Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie (Direktor: Univ

Werbung
Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie (Direktor: Univ.- Prof. Dr. K.-J. Klebingat) und dem
Institut für Anatomie und Zellbiologie (Direktor: Univ.- Prof. Dr. Karlhans Endlich)
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Immunhistochemische Untersuchungen von molekularen Markern der Metastasierung
am Peniskarzinom des Menschen
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2008
vorgelegt von:
Christoph Kakies
geb. am: 30.05.1980
in: Greifswald
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Kroemer
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Klebingat, Greifswald
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Schubert, Jena
Ort, Raum: Urologie Greifswald, Seminarraum
Tag der Disputation: 12.01.2009
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ix
1
1.1
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.4
1.5
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.3
1.7
1.7.1
1.7.1.1
1.7.2
1.8
Einleitung
Epidemiologie
Pathologie
Klassifikationsysteme des Peniskarzinoms
Grading
Staging
Prognose
Molekulare Marker
Caspasen
Zelltod
Effektorcaspase 3
Effektorcaspase 6
Metastasensuppressorgene
Tetraspanine
KAI1/CD82
Nm23-H1
Ziele der Arbeit
1
2
2
3
3
4
5
6
7
8
9
10
10
11
11
14
17
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.3.1
2.2.3.2
2.2.3.3
2.2.4
2.2.4.1
2.3
Material und Methoden
Material
Gewebe
Antikörper und Immunhistochemie
Chemikalien
Geräte
Methoden
Herstellen von Paraffinschnitten und Entparaffinieren
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Immunhistochemie
Durchführung
Auswertung der Immunreaktion
Kontrollreaktionen in der Immunhistochemie
TUNEL-Methode
Durchführung
Statistik und Software
18
18
18
19
19
21
21
21
22
22
22
23
24
24
25
26
3
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
3.1.8
3.1.9
Ergebnisse
Klinische Parameter
Alter
Pathologischer Befund
Tumorausdehnung (T-Stadium) und klinischer Verlauf
Regionaler Lymphknotenstatus (N-Stadium) und klinischer Verlauf
Fernmetastasen (M-Stadium) und klinischer Verlauf
Differenzierung (Grading) und klinischer Verlauf
Stadium nach WHO und klinischer Verlauf
Übersicht TNM, Grade & Stadium mit zugeordnetem Level
Tumorausbreitung bei Diagnose
28
28
29
29
29
30
30
30
30
31
31
Inhalt
3.1.10
3.15
Korrelation von TNM-Klassifikation, Differenzierung,
Tumorstadium und klinischem Verlauf
Immunhistochemische Ergebnisse
Lokalisation von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3 und 6
in den Penistumoren
Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion
Apoptosenachweis an Paraffingewebeschnitten
Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 3 mit der
TUNEL-Methode
Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 6 mit der
TUNEL-Methode
Korrelation der Immunreaktivität für die KAI1 mit der
TUNEL-Methode
Korrelation der klinikopathologischen Befunde mit den
immunhistochemischen Befunden
Korrelation der KAI1-Expression mit klinikopathologischen Parametern
Korrelation der nm23-H1 Expression mit klinikopathologischen
Parametern
Statistischer Vergleich der Immunreaktion für KAI1 und nm23-H1
mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen
Koexpression von nm23 und KAI1
Korrelation der Effektorcaspase-3-Immunreaktion
mit klinikopathologischen Parametern
Korrelation der Effektorcaspase-6-Immunreaktion
mit klinikopathologischen Parametern
Statistischer Vergleich der Immunreaktion für Effektorcaspase 3 und 6
mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen
Prädiktive Faktoren für die Metastasierung
Risikoeinteilung für Lymphknotenmetastasen
Risikoeinteilung nach Solsona für LK-Befall mit Überlebensstatistik
Risikoeinteilung nach EAU für LK-Befall mit Überlebensstatistik
Prognose
Nodalstatus und Prognose
Korrelation von Nodalstatus und Überlebenszeit
Korrelation der KAI1 Expression mit der Überlebenszeit
Korrelation der nm23 Expression mit der Überlebenszeit
Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Expression beider Proteine
im Tumor
Überlebenskurven für die Reaktivität der Antikörper nm23/KAI1
Korrelation der Effektorcaspase 3 und 6 Expression mit der
Überlebenszeit
Ergebnisse des Cox’schen Regressionsmodells für das Überleben
4
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.2
4.3
Diskussion
Klinische Tumorparameter und Prognose
Lokale Tumorausdehnung
Grading
Metastasierung
Risiko-Einteilungen
KAI1
Nm23-H1
3.2
3.2.1
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.13.1
3.13.2
3.14
3.14.1
3.14.1.1
3.14.2
3.14.3
3.14.4
3.14.4.1
3.14.5
32
33
36
40
40
43
44
45
45
46
49
51
51
52
53
54
55
57
58
58
58
59
59
60
61
61
62
62
62
63
63
63
64
65
65
66
70
Inhalt
4.4
Effektorcaspasen 3, 6 und TUNEL
73
5
Zusammenfassung
78
6
Literaturverzeichnis
80
7
Anhang
96
Abkürzungsverzeichnis
5-JÜR
A.D.
Abk.
abs.
AK
AS
ask1
ASP
BCIP/NBT
bcl-2
bd
bxo
bzw.
CC
cCasp(aspe) 3, 6
CD
CIS
CS
DAB
DARC
DNA
EAU
EGF-R
EQ
Fa.
FAK
Fkt.
GFs
GTP
HE
HPV
IHC
IR
KASP
KCl
kD
Kitenin
ksr
KST
LA
LK
L-SCC
M
MAP
MAPK
Mch 2
mind.
MKK
MMPs
5-Jahresüberlebensrate
Aqua dest.
Abkürzung
absolut
Antikörper
Aminosäure
apoptosis signal-regulating kinase 1
Asparaginsäure
alkaline phosphatase chromogen kit
B-cell lymphoma 2
bowen disease
balatitis xerotica obliterans
beziehungsweise
Corpora cavernosa
cleaved Caspase3, 6
cluster of differentiation
Carcinoma in situ
Corpus spongiosum
Diaminobenzidin
duffy antigen receptor for chemokines
deoxyribonucleic acid
european association of urology
epidermal growth factor receptor
Erythroplasie queyrat
Firma
fokale Adhäsionskinasen
Funktion
growth factors
Guanosintriphosphat
Hämatoxylin-Eosin
humanes Papillomavirus
Immunhistochemie
Immunreaktivität
KAI1/CD82 associated surface protein
Kaliumchlorid
Kilodalton
KAI1 COOH-terminal interacting tetraspanin
kinase supressor of ras
krankheitsspezifischer Tod
Lymphadenektomie
Lymphknoten
Larynxplattenepithelkarzinom
Fernmetastasen
Mitogen activated protein
mitogen-activated protein kinases
Untereinheit Caspase 6
mindestens
Mitogen activated protein (MAP) kinase kinases
Matrixmetalloproteinasen
Abkürzungsverzeichnis
MSG
MW
n
N
N+/NDPK
neg.
NF-IL6
NFkB
NGF
NSCLC
O-SCC
p53
Patn.
PBS
PET/CT
PIN
PK
Pkt.
PL
pos.
PSCC
rac
Rad
ras
Rho-GTPasen
ROS
RT
s.o.
SCC
sd (std.dev.)
SIL
sog.
src
Syn.
Tab.
TdT
tiam1
TM4SF
TNF
TNF-R
TSG
TUNEL
UE
UICC
Vergr.
Metastasensuppressorgene
Molekulargewicht
Anzahl
nodale Metastasen
nodal positiv/negativ
nucleoside diphosphate kinase
negativ
nuclear factor for interleukin 6
nuclear factor-kappa B
Nerve Growth Factor
Nicht-Kleinzelliges-Lungenkarzinom
orales Plattenepithelkarzinom
Protein 53
Patienten
phosphate-buffered saline
Positronenemissionstomographie/ Computertomographie
penile intraepitheliale Neoplasie
Peniskarzinom
Punkt
prämaligne Läsion
positiv
penile squamous cell carcinoma
Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1
Ras associated with diabetes
„rat sarcoma“ Genprodukt
Ras-related small GTPases
Sauerstoffradikale
Raumtemperatur
siehe oben
Plattenepithelkarzinom
standart deviation
squamous intrepithelial lesion
sogenannte(s)
„rous sarcoma virus“Gen-produkt
Synonym
Tabelle
terminal deoxynucleotidyl transferase
T-lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1
Tetraspanin-4-Superfamilie
Tumornekrosefaktor
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
Tumorsuppressorgene
TdT-mediated dUTP nick end labeling
Untereinheit
Union internationale contre le cancer
Vergrößerung
Des Weiteren wurden die Einheiten des SI-Systems und die für den deutschsprachigen Raum
gültigen Nomenklaturen für Namen und Formeln chemischer Verbindungen verwendet.
1
Einleitung
Das Peniskarzinom (PK) ist mit einer Inzidenz von 1 Neuerkrankung pro 100.000 Männer im
Jahr ein seltenes Malignom im europäischen Raum. Ätiologisch werden in Analogie zum
Cervixkarzinom Kontaminationen mit humanen Papilloma-Viren 16 and 18 diskutiert. Nach
der Therapie des Primärtumors stellt die Identifikation von Lymphknotenmetastasen ein
besonderes Problem dar. So werden trotz moderner bildgebender Verfahren in etwa 20% der
Fälle inguinale Mikrometastasen übersehen.
Da die Vorhersagegenauigkeit für Metastasen auf Grundlage der klinischen Untersuchung in
bis zu 50% der Fälle falsch positiv ist und eine radikale Lymphadenektomie mit einer sehr
hohen Morbidität korreliert, ist eine genaue Indikationsstellung zur Lymphadenektomie von
großer Bedeutung. Somit ist die Etablierung weitere prädikitiver Parameter für eine mögliche
Lymphknotenmetastasierung wünschenswert.
Aufgrund der geringen Inzidenz in Europa/ Nordamerika stellt sich die Datenlage zum
Peniskarzinom sowie zu Prognoseparametern ausgesprochen unbefriedigend dar und legt
weitere Untersuchungen zu prognostischen Markern nahe.
Als interessante „Kandidaten“ zur Abschätzung einer möglichen Metastasierung erscheinen
die Effektorcaspasen 3, 6 und insbesondere die Metastaseninhibitoren KAI1/CD82 sowie
nm23-H1.
Einleitung
2
1.1 Epidemiologie
Das Peniskarzinom ist in den Industrieländern mit einer Inzidenz von 0,1 - 0,9 pro 100.000
Männern in Europa und 0,7 - 0,9 pro 100.000 amerikanischen Männern eine sehr seltene
maligne Erkrankung. Asien, Afrika, und Südamerika sind mit einer Inzidenz von bis zu 19
pro 100.000 Männern die Spitzenreiter der Neuerkrankungsstatistik (Landis et al. 1999). In
diesen Ländern macht das PK 10-20% der bösartigen Tumore bei Männern aus (Solsona et al.
2004).
In Mecklenburg-Vorpommern betrug die Inzidenz 1,7/100.000 im Jahr 2002 (Gemeinsames
Krebsregister Berlin, Brandenburg, M/V, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Sachsen, 2005). Für
Deutschland werden etwa 600 Fälle pro Jahr geschätzt, wobei der Erkrankungsgipfel der
Patienten die am Plattenepithelkarzinom des Penis (PSCC) erkranken zwischen der 5. und 7.
Lebensdekade liegt. Nur in sehr seltenen Fällen wird das PK bei Kindern beobachtet (Culkin
and Beer 2003) beobachtet.
1.2 Pathologie
Nach der Herkunft unterscheidet man epitheliale, melanozytische, mesenchymale und
hämatopoetischen
Primärtumore.
Als
sekundäre
Tumoren
werden
metastatische
Absiedelungen, z.B. von Blase (häufig) und Prostata (zusammen >70% der Zweittumoren)
bezeichnet, die oft die Copora cavernosa (CC) betreffen (Young et al. 2000).
Das Plattenepithelkarzinom (Syn.: spinozelluläres Karzinom; Spinaliom; Stachelzellkrebs;
Epithelioma spinocellulare; penile squamous cell carcinoma) ist mit 90-95% die häufigste
Entität der Tumoren des Penis (Young et al. 2000).
