Expression von Proteinen des Virus der Maul
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Expression von Proteinen des Virus der Maul- und Klauenseuche (MKS) durch Bovines Herpesvirus 1 und Baculoviren unter dem Aspekt der Etablierung neuer Bekämpfungsstrategien gegen MKS Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.) an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Constanze Klopfleisch (geb. Höhle) geboren am 07.07.1979 in Dresden Insel Riems, 07.05.2008 Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser 1. Gutachter: Prof. Dr. Thomas C. Mettenleiter 2. Gutachter: Prof. Dr. Volker Moennig Tag der Promotion: 06.10.2008 Die vorliegende Arbeit wurde am Bundesinstitut für Tiergesundheit, Friedrich-LoefflerInstitut (FLI), im Institut für Molekularbiologie am Standort Insel Riems angefertigt. Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Insel Riems, im Mai 2008 Constanze Klopfleisch Meinen Eltern und Robert Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1. LITERATURÜBERSICHT .............................................................................1 1.1. Die Maul- und Klauenseuche.....................................................................1 1.1.1. Einführung .....................................................................................1 1.2. Das Virus der Maul- und Klauenseuche ....................................................2 1.2.1. Klassifizierung des Erregers und Krankheitsbild ..........................2 1.2.2. Genomorganisation und Replikation .............................................3 1.2.3. Zusammenbau, Stabilität und Antigenität der MKSV-Partikel.....6 1.2.4. Virale Proteasen.............................................................................8 1.3. Bekämpfung der Maul- und Klauenseuche................................................9 1.4. Bovines Herpesvirus 1 .............................................................................11 1.5. Baculoviren ..............................................................................................14 1.6. Impfstoffe in der Veterinärmedizin .........................................................16 1.7. Zielstellung dieser Arbeit.........................................................................18 2. MATERIAL UND METHODEN ...................................................................20 2.1. Material ....................................................................................................20 2.1.1. Zelllinien ......................................................................................20 2.1.2. Virusstämme ................................................................................20 2.1.3. Medien und Lösungen für Zellkulturen .......................................20 2.1.4. Bakterien ......................................................................................22 2.1.5. Medien und Lösungen für Bakterienkulturen ..............................22 2.1.6. Plasmide .......................................................................................23 2.1.7. Antibiotika ...................................................................................23 2.1.8. Enzyme, Nukleinsäuren, Längenstandards ..................................24 2.1.9. Seren.............................................................................................24 2.1.10. Antikörper und Adjuvanzien........................................................24 2.1.11. Chemikalien und Bioreagenzien ..................................................25 2.1.12. Kits ...............................................................................................26 2.1.13. Puffer und Lösungen....................................................................27 2.1.14. Primer...........................................................................................32 2.1.15. Geräte...........................................................................................33 2.1.16. Verbrauchsmaterial ......................................................................34 I Inhaltsverzeichnis 2.1.17. Versuchstiere ............................................................................... 34 2.1.18. Software....................................................................................... 34 2.2. Methoden................................................................................................. 35 2.2.1. Klonierung von DNA .................................................................. 35 2.2.1.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen.............. 35 2.2.1.2. Klenow-Behandlung von 5`-überhängenden Enden .... 35 2.2.1.3. Klenow-Behandlung von 3`-überhängenden Enden .... 35 2.2.1.4. Klonierung von PCR-Fragmenten mit glatten Enden .. 35 2.2.1.5. Dephosphorylierung von DNA .................................... 36 2.2.1.6. Reinigung von DNA mittels Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation ..................................................... 36 2.2.1.7. Phenolextraktion von DNA aus Agarosegelen ............ 37 2.2.1.8. Ligation ........................................................................ 37 2.2.2. Transformation und Transposition .............................................. 37 2.2.2.1. Herstellung kompetenter Bakterien für die Transformation bzw. Transposition ............................. 37 2.2.2.2. Transformation............................................................. 38 2.2.2.3. Transposition................................................................ 38 2.2.3. Isolierung von Nukleinsäuren...................................................... 38 2.2.3.1. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA und baculoviraler Bacmid-DNA ......................................... 38 2.2.3.2. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA mittels QIAGEN Plasmid-Midi Kit® ...................................... 39 2.2.3.3. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA mittels Gradientenzentrifugation ............................................. 39 2.2.3.4. Präparation von DNA aus BHV-1 Virionen ................ 40 2.2.3.5. Präparation von DNA aus infizierten Zellen................ 41 2.2.3.6. Isolierung von MKSV RNA ........................................ 41 2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmungen von Nukleinsäuren.............................................................................. 42 2.2.5. Polymerasekettenreaktion (PCR) ................................................ 42 2.2.6. Reverse Transkription ................................................................. 43 2.2.7. DNA-Sequenzierung ................................................................... 43 II Inhaltsverzeichnis 2.2.8. Zellkultur und Virusanzucht ........................................................43 2.2.8.1. Kultivierung von Säugerzellen .....................................43 2.2.8.2. Vermehrung und Titration von BHV-1 in Zellkultur ...43 2.2.8.3. Inaktivierung von BHV-1 durch Zitratpuffer ...............44 2.2.8.4. Kultivierung von Insektenzellen...................................44 2.2.8.5. Vermehrung und Titration von Baculoviren in Zellkultur ......................................................................44 2.2.8.6. Reinigung von Baculoviren über Sucrosekissen ..........45 2.2.8.7. Bestimmung der Zellzahl/Vitalitätstest ........................45 2.2.9. Gentransfer...................................................................................45 2.2.9.1. Transfektion mit Mammalian Transfection Kit von Stratagene ..............................................................45 2.2.9.2. Transfektion mit Polyethylenimine (PEI) ....................46 2.2.9.3. Transfektion von Insektenzellen mit rekombinanter Bacmid-DNA................................................................46 2.2.9.4. Baculovirus-vermittelte Transduktion von Säugerzellen .................................................................47 2.2.10. Isolierung rekombinanter Viren ...................................................47 2.2.10.1. BHV-1 Plaque-Assay ...................................................47 2.2.10.2. Baculovirus Plaque-Assay............................................47 2.2.11. Affinitätschromatographische Reinigung von Fusionsproteinen.48 2.2.12. Präparative Gewinnung von Proteinen ........................................48 2.2.13. Proteinbestimmung mittels BCA-Methode..................................49 2.2.14. Gelelektrophorese ........................................................................49 2.2.14.1. DNA-Agarosegelelektrophorese ..................................49 2.2.14.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese..........................49 2.2.15. Färbung von Polyacrylamidgelen mit colloidalem Coomassie (Neuhoff et al., 1988) ...................................................................50 2.2.16. Reinigung von Transduktionsüberständen für die elektronenmikroskopische Untersuchung ....................................50 2.2.17. Herstellung von Proben für den Western Blot .............................50 2.2.17.1. Zelluläre Proteine .........................................................50 III Inhaltsverzeichnis 2.2.17.2. Aceton-Präzipitation von Proteinen aus dem Zellkulturüberstand ...................................................... 51 2.2.18. Western Blot ................................................................................ 51 2.2.18.1. Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembran.... 51 2.2.18.2. Chemilumineszenz-Nachweisreaktion......................... 51 2.2.19. Indirekte Immunfluoreszenz (IIF) ............................................... 51 2.2.20. ELISA…...................................................................................... 52 2.2.21. Virusneutralisationstest (VNT).................................................... 53 2.2.22. Durchflußzytometrie.................................................................... 53 2.2.23. Analyse von Zellen aus peripherem Mäuseblut .......................... 54 2.2.24. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus der Milz .................. 54 2.2.25. Proliferationstest.......................................................................... 54 2.2.26. Tierversuche ................................................................................ 55 2.2.26.1. Immunisierung von Kaninchen.................................... 55 2.2.26.2. Immunisierung und Blutentnahme bei Mäusen ........... 55 3. ERGEBNISSE ............................................................................................ 57 3.1. Klonierung und Charakterisierung von MKSV Leserahmen vom Stamm A-Iran 97 ..................................................................................... 57 3.1.1. Klonierung der ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C in pcDNA3 ..... 58 3.1.2. Klonierung der NSP ORFs 3A, 3B, 3ABCmut und 3D in pSP73 ...................................................................................... 59 3.1.3. Sequenzanalyse der MKSV ORFs .............................................. 60 3.2. Expression der MKSV-Proteine in Insektenzellen.................................. 62 3.2.1. Konstruktion von universell einsetzbaren Transfervektoren für das Bac-to-Bac® System ....................................................... 63 3.2.2. Herstellung der rekombinanten Baculoviren, welche die RGS-6His getaggten MKSV-Proteine exprimieren .................... 66 3.2.2.1. Klonierung der Transferplasmide ................................ 66 3.2.2.2. Expression der rekombinanten Baculoviren in Insektenzellen............................................................... 67 IV Inhaltsverzeichnis 3.2.3. Reinigung der Fusionsproteine P1-2A_RGS-6His und VP2_RGS-6His für die Herstellung MKSV-spezifischer polyklonaler Antiseren.................................................................68 3.3. Charakterisierung der MKSV-spezifischen polyklonalen Antiseren.......70 3.4. Herstellung und Charakterisierung P1-2A, P1-2A3C und 3CPro exprimierender BHV-1 Viren ..................................................................73 3.4.1. Klonierung der Rekombinationsplasmide....................................74 3.4.2. Insertion der MKSV-Leserahmen in das Genom von BHV-1/80-221..............................................................................74 3.4.3. Insertion des mutierten MKSV ORF 3Cmut in das Genom von BHV-1/80-221.......................................................................75 3.4.4. In vitro-Charakterisierung der rekombinanten Viren BHV-1/P1-2A und BHV-1/3Cmut...............................................75 3.4.5. Charakterisierung der durch BHV-1/3C exprimierten 3CPro........80 3.5. Herstellung und Charakterisierung P1-2A, P1-2A3C und 3CPro exprimierender BacMam Viren ...............................................................85 3.5.1. Klonierung der Transferplasmide ................................................86 3.5.2. Selektion und DNA-Analyse der rekombinanten BacMam Viren .............................................................................87 3.5.3. In vitro-Wachstumskinetik...........................................................89 3.5.4. Expression und Prozessierung von MKSV-Proteinen in transduzierten Zellen....................................................................90 3.6. Immunisierung von Mäusen mit rekombinanten BacMam Viren ...........95 3.6.1. Charakterisierung der Leukozyten aus peripherem Mäuseblut mittels Durchflußzytometrie nach Immunisierung mit BacMam Viren.......................................................................95 3.6.2. Bildung von MKSV-spezifischen Antikörpern in immunisierten Mäusen ...............................................................100 3.6.3. Überprüfung der Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern ................................................................................101 3.6.4. Restimulation von Milzzellen immunisierter Mäuse .................101 3.5.4.1. Differenzierung der proliferierenden Lymphozyten...102 V Inhaltsverzeichnis 4. DISKUSSION ........................................................................................... 106 5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................. 118 6. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................... 120 7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 8. ANHANG ................................................................................................ 139 .................................................................. 135 VI Literaturübersicht 1. LITERATURÜBERSICHT 1.1. Die Maul- und Klauenseuche 1.1.1. Die Einführung Maul- und Klauenseuche (MKS) ist eine hochkontagiöse, fieberhafte Allgemeinerkrankung der Paarhufer. In weiten Teilen Afrikas, Asiens und Südamerikas tritt MKS immer noch endemisch auf. Wegen der erheblichen ökonomischen und sozialen Auswirkungen im Seuchenfall zählt MKS nicht nur in diesen Ländern, sondern auch in MKSfreien Regionen zu den wirtschaftlich bedeutsamsten Tierseuchen. Seit den 80iger Jahren des 20. Jahrhunderts ist die Seuche in Europa weitgehend ausgerottet. Wegen der drohenden Aberkennung des Status „MKS-frei ohne Impfung“ verzichtet die Europäische Union (EU) auf prophylaktische Impfungen. Obwohl die Mortalitätsrate unter den infizierten Tieren gering ist, bedeuten Seuchenausbrüche für die betroffenen Länder hohe wirtschaftliche Verluste durch Keulungen zur Eindämmung der Erkrankung sowie durch umfangreiche Handelssperren. Die Ausbrüche in Taiwan 1997 und im Vereinigten Königreich in den Jahren 2001 und 2007 zeigten, dass eine Verschleppung des Erregers in MKS-freie Gebiete gravierende ökonomische Auswirkungen hat (Yang et al., 1999; Davies, 2002) und verdeutlichen, dass die Gefahr einer Einschleppung der Seuche in Länder, welche jahrzehntelang MKS-frei waren, jederzeit besteht (Grubman et al., 2004; Kitching, 2005) .Beim Ausbruch in Großbritannien 2001, der durch illegale Fleischtransporte verursacht wurde, mussten zur Eindämmung der Seuche etwa drei Millionen Schafe, 600 000 Rinder und 138 000 Schweine in über 9000 infizierten Höfen und Kontaktbetrieben getötet werden. Weitere zwei Millionen Tiere wurden gekeult, da sie wegen der erforderlichen strengen Seuchenkontrolle weder gehandelt noch transportiert werden durften (Davies, 2002). Zu den hohen landwirtschaftlichen Verlusten kamen zusätzlich Verluste in Milliardenhöhe in der Tourismusbranche. Der volkswirtschaftliche Gesamtschaden für Großbritannien nach dem Seuchenzug 2001 wird auf mehr als 10 Milliarden Euro geschätzt. Deshalb ist es von aktueller und großer Bedeutung neue Bekämpfungsstrategien zur schnellen Eindämmung der Infektion im Seuchenfall zu entwickeln. Dies beinhaltet neben der Entwicklung neuartiger Markerimpfstoffe auch die Etablierung geeigneter Diagnostiksysteme für die Verwendung dieser Impfstoffe. 1 Literaturübersicht 1.2. 1.2.1. Das Virus der Maul- und Klauenseuche Klassifizierung des Erregers und Krankheitsbild Der Erreger der MKS wurde im Jahr 1897 von Friedrich Loeffler und Paul Frosch entdeckt (Loeffler F. et al., 1897). Erstmalig wurde dabei ein Virus als Auslöser einer Erkrankung beschrieben. Das MKS-Virus (MKSV) gehört zum Genus der Aphthoviren innerhalb der Familie der Picornaviridae. Picornaviren sind unbehüllt und besitzen ein einzelsträngiges RNA-Genom in positiver Orientierung (Brown, 2003). Neben den Aphthoviren gibt es acht weitere Genera in dieser Virusfamilie: Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus, Rhinovirus und Teschovirus (Racaniello, 2007). Weitere bekannte und bedeutsame Krankheitserreger innerhalb der Virusfamilie sind das Poliovirus und das humane Hepatitis A Virus. MKSV war zunächst einziger Vertreter des Genus Aphthovirus. Aufgrund hoher genetischer Übereinstimmungen wurde später auch das Equine Rhinitis A Virus diesem Genus zugeordnet (Li et al., 1996; Wutz et al., 1996). Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurde entdeckt, dass mehr als ein Serotyp von MKSV existiert. Heute werden aufgrund ihrer serologischen Eigenschaften sieben Serotypen unterschieden: A, O, C, Asia 1 und South African Territories (SAT) 1, SAT 2 und SAT 3. Von jedem dieser Serotypen sind eine Vielzahl weitere Subtypen beschrieben (Domingo et al., 2003; Knowles et al., 2003). Das MKSV verursacht eine akute, systemische Infektion bei Paarhufern, in deren Verlauf es zur Bildung der typischen Schleimhautläsionen (Aphthen) im Maulbereich, auf der Zunge und an den Klauen kommt. Weitere Krankheitssymptome sind Fieber, Abgeschlagenheit und Lahmheit aufgrund der schmerzhaften Aphthenbildung an den Klauen. Betroffen sind neben wirtschaftlich bedeutsamen Tieren wie Rindern, Schweinen und Schafen auch mehr als 70 Wildtierarten, die an MKS erkranken können (Thomson et al., 2003). Die Symptomatik ist stark abhängig vom MKSV-Serotyp und der erkrankten Tierart (Alexandersen et al., 2003). Lediglich schwache klinische Symptome werden bei infizierten Schafen und Ziegen beobachtet (Barnett et al., 1999). Damit verfügt MKSV, anders als die sonstigen Vertreter der Familie Picornaviridae, über ein sehr breites Wirtspektrum (Mason et al., 2003b). Die Mortalitätsrate ist bei adulten Tieren im Allgemeinen gering (< 5 %), während sie bei Jungtieren bis zu 50 % betragen kann. Bei infizierten Jungtieren, insbesondere bei Ferkeln, Kälbern und Lämmern, wird häufig eine akute Myokarditis beobachtet. Die Tiere verenden sehr bald nach der Infektion, noch bevor es zur Ausbildung von Läsionen kommt (Donaldson et al., 1984; Brown et al., 1995). Bei Rindern kommt es außerdem zu einem Abfall der 2 Literaturübersicht Milchleistung um bis zu 25 %. Eine Infektion kann sowohl über direkten als auch indirekten Kontakt mit erkrankten Tieren erfolgen. Erkrankte Tiere scheiden große Mengen an Virus über Aphthensekrete und Nasenflüssigkeit, aber auch über die Atemluft aus (Donaldson et al., 2002; Alexandersen et al., 2002a; Alexandersen et al., 2002b). MKS-Virionen sind gegenüber pH-Wert Schwankungen sehr labil (Bachrach et al., 1957). Dennoch können sie in der Natur, z.B. in Stroh, auf landwirtschaftlichen Geräten, aber auch im Erdboden monatelang infektiös bleiben und durch Überträger, insbesondere den Menschen, weiterverschleppt werden. Auch kontaminierte Nahrungsmittel wie Milch und Fleisch spielen bei der passiven Übertragung des Virus eine wichtige Rolle (Sobrino et al., 2001; Valarcher et al., 2007). Die MKS ist hochkontagiös und wurde von dem Office International des Èpizooties (OIE) aufgrund der schnellen und großräumigen Verbreitung des Virus und daraus resultierenden wirtschaftlichen Folgen in die Liste A eingestuft (http://www.oie.int/eng/maladies/en_classification.htm). 1.2.2. Genomorganisation und Replikation Das Genom von MKSV besitzt eine Größe von ca. 8,5 kb und liegt als einzelsträngige RNA in Plusstrangorientierung vor. Die virale RNA selbst ist infektiös, da sie nach Eintritt in die Zelle direkt translatiert wird und somit alle für die Virusreplikation benötigten Proteine bereitgestellt werden (Belsham et al., 1988). Der kodierende Bereich der RNA wird von einer 5`- und 3`- nicht translatierten Region (UTR) flankiert (Abb. 1). Die ca. 1 kb große 5`-UTR ist stark strukturiert und enthält eine Internal Ribosome Entry Site (IRES). Die Translation zellulärer mRNA wird gewöhnlich durch eine 7-Methyl-G cap Struktur initiiert. Die IRES ermöglicht eine cap-unabhängige Translation der viralen RNA (Belsham et al., 1990). An das 5`-Ende ist kovalent ein kleines viruskodiertes Protein, Vpg oder 3B Protein genannt, gebunden (Sangar et al., 1981). Es dient als Primer für die RNA Replikation (Falk et al., 1992). Der sich an die 5`-UTR anschließende offene Leserahmen (ORF) wird ausgehend von der IRES in ein einziges großes Polyprotein translatiert, das noch während der Synthese in die verschiedenen viralen Komponenten gespalten wird. Die primären Spaltungen des Polyproteins sind intramolekulare (cis) Ereignisse, während die nachfolgenden Spaltungen der entstandenen Zwischenprodukte als eine Kombination aus intra- und intermolekularen (trans) Spaltungen erfolgen (Ryan et al., 1991). Der kodierende Bereich wird nach den entstehenden ersten Spaltprodukten in die Abschnitte L-Region sowie P1-2A, P2 und P3 unterteilt (Grubman et al., 2004). 3 VPg (3B) 4 IRES NSP LPro VP3 Pentamer Strukturproteine VP0 VP0-VP3 P1-2A Polyprotein 12 Pentamere VP1 2A 2A Leeres Kapsid 2B 2BC O R F 2C 3B1,2,3 3CPro P3 VP0 → VP2 + VP4 Verpackung der RNA 3CD Reifes Kapsid Nichtstrukturproteine (NSP) 3A 3AB Polyprotein 3DPol An 3` UTR Abb. 1: Schematische Darstellung der Genomorganisation von MKSV und der Prozessierung der Translationsprodukte (angelehnt an Clavijo et al., 2004). Der einzige offene Leserahmen (ORF) wird von einer 5`- und 3`-UTR flankiert. Der ORF kodiert für ein großes Polyprotein. Noch während der Translation löst sich der aminoterminale Teil des Polyproteins vom Ribosom ab. Die weiteren Spaltungen werden durch die viralen Proteasen LPro und 3CPro vorgenommen. Lediglich der Prozess der Spaltung von VP0 in VP2 und VP4 beim Verpacken der RNA in das Kapsid ist noch unklar. Weitere Erläuterungen im Text. Schrittweise Spaltung der Translationsprodukte Translationsprodukte Genom 5` UTR Literaturübersicht Literaturübersicht Das 5`-Ende (L-Region) des ORF kodiert für die L-Protease (LPro), die sich vom entstehenden Translationsprodukt autokatalytisch abspaltet (Strebel et al., 1986). Die L-Region enthält zwei AUG Startkodons und es entstehen auch zwei unterschiedlich große LPro-Translationsprodukte, Lab und Lb (Sangar et al., 1987). Während in vitro beide Formen der Protease isoliert wurden (Clarke et al., 1985), zeigten in vivo Studien mit entsprechenden Mutanten, dass das zweite AUG bevorzugt verwendet wird und damit Lb die dominierende Form ist (Cao et al., 1995). An die L-Region schließt sich der Bereich des Vorläuferproteins P1-2A an, welcher für die vier Strukturproteine VP1, VP2, VP3 und VP4 sowie für 2A kodiert. Das 18 Aminosäure kleine Peptid 2A führt zur kotranslationalen Trennung des P1-2A Vorläuferproteins von der sich anschließenden P2-Region noch während der Synthese des Polyproteins. 2A bewirkt sehr wahrscheinlich die Freisetzung des bis dahin translatierten Polyproteins vom Ribosom (Ryan et al., 1994; Donnelly et al., 2001). Die Genomregionen P2 und P3 kodieren für sechs Nichtstrukturproteine (NSPs): 2B und 2C (P2-Region), sowie 3A, drei Kopien von 3B (VPg), 3CPro und 3DPol (P3-Region). Die NSPs werden vor allem für die Virusreplikation aber auch für den Zusammenbau der Viruspartikel benötig. An den kodierenden Genombereich schließt sich die 3`-UTR an. Sie besteht aus einem kurzen, ca. 100 Nukleotide umfassenden Segment, das sich zu einer Haarnadelstruktur faltet, und der PolyA-Sequenz (Rohll et al., 1995). Im Gegensatz zur zellulären mRNA, bei welcher der PolyA-Bereich enzymatisch angefügt wird, wird dieser bei den Picornaviren vom viralen Genom kodiert (Dorsch-Hasler et al., 1975). Es wurde gezeigt, dass die 3`-UTR Region die Aktivität der IRES stimuliert (Lopez et al., 2002). Die Interaktion zwischen 5`- und 3`-UTR Bereich wird dabei wahrscheinlich durch das Protein PABP (Poly(A)-Binding Protein) unterstützt, wobei noch unklar ist, ob PABP dies allein oder mit anderen viralen oder zellulären Proteinen vermittelt (Belsham, 2005). Weiterhin wird während der Virusreplikation Vpg-pUpU an das 3´-Ende des Genoms angelagert. Vpg-pUpU ist eine uridinylierte Form von Vpg, die als Primer für die Polymerisation des RNA-Negativstranges fungiert (Belsham, 2005). Die Infektion beginnt mit der Adsorption der MKS-Virionen an Integrine der Zelloberfläche. Verantwortlich für die Interaktion ist die konservierte RGS-Sequenz im Bereich des Strukturproteins VP1 (Fox et al., 1989; Logan et al., 1993). Im Zytoplasma erfolgt dann zunächst die Translation und Prozessierung des Polyproteins, dessen Spaltprodukte für die virale Replikation benötigt werden. Die Replikation von Picornaviren beginnt mit der Bildung von Negativstrang-RNA durch die viruseigene RNA-abhängige RNA-Polymerase 3DPol. Die 5 Literaturübersicht RNA-Stränge negativer Polarität sind wiederum Matrizen für die Synthese von PlusstrangRNA durch 3DPol. Die neusynthetisierte Plusstrang-RNA dient sowohl als mRNA für die Translation als auch als genomische RNA der Virusnachkommenschaft. In der letzten Phase des viralen Replikationszyklus setzen sich die einzelnen Virusproteine und das RNA-Genom zu infektiösen Virionen zusammen (self-assembly). Die Freisetzung der Viren erfolgt unter Lyse der Wirtszelle (Grubman et al., 2004; Belsham, 2005). 1.2.3. Zusammenbau, Stabilität und Antigenität der MKSV Partikel MKS-Virionen haben einen Durchmesser von ca. 25-30 nm. Röntgenuntersuchungen und elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen eine glatte, ikosaedrische Kapsidstruktur, die sich aus den vier Strukturproteinen VP1, VP2, VP3 und VP4 zusammensetzt (Wild et al., 1969; Acharya et al., 1989). Die Strukturproteine werden von der P1-2A Region des MKSVGenoms kodiert. Das entstehende Vorläuferprotein P1-2A wird posttranslational durch die viruseigene Protease 3CPro in VP1, VP3 und VP0 gespalten, wobei VP0 aus den noch nicht getrennten Strukturproteinen VP4 und VP2 besteht (Mason et al., 2003b). Jeweils fünf der Spaltprodukte VP1, VP3 und VP0 lagern sich zu Pentameren zusammen. Wiederum 12 Pentamere bilden das Kapsid. Dies bedeutet, dass für die Bildung eines MKSV-Partikels je 60 Kopien von VP0, VP1 und VP3 benötigt werden. Dieser Aufbau ist für alle Mitglieder der Familie Picornaviridae gleich (Racaniello, 2007). Der letzte Schritt der Partikelreifung ist die autokatalytische Spaltung von VP0 zu VP2 und VP4, welche wahrscheinlich nur in Anwesenheit der viralen RNA erfolgt (Arnold et al., 1987; Curry et al., 1997). Dieses Zusammenspiel zwischen viraler RNA und Spaltung von VP0 ist noch weitgehend unklar. Solange keine Spaltung des Vorläuferproteins VP0 in VP2 und VP4 stattfindet, werden die Partikel als unreife Virionen bezeichnet. Dabei wird zwischen RNA-haltigen Provirionen (Knipe et al., 1997) und RNA-freien leeren Kapsiden (Grubman et al., 1985) unterschieden. Weiterhin ist die Spaltung von VP0 für die Infektiosität der Viren notwendig. Untersuchungen bei MKSV und Poliovirus zeigten, dass ein konserviertes Histidin im VP2 für die Spaltung essentiell ist und bei einer Mutation dieser Aminosäure lediglich nichtinfektiöse Provirionen entstehen (Curry et al., 1997; Hindiyeh et al., 1999). Die beim Zusammenbau der Partikel entstehenden Zwischenformen lassen sich anhand ihres unterschiedlichen Sedimentationskoeffizienten unterscheiden. Infektiöse Virionen werden auch als 140S-Partikel bezeichnet. Leere Kapside, die den gleichen Durchmesser wie RNAhaltige Virionen haben, besitzen eine geringere Partikeldichte und haben einen 6 Literaturübersicht Sedimentationskoeffizient von 70S. Pentamere als kleinste Einheit sedimentieren bei 12S (Doel et al., 1982; Grubman et al., 1985). Im Gegensatz zu anderen Picornaviren ist MKSV bei niedrigen pH-Werten labil. Die Kapside zerfallen ab einem pH-Wert von weniger als 6,5 in Pentamere (Brown et al., 1961). Der Grund für diese Instabilität wird durch das Auftreten eines Histidin-Clusters am Übergang von VP2 zu VP3 vermutet, das bei niedrigem pH-Wert protoniert wird und damit die Stabilität des Virions schwächt (Curry et al., 1995; Ellard et al., 1999). Die Oberflächenstruktur reifer Virionen wird hauptsächlich von den Proteinen VP1, VP2 und VP3 bestimmt. Alle drei Proteine sind sich strukturell sehr ähnlich und bestehen aus stark konservierten achtsträngigen β-Faltblattstrukturen, die über Schleifen miteinander verbunden sind (Acharya et al., 1989). Diese Schleifen und die C-Termini von VP1-3 befinden sich auf der Oberfläche der Virionen, während die N-Termini nach innen zeigen (Mateu, 1995). Mit einem Molekulargewicht von jeweils etwa 24 kDa sind die Strukturproteine VP1, VP2 und VP3 im Vergleich zu denen anderer Picornaviren wesentlich kleiner (Jackson et al., 2003). Das ca. 8 kDa große VP4 befindet sich an der Innenseite des Kapsides und ist am N-Terminus kovalent mit einer lipophilen Myristoylgruppe verbunden, die zusammen mit VP3 für die Stabilität des Kapsides benötigt wird (Chow et al., 1987; Fry et al., 2005). Auf der Virusoberfläche der MKSV-Serotypen A, O, C, Asia sowie SAT 2 konnten mehrere Epitope identifiziert werden, die für die Bildung neutralisierender Antikörper verantwortlich sind (Lea et al., 1994; Curry et al., 1996; Grubman et al., 2004). Dabei wurde festgestellt, dass bei allen MKSV-Serotypen die stärkste Immunantwort gegen das Strukturprotein VP1 induziert wird. Neben dem C-Terminus wurden vor allem neutralisierende Antikörper gegen den Aminosäurebereich 134-158 von VP1 nachgewiesen. Dieser Bereich bildet eine schleifenförmige Verbindung zwischen den β-Faltblättern G und H und wird deshalb auch als G-H Loop bezeichnet. Der G-H Loop ist über die ansonsten glatte Virusoberfläche erhaben und stellt das Hauptantigen des MKSV dar (Borrego et al., 1995; Mateu et al., 1995; Carrillo et al., 2005). Gleichzeitig ist der G-H Loop die variabelste Strukturkomponente und bewirkt, dass die VP1 Gene innerhalb der sieben Serotypen lediglich eine Sequenzhomologie von 5070 % aufweisen, während insgesamt durchschnittlich 86 % der Sequenz identisch sind (Jackson et al., 2003; Knowles et al., 2003). Diese starke Variabilität im Hauptantigen ist maßgeblich für die Einteilung der einzelnen Virusvarianten verantwortlich und erschwert die einheitliche Bekämpfung der Seuche, da neutralisierende Antikörper gegen den G-H Loop meist nur die Eliminierung eines bestimmten Sero- oder Subtypes ermöglichen (Fry et al., 7 Literaturübersicht 2005). Neben Regionen des VP1 wurden auf der Virusoberfläche weitere Epitope gefunden, die allerdings von Serotyp zu Serotyp variieren können. Beim Serotyp A befinden sich Epitope für die Bildung neutralisierender Antikörper im Bereich des Strukturproteins VP3 (Thomas et al., 1988; Baxt et al., 1989). Für den Stamm O1 sind insgesamt 5 antigene Bereiche beschrieben, die alle drei Oberflächenproteine einschließen (Bolwell et al., 1989; Kitson et al., 1990; Fry et al., 2005). Weit weniger ist über die Epitope für T-Lymphozyten bekannt. Es gibt Hinweise, dass VP1 T-Zell-Epitope enthält. Zumindest konnte dies für synthetische Peptide, die von VP1 abgeleitet wurden, gezeigt werden (Glass et al., 1991; Collen et al., 1991). Außerdem wird vermutet, dass konservierte Regionen der NSPs 3A und 3DPol zu einer Stimulation der zellulären Immunantwort führen (Blanco et al., 2001; Garcia-Briones et al., 2004). 