INAUGURAL – DISSERTATION
Werbung
Aus dem Pathologischem Institut -Abteilung Neuropathologieder Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Die Auswirkungen einer konstitutiven Expression von TIMP-1 im ZNS transgener Mäuse INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Vorgelegt 2007 von Dea Humar geboren in Müllheim -1- Dekan Prof. Dr. Rudolf Korinthenberg 1. Gutachter Prof. Dr. Axel Pagenstecher 2. Gutachter Prof. Dr. Guido Nikkhah Jahr der Promotion 2007 -2- Meinungsverschiedenheit über ein Kunstwerk zeigt, dass das Werk neu, vielschichtig und lebendig ist. O.W. -3- INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen 4 1. Zusammenfassung 6 2. Einleitung 7 2.1 Die Matrix Metalloproteinasen (MMP) 7 2.1.1 Struktur, Molekularbiologie 7 2.1.2 Funktionen der MMPs und ihre Regulierung 8 2.2 Die Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinasen (TIMP) 10 2.2.1 Struktur, Molekularbiologie 10 2.2.2 Funktionen der TIMPs 13 2.3 TIMP/ MMP Expressionsmodell im zentralem Nervensystem und ihre Bedeutung 15 2.4 Zielsetzungen der Arbeit 16 3. Material und Methoden 17 3.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterialien 17 3.2 Allgemeine Puffer, Lösungen 17 3.3 Antikörper 18 3.4 Morphologische und funktionelle Untersuchungen 19 3.4.1 Rückenmark- und Gehirnentnahme, Weiterverarbeitung 19 3.4.2 Histochemie 20 3.4.3 Immunhistochemie 23 3.4.4 In Situ Cell Death Reaktion (TUNEL) 25 3.4.5 Evan´s Blue 25 3.5 Methoden zur Arbeit mit RNA 25 3.5.1 Extraktion und Quantifizierung von Gesamt-RNA 25 3.5.2 Radioaktive und nichtradioaktive In Situ Hybridisierung (ISH) 26 3.5.3 RNase Protection Assay (RPA) 29 3.6 Methoden zur Arbeit mit DNA 33 3.6.1 DNA Isolierung 33 3.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 33 3.6.3 DNA Gelelektrophorese 34 -43.7 Methoden zur Arbeit mit Proteinen 35 3.7.1 Proteinextraktion 35 3.7.2 Enzym-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 36 3.8 Phänotypische Untersuchungen an TIMP-1 transgenen Mäusen und Kontrollen 36 3.8.1 Experimentelle Allergische Enzephalomyelitis (EAE) 36 3.8.2 Verhaltenstestung 37 3.8.2.1 Light-Dark Box 37 3.8.2.2 Rotarod 37 3.8.2.3 Open Field 37 3.8.2.4 Water Maze 38 4. Ergebnisse 40 4.1 Verwendetes Mausmodell 40 4.2 Genotypisierung für das TIMP-1 Transgen 41 4.3 Analyse der transgenen Mauslinien auf TIMP-1 Expression 41 4.3.1 Nachweis der TIMP-1 mRNA Expression im ZNS 41 4.3.2 Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA im ZNS 42 4.3.3 Analyse der TIMP-1 Protein Expression 46 4.4 Pathologische Auswirkungen der TIMP-1 Expression auf den Phänotyp der Mauslinien 47 4.4.1 Makroskopische Besonderheiten 47 4.4.2 Histologische Besonderheiten 47 4.4.2.1 Histochemische Färbungen 47 4.4.2.2 Immunhistochemische Färbungen 50 4.4.2.3 Apoptose-Assay 57 4.4.2.4 Evan´s Blue 57 4.4.3 Zeitkinetik der TIMP-1 mRNA Expression 58 4.4.4 Zeitkinetik der Zytokinexpression 59 4.4.5 Klinische Merkmale: Verhaltensauffälligkeiten der Mauslinie T2 61 4.4.5.1 Open Field 61 4.4.5.2 Light-Dark Box 62 4.4.5.3 Water Maze: Water maze cue navigation (WmCn) 63 4.4.5.4 Water Maze: Water maze spatial reference memory & reversal 64 (WmRm) -54.4.5.5 Rotarod 67 4.4.5.6 Beurteilung der Ataxie 68 4.4.6 Experimentelle allergische Enzephalomyelitis in der Mauslinie T11 4.4.6.1 Phänotypische Merkmale 69 69 5. Diskussion 72 5.1 Phänotypische Auswirkungen einer konstitutiven zerebralen TIMP-1 Expression 72 sind konzentrationsabhängig 5.2 Phänotypische Merkmale bei konstitutiver TIMP-1 Expression 73 5.2.1 Leukozteninfiltrate 73 5.2.2 Kalzifikationen, Gliose und Demyelinisierung 74 5.2.3 Kleinhirnhypoplasie 75 5.3 TIMP-1 nimmt möglischerweise Einfluss auf die Entwicklung und Physioloige des zentralen Nervensystems 76 5.4 Rolle der konstitutiven Expression von TIMP-1 in der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) – TIMP-1 und Inflammation 76 5.5 Wechselwirkungen zwischen MMPs und TIMP-1 – ein komplexes System 80 5.6 Klinische Perspektiven und die Gefahren 81 5.7 Weiterführung des Projekts 82 6. Literaturverzeichnis 84 7. Danksagung 93 8. Lebenslauf 94 9. Tagungsbeitrag 96 -6- ABKÜRZUNGEN ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex ADAM a disintegrin and a metalloproteinase ADAMTS ADAM with thrombospondin type Ι domain BSA Serum Albumin vom Rind Bp Basenpaare CD Cluster of Differentiation DAB Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid DNA desoxy nucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DPM disintegrations per minute (Zerfälle pro Minute) DTH delayed-type hypersensitivity EAE Experimentelle Allergische Enzephalomyelitis EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay EPA erythroid-potentiating activity EZM Extrazelluläre Matrix g Relative Zentrifugalkraft GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor hGH human growth hormone (humanes Wachstumshormon) IFN Interferon IHC Immunhistochemie IL Interleukin IL12p35 p35-Untereinheit des Interleukin-12-Heterodimers IL12p40 p40-Untereinheit des Interleukin-12-Heterodimers ISH In Situ Hybridisierung Mac membrane attack complex MBP myelin basic protein (basisches Myelinprotein) MMP Matrix Metalloproteinase mRNA messenger ribonucleic acid MS Multiple Sklerose NHS Normales Pferdeserum PBS phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) -7PCR Polymerase-Kettenreaktion RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RPA RNase Protection Assay RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkription und anschließende PCR TACE tumor-necrosis-factor-alpha-converting enzyme TE Tris-EDTA tg transgen TGF transforming growth factor TIMP Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase TNF tumor necrosis factor (Tumor Nekrose Faktor) TUNEL in situ cell death reaction VEGF vascular endothelial growth factor WmCn Water maze cue navigation WmRm Water maze spatial reference memory & reversal wt Wildtyp-Maus w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) ZNS zentrales Nervensystem -8- 1. ZUSAMMENFASSUNG Die Auswirkungen einer konstitutiven TIMP-1 Expression im zentralen Nervensystem (ZNS) wurden anhand transgener Mäuse untersucht. Zur Verfügung standen drei verschiedene transgene Mauslinien: T2, T7 und T11, welche TIMP-1 in Astrozyten exprimierten. Diese Mauslinien unterschieden sich in der Konzentration und Lokalisation des exprimierten TIMP-1. Unter physiologischen Bedingungen zeigten die transgenen Mauslinien T7 und T11 keine klinischen und pathologischen Auffälligkeiten. Jedoch konnten in der transgenen Mauslinie T2 mehrere Besonderheiten festgestellt werden: Sie wies im Vergleich zu den anderen transgenen Mauslinien die höchste TIMP-1 Expression auf, speziell im Kleinhirn. Pathologische Merkmale waren eine Kleinhirnhypoplasie, Leukozyteninfiltrationen und Gliose im Kleinhirn und Hippocampus, wobei das Kleinhirn noch zusätzlich Kalzifikationen aufwies. MMPs und ihre Inhibitoren spielen zusätzlich in der neuronalen Entwicklung und in verschiedenen neuronalen Funktionen wichtige Rollen. Bei den histologischen Untersuchungen der transgenen Mauslinie T2 konnten jedoch keine Störungen in der Zellmigration und somit in der Entwicklung des Kleinhirns festgestellt werden. Auch der Hippocampus wies keine pathologischen Konfigurationen auf. Um Anhaltspunkte über die Wirksamkeit und Funktion der neuronalen Netzwerke zu erhalten, wurden an der Mauslinie T2, die auch eine TIMP-1 Expression im Hippocamus aufwies, Verhaltensuntersuchungen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten signifikante Unterschiede im Verhalten und Beeinträchtigungen in der Gedächtnis- und Lernfunktion. Weiterhin war eine Ataxie in dieser Mauslinie auffällig. Um die Wirkung einer konstitutiven TIMP-1 Expression unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, wurde in der transgenen Mauslinie T11, die eine hohe TIMP-1 Expression im Rückenmark aufwies, eine experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) durchgeführt. Hierbei stellte sich heraus, dass die TIMP-1 Expression einen verstärkten klinischen Verlauf der EAE mit ausgeprägter Symptomatik und verminderter Ausheilungschance bewirkte. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Doktorarbeit neue und unerwartete Informationen in Funktionen und Auswirkungen einer konstitutiven Überexpression von TIMP-1 brachte. -9- 2. EINLEITUNG 2.1 Die Matrix Metalloproteinasen (MMP) 2.1.1 Struktur, Molekularbiologie Die MMPs, auch Matrixine genannt, sind eine große Familie von Zinkendopeptidasen. Mittlerweile sind über 25 Mitglieder der MMP-Familie bekannt (Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. 1999). Sie werden als Pro-Enzyme synthetisiert und in den meisten Fällen als inaktive pro-MMPs sezerniert oder in die Plasmamembran verankert (Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. 1999). Ihre Aktivierung erfolgt durch Abspaltung eines Signalpeptids durch Proteasen. Gruppe Name Nummer Kollagensubstrat Andere Substrate der EZM Struktur der Domänen Kollagenase 1 MMP-1 I, II, III, VII, VIII, X Agg, Gel, PG B Kollagenase 2 MMP-8 I, II, III, V, VII, VIII, X Agg, EL, FN, Gel, LN B Kollagenase 3 MMP-13 I, II, III, IV, VII, IX, X, XIV Agg, FN, Gel B Kollagenase 4 MMP-18 I Gelatinase A MMP-2 I, III, IV, V, VII, X, XI, XIV Agg, EL, FN, Gel, LN, PG, VN C Gelatinase B MMP-9 IV, V, VII, X, XIV Agg, EL, FN, Gel, PG, VN C Stromelysin 1 MMP-3 III, IV, IX, X, XI Agg, EL, FN, Gel, LN, PG, VN B Stromelysin 2 MMP-10 III, IV, V, IX, X Agg, EL, FN, Gel, LN, PG B Stromelysin 3 MMP-11 Matrilysin MMP-7 Matrilysin 2/ Endometase MMP-26 Membran- MT1-MMP MMP-14 Typ- MMPs MT2-MMP MMP-15 MT3-MMP MMP-16 MT4-MMP MMP-17 MT5-MMP MMP-24 MT6-MMP MMP-25 IV Metalloelastase MMP-12 RASI 1 MMP-19 Enamelysin MMP-20 Chick embryo MMP MMP-22 Xenopus MMP MMP-21 Kollagenasen Gelatinasen Stomelysine Matrilysine Andere MMPs B E Agg, Ca, EL, FN, Gel, LN, PG, VN A Gel A Agg, EL, FN, Gel, LN F Agg, FN, Gel, LN F Gel, FN F Fibrinogen/Fibrin D Gel F Gel, FN D IV Ca, EL, FN, Gel, LN, PG, VN B IV Gel, FN, LN B Amelogenin B Ca, Gel B IV, X I, II, III III G H MMP-23 Epilysin MMP-28 Ca E Tabelle 2.1: Die Mitglieder der Matrix Metalloproteinasen und ihre Substrate. Die Tabelle spiegelt die jetzigen Kenntnisse über MMPs wieder und zeigt neben einer Auflistung der bisher bekannten MMPs (jeweils ihren Namen, ihre Nummerierung in der MMP-Reihe und die Gruppenzugehörigkeit) auch die Substrate der extrazellulären Matrix (EZM), die von den MMPs verdaut werden. Zusätzlich erfolgt hier die Einteilung der MMPs nach dem Aufbau ihrer Domänen (A-H), die in Abbildung 2.1 dargestellt werden. Folgende Abkürzungen werden verwendet: Agg, aggrecan; Ca, Casein; Gel, Gelatin; PG, proteoglycan link protein; EL, Elastin; FN, Fibronektin; LN, Laminin; VN, Vitronektin; MT, membrane type; RASI, rheumathoid arthritis synovial inflammation. (Yong, V.W. et al. 2001; Visse, R. and Nagase, H. 2003). - 10 - A B C G D E I Cp F G II H Ca Ig Signal Peptid Katalytische Domäne Vitronektin Propeptid Hemopexin Domäne Fibronektin Domäne I: Typ 1 Transmembran Domäne II: Typ 1I Transmembran Domäne G: GPI-Anker Cp: zytoplasmatische Domäne Ca: Cysteine array Region Ig: IgG ähnliche Domäne Furin cleavage site Linker Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der verschiedenen Domänen in MMPs. Dabei gibt es mehrere Möglichkeiten (A-H). Aus Tabelle 2.1 kann entnommen werden, welche MMPs diesem Aufbau entsprechen. (Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. 1999; Visse, R. and Nagase, H. 2003). Wie Tabelle 2.1 (Yong, V.W. et al. 2001; Visse, R. and Nagase, H. 2003) zeigt, können die MMPs in 6 Gruppen eingeteilt werden: die Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine, Matrilysine, die Membran-gebundenen MT-MMPs und "andere" MMPs. Dabei richtet sich ihre Einteilung nach der Substratspezifität, der Sequenzhomologie und der Organisation von Domänen. Die Substratspezifität überschneidet sich jedoch zwischen den Gruppen. MMPs können allgemein in 3 Domänen unterteilt werden: einer amino-terminalen Propeptid Region, einer amino-terminalen katalytischen Domäne, welche das katalytische Zink-Ion enthält und einer carboxy-terminalen Hemopexin Domäne. Die Zusammensetzung der einzelnen Domänen ist für jede MMP in Tabelle 2.1 aufgeführt und in Abbildung 2.1 schematisch dargestellt (Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. 1999; Visse, R. and Nagase, H. 2003). 2.1.2 Funktionen der MMPs und ihre Regulierung Die Aufgabe der MMPs besteht darin, Komponenten der exrazellulären Matrix zu verdauen (Tabelle 2.1). Da MMPs eine hohe proteolytische Aktivität aufweisen, muß diese streng kontrolliert werden. Die Gentranskription der MMPs wird durch Wachstumsfaktoren, Hormone, Zytokine und zelluläre Transformation kontrolliert. Des Weiteren stellt die Aktivierung der Pro-MMPs durch Proteasen oder durch andere aktivierte MMPs eine weitere - 11 Regulationsebene dar. Als wichtigster Kontrollpunkt der proteolytischen Aktivitäten der MMPs gilt die Regulation aktivierter MMPs durch die TIMPs (Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. 1999). Der Verdau von extrazellulärer Matrix spielt in vielen biologischen Prozessen, wie bei der Embryogenese, der Morphogenese, beim Gewebeumbau bis hin zur Wundheilung eine wichtige Rolle (Vu, T.H. and Werb, Z. 2000). Im ZNS regulieren MMPs die Migration von neuronalen Vorläuferzellen (Yong, V.W. et al. 2001). Außerdem fördern sie die Myelinogenese und regulieren bzw. erleichtern das Wachstum der Axone (Yong, V.W. et al. 2001; Oh, L.Y.S. et al. 1999). Nach einer ZNS-Schädigung unterstützen MMPs die Heilung, indem sie axonales Wachstum, Remyelinisierung und Angiogenese erleichtern (Yong, V.W. et al. 2001). Durch den Verdau von Chemokinen haben MMPs auch eine antiinflammatorische Wirkung (Yong, V.W. et al. 2001). Weiterhin spalten MMPs biologisch aktive Moleküle von der extrazellulären Matrix ab und beteiligen sich an Signaltransduktionsprozessen (Yong, V.W. et al. 2001; Visse, R. and Nagase, H. 2003). Eine Deregulierung der proteolytischen Aktivität führt zu abnormen MMP Funktionen, welche sich in pathologischen Prozessen äußern. Zum Beispiel findet sich eine gestörte MMP-Aktivität in der rheumatoiden Arthritis und in Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose und Aneurysmen (Visse, R. and Nagase, H. 2003). Außerdem erleichtern MMPs das Tumorwachstum, die -Invasion und die Metastasenbildung. So ist ein Übermaß an MMPAktivität ein Kennzeichen vieler ZNS-Tumoren (Yong, V.W. et al. 2001) und die Tatsache, Metalloproteinasen im ZNS Physiologische Aktivitäten Migration neuronaler Vorläuferzellen zum finalem Standort Myelinogenese, Axonwachstum, Angiogenese Beendigung der Inflammation Signaltransduktion Pathologische Aktivitäten Tumorgenese Schädigung der Blut-Hirn-Schranke Förderung der Inflammation Demyelinisierung Krankheiten wie MS, Guillain-Barré, Alzheimer, ZNS-Infektionen, Trauma, Schlaganfall Tabelle 2.2.: Zusammenfassung der berichteten Funktionen von MMP im ZNS - 12 dass synthetische MMP-Inhibitoren Tumorwachstum, -Invasion und Angiogenese hemmen (Price, A. et al. 1999), unterstreicht die Wichtigkeit der MMPs in diesen Prozessen. Weitere Folge einer abnormen MMP-Aktivität ist die Förderung der Inflammation. Im ZNS führt ihre Aktivität zu einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (Rosenberg, G.A. et al. 1992; Chandler, S. et al. 1997), was den Eintritt von Leukozyten in das ZNS erleichtert. Zusätzlich fördern MMPs die Aktivierung pro-inflammatorischen Zellen, was eine Aufrechterhaltung der Entzündung bewirkt (Yong, V.W. et al. 2001). Neurotoxizität und Demyelinisierung sind weitere pathologische Effekte von MMPs im ZNS. So spielen sie eine Rolle bei demyelinisierenden Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose, der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (ein Tiermodell der MS) und des Guillain-Barré Syndroms, bei der Alzheimer-Erkrankung, bei viralen Erkrankungen, bei Gehirntrauma und bei Ischämie (Kieseier, B.C. et al, 1999; Yong, V.W. et al. 2001). In Tabelle 2.2. werden die MMP Funktionen im ZNS nochmals zusammengefasst. 2.2 Die Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinasen (TIMP) 2.2.1 Struktur, Molekularbiologie Die Familie der humanen TIMPs besteht aus mindestens 4 Mitgliedern, die nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung nummeriert sind. Ihre Chromosomenlokalisationen und Größen (Gomez, D.E. et al. 1997; Olson, T.M. et al. 1998) sind in Tabelle 2.3 aufgeführt. Die Sequenzhomologie der TIMP-Proteine untereinander liegt bei ca. 40–50% (Green, J. et al. 1996). TIMP Lokalisation auf Chromosomen mRNA (kb) Protein (kDa) TIMP-1 Xp11.23 - Xp11.4 0.9 28.5, löslich TIMP-2 17q23 – 17q25 3.5, 1.0 21.0, löslich TIMP-3 22q12 – 22q13 5.0, 2.6, 2.4 21.0, unlöslich TIMP-4 3p25 1.4 23.0, löslich Tabelle 2.3: Chromosomenlokalisation und die Größe der 4 Mitglieder der humanen TIMP-Familie. Die 4 humanen TIMPs weisen folgende strukturelle Gemeinsamkeiten auf (Gomez, D.E. et al. 1997): Alle TIMPs besitzen 12 Cysteine, die miteinander 6 Disulfidbrücken bilden. Sie bestehen aus 2 Domänen: einer N-terminalen und einer C-terminalen Domäne, wobei jede dieser Domänen 3 Disulfidbrücken enthält. Zurzeit ist die Funktion der C-terminalen Domäne noch nicht geklärt. Die N-terminale Domäne faltet sich als eine separate Einheit und inhibiert - 13 die Funktionen der MMPs (Murphy, G. et al. 1991), indem sie an deren katalytisches Zentrum bindet. Als weitere Übereinstimmung gilt ein 29 Aminosäuren großes Signalpeptid, welches vermutlich während der Reifung des Proteins abgespalten wird. Abbildung 2.2 (Nagase, H. and Brew, K. 2002) zeigt schematisch die Sekundärstruktur von TIMP-1. Es besitzt β-Faltblattstrukturen (A-J) und α-Helices (1-4). TIMP-1 ist ein glykosyliertes Protein bestehend aus 184 Aminosäuren. Das N-terminale TIMP-1 Segment ist über die Disulfidbrücken Cystein1–Cystein70 und Cystein3–Cystein99 fest an die C-D- und E-F-Schleife fixiert. Bei Valin4 verläuft die Polypeptidkette in Richtung Zentrum des Moleküls, wo es die α-Helix1 passiert, bevor sie zu den β-Strängen A-F gelangt. Nach den βSträngen gelangt die Polypeptidkette über die α-Helices2 und 3 in die C-terminale Domäne. Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur von TIMP-1 (aus: Nagase, H. and Brew, K. 2002). Die ß-Stränge werden mit A-J bezeichnet, die α-Helices mit H1-H4. Das große N kennzeichnet die Nteminale, das große C die C-terminale. Abkürzungen für folgende Aminosäuren werden verwendet: C, Cystein; T, Thyrosin; V, Valin; S, Serin; L, Leuzin. Disulfidbrücken werden mit S-S gekennzeichnet und die 2 Rauten stellen Glykosylierungen am TIMP-1 Molekül dar. Diese enthält 2 parallel verlaufende β-Stränge (G, H), die α-Helix4 und 2 antiparallel verlaufende β-Stränge (I, J). Die N-terminale und die C-terminale Domäne von TIMP-1 werden durch Seitenketten- Interaktionen zusammengehalten. Insbesondere spielen hierbei die Reste von Histamin7 und Glutamin9 der N-terminalen Domäne eine Rolle, die in die Cteminalen Domäne hineinragen. Festgestellt wurde auch, dass die N-teminale Domäne relativ unbeweglich ist während in der C-terminlen Domäne die Flexibilität in Richtung C-terminales Ende zunimmt (Brew, K. et al. 1999). - 14 Abbildung 2.3 (Nagase, H. and Brew, K. 2002) zeigt ein Banddiagramm von TIMP-1, das an das katalytische Zentrum von MMP-3 gebunden ist. Sie verdeutlicht, dass hauptsächlich die N-terminale Domäne für die Inhibition von MMPs verantwortlich ist. Für die Bindung an das katalytische Zentrum spielen folgende Faktoren eine wichtige Rolle (Gomis-Rüth, F.-X. et al. 1997). Die über Disulfidbrücken verbundenen Segmente Cystein1-Valin4 und Serin68Valin69 der TIMP-1 binden an das katalytische Zink-Ion der MMP-3. Dabei ist das Cystein1 direkt über dem Zink-Ion lokalisiert. Cystein1 bildet auch Wasserstoffbrücken zu Serin68 und Glutaminsäure202 der MMP-3. Die Seitenketten von Cystein1 bis Valin4 binden an das aktive Zentrum des Enzyms in der gleichen Weise, wie ein Substratmolekül daran gebunden wird, wobei eine Spaltung von TIMP-1 ausbleibt (Brew, K. et al. 1999). Die MMPs besitzen zur rechten Seite des Zink-Ions eine spezifische Tasche, in die die Seitenkette von Tyrosin2 hineinreicht, diese jedoch nicht ausfüllt. Diese spezifische Tasche unterscheidet sich zwischen den MMPs in ihrer Größe. Zusätzlich weisen MMPs links vom zentralen Zink-Ion noch weitere Substratbindungsstellen auf, an die die Seitenketten von Serin68 und Valin69 binden. In die Interaktionen sind noch andere Regionen von TIMP-1 involviert, wie die A-B-Schleife, die E-F-Schleife (Tyrosin98 und Cystein99) und die Seitenketten von Leucin133 und Serin134 der C-terminalen Domäne. Diese Erkenntnisse sind hilfreich bei der Herstellung synthetischer und selektiver MMP-Inhibitoren. Abbildung 2.3: Banddiagramm von TIMP-1, gebunden an MMP-3 (aus: Nagase, H. and Brew, K. 2002). TIMP-1 wird in grün gezeigt, MMP-3 in hellbraun. Die ß-Stränge werden mit A-J bezeichnet, die α-Helices mit 1-4. Weiterhin werden die Cysteine, Thyrosin2 (T2), Valin4 (V4) und Serin68 (S68) in der Abbildung festgehalten: Stickstoff (N), blau; Sauerstoff (O), rot; Kohlenstoff (C), grau; und die Disulfidbrücken, gelb. Das katalytische und strukturelle Zink-Ion sind lila markiert, die Calcium-Ionen orange. - 15 - 2.2.2 Funktionen der TIMPs Die TIMPs werden von einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert und sind in den meisten Geweben und Körperflüssigkeiten enthalten (Gomez, D.E. et al. 1997). Wie die Namensgebung schon darauf hindeutet, inhibieren die TIMPs spezifisch Matrix Metalloproteinasen indem sie nicht-kovalente 1:1 Komplexe bilden (Gomis-Rüth, F.