Das klassische PSCC hat wenig papilläre Bestandteile. Es ist gut bis mittelgradig differenziert
und setzt sich aus irregulären nest- und/oder fingerförmigen Mustern von malignen,
plattenepithelialen Zellen zusammen. Das Tumorstroma weist z.T. eine kollagene
Bindegewebsmatrix (Desmoplasie) mit z.T. inflammatorischen Zellen auf, wobei gelegentlich
glykogenreiche, klare Zellen auftreten. Schlecht differenzierte Karzinome sind selten und in
der Mehrzahl im Penisschaft lokalisiert. Eine Keratinanhäufung (Hornperlen) wird oft in
Verbindung mit gut bis mäßig differenzierten Tumoren gesehen. Eine starke Akantholyse
(Verlust des Zusammenhaltes der Stachelzellschicht) in Neoplasien vom „high-grade“ wird
als ein pseudoglanduläres (adenoides) Erscheinungsbild sichtbar (Young et al. 2000).
Einleitung
3
Die Wachstumsmuster des PSCC sind sehr variabel (superfizial spreitend, vertikal wachsend,
verrukiform, multizentrisch) und wegen ihres Einflusses auf das Tumor-Stadium prognostisch
bedeutend (Solsona et al. 2004).
Tabelle 1.1: WHO Klassifikation von Tumoren des Penis (Classification of Tumours, 2004,
S.280, (Wittekind and International Union Against Cancer 2004)
WHO Klassifikation von Tumoren des Penis
Maligne epithliale Tumoren
klassisches Platenepithelzellkarzinom
Basaloides Karzinom
Warziges Karzinom
Papilläres Karzinom
Sarkomatöses Karzinom
Gemischtzelliges Karzinom
Adenomsquamöses Karzinom
Merkel-Zell Karzinom
Kleinzelliges Karzinom
Typus
Talgdrüsen Karzinom
Klarzell Karzinom
Basalzell Karzinom
vom
neuroendokrinen
Vorläufer-Läsionen
Intraepithliale Neoplasie Grade III (PIN,CIS)
Morbus Bowen
Erythroplasie Queyrat (EQ)
Morbus Paget (BD)
Melanozytische Tumoren
Melanozytische Naevi
Melanome
Mesenchymale Tumoren
Hämatopoetische Tumoren
Zweit-Karzinom
1.3 Klassifikationsysteme des Peniskarzinoms
1.3.1 Grading
Das klassische Grading (Malignitätsgradeinteilung) für invasive Plattenepithelkarzinome
basiert auf dem Grad der Zelldifferenzierung wie es die Einteilung in Tabelle 1.2 wiedergibt.
Ein von Maiche et al. (1991) vorgestelltes, optionales Klassifikationssystem für PSCC beruht
auf dem Grad der Keratinisierung (Keratinperlen), der Mitoseaktivität, Zellatypien und der
Beschreibung von entzündlichem Zellinfiltrat. Cubilla et al. (2000) kombiniert das klassische
Grading mit der anatomischen Invasionszone in Absicht Lymphknotenmetastasen besser
vorauszusagen.
Tabelle 1.2: Differenzierungsgrade des Peniskarzinoms nach UICC (Sobin et al. 2002)
Merkmale
GX
G1
G2
G3
G4
Differenzierungsgrad nicht
bestimmbar
hohe Differenzierung
mäßige Differenzierung
geringe Differenzierung
undifferenziert
Grad nach
Broders
Anteil undifferenz.
Tumorzellen
Grad I
Grad II
Grad III
Grad IV
<25%
<50%
≤75%
>75%
Einleitung
4
1.3.2 Staging
Zwanzig Jahre nachdem die erste TNM-Einteilung veröffentlicht wurde, kam es 1987 zur
Vereinheitlichung der TNM Klassifikationen durch die UICC (International Union Against
Cancer)/AJCC (American Joint Committee for Cancer), die bis 2008 besteht. Diese Einteilung
beruht auf einer Beschreibung von klinischen und histologischen Erscheinungen, die durch
körperliche Untersuchung, diagnostische Bildgebung (Ultraschall, MRT) und zyto-/
histologische Methoden gewonnen werden, um die Tiefeninvasion exakt zu erfassen
(Frimberger et al. 2002) und um mit einer Stadieneinteilung ein prognostisches Hilfsmittel im
Hinblick auf die Therapie zu etablieren (Tab. 1.3).
Tabelle 1.3: WHO Klassifikation von Penistumoren (WHO Classification of Tumours, 2004,
S.280)
TMN Stadieneinteilung von Tumoren des Penis
T-Primärtumor
TX
Nicht beurteilbar
T0
Kein Hinweis auf Primärtumor
Tis
Carcinoma in situ (BD, EQ)
Ta
Nicht-invasivives verrucöses Karzinom
T1
Tumor invadiert das subepitheliale
Bindegewebe
T2
Tumor invadiert die Corpora cavernosa
T3
Tumor invadiert die Urethra oder die
Prostata
T4
Tumor invadiert andere umliegende
Strukturen
N-Regionale Lymphknoten
NX
Nicht beurteilbar
N0
Kein Hinweis auf regionale Lymphknoten
Beteiligung
N1
Metastase in einzelnem oberflächlichem
LK
N2
Metastase in multiplen oder bilateralen
oberflächlichen LK
N3
Metastasen in tiefen inguinalen oder
pelvinen LK, uni-/bilateral
M-Fernmetastase
MX
Nicht beurteilbar
M0
Kein Hinweis auf Fernmetastase
M1
Fernmetastase
Stadieneinteilung
Stage 0
Tis
Ta
Stage I
T1
Stage II
T1
T2
Stage III
T1, T2
T3
Stage IV
T4
jedes T
jedes T
N0
N0
N0
N1
N0, N1
N2
N0,N1,N2
jedes N
N3
jedes N
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M1
Abk.: BD-Bowen Disease; EQ-Erythroplasia Queyrat; LK-Lymphknoten
1.4 Prognose
Die Anwesenheit und Ausdehnung der inguinalen LK-Beteiligung ist der wichtigste
Prognosefaktor für das Überleben von Männern mit invasivem PSCC (Johnson and Lo 1984;
McDougal et al. 1986; Ornellas et al. 1994; Ravi 1993; Srinivas et al. 1987).
Der Differenzierungsgrad des Primärtumors (Cubilla et al. 1993; Hall et al. 1998; Solsona et
al. 2001) und die Tiefe der Invasion (Corpus spongiosus,CS; Corpora cavernosa,CC; Urethra)
sind die wichtigsten prädiktiven Faktoren für die metastatische Streuung (Chiu et al. 1998;
Einleitung
5
Heyns et al. 1997; Horenblas et al. 1993; Lummen et al. 1997; McDougal et al. 1986) und
somit Parameter für die Selektion von Patienten zur frühen Lymphadenektomie (LA)
(McDougal 1995; Solsona et al. 2001). Weiter wurden Einflussgrößen wie Tumorstadium,
Wachstumsmuster (superfizial, vertikal), Tumorlokalisation, Invasion der Corpora cavernosa,
lymphatische und venöse Embolisation als signifikante Vorhersageparameter bestimmt
(Emerson et al. 2001; Lopes et al. 1996; Lummen et al. 1997; Pizzocaro et al. 1997; Slaton et
al. 2001; Villavicencio et al. 1997).
Unterschiedliche Faktoren wie histologischer Subtyp, Tumordicke, nukleäres Grading,
Mitoserate, DNA-Ploidie, HPV-Anwesenheit, monozytäre sowie eosinophile Infiltration
dagegen können nicht als verläßliche prädiktive Parameter herangezogen werden (Bezerra et
al. 2001; Emerson et al. 2001; Hall et al. 1998; Slaton et al. 2001; Solsona et al. 2001;
Villavicencio et al. 1997).
Für nicht-verruköse (s.o.) Neoplasien besteht eine Korrelation zwischen Größe und
Agressivität. Tumoren der Vorhaut sind weniger aggressiv als die der Glans oder des Sulcus
coronarii. Die aggressive Natur von Tumoren des Sulcus steht in Beziehung mit der Neigung
zur Invasion der Buck-Faszie (Faszia penis profunda), welche durch ihre reiche
Vaskularisation eine Metastasierung begünstigt.
Die Prognose beim verrukösem Tumor ist günstig, beim superfizial-spreitendem Wachstum
mäßig (35% LK-Metastasen) und beim vertikalem Wachstum äußerst schlecht (bis 100% LKMetastasen) (Villavicencio et al. 1997; Young et al. 2000).
Patienten mit verruköser Ausprägung des PSCC haben somit eine gute und die mit warziger,
papillärer Morphologie eine etwas schlechtere Prognose. Stärker überwacht werden sollten
Erkrankte mit nichtpapillärem PSCC (klassisch). Die schlechteste Prognose liegt beim
basaloidem, sarkomatoidem Karzinom vor (MacLennan et al. 2003).
Die beobachtete Inzidenz für lymphatische Metastasen, bei unterschiedlichem Grading
(Differenzierung), lag zwischen 4-24% für Grad I, 46-79% für Grad II und 82-100% für Grad
III PSCCs (Fraley et al. 1989; Horenblas and van Tinteren 1994; Solsona et al. 1992).
Solsona et al. (1992) stellten zur genaueren Beurteilung der Lymphknotenmetastasen
Risikogruppen aus einer Kombination von pathologischem Stadium und histologischem
Differenzierungsgrad auf.
1)
niedriges Risiko:
T1G1 Tumoren
2)
mittleres Risiko:
T1G2-3 & T2G1 Tumoren
3)
hohes Risiko:
T2G2-3 oder ≥T3 Tumoren
Einleitung
6
Eine LK-Beteiligung wurde in Gruppe 1 mit 0%, in Gruppe 2 mit 33% und in Gruppe 3 mit
über 83% beziffert (Solsona et al. 2001). Die abgewandelte Form dieser Einteilung stellt die
Risikoeinteilung der EAU dar. Bei dieser gibt es nur eine Formel für die mittlere
Risikogruppe (T1G2), darüber bzw. darunter hat der Betroffene ein höheres oder niedrigeres
Risiko (Solsona et al. 2004). Die Ergebnisse dieser Einteilung scheinen das Risiko einer LKBeteiligung besser zu bestimmen als die ürsprüngliche Einteilung Solsona’s.
Weiter scheint ein Zusammenhang zwischen Anzahl der beteiligten Lymphknoten und der
Mortalität zu bestehen. So steigt die Sterblichkeit falls mehr als zwei LK (≥N2) beteiligt sind,
was sich in der 5-Jahres-Überlebensrate (5-JÜR) widerspiegelt. Verschiedene Arbeiten
stellten für dieses Patientenkollektiv 5-JÜR’en zwischen 7-50% fest (Fossa et al. 1987; Fraley
et al. 1989; Horenblas et al. 1993; Ravi 1993; Solsona et al. 1992).
Die Möglichkeit einer pelvinen LK-Beteiligung lag bei 23%, wenn drei oder weniger LK
beteiligt und bei bis zu 56%, falls mehr als 3 regionäre LK tumorpositiv waren (Ornellas et al.
1994; Ravi 1993). Sofern es zur pelvinen LK-Beteiligung kam, sank die 5-JÜR auf weniger
als 5% ab (Ravi 1993; Srinivas et al. 1987).
1.5 Molekulare Marker
Molekulare Marker sind derzeit beim Peniskarzinom nicht etabliert. Als prognostische
Faktoren werden sie untersucht, aber klinisch-praktisch nicht verwendet.
In einer Arbeit von Lopes et al. wurde eine signifikante Beziehung der Expression von p53
mit LK-Metastasierung und Langzeitüberleben beim PK berichtet (Lopes et al. 2002). Eine
weitere Studie zeigte ebenfalls einen signifikanten Zusammenhang der p53-Expression und
LK-Metastasen des PK auf (Martins et al. 2002).
In verschiedenen Publikationen sind außerdem Interaktionen von Regulatoren der
Apoptosemaschinerie wie p53 mit KAI1 (Liu and Zhang 2006), nm23-H1 (Chakravarti and
Hong 2003; Rahman-Roblick et al. 2007) und Effektorcaspasen (Vaghefi et al. 2004)
beschrieben worden. Auch wurde gezeigt, dass bei Fehlen des Proteins KAI1 der Körper nicht
mehr vor einer metastatischen Absiedlung von Tumorzellen durch einen Mangel an
induzierbarer Apoptose geschützt ist (Schoenfeld et al. 2004).
