das
entstandene Konstrukt zusammen mit dem Plasmid pKR1 in S. albus eingebracht. Anschließend
wurde das Produktionsprofil des Stammes S. albus Cos2∆H7 x pKR1 analysiert. Dieses zeigte, dass
die DDMM-Biosynthese durch die Inaktivierung von MsnH7 nicht beeinträchtigt wird. Lediglich eine
geringe Abnahme der Produktionsrate konnte beobachtet werden. Wie bereits erwähnt, dienen
Thioesterasen in PKS II-Clustern als Korrekturenzyme am Anfang der Biosynthese, wenn diese nicht
mit einer Acetateinheit beginnen soll.118,119 Da durch Fütterungsversuche belegt wurde, dass
Mensacarcin nur aus Acetateinheiten aufgebaut ist,58 ist es unwahrscheinlich, dass MsnH7 als
Korrekturenzym dient. Eine weitere Funktion von Thioesterasen ist die Freisetzung des Polyketides
vom Acyl-Carrier-Protein. Dies könnte durch MsnH7 katalysiert werden. RedJ eine Thioesterase aus
der Prodiginin-Biosynthese setzt dadurch beispielsweise Dodecanonsäure vom Acyl-Carrier-Protein
frei. Die Inaktivierung des entsprechenden Gens redJ führte ebenfalls wie die Inaktivierung von
MsnH7 nicht zum Abbruch der Biosynthese, sondern nur zu einer niedrigeren Produktionsrate des
Naturstoffs.141
5.1.3 Die Komplementierung von MsnO2
Im DDMM-Gencluster codieren drei Gene (msnO2, msnO4 und msnO8) für Luciferase-like
Monooxygenasen. Die Gene msnO4 und msnO8 wurden von K. Probst inaktiviert und
komplementiert. Sie postulierte nach der Analyse der Produktionsprofile der Mutanten, dass die
entsprechenden Proteine für die Einführung der Epoxidgruppen verantwortlich sind.59 Die dritte
Luciferase-like Monooxygenase wurde von U. Hardter im Rahmen seiner Promotion inaktiviert.
Durch die Ergebnisse der Produktionsanalysen stellte er die Hypothese auf, dass dieses Protein die
143
Diskussion
DDMM-Seitenkette reduziert und dadurch die Doppelbindung ensteht, in welche MsnO8 die
Epoxidgruppe einführt.60 Die von MsnO2 katalysierte Reaktion ist in Abbildung 5-6 dargestellt.
Abbildung 5-6 Postulierte Funktion von MsnO2.60 Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O2 in S. albus führte zur
Produktion von Msn-UH, einem Intermediat der DDMM-Biosynthese. Deshalb wurde postuliert, dass MsnO2 die Bildung
der Doppelbindung in der Seitenkette katalysiert.
Da U. Hardter nicht den Nachweis erbrachte, dass die Produktion von Msn-UH nur auf die
Inaktivierung von MsnO2 zurückzuführen ist, wurde die Komplementierung im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführt. Hierfür wurde das Plasmid pKO2R1 kloniert und in die Mutante S. albus Cos2∆O2
eingebracht. Dadurch konnte die Produktion von DDMM zwar wiederhergestellt werden, allerdings
konnte auch Msn-UH detektiert werden. Die produzierte Menge an Msn-UH nahm durch die
Komplementierung jedoch ab. Wahrscheinlich wurde nicht genug MsnO2 gebildet, so dass Msn-UH
nicht vollständig weiterumgesetzt und aus der Zelle in das Medium abgegeben wurde. Um dies zu
bestätigen
sollte
durchgeführt
die
Komplementierung mit
einem anderen
werden. Eine Möglichkeit zur Verbesserung der
Komplementierungskonstrukt
Proteinproduktion besteht
beispielsweise durch den Austausch des verwendeten Promotors ermEup durch den stärken Promotor
ermE*
oder
durch
Verwendung
eines
integrativen
Plasmids.
Eine
nur
unvollständige
Komplementierung wurde beispielsweise auch bei der Komplementierung der Mutante Streptomyces
pristinaespiralis SP120 mit den Genen snaA und snaB erreicht. Erst durch den Austausch des tetPromotors durch den stärkeren ermE*-Promotor konnte die Pristinamycin IIA Produktion wieder
vollständig hergestellt werden.142 Die Beeinträchtigung der Produktion eines anderen Proteins durch
die Inaktivierung von msnO2 kann jedoch ausgeschlossen werden, da sonst die Komplementierung
nicht zur Produktion von DDMM führen würde.
5.1.4 Die NADH-abhängige Flavinreduktase MsnO3
Im
Gencluster
von
DDMM
codieren
drei
Gene
für
Flavin-abhängige
Luciferase-like
Monooxygenasen, allerdings konnte nur eine Flavinreduktase lokalisiert werden. Diese wird durch das
Gen msnO3 codiert. Um festzustellen, mit welcher Luciferase-like Monooxygenase MsnO3
interagiert, wurde das Gen inaktiviert und das Produktionsprofil der Mutante S. albus Cos2∆O3 x
144
Diskussion
pKR1 analysiert. Diese produzierte einige neue, zum Teil instabile Metabolite aber auch eine geringe
Menge DDMM. Die Intermediate Msn-SM3 und Msn-SM4 konnten für die Strukturaufklärung
aufgereinigt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei Msn-SM3 um die bereits
bekannte Substanz Msn-UH handelt, welche auch bei der Inaktivierung der Luciferase-like
Monooxygenase MsnO2 produziert wird. Das zweite Produkt Msn-SM4 hat sowohl identische MSund UV-Spektren als auch die identische Retentionszeit wie das Intermediat Msn-KP3, welches bei
der Inaktivierung der Luciferase-like Monooxygenase MsnO4 gebildet wird. Die vollständige
Strukturlösung der Substanzen Msn-SM4 und Msn-KP3 ist Gegenstand einer andauernden
Kooperation mit Dr. T. Paululat. Die Strukturen von Msn-UH, DDMM und der aktuelle
Strukturvorschlag für Msn-KP3 sind in Abbildung 5-7 dargestellt.
