Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie (Direktor: Univ
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Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie (Direktor: Univ.- Prof. Dr. K.-J. Klebingat) und dem Institut für Anatomie und Zellbiologie (Direktor: Univ.- Prof. Dr. Karlhans Endlich) der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Immunhistochemische Untersuchungen von molekularen Markern der Metastasierung am Peniskarzinom des Menschen Inaugural - Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2008 vorgelegt von: Christoph Kakies geb. am: 30.05.1980 in: Greifswald Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Kroemer 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Klebingat, Greifswald 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Schubert, Jena Ort, Raum: Urologie Greifswald, Seminarraum Tag der Disputation: 12.01.2009 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ix 1 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.4 1.5 1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.7 1.7.1 1.7.1.1 1.7.2 1.8 Einleitung Epidemiologie Pathologie Klassifikationsysteme des Peniskarzinoms Grading Staging Prognose Molekulare Marker Caspasen Zelltod Effektorcaspase 3 Effektorcaspase 6 Metastasensuppressorgene Tetraspanine KAI1/CD82 Nm23-H1 Ziele der Arbeit 1 2 2 3 3 4 5 6 7 8 9 10 10 11 11 14 17 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.2.4 2.2.4.1 2.3 Material und Methoden Material Gewebe Antikörper und Immunhistochemie Chemikalien Geräte Methoden Herstellen von Paraffinschnitten und Entparaffinieren Hämatoxylin-Eosin-Färbung Immunhistochemie Durchführung Auswertung der Immunreaktion Kontrollreaktionen in der Immunhistochemie TUNEL-Methode Durchführung Statistik und Software 18 18 18 19 19 21 21 21 22 22 22 23 24 24 25 26 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 Ergebnisse Klinische Parameter Alter Pathologischer Befund Tumorausdehnung (T-Stadium) und klinischer Verlauf Regionaler Lymphknotenstatus (N-Stadium) und klinischer Verlauf Fernmetastasen (M-Stadium) und klinischer Verlauf Differenzierung (Grading) und klinischer Verlauf Stadium nach WHO und klinischer Verlauf Übersicht TNM, Grade & Stadium mit zugeordnetem Level Tumorausbreitung bei Diagnose 28 28 29 29 29 30 30 30 30 31 31 Inhalt 3.1.10 3.15 Korrelation von TNM-Klassifikation, Differenzierung, Tumorstadium und klinischem Verlauf Immunhistochemische Ergebnisse Lokalisation von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3 und 6 in den Penistumoren Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion Apoptosenachweis an Paraffingewebeschnitten Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 3 mit der TUNEL-Methode Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 6 mit der TUNEL-Methode Korrelation der Immunreaktivität für die KAI1 mit der TUNEL-Methode Korrelation der klinikopathologischen Befunde mit den immunhistochemischen Befunden Korrelation der KAI1-Expression mit klinikopathologischen Parametern Korrelation der nm23-H1 Expression mit klinikopathologischen Parametern Statistischer Vergleich der Immunreaktion für KAI1 und nm23-H1 mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen Koexpression von nm23 und KAI1 Korrelation der Effektorcaspase-3-Immunreaktion mit klinikopathologischen Parametern Korrelation der Effektorcaspase-6-Immunreaktion mit klinikopathologischen Parametern Statistischer Vergleich der Immunreaktion für Effektorcaspase 3 und 6 mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen Prädiktive Faktoren für die Metastasierung Risikoeinteilung für Lymphknotenmetastasen Risikoeinteilung nach Solsona für LK-Befall mit Überlebensstatistik Risikoeinteilung nach EAU für LK-Befall mit Überlebensstatistik Prognose Nodalstatus und Prognose Korrelation von Nodalstatus und Überlebenszeit Korrelation der KAI1 Expression mit der Überlebenszeit Korrelation der nm23 Expression mit der Überlebenszeit Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Expression beider Proteine im Tumor Überlebenskurven für die Reaktivität der Antikörper nm23/KAI1 Korrelation der Effektorcaspase 3 und 6 Expression mit der Überlebenszeit Ergebnisse des Cox’schen Regressionsmodells für das Überleben 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.2 4.3 Diskussion Klinische Tumorparameter und Prognose Lokale Tumorausdehnung Grading Metastasierung Risiko-Einteilungen KAI1 Nm23-H1 3.2 3.2.1 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.13.1 3.13.2 3.14 3.14.1 3.14.1.1 3.14.2 3.14.3 3.14.4 3.14.4.1 3.14.5 32 33 36 40 40 43 44 45 45 46 49 51 51 52 53 54 55 57 58 58 58 59 59 60 61 61 62 62 62 63 63 63 64 65 65 66 70 Inhalt 4.4 Effektorcaspasen 3, 6 und TUNEL 73 5 Zusammenfassung 78 6 Literaturverzeichnis 80 7 Anhang 96 Abkürzungsverzeichnis 5-JÜR A.D. Abk. abs. AK AS ask1 ASP BCIP/NBT bcl-2 bd bxo bzw. CC cCasp(aspe) 3, 6 CD CIS CS DAB DARC DNA EAU EGF-R EQ Fa. FAK Fkt. GFs GTP HE HPV IHC IR KASP KCl kD Kitenin ksr KST LA LK L-SCC M MAP MAPK Mch 2 mind. MKK MMPs 5-Jahresüberlebensrate Aqua dest. Abkürzung absolut Antikörper Aminosäure apoptosis signal-regulating kinase 1 Asparaginsäure alkaline phosphatase chromogen kit B-cell lymphoma 2 bowen disease balatitis xerotica obliterans beziehungsweise Corpora cavernosa cleaved Caspase3, 6 cluster of differentiation Carcinoma in situ Corpus spongiosum Diaminobenzidin duffy antigen receptor for chemokines deoxyribonucleic acid european association of urology epidermal growth factor receptor Erythroplasie queyrat Firma fokale Adhäsionskinasen Funktion growth factors Guanosintriphosphat Hämatoxylin-Eosin humanes Papillomavirus Immunhistochemie Immunreaktivität KAI1/CD82 associated surface protein Kaliumchlorid Kilodalton KAI1 COOH-terminal interacting tetraspanin kinase supressor of ras krankheitsspezifischer Tod Lymphadenektomie Lymphknoten Larynxplattenepithelkarzinom Fernmetastasen Mitogen activated protein mitogen-activated protein kinases Untereinheit Caspase 6 mindestens Mitogen activated protein (MAP) kinase kinases Matrixmetalloproteinasen Abkürzungsverzeichnis MSG MW n N N+/NDPK neg. NF-IL6 NFkB NGF NSCLC O-SCC p53 Patn. PBS PET/CT PIN PK Pkt. PL pos. PSCC rac Rad ras Rho-GTPasen ROS RT s.o. SCC sd (std.dev.) SIL sog. src Syn. Tab. TdT tiam1 TM4SF TNF TNF-R TSG TUNEL UE UICC Vergr. Metastasensuppressorgene Molekulargewicht Anzahl nodale Metastasen nodal positiv/negativ nucleoside diphosphate kinase negativ nuclear factor for interleukin 6 nuclear factor-kappa B Nerve Growth Factor Nicht-Kleinzelliges-Lungenkarzinom orales Plattenepithelkarzinom Protein 53 Patienten phosphate-buffered saline Positronenemissionstomographie/ Computertomographie penile intraepitheliale Neoplasie Peniskarzinom Punkt prämaligne Läsion positiv penile squamous cell carcinoma Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Ras associated with diabetes „rat sarcoma“ Genprodukt Ras-related small GTPases Sauerstoffradikale Raumtemperatur siehe oben Plattenepithelkarzinom standart deviation squamous intrepithelial lesion sogenannte(s) „rous sarcoma virus“Gen-produkt Synonym Tabelle terminal deoxynucleotidyl transferase T-lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1 Tetraspanin-4-Superfamilie Tumornekrosefaktor Tumornekrosefaktor-Rezeptor Tumorsuppressorgene TdT-mediated dUTP nick end labeling Untereinheit Union internationale contre le cancer Vergrößerung Des Weiteren wurden die Einheiten des SI-Systems und die für den deutschsprachigen Raum gültigen Nomenklaturen für Namen und Formeln chemischer Verbindungen verwendet. 1 Einleitung Das Peniskarzinom (PK) ist mit einer Inzidenz von 1 Neuerkrankung pro 100.000 Männer im Jahr ein seltenes Malignom im europäischen Raum. Ätiologisch werden in Analogie zum Cervixkarzinom Kontaminationen mit humanen Papilloma-Viren 16 and 18 diskutiert. Nach der Therapie des Primärtumors stellt die Identifikation von Lymphknotenmetastasen ein besonderes Problem dar. So werden trotz moderner bildgebender Verfahren in etwa 20% der Fälle inguinale Mikrometastasen übersehen. Da die Vorhersagegenauigkeit für Metastasen auf Grundlage der klinischen Untersuchung in bis zu 50% der Fälle falsch positiv ist und eine radikale Lymphadenektomie mit einer sehr hohen Morbidität korreliert, ist eine genaue Indikationsstellung zur Lymphadenektomie von großer Bedeutung. Somit ist die Etablierung weitere prädikitiver Parameter für eine mögliche Lymphknotenmetastasierung wünschenswert. Aufgrund der geringen Inzidenz in Europa/ Nordamerika stellt sich die Datenlage zum Peniskarzinom sowie zu Prognoseparametern ausgesprochen unbefriedigend dar und legt weitere Untersuchungen zu prognostischen Markern nahe. Als interessante „Kandidaten“ zur Abschätzung einer möglichen Metastasierung erscheinen die Effektorcaspasen 3, 6 und insbesondere die Metastaseninhibitoren KAI1/CD82 sowie nm23-H1. Einleitung 2 1.1 Epidemiologie Das Peniskarzinom ist in den Industrieländern mit einer Inzidenz von 0,1 - 0,9 pro 100.000 Männern in Europa und 0,7 - 0,9 pro 100.000 amerikanischen Männern eine sehr seltene maligne Erkrankung. Asien, Afrika, und Südamerika sind mit einer Inzidenz von bis zu 19 pro 100.000 Männern die Spitzenreiter der Neuerkrankungsstatistik (Landis et al. 1999). In diesen Ländern macht das PK 10-20% der bösartigen Tumore bei Männern aus (Solsona et al. 2004). In Mecklenburg-Vorpommern betrug die Inzidenz 1,7/100.000 im Jahr 2002 (Gemeinsames Krebsregister Berlin, Brandenburg, M/V, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Sachsen, 2005). Für Deutschland werden etwa 600 Fälle pro Jahr geschätzt, wobei der Erkrankungsgipfel der Patienten die am Plattenepithelkarzinom des Penis (PSCC) erkranken zwischen der 5. und 7. Lebensdekade liegt. Nur in sehr seltenen Fällen wird das PK bei Kindern beobachtet (Culkin and Beer 2003) beobachtet. 1.2 Pathologie Nach der Herkunft unterscheidet man epitheliale, melanozytische, mesenchymale und hämatopoetischen Primärtumore. Als sekundäre Tumoren werden metastatische Absiedelungen, z.B. von Blase (häufig) und Prostata (zusammen >70% der Zweittumoren) bezeichnet, die oft die Copora cavernosa (CC) betreffen (Young et al. 2000). Das Plattenepithelkarzinom (Syn.: spinozelluläres Karzinom; Spinaliom; Stachelzellkrebs; Epithelioma spinocellulare; penile squamous cell carcinoma) ist mit 90-95% die häufigste Entität der Tumoren des Penis (Young et al. 2000). Das klassische PSCC hat wenig papilläre Bestandteile. Es ist gut bis mittelgradig differenziert und setzt sich aus irregulären nest- und/oder fingerförmigen Mustern von malignen, plattenepithelialen Zellen zusammen. Das Tumorstroma weist z.T. eine kollagene Bindegewebsmatrix (Desmoplasie) mit z.T. inflammatorischen Zellen auf, wobei gelegentlich glykogenreiche, klare Zellen auftreten. Schlecht differenzierte Karzinome sind selten und in der Mehrzahl im Penisschaft lokalisiert. Eine Keratinanhäufung (Hornperlen) wird oft in Verbindung mit gut bis mäßig differenzierten Tumoren gesehen. Eine starke Akantholyse (Verlust des Zusammenhaltes der Stachelzellschicht) in Neoplasien vom „high-grade“ wird als ein pseudoglanduläres (adenoides) Erscheinungsbild sichtbar (Young et al. 2000). Einleitung 3 Die Wachstumsmuster des PSCC sind sehr variabel (superfizial spreitend, vertikal wachsend, verrukiform, multizentrisch) und wegen ihres Einflusses auf das Tumor-Stadium prognostisch bedeutend (Solsona et al. 2004). Tabelle 1.1: WHO Klassifikation von Tumoren des Penis (Classification of Tumours, 2004, S.280, (Wittekind and International Union Against Cancer 2004) WHO Klassifikation von Tumoren des Penis Maligne epithliale Tumoren klassisches Platenepithelzellkarzinom Basaloides Karzinom Warziges Karzinom Papilläres Karzinom Sarkomatöses Karzinom Gemischtzelliges Karzinom Adenomsquamöses Karzinom Merkel-Zell Karzinom Kleinzelliges Karzinom Typus Talgdrüsen Karzinom Klarzell Karzinom Basalzell Karzinom vom neuroendokrinen Vorläufer-Läsionen Intraepithliale Neoplasie Grade III (PIN,CIS) Morbus Bowen Erythroplasie Queyrat (EQ) Morbus Paget (BD) Melanozytische Tumoren Melanozytische Naevi Melanome Mesenchymale Tumoren Hämatopoetische Tumoren Zweit-Karzinom 1.3 Klassifikationsysteme des Peniskarzinoms 1.3.1 Grading Das klassische Grading (Malignitätsgradeinteilung) für invasive Plattenepithelkarzinome basiert auf dem Grad der Zelldifferenzierung wie es die Einteilung in Tabelle 1.2 wiedergibt. Ein von Maiche et al. (1991) vorgestelltes, optionales Klassifikationssystem für PSCC beruht auf dem Grad der Keratinisierung (Keratinperlen), der Mitoseaktivität, Zellatypien und der Beschreibung von entzündlichem Zellinfiltrat. Cubilla et al. (2000) kombiniert das klassische Grading mit der anatomischen Invasionszone in Absicht Lymphknotenmetastasen besser vorauszusagen. Tabelle 1.2: Differenzierungsgrade des Peniskarzinoms nach UICC (Sobin et al. 2002) Merkmale GX G1 G2 G3 G4 Differenzierungsgrad nicht bestimmbar hohe Differenzierung mäßige Differenzierung geringe Differenzierung undifferenziert Grad nach Broders Anteil undifferenz. Tumorzellen Grad I Grad II Grad III Grad IV <25% <50% ≤75% >75% Einleitung 4 1.3.2 Staging Zwanzig Jahre nachdem die erste TNM-Einteilung veröffentlicht wurde, kam es 1987 zur Vereinheitlichung der TNM Klassifikationen durch die UICC (International Union Against Cancer)/AJCC (American Joint Committee for Cancer), die bis 2008 besteht. Diese Einteilung beruht auf einer Beschreibung von klinischen und histologischen Erscheinungen, die durch körperliche Untersuchung, diagnostische Bildgebung (Ultraschall, MRT) und zyto-/ histologische Methoden gewonnen werden, um die Tiefeninvasion exakt zu erfassen (Frimberger et al. 2002) und um mit einer Stadieneinteilung ein prognostisches Hilfsmittel im Hinblick auf die Therapie zu etablieren (Tab. 1.3). Tabelle 1.3: WHO Klassifikation von Penistumoren (WHO Classification of Tumours, 2004, S.280) TMN Stadieneinteilung von Tumoren des Penis T-Primärtumor TX Nicht beurteilbar T0 Kein Hinweis auf Primärtumor Tis Carcinoma in situ (BD, EQ) Ta Nicht-invasivives verrucöses Karzinom T1 Tumor invadiert das subepitheliale Bindegewebe T2 Tumor invadiert die Corpora cavernosa T3 Tumor invadiert die Urethra oder die Prostata T4 Tumor invadiert andere umliegende Strukturen N-Regionale Lymphknoten NX Nicht beurteilbar N0 Kein Hinweis auf regionale Lymphknoten Beteiligung N1 Metastase in einzelnem oberflächlichem LK N2 Metastase in multiplen oder bilateralen oberflächlichen LK N3 Metastasen in tiefen inguinalen oder pelvinen LK, uni-/bilateral M-Fernmetastase MX Nicht beurteilbar M0 Kein Hinweis auf Fernmetastase M1 Fernmetastase Stadieneinteilung Stage 0 Tis Ta Stage I T1 Stage II T1 T2 Stage III T1, T2 T3 Stage IV T4 jedes T jedes T N0 N0 N0 N1 N0, N1 N2 N0,N1,N2 jedes N N3 jedes N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 Abk.: BD-Bowen Disease; EQ-Erythroplasia Queyrat; LK-Lymphknoten 1.4 Prognose Die Anwesenheit und Ausdehnung der inguinalen LK-Beteiligung ist der wichtigste Prognosefaktor für das Überleben von Männern mit invasivem PSCC (Johnson and Lo 1984; McDougal et al. 1986; Ornellas et al. 1994; Ravi 1993; Srinivas et al. 1987). Der Differenzierungsgrad des Primärtumors (Cubilla et al. 1993; Hall et al. 1998; Solsona et al. 2001) und die Tiefe der Invasion (Corpus spongiosus,CS; Corpora cavernosa,CC; Urethra) sind die wichtigsten prädiktiven Faktoren für die metastatische Streuung (Chiu et al. 1998; Einleitung 5 Heyns et al. 1997; Horenblas et al. 1993; Lummen et al. 1997; McDougal et al. 1986) und somit Parameter für die Selektion von Patienten zur frühen Lymphadenektomie (LA) (McDougal 1995; Solsona et al. 2001). Weiter wurden Einflussgrößen wie Tumorstadium, Wachstumsmuster (superfizial, vertikal), Tumorlokalisation, Invasion der Corpora cavernosa, lymphatische und venöse Embolisation als signifikante Vorhersageparameter bestimmt (Emerson et al. 2001; Lopes et al. 1996; Lummen et al. 1997; Pizzocaro et al. 1997; Slaton et al. 2001; Villavicencio et al. 1997). Unterschiedliche Faktoren wie histologischer Subtyp, Tumordicke, nukleäres Grading, Mitoserate, DNA-Ploidie, HPV-Anwesenheit, monozytäre sowie eosinophile Infiltration dagegen können nicht als verläßliche prädiktive Parameter herangezogen werden (Bezerra et al. 2001; Emerson et al. 2001; Hall et al. 1998; Slaton et al. 2001; Solsona et al. 2001; Villavicencio et al. 1997). Für nicht-verruköse (s.o.) Neoplasien besteht eine Korrelation zwischen Größe und Agressivität. Tumoren der Vorhaut sind weniger aggressiv als die der Glans oder des Sulcus coronarii. Die aggressive Natur von Tumoren des Sulcus steht in Beziehung mit der Neigung zur Invasion der Buck-Faszie (Faszia penis profunda), welche durch ihre reiche Vaskularisation eine Metastasierung begünstigt. Die Prognose beim verrukösem Tumor ist günstig, beim superfizial-spreitendem Wachstum mäßig (35% LK-Metastasen) und beim vertikalem Wachstum äußerst schlecht (bis 100% LKMetastasen) (Villavicencio et al. 1997; Young et al. 2000). Patienten mit verruköser Ausprägung des PSCC haben somit eine gute und die mit warziger, papillärer Morphologie eine etwas schlechtere Prognose. Stärker überwacht werden sollten Erkrankte mit nichtpapillärem PSCC (klassisch). Die schlechteste Prognose liegt beim basaloidem, sarkomatoidem Karzinom vor (MacLennan et al. 2003). Die beobachtete Inzidenz für lymphatische Metastasen, bei unterschiedlichem Grading (Differenzierung), lag zwischen 4-24% für Grad I, 46-79% für Grad II und 82-100% für Grad III PSCCs (Fraley et al. 1989; Horenblas and van Tinteren 1994; Solsona et al. 1992). Solsona et al. (1992) stellten zur genaueren Beurteilung der Lymphknotenmetastasen Risikogruppen aus einer Kombination von pathologischem Stadium und histologischem Differenzierungsgrad auf. 1) niedriges Risiko: T1G1 Tumoren 2) mittleres Risiko: T1G2-3 & T2G1 Tumoren 3) hohes Risiko: T2G2-3 oder ≥T3 Tumoren Einleitung 6 Eine LK-Beteiligung wurde in Gruppe 1 mit 0%, in Gruppe 2 mit 33% und in Gruppe 3 mit über 83% beziffert (Solsona et al. 2001). Die abgewandelte Form dieser Einteilung stellt die Risikoeinteilung der EAU dar. Bei dieser gibt es nur eine Formel für die mittlere Risikogruppe (T1G2), darüber bzw. darunter hat der Betroffene ein höheres oder niedrigeres Risiko (Solsona et al. 2004). Die Ergebnisse dieser Einteilung scheinen das Risiko einer LKBeteiligung besser zu bestimmen als die ürsprüngliche Einteilung Solsona’s. Weiter scheint ein Zusammenhang zwischen Anzahl der beteiligten Lymphknoten und der Mortalität zu bestehen. So steigt die Sterblichkeit falls mehr als zwei LK (≥N2) beteiligt sind, was sich in der 5-Jahres-Überlebensrate (5-JÜR) widerspiegelt. Verschiedene Arbeiten stellten für dieses Patientenkollektiv 5-JÜR’en zwischen 7-50% fest (Fossa et al. 1987; Fraley et al. 1989; Horenblas et al. 1993; Ravi 1993; Solsona et al. 1992). Die Möglichkeit einer pelvinen LK-Beteiligung lag bei 23%, wenn drei oder weniger LK beteiligt und bei bis zu 56%, falls mehr als 3 regionäre LK tumorpositiv waren (Ornellas et al. 1994; Ravi 1993). Sofern es zur pelvinen LK-Beteiligung kam, sank die 5-JÜR auf weniger als 5% ab (Ravi 1993; Srinivas et al. 1987). 