Analyse genomischer Schäden und Quantifizierung genotoxischer

Analyse genomischer Schäden und Quantifizierung
genotoxischer Ereignisse
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt am Max-Planck-Institut
für molekulare Physiologie in Dortmund
Abteilung für strukturelle Biologie
Arbeitsgruppe für biophysikalische Analytik
vorgelegt von
DIPL. BIOL.
MARTINA FIRUS
GEB. PLAß
aus
Werne an der Lippe
Bochum 2002
II
Die vorliegende Arbeit wurde am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Abteilung
Strukturelle Biologie, Arbeitsgruppe für biophysikalische Analytik unter Leitung von Herrn
Dr. Jürgen Kuhlmann und Herrn Prof. Dr. Alfred Wittinghofer in Dortmund in der Zeit von
September 1996 bis Januar 2000 angefertigt.
Die Arbeiten der Zellkultur wurden von Mitarbeitern des Institutes für Arbeitsphysiologie,
Abteilung Toxikologie und Arbeitsmedizin, Arbeitsgruppe Zellkultur unter Leitung von
Herrn Dr. Wolfram Föllmann und Herrn Prof. Dr. Hermann Bolt an der Universität Dortmund
durchgeführt.
III
Abkürzungen
Aminosäuren sind im Dreibuchstabencode abgekürzt (SAMBROOK et al., 1989).
A
2-AAF
Abb
AC
Amp
AP
APS
AS
bp
BSA
β-ME
C
cDNA
CO2
C-Terminus
dATP
DEAE
DMSO
DNA
Dnase
ds
DTE
DTT
E.coli
EDTA
EGF
ε
FCS
F-12+
FPLC
G
g
GSH
GST
HEPES
HMSH2
HRP
IPTG
kass
kb
kDa
kdiss
kobs
LB
M
Adenin
2-Acetylaminofluoren
Abbildung
Accession-Nummer
Ampicillin
Alkalische Phosphatase
Ammoniumperoxidisulfat
Aminosäure
Basenpaare
Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
β-Mercaptoethanol
Cytosin
Copy Desoxyribonukleinsäure
Kohlendioxid
Carboxyterminus
Desoxyadenosintriphosphat
Diethylaminoethan
Dimethoxylsulfoxid
Desoxyribonucleic Acid (Desoxynukleinsäure)
Desoxyribonuklease
doppelsträngig
Dithioerythreitol (Erythro-1,4-Dimercapto-2,3-Butandiol)
Dithiothreitol (Threo-1,4-Dimercapto-2,3-Butandiol)
Escheria coli
Na-Salz der Ethylendiamintetraessigsäure
Epidermal Growth Factor (epidermaler Wachstumsfaktor)
Extinktionskoeffizient
Fetal Calf Serum (fötales Kälberserum)
Hams F-12 Medium mit Glutamin und verschiedenen Zusätzen
Fast-Performance-Liquid-Chromatography
Guanin
Gravitationskonstante = 9,81 m/s²
reduziertes Glutathion
Glutathion-S-Transferase
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
Humanes MutS Homolog
Horseradish-Peroxidase (Meerettich-Peroxidase)
Isopropyl-ß-D-thiogalactosid
Assoziationsgeschwindingkeitskonstante
Kilobasenpaare
Kilodalton
Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante
beobachtete Geschwindigkeitskonstante
Luria-Broth
Molar (mol/l)
IV
MNNG
MOPS
MutS
N
NTA
N-Terminus
OD
PBS
PCR
pH
PMSF
PNA
PVDF
RNA
rpm
RT
RU
SDS
SPR
s
ss
T
t
Tab.
TAE
Taq
TBE
TE
TEMED
TM
Tris
U
UvrA
üN
UpM
V
UV
Vol
W
wt
XPA
N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin
N-Morpholinopropanesulfonic acid (N-Morholinopropansulfonsäure)
Mutator S
normal
Nitriloacetat
Aminoterminus
optische Dichte
Phosphat buffered saline (Phosphatpuffer)
Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion)
negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Phenylmethylsulfonylfluorid
Peptide Nucleic Acid (Peptidnukleinsäuren)
Polyvinyldifluorid
Ribonucleicacid
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
Raumtemperatur
Resonance Unit (Resonanzeinheit)
Sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
Surface Plasmon Resonance (Oberflächenplasmonresonanz)
Sekunde
single-strand (einzelsträngig)
Thymidin
time (Zeit)
Tabelle
Tris-Acetat-EDTA
Thermus aquaticus
Tris-Borat-EDTA
Tris-EDTA
N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin
Trade Mark (eingetragenes Warenzeichen)
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Unit (Einheit der Enzymaktivität)
UV Resitenz Gen A
über Nacht
Umdrehungen pro Minute
Volt (Einheit der Spannung)
Ultraviolettes Licht
Volumen
Watt (Einheit der Leistung)
wildtyp
Xeroderma Pigmentosum Gruppe A
% v/v
% w/v
Volumenprozent
Gewichtsprozent
V
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
Tumorentstehung
Genotoxische und epigenetische Kanzerogene
Einsatz von Zellkulturen bei Mutagenitäts- und Kanzerogenesestudien
Charakterisierung von Zellkulturen mit Schweineharnblasenepithelzellen und
Rinderkolonepithelzellen
1.5. DNA-Veränderungen nach Mutagenbehandlung
1.5.1. Reparaturenzyme
1.5.2. Das Tumorsuppressorgen p53
1.5.3. DNA-Addukte
1.5.4. Mutationen in Proto-Onkogenen
1.6. Problemstellung und Zielsetzung
1
3
6
7
9
9
16
18
20
23
II. Material und Methoden
A. Material
2.1. Probenmaterial
2.2. Bakterienstämme
2.3. Nährmedien
2.4. Vektoren
2.5. Lösungen
2.6. Chemikalien
2.7. Verbrauchsmaterial
2.8. Enzyme und Proteine
2.9. Oligodesoxyribonukleotide
2.10. Reaktionssets („Kits“)
2.11. DNA- und Protein-Standards
2.12. Antikörper
2.13. Geräte
B. Methoden
2.1. Behandlung der primären Zellkulturen
2.1.1. Inkubation mit kanzerogenen Stoffen
2.1.2 Ablösen der Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung
2.1.3 DNA-Isolierung aus den primären Zellkulturen
2.1.4 Photometrische DNA-Quantifizierung
2.1.5 DNA-Verdau zum Einsatz im Biacore
2.1.6 Proteinisolierung aus den primären Zellkulturen
2.1.7 Proteinbestimmung nach Bradford
2.2. Amplifikation von c-DNA-Fragmenten aus der primären Zellkultur zur Klonierung
in Expressionsvektoren
2.2.1 RNA-Mini-Präparation aus den primären Zellkulturen
2.2.2 DNase-Behandlung von Gesamt-RNA
2.2.3 Computergestützte Versuchsplanung unter Verwendung von
Genetics Computer Group (GCG)
2.2.4 Reverse Transkription von mRNA
2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion
2.2.6 Klonierung von DNA Fragmenten
2.2.7 Gelelektrophoretische Verfahren
2.3. Expression und Isolierung von Proteinen
2.3.1 Proteinexpression
2.3.2 Zellaufschluß
2.3.3 Proteinreinigung
2.3.4 Thrombinspaltung von CBP-Fusionsproteinen und Reinigung des Spaltfragments
25
25
25
25
26
28
30
30
31
31
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35
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39
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41
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43
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55
55
56
57
60
VI
2.3.5 Konzentrierung von Proteinen durch Ultrafiltration
2.3.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.3.7 Western-Blot
2.3.8 Dot-Blot
2.4. Biophysikalische Meßmethode
2.4.1 Hybridisierung komplementärer Oligonukleotide
2.4.2 DNA-Standardproben zum Einsatz im BIAcore
2.4.3 BIAcore Messungen
2.4.4. Koppelung der einzelnen Liganden auf der Sensoroberfläche
60
61
62
64
64
64
64
66
68
III Ergebnisse
3.1 Nachweissysteme für globale, unspezifische DNA-Schädigungen
74
74
3.1.1 Mutagenitätstests
74
3.1.1.1 Zellkultur mit epithelialen Primärzellen
74
3.1.1.2 Inkubationsversuche mit anschließender DNA-Isolierung
75
3.1.1.3 Inkubationsversuche mit anschließender Proteinisolierung
3.1.2 Aufbau eines biophysikalischen Meßsystems für unspezifische DNA-Schädigungen 76
3.1.2.1 Oberflächen Plasmon Resonanz und BIAcore 1000
76
76
3.1.2.2 DNA-Reparturenzyme als Fängersysteme
3.1.2.3 Expression und Reinigung von den Reparaturenzymen des
76
Fehlpaarungssystems
76
3.1.2.3.1 hMSH2-Fragment mit DNA-Bindungs- und ATP-Aktivierungsregion
79
3.1.2.3.2 Expression und Reinigung von MutS
82
3.1.2.3.3 Expression und Reinigung von UvrA
84
3.1.2.4 DNA-Reparaturenzyme als Fänger im BIAcore-System
3.1.2.4.1 DNA-Standardproben für BIAcore-Experimente
84
85
3.1.2.4.2 Bindungsstudien mit hMSH2vk/MutS
91
3.1.2.4.3 Bindungsstudien mit biotinylierten DNA-Proben und löslichem MutS
98
3.1.2.4.4 Bindungsstudien mit UvrA / XPA als Fängersystem
98
3.1.2.5 p53 Lokalisation als Marker für DNA-Schädigungen
99
3.1.2.5.1 Klonierung von p53 aus Rind, Schaf, Schwein
105
3.1.2.5.2 Expression von p53 vom Rind und Schwein
107
3.1.2.6 Detektion von p53 mit kommerziellen anti-p53 monoklonalen Antikörpern
107
3.1.2.6.1 Test mit humanem p53-Protein
3.1.2.6.2 Kreuzreaktivität der verwendeten monoklonalen Antikörper gegen
109
nicht humanes p53-Protein
3.1.2.6.3 Quantifizierung der Bindung von rekombinantem MBPp53His6Fusionsprotein vom Schwein an den monoklonalen Antikörper Do-1
113
im BIAcore®-System
3.1.2.7 Einsatz von Zellkulturmaterial in das Fängersystem mit dem monoklonalen
117
Anti p53 Antikörper Do-1
120
3.2. Nachweissysteme für spezifische DNA-Schädigungen
120
3.2.1. Anti DNA Addukt spezifische Antikörper als Fänger im BIAcore®-System

3.2.1.1. DNA-Standardproben für BIAcore -Experimente....................................................120
3.2.1.2. Bindungsstudien mit vorgelegtem Anti DNA Addukt spezifischen Antikörper....... 121
123
3.2.2. DNA-Analoga – Peptid Nukleinsäuren
123
3.2.2.1 Klonierung von H-ras aus Rind
125
3.2.2.2 Klonierung von H-ras aus Schwein
128
3.2.2.3 Detektion von Punktmutationen mit DNA-Analoga
3.2.2.3.1 Etablierung des Detektionssystem mit 14 und 60 bp DNA-Oligomeren 129
3.2.2.3.2 Einsatz des Detektionssystem für Messungen mit Polymeraseketten134
reaktions-Produkten des H-ras Gens vom Schwein
VII
IV. Diskussion
4.1 Nachweissysteme für globale, unspezifische DNA-Schädigungen
4.1.1 Mutagenitätstests
4.1.2 Entwicklung eines Detektionssystem mit DNA-Reparaturenzymen
4.1.2.1 Expression der Reparaturenzyme
4.1.2.2 Einsatzfähigkeit von DNA-Reparaturproteinen im BIAcore
4.1.3 Entwicklung eines Detektionssystem mit dem Tumorsuppressorgen p53
4.1.3.1 Klonierung von p53 aus Rind und Schwein
4.1.3.2 Expression von p53 vom Rind und Schwein
4.1.3.3 Analyse der synthetisierten p53-Proteine im Dot- und Western Blot
4.1.3.4 Etablierung eines p53-gestützten Detektionssystems zur quantitativen Erfassung
unspezifischer DNA-Schäden
4.2 Nachweissysteme für spezielle DNA-Schädigungen
4.2.1 Einsatz von Anti Addukt spezifischen Antikörper im BIAcore
4.2.2 Entwicklung eines Detektionssystem zur Erkennung von Punktmutationen
im Marker-Gen H-ras
4.2.2.1 Einklonierung von H-ras vom Rind und Schwein
4.2.2.2 Einsatz von DNA-Analoga – Peptid-Nukleinsäuren - im BIAcore
4.3 Ausblick
139
139
141
141
143
145
146
147
149
V. Zusammenfassung
Summary
166
VI. Literaturverzeichnis
VII. Anhang
172
151
154
155
157
157
159
162
169
188
I EINLEITUNG
1
I. Einleitung
„Ist eine Substanz mutagen?“ ist die zentrale Frage in der Gentoxikologie. Bei der Überprüfung kanzerogener und mutagener Eigenschaften chemischer Verbindungen in den Zulassungsverfahren neuer pharmazeutischer Wirkstoffe gemäß Arzneimittelgesetz und bei Anmeldungsverfahren nach Chemikaliengesetz spielen Modelle mit Tierorganismen und epidemiologische Studien eine maßgebliche Rolle in der toxikologischen Praxis. Hier bietet die
Zellkulturtechnik einen Alternativansatz, mit dem eine nicht unerhebliche Zahl an Tierversuchen ersetzt werden kann. Zu den Vorzügen der in vitro Technik zählen neben dem Vorteil
definierter Versuchsbedingungen und erhöhter Reproduzierbarkeit vor allem die Reduktion
von Kosten und zeitlichem, wie personellem Aufwand. Zellkulturen bieten zusätzlich die
Möglichkeit der direkten Exposition der Zellen des Zielorgans in vitro mit Ausgangssubstanzen und Metaboliten der zu untersuchenden Stoffe. Es können aufgetretene Mutationen, induzierte DNA-Reparaturen, die Bildung von DNA-Addukten, das Auftreten von
Mikrokernen oder strukturelle chromosomale Veränderungen (Deletionen, Aberrationen,
Chromatidaustausche) nachgewiesen werden und damit Rückschlüsse auf die Genotoxizität
der Substanz gezogen werden. Anzahl und Muster der Veränderungen korrelieren mit der
Mutagenität der Testsubstanz.
Wesentliche Schritte genotoxischer Ereignisse spielen sich auf molekularer Ebene ab. Veränderungen in den Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen können beispielsweise zu einer
erhöhten Proliferationsrate der betroffenen Zelle führen. Solche DNA-Veränderungen bieten
sich daher als spezifische Analyseparameter bei der Durchführung von in-vitro Kanzerogenitätstests an.
1.1. Tumorentstehung
Störungen in der Kommunikation zwischen Zellen und ihrem Gewebeverband spielen eine
Schlüsselrolle bei der Entstehung von Krebserkrankungen. Die Zelle reagiert nicht mehr auf
Signale ihrer Umgebung und kann zur Tumorzelle werden. Dabei unterscheiden sich Krebserkrankungen von anderen genetischen Erkrankungen insbesondere dadurch, dass die meisten
tumorrelevanten Genveränderungen nicht vererbt werden, sondern auf somatischen Mutationen beruhen. Die Vorstellungen über die genetische Basis von Tumorerkrankungen lassen
sich fast ein ganzes Jahrhundert zurückverfolgen (WILKOWSKI, 1990). Die Krebsentstehung
beruht auf der schrittweisen Anhäufung mehrer unabhängiger Mutationen (VOGELSTEIN &
I EINLEITUNG
2
KINZLER, 1993). Dieses sogenannte Mehrschrittkonzept spielt eine zentrale Rolle für das Verständnis der Krebsentstehung.
Tumorzellen zeichnen sich im Vergleich zu Normalzellen durch eine erhöhte Proliferation aus
(FEARON, 1996). Die Tumorbildung geht dabei von einer einzelnen Zelle aus. Verlust der Differenzierungsfähigkeit, Verlust der Kontaktinhibition und erhöhte Fähigkeit zur Invasion in
benachbarte Gewebe sowie die Mestasenbildung sind weitere Charakteristika. An der Entstehung dieser Zellklone sind drei Klassen von Genen beteiligt, Tumorsuppressorgene, Onkogene und Reparatur-Mutator-Gene (LEVINE, 1995). Die Tumorsuppressorgene und Protoonkogene kann man aufgrund ihrer Wirkungsweisen auf das Proliferationsverhalten von Zellen zu
der Gruppe der „Gatekeeper“ (englisch: Pförtner/Torwächter) Gene zählen. Als „Gatekeeper“
werden Gene bezeichnet, die für die Aufrechterhaltung einer konstanten Zellzahl in Geweben
verantwortlich sind (KINZLER & VOGLESTEIN, 1997). Dabei kodieren Protoonkogene Proteine,
die in der gesunden Zelle an der Wachstumskontrolle beteiligt sind, wie z. B. Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, intrazelluläre Signalüberträger oder Transkriptionsfaktoren. Eine
Mutation in diesen Genen kann zu einer unkontrollierten Aktivierung und damit zur Zelltransformation und Tumorentstehung führen (WEINBERG, 1989). Tumorsuppressorgenprodukte
dagegen hemmen normalerweise das Zellwachstum und spielen eine wichtige Rolle bei der
Differenzierung der Zelle. Durch eine inaktivierende Mutation oder den vollständigen Verlust
eines solchen Gens können diese Funktionen nicht mehr ausgeübt werden. Dies führt damit
zur Tumorgenese (WEINBERG, 1991, FEARON & VOGELSTEIN, 1993; KLEIN, 1993; COLEMAN
& TSONGALIS, 1995; SIDRANSKY, 1996).
Untersuchungen zur Tumorentstehung in den letzten Jahren führten zu der Erkenntnis, dass es
noch eine zweite Gruppe von „Cancer-susceptibility“ (englisch für Krebs-empfängliche) Genen gibt, die das Verständnis über die Tumorentstehung und damit die Funktion von Tumorsuppressorgenen verändert hat (KINZLER & VOGELSTEIN, 1997). Diese neue Klasse von Tumorsuppressorgenen ist für die Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms verantwortlich
und wird daher als „Caretaker“ (englisch Wärter) bezeichnet. Die Inaktivierung eines „Caretaker“-Genes führt zu einer genetischen Instabilität, die in einer erhöhten Mutationsrate aller
Gene inklusive der „Gatekeeper“-Gene resultiert. Ein Defekt in einem „Caretaker“-Gen kann
somit Krebs verursachen. Für die Initiation der Tumorentwicklung sind sie aber nicht notwendig. Menschen mit einer ererbten Mutation in einem „Caretaker“-Gen werden im Laufe
ihres Lebens nur an Krebs erkranken, wenn sie drei weitere somatische Mutationen erwerben.
Zur Tumorentstehung kommt es, wenn eine Mutation in einem weiteren „Caretaker“-Gen und
Mutationen auf beiden Allelen von einem „Gatekeeper“-Gen vorliegen. Die zur Zeit bekann-
3
I EINLEITUNG
ten „Caretaker“-Gene kodieren für DNA-Reparatur-Proteine wie zum Beispiel: XPB, MSH2,
BRCA1 und BRCA2.
Die Tumorsuppressorgene sind eine Gruppe von Genen, die an den wichtigsten Schlüsselstellen der zellulären Signaltransduktionswege für Proliferation, Differenzierung, Apoptose und
genetischer Integrität sitzen. Sie definieren sich somit als Gene, die durch die „loss-offunction“ (englisch Funktionsverlust) Mutationen zur Entwicklung von Tumoren beitragen
(HABER & HARLOW, 1997).
1.2. Genotoxische und epigenetische Kanzerogene
Der Einfluss von verschiedenen Chemikalien auf die Entstehung von speziellen humanen
Krebsarten ist in der Literatur schon oft beschrieben worden. Es wurde der Zusammenhang
zwischen aromatischen Aminen in Farbstoffen und Harnblasenkrebs (IARC 1986 und 1989),
wie der Einfluss von Benzol auf die Entstehung von Leukämien, der Einfluss von Vinylchloriden auf Leberkrebs und von Rauchen auf Lungenkrebs nachgewiesen (MEYER ET AL., 1994).
Auf der Basis dieser epidemiologischen Befunde sind bei der Entstehung von über 70 % der
menschlichen Krebserkrankungen exogene Faktoren beteiligt, zu denen z.B. die Ernährungsgewohnheiten, das Rauchen, die berufliche Exposition sowie der Alkoholkonsum zählen. Dabei sind die chemischen Risikofaktoren sehr wahrscheinlich die wichtigsten (DOLL & PETO,
1981). Neben den Chemikalien ist aber auch für natürlich vorkommende Mykotoxine, wie
Aflatoxin und Ochratoxin A, eine erhöhte Inzidenz vorhanden, an Krebs zu erkranken (CHU,
1991).
Die krebsauslösenden Chemikalien werden aufgrund ihrer chemischen und biologischen Eigenschaften als Kanzerogene definiert. Man kann sie in zwei Kategorien aufteilen, die genotoxischen
(DNA-reaktiven)
und
epigenetischen
(WEISBURGER & WILLIAMS, 1991; MEYER
ET AL.,
(nicht-DNA-reaktiven)
Kanzerogene
1994). Die epigentischen Verbindungen
ändern nicht die primäre Sequenz der DNA, sondern haben Auswirkungen auf die Expression
und Repression von verschiedenen Genen bzw. auf zelluläre Abläufe wie Differentiation und
Proliferation. Zu den epigenitschen Kanzerogenen zählen chlorierte organische Pestizide,
Saccharin, Östrogene, Cyclosporin A und Azathioprin (WEISBURGER & WILLIAMS, 1991;
MEYER ET AL., 1994).
Zu den genotoxischen Agenzien werden die Chemikalien gezählt, die eine chemische Veränderung der DNA verursachen. Dabei kann man wieder unterteilen in direkt-wirksame genotoxische und indirekt-wirksame genotoxische Kanzerogene. Direkt-wirksame genotoxische
Kanzerogene benötigen nach Inkooperation keine metabolische Aktivierung, wogegen indi-
4
I EINLEITUNG
rekt-wirksame genotoxische Kanzerogene erst durch fremdstoffmetabolisierende Enzyme in
chemisch reaktive, ultimative Kanzerogene überführt werden. In dieser Form sind die indirekt-wirksamen genotoxischen Kanzerogene erst in der Lage mit DNA zu interagieren. Zu
den direkt-wirksamen genotoxischen Kanzerogenen zählt das N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin
(MNNG), ein Alkylants, das in dieser Dissertationsarbeit eingesetzt wurde (Abb. 1.1). Der
ebenfalls eingesetzte, aromatische Kohlenwasserstoff 2-Acetylaminofluoren (2-AAF) ist ein
indirekt-wirksam genotoxisches Kanzerogen (Abb. 1.1).
NO
H2C N C NHNO2
N H
NH
N-Methyl-N´-Nitro-N-Nitrosoguanidin
C CH
2-Acetylaminofluoren
O
Abb. 1.1 Strukturformeln von den verwendeten Kanzerognene in dieser Dissertatinsarbeit. N-Methyl-N´Nitrosoguanidin (MNNG) ist ein Alkylants, das ohne metabolische Aktivierung direkt genotoxisch wirksam ist.
2-Acetylaminofluoren (2-AAF) ist ein aromatischer Kohlenwasserstsoff, der eine Aminogruppe als Substituenten
hat. Dieses Kanzerogen muß erst metaboliscch aktiviert werden, bevor es systemisch kanzerogen wirksam wird.
Die Unterteilung in epigenetische und genotoxische Kanzerogene ist nicht absolut. Genotoxische Agenzien oder ihre Metabolite können ebenso epigentische Effekte auslösen und epigentische Kanzerogene können indirekt genotoxisch wirken. Deshalb werden die Chemikalien
nach dem von ihnen am stärksten hervorgerufenen Effekt klassifiziert.
Menschen kommen zum größten Teil am Arbeitsplatz mit Chemikalien in Berührung. Zur
Zeit werden etwa 50 Chemikalien und Chemikaliengemische als eindeutig kanzerogen für
den Menschen eingestuft (IARC, 1987 & 1999). Der Erkennung und Eliminierung solcher Risikosubstanzen kommt neben den therapeutischen Maßnahmen eine entscheidende Bedeutung
zu. Wichtig ist auch die Erkennung/Einstufung von kanzerogenen und mutagenen Eigenschaften chemischer Verbindungen bei Zulassungsverfahren neuer pharmazeutischer Wirkstoffe
gemäß Arzneimittelgesetz sowie bei Anmeldungsverfahren nach Chemikaliengesetz. Die Testung von Altchemikalien, die vor der Einführung des Chemikaliengesetzes 1979 auf dem
Markt waren und deren kanzerogenes oder mutagenes Potential teilweise noch nicht erkannt
ist, ist ebenfalls von besonderer Bedeutung. Neben den beruflichen Expositionen, denen der
Mensch ausgesetzt ist, gehören die individuelle Ernährung und das Rauchen zu den bedeutendsten Faktoren für die außerberufliche Exposition mit erhöhtem Krebsrisiko.
5
I EINLEITUNG
P450
CH3
CH3
N
N
N H
NH2
N
N
N
N
OH
UDGPT
UDPG
T
Leber
CH3
N
N
N
N
H
Gluc
Galle
Dickdarm
CH3
βß-Gluk.
CH3
N
N
N
N H
N
N
N
OH
N
H
Gluc
OAT
CH 3
N
N
N
N
H
DNA-Addukte
O
AC
Abb. 1.2: Aktivierung von heterozyklischen Aminen in der Entstehung von Dickdarmkrebs am Beispiel von 2Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-(4,5-6)pyridin. In der Leber wird das Amin von Cytochrom p450 N-hydroxyliert
und von UDP-Glukuronyltransferasen (UDPGT) N-glukuronidiert. Nach biliärer Ausscheidung gelangt das Glukoronid
in den Dickdarm, in dem es durch bakterielle β-Glukosidasen (ß-Gluk.) gespalten wird. Das Hydroxylamin wird durch
eine Acetyl-CoA-abhängige O-Acetyltransferase (OAT) in der Dickdarmschleimhaut in das hochreaktive NAcetoxyarylamin überführt, das mit nukleophilen Zentren in der DNA reagiert (MARQUADT, SCHÄFER 1997).
Bei der Freisetzung von Pyrolyseprodukten beim Abbrennen von Tabak werden als kanzerogen wirkende Produkte polyzyklische, aromatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Amine
und das Nitrosamin (4-(N-Methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl-1-butanon) angesehen (IARC,
1986; MOMMSEN & AAGAARD 1983). Beim Darmkrebs wird auf Basis von epidemiologischen
Befunden vermutet, dass für die Entstehung von über 70 % der menschlichen Darmkrebser-
I EINLEITUNG
6
krankungen exogene, insbesondere ernährungsbedingte, Risikofaktoren bedeutsam sind, die
somatische Mutationen auslösen. So üben beispielsweise infolge fettreicher und kalziumarmer
Ernährung vermehrt, gebildete Gallensäuren vermutlich eine karzinogene Wirkung aus
(WEISBURGER & WYNDER, 1991). Ende der siebziger Jahre erwiesen sich alle heterozyklischen Amine aus gebratenem Fleisch im Tierversuch als kanzerogen. Die heterozyklischen
Amine entstehen nicht nur beim Braten und Grillen, sondern bei jeglicher mit Erhitzen verbundener Zubereitungsform von Aminosäuren, Proteinen und proteinhaltigen Lebensmitteln.
In gebratenem Fleisch und Fisch ist 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-(4,5-6)pyridin am
häufigsten vertreten. Das Zielorgan in der Kanzerogenese für dieses heterocyclische Amin ist
der Dickdarm. Die Aktivierung von heterozyklischen Aminen in der Entstehung von Dickdarmkrebs ist am Beispiel von 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-(4,5-6)pyridin in Abb. 1.2
dargestellt. Nach Biotransformation von 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-(4,5-6)pyridin
kommt es zur Entstehung von DNA-Addukten.
1.3. Einsatz von Zellkulturen bei Mutagenitäts- und Kanzerogenesestudien
Wichtige Expositionsrouten für Fremdstoffe im Organismus sind die Lunge, der Gastrointestinaltrakt sowie Niere und Harnwege. Der Gastrointestinaltrakt wird als erstes Organsystem
nach oraler Aufnahme exponiert. Die Lunge wird durch den Gasaustausch, die Niere durch
die ausscheidungspflichtigen Substanzen und Stoffwechselendprodukte belastet. 90 % aller
bösartigen Tumoren entstehen in Epithelien. Bei malignen Harnblasentumoren haben ca.
95 % aller Neoplasien ihren Ausgang in der Schleimhaut der Harnblase (EDER & GEDIGK,
1977). Morphologisch sind 90 bis 95 % aller Dickdarmkarzinome von Epithelzellen ausgehende, sogenannte Adenokarzinome. Dabei entstehen Kolorektalkarzinome fast immer durch
Entartung von sekretorischen Zellen des Darmepithels.
Obwohl in einem lebenden Organismus Zellwachstum und Krebsbildung mit den Eigenschaften einzelner Zellen zusammenhängen, sind diese Zellen im jeweiligen Organismus nur
schwer einer gezielten Untersuchung zugänglich. Die jeweils relevanten Zellen lassen sich
nur mit großem Aufwand identifizieren und gezielt untersuchen. Ebenso lassen sich beobachtete Effekte nicht immer eindeutig bestimmten Zellen zuordnen, weil im Gesamtorganismus
zahlreiche Wechselwirkungen mit weiteren Zellarten bestehen. Umfassende Untersuchungen
und eine gründliche Charakterisierung der interessierenden Zellen sind somit kaum möglich.
I EINLEITUNG
7
Diese Schwierigkeiten werden durch die Verwendung von Zellkulturen mit genau definierten
Zellarten umgangen. Mit der Entwicklung der Zellkulturtechnik in den 50er Jahren
(FRESHNEY, 1987) konnten erstmals Studien an isolierten Zellen in vitro betrieben werden. Im
Vergleich zu Untersuchungen am Gesamtorganismus wird anstelle des Gewebeverbundes mit
seinen komplexen Wechselwirkungen auf die zu untersuchenden Zellen ein vereinfachtes
System eingesetzt, bei dem in der Regel nur ein Zelltyp kultiviert wird.
Neben epidemiologischen Studien wurde in den vergangenen Jahrzehnten eine große Anzahl
von Tierversuchen zur Problematik von Harnblasenkarzinomen durchgeführt. Beide Methoden sind allerdings in ihrer Aussagekraft begrenzt. Während beim Tierversuch die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen als problematisch bewertet wird, liegt der Vorteil
epidemiologischer Studien darin, dass ein qualitativer Vergleich bei bekannter Exposition
beim Menschen möglich ist (z. B. Fall-Kontrollstudien von CASE et al. 1954). Gravierende
Nachteile dieser Studien sind, dass Expositionsbedingungen nachträglich schwer zu ermitteln
sind und zusätzliche Parameter (z. B. Rauchen, Umweltfaktoren) klare Aussagen abschwächen.
1.4. Charakterisierung von Zellkulturen mit Schweineharnblasenepithelzellen und Rinderkolonepithelzellen
Die Primärkultur von Schweineharnblasenepithelzellen und Kolonepithelzellen bietet sich aus
den folgenden Gründen an. Schweineharnblasen und Rinderdärme fallen bei der industriellen
Fleischgewinnung als Abfallprodukte an und können von ortsansässigen Schlachthöfen in
nahezu beliebiger Menge bezogen werden. Die große Materialmenge läßt auch aufwendige
Bestimmungen zu. Aufgrund der niedrigen Beschaffungskosten kann damit auch eine hohe
statistische Sicherheit für die Untersuchungsergebnisse erreicht werden. Aus physiologischer
Sicht sind Schwein und Rind dem Menschen sehr ähnlich und sind vom phylogenetischen
Ursprung näher am Menschen als Ratte und Maus.
HICKS beschrieb 1975 für in vitro kultivierte menschliche Epithelzellen die gleichen Phänomene, wie sie hier bei den Urothelzellen der Schweineharnblase auftraten. Beide Zelltypen
zeigten auch nach mehrwöchiger Kultivierung die gleiche Polarität auf, wie sie auch in vivo
zu finden ist. Diese drückt sich durch das Auftreten von fusiformen Vakuolen im apikalen
Zellbereich und durch eine deutliche Erhöhung der Mikrovillianzahl auf der apikalen Zellmembran im Vergleich zur basalen Membran aus. Auch der Wechsel zwischen einfacher und
doppelschichtiger Membran auf der luminalen Seite und in apikalen Vesikeln wie sie von
I EINLEITUNG
8
PETER (1984) und HICKS (1975) in humanen Harnblasenepithel und bei einigen Säugern in
vivo beschrieben wurden, deckt sich mit den vorgestellten Ergebnissen in vitro. In Bezug auf
diese Erscheinung zeigen also isolierte Harnblasenzellen von Mensch und Schwein ein
gleichartiges Verhalten unter Kulturbedingungen.
Abb. 1.3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von einer Dickdarmepithelzelle, die eine Woche in Kultur gehalten
worden war. Der Longitudinalschnitt zeigt eine Zelle mit Basallamina (grüner Pfeil). Die Abb. zeigt Mikrovilli (schwarzer
Pfeil) mit Mikrofilamenten besetzt von Glycocalyx. Bei den dunklen ovalen und runden Strukturen handelt es sich um Mitochondrien (blauer Pfeil). Das Glykogen im Cytoplasma liegt in Form von α-Glycogen in Rosettenform (roter Stern) und
vereinzelt in β-Form vor (zur Verfügung gestellt von Sascha Birkner, Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund).
In der Dissertationsschrift von C. GUHE (1994) wurden anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen die Epithelzellen der Schweineharnblase eine Woche nach Kulturbeginn
charakterisiert. Ein Vergleich der kultivierten Zellen mit entsprechenden Zellen in situ ergab,
dass die Zellen in morphologischer Hinsicht stark den Urothelzellen im in vivo Zustand ähneln. Erst nach längerer Kulturdauer (> 8 Wochen) treten Seneszenzerscheinungen auf. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Harnblasenepithelzellen des Schweins alle für den
Fremdstoffmetabolismus notwendigen Enzyme auch in Kultur aufweisen. Aufgrund dieser
I EINLEITUNG
9
Ausstattung dürfte das Harnblasenepithel in der Lage sein, eine Aktivierung von Fremdstoffen autark, also auch unabhängig von der Leber, durchzuführen (FÖLLMANN & GUHE 1994,
GUHE & FÖLLMANN 1993, GUHE et al. 1994).
Die kultivierten Darmepithelzellen vom Rind wurden ebenfalls eine Woche nach Kulturbeginn anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen charakterisiert. Auch hier ergab sich
nach Vergleich der entsprechenden Zellen in situ, dass die Zellen in morphologischer Sicht
den Kolonepithelzellen im in vivo Zustand ähneln (siehe Abb. 1.3). Weitere Untersuchungen
ergaben, dass alle für den Fremdstoffmetabolismus wichtigen Enzyme auch in Kultur vorhanden sind. Ebenso wie das Harnblasenepithel vom Schwein ist auch das Kolonepithel vom
Rind in der Lage, eine Aktivierung von Fremdstoffen autark, also auch unabhängig von der
Leber, durchzuführen (WEBER ET AL., 1998).
1.5. DNA-Veränderungen nach Mutagenbehandlung
1.5.1. Reparaturenzyme
Die DNA jeder Zelle ist auch unter natürlichen Bedingungen ständig mutagenen Einflüssen
ausgesetzt. Dabei spielen neben inneren Faktoren wie Replikationsfehlern, spontaner Depurinierung und schädlichen Stoffwechselprodukten vor allem Umwelteinflüsse wie kosmische
Strahlung, radioaktive und UV-Strahlung sowie kanzerogene Verbindungen eine entscheidende Rolle. Die Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms benötigt deshalb funktionierende
Reparatursysteme. Eine fehlende oder ineffektive DNA-Reparatur wird die weitere Akkumulation von Mutationen begünstigen und zu einer intrinsischen Instabilität des Genoms führen
(KRAUSS, 1997). Der Verlust der Funktion des DNA-Reparatursystems (MMR für engl.:
mismatch repair) führt zu einem Mutatorphänotyp, der keine korrekte DNA-Replikation bzw.
–Rekombination ermöglicht. Die Reparatur-Mutator-Gene wurden erstmals in E.coli Mutanten entdeckt, die eine erhöhte spontane Mutationsrate aufwiesen. Im Laufe der Evolution haben sowohl pro- als auch eukaryontische Zellen eine Vielzahl von Mechanismen zur Reparatur von Schäden in der genomischen DNA entwickelt. In eukaryontischen Zellen wurde noch
eine weitere Hauptgruppe von Reparatur-Mutator-Genen gefunden, das Nukleotid-ExzisionsReparatursystem (NER für engl.: nucleotide-excision repair), das der Reparatur der von exogenen Mutagenen verursachten Schäden dient.
Die Bedeutung von DNA-Reparatur-Mechanismen wird bei der Betrachtung bestimmter
Krankheitsbilder wie des hereditären kolorektalen Karzinoms ohne Polypose (HNPCC) oder
der Xeroderma pigmentosum (siehe 1.5.1.2.) deutlich (KINZLER & VOGLESTEIN, 1996;
I EINLEITUNG
10
HUANG et al., 1996; VARMUS & WEINBERG, 1994). In beiden Fällen geht der Ausfall spezifischer DNA-Reparaturmechanismen mit einem statistisch stark erhöhten Risiko der Entwicklung bestimmter Tumoren einher (ROSS & BROWN, 1992). Aufgrund dieser Tatsachen ist es
für die Zelle essentiell, dass DNA-Schäden wieder repariert werden. Die beteiligten Reparatursysteme wie z.B. der Enzymapparat der Nukleotid-Exzisionsreparatur, die Alkyltransferasen und das Fehlpaarungs-Reparatursystem arbeiten nahezu fehlerfrei und vermögen den
weitaus größten Teil der DNA-Schäden zu reparieren.
1.5.1.1. Fehlpaarungsmechanismus
Der postreplikative DNA-Fehlpaarungsmechanismus detektiert Basenfehlpaarungen und Fehler im Leserahmen, die nicht von der 3´→ 5`Exonuklease erfaßt werden. Ein Defekt in diesem
Reparatursystem verursacht die Krankheitsform des hereditären kolorektalen Karzinoms ohne
Polypose (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer, HNPCC). Neben HNPCC gehört die
familiäre adenomatöse Polypose (Familäre adenomatöse Polyposis, FAP) zu den häufigsten
Darmkrebserkrankungen. Die FAP ist eine autosomal dominante Erbkrankheit, der eine
Keimbahnmutation im APC-Gen zugrunde liegt (LEPPERT et al., 1987). Im Gegensatz zu FAP
gibt es bei dem hereditären kolorektalen Karzinom ohne Polypose (HNPCC) keine vorausgehende Phase von Polypose. In den Tumoren liegt eine hohe Mikrosatelliteninstabilität aufgrund von Mutationen in den DNA-Reparaturgenen vor. Als Folge der defekten Fehlpaarungsreparatur kommt es zu einer Akkumulation weiterer, über das gesamte Genom verteilter
Mutationen. Aufgrund der fehlenden Reparatur von Fehlpaarungen steigt die Mutationsrate
bei der Zellteilung um das tausendfache (SHIBATA et al., 1994; BHATTACHARYYA et al.,
1994). Dabei werden in HNPCC-Familien häufig Mutationen im hMSH2- und hMLH1-Gen
gefunden, während die übrigen Gene weit seltener betroffen sind.
Die Funktionsweise des humanen Fehlpaarungs-Reparaturmechanismus ist noch nicht endgültig geklärt. Beschrieben aber ist, dass hMSH2 (humanes MutS Homolog) die Fehlpaarung im
neusynthetisierten Tochterstrang erkennt (FISHEL et al., 1994; KOLODNER, 1995). Das hMLH1 (humanes MutL Homolog) bindet dann mit weiteren Proteinen an diesen Protein-DNAKomplex.
Mit Hilfe von degenerativen Oligonukleotiden für das Gen MSH1 in S. cerevisae konnte
hMSH2 aus einem Pool von humaner cDNA kloniert werden. Das gefundene Gen kodiert für
ein 906 Aminosäuren langes und 100 kDa großes Protein, das eine 41 % Identität mit dem
966 Aminosäuren langen Protein von S. cerevisiae MSH2 hatte (FISHEL et al., 1993).
11
I EINLEITUNG
Lokalisiert ist hMSH2 auf dem Chromosom 2p22-21. In der hochkonservierten Region von
Aminosäure 573-764 der humanen Sequenz liegt die Identität zwischen dem humanen MSH2
und S. cerevisiae MSH2 bei 85 %.
Fehlpaarung
MutS
MutL
MutH
GATC
hemimethyliert
methyliert
Ssb
Abb. 1.4 : Schematische Darstellung der DNA-Fehlpaarungs-Reparatur in E.coli. Zuerst bindet MutS an die
Fehlpaarung, im weiteren bindet MutH, eine methylspezifische Endonuklease, an die Hemimethylierungsstelle auf
dem Tochterstrang und MutL stabilisiert den Komplex zwischen MutH-MutS. Die latente Endonuklease-Aktivität
von MutH initiiert einen Bruch in dem neu synthetisierten Strang an der Hemimethylierungsstelle. Der Abbau des
neusynthetisierten Strangs startet von diesem Punkt aus bis zu den fehlgepaarten Basen. Die entstandene Einzelstrang-Region wird vor Degradationen geschützt durch das Einzelstrang-bindende Protein (single-strand binding
protein, SSB). Der Doppelstrang wird im letzten Schritt wiederhergestellt durch die DNA-Polymerase III und die
DNA-Ligase (nach COX, 1997).
1964 wurde von SIEGEL & BRYSON das erste Mal Mutator S (MutS) beschrieben, das zu dem
Fehlpaarungs-Reparatursystem in E.coli gehört, der in der Literatur bereits ausführlich beschrieben wurde (RADMAN & WAGNER, 1986; GRILLEY et al., 1990; MODRICH, 1991 & 1995).
12
I EINLEITUNG
Das Genprodukt von MutS ist ein 97 kDa schweres Protein. Basenfehlpaarungen und Fehler
im Leserahmen werden in E.coli durch den Mut HLS Komplex repariert. Der humane Reparaturmechnismus ist in Substratspezifität und Vorgang der Reparatur zu dem in E.coli homolog
(MODRICH, 1991). Die Familie der Reparaturproteine ist eine hochkonservierte Familie, die
gerade in der Region des C-Terminus eine hohe Homologie aufweist. Hier befindet sich eine
für DNA-Bindungsmotive charakteristische Helix-Turn-Helix Domäne. Der Mechanismus in
E.coli war zu Beginn dieser Arbeit weitestgehend geklärt, wohingegen der humane Mechanismus der Reparatur von Fehlpaarungen noch viele Fragen offen ließ (MODRICH, 1991).
Wegen der hohen Homologie zum humanen System wird im folgenden der Reparaturmechanismus in E.coli beschrieben.
Der Reparaturmechanismus in E.coli ist „Methyl gerichtet“, d.h. DNA von E.coli ist an
GATC Bereichen durch eine DNA-Adenin-Methylase (DAM) methyliert (MARINUS &
MORRIS, 1974). Am homologen Bereich dieser Methylierungsstelle bindet MutH an den neusynthetisierten Tochterstrang, der in E.coli und anderen Bakterien an der Position 6 des Adenins hemimethyliert ist (COX, 1997). Insgesamt sind die Proteine MutS, MutH und MutL an
der Methyl-gerichteten-Reparatur von Fehlpaarungen (methyl-directed-mismatch, MDM)
beteiligt. MutS bindet an alle acht möglichen Fehlbasenpaarungen in unterschiedlicher Affinität (SU & MODRICH., 1986), wie auch an extrahelikale Schleifen (Loops) mit der Größe von
ein, zwei oder drei Nukleotiden (Parker & Marinus, 1992). Die Affinität der Bindung ist abhängig von der Anwesenheit der anderen Reparaturenzyme wie weiterer Kofaktoren (FENG &
WINKLER, 1995). MutS ist für die Erkennung des Fehlers zuständig. Der Erkennung des Fehlers folgt dann die Komplexierung mit MutL (siehe Abb.1.4). Zur Aufgabe von MutL gehört
es, den weiteren Komplex, der sich zwischen MutS und MutH ausbildet, zu stabilisieren.
MutH
ist
eine
Methyl-gerichtete
Endonuclease.
Charakteristisch
für
den
DNA-
Fehlpaarungsmechanismus ist, dass der Tochterstrang in E.coli hemimethyliert ist. Im homologen Bereich der Methylierungsstelle des Elternstranges bindet MutH an den Tochterstrang.
Die MutH-assozierte d(GATC) Endonuklease schneidet den unmodifizierten Strang in dem
hemimethylierten d(GATC) Bereich (AU et al., 1992). Dieser Strangbruch initiiert die
Korrektur der Fehlpaarung des hemimethylierten Strangs. Der Bereich zwischen der
Bindungsstelle von MutS und dem durch MutH verursachten Strangbruch des hemimethylierten Strangs wird durch das Zusammenspiel von MutS, MutL, DNA Helikase II und
verschiedener Exonukleasen herausgeschnitten (LAHUE et al., 1989; COOPER et al., 1993). Der
im folgenden vorliegende Einzelstrang an der Reparaturstelle wird vor Degradation durch das
Einzelstrang-bindende Protein (single-strand binding protein, SSB) geschützt. Der Aufbau des
I EINLEITUNG
13
bindende Protein (single-strand binding protein, SSB) geschützt. Der Aufbau des neuen komplementären Strangs erfolgt mit Hilfe der DNA-Polymerase III und der DNA-Ligase.
1.5.1.2. Nukleotid-Exzision-Reparaturmechanismus
Das Nukleotid-Exzision-Reparatursystem kann weitgefächert verschiedene DNA-Defekte
eliminieren wie z.B. durch UV-Licht induzierte Photoprodukte, verschiedene Cisplatin-Purin
DNA-Addukte (HANSSON et al., 1991; HUANG et al., 1994) und Addukte mit polyzyklischen
Kanzerogenen wie 2-Acetoaminofluoren (2-AAF siehe Abb. 2; HANSSON et al., 1989;
SZYMKOWSKI et al., 1993; MU et al., 1994). Ein Defekt in diesem Repartursystem verursacht
nach bisherigem Stand der Forschung drei Krankheiten: die photosensitive Form von Trichothiodystrophy, Cockayne´s Syndrom und Xeroderma Pigmentosum (BUCHKO, 1997). Für
alle drei Erkrankungen ist die UV-Sensivität der Patienten charakteristisch, wobei die Trichothiodystrophy und das Cockayne´s Syndrom keine erhöhte Rate an Hauttumoren zeigen,
sondern neurodegenerative Defekte zur Folge haben (VOS, 1995). Alle drei Erkrankungen
werden autosomal rezessiv vererbt. Die Patienten mit Xeroderma pigmentosum müssen direkte Sonnenbestrahlung meiden, denn sonst richtet das UV-Licht in den Hautzellen umfangreiche genetische Schäden an, so dass Hautkarzinome und -melanome entstehen. Bei an XPA
erkrankten Menschen ist die erhöhte Mutationsrate nicht auf eine Zerstörung des DNAReparaturapparates während der Tumorentstehung zurückzuführen. Der Defekt liegt vielmehr
schon lange vorher in allen Zellen vor und beschleunigt die Tumorprogression, so dass die
Krebshäufigkeit steigt (VARMUS & WEINBERG, 1994).
1968 wurde das erste Mal von CLEAVER die gestörte DNA-Reparatur in Fibroblasten von Xeroderma Pigmentosum Patienten gezeigt. Durch Fusionsexperimente mit Zellen, die verschiedenen Patienten mit Xeroderma Pigmentosum entnommen und in Zellkultur gehalten worden
sind, gelang der Nachweis, dass ein Defekt in einer von neun Komplementationsgruppen ausreicht, um die Krankheit hervorzurufen. TANAKA et al. beschrieben daraufhin 1989 das MausXPAGen (Xeroderma Pigmentosum Group A). Mit dem Maus-Gen war es möglich, das humane Gegenstück auf dem Chromosom 9q34.1 zu finden. Die cDNA Sequenz der Maus enthielt zwei Zink-Finger-Motive, die für DNA-bindende Proteine charakteristisch sind. Das
Genprodukt ist involviert in die ersten Schritte des humanen Nukleotid-ExzisionsReparaturmechanismus, in dem es an die geschädigte DNA bindet (TANAKA et al., 1990;
ROBINS et al., 1991; WOOD, 1996). Das XPA Gen kodiert für ein 31 kDa Zink-Metalloprotein
mit 273 Aminosäuren. XPA eignet sich besonders als Marker für die Detektion von cis-
14
I EINLEITUNG
Platinum(II)diammine Dichloride (Cisplatin) Defekten (JONES & WOODS, 1993). Bei der
Schädigung durch Cisplatin entstehen am Stickstoffatom N7 der DNA-Base Guanin Addukte,
die durch den Nukleotid-Exzisions-Reparaturmechnismus wieder repariert werden können.
Das homologe Gen in E.coli ist das UvrA (UV-Resistenz Gen A). Auch bei diesem Reparatursystem war der Mechanismus in E.coli zu Beginn dieser Arbeit weitestgehend geklärt
(VAN HOUTEN, 1990; GROSSMAN & THIAGALINGAM, 1993). Da der Nukleotid-ExzisionsReparaturmechanismus in allen Organismen hochkonserviert ist, soll im weiteren nur das System in E.coli beschrieben werden (siehe Abb.1.5).
Der Nukleotid-Exzisions-Reparaturmechanismus in E.coli wird von dem ATP-abhängigen
Enzymkomplex, der ABC Exzisionsnuklease, eingeleitet. Dieser Komplex hat drei Untereinheiten, die Genprodukte der UV Resistenz Gene A, B und C. Dabei ist UvrA eine ATPase
(KACINSKI
ET AL,
1981) und ein DNA-bindendes Protein mit hoher Affinität zu UV-Licht
geschädigter DNA (SEEBERG & STEINUM, 1982). Das Gen UvrA kodiert für ein 906
Aminosäuren langes Protein mit einem Molekulargewicht von 104 kD (HUSAIN ET AL, 1986).
UvrA ist jene Untereinheit des Enzymkomplexes, die den DNA-Schaden erkennt. Die anderen
beiden Untereinheiten UvrB und UvrC können die geschädigte DNA in Abwesenheit von
UvrA nicht erkennen (SEEBERG & STEINUM, 1982).
In Lösung befindet sich UvrA in einem Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer (Abb.
1.5). Das Dimer UvrA2 bildet mit UvrB ein Heterotrimer. Dieser Heterotrimer UvrA2B sucht
den DNA-Strang bis zum DNA-Schaden ab, indem er den Strang ATP-abhängig aufwindet
(KOO et al., 1991; GROSSMAN & THIAGALINGAM, 1993). Der Heterotrimer hat dabei DNAHelikase Aktivität. Die Dimerisierungsregion von UvrA liegt im N-terminalen Bereich des
Proteines. Im C-terminalen Bereich befindet sich eine Polyglycin-Region, die für die Erkennung von DNA-Schäden wichtig ist. Die verschiedenen Domänen von UvrA sind durch Duplikation entstanden. Charakteristisch für UvrA ist die bei Aminosäure 597 befindliche Trypsin
Schnittstelle, die UvrA in 2 Supra-Domänen von 60 und 40 kD aufteilt. Jede der A und B
Supra-Domänen von UvrA enthält eine ATPase-Region mit Walker A und B KonsensusSequenz und einer Zinkfinger DNA-Bindungs-Domäne.
15
I EINLEITUNG
UvrA
GTP
GDP
ATP
ADP
UvrB
ATP
UvrA2
UvrB
ADP
UvrA2
UvrA
GTP
GDP
ATP
ADP
GTP
GDP
ATP
ADP
ATP
UvrA
UvrB
ADP
5´
3´
UvrA
ADP
Abb. 1.5: Schematische Darstellung des Exzisionsreparturmechanismus in E.coli.
Die 6 Proteine UvrA, UvrB, UvrC,
DNA-Helikase II, Polymerase I
und Ligase sind notwendig für die
DNA-Exzisionsreparatur. Nach der
Dimerisierung von UvrA (UvrA2)
bindet UvrB an den Homodimer.
Dieser Hetero-trimer sucht den
DNA-Strang ATP-abhängig ab bis
zum DNA-Schaden (mit einem
blauen Dreieck markiert). Im folgenden dissoziiert der UvrA Homodimer ab und die UvrC Nuklease kann nach einer Konformationsänderung von UvrB binden. Nach
Hydrolyse des DNA-Strangs kann
durch das Zusammen-spiel von
DNA-Helikase II (Hel II) und
DNA-Polymerase I (Pol I) der
DNA-Strang dissoziiert werden
und die Lücke mit Hilfe der DNALigase (Ligase) wieder gefüllt
werden.
ATP
UvrC
UvrB
5´
3´
UvrA2
UvrC
UvrB
Pol 1
Hel II
5´
dNTPs
3´
Hel II
Pol 1
Ligase
5´
3´
16
I EINLEITUNG
Das UvrA-Protein erkennt den DNA-Schaden, nach Erkennung des Schaden nimmt die Affinität des UvrA2 zum DNA-Strang ab. Anschließend kommt es zu einem Konformationswechsel, UvrA2 dissoziert ab und der stabile Komplex zwischen UvrB-DNA legt eine Bindungstasche für UvrC frei (Abb. 1.5). Die allosterische Konformationsänderung von UvrB aktiviert
eine Nuklease, die das Phosphatrückgrad des DNA-Stranges vier Basen vor dem DNASchaden in 3´Richtung aufschneidet (LIN et al., 1992 a). Diese Reaktion aktiviert die UvrCNuklease, die in 5´Richtung vom DNA-Schaden Phosphat 7 Nukleotide hydrolisiert (SANCAR
& RUPP, 1983; LIN & SANCAR, 1992 b). Durch das Zusammenspiel von DNA-Helikase II und
DNA-Polymerase I wird der Komplex aus UvrBC-DNA nach der Inzision dissoziiert und die
resultierende Lücke im DNA-Strang wird von der DNA-Ligase über eine Länge von 12
Nukleotiden geschlossen.
1.5.2. Das Tumorsuppressorgen p53
Bei der Krebsentstehung spielen zwei Genklassen eine wichtige Rolle: die sogenannten ProtoOnkogene (siehe 1.5.4) und die Tumorsuppreossorgene. Zu den Tumorsuppressorgenen zählt
das p53-Gen. Der Verlust oder die vollständige Inaktivierung eines Tumorspuppressorgens
durch Deletion des betreffenden Chromosomenabschnitts oder durch inaktivierende Mutationen kann zu ungehemmter Zellteilung führen (WEINBERG, 1991). Mutationen im p53-Gen
kommen in ca. 60% aller Tumoren vor (HOLLSTEIN et al., 1991; LEVINE et al.; 1991;
HOLLSTEIN et al., 1996). Zur Identifikation von Kanzerogenen sind Testsysteme von Interesse, die auf Geninduktion beruhen (TODD
ET AL.,
1995). Das Tumorsuppressorgen und der
Transkriptionfaktor p53 werden durch DNA-schädigende Agenzien aktiviert (ZHAN
ET AL.,
1993).
p53 ist ein nukleäres, zelluläres Phosphoprotein mit 393 Aminosäuren, das seinen Namen
nach seinem apparenten Molekulargewicht von 53.000 g/mol erhielt. Im Zellkern liegt p53Protein als Tetramer vor, das als Kernprotein die Aufgabe eines Transkriptionsfaktors hat und
damit die Regulation bestimmter Zielgene auf der RNA-Ebene bestimmt. Das p53-Gen ist auf
dem kurzen Arm des Chromosoms 17p13.1 lokalisiert. Es hat eine Länge von über 20 kb, der
kodierende Bereich besteht aus elf Exonen (PRIVES, 1994), von denen die Exone 2-11 in ein
Protein translatiert werden. Das Tumorsuppressorprotein p53 ist von entscheidener Bedeutung
für den Zellzyklus. Unter normalen Umständen wirkt es als Barriere gegen unkontrolliertes
Wachstum und die Weitergabe genomischer Fehlinformationen (LANE, 1992; WHITE, 1996).
Wenn eine DNA-Schädigung vorliegt, wird ein Anstieg in der Konzentration des p53-Proteins
beobachtet, der die Arretierung der Zelle in der G1-Phase zur Folge hat (EL-DEIRY, 1998).
17
I EINLEITUNG
In einer normalen Zelle hat p53-Protein nur eine kurze Halbwertzeit (5 bis maximal 45 min)
und ist einer Detektion z.B. durch Immunhistologie meist nicht zugänglich (SHAULSKY et al.,
1990, EL-DEIRY, 1998). Bei DNA-Schädigung einer Zelle kommt es zur vermehrten Produktion von p53-Protein, was die Arretierung der Zelle in der G1-Phase zur Folge hat. Von
MIDDELER ET AL. (1997) konnte gezeigt werden, daß p53 schnell und energieabhängig in und
aus dem Zellkern (Halbwertszeiten einige wenige Minuten bei 22°C) transportiert wird. Aufgrund dieser Untersuchungen schließen MIDDELER et al. (1997) darauf, das p53 eine NLSequenz (Nuclear localisation sequence - Zellkernlokalisationssequenz) trägt, die den Import
in den Kern steuert. Ebenso hat p53 zwei Exportsequenzen vorzuweisen (NES- Nuclear export sequence, Zellkern-Export-Sequenz) (ZHANG et al., 2001). Bei Akkumulation im Zellkern wirkt p53-Protein als Transkriptionsfaktor, indem es die oben beschriebenen Zielgene
auf der RNA-Ebene reguliert (POREMBA et al., 1996).
DNA-Schaden
p53
bax
p21
bcl-2
GADD
CyclinKinase
ph-RB
S-Phase
Apoptose
pRb
E2F
Myc, Ras,
Thymidylate
DNAReparatur
Arretierung in
der G1/G0
Phase
Abb. 1.6: Genaktivierungskaskade von p53. Stimulation der p53-Expression nach DNA-Schädigung. p53-Protein initiiert bei geringen Schäden über eine Genaktivierungskaskade einen Stopp des Zellzyklus in der G0/G1-Phase mit der Möglichkeit zur DNA-Reparatur. Bei umfangreichen DNA-Schäden wird die Apoptose eingeleitet. Bei mutiertem p53-Protein
bleibt die Reparatur des DNA-Schadens aus. Folge kann die maligne Transformation der Zelle sein (erstellt nach POREMBA
et al., 1996).
I EINLEITUNG
18
Beteiligt ist p53 unter anderem an der Zellzykluskontrolle, der DNA-Reparatur (KASTAN et
al., 1992) und der Apoptose (SATO et al., 1994, YIN et al., 1994). Zu den wichtigsten Eigenschaften von p53 gehört unter anderem die spezifische Bindung an ein p53Erkennungselement auf der DNA. Das p53-Protein ist ein DNA-Bindungs-Protein, das sowohl ein negativer als auch ein positiver Modulator für die Transkription ist. Zu seinen Eigenschaften zählen die Transaktivierung von Zielgenen, Oligomerisierung und Bindung an kurze
DNA-Einzelstränge, an Basenfehlpaarungen und an überstehende Doppelstrang-Enden
(YANG & DUERKSEN-HUGHES, 1998). Bei deutlicher Schädigung der DNA akkumuliert p53
und kann als Transaktivator auf Zielgene wirken, welche die p53-Erkennungssequenz tragen.
Zu diesen Genen gehört das Gen p21/Waf1/Cip1, das für den CDK-Inhibitor p21cip1 (CDK:
cyclin-abhängige Kinase) kodiert (EL-DEIRY et al., 1993) und das GADD45-Gen („Growtharrrest-DNA-damage-inducible-gene“- durch DNA-Schäden angeregtes Gen) (KASTAN et al.,
1992, SMITH et al., 1994). Beide Genprodukte interagieren mit dem Prozessivitätsfaktor
PCNA („proliferating cell nuclear antigen“- kernlokalisiertes Antigen aus teilenden Zellen),
welcher sowohl bei der Replikation als auch bei der Reparatur der DNA eine wichtige Rolle
spielt (SHIVAKUMAR et al., 1995). Die einzelnen Zielgene sind in Abbildung 1.6 dargestellt.
1.5.3. DNA-Addukte
Die meisten bekannten chemischen Mutagene und Kanzerogene sind an sich chemisch nicht
reaktiv, bilden aber im Verlauf ihrer Metabolisierung chemisch reaktive, meist elektrophile
Zwischenprodukte wie Epoxide oder positiv geladene Zwischenprodukte (LUTZ, 1984). Diese
werden als ultimales Kanzerogen bezeichnet. Die chemische Reaktion dieser ultimalen Kanzerogene mit der DNA führt unter der Ausbildung von kovalenten Bindungen zu DNAAddukten (siehe Abb. 1.7). Dabei können mehr als ein Dutzend verschiedener Atome der
DNA-Bausteine als Reaktionspartner in Frage kommen. Die Verteilung dieser Reaktanden auf
der DNA ist vor allem abhängig von Größe und Reaktivität des ultimalen Kanzerogens
(HEMMINKI, 1983). Für kleine Alkylantien und kleine Epoxide steht der Stickstoff-7 von
Guanin im Vordergrund, gefolgt von N-3 von Adenin und dem Sauerstoff O6 (O am C-6) von
Guanin (siehe Abb. 1.7). Die Nukleobasenadduktmuster sind heute für eine Vielzahl von
Kanzerogenen charakterisiert.
19
I EINLEITUNG
OR
N
N
H2N
OR
N
N
O 6 -Alkyguanin
N
O
O 4 - Alkylthymin
O
R
O
O
CH 3
N
N
H2N
N
N
O 2 -Alkylthymin
R
N
HN
CH 3
N
RO
N3-A lkylthymin
O
CH 3
N
+
N
N7-Alkylguanin
Abb. 1.7: DNA-Addukte. Prinzipien der DNA-Adukkt Ausbildung
durch Alkylantien (nach VOS, 1995).
DNA-Addukte können in der Zelle erkannt und repariert werden, wobei Geschwindigkeit und
Effizienz der Reparatur sowohl vom spezifischen Addukt als auch vom Zelltyp abhängig sind.
Wenn DNA-Addukte nicht repariert werden, kann es nur dann zu Mutationen kommen, wenn
die Zelle mit ihrer geschädigten DNA eine Zellteilungsrunde durchläuft. Bei der Replikation
der geschädigten DNA wird es, falls vorher keine fehlerfreie Reparatur erfolgt ist, mit erhöhter Wahrscheinlichkeit zu Änderungen in der DNA-Sequenz kommen, die dann als Mutationen an die nachfolgenden Zellgenerationen weitergegeben werden.