1.2.4. Virale Proteasen MKSV besitzt drei proteolytisch wirkende Enzyme, die zu unterschiedlichen Zeiten aktiv sind. Dazu gehört neben den bereits erwähnten Proteasen LPro und 3CPro auch das bei der Prozessierung des Polyproteins entstehende Zwischenprodukt 3CD. Die Protease LPro ist eine autokatalytische Papain-ähnliche Protease (Strebel et al., 1986). Sie spielt eine wichtige Rolle beim virus-host shutoff. LPro spaltet eIF4G, einen Initiationsfaktor für die cap-abhängige Translation der zellulären mRNA, und inhibiert somit die Proteinsynthese der Zelle (Devaney et al., 1988; Chinsangaram et al., 2001). Die Protease 3CPro ist für die Mehrzahl der proteolytischen Spaltungen verantwortlich, bei denen die einzelnen viralen Komponenten aus dem Polyprotein entstehen. Die Prozessierung des Polyproteins durch 3CPro beginnt mit der Spaltung zwischen 2C und 3A. Im weiteren Verlauf wird in einer autokatalytischen Reaktion 3CPro am aminoterminalen Ende aus dem Vorläuferprotein P3 freigesetzt. Das entstandene Zwischenprodukt 3CD besitzt ebenfalls proteolytische Aktivität (Ryan et al., 1989) und ist vermutlich für die intermolekulare Abspaltung von 3DPol nötig. Im Gegensatz zu anderen Picornaviren zeigt die Erkennungssequenz für MKSV 3CPro eine größere Heterogenität. Eine Spaltung erfolgt nach Glutamin oder Glutaminsäure, wenn anschließend eine Aminosäure mit hydrophobem Rest, bevorzugt Leucin, folgt. Auch umliegende Aminosäuren scheinen die Spaltungsspezifität von 3CPro zu beeinflussen. Aufgrund der Lage und Zusammensetzung des katalytischen Zentrums wird 3CPro zur Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Cysteinproteasen gezählt. Die Aminosäuren Histidin an Position 46, Aspartat an Position 84 sowie Cystein an Position 163 bilden das aktive Zentrum (Birtley et al., 2005). Substitution von Aminosäuren, 8 Literaturübersicht die an der Substratbindung beteiligt sind oder das katalytischem Zentrum bilden, führen zu einer Inaktivierung der Proteaseaktivität (Grubman et al., 1995). Wie LPro kann auch 3CPro eIF4G sowie eIF4A, einen weiteren Translationsfaktor, durch proteolytische Spaltung inaktivieren (Belsham et al., 2000). Außerdem spaltet 3CPro H3 Histone. Die Auswirkungen dieses Prozesses sind noch weitgehend unklar. Es wird vermutet, dass die Spaltung von H3 zu einem Herabsetzen der zellulären Transkriptionsrate führt (Falk et al., 1990; Tesar et al., 1990). 1.3. Bekämpfung der Maul- und Klauenseuche Während die Seuche in Europa in der zweiten Hälfte des vergangenen Jahrhunderts durch eine konsequente Impfpolitik weitgehend ausgerottet werden konnte, kommt sie in vielen Teilen Asiens, Afrikas sowie Südamerikas immer noch endemisch vor (Brown, 1992). Die weltweit aktuell zugelassenen MKS-Vakzinen basieren auf inaktiviertem Vollvirus. Sie induzieren im Tier vorrangig eine humorale Immunantwort, die durch die Verabreicherung mit einem starken Adjuvans verstärkt wird. Der Schutz in immunisierten Tieren wird hauptsächlich durch neutralisierende Antikörper vermittelt und hält je nach Anzahl der Wiederholungsimpfungen (Boostering) bis zu zwölf Monate (Doel, 2005). Der geringen Effektivität steht jedoch die hohe biologische Sicherheit gegenüber, da keine replikationsfähigen Viren eingesetzt werden (Schijns, 2000). Heutige Impfstoffe werden in Zellkulturen hergestellt, durch die Behandlung mit Aziridinen inaktiviert und mit Aluminiumhydroxid oder Saponin versetzt (Barteling, 2002). Obwohl die konsequente Impfpolitik mit inaktiviertem Vollvirus eine effektive Eradikation der Seuche in Europa ermöglichte, ergeben sich dennoch eine Vielzahl von Nachteilen bei der Anwendung der Impfstoffe. So erfordert die Produktion des Impfstoffes höchste Sicherheitsmaßnahmen. MKS-Ausbrüche durch Erregerverschleppung aus Impfstoffproduktionsanlagen wurden mehrfach beobachtet, zuletzt 2007 in Großbritannien. Bei einer Immunisierung mit inaktiviertem Vollvirus ist im Tier erst nach ca. 14 Tagen mit einem ausreichend hohem Status an neutralisierenden Antikörper zu rechnen. Auch sind immunisierte Tiere nicht zwangsläufig vor einer Infektion mit Feldvirus geschützt. Die Impfstoffe induzieren keine sterile Immunität und können eine virale Replikation von Feldvirus in Epithelzellen nicht verhindern (Doel, 2003). Zwar erkranken diese Tiere in der Regel nicht, sie können aber zu persistent infizierten Carrier-Tieren werden und sind somit eine große Gefahr für eine unkontrollierte Ausbreitung des Virus (Salt, 1993; Alexandersen et al., 2002c). Basierend auf 9 Literaturübersicht den Kenntnissen zur Kapsidstruktur bietet sich als Alternative der Einsatz des Strukturproteins VP1 als Impfstoff an. Diese Art von Impfstoff, auch als Subunit Vakzine bezeichnet, hätte gegenüber den klassischen MKS-Vakzinen die Vorteile, dass eine deutlich höhere Sicherheit in der Produktionsphase gewährleist und außerdem eine einfache diagnostische Differenzierung zwischen geimpften und infizierten Tieren erlaubt würde. Der G-H Loop von VP1 ist als B-Zell-Epitop für alle MKSV-Serotypen beschrieben. Es gibt eine Vielzahl von Studien, die sich mit der Expression, Reinigung und Immunogenität von VP1 beschäftigen. Synthetische VP1 Peptide (Pfaff et al., 1982; Francis et al., 1990; Francis et al., 1991), VP1 kodierende DNA-Vakzine allein oder mit IL-12 (Wong et al., 2000; Wong et al., 2002), bakteriell exprimiertes VP1 ebenfalls in Kombination mit Zytokinen (Shi et al., 2006; Shi et al., 2007) sowie in Pflanzen synthetisiertes VP1 (Wigdorovitz et al., 1999a; Wigdorovitz et al., 1999b) rufen meist einen hohen Titer neutralisierender Antikörper in geimpften Tieren hervor, schützen aber nur in seltenen Fällen im Belastungsversuch vor einer Infektion mit Feldvirus (Frimann et al., 2007). Meist wurde nur ein unzureichender Schutz im Tier beobachtet (Mulcahy et al., 1990; Taboga et al., 1997; Rodriguez et al., 2003). Vielmehr scheint es, dass eine Kombination aus Epitopen, welche möglicherweise erst bei der Prozessierung der Strukturproteine sowie beim Zusammenbau der dreidimensionalen Kapside entsteht, eine ausreichend hohe Immunogenität gewährleistet (Cedillo-Barron et al., 2001; Mayr et al., 2001). Da es sich bei den klassischen Impfstoffen um nicht replikationsfähige Viren handelt, sollten Antikörper nur gegen die Strukturproteine gebildet werden. Um das Vorhandensein von NSPs in den fertigen Formulierungen auszuschließen, müssen die aus der Zellkultur stammenden Impfstoffe über Polyethylenglykol-Fällung und anschließender Filtration gereinigt werden (Doel, 1996; Grubman et al., 2002). Die zugelassenen Impfstoffe müssen NSP-frei sein, da sich sonst Probleme in der Markerdiagnostik ergeben, welche hauptsächlich auf dem Einsatz von NSP-ELISAs basiert (Clavijo et al., 2004). Durch die Verschleppung von NSP-Antigenen in den Vakzinen könnten immunisierte Tiere von natürlich infizierten Tieren nicht mehr sicher anhand ihres Antikörperstatus gegen NSPs differenziert werden (Grubman et al., 2002). Weitere wesentliche Nachteile, die sich durch den Einsatz von MKS-Impfstoffen ergeben, sind langfristige ökonomische Konsequenzen. So ist laut Richtlinien der OIE das Verbringen MKS-seropositiver Tiere in Länder mit MKS-freiem Status nicht erlaubt, was zu umfassenden Handelrestriktionen für die betroffenen Länder führt. Aufgrund der vielfältigen Probleme, die sich mit dem Einsatz von MKS-Vakzinen ergeben, sind in Deutschland wie in der gesamten 10 Literaturübersicht EU prophylaktische Impfungen gegen MKSV seit 1992 verboten. Nur im Seuchenfall darf unter strengen Auflagen auf Notfallimpfstoffe zurückgegriffen werden. 1.4. Bovines Herpesvirus 1 Das Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) gehört zur weit verbreiteten Familie der Herpesviridae. Herpesviren verursachen Erkrankungen sowohl bei warm- und kaltblütigen Vertebraten, als auch bei Invertebraten. Sie werden aufgrund biologischer und genetischer Unterschiede in drei Subfamilien untergliedert: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae und Gammaherpesvirinae (McGeoch et al., 1994). Alphaherpesviren zeichnen sich durch ein breites Wirtsspektrum, einen relativ kurzer Replikationszyklus und einer schnellen Verbreitung in Zellkultur unter Lyse der infizierten Zellen aus. Im natürlichen Wirt verbleiben Alphaherpesviren nach der Primärinfektion meist in Neuronen sensorischer Ganglien im Stadium der Latenz. Zur Subfamilie Alphaherpesvirinae zählen vier Genera. Dem Genus Simplexvirus gehören die humanpathogenen Herpes Simplex Virus 1 und 2 (HSV-1, HSV-2) an. Neben dem Varicella-Zoster-Virus (VZV) werden die tierpathogenen Erreger BHV-1, Pseudorabies Virus (PrV) und Equines Herpesvirus 1 und 4 (EHV-1, EHV-4) dem Genus Varicellovirus zugeordnet. Die Genera Mardivirus und Iltovirus, welche die galliden Herpesviren umfassen, werden ebenfalls zur Subfamilie Alphaherpesvirinae gezählt (Minson et al., 2000). Im Gegensatz zu den Alphaherpesviren besitzen die Betaherpesviren ein sehr enges Wirtsspektrum und replizieren in vitro wesentlich langsamer. Infizierte Zellen können ausgeprägte Zytomegalie zeigen. Die Viren bleiben in latenter Form in sekretorischen Drüsen, lymphatischen Geweben, Nieren, Knochenmark oder anderen Geweben. Neben dem humanen und murinen Zytomegalovirus (HCMV, MCMV) gehören auch die Humanen Herpesviren 6 und 7 (HHV-6, HHV-7) dieser Subfamilie an. Die Gammaherpesviren zeichnen sich durch einen sehr engen Wirtsbereich aus. Im natürlichen Wirt infizieren sie ausschließlich T- bzw. B-Lymphozyten und persistieren in lymphatischen Geweben. Vertreter dieser Subfamilie sind die Genera Lymphocryptovirus mit dem Epstein-Barr-Virus und Rhadinovirus mit dem Humanen Herpesvirus 8 (HHV-8). Zu den „Herpes-like viruses“ werden Viren gezählt, die genetisch wenig Ähnlichkeiten zu den Alpha-, Beta- und Gammaherpesviren aufweisen. Dazu gehören Herpesviren der Fische, Amphibien und Muscheln wie das Koi Herpesvirus (KHV), die Froschherpesviren RaHV-1 und RaHV-2 (ranid herpesvirus) und das Herpesvirus der Pazifischen Auster (OsHV-1) (McGeoch et al., 2006). 11 Literaturübersicht BHV-1 verursacht in Rindern verschiedene Krankheitsbilder. Zum einen ist es der Erreger der Infektiösen Bovinen Rhinotracheitis (IBR), einer akuten respiratorischen Erkrankung, die mit Symptomen wie Fieber, Anorexie und Atembeschwerden einhergeht. Außerdem kommt es zu einem Rückgang der Milchleistung. Die meist gutartig verlaufende Infektion ist häufig von bakteriellen Sekundärinfektionen begleitet, wodurch schwerwiegendere Krankheitsverläufe auftreten können. Weitere Erkrankungen bei Rindern, die durch BHV-1 hervorgerufen werden, sind die Infektiöse Pustuläre Vulvovaginitis (IPV) bzw. Infektiöse Balanoposthitis (IBP). Hierbei handelt es sich um schmerzhafte fiebrige Schleimhauterkrankungen der Genitalien, die zu Fruchtbarkeitsstörungen bzw. Aborten führen können (Engels et al., 1996). BHV-1 wird vor allem durch den direkten Tierkontakt übertragen. Nach Abklingen der Primärinfektion wandert das Virus anterograd über Nervenbahnen zum Trigeminalganglion (IBR) bzw. zu Sakralganglien (IPV/IBP) und etabliert dort eine latente Infektion. Während der Latenzphase findet keine Virusreplikation statt. Unter ungünstigen Bedingungen wie Stress oder Immunsuppression kann latentes Virus reaktiviert werden. Infizierte Tiere sind somit eine ständige potentielle Infektionsquelle (Homan et al., 1980; Ackermann et al., 1984). In Deutschland sind BHV-1 Infektionen anzeigepflichtig. Seit 1995 dürfen zur Bekämpfung von BHV-1 nur Markervakzinen verwendet werden. Bei BHV-1 Markerimpfstoffen ist das Gen für das nicht essentielle Glykoprotein E deletiert. Durch das Fehlen von Antikörpern gegen gE lassen sich geimpfte Tiere von Feldvirus-infizierten Tieren unterscheiden (Kaashoek et al., 1994). Die Familie der Herpesviridae zeigt eine einheitliche Virusmorphologie. Das virale doppelsträngige DNA-Genom befindet sich in einem elektronendichten, zentralen Kern (Core), der von einem ikosaedrischen Kapsid umschlossen wird (Furlong et al., 1972). Um das Kapsid schließt sich das Tegument, eine amorphe Substanz variabler Dicke an, die eine Vielzahl von viralen Proteinen enthält. Eine Lipidmembran zellulären Ursprungs, in die virale Glykoproteine eingelagert sind, bildet die äußere Hülle (envelope) des Virions. Der Gesamtdurchmesser der Herpesviren liegt zwischen 120 - 300 nm in Abhängigkeit von der Menge des eingelagerten Teguments. BHV-1 Virionen sind ca. 150 - 200 nm groß (Pellet et al., 2007). Die Genomformen der Herpesviren werden aufgrund der Lokalisation repetitiver Sequenzen in die Gruppen A bis F eingeteilt. Die für das Genus Varicellovirus und damit auch für BHV1 charakteristische Genomform wird der Gruppe D zugeordnet. Sie besteht aus einer „Unique 12 Literaturübersicht Long“ (UL)- und einer „Unique Short“ (US)-Region. Die US-Region wird von einer internen repetitiven (IR)-Region und einer terminalen repetitiven (TR)-Region flankiert. Durch Rekombinationen innerhalb der repetitiven Regionen während der DNA-Replikation entstehen bezüglich der Orientierung der US-Region zwei phänotypisch äquivalente isomere Formen des Genoms, welche in den Viruspopulationen in gleichen Mengen vorliegen (Pellet et al., 2007). IR UL US TR 10kb Abb. 2: Genomorganisation von BHV-1. Schematisch dargestellt ist die Anordnung der Unique Long (UL) und der Unique Short (US) sowie der repetitiven Sequenzen IR und TR, welche die US-Region flankieren. Das lineare doppelsträngige DNA-Genom des BHV-1 umfasst ca. 136 kbp (Schwyzer et al., 1996). Es besitzt einen GC-Gehalt von 72 % und ist mittlerweile vollständig sequenziert (Schwyzer et al., 1996). Gegenwärtig sind 73 offene Leserahmen (ORF) beschrieben. Sequenzvergleiche mit anderen Alphaherpesviren zeigten, dass die Anordnung der Gene im Wesentlichen kolinear ist (McGeoch et al., 1995). Innerhalb der Alpha-, Beta- und Gammaherpesviren sind etwa 40 Gene konserviert, die für Kapsidproteine, Replikationsproteine, Enzyme, Glyko- und Tegumentproteine kodieren (Pellet et al., 2007). Dementsprechend läuft bei Herpesviren trotz großer Variabilität hinsichtlich biologischer Eigenschaften die Replikation nach einem einheitlichen Grundmuster ab (Honess et al., 1977). Die Infektion von Wirtszellen erfolgt durch Adsorption von BHV-1 an Rezeptoren der Zellmembran. Die viralen Glykoproteine gC bzw. gB interagieren mit Heparansulfaten der Zelloberfläche und führen unter Beteiligung des Glykoproteins gD zu einer stabilen Bindung (Okazaki et al., 1987; Okazaki et al., 1991; Liang et al., 1991; Li et al., 1995). Die sich daran anschließende Penetration erfolgt durch Fusion der Virushülle mit der Zellmembran. In diesem Prozess sind mindestens vier BHV-1 Glykoproteine involviert: gD, gB und ein aus gH und gL bestehendes Heterodimer (Rauh et al., 1991; Fehler et al., 1992; Meyer et al., 1998). Diese Proteine sind auch für die Virusausbreitung von Zelle zu Zelle notwendig (Muylkens et al., 2007). Nach der Penetration werden das Kapsid und die Tegumentproteine ins Zytoplasma entlassen. Das Kapsid wird zum Zellkern transportiert und die Virus-DNA in den Kern eingeschleust, wo sie zirkularisiert vorliegt. Wie bei anderen Herpesviren läuft auch bei BHV13 Literaturübersicht 1 die Genexpression kaskadenartig ab und ist zeitlich reguliert (Pellet et al., 2007). Zunächst werden die immediate-early (ie) Gene transkribiert. Die ie-Genprodukte haben regulatorische Funktionen und steuern die Expression der early (e) Gene. Deren Genprodukte sind an der viralen Replikation und der Expression der late (l) Gene beteiligt. Die l-Gene kodieren überwiegend für Strukturproteine und werden für den Zusammenbau der Viruspartikel benötigt. Die DNA repliziert über einen „rolling circle“-Mechanismus. Die zunächst entstehenden Konkatemere werden durch Spaltung auf die korrekte Genomlänge verkürzt und im Kern in leere Kapside verpackt (Schynts et al., 2003). Der genaue Prozess der Kapsidumhüllung ist für BHV-1 noch weitestgehend unklar. Für die Alphaherpesviren HSV-1 und PrV konnte allerdings gezeigt werden, dass die Kapside den Kern durch Fusion mit der inneren Kernmembran verlassen und bei diesem Prozess eine erste Hülle erhalten, welche sie aber bei der Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verlieren (Mettenleiter et al., 2006). Vom Zytoplasma aus wandern die Kapside über das Trans-Golgi-Netzwerk in Vesikeln weiter Richtung Zelloberfläche. Auf dem Weg erhalten die Virionen ihre Tegumentproteine sowie die endgültige, mit prozessierten Glykoproteinen versehene Virushülle (Mettenleiter et al., 2006). Die Freisetzung der reifen Virionen erfolgt durch Fusion der Vesikelmembranen mit der Plasmamembran (Granzow et al., 1997). 1.5. Baculoviren Baculoviren sind umhüllte stäbchenförmige Insektenviren mit einem zirkulären, doppelsträngigen DNA-Genom. Alle bisher beschriebenen Baculoviren wurden aus Arthropoden, insbesondere aus der Ordnung Lepidoptera isoliert. Die Vertreter der Baculoviridae lassen sich aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften bei der Ausbildung der charakteristischen Einschlusskörper während der Infektion in zwei Genera einteilen. Baculoviren des Genus Nucleopolyhedrovirus bilden in den Kernen infizierter Wirtszellen Proteineinschlusskörper, sogenannte Polyhedra, die nach Zelllyse die Virionen vor Umwelteinflüssen schützen. Auch die Viren des Genus Granulovirus zeichnen sich durch Bildung von Einschlusskörper aus, allerdings wird hier im Gegensatz zu dem Genus Nucleopolyhedrovirus pro Einschlusskörper nur ein Virion verpackt. Das im Rahmen dieser Arbeit verwendete Baculovirus Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrosis virus (AcMNPV) gehört zum Genus Nucleopolyhedrovirus. Es wurde aus dem Eulenfalter Autographa californica isoliert und ist das am besten charakterisierte Baculovirus (Herniou et al., 2003). 14 Literaturübersicht Das Genom von AcMNPV hat eine Größe von etwa 130 kbp. Die virale DNA ist von dem Kapsidprotein p39 umgeben. Zusammen bilden sie das Nukleokapsid, welches von einer Virushülle umschlossen wird (Blissard et al., 1990). Die Expression der Gene ist zeitlich geregelt und wird in die vier Phasen unterteilt: immediate early, delayed early, late und very late (Rohel et al., 1984). Zwei Gene, die erst in der letzten Phase exprimiert werden, kodieren für die Proteine Polyhedrin und p10. Beide sind nicht essentiell für die Virusreplikation. Ihre Expression steht unter der Kontrolle starker Promotoren (Vialard et al., 1995). Im Wirt werden die aus der Umgebung aufgenommen Baculoviren aus den Einschlusskörpern im Mitteldarm des Insekts freigesetzt. Die Primärinfektion des Darmepithels erfolgt über Fusion der Virushülle mit der Zellmembran. Die Nukleokapside werden zum Zellkern transportiert. Dort findet auch die Replikation des viralen Genoms statt. Bei der Virusnachkommenschaft werden zwei Phänotypen unterschieden: der PDV- (polyhedraderived virus) und der BV- (budded virus) Typ. Beim erstgenannten Typ werden noch im Zellkern die Nukleokapside der Virusnachkommen umhüllt und in Einschlusskörper verpackt. Die Freisetzung der Viren erfolgt unter Lyse der Zelle. Nach dem Tod des Wirtes gelangen die Viren vom PDV-Typ in die Umwelt und können dort längere Zeit stabil verbleiben. Bei den Viren vom BV-Phänotyp erhalten die Viren eine endgültige Hülle erst beim Knospen durch die Zellmembran. Dieser Virustyp ermöglicht im infizierten Insekt die Sekundärinfektion weitere Gewebearten wie Muskel und Fettgewebe über Endozytose (Herniou et al., 2003). Rekombinante Baculoviren finden eine breite Anwendung in der heterologen Proteinexpression in Insektenzellen und in Säugerzellen. Baculovirale Expressionssysteme erlauben eine im Vergleich zu anderen eukaryontischen Systemen hohe Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen. Außerdem stellt das Arbeiten mit Baculoviren ein sehr niedriges Sicherheitsrisiko dar, da diese Viren ein äußerst begrenztes Wirtsspektrum haben, das sich auf die Infektion spezieller Invertebratenspezies beschränkt (Kost et al., 2005). Die für die heterologe Proteinexpression verwendeten Insektenzelllinien entstammen überwiegend den Lepidopteren-Arten Spodoptera frugiperda (Sf9-Zellen) und Trichopulsia ni (High Five-Zellen) (McCarroll et al., 1997). Rekombinante Baculoviren können auch für die Transduktion von Säugerzellen verwendet werden und werden dann aufgrund dieser speziellen Eigenschaft als BacMam Viren bezeichnet (Kost et al., 2005). Baculoviren verfügen über die Eigenschaft unter bestimmten 15 Literaturübersicht Bedingungen an Wirbeltierzellen zu binden und von diesen Zellen aufgenommen zu werden, ohne dass eine Replikation des viralen Genoms stattfindet. Hoffmann et al. beschrieben 1995 erstmals die Möglichkeit eines Baculovirus-vermittelten Gentransfers in humane Hepatozyten. Dazu wurden rekombinante Baculoviren eingesetzt, welche ein Reportergen unter Kontrolle des immediate early Promotors von HCMV exprimierten (Hofmann et al., 1995). 1.6. Impfstoffe in der Veterinärmedizin Impfstoffe dienen der Prävention vor einer Infektion. Sie induzieren eine spezifische Immunantwort und gewähren dadurch Schutz vor dem jeweiligen Erreger. Es werden zwei Arten der Immunisierung unterschieden: passive und aktive Immunisierung. Bei ersterer wird durch die Verabreichung von spezifischen Immunglobulinen ein Schutz vermittelt, ohne dass im immunisierten Organismus eine körpereigene Immunreaktion hervorgerufen wird. Im Gegensatz dazu induziert die aktive Immunisierung eine spezifische, adaptive Immunantwort, die sowohl auf dem humoralen Immunsystem mit antikörperproduzierenden B-Zellen, als auch auf dem zellulären Immunsystem mit immunregulatorischen T-Helferzellen und zytotoxischen T-Zellen (CTL) basiert. Durch die Bildung von Gedächtniszellen ist ein wesentlich längerer Schutz gegen den Erreger gegeben als bei der passiven Immunisierung (Babiuk, 2002). Eine aktive Immunisierung kann mit vermehrungsfähigen oder nicht vermehrungsfähigen Impfstoffen durchgeführt werden. Zu letztgenannten zählen die bereits im Zusammenhang mit MKS-Vakzinen erwähnten Tot- und Subunit-Impfstoffe sowie DNAVakzinen. Ähnlich dem Prinzip der Subunit-Impfstoffe werden DNA-Vakzinen meist für die Induktion einer Immunreaktion gegen definierte Antigene des Erregers eingesetzt. Die in Körperzellen des Impflings transferierte DNA vermittelt die endogene Synthese des Antigens, wodurch sowohl eine humorale als auch eine zellvermittelte Immunantwort hervorgerufen wird (Babiuk et al., 1999). Zur Gruppe der vermehrungsfähigen Impfstoffe gehören u.a. attenuierte Viren. Attenuierte Viren haben im Vergleich zu Wildtypviren eine verminderte Virulenz, sind aber infektiös. Eine Attenuierung kann z.B. durch mehrfache Passagen in Zellkultur oder in heterologen Wirtstieren erreicht werden. Obwohl grundsätzlich die Gefahr einer Reversion zur ursprünglichen Virulenz besteht, beruhen eine Vielzahl von Impfstoffen auf diesem Prinzip der Virusabschwächung (van Oirschot, 2001). Eine wesentlich sicherere Möglichkeit der Attenuierung von Viren ist die gezielte Deletion definierter viraler Gene. Die Deletion nicht 16 Literaturübersicht essentieller, aber Virulenz bestimmender Gene führt zu einer irreversiblen Schwächung des Erregers und kann zudem durch das fehlende Genprodukt eine Unterscheidung zu Wildtypviren erlauben. Voraussetzung für die serologische Differenzierung zwischen geimpften und infizierten Tieren ist, dass das fehlende Protein ausreichend immunogen ist und der veränderte Antikörperstatus im Tier durch geeignete Testsysteme nachweisbar ist. Diese gentechnisch veränderten Impfstoffe werden als Marker- oder DIVA (differentiate infected from vaccinated animals)-Vakzinen bezeichnet. Beispiele für Markervakzinen sind die in Deutschland zugelassene Impfstoffe gegen BHV-1 und PrV. Die BHV-1 Vakzine weist eine Deletion des nichtessentiellen Glykoproteins gE auf (Makoschey et al., 2000). Bei den PrV Impfstoffen sind neben gE- auch gC- oder gG-negative Deletionsimpfstoffe verfügbar (Mettenleiter, 2000). Die beiden letztgenannten sind aber in Deutschland nicht zugelassen. Eine neue Generation von Impfstoffen basiert auf viralen Vektoren. Virale Vektoren sind rekombinante Viren, die durch Fremdgeninsertion für die Expression heterologer Proteine oder Peptide genutzt werden. Dabei kann es sich um vermehrungsfähige oder nicht vermehrungsfähige Viren handeln. Unter den DNA Viren eignen sich aufgrund ihrer Genomgröße und der Vielzahl nicht essentieller Gene beispielsweise Poxviren, Herpesviren, Adenoviren oder Baculoviren. Seit einigen Jahren ermöglicht die Etablierung reverser genetischer Systeme auch den Einsatz von RNA-Viren wie Paramyxoviren, Flaviviren oder Retroviren als virale Vektoren. Die Insertion kann anstelle nicht essentieller Gene oder zusätzlich ins Genom des Vektors erfolgen. Kodieren die Fremdgene für immunogene Proteine anderer Infektionserreger, besteht die Möglichkeit eine spezifische Immunantwort sowohl gegen das parentale als auch gegen das heterologe Virus im Impfling zu induzieren. Aus der Kombination von Vektor und Fremdgen zweier Viren desselben Wirtes kann ein bivalenter Impfstoff resultieren. Ein möglicher Nachteil von Vektorimpfstoffen ist die Immunantwort gegen den Vektor selbst, da in diesen Fällen meist nur eine einmalige Impfung möglich ist. In der Veterinärmedizin gibt es etliche Beispiele für Vektorvakzinen, die entwickelt wurden, um eine gleichzeitige Immunisierung gegen mehrere Erreger zu induzierten. Stellvertretend seien hier rekombinante Viren genannt, die in Hühnern eine schützende Immunantwort gegen das Virus der infektiösen Laryngotracheitis sowie gegen das aviäre Influenzavirus induzieren (Lüschow et al., 2001; Veits et al., 2003). Auch in das Genom von BHV-1 wurden Fremdgene für eine zusätzliche Expression von Antigenen des Bovinen Respiratorischen Syncytialvirus integriert (Schrijver et al., 1997; Kühnle et al., 17 Literaturübersicht 1998). Weiterhin gibt es Untersuchungen zur Expression von Zytokinen durch BHV-1. So wurden verschiedenen Interleukine unter dem Aspekt der Optimierung des BHV-1 Impfstoffes in das BHV-1 Genom inseriert (Kühnle et al., 1996; König et al., 2003). Außerdem wurde ein synthetisches offenes Leseraster für bovines Interferon alpha (IFN-α) erfolgreich an unterschiedliche Stellen des BHV-1 Genoms inseriert und die antivirale Wirkung des Zytokins gezeigt (Keil et al., 2005; Höhle et al., 2005). Baculoviren werden ebenfalls als virale Vektoren für heterologen Proteinexpressionen in Tieren eingesetzt (Aoki et al., 1999; Abe et al., 2003). Da diese Viren im Wirt nicht replizieren, gehören sie in die Gruppe der nicht vermehrungsfähigen Vektoren, die einen hohen Sicherheitsstandard bieten. 1.7. Zielstellung dieser Arbeit Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Markervakzinen im Rahmen einer neuartigen Strategie zur Bekämpfung von MKS-Ausbrüchen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Eignung von BHV-1 sowie von rekombinanten BacMam Viren als virale Vektoren für die Expression von Proteinen des MKSV untersucht werden. Die Herstellung der rekombinanten BHV-1 und BacMam Viren erfolgte durch die Integration von MKSV ORFs in die DNAGenome der beiden Virusvektoren. Die ORFs kodieren für das Vorläuferprotein P1-2A, die virale Protease 3CPro sowie für ein Fusionsprotein aus P1-2A und 3CPro und exprimieren somit die Bereiche des MKSV-Genoms, die für Synthese, Prozessierung und Zusammenbau von leeren Kapsiden benötigt werden (Grubman, 2005). Die BHV-1 Rekombinanten sollten zu einer in Rindern anwendbaren replikationsfähigen Vektorvakzine mit dem Ziel der Doppelimmunisierung sowohl gegen MKS als auch gegen BHV-1 führen. Die rekombinanten BacMam Viren sind dagegen in Säugerzellen nicht vermehrungsfähig und wurden deshalb für die Transduktion von Targetzellen verwendet. Aufgrund ihres breiten Spektrums an Targetzellen könnten die BacMam Viren zur Immunisierung verschiedener Spezies gegen MKSV-Infektionen eingesetzt werden. Der Einsatz von Markervakzinen verlangt geeignete Diagnostiksysteme zur Differenzierung zwischen geimpften und infizierten Tieren. Deshalb sollte parallel zur Entwicklung der rekombinanten BHV-1 bzw. MamBac Viren als mögliche Markervakzinen die Etablierung eines auf dem Nachweis von MKSV-NSP basierendes ELISA-System unterstützt werden. Die MKSV-NSPs 3A, 3B, 3DPol und 3ABCmut sollten über heterologe Proteinexpression durch Baculoviren in Insektenzellen hergestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die dafür 18 Literaturübersicht notwenigen molekularbiologischen Schritte, die zur Generierung der rekombinanten Baculoviren führten, geleistet. 19 Material und Methoden 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. Material 2.1.1. Zelllinien KOP-R primäre bovine Ösopharynxzelllinie (Zellbank, FLI) MDBK Madin-Darby Bovine Kidney (A.Metzler, Zürich) COS-7 SV40 transformierte Fibroblastenzellinie aus Nieren der Meerkatze (Zellbank, FLI) BHK Baby Hamster Kidney Cells (Zellbank, FLI) Sf9 Insektenzelllinie aus dem Ovargewebe des Nachtfalters Spodoptera frugiperda (Zellbank, FLI) HIGH V Insektenzelllinie aus dem Ovargewebe der Kohlspannerraupe Trichoplusia ni (Zellbank, FLI) 2.1.2. Virusstämme MKSV A-Stamm Subtyp A-Iran 97 (FLI) BHV-1 Schönböken BHV-1 Wildtypstamm (FLI) BHV-1/80-221 Glykoprotein gD-negative, LacZ-positive BHV-1 Mutante (FLI) rBac Baculovirus Wildtyp (nach Bac-to-Bac®, Invitrogen) BacMam Baculovirus für Transduktionen ohne Fremdgeninsertion (FLI) BacMam/GFP rekombinantes Baculovirus, GFP unter der Kontrolle eines HCMV-Promotors (FLI) 2.1.3. Medien und Lösungen für Zellkulturen Trypsinlösung DMEM-Kulturmedium 136,0 mM NaCl Dulbecco`s Modified Eagle’s Medium mit 2,6 mM KCl 0,37 g/l Na2HPO4 8,0 mM NaH2HPO4 100 U/ml PenicillinG 1,5 mMKH2PO4 100 µg/ml Streptomycin 3,3 mM EDTA 350 µg/ml L-Glutamin 0,125 % Trypsin vor Gebrauch Zugabe von 10 % FCS 16,0 mg/l Phenolrot pH 7,2 20 Material und Methoden ZB 28 ZB 28 mit β-Mercaptoethanol 8,8 g Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium Zugabe von 5 x 10-5 M β-Mercaptoethanol 5,32 g Medium F12 (Invitrogen) 2,45 g NaHCO3 100 ml FCS ad 1 l H2O Grace’s Medium Sf9-900 II Medium 45,5 g Serva Insect Medium mit Glutamin von Invitrogen 0,35 g NaHCO3 100 U/ml PenicillinG 3,3 g Laktatalbuminhydrolysat (LAH) 100 µg/ml Streptomycin 3,3 g Yeast 10 % FCS ad 1 l H2O 100 U/ml PenicillinG 100 µg/ml Streptomycin ZB5 Zitratpuffer 5,32 g MEM Hanks 40 mM Zitronensäure 4,76 g MEM Earle 10 mM KCl 1,52 g NaHCO3 135 mM NaCl 0,12 g Natriumpyruvat pH 3,0 mit NaOH 10 ml NEAS 100 ml FCS ad 1 l H2O 100 U/ml PenicillinG 100 µg/ml Streptomycin Methylzellulosehaltiges Medium 3,75g Methylzellulose mit 250 ml H2O autoklavieren rühren bis die Methylzellulose gelöst ist Zugabe von 250 ml doppelt konzentriertem DMEM Kulturmedium mit 10 % FCS, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml PenicillinG 21 Material und Methoden 2.1.4. Bakterien Escherichia coli Genotyp: F– supE44 thi-1 thr-1 leuB6 LacY1 C600 tonA21 Lambda- hsdR-hsdM+ (FLI) DH10Bac™ Escherichia coli Genotype: F– mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZ M15 lacX74 recA1 endA1 araD139 galU galK – (ara, leu)7697 rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124 (Invitrogen) Alle Bakterien wurden in LB-Medium unter ständigem Schütteln bzw. auf LB-Platten bei 37°C inkubiert. 