1.5 Molekulare Marker Molekulare Marker sind derzeit beim Peniskarzinom nicht etabliert. Als prognostische Faktoren werden sie untersucht, aber klinisch-praktisch nicht verwendet. In einer Arbeit von Lopes et al. wurde eine signifikante Beziehung der Expression von p53 mit LK-Metastasierung und Langzeitüberleben beim PK berichtet (Lopes et al. 2002). Eine weitere Studie zeigte ebenfalls einen signifikanten Zusammenhang der p53-Expression und LK-Metastasen des PK auf (Martins et al. 2002). In verschiedenen Publikationen sind außerdem Interaktionen von Regulatoren der Apoptosemaschinerie wie p53 mit KAI1 (Liu and Zhang 2006), nm23-H1 (Chakravarti and Hong 2003; Rahman-Roblick et al. 2007) und Effektorcaspasen (Vaghefi et al. 2004) beschrieben worden. Auch wurde gezeigt, dass bei Fehlen des Proteins KAI1 der Körper nicht mehr vor einer metastatischen Absiedlung von Tumorzellen durch einen Mangel an induzierbarer Apoptose geschützt ist (Schoenfeld et al. 2004). Darüber hinaus besteht ein Zusammenhang zwischen einer starken Ki67 Expression, der Metastasierung und dem Überleben (Berdjis et al. 2005; Protzel et al. 2007). Außerdem scheint bei erhöhten Konzentrationen des Tumor-assoziierten Serum- Glykoproteins SCC-Ag die Häufigkeit von LK-Metastasen zu steigen. Allerdings existiert nur eine neuere Studie zum PSCC mit lediglich 11 Patienten (Laniado et al. 2003). Einleitung 7 1.6 Caspasen C-asp-asen (engl.: cysteinyl-aspartate-cleaving-proteases; Proteasen mit Cystein-Rest im katalytischen Zentrum) werden als Bezeichnung für die ICE/CED-3 Familie von CysteinProteasen verwendet. Diese Proteasen haben die Eigenschaft, ihre Substrate nach der Aminosäure Aspartat zu spalten. Die Proteasen der Caspase-Familie spielen eine zentrale Rolle in der Apoptose, bei Entzündungen, aber auch bei Proliferation, der Kontrolle des Zellzyklus und des Zellüberlebens (Fan et al. 2005; Garrido and Kroemer 2004; Lamkanfi et al. 2007; Los et al. 2001; Schwerk and Schulze-Osthoff 2003). Bis heute sind 15 Mitglieder der Caspasen-Familie beschrieben worden, wobei 11 von ihnen (Casp 1-10 & 14) in menschlichen Zellen exprimiert werden (Eckhart et al. 2005). Die humanen Caspasen 2, 8, 9 und 10 sind Initiatoren einer proapoptotischen proteolytischen Kaskade (Initiator-Caspasen), die als Ergebnis die Aktivierung der sog. ApoptoseVollstrecker-Proteasen, Caspasen 3, 6 und 7 (Effektor-Caspasen), bewirken. Diese zur Todesmaschinerie der Zelle gehörenden Caspasen können die Apoptose entweder über externe Stimuli im extrinischen/todesrezeptorvermittelten intrinsischen/mitochondrienvermittelten Signalweg oder über einen einleiten. Caspasen liegen zum Schutz der Zellen als inaktive Vorstufen (Pro-caspasen/ Zymogene) vor. Aktiviert werden sie durch Autoaktivierung, Transaktivierung oder Proteolyse durch andere Proteasen (Ashkenazi and Dixit 1998; Martin et al. 1998; Muzio et al. 1998; Orth et al. 1996; Srinivasula et al. 1998; Yang et al. 1998; Yang et al. 1998). Die Procaspasen (30-50kD) bestehen aus 3 Domänen, einer NH2-terminalen Prodomäne, einer kleinen Untereinheit (UE) p10 und einer großen UE p20 (Cohen 1997; Cryns and Yuan 1998; Nicholson and Thornberry 1997). Aktivierte Caspase-3 zerschneidet bspw. die Apoptoseinhibitoren Bcl-2/ Bcl-XL und hebt somit ihre anti-apoptotischen Wirkungen auf. Außerdem werden C-terminale Fragmente freigelegt, die pro-apoptotisch wirken (Wolf and Green 1999). Ein weiterer wichtiger Schritt der Apoptose ist die Zerschneidung von ICAD (inhibitor of caspase-activated DNase) durch Caspase-3, wodurch die aktive CAD (caspase-activated DNase) freigesetzt und die DNA der betreffenden Zelle degradiert und kondensiert wird. Auch der Reparaturmechanismus der DNA wird durch Caspase-3-abhängige Spaltung der PARP [poly (adp-ribose) polymerase] inhibiert. Caspase-6 ist von Bedeutung beim Zerschneiden von nukleärem Lamin A, das als Intermediärfilament einen fibrösen Mantel zwischen innerer Kernmembran und dem Chromatin bildet. Es spielt eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Kernintegrität und vermittelt einen Chromatin-Kern-Kontakt (Georgatos et al. 1994). Einleitung 8 Heute sind mehr als 280 Caspasen-Substrate bekannt, welche in allen Bereichen der Zellfunktion, wie bei der Aufrechterhaltung der Zellstruktur, Adhäsion, DNA-Synthese und Reparatur, Protein-Translation oder Signal-Transduktion, eine entscheidene Rolle spielen (Fischer et al. 2003). Obwohl der Fokus der Caspase-Forschung auf ihre Funktionen in der Apoptose gerichtet ist, gibt es deutliche Hinweise, dass sie einen größeren Aufgabenbereich umfassen. Zum einen gibt es Berichte über die selektive Aktivierung der Effektorcaspasen während der T-Zell Differenzierung neben der trotzdem ablaufenden massiven Apoptose von T-Zell-Blasten (Alam et al. 1999; Kennedy et al. 1999). Zum anderen wird die Beteiligung von Effektorcaspasen bei der Erythroblastendifferenzierung beschrieben, bei der sie Proteine schneiden, die für die nukleäre Integrität und Chromatinkondensation verantworlich sind, ohne dass Apoptose involviert wäre (De Maria et al. 1999). 1.6.1 Zelltod Die effektive Wachstumsrate einer Tumormasse spiegelt das Verhältnis zwischen Zellzuwachs und -verlust wider. In vielen Tumoren wird auch ein Absterben von Tumorzellen sowohl durch Apoptose als auch durch Nekrose beobachtet (Martin 1997). Nekrose findet statt, wenn die Zellen extremen Bedingungen (Strahlung, Hypothermie, Anoxie, Trauma, chemischen Noxen) ausgesetzt sind, die zu einem Zellmembranschaden führen. Nekrose beginnt mit dem Unvermögen der Zelle ihr homöostatisches Gleichgewicht aufrecht zu erhalten, was zur Anreicherung von Wasser und Ionen im Zellinneren führt. Sowohl die intrazellulären Organellen als auch die gesamte Zelle schwellen an. Dies endet in einer Zelllyse, bei der lysosomale Enzyme in den extrazellulären Raum eindringen, benachbarte Zellen sowie die extrazelluläre Matrix zerstören und eine entzündliche Reaktion auslösen. Die Apoptose (griechisch: apo-ab, ptosis-Senkung, ähnlich dem herbstlichen Blätterfallen; programmierter Zelltod, PCD) ist der Zelltod unter physiologischen Bedingungen und geht mit einer aktiven Beteiligung der Zelle an ihrem Untergang einher. Apoptotische Zellen zeigen bestimmte morphologische und biochemische Merkmale. Hierzu zählen die Kernchromatinaggregation, die nukleäre/zytoplasmatische Kondensation und der Zerfall in membrangebundene Vesikel (apoptotic bodies). Diese Vesikel werden entweder von Makrophagen oder umliegenden Zellen ohne Entzündungsreaktion phagozytiert. Apoptose wird im Organismus beim zellulären „turn-over“ und der Gewebehomöostase (Haut, Epithel in Hohlorganen, Knochenmark), Zwischenfingerhäutchen), der der Embryogenese Aussortierung autoreaktiver (z.B. Rückbildung Immunozyten (B-/ der T- Einleitung 9 Lymphozyten) bei der Reifung und Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz oder der hormonabhängigen Involution (Mammainvolution nach Stillzeit, Prostatatrophie nach Kastration) benötigt. Insuffiziente Apoptose kann aufgrund von Caspasen-Inaktivierung die Onkogenese durch Zulassen von Zellanhäufungen fördern (Martin and Green 1995). Auf der anderen Seite kann die Überaktivität von Caspasen zu einem übermäßigen Verlust von Zellen führen und so die Basis für degenerative Erkrankungen, wie Chorea Huntington oder Morbus Alzheimer bilden. Des Weiteren fallen Zellen nach Ischämien in den reperfundierten Geweben (Myokardinfarkt oder cerebrale Ischämie) der Apoptose anheim (Goldberg et al. 1996; Jaworowski and Crowe 1999; Lopez-Neblina et al. 2005; Nagarajah et al. 2004; Thompson 1995; Wellington et al. 1998; Wolozin et al. 1996). 1.6.2 Effektorcaspase 3 Die Caspase-3 (Casp-3) wird synonym als Cystein Protease-CPP32, APOPAIN, YAMA (Hindu Gott des Todes)-Protein, PARP cleavage protease, SREBP cleavage activity 1 bezeichnet. Das Casp-3 Gen ist auf dem Chromosom 4q33-q35.1 lokalisiert (Tiso et al. 1996). Dieses Gen kodiert für eine Cystein-Protease, welche ein Molekulargewicht von 31600 hat und aus 277 AS (Aminosäuren) besteht (Alnemri et al. 1996). Die aktivierte (cleaved, c) Casp-3 besteht aus 2 UE von 17kDa und 12kDa Größe. Während der Vollstreckung der Apoptose ist c-Casp3 entweder gänzlich oder in Teilen für die Spaltung einer großen Menge an Substraten, welche gewöhnlich ein Asp-XAs-XAs-Asp Motiv enthalten, verantwortlich. Die Casp-3 ist intrazellulär sowohl an der inneren Mitochondrienmembran als auch im Zytoplasma, dem Zellkern und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Die Procaspase-3, die im Intermembranraum der mitochondralen Membran gespeichert wird, kann erst auf ein geeignetes apoptotisches Signal in das Zytosol entlassen werden. 1.6.3 Effektorcaspase 6 Als alternative Bezeichnung wird MCH2 (mammilian CED-3 homoloque) verwendet. Das Gen der Capsase-6 (Casp-6) ist auf dem Chromosom 4q25-q26 lokalisiert. Von Casp-6 sind zwei Isoformen, Mch2α( Hauptform; 1,7kb) und Mch2β (1,4kb), beschrieben. Mch2α kodiert die volle Länge von Mch2. Das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 34000 und besteht aus 293 Aminosäuren (AS). Mch2β kodiert ein nur 204 AS großes Protein Einleitung 10 und hat ein Molekulargewicht von etwa 23000. Dieser Isoform fehlt die Hälfte der p20 UE und ist wahrscheinlich katalytisch inaktiv (Alnemri et al. 1996). Die Procaspase-6 wird an 3 Asparaginsäurestellen (Asp-23, Asp-179, Asp-193) gespalten, um so in die aktivierte Form (cleaved, c), welche eine große p18 (MW:18000) und eine kleine p11 (MW:11000) Untereinheit enthält, umgewandelt zu werden (Srinivasula et al. 1996). Casp-6 wird wie Casp-3 im mitochondralen Intermembranraum gespeichert und auf ein geeignetes apoptosisches Signal in das Cytoplasma der Zelle entlassen. Eine Aktivierung von Procaspase-6 erfolgt durch cCasp-3, wodurch sie die Fähigkeit erlangt, Lamin A (stärkste Laminase während der Apotose) zu spalten. In diesem Zustand kann sie auch inaktive Casp-3 aktivieren, sodass ein Verstärkerzyklus entsteht (Takahashi et al. 1996). 1.7 Metastasensuppressorgene Die Metastasierung kann als Vorgang mit zwei Komponenten, positive und negative Regulatoren, aufgefasst werden. Die positiven Regulatoren (metastasing promoting genes) ermöglichen es Zellen (z.T. sehr ineffizient) einen oder mehrere Schritte in der Metastasierungskaskade zu gehen, wohingegen es bei den negativen Regulatoren (Metastasensuppressorgene) ausreicht einen einzigen Schritt zu blockieren, um die gesamte Kaskade außer Funktion zu setzen (Schwab 2001). Positive Regulatoren sind bspw. die Matrixmetalloproteinasen (MMPs), da sie während der Metastasierung in den Abbau der Basalmembran involviert sind. Die Metastasensuppressorgene (MSG) werden von den Tumorsuppressorgenen (TSG) unterschieden, da sie die Metastasierung unterdrücken sollen, ohne das primäre Tumorwachstum zu beeinflussen. Weiter sind MSG in Tumoren im Gegensatz zu den TSG selten mutiert, sodass eine Herabregulierung durch Methylierung am Gen oder durch posttranskriptionelle/ translationale Veränderungen angenommen wird. Verschiedene Kandidaten wurden als MSG identifiziert, von denen bis jetzt über ein Dutzend in vivo die Fähigkeit zeigten Metastasen zu verhindern (z.B. nm23, KAI1, KiSS1, E-cadherin, BRMS1 und MKK4) (Berger et al. 2005; Kauffman et al. 2003; Schwab 2001; Welch et al. 2000). 1.7.1 Tetraspanine Die Mitglieder der Tetraspanin-4-Superfamilie (TM4SF), momentan 32 verschiedene in Säugetieren, sind integrale Membranproteine, charakterisiert durch vier transmembrane Domänen, die sich von drei intrazellulären und zwei extrazellulären Domänen abgrenzen. Die äußeren Domänen zeigen in allen TM4SF eine identische Sequenz mit spezifischen Einleitung 11 strukturellen Eigenschaften (Boucheix and Rubinstein 2001; Hemler 2005; Levy and Shoham 2005). Viele Zelltypen exprimieren TM4SF Moleküle, die in eine Vielzahl physiologischer Prozesse wie Aktivierung von Zellen des Immunsystems, Zellmigration, Zelladhäsion, ZellZellfusion (inklusive Befruchtung), Zellproliferation und in verschiedene Teilschritte der Zelldifferenzierung eingebunden sind. Weiter sollen diese Moleküle eine Rolle bei infektiösen Erkrankungen wie Malaria, Hepatitis-C und AIDS spielen. Darüber hinaus scheint es Beziehungen zwischen Mutationen verschiedener Moleküle der TM4SF und genetischen Erkrankungen zu geben (X-chromosomale geistige Retradierung, retinale Degeneration und Fehler im Zusammenbau von Basalmembranen von Haut und Niere) (Le Naour et al. 2006). Bei Krebs konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass es eine Verbindung zwischen dem Tetraspanin-Expressionslevel und der Prognose und/oder der Metatsasierung gibt. So sind beispielsweise hohe Level an CD9 und KAI1/CD82 in Tumorzellen mit einer guten Prognose in Brust, Lunge, Kolon, Prostata und Pankreastumoren verbunden. Im Gegensatz hierzu ist eine Überexpression von CD151 in Lunge, Kolon und Prostatatumoren mit einer schlechten Prognose korreliert. Somit scheinen CD 9 und KAI1/CD82 bei der Metastasensuppression und CD151 bei der Metastasenprogression eine Rolle zu spielen (Le Naour et al. 2006). 1.7.1.1KAI1/CD82 Dieses Glykoprotein wird alternativ als kangai 1 (chinesisch für anti-cancer), suppression of tumorgenicity 6 (ST6), CD 82 (Cluster of differentiation, erstmals als Lymphozytenoberflächenprotein beschrieben), C33-Antigen, Leukocyte Surface Antigen R2 (SAR2), 4F9, IA4 bezeichnet. Das Gen ist auf dem Chromosom 11p11.2-p11.13 lokalisiert. Das Protein hat ein Molekulargewicht von 29600 und besteht aus 267 AS. Es gehört zur Familie der Tetraspanine (TM4SF) und enthält eine Domäne mit vier hydrophoben membrandurchspannenden Segmenten, denen mehrere konservierte hydrophile Enden anhängen. Diese sind eine kleine intrazelluläre Schleife (4 AS), zwei extrazelluläre Schleifen (23 und 114 AS), wobei sich die große zwischen den Transmembransegmenten 3/4 erstreckt (Maecker et al. 1997) und 3 potentielle N-Glykolysierungsseiten besitzt (Dong et al. 1997). In der zytoplasmatischen Domäne sind kurze N- und C-terminale Regionen (9 und 13 AS lang) lokalisiert (Berditchevski 2001; Hemler 2001; Kopczynski et al. 1996; Stipp and Hemler 2000). Das Gen KAI1/CD82 wird in vielen menschlichen Geweben exprimiert. Die Herabregulierung der KAI1/CD82 mRNA- und Proteinexpression ist in verschiedenen Einleitung 12 Tumoren mit fortgeschrittenen Tumorstadien und einer verstärkten Metastasierung verbunden, ohne das Tumorwachstum zu beeinflussen. Die Herabregulierung der KAI1/CD82 Funktion kann sowohl ein frühes, einzeitiges Ereignis in der Tumorentwicklung (Lombardi et al. 1999) als auch ein zweizeitiges Ereignis mit einer Hochregulation in den frühen TumorStadien und einem Verlust in metastatischen Tumorzellen darstellen (Bouras and Frauman 1999; Friess et al. 2001; Maurer et al. 1999; Wu et al. 2004). Erstmals identifiziert wurde dieses Gen, als Dong et al. feststellten, dass sich das Metastasierungspotenzial von AT6.1 Ratten-Prostatakrebszellen reduzierte, nachdem sie mit nicht-metastasierenden Krebszellen fusioniert wurden (Dong et al. 1995). Des Weiteren war die Expression in Zelllinien von humanem, metastasierendem Prostatatumoren reduziert (Dong et al. 1995). Auch konnte eine Herabregulierung der Proteinexpression während der Progression von humanen Prosatatakarzinomen gezeigt werden (Dong et al. 1996). Dass der Verlust der KAI1/CD82-Proteinexpression mit dem verstärkten Auftreten von Metastasen und einer Tumorprogression einhergeht, wurde an einer Vielzahl humaner Malignome aufgezeigt. Zu ihnen zählen Lungen-, Pankreas-, Mamma-, hepatozelluläre-, kolorektale-, ovariale-, Cervix- sowie Speiseröhrentumoren (Adachi et al. 1996; Geradts et al. 1999; Guo et al. 1996; Guo et al. 1998; Guo et al. 1998; Liu et al. 2001; Liu et al. 2000; Lombardi et al. 1999; Miyazaki et al. 2000). Der Expressionsverlust findet wahrscheinlich auf RNA- und Protein-Ebene statt und ist vermutlich keine Folge von Genmutationen, Deletionen (Heterozygotieverlust am Genlokus) (Tagawa et al. 1999), Promotormutationen (Dong et al. 1996; Liu et al. 2000; Miyazaki et al. 2000) oder verstärkter Methylierung (Jackson et al. 2000; Sekita et al. 2001), sondern entsteht durch verschiedene Mechanismen, die aus veränderter transkriptionaler Regulierung, der Produktion von Splicevarianten und post-translationaler Modifikation des KAI1/CD82 Proteins bestehen (Tonoli and Barrett 2005). Die Aktivierung der Transkription von KAI1/CD82 wird durch Motive in der Promotorregion vollzogen, an die Faktoren wie p53 (Apotoseinduktion und Tumorsuppression) (Mashimo et al. 2000; Mashimo et al. 1998) und NF-IL6 (bei Sauerstoffmangel aktiver Transkriptionsfaktor) binden (Dong et al. 1997; Yan et al. 1997). Des Weiteren stehen als Aktivatoren NGF (nerve growth factor) und NFκB zur Verfügung. In verschiedenen Tumoren wurde ein Fehlen oder die Inaktivierung von Faktoren wie p53, NFκB oder NGF beobachtet, was zu der Vermutung führt, dass dieser Aktivatormangel zur Herunterregulierung von KAI1/CD82 beiträgt (Li et al. 2001; Shinohara et al. 2001; Sigala et al. 1999). Auch wurde Einleitung 13 gezeigt, dass für wirkungsvolle Interaktionen mehr als ein Transkriptionsfaktor notwendig ist (Tonoli and Barrett 2005). Es wird angenommen, dass KAI1/CD82 Proteine in einem Netzwerk (tetraspanin-web) organisiert sind (Vogt et al. 2002) und so das Zellwachstum und die Zellbewegung beeinflussen (Maecker et al. 1997). KAI1/CD82 interagiert über seine große extrazelluläre Schleife mit Integrinen (α3β1, α4β1, α6β1, LFA, E-Cadherin), die zum Teil die Kontakte zwischen den Zellen vermitteln. So verstärkt KAI1/CD82 diese Bindungen und hemmt hierdurch deren Beweglichkeit, wodurch es wahrscheinlich zur Metastasenunterdrückung beiträgt (Lagaudriere-Gesbert et al. 1998). Weitere Interaktionen wurden mit anderen Tetraspanin-Mitgliedern (CD 9, 53, 81, 151) gefunden (Hammond et al. 1998). Auch bedingt eine Assoziation von KAI1/CD82 mit Integrinen (α6) und nachfolgender Internalisierung derselben eine Herabsetzung der Tumorzellmigration (He et al. 2005). KAI1/CD82 kann weiter über Tyrosinphosphorylierung fokale Adhäsionskinasen (FAK) aktivieren (Lebel-Binay et al. 1995). Die FAK spielt eine Rolle bei der Organisation des Aktin-Zytoskeletts, bei IntegrinInteraktionen sowie der Zellmigration (Boucheix and Rubinstein 2001). Über die aktivierte FAK werden sowohl Rho-GTPasen (Delaguillaumie et al. 2002) als auch Src-Kinasen (Zhang et al. 2003) beeinflusst, deren Signalwege an Invasion und Motilität beteiligt sind (Tonoli and Barrett 2005). Außerdem scheint KAI1/CD82 durch die Aktivierung spezifischer Transporter Glutathion aus betroffenen Zellen auszuschleusen. Hierdurch verlieren die Zellen einen antioxidativen Schutz, es resultiert eine vermehrte Apoptoseinduktion. Bei hohem KAI1/CD82Expressionsniveau wird so ein Heranwachsen von Mikrometastasen verhindert (Schoenfeld et al. 2004). Weiterhin beschleunigt KAI1/CD82 die Endozytose des EGF (epidermal growth factor)Rezeptors, wodurch es externe Signale für Proliferation und Migration abschwächt, aber auch die Ausbildung von Zellausläufern (Lamellipodien) verhindert (Nicholson et al. 2001; Odintsova et al. 2000). Eine Regulierung von KAI1/CD82 auf der Proteinebene kann zum einen über die NGlykosylierung erfolgen, da hierdurch die Interaktion mit den Integrinen beeinflusst wird. Wenn KAI1/CD82 beispielsweise nicht glykosyliert vorliegt, kommt es zur Komplexbildung zwischen α5-Integrin und KAI1/CD82, was zur Behinderung der Laminin- und Fibronektinvermittelten Motilität führt (Ono et al. 2000). Zum anderen können durch Palmitolierung der intrazytoplasmatischen Cysteinenden des KAI1/CD82-Moleküls die inhibitorischen Effekte auf Migration/Invasion, die zelluläre Lokalisation des Proteins und die Beeinflussung anderer Tetraspanine geregelt werden Einleitung 14 (Charrin et al. 2003; Zhou et al. 2004). Auch die direkte Bindung anderer Proteine scheint an der Regulierung der Migrations- und Invasionshemmung beteiligt zu sein. So besitzt das Oberflächenprotein KASP einen synergistischen (Zhang et al. 2003) und das Tetraspanin KITENIN einen antagonistischer Effekt (Lee et al. 2004). Ein weiterer Aspekt in der Bildung von Metastasen scheint in der Beziehung zwischen DARC-Molekülen (Duffy antigen receptor for chemokines) auf Endothelzellen und der KAI1/CD82-positiven Tumorzelle zu liegen. Die disseminierte Tumorzelle soll über KAI1/CD82 mit dem DARC-exprimierenden Endothel interagieren und verhindert über diese Bindung eine Proliferation von Tumorzellen an der potentiellen Metastasierungsseite. Im Falle einer fehlenden KAI1/CD82 Expression können die Tumorzellen in diesem Bereich die Bildung von Makrometastasen einleiten (Bandyopadhyay et al. 2006). Die Expression von KAI1/CD82 ist gewebespezifisch. Beispielsweise ist die Expression in Speiseröhren- und Magen-Tumoren (Easty et al. 1996; Guo et al. 1998) sowie in der Papilla Vateri des Pankreas nicht erhöht, während in anderen Pankreastumoren eine signifikante Herabregulierung von KAI1/CD82 gefunden wurde (Friess et al. 2001). 