Der Mensch wird täglich mit DNA-bindenden Kanzerogenen belastet. Im Tierversuch konnte
bis in niedrigste Dosisbereiche eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für einige Kanzerogene z.B.
N-Nitrosodimethylamin, Benzo[a]pyren, Aflatoxin B1 und 2-Acetylaminofluoren, nachgewiesen werden, so dass davon auszugehen ist, dass für diese Kanzerogene keine Wirkungsschwelle im niedrigen Konzentrationsbereich existiert (LUTZ, 1986).
I EINLEITUNG
20
Alkylierende N-Nitroso-Verbindungen induzieren mindestens 12 verschiedene DNA-Alkylierungsprodukte, die zudem Substrate für unterschiedliche Reparaturproteine darstellen
(RAJEWSKY, 1980; SINGER & GRUNBERGER, 1983). Mutagene und kanzerogene Verbindungen
dieser Klasse können exogener und endogener Herkunft sein. Unter den exogenen Umweltmutagenen sind mehr als 300 verschiedene alkylierend wirkende N-Nitrosoverbindungen bekannt, die sich im Tierversuch als karzinogen erwiesen haben (PREUSSMANN & STEWART,
1984). N-Nitrosoverbindungen befinden sich in Nahrungs- und Genußmitteln, in Kosmetika
und Pestiziden, in Autoabgasen und Arbeitsplatzemissionen. Endogene N-Nitrosamine entstehen aus der Reaktion von Nitrit mit sekundären und tertiären Aminen bevorzugt im Magen
(Kyrtopoulos, 1989) sowie durch Endotoxin-aktivierte Makrophagen und in Endothelzellen
(Leaf et al., 1989).
1.5.4. Mutationen in Proto-Onkogenen
Die Entdeckung der zellulären ras-Protoonkogene als Homologe der transformierenden Gene
der Harvey- (H-ras) und Kirsten-Mäuse-Sarkomviren (K-ras) und des N-ras-Gens brachte der
Krebsforschung eine Fülle neuer wichtiger Erkenntnisse (BARBACID, 1987). Sequenzvergleiche zwischen ras-Genen aus Tumoren und Normalgewebe zeigten, dass sich Proto-Onkogen
und Onkogen nur in einer einzigen Base unterscheiden (BISHOP, 1983).
Die Transformation epithelialer Zellen ist fast immer begleitet von chromosomalen Strangbrüchen und Sequenzmutationen im Onkogen H-ras (FUJITA et al., 1985). Bei ca. 30% aller
menschlichen Tumore ist eine onkogene Form der ras Gene (H-, K- und N-ras) gefunden
worden, die durch eine Punktmutation in einem der vier Kodons 12, 13, 59 und 61 aktiviert
worden waren (BISHOP, 1983; BOS, 1989). Vor allem in Adenokarzinomen des Pankreas
(90%), im Kolon (50%) und der Lunge (30%) sind Mutationen in ras-Genen zu finden. In
Kolorektalkarzinomen ist im allgemeinen das K-ras-Gen betroffen. In large-screening Studien
konnten Veränderungen in den Kodons 12, 13, und 61 des H-ras Gens in einem Drittel der
untersuchten Blasentumoren nachgewiesen werden (LEVESQUE et al, 1993).
Bei Mutagenbehandlung von Zellen können die Mutationen in den ras-Genen durch promutagene DNA-Addukte entstehen, die durch Zellteilung auf die Tochterzellen weitergegeben
werden können. Diese Veränderungen bieten sich daher als spezifische Analyseparameter bei
der Durchführung von in-vitro Mutagenitätstest an. Die Kanzerogenspezifität der rasMutationstypen belegt den kausalen Zusammenhang zwischen Kanzerogenexposition, Mutation und Tumorentstehung (BITSCH et al., 1993).
I EINLEITUNG
21
DNA ist ein ideales Substrat für molekulare Analysen, weil es ein leicht zu handhabendes
stabiles Molekül ist und durch die PCR-Technik schnell und effektiv amplifiziert werden
kann. Deshalb werden bei auf DNA basierenden Detektionsverfahren nur geringste Mengen
an Ausgangsmaterial benötigt. Die meisten der verwendeten Analyseverfahren gründen auf
der einzigartigen Struktur von DNA, die aus zwei komplementären, antiparallelen Polynukleotidketten besteht, die durch Watson–Crick-Basenpaarung (AT- und GC-Basenpaarung) und
Wechselwirkungen (Basenstapellung) zusammengehalten werden. Einzelstrang-DNA (ssDNA) Fragmente, die über Hitzedanturierung von Doppelstrang-DNA (ds-DNA) generiert
oder chemisch synthetisiert werden können, binden spezifisch an andere komplementäre ssDNA. Dieser Vorgang wird Hybridisierung genannt.
Mit Peptidnukleinsäuren (engl.:Peptide Nucleic Acid - PNA) stehen DNA-Analoga zur Verfügung , bei denen die Ribosereste und die Phospodiesterbindungen durch Amidbindungen
zwischen den neutralen, nichtchiralen N-(2-Aminoethyl)-Glycin-Einheiten ersetzt sind, die
der Amidbindung zwischen den Aminosäuren eines Polypeptids entsprechen (NIELSEN,
1991). Die Nukleobasen sind über einen Methylen-Carbonyl-Linker mit dem PseudoPeptidrückrad verknüpft (Abb.1.8).
Trotz der gravierenden strukturellen Unterschiede in den Strukturen zwischen PNA und
DNA hybridisieren PNA-Oligomere mit komplementären, antiparallelen DNA-Oligomeren
[antiparallel: Aminoterminus der PNA mit dem 3‘-Ende der DNA] (EGHOLM et al., 1992). Die
PNA-Oligomere haben gegenüber den DNA-Oligonukleotiden eine Reihe von Vorteilen.
PNA-Oligomere sind wegen der artifiziellen Struktur des Rückgrats und der Basenverknüpfung gegenüber Nukleasen und Proteasen stabil, was eine hohe Stabilität der Oligomeren bewirkt. Geringere Oligomerenlängen führen zu höheren Diffusionsraten und damit zu schnellerer Hybridisierungskinetik .
Im Gegensatz zu DNA und RNA, die ein negativ geladenes Ribosephosphatrückrad besitzen,
ist das PNA Pseudopeptidrückrad neutral. Diese negative Ladungen führen bei der Hybridisierung von DNA mit DNA oder RNA zu elektrostatischen Abstoßungen, falls sie nicht durch
Kationen im umgebenden Medium komplexiert werden. Bei der Hybridisierung von PNA mit
DNA oder RNA ist keine solche Abstoßung zu beobachten, was einerseits in einer erhöhten
thermischen Stabilität resultiert und andererseits die Hybridisierungsreaktion über einen großen Konzentrationsbereich unabhängig von der Konzentration von mono und divalenten Kationen im Reaktionspuffer macht (PERRY-O`KEEFE et al., 1996).
Die stärke Bindung zwischen PNA- und DNA-Oligomeren komplementärer Sequenzen resultiert allerdings nicht in einem Verlust an Sequenzspezifität bei der Hybridisierung. Eine einzi-
22
I EINLEITUNG
ge Fehlpaarung (engl.: Mismatch) im Vergleich zu einer korrekten Paarung (engl.: Match)
destabilisiert das PNA/DNA Hybrid stärker als ein entsprechendes DNA/DNA Hybrid. Deshalb ist der Schmelzpunkt (Tm)-Unterschied zwischen Match und Mismatch mit PNAOligomeren ausgeprägter als mit DNA-Oligomeren. Mit der Schmelztemperatur Tm wird die
Temperatur im Wendepunkt der Schmelzkurve bezeichnet. Der Schmelzpunkt-Unterschied
führt zu höherer Basenfehlpaarungs-Diskriminierung (mismatch discrimination) und Sequenzspezifität. Eine Einzelbasenfehlpaarung in einem 15 Basen PNA/DNA Hybrid senkt den
Schmelzpunkt um 8-20 °C (15 °C im Durchschnitt), bei einem 15 Basenpaar DNA/DNA
Hybrid wird der Schmelzpunkt nur um 4-16 °C abgesenkt (11 °C im Durchschnitt). Die Stabilität von Einzelbasenfehlpaarungen innerhalb von PNA/DNA Hybriden hängt sowohl von der
Position der Fehlpaarung als auch von der chemischen Natur der Fehlpaarung ab.
Mit der Oberflächen Plasmon Resonanz Technik konnten die Hybridisierungreaktionen zwischen zwei komplementären ss-DNA Strängen gezeigt werden (POLLARD-KNIGHT et al.,
1990). Bei der Bestimmung der Dissoziations- und Assoziationskonstanten der Hybridisierungsreaktion
konnten
erhebliche
Unterschiede
in
dem
Assoziations-
und
Dissoziationsverhalten zwischen absolut komplementären ss-DNA Strängen und solchen, die
eine Einzelbasenfehlpaarung aufwiesen, festgestellt werden (GOTOH et al., 1994).
NH2
G
N
O
O
G
HOCH2 O
H
H
H
H
OH
O
-
NH
C
O
P
C
CH2 O
H
H
H
H
OH
O
O
N
O
O
O
-
NH
G
O
P
O
T
CH2 O
H
H
H
H
OH
O
N
O
O
NH2
O
-
O
P
O-
O
PNA
DNA
R e p e a t U n it:
Abb. 1.8: Vergleich der chemischen Struktur zwischen Desoxyribonukleinsäure (DNA)- und Pepide
Nucleic Acid (PNA)-Molekülen. Die sich wiederholenden strukturellen Einheiten sind rot gefärbt dargestellt.
I EINLEITUNG
23
1.6. Problemstellung und Zielsetzung
Die vorliegende Dissertationsarbeit war Teil des Verbundprojekts „Molekulare Marker für
Kanzerogenitätstests mit primären Epithelzelle“, bei dem molekulare Analysemethoden zum
Nachweis von mutagenen Schädigungen in kultivierten Epithelzellen entwickelt werden sollten. Ansatz war hierbei primäre Zellkulturen aus Harnblasen- und Dickdarmepithelzellen von
Rind und Schwein mit potentiell mutagenen Agentien zu inkubieren und in der nachfolgenden
molekularen Analyse DNA-Modifikationen nachzuweisen sowie die Konzentration und Einwirkdauer einer bestimmten Substanz mit deren mutagener Wirkung zu korrelieren.
Im Vordergrund des Interesses standen dabei Indikatoren, mit denen globale – über das gesamte Genom verstreut erfolgende – Schädigungsereignisse auch vor dem Hintergrund eines
hohen Überschusses an unveränderter DNA detektiert werden konnten. Die hierfür notwendige reproduzierbare Gewinnung genomischer DNA aus kultivierten Harnblasenepithelzellen
konnte in Vorarbeiten etabliert werden (PLAß, 1996).
Mit der Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR-Technik, Biacore) stand eine Analysentechnik zur Verfügung, mit der die Interaktion von zwei Makromolekülen direkt verfolgt werden
kann (Szabo et al., 1995). Durch die Kopplung von DNA-Reparaturproteinen vom Exzisionsund Fehlpaarungs-Reparaturmechanismus an die Oberfläche des SPR-Sensors mußte es möglich sein, geschädigte DNA-Fragmente selektiv zu binden und zu quantifizieren. Damit wäre
der Zugriff nicht nur auf Mutationsereignisse in ausgewählten Markergenen, wie bei der klassischen molekulargenetischen Analyse, sondern auch auf statistische über das Genom verteilte
Schädigungen möglich/eröffnet.
Ein weiterer globaler Marker für genotoxische Ereignisse ist die Akkumulation des Tumorsuppressorproteins p53 und dessen anschließende Translokalisation in den Zellkern (UNGER
et al., 1994). Auch mit diesem Ansatz wurde durch den indirekten Beweis der Akkumulation
von p53-Protein aufgrund von DNA-Schädigungen eine Detektion von globalen Schädigungen in den behandelten DNA-Proben analysiert. Das Merkmal Überexpression bzw. Aktivierung von vorhandenem p53-Protein läßt sich nutzen für die Identifikation von mutagenen und
kanzerogenen Stoffen in einem in-vitro Testsystem.
Eine Option zur direkten Detektion von DNA-Schädigungen bieten DNA-Addukt spezifische
Antikörper. Mit diesem Ansatz werden allerdings nicht mehr globale Schädigungen in den
behandelten Epithelzellen verfolgt. Der Fokus liegt vielmehr auf einer spezifischen Schädigung der DNA durch alkylierende Agenzien. Bei diesem Ansatz können nicht alkylierende
genotoxische Veränderungen keinesfalls detektiert werden.
I EINLEITUNG
24
Für den Nachweis von Punktmutationen boten sich Peptidnukleinsäuren (PNA- Peptide Nucleic Acids) an. Durch die Kombination von PNAs mit der SPR-Technik kann ein Biosensor
entworfen werden, der sensitiv genug ist, Einzelbasenfehlpaarungen innerhalb einer bestimmten DNA-Sequenz bei einer Hybridisierung zu detektieren und der bei unterschiedlichen
Hybridisierungsbedingungen einsetzbar ist. Dadurch hat diese Technik ein großes Potential in
der klinischen Diagnostik.
Ziel dieser Arbeit war es, die oben aufgeführten Systeme für den Nachweis globaler bzw.
spezifischer DNA-Schädigungen in den für toxikologische Studien verwendeten Testsystemen zu etablieren und hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit zu validieren. Der Fokus lag dabei
auf der Verwendung biosensorischer Detektionsverfahren, die eine weitergehende Automatisierung und Miniaturisierung der Analyse eröffnen sollten.
25
II MATERIAL
II. Material und Methoden
A. Material
2.1. Probenmaterial
Die Harnblasen bzw. die Gedärme von frisch geschlachteten Hausschweinen (sus scrofa
domestica) und von frisch geschlachteten Rindern (bovine taurus) wurden vom Schlachthof
Lünen bezogen. Die Kultivierung der primären Epithelzellen der verschiedenen Organe und
Spezies wurden am Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund durchgeführt.
2.2. Bakterienstämme
Stamm:
E. coli DH5α
E. coli BL21 (DE3)
E.coli CK600K
E. coli TG1
Genotyp:
F-, endA1, hsdR17 (rk-, mk+),
supE44,
thi-1,
recA1,
gyrA96,
relA1,
∆(lacZYargF)U169,
ϕ80dlacZ∆M15,khsdS, gal (λcIts857, ind1,
Sam7, nin5 , lacUV5T7gene1)
SupE, hsdM+, hsdR-, kanR
∆ lac-pro, thi-1, supE,
hsdD5, [F´traD36, proAB+,
lacIQ, lacZ∆M15]
Referenz
Hanahan, 1983
Studier & Moffat, 1986
Hoffmann-Berling, Heidelberg
Stratagene Europe, Amsterdam
Der Stamm E. coli TG1 wurde zur Plasmidherstellung verwendet, die anderen ausschließlich
zur Proteinexpression.
2.3. Nährmedien
Luria Bertani (LB)-Agarplatten
1% (w/v) Bacto-Trypton
0,5%(w/v) Hefeextrakt
1%(w/v) NaCl
1,6%(w/v) Bacto-Agar
LB-Amp-Agarplatten
LB-Agarplatten + 50 mg/l Ampicillin
LB-Medium
1%(w/v) Bacto-Trypton
0,5%(w/v) Hefeextrakt
1%(w/v) NaCl
0,25%(v/v) 2M NaOH
LB-Amp-Medium
LB-Medium + 100 mg/l Ampicillin
26
II MATERIAL
2.4. Vektoren
2.4.1 pCRII
Der Vektor pCRII gehört zu dem TA CloningKit von der Firma Invitrogen (Leek,
Holland). Der Vektor hat eine Größe von 3900 Basenpaaren und enthält einen T7 Promotor
mit einem darauffolgenden lacZα-Promotor. pCRII wird zur Plasmidherstellung und für die
genaue Sequenzierung benutzt. Für die genaue Sequenzierung kann das amplifizierte cDNAFragment nach der sogenannten TA-Klonierungsmethode (MARCHUK et al., 1990) in den
Plasmidvektor pCR2.1 (Invitrogen, Leek, Holland) kloniert werden. Das cDNA-Insert mit
einem singulären 3’-A-Überhang wird in die Klonierungsstelle des linearisierten Vektors
ligiert, welcher ein 3’-überhängendes Ende aus einem einzelnen T besitzt. Die einklonierte cDNA ist flankiert von zwei EcoRI-Schnittstellen, die zur Restriktionsanalyse zur Verfügung
stehen. Zur Selektion mit Ampicillin und Kanamycin besitzt der Vektor ein Ampicillin und
Kanamycinresistenzgen.
2.4.2 pGEX 2T
Der Vektor wurde von der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen. Der
Vektor besteht aus 4900 Basenpaaren und beinhaltet einen durch das Allolactose-Analogon
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren tac-Promotor. Der in dieser Arbeit
zur
Proteinexpression
verwendete
Bakterienstamm
E.coli
BL21DE3
enthält
ein
chromosomales T7-RNA-Polymerase-Gen. Das Gen steht unter Kontrolle des lacUV5Promotors und kann durch IPTG induziert werden. Um die basale Aktivität des T7-Promotors
in Abwesenheit von IPTG möglichst gering zu halten, beinhaltet der Vektor ebenfalls das Gen
lacIq, das den lac-Repressor kodiert. Dieser Repressor bindet in Abwesenheit von IPTG an
den lacUV5-Promotor und verhindert so die Transkription der T7-Polymerase durch die
bakterielle RNA-Polymerase.
Stromaufwärts zur multiplen Klonierungsstelle beinhaltet der Vektor ein ATG-Startkodon
sowie die DNA-Sequenz für das Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) aus Schistosoma
japonicum. Das durch das einklonierte Fremdgen kodierte Protein wird daher als GSTFusionsprotein synthetisiert. Da Glutathion-S-Transferase an Glutathion (Tripepetid γ-GluCys-Gly) bindet, läßt sich dieses Fusionsprotein affinitätschromatographisch über GlutathionSepharose reinigen. Zur Beendigung der Translokalisation sind stromabwärts der multilplen
Klonierungsstelle Stopkondons kodiert. Zur Selektion mit Ampicillin enthält der Vektor ein
Ampicillinresistenzgen (AMPr). Zwischen dem GST-Gen und dem Fremdgen liegt eine
II MATERIAL
27
Thrombin-Schnittstelle, so dass das Fusionsprotein durch Thrombin-Spaltung vom GSTAnteil befreit werden kann. Das hier beschriebene Verfahren und die Vektoren sind bei
Smith & Johnson (SMITH & JOHNSON, 1988) dargestellt.
2.4.3 pQE-32
Der Vektor pQE-32 wurde von der Firma Qiagen (Hilden) bezogen. Der Vektor besteht aus
3463 Basenpaaren. Stromaufwärts zur multiplen Klonierungsstelle beinhaltet der Vektor ein
ATG-Startkodon sowie eine DNA-Sequenz, die sechs aufeinanderfolgende Histidin-Reste
kodiert. Alle mit Hilfe dieses Vektors expremierten Proteine tragen daher an ihrem NTerminus einen Histindin-Tag, der die Reinigung der rekominanten Proteine durch
Affinitätschromatographie über Ni2+-NTA (nitrilo-tri-acetic-acid)-Agarose ermöglicht. Der
Vektor trägt einen unter der Kontrolle einer doppelten lac-Operatorsequenz stehenden und
durch IPTG induzierbaren Phagen-T5-Promotor, der durch die E.coli-RNA-Polymerase
erkannt wird. Stromabwärts der multiplen Klonierungsstelle sind in allen drei möglichen
Leserahmen Translationsstopkodons kodiert. Zur Selektion enthält der Vektor ein
Ampicillinresistenzgen (AMPr).
2.4.4. pMALc2H
Der Vektor pMAlc2H wurde von der Firma New England Biolabs GmbH (Schwalbach)
bezogen und modifiziert von Herrn Dr. Christoph Block (AG Proteinkinasen). Der Vektor
besteht aus 6600 Basenpaaren. Der Vektor trägt ebenfalls einen durch IPTG induzierbaren
tac-Promotor und ein Ampicillinresistenzgen (AMPr). Direkt vor dem Fremdgen liegt in
diesem Vektor das Gen malE, das ein Maltose bindendes Protein (MBP) kodiert.
Stromabwärts zur multiplen Klonierungsstelle beinhaltet der Vektor eine DNA-Sequenz, die
sechs aufeinanderfolgende Histidin-Reste kodiert. Alle mit Hilfe dieses Vektors expremierten
Proteine tragen daher an ihrem N-Terminus ein Maltose bindendes Protein und an ihrem CTerminus einen Histidin-Tag. Die Reinigung des rekombinanten Proteins kann daher auf zwei
Wegen erfolgen. Der MBP-Anteil des Fusionsproteins ermöglicht eine Reinigung durch
Affinitätschromatographie über eine Amylosesäule oder durch den Histidin-Tag, der die
rekombinanten Proteine durch Affinitätschromatographie über Ni2+-NTA (nitrilo-tri-aceticacid)-Agarose ermöglicht. Zwischen dem malE-Gen und dem Fremdgen liegt eine ThrombinSchnittstelle, so dass das Fusionsprotein durch Thrombin-Spaltung vom MBP-Anteil befreit
werden kann.
28
II MATERIAL
2.4.5 pCAl-N
Der Vektor pCAL-N wurde von der Firma Stratagene (Heidelberg) bezogen. Der Vektor
besteht aus 5782 Basenpaaren und enthält einen T7-Promotor mit einem darauffolgenden lacOperator. Das in dem Bakterienstamm E.coli BL21DE3 enthaltende chromosomale T7-RNAPolymerase-Gen steht unter Kontrolle des lacUV5-Promotors und kann durch IPTG induziert
werden. Um die basale Aktivität des T7-Promotors in Abwesenheit von IPTG möglichst
gering zu halten, beinhaltet der Vektor ebenfalls das Gen lacIq, das den lac-Repressor kodiert.
Dieser Repressor bindet in Abwesenheit von IPTG an den lacUV5-Promotor und verhindert
so die Transkription der T7-Polymerase durch die bakterielle RNA-Polymerase. Zur Selektion
enthält der Vektor ein Ampicillinresistenzgen (AMPr).
Die induzierte T7-RNA-Polymerase transkribiert ausgehend von dem Vektor-eigenen T7Promotor die in der multiplen Klonierungsstelle insertierten Gensequenzen. Auf diese Weise
können in den Vektor einklonierte Gensequenzen effizient in E.coli-Bakterien expremiert
werden. Der Sequenz des eingefügten Genabschnittes sind dabei ein ATG-Startkodon sowie
eine DNA-Sequenz, die für das Calmodulin-Bindungs-Peptid (CBP) der Myosin-leichteKettenkinase kodiert, vorgeschaltet. Alle aus diesem Vektor expremierten Proteine beinhalten
dementsprechend einen N-terminalen CBP-Tag, der eine affinitätschromatographische
Reinigung des rekombinanten Proteins über Calmodulin-Sepharose ermöglicht. Zwischen
dem CBP-Gen und dem Fremdgen liegt eine Thrombin-Schnittstelle, so dass das
Fusionsprotein durch Thrombin-Spaltung vom CBP-Anteil befreit werden kann.
2.5. Lösungen
Lösung
Zusammensetzung
Agaroselösung:
0,7 bis 2 % (w/v) Agarose
0,03 % (w/v) Ethidiumbromid
in TAE-Puffer
DNA-Probenpuffer (6x):
50 % (v/v)Glycerol
0,05 % (w/v)Xylencyanol
in TAE-Puffer
Ethidiumbromid-Lösung
0,001 % (w/v) Ethidiumbromid
29
II MATERIAL
Lösung
Zusammensetzung
10 x PBS-Puffer
1,4 M NaCl
30 mM KCl
100 mM Na2HPO4
10 mM KH2PO4
50 x TAE-Puffer:
2 M Tris
0,05 M EDTA
pH 8 mit Essigsäure einstellen
5 x TBE-Puffer:
10 mM EDTA
450 mM Tris
450 mM Borsäure
pH 8,0 (eingestellt mit NaOH)
BIAcore-Meßpuffer:
10 mM HEPES
150 mM NaCl
5 mM MgCl2
0,0005 % (v/v) Igepal CA-630
pH 7,4 (eingestellt mit NaOH)
SDS-Trenngelpuffer
1,5 M TrisHCl
pH: 8,8
SDS-Sammelgelpuffer
1,0 M TrisHCl
pH: 6,8
5x SDS-Probenpuffer
0,05 M TrisHCl
50 % (v/v) Glycerol
10 % (w/v) SDS
Spatelspitze Bromphenolblau
Spatelspitze DTE
10x SDS-Laufpuffer
125 mM Tris
0,5 % (w/v) SDS
1,25 M Glycin
Färbelösung
400 ml Ethanol
100 ml Essigsäure
500 ml Wasser
je 0,6 g Coomassie Brilliantblau R250 &
Coomassie Brilliantblau G250
Entfärbelösung
200 ml Ethanol
100 ml Essigsäure
700 ml Wasser
Die hier nicht aufgeführten Lösungen sind in dem jeweiligen Methodenteil beschrieben.
30
II MATERIAL
2.6. Chemikalien
Substanz
Lieferant
2-Acetylaminofluoren:
30 % Acrylamid-/0,8 % Bisacrylamidlösung:
40 % Acrylamid-Stocklösung:
Agarose:
Ammoniumpersulfat:
Bradfordreagenz:
Bromphenolblau:
Coomassie Brillant Blue R 250/G250:
Desoxyribonukleinsäure Natriumsalz vom Kalbsthymus:
Dimethylsulfoxid:
Dithioerythreitol
(Erythro-1,4-Dimercapto-2,3-Butandiol):
Essigsäure:
Ethidiumbromid:
reduziertes Glutathion (GSH):
4-(2-Hydroxyethyl)-1piperazinethansulfonsäure:
Igepal CA-630:
IPTG:
N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin:
PMSF:
Protein Standard Rinderserumalbumin:
SDS:
TEMED:
Tris:
Trypanblau-Färbelösung:
Xylencyanol:
Sigma (Deisenhofen)
National Diagnostics (Atlanta,
USA)
Serva (Heidelberg)
GIBCO (Eggenstein)
Riedel-de Haen AG (Seelze)
BioRad (München)
Serva (Heidelberg)
Serva (Heidelberg)
Sigma (Deisenhofen)
Merck (Darmstadt)
GERBU Biotechnik, Gailberg
J. T. Baker B. V. (Deventer, Holland)
Serva (Heidelberg)
Sigma (Deisenhofen)
GERBU Biotechnik, Gailberg
Sigma (Deisenhofen)
GERBU Biotechnik, Gailberg
Sigma (Deisenhofen)
Sigma (Deisenhofen)
Sigma (Deisenhofen)
GERBU Biotechnik, Gailberg
Serva (Heidelberg)
Amersham (Braunschweig)
Serva (Heidelberg)
Sigma (Deisenhofen)
Weitere Chemikalien (in p.A. Qualität) stammten von Merck (Darmstadt), Serva
(Heidelberg), Baker (Deventer, Holland) und Sigma Chemie (Deisenhofen).
2.7. Verbrauchsmaterial
Film AGFAPAN APX 100 Professional 135 36
Autoradiographie-Filme Kodak X-OMAT
Ultra Tube, 0.25 ml PCR-Reaktionsgefäß
Nylonmembran Hybond N+
Whatman 3 MM Papier
PVDF-Membran Trans-Blot Transfer Medium
Sensor Chip CM 5 Research Grade
Sterilfilter FP 030/ 0,2 mM
Ultrafiltrationsröhrchen Centricon 30
AGFA (Leverkusen)
Sigma (Deisenhofen)
BioRad (München)
Amersham (Braunschweig)
Schleicher & Schüll (Dassel)
Bio Rad (München)
BIAcore AB (Uppsala, Schweden)
Schleicher & Schüll (Dassel)
Amicon (Beverly, USA)
31
II MATERIAL
2.8. Enzyme und Proteine
Pfu-DNA-Polymerase (2,5 U/µl)
Stratagene (Heidelberg)
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
Qiagen (Hilden)
Klen-Taq-DNA-Polymerase (100 U/µl)
Clontech (Heidelberg)
T4-DNA-Ligase (400 U/µl)
New England Biolabs (Schwalbach)
DNase I, RNase-frei (50 U/µl):
Pharmacia (Heidelberg)
Restriktionsendonukleasen (5-20 U/µl)
New England Biolabs (Schwalbach)
Super Script II RNase H- Reverse Transkriptase
Gibco BRL (Eggenstein)
(2000 U/µl)
Alkalische Phosphatase (1 U/µl)
Boehringer Mannheim (Mannheim)
Terminale Transferase (20 U/µl)
GIBCO (Eggenstein)
Thrombin (1 U/µl)
Serva
(Heidelberg),
Merck
(Darmstadt)
GST p53-Protein (1-393)
Santa Cruz Biotechnology, Inc
(Santa Cruz, CA, USA)
2.9. Oligodesoxyribonukleotide
Die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Oligonukleotide für DNA- und RNA-Proben aus
Schweineharnblasenepithelzellen wie auch Rinderdickdarmepithelzellen wurden von der
Zentralen Einrichtung „Synthese und Sequenzierung“ im Max-Planck-Institut für molekulare
Physiologie in Dortmund synthetisiert oder von der Firma MWG-Biotech (Ebersburg)
synthetisiert und über eine NAP-5 Säule gereinigt.
32
II MATERIAL
2.9.1. Oligonukleotide für die Polymeraseketten-Reaktionen
Oligonukleotid-Name
Sequenz (5’→ 3’)
Speziesspezifität
Länge
(bp)
hMSH2vkfwd
hMSH2vkrev
AAAGGATCCAGGCATGCTTG
TTTTCTCGAGGCTCTCTTTCCAAGAT
AGC
GGACATAACCGCATGCGTGCAATAG
AAAATTTCG
TCGGGAACTGCAGTTACACCAGGCT
CTTCAAGC
CGGGCCGGATCCCTGAACTACACC
TTTATCGGATCCCCGCTGAATC
GGAGTTCTGAGGGAATTCCTGGATC
TATC
AACTTGGATCCATGGATAAGATCGAA
GTTCGG
AATTGAATTCAGTGAAGCGTGCCGTG
TG
CCAGGGAGCTACAATGGAAG
GACAGGAAGCAGAAGACATCAG
CCTTCCAGGAATTCACAATGG
GACAGGAAGCAGAAGCATTCAGTCT
G
ATGACGGAGTATAAGCTCGTGG
AGGATGTCCAGCAGGCAC
GGTTCTGGATAAGCTGGATGG
human
human
20
29
E.coli
34
E.coli
33
E.coli
E.coli
E.coli
24
22
29
E.coli
32
E.coli
28
Schaf
Schaf
Schaf
Schaf
20
22
21
26
Schwein
Schwein
Schwein
22
18
21
ecm-sph-fwd
ecm-pml-rev
Ecmutsvklfwd
Ecmutsvkfwd
Ecmutsvkrev
UvrABamH1fwd
UvrAEcoR1rev
p53-ovine-fwd
p53-ovine-rev
p53-ovine-EcoRI-fwd
p53-ovine-BamHI-rev
pras-PNA-for
pras-PNA-rev
pras-PNA-s-rev
2.9.2. Oligonukleotide als Sequenzierprimer
Oligonukleotid-Name
Sequenz (5’→ 3’)
Vektor
Länge
(bp)
3`pGEXSequencing
Primer
5`pGEXSequencing
Primer
T7 Promoter Primer
T7 Terminator Primer
M13Forward Primer
CCGGGAGCTGCATGTGTCAGA
GG
GGGCTGGCAAGCCACGTTTGG
TG
TAATACGACTCACTATAGGG
CGTTAATTGGGAGTGATTTCCC
GTAAAACGACGGCCAG
M13Reverse Primer
CAGGAAACAGCTATGAC
Reverse Primer
Promotor Primer
CAAGACTCCAGTAATGACC
CCCGAAAAGTGCCACCTG
pGEX2T
23
pGEX2T
23
pCALN
pCALN
pCRII,
pMalc2H
pCRII,
pMalc2H
pQE-32
pQE-32
20
22
16
17
19
18
33
II MATERIAL
2.9.3. Oligonukleotide als DNA-Standards im Biacore
Oligonukleotid-
Sequenz (5’→ 3’)
Name
Länge
(bp)
Match-pig-PNAG12V (Primer A)
Mismatch-pig-PNA
G12V (Primer C)
Match-pig-PNAG12V (Primer D)
ACACCTACAGCCGC
14
ACACCTCCAGCCGC
14
Mismatch-pig-PNA
GGTCAGGGCACTCTTCCCCACACCTCCAGCGCCCACC
G12V (Primer E)
ACCACGAGCTTATACTCCGTCAT
DNA-Addukte
p-TCT TCT TCT GTG CG*C TCT TCT TCT
24
TT-Dimer fwd
GCTGATGAGATCCAGTTCGAGGTATCCCACTCTGC
36
TT-Dimer rev
TCACGAGTGGGATACCTCGAACTGGATCTCATCAGC
36
Match fwd
GCTGTTGAGATCCAGTTCGAAGTAACCCACTCGTGC
36
Mismatch fwd
GCTGTTGAGATCCAGTTCGAGGTAACCCACTCGTGC
36
Match rev
GCACGAGTGGGTTACTTCGAACTGGATCTCAACAGC
36
Match rev2AB
b-GCACGAGTGGGTTACTTCGAACTGGATCTCA ACAGC
36
GGTCAGGGCACTCTTCCCCACACCTACAGCGCCCACCA 60
CCACGAGCTTATACTCCGTCAT
60
Tab. 2.1: Oligonukleotide für den Einsatz im Biacore. Die phosphorylierten Oligonukleotide sind mit einem p
am 5’-Ende gekennzeichnet und die biotinylierten Oligonukleotide mit einem b am 5´-Ende.
2.10. Reaktionssets („Kits“)
Cycle Sequencing Kit:
„ABI PRISM Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit“:
Perkin Elmer (Überlingen)
ECL Western-Blot-Detektion-Kit
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
QIAprep Plasmid Miniprep Kit
Qiagen (Hilden)
QIAampBlood-Kit:
Qiagen (Hilden)
QIAquickGel-Extraction-Kit:
Qiagen (Hilden)
QIAquick PCR Purification Kit
Qiagen (Hilden)
RNeasy Mini Kit
Qiagen (Hilden)
QIAshredder
Qiagen (Hilden)
34
II MATERIAL
2.11. DNA- und Protein-Standards
Proteinstandards
SDS 6H
Hersteller
Sigma (Dreisenhofen)
205; 116; 97,4; 66; 45; 29 kDa
SDS 7 prestained
Sigma (Dreisenhofen)
102; 81; 46,9; 32,7; 30,2; 24 kDa
SDS 7
Sigma (Dreisenhofen)
66; 45; 36; 29; 24; 14 kDa
DNA-Standards
1 kb Marker
Hersteller
Gibco (Eggenstein)
12,2; 11,2; 6,1; 5,1; 4,1; 3,1; 2,0; 1,6; 1,0:
0,5; 0,4; 0,34: 0,3: 0,22; 0,2; 0,15; 0,13;
0,08 kb
λ-Marker
Gibco (Eggenstein)
8454; 7242; 6369; 5686; 4822; 3675;
2323; 1929; 1371; 1264; 702; 224;
117 bp
SLL 100 DNA-Marker
100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800;
900; 1000 bp
Roth (Karlsruhe)
35
II MATERIAL
2.12. Antikörper
Bezeichnung
Spezifität
Immunogen
Anti-GST
Anti-GST
Humanes GST Polyklonaler
Mausantikörper
7G3F3
Anti-GST
Humanes GST Monoklonaler
Mausantikörper
Beschreibung
Anti-Mouse-IgG,
Anti-Maus-IgG Maus-IgG
HRP linked whole
antibody
Polyklonaler
Schafsantikörper;
Peroxidase-gekoppelt
Rabbit Anti-Rat
IgG
Anti-Ratte
IgG2b
Polyklonaler
Kaninchenantikörper
Anti-Rac
Anti-Rac
α-Mouse Fcγ
Ratten-FcγFragment
Humanes Rac Monoklonaler
Zellkulturüberstand
einer
Hybridomazellkultur
Polyklonaler
Anti-Maus Fcγ- Maus-FcγKaninchenantikörper
Fragment
Fragment
Pab 240
Anti-p53
human
Aminosäuren Monoklonaler
156-214 des
Mausantikörper
humanen p53Proteins
Do-1
Anti-p53
human
Aminosäuren Monoklonaler
11-25 des
Mausantikörper
humanen p53Proteins
Herkunft
Amersham
Pharmacia
Biotech,
Freiburg
MPI für
molekulare
Physiologie,
Dortmund
Amersham
Pharmacia
Biotech,
Freiburg
Dianova,
Hamburg
Dr. Hans Faix,
MPI für
Biochemie,
München
Biacore AB,
Uppsala,
Schweden
Santa Cruz
Biotechology,
Inc (Santa
Cruz, CA,
USA)
Santa Cruz
Biotechology,
Inc (Santa
Cruz, CA,
USA)
Tab. 2.2: Alle Antikörper, die in dieser Arbeit in die Biacore-Messungen und in den Western-Blot-Analysen eingesetzt
wurden.
2.13. Geräte
BIAcore 1000:
Fast-Blot Kammer:
Fluidizer:
FPLC-Anlage:
Gelscanner Bioprofil:
Mini-Gelsystem:
pH-Meter 761 Calimatic:
Speed Vac Plus SC 110 A:
Thermocycler Mastercycler:
BIAcore AB (Uppsala, Schweden)
Biometra (Göttingen)
Microfluidics (Freudenberg)
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
Fröbel (Lindau).
BioRad (München)
Knick (Berlin)
Savant (Farmingdale, USA)
Eppendorf (Hamburg)
36
II MATERIAL
PCR-Gerät PTC 200:
Ultraschallgerät Sonifier 450
Ultraschallgerät Sonifier 250/450:
MJ Research (Watertown, USA)
Branson (Schwäbisch Gmünd)
Branson (Schwäbisch Gmünd)
Netzgeräte:
Electrophoresis-EPS 3500:
Pharmacia LKB.GPS 200/400:
Power PAC 300:
Pharmacia (Freiburg)
Pharmacia (Freiburg)
BioRad (München)
Spektralphotometer:
Biochrom 4060, UV-Visible:
Gene Quant RNA/DNA Calculator:
Ultrospec III, UV-Visible:
Uvikon 933, Double Beam UV/VIS:
Pharmacia (Freiburg)
Pharmacia (Freiburg)
Pharmacia (Freiburg)
Kontron (Neu-Fahrn)
Tischzentrifuge:
Eppendorf Zentrifuge 5415 C:
Biofuge 13 Heraeus SEPATECH:
Eppendorf (Hamburg)
Heraeus (Hanau)
Zentrifuge:
Laborfuge A:
Megafuge 1.0 R:
Heraeus (Hanau)
Heraeus (Hanau)
II METHODEN
37
B. Methoden
2.1. Behandlung der primären Zellkulturen
2.1.1. Inkubation mit kanzerogenen Stoffen
Reagentien:
1.) 2-Acetylaminofluoren: 100µM in DMSO
2.) N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin: 100 µM in DMSO
3.) DMSO
4.) 0,05% Trypsin/0,02% EDTA-Lösung
5.) F-12+ Medium
6.) Fötales Kälber Serum
7.) PBS pH 7,4
Arbeitsschema:
1. Inkubation mit aromatischem Amin und N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin
Es wurden 12 Kulturflaschen vorbereitet für den Inkubationsversuch. Die Zellen wurden
direkt nach der Inkubation geerntet (3 Kontrollen, 3 Flaschen versetzt mit DMSO, je 3
Flaschen versetzt mit 2-AAF oder MNNG). Die Epithelzellen wurden mit einer Zelldichte
von 5 x 106 Zellen pro 75 cm² Flasche ausgepflanzt und 5 Tage bei 37° C, 5 % CO² und 100 %
Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach 5 Tagen Kultivierung war ein konfluenter Monolyer in den
75 cm² Kulturflaschen vorhanden. Am fünften Tag wurde das Medium gewechselt und mit 25
µl aromatischem Amin oder alkylierenden Alkylants (Lösungsmittel-Endkonzentration 0,5 %)
bzw. mit 25 µl DMSO (Lösungsmittel-Endkonzentration 0,5 %) versetzt. Die Inkubation
erfolgte 5 h im Brutschrank.
2. Aufarbeitung von Zellen und Protein oder DNA-Isolierung nach der Inkubation
Zuerst wurde das Medium verworfen und die Zellen mit 5 ml F-12+-Medium gewaschen.
Nach den 5 h Inkubation wurden die Zellen von den 12 Kulturflaschen durch 1 ml
Trypsin/EDTA-Lösung pro Flasche vom Gefäßboden abgelöst und die Trypsinaktivität mit 1
ml F-12+-Medium mit 20 % FCS gestoppt. Es folgte eine fünfminütige Zentrifugation der
Zellen bei 50 x g und das Absaugen des Überstandes. Dieser Waschschritt wurde noch einmal
wiederholt. Danach wurden die Zellen abgelöst (siehe 2.1.2). Die so gewonnenen Zellen
wurden zur DNA-oder Protein-Isolierung eingesetzt (wie Kap. 2.1.3 und 2.1.5).
II METHODEN
38
2.1.2 Ablösen der Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung
Das Kulturmedium wurde möglichst vollständig entfernt; dann wurden bei 25-cm² Flaschen 1
ml, bei 75 cm² Flaschen 5 ml einer vorgewärmten 0,05% Trypsin/0,02% EDTA-Lösung
hineinpipettiert und für 6 min bei 37° C inkubiert. Anschließend wurde zum Abstoppen der
Trypsinaktivität auf die abgelöste Zellsuspension fötales Kälberserum (FCS) in F-12+
Medium gegeben mit einer Endkonzentration von 20% FCS (bei 25-cm² Flaschen 1 ml, bei 75
cm² Flaschen 5 ml). Nachdem die so behandelte Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen
überführt worden war, folgte ein Waschschritt (5 min Zentrifugation bei 50 x g; Absaugen des
Überstandes und Resuspension in PBS-Puffer), 10 minütiges Sedimentieren bei 50 x g,
Abnehmen des Überstandes und Aufnahme der Zellen in dem gewünschten Volumen PBSPuffer. Nach Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen in die DNA- oder ProteinIsolierung (siehe 2.1.3 und 2.1.5) eingesetzt.
2.1.3 DNA-Isolierung aus den primären Zellkulturen
Zur Isolierung genomischer DNA aus kultivierten Harnblasen- und Dickdarmeptihelzellen
vom Schwein und Rind wurde das QIAamp Blood Kit verwendet. Die Bezeichnungen der
Puffer wurden vom Hersteller übernommen. Die Zusammensetzung war aufgrund von
Patentrechten und kommerziellen Gründen nicht zugänglich. DNA-Standardproben
(Desoxyribonucleinsäure, Natriumsalz vom Kalbthymus; Sigma/Deisenhofen) wurden zur
Kalibrierung des Systems verwendet.
Zu 200 µl Zellsuspension wurden 25 µl Proteinase K (19,23 mg/ml) und 200 µl Puffer „AL“
gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde der Ansatz erst 30 min bei 50°C und 10 min bei
70° C inkubiert. Anschließend wurden 210 µl Ethanol hinzugefügt und sofort gemischt. Der
Ansatz wurde in ein QIAamp spin Säulchen überführt und eine Minute bei 6.000 x g
zentrifugiert. Die zu isolierende DNA bindet dabei an die Silikatmatrix der Säule,
Verunreinigungen werden in zwei nachfolgenden Waschschritten abgetrennt. Gewaschen
wurde mit 500 µl des Puffers „AW“. Es wurde eine Minute mit 6.000 x g zentrifugiert, beim
zweiten Waschschritt drei Minuten bei 10.000 x g. Die DNA wurde mit 200 µl 70° C heißem
H2O (deionisiert) eluiert. Dabei wurde wieder eine Minute bei 6.000 x g zentrifugiert. Die
Konzentration der isolierten DNA wurde spektrophotometrisch ermittelt. Die DNA wurde
anschließend auf einem 0,7 %igen Agarosegel überprüft und danach bis zur weiteren
Verwendung bei - 20 °C gelagert.
39
II METHODEN
2.1.4 Photometrische DNA-Quantifizierung
Zur
Bestimmung
von
Nukleinsäurekonzentrationen
in
Lösungen
wurden
spektralphotometrische Messungen mit Ultra-Mikro- bzw. Mikro-Küvetten aus Quarzglas
(Suprasil 300, Firma Hellma, Mülheim) durchgeführt. Die Volumina der Quarzküvetten
betrugen 80 µl, 700 µl und 1000 µl. Der Nullabgleich erfolgte durch die Messung der
optischen Dichte des Puffers ohne Nukleinsäuren. Entsprechend des Linearitätsbereiches des
Photometers (ca. 0,03 bis 0,12 OD) mußten die Proben verdünnt werden. Legt man eine
durchschnittliche Molmasse der Nukleotide von 350 g/mol zugrunde, ergibt sich nach PARISH
(1972):
1 OD260 entspricht:
50 µg dsDNA/ml
40 µg ssDNA/ml
20 µg Oligonukleotid/ml
Indem der Quotient OD260/OD280 ermittelt wurde, konnten Rückschlüsse auf die Reinheit
der DNA gezogen werden. Bei einer Wellenlänge von 260 nm besitzt DNA ihre höchste
Absorption, Proteine bei 280 nm. Handelt es sich bei dem Quotienten um eine Zahl zwischen
1,75 und 1,85, kann von einer hohen Reinheit der DNA-Lösung ausgegangen werden. Bei
einem Wert von > 1,9 ist die Probe mit RNA verunreinigt. Bei 2,0 liegt reine RNA vor. Im
Idealfall liegt der Quotient für reine DNA bei 1,8, dieser niedrige Wert ist auf den
Hyperchromieeffekt bei der Basenpaarung zurückzuführen. Die Kalibrierung des Meßgerätes
wurde mit einem DNA-Standard (Desoxyribonucleisäure, Natriumsalz vom Kalbsthymus;
Sigma, Deisenhofen) durchgeführt.
2.1.5 DNA-Verdau zum Einsatz im Biacore
Nach Isolierung der genomischen DNA aus dem Zellkulturmaterial wurde sie unter
Verwendung verschiedener Restriktionsnukleasen (Hae III, RSA I, Dra I, EcoR V, Alu I)
verdaut. Bei RSA I, Hae III und Alu I handelt es sich um Restriktionsenzyme, die eine
Erkennungssequenz von 4 bp haben, EcoR V und Dra I haben eine Erkennungssequenz von 6
bp. Die Hydrolyse von DNA mit Restriktions-Endonukleasen erfolgte unter den vom
Hersteller (New England BioLabs, Schwalbach/Taunus) empfohlenen Bedingungen in einem
20 µl Ansatz in dem jeweils dazugehörigen Reaktionspuffer. Der Restriktionsansatz wurde
für 3 Std bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde zu dem 20 µl-Ansatz 4 µl 6x DNAProbenpuffer gegeben und dann in eine gelelektrophoretische Untersuchung eingesetzt. Die
Kombination von RSA I und Hae III wurde für die weiteren Versuche benutzt.
II METHODEN
40
2.1.6 Proteinisolierung aus den primären Zellkulturen
Aus den Primärkulturen von Harnblasenepithelzellen vom Rind und Schwein konnte nach der
veränderten Methode von NEUFELD & WHITE. (1997) die cytosolische und nukleäre Fraktion
der kultivierten Zellen isoliert werden. Der konfluente Monolayer von 4-5 Tage kultivierten
Zellen in einer Kulturflasche (Kulturflache = 75 cm2) wurde mit 3 ml eiskaltem PBS-Puffer
gewaschen. In jede 75cm2 Kulturflasche wurden anschließend 1,5 ml STKM-Puffer mit 0.8%
Triton X 100 und einem Proteaseinhibitorset bestehend aus Pefabloc (40 mg/ml), Leupeptin
(1 mg/ml), Aprotenin (0,1 mg/ml), Pepstatin (1 mg/ml) und 1 mM PMSF gegeben. Danach
wurden die Zellen vorsichtig abgeschabt und die Zellsuspension in ein 2 ml Eppendorf
Reaktionsgefäß überführt. Ab hier wurde die Aufreinigung bei 4°C im Kühlraum
durchgeführt. Durch hypotonische Bedingungen und bechleunigte Lyse der Zellmembran
durch Triton X 100 konnten die Zellen aufgeschlossen werden.
Zur Gewinnung der cytosolischen Fraktion an Proteinen und der intakten Zellkerne aus den
kultivierten Zellen wurden die Zellsuspensionen für 15 min bei 1000 x g und 4°C
zentrifugiert.
Im Überstand befand sich die cytosolische Fraktion an Proteinen, die in
flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde und zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert
wurde. Das Pellet enthielt die intakten Zellkerne mit der Fraktion der nukleären Proteine, die
in weiteren Schritten unter hypotonen Bedingungen aus den intakten Zellkernen isoliert
wurden. Das Pellet wurde in 500 µl STKM-Puffer mit dem Proteaseinhibitorset bestehend aus
Pefabloc (40 mg/ml), Leupeptin (1 mg/ml), Aprotenin (0,1 mg/ml), Pepstatin (1 mg/ml) und
1 mM PMSF resuspendiert und einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 1000 x g für 15 min
bei 4°C unterzogen. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in 500 µl STKMPuffer mit dem Proteaseinhibitorset resuspendiert wie auch zentrifugiert bei 1000 x g für 15
min bei 4°C. Der Überstand wurde wieder verworfen und das Pellet in 100 µl
Extraktionspuffer mit dem Proteaseinhibitorset bestehend aus Pefabloc (40 mg/ml),
Leupeptin (1 mg/ml), Aprotenin (0,1 mg/ml), Pepstatin (1 mg/ml) und 1 mM PMSF mit 50
Units DNase I pro 100 µl Extraktionspuffer resuspendiert. Die eingesetze DNase baut die
mitisolierte DNA ab. Der Ansatz wurde dann 30 min auf Eis inkubiert und alle 10 min
vorsichtig gemischt. Ein letzter Zentrifugationsschritt bei 15.000 x g für 10 min bei 4°C
schloß sich an. Im Überstand befanden sich die nukleären Proteine,
die in flüssigem
Stickstoff schockgefroren wurden und zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert wurden.
Die Proteinmengen der cytosolischen und nukleären Fraktionen wurden nach Bradford
bestimmt.
41
II METHODEN
STKM-Puffer 40 mM Tris/HCL pH 7.5
37 mM KCl
12 MM MgCl2
30 % Sucrose
Extraktionspuffer 10 mM Hepes pH 7.9
400 mM NaCl
1,5 mM MgCl2
0,2 mM EGTA
20 % Glycerin
2.1.7 Proteinbestimmung nach Bradford
Bei der Proteinbestimmung nach Bradford (1976) erfolgt durch Bindung von Coomassie
Brillant Blau G-250 an die Seitenketten verschiedener Aminosäuren (Arg, His, Lys, Phe, Trp
und Tyr) eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm, die
photometrisch nachgewiesen werden kann. Der Vorteil dieser Methode liegt in ihrer schnellen
Durchführbarkeit und in der fehlenden Interferenz mit Natrium- oder Kaliumionen. Zur
Bestimmung einer Proteinkonzentration wurden 1 bis 10 µl der zu vermessenden Lösung mit
1 ml Bradford-Lösung vermischt und nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei RT die
Absorption bei 595 nm gemessen. Mit einer zuvor bestimmten Eichgeraden mit
Rinderserumalbumin (BSA) konnte dann die unbekannte Proteinkonzentration bestimmt
werden. Zur Erstellung einer Eichgerade wurden
2, 4, 6, 8 und 10 mg des
Rinderserumalbumines (BSA) verwendet.
Bradford-Lösung:
Reagenzien
Volumen [ml]
BioRad Protein Assay
50
Wasser
200
2.2. Amplifikation von c-DNA-Fragmenten aus der primären
Zellkultur zur Klonierung in Expressionsvektoren
2.2.1 RNA-Mini-Präparation aus den primären Zellkulturen
Die
Präparation
von
Gesamt-RNA
aus
4-5
Tage
kultivierten
Rinder-
und
Schweineharnblasenepithelzellen im kleinen Maßstab erfolgte mit Hilfe des Reagenziensets
RNeasy

Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Dabei wurde zunächst der Zellayer (maximal 107
Zellen) einer Kulturflasche (Kulturfläche=75 cm2) mit 900 µl Puffer RLT mit 1% βMercaptoethanol lysiert. Zum Ausschluß der Aktivität von Ribonukleasen während der
Aufbereitung
der
Zellen
enthält
der
denaturierende
Lysepuffer
GITC
(Guanidiniumisothiocyanat) als starken RNase-Inhibitor. Anschließend erfolgte die
Zerkleinerung der genomischen DNA und anderer hochmolekularer Zellkomponenten in
II METHODEN
42
einem speziellen Gefäß (QIAshredder, QIAGEN). In diesem wurde das Lysat mittels
Zentrifugation bei 10.000 x g (Tischzentrifuge) durch eine spezielle Matrix gepreßt, so dass
die DNA mechanisch geschert wurde. Das homogenisierte Lysat wurde im Verhältnis 1:1 mit
70 %igem Ethanol gemischt, auf eine RNeasy Mini-Säule appliziert und die RNA nach den
Angaben des Herstellers isoliert. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -80 °C. Die
Konzentration der isolierten RNA wurde spektrophotometrisch ermittelt.
2.2.2 DNase-Behandlung von Gesamt-RNA
Für sehr sensitive Anwendungen wie die der Reversen Transkriptionsreaktion ist eine
enzymatische Spaltung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase erforderlich. Diese
Behandlung verhindert, dass bei der PCR nicht nur die in spezifische cDNA transkribierte
mRNA, sondern auch entsprechende genomische Sequenzen amplifiziert werden. Diese
Reaktionen treten auf, wenn Reste genomischer DNA als Verunreinigung in den RNAPräparationen vorliegen. Für einen DNase-Verdau wurden ungefähr 15 µg RNA mit 1 U
RNase-freier DNase I und 4 µl 10 x DNase-Puffer versetzt und der Ansatz auf ein
Gesamtvolumen von 40 µl mit DEPC-behandeltem dH2O aufgefüllt. Der Ansatz wurde 30
min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Isolierung der RNA, um kontaminierende
Substanzen aus der enzymatischen Reaktion zu entfernen. Die Extraktion der RNA erfolgte
mit Hilfe des RNeasy Mini Reagenziensatzes nach dem RNA Clean-up Protokoll. Die
Lagerung der RNA erfolgte bei -80 °C.
10 x DNAse-Puffer: 0,4 M Tris HCL, pH 7,5, 0,06 M MgCl2 in DEPC-H2O; autoklaviert.
2.2.3 Computergestützte Versuchsplanung unter Verwendung von Genetics
Computer Group (GCG)
Abgelegte Sequenzen in den Gendatenbanken wurden mit Hilfe der „Sequence Analysis
Software Package“ der „Genetics Computer Group“ Inc. (GCG), Madison, Wisconsin,
Version 9.0-UNIX dargestellt und Oligonukleotidpaare zur Amplifikation der Sequenzen aus
einem DNA-Pool abgeschätzt. Ebenfalls sind die noch nicht in Datenbanken abgelegten
Sequenzen auf Homologien mit dem GCG untersucht worden. Die klonierte Sequenz vom
Schwein und die schon in den Datenbanken abgelegten Sequenzen wurden in einem
Vergleich gestellt und als Alignment dargestellt. Die erhaltenen Klone der schon in den
Datenbanken abgelegten Sequenzen wurden auf Homologien hin untersucht. Für das Design
von Oligonukleotiden zum Einsatz in die Polymerasekettenreaktionen wurde auch das
Programm Primer für Macintosh benutzt.
43
II METHODEN
2.2.4 Reverse Transkription von mRNA
Für die Reverse Transkription (RT) von mRNA wurde die aus Zellkulturen isolierte (siehe
1.3), DNase-verdaute (siehe 2.2.) Gesamt-RNA verwendet. Hierzu wurde nach dem Protokoll
der SuperScript II Reverse Transkriptase (Gibco BRL, Eggenstein) vorgegangen.
In einem Reaktions-Ansatz wurden zuerst 3 µg RNA mit 0,8 µl poly dT18- RT-Oligonukleotid
für 10 min bei 70°C im Thermocycler inkubiert. Danach wurde der Reaktionsansatz sofort auf
Eis gesetzt. Nach 10 sek Zentrifugation bei 6.000 x g wurden zu dem Reaktionsansatz 4 µl 5 x
RT-Puffer, 0,5 µl dNTP-Lösung (20 mM), 2 µl DTT (0,1 M) gegeben und mit dH2O RNase
frei auf 19 µl aufgefüllt. Nachdem der Ansatz vorsichtig mit der Pipette gemixt wurde, wurde
er für 52 min in einem Thermocycler bei 42°C inkubiert. 1 µl 200 U Super Skript II Rnase HReverse Transkriptase (Reverse Transkriptase, von Gibco BRL, Eggenstein) wurde zu dem
Reaktionsansatz nach 2 min gegeben. Nach der Reaktion erfolgte die Inaktivierung des
Enzyms durch 15 minütige Inkubation bei 70°C. Anschließend wurde der Ansatz für eine
darauffolgende Polymerasekettenreaktion auf Eis bzw. bei -20 °C gelagert. Alle
Inkubationsschritte wurden im Thermocycler PTC 200 von MJ Research durchgeführt.
5 x RT-Puffer:
250 mM Tris-Cl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2
2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction; PCR) ist ein in vitro-Verfahren
zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter
Sequenz (SAIKI et al., 1988). Das Verfahren basiert auf der Nutzung thermoresistenter DNAPolymerasen, die von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden ausgehend einen Einzelzum Doppelstrang vervollständigen können, sofern ihnen ein kurzer, doppelsträngiger
Bereich als „Primer“ (englisch: Anlagerungsstelle) zur Verfügung steht. Der zu
amplifizierende Genabschnitt wird durch die Wahl zweier Oligonukleotide festgelegt, welche
an homologe Bereiche der komplementären Einzelstrang-DNA hybridisieren und enzymatisch
unter Einbau von Desoxynukleotiden verlängert werden. Durch z. B. 30-fache Wiederholung
der Reaktionsfolge, bestehend aus Hitzedenaturierung, Anlagerung der Oligonukleotide und
DNA-Synthese kommt es nach jedem Reaktionszyklus zu einer Verdopplung der DNAMoleküle und damit im Idealfall zu einer exponentiellen, selektiven Zunahme des
gewünschten Fragments um die Größenordnung 106 bis 107. Für die Reaktion wurde die
hitzestabile Taq-DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus
eingesetzt, deren Temperaturoptimum knapp über 70°C liegt. Das Enzym ist stabil gegenüber
44
II METHODEN
der hohen Denaturierungstemperatur von 95°C und bleibt während des gesamten
Reaktionsablaufs etwa gleich aktiv.
2.2.5.1 Touchdown-Polymerasekettenreaktion
Mit einer Touchdown-Polymerasekettenreaktion (Touchdown - englisch: langsam annähern)
wird eine Polymerasekettenreaktion-Technik beschrieben, bei der im Laufe der einzelnen
Polymeraseketten-Zyklen die Anlagerungstemperatur kontinuierlich von einem Wert oberhalb
der zu erwartenden Annealing-Temperatur der Oligonukleotide auf einen Wert unterhalb
dieser Annealing-Temperatur gesenkt wird (DON et al., 1991). Dies erleichtert eine optimale
Hybridisierung der Oligonukleotide mit ihrer Zielsequenz, wodurch das Auftreten von
unspezifischen Nebenprodukten unterdrückt wird. Es wurde ebenfalls eine umgekehrte
Touchdown-Polymerasekettenreaktion durchgeführt, bei der im Laufe der einzelnen
Polymeraseketten-Zyklen die Anlagerungstemperatur kontinuierlich von einem Wert
unterhalb der zu erwartenden Annealing-Temperatur der Oligonukleotide auf einen Wert
oberhalb dieser Annealing-Temperatur erhöht wird. Dieser Ablauf wurde für TouchdownPolymerasekettenreaktionen benutzt, bei denen Oligonukleotide eingesetzt wurden, die
Erkennungssequenzen für Restriktionsschnittstellen enthielten. Der Thermocycler PTC 200
von
MJ
Research
kann
so
programmiert
werden,
dass
eine
Touchdown-
Polymerasekettenreaktion automatisch abläuft. Die Touchdown-Polymeraseketten-ReaktionsProgramme ist in Tabelle 2.4 für die einzelnen Reaktionsabläufe dargestellt.
Temperatur
Zeit
94°C
92°C
62°C
72°C
92°C
60°C
72°C
92°C
58°C
72°C
92°C
56°C
3 min
1 min
1 min
3,5 (1) min
1min
1 min
3,5 min
1min
1 min
3,5 (1) min
1min
1 min
54°C
56°C
58°C
60°C
72°C
3,5 (1) min
72°C
5min
4°C
∼
3 Zyklen
3 Zyklen
3 Zyklen
25 Zyklen
Tab.
2.4:
Programm
zur
Amplifikation des p53-Gens aus
Rind. Das DNA/mRNA Hybrid
wurde
zunächst
vollständigdenaturiert und dann
zyklisch
jeweils
eine
Denaturierung
(92°C),
eine
Anlagerung
der
Primer
(wechselnde Temperaturen) und
anschließend deren Verlängerung
(72°C)
durchgeführt.
Die
Unterschiede in der Temperatur
und Zeit zur 2. Touchdown-PCR
sind hier in rot dargestellt. Nach
der Durchführung der TouchdownPCR wurden die Ansätze weitere
fünf Minuten bei 72°C gehalten.