Darüber hinaus besteht ein Zusammenhang zwischen einer starken Ki67 Expression, der
Metastasierung und dem Überleben (Berdjis et al. 2005; Protzel et al. 2007).
Außerdem
scheint
bei
erhöhten
Konzentrationen
des
Tumor-assoziierten
Serum-
Glykoproteins SCC-Ag die Häufigkeit von LK-Metastasen zu steigen. Allerdings existiert nur
eine neuere Studie zum PSCC mit lediglich 11 Patienten (Laniado et al. 2003).
Einleitung
7
1.6 Caspasen
C-asp-asen (engl.: cysteinyl-aspartate-cleaving-proteases; Proteasen mit Cystein-Rest im
katalytischen Zentrum) werden als Bezeichnung für die ICE/CED-3 Familie von CysteinProteasen verwendet. Diese Proteasen haben die Eigenschaft, ihre Substrate nach der
Aminosäure Aspartat zu spalten.
Die Proteasen der Caspase-Familie spielen eine zentrale Rolle in der Apoptose, bei
Entzündungen, aber auch bei Proliferation, der Kontrolle des Zellzyklus und des
Zellüberlebens (Fan et al. 2005; Garrido and Kroemer 2004; Lamkanfi et al. 2007; Los et al.
2001; Schwerk and Schulze-Osthoff 2003).
Bis heute sind 15 Mitglieder der Caspasen-Familie beschrieben worden, wobei 11 von ihnen
(Casp 1-10 & 14) in menschlichen Zellen exprimiert werden (Eckhart et al. 2005). Die
humanen Caspasen 2, 8, 9 und 10 sind Initiatoren einer proapoptotischen proteolytischen
Kaskade (Initiator-Caspasen), die als Ergebnis die Aktivierung der sog. ApoptoseVollstrecker-Proteasen, Caspasen 3, 6 und 7 (Effektor-Caspasen), bewirken. Diese zur
Todesmaschinerie der Zelle gehörenden Caspasen können die Apoptose entweder über
externe
Stimuli
im
extrinischen/todesrezeptorvermittelten
intrinsischen/mitochondrienvermittelten
Signalweg
oder
über
einen
einleiten.
Caspasen liegen zum Schutz der Zellen als inaktive Vorstufen (Pro-caspasen/ Zymogene) vor.
Aktiviert werden sie durch Autoaktivierung, Transaktivierung oder Proteolyse durch andere
Proteasen (Ashkenazi and Dixit 1998; Martin et al. 1998; Muzio et al. 1998; Orth et al. 1996;
Srinivasula et al. 1998; Yang et al. 1998; Yang et al. 1998). Die Procaspasen (30-50kD)
bestehen aus 3 Domänen, einer NH2-terminalen Prodomäne, einer kleinen Untereinheit (UE)
p10 und einer großen UE p20 (Cohen 1997; Cryns and Yuan 1998; Nicholson and Thornberry
1997). Aktivierte Caspase-3 zerschneidet bspw. die Apoptoseinhibitoren Bcl-2/ Bcl-XL und
hebt somit ihre anti-apoptotischen Wirkungen auf. Außerdem werden C-terminale Fragmente
freigelegt, die pro-apoptotisch wirken (Wolf and Green 1999). Ein weiterer wichtiger Schritt
der Apoptose ist die Zerschneidung von ICAD (inhibitor of caspase-activated DNase) durch
Caspase-3, wodurch die aktive CAD (caspase-activated DNase) freigesetzt und die DNA der
betreffenden Zelle degradiert und kondensiert wird. Auch der Reparaturmechanismus der
DNA wird durch Caspase-3-abhängige Spaltung der PARP [poly (adp-ribose) polymerase]
inhibiert. Caspase-6 ist von Bedeutung beim Zerschneiden von nukleärem Lamin A, das als
Intermediärfilament einen fibrösen Mantel zwischen innerer Kernmembran und dem
Chromatin bildet. Es spielt eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Kernintegrität und
vermittelt einen Chromatin-Kern-Kontakt (Georgatos et al. 1994).
Einleitung
8
Heute sind mehr als 280 Caspasen-Substrate bekannt, welche in allen Bereichen der
Zellfunktion, wie bei der Aufrechterhaltung der Zellstruktur, Adhäsion, DNA-Synthese und
Reparatur, Protein-Translation oder Signal-Transduktion, eine entscheidene Rolle spielen
(Fischer et al. 2003). Obwohl der Fokus der Caspase-Forschung auf ihre Funktionen in der
Apoptose gerichtet ist, gibt es deutliche Hinweise, dass sie einen größeren Aufgabenbereich
umfassen. Zum einen gibt es Berichte über die selektive Aktivierung der Effektorcaspasen
während der T-Zell Differenzierung neben der trotzdem ablaufenden massiven Apoptose von
T-Zell-Blasten (Alam et al. 1999; Kennedy et al. 1999). Zum anderen wird die Beteiligung
von Effektorcaspasen bei der Erythroblastendifferenzierung beschrieben, bei der sie Proteine
schneiden, die für die nukleäre Integrität und Chromatinkondensation verantworlich sind,
ohne dass Apoptose involviert wäre (De Maria et al. 1999).
1.6.1 Zelltod
Die effektive Wachstumsrate einer Tumormasse spiegelt das Verhältnis zwischen
Zellzuwachs und -verlust wider. In vielen Tumoren wird auch ein Absterben von Tumorzellen
sowohl durch Apoptose als auch durch Nekrose beobachtet (Martin 1997).
Nekrose findet statt, wenn die Zellen extremen Bedingungen (Strahlung, Hypothermie,
Anoxie, Trauma, chemischen Noxen) ausgesetzt sind, die zu einem Zellmembranschaden
führen. Nekrose beginnt mit dem Unvermögen der Zelle ihr homöostatisches Gleichgewicht
aufrecht zu erhalten, was zur Anreicherung von Wasser und Ionen im Zellinneren führt.
Sowohl die intrazellulären Organellen als auch die gesamte Zelle schwellen an. Dies endet in
einer Zelllyse, bei der lysosomale Enzyme in den extrazellulären Raum eindringen,
benachbarte Zellen sowie die extrazelluläre Matrix zerstören und eine entzündliche Reaktion
auslösen.
Die Apoptose (griechisch: apo-ab, ptosis-Senkung, ähnlich dem herbstlichen Blätterfallen;
programmierter Zelltod, PCD) ist der Zelltod unter physiologischen Bedingungen und geht
mit einer aktiven Beteiligung der Zelle an ihrem Untergang einher. Apoptotische Zellen
zeigen bestimmte morphologische und biochemische Merkmale. Hierzu zählen die
Kernchromatinaggregation, die nukleäre/zytoplasmatische Kondensation und der Zerfall in
membrangebundene Vesikel (apoptotic bodies). Diese Vesikel werden entweder von
Makrophagen oder umliegenden Zellen ohne Entzündungsreaktion phagozytiert. Apoptose
wird im Organismus beim zellulären „turn-over“ und der Gewebehomöostase (Haut, Epithel
in
Hohlorganen,
Knochenmark),
Zwischenfingerhäutchen),
der
der
Embryogenese
Aussortierung
autoreaktiver
(z.B.
Rückbildung
Immunozyten
(B-/
der
T-
Einleitung
9
Lymphozyten) bei der Reifung und Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz oder
der hormonabhängigen Involution (Mammainvolution nach Stillzeit, Prostatatrophie nach
Kastration) benötigt.
Insuffiziente Apoptose kann aufgrund von Caspasen-Inaktivierung die Onkogenese durch
Zulassen von Zellanhäufungen fördern (Martin and Green 1995).
Auf der anderen Seite kann die Überaktivität von Caspasen zu einem übermäßigen Verlust
von Zellen führen und so die Basis für degenerative Erkrankungen, wie Chorea Huntington
oder Morbus Alzheimer bilden. Des Weiteren fallen Zellen nach Ischämien in den
reperfundierten Geweben (Myokardinfarkt oder cerebrale Ischämie) der Apoptose anheim
(Goldberg et al. 1996; Jaworowski and Crowe 1999; Lopez-Neblina et al. 2005; Nagarajah et
al. 2004; Thompson 1995; Wellington et al. 1998; Wolozin et al. 1996).
1.6.2 Effektorcaspase 3
Die Caspase-3 (Casp-3) wird synonym als Cystein Protease-CPP32, APOPAIN, YAMA
(Hindu Gott des Todes)-Protein, PARP cleavage protease, SREBP cleavage activity 1
bezeichnet.
Das Casp-3 Gen ist auf dem Chromosom 4q33-q35.1 lokalisiert (Tiso et al. 1996). Dieses Gen
kodiert für eine Cystein-Protease, welche ein Molekulargewicht von 31600 hat und aus 277
AS (Aminosäuren) besteht (Alnemri et al. 1996). Die aktivierte (cleaved, c) Casp-3 besteht
aus 2 UE von 17kDa und 12kDa Größe. Während der Vollstreckung der Apoptose ist c-Casp3 entweder gänzlich oder in Teilen für die Spaltung einer großen Menge an Substraten,
welche gewöhnlich ein Asp-XAs-XAs-Asp Motiv enthalten, verantwortlich.
Die Casp-3 ist intrazellulär sowohl an der inneren Mitochondrienmembran als auch im
Zytoplasma, dem Zellkern und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Die
Procaspase-3, die im Intermembranraum der mitochondralen Membran gespeichert wird,
kann erst auf ein geeignetes apoptotisches Signal in das Zytosol entlassen werden.
1.6.3 Effektorcaspase 6
Als alternative Bezeichnung wird MCH2 (mammilian CED-3 homoloque) verwendet.
Das Gen der Capsase-6 (Casp-6) ist auf dem Chromosom 4q25-q26 lokalisiert. Von Casp-6
sind zwei Isoformen, Mch2α( Hauptform; 1,7kb) und Mch2β (1,4kb), beschrieben.
Mch2α kodiert die volle Länge von Mch2. Das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa
34000 und besteht aus 293 Aminosäuren (AS). Mch2β kodiert ein nur 204 AS großes Protein
Einleitung
10
und hat ein Molekulargewicht von etwa 23000. Dieser Isoform fehlt die Hälfte der p20 UE
und ist wahrscheinlich katalytisch inaktiv (Alnemri et al. 1996).
Die Procaspase-6 wird an 3 Asparaginsäurestellen (Asp-23, Asp-179, Asp-193) gespalten, um
so in die aktivierte Form (cleaved, c), welche eine große p18 (MW:18000) und eine kleine
p11 (MW:11000) Untereinheit enthält, umgewandelt zu werden (Srinivasula et al. 1996).
Casp-6 wird wie Casp-3 im mitochondralen Intermembranraum gespeichert und auf ein
geeignetes apoptosisches Signal in das Cytoplasma der Zelle entlassen. Eine Aktivierung von
Procaspase-6 erfolgt durch cCasp-3, wodurch sie die Fähigkeit erlangt, Lamin A (stärkste
Laminase während der Apotose) zu spalten. In diesem Zustand kann sie auch inaktive Casp-3
aktivieren, sodass ein Verstärkerzyklus entsteht (Takahashi et al. 1996).
1.7 Metastasensuppressorgene
Die Metastasierung kann als Vorgang mit zwei Komponenten, positive und negative
Regulatoren, aufgefasst werden. Die positiven Regulatoren (metastasing promoting genes)
ermöglichen es Zellen (z.T. sehr ineffizient) einen oder mehrere Schritte in der
Metastasierungskaskade zu gehen, wohingegen es bei den negativen Regulatoren
(Metastasensuppressorgene) ausreicht einen einzigen Schritt zu blockieren, um die gesamte
Kaskade außer Funktion zu setzen (Schwab 2001).
Positive Regulatoren sind bspw. die Matrixmetalloproteinasen (MMPs), da sie während der
Metastasierung in den Abbau der Basalmembran involviert sind.
