StefanVollathDissertation

Aus der Klinik für Rheumatologie und Immunologie
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Georg Schett
Vitamin D-Rezeptor als Regulator des
TGF-β-Signalwegs bei systemischer Sklerose
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Doktor der Medizin (Dr. med.)
vorgelegt von
Stefan Vollath
aus Passau
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
03.12.2013
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Gutachter:
PD Dr. med. Jörg Distler
Gutachter:
Prof. Dr. med. Georg Schett
Meiner Familie in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung/ Abstract ............................................................................ 1
1.1. Zusammenfassung ............................................................................................... 1
1.1.1. Hintergrund und Ziele ......................................................................................................... 1
1.1.2. Material und Methoden ..................................................................................................... 1
1.1.3. Ergebnisse ........................................................................................................................... 1
1.1.4. Praktische Schlussfolgerung ............................................................................................... 2
1.2. Abstract .............................................................................................................. 3
1.2.1. Background and objective .................................................................................................. 3
1.2.2. Material and Methods ........................................................................................................ 3
1.2.3. Results................................................................................................................................. 3
1.2.4. Conclusion .......................................................................................................................... 4
2. Einleitung ........................................................................................................ 5
2.1. Definition der systemischen Sklerose ................................................................... 5
2.2. Epidemiologie und Klassifikation .......................................................................... 5
2.3. Pathogenese und Histopathologie ........................................................................ 8
2.4. Vitamin D-Rezeptor (VDR).................................................................................... 9
3. Material und Methoden ................................................................................. 11
3.1. Patienten und Fibroblastenkulturen ................................................................... 11
3.2. Immunfluoreszenzfärbung ................................................................................. 11
3.3. Western Blot-Analyse ........................................................................................ 12
3.4. Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR) ............................................................... 12
3.5. VDR-Überexpression und Blockade .................................................................... 13
3.6. Quantifizierung des Kollagenproteins ................................................................. 14
3.7. Färbung der Stressfasern ................................................................................... 14
3.8. Ko-Immunopräzipitation .................................................................................... 15
3.9. SMAD-Reporter-Assay ....................................................................................... 15
3.10. Bleomycin-induzierte Hautfibrose .................................................................... 15
3.11. TβRI-induzierte Hautfibrose ............................................................................. 16
3.12. Behandlung mit Paricalcitol.............................................................................. 16
3.13. Histologische Analyse ...................................................................................... 16
3.14. Hydroxyprolin-Assay ........................................................................................ 17
3.15. Quantifizierung der Myofibroblasten ............................................................... 17
3.16. Statistik ........................................................................................................... 17
4. Ergebnisse ..................................................................................................... 18
4.1. Verminderung der VDR-Expression bei SSc ......................................................... 18
4.2. Hemmung der VDR-Expression durch TGF-β ....................................................... 21
4.3. VDR als negativer Regulator der TGF-β-induzierten Fibroblastenaktivierung ....... 24
4.4. Verbesserung der experimentellen Fibrose durch Paricalcitol ............................. 28
5. Diskussion...................................................................................................... 33
6. Literaturverzeichnis........................................................................................ 36
7. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 46
8. Lebenslauf ..................................................................................................... 48
9. Danksagung................................................................................................... 49
1
1. Zusammenfassung/ Abstract
1.1. Zusammenfassung
1.1.1. Hintergrund und Ziele
Der Vitamin D-Rezeptor (VDR) zählt zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren.
Sein physiologischer Ligand, 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3), ist ein
metabolisch aktives Hormon, das von Vitamin D3 stammt. Die Vitamin D3-Spiegel
sind typischerweise bei Patienten mit systemischer Sklerose (SSc) vermindert.
In dieser Arbeit soll die Rolle des VDR-Signalwegs bei fibrotischen Erkrankungen
am Beispiel der SSc analysiert werden.
1.1.2. Material und Methoden
Die VDR-Expression wurde in SSc-Haut, in experimentell erstellter Fibrose und
humanen Fibroblasten untersucht. Es erfolgte eine Modulation der VDRSignaltransduktion durch small interfering RNA (siRNA) und den selektiven
Agonisten Paricalcitol. Die Effekte von VDR auf den Smad-Signalweg analysierte
man durch Reporter-Assays, Zielgen-Analysen und Ko-Immunopräzipitation.
Die Wirkung von Paricalcitol wurde in den Modellen der Bleomycin-induzierten
Fibrose und einer durch Überexpression des konstitutiv aktiven TGF-β-Rezeptors I
(TBRICA) ausgelösten Fibrose getestet.
1.1.3. Ergebnisse
Die VDR-Expression war in Fibroblasten von SSc-Patienten und SSc-Mausmodellen in einer TGF-β-abhängigen Weise vermindert.
Eine VDR-Blockade erhöhte die Sensitivität von Fibroblasten gegenüber TGF-β.
Dagegen führte die Aktivierung von VDR durch Paricalcitol zu einer Reduktion der
2
stimulatorischen
Effekte
von
TGF-β
auf
Fibroblasten.
Sie
verhinderte
Kollagenfreisetzung und Differenzierung der Myofibroblasten.
Paricalcitol regte den Komplex von VDR und phosphoryliertem Smad3 in
Fibroblasten zur Hemmung der Smad-abhängigen Transkription an. Die Behandlung
mit Paricalcitol zeigte potente antifibrotische Effekte und verbesserte sowohl die
Bleomycin- als auch die TBRICA-induzierte Fibrose.
1.1.4. Praktische Schlussfolgerung
VDR wird als negativer Regulator des TGF-β-/ Smad-Signalweges charakterisiert.
Abgeschwächte VDR-Signaltransduktion mit reduzierter Expression von VDR und
erniedrigten Liganden-Spiegeln kann zu überaktiver TGF-β-Signalübertragung und
überschießender Fibroblastenaktivierung bei SSc beitragen.
3
1.2. Abstract
1.2.1. Background and objective
Vitamin D receptor (VDR) is a member of the nuclear receptor superfamily. Its
ligand, 1,25-(OH)2D3, is a metabolically active hormone derived from vitamin D3.
The levels of vitamin D3 are decreased in patients with systemic sclerosis (SSc).
Here, we aimed to analyze the role of VDR signaling in fibrosis.
1.2.2. Material and Methods
VDR expression was analyzed in SSc skin, in experimental fibrosis and in human
fibroblasts. VDR signaling was modulated by siRNA and with the selective agonist
paricalcitol. The effects of VDR on Smad signaling were analyzed by reporter
assays, target gene analyses and by co-immunoprecipitation. The effects of
paricalcitol were the models of bleomycin-induced fibrosis and fibrosis induced by
overexpression of a constitutively active TGF-β receptor I (TBRICA).
1.2.3. Results
VDR expression was decreased in fibroblasts of SSc patients and in murine models
of SSc in a TGF-β dependent manner. Knockdown of VDR enhanced the sensitivity
of fibroblasts towards TGF-β. In contrast, activation of VDR by paricalcitol reduced
the stimulatory effects of TGF-β on fibroblasts and inhibited collagen release and
myofibroblast differentiation. Paricalcitol stimulated the formation of complexes
between VDR and phosphorylated Smad3 in fibroblasts to inhibit Smad-dependent
transcription. Treatment with paricalcitol exerted potent anti-fibrotic effects and
ameliorated bleomycin- as well as TBRICA-induced fibrosis.