Die Lagerung der Produkte erfolgte
45
II METHODEN
OligonukleotidName
Sequenz (5’→ 3’)
Nicht degenerative Oligonukleotide
Bovp53fwd
ATGGAAGAATCAC
AGGCAGAACTC
Bovp53rev
TCAGTCTGAGTCA
GGCCCCTC
Degenerative Oligonukleotide
Btp53EcoR1fwd
TATTAACCGAATT
CATGGAAGAATCA
CAGGCAG
Btp53BamH1rev
CCCTAAGAGGAT
CCGTCTGAGTCA
GGCCC
Speziesspezifität
Besonderheit
Anlagerung
Länge
(bp)
Rind
-
5´Ende
24
Rind
-
3´Ende
21
Rind
mit EcoRI
Schnittstelle
5´Ende
33
Rind
mit BamHI
Schnittstelle
3´Ende
25
human
-
5´Ende
20
human
biotinyliert
3´Ende
19
human
-
5´Ende
21
human
biotinyliert
3´Ende
21
Schwein
-
5´Ende
20
Schwein
-
3´Ende
17
Exon 5-6 Oligonukleotidpaar
P1
GGTGCTTACACAT
GTTTGTT
P2b
CCACTGACAACC
ACCCTTA
Exon 7-8-9 Oligonukleotidpaar
P3
TCCCCTGCTTGC
CACAGGTCT
P4b
AAGACTTAGTACC
TGAAGGGT
Exon 8 Oligonukleotidpaar
5´E 8
TTTGAGGTGCGT
GTTTGTGC
3´E 8
GGGTGGCTCGGG
GCAAG
Nicht degenerative Oligonukleotide
Rasbovfwd
ATGACGGAGTAT
AAGCTCGTG
Rasbovrev
GTACTGGTGGAT
GTCCTCGAA
Degenerative Oligonukleotide
bovrasBamH1fwd GAATTGGATCCA
TGACGGAGTATA
AGCTC
bovrasEcoR1rev
CATTTGAATTCG
TACTGGTGGATG
TCC
Rind
-
5´Ende
22
Rind
-
3´Ende
21
Rind
mit BamHI
Schnittstelle
5´Ende
29
Rind
mit EcoRI
Schnittstelle
3´Ende
28
Tab. 2.3: Oligonukleotide, die in der Touchdown-PCR zur Amplifikation des p53-Gens von verschiedenen
Spezies und des ras-Gens vom Rind verwendet wurden. Es sind hier die Oligonukleotidpaare für die
Touchdown-PCR aus dem c-DNA/m-RNA-Hybrid (nicht degenerative Oligonukleotide) aus genomischer DNA
aus kultivierten primären Rinderharnblasenepithelzellen zur Amplifikation des p53 Gens wie auch die
Oligonukleotidpaare aufgelistet, die Restriktionsschnittstellen in die vorhandene c-DNA zum Einklonieren in den
Vektor pMALc2H (degenerative Oligonukleotide) eingeführt haben. Aus genomischer DNA aus kultivierten
primären Schweineharnblasenepithelzellen wurde versucht mit den humanen Primern die Exone 5-6 und 7-8-9
vom p53 Gen zu amplifizieren. Das Oligonukleotidpaar für das Exon 8 aus Schwein wurden in die TouchdownPCR eingesetzt nach der Reversen Transkriptionsreaktion mit poly-dT18-Oligonukleotid und Gesamt-RNA aus
kultivierten primären Schweineharnblasenepithelzellen. Für die Touchdown-PCR zur Amplifikation des ras Gens
vom Rind sind sowohl Oligonukleotidpaare für die Reaktion aus dem c-DNA/m-RNA-Hybrid (nicht
degenerative Oligonukleotide) dargestellt, als auch degenerative Oligonukleotidpaare, in die zusätzlich
Restriktionsschnittstellen zum Einklonieren der resultierenden c-DNA in den Vektor pGEX2T eingeführt worden
waren.
46
II METHODEN
Reagenzien
Volumen
In jeden Ansatz eingesetzt:
5x Q-Lösung
10 µl
10x PCR-Puffer
5 µl
dNTP [20mM]
0,5 µl
Oligonukleotide
20 pmol
Taq-Polymerase
0,5 µl
Variabel eingesetzt:
Reversen Transkriptionsansatz
5 µl oder 10 µl
dH2O
ad 50 µl
Tab 2.5: Touchdown-Polymerasekettenreaktion-Ansatz mit Gesamtvolumen von
50µl. Es sind die Anteile dargestellt, die in jeden Ansatz verwendet wurden und die
variablen Anteile
2.2.5.2 RACE- Reaktionen
Mit der RACE Reaktion (Rapid Amplifikation of cDNA ends - englisch schnelle
Amplifikation von c-DNA Enden) wurden die 3´ und 5´ Enden der p53-Sequenz und rasSequenz beim Schwein bzw. Rind überprüft und vervielfältigt (FROHMAN ET AL., 1988). Da
die Sequenzen mittels der Oligonukleotide vom Rind amplifiziert wurden, mußten die
Anlagerungssequenzen am 3´ und 5´ Ende für diese Oligonukleotide überprüft werden. Bei
den ras-Genen wurde die RACE-Reaktion eingesetzt zur Vervollständigung der zuerst
amplifizierten Sequenz der ersten beiden Exone. Für diese Reaktion wurden Oligonukleotide,
die in der Sequenz liegen und den Strang in 3´- oder 5´- Richtung amplifizieren, abgeschätzt.
Es wurden Fragmente von 250 bis 300 bp gewählt. Mit der RACE-Reaktion können bis zu
2000 bp in 3´ und 5´Ende amplifiziert werden, wenn mindestens ein Fragment von 300 bp
Länge von der zu amplifizierenden Gensequenz bekannt ist. In dem bekannten Bereich der
Gensequenz wurden Oligonukleotide abgeschätzt zur Amplifikation in 3´ und 5´ Richtung.
Der schematische Ablauf der RACE-Reaktion wurde in Abb. 2.1 dargestellt.
Zur Amplifikation des 3´Endes wurde die Reverse Transkriptionsreaktion, wie unter 2.4
beschrieben, mit einem poly-dT18-Oligonukleotid mit einer anhängenden T7-Promotorsequenz
durchgeführt (siehe Tab. 2.7 T7T17). In die Reverse Transkriptionsreaktion zur Amplifikation
des 5´Endes wurde ein Oligonukleotid eingesetzt, das den Strang von 3´ in 5´-Richtung
aufbaut (siehe Tab.2.7 RT2). Ein c-DNA/m-RNA-Hybrid von ca. 300 bp Größe ist das
Ergebnis aus beiden Reaktionen.
47
II METHODEN
An
die
Reverse
Transkriptionsreaktion
schloß
sich
eine
Reinigung
der
Polymerasekettenreaktions-Produkte mit dem QIAquick PCR-Purification-Kit von Qiagen
(Hilden) nach Herstellerangaben an, bevor die entstandenen c-DNA/m-RNA-Hybride in eine
Polymeraseketten-Reaktion eingesetzt wurden (siehe 2.5.1). Es wurde eine PolymerasekettenReaktion mit nested (englisch: ineinandergesetzt) Oligonukleotiden durchgeführt (siehe
Tab.2.7 N1 Oligonukleotide). Ineinandergesetzte Oligonukleotide erhöhen die Spezifität einer
Polymeraseketten-Reaktion.
Die
Wahrscheinlichkeit,
dass
unerwünschte
Sequenzen
vervielfältig werden, erhöht sich mit der Anzahl der Polymeraseketten-Reaktionszyklen. Man
kann sie senken, indem man zwei aufeinanderfolgende Polymeraseketten-Reaktionsrunden
durchführt und dazu zwei verschiedene Oligonukleotidpaare einsetzt. Zur Konstruktion der
beiden Oligonukleotidpaare dient die bekannte Sequenz, dabei liegt ein Paar (die inneren
Oligonukleotide) innerhalb des Bereichs, der mit dem ersten Paar vervielfältigt wurde. Es
wurden für das Programm der Polymeraseketten-Reaktionen in der ersten Runde unstringente
Bedingungen
gewählt,
d.h.
die
Annealingtemperatur
für
die
Anlagerung
der
Oligonukleotidpaare an die Sequenz wurde sehr niedrig gewählt.
Ein in der Sequenz liegendes Oligonukleotid wurde mit dem poly-dT18-Oligonukleotid mit
anhängender T7-Promotorsequenz (siehe Tab.2.7, T7T17) in die Polymeraseketten-Reaktion
zur Amplifikation des 3´Endes eingesetzt. Eine zweite Polymeraseketten-Reaktion schloß
sich mit einem weiteren aus der bekannten Sequenz abgeschätzten Oligonukleotid, das 30 bp
von dem ersten Oligonukleotid entfernt näher an dem 3´Ende liegt (siehe Tab.2.6 N2Oligonukleotide). Das zweite Oligonukleotid, das in die Polymeraseketten-Reaktion
eingesetzt wurde, bindet an die am 3´Ende eingeführte Sequenz des T7-Promotors (siehe Tab.
2.7, T7). Zur Amplifikation des 5´Endes mußte erst noch an das 5´Ende ein poly-A Schwanz
mit Hilfe der Terminalen Transferase (Gibco, Eggenstein) nach der Aufreinigung der cDNA/m-RNA-Hybride aus der Reverse Transkriptionsreaktion eingeführt werden. In einen 30
µl Ansatz wurden 0,2 mM dATP, 6 µl 5 x Terminale Transferase Puffer, 2 U Terminale
Transferase und 20 µl c-DNA/m-RNA-Hybrid aus der Aufreinigung eingesetzt. Die zeitliche
Länge der Reaktion bestimmt die Länge des poly-A Schwanzes. In dieser Arbeit wurde der
Terminale Transferase-Ansatz 5 min bei 37°C inkubiert und anschließend für 10 min bei
65°C inaktiviert. Der weitere Ablauf der Amplifikation des 5´Endes wurde wie oben für das
3´Ende beschrieben durchgeführt. Nach der ersten Polymeraseketten-Reaktion wurden die
Ansätze direkt in den TA-Klonierungsvektor (TA-Cloning Kit, Invitrogen, Leek, Holland)
ligiert (siehe 2.5.3).
48
II METHODEN
Polymeraseketten-Reaktion-Programm:
Temperatur Zeit
96°C
1 min
96°C
0,5 min (Denaturierung der DNA)
50°C
1 min
(Anlagerung
der 40 Zyklen
Oligonukleotide)
72°C
2 min
(Verlängerung der Primer)
72°C
5min
4°C
∼
Tab. 2.6: Programm des automatisierten Heizblocks für die Amplifikation des p53-Gens Im
ersten Schritt erfolgte eine vollständige Denaturierung der DNA. Daraufhin wurden Zyklen
wiederholt, in denen jeweils eine Denaturierung, eine Anlagerung der Primer und anschließend deren
Verlängerung stattfanden. Es wurde eine sehr unspezifische Anlagerungstemperatur für die
Oligonukleotide gewählt. Nach der Durchführung der Touchdown-PolymerasekettenReaktionsschritte wurde der Ansatz zunächst bei 72°Czur weiteren Verlängerung gehalten, um dann
bei 4°C gelagert zu werden.
Oligonukleotid-Name
Sequenz (5’→ 3’)
Speziesspezifität
Länge (bp)
p53 5´Ende Oligonukleotide
AGGGAAGGGGAATACGTGC
RT2
CGTAGTTGCCAGGGTAGGTCT
N1
ACAGGGGCCAGGAGGTGGCT
N2
p53 3´Ende Oligonukleotide
GCACTGAGGAAGAAAATTTTCG
N1
AGCTCCTCTCCACAGCAAAAG
N2
ras 5´Ende Oligonukleotide
CCTCATGTCACGGTACGCC
RT2
CTGCACGGACGACCTGTAGG
N1
GAGGATGGCCTTCGTTCACC
N2
ras 3´Ende Oligonukleotide
GGAGTACAGTGCCATGCGG
N1
GCTTCCTCTGCGTGTTCGC
N2
ras 3´Ende Oligonukleotide
CCTTATGTCGCGGTACGCTC
N1
CGAAAGAGACGCACAAACG
N2
Oligonukleotide für Reverse Transkriptionsreaktion
TAATACGACTCACTATAGGGT T16
T7T17
TAATACGACTCACTATAG
T7
Schwein
Schwein
Schwein
19
21
20
Schwein
Schwein
22
21
Schwein
Schwein
Schwein
19
20
20
Schwein
Schwein
19
19
Rind
Rind
20
19
Schwein/Rind
Schwein/Rind
37
18
Tab. 2.7: Oligonukleotide zur Amplifikation der 5´und 3´Enden des p53- und ras-Genes vom Schwein bzw. Rind
mittels RACE-Reaktion. Aus der Gesamt-RNA aus kultivierten primären Schweineharnblasenepithelzellen wurde mit Hilfe
des RT2-Oligonukleotides ein c-DNA/m-RNA-Hybrid erstellt wie auch mit dem poly-dT18-Oligonukleotid. In die
nachfolgende Touchdown-Polymerasekettenreaktion wurden die Oligonukleotide p53 5´Nested 1 in Kombination mit dem
T7T17 eingesetzt, nachdem vorher mittels Terminaler Transferase und dATP´s ein poly-A-Schwanz am 5´-Ende angehängt
wurde. In die Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion zur Amplifikation des 3´-Endes wurden die Oligonukleotide p53
3´Nested 1 und T7 eingesetzt. In die zweite Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurden anstelle der Nested 1
Oligonukleotide die Nested 2 Oligonukleotide eingesetzt.
49
II METHODEN
RACE: 3` Ende
m-RNA
RACE 5´ Ende
AAAAA
m-RNA
AAAAA
Reverse Trankriptase Reaktion
Oligonukleotid: T7T17
m-RNA
cDNA
RT2-Oligonukleotid
AAAAA
TTTTTT
m-RNA
cDNA
AAAAAA
Terminale Transferase
+ dATP´s
AAAAA
1. Polymerasekettenreaktion
Oligonukleotidpaar:
T7T17
N2-Oligonukleotid
Oligonukleotidpaar:
T7T17
N2-Oligonukleotid
m-RNA
cDNA
AAAAA
TTTTTT
Oligonukleotidpaar:
T7
N2-Oligonukleotid
2. Polymerasekettenreaktion
Oligonukleotidpaar:
T7
N2-Oligonukleotid
cDNA
AAAAA
TTTTTT
AAAAA
AAAAA
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der RACE-Reaktion (Rapid amplification of cDNA ends) zur
Amplifikation des p53- und ras-Gens vom Schwein. Nähere Erläuterungen siehe 2.2.5.2
2.2.5.3 Direkte Ligation von Polymeraseketten-Reaktions-Produkten
Für die Ligation wurde ein TA-Klonierungsvektor (TA-Cloning Kit, Invitrogen, Leek,
Holland) eingesetzt (MARCHUK et al., 1990). Die Ligationsreaktion basiert auf der
Verwendung eines linearisierten Vektors (pCR2.1), welcher an den 3’-Enden einen einzelnen
T-Überhang besitzt. Dieser reduziert die Häufigkeit von Selbstligationen und erzeugt
komplementäre Enden für die Verknüpfung mit Fremd-DNA-Fragmenten mit 3’-
II METHODEN
50
überstehenden Enden, welche aus einem einzelnen Desoxyadenosin (A) bestehen. Hierbei
wird die Template unabhängige Aktivität der Taq-DNA-Polymerase ausgenutzt, durch welche
ein einzelnes A an die 3’-Enden von PCR-Produkten addiert wird. Zur Ligation wurden 1,0 µl
(etwa 100 ng) Vektor-DNA, eine äquimolare Menge des frischen cDNA-PCR-Fragments
eingesetzt und mit dH2O auf 5 µl aufgefüllt. Als Kontrolle diente ein Ansatz, welcher nur
Vektor-DNA enthielt. Die Ansätze wurden 5 min bei RT inkubiert, dann für 10 sek
zentrifugiert bei 6.000 x g und anschließend auf Eis gelagert. Der gesamte Ligationsansatz
wurde dann in die Transformationsreaktion mit kompetenten E.coli TG1-Zellen eingesetzt
(wie in 2.6.4 beschrieben). Die Plasmide wurden aus den E.coli TG1-Zellen isoliert (siehe
2.6.5) und einer Restriktionsanalyse (siehe 2.6.6) unterzogen. Die inserierte DNA der
positiven Klone aus der Restriktionsanalyse wurde zur weiteren Bestätigung sequenziert.
Danach wurden die positiven Klone in E.coli Expressionszellen transformiert und
Glycerolstocklösungen angelegt (siehe 2.6.8).
2.2.6 Klonierung von DNA Fragmenten
2.2.6.1 Reinigung der PCR-Produkte
Die Reinigung der PCR-Produkte von nicht eingebauten Nukleotiden, Primern und
Polymerasen erfolgte mit dem QIAquick PCR-Purification-Kit von Qiagen (Hilden) nach
Herstellerangaben und unter Verwendung der gelieferten Lösungen. Das Reagenzienset
eignet sich zur Reinigung von DNA-Fragmenten mit einer Länge von 100 bis 10000 bp.Die
DNA wurde mit 5 mM Tris-HCl pH 8 eluiert und zur Erhöhung der Ausbeute wurde der
Ansatz vor der Elution der DNA für 5 min bei RT stehengelassen. Bis zur weiteren
Verwendung wurden die Proben bei -20°C gelagert.
2.2.6.2 Restriktionshydrolyse
Die Hydrolyse von doppelsträngiger DNA wurde mittels Restriktionsendonukleasen in den
von dem Hersteller (New England Biolabs, Schwalbach) angegebenen Puffern durchgeführt.
Die Restriktion erfolgte dann bei 37°C für 2,5 Stunden. Die für einen Ansatz einzusetzende
Menge an Enzym wurde wie folgt ermittelt:
U
λ ⋅ S ( Plasmid )
=
Plasmid ⋅ S (λ )
µg ⋅ h
λ : Genomgröße des λ-Phagen (48500 bp)
Plasmid : Größe des zu schneidenden Plasmids in bp
S : Anzahl der Schnittstellen der jeweiligen Endonuklease im Plasmid bzw. im λ-Genom
51
II METHODEN
Der sich aus dieser Formel ergebende Wert bezeichnet die Enzymeinheiten (U) die pro
Mikrogramm
eingesetzter
DNA-Menge
und
pro
Stunde
gebraucht
werden.
Die
Restriktionsansatzvolumina wurden nicht größer als 50 µl gewählt, um die Effizienz der
Restriktionsendonukleasen möglichst hoch zu halten.
Handelte es sich bei der zu hydrolysierenden DNA um Plasmid-DNA, in die in einer
anschließenden Reaktion ein Fremd-Gen insertiert werden sollte, so wurde die geschnittene
Plasmid-DNA durch Zugabe von alkalischer Phosphatase an den beiden 5‘-Enden
dephosphoryliert. Dies geschah durch Zugabe von alkalischer Phosphatase nach 90 Minuten
zum Restriktionsansatz, dabei wurden pro 5 µg Plasmid-DNA 1 U Enzym eingesetzt und das
Volumen des Ansatzes mit dem Reaktionspuffer für die alkalische Phosphatase und dH2O auf
60 µl erhöht. Nach 30 Minuten wurde noch einmal die gleiche Menge an alkalischer
Phosphatase zugesetzt und die Reaktion nach weiteren 30 Minuten durch die Zugabe von 10
mM EDTA und 15 minütiger Inkubation bei 72°C abgestoppt. Die zu insertierende FremdDNA wie auch die linearisierte Plasmid-DNA wurden durch präparative Gelelektrophorese
aufgereinigt und anschließend in den Ligationsansatz eingesetzt.
Durch die Dephosphorylierung der Vektor-DNA kann eine Religation des Vektors verhindert
werden, da die T4-DNA-Ligase die dephosphorylierten 5‘-Enden nicht kovalent mit den 3‘Enden verbinden kann. Die Vektor-DNA kann also kein cirkuläres DNA-Molekül bilden und
verbleibt in ihrer linearisierten Form. Kommt es jedoch zu einer Assoziation zwischen den
kohäsiven Enden der Vektor-DNA mit den Enden der zu insertierenden Fremd-DNA, kann
die Ligase die 3‘-Enden des Vektors kovalent mit den 5‘-Enden der Fremd-DNA verbinden.
So wird erreicht, dass die Insertion von Fremd-DNA in die Vektor-DNA bei der Ligation als
bevorzugte Reaktion abläuft.
2.2.6.3 Ligation
Für die Ligation wurden die Expressionsvektoren (pGEX 2T, pMALc2H, pCAL N oder pQE
32 TypIV) eingesetzt. Die Ligationsreaktion basiert auf der Verwendung eines linearisierten
Vektors, welcher durch Restriktionshydrolyse in der Multiplen Klonierungsstelle geschnitten
wurde. Die Enden des Vektors weisen dann einen Überhang auf, an den die durch
Restriktionshydrolyse entstandenen, überhängenden Enden der Fremd-DNA ligieren können.
Zusätzlich werden die Vektoren durch alkalische Phosphatase dephosphoryliert. Dies
reduziert die Häufigkeit von Selbstligationen und erzeugt komplementäre Enden für die
Verknüpfung mit den Fremd-DNA-Fragmenten mit überstehenden Enden.
52
II METHODEN
Zur Ligation wurden 20 ng und 40 ng Vektor-DNA und die zu insertierende DNA im 5
fachen Überschuß eingesetzt.
Die einzusetzende Menge des Inserts wurde nach folgender Formel berechnet:
Anzahl.bp.Insert
∗ 20ngVektor ∗ 5 facherÜberschuß = ng .Insert
Anzahl.bp.Plasmid
Zu der DNA wurden 1 µl 10 x T4-Ligasepuffer sowie 1 µl T4-DNA-Ligase (400 U) gemischt
und der Ansatz mit dH2O auf 10 µl ergänzt. Die Ligationsreaktion erfolgte bei 16 °C über
Nacht im automatisierten Heizblock. Als Kontrolle diente ein Ansatz, welcher nur VektorDNA enthielt. Für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen wurden die kompletten
Ligationsansätze eingesetzt.
10 x T4-Ligase-Puffer:
50 mM Tris/HCl pH 7,5
10 mM MgCl2
10 mM Dithiothreitol
1 mM ATP
25 µg/ml BSA
2.2.6.4 Transformation kompetenter E. coli-Zellen
Zur Transformation mit rekombinanter Plasmid-DNA wurden nach COHEN et al. (1972)
kompetente E. coli-TG1-Zellen zunächst auf Eis aufgetaut und 100 µl der Zellen in ein
steriles Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe des kompletten Ligationsansatzes
(siehe 2.2.6.3) wurden die Zellen für 30 min auf Eis belassen. Es schloß sich ein Hitzeschock
für 45 sek bei 42 °C an mit anschließender 1 minütiger Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von
900µl LB-Medium wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C inkubiert (Thermoschüttler von
Eppendorf, Hamburg), um die Expression des plasmidkodierten Antibiotikaresistenzmarkers
zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen 3 min bei 4.000 x g abzentrifugiert, dann
850 µl des Überstandes abgesaugt und die Bakterien im verbliebenen Volumen resuspendiert.
Die so behandelten Ansätze wurden auf einer vorgetrockneten LB-Amp-Platte (100 µg
Ampicillin/ml) komplett ausgespatelt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Als Kontrollansatz
wurde eine positiv Kontrolle in die Transformation eingesetzt und ausplattiert.
2.2.6.5 Plasmid-Mini-Isolierung aus E. coli
Die Plasmidisolierung aus E. coli erfolgte mit Hilfe des QIAprep spin Miniprep-Kit
(QIAGEN, Hilden) und basiert auf der alkalischen Bakterienlyse und der selektiven Bindung
der Plasmid-DNA an eine Silikamatrix (BIRNBOIM & DOLY, 1979).
53
II METHODEN
Aus 5 ml-Übernachtkulturen von E. coli TG1/c-DNA-Fragment in ampicillinhaltigem LBMedium (37°C, 220 rpm, Schüttler) wurden 1,5 ml der Bakteriensuspension in ein steriles
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Durch Zentrifugation bei 4.000 x g bei RT
sedimentierten die Zellen. Der Überstand wurde verworfen. Die Isolierung der Plasmid-DNA
erfolgte mit Hilfe von QIAprep spin-Säulen nach dem Protokoll des Herstellers.
Für die DNA-Sequenzierung wurde die Plasmid-DNA wie in Kapitel 2.6.7 beschrieben
behandelt.
2.2.6.6 Restriktionsanalyse positiver Klone
Die
rekombinanten
Plasmide
derjenigen
Bakterienklone,
welche
sich
in
der
Antibiotikaresistenz als positiv erwiesen, wurden mit Hilfe einer Restriktionsanalyse auf das
Vorhandensein und die Orientierung des inserierten Fremd-DNA-Fragmentes überprüft.
Die Hydrolyse von DNA mit Restriktions-Endonukleasen erfolgte unter den vom Hersteller
(New England BioLabs, Schwalbach/Taunus) empfohlenen Bedingungen in einem 20 µl
Ansatz in dem jeweils dazugehörigen Reaktionspuffer. Der Restriktionsansatz wurde für 2,5
Std bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde zu dem 20 µl-Ansatz 4 µl 6x DNA-Probenpuffer
gegeben und dann in eine gelelektrophoretische Untersuchung eingesetzt. Die positiven Klone
wurden zum Abschluß in die direkte zyklische Sequenzierung von DNA eingesetzt.
2.2.6.7 Direkte zyklische Sequenzierung von DNA
Die direkte Sequenzanalyse von PCR-Produkten erfolgte mittels zyklischer Sequenzierung
nach der sogenannten Dye Terminator-Methode auf der Basis von fluoreszenzmarkierten
Didesoxynukleotiden und Taq-DNA-Polymerase (AmpliTaq FS). Die Methode beruht auf der
Kettenabbruchmethode nach SANGER et al. (1977). Hierbei dient Einzelstrang-DNA als
Matritze, an welche ein kurzes DNA- Primer-Molekül mit freier 3’-OH-Gruppe bindet und
den Startpunkt für die Synthese eines komplementären Stranges bildet.
Ein Reaktionsansatz enthält die vier Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) sowie
fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), sogenannte Dye-Terminatoren. Diese führen bei ihrem Einbau in den wachsenden DNA-Strang zu einem
Kettenabbruch, da ihnen die 3’-OH-Gruppe fehlt. Für die Sequenzierreaktion wurde das „ABI
PRISM Dye Terminator Cycle Ready Reaction Kit“ (Perkin Elmer, Überlingen) verwendet.
Für
einen
Ansatz
wurden
30
bis
60
ng
isolierte
Plasmide
mit
32
pmol
Sequenzieroligonukleotid und 8 µl „Terminator Ready Reaction Mix“ (englisch: fertiger
Terminator Reaktionsmix) gemischt und mit dH2O auf ein Gesamtvolumen von 20 µl ergänzt.
54
II METHODEN
Die Reaktion erfolgte in einem Thermocycler (PTC 200 von MJ Research) unter Anwendung
des in Tabelle 2.8 aufgeführten Programms.
Temperatur [°C]
Zeit
96
30 s (Denaturierung)
50
15 s (Oligonukleotidanlagerung)
60
4 min (Oligonukleotidextension)
Zahl der Zyklen: 25
Tab 2.8: Programm der zyklischen Sequenzierung von DNA
Für eine Sequenzierung wurden die DNA-Proben nach den Angaben des Herstellers vorbereitet. Für die Entfernung nicht eingebauter dye Terminatoren wurde die markierte DNA
durch Zugabe von 2 µl 3 M NaAc, pH 5.2 und 60 µl 100 %igem Ethanol präzipitiert und für
30 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das DNAPräzipitat durch Zugabe von 60 µl 70 %igem Ethanol und erneuter Zentrifugation gewaschen,
der Überstand entfernt und die DNA an der Luft getrocknet.
Die Sequenzanalysen wurden mit einem DNA-Sequencer Model 373A der Firma Applied
Biosystems (ABI) in der Zentraleinrichtung Synthese und Sequenzierung des Max Planck
Instituts
für
molekulare
Physiologie,
Dortmund
durchgeführt.
Eine
Analyse
der
fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente erfolgte in Polyacrylamidgelen mit Hilfe eines
Laseredetektors.
Die
mit
der
ABI-Software
ermittelten
Sequenzen
wurden
für
Datenbankvergleiche eingesetzt.
2.2.6.8 Herstellung von Glycerolkulturen
Um eine Bakterien-Kolonie langfristig aufzubewahren, wurde eine Bakterien-Kolonie von
einer LB-Amp-Platte abgenommen und in 5 ml LB-Amp Flüssig-Medium gegeben. Der
Ansatz wurde dann im Schüttler über Nacht bei 37°C inkubiert. Von dieser Übernachtkultur
wurde 1 ml abgenommen und mit 1 ml autoklaviertem 100% Glycerol gemischt und bei –
80°C eingefroren.
2.2.7 Gelelektrophoretische Verfahren
2.2.7.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA erfolgte in Horizontal-Flachbettgelen mit
Agarosekonzentrationen von 0,8 bis 2 % (w/v). Agarose ist ein gelierfähiges lineares ZuckerPolymer. Beim Anlegen von Spannung wandern die negativ geladenen DNA-Fragmente in
55
II METHODEN
Richtung Anode durch das Gel, wobei ihre elektrophoretische Beweglichkeit umgekehrt
proportional zum Logarithmus der Anzahl der Basenpaare ist. So kommt es zu einer
größenabhängigen Auftrennung der DNA-Fragmente. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE-Puffer
verwendet. Die Agarosegele enthielten zusätzlich 0,03 % (w/v) Ethidiumbromid. Diese
Chemikalie interkaliert mit der DNA und fluoresziert bei einer Anregung unter
UV-Licht
im
sichtbaren
Bereich
(orange).
Die
Nachweisgrenze
bei
einer
Ethidiumbromidfärbung liegt bei 50 ng DNA. Ein Gellauf erstreckte sich bei einer angelegten
Spannung von 120 V auf 15 bis 30 Minuten. Die DNA-Proben wurden mit 1/5 Volumen 6 x
DNA-Probenpuffer vermischt und mit einem Größenstandard auf das Gel aufgetragen. Nach
Abschluß der Elektrophorese konnte das in die DNA interkalierte Ethidiumbromid auf einem
UV-Transilluminator (Anregung 302 nm) sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation
erfolgte mit einem Gelscanner der Marke Bioprofil der Firma Fröbel (Lindau).
2.2.7.2 Präparative Gelelektrophorese mit anschließender DNA-Elution
Zur Isolierung von einem bestimmtem Fragment aus einem Gemisch an DNA-Fragmenten
wurde eine präparative Gelelektrophorese mit anschließender Gelelution durchgeführt.
Dazu wurde die Probe nach der PCR-Reaktion auf ein Agarosegel aufgetragen. Nach dem
Gellauf wurde das präparative Gel kurz unter UV-Strahlung betrachtet. Die Stelle im Gel, an
der sich das zu eluierende DNA-Fragment befand, wurde markiert und aus dem Gel entfernt.
Die DNA wurde aus dem Gelstück mit dem QIAquick Gel-Extraction-Kit, der Firma Qiagen
(Hilden), laut Herstellerangaben eluiert. Zur Elution wurden 45 µl H2O (deionisiert) auf die
Mitte der Säule gegeben, die Säule für 1 min bei RT stehengelassen und anschließend 1 min
bei 10.000 x g zentrifugiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben auf Eis
gelagert.
2.3. Expression und Isolierung von Proteinen
2.3.1 Proteinexpression
Die Expression der Reparaturenzyme wie auch des p53-Proteines von verschiedenen Spezies
erfolgte in Ampicillin-haltigem LB-Medium. Die Konzentration des Antibiotikums betrug
dabei 100 µg/ml Ampicillin. Jeweils 1/10-Volumen der Expressionskultur wurden am
Vorabend mit dem jeweiligen rekombinanten E.coli-Klon angeimpft und über Nacht bei 37°C
und 180 UpM kultiviert. Das verbleibende Medium wurde am darauffolgenden Tag mit dieser
Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C, 180 UpM bis zu einer OD600 von 0,3 bis 0,8
kultiviert. Nun erfolgte die Induktion der Proteinexpression durch Zugabe von 10 oder 100
II METHODEN
56
µM IPTG. Nach einer Expressionsdauer von 5 bis 15 Stunden wurden die Bakterien
abzentrifugiert, in PBS-Puffer gewaschen und nach erneuter Zentrifugation in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Die genauen Bedingungen für die
Proteinexpressionen sind im Ergebnisteil für das jeweilige Protein beschrieben.
2.3.2 Zellaufschluß
Die in dieser Arbeit beschriebenen Proteine wurden mit unterschiedlichen Methoden
aufgeschlossen. Von den Reparaturenzymen wurden das überexpremierte hMSH2-Protein mit
der Kugelmühle aus den Bakterienzellen isoliert. Die Bakterienzellpellets mit dem
überexpremierten Volle-Länge MutS wie auch mit den verkürzten Konstrukten wurden mit
Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen. Der Fluidizer (Microfluidics, Freudenberg) kam beim
Aufschluß der Bakterienzellpellets mit dem überexpremierten p53-Protein vom Rind zum
Einsatz. Das p53-Protein vom Schwein wurde aus den Bakterienzellpellets mit Hilfe von
Ultraschall isoliert. Alle Bakterienzellpellets wurden in einem zahlenmäßig dem dreifachen
Gewicht des Sediments entsprechenden Volumen in dem jeweiligen Bindungspuffer für das
überexpremierte Protein aufgenommen. Kurz vor dem Zellaufschluß wurde 1 mM PMSF und
ein Proteaseinhibitor-Set bestehend aus Pefabloc(40 mg/ml), Leupeptin (1 mg/ml),
Aprotenin (0,1 mg/ml) und Pepstatin (1 mg/ml) mit einer Spatelspitze DNase I zugegeben und
die Bakteriensuspension dann aufgeschlossen.
Die Bakteriensuspension wird im Fluidizer zuerst geteilt und dann unter einem Druck von 80
bar aufeinander geschossen. Durch die dabei entstehenden Scherkräfte werden die Zellen
auseinander gerissen. In der Glasperlenmühle (Disintegrator S von BIOmatik GmbH,
Rodgau) kommt es auch zum Zellaufschluß aufgrund der entstehenden Scherkräfte, die durch
die rotierenden Glasperlen in der Zellsuspension entstehen. Bei der Glasperlenmühle werden
Glasperlen bei hoher Frequenz (4000 UpM, 0,1 mm ø Glasperlen) geschüttelt. Das Verhältnis
des Glasperlen Volumens zu dem Volumen der Zellsuspension lag mindestens bei 1,5:1.
Beim Ultraschallaufschluß wurde das Ultraschallgerät der Firma Branson, Modell 250/450
Sonifer (Branson, Schwäbisch Gmünd) eingesetzt. Die Bakterien wurden unter Eiskühlung
insgesamt fünfmal der Anzahl an ml-Zellaufschluß in Stößen, mit jeweils einer Minute Pause
auf Eis zwischen den 5 Behandlungszyklen, mit Ultraschall (Leistungsstufe 4, Duty Cycle 40
%) behandelt. Das Rohlysat wurde bei allen drei Aufschlußmethoden bei 108.000x g und 4°C
60 Minuten lang zentrifugiert, dann konnte der Überstand mit den löslichen Proteinen vom
Sediment getrennt werden.
57
II METHODEN
2.3.3 Proteinreinigung
2.3.3.1 Reinigung von Proteinen mit Histidin-Tag
Proteine mit einem Tag aus 6 Histidinen (MutS, sowie alle p53-Proteine verschiedener
Spezies)
wurden
aus
Affinitätschromatograhie
dem
an
Überstand
des
Bakterienzellaufschlusses
Nickel-NTA-Agarose
aufgereinigt.
durch
Die
Affintitätschromatographie basiert auf der Bindung von Histidinresten an divalente Kationen,
wie z.B. Ni2+-Ionen. Der Gensequenz für die verschiedenen Proteine ist in dem
Expressionsvektor pQE32 Typ IV noch eine Sequenz vorgeschaltet, die für 6
aufeinanderfolgende Histidinreste kodiert. In dem Expressionsvektor pMALc2H ist der
Gensequenz für die verschiedenen Proteine eine Sequenz nachgeschaltet, die für 6
aufeinanderfolgende Histidinreste kodiert. Dadurch werden diese Proteine mit einem N- oder
C-terminalen Histidin-Tag expremiert. Als Matrix der Affinitätssäule wurde eine AgaroseMatrix verwendet, auf der Ni2+-Ionen durch Chelatierung mittels Nitrilotriacetatgruppen
gebunden
waren
(Ni2+-NTA-Agarose).
Leitet
man
den
Überstand
des
Bakterienzellaufschlusses über diese Matrix, so wird das mit einem Histidin-Tag versehene
Protein auf der Ni2+-NTA-Agarose gebunden, während andere Proteine ohne Histidin-Tag
ungebunden bleiben. Die Bindung erfolgt indem jeweils zwei der Histidinreste einen
Chelatkomplex mit einem Ni2+-Ion ausbilden. Dieser Chelatkomplex kann durch Zugabe von
Imidazol im Überschuß kompetitiv wieder gelöst werden, da Imidazol eine dem Histidin sehr
ähnliche Struktur aufweist. Zur Abtrennung unspezifisch gebundener Proteine wurde die
Matrix jeweils zunächst mit ungefähr 300 ml Ni2+-Bindungspuffer gespült. Diesem
Waschschritt schloß sich ein 2. Waschschritt mit Ni2+-NTA-Chaperonpuffer (60 ml) an, damit
an immobilisierte Proteine gebundene Chaperone von diesen abdissoziieren können und von
der Säule eluiert werden. Danach wurden die Proteine mit etwa 100 ml Elutionspuffer durch
einen Gleitgradienten von 5 auf 200 mM Imidazol von der Säule eluiert. Die Proteine wurden
dabei in Fraktionen von 2 ml aufgefangen. In einer Polyacrylamidgelelektrophorese wurde
die Reinheit der Proteine in den einzelnen Fraktionen analysiert und die Fraktionen vereinigt,
die das jeweilige rekombinante Protein als Hauptbestandteil enthielten. Die Proteine wurden
durch Ultrafiltration oder Ammoniumsulfatfällung konzentriert, in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –80°C gelagert.
58
II METHODEN
Puffer
Reagenzien
Ni2+-NTA-Bindungspuffer
NaCl:
300 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
β-Mercaptoethanol: 1 mM
Imidazol:
5 mM
Ni2+-NTA-Chaperonpuffer
NaCl:
200 mM
KCl:
100 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
β-Mercaptoethanol: 1 mM
Imidazol:
5 mM
ATP:
1mM
Ni2+-NTA-Elutionspuffer
NaCl:
300 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
β-Mercaptoethanol: 1 mM
Imidazol:
200 mM
Tab. 2.9: Reagenzien für die Puffer zur Aufreinigung von rekombinanten
Histidin-Fusionsproteinen
2.3.3.2 Reinigung der GST-Fusionsproteine
GST-Fusionsproteine (MutS vk, MutS vkl, hMSH2vk) wurden affinitätschromatographisch
über
eine
Glutathion-Sepharose-Säule
gereingt
(Glutathion-Sepharose
4B).
Die
Chromatographie beruht auf der Bindung von Glutathion-S-Transferase an das auf der
Säulenmatrix immobilisierte Glutathion. Diese Bindung kann durch Kompetition mit freiem
Glutathion wieder gelöst werden. Zur Proteinaufreinigung wurde der Überstand des
Ultraschallaufschlusses oder Glasperlenaufschlusses mit einer Flußgeschwindigkeit von 1
ml/min über eine Glutathion-Sepharose-Säule geleitet. Nicht gebundene Proteine wurden
durch Spülen der Säule mit etwa 300 ml PBS entfernt. Im Anschluß wurde das jeweilige
GST-Fusionsprotein mit GST-Elutionspuffer (20 mM Glutathion in 1 x PBS-Puffer pH 7,0)
von der Säule eluiert. Die Proteine wurden dabei in Fraktionen von 2 ml aufgefangen. In einer
Polyacrylamidgelelektrophorese wurde die Reinheit der Proteine in den einzelnen Fraktionen
analysiert und die Fraktionen vereinigt, die das jeweilige rekombinante Protein als
Hauptbestandteil
enthielten.
Das
Protein
wurde
durch
Ammoniumsulfatfälllung
aufkonzentriert und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um es bei –80°C zu lagern.
2.3.3.3 Reinigung von Proteinen mit MBP-Tag
MBP-Fusionsproteine (p53-Proteine verschiedener Spezies) wurden mittels einer Affinitätschromatographie gereinigt; als Säulenmaterial wurde hierfür Amylose-Harz verwendet. Die
Chromatographie beruht auf der Bindung von Maltose-bindendem-Protein an die auf der
Säulenmatrix immobilisierte Maltose. Diese Bindung kann durch Kompetition mit Maltose
wieder gelöst werden. Die freie Maltose konkurriert dabei mit dem Amylose-Harz um die
59
II METHODEN
Bindung mit dem MBP-Anteil des Fusionsproteins. Die Amylose-Säule mit einem Volumen
von 12 ml wurde zunächst mit Amylose-Bindungspuffer äquilibriert und die Probe dann mit
einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgetragen. Es wurde solange mit Puffer
nachgewaschen, bis kein Protein im Durchlauf mehr detektiert werden konnte. Danach wurde
die Säule noch zusätzlich eine Stunde mit Chaperonpuffer gewaschen, um an immobilisierte
p53-Proteine gebundene Chaperone zu entfernen. Die Fraktion mit p53 wurde anschließend
über einen linearen Gradienten von 0 auf 10 mM Maltose mit Elutionspuffer in Kombination
mit
Bindungspuffer
über
50
ml
von
der
Säule
eluiert.
In
einer
Polyacrylamidgelelektrophorese wurde die Reinheit der Proteine in den einzelnen Fraktionen
analysiert und die Fraktionen vereinigt, die das jeweilige rekombinante Protein als
Hauptbestandteil enthielten. Die Proteine wurden durch Ultrafiltration konzentriert, in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Puffer
Amylose-Bindungspuffer
Reagenzien
NaCl:
200 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
β-Mercaptoethanol: 1 mM
Amylose-Chaperonpuffer
NaCl:
100 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
KCl:
100 mM
β-Mercaptoethanol: 1 mM
ATP:
1 mM
Amylose-Elutionspuffer
NaCl:
200 mM
Tris/HCl:
20 mM; pH 7,6
β-Mercaptoethanol: 1 mM
Maltose:
10 mM
Tab. 2.10: Reagenzien für die Puffer zur Aufreinigung von rekombinanten MBPFusionsproteinen
2.3.3.4 Reinigung von CBP-Fusionsproteinen
CBP-Fusionsproteine (UvrA) wurden affinitätschromatographisch über eine CalmodulinSepharose-Säule gereingt. Die Chromatographie beruht auf der Bindung von Calmodulinbindendes Protein aus der Myosin-leichte-Ketten-Kinase an das auf der Säulenmatrix
immobilisierte Calmodulin in Anwesenheit von Kalzium. Diese Bindung kann durch
Komplexierung von Kalzium mit EDTA wieder aufgehoben werden. Zur Proteinreinigung
wurde der Überstand des Ultraschallaufschlusses mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min
über eine Calmodulin-Säule geleitet. Nicht gebundene Proteine wurden duch Spülen der
Säule mit etwa 100 ml CBP-Bindungspuffer entfernt. Im Anschluß wurde das CBPFusionsprotein mit CBP-Elutionspuffer von der Säule eluiert. Die Proteine wurden dabei in
Fraktionen von 2 ml aufgefangen. In einer Polyacrylamidgelelektrophorese wurde die
60
II METHODEN
Reinheit der Proteine in den einzelnen Fraktionen analysiert und die Fraktionen vereinigt, die
das jeweilige rekombinante Protein als Hauptbestandteil enthielten. Die Proteine wurden
durch Ultrafiltration konzentriert oder einer Thrombinspaltung auf der Säule unterzogen, um
das gewünschte UvrA-Proteinfragment vom CBP-Fusionsanteil abzutrennen. Dann wurden
die aufgereinigten Proteine in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Puffer
CBP-Bindungspuffer
Reagenzien
Tris/HCl
50 mM pH: 8,0
NaCl
150 mM
Mercaptoethanol
10 mM
Mg-Acetat
1 mM
Imidazol
1 mM
CaCl2
1 mM
CBP-Elutionspuffer
Tris/HCl
EDTA
Tab.2.11: Reagenzien für die Puffer
rekombinanten CBP-Fusionsproteinen
2.3.4
50 mM pH: 8,0
7 mM
zur
Aufreinigung
von
Thrombinspaltung von CBP-Fusionsproteinen und Reinigung des
Spaltfragments
Das CBP-Fusionsprotein wurde auf die Affinitätschromatographiesäule aufgetragen und mit
75 ml CBP-Bindungspuffer (siehe 2.3.3.4) gewaschen. Im Anschluß wurde Thrombin (1
U/mg CBP-Fusionsprotein) in 30 ml CBP-Bindungspuffer zugesetzt. Die Spaltung erfolgte
nun durch Inkubation für 15 Stunden bei 4°C. Danach wurde die Calmodulin-Säule mit CBPBindungspuffer gewaschen und die gespaltenen Proteine wurden in Fraktionen von 2 ml
aufgefangen. In einer Polyacrylamidgelelektrophorese wurde die Reinheit der Proteine in den
einzelnen Fraktionen analysiert und die Fraktionen vereinigt, die das jeweilige rekombinante,
gespaltene Protein als Hauptbestandteil enthielten. Die Proteine wurden durch Ultrafiltration
konzentriert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
2.3.5 Konzentrierung von Proteinen durch Ultrafiltration
Das Prinzip der Ultrafiltration beruht darauf, dass eine Probenlösung durch eine
semipermeable Membran mit definierter Porengröße mittels Zentrifugalkraft gedrückt wird.
Die Membran kann vom Lösungsmittel und niedermolekularen Substanzen passiert werden,
während Proteine zurückgehalten werden. Je nach Molekulargewicht des zu konzentrierenden
Proteins kommen Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen zum Einsatz. Für die
Ultrafiltration standen Vivaspins (Vivascience, USA) und Centricons (Amicon, USA) mit
einer Porengröße von 10 bzw. 30 kD zur Verfügung. Die Proteinkonzentrierung mit den
61
II METHODEN
unterschiedlichen Membransystemen erfolgte nach den Angaben der Hersteller und wurde
anschließend in 20 mM K2HPO4, 500 mM MgCl2, 1 mM DTE pH 7,4 gelagert.
2.3.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zur gelelektrophoretischen Auftrennung von Proteinen aus Zelllysaten wurden vertikale
Polyacrylamidgele (9 cm x 6 cm x 0,75 mm) benutzt (LAEMMLI, 1970). Bei diesen handelte es
sich um aus Trenn- und Sammelgel bestehenden Stufengelen. Die Proben wurden mit SDSProbenpuffer versetzt und die Proteine fünf Minuten lang bei 95 °C denaturiert. Die
Gelelektrophorese erfolgte in einer Gelapparatur der Firma BioRad (Freiburg) bei konstanter
Stromstärke (35mA). Als Größenstandard wurden SDS-6H und SDS-7 von Sigma
(Deisenhofen) verwendet.
Sammelgelpuffer:
Elektrophoresepuffer:
w
0,4% /v SDS
w
0,4% /v SDS
Trenngelpuffer:
0,5 M Tris/HCl
1,5 M Tris/HCl
pH 6,8
pH 8,8
25 mM Tris/HCl, pH 8,3
190 mM Glycin
3,5 mM SDS
Trenngel (30 ml):
15%
12,5%
10%
9%
7,5%
Acrylamid/Bisacrylamidlösung (30:0,8)
15 ml
12,5 ml
10 ml
9 ml
7,5 ml
Trenngelpuffer
7,5 ml 7,5 ml
7,5 ml
7,5 ml
7,5 ml
H20
7,4 ml 9,9 ml
12,4 ml
13,4 ml
14,9 ml
10% w/v APS
200 µl 200 µl
200 µl
200 µl
200 µl
TEMED
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
Tab.2.12: Zusammensetzung des Trenngels
Sammelgel (10 ml):
3%
3,6%
3,9%
Acrylamid/Bisacrylamidlösung (30:0,8)
1,0 ml
1,2 ml
1,3 ml
Sammelgelpuffer
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
H20
6,5 ml
6,3 ml
6,2 ml
10% w/v APS
50 µl
50 µl
50 µl
TEMED
3 µl
3 µl
3 µl
Tab.2.13: Zusammensetzung des Sammelgels
62
II METHODEN
Nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine im Gel
für etwa 30 Minuten in einer Coomassie-Lösung gefärbt. Anschließend wurde das Gel bis zur
deutlichen Sichtbarkeit der Banden in Entfärberlösung entfärbt.
Färbelösung:
40% v/v Ethanol
10% v/v Essigsäure
0,2% w/v Serva Blue R 250
Entfärberlösung:
20% v/v Methanol
10% v/v Essigsäure
2.3.7 Western-Blot
Die in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine wurden für die Identifizierung
durch eine Hybridisierung mit Protein-spezifischen Antikörpern zunächst auf eine PVDFMembran übertragen. Diese Übertragung erfolgte durch Elektronentransfer in einer Fast-BlotApparatur (Biometra, Göttingen). Die Apparatur besteht im Wesentlichen aus einer Anodenund einer Kathodenplatte. Die Verbindung zwischen Anode und Kathode wird durch einen
„Sandwich“ aus Puffer getränkten Blotting-Papieren sowie der PVDF-Membran und dem
Polyacrylamidgel hergestellt: Zunächst wurden zwei Blottingpapiere in Anodenpuffer
getränkt und auf die Anodenplatte aufgelegt. Auf diese Papiere wurde die kurz in Methanol
geschwenkte PVDF-Membran aufgebracht, auf die sodann das Polyacrylamidgel aufgelegt
wurde. Das Gel wurde mit zwei Blotting-Papieren bedeckt, die zuvor in Kathodenpuffer
getränkt worden waren. Nun wurde die Kathodenplatte aufgelegt und es erfolgte der
Elektronentransfer der Proteine auf die Membran indem ein Stromfluß von 5 mA pro cm² der
Gelfläche angelegt wurde. Der Transfer war nach 20 Minuten abgeschlossen. Während des
Blotvorgangs wurde die Apparatur gekühlt. Der Nachweis eines bestimmten Proteines auf der
Membran beruht auf der spezifischen Bindung eines Primärantikörpers, der gegen ein Epitop
des Proteins gerichtet ist. Die Detektion erfolgt durch die Anlagerung eines gegen den ersten
Antikörper gerichteten Sekundärantikörpers, der mit Meerrettichperoxidase (horseradish
peroxidase, HRP) gekoppelt ist. Die Lokalisation dieser Peroxidase wird abschließend durch
die Zugabe eines chemischen Substrates nachgewiesen, das durch das Enzym unter
Entstehung von Licht umgesetzt wird. Diese chemische Lumineszenz wird zur Belichtung
eines Röntgenfilmes genutzt. Der Film wird dabei nur an den Stellen belichtet, an denen das
gesuchte Protein auf der Membran durch den Primärantikörper erkannt wurde. Um
unspezifische Antikörperbindungsstellen abzusättigen, wurde die PVDF-Membran im
Anschluß an den Elektronentransfer zunächst in Blockierungspuffer geschwenkt (1 Stunde
63
II METHODEN
bei RT oder über Nacht bei 4 °C). Anschließend wurde die Membran dreimal 5 Minuten bei
RT in PBST gewaschen und sodann der Primärantikörper in einer individuellen Verdünnung
(1:200 bis 1:100 in PBST mit 5% Magermilchpulver) aufgebracht. Die eingesetzten
Primärantikörper waren der Anti p53 Antikörper PAB 240, der gegen ein mittleres Epitop des
humanen p53-Proteins gerichtet ist, und der Anti p53 Antikörper Do-1, der gegen ein Nterminales Epitop des humanen p53-Proteins gerichtet ist. Die Membran wurde auf einem
Schüttler bei 4°C für 2 Stunden oder über Nacht mit dem Primärantikörper inkubiert. Im
Anschluß wurde die Membran kurz mit PBST abgespült und sodann unter ständigem
Schütteln bei RT dreimal für 5 min mit großen Volumina PBST gewaschen (> 4 ml/cm²). Als
Sekundärantikörper wurde ein Peroxidase-gekoppelter, gegen Mausantikörper gerichteter
polyklonaler Antikörper aus Schaf (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in einer
Verdünnung 1:10.000 in PBST mit 5% Magermilchpulver auf die Membran gegeben. Die
Membran wurde wiederum eine Stunde oder über Nacht bei 4°C unter Schütteln in dem
Antikörper inkubiert. Abschließend wurde die Membran erneut bei RT dreimal für 5 min mit
PBST gespült. Die Detektion der Proteine erfolgte durch chemische Lumineszenz mit dem
ECL
Western-Blot-Detektionskit
der
Firma
Amersham
(Freiburg).
Bei
dieser
Detektionsmethode wird ein zyklisches Diaclyhydrazid durch die an den Sekundärantikörper
gekoppelte Peroxidase in einen intermediären Acridinester umgesetzt, der weitergehend mit
Peroxid unter Lichtausstrahlung bei einem Emissionsmaximum von 430 nm reagiert. Die
Belichtung der hochempfindlichen Röntgenfilme (Autoradiographie-Filme Kodak X-OMAT,
Sigma, Deisenhofen) erfolgte für 1 bis 60 min.
Puffer
Reagenzien
Anodenpuffer
300 mM TrisHCl
100 mM Tricine
pH: 8,75
Blockierungspuffer
PBST
6% Magermilchpulver
Entwicklerlösung
Fixierlösung
Kathodenpuffer
Metinol (Agfa-Gevaert-AG, Leverkusen)
Agefix (Agfa-Gevaert-AG, Leverkusen)
30 mM TrisHCl
300 mM Capronsäure
PBST
PBS 1x
0,05% (w/v) Tween 20
Waschpuffer
PBST
0,6% Magermilchpulver
Tab.2.14: Reagenzien für die Puffer für Western-Blot-Analysen
64
II METHODEN
2.3.8 Dot-Blot
Zur Identifizierung mit Protein-spezifischen Antikörpern wurden die rekombinanten Proteine
bzw. die isolierten Proteine aus den unterschiedlichen Fraktionen aus Zellkulturmaterial
(siehe 2.1.6) in gleichen Volumina auf eine Nitrocellulose Membran aufgetragen. Nachdem
die Proteinmengen von der Nitrocellulose Membran aufgesogen waren, wurde die Membran,
zunächst 1 Stunde bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (Tab.2.12) geschwenkt, um
unspezifische Antikörperbindungsstellen abzusättigen. Danach wurde der weitere Ablauf
gewählt wie unter 2.3.7 beschrieben. Als Primärantikörper wurde der Anti p53 Antikörper
PAB 240 von Santa Cruz Biotechology eingesetzt, der gegen ein mittleres Epitop des p53Proteins
gerichtet
ist.
Der
eingesetzte
Sekundärantikörper
war
der
polyklonale
Schafsantikörper Anti-Maus-IgG, an den Meerrettichperoxidase gekoppelt war. Reagenzien
für die Puffer für Dot-Blot-Analysen entsprachen denen für die Western Blot Analyse.
2.4. Biophysikalische Meßmethode
2.4.1 Hybridisierung komplementärer Oligonukleotide
Zur Hybridisierung zweier chemisch hergestellter Oligodesoxynukleotide wurden jeweils 1
µg der beiden Oligodesoxynukleotide mit 2 µl 10x Restriktionspuffer 2 [New England
Biolabs (Schwalbach)] auf 20 µl mit dH2O aufgefüllt und zwei Minuten lang auf 94 °C
erhitzt. Die Hybridisierung erfolgte im sich langsam auf RT abkühlenden Heizblock.
Puffer 2:
10 mM MgCl2
50 mM NaCl
1 mM DTT
10 mM Tris/HCl, pH 7,9
2.4.2 DNA-Standardproben zum Einsatz im BIAcore
Für Messungen mit MutS und hMSH2 vk fand ein Homo- bzw. Heteroduplex von 36
Basenpaaren Länge Verwendung (Abb. 2.2.). Die Oligonukleotide wurden so gewählt, dass
in der Mitte der Stränge an Position 21 anstelle eines A/T Paares im Homoduplex ein A/G
Paar liegt. Die restlichen Basen wurden mit Hilfe des Primer Programmes des „Sequence
Analysis Software Package“ (Genetics Computer Group, GCG) entsprechend gewählt. Dabei
gab es ein ausgewogenes Verhältnis zwischen G/C Paaren zu A/T Paaren.
Die Hybridisierung geschah wie unter 2.4.1 beschrieben. Danach wurden die Proben über
Sensoroberflächen geleitet, die mit GST-hMSH2vk bzw. HisTag-MutS beladen waren. Zur
Überprüfung der prinzipiellen Eignung von HisTag-MutS für die Fehlpaarungs-Erkennung
waren die DNA-Proben mit Biotingruppen versehen und ihrerseits an Sensoroberflächen
65
II METHODEN
gekoppelt, die mit Streptavidin versehen waren (GOTOH et al., 1997). Das reverse Match
Oligonukleotid (Match rev, Abb. 2.2) war mit einer Biotingruppe am 5´Ende versehen und
konnte so zum Einsatz für den Homo- und Heteroduplex kommen. Die Hybridisierung fand
wie unter 2.4.1 beschrieben statt. Das Reparaturprotein wurde in diesen Experimenten als
löslicher Ligand eingesetzt.
Position
1
21
36
Mismatch fwd 5´ GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAG GTA ACC CAC TCG TGC 3´
5´ GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAA GTA ACC CAC TCG TGC 3´
Match fwd
5´ CGA CAA CTC TAG GTC AAG CT T CAT TGG GTG AGC ACG 3´
Match rev
Abb. 2.2: Darstellung der verwendeten Homo- und Heteroduplexe für die BIAcore-Experimente mit MutS
und hMSH2. Die mit rot unterlegten Buchstaben entsprechen dem Match- bzw. Mismatchbasenpaar im
Oligonukleotidstrang (siehe Material 9.1.). Es wurde der jeweilige fwd ("forward") Oligonukleotid mit dem rev
("revers") Oligonukleotid gepaart zu einen Mismatch bzw. Mismatchbasenpaar.
Für die Experimente mit dem Protein UvrA des Nukleotid-Exzisions-Reparatursystems
wurden DNA-Oligomere von 36 Basenpaaren Länge (TT-Dimer fwd und rev, Abb. 2.3)
verwendet. Die Homoduplexe wurden wie auch die DNA-Oligomere für die Messungen mit
MutS und hMSH2 vk hergestellt. Zur Erzeugung eines definierten Thymidindimers in der
Mitte der dsDNA-Sequenz wurde diese in einer Konzentration von 10 µM in einer UVBestrahlungslampe mit 380 J s-1 m-2 für 7 Minuten auf einem Eisbett bestrahlt. Eine Probe
wurde nicht mit UV-Licht behandelt und diente als Kontrolle in den Bindungsstudien.
TT-Dimer fwd
5´ GCT GAT GAG ATC CAG T T C GAG GTA TCC CAC TCT GC 3´
5´ CGA CTA CTC TAG GTC A A G CTC CAT AGG GTG AGA CG 3´
TT-Dimer rev
Abb. 2.3: Darstellung der verwendeten Homoduplexe mit Thymidindimer für die BIAcore-Experimente
mit UvrA. Die mit Gelb unterlegten Buchstaben entsprechen dem Thymididimer im Oligonukleotidstrang (siehe
auch II A Material 9.3.). Mit Rot ist die ausgebildete Doppelbindung zwischen den beiden Thymidinen
dargestellt.
Für Experimente mit XPA - einem weiteren Protein der DNA-Reparatur – wurde
Kalbsthymus DNA mit Cisplatin (Cis-Dichlorodiamine platinum (II)) behandelt. Die DNA
wurde mittels Ultraschallbehandlung zerkleinert und in 20 fachem Überschuß mit 20 µM
Cisplatin geschädigt. Beim Ultraschallaufschluß wurde das Ultraschallgerät der Firma
Branson, Modell 250/450 Sonifer (Branson, Schwäbisch Gmünd) eingesetzt. Die
66
II METHODEN
Kalbsthymus DNA wurde unter Eiskühlung insgesamt fünfmal (Leistungsstufe 4, Duty Cycle
40 %) für 10 Sekunden, mit jeweils einer Minute Pause auf Eis zwischen den 5
Behandlungszyklen, mit Ultraschall behandelt. Die Platinierungsreaktion wurde in einem
Phosphatpuffer (1 mM NaP; 3 mM NaCl pH 7.2) durchgeführt. Die Reaktion lief über Nacht
bei 37°C im Dunkeln ab. Durch Salzzugabe (Endkonzentration 500 mM NaCl) wurde die
Reaktion gestoppt, die DNA durch Ethanolfällung entsalzt und von Cisplatin befreit (JONES &
WOOD, 1993; MOGGS et al., 1996). Die Quantifizierung der DNA wurde photometrisch
durchgeführt.
Zum Einsatz in die biophysikalischen Messung mit Anti DNA-Addukt spezifischen
Antikörpern wurden 10 µg RNA-freie Kalbsthymus DNA mittels Ultraschallbehandlung auf
eine durchschnittliche Größe von 500 bp gebracht. Danach wurde die DNA durch
Ethanolfällung entsalzt und im 3 fachem Überschuß mit 3 mg/ml Ethyl-N-Nitrosoharnstoff
geschädigt. Die Alkylierungssreaktion wurde in folgendem Reaktionspuffer: 60 mM NaCl; 1
mM MES pH 6.0, 0.5 mM EDTA durchgeführt. Nach Inkubation für 60 min bei 37°C wurde
die DNA-Lösung zur Entfernung von niedermolekularen Substanzen über Centricon-3
Einweg-Mikrokonzentratoren (Molekulargewichtsausschlußgrenze: 3 kD) gereinigt. Der
molare Gehalt der DNA an O6-Ethylguanin wurde mit Hilfe eines kompetitiven
Radioimmunassay ermittelt und aus den erhaltenen Werten die durchschnittliche Anzahl der
O6-Ethylguanine pro DNA-Strang berechnet. Um auch einzelsträngige DNA in die
Oberflächenplasmonresonanz-Messungen einsetzen zu können, wurde ein Teil der mit
Ultraschall-behandelten DNA eine Minute bei 94°C inkubiert und dann direkt auf Eis
gelagert, bis sie in die Messungen eingesetzt wurden.
2.4.3 BIAcore Messungen
Um Wechselwirkungen wie die Assoziations- oder Dissoziationskinetiken zwischen zwei
unmarkierten Molekülen zu untersuchen, kann das BIAcore-System eingesetzt werden. Das
Detektionsprinzip beruht dabei auf der Oberflächen-Plasmonresonanz, einem optischen
Phänomen, das auftritt, wenn Licht unter bestimmten Bedingungen auf einen dünnen
leitenden Film einstrahlt (SZABO et al, 1995).
Der für die Messungen eingesetzte Sensorchip (Standardchip CM5, Research Grade) besteht
aus einer Glasschicht mit einem aufgedampften ca. 50 nm dicken Goldfilm und einer über
Thiolfunktionen
kovalent
gebundenen
Interaktionspartner, der Ligand,
Dextranmatrix,
an
die
einer
der
beiden
immobilisiert wird (CHAIKEN et al., 1992). Die
Carboxylgruppen der Dextranmatrix werden durch eine Mischung aus Carbodiimid und N-
67
II METHODEN
Hydroxysuccinimid aktiviert. Der Ligand wird über die gebildeten aktivierten Ester
immobilisiert. Im zweiten Schritt wurde nun der putative Interaktionspartner des Liganden in
einem kontinuierlichen Pufferstrom über das auf der Sensormatrix immobilisierte Protein
geleitet. Die Kopplung geschieht entweder durch eine kovalente (nicht-reversible) chemische
Kopplung oder durch Fänger-Moleküle (z.B. Antikörper), die den Liganden mit hoher
Affinität (reversibel) binden. Überschüssige reaktive Gruppen werden durch Ethanolamin
blockiert.