2.1.5. Medien und Lösungen für Bakterienkulturen LB-Medium LB+-Medium 10 g Bacto Tryphon LB-Medium mit 10 mM KCl und 5 g Hefe Extrakt 20 mM MgSO4 8 g NaCl ad 1 l H2O SOC-Medium SOA-Medium 10 ml SOA-Medium 10 g Bacto Tryphon 100 µl 1M MgSO4 2,5 g Hefe Extrakt 100 µl 1M MgCl2 1 ml 5M NaCl 200 µl 1M Glucose 1,25 ml 1M KCl ad 500 ml H2O ad 10 ml H2O Selektionsmedium Selektionsmarker wurden in folgenden Konzentrationen eingesetzt: Ampicillin 100 µg / ml Tetracyclin 10 µg / ml Kanamycin 50 µg / ml Gentamycin 7 µg / ml X-Gal 100 µg / ml in Dimethylformamid IPTG 40 µg / ml 22 Material und Methoden LB-Agar CaCl2-Puffer LB-Medium mit 1,5 % Agar 3 ml 1 M CaCl2 und entsprechendem Selektionsmarker 7,5 ml Glycerol (gleiche Konzentrationen wie im Medium) 1 ml 0,5 M PIPES pH 7,5 ad 50 ml H2O 2.1.6. Plasmide pcDNA3 Expressionsvektor (Invitrogen) pSP73 Klonierungsvektor (Promega) pROMI Rekombinationsplasmid zur Integration von Fremdgenen unter der Kontrolle des MCMVie1-Promotors in BHV-1 (FLI) pFastBacDual Transfervektor zur Herstellung rekombinanter Baculoviren (Bac-to-Bac® System, Invitrogen) pBacMamDual_MCMVie von pFastBacDual abstammender modifizierter Transfervektor mit einem GFP ORF unter Kontrolle des Polyhedrin Promotors sowie MCMV ie1 und ie2 Promotoren zur Herstellung rekombinanter BacMam Viren für die Transduktion (FLI) pUHis 2.1.7. Klonierungsvektor mit Universal RGS-6His-Tag Sequenz (FLI) Antibiotika Ampicillin Serva Chloramphenicol Serva Gentamycin Sigma Kanamycin Sigma Penicillin G Grünenthal AG Streptomycin Sigma Tetrazyklin Sigma 23 Material und Methoden 2.1.8. Enzyme, Nukleinsäuren, Längenstandards Alkalische Phosphatase Roche DNase Pharmacia DNA-Längenstandard „1kb-ladder“ Invitrogen DNA-Polymerase I (Klenow Enzym) Roche dNTPs Promega FastStart-Polymerase Roche Lysozym Sigma Proteinase K Roche Protein-Längenstandard Benchmark® Invitrogen Protein-Längenstandard Benchmark® Prestained Invitrogen Restriktionsendonukleasen NEB, Roche, Promega RNase A Sigma T4-DNA-Ligase Roche T4-Polynukleotidkinase PNK NEB Taq-Polymerase Roche 2.1.9. Seren FCS Invitrogen Kaninchen Normalserum FLI, Tübingen bovines Hyperimmunserum (für VNT) FLI, Tübingen 2.1.10. Antikörper und Adjuvanzien α-gB COOH polyklonales Kaninchenserum gegen das carboxyterminale Ende des Glykoproteins gB von BHV-1 (G.Keil, FLI) α-3ABCmut polyklonales Kaninchenserum gegen das MKSV Polyprotein 3ABCmut (N.Kumar, FLI) α-RGS-6His monoklonaler Maus-Antikörper gegen die AS-Sequenz RGS-6His (QIAGEN) mab 42/18/7 monoklonaler Maus-Antikörper gegen BHV-1 gB (G.Keil, FLI ) mab 9C-2 monoklonaler Maus-Antikörper gegen den Serotyp MKSV A-Iran 97 (B.Haas, FLI) 24 Material und Methoden Ziege α-Kaninchen IgG, Peroxidase-konjugiert (Dianova) Ziege α-Maus IgG, Peroxidase-konjugiert (Dianova) Ziege α-Kaninchen IgG, Alexa Flour® 594 konjugiert (Invitrogen) Ziege α-Kaninchen IgG, Alexa Flour® 488 konjugiert (Invitrogen) Ziege α-Maus IgG, Alexa Flour® 594 konjugiert (Invitrogen) α-Maus CD4, PE-konjugiert (BD Pharmingen™) α-Maus I-Ab, FITC-konjugiert (BD Pharmingen™) α-Maus CD8a, FITC-konjugiert (eBioscience) Ratte α-Maus CD8 (U.Blohm, FLI) α-Maus/Mensch CD45R (B220), Biotin-konjugiert (eBioscience) α-Maus CD11b, Biotin-konjugiert (eBioscience) α-Maus CD11b, Biotin-konjugiert (eBioscience) α-Ratte IgG, PE-konjugiert (eBioscience) FITC konjugiertes Streptavidin (eBioscience) PE konjugiertes Streptavidin (eBioscience) Freund`s Complete Adjuvans / Incomplete Adjuvans (Sigma) 2.1.11. Chemikalien und Bioreagenzien Agar Difco Agarose Invitrogen ATP Sigma Bacto Typton Invitrogen Bicinchoninsäure ICN Bluo-Gal Serva Bromphenolblau Serva BSA NEB Cäsiumchlorid Invitrogen CFSE ALEXIS DMSO Roche DTT Roche EDTA freie Säure Sigma EGTA Sigma 25 Material und Methoden Ethidiumbromid Serva FuGENE® HD Roche L-Glutamin Serva Glycerol Sigma IPTG Roche Polyethylenimin (PEI) Sigma Polyethylenglycol (PEG) Sigma PIPES Sigma Protease Inhibitor (EDTA-frei) Roche SDS Serva Seakem ME-Agarose FMC Sucrose Serva Tricin Sigma Tris Invitrogen Triton X-100 Serva Trizol Invitrogen X-Gal Invitrogen Yeast-Extrakt Difco Alle anderen Chemikalien wurden von den Firmen ROTH bzw. Merck bezogen. 2.1.12. Kits Plasmid Midi Kit® QIAGEN Mammalian Transfection Kit Stratagene Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit Amersham Biosciences Super Signal® West Pico Chemiluminescent Perbio First strand cDNA Kit Amersham Biosciences 26 Material und Methoden 2.1.13. Puffer und Lösungen PBS PBS+ 140 mM NaCl 140 mM NaCl 2,7 mM KCl 2,7 mM KCl 6,5 mM Na2HPO4 8 mM Na2HPO4 1,5 mM KH2PO4 1,5 mM KH2PO4 pH 7,4 0,9 mM CaCl2 2 H2O 0,5 mM MgSO4 pH 7,4 FACS-Puffer Blutpuffer 0,1 % NaN3 0,1 % NaN3 0,1 % BSA 0,1 % BSA 1 mM EDTA 10 x Blut-Lysepuffer nach (Muirhead et al., 1986) 8,3 g NH4Cl 1,0 g KHCO3’ 1,6 ml 0,5 EDTA ad 100 ml H2O pH 7,4 mit NaOH Sterilfiltrieren Colloidales Coomassie Brilliant-Blue nach (Neuhoff et al., 1988) Stammlösung 100 x Coomassie Brillant Blue (CBB) G-250: CBB G250 10 % (w/v) Methanol 50 % (v/v) Stammlösung Ammoniumsulfat / Phosphorsäure: Ammoniumsulfat 10 % (w/v) Phosphorsäure 2 % (v/v) Färbelösung: 1 Teil CBB Stammlösung wird in 20 Teilen Methanol gelöst und mit 80 Teilen Ammoniumsulfat / Phosphorsäure gemischt. 27 Material und Methoden Glycerolschocklösung 2 x Hepes 20 % Glycerol (87%) 50 mM Hepes 50 % 2 x Hepes 1,5 mM Na2HPO4 30 % H2O 280 mM NaCl pH mit 5 M NaOH auf 7,13 einstellen ELISA Waschpuffer Coating Puffer 29 g Na2HPO4 10 mM Na2HCO3 2 g KH2PO4 35 mM NaHCO3 ad 500 ml H2O, aufkochen, Zugabe von pH 9,6 80 g NaCl 2 g KCl 5 ml Tween20 ad 10 l H2O ELISA Puffer I ELISA Puffer II PBS+ mit 0,1 % Tween 20 ELISA Puffer I mit 5 % Kaninchen Normalserum 10 % FCS DNA-Marker Probenpuffer für DNA Marker 30 µl 1 kb Ladder (1000 µg/ml) 40 % Sucrose 40 µl 10 x TA 0,05 % Bromphenolblau 330 µl H2O 0,1 % SDS 100 µl Probenpuffer 1 mM EDTA 10 min bei 56°C erhitzen Klenow Puffer PNK-Puffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 25 % PEG 8000 10 mM MgCl2 5 mM ATP 0,1 mM jedes dNTP 5 mM DTT 1 mg/ml BSA 28 Material und Methoden 10 x TA (für Klonierungen) 50 x TA (für DNA-Agarosegele) 330 mM Tris 2 M Tris 660 mM Kaliumacetat 0,05 M Natriumacetat 100 mM Magnesiumacetat pH 7,8 mit Eisessig 1 mg/ml BSA 5 mM DTT pH 7,9 mit Essigsäure Lösung I / Plasmidpräparation Lösung II / Plasmidpräparation 10 mM EDTA, pH 8,0 0,2 M NaOH 20 mM Tris, pH 8,0 1 % SDS 50 mM Glucose 2 mg/ml Lysozym Lösung III / Plasmidreinigung 3 M Natriumacetat pH 4,8 Nativer Lysepuffer / Proteinreinigung Denaturierender Lysepuffer / Proteinrein. 50 mM NaH2PO4 100 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM Tris 0,1 % Triton X-100 8 M Urea Protease Inhibitor (EDTA frei) Protease Inhibitor (EDTA frei) pH 8,0 mit NaOH pH 8,0 mit NaOH Waschpuffer / Proteinreinigung Elutionspuffer / Proteinreinigung 50 mM NaH2PO4 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 300 mM NaCl pH 8,0 mit NaOH 250 mM Imidazol pH 8,0 mit NaOH 29 Material und Methoden BCA-Lösung A BCA-Lösung B 25,8 mM Bicinchoninsäure 4 % CuSO4 2 % Na2CO3 0,16 % Natriumtartrat 0,95 % NaHCO3 pH 11,25 mit NaOH 4 x Lower Tris 4 x Upper Tris 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 0,4 % SDS 0,4 % SDS 10 x Protein-Laufpuffer 3 x Protein-Probenpuffer 144 g/l Glycin 40 % Sucrose 30 g/l Tris 12% SDS 10 g/l SDS 0,02 Bromphenolblau 62,5 mM Tris Transferpuffer TE-Puffer 1,514 g Tris 10 mM Tris pH 7,5 7,21 g Glycin 1 mM EDTA pH 7,5 0,5 g SDS 100 ml 30 % Methanol ad 500 ml mit H2O TES-Puffer STET-Puffer 50 mM Tris pH 8 50 mM Tris pH 8 50 mM NaCl 50 mM EDTA pH 8 50 mM EDTA pH 8 8 % Sucrose 5 % Triton X-100 Western Blot Waschpuffer I Western Blot Waschpuffer II PBS mit 0,3 % Tween 20 PBS mit 0,1 % Tween 20 30 Material und Methoden Trypanblau VSB 0,2 % in PBS 50 mM Tris sterilfiltriert 10 mM KCl 5 mM EDTA pH 7,8 SDS 10 % Trenngel SDS 12,5 % Trenngel 20 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid 25ml 30% Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid 15 ml 4 x Lower Tris 15 ml 4 x Lower Tris 24,4 ml H2O 19,4 ml H2O 600 µl 10% Ammoniumpersulfat 600 µl 10% Ammoniumpersulfat 20 µl TEMED 20 µl TEMED SDS 3% Sammelgel TEN-Puffer 2 ml 30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid 150 mM NaCl 5 ml 4 x Upper Tris 20 mM Tris 12,9 ml H2O 1mM EDTA 100µl 10 % Ammoniumpersulfat pH 7,6 30µl TEMED CsCl-Lösung 50 g CsCl in 20 mM Tris pH 8,0 lösen und auf 65 ml auffüllen. Refraktärer Index liegt bei RI=1,3865 NaCl-gesättigtes Isopropanol 300 ml NaCl-gesättigtes TE (10 mM Tris/1 mM EDTA pH 8,0) mit 20 ml Isopropanol ausschütteln 31 Material und Methoden 2.1.14. Primer (MWG Biotech) Tab. 1: PCR-Primer 3ABC+ 3ABC_5`- 5`- TAA GAG CTC GAG CCA CCA TGA TCT CAA TTC CTT CCC AAA AAT CTG TGT TG - 3` 5`- TAA TCT AGA GTA ACC AGC CTT GGT GGC GGC TCT GTA G - 3` 3ABC_3`mut+ 5`- TAA GAA TTC GCC ACC AAG GCT GGT TAC GGC GGA G - 3` 3ABC_3`mut- 5`- TAA AGA TCT GCG GCC GCT AAC TCG AGT CAT GGT GTG GTT CAG GGT CGA -3` 5`- TAC AGA TCT GCGGCC GCT AAC TCG AGC CTT CAG CTT GTG GTT GTT CCT CC -3` 5`- TAA GAG CTC GAG CCA CCA TGG GAC CCT ACG CCG GGC CAC TTG AGC GTC AG - 3` 5`- AGA GAT CTG CGG CCG CTA GCT CGA GCC CTC AGT GAC AAT CAA GTT CTT CG - 3` 5`- ACA GAT CTC TCG AGC CAC CAT GGG CAG TGG TGC CCC ACC GAC CGA CTT GC - 3` 5`- TAA GCG GCC GCA GAG AGT GGT GCC CCA CCG ACC GAC TTG -3` 3A3B+ 3B3C+ 3CNotI 3C3D+ 3DP1-2A+ 5`- TAA TCT AGA GGT CAC CGA TAT CTC ACT CAT GGT GTG GTT CAG GGT CGA TG - 3` 5`- TAC AGA TCT GAG CTC CAC CAT GGG AGG TTT GAT TGT TGA CACCAG AGA TG- 3` 5`- TAA AGA TCT AAG AGC TCG CTG CGT CGC CGC ACA CGG CGT TCA C - 3` P1-2ANotI 5`- TAC GAT ATC TTA AGC CAC CAT GGG AGG AGC CGG ACA ATC CAG TCC -3` 5`- TAA GCG GCC GCT CCA GGG TTG GAC TCA ACG TC -3` P1-2A- 5`- TAA CTT AGG TGG TCA TCC AGG GTT GGA CTC AAC GTC – 3` VP2+ 5`- TAA CCC GGG ACG ATG CTT CTT GCT GAC AAG AAG ACA GAG G - 3` VP2- 5`- TAA CCC GGG GCC TCT TTC GAC GGG AGC TCA CCG GCT ACG - 3` gB-9 5`- TGA GAA TTC AGC TGT ACC TGC AGG AGC TGG - 3` gB-10 5`- TAG TCT AGA CCA GGC GGC TGA ACA TGG TGT- 3` Tab. 2: Sequenzierprimer P1-2Afor 5`- ACC TAC CTA TCA GGG ATA G - 3` 5`-IRD 800 markiert P1-2Arev 5`- GAG TCA GTA GAA CCA GTG - 3` 5`-IRD 700 markiert VP1for 5`- ACA GAA GAT CAT TAC GCC TGT G - 3` 5`-IRD 800 markiert 2Arev 5`- CGC TGG TCC AGG GTT GGA CTC - 3` 5`-IRD 700 markiert 3Dfor 5`- GAC TAC GCG TCA CGC TTA CAC - 3` 5`-IRD 800 markiert 3Drev 5`- CCA TGG CGT CGA GGC CGT C - 3` 5`-IRD 700 markiert SP6 5`- ATT TAG GTG ACA CTA TAG - 3` 5`-IRD 700 markiert T7 5`- TAA TAC GAC TCA CTA TAG G - 3` 5`-IRD 800 markiert pspSP6 5`- GTC GTT AGA ACG CGG CTA - 3` 5`-IRD 800 markiert 32 Material und Methoden pspT7 5`- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG - 3` 5`-IRD 700 markiert gDpola 5`- TCT TCG CTA TGG TGG CGA GG - 3` 5`-IRD 700 markiert ie1cas 5`- CGG TCT GAC CAC CGT AGA ACG CAG AG - 3` 5`-IRD 800 markiert pHrev 5`- ATG TGG TAT GGC TGA TTA TGA TCC - 3` 5`-IRD 700 markiert p10for 5`- TCG ACA GAG TGC CAG CCC TGG GAC - 3` 5`-IRD 800 markiert 2.1.15. Geräte Agarosegelapparatur FLI, Insel Riems BioTrap Apparatur u. Membranen Schleicher & Schuell Brutschrank Bakterien Bachofer Eppendorf Mastercycle Gradient Eppendorf Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf ELISA-Reader Sunrise Tecan FACSCalibur Becton Dickinson Fluoreszenzmikroskop TO 41 mit Digitalkamera Olympus Gel-Netzgeräte Pharmacia Biotech Küvetten Biorad, Brand Multikanalpipette, Pipetten Eppendorf, Gilson Lichtmikroskop Leica Neubauer Zählkammer Marienfeld GmbH Protean® bzw. Mini-Protean® Biorad Schüttler Innova 4330 für Bakterienkulturen New Brunswick Scientific Spektrometer Du® 640 Beckman Sequenzierer LI-COR GENE READER 4200 MWG Trans-Blot®-SD Semi-Dry Transfer Cell Biorad Ultraschallgerät Branson UV-Transilluminator Herolab Vortex Heidolph Wassermantel-CO2 Inkubator für Zellkulturen Forma Scientific Zentrifugen Tischzentrifuge 5415D Eppendorf Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf 33 Material und Methoden Minifuge 2 Heraeus LE 70 Ultrazentrifuge mit 50 TI Rotor Beckman Zentrifuge J2-HS mit JA17/ JA10 Rotor Beckman Tisch-UZ TL100 mit TLA 45 Rotor 2.1.16. Beckman Verbrauchsmaterial Chromatographiepapier 3MM Whatmann FACS Röhrchen Becton Dickinson Hyperfilm™ MP High Performance autoradiography film Amersham Bioscience Maxisorb 96-well Platten Nunc Microtainer® Becton Dickinson Nitrozellulose 0,22µm Schleicher & Schuell Kanülen Dispomed Reaktionsgefäße Eppendorf Sterilfilter Millipore Spritzen Dispomed Zellkulturmaterial Costar, Greiner Zentrifugengefäße Beckman 2.1.17. Versuchstiere Kaninchen vom Stamm Chinchilla Bastard, FLI-eigene Zucht Mäuse vom Stamm C57 BL/6, FLI-eigene Zucht 2.1.18. Software Sequenzauswertung: GCG Version 11.1. Accelrys Inc. San Diego, CA Plaqueflächenausmessung: analySIS labFlow 5.0, Soft Imaging Systems GmbH, Germany Statistische Auswertung / Plaqueflächen: GraphPad Software Inc. FACS-Auswertung: Cellquest software, Becton Dickinson ELISA Reader: Magellan PC Software, Tecan 34 Material und Methoden 2.2. Methoden 2.2.1. Klonierung von DNA 2.2.1.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen Die Spaltungen mit Restriktionenzymen erfolgte bezüglich Pufferzusammensetzung, Temperatur und Zusatz von BSA nach den Herstellerangaben. Für die Spaltungen wurden 2 U Enzym pro µg Plasmid-DNA eingesetzt. 2.2.1.2. Klenow-Behandlung von 5`-überhängenden Enden Die 5`→ 3` Polymerase-Aktivität des Klenow-Fragmentes der E.coli Polymerase I wurde genutzt, um 5`-überstehende DNA-Enden zu glatten Doppelstrangenden aufzufüllen. Dazu wurde gespaltene DNA (5 µg) in 42 µl H2O und 5 µl 10 x TA resuspendiert und nach Zugabe von 2 µl dNTP-Mix (10mM) und 5 U Klenow-Polymerase für 30 min bei RT inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurde 1 µl EDTA (0,5 M, pH 7,5) zugegeben bzw. 10 min bei 75°C inkubiert. 2.2.1.3. Klenow-Behandlung von 3’-überhängenden Enden Das Klenow-Fragment der E.coli Polymerase I besitzt neben der 5`→ 3` Polymerase Aktivität auch eine 3`→ 5` Exonuklease Funktion, welche für den Abbau von 3`-überhängenden Enden genutzt wurde. Hierzu wurden 5 µg gespaltene DNA in 42 µl H2O und 5 µl 10 x TA resuspendiert, nach Zugabe von 5 U Klenow-Fragment gut vermischt und abzentrifugiert. Es wurden sofort 2 µl dNTPs (10 mM) zugegeben und 30 min bei RT inkubiert. Während dieser Zeit wurde der abgedaute Einzelstrang durch die 5`→ 3` Polymerase Aktivität des Enzyms zu glatten Doppelstrangenden aufgefüllt. Die Reaktion wurde durch 1 µl EDTA (0,5 M, pH 7,5) bzw. durch 10 min Inkubation bei 75°C beendet. 2.2.1.4. Klonierung von PCR-Fragmenten mit glatten Enden Wenn das PCR-Produkt keine passenden Restriktionsspaltstellen besaß, verlief die weitere Klonierung über glatte Enden. Dazu ist es notwendig, mögliche überstehende Enden zu entfernen, die bei Verwendung der Taq-Polymerase häufig durch unspezifisches Anhängen eines dATP an das 3`-Ende des Amplifikationsproduktes entstehen. Zou und Brown entwickelten ein Protokoll, welches es ermöglicht, die enzymatische Behandlung des PCRProduktes bis zur Ligation in den Vektor zügig durchzuführen (Zou et al., 1992). 35 Material und Methoden Zunächst wird der PCR-Ansatz auf ein 1,5 - 2 % Agarosegel aufgetragen und das gewünschte Fragment nach Auftrennung aus dem Gel eluiert. Das Pellet wird in 16 µl Klenowpuffer und 2 U Klenow Enzym aufgenommen und 30 min bei 21°C inkubiert. Danach wurde das Enzym durch 10 min Inkubation bei 75°C inaktiviert. Jetzt wurden 2 U Polynukleoitidkinase (PNK) und 4 µl PNK-Puffer zugegeben und weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 75°C über 10 min wurden direkt 100 ng linearisierte und dephosphorylierte Vektor-DNA und 1 U T4-DNA-Ligase in den Reaktionsansatz gegeben und laut Ligationsprotokoll über Nacht inkubiert. 2.2.1.5. Dephosphorylierung von DNA Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) wurde genutzt um die terminale 5`Phosphatgruppe an linearer DNA zu entfernen. Bei Klonierungen wurde der linearisierte Vektor mit Phosphatase behandelt, um dessen Religation zu verhindern. Dazu wurde der gespaltene Vektor (5 µg) mit 25 µl 10 x Phosphatasepuffer und 1 µl CIP versetzt und mit H2O auf 250 µl aufgefüllt. Zunächst wurde für 30 min bei 37°C inkubiert, nach nochmaliger Zugabe von 1 µl CIP für weitere 30 min bei 56°C. Zur Inaktivierung des Enzyms wurden 50 µl 60 mM EGTA zugegeben und 15 min bei 65°C inkubiert. Die Phosphatase wurde anschließend durch Proteinase K zerstört. Dazu wurden 30 µl 10 % SDS und 1 µl (10 mg/ml) Proteinase K gegeben und für 30 min bei 56°C inkubiert. 2.2.1.6. Reinigung von DNA mittels Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation Um Enzyme und andere Proteine aus DNA-Lösungen zu entfernen, wurde ein Volumen DNA-Lösung nacheinander mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol je dem (25:24:1) und gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol Phenol, (24:1) extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugation (Eppendorf-Tischzentrifuge) bei 14000 rpm getrennt. Der wässrige Überstand wurde dann mit 1/10 Vol 3 M Natriumacetat pH 7,0 und 2,5 Vol 100% Ethanol 30 min bei -70°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation für 15 min bei RT und 14000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge) pelletiert. Das DNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, bei 56°C getrocknet und schließlich in TEPuffer resuspendiert. 36 Material und Methoden 2.2.1.7. Phenolextraktion von DNA aus Agarosegelen Die gewünschte Bande wurde mittels Skalpell unter UV-Licht (366nm) aus dem Gel geschnitten und mit einem Glasstab im Eppendorfgefäß zerstampft, mit dem gleichen Volumen Phenol gemischt und anschließend gevortext und in flüssigem Stickstoff gefroren. Es folgte ein sofortiger Zentrifugationsschritt bei 14000 rpm für 25 min bei RT (Eppendorfzentrifuge). Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt, mit dem gleichen Volumen Chloroform/Isoamyalkohol (24:1) versetzt, gut gemischt und erneut zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde wieder abgenommen und zur Fällung mit 1/10 Vol 3 M Natriumacetat pH 7,0 und 2,5-fachem Vol 100 % Ethanol versetzt und für 30 min bei -70°C inkubiert. Die Pelletierung der DNA erfolgte bei 14000 rpm für 15 min bei RT (Eppendorf-Zentrifuge). Die DNA wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, anschließend bei 56°C getrocknet und in insgesamt 50 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur Kontrolle wurde 1 µl auf ein 0,6 % Agarosegel auftragen. 2.2.1.8. Ligation Die T4-DNA-Ligase verknüpft unter ATP-Verbrauch 5`- Phosphat-Enden mit 3´- OH-Enden linearer DNA-Fragmente. Linearisierte und dephosphorylierte Vektor-DNA und das zu inserierende DNA-Fragment wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt (ca. je 0,5-1 µg). Sollten bei der Ligation überstehende Enden miteinander verknüpft werden, wurde 0,1 U an T4-DNALigase eingesetzt, bei glatten Enden wurde 1 U der T4-DNA-Ligase verwendet. Als Puffer diente 1 x TA. Weiterhin wurden für einen 50 µl Ligationsansatz 5 µl ATP (10 mM), 5 µl BSA (500 µg/ml) und 5 µl DTT (100 mM) zugegeben und entsprechend mit H2O aufgefüllt. Die Proben wurden 5 min bei 37°C, 1 h bei RT und über Nacht bei 4°C inkubiert. 2.2.2. Transformation und Transposition 2.2.2.1. Herstellung kompetenter Bakterien für die Transformation bzw. Transposition + 20 ml LB -Medium wurden mit 20 µl Bakterienkultur (E.coli Stamm C600 oder DH10Bac™) angeimpft und bis zu einer OD660 von ca. 0,6 auf dem Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden dann durch 10 minütige Zentrifugation bei 1500 g und 4°C (Heraeus-Zentrifuge) pelletiert, das Pellet in 25 ml CaCl2-Puffer aufgenommen und für 40 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien wieder pelletiert (10 min, 1500 g, 4°C) und in 5 ml CaCl2-Puffer resuspendiert. Nach weiteren 2 h Inkubation auf Eis wurde die 37 Material und Methoden Bakteriensuspension aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert. 2.2.2.2. Transformation Je 10 µl eines Ligations- bzw. Kontrollansatzes wurden mit 50 µl kompetenten Bakterien C600 versetzt und 20 min auf Eis, 2 min bei 42°C und wiederum 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde je Transformation 200 µl LB+-Medium zugegeben und für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Transformationsansätze wurden dann auf LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Kolonien wurden in jeweils 3 ml LB-Medium mit Antibiotika aufgenommen und über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. 2.2.2.3. Transposition Je 1 µl eines rekombinanten Transfervektors wurde mit 100 µl kompetenten Bakterien DH10Bac™ versetzt und 20 min auf Eis, 2 min bei 42°C und wiederum 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurde 900 µl SOC-Medium (= 10-1 Verdünnung) zugegen und der Ansatz für ca. 4 h bei 37 °C und 300 rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Transpositionsansatz bis 10-3 mit SOC-Medium verdünnt und für weitere 8 - 12 h bei 37 °C und 300 rpm inkubiert. Am nächsten Morgen wurde der Transpositionsansatz bis 10-5 mit SOC-Medium verdünnt und je 250 µl der Verdünnungen 10-3 bis 10-5 auf je eine Agarplatte mit Tetracyclin, Kanamycin, Gentamycin, X-Gal und IPTG ausplattiert. Nach ca. 48 h Inkubation bei 37°C konnten blaue von weißen Kolonien differenziert werden. Rekombinante weiße Klone wurden gepickt und in 3 ml LB-Selektionsmedium mit den bereits aufgezählten Antibiotika aufgenommen und über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. 2.2.3. Isolierung von Nukleinsäuren 2.2.3.1. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA und baculoviraler Bacmid-DNA Von einer E.coli Übernachkultur wurde 1 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und für 1 min bei 7000 rpm pelletiert (Eppendorf-Zentrifuge). Der Überstand wurde abgesaugt und das Bakterienpellet in 100 µl der Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 100 µl der Lösung II zugeben und gut gemischt. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde die Bakteriensuspension vorsichtig geschwenkt und für 20 - 60 min auf Eis inkubiert. Nach 38 Material und Methoden Zentrifugation in der Eppendorf-Zentrifuge mit 14000 rpm für 5 min wurde der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß gegeben und zur Fällung der Plasmid-DNA mit 1 ml 100% Ethanol versetzt und für 15 min bei -70°C gelagert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA durch Zentrifugation für 10 min bei 14000 rpm und RT pelletiert (Eppendorf-Zentrifuge). Die DNA wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, dann bei 56°C getrocknet und schließlich in 40 µl TEPuffer mit RNAse A (50 µg/ml) resuspendiert. Ein Teil der DNA (10 µl) wurde für eine Kontrollspaltung zur Identifizierung von rekombinanten Klonen eingesetzt. Die gesamte Kontrollspaltung wurde auf ein 0,6 % Agarosegel aufgetragen. 2.2.3.2. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA mittels QIAGEN Plasmid-Midi Kit® Plasmidpräparationen mit QIAGEN Kits ergaben eine wesentlich sauberere DNA als bei der Schnellpräparation. 1 µl Plasmid-DNA aus der Schnellpräparation wurde in 50 µl E.coli C600 transformiert. Damit wurden 50 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotikazusätzen angeimpft und über Nacht geschüttelt. Die Präparation von Plasmid-DNA erfolgt nach Angaben des Herstellers. Das DNA-Pellet wurde schließlich in 125 µl TE-Puffer resuspendiert. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurden 500 ng DNA für eine Kontrollspaltung eingesetzt. 2.2.3.3. Präparation von bakterieller Plasmid-DNA mittels Gradientenzentrifugation 300 ml LB-Selektionsmedium wurden mit 1 ml einer frisch gewachsenen Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD550 von ca. 1,4 inkubiert. Es wurden nun 1,5 ml Chloramphenicol (34 mg/ml in Ethanol) zugegeben. Chloramphenicol ermöglicht die selektive Anreicherung von Plasmiden bei gleichzeitiger Hemmung der chromosomalen Replikation. Nach Übernacht-Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien bei 4000 rpm (Beckman JA10 Rotor) für 20 min pelletiert. Das Pellet wurde in 20 ml TES-Puffer resuspendiert und erneut bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman JA17 Rotor). Das Bakterienpellet wurde in 25 ml STET-Puffer aufgenommen und nach Zugabe von 1 ml Lysozym (20 mg/ml in Tris pH 8,0) über der Bunsenbrennerflamme ca. 40 s erhitzt. Die denaturierten Bakterien wurden auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation im JA17 Rotor (45 min, 16000 rpm) wurde der Überstand mit der gleichen Menge Isopropanol versetzt, gemischt und für 10 min bei -70°C inkubiert. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugation im JA17 Rotor 39 Material und Methoden mit 10000 rpm in 15 min pelletiert, für 20 - 30 min im Vakuumschrank bei 37°C getrocknet und anschließend unter Schütteln bei 37°C in 8,7 ml 20 mM Tris pH 8,0 / 1 % Sarcosyl resuspendiert. Nach Zugabe von 9,4 g Cäsiumchlorid (CsCl) und 900 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml in 20 mM Tris pH 8,0) wurde die Suspension für 48 h bei RT mit 40000 rpm im 50 TI Rotor zentrifugiert. Die untere Plasmidbande wurde mit einer Kanüle abgenommen und mit einer CsCl-Lösung (refraktärer Index 1,3865) auf 12 ml aufgefüllt. Nach erneuter Zentrifugation für 48 h im 50 TI Rotor (40000 rpm, RT) wurde wieder die untere Plasmidbande abgezogen und 5 x mit dem gleichen Volumen an NaCl-gesättigtem Isopropanol ausgeschüttelt, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Es folgte eine zweitägige Dialyse gegen 5 mM Tris pH 8,0, wobei der Puffer mehrmals gewechselt wurde. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurde mit 500 ng DNA eine Kontrollspaltung durchgeführt. 2.2.3.4. Präparation von DNA aus BHV-1 Virionen Konfluente KOP-R Zellen in 10 cm Kulturschalen wurden mit BHV-1 infiziert (moi ~ 0,1) und bis zur vollständigen Lyse der Kultur bei 37°C inkubiert. Die lysierten Zellkulturen wurden bei 1500 g (Heraeus-Zentrifuge) für 15 min zentrifugiert und der Überstand in ein Becherglas gefüllt. Die Pellets wurden in PBS resuspendiert (ca. 1/10 des Ausgangsvolumens) und anschließend zum Aufbrechen der Zellen und damit zur Freisetzung von intrazellulärem Virus zweimal in flüssigen Stickstoff gefroren und getaut, sowie für 20 s mit Ultraschall behandelt. Durch Zentrifugation bei 3000 g für 15 min wurden die Zelltrümmer pelletiert und der Überstand mit dem der ersten Zentrifugation vereint. Hiervon wurde das Gesamtvolumen (in g) bestimmt und PEG 6000 (ad 8 % Gewicht) und NaCl (Endkonzentration 0,7 M) zugegeben und bei Raumtemperatur gelöst. Anschließend wurde das Gemisch zur Fällung der Viren über Nacht auf Eis inkubiert. Am nächsten Tag wurde bei 3000 g und 4°C für 20 min zentrifugiert, das Pellet in insgesamt 10 ml TE-Puffer aufgenommen und zum Abbau restlicher genomischer Zell-DNA mit 10 mM MgCl2 und 1 U DNase versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde das Viruslysat vorsichtig auf 5 ml 15 % Sucrose in VSB geschichtet. Anschließend erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 25000 rpm für 60 min (Beckman-Zentrifuge, SW41-Rotor), bei welchem lediglich die Viruspartikel das Sucrosekissen passierten und pelletiert wurden. Das Pellet wurde in insgesamt 1,8 ml TE-Puffer resuspendiert und zum Aufbrechen der Viruskapside mit 200 µl 20 % Sarcosyl für 1 h bei 56°C inkubiert. Die Reinigung viraler DNA erfolgt über 40 Material und Methoden Dichtegradientenzentrifugation mit CsCl. Dazu wurden 10 g CsCl in 6 ml TE-Puffer gelöst und der refraktäre Index von 1,4115-1,4120 kontrolliert. Die CsCl-Lösung wurde zusammen mit den lysierten Viren in Ultrazentrifugenröhrchen gefüllt und 42 h mit 40000 rpm bei 20°C zentrifugiert (LE 70 Ultrazentrifuge mit 50 TI Rotor, Beckman). Der Gradient wurde mittels Kanüle á 10 Tropfen von unten fraktioniert. Um Fraktionen mit Virus-DNA zu identifizieren, wurden von jeder Fraktion 5 µl in einem 0,6 % Agarosegel aufgetrennt. DNA-haltige Fraktionen wurden vereint und erneut der refraktäre Index bestimmt. Für einen zweiten Ultrazentrifugenlauf wurden identische Bedingungen bezüglich CsCl-Gehalt und TEVolumen wie oben eingestellt. Die Proben wurden wiederum für 42 h mit 40000 rpm bei RT zentrifugiert. Nach Fraktionieren des Gradienten wurden die DNA-haltigen Proben wie oben beschrieben identifiziert und vereint und zur Entfernung des CsCl gegen 5 mM Tris pH 8 über 48 h mit mehrfachem Pufferwechsel dialysiert. Anschließend wurde die Konzentration der viralen DNA photometrisch bestimmt. 2.2.3.5. Präparation von DNA aus infizierten Zellen Zur Isolierung von gesamtzellulärer DNA aus infizierten Zellen wurden nach durchgängigem CPE 435 µl des Zelllysates abgenommen und mit 5 µl 1 M Tris pH 7,5, 10 µl 0,5 M EDTA pH 7,5 und 50 µl 20 % Sarcosyl versetzt. Nach Zugabe von 10 µl RNase A (50 µg/ml) wurde der Ansatz für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10 µl Proteinase K (10 mg/ml) zugegeben und für 1 h bei 56°C inkubiert. Die DNA wurde dann mittels Phenol-ChloroformExtraktion gereinigt, ethanolpräzipiziert und in 30 µl TE resuspendiert. 2.2.3.6. Isolierung von MKSV RNA 250 µl Virus-Isolat vom MKSV Stamm A-Iran 97 wurden mit 750 µl Trizollösung versetzt und für 15 s kräftig geschüttelt. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde wiederum kräftig geschüttelt, die Probe dann für 5 min bei RT inkubiert und schließlich für 10 min bei 11000 rpm und 6°C zentrifugiert (Eppendorf-Tischzentrifuge). Aus der oberen, wässrigen Phase wurde die RNA mit 500 µl Isopropanol für 5 min bei RT präzipitiert und durch anschließende Zentrifugation für 10 min bei 13000 rpm und 6°C sedimentiert. Die RNA wurde mit 75 % Ethanol gewaschen und bei -70°C gelagert. 41 Material und Methoden 2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration von Nukleinsäuren wurde am Photometer über die Absorption bei 260 nm bestimmt. Dabei entspricht eine OD260 = 50 µg/ml DNA. 2.2.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht die gezielte Amplifizierung von DNAFragmenten. Dazu werden Oligonukleotide (Primer) benutzt, die in gegenläufiger Richtung an Strang und Gegenstrang des gewünschten DNA-Abschnittes hybridisieren. Die Primer besaßen in der Regel am 5’-Ende Restriktionspaltstellen, die in das amplifizierte DNA-Fragment eingeführt wurden und für spätere Klonierungszwecke benutzt wurden. Die Proben wurden in 33 Zyklen im Mastercycler gradient (Eppendorf) amplifiziert. Einer einmaligen Denaturierungszeit von 2 min bei 95°C, folgten Zyklen mit je 30 s bei 95°C (DNA-Denaturierung), 45 s Primer-Annealing (Temperatur abhängig vom GC-Gehalt der Primer) und 60 s bei 72°C (DNA-Synthese). Eventuell wurde nach den Zyklen für 5 - 7 min ein Inkubationsschritt bei 72°C zum Vervollständigen der DNA-Synthese angefügt. Als Kontrolle wurde eine Wasserprobe mitgeführt. Für die Überprüfung der PCR-Reaktion wurden 5 µl der Proben auf ein 1,5 - 2 % Agarosegel aufgetragen. Standard PCR-Ansatz: 0,1 - 100 ng Template-DNA 10 µl 10 x PCR-Puffer (spezifisch nach Enzym; vom Hersteller) 2,5 µl je Primer (40 pmol/µl) 5 µl 5 M Betain 2,5 µl DMSO 0,2 mM dNTP-Mix 0,5 mM MgCl2 1 U DNA-Polymerase ad 50 µl H2O Als Polymerasen wurden die Taq-Polymerase bzw. die FastStart-Polymerase verwendet. 42 Material und Methoden 2.2.6. Reverse Transkription (RT) Als RT wird die DNA-Synthese von RNA-Matrizen bezeichnet, wobei ein gegenläufig orientiertes Oligonukleotid als Primer fungiert. Die MKSV cDNA-Synthese wurde mit dem Primer 3D- (40 pmol) und dem First strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 2.2.7. DNA-Sequenzierung Sequenzierungen von DNA-Plasmiden wurden nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) mit dem Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit (Amersham RPN 2438 / RPN 2538) laut Protokoll des Herstellers durchgeführt. An DNAMenge wurden 250 - 500 ng bzw. bei Proben von DNA-Schnellpräparationen 3 µl eingesetzt. Die Primer waren 5`-seitig IRD700 bzw. IRD800 fluoreszenzmarkiert und es wurden 2 µl einer Vorverdünnung (1 pmol/µl) verwendet. Die Proben wurden im Sequenzlabor des FLI, Insel Riems analysiert und anschließend mit entsprechender Software (GCG Version 11.1. Accelrys Inc. San Diego, CA) ausgewertet. 2.2.8. Zellkultur und Virusanzucht 2.2.8.1. Kultivierung von Säugerzellen Die verwendeten Säugerzelllinien wurden in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 3 bis 5 Tagen wurden die Zellen passagiert. Dazu wurde das Medium entfernt und die Zellen mit Trypsinlösung bei 37°C inkubiert, bis sie sich abgelöst hatten. Die Zellen wurden kurz abzentrifugiert (1 min, 1000 rpm, RT, Heraeus-Zentrifuge) und in frischem DMEM-Kulturmedium oder ZB5 Medium (COS-7) resuspendiert. Ein Sechstel (MDBK, COS-7, BHK) bzw. ein Drittel (KOP-R) der Zellsuspension wurde dann in ein neues Kulturgefäß gleicher Wachstumsfläche ausgesät. 2.2.8.2. Vermehrung und Titration von BHV-1 in Zellkultur Zellkulturen wurden mit Viren infiziert (moi ~ 0,1) und bis zur vollständigen Lyse des Zellrasens bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Zellüberstand abgenommen, aliquotiert und bei -70°C gelagert. Bei Weiterverwendung der Viren wurden die aufgetauten Suspensionen zum Auflösen eventuell vorhandener Aggregate für ca. 10 s mit Ultraschall (40 W, Stufe 7) behandelt. Durch eine kurze Zentrifugation bei 1000 rpm für 2-3 min wurden die Zelltrümmer pelletiert. 43 Material und Methoden Für die Bestimmung infektiöser Virionen pro ml (plaque forming units, pfu/ml) wurden die Viren titriert. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe in Medium angelegt und auf eine konfluente Zellkultur gegeben. Nach ca. 2 h wurde das Inokulum abgenommen und durch methylzellulosehaltiges Medium ersetzt. Methylzellulose verhindert die passive Bewegung der Viren im Medium, so dass nur eine lokal begrenzte Virusausbreitung möglich ist. Durch diesen Schritt wurde sichergestellt, dass nach weiterer Inkubation bei 37°C Einzelplaques entstehen. Unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufe wurde der Virustiter bestimmt. 2.2.8.3. Inaktivierung von BHV-1 durch Zitratpuffer Zu verschiedenen Zeiten nach Infektion wurde freies, nicht penetriertes Virus durch Behandlung mit Zitratpuffer inaktiviert. Dazu wurde der Kulturüberstand entfernt und die Zellen für 2 min mit Zitratpuffer bei RT inkubiert Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurde den Zellen frisches DMEM-Medium zugegeben und bei 37°C inkubiert. 