Abbildung 5-7 Strukturen von Msn-UH und Msn-KP3 im Vergleich zu DDMM. Die heterologe Expression des Cosmids
Cos2∆O3 in S. albus führte zur Produktion der Intermediate Msn-UH und Msn-KP3. Diese werden auch von den Stämmen
S. albus Cos2∆O2 x pKR1 beziehungsweise S. albus Cos2∆O4 x pKR1 gebildet, in welchen die Luciferase-like
Monooxygenasen inaktiviert wurden.
In der Literatur wurden schon mehrere Geninaktivierungsexperimente bei Zwei-Komponenten
Systemen beschrieben.55,143,144 Dabei führte die separate Inaktivierung der beiden Komponenten immer
zum selben Produkt. Ein nennenswertes Beispiel ist das Zwei-Komponenten System AlnT/AlnH aus
der Alnumycin-Biosynthese, welches die Einführung einer Hydroxygruppe katalysiert. Sowohl die
Inaktivierung der NADH-abhängigen Flavinreduktase AlnH als auch die Inaktivierung der
Monooxygenase AlnT führte zur Bildung desselben Produktes Thalnumycin A.144 Auch bei der
Inaktivierung der einzelnen Gene des Zwei-Komponenten Systems ActVA-ORF5/ActVB aus dem
Actinorhodin-Cluster wurde jeweils dasselbe Produkt Dihydrokalafungin gebildet.55,145,146 Ein
Vergleich dieser Forschungsergebnisse mit den Ergebnissen der MsnO3 Inaktivierung führt zu
folgenden Hypothesen: reduziertes Flavin wird nicht nur durch MsnO3 zur Verfügung gestellt, da die
145
Diskussion
Mutante immer noch eine geringe Menge DDMM produziert. Außerdem kann MsnO3 reduziertes
Flavin sowohl auf MsnO2 als auch auf MsnO4 übertragen. Durch die Inaktivierung von MsnO3 steht
kein reduziertes Flavin für die DDMM Produktion zur Verfügung. MsnO2 und MsnO4 können die
entsprechenden Reaktionen aber trotzdem teilweise katalysieren, da reduziertes Flavin durch eine
Flavinreduktase aus S. albus übertragen wird oder da sie eine sehr hohe Affinität zu reduziertem
Flavin aufweisen und freigesetztes reduziertes Flavin sehr schnell binden. Durch den Mangel an
MsnO3 finden die durch MsnO2 und MsnO4 katalysierten Reaktionen aber nicht schnell genug statt,
was zur Akkumulation der Zwischen- und Shunt-Produkte Msn-UH und MsnKP3 führt. Dass MsnO3
reduziertes Flavin auch für MsnO8 zur Verfügung stellen kann, konnte durch ein in vitro Assay belegt
werden
5.1.5 Die Biosynthese von Didesmethylmensacarcin
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der Ketoreduktasen (MsnO1, MsnO10, MsnO11),
der Flavinreduktase (MsnO3) und des putativen Proteins MsnH7 untersucht. Dadurch kann der von
K. Probst und U. Hardter postulierte Biosyntheseweg für DDMM weiter ergänzt werden. Yan et al.
konnten durch Fütterungsversuche zeigen, dass Mensacarcin aus zehn Acetateinheiten aufgebaut
wird.58 Diese werden durch die minimale PKS MsnK1-K3 zu einer Polyketidkette verknüpft. Für diese
Reaktionen sind aber auch die Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11 essentiell. Ob diese dabei aber
nur eine strukturelle oder auch eine katalytische Rolle spielen, muss noch abschließend geklärt
werden. Nach der C-9 Ketoreduktion durch MsnO11 findet der erste Ringschluss statt, welcher
vermutlich durch die Cyclase MsnC3 katalysiert wird. Das die dritte Ketoreduktase MsnO1 erst im
Anschluss daran die nächste Reaktion katalysiert, konnte durch die Bildung von SEK43 durch die
Mutante S. albus Cos2∆O1 x pKR1 belegt werden.112 Nach der Bildung des dreigliedrigen
Ringsystems durch die Cyclasen MsnC1 und MsnC2 erfolgt die Einführung der Doppelbindung
zwischen C-12/C-13, bevor die Luciferase-like Monooxygenase MsnO4 die Bildung der
Epoxidgruppe in der Kernstruktur katalysiert.59,60 Anschließend erfolgt die Einführung des
Carbonylsauerstoffs an Position C-5 durch die Anthronoxygenasen MsnO5-O7. Die Einführung der
Hydroxygruppen an C-2 und C-4 ist noch ungeklärt. Am Ende der Biosynthese katalysiert MsnO8 die
Bildung der Epoxidgruppen in der Seitenkette.59,61 Für die Reaktionen der Luciferase-like
Monooxgenasen wird der reduzierte Cofaktor FMNH2 durch die NADH-abhängige Flavinreduktase
MsnO3 bereitgestellt. Die Methylierungen der Hydroxygruppen werden wahrscheinlich durch das
SAM-abhängige Enzym MsnM6 katalysiert.58 MsnM6 sowie die Enzyme MsnM1-5, welche für die
SAM-Regeneration verantwortlich sind, sind im Mensacarcin-Cluster codiert, liegen aber nicht
vollständig auf dem Cosmid Cos2 vor. Dies führt dazu, dass bei der heterologen Expression des
Cosmids Cos2 in S. albus nur DDMM gebildet wird. Ob die Methylierung oder die Einführung der
Epoxidgruppe in die Seitenkette früher stattfindet, kann nicht eindeutig geklärt werden. Bei der
146
Diskussion
Produktion von DDMM im heterologen Wirt S. albus wird die Epoxidgruppe in 4 eingeführt. Das
Enzym MsnO8 akzeptiert hierbei das unmethylierte Derivat. Im in vitro Assay wurde aber das
methylierte Substrat Deoxymensacarcin verwendet, welches ebenfalls als Substrat genutzt werden
konnte. Eine Übersicht der Mensacarcin-Biosynthese ist in Abbildung 5-8 dargestellt.