4
1.2.4. Conclusion
We characterize VDR as a negative regulator of TGF-β / Smad signaling. Impaired
VDR signaling with reduced expression of VDR and decreased levels of its ligand
may thus contribute to hyper-active TGF-β signaling and aberrant fibroblast
activation in SSc.
5
2. Einleitung
2.1. Definition der systemischen Sklerose
Die systemische Sklerose (SSc) ist eine chronisch fibrosierende Systemerkrankung,
welche mit einer pathologischen Verhärtung von Haut und Unterhaut einhergeht,
aber auch zahlreiche innere Organe betreffen kann.
Die Ätiologie der Erkrankung ist bisher weitgehend unbekannt. Es wird jedoch ein
multifaktorieller Prozess, bestehend aus autoimmunen Mechanismen, genetischer
Disposition und Umweltfaktoren als ursächlich betrachtet.
Die SSc zeigt sowohl im Ausmaß der Haut- und Organbeteiligung, als auch in
Krankheitsverlauf und Prognose eine große individuelle Variabilität (1, 2).
Sie wird zusammen mit dem systemischen Lupus erythematodes (SLE), der Poly-/
Dermatomyositis, dem Sjögren-Syndrom (SS) und der Mischkollagenose (MCTD,
Sharp-Syndrom) der heterogenen Gruppe der Kollagenosen zugeordnet.
Diese systemischen Autoimmunerkrankungen manifestieren sich vorwiegend am
menschlichen Bindegewebe (3).
2.2. Epidemiologie und Klassifikation
Die SSc ist eine sehr seltene Erkrankung. Eine exakte Erhebung von Daten zur
Prävalenz
und
Inzidenz
erweist
sich
als
schwierig.
In
den
wenigen
epidemiologischen Studien wird die Prävalenz mit 50-300 Fällen pro eine Million
Einwohner angegeben, mit erheblichen Unterschieden je nach untersuchter
Population und Rasse. So tritt die Erkrankung in den USA und in Australien häufiger
auf als in Japan und Europa. Frauen sind 3- bis 14-mal häufiger betroffen als
Männer. Auch zeigt sich hier eine frühere Manifestation der SSc. Die Bevölkerung
mit dunkler Hautfarbe scheint ein erhöhtes Erkrankungsrisiko zu haben. Die Anzahl
der Neuerkrankungen erstreckt sich von 2.3 bis 22.8 Fällen pro Jahr pro eine Million
Einwohner (2).
6
Eine positive Familienanamnese gilt als bedeutendster Risikofaktor für die
Erkrankung an SSc (4). Auch Noxen wie Viren (CMV), Medikamente (Bleomycin),
Vinylchlorid und Siliziumdioxid werden als mögliche Auslöser diskutiert (5).
Die Diagnose der SSc kann anhand der 1980 vom American College of
Rheumatology (ACR) entwickelten Kriterien gestellt werden.
1. Hauptkriterium: Sklerodermie der Haut proximal der Metacarpophalangealgelenke
2. Nebenkriterien:
Sklerodaktylie
digitale Ulzera/ Substanzverluste der distalen Weichteile
bibasilare Lungenfibrose
Die Diagnose gilt demnach als gesichert, wenn entweder das Hauptkriterium oder
zwei
Nebenkriterien
erfüllt
sind.
Die
ACR-Kriterien
führen
bei
der
Krankheitserkennung zu einer Spezifität von 98% und einer Sensitivität von 97% (6).
In der klinischen Praxis hat sich noch eine weitere internationale Einteilung der SSc
etabliert, welche entsprechend dem Ausmaß der Hautbeteiligung zwischen einer
limitierten und einer diffusen Verlaufsform differenziert (7).
Die limitierte kutane systemische Sklerose (lcSSc) ist distal der Ellenbeugen und
Kniegelenke lokalisiert, oft mit fazialer Beteiligung. Das Raynaud-Phänomen wird
als häufiges Frühsymptom angesehen und zeigt sich meist Jahre voraus. Der Befall
innerer Organe ist möglich, tritt jedoch seltener und protrahierter auf, als bei der
diffusen kutanen systemischen Sklerose (dcSSc) (8) (9). Der Nachweis von AntiZentromer-Antikörpern gilt als spezifisch für eine limitierte Form der SSc.
Die dcSSc zeichnet sich durch einen raschen Krankheitsverlauf aus. Die
Hautsklerose betrifft distale, proximale Extremitäten, Gesicht und Rumpf. Schon
früh sind innere Organe betroffen, die Prognose ist im Vergleich zur lcSSc schlechter
(10).
Bei bis zu 90% aller Patienten zeigt sich eine Fibrose der glatten Muskulatur im
Gastrointestinaltrakt. Eine Dysfunktion des unteren Ösophagussphinkters führt sehr
häufig zur Refluxerkrankung. Die Ausbildung eines Barrett-Ösophagus mit
Narbenbildung ist eine mögliche Komplikation.
7
Der Befall von Dünn- und Dickdarm geht oft mit Malabsorptionssyndrom,
Diarrhoen, sowie schweren Obstipationen einher (11).
Eine Lungenbeteiligung gilt heute als größter Mortalitätsfaktor bei SSc-Patienten.
Es wird zwischen einer Lungenfibrose mit restriktiver Ventilationsstörung und
pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) unterschieden.
Eine renale Beteiligung war früher die häufigste Todesursache. Die Anwendung von
ACE-Hemmern hat die Prognose bei renalen Krisen jedoch deutlich verbessert.
Grundsätzlich kann die SSc fast jedes Organsystem betreffen (8).
Die dcSSc zeigt eine Assoziation mit Anti-Topoisomerase I (Scl-70), Anti-RNAPolymerase und Anti-Fibrillarin/ U3-RNP-Antikörpern (12).
Die SSc kann mit anderen Krankheiten aus dem entzündlich-rheumatischen Bereich
vergesellschaftet sein. Manifestieren sich neben den sklerodermietypischen
Veränderungen auch Symptome eines systemischen Lupus erythematodes, einer
rheumatoiden Arthritis oder Polymyositis, so spricht man vom sogenannten OverlapSyndrom (10).
Hautveränderungen als führendes Symptom der SSc sind je nach Subtyp
unterschiedlich stark ausgeprägt. In ca. 90-98% der Fälle wird ein vorausgehendes
Raynaud-Phänomen beobachtet. Es treten bevorzugt an Händen und Füßen kälteoder stressbedingte Gefäßspasmen auf, sichtbar an einem Abblassen der Haut.
Folgend sind Ischämie und reaktive schmerzhafte Hyperämie (6).
Die Hauterscheinungen der SSc lassen sich in drei Stadien gliedern: die ödematöse,
indurative, und atrophische Phase. In der Frühform zeigen sich charakteristische
Schwellungen an den Händen (engl.: puffy fingers), später eine Verhärtung und
Schrumpfung der Haut. Sklerodaktylie, Beugekontrakturen, Ulzerationen v.a. an den
Fingerkuppen und Hypomimie kennzeichnen diese Erkrankungsstadien (13).
8
2.3. Pathogenese und Histopathologie
Obwohl Ätiologie und Pathogenese der SSc weitgehend unbekannt sind, haben in
den letzten Jahren neue Entwicklungen zum besseren Verständnis der zellulären und
molekularen Mechanismen beigetragen (1).
So nimmt man heute an, dass sich die Pathogenese aus der Trias Vaskulopathie,
autoimmunem Entzündungsprozess und interstitieller Fibrosebildung zusammensetzt
(14) (15).