2.2.8.4. Kultivierung von Insektenzellen Die Insektenzelllinien wurden bei 27°C und 2,5 % CO2 inkubiert. Nach 3 - 4 Tagen wurden die Zellen in frisches Zellkulturmedium aufgenommen, durch Klopfen vom Zellkulturboden gelöst und im Verhältnis 1:4 umgesetzt. SF9 Zellen wurden mit Grace`s Medium, HIGH V Zellen mit SF9-900 II Medium mit Glutamin (Invitrogen) kultiviert. 2.2.8.5. Vermehrung und Titration von Baculoviren in Zellkultur Sf9 Zellen wurden mit Baculoviren infiziert (moi ~ 0,1) und anschließend für 5 - 7 Tage im Brutschrank inkubiert. Eine durchgängige Infektion ließ sich durch vergrößerte und abgelöste Zellen bzw. durch die GFP Autofluoreszenz erkennen. Die infizierten Zellen wurden anschließend aliquotiert und bei -70°C gelagert bzw. es wurden die Baculoviren für spätere Transduktionen gereinigt. Die Viren wurden nach dem Auftauen für 10 s mit Ultraschall behandelt (40 W, Stufe 7). Die Titerbestimmung der Baculoviren erfolgte über einen Endpunkt-Verdünnungsassay. Dazu wurden je 2 x 104/well Zellen auf einer 96-well Platte ausgesät und mit 100 µl Virus unterschiedlicher Verdünnungen (10-2 – 10-9) versetzt. Nach 3 Tagen wurde die Anzahl der wells, welche mit Virus infiziert waren, über indirekte Immunfluoreszenz oder über GFP Autofluoreszenz ausgezählt und der Virustiter als TCID50 (Tissue culture infective dose 50%) nach folgender Formel bestimmt (Spearman C., 1908; Kaerber G., 1931): 44 Material und Methoden TCID50 = D (n/p +0,5) x 1/Probenvolumen D…Serieller Verdünnungsfaktor n… Anzahl positiver wells p… Anzahl Parallelwerte 2.2.8.6. Reinigung von Baculoviren über Sucrosekissen Sf9 Zellen wurden mit Baculoviren (moi ~ 1) infiziert und für 5 - 7 Tage bei 27°C inkubiert. Die lysierten Zellkulturen wurden für 20 min bei 4000 rpm und 4°C pelletiert. Der virushaltige Überstand wurde abgenommen und vorsichtig auf 7,5 ml 12,5 % Sucrose in PBS geschichtet. Anschließend erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 25000 rpm für 90 min bei 4°C (Beckman-Zentrifuge, SW32-Rotor), bei welchem die Viruspartikel das Sucrosekissen passierten und pelletiert wurden. Die Pellets wurden in PBS+ aufgenommen und ü.N. bei 4°C resuspendiert. Die Viruskonzentrate wurden aliquotiert, titriert und schließlich bei -70 °C gelagert. 2.2.8.7. Bestimmung der Zellzahl/Vitalitätstest Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 90 µl einer Einzelzellsuspension mit Trypanblau im Verhältnis 1:10 versetzt, in eine Neubauer-Zählkammer gegeben und lichtmikroskopisch untersucht. Trypanblau kann intakte Plasmamembranen vitaler Zellen nicht durchdringen und erlaubt somit die selektive Färbung toter Zellen über das Eindringen des Farbstoffs ins Zellinnere. Ein Eckquadrat aus 16 kleinen Quadraten wurde ausgezählt. Da das Fassungsvolumen des Eckquadrates 0,1 µl ist, musste für die Berechnung der Zellzahl pro ml zusätzlich ein Verdünnungsfaktor von 10000 berücksichtigt werden. Somit ergibt sich folgende Formel: Zellzahl/ml = Zahl vitaler Zellen x 10000 x Verdünnungsfaktor 10 2.2.9. Gentransfer 2.2.9.1. Transfektion mit Mammalian Transfection Kit von Stratagene Diese Methode beruht auf dem Prinzip der Transfektion über Calciumphosphat-Präzipitation und wurde für Insertionen von Fremdgenen in das BHV-1 Genom genutzt. Dazu wurden je 5 µg des jeweiligen Rekombinationsplasmides mit 1 µg Virus-DNA in KOP-R kotransfiziert. Die Transfektionen wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. KOP-R Zellen wurden am Vortag im Verhältnis 1:2 umgesetzt. 45 Material und Methoden Für die Erhöhung der Transfektionseffizienz wurden die Zellen ca. 4 h nach der Transfektion mit Glycerolschocklösung behandelt. Dazu wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und dann für 2 min mit Glycerolschocklösung bei RT inkubiert. Die Zellen wurden anschließend wieder zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und bis zum Erscheinen von Plaques bei 37°C inkubiert. 2.2.9.2. Transfektion mit Polyethylenimine (PEI) Zur transienten Expression plasmidkodierter Proteine in COS-7 Zellen wurde das Polymer Polyethylenimine (PEI) eingesetzt. Die Zellen wurden am Vortag 1:2 in 24-well Platten ausgesät und unmittelbar vor Zugabe der Transfektionsansätze mit ZB5 Kulturmedium ohne FCS und Antibiotika gewaschen. Serum- und antibiotikafreies Medium wurde auch für die Bereitung der Transfektionsansätze genutzt. Zur DNA-Lösung (625 ng Plasmid-DNA in 50 μl Medium) wurde 1 Vol PEI-Lösung (1,25 μl PEI in 50 µl Medium), welche zuvor 5 min bei RT vorinkubiert worden war, gegeben. Nach 20 min Inkubationszeit der Transfektionsansätze wurde diese mit 150 µl serum- und antibiotikafreiem Medium vermischt, vorsichtig auf die Zellen gegeben und die Zellkulturen für 24 h bei 37°C inkubiert. 2.2.9.3. Transfektion von Insektenzellen mit rekombinanter Bacmid-DNA Für die Herstellung von rekombinanten Baculoviren wurde die entsprechende Bacmid-DNA mit Hilfe des Lipo-Reagenz FuGENE® HD in HIGH V Zellen transfiziert. Pro well einer 6-well Platte wurden ca. 106 Zellen in antibiotikafreiem Medium SF9-900 II (Invitrogen) ausgesät und für 1 h bei 27°C kultiviert. Parallel wurden 5 µg Bacmid-DNA (Schnellpräparation) in H2O ad 100 µl aufgenommen, dann 6 µl FuGENE® HD zugeben und das Gemisch für ca. 40 min bei RT inkubiert. Von den Zellen wurde der Überstand abgenommen und 1 ml antibiotikafreies Medium vorgelegt, bevor anschließend der Transfektionsansatz vorsichtig auf die Zellen gegeben wurde. Nach 5 h Inkubation bei 27 °C wurde das Inokulum entfernt und durch antibiotikahaltiges Medium ersetzt. Nach ca. 3 - 4 Tagen konnte die Replikation der Baculoviren über die Lyse der Zellen bzw. die GFP Autofluoreszenz beobachtet werden. Dann wurden die Zellüberstände geerntet und bei -70°C gelagert. 46 Material und Methoden 2.2.9.4. Baculovirus-vermittelte Transduktion von Säugerzellen KOP-R Zellen wurden 24 h vor der Transduktion 1:1 umgesetzt. Für die Transduktion wurde eine moi von 25 – 50 in einem Volumen von 250 µl (24-well) oder 750 µl (6-well) gewählt. Die dazu notwendigen Verdünnungen der Baculoviren wurden mit PBS+ durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS+ gewaschen, anschließend wurden die Virusinokula auf die Zellen gegeben und für 6 h bei 27 °C unter Schwenken (300 rpm) inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Virussuspension abgenommen und durch DMEM-Medium ohne FCS und ohne Antibiotika ersetzt. Zur Verstärkung der Fremdgenexpression wurde außerdem 7,5 mM Butyrat zugegeben. Die Zellen wurden bis zur Ernte bei 37 °C inkubiert. 2.2.10. Isolierung rekombinanter Viren 2.2.10.1. BHV-1 Plaque-Assay Die Expression von β-Galaktosidase in BHV-1 infizierten Säugerzellen wurde nachgewiesen, indem die Zellen 2 – 4 h nach Infektion mit 0,6 % Seakem-Agarose und 0,3 mg/ml Blue-Gal (Stammlösung: 30 mg/ml in DMSO) haltigem Medium überschichtet wurden. Die Zellen wurden bis zum Erscheinen von blauen Plaques bei 37 °C inkubiert. 2.2.10.2. Baculovirus Plaque-Assay Die aus der Transfektion erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden mittels des PlaqueAssays gereinigt. 106 Sf9 Zellen je well einer 6-well Platte wurden zur Anheftung für 30 min bei 27°C inkubiert und anschließend mit 100 µl virushaltigem Zellüberstand der Verdünnungen 10-1 - 10-3 infiziert. Nach einer Inkubation von 1 h bei 27°C wurde das Inokulum wieder entfernt und die Zellen mit Agarose-Overlay, bestehend aus einem Teil 2 % LMP Agarose (auf 45°C temperiert) und einem Teil doppelt konzentriertem Grace`s Medium mit 20 % FCS, überschichtet. Bei rekombinanten GFP-exprimierenden Viren konnten mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops Einzelplaques bereits nach 3 - 4 d identifiziert werden. Diese wurden gepickt und zur Anreicherung mit 105 Sf9 Zellen in T25 Zellkulturflaschen vermischt. Nach vollständigem CPE wurde das Zelllysat geerntet, titriert und schließlich bei -70°C gelagert. Nicht fluoreszierende Plaques wurden erst nach ca. 7 d durch morphologische Veränderungen des Zellrasens, welche mit bloßem Auge im Gegenlicht erkannt wurden, sichtbar. Die gepickten Plaques wurden in je 200 µl Grace`s Medium aufgenommen, davon wurden 180 µl mit 4 x 105 Sf9 Zellen in 24-well Platten (Virusressource) und die verbliebenen 20 µl mit 2,5 47 Material und Methoden x 104 Sf9 Zellen in 96-well Mikrotiterplatten angelegt. Nach 3 d wurden die Viren der 96-well Platte in der indirekten Immunfluoreszenz getestet. Positive getestete Einzelplaques wurden aus der 24-well Platte isoliert und wie oben erwähnt angereichert, geerntet und titriert. 2.2.11. Affinitätschromatographische Reinigung von Fusionsproteinen Für eine Proteinreinigung wurden vier T75 Zellkulturflaschen im Verhältnis 3:4 frisch ausgesät und sofort mit dem jeweiligen rekombinanten Baculovirus mit einer moi ~ 10 infiziert. Nach 3 d Inkubation bei 27 °C wurden die infizierten Zellen geerntet und für 5 min bei 3000 rpm sedimentiert. Das Zellpellet wurde je nach Löslichkeit des rekombinanten Proteins in 5 ml nativen bzw. denaturierenden Lysispuffer aufgenommen und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Lysat in Beckman-Zentrifugengefäße transferiert und für 45 min bei 27000 rpm und 4°C in der Tisch-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 4 x 250 µl Ni-NTA, welche zuvor mit PBS äquilibriert worden war, verteilt und für 2 h bei 4°C geschwenkt. Nach dieser Inkubation wurde die Matrix bei 700 x g sedimentiert (Eppendorf-Tischzentrifuge), der Überstand mit den nichtgebundenen Proteinen aufgewahrt und die Ni-NTA zweimal gewaschen. Dazu wurde jedes Pellet vorsichtig in 1 ml bzw. beim zweiten Waschschritt in 300 µl Waschpuffer resuspendiert, für 10 min bei 4°C geschwenkt und wiederum bei 700 x g pelletiert. Beim zweiten Waschschritt wurden die Pellets in einem Eppendorfgefäß vereint. Anschließend erfolgte die Elution der gebundenen Fusionsproteine. Zunächst wurde 1 ml Elutionspuffer zur Ni-NTA gegeben, die Probe für etwa 1 min geschwenkt und dann für 3 min bei 700 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde als Elution 1 aufbewahrt und die Prozedur mit 750 µl, 500 µl und 250 µl Elutionspuffer wiederholt. Die Elutate wurden zusammen mit den Kontrollproben der Reinigung auf einem SDS-Proteingel analysiert. Die Protein-Konzentrationsbestimmung der Eluate erfolgte nach der BCAMethode. 2.2.12. Präparative Gewinnung von Proteine Auch unter denaturierenden Lysisbedingungen nicht lösliche Proteine wurden aus SDSProteingelen eluiert. Dazu wurden wie unter 2.2.11. beschrieben Sf9 Zellen mit rekombinanten Baculoviren infiziert, geerntet und das Zelllysat zur Klärung ultrazentrifugiert. Die pelletierten unlöslichen Proteine wurden in insgesamt 5 ml Protein-Probenpuffer resuspendiert, für 3 min mit Ultraschall (Stufe 10) behandelt und für 5 min bei 85°C inkubiert. 500 - 1000 µl der Proben wurden mit 4 % Mercaptoethanol in einem präparativen 48 Material und Methoden SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, die Proteine mit Coomassie angefärbt und die gewünschte Proteinbande aus dem Gel ausgeschnitten. Die Elution aus dem Proteingel erfolgte mit der BioTrap Apparatur (Schleicher & Schuell) in 1 x Laufpuffer bei 100 V über Nacht. Nach einem kurzen Umpolen des elektrischen Feldes (1 min, 200 V) wurde das Eluat isoliert und mittels BCA-Methode die Konzentrationsbestimmung durchgeführt. 2.2.13. Proteinbestimmung mittels BCA-Methode Die Bestimmungen der Proteinkonzentration wurden anhand der BCA-Methode durchgeführt (Stoscheck, 1990). Die benötigte Menge an Arbeitslösung wurde immer frisch angesetzt. Es wurden pro ml BCA-Lösung A 20 µl der BCA-Lösung B zugeben, so dass die smaragdgrüne Arbeitslösung entstand. Von den zu untersuchenden Proben wurde 2 µl, 4 µl und 8 µl mit je 500 µl Arbeitslösung vermischt und für 30 min bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden die Extinktionen der abgekühlten Proben bei 562 nm gemessen und anhand einer BSA-Eichreihe (0 µg bis 16 µg) wurden die Proteinkonzentrationen bestimmt. 2.2.14. Gelelektrophorese 2.2.14.1. DNA-Agarosegelelektrophorese Für die Auswertung von Restriktionsspaltungen und Reinigungen von Virus-DNA, für die Analyse von PCR-Produkten sowie für die Präparation von DNA-Fragmenten für Klonierungen wurden 0,6 - 2 % Agarosegele verwendet. Dazu wurde die Agarose in 1 x TA mit 0,1 µg/ml Ethidiumbromid (in 20 mM Tris pH 8,0) in horizontale Gelapparaturen gegossen. Als Laufpuffer wurde 1 x TA, ebenfalls mit 0,1 µg/ml Ethidiumbromid versetzt, verwendet. Die Auftrennung der Fragmente wurde bei einer Spannung von 60 – 135 V, je nach Größe des Gels und der DNA-Fragmente, durchgeführt. Als Längenstandard diente ein 1 kbp-Marker. Die Dokumentation der Gele erfolgte unter UV-Licht bei 256 nm, bei präparativen Gelen bei 366 nm. 2.2.14.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte in diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen, die sich aus einem 10 % oder 12,5 % Trenngel und einem 3 % Sammelgel zusammensetzten. Die Proben wurden in Protein-Probenpuffer und 3 % Mercaptoethanol aufgenommen und für 5 min bei 85°C inkubiert. Anschließend erfolgte die 49 Material und Methoden Auftrennung der Proteine über Nacht bei 60 V in großen Gelapparaturen (Protean®, Biorad) bzw. für 45 min bei 200 V in kleinen Gelapparaturen (Mini Protean®, Biorad), so dass der Bromphenolblau-Marker das Gel vollständig durchlaufen hatte. Es wurde 1 x ProteinLaufpuffer verwendet. 2.2.15. Färbung von Polyacrylamidgelen mit colloidalem Coomassie (Neuhoff et al., 1988) Die Gele wurden über Nacht in colloidaler Coomassiefärbelösung inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Färbelösung entfernt und die Gele in H2O geschwenkt. Nach mehrmaligem Wasserwechsel wurden die Gele für ca. 2 h in 10 % Methanol gelegt bis die endgültige Färbung erreicht war. 2.2.16. Reinigung von Transduktionsüberständen für die elektronenmikroskopische Untersuchung Die lysierten Zellen und deren Überstände wurden in 15 ml Röhrchen überführt und für 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert, um große Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wurde die Probe 45 min bei 6000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Auch hier wurde das Pellet verworfen. Die Hälfte des Überstandes wurde mit Aceton gefällt und das erhaltene Proteinpellet in 100 µl TEN-Puffer über Nacht bei 4°C resuspendiert. Diese Probe und ein Teil des nicht präzipitierten Überstandes wurden elektronenmikroskopisch im Labor von Herrn Dr. H. Granzow untersucht. Parallel wurden die beiden Proben im Western Blot auf die Anwesenheit der MKSV Strukturproteine überprüft. 2.2.17. Herstellung von Proben für den Western Blot 2.2.17.1. Zelluläre Proteine MDBK-ZH oder BHK Zellen wurden mit dem jeweiligen Virus mit einer moi von 10 infiziert. Nach 12 - 18 h wurden die Kulturüberstände entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und in Proteinprobenpuffer aufgenommen. 50 Material und Methoden 2.2.17.2. Aceton-Präzipitation von Proteinen aus dem Zellkulturüberstand Zur Trennung von Zellen und Zellüberstand wurden die geernteten Proben für 5 min bei 5000 rpm und RT zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Protein-Probenpuffer aufgenommen. Der Zellkulturüberstand wurde mit der dreifachen Menge an eiskaltem Aceton gemischt, 30 min bei -70 °C gefällt und daraufhin bei 14000 rpm und 4°C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die pelletierten Proteine in 80 % Ethanol gewaschen und schließlich in Protein-Probenpuffer aufgenommen. 2.2.18. Western Blot 2.2.18.1. Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembran Die zu untersuchenden Proteinproben wurden in einem SDS-Polyacrylamidgel (Mini-Protean, Biorad) aufgetrennt. Anschließend wurden sie durch Elektroblotting in einer Semi-Dry Western Blot Apparatur auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Dazu wurde auf 7 in Transferpuffer getränkte Whatman 3MM Papiere die in Transferpuffer äquilibrierte Nitrozellulosemembran gelegt. Darauf wurden das Gel und weitere 7 in Transferpuffer getränkte Whatman 3MM Papiere geschichtet. Der Transfer wurde 45 min bei 20 V konstanter Spannung durchgeführt. 2.2.18.2. Chemilumineszenz - Nachweisreaktion Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurde die Nitrozellulosemembran 1 h in 6 % Magermilch in PBS inkubiert. Dann wurde die Membran dreimal hintereinander zügig und anschließend 15 min in Waschpuffer I geschwenkt. Es folgten 3 schnelle und ein 5 minütiger Waschschritt mit Waschpuffer II. Anschließend wurde die Membran für 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht in mit Waschpuffer II verdünntem spezifischem Antiserum inkubiert. Die Membran wurde wie beschrieben mit Waschpuffer I und II gewaschen, bevor der Peroxidasegekoppelte Sekundärantikörper (1:20000 in Waschpuffer II) zugegeben wurde. Nach weiteren Waschschritten wurde die gebundene Peroxidase unter Verwendung des Super Signal® West Pico Chemiluminescent Kits (Perbio) nachgewiesen. Für die Lichtdetektion wurde Hyperfilm™ (Amersham Bioscience) verwendet. 2.2.19. Indirekte Immunfluoreszenz (IIF) Für die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) wurde die Zellkultur zunächst mit PBS gewaschen und dann mit 3 % Paraformaldehyd in PBS 20 min bei RT fixiert. Um die Zellmembranen zu 51 Material und Methoden permeabilisieren wurde Triton X-100 in einer Endkonzentration von 0,2 % zugegeben und für weitere 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde 3 x mit PBS gewaschen, bevor der in PBS verdünnte spezifische Antikörper zugegeben wurde. Nach 1 h Inkubation bei RT wurde der Antikörper wieder abgenommen und die Zellen wiederum 3 x mit PBS gewaschen. Dann wurde der gegen den ersten Antikörper gerichtete, fluoreszenzmarkierte anti-Spezies Antikörper, zugegeben. Nach 1 h lichtgeschützter Inkubation wurde der zweite Antikörper abgenommen, die Zellen 2 x mit PBS gewaschen und das Ergebnis der Immunfluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. 2.2.20. ELISA Ein MKSV-spezifischer indirekter ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wurde zum Nachweis von Antikörpern in Serumproben verwendet. Pro well einer Maxisorb 96-well Platte wurden 50 µl des im Coating-Puffer 1:2000 verdünnten Kaninchenserums A-Iran 97 zugegeben, für 20 h lichtgeschützt inkubiert und anschließend bei -70°C schockgefroren. Die beschichteten Platten konnten direkt verwendet werden oder wurden bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und dann für 1 h mit Antigen bei 37 °C inkubiert. Bei dem Antigen handelte es sich um durch binäres Ethylenimid inaktivierten MKS Vollvirus vom Subtyp A-Iran 97 und wurde in einer 1: 1000 Verdünnung mit ELISA-Puffer I eingesetzt. Die Platten wurden erneut dreimal mit Waschpuffer gewaschen und anschließend folgte die Zugabe der Testseren. Diese Seren wurden zuvor mit ELISA-Puffer II 1:80 verdünnt. Es wurde pro Testserum eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde der monoklonale Mausantikörper mab 9C-2 verwendet. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Seren entfernt, die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und mit einem Peroxidasegekoppelten Anti-Maus IgG Konjugat, welches zuvor mit ELISA-Puffer II 1:1000 verdünnt worden war, inkubiert. Nach 45 min Inkubation bei 37 °C wurden die Platten mit Waschpuffer fünfmal gewaschen. Nach Zugabe des Substrates (OPD mit 0,012 % H202) erfolgte der Farbumschlag. Nach 15 min lichtgeschützter Inkubation wurde die Reaktion mit 25 % H2SO4 gestoppt und im ELISA-Reader ausgewertet. 52 Material und Methoden 2.2.21. Virusneutralisationstest (VNT) Der VNT wurde in Anlehnung an die Beschreibung im „Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines“ (OIE, 2000) durchgeführt. Die Seren wurde zunächst für 30 min bei 56°C inaktiviert. Sowohl von den Testseren als auch von dem als Positivkontrolle verwendeten bovinen Hyperimmunserum (1:20000 vorverdünnt) wurden Verdünnungsreihen von 1:4 bis 1:512 in 100 µl Volumina mit ZB5 in Mikrotiterplatten angelegt. Nach Zugabe von ca. 100 TCID50 MKS-Virus A-Iran/97 wurden die Serum-Virus-Gemische für 2 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden pro well 100 µl BHK Zellen (5 x 105 Zellen/ml) zugeben. Die Platten wurden für 4 - 5 Tage bei 37 °C inkubiert. Die Auswertung des Tests erfolgte lichtmikroskopisch. Der Virusneutralisationstiter wurde nach der Methode von Spearman und Kärber (siehe 2.2.8.5.) berechnet. Seren mit einem Titer unter 1:8 wurden negativ gewertet. Die Gültigkeit des VNT wurde überprüft, indem auf einer separaten Mikrotiterplatte der Virustiter bestimmt wurde. Der angestrebte Virustiter war 100 TCID50 = 2,0 log10. Die zulässige Abweichung betrug +/- 0,5 log10, d.h. der Test war gültig zwischen 31,6 und 316 TCID50/well bzw. 50 µl. 2.2.22. Durchflußzytometrie Die Durchflußzytometrie oder FACS-Analyse (Fluorescence activated cell sorting) erlaubt die Charakterisierung von lebenden Zellen bezüglich ihrer Oberflächenmoleküle. Der selektive Nachweis der Oberflächenmoleküle erfolgte über spezifische monoklonale Antikörper, die bereits einen Fluoreszenzmarker tragen oder über einen Fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörper. Die zu untersuchenden Zellproben wurden bei 1100 rpm und 4°C für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 100 µl FACS-Puffer aufgenommen. Die resuspendierten Zellen wurden gesplittet und mit 0,5 µl – 4 µl des jeweiligen Antikörpers in einem Endvolumen von 100 µl für 20 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben gewaschen. Dazu wurden die Röhrchen mit FACS-Puffer aufgefüllt und erneut für 5 min bei 1100 rpm und 4°C zentrifugiert. Die in FACS-Puffer resuspendierten Zellen wurden mit Fluoresceinisothiocyanat- (FITC) oder Phycoerythrin- (PE) gekoppelten Sekundärantikörper für 20 min bei 4°C inkubiert, sofern der erste Antikörper nicht bereits fluoreszenzmarkiert war. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die für die Messung störenden Erythrozyten durch Zugabe von 100 µl BlutLysepuffer lysiert. Nach kurzer Zeit wurde anhand der Klärung des Überstandes die Lyse 53 Material und Methoden sichtbar. Die Proben wurden sofort mit FACS-Puffer gewaschen, in 300 µl FACS-Puffer aufgenommen und im Durchflußzytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson) mit der entsprechenden Software (Cellquest software, Becton Dickinson) untersucht. Im Durchflußzytometer wurden die Zellen zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe einzeln an einem Laser vorbeigeführt. Neben den Fluoreszenzimpulsen emittierten die Zellen auch Streulicht im sichtbaren Bereich. Anhand der Vorwärtsstreuung wurde die Größe der Zelle bestimmt. Die Seitwärtsstreuung ließ auf die Zellgranularität schließen. Über diese Messungen wurden vitale Zellen von toten Zellen differenziert. Bei der gleichzeitigen Verwendung zweier unterschiedlicher Fluoreszenzmarker mussten außerdem überschneidende Wellenlängenbereiche durch geeignete Signalprozessierung kompensiert werden. 2.2.23. Analyse von Zellen aus peripherem Mäuseblut Die Untersuchungen der Blutproben im Durchflußzytometer erfolgte wie unter 2.2.22. beschrieben. Allerdings wurde statt FACS-Puffer Blutpuffer verwendet. Bei der Blutentnahme wurden 4 - 5 Tropfen Blut direkt in 4 ml Blutpuffer gegeben und kräftig geschüttelt. Das im Blutpuffer enthaltenen EDTA bindet Calciumkationen irreversibel und verhindert somit eine Gerinnung des Blutes. 2.2.24. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus der Milz Die entnommen Milzen wurden in je 5 ml PBS in einer Petrischale aufgenommen. Um die Zellen in Lösung zu bringen, wurden die Organe mit einem Stempel durch ein Metallgitter gedrückt. Nach mehrmaligen Spülen des Gitters wurden die Zellen in ein 15 ml Falcon Röhrchen gegeben und für ca. 2 min bei RT stehen gelassen. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt, die abgesetzten großen Gewebetrümmer wurden verworfen. Die Milzzellen im Überstand wurden bei 1100 rpm für 10 min sedimentiert und anschließend in 5 ml β-Mercaptoethanol-haltigem ZB 28 resuspendiert. Die Zellzahl der nun vorliegenden Einzelzellsuspension wurde mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt. 2.2.25. Proliferationstest Frisch isolierte Milzzellen wurden in PBS gewaschen und die Zellzahl auf 5 x 106 eingestellt. Die Zellen wurden unter Verwendung des Farbstoffes Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) markiert. Dazu wurden die Zellen mit 0,5 mM CFSE für 15 min bei 37°C inkubiert. 54 Material und Methoden Die markierten Zellen wurden in PBS gewaschen und in ZB28 mit β-Mercaptoethanol resuspendiert. In einer 24-Lochplatte wurden pro well 2 x 106 markierte Zellen ausgesät und mit 10 µg, 7,5 µg, 5 µg bzw. 2,5 µg MKSV-spezifisches Antigen für 5 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Als Kontrolle wurden unstimulierte Zellen mitgeführt. Der Farbstoff CFSE ist membrangängig und nach mehrtägiger Inkubation konnte anhand der Abnahme der intrazellulären Konzentration des Farbstoffes die Teilung der Zellen nachvollzogen werden. Die Differenzierung der proliferierten CFSE-markierten Milzzellen wurde über die Expression definierter Oberflächenproteine in der Durchflußzytometrie untersucht. 2.2.26. Tierversuche 2.2.26.1. Immunisierung von Kaninchen Zur Immunisierung von Kaninchen wurden 150 - 200 µg des gereinigten Proteins in PBS mit dem gleichen Volumen kompletten Freund`s Adjuvans versetzt, mit Ultraschall emulgiert und subkutan injiziert. Weitere Injektionen des Antigens mit inkompletten Freund`s Adjuvans erfolgten im Abstand von jeweils ca. 3 - 4 Wochen. Vor jeder Injektion wurden Blutproben entnommen. Bis zur vollständigen Agglutinierung der Blutzellen wurden die Proben über Nacht bei 4°C gelagert. Das Serum wurde nach einem Zentrifugationsschritt von 1200 rpm für 10 min in der Heraeus-Zentrifuge abgenommen und für 30 min bei 56°C inaktiviert. 2.2.26.2. Immunisierung und Blutentnahme bei Mäusen Für den Immunisierungsversuch mit rekombinanten BacMam Viren wurden 6 - 8 Wochen alte C57 BL/6 Mäuse verwendet. Die Tiere wurden in vier Gruppen eingeteilt: Gruppe A wurde mit BacMam_P1-2A, Gruppe B mit BacMam_P1-2A3C und Gruppe C mit einem leeren BacMam Virus immunisiert. Jeweils 6 Tiere wurden pro Gruppe eingesetzt. Die Gruppe D bildeten drei Kontrolltiere, welche lediglich PBS+ erhielten. Die Immunisierung der Tiere erfolgte durch intramuskuläre (i.m.) Injektion der virushaltigen Suspension bzw. PBS+ in die Oberschenkelmuskulatur. Den Tieren wurden dreimal innerhalb einer Woche je 2 x 107 TCID50 Virus oder PBS+ verabreicht. Pro Oberschenkel wurde 1 x 107 TCID50 in einem Volumen von 100 µl PBS+, injiziert. Zur Gewinnung von Vollblut wurde den Versuchsmäusen an der lateralen Schwanzvene oder aus dem Blutsinus hinterm Auge Blut entnommen. Für die Blutentnahme aus der Schwanzvene wurden die Tiere für ca. 5 -10 min unter einer Infrarotlampe platziert. Anschließend wurde mit einer Rasierklinge die Vene geöffnet und das abtropfende Blut aufgefangen. Zur retrobulbären Blutentnahme wurden die 55 Material und Methoden mit Äther narkotisierten Tiere im Nacken fixiert und mit einer glatt abgebrochenen Pasteurpipette wurde der Blutsinus punktiert. Das aufsteigende Blut wurde in der Kapillare gesammelt und anschließend in Blutpuffer oder in Microtainer® aufgenommen. Zur finalen Blutung wurden die Tiere mit Äther narkotisiert und dekapitiert. Zur Serumgewinnung wurden die Vollblutproben in den Microtainer® bis zur vollständigen Agglutination ü.N. bei 4°C gelagert. Nach einer Zentrifugation bei 10000 x g für 2 min in der EppendorfTischzentrifuge wurden die Seren abgenommen und für 30 min bei 56°C inaktiviert. 56 Ergebnisse 3. ERGEBNISSE 3.1. Klonierung und Charakterisierung von MKSV Genen vom Stamm A-Iran 97 Ausgehend von der cDNA des MKSV Stamms A-Iran 97 wurden Leserahmen (ORFs) für die Expression von Proteinen in eukaryontischen Zellen abgeleitet. Die zu konstruierenden Klone der MKSV ORFs sind in Abb. 3 dargestellt. Mittels reverser Transkription und PCR wurden die Regionen des viralen MKSV-Genoms amplifiziert, die für die Synthese und Prozessierung der Strukturproteine (Abb. 3b-d) sowie für die Regionen der Nichtstrukturproteine (NSPs), welche für die Etablierung der NSP-ELISAs benötigt wurden (Abb. 3e-h), kodieren. a) Genom MKSV 5`- UTR (L ) IRES Vpg (3B) b) P1-2A 3`- UTR ORF Pro (P1-2A) (2BC) (P3) 3B1,2,3 2A LPro VP4 VP2 VP3 VP1 VP4 VP2 VP3 VP1 2B 2C 3CPro 3A 3DPol A(n) 2A 3CPro c) 3C 2A d) P1-2A3C VP4 VP2 VP3 3CPro VP1 NotI NotI 3A e) 3A 3B f) 3B 3ABCmut g) 3ABCmut 3DPol h) 3D Abb. 3: Schematische Darstellung der klonierten MKSV Leserahmen. a) zeigt den MKSV-Genomaufbau mit dem kodierenden Bereich (ORF), der von der 5`- und 3`- UTR-Region flankiert wird. Ebenfalls benannt sind die Vorläuferproteine P1-2A, 2BC, P3 sowie die Protease LPro, die als erstes aus dem Polyprotein gespalten werden. b) Das Fragment P1-2A umfasst einen eigenen ORF für das gleichnamige Vorläuferprotein. c) Der ORF 3C kodiert für die virale Protease 3CPro. d) P1-2A3C kodiert für ein Fusionsprotein aus P1-2A und 3CPro. Die Sequenzen wurden über NotI Schnittstellen unter Einhaltung eines gemeinsamen Leserahmens fusioniert. ORF e) und f) kodieren für die NSPs 3A bzw. 3B. g) Das Fragment 3ABCmut kodiert für ein Fusionsprotein aus 3A, 3B und der inaktiven 3CPro und wurde aus zwei PCR-Fragmenten zusammengesetzt (siehe 3.1.2). h) Der ORF 3D kodiert für die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase 3DPol. 57 Ergebnisse Zur Klonierung der jeweiligen ORFs wurde zunächst die entsprechende cDNA vom MKSVGenom hergestellt. Dazu wurde aus mit MKSV A-Iran 97-infizierten BHK-Zellen die Gesamtzell-RNA isoliert und für die Erststrang cDNA-Synthese mit dem Primer 3D- (Tab. 1) verwendet. Diese cDNA diente dann als Matrize für PCR-Reaktionen. Die dabei verwendeten Primer enthielten Erkennungssequenzen für geeignete Restriktionsenzyme zur Erleicherung der Klonierungen sowie Start- bzw. Stopkodons für die Synthese der jeweiligen MKSVProteine. Alle Primer, die für die Amplifizierung eingesetzt wurden, sind in Tab. 1 (Seite 32) aufgeführt. Tab. 3 zeigt zusammenfassend für alle hergestellten MKSV ORFs die Nukleotidpositionen in der cDNA sowie die Größe der amplifizierten DNA-Fragmente und der von ihnen kodierten Proteine. kodierende Gensequenz # (MKSV cDNA) Größe der Fragmente im Vektor abgeleitetes Protein P1-2A 603 - 2862 2265 bp 755 AS P1-2A3C 603 - 2862 2919 bp 973 AS ORF 4950 - 5589 3C 4950 - 5589 645 bp 215 AS 3A 4278 - 4737 465 bp 155 AS 3B 4738 - 4951 219 bp 73 AS 3ABCmut 4278 - 5589 1317 bp 439 AS 3D 5590 - 7000 1416 bp 472 AS # Tab. 3: Übersicht der amplifizierten MKSV-Leserahmen. Die Nummerierungen der Gensequenzen beziehen sich auf die Nukleotidpositionen in der cDNA für den Stamm A-Iran 98 (Carrillo et al., 2005). bp Basenpaare, AS Aminosäure 3.1.1. Klonierung der ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C in pcDNA3 Die kodierende Sequenz für das Vorläuferprotein P1-2A wurde unter Verwendung der Primer P1-2A+ und P1-2A- (Tab. 1) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit AflII gespalten und die überhängenden Enden durch Behandlung mit dem Klenow-Enzym geglättet. Anschließend erfolgte die Ligation in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pcDNA3. Das entstandene Plasmid wurde pcDNA_P1-2A bezeichnet. Die kodierende Sequenz für die Protease 3CPro wurde über PCR mit den Primern 3C+ und 3C(Tab. 1) aus der cDNA amplifiziert und das Produkt mit den Restriktionsenzymen XbaI und BglII gespalten. Der Vektor pcDNA3 wurde ebenfalls mit diesen Enzymen verdaut und der ORF 3C inseriert. Das resultierende Plasmid wurde pcDNA_3C genannt. 58 Ergebnisse In einem weiteren Expressionsplasmid sollten die Sequenzen für das Vorläuferprotein P1-2A sowie für die 3CPro als ein einziger offener Leserahmen P1-2A3C exprimiert werden. Der ORF P1-2A3C ist für die Expression und Prozessierung der Strukturproteine sowie für die Assemblierung von leeren Kapsiden beschrieben (Lewis et al., 1991). Für die Konstruktion des Plasmids pcDNA_P1-2A3C wurden die zwei PCR-Produkte P1-2AFus und 3CFus durch Klonierung fusioniert. Das PCR-Produkt P1-2AFus wurde unter Verwendung des Primerpaares P1-2A+ und P1-2ANotI (Tab. 1) synthetisiert. Als DNA-Template diente das Plasmid pcDNA_P1-2A. Über den Primer P1-2ANotI wurde eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NotI eingefügt. Das PCR-Produkt wurde gereinigt, mit EcoRV und NotI gespalten und in den mit den gleichen Enzymen verdauten Expressionsvektor pcDNA3 kloniert. Das resultierende Plasmid war ein Zwischenprodukt und wurde als pcDNA_P12ANotI bezeichnet. In einer zweiten PCR wurde die Sequenz für 3CFus aus dem Plasmid pcDNA_3C amplifiziert. Durch die Primer 3CNotI und 3C- (Tab. 1) wurde stromaufwärts der Kodons für die Protease eine NotI Schnittstelle eingefügt. Das gereinigte 3CFus Amplifikat wurde mit den Enzymen NotI und XbaI gespalten und mit dem entsprechend verdauten Vektor pcDNA_P1-2ANotI ligiert. Durch die gerichtete Klonierung über die NotI Spaltstellen wurden die für P1-2A und 3CPro kodierenden ORFs unter Einhaltung des Leserasters fusioniert, wobei zwischen den beiden Sequenzen ein Spacerbereich aus 15 Nukleotiden entstand. Das fertige Plasmid wurde pcDNA_P1-2A3C genannt. 