Abbildung 5-8 Postulierte Biosynthese von Mensacarcin.
147
Diskussion
5.2
Einfluss von Mycothiol auf die Bildung von MSN-KP2
und MSN-KP2a
Nach der Inaktivierung des Gens msnO8, welches für eine Luciferase-like Monooxygenase codiert,
kam es zur Akkumulation der Intermediate Msn-KP2 und Msn-KP2a. Diese weisen dieselbe
Kernstruktur wie DDMM auf und unterscheiden sich lediglich in der Seitenkette. Die isolierten
Intermediate haben anstelle der Epoxidgruppe einen N-Acetylcysteinrest (siehe Abbildung 5-9).
K. Probst postulierte, dass dieser Rest aus dem MSH-abhängigen Entgiftungsweg stammt. Auch
andere Shunt-Produkte, welche durch die Inaktivierung von Genen des DDMM-Clusters gebildet
wurden, tragen einen N-Acetylcysteinrest.59
Abbildung 5-9 Die heterologe Expression des Cosmids Cos2∆O8 in S. albus führt zur Produktion von Msn-KP2 und
Msn-KP2a. Diese Intermediate sind Diastereomere und unterscheiden sich nur an dem, mit einem Asterisk markierten,
Stereozentrum.
MSH kann sich spontan oder enzymvermittelt an reaktive Substanzen addieren. Das enstehende MSHAddukt wird dann durch Mca in ein N-Acetylcysteinderivat gespalten, welches aus der Zelle
ausgeschleust werden kann. Durch die Verknüfpung mit N-Acetylcystein können diese Sustanzen
nicht nur ausgeschleust werden, sondern verlieren meist auch ihre biologische Aktivität. So isolierten
Schulz et al. sowohl Piceamycin als auch ein N-Acetylcysteinderivat aus Streptomyces sp. GB 4-2,
wobei nur Piceamycin selbst Aktivität gegen gram-positive Bakterien aufwies.147 Derselbe
Aktivitätsunterschied konnte auch bei dem Phenazin-Antibiotikum SB 212021 und seinem
N-Acetylcysteinderivat SB 212305 festgestellt werden.148 In Piceamycin addiert sich MSH an eine
Doppelbindung in einem Michael-System.147 Dieselbe Reaktion wurde auch für die Entstehung von
Msn-KP2 und Msn-KP2a postuliert. Durch die Inaktivierung von msnO8, welches für die
Epoxidierung der Seitenkette verantwortlich ist, kommt es zur Akkumulation des α,β-ungesättigten
Ketons, welches ein reaktives Michael-System darstellt und spontan mit MSH reagieren kann.59 Zum
Nachweis, dass der N-Acetylcysteinrest von MSH stammt, wurde die MSH-Biosynthese in der
Mutante S. albus Cos2ΔO8 x pKR1 inaktiviert (siehe Kapitel 4.2). Da bekannt ist, dass
Actinobakterien neben MSH auch andere niedermolekulare Thiole, wie beispielsweise Ergothionin
148
Diskussion
produzieren können,149 wurde erwartet, dass diese anstelle von MSH zur Entgiftung von Msn-KP2 und
MsnKP2a verwendet werden können und dadurch neue Msn-KP2 bzw. Msn-KP2a-Thiolderivate
gebildet werden. Die Analyse des Produktionsprofils der Mutante S. albus∆mshA Cos2ΔO8 x pKR1
zeigte jedoch, dass die Inaktivierung der MSH-Biosynthese zum vollständigen Zusammenbruch der
DDMM-Biosynthese führte. Daraus folgt, dass Ergothionin in diesem Fall nicht die Funktion von
MSH übernehmen kann, obwohl es ebenfalls als Antioxidants wirkt und in der MSH-Mangelmutante
M. smegmatis
mshA::Tn5
bis
zu
35
mal
mehr
produziert
wird.150
Da
im
Stamm
S. albusΔmshA Cos2ΔO8 x pKR1 weder Msn-KP2 noch ein Derivat gebildet wurde, muss es zudem
einen negativen Feedback-Mechanismus geben, welcher die Biosynthese von DDMM inhibiert und so
die Zellen vor der Akkumulation der reaktiven Intermediate schützt. Es ist möglich, dass es sich bei
den N-Acetylcystein-haltigen Intermediaten Msn-KP2/2a und Msn-KP3 nicht um Shunt-Produkte
handelt, sondern dass der N-Acetylcysteinrest während der DDMM-Biosynthese notwendig ist, um die
Zelle vor den reaktiven Intermediaten zu schützen. Diese Funktion des Selbstschutzes wurde auch für
die Biosynthese von Streptothricin, Erythromycin und Rifamycin postuliert.75 Allerdings wurden in
den entsprechenden Genclustern Gene gefunden, welche für Mca-homologe Proteine codieren. Im
DDMM-Cluster konnte kein homologes Protein lokalisiert werden, weshalb davon auszugehen ist,
dass der N-Acetylcysteinrest nicht Teil der Biosynthese ist, sondern nur zur Exkretion der
akkumulierten Intermediate dient. Dass das α,β-ungesättigte Keton und nicht Msn-KP2 oder
Msn-KP2a als Substrat für MsnO8 dient, konnte im weiteren Verlauf dieser Arbeit durch ein in vitro
Assay belegt werden.