Die Schädigung vornehmlich kleiner Blutgefäße (Arteriolen) gilt als sehr frühes
Ereignis in der Krankheitsentstehung (16).
Als ursächlich werden endothelzellspezifische Antikörper, vaskulotrope Viren,
inflammatorische Zytokine und reaktive Sauerstoffradikale angesehen.
Die Gefäßverletzung führt zur Aktivierung von Endothelzellen, veränderter
Kapillarpermeabilität und erhöhter Ausschüttung vasoaktiver Mediatoren wie z.B.
dem vasokonstriktiv, proliferativ und fibrogenetisch wirkenden Endothelin-1 (4).
Eine perivaskuläre Infiltration von mononukleären Immunzellen, überwiegend
bestehend aus T-Zellen, Makrophagen, B-Zellen und Mastzellen, wird beobachtet.
Die Hypertrophie von Intima und Media, sowie die Fibrosierung der Adventitia
führen zu einer zunehmenden Verengung mit Obliteration der Gefäße.
Gesteigerte Apoptose von Endothelzellen und Beeinträchtigung der Angiogenese
gehen mit einer progressiven Rarefizierung der Kapillardichte einher (17) (10).
Profibrotischen Zytokinen, z.B. Transforming Growth Factor beta (TGF-β),
Connective Tissue Growth Factor (CTGF) und Platelet Derived Growth Factor
(PDGF), wird eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von Fibroblasten
zugeschrieben (18).
Die Zusammensetzung und Architektur der extrazellulären Matrix (EZM), im
Wesentlichen
bestehend
aus
Kollagen,
Proteoglykanen,
Fibrillin
und
Adhäsionsmolekülen, ist essentiell für eine intakte Zell- und Organfunktion (4). Die
EZM
unterliegt
bei
Gesunden
einer
dauerhaften,
kontrollierten
und
selbstlimitierenden Erneuerung (14).
Dem gegenüber steht die unbegrenzte, überschießende Produktion von EZM bei
Patienten mit SSc (19).
9
2.4. Vitamin D-Rezeptor (VDR)
Vitamin D wird primär in der Haut synthetisiert. Zusätzlich deckt die Vitamin DAufnahme über die Nahrung annähernd 20% des körperlichen Bedarfs (20).
In Leber und Niere wird Vitamin D schrittweise hydroxyliert und in die aktive Form
1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (1,25-(OH)2D3) umgewandelt. 1,25-(OH)2D3 ist der
endogene Ligand des Vitamin D-Rezeptors (VDR), welcher zur Superfamilie der
nukleären Rezeptoren zählt (21). Die Transkriptionsaktivität des VDR wird jedoch
nicht nur durch seinen Liganden reguliert, sondern auch durch Rekrutierung von
Transkriptions-Koaktivatoren und Dimerisierung von anderen Transkriptionsfaktoren wie z.B. Retinoid-X-Rezeptor oder Smad3-Protein (21).
Am besten verstanden wird die VDR-Signaltransduktion in der essentiellen Rolle des
Kalzium- und Phosphatstoffwechsels (20, 21).
Neben der Regulierung des Kalziumhaushalts hat der VDR-Signalweg eine wichtige
Bedeutung als Schlüsselregulator für Zellproliferation, Differenzierung und
Immunmodulation (20-22).
Ein Mangel an Vitamin D wird bei verschiedensten Autoimmunerkrankungen
beobachtet. Zahlreiche unabhängige Studien berichteten von signifikant erniedrigten
Vitamin D3-Spiegeln bei SSc (23-30).
Eine Studie zeigt eine inverse Korrelation zwischen Vitamin D-Spiegel und
modifiziertem Rodnan-Skin-Score. Dies lässt einen direkten Zusammenhang
zwischen Vitamin D-Mangel, beeinträchtigter VDR-Signaltransduktion und SScPathogenese vermuten (23).
Zahlreiche Präparate, welche modulierend in den VDR-Signalweg eingreifen, sind
für den klinischen Gebrauch zugelassen. Der endogene VDR-Agonist 1,25-(OH)2D3
findet Anwendung in der Behandlung des sekundären Hyperparathyreoidismus (31).
Jedoch ist der therapeutische Nutzen von 1,25-(OH)2D3 oft durch Nebenwirkungen
wie Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie eingeschränkt. Um diese Limitationen
zu umgehen, wurden synthetische VDR-Agonisten entwickelt, die hochaffin VDR
binden und ein stark verringertes Risiko für Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie
aufweisen (32).
Einer dieser VDR-Agonisten für den klinischen Gebrauch ist Paricalcitol. In
klinischen Studien wird Paricalcitol sehr gut toleriert. Es supprimiert die
Parathormonspiegel effektiver als 1,25-(OH)2D3 (33).
10
Von den klinischen Beobachtungen des Vitamin D-Mangels bei SSc inspiriert, soll
die Bedeutung von VDR für die Fibroblastenaktivierung geklärt werden. Es wird
nicht nur ein Vitamin D-Mangel bei SSc-Patienten aufgezeigt, sondern auch die
TGF-β-abhängige Hemmung des VDR in SSc-Fibroblasten. VDR stellt einen
negativen Regulator des TGF-β/ Smad-Signalwegs dar und verhindert eine
überschießende Fibroblastenaktivierung. Des Weiteren hemmt der VDR-Agonist
Paricalcitol die TGF-β-Signalübertragung und verhindert in zwei unterschiedlichen
Mausmodellen experimentelle Fibrose.
11
3. Material und Methoden
3.1. Patienten und Fibroblastenkulturen
Die Fibroblastenkulturen wurden aus Hautbiopsien von SSc-Patienten und gesunden
freiwilligen Probanden gewonnen, welche bezüglich Alter und Geschlecht in
gleichem Verhältnis zu den SSc-Patienten standen.
Alle SSc-Patienten erfüllten die ACR-Kriterien für SSc. Das mittlere Alter der SScPatienten war 52 Jahre (19 - 78 Jahre) und die mittlere Erkrankungsdauer 4 Jahre
(0.5 - 10 Jahre). Alle Teilnehmer der Patienten- und Kontrollgruppe unterzeichneten
eine von der institutionellen Prüfungskommission zugelassene Einverständniserklärung.
Für die in vitro Experimente wurden Fibroblasten aus SSc-Patienten, Gesunden,
VDR-defizienten-Mäusen (VDR-/-) und Wildtypmäusen (VDR+/+) gewonnen und 4-8
Zellpassagen wie beschrieben bearbeitet (34, 35).
In ausgewählten Experimenten stimulierte man Fibroblasten mit Kombinationen aus
TGF-β in einer Konzentration von 10 ng/ml (R&D Systems, WiesbadenNordenstadt, Deutschland) und/ oder Paricalcitol in einer Konzentration von
40 ng/ml (Zemplar; 5 µg/ml; Abbott, Wiesbaden, Deutschland).
3.2. Immunfluoreszenzfärbung
Die Immunfluoreszenzfärbung für VDR erfolgte gemäß zuvor ausgearbeiteter
Protokolle (36, 37).
Abschnitte von humanen und murinen Hautproben und dazugehörige Kontrollen
wurden mit polyklonalem Kaninchen-anti-VDR-Antikörper (Abcam, Cambridge,
UK) inkubiert.
Die VDR-Expression stellte man mit Hilfe eines zweiten Antikörpers dar, der mit
dem roten Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 594 (Life Technologies, Darmstadt,
Deutschland) markiert war. Die Gegenfärbung erfolgte mit einem polyklonalen
Maus-anti-Vimentin-Antikörper
(Abcam),
visualisiert
Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 488 (Life Technologies).
durch
den
grünen
12
Die Zellkerne wurden mit 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) gefärbt und die
Präparate in 200- und 1000-facher Vergrößerung abgelichtet.