1.7.2 Nm23-H1 Dieses Protein wird weiter als NDP-Kinase A, Nme1 (non-metastatic cell 1), awd (abnormal wing discs) und Granzym A activated DNase (GAAD) bezeichnet. Es hat ein Molekulargewicht von 17100, besteht aus 152 AS und ist auf dem Chromosom 17q21.31 lokalisiert, das für die A-Isoform der Nukleosiddiphosphokinase kodiert. Erstmals wurde es in Maus-Melanom-Zellen gefunden. Unter dem Namen „non-metastatic clone 23“ (nm23) war es das erste identifizierte Metastasen-Suppressor Gen (Steeg et al. 1988). Eine verstärkte Expression in Zelllinien unterschiedlichsten Ursprungs unterdrückte die Metastasierung, ohne das Tumorwachstum zu beeinflussen (Salerno et al. 2003). Das humane Analog, nm23-H1, wurde als Nukleosiddiphosphkinase (NDPK) identifiziert. Als Histidin-Protein-Kinase katalysiert es die Transphosphorylisierung eines terminalen Phosphates von Nukleotidtriphosphat (NTP) zu Nukleotiddiphosphat (NDP) unter Bildung eines Histidin-phophorylierten Zwischenproduktes (Wallet et al. 1990). Weitere biochemische Funktionen sind die DNA-Transaktivierung, die DNA-Nuklease-Aktivität, und das Wirken als Serin-Protein-Kinase (Salerno et al. 2003). Im Mausmodell wurde die Beteiligung von mm23-H1 bei der Zellreifung von Geweben epithelialer und neuronaler Herkunft beschrieben (Lombardi 2006). Auch wurden Beziehungen zum Zellzyklus beobachtet, da es an nm23-H1-exprimierenden Zelllinien Einleitung 15 (Brustkrebs-, Prostatakrebs- sowie Muskelzellen) zu einer Reduzierung der Wachstumsrate kam (Gervasi et al. 1996; Lombardi et al. 1995). Diese Funktion scheint auf die von nm23 induzierte Promotoraktivität von Rb2/p130 mit Akkumulation von aktiven hypophosphorylierten pRb2/p130 Proteinen in den Zellen zurückzugehen. Das Protein Rb2/p130 gehört zur Retinoblastomfamilie, welche als Prototyp der Tumorsuppressorgene gilt, die den G1/S-Phasenübergang negativ kontrollieren und somit wichtige Effektoren der Zelldifferenzierung sind. Daraus folgt die Annahme, dass nm23 Tumorsuppressor-ähnliche Funktionen bei der Hemmung der Zellzyklusprogression und somit in der Zelldifferenzierung hat (Lombardi 2006). Weiter wurde über eine in vitro 3’-5’ Exonuklease Aktivität von nm23-H1 berichtet. Diese ist streng an die DNA-Reparatur gebunden, die die Zellen vor genomischer Instabilität, maligner Transformation und Progression bewahrt (Ma et al. 2004). Darüber hinaus scheint das Protein nm23-H1 mit Onkoproteinen, wie dem Ebstein-Barr-Virus (EBV), welches an Immortalisation und der Initiierung von Transformation in Zellen beteiligt ist, zu interagieren (Murakami et al. 2005; Subramanian et al. 2001). Auch gibt es Beschreibungen zu Interaktionen zwischen dem Onkoprotein E7 des humanen Papillomavirus-16 (HPV-16) und nm23. So wurden an einer HPV-16 E7 exprimierenden Keratinozyten-Zelllinie Interaktionen gezeigt, die zur Herabregulierung und Inaktivierung von nm23-Protein führten. Als Konsequenz wurden eine gesteigerte Proliferationsrate, die Beeinträchtigung der Differenzierung, eine Resistenz gegenüber der Granzym-A induzierten Apoptose und die Invasion in die Extrazellularmatrix beobachtet. Die Ergebnisse der Verbindung von nm23-H1 mit HPV-16 E7 scheinen bis jetzt nicht nur die Zellinvasion, sondern auch den Zellzyklus, die Zelldifferenzierung und die Apoptose zu beeinflussen, was die Hypothese der nm23 Beeinträchtigung als zentralen Schritt der verschiedenen Stadien in der Tumorentwicklung stützt (Mileo et al. 2006). Bis heute wurden 8 Mitglieder (NME1-NME8) der nm23-Familie identifiziert. Von diesen besitzt allerdings nur NME1 und -2 Metastasen-Suppressor-Aktivität (Otsuki et al. 2001). Das nm23-H2 codiert für eine Proteinkinase, die eine 88% ige Homologie mit nm23-H1 aufweist. Dieses Protein reguliert ebenfalls Wachstum und spielt eine Rolle bei der Transkripitionsregulierung von Wachstumsgenen, wie c-myc und PDGF (platelet derived growth factor) (Konishi et al. 1993). Zurzeit ist wenig über die genauen biochemischen Mechanismen bekannt, mit denen nm23H1 die metastatische Aktivität ändert. Wie in früheren Arbeiten (MacDonald et al. 1993),(Lee and Lee 1999) gezeigt wurde, scheint die Metastasensuppression nicht auf die Enzymaktivität Einleitung 16 der NDPK, sondern auf Proteininteraktionen zurückzuführen sein. (MacDonald et al. 1993). Jedoch wird in neueren Arbeiten gegensätzlich von einer guten Korrelation der Histidinproteinkinase-Aktivität von nm23-H1 und der Unterdrückung von Zellmotilität berichtet (Salerno et al. 2003). Diese soll beispielsweise für die Phosphorylierung von Ksr (Kinase suppressor of Ras), einem zentralen Protein des MAP-Kinase Weges, verantwortlich sein. Ksr verliert die Eigenschaft zur Vermittlung der MAP (mitogen activated protein)Kinase Aktivierung, was zur Hemmung der Metastasierung (in vivo) und der Motilität (in vitro) führen soll (Hartsough et al. 2001; Salerno et al. 2003; Steeg et al. 2003). Ras ist ein Guanosinnukleotid (GTP)-bindendes Protein, das durch GTP aktiviert wird und dann für die Signalübermittlung in den Zellen verantwortlich ist. Ras wird wahrscheinlich ebenfalls von nm23-H1 beeinflusst, indem nm23 durch Phosphorylierung an der Bildung von Farnesyltriphosphat beteiligt ist, was das inaktive Ras-GDP in einen aktiven Ras-GTPKomplex überführt, der an der Aktivierung der MAP-Kinasen beteiligt ist (Wagner and Vu 2000). Mutationen des nm23 Genes in Tumoren sind selten. Dies deutet darauf hin, dass die nm23 Funktionsbehinderung auf der Ebene der Proteinexpression erfolgt und dass andere Proteine Einfluss auf die Regulierung von biochemischen Mechanismen haben, durch die das metastatische Schicksal der Tumorzelle bestimmt wird (Roymans et al. 2002). So korrelieren die verminderte Expression von nm23 und die Metastasensuppression mit vielen, aber dennoch nicht mit allen Malignomen. An Neuroblastomen ist beispielsweise eine höhere Expression mit gesteigerter Aggressivität vergesellschaftet (Almgren et al. 2004; Hailat et al. 1991). Die physiologischen Funktionen von nm23-H1 sind die Beteiligung an der Zellproliferation (Cipollini et al. 1997), Regulierung der Transkription (Ji et al. 1995; Postel et al. 1993) sowie Entwicklung und Differenzierung (Lombardi et al. 2000). Eine besondere Bedeutung scheint dem Protein bei der Differenzierung von Epithel und Nervengewebe zuzukommen (Dabernat et al. 1999; Gervasi et al. 1998; Lakso et al. 1992). Eine weitere physiologische Funktion ist die Assoziation mit Tiam1, einem Nukleotidaustauschfaktor für Rac1. Bei nm23Überexpression verhindert dieses über Tiam1 den GTP-Austausch an Rac1. Rac hat eine zentrale Rolle in der Reorganisation des Zytoskletts, der Proliferation und Apoptose (Kauffman et al. 2003). Auch eine Wirkung von nm23 mit seiner NDP-Kinase Aktivität an Rad ist anzunehmen. Die Rad-Überexpression geht in vivo mit verstärkter Tumorigenität einher und kann durch eine nm23-H1 Überexpression verhindert werden (Tseng et al. 2001). Einleitung 17 Schließlich werden eine Menge weiterer Assoziationen, wie mit Enzymen (GAPDH; CK2), Telomeren, Vimentin und ICAP-1a berichtet (Salerno et al. 2003). Intrazellulär ist es außer im Zytosol, partiell mit Mikrotubuli assoziiert, in den Mitochondrien und dem Nukleus zu finden. Es ist kein Hauptexpressionsort beschrieben, sondern ein ubiquitäres Vorkommen ist anzunehmen (Bsp.: Herzmuskelzellen, B-Lymphozyten (Caligo et al. 1995; Yi et al. 1996). 1.8 Ziele der Arbeit Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit immunhistochemisch untersucht, ob die Effektorcaspasen 3 und 6, die Proteine KAI1 und nm23-H1 in Peniskarzinomen exprimiert werden und ob bestimmte Expressionsmuster mit klinikopathologischen Faktoren wie dem pathologischen Grading, dem Vorkommen von Lymphknotenmetastasen und dem Krankheitsverlauf korrelieren. Zum Vergleich der Effektorcaspasenexpression mit der Tumorzellapoptose wurde die zusätzlich TUNEL-Methode eingesetzt. Fragestellung: Sind bisherige Prognoseparameter (wie Tumorstadium, Grade, Nodalstatus) in Bezug zur Metatstasierung und dem Überleben auf die untersuchte Population anwendbar Haben die MSG-Produkte KAI1 und nm23-H1 eine Beziehung zur Metastasierung und/oder dem Überleben beim PSCC Haben die aktivierten Effektorcaspasen 3 und 6 eine Beziehung zur Metastasierung und/oder dem Überleben beim PSCC 2 Material und Methoden 2.1 Material Bei der Durchführung der Versuche sind alle Materialien und Chemikalien gemäß den Angaben der Hersteller zur Gewinnung und Auswertung der Ergebnisse verwendet worden. Die benutzten Chemikalien, Antikörper und Enzyme sind in reinster Konzentration oder der höchsten kommerziell erhältlichen Reinheit zur Anwendung gekommen. 2.1.1 Gewebe Das entnommene Material wurde in Einklang mit den aktuellen Datenschutzbestimmungen des Landes M/V zur Wahrung der Patientenanonymität verwendet. Die vorliegende Studie wurde nach Beratung und Abstimmung mit der Ethikkommission der Universität Greifswald durchgeführt. Für die Untersuchungen wurden Proben von 30 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen (PSCC) und von 4 Patienten mit intrepithelialen Neoplasien des Penis analysiert, wovon 12 Tumore aus der Klinik für Urologie der Universität Greifswald und 22 Tumore aus der urologischen Klinik des medizinischen Zentrums Schwerin stammten. Die retrospektive Studie umfasst den Zeitraum zwischen 1993 und 2001. Die Alterspanne der erkrankten Männer lag zwischen 35 und 89 Jahren (Mittel 65,2 Jahre). Die Patienten wurden entsprechend der Tumorausdehnung unterschiedlich behandelt. So wurden die Proben von 9 Circumcisionen, 23 Exzisionen bzw. Teilamputationen und 6 Amputationen entnommen. Das Untersuchungsmaterial wurde in 4%iger gepufferter Formaldehydlösung fixiert (mindestens 24 h). Die Befundung der Gewebeproben wurde am Institut für Pathologie der Ernst-MoritzArndt-Universität Greifswald sowie dem Pathologischen Institut der Klinik Schwerin an HEgefärbten Schnitten durchgeführt. Die allgemeinen Patientendaten, Angaben zur Tumorausdehnung, Nodalstatus, Fernmetastasen und der Krankheitsverlauf wurden den Krankenakten entnommen. 2.1.2 Antikörper und Immunhistochemie Verwendete Antikörper Maus-Anti-nm23-H1-Antikörper (monoklonal) (Clone 37,6) Kaninchen-Anti-KAI1-Antikörper (polyklonal) Santa Cruz, USA Novocastra, Newcastle, UK SantaCruz Biotechnology, Material&Methoden 19 (H-173) Maus-cleaved Caspase3-Antikörper (polyklonal) USA (Asp 175) Maus-cleaved Caspase6-Antikörper (polyklonal) USA (Aps 162) Cell Signaling, Beverly, Cell Signaling, Beverly, Immunhistochemie-Kit 4plus HRP-DAB Sample-KIT Biocarta, Hamburg 2.1.3 Chemikalien Sofern die Bezugsquelle nicht aufgeführt ist, wurden die verwendeten Chemikalien über die Universitäts-Apotheke Greifswald bezogen, Chemikalien Neoclear Neomount Eosin (1%ig in 70% Alkohol) Ethanol (99,8%ig/ abs.) Neoclear Neomount Salzsäure Xylene 3’3 DAB Proteinase K Tris (1M) DNase TdT-Puffer Biotin Gylcerogelatine Natriumchlorid Kaliumchlorid Kaliumhydrogenphoshat (KH2PO4) Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt ROTH, Karlsruhe Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe J.T. Baker, Deventer, Holland Sigma, München Roth, Karlsruhe Promega Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Roamal, Budapest, Ungarn Lösungen Citratpuffer 9 ml Stammlösung A ( 0,1 M Zitronensäure) 41 ml Stammlösung B ( 0,1 M Natriumcitrat) ad 450 ml Aqua. dest. pH 6,0 Peroxidase-Substrat- DAB 10 ml PBS 10 mg DAB (1 Tablette) 10 µl H2O2 Material&Methoden 20 PBS 0,2 g/l KCl 0,2 g/l KH2HPO4 8,0 g/l NaCl 1,44 g/l Na2HPO X 7H2O ad 1,0 l Aqua. dest. pH 7,2-7,4 Hämalaun (nach Mayer) 2,5 g Hämatoxylin 0,5 g Natriumjodat 125 g Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat 125 g Chloralhydrat 2,5 g Zitronensäure ad 2,5 l Aqua. dest. TUNEL-Lösungen Proteinase-K-Puffer Stammlösung A Stammlösung B Stammlösung C 77,4 g/l Kaliumchlorid 121,1 g/l Tris (pH 8,3) 203,3 g/l Magnesiumchlorid Puffer für Proteinase K 25 ml Lsg. A +5 ml Lsg. B +1 ml Lsg. C auffüllen auf 500 ml Aqua bidest. DNase-Reagenz 10 µl Tris (1M) 10 µl MgCl2 50 µl DNase (10mg/ml) 100 µl TdT Puffer (Promega) 330 µl Aqua dest. Puffer für TdTransferase 40 µl TdT Puffer 2 µl Biotin 20 µl CoCl2 138 µl Aqua dest. Lyse-Puffer für entsprechende Vol. 0,1% Natriumcitrat 0,1% Triton 2.1.4 Geräte Ausgießstation, Typ DDM-P 063-5 MEDIS Weber, Gießen Schlittenmikrotom „Jung Histoslide 2000“ Leica Instruments, Nussloch Einmalmesser, N35 Feather, Japan Objektträger Super-FrostPlus Fa.Menzel, Braunschweig Wasserbad Elektothermal, UK Streckplatte Gerhardt, Bonn Material&Methoden 21 Mikroskop „Olympus BX 50“ mit „Olympus DP 10“ Digitalkamera Olympus, Hamburg Deckgläser, 24x40mm Marienfeld, Deutschland Rotationsschüttler, Polymax 2040 Heidolph, Deutschland Schüttler Jahnke & Kunkel, Staufen Pap-Pen (Dako Cytomation Pen) Glostrup, Dänemark Eppendorf-Gefäß (Safe Lock Tubes) Eppendorf, Hamburg Mikroliterpipetten Eppendorf, Hamburg Histokinette, Typ DDM-P800 MEDIS Weber, Gießen Brutschrank, Modell 400 Memmert, Schwabach Filtertips, d=125mm Schlichter & Schnell, Dassel Feinwaage Satorius pH-Meter, ino Lab WTW, Weilheim 2.2 Methoden 2.2.1 Herstellen von Paraffinschnitten und Entparaffinieren Nach Entnahme wurde das Probenmaterial in 4%-igem gepufferten Formalin für 12-24 h fixiert und anschließend unter fließendem Leitungswasser gespült (24 h). Die Gewebeproben wurden in die Histokinette eingebracht und in der aufsteigenden Ethanolreihe (50%, 70%, 80%, 96%, 2x abs. Ethanol) für je 2h dehydriert. Hierauf kamen die Proben für jeweils 2 h in Neo-Clear (Xylolersatz), in weiches und letztlich in hartes Paraffin. Anschließend wurde das Gewebe mit filtriertem hartem Paraffin ausgegossen. Mit dem Schlittenmikrotom wurden von den ausgehärteten Blöcken je 5 µm dicke Schnitte hergestellt, die im Streckbad (40°C) entfaltet und auf Superfrost-Objektträger (Silan-beschichtet) aufgezogen wurden. Es folgte die Trocknung für mindestens 1 h auf der Streckplatte (35°C) und für mind. 24 h im Brutschrank bei 38°C. Zum Herauslösen des Paraffins wurden die Schnitte in Xylol entparaffiniert und in der absteigenden Ethanolreihe (2x abs. Ethanol, 96%, 80%, 70%, 50%) und PBS rehydriert. 2.2.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung Neben der immunhistochemischen Bearbeitung wurden die Gewebeproben mit HämatoxilinEosin gefärbt. Die Gewebeschnitte wurden auf dem Objektträger nach Entparaffinierung für 5 min. in Hämalaun gefärbt und darauf 10 min. in Leitungswasser gebläut. Nach Abstoppen der Reaktion mit Aqua dest. wurde für 10 min. mit Eosin gegengefärbt und wieder mit Aqua dest. Material&Methoden 22 gespült. Im weiteren Verlauf wurden die Gewebeschnitte in der aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und in Neomount eingedeckelt. 2.2.3 Immunhistochemie Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden in Anlehnung an das Biocarta-Protokoll durchgeführt. Nach Entparaffinierung der Schnitte folgte die Blockierung der endogenen Peroxidase mit Peroxidazed-1. Anschließend wurde mit Backgrounderaser inkubiert, um die nichtspezifische Hintergrundreaktion zu verringern. Darauf wurde mit den primären Antikörper inkubiert. Es folgten ein biotinylierter, sekundärer Antikörper (aus der Ziege) und der Biotin-Streptavidin-HRP-Komplex (aus Streptomyces avidinii, das eine besondere Affinität hat mit seinen 4 Untereinheiten das wasserlösliche Vitamin Biotin stabil zu binden). Schließlich wird die Antikörperbindung durch Diaminobenzidin visualisiert. 2.2.3.1 Durchführung 1) Entparaffinieren s.o. 2) Blocken der endogenen Peroxidase mit Peroxidazed 1 (5 min.) 3) Waschen in Aqua dest. (5 min.) 4) Kochen der Präparate in der Mikrowelle (700 W) in Citratpuffer (sprudelnd, 20 min.) 5) Abkühlen auf ( 22C°) (mindest. 