149
Diskussion
5.3
Charakterisierung von MsnO8
Im DDMM-Cluster sind drei Gene (msnO2, msnO4 und msnO8) für Luciferase-like Monooxygenasen
codiert. K. Probst führte im Rahmen ihrer Dissertation Geninaktivierungsexperimente durch und
postulierte, dass MsnO8 die Epoxidgruppe in die Seitenkette von DDMM einführt.59 Da die
Deletionsmutante ein N-Acetylcysteinderivat produzierte, wurde ein in vitro Assay entwickelt um das
richtige Substrat zu identifizieren. Zudem wurde das Protein genauer charakterisiert und die
Proteinstruktur gelöst. Da Epoxidgruppen die biologische Aktivität einer Substanz maßgeblich
beeinflussen können, ist die Funktionsweise dieses Enzyms von großem Interesse. Durch die
Aufklärung der Struktur und der Entwicklung eines in vitro Assays kann dieses Enzym gezielt
verändert werden und zur Epoxidierung anderer Substanzen in der kombinatorischen Biosynthese
verwendet werden.
5.3.1 Produktion und Reinigung von MsnO8
Zur Entwicklung eines in vitro Enzymassays und für die Kristallisationsexperimente musste MsnO8 in
großer Reinheit und ausreichender Menge gewonnen werden. Hierfür wurde das Protein mit einem
N-terminalen Hexahistidintag heterolog in E. coli produziert. Obwohl die heterologe Produktion von
Proteinen aus Actinomyceten sich häufig, aufgrund des hohen GC-Gehalts der Gene, problematisch
gestaltet, konnte MsnO8 mit dem hier beschriebenen Protokoll produziert und rein gewonnen werden.
Die Aufreinigung von MsnO8 erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und anschließender
Gelfiltration, wodurch gezeigt werden konnte, dass MsnO8 nicht aggregiert, sondern in einem DimerMonomer Gleichgewicht vorliegt. Das reine Protein wurde für Kristallisationsexperimente und zur
Entwicklung eines Enzymassays verwendet.
5.3.2 Enzymassay
Es wurde postuliert, dass MsnO8 am Ende der Didesmethylmensacarcin-Biosynthese die
Epoxidgruppe in das Substrat Deoxymensacarcin einführt um Mensacarcin zu bilden. 59 Yan et al.
postulierten F420 als möglichen Cofaktor für MsnO8.58 Aus diesem Grund wurde ein Enzymassay
entwickelt, in welchem reduziertes F420 für die Epoxidierung bereitgestellt wird. Da F420 kommerziell
nicht erhältlich ist und nur in sehr niedriger Ausbeute aus Actinomyceten gewonnen werden kann,
wurde der Assay so entwickelt, dass F420 im Laufe der Reaktion wieder reduziert wird und dadurch nur
katalytisch notwendig ist. Für diese Reduktionsreaktion wurde das Protein FGD aus M. smegmatis
heterolog in
E. coli
produziert
und aufgereinigt.128,151
Die
Aktivität von
FGD
konnte
spektrophotometrisch bei 420 nm nachgewiesen werden, da die oxidierte Form von F420 im Gegensatz
zur reduzierten Form bei dieser Wellenlänge ein UV-Maximum aufweist.77 Die Erweiterung dieses
Assays mit MsnO8 und dem Zusatz des Substrates Deoxymensacarcin zeigte aber keine Umsetzung.
Hierfür gibt es mehrere plausible Erklärungen: es ist möglich das MsnO8 nicht aktiv ist, dass
Deoxymensacarcin nicht das richtige Substrat darstellt oder das MsnO8 einen anderen oder einen
150
Diskussion
weiteren Cofaktor benötigt. Eine weitere plausible Erklärung könnte sein, dass FGD mit MsnO8 einen
stabilen Komplex eingehen muss, um den reduzierten Cofaktor zu übertragen. Jedoch gibt es auch
Zwei-Komponenten Monooxygenasen, bei welchen der benötigte reduzierte Cofaktor durch freie
Diffusion übertragen wird. Ein Beispiel hierfür bildet das LuxAB/ LuxG System aus P. leiognathi.120
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde das Enzym MsnO3 aus dem msn-Cluster untersucht, da es die
einzige Flavinreduktase ist und möglicherweise auch den Cofaktor für MsnO8 bereitstellt. Nach der
heterologen Produktion in E. coli wurde das Protein über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und
anschließende Gelfiltration gereinigt. Um den verwendeten Cofaktor zu identifizieren, wurden FMNund F420-Lösungen mit NADH und dem gereinigten Protein MsnO3 versetzt. Anschließend wurde die
Absorptionsabnahme von NADH spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt. Dadurch konnte
eindeutig nachgewiesen werden, dass MsnO3 eine NADH-abhängige FMN-Reduktase darstellt. Dies
führte zu der Annahme, dass auch MsnO8 FMN abhänigig ist.
Im nächsten Schritt wurde der MsnO3-Assay durch Zugabe der Luciferase-like Monooxygenase
MsnO8 und dem postulierten Substrat Deoxymensacarcin erweitert. Durch eine HPLC-MS/ESIAnalyse des Reaktionsansatzes konnte eindeutig der Umsatz von Deoxymensacarcin zu Mensacarcin
nachgewiesen werden. Da nur eine geringe Menge des Substrates zur Verfügung stand, konnten keine
weiteren Messungen zur Berechnung enzymkinetischer Parameter durchgeführt werden.