3.3. Western Blot-Analyse
Auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragene Proteine wurden mit
polyklonalem Kaninchen-anti-VDR-Antikörper (Abcam) in einer Verdünnung von
1:100 in 2% BSA/ PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert. Als interne Kontrolle des
Western Blots diente das Housekeeping-Gen β-Actin. Die VDR- und β-ActinMengen wurden via sekundären, Spezies-spezifischen IgG-Antikörpern, welche mit
Meerrettich Peroxidase (Dako, Hamburg, Germany) markiert waren, detektiert.
Die Entwicklung des Western Blots erfolgte auf Hochleistungsröntgenfilmen per
Chemielumineszenzverfahren (ECL Plus Western Blotting Detection System).
3.4. Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR)
Die quantitative-Echtzeit-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren,
basierend
auf
dem
Prinzip
der
PCR.
Sie
gestattet
mit
Hilfe
von
Fluoreszenzmessungen die Quantifizierung der gewonnen DNA während der PCRZyklen. Die Fluoreszenz nimmt proportional zur Menge der PCR-Produkte zu. Die
Quantifizierung wird in der exponentiellen Phase der PCR durchgeführt, da hier die
optimalen Reaktionsbedingungen vorliegen.
Die Genexpression erfolgte mittels SYBR-Green-Echtzeit-PCR unter Verwendung
des MxPro-3500P-Sequenz-Detektion-Systems (Agilent, Böblingen, Germany)
(38, 39).
13
Folgende Primer-Paare wurden verwendet:
Als Negativkontrollen dienten Proben, die keine Reverse Transkriptase enthielten
(Non-RT-Kontrollen).
Unspezifische
Signale,
welche
durch
Primer-Dimere
verursacht waren, wurden durch Nicht-Template-Kontrollen (Proben ohne cDNA)
und Dissoziations-Kurven-Analyse aus der Auswertung genommen. β-Actin wurde
zur Normierung der cDNA-Mengen verwendet.
3.5. VDR-Überexpression und Blockade
Menschliches VDR wurde aus Vollblut-DNA-Proben amplifiziert und in die
multiple Klonierungsstelle des pEF1/ myc-His B-Plasmids (Invitrogen, Karlsruhe,
Deutschland) geklont. Dies ergab einen VDR-Komplex, versehen mit myc und His,
der unter Kontrolle des human elongation-factor-1-subunit (hEF-1)-Promotors
hohe Expressionsspiegel bewirkt.
Unter
Verwendung
von
Amaxa-4D-Nucleofector
(Amaxa
GmbH,
Köln,
Deutschland) wurde das VDR-Genkonstrukt in humane Hautfibroblasten übertragen
(40, 41). Als Kontrolle diente das pEF1/ myc-His B- Plasmid ohne VDR-Gen.
Für die VDR-Knockdown-Experimente transferierte man VDR-siRNA (Eurogentec,
Köln, Deutschland) mittels Nukleofektion in humane Hautfibroblasten.
14
Die Sequenzen waren:
Als Kontrollen dienten nicht zielgerichtete siRNAs (Ambion, Darmstadt,
Deutschland).
3.6. Quantifizierung des Kollagenproteins
Die Menge an löslichem Kollagen in Zellkulturüberständen wurde mittels SirColKollagen-Analyse (Biocolor, Belfast, Nordirland) gemessen (42, 43). Die
Zellkulturüberstände wurden für 30 Minuten mit dem Sirius-Red-Farbstoff inkubiert.
Dieser anionische Farbstoff bindet spezifisch an die basischen Seitenketten von
Kollagen. Den Komplex aus Sirius-Red und Kollagen löste man in 0.5 M NaOH
erneut auf. Der Kollagengehalt wurde durch Bestimmung der Sirius-Red-Extinktion
bei 540 nm mit einem SpectraMAX-190-Microplate-Spektrophotometer (Molecular
Devices, Sunnyvale, USA) ermittelt.
3.7. Färbung der Stressfasern
In gesunden, in Zellkulturkammern bebrüteten humanen Hautfibroblasten wurden
Veränderungen bei der Bildung von Stressfasern festgestellt. Nach Fixierung und
Permeabilisierung wurden die Stressfasern mit Phalloidin dargestellt (44, 45) und via
ImageJ (V. 1.42q, National Institutes of Health, USA) quantifiziert.
15
3.8. Ko-Immunopräzipitation
Humane Hautfibroblasten wurden mit dem pEF1/ myc-His B-Plasmid, welches VDR
(pEF1_VDR) enthielt, oder dem Kontrollplasmid pEF1/myc-His B (pEF1)
transfiziert.
Die
Fibroblasten
sind
vorausgehend
mit
unterschiedlichen
Kombinationen aus TGF-β (10 ng/ml) und Paricalcitol (41.6 ng/ml) stimuliert
worden. Sowohl die zytoplasmatischen Extrakte als auch die Kernzellextrakte
wurden nach 3-stündiger Stimulation entnommen. Es erfolgte eine Inkubation der
Zellextrakte mit Protein G-Sepharose, Maus-anti-Myc-Tag (Cell Signaling,
Deutschland) und normalem Maus-IgG-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, Deutschland). Zuletzt wurde ein Western Blot der Proteine c-Myc,
Smad3 und pSmad3 durchgeführt. Die Housekeeping-Gene β-Actin und Lamin A/C
(Cell Signaling) dienten als Referenzwerte.
3.9. SMAD-Reporter-Assay
Humane Hautfibroblasten wurden mit
dem replikationsdefizienten Adeno-
assoziierten-Virus (AAVs) AdCAGA-Luc transfiziert, welches unter Kontrolle eines
CAGA-Promotors Luziferase-Enzyme kodiert. Nach 24-stündiger Stimulation mit
unterschiedlichen Kombinationen aus TGF-β (10 ng/ml) und Paricalcitol
(41.6 ng/ml) wurde die Luziferaseaktivität via Microplate-Luminometer (Berthold
Technologies, Deutschland) gemessen.
3.10. Bleomycin-induzierte Hautfibrose
VDR-/--Mäuse mit dem genetischen Hintergrund C57/Bl6 wurden bereits beschrieben
(46). Als Kontrollen dienten Wurfgeschwister vom Wildtyp C57/Bl6 (VDR+/+).
Die
Hautfibrose
wurde
in
6
Wochen
alten
Mäusen
durch
lokale
Bleomycininjektionen herbeigeführt. Die Bleomycingaben erfolgten jeden zweiten
Tag über einen Zeitraum von 4 Wochen (47, 48). Bei den Kontrollmäusen injizierte
man subkutan Kochsalzlösung. Die Mäuse wurden nach 4 Wochen durch zervikale
Dislokation getötet.
16
3.11. TβRI-induzierte Hautfibrose
Replikationsdefiziente Adeno-assozierte-Viren (AAVs), welche den konstitutiv
aktiven TGF-β-Rezeptor Typ I (AdTBR) kodieren, wurden zur Induktion von
Hautfibrose in die Haut von C57/Bl6 Mäusen injiziert (49, 50). Das Einbringen der
AAVs erfolgte bei 4 Wochen alten Mäusen intrakutan in ausgewählte Bereiche des
oberen Rückens an Tag 1 und Tag 28. Die Mäuse wurden nach 8 Wochen durch
zervikale Dislokation getötet.