-X. et al. 1997). Jedoch bestehen zwischen den einzelnen TIMPs leichte Unterschiede in Bezug auf ihre Inhibition (Baker, A.H. et al. 2002; Visse, R. and Nagase, H. 2003). Im Allgemeinen hemmt TIMP-1 alle MMPs im unterschiedlichem Maße bis auf MMP-14, -15, -16 und -24. TIMP3 inhibiert zusätzlich ADAM-17 (TACE), ADAM-10, ADAM-12, ADAMTS-4 und ADAMTS5. Dadurch, dass die TIMPs MMPs inhibieren, spielen sie eine wichtige Rolle in vielen physiologischen Prozessen, in die MMPs involviert sind. Zu nennen sind hier die Embryogenese, die Morphogenese, der Gewebeumbau und die Wundheilung. Die TIMPs sind multifunktionelle Proteine. Neben der Inhibition von MMPs, können auch mehrere zelluläre Effekte ausgelöst werden, deren Mechanismen zum Teil noch unbekannt sind (Brew, K. et al. 1999). Im Weiteren wird nur auf die Funktionen von TIMP-1 eingegangen, die in Tabelle 2.4 zusammengefasst sind. Viele Studien zeigen, dass TIMP-1 eine paradoxe Rolle in Tumoren spielt. Es besitzt anti-neoplastische Effekte. So inhibiert TIMP-1 Tumorwachstum, Tumorinvasion und die Metastasenbildung (Alvarez, O.A. et al. 1990; DeClerck, Y.A. et al. 1992; DeClerck, Y.A. and Imren, S. 1994; Krüger, A. et al. 1998). Diese anti-neoplastischen Effekte kommen dabei durch die Inhibition der MMPs zustande. Die extrazelluläre Matrix wird dadurch stabilisiert und die Angiogenese gehemmt. Im Widerspruch stehen hierzu Berichte über pro-neoplastische Effekte. Sie besagen, dass eine erhöhte Expression von TIMP-1 mRNA mit der Malignität und der schlechten klinischen Prognose bei vielen verschiedenen humanen Tumoren korreliert, wie zum Beispiel beim non-Hodgkin Lymphom (Kossakowska, A.E. et al. 1991; Kossakowska, A.E. et al. 1993) oder beim kolorektalen Karzinom (Zeng, Z.S. et al. 1995). TIMP-1 zeigt auch gegenüber der Angiogenese ein gegensätzliches Verhalten. So wird die Angiogenese durch Hemmung der MMPs unterdrückt (Johnson, M.D. et al. 1994; Fassina, G. et al. 2000). Dadurch wird die Migration endothelialer Zellen verhindert wie auch die Freigabe von Matrix-gebundenen angiogenetischen Faktoren und die Degradation der extrazellulären Matrix. Außerdem wurde gezeigt, dass die Behandlung von mikrovaskulären endothelialen Zellen mit VEGF, einem angiogenetischen Wachstumsfaktor, eine Hochregulation von MMP-2 und gleichzeitig eine Herunterregulation von TIMP-1 und TIMP- - 16 Funktionen von TIMP-1 Inhibition aktivierter MMPs: Rolle im physiologischen oder pathologischen Gewebeumbau Rolle in der Embryogenese, in der Morphogenese und in der Wundheilung Inhibition von Tumorwachstum, Tumorinvasion und Metastasenbildung Assoziation mit fortgeschrittenen Tumorstadien und der Malignität von Tumoren Hemmung der Angiogenese Aktivierung der Angiogenese Wachstumsfaktor- und EPA-Aktivität Stimulation der Steroidbildung in den Gonaden Hemmung der Apoptose Tabelle 2.4: Zusammenfassung der berichteten Funktionen von TIMP-1. 2 bewirkt (Lamoreaux, W.J. et al. 1998). Auf der anderen Seite ist aber auch über eine Aktivierung der Angiogenese berichtet worden (Thorgeirsson, U.P. et al. 1996; Yamada, E. et al. 2001; Lafleur, M.A. et al. 2003). TIMP-1 ist dem EPA, einem erythrozytären Wachstumsfaktor, identisch (Gasson, J.C. et al. 1985). Für die MMP-Inhibition und die EPA-Aktivität sind jedoch verschiedene Domänen im TIMP-1 Molekül verantwortlich (Chesler, L. et al. 1995). EPA stimuliert das Wachstum früher erythrozytärer Vorläuferzellen (Golde, D.W. et al. 1980). TIMP-1 fördert auch in verschiedenen Zellkulturlinien das Zellwachstum und induziert in einer Vielzahl von Zelltypen die Proliferation (Hayakawa, T. et al. 1992). TIMP-1 spielt auch in der Steroidbildung in den Gonaden eine Rolle (Boujrad, N. et al. 1995). Die Steroidbildung wird durch die Gonadotropine FSH und LH reguliert. An der Regulierung beteiligt sich aber auch ein lokal produzierter Faktor, der die Sterodbildung in den Leydig´schen Zellen und in den Granulosazellen des Ovars stimuliert. Dieser Faktor ist als ein Komplex zwischen Pro-Cathepsin L und TIMP-1 identifiziert worden. Des Weiteren zeigt TIMP-1 anti-apoptotische Effekte in vielen Zelllinien wie zum Beispiel in den humanen Epithelzellen der Brust (Gangyong, L. et al. 1999), oder in B-Lymphozyten (Guedez, L. et al. 1998). Die anti-apoptotische Wirkung wird MMP-unabhängig und somit als direkter Effekt von TIMP-1 (Guedez, L. et al. 1998) beschrieben. Hieraus könnte die paradoxe Wirkung von TIMP-1 auf Tumoren erklärt werden (Li, G. et al. 1999): durch MMPInhibition reduziert TIMP-1 die Tumorinvasion, während die MMP-unabhängige Hemmung der Apoptose ein Fortschreiten des Tumors bewirkt. Diese Annahme steht jedoch in einer Diskrepanz zu einer Veröffentlichung von Porter, J.F. et al. 2004, die zeigen konnten, dass die proliferative Wirkung von TIMP-1 von der Inhibition der Metalloproteinasen abhängig ist. - 17 - 2.3 TIMP/ MMP Expressionsmodell im zentralem Nervensystem und ihre Bedeutung Im Gehirn konnten mehrere MMPs nachgewiesen werden, unter anderem MMP-2, -3, -7, -9 und -24. Allerdings unterscheidet sich die EZM im Gehirn in der Zusammensetzung im Vergleich zu anderen Organen. Sie enthält nicht die klassischen MMP Substrate. Die Adhäsion zwischen Gehirnzellen wird zum Beispiel nicht durch Kollagen vermittelt, sondern durch Dystrophin-verwandte Komplexe (Sugita, S. et al. 2001). Im Gehirn gelten Integrine, Neurotrophine und Dystroglykane als Substrate der MMPs. Diese Substrate spielen eine wichtige Rolle in der neuronalen Entwicklung und Plastizität (Kaczmarek, L. et al. 2002) und haben somit zum Beispiel Einfluss auf die Morphologie, die Reorganisation von Synapsen, auf das Gedächtnis, auf Lernvorgänge (Rohrbough, J. et al. 2000; Chun, D. et al. 2001) und auf das Überleben von Neuronen (Lee, R. et al. 2001). Mittels anderer EZM Substrate wie die Tenascine und Laminin können MMPs auch die Migration von Granularzellen im Kleinhirn regulieren (Liesi, P. et al. 1995; Bartsch, S. et al.1992). Auch die Migration, Proliferation und Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen stehen unter dem Einfluss der MMPs (Amberger, V.R. et al. 1997; Froelichsthal-Schoeller, P. et al. 1999; Blaess, S. et al. 2004) und sie spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung des axonalen Wachstums (Oh, L.Y.S. et al. 1999; Yong, V.W. et al. 2001). Im adulten Gehirn kann eine hohe konstitutive Expression von TIMP-2, -3, und -4 nachgewiesen werden (Leco, K.J. et al. 1997, Pagenstecher, A. et al. 1997). TIMP-4 mRNA wird dabei reichlich im Kleinhirn exprimiert. TIMP-3 mRNA ist vor allem im Choroid Plexus zu finden und TIMP-2 mRNA im gesamten Gehirn, jedoch mit einer niedrigeren Expression im Kleinhirn (Kaczmarek, L. et al. 2002). Im Gegensatz dazu steht das TIMP-1 Gen, welches streng reguliert wird und konstitutiv meist nicht nachweisbar ist (Pagenstecher, A. et al. 1997). Die Untersuchung am Kleinhirn der Ratte brachte auch Erkenntnisse über das zelluläre und zeitliche Auftreten von MMP-2, -3 und -9 und TIMP-1, -2 und -3 (Vaillant, C. et al.1999). Während der postnatalen Kleinhirnentwicklung exprimierten die Purkinjezellen TIMP-1, -2 und -3. Die Dendriten exprimierten postnatal nur MMP-3 und TIMP-3. Ungeachtet des Entwicklungsstandes enthielten die Fortsätze der Bergmannglia nur MMP-9, ihr Zellkörper jedoch TIMP-1 und MMP-9. In den Körnerzellen konnten MMP-3 und -9 und TIMP-2 und -3 hauptsächlich zu der Zeit nachgewiesen werden, in der sich die Zellmigration maximal ereignet. Am 10. Tag postnatal war die MMP-9 Aktivität maximal, aber anschließend nur noch auf einem geringen Niveau nachweisbar. Im Gegensatz dazu blieb die Aktivität von MMP-2 durchgehend gleich. All diese Beobachtungen unterstreichen die - 18 Signifikanz der MMPs mit ihren Inhibitoren in der neuronalen Entwicklung und in verschiedenen neuronalen Funktionen. 2.4 Zielsetzungen der Arbeit Das Ziel dieser Arbeit war, anhand eines transgenen Tiermodells die Auswirkungen einer konstitutiven Expression von TIMP-1 im ZNS zu untersuchen. Die Untersuchung sollte zum einen unter physiologischen und zum anderen unter pathologischen Bedingungen erfolgen. Wir erhofften uns somit neue Erkenntnisse über die direkte Wirkung von TIMP-1 im ZNS zu erlangen. Weiterhin konnte auch durch TIMP-1 Inhibition indirekt die Rolle der MMPs im ZNS erfasst werden. Folgende Fragen sollten geklärt werden: 1. a) Führt eine konstitutive TIMP-1 Expression im Kleinhirn zu einer Störung der Entwicklung des Kleinhirns aufgrund einer Hemmung der wahrscheinlich MMPvermittelten Zellmigration? b) Gibt es durch eine hippocampale TIMP-1 Expression eine Störungen in der Entwicklung des Hippocampus, die sich auf das Lernverhalten auswirkt? c) Können im ZNS verschiedener TIMP-1 transgenen Mauslinien histologische Auffälligkeiten nachgewiesen und diese erklärt werden? Welchen Einfluß hat eine TIMP1-Expression im Rückenmark auf das Modell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)? Besteht im Vergleich zum Wildtyp ein Unterschied in der Erkrankungsrate und in der Schwere der Symptomatik? - 19 - 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterialien Puffersubstanzen, Lösungsmittel und andere gängige Laborchemikalien wurden von den Firmen Merck (Darmstadt), Baker (Deventer, Holland), Fluka (Neu-Ulm), Roth (Karlsruhe) und Sigma (Deisenhofen) bezogen. Die Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und Pipetten wurden von den Firmen Gilson (Villiers-le-Bel, Frankreich) und Greiner (Frickenhausen) erworben. Objektträger, Deckgläser, Eindeckmedium (Vitroclud) und Eindeckbettmedium (Tissue-tek) stammten von der Firma Langenbrinck (Emmendingen). 3.2 Allgemeine Puffer, Lösungen (Die Lösungen, deren Zusammensetzung im unmittelbaren Anschluss an die jeweilige Methode aufgeführt ist, sind im Text kursiv gedruckt.) 4 % Formalin 37-40 % Formaldehyd (Riedel-de-Haën, Seelze) in PBS PBS-Puffer 154 mM NaCl 8.32 mM Na2HPO4 2.28 mM KH2PO4 TE-Puffer pH 8.0 10 mM Tris-HCl pH 8.0 1 mM EDTA pH 8.0 Proteinase K (Stocklösung) 10 mg/ml Proteinase K (Peqlab, Erlangen) in 10 mM Tris-HCl pH 8.0 Verdünnungslösung für primäre Antikörper 10 mg/ml BSA 0,02 % NaN3 in PBS - 20 - 3.3 Antikörper Primäre Antikörper Antikörper Hersteller Herkunft IHC Verdünnung P, K V Calbindin Swant, Bellinzona, Schweiz Maus, mono P, V 1:1000 1:2000 Caspase3 R&DSystems, Minneapolis, MN, USA Kaninchen, poly K 1:500 ― CD4 Pharmingen, San Diego, CA, USA Ratte, mono K 1:2000 ― CD8a Pharmingen, San Diego, CA, USA Ratte, mono K 1:500 ― CD31 Pharmingen, San Diego, CA, USA Ratte, mono K 1:500 ― CD45 Pharmingen, San Diego, CA, USA Ratte, mono K 1:2000 ― GFAP Dako, Glostrup, Dänemark Kaninchen, poly P, K 1:1000 ― Ki67 Dianova, Hamburg Kaninchen, poly P٭ 1:50 1:2000 Mac1 MPI Freiburg, Thomas Stehle Ratte, mono K 1:500 ― MAP1a Sigma, Saint Louis, MO, USA Maus, mono P ― 1:10 MAP2ab Sigma, Saint Louis, MO, USA Maus, mono P, V 1:400 1:400 Neurofilament Sigma, Saint Louis, MO, USA Maus, mono P, V 1:20 1:1000 Synaptophysin Boehringer, Mannheim Maus, mono P 1:100 ― Synaptoporin Synaptic Systems, Göttingen Kaninchen, poly P 1:400 ― Tabelle 3.1: In den Experimenten verwendete Primärantikörper. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: P; Paraffinschnitt, K; Kryostatschnitt, V; Vibratomschnitt, ;٭mit Vorbehandlung, mono; monoklonal, poly; polyklonal Sekundäre Antikörper Antikörper Hersteller Verdünnung Vectastain-ABC-Kit: HAM, GAR, RAR Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA IgG (H+L) Ziege anti Ratte absorbiert gegen Maus-Ig Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA 1:200 Alexa fluor 488 Ziege anti Maus IgG (H+L) Molecular Probes, Leiden, Niederlande 1:500 Alexa 488 cross ad Ziege anti Kaninchen IgG (H+L) Molecular Probes, Leiden, Niederlande 1:500 Tabelle 3.2.: In den Experimenten verwendete Sekundärantikörper. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: HAM; Pferd anti Maus, GAR; Ziege anti Kaninchen, RAR; Kaninchen anti Ratte - 21 - 3.4 Morphologische und funktionelle Untersuchungen 3.4.1 Rückenmark- und Gehirnentnahme, Weiterverarbeitung Zur Entnahme des Gehirns wurde einer in Forene (Abbott GmbH&Co, Wiesbaden) betäubten Maus der Kopf abgetrennt. Die Öffnung der Schädelkalotte wurde ausgehend vom Foramen magnum mit einer kleinen Schere lateral an beiden Seiten durchgeführt. Das freigelegte Gehirn wurde vorsichtig von der Schädelbasis gelöst und anschließend mit einem Skalpell in Längsrichtung halbiert. Zur Entnahme des Rückenmarkes wurde die Wirbelsäule mit einer großen Schere oberhalb der Beckenschaufeln durchtrennt. Das Rückenmark konnte daraufhin mit einer PBS gefüllten Spritze hinausgespült werden. Für die RNA- oder Protein-Extraktion wurden eine Großhirn- und Kleinhirnhälfte sowie das Rückenmark in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -70°C aufbewahrt. Für die Kryostatschnitte wurden eine Gehirnhälfte und 2-3 Rückenmarkfragmente auf einer Korkplatte in Tissue Tec (Sakura Finetek, Niederlande) eingebettet. Anschließend wurden die Präparate mit in flüssigem Stickstoff gekühltem 2-Methylbutan (Merck, Darmstadt) schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt. Für die Paraffinschnitte wurde eine Hemisphäre und 2-3 Rückenmarkfragmente in 4 % Formalin fixiert und bei 4°C gelagert. Das in Formalin fixierte Gewebe wurde in einem Einbettautomaten für 15 h entwässert, mit Paraffin durchtränkt und in Paraffinblöcke gegossen. Kryostatschnitte Schockgefrorenes Gewebe wurde ca. 30-45 min im Kryostaten auf eine Temperatur von -18°C äquilibriert. Anschließend wurden 12 µm dicke Schnitte hergestellt und auf beschichtete Superfrost Plus-Objektträger aufgezogen. Nach einer Trockenzeit von 30 min bei RT wurden die Schnitte für 45 sec in Methanol/Aceton (1:1) bei -20°C fixiert. Nach Blockierung der endogenen Peroxidase für 18 min mit 0.3 % H2O2 in PBS wurden die Schnitte zur weiteren Verarbeitung in PBS gewaschen. Paraffinschnitte Aus Paraffinblöcken wurden 2-4 µm (für IHC) oder 8 µm (für rISH) dicke Schnitte an einem Mikrotom (Leica, Bensheim) hergestellt. Diese wurden auf beschichtete Superfrost Plus-Objektträger aufgezogen und für 15 min bei 80°C getrocknet. Die Schnitte wurden dann - 22 für 2 × 15 min in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert (je 2 × 5 min 100 %, 97 %, 70 % Ethanol). Die endogene Peroxidase wurde für 18 min in 0.3 % H2O2 in PBS blockiert. Anschließend wurden die Schnitte zur weiteren Verarbeitung in PBS gewaschen. Vibratomschnitte Hierzu wurde die folgende Tierpräparation durchgeführt: Einer Maus wurde intraperitoneal 100 µl eines Rompun-Ketamin-Narkosegemisches injiziert. Nachdem eine tiefe Narkose erreicht war, wurde die Maus mit Nadeln an eine Korkunterlage fixiert, der Bauchund Thoraxraum eröffnet und das Herz freigelegt. Die linke Herzkammer wurde mit einer Kanüle punktiert und PBS infundiert, bis aus dem eröffneten rechten Vorhof weitgehend klare Lösung austrat. Es folgte für 10 min eine Perfusionsfixierung mit 4 % Formalin. Der Kopf wurde abgetrennt, das Gehirn entnommen und für 3-24 h in 4 % Formalin nachfixiert. Anschließend wurde das Gehirn sagittal geteilt und in 4 % Agarose in PBS und 0.1 % NaN3 eingebettet. Am Vibratom wurden 60 µm dicke Schnitte angefertigt und in 0.1 % NaN3 bei 4°C gelagert. Rompun-Ketamin-Narkose 2 ml 10 % Ketamin 0.5 ml Rompun 1.5 ml 0.9 % NaCl 3.4.2 Histochemie Hämatoxylin-Eosinfärbung (HE-Färbung) Schnitte wurden 3-5 min in Hämatoxylin gefärbt, 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut und kurz mit 0.1 % NH3 inkubiert. Anschließend wurde 5 min in Eosin gegengefärbt. In einer aufsteigenden Alkohol/Xylolreihe (2 × 2 min 70 %, 95 %, 100 % Ethanol, 2 × 5 min Xylol) wurden die Schnitte entwässert und in Kunstharz (Eukitt) eingedeckelt. Bei dieser Färbung erscheinen die Kerne blauviolett, alle übrigen Strukturen in verschiedenen Farbabstufungen rot. Hämatoxylin-Färbelösung 2 mg/ml Hämatoxylin 0.2 mg/ml NaJO3 - 23 50 mg/ml KAl(SO4)2 50 mg/ml C2H3Cl3O2 1 mg/ml C6H8O7 Eosin-Färbelösung 1 g Eosin in 100 ml 70 % Ethanol 1 Tropfen 100 % CH3COOH Klüver-Barrera-Färbung Schnitte wurden entparaffiniert, rehydriert und über Nacht bei 57°C in einer verschlossenen Küvette mit Luxolechtblau inkubiert. Am nächsten Tag wurde mit 70 % Ethanol und dd H2O gespült, bevor für 3-5 sec in 0.05 % Lithiumcarbonatlösung und 70 % Alkohol differenziert wurde. Anschließend wurde erneut mit dd H2O gespült und für 2 min in Kresylechtviolett gegengefärbt. In 70 % Alkohol wurde wieder gespült und durch hinzuführen einiger Tropfen 1 % CH3COOH differenziert. Es folgte die aufsteigende Alkohol/Xylolreihe (s.o.) und das Eindeckeln (s.o.). Bei dieser Färbung werden Markscheiden türkisblau und Nerven violett dargestellt. Luxolechtblau 1 g Luxolblau (Division Chroma, Münster) 1000 ml 100 % Ethanol 0.5 ml 100 % CH3COOH Kesylechtviolett 10 g Kresylechtviolett (Division Chroma, Münster) 1000 ml dd H2O 10 Tropfen 100 % CH3COOH Alizarinrot-Färbung Entparaffinierte Schnitte wurden nach einem Wasserbad für 15 min bei 50°C in Färbelösung pH 9.0 inkubiert und kurz mit Tris-HCl pH 9.0 gespült. Es folgte die Inkubation mit einer weiteren Färbelösung pH 7.0 für 3 min bei 50°C und die Spülung in PBS pH 7.0. In einer aufsteigenden Alkohol/Xylolreihe (s.o.) wurden die Schnitte entwässert und eingedeckelt (s.o.). Durch diese Färbung werden Kalkeinlagerungen rot dargestellt. - 24 Alizarinrot-Färbelösung pH 7.0 0.5 % Alizarinrot S (Sigma, Deisenhofen) bei 50°C in PBS pH 7.0 Alizarinrot-Färbelösung pH 9.0 0.5 % Alizarinrot S bei 50°C in 10 mM Tris-HCl pH 9.0 TIBOR-PAP-Färbung Zur Darstellung von Retikulinfasern (schwarz gefärbt) wurden entparaffinierte Schnitte für 5-8 min mit 0.25 % KMnO4 und anschließend für 8-10 min mit 5 % C2H2O4 inkubiert. Die Schnitte wurden für 5 min unter fließendes Wasser gestellt und 1 min mit 2 % NH4Fe(SO4)2 inkubiert. Nach Wiederholung der Wässerung erfolgte jeweils für 10 min eine Inkubation in der Silberlösung, der Reduktionslösung (4 % Formaldehyd) und in der Goldchloridlösung. Daraufhin wurden die Schnitte für 1 min in 1-3 % K2S2O3 gestellt und für 3 min in 5 % Na2O3S2 fixiert. Nach einer 10 min Wässerung wurde mit Kernechtrot für 5-10 min eine Kernfärbung durchgeführt. In der aufsteigenden Alkohol/Xylol-Reihe (s.o.) wurden die Schnitte entwässert und eingedeckelt. Silberlösung 10 ml 5 % AgNO3 11 Tropfen 40 % NaOH mehrere Tropfen 25 % NH3 (bis sich Niederschlag löst) ad 100 ml H2O Goldchloridlösung 20 ml 1 % HAuCl4 in 80 ml H2O Kernechtrot 1 g Kernechtrot (Division Chroma, Münster) in 100 ml 5 % Kaliumaluminiumsulfat heiß lösen Nach Erkalten filtrieren - 25 - 3.4.3 Immunhistochemie Immunhistochemie an Paraffin- und Kryostatschnitten Mit dieser Methode konnte in Gewebeschnitten mit Hilfe von 2 Antikörpern spezifische Proteine sichtbar gemacht werden. Hierbei wurde hauptsächlich mit dem Vectastain-ABC-Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) gearbeitet, das eine Blockierungslösung, einen biotinylierten sekundären Antikörper und einen StreptavidinPeroxidase-Komplex enthält. Je nachdem, aus welchem Tier der primäre Antikörper stammte, wurde entsprechend der HAM-Kit (Pferd anti Maus) oder der GAR-Kit (Ziege anti Kaninchen) verwendet. Nach der Vorbehandlung (siehe 3.4.1) wurden die Schnitte zuerst für 30 min in Normalserum blockiert, um spätere unspezifische Bindungen zu vermeiden. Danach wurde das Normalserum entfernt, der entsprechend verdünnte primäre Antikörper (siehe Tabelle 3.1) aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte 3 × 5 min in PBS gewaschen und der biotinylierte sekundäre Antikörper für 1 h aufgetragen. Nach Waschen in PBS (3 × 5 min) wurden die Schnitte für 1 h mit einem Streptavidin-PeroxidaseKomplex inkubiert. Die Schnitte wurden wieder in PBS gewaschen bevor die DABFärbelösung (Merck, Darmstadt) unter Zusatz von H2O2 aufgetragen wurde. Die DABFärbelösung wurde durch die gebundene Peroxidase am Ort des entsprechenden Antigens in einen unlöslichen Farbstoff umgewandelt. Die Farbreaktion wurde in PBS gestoppt, die Schnitte kurz in destilliertes Wasser gestellt, für 10 sec in Hämatoxylin gegengefärbt und anschließend 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut. In einer aufsteigenden Alkohol/Xylolreihe (siehe 3.4.2) erfolgte die Entwässerung und schließlich das Eindeckeln in Kunstharz (Eukitt). Immunhistochemie an Vibratomschnitten Die Vibratomschnitte wurden für 3 × 5 min in PBS gespült. Nach einer Vorbehandlung mit 0.3 % H2O2 für 20 min und nochmaligem Spülen wurden die Schnitte für mindestens 4 h mit einer steril filtrierten Blockierungslösung inkubiert. Anschließend folgte das Auftragen des entsprechend verdünnten primären Antikörper (siehe Tabelle 3.1) für mindestens 48 h bei 4°C. Die Schnitte wurden dann für 3 × 3 h in PBS/0.1 % TritonX-100 gespült und über Nacht mit einem entsprechend verdünnten sekundären Antikörper (siehe Tabelle 3.2) inkubiert. Nach Waschen für je 3× 2 h in PBS/0.1 %TritonX-100 wurde die ABC-Lösung aufgetragen. Am nächsten Tag wurde 5 × in PBS gespült und mit einer DABFärbelösung entwickelt. Nach der Entfärbung mit PBS wurden die Vibratomschnitte auf - 26 Objektträger aufgezogen und über Nacht getrocknet. Am nächsten Tag wurden sie dehydriert (siehe 3.4.2) und eingedeckelt (s.o.). Bei fluoreszierenden sekundären Antikörpern entfielen die Schritte mit der ABC- und DABLösung. Die Schnitte wurden nach mehreren Waschvorgängen in PBS direkt auf Objektträger aufgezogen und mit Elvanol eingedeckelt. Blockierungslösung 940 µl 0,1 % TritonX-100 (Fluka, Neu-Ulm) 50 µl NHS (normales Pferdeserum) ad 1 ml PBS Verdünnungslösung für primäre Antikörper 985 µl 0,1 % TritonX-100 5 µl NHS 5 mg BSA (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania) 1 µl 1 % NaN3 ad 1 ml PBS Verdünnungslösung für sekundäre Antikörper 988 µl 0,1 % TritonX-100 7.5 µl NHS 7.5 mg BSA 5 µl α-mouse oder α-rabbit ad 1 ml PBS ABC-Lösung 960 µl 0.05 % TritonX-100 20 µl Reagent A (Vectastain-Kit) 20 µl Reagent B (Vectastain-Kit) ad 1 ml PBS Elvanol 1.92 g DTT 1 g Polyvinylalkohol 12 ml 0.5 M Tris-HCl pH 8.2 bei 70°C lösen, abkühlen lassen und in 10 ml Glyzerin aufnehmen - 27 - 3.4.4 In Situ Cell Death Reaktion (TUNEL) Zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Fragmente wie auch von Einzelstrangbrüchen, wurden modifizierte Nukleotide in einer enzymatischen Reaktion (TUNEL-Reaktion) an freie 3`-OH-Enden gebunden. Für diesen Versuch wurden die Lösungen der Firma Roche, Penzberg verwendet. Die hierzu verwendeten Kryostatschnitte wurden für 5 min in Methanol/Aceton (1:1) fixiert, 20 min in PBS gewaschen und 10 min mit 3 % H2O2 in Methanol nochmals fixiert und die endogene Peroxidase blockiert. Anschließend erfolgte auf Eis eine Inkubation für 2 min mit der Permeabilisationslösung (0.1 % TritonX-100 in 0.1 % C6H5Na3O7). Für 1 h wurde bei 37°C ein TUNEL Reaktionsgemisch hinzugefügt. Nach diesem Schritt konnte unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden. Durch Hinzufügen einer Lösung mit einem Peroxidase gekoppeltem Antikörper gegen das Fluoreszin und der Substratlösung wurde die Reaktion mit Hilfe der DAB-Färbelösung sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden kurz gegengefärbt, gebläut und eingedeckelt. Unter einem Lichtmikroskop erfolgte anschließend in einem Gesichtsfeld die Auszählung. 