Für die Übertragung von reduziertem FMN auf MsnO8 kann postuliert werden, dass dies höchst
wahrscheinlich ohne eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung stattfindet. Grund zu dieser
Annahme liefern die Inaktivierungen der Luciferase-like Monooxygenasen MsnO2, MsnO4 und
MsnO8 und die Inaktivierung der Flavinreduktase MsnO3. Zum einen stellt MsnO3 allen drei
Proteinen reduziertes FMN bereit, dass MsnO3 mit allen Enzymen einen Komplex zur Übertragung
bilden kann, ist unwahrscheinlich. Zum anderen wird bei der Inaktivierung von MsnO3 DDMM
gebildet, was vermuten lässt, dass die Luciferase-like Monooxygenasen eine sehr hohe Affinität zu
freiem, reduzierten FMN haben und deshalb keine direkte Übertragung notwendig ist. Auch für ein
homologes Zwei-Komponenten Enzymsystem aus S. coelicolor konnte gezeigt werden, dass keine
direkte Übertragung, durch eine Protein-Protein-Wechselwirkung des reduzierten FMN von der
Reduktase ActVB auf die Monooxygenase ActVA stattfindet.152
Der Mechanismus der Epoxidierung wird ähnlich wie die Reaktionen bereits postulierter Ein- und
Zwei-Komponenten Monooxygenasen funktionieren.55,153–155 Es ist allgemein anerkannt, dass die
Reaktion im wesentlichen folgende Schritte umfasst.156 Am Anfang katalysiert die Reduktase MsnO3
die Reduktion des Cofaktor FMN durch NADH. Anschließend wird dieser durch freie Diffusion auf
die Monooxygenase MsnO8 übertragen. Im nächsten Schritt reagiert das reduzierte FMN mit
molekularem Sauerstoff unter Bildung eines Flavin-4a-hydroperoxids. Valton et al. konnten zeigen,
dass die Bildung dieses Intermediates erst stattfindet, nachdem das reduzierte FMN freigesetzt und auf
die Monooxygenase übertragen wurde.152 Zudem kann die Monooxygenase das Flavin-4a151
Diskussion
hydroperoxid stabilisieren, bis im letzten Schritt das Substrat an das Protein bindet.55,157 Abhängig
davon, ob das Peroxyflavin protoniert oder deprotoniert vorliegt, ist es in der Lage als Elektrophil oder
Nucleophil zu reagieren. Dies wird vor allem durch die Aminosäuren, welche in der Nähe des C-4a
liegen beeinflusst.46 Im Fall der Epoxidierung von Deoxymensacarcin liegt das Peroxyflavin
wahrscheinlich als Nucleophil vor und der distale Sauerstoff reagiert mit dem Michael-Akzeptor über
einen 1,4-Angriff. Die so entstehende negative Ladung kann über die Carbonylgruppe stabilisiert
werden. Das Carbanion greift im nächsten Schritt das distale Sauerstoffatom an und es entseht
Mensacarcin unter der Freisetzung von Hydroxyflavin. Letzteres spaltet Wasser ab und steht als
oxidertes FMN wieder zur Verfügung. Ein analoger Mechanismus wurde auch schon für die Bildung
von Epoxykalafungin durch die Zwei-Komponenten Monooxygenase ActVA-5/ActVB postuliert.52
Der postulierte Reaktionsmechanismus für die Epoxidierung von Deoxymensacarcin durch MsnO8 ist
schematisch in Abbildung 5-10 dargestellt.
Abbildung 5-10 Postulierter Mechanismus der Epoxidierung von Deoxymensacarcin.
152
Diskussion
5.3.3 Kristallstruktur von MsnO8
Um die funktionsweise von MsnO8 zu verstehen und um die wichtigen Aminosäuren der Cofaktorund Substratbindestelle zu identifizieren, wurde MsnO8 kristallisiert und die Struktur gelöst. Bei der
Kristallisation des apo-Proteins konnten plättchenförmige Kristalle erhalten werden. Aus den
Beugungsdaten dieser Kristalle konnte die Kristallstruktur von MsnO8 bei einer Auflösung von 1.80 Å
berechnet werden. Um die Cofaktor-Bindestelle zu identifizieren wurden von T. Pfüger
Co-Kristallisations- und Soakingexperimente mit FMN durchgeführt. Bisher konnte MsnO8 aber nur
als apo-Protein ohne gebundenen Cofaktor und ohne Substrat kristallisiert werden. Das MsnO8 bei der
Reinigung immer ohne Cofaktor gewonnen wurde zeigt, dass der Cofaktor FMN nicht sehr stark
gebunden ist. Eine höhere Affinität zur Bindetasche ist für den reduzierten Cofaktor zu erwarten.
Demnach sollten weitere Co-Kristallisationsexperimente unter anaeroben Bedingungen mit dem
reduzierten Cofaktor durchgeführt werden, um das FMN-gebundene Protein zu kristallisieren. Die CoKristallisation von MsnO8 mit dem Substrat erweist sich als schwieriger. Nach Ballou et al. sollte
zuerst der reduzierte Cofaktor und anschließend das Substrat binden.156 Daraufhin wird dieses sofort
umgesetzt und sowohl das Produkt als auch der Cofaktor werden freigesetzt. Um dennoch einen
Einblick in die Bindetasche und die Konformation des Proteins während der Substratbindung zu
erhalten, müsste das Substrat durch ein nicht reaktives Substrat oder einen Inhibitor ausgetauscht
werden.
Ein Strukturhomologie-Abgleich über DALI158 ergab, dass MsnO8 zur Familie der bakteriellen
Luciferasen gehört. Die höchste Übereinstimmung besteht zur FMN-abhängigen bakteriellen
Luciferase LuxA von V. harveyi (PDB-ID: 3FGC, 1LUC)159,160 mit einem Z-Wert von 33 und einer
Standardabweichung von 2,4 Å. Einen Z-Wert von über 22 und einer Standardabweichung zwischen
2,3 und 3,2 Å lieferte unter anderem auch der Vergleich mit der F420-abhängigen Reduktase Mer von
Methanosarcina barkeri (PDB-ID: 1Z69)161, kMer von Methanopyrus kandleri (PDB ID: 1EZW)162,
der Dehydrogenase Adf von Methanoculeus thermophiles (PDB ID: 1RHC)163 und der FMNabhängigen Monooxygenase LadA von Geobacillus thermodenitrificans (PDB ID: 3B9O)164. Im
Gegensatz zu anderen FMN-abhängigen Enzymen fehlt den bakteriellen Luciferasen und MsnO8 eine
α-Helix zwischen β8 und αVIII, wodurch sie nicht in der Lage sind, kovalente Bindungen zum
entsprechenden Cofaktor FMN oder F420 zu bilden.61,160,164 Das Fehlen dieser Helix ist auch eine
möglich Erklärung dafür, dass MsnO8 bei der Aufreinigung ohne Cofaktor gewonnen wurde.