3.12. Behandlung mit Paricalcitol
Paricalcitol (Zemplar; 5 µg/ml; Abbott) wurde in einer Dosis von 0.3 µg/kg in
fibrotische Hautareale injiziert. Die Behandlung begann gleichzeitig mit den
Bleomycin- oder TβRI-Injektionen und setzte sich in der Beobachtungsperiode fort.
3.13. Histologische Analyse
Aus dem oberen Rückenbereich wurden ca. 1 cm2 große Hautproben entnommen, in
4% Formalinlösung fixiert und in Paraffin eingebettet.
Es folgte die Fertigung 5 μm dicker Schnitte, die Deparaffinierung mit Xylol und
Rehydratisierung mit Isopropanol der Konzentrationen 98%-70%. Anschließend
wurden die Schnitte 10 min mit Hämatoxylin und 3 min mit Eosin gefärbt, nach
kurzer Rückreihe in 70%-100% Isopropanol und 2 minütigem Xylolbad mit Histokitt
versiegelt.
Die Hautdicke ermittelte man mit einem Nikon-Eclipse-80i-Mikroskop (Nikon,
Badhoevedorp, Niederlande) in 100-facher Vergrößerung. Dabei wurde die Strecke
zwischen der epidermal-dermalen Grenzfläche und der dermal-subkutanen Fettzone
bestimmt. Die Auswertung der fibrotischen Hautbereiche erfolgte in drei
aufeinanderfolgenden Schnitten (51).
17
3.14. Hydroxyprolin-Assay
Die Kollagenmenge in Hautproben wurde via Hydroxyprolin-Assay bestimmt
(52, 53).
Nach Verdauung der Stanzbiopsien (Ø 3mm) in 6 M HCl für 3 Stunden bei 120 °C
wurde der pH-Wert der Proben mit 6 M NaOH auf 6 eingestellt. Im Anschluss wurde
0.06 M Chloramine T zu jeder Probe hinzugefügt und bei Raumtemperatur für
20 Minuten inkubiert. Darauf erfolgte eine Beimischung von 3.15 M Perchlorsäure,
20% p-Dimethylaminobenzaldehyd und eine erneute Inkubation für 20 Minuten bei
60 °C.
Die Absorption wurde bei 557 nm mit einem SpectraMAX-190-MicroplateSpektrophotometer gemessen.
3.15. Quantifizierung der Myofibroblasten
Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Hautschnitte wurden mit anti-SMAAntikörpern (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) gefärbt. Als Sekundärantikörper dienten Spezies-spezifische IgGs, die mit Meerrettich Peroxidase (Dako,
Glostrup, Dänemark) markiert waren. Die Färbung wurde mit einer DABPeroxidase-Substratlösung
(Sigma-Aldrich)
dargestellt.
Es
erfolgte
eine
Gegenfärbung der αSMA-gefärbten Schnitte mit Hämatoxylin. Die Anzahl der
Myofibroblasten wurde unter 200-facher Vergrößerung von zwei unabhängigen
Untersuchern verblindet ausgewertet (54, 55).
3.16. Statistik
Die ermittelten Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler vom Mittelwert
dargestellt. Statistische Analysen basierten auf der studentischen T-Verteilung. Ein
P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant gewertet.
18
4. Ergebnisse
4.1. Verminderung der VDR-Expression bei SSc
Um die Rolle des VDR in der Pathogenese von SSc zu untersuchen, erfolgte
zunächst eine Analyse der VDR-Expression. Die mRNA-Spiegel des VDR-Gens
waren bei SSc-Patienten, verglichen mit Gesunden (p), welche bezüglich Alter und
Geschlecht den SSc-Patienten angepasst waren, um 88% reduziert (Abb. 1A).
Die verminderte VDR-Expression in SSc-Haut wurde durch Immunfluoreszenzmessung bestätigt. Eine Doppelfärbung mit dem Fibroblastenmarker Vimentin
zeigte, dass SSc-Fibroblasten besonders niedrige VDR-Spiegel exprimierten
(Abb. 1B).
Semiquantitative Analysen bestätigten die ausgeprägte Hemmung von VDR in SScFibroblasten im Vergleich zu Fibroblasten in gesunder Haut (Abb. 1C). Verminderte
VDR-Expression in kulturellen SSc-Fibroblasten wurde sogar nach zahlreichen
Zellpassagen in vitro aufrechterhalten, was auf einen intrinsischen Zellmechanismus
hinweist (Abb. 1D).
Auch in experimentellen Modellen bestätigte sich eine verminderte Expression von
VDR. Subkutane Bleomycin-Injektionen führten zu einer starken Reduktion der
mRNA- und Proteinspiegel von VDR in muriner Haut (Abb. 1E und F).
Die
Immunfluoreszenz
mit
Vimentin-Kofärbung
brachte
ein
ähnliches
Expressionsmuster in mit Bleomycin behandelten Mäusen hervor, wie in
menschlichen SSc-Patienten. Die VDR-Spiegel in Fibroblasten waren stark
vermindert (Abb. 1G).
19
20
Abb.1: Verminderung der VDR-Expression bei SSc und experimenteller Fibrose
A: Die mRNA-Spiegel von VDR sind in SSc-Haut verglichen mit gesunder Haut signifikant
vermindert (n = 5). B: Die Immunfluoreszenzfärbung für VDR mit Kofärbung für Vimentin und
DAPI zeigt eine geringere Färbung für VDR in SSc-Fibroblasten. Repräsentative Bilder sind in 200und 1000-facher Vergrößerung dargestellt. C: Semiquantitative Analysen bestätigen die Hemmung
von VDR-Protein in SSc-Haut-Fibroblasten (n = 10). D: Die Hemmung von VDR wird in kulturellen
SSc-Fibroblasten aufrechterhalten (n = 5) E; F: Die mRNA- (n = 6) (E) und Proteinspiegel (n = 5) (F)
21
von VDR sind in der Haut von mit Bleomycin behandelten Mäusen im Vergleich zu mit NaCl
behandelten Kontrollmäusen vermindert.
G: Verminderte VDR-Expression in Fibroblasten aus mit Bleomycin behandelten Mäusen.
Repräsentative Bilder gefärbt für VDR, Vimentin und DAPI sind in 200- und 1000-facher
Vergrößerung gezeigt.
4.2. Hemmung der VDR-Expression durch TGF-β
Folgend wurde der molekulare Mechanismus untersucht, welcher der Hemmung von
VDR bei SSc unterliegt. TGF-β gilt als Schlüsselfaktor für die Fibroblastenaktivierung bei fibrotischen Erkrankungen. SSc-Fibroblasten zeichnen sich durch
anhaltende endogene Aktivierung von TGF-β aus. Daher wurde angenommen, dass
TGF-β an einer verminderten VDR-Expression beteiligt ist. In der Tat zeigten
gesunde Hautfibroblasten unter fortdauernder TGF-β-Einwirkung signifikant
verminderte VDR-Spiegel (Abb. 2A).
Die Stimulation mit TGF-β bedingte einen anfänglichen VDR mRNA- und ProteinHöchststand. Jedoch zeigte sich bei fibrotischen Störungen unter Einwirkung von
chronisch erhöhten TGF-β-Mengen eine signifikante Verminderung. Nach 96
Stunden waren die Spiegel nahezu nicht mehr messbar (Abb. 2B).