30min.) 6) Spülen in Aqua dest. und PBS (je 5 min.) 7) Inkubation der Proben mit Backgrounderaser (5 min.) 8) Inkubation des primären Antikörpers (KAI 1 1:50, nm23 1:1500, cleaved Caspase-3 1:300, cleaved Caspase-6 1:200, über Nacht bei 4C°) 9) Spülen in PBS (2x 5 min.) 10) Inkubation mit Univeral Link (10 min., 25C°) 11) Waschen in PBS (2x 5 min.) 12) Inkubation mit Streptavidin-HPR (5 min., 25C°) 13) Waschen in PBS (2x 5 min.) 14) Visualisieren mit Peroxidase-Substrat DAB- Lösung (3-5 min.) 15) Abstoppen der Farbreaktion in Aqua dest. Im Anschluss wurden die Zellkerne mit Hämalaun (1 min.) gegen gefärbt und mit Leitungswasser (5 min.) gebläut. Nach weiterem Spülen in Aqua dest. (5 min.) folgte ein Dehydrieren in der Alkoholreihe (2x 96% Ethanol abs., 2x Neoclear, je 5 min.) und schließlich die Einbettung in Neomount. Material&Methoden 23 2.2.3.2 Auswertung der Immunreaktion Die Beurteilung und Photodokumentation der Präparate erfolgte am Lichtmikroskop mit Kameramodul. Hierzu wurden 4-5 beliebige Stellen („region of interest“, ROI) im Tumor ausgewählt. Die ROI’s wurden zu je 100 Zellen in einer 400-fachen Vergrößerung (HPF, „high power field“ = 400-fache Vergrößerung [10 (Okular) x 40 (Objektiv)]) ausgezählt. Zellen des Präparatrandes wurden nicht in die Bewertung des Gesamtbildes einbezogen, da sich hier schwankende Intensitätsdarstellungen in der Anfärbung ergaben. Die Immunreaktivität der Tumoren wurde unabhängig durch zwei Beobachter ausgewertet und im Vergleich mit normalen Gewebsbestandteilen (interne Kontrollen) im selben Schnitt in schwache, mäßige oder starke Reaktivität eingeteilt. Bei abweichenden Ergebnissen wurden die Schnitte gemeinsam betrachtet und übereinstimmend beurteilt. Immunreaktivität für KAI1 und nm23-H1 Je nach immunologischer Anfärbbarkeit wurden die Tumorzellen prozentual in folgende Reaktivitätsgruppen eingeteilt: 0) [≤10% der Tumorzellen] geringe Reaktion 1) [11-50% der Tumorzellen] moderate Reaktion 2) [51-100% der Tumorzellen] starke Reaktion Immunreaktivität für c-Caspase 3 und 6 Bei der Auswertung der cleaved-Caspasen 3 und 6 (cCasp3, cCasp6) wurden veränderte Immunreaktivitätsgruppen festgelegt, da die Mehrzahl eine geringe, jedoch nur wenige Präparate eine starke Immunreaktion aufzeigten. 0) [<1% der Tumorzellen] keine Reaktion 1) [1-10% der Tumorzellen] geringe Reaktion 2) [11-50% der Tumorzellen] moderate Reaktion 3) [51-100% der Tumorzellen] starke Reaktion 2.2.3.3 Kontrollreaktionen in der Immunhistochemie Zum Ausschluss einer unspezifischen Bindung der Antikörper auf den Gewebeschnitten wurden verschiedene Kontrollreaktionen durchgeführt: Material&Methoden 24 • nur PBS, statt Blockierungsreagenz zum Ausschluss endogener Peroxidaseaktivität • PBS statt Primärantikörper zum Ausschluss unspezifischer Bindungen der nachfolgenden Ag/AK-Komplexe • Präimmunserum statt Primärantikörper zum Ausschluss unspezifischer Bindung des AK gegen Penis-/Tumorgewebe 2.2.4 TUNEL-Methode Die während des programmierten Zelltodes (progammed cell death; PCD) stattfindende intrazelluläre DNA-Fragmentierung kann zum Nachweis apoptotischer Zellen herangezogen werden. Hierbei werden unabhängig vom jeweiligen Stimulus Apoptose-spezifische DNAFragmentlängen beobachtet (Grasl-Kraupp et al. 1995; Negoescu et al. 1996). Der Nachweis dieser DNA-Fragmente wird unter enzymatischer Kopplung von markierten Desoxy-Uridin-Triphoshaten (dUTP) an Hydroxid-(OH)-Enden von DNA-Strangbrüchen durchgeführt. Bei dem hier verwendeten indirekten Nachweis, über den Einbau eines BiotinUDP werden die an die DNA-Fragmente gebundenen Moleküle über einen zweiten Schritt immunhistochemisch sichtbar gemacht. Die Reaktion der Nukleotidtriphosphate (NTP) an den DNA-Bruchstücken wird durch den Zusatz von Enzymen (terminale Transferase) katalysiert. Die gebundenen Biotinmoleküle werden durch Zugabe von Avidin-AK und folgender Färbereaktion sichtbar gemacht. 2.2.4.1Durchführung Pro Versuch wurden 4 Schnitte verwendet S1-S4. Versuchsaufbau S1 S2 S3 S4 +DNase +DNase -DNase -DNase 1) +TdT -TdT +TdT -TdT Positiv-Kontrolle Negativ-Kontrolle Apoptosenachweis keine Reaktion Entparaffinieren s.o. Einkreisen der Gewebeprobe mit dem Pap-Pen, damit Lösung nicht abfließt 2) Adaptieren der Schnitte S1-S4 in Proteinase-K-Puffer (3 min. 22°C) 3) Inkubation der Schnitte S1-S4 mit Proteinase-K (30 min. im Wasserbad ,30°C) 4) 3x waschen in PBS 5) Inkubation mit Lysepuffer (2 min. 22°C) 6) 3x waschen in PBS Material&Methoden 25 7) DNase Behandlung der Schnitte S1-2, S3-4 in PBS (20 min. 22°C ) 8) Spülen in PBS in getrennten Küvetten 9) Inkubation mit TUNEL-Reagenz S1&S3 +TdT, S2&4 –TdT (60 min. in feuchter Kammer im Brutschrank) 10) 3x waschen in PBS 11) Strepavidin-AP [1:100] (30 min. 22°C ) 12) 3x waschen in PBS 13) Inkubation mit BCIP/NBT (10 min. 22°C) 14) 3x waschen in PBS 15) Eindecken in Glycerolgelatine Die Proteinase K-Lösung bestand aus 3 mg Proteinase-K, die in 50ml Proteinase-K-Puffer gelöst und in einem Wasserbad auf 37°C vorgewärmt wurden. Die Gewebeschnitte(S) der TUNEL-Reaktion wurden mit einem Standard-Lichtmikroskop ausgewertet. Erfasst wurden positive Zellen in Tumorarealen. Diese wurden in Beziehung zu Caspase-positiven Zellen gleicher Bezirke gesetzt. Als positiv wurden Zellen bewertet, die eine Zellanfärbung und morphologische Eigenschaften der Apoptose (z.B. Schrumpfung, Apoptose-Körperchen) aufzeigten. 2.3 Statistik und Software Die Auswertung der Variablen erfolgte je nach Fragestellung mit dem Chi-Quadrat-Test nach dem Pearson/Fisher-Yates-Test, dem T-Test, dem Kendall-τ-Test, der Kaplan-Meier-Methode und der multivariaten Regressionsanalyse bzw. der Cox’schen Regression. Chi-Quadrat nach Pearson /Fisher-Yates-Test Mit dem Chi2-Test berechnet man, ob es Unterschiede zwischen den beobachteten und den nach der Nullhypothese zu erwartenden Häufigkeiten gibt. Als Vorraussetzung dürfen die Häufigkeiten der Zellen nicht zu klein sein, das heißt nicht weniger als 1/5 der Zellen dürfen eine absolute Häufigkeit kleiner 5 haben und keine Zelle darf eine Häufigkeit kleiner 1 aufweisen. Falls diese Vorraussetzungen nicht erfüllt wurden, kam der exakte Test nach Fisher zur Anwendung. Material&Methoden 26 T-Test Der ungepaarte T-Test ist ein Signifikanztest. Er dient zum statistischen Nachweis von Unterschieden oder Effekten von unabhängigen Variablen zweier unterschiedlicher Gruppen. Dabei wird versucht, die Nullhypothese zu widerlegen. Das Ergebnis des Tests wird häufig als p-Wert angegeben. Signifikanz liegt vor (d.h. die Nullhypothese ist widerlegt), wenn der pWert kleiner als das zuvor festgelegte Signifikanzniveau (z.B. p<0,05) ist. Kendall-τ(Tau)-Test Ein nichtparametrisches Maß des Zusammenhanges für ordinale und ranggeordnete Variablen berücksichtigt. Das Vorzeichen des Koeffizienten gibt die Richtung des Zusammenhanges und sein Absolutwert die Stärke an. Größere Absolutwerte deuten auf stärkere Zusammenhänge. Mögliche Werte liegen zwischen -1 und 1. Multivariate logistische Regressionsanalyse Mit dieser Methode wird die Abhängigkeit einer Variablen, die mehr als zwei Kategorien aufweisen darf, von anderen unabhängigen Variablen mit beliebigem Skalenniveau untersucht. Die Analyse zeigt dann die Wahrscheinlichkeit des Eintreffens des Ereignisses in Abhängigkeit von den Werten der unabhängigen Variablen. Mit der multivariaten Analyse kann bei genügend großem Untersuchungsgut eine Vorhersage über prognostische Faktoren gemacht werden. Ein unabhängiger prognostischer Faktor muss fähig sein, den natürlichen Verlauf einer Erkrankung statistisch unabhängig von anderen Parametern vorherzusagen (Hartsough and Steeg 2000; Horenblas 2001). Kaplan-Meier-Methode und Logranktest Die Kaplan-Meier-Methode berücksichtigt die Informationen aller Patienten bei der Berechnung der Überlebenszeiten so lange diese beobachtet wurden. Der Logranktest macht Aussagen darüber, ob die beobachteten Unterschiede in den Überlebenszeitkurven statistisch signifikant sind. Cox’sche Regressionsanalyse Mit der Hilfe dieses Verfahrens kann man untersuchen, wie bestimmte Variablen (Vorhersagevariablen) die Überlebenswahrscheinlichkeit beeinflussen. Es handelt sich hierbei um eine der multinominalen Regressionsanalyse verwandte Methode, die auch die Einbeziehung zensierter Fälle gestattet. Material&Methoden 27 Die Berechnungen der erhobenen Daten wurde mit dem Statistikprogramm SPSS 12.0 durchgeführt. Weiter wurden die Microsoft-Software Word, Exel und PowerPoint eingesetzt. 3 Ergebnisse 3.1 Klinische Parameter 3.1.1 Alter Insgesamt gingen 34 Patienten in die Auswertung mit ein. Das Durchschnittsalter betrug 65 Jahre (35-89 Jahre). 12 Mean = 65,24 Std. Dev. = 13,262 N = 34 10 Anzahl 8 6 4 2 0 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Alter in Jahren Abb. 3.1: Altersverteilung der Patienten. Mean: Durchschnittsalter Std.Dev.: Standardabweichung N:Anzahl der Patienten 3.1.2 Pathologischer Befund Von den 34 untersuchten Penistumoren wurden in Anlehnung an die WHO „histological classification of tumours of the penis“ (2004) 30 als Plattenepithelkarzinome (squamous cell carcinoma, SCC) klassifiziert. Als Subtypen kamen in den Gewebeschnitten 3 basaloide und 1 kondylomatöses (warziges) Karzinom vor. Weiter wurden 4 Karzinoma in situ (PIN, nicht invasiv) einbezogen. 3.1.3 Tumorausdehnung (T-Stadium) und klinischer Verlauf Das Stadium pT0/Tis wurde bei 4 Patienten gefunden, von denen keiner im Beobachtungszeitraum (1-125 Monate) verstarb. Von den 13 Patienten mit pT1-Stadium verstarben 6 (davon 5 durch krankheitsspezifischen Tod; KST), von 8 Patienten mit pT2Stadium verstarben 3 (2 davon KST), von 8 Patienten im Stadium pT3 verstarben 5 (2 KST). Der einzige Patient mit pT4-Stadium verstarb krankheitsspezifisch. Die Korrelation zwischen pT-Stadium und Krankheitsverlauf ist statistisch nicht signifikant (log rank: p= 0,061). Ergebnisse 3.1.4 29 Regionaler Lymphknotenstatus (N-Stadium) und klinischer Verlauf Zur Sicherung des Lymphknotenstatus wurden bei 16 von 34 Patienten Lymphknoten (LK) in einem metachronen Eingriff entfernt (hiervon einer in Sentineltechnik), während bei den übrigen 18 Patienten ein Befund zur LK-Veränderung entweder durch die körperliche Untersuchung (Palpation) oder in der Bildgebung (US, respektive CT) erhoben wurde. Bei 17 Patienten konnte kein LK-Befall nachgewiesen werden (N0). Von diesen verstarben 4 (davon 1 KST) im Beobachtungszeitraum. 6 Patienten hatten einen Lymphknotenbefall N1, von denen 3 verstarben (3 KST). Bei 7 Patienten wurde die Klassifikation N2 vorgenommen. Von diesen verstarben 6 (5 KST) im Beobachtungszeitraum. Von den 4 als N3 klassifizierten Patienten verstarben 2 (1 KST). Die Korrelation zwischen regionärem LK-Status und progressiven bzw. letalen Krankheitsverlauf ist statistisch signifikant (log rank: p= 0,025). 3.1.5 Fernmetastasen (M-Stadium) und klinischer Verlauf Innerhalb der Patientengruppe wurden bei 6 Erkrankten Fernmetastasen gefunden [p(pathological)M1: n=1; c(clinical)M1: n=5]. Diese traten in der Haut, den Knochen und der Lunge auf. Bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes verstarben 5 Patienten (3 KST) mit Fernmetastasierung. Die Gruppe ohne Fernmetastasen umfasste 22 Patienten, von denen 5 Patienten im Nachbeobachtungszeitraum verstarben. Bei 6 Erkrankten konnte keine Beurteilung der Fernmetastasierung vorgenommen werden, allerdings verstarben in dieser Gruppe, welche einem Beobachtungszeitraum von 12 bis 43 Monaten umfasste, 5 (4 KST) Patienten. Die Korrelation zwischen Fernmetastasen und dem letalen Krankheitsverlauf ist statistisch hochsignifikant (log rank: p= 0,001). 3.1.6 Differenzierung (Grading) und klinischer Verlauf Von den Tumoren sind 5 als G0, 4 als G1, 21 als G2 und 4 als G3 beurteilt worden. Im gesamten Beobachtungszeitraum verstarben in der G0-Gruppe kein Patient, in der G1-Gruppe 1 Patient (KST), in der G2-Gruppe 12 Patienten (davon 7 KST) sowie in der G3-Gruppe 2 (alle KST). Die Korrelation der Differenzierung mit dem Krankheitsverlauf ist statistisch nicht signifikant (log rank: p= 0,383). 3.1.7 Stadium nach WHO und klinischer Verlauf Die Stadien 0-1 (LK-negativ, N-) nach WHO wurden bei 10 Patienten gefunden, von denen einer (KST) verstarb. Von den 10 Patienten der Stadien 2-3 (LK-positiv; N+) erlagen 4 (2 KST) Patienten ihrer Krankheit. Von insgesamt 8 Patienten mit Stadium 4 verstarben 5 (3 KST). Einer Einordnung in ein Stadium nicht zugänglich waren 6 Patienten, bei denen eine Ergebnisse 30 Aussage zur Fernmetastasierung unterblieb. Allerdings verstarben hier 5 (4 KST) Patienten im Verlauf der Beobachtung. Die Korrelation der Differenzierung mit dem Krankheitsverlauf ist statistisch nicht signifikant (log rank: p= 0,139). 3.1.8 Übersicht TNM, Grade & Stadium mit zugeordnetem Level Tabelle 3.1 Verteilungshäufigkeit der klinikopathologischen Parameter Level/pathologischeMerkmale 0 1 2 Level 3 4 nicht beurteilbar T 4 13 8 8 1 N 17 6 7 4 - M 22 6 - Grade 5 4 21 4 - Stadium 4 6 6 4 8 0 0 6 - 6 -: Auflistung der absoluten Patientenhäufigkeiten in den einzelnen TNM-Stufen (Level), der Differenzierung (Grade) und dem Stadium (WHO) 3.1.9 Tumorausbreitung bei Diagnose Zum Diagnosezeitpunkt waren bei 44,1% der Patienten keine Metastasen auffindbar. Allerdings konnte zu diesem Zeitpunkt schon bei über einem Drittel (38,2%, davon 17,6% mit Fermetastasen) der Betroffenen eine Metastasierung nachgewiesen werden. Bei fast jedem Prozent der Fälle fünften Patienten (17,6%) konnte zur Metastasierung keine Aussage getroffen werden. 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Lokalisiert Regional Fern X Tumor bei Diagnose Abb. 3.2: Auflistung der relativen Häufigkeiten der Tumorausbreitung; lokalisiert: N0; regional: N1-3; fern: M1; X: keine Aussage zur Metastasierung möglich Ergebnisse 31 3.1.10 Korrelation von TNM-Klassifikation, Differenzierung, Tumorstadium und klinischem Verlauf Tabelle 3.2 Klinikopathologische Parameter und Status Status 4 12 7 5 1 14 6 6 3 20 4 5 5 4 16 4 4 6 4 4 6 Anzahl 0 5 2 2 1 1 3 5 1 3 3 4 0 1 7 2 0 1 1 1 3 Leben mit/ ohne Krankheit Anzahl 4 7 5 3 0 13 3 1 2 17 1 1 5 3 9 2 4 5 3 3 3 5 4 1 Gesamt n T N M Grade Stadium WHO 0 1 2 3 4 0 1 2 3 0 1 Mx 0 1 2 3 0 1 2 3 4 nicht beurteilbar krankheitsspez. Tod log rank 0,061 0,025 0,001 0,383 0,139 -: Auflistung der absoluten Patientenhäufigkeiten nach TNM-Klassifikation , der Differenzierung und dem Stadium nach WHO, verglichen mit dem klinischen Verlauf (Status), ausgeschlossen wurden nichtkrankheitsspezfisch verstorbene Patienten (n=5). Ergebnisse 32 3.2 Immunhistochemische Ergebnisse Die immunhistochemischen Untersuchungen mit den verwendeten Antikörpern zeigten eine spezifische Reaktion an allen untersuchten Gewebeproben. Immunhistochemische Kontrollreaktion Eine positive Reaktion blieb in den mitgeführten Kontrollschnitten aus (Abb 3.3). A B Abb. 3.3: A) Kontrollreaktion im Epithel B) Kontrollreaktion im Tumor Vergr.: 100-fach Immunhistochemische Lokalisation von KAI1 in nicht-neoplastischenm Gewebe Im nicht-neoplastischen Gewebe war mit dem anti-KAI1-AK eine Anfärbung an Endothelzellen und Nervenfasern (Markscheide) zu beobachten.. Die Zellen des Oberflächenepithels zeigten keine oder nur eine sehr schwache Reaktion. Eine starke Reaktion wurde im Zytoplasma von Lymphozyten der Keimzentren von Lymphfollikeln beobachtet. Immunhistochemische Lokalisation von nm23-H1 in nicht-neoplastischenm Gewebe Mit dem Antikörper gegen das nm23-H1-Protein zeigte sich eine Immunreaktion im Zytoplasma aller und in den Zellkernen einiger Oberflächenepithelzellen. Zellen in der Gefäßwand sowie Lymphozyten in lymphoplasmazellulären Infiltraten waren immunpositiv. Des Weiteren wurden Talgdrüsen und Bindegewebszellen (Fibroblasten) angefärbt. Immunhistochemische Lokalisation von c-Caspase 3 und 6 in nicht-neoplastischenm Gewebe Eine Immunreaktivität für die cCaspasen zeigte sich zytoplasmatisch, teils nukleär in Oberflächenepithelzellen des Stratum basale, spinosum und granulosum des nicht- Ergebnisse 33 neoplastischen Gewebes sowie in begleitenden lymphoplasmazellulären Infiltraten. Die Verteilung beider Proteine war sich ähnlich, dennoch überwogen cCaspase 6-positive Zellen. Abb. 3.3.1: Immunhistochemischer Nachweis von KAI1 in nicht-neoplastischem Gewebe. A) Eine positive Reaktion ist in Gefäßwänden, Nervenfasern und Lymphozyten zu beobachten B) Positive Immunreaktion in Lymphzyten (Ly) und Gefäßwandschichten; Erythrozyten sind immunnegativ (Ery); C-D) Gefäßlängsschnitt mit positiver Reaktion von Endothel und Myozyten Vergr.: A) 100-fach; B) 1000-fach; C, D) 200-fach. Abb. 3.3.2: Immunhistochemischer Nachweis von KAI1 in nicht-neoplastischem Gewebe. A-B) Gefäße, Nerven und Rundzellen sind immunpositiv; C-D) positive Reaktion der Markscheiden eines Nervs, Vergr.: A-B) 100-fach; C) 200-fach; D) 1000-fach Ergebnisse 34 Abb. 3.4: Immunhistochemischer Nachweis von nm23 in nicht-neoplastischem Gewebe. A) positive Reaktion des Oberflächenepithels mit dem Anitkörper gegen nm23 B) Begleitinfiltrat mit positiver Immunreaktion an Rundzellen C) positive Reaktion im Keimzentrum eines Lymphfollikels Vergr.: A) 100-fach B) 400-fach C) 100-fach Abb. 3.5: Immunhistochemischer Nachweis von c-Caspase 3 und 6 in nicht-neoplastischem Gewebe. Oben: Immunreaktion des Antikörpers gegen c-Caspase 3; Unten: Immunreaktion des Antikörpers gegen-cleavedCaspase 6. Positive Reaktionen finden sich im penilem Plattenepithel und in Rundzellen des Coriums. Vergr.: 100-fach Ergebnisse 3.2.1 35 Lokalisation von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3 und 6 in den Penistumoren Die Immunreaktion der Proteine KAI1 und nm23-H1 fand sich vorwiegend an der Zellmembran und intrazellulär. Im Vergleich der untersuchten Proben wurden jedoch unterschiedliche Intensitäten gefunden. Trotz der Intensitätsunterschiede der Tumorareale wird der hieraus gebildete Score aufgrund mangelnder Aussagekraft nicht aufgeführt und lediglich eine Einteilung nach der Häufigkeit von pos. Zellen unternommen. Eine Immunreaktion für KAI1 war in Tumorzellen sowohl in der Zellmembran als auch im Zytoplasma sowie in den Kernen der Tumorzellen zu beobachten. Eine starke Reaktivität wurde für KAI1 in 21 Fällen (61,8%) beobachtet. Die Färbung für nm23-H1 war hingegen stärker im Zytoplasma sowie den Zellkernen nachweisbar. Eine starke Reaktivität wurde hier in 15 Fällen (44,1%) ausgemacht. Die c-Caspasen 3 und 6 zeigten untereinander eine ähnliche Immunreaktivität. Eine starke Reaktivität konnte für c-Caspase 3 in keinem Fall, für c-Caspase 6 in 6 (18,8%) Tumoren nachgewiesen werden. Die c-Caspase 3 zeigte meist eine zytoplasmatische Immunreaktion, während für c-Caspase 6 häufiger die Zellkerne einzelner Zellen bzw. kleinerer Zellverbände positiv waren. Ergebnisse 36 Tabelle 3.3: Häufigkeit der Immunreaktivität von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3 und 6 in den Tumoren KAI1 nm23-H1 cCasp3 cCasp6 Häufigkeit, n 3 10 21 Prozent, % 8,8% 29,4% 61,8% Gesamt 34 100,0% 0 1 