Die am häufigsten eingesetzte Methode ist die kovalente Kopplung über eine primäre
Aminogruppe (JOHNSSON et al., 1991), die z.B. in der Aminosäure Lysin vorhanden ist.
Weitere funktionelle Gruppen, die sich gut für eine Kopplung eignen, sind Thiole (in Cystein)
und Aldehyde (O´SHANNESSY et al., 1992). Als Fänger-Moleküle werden meistens Antikörper
eingesetzt, die hochspezifisch und mit hoher Affinität den Liganden binden. Die Antikörper
werden über ihren Fc-Anteil auf die Sensoroberfläche gekoppelt (DUBS et al., 1991).
Abb. 2.4 Immobilisierung eines Liganden auf der Sensoroberfläche (Quelle: www.biacore.com)
Auf die Gold enthaltende Grenzschicht zwischen der Glasschicht und der Dextranmatrix des
Sensorchips wird monochromatisches, linear polarisiertes und durch ein Prisma keilförmig
gebündeltes Licht eingestrahlt. Der Einstrahlwinkel wird dabei so gewählt, dass es nach den
Gesetzen der klassischen Physik zu einer Totalreflexion an der Grenzschicht zwischen dem
optisch dichteren Glas und der optisch dünneren Dextranmatrix kommt. Bei einem ganz
bestimmten
Einfallwinkel
kommt
es
jedoch
zu
einer
Kopplung
zwischen
der
elektromagnetischen Welle des einfallenden Lichts und den freien Elektronen des Goldfilms,
den sogenannten Oberflächenplasmonen. Dadurch kommt es zu einer teilweisen Absorption
der Energie des eingestrahlten Lichts, die dann als eine elektromagnetische Welle in die
Dextranmatrix eindringt. Die Eindringtiefe in das optisch dünnere Medium beträgt ungefähr
eine Wellenlänge des eingestrahlten Lichts. Darum weist das bei diesem Winkel reflektierte
Licht eine geringere Intensität als das eingestrahlte Licht auf. Der Winkel, bei dem dieses
optische Phänomen auftritt, wird SPR-Winkel genannt und ist direkt proportional zum
II METHODEN
68
Brechungsindex des otisch dünnen Mediums, der wiederum proportional zu den
Massenänderungen an der Sensoroberfläche ist.
Eine Bindung des Liganden an das immobilisierte Protein verursacht eine Massenänderung an
der Sensoroberfläche, was in einer Änderung des SPR-Winkels resultiert, die gemessen
werden kann. Die Änderung des SPR-Winkels ist in Näherung proportional zur
Masseneinlagerung innerhalb einer ca. 100 nm dicken Dextranschicht auf der Oberfläche des
Sensorchips. Im BIAcore-Gerät können Massenänderungen bis zu einer Entfernung von 100
nm von der Sensoroberfläche detektiert werden. Das im BIAcore-System gemessene Signal
wird in der Einheit RU (Resonance Unit) angegeben und in Abhängigkeit von der Zeit in
einem sogenannten Sensorgramm dargestellt (Abb.2.5). 1000 RU entsprechen einer SPRWinkelverschiebung von 0,1° Grad bzw. einer Massenänderung an der Sensoroberfläche von
1 ng*mm-2 (O´SHANNESSY et al., 1992). Mit Hilfe der BIAevaluation 3.0 Software können die
Sensorgramme kinetisch ausgewertet werden und sowohl die Assoziations- als auch die
Dissoziationsrate bestimmt werden (Abb.2.5).
Abb. 2.5 Darstellung eines Sensorgramms für einen BIAcore-Lauf. Die verschiedenen Phasen von Assoziation,
Dissoziation und Regeneration des Sensorgrammes sind hier dargestellt (Quelle: www.biacore.com).
2.4.4. Kopplung der einzelnen Liganden auf der Sensoroberfläche
Für den Einsatz zur Detektion von globalen, über das gesamte Genom verteilten
Schädigungen wurden die Reparaturenzyme auf der Sensoroberfläche immobilisiert, um sie
als Fängermoleküle für geschädigte DNA einzusetzen. Um eine korrekte räumliche
Anordnung in der Flußzelle des BIAcore-Systems zu garantieren, wurden alle eingesetzten
Reparaturenzyme über ihren Fusionsanteil an der Sensoroberfläche gekoppelt.
69
II METHODEN
Das mit GST fusionierte hMSH2vk wurde über den GST-Anteil an eine Anti-GST-Matrix
auf der Sensoroberfläche des BIAcore-Gerätes immobilisiert (LENZEN et al., 1998). Ein
polyklonaler Anti GST-Antikörper wurde wie oben beschrieben kovalent an die Oberfläche
gekoppelt (Abb. 2.6). Nach der Beladung der Oberfläche mit Anti GST-Antikörper wurde das
GSThMSH2vk Fragment in einer Konzentration von 200µg/ml mit einer Flußgeschwindigkeit
von 5µl/min über die Matrix geleitet. Im weiteren wurde über die mit GSThMSH2vk
beladene Matrix geschädigte und wt DNA geleitet. Die Oberfläche wurde durch Injektion von
3 M Guanidiniumchlorid und 0,5% SDS mit einer Flußgeschwindigkeit von 5µl/min wieder
regeneriert.
35000
Ethanolamin Deaktivierung
30000
SPR-Signal [RU]
25000
NHS/EDC
Aktivierung
20000
Anti GSTAntikörper
Immobillisierung
Immobilisierung
anti GST Antikörper
15000
10000
Grundlinie
5000
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
2400
2700
3000
Zeit [sec]
Abb. 2.6: Beispiel für die kovalente Immobilisierung eines Liganden (hier ein anti-GST-Antikörper) über
Aminkopplung auf einer CM-Dextran-Oberfläche. Die Oberfläche wird zunächst aktiviert mit einer Mischung aus
Carbodiimiden und N-Hydroxysuccinimiden (NHS/EDC), dann wird der Ligand unter optimierten Pufferbedingungen
gekoppelt und anschließend wird die Oberfläche deaktiviert mit Ethanolamin. Die Differenz zwischen der Grundlinie
und dem Signal nach der Deaktivierung entspricht der Menge an gekoppeltem Liganden.
MutS wurde mit dem Histidin-Tag über eine Ni2+-NTA-Matrix auf der Sensoroberfläche
immobilisiert (GERSHON & KHILO, 1995). Danach wurde über die MutS beladene Matrix
geschädigte und wt DNA geleitet. NTA als Ligand wird kovalent über seine primäre
Aminogruppe immobilisiert, ähnlich der Abb. 2.6. Bevor MutS auf die Matrix geladen wurde,
wurde jedesmal die Sensoroberfläche mit Nickel beladen. Dabei wird Nickel auf der
Sensoroberfläche durch Nitriloessigsäure-Reste gebunden und kann mit zwei Histidinresten
des Fusionproteins im Austausch gegen Wasser interagieren (Abb. 2.7). Nickel wurde in einer
1mM Lösung mit 5 µl/min über die Sensoroberfläche geleitet.
70
II METHODEN
Danach erfolgte die Beladung der Matrix mit MutS in einer Konzentration von 20 µg/ml mit
einer Flußgeschwindigkeit von 5 µl/min. Die Regeneration der Sensoroberfläche erfolgte mit
40 mM EDTA an, um das Nickel zu komplexieren und von der NTA-Matrix zu lösen. Danach
wurde mit 3 M Guanidiniumchlorid und 0,05% SDS die Matrix gewaschen.
Zur Überprüfung der prinzipiellen Eignung des Reparaturenzymes MutS für die
Fehlpaarungs-Erkennung wurden DNA-Oligomere von 36 Basenpaaren Länge mit
Biotingruppen versehen und ihrerseits an die Sensoroberfläche des BIAcore-Meßgerätes
immobilisiert (GOTOH et al., 1997). Zu diesem Zweck war die Sensoroberfläche zuvor mit
einer minimal-Streptavidin-Matrix beschichtet worden. (MORGAN &
TAYLOR,
1992).
Streptavidin ist ein tetrameres Protein, das aus vier identischen Untereinheiten besteht. Jede
Untereinheit bindet ein Molekül Biotin mit der Dissoziationskonstante Kd= 4∗10-15 M. Bei
minimal-Streptavidin handelt es sich um N- und C-terminal verkürztes Streptavidin mit
verbesserten proteinchemischen Eigenschaften gegenüber nativem Streptavidin bezüglich
Homogenität, Löslichkeit, Resistenz gegenüber Proteasen und sterischer Zugänglichkeit der
Biotin-Bindungstasche (SCHMIDT & SKERRA, 1994). Der Ligand Streptavidin wurde
entsprechend dem Verlauf in Abbildung 2.6 kovalent auf der Sensormatrix immobilisiert in
einer Konzentration von 10µg/ml mit einer Flußgeschwindigkeit von 3µl/min. 1µM
fehlgepaarter bzw. korrekt gepaarter DNA wurde mit einer Flußgeschwindigkeit von 5µl/min
auf der Streptavidin-Oberfläche immobilisiert. Danach wurde konzentrationsabhängig das
MutS über die DNA-Matrix mit einer Flußgeschwindigkeit von 5µl/min geleitet. Danach
NTA
Sensor-
MutS
oberfläche
fand die Regeneration der Sensoroberfläche mit 3M NaCl statt.
Abb. 2.7: Darstellung der Koppelung von MutS über den HisTag komplexiert mit Ni++ an die NTA
beladene Sensoroberfläche
XPA wurde ebenfalls über einen His-Tag auf der Sensoroberfläche immobilisiert und mit
Cisplastin-geschädigter DNA bzw. nicht geschädigter DNA inkubiert. Der Ablauf entsprach
dem, bei dem MutS als Fänger auf der Sensoroberfläche gekoppelt wurde. Die Beladung der
71
II METHODEN
Matrix mit XPA erfolgte, indem das Protein in einer Konzentration 0,02 g/l mit einer
Flußgeschwindigkeit von 5 µl/min über die Matrix geleitet wurde. 1µM Cisplatin geschädigte
oder wt-DNA wurde über das auf der Sensoroberfläche immobilisierte XPA geleitet. Die
Regeneration fand auch hier mit 40 mM EDTA statt.
Das Reparaturenzym UvrA wurde über das Calmodulin-bindende-Peptid (CBP) der LeichtenKetten-Kinase in Anwesenheit von Kalzium an die mit Calmodulin beschichtete DextranMatrix gebunden (BAGCHI et al., 1992). Die Beladung erfolgte, indem das Protein in einer
Konzentration von 0,4 g/l mit einer Flußgeschwindigkeit von 5 µl/min über die Matrix mit
Ca2+-haltigem Laufpuffer geleitet wurde. Nach der Inkubation der Sensormatrix mit dem
UvrA wurde anschließend mit Ca2+-haltigem Laufpuffer nachgewaschen, um überschüssiges,
nicht gebundenes Protein von der Matrix zu entfernen. Danach wurde UvrA ohne
Calmodulin-Bindungs-Peptid-Tag
in
einer
Konzentration
von
0,4
g/l
mit
einer
Flußgeschwindigkeit von 5µl/min über das immobilisierte UvrA in Anwesenheit von 2 mM
ATP geleitet. Auch hier wurde mit Ca2+-haltigem Laufpuffer nachgewaschen, um
überschüssiges, nicht gebundenes Protein von der Matrix zu entfernen. Im nächsten Schritt
wurden die UV-geschädigte und wt-DNA in einer Konzentration von 1µM über das
ausgebildete Dimer UvrA2 geleitet.
In weiteren Messungen wurde der Anti p53 Antikörper (Do-1) spezifisch für p53-Protein vom
Schwein über den sekundären Antikörper Anti-Maus Fcγ-Fragment auf der Sensoroberfläche
des BIAcore-Gerätes gebunden. Diese Matrix war zuvor durch kovalente Kopplung von AntiMaus
Fcγ-Fragment
Antikörpern
an
die
Dextranmatrix
hergestellt
worden.
Zur
Immobilisierung wurden 35 µl Anti p53 Antikörper (Do-1) in einer Konzentration von 4
µg/ml und der Anti p53 Antikörper (PAB 240) in einer Konzentration von 1 µg/ml mit einer
Flußgeschwindigkeit von 5 µl/min über die Matrix geleitet. Im Anschluß an einen
Waschschritt wurde jeweils rekombinantes p53-Protein vom Schwein in Konzentrationen von
0,05 bis 2 µM darübergeleitet (je 35 µl).
Zur Detektion von spezifischen Schädigungen wurde der Anti DNA-Addukt spezifische
Antikörper ER 6.7, der O6Alkylguanine erkennt, über eine indirekte Kopplung an die
Sensoroberfläche gebunden. Der polyklonale Antikörper Anti-Ratte IgG2b wurde mit 24
µg/ml kovalent auf der Sensoroberfläche des BIAcore-Gerätes immobilisiert. Dieser
Antikörper bindet an das Fcγ-Fragment des Anti Addukt spezifischen Antikörpers ER 6.7, so
dass deren Antigenbindungsstellen frei zugänglich bleiben sollten. Die Beladung der Matrix
mit dem Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 erfolgte, indem der Antikörper in einer
II METHODEN
72
Konzentration von 20 µg/ml mit einer Flußgeschwindigkeit von 5 µl/min über die Matrix
geleitet wurde. In Anschluß an einen Waschschritt mit Biocore-Messpuffer wurde DNA mit
einem einzelnen DNA-Addukt und wt DNA über die Matrix geleitet.
Die biotinylierte „Peptide Nucleic Acid“ (PNA) wurde über die spezifische Bindung
zwischen minimal-Streptavidin und Biotin auf der Sensoroberfläche gekoppelt. Der Vorteil
dieser Anordnung gegenüber einer direkten Immobilisierung der PNAs auf der
Dextranoberfläche ist erstens, dass ein räumlicher Abstand zwischen der Dextranmatrix und
den PNAs besteht, so dass die zu untersuchenden DNA-Oligonukleotide besser mit den PNAs
interagieren können, und zweitens dass die Kopplung der PNAs an das minimal-Streptavidin
eine korrekte räumliche Anordnung in der Flußzelle des BIAcore-System garantiert.
Zum Austesten der Hybridisierung von der einzelnen DNA-Oligonukleotide an die PNAOligonukleotide wurden jeweils unterschiedliche Konzentrationen der DNA-Oligonukleotide
in PBS-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4 und 0,1 mM EDTA, pH: 7,0) angesetzt. In
jedem Probenlauf wurden 35 µl der DNA-Oligonukleotid-Lösung über die auf der
Sensoroberfläche kovalent gekoppelten PNA-Oligonukleotide gespült und für 250 Sekunden
mit Puffer-Lösung nachgewaschen, die Flußgeschwindigkeit betrug jeweils 5 µl/min.
Zwischen den einzelnen Läufen wurde die Sensoroberfläche durch die Injektion von 30 µl 10
mM Salzsäure regeneriert.
Um DNA-Fragmente mit einer Punktmutation vor einem hohen Hintergrund an Wildtyp
DNA-Fragmenten zu detektieren, wurde Konzentration an Wildtyp-ras DNA-Oligonukleotid
langsam erhöht und die Konzentration an DNA-Oligonukleotiden mit der G12V-ras Sequenz
konstant gehalten. Dabei wurden folgende G12V/Wildtyp – Verhältnisse eingesetzt: 1:1, 1:10
und 1:100. Bei einem weiteren Experiment wurde die Konzentration an Wildtyp-ras DNAOligonukleotid konstant gehalten und die Menge an G12V-ras DNA-Oligonukleotid von Lauf
zu Lauf weiter reduziert. In jedem Probenlauf wurden 35 µl der G12V/Wildtyp DNAOligonukleotid Lösung über die Senoroberfläche gespült und für 250 Sekunden mit PufferLösung nachgewaschen, die Flußgeschwingigkeit betrug jeweils 5 µl/Minute. Zwischen den
einzelnen Läufen wurde die Sensoroberfläche mit 10 mM Salzsäure regeneriert.
Alle Messungen wurden bei 20°C durchgeführt. Die erhaltenen Meßdaten wurden mit dem
Computerprogramm Biaevaluation 3.0 (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) nach den Angaben
des Herstellers ausgewertet.
III ERGEBNISSE
73
III Ergebnisse
Wesentliche Schritte genotoxischer Ereignisse spielen sich auf molekularer Ebene ab. Auf
diese Ereignisse wird bei der Überprüfung kanzerogener und mutagener Eigenschaften von
chemischen Verbindungen in der Gentoxikologie fokussiert. Bei der molekularen Analyse
von mutagenen Schädigungen stehen dabei solche Indikatoren im Vordergrund, mit denen
globale, über das gesamte Genom verstreut erfolgende Schädigungen nach Behandlung mit
potentiell mutagenen Agenzien auch vor dem Hintergrund eines hohen Überschusses an unveränderter DNA nachgewiesen werden können.
Mutagene Substanzen können Struktur und Sequenz der DNA verändern. Die meisten dieser
Veränderungen werden sofort repariert, andere sind für die betroffene Zelle letal. In beiden
Fällen wird die Mutation somit nicht weitergegeben. Überlebt die Zelle hingegen die Schädigung und findet eine Replikation statt, ohne dass es zur Reparatur gekommen ist, so wird die
DNA-Modifikation mit den Tochterzellen weitergegeben. Während zufällige über das gesamte Genom verteilte Schädigungen i.d.R. keinen Selektionsvorteil bringen, sind Sequenzmutationen in Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen für die weitere Zellentwicklung von großer Bedeutung. Sie führen zu einer erhöhten Proliferationsrate der betroffenen
Zelle. DNA-Schädigungen treten im Leben einer normalen Zelle ständig auf und können sowohl durch äußere Einflüsse (Ernährung, Umweltchemikalien usw.) als auch durch innere
Einflüsse (Replikationsfehler, Stoffwechselendprodukte) bedingt sein.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Testsystem zur Detektion von unspezifischen und
spezifischen DNA-Schädigungen zu etablieren, um Stoffe und Verbindungen hinsichtlich
ihres mutagenen Potentials auf Primärzellkulturmaterial (hier aus Schweineharnblasen und
Rinderkolon) zu untersuchen. Hierbei war vorgesehen, DNA-Reparturenzyme als Fängermoleküle in ein biophysikalisches Meßsystem zu integrieren, mit dem Ziel unspezifische Veränderungen in der DNA nachzuweisen. In einem zweiten Ansatz wurde versucht, die zellkernspezifische Akkumulation des „Wächterproteins“ p53 in den behandelten Primärzellkulturen
als Hinweis auf DNA-Schädigungen zu detektieren. In einem weiteren Ansatz wurde dann
auf spezifische DNA-Schädigungen fokussiert. Mit Hilfe von DNA-Addukt spezifischen Antikörpern als Fängermoleküle in einem biophysikalischen Meßsystem wurde versucht, DNAAddukte in der DNA behandelter Zellen zu detektieren. In einen zweiten Ansatz wurde das
Protoonkogen p21 ras als Sonde für Mutationsereignisse verwendet. Hierbei fanden PNAAnaloga mit der korrespondierenden Sequenz des p21 ras-Gens wurden zur Detektion von
Einzelbasenfehlpaarungen Verwendung.
III ERGEBNISSE
74
Wichtige Grundlage für den reibungslosen Ablauf des Testsystems war die Etablierung der
Primärzellkultur von Rinderkolonepithelzellen (BIRKNER et al., 1998) und Schweineharnblasenepithelzellen (GUHE, 1994) im Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund. Der nächste Schritt zur Detektion von DNA-Schädigungen in behandeltem Zellkulturmaterial war die reproduzierbare Isolierung von DNA aus den kultivierten Epithelzellen.
Diese wurde in der vorausgegangenen Diplomarbeit (PLAß,1996) eingeführt.
3.1 Nachweissysteme für globale, unspezifische DNA-Schädigungen
3.1.1 Mutagenitätstests
3.1.1.1 Zellkultur mit epithelialen Primärzellen
Die Kultivierung von primären Schweineharnblasenepithelzellen wurde von GUHE 1994 etabliert. Rinder-Dickdarmepithelzellen wurden nach mechanischer Entfernung der Epithelschicht
mit Verdauungsenzymen (Kollagenase I) isoliert. In einer Mischung aus Leibovitz L-15 und
SMEM-Medium (1:1) mit 10 % FCS plus Antibiotika wurden die Zellen in Kollagen I - beschichteten Kulturflaschen kultiviert. Eine positive Markierung mit Anti-Cytokeratin 7 und
13- Antikörpern konnte die epitheliale Herkunft der Zellen bestätigen. Die Inkubation mit
Anti-Vimentin-Antikörpern zeigte keine Markierung. Die in Zellkultur erhaltene sekretorische Funktion der Dickdarmepithelzellen konnte mit Schiff´scher Reaktion, Pass-Reaktion
und Alcian-Blau-Färbung nachgewiesen werden. Diese Versuche wurden am Institut für Arbeitsphysiologie in Dortmund von Herrn Sascha Birkner durchgeführt und die Ergebnisse wie
auch das Zellkulturmaterial für die Inkubationsversuche (siehe 1.2.2.) freundlicherweise zur
Verfügung gestellt.
3.1.1.2 Inkubationsversuche mit anschließender DNA-Isolierung
Die Inkubationsversuche wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Sascha Birkner am Institut für
Arbeitsphysiologie durchgeführt. Die Ernte der Zellen wie auch die Isolierung der DNA aus
den behandelten Zellen fanden am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie statt. Primärzellkulturen von Rinderharnblasenepithelzellen wurden in gewöhnlichem Medium sowie
mit 250µM 2-Acetylaminofluoren (2AAF) behandelt, und aus je einer 75 cm² Kulturschale
ca. 5-7 x106 Zellen für die DNA-Isolierung eingesetzt. Parallel wurde die DNA von Kontrollzellen isoliert. 2 AAF wurde in den Inkubationsversuchen in Konzentrationen eingesetzt, die
beim Schwester-Chromatid-Austausch und der unplanmäßigen DNA-Synthese (UDS) muta-
III ERGEBNISSE
75
gene Effekte zeigten. 2-Acetylaminofluoren ist ein aromatischer Kohlenwasserstoff, der erst
metabolisch aktiviert werden muß, bevor er systemisch kanzerogen wirksam wird.
Bereits in der vorangegangenen Diplomarbeit (PLAß, 1996) wurde die Isolierung von DNA
aus kultivierten Harnblasenepithelzellen demonstriert. Die genomische DNA wurde unter
Verwendung der Restriktionsendonukleasen RSA I und Hae III (siehe Abb. 3.1 Spur 3) auf
eine Größenverteilung um etwa 800 ± 400 Basenpaaren verdaut, um das Probenmaterial für
die spätere biophysikalische Analytik vorzubereiten.
Basen-
L
M
1
2
3
4
5
6
paare
2000
1200/1300
1000
702
400/500
Abb. 3.1: Größenverteilung nach Verdau von genomischer DNA mit 5 verschiedenen Restriktionsenzymen. Je 5 µg genomischer DNA wurden mit Kombinationen von 5 verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37° C wurden die DNA-Fragmente auf einem 2% Agarose-Gel
aufgetrennt. Die Restriktionsenzyme wurden mit je 20 Units/µl Verdau-Ansatz eingesetzt (Spur 1: λ-Marker;
Spur 2: 1 kb-Marker Spur 3: Hae III / RSA I; Spur 4: Dra I / EcoR V; Spur 5: Ecor V / Alu I; Spur 6: RSA I /
Dra I; Spur 7: Dra I / Alu I; Spur 8: Dra I / Hae III)
3.1.1.3 Inkubationsversuche mit anschließender Proteinisolierung
Auch bei diesen Versuchen wurden die Inkubationen mit kanzerogenen Stoffen am Institut für
Arbeitsphysiologie durchgeführt. Die Ernte der Zellen wie auch die Isolierung der verschiedenen Proteinfraktionen aus den behandelten Zellen wurde am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie durchgeführt. Primäre Rinderharnblasenepithelzellen wurden mit 100 µM
N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin (MNNG) in gewöhnlichem Medium inkubiert. MNNG ist ein
Alkylants, das ohne metabolische Aktivierung direkt genotoxisch wirksam ist. Hierfür wurden
75 cm² Kulturflaschen mit ca. 7 x 106 Zellen eingesetzt. Die Rinderharnblasenepithelzellen
wurden in einem weiteren Ansatz mit 100 µM 2-Acetylaminofluoren (2-AAF, siehe 3.1.1.2)
in gewöhnlichem Medium inkubiert. Aus den behandelten Zellen wurden, verändert nach
NEUFELD & WHITE (1997), die zytosolischen und nukleären Fraktionen der zellulären Protei-
III ERGEBNISSE
76
ne isoliert. Die isolierten Proteinfraktionen aus den behandelten Zellen wurden dann (siehe
Ergebnisse 3.1.2.5.3) zur Lokalisation von p53 in den beiden Fraktionen eingesetzt.
3.1.2 Aufbau eines biophysikalischen Meßsystems für unspezifische
DNA-Schädigungen
3.1.2.1 Oberflächen Plasmon Resonanz und BIAcore 1000
Im BIAcore–System kann die Wechselwirkung zwischen einem an einem Sensorchip immobilisierten und einem in der Reaktionslösung befindlichem Interaktionspartner über den
Effekt der Oberflächen-Plasmonresonanz in Echtzeit untersucht werden (JÖNSSON et al. ,
1991). Dabei wird einer der Interaktionspartner kovalent auf der Sensoroberfläche gekoppelt
und der gelöste zweite Interaktionspartner wird über die Oberfläche geleitet (siehe Methoden
2.4.3). Mit dem BIAcore-System ist es so z.B. möglich, verschiedene DNA-Proben über
einen Fänger für DNA-Schädigungen zu leiten, der selektiv und spezifisch geschädigte DNA
der Probe bindet.
3.1.2.2 DNA-Reparturenzyme als Fängersysteme
Das menschliche Genom besteht aus einer Sequenz von 3 x 109 Basenpaaren, deren exakte
Duplikation Voraussetzung für das Überleben von Zellen und die Funktionsfähigkeit des Organismus ist. Um die erforderliche Präzision zu erreichen, bedarf es DNA-Polymerasen, die
eine außergewöhnlich exakte Kopierfähigkeit haben sowie Reparaturmechanismen, die DNASchäden vor und nach der Replikation erkennen und entfernen. Solche Reparaturproteine
können prinzipiell als Fängermoleküle in biophysikalischen Meßsystemen eingesetzt werden,
um die geschädigte DNA (z.B. aus behandelten Kulturen von Primärepithelzellen) zu detektieren. In dieser Dissertationsarbeit wurden die Reparaturenzyme hMSH2, MutS, UvrA und
XPA eingesetzt (siehe Methoden 2.4.4.).
3.1.2.3 Expression und Reinigung von den Reparaturenzymen des Fehlpaarungssystems
3.1.2.3.1 hMSH2-Fragment mit DNA-Bindungs- und ATP-Aktivierungsregion
Ein verkürztes Konstrukt von humanem hMSH2 (hMSH2vk) mit N-terminalem GSTFusionsanteil konnte mit dem E.coli BL21-pGEX2T Expressionssystem hergestellt und durch
GSH-Affinitätschromatographie isoliert werden. Das Konstrukt umfasst 768 Basenpaare und
kodiert für ein 54,4 kD schweres Proteinfragment inklusive GST-Fusionsanteil. hMSH2vk
wurde dazu aus dem Lagerungsvektor pBS(sk+)hMSH2 (siehe VII. Anhang) über BamHI/EcoRI Schnittstellen in pGEX2T kloniert. Das vorliegende Konstrukt umfasst die Regio-
III ERGEBNISSE
77
nen von Base 1971 bis Base 2640, die nach der Sekundärstrukturvorhersage (EMBL, The
Predict Protein Server) und nach der von WHITEHOUSE et al. (1997) beschriebenen Minimaldomäne von hMSH2 zur DNA-Bindung ausreichend sein sollte. Das Konstrukt enthält eine
Region von 195 Aminosäuren (585 bp) aus dem C-Terminus von hMSH2 die ausreichend ist,
um DNA mit Fehlpaarungen zu erkennen und zu binden. Essentiell für die Fehlpaarungserkennung ist eine weitere Region von 73 Aminosäuren (219 bp) im C-Terminus, die ATPase
Aktivität aufweist (WHITEHOUSE et al., 1997). Auch diese Region ist Bestandteil des Konstruktes.
1
M
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
kDa
66
45
36
hMSH2vk
29
24
14
Abb.3.2: Reinigung des rekombinanten hMSH2-Proteinfragmentes hMSH2-DNA-Bindungsund ATP-Aktivierungsregion mit N-terminalen GST-Fusionsanteil aus E.coli-BL21-Zellen. Die
Abbildung zeigt Proben der folgenden Reinigungsschritte in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese: M) Molekulargewichtsmarker SDS7, 1) unlösliche Proteinanteile des Zellsaufschlusses, 2) lösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 3) nicht gebundene Proteinanteile, 4-14 ) verschiedene Fraktionen von GSThMSH2vk nach Elution von der GSH-Sepharose-Säule
Induktion der Expression mit 10 µM IPTG bei einer OD600 von 0,6 lieferte nach ca. 15 Stunden Inkubation bei 25°C lösliches Protein, das über GSH-Affinitätschromatographie gereinigt
wurde. Die Ausbeute lag bei der hMSH2vk Expression bei ca. 4 mg Protein aus 10 Litern
Bakterienkultur. Neben dem rekombinant expremierten hMSH2vk–Fragment mit einem Molekulargewicht von ca 54 kD zeigt die SDS-Gelelektrophorese noch ein zweites Fragment bei
ca. 66 kD (siehe Abb.3.2). Die leichten Verunreinigungen unter 50 kD des hMSH2vkFragments nach der Affinitätschromatographie (Abb.3.2) wurden durch Fällung des Proteins
bei einer 75 prozentigen Ammoniumsulfatkonzentration entfernt. Das hMSH2vk-Fragment
wurde auf etwa 4 mg/ml konzentriert. Da das Protein leicht degradierte, wurde die aufgereinigte Fraktion in flüssigem Stickstoff tröpfchenweise schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Das Protein war zu 80 % rein. In Westernblotanalysen wurde das gefällte und resuspendierte
Fusionsprotein in 20 mM K2HPO4, 0.5 mM MgCL2, 1 mM DTE pH 7.4 eingesetzt.
III ERGEBNISSE
78
Die anschließende Westernblotanalyse mit einem anti-GST-Antikörper zeigte, dass das untere
Fragment in der gepoolten Fraktion ein GST-Fusionsprotein war (Abb. 3.2). Das Fragment
von ca. 66 kD konnte im Westernblot vom anti-GST-Antikörper nicht detektiert werden. Das
GST-Fusionsprotein hatte in der Westenblotanalyse die erwartete Größe von ca. 54 kD (Abb.
3.3, Spur F). Das als Referenz eingesetzte Fusionsprotein GSTRanBP1 (Abb. 3.3, Spur K) hat
ein Molekulargewicht von 49.5 kD und läuft auf ungefähr der gleichen Höhe wie das
hMSH2vk–Fragment. Die Referenzprobe ist ein GST-Protein von 26 kD fusioniert mit HTF9Protein der Maus-Variante von Ran BP1 mit N-terminalen GST-Fusionsanteil von ca. 50 kD.
DNA-Reparaturproteine wie hMSH2 zeigen in der Literatur unterschiedliche Bindungsstärken
für DNA-Oligomere mit korrekter Basenpaarung im Vergleich mit fehlgepaarten Oligomeren
(WHITEHOUSE et al., 1997). Das vorliegende Konstrukt wurde in Retardationsexperimenten
hinsichtlich seiner Bindungseigenschaften für 32P-markierte DNA-Oligomere untersucht. Die
Bindung des Proteins an die DNA-Proben führt zu einer Verzögerung der Oligomerenwanderung durch ein analytisches Agarosegel. In den Gelshiftanalysen unterscheidet sich die Erkennung von fehlgepaarten zu korrektgepaarten Oligomeren durch das hMSH2vk-Fragment
um den Faktor 4. Diese Experimente wurden von Guido Böse aus der AG Tumorgenetik am
Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie durchgeführt.
Z
F
K
kDa
~ 50
26
Abb. 3.3: Western-Blot des rekombinanten GST-hMSH2-Proteinfragmentes mit
DNA-Bindungs- und ATP-Aktivierungsregion. Die Abbildung zeigt die Detektion von
hMSH2vk: Z) Unlösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, F) hMSH2-DNABindungs- und ATP-Aktivierungsregion mit N-terminalen GST-Fusionsanteil nach Fällung mit 75 % Ammoniumsulfat und Resuspension in 20 mM K2HPO4, 0.5 mM MgCL2,
1 mM DTE pH 7.4, K) 0,6 µg der Kontrolle mit GST-Protein (26 kD) fusioniert mit
HTF9-Protein (Maus-Variante von Ran BP1) mit N-terminalen GST-Fusionsanteil ( 49,5
kD).
Als weiterer Marker für funktionelle Aktivität von hMSH2vk wurde die ATPase-Aktivität
des Fragmentes über HPLC analysiert. Der Ansatz wurde so gewählt, dass 5µM Protein mit
100 µM ATP, 10µM MgCl2 in 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl pH 7,9 inkubiert wurde.
Hierbei zeigte sich eine signifikante Erhöhung der ATPase-Aktivität in Gegenwart von fehlgepaarten DNA-Proben, die chromatographisch verfolgt werden konnte. Die Experimente mit
III ERGEBNISSE
79
dem vorliegenden Konstrukt von hMSH2 wurden von Guido Böse aus der AG Tumorgenetik
in Zusammenarbeit mit Peter Rudolph durchgeführt (BÖSE, 2000).
3.1.2.3.2 Expression und Reinigung von MutS
MutS-Protein mit Wildtypsequenz
Bakterielles MutS Protein mit N-terminalem Hexahistidin-Tag (His 6) wurde mit dem E.coli
CK600-pQE32-Expressionssystem hergestellt und durch Ni2+-NTA-Agarose-Säule isoliert.
MutS umfasst 2561 Basenpaare und kodiert für ein 97 kD schweres Protein mit His6Fusionsanteil. Hierzu war das MutS Gen zunächst unter Verwendung von nicht degenerierten
Oligonukleotiden, die anhand der Datenbanksequenz von MutS (AC M64730) entworfen
worden waren, aus TG1 Zellen amplifiziert worden. In einem zweiten Amplifikationsschritt
wurden die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Sph I und Pml I eingeführt, so dass
MutS in den Vektor pQE32 Typ IV (Qiagen) einkloniert werden konnte.
Induktion mit 10 µM IPTG bei einer OD600 von 0,3 lieferte nach ca. 15 Stunden bei 30 °C
lösliches Protein, das über Ni2+-NTA-Agarose-Säule aufgereinigt wurde. Die Ausbeute lag
bei ca. 3 mg Protein aus 2 Litern Bakterienkultur. MutS war nach dieser Affinitätschromatographie nur noch leicht mit anderen Proteinen verunreinigt (siehe Abb.3.4).
Um die Funktionalität von MutS zu überprüfen, wurde die ATPase-Aktivität mittels HPLC
bestimmt. 5µM Protein wurden mit 100 µM ATP und 10µM MgCl2 inkubiert in 20 mM TrisHCl, 200 mM NaCl pH 7,9. Hierbei zeigte sich eine signifikante Erhöhung der ATPaseAktivität in Gegenwart von fehlgepaarten DNA-Proben, die chromatographisch verfolgt werden konnte (BÖSE, 2000). Gleichzeitig wurde auch festgestellt, dass Ammoniumsulfatfällung
die Aktivität des Proteins nicht beeinflusst. Nach Fällung von MutS bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 75 % wurde die Proteinlösung bei 40.000 x g abzentrifugiert und in 20
mM K2HPO4, 500 mM MgCl2, 1 mM DTE pH 7,4 resuspendiert. Die Konzentration von
MutS betrug etwa 3 mg/ml. Das Protein wurde in flüssigem Stickstoff in kleinen Aliquots
schockgefroren und war zu fast 80 % rein. Gelagert wurde es bei – 80°C.
Das bakterielle DNA-Reparaturenzym MutS zeigt ebenso wie das humane Homolog hMSH2
unterschiedliche Bindungsstärken für DNA-Oligomere mit korrekter Basenpaarung gegenüber fehlgepaarten Oligomeren. FENG & WINKLER (1995) haben zeigen können, dass natives
MutS und rekombinantes MutS mit His6-Fusionsanteil äquivalent fehlgepaarte DNAOligomere erkennen können. Das vorliegende Fusionsprotein His6-MutS wurde in Retardationsexperimenten hinsichtlich seiner Bindungseigenschaften für
32
P-markierte DNA-
III ERGEBNISSE
80
Oligomere untersucht. Die Erkennung von fehlgepaarten zu korrektgepaarten Oligomeren
unterscheidet sich in den Gelshiftanalysen um den Faktor 2.
KDa
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
M
205
116
97,4
66
His6MutS
45
29
Abb.3.4: Reinigung des rekombinanten Wildtyp MutS-Proteines mit N-terminalen His6Fusionsanteil aus E.coli-CK600-Zellen. Die Abbildung zeigt Proben der folgenden Reinigungsschritte in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese: M) Molekulargewichtsmarker SDS6, 1) unlösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 2) lösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 3)
Durchlauf nach Auftragung auf die Ni2+-NTA-Agarose, 4-13) Fraktionen von His6MutS nach Elution von der Ni2+-NTA-Agarose-Säule mittels Imidazol-Gradient.
verkürzte MutS-Fragmente
Zwei verkürzte Konstrukte von MutS (MutS vk und MutS vkl) mit N-terminalem GSTFusionsanteil wurden mit dem E.coli BL21-pGEX2T Expressionssystem hergestellt und
durch GSH-Affinitätschromatographie isoliert.
Auf Grundlage des vorliegenden humanen hMSH2vk-Fragmentes (siehe 1.4.1) wurde versucht auch von MutS aus E.coli jene Bereiche festzulegen, die hochaffin geschädigte DNA
binden und auch ATPase Aktivität aufweisen. Mit Hilfe eines Proteinsequenz-Vergleiches
von hMSH2 (AC P43246) und MutS (AC P23909) wurde eine entsprechende Sequenz von
MutS in der Datenbankanalyse mit dem „Sequence Analysis Software Package“ (Genetics
Computer Group Inc., GCG) ermittelt. Ein Abgleich dieser Sequenz mit der Sekundärstrukturvorhersage vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL, The Predict Protein
Server) lieferte zwei verkürzte Fragmente des MutS-Proteins, die den Anforderungen entsprechen und aufgrund fehlender Einschnitte in Sekundärstrukturelemente lösliche Proteine liefern sollten. Das erste Fragment (MutS vk) entsprach weitestgehend dem Konstrukt von
hMSH2vk (Proteinsequenz 604-850 AS bzw. DNA-Sequenz von Base 2491 bis Base 3229),
das 738 bp umfaßt und für ein 53,3 kD schweres Protein mit GST-Fusionsanteil kodiert. Da
III ERGEBNISSE
81
der Anfang des Fragmentes laut Sekundärstrukturvorhersage in einer Loopkonfiguration lag,
wurde noch ein zweites Fragment hergestellt (MutS vkl). Die beiden Fragmente umfassen im
hinteren Teil den kompletten C-Terminus von MutS. Muts vkl umfaßt 858 bp von Base 2371
bis Base 3229 (Proteinsequenz 564-850 AS) und kodiert für ein 57,8 kD schweres Protein mit
GST-Fusionsteil. Dieses Fragment umfaßt die gesamte Loopstruktur und den kompletten CTerminus von MutS. Der Vergleich der beiden Sequenzen von MutS und hMSH2 ist in Abbildung 3.5 dargestellt.
645 QDEIAFIPNDVYFEKDKQMFHIITGPNMGGKSTYIRQTGVIVLMAQIGCF
|| | .
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591 VLNEPFIANPLNLSPQRRML.IITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIGSY
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.
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695 VPCESAEVSIVDCILARVGAGDSQLKGVSTFMAEMLETASILRSATKDSL
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640 VPAQKVEIGPIDRIFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSL
.
.
.
.
.
745 IIIDELGRGTSTYDGFGLAWAISEYIATKIGAFCMFATHFHELTALANQI
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690 VLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACAENLANKIKALTLFATHYFELTQLPEKM
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.
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795 PTVNNLHVTALTTEETLTMLYQVKKGVCDQSFGIHVAELANFPKHVIECA
| |.|. ||
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740 EGVANVHLDALEHGDTIAFMHSVQDGAASKSYGLAVAALAGVPKEVIKRA
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845 KQKALELEEFQYIGESQGYDIMEPAAKKCYLEREQGEKIIQEFLSKVKQM
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.
|
.
|
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| | .
790 RQKLRELESISPNAAATQVD....GTQMSLLSVPEETSPAVEALENLDPD
.
895 PFTEMSEENITIKLKQL 911
|
:|| |
836 SLTPRQALEWIYRLKSL 852
694
639
744
689
794
739
844
789
894
835
Abb.3.5: Proteinsequenzvergleich von hMSH2 (AC P43246) und MutS (AC P23909) mit dem „Sequence Analysis Software Package“ (Genetics Computer Group Inc., GCG). Gezeigt ist die C-terminale Region von AS 659 bis
AS 899 (240 Aminosäuren, Gelb unterlegt) des hMSH2-Proteins im Vergleich zum MutS-Protein (AS 604 bis AS 841,
rot unterlegt), die ausreichend ist, um DNA mit Fehlpaarungen zu erkennen und zu binden (WHITEHOUSE ET AL., 1997).
Die beiden Konstrukte MutS vk und MutS vkl wurden über BamHI/EcoRI in pGEX2T kloniert, die zugrundeliegende MutS Sequenz lag im pQE32(Typ IV)-Vektor vor (siehe
3.1.3.2.1). Die rekombinanten Vektoren wurden in den E.coli-Expressionsstamm BL21 transformiert und in Ampicillin-haltigem LB-Medium kultiviert. In Induktionstests wurden verschiedene Bedingungen für die beiden vorliegenden Konstrukte ausgetestet. Bei keiner der
ausgetesteten Bedingungen konnte in ausreichenden Mengen lösliches Protein gewonnen
werden.
III ERGEBNISSE
82
Auch nach Variation verschiedener Parameter wie z.B. IPTG-Konzentration und Expressionsdauer konnte unter allen getesteten Bedingungen kein lösliches GST-MutS-Konstrukt (vk
oder vkl) gewonnen werden. Eine SDS-Gelelektrophorese des Zellaufschlusses der vermeintlich besten Bedingungen für die beiden eingesetzten Konstrukte von MutS und eine anschließende Western-Blot-Analyse (Abb. 3.6) zeigte, dass nur in der unlöslichen Fraktion des Zellaufschlusses Proteinanteile mit dem Anti-GST-Antikörper detektiert werden konnten. Als
Referenzprobe wurde ein GST-Fusionsprotein (GST-RanBP1) mit N-terminalen GSTFusionsanteil und einem Molekulargewicht ca. 50 kD aufgetragen.
Z1
Z2
K1
K2
kDa
~ 50
kDa
~ 50
26
Abb. 3.6: Detektion des rekombinanten MutS-Proteinfragmentes vk und vkl mit N-terminalen
GST-Fusionsanteil aus E. coli-BL21-Zellen durch Western Blot mit Anti-GST Antikörper. Die
Abbildung zeigt die Detektion von GST-MutS Konstrukten in folgenden Proben auf dem Röntgenfilm: Z1) unlöslichen Proteinanteile des Zellaufschlusses von MutS vkl (57,8 kDa), Z2) unlösliche
Anteile des Zellaufschlusses von MutS vk (53,5 kD), K) 1µg (K1) und 0,5µg (K2) GST-RanBP1
(49,5 kD).
26
3.1.2.3.3 Expression und Reinigung von UvrA
Der für das komplette UvrA-Protein (104 kD) kodierende Genabschnitt umfaßt 2822 Basenpaare (HUSAIN et al., 1986). Der Genabschnitt wurde in den Vektor pCal N mit einem Nterminalen Calmodulin-Bindungs-Peptid-Tag (CBP) einkloniert, um dann in den E.coliExpressionsstamm BL21 transformiert zu werden. Die Expression des UvrA erfolgte bei 25°C
bis zu einer OD600 von 0,3 durch Zugabe von IPTG (100 µM Endkonzentration). Nach einer
Expressionsdauer von 15 Stunden wurden die Bakterien abzentrifugiert.
Die Suspension der Bakterienzellen geschah in CBP-Bindungspuffer, Aufschluß der Bakterienzellen durch sanfte Ultraschallbehandlung. Nach Zentrifugation wurde der Überstand über
eine Calmodulin-Sepharose-Säule geleitet (Methoden 2.3.2 und 2.3.3.4). Eine SDSGelelektrophorese der aufgefangenen Fraktionen zeigte, dass UvrA nach der Affinitätschromatographie noch stark mit anderen Proteinen verunreinigt war (Abb. 3.7). Es wurde parallel
dazu versucht, UvrA ohne den Fusionstag CBP aufzureinigen. Dazu wurde ein proteolytischer
Thrombinverdau von UvrA direkt auf der Säule durchgeführt, um das gespaltene UvrA mit
CBP-Bindungspuffer von der Säule zu eluieren. Durch Fällung der verunreinigten Proteine
III ERGEBNISSE
83
mit 3,4 M Ammoniumsulfat wurden CBP-UvrA und UvrA aufkonzentriert. Die Proteine wurden bei 40.000 x g abzentrifugiert und in 20 mM K2HPO4, 500 mM MgCl2, 1 mM DTE pH
7.4 resuspendiert. Die Ausbeute der Expression an UvrA nach Thrombinspaltung lag bei ca.
8 mg Protein aus 4 Litern Bakterienkultur.Von CBP-UvrA konnte eine Ausbeute von ca. 4 mg
allerdings verunreinigten Proteins aus 2 Litern Bakterienkultur erzielt werden. Die Proteine
wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei – 80°C gelagert.
M
kDa
1
2
3
4
5
6
205
116
97,4
66
CBPUvrA
45
29
14
Abb.3.7: Reinigung des rekombinanten UvrA-Proteins mit
N-terminalen CBP-Fusionsanteil aus E.coli-Bl21-Zellen.
Die Abbildung zeigt Proben der folgenden Reinigungsschritte
in einer SDS-Polyacrylamid-gelelektrophorese: M) Molekulargewichtsmarker SDS 6H, 1) unlösliche Proteinanteile des
Zellaufschlusses, 2) lösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 3) nicht gebundener Proteinanteil, 4-6) verschiedene Fraktionen von CBPUvrA nach Elution von der
Calmodulin-Sepharose-Säule
DNA-Reparaturproteine wie UvrA zeigen in der Literatur unterschiedliche Bindungsstärken
für DNA-Oligomere mit UV-Schädigung im Vergleich zu nicht geschädigten DNAOligomeren (MAZUR & GROSSMAN, 1991). Das vorliegende Konstrukt wurde wie auch die
anderen Konstrukte von Reparaturenzymen in Retardationsexperimenten hinsichtlich ihrer
Bindungseigenschaften für
32
P-markierte DNA-Oligomere untersucht. Die Erkennung von
geschädigten zu nicht geschädigten Oligomeren in Gelshiftanalysen unterscheidet sich um
den Faktor 3 (Experimente: Guido Böse).
III ERGEBNISSE
84
3.1.2.4 DNA-Reparaturenzyme als Fänger im BIAcore-System
Die Herstellung von Fusionsproteinen aus DNA-Bindungsdomänen von Reparaturenzymen
und Peptidsequenzen zur Affinitätsaufreinigung dienten vorrangig dem Ziel Proteinkonstrukte
zu erzeugen, die vermittelt durch ihre Affinitätssequenz spezifisch an die Matrix von Biosensoren gekoppelt werden können. In einem BIAcore-System wurde unter Verwendung der
Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) die Bindung unterschiedlicher DNA-Proben an die
immobilisierten Konstrukte der DNA-Reparaturenzyme verfolgt.
Die verfügbaren Konstrukte aus hMSH2 vk mit GST-Affinitätssequenz bzw. MutS und XPA
mit sechs Histidinen (HisTag) wurden an kovalent mit anti-GST-Serum bzw. Nitriloessigsäure
(NTS/NTA) beschichteten Sensorchips immobilisiert. Das Konstrukt von UvrA mit der Fusionsdomäne aus Calmodulin-Bindungs-Peptid (CBP) wurde über kovalent gebundenes Calmodulin an den Sensorchip immobilisiert.
3.1.2.4.1 DNA-Standardproben für BIAcore-Experimente
Als einfachstes Modell für DNA–Fehlpaarungen, wie sie infolge mutagener Schädigungen
auch in genomischer DNA auftreten, dienten korrekt bzw. fehlgepaarte DNA-Oligomere (Methoden 2.4.2, Abb. 2.2.). Diese DNA-Oligomere wurden für erste qualitative Experimente
über die immobilisierten Reparaturproteine hMSH2vk und MutS geleitet. Die Oligonukleotide wurden mit Hilfe des Primer Programmes des „Sequence Analysis Software Package“
(Genetics Computer Group, GCG) entsprechend gewählt. Dabei gab es ein ausgewogenes
Verhältnis zwischen G/C Paaren zu A/T Paaren.
Zur Überprüfung der prinzipiellen Eignung des eingesetzten Reparaturenzyms His6MutS
wurde ein in der Literatur schon beschriebener Ansatz nach GOTOH et al. (1997) gewählt.
Hierfür wurde ein Oligonukleotid (Match rev Oligonukleotid, Methoden 2.4.2., Abb. 2.2.) am
5´Ende biotinyliert und als Dimer mittels Streptavidin auf der Sensoroberfläche kovalent
gebunden.
Für die Experimente mit dem Protein UvrA des Nukleotid-Exzisions-Reparatursystems wurden DNA-Oligomere von 36 Basenpaaren Länge (Methoden 2.4.2., Abb. 2.3) verwendet. Die
Homoduplexe wurden wie in Methodenteil unter 2.4.2 beschrieben mit UV-Licht behandelt.
Zum Nachweis der Schädigung wurde die 36 Basenpaar Homoduplexe, die TTAA in der Sequenz enthält, mit dem Restriktionsenzym Mse I vollständig verdaut. Das Enzym Mse I
schneidet spezifisch die TTAA-Sequenz. Bildung von Thymidimeren führt hierbei zu einem
Schutz der DNA vor der Spaltung. Hierzu wurde 1 µM DNA nach der Bestrahlung mit 4 Mse
I in NEB 2-Puffer unter Zusatz von 100 µg/µl BSA für 1 Stunde bei 37°C verdaut. Die Re-
III ERGEBNISSE
85
striktion wurde mittels Polyamidgelelektrophorese analysiert und bei BÖSE (2000) dargestellt.
Es zeigt sich eine fast vollständige Restriktion von DNA ohne Schädigung, die bei ansteigender Bestrahlungszeit immer mehr inhibiert wird. Nach 7 Minuten Bestrahlungsdauer wird
der größte Teil der DNA aufgrund eines Thymindimers vor der Restriktion geschützt.
Für Experimente mit XPA- einem weiteren Protein der DNA-Reparatur – wurde Kalbsthymus
DNA mit Cisplatin (Cis-Dichlorodiamine platinum (II)) behandelt. Bei der Platinierungsreaktion von Kalbsthymus-DNA entstehen N7-Alkylguanin-Addukte (siehe Einleitung Abb. 1.7),
an die XPA bevorzugt bindet und so die Nukleotid-Exzisions-Reparatur einleitet. Die DNA
wurde mittels Ultraschallbehandlung auf eine mittlere Größenverteilung von 400 bp gebracht
mit einem 20 fachem Überschuß (20µM) Cisplatin umgesetzt. Die Platinierungsreaktion wurde mittels Atomabsorptionsspektroskopie überprüft (am Institut für Spektrochemie und angewandte Spektroskopie in Dortmund). Bei einer mittleren Größenverteilung von 400 bp ergibt
sich für die Probe ein Verhältnis von Cisplatin zu dem DNA-Strang von 171µM/10µM, d.h.
dass im Mittel 17 Cisplatin-Moleküle in einen DNA-Strang interkaliert wurden.
3.1.2.4.2 Bindungsstudien mit hMSH2vk/MutS
In Gelretardationsexperimenten war die Erkennung fehlgepaarter DNA durch hMSH2 vk
(siehe 1.4.1) und MutS (siehe 1.4.2.1) halbquantitativ analysiert worden und hatte eine etwa
2-4 fach stärkere Erkennung der fehlgepaarten Proben gezeigt. Im SPR-System sollte nun die
Affinität von hMSH2 vk und MutS für DNA-Homo- und Heterodimere analysiert werden.
Über den Anstieg des SPR-Signals wurde die Bindung von GSThMSH2 vk an den immobilisierten Liganden anti-GST-Serum in Echtzeit verfolgt. Die Immobilisierung des anti-GSTSerum ist in Abb.2.6 bei den Methoden 2.4.4 dargestellt.
Bei einer Konzentration von 200µg/ml GSThMSH2 vk ergab sich im Mittel eine Signalerhöhung von 600-700 RU durch Bindung von GSThMSH2 vk an die Sensoroberfläche (Abb.
3.8). Bei einer durchschnittlichen Beladung mit 600 RU GSThMSH2vk (ca.54,4 kD) und einer durchschnittlichen Hetero- und Homodimergröße von 36 bp (ca.22 kD) ist bei Absättigung des Reparaturproteins durch die DNA-Probe ein Signalanstieg um 240 RU für die Bindung der Oligonukleotide zu erwarten. Diese liegt deutlich oberhalb der Nachweisgrenzen des
Systems.
Nach Inkubation der Sensormatrix mit dem GSThMSH2 vk Fragment wurde mit BIAcoreMeßpuffer gewaschen, um überschüssige, nicht-spezifisch (d.h. über Antikörper) gebundene
GSThMSH2 vk Fragmente von der Matrix zu entfernen. Nach Abschluss jedes Einzellaufs
wurden Regenerationslösungen (Reg.lsg.1: 3 M Guanidiniumchlorid und Reg.lsg.2: 0,5%
III ERGEBNISSE
86
SDS) injiziert, die nicht kovalent gebundene Moleküle (GSThMSH2 vk, DNA) wieder von
der Oberfläche entfernten. Beim Umschalten von der einen auf die andere Pufferlösung kam
es zu den in Abbildung 3.8 markierten Puffereffekten.
Idealerweise wurde eine vollständige Regeneration ohne Verlust der Bindungsaktivität des
immobilisierten Antikörpers erreicht. Unter den verwendeten Regenerationsbedingungen liess
sich eine anti-GST-Matrix für bis zu 100 Bindungsexperimente einsetzen.
33000
Regeneration
32000
Assoziationsphase
Puffer-
31000
SPR-Signal [RU]
effekt
Puffer-
30000
effekt
Dissoziationsphase
29000
Gebundener
Analyt
28000
Grundlinie
27000
P
Reg.lsg
Puffer
Analyt
Puffer
Reg.lsg 2
1
26000
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Zeit [sek]
Abb. 3.8: Beladung der anti-GST-Matrix mit GST-Fusionsprotein. Während der Injektion der rekombinanten
GSThMSH2 vk Fraktion (Analyt) sieht man einen deutlichen Anstieg des SPR-Signals, was eine Bindung des Fusionsproteins an den auf der Biosensor-Oberfläche immobilisierten Liganden (anti-GST-Serum) anzeigt. In der Dissoziationsphase
wird nur Puffer (Biacore-Meßpuffer) injiziert. Nach kurzer Beobachtung der Dissoziationsphase wurde die Flußzelle in
Vorbereitung weiterer Messungen mit Regenerationslösungen (Reg.lsg.1: 3 M Guanidiniumchlorid und Reg.Nr.2: 0,5 %
SDS) gespült, die den gebundenen Analyten GSThMSH2 vk wieder von der Oberfläche entfernt.
Zur qualitativen Messung der Interaktionsreaktion zwischen GSThMSH2vk und fehlgepaarter
DNA wurde zunächst wie oben beschrieben die GSThMSH2 vk Fraktion injiziert. In einem
zweiten Schritt wurden die verschiedenen DNA-Proben über die Sensoroberfläche des Oberflächenplasmonresonanz-Meßgerätes geleitet. Abbildung 3.9 zeigt den Verlauf des Oberflächenresonanzsignales (RU) über die Zeit für eine mittlere Konzentration von 1µM an
fehlgepaarter und wt DNA (siehe Methoden 2.4.2, Abb. 2.2). Die Assoziation der fehlgepaarten Heterodimere an die GSThMSH2 vk Fragmente hätte sich in einer stärkeren Zunahme des
Resonanzsignals im Vergleich zu der Assoziation der Homodimere niederschlagen müssen.
Ein entsprechender Unterschied für die beiden Proben konnte allerdings nicht beobachtet
III ERGEBNISSE
87
werden. Die gemessene Interaktion von GSThMSH2 vk an fehlgepaarte DNA unterscheidet
sich nur um 12 Response Units (RU) von der an wt DNA. Dieser Unterschied ist für eine spezifische Erkennung deutlich zu gering. Deshalb wurde versucht die Sensibilität des hMSH2Konstrukts zu erhöhen, indem dem BIAcore-Meßpuffer bei der nächsten Injektion von 1µM
an fehlgepaarter und wt DNA auf die Sensoroberfläche 50 µM ATP zugesetzt wurde. Dies
wurde aufgrund der ATPase Aktivität in der C-terminalen Region von hMSH2 gemacht, die
notwendig ist, um gefehlgepaarte DNA zu erkennen (WHITEHOUSE et al., 1997). Aber auch
die Zugabe von 50 µM ATP zeigte nicht die erwartete verstärkte Assoziation von fehlgepaarter DNA an hMSH2vk. Es zeigte sich kein Unterschied in der Interaktion zwischen fehlgepaarter und wt DNA an hMSH2vk.
400
350
300
250
200
SPR-Signal [RU]
150
100
50
0
-50
Immobilisierung
von GSThMSH2vk
-100
Injektion der
DNA-Proben
Puffer
-150
Puffer
-200
-250
0
500
1000
1500
2000
2500
Zeit [sek]
1µM Homodimer
1µM Homodimer + 50 µM ATP
1µM Heterodimer
1µM Heterodimer + 50 µM ATP
Abb.3.9: Messung der Assoziation von fehlgepaarten Heterodimeren und Homodimeren an das immobilisierte
Proteinfragment GSThMSH2 vk unter normalen und veränderten Pufferbedingungen. Das hMSH2 vk Fragment
wurde über seinen GST-Tag auf der mit anti-GST-Serum beschichteten Sensoroberfläche immobilisiert. Überschüssiges,
nicht gebundenes Protein wurde durch Inkubation der Matrix mit Puffer (Biacore-Meßpufer) entfernt. Im Anschluß wurde jeweils 1 µM Heterodimere (rote Kurve) und 1 µM Homodimere (lila Kurve) im Biacore-Meßpuffer injiziert. In einem weiteren Lauf wurde der 1µM Heterodimer (blaue Kurve) und der 1µM Homodimer (grüne Kurve) jeweils 50 µM
ATP zugegeben.
Um die Spezifität der beobachteten Bindung sicherzustellen, wurde folgendes Kontrollexperiment (siehe Abb. 3.10) durchgeführt: GST wurde auf der Sensoroberfläche immobilisiert
und dieselben DNA-Proben wie in den vorherigen Experimenten mit dem hMSH2-Konstrukt
darüber geleitet, um sicherzustellen, dass die DNA-Proben nicht unspezifisch an den GST-
III ERGEBNISSE
88
Tag oder die Dextranmatrix des Sensors binden. Hierbei zeigte sich der gleiche Signalverlauf,
wie zuvor für das GSThMSH2vk Protein. Daraus kann geschlossen werden, dass die zuvor
beobachteten Signalverläufe keine spezifische Bindung an hMSH2vk widerspiegeln.
400
350
300
250
200
SPR-Signal [RU]
150
100
50
0
-50
-100
Immobilisierung
von GST
-150
Injektion der
DNA-Proben
Puffer
Puffer
-200
-250
0
500
1000
1500
2000
2500
Zeit [sek]
1µM Homodimer
1µM Homodimer + 50 µM ATP
1µM Heterodimer
1µM Heterodimer
+ 50 µM ATP
Grundlinie
Abb.3.10: Kontrollexperiment Assoziation von fehlgepaarten Heterodimeren und Homodimeren an das immobilisierten Fusionsprotein GST unter normalen und veränderten Pufferbedingungen. 1 µM fehlgepaarte DNA
(Heterodimere, grüne Kurve) und 1 µM korrekt gepaarte DNA (Homodimere, lila Kurve) im Biacore-Meßpuffer wie
1µM fehlgepaarter DNA-Lösung (Heterodimer, blaue Kurve) und der 1µM korrekt gepaarter DNA-Lösung (Homodimer, grüne Kurve) in Biacore-Meßpuffer mit 50 µM ATP wurden über das auf der Sensoroberfläche immobilisierte
GST injiziert.
Da die vorgestellten Experimente mit GSThMSH2vk nicht zu dem gewünschten Ergebnis
führten und auch die in der Literatur erforderlichen Bedingungen zur Bindung von DNA an
das Reparaturenzym keinen Erfolg zeigten, wurde bei den weiteren Experimenten mit dem
MutS Protein aus E.coli gearbeitet. MutS zeigte bei den Gelretardationsexperimenten zwar
nur eine um den Faktor 2 stärkere Erkennung der fehlgepaarten DNA gegenüber der wt DNA
als hMSH2, ist aber in der Literatur schon von GOTOH et al. (1997) in einem anderen Ansatz
zur Oberflächenplasmonresonanz-Messung eingesetzt worden (siehe Ergebnisse 3.1.2.4.3).
Zur Immobilisierung der rekombinanten MutS-Fraktion wurde die Sensoroberfläche zuvor
mit einer Ni2+-NTA-Dextran-Matrix beschichtet (GERSHON & KHILKO, 1995), so dass das
rekombinante MutS Konstrukt über den Histidin-Tag gebunden werden konnte (Abb. 3.11).