3.1.2 Klonierung der NSP ORFs 3A, 3B, 3ABCmut und 3D in pSP73 Die ORFs für die NSPs 3A und 3B wurden unter Verwendung der Primer 3ABC+ und 3Abzw. 3B+ und 3B- (Tab. 1) aus der cDNA amplifiziert. Die gereinigten PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen BglII und SacI gespalten und jeweils in die kompatiblen BglII und SacI Schnittstellen von pSP73 kloniert. Die entstandenen Plasmide wurde pSP_3A und pSP_3B bezeichnet. Die NSPs 3A, 3B und 3CPro sollten als Polyprotein exprimiert werden. Da 3CPro aber die Spaltung in die einzelnen Proteine bewirkt (Vakharia et al., 1987; Clarke et al., 1988), muss durch eine gezielte Mutagenese das aktive Zentrum der Protease zerstört werden, um das Polyprotein 3ABCmut zu erhalten (Rodriguez et al., 1994). Dazu wurde der 3`- terminale Bereich von 3CPro von Aminosäureposition 159 - 213 mit den Primern 3ABC_3`mut+ und 3ABC_3`mut- (Tab. 1) amplifiziert. Mit dem Primer 3ABC_3`mut+ wurde das Kodon für das im aktiven Zentrum von 3CPro liegende Cystein an Position 163 gegen ein Kodon für Glycin 59 Ergebnisse ausgetauscht. Diese Mutation führt zu einem vollständigen Funktionsverlust von 3CPro (Grubman et al., 1995). Das PCR-Produkt 3ABC_3`mut wurde anschließend mit BglII und EcoRI gespalten und in den mit selbigen Enzymen gespaltenen Vektor pSP73 kloniert. Das erhaltene Zwischenprodukt wurde pSP_3ABC_3`mut genannt. Der 5`-terminale Bereich von 3ABC wurde mit den Primern 3ABC+ und 3ABC_5`- (Tab. 1) aus der cDNA amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde anschließend mit XhoI und EcoRI gespalten und in den parallel verdauten Vektor pSP73 kloniert. Das erhaltene Zwischenprodukt wurde pSP_3ABC_5` bezeichnet. Für die in frame Fusion der für 3ABCmut kodierenden Bereiche 3ABC_5` und 3ABC_3`mut wurde das Plasmid pSP_3ABC_5` mit den Enzymen BglII und StyI gespalten und dephosphoryliert. Das Plasmid pSP_3ABC_3`mut wurde ebenfalls mit diesen Enzymen gespalten und das herausfallende ca. 170 bp DNA-Fragment in pSP_3ABC_5` kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pSP_3ABCmut genannt. Das PCR-Produkt 3DPol kodiert für die RNA-abhängige RNA-Polymerase von MKSV und wurde mit den Primern 3D+ und 3D- (Tab. 1) aus der cDNA amplifiziert. Nach Verdau mit BglII wurde das PCR-Fragment in den vorbereiteten Vektor pSP73 kloniert und das Plasmid als pSP_3D bezeichnet. 3.1.3. Sequenzanalyse der MKSV ORFs Jeweils drei Klone der Expressionsplasmide pcDNA_P1-2A, pcDNA_3C und pcDNA_P12A3C wurden mit den Primern SP6 und T7 sowie den MKSV-spezifischen Primern P12Afor, P1-2Arev, VP1for, 2Arev, 3Dfor und 3Drev (Tab. 2) sequenziert. Die Sequenzierung von je drei der Plasmide pSP_3A, pSP_3B, pSP_3ABCmut und pSP_3D wurde mit den Primern pspSP6 und pspT7 (Tab. 2) durchgeführt. Da keine Sequenz vom MKSV Stamm AIran 97 vorlag, wurden die Ergebnisse der Sequenzierungen mit dem epidemiologisch eng verwandten Stamm A-Iran 98 (Carrillo et al., 2005) verglichen. Die Homologie der Nukleotidsequenz für das Vorläuferprotein P1-2A betrug 97,9 %. Von den 48 Unterschieden in der Nukleinsäuresequenz resultierten zwölf in Aminosäureaustauschen (Homologie 98,4 %). Ein Vergleich der Nukleotidsequenz für die Protease 3CPro ergab eine Übereinstimmung von 98,0 %. Es wurden 13 Nukleotidaustausche festgestellt, von denen lediglich einer zu einem Aminosäureaustausch von Lysin zu Arginin führte. Dieser Austausch ist konservativ, da bei beiden Aminosäuren die Seitenketten basische Eigenschaften besitzen. Die Homologie für 3CPro lag somit im Aminosäurebereich bei 99,5 %. Für die MKSV 3CPro sind mehrere essentielle Aminosäuren beschrieben, so auch die Aminosäuren, die das aktive Zentrum der 60 Ergebnisse Protease bilden (Grubman et al., 1995; Birtley et al., 2005; Curry et al., 2007). Der beobachtete Austausch betraf keine dieser für die Funktion von 3CPro notwendigen Aminosäuren. Die Sequenzierung des ORF 3A ergab sechs Nukleotidaustausche (Homologie 98,7 %), von denen einer zu einem Aminosäureaustausch von Alanin zu Threonin führte. Damit lag die Homologie auf Aminosäureebene bei 99,3 %. Für das NSP 3B wurden fünf Austausche auf Nukleotidebene festgestellt (Homologie 97,6 %). Auch hier resultierte nur einer der Austausche in einem Aminosäureaustausch von Alanin zu Threonin (Aminosäurehomologie 98,5 %). Bei der Sequenzierung von 3ABCmut wurden die gleichen Unterschiede in der Nukleotid- und Aminosäuresequenz wie bei den Sequenzierungen der ORFs, die für die einzelnen Proteine 3A, 3B und 3CPro kodieren, gefunden. Zusätzlich wurde der Aminosäureaustausch an Position 407 verifiziert, der zu der gewünschten Inaktivierungen der Protease führt. Die Sequenz von 3DPol zeigte eine Homologie von 98,4 % auf Nukleotidund 99,1 % auf Aminosäureebene zu A-Iran 98. Von den 22 Nukleotidaustauschen resultierten vier in einer Änderung der Aminosäureabfolge. In Tab. 4 sind die Abweichungen in der Aminosäuresequenz des Stamms A-Iran 97 zum Referenzstamm A-Iran 98 zusammengefasst. 3CPro 3ABC mut 1311 bp 437 AS Ala128→Thr128 3DPol 1410 bp 470 AS Lys46→Gln46 Asp312→Gly312 Ala195→Thr195 Ser47→Asn47 Gly373→Glu373 Lys332→Arg332 Lys61→Arg61 Val507→Ile507 *Cys407→Gly407 Val361→Leu361 P1-2A 2259 bp 753 AS Ile43→Thr43 639 bp 213 AS Lys108→Arg108 3A 459 bp 153 AS Ala128→Thr128 3B 213 bp 71 AS Ala42→Thr42 Val517→Ile517 Cys605→Arg605 Asn632→Thr632 Thr676→Ala676 Ala678→Val678 Arg703→Ser703 Thr731→Ala731 Val733→Ala733 Tab. 4: Übersicht der Aminosäureaustausche des Stammes A-Iran 97 im Vergleich zu A-Iran 98. Angegeben sind die Aminosäuren im Dreibuchstabencode mit Position im Protein. Ausgehend vom Referenzstamm A-Iran 98 sind die Austausche mit Pfeilsymbol gezeigt. Konservative Austausche sind kursiv dargestellt. Der Austausch, der zur Inaktivierung der 3CPro im Fusionsprotein 3ABC führt, ist mit * markiert. bp Basenpaar, AS Aminosäure 61 Ergebnisse 3.2. Expression der MKSV-Proteine in Insektenzellen Die Expression der MKSV-Proteine erfolgte über rekombinante Baculoviren (rBac) in Insektenzellen. Die Proteine waren für die affinitätschromatographische Reinigung carboxyterminal mit einer RGS-6His Markierung versehen worden. Die Fusionsproteine 3A_RGS-6His, 3B_RGS-6His, 3ABCmut_RGS-6His und 3D_RGS-6His wurden für die Etablierung von NSP-ELISAs verwendet. Die Gewinnung von spezifischen Antiseren gegen Strukturproteine vom Stamm A-Iran 97 erfolgte durch Immunisierung von Kaninchen mit den gereinigten Fusionsproteinen VP2_RGS-6His und P1-2A_RGS-6His. Für die Herstellung der rBac Viren wurde das Bac-to-Bac® Expressionssystem von Invitrogen genutzt. In Abb. 4 ist schematisch die Vorgehensweise dargestellt. Transfervektor pFastBacDual Rekombinante Baculoviren Transfektion der DNA in High V Zellen Fremdgeninsertion Tn7R GmR p10 PolH Fremdgen AmpR Tn7L Bacmid-Isolierung über Antibiotikaselektion und Blau/Weiß Screening Transformation Kompetente DH10Bac™ E.coli Zelle Helferplasmid p10 PolH Transfervektor lacZ mini-attTn7 TetR Tn7R Bacmid Bacmid mit Insertion Transposition Tn7L Abb. 4: Schematische Darstellung der Herstellung von rekombinanten Baculoviren für die heterologe Proteinexpression in Insektenzellen (modifiziert nach Bac-to-Bac® Expression Systems - Instruction Manual, Invitrogen). Im gezeigten Beispiel erfolgt die Fremdgenexpression unter dem Polyhedrin (PolH) Promotor. Weitere Erläuterungen siehe Text. 62 Ergebnisse Die Herstellung von rBacs mittels des Bac-to-Bac® Systems beruht auf einer ortsgerichteten Transposition einer Expressionskassette von einem Transfervektor in das Baculovirusgenom, das als sogenanntes bakterielles artifizielles Chromosom (Bacmid) in den Bakterien E.coli DH10Bac™ vorliegt. Das zu exprimierende heterologe Leseraster wird zunächst in den Transfervektor pFastBacDual kloniert. Der Vektor enthält zwei Baculovirus-spezifische Promotoren für die Expression in Insektenzellen, den Polyhedrin (PolH) und den p10 Promotor. Beide werden erst in der späten bis sehr späten Phase der Replikation aktiviert (Vialard et al., 1995; Van Oers et al., 1997). Außerdem sind das Gen für Gentamicinresistenz sowie die Polyadenylierungssignale der frühen Region von SV40 (SV40 PolyA) bzw. des Thimidinkinasegens des Herpes Simplex Virus (HSV TK PolyA) innerhalb des Transpositionsbereichs lokalisiert, welcher von mini-Tn7-Elementen (Tn7R und Tn7L) flankiert wird. Das Plasmid wird dann in die bacmidhaltigen Bakterien DH10Bac™ transformiert. Das zirkuläre Bacmid beinhaltet das gesamte baculovirale Genom von AcMNPV sowie ein low copy number mini F Replikon für die Vermehrung in E.coli. Weiterhin befinden sich auf dem Bacmid neben dem Gen für Kanamycinrestistenz noch ein Leserahmen für das lacZ-α Peptid, das eine chromosomale LacZ Deletion komplementieren kann. In Anwesenheit des Substrates X-Gal und des Induktors IPTG wachsen diese Bakterien als blaue Kolonien. Im 5`-Bereich des lacZ-α Peptid-Gens ist eine Tn7 (mini-attTn7) Erkennungssequenz inseriert. Rekombinante Bacmide entstehen durch Transposition des mini-Tn7-Elementes, das auf dem Transfervektor lokalisiert ist, in die mini-Tn7Erkennungssequenz des Bacmids. Die dazu notwendige Transponase ist auf einem Helferplasmid kodiert. Erfolgt eine Insertion in die Bacmid-DNA, so wird der lacZ-α Leserahmen unterbrochen. Rekombinante Bakterien lassen sich unter Zugabe von X-Gal und IPTG somit als weiße Kolonien identifizieren. Die rekombinante Bacmid-DNA wird aus den Bakterien isoliert und für die Transfektion von Insektenzellen verwendet. Rekombinante Baculoviren werden anschließend plaquegereinigt und für die heterologe Proteinexpression in Insektenzellen eingesetzt. 3.2.1. Konstruktion von universell einsetzbaren Transfervektoren für das Bac-to-Bac® System Die Reinigung der baculoviral exprimierten MKSV-Proteine erfolgte über Ni2+-NTAAffinitätschromatographie. Dazu wurden MKSV-Fusionsproteine hergestellt, die carboxyterminal mit einem RGS-6His-Tag versehen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 63 Ergebnisse für die Proteinexpression in Sf9 Zellen mit anschießender Reinigung der Histidin-markierten Fusionsproteine zwei universell verwendbare Plasmide namens pFBD∆XhoI_Histag und pFBD∆SacI_Histag konstruiert. Ausgangspunkt für die Herstellung dieser Plasmide war der Transfervektor pFastBacDual (Invitrogen). Dieser Vektor besitzt zwei multiple cloning sites (MCS) für die Integration der Zielsequenzen. Die Expression der in die MCS I inserierten Sequenzen unterliegt der Kontrolle des PolH Promotors, die Transkription unterhalb der MCS II wird vom p10 Promotor gesteuert. Beide Promotoren sind Baculovirus spezifisch und erlauben eine etwa gleich starke Expression der heterologen Gene in der späten Phase der Virusreplikation (O'Reilly, 1997). Bei der Herstellung der Plasmide pFBD∆XhoI_Histag und pFBD∆SacI_Histag wurde in jeweils einem der beiden Polylinker die Nukleotidsequenz des RGS-6His-Tags sowie das sich anschließende Stopkodon inseriert. Außerdem befanden sich stromaufwärts der RGS-6His-Tag Sequenz Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die eine Integration der Zielsequenzen unter Einbehaltung des gemeinsamen Leserahmens ermöglichen. In Abb. 5 sind die Vorgehensweisen bei der Herstellung der Plasmide zusammengefasst. Für die Konstruktion des Transfervektors pFBD∆XhoI_Histag musste zunächst die Restriktionsschnittstelle für XhoI in der MCS II im Ausgangsvektor pFastBacDual entfernt werden. Dazu wurde der Vektor pFastBacDual mit SmaI und NcoI verdaut und die überhängenden 3`-Enden durch Klenow-Behandlung aufgefüllt. Der religierte Vektor wurde als pFBD∆XhoI bezeichnet und die Deletion der XhoI Spaltstelle durch Sequenzierung mit dem Primer pHrev (Tab. 2) überprüft. Die RGS-6His-Tag Sequenz wurde durch Spaltung mit EcoRI, anschließender Klenow-Behandlung sowie einem Verdau mit XhoI aus dem Plasmid pUhis erhalten. Das ca. 50 bp kleine DNA-Fragment wurde in den Vektor pFBD∆XhoI kloniert, der zuvor mit BamHI gespalten, mit Klenow-Enzym behandelt und mit EcoRI nachverdaut worden war. Das entstandene Plasmid wurde pFBD∆XhoI_Histag genannt und die Insertion durch Sequenzierung mit dem Primer pHrev (Tab. 2) überprüft. Durch Nutzung der eingefügten Restriktionsschnittstelle für XhoI ließen sich nun Sequenzen inserieren, deren Expression in Baculoviren unter Kontrolle des p10 Promotors standen. 64 Ergebnisse MSC II a) MSC I p10 PolH HSV TK PolyA SV40 PolyA pFastBacDual Tn7L Tn7R MSC II ∆XhoI p10 PolH HSV TK PolyA MSC II MSC I pFBD∆XhoI p10 PolH HSV TK PolyA SV40 PolyA MSC I ∆SacI pFBD∆SacI Tn7L Tn7R SacI, Ecl136II, XhoI MSC I RGS-6His p10 PolH MSC II RGS-6His p10 PolH HSV TK PolyA SV40 PolyA pFBD∆XhoI_Histag SV40 PolyA pFBD∆SacI_Histag Tn7L Tn7R b) Tn7L Tn7R XhoI HSV TK PolyA SV40 PolyA Tn7L Tn7R XhoI C TCG AGC TCT CGC GGC AGC CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG SacI/Ecl136II S S S R G S H H H H H H * Abb. 5: Schematische Darstellung der Konstruktion der Transfervektoren pFBD∆XhoI_Histag und pFBD∆SacI_Histag. In a) ist das Klonierungsschema gezeigt. Zunächst wurden die Restriktionsschnittstellen SacI in MCS I bzw. XhoI in MCS II im Ausgangsvektor pFastBacDual zerstört. In die entstandenen Zwischenprodukte wurden die RGS-6His Sequenz sowie zusätzliche Restriktionsenzymschnittstellen für die Integration der Zielsequenzen inseriert, die dann unter Kontrolle des Polyhedrin (PolH) oder p10 Promotors stehen. b) zeigt die Nukleotid- und die Aminosäuresequenz im Einbuchstabencode des RGS-6His-Tags, sowie die Spaltstellen, die für die anschließenden Klonierungen genutzt werden können. Weitere Erläuterungen im Text. * Stopkodon 65 Ergebnisse Für die Herstellung des Plasmids pFBD∆SacI_Histag musste zunächst im Ausgangsvektor pFastBacDual die Spaltstelle für SacI entfernt werden. Dazu wurde der Vektor pFastBacDual mit SacI gespalten, die überhängenden Enden durch Klenow-Behandlung entfernt und der Vektor religiert. Dieses Zwischenprodukt wurde als pFBD∆SacI bezeichnet und mittels Sequenzierung mit dem Primer p10for (Tab. 2) wurde das Fehlen der SacI Spaltstelle kontrolliert. Für die Insertion der wie oben beschrieben aus pUHis gespalten 50 bp RGS6His-Tag Sequenz wurde der Vektor pFBD∆SacI mit PvuII und XhoI gespalten. Das resultierende Plasmid wurde pFBD∆SacI_Histag genannt und die Insertion über Sequenzierung mit dem Primer p10for (Tab. 2) überprüft. In das Plasmid pFBD∆SacI_Histag konnten nun unter Nutzung der Restriktionsschnittstellen SacI, Ecl136II sowie XhoI die Zielsequenzen kloniert werden. Die Fusionsproteine wurden in Baculoviren unter Kontrolle des Promotors PolH exprimiert. 3.2.2. Herstellung der rekombinanten Baculoviren, welche die RGS-6His getaggten MKSV-Proteine exprimieren 3.2.2.1. Klonierung der Transfervektoren Für die Integration der Sequenz P1-2A in den Vektor pFBDXho_Histag wurde das Plasmid pcDNA_P1-2A3C mit den Restriktionsenzymen EcoRV und NotI geschnitten und das bei der NotI Spaltung entstandene 5`-überhängende Ende mittels Klenow-Behandlung aufgefüllt. Das 2,9 kbp Fragment wurde in den Vektor pFBDdeltaXho_His, der mit XhoI gespalten und anschließend mit Klenow-Enzym inkubiert worden war, kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pFBD_P1-2A bezeichnet und der Übergang der P1-2A Sequenz zur RGS-6His-Tag Sequenz durch Sequenzierung mit dem Primer pHrev (Tab. 2) kontrolliert. Die Sequenz für das Strukturprotein VP2 wurde mittels PCR aus dem Plasmid pcDNA_P1-2A amplifiziert. Die durch die Primer VP2+ und VP2- (Tab. 1) angefügten SmaI Schnittstellen dienten der Klonierung in den Transfervektor pFBD∆SacI_Histag. Der Vektor wurde parallel mit Ecl136II verdaut. Der Übergang zwischen inserierter Sequenz und RGS-6His-Tag Sequenz wurde durch Sequenzierung mit dem Primer p10for (Tab. 2) kontrolliert. Das resultierende Plasmid wurde pFBD_VP2 genannt. Die Plasmide pSP_3A, pSP_3B und pSP_3ABCmut wurden mit XhoI gespalten und die für die NSPs kodierenden Sequenzen wurden in den ebenfalls mit XhoI gespaltenen Vektor pFBD∆XhoI_Histag kloniert. Die fertigen Transfervektoren wurden pFBD_3A, pFBD_3B und pFBD_3ABCmut genannt und die Übergänge zwischen den NSP Sequenzen und der 66 Ergebnisse Sequenz des RGS-6His-Tags in der Sequenzierung mit dem Primer pHrev (Tab. 2) überprüft. Die Sequenz für 3DPol wurde aus dem Plasmid pSP_3D durch Spaltung mit dem Enzym SacI isoliert und anschließend in den parallel verdauten Vektor pFBD∆SacI_Histag kloniert. Der erhaltene Transfervektor wurde pFBD_3D bezeichnet. In der Sequenzierung mit p10for (Tab. 2) wurde die in frame Insertion der 3D Sequenz kontrolliert. 3.2.2.2. Expression der rekombinanten Baculoviren in Insektenzellen Die Transfervektoren pFBD_P1-2A, pFBD_VP2, pFBD_3A, pFBD_3B, pFBD_3ABCmut und pFBD_3D wurden jeweils in kompetente E.coli DH10Bac™ Bakterien transformiert. Aus rekombinanten E.coli Klonen wurde die Bacmid-DNA isoliert und für die Transfektion von HIGH V Insektenzellen eingesetzt. Nach 4 Tagen wurden die Transfektionsansätze zu frisch ausgesäten Sf9 Zellen gegeben und diese bis zur kompletten Lyse der Zellen bei 27°C inkubiert. Mittels Plaquereinigung wurden Einzelplaques gewonnen und in der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) auf Expression des RGS-6His-Tags getestet. In der Immunfluoreszenz positiv getestete Einzelplaqueisolate wurden als rBac/P1-2A, rBac/VP2, rBac/3A, rBac/3B, rBac/3ABCmut bzw. rBac/3D bezeichnet und in Sf9 Zellen vermehrt. In Abb. 6 sind stellvertretend für alle hergestellten rekombinanten Baculoviren Aufnahmen der IIF von Zellen, die mit rBac/P1-2A und rBac/VP2 infiziert worden waren, gezeigt. rBac P1-2A rBac VP2 rBac mock Abb. 6: Nachweis der Expression der RGS-6His getaggten Fusionsproteine in infizierten Sf9 Zellen. Insektenzellen wurden mit rBac/P1-2A, rBac/VP2 und Wildtyp Baculovirus rBac infiziert. Zur Kontrolle wurden nicht infizierte Sf9 Zellen mitgeführt (mock). 3d p.i. wurden die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und in der IIF analysiert. Hierfür wurden die Zellen mit dem RGS-6His spezifischen murinen monoklonalen Antikörper inkubiert und gebundene Antikörper mit einem Fluor®594gekoppelten Ziege-anti-Maus Konjugat detektiert. Die Viren rBac/P1-2A und rBac/VP2 wurden für die Reinigung der Fusionsproteine P12A_RGS-6His und VP2_RGS-6His verwendet. Damit wurden Kaninchen für die Gewinnung 67 Ergebnisse polyklonaler Seren immunisiert. Diese Seren wurden für den Nachweis der Expression von MKSV-Strukturproteinen und deren Prozessierung durch die viralen Vektoren benötigt. Die von den Rekombinanten rBac/3A, rBac/3B, rBac/3ABC und rBac/3D exprimierten RGS6His getaggten Fusionsproteine wurden ebenfalls gereinigt und für die Entwicklung und Etablierung von ELISAs zur Detektion von Antikörpern gegen NSPs verwendet (Höhle et al., 2006). Auf MKSV-NSP basierende Nachweissysteme sind wichtige Diagnostikwerkzeuge zur Differenzierung zwischen geimpften und infizierten Tieren. Dies gilt sowohl für den Einsatz aktuell zugelassenen Vakzinen als auch für zukünftige DIVA Impfstoffe, welche lediglich auf der Expression von MKSV-Strukturproteine und der für die Prozessierung der Proteine benötigte 3CPro beruhen (Clavijo et al., 2004). So sind bereits kommerzielle ELISA`s für die Detektion von Antikörpern gegen NSPs verfügbar, wie beispielsweise der Ceditest® FMDVNS von Cedi Diagnostic oder der SVANOVIR FMDV-3ABC-Ab ELISA von Svanova. Zur Validierung der am FLI neuentwickelten ELISAs wurden Seren infizierter, geimpfter und naϊve Rinder eingesetzt. Diese Arbeiten wurden von Naveen Kumar im Rahmen seiner Dissertation durchgeführt (Kumar, 2006; Kumar et al., 2007). Die gereinigten NSPs 3A und 3ABCmut wurden von Naveen Kumar ebenfalls für die Herstellung polyklonaler Kaninchenseren genutzt. Das Serum α-3ABCmut wurde später auch in dieser Arbeit für die Charakterisierung rekombinanter BHV-1 Viren verwendet (siehe 3.4.4). 3.2.3. Reinigung der Fusionsproteine P1-2A_RGS-6His und VP2_RGS-6His für die Herstellung MKSV-spezifischer polyklonaler Antiseren Für die Anreicherung und Reinigung der RGS-6His getagten MKSV-Proteine P1-2A und VP2 wurden Sf9 Zellen mit dem jeweiligen rekombinanten Baculovirus rBac/P1-2A und rBac/VP2 infiziert. Nach Ernte und Lyse der Zellen wurden die im Überstand des Zelllysates befindlichen löslichen Proteine mit der Ni2-NTA®Matix von QIAGEN inkubiert. Die mit RGS-6His markierten Proteine gehen mit den Nickel-Ionen eine Chelatbindung ein. Die Verwendung eines Imidazol-haltigen Puffers führt zu einer kompetitiven Verdrängung des Histidins und ermöglicht somit die Elution der gebundenen Proteine. Bei jedem Schritt der Reinigung wurden Proben abgenommen. Diese Proben wurden anschließend im SDSPolyacrylamidgel aufgetrennt und sowohl in der Coomassie-Färbung als auch im Western Blot analysiert. 68 Ergebnisse b) a) kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa M 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100 100 50 30 P1-2A_ RGS-6His VP2_ 50 RGS-6His 20 117 48 36 25 VP2_ 81 RGS-6His 19 48 P1-2A_ RGS-6His 61 Abb. 7: Verlauf der Reinigung der Fusionsproteine P1-2A_RGS-6His und VP2_RGS-6His mittels Affinitätschromatografie. Während der nativen Proteinreinigung (siehe 2.2.11.) wurden folgende Proben entnommen und elektrophoretisch aufgetrennt: Spur 1: Gesamtes Zelllysat, 2: geklärtes Lysat nach Ultrazentrifugation, 3: Pellet nach Ultrazentrifugation, 4: nicht an Ni-NTA gebundene Proteine, 5-6: Proben der Waschschritte, Spur 7-9: Eluate. In a) wurden die Proben der Reinigung des Fusionsproteins VP2_RGS-6His in einem SDS-12,5 %-Acrylamidgel aufgetrennt und durch Coomassie-Blue sichtbar gemacht (oben) sowie im Western Blot analysiert (unten). b) zeigt die Reinigungsschritte des Fusionsproteins P1-2A_RGS-6His. Die Proteine wurden in einem SDS-10 %-Acrylamidgel aufgetrennt und ebenfalls in der Coomassie-Blue Färbung (oben) und im Western Blot (unten) untersucht. In den Western Blots wurde der murine α-RGS-6His Antikörper sowie Peroxidase-gekoppelte α-Maus Sekundärantikörper verwendet. Gebundene Antikörper wurden mittels Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen. Die Pfeile markieren die Fusionsproteine. Die molaren Massen von Markerproteinen (M) sind angegeben (kDa). Das Fusionsprotein VP2-RGS-6His war löslich und verblieb nach Lyse der Zellen und anschließender Ultrazentrifugation im Überstand. VP2_RGS-6His konnte in den Eluaten 1 bis 3 sowohl in der Coomassie-Blue Färbung als auch im Western Blot nachgewiesen werden (Abb. 7a). Die Coomassie-Blue Färbung zeigte, dass neben dem His-getaggten VP2 noch weitere Proteine eluiert wurden und somit VP2-RGS-6His nicht ganz rein vorlag. Die Proteinkonzentration in den Eluaten wurde anschließend mittels der BCA-Methode bestimmt. Versuche zur Reinigung des Fusionsproteins P1-2A_RGS-6His unter nativen Bedingungen zeigten, dass das Protein nur schlecht in Lösung ging. Der Hauptanteil von P1-2A_RGS-6His wurde während der Ultrazentrifugation zusammen mit unlöslichen baculoviralen und 69 Ergebnisse zellulären Proteinen sedimentiert (Abb. 7b, Spur 3). Im Coomassie-Blue gefärbten Gel war das Fusionsprotein in den Eluaten nicht nachweisbar. Das Ergebnis im Western Blot zeigte, dass die Eluate 1 und 2 lediglich sehr geringe Mengen an P1-2A_RGS-6His enthielten (Abb. 7b, Spur 7-9). Auch die Verwendung von denaturierend-wirkendem harnstoffhaltigem Lysepuffer führte nicht zu einer Verbesserung der Löslichkeit des Fusionsproteins P12A_RGS-6His (Daten nicht gezeigt). Die Reinigung von P1-2A_RGS-6His musste somit über präparative SDS-Acrylamidgele erfolgen. Dazu wurden die Proteinpellets nach der Ultrazentrifugation in insgesamt 2 ml Protein-Ladepuffer aufgenommen. Nach Aufkochen der Proben wurden diese auf ein SDS-10 %-PAGE-Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie-Blue gefärbt und das Fusionsprotein ausgeschnitten. Nach der Elektroelution von P1-2A_RGS6His aus dem Polyacrylamidgel wurde die Proteinkonzentration mittels der BCA-Methode bestimmt. 3.3. Charakterisierung der MKSV- spezifischen polyklonalen Antiseren Das gereinigte Fusionsprotein P1-2A_RGS-6His und die VP2_RGS-6His Präparation wurden zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Nach fünfmaliger Immunisierung mit dem jeweiligen Antigen in Kombination mit Freund`schen Adjuvans wurden die Tiere entblutet. Die gewonnenen MKSV-spezifischen Seren α-P1-2A und α-VP2 wurden zunächst zum Nachweis der Expression von MKSV-Proteinen mittels der IIF in mit Plasmid-DNA transient transfizierten COS-7 Zellen verwendet. Die Expression von MKSV-Strukturproteinen konnte in COS-7 Zellen nach Transfektion mit den Expressionsplasmiden pcDNA_P1-2A und pcDNA_P1-2A3C nachgewiesen werden. In den Zellen, die mit dem leeren pcDNA3 Vektor transfiziert wurden, traten dagegen keine spezifischen Signale auf (Abb. 8). 70 Ergebnisse pcDNA_P1-2A pcDNA_P1-2A3C pcDNA α- P1-2A α- VP2 Abb. 8: Nachweis der Expression von MKSV-Strukturproteinen in transient transfizierten COS-7 Zellen. 24 h nach Transfektion mit pcDNA_P1-2A und pcDNA_P1-2A3C wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit 1:1000 verdünntem α-P1-2A bzw. α-VP2 Kaninchenserum inkubiert. Der Nachweis der gebundenen Antikörper erfolgte unter Verwendung kaninchenspezifischer Fluor®488-gekoppelter sekundärer Antikörper. Als Kontrolle für die Spezifität der Seren dienten Zellen, die mit dem Vektor pcDNA3 transfiziert wurden. Bei der Auswertung der Immunfluoreszenz wurde weiterhin beobachtet, dass die mit dem Plasmid pcDNA_P1-2A3C transfizierten COS-7 Zellen ein verändertes mikroskopisches Bild aufwiesen. Bei diesen Zellen war deutlich weniger Zytoplasma vorhanden, weshalb die Zellen auch kleiner wirkten. Die Zellkerne zeigten hinsichtlich ihrer Größe und Morphologie keine Unterschiede. Da dieser Effekt nicht in den Zellen beobachtet wurde, die das Plasmid pcDNA_P1-2A exprimierten, beruht die Veränderung in der Zellstruktur vermutlich auf der Expression der 3CPro durch das Plasmid pcDNA_P1-2A3C. Um zu überprüfen, ob die Seren α-P1-2A und α-VP2 auch zum Nachweis der Proteine P1-2A und VP2 im Western Blot einsetzbar sind und um zu klären, ob die Expression der 3CPro zu einer Spaltung von P1-2A in die einzelnen Strukturproteine VP1, VP3 und VP0 führt, wurden COS-7 Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA_P1-2A, pcDNA_P1-2A3C, pcDNA_3C sowie einem äquivalenten Gemisch aus den beiden Plasmiden pcDNA_P1-2A und pcDNA_3C transfiziert und die Zellen 24 h später geerntet. 71 Ergebnisse a) α-VP2 kDa 1 b) α-P1-2A 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 111 P1-2A 81 61 48 36 VP0 25 VP2 19 Abb. 9: Nachweis der Expression und Prozessierung des MKSV-Vorläuferproteins P1-2A in transfizierten Zellen. COS-7 Zellen wurden mit den Expressionsplasmiden pcDNA_P1-2A (1), pcDNA_P1-2A3C (2), pcDNA_P1-2A + pcDNA_3C (3), pcDNA_3C (4) und pcDNA (5) transfiziert, 24 h später geerntet und diese Proteine sowie die Proteine von MKSV-infizierten BHK-Zellen (6) und als Kontrolle von nicht infizierten BHKZellen (7) in 12,5 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die auf Nitrozellulosemembranen transferierten Proteine wurden mit den MKSV-spezifischen Seren α-VP2 (A) bzw. α-P1-2A (B) und anschließend mit einem Peroxidase-gekoppelten kaninchenspezifischen Sekundärantikörper inkubiert. Gebundene Antikörper wurden über Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die Western Blots zeigten, dass das α-VP2 Serum das Vorläuferprotein P1-2A (Abb. 9a, Spur 1) und das in Gegenwart von 3CPro daraus abgespaltene, 36 kDa große VP0 erkannte (Abb. 9a, Spuren 2 und 3). VP0, das aus den Strukturproteinen VP2 und VP4 besteht, wird nur bei der Verpackung der viralen DNA in die Kapside gespalten (Curry et al., 1997). Daher ist VP2 nicht in den transfizierten Zellen nachweisbar, wohl aber in den MKSV-infizierten Zellen (Abb. 9a, Spur 6). Abb. 9a zeigt darüber hinaus, dass 3CPro das Vorläuferprotein P1-2A sowohl in cis (Spur 2) als auch in trans (Spur 3) effizient spaltet, da in den jeweiligen Spuren nur noch geringe Mengen an Vorläuferprotein vorhanden waren. Mit dem Kaninchenserum α-P1-2A konnte lediglich das ungespaltene Vorläuferprotein P12A detektiert werden (Abb. 9b). Das Serum reagierte nicht mit VP0, VP1 und VP3, die sowohl in den transienten als auch in den MKSV-infizierten Zellen vorhanden sein sollten (Abb. 9b, Spur 1 bis 3 und 6). Es erkannte auch nicht VP2 in den Proteinen aus den infizierten Zellen (Abb. 9b, Spur 6). Möglicherweise werden erst bei der Prozessierung von P1-2A Epitope zugänglich, die zuvor im Polyprotein maskiert sind. Dies würde erklären, warum das Serum α-P1-2A die aus P1-2A gespaltene Proteine VP1, VP3 und VP0 nicht erkennt. 72 Ergebnisse 3.4. Herstellung und Charakterisierung P1-2A, P1-2A3C und 3CPro exprimierender BHV-1 Viren Für die Integration der ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C in das Genom von BHV-1 wurde der Stamm BHV-1/80-221 gewählt. In diesem Stamm wurde der gesamte ORF für das essentielle Glykoprotein gD durch den ORF für β-Galaktosidase (lacZ) ersetzt. Dadurch kann sich BHV1/80-221 lediglich auf gD exprimierenden Zellen, die das gD in trans zur Verfügung stellen, produktiv vermehren (Fehler et al., 1992). Für die Herstellung der Rekombinationsplasmide wurde der Vektor pROMI verwendet, der Sequenzen für die homologe Rekombination in das Genom von BHV-1/80-221 enthält (Kühnle et al., 1996). Die zu BHV-1/80-221 homologen Bereiche in pROMI flankieren neben dem gD ORF und dem Polyadenylierungssignal des immediate-early 2 Gens des murinen Zytomegalovirus (MCMV) weiterhin den MCMVie1Promotor und eine anschließende Polylinkersequenz mit singulären Spaltstellen für die Insertion eines heterologen ORF (Abb. 10). IR UL Us TR a) Organisation 10kb b) wt BHV-1 gE gI gD gG PK c) BHV-1/80-221 lacZ d) pROMI gD Poly A MKSV ORF MCMVie1 Promotor MCMVie2 Poly A gD ORF gD Promotor Abb. 10: Schematische Darstellung zur Konstruktion von BHV-1 Rekombinanten (modifiziert nach Kühnle et al., 1996). a) zeigt die Genomorganisation von BHV-1 mit der Unique long (UL) und der Unique short (US), die von der internen repetitiven Region (IR) und der terminalen repetitiven Region (TR) flankiert wird. Der relevante Bereich in der US-Region ist vergrößert dargestellt: b) Wildtyp (wt) BHV-1 und c) der entsprechenden Abschnitt in BHV-1/80-221. Die Lokalisationen und Transkriptionsausrichtungen der ORFs für die Glykoproteine gG, gD, gI, gE, die Proteinkinase PK sowie für lacZ sind anegeben. d) zeigt die schematische Darstellung eines Rekombinationsplasmides, das einen MKSV Leserahmen trägt (MKSV ORF) und zur Herstellung der rekombinanten BHV-1 Viren verwendet wurde. Die zur homologen Rekombination vorgesehenen Sequenzen wurden schwarz ausgefüllt. 73 Ergebnisse Erfolgt eine homologe Rekombination, so werden der gD ORF sowie das heterologe Gen zusammen in das Genom von BHV-1/80-221 integriert. Die rekombinante, nun LacZnegative Virusnachkommenschaft kann auf nicht komplementieren Zellen replizieren. Diese Technik ist sehr effizient, da alle auf nicht komplementierenden Zellen vermehrbaren Viren rekombinant sein müssen. 3.4.1. Klonierung der Rekombinationsplasmide Der Leserahmen für P1-2A wurde durch Spaltung mit den Enzymen EcoRI und NotI aus dem Plasmid pcDNA_P1-2A geschnitten. Das Plasmid pcDNA_P1-2A3C wurde mit den Restriktionsenzymen BstEII und AflII zur Isolierung des ORF P1-2A3C gespalten. Der ORF 3C wurde mit NotI und BamHI aus pcDNA_3C gespalten. Die DNA-Fragmente wurden anschließend mit Klenow-Enzym zur Glättung der überstehenden Enden behandelt und in den mit AflII geschnitten und Klenow-Enzym behandelten Vektor pROMI kloniert. Die fertigen Rekombinationsplasmide wurden pROMI_P1-2A, pROMI_P1-2A3C und pROMI_3C genannt. In der Sequenzierung mit den Primern gDpola und ie1cas (Tab. 2) wurden die Insertionen überprüft. In pROMI steht die Transkription der für MKSV-Proteine kodierende Leserahmen unter der Kontrolle des MCMVie1-Promotors und des gD Poly A Signals. 3.4.2. Insertion der MKSV-Leserahmen in das Genom von BHV-1/80-221 KOP-R Zellen wurden mit 1 µg gereinigter DNA des gD-negativen/LacZ-positiven BHV-1/80-221 Stammes und je 5µg der Rekombinationsplasmide pROMI_P1-2A, pROMI_P1-2A3C oder pROMI_3C kotransfiziert. Die Virusnachkommenschaft aus den Transfektionsansätzen wurde auf MDBK Zellen titriert. Viren, die unter einen Bluo-Galhaltigen Agarose-Overlay nicht blau gefärbte („weiße“) Plaques bildeten, wurden isoliert und bis zur Homogenität weiter plaquegereinigt. Die Isolierung der Rekombinante BHV-1/P1-2A erfolgte problemlos. Dagegen waren die Transfektionen mit den Plasmiden pROMI_P1-2A3C und pROMI_3C wiederholt negativ. Ursache dafür könnte sein, dass die 3CPro virale bzw. zelluläre Proteine, die für die Vermehrung von BHV-1 essentiell sind, spaltet und diese Aktivität somit nicht mit der Replikation von BHV-1 kompatibel ist. Denkbar war auch, dass die Nukleotidsequenz des 3C ORF an sich die Replikation der BHV-1 DNA inhibierte. Diese Überlegungen sollten durch die Herstellung einer BHV-1 Rekombinanten, die den ORF für die inaktive 3CPro exprimierte, überprüft werden. 