Die Metastasensuppressorgene (MSG) werden von den Tumorsuppressorgenen (TSG)
unterschieden, da sie die Metastasierung unterdrücken sollen, ohne das primäre
Tumorwachstum zu beeinflussen. Weiter sind MSG in Tumoren im Gegensatz zu den TSG
selten mutiert, sodass eine Herabregulierung durch Methylierung am Gen oder durch posttranskriptionelle/ translationale Veränderungen angenommen wird. Verschiedene Kandidaten
wurden als MSG identifiziert, von denen bis jetzt über ein Dutzend in vivo die Fähigkeit
zeigten Metastasen zu verhindern (z.B. nm23, KAI1, KiSS1, E-cadherin, BRMS1 und
MKK4) (Berger et al. 2005; Kauffman et al. 2003; Schwab 2001; Welch et al. 2000).
1.7.1 Tetraspanine
Die Mitglieder der Tetraspanin-4-Superfamilie (TM4SF), momentan 32 verschiedene in
Säugetieren, sind integrale Membranproteine, charakterisiert durch vier transmembrane
Domänen, die sich von drei intrazellulären und zwei extrazellulären Domänen abgrenzen. Die
äußeren Domänen zeigen in allen TM4SF eine identische Sequenz mit spezifischen
Einleitung
11
strukturellen Eigenschaften (Boucheix and Rubinstein 2001; Hemler 2005; Levy and Shoham
2005). Viele Zelltypen exprimieren TM4SF Moleküle, die in eine Vielzahl physiologischer
Prozesse wie Aktivierung von Zellen des Immunsystems, Zellmigration, Zelladhäsion, ZellZellfusion (inklusive Befruchtung), Zellproliferation und in verschiedene Teilschritte der
Zelldifferenzierung eingebunden sind. Weiter sollen diese Moleküle eine Rolle bei
infektiösen Erkrankungen wie Malaria, Hepatitis-C und AIDS spielen. Darüber hinaus scheint
es Beziehungen zwischen Mutationen verschiedener Moleküle der TM4SF und genetischen
Erkrankungen zu geben (X-chromosomale geistige Retradierung, retinale Degeneration und
Fehler im Zusammenbau von Basalmembranen von Haut und Niere) (Le Naour et al. 2006).
Bei Krebs konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass es eine Verbindung zwischen
dem Tetraspanin-Expressionslevel und der Prognose und/oder der Metatsasierung gibt. So
sind beispielsweise hohe Level an CD9 und KAI1/CD82 in Tumorzellen mit einer guten
Prognose in Brust, Lunge, Kolon, Prostata und Pankreastumoren verbunden. Im Gegensatz
hierzu ist eine Überexpression von CD151 in Lunge, Kolon und Prostatatumoren mit einer
schlechten Prognose korreliert. Somit scheinen CD 9 und KAI1/CD82 bei der
Metastasensuppression und CD151 bei der Metastasenprogression eine Rolle zu spielen (Le
Naour et al. 2006).
1.7.1.1KAI1/CD82
Dieses Glykoprotein wird alternativ als kangai 1 (chinesisch für anti-cancer), suppression of
tumorgenicity
6
(ST6),
CD
82
(Cluster
of
differentiation,
erstmals
als
Lymphozytenoberflächenprotein beschrieben), C33-Antigen, Leukocyte Surface Antigen R2
(SAR2), 4F9, IA4 bezeichnet.
Das Gen ist auf dem Chromosom 11p11.2-p11.13 lokalisiert. Das Protein hat ein
Molekulargewicht von 29600 und besteht aus 267 AS. Es gehört zur Familie der Tetraspanine
(TM4SF) und enthält eine Domäne mit vier hydrophoben membrandurchspannenden
Segmenten, denen mehrere konservierte hydrophile Enden anhängen. Diese sind eine kleine
intrazelluläre Schleife (4 AS), zwei extrazelluläre Schleifen (23 und 114 AS), wobei sich die
große zwischen den Transmembransegmenten 3/4 erstreckt (Maecker et al. 1997) und 3
potentielle N-Glykolysierungsseiten besitzt (Dong et al. 1997). In der zytoplasmatischen
Domäne sind kurze N- und C-terminale Regionen (9 und 13 AS lang) lokalisiert
(Berditchevski 2001; Hemler 2001; Kopczynski et al. 1996; Stipp and Hemler 2000).
Das
Gen
KAI1/CD82
wird
in
vielen
menschlichen
Geweben
exprimiert.
Die
Herabregulierung der KAI1/CD82 mRNA- und Proteinexpression ist in verschiedenen
Einleitung
12
Tumoren mit fortgeschrittenen Tumorstadien und einer verstärkten Metastasierung
verbunden, ohne das Tumorwachstum zu beeinflussen. Die Herabregulierung der KAI1/CD82
Funktion kann sowohl ein frühes, einzeitiges Ereignis in der Tumorentwicklung (Lombardi et
al. 1999) als auch ein zweizeitiges Ereignis mit einer Hochregulation in den frühen TumorStadien und einem Verlust in metastatischen Tumorzellen darstellen (Bouras and Frauman
1999; Friess et al. 2001; Maurer et al. 1999; Wu et al. 2004).
Erstmals identifiziert wurde dieses Gen, als Dong et al. feststellten, dass sich das
Metastasierungspotenzial von AT6.1 Ratten-Prostatakrebszellen reduzierte, nachdem sie mit
nicht-metastasierenden Krebszellen fusioniert wurden (Dong et al. 1995). Des Weiteren war
die Expression in Zelllinien von humanem, metastasierendem Prostatatumoren reduziert
(Dong et al. 1995). Auch konnte eine Herabregulierung der Proteinexpression während der
Progression von humanen Prosatatakarzinomen gezeigt werden (Dong et al. 1996).
Dass der Verlust der KAI1/CD82-Proteinexpression mit dem verstärkten Auftreten von
Metastasen und einer Tumorprogression einhergeht, wurde an einer Vielzahl humaner
Malignome aufgezeigt. Zu ihnen zählen Lungen-, Pankreas-, Mamma-, hepatozelluläre-,
kolorektale-, ovariale-, Cervix- sowie Speiseröhrentumoren (Adachi et al. 1996; Geradts et al.
1999; Guo et al. 1996; Guo et al. 1998; Guo et al. 1998; Liu et al. 2001; Liu et al. 2000;
Lombardi et al. 1999; Miyazaki et al. 2000).
Der Expressionsverlust findet wahrscheinlich auf RNA- und Protein-Ebene statt und ist
vermutlich keine Folge von Genmutationen, Deletionen (Heterozygotieverlust am Genlokus)
(Tagawa et al. 1999), Promotormutationen (Dong et al. 1996; Liu et al. 2000; Miyazaki et al.
2000) oder verstärkter Methylierung (Jackson et al. 2000; Sekita et al. 2001), sondern entsteht
durch verschiedene Mechanismen, die aus veränderter transkriptionaler Regulierung, der
Produktion von Splicevarianten und post-translationaler Modifikation des KAI1/CD82
Proteins bestehen (Tonoli and Barrett 2005).
Die Aktivierung der Transkription von KAI1/CD82 wird durch Motive in der Promotorregion
vollzogen, an die Faktoren wie p53 (Apotoseinduktion und Tumorsuppression) (Mashimo et
al.
2000;
Mashimo
et
al.
1998)
und
NF-IL6
(bei
Sauerstoffmangel
aktiver
Transkriptionsfaktor) binden (Dong et al. 1997; Yan et al. 1997). Des Weiteren stehen als
Aktivatoren NGF (nerve growth factor) und NFκB zur Verfügung. In verschiedenen Tumoren
wurde ein Fehlen oder die Inaktivierung von Faktoren wie p53, NFκB oder NGF beobachtet,
was zu der Vermutung führt, dass dieser Aktivatormangel zur Herunterregulierung von
KAI1/CD82 beiträgt (Li et al. 2001; Shinohara et al. 2001; Sigala et al. 1999). Auch wurde
Einleitung
13
gezeigt, dass für wirkungsvolle Interaktionen mehr als ein Transkriptionsfaktor notwendig ist
(Tonoli and Barrett 2005).
Es wird angenommen, dass KAI1/CD82 Proteine in einem Netzwerk (tetraspanin-web)
organisiert sind (Vogt et al. 2002) und so das Zellwachstum und die Zellbewegung
beeinflussen (Maecker et al. 1997). KAI1/CD82 interagiert über seine große extrazelluläre
Schleife mit Integrinen (α3β1, α4β1, α6β1, LFA, E-Cadherin), die zum Teil die Kontakte
zwischen den Zellen vermitteln. So verstärkt KAI1/CD82 diese Bindungen und hemmt
hierdurch deren Beweglichkeit, wodurch es wahrscheinlich zur Metastasenunterdrückung
beiträgt (Lagaudriere-Gesbert et al. 1998). Weitere Interaktionen wurden mit anderen
Tetraspanin-Mitgliedern (CD 9, 53, 81, 151) gefunden (Hammond et al. 1998). Auch bedingt
eine Assoziation von KAI1/CD82 mit Integrinen (α6) und nachfolgender Internalisierung
derselben eine Herabsetzung der Tumorzellmigration (He et al. 2005). KAI1/CD82 kann weiter
über Tyrosinphosphorylierung fokale Adhäsionskinasen (FAK) aktivieren (Lebel-Binay et al.
1995). Die FAK spielt eine Rolle bei der Organisation des Aktin-Zytoskeletts, bei IntegrinInteraktionen sowie der Zellmigration (Boucheix and Rubinstein 2001). Über die aktivierte
FAK werden sowohl Rho-GTPasen (Delaguillaumie et al. 2002) als auch Src-Kinasen (Zhang
et al. 2003) beeinflusst, deren Signalwege an Invasion und Motilität beteiligt sind (Tonoli and
Barrett 2005). Außerdem scheint KAI1/CD82 durch die Aktivierung spezifischer Transporter
Glutathion aus betroffenen Zellen auszuschleusen. Hierdurch verlieren die Zellen einen antioxidativen Schutz, es resultiert eine vermehrte Apoptoseinduktion. Bei hohem KAI1/CD82Expressionsniveau wird so ein Heranwachsen von Mikrometastasen verhindert (Schoenfeld et
al. 2004).
Weiterhin beschleunigt KAI1/CD82 die Endozytose des EGF (epidermal growth factor)Rezeptors, wodurch es externe Signale für Proliferation und Migration abschwächt, aber auch
die Ausbildung von Zellausläufern (Lamellipodien) verhindert (Nicholson et al. 2001;
Odintsova et al. 2000).
Eine Regulierung von KAI1/CD82 auf der Proteinebene kann zum einen über die NGlykosylierung erfolgen, da hierdurch die Interaktion mit den Integrinen beeinflusst wird.
Wenn KAI1/CD82 beispielsweise nicht glykosyliert vorliegt, kommt es zur Komplexbildung
zwischen α5-Integrin und KAI1/CD82, was zur Behinderung der Laminin- und Fibronektinvermittelten Motilität führt (Ono et al. 2000).
Zum anderen können durch Palmitolierung der intrazytoplasmatischen Cysteinenden des
KAI1/CD82-Moleküls
die inhibitorischen Effekte auf Migration/Invasion, die zelluläre
Lokalisation des Proteins und die Beeinflussung anderer Tetraspanine geregelt werden
Einleitung
14
(Charrin et al. 2003; Zhou et al. 2004). Auch die direkte Bindung anderer Proteine scheint an
der Regulierung der Migrations- und Invasionshemmung beteiligt zu sein. So besitzt das
Oberflächenprotein KASP einen synergistischen (Zhang et al. 2003) und das Tetraspanin
KITENIN einen antagonistischer Effekt (Lee et al. 2004).
Ein weiterer Aspekt in der Bildung von Metastasen scheint in der Beziehung zwischen
DARC-Molekülen (Duffy antigen receptor for chemokines) auf Endothelzellen und der
KAI1/CD82-positiven Tumorzelle zu liegen. Die disseminierte Tumorzelle soll über
KAI1/CD82 mit dem DARC-exprimierenden Endothel interagieren und verhindert über diese
Bindung eine Proliferation von Tumorzellen an der potentiellen Metastasierungsseite. Im
Falle einer fehlenden KAI1/CD82 Expression können die Tumorzellen in diesem Bereich die
Bildung von Makrometastasen einleiten (Bandyopadhyay et al. 2006).
Die Expression von KAI1/CD82 ist gewebespezifisch. Beispielsweise ist die Expression in
Speiseröhren- und Magen-Tumoren (Easty et al. 1996; Guo et al. 1998) sowie in der Papilla
Vateri des Pankreas nicht erhöht, während in anderen Pankreastumoren eine signifikante
Herabregulierung von KAI1/CD82 gefunden wurde (Friess et al. 2001).