Bevor His6MutS auf die Matrix geladen wurde, wurde jedesmal die Sensoroberfläche mit
NiSO4 inkubiert. Dabei wird Nickel auf der Sensoroberfläche durch Nitriloessigsäure-Reste
III ERGEBNISSE
89
gebunden und kann mit zwei Histidinresten des Proteins im Austausch gegen Wasser interagieren. Allerdings ist die Chelatierung von Nickel nicht so selektiv, um His6Fusionsproteine so zu komplexieren, dass es einer kovalenten Bindung gleich kommt. Die
Folge ist eine stark erhöhte Dissoziationsgeschwindigkeit von His6MutS beim Nachwaschen
mit Puffer, das Protein "blutet" stark von der Sensoroberfläche ab, wie in Abbildung 3.11,
3.12 und 3.13 zu sehen. Die starke Beladung in Abb. 3.11 mit bis zu 3000 RU (direkt nach
Ende der His6MutS Injektion) blutet während der Pufferspülphase bis zu einem Wert von
1500 RU (bis Start der Injektion der DNA-Proben) ab.
3000
2400
1800
SPR-Signal [RU]
1200
600
Grundlinie
0
Beladung
Ni2+
-600
Injektion von
His6MutS
Puffer
Puffer
-1200
-1800
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Zeit [sek]
Abb. 3.11: Beladung der Sensoroberfläche mit Nickel und Interaktion mit His6MutS. Nickel wurde auf der mit
NTA modifizierten Oberfläche geleitet (150-500 sek). Über die Histidingruppen des Fusionsprotein His6MutS wird
Nickel auf der NTA-Sensoroberfläche chelatiert und damit das Fusionsprotein His6MutS auf der Sensoroberfläche gebunden (800-1200 sek). Dissoziation von His6MutS von 1200-1700 sek.
Bei einer Signalerhöhung von 1500 RU für die Bindung von His6MutS (97 kD) und einer
durchschnittlichen Hetero- und Homodimergröße von 36 bp (24 kD) ist bei Absättigung des
Reparaturproteins durch die DNA-Probe ein Signalanstieg um 370 RU für die Bindung der
Oligonukleotide zu erwarten. Dies liegt deutlich oberhalb der Nachweisgrenzen des Systems.
In Abb. 3.12 wurden die fehlgepaarten Heterodimere bzw. korrekt gepaarten Homodimere in
zwei Konzentrationen (1 und 5 µM) über das auf der Sensoroberfläche immobilisierte MutS
Protein geleitet. Es kommt zu keiner Bindung der Hetero- und Homodimeren an das MutS, es
ist ein fortlaufender Abfall des Resonanzsignals zu beobachten.
III ERGEBNISSE
90
1200
800
400
SPR-Signal [RU]
0
-400
-800
Injektion
von DNA
-1200
Injektion von
His6MutS
-1600
Puffer
Puffer
-2000
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
Zeit [sek]
1µM Heterodimer
5µM Heterodimer
1µM Homodimer
5µM Homodimer
Abb. 3.12: Messung der Assoziation von fehlgepaarten Heterodimeren, korrekt gepaarten Homodimeren an
das immobilisierte Protein MutS durch Oberflächenplasmonresonanz. Das MutS-Protein wurde über seinen
His6-Tag auf der mit Ni2+-NTA-Dextran beschichteten Sensoroberfläche immobilisiert. Im Anschluß wurde jeweils
1µM und 5 µM Heterodimere und Homodimere injiziert.
Desweiteren wurden DNA-Proben aus den Inkubationsversuchen mit 2 AAf eingesetzt (siehe
Abb. 3.13). Bei der isolierten DNA aus Primärzellen handelte es sich um Schweineharnblasenepithelzellen, die mit 250 µM 2- AAF behandelt wurden (siehe Ergebnisse 3.1.2.2). Aus
diesen kultivierten und behandelten Zellen wurde die DNA isoliert und mit Hilfe von Kombinationen
verschiedener
Restriktionsendonukleasen
(HaeIII/RSAI;
EcoRV/AluI
und
RSAI/DraI) auf eine Größenverteilung von 400-600 bp verdaut (siehe 3.1.1.2, Abb. 3.1). Eine
4,3 µM Probe der nicht behandelten bzw. der behandelten DNA-Probe wurde über das auf der
Sensoroberfläche immobilisierte MutS Protein geleitet. Bei einer durchschnittlichen Beladung
mit 1800 RU His6MutS (ca.97 kD) und einer durchschnittlichen DNA-Größe von ca. 500 bp
(ca. 330 kD) wäre eine Bindung um die 6200 RU von den verschiedenen DNA-Proben zu
erwarten gewesen. Hier würde es dann zu Massentransfer limitierenden Effekten kommen.
Auch bei diesem Versuchsablauf kommt es zu keiner Bindung von DNA an MutS in folge
dessen waren auch keine Unterschiede in der Erkennung der 2-AAF bzw. der Kontrollproben
detektierbar (Abb. 3.13).
III ERGEBNISSE
91
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
SPR-Signal [RU]
600
400
200
0
-200
-400
-600
-800
Injektion von
His6MutS
-1000
-1200
Injektion
von DNA
Puffer
-1400
Puffer
-1600
-1800
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
Zeit [sek]
4,3 µM Kontrolle
4,3 µM behandelte Probe
Abb. 3.13: Messung der Assoziation von DNA-Proben aus behandelten Primärzellkulturen an das immobilisierte
Protein MutS durch Oberflächenplasmonresonanz. Das MutS-Protein wurde über seinen His6-Tag auf der mit Ni2+NTA-Dextran beschichteten Sensoroberfläche immobilisiert. 4,3 µM von der Kontrolle und der behandelten DNA-Probe
wurden über das auf der Sensoroberfläche immobilisierte MutS Protein geleitet. Die DNA wurde isoliert aus Primärzellen von Schweineharnblasenepithelzellen, die mit 250 µM 2-Acetylaminofluoren (2 AAF) behandelt wurden. Bei der
Kontrolle handelt es sich um unbehandelte DNA, die aus der parallel kultivierten Zellprobe isoliert wurde.
3.1.2.4.3 Bindungsstudien mit biotinylierten DNA-Proben und löslichem MutS
Da keine ausreichende Bindung von fehlgepaarter DNA an MutS verfolgt werden konnte,
wurde zur Überprüfung der prinzipiellen Eignung der Konstrukte für die FehlpaarungsErkennung ein bereits in der Literatur beschriebener Ansatz gewählt (GOTOH et al., 1997).
Hierbei wurden die Hetero- und Homodimere (Methoden 4.4, Abb. 2.2.) auf der Sensoroberfläche immobilisiert, indem ein Oligonukleotid (Match rev Oligonukleotid, Methoden 2.4.2.,
Abb. 2.2.) am 5`Ende biotinyliert und dann mit der korrekten bzw. FehlpaarungsGegensequenz zum Homo- bzw. Heterodimer hybridisiert wurde. Die biotinylierten Proben
wurden dann über eine mit Streptavidin modifizierte Oberfläche gebunden. Aufgrund der hohen Affinität von Streptavidin zu Biotin (1015 M-1) kann die Dissoziation der Oligomeren von
der Sensormatrix während des Experiments vernachlässigt werden.
Zwei verschiedene Flußzellen des Messgerätes kamen zum Einsatz, in jeder wurde kovalent
Streptavidin auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Im weiteren Schritt wurde in den beiden
Fließzellen je 1µM Homo- bzw. Heterodimer injiziert. Die Hetero- und Homodimere haben
mit dem Biotin-Tag ein Molekulargewicht von 24 kD. Streptavidin hat 4 Untereinheiten von
der jede Untereinheit ein Biotin-Molekül binden kann. Jede Untereinheit von Streptavidin hat
III ERGEBNISSE
92
ein Molekulargewicht von 13 kD. Bei ca. 4000 RU für die Kopplung von Strepavidin an die
Sensormatrix wäre eine maximale Beladung von 7200 RU für die DNA-Probe zu erwarten
gewesen. Realisiert wurden jedoch nur rund 2700 RU (Beladung von 37 %) für das hier eingesetzte Heterodimer (Abb. 3.14). Bei der zweiten Sensorspur wurden für 1900 RU Streptavidinbindung 1800 RU Signal durch das Homodimer erzielt (Abb. 3.15). Dies entspricht 52 %
der maximalen theoretischen Bindung.
Nach Immobilisierung der Hetero- bzw. Homodimere wurden steigende His6MutSKonzentrationen (100, 200, 400, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 und 5000 nM) über die
Sensoroberfläche geleitet (Abb. 3.14, 3.15). Als Kontrolle wurde His6MutS konzentrationsabhängig über die nackte Streptavidin-Oberfläche geleitet. Es war deutlich zu sehen, dass das
Resonanzsignal in Abhängigkeit der His6MutS-Konzentration bei der Assoziation an die immobilisierte Hetero- bzw. Homodimer-Matrix zunimmt. Die unspezifische Bindung von
His6MutS an die Streptavidinoberfläche (Abb. 3.16) wurde von der spezifischen Bindung von
His6MutS an die Hetero- bzw. Homodimeren abgezogen und die Nettobindung von
His6MutS in Abb. 3.14 und 3.15 dargestellt.
1500
1000
1µM Heterodimer
500
100 nM His6mutS
200 nM His6MutS
0
SPR-Signal [RU]
400 nM His6MutS
-500
700 nM His6MutS
1000 nM His6MutS
-1000
1500 nM His6MutS
-1500
2000 nM His6MutS
3000 nM His6MutS
-2000
Immobilisierung von DNA
-2500
Puffer
His6MutSInjektion
4000 nM His6MutS
Puffer
5000 nM His6MutS
-3000
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Zeit [sek]
Abb. 3.14: Messung der Assoziation von His6Muts an fehlgepaarte DNA-Dimeren. 1µM Heterodimer wurde kovalent
über das Biotin am 5´Ende auf der Strepavidin-Matrix immobilisiert. Im Anschluß wurde His6MutS in den angegebenen
Konzentrationen (100 – 5000 nM) injiziert. Die Bindung des His6MutS an das Heterodimer wird durch die Zunahme des
Resonanzsignales (RU) angezeigt. Die unspezifische Bindung von His6MutS an die Streptavidinoberfläche wurde von der
spezifischen Bindung von His6MutS an das Heterodimer abgezogen und hier die Nettobindung dargestellt.
III ERGEBNISSE
93
1500
1000
100 nM His6MutS
200 nM His6MutS
500
SPR-Signal [RU]
400 nM His6MutS
700 nM His6MutS
0
1000 nM His6MutS
1500 nM His6MutS
-500
2000 nM His6MutS
3000 nM His6MutS
-1000
4000 nM His6MutS
Immobilisierung von DNA
-1500
5000 nM His6MutS
Puffer
Puffer His6MutS-Injektion
1 µM Homodimer
-2000
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Ziet [sek]
Abb. 3.15: Messung der Assoziation von His6Muts an korrektgepaarte DNA-Dimeren. 1µM Homodimer wurde kovalent über das Biotin am 5´Ende auf der Strepavidin-Matrix immobilisiert. Im Anschluß wurde His6MutS in den angegebenen Konzentrationen (100 – 5000 nM) injiziert. Die Bindung des His6MutS an das Heterodimer wird durch die Zunahme
des Resonanzsignales (RU) angezeigt. Die unspezifische Bindung von His6MutS an die Streptavidinoberfläche wurde von
der spezifischen Bindung von His6MutS an das Homodimer abgezogen und hier die Nettobindung dargestellt.
700
650
600
550
100 nM His6MutS
500
200 nM His6MutS
450
400 nM His6MutS
SPR-Signal [RU]
400
700 nM Hist6MutS
350
1000 nM His6MutS
300
1500 nM His6MutS
250
2000 nM His6MutS
200
3000 nM His6MutS
150
Injektion von
His6MutS
100
50
4000 nM His6MutS
5000 nM His6MutS
Puffer
0
-50
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Zeit [sek]
Abb. 3.16: Messung der Assoziation von His6MutS an die Streptavidinoberfläche. Als Kontrolle wurde
His6MutS in den angegebenen Konzentrationen (100 – 5000 nM) über die Streptavidinoberfläche injiziert. Die unspezifische Bindung des His6MutS an die Streptavidin wird durch die Zunahme des Resonanzsignales (RU) angezeigt.
Die unspezifische Bindung von His6MutS an die Streptavidinoberfläche wurde von der spezifischen Bindung von His6MutS an das Homo- bzw. Heterodimer abgezogen. Aus der spezifischen Bindung von His6MutS an die immobilisierten fehlgepaarten Hetero- bzw. korrekt
gepaarten Homodimere wurden die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziations- (kass)
III ERGEBNISSE
94
und die Dissoziationsreaktion (kdiss) sowie aus dem Quotienten kdiss/kass die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD für die Bindung von His6MutS bestimmt. Zunächst wurden für die
zehn verschiedenen MutS-Konzentrationen von 100 nM bis 5000 nM die apparenten Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) errechnet. Dazu wurden die erhaltenen Meßkurven der Assoziationsreaktionen für die Bindung an die Homo- und Heterodimeren mit
Hilfe des Models "1:1 (Langmuir) association" BIAevaluation - Software (Version 3.0) an
eine einfach exponentielle Steigung angepaßt (Abb. 3.17, 3.18).
1400
1200
1000
100nM His6MutS
700nM His6MutS
800
SPR-Signal [RU]
1000nM His6MutS
1500nM His6MutS
600
2000nM His6MutS
400
3000nM His6MutS
4000nM His6MutS
200
5000nM His6MutS
200nM His6MutS
0
400nM His6MutS
-200
-400
0
200
400
600
800
1000
1200
Zeit [sek]
Abb. 3.17: Anpassung der Meßkurven der Assoziationsreaktion von steigenden Konzentrationen MutS an das
korrekt gepaarte Homodimer an eine einfache exponentielle Steigung. Dargestellt ist die Anpassung an die Nettoassoziation von zehn verschiedenen MutS-Konzentrationen von 100 bis 5000 nM an die korrekt gepaarten Homodimere.
1800
MutS 400nM on mismatch
MutS 700nM on mismatch
SPR-Signal [RU]
1300
MutS 1000nM on mismatch
800
MutS 1500nM on mismatch
MutS 2000nM on mismatch
300
MutS 3000nM on mismatch
MutS 4000nM on mismatch
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
MutS 5000nM on mismatch
Zeit [sek]
Abb. 3.18: Anpassung der Meßkurven der Assoziationsreaktion von steigenden Konzentrationen MutS an das fehlgepaarte Heterodimer an eine einfache exponentielle Steigung. Dargestellt ist die Anpassung an die Nettoassoziation von
acht verschiedenen MutS-Konzentrationen von 400 bis 5000 nM an die fehlgepaarten Heterodimere. Mit Hilfe des Models
"1:1 (Langmuir) association" der BIAevaluation®-Software wurde die Messkurven an eine einfache exponentielle Steigung
angepaßt.
Die apparenten Geschwindigkeitskonstanten wurden nun gegen die MutS-Konzentrationen
aufgetragen (Abb. 3.19, 3.20). Die niedrigen Konzentrationen wurden bei der kobs vs. C Auftragung nicht berücksichtigt, da sie fehleranfällig waren (SCHUCK et al., 1998). Es ergab sich
aus der Auftragung eine Gerade, deren Steigung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten
III ERGEBNISSE
95
kass und deren Achsenabschnitt der Dissoziations-geschwindigkeitskonstanten kdiss entsprach.
Die Geschwindigkeitskonstante kass für die Bindung an die Heterodimeren betrug 3·106M-1s-1
und für die Bindung an die Homodimeren betrug 6·107M-1s-1 .
1,70E-02
y = 3E-06x - 0,0015
1,50E-02
1,30E-02
Kobs 1/sek
1,10E-02
9,00E-03
7,00E-03
5,00E-03
3,00E-03
1,00E-03
-1,00E-03
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
Konzentration in nM
Abb. 3.19: Auftrag der apparenten Geschwindigkeitskonstanten der Assoziationsreaktion von MutS an
fehlgepaarte Heterodimere gegen die jeweilige MutS-Konzentration
4,00E-03
y = 6E-07x + 0,0006
3,50E-03
3,00E-03
kobs 1/sek
2,50E-03
2,00E-03
1,50E-03
1,00E-03
5,00E-04
0,00E+00
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
Konzentration in nM
Abb. 3.20: Auftrag der apparenten Geschwindigkeitskonstanten der Assoziationsreaktion von MutS an
korrektgepaarte Homodimere gegen die jeweilige MutS-Konzentration
III ERGEBNISSE
96
Konzentration
Kobs 1/sek
in nM
für Heterodimere für Homodimere
100
Kobs 1/sek
1,00E-04
400
1,00E-04
1,00E-04
700
3,63E-04
1,09E-03
1000
1,21E-03
1,38E-03
1500
2,88E-03
1,58E-03
2000
6,27E-03
2,27E-03
3000
0,0111
2,68E-03
4000
0,0137
2,86E-03
5000
1,38E-02
3,53E-03
Tab. 3.1: Werte zu den Abbildungen 3.19 und 3.20
Da die Ermittlung der Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziationsreaktion aus der kobs
vs. C Auftragung bei kleinen Werten für kdiss sehr fehleranfällig ist (SCHUCK et al., 1998),
wurde kdiss aus der unabhängigen Messung der Dissoziationsreaktion durch Anpassung der
Messkurven an eine einfach exponentielle Funktion errechnet. Mit Hilfe des Models " 1:1
(Langmuir) dissociation" der BIAevaluation®-Software wurde die Anpassung der Messkurven
durchgeführt. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde eine mittlere Konzentration von 1000 nM His6MutS über die nackte Streptavidinoberfläche, die Heterodimeroberfläche wie die Homodimeroberfläche injiziert und die Abnahme des Resonanzsignales über 2
Stunden aufgezeichnet (Abb. 3.21). Die Abnahme des Resonanzsignales spiegelte in diesem
Fall zwei Dissoziationsreaktionen wider: Zum einen die Dissoziation des unspezifisch an die
Oberfläche gebundenen MutS Proteins sowie die Dissoziation des MutS aus dem Komplex
mit der immobilisierten DNA. Um die Dissoziation des MutS aus dem Protein-DNAKomplex möglichst genau zu bestimmen, wurde ebenfalls die unspezifische Bindung und
Dissoziation von MutS von der Streptavidin-Oberfläche über 2 Stunden gemessen. Die erhaltenen Daten wurden jeweils von den Meßdaten für den Proteinkomplex subtrahiert und so die
Netto-Dissoziation des MutS aus dem Komplex mit den fehlgepaarten Heterodimeren und
richtig gepaarten Homodimeren errechnet (Tab.3.1). Der Wert kdiss für die Dissoziation von
der Hetrodimeren-Sensoroberfläche betrug 1,16 x 10-4 s-1 und für die Dissoziation von der
Homodimeren-Sensoroberfläche 2,48 x 10-4s-1. Aus den so erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziations- und die Dissoziationsreaktion wurde über die Beziehung
III ERGEBNISSE
97
KD=kdiss/kass die Gleichgewichtskonstante KD berechnet. Die Gleichgewichtskonstante für die
Bindung an die Heterodimeren betrug 3,9 x 10-11 M und für die Homodimeren 4,1 x 10-12 M.
620
540
460
SPR-Signal [RU]
380
300
220
140
60
-20
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
65
Zeit [sek]
MutS an Heterodimere
MutS an Homodimere
MutS an Streptavidinoberfläche
Abb. 3.21: Messung der Dissoziation des MutS-Komplexes mit fehlgepaarten Heterodimeren, korrekt gepaarten
Homodimeren und Streptavidin.. Dargestellt ist die Langzeitdissoziation der entsprechenden Komplexe nach Bindung von 1 µM His6MutS an eine Strepavidin-Oberfläche (grüne Kurve), eine Heterodimer-Oberfläche (rote Kurve)
sowie eine Homodimer-Oberfläche (blaue Kurve).
350
300
250
SPR-Signal [RU]
200
150
100
50
0
-50
-100
0
700
1400
2100
2800
3500
4200
4900
5600
6300
7000
Zeit [sek]
Abb. 3.22: Anpassung der Meßkurven der Dissoziationsreaktion von 1000 nM MutS an eine einfache exponentielle
Steigung. Dargestellt ist die Anpassung an die Nettodissoziation von 1000 nM MutS-Konzentrationen aus dem Komplex mit
den fehlgepaarten Heterodimeren (rote Kurve) bzw. mit den korrektgepaarten Homodimeren (blaue Kurve).
III ERGEBNISSE
98
3.1.2.4.4 Bindungsstudien mit UvrA / XPA als Fängersystem
Mit XPA sollte ein weiteres Reparaturenzym als Fänger in das Meßsystem eingesetzt werden,
um eine qualitative Aussage über die Bindungskapazität an Cisplatin-geschädigte DNA leisten zu können. Das Protein hat ein Molekulargewicht von 40,4 kD
Das XPA-Protein besitzt einen HisTag, über den das rekombinante Protein an die Sensoroberfläche gebunden werden konnte. Die Sensoroberfläche des Meßgerätes (BIAcore) war wie
bei MutS zuvor mit einer Ni2+-NTA-Dextran-Matrix beschichtet (GERSHON & KHILKO, 1995)
worden, so dass das rekombinante XPA Konstrukt über den Histidin-Tag gebunden werden
konnte. 1µM Cisplatin geschädigte sowie wt DNA wurden über das auf der Sensoroberfläche
immobilisierte XPA geleitet. Im Kontrollexperiment wurde Importin β über einen His-Tag an
die Sensoroberfläche gekoppelt, um die Spezifität der beobachteten Bindung von geschädigter
bzw. wt-DNA sicherzustellen. Es erfolgte keine Bindung von der Cisplatin-geschädigter oder
wt-DNA an Importin β, ebenso aber auch keine Bindung an XPA. Die Ergebnisse sind nicht
dargestellt, da mit dem bakteriellen Nukleotid-Excisions-Reparturenzym UvrA weitergearbeitet wurde.
Da UvrA als Dimer den DNA-Schaden erkennt, wurde UvrA auf der Sensoroberfläche dimerisiert und dann die DNA-Probe über das immobilisierte UvrA2 Dimer geleitet. In Lösung
befindet sich UvrA in einem Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer. Das Dimer UvrA2 sucht den DNA-Strang ATP-abhängig nach Schäden ab (SEEBERG & STEINUM, 1982).
UvrA wurde über den Calmodulin-Bindungs-Peptid-Tag auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Zu diesem Zweck war die Sensoroberfläche zuvor mit Calmodulin beschichtet worden.
Für dieses Fängersystem war es erforderlich, dass der BIAcore Meßpuffer mit 2 mM CaCl2
versetzt wurde. In der Anwesenheit von Kalzium kann es zu einer Bindung zwischen dem
Fusions-Tag Calmodulin-Bindungs-Peptid aus der Myosin-leichte-Kettenkinase und dem
Calmodulin kommen. Über das immobilisierte UvrA wurde konzentrationsabhängig UVgeschädigte bzw. wt-DNA injiziert. Es wurde nur wenig UvrA auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Das über Calmodulin immobilisierte UvrA dissoziierte von der Sensoroberfläche
ab, so dass keine Aussage über die Bindungseigenschaften von UvrA an UV-geschädigter
DNA im Vergleich zu wt-DNA getroffen werden konnte.
3.1.2.5 p53 Lokalisation als Marker für DNA-Schädigungen
Die Überexpression bzw. Aktivierung von vorhandenem p53-Protein läßt sich für die Identifikation von mutagenen und kanzerogenen Stoffen in in-vitro Testsystemen ausnutzen (YANG
& DUERKSEN-HUGHES, 1998). In dieser Arbeit waren Primärzellkulturen aus Rinder- und
III ERGEBNISSE
99
Schweineharnblasenepithelzellen als neues Testsystem für genotoxische Ereignisse vorgesehen. Das Detektionssystem sollte mit rekombinant exprimiertem p53 Protein vom Rind und
Schwein etabliert und standardisiert werden. Es wurde auch angestrebt, primär kultivierte
Schafharnblasenepithelzellen in das genotoxische Testsystem einzusetzen. Die Schafharnblasenepithelzellen konnten aber in den Arbeiten des Projektpartners nicht stabil und reproduzierbar kultiviert werden.
3.1.2.5.1 Klonierung von p53 aus Rind, Schaf, Schwein
3.1.2.5.1.1 p53 aus Rind und Schaf
Die Gensequenzen von p53 aus Rind und Schaf konnten mit Hilfe den bereits beschriebenen
Gendatenbanksequenzen (Rind X81704, Schaf AC X81705) isoliert werden. Hierbei wurden
mit Hilfe des Programms „Primer für Macintosh“ Oligonukleotide zur Amplifikation des p53Gens aus Rind und Schaf ermittelt (Oligonukleotide siehe Tab. 2.5 Methoden 2.2.5.1).
In Abbildung 3.23 sind die Ergebnisse aus der ersten Touchdown-PCR mit nichtdegenerativen Oligonukleotiden zur Amplifikation des p53-Gens aus Rind aufgeführt. In die
Reaktion wurde Gesamt-RNA aus primär kultivierten Harnblasenepithelzellen des Rinds eingesetzt. Die hohe Spezifität wie auch Leistungsfähigkeit der Touchdown-PCR leigt in der
genauen Hybridisierung der Oligonukleotide mit dem komplementären Sequenzen der eingesetzten DNA. Die Hybridisierung kann durch die Annealing-Temperatur der Oligonukleotide
beeinflußt werden. Unter optimalen Bedingungen, die nur annähernd während der ersten Zyklen (1 bis ~ 20 Zyklen) gegeben sind, folgt die Produktbildung einem exponenetiellen Gesetz
Mit zunehmender Zyklenzahl kommt es zu einer Verlangsamung der Reaktion bis in der Plateauphase (ab ~ 25. Zyklus) kaum noch eine Amplfikation stattfindet. Während der Reaktion
akkumulieren Reaktionsnebenprodukte (Pyrophosphat), die die Reaktion hemmen, und Reaktionsprodukte (doppelsträngige DNA), deren Einzelstränge mit dem jeweiligen Oligonukleotid um den komplementären Strang kompetieren. Gleichzeitig nehmen Oligonukleotid- und
dNTP-Konzentration ab. Als Summe dieser Effekte sinkt die Amplifikationseffizienz, bis in
der Plateauphase die PCR langsam zum Erliegen kommt. Deshalb hat man in den ersten Zyklen der PCR die Möglichkeit durch die Varianz der Annealingtemperatur, das Ergebnis der
Reaktion zu beeinflussen. Bei der hier eingesetzten Touchdown-PCR wurde mit einer spezifischen, hohen Annealingtemperatur gestartet und mit einer unspezifischen geendet. So war es
möglich in den ersten Zyklen genug Ausgangsbasis für die weitere Produktbildung zu schaffen (Programm der Touchdown-PCR siehe Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.4). Mit der zugesetzten
Q-Solution von Qiagen sollte das Amplifikationsergebnis noch weiter gesteigert werden.
III ERGEBNISSE
100
Nach Angaben des Herstellers modifiziert die Q-Solution die Schmelzverhalten der DNA und
ermöglicht so eine Optimierung der PCR-Reaktion um 10%.
L
M
1
+Q
2
3
-Q
+Q
Basenpaare
1600
1300
1000
702
500
4
Abb. 3.23: Amplifikationsergebnisse des p53-Gens
aus der isolierten GesamtRNA aus kultivierten Rinderharnblasenepithelzellen.
Nach der RT-Reaktion wurde
der Reaktionsansatz in 5 µl
und 10 µl aufgeteilt und so in
die Touchdown-PCR eingesetzt.
Auf dem 1%Agarosegel sind in Spur 1 die
Probe mit 5 µl von der RTReaktion plus Q-Solution
(+Q), 2. Spur die Probe mit 5
µl aus der RT-Reaktion ohne
Q-Solution (-Q), 3. Spur 10
µl aus der RT-Reaktion mit
Q-Solution (+Q), 4. Spur die
negativ Kontrolle ohne Einsatz von DNA, M: 1 kbDNA-Leiter und L: λ-DNALeiter dargestellt.
In die zweite Touchdown-PCR wurde von der amplifizierten c-DNA 1 µl einer 100fachen
Verdünnung eingesetzt. Dabei wurden nur die eindeutig positiven Ansätze eingesetzt. Unter
Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden (mit Erkennungssequenzen für geeignete
Restriktionsenzyme) wurde dann eine umgekehrte Touchdown-PCR durchgeführt. Gestartet
wurde mit einer unspezifischen, niedrigen und geendet mit einer spezifischen, hohen Anlagerungstemperatur für die Oligonukleotide (siehe Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.4). Die Ergebnisse
der zweiten Touchdown-PCR wurden auf einem 0,8 % Agarosegel (Abb. 3.24) überprüft, die
erwartete DNA-Bande in der Größe von ca. 1100 - 1200 bp (volle Länge des p53-Gens aus
Rind: 1116 bp) konnte detektiert werden.
M
1
+Q
2
+Q
3
-Q
Basenpaare
1600
1000
500
Abb.3.24: Amplifikationsergebnisse des p53-Gens
aus der 2. Touchdown-PCR mit degenerierten Oligonukleotiden. Amplifikation des p53-Gens inklusive EcoRI/BamHI Restriktionsschnittstellen mit Q-Solution.
0,8 %-Agarosegel Spur 1: Negativ-Kontrolle ohne
DNA-Einsatz, Spur 2: 1 µl des 10 µl Reaktionsansatzes
mit Q-Solution aus der RT-Reaktion, Spur 3: 1 µl des 5
µl Reaktionsansatzes mit Q-Solution der RT-Reaktion,
M: 1 kb-DNA-Leiter dargestellt.
III ERGEBNISSE
101
Die amplifizierte c-DNA mit Hilfe der eingeführten Restriktionsschnittstellen EcoRI / BamHI
in den Expressionsvektor pMAlc2H einkloniert und in hochkompetente DHα-Zellen transformiert. Nach der Plasmidaufreinigung wurde die isolierte DNA zur Überprüfung der Ligation einer Restriktion unterzogen und mittels Gelelektrophorese analysiert (Abb. 3.25). Die
insertierte DNA der positiven Klone wurde sequenziert und die ermittelten Sequenzen wurden
in Datenbankvergleichen überprüft. Alle 5 positiven Klone wurden bestätigt. Die positiven
Klone
wurden
in
die
E.coli-BL21DE3-Expressionszellen
transformiert
und
als
Glycerolstocklösung gelagert.
Basen
M
1
2
3
4
5
6
paare
11200
6100
2000
1600
1000
Abb. 3.25: 0,8 % Agarosegel zur Überprüfung Restriktionsanalyse der Plasmid DNA aus E.coli-TG1-Zellen. Entsprechend der Ligation wurde ein 3,9 kb
große Vektorbande und eine ca. 1100-1200 bp große Insertionsbande in 5 der 6
Klone gefunden (Spur 1, 2, 4, 5, 6). Die Vektorbande bewegt sich träger im Gel
und wird deshalb bei einer Größe von 11200 bp detektiert. M: 1kb-DNA-Leiter.
Das p53-Gen aus Schaf wurde im Rahmen einer parallel durchgeführten Diplomarbeit von
Herrn Alexander Wolf in den modifizierten Expressionsvektor pMAlc2H einkloniert. Sequenzanalysen zeigten, dass das p53-Genfragment aus Schaf nicht in vollständiger Länge
einkloniert werden konnte. Nur 963 bp des insgesamt 1179 bp großen Fragmentes waren in
dem Epressionsvektor insertiert (entsprechend der Aminosäuren 1 – 321 p53 Proteins aus
Schaf). Weitere Klonierungsarbeiten und Expressionsversuche zu p53 aus Schaf wurden nicht
durchgeführt, da das entsprechende Zellkultursystem mit Epithelzellen aus Schaf nicht erfolgreich durch den Kooperationspartner am Institut für Arbeitsphysiologie, Dortmund, etabliert
werden konnte.
III ERGEBNISSE
102
3.1.2.5.1.2 p53 aus Schwein
Die Sequenz vom Schwein war zum Zeitpunkt der experimentellen Arbeiten in keiner der
verfügbaren Datenbanken vorhanden. Bei der Klonierung von p53 aus Schwein kamen verschiedene Strategien zum Einsatz. Zuerst wurde versucht mit Hilfe von Oligonukleotiden die
von der humanen Sequenz abgeleitet worden waren, das p53-Gen zu amplifizieren. Es wurden
Oligonukleotidpaare gewählt, die Exon 5-6 und Exon 7-8-9 amplifizieren (Oligonukleotide
siehe Tab. 2.3, Methoden 2.2.5.1). Der Touchdown-PCR Ansatz mit genomischer DNA, isoliert aus kultivierten primären Harnblasenepithelzellen vom Schwein wurde genauso gewählt
wie bei der 2. Touchdown-PCR zur Amplifikaion von p53 vom Rind. Das verwendete Temperaturprogramm entsprach jenem für die 1. Touchdown-PCR zur Isolierung der Rinder p53
Sequenz (Methoden 2.2.5.1, Tab.2.4). Mit diesem Ansatz konnte das p53-Gen vom Schwein
nicht amplifiziert werden.
Im nächsten Ansatz wurde die von MAYR et al. (1995) beschriebene Sequenz von Exon 8 des
Schweins ausgenutzt. Mit Hilfe der RACE-Reaktion (Rapid Amplifikation of cDNA ends englisch schnelle Amplifikation von c-DNA Enden, siehe Methoden 2.2.5.2) wurde versucht,
das komplette Genfragment des p53-Gens zu finden. Mit der RACE-Reaktion können bis zu
2000 bp Fragmente in Richtung des 3´ und 5´Endes amplifiziert werden, wenn mindestens
ein Fragment von 300 bp Länge innerhalb der zu amplifizierenden Gensequenz bekannt ist.
Das Prinzip der RACE-Reaktion ist die aufeinanderfolge von zwei nacheinander geschalteten
PCR-Reaktionen mit ineinandergesetzten "nested" Oligonukleotiden, die in der bekannten
Sequenz liegen. Der erste Schritt einer RACE-Reaktion ist eine Reverse Transkriptionsreaktion, bei der Gesamt-RNA isoliert aus kultivierten, primären Schweineharnblasenepithelzellen
eingesetzt wurde. Das c-DNA/m-RNA-Hybrid wurde in eine anschließende Touchdown-PCR
mit den spezifischen Oligonukleotiden für das Exon 8 vom Schwein eingesetzt. Das Temperaturprogramm der Touchdown-PCR wurde mit einer spezifischen hohen Annealingtemperatur
von 64°C gestartet und in drei Schritten von 63°C über 62°C auf 60°C abgeschlossen. Bei
dieser unspezifischen Anlagerungstemperatur für die Primer wurden 30 Reaktionszyklen
durchgeführt, bei den ersten drei Annealingtemperaturen wurden nur 3 Reaktionszyklen
durchlaufen. Die Zyklusdauer für den Denaturierungsschritt der DNA und der Anlagerung der
Oligonukleotide lag bei 30 Sekunden. Für die Verlängerung der Primer wurde eine Reaktionszeit von 1 Minute festgelegt. Alle anderen Bedingungen entsprechen denen im Methodenteil
unter 2.2.5.1 in Tabelle 2.4 beschriebenen. Für die genaue Sequenzierung wurde das amplifizierte cDNA-Fragment nach der sogenannten TA-Klonierungsmethode (MARCHUK et al.,
1990) in den Plasmidvektor pCR2.1 kloniert (siehe Methoden 2.2.5.3). Die Ergebnisse aus der
III ERGEBNISSE
103
Fragmentlängenüberprüfung mittels Restriktion sind in Abbildung 3.26 dargestellt. Die insertierte DNA der positiven Klone wurde sequenziert und in Datenbankvergleiche eingesetzt. Es
bestätigte sich, dass erfolgreich das 90 bp Fragment vom Exon 8 aus Schwein in den Plasmidvektor pCR2.1 einkloniert worden war.
Gleichzeitig zu dem zweiten Ansatz wurde eine dritte Strategie verfolgt, bei der versucht
wurde, das p53-Gen des Schweins unter Verwendung eines nicht degenerativen Oligonukleotidpaares auf Basis der Rinder p53-Sequenz (Bovp53fwd, Bovp53rev siehe Tab. 2.3 Methoden 2.2.5.1) zu amplifizieren. In die Reverse Transkriptionsreaktion wurde Gesamt-RNA eingesetzt, isoliert aus kultivierten primären Schweineharnblasenepithelzellen. Der Ablauf der
Reaktion entsprach dem zur Isolierung der p53 Sequenz des Rinds. Es wurde das gleiche Programm benutzt, wie in Methoden 2.2.5.1 Tabelle 2.4 beschrieben. Das Ergebnis der Touchdown-PCR wurde gelelektrophoretisch ausgewertet (Abb. 3.27).
Für die Sequenzierung wurde das amplifizierte cDNA-Fragment ebenfalls in den Plasmidvektor pCR2. kloniert. Bei den erhaltenen Transformanden wurde die Länge der einklonierten
Fragmente mittels Restriktion überprüft. Bei der gelelektrophoretischen Auswertung wurde
eine ca. 1100-1200 bp große Insertionsbande in 2 Klonen gefunden, die sequenziert wurden.
Die Sequenzierungen waren jedoch nicht auswertbar. Daher sind die positiven Klone in die
hochkompetenten E.coli-DH5α-Zellen transformiert worden, um über diesen Schritt die
Plasmide zu vervielfältigen. Die Überprüfung dieser Klone mittels Restriktion und Sequenzierung zeigte bei allen ein positives Ergebnis.
Basen
paare
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
4100 / 3100
2000 / 1600
500
300
200
Abb. 3.26: 0,8 % Agarosegel zur Überprüfung Restriktionsanalyse
der Plasmid DNA aus E.coli-TG1-Zellen. Entsprechend der Ligation
wurde ein 3.9 kb große Vektorbande und ein ca. 90 bp große Insertionsbande in der Spur 3 der 11 Klone gefunden (Spur 6,7,10). M: 1kb-DNALeiter
III ERGEBNISSE
104
Die ermittelten Sequenzen wurden in Datenbankvergleiche eingesetzt und ergaben eine hohe
Homologie zu anderen p53-Sequenzen von Rind, Schaf und Mensch (Anhang Abb. 7.1). Mit
dem FASTA-Suchprogramm des „Sequence Analysis Software Package“ der „Genetics
Computer Group“ Inc. (GCG), Madison, Wisconsin, Version 9.0-UNIX wurde dann ein Homologievergleich mit den in den EMBL-Datenbanken abgelegten Sequenzen durchgeführt.
Die höchste Homologie von 87% zeigt die putative p53 Sequenz aus Schwein gegenüber der
humanen Sequenz des p53-Gens. Die p53-Sequenz vom Rind besitzt eine 86% prozentige
Homologie gegenüber der p53-Sequenz vom Schwein.
In einer weiteren Touchdown-PCR wurden in die insertierte DNA mit Hilfe von degenerierten
Oligonukleotidpaaren für das p53-Gen vom Rind (Btp53EcoR1fwd, Btp53BamH1rev siehe
Tab. 2.3 Methoden 2.2.5.1) Schnittstellen zum Einklonieren der DNA in den Expressionsvektor pMAL2cH eingefügt. Es wurden die Oligonukleotide unter den gleichen Bedingungen und
dem gleichen Programm (Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.4) eingesetzt wie bei der zweiten umgekehrten Touchdown-PCR mit p53 vom Rind. In allen Ansätzen konnte die c-DNA amplifiziert werden. Mit Hilfe der eingeführten Restriktionsschnittstellen EcoRI /BamHI wurde die
c-DNA in den Expressionsvektor pMAlc2H einkloniert. Die insertierte DNA (Abb. 3.28) der
positiven Klone wurde sequenziert und die ermittelte Sequenz erneut überprüft. Die Sequenzierung zeigte, dass erfolgreich das 1164 bp Fragment für das p53-Gen vom Schwein in den
Expressionsvektor pMalc2H einkloniert wurde.
1
+Q
2
+Q
3
M
Basen
paare
2000
1600
1000
Abb. 3.27: Amplifikationsergebnisse des
p53-Gens vom Schwein aus der Touchdown-PCR mit nicht degenerierten Oligonukleotiden für das p53-Gen vom Rind.
Nach der Reversen Transkriptionsreaktion
wurde der Reaktionsansatz in 5 µl und 10 µl
aufgeteilt und so in die Touchdown-PCR
eingesetzt. Auf dem 0,8%-Agarosegel wurden in Spur1 5 µl Reaktionsansatz, in Spur 2
10 µl Reaktionsansatz aufgetragen. In Spur 3
ist die Negativkontrolle ohne DNA-Einsatz
aufgetragen, M: 1 kb-DNA-Leiter.
Zur Ablage der amplifizierten Gensequenz für p53 vom Schwein mußten noch die Sequenzen
für das C- und N-Terminale Ende überprüft werden, da in diesen Bereichen die für die Rindersequenz spezifischen Oligonukleotidpaare verwendet worden waren. Diese Überprüfung
wurde mittels RACE-Reaktion durchgeführt (FROHMAN et al., 1988). Für diese Reaktion
wurden Oligonukleotide verwendet, die innerhalb der zuvor klonierten Sequenz liegen und
III ERGEBNISSE
105
den Strang in C- oder N-terminale Richtung amplifizieren (p53 5´Ende Oligonukleotide; p53
3´Ende Oligonukleotide siehe Tab. 2.5. und 2.2.5.2).
In den Randbereichen gab es keine Änderungen gegenüber der Sequenz vom Rind. Nach dieser Überprüfung wurde die Sequenz in der Genbank des National Center for Biotechnology
Information (AF124298) eingetragen. Die positiven Klone pMALc2H-p53-Schwein wurden
in E.coli-BL21-Expressionszellen transformiert und zur Lagerung Glycerolstocklösungen
angelegt (siehe Anhang Abb. 7.1).
Basen
paare
M
1
2
3
4
3100
1600
1000
500
300
Abb. 3.28: 0,8 % Agarosegel zur
Überprüfung der Restriktionsanalyse der Plasmid DNA aus
E.coli-TG1-Zellen. Entsprechend
der Ligation wurde ein 3.9 kb
große Vektorbande und ein ca.
1100-1200 bp große Insertionsbande in allen Klonen gefunden. Hier
sind exemplarisch 4 positive Klone
dargestellt. M: 1kb-DNA-Leiter
3.1.2.5.2 Expression von p53 vom Rind und Schwein
In Vorversuchen wurde N-terminal mit einem GST-Anteil fusioniertes p53-Protein vom Rind
über BamHI/EcoRI in das E.coli BL21-pGEX2T Expressionssystem einkloniert. GST-p53Rind
wurde dann in BL21-Zellen synthetisiert und mittels GSH-Affinitätschromatographie isoliert.
Hierbei zeigte sich allerdings eine rasche Degradation des gewünschten Produkts. Um eine
dieses Problem zu umgehen, wurden sowohl p53 vom Rind als auch vom Schwein in den
pMalc2H Vektor mit N- und C-terminalen Fusionstag einkloniert. Hieraus resultierte in beiden Fällen ein 90 kD schweres Protein mit HisTag und MBP-Tag. Durch die zwei Affinitätstags könnten über zwei in Reihe geschaltete Affinitätschromatographien vollständige Proteine
aufgereinigt werden. p53 vom Schwein umfasst 1164 Basenpaare und p53 vom Rind umfasst
1161 Basenpaare. Das Volle-Länge Protein von p53 vom Schwein und Rind wurde über die
Ni2+-NTA-Agarose-Säule und Amylosesäule aufgereinigt.
Die Induktion mit 100 µM IPTG bei einer OD600 von 0,6 lieferten nach ca. 15 Stunden bei
30°C lösliches p53-Protein vom Rind, das über eine Amylose-Säule gereinigt wurde. Die
Ausbeute der Expression von Rinder-p53 lag bei ca. 2 mg Protein aus 2 Litern Bakterienkultur nach der Amylose-Säule. Die Analyse des Aufreinigungsschrittes wurde über eine SDSGelelektrophorese beurteilt (Abb. 3.29). Aufgrund der geringen Ausbeute und da das Protein
nach der Amylose-Säule schon sehr sauber war (siehe Abb. 3.29) wurde kein weiterer Reinigungsschritt über die Ni2+-NTA-Agarose-Säule durchgeführt.
III ERGEBNISSE
106
Das p53 Protein vom Rind war nach dieser Affinitätschromatographie zu 80 % rein (Spuren
10-12, Abb. 3.29). Das Protein wurde mittels Ultrafiltration mit Vivaspins aufkonzentriert.
Die Konzentration von p53 vom Rind betrug etwa 2 mg/ml. Das Protein wurde in flüssigem
Stickstoff in kleinen Mengen schockgefroren und bei – 80°C gelagert. Um zu überprüfen, ob
es sich bei dem aufgereinigten Protein wirklich um p53 vom Rind handelt, wurde ein Western-Blot (Abb. 3.34) mit kommerziell erhältlichen p53-Antikörpern (Pab 240, II Material
2.12) durchgeführt.
M
S
1
2
3
4
5
6
7
8
9
kDa
10 11 12 S
kDa
205
205
116
97,4
116
97,4
66
MBPp53His6
vom Rind
45
36
29
24
14
Abb. 3.29: Reinigung des rekombinanten p53-Proteines vom Rind mit N-terminalem MBP- und
C-terminalem His6-Fusionsanteil aus E.coli-Bl21-Zellen. Die Abbildung zeigt Proben der folgenden Reinigungsschritte in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese: M) Molekulargewichtsmarker
SDS7, S) Molekulargewichtsmarker SDS6 1) Proteinanteile nicht induzierter Zellen, 2) unlösliche
Proteinanteile des Zellaufschlusses, 3) lösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 4) nicht an die
Maltose-Agarose gebundene Anteile der löslichen Fraktion des Zellaufschlusses, 5-12 ) verschiedene
Fraktionen von MBPp53His6 vom Rind nach Elution von der Maltose-Agarose -Säule
Bei der Herstellung von Schweine p53 lieferte die Induktion der für die Synthese verwendeten E. coli BL21 mit 100 µM IPTG bei einer OD600 von 0,8 nach ca. 4 Stunden bei 25 °C lösliches Protein, das ebenfalls über die Amylose-Säule aufgereinigt wurde. Die Ausbeute lag
bei der p53 Expression vom Schwein bei ca. 0,3 mg Protein aus 2 Litern Bakterienkultur. Eine SDS-Gelelektrophorese zeigte, dass in den aufgefangenen Fraktionen nur geringe Mengen
lösliches Protein zu finden waren, die zudem noch deutliche Verunreinigungen aufwiesen
(Spur 8-10, Abb. 3.30).
Das Protein wurde mittels Ultrafiltration mit Vivaspins aufkonzentriert. Nach der Aufkonzentrierung betrug die Konzentration von p53 vom Schwein etwa 0,2 mg/ml. Um zu überprüfen, ob es sich bei dem aufgereinigten Protein wirklich um p53 vom Schwein handelt, wurde
III ERGEBNISSE
107
ein Western-Blot (Abb. 3.33) mit kommerziell erhältlichen p53-Antikörpern (Pab 240) durchgeführt.
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
kDa
102
81
46,9
32,7
30,2
24
MBPp53His6
vom
Schwein
Abb. 3.30: Reinigung des rekombinanten p53-Proteines vom Schwein
aus E.coli-Bl21-Zellen. Die Abbildung zeigt Proben der folgenden
Reini-gungsschritte in einer SDSPoly-acrylamidgelelektrophorese: M)
Mo-lekulargewichtsmarker
SDS7
prestai-ned, 1) Proteinanteile nicht
induzierter Zellen, 2) unlösliche
Proteinanteile des Zellaufschlusses,
3) lösliche Proteinanteile des Zellaufschlusses, 4) nicht an die Maltose
Agarose gebundene Anteile der
löslichen Fraktion des Zellaufschlusses, 5-10) verschiedene Fraktionen
von MBPp53His6 vom Schwein
nach Elution von der MaltoseAgarose -Säule
3.1.2.6 Detektion von p53 mit kommerziellen anti-p53 monoklonalen Antikörpern
3.1.2.6.1 Test mit humanem p53-Protein
Als Standard des humanen p53 lagen zwei rekombinante Proteine vor. Kommerzielles p53Protein als Fusionsprotein mit einem N-terminalen GST-Tag und p53-Protein, das mit dem
E.coli BL21-pET3a-Expressionssystem aufgereinigt wurde. Die Expression von humanem
pET3ap53 wurde induziert mit 2 mM IPTG bei einer OD600 von 0,8. Nach 4 Stunden bei 37°C
lieferte das Expressionssystem lösliches humanes p53-Protein. Der Aufschluß der Zellsusupension geschah mittels Ultraschallbehandlung. Der Überstand des Zellaufschlusses wurde
dann ohne weitere Reinigung in einer Konzentrationsreihe von 10 bis 0,05 µg im Dot-Blot
eingesetzt. Das kommerzielle p53-Protein wurde in einer Konzentrationsreihe von 0,1 bis
0,001 µg eingesetzt.
Neben den rekombinanten Proteinen wurden zytosolische und nukleäre Fraktionen aus primärem Zellkulturmaterial eingesetzt (Methoden 2.1.6). Die Primärzellkulturen (Schweineharnblasenepithelzellen) waren entweder unbehandelt (Kontrolle) oder mit 250µM 2Acetylaminofluoren behandelt worden (siehe 3.1.1.3). Als Kontrolle wurden Proben eingesetzt, die nur mit dem für 2-AAF verwendeten Lösungsmittel DMSO behandelt worden waren. Es wurde von der cytosolischen wie auch nukleären Fraktionen 10µg Gesamtprotein eingesetzt, weil der Anteil an p53 an Gesamtprotein sonst mutmaßlich nicht für eine Detektion
rausreichen würde (Abb. 3.31). Das ließen die Literaturdaten vermuten, da in einer normalen
III ERGEBNISSE
108
Zelle p53-Protein nur eine kurze Halbwertzeit (5 bis maximal 45 min) hat und einer Detektion
z.B. durch Immunhistologie nicht zugänglich ist (SHAULSKY et al., 1990, EL-DEIRY, 1998).
5
10
13
4
3
9
8
12
2
1
7
6
11
15
14
Abb.3.31: Detektion des rekombinanten humanen p53-Proteins aus
E.coli-BL21-Zellen sowie kommerzielles p53-Protein durch Dot-Blot
mit Anti p53 Antikörper PAB 240. Die Abbildung zeigt die Detektion
von p53 in fast allen Proben, außer bei Punkt 3 (GSTp53 0,001µg) auf
dem Röntgenfilm. Das humane p53-Protein konnte noch bis zu 0,01 µg
GSTp53 und 0,05 µg von pET3a p53 detektiert werden. Alle Auftragungen
von 4 bis 8 sind in Sättigung. In allen Zellkulturproben konnte p53-Protein
detektiert werden. Die mit rot markierten Ziffern kennzeichnen die nukleären Fraktionen der Zellkulturproben. Die Auftragung der einzelnen Proben
siehe rechts.
Dots
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Probe
GSTp53
GSTp53
GSTp53
pET3a p53
pET3a p53
pET3a p53
pET3a p53
pET3a p53
pET3a p53
Menge in µg
0,1
0,01
0,001
10
5
1
0,5
0,1
0,05
Kontrolle: nukle- 10
äre Fraktion
Kontrolle: cytosolische Fraktion
DMSO: nukleäre
Fraktion
DMSO: cytosolische Fraktion
2 AAF in DMSO:
nukleäre Fraktion
2 AAF in DMSO:
cytosolische
Fraktion
10
10
10
10
10
Im Dot-Blot wurde der Gesamtproteinüberstand eingesetzt, um auszutesten, inwieweit der
Anti p53 Antikörper PAB 240 aus der Menge aller Bakterienzellproteine p53 vom Schwein
erkennt. In allen Fraktionen wurde p53 vom Schwein mit dem monoklonalen Anti p53 Antikörper gegen humanes p53-Protein erkannt. Unspezifische Bindungen des Anti-p53Antikörpers PAB 240 im Dot Blot wie auch Western Blot wurden durch die Zugabe von 6%
Magermilchpulver im Blockierungspuffer wie auch Zugabe von 5% Magermilchpulver bei
der Inkubation der Nitrocellulosemembran mit dem Antikörper verhindert. Die unspezifischen
Bindungsstellen wurden hierbei durch den Überschuß an Albuminen im Magermilchpulver
blockiert. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß der Anti-p53-Antikörper PAB 240
aus der Gesamtmenge an Proteinen in den einzelnen Proben im Dot-Blot p53-Protein vom
Schwein erkannt hat. Im Dot Blot konnten noch bis zu 0,01 µg GSTp53 und 0,05 µg von
pET3a p53 detektiert werden. In den Proben aus den kultivierten Zellen bleibt unklar, ob die
diffuse Anfärbung p53 spezifisch ist (Punkte 10-15, Abb. 3.31). Das vermeintliche Signal war
in den mit 2-AAF behandelten Zellen in beiden Fraktionen (Punkt 14,15 Abb. 3.31) etwas
stärker ausgeprägt, als in den unbehandelten, bzw. mit DMSO-inkubierten Zellen.
III ERGEBNISSE
109
Im Western Blot wurden von den humanen Fusionsproteinen in einer Konzentrationsreihe 1,
0.5, 0.1, 0.05, 0.025 und 0.01 µg Gesamtprotein auf das 15% SDS-Gel aufgetragen. Der Primär- und Sekundärantikörper entsprach den eingesetzen Antikörpern beim Dot-Blot. Bei beiden humanen p53-Proben konnte 0,1µg Gesamtprotein nicht mehr erkannt werden. Bei dem
kommerziellen humanen GSTp53 Protein wurden neben der Hauptbande bei 53 kDA auch
Abbaubanden detektiert. Die Kontrolle mit reinem GST-Protein (Auftrag 0,1 µg
Gesamtprotein) wurde weder beim Western Blot (Abb. 3.32) noch beim Dot-Blot vom Anti
p53 Antikörper PAB 240 erkannt. Damit kann davon ausgegangen werden, dass bei dem
rekombinanten GSTp53 Fusionsprotein der p53 Anteil erkannt wurde. Die cytosolischen und
nukleären Fraktionen von den kultivierten und teilweise behandelten Zellen wurden ebenso in
den Western Blot eingesetzt, es konnte aber mit den monoklonalen Antikörpern in keiner der
Fraktionen p53-Protein detektiert werden.
1
2
3
4
GSTp53
pET3ap53
Abb. 3.32: Detektion des rekombinanten humanen p53-Proteins aus E.coli-BL21Zellen und von kommerziellem p53-Protein durch Western-Blot mit Anti p53 Antikörper PAB 240 (Santa Cruz Biotechology Inc.). Rekombinantes pET3ap53 konnte in
Spur1 mit 0,5 µg und in Spur2 mit 1 µg Protein detektiert werden. Vom kommerziellen
GSTp53 wurden in Spur3 0,5 µg und in Spur4 1 µg detektiert. Degradationsprodukte des
kommerziellen GSTp53 wurden auch erkannt.
3.1.2.6.2
Kreuzreaktivität der verwendeten monoklonalen Antikörper gegen nicht
humanes p53-Protein
Verschiedene kommerzielle Antikörper gegen humanes p53 wurden hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität auf p53 aus Rind und Schwein untersucht. Hierbei zeigte der monoklonale Antikörper Pab 240 eine hochaffine Erkennung von rekombinantem p53 vom Rind im Western
Blot und der monoklonale Antikörper Do-1 erkannte hochaffin rekombinantes p53 vom
Schwein im Western-Blot.
Das rekombinante MBPp53His6 vom Schwein wurde hergestellt, wie unter 3.1.5.2 beschrieben. Für die Analyse wurden sowohl der unlösliche Anteil an Protein (Zellpellet), der lösliche
Überstand des Aufschlusses sowie der nicht an die Amylosesäule gebundene Anteil des löslichen Proteins mit jeweils 10 µg absolut auf ein 15 % SDS-Gel aufgetragen. Daneben wurden
auch die beiden Hauptfraktionen der Aufreinigung sowie eine Konzentrationsreihe der aufge-
III ERGEBNISSE
110
reinigten und aufkonzentrierten Fraktionen des rekombinanten MBPp53His6 Protein vom
Schwein (1, 1.5 und 2 µg) auf das Gel aufgetragen.
1
2
Abb. 3.33: Detektion des rekombinanten MBP-p53Proteins vom Schwein durch Western-Blot mit Anti
p53 Antikörper Do-1. In Spur1 wurden 2 µg und in
Spur2 1.5 µg der aufgereinigten, aufkonzentrierten
Fraktion des rekom-binanten MBPp53His6 Protein
vom Schwein detektiert. Auch die Abbaubanden
wurden erkannt.
MBPp53His6
Bei der eingesetzten Menge von 2 µg (Spur 1, Abb.3.33) und 1,5 µg (Spur2, Abb.3.33) der
aufgereinigten, aufkonzentrierten Fraktion von MBPp53His6 wurde eine Bande bei 90 kDa
mit dem humanen Primärantikörper DO-1 detektiert. Diese Bande entspricht dem Molekulargewicht des Fusionsproteines. Ebenfalls wurden in beiden Proben auch Abbaubanden des
Fusionsproteins erkannt. Bei den anderen aufgetragenen Proben auf dem SDS-Gel wurde kein
p53-Protein wie auch kein anderes Protein vom Schwein detektiert.
1
2
3
4
5
GSTp53
GSTp53
vom Rind
human
Abb. 3.34: Detektion des GSTp53 vom Rind aus E.coli-BL21Zellen durch Western-Blot mit Anti p53 Antikörper PAB 240. In
der Konzentrationsreihe von 10µg (Spur1), 7.5µg (Spur2), 5µg
(Spur3) und 2.5 µg (Spur4) absolut des löslichen Überstandes vom
Bakterienaufschluß des GSTp53 Protein vom Rind wurde das Protein
detektiert. Desweiteren wurde die Bande von 0.25 µg des kommerziellen humanen GSTp53 Protein (Spur5) mit Hilfe des Anti p53
Antikörper PAB 240 detektiert.
Auf einem weiteren 15 % SDS Gel wurde das rekombinante GSTp53 Protein (siehe 3.1.5.2)
vom Rind aufgetrennt. Zur generellen Eignung der Antikörper wurde hier mit dem vorliegenden GSTp53 vom Rind gearbeitet, obwohl es instabiler als das MBPp53His6 vom Rind war.
MBPp53His6 vom Rind lag erst im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit vor und zeigte
im Bezug auf Stabilität und Ausbeute bessere Ergebnisse als das GSTp53 vom Rind Von
dem löslichen Überstand des Bakterienaufschlusses wurde eine Konzentrationsreihe von 10,
7.5, 5 und 2.5 µg absolut aufgetragen. Daneben wurde als Kontrolle 0,25 µg absolut des
kommerziellen humanem GSTp53 Protein aufgetragen. Als Primärantikörper wurde der Anti
III ERGEBNISSE
111
p53 Antikörper PAB 240 eingesetzt. Im Western Blot wurden in allen aufgetragenen Proben
p53-Protein detektiert (Abb.3.34). Ebenfalls wurden Degradationsprodukte bei den hohen
Konzentrationen an p53 erkannt (Abb. 3.34, Spur 1-3).
Die beiden Anti p53 Antikörper Pab240 und Do-1 wurden in erste Oberflächenplasmonresonanz-Messungen eingesetzt, um eine qualitative Aussage über die Detektion von
MBPp53His6 Protein vom Rind und Schwein an die Anti p53 Antikörper machen zu können.
Die Antikörper wurden über den kovalent auf der Sensoroberfläche des Oberflächenplasmonresonanz-Meßgerätes immobilisierten Anti-Maus-Fcγ-Fragment Antikörper aus Ziege (GAMIF) reversibel gebunden. Von dem Anti p53 Antikörper Do-1 wurden 580 RU, von dem
Anti p53 Antikörper PAB 240 630 RU gebunden. Beide Antikörpern konnten auch nach mehreren Regenerationszyklen mit etwa 600 RU Bindung auf der Sensoroberfläche gebunden
werden. Bei etwa 600 RU Bindung der Antikörper (Molekulargewicht 150 kD) auf der Matrix
sind 720 RU Kopplung der jeweiligen rekombinanten Proteine vom Rind und Schwein (beide
90 kD) als maximales Signal zu erwarten (2:1 Stöchiometrie Antigen/Antikörper). Die Vorexperimente mit MBPp53His6 vom Schwein sind hier nicht dargestellt, wurden aber genauso
wie bei dem Rinder-Protein durchgeführt und führten zu dem gleichen Ergebnis (siehe
3.1.6.3). Hier sind die qualitativen Versuche mit Rinder p53 Protein dargestellt. Abbildung
3.35 zeigt den Verlauf des Oberflächenresonanzsignals (RU) für eine mittlere Konzentration
von 500 nM rekombinanten MBPp53His6 Protein vom Rind.
800
600
400
SPR-Signal [RU]
200
0
-200
Injektion von
MBPp53His6
Injektion von
Antikörpern
-400
Puffer
-600
Puffer
-800
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Zeit [sek]
Anti p53 Antikörper DO-1
Anti p53 Antikörper PAB 240
Anti GST Antikörper
Abb. 3.35: Verlauf des SPR-Signals für die Bindung des MBPp53His6 Proteins vom Rind an die immobilisierten
monoklonalen Anti p53 Antikörper Do-1 und PAB240 sowie an einen Anti GST Antikörper. Die monoklonalen Anti
p53 Antikörper Do-1 und PAB240 sowie der monoklonale Anti GST Antikörper 7G3F3 aus Maus wurden auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Im Anschluß wurde 500 nM MBPp53His6 Protein vom Rind injiziert.
III ERGEBNISSE
112
150
110
70
30
SPR-Signal [RU]
-10
-50
-90
-130
-170
-210
-250
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
2200
Zeit [sek]
Anti p53 Antikörper DO-1
Anti p53 Antikörper PAB 240
Anti GST Antikörper
Abb. 3.36: Spezifische Bindung von MBPp53His6 Proteins vom Rind an die immobilisierten Anti p53 Antikörper
sowie Anti GST Antikörper. Dargestellt ist die spezifsche Bindung von 500 nM MBPp53His6 an die monoklonalen Anti
p53 Antikörper Do-1 und PAB240 sowie an den monoklonalen Anti GST Antikörper 7G3F3 aus Maus. Die unspezifische
Bindung von MBPp53His6 vom Rind an die GAMIF Sensoroberfläche wurde von der gemessenen Assoziation von
MBPp53His6 an die immobilisierten Antikörper subtrahiert.
Im Kontrollexperiment wurde MBPp53His6 vom Rind über den kovalent immobilisierten
GAMIF Antikörper geleitet, um die unspezifische Bindung bzw. Akkumulation des Proteins
an die Sensormatrix zu erfassen. Um die Spezifität der beobachteten Bindung sicherzustellen,
wurde als Kontrolle die Assoziation von MBPp53His6 vom Rind an einen gegen GST gerichteten monoklonalen Antikörper (7G3F3) aus Maus gemessen. Hierzu war eine 1:20 Verdünnung des Kulturüberstands der Hybridomazellen eingesetzt worden, mit dem ein Bindungssignal von 300 RU an die GAMIF-Matrix erzielt wurde. Reines MBP-Protein wurde
ebenfalls eingesetzt, um sicherzustellen, dass das rekombinante MBPp53His6 vom Rind nicht
unspezifisch über den MBP-Tag gebunden wurde. Alle Experimente mit dem MBP-Protein
zeigten keine Zunahme des Resonanzsignals.