3.4.5 Evan’s Blue Um eine Störung der Blut-Hirn-Schranke nachzuweisen, wurden Mäusen jeweils 100 µl 2 % Evan’s Blue (Sigma, Deisenhofen) in 0.9 % NaCl intravenös injiziert. Nach 20 h wurden die Tiere mit 100 ml 4°C kalten PBS perfundiert und das Gehirn wurde zur Herstellung von Kryostatschnitten entnommen. Die Schnitte wurden für 20 min in 100 % Ethanol fixiert. Evan’s Blue ist im Fluoreszenzmikroskop durch eine Eigenfluoreszenz nachweisbar. Das Vorhandensein dieser Substanz im ZNS zeigt eine Störung der Blut-HirnSchranke an. 3.5 Methoden zur Arbeit mit RNA 3.5.1 Extraktion und Quantifizierung von Gesamt-RNA Gewebestücke (Großhirn, Kleinhirn, Rückenmark) wurden in Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit Hilfe eines Homogenisators (Turrax, IKA Labortechnik Staufen) homogenisiert. Das Homogenisat wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß umgefüllt, 2 min bei RT inkubiert und nach Zugabe von 0.2 ml Chloroform pro ml Trizol kräftig geschüttelt. Nach einer Inkubation von 3 min bei RT wurden die Proben für 15 min bei 4°C mit 11900 g zentrifugiert. Die wässrig-klare Oberphase wurde in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die darin enthaltene RNA wurde in 0.5 ml Isopropanol pro ml Trizol präzipitiert - 28 und bei 4°C mit 11900 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 1 ml 75 % Ethanol pro 1 ml Trizol gewaschen und 10 min bei 7500 g und 4°C zentrifugiert. Nach Entfernen des Ethanols wurde das Pellet in der Speedvac für 5 min getrocknet, in TE pH 7.4 (100 µl für Vorderhirn, 40 µl für Kleinhirn und Rückenmark) gelöst und bei -80°C gelagert. Für die Bestimmung der RNA-Konzentration wurde die gelöste RNA 1:100 in H2O verdünnt und die Absorption im Photo-Spektrophotometer (Pharmacia, Uppsala, Schweden) bestimmt. 3.5.2 Radioaktive und nichtradioaktive In Situ Hybridisierung (ISH) Die Radioaktive und nichtradioaktive ISH wurde zum Nachweis der Expression von mRNA in Gewebeschnitten eingesetzt. Dazu wurden DIG- oder radioaktiv-markierte RNASonden verwendet. Paraffinschnitte wurden mit Xylol deparaffiniert, in absteigender Alkoholreihe rehydriert und in 4% Formalin fixiert. Proteinase K (24 µg/ml) in 5 × TE Puffer wurde für 15 min bei 37°C zugegeben, um die Permeabilität der Probe zu verbessern. Eine 10 minütige Acetylierung (250 µl Essigsäureanhydrid in 100 ml PBS) diente der Minimierung unspezifischer Bindungen an positiv geladene Aminogruppen. Nach wiederholter Fixierung in 4 % Formalin wurden die Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert und an der Luft getrocknet. Für die Hybridisierung wurde eine antisense Sonde für TIMP-1 verwendet, die im Labor selbst hergestellt worden war (Pagenstecher, A. et al. 1998). Radioaktive ISH Die radioaktive ISH wurde, wie bei Rauer, M. et al. 2002 beschrieben, mit folgenden Modifikationen durchgeführt. Die Herstellung der radioaktiv markierten Sonde erfolgte in Anwesenheit von 250 µCi [33P]UTP, 0.62 µl GTP,CTP,ATP (jeweils 2.5 mM), 1.25 µl 5 × Transkriptions-Puffer (Promega, Madison, WI, USA), 0.33 µl RNAse Inhibitor (40 U/µl) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), 0.33 µl T7 Polymerase (20 U/µl) (Promega, Madison, WI, USA) für die Synthese der Antisense-Sonde oder sp6 Polymerase (20 U/µl) (Promega, Madison, WI, USA) für die Synthese der Sense-Sonde, 0.5 µg lineare DNA Matrize, ad 6.26 µl H2O. Die Reaktion wurde für 90 min bei 37°C inkubiert und anschließend für 30 min bei 37°C durch 0.33 µl DNAse 1 (1 U/µl) (Promega, Madison, WI, USA) verdaut. Nach der Phenol/Chloroform Extraktion und der Ethanolpräzipitation (siehe 3.5.2) wurde das getrocknete Pellet in 63 µl TE und 1 µl RNAse Inhibitor resuspendiert und die Aktivität im Szintilationszähler (Canberra-Packard, Dreieich) gemessen. Solution A und Solution B wurden in einem Verhältnis von 5:1 gemischt und die Schnitte mit dieser Lösung inkubiert. Die radioaktiv-markierten Sonden wurden über Nacht bei 56°C hybridisiert. Die Schnitte - 29 wurden anschließend für 4 × 5 min in 4 × SSC gewaschen. Nach dem Verdau mit 20 µg/ml RNAse A (Promega, Madison, WI, USA) in RNAse Puffer für 35 min bei 37°C wurden die Schnitte in absteigender Konzentration mit SSC (2 ×, 1 ×, 0.5 × und 60°C warmes 0.1 × SSC) gewaschen. Ein Cronex film (Du Pont, Wilmington, USA) wurde für 5 Tage durch die getrockneten Schnitte belichtet und dann entwickelt, um einen Anhaltspunkt zu gewinnen, wie lange die Emulsion (s.u.) exponiert werden muss. Die Schnitte wurden dann in eine Kodak NTB-2 Emulsion gedippt, getrocknet und bei 4°C für 3-4 Wochen im Dunkeln gelagert. Anschließend wurden die Schnitte entwickelt, für 25 sec in Hämatoxylin gefärbt und mit Hilfe des Dunkelfeldmikroskops untersucht. Nichtradioaktive ISH Die DIG-markierte RNA-Sonde wurde im folgendem Transkriptionsansatz hergestellt: 1 µg lineare DNA Matrize, 2 µl 10 × NTP-Markierungsmix (Boehringer Kit), 4 µl 5 × Transkriptions-Puffer, 1 µl RNAse Inhibitor (40 U/µl), 2 µl T7 Polymerase (20 U/µl) (Promega, Madison, WI, USA) oder sp6 Polymerase (20 U/µl) (Promega, Madison, WI, USA) ad 20 µl H2O. Die Inkubation erfolgte für 2 h bei 37°C. Anschließend wurde unter Zugabe von 2 µl 4 M LiCl und 80 µl 100 % Ethanol für 1 h bei -70°C oder Trockeneis gefällt. Das Präzipitat wurde mit 80 % Ethanol gewaschen und in 100 µl TE resuspendiert. Zur Bestimmung der Konzentration wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt. Solution A und Solution B wurden in einem Verhältnis von 5:1 gemischt und die Schnitte mit dieser Lösung inkubiert. Die Hybridisierung der DIG-markierten Sonden vollzog sich über Nacht bei 56°C. Die Schnitte wurden anschließend für 4 × 5 min in 4 × SSC gewaschen, um freie RNASonden zu entfernen. Nach dem Verdau mit 20 µg/ml RNAse A (Promega, Madison, WI, USA) in RNAse Puffer für 35 min bei 37°C wurden die Schnitte in absteigender Konzentration mit SSC (2 ×, 1 ×, 0.5 × und 60°C warmes 0.1 × SSC) gewaschen. Nach Äquilibrierung der Schnitte in Puffer 1 (5 min) wurden die Schnitte in Puffer 2 blockiert (1 h) und mit anti DIG-AP-Konjugat (1:4000 in Puffer 2) in einer feuchter Kammer für 1.5 h inkubiert. Die überschüssigen Antikörper wurden durch 2 × 30 min Waschen in Puffer 1 entfernt und nach Äquilibrierung der Schnitte in Puffer3 (5 min) erfolgte die Nachweisreaktion mit der NBT/BCIP-Lösung. Die mit Farbreagenz überschichteten Schnitte wurden im Dunkeln bei RT bis zu 3 Tage inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch Waschen der Schnitte in Puffer 4 und nachfolgendem Waschen in Leitungswasser gestoppt. Anschließend wurde ein Teil der Gewebeschnitte in Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt) eingedeckelt, der andere Teil für die anschließende Immunhistochemie verwendet. - 30 Solution A 25 ml deionisiertes Formamid (Fluka, Neu-Ulm) 10 ml 50 % Dextran Sulfate (Pharmacia, Uppsala, Schweden) 4 ml 20 × SSC 1 ml 50 × Denhardt`s Solution 1 ml 0.5 M EDTA Denhard`s Solution 1 g Ficoll (Amersham, Piscutaway, NY, USA) 1 g Polyvinylpyrrolidon 1 g BSA ad 100 ml DEPC-H2O Solution B 100 µl 10 mg/ml tRNA 10 µl 1 M DTT 35 µl 20 × SSC 150-200 ng DIG- oder radioaktiv-markierte Sonde ad 200 µl H2O RNAse Puffer 444 ml H2O 50 ml 5 M NaCl 5 ml 1 M Tris 1 ml 0.5 M EDTA Puffer 1 0.1 M Maleinsäure 0.15 M NaCl pH 7.5 einstellen mit konzentrierte NaOH, autoklavieren Puffer 2 1 g DIG Nucleid Acid Detection Kit ad 10 ml Puffer 1 - 31 Puffer 3 0.1 M Tris-HCl 0.1 M NaCl 50 mM MgCl2 pH 9.5 einstellen Puffer 4 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8.0 einstellen Färbelösung 66 µl NBT 33 µl BCIP ad 10 ml Puffer 3 3.5.3 RNase Protection Assay (RPA) RNase Protection Assays wurden zur quantitativen Bestimmung der RNA-Expression verschiedener Gene quantitativ eingesetzt. Dazu wurde ein Überschuss an radioaktiv markierter Einzelstrang-RNA zur Bildung stabiler doppelsträngiger RNA-RNA-Hybride als Antisense-Sonde verwendet. Nicht hybridisierte Einzelstrang-RNA wurde durch spezifische RNasen verdaut. RNA-RNA-Hybride hingegen waren vor diesem Verdau geschützt (Rnase protection), wurden anschließend denaturiert und in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Durch Autoradiographie wurde die protektierte radioaktive RNA sichtbar gemacht. Die Sonden, mit denen gearbeitet wurde, wurden zum Teil im Labor selbst hergestellt (TIMP1 (Pagenstecher, A. et al. 1997) und zum Teil von anderen Labors etabliert (ML11, ML26 (Hobbs, M.V. et al. 1993)). Herstellung der radioaktiv markierten Sonden Folgende Sonden wurden verwendet: - 32 TIMP-1 Sonde Länge[bp] ML11 ML26 Sonden Länge[bp] Sonden Länge[bp] Timp-1 249 TNF-ß 323 IL-3 345 RPL32 78 TNF-α 303 IL-10 319 IL-4 279 GM-CSF 292 IL-5 252 TGF b1 265 IL-1α 229 IL-13 199 IFN-γ 206 IL12p40 173 IL-2 184 IL12p35 162 IL-6 158 IL-7 110 IL-1ß 142 RPL32 78 IL-3 129 RPL32 78 Tabelle 3.3: Sondensätze für die RPA In ein Reaktionsgefäß wurde 7.3 µl 10 µM UTP, 1.1 µl GTP, CTP, ATP (jeweils 2.5 mM) und 12 µl [32P]UTP (3000 Ci/mmol; 10 mCi/ml) pipettiert. Dieses Gemisch wurde für 45 min in der Speedvac getrocknet. Zur Synthese der radioaktiv markierten Antisense RNA-Sonde wurden anschließend folgende Substanzen hinzugefügt: Produkt [µl] Endkonzentration Hersteller dd H2O 5.0 Transkriptions-Puffer (5 ×): 2.0 1× Promega, Madison, WI, USA DTT (100 mM) 1.0 10 mM Promega, Madison, WI, USA RNase-Inhibitor (40 U/ml) 0.5 2 U/µl Pharmacia, Uppsala, Schweden T7 RNA-Polymerase (20 U/µl) 0.5 1 U/µl Promega, Madison, WI, USA Lineare DNA-Matrize 1.0 15 ng/Ansatz 40 mM Tris-HCl 6 mM MgCl2 2 mM Spermidine 10 mM NaCl Tabelle 3.4 Der Transkriptionsansatz wurde für 1 h bei 37°C inkubiert. Zum Verdau der DNA-Matrize wurde nach folgendem Schema pipettiert: - 33 Produkt [µl] Endkonzentration Hersteller TE pH 7.4 16.0 Transkriptions-Puffer (5 ×) 2.0 0.5 × Promega, Madison, WI, USA DNase I (2 U/µl) 1.0 0.1 U/µl Ambion, Austin, USA Tabelle 3.5 Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurden die RNA-Sonden durch eine Phenol/Chloroform Extraktion und einer Ethanolpräzipitation gereinigt. Die getrockneten Pellets wurden in 20 µl Hybridisierungspuffer resuspendiert. 1 µl dieser Lösung wurde mit 5 ml Szintilationsflüssigkeit (rotiszint eco plus, Roth, Karlsruhe) vermischt und die Aktivität in einem Szintilationszähler (Canberra-Packard, Dreieich) ausgemessen. Die Sonde wurde so verdünnt, dass sie 100 DPM/µl pro UTP-Rest im Sondenmix aufwies. Hybridisierung, RNase Behandlung, Proteinase-K Verdau 10 µl der verdünnten radioaktiv markierten Sonde wurden zu 5 µg der zu untersuchenden gesamt-RNA-Probe hinzugegeben. Die Proben wurden mit Mineralöl bedeckt, auf 95°C aufgeheizt und über Nacht bei 56°C inkubiert. Nicht-hybridisierte Einzelstrang-RNA wurde am nächsten Tag 45 min bei 32°C mit 100 µl RNase-Puffer verdaut. Anschließend wurden die RNasen mittels einer 30 min Inkubation bei 37°C mit 20 µl Proteinase K verdaut. Es folgte eine Reinigung der verbliebenen RNA-RNA-Hybride durch eine Phenol/Chlorophorm Extraktion und Ethanolpräzipitation. Anschließend wurden die getrockneten Pellets in 4 µl Ladepuffer resuspendiert und für 3 min bei 95°C denaturiert. Gelelektrophorese, Autoradiographie Die Glasplatten der Gelkammer (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) wurden vorbereitet, das Polyacrylamidgel gemischt und in die Gelkammer gegossen. Nach der Polymerisierung des Gels, wurde es in die Elektrophoreseapparatur eingespannt und bei 50 Watt in 1 × TBE (Ambion, Austin, TX, USA) für eine halbe Stunde vorgewärmt. Als Längenstandard wurde der radioaktiv markierte Sonden-Satz auf 5000 DPM/µl verdünnt und zusammen mit den Proben bei 60 Watt aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel auf ein Filterpapier Whatman 3M (Schleicher und Schuell, Dassel) aufgezogen und die Oberseite mit Zellophanfolie beschichtet. Das Gel wurde in einem Gel-Trockenapparat (Bio-Rad Laboratories, Deisenhofen) für 30 min bei 80°C getrocknet. Das getrocknete Gel wurde auf ein Röntgenfilm (Kodak: BioMax MR, Kodak Company, Rochester, USA) gelegt und bei -70°C bis zu 4 Tage exponiert. Anschließend wurde der Film entwickelt. - 34 1 × Hybridisierungspuffer 40 mM PIPES pH 6.4 0.4 M NaCl 1 mM EDTA in Formamid RNase-Puffer 25 µl 1 M Tris-HCl pH 7.5 150 µl 5 M NaCl 25 µl 0.5 M EDTA pH 8.0 ad 2.5 ml dd H2O vor Benutzung hinzugeben: 5 µl RNaseA 100 µg/ml (Boehringer, Mannheim) 1 µl RNaseT1 125 U/µl (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) Phenol/Chloroform Extraktion 29 µl 20 mM EDTA pH 8.0 70 µl Phenol/Chloroform (1:1) Ethanolpräzipitation 60 µl 4 M CH3COONH4 600 µl Ethanol 5 µl tRNA (2mg/ml) RNA-Ladepuffer 80 % Formamid 10 mM EDTA pH 8.0 1 mg/ml Xylencyanol 1 mg/ml Bromphenolblau Polyacrylamidgel 5 % Acrylamid 0.6 % Ammoniumpersulfat 10 % 0.08 % TEMED - 35 - 3.6 Methoden zur Arbeit mit DNA 3.6.1 DNA Isolierung Schwanzspitzen von Mäusen wurden in 500 µl Lyse-Puffer über Nacht bei 56°C auf dem Thermorüttler verdaut. Dieser Ansatz wurde bei 14000 g zentrifugierte und der Überstand in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß gegossen, welches 500 µl Isopropanol enthielt. Durch kräftiges Schütteln wurde ein DNA-Präzipitat sichtbar, das in ein weiteres Reaktionsgefäß mit 100 µl TE pH 8.0 überführt wurde. Das Resuspendieren erfolgte in einem Thermorüttler bei 40°C über mehrere Stunden. Wenn kein DNA-Präzipitat zu sehen war, wurde für 5 min bei 14000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 150 µl 80 % Ethanol gewaschen. Nach 5 min Zentrifugieren bei 14000 g wurde das Ethanol vollständig abgesaugt und das Pellet in der Speedvac kurz angetrocknet. Das Pellet löste sich anschließend in 100 µl TE pH 8.0 bei 40°C. Lyse-Puffer 200 mM NaCl 100 mM TrisHCl 5 mM EDTA 0.2 % SDS 100 µg/ml Proteinase K 3.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mittels PCR können bestimmte DNA-Sequenzen unter Einsatz von OligonukleotidPrimer, die die DNA-Segmente flankieren, enzymatisch vermehrt werden. Die Primer müssen komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen sein, um mit Hilfe der Taq-Polymerase den gewünschten DNA-Abschnitt zu vervielfältigten. Zur Identifikation der transgenen Genotypen wurden folgende Oligonukleotid-Primer verwendet: Primer Sequenz von 5´nach 3´ TIMP1tg5´ (forward primer) ATG CGG CCG CAT GAT GGC CCC DTT TGC ATC hGH (reverse primer) TGG GCA CTG GAG TGG CAA CTT Tabelle 3.6 - 36 Die 25 µl-PCR-Ansätze beinhalteten: Produkt [µl] Endkonzentration Hersteller MgCl2 (50 mM) 0.5 µl 1 mM Amersham, Piscutaway, NY, USA PCR-Puffer : MgCl2 (15 mM) 2.5 µl 1.5 mM Amersham, Piscutaway, NY, USA Tris-HCl (pH 8.3) 10 mM KCl (500 mM) 50 mM dNTP´s (10 mM) 0.5 µl 0.2 mM Amersham, Piscutaway, NY, USA TIMP1tg5 (102,5 ng/µl) 1.0 µl 4.1 ng/µl Institut für Biologie, Freiburg hGH (85,9 ng/µl) 0.25 µl 0.86 ng/µl Institut für Biologie, Freiburg Taq-Polymerase (125 U) 0.1 µl 0.5 U/µl Amersham, Piscutaway, NY, USA DNA 0.5 µl Tabelle 3.7 Mit folgendem PCR-Programm wurde amplifiziert: Zyklen Temperatur Zeit 1 94 °C 4 min Primäre Denaturierung der DNA 37 94 °C 1 min Denaturierung der DNA 56 °C 1 min Anlagerung der Oligonikleotid-Primer an die DNA-Matrize 72 °C 1 min Verlängerung der Primer durch DNA-Polymerase (Elongation) 72 °C 5 min Elongation am Ende 1 Vorgang Tabelle 3.8 3.6.3 DNA Gelelektrophorese Die PCR-Produkte wurden jeweils mit 5 µl 6 × Ladepuffer gemischt und auf einem ethidiumbromid-haltigen 1.2 % Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Als Größenmarker wurde der DNA ladder mix von MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania verwendet. Anschließend wurde das Gel mit UV-Licht beleuchtet. Banden von 700 Basenpaaren (bp) verwiesen auf eine TIMP1-Transgenität. 6 × Ladepuffer 0.25 % Bromphenol-Blau (Sigma, Saint Louis, MO, USA) 30 % Glycerin 0.25 % Xylencyanol (Merck, Darmstadt) - 37 Agarose-Gel 1.2 g LE-Agarose (BMA, Rockland, USA) 100 ml TAE-Puffer 7 µl Ethidiumbromid 10 µg/µl (Fluka, Neu-Ulm) 1 × TAE-Puffer 40 mM Tris Acetate 20 mM CH3COOH 1 mM EDTA pH 8.0 3.7 Methoden zur Arbeit mit Proteinen 3.7.1 Proteinextraktion Bei der Proteinextraktion wurde entnommenes Gewebe (siehe Tabelle 3.4.1) gewogen, mit Lyse-Puffer 1:10 (w/v) versetzt und mit Hilfe des Homogenisators auf Eis homogenisiert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach Bradford. Als Vergleichsstandard diente eine Verdünnungsreihe mit BSA. 10 µl einer 1:100 verdünnten Proteinprobe wurde mit 200 µl Bradfordreagenz in einer Mikrotiterplatte gemischt und anschließend bei 595 nm im Elisa-Reader (Dynatech Laboratories, Denkendorf) ausgemessen. Referenzwerte der Standardreihe dienten zur Berechnung der Konzentration der Proben. Lysis Puffer 50 mM Tris pH 7.4 1 % Nonidet P-40 5 mM EDTA 10 µg/ml PMSF 5 µg/ml Aprotinin 5 µg/ml Pepstatin A Bradfordreagenz 100 mg Coomassie Brillant Blue G-250 (Bio-Rad Laboratories, Deisenhofen) 50 ml 95 % Ethanol 100 ml 85 % Phosphorsäure ad 1000 ml dd H2O - 38 - 3.7.2 Enzym-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) TIMP-1 ELISA von R&D Systems, Minneapolis, MN, USA wurde entsprechend den Herstellerausgaben angewendet. Die eingesetzten Mikrotiterplatten waren mit einem monoklonalen Antikörper vorbeschichtet, welcher spezifisch TIMP-1 der Maus erkennt. Standards, Kontrollen und Proben wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert, wobei vorhandenes TIMP-1 an den immobilisierten Antikörper band. Nach 2 h wurden nichtgebundene Proteine durch Waschen entfernt, bevor für 2 h ein enzym-gebundener polyklonaler Antikörper hinzugeführt wurde, der spezifisch gegen TIMP-1 der Maus gerichtet war. Anschließend wurde wiederholt gewaschen und für 30 min eine Substratlösung in die Mikrotiterplatten pipettiert. Bei der folgenden Enzymreaktion kam es zu einem blauen Farbumschlag. Nach Zugabe der Stopp-Lösung wurde die Absorption bei 450 nm bestimmt. Dabei war die Intensität der Farbe proportional zu der Menge an gebundenem TIMP-1. Die Konzentration der Proben konnte mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt werden. 3.8 Phänotypische Untersuchungen an TIMP-1 transgenen Mäusen und Kontrollen 3.8.1 Experimentelle Allergische Enzephalomyelitis (EAE) 8-12 Wochen alte Mäuse erhielten am Tag 1 eine subkutane Injektion einer immunisierenden Emulsion (200 µl). Diese erfolgte an beiden Seiten des Rückens, über den Hinterbeinen. Die immunisierende Emulsion enthielt 200 µg MOG-Peptid (4 mg/ml in saline; Sigma, St.Louis, MO, USA) und 500 µg durch Hitze abgetötete Mycobacterium tuberculosis (10 mg/ml in 0.9 % NaCl; Difco, Detroit, MI, USA), die jeweils mit 100 µl inkomplettem Freund´s adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA) emulgiert wurden. Am Tag 1 und 3 erhielten die Mäuse zusätzlich eine intraperitoneale Injektion von 250 ng Pertussistoxin (Alexis) in 150 µl steriler Kochsalzlösung. Die dadurch entstandenen neurologischen Symptome wurden jeden Tag vermerkt und folgendermaßen eingeteilt: 1: Schwanzlähmung 2: leichte Paraparese und/oder Ataxie der Hinterbeine 3: schwere Paraparese der Hinterbeine 4: Tetraparese 5: Moribund (diese Tiere wurden aus Gründen des Tierschutzes getötet) - 39 - 3.8.2. Verhaltenstestung 3.8.2.1 Light-Dark Box Dauer: ½ Tag Ablauf: Eine rechteckige Box aus Plexiglas wurde zu ca. 1/3 von einer Dunkelkammer ausgefüllt, die dem Beobachter keinen Einblick erlaubte (Abbildung 3.1). Vor Versuchsbeginn wurde die Oberfläche mit 70 % Ethanol gereinigt und die Boli (Kotkegel) entfernt. Daraufhin wurde die Maus für 5 min in die Box gelassen und von einer Kamera aufgenommen. Die Dauer des Aufenthalts in der Dunkelkammer, die Anzahl der Putzvorgänge, der Boli und das Aufstellen auf die Hinterbeine wurde bestimmt. Erforschungszone Übergangszone Heimzone Eingang in die Dunkelkammer Abbildung 3.1: Light-Dark Box. Die Grundfläche der Box wurde für die Auswertung in 4 Zonen unterteilt. Die Erklärung der Symbole findet sich in der Abbildung wieder. 