1.7.2 Nm23-H1
Dieses Protein wird weiter als NDP-Kinase A, Nme1 (non-metastatic cell 1), awd (abnormal
wing discs) und Granzym A activated DNase (GAAD) bezeichnet. Es hat ein
Molekulargewicht von 17100, besteht aus 152 AS und ist auf dem Chromosom 17q21.31
lokalisiert, das für die A-Isoform der Nukleosiddiphosphokinase kodiert.
Erstmals wurde es in Maus-Melanom-Zellen gefunden. Unter dem Namen „non-metastatic
clone 23“ (nm23) war es das erste identifizierte Metastasen-Suppressor Gen (Steeg et al.
1988). Eine verstärkte Expression in Zelllinien unterschiedlichsten Ursprungs unterdrückte
die Metastasierung, ohne das Tumorwachstum zu beeinflussen (Salerno et al. 2003). Das
humane Analog, nm23-H1, wurde als Nukleosiddiphosphkinase (NDPK) identifiziert. Als
Histidin-Protein-Kinase katalysiert es die Transphosphorylisierung eines terminalen
Phosphates von Nukleotidtriphosphat (NTP) zu Nukleotiddiphosphat (NDP) unter Bildung
eines Histidin-phophorylierten Zwischenproduktes (Wallet et al. 1990). Weitere biochemische
Funktionen sind die DNA-Transaktivierung, die DNA-Nuklease-Aktivität, und das Wirken
als Serin-Protein-Kinase (Salerno et al. 2003).
Im Mausmodell wurde die Beteiligung von mm23-H1 bei der Zellreifung von Geweben
epithelialer und neuronaler Herkunft beschrieben (Lombardi 2006). Auch wurden
Beziehungen zum Zellzyklus beobachtet, da es an nm23-H1-exprimierenden Zelllinien
Einleitung
15
(Brustkrebs-, Prostatakrebs- sowie Muskelzellen) zu einer Reduzierung der Wachstumsrate
kam (Gervasi et al. 1996; Lombardi et al. 1995). Diese Funktion scheint auf die von nm23
induzierte
Promotoraktivität
von
Rb2/p130
mit
Akkumulation
von
aktiven
hypophosphorylierten pRb2/p130 Proteinen in den Zellen zurückzugehen. Das Protein
Rb2/p130 gehört zur Retinoblastomfamilie, welche als Prototyp der Tumorsuppressorgene
gilt, die den G1/S-Phasenübergang negativ kontrollieren und somit wichtige Effektoren der
Zelldifferenzierung sind. Daraus folgt die Annahme, dass nm23 Tumorsuppressor-ähnliche
Funktionen bei der Hemmung der Zellzyklusprogression und somit in der Zelldifferenzierung
hat (Lombardi 2006).
Weiter wurde über eine in vitro 3’-5’ Exonuklease Aktivität von nm23-H1 berichtet. Diese ist
streng an die DNA-Reparatur gebunden, die die Zellen vor genomischer Instabilität, maligner
Transformation und Progression bewahrt (Ma et al. 2004).
Darüber hinaus scheint das Protein nm23-H1 mit Onkoproteinen, wie dem Ebstein-Barr-Virus
(EBV), welches an Immortalisation und der Initiierung von Transformation in Zellen beteiligt
ist, zu interagieren (Murakami et al. 2005; Subramanian et al. 2001). Auch gibt es
Beschreibungen
zu
Interaktionen
zwischen
dem
Onkoprotein
E7
des
humanen
Papillomavirus-16 (HPV-16) und nm23. So wurden an einer HPV-16 E7 exprimierenden
Keratinozyten-Zelllinie Interaktionen gezeigt, die zur Herabregulierung und Inaktivierung von
nm23-Protein führten. Als Konsequenz wurden eine gesteigerte Proliferationsrate, die
Beeinträchtigung der Differenzierung, eine Resistenz gegenüber der Granzym-A induzierten
Apoptose und die Invasion in die Extrazellularmatrix beobachtet. Die Ergebnisse der
Verbindung von nm23-H1 mit HPV-16 E7 scheinen bis jetzt nicht nur die Zellinvasion,
sondern auch den Zellzyklus, die Zelldifferenzierung und die Apoptose zu beeinflussen, was
die Hypothese der nm23 Beeinträchtigung als zentralen Schritt der verschiedenen Stadien in
der Tumorentwicklung stützt (Mileo et al. 2006).
Bis heute wurden 8 Mitglieder (NME1-NME8) der nm23-Familie identifiziert. Von diesen
besitzt allerdings nur NME1 und -2 Metastasen-Suppressor-Aktivität (Otsuki et al. 2001). Das
nm23-H2 codiert für eine Proteinkinase, die eine 88% ige Homologie mit nm23-H1 aufweist.
Dieses
Protein
reguliert
ebenfalls
Wachstum
und
spielt
eine
Rolle
bei
der
Transkripitionsregulierung von Wachstumsgenen, wie c-myc und PDGF (platelet derived
growth factor) (Konishi et al. 1993).
Zurzeit ist wenig über die genauen biochemischen Mechanismen bekannt, mit denen nm23H1 die metastatische Aktivität ändert. Wie in früheren Arbeiten (MacDonald et al. 1993),(Lee
and Lee 1999) gezeigt wurde, scheint die Metastasensuppression nicht auf die Enzymaktivität
Einleitung
16
der NDPK, sondern auf Proteininteraktionen zurückzuführen sein. (MacDonald et al. 1993).
Jedoch wird in neueren Arbeiten gegensätzlich von einer guten Korrelation der
Histidinproteinkinase-Aktivität von nm23-H1 und der Unterdrückung von Zellmotilität
berichtet (Salerno et al. 2003). Diese soll beispielsweise für die Phosphorylierung von Ksr
(Kinase suppressor of Ras), einem zentralen Protein des MAP-Kinase Weges, verantwortlich
sein. Ksr verliert die Eigenschaft zur Vermittlung der MAP (mitogen activated protein)Kinase Aktivierung, was zur Hemmung der Metastasierung (in vivo) und der Motilität (in
vitro) führen soll (Hartsough et al. 2001; Salerno et al. 2003; Steeg et al. 2003). Ras ist ein
Guanosinnukleotid (GTP)-bindendes Protein, das durch GTP aktiviert wird und dann für die
Signalübermittlung in den Zellen verantwortlich ist. Ras wird wahrscheinlich ebenfalls von
nm23-H1 beeinflusst, indem nm23 durch Phosphorylierung an der Bildung von
Farnesyltriphosphat beteiligt ist, was das inaktive Ras-GDP in einen aktiven Ras-GTPKomplex überführt, der an der Aktivierung der MAP-Kinasen beteiligt ist (Wagner and Vu
2000).
Mutationen des nm23 Genes in Tumoren sind selten. Dies deutet darauf hin, dass die nm23
Funktionsbehinderung auf der Ebene der Proteinexpression erfolgt und dass andere Proteine
Einfluss auf die Regulierung von biochemischen Mechanismen haben, durch die das
metastatische Schicksal der Tumorzelle bestimmt wird (Roymans et al. 2002).
So korrelieren die verminderte Expression von nm23 und die Metastasensuppression mit
vielen, aber dennoch nicht mit allen Malignomen. An Neuroblastomen ist beispielsweise eine
höhere Expression mit gesteigerter Aggressivität vergesellschaftet (Almgren et al. 2004;
Hailat et al. 1991).
Die physiologischen Funktionen von nm23-H1 sind die Beteiligung an der Zellproliferation
(Cipollini et al. 1997), Regulierung der Transkription (Ji et al. 1995; Postel et al. 1993) sowie
Entwicklung und Differenzierung (Lombardi et al. 2000). Eine besondere Bedeutung scheint
dem Protein bei der Differenzierung von Epithel und Nervengewebe zuzukommen (Dabernat
et al. 1999; Gervasi et al. 1998; Lakso et al. 1992). Eine weitere physiologische Funktion ist
die Assoziation mit Tiam1, einem Nukleotidaustauschfaktor für Rac1. Bei nm23Überexpression verhindert dieses über Tiam1 den GTP-Austausch an Rac1. Rac hat eine
zentrale Rolle in der Reorganisation des Zytoskletts, der Proliferation und Apoptose
(Kauffman et al. 2003). Auch eine Wirkung von nm23 mit seiner NDP-Kinase Aktivität an
Rad ist anzunehmen. Die Rad-Überexpression geht in vivo mit verstärkter Tumorigenität
einher und kann durch eine nm23-H1 Überexpression verhindert werden (Tseng et al. 2001).
Einleitung
17
Schließlich werden eine Menge weiterer Assoziationen, wie mit Enzymen (GAPDH; CK2),
Telomeren, Vimentin und ICAP-1a berichtet (Salerno et al. 2003).
Intrazellulär ist es außer im Zytosol, partiell mit Mikrotubuli assoziiert, in den Mitochondrien
und dem Nukleus zu finden. Es ist kein Hauptexpressionsort beschrieben, sondern ein
ubiquitäres Vorkommen ist anzunehmen (Bsp.: Herzmuskelzellen, B-Lymphozyten (Caligo et
al. 1995; Yi et al. 1996).
1.8 Ziele der Arbeit
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit immunhistochemisch untersucht,
ob die Effektorcaspasen 3 und 6, die Proteine KAI1 und nm23-H1 in Peniskarzinomen
exprimiert werden und ob bestimmte Expressionsmuster mit klinikopathologischen Faktoren
wie dem pathologischen Grading, dem Vorkommen von Lymphknotenmetastasen und dem
Krankheitsverlauf korrelieren. Zum Vergleich der Effektorcaspasenexpression mit der
Tumorzellapoptose wurde die zusätzlich TUNEL-Methode eingesetzt.
Fragestellung:
ƒ
Sind bisherige Prognoseparameter (wie Tumorstadium, Grade, Nodalstatus) in Bezug
zur Metatstasierung und dem Überleben auf die untersuchte Population anwendbar
ƒ
Haben die MSG-Produkte KAI1 und nm23-H1 eine Beziehung zur Metastasierung
und/oder dem Überleben beim PSCC
ƒ
Haben die aktivierten Effektorcaspasen 3 und 6 eine Beziehung zur Metastasierung
und/oder dem Überleben beim PSCC
2 Material und Methoden
2.1 Material
Bei der Durchführung der Versuche sind alle Materialien und Chemikalien gemäß den
Angaben der Hersteller zur Gewinnung und Auswertung der Ergebnisse verwendet worden.
Die benutzten Chemikalien, Antikörper und Enzyme sind in reinster Konzentration oder der
höchsten kommerziell erhältlichen Reinheit zur Anwendung gekommen.
2.1.1 Gewebe
Das entnommene Material wurde in Einklang mit den aktuellen Datenschutzbestimmungen
des Landes M/V zur Wahrung der Patientenanonymität verwendet. Die vorliegende Studie
wurde nach Beratung und Abstimmung mit der Ethikkommission der Universität Greifswald
durchgeführt.
Für die Untersuchungen wurden Proben von 30 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen
(PSCC) und von 4 Patienten mit intrepithelialen Neoplasien des Penis analysiert, wovon 12
Tumore aus der Klinik für Urologie der Universität Greifswald und 22 Tumore aus der
urologischen Klinik des medizinischen Zentrums Schwerin stammten. Die retrospektive
Studie umfasst den Zeitraum zwischen 1993 und 2001. Die Alterspanne der erkrankten
Männer lag zwischen 35 und 89 Jahren (Mittel 65,2 Jahre). Die Patienten wurden
entsprechend der Tumorausdehnung unterschiedlich behandelt. So wurden die Proben von 9
Circumcisionen, 23 Exzisionen bzw. Teilamputationen und 6 Amputationen entnommen. Das
Untersuchungsmaterial wurde in 4%iger gepufferter Formaldehydlösung fixiert (mindestens
24 h). Die Befundung der Gewebeproben wurde am Institut für Pathologie der Ernst-MoritzArndt-Universität Greifswald sowie dem Pathologischen Institut der Klinik Schwerin an HEgefärbten Schnitten durchgeführt.