Wie bereits in Kapitel 4.3.3, beschrieben bildet MsnO8 ein Homodimer wobei jedes Monomer ein
(α,β)8-Tim-Barrel bildet. Zusätzlich zu dieser Fassstruktur gibt es drei lange flexible Bereiche IS1, IS2
und IS3. Während der Loop IS2 zusammen mit den α-Helices II und III maßgeblich an der
Stabilisierung der Homodimerstruktur beteiligt ist, bilden die Loops IS1 und IS3 die
Substratbindetasche. Diese befindet sich auf der C-terminalen Seite des β-Barrels. Die Position der
Substratbindetasche stimmt gut mit der Beobachtung überein, dass sich das katalytische Zentrum bei
allen Enzymen mit einer TIM-Barrel-Struktur auf dieser Seite des Barrels befindet.165 Dass IS1 zudem
153
Diskussion
für die Bindung des Cofaktors wichtig ist, konnte durch eine Überlagerung der Proteinstruktur von
apo-MsnO8 mit der Proteinstruktur von LuxA aus V. harveyi (PDB-ID: 3FGC)159 mit gebundenem
FMN belegt werden. Ein Modell von MsnO8 mit eingefügtem FMN ist in Abbildung 5-11 dargestellt.
Durch ein Sequenzalignment mit verschiedenen Flavin-abhängigen Enzymen konnten außerdem die
Aminosäuren E48, H44 und S170 identifiziert werden.61 Diese sind hochkonserviert und spielen
ebenfalls eine wichtige Rolle für die Wechselwirkung mit dem Cofaktor.
Abbildung 5-11 Proteinstruktur von apo-MsnO8. Dargestellt ist eine Oberflächenansicht eines MsnO8-Monomers zur
besseren Darstellung der Cofaktor- und Substratbindestelle. Die Cofaktorbindestelle von FMN wurde durch Überlagerung
mit dem FMN-abhängigen Protein LuxA identifiziert. Die Lage der konservierten Aminosäuren E48, H44 und S170 sind in
rot dargestellt. Zwischen den Loops IS1 (grün) und IS3 (blau) liegt die Substratbindestelle.
154
Literaturverzeichnis
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Abkürzungsverzeichnis
7 Abkürzungsverzeichnis
Physikalische Größen
A
Absorption
J
Kopplungskonstante
m
Masse
m/z
Masse-Ladungs-Verhältnis
Rf
Retentionsfaktor
t
Zeit
V
Volumen
δ
chemische Verschiebung
λ
Wellenlänge
Einheiten
%
Prozent
°C
Grad Celsius
Au
absorption units: Absorptionseinheiten
b(p)
Basenpaar(e)
Da
Dalton
g
Gramm
h
Stunde(n)
Hz
Hertz
L
Liter
M
molar
m
Meter
min
Minute(n)
mol
Einheit der Stoffmenge
ppm
parts per million
rpm
revolutions per minute: Umdrehungen pro Minute
s
Sekunde(n)
u
unit: Enzymmenge, die μmol Substrat pro Minute umsetzt
V
Volt
167
Abkürzungsverzeichnis
Vorsilben
G
Giga
109
M
Mega
106
k
kilo
103
c
zenti
10-2
m
milli
10-3
µ
micro
10-6
n
nano
10-9
p
pico
10-12
Nukleotide
A
Adenin
C
Cytosin
G
Guanin
T
Thymin
Aminosäuren
Alanin
Ala
A
Arginin
Arg
R
Asparagin
Asn
N
Asparaginsäure
Asp
D
Cystein
Cys
C
Glutamin
Gln
Q
Glutaminsäure
Glu
E
Glycin
Gly
G
Histidin
His
H
Isoleucin
Ile
I
Leucin
Leu
L
Lysin
Lys
K
Methionin
Met
M
Phenylalanin
Phe
F
Prolin
Pro
P
Serin
Ser
S
Threonin
Thr
T
Tryptophan
Trp
W
Tyrosin
Tyr
Y
Valin
Val
V
168
Abkürzungsverzeichnis
Sonstiges
act
Gen aus dem Actinorhodin-Cluster
APS
Ammoniumperoxodisulfat
ACP
Acyl-Carrier-Protein
ARO
Aromatasen
AT
Acyltransferase
ATP
Adenosintriphosphat
bidest
bidestilliert
bla
β-Lactamresistenzgen
BLAST
Basic local alignment search tool
BSA
Bovines Serum Albumin
C
Kohlenstoff
CHS
Chalcon-Synthase
CLF
chain length factor
CoA
Coenzym A
Cos
Cosmid
COSY
correlation spectroscopy: homonukleare Korrelationspektroskopie für 1H/1H
CYC
Cyclase
dau
Gen aus dem Daunomycin-Cluster
DC
Dünnschichtchromatografie
DDMM
Didesmethylmensacarcin
DEBS
6-Deoxyerythronolid B Synthase
DH
Dehydratase
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
desoxyribonucleic acid: Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleotide
EDTA
Dinatriumethylendiamintetraessigsäure
DTT
1,4-Dithiothreitol
EN
Enoylreduktase
ESI
Elektrospray-Ionisation
et al.