Um die inhibitorischen Effekte von TGF-β in vivo zu bestätigen, analysierte man die
VDR-Spiegel in der Haut von TBRICA-überexprimierenden Mäusen. Mit den
Ergebnissen der in vitro Versuche übereinstimmend, waren die mRNA- und ProteinSpiegel von VDR in TBRICA-Mäusen, verglichen mit LacZ-Kontrollmäusen,
vermindert (Abb. 2C und D).
Die Immunfluoreszenzuntersuchung bestätigte die Hemmung von VDR in
Hautfibroblasten von TBRICA-Mäusen (Abb. 2F).
Um noch deutlicher hervorzuheben, dass die Verminderung von VDR bei SSc durch
TGF-β hervorgerufen wird, wurde die VDR-Expression im Bleomycin-Mausmodell
bewertet, wobei die Mäuse mit dem selektiven TGF-β-Rezeptor-Typ I-Inhibitor
SD-208 behandelt wurden. Die Applikation von SD-208 verhinderte die Bleomycininduzierte Hemmung von VDR (Abb. 2E). Dies deutet darauf hin, dass die TGF-βSignaltransduktion essentiell für die Hemmung von VDR in fibrotischer Haut
benötigt wird.
22
23
Abb 2: Verminderung der VDR-Expression durch permanente TGF-β Stimulation
A; B: Chronische Stimulation mit TGF-β resultiert in nachhaltiger Hemmung von VDR-mRNA
(n = 4) (A) und -Protein (B) nach anfänglichem Höchststand. C; D: Überexpression von TBRICA
reduziert signifikant die mRNA- (n = 5) (C) und Proteinspiegel (n = 5) (D) von VDR in muriner Haut.
E: Die Behandlung mit dem selektiven TBRI-Inhibitor SD-208 verhindert die Hemmung von VDRmRNA in Bleomycin-induzierter Hautfibrose (n = 5).
F: Verminderte Expression von VDR in Fibroblasten aus der Haut von TBRI CA-überexprimierenden
Mäusen. Repräsentative Bilder gefärbt für VDR, Vimentin und DAPI sind in 200- und 1000-facher
Vergrößerung dargestellt.
24
4.3. VDR als negativer Regulator der TGF-β-induzierten
Fibroblastenaktivierung
Um die funktionellen Auswirkungen der verminderten VDR-Expression zu
untersuchen, wurde die Expression von VDR in gesunden Hautfibroblasten durch
siRNA gehemmt. SiRNA gegen VDR reduzierte die VDR-Expression effektiv um
83% (p = 0.0049). Die Blockade des VDR-Gens verstärkte die Sensitivität von
Fibroblasten gegenüber den stimulierenden Effekten von TGF-β. Die stimulatorische
Wirkung von TGF-β auf col1a1-mRNA (Abb. 3A), die Kollagenfreisetzung (Abb.
3B) und die Bildung von Stressfasern (Abb. 3C) war in VDR-defizientenFibroblasten stärker ausgeprägt als in Fibroblasten, die mit nicht zielgerichteter
siRNA transfiziert waren.
Im Gegensatz dazu führte die Aktivierung der VDR-Signaltransduktion durch den
hochselektiven VDR-Agonisten Paricalcitol zu einer Inhibition der TGF-βSignalübertragung in Fibroblasten. Eine Behandlung von TGF-β-stimulierten
Fibroblasten mit Paricalcitol verhinderte die Hochregulierung von col1a1-mRNA
(Abb. 3D), die Freisetzung von Kollagen (Abb. 3E) und die Bildung von Stressfasern
(Abb. 3F). Jedoch veränderte Paricalcitol nicht die basale Kollagenexpression in
ruhenden Fibroblasten. Dies zeigt einen selektiven Zusammenhang zwischen
Paricalcitol und TGF-β-Signalweg.
25
26
Abb. 3: VDR als negativer Regulator der TGF-β-induzierten Fibroblastenaktivierung
A; B; C: SiRNA-vermittelte Blockade von VDR verstärkt die Sensitivität von Fibroblasten gegenüber
den profibrotischen Effekten von TGF-β mit erhöhtem Spiegel von col1a1-mRNA (n = 7) (A),
Kollagenprotein (n = 6) (B) und vermehrter Bildung von Stressfasern (C) nach Stimulation mit
TGF-β. Die Werte sind verglichen mit Fibroblasten, welche mit nicht zielgerichteter siRNA
transfiziert waren.
D; E, F: Die Behandlung mit dem VDR-Agonisten Paricalcitol verhindert TGF-β-vermittelte
Induktion von col1a1-mRNA (n = 6) (D), Kollagenprotein (n = 6) (E) und Bildung von Stressfasern
(n = 12) (F).
Um zu eruieren, ob VDR und Paricalcitol mit TGF-β über eine Regulation der
Smad-abhängigen Transkription interagieren, bediente man sich eines SmadReporter-Assays. Hierfür wurden humane Hautfibroblasten mit einem LuziferaseKonstrukt unter Kontrolle von vier Smad-Bindungs-Elementen (SBE) transfiziert.
Die
Behandlung
mit
Paricalcitol
verminderte
die
TGF-β-induzierte
Luziferaseaktivität signifikant um 52% (p = 0.0159), nicht aber die Basalaktivität des
Smad-Reporters (Abb. 4A). Übereinstimmend mit den Ergebnissen des SmadReporters, hemmte Paricalcitol auch die stimulatorischen Effekte von TGF-β auf die
Expression von Smad-Ziel-Genen wie PAI-1(Abb. 4B), Smad7 (Abb. 4C) und CTGF
(Abb. 4D).
Um zu testen, ob aktiviertes VDR zur Hemmung Smad-abhängiger Transkription
direkt mit Smad-Proteinen wechselwirkt, wurde eine Ko-Immunopräzipitation in
Fibroblasten durchgeführt. Die Fibroblasten überexprimierten VDR, welches mit
c-myc versehen war. Smad3 gilt als das zentrale rezeptorregulierte Smad (R-SMAD),
verantwortlich für die profibrotischen Effekte von TGF-β in Fibroblasten, weswegen
zunächst eine mögliche Verbindung zwischen VDR und Smad3 untersucht wurde.
27
In Abwesenheit von Paricalcitol interagierte VDR mit Smad3, nicht jedoch mit
pSmad3. Eine Aktivierung von VDR durch Paricalcitol induzierte die Bindung von
VDR mit pSmad3 und erhöhte auch die absoluten Smad3-Spiegel, welche mit VDR
ko-immunopräzipitiert waren. Daher wird angenommen, dass Paricalcitol die TGF-βSignaltransduktion hemmt, indem es die Bindung von VDR mit pSmad3 induziert
(Abb. 4E).
28
Abb. 4: Verhinderung der Smad3-abhängigen Transkription durch VDR
A: Die Inkubation mit Paricalcitol verhindert die stimulatorischen Effekte von TGF-β auf die
Luziferaseaktivität unter der Kontrolle von Smad-Bindungs-Elementen (SBE) (N = 5). B; C; D: Die
Behandlung mit Paricalcitol reduziert die Expression der prototypischen Smad-Zielgene PAI-1 (n = 6)
(B), Smad7 (n = 6) (C) und CTGF (n = 6) (D). E: Die Ko-Immunopräzipitation zeigt, dass Paricalcitol
die Bindung von VDR mit phosphoryliertem Smad3 in TGF-β-stimulierten Fibroblasten aktiviert.