Die
allgemeinen
Patientendaten,
Angaben
zur
Tumorausdehnung,
Nodalstatus,
Fernmetastasen und der Krankheitsverlauf wurden den Krankenakten entnommen.
2.1.2 Antikörper und Immunhistochemie
Verwendete Antikörper
Maus-Anti-nm23-H1-Antikörper (monoklonal)
(Clone 37,6)
Kaninchen-Anti-KAI1-Antikörper (polyklonal)
Santa Cruz, USA
Novocastra, Newcastle, UK
SantaCruz Biotechnology,
Material&Methoden
19
(H-173)
Maus-cleaved Caspase3-Antikörper (polyklonal)
USA
(Asp 175)
Maus-cleaved Caspase6-Antikörper (polyklonal)
USA
(Aps 162)
Cell
Signaling,
Beverly,
Cell
Signaling,
Beverly,
Immunhistochemie-Kit
4plus HRP-DAB Sample-KIT
Biocarta, Hamburg
2.1.3 Chemikalien
Sofern die Bezugsquelle nicht aufgeführt ist, wurden die verwendeten Chemikalien über die
Universitäts-Apotheke Greifswald bezogen,
Chemikalien
Neoclear
Neomount
Eosin (1%ig in 70% Alkohol)
Ethanol (99,8%ig/ abs.)
Neoclear
Neomount
Salzsäure
Xylene
3’3 DAB
Proteinase K
Tris (1M)
DNase
TdT-Puffer
Biotin
Gylcerogelatine
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Kaliumhydrogenphoshat (KH2PO4)
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
ROTH, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
J.T. Baker, Deventer,
Holland
Sigma, München
Roth, Karlsruhe
Promega
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roamal, Budapest, Ungarn
Lösungen
Citratpuffer
9 ml Stammlösung A ( 0,1 M Zitronensäure)
41 ml Stammlösung B ( 0,1 M Natriumcitrat)
ad 450 ml Aqua. dest.
pH 6,0
Peroxidase-Substrat- DAB
10 ml PBS
10 mg DAB (1 Tablette)
10 µl H2O2
Material&Methoden
20
PBS
0,2 g/l KCl
0,2 g/l KH2HPO4
8,0 g/l NaCl
1,44 g/l Na2HPO X 7H2O
ad 1,0 l Aqua. dest.
pH 7,2-7,4
Hämalaun (nach Mayer)
2,5 g Hämatoxylin
0,5 g Natriumjodat
125 g Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat
125 g Chloralhydrat
2,5 g Zitronensäure
ad 2,5 l Aqua. dest.
TUNEL-Lösungen
Proteinase-K-Puffer
Stammlösung A
Stammlösung B
Stammlösung C
77,4 g/l Kaliumchlorid
121,1 g/l Tris (pH 8,3)
203,3 g/l Magnesiumchlorid
Puffer für Proteinase K
25 ml Lsg. A
+5 ml Lsg. B
+1 ml Lsg. C
auffüllen auf 500 ml Aqua bidest.
DNase-Reagenz
10 µl Tris (1M)
10 µl MgCl2
50 µl DNase (10mg/ml)
100 µl TdT Puffer (Promega)
330 µl Aqua dest.
Puffer für TdTransferase
40 µl TdT Puffer
2 µl Biotin
20 µl CoCl2
138 µl Aqua dest.
Lyse-Puffer für entsprechende Vol.
0,1% Natriumcitrat
0,1% Triton
2.1.4 Geräte
Ausgießstation, Typ DDM-P 063-5
MEDIS Weber, Gießen
Schlittenmikrotom „Jung Histoslide 2000“
Leica Instruments, Nussloch
Einmalmesser, N35
Feather, Japan
Objektträger Super-FrostPlus
Fa.Menzel, Braunschweig
Wasserbad
Elektothermal, UK
Streckplatte
Gerhardt, Bonn
Material&Methoden
21
Mikroskop „Olympus BX 50“
mit „Olympus DP 10“ Digitalkamera
Olympus, Hamburg
Deckgläser, 24x40mm
Marienfeld, Deutschland
Rotationsschüttler, Polymax 2040
Heidolph, Deutschland
Schüttler
Jahnke & Kunkel, Staufen
Pap-Pen (Dako Cytomation Pen)
Glostrup, Dänemark
Eppendorf-Gefäß (Safe Lock Tubes)
Eppendorf, Hamburg
Mikroliterpipetten
Eppendorf, Hamburg
Histokinette, Typ DDM-P800
MEDIS Weber, Gießen
Brutschrank, Modell 400
Memmert, Schwabach
Filtertips, d=125mm
Schlichter & Schnell, Dassel
Feinwaage
Satorius
pH-Meter, ino Lab
WTW, Weilheim
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellen von Paraffinschnitten und Entparaffinieren
Nach Entnahme wurde das Probenmaterial in 4%-igem gepufferten Formalin für 12-24 h
fixiert und anschließend unter fließendem Leitungswasser gespült (24 h). Die Gewebeproben
wurden in die Histokinette eingebracht und in der aufsteigenden Ethanolreihe (50%, 70%,
80%, 96%, 2x abs. Ethanol) für je 2h dehydriert. Hierauf kamen die Proben für jeweils 2 h in
Neo-Clear (Xylolersatz), in weiches und letztlich in hartes Paraffin. Anschließend wurde das
Gewebe mit filtriertem hartem Paraffin ausgegossen. Mit dem Schlittenmikrotom wurden von
den ausgehärteten Blöcken je 5 µm dicke Schnitte hergestellt, die im Streckbad (40°C)
entfaltet und auf Superfrost-Objektträger (Silan-beschichtet) aufgezogen wurden. Es folgte
die Trocknung für mindestens 1 h auf der Streckplatte (35°C) und für mind. 24 h im
Brutschrank bei 38°C. Zum Herauslösen des Paraffins wurden die Schnitte in Xylol
entparaffiniert und in der absteigenden Ethanolreihe (2x abs. Ethanol, 96%, 80%, 70%, 50%)
und PBS rehydriert.
2.2.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Neben der immunhistochemischen Bearbeitung wurden die Gewebeproben mit HämatoxilinEosin gefärbt. Die Gewebeschnitte wurden auf dem Objektträger nach Entparaffinierung für 5
min. in Hämalaun gefärbt und darauf 10 min. in Leitungswasser gebläut. Nach Abstoppen der
Reaktion mit Aqua dest. wurde für 10 min. mit Eosin gegengefärbt und wieder mit Aqua dest.
Material&Methoden
22
gespült. Im weiteren Verlauf wurden die Gewebeschnitte in der aufsteigenden Alkoholreihe
dehydriert und in Neomount eingedeckelt.
2.2.3 Immunhistochemie
Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden in Anlehnung an das Biocarta-Protokoll
durchgeführt. Nach Entparaffinierung der Schnitte folgte die Blockierung der endogenen
Peroxidase mit Peroxidazed-1. Anschließend wurde mit Backgrounderaser inkubiert, um die
nichtspezifische Hintergrundreaktion zu verringern. Darauf wurde mit den primären
Antikörper inkubiert. Es folgten ein biotinylierter, sekundärer Antikörper (aus der Ziege) und
der Biotin-Streptavidin-HRP-Komplex (aus Streptomyces avidinii, das eine besondere
Affinität hat mit seinen 4 Untereinheiten das wasserlösliche Vitamin Biotin stabil zu binden).
Schließlich wird die Antikörperbindung durch Diaminobenzidin visualisiert.
2.2.3.1 Durchführung
1) Entparaffinieren s.o.
2) Blocken der endogenen Peroxidase mit Peroxidazed 1 (5 min.)
3) Waschen in Aqua dest. (5 min.)
4) Kochen der Präparate in der Mikrowelle (700 W) in Citratpuffer (sprudelnd, 20 min.)
5) Abkühlen auf ( 22C°) (mindest. 30min.)
6) Spülen in Aqua dest. und PBS (je 5 min.)
7) Inkubation der Proben mit Backgrounderaser (5 min.)
8) Inkubation des primären Antikörpers (KAI 1 1:50, nm23 1:1500, cleaved Caspase-3
1:300, cleaved Caspase-6 1:200, über Nacht bei 4C°)
9) Spülen in PBS (2x 5 min.)
10) Inkubation mit Univeral Link (10 min., 25C°)
11) Waschen in PBS (2x 5 min.)
12) Inkubation mit Streptavidin-HPR (5 min., 25C°)
13) Waschen in PBS (2x 5 min.)
14) Visualisieren mit Peroxidase-Substrat DAB- Lösung (3-5 min.)
15) Abstoppen der Farbreaktion in Aqua dest.
Im Anschluss wurden die Zellkerne mit Hämalaun (1 min.) gegen gefärbt und mit
Leitungswasser (5 min.) gebläut. Nach weiterem Spülen in Aqua dest. (5 min.) folgte ein
Dehydrieren in der Alkoholreihe (2x 96% Ethanol abs., 2x Neoclear, je 5 min.) und
schließlich die Einbettung in Neomount.
Material&Methoden
23
2.2.3.2 Auswertung der Immunreaktion
Die Beurteilung und Photodokumentation der Präparate erfolgte am Lichtmikroskop mit
Kameramodul. Hierzu wurden 4-5 beliebige Stellen („region of interest“, ROI) im Tumor
ausgewählt. Die ROI’s wurden zu je 100 Zellen in einer 400-fachen Vergrößerung (HPF,
„high power field“ = 400-fache Vergrößerung [10 (Okular) x 40 (Objektiv)]) ausgezählt.
Zellen des Präparatrandes wurden nicht in die Bewertung des Gesamtbildes einbezogen, da
sich
hier
schwankende
Intensitätsdarstellungen
in
der
Anfärbung
ergaben.
Die
Immunreaktivität der Tumoren wurde unabhängig durch zwei Beobachter ausgewertet und im
Vergleich mit normalen Gewebsbestandteilen (interne Kontrollen) im selben Schnitt in
schwache, mäßige oder starke Reaktivität eingeteilt. Bei abweichenden Ergebnissen wurden
die Schnitte gemeinsam betrachtet und übereinstimmend beurteilt.
Immunreaktivität für KAI1 und nm23-H1
Je nach immunologischer Anfärbbarkeit wurden die Tumorzellen prozentual in folgende
Reaktivitätsgruppen eingeteilt:
0) [≤10% der Tumorzellen]
geringe Reaktion
1) [11-50% der Tumorzellen]
moderate Reaktion
2) [51-100% der Tumorzellen]
starke Reaktion
Immunreaktivität für c-Caspase 3 und 6
Bei der Auswertung der cleaved-Caspasen 3 und 6 (cCasp3, cCasp6) wurden veränderte
Immunreaktivitätsgruppen festgelegt, da die Mehrzahl eine geringe, jedoch nur wenige
Präparate eine starke Immunreaktion aufzeigten.
0) [<1% der Tumorzellen]
keine Reaktion
1) [1-10% der Tumorzellen]
geringe Reaktion
2) [11-50% der Tumorzellen]
moderate Reaktion
3) [51-100% der Tumorzellen]
starke Reaktion
2.2.3.3 Kontrollreaktionen in der Immunhistochemie
Zum Ausschluss einer unspezifischen Bindung der Antikörper auf den Gewebeschnitten
wurden verschiedene Kontrollreaktionen durchgeführt:
Material&Methoden
24
•
nur PBS, statt Blockierungsreagenz zum Ausschluss endogener Peroxidaseaktivität
•
PBS statt Primärantikörper zum Ausschluss unspezifischer Bindungen der
nachfolgenden Ag/AK-Komplexe
•
Präimmunserum statt Primärantikörper zum Ausschluss unspezifischer Bindung des
AK gegen Penis-/Tumorgewebe
2.2.4 TUNEL-Methode
Die während des programmierten Zelltodes (progammed cell death; PCD) stattfindende
intrazelluläre DNA-Fragmentierung kann zum Nachweis apoptotischer Zellen herangezogen
werden. Hierbei werden unabhängig vom jeweiligen Stimulus Apoptose-spezifische DNAFragmentlängen beobachtet (Grasl-Kraupp et al. 1995; Negoescu et al. 1996).