3.8.2.2 Rotarod Dauer: ½ Tag Ablauf: Eine Maus wurde auf ein sich beschleunigendes Rotationsrad gesetzt. Es wurde die Zeit bis zum Fall der Maus vom Rotationsrad gemessen, oder bis sie sich 2 × um ihre Achse drehen ließ, was als Zeichen der Erschöpfung galt. Die maximale Zeitmessung betrug 5 min. Es wurden 5 Tests pro Maus durchgeführt. 3.8.2.3 Open Field Dauer: 2 Tage Ablauf: Eine Grundfläche mit einem Durchschnitt von 1.5 m wurde vor Versuchsbeginn mit 70 % Ethanol gereinigt und die Boli entfernt. Eine ca. ½ m hohe Wand umschloss die Grundfläche. Jede Maus wurde unter vollständiger Stille und ohne Ablenkung 10 min auf der Grundfläche laufen gelassen und dabei von einer Kamera aufgenommen. Die Beobachtung der Maus erfolgte per Monitor, um Irritationen der Maus zu vermeiden. Während des Versuchs wurden Fortbewegung, Ruhephasen sowie das Absuchen / Forschen der Umgebung - 40 registriert (Abbildung 3.2.A). Zusätzlich wurde für die Auswertung die Grundfläche in 3 Zonen eingeteilt (Abbildung 3.2.B). A Fortbewegung Ereignisse über einer bestimmten Geschwindigkeit und einer zurückgelegten Entfernung, Geschwindigkeitsabnahmen nicht hinzugerechnet Grenzwert der Geschwindigkeit 0,085 m/sec Grenzwert der zurückgelegten Entfernung 0,05 m Geschwindigkeitsabnahmen 0,15m/sec Absuchen / Forschen der Umgebung Ereignisse, die durch Waschvorgänge, Schnüffeln, Kopf wenden, usw. definiert werden Ruhephasen Ereignisse, bei der Bewegungen von < 0.025 m/s länger als 2 sec dauern B Erforschungszone Übergangszone Heimzone Abbildung 3.2.A-B: Open Field. Unter den Gesichtspunkten der Fortbewegung, der Ruhephasen und des Absuchen / Erforschen der Umgebung erfolgte die Auswertung des Open Field’s (A). Dabei wurde die Oberfläche in 3 Zonen unterteilt (B). In den Abbildungen werden die Symbole erklärt. 3.8.2.4 Water Maze Water maze cue navigation (WmCu) Dauer: 2 Tage Ablauf: Eine runde Wanne (siehe Open Field) wurde mit Wasser gefüllt und mit 1l Milch getrübt. Das Wasser überragte mit ½ cm eine verlegbare Plattform, die durch eine Fahne - 41 markiert wurde. Eine Maus wurde pro Tag 6 × 5 min an einer definierten Stelle in das Wasser gelassen. Die Zeit bis zum Finden der Plattform wurde gemessen. Water maze spatial reference & reversal (WmRm) Dauer: 5 Tage Ablauf: Selber Versuchsaufbau, wie bei WmCu. Die Plattform wurde aber nicht mehr durch eine Fahne markiert und sie blieb für 3 Tage an einer gleichen, definierten Stelle. Am 4. Tag erfolgte eine Änderung des Standpunktes der Plattform (Reversal), die für die letzten 2 Tage bestehen blieb. Die Maus wurde für 6 × 5 min an einer definierten Stelle in das Wasser gelassen. Das Auffinden der nicht sichtbaren Plattform wurde durch Navigation mit Hilfe von Zimmerwandzeichnungen erreicht. Die Zeit bis zum Finden der Plattform wurde gemessen. - 42 - 4. ERGEBNISSE 4.1 Verwendetes Mausmodell Die biologischen Auswirkungen einer konstitutiven TIMP-1 Expression wurden in vivo an mehreren heterozygot transgenen Mauslinien untersucht. Zur Herstellung dieser Mauslinien (Abbildung 4.1) wurde TIMP-1 mRNA aus Gewebe extrahiert und diese durch eine RT-PCR amplifiziert. Anschließend wurde die entstandene cDNA in einen Vektor eingefügt, der einen GFAP-Promotor enthielt. Diese Vektoren wurden in Eizellen von Wildtyp-Mäusen C57BL/6 injiziert und scheinschwangeren Mäusen implantiert. Die daraus resultierenden Mäuse der ersten Generation (Founder-Mäuse F1-F20) wurden mit Hilfe einer PCR an Schwanzspitzen DNA auf Transgenität getestet. Transgene Tiere dieser Generation wurden gezüchtet und transgene Nachkommen dieser Tiere dann mit Hilfe der RPA auf eine TIMP-1 mRNA Expression im ZNS untersucht. Bei den Nachkommen der Founder-Mäuse F2, F7 und F11 konnte eine Transgenexpression nachgewiesen werden. Diese wurden zur Etablierung der Mauslinien T2, T7 und T11 mit Wildtyp-Mäusen C57BL/6 verpaart. Gen-Konstrukt TIMP-1 GFAP-Promotor Poly A Signal GFAP Mikroinjektion in Eizelle transgene TIMP-1 Expression in Astrozyten von Founder-Mäusen F2, F7 und F11 Transgene Founder-Mäuse F1-F20 F2, F7, F11 + wt C57BL/6 Mauslinie TIMP-1/2 (T2) Mauslinie TIMP-1/7 (T7) Mauslinie TIMP-1/11 (T11) Abbildung 4.1: Etablierung TIMP-1 transgener Mauslinien T2, T7 und T11. Zur Herstellung TIMP-1 transgener Mauslinien wurde ein Gen Konstrukt verwendet, welches TIMP-1 cDNA enthielt, das unter transkriptioneller Kontrolle des GFAP-Promotors steht. Dieser Vektor wurde in Eizellen von Wildtyp-Mäusen C57BL/6 injiziert. Unter den daraus entstandenen Founder-Mäusen F1-F20 exprimierten F2, F7 und F11 in Astrozyten transgenes TIMP-1. Diese wurden zur Etablierung der transgenen Mauslinien T2, T7 und T11 mit Wildtyp-Mäusen C57BL/6 (wt) verpaart. Die Nachkommen der Mauslinien waren somit heterozygot transgen oder vom Wildtyp. - 43 - 4.2 Genotypisierung für das TIMP-1 Transgen Die Nachkommen der Mauslinien von T2, T7 und T11 wurden mit Hilfe der PCR auf ihren Genotyp (wt oder transgen) hin untersucht (Abbildung 4.2). Bei TIMP-1 transgenen Mäusen zeigte sich das TIMP-1 Transgen auf dem Agarosegel als eine Bande von 700 Basenpaaren (bp). War – bei positiver Kontrollreaktion – keine Bande sichtbar, so wurde die Maus als wildtypisch gewertet. TIMP-1tg TIMP-1tg Abbildung 4.2: Nachweis der TIMP-1 Transgenität mittels PCR. Die Amplifikation eines 700 bp Fragmentes beweist die TIMP-1 Transgenität in den Mauslinien T2, T7 und T11. Das Fehlen von Banden ist charakteristisch für nicht-transgene Nachkommen (wt). Die Ergebnisse der PCR wurden mit einer positiven Kontrolle (K) und dem Leerwert (L) verglichen. 4.3 Analyse der transgenen Mauslinien auf TIMP-1 Expression 4.3.1 Nachweis der TIMP-1 mRNA Expression im ZNS Die Expression der TIMP-1 mRNA wurde mit Hilfe der RPA im ZNS nachgewiesen. Dabei wurden für die Mauslinien T2, T7 und T11 im Vergleich zur Wildtyp-Maus drei verschiedene ZNS-Areale getrennt untersucht: das Vorderhirn, das Kleinhirn und das Rückenmark. Diese Analyse ergab eine für jede Mauslinie charakteristische Verteilung der transgenen TIMP-1 mRNA Expression im ZNS (Abbildung 4.3): In der Wildtyp-Maus konnte eine Expression von transgener TIMP-1 mRNA nicht nachgewiesen werden. Die Mauslinie T2 zeigte im Vorderhirn eine leichte, im Kleinhirn eine sehr starke und im Rückenmark eine geringe Expression von transgener TIMP-1 mRNA. Auffällig war, dass im Kleinhirn neben der hohen transgenen TIMP-1 mRNA Expression gleichzeitig die mRNA Expression von Wildtyp TIMP-1 stark hochreguliert wurde. In den anderen transgenen Mauslinien konnte eine zusätzliche und gesteigerte Wildtyp TIMP-1 - 44 mRNA Expression nicht beobachtet werden. Die Mauslinie T7 zeigte eine starke Expression im Vorderhirn, eine schwächere Expression im Kleinhirn und eine geringe Expression im Rückenmark. In Mauslinie T11 war im Rückenmark die transgene TIMP-1 mRNA Expression stark, im Kleinhirn und Vorderhirn gering ausgeprägt. wt T2 T7 T11 wt T2 T7 T11 wt T2 T7 T11 TIMP-1tg TIMP-1wt L32 Vorderhirn Kleinhirn Rückenmark Abbildung 4.3: Verteilung der TIMP-1 mRNA Expression im ZNS der transgenen Mauslinien. Mittels RPA wurde die Expression von TIMP-1 mRNA in den Mauslinien T2, T7 und T11 untersucht (siehe auch Tabelle 3.3). Zum Vergleich stand Gewebe nicht transgener Geschwisterpaare (wt) zur Verfügung. Das ZNS wurde für die Untersuchung in Vorderhirn, Kleinhirn und Rückenmark aufgetrennt. Die Bande mit dem höchsten Molekulargewicht repräsentiert die Expression der transgenen TIMP-1 mRNA (TIMP-1tg), die Bande mit einem geringeren Molekulargewicht steht für die Wildtyp TIMP-1 mRNA (TIMP-1wt). Die Bande mit geringstem Molekulargewicht entspricht der konstitutiv exprimierten ribosomalen Protein L32 mRNA und diente als Ladekontrolle. Die optische Dichte der Banden ermöglicht auch eine semiquantitative Aussage über eine mRNA-Expression. 4.3.2 Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA im ZNS Für die zelluläre Zuordnung der TIMP-1 mRNA Expression in den verschiedenen ZNS-Arealen wurden die radioaktive ISH und die nichtradioaktive ISH verwendet. Jede Mauslinie besaß ein charakteristisches Muster bezüglich der transgenen TIMP-1 mRNA Expression. Zusätzlich konnte durch gleichzeitige Immunhistochemie für GFAP die Transgenexpression Astrozyten zugeordnet werden. In Abbildung 4.4.A-E ist die Transgenexpression in der Großhirnrinde der verschiedenen Mauslinien dargestellt, wt T2 T7 T11 Großhirnrinde Hippocampus Kleinhirn Rückenmark ++ - + + - +++ + - + Tabelle 4.1: Zusammenfassung der ISH-Ergebnisse über die transgene TIMP-1 mRNA Expression im ZNS der verschiedenen Mauslinien. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: wt, Wildtyp-Maus; Mauslinien T2, T7, T11; +++ starke Expression, + mäßige Expression, - fehlende Expression von transgenem TIMP-1. - 45 Abbildung 4.5.A-E zeigt die Expression im Hippocampus, Abbildung 4.6.A-F im Kleinhirn und Abbildung 4.7.A-D zeigt sie im Rückenmark. Einen Überblick über die Resultate der transgenen TIMP-1 Expression ermöglicht die Tabelle 4.1. Deren Aussagen stimmen mit den Ergebnissen der RPA (4.3.1) überein. A: wt B: T2 C: T7 D: T11 E: T7 Abbildung 4.4.A-E: Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA in der Großhirnrinde. Der Nachweis erfolgte durch die radioaktive ISH (A-D) und durch die nichtradioaktive ISH (E). Die nichtradioaktive ISH wurde mit einer Astrozyten-spezifischen GFAP-IHC verknüpft (E: Pfeile). Für den Wildtyp (A) und für die Mauslinien T2 (B) und T11 (D) konnte keine Expression nachgewiesen werden. Jedoch zeigte die Mauslinie T7 eine starke transgene TIMP-1 mRNA Expression (C: Pfeile) in Astrozyten (E: Pfeilköpfe). - 46 - A: wt B: T2 C: T7 D: T11 E: T2 Abbildung 4.5.A-E: Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA im Hippocampus. Der Nachweis erfolgte durch die radioaktive ISH (A-D) und durch die nichtradioaktive ISH (E). Die nichtradioaktive ISH wurde mit einer Astrozyten-spezifischen GFAP-IHC verknüpft (E: Pfeil). Die Wildtyp-Maus (wt) (A) und die Mauslinie T11 (D) exprimierten keine TIMP-1 mRNA. Im Gegensatz dazu konnte in den Mauslinien T2 (B: Pfeil) und T7 (C: Pfeil) eine Expression nachgewiesen werden. Mit Hilfe der GFAP-IHC konnte zusätzlich gezeigt werden, dass es sich bei den TIMP-1 mRNA positiven Zellen um Astrozyten handelt (E: Pfeilkopf). - 47 A: wt B: T2 C: T7 D: T11 E: T2 F: T7 Abbildung 4.6.A-B: Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA im Kleinhirn. Der Nachweis erfolgte durch die radioaktive ISH (A-D) und durch die nichtradioaktive ISH (E-F). Die nichtradioaktive ISH wurde mit einer Astrozyten-spezifischen GFAP-IHC verknüpft (F: Pfeil). In der Wildtyp-Maus (wt) (A) und in der Mauslinie T11 (D) war keine Expression nachweisbar. Jedoch konnte eine hohe transgene TIMP-1 mRNA Expression in der Mauslinie T2 (B: Pfeile) und vereinzelt in T7 (C: Pfeil) nachgewiesen werden. Die GFAPIHC zeigte zusätzlich in den Mauslinien T2 (E: Pfeilkopf) und T7 (F: Pfeilkopf) eine Astrozyten-assoziierte Expression von TIMP-1. - 48 - A: wt B: T7 C: T11 D: T11 Abbildung 4.7.A-B: Nachweis der lokalen Expression von TIMP-1 mRNA im Rückenmark. Der Nachweis erfolgte durch die radioaktive ISH (A-C) und durch die nichtradioaktive ISH (D). Die nichtradioaktive ISH wurde mit einer Astrozyten-spezifischen GFAP-IHC verknüpft (D: Pfeil). Die Wildtyp-Maus (wt) (A) und die Mauslinien T7 (B) exprimierten keine transgene TIMP-1 mRNA. Die Mauslinie T11 hingegen war positiv für eine Expression (C: Pfeil), welche astrozyten-assoziiert war (D: Pfeilkopf). 4.3.3 Analyse der TIMP-1 Protein Expression Neben der TIMP-1 mRNA Expression wurden ebenfalls die Konzentrationen der TIMP-1 Proteine im ZNS der verschiedenen Mäuselinien untersucht. Dazu wurde der TIMP-1 ELISA von R&D Systems verwendet (Abbildung 4.8). Im ZNS der Wildtypmaus war eine niedrige TIMP-1 Proteinkonzentration von 1-5 pg/ml nachweisbar. In der Mauslinie T2 zeigten sich im Kleinhirn TIMP-1 Konzentrationen von 230-240 pg/ml und im Vorderhirn TIMP-1 Konzentrationen von 30-40 pg/ml. Im Gegensatz dazu produzierte die Mauslinie T7 im Vorderhirn 100-110 pg/ml und im Kleinhirn 30-40 pg/ml TIMP-1. Die Mauslinie T11 exprimierte im Rückenmark 60-70 pg/ml TIMP-1. Das Ergebnis des ELISA deckt sich mit den Aussagen der RPA und der ISH. - 49 300 Vorderhirn Kleinhirn Rückenmark TIMP-1 (pg/ml) 250 200 150 100 50 0 wt T7 T2 T11 Abbildung 4.8: Bestimmung der TIMP-1 Protein-Konzentration im Vorder-, Kleinhirn und Rückenmark transgener Mäuse durch einen TIMP-1 spezifischen ELISA. In den Mauslinien T2, T7 und T11 sowie in der Wildtyp-Maus (wt) wurden die TIMP-1 Protein-Konzentration ermittelt. Dabei wurden für jede Mauslinie das Vorderhirn, das Kleinhirn und das Rückenmark getrennt untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung werden hier jeweils als Mittelwerte von 2 Mäusen jeder Mauslinie dargestellt. Die Wildtyp-Maus exprimierte kaum TIMP-1 Protein. Die TIMP-1 Konzentration der Mauslinie T2 ergab für das Vorderhirn 30-40 pg/ml, für das Kleinhirn den höchsten gemessenen Wert von 230-240 pg/ml und für das Rückenmark weniger als 15 pg/ml. In der Mauslinie T7 zeigten sich folgende Konzentrationen: 100-110 pg/ml im Vorderhirn, 30-40 pg/ml im Kleinhirn und weniger als 25 pg/ml im Rückenmark. Die TIMP-1 Protein-Konzentration in der Mauslinie T11 lag im Vorder- und Kleinhirn unter 25 pg/ml und im Rückenmark bei 60-70 pg/ml. Symbolbezeichnungen werden in der Abbildung erklärt. Die untere Nachweisgrenze des ELISAs liegt bei 2,1 pg/ml. 4.4 Pathologische Auswirkungen der TIMP-1 Expression auf den Phänotyp der Mauslinien 4.4.1 Makroskopische Besonderheiten Im Vergleich zur Wildtyp-Maus wiesen die Gehirnpräparate der Mauslinie T2 eine deutliche Hypoplasie des Kleinhirns auf. Die Kleinhirn-Hypoplasie ist in Abbildung 4.9 dargestellt. Deutlich erkennt man in der Mauslinie T2 die verkleinerten Hemisphären und den hypoplastischen Wurm. Dadurch treten die Colliculi inferiores und superiores, die normalerweise zum großen Teil vom Kleinhirn bedeckt werden, stark hervor. Die Gehirnpräparate der Mauslinien T7 und T11 waren im Vergleich zur Wildtyp-Maus unauffällig. 4.4.2 Histologische Besonderheiten 4.4.2.1 Histochemische Färbungen Histologische Besonderheiten wurden mittels verschiedener histochemischer Färbemethoden identifiziert. Die HE-Färbung der Mauslinie T2 zeigte im Vergleich zur - 50 - wt T2 Abbildung 4.9: Kleinhirn-Hypoplasie der Mauslinie T2. Das Gehirn der Wildtyp-Maus zeigt eine regelrechte Konfiguration. Vergleicht man es mit dem Gehirn der Mauslinie T2, so fällt eine Hypoplasie der Kleinhirnhemisphären und des Wurm auf, wodurch die Colliculi inferiores und superiores stark hervortreten. Wildtyp-Maus (Abbildung 4.10.A-C) eine Hypoplasie des Kleinhirns mit Körnerzellverlust (Abbildung 4.10.G). Zusätzlich konnten im Kleinhirn und Hippocampus der Mauslinie T2 Leukozyteninfiltrate (Abbildung 4.10.G-F) nachgewiesen werden. Der Verlust von Neuronen im Kleinhirn wurde von einer Verminderung der Myelinisierung begleitet, was durch eine Klüver-Barrera Färbung (Abbildung 4.11) gezeigt werden konnte. Durch die AlizarinrotFärbung konnten im Kleinhirn der Mauslinie T2 Kalzifikationen dargestellt werden. Der Verlauf der Entstehung dieser Kalzifikationen wurde an Gehirnen unterschiedlich alter Mäuse untersucht. Das Gehirn 1 Tag, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen alter T2 Mäuse wurde entnommen, Schnittpräparate angefertigt und diese mit Alizarinrot gefärbt. Die ersten Kalzifikationen konnten bereits in der 2. Lebenswoche (Abbildung 4.12.A) nachgewiesen werden. Das Ausmaß der Kalzifikationen nahm zur 4. Lebenswoche (Abbildung 4.12.B) stark zu. Die Kalzifikationen persisierten dann im Verlauf eines Mauslebens. In den Mauslinien T7 und T11 zeigte die HE-Färbung im Vergleich zur Wildtyp-Maus keine pathologischen Auffälligkeiten (Abbildung 4.10.D-F). Auch bei den weiteren Färbungen, die im Folgenden beschrieben werden, konnten in diesen Mauslinien keine pathologischen Veränderungen festgestellt werden. Deswegen wurde im Weiteren auf die photographische Darstellung dieser Präparate verzichtet. Gezeigt werden nur noch Ergebnisse zu der Mauslinie T2, da nur diese relevante pathologische Merkmale aufwies. - 51 A: wt/Vh B: wt/Kh C: wt/Rm D: T11/Rm E: T7/Vh F: T7/Kh G: T2/Kh H: T2/Vh/Hippo Abbildung 4.10: HE-Färbung. Im Vergleich zur Wildtyp-Maus (wt) (A-C) konnten in den Mauslinien T11 (D-E) und T7 (E-F) auch an Orten nachgewiesener TIMP-1 Expression keine pathologischen Auffälligkeiten erkannt werden. Hingegen wies die Mauslinie T2 im Kleinhirn Körnerzellverlust (G: Pfeilkopf) und Kalzifikationen (G: blaue Pfeile) auf sowie im Kleinhirn und Hippocampus Leukozyteninfiltrate (G, H: Pfeile). Folgende Abkürzungen wurden verwendet: Vh, Vorderhirn; Kh, Kleinhirn; Rm, Rückenmark; Hippo, Hippocampus. - 52 A: wt/Kh B: T2/Kh Abbildung 4.11: Klüver-Barrera Färbung. Myelin wird bei dieser Färbung blau angefärbt. Im Vergleich zur Wildtyp-Maus (wt) (A) erkennt man im Kleinhirn (Kh) der Mauslinie T2 (B) deutlich den Verlust der Körnerzellschicht (violett) (Pfeilkopf), sowie eine Verminderung des Myelins (Pfeile). B: T2/Kh 4.Woche A: T2/Kh 2.Woche Abbildung 4.12: Kinetik der Kalzifikationen in der Mauslinie T2. Kalzifikationen im Kleinhirn der Mauslinie T2 (durch die Alizarinrot-Färbung rot dargestellt) begannen in der 2. Woche (A) und nahmen zur 4. Wochen (B) stark zu. 4.4.2.2 Immunhistochemische Färbungen Anhand immunhistochemischer Verfahren wurden Wildtyp-Mäuse mit der Mauslinie T2 verglichen, wobei mehrere Auffälligkeiten zu Tage traten. Mittels GFAPFärbung wurde in der Mauslinie T2 eine ausgeprägte Gliose (Abbildung 4.13) festgestellt. Diese trat sowohl im Kleinhirn als auch im Hippocampus auf. In der Wildtyp-Maus konnte keine Gliose nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung der Purkinjezellen durch die Calbindin-Färbung (Abbildung 4.14) zeigte diese zwar in der Mauslinie T2 einen rarefizierten Zellbestand, sonst aber keine weitere pathologische Konfigurationen. Da bei einer Abnahme der Körnerzelldichte (Abbildung 4.10) eine Minderung der Synapsen resultieren sollte, wurde eine Synaptophysin-Immunhistochemie (Abbildung 4.15) zur Bestimmung der - 53 Synapsendichte durchgeführt. Diese Untersuchung zeigte im Vergleich zur Wildtyp-Maus eine deutliche Abnahme der Glomerula. A: wt/Kh B: T2/Kh C: wt/Hippo D: T2/Hippo Abbildung 4.13: Gliose im Kleinhirn und Hippocampus bei T2 Mäusen. Die GFAP-Immunhistochemie färbt saures Gliafaserprotein braun. Das Kleinhirn (Kh) (A) und der Hippocampus (Hippo) (C) der Wildtyp-Maus (wt) wies hinsichtlich des GFAP keine pathologischen Auffälligkeiten auf. Jedoch konnte in der Mauslinie T2 sowohl im Kleinhirn (B) als auch im Hippocampus (D) eine ausgeprägte Vermehrung der Gliazellen (Pfeile) festgestellt werden. A: wt/Kh B: T2/Kh Abbildung 4.15: Synaptophysin-Färbung. Die Synaptophysin-Immunoreaktivität erscheint braun (Pfeil). Es ist das Hauptprotein der präsynaptischen Vesikeln der Neuronen. Im Vergleich zur Wildtyp-Maus (wt) (A) erkennt man im Kleinhirn (Kh) der Mauslinie T2 (B) deutlich einen Verlust an Synaptophysin als Folge eines minimierten Zellbestandes. - 54 A: wt/Kh B: T2/Kh C: wt/Kh D: T2/Kh E: T2/Kh Abbildung 4.14: Calbindin-Färbung. A-B zeigt die Calbindin-Färbung an Paraffinschnitten, C-E an Vibratomschnitten. Die Purkinje-Zellen des Kleinhirns (Kh) imponieren als braune Zellen mit Zellfortsätzen. Bei der Wildtyp-Maus (wt) (A, C) sind die Konfigurationen in der Purkinje-Zellschicht unauffällig. Bei der Mauslinie T2 (B, D, E) deuten die Pfeile das Fehlen von Purkinjezellen und ihrer Nervenzellfortsätze an. Allerdings sind ebenfalls Zonen mit einer normalen Anzahl vorzufinden (D: Pfeilkopf). Bei der Untersuchung der ausgeprägten Leukozyteninfiltrate wurden im Kleinhirn und im Hippocampus der Mauslinie T2 im Gegensatz zur Wildtyp-Maus T-Helfer-Zellen, TSupressor-Zellen, Makrophagen und vereinzelt B-Zellen gefunden. Diese wurden mit Hilfe der CD4-, CD8-, CD45R- und Mac1-Antikörper (Abbildung 4.17) identifiziert. Dabei fiel auf, dass die Leukozyteninfiltrate vor allem meningeal, und weniger im Parenchym lokalisiert waren. Um die proliferierende Aktivität der Leukozyten zu beurteilen, wurde eine Ki67Färbung (Abbildung 4.16) durchgeführt. Es wurden reichlich positive Zellen nachgewiesen, - 55 was auf proliferierende Leukozyten schließen ließ. Um festzustellen, zu welchem Zeitpunkt Leukozyten das Kleinhirn und den Hippocampus der Mauslinie T2 infiltrieren, wurde das Gehirn am Tag 1, Tag 7, Tag 14, Tag 21 und Tag 28 nach Geburt entnommen. Eine immunhistochemische Färbung mit Antikörpern gegen CD4, CD8, CD45R und Mac1 (Abbildung 4.18) ergab, dass das Gehirn neugeborener Mäuse unauffällig war. Jedoch traten im Kleinhirn und im Hippocampus nach einer Woche die Leukozyteninfiltrate auf, die sich in den folgenden 2 Wochen massiv steigerten. A: wt/Kh B: wt/Hippo C: T2/Kh D: T2/Hippo Abbildung 4.16: Färbung mit Ki67 in der Mauslinie T2. Im Gegensatz zur Wildtyp-Maus (A-B) können im Kleinhirn (Kh) und im Hippocampus (Hippo) der Mauslinie T2 (C-D) mittels Ki67-Immunhistochemie proliferierende Zellen (Pfeile) nachgewiesen werden. Bei den Zellen handelt es sich um Leukozyten. A: wt/hb B: wt/Hippo - 56 C: T2/Kh CD4 D: T2/Kh CD45R E: T2/Kh CD8 F: T2/Kh Mac1 G: T2/Hippo CD4 H: T2/Hippo CD45R I: T2/Hippo CD8 J: T2/Hippo Mac1 Abbildung 4.17: Leukozyteninfiltrationen bei adulten T2 Mäusen. In A-B werden zum Vergleich Kleinhirn (Kh) und Hippocampus (Hippo) der Wildtyp-Maus abgebildet. E-F zeigen Leukozyteninfiltrationen (braune Zellen) im Kleinhirn und G-J im Hippocampus der Mauslinie T2. Die einzelnen Leukozytenmarker, mit denen gearbeitet wurde, stehen in den Abbildungen selbst. Bei den CD4 positiven Zellen handelt es sich um T-HelferZellen, bei den CD8 positive Zellen um T-Supressor-Zellen, CD45R positive Zellen weisen auf B-Zellen hin und Mac1 positiven Zellen auf Makrophagen. - 57 A: CD4 Tag 1 B: CD4 Tag 7 C: CD4 Tag 14 D: CD4 Tag 28 E: CD45R Tag 1 F: CD45R Tag 14 G: CD45R Tag 21 H: CD45R Tag 28 - 58 I: Mac1 Tag 1 J: Mac1 Tag 7 K: Mac1 Tag 14 L: Mac1 Tag 28 M: CD8 Tag 14 N: CD8 Tag 28 Abbildung 4.18: Kinetik der Leukozyteninfiltrationen in der Mauslinie T2. Die Abbildungen zeigen die Entwicklung der Leukozyteninfiltration (braun imponierende Zellen) im Kleinhirn der Mauslinie T2 vom 1. Lebenstag an bis zur 4. Woche. In A-D sind die Ergebnisse für CD4 dargestellt, in E-H auf CD45R, in I-L auf Mac1 und in M-N auf CD8. Das Alter der Tiere wird in den Abbildungen angegeben. Allen gemeinsam war das Fehlen von Leukozyten am 1. Lebenstag. Jedoch traten Infiltrate in der 1. Woche auf und nahmen zur 4. Woche an Ausmaß zu. Die Anzahl an CD8 positiven Zellen fiel jedoch im Gegensatz zu den anderen Leukozyten geringer aus und der Höhepunkt der Infiltrate trat schon in der 3. Woche auf. Vergleicht man die Leukozyteninfiltrationen mit denen der adulten Mäuse (Abbildung 4.15.A), so fällt auf, dass diese bei adulten Mäusen bei Weitem nicht so ausgeprägt waren. Bei den CD4 positiven Zellen handelt es sich um T-Helfer-Zellen, bei CD8 positive Zellen um T-SupressorZellen, CD45R positive Zellen weisen auf B-Zellen hin und Mac1 positiven Zellen auf Makrophagen. - 59 - 4.4.2.3 Apoptose-Assay Möglicherweise liegt dem Verlust der Körnerzellschicht der Mauslinie T2 (siehe Kapitel 4.4.2.2) der Vorgang der Apoptose zugrunde. Deshalb wurden mittels immunhistochemischer Färbungen für Caspase3 und mit der TUNEL-Reaktion im adulten wie auch im 1 bis 28 Tage alten Gewebe nach Zeichen von Apoptose gesucht. Während die Immunhistochemie mit Caspase3 keine Auffälligkeiten zeigte, konnten mit Hilfe der TUNELReaktion in 2 und 3 Wochen altem Gewebe apoptotische Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 4.19). In der Wildtyp-Maus ergaben die Untersuchungen keinen Nachweis apoptotischer Zellen. A: wt/Kh 2.Woche B: wt/Kh 3.Woche C: T2/Kh 2.Woche D:T2/Kh 3.Woche Abbildung 4.19: TUNEL-Reaktion in der Mauslinie T2. A-B: TUNEL-Reaktion im Kleinhirn (Kh) 2 und 3 Wochen alter Wildtyp-Mäuse (wt) ohne Nachweis apoptotischer Zellen. C: Im Kleinhirn 2 Wochen alter T2 Mäuse fanden sich mehrere apoptotische Zellen (Pfeile). D: In der 3. Woche konnten nur noch vereinzelt apoptotische Zellen nachgewiesen werden (Pfeil). 