2 2 17 15 5,9% 50,0% 44,1% Gesamt 34 100,0% 0 1 2 13 16 1 43,3% 53,3% 3,3% Gesamt 30 100,0% 0 1 2 3 10 8 8 6 31,3% 25,0% 25,0% 18,8% Gesamt 32 100,0% 0 1 2 -: Häufigkeitsverteilung der Immunreaktivität von KAI1, nm23-H1, cCasp3, cCasp6 absolut und in Prozentzahlen ausgedrückt. Für die Untersuchung der cCasp 3 standen vier und für cCasp 6 zwei Präparate nicht mehr zur Verfügung. Ergebnisse 37 Abb. 3.6: Immunreaktion von Tumorzellen mit anti-KAI1 Antikörper. Die Immunreaktion findet sich vorwiegend zytoplasmatisch und ist nicht streng abgrenzbar. A) schwache Immunreaktion B) moderate Immunreaktion C) starke Immunreaktion Vergr.: 1-3) 100-fach A B C Abb. 3.7: Darstellung der Immunreaktivität von Tumorzellen mit anti-nm23-H1 Antikörper Die Reaktionsstärken sind unterschiedlich bei vorwiegend zytoplasmatischer Lokalisation. A) schwache Immunreaktion B) moderate Immunreaktion C) starke Immunreaktion Vergr.: A) 100-fach, B) 200-fach, C) 100-fach Ergebnisse 38 A B Abb. 3.8.: Darstellung der Immunreaktivität von Tumorzellen mit anti-cCasp3-Antikörper. cCasp3-positive Zellen im SCC; A) und B) pos. Zellen mit Charakteristika der Apoptose, wie Apoptosekörperchen, Chromatinkondensation und Zellschrumpfung (dicke Pfeile), aber auch nicht-reaktive Zellen mit Anzeichen der Apoptose (gestrichelte Pfeile) B) reaktive Zellen mit z.T. apoptotischen Körperchen, dicke Pfeile; teils keine Reaktion an Zellen mit apoptotischer Morphologie, gestrichelter Pfeil Vergr.: A) 200-fach B) 100-fach A B C Abb. 3.9.: Reaktionsstärken im Tumorgewebe mit anti-cCaps6 Antikörpern, A) schwach B) moderat C) stark; deutlich kommt die teils nukeäre, teils zytoplasmatische Reaktion in den Zellen hervor; Abb. C) basaloide Teilkomponente eines Plattenepithelzellkarzinoms Vergr.: A-C) 100-fach Ergebnisse 39 Abb. 3.10.: HE-Färbung von Nekrosezonen im Karzinom. Nicht-nekrotischer Bereich (vierzackiger Stern) ist durch Linien vom nekrotischen Bereich abgegrenzt; B) Ausschnitt von A), bei dem der Unterschied zwischen Nekrose und Tumor hervor tritt; C) zeigt im Übergangsbereich (gestrichelte Linie) zur Nekrosezone (fünfzackiger Stern) mehrere Zellen mit Apoptosemorphologie (Eosinophilie, kompaktes Chromatin, apoptotische Körperchen); D) Ausschnittsvergrößerung von C); fünfzackiger Stern: Nekrose, vierzackiger Stern: Karzinom, Pfeile: apoptotische Zellen Vergr.:A) 25-fach B) 100-fach C) 200-fach D) 1000-fach 3.3 Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion Die TUNEL-Reaktion wurde verwendet, einerseits zur Festzustellung der Lokalisation apoptotischer Zellen, andererseits um nachzuweisen, ob eine Kolokalisation der cCaspasen, als Apoptosenachweis, mit TUNEL-pos. Zellen besteht. Um interpretierbare Versuchsergebnisse zu erhalten, wurden sowohl Positiv-, wie auch Negativkontrollen mitgeführt. In den Positivkontrollen wurden sämtliche Zellkerne angefärbt. Bei den Negativkontrollen, als Nachweis möglicher unspezifischer Bindungen (z.B. des StrepavidinAK) blieb eine Färbung der Schnitte aus. 3.3.1 Apoptosenachweis an Paraffingewebeschnitten Im Folgenden sind beispielhaft mit der TUNEL-Methode untersuchte Tumoren dargestellt (Abb. 3.11 A-G). Die Tumoren zeigten meist nur eine Reaktion einzelner SCC-Zellen auf (A). Es wurden vermehrt TUNEL-pos. Zellen in Arealen von zentralen Tumornekrosen (Übergangsbereich Tumor/Nekrose) gefunden (E, F, G). In Karzinomen mit Verhornungsgebieten waren im Vergleich zum umgebenden Tumor vermehrt TUNELpositive Zellen nachweisbar (C, D). Ergebnisse 40 Abb. 3.11.1: Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion. A) pos. Zellen im Karzinom; B) pos. Zellen (Pfeilköpfe) in der Nekrosezone (Stern) sowie im nicht-nekrotischen Tumor (Pfeile); C-D) TUNELpositive Zellen in der Verhornungszone des Tumors. Vergr.: A) 200-fach B) 100-fach C) 25-fach D) 200-fach Ergebnisse 41 Abb. 3.11.2.: Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion. E-G) immunositive Zellen (Pfeilköpfe) in Tumoren mit Nekrosezone (Sterne) Vergr.: E-F)100-fach G) 25-fach Ergebnisse 3.3.2 42 Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 3 mit der TUNELMethode Die Gegenüberstellung von TUNEL- und Effektorcaspase 3-Immunreaktion zeigt eine ähnliche Kolokalisation positiver Zellen im Tumor auf (Abb. 3.12.1). Vermehrt stellten sich auf beide Reaktionen pos. Zellen im Übergang zur Tumornekrosezone dar. Der übrige Tumor zeigte nur vereinzelt pos.Reaktionen auf. Abb. 3.12.1.: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit cCaspase-3-Immunreaktivität. A) TUNEL pos. Tumorzelle; B-C) cCasp3 positive Zellen, teilweise mit Apoptosemorphologie D-E) Vergleich TUNEL(D) mit cCaspase 3 pos. Zellen in Nekrose-/Apoptosezone (Pfeile zeigen pos. Tumorzellen an) Vergr.: A-C) 400-fach; D-E) 100-fach Ergebnisse 3.3.3 43 Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 6 mit der TUNELMethode Die Gegenüberstellung von TUNEL- und Effektorcaspase 6-Immunreaktion zeigte im Tumor eine ähnliche Kolokalisation wie bei Effektorcaspase 3 beschrieben auf (Abb. 3.12.2). Abb. 3.12.2.: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit Caspase-6-Immunreaktivität. F) pos. TUNEL-Reaktion (Pfeile), Nekrosezone (Stern), Inset: pos. Tunel Reaktion einer Zelle in Nekrosezone G) cCasp-6 Reaktion in Übergangszone zw. SCC und Nekrose in morphologisch ähnlichem Gebiet H-I) Abbildung ähnlicher Areale mit Darstellung von immunpositiven Zellen (Pfeile) ähnlicher Areale (H-TUNEL, IcCasp6), (Sterne-Nekrosezonen) Vergr.: F-G) 100-fach; H) 200-fach; I) 100-fach Ergebnisse 3.3.4 44 Korrelation der Immunreaktivität für die KAI1 mit der TUNEL-Methode Eine Immunreaktion des Protein KAI1 war vermehrt in den Nekroseübergangszonen des Tumors auffindbar. Die Stärke der KAI1-Immunreaktivität nimmt von der Außenzone zum Nekroseareal hin zu. Abb. 3.13: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit KAI1-Immunreaktivität. A-C) verschiedene TUNEL-pos. Zellen in morphologisch ähnlichen Bereichen, welche z.T. verstärkt Immunreaktion im Übergangsbereich zur Nekrose zeigen D-E) starke Immunreaktion mit dem KAI1-Antikörper im Übergangsbereich Tumor/Nekrose. Vergr.:A-E) 100-fach 3.4 Korrelation der klinikopathologischen Befunde mit den immunhistochemischen Befunden Die Tabelle 3.4 zeigt die histopathologischen Befunde und den Lymphknotenstatus, Fernmetastasierung sowie den klinischen Verlauf aller untersuchten PSCC in willkürlich gewählter Reihenfolge in Korrelation mit Expressionsstärke von KAI1, nm23-H1, cCasp3 und cCasp6. Ergebnisse 45 Tabelle 3.4: Übersicht klinikopathologischer Befunde Nr. Alter T N M G St KAI NM C3 1 58 T1 N1 M1 G2 4 2 2 0 2 44 T1 N0 M0 G2 1 3 3 1 3 77 T2 N1 M0 G2 2 1 1 1 4 69 T1 N3 M0 G2 4 2 2 1 5 40 T1 N3 M1 G3 4 1 2 1 6 66 T3 N2 M0 G2 3 3 2 0 7 60 T3 N3 M1 G2 4 2 2 0 8 63 T2 N1 M1 G2 4 2 2 0 9 89 T3 N2 M1 G2 4 1 2 0 10 68 T3 N0 M0 G1 3 3 3 0 11 78 T4 N2 Mx G2 x 2 2 x 12 51 T0/PIN N0 M0 G0 0 3 3 2 13 88 T3 N2 Mx G1 x 2 2 0 14 78 T2 N0 M0 G2 2 3 3 1 15 56 T0/PIN N0 M0 G0 0 3 2 0 16 78 T2 N2 M1 G2 4 2 1 0 17 35 T1 N0 M0 G0 1 3 3 1 18 55 T0/PIN N0 M0 G0 0 3 3 0 19 68 T2 N0 M0 G2 2 3 3 1 20 62 T1 N2 M0 G2 3 3 2 1 21 76 T1 N1 M0 G2 2 3 3 1 22 87 T3 N2 Mx G3 x 2 2 1 23 67 T1 N0 M0 G2 1 3 3 1 24 87 T3 N0 Mx G2 x 3 3 1 25 58 T2 N3 M0 G2 4 2 2 1 26 59 T1 N0 M0 G1 1 3 3 0 27 59 T1 N0 M0 G2 1 3 2 x 28 69 T1 N0 M0 G2 1 3 2 1 29 55 T2 N1 M0 G2 2 3 2 1 30 61 T0/PIN N0 M0 G0 0 3 3 x 31 66 T2 N0 Mx G1 x 3 3 x 32 56 T1 N1 Mx G2 x 2 2 0 33 59 T1 N0 M0 G3 2 3 3 1 34 76 T3 N0 M0 G2 3 3 3 0 C6 1 3 3 3 3 1 0 0 0 0 x 2 2 2 x 3 2 0 0 1 1 1 1 0 0 2 2 1 0 2 3 0 2 1 Krankheitsverlauf Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei lebend mit Tumor lebend mit Tumor Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei Tod andere Ursache lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor Tod, andere Ursache lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei lebend, krankheitsfrei lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor lebend, krankheitsfrei Tod, andere Ursache lebend, krankheitsfrei lebend, krankheitsfrei lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor Tod durchTumor lebend, krankheitsfrei lebend, krankheitsfrei Tod durch Tumor Tod, andere Ursache lebend, krankheitsfrei ÜZ 23 36 96 36 8 78 6 101 2 60 12 73 31 33 1 10 47 123 105 47 83 43 76 16 122 73 63 17 29 40 125 13 30 28 -: Abk.: Nr.-Nummer, T-Tumorstadium, N-Nodalstatus, M-Metastasen, G-Grade, St-Stage, KAI/ NM-nm23 / CcCaspase-3/ C-cCaspase-6-Immunreaktivität, ÜZ-Überlebenszeit in Monaten , PIN-penile intraepitheliale Neoplasie, x-nicht beurteilbar bzw. fehlen 3.5 Korrelation der KAI1-Expression mit klinikopathologischen Faktoren In der Tabelle 3.5 sind die statistischen Beziehungen KAI1-Expression mit dem Alter, der Tumorausdehnung, dem LK-Status, der Fernmetatstasierung, der Tumordifferenzierung, dem WHO-Tumorstadium und der EAU-Risikoeinteilung dargestelllt. Die Prüfung der Signifikanzen wurde mit dem exakten Fisher Test durchgeführt. Der Vergleich von Alter und Ergebnisse 46 T-Stadium stellt sich als statistisch nicht signifikant dar (p≥0,05). Dagegen ist eine Gegenüberstellung der KAI1-Expression mit N-Stadium (graphisch dargestellt in Abb. 3.14), M-Stadium, der Differenzierung und dem WHO-Stadium statistisch signifikant (p <0,05). Für die Immunreaktivität des KAI1-Antikörpers, dem Alter der Patienten, der Tumoreindringtiefe (T-Stadium) sowie dem EAU-Risiko wurde keine statistische Signifikanz festgestellt. Immunreaktivität KAI1 in Prozent 100% 80% ---95% CI 60% 40% 20% 0% 0 1 Lymphknotenbefall Abb. 3.14. Graphische Darstellung der signifikanten Beziehung der KAI1 Immunreaktivität und des LK-Befallls. Zusammenhang von LK-Befall (0-nein, 1-ja) und der Abbnahme der Immunreaktivität von KAI1 auf, 4 PIN nicht aufgenommen; Mittelwertvergleich (T-Test): N0=71% gegen N1=34% Immunreaktivität der Tumorzellen (p<0,001). Ein Pkt. entspricht z.T. mehreren Fällen; 95% CI-Konfidenzintervall. Ergebnisse 47 Tabelle 3.5: Korrelation der KAI1 Immunreaktivität mit klinikopathologischen Parametern kliniko-pathologische Parameter Alter in Jahren Tumor Lymphknotenstatus, N Fernmetastasen, M Differenzierungsgrad Stadium EAURisiko №.₧. Anzahl Level der KAI1 Expression 0 Anzahl 1 Anzahl 2 Anzahl ≤ 60 Jahre 14 1 4 9 >60 Jahre 20 2 6 12 Gesamt 34 3 10 21 0 4 0 0 4 1 13 1 3 9 2 8 1 3 4 3 8 1 3 4 4 1 0 1 0 Gesamt 34 3 10 21 0 13 0 0 13 1 6 1 3 2 2 7 1 4 2 3 4 1 3 0 Gesamt 30 3 10 17 0 18 1 2 15 1 6 2 4 0 Mx 6 0 4 2 Gesamt 30 3 10 17 0 5 0 0 5 1 4 0 1 3 2 21 1 7 13 3 4 2 2 0 Gesamt 34 3 10 21 0 4 0 0 4 1 6 0 0 6 2 6 1 0 5 3 4 0 0 4 4 nicht beurteilbar Gesamt 8 2 6 0 6 0 4 2 34 3 10 21 gering 6 0 0 6 mittel 9 0 2 7 hoch 19 3 8 8 Gesamt 34 3 10 21 p-Wert 1,00 0,614 <0,001 <0,001 0,035 <0,001 0,108 -: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistisch signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an; sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen Ergebnisse 48 3.6 Korrelation der nm23-H1 Expression mit klinikopathologischen Parametern Die Tabelle 3.6 stellt den Zusammenhang zwischen der Immunreaktivität für nm23-H1 mit den klinikopathologischen Parametern mit dem exakten Fisher Test dar. Der Vergleich von Alter, T-Stadium, Grade, Stage, M-Stadium und EAU-Risiko mit der Immunreaktivität war dabei statistisch nicht signifikant (p>0,05). Dagegen korrelierte das N-Stadium hochsignifikant (p<0,001) mit der nm23-H1 Immunreaktivität (Tab.3.7, Abb.3.15). Immunreaktivität nm23 in Prozent 100% 80% 60% --- 95% CI 40% 20% 0% 0 1 Lymphknotenbefall Abb. 3.15.: Das Streudiagramm zeigt graphisch den signifikanten Unterschied der nm23-H1 Immunreaktivität und des LK-Befalls auf. Zusammenhang von LK-Befall (0-nein, 1-ja) und der Abnahme der Immunreaktivität von nm23, 4 PIN nicht eingeschlossen. Mittelwertvergleich (T-Test): N0=64% gegen N1=31% Immunreaktivität der Tumorzellen (p<0,001). Ein Pkt. entspricht z.T. mehreren Fällen; 95% CI-Konfidenzintervall. Ergebnisse 49 Tabelle 3.6: Korrelation der nm23-H1 Immunreaktivität mit klinikopathologischen Parametern kliniko-pathologische Parameter Alter in Jahren Tumor Lymphknotenstatus, N Fernmetastasen, M Differenzierungsgrad Stadium EAU-Risiko №.₧. Anzahl Level der nm23 Expression 0 Anzahl 1 Anzahl 2 Anzahl ≤ 60 Jahre 14 0 8 6 >60 Jahre 20 2 9 9 Gesamt 34 2 17 15 0 4 0 1 3 1 13 0 7 6 2 8 2 3 3 3 8 0 5 3 4 1 0 1 0 Gesamt 34 2 17 15 0 13 0 2 11 1 6 1 4 1 2 7 1 6 0 3 4 0 4 0 Gesamt 30 2 16 12 0 18 1 7 10 1 6 1 5 0 Mx 6 0 4 2 Gesamt 30 2 16 12 0 5 0 1 4 1 4 0 1 3 2 21 1 12 8 3 4 1 3 0 Gesamt 34 2 17 15 0 4 0 1 3 1 6 0 2 4 2 6 1 1 4 3 4 0 2 2 4 8 1 7 0 nicht beurteilbar 6 0 4 2 Gesamt 34 2 17 15 gering 6 0 1 5 mittel 9 0 5 4 hoch 19 2 11 6 Gesamt 34 2 17 15 p-Wert 0,551 0,447 <0,001 0,093 0,136 0,054 0,228 -: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an; sämtliche PIN(n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen. Ergebnisse 50 3.7 Statistischer Vergleich der Immunreaktion für KAI1 und nm23-H1 mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen Die Immunreaktivität für KAI1 und nm23-H1 ist zwischen den Gruppen mit und ohne LKBefall unterschiedlich. Der Mittelwertunterschied der Proteinexpression mit dem LK-Befall ist hochsignifikant (p<0,001)(Abb. 3.16). mittlere Immunreaktivität in Prozent 80% KAI1 nm23 60% 40% 20% 0% negativ positiv Lymphknotenbefall Abb. 3.16.: Vergleich der mittleren Immunreaktivität der Antikörper gegen KAI1 und nm23-H1 mit dem Lymphknotenbefall (Werte: siehe Abb. 3.14, 3.15) 3.8 Koexpression von nm23 und KAI1 Die Beziehung zwischen der nm23-H1 und KAI1-Immunreaktivität wird in Tabelle 3.7 veranschaulicht. Der statistische Zusammenhang zwischen beiden Größen ist hochsignifikant (p<0,001). Die Korrelationanalyse ist stark positiv (Kendall-Tau-c: τ=0,720) und beschreibt eine starke Koexpression beider Proteine im Tumor. Tabelle 3.7: Koexpression von nm23 und KAI1 KAI1 nm23 ≤50% ≤50% 13 (100%) >50% 5 (23,8%) >50% 0 (0%) 16 (76,2%) F p 19,860 <0,001 -: KAI1/ nm23-H1 Immunreaktivität schwach oder stark (≤50%/ >50%); dargestellt sind Absolutwerte sowie Prozentwerte, F-Fisher-Exact-Test: Wert, p-Wahrscheinlichkeit Ergebnisse 51 3.9 Korrelation der Effektorcaspase-3-Immunreaktion mit klinikopathologischen Parametern Tabelle 3.8 Level der Caspase 3 Expression №.₧. Anzahl fehlende Fälle Anzahl ≤ 60 Jahre 14 1 6 6 1 >60 Jahre 20 3 7 10 0 Gesamt 34 4 13 16 1 0 4 1 2 0 1 1 13 1 3 9 0 2 8 1 2 5 0 3 8 0 6 2 0 4 1 1 0 0 0 Gesamt 34 4 13 16 1 0 13 2 3 8 0 1 6 0 3 3 0 2 7 1 4 2 0 3 4 0 1 3 0 Gesamt 30 3 11 16 0 0 18 1 4 13 0 1 6 0 5 1 0 Mx 6 2 2 2 0 Gesamt 30 3 11 16 0 0 5 1 2 1 1 1 4 1 3 0 0 Differenzierungsgrad 2 21 2 8 11 0 3 4 0 0 4 0 Gesamt 34 4 13 16 1 0 4 1 2 0 1 1 6 1 1 4 0 2 6 0 0 6 0 3 4 0 3 1 0 4 8 0 5 3 0 nicht beurteilbar 6 2 2 2 0 Gesamt 34 4 13 16 1 gering 6 1 3 1 1 mittel 9 1 2 6 0 hoch 19 2 8 9 0 Gesamt 34 4 13 15 2 kliniko-pathologische Parameter Alter in Jahren Tumor Lymphknotenstatus N Fernmetastasen M Stadium EAURisiko 0 Anzahl 1 Anzahl 2 Anzahl p-Wert ,575 ,020 ,427 ,034 ,023 ,024 ,145 -: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an; sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung vom N-, M-Stadium nicht einbezogen; fehlende Fälle: waren bei der Auswertung nicht verfügbar. Ergebnisse 52 3.10 Korrelation der Effektorcaspase-6-Immunreaktion mit klinikopathologischen Parametern Tabelle 3.9 kliniko-pathologische Parameter №.₧. Anzahl fehlende Fälle Anzahl ≤60 14 >60 Alter in Jahren Tumor N M Grade Stadium EAURisiko Level der Caspase 6 Expression 0 Anzahl 1 Anzahl 2 Anzahl 3 Anzahl 1 5 1 5 2 20 1 5 7 3 4 Gesamt 34 2 10 8 8 6 0 4 1 1 0 2 0 1 13 0 1 5 4 3 2 8 0 4 0 1 3 3 8 0 4 3 1 0 4 1 1 0 0 0 0 Gesamt 34 2 10 8 8 6 0 13 0 3 3 5 2 1 6 0 3 2 0 1 2 7 1 1 3 1 1 3 4 0 2 0 0 2 Gesamt 30 1 9 8 6 6 0 18 0 4 6 5 3 1 6 0 3 1 0 2 Mx 6 1 2 1 1 1 Gesamt 30 1 9 8 6 6 0 5 1 1 0 3 0 1 4 0 1 0 2 1 2 21 1 8 7 3 2 3 4 0 0 1 0 3 Gesamt 34 2 10 8 8 6 0 4 1 1 0 2 0 1 6 0 0 2 3 1 2 6 0 2 1 2 1 3 4 0 1 3 0 0 4 8 0 4 1 0 3 nicht beurteilbar 6 1 2 1 1 1 Gesamt 34 2 10 8 8 6 gering 6 1 1 0 4 0 mittel 9 0 1 5 2 1 hoch 19 1 8 3 2 5 Gesamt 34 2 10 8 8 6 p-Wert ,20 ,052 ,231 ,733 ,015 ,287 ,016 -: Signifikanzniveau: p<0,05, zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an; sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen; fehlende Fälle: waren bei der Auswertung nicht verfügbar. Ergebnisse 53 Die Tabellen 3.8-3.9 stellen den Zusammenhang zwischen der Immunreaktion für die cCaspasen 3 und 6 und den histo-/klinikopathologischenen Befunden dar. Die Prüfung der Signifikanzen wurde mit dem exakten Fisher Test durchgeführt. Der Vergleich von T-Stadium, M-Stadium, Grad und Stage mit der Immunreaktion von cCaspase 3 ist statistisch signifikant (p<0,05). Dagegen ist Zusammenhang der c-Caspase 6 Immunreaktion nur mit dem Differenzierungsgrad und dem EAU-Risiko statistisch signifikant (p<0,05). Eine tendenzielle Beziehung zum T-Stadium lässt sich mit der c-Caspase 6 Immunreaktion erkennen (p=0,052). 