Der Nachweis dieser DNA-Fragmente wird unter enzymatischer Kopplung von markierten
Desoxy-Uridin-Triphoshaten (dUTP) an Hydroxid-(OH)-Enden von DNA-Strangbrüchen
durchgeführt. Bei dem hier verwendeten indirekten Nachweis, über den Einbau eines BiotinUDP werden die an die DNA-Fragmente gebundenen Moleküle über einen zweiten Schritt
immunhistochemisch sichtbar gemacht. Die Reaktion der Nukleotidtriphosphate (NTP) an
den DNA-Bruchstücken wird durch den Zusatz von Enzymen (terminale Transferase)
katalysiert. Die gebundenen Biotinmoleküle werden durch Zugabe von Avidin-AK und
folgender Färbereaktion sichtbar gemacht.
2.2.4.1Durchführung
Pro Versuch wurden 4 Schnitte verwendet S1-S4.
Versuchsaufbau
S1
S2
S3
S4
+DNase
+DNase
-DNase
-DNase
1)
+TdT
-TdT
+TdT
-TdT
Positiv-Kontrolle
Negativ-Kontrolle
Apoptosenachweis
keine Reaktion
Entparaffinieren s.o.
Einkreisen der Gewebeprobe mit dem Pap-Pen, damit Lösung nicht abfließt
2)
Adaptieren der Schnitte S1-S4 in Proteinase-K-Puffer (3 min. 22°C)
3)
Inkubation der Schnitte S1-S4 mit Proteinase-K (30 min. im Wasserbad ,30°C)
4)
3x waschen in PBS
5)
Inkubation mit Lysepuffer (2 min. 22°C)
6)
3x waschen in PBS
Material&Methoden
25
7)
DNase Behandlung der Schnitte S1-2, S3-4 in PBS (20 min. 22°C )
8)
Spülen in PBS in getrennten Küvetten
9)
Inkubation mit TUNEL-Reagenz S1&S3 +TdT, S2&4 –TdT (60 min. in feuchter
Kammer im Brutschrank)
10) 3x waschen in PBS
11) Strepavidin-AP [1:100] (30 min. 22°C )
12) 3x waschen in PBS
13) Inkubation mit BCIP/NBT (10 min. 22°C)
14) 3x waschen in PBS
15) Eindecken in Glycerolgelatine
Die Proteinase K-Lösung bestand aus 3 mg Proteinase-K, die in 50ml Proteinase-K-Puffer
gelöst und in einem Wasserbad auf 37°C vorgewärmt wurden.
Die Gewebeschnitte(S) der TUNEL-Reaktion wurden mit einem Standard-Lichtmikroskop
ausgewertet. Erfasst wurden positive Zellen in Tumorarealen. Diese wurden in Beziehung zu
Caspase-positiven Zellen gleicher Bezirke gesetzt. Als positiv wurden Zellen bewertet, die
eine Zellanfärbung und morphologische Eigenschaften der Apoptose (z.B. Schrumpfung,
Apoptose-Körperchen) aufzeigten.
2.3 Statistik und Software
Die Auswertung der Variablen erfolgte je nach Fragestellung mit dem Chi-Quadrat-Test nach
dem Pearson/Fisher-Yates-Test, dem T-Test, dem Kendall-τ-Test, der Kaplan-Meier-Methode
und der multivariaten Regressionsanalyse bzw. der Cox’schen Regression.
Chi-Quadrat nach Pearson /Fisher-Yates-Test
Mit dem Chi2-Test berechnet man, ob es Unterschiede zwischen den beobachteten und den
nach der Nullhypothese zu erwartenden Häufigkeiten gibt. Als Vorraussetzung dürfen die
Häufigkeiten der Zellen nicht zu klein sein, das heißt nicht weniger als 1/5 der Zellen dürfen
eine absolute Häufigkeit kleiner 5 haben und keine Zelle darf eine Häufigkeit kleiner 1
aufweisen. Falls diese Vorraussetzungen nicht erfüllt wurden, kam der exakte Test nach
Fisher zur Anwendung.
Material&Methoden
26
T-Test
Der ungepaarte T-Test ist ein Signifikanztest. Er dient zum statistischen Nachweis von
Unterschieden oder Effekten von unabhängigen Variablen zweier unterschiedlicher Gruppen.
Dabei wird versucht, die Nullhypothese zu widerlegen. Das Ergebnis des Tests wird häufig als
p-Wert angegeben. Signifikanz liegt vor (d.h. die Nullhypothese ist widerlegt), wenn der pWert kleiner als das zuvor festgelegte Signifikanzniveau (z.B. p<0,05) ist.
Kendall-τ(Tau)-Test
Ein nichtparametrisches Maß des Zusammenhanges für ordinale und ranggeordnete Variablen
berücksichtigt. Das Vorzeichen des Koeffizienten gibt die Richtung des Zusammenhanges
und sein Absolutwert die Stärke an. Größere Absolutwerte deuten auf stärkere
Zusammenhänge. Mögliche Werte liegen zwischen -1 und 1.
Multivariate logistische Regressionsanalyse
Mit dieser Methode wird die Abhängigkeit einer Variablen, die mehr als zwei Kategorien
aufweisen darf, von anderen unabhängigen Variablen mit beliebigem Skalenniveau
untersucht. Die Analyse zeigt dann die Wahrscheinlichkeit des Eintreffens des Ereignisses in
Abhängigkeit von den Werten der unabhängigen Variablen. Mit der multivariaten Analyse
kann bei genügend großem Untersuchungsgut eine Vorhersage über prognostische Faktoren
gemacht werden. Ein unabhängiger prognostischer Faktor muss fähig sein, den natürlichen
Verlauf einer Erkrankung statistisch unabhängig von anderen Parametern vorherzusagen
(Hartsough and Steeg 2000; Horenblas 2001).
Kaplan-Meier-Methode und Logranktest
Die Kaplan-Meier-Methode berücksichtigt die Informationen aller Patienten bei der
Berechnung der Überlebenszeiten so lange diese beobachtet wurden.
Der Logranktest macht Aussagen darüber, ob die beobachteten Unterschiede in den
Überlebenszeitkurven statistisch signifikant sind.
Cox’sche Regressionsanalyse
Mit der Hilfe dieses Verfahrens kann man untersuchen, wie bestimmte Variablen
(Vorhersagevariablen) die Überlebenswahrscheinlichkeit beeinflussen. Es handelt sich hierbei
um eine der multinominalen Regressionsanalyse verwandte Methode, die auch die
Einbeziehung zensierter Fälle gestattet.
Material&Methoden
27
Die Berechnungen der erhobenen Daten wurde mit dem Statistikprogramm SPSS 12.0
durchgeführt. Weiter wurden die Microsoft-Software Word, Exel und PowerPoint eingesetzt.
3 Ergebnisse
3.1 Klinische Parameter
3.1.1
Alter
Insgesamt gingen 34 Patienten in die Auswertung mit ein. Das Durchschnittsalter betrug 65
Jahre (35-89 Jahre).
12
Mean = 65,24
Std. Dev. = 13,262
N = 34
10
Anzahl
8
6
4
2
0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
Alter in Jahren
Abb. 3.1: Altersverteilung der Patienten.
Mean: Durchschnittsalter Std.Dev.: Standardabweichung N:Anzahl der Patienten
3.1.2
Pathologischer Befund
Von den 34 untersuchten Penistumoren wurden in Anlehnung an die WHO „histological
classification of tumours of the penis“ (2004) 30 als Plattenepithelkarzinome (squamous cell
carcinoma, SCC) klassifiziert. Als Subtypen kamen in den Gewebeschnitten 3 basaloide und 1
kondylomatöses (warziges) Karzinom vor. Weiter wurden 4 Karzinoma in situ (PIN, nicht
invasiv) einbezogen.
3.1.3
Tumorausdehnung (T-Stadium) und klinischer Verlauf
Das Stadium pT0/Tis wurde bei 4 Patienten gefunden, von denen keiner im
Beobachtungszeitraum (1-125 Monate) verstarb. Von den 13 Patienten mit pT1-Stadium
verstarben 6 (davon 5 durch krankheitsspezifischen Tod; KST), von 8 Patienten mit pT2Stadium verstarben 3 (2 davon KST), von 8 Patienten im Stadium pT3 verstarben 5 (2 KST).
Der einzige Patient mit pT4-Stadium verstarb krankheitsspezifisch. Die Korrelation zwischen
pT-Stadium und Krankheitsverlauf ist statistisch nicht signifikant (log rank: p= 0,061).
Ergebnisse
3.1.4
29
Regionaler Lymphknotenstatus (N-Stadium) und klinischer Verlauf
Zur Sicherung des Lymphknotenstatus wurden bei 16 von 34 Patienten Lymphknoten (LK) in
einem metachronen Eingriff entfernt (hiervon einer in Sentineltechnik), während bei den
übrigen 18 Patienten ein Befund zur LK-Veränderung entweder durch die körperliche
Untersuchung (Palpation) oder in der Bildgebung (US, respektive CT) erhoben wurde. Bei 17
Patienten konnte kein LK-Befall nachgewiesen werden (N0). Von diesen verstarben 4 (davon
1 KST) im Beobachtungszeitraum. 6 Patienten hatten einen Lymphknotenbefall N1, von
denen 3 verstarben (3 KST). Bei 7 Patienten wurde die Klassifikation N2 vorgenommen. Von
diesen verstarben 6 (5 KST) im Beobachtungszeitraum. Von den 4 als N3 klassifizierten
Patienten verstarben 2 (1 KST). Die Korrelation zwischen regionärem LK-Status und
progressiven bzw. letalen Krankheitsverlauf ist statistisch signifikant (log rank: p= 0,025).
3.1.5
Fernmetastasen (M-Stadium) und klinischer Verlauf
Innerhalb der Patientengruppe wurden bei 6 Erkrankten Fernmetastasen gefunden
[p(pathological)M1: n=1; c(clinical)M1: n=5]. Diese traten in der Haut, den Knochen und der
Lunge auf. Bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes verstarben 5 Patienten (3 KST) mit
Fernmetastasierung. Die Gruppe ohne Fernmetastasen umfasste 22 Patienten, von denen 5
Patienten im Nachbeobachtungszeitraum verstarben. Bei 6 Erkrankten konnte keine
Beurteilung der Fernmetastasierung vorgenommen werden, allerdings verstarben in dieser
Gruppe, welche einem Beobachtungszeitraum von 12 bis 43 Monaten umfasste, 5 (4 KST)
Patienten. Die Korrelation zwischen Fernmetastasen und dem letalen Krankheitsverlauf ist
statistisch hochsignifikant (log rank: p= 0,001).
3.1.6
Differenzierung (Grading) und klinischer Verlauf
Von den Tumoren sind 5 als G0, 4 als G1, 21 als G2 und 4 als G3 beurteilt worden. Im
gesamten Beobachtungszeitraum verstarben in der G0-Gruppe kein Patient, in der G1-Gruppe
1 Patient (KST), in der G2-Gruppe 12 Patienten (davon 7 KST) sowie in der G3-Gruppe 2
(alle KST). Die Korrelation der Differenzierung mit dem Krankheitsverlauf ist statistisch
nicht signifikant (log rank: p= 0,383).
3.1.7
Stadium nach WHO und klinischer Verlauf
Die Stadien 0-1 (LK-negativ, N-) nach WHO wurden bei 10 Patienten gefunden, von denen
einer (KST) verstarb. Von den 10 Patienten der Stadien 2-3 (LK-positiv; N+) erlagen 4 (2
KST) Patienten ihrer Krankheit. Von insgesamt 8 Patienten mit Stadium 4 verstarben 5 (3
KST). Einer Einordnung in ein Stadium nicht zugänglich waren 6 Patienten, bei denen eine
Ergebnisse
30
Aussage zur Fernmetastasierung unterblieb. Allerdings verstarben hier 5 (4 KST) Patienten
im Verlauf der Beobachtung. Die Korrelation der Differenzierung mit dem Krankheitsverlauf
ist statistisch nicht signifikant (log rank: p= 0,139).
3.1.8 Übersicht TNM, Grade & Stadium mit zugeordnetem Level
Tabelle 3.1 Verteilungshäufigkeit der klinikopathologischen Parameter
Level/pathologischeMerkmale
0
1
2
Level
3
4
nicht
beurteilbar
T
4
13
8
8
1
N
17
6
7
4
-
M
22
6
-
Grade
5
4
21
4
-
Stadium
4
6
6
4
8
0
0
6
-
6
-: Auflistung der absoluten Patientenhäufigkeiten in den einzelnen TNM-Stufen (Level), der Differenzierung
(Grade) und dem Stadium (WHO)
3.1.9
Tumorausbreitung bei Diagnose
Zum Diagnosezeitpunkt waren bei 44,1% der Patienten keine Metastasen auffindbar.