4.4.2.4 Evan´s Blue Als mögliche Ursache für die Leukozyteninfiltrate der Mauslinie T2 wurde eine Störung der Blut-Hirn-Schranke in Betracht gezogen. Deshalb wurde die Funktion der BlutHirn-Schranke mit Hilfe der Evan´s Blue Anfärbetechnik untersucht. Jedoch konnte im - 60 Hirngewebe adulter Mäuse kein Evan´s Blue nachgewiesen werden, was auf eine intakte Blut-Hirn-Schranke zurückzuführen ist. 4.4.3 Zeitkinetik der TIMP-1 mRNA Expression Nach den Resultaten der Kinetik der Leukozyteninfiltrationen im Kleinhirn der Mauslinie T2 wurde mit Hilfe der RPA untersucht, ob diese in einem Zusammenhang mit der Kinetik der transgenen TIMP-1 mRNA Expression gebracht werden konnte (Abbildung 4.20). Dazu wurde das Gehirn von T2- und Wildtyp-Mäuse zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Geburt entnommen und untersucht. In der Wildtyp-Maus wurde zu keinem Zeitpunkt eine TIMP-1 mRNA nachgewiesen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die TIMP-1 mRNA Expression im Vorderhirn der Mauslinie T2 innerhalb der ersten Woche hochreguliert wurde. Diese blieb in den weiteren Wochen weitgehend konstant. Zugleich konnte in den ersten 2 Wochen eine leichte TIMP-1 mRNA Expression im Rückenmark nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung der transgenen TIMP-1 mRNA Expression im Kleinhirn fiel auf, dass diese bereits ab dem ersten Lebenstag vorhanden war. Die mRNA Expression blieb allerdings nicht konstant, sondern steigerte sich im Laufe der ersten Wochen auf einen Maximalwert. Zusätzlich konnte ab der 2. Woche auch die Expression der Wildtyp-TIMP-1 mRNA im 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 Tage TIMP-1tg TIMP-1wt L32 Vh (wt) Kh (wt) Rm (wt) Vh (T2) Kh (T2) Rm (T2) Abbildung 4.20: Kinetik der TIMP-1 mRNA Expression in der Mauslinie T2. Mittels RPA wurde in der Mauslinie T2 zwischen dem 1. Lebenstag und der 4. Woche die Expression von TIMP-1 mRNA untersucht (siehe auch Tabelle 3.3). Zum Vergleich stand Gewebe nicht transgener Geschwisterpaare (wt) zur Verfügung. Das ZNS wurde für die Untersuchung in Vorderhirn (Vh), Kleinhirn (Kh) und Rückenmark (Rm) aufgetrennt. Die Bande mit dem höchsten Molekulargewicht steht für eine Expression der transgenen TIMP-1 mRNA (TIMP-1tg), etwas tiefer tritt die Bande für die Wildtyp TIMP-1 mRNA (TIMP-1wt) auf. Die Bande mit dem niedrigsten Molekulargewicht entspricht der konstitutiv exprimierten ribosomalen Protein L32 mRNA und diente als Ladekontrolle. Die optische Dichte der Banden ermöglicht auch eine semiquantitative Aussage über eine mRNA-Expression. Kleinhirn der Mauslinie T2 nachgewiesen werden. Die Wildtyp-TIMP-1 mRNA Expression erreichte in der 3. Woche ein Maximum und nahm anschließend wieder auf das Niveau der 2. Woche ab. Die Wildtyp-Maus exprimierte weder transgene noch Wildtyp-TIMP-1 mRNA. - 61 Die erhöhte Expression von transgener TIMP-1 mRNA in der 1. Lebenswoche korrelierte mit dem ersten Auftreten von Leukozyten im Kleinhirn (Abbildung 4.19). Die anschließende Zunahme der Leukozyteninfiltrate könnte mit dem zusätzlichen Einsetzen der Wildtyp-TIMP1 mRNA und somit der hohen Konzentration an TIMP-1 im Kleinhirn in Verbindung gebracht werden. 4.4.4 Zeitkinetik der Zytokinexpression CD4 positive T-Helferzellen stellen eine primäre Quelle der Zytokinsynthese dar. Deshalb wurde in der Mauslinie T2 im Vergleich zur Wildtyp-Maus das Profil der Zytokinsynthese untersucht, wie auch eine mögliche Korrelation der Kinetik der Zytokinexpression mit der Kinetik der TIMP-1 mRNA Expression und dem Auftreten von Infiltrationen. Mittels RPA konnten in der Mauslinie T2 im Gegensatz zur Wildtyp-Maus folgende Zytokine nachgewiesen werden (Abbildung 4.21 und 4.22): Das Rückenmark wies eine leichte Expression von TNFβ, TNFα, IL1α und TGFβ auf. Allerdings traten diese nur innerhalb der ersten 14 Lebenstage auf. Dies entsprach dem Expressionsmuster der TIMP-1 mRNA. Während TNFβ, TNFα und IL1α in den 2 Wochen durchgehend exprimiert wurden, erschien TGFβ erst ab den 7. Lebenstag. Im Vorderhirn konnte durchgehend eine leichte Expression von TNFβ, TNFα, IL1α und TGFβ festgestellt werden. Dies korrelierte ebenfalls mit einer durchgehenden TIMP-1 mRNA Expression im Vorderhirn. Zytokine, die im Kleinhirn synthetisiert wurden, waren TNFβ, TNFα, IL1α, IFNγ, IL1β, IL3, TGFβ, IL12p40 und IL12p35. Das Ausmaß der Expression unterschied sich aber innerhalb der Zytokine. TNFβ, TNFα und IL1α wurden durchgehend exprimiert, TNFα jedoch am stärksten. IFNγ und IL1β waren nur bis zum 21. Lebenstag nachweisbar. IL3 trat am 21. Lebenstag auf und nahm am 28. Lebenstag bereits wieder ab. Am Beispiel von TGFβ erkennt man gut, wie die Expression vom ersten bis zum 21. Lebenstag zunahm und anschließend wieder abnahm. IL12p40 wurde ab den 14. Lebenstag nachgewiesen und IL12p35 ab dem 21. Lebenstag. Vergleicht man dieses Ergebnis mit der Kinetik der Expression von TIMP-1 mRNA, so korreliert dies in einem Punkt: Das Auftreten der Zytokine wird immer von einer TIMP-1 mRNA Expression begleitet. Jedoch macht das zeitlich unterschiedliche Zytokinmuster TIMP-1 als Ursache für die Zytokinproduktion unwahrscheinlich. - 62 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 Tage TNFβ TNFα IL4 IL5 IL1α IFNγ IL2 IL6 IL1β IL3 L32 Vh (wt) Kh (wt) Rm (wt) Vorderhirn (T2) Kleinhirn (T2) Rückenmark (T2) Abbildung 4.21: Kinetik der Zytokinexpression. Mittels RPA wurde in der Mauslinie T2 vom 1. bis zum 28. Lebenstag die zeitliche Expression von Zytokinen untersucht (siehe auch Tabelle 3.3). Zum Vergleich stand Gewebe nicht transgener Geschwisterpaare (wt) zur Verfügung. Das ZNS wurde für die Untersuchung in Vorderhirn (Vh), Kleinhirn (Kh) und Rückenmark (Rm) aufgetrennt. Die Beschriftungen der Banden finden sich in der Abbildung. Die Bande mit dem niedrigsten Molekulargewicht entspricht der konstitutiv exprimierten ribosomalen Protein L32 mRNA und diente als Ladekontrolle. Die optische Dichte der Banden ermöglicht auch eine semiquantitative Aussage über eine mRNA-Expression. 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 Tage IL3 IL10 GM-CSF TGFß IL13 IL12p40 IL12p35 IL7 L32 Vh Kh Rm (wt) Vorderhirn (T2) Kleinhirn (T2) Rückenmark (T2) Abbildung 4.22: Kinetik der Zytokinexpression. Mittels RPA wurde in der Mauslinie T2 vom 1. bis zum 28. Lebenstag die zeitliche Expression von Zytokinen untersucht (siehe auch Tabelle 3.3). Zum Vergleich stand Gewebe nicht transgener Geschwisterpaare (wt) zur Verfügung. Das ZNS wurde für die Untersuchung in Vorderhirn (Vh), Kleinhirn (Kh) und Rückenmark (Rm) aufgetrennt. Die Beschriftungen der Banden finden sich in der Abbildung. Die Bande mit dem niedrigsten Molekulargewicht entspricht der konstitutiv exprimierten ribosomalen Protein L32 mRNA und diente als Ladekontrolle. Die optische Dichte der Banden ermöglicht auch eine semiquantitative Aussage über eine mRNA-Expression. - 63 - 4.4.5 Klinische Merkmale: Verhaltensauffälligkeiten der Mauslinie T2 In Bezug auf die transgene Mauslinie T2 wurde bisher festgestellt, dass die Expression von TIMP-1 überwiegend in Kleinhirn und Hippocampus stattfindet. Dies wird von pathologischen Merkmalen begleitet wie zum Beispiel einer Leukozyteninfiltration im Kleinhirn und Hippocampus, einer Kleinhirn-Hypoplasie, einer Gliose im Kleinhirn und Hippocampus und Kalzifikationen im Kleinhirn. Vermutlich haben diese pathologischen Merkmale Einfluss auf die Funktion des Kleinhirns und des Hippocampus. Um dies näher zu untersuchen, wurde das Verhalten der transgenen Mauslinie mit Hilfe folgender Versuchsanordnungen untersucht. Bei diesen Versuchsanordnungen wurde das in Abbildung 4.23 dargestelltes Versuchsschema verwendet. 32 Mäuse, ca. 6 Wochen alt 16 wt 8♀ 8♂ 16 T2tg 8 ♀ 8♂ Abbildung 4.23: Mausmodell zur Untersuchung phänotypischer Verhaltensstörungen. Zur Verwendung kamen 32 Mäuse der Mauslinie T2, die alle ungefähr 6 Wochen alt waren. Davon waren 16 transgen (T2tg), 16 nicht-transgene Geschwister (wt) und davon jeweils wieder 8 weiblich und 8 männlich. 4.4.5.1 Open Field Mit Hilfe dieser Versuchsanordnung wurde das Verhalten der Mäuse auf einer freien Fläche untersucht. Ein Unterschied in der durchschnittlichen Aufenthaltsdauer in den 3 verschiedenen Zonen konnte festgestellt werden. Sowohl die Kontrolltiere als auch die transgenen Mäuse mieden die Erforschungszone, allerdings hielten sich die Kontrolltiere häufiger an der Wand auf als ihre transgenen Geschwister (Abbildung 4.24.A). Dieser signifikante Unterschied wurde weiter untersucht und die Zeit gemessen, die die Mäuse im Zentrum verbrachten (Abbildung 4.24.B). Die transgenen Mäuse hielten sich insgesamt länger im Zentrum auf. Auch ihr Explorationsverhalten war im Gegensatz zu den Kontrolltieren signifikant erhöht (Abbildung 4.24.C). Abbildung 4.24.D und E zeigt Ergebnisse der Untersuchung geradliniger Fortbewegung und Beschleunigung während der Fortbewegung bei Mäusen. Diese waren bei den transgenen Mäusen deutlich erniedrigt. - 64 - 60 10 8 Kontrolle Transgen 6 4 2 Mittelwert in sec Mittelwert in sec 12 A Durchschnittliche Zeit in den 3 Zonen 0 55 50 Kontrolle Transgen 45 40 35 30 25 e ü h t1 88 64 87 62 60 Kontrolle Transgen 56 54 52 Mittelwert in % 66 58 t2 t3 t4 D Geradlinige Fortbewegung C Explorationsverhalten Mittelwert in % B Durchschnittliche Zeit in der zentralen Zone 86 85 Kontrolle Transgen 84 83 82 81 80 50 79 48 t1 t2 t3 t1 t4 t2 t3 t4 Mittelwert in m/sec2 E Durchschnittliche Beschleunigung in Episoden der Fortbewegung ..28 ..26 ..24 Kontrolle Transgen ..22 ..20 .18 .16 t1 t2 t3 t4 Abbildung 4.24: Statistische Auswertungen des Open Field Tests. A: Blockdiagramm. Folgende Abkürzungen wurden benutzt: e, Erforschungszone; ü, Übergangszone; h, Heimzone. B-E: Kurvengraphiken. In t1-t4 wurden jeweils nacheinander die Ergebnisse von 5 min zusammengefasst. Weitere Erklärungen finden sich in den Abbildungen selbst. 4.4.5.2 Light-Dark Box Da die transgenen Mäuse im Open Field-Test einen höheren Erforschungsindex zeigten, wurde mit Hilfe der Light-Dark Box untersucht, ob dies an einer verminderten Ängstlichkeit lag. Sowohl die transgenen Mäuse als auch die Kontrolltiere verbrachten die gleiche Zeit in der nicht einsehbaren Zone (Abbildung 4.25.A). Jedoch zeigten sich Tendenzen einer Interaktion zwischen Geschlecht und Genotyp, wobei sich die weiblichen transgenen Mäuse der nicht einsehbaren Zone stärker hingezogen fühlten als die männlichen transgenen Mäuse - dasselbe Phänomen umgekehrt bei den Kontrollen. - 65 - A Zeit in der nicht einsehbarer Zone 7 6 5 Kontrolle Transgen 4 3 2 1 0 F M Mittelwert in sec Mittelwert in % 8 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 B Durchschnittliche Zeit in den 3 Zonen F, Kontrolle F, Transgen M, Kontrolle M, Transgen e ü h Abbildung 4.25: Statistische Auswertungen der Light-Dark Box. A-B: Blockdiagramme. Folgende Abkörzungen wurden verwendet: F, weiblich; M, männlich; e, Erforschungszone; ü, Übergangszone, h; Heimzone. Weitere Erklärungen finden sich in den Abbildungen selbst. Bei der Untersuchung der durchschnittlichen Aufenthaltsdauer in den 3 sichtbaren Zonen konnten keine Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Kontrolltieren festgestellt werden (Abbildung 4.25.B). Beide Linien mieden die Erforschungszone und bevorzugten die Übergangs- und Heimzone, wobei sich auch hier ein leicht gegensätzliches Verhalten zwischen dem Geschlecht und dem Genotypen zeigte. Folglich gab es keine Hinweise für eine verminderte Ängstlichkeit transgener Mäuse gegenüber Kontrolltiere. 4.4.5.3 Water Maze: Water maze cue navigation (WmCn) Bei diesem Versuch lernten die Mäuse auf eine sichtbare Plattform zu schwimmen. Abbildung 4.26 zeigt ein Beispiel eines Lernvorgangs einer Maus. Es stellte sich heraus, dass sowohl die transgenen Mäuse als auch die Kontrolltiere lernten, die Plattform zu erreichen. Unterschiede gab es in Bezug auf kreisende Bewegungen, welche bei den transgenen Tieren stärker ausgeprägt war (Abbildung 4.27.A) und auf die Schwimmgeschwindigkeit (Abbildung 4.27.B). Dort zeigte sich, dass anfangs die Schwimmgeschwindigkeit in beiden Mauslinien niedrig war, die Kontrolltiere im Vergleich zu den transgenen Mäusen diese jedoch im Verlauf der Experimente erheblich steigern konnten. Diese signifikanten Unterschiede hatten jedoch keinen Einfluss auf die durchschnittliche Zeit, die eine Maus brauchte um auf die Plattform zu schwimmen (Abbildung 4.27.C). Beide Mauslinien zeigten einen vergleichbaren Lerneffekt, denn die Zeit zum Erreichen der Plattform verkürzte sich von Experiment zu Experiment. Dieser Aspekt galt als Voraussetzung für die Durchführung des Water maze spatial reference & memory (WmRm). - 66 - Abbildung 4.26: Beispiel eines Versuchsverlaufs des WmCn. Eine Maus (schwarzer Punkt) wird insgesamt 12 × an verschiedenen definierten Stellen ins Wasser gelassen. Die Linien kennzeichnen den zurückgelegten Weg bis zur Plattform (schwarzes Viereck). Auch der Standort der Plattform wird mit jedem Durchgang gewechselt. Die weißen Vierecke zeigen den Standort des vorangegangenen Durchganges an. Hier, in diesem Beispiel erkennt man, dass die Maus nach dem ersten Versuch schnell gelernt hatte die sichtbare Plattform auf direktem Weg aufzusuchen. B Schwimmgeschwindigkeit A Kreiselnde Bewegungen 280 260 240 Kontrolle Transgen 220 200 180 160 140 ..25 ..24 Kontrolle Transgen ..23 ..22 ..21 ..20 b1 b2 b3 b4 b5 b6 b1 b2 b3 b4 b5 b6 Mittelwert in sec ..26 .19 120 80 Mittelwert in m/sec Mittelwert in °/m 300 C Zeit bis zum Auffinden der Plattform 70 60 50 Kontrolle Transgen 40 30 20 10 0 b1 b2 b3 b4 b5 b6 Abbildung 4.27: Statistische Auswertung des WmCn. A-C: Liniengraphiken. Jeder Messwert (b1-b6) stellt sich aus den Mittelwerten von 2 Versuchsdurchführungen zusammen. Weitere Erklärungen finden sich in den Abbildungen selbst. 4.4.5.4 Water Maze: Water maze spatial reference memory & reversal (WmRm) Bei diesem Versuch lernten Tiere der beiden Mauslinien auf eine nicht sichtbare Plattform zu schwimmen, deren Standort nach 3 Tagen verändert wurde. Die Abbildungen 4.28.A und B zeigen exemplarisch an einem Kontrolltier und an einer transgenen Maus den - 67 - A B - 68 Abbildung 4.28.A-B: WmRm. Repräsentative Darstellung der geschwommenen Wegstrecke einer Kontrolle (A) und einer transgenen Maus (B) in 30 Durchgängen: Eine Maus (schwarzer Punkt) wird an 5 Tagen (jede Reihe ein Tag) 6× ins Wasser gelassen. Die Zeit bis zum Auffinden der nicht sichtbaren Plattform (schwarzes Viereck) wird gemessen. Am 4. Tag wird der Standort der Plattform verändert. Das weiße Viereck stellt den vorangegangenen Standort dar. Die Linien in A kennzeichnen den zurückgelegten Weg einer Kontrollmaus, in B einer transgenen Maus. B Kreiselnde Bewegungen A Zeit bis zum Auffinden der Plattform 38 36 50 Kontrolle Transgen 40 30 20 Mittelwert in °/m Mittelwert in sec 60 34 32 30 Kontrolle Transgen 28 26 24 22 20 10 b01 b02 b03 b04 b05 b06 b07 b08 b09 b10 b11 b12 b13 b14 b15 b01 b02 b03 b04 b05 b06 b07 b08 b09 b10 b11 b12 b13 b14 b15 18 Mittelwert in sec 30 25 Kontrolle Transgen 20 15 10 5 t .8 D Kreuzen der trainierten Zone durch geschwommene Distanz .6 .4 Kontrolle Transgen ..2 0 -..2 -.4 t 19 t 20 t 21 t 23 t 24 t 26 t 27 t 28 t 29 0 Mittelwert in Anzahl/m C Zeit in den Zonen 35 k 40 35 30 Kontrolle Transgen 25 20 15 10 5 ZS FK CH ER TH ZU KR 0 FL Mittelwert der Zeit in % E Strategien 45 Abbildung 4.29.A-E: Statistische Auswertungen des WmRm. A-B: Liniengraphiken. Die Messwerte b01-b15 fassen jeweils die Mittelwerte von 2 Ereignissen zusammen. Beim Messwert b10 wurde der Standort der Plattform verändert. C: Blockdiagramm. Folgende Abkürzungen wurden verwendet: t, trainierte Zone; k, korrigierte Zone. D: Liniengraphik. Die Versuchsereignisse t19-t29 beziehen sich auf den letzten Teil des WmRm, bei dem ein neuer Standort der Plattform gesetzt wurde. E: Blockdiagramm. Folgendes Verhalten wurden untersucht: KR, Kreise ziehen; FL, sich treiben lassen/floaten; TH, Thigmotaxis; ZU; Zufall; ER, Erforschen; CH, check; FK, fokales Suchen; ZS, zielstrebiges Schwimmen. Weitere Erklärungen finden sich in den Abbildungen selbst. - 69 typischen Versuchsablauf. Die Kontrollmaus findet nach anfänglichen Schwierigkeiten die Plattform auf direktem Weg. Nach der Umlagerung der Plattform an eine neue Stelle wird diese ebenfalls gefunden, wobei immer wieder der Bereich aufgesucht wird, in dem sich die Plattform zuvor befand. Bei der transgenen Maus blieb das Auffinden der Plattform oft erfolglos. Auch erschien die Suche im Gegensatz zur Kontrolle unkoordiniert und zufällig. In Abbildung 4.29.A kann man erkennen, dass transgene Mäuse, aber auch Kontrolltiere anfänglich Mühe hatten, die Plattform zu finden. Bei beiden trat im Verlauf des Versuches ein Lerneffekt auf, der jedoch bei den Kontrolltieren stärker ausgeprägt war. Interessant ist die 19. und 20. Durchführung des Experiments, an dem der Standort der Plattform verändert wurde. Hier bewies die längere Dauer bis zum Auffinden der Plattform, dass sowohl in den Kontrolltieren als auch in den transgenen Mäusen ein Lernvorgang statt fand. Jedoch zeigte sich, dass transgene Mäuse anschließend größere Probleme hatten, die neue Plattform zu finden. Zusätzlich war während des Versuches auch der Loop-Index bei den transgenen Mäusen signifikant erhöht (Abbildung 4.29.B). Selbiges wurde schon im WmCu festgestellt. Zum Zeitpunkt der Änderung des Standortes der Plattform fällt auf, dass sich Kontrolltiere vor allem in der trainierten Zone aufhielten, aber weniger in der korrigierten Zone, was auch auf einen Lerneffekt hindeutete (Abbildung 4.29.C). Bei den transgenen Mäusen hingegen war dieser Unterschied zwischen den 2 Zonen nicht signifikant. Während des weiteren Versuchverlaufs neigten die Kontrolltiere dazu, die trainierte Zone weiterhin zu besuchen und sie zu kreuzen (Abbildung 4.29.D). Dies war bei den transgenen Tieren nur anfänglich der Fall. Bei der Untersuchung der Strategie, mit der die Plattform gesucht wurde (Abbildung 4.29.E), wiesen die transgenen Mäuse ein stärkeres fokales Suchen auf, jedoch oft an unpassenden Lokalisationen. Im Gegensatz dazu zeigten die Kontrolltiere ein zielstrebigeres Schwimmen und verstärktes Erforschen der Umgebung. 4.4.5.5 Rotarod In Abbildung 4.30.A und B sind die Ergebnisse bezüglich des Rotierens und des Fallens vom Rotationsrad dargestellt. Die Graphiken zeigen an, dass transgene Mäuse im ersten Versuchsablauf in ihrer Leistung vergleichbar zu den Kontrolltieren waren. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Fallrate und in der Rotationshäufigkeit. Jedoch konnten sich die Kontrolltiere bei den weiteren Versuchdurchgängen deutlich verbessern. Infolge des Trainings fielen sie immer weniger vom Rotationsrad und ließen sich seltener rotieren. Der Lerneffekt konnte auch bei der Mauslinie T2 beobachtet werden. Dieser war jedoch signifikant vermindert. - 70 - A Fallen vom Rotationsrad bei einer bestimmten Geschwindigkeit B Rotieren am Rotationsrad bei einer bestimmten Geschwindigkeit 220 220 200 180 Transgen Kontrolle 160 140 120 100 Mittelwert in m/sec Mittelwert in m/sec 240 200 180 160 Transgen Kontrolle 140 120 100 80 60 80 t1 t2 t3 t4 t1 t5 t2 t3 t4 t5 Abbildung 4.30.A-B: Statistische Auswertungen des Rotarod. A-B: Liniengraphiken. Die Messwerte t1-t5 stellen jeweils die durchgeführten Ereignisse dar, die y-Achse die Beschleunigung des Rotationsrad. Weitere Erklärungen finden sich in den Abbildungen. 