3.11 Statistischer Vergleich der Immunreaktion für Effektorcaspase 3 und 6 mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen Die Abb.3.16 gibt graphisch die mittleren Immunreaktivitätsscores der cCasp3 und 6 in Bezug auf den Lymphknotenstatus wieder. Die Werte sind annähernd gleich verteilt, sodass kein Unterschied zwischen den Gruppen mit und ohne LK-Befall in Bezug auf die Immunreaktion beider Antikörper besteht (p>0,05). mittlerer Score 1,5 C3 C6 1 0,5 0 negativ positiv Lymphknotenbefall Abb.3.16.: mittlere Immunreaktivität der cCasp3 und 6 bei LK-Befall neg./pos. (N0/N1); mittlerer Score (Immunreaktivitätsgruppe): gebildet aus Reaktivitätsgruppen 0-3 (siehe 2.2.3.2), 4 PIN nicht aufgenommen; Mittelwertvergleich (T-Test): cCaspase 3: mittlerer Immunreaktivitätsscore N0=0,73 gegen N1=0,56, p=0,467; c-Caspase 6: mittlerer Immunreaktivitätsscore N0=1,25 gegen N1=1,13, p=0,77 Ergebnisse 54 3.12 Prädiktive Faktoren für die Metastasierung In der univariaten Analyse mit dem exakten Fisher Test stellten sich die Faktoren Differenzierung, Risikoeinteilung nach EAU (2004), Reaktivität für KAI1 und nm23-H1 als statistisch signifikante Parameter (p<0,05) für eine nodale Metastasierung heraus. Das Tumorstadium ergibt keine statistische Signifikanz (p>0,05). Die Korrelationsanalyse mit dem Kendall-Tau Test (τ) zeigte eine mittelstarke positive Korrelation (Korrelationskoeffizient: r>0,5) für die Differenzierung mit dem N-Status. Für die Faktoren nm23-H1 und KAI1 bestehen starke negative Korrelationen (r>-0,7) mit der Metastasierung. In der multivariaten Analyse (logistische Regression) zeigte sich nur das Protein nm23-H1 als prognostisch unabhängige Variable (p<0,05) für die Vorhersage von Metastasen in Bezug auf T-Stadium/ Differenzierungsgrad/ EAU-Risiko bzw. auf die Expression von KAI1. Die Effektorcaspasen wurden in die multivariate Analyse nicht mit einbezogen, da bereits bei der Prüfung mit dem Fisher-Exakt-Test keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf den Metastasenstatus vorlagen. Das Streudiagramm in Abb. 3.17 stellt den Zusammenhang der Stärke der Immunreaktivität von KAI1 bzw. nm23-H1 mit dem Lymphknotenbefall dar. Deutlich wird in dieser Abbildung eine tendenzielle Zunahme der Metastasierung bei Abnahme der Immunreaktivität beider Antikörper. Die Koexpression beider Proteine in Bezug auf den LK-Status ist in der multivariaten Analyse statistisch jedoch nicht signifikant (siehe Tab.3.10. KAI1/ nm23-H1 [III]). Ergebnisse 55 Tabelle 3.10: Analyse prädiktiver Faktoren für die Metatstasierung Gesamt n T Grade Risiko nach EAU KAI1 nm23H1 Prädiktive Faktoren für Metastasierung Patn. mit Fisher Metastasen τ p-Wert n (%) 0 4 0 (,0%) 1 13 6 (46,2%) 2 8 5 (62,5%) 3 8 5 (62,5%) 4 1 1 (100,0%) 0 5 0 (,0%) 1 4 1 (25,0%) 2 21 12 (57,1%) 3 4 4 (100,0%) 1 6 0 (0%) 2 9 4 (44,4%) 3 19 13 (68,4%) 0 3 3 (100,0%) 1 10 10 (100,0%) 2 21 4 (19,0%) 0 2 2 (100,0%) 1 17 14 (82,4%) 2 15 1 (6,7%) 0,201 Wert:5,754 0,009 Wert:9,932 0,012 Wert:8,742 <0,001 Wert:21,925 <0,001 Wert:21,070 Multivariat p-Wert I II III 0,037 r=0,398 ,827 1,0 0,002 r=0,554 ,346 ,997 0,006 r=0,495 ,697 ,938 <0,001 r=-0,765 <0,001 r=-0,785 ,997 ,998 ,004 ,045 -: Zusammenhänge zwischen Metastasierung (nodal) und der Tumoreindringtiefe (T), der Differenzierung (Grade), und der Antikörperreaktion für KAI1 und nm23 Die Auswertung auf Signifikanz wurde mit dem Fisher-Exakt Test, die Korrelationanalyse mit Kendall-Tau-c und die multivariate Analyse der Faktoren T-Stadium, Grade, EAU-Risikoeinteilung und nm23(I), KAI1(II) bzw. KAI1/ nm23 (III) mit der binär logistischen Regression durchgeführt. Ergebnisse 56 100% KAI1 in Prozent 80% 60% ---95% CI 40% Lymphknotenbefall 20% negativ positiv 0% 0% 20% 40% 60% 80% 100% nm23 in Prozent Abb. 3.17.: Darstellung der Abhängigkeit des LK-Befall mit der Immunreaktivität der Antikörper gegen KAI1 (Ordinate) und nm23-H1 (Abszisse). Fünfeck: kein LK-Befall; Stern: LK-Befall nur Tumoren mit Invasionsverhalten wurden berücksichtigt, PIN (n=4) wurden ausgeschlossen 3.13 Risikoeinteilung für Lymphknotenmetastasen Die Tabellen 3.11-12 zeigen in Anlehnung an die Einteilungen nach Solsona und EAU Risikoabschätzungen für das Vorhandensein von positiven Lymphknoten in je drei Gruppen mit den Überlebenswahrscheinlichkeiten dieser Gruppen. In den Tabellen wurden lediglich 29 Patienten in die Risikoeinteilung aufgenommen, da die ausgeschlossenen Patienten (n=5) nicht krankheitsspezifisch verstorben sind. Nach der Solsona-Einteilung besteht eine statistische Signifikanz weder für den LK-Befall (p ≥0,05) noch für einen postoperativen Überlebensvorteil niedriger gegen höhere Risikogruppen (log rank ≥0,05). Für die Einteilung nach EAU hingegen besteht ein signifikanter Unterschied der Risikogruppen und dem LK-Befall, sodass eine niedrige Risikogruppe mit einer geringen Metastasierungsneigung korreliert. Nicht signifikant ist der Zusammenhang dieser Risikoeinteilung mit dem Überleben (log rank ≥0,05). Ergebnisse 57 3.13.1 Risikoeinteilung nach Solsona für LK-Befall mit Überlebensstatistik Tabelle 3.11 Risikogruppe Gruppenbeschreibung LK pos./ Gesamtzahl der Tumoren 1-niedriges Risiko ≤ T1G1 1/7 2-mittleres Risiko T1G2-3 & T2G1 9/15 3-hohes Risiko T2G2-3 & > T3 5/7 p-Wert für LK-Befall n (%) Log rank für Überleben 6(85,71) 0,101 (Wert:5,182) 9(60,0) 0,586 (Wert:1,653) 4(57,14) -: verändert nach Solsona (2001) LK pos./Tumoren: positiver LK-Nachweis auf Gesamtanzahl der Tumoren in jeweiliger Risikogruppe; Fisherexakter Fisher Test; n-Anzahl und Prozentzahlen überlebender Patienten der jeweiligen Gruppe; die Überlebensanalyse wurde nach Kaplan-Meier berechnet (log rank). 3.13.2 Risikoeinteilung nach EAU für LK-Befall mit Überlebensstatistik Tabelle 3.12 Risikogruppe Gruppenbeschreibung LK pos./ Gesamtzahl der Tumoren 1-niedriges Risiko < T1G2 0/6 2-mittleres Risiko T1G2 4/9 > T1G2 13/19 3-hohes Risiko p-Wert für LK-Befall n (%) Log rank für Überleben 6(100) 0,012 (Wert:8,742) 4(50,0) 0,23 (Wert:2,93) 9(60) -: verändert nach EAU (2004) LK pos./Tumoren: positiver LK-Nachweis auf Gesamtanzahl der Tumoren in der jeweiligen Risikogruppe; Fisher-exakter Fisher Test; n-Anzahl und Prozentzahlen überlebender Patienten der jeweiligen Gruppe; die Überlebensanalyse wurde nach Kaplan-Meier berechnet (log rank). 3.14 Prognose Im Verlauf des Beobachtungszeitraumes mit einer mittleren Beobachtungszeit von 49,59 Monaten (Spannweite: 1 bis 125 Monate) verstarben 15 (44,1%) Patienten, hiervon 5 (14,7%) nicht tumorbedingt. Bei 2 (5,9%) von 19 (55,9%) der überlebenden Patienten wurde zum Ende der Beobachtungszeit ein Fortschreiten der Tumorerkrankung festgestellt. Ergebnisse 58 3.14.1 Nodalstatus und Prognose Die mittlere Überlebenszeit und die 5-Jahres-Überlebensrate zeigen eine deutliche Abhängigkeit vom Nodalstatus. Die Ergebnisse des Nodalstatus in Bezug auf das Überleben zeigten nicht nur die prognostische Bedeutung der Metastasierung (ja/nein) als Marker eines besseren Outcomes auf, sondern auch eine bessere Prognose bei Patienten mit bis zu einem pos. Lymphknoten (≤N1)(log rank<0,05). Der Vergleich zwischen N1 und N2 zeigte tendenziell, dass Patienten mit geringerer lymphatischer Absiedelung bessere Prognosen haben, jedoch fehlte die statistische Signifikanz (log rank: p=0,52). Die Überprüfung auf Unterschiede des mittleren Beobachtungszeitraumes mittels T-Test aller Gruppen ergab keine statistische Signifikanz (p≥0,05), so dass von einer gleichmäßigen Verteilung für die Nachbeobachtungszeiten ausgegangen werden kann. Dies zeigt, dass eine Selektion bestimmter Gruppenhäufigkeiten durch kürzere oder längere Beobachtungsintervalle nicht statt fand. Tabelle 3.13: Prognostische Bedeutung der Anzahl des LK-Befalls bei der Prognose NN+ N0/1 ≥N2 N-Status N1 ≥N2 Anzahl n 14 15 20 9 6 9 BZR Mittelwert 61,93 48,8 60,6 43,0 57,5 43,0 T p-Wert n.s. 0,355 n.s. 0,248 n.s. 0,484 5-JÜR 92,31% 39,11% 78,78% 30,86% 50,0% 30,86% Log rank 0,0067 0,0171 0,54 -: Patienten, welche nicht krankheitsbedingt verstarben sind für die Berechnung ausgeschlossen worden (eingeschlossen n=29). n: Anzahl von Patienten in der jeweiligen Gruppe, BZR Mittelwert: mittlerer Beobachtungszeitraum in Monaten, T: T-Test zum Vergleich der Mittelwerte der BZR mit zugehöriger Signifikanz, n.s.: nicht signifikant, 5-JÜR: 5Jahres-Überlebensrate (60-Monate) in Prozent, log rank: zeigt Signifikanz des Kapal-Meier-Testes; N-/N0_kein LK-Befall; N+/≥N1/N2_pos. LK-Befall/einer/ mehr als ein LK befallen. 3.14.1.1 Korrelation von Nodalstatus und Überlebenszeit Die beiden Überlebenskurven berechnet nach Kaplan-Meier zeigen, dass Überlebenswahrscheinlichkeit signifikant vom Nodal-Status abhängt (log rank: 0,0067). die Ergebnisse 59 100% Überleben in Prozent 90% 80% Lymphknotenbefall 70% 60% nein nein-zensiert ja ja-zensiert 50% 40% 30% 0 25 50 75 100 125 Beobachtungszeitraum in Monaten Abb. 3.18.: In die Berechnung wurden nur Patienten einbezogen die krankheitspezifisch verstarben und jene, die mit/ohne Krankheit den Beobachtungszeitraum überlebten (n=29). Lymphknotenbefall-zensiert: Ende des Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich zwischen 30-100% wieder. 3.14.2 Korrelation der KAI1 Expression mit der Überlebenszeit Die Überlebenskurven berechnet nach Kaplan-Meier, geben die unterschiedlichen Überlebenszeitverteilungen bei verschieden starker Immunreaktivität des KAI1-AK im Tumorgewebe wieder. Die differenten Kurvenverläufe zeigen einen Überlebensvorteil für die Gruppe mit Immunreaktivität >50% (log rank: p=0,007). Die 3-JÜR betrug für die Gruppe mit starker Expression 87,8%, gegen nur 45,5% der anderen Gruppen. 100% Überleben in Prozent 90% 80% KAI1 70% <50% >50% 60% <50%-zensiert >50%-zensiert 50% 40% 30% 0 25 50 75 100 125 Beobachtungszeitraum in Monaten Abb. 3.19.: In die Berechnung wurden nur Patienten. einbezogen die krankheitspezifisch verstarben und jene, die mit/ohne Krankheit den Beobachtungszeitraum überlebten (n=29). KAI1: <50/ >50% (geringe/ starke) Immunreaktivität von KAI1-AK; (<50%)-(>50%)- zensiert: kennzeichnet das Ende des Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich zwischen 30-100% wieder. Ergebnisse 60 3.14.3 Korrelation der nm23 Expression mit der Überlebenszeit Die graphische Darstellung der Überlebenszeitanalyse nach Kaplan-Meier zeigt eine deutliche Beziehung zwischen höherer Immunreaktivität und dem Überleben der Gruppe >50%. Die 3JÜR betrug für die Gruppe mit starker Expression 100%, wohingegen nur 50% der Patienten der übrigen Gruppen den Zeitraum überlebten. Deutlich wird die bessere Prognose für die Gruppe mit starker Reaktivität (log rank: p=0,0013). 100% Überleben in Prozent 90% nm23 80% <50% >50% 70% <50%-zensiert >50%-zensiert 60% 50% 40% 30% 0 25 50 75 100 125 Beobachtungszeitraum in Monaten Abb. 3.20.: In die Berechnung wurden nur Patienten. Einbezogen, die krankheitspezifisch verstarben und jene, die mit/ohne Krankheit im Beobachtungszeitraum überlebten (n=29). nm23: 1-3 (geringe-starke) Immunreaktivität von nm23-AK; (+0)-(+2)- zensiert: Ende des Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich zwischen 30-100% wieder. 3.14.4 Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Expression beider Proteine im Tumor Die Überlebenszeiten bei Gruppen deren Tumoren eine stark positive Reaktivität (>50%) auf beide Antikörper (N+K+) zeigten, waren signifikant höher als die der Patienten mit Tumoren der anderen Gruppen (N-K+/ N+K-/ N-K-) (log rank: p=0,0079). Ein signifikanter Unterschied der Überlebenszeiten der drei anderen Gruppen untereinander bestand nicht (log rank: p= 0,3974). Tabelle 3.15: Mittlere Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Proteinexpression N+K+ 104 Mittleres Überleben in Monaten N+KN-K+ 50 N-K47 -: zeigt das mittlere Überleben in Monaten der Gruppen mit unterschiedlich starker Reaktivität der Antikörper (AK) nm23 (N) und KAI1 (K) im Tumor; N+K+: Reaktivität beider AK >50%; N+K-: nm23 >50%, KAI1<50% (diese Gruppe enthält keinen Patienten); N-K+: nm23<50%, KAI1>50%; N-K-:nm23/KAI1<50%. Ergebnisse 61 3.14.4.1 Überlebenskurven für die Reaktivität der Antikörper nm23/KAI1 Überleben in Prozent 100% 80% 60% 40% NM23&KAI1 20% 0% 0 25 50 alle anderen 1-zensiert N+K+ 2-zensiert 75 100 125 Überlebenszeit in Monaten Abb. 3.21.: Kurven nach Kaplan-Meier zeigen den signifikanten Unterschied der Überlebenszeiten zwischen der Gruppe nm23/KAI1 >50% (N+K+) und den übrigen Gruppen (einer oder beide AK negativ); log rank: p= 0,0079 3.14.5 Korrelation der Effektorcaspase 3 und 6 Expression mit der Überlebenszeit Die Ergebnisse für die Effektorcaspasen 3 und 6 sind in Bezug auf das Überleben nicht signifikant (log rank: C3=0,63; C6=0,85). Die Grafiken wurden wegen fehlender Zusammenhänge nicht dargestellt. 3.15 Ergebnisse des Cox’schen Regressionsmodells für das Überleben Mit Hilfe der Cox’schen Regression wurde in der multivariaten Analyse der Einfluss von klinikopathologischen Faktoren (TNM-Stadium, Stadium nach WHO, Differenzierung) und den immunhistochemischen Ergebnissen in Bezug auf das Überleben untersucht. Hierbei erlangte nur das Protein nm23-H1 als unabhängiger prognostischer Faktor statistische Signifikanz (p<0,05). Die Analyse zeigt eine Risikoreduktion (RR=0,056) in Bezug auf das Überleben bei einer starken Immunoreaktivität von nm23-AK im Tumorgewebe. Alle weiter aufgeführten Faktoren sind in der multivariaten Analyse nicht signifikant. Ergebnisse 62 Tabelle 3.5: Multivariate Analyse von KAI1, nm23-H1 und klinikopathologischen Faktoren mit dem Überleben RR KAI1 Nm23 Stadium T N M Grade 2,452 ,056 ,948 ,461 1,795 1,419 ,919 95,0% Konfidenzintervall für RR untere Grenze obere Grenze ,462 13,008 ,005 ,632 ,211 4,254 ,167 1,273 ,385 8,362 ,471 4,276 ,328 2,579 p-Wert ,292 ,020 ,945 ,135 ,456 ,534 ,873 -: Auflistung prognostischer Faktoren mit Signifikanz (p-Wert), relativem Risiko (RR) und dem Konfidenzintervall (gibt den kleinsten bzw. größten Wert des berechneten RR wieder) in Bezug auf das Überleben. In die Berechnung gingen 29 Patn. ein. Aufgrund eines nicht krankheitsspezifischen Todes wurden 5 Patn. ausgeschlossen. 4 Diskussion 4.1 Klinische Tumorparameter und Prognose Die Einteilung der Tumoren nach dem TNM-System und dem hieraus gebildeten WHOStadium wurde für diese Studie beibehalten, da die im angloamerikanischen Sprachraum verwendete Jackson-Klassifikation in Deutschland unüblich in Bezug auf die Aussage für das klinische Procedere ist, da hier nur die Tumorlokalisation (Glans, Corpus), nicht aber die Differenzierung, Eindringtiefe oder die Ausdehnung des Lymphknotenbefalls Beachtung finden. In Anlehnung an frühere Studien (Naumann et al. 2006) wurden in der vorliegenden Untersuchung die prognostisch relevanten Faktoren in retrospektiver Auswertung überprüft. 4.1.1 Lokale Tumorausdehnung Die bisher für die Prognose entscheidende Einbeziehung von Tumor-Stadium und Metastasen-Status für eine Stadieneinteilung nach dem TNM-System scheint nicht unproblematisch zu sein, da das T-Stadium in den meisten Untersuchungen keinen unabhängigen prognostischen Faktor darstellt (Hiddemann and Hiddemann Huber 2004). Dennoch wird das T-Stadium neben dem Differenzierungsgrad des Primärtumors und des klinischen inguinalen Lymphknotenstatus als Indikation für die Lymphknotenentfernung herangezogen. In verschiedenen Publikationen wurde gezeigt, dass eine Unterscheidung von Patienten in Gruppen ohne (pTa-T1) bzw. mit Infiltration der Corpora spongiosa/ cavernosa oder Urethra (pT2-3) sinnvoll ist. So schwankt die lymphatische Progression in der Gruppe ohne Infiltration der Schwellkörper zwischen 5-11% (de Kernion et al. 1973; Hardner et al. 1972; McDougal 1995), wohingegen bei der Gruppe mit Inflitration die Progressionsrate auf 60-70% anstieg (Horenblas and van Tinteren 1994; McDougal 1995; Villavicencio et al. 1997). Besonders problematisch scheinen sehr unterschiedliche Aufteilungen in Untergruppen zu sein (Naumann et al. 2006). So werden nicht-invasive Tumoren (Ta und CIS) mit T1Tumoren subsumiert oder die höhere Metastasierungsrate bei schlechter differenzierten Tumoren nicht berücksichtigt. Als Konsequenz dieser unterschiedlichen Einteilungen liegen die Metastasierungsraten bei Tumoren bis T1 zwischen 0-58% (Naumann et al. 2006). In den durch die europäische Gesellschaft für Urologie (EAU) herausgegebenen Leitlinien erfolgte eine modifizierte Einteilung der Risikogruppen auf der Grundlage der Daten Solsona’s Diskussion 64 (Solsona et al. 1992). Auch hier scheint die genaue Voraussage für die lymphatische Metastasierung, insbesondere in der mittleren Risikogruppe (T1G2) nicht sicher zu gelingen. So fanden Naumann et al. (2006) keine Unterschiede in der Metastasierungswahrscheinlichkeit bei T1 und T2 Tumoren. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls kein statistischer Zusammenhang zwischen T-Stadium und dem Nodalstatus bzw. der Überlebenswahrscheinlichkeit nachgewiesen (Tab. 3.2). Dennoch war bei höherer Eindringtiefe eine tendenzielle Zunahme metastatischer Absiedelungen und auch die Abnahme der Überlebenswahrscheinlichkeit augenscheinlich. Die Gruppe der pTa-1 Tumoren zeigte in der vorliegenden Arbeit Tendenzen einer besseren Prognose. So wiesen 67% der Patienten ohne Infiltration der Schwellkörper keine Metastasen auf. Allerdings waren diese Korrelationen statistisch nicht signifikant (p=0,085; Daten nicht aufgeführt). 4.1.2 Grading In der Literatur wird die zunehmende Entdifferenzierung der Tumorzellen, mehr noch als das bloße Vordringen des Tumors, für die Zunahme der Metastasierung verantwortlich gemacht (Horenblas and van Tinteren 1994; Theodorescu et al. 1996; Villavicencio et al. 1997). Ein Befall der inguinalen Lymphknoten fand sich bei dem in dieser Arbeit vorliegenden Patientengut in 25% der gut differenzierten, in 57% der mittelgradig differenzierten und zu 100% bei schlecht differenzierten Tumoren. In der Literatur wurden sehr ähnliche Verteilungen des Lymphknotenbefalls bei G1-3-Tumoren von 4-24%, 46-79% respektive 82100% beschrieben (Fraley et al. 1989; Heyns et al. 1997; Horenblas et al. 1993; Solsona et al. 1992; Theodorescu et al. 1996). Die positive Korrelation des Differenzierungsgrades mit dem Nodal-Status war signifikant und könnte somit zur Prognoseeinschätzung herangezogen werden (Tab. 3.25). Dies steht im Einklang mit den Kriterien der von der EAU herausgegebenen Richtlinien für die Durchführung einer Lymphadenektomie (Solsona et al. 2004). Eine Bestätigung der prognostischen Wertigkeit des Gradings findet sich auch in einer Multicenter Studie von Ficarra et al. (2005), die zudem die Mitberücksichtigung der Lymph- und Gefäßembolisation für gute Vorhersageergebnisse empfiehlt. Diskussion 65 4.1.3 Metastasierung Die Metastasierung ist der entscheidende prognostische Faktor für das Überleben (Horenblas 2001; Ravi 1993). So konnte bei fortgeschrittenen Tumoren, welche die Corpora cavernosa infiltrierten, eine 5-JÜR von 66-88% bei Patienten mit negativen und eine 5-JÜR von nur 038% der Patienten mit positivem LK-Status beobachtet werden (Pizzocaro et al. 1997). Auch scheint die Anzahl der betroffenen LK Einfluss auf das Überleben zu haben. So sinkt bei einem LK-Befall von mehr als 2 Lymphknoten die 5-Jahresüberlebensrate (5-JÜR) von 80% auf 20% (Fraley et al. 1989; Horenblas and van Tinteren 1994; Lopes et al. 1996; McDougal et al. 1986; Skinner et al. 1972; Srinivas et al. 1987). In der eigenen Untersuchung wurden ähnliche Beobachtungen gemacht. So hatten Patienten, die keine oder nur einen solitären positiven Leistenlymphknotenbefall (≤N1) aufwiesen, eine 5-JÜR von 78,8% und jene mit mehr als einem positiven Lymphknoten (≥N2) eine 5-JÜR von 30,9% (Tab.3.13). Bei der Unterscheidung Lymphknoten positiv ja/nein, lag ein deutlicher Überlebensvorteil auf der Seite der Patienten ohne Lymphknotenbefall mit 92,3% (5-JÜR) gegen 39,1% (5-JÜR) der Patienten mit Lymphknotenbefall. 