Die unspezifische Bindung von MBPp53His6 wurde von der Bindung der p53 Proteine an die
Anti p53 Antikörper wie auch an den Anti GST Antikörper 7G3F3 aus Maus abgezogen (Abb.
3.36). Der Anti p53 Antikörper Do-1 zeigt eine qualitativ stärkere Zunahme des Resonanzsignals (120 RU) als die Assoziation von MBPp53His6 vom Rind an den immobilisierten
Anti p53 Antikörper PAB240 (40 RU). Die Assoziation von MBPp53His6 vom Rind an den
immobilisierten Anti-GST-Antikörper entspricht der unspezifischen Bindung an die GAMIFSensoroberfläche.
III ERGEBNISSE
113
Sowohl die spezifische Bindung von 120 RU an den Anti p53 Antikörper Do-1 wie auch 40
RU an PAB 240 liegt deutlich unter der berechneten maximalen Bindung von 720 RU. Dies
entspricht 17 % Beladung bei dem Anti p53 Antikörper Do-1 und 6 % Beladung bei dem Anti
p53 Antikörper PAB 240. Bei den Messungen mit dem rekombinanten p53 Protein vom
Schwein konnten ebenfalls keine höheren Beladungen erzielt werden.
3.1.2.6.3
Quantifizierung der Bindung von rekombinantem MBPp53His6-Fusionsprotein vom Schwein an den monoklonalen Antikörper Do-1 im BIAcore®System
Zur Reduktion der unspezifischen Adsorbtion von MBPp53His6 Protein an Systemkomponenten (Schlauchleitungen, Plastikgefäße etc.) wurde während der gesamten nachfolgenden
Messungen mit einem BIAcore-Meßpuffer gearbeitet, der zusätzlich 0.1 g/l BSA enthielt.
Um das Fängersystem mit dem Anti p53 Antikörper Do-1 zu etablieren, war es wichtig die
Affinität, also die Stärke der Bindung des Antikörpers zu dem rekombinanten p53-Protein
vom Schwein, zu bestimmen. Die Stärke dieser Bindung wird durch die Bindungskonstante
(KA) angegeben. Die Bindungskonstante kann kinetisch als Quotient der Assoziationsrate
(kass) durch die Dissoziationsrate (kdiss) beschrieben werden. Die kinetischen Untersuchungen
erfolgten durch Oberflächenplasmonresonanz-Messungen, bei denen die Bindung von verschiedenen Konzentrationen p53-Protein an die immobilisierten Antikörper verfolgt wurden.
Hierbei lieferten entsprechende Messungen mit MBP-p53 mit der p53 Sequenz von Rind keine kinetisch auswertbaren Kurvenverläufe, während für das analoge Konstrukt mit Schweine
p53 eine Quantifizierung der Interaktion möglich war.
Abbildung 3.37 zeigt den Verlauf des Oberflächenplasmonresonanzsignales (RU) für verschiedene Messungen mit steigenden p53-Konzentrationen (50, 100, 200, 400, 600, 800,
1000, 1500 und 2000nM) vom Schwein an den immobilisierten Anti p53 Antikörper Do-1. Es
ist deutlich zu sehen, dass das Resonanzsignal in Abhängigkeit von der p53-Konzentration
zunimmt.
Im Kontrollexperiment wurde MBPp53His6 vom Schwein ebenfalls konzentrationsabhängig
über eine Anti Rac-Matrix geleitet, um die Spezifität der beobachteten Bindung sicherzustellen. Der Anti Rac Antikörper stand der Arbeitsgruppe über Herrn Dr. Faix (MPI für Biochemie, München) zur Verfügung und war neben dem Anti GST Antikörper freizugängig. Der
monoklonale Zellkulturüberstand einer Hybridomazellkultur ist gegen das zu der Superfamilie Ras gehörende kleine G-Protein Rac gerichtet. Auch vom Anti Rac Antikörper wurde eine
1:20 Verdünnung des Kulturüberstands der Hybridomazellen eingesetzt. Damit wurde ein
III ERGEBNISSE
114
Bindungssignal von 700 RU an die GAMIF-Matrix erzielt. Es wurde keine Bindung des Proteins an die Anti-Rac-Matrix im Vergleich zu der Bindung an die Anti p53 Antikörper Do-1 Oberfläche beobachtet (Abb. 3.38).
200
100
0
0.05 µM MBPp53His6 pig
0.1µM MBPp53His6 pig
SPR-Signal [RU]
-100
0.2 µM MBPp53His6 pig
0.4 µM MBPp53His6 pig
-200
0.6µM MBPp53His6 pig
-300
Injektion von
Anti p53 Antikörper Do-1
-400
0.8µM MBPp53His6 pig
Injektion von
MBPp53His6
1µM MBPp53 his6 pig
1.5 µM MBPp53His6 pig
Puffer
-500
2 µM MBP53His6 pig
Puffer
-600
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Zeit [sek]
Abb.3.37: Messung der Assoziation von steigenden Konzentrationen MBPp53His6 vom Schwein an den immobilisierten Anti p53 Antikörper Do-1 durch Oberflächenplasmonresonanz. Der Anti p53 Antikörper Do-1 wurde zunächst an
eine GAMIF-Matrix gebunden. Im Anschluß wurde MBPp53His6 vom Schwein in steigenden Konzentrationen (von 50 bis
2000 nM) injiziert. Die konzentrationsabhängige Bindung des MBPp53His6 vom Schwein an den Anti p53 Antikörper Do-1
wird durch die Zunahme des Resonanzsignales (RU) angezeigt.
100
20
-60
0.05µM MBPp53His6 pig
-140
0.1µM MBPp53His6 pig
0.2µM MBPp53His6 pig
SPR-Signal [RU]
-220
0.4 µM MBPp53His6 pig
-300
0.6µM MBPp53His6 pig
-380
0.8µM MBPp53His6 pig
Injektion von Anti
Rac Antikörper
-460
1µM MBPp53His6 pig
Injektion von
MBPp53His6
1.5µM MBPp53His6 pig
-540
2 µM MBPp53His6 pig
Puffer
Puffer
-620
-700
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Zeit [sek]
Abb.3.38: Messung der Assoziation von steigenden Konzentrationen MBPp53His6 vom Schwein an den Anti Rac
Antikörper durch Oberflächenplasmonresonanz. Im Kontrollexperiment wurde zunächst der Anti Rac Antikörper in einer
1:20 Verdünnung des Hybridomazellkulturüberstands an die Sensoroberfläche gebunden. Im Anschluß wurde MBPp53His6
vom Schwein in steigenden Konzentrationen (von 50 bis 2000 nM) injiziert. Es ist keine Bindung von MBPp53His6 vom
Schwein an den Anti Rac Antikörper zu sehen.
III ERGEBNISSE
115
150
100
SPR-Signal [RU]
50
0
-50
-100
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
3000
3200
Zeit [sek]
0.05 µM MBPp53His6 pig
0.1µM MBPp53His6 pig
0.2 µM MBPp53His6 pig
1µM MBPp53 his6 pig
1.5 µM MBPp53His6 pig
2 µM MBP53His6 pig
0.4 µM MBPp53His6 pig
0.6µM MBPp53His6 pig
0.8µM MBPp53His6 pig
Abb. 3.39: Anpassung der Meßkurven der Assoziationsreaktion von steigenden Konzentrationen MBPp53His6 vom
Schwein an den Anti p53 Antikörper DO-1 an eine einfache exponentielle Steigung. Dargestellt ist die Anpassung an die
Assoziation von neun verschiedenen MBPp53His6-Konzentrationen von 0,05 bis 2 µM an den Anti p53 Antkörper DO-1.
Mit Hilfe des Models "1:1 (Langmuir) association" der BIAevaluation®-Software wurde die Messkurven an eine einfache
exponentielle Steigung angepaßt.
MBPp53His6 Konzentration in nM
kobs 1/s
50
4,89E-03
100
5,41E-03
200
5,90E-03
400
9,16E-03
600
0,0105
800
0,013
1000
0,0142
1500
0,0165
2000
0,02
Tab. 3.2: Werte zu der Abbildung 3.40
Aus den gewonnenen Meßdaten für die Bindung von MBPp53His6 vom Schwein an die auf
der Sensoroberfläche immobilisierten Antikörper wurden die Geschwindigkeitskonstanten für
die Assoziations- (KA) und Dissoziationsreaktion
sowie die Gleichgewichtsdissoziati-
onskonstante KD für die Bindung von MBPp53His6 vom Schwein bestimmt. Zunächst wurde
aus sieben der neun verschiedenen p53-Konzentrationen von 50 bis 1000 nM die apparenten
3400
III ERGEBNISSE
116
Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation errechnet. Die hohen p53-Konzentrationen von
1500 und 2000 nM wichen von den errechneten Geschwindigkeitskonstanten kAss der niedrigen p53-Konzentrationen stark ab. Die Assoziation bei den hohen Konzentrationen lief
schneller ab. Die Meßkurven der Assoziationsreaktionen wurden mit Hilfe des Models "1:1
(Langmuir) association" BIAevaluation - Software (Version 3.0) an eine einfach exponentielle Steigung angepaßt (Abb. 3.39).
2,50E-02
y = 8E-06x + 0,0053
2,00E-02
Kobs 1/sek
1,50E-02
1,00E-02
5,00E-03
0,00E+00
0
500
1000
1500
2000
2500
Konzentration in nM
Abb. 3.40: Auftrag der apparenten Geschwindigkeitskonstanten der Assoziationsreaktion von verschiedenen Konzentrationen von MBPp53His6 vom Schwein an den Anti p53 Antikörper Do-1 gegen die jeweilige MBPp53His6Konzentration.
Die apparenten Geschwindigkeitskonstanten wurden nun gegen die jeweilige p53Konzentration aufgetragen (Abb. 3.40). Es ergab sich eine Gerade, deren Steigung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten kAss und deren Achsenabschnitt der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten kDiss entsprach. Die Geschwindigkeitskonstante kAss betrug 8 x
106 M-1s-1.
Aufgrund der Fehleranfälligkeit bei kleinen Werten in kobs vs. C Auftragung für kdiss (SCHUCK
et al., 1998), wurde kdiss aus der unabhängigen Messung der Dissoziationsreaktion durch Anpassung der Messkurven an eine einfach exponentielle Funktion errechnet. Mit Hilfe des Models " 1:1 (Langmuir) dissociation" der BIAevaluation®-Software wurde die Anpassung der
Messkurven durchgeführt. Eine mittlere Konzentration von 0,8 µM MBPp53His6 wurde auf
der Oberfläche kovalent an den Anti p53 Antikörper DO-1 gebunden und die Abnahme des
Resonanzsignales über 2 Stunden aufgezeichnet (Abb. 3.41). Der Wert der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante kDiss betrug 1,8 x 10-4 s-1. Aus den so erhaltenen Geschwindig-
III ERGEBNISSE
117
keitskonstanten für die Assoziations- und die Dissoziationsreaktion wurde über die Beziehung
KD=kDiss/kAss die Gleichgewichtskonstante KD zu 2,25 x 10-11 M berechnet.
120
100
80
60
SPR-Signal [RU]
40
20
0
-20
-40
-60
-80
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
2200
2300
2400
2500
2600
2700
2800
2900
3000
3100
Zeit [sek]
Abb. 3.41: Anpassung der Meßkurven der Dissoziationsreaktion von 0,8 µM MBPp53His6 an eine einfache
exponentielle Steigung. Dargestellt ist die Assoziation von 0,8 µM MBPp53His6 an den immobilisierten Anti p53
Antikörper DO-1. Die Dissoziationsreaktion von MBPp53His6 von der Sensoroberfläche ist von 1680 bis 3100 sek
dargestellt. Insgesamt wurde 2 Stunden nach Injektion des MBPp53His6 mit Puffer nachgespült. Das Resonanzsignal
veränderte sich dabei nicht und entsprach dem Verlauf zwischen 1680 bis 3100 sek.
3.1.2.7 Einsatz von Zellkulturmaterial in das Fängersystem mit dem monoklonalen Anti p53
Antkörper Do-1
Nachdem das Fängersystem mit dem Anti p53 Antikörper Do-1 mit rekombinantem Protein
etabliert werden konnte, wurde Zellkulturmaterial anstelle von rekombinantem Protein eingesetzt. Von dem Zellkulturmaterial aus 4 Tage kultivierten Rinderkolonepithelzellen wurde das
Gesamtprotein isoliert. Die kultivierten Rinderkolonepithelzellen stammten aus Inkubationsversuchen mit 100 µM MNNG (siehe 3.1.1.3). Aus den behandelten Zellen wurde, verändert
nach NEUFELD & WHITE (1997), die zytosolische und nukleäre Fraktion der zellulären Proteine isoliert.
Ziel war es, mit Hilfe des reversibel auf der Sensoroberfläche gebundenen Anti p53 Antikörper Do-1 in der cytosolischen und nukleären Fraktion p53-Protein zu detektieren. Die verschiedenen Proteinproben, isoliert aus den kultivierten und behandelten Zellen, wurden in
einer Konzentration von 0,1 g/l in den Messungen eingesetzt. Es wurde jeweils die cytosolische und nukleäre Fraktion der nicht behandelten Zellen und der mit 100 µM MNNG behandelten Zellen eingesetzt.
III ERGEBNISSE
118
3500
Injektion von
Zellkulturproben
3000
2500
SPR-Signal [RU]
2000
1500
1000
Injektion von
Anti p53 AK
500
Puffer
Puffer
0
-500
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
2400
2700
3000
Zeit [sek]
mAK p53: Kontrolle nukeläre Fraktion
mAK p53: MNNG nukuleäre Fraktion
mAK p53: Kontrolle cytosolische Fraktion
mAK p53: MNNG cytosolische Fraktion
Abb. 3.42: Messung der Assoziation von p53-Protein isoliert aus behandelten Primärzellkulturen von dem immobilisierten Anti p53 Antikörper DO-1 durch Oberflächenplasmonresonanz. Der Anti p53 Antikörper Do-1 wurde über sein
Fcγ-Fragment an die mit Anti Maus Fcγ-Fragment beschichteten Sensoroberfläche immobilisiert. Im Anschluß wurde jeweils
0.1 g/l Gesamtprotein der cytosolischen und nukleären Fraktion isoliert aus kultivierten Primärzellen von Rinderkolonepithelzellen, die mit 100µM MNNG inkubiert worden sind, über den auf der Sensoroberfläche immobilisierte Antikörper
geleitet (mAK p53: MNNG-cytosolische Fraktion und mAK p53: MNNG-nukleäre Fraktion). Ebenso wurden die nicht behandelten Kontrollproben aus der Zellkultur eingesetzt (mAK p53: Kontrolle-cytosolische.Frakton und mAK p53: Kontrollenukläre Fraktion).
Die Abbildung 3.42 zeigt die Ergebnisse für die Detektion von p53-Protein in den Zellkulturproben. Im Kontrollexperiment wurden die Proteinproben aus den Zellkulturproben über eine
Anti Rac-Matrix geleitet, um die Spezifität der beobachteten Bindung sicherzustellen. Es
kommt zu einer Zunahme des Resonanzsignals. Ob das die Bindung von p53-Protein aus den
Fraktionen des Inkubationsversuches an den immobilisierten Anti p53 Antikörper Do-1 darstellt, kann erst durch weitere Versuche abgesichert werden, z.B. durch die Zugabe von rekombinanten p53-Protein in die Zellkulturprobe. Im Vergleich bindet kaum Protein aus den
Fraktionen des Inkubationsversuchs an den immobilisierten Kontroll Anti Rac Antikörper.
Als Kontrolle wurde der Anti Rac Antikörper einer 1:20 Verdünnung des Kulturüberstands
der Hybridomazellen eingesetzt. Damit wurde ein Bindungssignal von 500 RU an die GAMIF-Matrix erzielt. Es wurde keine Bindung des Proteins an die Anti-Rac-Matrix im Vergleich zu der Bindung an die Anti p53 Antikörper Do-1 -Oberfläche beobachtet (Abb. 3.43).
Von dem Anti-p53-Antikörper DO-1 konnten jeweils 200 RU reversibel gebunden werden.
Bei etwa 200 RU Bindung des Antikörpers (Molekulargewicht 150 kD) auf der Matrix sind
140 RU Kopplung von p53 Protein (53 kD) als maximales spez. Bindungssignal (2:1 Stöchi-
III ERGEBNISSE
119
ometrie) zu erwarten. Bei beiden Kontrollproben (cytosolische und nukleäre Fraktion) sind
ca. 200 RU Bindung an den Anti p53 Antikörper zu sehen. Bei den behandelten Proben sind
200 RU Bindung bei der cytosolischen Fraktion detektiert worden und 280 RU bei der nukleären Fraktion. In allen vier Messungen übersteigt die Änderung des SPR-Signals damit den
Wert der maximalen spezifischen Bindung von Abb. 3.37. Das Bindungssignal der nukleären
Fraktion der mit MNNG behandelten Zellkulturprobe übersteigt das Bindungssignal von der
höchsten eingesetzten Konzentration von 2 µM des rekombinanten p53-Proteins aus den
Konzentrationsreihen Um eine Aussage machen zu können, ob hier spezifisch p53-Protein
erkannt wird, müßte rekombinantes Protein den Zellkulturproben zu dotiert werden und dann
müsste das Resonanzsignal sich bei einem spezifischen Bindungssignal entsprechend erhöhen.
3000
2500
2000
Injektion der
Zellkulturproben
SPR-Signal [RU]
1500
1000
Injektion des
Anti Rac AK
500
Puffer
Puffer
0
-500
-1000
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
2400
2700
3000
Zeit [sek]
mAK Rac: Kontrolle - cyt. Frak.
mAK Rac: Kontrolle - nuk. Frak.
mAK Rac: MNNG - cyt. Frak.
mAK Rac: MNNG - nuk. Frak.
Abb. 3.43: Messung der Assoziation von p53-Protein isoliert aus behandelten Primärzellkulturen von dem immobilisierten anti Rac Antikörper durch Oberflächenplasmonresonanz. Der Anti Rac Antikörper wurde auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Im Anschluß wurde jeweils 0.1 g/l Gesamtprotein der cytosolischen und nukleären Fraktion isoliert aus
kultivierten Primärzellen von Rinderkolonepithelzellen, die mit 100µM MNNG inkubiert worden sind, über die Sensoroberfläche geleitet (mAK Rac: MNNG-cytosolische Fraktion und mAK Rac: MNNG-nukleäre Fraktion). Ebenso wurden die
nicht behandelten Kontrollproben aus der Zellkultur eingesetzt (mAK Rac: Kontrolle-cytosolische.Frakton und mAK Rac:
Kontrolle-nukläre Fraktion).
III ERGEBNISSE
120
3.2. Nachweissysteme für spezifische DNA-Schädigungen
3.2.1. Anti DNA Addukt spezifische Antikörper als Fänger im BIAcore®-System
Von Herrn PD Dr. Thomale (Institut für Zellbiologie, Universitätsklinikum Essen) wurden
freundlicherweise monoklonale Antikörper (ER 6.7) zur Verfügung gestellt, die spezifische
Alkylierungsprodukte - O6Alkylguanin - in der DNA erkennen. Hiermit steht ein Fänger zur
Verfügung der noch eine Klasse von primären Schädigung in der DNA erkennt. Die Anti Addukt spezifischen monoklonalen Antikörper binden dabei nicht an den Doppelstrang als solchen, sondern an die modifizierte Nukleobase des DNA-Adduktes. Die Quantifizierung der
Alkylierungsprodukte in der Gensequenz ist mit diesen Antikörpern im fentomolaren bis subfentomolaren Bereich möglich mit Radioimmunassays (SEILER et al., 1993). Aufgrund der
hohen Selektifität der Antikörper wurden sie in die Oberflächenplasmonresonanztechnik eingesetzt zur Detektion von DNA-Addukten in den behandelten Zellkulturproben. Der Anti
Addukt spezifische Antikörper ER 6.7, der O6Alkylguanine erkennt, wurde als Fänger in das
SPR-System eingesetzt, um selektiv und sehr spezifisch die geschädigte DNA zu binden.
3.2.1.1. DNA-Standardproben für BIAcore-Experimente
Als einfachstes Modell für DNA–Addukte, wie sie infolge mutagener Schädigungen auch in
genomischer DNA auftreten, dienten DNA-Oligomere von 24 Basenpaaren Länge. Bei diesen
Oligomeren war die Position 14 entweder ein Guanin oder O6Alkylguanin (II Material, 2.9.3
Tab. 2.1). Beide Oligomere waren am 5´Ende phosporyliert. Die Proben wurden (siehe Anhang 7.1) wie unter 2.4.1 im Methodenteil beschrieben hybridisiert.
Zur Herstellung größerer, alkylierter DNA-Oligomeren wurde RNA-freie Kalbsthymus DNA
mit Ethyl-N-Nitrosoharnstoff behandelt. Diese Proben wurden in der AG von Herrn PD Dr.
Jürgen Thomale (Institut für Zellbiologie, Universitätsklinikum Essen) durchgeführt und
freundlicherweise für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. 10 µg DNA wurden mittels
Restriktionsverdau mit EcoRI auf eine mittlere Größenverteilung von 500 bp gebracht, die
DNA durch Ethanolfällung entsalzt und im 3 fachem Überschuß mit 3 mg/ml Ethyl-NNitrosoharnstoff geschädigt. Der molare Gehalt der DNA an O6-Ethylguanin wurde mit Hilfe
eines kompetiven Radioimmunassay ermittelt und aus den erhaltenen Werten die durchschnittliche Anzahl der O6-Ethylguanine pro DNA-Strang berechnet.
Bei einer mittleren Größenverteilung von 500 bp ergibt sich für die Probe ein Verhältnis von
einem O6-Ethylguanin zu 104 nicht modifiziertem DNA-Strang, d.h. alkyliertes Guanin tritt
III ERGEBNISSE
121
im Verhältnis 1:10.000 zu nicht alkyliertem Guanin auf. Bei einem ca. 500 bp Strang sind
statistisch ¼ also ca. 125 Guanosine vorhanden, dann trägt etwa jedes 100ste DNA-Fragment
ein Alkylguanin.
3.2.1.2. Bindungsstudien mit vorgelegtem Anti DNA Addukt spezifischen Antikörper
Der Anti DNA-Addukt spezifische Antikörper ER 6.7 wurde in erste qualitative Oberflächenplasmonresonanz-Messungen eingesetzt. Über kovalent gebundenes Anti-Ratten-IgG
Serum wurde der Antikörper reversibel gebunden, es konnten reproduzierbar 160 RU Bindung erzielt werden. Im weiteren sollte im SPR-System die Affinität des Anti DNA-Addukt
spezifischen Antikörpers zu den DNA-Addukten in dem hybridisierten und einzelstängigen
24 bp Oligomeren wie auch der 500 bp langen RNA-freien Kalbsthymus DNA bestimmt werden. Bei einer durchschnittlichen Beladung mit etwa 160 RU von dem Antikörper ER 6.7
(150 kDa) würde eine maximale spezifische Beladung mit dem Einzelstrang Oligomer (24 bp,
ca. 8 kDa) von 17 RU und bei dem Einzelstrang Fragmenten (500bp, 165 kD) der RNAfreien Kalbsthymus DNA von 360 RU zu erwarten sein. Damit reichten 100 RU Beladung an
Antikörper ER 6.7 nicht für die Detektion von DNA-Addukten in den behandelten Oligomeren aus (spezifisches Signal im Bereich des Systemrauschens).
Durch eine lange Aktivierungsphase der Dextranmatrix wurde versucht die Immobilisierung
der Sensoroberfläche mit Anti-Ratte-Fcγ-Fragment-Antikörper zu erhöhen, um so auch die
Beladung der Matrix mit Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 zu erhöhen. Nach der Immobilisierung von Anti-Ratten-Fcγ-Fragment-Antikörper auf der Sensoroberfläche konnte 540 RU
Anti DNA-Addukt Antikörper ER 6.7 reversibel gebunden werden.
1 µM von der nicht behandelten und von der mit Ethyl-N-Nitrosoharnstoff behandelten RNA
freien Kalbsthymus DNA wurden als Doppel- und Einzelstrang über die auf der Sensoroberfläche immobilisierten Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 geleitet. Es ist keine Assoziation
der DNA-Proben an den immobilisierten Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 zu detektieren,
das Resonanzsignal fällt während der Bindungsverläufe weiter ab (Abb. 3.44). Nach Wechsel
auf Laufpuffer hätte sich eine Bindung der DNA in einer Erhöhung des Resonanzsignals gegenüber dem Startwert vor DNA-Injektion zeigen müssen. Bei im Durchschnitt 540 RU Bindung des Antikörpers (150 kD) wären bis zu 1200 RU spezifischer Bindung für die mit EthylN-Nitrosoharnstoff behandelte RNA freie Kalbsthymus DNA (165kD) erwartet worden.
Der verwendete monoklonale Anti DNA Addukt spezifische Antikörper ER 6.7 entstammt
einer Kollektion hochaffiner und spezifischer Anti Alkyl-Desoxynukleosid Antikörper. Der
vorliegende Antikörper wurde durch Immunisierung von Ratten mit an Trägerproteine gekop-
III ERGEBNISSE
122
pelte Alkyl-Ribonukleoside (Haptene) gewonnen. Die Affinitätskonstanten aller gewonnenen
Antikörper sind durchweg sehr hoch (109 bis > 1010 l/mol), ihre Kreauzreaktivitäten mit nicht
modifizierter DNA sehr gering (RAJEWSKY, 1980, ADAMKIEWICZ, 1985; EBERLE, 1989). Ist
das Antigen nicht frei zugänglich, sondern in Einzelstrang oder Doppelstrang DNA eingebunden, so nimmt die Affinität der Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörper deutlich ab. So ist
die Affinität des anti-(O6-Ethyl-2´-Desoxyguanosin)-Antikörper ER 6.7 gegenüber O6-Ethyl2´-Desoxyguanosin in Einzelstrang DNA höher als zu O6-Ethyl-2´-Desoxyguanosin in Doppelstrang DNA (ADAMKIEWICZ, 1985).
100
-200
SPR-Signal [RU]
-500
-800
-1100
Injektion der
Antikörper
-1400
Injektion
der DNA
Puffer
Puffer
-1700
-2000
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
Zeit [sek]
1 µM ds alkylierte DNA
1 µM ss alkylierte DNA
1 µM ds DNA
1 µM ss DNA
Abb.3.44: Messung der Bindung von alkylierter und nicht alkylierter DNA an die immobilisierten Anti DNA Addukt Antikörper ER6.7 durch Oberflächenplasmonresonanz. Der Anti DNA Addukt Antikörper ER6.7 wurde über die
mit Fänger Antikörper beschichtete Sensoroberfläche gebunden . Überschüssige, nicht gebundene Antikörper wurden
durch Inkubation der Matrix mit Puffer entfernt (Sekunden 520 bis 1200). Im Anschluß wurde jeweils 1 µM DNA doppelsträngige (ds) bzw. einzelsträngige (ss) und alkylierte bzw. nicht alkylierte DNA injiziert. Die Bindung der DNA an die
Antikörper wird durch die Zunahme des Resonanzsignales (RU) angezeigt.
Aufgrund dieser Tatsachen wurde im weiteren in die SPR-Technik DNA-Oligomere von 24
bp Länge eingesetzt, bei denen sich auf Position 14 entweder ein Guanin oder O6Alkylguanin
befand.
Die Abbildung 3.45 zeigt den Verlauf des Oberflächenplasmonresonanzsignales (RU) für
steigende DNA-Konzentrationen. Die 24 bp DNA-Oligomere mit O6Alkylguanin oder Guanin
wurden in den Konzentrationen 100, 500, 1000, 2000 und 3000nM eingesetzt. Bei im Durchschnitt 540 RU Bindung des Antikörpers (150 kD) wären maximal ca. 60 RU Bindung von
dem 24 bp DNA-Oligomer mit O6Alkylguanin (8 kD) erwartet worden.
III ERGEBNISSE
123
Unterschiede in der Erkennung der DNA-Oligomeren mit O6Alkylguanin sind nicht detektierbar. Die Signalhöhe ist bei allen eingesetzten Messungen gleich hoch. Bei einr Konzentration von ca. 1000 nM DNA-Oligomeren mit O6Alkylguanin wurde eine Signalerhöhung von
ca. 13 RU erzielt, das entspricht einer Belegung des vorgelegten Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 von etwa 13 %.
300
250
200
100 nM DNA-Addukt Oligomer
500 nM DNA-Addukt Oligomer
150
1000 nM DNA-Addukt Oligomer
SPR-Signal [RU]
100
2000 nM DNA-Addukt Oligomer
50
3000 nM DNA-Addukt Oligomer
100 nM DNA Oligomer
0
500 nM DNA Oligomer
-50
Injektion
der Antikörper
-100
-150
1000 nM DNA Oligomer
Injektion
der DNA
Puffer
2000 nM DNA Oligomer
3000 nM DNA Oligomer
Puffer
-200
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
Zeit [sek]
Abb.3.45: Messung der Dissoziation von DNA-Oligomeren mit Guanin oder O6Alkylguanin an die immobilisierten
Anti DNA-Addukt Antikörper ER6.7 durch Oberflächenplasmonresonanz. Der Anti DNA Addukt Antikörper ER6.7
wurde über eine anti-Ratten-IgG-Matrix immobilisiert. Im Anschluß wurden 100, 500, 1000, 2000 und 3000 nM DNAOligomeren ohne Guanin-Modifikation (DNA-Olgomer) oder O6Alkylguanin (DNA-Addukt Oligomer) injiziert.
3.2.2. DNA-Analoga – Peptid Nukleinsäuren
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Detektionssystem zur Erkennung von Punktmutationen in
Marker-Genen etabliert, das auf der sequenzspezifischen Hybridisierung von komplementären
Nukleinsäuren beruht. Das von NIELSEN 1991 synthetisierte DNA Analogon weist bei der
sequenzspezifischen Hybridisierung mit Einzelstrang-DNA bessere Eigenschaften auf als
gegenüber „normaler“ DNA (HYRUP & NIELSEN, 1996). Als Marker-Gen wurde das Ras-Gen
gewählt, da diese Gen durch eine einzige Punktmutation von einem Protoonkogen in ein Onkogen überführt werden kann.
3.2.2.1 Klonierung von H-ras aus Rind
Da die geplanten zellulären Toxizitätstests auf Rinder- und Schweineepithelzellkulturen aufbauen sollten, mußten zunächst die Gensequenzen von H-ras aus Rind und Schwein kloniert
werden. Die Gensequenz der Exone 1 und 2 von H-ras aus Rind konnten mit Hilfe der beschriebenen Sequenz aus der Gendatenbank (Genbank des National Center for Biotechnology
III ERGEBNISSE
124
Information, AC X17363) isoliert werden. Die eingesetzten Oligonukleotide zur Amplifikation des H-ras-Gen vom Rind wurden als „Rasbovfwd“ und „Rasbovrev“ bezeichnet (II Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.3).
In die erste Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurden nicht-degenerative Oligonukleotide (II Methoden 2.2.5.1, Tabelle 2.3) eingesetzt. Gesamt-RNA aus primär kultivierten
Harnblasenepithelzellen des Rinds war das Ausgangsmaterial für die TouchdownPolymeraseketten-Reaktion, die mit einer hohen spezifischen Annealingtemperatur von 60°C
gestartet und in drei 1°C-Temperaturschritten mit einer unspezifischen Temperatur von 58°C
abgeschlossen wurde. Die weiteren Bedingungen wurden gewählt wie in Tab.3.3 beschrieben.
Das Amplifikationsergebniss wurde gelelektrophoretisch ausgewertet und ist in Abbildung
3.46 dargestellt.
Danach konnte das H-ras-Gen vom Rind mit der erwarteten Grösse von 300 kD erfolgreich
amplifiziert werden.
Basen
paare
2000
1600
1000
500
400
M
1
-Q
2
+Q
3
+Q
4
+Q
Abb. 3.46: Amplifikations des H-ras-Gens aus
Gesamt-RNA von kultivierten Rinderharnblasenepithelzellen.
Nach der Reversen Transkriptionsreaktion (RTReaktion) mit dem poly-dT18-Oligonukleotid
wurde der Reaktionsansatz in 2 x 5 µl und 10 µl
aufgeteilt und so in die TouchdownPolymeraseketten-Reaktion eingesetzt. Auf dem
1,3%-Agarosegel sind in Spur 1 die Probe der
Touchdown-Polymerasekettenreaktion, in die 5 µl
von der RT-Reaktion ohne Q-Solution eingesetzt
wurde, in der 2. Spur die Probe mit 5 µl aus der
RT-Reaktion mit Q-Solution, 3. Spur 10 µl aus der
RT-Reaktion mit Q-Solution, 4. Spur die Negativkontrolle, M: 1 kb-DNA-Leiter dargestellt.
Dann schloß sich eine zweite Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion mit degenerierten Oligonukleotiden (II Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.3) an. In die zweite TouchdownPolymeraseketten-Reaktion wurde von der aus der ersten Reaktion erhaltenen c-DNA der
Probe in der Spur 2 1 µl einer 100fachen Verdünnung eingesetzt. Auch bei dieser Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurde mit einer spezifischen hohen Annealingtemperatur
gestartet (58°C) und in zwei 1°C-Temperaturschritten die Annealingtemperatur auf 56°C gebracht, um im letzten Temperaturschritt mit einer unspezifischen Temperatur von 52°C zu
abzuschliessen. Die anderen Bedingungen wurden gewählt wie in Tab. 3.3 beschrieben. Die
Ergebnisse der zweiten Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurden auf einem 0,8 % A-
III ERGEBNISSE
125
garosegel überprüft, die erwartete DNA-Bande in der Größe von ca. 300 bp (Länge der Exone
1-2 des H-ras-Gens aus Rind: 288 bp) konnte detektiert werden (Abb. 3.47).
Basen
paare
M
1
+Q
2
+Q
3
+Q
1600
1000
500
400
4
+Q
5
+Q
Abb.3.47: Amplifikationsergebnisse des
H-ras-Gens
aus
TouchdownPolymeraseketten-Reaktion mit degenerierten Oligonukleotiden. Die positive
Probe in Spur 2 aus Abb. 3.36 wurde mit 1
µl einer 1:100 fachen Verdünnung in einer
Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion
eingesetzt. Mit Hilfe der Q-Solution konnte das gewünschte ras-Gen vom Rind
inklusive BamHI/EcoRI Restriktionsschnittstellen amplifiziert werden. Auf
dem 0,8 %-Agarosegel sind in Spur 1-4 die
mit Q-Solution (+Q) amplifizierten Proben, in Spur 5 die Negativkontrolle dargestellt. M: 1 kb-DNA-Leiter
Mit Hilfe der eingeführten Restriktionsschnittstellen BamHI / EcoRI wurde die c-DNA in den
Expressionsvektor pGEX2T einkloniert. Alle mit Hilfe dieses Vektors exprimierten Proteine
tragen dann an ihrem N-Terminus einen Glutathion-S-Transferase-Tag (GST-Tag). Der Ligationsansatz wurde in kompetente E.coli-TG1-Zellen transformiertund der pGEX2T-Ras Vektor dann über eine Plasmid-Isolierung aufgereinigt. Die isolierte DNA wurde dann mit BamHI
und EcoRI verdaut, gelelektrophoretisch analysiert und sequenziert. Die ermittelten Sequenzen wurden in Datenbankvergleiche (siehe Abb.7.3, Anhang) eingesetzt, wobei für drei der
positiven Klone die Ras-Sequenz des Rindes bestätigt werden konnte. Die positiven Klone
wurden in die E.coli-BL21DE3-Expressionszellen transformiert und zur Lagerung wurden
Glycerolstocklösungen angelegt.
3.2.2.2 Klonierung von H-ras aus Schwein
Mit Hilfe des nicht degenerativen Oligonukleotidpaares (II Methoden 2.2.5.1, Tab. 2.3) spezifisch für die H-ras-Sequenz vom Rind wurde das H-ras-Gen vom Schwein amplifiziert. Eingesetzt in die Touchdown-Polymerase-Reaktion wurde Gesamt-RNA, isoliert aus kultivierten
primären Schweineharnblasenepithelzellen. Hierbei wurde das gleiche Temperaturprogramm
benutzt wie zuvor für die Amplifikation des H-ras-Gens vom Rind beschrieben. Das Ergebnis
der Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurde gelelektrophoretisch ausgewertet (Abb.
3.48).
Für die genaue Sequenzierung direkt nach der Touchdown-Polymerase-Reaktion wurde das
amplifizierte cDNA-Fragment in den Plasmidvektor pCR2.1 kloniert. E.coli-TG1-Zellen
wurden mit dem Ligationsansatz transformiert und die erhaltenen Transformanden durch an-
III ERGEBNISSE
126
schließende Restriktionsanalyse mit dem Enzym EcoRI daraufhin untersucht, ob das PCRProdukt insertiert worden war (Abb.3.49). Die Restriktionsanalysen dieser Klone zeigten alle,
dass das gewünschte Fragment vorlag. Die anschliessenden Sequenzierungen bestätigten
dann, dass das H-ras-Gen vom Schwein isoliert worden war.
Basen
paare
M
1
+Q
2
-Q
3
+Q
4
+Q
1000
500
300
Abb. 3.48: Amplifikations-ergebnisse des
H-ras-Gens vom Schwein unter Verwendung
nicht degenerierter Oligonukleotide für das Hras-Gen vom Rind. Nach der Reversen
Transkriptions-reaktion (RT-Reaktion) mit dem
poly-dT18-Oligonukleotid wurde der Reaktionsansatz in 2 x 5 µl und 10 µl aufgeteilt und so in die
Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion
eingesetzt. Mit Hilfe der Q-Solution konnte das gewünschte H-ras-Gen vom Schwein amplifiziert
werden. Auf dem 2 %-Agarosegel ist in Spur 1 die
Probe der Touchdown-Polymerasekettenreaktion,
in die 5 µl von der RT-Reaktion mit Q-Solution
eingesetzt wurde, in der 2. Spur die Probe mit 5 µl
aus der RT-Reaktion ohne Q-Solution, 3. Spur 10
µl aus der RT-Reaktion mit Q-Solution, 4. Spur
die negativ Kontrolle, M: 1 kb-DNA-Leiter dargestellt.
Die insertierte DNA von 3 positiven Klonen wurde mittels zyklischer Sequenzierung (II Methoden, 2.2.6.7) analysiert. Die ermittelten Sequenzen wurden in Datenbankvergleiche eingesetzt und ergaben eine hohe Homologie zu anderen H-ras-Sequenzen von Rind und Mensch
(siehe Abb. 7.3, Anhang).
In einer weiteren Touchdown-Polymeraseketten-Reaktion wurden in die insertierte DNA mit
Hilfe des degenerierten Oligonukleotidpaares für das H-ras-Gen vom Rind (II Methoden,
2.2.5.1 Tab. 2.3) Schnittstellen zum Einklonieren der DNA in den Expressionsvektor
pGEX2T
eingefügt.
Von
den
isolierten
Plasmiden
wurde
in
die
Touchdown-
Polymeraseketten-Reaktion 1 µl einer 10fachen Verdünnung eines isolierten, sequenzierten
Plasmides und 1 µl einer unverdünnten Lösung aus der ersten Touchdown-PolymerasekettenReaktion eingesetzt. In allen Ansätzen konnte die c-DNA amplifiziert werden. Es wurde das
gleiche PCR-Programm wie für die Amplifikation des H-ras-Gens vom Rind verwendet.
Mit Hilfe der eingeführten Restriktionsschnittstellen EcoRI /BamHI wurde die c-DNA in den
Expressionsvektor pGEX2T einkloniert, transformiert in E.coli-TG1-Zellen und anschließend
mittels Restriktion mit BamHI und EcoRI die Länge des einklonierten Fragments überprüft.
Nach der gelelektrophoretischen Auswertung wurde die insertierte DNA der positiven Klone
sequenziert. Die ermittelten Sequenzen wurden in Datenbankvergleiche eingesetzt und bestä-
III ERGEBNISSE
127
tigten, daß erfolgreich das 288 bp Fragment für das H-ras-Gen vom Schwein in den Expressionsvektor pGEX2T einkloniert war.
Basen
M
1
2
3
4
5
6
7
paare
4100
1000
500
300
Abb. 3.49: 2 % Agarosegel zur Überprüfung Restriktionsanalyse der Plasmid DNA aus E.coli-TG1Zellen. Entsprechend der Ligation wurde eine 3,9 kb große Vektorbande und eine ca. 300 bp große Insertionsbande den untersuchten Klonen gefunden (Spur 1-7). M: 1kb-DNA-Leiter
Die Sequenz wurde unter Verwendung des Programmes Bankit in die Genbank des National
Center for Biotechnology Information (NCBI englisch nationales Zentrum für biotechnologische Informationen) eingegeben (siehe Anhang, 7.4). Die positiven Klone pGEX2TrasExon1+2 vom Schwein wurden in E.coli-BL21-Expressionszellen transformiert und zur
Lagerung wurden Glycerolstocklösungen angelegt.
Im weiteren mußten noch die Sequenzen für das C- und N-Terminale Ende überprüft werden,
dadiese Bereiche durch DNA-Sonden amplifiziert worden waren, die spezifisch für die Rindersequenz entworfen worden waren. Diese Überprüfung wurde mittels RACE-Reaktion
durchgeführt (FROHMAN et al., 1988). Für diese Reaktion wurden Oligonukleotide, die in der
Sequenz liegen und in C- oder N-Terminale Richtung den Strang amplifizieren, mit Hilfe des
Programmes Primer für Macintosh entworfen (II Methoden, 2.2.5.2, Tab. 2.6). Am Cterminalen Ende war in den Bereichen des DNA-Sonde bei nur einer Base ein Unterschied zu
finden. Mit den Oligonukleotiden des N-terminalen Endes war es nicht möglich, die komplette c-DNA-Sequenz des H-ras-Genes vom Schwein zu amplifizieren. Für die genaue Sequenzierung wurde das amplifizierte cDNA-Fragment vom Exon 1+2 des H-ras-Gens vom
Schwein in den Plasmidvektor pCR2.1 kloniert.
3.2.2.3 Detektion von Punktmutationen mit DNA-Analoga
Ein erster Einstieg in die Detektion onkogener Punktmutationen wurde nun auf Basis der oben ermittelten Sequenz des H-Ras Gens vom Schwein vorgenommen. Die Hybridisierung
III ERGEBNISSE
128
mit DNA- oder PNA-Sonden erfasst nicht mehr primäre Schädigungen (wie z.B. DNAAddukte), sondern Abweichungen von der Wildtypsequenz, die nach Schädigung und Zellteilung ohne vorhergehende Reparatur manifest geworden sind. Mit der erfolgreichen Klonierung des ras-Gens aus Schwein stand hierfür die Sequenz eines bei der Krebsentstehung bedeutsamen Mitspielers zur Verfügung. Die sequenzspezifische Hybridisierung eines 8mer
PNA-Oligomers mit komplementären DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe der Oberflächenresonanzmeßtechnik verfolgt. Die Etablierung dieses Detektionssystems war Ziel der Diplomarbeit von Herrn Alexander Wolf, deren Ergebnisse als Kooperationsprojekt mit der hier vorgelegten Arbeit zusammenfassend dargestellt werden.
PNA/DNA Match-Hybrid:
5‘-Bio-GCTGTAGG-3‘
(PNA/DNA Primer A Hybrid)

3‘-CGCCGACATCCACA-5‘
PNA/DNA Mismatch-Hybrid:
5‘-Bio-GCTGTAGG-3‘
(PNA/DNA Primer C Hybrid)
 
3‘-CGCCGACCTCCACA-5‘
Abb. 3.50: Darstellung der PNA/DNA Match- und Mismatch Hybride mit dem 8mer PNA Oligomer und den 14 Basen
DNA-Oligomeren
Die Sequenz des 8mer PNA-Oligomers wurde so gewählt, daß sie genau über dem Kodon 12
des H-ras Genes vom Schwein liegt und der Sequenz der onkogenen G12V Mutante des Hras Gens entspricht. Zur Etablierung des Detektionssystems im BIAcore wurde das Hybridisierungsverhalten der PNA-Oligomere zunächst mit synthetisierten DNA-Oligomeren untersucht. Zuerst wurden die PNA-DNA Hybride (Abb. 3.50) mit unabhängigen biophysikalischen Meßsystemen (Differentialscanning-Mikrokalometrie, isotherme Titrationsmikrokalorimetrie) charakterisiert und ein Vergleich mit DNA-DNA Hybriden durchgeführt. Dazu wurden zwei unterschiedliche 14 bp DNA-Oligomere synthetisiert, die in ihrer Sequenz einmal
dem Wildtyp H-ras Gen (Primer C, II Material 2.9.3, Tab. 2.1) und einmal der G12V Mutante
(Primer A, II Material 2.9.3, Tab. 2.1) des H-ras Genes entsprachen. Der Primer A ist mit
allen 8 Basen komplementär zu dem PNA-Oligomer, wohingegen das PNA/DNA Primer C
Hybrid eine Einzelbasenfehlpaarung aufweist (Abb. 3.50).
Neben den oben beschriebenen Primern A und C wurden weiterhin zwei 60 bp große DNAOligomere (Abb. 3.51) eingesetzt, die in ihrer Sequenz ebenfalls einmal dem Wildtyp H-ras
Gen (Primer E II Material, 2.9.3, Tab. 2.1) und einmal der G12V Mutante (Primer D II Material, 2.9.3, Tab. 2.1) des H-ras Gens entsprachen.
III ERGEBNISSE
129
PNA/DNA Match-Hybrid:
5‘-Bio-GCTGTAGG-3‘
(PNA/DNA Primer D Hybrid)

3’TACTGCCTCATATTCGAGCACCACCACCCGCGACATCCACACCCCTTCTCACGGGACTGG-5’
PNA/DNA Mismatch-Hybrid:
5‘-Bio-GCTGTAGG-3‘
(PNA/DNA Primer E Hybrid)
 
3’-TACTGCCTCATATTCGAGCACCACCACCCGCGACCTCCACACCCCTTCTCACGGGACTGG-5’
Abb. 3.51: Darstellung des PNA/DNA Match- und Mismatch Hybrides mit dem 60 Basen DNA-Oligomer und 8 mer
PNA-Oligomer
Den Abschluss bildeten dann Arbeiten mit Proben des H-ras Gens, die mittels einer PCR
hergestellt worden waren. Hiermit sollte die Anwendbarkeit der Methodik für den gleichen
Typ an Probenmaterial gezeigt werden, wie er bei toxikologischen Charakterisierungen mit
Zellkultur-DNA anfällt.
3.2.2.3.1 Etablierung des Detektionssystem mit 14 und 60 bp DNA-Oligomeren
Zunächst wurden Charakterisierungen der unterschiedlichen Hybride (Match- und MismatchHybride) und Hybridformen (DNA/DNA und PNA/DNA) mittels der DifferentialscanningMikrokalometrie und der isothermen Titrationsmikrokalorimetrie vorgenommen. Mit Hilfe
der Differentialscanning-Mikrokalometrie und der isothermen Titrationsmikrokalorimetrie
konnte die Stabilität der PNA-DNA Hybride (Abb.3.50) abgeschätzt werden. Bei der Differentialscanning-Mikrokalometrie wurde der 8mer PNA/DNA Hybrid eingesetzt, der in der
Sequenz der G12V Mutante des H-ras Gens vom Schwein entsprach. Mit dieser Methode
konnte die thermische Stabilität der Hybride bestimmt werden. Aus der Schmelzkurve ergibt
sich eine Schmelztemperatur Tm von 55,3°C. Die Schmelztemperatur für das DNA/DNA
Hybrid lag bei Tm: 48,3°C.
Mit der isothermen Titrationsmikrokalorimetrie konnte die Dissoziationskonstante durch ein
von der Oberflächenresonanz-Technologie unabhängiges Meßverfahren ermittelt werden. Aus
der Titrationskurve ergab sich eine Dissoziationskonstante von 117 nM für PNA-Oligomer
und das komplementäre DNA-Oligonukleotid. Die Dissoziationskonstante des DNA/DNAHybrids lag bei 232 nM. Für die jeweiligen Hybride mit einer Einzelbasenfehlpaarung ist mit
der isothermischen Titrationsmikrokalometrie keine messbare Affinität zwischen dem PNAOligonukleotid und dem DNA-Oligonukleotid (PNA/DNA Primer C Hybrid, Abb. 3.50) festzustellen. Die bei diesem Experiment gemessene Wärmetönung entspricht der Verdünnungswärme von dem DNA-Oligonukleotid in Puffer. Diese Ergebnisse sind in einer Diplomarbeit
(WOLF, 2000) veröffentlich worden.
III ERGEBNISSE
130
Danach wurde mit Standard-DNA das Detektionssystem im BIAcore unter Verwendung
der vier unterschiedlichen DNA-Oligonukleotide charakterisiert. Die PNA-Hybride mit einer
Biotingruppe am 5´Ende wurden dabei an eine Sensoroberfläche gebunden, an die zuvor
chemisch minimal-Streptavidin gekoppelt worden war. Bei minimal-Streptavidin handelt es
sich um N- und C-terminal verkürztes Streptavidin mit verbesserten proteinchemischen Eigenschaften gegenüber nativem Streptavidin bezüglich Homogenität, Löslichkeit, Resistenz
gegenüber Proteasen und sterischer Zugänglichkeit der Biotin-Bindungstasche (SCHMIDT &
SKERRA, 1994). Die Bindung zwischen Biotin und minimal-Streptavidin ist mit einer Dissoziationskonstanten von 4 x 10-15 M so stark (MORGAN & TAYLOR, 1992), dass sie einer kovalenten Bindung gleichkommt. Über diese Sensoroberfläche wurden dann die verschiedenen
DNA-Oligonukleotid-Lösungen in unterschiedlichen Konzentrationen gespült.
Zunächst wurden unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen ausgetestet, um die optimalen
Versuchsbedingungen zu ermitteln. Es wurde damit begonnen, die Abhängigkeit der
DNA/PNA Hybridisierung vom Salzgehalt des verwendeten PBS-Puffers zu bestimmen. Bei
niedrigen Salzkonzentrationen bis 50 mM NaCl ist fast keine Hybridisierung zu detektiren,
ebenso bei hohen Salzkonzentrationen von 600 mM NaCl. In einem Fenster von 100-240 mM
erhält man ein gutes Hybridisierungssignal, wobei die Selektivität der Bindung bei steigender
Salzkonzentration abnimmt. Deshalb wurde als optimale Bedingung eine Salzkonzentration
von 150 mM NaCl für weitere Experimente angesehen. Als nächstes wurden Messungen
durchgeführt, bei denen die DNA/PNA Hybridisierung bei unterschiedlichen pH-Werten (Bereich von pH 6.5-7.5) verfolgt wurde. Dabei konnte eine leichte pH-Abhängigkeit der Hybridisierungsreaktion im untersuchten pH-Bereich festgestellt werden, ds Optimun liegt bei pH
7,0. Ein Einfluß auf die Bindungsspezifität konnte innerhalb dieses pH-Bereichs nicht festgestellt werden.Für alle folgenden Experiments wurde der pH-Wert der Puffer auf 7,0 eingestellt.
III ERGEBNISSE
131
Konzentrationsreihe für Primer A
400
350
Response Units [RU]
300
250
200
150
100
50
0
Primer A [10 µM]
Primer A [5 µM]
Primer A [1 µM]
Primer A [0,7 µM]
Primer A [0,5 µM]
Primer A [0,2 µM]
Primer A [0,1 µM]
Probenbezeichnung
Konzentrationsreihe für Primer D
70
60
Response Units [RU]
50
40
30
20
10
0
Primer D [5 µM]
Primer D [2 µM]
Primer D [1 µM]
Primer D [0,8 µM] Primer D [0,6 µM] Primer D [0,4 µM] Primer D [0,2 µM] Primer D [0,1 µM]
Probenbezeichnung
Abb. 3.52: Hybridisierungssignale von DNA-Oligonukleotiden (Primer A und D) an die immobilisierten PNA´s.
Das obere Diagramm zeigt die untersschiedlichen Nettobeladungen der immobilisierten PNA´s bei einer Konzentrationsreihe von 10 bis 0,1 µM mit Primer A (Abb. 3.50) und das untere Diagramm stellt eine Konzetnrationsreihe von 5 bis 0,1
µM mit Primer D (Abb. 3.51) dar. Sowohl bei dem 14 bp als auch bei dem 60 bp G12Vras-DANN-Oligonukleotid ist ein
klares Hybridisierungssignal zu detektiern. Die Messungen wurden in 150 mM NaCl,, 10 mM NaH2PO4 und 0.1 mM EDTA bei pH 7,0 durchgeführt.
III ERGEBNISSE
132
Konzentrationsreihe für Primer C
140
120
Response Units [RU]
100
80
60
40
20
0
Primer C [50 µM]
Primer C [20 µM]
Primer C [10 µM]
Primer C [5 µM]
Primer C [2 µM]
Probenbezeichnung
Konzentrationsreihe für Primer E
0
Primer E [68 µM]
Primer E [30 µM]
Primer E [20 µM]
Primer E [10 µM]
-2
-4
Response Units [RU]
-6
-8
-10
-12
-14
-16
-18
-20
Probenbezeichnung
Abb. 3.53: Hybridisierungssignale von DNA-Oligonukleotiden (Primer C und E) an die immobilisierten PNA´s.
Das obere Diagramm zeigt die unterschiedlichen Nettobeladungen der immobilisierten PNA´s bei einer Konzentrationsreihe von 50 bis 2 µM mit Primer C (Abb. 3.50) und das untere Diagramm stellt eine Konzentrationsreihe von 10 bis 68 µM
mit Primer E (Abb. 3.51) dar. Bei dem 60 bp wt-ras-DNA-Fragment (Primer E) ist kein Hybridisierungssignal zu detektieren. Dagegen läßt sich bei dem 14 bp wt-ras-DNA-Fragment (PrimerC) ein Hybridisierungssignal detektieren. Die Messungen wurden in 150 mM NaCl,, 10 mM NaH2PO4 und 0.1 mM EDTA bei pH 7,0 durchgeführt.
III ERGEBNISSE
133
Mit den ermittelten Pufferbedingungen wurde nun das Hybridisierungsverhalten der unterschiedlichen DNA-Oligonukleotide (Primer A, C, D und E, II Material 2.9.3, Tab. 2.1) mit
den immobilisierten PNA-Oligonukleotiden (Abb. 3.50, Abb. 3.51) untersucht. Dazu wurden
jeweils Konzentrationsreihen der unterschiedlichen DNA-Oligonukleotide in PBS-Puffer angesetzt.
Bei den 60 bp DNA-Oligonukleotiden konnte keine Hybridisierung zwischen dem Wildtyp
DNA-Oligonukleotid (Primer E, Abb. 3.51) und dem PNA-Oligonukleotid beobachtet werden
(Abb. 3.53 unteres Diagramm), obwohl sich die Wildtyp-Sequenz nur in einer Punktmutation
von der G12V-Sequenz des H-ras Gens unterscheidet. Bis zu einer Konzentration von 100
nM konnte ein Hybridisierungssignal mit den immoblisierten 8mer PNA´s für die 60 bp großen DNA-Oligonukleotide mit der G12V-Sequenz (Primer D, Abb. 3.50) beobachtet werden
(Abb. 3.52, unteres Diagramm).
Für die 14 bp großen DNA-Oligonukleotiden mit der Wildtyp-Sequenz des H-ras Gens (Primer C, Abb. 3.50) und der G12V-Sequenz konnte eine Hybridisierung mit den immobilisierten PNA-Oligonukleotid festgestellt werden, wenn aus das Meßsignal des wt-ras-DNAOligonukleotids bedeutend kleiner war, als das von dem G12V-DNA-Oligonukleotid. Die
DNA-Oligonukleotide mit der G12V-Sequenz konnten bis zu einer Konzentration von 100
nM detektiert werden, während die Oligonukleotide mit der Wildtyp Sequenz nur bis zu einer
Konzentration von 2 µM detektiert wurden.
Ein Detektionssystem das eine DNA-Punktmutation in DNA aus Zellkultur oder Gewebe erkennen soll, muß in der Lage sein, DNA-Fragmente mit einer Punktmutation vor einem hohen
Hintergrund an Wildtyp DNA-Fragmenten zu detektieren. Es wurde untersucht, ob ein Hybridisierungssignal detektiert werden kann, wenn DNA-Oligonukleotide, mit der Sequenz der
G12V Mutante des H-ras Gens, in Gegenwart größerer Mengen an Wildtyp DNAOligonukleotiden injiziert werden. Diese Ergebnisse sind in der Diplomarbeit WOLF (2000)
veröffentlich worden.
Bei den 60 bp langen DNA-Fragmenten war es möglich die DNA-Oligonukleotide, mit der
G12V-Sequenz des H-ras Gens bis zu einem Verhältnis von 250 zu 1 gegenüber WildtypDNA-Oligonukleotiden zu detektieren. Die 14 bp langen G12V-ras DNA-Oligonukleotide
können bis zu einem Verhältnis von 100 zu 1 gegenüber 14 bp Wildtyp-DNAOligonukleotiden detektiert werden.
III ERGEBNISSE
134
3.2.2.3.2 Einsatz des Detektionssystem für Messungen mit PolymerasekettenreaktionsProdukten des H-ras Genes vom Schwein
Grundlage für den Einsatz von Polymerasekettenreaktions-Produkten in das Detektionssystem
war die Klonierung des H-ras Gens vom Schwein (siehe 3.2.2.2). Die anschließende Polymerasekettenreaktions-Mutagenese, in der ein Klon mit einer G12V Mutante des H-ras Genes
hergestellt wurde, wurde nach PICARD et al. (1994) durchgeführt. In die Polymerasekettenreaktion (Tab. 3.3) wurde als Templat DNA aus der Mini-Plasmid-Präparation eingesetzt, die
wie im Material- und Methodenteil beschrieben hergestellt wurde. Es wurden zwei unterschiedlich große Fragmente des H-ras Gens mittels der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, ein 79 bp langes Fragment (Basen 1 bis 79 von 288 bp insgesamt) und ein 170 bp langes
Fragment (Basen 1 bis 170 von 288 bp insgesamt). Dabei wurden die Primer so gewählt, daß
sie außerhalb der G12V-Mutationsstelle (Basenpaar 35) und außerhalb der 8 bp langen PNABindungstelle (Basen 31 bis 38) im H-ras Gen lagen.
Nach Beendigung der Polymerasekettenreaktion wurden eine Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese und Sequenzierung durchgeführt. Das 79bp lange H-ras
Fragment konnte in der G12V Mutante und im Wildtyp amplifiziert werden. Ebenso konnte
das 179 bp große H-ras Fragment als G12V Mutante und als Wildtyp amplifiziert werden.
Nach der gelelektrophoretischen Auswertung wurden 10 µl der PCR-Ansätze von jedem der
vier DNA-Fragmente mittels einer Natrium-Acetat / Ethanol Fällung gereinigt. Die gefällte
DNA wurde in 100 µl Wasser resuspendiert und die DNA-Konzentration spektrometrisch bei
260 nm bestimmt. Für die Experimente im SPR-System wurden 100 µl Fraktionen der vier
unterschiedlichen DNA-Fragmente in PBS-Puffer in unterschiedlichen Konzentrationen angesetzt. Die DNA-Lösungen wurden, da die PNA-Oligonukleotide nur mit Einzelstrang–DNA
hybridisieren können, hitzedenaturiert und auf Eis gestellt, um eine Renaturierung der DNA
zu verhindern.
In die ersten Experimente mit dem SPR-System wurde das 79 bp Fragment als G12V Mutante
und als Wildtyp eingesetzt. Von der Wildtyp H-ras Sequenz wurden zwei Konzentrationen
eingesetzt, 4.9 µM und 0,59 µM. Von der Mutante wurden 5.4 µM, 5.1 µM, 650 nM, 520 nM
eingesetzt. In Abb. 3.54 ist die Hybridisierung der verschiedenen 79 bp Fragmente an die kovalent gebundene PNA dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass das 79 bp lange Polymerasekettenreaktionsprodukt der G12V Mutante des H-ras Gens vom Schwein detektiert wird.
Dagegen ist das Meßsignal vom 79 bp Wildtyp PCR-Produkt kaum detektierbar. Bei den
Konzentrationen um 5 µM der G12V Mutante werden um die 100 RU Bindung detektiert und
bei 650 und 500 nM um die 15 Ru Bindung (Abb. 3.54).
III ERGEBNISSE
135
Polymeraseketten-Reaktion-Programm:
Temperatur
Zeit
94°C
3 min
94°C
0,5 min
(Denaturierung der DNA)
56°C
0,5 min
(Anlagerung der Oligonukleotide)
72°C
0,5 min
(Verlängerung der Primer)
72°C
5 min
4°C
∼
25 Zyklen
Tab. 3.3: Programm für die Amplifikation der unterschiedlich langen Fragmente für den Wildtyp
und die G12V Mutante des H-ras Gens vom Schwein aus Plasmid-DNA aus E.coli TG1 Zellen isoliert. Im ersten Schritt erfolgte eine vollständige Denaturierung der DNA. Daraufhin wurden Zyklen wiederholt, in denen jeweils eine Denaturierung, eine Anlagerung der Primer und anschließend deren Verlängerung stattfanden. Nach der Durchführung der Polymeraseketten-Reaktionsschritte wurde der Ansatz
bei 4°C gelagert.
Hybridisierungssignal für die 79 bp großen H-ras DNA-Fragmente
140
120
Response Units [RU]
100
80
60
40
20
0
G12V H-ras 79 bp [5,4
µM]
G12V H-ras 79 bp [5,1
µM]
G12V H-ras 79 bp [0,65
µM]
G12V H-ras 79 bp [0,52
µM]
wt H-ras 79 bp [4,9 µM]
wt H-ras 79 bp [0,59 µM]
Probenbezeichnung
Abb. 3.54: Bindungstests mit 79 bp Polymerasekettenreaktionsprodukten der G12V Mutante und des wtras Fragments vom Schwein an die immobilisierten PNAs. Sowohl das Hybridisierungssignal des PCR-Produkt
mit der G12V Sequenz des H-ras Gens als auch das PCR-Produkt mit der Wildtyp Sequenz wurden gemessen. Die
Messungen wurden in 150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4 und 0,1 mM EDTA bei pH: 7,0 durchgeführt.