4.4.5.6 Beurteilung der Ataxie Da ein Teil der Mauslinie T2 eine Ataxie aufwies, wurde die Schwere der Ataxie in einer Skala von 1 bis 4 durch zwei voneinander unabhängige Beobachter beurteilt. Dazu wurden die Mäuse für 1 min in einen großen Mauskäfig gelassen. Es zeigte sich ein Stärke der Ataxie signifikant erhöhtes Auftreten von Ataxie in den transgenen Mäusen (Abbildung 4.31). 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 Transgen Kontrolle 1 .5 0 -.5 Beobachtungen Abbildung 4.31: Auswertung der Ataxie an den Mauslinien. In der transgenen Linie wiesen 9 von 16 Mäusen leicht bis stark ausgeprägte Ataxie auf. Bei den Kontrollen konnte nur an 2 Tieren eine geringe Ataxie festgestellt werden. - 71 - 4.4.6 Experimentelle allergische Enzephalomyelitis in Mauslinie T11 Die Mauslinie T11 ist durch eine geringe TIMP-1 Expression im Großhirn und durch eine starke Expression im Rückenmark charakterisiert (siehe 4.3). Da eine Induktion der experimentellen allergische Enzephalomyelitis (EAE), ein Tiermodell der MS, eine Hochregulation von TIMP-1 im Rückenmark verursacht (Pagenstecher, A. et al. 1998), eignete sich das Expressionsmuster der Mauslinie T11 gut zur Untersuchung, ob und inwiefern eine konstitutive TIMP-1 Expression Einfluß auf die Pathogenese der EAE hat. Das Mausmodell, welches für die Untersuchung verwendet worden ist, wird in Abbildung 4.32 dargestellt. 31 Mäuse, ca. 5 Wochen alt 8 Kontrollen ohne pt 23 Mäuse mit pt 11 wt 8♀ 7♂ 12 T11tg 8 ♀ 8♂ Abbildung 4.32: Mausmodell der EAE. Zur Verwendung kamen 31 Mäuse der Mauslinie T11, die alle zwischen 8 und 12 Wochen alt waren. 8 Mäuse wurden als Kontrollen der EAE mitgeführt. Diese erhielten kein Pertussis Toxin (pt). 23 Mäuse erhielten eine komplette EAE-Induktion mit 250 ng Pertussis Toxin. Davon waren 12 TIMP-1-Transgen (T11tg) und 11 Wildtyp (wt) mit einer jeweils gleichen Aufteilung im Geschlecht. 4.4.6.1 Phänotypische Merkmale Nach der EAE-Induktion in der Mauslinie T11, wurde das Auftreten der Symptomatik über 9 Wochen hinweg dokumentiert. Die nachfolgenden Auswertungen führten zu folgenden Ergebnissen: bei dem Vergleich der Anzahl erkrankter Kontrolltiere und transgener Mäuse (Abbildung 4.33) zeigte sich, dass die Erkrankung bei der Mauslinie T11 einen Tag früher einsetzte, die Gesamtrate der Erkrankungen jedoch gleich war. Allerdings nahm der Anteil der Erkrankungen in der Wildtyp-Maus auf 45% kontinuierlich ab, während sich die transgenen Mäuse auf einen hohen Wert zwischen 83 und 75% hielten. Zusätzlich wurde der Anteil krank gebliebener wie auch ausgeheilter Tiere untersucht (Abbildung 4.34). In der Wildtyp-Maus zeigte sich eine Remissionsrate von 50%. Im Gegensatz dazu blieben 90% der transgenen Mäuse krank, und nur in 10% fand eine Remission statt. P ro zen t - 72 - 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 wt+pt tg+pt 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 Tage nach Induktion Abbildung 4.33: Anteil erkrankter Tiere in Prozent. Die Liniengraphik zeigt den Verlauf der Erkrankungen über 9 Wochen hinweg. Dabei wurden für die Auswertung nur die Wildtyp-Maus (wt) und die Transgenen (tg) berücksichtigt, die eine komplette EAE mit 250 ng Pertussis Toxin (pt) erhielten. Tiere mit EAE ohne Pertussis Toxin Injektionen wurden aus der Auswertung ausgeschlossen. Diese dienten der Kontrolle und zeigten keine EAE-Symptomatik. Weitere Erklärungen finden sich in der Abbildung. 1 Prozent 0,8 Prozentsatz erkrankter Tiere 0,6 Prozentsatz der Tiere, die wieder gesund wurden 0,4 Prozentsatz der Tiere, die krank blieben 0,2 0 Wild-Typ Transgen Abbildung 4.34: Verlauf erkrankter Tiere in Prozent. Im Blockdiagramm werden die Prozentsätze der ausgeheilten und der krank gebliebenen Mäuse in Bezug auf die Gesamterkrankungen dargestellt. Weitere Erklärungen finden sich in der Abbildung. Als nächstes wurde im EAE-Experiment bei den Kontrolltieren sowie bei der transgenen Mauslinie T11 die Schwere der neurologischen Symptome untersucht. Den verschiedenen neurologischen Symptomen wurden die Schweregrade von 1-5 zugeordnet: 1- Schwanzlähmung, 2- leichte Paraparese und/oder Ataxie der Hinterbeine, 3- schwere Paraparese der Hinterbeine, 4- Tetraparese und 5- Moribund (diese Tiere wurden aus Gründen des Tierschutzes getötet). Es zeigte sich, dass die Symptome in der transgenen Mauslinie gegenüber denen der Kontrolltiere stärker ausgeprägt waren (Abbildung 4.35) Diese befanden - 73 sich nach vollem Ausbruch der Erkrankung zwischen einem Mittelwert von 2-2,5. In den Kontrolltieren lag der Mittelwert des klinischen Schweregrades akut bei 2,3 und pendelte sich im Verlauf der Erkrankung auf einen Wert von 1,5 ein. Aus den Beobachtungen kann somit von einer verstärkten klinischen Symptomatik der Mauslinie T11 während einer EAEInduktion ausgegangen werden. Mittelwert klin. Schwere 3 2,5 2 wt+pt 1,5 tg+pt 1 0,5 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 Tage nach Induktion Abbildung 4.35: Schweregrad erkrankter Tiere. Die Liniengraphik zeigt den Verlauf der Mittelwerte der klinischen Schweregrade 0-5 (1- Schwanzlähmung, 2- leichte Paraparese und/oder Ataxie der Hinterbeine, 3schwere Paraparese der Hinterbeine, 4- Tetraparese, 5- Moribund) über 9 Wochen hinweg. Dabei wurden für die Auswertung nur die Wildtyp-Maus (wt) und die Transgenen (tg) berücksichtigt, die eine vollständige EAE mit 250 ng Pertussis Toxin (pt) erhielten. Tiere mit EAE ohne Pertussis Toxin Injektionen wurden aus der Auswertung ausgeschlossen. Diese dienten der Kontrolle und zeigten keine EAE-Symptomatik. Weitere Erklärungen finden sich in der Abbildung. - 74 - 5. DISKUSSION 5.1 Phänotypische Auswirkungen einer konstitutiven zerebralen TIMP-1 Expression sind konzentrationsabhängig Charakteristika der TIMP-1 Expression wurden in den Mauslinien T2, T7 und T11 ermittelt. Wir konnten zeigen, dass verschiedene transgene Mauslinien die jeweils höchste Konzentration von TIMP-1 im Kleinhirn (T2), im Vorderhirn (T7) oder im Rückenmark (T11) exprimierten. Unter physiologischen Bedingungen zeigte allerdings nur die transgene Mauslinie T2 histologische Auffälligkeiten. Diese fanden sich im Kleinhirn, korrelierend mit einer dort lokalisierten hohen TIMP-1 Expression. Im Vergleich zur Mauslinie T2, wiesen die Mauslinien T7 und T11 eine deutlich geringere Expression von TIMP-1 im Kleinhirn auf. Ihre Konzentrationen reichten offensichtlich nicht aus, um ebenfalls pathologische Veränderungen im Kleinhirn zu verursachen. Die weiteren untersuchten Bereiche des Gehirns, wie das Vorderhirn und das Rückenmark waren jedoch in allen Mauslinien unauffällig. In diesen ZNS-Arealen wurden jeweils nur geringere TIMP-1 Konzentrationen nachgewiesen. Aus diesen Beobachtungen schlossen wir eine Konzentrationsabhängigkeit TIMP-1 vermittelter Effekte. Diese Vermutung könnte mit TIMP-1 spezifischen Inhibitoren bekräftigt werden, bei deren Einsatz die histologischen Auffälligkeiten im Kleinhirn der Mauslinie T2 nicht mehr vorhanden sein sollten. Des Weiteren gibt es in der Literatur zahlreiche Belege für eine konzentrationsabhängige Wirksamkeit der TIMP-Familie: Die maximale Wirkung der Wachstumsfaktor-Aktivität von humanem TIMP-1 wurde in verschiedenen Zellinien von Mensch und Rind bei einer Konzentration von 100 ng/ml erreicht (Hayakawa, T. et al. 1994). Chromek, M. et al. 2004 zeigten, dass das Wachstum von E. coli im Blut mit einer Konzentration von 500 ng/ml humanen TIMP-1 signifikant inhibiert wurde, einhergehend mit einer signifikanten Steigerung der metabolischen Aktivität von humanen Granulozyten. Boulday, G. et al. 2004 bewiesen die Konzentrationsabhängigkeit der antiapoptotischen Wirkung von TIMP-1 in humanen Endothelzellen. So konnte rekombinantes humanes TIMP-1 bei einer Konzentration von 250 ng/ml maximal anti-apoptotisch auf humane Endothelzellen wirken, die mit TNFα. und Cycloheximid vorbehandelt wurden. Hayakawa, T. et al. 1992 zeigten, dass humanes TIMP-2 dagegen schon bei einer Konzentration von 10 ng/ml seine maximale Wirkung als Wachstumsfaktor in verschiedenen Zellinien von Mensch, Rind und Maus entfaltete. - 75 - 5.2 Phänotypische Merkmale bei konstitutiver TIMP-1 Expression 5.2.1 Leukozyteninfiltrate Bei der histologischen Untersuchung der transgenen Mauslinie T2 wurden im Kleinhirn und im Hippocampus ausgeprägte Leukozyteninfiltrate gefunden. Diese Infiltrate bestanden aus CD4+ und CD8+ T-Zellen, Makrophagen und vereinzelt B-Zellen. Unsere Untersuchungen zeigten eine zeitabhängige Entwicklung dieser Infiltrate: Das Gehirn neugeborener T2-Mäuse war zunächst unauffällig. Erste Infiltrate traten im Kleinhirn und im Hippocampus nach einer Woche auf, steigerten sich aber massiv im Verlauf der folgenden 2 Wochen. Die Fähigkeit von TIMP-1 Leukozyten zu rekrutieren und Entzündungsreaktionen zu fördern wird in der Literatur nur spärlich erwähnt (siehe Kapitel 5.4). Allerdings muss kritisch hinterfragt werden, inwiefern diese Leukozyteninfiltrationen tatsächlich mit einer TIMP-1 Expression zusammenhängen. Folgende Beobachtung im TIMP-1 transgenem Mausmodell spricht jedoch für den Entzündungs-fördernden Aspekt von TIMP-1: Leukozyteninfiltrationen waren nur in ZNS-Arealen hoher konstitutiver, transgener TIMP-1 Expression lokalisiert. Des Weiteren besteht eine Korrelation der Leukozyteninfiltration und der Zeitkinetik der TIMP-1 mRNA Expression: Die Zunahme der Expression transgener TIMP-1 mRNA im postnatalen Kleinhirn transgener Mäuse wird begleitet von einer Zunahme der Leukozyteninfiltrate. Die hohe konstitutive Expression von transgenem TIMP-1 könnte also eine ursächliche Rolle für die Leukozyteninfiltrationen spielen. Das gleichzeitige Einsetzen der Wildtyp-TIMP-1 mRNA spiegelt am ehesten die Reaktion auf eine Entzündung wieder, da Entzündungen im ZNS selbst zu einer Hochregulation von TIMP-1 führen (Pagenstecher, A. et al. 1998; Suryadevara, R. et al. 2003). TIMP-1 wird dabei von vielen Zellen exprimiert, die in Entzündungen involviert sind, wie zum Beispiel von Astrozyten und von infiltrierenden Zellen (Pagenstecher, A. et al. 1998; Suryadevara, R. et al. 2003; Zhou, J. et al. 2005). Weiterhin passen in das Entzündungs-fördernde Bild von TIMP-1 auch unsere Ergebnisse der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) mit verstärktem klinischen Verlauf bei ausgeprägter Symptomatik und verminderter Ausheilungschance (siehe Kapitel 5.4). Unsere Befunde korrelieren gut zu einem Mausmodell der Kollagen-induzierten Arthritis, in dem ebenfalls klinische Symptomatik und histologisch/ radiologisch entzündliche Veränderungen durch eine Überexpression von TIMP-1 verstärkt werden konnten (Apparailly, F. et al. 2001). Als mögliche Ursache für die Leukozyteninfiltrate der transgenen Mauslinie T2 wurde eine Störung der Blut-Hirn Schranke in Betracht gezogen. Bei der Untersuchung der Blut-Hirn- - 76 Schranke adulter T2 Mäuse konnte jedoch im Vergleich zur Wildtyp-Maus keine erhöhte Durchlässigkeit gefunden werden. Diese Beobachtung stimmt mit Berichten überein, die TIMP-1 eine verstärkte Stabilisierung der Blut-Hirn-Schranke zuschreiben. So konnte durch TIMP-1 die Transmigration von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten signifikant inhibiert werden (Prat, A. et al. 2002; Alter, A. et al. 2003; Séguin, R. et al. 2003; Chromek, M. et al. 2004). Ähnliche Effekte erreichte man auch durch den Einsatz von MMP Inhibitoren (Leppert, D. et al. 1995; Matyszak, M.K. and Perry, V.H. 1996). Um die Störung der BlutHirn-Schranke als mögliche Ursache der Leukozyteninfiltration auszuschließen, muss ihre Entwicklung in den ersten Lebenswochen noch untersucht werden, da sich die Blut-HirnSchranke bei Wildtyp-Mäusen erst in der 2. postnatalen Woche ausbildet (Brett, F. et al. 1995). Möglicherweise führt eine konstitutive TIMP-1 Expression zu einer verzögerten Entwicklung der Blut-Hirn-Schranke, was die Invasion von Leukozyten in das ZNS-Gewebe erleichtern würde. Als weitere mögliche Ursache der Leukozyteninfiltation könnte auch ihre direkte Aktivierung in Betracht gezogen werden. So zeigten Chromek, M. et al. 2004, dass bei einer Konzentration von 500 ng/ml die Aktivität von Granulozyten signifikant gesteigert werden konnte. 5.2.2 Kalzifikationen, Gliose und Demyelinisierung Im Kleinhirn der Mauslinie T2 wurden Kalzifikationen beobachtet, welche ab der 2. Lebenswoche auftraten und in den nachfolgenden 2 Wochen deutlich zunahmen. Die Kalzifikationen stellen bereits womöglich eine spezifische Antwort auf die Präsenz von proinflammatorischen Zytokinen dar, von denen bekannt ist, dass sie von Leukozyten gebildet und sezerniert werden und als interzelluläre Mediatoren zur Aktivierung weiterer Leukozyten beitragen. Tatsächlich wird in transgenen Mausmodellen die Expression von IFNα (Akwa, Y. et al. 1998), IL12 und IFNγ (Corbin, J.G. et al. 1996; Pagenstecher, A. et al. 2000; Hofer, M. et al. 2004) von Kalzifikationen begleitet. Parallel dazu konnten wir im Kleinhirn der transgenen Mauslinie T2 als Zeichen einer aktiven Entzündung eine Expression von IL12 und IFNγ nachweisen und somit die Anwesenheit von Verkalkungen erklären. Weitere Auffälligkeiten im Kleinhirn der Mauslinie T2 wie die Gliose und die Demyelinisierung könnten ebenfalls eine Reaktion auf die massive Inflammation darstellen (Corbin, J.G. et al. 1996; LeFerla, F.M. et al. 2000; Pagenstecher, A. et al. 2000). - 77 5.2.3 Kleinhirnhypoplasie Gehirnpräparate der Mauslinie T2 wiesen eine deutliche Hypoplasie des Kleinhirns auf. Verkleinerte Hemisphären und ein hypoplastischer Wurmfortsatz wurden beobachtet. Infolge dessen traten die Colliculi inferiores und superiores stark hervor. MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Entwicklung des Nervensystems (Yong, V.W. et al. 2001). Da TIMP-1 die MMP-Aktivität hemmt, könnte man folgern, dass die konstitutive TIMP-1 Expression die Kleinhirnhypoplasie bedingt und die normale Entwicklung des Kleinhirns behindert. Histologische Untersuchungen in postnatalem Kleinhirn transgener Mäuse zeigten jedoch im Vergleich zur Wildtyp-Maus keine Unterschiede in der Entstehung der Molekular-, der Purkinjezell- und der Körnerzellschicht. Zudem wurde die postnatale Zellmigration von äußerer nach innerer Körnerzellschicht anscheinend nicht gestört. Somit scheinen dem Verlust der Körnerzellschicht andere Ursachen zu Grunde zu liegen. Als nächstes untersuchten wir apoptotische Vorgänge im Kleinhirn. Mittels TUNEL-Reaktion konnten im Vergleich zur Wildtyp-Maus vermehrt apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich am ehesten um neuronale Zellen, da Apoptose auch in nicht infiltrierten Bereich des Gewebes gefunden wurden. Weiterhin scheint auch der zeitliche Verlauf der Apoptose für neuronale Zellen zu sprechen, da Apoptose nur im Verlauf der 2. und 3. Woche nachgewiesen wurde, während die Leukozyten über Wochen hinweg anwesend waren. Die Kleinhirnhypoplasie könnte also Folge vermehrter Apoptose sein. Ein Zusammenhang zwischen den apoptotischen Vorgängen in den Körnerzellen und TIMP-1 als Förderer der Apoptose wurde bisher nicht beschrieben, da im Gegenteil viele Veröffentlichungen belegen, dass TIMP-1 Zellen vor einer Apoptose schützt (Guedez, L. et al. 1998; Li, G. et al. 1999; Chromek, M. et al. 2004) und ihr Überleben fördert (Oelmann, E. et al. 2002; Boulday, G. et al. 2004). Dies erklärte zumindest, warum infiltrierende Zellen im Kleinhirn mit verminderter Apoptose reagierten. Die Frage nach der Ursache der apoptotischen Vorgänge in der Körnerzellen trotz einer hohen TIMP-1 Expression konnte nicht eindeutig beantwortet werden. Untersuchungen mit Hilfe der ISH zeigten allerdings eine nicht gleichmäßige Verteilung der lokalisierten TIMP-1 Expression im Kleinhirn. Der apoptotische Schutz durch TIMP-1 scheint somit nicht auf alle Zellen im Kleinhirn wirken zu können. Wir vermuten, dass die Ursache der Apoptose und somit der Kleinhirnhypoplasie im Zusammenhang mit der akuten Inflammation zu sehen ist. Die histologisch sichtbaren starken Gewebsdestruktionen durch die Leukozyteninfiltration und die Kalzifikationen können zu Störungen und zu bleibenden Schäden des Kleinhirns geführt haben. - 78 - 5.3 TIMP-1 nimmt möglicherweise Einfluss auf die Entwicklung und Physiologie des zentralen Nervensystems Das Kleinhirn und der Hippocampus erfüllen verschiedene Aufgaben. Die Funktionen des Kleinhirns bestehen in der Aufrechterhaltung des normalen Tonus der Skelettmuskulatur und des Körpergleichgewichts, Einzelbewegungen und in der in der Regulierung Zusammenfassung zu der Innervationsgröße geordneten, der kombinierten Bewegungsabläufen. Der Hippocampus dient als endokrines und vegetativ-nervöses Regulationssystem. Er spielt eine Rolle bei Trieb- und Instinkthandlungen, bei der affektiven Tönung des Gesamtverhaltens, bei emotionalen Reaktionen und bei Gedächtnis- und Lernfunktionen. Histologische Untersuchungen von Kleinhirn und Hippocampus der transgenen Mauslinie T2 weisen bereits darauf hin, dass diese Organe bei TIMP-1 Überexpression in ihrer Funktion beeinträchtigt sein könnten. Diese Möglichkeit wurde mittels folgender Beobachtungen überprüft: Tatsächlich wies die transgene Mauslinie T2 eine Ataxie auf, offensichtlich aufgrund der Ausbildung einer schweren Inflammation im Kleinhirn. Die transgene Mauslinie T2 zeigte zudem ein signifikant erhöhtes Explorationsverhalten. Im Gegensatz dazu konnten im Bezug auf die Ängstlichkeit keine Unterschiede festgestellt werden und Folgeversuche (WmCn, Rotationsrad) zeigten, dass transgene Mäuse dieser Linie ein normales Lernverhalten aufwiesen. Unterschiede erkannte man jedoch bei Zunahme des Schwierigkeitsgrades der Versuche (WmRm, Rotationsrad). Die angelernte Aktivität konnte nicht über ein bestimmtes Maß hinaus verbessert und adäquat eingesetzt werden. Wie Reeves, T.M. et al. 2003 mittels intraventrikulärer Infusion eines unspezifischen MMP-Inhibitors bei iatrogen verletzten Rattenhirn zeigten, wird die Synaptogenese durch die Anwesenheit der MMPs bestimmt. Des Weiteren beschrieben Kaczmarek, L. et al. 2002 eine entscheidende Rolle der MMPs bei der Reorganisation synaptischer Verbindungen. Eine TIMP-1 Überexpression im Hippocampus, wie sie in der transgenen Mauslinie T2 vorliegt, könnte diese ständige Reorganisation von Synapsenverbindungen stören und somit zu Beeinträchtigungen der Gedächtnis- und Lernfunktion zu führen. 