74 Ergebnisse 3.4.3. Insertion des mutierten MKSV ORF 3Cmut in das Genom von BHV-1/80-221 Das Plasmid pSP_3ABCmut kodiert für eine proteolytisch inaktive Variante von 3CPro (siehe 3.1.2.). Unter Verwendung der Primer 3C+ und 3C- (Tab. 2) wurde der ORF 3Cmut aus dem Plasmid pSP_3ABCmut amplifiziert. Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit Klenow-Enzym und Polynukleotidkinase behandelt und in den Vektor pROMI kloniert, welcher zuvor mit AflII und BstEII gespalten und mit Klenow-Enzym behandelt worden war. Das resultierende Plasmid wurde pROMI_3Cmut genannt. Nach Überprüfung der Insertion durch Sequenzierung mit den Primern gDpola und pie1cas (Tab. 2) wurden 5 µg Plasmid-DNA pROMI_3Cmut mit 1 µg BHV-1/80-221 DNA in KOP-R Zellen kotransfiziert. Bereits beim ersten Transfektionsversuch wurde replikationsfähiges Virus generiert. Dieses wurde anschließend auf MDBK Zellen titriert. Viren aus Plaques, die unter einem Bluo-Gal-haltigen Agarose-Overlay keinen blauen Phänotyp zeigten, wurden erneut plaquegereinigt bis die Viruspopulation homogen war. Das so erhaltene Virusisolat wurde BHV-1/3Cmut genannt. Die unproblematische Generierung der Rekombinante BHV-1/3Cmut deutete darauf hin, dass die Aktivität der 3CPro der limitierende Faktor für eine Expression der ORFs P1-2A3C und 3C durch BHV-1 ist. 3.4.4 In vitro-Charakterisierung der rekombinanten Viren BHV-1/P1-2A und BHV-1/3Cmut Während der Plaquereinigung der Rekombinanten BHV-1/P1-2A und BHV-1/3Cmut war erkennbar, dass die BHV-1/P1-2A Plaques deutlich kleiner waren als durch Wildtyp (wt) BHV-1 oder BHV-1/3Cmut induzierte Plaques. Dies zeigte sich auch bei den Untersuchungen zum Nachweis der Expression von P1-2A bzw. 3Cmut durch die entsprechenden Rekombinanten mittels IIF (Abb. 11 und 12). Hierzu wurden MDBK Zellen mit BHV-1/P12A, BHV-1/3Cmut und dem Wildtypstamm BHV-1 Schönböken infiziert. Nach dem Auftreten von Plaques wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit dem jeweiligen MKSV-spezifischen Kaninchenserum α-P1-2A bzw. α-3ABCmut inkubiert. Das Serum α3ABCmut richtet sich gegen das MKSV NSP-Fusionsprotein 3ABCmut, das sich aus den NSPs 3A, 3B und der inaktiven 3CPro zusammensetzt (siehe 3.1.2.). Zur Kontrolle der BHV-1 Infektion wurde eine Doppel-IIF mit dem BHV-1 gB-spezifischen mab 42/18/7 durchgeführt. 75 Ergebnisse α-P1-2A mab 42/18/7 BHV-1/P1-2A BHV-1 Schönböken Abb. 11: Das P1-2A Protein wird in BHV-1/P1-2A infizierten MDBK-Zellen exprimiert. Die fixierten und permeabilisierten MDBK Zellen wurden mit dem MKSV-spezifischen Kaninchenserum α-P1-2A und einem Fluor®488 Ziege anti-Kaninchen Konjugat inkubiert (links). Parallel wurden die Plaques mit dem BHV-1spezifischen monoklonalen Mausantikörper mab 42/18/7 und einem Fluor®594-markiertem Ziege anti-Maus Konjugat nachgewiesen (rechts). α-3ABCmut mab 42/18/7 BHV-1/3Cmut BHV-1 Schönböken Abb. 12: Die mutierte 3CPro wird in MDBK Zellen nach Infektion mit der Rekombinante BHV-1/3Cmut exprimiert. Nach der Entstehung von Plaques wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Die Analyse in der IIF erfolgt unter Verwendung des MKSV-spezifischen Kaninchenserum α-3ABCmut und dem Fluor®488 Ziege anti-Kaninchen Konjugat (links). Gleichzeitig wurden die Proben mit dem BHV-1-spezifischen monoklonalen Mausantikörper mab 42/18/7 und einem Fluor®594-markiertem Ziege anti-Maus Konjugat inkubiert (rechts). Der BHV-1-spezifische Antikörper mab 42/18/7 reagierte wie erwartet mit den Zellen der Plaques aller Viren (Abb. 11 und 12), während das α-P1-2A Serum spezifisch nur mit BHV-1/P1-2A infizierten Zellen reagierte (Abb. 11) und das α-3ABCmut Serum nur 76 Ergebnisse BHV-1/3Cmut infizierte Zellen detektierte. Dieses Ergebnis belegt, dass die Rekombinanten die jeweiligen MKSV-Proteine exprimieren und zeigt im direkten Vergleich, dass die von BHV-1/P1-2A induzierten Plaques bei weitem nicht die Größe von wt-Plaques des Stamms BHV-1 Schönböken erreichten. Dagegen war zwischen den BHV-1 Schönböken Plaques und BHV-1/3Cmut Plaques kein deutlicher Unterschied erkennbar. Um den Einfluss der Expression der MKSV-Proteine auf die Ausbreitung der Viren von Zelle zu Zelle zu quantifizieren, wurden die Flächen der durch die Rekombinanten induzierten Plaques im Vergleich zu BHV-1 Schönböken bestimmt. BHV-1/P1-2A, BHV-1/3Cmut und BHV-1 Schönböken wurden dazu auf MDBK-Zellen titriert. 3 d p.i. wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und die Plaques in der indirekten Immunfluoreszenz mit dem BHV-1spezifischen Kaninchenserum α-gB-COOH angefärbt. Das Serum richtet sich gegen die carboxyterminale Untereinheit des BHV-1 Glykoproteins gB. Die Fläche von jeweils 50 Plaques wurde unter Verwendung des Programms analySIS labFlow 5.0 (Soft Imaging Systems GmbH, Germany) ermittelt. 120 Plaquefläche in % 100 80 60 40 20 0 BHV-1 Schönböken BHV-1/P1-2A BHV-1/3Cmut Abb. 13: Bestimmung der Fläche, der durch BHV-1/P1-2A und BHV-1/3Cmut induzierten Plaques im Vergleich zu BHV-1 Schönböken Plaques mittels indirekter Immunfluoreszenz auf MDBK-Zellen. Die fixierten und permeabilisierten Zellen wurden mit dem BHV-1 gB-spezifischen Kaninchenserum α-gB COOH sowie einem Fluor®594-gekoppelten Ziege anti-Kaninchen Konjugat inkubiert. Es wurden die Flächen von jeweils 50 Plaques bestimmt. Angegeben sind die relativen Plaqueflächen mit Standardabweichung in Bezug zu BHV-1 Schönböken (100%). Die Bestimmung der Plaqueflächen bestätigte, dass die Expression von P1-2A durch BHV1/P1-2A zu einer deutlichen Inhibierung der Zell-zu-Zellausbreitung der Virusrekombinante 77 Ergebnisse führte. BHV-1/P1-2A induzierte Plaques zeigen im Vergleich zu BHV-1 Schönböken eine mehr als 60 %ige Reduktion der Plaquegröße (Abb. 13). Dagegen beeinflusst die Expression des ORF 3Cmut das Wachstum von BHV-1 in den MDBK Zellen wesentlich geringer. Die Plaques von BHV-1/3Cmut waren zwar signifikant kleiner als bei BHV-1 Schönböken (Student`s t-Test, p < 0,0001). Sie erreichten aber immer noch durchschnittlich ca. 87 % der Größe des Wildtyps. Zur Klärung der Frage, ob die Expression von P1-2A und gegebenenfalls auch von 3Cmut auch die BHV-1 Replikation beeinflusst, wurden die in vitro-Replikationseigenschaften der Rekombinanten im Vergleich zu BHV-1 Schönböken analysiert (Abb. 14). Für Wachstumskinetiken wurden MDBK Zellen mit einer moi von 10 infiziert und 3 h p.i. extrazellulär verbliebenes Virus mit Zitratpuffer pH 3 inaktiviert. 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h sowie 32 h p.i. wurden Zellkulturüberstand und Zellen getrennt geerntet und zunächst bei -70°C gelagert. Die Menge an freigesetzten sowie intrazellulären Viren wurde anschließend durch Titration auf MDBK Zellen bestimmt. Die Ergebnisse der Wachstumskinetiken (Abb. 14) zeigten, dass die Insertion des ORF 3Cmut keinen erkennbaren Einfluss auf die Replikation von BHV-1 hatte. Der Titerverlauf der intraund extrazellulären BHV-1/3Cmut Virionen ist nahezu identisch zu BHV-1 Schönböken. Dagegen wurde bei der Rekombinanten BHV-1/P1-2A im Vergleich zum Wildtyp eine reduzierte Virusfreisetzung beobachtet. Der Titer an intrazellulär verbleibenden BHV-1/P12A Virionen stieg zunächst vergleichbar zu BHV-1 Schönböken an, blieb aber auch nach 20 h p.i. hoch, während bei BHV-1 Schönböken und BHV-1/3Cmut die intrazellulären Titer abfielen. Außerdem steigt der Titer an extrazellulären Viren bei BHV-1 Schönböken und BHV-1/3Cmut wesentlich schneller an. Dies wird vor allem deutlich, wenn man das Verhältnis von intrazellulären zu extrazellulären Virionen betrachtet. Bereits 20 h p.i. befindet sich bei BHV-1 Schönböken und BHV-1/3Cmut mehr infektiöses Virus im Kulturüberstand als in den Zellen. Dieser Überschneidung der Kurven wurde in der Wachstumskinetik von BHV-1/P1-2A nicht beobachtet. 78 8 8 7 7 6 6 log10 pfu/ml log10 pfu/ml Ergebnisse 5 4 3 2 5 4 3 2 1 1 BHV-1/P1-2A 0 BHV-1/3Cmut 0 6 8 10 12 16 20 24 32 6 8 10 12 Zeit p.i. in h 16 20 24 32 Zeit p.i. in h 8 7 log10 pfu/ml 6 5 4 3 2 1 BHV-1 Schönböken 0 6 8 10 12 16 20 24 32 Zeit p.i. in h Abb. 14: Die Virusfreisetzung von BHV-1/P1-2A ist im Vergleich zu BHV-1 Schönböken und BHV1/3Cmut verzögert. MDBK Zellen wurden mit den Viren BHV-1/P1-2A, BHV-1/3Cmut und BHV-1 Schönböken mit einer moi von 10 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Zellkulturüberstand (■) und Zellen (▲) geerntet. Der Virustiter wurde durch Titration auf MDBK Zellen bestimmt. Diese Ergebnisse der in vitro-Charakterisierung der Rekombinanten BHV-1/3Cmut bestätigen die Hypothese, dass die Funktion von 3CPro und nicht die für 3CPro kodierende Sequenz der limitierende Faktor für eine Expression durch BHV-1 waren. 79 Ergebnisse 3.4.5. Charakterisierung der durch BHV-1/3C exprimierten 3CPro Die transienten Expressionen von P1-2A, P1-2A3C und 3C wiesen darauf hin, dass die Anwesenheit von 3CPro schädigend für die Zellen sein könnte (Abb. 8), dass sich entsprechende Rekombinanten selbst wenn sie entstanden sein sollten, nicht vermehren können. Daher wurde versucht durch Reduktion der Menge an Rekombinationsplasmiden pROMI_P1-2A3C und pROMI_3C bei der Kotransfektion mit der BHV-1/80-221 DNA doch noch 3CPro exprimierende BHV-1 Rekombinanten zu generieren. Aus den Transfektionsansätzen mit dem Plasmid pROMI_P1-2A3C konnte auch nach mehrfach wiederholten unabhängigen Transfektionsversuchen keine infektiöse Virusnachkommenschaft generiert werden. Dagegen gelang es nach mehreren Wiederholungen doch noch, die Rekombinante BHV-1/3C zu isolieren. Diese zeigte überraschenderweise keine erkennbaren Änderungen im Vergleich zu BHV-1 Schönböken bezüglich der induzierten Plaquegröße und des erreichbaren Virustiters (Daten nicht gezeigt). Daher wurde zunächst die Sequenz des inserierten ORF 3C und die Proteaseaktivität der exprimierten 3CPro überprüft. Dazu wurde aus BHV-1/3C infizierten MDBK Zellen die Gesamtzell-DNA isoliert. Zur Kontrolle wurde auch die Gesamtzell-DNA von BHV-1 Schönböken infizierten Zellen aufgearbeitet. Jeweils 50 ng der gereinigten Gesamtzell-DNAs wurden in der PCR eingesetzt. Unter Verwendung der Primer 3C+ und 3C- (Tab. 1) wurde der ORF für die MKSV 3CPro aus dem herpesviralen Genom amplifiziert. Zur Überprüfung der DNA-Präparation wurde eine weitere PCR mit den BHV-1 gB-spezifischen Primern gB9 und gB10 (Tab. 1) durchgeführt. Aus der DNA von BHV-1/3C infizierten Zellen wurde das erwartete ca. 650 bp große DNAFragment 3C amplifiziert (Abb. 15). Keine Amplifikate wurden aus der DNA von BHV-1 Schönböken-infizierten Zellen sowie aus der Wasserkontrolle erhalten. Somit konnte gezeigt werden, dass eine Integration des ORF 3C in das Genom von BHV-1/80-221 erfolgt war. In der BHV-1 gB-spezifischen PCR wurde mit den Primern gB9 und gB10 aus den infizierten MDBK Zellen die Kodons 474-558 des gB ORF amplifiziert. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die DNA-Präparation keine für die PCR-Reaktion inhibierenden Komponenten enthielten. Die Wasserkontrolle war wiederum negativ. 80 Ergebnisse Kontrolle BHV-1 Schönböken gB Primer BHV-1/3C Kontrolle BHV-1 Schönböken M BHV-1/3C 3C Primer bp 1018 506 344 Abb. 15: Amplifizierung des ORF 3C und eines gB Fragmentes aus dem Genom von BHV-1/3C und BHV1 Schönböken. Die PCR wurde mit Gesamtzell-DNA Präparationen von BHV-1/3Cmut- und BHV-1 Schönböken-infizierten MDBK-Zellen sowie dem MKSV-spezifischen Primerpaar 3C+/3C- und dem BHV-1 gB-spezifischen Primerpaar gB9/gB10 durchgeführt. Die PCR-Proben wurden in einem 2 %igem Agarosegel aufgetragen. Der DNA-Größenstandard (M) ist angegeben. Zur Überprüfung der Sequenz und für weitere funktionelle Analysen wurde das PCR-Produkt nach Inkubation mit dem Klenow-Enzym und Phosphorylierung der 5`-Enden durch die Polynukleotidkinase in den EcoRV gespaltenen Vektor pcDNA3 kloniert. Das fertige Plasmid wurde pcDNA_3CBHV-1 genannt. Die inserierten Sequenzen von 3 Klonen des Plasmides pcDNA_3CBHV-1 wurden anschließend analysiert. Die Sequenzreaktionen wurden mit den Primern SP6 und T7 (Tab. 2) durchgeführt. Die Sequenzierung des aus BHV-1/3C - infizierten MDBK Zellen amplifizierten PCRFragments 3C ergab im Vergleich zur Ausgangssequenz A-Iran97 zwei Nukleotidaustausche. Die beiden Änderungen führten zu zwei Aminosäureaustauschen und zwar von Gly38 zu Ser und von Phe48 ebenfalls zu Ser (Abb. 16). Die Sequenzierung des Rekombinationsplasmides pROMI_3C hatte keine Nukleotidaustausche zur Ausgangssequenz ergeben und ließ somit schlussfolgern, dass die Änderungen in der Nukleotidsequenz bei der Replikation des ORF 3C im BHV-1 Genom erfolgt waren. 81 Ergebnisse A-Iran 98 A-Iran 97 BHV-1/3C SGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTA -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------S---- 40 YLVPRHLFAEKYDKIMLDGRAMTDSDYRVFEFEIKVKGQD ----------------------------------------------------------------------------- S------------------------------------------------------ 80 MLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDVAKMKKGTPVVGVIN --------------------------------------------- R --------------------------------------------------------------- R ------------------- 120 NADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYRAATKA 160 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLL ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 200 KMKAHIDPEPHHE ------------------------------------------- 213 Abb. 16: Vergleichende Darstellung der Aminosäuresequenzen der MKSV Protease 3CPro. Die Aminosäuresequenz des Referenzstammes MKSV A-Iran 98 (Carrillo et al., 2005) ist im Einbuchstabencode angegeben. Blau und unterstrichen dargestellt sind die für die Proteaseaktivität essentiellen Aminosäuren (Grubman et al., 1995). Weiterhin angegeben ist die Sequenz des in dieser Arbeit verwendeten Stammes A-Iran 97 (siehe 3.1.3.) sowie die 3C Sequenz aus dem rekombinanten Virus BHV-1/3C. Identische Aminosäuren wurden durch kurze Linien, die beobachteten Aminosäureaustausche durch rot hervorgehobene Buchstaben dargestellt. Die Aminosäureaustausche betrafen keine der bisher als essentiell für die Proteaseaktivität identifizierten Aminosäure. Ob die Austausche von Gly38 und Phe48 zu Serin einen Einfluss auf die Funktion von 3CPro hatten, sollte daher in einem in vitro-Test zur Untersuchung der Proteaseaktivität überprüft werden. Dazu wurde das Plasmid pcDNA_3Cmut konstruiert, das als Negativkontrolle in diesem Test eingesetzt werden sollte. Für dessen Herstellung wurde das Plasmid pROMI_3Cmut mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und Einzelstrangüberhänge durch Klenow-Behandlung entfernt. Der für die mutierte 3CPro kodierende ORF wurde anschließend in den mit EcoRV gespalten Vektor pcDNA3 inseriert. Zur Kontrolle wurde das Plasmid mit den Primern SP6 und T7 sequenziert (Tab. 2). 82 Ergebnisse Für den in vitro-Test wurden die Plasmidpaare pcDNA_P1-2A und pcDNA_3CBHV-1, pcDNA_P1-2A und pcDNA_3C sowie pcDNA_P1-2A und pcDNA_3Cmut gemischt und in COS-7 Zellen transfiziert. Nach Ernte der Zellen wurden die Proteine im Polyacrylamidgel aufgetrennt und anschließend im Western Blot untersucht (Abb. 17). kDa 1 2 3 4 111 P1-2A 81 61 48 VP0 36 25 Abb. 17: Die Aktivität der Protease 3CPro aus BHV-1 ist stark verringert. COS-7 Zellen wurden mit je 625 ng der Plasmidpaare (1) pcDNA_P1-2A und pcDNA_3CBHV-1, (2) pcDNA_P1-2A und pcDNA_3C und (3) pcDNA_P1-2A und pcDNA_3Cmut kotransfiziert. Weiterhin wurden nicht transfizierte COS-7 Zellen mitgeführt (4). Die Proteine wurden im Polyacrylamidgel (10%) aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembran transferiert, mit α-VP2 Serum und Ziege anti-Kaninchen Peroxidase-gekoppelten Konjugat inkubiert und schließlich mittels Chemilumineszenz detektiert. In COS-7 Zellen, die mit den Plasmiden pcDNA_P1-2A und pcDNA_3CBHV-1 (Abb. 17, Spur 1) bzw. pcDNA_P1-2A und pcDNA_3C (Abb. 17, Spur 2) kotransfiziert wurden, konnten im Western Blot die Proteine P1-2A und VP0 detektiert werden. Allerdings war der Anteil des Spaltproduktes VP0 in der Spur 1 im Vergleich zum Anteil in Spur 2 deutlich niedriger. Dafür wurde in den Zellen nach Transfektion mit pcDNA_P1-2A und pcDNA_3CBHV-1 wesentlich mehr an ungespaltenem Vorläuferprotein P1-2A gefunden als in den Zellen nach Transfektion mit pcDNA_P1-2A und pcDNA_3C. Die Menge an exprimierten P1-2A in Spur 1 entsprach in etwa der Menge an P1-2A in den Zellen nach Kotransfektion von pcDNA_P1-2A und pcDNA_3Cmut. In den mit der inaktiven Protease 3C transfizierten Zellen (Abb. 17, Spur 3) konnte erwartungsgemäß nur das P1-2A Vorläuferprotein detektiert werden. Das Ergebnis der Western Blot Analyse zeigte, dass der mutierte ORF 3C aus dem Genom von BHV-1/3C für eine Protease kodiert, die deutlich an Aktivität verloren hat, da das Vorläuferprotein P1-2A wesentlich ineffizienter gespalten wurde. Dies zeigt, dass Gly38 und/oder Phe48 für die Proteaseaktivität notwendig sind. Keiner dieser Aminosäureaustausche betrifft das aktive Zentrum oder eine bisher beschriebene für die proteolytische Aktivität notwendige 83 Ergebnisse Aminosäure (Grubman et al., 1995; Birtley et al., 2005; Curry et al., 2007). Aus der Kristallstrukturanalyse der 3CPro geht hervor, dass Phe38 allerdings sehr nah am aktiven Zentrum der Protease lokalisiert ist (Birtley et al., 2005). Daher ist es denkbar, dass dieser Austausch zu Serin Auswirkungen auf die Konformation des aktiven Zentrums hat und dadurch auch die Aktivität von 3CPro beeinflusst. Die Versuche zur Generierung von rekombinanten BHV-1 Viren ergaben, dass die normale Proteaseaktivität der MKSV 3CPro mit der Replikation von BHV-1 nicht kompatibel ist. Darüber hinaus ergab die Analyse der in vitro-Wachstumseigenschaften, dass auch die Expression von P1-2A mit der Replikation von BHV-1 bezüglich der direkten Zell-zuZellausbreitung und Virusfreisetzung korreliert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass sich BHV-1 nicht als Vektor zur Expression von aus P1-2A durch 3CPro generierten MKSV-Strukturproteinen eignet. Die Spaltung von P1-2A ist allerdings für die Induktion einer schützenden Immunantwort unabdingbar ist (Chinsangaram et al., 1998; Mayr et al., 1999; Cedillo-Barron et al., 2001; Mayr et al., 2001). 84 Ergebnisse 3.5. Herstellung und Charakterisierung P1-2A, P1-2A3C und 3CPro exprimierender BacMam Viren Rekombinante Baculoviren werden bisher weitgehend wie unter 3.2. beschrieben für eine effiziente Expression von heterologen Proteinen in Insektenzellen genutzt. Seit einiger Zeit werden sie aber auch zunehmend für den in vitro- und in vivo-Gentransfer in Vertebratenzellen verwendet. Dazu muss in diesen sogenannten BacMam Viren die Transkription der zu exprimierenden ORFs unter der Kontrolle von Promotoren sein, die in diesen Zellen aktiv sind, da Baculoviruspromotoren in den bisher untersuchten Vertebratenzellen nicht aktiv sind (Kost et al., 2005). Da andererseits die für die Expression in Säugerzellen häufig verwendeten herpesviralen immediate-early (ie) Promotor / Enhancerelemente in Insektenzellen nur eine sehr geringe Aktivität aufweisen, sollte geprüft werden, ob BacMam Viren eine Alternative zu BHV-1 für die Expression der MKSVProteine P1-2A, P1-2A3C und 3CPro und zur Immunisierung von Tieren sein können. Dazu wurden die jeweiligen ORFs in den Transfervektor pBacMamDual_MCMVie kloniert (Abb. 18). pBacMamDual_MCMVie wurde aus dem Tranfervektor pFastBacDual (Invitrogen) abgeleitet und enthält zwischen den Polyadenylierungssignalen von HSV TK und SV40 das bidirektional aktive ie1 und ie2 Promotor / Enhancerelement des murinen Zytomegalovirus (MCMV) (Dorsch-Hasler et al., 1985; Messerle et al., 1991). Weiterhin enthält der Transfervektor eine Insektenzell-aktive Expressionskassette mit dem GFP ORF unter der Kontrolle des PolH Promotors und den PolyA Signal des BHV-1 gD Gens, um die Generierung und Replikation der BacMam Viren in Insektenzellen einfach und schnell zu verfolgen. Die Herstellung der BacMam Viren erfolgte wie unter 3.2. beschreiben. GFP ORF Tn7L PolH Promotor BHV-1 gD PolyA SV40 PolyA HSV TK PolyA MKSV ORF MCMVie1 MCMVie2 Promotor Promotor Tn7R Abb. 18: Schematische Darstellung des relevanten Bereichs des für die Herstellung rekombinanter BacMam Viren verwendetes Rekombinationsplasmides. Die für die Rekombination benötigten Bereiche sind schwarz dargestellt. Sie flankieren den unter der Kontrolle des baculoviralen Promotors PolH stehenden GFP ORF sowie den jeweiligen MKSV ORF, welcher durch den MCMVie1 Promotor und dem PolyA Signal von SV40 kontrolliert wird. 85 Ergebnisse Transferplasmid Tn7R MCMVie1 GmR Transformation MKSV ORF DH10Bac E.coli Zelle Transposition ApR Tn7L GFP ORF PolH Isolierung der rekombinanten Bacmid-DNA Transfektion der BacmidDNA in HIGH V Zellen Rekombinante Baculoviren Insektenzellen: Virusanreicherung in Insektenzellen Transduktion Bacmid mit Insertion Säugerzellen: Starke Expression heterologer Gene PolH Promotor: +++ PolH Promotor: -- MCMVie1 Promotor: (+) MCMVie1 Promotor: +++ Abb. 19: Schematische Darstellung der Herstellung von BacMam Viren für die Transduktion von Säugerzellen. Die Zielsequenz wurde im Transfervektor unterhalb des MCMVie1 Promotor inseriert. Die Generierung rekombinanter BacMam Viren erfolgte wie unter 3.2. beschrieben (siehe Abb. 4). Nach Vermehrung der Rekombinanten in Insektenzellen wurden sie für die Transduktion von Säugerzellen verwendet. In Insektenzellen ist der MCMVie1 Promotor schwach (+), in Säugerzellen stark (+++) aktiv. Im Gegensatz dazu ist der PolH Promotor nur in Insektenzellen stark aktiv (+++), in Säugerzellen dagegen inaktiv (--). 3.5.1. Klonierung der Transferplasmide Der Vektor pBacMamDual_MCMVie wurden mit HindIII gespalten und anschließend mit Klenow-Enzym behandelt. Die zu inserierenden ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C wurden aus den Plasmiden pROMI_P1-2A, pROMI_P1-2A3C und pcDNA_3C isoliert. Dazu wurden die Plasmide pROMI_P1-2A und pROMI_P1-2A3C mit Acc65I gespalten und nach Glättung der überstehenden Enden wurden die ORFs P1-2A und P1-2A3C in den kompatiblen Vektor kloniert. Durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen NotI und BamHI wurde der ORF 3C aus dem Plasmid pcDNA_3C erhalten und ebenfalls nach Klenow-Behandlung in den Vektor kloniert. Die Transferplasmide wurden pMCMVie_P1-2A, pMCMVie_P1-2A3C und 86 Ergebnisse pMCMVie_3C genannt. Die für die Protease 3CPro kodierenden Sequenzen der Plasmide pMCMVie_3C und pMCMVie_P1-2AC wurden durch Sequenzierung mit dem Primer pHrev (Tab. 2) kontrolliert. 3.5.2. Selektion und DNA-Analyse der rekombinanten BacMam Viren Je 0,5 µg der Plasmide pMCMVie_P1-2A, pMCMVie_P1-2A3C und pMCMVie_3C wurden in kompetente E.coli DH10Bac™ Bakterien transformiert. In den Bakterien erfolgte durch Transposition die Integration der Fremdgenbereiche in die Bacmid-DNA. Die Bacmid-DNA rekombinanter Klone wurde anschließend isoliert. Jeweils 5 µg rekombinanter Bacmid-DNA wurden im Doppelansatz in HIGH-V Zellen transfiziert und die Generierung der Rekombinanten anhand der GFP-Autofluoreszenz verfolgt (Abb. 20). Die erhaltenen Viren wurden BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C bezeichnet. a) b) c) Abb. 20: Nachweis der Generierung der Rekombinanten BacMam/P1-2A (a), BacMam/P1-2A3C (b) und BacMam/3C (c) anhand der GFP-Autofluoreszenz. Dargestellt sind die infizierten HIGH V Zellen 3 Tage nach der Transfektion. Bei der Generierung von BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C fiel auf, dass sich diese Viren im Vergleich zu BacMam/P1-2A wesentlich langsamer in den HIGH V Zellen ausbreiteten (Abb. 20). Darüber hinaus waren die ersten Titer nach Vermehrung in Sf9 Zellen mit einer TCID50 von 106 für BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C deutlich niedriger als für BacMam/P1-2A mit einer TCID50 von 5 x 107. Da der MCMVie1 Promotor in Insektenzellen schwach aktiv ist, kommt es somit zu einer schwachen Expression der MKSV-Proteine und damit auch der 3CPro, was zu der langsameren Ausbreitung von BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C in Insektenzellen führen könnte. 87 Ergebnisse Um auszuschließen, dass wie in BHV-1 auch in den Viren BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C auf Mutationen im Leserahmen der 3CPro selektioniert wurde, wurde bei diesen Rekombinanten nach Plaquereinigung der jeweilige 3C ORF mittels Sequenzierung überprüft. Dazu wurden Sf9 Zellen mit BacMam/P1-2A3C, BacMam/3C bzw. mit BacMam/GFP infiziert. Nach Eintreten eines vollständigen CPE wurden die Gesamtzell-DNAs isoliert. Mittels PCR mit den MKSV-spezifischen Primern 3C+ und 3C- (Tab. 1) wurde dann der für Kontrolle BacMam/GFP BacMam/3C M BacMam/P1-2A3C 3CPro kodierende Leserahmen aus den DNA-Isolaten amplifiziert (Abb. 21). bp 1018 506 Abb. 21: Amplifizierung des ORF 3C aus infizierten Sf9 Zellen. Die PCR wurde mit Gesamtzell-DNA Präparationen aus BacMam/P1-2A3C, BacMam/3C und BacMam/GFP infizierten Zellen als Template DNA sowie mit den MKSV-spezifischen Primern 3C+ und 3C- durchgeführt. Die PCR-Proben wurden auf einem 2 %ige Agarosegel aufgetragen. Der DNA-Größenstandard (M) ist angegeben. Aus den Proben BacMam/P1-2A3C- und BacMam/3C- infizierter Zellen wurde jeweils eine spezifische Bande von ca. 650 bp amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden nach Behandlung mit Klenow-Enzym und Polynukleotidkinase in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pcDNA3 kloniert. Es wurden jeweils drei Plasmidklone unter Verwendung der Sequenzprimer SP6 und T7 (Tab. 2) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen zeigten eine komplette Übereinstimmung zu der in 3.1.3. ermittelten Nukleotidsequenz für den ORF 3C vom MKSV Stamm A-Iran 97. 88 Ergebnisse 3.5.3. In vitro-Wachstumskinetik Zur Untersuchung von Auswirkungen der inserierten MKSV-Sequenzen auf die Replikation der BacMam Viren in Insektenzellen wurden mit BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C, BacMam/3C und BacMam/GFP Wachstumskinetiken durchgeführt (Abb. 22). Sf9 Zellen wurden mit den jeweiligen Viren infiziert (moi 0,1). Zu den angegebenen Zeiten wurden die infizierten Zellen mit dem Kulturüberstand abgespült und bei -70 °C eingefroren. Nach dem Tauen der Proben wurden diese für 5 s mit Ultraschall behandelt (40W) und anschließend der Virustiter bestimmt. 10 lo g 1 0 T CID 5 0 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit p.i. in d Abb. 22: Vergleich des Wachstumsverhaltens der rekombinanten BacMam Viren, welche MKSV-Proteine exprimieren, mit BacMam/GFP in Sf9 Zellkultur. Mit BacMam/P1-2A (♦), BacMam/P1-2A3C (▲), BacMam/3C (■) und BacMam/GFP (ο) infizierte Zellen sowie deren Überständen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und der Virustiter bestimmt. Die Replikationskinetiken zeigten, dass alle untersuchten Viren ein sehr ähnliches Verhalten in Zellkultur hatten (Abb. 22). Zwischen Tag 1 und 6 kam es zu einem deutlichen Titeranstieg. Danach fielen die Titer bis zum Tag 8 leicht ab. Die Rekombinanten BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C erreichten allerdings über den gesamten Zeitraum Titer, die im Vergleich mit den anderen beiden rekombinanten Viren um das ca. 10-fache reduziert waren. Diese reduzierten Virustiter lassen sich wie die beobachtete verzögerte Virusausbreitung nach Transfektion (siehe 3.5.2.) bei den rekombinanten Viren BacMam/P12A3C und BacMam/3C dadurch erklären, dass die Expression der 3CPro wahrscheinlich zu einer leichten Inhibierung in der Virusreplikation im Vergleich zu den rekombinanten Viren BacMam/P1-2A und BacMam/GFP führen. 89 Ergebnisse 3.5.4. Expression und Prozessierung von MKSV-Proteinen in transduzierten Zellen Zur Analyse der P1-2A und P1-2A3C Expression sowie der Prozessierung der Proteine durch die rekombinanten BacMam Viren, wurden die Viren für die Transduktion von KOP-R Zellen verwendet. Zunächst wurden KOP-R Zellen mit BacMam/P1-2A bzw. BacMam/P1-2A3C transduziert (moi 25). Dabei wurde neben den intrazellulär vorkommenden Proteinen auch der Zellkulturüberstand auf MKSV-Proteine untersucht. Nach 2 h, 4 h, 7 h, 11 h, 21 h und 24 h Inkubation bei 37°C wurden die Zellen und deren Überstand geerntet und im Western Blot untersucht. Um sicherzustellen, dass vergleichbare Probenmengen an transduzierten Zellen aufgetragen wurden, wurden die Zellproben auf einem zusätzlichen Gel getrennt und die Proteine mit Coomassie-Blue gefärbt (Abb. 23a und 23d). Nach der Transduktion mit BacMam/P1-2A war das P1-2A Protein ab 7 h nach Beginn der Inkubation bei 37°C nachweisbar (Abb. 23b). Dessen Menge nahm über den Zeitraum von 24 h kontinuierlich zu. Im Überstand der transduzierten Zellen war lediglich nach 24 h eine geringe Menge an P1-2A Protein zu detektieren (Abb. 23c). In den Zellen, die mit BacMam/P1-2A3C transduziert wurden, waren bereits ab 4 h nach Beginn der Inokulation bei 37 °C das P1-2A Protein sowie das daraus durch 3CPro-vermittelte Spaltung entstandene Protein VP0-VP3 und nach 7 h auch VP0 nachweisbar. Der zeitliche Verlauf zeigt aber, dass die in den Zellen vorhandene Menge an MKSV-Proteinen nur bis 11 h zunimmt und VP0 akkumuliert. Bis 24 h nach Beginn der Inkubation bei 37°C sind unter den zellassozierten Proteinen deutlich weniger an MKSV-Proteinen zu finden und P1-2A ist nahezu vollständig prozessiert worden (Abb. 23e). Im Überstand dieser Kulturen erscheinen nach 11 h neben Spuren von P1-2A vor allem die Proteine VP0-VP3 und VP0, deren relative Mengen bis 24 h allerdings nicht weiter zunehmen (Abb. 23f). Dieses Ergebnis zeigt, dass 3CPro das Vorläuferproteine P1-2A auch nach Transduktion mit BacMam/P1-2A3C effizient spaltet. Allerdings scheint die P1-2A3C Neusynthese 11 h nach Beginn der Inkubation bei 37°C zu stagnieren bzw. eingestellt zu sein. 90 Ergebnisse BacMam/P1-2A3C BacMam/P1-2A a) M 2 4 7 2 4 7 11 21 24 K d) M 2 4 7 11 21 24 2 4 7 11 21 24 K kDa 100 50 b) 11 21 24 K kDa 111 e) K P1-2A VP0-VP3 81 61 48 VP0 36 c) 2 kDa 111 4 7 11 21 24 K f) 2 4 7 11 21 24 K P1-2A VP0-VP3 81 61 48 VP0 36 Abb. 23: Nachweis der Expression und Spaltung von MKSV-Proteinen in transduzierten KOP-R Zellen. KOP-R Zellen wurden mit BacMam/P1-2A (links) bzw. BacMam/P1-2A3C (rechts) transduziert (moi 25). 2 h, 4 h, 7 h, 11 h, 21 h und 24 h nach Beginn der Inokulation bei 37°C wurden die Zellen und deren Überstände geerntet. Als Kontrolle wurden nicht transduzierte KOP-R Zellen mitgeführt (K). Nach der Ernte wurden die Zellproben im SDS-10%-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Coomassie-Blue gefärbt (A). Die molaren Massen von Markerproteinen (M) sind angegeben (kDa). Im Western Blot wurden sowohl die Zellen (B) als auch die Überstände (C) getestet. Die Proteine in den Überständen wurde mit Aceton gefällt. Nach Auftrennung der Proben im SDS-10%- Polyacrylamidgel wurden die Proteine auf Nitrozellulosemembranen transferiert und anschließend mit α-VP2 Serum und Peroxidase-gekoppeltem α-Kaninchen Konjugat inkubiert. Der Nachweis gebundener Antikörper erfolgte über Chemilumineszenzreaktion. 91 Ergebnisse Da in Abwesenheit der 3CPro die P1-2A Neusynthese nicht inhibiert wurde (Abb. 23b) und außerdem BacMam/P1-2A3C transduzierte KOP-R Kulturen im lichtmikroskopischen Vergleich mit BacMam/P1-2A transduzierten Zellen erhebliche morphologische Änderungen aufwiesen, wurde die Vitalität der transduzierten Zellen mit Trypanblau untersucht. Dieser Farbstoff erlaubt die selektive Färbung toter Zellen, da er die Zellmembranen lebender Zellen nicht passieren kann. KOP-R Zellen wurden mit den Rekombinanten BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C, BacMam/3C und BacMam/GFP transduziert (moi 25). Nach 6 h, 12 h, 24 h und 48 h wurden die Zellen geerntet und der Anteil der toten Zellen in den Proben bestimmt (Abb. 24). BacMam/P1-2A BacMam/3C KOP-R BacMam/P1-2A3C BacMam/GFP Anteil toter Zellen (%) 100 80 60 40 20 0 6h 12h 24h 48h Zeit nach Transduktion Abb. 24: Einfluss der Transduktion mit BacMam/P1-2A3C auf die Vitalität der transduzierten Zellen. KOP-R Zellen wurden mit BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C, BacMam/3C sowie BacMam/GFP transduziert (moi 25). Als Kontrolle wurden nicht transduzierte KOP-R Zellen eingesetzt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen im Vitalitätstest mit Trypanblau getestet und der Anteil an toten Zellen bestimmt. Der Vitalitätstest zeigte, dass die Transduktion von KOP-R Zellen mit BacMam Viren per se keine erhebliche Zellschädigung zur Folge hatte, da die Kulturen nach Transduktion mit BacMam/GFP mit einem Anteil an toten Zellen von maximal 8 % über den beobachteten Zeitraum lediglich etwas mehr tote Zellen enthielten als die Kontrollkulturen, in denen durchschnittlich 3 % der Zellen mit Trypanblau anfärbbar waren. Im Gegensatz dazu waren nach der Transduktion mit BacMam/P1-2A3C bereits 6 h nach Beginn der Inkubation bei 37°C 22,8 % der Zellen tot. Dieser Anteil stieg auf 69,4 % nach 12 h und auf fast 100 % nach 92 Ergebnisse 24 h. Die festgestellte hohe Zelltoxizität erklärt, warum wie oben beschrieben in BacMam/P12A3C transduzierten Zellen nach 11 h keine deutliche Neusynthese der MKSV-Proteine mehr erkennbar war. Auch die Kulturen, die mit BacMam/P1-2A transduziert wurden, zeigten eine im zeitlichen Verlauf zunehmende Anzahl toter Zellen, deren Anteil 48 h nach Transduktion 20,8 % erreicht. Demzufolge schein auch die Akkumulation des P1-2A Proteins eine zellschädigende Wirkung zu haben, die auch für die Hemmung der Replikation von BHV-1/P1-2A verantwortlich sein könnte (siehe 3.4.4.). Interessanterweise war die Zytotoxizität der 3CPro nach Transduktion mit der Rekombinanten BacMam/3C mit nur 18,2 % nach 24 h und 43,2 % nach 48 h deutlich geringer als die durch BacMam/P1-2A3C vermittelte Expression. Dies könnte bedeuten, dass sich die zytotoxische Wirkung der 3CPro erst vollständig entwickeln kann, wenn in den Zellen auch das Vorläuferprotein P1-2A vorliegt. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurden KOP-R Zellen mit BacMam/P1-2A und BacMam/3C im Verhältnis 1:1 kotransduziert. Die Ernte der Zellen und der zugehörigen Überstände erfolgte nach 24 h, 48 h und 120 h. Die Proben wurden im Western Blot analysiert und auch hier wurden zur Sicherstellung gleicher Mengen an eingesetzten Proben die zellulären Proteine auf einem Gel aufgetrennt, das anschließend mit Coomassie-Blue gefärbt wurde (Abb. 25a). a) M 24 48 120 K b) kDa 24 kDa 111 100 48 120 K c) 24 48 120 K P1-2A 81 VP0-VP3 50 61 48 VP0 36 Abb. 25: Nachweis der intermolekularen Spaltung des P1-2A Proteins in transduzierten Zellen. KOP-R Zellen wurden gleichzeitig mit BacMam/P1-2A und BacMam/3C transduziert (moi je 25) und nach 24 h, 48 h und 120 h wurden Zellen sowie Überstände geerntet. Zur Kontrolle wurden nicht transduzierte KOP-R Zellen mitgeführt (K). a) zeigt die Coomassie-Blue Färbung der aufgetrennten Zellproben. Die molaren Massen von Markerproteinen (M) sind angegeben (kDa). Die Zellen (b) und die Überstände (c), welche zuvor mit Aceton gefällt wurden waren, wurden im 10 %igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembranen transferiert und mit α-VP2 Serum sowie α-Kaninchen Konjugat inkubiert. Der Nachweis gebundener Antikörper erfolgte mittels Chemilumineszenzreaktion. 93 Ergebnisse Das Ergebnis zeigte, dass die intermolekulare Spaltung des Vorläuferproteins P1-2A in mit BacMam/P1-2A und BacMam/3C transduzierten Zellen wesentlich ineffizienter als die intramolekulare Spaltung bei BacMam/P1-2A3C ablief. 24 h und 48 h nach der Transduktion befand sich ungespaltenes P1-2A in großer Menge in den Zellen (Abb. 25b). Lediglich ein geringer Teil an P1-2A lag zu diesen Zeitpunkten gespalten vor. Es wurde nur wenig VP0VP3 und VP0 Protein nach 24 h und 48 h detektiert. Der Anteil der beiden Proteine in den Zellen war 120 h nach Transduktion etwas höher. Auch im Überstand der transduzierten Zellen konnten nur geringe Mengen an prozessierten MKSV-Proteinen nachgewiesen werden (Abb. 25c). Dieses Ergebnis ist in Einklang mit der Tatsache, dass die Expression der 3CPro durch BacMam/3C weniger zytotoxisch ist als nach der Expression des P1-2A3C ORF und unterstützt daher nicht die Annahme, dass nur die gleichzeitige Anwesenheit von P1-2A und 3C in transduzierten Zellen zytotoxisch wirkt. Weiterhin zeigt dieses Ergebnis, dass die Prozessierung des Vorläuferproteins P1-2A durch 3CPro in cis wesentlich effizienter verläuft als in trans. Die Western Blot Analysen hatten gezeigt, dass das P1-2A Protein nach Transduktion von KOP-R Zellen mit BacMam/P1-2A3C nahezu vollständig gespalten wird. Da davon ausgegangen wird, dass sich nach Spaltung des Vorläuferproteins die einzelnen Strukturproteine zu leeren Kapsiden bzw. VLPs zusammensetzen (Grubman et al., 1985; Lewis et al., 1991), wurde versucht, in den Überständen von KOP-R Kulturen nach Transduktion mit BacMam/P1-2A3C MKSV VLPs nachzuweisen. Dazu wurden die Zellkulturüberstände 21 h nach Transduktion ohne und mit Konzentrierung durch Fällung mit Aceton im Elektronenmikroskop durch Herrn Dr. H. Granzow auf VLPs hin untersucht. In keinem Fall konnten leere Kapside oder der Zusammenbau der Strukturproteine zu Pentameren, dem ersten Schritt der Kapsidbildung, nachgewiesen werden. 94 Ergebnisse 3.6. Immunisierung von Mäusen mit rekombinanten BacMam Viren Da sich BacMam Viren auch zum Gentransfer in Tieren eignen (Aoki et al., 1999; Abe et al., 2003), sollte untersucht werden, ob eine MKSV-spezifische Immunantwort in Mäusen nach Immunisierung mit den Rekombinanten BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C induziert werden kann. Dazu wurden 6-8 Wochen alte C57 BL/6 Mäuse innerhalb von einer Woche dreimal mit jeweils 2 x 107 TCID50 gereinigten BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C und einem leeren BacMam Virus i.m. immunisiert. Kontrolltiere erhielten im äquivalenten Volumen lediglich PBS+. An den Tagen 0, 3, 7, 14, 21 und 38 wurde den Tieren Blut entnommen und in der Durchflußzytometrie bzw. im indirekten MKSV-spezifischen ELISA getestet. 69 Tage nach der ersten Immunisierung wurden die Tiere euthanasiert und die isolierten Milzzellen im Proliferationstest verwendet. In Abb. 26 ist der Versuchsablauf schematisch zusammengefasst. Tag Immunisierung 0 3 7 I. II. III. 14 38 21 69 Blutentnahmne FACS Analyse ELISA Proliferations-Assay Abb. 26: Übersicht zum Tierversuchsaufbau. Die Tiere wurden innerhalb der ersten 7 Tage dreimal immunisiert. Die entnommen Blutproben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten hinsichtlich ihrer zellulären Oberflächenmarker im FACS bzw. auf MKSV-spezifische Antikörper im ELISA untersucht. Am Ende des Tierversuchs wurden außerdem die Milzzellen der Mäuse im Proliferationstest getestet. 3.6.1. Charakterisierung der Leukozyten aus peripherem Mäuseblut mittels Durchflußzytometrie nach Immunisierung mit BacMam Viren An den Tagen 0, 3, 7, 14 und 21 nach der ersten Immunisierung wurden jeweils drei Mäusen pro Versuchsgruppe Blut entnommen und die Blutzellen hinsichtlich ihrer Oberflächenmoleküle analysiert. Die eingesetzten Antikörper richteten sich gegen die Oberflächenmarker CD4, CD25, CD8, B220, MHC II und CD11b. 95 Ergebnisse BacMam/ P1-2A3C BacMam/ P1-2A PBS+ BacMam 30 CD4 (%) 20 10 0 0 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 0 3 7 14 21 20 25 15 20 0 3 7 14 21 25 0 3 7 14 21 25 0 3 7 14 21 Zeit in d CD25 von CD4 (%) 20 15 10 5 0 0 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 0 3 7 14 21 Zeit in d 25 CD8 (%) 20 15 10 5 0 0 0 3 7 14 21 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 20 Zeit in d Abb. 27: Messung der T-Zellpopulation im peripheren Blut immunisierter Mäuse. Die gewaschenen Blutzellen der Versuchstiere, die mit BacMam/P1-2A (♦), BacMam/P1-2A3C (▲) oder BacMam (■) immunisiert worden waren sowie die PBS-Kontrollgruppe (ο), wurden mit PE-markiertem α-CD4, Biotingekoppelten α-CD25 bzw. FITC-markiertem α-CD8 Antikörper inkubiert. Der Nachweis von gebundenem Biotin erfolgte mit FITC-markiertem Streptavidin. Markierte Zellen wurden im Durchflußzytometer analysiert. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der jeweiligen Zellen am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach der ersten Immunisierung. 96 Ergebnisse Die Untersuchung der T-Zellpopulationen der vier Versuchsgruppen zeigte, dass der Anteil an CD4-positiven T-Helferzellen im Blut über den beobachteten Zeitraum von 21 Tagen nahezu konstant bei 15 bis 20 % lag (Abb. 27, oben). Lediglich zwischen Tag 3 und 7 kam es in allen Gruppen zu einem leichten Anstieg der CD4-positiven T-Lymphozyten. Weiterhin wurde der Anteil an CD4/CD25-positiven T-Lymphozyten bestimmt (Abb. 27, Mitte). Bei diesen Zellen handelt es sich um eine Untergruppe von regulatorischen T-Zellen. CD25 besteht aus der αKette des IL-2 Rezeptors und ist ein früher Aktivierungmarker innerhalb der zellulären Immunantwort (Toda et al., 2006). Bereits nach der ersten Applikation am Tag 0 wurde in allen Gruppen ein Anstieg der CD4/CD25-positiven Zellen von ca. 7 % auf 12 % beobachtet. Im Blut der Tiere, die mit BacMam immunisiert worden waren, konnte eine Steigerung des Wertes auf fast 15 % gemessen werden. In dieser Gruppe fiel der Wert bis zum Tag 7 wieder stark ab und blieb bis zum Tag 21 deutlich unter 10 %. In den Gruppen, welche mit BacMam/P1-2A oder BacMam/P1-2A3C immunisiert wurden waren sowie in der PBS+ Kontrollgruppe, nahm der Anteil an CD4/CD25-positiven T-Zellen wesentlich langsamer ab. Am Tag 21 lagen die Werte in diesen drei Gruppen noch etwas höher als der Anfangswert. Da die beobachteten Veränderungen bei den CD25/CD4-positiven T-Zellen alle Gruppen betrafen, dürften sie auf eine generelle Reaktion der Mäuse auf die Injektion zurückzuführen sein. Ein Zusammenhang mit der Expression der MKSV-Proteine besteht offensichtlich nicht. Eine Erhöhung der zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die über den Oberflächenmarker CD8 definiert werden, wurde zwischen Tag 3 und 7 festgestellt (Abb. 27, unten). Die Werte stiegen von durchschnittlich 10 % auf über 15 %. In den Gruppen, welche die Viren BacMam/P1-2A und BacMam erhalten hatten, stieg der Anteil an CD8-positiven Zellen bis zum Tag 14 sogar noch etwas höher. Da auch hier der Anstieg alle Gruppen betraf, konnte nicht von einem spezifischen Anstieg der CTLs nach Immunisierung mit BacMam Viren ausgegangen werden. Bis zum Tag 21 gingen die Werte leicht zurück und lagen außer bei den PBS-Kontrolltieren nur unwesentlich höher als die Anfangswerte. Die Charakterisierung der B-Lymphozyten im peripheren Blut der Versuchstiere erfolgte über die Oberflächenantigene B220 und MHC Klasse II Moleküle (Abb. 28). B-Zellen unterscheiden sich von anderen MHC II-positiven Zellen wie Makrophagen und Monozyten durch das Fehlen des Oberflächenmarkers CD11b. Der Anteil der B220-positiven Zellen im Blut lag in den Gruppen, die mit BacMam/P1-2A bzw. BacMam/P1-2A3C immunisiert worden waren, über den gesamten Zeitraum konstant bei 40 %. In den beiden anderen Gruppen sank der Anteil an B-Zellen bis zur letzten Messung am Tag 21 leicht ab. 97 Ergebnisse BacMam/ P1-2A BacMam/ P1-2A3C PBS+ BacMam 60 50 B220 (%) 40 30 20 10 0 0 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 0 3 7 14 21 20 0 3 7 14 21 25 Zeit in d MHC II +, CD11b - (%) 50 40 30 20 10 0 0 0 3 7 14 21 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 0 3 7 14 21 20 25 Zeit in d Abb. 28: Verlust von MHC Klasse II Molekülen auf der Oberfläche von B-Lymphozyten im peripheren Blut immunisierter Mäuse. Die Lymphozyten der Gruppen BacMam/P1-2A (♦), BacMam/P1-2A3C (▲), BacMam (■) sowie der PBS-Kontrollgruppe (ο) wurden zur Selektion von B-Lymphozyten mit Biotingekoppelten α-B220 Antikörper inkubiert. Der Nachweis von gebundenem Biotin erfolgte mit PE-markiertem Streptavidin. Zur Detektion von MHC II Molekülen wurden der FITC-markierte α- I-Ab Antikörper verwendet. Markierte Zellen wurden im Durchflußzytometer analysiert. Dargestellt ist der prozentuale Anteil (Mittelwerte mit Standardabweichungen) der charakterisierten Zellen am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach Erstapplikation. Bei der Messung der MHC Klasse II-positiven B-Zellen ergab sich in allen vier Gruppen nach der ersten Applikation ein starker Abfall dieser Zellen (Abb. 28, unten). Während in den drei BacMam Gruppen die Werte von 45 % deutlich auf unter 30 % fielen, war der Abfall an MHC Klasse II-positiven Zellen in der PBS-Kontrollgruppe etwas schwächer. Hier blieb der Mittelwert bei über 30 % und stieg zwischen Tag 7 und 14 auch wieder an. In den anderen drei Gruppen war dagegen nur ein leichter Anstieg an MHC II-positiven B-Lymphozyten festzustellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in den mit BacMam Viren 98 Ergebnisse immunisierten Tieren über den beobachteten Zeitraum etwa ein Drittel der B-Lymphozyten ihre MHC Klasse II Moleküle verlieren. Weiterhin wurde der Anteil an CD11b-positiven Granulozyten und Makrophagen bestimmt (Abb. 29). Echte Makrophagen besitzen als Antigen-präsentierende Zellen neben dem CD11b Antigen außerdem MHC Klasse II Moleküle. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl der Anteil an Granulozyten als auch an echten Makrophagen im peripheren Blut über den Zeitraum von 21 Tagen im Rahmen der biologischen Schwankungen konstant blieb. BacMam/ P1-2A BacMam/ P1-2A3C PBS+ BacMam MHC II -, CD11b + (%) 40 30 20 10 0 0 5 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 0 3 7 14 21 20 25 0 3 7 14 21 Zeit in d MHC II +, CD11b + (%) 10 8 6 4 2 0 0 5 0 3 7 14 21 0 3 7 14 21 10 0 3 7 14 21 15 0 3 7 14 21 20 25 Zeit in d Abb. 29: Messung des Anteils an Phagozyten im Blut immunisierter Mäuse. Die Blutzellen der Gruppen BacMam/P1-2A (♦), BacMam/P1-2A3C (▲), BacMam (■) sowie die PBS-Kontrollgruppe (ο) wurden mit FITC-markierte α-I-Ab Antikörper sowie mit Biotin-gekoppelten α-CD11b Antikörper inkubiert. Der Nachweis von gebundenem Biotin erfolgte mit PE-markiertem Streptavidin. Markierte Zellen wurden im Durchflußzytometer analysiert. Dargestellt ist der prozentuale Anteil (Mittelwerte mit Standardabweichungen) der charakterisierten Zellen am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach Erstapplikation. 99 Ergebnisse 3.6.2. Bildung MKSV-spezifischer Antikörper in immunisierten Mäusen Der Nachweis von MKSV-spezifischen IgG Antikörpern im Serum von immunisierten C57 BL/6 Mäusen wurde an den Tagen 7, 14, 21 und 38 nach der ersten Immunisierung durchgeführt. Die aufgearbeiteten Seren wurden dazu in einer 1:80 Verdünnung im indirekten ELISA getestet. 2,5 OD 495nm 2 1,5 1 0,5 0 0 7 14 21 28 35 42 Zeit in d Abb. 30: Nachweis von MKSV-spezifischen IgG Antikörpern nach Immunisierung mit rekombinanten Baculoviren. BL/6 Mäuse wurde dreimal innerhalb der ersten 7 Tage je 2 x 107 TCID50 BacMam/P1-2A (♦), BacMam/P1-2A3C (▲), BacMam (■) bzw. PBS+ (ο) i.m. appliziert. An den Tagen 0, 7, 14, 21 und 38 nach Erstimmunisierung wurden die entnommenen Seren im ELISA getestet. Dargestellt sind die Mittelwerte der Gruppen mit Standardabweichung. 14 Tage nach der ersten Immunisierung wurde in der Seren der mit BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C immunisierten Mäuse die Bildung MKSV-spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Menge der Antikörper in diesen beiden Gruppen stieg innerhalb einer Woche an. Allerdings war der Anstieg in der mit BacMam/P1-2A3C immunisierten Gruppe deutlich stärker. Am Tag 21 war der durchschnittliche OD-Wert dieser Gruppe doppelt so hoch wie der der BacMam/P1-2A Gruppe. Bis zu Tag 38 blieb der MKSV-spezifische Antikörperspiegel im Serum der Tiere nahezu konstant. Erwartungsgemäß wurden keine spezifischen Antikörper in den anderen beiden Tiergruppen nachgewiesen. Die gemessenen OD-Werte der mit BacMam Viren und PBS+ inokulierten Mäuse lagen unterhalb des spezifischen Messbereichs. 100 Ergebnisse 3.6.3. Überprüfung der Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern Mit Hilfe des Virusneutralisationstests (VNT) wurden die MKSV-spezifischen Antikörper hinsichtlich ihrer neutralisierenden Eigenschaften überprüft. Da die Serumvolumina der Zwischenblutungen zu gering waren, konnten lediglich die Seren der Endblutung vom Tag 69 im VNT eingesetzt werden. Das Ergebnis zeigte, dass zu diesem Zeitpunkt in keinem der Mäuseseren MKSV-neutralisierende Antikörper nachgewiesen werden konnten. Die mitgeführte Positivkontrolle (Hyperimmunserum) hatte einen log10 VN Titer von 3,1. 3.6.4. Restimulation von Milzzellen immunisierter Mäuse Um die Proliferation von Lymphozyten, die sich gegen MKSV- Strukturproteine richten, zu untersuchen, wurden mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) - markierte Milzzellen in vitro restimuliert. Der Farbstoff CFSE verteilt sich nach Aufnahme in die Zellen und Spaltung durch Esterase gleichmäßig im Zytoplasma und wird bei der Mitose in gleichen Teilen an die Tochterzelle weitergegeben. Somit ließ sich anhand der Abnahme der Fluoreszenzintensität der Zellen auf die stattgefundenen Zellteilungen schließen. Von jeweils 3 Mäusen pro Gruppe wurden nach der Euthanasie der Tiere am Tag 69 nach Erstimmunisierung die Milzen entnommen und daraus Einzelzellsuspensionen hergestellt. Anschließend wurden die Milzzellen mit CFSE markiert und mit Antigen restimuliert bzw. nicht restimulierte Negativkontrollen mitgeführt. Als MKSV-spezifisches Antigen wurde ein 1:1 Gemisch aus gereinigten P1-2A und VP2 Protein verwendet, welche für die Herstellung der polyklonalen Kaninchenseren hergestellt worden war (siehe 3.2.3.). Zunächst wurde die für die Restimulierung benötigte Antigenkonzentration bestimmt. Die Auswertung am Durchflußzytometer ergab, dass 7,5 µg/ml des Proteingemischs optimal für den Proliferationstest waren. Bei einer Konzentration von 10 µg/ml Antigen waren sehr viele Zellen tot, bei niedrigeren Antigenkonzentrationen sank die Anzahl proliferierender Lymphozyten stark ab (Daten nicht gezeigt). 101 Ergebnisse Proliferation (%) 35 30 25 20 15 10 5 0 BacMam/P1-2A BacMam/P1-2A3C BacMam PBS+ Abb. 31: Nachweis der spezifischen Proliferation von Milzzellen nach Restimulation. Jeweils 2 x 106 Milzzellen wurden mit CFSE gefärbt, naiv belassen (weiß) oder mit 7,5 µg/ml Antigen restimuliert (grau). Nach 5 Tagen Inkubation wurden die Zellen im Durchflußzytometer analysiert. Die Proliferationsmessungen zeigten, dass mehr als 25 % der markierten Milzzellen der Mäuse, welche mit BacMam/P1-2A bzw. BacMam/P1-2A3C immunisiert worden waren, nach Antigenzugabe sich mindestens einmal geteilt haben. Interessanterweise wurden in den nicht restimulierten Negativkontrollen der beiden Gruppen ebenfalls proliferierende Zellen nachgewiesen. Die Proliferationsrate lag hier bei 10 %. Bei den Proben der mit BacMam immunisierten Mäuse sowie bei den Tieren der PBS Kontrollgruppe fand nach Restimulation lediglich bei 2 bis 3 % der Zellen eine Teilung stattfand. Bei den ruhenden Zellen lag der prozentuale Anteil an sich teilenden Zellen ebenfalls bei ca. 3 %. 3.6.4.1. Differenzierung der proliferierenden Lymphozyten Die CFSE-markierten Milzzellen der Mäuse (siehe 3.6.4.), die mit BacMam/P1-2A bzw. BacMam/P1-2A3C immunisiert worden waren, wurden hinsichtlich ihrer Oberflächenantigene in T- bzw. B- Lymphozyten differenziert. Dazu wurden die untersuchten Milzzellen der Tiere pro Gruppe vereinigt und anschließend wieder in drei gleiche Teile getrennt. Das Ergebnis der durchflusszytometrischen Messung zeigte, dass 6,3 % der CD4positiven T-Lymphozyten in der Gruppe BacMam/P1-2A sowie 3,1 % der CD4-positiven Zellen bei der Gruppe BacMam/P1-2A3C nach Restimulation proliferierten. Die Kontrollwerte lagen bei 3,0 % (BacMam/P1-2A) und 1,8 % (BacMam/P1-2A3C). Somit konnte etwa eine Verdopplung der Anteile an CD4-positiven T-Zellen nach Restimulation im Gegensatz zu den ruhenden Zellen in beiden Gruppen festgestellt werden (Abb. 32). 102 Ergebnisse ohne Antigen BacMam/P1-2A mit Antigen 3,0 % BacMam/P1-2A3C CD4 CD4 6,3 % 3,1 % CD4 CD4 1,8 % Abb. 32: Proliferation CD4-positiver Milzzellen nach Stimulation mit MKSV Antigen. Ein Drittel der gepoolten CFSE-markierten Zellen wurde mit PE-markiertem Ziege anti-Maus CD4 Antikörpern inkubiert. Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer. Die Prozentwerte in den Punktdiagrammen geben den Anteil proliferierender CD4-positiver T-Lymphozyten an. Es wurden Zellen mit einer Fluoreszenzintensität von > 103 berücksichtigt. Ein ähnliches Bild ergab sich bei der Charakterisierung der CD8-positiven CTLs (Abb. 33). In der Gruppe BacMam/P1-2A hatten sich 14,3 % der CD8-positiven T-Zellen nach Restimulation mindestens einmal geteilt. Für die mit BacMam/P1-2A3C immunisierten Tiere lag der Anteil der proliferierenden Zellen nach Inkubation mit dem Antigengemisch bei 10,7 %. Auch bei den CTLs kam es durch die Restimulation zu einem Anstieg der sich teilenden Zellen von über 100 % im Vergleich zu den nicht stimulierten Zellen. Der Proliferationsanteil bei den ruhenden Zellen lag mit ca. 5 % etwas über dem unspezifischen Bereich. 103 Ergebnisse mit Antigen ohne Antigen BacMam/P1-2A 14,3 % BacMam/P1-2A3C CD8 CD8 5,1 % 5,2 % CD8 CD8 10,7 % Abb. 33: Proliferation CD8-positiver Milzzellen nach Stimulation mit MKSV Antigen. Ein Drittel der gepoolten CFSE-markierten Zellen wurde mit einem Ratte-anti-Maus CD8 Antikörper inkubiert und gebundene Antikörper mittel PE-markierten Esel anti-Ratte IgG detektiert. Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer. Die Prozentwerte in den Punktdiagrammen geben den Anteil proliferierender CD8positiver T-Lymphozyten an. Es wurden Zellen mit einer Fluoreszenzintensität von > 102 berücksichtigt. ohne Antigen BacMam/P1-2A mit Antigen 10,8 % BacMam/P1-2A3C B220 B220 21,0 % 24,0 % B220 B220 10,3 % Abb. 34: Proliferation B220-positiver Milzzellen nach Stimulation mit MKSV Antigen. Ein Drittel der gepoolten CFSE-markierten Zellen wurde mit Biotin-gekoppelten Ziege anti-Maus B220 Antikörpern und PEkonjugiertes Streptavidin inkubiert. Die Auswertung erfolgte im Durchflußzytometer. Die Prozentwerte in den Punktdiagrammen geben den Anteil proliferierender B220-positiver B-Lymphozyten an. Es wurden Zellen mit einer Fluoreszenzintensität von > 102 berücksichtigt. 104 Ergebnisse Der für die Identifizierung von B-Lymphozyten eingesetzte α-B220 Antikörper markierte 10,8 % der ruhenden und 21,0 % der stimulierten Zellen in der Gruppe BacMam/P1-2A. Bei der Gruppe BacMam/P1-2A3C wurde ein Anteil an proliferierenden Zellen von 10,3 % ohne Stimulation und von 24 % nach Restimulation gemessen. Dies bedeutet, dass auch bei den BZellen ein Anstieg der Zellteilungen nach Antigenzugabe ca. um den Faktor 2 stattfand (Abb. 34). Die Proliferationsraten der nicht stimulierten B-Zellen in den beiden Gruppen lagen deutlich über dem unspezifischen Bereich von ca. 3 %. Die erhöhten Messwerte der ruhenden B-Zellen deckten sich mit den ebenfalls erhöhten Werten der nicht stimulierten Milzzellen bei den Gruppen BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C in 3.6.4.. Die Ergebnisse des Tierversuchs zeigen, dass die Immunisierung der C57/BL6 Mäuse mit den rekombinanten BacMam Viren zu einer spezifischen Immunantwort führte. Der Nachweis von MKSV-spezifischen Antikörpern im ELISA, die verstärkte Differenzierung von BLymphozyten hin zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen nach der Immunisierung sowie die Detektion von proliferierenden B-Zellen nach Restimulation der Milzzellen mit MKSVspezifischen Antigen deuten darauf hin, dass vor allem das humorale Immunsystem aktivierte wurde. Darüber hinaus konnte auch eine zellvermittelte Immunantwort nachgewiesen werden, da nach Restimulation der Milzzellen auch eine Proliferation der T-Zellen festgestellt wurde. Somit konnte gezeigt werden, dass die Immunisierung mit rekombinanten BacMam Viren sowohl zu einer spezifischen humoralen als auch zu einer spezifischen zellulären Immunantwort in den Versuchstieren führte. 105 Diskussion 4. DISKUSSION MKS ist eine hochinfektiöse Erkrankung bei Paarhufern, die hohe wirtschaftliche Schäden verursacht. Obwohl die Möglichkeit einer Immunisierung von Nutztieren mit chemisch inaktiviertem Vollvirus besteht, wird in vielen Ländern, darunter auch in der EU, von einer prophylaktischen Impfung abgesehen. Ursache dafür sind strikte Exportverbote für MKSVseropositive Tiere in MKS-freie Länder. Aufgrund dieser unbefriedigenden Situation bei der Verwendung der klassischen Impfstoffe werden seit Jahren alternative Vakzinierungsmöglichkeiten erforscht, da die Gefahr einer Verschleppung der Seuche in MKS-freie Gebiete jederzeit besteht. Abgeleitet von natürlich vorkommenden RNA-freien MKSV-Partikeln, auch leere Kapside genannt, wird an der Entwicklung rekombinanter Markerimpfstoffe gearbeitet, die auf der Expression der Bereiche des MKSV-Genoms basieren, die für das Vorläuferprotein P1-2A und für die viruseigene Protease 3CPro kodieren (Mason et al., 2003a; Grubman, 2005). Es wurde bereits gezeigt, dass eine Immunisierung von Schweinen durch die heterologe Expression des ORF P1-2A3C, welcher für ein Fusionsprotein aus P1-2A und 3CPro kodiert, möglich ist und die Tiere im anschließenden Belastungsversuch partiell oder komplett gegen MKSV geschützt waren. Es wurden sowohl DNA-Vakzinen in Form von Plasmid-DNA (Chinsangaram et al., 1998; Cedillo-Barron et al., 2001) als auch rekombinante Adenoviren eingesetzt (Mayr et al., 1999; Mayr et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit sollte die Eignung von BHV-1 und Baculovirus als alternative virale Vektoren für die Expression von MKSV-Proteinen und damit deren Potential für die Entwicklung von Markerimpfstoffen gegen MKS untersucht werden. Für die heterologe Expression wurden die von der MKSV cDNA abgeleiteten ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C ausgewählt. Für den Einsatz von MKSV-Impfstoffen sind Diagnostiksysteme zur sicheren Differenzierung zwischen geimpften und mit Feldviren infizierten Tieren zwingend erforderlich. Bei einer MKSV-Infektion wird die Bildung von Antikörpern sowohl gegen Epitope der Strukturproteine als auch gegen NSPs induziert (Clavijo et al., 2004). Dagegen werden nach Immunisierung mit zugelassenen Impfstoffen, bei denen nach intensiver Reinigung das Vorhandensein von NSPs ausgeschlossen wird, lediglich Antikörper gegen die Strukturproteine gebildet. Ebenso sollte es bei bei der Verwendung zukünftiger Markervakzinen, die auf der Expression des ORF P1-2A bzw. P1-2A3C beruhen, nur zur Induktion von Antikörper gegen die Strukturproteine und bei letzteren auch gegen 3CPro kommen. Der Nachweis von Antikörpern gegen MKSV-NSP ist daher geeignet, um zwischen 106 Diskussion geimpften und infizierten Tieren zu unterscheiden. Dafür stehen bereits kommerzielle ELISA`s, z.B. von Cedi Diagnostic, zur Verfügung. Deren Anschaffung ist allerdings sehr kostenintensiv. Daher sollte am FLI ein ähnliches Nachweissystem basierend auf indirekten ELISA´s zur Detektion von Antikörpern gegen MKSV-NSP aus Serumproben etabliert werden. Dafür wurden die Proteine 3A, 3B, 3ABCmut und 3DPol verwendet, die äußerst immunogen sind (Berger et al., 1990; MacKay et al., 1998; Sorensen et al., 1998; Clavijo et al., 2006). Der Nachweis von Antikörpern mittels des Fusionsproteins 3ABCmut ist allerdings für die Diagnostik bei Seren von Tieren, die mit Markervakzinen immunisiert worden waren, welche P1-2A3C enthalten, ungeeignet, da nach Expression des ORF P1-2A3C auch Antikörper gegen 3CPro gebildet werden. Ein auf 3ABCmut basierender ELISA wäre deshalb eher zur Identifizierung von Carrier-Tieren geeignet. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologischen Voraussetzungen zur Etablierung der NSP-ELISAs erarbeitet. Dazu wurden rekombinante Baculoviren, die die NSPs 3A, 3B, 3ABCmut und 3DPol in infizierten Insektenzellen exprimieren, isoliert. Die NSPs waren zur affinitätschromatographischen Reinigung jeweils mit einem RGS-6His-Tag versehen. Das baculovirale System wurde der Expression in Bakterien vorgezogen, um das Auftreten unlöslicher Einschlusskörper (inclusion bodies), die bei der Überexpression von Proteinen in Bakterien auftreten können (Makrides, 1996), zu vermeiden. Die Arbeiten zur Reinigung der NSPs sowie deren Verwendung zur Etablierung und Validierung von NSP-ELISAs wurden unter Verwendung der rekombinanten Viren von Naveen Kumar im Rahmen seiner Dissertation fortgeführt (Kumar, 2006). Die zur Charakterisierung der Expression und Prozessierung der Strukturproteine verwendeten α-P1-2A und α-VP2 Seren wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit den Proteinen P1-2A_RGS-6His und VP2_RGS-6His erhalten. Diese Proteine wurden ebenfalls durch rekombinante Baculoviren in infizierten Insektenzellen exprimiert und waren für die Reinigung über Nickel-Agarose carboxyterminal mit RGS-6His getaggt. Das Protein P1-2A_RGS-6His war allerdings auch unter stark denaturierenden Bedingungen nicht löslich und musste daher nach elektrophoretischer Auftrennung aus SDS-Polyacrylamidgelen isoliert werden. Bei der Reinigung des VP2_RGS-6His Proteins mittels Affinitätschromatographie eluierten neben dem gewünschten Protein weitere Proteine mit höherem Molekulargewicht. Diese traten bei den Reinigungen anderer mit RGS-6His getaggter Proteine nicht auf und dürften daher keine an Nickel-Agarose bindenden Proteine aus infizierten Zellen sein. 107 Diskussion Antikörper, die in den immunisierten Kaninchen gegen die kontaminierenden Proteine gegebenenfalls induziert wurden, reagierten allerdings in der Immunfluoreszenz nicht mit Proteinen aus Säugerzellen. Die Seren α-P1-2A und α-VP2 reagierten beide positiv in der IIF mit transient transfizierten COS-7 Zellen, die die ORFs P1-2A und P1-2A3C exprimierten. Die beobachteten morphologischen Veränderungen bei den mit pcDNA_P1-2A3C transfizierten COS-7 Zellen sind dabei mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die Expression der 3CPro zurückzuführen, da 3CPro auch zellulärer Proteine, wie eIF4A und Histon H3, spaltet und folglich die zelluläre Proteinexpression beeinflussen kann (Falk et al., 1990; Tesar et al., 1990; Belsham et al., 2000). Um zu klären, ob die exprimierte 3CPro die Prozessierung des Vorläuferproteins P1-2A bewirkt, wurden transient transfizierte Zellen in der Western Blot Analyse eingesetzt. Mit dem α-VP2 Serum wurde das 88 kDa große P1-2A Protein nachgewiesen, aus dem bei der Anwesenheit der 3CPro in cis und trans das VP0 Protein entstand. Das plasmidkodierte VP0 wies dabei das gleiche Molekulargewicht auf wie VP0 aus MKSV-infizierten Zellen. Dies weist darauf hin, dass das transient exprimierte P1-2A korrekt prozessiert wird. Dass 3CPro sowohl intra- als auch intermolekular spaltet, ist in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von Ryan et al. (1991). In den infizierten Zellen wurde auch VP2 detektiert, da nur hier die Spaltung von VP0 in VP2 und VP4 beim Verpacken der genomischen VirusRNA stattfand (Curry et al., 1997). Das α-P1-2A Serum reagierte lediglich mit dem ungespaltenen Vorläuferprotein P1-2A. Spaltprodukte des plasmidkodierten Vorläuferproteins und aus MKSV-infizierter Zellkultur konnten mit diesem Serum nicht nachgewiesen werden. Möglicherweise sind die Epitope der einzelnen Strukturkomponenten VP1, VP3, VP2 und VP4 bzw. VP0 in P1-2A maskiert und treten erst nach der Prozessierung von P1-2A durch 3CPro hervor. Dies würde erklären, warum α-P1-2A nur das ungespaltene Protein P1-2A erkennt. In der Literatur gibt es widersprüchliche Aussagen darüber, ob das Vorläuferprotein P1-2A zu einer Induktion von Antikörpern führt oder nicht (Saiz et al., 1994; Taboga et al., 1997; Mateu et al., 1998; Sanz-Parra et al., 1999a). Auch kann es während der präparativen Reinigung des unlöslichen Proteins P1-2A_RGS-6His zu Proteinkonformation und zur Zerstörung von Epitopen gekommen sein. 108 Änderungen der Diskussion BHV-1, dessen Eignung als viraler Vektor mehrfach dokumentiert ist (Kühnle et al., 1996; Kweon et al., 1999; König et al., 2003; Höhle et al., 2005), wurde für die heterologe Expression von MKSV-Kapsidproteinen mit dem Ziel der Generierung einer Doppelvakzine gegen BHV-1- und MKSV-Infektionen eingesetzt. Der in dieser Arbeit verwendete Stamm BHV-1/80-221 wurde ausgewählt, da hier eine Integration fremder Sequenzen mit der Komplettierung des Gens für das essentielle Glykoprotein gD assoziiert ist (Kühnle et al., 1996). Im Stamm BHV-1/80-221 wurde das Gen für gD durch das lacZ Gen ersetzt. Dieses BHV-1 Virus kann demzufolge nur auf gD komplementierenden Zellen replizieren. Erfolgt eine Integration des gD Gens zusammen mit dem heterologen Gen, so kann diese rekombinante Virusnachkommenschaft wieder auf nicht komplementierenden Zellen wachsen. Somit besteht eine Selektion auf infektiöse Viren, die es ermöglicht, die rekombinante Nachkommenschaft auch nach nur einem Rekombinationsereignis zu isolieren. Die Versuche, BHV-1 Rekombinanten, die die ORFs P1-2A, P1-2A3C oder 3C exprimierten, zu erhalten, ergaben, dass nur BHV-1/P1-2A im ersten Kotransfektionsversuch isoliert wurde. Auch nach einer Vielzahl von Kotransfektionen konnten keine P1-2A3C exprimierenden Viren generiert werden. Auch die Isolierung einer Rekombinanten mit dem 3C Gen war zunächst nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass die Expression von 3CPro nicht mit der produktiven Vermehrung von BHV-1 kompatibel sein könnte. Diese Annahme wurde durch die problemlose Generierung der Rekombinante BHV-1/3Cmut bestätigt. In 3Cmut wurde durch eine gezielte Punktmutation das Kodon für das Cystein, das an der Bildung des aktiven Zentrums der Protease 3CPro beteiligt ist, geändert. Dies führte zur Expression einer proteolytisch inaktiven Form der 3CPro (Grubman et al., 1995). Die Analysen der Eigenschaften von BHV-1/3Cmut in Zellkultur ergaben, dass sowohl die intrazelluläre Vermehrung als auch die Virusfreisetzung nahezu identisch mit BHV-1 Schönböken waren. Die Größen der von BHV-1/3Cmut induzierten Plaques waren lediglich um ca. 13 % kleiner als BHV-1 Schönböken Plaques. Diese Ergebnisse zeigen, dass die proteolytische Aktivität von 3CPro und nicht die Nukleotidsequenz des ORF 3C oder die Expression des Proteins an sich mit der Replikation von BHV-1 interferiert. Die von BHV-1/P1-2A induzierten Plaques erreichten nur ca. 35 % der Größe der BHV-1 Schönböken Plaques. Diese Hemmung in der Zell-zu-Zellausbreitung ist nicht auf eine verminderte Virusproduktion zurückzuführen, da die Wachstumskinetiken zeigten, dass die maximalen intrazellulären Virustiter mit denen in BHV-1 Schönböken und BHV-1/3Cmut infizierten Zellen vergleichbar waren. Die 109 Diskussion Wachstumskinetiken zeigten auch, dass die Titer freigesetzter Viren von BHV-1/P1-2A zu keinem Zeitpunkt höher waren als die intrazellulären Titer. Dagegen waren bei BHV-1 Schönböken und BHV-1/3Cmut bereits 20 h p.i. die intrazellulären Virustiter geringer als die jeweiligen extrazellulären Titer. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Akkumulation des Proteins P1-2A in den Zellen die Virusfreisetzung der Rekombinante BHV-1/P1-2A beeinträchtigt. Nach Reduktion der Menge des in der Kotransfektion mit BHV-1/80-221 DNA eingesetzten Plasmides pROMI_3C wurde überraschenderweise die Rekombinante BHV-1/3C isoliert, die bezüglich Wachstumseigenschaften und direkter Ausbreitung von Zelle zu Zelle vergleichbar war mit BHV-1 Schönböken. Die Sequenzierung des in BHV-1/3C enthaltenen ORF 3C ergab, dass dieser zwei Punktmutationen enthielt, die zum Austausch von Glycin und Phenylalanin an Position 38 bzw. 48 jeweils hin zu Serin führte. Obwohl letztendlich nicht ausgeschlossen werden kann, dass diese Mutationen bereits in der zur Kotransfektion verwendeten Plasmidpräparation vorhanden waren - die Sequenzierung des Plasmides ergab dafür aber keine Hinweise - dürften diese Änderungen im Laufe der Entstehung bzw. der Plaquereinigung von BHV-1/3C entstanden sein und für die Vermehrung der Rekombinante einen Vorteil gegenüber der Expression der unveränderten 3CPro bewirken. Eine derartige „Evolution in Zellkultur“ von BHV-1 ist bereits früher beobachtet worden (Schröder et al., 1997; Schröder et al., 1999). Im Fall von BHV-1 ist der Vorteil mit großer Wahrscheinlichkeit auf die stark verminderte proteolytische Aktivität des ORF 3CBHV-1 zurückzuführen. Die reduzierte Proteaseaktivität wurde durch die Koexpression des ORF 3CBHV-1 mit P1-2A im Vergleich zur Koexpression von P1-2A mit 3CPro festgestellt. Welchen Beitrag die einzelnen Aminosäureaustausche zur Herabsetzung der Proteaseaktivität der 3CPro leisten, ist auch anhand der seit 2005 bekannten Kristallstruktur der 3CPro (Birtley et al., 2005) nicht eindeutig ersichtlich. Das hydrophobe Phenylalanin an Position 48 liegt im Molekül nahe dem Histidin, das Bestandteil des aktiven Zentrums der Protease ist. Das anstatt von Phenylalanin eingebaute Serin könnte somit die Konformation des Zentrums und damit auch die proteolytische Aktivität der Protease beeinflussen. Im Strukturmodell der 3CPro liegt das Glycin, das in BHV-1/3C gegen Serin ausgetauscht wurde, im äußeren Bereich des Proteins. Die Lage des Austausches und die Tatsache, dass die biochemischen Eigenschaften der Seitenketten der beiden Aminosäuren ähnlich sind, lassen eine Beeinträchtigung der 110 Diskussion Proteaseaktivität recht unwahrscheinlich erscheinen. Sie kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich BHV-1 nicht für die Expression der MKSVProtease 3CPro, welche für die Prozessierung von P1-2A benötigt wird, eignet. In der Literatur sind allerdings mehrere Beispiele bekannt, bei denen virale Proteasen anderer Picornaviren, die für die Prozessierung der Kapsidproteine verantwortlich sind, erfolgreich durch DNAViren exprimiert werden konnten. Die für die Strukturproteine kodierenden P1-Regionen des Hepatitis A Virus bzw. des Poliovirus wurden zusammen mit der jeweiligen viralen Protease 3C bzw. 3C3D in rekombinanten Vaccinia Viren exprimiert, was zur Produktion leerer Viruspartikel dieser Picornaviren führte (Winokur et al., 1991; Ansardi et al., 1991). Dagegen erfolgte die Expression des ORF P1-2A3C aus MKSV in rekombinanten Vaccinia Viren nur, nachdem das Konstrukt unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors stand. Eine konstitutive Expression war ebenfalls nicht möglich (Abrams et al., 1995). Im zweiten Teil der Arbeit wurden rekombinante MamBac Viren, die die ORFs P1-2A, P12A3C und 3C exprimieren, hergestellt. Da nun die Expression dieser ORFs unter der Kontrolle des MCMVie Promotors standen, sollte der potentiell zytotoxische Effekt der 3CPro bei der Herstellung und Anzucht der rekombinanten BacMam Viren in Insektenzellen umgangen werden. Im Gegensatz zu Säugerzellen ist der MCMVie Promotor in Insektenzellen nur sehr schwach aktiv und die Expressionsrate der MKSV-Proteine, so auch von 3CPro, sollte nur sehr gering sein. Diese geringe Expressionsrate der 3CPro schien dennoch ausreichend, um die Infektionsverläufe der Viren BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C leicht zu beeinflussen, wie die Ausbreitung drei Tage nach der Transfektion sowie die Wachstumskinetiken zeigten, bei denen die Endtiter von BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C im Vergleich zu BacMam/P1-2A und BacMam/GFP um den Faktor 10 reduziert waren. Nach Transduktion von KOP-R Zellen mit BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C wurde die Expression der MKSV-Proteine mittels Western Blot Analysen nachgewiesen. Dabei wurde bei Anwesenheit der 3CPro eine korrekte Spaltung von P1-2A in die Proteine VP0-VP3 und VP0 gezeigt, allerdings fand keine Neusynthese und Prozessierung von P1-2A ab einem Zeitpunkt von 11 h nach Beginn der Inkubation bei 37°C mehr statt. Währenddessen nahm die Expression des ungespaltenen Vorläuferproteins P1-2A nach Transduktion mit BacMam/P1-2A weiterhin zu. Die Ursache des Abbruchs der Neusynthese der MKSV111 Diskussion Proteine in mit BacMam/P1-2A3C transduzierten Zellen konnte anhand des Vitalitätstests geklärt werden. Dieser zeigte, dass die Expression des ORF P1-2A3C zu einer starken Schädigung der Zellen führte, sodass 12 h nach Transduktion schon ca. 70 % der Zellen tot waren und folglich auch die Proteinsyntheserate rapide sank. Die Ursache für die zytotoxische Wirkung ist mit großer Wahrscheinlichkeit ebenfalls auf die Aktivität von 3CPro zurückzuführen. Allerdings war überraschenderweise die zytotoxische Wirkung von BacMam/3C deutlich geringer als die von BacMam/P1-2A3C. Der Anteil an toten Zellen nach Transduktion mit BacMam/3C lag nach 48 h lediglich bei ca. 50 %. Auch die intermolekulare Spaltung des baculoviral exprimierten Vorläuferproteins P1-2A durch die Rekombinante BacMam/3C war wesentlich ineffizienter als die cis-Spaltung von P1-2A durch BacMam/P1-2A3C. Die Unterschiede in der Spalteffizienz sowie in der zytotoxischen Wirkung beruhen vermutlich auf einer unterschiedlich starken Aktivität der Protease bei BacMam/P1-2A3C und BacMam/3C. Dieses Ergebnis ist überraschend, da bei der plasmidkodierten Expression von 3CPro eine nahezu identisch starke cis - bzw. trans-Spaltung des Vorläuferproteins P1-2A festgestellt wurde. Die Überprüfung des für die Protease kodierenden ORF 3C aus BacMam/P1-2A3C und aus BacMam/3C ergab allerdings keine Abweichungen zur Ausgangssequenz des Stamms A-Iran 97. Obwohl die Spaltung des durch BacMam/P1-2A3C exprimierten Vorläuferproteins nachgewiesen wurde, konnte keine Bildung von leeren MKSV-Partikeln mittels Elektronenmikroskopie dokumentiert werden. Der zeitlich versetzte Nachweis der Zwischenprodukte VP0-VP3 und VP0 im Western Blot zeigte, dass zunächst eine Abspaltung von VP1 und anschließend von VP3 aus dem Vorläuferprotein P1-2A stattfand und somit von einer kompletten Spaltung von P1-2A in VP1, VP3 und VP0 auszugehen war. Die Spaltung von VP0 zu VP2 und VP4 findet erst beim Verpacken der RNA statt und somit nicht bei der Synthese nicht-infektiöser leerer Kapside (Curry et al., 1997). Die Stabilität der Viruskapside ist sehr stark pH-Wert abhängig. Das pH-Wert Optimum ist bei 6,5 - 7,5 (Brown et al., 1961). In diesem Bereich lag auch der pH-Wert des butyrathaltigen Mediums, das bei den Transduktionen während der Inkubation bei 37°C verwendet wurde. Dies deutet zunächst nicht auf eine Beeinträchtigung des Viruszusammenbaus durch die Zellkulturbedingungen hin. Allerdings kann es möglicherweise durch die zytotoxische Wirkung von 3CPro zu einer Änderung des pH-Wertes sowie zur Inhibierung der Kapsidbildung durch aktivierte zelluläre Enzyme gekommen sein. 112 Diskussion Um die Expression der heterologen Gene in vivo zu überprüfen, wurden C57 BL/6 Mäuse mit den gereinigten Viren BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C immunisiert. Ein wesentlicher Vorteil für die Anwendung von rekombinanten BacMam Viren als virale Vektoren ist, dass die Existenz einer bereits bestehenden Immunität gegenüber Baculoviren in Vertebraten sehr unwahrscheinlich ist. Die Viren wurden intramuskulär (i.m.) appliziert. Literaturdaten verweisen darauf, dass dieser Weg bei der baculoviralen Vektorapplikation der subkutanen sowie der intranasalen Injektion vorzuziehen ist, da nach i.m. Inokulation eine wesentlich stärkere Induktion der spezifischen Immunität gegen die Fremdproteine erfolgt (Facciabene et al., 2004; Strauss et al., 2007). Die mögliche Ursache dafür könnte in der unterschiedlichen Transduktionseffizienz der Baculoviren in verschiedene Zelltypen liegen. Außerdem ist bekannt, dass Baculoviren das Komplementsystem über den klassischen Weg auch ohne das Vorhandensein von Antikörpern gegen baculovirale Proteine aktivieren und dadurch die Viren inaktiviert werden können (Hofmann et al., 1998). Möglicherweise sind die Baculoviren in der Muskulatur besser vor einer Eliminierung durch das Komplementsystem geschützt als im Blut oder in Epithelzellen. Nach dreimaliger Immunisierung der Mäuse mit BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C innerhalb einer Woche ließen sich MKSV-spezifische Antikörper 14 Tage nach der ersten Immunisierung nachweisen. Der Zeitpunkt der Ausbildung einer humoralen Immunantwort stimmt mit Literaturangaben überein, welcher sowohl bei natürlichen Infektionen als auch bei Immunisierungen ebenfalls zwischen Tag 7 und Tag 14 liegt (Mulcahy et al., 1990; McCullough et al., 1992). Auch der Verlauf des Antikörperanstiegs ist vergleichbar mit dem nach einer Immunisierung von Mäusen mit einer klassischen Vakzine (Shi et al., 2006; Shi et al., 2007). Die gemessenen Immunglobulinkonzentrationen der BacMam/P1-2A3C immunisierten Gruppe lagen zu allen Zeitpunkten deutlich höher als die Werte bei der BacMam/P1-2A imunisierten Gruppe. Dies deutet darauf hin, dass die Prozessierung der Kapsidproteine durch die Protease 3CPro zu einer gesteigerten Antikörperantwort führt. Diese These wird auch von anderen Arbeitsgruppen diskutiert. Sanz-Parra et al. verwendeten ein rekombinantes Adenovirus, das die P1 Region des Vorläuferproteins P1-2A exprimierte. Die Immunisierung von Rindern mit diesem Virus induzierte keine spezifischen Antikörper und reduzierte den Krankheitsverlauf nach einer MKS-Belastungsinfektion nur unwesentlich (Sanz-Parra et al., 1999b). Dagegen konnten mit einem anderen rekombinanten Adenovirus, das die P1-2A3C Genkassette kodiert, sowohl in Mäusen als auch in Schweinen hohe 113 Diskussion Antikörpertiter induziert werden. Die immunisierten Schweine waren partiell vor einer MKSV-Infektion geschützt (Mayr et al., 1999). Um eine bessere Einordnung der gemessenen Immunglobulinkonzentrationen nach Immunisierung mit den rekombinanten BacMam Viren vornehmen zu können, müssten die erzielten Ergebnisse mit den ELISA-Werten von Mäuseseren, die mit inaktiviertem Vollvirus immunisiert wurden, verglichen werden. Die nachgewiesen Antikörper zeigten keine neutralisierenden Eigenschaften. Das war überraschend, da sich die Epitope für neutralisierende Antikörper innerhalb der Kapsidproteine befinden. Insbesondere Bereiche des Strukturproteins VP1 sind für die Induktion der neutralisierenden Antikörper verantwortlich (Cedillo-Barron et al., 2003). Für das Vorläuferprotein P1-2A sind sowohl kontinuierliche als auch diskontinuierliche Epitope für neutralisierende Antikörper durch Verwendung der entsprechenden monoklonalen Antikörper identifiziert wurden (Strohmaier et al., 1982; Saiz et al., 1994; Brown F., 1995; Mateu, 1995). Allerdings werden oftmals im Tier nach Immunisierung mit DNA- oder Vektorvakzinen, die für P1-2A kodieren, keine oder nur geringe Titer an neutralisierenden Antikörpern induziert (Sanz-Parra et al., 1999a; Sanz-Parra et al., 1999b; Yu et al., 2006). Dagegen ist es wesentlich wahrscheinlicher, dass die Expression des ORF P1-2A3C zur Bildung neutralisierender Antikörper führt, da hier wiederum die Prozessierung sowie der Zusammenbau der Kapsidproteine von entscheidender Rolle für die Bildung der neutralisierenden Antikörper sind (Grubman, 2005). Tierexperiementelle Studien zeigen allerdings, dass hohe Titer an neutralisierenden Antikörpern nach Immunisierung mit Markervakzinen, die den ORF P1-2A3C exprimieren, erst nach mehreren Wiederholungsimpfungen erreicht werden (Chinsangaram et al., 1998; Mayr et al., 1999). Möglicherweise wären für die Induktion einer neutralisierenden Antikörperantwort weitere Immunisierungen mit den rekombinanten BacMam Viren zu späteren Zeitpunkten nötig. Die kurz aufeinander folgenden Immunisierungen innerhalb einer Woche wurden allerdings gewählt, da davon auszugehen ist, dass die Tiere auch eine Immunität gegen Baculoviren entwickeln. Damit ist es fraglich, inwieweit spätere Impfungen effektiv für eine Erhöhung der MKSV-spezifischen Immunantwort sind. Die Untersuchung des peripheren Blutes der Versuchstiere unterstützt die Beobachtung der Ausbildung einer humoralen Immunantwort. Der Anteil an B-Lymphozyten wurde in der Durchflußzytometrie über den Oberflächenmarker B220 bestimmt und blieb über den 114 Diskussion beobachteten Zeitraum konstant bzw. fiel in den Kontrollgruppen nur leicht ab. Allerdings wurde beobachtet, dass ab Tag 3 der Anteil an B-Zellen, die keine MHC II Oberflächenmolekülen besitzen, in den Gruppen BacMam/P1-2A, BacMam/P1-2A3C und BacMam stark zunahm. Bei diesen MHC II-negativen B-Lymphozyten handelte es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um Plasmazellen. Plasmazellen sind terminal differenzierte BLymphozyten, die Antikörper sezernieren (Latron et al., 1988; Calame, 2001). Somit gaben die Ergebnisse der Analyse der B-Zellen im peripheren Blut einen weiteren Hinweis auf eine humorale Immunantwort auf die Immunisierung mit den BacMam Viren. Die Differenzierung der B-Lymphozyten hin zu Plasmazellen erfolgte neben den untersuchten Blutproben der Gruppen BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C auch bei der Versuchsgruppe, die mit dem leeren BacMam Virus immunisiert worden waren, zu. Dies würde bedeuten, dass sich die induzierte humorale Immunantwort nicht nur gegen Epitope der MKSV-Proteine, sondern auch gegen baculovirale Proteine richtete. Neben dem Nachweis der Induktion von Antikörpern konnten auch Hinweise auf die Stimulation einer spezifischen, zellulären Immunantwort erhalten werden. Einzelzellsuspensionen von Milzzellen aus mit BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C immunisierten Mäusen zeigten nach Restimulation mit einem MKSV-Proteingemisch eine gegenüber der Spontanproliferation zweifach höhere Proliferationsrate. Der Anteil der spontan proliferierenden Zellen lag mit ca. 10 % bei diesen beiden Gruppen allerdings deutlich höher als in den beiden Kontrollgruppen BacMam und PBS+, bei denen die Werte nur ca. 3 % betrugen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass mehr als 60 Tagen nach der letzten Immunisierung immer noch MKSV-spezifisches Antigen in den Versuchstieren zirkulierte bzw. persistent in Zellen vorlag. Gerade für die Rekombinante BacMamP1-2A3C war diese Beobachtung überraschend, da die zytotoxische Wirkung der 3CPro sicherlich ähnlich wie in der Zellkultur zu einer Lyse der Zielzellen führte. Somit wäre eine schnellere Eliminierung der heterologen Proteine zu erwarten gewesen. Die zelluläre Immunantwort der mit BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C immunisierten Tiere wurde anschließend hinsichtlich der beteiligten Immunzellen analysiert, indem die Milzzellen entsprechend ihrer Oberflächenantigene sortiert wurden. Der Hauptanteil der proliferierenden Milzzellen stellten die B-Zellen dar. Dieses Ergebnis unterstrich die beobachtete Induktion einer MKSV-spezifischen humoralen Immunantwort. 115 Diskussion Weiterhin wurden Hinweise für eine Beteiligung sowohl CD4-positiver T-Helferzellen als auch zytotoxischer T-Zellen an der zellulären Immunantwort festgestellt. Diese Zellen proliferierten nach Restimulation verglichen mit den Kontrollen etwa doppelt so stark. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von anderer Arbeitsgruppen erzielt, wo nach Immunisierung mit MKSV-Impfstoffen oder potenziellen Markervakzinen eine zwei - bis vierfache T-Zell-Proliferation gemessen wurde (Shi et al., 2006; Zheng et al., 2006; Shi et al., 2007). T-Helferzellen werden für die Induktion einer humoralen Immunantwort benötigt. Zumindest von synthetischen Peptiden, die Regionen des Strukturproteins VP1 repräsentieren, sind T-Zellepitope bekannt (Collen et al., 1991). Dass CD8-positive Zellen ebenfalls in der Immunantwort nach einer Feldinfektion sowie nach einer Impfung eine Rolle spielen, wurde mehrfach publiziert (Collen et al., 1989; Saiz et al., 1992; Garcia-Valcarcel et al., 1996; Childerstone et al., 1999). Allerdings sind die Notwendigkeit und Aufgaben der CTLs, sowie die viralen Epitope, weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass die Ausschüttung von Interferonen durch CTLs, insbesondere von IFN-γ, für die Bildung von MKSV-spezifischen T-Gedächtniszellen verantwortlich ist (Parida et al., 2006; Guzman et al., 2008). Es kann weiterhin davon ausgegangen werden, dass die Anwesenheit des Vektors Baculovirus das angeborene Immunsystem stimuliert. Bisher durchgeführte in vitro- sowie in vivo-Studien zeigten eine signifikante Stimulation der Zytokinproduktion nach Transduktion bzw. Immunisierung mit BacMam Viren. Dabei kam es sowohl zu einer Ausschüttung von sowohl antiviralen als auch inflammatorischen Zytokinen (Gronowski et al., 1999; Abe et al., 2003). Eine MKSV-Infektion mit Virämie und klinischen Symptomen ist bei Mäusen sehr stark serotypabhängig (Salguero et al., 2005). Der in dieser Arbeit verwendete MKSV-Serotyp AIran 97 erwies sich als nicht pathogen für Mäuse und war daher nicht geeignet für einen Belastungsversuch der mit Baculovirus immunisierten Mäuse. Da die notwendige Adaptierung des Virusisolates an Mäuse via Passagierung in Babymäusen noch eine längere Zeit in Anspruch nimmt, ist die Klärung der Frage inwieweit die rekombinanten BacMam Viren eine schützende Immunantwort vor einer Belastungsinfektion bieten, weitere Tierversuchen vorbehalten. Diese konnten allerdings im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht mehr durchgeführt werden. Obwohl keine neutralisierenden Antikörper nach der Immunisierung nachgewiesen werden konnten, ist es dennoch möglich, dass ein ausreichend hoher Schutz vor einer Infektion 116 Diskussion vorhanden ist. Es wird zwar angenommen, dass eine schützende Immunität gegen eine MKSV-Infektion mit dem Auftreten neutralisierender Antikörper korreliert (McCullough et al., 1992), allerdings kann auch ohne die Ausbildung einer MKSV-spezifischen humoralen Immunantwort ein Schutz vor der Infektion in Mäusen induziert werden, welche allein auf einer zellulären Immunantwort basiert (Borrego et al., 2006). Weiterhin ist auch bekannt, dass allein ein hoher Titer an neutralisierenden Antikörpern nicht zwangsläufig zu einem Schutz vor einer MKSV-Infektion führt (Taboga et al., 1997). Diese Literaturdaten deuten darauf hin, dass neben einer spezifischen B- auch die T-Zellantwort eine wichtige Rolle spielt. 117 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Seit einigen Jahren werden alternative Vakzinierungsmöglichkeiten gegen MKSV-Infektionen erforscht. Diese beruhen zumeist auf der Expression der Regionen des Genoms von MKSV, die für das P1-2A Vorläuferprotein und für die virale Protease 3CPro kodieren. Diese Markerimpfstoffe haben den Vorteil, dass sie eine einfache Differenzierung zwischen geimpften und infizierten Tieren, die sogenannte DIVA-Strategie (differentiate infected from vaccinated animal), erlauben. In der vorliegenden Arbeit sollten die aus dem MKSV-Genom abgeleiteten ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C in das Genom von BHV-1 und BacMam Viren integriert werden, um der Fragestellung nachzugehen, inwieweit diese beiden Viren sich als virale Vektoren zur heterologen Expression von MKSV-Proteinen eignen und damit eine weitere Möglichkeit der Entwicklung von Markervakzinen gegen MKS gegeben ist. Für den Einsatz von Markerimpfstoffen ist es zwingend erforderlich, dass geeignete Diagnostiksysteme zur Verfügung stehen, die eine Unterscheidung des Antikörperstatus eines immunisierten Tieres von einem infizierten Tier erlaubt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekularbiologischen Voraussetzungen zur Etablierung von ELISAs, die auf dem Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturproteine (NSPs) basieren, geschaffen, indem rekombinante Baculoviren, die die NSPs 3A, 3B, 3ABCmut und 3DPol in infizierten Insektenzellen exprimieren, im Bac-to-Bac® System hergestellt wurden. Die gereinigten NSPs wurden in weiterführenden Arbeiten, die allerdings nicht Bestandteil der vorliegenden Dissertation waren, für die Etablierung und Validierung der ELISAs eingesetzt. Ebenfalls durch rekombinante Baculoviren wurden die Proteine P1-2A_RGS-6His und VP2_RGS-6His in infizierten Insektenzellen exprimiert und nach affinitäts- chromatographischer Reinigung zur Gewinnung der polyklonalen Kaninchenseren α-P1-2A und α-VP2 eingesetzt. Die Seren dienten zur Überprüfung der Expression und Prozessierung der MKSV-Kapsidproteine durch 3CPro sowohl in mit Plasmid-DNA transient transfizierten Zellen als auch bei der Expression der MKSV ORFs durch die viralen Vektoren. Die heterologe Expression der ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C durch BHV-1 diente der grundlegenden Untersuchung hinsichtlich des Einsatzes von rekombinanten BHV-1 als bivalente Vakzine gegen BHV-1- und MKSV-Infektionen. Die Transfektionsversuche zur Herstellung rekombinanter BHV-1 führten zu dem Ergebnis, dass die Expression einer 118 Zusammenfassung aktiven 3CPro nicht mit der Replikation von BHV-1 kompatibel ist. Es konnten entweder keine 3CPro-exprimierenden Viren isoliert werden oder die durch BHV-1 exprimierte Protease zeigte einen deutlichen Aktivitätsverlust, der vermutlich durch Mutationen hervorgerufen wurde. Ursache für die Inkompatibilität war die toxische Wirkung der Protease, da die Generierung einer weiteren Rekombinante, die für eine inaktive Form der 3CPro kodiert, problemlos möglich war. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Expression des ORF P1-2A zu einer deutlichen Beeinträchtigung der Freisetzung rekombinanter Viren aus den Zellen führt. Bei den rekombinanten BacMam Viren stand die Expression der ORFs P1-2A, P1-2A3C und 3C unter der Kontrolle des MCMVie Promotors und erfolgte hauptsächlich in transduzierten Säugerzellen. Die zytotoxische Wirkung der 3CPro, die anhand eines Vitalitätstests mit transduzierten Zellen bestätigt wurde, konnte somit während der Herstellung und Anzucht der rekombinanten Viren in Insektenzellen umgangen werden. Die Expression und Prozessierung der MKSV-Kapsidproteine in transduzierten Säugerzellen wurde in Western Blot Analysen mittels des Serums α-VP2 nachgewiesen. Im anschließend durchgeführten Tierversuch wurden C57 BL/6 Mäuse mit den rekombinanten Viren BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C intramuskulär immunisiert. Im ELISA konnten 14 Tage nach der ersten Immunisierung MKSV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden Die Induktion einer humoralen Immunantwort war nach Immunisierung mit BacMam/P1-2A3C deutlich höher als mit BacMam/P1-2A. Weiterhin konnte anhand der durchflusszytometrischen Ergebnisse des peripheren Blutes auf eine Reifung der B-Zellen zu antikörper-sezernierenden Plasmazellen nach der Immunisierung geschlossen werden. Im Proliferationstest wurden isolierte Milzzellen von immunisierten Tieren mit gereinigten MKSV-Strukturproteinen restimuliert. Dabei wurden neben der Proliferation von B-Zellen auch Hinweise auf die Induktion einer spezifischen zellvermittelten Immunantwort durch die Proliferation von CD4- und CD8-positiven Zellen erhalten. Mit dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine Immunisierung mit rekombinanten BacMam Viren in Mäusen zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen MKSV führt und diese Viren somit möglicherweise gute Kandidaten für eine Markervakzine zur Bekämpfung von MKSV-Infektionen darstellen. 119 Literaturverzeichnis 6. LITERATURVERZEICHNIS Abe, T, Takahashi, H, Hamazaki, H, Miyano-Kurosaki, N, Matsuura, Y, Takaku, H. 2003. Baculovirus induces an innate immune response and confers protection from lethal influenza virus infection in mice. J Immunol. 3:1133-1139. Abrams, CC, King, AM, Belsham, GJ. 1995. Assembly of foot-and-mouth disease virus empty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system. J Gen Virol. 3089-3098. 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IRES IPTG IR KanR Abbildung Ampicillin-Resistenzgen Aminosäure Adenosintriphosphat bovine growth hormon Bovines Herpesvirus 1 halogeniertes Indolyl-β-D-Galactosid Basenpaar Bovines Serumalbumin Grad Celsius cluster of differentiation copy-DNA Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester Calf intestinal phosphatase Zytopathischer Effekt Zytotoxische T-Zelle Tage Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Dithiothreitol early Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)N,N`-tetraessigsäure Enzyme linked Immunosorbent Assay Europäische Union Fluorescence activated cell sorter Fetales Kälberserum Fluoresceinisothiocyanate Friedrich-Loeffler-Institut Gramm, rel. Zentrifugalbeschleunigung Green Fluorescent Protein Gentamycin-Resistenzgen Stunde(n) humanes Zytomegalovirus Histidin Herpes Simplex Virus immediate early Indirekter Immunfluoreszenztest intramuskulär Internal Ribosome Entry Site Isopropyl-9-β-D-Thiogalactopyranoid interne repetitive Region Kanamycin-Restistenzgen 135 Abkürzungsverzeichnis kbp kDa l lacZ LB LMP µ M m mab BacMam MCMV MCS min MHC MKS MKSV moi n NSP OD OIE ORF p10 PAGE PBS PCR PE PEI PFA pfu p.i. PIPES PolH PolyA PrV rBac RNA RT rpm s SDS SV40 TA Tab. TAE TBS Kilobasenpaar(e) Kilodalton Liter, late Gen für β-Galactosidase Luria-Bertani-Medium low melting point mikro Molar milli monoklonaler Antikörper rekombinantes Baculovirus für die Transduktion von Säugerzellen (mammalia cells) murines Zytomegalovirus multiple cloning site Minute(n) major histocompatibility complex Maul- und Klauenseuche Virus der Maul- und Klauenseuche multiplicity of infection nano Nichtstrukturprotein Optische Dichte Office International des Èpizooties Open Reading Frame, Offener Leserahmen Baculovirus p10-Promotor Polyacrylamid-Gelelektrophorese Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Phycoerythrin Polyethylenimine Paraformaldehyd Plaque Forming Units Post infectionem Piperazin-1,4-bis (2-ethansulfonsäure) Baculovirus Polyhedrinpromotor Polyadenylierungssignal Pseudorabies Virus Baculovirus für die Proteinexpression in Insektenzellen Ribonukleinsäure Raumtemperatur, Reverse Transkription Rounds Per Minute Sekunde(n) Natriumdodecylsulfat Simian Virus Typ 40 Tris-Acetat-Puffer Tabelle Tris-Acetat-EDTA-Puffer Tris Buffered Saline 136 Abkürzungsverzeichnis TCID50 TE TEN TEMED TetR TK TR Tris Tween20 U UL US ü.N. VNT UTR UV V Vol VP v/v wt w/v X-Gal Tissue culture infectious dose 50 % Tris-EDTA-Puffer Tris-EDTA-Natriumchlorid-Puffer N,N,N`,N`;-Tetramethylethylendiamin Tetrazyklin-Resistenzgen Tymidinkinase terminale repetitive Region Tris(hydroxymethyl)aminomethan Polyoxyethylensorbitanmonolaurat Enzymeinheit (“unit”) Unique Long Region Unique Short Region über Nacht Virusneutralisationstest nichttranslatierte Region Ultraviolett Volt Volumen Virusprotein Volumen/Volumen Wildtyp Gewicht/Volumen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyraosid Die Abkürzungen der Aminosäuren entsprechen den von der IUPAC vorgeschlagenen Ein-Buchstaben-Symbolen. 137 138 Anhang 8. ANHANG Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde am FLI im Labor von Dr. Günther M. Keil angefertigt. Ihm danke ich sehr für die exzellente Betreuung, die vielen hilfreichen Ratschläge und schließlich für seine Hilfe bei der Korrektur dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. Thomas C. Mettenleiter danke ich recht herzlich für die Möglichkeit der Anfertigung dieser Arbeit am Institut für Molekularbiologie, FLI sowie für die Begutachtung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. Volker Moennig danke ich für die Erstellung des exernen Gutachtens. Bei Dr. Bernd Haas und seinen Mitarbeitern Bianca Nehmzow, Katharina Brehm, Anja Schulz und Naveen Kumar möchte ich mich für die herzliche Aufnahme in ihrem Labor und für ihre Unterstützung bei den Arbeiten im L4-Bereich danken. Frau Dr. Urike Blohm hat mir mit ihrem immunologischen Wissen bei der Durchführung und Auswertung des Tierversuchs sehr geholfen. Ihr danke ich für die Einführung in die immunologischen Methoden sowie für ihre stete Hilfe und Disskusionsbereitschaft. Für die Unterstützung bei der Durchführung des Tierversuches danke ich weiterhin Herrn Dr. Bernd Köllner und Christina Maresch. Bei Katrin Giesow möchte ich mich recht herzlich für ihre nützlichen Ratschläge sowie für die freundschaftliche Zusammenarbeit im Labor bedanken. Ihr und Frau Dr. Patricia König danke ich für die schöne gemeinsame Zeit auf der Insel. Allen Mitarbeitern am FLI danke ich für das angenehme Arbeitsklima sowie ihre Hilfe beim Auftreten des einen oder anderen Problems - insbesondere Frau Dr. Jutta Veits danke ich für die statistischen Berechnungen. Meiner Familie danke ich für ihr ausdauerndes und immer aufmunterndes Engagement während der Zeit auf dem Riems. Auf ihre Unterstützung konnte ich jederzeit zählen. Robert danke ich ganz besonders für die schöne Zeit auf dem Riems, dafür, dass er mir immer zur Seite stand und gerade in der letzten Phase der Arbeit mich sehr unterstützt hat. 139 Anhang Veröffentlichungen Teile der vorliegenden Arbeit sind bereits vorab veröffentlicht wurden: Höhle C., N.Kumar, S.Grazioli, G.M.Keil, B.Haas (2006) “Establishment of a confirmatory profiling ELISA for antibodies to FMDV nonstructural proteins.” in: Tagungsbericht der Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie in München, 15.03.-18.03.2006 Keil G.M., C.Höhle, K.Vogt, K.Giesow (2007) “Recombination vectors for gene transfer into vertebrate cells by baculoviruses.” in: Tagungsbericht “First Annual Meeting EPIZONE” in Lublin/Pulawy, Poland 30.05.-01.06.2007 Keil G.M., C.Höhle, K.Giesow, U.Blohm, H.Schirrmeier, U.Fischer, B.Haas, K.Brehm, J.P.Teifke (2008) “In-vitro and in-vivo gene delivery into vertebrate cells by recombinant baculoviruses.” in: Tagungsbericht der Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie in Heidelberg, 05.03.-08.03.2008 140 Anhang Lebenslauf Name: Constanze Klopfleisch (geb. Höhle) Geburtsdatum: 07.07.1979 Geburtsort: Dresden Schulausbildung: 1986 - 1991 47. Grundschule in Dresden-Strehlen 1991 - 1992 23. Mittelschule in Dresden-Strehlen 1992 - 1998 Vitzthum - Gymnasium Dresden 07 / 1998 Abitur Hochschulstudium: 1998 - 2004 Studium der Biologie an der Technischen Universität Dresden 03 / 2004 Diplom in Biologie Thema der Diplomarbeit: „Expression von IFN-α durch Bovines Herpesvirus 1“, angefertigt am Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems Berufliche Tätigkeit: 05 / 2004 - 04 / 2008 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems Anfertigung der vorliegenden Dissertation unter der Anleitung von Dr. G.M. Keil mit dem Thema: „Expression von Proteinen des Virus der Maul- und Klauenseuche (MKS) durch Bovines Herpesvirus 1 und Baculoviren unter dem Aspekt der Etablierung neuer Bekämpfungsstrategien gegen MKS“ Insel Riems, 07.05.2008 141