et alii: und andere
EtOH
Ethanol
FAS
Fatty acid synthase: Fettsäuresynthase
FMN
Flavinmononucleotid, oxidierte Form
FMNH2
Flavinmononucleotid, reduzierte Form
FPLC
Fast protein liquid chromatography
169
Abkürzungsverzeichnis
GSH
Glutathion
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HPLC
high performance liquid chromatography: Hochleistungsflüssigkeitschromatografie
Ins-P
Inositolphosphat
IPTG
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
IS
insertion segment
KR
Ketoreduktase
KS
Ketosynthase
LD50
letale Dosis 50% der Zellen
mBBr
Monobromobiman
Mca
MSH S-Konjugat Amidase
MOPS
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
MS
Massenspektrometrie
MSH
Mycothiol
msn
Gen aus dem Mensacarcin-Cluster
Msn
Protein, das zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin gehört
+
NAD
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid, oxidierte Form
NADH
Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid, reduzierte Form
NADP+
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat, oxidierte Form
NADPH
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat, reduzierte Form
NMR
nuclear magnetic resonance: Kernspinresonanz
NRPS
Nichtribosomale Peptidsynthase
OD
optische Dichte
OH-Gruppe
Hydroxylgruppe
ORF
open reading frame: offener Leserahmen
oriT
origin of transfer
PAGE
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PCR
polymerase chain reaction: Polymerase-Kettenreaktion
PKS
Polyketidsynthase
RNA
ribonucleic acid: Ribonukleinsäure
ROS
reactive oxygen species: reaktive Sauerstoffspezies
ROESY
Rotating Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
RT
Raumtemperatur
SAM
S-Adenosyl-L-Methionin
SARP
Streptomyces Antibiotic Regulatory Protein
SDR
short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen
170
Abkürzungsverzeichnis
SDS
Natriumdodecylsulfat
sno
Gen aus dem Nogalamycin-Cluster
sp(p).
Species; Art(en)
SPE
solid phase extraction: Festphasenextraktion
STS
Stilben-Synthase
tcm
Gen aus dem Tetracenomycin-Cluster
TE
Thioesterase
TEMED
N,N,N`;N`-Tetramethylenethan-1,2-diamin
TGI
total growth inhibition: Inhibition des Zellwachstums
THN
1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen
THNS
1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen-Synthase
TRIS
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
UV
Ultraviolett
X-Gal
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Galaktopyranosid
∆
In einer Mutante inaktiviertes Gen
171
Abkürzungsverzeichnis
172
Anhang
8 Anhang
8.1
Optimierte DNA-Sequenz von FGD
CATATGGCTGAATTGAAGCTAGGTTACAAGGCATCTGCGGAGCAGTTTGCTCCTCGCGAG
TTGGTCGAGTTGGCGGTTTTGGCCGAGTCGGCAGGTATGGACAGTGCGACTGTCAGTGAT
CATTTCCAGCCGTGGCGTCACGAAGGTGGGCATGCGCCGTTCTCGCTGGCGTGGATGACC
GCGGTGGGCGAGCGCACCAAGAACCTGGTGCTGGGGACGTCGGTGCTGACGCCGACGTT
CCGGTACAACCCGGCGGTGATCGCCCAGGCGTTCGCGACGATGGGATGTCTGTATCCGGG
GCGGATCTTCCTCGGTGTGGGCACCGGTGAGGCGCTCAACGAGATCGCGACCGGGTATGC
CGGCGAGTGGCCGGAGTTCAAGGAGCGGTTCGCGCGGCTACGCGAATCGGTGCGGTTGA
TGCGTGAGCTGTGGCTGGGGGACCGGGTCGATTTCGACGGCGAGTACTACCGCACCAAG
GGCGCGTCGATCTATGACGTGCCCGAGGGTGGCATCCCGGTGTACATCGCCGCGGGTGGT
CCGGTGGTGGCCAAGTACGCCGGCCGTGCCGGTGACGGGTTCATCTGCACCTCGGGCAAG
GGTGAGGAGCTCTATGCCGAGAAGCTGATCCCGGCGGTCAAGGAGGGTGCTGCGGCCGC
CGATCGCGACGCCGACGCGATCGACCGGATGATCGAGATCAAGATCTCCTATGACACCG
ATCCCGAGTTGGCGCTGGAGAACACCCGGTTCTGGGCGCCGCTGTCGTTGACCGCCGAGC
AGAAGCATTCGATCGACGATCCGATCGAGATGGAGAAGGCTGCCGACGCGTTGCCCATC
GAGCAGGTCGCCAAGCGCTGGATCGTCGCGTCGGACCCCGACGAGGCGGTCGAGAAGGT
CGGCCAGTACGTCAAGTGGGGGCTGAACCACCTGGTGTTCCACGCCCCGGGCCATGACCA
GCGTCGATTCCTCGAGCTGTTCAAACGCGATCTGGAACCGCGGTTGCGCAAGCTGGCCTG
ATAACTCGAG
8.2
Proteinsequenz von MsnO8
MKLSVVEQAPVVEGLTPAHSLQHSIELARLADRLGYERFWVAEHHAEIFNAVPAPEILIARIA
AETSGIRVGSGGVLLSLYSPLKVAEVFRTLHALYPDRIDLGIGRANRVKLPVFAALRDDTAGK
EPSSDDLWRRLEQLRAYLDPDSGLPFTVSPRMPGGPALWLLGASVSSAEAAARLGLPYAYAH
FITPQFTREAMDTYRAAFVPGPDTPSPRPILSVVVCCAETDAEAQRVYATHRLFHRRMSQGDV
RLLPPADLAVAEMDKPGPDPLAEESFEWPRYVVGSPDRVRDQLTKMADATGAEELGVVSMI
HDQRDRLRSYRLLAEAFELTPR
8.3
Proteinsequenz von MsnO3
MPTGTTTGTVDASLFRDAFASLPTSVAVITTTDAQGMPKGLTSSAVCAVSMDPPLLLICVDKS
SQTLPALQQANGFVVNFLSAGSEQVSRQFATKSADKFAGVQHRTSSRAAGSPILFADSVAYLE
CAAESRIEAGDHWILLGRVLGGEVHDKGALLYHRRSYLKLLPERNAS
173
Anhang
8.4
Plasmidkarten
8.4.1 Plasmid zur Geninaktivierung
Abbildung 8-1 Plasmidkarte des Suizidvektors pKCXY02∆mshA.