In weiteren Experimenten wurden die 170 bp großen Polymerasekettenreaktionsprodukte der
G12V Mutante wie auch der Wildtyp DNA eingesetzt. Für beide Fragmente wurde eine Konzentration von 4 µM eingesetzt, es kam aber zu keiner Hybridisierung der 170 bp Fragmente
III ERGEBNISSE
136
auf der Oberfläche. Bei den weiteren Experimenten wurden daher nur noch die 79 bp langen
DNA-Fragmente verwendet.
70
60
Response Units [RU]
50
40
30
20
10
0
G12V H-ras 79 bp
G12V H-ras 79 bp & 10%
Formamid
Primer D [5 µM]
Primer D & 10% Formamid [5
µM]
Primer E [20 µM]
Probenbezeichnung
Abb. 3.55: Abbhängigkeit der hybridisierungsreaktion in Gegenwart von 10% Formamid. Das Diagramm zeigt
die Auswirkung der zugabe von 10 % Formamid iim Reaktionspuffer im Vergleich zum Standardreaktionspuffer. Die
Balkendiagrame zeigen die hybridisierungssignale von 79 bp G12V-ras PCR-Fraagmenten und von 60 bp G12V-ras
DNA Oligonukleotiden.
Da der komplementäre DNA-Strang als kompetitiver Inhibitor der PNA-DNA Hybridisierungsreaktion wirkt, sollte das Reannealen der beiden komplementären DNA-Stränge durch
die Zugabe von 10 % Formamid im Reaktionspuffer verhindert werden. Es wurde aber nicht
der gewünschte Effekt beobachtet, es kam zu einer starken Verschlechterung des Hybridisierungssignals (Abb. 3.55).
Ein weiteres Indiz für die Verschlechterung des Hybridisierungssignales durch die Zugabe
des Formamids, lieferten Experimente mit dem 60 bp großen DNA-Oligonukleotid der G12V
Mutante von H-ras (Primer D). In der Abbildung 3.56 ist zu sehen, dass der komplementäre
DNA-Strang im PCR-Produkt wirklich als kompetetiver Inhibitor der PNA-DNA Hybridisierungsreaktion wirkt.
Um zu zeigen, dass der komplementäre DNA-Strang des PolymerasenkettenreaktionsProdukts wirklich als kompetitiver Inhibitor der PNA-DNA Hybridisierungsreaktion wirkt,
wurden die DNA-Proben, sowohl das 79 bp Polymerasenkettenreaktions-Produkt des Wildtyps als auch die G12V-ras Mutante nach der Hitzedenaturierung nicht auf Eis gestellt, sondern bei Raumtemperatur verwahrt. Die beiden komplementären DNA-Stränge konnten anschließend "reannealen", so dass bei den anschließenden Messungen nur ein schwaches Meß-
III ERGEBNISSE
137
signal detektiert werden konnte (Abb. 3.56). Eine Unterscheidung der beiden DNAFragmente war so nicht mehr möglich.
140
120
Response Units [RU]
100
80
60
40
20
0
G12V H-ras 79 bp, 4°C [5,4 µM]
wt H-ras 79 bp, 4°C [4,9 µM]
G12V H-ras 79 bp, 20°C [5,5 µM]
wt H-ras 79 bp, 20°C [5,0 µM]
Probenbezeichnung
Abb. 3. 56: Abhängigkeit der Hybridisierungsreaktion von der Probentemperatur. In diesem Diagramm sind die Eigenschaften des komplementären DNA-Strangs als kompetetiver Inhibitor demonstriert. Die Proben wurden nach der Hitzedenaturierung bei Raumtemperatur geahlten und nicht auf Eis gekühlt. Die Messungen wurden in 150 mM NaCl, 10 mM
NaH2PO4, 0.1 EDTA bei pH 7,0 durchgeführt.
IV DISKUSSION
138
IV. Diskussion
DNA Veränderungen, Mutationen durch genotoxische Substanzen stehen seit jeher im Interesse der Forschung. Dabei werden in der Bearbeitung toxikologischer Fragestellungen zur
Abklärung von potentiellen Risiken durch Chemikalien in unserer Umwelt zunehmend invitro Studien an Zellkulturen eingesetzt. Dadurch kann auf Versuche mit Tieren teilweise oder ganz verzichtet werden.
Zahlreiche Genotoxizitätstests wurden bereits entwickelt, von denen jedoch keiner viele verschiedene Primärschädigungen nachweist, dabei hochsensitiv, automatisierbar und für hohe
Probendurchsätze geeignet ist.
Die vorliegende Dissertationsarbeit war Teil des Forschungsprojektes "Molekulargenetische
Marker für Kanzerogenitätstests mit primären Epithelzellen" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (Projektnummer: 0311265). Ziel des Projektes war die Entwicklung eines in-vitro Kanzerogenitätstests. Dazu wurden kultivierte Epithelzellen mit potentiell kanzerogenen Substanzen inkubiert. Als Analyseparameter der Wirkung der betreffenden Substanz
wurden DNA-Veränderungen auf chromosomaler wie auch auf Sequenzebene untersucht.
Geplant war die reproduzierbare Detektion spezifischer DNA-Veränderungen in den behandelten Zellen und der isolierten DNA. Das Ziel war der Nachweis einer einzelnen DNAModifikation oder einer Kombination mehrerer Veränderungen in verschiedenen Genen oder
Chromosomenabschnitten, die sowohl mit der Konzentration als auch mit der Einwirkungsdauer einer bestimmten getesteten Substanz signifikant korrelieren.
Langfristig wurde darauf abgezielt, mit den Ergebnissen aus diesem Projekt die Grundlage für
die Entwicklung einer neuartigen, cyto- beziehungsweise molekulargenetischen Technik zur
Testung der Giftigkeit von chemischen Substanzen zu bilden.
Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit im einzelnen war es, solche Proteine an die Oberfläche des SPR-Sensors zu koppeln, die in der Lage sind geschädigte DNA selektiv zu binden.
Damit wäre es möglich, auch statistische, nicht auf ein ausgewähltes Markergen erfolgte Mutationsereignisse zu erfassen. Hierzu war es notwendig neben der Etablierung des meßtechnischen Aufbaus die Sensitivität der Methodik mit den zellbiologischen Endpunkten abzugleichen. Fokussiert wurde auf Nachweissysteme, die globale, unspezifische DNA-Schädigungen
und spezielle DNA-Schädigungen detektieren.
IV DISKUSSION
139
4.1 Nachweissysteme für globale, unspezifische DNA-Schädigungen
4.1.1 Mutagenitätstests
Im geplanten Testsystem mit der SPR-Meßtechnik zum Nachweis der Genotoxizität von
chemischen Substanzen war es das Ziel, genomische DNA und zelluläres Gesamtprotein aus
in vitro behandelten Zellen einzusetzen.
Mit der Kultivierung primärer Epithelzellkulturen aus Schweineharnblasen (GUHE, 1994) und
dem Rinderkolon (BIRKNER et al., 1998) wurde am Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund, Abteilung Toxikologie, der Zugang zu zwei stabilen, weitgehend der
menschlichen Enzymausstattung entsprechenden Ansätzen für die Untersuchung der mutagenen Wirkung aromatischer Amine und Alkylantien etabliert. Bei der Etablierung von Kanzerogenitätstest dient die Primärzellkultur zum Gewinn von Schweineharnblasen- und Rinderkolonepithelzellen, die in die spätere Isolierung und Analyse von DNA und Proteinen eingesetzt wurden.
Erst in den letzten Jahren wurden die Primärzellkulturen für toxikologische Fragestellungen
genutzt (HATCHER et al., 1993; SWAMINATHAN & REZNIKOFF, 1992). Grundsätzlich wäre als
Spenderorganismus der Mensch vorzuziehen, da Untersuchungsergebnisse direkte Aussagen
zur Humankarzinogenese ermöglichen können. Die Beschaffung humanen Probenmaterials ist
jedoch starken ethischen und praktischen Restriktionen unterworfen. Für die vorliegende Arbeit wurden daher anstelle von Human-Proben Harnblasen des Hausschweins (Sus scrofa domestica) und des Rindes (Bovine taurus) verwendet. Ohne Tötung von Versuchstieren zum
Zwecke der Organentnahme wurden Harnblasen- und Rinderepithelzellkulturen bei der Verwendung von Schweineharnblasen und Rinderkolons erhalten. Die Organe wurden von einem
örtlichen Schlachthof im frischen Zustand in beliebig großen Mengen bezogen und wurden
daher zur routinemäßigen Anlage von Harnblasen und Kolonepithelzellkulturen verwendet.
Um die Verknüpfung der Zellkultivierung mit der molekularen Analyse zu ermöglichen, muss
eine standardisierte Isolierung von DNA aus den kultivierten Schweineharnblasen- und Rinderkolonepithelzellen nach den Inkubationsversuchen gewährleistet sein. Dieser Schritt muss
daher ohne große Schwankungsbreiten bei den DNA-Ausbeuten reproduzierbar durchgeführt
werden. Eine zu hohe Streuung hätte negative Auswirkungen auf die Quantifizierung im
Rahmen der angestrebten Mutationsanalyse. Aus den Zellen der kultivierten Epithelzellen
konnte reproduzierbar DNA in gleichen Mengenverhältnissen von um die 20 µg DNA isoliert
werden. Dies sind geringere Mengen als die angegebenen 40-60 µg des Herstellers, aber da
die Zellen sofort und gleichmäßig lysiert wurden, ist die isolierte DNA definierter.
IV DISKUSSION
140
Die DNA war durch das aromatische Amin oder Alkylants in der Zellkultur geschädigt worden. Dabei ist das eingesetzte Alkylants MNNG ohne Metabolisierung genotoxisch. MNNG
führt zu einer Methylierung bevorzugt von Guaninresten an der O6-Position. Das aromatische
Amin 2-AAF muss, um genotoxisch wirksam zu werden, zuvor aktiviert werden. Diese Aktivierung ist durch die Cytochrom P-450-Monooxygenasen oder/und Prostaglandin-Synthase
möglich. FÖLLMANN & GUHE (1994) zeigten in ihren Untersuchungen, dass die Harnblasenepithelzellen des Schweins alle für den Fremdstoffmetabolismus notwendigen Enzyme auch in
Kultur aufweisen. Aufgrund dieser Ausstattung war das Harnblasenepithel in der Lage eine
Aktivierung von Fremdstoffen (in diesem Fall 2-AAF) autark durchzuführen, also auch unabhängig von der Leber. Ebenso wurde in den kultivierten Kolonepithelzellen die Aktivität von
Cytochrom P-450-Monooxygenasen stabil nachgewiesen (FÖLLMANN et al., 2000). Auch in
diesem Zellsystem war es damit möglich, eine Aktivierung von Fremdstoffen unabhängig von
der Leber durchzuführen.
Durch Agarose–Gelelektrophorese wurde nachgewiesen, dass die genomische DNA durch die
chemische Behandlung nicht in ihrer Größe verändert wird. Bei den eingesetzten Dosen treten
weder Strangbrüche (DNA-Abbau) noch größere Komplexe (Vernetzung mehrerer DNAMoleküle) auf. Deshalb wurde die DNA mittels Restriktionsenzyme auf eine mittlere Größenverteilung von 800 ± 400 Basenpaaren gebracht. Ziel war es durch die Verkürzung der
DNA, die DNA-Schädigungen besser für die DNA-Reparaturenzyme zugänglich zu machen.
Neben der DNA-Isolierung aus den behandelten und kultivierten Schweineharnblasen- und
Rinderkolonepithelzellen war auch die reproduzierbare Proteinisolierung ein wichtiger Schritt
in der Verknüpfung der Zellkultivierung mit der molekularen Analyse. Aus den Primärkulturen von Schweineharnblasen- und Rinderkolonepithelzellen konnte nach der veränderten Methode von NEUFELD & WHITE. (1997) die cytosolische und nukleäre Fraktion der kultivierten
Zellen isoliert werden. Nach Quantifizierung der Proteinmengen in den beiden Fraktionen
wurden die isolierten Proteinfraktionen in die SPR-Meßtechnik eingesetzt, um eine Überexpression von p53-Protein in den beiden Fraktionen zu detektieren. Neben der SPR-Analytik
wurde versucht durch Western-Blot-Analysen mit einem humanen monoklonalen Anti-p53
Antikörper PAB 240 und auch mit dem DO-1 p53-Protein vom Rind zu detektieren. In keiner
der beiden Proteinfraktionen konnte jedoch p53 vom Rind durch diese Antikörper nachgewiesen werden. Im Western Blot können durch die Übertragung der Proteinbanden auf die Nitrocellulose Proteine verloren gehen bzw. die Gesamtproteinmenge zu gering sein, so dass sie
nicht von dem Antikörper detektiert werden (TIMMONS & DUNBAR, 1990). Ein zusätzliches
Problem war auch der große Hintergrund an anderen Proteinen, der die Affinität des Antikör-
IV DISKUSSION
141
pers für das p53 Protein vom Rind verringert (TIMMONS & DUNBAR, 1990). In den Western
Blots mit rekombinanten p53-Protein vom Rind (siehe 4.1.3.3) wurde eindeutig gezeigt, dass
es eine Kreuzreaktivität zwischen dem Antikörper PAB 240 und dem Protein gibt.
4.1.2 Entwicklung eines Detektionssystem mit DNA-Reparaturenzymen
Das menschliche Genom besteht aus einer Sequenz von 3 x 109 Basenpaaren, deren exakte
Duplikation Voraussetzung für das Überleben von Zellen und die Funktionsfähigkeit des Organismus ist. Um die erforderliche Präzision zu erreichen, bedarf es DNA-Polymerasen, die
eine außergewöhnliche exakte Kopierfähigkeit haben, sowie Reparaturmechanismen, die
DNA-Schäden vor und nach der Replikation erkennen und entfernen (FAHRIG, 1993).
Um die hohe Kopiergenauigkeit bei der Replikation zu erreichen, haben Reparatursysteme die
Fähigkeit mannigfaltige Primärschäden wie z.B. Basenveränderungen, apurine/apyrimidine
Stellen, Intra- und Interstrangverletzungen sowie DNA-Einzelstrang- und Doppelstrangbrüche
spezifisch in der DNA zu erkennen, die sowohl im normalen Zellzyklusablauf wie auch durch
mutagene Agenzien entstehen können (AU et al., 1992; FISHEL et al., 1994). Die Reparatursysteme des Enzymapparates der Nukleotid-Exzisionsreparatur und das FehlpaarungsReparatursystem arbeiten dabei nahezu fehlerfrei und vermögen den weitaus größten Teil der
DNA-Schäden zu reparieren.
Im Zuge dieser Dissertationsarbeit war es vorgesehen, funktionelle Domänen von DNAReparaturproteinen zur Anreicherung von DNA-Proben aus primären Epithelzellen einzusetzen, die aufgrund einer vorhergehenden Behandlung mit mutagenen Substanzen einen erhöhten Anteil an Fehlpaarungen und Addukten im Erbmaterial aufweisen. Durch die Koppelung
von DNA-Reparaturproteinen an die Oberfläche des SPR-Sensors sollte möglich sein, geschädigte DNA-Fragmente selektiv zu binden und zu quantifizieren. Damit wäre ein Zugriff
nicht nur auf Mutationsereignisse in ausgewählten Markergenen wie bei der klassischen molekulargenetischen Analyse sondern auch auf statistisch über das Genom verteilter Schädigungen möglich.
4.1.2.1 Expression der Reparaturenzyme
Voraussetzung für die weiteren Untersuchungen im SPR-System war die Verfügbarkeit der
Reparaturenzyme in ausreichenden Mengen. WHITEHOUSE et al. (1997) haben Zufallsfragmente von hMSH2 kloniert und als Fusionsproteine mit dem pFlag-Tag expremiert. Mit den
erhaltenen Rohlysaten konnten sie zeigen, dass ein C-terminales hMSH2-∆1-Fragment von
Aminosäure 660 bis 905 in Filterbindungsversuchen mit radioaktiv markierter DNA eine ähn-
IV DISKUSSION
142
liche DNA-Bindung und in radioaktiven multiturnover ATPase-Versuchen eine ähnliche ATPase-Aktivität wie das unverkürzte Protein hat. Das von WHITEHOUSE et al. (1997) beschriebene verkürzte Konstrukt der C-terminalen Region von hMSH2 (hMSH2vk) wurde mit Nterminalen GST-Fusionsanteil einkloniert. Das vorliegende Konstrukt umfasst die Regionen
von Base 1971 bis Base 2640 nach der von WHITEHOUSE et al. (1997) beschriebenen Minimaldomäne von hMSH2 zur DNA-Bindung (195 Aminosäuren, 585 bp) und mit ATPase Aktivität (73 Aminosäuren, 219 bp).
hMSH2vk konnte im Milligramm-Maßstab gereinigt werden, war allerdings noch verunreinigt. In der Gelanalyse war eine Bande bei 66 kDa und eine bei 54 kDa zu sehen. Die anschliessende Western Blot Analyse zeigte aber, dass nur die Bande bei 54 kDa durch den
GST-Antikörper erkannt wurde. Das Degradationsprodukt bei 66 kDa spricht auch für die
schlechte Ausbeute bei der Expression. Die Reinigung von hMSH2vk musste an einem Tag
durchgeführt werden und das Protein tröpfchenweise in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Dies war notwendig, da hMSH2vk bei längerer Lagerung über 0°C denaturiert wäre.
Außerdem muss hMSH2 in Puffer mit 20 mM K2HPO4, 0.5 mM MgCL2, 1mM DTE bei einen
pH-Wert von 7.4 gelagert werden, da das Protein sonst zur Aggregation neigt..
Das Vollelängen Protein MutS konnte mit N-terminalen HisTaq im Milligramm-Maßstab gereinigt werden. Das Protein wurde angelehnt an das Protokoll von FENG & WINKLER (1995)
überexpremiert und aufgereinigt. Auch hier musste die Aufreinigung an einem Tag laufen,
trotzdem wurden leichte Verunreinigungen nicht vermieden. Die Ausbeute war allerdings im
Vergleich zu hMSH2vk erheblich höher. Die weiteren Lagerungsbedingen bzw. der Schritt
des Einfrierens wurde wie bei hMSH2vk durchgeführt, um Degradationen zu vermeiden. Es
wurde auch versucht von MutS verkürzte Konstrukte herzustellen. Auf Grundlage des vorliegenden humanen hMSH2vk-Fragments wurde im Vergleich versucht, von MutS jene Bereiche abzuschätzen, die hochaffin geschädigte DNA binden und ATPase Aktivität aufweisen.
Diese verkürzten Proteine konnten nicht überexpremiert werden.
In Gelretardations-Versuchen konnte sowohl für hMSH2 (FISHEL et al., 1994) als auch für
MutS (FENG & WINKLER, 1995) eine Bindung an DNA nachgewiesen werden. Bei Kompetitionsexperimenten zeigte sich eine 50 bis 100fach von hMSH2 und eine 10 bis 20fach von
MutS affinere Bindung für DNA mit einer GT-Fehlpaarung als für DNA ohne Fehlpaarung.
Gelretardationsexperimente wurden mit den vorliegenden Konstrukten durchgeführt und zeigten DNA-Bindung von hMSH2vk und MutS (Experimente: Guido Böse, AG Tumorgenetik,
Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie). Hierbei wurde jedoch nur eine maximal
IV DISKUSSION
143
vierfach für hMSH2vk und eine maximal zweifach für MutS affinere Bindung an DNA mit
einer GT-Fehlpaarung als an DNA ohne Fehlpaarung gefunden.
Die Expression von UvrA wurde mit Calmodulin-Fusionsanteil durchgeführt. UvrA konnte
im Milligramm Maßstab stark verunreinigt gewonnen werden. Auch hier wurde die Reinigung von UvrA an einem Tag durchgeführt, um zu starke Denaturierung bei längerer Lagerung bei 0°C zu vermeiden. Da eine Dimerisierung auf der Oberfläche des SPR-Sensors von
UvrA mit und ohne Fusionsanteil durchgeführt wurde, musste der Fusionsanteil auf der Säule
durch Thrombin abgespalten werden. Das Fusionsprotein ließ sich aber schlecht durch
Thrombin spalten. Eine Beurteilung der Effizienz der Spaltung wurde durch die geringe Größe des Fusionstags CBP (4000 Da) erschwert. Das Fusionsprotein CBP-UvrA hat ein Gewicht
von 108.kDa und das gespaltene UvrA ein Molekulargewicht von 104.kDa. Die Differenz im
Molekulargewicht ist zu marginal, um bei einer SDS-Gelelektrophorese unterscheidbar zu
sein. Eine Möglichkeit der Überprüfung wäre ein nochmaliger Reinigungsschritt über die
Calmodulin-Sepharose-Säule. Dies ließ aber die zu geringe Ausbeute von UvrA nach dem
Thrombinverdau nicht zu. In Gelretardationsexperimenten konnte ebenfalls die DNABindung von UvrA (Experimente: Guido Böse, AG Tumorgenetik, Max-Planck-Institut für
molekulare Physiologie) gezeigt werden. Hierbei konnte eine maximal dreifach affinere Bindung an DNA mit einem Thymidindimer als an DNA ohne Dimer gefunden werden.
4.1.2.2 Einsatzfähigkeit von DNA-Reparaturproteinen im BIAcore

Eine ausreichende Selektivität der DNA-Reparaturenzyme für fehlgepaarte gegenüber korrekt
gepaarter DNA konnte nicht erreicht werden. Dies gilt für DNA-Oligomere genauso wie für
große DNA-Fragmente aus den Inkubationsversuchen. Bis hin zu DNA-Konzentrationen im
µM Bereich konnte keine spezifische Bindung von DNA-Oligomeren an die vorgelegten Reparaturproteine detektiert werden. Analyse von den DNA-Proben von 2 AAF-behandelten
sowie von Kontrollzellen an HisTag-MutS im BIAcore-System zeigte bei den eingesetzten
DNA-Konzentrationen (300nM) insgesamt nur eine schwache Bindung an das Reparaturprotein, jedoch keine spezifische Erkennung der 2-AAF behandelten Probe. Auch das eingesetzte
hMSH2vk Konstrukt erkannte nicht spezifisch die geschädigte DNA-Probe bzw. die ungeschädigte DNA-Probe.
Bei dem schon in der Literatur beschriebenen Ansatz (GOTOH et al., 1997) konnte eine spezifische Bindung von HisTag-MutS an die fehlgepaarte Oligomeren-DNA im Vergleich zur Kontrolle festgestellt werden. Allerdings war die Spezifierung der Bindung nicht so hoch, da auch
die Bindung der korrekt gepaarten DNA an MutS relativ hoch war. Die fehlgepaarte DNA
IV DISKUSSION
144
wurde nur um den Faktor 1,3 spezifischer erkannt als die korrekt gepaarte DNA. Die Bindung
ist allerdings nicht stabil genug, MutS dissoziert von der mit korrekt gepaarten immobilisierten DNA schneller ab als von der mit fehlgepaarten DNA. 15 % von MutS sind noch gebunden nach 2 Stunden Waschen mit BIAcore-Meßpuffer bei der korrekt gepaarten DNA im Gegensatz zu 40% bei der fehlgepaarten DNA.
Nach gängiger Vorstellung binden hMSH2 und MutS zunächst unspezifisch an DNA und
laufen dann auf dem Doppelstrang entlang, bis sie Fehlstellen detektieren. Hierdurch ist immer ein hoher Hintergrund an DNA-Bindung ohne Fehlstellen vorhanden. Im Fehlpaarungsmechanismus kommen hMSH2 und MutS die Rolle zu, die Fehlpaarung zu erkennen (AU et
al., 1992; FISHEL et al., 1994). Die Reparatur wird dadurch eingeleitet, weitere Enzyme bilden mit MutS und hMSH2 einen Enzymkomplex an der Fehlpaarungsstelle. An diesem Enzymkomplex sind teilweise bis zu 10 verschiedene Proteine beteiligt (AU et al., 1992). SU et
al. (1988) konnten zeigen, dass ein Heteroduplex mit einem zentralen G/T-Fehlpaar die
höchste Affinität für MutS hat. Deshalb wurden die Oligomeren so gewählt und hätten in dem
gewählten Versuchsaufbau eine hohe Affinität erwarten lassen können.
Da hMSH2vk und MutS nicht zur Detektion von Mutationen in der SPR-Analytik geeignet
waren, wurde versucht mit XPA und UvrA eine Möglichkeit zu finden, um DNAVeränderungen nachzuweisen. Mit XPA sollte ein weiteres Reparaturenzym als Fänger in das
Meßsystem eingesetzt werden, um eine qualitative Aussage über die Bindungskapazität an
Cisplatin-geschädigte DNA leisten zu können. Das XPA Protein wurde von Herrn Thomas
Hey (AG von Prof. Krauss, Universität Bayreuth) zur Verfügung gestellt. Cisplatin geschädigte DNA konnte von dem auf der Sensoroberfläche gebundenem XPA nicht detektiert werden. Es ist auch hier zu vermuten, dass XPA alleine nicht ausreichend ist, um die DNASchädigung zu erkennen. Aufgrund des Meßsystems befindet sich der eine Interaktionspartner
(DNA-Probe) im Fluss und der andere Partner ist auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Die
Interaktionszeit und die Nähe der beiden Partner zueinander ist erheblich verringert im Vergleich zu Filterbindungsassays, die in der Literatur beschrieben wurden (MOGGS et al., 1996).
Hier könnte der Grund liegen, wieso es zu keiner Detektion der DNA-Proben kam.
Nach MAZUR & GROSSMAN (1991) bindet das UvrA Homodimer ohne UvrB ungefähr
1000fach affiner an geschädigte DNA als an ungeschädigte DNA. Deshalb schien es möglich,
UvrA zur spezifischen Detektion von DNA-Schädigungen im SPR-System einzusetzen. Zuerst musste definierte Test-DNA hergestellt werden, die einfach und reproduzierbar geschädigt werden konnte. Es wurde doppelsträngige 36 bp Oligonukleotide mit zwei aufeinander
folgenden Thyminresten gewählt, die durch UV-Bestrahlung dimerisiert werden konnten. Das
IV DISKUSSION
145
Ausmaß der Schädigung wurde experimentell durch Verwendung von 36 bp Oligonukleotiden
bestimmt, die eine TTAA-Sequenz enthielten. Eine Dimerisierung durch UV-Licht verhindert
eine Restriktion der DNA in dieser Sequenz durch das Enzym Mse I. Bei den gewählten Bedingungen führte eine Bestrahlungsdauer von 7 Minuten zu einem Schutz von über 95% der
DNA vor der Restriktion und somit zu einer Dimerisierung der Thyminreste. Die Anwesenheit von ATP bei der Dimerisierung von UvrA auf der Sensoroberfläche sollte die Bildung
des aktiven UvrA2 Dimers bewirken, der die DNA binden kann (SANCAR & SANCAR, 1988;
SELBY & SANCAR,1991)
Es konnte aber keine Dimerisierung des UvrA Proteins auf der Sensoroberfläche erzielt werden und im Folge dessen auch keine Detektion von UV-geschädigter DNA. Dies kann an der
schnellen Dissoziation von UvrA von der Sensoroberfläche liegen und auch an der schlechten
und verunreinigten Ausbeute des Proteins.
4.1.3 Entwicklung eines Detektionssystem mit dem Tumorsuppressorgen p53
Das Tumorsuppressorgen p53 ist mit einer Mutationshäufigkeit von mehr als 50% das in
menschlichen Tumoren am häufigsten mutierte Gen (WEINBERG, 1991). Untersuchungen an
Karzinomen der Harnblase und an in-vitro kultivierten Blasenzellen zeigten, dass sowohl die
Expressionsrate des p53 Proteins, als auch die Anzahl der p53 Mutationen mit dem Stadium
der Tumorprogression signifikant korrelieren (ESRIG et al., 1993). p53 Protein ist ein
Transkriptionsfaktor, der eine Serie an protektiven Genen anschalten kann, wenn die Zelle
schädigenden Einflüssen ausgesetzt ist. Die Stabilität und damit die Konzentration von p53
Protein steigt bei DNA-Schäden, Hypoxie, Abfall der zellulären ATP-Konzentration und
manchen viralen Infektionen durch Kommunikation mit anderen Proteinen an.
p53 kann durch DNA-Schädigung aktiviert werden, indem es phosphoryliert (OREN, 1999)
wird oder durch die Aktivierung des Tumorsuppressorgens ARF (alternative reading frame of
the INK4a locus) (SHERR, 1998). Die Expression von p53-Protein wird im normalen Zellzyklus von dem Protoonkogen MDM 2 (Murine Double Minute Chromosome) durch eine Degradation im Zytoplasma der Zelle inhibiert (TAO & LEVINE, 1999). Deshalb kommt p53 unter
normalen Bedingungen nur in geringer Konzentration im Cytoplasma vor und zeichnet sich
durch einen schnellen Turnover aus. Überwiegend wird p53 in der nukleären Fraktion der
Zellen gefunden, im Cytoplasma weniger wegen der Ubiquitin abhängigen Degradation mit
Hilfe des Protoonkogens MDM2 (ZHANG & YIONG, 2001; MIDDELER et al., 1997).
Als weiterer Marker für genotoxische Ereignisse war die Translokation des Tumorsuppressorproteins p53 in den Zellkern vorgesehen. Hier wurde ebenfalls die SPR-Techik eingesetzt,
IV DISKUSSION
146
um zellkernlokalisiertes p53 nach Induktion von DNA-Schädigungen in Protein-Proben aus
primären Epithelzellen zu quantifizieren.
4.1.3.1 Einklonierung von p53 vom Rind und Schwein
Im Institut für Arbeitsphysiologie wurden Kolon- wie auch Harnblasenepithelzellen vom Rind
und Schwein kultiviert, um sie in ein Testsystem für die DNA-schädigende Wirkung von
Chemikalien einzusetzen. Daher musste das p53 Gen aus diesen beiden Spezies isoliert und in
einen Expressionsvektor kloniert werden, um so rekombinantes p53 Protein aus Rind und
Schwein als Proteinstandard für das p53-gestützte Detektionssystem zur quantitativen Erfassung unspezifischer DNA-Schäden zu gewinnen. Bei der hierzu erfolgten Datenbank- und
Literatur-Recherche wurde keine Beschreibung der Wildtypsequenz des Tumorsuppressorgens p53 vom Schwein zu diesem Zeitpunkt gefunden.
Die Gensequenz von p53 aus Rind wurde mit Hilfe der von KOMORI et al. (1996) beschriebenen und in der Gendatenbank (Accession Nr.: Rind X81704) abgelegten Sequenz isoliert. Die
erwartete DNA-Bande in der Größe von ca. 1100 - 1200 bp (volle Länge des p53-Gens aus
Rind: 1116 bp) wurde gelelektrophoretisch nach der Touchdown-PCR detektiert. Nach der
Einklonierung in den Expressionsvektor pMAlc2H und einer anschließenden Restriktionsanalyse wurde die einklonierte cDNA von 5 Klonen sequenziert. Die erhaltene Sequenz stimmte
mit der abgelegten Sequenz (Accession Nr.: Rind X81704) des p53 Gens aus Rind in der Datenbank überein. So konnte eindeutig die Übereinstimmung der einklonierten cDNA mit der
abgelegten Sequenz des p53 Gens aus Rind belegt werden.
Von der p53 Gensequenz vom Schwein war in der Literatur nur die Sequenz des Exon 8 beschrieben (MAYR et al., 1995) und die Lokalisation des Gens auf dem Chromosom 12q12-q14
(RETTENBERGER et al., 1993). Mit Hilfe der Oligonukleotide der Amplifikation des p53 Gens
vom Rind wurde das p53 Gen (1164 bp) vom Schwein isoliert. Auch mit Oligonukleotiden
für das Exon 8 vom p53 Gen des Schweins wurde das 90 bp Fragment erfolgreich amplifiziert. Sequenzvergleiche mit den p53 Gensequenzen von verschiedenen Spezies zeigten eindeutig, dass es sich um das p53 Gen vom Schwein handelt. Homologie-Vergleiche mit dem
FASTA-Suchprogramm auf Nukleotidebene ergaben eine 87%ige Homologie zu der humanen Sequenz und eine 86%ige Homologie zu der Rindersequenz. Auf der Aminosäurenebene
zeigte ein Vergleich zu der humanen Sequenz eine 88%ige und eine 86%ige Homologie zu
der Rindersequenz bei den vorhergesagten Proteinen. Die höchste konservierte Region bei der
Aminosäuresequenz lag zwischen Aminosäure 100 und 300, größere Unterschiede gab es am
N- und C-terminalen Ende. Fünf hochkonservierte Regionen in der Evolution des p53 Gens
IV DISKUSSION
147
sind beschrieben worden (SOUSSIE et al., 1990), die vorhergesagte Proteinsequenz für p53
vom Schwein hatte zu der Konsensus Sequenz dieser Regionen eine 98%ige Homologie.
Gleichzeitig gab es einen hohen Grad an Homologie in der zentralen Region des Proteins für
die DNA-Bindung (SOUSSIE & MAY, 1996) und in der Region, in der eine große Häufung an
Mutationen beobachtet werden, die p53 in seiner Funktion inhibieren (HOLLSTEIN et al., 1991,
1996).
Ein weiterer entscheidender Grund, die Gensequenz von p53 vom Schwein zu klonieren, war
neben dem in dieser Arbeit zur Verfügung stehendem Zellkultursystem, das es mittlerweile
ein gesteigertes Interesse an dem Einsatz von Geweben, Organen und Zellen der Spezies
Schwein in der Behandlung von humanen Erkrankungen gibt (BACH, 1998). Deshalb haben
auch BURR et al. (1999) parallel zu dieser Arbeit das p53 Gen vom Schwein isoliert, um es
weiteren Studien an Gewebe-, Zell- und Organproben des Schweins zur Verfügung zu stellen.
Die beschriebene Sequenz in dieser Arbeit und die von BURR et al.(1999) beschriebene stimmen 100% überein. Zur humanen Protein-Sequenz unterscheidet sich die vorhergesagte Protein-Sequenz vom Schwein durch eine Verkürzung um 7 Aminosäuren. Die Deletion liegt in
der Prolin reichen N-terminalen Region, die Domäne, die involviert ist in die Apoptose (SAKAMURO
et al., 1997) und Wachstumskontrolle (RUARO et al., 1997).
4.1.3.2 Expression von p53 vom Rind und Schwein
In der Literatur gibt es mehrere beschriebene Methoden zur Aufreinigung von p53 (CHÉNE,
1997; MIDDELER et al., 1997; BISCHOFF et al., 1990) sowie verschiedener Mutanten und einzelner Domänen (LIANG & CLARKE, 1999; NAGAICH et al., 1997). Vor allem die einzelnen
p53-Domänen lassen sich gut aus bakterieller Expression gewinnen; die Überexpression des
gesamten Proteins ist allerdings in Bakterien problematisch. So konnte beobachtet werden,
dass es bei bakterieller Expression nicht immer zu einer korrekten Faltung des p53 Proteins
kommt (SOUSSI & MAY, 1996). Des weiteren fehlt die posttranslationale Phosphorylierung
des p53 Proteins, die jedoch einen entscheidenden Einfluß auf die biologische Aktivität dieses
Phosphoproteins hat (GOTTIFREDI & PRIVES, 2001; PATTERSON et al, 1996, NELSON &
KASTAN, 1994). Deshalb wird p53, wenn eine biologische Aktivität des Proteins vorhanden
sein muss, für die Beantwortung der wissenschaftlichen Fragestellungen ausschließlich aus
einem Bacculoviren-Expressionssystem gewonnen (LUDES-MEYERS et al., 1996). Auf dieses
aufwendige Expressionssystem konnte in der vorliegenden Arbeit verzichtet werden, da keine
Experimente notwendig waren, in denen die biologische Aktivität des p53 Proteins gefordert
war.
IV DISKUSSION
148
Aufgrund der Autoproteolyseaktivität von p53 Protein (OKOROKOV et al., 1997) wurde das
Rinder und Schweine p53-Gen in den Vektor pMal C T/H einkloniert. Dieser Vektor dient der
Expression von einklonierten Genen als Fusionsproteine mit einem N-terminalen MBP-Anteil
(Maltose-Bindungsprotein aus E.coli) und 6 Histidinen am C-Terminus. So ist eine Reinigung
des Fusionsproteins über zwei unterschiedliche Affinitätschromatographien möglich, mit der
nur sowohl N- als auch C-terminal intaktes Protein aufgereinigt werden kann.
Das rekombinante p53-Fusionsprotein wurde aufgrund der geringen Ausbeute nur über die
Ni-NTA-Säule gereinigt. Der zweite Schritt über die Amylose-Säule wurde nicht gemacht.
Bei der Reinigung des p53-Fusionsproteins über die Ni-NTA-Säule wurde C-terminal verkürztes p53-Fusionsprotein und der überwiegende Rest der anderen Proteine aus dem Rohlysat durch die verschiedenen Waschschritte von der Säule eluiert. Die Mitreinigung, von an
p53 gebundenen Chaperonen wurde durch die Verwendung von spezifischen Chaperonpuffer
verhindert. Durch die gewählten Pufferbedingungen und der Zugabe von ATP können die
Chaperone die Faltung der p53-Proteine beenden und dann von diesen abdissoziieren.
Da sich im Zellextrakt der zur Überexpression verwendeten Zellen auch immer Proteasen
befinden, wurde zur Minimierung der Proteolyse kurz vor dem Zellaufschluß ein Proteaseinhibitor-Cocktail zugegeben. Die Proteaseaktivität im Extrakt sollte unter diesen Bedingungen
fast vollständig unterdrückt werden. Erstaunlich ist, dass trotzdem eine deutliche Proteaseaktivität beobachtet werden konnte. Es kommt fast zum vollständigen Abbau des p53-Proteins,
wenn das Fusionsprotein über Nacht an das Säulenmaterial gebunden bleibt (Daten nicht gezeigt). Durch die verwendeten Proteaseinhibitoren ist eine proteolytische Aktivität des p35Fragments weitgehend auszuschließen. Daher ist anzunehmen, dass es sich um eine Autoproteolyse von p53 unter der Freisetzung verschiedener C-terminal verkürzter Fragmente handelt.
Wegen der Vermutung, dass das Protein bei längerer Lagerung schnell degradiert, wurde das
Protein direkt in die biophysikalische Analytik eingesetzt. In kleinen Aliquots wurde das aufgereinigte Protein für weitere biophysikalische Ansätze im Dwer (bestückt mit Eis) für kurze
Zeit bei 0°C im Kühlschrank gelagert.
Weitere Versuche der Aufreinigung mit einem ersten Schritt über die Nickel-NTA-Agarose
führten auch nicht zu einer höheren Ausbeute an p53-Protein vom Schwein. Auch die Variationen der Induktionsbedingungen veränderten nicht das dargestellte Ergebnis. Insgesamt war
die Expression und Aufreinigung von p53 vom Schwein und Rind sehr schwierig und war
starken Degradationsprozessen unterworfen.
IV DISKUSSION
149
4.1.3.3 Analyse der überexpremierten Proteine im Dot- und Western Blot
Um die rekombinanten p53 Proteine vom Rind und Schwein zu analysieren, wurden verschiedene kommerzielle Antikörper gegen humanes p53 Protein hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität gegen p53 Protein vom Rind und Schwein untersucht. Bei einer Kreuzreaktion geht ein
ähnliches Molekül, aber nicht das gegen das der Antikörper erzeugt wurde, eine intermolekulare Bindung mit dem Antikörper ein. Kreuzreaktionen werden häufig beobachtet zwischen
homologen Proteinen unterschiedlicher Spezies, deren Aminosäuresequenz sich nur geringfügig unterscheidet (BREITLING & DÜBEL, 1997).
Mit der Kreuzreaktivität wird auch die Spezifierung des Antikörpers für sein Antigen beschrieben. Die Spezifierung gibt an, wie gut ein Antikörper zwischen ähnlichen Antigenstrukturen unterscheiden kann. Auf molekularer Ebene wird sie durch die Wechselwirkungen zwischen den variablen Ketten und dem Antigen bestimmt. Dabei treffen zwei Proteinoberflächen aufeinander, die möglichst genau ineinander passen sollten. Die Stärke der nicht kovalenten, intermolekularen Bindung bestimmt dann, wie nahe sich die zwei Oberflächen kommen. Die Form der Oberfläche und die Anordnung dieser Bindungen entscheiden über die
Spezifierung, während die Art und der Energiebeitrag dieser Bindungen wichtige Faktoren für
die Affinität sind. Aber die Kreuzreaktion eines monoklonalen Antikörpers darf nicht mit seiner unspezifischen Bindung verwechselt werden. Die Unterscheidung liegt in der Art der
Bindung. Die Kreuzreaktion wird prinzipiell über die Antigenbindungsstelle (den Idiotyp)
vermittelt und besitzt oft Affinitäten, die der Bindung an das Antigen ähnlich sind. Unspezifische Bindungen werden dagegen über andere Teile des Moleküls vermittelt.
Des weiteren bestimmt die Struktur des Epitops die Verwendbarkeit von Antikörpern. Das
Epitop ist der Teil eines Antigens, der mit dem Antikörper in molekulare Wechselwirkung
tritt. Die Bindung an ein Protein wird meist vom einem größerem Epitop vermittelt. Ein Antikörper kann an einen einzelnen Abschnitt des Polypeptidstranges binden (sequentielles Epitop, 5-15 Aminosäuren) oder verschiedene Aminosäurereste aus verschiedenen Abschnitten
der Peptidkette tragen zur Bindung bei (konformationellen Epitopen) (SONG et al., 1997).
Die meisten kommerziellen Anti p53 Antikörper sind gegen Maus oder Mensch gemacht
worden. Kreuzreaktionen dieser Antikörper gegen rekombinantes p53 Protein anderer Spezies
sind in der Literatur selten beschrieben worden (VELDHOEN & MILNER, 1998). Zwei kommerzielle Anti-p53-Antikörper wurden in den Dot Blot und Western Blot mit rekombinanten p53
Protein vom Schwein und Rind wie auch Proben aus den Inkubationsversuchen mit den
Schweineharnblasenepithelzellen eingesetzt. Bei dem Anti p53 Antikörper PAB 240 und DO-
IV DISKUSSION
150
1 handelt es sich um Antikörper, die an ein sequentielles Epitop binden. Anti p53 Antikörper
PAB 240 ist gegen ein lineares Epitop (Aminosäure 212-217) im zentralen Bereich des humanen p53 Proteins gerichtet. Das ist auch der Bereich, der bei p53-Protein von Mensch und
Schwein hochkonserviert (Aminosäure 100-300, DNA-Bindungsregion) ist. Im Gegensatz
dazu bindet der Anti-p53-Antikörper Do-1 an ein lineares Epitop (Aminosäure 21-25), das am
N-Terminus des humanen p53-Proteins liegt. Dieser Bereich ist nicht hochkonserviert.
Im Dot-Blot wurde der Gesamtproteinüberstand eingesetzt, um auszutesten, inwieweit der
Anti p53 Antikörper PAB 240 aus der Menge aller Bakterienzellproteine p53 vom Schwein
erkennt. Als Kontrolle bzw. um die Affinität des Antikörpers abschätzen zu können, wurde
das kommerzielle p53-Protein wie auch das überexpremierte humane Protein eingesetzt. In
allen Fraktionen wurde p53 vom Schwein mit dem monoklonalen Anti p53 Antikörper gegen
humanes p53-Protein erkannt. Unspezifische Bindungen des Anti-p53-Antikörpers PAB 240
im Dot Blot wie auch Western Blot wurden durch die Zugabe von 6% Magermilchpulver im
Blockierungspuffer wie auch Zugabe von 5% Magermilchpulver bei der Inkubation der Nitrocellulosemembran mit dem Antikörper verhindert. Die unspezifischen Bindungsstellen
wurden durch einen Überschuss an Albuminen im Magermilchpulver blockiert. Deshalb kann
davon ausgegangen werden, dass der Anti-p53-Antikörper PAB 240 aus der Gesamtmenge an
Proteinen in den einzelnen Proben im Dot-Blot p53-Protein vom Schwein erkannt hat. Ein
weiterer Grund ist, dass der Dot-Blot einen direkteren Zugang auf die Proteine zulässt.
Im Western Blot können bei der Übertragung der Proteinbanden auf die Nitrocellulose Proteine verloren gehen bzw. die übertragene Gesamtproteinmenge zu gering sein, so dass sie nicht
von dem Antikörper detektiert werden kann (TIMMONS & DUNBAR, 1990). Durch Kühlung
der Fast-Blot-Apparatur und Verlängerung der Blotting-Zeit wurde die Übertragung der Proteinbanden vom SDS-Gel auf die Nitrocellulose Membran optimiert.
Bei dem Western-Blot im Anschluß an die Proteinreinigung des p53-Protein vom Rind wurde
der monoklonale p53-Antikörper Pab 240 verwandt. Dadurch wurden mehrere wichtige Erkenntnisse gewonnen. Erstens: bei dem gereinigten Protein handelt es sich wirklich um p53
vom Rind, was durch die spezifische Detektion durch den verwendeten Antikörper und die
erwartete Größe des Proteins von 79 kDa belegt wurde. Zweitens: in der gewonnenen Proteinfraktion gibt es Proteolyseprodukte, da nicht nur eine Bande detektiert wurde und der Antikörper sowohl N- als auch C-terminal verkürztes p53-Protein erkennen kann, da er an den
zentralen Bereich des p53 Proteins bindet. Durch die Zugabe von Proteasehemmer beim Zellaufschluss wurde darauf abgezielt, die Proteolyse durch Proteasen während des Zellaufschlusses zu verhindern. Die Autoprotolyseaktivität von p53 ist damit aber nicht verhindert worden.
IV DISKUSSION
151
Für humanes p53 ist in Gegenwart von einzelsträngiger oder geschädigter DNA eine Autoproteolyseaktivität beschrieben. Durch die Wechselwirkung mit geschädigter DNA wird in p53
eine Autoproteolyse induziert, die zu einem N-terminal verkürzten Protein p40 und einem Nund C-terminal verkürzten Protein p35 führt (OKOROKOV et al., 1997). Dieses Fragment zeigt
gegenüber vollständigem p53 Protein eine Proteaseaktivität und schneidet an einer Stelle im
N-terminalen Bereich, was in dem Produkt p50 resultiert. Alternativ beschreiben die Autoren
in Gegenwart von Einzelstrang-DNA eine C-terminale Autoproteolyse des p53 Proteins, die
zu zwei Produkten führt: p40 und p50. Die Nummern der Proteolyseprodukte geben jeweils
ihr apparentes Molekulargewicht an (OKOROKOV et al., 1997). Die Wiederholung des Western
Blots mit dem Anti p53 Antikörper Do-1, der ein N-terminales Epitop erkennt, führte zu keiner Detektion von p53 Protein auf der Nitrocellulose.
Sowohl beim Western Blot mit p53-Protein vom Rind als auch beim Western Blot mit p53Protein vom Schwein konnten Abbauprodukte des Proteins gefunden werden. Beim Western
Blot mit p53-Protein vom Schwein wurde der Anti-p53-Antikörper Do-1 eingesetzt. Da der
Antikörper ein N-terminales Epitop erkennt, muss die Autoproteolyse von p53-Protein vom
Schwein am C-Terminus stattgefunden haben. Leider hat der N- und C-terminale Fusionstag
beim p53-Protein vom Schwein diese Autoproteolyse nicht verhindert. Diese Ergebnisse bestätigen, die schon in der Literatur beschriebene schwierige Expression und Aufreinigung von
humanen p53-Protein in bakteriellen Expressionssystemen (CHÉNE, 1997; MIDDELER et al.,
1997; BISCHOFF et al., 1990).
4.1.3.4 Etablierung eines p53-gestützten Detektionssystems zur quantitativen Erfassung
unspezifischer DNA-Schäden
In der Literatur ist die Translokation des Tumorsuppressorproteins p53 in den Zellkern als
Marker für genotoxische Ereignisse mehrfach beschrieben worden (ZHANG & XIONG, 2001;
YANG & DUERKSEN-HUGHES, 1998; MIDDELER et al., 1997; UNGER et al., 1994) wie auch die
damit verbundene erhöhte Produktion von p53-Protein (NELSON & KASTAN, 1994; HESS et
al., 1994; FRITSCHE et al., 1993; KASTAN et al., 1991). Die kritischen Faktoren, die die Induktion von p53-Protein auslösen, sind DNA-Schädigungen, die einen Strangbruch zur Folge
haben (KASTAN et al., 1992). YANG & DUERKSEN-HUGHES (1998) haben als Erste den Anstieg an p53-Protein in Zellen als Indikator für den genotoxischen Schaden in ihrem ElisaMeßsystem gesehen. Deshalb schien es möglich, mit der SPR-Techik das zellkernlokalisierte
p53 nach Induktion von DNA-Schädigungen in Protein-Proben aus primären Epithelzellen
quantifizieren zu können. In einem ersten Schritt wurde die Bindung von verschiedenen Kon-
IV DISKUSSION
152
zentrationen p53-Protein an die immobilisierten Antikörper verfolgt. Dabei lieferten entsprechende Messungen mit MBP-p53 (p53 Protein von Rind) keine kinetisch auswertbaren Kurvenverläufe, während für das analoge Konstrukt mit Schweine p53 eine Quantifizierung der
Interaktion möglich war. Konzentrationen von 50-2000 nM an rekombinantem Protein wurden in die Messungen eingesetzt. Die Kreuzreaktion mit dem Anti-p53-Antikörper Do-1 und
dem rekombinantem p53-Protein vom Schwein war am Aussage kräftigsten. Im zweiten
Schritt wurden die Zellkulturproben nach dem Inkubationsversuch über den Anti-p53Antikörper geleitet.
Mit Hilfe von Oberflächen Plasmon Resonanz-Messungen wurde ein sensitives und hoch spezifisches System gewählt, das außerdem einfach durchführbar und durch den Einsatz von geringen Volumina an Proteinen auch kostensparend war. In Echtzeit konnte die Bindung zwischen dem immobilisiertem Anti-p53-Antikörper Do-1 und dem rekombinantem p53-Protein
vom Schwein beobachtet werden, das im Fluss über die Sensoroberfläche geleitet wurde. Der
Anti-p53-Antikörper PAB 240 zeigte in dem SPR-Meßsystem mit dem rekombinantem p53Protein keine ausreichende Bindung, das entspricht den Literaturdaten. Für den Antikörper
PAB 240 konnte gezeigt werden, dass er spezifisch nicht denaturiertes, mutiertes p53-Protein
detektiert. Diese Spezifierung verliert er jedoch im Western-Blot und in der Immunhistologie
aufgrund der Denaturierung des Proteins und erkennt somit auch das Wild-Typ-Protein
(GANNON et al., 1990). Auch die hier vorgestellten Ergebnisse des Western Blots bestätigen
die Literaturdaten.
Die Stärke der Bindung des Anti-p53-Antikörpers Do-1 an sein Antigen, also seine Affinität
zu dem p53-Protein vom Schwein, ist neben der Spezifierung der zweite wichtige Faktor zur
Beurteilung der Bindung des Antikörpers an das Protein. Die Stärke dieser Bindung wurde
durch die Bindungskonstante angegeben. Die Bindungskonstante (Kd) ist ein Maß für das Reaktionsgleichgewicht, das sich zwischen den an den Antikörper bindenden und davon abdisoziierenden, rekombinanten Protein einstellt. Je mehr rekombinantes Protein oder Protein aus
den Zellkulturproben im Gleichgewicht in gebundener Form vorliegt, desto besser ist die Affinität des Antikörpers für sein Antigen (p53 Protein). Die Bindungskonstante wurde kinetisch
als Quotient der Assoziationsrate (kass) und der Dissoziationsrate (kdiss) bestimmt.
Um die unspezifischen Bindungsstellen auf der Sensoroberfläche zu blockieren und die spezifische Bindung zwischen dem Anti-p53-Antikörper DO-1 und dem rekombinantem p53
Protein vom Schwein zu fördern, wurde mit einem Überschuss an BSA (1% w/v) im
Messpuffer gearbeitet. Außerdem verhindert ein Überschuss an BSA, das Proteasen p53Protein schon im Schlauchsystem degradieren, das ist besonders die Gefahr beim Einsatz von
IV DISKUSSION
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Schlauchsystem degradieren, das ist besonders die Gefahr beim Einsatz von niedrigen Konzentration an p53-Protein.
Bis hin zu p53-Konzentrationen im nanomolaren Bereich konnte eine spezifische Bindung
von rekombinanten MBPp53His6 vom Schwein an die vorgelegten Anti p53 Antikörper Do-1
detektiert werden. Das Detektionssystem wurde mit dem rekombinant expremiertem p53
Protein vom Schwein etabliert und standardisiert. Da bei einer DNA-Schädigung die Neusynthese und Aktivierung von p53-Protein in den Zellen stark erhöht ist, wurde vermutet, dass
eine Konzentration von 50 nM und eine Bindungskonstante von 5,2 x 10-10 M zur Detektion
einer Überexpression von p53-Protein in den behandelten Primärzellkulturen ausreicht (YANG
& DUERKSEN-HUGHES, 1998).
In ersten Versuchen wurde mit nukleären und zellulären Extrakten aus kultivierten und mit
100 µM MNNG behandelten Rinderkolonepithelzellen versucht, p53 in den zellulären Extrakten zu quantifizieren. Unterschiede in der Erkennung der nukleären bzw. der zellulären Fraktion von den Kontrollproben und mit 100 µM MNNG behandelten Proben sind gering detektierbar. Die nukleäre Zellfraktion der behandelten Probe zeigt zwar die meiste Bindung von
p53-Protein an den eingesetzten Anti-p53-Antikörper Do-1, was die Ergebnisse aus der Literatur bestätigt, insgesamt bindet aber mehr Protein an die Antikörper als erwartet. Das deutet
daraufhin, dass Protein auch unspezifisch auf der Sensoroberfläche akkumuliert, obwohl mit
der Zugabe von BSA im Messpuffer in den Experimenten mit rekombinanten Protein die unspezifischen Bindungen verhindert wurden. Bei den Zellkulturproben ist aber ein größerer
Hintergrund an anderen Proteinen vorhanden, vor dem der Antikörper mit einer hohen Spezifierung und Affinität p53-Protein erkennen und binden muss.
YANG & DUERKSEN-HUGHES (1998) bestimmten die p53-Konzentrationen im Cytosol und
Kern einer murinen Zelllinie nach Behandlung mit genotoxischen Substanzen und konnten in
dem Sandwich-ELISA einen Anstieg des p53-Spiegels feststellen. Dieser ist allerdings erst
bei sehr hohen Konzentrationen der genotoxischen Substanz im Bereich von 100 µM MNNG
signifikant erhöht. Ebenso ist dieser Effekt zeitabhängig. Direkt genotoxische Agenzien wie
MNNG zeigen einen frühzeitig erhöhten p53-Level 2 Stunden nach der Behandlung mit einem Peak bei 4 Stunden, danach fällt der p53-Level wieder (YANG & DUERKSEN-HUGHES,
1998; NELSON & KASTAN, 1994). Die normale Halbwertszeit von p53 in verschiedenen Zellen liegt bei 20 bis 40 Minuten (REICH & LEVINE, 1984; GRONOSTAJSKI et al., 1984). Es konnte von YANG & DUERKSEN-HUGHES (1998) aber gezeigt werden, dass durch die Behandlung
mit MNNG die Halbwertszeit von p53 verlängert wird. Zur Stimulation der p53-Expression
kommt es in Zellen aufgrund DNA-Schädigungen die Brüche in der DNA-Doppelhelix und /
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oder einer Desintegration der Chromosomen vor der Mitosephase verursachen (LANE, 1992;
KASTAN et al., 1991). Das eingesetzte MNNG methyliert z.B. O6-Guaninreste und kann so
Einzelbasenaustausche verursachen. Erst hohe Dosen führen zu chromosomalen Schädigungen wie Strangbrüchen, deshalb haben YANG & DUERKSEN-HUGHES (1998) nur bei hohen
Konzentrationen gesteigerte p53-Level detektiert. Kleinere Primärschädigungen der DNA
führen nicht zu einem Anstieg der p53-Konzentration, da ihre Reparatur auch kein Anhalten
des Zellzyklus erfordert. Die in dieser Arbeit verwendeten Zellkulturproben wurden direkt
nach Schädigung geerntet, es ist zu vermuten, dass die stimulierte p53-Expression noch im
vollen Gange war wie auch der Kernimport von p53-Protein. Erst in der nukleären Fraktion
kann p53-Protein die Genaktivierungskaskade in Gang setzen, um die Zelle in eine Wachstumsstillstand zu befördern und die Reparatur des Schadens einzuleiten (ZHANG & XIONG,
2001; XIONG et al., 1993; HUNTER, 1993; EL-DEIRY et al., 1993).
4.2 Nachweissysteme für spezielle DNA-Schädigungen
Im weiteren sind Nachweissysteme für spezielle DNA-Schädigungen zum Einsatz gekommen. Fokussiert wurde auf DNA-Addukt spezifische Antikörper, die auf der Oberfläche des
SPR-Sensors kovalent gebunden wurden. DNA-Standardproben (Oligonukleotide mit oder
ohne O6Alkylguanin) wurden in erste Experimente eingesetzt, um in einem zweiten Schritt
DNA-Proben aus primären Epithelzellen einzusetzen. DNA-Addukt spezifische Antikörper
bieten den Vorteil der hohen Selektivität und des spezifischeren Erkennungsmechanismus im
Vergleich zu Reparaturenzymen, die zunächst unspezifisch an DNA binden und dann auf dem
Doppelstrang entlang laufen, bis sie Fehlstellen detektieren. Adduktspezifische monoklonale
Antikörper binden dagegen nicht an den DNA-Doppelstrang als solchen sondern an die modifizierte Nukleobase (THOMALE et al., 1996; PREVOST et al., 1993; HOCHLEITNER et al., 1991).
Im zweiten Schritt wurden DNA-Analoga – Peptid-Nukleinsäuren – zur Detektion von Einzelfehlpaarungen in die SPR-Technik eingesetzt. 1991 wurde ein DNA Analogon synthetisiert
(NIELSEN, 1991), das bei der sequenzspezifischen Hybridisierung mit Einzelstrang-DNA überlegene Eigenschaften gegenüber „normaler“ DNA aufweist (HYRUP & NIELSEN, 1996).
Dabei handelt es sich um Peptide Nucleic Acids (PNA), bei denen das negativ geladene Ribosephosphatrückrat der DNA durch ein achirales neutrales Pseudopeptidrückrat ersetzt wurde.
Bedingt durch den Wegfall der negativen Ladung weisen die PNA-DNA Hybride eine erhöhte
Stabilität auf, wodurch die PNA-Oligomerlänge zur Ausbildung eines stabilen Hybrids im
Vergleich zu einem DNA-Oligomer drastisch verkleinert werden kann. So ein PNA-DNA
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Hybrid ist dann so sensitiv gegenüber Basenfehlpaarungen, dass eine Einzelbasenfehlpaarung
das Hybid stark destabilisiert, dass es sofort wieder dissoziiert. Damit wäre die theoretische
Voraussetzung gegeben, ein Detektionsverfahren zu etablieren, das sensitiv genug ist eine
Punktmutation innerhalb einer bestimmten DNA-Sequenz zu detektieren. Es ist so spezifisch,
dass DNA-Fragmente mit einer Punktmutation vor einem hohen Hintergrund an Wildtyp
DNA-Fragmenten detektiert werden können. In dieser Arbeit wurden DNA-Oligonukleotide
mit der Sequenz der G12V Mutante des H-ras Gens eingesetzt.
4.2.1 Einsatz von Anti Addukt spezifischen Antikörper im BIAcore
Der Aktivierungsstoffwechsel von Kanzerogenen führt häufig zur Bildung reaktiver Elektrophile, die an nukleophilen Zentren wie der DNA binden können. Dabei können mehr als
ein Dutzend verschiedener Atome der DNA-Bausteine als Reaktionspartner in Frage kommen. Bevorzugte Zielatome der DNA-Bausteine sind die heterozyklischen N-Atome von Adenin und Guanin, die alkyliert werden, z.B. bei Behandlung mit N-Nitroso-Verbindungen
(POIRIER et al., 1990; MELLON & HANAWALT, 1989). Eine Alkylierung an heterozyklischen
N-Atomen von Adenin und Guanin hat eine Destabilisierung der N-glykosidischen Bindung
der betroffenen Basen zur Desoxyribose zur Folge, welche einen Basenverlust und somit die
Entstehung abasischer Stellen in der DNA begünstigen. Abasische Stellen werden durch einen
mehrstufigen Exzisionsreparatur-Mechanismus repariert (LE DOUX et al., 1990).
Bei einer chronischen Belastung mit DNA-bindenden Kanzerogenen, das ist der Normalfall
beim Menschen, stellt sich für die Adduktkonzentration auf der DNA nach einer gewissen
Zeit ein Gleichgewicht zwischen täglicher Bildung und Verschwinden durch Reparatur und
Zelltod ein. Diese Adduktkonzentration im Fließgleichgewicht ist der wichtigste Faktor für
die genotoxische Kanzerogenese (BUSS et al., 1990).
Diese Adduktbildung mit der DNA konnte in vielen Fällen als die Primärläsion zur Kanzerogenese identifiziert werden. Promutagene DNA-Addukte können zu Mutationsereignissen
führen, die durch Zellteilung auf die Tochterzellen weitergegeben werden können. Die Zahl
der Tumorvorläuferzellen nimmt dabei im Laufe des Lebens ständig zu, obwohl ein Teil der
durch Mutation veränderten Zellen durch Zelltod eliminiert wird. Die Adduktbildung auf der
DNA ist ein teilweise irreversibler Prozeß (GREIM & DEML, 1996).
Durch die Einwirkung mutagener und kanzerogener chemischer Agenzien kommt es in der
DNA von Säugerzellen zu DNA-Addukt-Konzentrationen in der Größenordnung von etwa
einem O6-Ethylguanin-Molekül pro 10.000 Guaninmolekülen. Dies bedeutet, dass nur ein
Bruchteil der in der genomischen DNA einer gegebenen Zahl von Zellen vorhandenen Kopien
IV DISKUSSION
156
eines spezifischen Gen-Abschnitts von z.B. 10.000 bp eine spezifische Strukturmodifikation
(z.B. O6-Ethylguanin) aufweist. Dieser Anteil wird zudem durch Reparaturprozesse noch verkleinert (SEILER et al., 1993). Daher sind nur Methoden zum Nachweis von DNA-Addukten
mit einer hohen Spezifierung und Nachweisempfindlichkeit anwendbar.