4.4. Verbesserung der experimentellen Fibrose durch Paricalcitol
Als Nächstes wurden die antifibrotischen Effekte von Paricalcitol auf Bleomycininduzierte Hautfibrose beurteilt. Bleomycin-Injektionen stimulierten Leukozyteninfiltration und Kollagenakkumulation mit auffälliger Hautverdickung (Abb. 5A).
Die Behandlung mit Paricalcitol reduzierte effektiv die Bleomycin-induzierte
Fibrose. So wurden, verglichen mit den Kontrollmäusen, die Hautdicke
(-56%, p = 0.0009) (Abb. 5B), die Differenzierung von ruhenden Fibroblasten in
metabolisch aktive Myofibroblasten (-80%, p < 0.0001) (Abb. 5C), der
Hydroxyprolingehalt (-78%, p = 0.0209) (Abb. 5D) und die mRNA-Spiegel von
col1a1(-93%, p = 0.0231) (Abb. 5E) gesenkt.
Im Gegensatz zu den Effekten in Wildtypmäusen, welche normale VDR-Spiegel
exprimierten, wurde die Fibrose in VDR-defizienten Mäusen nicht durch Paricalcitol
vermindert (Abb. 5A-E). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die antifibrotischen
Effekte von Paricalcitol durch eine Aktivierung von VDR und nicht durch
unspezifische Effekte vermittelt werden.
29
30
Abb. 5: Verhinderung der Bleomycin-induzierten Hautfibrose durch Paricalcitol
Die Behandlung mit Paricalcitol verbessert die histologischen Eigenschaften der Fibrose (A), reduziert
die Hautdicke (B), verhindert die Differenzierung von ruhenden Fibroblasten in Myofibroblasten (C),
vermindert den Hydroxyprolingehalt (D) und normalisiert die mRNA-Spiegel von col1a1 (E) in
Wildtypmäusen, nicht jedoch in VDR-defizienten Mäusen. Repräsentative Bilder von Trichromgefärbten Schnitten sind in 200- facher Vergrößerung in (A) (N = 6-8 pro Gruppe) dargestellt.
Um Paricalcitol in einem anderen Modell mit abweichendem Pathomechanismus zu
beurteilen, erstellte man das Mausmodell der TBRICA-induzierten Fibrose. Eine
Behandlung mit Paricalcitol zeigte potente antifibrotische Effekte (Abb. 6A),
signifikant eingeschränkte, durch TBRICA verursachte Hautverdickung (-46%,
p = 0.0079) (Abb. 6B), verminderte Myofibroblastendifferenzierung (-70%, p =
0.0013) (Abb. 6C), reduzierten Hydroxyprolingehalt (-77%, p = 0.0172) (Abb. 6D)
und mRNA-Spiegel von col1a1 (-91%, p = 0.0222) (Abb. 6E).
31
Abb. 6: Verbesserung der TBRICA-induzierten Hautfibrose durch Paricalcitol
Paricalcitol reduziert TBRICA-induzierte Hautfibrose (A), Hautdicke (B), Myofibroblastendifferenzierung (C), Hydroxyprolingehalt (D) und col1a1-mRNA (E).
Repräsentative Bilder von trichromgefärbten Schnitten sind in 200-facher Vergrößerung in (A) (n = 6
pro Gruppe) dargestellt.
Paricalcitol wurde in antifibrotischen Dosen gut vertragen. In klinischen
Untersuchungen und in der Autopsie ergab sich kein Hinweis auf Toxizität.
32
Abb. 7: Schema der Rolle von VDR und Effekte von Paricalcitol auf die TGF-βSignaltransduktion in Fibroblasten
(A) Ruhende Fibroblasten in Abwesenheit von TGF-β: Hohe VDR-Spiegel. Smad3 ist im Zytoplasma
lokalisiert und nicht phosphoryliert. (B) Aktivierte Fibroblasten unter TGF-β-Einfluss: Verminderte
VDR-Spiegel. Smad3 ist phosphoryliert, transloziert in den Zellkern und stimuliert die Transkription
von col1a1 und anderen profibrotischen Genen. (C) Aktivierte Fibroblasten, behandelt mit
Paricalcitol: Paricalcitol aktiviert VDR, welches mit phosphoryliertem Smad3 bindet. Die Bindung
von VDR beeinträchtigt die Transkriptionsaktivität von Smad3 und verhindert die Transkription von
col1a1 und anderen TGF-β/ Smad-Zielgenen.
33
5. Diskussion
Die vorliegende Studie beschreibt eine massive Verminderung der VDRSignalübertragung bei SSc mit stark verminderten Expressionsspiegeln von VDR in
SSc-Fibroblasten und entsprechenden Mausmodellen.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die VDR-Reduktion durch TGF-β
vermittelt ist.
Eine permanente Aktivierung des TGF-β-Signalwegs vermindert die Expression von
VDR. Die selektive Hemmung der TGF-β-Signalkaskade verhindert hingegen eine
Herabregulierung von VDR bei experimenteller Fibrose.
Entsprechend der endogenen Aktivierung der TGF-β-Signaltransduktion in
kulturellen SSc-Fibroblasten und den hemmenden Effekten von TGF-β auf VDR,
sind die VDR-Spiegel in kulturellen SSc-Fibroblasten auch nach mehreren
Zellpassagen reduziert (56).
Jedoch ist die VDR-Signalübertragung nicht nur auf Ebene des Rezeptors gestört.
Auch Vitamin D3, der Vorläufer des endogenen Liganden 1,25-(OH)2D3, ist bei SSc
vermindert. Zahlreiche unabhängige Studien aus verschiedenen Ländern mit mehr als
1000 SSc-Patienten berichten von signifikant erniedrigten Vitamin D3-Spiegeln bei
SSc-Patienten (23, 25-29). Darüber hinaus wird eine verminderte VDR-Signaltransduktion indirekt durch die hohe Prävalenz von Osteopenie und Osteoporose bei
SSc-Patienten unterstützt (29, 57, 58). Diese Daten bestätigen die These der
beeinträchtigten VDR-Signalkaskade bei SSc.
Die
vorliegende
Studie
identifiziert
VDR
als
negativen
Regulator
der
Fibroblastenaktivierung, welcher die profibrotischen Effekte von TGF-β mindert.
Aktiviertes VDR bindet an phosphoryliertes Smad3, einen zentralen Vermittler des
TGF-β-Signalwegs in Fibroblasten und blockiert die Smad-abhängige-Transkription.
Die verminderte VDR-Expression bei SSc in Kombination mit erniedrigten Vitamin
D3-Spiegeln verschlechtert die regulatorischen Effekte des VDR-Signalwegs und
verstärkt die Sensitivität von SSc-Fibroblasten gegenüber den profibrotischen
Effekten von TGF-β. In der Tat zeigen sich gesunde Fibroblasten sensitiver
gegenüber TGF-β und setzen bei Blockade des VDR-Gens mehr Kollagen frei.
Die Ergebnisse werden durch klinische Beobachtung unterstützt. Eine aktuelle Studie
zeigt eine inverse Korrelation von Serum-Vitamin D3-Spiegel und modifiziertem
34
Rodnan-Haut-Score (23). Dadurch wird die kausale Beziehung zwischen gestörter
VDR-Signaltransduktion und Fibrose bei SSc weiter betont.