4.1.4 Risiko-Einteilungen Die Einteilung in drei Risikokategorien zur besseren Voraussage des Lymphknotenbefalls, wie durch Solsona et al. (2001) vorgeschlagen, hat im vorliegenden Krankengut keine statistische Signifikanz erreicht (p=0,1). In früheren Arbeiten wurden von der niedrigen bis zur hohen Risikogruppe bei 0%, 33% respektive 83% der Patienten Metastasen nachgewiesen (Solsona et al. 1992; Solsona et al. 2001). Die eigenen Patienten wiesen entsprechend den Kriterien der Solsona-Einteilung in der niedrigen Risikogruppe in 14%, in der mittleren in 60% und in der hohen Risikogruppe in 71% der Fälle Metastasen auf. Im Gegensatz hierzu zeigte sich entsprechend der neueren EAU-Risikoeinteilung (2004) eine signifikante Beziehung zum Nodalstatus (p=0,012). Ficarra et al. (2005) bestätigten sowohl die Beziehungen des lokoregionären LK-Status mit der Solsona-Einteilung als auch mit der EAURisikoeinteilung. Im Vergleich der vorliegenden Arbeit mit anderen Studien ist festzustellen, dass das eigene untersuchte Patientengut aus 34 Patienten bestand, während beispielsweise Ficarra et al. (2005) Tumoren von weit über 100 Patienten untersuchten. Weiter ist es schwierig, die verschiedenen retrospektiven Studien gegenüberzustellen, da einerseits unterschiedliche Gruppenzusammensetzungen (siehe T-Stadium) bestanden oder unterschiedliche TNM Klassifikationen herangezogen wurden (TNM 1978 oder 1997). Außerdem wird die Diskussion 66 Ergebnisbewertung durch unvollständige Datenerhebung und fehlende multivariate Anlaysen limitiert (Ficarra et al. 2005; Lopes et al. 1996; Slaton et al. 2001; Solsona et al. 2004; Theodorescu et al. 1996; Villavicencio et al. 1997). Es kann schlussfolgernd festgehalten werden, dass von den untersuchten klinikopathologischen Parametern in der vorliegenden Arbeit die Tumordifferenzierung und die EAU-Risikoeinteilung eine Aussage über den lymphatischen Befall zulassen. Der Nodalstatus ist bisher der einzige klinische Parameter, der Aussagen über das Outcome der Patienten gestattet. Dennoch kann für die Patienten der mittleren Risikogruppe (T1G2) nicht genau bestimmt werden, welches therapeutische Procedere klinisch sinnvoll ist. Möglicherweise könnten molekulare Marker im Primärtumor die Entscheidung für das weitere Vorgehen erleichtern. 4.2 KAI1 In den immunhistochemischen Untersuchungen wurde das KAI1 Glykoprotein im nichtneoplastischen Gewebe im Epithel, in Gefäßen und Keimzentren von Lymphfollikeln nachgewiesen, wie es bereits früher beschrieben wurde (Fukudome et al. 1992; Huang et al. 1998; Imai et al. 1992; Okochi et al. 1997; Ward et al. 1998). Das Protein war dabei sowohl in der Zellmembran als auch im Zytoplasma lokalisiert, was sich mit der Literatur deckt (Okochi et al. 1997). Die hohe KAI1 Expression in aktivierten Lymphozyten in Keimzentren von Lymphfollikeln und eine verminderte Reaktivität an den Lymphozyten in der Randzonen stehen ebenfalls in Einklang mit Resultaten anderer Arbeiten (Fukudome et al. 1992; Imai et al. 1992; LebelBinay et al. 1994). Die in der vorliegenden Arbeit festgestellte Expression an peripheren Nerven dagegen wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Im untersuchten Tumorgewebe war eine Reduktion der KAI1 Immunreaktivität bei vorhandener Metastasierung evident. Dabei wurde im gesamten primären Tumormaterial eine verminderte Proteinexpression (≤50%) bei 38,2% (n=13) der Tumore ausgemacht und alle Patienten mit positiven LK-Status (n=13) zeigten eine deutlich geminderte Immunreaktivität, die im Mittel bei 34,4% (SD±20,6) lag. Patienten hingegen mit negativen LK-Status wiesen eine mittlere Immunreaktivität von 73,1% (SD±13,6) auf (Abb. 3.16). Diskussion 67 Diese Beobachtungen sind vergleichbar mit Untersuchungen an humanen NSCLC, Pankreas-, Brust-, Blasen-, Leber-, Kolonkarzinomen, obwohl gewisse Schwankungen bestehen (Adachi et al. 1996; Dong et al. 1996; Geradts et al. 1999; Guo et al. 1996; Guo et al. 1998; Higashiyama et al. 1998; Tagawa et al. 1999; Ueda et al. 1996; Yu et al. 1997). Die Herunterregulation des Proteins wird dabei auf in der Translationsebene gelegene Vorgänge zurückgeführt. In vitro Untersuchungen an metastasierenden Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebe ergaben eine Reduktion des Protein KAI1. So sind in ovarialen-, Prostata-, Blasen-, endometrialen- und Lungenkarzinom-Zelllinien Expressionsminderungen von 50%, 75%, 38%, 88% respektive 91% im Vergleich zu nicht metastasierenden Zellen beobachtet worden. In Melanom-Zelllinien wurde eine völliger Expressionsverlust beschrieben (White et al. 1998). In der Literatur wird weiter auf die unterschiedliche Immunreaktivität des Proteins innerhalb eines Zellverbandes (bei invasiven SCC von Lunge, Kopf/ Hals und Cervix uteri) hingewiesen, die auch in dem hier untersuchten Probengut zu beobachten war. Möglicherweise stellt diese lokale Expressionsminderung des Proteins einen möglichen Ort zur Metastasenabsiedelung dar (Geradts et al. 1999). Die KAI1 Expression in intraepithelialen Neoplasien ist unterschiedlich. Während Okochi et al.(1997) keinen Verlust von KAI1 in intraepithelialen Neoplasien der Haut feststellten, beschrieben Geradts et al. (1999) einen Verlust in der Cervix uteri (CIN). Allerdings wurde nicht untersucht, ob diese Herunterregulation mit einer erhöhten Stromainvasion einhergeht. Bei den PIN der vorliegenden Arbeit wurde keine Veränderung der Immunreaktivität im Vergleich zum nicht-neoplastischen Gewebe festgestellt (4/4 Reaktivität >50%). Allerdings wurde hierbei auch nicht auf eine lokale Reaktivitätsminderung z.B. an der Basis der Läsion eingegangen. Dennoch steht dieses Ergebnis in Einklang mit Untersuchungen an frühen Pankreaskarzinomen, die eine Hoch- und in metastatischen Stadien eine Herunterregulierung von KAI1 beobachteten (Guo et al. 1996). Die Gegenüberstellung der KAI1 Expression in den Tumorzellen mit klinischen Parametern wies eine signifikant inverse Beziehung der KAI1 Immunreaktivität mit der Differenzierung Diskussion 68 (Grade) auf (p<0,05). Hochsignifikant stellten sich Vergleiche mit dem N-, M-Status und dem WHO-Stadium dar (p<0,001). Die Reduktion der KAI1 Expression in Bezug auf klinikopathologische Parameter wird in der Literatur unterschiedlich bewertet, zeigt jedoch tendenzielle Zusammenhänge mit der Progression des Krankheitsverlaufes. So wurden in Karzinomen von Cervix, Ovar und Kolon keine signifikanten Unterschiede der Expression von KAI1 in Bezug auf verschiedene Tumorstadien gefunden, während dieser Unterschied in Prostata-, Lungen- und Pankreastumoren nachweisbar war (Liu et al. 2001; Liu et al. 2000; Lombardi et al. 1999). Da der Verlust von KAI1 nicht nur auf die späten Stadien und die Metastasierung beschränkt ist, scheint die Herunterregulierung einen wichtigen Schritt bei der Progression vom in situ Karzinom zum invasiven Zustand darzustellen. In den untersuchten Tumoren dieser Arbeit zeigten 13 von 17 der Tumore mit LK-Befall eine Reduzierung der Immunreaktivität. Ähnliche Verhältnisse finden sich in einer früheren Studie, in der bei metastasierten Cervixkarzinomen in 5 von 6 Fällen eine reduzierte Expression auftrat (Liu et al. 2001). Grund hierfür soll eher eine abweichende Glykosylierung von KAI1 als eine Herabregulierung des Proteins sein (Adachi et al. 1996). Dass in der vorliegenden Studie 4 der Tumoren mit LK-Befall eine starke Immunreaktivität aufwiesen, könnte entweder an einer verminderten Funktion oder an einer Funktionsstörung der N-Glykosylierung des KAI1 Proteins liegen (Tagawa et al. 1999) und sollte in weiteren Untersuchungen aufgeklärt werden. Patienten, die eine starke Immunreaktivität (>50%) des KAI1 Proteins aufwiesen, zeigten im Vergleich der Überlebensstatistiken ein deutlich besseres Outcome (3-JÜR: 87,8% gegen 45,5% mit geringer Expression, Abb. 3.19). Ähnliche Ergebnisse zeigten Untersuchungen an Lungen- und oralen Plattenepithelkarzinomen (Adachi et al. 1996; Farhadieh et al. 2004; Higashiyama et al. 1998). Andererseits wurden keine signifikanten Unterschiede im Überleben mit reduzierter KAI1 Expression an Mammakarzinomen beobachtet. Allerdings lag ein tendenziell längeres Überleben bei hoher KAI1 Expression vor (Huang et al. 1998; Yang et al. 2000). Das bessere Outcome der Patienten der vorliegenden Studie Arbeit ist in der univariaten Analyse (Abb. 3.19), nicht aber in der multivariaten Cox’schen Regression statistisch signifikant (Tab. 3.30). In einer multivariaten Analyse an über 100 Adenokarzinomen der Lunge zeigte sich ein deutlich besseres Outcome bei Tumoren mit hoher KAI1 Expression Diskussion 69 (Adachi et al. 1996), so dass die fehlende Signifikanz der eigenen Ergebnisse auf die geringe Fallzahl zurückzuführen sein kann. Eine für die klinischen Parameter durchgeführte Korrelationsanalyse zeigte für alle untersuchten Faktoren einen negativen Zusammenhang (τ= -0,402 bis -0,620) mit der KAI1 Expression. Für das untersuchte Material kann gefolgert werden, dass gut differenzierte Tumoren und somit eine verminderte Metastasierungstendenz mit einer hohen Immunreaktivität für KAI1 einhergehen. Obwohl die Tumoreindringtiefe (T-Stadium) selbst nicht in signifikantem Zusammenhang mit der Immunreaktivität steht, konnte dieser Zusammenhang für die WHO-Stadien, welche aus den verschiedenen Komponenten der TNM-Stadien gebildet werden, aufgezeigt werden. Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass nicht das bloße Eindringen des Tumors in die verschiedenen Schichten (subepithelial, CS/CC, Nachbarstrukturen) selbst die Metastasierung bewirkt, sondern unter anderem erst die Herabregulierung der Expression des KAI1 Glykoproteins den Schritt der Metastasierung einleitet. Diese Änderung des Expressionsverhaltens neoplastischer Zellen wurde auch in experimentellen Arbeiten gezeigt, in denen das KAI1 Glykoprotein je nach Expressionsniveau durch verschiedene Interaktionen mit anderen Zell-Proteinen die Metastasierung hemmt bzw. fördert (He, B. et al. 2005; Lagaudriere-Gesbert et al. 1998; Odintsova, E. et al. 2000; Ono, M. et al.2000). Als methodisches Problem für allen untersuchten Antikörper wird in der Literatur auf eine mögliche Verminderung der Reaktivität der Antikörper im Gewebe durch die durch Einbettung und Bearbeitung verursachten Zellschäden hingewiesen. Dennoch scheint die Immunhistochemie für die Auffindung der KAI1 Herunterregulation, weit zuverlässiger zu sein als beispielsweise die PCR, da ohne eine Separierung von Tumorzellen aus dem Gewebe auch Lymphozyten und Makrophagen im oft vorhandenen entzündlichen Infiltrat mit untersucht werden. Da diese ebenfalls KAI1 stark exprimieren, kann es zur Überlappung mit den inflammatorischen Zellen bei der Auswertung kommen, was insbesondere bei der Untersuchung von Lymphknotenmetastasen zu erheblichen Schwierigkeiten führen kann (Schindl et al. 2002). In der vorliegenden Untersuchung wurde erstmals gezeigt, dass der partielle oder komplette Verlust der KAI1-Immunreaktivität in statistisch signifikanter Korrelation mit der Progression Diskussion 70 und der Metastasierung beim Peniskarzinom steht. Weiter wurde festgestellt, dass KAI1 nicht als unabhängiger prognostischer Faktor für die Metastasierung gesehen werden kann, da die Prüfung auf Korrelation mit den Faktoren T-Stadium, Grade bzw. dem anti-nm23-H1 Antikörper (siehe unten) der multivariaten Analyse nicht standhielt (Tab. 3.10). Es kann festgehalten werden, dass sich in dem begrenzten Untersuchungsgut starke Korrelationen des Glykoproteins KAI1 mit verschiedenen klinischen Faktoren bestehen. Diese lassen eine Etablierung eines prognostischen Faktors jedoch noch nicht zu, da hierfür von verschiedenen Autoren eine statistisch signifikante multivariate Analyse als Voraussetzung gilt (Horenblas 2001). Dennoch sind deutliche Tendenzen zu beobachten, die bei verringerter KAI1 Immunreaktivität mit einer schlechteren Prognose in Hinblick auf die Metastasierung und auf das Gesamtüberleben der erkrankten Population einhergehen. Der Verlust der KAI1 Immunreaktivität des Primärtumors könnte somit einen Hinweis für ein radikales Procedere in der operativen Therapie des PSCC darstellen. Eine Überprüfung der Anwendbarkeit kann jedoch erst im klinischen Einsatz, prospektiv, mit größeren Fallzahlen erfolgen. 4.3 Nm23-H1 Eine starke Expression von Nm23-H1 wurde im Oberflächenepithel der Haut (Stephenson et al. 1993), im Urothel (Chow et al. 2000), im Kolonepithel (Martinez et al. 1995), in apikalen Prostataepithelzellen (Myers et al. 1996) sowie in Talgdrüsen, Lymphfollikeln und vielen anderen Geweben nachgewiesen (Lacombe et al. 1991). Nm23-H1 zeigte in den nichtneoplastischen Gewebensanteilen der Tumoren dieser Arbeit eine ähnliche Verteilung wie bereits für die Harnblase beschrieben (Oberflächenepithel, Nerven und glatte Muskelzellen kleinerer Gefäße (Chow et al. 2000). In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das Protein nm23-H1 beim Tumorprogress und der Metastasierung des PSCC eine Rolle spielen könnte, da ein Zusammenhang zwischen der Reduktion der Proteinexpression und einer verstärkten Metastasenbildung für verschiedene Tumoren nachgewiesen wurde. So korreliert die Zunahme der Aggressivität mit niedriger nm23-H1 Expression in malignen Melanomen (Florenes et al. 1992), ovarialen (Mandai et al. 1994; Qian et al. 1997; Scambia et al. 1996; Srivatsa et al. 1996; Viel et al. 1995), hepatozellulären (Iizuka et al. 1995; Nakayama et al. 1992; Shimada et al. 1998; Yamaguchi et al. 1994), laryngealen- (Gunduz et al. 1997; Lee et al. 1996), nasopharyngealen Diskussion 71 Karzinomen (Guo et al. 1998) sowie in oralen (Lo Muzio et al. 1999; Otsuki et al. 1997) und ösophagealen Plattenepithelkarzinomen (Iizuka et al. 1999). In Pankreaskarzinomen (Nakamori et al. 1993) und Neuroblastomen (Hailat et al. 1991) dagegen ist eine hohe Expression von nm23-H1 mit der Zunahme der Metastasierungsfähigkeit assoziiert. Bei Untersuchungen an Magen- und Kolonkarzinomen liegen keine homogenen Ergebnisse über die Bedeutung der nm23-H1 Expression vor (Hartsough and Steeg 2000). Der Expressionsverlust von nm23-H1 ist also in nicht allen Tumoren ein signifikanter Faktor für zunehmende Aggressivität, was auf genetische Instabilität und die Heterogenität der Tumorentitäten zurückgeführt wird (Easty et al. 1996). In der vorliegenden Untersuchung wurde eine starke Immunreaktivität bei weniger als der Hälfte der untersuchten Proben beobachtet (44,1%, Tab. 3.3). Ähnliche Verhältnisse wurden bei Ösophagus- (29-46%) (Iizuka et al. 1999; Patel et al. 1997) und Lungenkarzinomen (50%) (Gazzeri et al. 1996; Volm et al. 1998) beschrieben. Stärkere Immunreaktivitäten dagegen fanden sich bei Mammakarzinomen (81%) (Sawan et al. 1994). Für diese Schwankungen werden zum einen immer wieder die unterschiedlichen Spezifitäten der verwendeten Antikörper als auch Unterschiede in der Auswertung der Beobachtungen verantwortlich gemacht (Tomita et al. 2001). Die eigenen Ergebnisse zeigten für das PSCC eine Korrelation des Verlustes der nm23-H1 Immunreaktivität mit der Metastasierung und einem ungünstigen Outcome. Erstaunlich war in der vorliegenden Untersuchung, dass die Fernmetastasierung nur tendenziell eine inverse Korrelation mit der Immunreaktivität zeigte (p=0,09), obwohl der Lymphknotenstatus hochsignifikant mit der nm23-H1 Expression korrelierte. Andererseits besteht ein signifikanter Zusammenhang der Fernmetastasierung mit der reduziertem nm23-H1 Immunreaktivität (p=0,03; Daten nicht gezeigt), wenn bei der Berechnung die MX Patienten (keine Zuordnung in das Stadium M0-1) unberücksichtigt bleiben. Dies verdeutlicht die Beeinflussung der Ergebnisse durch niedrige Fallzahlen und deren eingeschränkte Aussagekraft in der Praxis. Ein weiterer statistischer Zusammenhang der Stärke der nm23-H1 Immunreaktion mit Alter, T-Stadium, Grade, WHO-Stadium wurde nicht gefunden, wobei mit dem WHO-Stadium zumindest tendenziell ein statistischer Zusammenhang bestand (p=0,054). Die Gegenüberstellung der nm23-H1 Immunreaktivität mit dem Überleben zeigte in den vorliegenden Ergebnissen einen hochsignifikanten Vorteil für die Gruppe mit starker Immunreaktivität. Dies steht zum Teil in Einklang mit früheren Untersuchungen in denen ein Diskussion 72 Überlebensvorteil nur bei Patienten mit lymphatischer Metastasierung und hoher Proteinexpression auftrat (Iizuka et al. 1999; Tomita et al. 2001). Übereinstimmend mit den eigenen Ergebnissen wurden bei Mamma-, Magen-, Lungen-, Prostata- und Schilddrüsenkarzinomen, bei Knochentumoren und malignen Melanomen Korrelationen mit der Überlebenszeit gefunden (Arai et al. 1995; Florenes et al. 1992; Kawakubo et al. 1997; Konishi et al. 1993; Oda et al. 1995). Die Resultate der uni- und multivariaten Analyse der klinischen Faktoren einerseits und die Korrelation mit KAI1 weisen nm23-H1 als einzigen unabhängigen Faktor sowohl in Bezug zum Metastasenstatus als auch auf das Überleben aus (Tab. 3.10, 3.15). Dies ist übereinstimmend mit multivariaten nm23-H1-Analysen anderer Tumoren (Guo et al. 1998; Kawakubo et al. 1997). Aufgrund der Datenlage kann von einer Verbindung der Überexpression von nm23-H1 in frühen Tumorstadien und dem Verlust der Expression in weiter fortgeschritten Stadien ausgegangen werden. Allerdings sind weitere prospektive Studien nötig, um den Wert des nm23-H1 Proteins als prognostischen Marker zu verifizieren. Für nm23-H1 und KAI1 wurde in der vorliegenden Arbeit eine Abnahme der Immunreaktivität im neoplastischen Gewebe im Vergleich zum nicht-neoplastischen Gewebe bis schließlich zur Metastasierung nachgewiesen. Veränderungen der Proteinexpression und die Korrelation mit dem Metastasenstatus liegen in vielen Tumoren vor, scheinen aber vom zugrunde liegenden Tumortyp abzuhängen (Friess et al. 2001). Während eine signifikante Koexpression beider Proteine in den Tumorzellen auftrat (Tab.3.7), war eine Beziehung dieser Koexpression zum Lymphknotenstatus nicht evident (Abb.3.17, Tab.3.10). Dennoch fiel die multivariate Analyse beider Proteine und dem LKStatus für nm23-H1 signifikant aus (p=0,045). Die fehlende Beziehung beider Proteine in der multivariaten Analyse kann auf den niedrigen Fallzahlen beruhen, da in einer univariaten Analyse sowohl für nm23-H1 (p<0,001) als auch für KAI1 (p<0,001) eine hochsignifikante Beziehung wie auch eine stark negative Korrelation (r>-0,7) zur Metastasierung nachgewiesen werden konnte (Tab.3.10). Bisherige Untersuchungen ergaben, dass die Herunterregulierung der beiden Proteine in keiner signifikanten Beziehung zum Nodalstatus stehen (Friess et al. 2001; Goncharuk et al. 2004). Hingegen wurde eine gemeinsam verminderte Expression von KAI1 und nm23-H1 bei Fernmetastasen beobachtet (Goncharuk et al. 2004). Interessanterweise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit für die Patienten, deren Tumoren eine starke Immunreaktivität beider Diskussion 73 Antikörper (nm23-H1/ KAI1>50%) aufwiesen, ein signifikant besseres Outcome (Abb.3.21). So war eine starke Reaktion des Primärtumors mit einer statistisch fast doppelt so langen Überlebenszeit im Vergleich zu den anderen Gruppen (mittlere Überlebenszeit: 104 gegen 53 Monate) assoziiert (Tab. 3.15). Trotz fehlender Signifikanz stellte sich eine tendenziell inverse Beziehung der nm23-H1/ KAI1 Ko-Expression mit dem LK-Status und bei starker Expression eine klare Beziehung beider Proteine mit dem besseren Outcome heraus. 