5.4 Rolle der konstitutiven Expression von TIMP-1 in der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) – TIMP-1 und Inflammation Die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell der Multiplen Sklerose (MS). In vielen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass die MMPExpression zur Pathologie der MS beiträgt: MMPs führen zu einem Zusammenbruch der - 79 Blut-Hirn-Schranke und zu Gewebeläsionen (Rosenberg, G.A. et al. 1992; Chandler, S. et al. 1997). Der Eintritt von Lymphozyten in das ZNS wird dadurch erleichtert (Leppert, D. et al. 1995; Yong, V.W. et al. 2001). Zusätzlich verdauen MMPs basisches Myelinprotein (MBP) (Chandler, S. et al. 1995). Die dabei entstehenden Fragmente des MBP induzieren bzw. verstärken das Krankheitsbild der EAE (Opdenakker, G. and Van Damme, J. 1994). MMPs können ebenfalls die Umwandlung inaktiver pro-inflammatorischer Zellen in ihre aktive Form fördern, und führen so zu einem Anstieg von TNF-α (Black, R.A. et al. 1997; English, W.R. et al. 2000), das nachweislich bei MS im Blut und Liquor erhöht ist. TNF ist ein potentes proinflammatorisches Zytokin, dessen Inhibition zu einer Reduktion der Schwere der EAE führt (Baker, D. et al. 1994). Gleichfalls führt der Einsatz von MMP-Inhibitoren zu einer deutlichen Verbesserung der EAE Symptomatik (Gijbels, K. et al. 1994; Hewson, A.K. et al. 1995; Clements, J.M. et al. 1997). So ist es nicht überraschend, dass eine knockout Mauslinie für MMP-9 in einem Alter bis zu 4 Wochen weniger anfällig für die Entwicklung der EAE ist (Dubois, B. et al. 1999). Interessant war dabei auch die Beobachtung, dass jenseits der 4 Wochen im Vergleich zur Wildtyp-Maus keine Unterschiede im Verlauf einer EAE bestanden, was einmal mehr auf die breite und komplexe Überlappung der MMP-Wirkung hinweist. In diesem Projekt sollte untersucht werden, inwiefern TIMPs als Gegenspieler der MMPs Entzündungen, wie die bei der EAE, eindämmen könnten. Unter normalen Bedingungen wird TIMP-1 weder im Rückenmark, noch im Klein- oder Vorderhirn stark exprimiert. Pagenstecher, A. et al. 1998 zeigten, dass TIMP-1 im EAE-Modell bei symptomatischen und bei Mäusen in Remission im Rückenmark stark hochreguliert wird. Auch das Kleinhirn zeigte eine deutliche TIMP-1 Expression auf. Das induzierte TIMP-1 war in reaktiven Astrozyten in der Umgebung von lymphozytären Infiltrationen lokalisiert. Pagenstecher, A. et al. 1998 schlussfolgerten, dass diese Aufregulation geeignet sein könnte, die Gewebeschädigung zu vermindern. Dadurch könnte die Ausbreitung der Entzündung verzögert oder gar unterbunden werden. Diese Mutmaßungen werden durch Ozenci, V. et al. 1999 und Waubant, E. et al. 1999 unterstützt, welche zeigten, dass TIMP-1 zur Eindämmung der durch MMPs hervorgerufenen ZNS-Schädigung beiträgt. Crocker, S.J. et al. 2006 gingen ebenfalls von einer zytoprotektiven Funktion von TIMP-1 aus. Mittels einer EAE-Induktion an TIMP-1 knockout Mäusen stellten sie im ZNS dieser Mäuse eine verstärkte Infiltration von Leukozyten und eine anhaltende Myelinschädigung fest. Eine Induktion von TIMP-1 während Entzündungsvorgängen schien erforderlich um das Ausmaß der Gewebsschädigung im ZNS - 80 einzudämmen. Die Beteiligung von TIMP-1 in der Regulation von Leukozyteninfiltration und von Mikroglia-Aktivierung wurde dabei angenommen. Im hier beschriebenen Projekt sollte nun festgestellt werden, inwiefern eine konstitutive TIMP-1 Expression im Rückenmark Einfluss auf die Pathogenese der EAE hat. Entgegen der Annahme einer protektiven Funktion von TIMP-1 in der EAE, stellte sich allerdings heraus, dass die transgene Mauslinie T11, welche TIMP-1 im Rückenmark exprimierte, im Vergleich zur Wildtyp-Maus einen schwereren klinischen Verlauf zeigte. Dies äußerte sich in mehreren Beobachtungen: Die Erkrankung setzte früher ein, die Schwere der Symptomatik war gesteigert und nur bei 10% der erkrankten Tiere kam es zu einer Spontanremission. Parallel dazu führt eine konstitutive Expression von TIMP-1 im Cerebellum, wie sie bei der transgenen Mauslinie T2 beobachtet wird, zu vermehrten Leukozyteninfiltraten (siehe Kapitel 5.2.1). Diese gemeinsamen Beobachtungen scheinen einer rein protektiven Funktion von TIMP-1 zu widersprechen. Somit steht unser EAE Experiment auf dem ersten Blick in Widerspruch zu den Ergebnissen von Crocker, S.J. et al. 2006 (siehe oben). So zeigten doch Crocker, S.J. et al. 2006 die Notwendigkeit der Anwesenheit von TIMP-1 im EAE Experiment, um einer Gewebsschädigung entgegen zu wirken. Jedoch waren erstaunlicherweise in den TIMP-1 knockout Mäusen im Vergleich zur Wild-Typ Maus trotz der histologischen Auffälligkeiten keine signifikanten Unterschiede im klinischen Erscheinungsbild und dem EAE Verlauf zu erkennen. Eine mögliche Erklärung bestand in der Annahme einer Resistenz der Axone gegenüber induzierter Schädigung bei TIMP-1 knockout Mäusen. Diese Annahme wurde durch Jourquin, J. et al. 2005 unterstützt, der für TIMP-1 knockout Mäuse eine Resistenz in Bezug auf Kainat induzierter Hippocampus-Schädigung feststellte. Die konstitutive Expression von TIMP-1 in unserer transgenen Mauslinie T11 scheint im Vergleich zur WildTyp Maus die verstärkte Ausbildung neurologischer Symptome bei ähnlichem histologischem Erscheinungsbild zu ermöglichen, deren Mechanismen noch nicht geklärt sind. Tatsächlich wird die protektive Funktion der TIMPs in der Literatur kontrovers diskutiert. So beobachteten Chromek, M. et al. 2003 bei Kindern mit akuter Pyelonephritis einen verstärkten entzündlichen Verlauf der Erkrankung im Falle einer erhöhten Konzentration von TIMP-1 im Urin im Vergleich zu der von MMP-9. Auch das Mausmodell der Kollageninduzierten Arthritis (Apparailly, F. et al. 2001) sollte an dieser Stelle nochmals erwähnt werden (siehe Kapitel 5.2.1). Mehrere Mechanismen könnten den entzündungsfördernden Aspekt bei einer konstitutiven TIMP-1 Expression in unserem Mausmodell erklären: - 81 Toft-Hansen, H. et al. 2003 zeigten eine typische MMP-, ADAM- und TIMP-Konstellation während der EAE. Für MMP-8, -10, -12, ADAM-12 und TIMP-1 wurde erst während einer EAE eine signifikante Hochregulation festgestellt. Die jedoch schon vorbestehende konstitutive TIMP-1 Überexpression in unserem EAE-Modell der transgenen Mauslinie T11 verhindert möglicherweise durch Inhibition von MMPs die Ausheilung und Regeneration des neuralen Gewebes. MMPs sind somit nicht nur Förderer der Entzündung, sondern sind auch an protektiven Regulationsprozessen beteiligt, wie zum Beispiel an der Beendigung der Inflammation oder der Förderung der Restauration von geschädigtem Gewebe (Yong, V.W. et al. 2001). Weitere Mechanismen, die einen schwereren klinischen Verlauf bei TIMP-1 transgenen Mäusen im EAE-Modell erklären könnten und auf die anschließend im Einzelnen näher eingegangen wird, sind das Zusammenspiel einer direkten Aktivierung der Leukozyten durch TIMP-1, ihr Schutz vor Apoptose und ihr Festhalten im Gewebe durch Inhibition ihrer Migration über die Basalmembran. Chromek, M. et al. 2004 beschrieben die direkte Aktivierung von humanen Granulozyten durch TIMP-1 und gingen somit von einer bis dahin noch recht unbekannten Zytokin-ähnlichen Eigenschaft von TIMP-1 aus. Der antiapoptotische Effekt von TIMP-1 ist schon länger bekannt. So inhibiert TIMP-1 die Apoptose humaner B-Zellen der Burkittlymphom Zellinien (Guedez, L. et al. 1998) oder humaner Granulozyten (Chromek, M. et al. 2004). Des Weiteren belegen viele Studien die durch TIMP-1 hervorgerufene Hemmung der Migration immunaktiver Zellen durch die Basalmembran: Alter, A. et al. 2003 zeigten, dass TIMP-1 signifikant die Migration humaner B-Zellen durch die aus menschlichem Gehirn gewonnenen Endothelzellen verringerte. Aktivierte dendritische Zellen haben wichtige Funktionen in der Einleitung antigenspezifischer Immunantwort und haben die Fähigkeit fast jedes Gewebe zu durchqueren, indem sie vermehrt MMPs sezernieren und die Expression von TIMP-1 und -2 herunterregulieren (Osman, M. et al. 2002). Mit Hilfe eines unspezifischen MMP-Inhibitors konnte ihre Migration gehemmt werden (Osman, M. et al. 2002), wie die der humanen TZellen (Leppert, D. et al. 1995). Die Anwesenheit der MMPs ist auch bei der Migration natürlicher Killerzellen bedeutend (Kitson, R.P. et al. 1998). Wir gehen davon aus, dass in unserem EAE-Modell durch erhöhte TIMP-1 Expression immunaktive Zellen im Gewebe zurückgehalten und stimuliert werden, und sie somit ein Prozess exzessiver Gewebsschädigung hervorrufen. Integrine regulieren diverse zelluläre Prozesse wie die Zelladhäsion, die Zellmotilität, Proliferation und Überleben. Jung, K.K. et al. 2006 zeigten eine CD63 abhängige Bindung von TIMP-1 mit ß1 Integrin an der Zelloberfläche von humanen Epithelzellen der Brust. Diese Epithelzellen bildeten in einem dreidimensionalen - 82 Matrigel eine geordnete Struktur, ähnlich die der Brustdrüse. Eine TIMP-1 Überexpression zerstörte die geordnete Struktur der Epithelzellen und inhibierte die Apoptose- beides jedoch wichtige Elemente für die Formierung und Erhaltung der Brustdrüsenstruktur. In Bezug auf unser EAE-Modell kann vermutet werden, dass, indem die Aktivität der Integrine moduliert wird, die erhöhte TIMP-1 Expression die Regeneration des entzündeten neuronalen Gewebes stört. Damit könnte sich auch der prolongierte Verlauf der Erkrankung erklären lassen. Des Weiteren gelang Pfistershammer K. et al. 2004 der Nachweis einer erhöhten CD63 Expression bei aktivierten Lymphozyten. Zusammen mit den Ergebnissen von Jung, K.K. et al. 2006 stellt sich die Frage, ob TIMP-1 ein physiologischer Ligand von CD63 bei Leukozyten darstellt und somit eine Aktivierung der Zelllinie bewirkt und ihre Differenzierung und Zellüberleben reguliert- eine mögliche und wichtige Erklärung für den Entzündungsfördernden Aspekt in TIMP-1 transgenen Mäusen. Clark, I.M. et al. 1994 konnte eine durch TIMP-1 verursachte Sekretion von MMPs in humanen Fibroblasten der Haut und der Synovia zeigen. Somit wäre abschließend eine weitere Überlegung zum Entzündungsbild in unserem transgenen Tiermodell wert, die annimmt, dass durch die konstitutive TIMP-1 Expression und somit durch die Störung der TIMP-1- und MMP-Balance bestimmte Bedingungen geschaffen wurden, was wiederum eine Sekretion von MMPs stimuliert. 5.5 Wechselwirkungen zwischen MMPs und TIMP-1 – ein komplexes System Der pathologische Phänotyp im Kleinhirn transgener T2 Mäuse ist stark ausgeprägt. Er ist charakterisiert durch Leukozyteninfiltrate, Gewebedestruktionen, Kalzifikationen, Demyelinisierung, Gliose und Hochregulation von proinflammatorischen Zytokinen. Die transgene Mauslinie T11 zeigte im EAE-Modell einen verstärkten klinischen Verlauf. Wir vermuten, dass die konstitutive TIMP-1 Expression der transgenen Mäuse diese nicht erwarteten pathologischen Erscheinungsbilder erklärt. Es ist bekannt, dass MMPs in Neuroinflammation und neuronalen Schäden verwickelt sind (Yong, V.W. et al. 2001; Jourquin, J. et al. 2003). Eine erhöhte MMP und eine erniedrigte TIMP-1 Expression korreliert zum Beispiel bei der MS mit einer Verschlechterung der Prognose (Ozenci, V. et al. 1999; Waubant, E. et al. 1999; Yong, V.W. et al. 2001; Waubant, E. et al. 2001). Bekannt ist auch, dass eine erhöhte MMP Aktivität den Hergang einer Entzündung erleichtert (Yong, V.W. et al. 2001). Da TIMP-1 ein Gegenspieler der MMP Aktivität ist und es im ZNS bei Entzündungen hochreguliert wird, geht man von ihren - 83 positiven und hilfreichen Effekten bei Entzündungen aus. Demgegenüber stehen jedoch nun die Ergebnisse dieser Arbeit und die Veröffentlichungen von Chromek, M. et al. 2004 und Apparailly, F. et al. 2001 (siehe Kapitel 5.4). Daraus könnte geschlossen werden, dass im Mittelpunkt der Problematik die Balance zwischen MMP und TIMP steht (die weiteren biologischen Aktivitäten von TIMP werden hier nicht berücksichtigt). Eine TIMP-1 Überexpression führt möglicherweise zu einer zu starken Stabilisierung der EZM, wodurch im Falle einer Entzündung, aktivierte Leukozyten im Gewebe festgehalten werden. Da sie zusätzlich noch von einer anti-apoptotischen Wirkung durch TIMP-1 geschützt werden (Guedez, L. et al. 1998; Chromek, M. et al. 2004) und eine gewisse MMP Aktivität zur Beendigung einer Entzündung beiträgt (Yong, V.W. et al. 2001), führen diese Mechanismen zu einer übermäßigen Gewebsdestruktion und Aufrechterhaltung einer Entzündung. Diese unterschiedlichen Ergebnisse der Auswirkungen von TIMP-1 zeigten sich ebenfalls in vielen Studien über Tumoren. Durch eine TIMP-1 abhängige Hemmung der MMPs wird die EZM stabilisiert und die Angiogense unterbunden, und somit das Tumorwachstum, die Tumorinvasion und Metastasenbildung gehemmt (Gomez, D.E. et al. 1997). Des Weiteren zeigten transgene Mauslinien mit TIMP-1 Überexpression erhöhte Resistenz gegenüber Gehirnmetastasen einer Fibrosarkom-Zellinie (Krüger, A. et al. 1998) und Suppression einer Antigen-induzierten Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms (Martin, D.C. et al. 1996). Im Widerspruch hierzu stehen Berichte über pro-neoplastische Effekte durch TIMP-1. Dabei korreliert eine erhöhte Expression von TIMP-1 mRNA mit der Malignität und der schlechten klinischen Prognose bei verschiedenen humanen Tumoren, wie zum Beispiel beim nonHodgkin Lymphom (Kossakowska, A.E. et al. 1991; Kossakowska, A.E. et al. 1993) oder beim kolorektalen Karzinom (Zeng, Z.S. et al. 1995). Diese Effekte werden hier möglicherweise nicht durch MMP-Inhibition verursacht, sondern könnten durch eine TIMPeigene Wirkung zu erklären sein. 5.6 Klinische Perspektiven und die Gefahren Trotz dieser kontroversen Beobachtungen und Schlussfolgerungen werden die Eigenschaften von MMPs und TIMPs verwendet, um nach neuen Therapieansätzen zu suchen, welche die Progression von entzündlichen Krankheiten oder Tumoren beeinflussen oder ihren Rückgang fördern. Dabei kommen vor allem Methoden zum Einsatz, welche MMPs in ihrer Aktivität inhibieren oder die lokale TIMP Konzentration durch Gentransfer oder durch Zugabe rekombinanten Proteins erhöhen. Präklinische Studien verlaufen durchaus erfolgversprechend. Durch den Einsatz synthetischer MMP-Inhibitoren konnten in - 84 verschiedenen MS-Modellen bei Mäusen und Ratten, wie die EAE und die DTH, ein MSähnliches Modell bei Ratten, das Ausmaß der ZNS-Inflammation und Gewebsschädigung reduziert werden (Gijbels, K. et al. 1994; Matyszak, M.K. and Perry, V.H. 1996; Clements, J.M. et al. 1997). Unter ähnlichen Bedingungen wurden ebenfalls Tumorwachstum und Tumorinvasion eines humanen malignen Glioms reduziert (Price, A. et al. 1999). Weitere Mausmodelle zeigten eine Abnahme der Tumor-Malignität, in die humane, mit TIMP-1 Genen behandelte Zellinien eines Kolonkarzinoms (Yamauchi, K. et al. 2001), eines Magenkarzinoms (Watanabe, M. et al. 1996), eines Pankreaskarzinoms (Bloomston, M. et al. 2002) transplantiert wurden. Rekombinantes humanes TIMP inhibierte die KollagenDegradation und Metastasierung einer embryonalen Zellinie der Ratte, die eine hohe metastatische Aktivität aufwies (Alvarez, O.A. et al. 1990). Klinische Studien mit MMPInhibitoren zeigten jedoch Nebenwirkungen wie z.B. Entzündungserscheinung bzw. führten zu keinen therapeutischen Vorteilen bei Behandlung humaner Karzinome (Coussens, L.M. et al. 2002). Dies deckt sich mit unseren Beobachtungen, dass TIMP-1 Überexpression das Entzündungsmodell negativ beeinflusst. Folglich ist es nicht überraschend, dass kontroverse klinische Studien die Überlebenschancen mal verschlechtert (Coussens, L.M. et al. 2002, Sparano, J. et al. 2004), mal verbessert (Evans, J.D. et al. 2001, Bramhall, S.R. et al. 2002; Rosenbaum, E. et al. 2005) zeigten. Es veranschaulicht umso mehr die multiplen und komplexen Funktionen von TIMP-1, die noch zu erforscht bleiben. 5.7 Weiterführung des Projekts Zurzeit werden weitere TIMP-1 transgene Mauslinien hergestellt. Diese sollten zur Überprüfung unserer Ergebnisse herangezogen werden. An den neuen TIMP-1 transgenen Mauslinien soll untersucht werden, ob ähnliche pathologische, Merkmale, wie sie in der Mauslinie T2 nachgewiesen wurden, beobachtet werden können. Gleichzeitig kann dadurch ausgeschlossen werden, dass der Phänotyp der Mauslinie T2 durch die Integration des TIMP1 Transgenkonstruktes in das Genom mit daraus folgernder Störung der physiologischen Genexpression zustande gekommen ist. Durch die verschiedenen transgenen Mauslinien erhoffen wir uns auch Rückschlüsse auf die Abhängigkeit des Phänotyps von der Höhe der TIMP-1 Konzentration in den verschiedenen ZNS-Arealen ziehen zu können. Parallel dazu beschäftigt uns die Frage, ob die Kleinhirnhypoplasie der transgenen Mauslinie T2 eine Folge der Leukozyteninfiltrationen darstellt oder ob sie in direktem Zusammenhang zu einer TIMP-1 Expression steht. Um hierüber Aussagen machen zu können, wird eine - 85 weitere transgene Mauslinie auf der Basis einer Maus mit Disruption des Rag2 Genes etabliert, die keine funktionsfähigen Lymphozyten aufweisen. Durch den Einsatz spezifischer TIMP-1 Inhibitoren in der transgenen Mauslinie T2 könnten die phänotypischen Auffälligkeiten auf die Abhängigkeit von TIMP-1 untersucht werden. Unsere Untersuchungen im transgenen Mausmodell zeigten unerwartete Auswirkungen einer konstitutiven TIMP-1 Expression im ZNS. Sie haben einmal mehr verdeutlicht, dass TIMP-1 im Mittelpunkt eines komplexen Systems steht, welches noch zu erforschen bleibt. Vieles ist noch nicht geklärt worden. Wir erhoffen uns auf lange Sicht Einblicke in die Wirkungsweisen von TIMP-1 und das Zusammenspiel mit ihren Mediatoren zu erhalten. Somit könnten in Zukunft in klinischen Studien synthetische Inhibitoren oder analoge Substanzen gezielter eingesetzt werden, um gravierende Nebenwirkungen zu vermeiden. Mit Spannung werden wir diese Weiterentwicklung verfolgen. - 86 - 6. LITERATURVERZEICHNIS Akwa, Y., Hassett, D.E., Eloranta, M.L., Sandberg, K., Masliah, E., Powell, H., Whitton, J.L., Bloom, F.E. and Campbell, I. (1998). Transgenic expression of IFN-α in the central nervous system of mice protects against lethal neurotropic viral infection but induces inflammation and neurodegeneration. J. Immunol., vol.161:5016-5026. Alter, A., Duddy, M., Hebert, S., Biernacki, K., Prar, A., Antel, J.P., Yong, V.W., Nuttall, R.K., Pennington, C.J., Edwards, D.R. and Bar-Or, A. (2003). Determinants of human B cell migration across brain endothelial cells. J. Immunol., vol.170:4497-4505. Alvarez, O.A., Carmichael, D.F., DeClerck, Y.A. (1990). Inhibtion of collagenolytic activity and metastasis of tumor cells by a recombinant human tissue inhibitor of metalloproteinases. J. Natl. Cancer Inst., vol.82:589-595. Amberg, V.R., Avellana-Adalid, V., Hensel, T., Baron-van, E.A. and Schwab, M.E. (1997). Oligodendrocyte-type 2 astrocyte progenitors use a metalloendoprotease to spread and migrate on CNS myelin. Eur. J. Neurosci., vol.9:151-162. Apparailly, F., Noël, D., Millet, V., Baker, A.H., Lisignoli, G., Jacquet, C., Kaiser, M.J., Sany, J. and Jorgensen, C. (2001). Paradoxical effects of tissue inhibitor of metalloproteinases 1 gene transfer in collagen-induced arthritis. Arthritis & Rheumatism, vol.44:1444-1454. Baker, D., Butler, D., Scallon, B.J., O´Neill, J.K., Turk, J.L. and Feldmann, M. (1994). Control of established experimental allergic encephalomyelitis by inhibition of tumor necrosis factor (TNF) activity within the central nervous system using monoclonal antibodies and TNF receptor-immunoglobulin fusion proteins. Eur. J. Immunol., vol.24:2040-4048. Baker, A.H., Edwards, D.R. and Murphy, G. (2002). Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities. J. Cell Sci., vol.115:3719-3727. Bartsch, S., Bartsch, U., Dörries, U., Faissner, A., Weller, A., Ekblom, P. and Schachner, M. (1992). Expression of tenascin in the developing and adult cerebellar cortex. J. Neurosci., vol.12:736-749. Black, R.A., Rauch, C.T., Kozolsky, C.J., Peschon, J.J., Slack, J.L., Wolfson, M.F., Castner, B.J., Stocking, K.L., Reddy, P., Srinivasan, S., Nelson, N., Boiani, N., Schooley, K.A., Gerhart, M., Davis, R., Fitzner, J.N., Johnson, R.S., Paxton, R.J., March, C.J. and Ceretti, D.P. (1997). A metalloproteinase disintegrin that releases tumor-necrosis factor-alpha from cells. Nature., vol.385(6618):729-733. Blaess, S., Graus-Porta, D., Belvindrah, R., Radakovits, R., Pons, S., Littlewood-Evans, A., Senften, M., Guo, H., Li, Y., Miner, J.H., Reichardt, L.F. and Müller, U. (2004). β1-Integrins are critical for cerebellar granule cell precursor proliferation. J. Neurosci., vol.24:3402-3412. Bloomston, M., Shafii, A., Zervos, E.E. and Rosemurgy, A. (2002). TIMP-1 overexpression in pancreatic cancer attenuates tumor growth, decreases implantation and metastasis, and inhibits angiogenesis. J. Surg. Res., vol.102:39-44. - 87 Boujrad, N., Ogwuegbu, S.O., Garnier, M., lee, C.H., Martin, B.M. and Papadopoulos (1995). Identification of a stimulator of steroid hormone synthesis isolated from testis. Science, vol.268:1609-1612. Boulday, G., Fitau, J., Coupel, S., Soulillou, J.P. and Charreau, B. (2004). Exogenous tissue inhibitor of metalloproteinase-1 promotes endothelial cell survival through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/akt pathway. Ann. N.Y. Acad. Sci., vol.1030:28-36. Bramhall, S.R., Hallissey, M.T., Whiting, J., Scholefield, J., Tierney, G., Stuart, R.C., Hawkins, R.E., McCulloch, P., Maughan, T., Brown, P.D., Baillet, M. and Fielding, J.W. (2002). Marimastat as maintenance therapy for patients with advanced gastric cancer: a randomised trial. Br. J. Cancer, vol.86:1864-1870. Brett, F.M., Andrew, P., Powell, H.C. and Campbell, I.L. (1995). Evolution of neuropathologic abnormalities associated with blood-brain barrier breakdown in transgenic mice expressing interleukin-6 in astrocytes. J. Neuropath. Exp. Neurol., vol.54:766-775. Brew, K., Dinakarpandian, D., Nagase, H. (1999). Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochemica et Biophysica Acta, vol.1477:267-283. Chandler, S., Coates, R., Gearing, A.J.H., Lury, J., Wells, G. and Bone, E. (1995). Metalloproteinases degrade myelin basic protein. Neurosci. Letters, vol.201:223-226. Chandler, S., Miller, K.M., Clements, J.M., Lury, J., Corkill, D., Anthony, D.C.C., Adams, S.E. and Gearing A.J.H. (1997). Matrix metalloproteinases, tumor necrosis factor and multiple sclerosis: an overview. J. Neuroimmunol., vol.72:155-161. Chesler, L., Golde, D.W., Bersch, N. and Johnson, M.D. (1995). Metalloproteinase inhibition and erythroid potentiation are independent activities of tissue inhibitor of metalloproteinases1. Blood, vol.86:4506-4515. Chromek, M., Tullus, K., Hertting, O., Jaremko, G., Khalil, A., Li, Y.H. and Brauner, A. (2003). Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in acute pyelonephritis and renal scarring. Pediatr. Res., vol.53:698-705. Chromek, M., Tullus, K., Lundahl, J. and Brauner, A. (2004). Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 activates normal normal human granulocytes, protects them from apoptosis, and blocks their transmigration during inflammation. Infection and Immunity, vol.72:82-88. Chun, D., Gall, C.M., Bi, X. and Lynch, G. (2001). Evidence that integrins contribute to multiple stages in the consolidation of long term potentiation in rat hippocampus. Neuroscience, vol.105:815-829. Clark, I.M., Powell, L.K. and Cawston, T.E. (1994). Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-1) stimulates the secretion of collagenase from human skin fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.203:874-880. Clements, J.M., Cossins, J.A., Wells, G.M., Corkill, D.J., Helfrich, K., Wood, L.M., Pigott, R., Stabler, G., Ward, G.A., Gearing, A.J. and Miller, K.M. (1997). Matrix metalloproteinase expression during experimental autoimmune encephalomyelitis and effects of a combined - 88 matrix metalloproteinase and tumor necrosis factor-alpha inhibitor. J. Neuroimmunol., vol.74:85-94. Corbin, J.G., Kelly, D., Rath, E.M., Baerwald, K.D., Suzuki, K. and Popko, B. (1996). Targeted CNS expression of interferon-gamma in transgenic mice leads to hypomyelination, reactive gliosis, and abnormal cerebellar development. Mol. Cell Neurosci., vol.7:354-370. Coussens, L.M., Fingleton, B. and Matrisian, L.M. (2002). Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trails and tribulations. Science, vol.295:2387-2392. Crocker, S.J., Whitmire, J.K., Frausto, R.F., Chertboonmuang, P., Soloway, P.D., Whitton, J.L. and Campbell I.L. (2006). Persistent macrophage/microglial activation and myelin disruption after experimental autoimmune encephalomyelitis in tissue inhibitor of metalloproteinase-1-deficient mice. J. of Pathology, vol.169:2104-2116. DeClerck, Y.A., Perez, N., Shimda, H., Boone, T.C., Langley, K.E., Taylor, S.M. (1992). Inhibtion of invasion and metastasis in cell transfected with an inhibitor of metalloproteinases. Cancer Res., vol.52:701-708. DeClerck, Y.A. and Imren, S. (1994). Protease inhibitors: role and potential therapeutic use in human cancer. Eur. J. Cancer, vol.14:2170-2180. Dubois, B., Masure, S., Hurtenbach, U., Paemen, L., Heremans, H., Van den Oord, J., Sciot, R., Meinhardt, T., Hämmerling, G., Opdenakker, G. and Arnold, B. (1999). Resistance of young gelatinase B-deficient mice to experimental encephalomyelitis and necrotizing tail lessions. J. Clin. Invest., vol.104:1507-1515. English, W.R., Puentes, X.S., Freije, J.M.P., Knäuper, V., Amour, A., Merryweather, A., Lopez-Otin, C. and Murphy, G. (2000). Membrane type 4 matrix metalloporteinase (MMP17) has tumor necrosis factor-α convertase activity but does not activate pro-MMP2. J. Biol. Chem., vol.275:14046-14055. Evans, J.D., Stark, A., Johnson, C.D., Daniel, F., Carmichael, J., Buckels, J., Imrie, C.W., Brown, P, and Neoptolemos, J.P. (2001). A phase II trial of marimastat in advanced pancreatic cancer. Br. J. Cancer, vol.85:1865-1870. Fassina, G., Ferrari, N., Brigati, C., Benelli, R., Santi, L., Noonan, D.M. and Albini, A. (2000). Tissue inhibitors of metalloproteinases: Regulation and biological activities. Clinical and Experimental Metastasis, vol.18:111-120. Froelichsthal-Schoeller, P., Vescovi, A.L., Krekoski, C.A., Murphy, G., Edwards, D.R. and Forsyth, P. (1999). Expression and modulation of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinases in human embryonic CNS stem cells. Neuroreport, vol.10:345-351. Gasson, J.C., Golde, D.W., Kaufman, S.B., Westbrook, C.A., Hewick, R.M., Kaufman, R.J., Wong, G.G., Temple, P.A., Leary, A.C., Brown, E.L., Orr, E.C. and Clarck, S.C. (1985). Molecular characterization and expression of the gene encoding human erythroid-potentiating activity. Nature, vol.315:768-771. - 89 Gijbels, K., Galardy, R.E. and Steinmann, L. (1994). Reversal of experimental autoimmune encephalomyelitis with a hydroxamate inhibitor of matrix metalloproteinases. J. Clin. Invest., vol.94:2177-2182. Golde, D.W., Bersch, N., Quau, S.G. and Lusis, A.J. (1980). Production of erythroidpotentiating activity by a human T-lymphoblast cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.77:593-596. Gomez, D.E., Alonso, D.F., Yoshiji, H., and Thorgeirsson, U.P. (1997). Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. E. J. Of Cell Biology, vol.74:111-122. Gomis-Rüth, F.-X., Maskos, K., Betz, M., Bergner, A., Huber, R., Suzuki, K., Yoshida, N., Nagase, H., Brew, K. Bourenkov, G.P., Bartunik, H., and Bode, W. (1997). Mechanism of inhibition of the human metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature, vol.389:77-81. Green, J., Wang, M., Liu, Y.E., Raymond, L.A., Rosen, C. and Shi, Y.E. (1996). Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinse 4. J. Biol. Chem., vol.271:30375-30380. Guedez, L., Stetler-Stevenson, W.G., Wolff, L., Wang, J., Fukushima, P., Mansoor, A. and Stetler-Stevenson, M. (1998). In Vitro supression of programmed cell death of B cells by tissue inhibitor of metalloproteinases-1. J. Clin. Investig., vol.102:2002-2010. Guedez, L., Courtemanch, L. and Stetler-Stevenson, M. (1998). Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 induces differantiation and an antiapoptotic phenotype in germinal center B cells. Blood, vol.92:1342-1349. Hayakawa, T., Yamashita, K., Tanzawa, K., Uchijima, E. and Iwata, K. (1992). Growth promoting activity of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) for a wide range of cells. FEBS Lett., vol.298:29-32. Hayakawa, T., Yamashita, K., Ohuchi, E. and Shinagawa, A. (1994). Cell growth-promoting activity of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2). J. of Cell Science, vol.107:23732379. Hewson, A.K., Smith, T., Leonard, J.P. and Cuzner, M.L. (1995). Suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the Lewis rat by the matrix metalloproteinase inhibitor Ro31-9790. Inflamm. Res., vol.44:345-349. Hobbs, M.V., Weigle, W.O., Noonan, D.J., Torbett, B.E., McEvilly, R.J., Koch, R.J., Cardenas, G.J., and Ernst, D.N. (1993). Patterns of cytokine expression by CD4+ T cells from young and old mice. J. Immunol., vol.150:3602-3614. Hofer, M., Hausmann, J., Staeheli, P. and Pagenstecher, A. (2004). Cerebral expression of interleukin-12 induces neurological disease via differential pathways and recruits antigenspecific T cells in virus-infected mice. Am. J. Pathol., vol.165:949-958. Johnson, M.D., Kim, H.R.C., Chesler, L. Tsao-Wu, G., Bouck, N. and Polverini, P.J. (1994). Inhibition of angiogenesis by tissue inhibitor of metalloproteinases. J. Cell. Physiol., vol.160:194-202. - 90 Jourquin, J., Tremblay, E., Decanis, N., Charton, G., Hanessian, S., Chollet, A.M., Le Diguardher, T., Khrestchatisky, M. and Rivera, S. (2003). Neuronal activity-dependent increase of net matrix metalloproteinase activity is associated with MMP-9 neurotoxity after kainite. Eur. J. Neurosci., vol.18:1507-1517. Jung, K.K., Liu X.W., Chirco, R., Fridman, R. and Choi Kim, H.R. (2006). Identification of CD63 as a tissue inhibitor of metalloptroteinase-1 interacting cell surface protein. EMBO J., vol.25:3934-3942. Kaczmarek, L., Lapinska-Dzwonek, J. and Szymczak, S. (2002). Matrix metalloproteinases in the adult brain physiology: a link between c-Fos, AP-1 and remodeling of neuronal connections? J. Europ. Mol. Biol. Organization, vol.21:6643-6648. Kieseier, B.C., Seifert, T., Giovannoni G. and Hartung, H.P. (1999). metalloproteinases in inflammatory demyelination. Neurology, vol.53:20-25. Matrix Kitson, R.P., Appasamy, P.M., Nannmark, U., Albertsson, P., Gabauer, M.K. and Goldfarb, R.H. (1998). Matrix metalloproteinases produced by rat IL-2-activatedNK cells. J. Immunolgy, vol.160:4248-4253. Kossakowska, A.E., Urbanski, S.J. and Edwards, D.R. (1991). Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) RNA is expressed at elevated levels in malignant nonHodgkin`s lymphomas. Blood, vol.77:12475-12481. Kossakowska, A.E., Urbanski, S.J., Watson, A., Hayden, L.J. and Edwards, D.R. (1993). Patterns of expression of metalloproteinases and their inhibitors in human malignant lymphomas. Oncology Res., vol.5:19-28. Krüger, A., Sanchez-Sweetman, O.H., Martin, D. C., Fata, J.E., Ho, A.T., Orr, F.W., Rüther, U. and Khokha, R. (1998). Host TINP-1 overexpression confers resistance to experimental brain metastasis of a fibrosarcoma cell line. Oncogene, vol.16:2419-2423. LaFerla, F.M., Sugarman, M.C., Lane, T.E. and Leissring, M.A. (2000). Regional hypomyelination and dysplasia in transgenic mice with astrocyte-directed expression of interferon-gamma. J. Mol. Neurosci., vol.15:45-59. Lafleur, M.A., Hansley, M.M. and Edwards, D.R. (2003). Metalloproteinases and their inhibitors in angiogenese. Exp. Rev. Mol. Med., vol.5:1-39. Lamoreaux, W.J., Fitzgerald, M.E., Reiner, A., Hasty, K.A. and Charles, S.T. (1998). Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro. Microvasc. Res., vol.55:29-42. Leco, K.J., Apte, S.S., Taniguchi, G.T., Hawkes, S.P. Khokha R., Schultz, G.A. and Edwards, D.R. (1997). Murine tissue inhibitor of metalloproteinases-4 (TIMP-4): CDNA isolation and expression in adult mouse tissue. FEBS Lett., vol.401:213-217. Lee, R., Kermani, P., Teng, K.K. and Hempstead, B.L. (2001). Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins. Science, vol.294:1945-1948. - 91 Leppert, D., Waubant, E., Galardy, R., Bunnett, N.W. and Hauser, S.L. (1995). T cell gelatinases mediate basement membrane transmigration. In vitro. J. Immunol., vol.154:43794389. Li, G., Fridmann, R. and Kim, H.R.C. (1999). Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 inhibits apoptosis of human breast epithelial cells. Cancer Res., vol.59:6267-6275. Liesi, P., Hager, G., Dodt, H.U., Seppala, I., and Zieglgangsberger, W. (1995). Domainspecific antibodies against the B2 chain of laminin inhibit neuronal migration in the neonatal rat cerebellum. J. Neurosci. Res., vol.40:199-206. Martin, D.C., Rüther, U., Sanchez-Sweatman, O.H., Orr, F.W. and Khokha, R. (1996). Inhibition of SV40 T antigen-induced hepatocellular carcinoma in TIMP-1 transgenic mice. Oncogene, vol.13(3):569-576. Matyszak, M.K. and Perry, V.H. (1996). Delayed-type hypersensitivity lesions in the central nervous system are prevented by inhibitors of matrix metalloproteinases. J. Neuroimmunol., vol.69:141-149. Murphy, G., Houbrechts, A., Cockett, M.I., Williamson, R.A., O`Shea, M., Docherty, A.J. (1991). The N-terminal domain of tissue inhibitor of metalloproteinasesretains metalloproteinase inhibitory activity. Boichemistry, vol.30:8097-8102. Nagase, H. and Brew, K. (2002). Engineering of tissue inhibitor of metalloproteinases mutants as potential therapeutics. Arthritis Res., vol.4:S51-S61. Nagase, H. and Woessner Jr., J.F. (1999). Matrix Metalloproteinases. J. Biol. Chem., vol.274:21491-21494. Oelmann, E., Herbst, H., Zühlsdorf, M., Albrecht, O., Nolte, A., Schmitmann, C., Manzke, O., Diehl, V., Stein, H. and Berdel, W.E. (2002). Tissue inhibitor of metalloproteinases 1 is an autocrine survival factor, with additional immune-regulatory functions, expressed by Hodgkin/Reed-Sternberg cells. Neoplasia, vol.99:258-267. Oh, L.Y.S., Larsen, P.H., krekoski, C.A., Edwards, D.R., Donovan, F., Werb, Z. and Yong V.W. (1999). Matrix Metalloproteinase-9/Gelatinase B is required for process outgrowth by oligodendrocytes. J. of Neuroscience., vol.19(19):8464-8475. Olson, T.M., Hirohata, S., and Ye, J. (1998). Cloning of human tissue inhibitor of metalloproteinases-4 gene (TIMP4) and localization of the TIMP4 and Timp4 genes to human chromosome 3p25 and mouse chromosome 6, respectively. Genomics, vol.51:148-151. Opdenakker, G. and Van Damme, J. (1994). Cytokine-regulated proteases in autoimmune diseases. Immunol. Today, vol.15:103-107. Osman, M., Tortorella, M., Lomdei, M. and Quaratino, S. (2002). Expression of metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases define the migratory characteristics of human monocyte-derived dendritic cells. Immunology, vol.105:73-82. Formatie (Großbrita - 92 Ozenci, V., Rinaldi, L., Teleshova, N., Matusevicius, D., Kivisakk, P., Kouwenhoven, M. and Link, H. (1999). Metalloproteinases and their tissue inhibitors in multiple sclerosis. J. Autoimmun., vol.12:297-303. Pagenstecher, A., Stalder, A.K., and Campell, I.L. (1997). RNase protection assays for the simultaneous and semiquantitative analysis of multiple murine matrix metalloproteinases (MMP) and MMP inhibitor mRNAs. J. of Immunol. Meth., vol.206:1-9. Pagenstecher, A., Stalder, A.K., Kincaid, C.L., Shapiro ,S.D., and Campbell, I.L. (1998). Differential expression of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase genes in the mouse central nervous system in normal and inflammatory states. Am. J. of Pathology, vol.152:729-741. Pagenstecher, A., Lassmann, S., Carson, M.C., Kincaid, C.L., Stalder, A.K. and Campbell, I.L. (2000). Astrocyte-targeted expression of IL-12 induces active cellular immune responses in the central nervous system and modulates experimental allergic encephalomyelitis. J. of Immunol., vol.164:4481-4492. Formatie (Deutschla Pfistershammer, K., Majdic, O., Stockl, J., Zlabinger, G., Kirchberger, S., Steinberger, P. and Knapp, W. (2004). CD63 as an activation-linked T-cell costimulatory element. J. of Immunol., vol.173:6000-6008. Porter, J.F., Shen, S. and Denhardt, D.T. (2004). Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 stimulates proliferation of human cander cells by inhibiting a metalloproteinase. J. of Neuropathol. Exp. Neurol., vol.60:598-612. Prat, A., Biernacki, K., Lavoie, J.F., Poirier, J., Duquette, P. and Antel, J.P. (2002). Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch. Neurol., vol.59:391-397. Formatie (Großbrita Price, A., Shi, Q., Morris, D., Wilcox, M.E., Brasher, P.M.A., Rewcastle, N.B., Shalinsky, D., Zou, H., Appelt, K., Johnston, R.N., Yong, V.W., Edwards, D. and Forsyth, P. (1999). Marked inhibition of tumor growth in a malignant glioma tumor model by a novel synthetic matrix metalloproteinase inhibitor AG3340. Clin. Cancer Res., vol.5:845-854. Rauer, M., Pagenstecher, A., Schulte-Monting, J. and Sauder, C. (2002). Upregulation of chemokine receptor gene expression in brains of Borna disease virus (BDV)-infected rats in the absence and presence of inflammation. J. Neurovirol., vol.8(3):168-179. Reeves, T.M., Prins, M.L., Zhu, J.P., Povlishock, J.T. and Phillips, L.L. (2003). Matrix metalloproteinase inhibitor alters functional and structural correlates of deafferentationinduced sprouting in the dentate gyrus. J. Neurosci., vol.23:10182-10189. Rohrbough, J., Grotewiel, M.S., Davis, R.L. and Broadie, K. (2000). Integrin-mediated regulation of synaptic morphology, transmission, and plasticity. J. Neurosci., vol.20:68686878. Rosenbaum, E., Zahurak, M., Sinibaldi, V., Carducci, M.A., Pili, R., Laufer, M., DeWeese, T.L. and Eisenberger, M.A. (2005). Marimastat in the treatment of patients with biochemically relapsed prostate cancer: a prospective randomized, double-blind, phase I/II trial. Cli. Cancer Res., vol.11:4437-4443. Formatie (Großbrita - 93 Rosenberg, G.A., Kornfeld, M., Estrada, E., Kelley, R.O., Liotta, L.A. and Stetler-Stevenson, W.G. (1992). TIMP-2 reduces proteolytic opening of blood-brain barrier by type IV collagenase. Brain Res., vol.576: 203-207. Séguin, R., Biernacki, K., Rotondo, R.L., Prat, A. and Antel, J.P. (2003). Regulation and functional effects of monocyte migration across human brain-derived endothelial cells. J Neuropath. Exp. Neurol., vol.62:412-419. Sparano, J.A., Bernardo, P., Stephenson, P., Gradishar, W.J., Ingle, J.N., Zucker, S. and Davidson, N.E. (2004). Randomized phase III trial of marimastat versus placebo in patients with metastatic breast cancer who have responding or stable disease after first-line chemotherapy: eastern cooperative oncology group. J. Clin. Oncol., vol.22:4683-4690. Sugita, S., Saito,F., Tang, J., Satz, J., Campbell, K. And Sudhof, T.C. (2001). A stoichiometric complex of neurexins and dystroglycan in brain. J. Cell Biol., vol.154:435-445. Suryadevara, R., Holter, S., Borgmann, K., Persidsky, R., Labenz-Zink, C., Persidsky, Y., Gendelmann, H.E., Wu, L. and Ghorpade, A. (2003). Regulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by astrocytes: links to HIV-1 dementia. Glia, vol.44:47-56. Thorgeirrsson, U.P., Yoshiji, H., Sinha, C.C. and Gomez, D.E. (1996). Breast cancer; tumor neovasculature and the effect of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) on angiogenesis. In Vivo, vol.10:137-144. Toft-Hansen, H., Nuttall, R.K., Edwards, D.R. and Owens, T. (2004). Key metalloproteinases are expressed by specific cell types in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. of Immunol., vol.173:5209-5218. Vaillant, C., Didier-Bazès, M., Hutter, A., Belin, M.F. and Thomasset, N. (1999). Spatioteporal expression patterns of metalloproteinases and their inhibitors in the postnatal developing rat cerebellum. J. Neurosci., vol.19(12):4994-5004. Visse, R. and Nagase, H. (2003). Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases: Structure, Function and Biochemistry. Circ. Res., vol.92:827-839. Vu, T.H. and Werb, Z. (2000). Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiologie. Genes & Development, vol.14:2123-2133. Wang, M., Liu, Y.E., Greene, J., Sheng, S., Fuchs, A., Rosen, E.M. and Shi, Y.E. (1997). Inhibition of tumor growth and metastasis of human breast cancer cells transfected with tissue inhibitor of metalloproteinase 4. Oncogene, vol.14: 2767-2774.) Waubant, E., Goodkin, D.E., Gee, L., Bacchetti, P., Sloan, R., Stewart, T., Andersson, P.B., Stabler, G. and Miller, K. (1999). Serum MMP-9 and TIMP-1 levels are related to MRI activity in relapsing multiple sclerosis. Neurology, vol.53:1397-1401. Waubant, E., Gee, L., Miller, K., Stabler, G. and Goodkin, D. (2001). IFN-β1a may increase serum levels of TIMP-1 in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. J. Interferon and Cytokine Res., vol.21:181-185. - 94 Watanabe, M., Takahashi, Y., Ohta, T., Mai, M., Sasaki, T. and Seiki, M. (1996). Inhibition of metastasis in human gastric cancer cells transfected with tissue inhibitor of metalloproteinase 1 gene in nude mice. Cancer, vol.77:1676-1680. Yamada, E., Tobe, T., Yamada, H., Okamoto, N., Zack, D.J., Werb, Z., Soloway, P.D. and Campochiaro, P.A. (2001). TIMP-1 promotes VEGF-induced neovascularization in the retina. Histol. Histopathol., vol.16:87-97. Yamauchi, K., Ogata, Y., Nagase, H. and Shirouzu, K. (2001). Inhibition of liver metastasis from orthotopically implanted colon cancer in nude mice by transfection of the TIMP-1 gene into KM12SM cells. Surg. Today, vol.31:791-798. Yong, V.W., Power, C., Forsyth, P. and Edwards, D.R. (2001). Metalloproteinases in biologie and pathologie of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci., vol:502-511. Zeng, Z.S., Cohen, A.M., Zhang, Z.F., Stetler-Stevenson, W. and Guillem, J.G. (1995). Elevated tissue inhibitor of metalloproteinase 1 RNA in colorectal cancer stroma correlates with lymph node and distant metastases. Clin. Cancer Res., vol.1:899-906. Zhou, J., Marten, N.W., Bergmann, C.C., Macklin, W.B., Hinton, D.R. and Stohlmann, S.A. (2005). Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor during viral encephalitis. J. of Virology, vol.79:4764-4773. - 95 - 7. DANKSAGUNG An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Axel Pagenstecher herzlich danken, der mir diese Arbeit ermöglicht hatte. Seine engagierte Betreuung und Hilfsbereitschaft, die zahlreichen Anregungen und kritische Diskussionen wie auch die angenehme Arbeitsatmosphäre hatten wesentlich zu meiner Arbeit beigetragen. Herzlichen Dank auch an Herrn Prof. Dr. med. Guido Nikkhah, der das Zweitgutachten für diese Arbeit schrieb. Allen Mitarbeitern in unserem Labor danke ich für die wohlwollende Unterstützung meiner Arbeit. Danke auch allen anderen Mitarbeitern des Instituts, die bei der Lösung alltäglicher Probleme sehr hilfsbereit waren. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Dr. David F. Wolfer, Universität Zürich, Schweiz, der sich bereit erklärte uns sein Labor für Verhaltensbeobachtungen zur Verfügung zu stellen und während dieser Zeit bei Fragen stets zur Seite stand. Schließlich möchte ich besonders meiner Familie danken, die mich in der gesamten Zeit unterstützt hat. - 96 - 8. LEBENSLAUF Persönliche Daten Dea B. Humar, geb. am 19.03.79 in Müllheim Eltern: Janko Humar, Elizabeth Humar, geb. Hočevar Staatsangehörigkeit: slowenisch Konfession: katholisch Familienstand: ledig Ausübende Tätigkeit seit 09.2007 Assistenzärztin der Inneren Medizin mit Schwerpunkt Kardiologie, Zentralklinikum Augsburg, Deutschland Studium der Humanmedizin 10.1998- 05.2007 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br., Deutschland Praktisches Jahr 12.2006- 03.2007 Operative Medizin in der Kinderchirurgie, chirurgische Notfallstation, Unfallchirurgie, Plastische und Rekonstruktive Chirurgie, Universitätsspital Basel, Schweiz 08.2006- 11.2006 Innere Medizin: Hämatologie/ Onkologie, Nephrologie und Kardiologie/ Pulmologie, Klinikum Offenburg, Deutschland 04.2006- 08.2006 Neurologische Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Freiburg Theoretisches Studium 05.2007 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung mit Erlangen der Approbation als Ärztin 04.2006 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 08.2001 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 08.2000 Ärztliche Vorprüfung Wissenschaftlicher Bildungsgang 02.2003 Beginn der experimentellen Doktorarbeit, Abteilung Neuropathologie der Universitätsklinik Freiburg, Thema:„Die Auswirkungen einer konstitutiven TIMP-1 Expression im ZNS transgener Mäuse“ - 97 10.2005 Teilnahme am Kongress für Neuropathologie und Neuroanatomie in Graz, Österreich, Posterdarstellung Klinische Tätigkeiten 07.2005- 08.2005 Famulatur, Innere Medizin/Allgemeinmedizin, Gemeinschaftspraxis Freiburg 03.2005- 04.2005 Famulatur, Neuropathologie, Universitätsklinikum Freiburg 02.2005- 03.2005 Famulatur, Anästhesie, Herz-Zentrum Bad Krozingen 10.2004- 02.2005 Studentische Hilfskraft in der Orthopädischen Chirurgie des Lorettokrankenhauses Freiburg als OP-Assistent 09.2004- 10.2004 Famulatur, Orthopädische Chirurgie, Lorettokrankenhaus Freiburg 03.2002 Famulatur, Innere Medizin: Gastroenterologie/ Hepatologie, Endokrinologie, Universitätsklinikum Freiburg Musikalisches Studium 10.2002- 08.2006 Parallelstudium der Musik an der Musikhochschule Freiburg, Diplomstudiengang künstlerische Ausbildung im Fach Violine 10.2002- 08.2006 Mitglied des Hochschulorchesters Freiburg seit 02.2004 Mitglied des Kammerorchesters Freiburg 02.2001- 01.2005 Mitglied der Kammerphilharmonie Baden-Württemberg Schulbildung 1998 Abitur 1989- 1998 Markgräfler Gymnasium, Müllheim 1985- 1989 Friedrich-Wild Grundschule, Müllheim - 98 - 9. TAGUNGSBEITRAG Teile der Doktorarbeit wurden in Form einer Posterdarstellung auf folgendem Kongress vorgestellt: Kongress der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie 05.10.08.10.2005 in Graz, Österreich. Transgenic expression of TIMP 1 in the CNS recruits lymphocytes and prolongs clinical symptoms in EAE. D. Humar and A. Pagenstecher, Dept. Neuropathology, University of Freiburg.