Der gleichzeitige Mangel von VDR und seinem Liganden in Fibroblasten lässt
vermuten, dass eine Supplementierung mit Standarddosen von Vitamin D3 nicht
genügt, um die VDR-Signalkaskade bei SSc zu normalisieren. Tatsächlich konnte
eine Ergänzung mit Vitamin D-Standarddosen die niedrigen Vitamin D-Spiegel nicht
korrigieren und normale VDR-Signaltransduktion bei SSc-Patienten wiederherstellen
(30). Sehr hohe Dosen von Vitamin D3 oder 1,25-(OH)2D3 dürften andererseits mit
Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie als dosislimitierende Nebenwirkungen
einhergehen.
Diese Probleme können durch den Gebrauch von neuen synthetischen VDRAgonisten wie Paricalcitol minimiert werden. Paricalcitol aktiviert VDR potenter als
1,25-(OH)2D3 und bringt signifikant niedrigere Risiken durch Hyperkalzämie und
Hyperphosphatämie mit sich.
In der Tat werden antifibrotische Dosen von Paricalcitol gut toleriert, ohne
Anzeichen von Toxizität in klinischer Beobachtung und Autopsie. Eine ParicalcitolSubstitution reaktiviert die VDR-Signalübertragung in SSc-Fibroblasten, hemmt die
Smad-abhängige Transkription und vermindert in vitro die profibrotischen Effekte
von TGF-β auf Fibroblasten.
Paricalcitol
verbessert
effektiv
die
Fibrose
in
zwei
Mausmodellen
mit
unterschiedlichen zugrundeliegenden Pathologien, die verschiedene Stadien der SSc
repräsentieren. Zunächst die Bleomycin-induzierte Fibrose, welche als Modell für
frühe, inflammatorische Stadien dient und schließlich die TBRICA-induzierte Fibrose
als ein Modell für spätere, nicht inflammatorische SSc-Stadien mit endogener
Aktivierung von ansässigen Fibroblasten (59).
Desweiteren dürften sich VDR-Agonisten auch in der Behandlung von anderen
fibrotischen Erkrankungen als effektiv erweisen.
Tatsächlich wurde erst vor Kurzem entdeckt, dass VDR-Agonisten eine Aktivierung
der hepatischen Sternzelle bei Leberzirrhose und die sog. Epithelial-to-Mesenchymal
Transition, also die Ausbilung mesenchymaler Charakteristika bei Epithelzellen, in
Experimenten mit Nierenfibrose verhindern (60-62).
Obwohl es weiterer Studien in zusätzlichen Modellsystemen bedarf, zeigen diese
Ergebnisse, dass Paricalcitol starke antifibrotische Effekte in verschiedenen
Untergruppen und Stadien von SSc und anderen fibrotischen Erkrankungen aufweist.
35
Unsere Ergebnisse haben direkt translationale Konsequenzen, da Paricalcitol für den
klinischen Gebrauch zugelassen ist. Es stehen zahlreiche andere VDR-Agonisten
unter klinischer Beobachtung, welche dem Paricalcitol in den antifibrotischen
Effekten sehr ähnlich sind, wie z.B. 20S-Hydroxyvitamin D3 (63).
Zusammenfassend wird gezeigt, dass VDR einen negativen Regulator des TGF-β/
Smad-Signalwegs in Fibroblasten darstellt. Gestörte VDR-Signaltransduktion mit
reduzierten Vitamin D3-Spiegeln und verminderter VDR-Expression resultiert in
einer Überempfindlichkeit von SSc-Fibroblasten gegenüber TGF-β und dürfte direkt
zur unkontrollierten Aktivierung von Fibroblasten beitragen. Im Gegensatz dazu
verhindert die Aktivierung von Paricalcitol die TGF-β-Signalübertragung und
verbessert experimentelle Fibrose.
Diese Ergebnisse könnten unmittelbar klinische Auswirkungen haben, wenn man die
Verfügbarkeit von gut tolerierbaren, nicht hypercalzämischen VDR-Agonisten
bedenkt.
36
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46
7. Abkürzungsverzeichnis
1,25-(OH)2D3
1,25-Dihydroxycholecalciferol
A
Adenin
AAV
Adeno-assoziierter Virus
ACR
American College of Rheumatology
BSA
bovine serum albumin
C
Cytosin
cDNA
komplementäre DNA
CMV
Cytomegalievirus
CTGF
connective tissue growth factor
DAB
Diaminobenzidin
DAPI
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
dcSSc
diffus kutane systemische Sklerose
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EZM
extrazelluläre Matrix
G
Guanin
HCl
Salzsäure
IgG
Immunglobulin G
lcSSc
limitiert kutane systemische Sklerose
MCTD
mixed connective tissue disease
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NaOH
Natronlauge
PAH
pulmonal arterielle Hypertonie
PBS
phosphate buffered saline
PDGF
platelet derived growth factor
pSMAD
phosphoryliertes SMAD
PVDF
Polyvinylidenfluorid
qRT-PCR
quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
R-SMAD
rezeptorreguliertes-SMAD
SBE
smad binding element
siRNA
small interfering RNA
SLE
systemischer Lupus erythematodes
47
SMA
smooth muscle actin
SS
Sjögren-Syndrom
SSc
systemische Sklerose
TBRICA
konstitutiv aktiver TGF-β-Rezeptor I
U
Uracil
VDR
Vitamin D-Rezeptor
48
8. Lebenslauf
Persönliche Angaben:
Name:
Stefan Vollath
Geburtsdatum:
12.07.1985
Geburtsort:
Passau
Heimatadresse:
Lindenbergweg 5, 94113 Tiefenbach
E-Mail:
[email protected]
Vater:
Hubert Vollath, Dipl. Ing. (FH)
Mutter:
Berta Vollath, Kinderkrankenschwester
Schwester:
Veronika Vollath, Studium der Humanmedizin
Ausbildung:
1996 – 2005
Auersperg-Gymnasium Passau
2005 – 2006
Ersatzwehrdienst im Klinikum Passau
04/2007 – 03/2009
Vorklinischer Ausbildungsabschnitt an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Abschluss mit dem Ersten Abschnitt der
Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
Note: 2,0
04/2009 – 01/2012
Klinischer Ausbildungsabschnitt an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
02/2012 – 01/2013
Praktisches Jahr mit den Tertialen:
Chirurgie
(Karapitiya Teaching Hospital-Sri
Lanka; Kantonspital Leuggern-Schweiz)
04/2013 – 06/2013
Innere
(Universitätsklinikum Erlangen)
Orthopädie
(Universitätsklinikum Erlangen)
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach
ÄAppO 2002
Note: 1,5
49
9. Danksagung
Ich bedanke mich sehr herzlich bei meinem Doktorvater Herrn PD Dr. med. Jörg
Distler für die freundliche Überlassung des Themas und die Unterstützung bei der
Dissertation. Die exzellente, fürsorgliche und freundschaftliche Betreuung hat im
Wesentlichen zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Bei Herrn Prof. Dr. med. Georg Schett, Direktor der Medizinischen Klinik III,
bedanke ich mich für die sehr guten Rahmenbedingungen dieser Studie.
Ein ganz persönlicher Dank gilt meinem Freund und Projektkollegen Pawel Zerr für
die wertvolle und erfolgreiche Zusammenarbeit.
Besonders möchte ich mich bei Katrin Palumbo-Zerr und den weiteren Mitarbeitern
unseres Laborteams bedanken, die mich stets motiviert und ihre umfangreichen
Kenntnisse an mich weitergegeben haben.
Darüber hinaus danke ich all jenen, die mit Rat und Unterstützung an dieser Arbeit
mitgewirkt haben.
Ein herzliches „Vergelt's Gott“ meiner Familie für die liebevolle Begleitung auf
meinem bisherigen Weg.