4.4 Effektorcaspasen 3, 6 und TUNEL In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig untersucht, ob Beziehungen zwischen der Expression der Effektorcaspase 3 und 6 beim Tumorprogress und der Metastasierung des PSCC vorliegen. Im gesunden Oberflächenepithel des Penis war eine moderate Immunreaktivität für die aktivierten Caspasen 3 und 6 in allen Schichten nachweisbar. Eine Reaktion der äußeren Hornschicht war in einigen der untersuchten Präparate, im Gegensatz zu anderen Studien (Krajewska et al. 1997), vorhanden. In verschiedenen Gewebeschnitten war im Epithel ein parakeratotisches Stratum corneum zu beobachten, welches nicht Caspase-positiv war. Diese fehlende Reaktion könnte Ausdruck eines ausbleibenden Zelltodes sein (Tobon-Arroyave et al. 2004). Im Vergleich mit nicht-neoplastischem Gewebe waren die aktivierten Caspasen in den Karzinomen deutlich seltener nachweisbar. Diese Beobachtung steht in Einklang mit früheren Arbeiten, die eine verminderte Expression im Tumor, sowohl für die Caspasen 3 und 6 als auch für die Caspasen 1, 2, 7, 8, 9 und 10 aufzeigten (Philchenkov et al. 2004). Die teilweise nukleäre Lokalisation der Effektorcaspasen (neoplastische und nichtneoplastische Zellen) scheint auf die Translokation der aktivierten Caspasen zurückzugehen (Duan et al. 2003). Im Kern können dann Proteine wie Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), Lamin, U1-RNP-70 kD und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (Krajewski et al. 1997) abgebaut werden. Die Immunreaktionen für die Caspasen 3 und 6 waren sich in ihrer Verteilung und Quantität sowohl im soliden Tumorzellverband als auch in der Nekrose-/ Apoptoseübergangszone ähnlich, wobei eine positive Immunreaktion für die Capasen 3 und 6 in 56,7%, respektive in 68,7% der untersuchten Tumoren nachgewiesen werden konnte. Andere Untersuchungen zeigten an ösophagealen Plattenepithelzelkarzinomen bei 60% der Tumoren eine positive Caspase 3 Reaktion (Hsia et al. 2003). In pulmonalen SCC lag die Diskussion 74 positive Immunreaktivität bei 64% für Caspase 3, und 48% für Caspase 6 (TormanenNapankangas et al. 2001). Die Schwankungen der Reaktivität im Gewebe der verschiedenen Arbeiten könnten sich durch die unterschiedlich verwendeten Antiköper oder aber in der Gewebsspezifität erklären. So benutzte Tormanen-Napankangas et al. (2001) beispielsweise polyklonale Antikörper, die sowohl die 32-kD pro-Caspase 3 und die 17-kD Untereinheit der aktivierten Caspase 3 erkennen, wohingegen Hsia et al. (2003) einen monoklonalen Antikörper gegen aktivierte Caspase nutzten. Außerdem erschwert ein differentes Scoring-System einen unmittelbaren Vergleich der verschiedenen Arbeiten. Auch scheint die Caspase-Immunreaktivität von der Lokalisation des Primärtumors abzuhängen, was an laryngealen-SCC (stärkere Reaktivität an supraglottischen gegen glottische Tumoren) und oralen-SCC (stärkere Reaktivität Lippe, Wange gegen schwächere an Gaumen, Mundboden) gezeigt wurde (Cor et al. 2004; Hague et al. 2004). An den eigenen Präparaten wurden signifikante Beziehungen der Reduktion der Caspase 3 Immunreaktivität mit Zunahme des T-Stadiums, dem Differenzierungsgrad, dem WHOStadium und der Fernmetastasierung gezeigt (p<0,05). Die Reduktion der Caspase 6 Immunreaktivität stand im signifikanten Zusammenhang mit der Tumordifferenzierung und darüber hinaus in tendenziellem Zusammenhang mit dem T-Stadium (p=0,052). Dies könnte einen Hinweis auf die Beteiligung der beiden Effektorcaspasen beim lokalen Tumorprogress darstellen. Zur signifikanten Beziehung von Caspase 3 und der Fernmetastasierung kann am vorliegenden Material keine definitive Wertung getroffen werden. Während die eigenen Ergebnisse keine signifikante Beteiligung der Effektorcaspasen 3 und 6 bei der Metastasierung des PSCC zeigten (Tab. 3.8, 3.9), wiesen vergleichbare Untersuchungen an SCC der Lunge in uni- und multivariater Analyse die inverse Beziehung zwischen der Expression der Effektorcaspase 3 und dem Lymphknotenbefall nach (Volm et al. 2002). In den eigenen Untersuchungen konnte weiterhin keine Beziehung der Immunreaktivität beider Proteine und dem Outcome der Patienten gefunden werden, ähnlich den Ergebnissen von Blazquez et al. (2006) an Mammakarzinomen. Dennoch gibt es Untersuchungen, die eine Zunahme der Caspase-Expression in oralen Plattenepithelkarzinomen mit einem aggressiveren Tumorverhalten und kürzerer Gesamtüberlebenszeit beschreiben (Hague et al. 2004). Zur Begründung werden eine durch Diskussion 75 die Tumorlokalisation bedingte differente Karzinogenese sowie Unterschiede in der Ätiologie als auch im Differenzierungsmuster der Tumoren (z.B. keratinisierende versus nichtkeratinisierende) angegeben. Hohe Level der Caspase-Expression und eine ungünstige Prognose wurden darüber hinaus an Brust- (Parton et al. 2001) und Nicht-KleinzelligenBronchialkarzinomen (NSCLC) festgestellt (Tormanen-Napankangas et al. 2001). Keine Beziehungen in der Expression von Effektorcaspasen und klinischen Faktoren der Tumorprogression wurden beispielsweise an Prostatakarzinomen (Sohn et al. 2000) beschrieben. In den untersuchten Peniskarzinomen zeigten die Caspase-positiven Zellen häufig keine morphologischen Merkmale der Apoptose (Apoptosekörperchen, Schrumpfung), was in Einklang mit anderen Autoren steht (Cor et al. 2004; Duan et al. 2003). Dieses Phänomen wird auf eine bevorstehende Apoptose zurückgeführt, bei der die Caspasen in den Zellen bereits aktiviert werden, bevor histomorphologische Zeichen der Apoptose auftreten (Krajewski et al. 1997). Demgegenüber muss die Apoptose nicht zwingend mit einer erhöhten Caspase-Expression einhergehen, da die Apoptose auch durch eine Caspase-unabhängige Kaskasde initiiert werden kann (Duan et al. 2003). An ausgewählten Präparaten des eigenen Materials konnten Zellen mit positiver TUNELReaktion, als Apoptosenachweis, ausgemacht werden (Abb. 3.11). In Tumorarealen mit Übergang zu zentralen Nekrose-Apoptosezonen wurde eine besonders ausgeprägte Immunreaktion der Effektorcaspasen 3 und 6 sowie vermehrt positive TUNELReaktion nachgewiesen (Abb. 3.12). Diese Beobachtung wird in der Literatur mehreren Ursachen zugewiesen. Zum einen wird die unspezifische Unterscheidung von Apoptose und Nekrose angeführt, da bei letzterer eine Vielzahl entstehender DNA-Fragmente markiert werden (Bonegio and Lieberthal 2002; Duan et al. 2003; Grasl-Kraupp et al. 1995; Mundle and Raza 1995; Parton et al. 2001). Auf der anderen Seite tritt häufig ein begleitendes Rundzellinfiltrat auf, in dem Lymphozyten eine pos. Caspase-Immunreaktion zeigen (Krajewski et al. 1997). Eine endgültige Beurteilung, ob in diesen Bereichen vermehrt Apoptose auftritt, kann mit den durchgeführten Untersuchungen nicht getroffen werden. Auch die morphologischen Apoptosezeichen sind nur schwer vom Zelldetritus in den Nekrosearealen abgrenzbar (Abb.3.10) (Duan et al. 2003) und bringen keine weitere diagnostische Sicherheit. Erwähnenswert scheint auch die Beobachtung von morphologisch abgrenzbaren apoptotischen Zellen, die keine Caspase-Immunreaktion aufwiesen (Abb. 3.8). Hague et al. Diskussion 76 (2004) beschrieben ähnliche Beobachtungen an oralen Plattenepithelkarzinomen und begründeten diese fehlende Immunreaktion mit einer nach der Caspase-Aktivierung einsetzenden Degradation des Proteins während oder durch die Apoptose. Im übrigen Tumorgewebe überwog die Reaktion der beiden Effektorcaspasen über TUNELpositive Zellen. Das Verhältnis der Caspase- zur TUNEL-Immunreaktion ähnelt den Beobachtungen von Duan et al. (2003) an einer Prostatakrebszelllinie (3-fach höhere Caspase3 Reaktion als TUNEL-positive Zellen), nicht aber den Beobachtungen von Krajewski et al. (1997) an Lymphknoten (10-fach höhere Caspase 3-Reaktion). Nach Untersuchungen von Duan et al. (2003) soll die Caspase-Immunreaktion als zuverlässiger Apoptosenachweis in der Routine genutzt werden können. Eine Abnahme der Immunreaktivität der Effektorcaspasen und damit einhergehend eine verringerte Apoptoserate der Tumorzellen wird in der Literatur durch mehrere Autoren bestätigt. So wurde die Expressionsminderung der Caspasen 3 und 6 in Cervixkarzinomen (Cheung et al. 2002; Zanotti et al. 2003) sowie die Abnahme von Caspase 3 in Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre (Hsia et al. 2003), bei hepatozellulären Karzinomen (Cheung et al. 2002; Hsia et al. 2003; Sun et al. 2000; Zanotti et al. 2003), in NichtKleinzelligen-Bronchialkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen der Lunge (Koomagi and Volm 2000; Volm et al. 2002) beschrieben. Bei der Transformation von kolorektalem Epithel zum Karzinom war eine Veringerung der Apoptoserate (TUNEL-Methode) nachweisbar (Bedi et al. 1995). Die Herabregulierung proapoptotischer Gene und die Verringerung der Apoptoserate während der malignen Transformation wird als Überlebensvorteil für Tumorzellen angesehen. Hierdurch wird das Überleben dieser Zellen in einer durch Tumorvergrößerung zunehmend hypoxischen und nährstoffarmen Umgebung ermöglicht (Cheung et al. 2002; Graeber et al. 1996; Zanotti et al. 2003). Betrachtet man die eigenen und die zum Teil recht kontroversen Ergebnisse der Literatur sowohl zu den Beziehungen der Proteinexpression mit klinikopathologischen Faktoren und dem Outcome als auch die eher vagen Erklärungsmodelle für das Vorhandensein oder die Abwesenheit in den verschiedenen Tumoren oder Lokalisationen, so scheinen die untersuchten Effektorcaspasen als Prognoseparameter beim Peniskarzinom nicht hilfreich zu sein. Trotzdem sind die Beziehungen beim lokalen Tumorprogress nachweisbar, die möglicherweise aufgrund der geringen Fallzahl nicht bei allen klinikopathologischen Faktoren signifikant werden. Diskussion 77 Die eigenen Beobachtungen unterstützen jene Arbeiten, die den Tumorprogress bei Verlust der Selbstlimitierung des Tumorwachstums durch ein vermindertes Vorhandensein (Funktion) der Effektorcaspasen annehmen (Zanotti et al. 2003). Die Resultate der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Proteine KAI1 und nm23-H1 durchaus als Parameter zur Prognoseabschätzung und hiermit ein entscheidendes Kriterium bei der Entscheidung über die Durchführung einer Lymphadenektomie darstellen können. Die Effektorcaspasen 3 und 6 erfüllen diese Anforderungen im Untersuchungsgut nicht, und werden daher weder für die Abschätzung der Prognose noch als Entscheidungshilfe für das therapeutische Vorgehen empfohlen. Da die geringe Patientenzahl jedoch nur eine sehr beschränkte Aussagen und keine sicheren Rückschlüsse auf die Grundgesamtheit einer Population zulassen, müssen weitere Untersuchungen mit größeren Fallzahlen folgen, um eine Einführung in die klinische Routine zu ermöglichen. 5 Zusammenfassung Das Peniskarzinom ist mit bis zu 1/100000 Patienten pro Jahr ein seltener Tumor des Mannes. Das Plattenepithelzellkarzinom (PSCC) ist mit 95% der meist anzutreffende Tumortyp. Die bevorzugte Lokalisation ist neben dem Präputium die Glans penis. Von hieraus metastasiert es vorwiegend lymphatisch in die oberflächlichen inguinalen Lymphknoten (LK), erst spät in die iliakalen LK. Hinweise für eine Vorhersage des Lymphknotenbefalls und dem zu erwartenden klinischen Verlauf geben momentan, neben apparativer Diagnostik, verschiedene Parameter, wie Tumordifferenzierung, lymphatische und vaskuläre Invasion oder die Tumoreindringtiefe am Primärtumor. Da für das Peniskarzinom zur Zeit keine etablierten molekularen Marker zur Vorhersage der Metastasierungswahrscheinlichkeit vorliegen, ist die Identifizierung neuer Prognosemarker wünschenswert. In dieser Arbeit wurden die Metastasensuppressor-Proteine KAI1 und nm23-H1 sowie die aktivierten (c-cleaved) Caspasen 3 und 6 auf ihre Relavanz für das Peniskarzinom überprüft, da sie bei Mamma-, Lungen-, Leber- und Darmtumoren relevante Marker zur Vorhersage des klinischen Verlaufs sind. KAI1 ist ein zur Familie der Tetraspanine zählendes Membranglykoprotein, das physiologisch an der Weiterleitung externer Signale zum Zellkern beteiligt ist und in verschiedenen Tumoren herauf- oder herunterreguliert sein kann. Das Protein nm23-H1 (NDPK; Nukleosid-Diphosphat-Kinase) katalysiert in seiner physiologischen Funktion die Übertragung von Phosphatresten von Nukleosidtriphosphaten (NTP, z.B. ATP) auf Nukelosidiphosphate (NDP, z.B. GDP) und ist in eine Reihe von Interaktionen eingebunden, die eine Hemmung der Zellmotilität bewirken. Die Effektorcaspasen 3 und 6 sind Schlüsselenzyme der Apoptose (programmierter Zelltod) und ihre Expression wird in vielen Tumoren herunterreguliert. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression klinikopathologischen der genannten Parametern (TNM, Proteine im Peniskarzinom Differenzierungsgrad, und WHO-Stadium, Risikoeinteilung) sowie dem postoperativen Verlauf besteht. Das Untersuchungsmaterial stammte von 34 Patienten, die sich auf Grund eines Penistumors (30 Plattenepithelzellkarzinome und 4 Carcinoma in situ) einer Resektion unterzogen. Immunhistochemische Untersuchungen wurden mit Antikörpern gegen KAI1, nm23-H1, cCaspasen 3 und 6 durchgeführt. Mittels TUNEL-Methode (Terminale DesoxyribosylTransferase mediated dUTP Nick End Labeling) wurden apoptotische Zellen nachgewiesen. Im nicht-neoplastischen Penisgewebe waren Immunreaktionen für KAI1 und nm23-H1 in Zusammenfassung 79 Oberflächenepithelzellen, Gefäßwänden, Nervenfasern und Lymphozyten vorhanden. Die immunhistochemische Lokalisation der beiden Effektorcaspasen im umliegenden Gewebe erstreckte sich auf Epithelzellen und Rundzellinfiltrate. Eine positive Immunreaktivität für KAI1 und nm23-H1 wurde in mehr als 90% der Tumoren nachgewiesen. Hingegen zeigten die cCaspasen 3 und 6 nur in 57%, respektive 69% der Tumoren eine positive Immunreaktion auf. Die statistische Auswertung ergab für KAI1 und nm23-H1, dass eine starke Immunreaktivität mit einer geringeren Metastasierung (N-, M-Status) korreliert. Weitere signifikant inverse Beziehungen zeigten sich für die Tumordifferenzierung (Grading) und dem WHO-Stadium (p<0,05). Auch wurde die signifikante Koexpression beider Metastasensuppressoren festgestellt (p<0,001), die jedoch nicht in signifikantem Zusammenhang zum regionalen LKStatus stand. Des Weiteren wurde ein inverser Zusammenhang der cCaspase 3-Expression mit dem T-Stadium, dem M-Stadium, dem Differenzierungsgrad und dem WHO-Stadium nachgewiesen (p<0,05). Für die cCaspase 6 lagen Korrelationen mit dem Differenzierungsgrad und mit der EAU-Risikoeinteilung vor (p<0,05). In der univariaten Analyse stellten sich die Differenzierung, die EAU-Risikoeinteilung sowie die Proteine KAI1 und nm23-H1 als signifikante Faktoren für die Vorhersage des lymphatischen Befalls dar. Die multivariate Analyse mehrerer Parameter zeigte für nm23-H1 eine signifikante Beziehung in Hinsicht auf den LK-Status. Eine signifikante Beziehung bestand außerdem zwischen negativem LK-Status und der starken Expression von KAI1 bzw. nm23-H1 sowie deren Koexpression mit einem günstigen postoperativen Verlauf der Erkrankung (log rank: p<0,01). Die multivariate Cox’sche Analyse zeigte außerdem, dass die starke Expression des Proteins nm23-H1 im Vergleich mit anderen untersuchten Faktoren (KAI1-Expression, TNMEinteilung, Grading, WHO-Stadium) mit einer günstigen Prognose korreliert (p=0,02). Die Resultate der vorliegenden Arbeit bestätigen die Bedeutung des regionalen Lymphknotenbefalls für die Prognose beim Peniskarzinom. Die Untersuchungen des Primärtumors auf mögliche prädiktive Marker ergaben, dass die Expression der beiden Effektorcaspasen in keinem statistischen Zusammenhang mit der Prognose des Peniskarzinoms stehen. Im Gegensatz dazu zeigte die Expression von nm23-H1, auch im Vergleich zu KAI1, eine eindeutige Korrelation in Bezug auf Metastasierung und Überlebenswahrscheinlichkeit. Ebenso korrelierte die Koexpression beider Metastasensupressoren mit dem postoperativen Verlauf. Auf Grund der begrenzten Patientenanzahl sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Bedeutung der Metastasensuppressoren KAI1 und nm23-H1 beim Krankheitsverlauf des Peniskarzinoms zu bestätigen. 6 Literaturverzeichnis Adachi, M., T. Taki, Y. Ieki, C. L. Huang, M. Higashiyama and M. Miyake (1996). "Correlation of KAI1/CD82 gene expression with good prognosis in patients with non-small cell lung cancer." Cancer Res 56(8): 1751-5. Alam, A., L. Y. Cohen, S. Aouad and R. P. Sekaly (1999). "Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in nonapoptotic cells." J Exp Med 190(12): 1879-90. Almgren, M. A., K. C. Henriksson, J. Fujimoto and C. L. Chang (2004). 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Danksagung Herrn Prof. Dr. K.-J. Klebingat, Direktor der Klinik für Urologie, danke ich für die Überlassung des Themas und die hervorragende Unterstützung. Herrn Prof. J. Fanghänel, ehemaliger Direktor des Institutes für Anatomie und Zellbiologie, und Herrn Prof. K. Endlich, Direktor des Institutes für Anatomie und Zellbiologie, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. Herrn Prof. J. Giebel danke ich für die Planung, die Durchführung und die kritische Beurteilung der experimentellen Versuchsergebnisse sowie für fortwährende Diskussionsbereitschaft, mit der ein wissenschaftliches Arbeiten möglich wurde. Herrn Dr. C. Protzel danke ich für sein hohes persönliches Engagement, mit dem er sich in unzähligen Stunden dem Thema widmete und der maßgeblich als Mentor für die Umsetzung verantwortlich war. Außerdem möchte ich Frau Bansemir, Mitarbeiterin des Institutes für Anatomie, danken, die häufig in Rat und Tat, bei der Durchführung der Untersuchungen, unterstützend zur Seite stand. Meiner Großtante danke ich für die Durchsicht und die Korrektur von Unzulänglichkeiten bei Rechtschreibung und Grammatik. Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter, ohne ihre Unterstützung wären das Studium sowie die Promotion nicht möglich gewesen. 97 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden. Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt. Christoph Kakies 98 Lebenslauf Zur Person Name: Vorname: Adresse: Kakies Christoph E.-Böhmke-Str.12 17489 Greifswald Geburtsdatum: Geburtsort: Familienstand: Konfession: 30.Mai 1980 Greifswald ledig evangelisch Schulbildung 1986 - 1992 1992 - 1998 1998 Grundschule Greifswald Gymnasium Greifswald Abitur Wehrdienst 1998 - 2000 Soldat auf Zeit im Sanitätsdienst der Bundeswehr, Panzerbataillon 423 Brück Studium 2000 - 2007 2007 Studium der Humanmedizin an der EMAU-Greifswald Staatsexamen Berufliche Tätigkeit 2007 - 2008 2008 Weiterbildungsassistent in den Fachbereichen Chirurgie/ Urologie am Neurologischen Rehabilitationszentrum Greifswald Weiterbildungsassistent im Fachbereich Pathologie an der EMAU-Greifswald