8.4.2 Plasmide zur Komplementierung
Abbildung 8-2 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids pKO10R1.
174
Anhang
Abbildung 8-3 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids pKO11R1.
Abbildung 8-4 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids pKR1H7.
175
Anhang
Abbildung 8-5 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids pKO2R1.
Abbildung 8-6 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids pKO3R1.
176
Anhang
8.4.3 Plasmidkarte von pTESb*FbiABC
Abbildung 8-7 Plasmidkarte von pTESb*FbiABC.
8.4.4 Plasmide zur heterologen Überexpression von Proteinen in
E. coli
Abbildung 8-8 Plasmidkarte des Proteinexpressionsplasmids pET28a-O8-NHT.
177
Anhang
Abbildung 8-9 Plasmidkarte des Proteinexpressionsplasmids pET21a-O8-CHT.
Abbildung 8-10 Plasmidkarte des Proteinexpressionsplasmids pET28a-fgd-NHT.
178
Anhang
Abbildung 8-11 Plasmidkarte des Proteinexpressionsplasmids pET28a-O3-NHT.
179
Anhang
8.5
NMR-Spektren
8.5.1 1D- und 2D-NMR Spektren von Msn-SM2
8.5.1.1
1
8.5.1.2
13
180
H-NMR-Spektrum von Msn-SM2
C-NMR-Spektrum von Msn-SM2
Anhang
8.5.1.3
1
H/1H COSY-NMR-Spektrum von Msn-SM2
8.5.1.4
1
H/13C HMBC-NMR-Spektrum von Msn-SM2
181
Anhang
8.5.1.5
1
8.5.1.6
1
182
H/13C HSQC-NMR-Spektrum von Msn-SM2
H/15N HMBC-NMR-Spektrum von Msn-SM2
Anhang
8.5.2 1D- und 2D-NMR Spektren von Msn-SM3
8.5.2.1
1
8.5.2.2
13
H-NMR-Spektrum von Msn-SM3
C-NMR-Spektrum von Msn-SM3
183
Anhang
8.5.2.3
1
8.5.2.4
1
184
H/1H COSY-NMR-Spektrum von Msn-SM3
H/13C HMBC-NMR-Spektrum von Msn-SM3
Anhang
8.5.2.5
1
H/13C HSQC-NMR-Spektrum von Msn-SM3
8.5.3 1D-NMR Spektren von Msn-SM4
8.5.3.1
1
H-NMR-Spektrum von Msn-SM4
185
Anhang
8.5.3.2
186
13
C-NMR-Spektrum von Msn-SM4
Danksagung
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken, die zur Entstehung dieser Arbeit
beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. A. Bechthold nicht nur für die Überlassung des sehr interessanten Themas,
sondern auch für seine Diskussionsbereitschaft, seine umfangreiche Unterstüzung und Förderung und
seine stets offene Tür bei allen Problemen und Fragestellungen. Besonders bedanken möchte ich mich
für die wissenschaftlichen Freiheiten und die Möglichkeit meine Ergebnisse auf nationalen und
internationalen Kongressen zu präsentieren.
Herrn Prof. Dr. O. Einsle für sein Interesse an meiner Arbeit und die Übernahme des
Korreferats, sowie Herrn Prof. Dr. T. Friedrich für seine Bereitschaft an meinem Rigorosum als
Drittprüfer teilzunehmen.
Frau Prof. Dr. S. Andrade und Tobias Pflüger für die gute Zusammenarbeit, die Durchführung
der Kristallisationsexperimente und die Strukturlösung von MsnO8. Danke für die stets hilfsbereite
und verlässliche Kooperation und die wertvollen Anregungen und Diskussionen.
Herrn Dr. T. Paululat für die gute Zusammenarbeit, die Durchführung der NMR-Messungen
und Strukturaufklärung der Mensacarcin-Intermediate.
Frau Prof. Dr. S. Lösgen und Dr. E. Brötz für ihr Interesse an meiner Arbeit und die
hilfreichen Diskussionen und Ratschläge.
Mein herzlicher Dank geht an alle Freunde und Kollegen der AG Bechthold und der AG
Merfort für die produktive und kollegiale Arbeitsatmosphäre. Besonders bedanken möchte ich mich
bei allen ehemaligen und jetzigen Büro- und Laborkollegen für die freundschaftliche Zusammenarbeit.
Meinen Korrekturlesern Jana Derochefort, Tanja Heitzler, Dr. Sandra Ebeling, Dr. Arne
Gessner und Dr. Julia Wunsch-Palasis für die gründliche Fehlersuche und die vielen hilfreichen
Vorschläge und Kommentare zu meiner Arbeit.
Dr. Sandra Ebeling, Tanja Heitzler, Anna Lutz, Jana Derochefort und meiner ehemaligen
Diplomandin Katharina Heßelbach für die gemeinsamen Kaffeepausen und das ein oder andere
Gläschen Sekt nach der Arbeit.
Meiner Großmutter, meinen Eltern und Geschwistern für die stets große Unterstüzung in allen
Lebenslagen. Danke, dass ihr immer für mich da seid und für eure Liebe. Ihr seid die beste Familie,
die es gibt.
Meinem Freund Thomas für seine Liebe, sein Verständnis und die schöne gemeinsame Zeit,
die mir immer wieder neue Kraft gibt.
187
Danksagung
188
Bildungsgang
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Sie ist deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.
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