Die verwendeten Anti-DNA-Addukt spezifischen Antikörper entstammen der am Institut für
Zellbiologie des Universitätsklinikums Essen etablierten Kollektion hochaffiner und spezifischer monoklonaler Anti-Alkyl-Desoxy-Nukleosid Antikörper. Diese Antikörper wurden
durch Immunisierung von Ratten oder Mäusen mit an Trägerproteinen gekoppelten AlkylRibonukleosiden (Haptene) gewonnen. Die Affinitätskonstanten dieser Antikörper für die
entsprechenden Alkyl-Desoxynukleoside sind durchwegs sehr hoch (109 bis > 1010 l/mol),
ihre Kreuzreaktivitäten mit nicht modifizierten DNA-Komponenten sehr gering (RAJEWSKI,
1980, EBERLE, 1989). Ist das Antigen frei zugänglich, sondern in Einzel- bzw. DoppelstrangDNA eingebunden, so nimmt die Affinität dieser Antikörper deutlich ab. Die Affinität des
anti-(O6-Ethyl-2`-Desoxyguanosin) Antikörper Er-6 gegenüber O6-Ethylguanin in Einzelstrang-DNA ist dabei höher als zu O6-Ethylguanin in Doppelstrang-DNA (SEILER et al.,
1993). Die Anti Addukt spezifischen monoklonalen Antikörper ER 6.7 binden bevorzugt an
die modifizierte Nukleobase des DNA-Addukts.
Die Quantifizierung der Alkylierungsprodukte in der Gensequenz ist mit diesen Antikörpern
mit Radioimmunassays im fentomolaren bis subfentomolaren Bereich möglich (SEILER et al.,
1993). In Nitrocellulosefilterbindungsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen den
Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörpern und Einzelstrang DNA bestimmt. Damit sich die
Komplexe ausbilden konnten, wurden die Antikörper mit der Einzelstrang-DNA inkubiert
und dann auf die Nitrocellulosefilter gegeben. 85% aller DNA-Fragmente die ein O6Ethylguanin beinhalten, wurden auf dem Filter gebunden (HOCHLEITNER et al., 1991). Aufgrund dieser hohen Selektivität der Antikörper wurden sie in die Oberflächenplasmonresonanztechnik eingesetzt, um ihre Eignung zur Detektion von DNA-Addukten in den behandelten Zellkulturproben zu testen.
Da die Antikörper eine höhere Affinität zu Einzelstrang DNA haben, wurden in den ersten
qualitativen Tests Oligomeren eingesetzt, bei denen die Position 14 entweder ein Guanin oder
O6Alkylguanin war. Zur Herstellung größerer, alkylierter DNA-Oligomeren wurde RNA-freie
Kalbsthymus DNA mit Ethyl-N-Nitrosoharnstoff behandelt und als Einzel- wie auch Doppelstrang eingesetzt. Bei keiner der eingesetzten DNA-Fragmente konnte eine spezifische Bindung an den Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörper Er 6.7 beobachtet werden. Wahrscheinlich bedingt die Reaktionszeit, die in der Flusszelle des SPR-Systems im Vergleich zu
IV DISKUSSION
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den Nitrocellulosefilterbindungsassays sehr gering ist, dass auch die Einzelstrang-DNA sowohl von den 24 bp Oligonukleotiden als auch von der Kalbsthymus DNA vom Antikörper
nicht erkannt wurde.
Bei der Doppelstrang DNA kommt neben der geringen Reaktionszeit noch erschwerend dazu,
dass O6Alkylguanin in der DNA in zwei unterschiedlichen Konformationen auftreten kann
(PEDERSEN et al., 1988; PARTHASARATHY & FRIDAY, 1986). In einem Fall befindet sich der
Ethyl-Rest in der "Major Grove" der DNA, im anderen weiter innerhalb der Helix (GRAVES et
al., 1989). Schon im ersten Fall muss der Anti DNA-Addukt spezifische Antikörper Er 6.7
gegen O6-Ethyl-2`-Desoxyguanosin mit einer Vielzahl anderer Atome in der DNA in Wechselwirkung treten, um spezifisch binden zu können. In der schlechteren Zugänglichkeit durch
sterische Inhibition im Vergleich zur Situation am freien oder in der Einzelstrang DNA vorliegenden O6-Ethyl-2`-Desoxyguanosin liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die geringere
Affinität der Anti-DNA-Addukt spezifischen Antikörper Er 6.7 für O6-Ethyl-2`Desoxyguanosin in der Doppelstrang-DNA begründet.
4.2.2 Entwicklung eines Detektionssystem zur Erkennung von Punktmutationen im
Marker-Gen H-ras
4.2.2.1 Einklonierung von H-ras vom Rind und Schwein
Da die zellulären Toxizitätstests auf Rinder- und Schweineepithelzellkulturen aufgebaut wurden, mussten die Gensequenzen von H-ras aus Rind und Schwein kloniert werden. Für das
Rind war in der Literatur die Gensequenz von Exon 1-2 beschrieben (MCCAFFEREY et al.,
1989). Auf Grundlage der Rindersequenz wurde auch die Schweine-Sequenz des H-ras-Gens
gefunden. Die Exone 1-2 des H-ras-Gens vom Rind und Schwein waren ausreichend für den
Einsatz in das Detektionssystem zur Erkennung von Punktmutationen, da bei Kodon 12 (Exon
1) eine Punktmutation von Glycin zu Valin schon zu der onkogenen Form des H-ras Proteins
führt. Aufgrund des kausalen Zusammenhangs zwischen Kanzerogenexposition, Mutation
und Tumorentstehung in chemisch induzierten Tumoren (BOS, 1989; SUKUMAR, 1989) wurde
dieses Gen in der vorliegenden Arbeit für die Entwicklung eines Detektionssystems zur Erkennung von Punktmutationen in einem Marker-Gen ausgewählt.
Das H-ras Gen kodiert für ein kleines G-Protein. Es ist in der GTP-Form aktiv. Ein Austausch
des Glycinrests in Kodon 12 (Exon 1) durch Valin hemmt die intrinsische GTPase-Aktivität
und verringert die Affinität zu GAP [GTPase activating protein] (BISHOP, 1983). Die Sequenz
des 8 bp PNA-Oligomers wurde so gewählt, dass sie genau über dem Hotspot des H-ras Gens
IV DISKUSSION
158
vom Schwein im Kodon 12 liegt und in seiner Sequenz den Basen 31 bis 38 der G12V Mutante des H-ras Gens entspricht.
Die Gensequenz der Exone 1-2 von H-ras aus Rind wurde mit Hilfe der von MCCAFFEREY et
al. (1989) beschriebenen und in der Gendatenbank (Accession Nr.: Rind X17363) abgelegten
Sequenz isoliert. Die erwartete DNA-Bande für die Exone 1 und 2 in der Größe von ca. 300
bp (Länge der Exone 1-2: 286 bp) wurde gelelektrophoretisch nach der Touchdown-PCR detektiert. Nach der Einklonierung in den Expressionsvektor pGEX2T und einer anschließenden
Restriktionsanalyse wurde die einklonierte cDNA sequenziert. Die erhaltene Sequenz stimmte
mit der abgelegten Sequenz (Accession Nr.: Rind X81704) des H-ras Gens aus Rind in der
Datenbank überein. So wurde eindeutig die Übereinstimmung der einklonierten cDNA mit
der abgelegten Sequenz von Exon 1-2 des H-ras Gens aus Rind belegt.
Von der ras Gensequenz vom Schwein war in der Literatur keine Sequenz beschrieben. Es
wurde hier derselbe Ansatz gewählt wie schon bei der Einklonierung des p53-Gens vom
Schwein, mit Hilfe der Oligonukleotide zur der Amplifikation der Exone 1-2 des H-ras Gens
vom Rind wurden die Exone 1-2 vom H-ras-Gen vom Schwein amplifiziert. Sequenzvergleiche mit den H-ras Gensequenzen von verschiedenen Spezies zeigten eindeutig, dass es sich
um das H-ras Gen vom Schwein handelt. Mit dem FASTA-Suchprogramm wurde ein Homologievergleich mit den in den Datenbanken abgelegten Sequenzen durchgeführt. Die höchste
Priorität bei der Homologiesuche hat die humane Sequenz des H-ras-Gens zu der inserierten
DNA in den positiven Klonen. Eine 85%ige Homologie liegt zwischen der humanen Sequenz
und der H-ras-Sequenz vom Schwein vor. Die H-ras-Sequenz vom Rind besitzt eine 70%ige
Homologie zu der H-ras-Sequenz vom Schwein.
Mittels RACE-Reaktion wurden die N- und C-terminalen Bereiche der Sequenz überprüft.
Am C-terminalen Ende war in dem Bereich des Oligomers für die Rindersequenz bei nur einer Base ein Unterschied zu finden. Bei der Base 18 wurde eine C zu G Transition gefunden,
die jedoch an dritter Stelle des Kodons 6 (CTG) liegt. Daher hat diese Abweichung in der
DNA-Sequenz für die Aminosäuresequenz keine Folgen, da die beiden entsprechenden Kodons CTG und CTC für die Aminosäure Leucin kodieren. Mit den Oligonukleotiden des Nterminalen Endes wurde kein Unterschied in der Basensequenz gefunden. Leider war es aber
nicht möglich, die komplette c-DNA-Sequenz des H-ras-Genes vom Schwein mit der RACEReaktion zu amplifizieren.
IV DISKUSSION
159
4.2.2.2 Einsatz von DNA-Analoga – Peptid-Nukleinsäuren - im BIAcore
Zuerst wurden die 14 bp DNA-Oligomeren mit den 8 bp PNA-Oligomer hybridisiert und mit
unabhängigen biophysikalischen Meßsystemen (Differentialscanning-Mikrokalometrie, isotherme Titrationsmikrokalorimetrie) charakterisiert. Die Ergebnisse wurden verglichen mit
den Ergebnissen der DNA-DNA Hybride. Danach wurden in dem SPR-Detektionssystem die
synthetisierten DNA-Oligomeren eingesetzt. Im folgenden war zu überprüfen, ob auch mittels
PCR amplifizierte DNA-Fragmente von den immobilisierten PNA´s detektiert wurden, was
eine zwingende Voraussetzung für das Vermessen von „realen“ DNA-Proben aus Zellkuturmaterial darstellt.
HYRUP & NIELSEN (1996) haben beschrieben, dass die PNA/DNA Hybride eine größere Stabilität haben als die DNA/DNA Hybride. Dabei gehen sie von einer Erhöhung der Schmelztemperatur von 1°C pro Basenpaar aus. Die thermische Stabilität des 8 bp PNA/DNA Hybrids
wurde mittels der Differentialscanning-Mikrokalometrie untersucht. Dabei wurde die spezifische Schmelztemperatur des Hybrids bei einer Temperatur von 55,3°C bestimmt. Zum Vergleich ergab sich für ein entsprechendes DNA/DNA Hybrid eine Schmelztemperatur von
48,3°C. Die Temperaturdifferenz der ermittelten Schmelztemperaturen beträgt 7°C, was in
etwa der theoretisch erwarteten Temperaturdifferenz von 8°C entspricht.
Mittels der isothermen Titrationsmikrokalometrie wurde die Dissoziationskonstante KD für
die Hybridisierungsreaktion zwischen den PNA/DNA Match- und Mismatch-Hybriden (siehe
Ergebnisse Abb. 3.38 und 3.39) bestimmt. Dabei wurde zwischen dem PNA-Oligomer und
einem komplimentären DNA-Oligonukleotid eine Bindung eindeutig nachgewiesen und eine
Dissoziationskonstante von 117 nM bestimmt. Zwischen dem PNA-Oligomer und dem DNAOligonukleotid mit der Basenfehlpaarung wurde mit der isothermen Titrationsmikrokalometrie keine messbare Affinität festgestellt. Um außerdem einen Vergleich zwischen den unterschiedlichen Hybridformen DNA/DNA und PNA/DNA ziehen zu können, wurden die Experimente unter Ersatz des PNA-Strangs durch einen DNA-Strang gleicher Länge und Sequenz wiederholt. Zwischen den beiden komplementären DNA-Oligonukleotiden wurde eine
Bindung festgestellt und die Dissoziationskonstante mit 232 nM bestimmt. Weisen die DNAOligonukleotide zueinander bezüglich ihrer Sequenz eine Einzelbasenfehlpaarung auf, so
wurde mit der isothermen Titrationsmikrokalometrie keine messbare Affinität mehr festgestellt. Die Dissoziationskonstante des DNA-DNA Hybrids ist erwartungsgemäß größer als die
des PNA-DNA Hybrids, was durch die erhöhte Stabilität des PNA-DNA Hybrids begründet
ist. Bei einem Detektionsverfahren, das auf der Spezifierung der PNA/DNA Hybridisierung
IV DISKUSSION
160
beruht, hätte die unerwartete Ausbildung stabiler „Mismatch“-Hybride (HOHEISEL et al.,
1997) erhebliche negative Konsequenzen. In den hier gemessenen Hybridisierungsreaktionen
kommt es nicht zu der Ausbildung von den von HOHEISEL (1997) beschriebenen stabilen
Mismatch-Hybriden. Außerdem destabilisiert schon eine Einzelbasenfehlpaarung das 8 bp
PNA-DNA Hybrid so stark, dass es sofort wieder dissoziiert. Dadurch ist eine Detektion von
G12V Mutanten des H-ras Gens, die sich nur in einer Punktmutation von der Wildtyp DNA
unterscheidet, auch bei einem hohen Hintergrund an Wildtyp DNA in der Probe möglich.
Zur Charakterisierung der Hybridisierungseigenschaften der PNA´s mit DNA-Oligomeren im
SPR-System wurden die PNA´s über Biotin auf der Streptavidinoberfläche kovalent gebunden. Eine besonders starke Bindung liegt bei der Bindung des niedermolekularen Liganden
Biotin an das Protein Streptavidin vor. Die extrem kleine Bindungskonstante beträgt Ki= 2,5 x
10-13 M. Dies entspricht einer freien Bindungsenthalpie von –76 kJ/mol. Biotin bildet sieben
geometrische ideale Wasserstoffbrücken zum Streptavidin. Alle polaren Gruppen des Liganden sind an diesen H-Brücken beteiligt. Der Mittelteil des Biotinmoleküls ist lipophil und
schmiegt sich optimal an lipophile Bereiche der Proteinoberfläche an. Biotin passt also optimal in die Bindetasche, darüber hinaus besteht aber auch eine perfekte Komplementarität der
funktionellen Gruppen.
Der Vorteil dieser Anordnung gegenüber einer direkten Immobilisierung der PNAs auf der
Dextranoberfläche ist zum einen, dass ein räumlicher Abstand zwischen der Dextranoberfläche und den PNAs besteht. So können die zu untersuchenden DNA-Oligonukleotide besser
mit den PNAs interagieren und des weiteren garantiert die Kopplung der PNA`s an das minimal-Streptavidin eine korrekte räumliche Anordnung in der Flußzelle des SPR-Systems.
Bei der Charakterisierung des Detektionssystems wurden zunächst die geeigneten Pufferbedingungen für die Hybridisierungsreaktion ausgetestet. Das beste Hybridisierungssignal mit
einer gleichzeitig hohen Sequenzspezifierung wurde in einem PBS-Puffer mit 150 mM NaCl
erreicht. Dies stimmt mit den Literaturdaten überein, WEILER et al. (1997) haben ein Fenster
von 90-200 mM NaCl beschrieben.
Bei der Injektion der 60 bp großen DNA-Oligonukleotiden mit der G12V-Sequenz des H-ras
Gens wurde ein Hybridisierungssignal mit den immobilisierten PNAs bis zu einer Konzentration von 100 nM beobachtet, während für das 60 bp große Wildtyp H-ras DNAOligonukleotid kein Hybridisierungssignal detektiert wurde. Wildtyp- zu der G12V-Mutante
des H-ras Gens unterscheidet sich dabei nur in einer Punktmutation. Bei den 14 bp DNAOligonukleotiden wurde eine Hybridisierung zwischen dem Wildtyp DNA-Oligonukleotid
IV DISKUSSION
161
und dem PNA-Oligonukleotid beobachtet, wenn auch das Meßsignal bedeutend kleiner war
als das bei den komplementären DNA-Oligonukleotiden gleicher Konzentration.
Die Ergebnisse von den Hybridisierungsversuchen, besonders die mit den 60 bp langen DNAOligomeren, zeigten eine sehr hohe Sequenzspezifierung für einen SPR-Biosensor. In der
Literatur wurden zwar Unterschiede in der Dissoziationskonstante zwischen vollkommen
komplementären Oligonukleotid-Hybriden und solchen mit Fehlpaarungen detektiert, aber die
Mismatch Hybride wurden immer detektiert (JENSEN et al., 1997). Die Hybridisierungssignale
von den 14 bp Wildtyp DNA-Oligonukleotiden sind zur Zeit nicht abschließend zu erkären.
Es handelt sich aber nicht um eine unspezifische Einlagerung der DNA in die Sensormatrix,
da sonst auch von den 60 bp Wildtyp DNA-Oligonukleotid Hybridisierungssignale zu erwarten gewesen wären. Eine kinetische Analyse der erhaltenen Daten wurde versucht, konnte
jedoch wegen des Auftretens von Massen-Transfer-Problemen nicht gemacht werden. Allerdings wurde die Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse nachgewiesen.
Abschließend wurden die DNA-Oligonukleotide mit der G12V Sequenz des H-ras Gens gegen einen hohen Hintergrund an Wildtyp DNA Oligonukleotiden detektiert. Bis zu einem
Verhältnis von 250 zu 1 war es möglich, die 60 bp G12V-ras DNA-Oligomere gegenüber
Wildtyp DNA Oligonukleotiden zu detektieren. Bei den 14 bp DNA-Oligonukleotiden wurde
ein Verhältnis von 100 zu 1 erreicht. Durch die positiven Ergebnisse dieser Versuche wurde
eine zwingende Voraussetzung erfüllt, die an ein Detektionssystem zur Erfassung von DNAPunktmutation in DNA aus Zellkultur oder Gewebe gestellt wird.
Mittels PCR amplifizierte DNA Fragmente des H-ras Gens wurden in das oben beschriebene
Detektionssystem eingesetzt. Diese Proben entsprechen den „realen“ DNA-Proben, bei denen
DNA-Sequenzen voneinander getrennt werden sollen, die sich nur in einer Punktmutation
unterscheiden. Zwei unterschiedlich große Fragmente des H-ras Gens wurden mittels PCR
amplifiziert: ein 79 bp langes Fragment (Basen 1 bis 79 von 564) und ein 170 bp langes
Fragment (Basen 1 bis 170 von 564). Es wurde von beiden Fragmentgrößen jeweils DNA mit
der Wildtyp Sequenz und mit der G12V Sequenz des H-ras Gens amplifiziert.
Eine Detektion der 79 bp langen DNA-Fragmente mit der G12V Sequenz des H-ras Gens war
bis ca. 500 nM möglich, bei den DNA-Fragmenten mit der Wildtyp Sequenz lag das Messsignal innerhalb der Messgenauigkeit des Systems. Bei den 170 bp langen DNA-Fragmenten
wurde für keines der beiden Fragmente ein auswertbares Messsignal erhalten. Mit diesen Experimenten wurde gezeigt, dass das Detektionssystem geeignet ist DNA, die mittels PCR
amplifiziert worden ist, zu erkennen und somit die an das Testsystem gestellte grundlegende
Anforderung für die Analyse von DNA-Proben auf Punktmutationen in Marker-Genen erfüllt.
IV DISKUSSION
162
Es ist das erste Mal, dass ein SPR-basiertes Testsystem beschrieben wurde, das sensitiv genug
war, mittels PCR amplifizierte DNA voneinander zu trennen, die sich in ihrer Sequenz nur in
einer Punkmutation unterscheidet. SAWATA et al (1999) zeigten die generelle Eignung ihres
System, mittels PCR amplifizierte DNA zu detektieren. Eine so hohe Sensitivität der Hybridisierungsreaktion konnte von SAWATA et al. (1999) jedoch nicht beobachtet werden.
Da der komplementäre DNA-Strang als kompetitiver Inhibitor der PNA-DNA Hybridisierungsreaktion wirkt, kommt es bei den 170 bp langen DNA-Fragmenten zu keiner Hybridisierung zwischen den immobilisierten PNA-Oligomeren und der DNA. Um das Reannealen der
beiden komplementären DNA-Stränge aus der PCR zu unterbinden, wurden neben der Hitzedenaturierung dem Reaktionspuffer auch noch verschiedene Detergenzien wie z.B. Formamid
zugesetzt (SAWATA et al, 1999). Es wurde eine Bindungsstudie durchgeführt, bei der dem
Reaktionpuffer 10 % Formamid zugesetzt worden war. Dies hatte jedoch nicht den gewünschten Effekt. Es kam zu einer starken Verschlechterung des Hybridisierungssignals, so dass dieses Detergenz für das vorliegende Testsystem nicht geeignet war.
4.3 Ausblick
Im täglichen Gebrauch werden ständig Substanzen verwendet, die sich langfristig als krebserregend herausstellen. Asbest ist ein solches Beispiel, die freigesetzten Asbestfasern können
DNA-Schäden wie Doppelstrangbrüche hervorrufen (MARCYNSKI et al., 1999; OKAYASU et
al., 1999). Der künstliche Süßstoff Aspartam wird in diätetischen Nahrungsmittel zugesetzt.
Aspartam ist deshalb umstritten, da es im Organismus Formaldehyd erzeugt, das mit Proteinen, RNA und DNA reagieren (TEPHLY, 1999) und vermutlich Gehirntumoren begünstigen
kann (FLAMM, 1997).
Aus diesem Grund unterliegen Nahrungsmittelzusätze, Medikamente und Kosmetika einem
Zulassungsverfahren, in dessen Verlauf sie auf Genotoxizität getestet werden. Dabei werden
die Substanzen in geeigneten Testsystemen auf die Verursachung von "genetischen Endpunkten" getestet, um von diesen auf die Erzeugung von Mutationen rückschließen zu können
(FAHRIG, 1993). Zu den genetischen Endpunkten zählen Genmutationen (inklusive Deletionen), Chromosomenaberrationen (inklusive erblicher Translokationen), mitotische Rekombination und Chromosomenfehlverteilungen (Nondisjunction). Induzierte Mutationen wie auch
induzierte Rekombinationen sind insbesondere deshalb relevant, weil sie beim Menschen in
der Keimbahn übertragen werden (MOHRENWEISER & JONES, 1990). Die verschiedenen genetischen Endpunkte sind auch für allgemeine toxikologische Abklärungen interessant, denn sie
IV DISKUSSION
163
gehören alle zu den in den verschiedenen Stadien der humanen Kanzerogenese auftretenden
genetischen Veränderungen.
Sowohl bei Harnblasentumoren als auch bei Darmkrebs konnte eine Tumorentstehung durch
kanzerogene Stoffe nachgewiesen werden. Über zwei Drittel der Krebserkrankungen werden
durch die Risikofaktoren Rauchen, Ernährungsgewohnheiten, Alkoholkonsum und berufliche
Exposition mittels chemischer Schädigung der DNA verursacht (BECKER & WAHRENDORF,
1998).
Aussagen über die Kanzerogenität von verschiedenen Chemikalien zeigen mit den vorhandenen in vitro Testsystemen (Schwesterchromatidenaustausch-Test, Analyse von Chromosomenabberationen mit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, Mutagenitätstest in LymphomaZellen der Maus, Salmonella-Mutagenitätstest) eine Übereinstimmung von 60% (TENNANT et
al., 1987a und b; ZEIGER et al., 1990; TENNANT et al., 1991). Andere Untersuchungen mit 30
verschiedenen Chemikalien zeigten nur bei der Hälfte der Chemikalien eine Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der Kurzzeittests und einer über 2 Jahre durchgeführten
Kanzerogenitäts-Langzeitstudie (ASHBY, 1997).
Aufgrund dieser langen, aufwendigen Testsysteme mit einer relativ geringer Genauigkeit ist
es erstrebenswert, ein genaues und Kosten-effektives Testsystem zu etablieren. Keines der
vorhandenen Systeme ist automatisierbar, für einen hohen Probendurchsatz geeignet und
weist viele verschiedene DNA-Schädigungen von Addukten über Interkalationen bis zu Basenverlusten direkt nach. Dies hätte durch Verwendung einer direkten Bindung von Reparaturenzymen an DNA-Schäden oder DNA-Mutationen erreicht werden können. Leider konnte
das in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Eine Vielzahl von Analysen haben aber bisher gezeigt (BENZER, 1961; MILLER, 1972; WILKENS & HART, 1974), dass die DNA-Sequenz, die
DNA-Konformation und die Struktur des Chromatins sowohl die initiale Bildung als auch die
Erkennung und Reparatur spezifischer Karzinogen-induzierter DNA-Läsionen durch Reparaturproteine und damit die Verteilung der induzierten Mutationen in erheblichem Maße beeinflussen (SMITH & MELLON, 1990; TERLETH et al., 1991; LINK et al., 1991).
Eine genauere Charakterisierung der Erkennung von Fehlpaarungen durch hMSH2, der Bindung der weiteren an dem Fehlpaarungsmechanismus beteiligten Proteine wie auch der Reparatur des Schadens könnten Einblick in den Mechnismus dieses Systems geben.
Das UvrABC-Reparatursystem ist weitgehend charakterisiert, ist allerdings kaum biophysikalisch analysiert worden. Die Affinitäten des Systems für verschiedene DNA-Schädigungen
wurden nur teilweise bestimmt und dann nur apparent über Geretardationsversuche. Weitere
Experimente zur verbesserten Dimerisierung von UvrA auf der Sensoroberfläche sind not-
IV DISKUSSION
164
wendig, um dann im weiteren die generelle Eignung des Systems zur Erkennung von UVSchäden bzw. chemisch induzierten DNA-Schäden abzuschätzen.
Mit p53 liegt ein guter Malignitätsmarker vor, der indirekt DNA-Schäden quantifizierbar machen kann. p53 ist beteiligt an der Zelldifferenzierung, der DNA-Reparatur und der Apoptose.
Bei einer DNA-Schädigung kommt es zur vermehrten Produktion von p53 (FRITSCHE et al.,
1993; KASTAN et al., 1991), was die Arretierung der Zelle in der G1-Phase zur Folge hat. Das
Detektionssystem hat sich in den vorliegenden Experimenten als vielversprechend erwiesen
und kann zur indirekten Detektion von chemisch verursachten, unspezifischen DNA-Schäden
genutzt werden. Als verbleibende Aufgabe stellt sich noch, das Detektionssystem mit realen
Proben aus der Zellkultur auszutesten. Eine Standardisierung ist dabei ein wichtiger Punkt,
um das System genauer und stabiler zu machen. Desweiteren müßte darauf abgezielt werden,
einen monoklonalen Antikörper mit dem Antigen p53-Protein vom Rind und Schwein herzustellen. Damit wird die Spezifierung und Affinität der Antikörperbindung steigen und es wird
möglich sein, die beobachteten Bindung von p53-Protein vom Rind und Schwein an den immobilisierten Antikörper zu verbessern und eine quantitative Erfassung der geschädigten
DNA in den unterschiedlichen Zellkompartimenten zu ermöglichen. In ersten Versuchen mit
dem Zellkulturmaterial wäre eine Zudotierung von rekombinanten p53 Protein in die Zellkulturproben möglich, um das System erstmal zu sensibilisieren und die Grenze abzuschätzen, ab
wann noch p53-Protein detektiert vor einem großem Hintergrund an anderen Proteinen.
Das Detektionssystem zur Erkennung von Punktmutationen in Marker-Genen ist auf die Erkennung eines spezifischen mutagenen Ereignisses innerhalb eines Marker-Gens beschränkt
und ist zur Untersuchung der mutagenen Wirkung von Chemikalien auf das Erbgut nur bedingt geeignet. In den Inkubationsversuchen in der Zellkultur kommt es zu einer globalen
Schädigung der DNA, die von dem System nicht erfasst werden kann. Die Stärke dieses Detektionssystems liegt in der klinischen Diagnostik zur Krebsfrüherkennung oder in der Identifizierung maligner Tumore wie auch durch die Verwendung der SPR-Technik, die einen hohen Probendurchsatz bei geringen Kosten gestattet. Da hier das Spektrum von möglichen Mutationen innerhalb der unterschiedlichen Tumortypen stark eingeschränkt ist. Im Idealfall
handelt es sich um eine einzige Punktmutation die ein Proto-Onkogen in ein Onkogen überführt oder ein Tumorsuppressorgen deaktiviert, nach der dann spezifisch gesucht werden
kann. Ein ideales Marker-Gen ist das H-ras Gen, da es nur durch drei unterschiedliche Punktmutationen in ein Onkogen überführt werden kann und diese onkogene Form sehr früh in der
Tumorprogression auftritt.
IV DISKUSSION
165
In den folgenden Versuchen muss eine kinetische Analyse der beobachteten Hybridisierungen
erfolgen, um einen Nachweis zur quantitativen Erfassung der geschädigten DNA in der zu
analysierenden Probe zu erhalten. Desweiteren muss das Problem des Reannealen der komplementären DNA Stränge aus der PCR angegangen werden. Dabei können neue PCRTechniken wie die „Asymetrische PCR“ zur Anwendung kommen, bei der als Hauptprodukt
nur ein DNA Strang amplifiziert wird. Auch die Verwendung anderer Detergenzien wie z. B.
N-Lauroylsarcosine im Reaktionspuffer muss für das Detektionssystem ausgetestet werden.
Schließlich muss das Detektionssystem mit realen Tumorproben, bei denen eine ras-Mutation
duch andere Methoden festgestellt worden ist, ausgetestet werden.
Insgesamt kann die Aussage getroffen werden, dass die vorliegenden Detektionssysteme einen wichtigen Beitrag liefern, um innerhalb des Verbundprojektes langfristig einen in vitro
Kanzerogenitätstest mit kultivierten Epithelzellen zu etablieren und eine reproduzierbare Detektion spezifischer DNA-Veränderungen in den behandelten Zellen wie der isolierten DNA
zu ermöglichen, mit dem Ziel des Nachweises einer einzelnen DNA-Modifikation oder einer
Kombination mehrerer Veränderungen in verschiedenen Genen oder Chromosomenabschnitten, die sowohl mit der Konzentration als auch mit der Einwirkungsdauer einer bestimmten
getesteten Substanz signifikant korrelieren.
V ZUSAMMENFASSUNG
166
V. Zusammenfassung
Wesentliche Schritte genotoxischer Ereignisse spielen sich auf molekularer Ebene ab. Auf diese Ereignisse wird bei der Überprüfung kanzerogener und mutagener Eigenschaften von chemischen Verbindungen in der Gentoxikologie fokussiert. Bei der molekularen Analyse von mutagenen Schädigungen stehen dabei solche Indikatoren im Vordergrund, mit denen globale, über das gesamte Genom
verstreut erfolgende Schädigungen nach Behandlung mit potentiell mutagenen Agenzien auch vor dem
Hintergrund eines hohen Überschusses an unveränderter DNA nachgewiesen werden können.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Testsystem zur Detektion von unspezifischen und spezifischen DNA-Schädigungen zu etablieren, um Stoffe und Verbindungen hinsichtlich ihres mutagenen
Potentials auf Primärzellkulturmaterial mit Rinderkolon- und Schweinharnblasenepithelzellen zu untersuchen.
Als erster methodischer Ansatz wurde die Kopplung von Proteinen an die Oberfläche eines geeigneten
Bio-Sensors (SPR-Technik, Biacore) verfolgt, die in der Lage sind geschädigte DNA selektiv zu
binden. Da haben sich die Reparturenzymen angeboten, die die Fähigkeit haben mannigfaltige Primärschäden wie z.B. Basenveränderungen, apurine/apyrimidine Stellen, Intra- und Interstrangverletzungen sowie DNA-Einzelstrang- und Doppelstrangbrüche spezifisch in der DNA zu erkennen. Damit
wäre es möglich, auch statistische, nicht auf ein ausgewähltes Markergen beschränkte Mutationsereignisse zu erfassen. Hierzu war es notwendig neben der Etablierung des meßtechnischen Aufbaus, die
Sensivität der Methodik mit den zellbiologischen Endpunkten abzugleichen.
Zunächst wurden DNA-Reparaturproteine des Fehlpaarungs- und Exzisionsmechanismus zur
Anreicherung von genotoxisch modifizierten DNA-Proben aus primären Epithelzellen in der
SPR-Technik eingesetzt. Hierzu war es notwendig, die entsprechenden Gensequenzen der
Reparaturproteine in geeignete Expressionsvektoren zu überführen und deren bakterielle Synthese und Aufreinigung zu etablieren. Es zeigte sich bei den qualitativen Tests mit den Reparaturenzymen hMSH2 und MutS im SPR-System keine ausreichende Selektivität für fehlgepaarte gegenüber korrekt gepaarter DNA. Dies gilt für DNA-Oligomere genauso wie für große DNA-Fragmente aus den Inkubationsversuchen. Zur generellen Überprüfung von MutS
wurde ein schon in der Literatur beschriebener Ansatz (GOTOH, 1997) gewählt. Dazu wurde
die DNA auf der Sensoroberfläche gekoppelt und konnte eine spezifische Bindung von MutS
an die fehlgepaarte Oligomeren-DNA im Vergleich zur Kontrolle festgestellt werden. Die
fehlgepaarte DNA wurde um den Faktor 1,3 spezifischer erkannt als die korrekt gepaarte
DNA. Mit XPA wurde ein weiteres Reparaturenzym als Fänger in dem SPR-System eingesetzt, um eine qualitative Aussage über die Bindungskapazität an Cisplatin-geschädigte DNA
leisten zu können. Auch das bakterielle Homolog UvrA wurde zur qualitativen Detektion von
UV-geschädigter DNA im SPR-System einsetzt. Es kam bei beiden Reparaturenzymen unter
V ZUSAMMENFASSUNG
167
verschiedenen Messbedingungen zu keiner spezifischen Erkennung von geschädigter im Vergleich zu geschädigter DNA im SPR-System.
Im zweiten Ansatz wurde zum Nachweis einer genotoxischen Wirkung von Substanzen die
zelluläre p53-Konzentration bei Behandlung von Zellen bestimmt. Wenn es in einer eukaryontischen Zelle zu einer DNA-Schädigung kommt, kann bei dem p53 Protein sowohl eine
Akkumulation, als auch ein Translokation in den Zellkern beobachtet werden. Indirekt ist so,
durch die Quantifizierung der p53 Proteinkonzentration in den unterschiedlichen Zellkompartimenten, ein Nachweis von mutagenen Ereignissen möglich. Die Akkumulation von p53 in
behandelten Epithelzellen wurde ebenfalls grundsätzlich über die SPR-Technik verfolgt.
Hierbei wurde aufgrund der Verfügbarkeit kommerzieller Antikörper gegen das Tumorsuppressorprotein p53 ein entsprechendes Fängersystem für das zelluläre Protein konzipiert
und etabliert. In der weiteren biophysikalischen Analyse wurde überprüft, ob es zu einer Anreicherung von p53-Protein im Zellkern von behandelten, kultivierten Epithelzellen kam.
Aufgrund der Verwendung tierischen Gewebes aus Schwein und Rind für die Primärzellkulturen wurden zusätzlich die Gensequenzen für p53 aus beiden Spezies kloniert.
Bei der Etablierung von Nachweissystemes für spezielle DNA-Schädigungen wurde fokussiert auf den
Einsatz von Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörpern und auf DNA-Analoga, Peptid Nukleinsäuren.
Mit den Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörper wurde im SPR-System das Ziel verfolgt,
die Konzentration eines potentiell mutagenen DNA-Alkylierungsprodukts (O6-Ethyl-2´Desoxyguanosin) in behandelten DNA-Proben zu detektieren. Zuerst wurde das Testsystem
mit Oligonukleotiden mit schädigungsrelevanter Modifikation versucht zu etablieren, um in
einem zweiten Schritt DNA-Proben aus primären Epithelzellen einzusetzen. Da die Antikörper eine höhere Affinität zu Einzelstrang DNA haben, wurden in den ersten qualitativen Tests
Oligomere eingesetzt, bei denen die Position 14 entweder ein Guanin oder O6Alkylguanin
war. Zur Herstellung größerer, alkylierter DNA-Fragmente wurde RNA-freie Kalbsthymus
DNA mit Ethyl-N-Nitrosoharnstoff behandelt und als Einzel- wie auch Doppelstrang eingesetzt. Bei keinem der eingesetzten DNA-Fragmente konnte eine spezifische Bindung an den
Anti DNA-Addukt spezifischen Antikörper beobachtet werden.
Im zweiten Ansatz wurden DNA-Analoga – Peptid-Nukleinsäuren – zur Etablierung eines
Detektionssystem eingesetzt, das auf der sequenzspezifischen Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren beruhte. Mit diesem Detektionssystem können Punktmutationen in
Marker-Genen erkannt werden. Als Markergen wurde hier das ras-Gen gewählt, da dieses
V ZUSAMMENFASSUNG
168
Gen durch eine einzige Punktmutation von einem Protoonkogen in ein Onkogen überführt
werden kann. Von dem verwendeten 8mer PNA/DNA Hybrid, das in seiner Sequenz der
G12V Mutante des H-ras Gens vom Schwein entsprach, wurde die thermische Stabilität mittels Differential Scanning-Mikrokalorimetrie (DSC) untersucht. Die Hybridisierungsreaktion
des 8mer PNA-Oligonukleotids mit dem komplementären DNA-Oligonukleotid wurde mit
der isothermen Titrationsmikrokalorimetrie (ITC) bestimmt. Dabei konnte eine etwas höhere
Dissoziationskonstante für das "Match-Hybrid" beobachtet werden, während für das "Mismatch-Hybrid" keine messbare Affinität festgestellt wurde.
Im SPR-System wurde das 8 mer PNA-Oligonukleotid auf der Sensoroberfläche immobilisiert und verschiedene DNA-Proben darüber geleitet. Für die DNA-Oligonukleotide (14 bp
und 60 bp), die in ihrer Sequenz der G12V-Mutante des H-ras Gens vom Schwein entsprachen, konnte eine Hybridisierungsreaktion bis zu einer Konzentration von 100 nM detektiert
werden. Bei den nicht komplementären DNA-Oligonukleotiden mit einer Basenfehlpaarung
konnte
kein
Hybridisierungssignal
detektiert
werden.
Die
Detektion
von
DNA-
Oligonukleotiden vor einem hohen Hintergrund an Wildtyp DNA-Oligonukleotiden war bei
den 60 bp G12V-ras DNA-Oligomeren bis zu einem Verhältnis von 250 zu 1 gegenüber
Wildtyp DNA-Oligonukleotiden und bei den 14 bp Wildtyp DNA-Oligonukleotiden bis zu
einem Verhältnis von 100 zu 1 möglich. Das Detektionssystem mit der PNA-Sonde war sensitiv genug, um mittels PCR amplifizierte DNA voneinander zu trennen, die sich nur durch eine
Punktmutation unterscheidet.
Die vorliegende Arbeit beschreibt ein System zur Detektion von unspezifischen wie auch von
spezifischen DNA-Schäden und bietet so durch weiteren Einsatz von "realen" Zellkulturproben die Möglichkeit, die beiden Systeme langfristig für einen in-vitro Kanzerogenitätstest zu
etablieren.
V SUMMARY
169
Summary
Basic steps of genotoxic effects are happening at the molecular level. Analysis of
cancerogenic or mutagenic properties of chemical substances tests for these kind of effects.
The molecular analysis of mutagenic damages focuses on such indicators, with which global
damages that spread over the whole genome can be detected after treatment with potential
mutagenic agents against the high background of wildtype DNA.
Aim of this work was to establish an assay for the detection of both nonspecific and specific DNAdamages, so that chemical substances can be analysed regarding their mutagenic potential for primary
cell cultures from bovine colon and pig urinary bladder epithelial cells.
In a first approach, proteins that selectively bind to damaged DNA, were immobilised on the affinity
matrix of an appropriate biosensor (surface plasmon resonance technique, BIAcore). Suitable for this
approach are repair enzymes, which can specifically recognize various primary damages such as base
variations, apurine/apyrimidine parts, intra- and inter-strand break damages or single strand and
double strand breaks in the DNA. Thus it would be possible to detect damages in general, and not only
ones in a selected marker gene. For this it was necessary to establish the technical set-up and to adapt
the sensitivity to the cell biological endpoints.
Initially, the DNA repair proteins of the mismatch repair system and of the nucleotide
excision repair system were used for the accumulation of genotoxically modified DNAprobes from primary cell culture. For this it was necessary to clone the gene sequence of these
proteins into expression vectors and to produce and purify the proteins in E.coli. The first
qualitative tests using the repair enzymes hMSH2 and MutS in the SPR-system showed that
there is not enough selectivity for mismatched DNA compared to matched DNA. This was
found for DNA-oligonucleotides and for bigger DNA-fragments from treated cell cultures. A
previously described system (GOTOH, 1997) was used to analyse MutS in detail. The DNA
was immobilized on the affinity matrix and a specific binding of MutS to mismatched DNAoligomeres compared to control DNA was observed. The binding to the mismatched DNA
was 1,3 more specific than to the matched DNA. XPA was another repair enzym that could be
used as a catcher in the SPR-System to qualitatively detect DNA damaged by cisplatin. In
addition, the bacterial homolog UvrA was used for the qualitative detection of UV-damaged
DNA in the SPR-system. However, under various conditions no specific detection of
damaged DNA compared to non-damaged DNA could be observed with one of these
enzymes.
In a second approach, the cellular p53 concentration was analysed to test if it can be used as an
indicator for the genotoxicity of chemical substances. Subsequent to DNA-damage in eukaryotic cells,
V SUMMARY
170
the p53 protein can accumulate as well as translocate into the nucleus. Thus it might be possible to
detect mutagenic events by quantifying the p53 protein-level in the different cell compartments. The
accumulation in treated epithelial cells was analysed with the SPR-technique. Using commercially
available antibodies against the tumorsuppressorprotein p53, it was possible to establish a catcher
system for the cellular protein. Using this system it was then tested, if the p53-protein accumulates in
the nucleus of treated epithelial cells in cell culture. In parallel, the gene of p53 from pig and bovine
was cloned, because tissues from these two animals were used in the primary cell culture.
In the second part of this work it was the aim to establish a detection system for special DNAdamages. Here the focus was on antibodies against DNA adducts and on DNA-analogues,
peptid nucleic acids.
Using the anti DNA adduct specific antibodies in the SPR-System it was tried to measure the
concentration of a potential mutagenic alkylation product (O6-Ethyl-2´-Desoxyguanosin) in
treated DNA. First, it was aspired to establish the test system with DNA-Oligonucleotides,
which can then be used with DNA from primary cell culture. Initially, oligomeres that have
either a guanine or a O6 alkyl guanine at position 14 were used, because of the higher affinity
of the antibodies to single stranded DNA. For the preparation of larger, alkylated fragments of
DNA, RNA-free calf thymus DNA was treated with N-ethyl-N-nitrosourea, using either
single stranded or double stranded DNA. Unfortunately, no specific binding to the anti DNA
adduct antibodies was observed with any kind of DNA-fragments.
In the second approach, the DNA-analogue – peptid nucleic acids- was used in the detection
system. This was based on the specific hybridisation of complementary nucleic acids, so that
it should be possible to detect point mutations in marker genes. Here, the ras-gene was used
as the marker gene, because ras can be transformed into a protooncogene by a single
pointmutation. The thermic stability of an 8mer PNA/DNA hybrid, which is similar to the
G12V mutant of ras from pig, was analysed using differential scanning microcalometry. The
hybridization of the 8mer PNA-Oligonukleotid to the complementary strand was observed
with isothermal titration calorimetry. The dissociation rate was higher for the matching
hybrids, while no affinity was detectable for the mismatching hybrids.
The 8mer PNA-oligonucleotide was immobilized on the sensoring surface of the SPR-system,
and different DNA-probes were tested. The hybridization reaction could be measured for 14
bp and 60 bp DNA oligonucleotides complementary to the sequence of the G12V mutatnt of
ras up to a concentration of 100 nM. Using the mismatching DNA oligonucleotides, no
hybridisation signal was detectable. The detection of complementary DNA-oligonucleotides
against a high background of mismatching DNA-oligonucleotides was possible for the 60 bp
G12V-ras DNA oligonucleotides up to a ratio of 1:250 compared to wild type DNA-
V SUMMARY
171
oligonucleotides, and for the 14 bp G12V-ras DNA oligonucleotides up to a ratio of 1:100.
The detectionsystem with the PNA probe was sensitive enough for the detection of PCR
amplified DNA that differs only in a single point mutation.
This work describes a system for the detection of nonspecific DNA-damages, as well as one
for specific DNA-damages. In the long term it should be possible to improve the two systems,
so that the cancerogenic potential can be analysed in an in-vitro assay using "real" cell culture
probes.
VI LITERATURVERZEICHNIS
172
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Plaß, M., Wolf, A., Hartmann, E., Müller, O. und Kuhlmann, J.: Analysis of Genomic Damages and
Quantification of Genetoxic Events. Posterpräsentation auf der GBM–Jahrestagung in Hamburg
(1999)
VII ANHANG
188
VII. Anhang
7.1 Herkunft von Proteinen und Antikörpern
hMSH 2
Der Klon mit dem kompletten humanen MSH2-Gen wurde der Arbeitsgruppe freundlicherweise von
Kenneth Kinzler zur Verfügung gestellt (LEACH ET AL., 1993). Die vollständige c-DNA Sequenz des
hMSH2-Gens liegt im pBS(sk+) Vektor vor, transformiert in TG1-Zellen.
MutS
MutS konnte mit Hilfe der beschriebenen Sequenz aus der Gendatenbank (AC M64730) aus einem
Pool genomischer DNA in den Vektor pQE 32 Typ IV mit einem N-terminalen Hexahistidin-Tag (His
6) kloniert werden. Die genomische DNA wurde mit Hilfe des QIAamp Blood Kit aus TG1-Zellen
isoliert.
UvrA
UvrA konnte mit Hilfe der in der Gendatenbank (AC M13495) beschriebenen Sequenz aus einem Pool
genomischer DNA in den Vektor pCal N mit einem N-terminalen Calmodulin-Bindungs-Peptid-Tag
(CBP) kloniert werden. Die genomische DNA wurde aus TG1-Zellen mit Hilfe des QIAamp Blood
Kits isoliert .
XPA
Die XPA-Proteinproben wurden freundlicherweise von Thomas Hey (AG von Prof Krauss,
Universität Bayreuth) zur Verfügung gestellt.
humanes p53
Der Klon mit der kompletten humanen p53-Gensequenz wurde freundlicherweise von Jim Bischoff
(Onyx Pharmaceuticals, San Francisco USA) zur Verfügung gestellt. Die vollständige c-DNA Sequenz
des p53-Genes liegt im pBS(sk+) Vektor vor, transformiert in TG1-Zellen. Aus diesem
Lagerungsvektor wurde die vollständige c-DNA Sequenz in den Expressionsvektor pET 3a (Novagen,
Madison USA) kloniert von Herrn PD Dr. Müller (AG für Tumorgenetik) und für diese
Dissertationsarbeit zur Verfügung gestellt.
Anti DNA-Addukt spezifischer Antikörper
Von Herrn PD Dr. Jürgen Thomale vom Institut für Zellbiologie der Universitätsklinikum Essen
wurden freundlicherweise monoklonale Antikörper (ER 6.7) aus Ratte zur Verfügung gestellt, die
spezifische Alkylierungsprodukte - O6Alkylguanin - in der DNA erkennen. DNA-Oligomere von 24
Basenpaaren Länge, bei denen die Position 14 entweder ein Guanin oder O6Alkylguanin ist, wurden
von Herrn PD Dr. Thomale ebenfalls zur Verfügung gestellt (II Material, 2.9.3 Tab. 2.1). Beide
Oligomere waren am 5´Ende phosporyliert.
VII ANHANG
189
7.2. Datenbankablagen der klonierten Sequenzen und
Sequenzvergleiche
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
AF124298
1164 bp
mRNA
MAM
31-JAN-2000
Sus scrofa p53 protein mRNA, complete cds.
AF124298
.
pig.
Sus scrofa
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Mammalia;
Eutheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1164)
AUTHORS
Plass,M., Hartmann,E., Mueller,O. and Kuhlmann,J.
TITLE
Identification of a Sus scrofa gene encoding a protein with
high
similarity to p53 from Homo sapiens, Bos taurus and Ovis aries
JOURNAL
Unpublished
REFERENCE
2 (bases 1 to 1164)
AUTHORS
Plass,M., Hartmann,E., Mueller,O. and Kuhlmann,J.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (27-JAN-1999)
Strukturelle Biologie, Max-Planck-Institut fuer Molekulare
Physiologie, Rheinlanddamm 201, Dortmund 44139,
Germany
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1164
/organism="Sus scrofa"
/db_xref="taxon:9823"
/tissue_type="urinary bladder epithelium"
/note="primary cell culture"
CDS
1..1164
/note="tumor suppressor; similar to Homo sapiens, Bos
taurus, and Ovis aries p53 protein"
/codon_start=1
/product="p53 protein"
/translation="MEESQAELGVEPPLSQETFSDLWNLLPENNLLSSELSAPVDDLL
PYSEDVVTWLDECPNEAPQMPEPPAQAALAPATSWPLSSFVPSQKTYPGNYGFRLGFL
HSGTAKSVTCTYSPSLNKLFCQLAKTCPVQLWVDSPPPPGTRVRAMAIYKKLEHMTEV
VRRCPHHERSSDYSDGLAPPQHLIRVEGNLRAEYFDDRNTFRHSVVVPYESPEIESEC
TTIHYNFMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDFRGNLLGRSSFEVRVCACPGRDRRTEEE
NFRKKGQSCPEPPPGSTKRALPSSTSSSPQQKKKPLDGEYFTLQIRGRKRFEMFRELN
EALELMDAQAGREPGESRAHSSHLKSKKGPSPSCHKKPMLKREGPDSEFIVTD"
BASE COUNT
259 a
360 c
308 g
237 t
ORIGIN
1 atggaagaat cacaggcaga actcggtgtg gagccccctc tgagtcagga gacattttcc
61 gacttgtgga acctacttcc tgaaaacaac cttctgtcct ccgagctctc cgcacctgtg
121 gatgacctgc tcccgtactc agaagatgtt gtcacctggc tggatgagtg tccgaatgaa
181 gcgccccaaa tgccagagcc tcctgcccaa gctgccctgg caccagccac ctcctggccc
241 ctgtcgtcct ttgtcccctc ccagaagacc taccctggca actacggttt ccgtctcggg
301 ttcctgcatt ccggaacagc caagtctgtg acctgcacgt attccccttc cctcaacaag
361 ctgttctgcc agctggccaa gacctgccca gtgcagctat gggtcgactc gccgcccccg
421 cccggcaccc gcgtccgcgc catggccatc tacaagaagc tggagcacat gacggaggtt
481 gtgaggcgct gtccccacca tgagcgctcc tctgactata gcgatggtct ggccccgcct
541 cagcacctta tccgggtgga agggaattta cgcgcggagt atttcgacga ccggaacacc
601 tttagacaca gtgtggtggt gccctatgag tcccccgaga tcgagtctga gtgcaccacc
661 atccactaca acttcatgtg taacagctcc tgcatggggg gcatgaaccg gcggcccatc
721 ctcaccatca tcacactgga agactttcgt ggtaacctgc tgggacggag cagctttgag
781 gtgcgtgttt gtgcctgtcc tgggagagac cgccgcactg aggaagaaaa ttttcgcaag
841 aaggggcagt cttgccccga gccaccccct gggagcacta agcgagcact gcccagcagc
901 accagctcct ctccacagca aaagaagaaa ccactggatg gagaatattt cactcttcag
961 atccgtgggc gtaaacgctt tgagatgttc cgagagctga atgaggcctt ggagctgatg
1021 gatgctcagg ctggaaggga accaggggaa agcagggctc attctagcca cctgaagtct
1081 aagaaggggc cttctccctc ctgccataaa aaaccaatgc tcaagagaga ggggcctgac
1141 tcagaattca tcgtgactga ctga
//
Abb. 7.1: Datenbankablage der p53-Gensequenz vom Schwein unter der Accession-Nummer AF124298. Die Sequenz
wurde in der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI englisch: nationales Zentrum für
biotechnologische Informationen) abgelegt. Mit Hilfe des Programms Bankit wurde die Sequenz eingegeben
VII ANHANG
190
Abb. 7.2: Alignment der vorhandenen Datenbanksequenzen von p53 für Rind (btp53), Schaf (oap53) und Mensch (hsp53) mit der
klonierten p53-Sequenz vom Schwein (p53pig). In Grau unterlegt sind die Bereiche dargestellt, die homolog sind. Die heterologen
Bereiche sind nicht unterlegt. Unter den 4 Sequenzen der unterschiedlichen Spezies ist die Consensus-Sequenz dargestellt.
191
VII ANHANG
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
1
ATGACGGAGT
ATGACGGAAT
ATGACGGAGT
ATGACGGA - T
ATAAGCTCGT
ATAAGCTGGT
ATAAGCTCGT
ATAAGCT -GT
GGTGGTGGGC
GGTGGTGGGC
GGTGGTGGGC
GGTGGTGGGC
GCTGGAGGTG
GCCGGCGGTG
GCCGGTGGCG
GC-GG –GG -G
50
TGGGGAAGAG
TGGGCAAGAG
TGGGGAAGAG
TGGG- AAGAG
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
51
TGCCCTGACC
TGCGCTGACC
CGCCCTGACT
-GC- CTGAC -
ATCCAGCTTA
ATCCAGCTGA
ATCCAGCTCA
ATCCAGCT - A
TCCAGAACCA
TCCAGAACCA
TTCAGAATCA
T- CAGAA- CA
CTTTGTGGAT
TTTTGTGGAC
CTTCGTGGAC
- TT- GTGGA -
100
GAGTACGACC
GAATACGACC
GAGTACGACC
GA- TACGACC
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
101
CCACCATAGA
CCACTATAGA
CCACCATCGA
CCAC- A T- GA
GGACTCCTAC
GGATTCCTAC
GGACTCCTAC
GGA- TCCTAC
CGGAAGCAAG
CGGAAGCAGG
CGGAAGCAAG
CGGAAGCA- G
TGGTCATTGA
TGGTCATTGA
TGGTCATCGA
TGGTCAT- GA
150
CGGGGAGACG
TGGGGAGACG
TGGGGAGACG
-GGGGAGACG
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
151
TGCCTGCTGG
TGCCTGTTGG
TGCCTGCTGG
TGCCTG- TGG
ACATCCTGGA
ACATCCTGGA
ACATCCTGGA
ACATCCTGGA
200
CACCGCGGGC CAGGAGGAGT ACAGTGCCAT
TACCGCCGGC CAGGAGGAGT ACAGCGCCAT
CACAGCGGGC CAGGAGGAAT ACAGCGCCAT
-AC- GC- GGC CAGGAGGA- T ACAG- GCCAT
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
201
GCGGGACCAG
GCGGGACCAG
GCGAGACCAG
GCG- GACCAG
TACATGCGCA
TACATGCGCA
TACATGCGCA
TACATGCGCA
CCGGGGAGGG
CCGGGGAGGG
CCGGGGAGGG
CCGGGGAGGG
pig-H-ras
hum-H-ras
bov-H-ras
Consensus
251
TCAACAACAC
TCAACAACAC
TCAACCACGT
TCAAC- AC--
CAAATCTTTC
CAAGTCTTTT
CAAGTCCTTC
CAA- TC- TT-
GAGGACATCC
GAGGACATCC
GAGGACATCC
GAGGACATCC
250
CTTCCTCTGC GTGTTCGCCA
CTTCCTGTGT GTGTTTGCCA
CTTTCTCTGC GTGTTTGCTA
CTT- CT- TG - GTGTT- GC -A
290
ACCAGTAC~~
ACCAGTACAG
ACCAGTAC~~
ACCAGTAC--
Abb. 7.3: Alignment der vorhandenen Datenbanksequenzen von ras für Rind und Mensch mit der klonierten
ras-Sequenz vom Schwein. Die mit Rot markierten Sequenzen gehören zum Exon 1 und die mit Blau markierten
gehören zm Exon 2 des ras-Genes.
192
VII ANHANG
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
high
JOURNAL
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
JOURNAL
Institut
AF116346
288 bp
mRNA
MAM
31-DEC-1999
Sus scrofa H-ras (H-ras) mRNA, partial cds.
AF116346
.
pig.
Sus scrofa
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Mammalia;
Eutheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus.
1 (bases 1 to 288)
Plass,M., Hartmann,E., Mueller,O. and Kuhlmann,J.
Identification of a Sus scrofa gene encoding a protein with
similarity to H-ras from Bos taurus
Unpublished
2 (bases 1 to 288)
Plass,M., Hartmann,E., Mueller,O. and Kuhlmann,J.
Direct Submission
Submitted (23-DEC-1998) Strukturelle Biologie, Max-Planck-
fuer Molekulare Physiologie, Rheinlanddamm 201, Dortmund 44139,
Germany
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..288
/organism="Sus scrofa"
/db_xref="taxon:9823"
gene
1..>288
/gene="H-ras"
CDS
1..>288
/gene="H-ras"
/note="proto-oncogene."
/codon_start=1
/product="H-ras"
/translation="MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQV
VIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQY"
BASE COUNT
67 a
78 c
90 g
53 t
ORIGIN
1 atgacggagt ataagctcgt ggtggtgggc gctggaggtg tggggaagag tgccctgacc
61 atccagctta tccagaacca ctttgtggat gagtacgacc ccaccataga ggactcctac
121 cggaagcaag tggtcattga cggggagacg tgcctgctgg acatcctgga caccgcgggc
181 caggaggagt acagtgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctctgc
241 gtgttcgcca tcaacaacac caaatctttc gaggacatcc accagtac
//
Abb. 7.4: Datenbankablage der Exone 1-2 der ras-Gensequenz vom Schwein unter der Accession-Nummer
AF116346. Die Sequenz wurde in der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI englisch:
nationales Zentrum für biotechnologische Informationen) abgelegt. Mit Hilfe des Programms Bankit wurde die Sequenz
eingegeben.
VII ANHANG
193
DANKSAGUNG
Der Einstieg in ein neues Themengebiet fällt leichter, wenn der Neuling bei seinen ersten Schritten
von erfahrenen und interessierten Menschen begleitet wird. Allen technischen und wissenschaftlichen
Mitarbeitern der Abteilungen von Prof. Dr. A. Wittinghofer und Prof. Dr. Dr. H.M. Bolt wie auch der
zentralen Einrichtungen des Max-Planck-Institutes für molekulare Physiologie gilt mein besonderer
Dank. Sie haben mit ihrer kollegialen und herzlichen Haltung zu einem produktiven Klima
beigetragen.
An dieser Stelle besonders hervorheben möchte ich Herrn Prof. Dr. A. Wittinghofer für die
freundliche Aufnahme in seine Abteilung, sowie die ausgezeichneten technischen und materiellen
Voraussetzungen für die Durchführung der Arbeit und Herrn Prof. Dr. Wildner für sein freundliches
Entgegenkommen, das Zweitgutachten zu übernehmen.
Herrn Dr. J. Kuhlmann gilt mein besonderer Dank für die Bereitstellung des interessanten Themas.
Seine reichhaltigen Erfahrungen auf den Gebieten der biophysikalischen Analytik, Proteinchemie,
Validierung und Qualitätssicherung waren essentiell. Seine zuverlässige Betreuung und
Diskussionsbereitschaft begleiteten das Projekt kontinuierlich.
Danken möchte ich sehr herzlich Herrn Dr. O. Müller, der auf dem Gebiet der Molekulargenetik ein
steter Ansprechpartner war und mich immer tatkräftig unterstützt hat.
Frau Elisabeth Hartmann und Herrn Alexander Wolf möchte ich danken für die sehr erfolgreiche
Zusammenarbeit. Durch Ihre Untersützung ist diese vorliegende Arbeit sehr bereichert worden.
Der Arbeitsgruppe Biopysikalische Analytik, im besonderen Frau Christine Nowak, habe ich viel
zu verdanken. Für die ständige Hilfsbereitschaft bei fachlichen Problemen, wie auch die moralische
Unterstützung in einer schweren Zeit in meinem Leben, möchte ich Euch herzlich danken. Ich war
gerne Teil der Arbeitsgruppe.
Frau Susanne Weber und Herrn Sascha Birkner möchte ich danken für die Bereitstellung des
behandelten Zellkulturmaterials. Die gemeinsam besuchten Fortbildungsveranstaltungen haben mir
viel Freude gemacht. Auch Herrn Dr. Wolfram Föllmann gilt mein Dank für seine Unterstützung.
Herrn Prof. Dr. A. Wittinghofer möchte ich weiterhin danken, daß er mir die Möglichkeit gegeben
hat, eine Geschäftsstelle der Biotechnologischen Studenteninitiative e.V. (BTS) in Dortmund
aufzubauen. Herrn Maik Brinkmann danke ich, daß er es mit mir im Hauptvorstand der BTS gewagt
hat. Allen Mitstreitern in der BTS, besonders den Dortmunder BTS´lern, gilt mein besonderer Dank,
ich habe viel von Euch gelernt neben dem Spaß und Interesse, den ich an unserer gemeinsamen Idee
hatte.
Meinen Eltern, meinem Mann Siegfried und meinen Freunden danke ich für die stete Unterstützung
und den Glauben an mich, ohne Sie wäre mir vieles schwerer gefallen, was mit Worten nicht zu
beschreiben ist. Danke!
194
VII ANHANG
LEBENSLAUF
PERSÖNLICHE DATEN
Name
Martina Firus, geb. Plaß
Anschrift
Roonstr. 1
47799 Krefeld
geboren
19.04.1968 in Werne an der Lippe
Familienstand
verheiratet
Staatsangehörigkeit
deutsch
AUSBILDUNG
1974-1978
Uhland-Grundschule in Werne an der Lippe
1978-1987
Anne-Frank-Gymnasium in Werne an der Lippe
Abitur: Juni 1987
1987-1989
Krankenpflegeausbildung
an der Zentralkrankenpflegeschule Lünen e.V.
1990-1992
Studium der Medizin
an der Ruhr-Universität-Bochum
1992-1996
Studium der Biologie
Oktober-November 1995
Diplomprüfungen
Dezember 1995- August 1996
Diplomarbeit in der Abteilung Strukturelle Biologie von
Prof. Dr. Alfred Wittinghofer am Max-Planck-Institut für
molekulare Physiologie, Dortmund:
“ Etablierung eines experimentellen Systems zur Isolierung
genomischer DNA aus kultivierten Primärzellen zur
Vorbereitung genotoxischer Untersuchungen”
September 1996- Januar 2000
Doktorarbeit unter Leitung von Prof. Dr. Alfred Wittinghofer,
Abteilung Strukturelle Biologie, Max-Planck-Institut für
molekulare Physiologie, Dortmund
BERUFLICHE TÄTIGKEIT
Seit Januar 2000
D&P Consult GmbH, Düsseldorf