Allerdings konnte zu diesem Zeitpunkt schon bei über einem Drittel (38,2%, davon 17,6% mit
Fermetastasen) der Betroffenen eine Metastasierung nachgewiesen werden. Bei fast jedem
Prozent der Fälle
fünften Patienten (17,6%) konnte zur Metastasierung keine Aussage getroffen werden.
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
Lokalisiert
Regional
Fern
X
Tumor bei Diagnose
Abb. 3.2: Auflistung der relativen Häufigkeiten der Tumorausbreitung; lokalisiert: N0; regional: N1-3; fern: M1;
X: keine Aussage zur Metastasierung möglich
Ergebnisse
31
3.1.10 Korrelation von TNM-Klassifikation, Differenzierung, Tumorstadium und
klinischem Verlauf
Tabelle 3.2 Klinikopathologische Parameter und Status
Status
4
12
7
5
1
14
6
6
3
20
4
5
5
4
16
4
4
6
4
4
6
Anzahl
0
5
2
2
1
1
3
5
1
3
3
4
0
1
7
2
0
1
1
1
3
Leben mit/
ohne
Krankheit
Anzahl
4
7
5
3
0
13
3
1
2
17
1
1
5
3
9
2
4
5
3
3
3
5
4
1
Gesamt
n
T
N
M
Grade
Stadium
WHO
0
1
2
3
4
0
1
2
3
0
1
Mx
0
1
2
3
0
1
2
3
4
nicht
beurteilbar
krankheitsspez.
Tod
log rank
0,061
0,025
0,001
0,383
0,139
-: Auflistung der absoluten Patientenhäufigkeiten nach TNM-Klassifikation , der Differenzierung und dem
Stadium nach WHO, verglichen mit dem klinischen Verlauf (Status), ausgeschlossen wurden nichtkrankheitsspezfisch verstorbene Patienten (n=5).
Ergebnisse
32
3.2 Immunhistochemische Ergebnisse
Die immunhistochemischen Untersuchungen mit den verwendeten Antikörpern zeigten eine
spezifische Reaktion an allen untersuchten Gewebeproben.
Immunhistochemische Kontrollreaktion
Eine positive Reaktion blieb in den mitgeführten Kontrollschnitten aus (Abb 3.3).
A
B
Abb. 3.3: A) Kontrollreaktion im Epithel B) Kontrollreaktion im Tumor
Vergr.: 100-fach
Immunhistochemische Lokalisation von KAI1 in nicht-neoplastischenm Gewebe
Im nicht-neoplastischen Gewebe war mit dem anti-KAI1-AK eine Anfärbung an
Endothelzellen und Nervenfasern (Markscheide) zu beobachten.. Die Zellen des
Oberflächenepithels zeigten keine oder nur eine sehr schwache Reaktion. Eine starke
Reaktion wurde im Zytoplasma von Lymphozyten der Keimzentren von Lymphfollikeln
beobachtet.
Immunhistochemische Lokalisation von nm23-H1 in nicht-neoplastischenm Gewebe
Mit dem Antikörper gegen das nm23-H1-Protein zeigte sich eine Immunreaktion im
Zytoplasma aller und in den Zellkernen einiger Oberflächenepithelzellen. Zellen in der
Gefäßwand sowie Lymphozyten in lymphoplasmazellulären Infiltraten waren immunpositiv.
Des Weiteren wurden Talgdrüsen und Bindegewebszellen (Fibroblasten) angefärbt.
Immunhistochemische Lokalisation von c-Caspase 3 und 6 in nicht-neoplastischenm
Gewebe
Eine Immunreaktivität für die cCaspasen zeigte sich zytoplasmatisch, teils nukleär in
Oberflächenepithelzellen des Stratum basale, spinosum und granulosum des nicht-
Ergebnisse
33
neoplastischen Gewebes sowie in begleitenden lymphoplasmazellulären Infiltraten. Die
Verteilung beider Proteine war sich ähnlich, dennoch überwogen cCaspase 6-positive Zellen.
Abb. 3.3.1: Immunhistochemischer Nachweis von KAI1 in nicht-neoplastischem Gewebe. A) Eine positive
Reaktion ist in Gefäßwänden, Nervenfasern und Lymphozyten zu beobachten B) Positive Immunreaktion in
Lymphzyten (Ly) und Gefäßwandschichten; Erythrozyten sind immunnegativ (Ery); C-D) Gefäßlängsschnitt mit
positiver Reaktion von Endothel und Myozyten
Vergr.: A) 100-fach; B) 1000-fach; C, D) 200-fach.
Abb. 3.3.2: Immunhistochemischer Nachweis von KAI1 in nicht-neoplastischem Gewebe. A-B) Gefäße, Nerven
und Rundzellen sind immunpositiv; C-D) positive Reaktion der Markscheiden eines Nervs,
Vergr.: A-B) 100-fach; C) 200-fach; D) 1000-fach
Ergebnisse
34
Abb. 3.4: Immunhistochemischer Nachweis von nm23 in nicht-neoplastischem Gewebe. A) positive Reaktion
des Oberflächenepithels mit dem Anitkörper gegen nm23 B) Begleitinfiltrat mit positiver Immunreaktion an
Rundzellen C) positive Reaktion im Keimzentrum eines Lymphfollikels
Vergr.: A) 100-fach B) 400-fach C) 100-fach
Abb. 3.5: Immunhistochemischer Nachweis von c-Caspase 3 und 6 in nicht-neoplastischem Gewebe. Oben:
Immunreaktion des Antikörpers gegen c-Caspase 3; Unten: Immunreaktion des Antikörpers gegen-cleavedCaspase 6. Positive Reaktionen finden sich im penilem Plattenepithel und in Rundzellen des Coriums. Vergr.:
100-fach
Ergebnisse
3.2.1
35
Lokalisation von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3 und 6 in den Penistumoren
Die Immunreaktion der Proteine KAI1 und nm23-H1 fand sich vorwiegend an der
Zellmembran und intrazellulär. Im Vergleich der untersuchten Proben wurden jedoch
unterschiedliche Intensitäten gefunden. Trotz der Intensitätsunterschiede der Tumorareale
wird der hieraus gebildete Score aufgrund mangelnder Aussagekraft nicht aufgeführt und
lediglich eine Einteilung nach der Häufigkeit von pos. Zellen unternommen. Eine
Immunreaktion für KAI1 war in Tumorzellen sowohl in der Zellmembran als auch im
Zytoplasma sowie in den Kernen der Tumorzellen zu beobachten. Eine starke Reaktivität
wurde für KAI1 in 21 Fällen (61,8%) beobachtet. Die Färbung für nm23-H1 war hingegen
stärker im Zytoplasma sowie den Zellkernen nachweisbar. Eine starke Reaktivität wurde hier
in 15 Fällen (44,1%) ausgemacht.
Die c-Caspasen 3 und 6 zeigten untereinander eine ähnliche Immunreaktivität. Eine starke
Reaktivität konnte für c-Caspase 3 in keinem Fall, für c-Caspase 6 in 6 (18,8%) Tumoren
nachgewiesen werden. Die c-Caspase 3 zeigte meist eine zytoplasmatische Immunreaktion,
während für c-Caspase 6 häufiger die Zellkerne einzelner Zellen bzw. kleinerer Zellverbände
positiv waren.
Ergebnisse
36
Tabelle 3.3: Häufigkeit der Immunreaktivität von KAI1, nm23-H1, Effektorcaspasen 3
und 6 in den Tumoren
KAI1
nm23-H1
cCasp3
cCasp6
Häufigkeit, n
3
10
21
Prozent, %
8,8%
29,4%
61,8%
Gesamt
34
100,0%
0
1
2
2
17
15
5,9%
50,0%
44,1%
Gesamt
34
100,0%
0
1
2
13
16
1
43,3%
53,3%
3,3%
Gesamt
30
100,0%
0
1
2
3
10
8
8
6
31,3%
25,0%
25,0%
18,8%
Gesamt
32
100,0%
0
1
2
-: Häufigkeitsverteilung der Immunreaktivität von KAI1, nm23-H1, cCasp3, cCasp6 absolut und in
Prozentzahlen ausgedrückt.
Für die Untersuchung der cCasp 3 standen vier und für cCasp 6 zwei Präparate nicht mehr zur Verfügung.
Ergebnisse
37
Abb. 3.6: Immunreaktion von Tumorzellen mit anti-KAI1 Antikörper.
Die Immunreaktion findet sich vorwiegend zytoplasmatisch und ist nicht streng abgrenzbar. A) schwache
Immunreaktion B) moderate Immunreaktion C) starke Immunreaktion
Vergr.: 1-3) 100-fach
A
B
C
Abb. 3.7: Darstellung der Immunreaktivität von Tumorzellen mit anti-nm23-H1 Antikörper
Die Reaktionsstärken sind unterschiedlich bei vorwiegend zytoplasmatischer Lokalisation. A) schwache
Immunreaktion B) moderate Immunreaktion C) starke Immunreaktion
Vergr.: A) 100-fach, B) 200-fach, C) 100-fach
Ergebnisse
38
A
B
Abb. 3.8.: Darstellung der Immunreaktivität von Tumorzellen mit anti-cCasp3-Antikörper.
cCasp3-positive Zellen im SCC; A) und B) pos. Zellen mit Charakteristika der Apoptose, wie
Apoptosekörperchen, Chromatinkondensation und Zellschrumpfung (dicke Pfeile), aber auch nicht-reaktive
Zellen mit Anzeichen der Apoptose (gestrichelte Pfeile) B) reaktive Zellen mit z.T. apoptotischen Körperchen,
dicke Pfeile; teils keine Reaktion an Zellen mit apoptotischer Morphologie, gestrichelter Pfeil
Vergr.: A) 200-fach B) 100-fach
A
B
C
Abb. 3.9.: Reaktionsstärken im Tumorgewebe mit anti-cCaps6 Antikörpern, A) schwach B) moderat C) stark;
deutlich kommt die teils nukeäre, teils zytoplasmatische Reaktion in den Zellen hervor; Abb. C) basaloide
Teilkomponente eines Plattenepithelzellkarzinoms
Vergr.: A-C) 100-fach
Ergebnisse
39
Abb. 3.10.: HE-Färbung von Nekrosezonen im Karzinom.
Nicht-nekrotischer Bereich (vierzackiger Stern) ist durch Linien vom nekrotischen Bereich abgegrenzt; B)
Ausschnitt von A), bei dem der Unterschied zwischen Nekrose und Tumor hervor tritt; C) zeigt im
Übergangsbereich (gestrichelte Linie) zur Nekrosezone (fünfzackiger Stern) mehrere Zellen mit
Apoptosemorphologie
(Eosinophilie,
kompaktes
Chromatin,
apoptotische
Körperchen);
D)
Ausschnittsvergrößerung von C); fünfzackiger Stern: Nekrose, vierzackiger Stern: Karzinom, Pfeile:
apoptotische Zellen
Vergr.:A) 25-fach B) 100-fach C) 200-fach D) 1000-fach
3.3 Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion
Die TUNEL-Reaktion wurde verwendet, einerseits zur Festzustellung der Lokalisation
apoptotischer Zellen, andererseits um nachzuweisen, ob eine Kolokalisation der cCaspasen,
als Apoptosenachweis, mit TUNEL-pos. Zellen besteht. Um interpretierbare
Versuchsergebnisse zu erhalten, wurden sowohl Positiv-, wie auch Negativkontrollen
mitgeführt. In den Positivkontrollen wurden sämtliche Zellkerne angefärbt. Bei den
Negativkontrollen, als Nachweis möglicher unspezifischer Bindungen (z.B. des StrepavidinAK) blieb eine Färbung der Schnitte aus.
3.3.1
Apoptosenachweis an Paraffingewebeschnitten
Im Folgenden sind beispielhaft mit der TUNEL-Methode untersuchte Tumoren dargestellt
(Abb. 3.11 A-G). Die Tumoren zeigten meist nur eine Reaktion einzelner SCC-Zellen auf
(A). Es wurden vermehrt TUNEL-pos. Zellen in Arealen von zentralen Tumornekrosen
(Übergangsbereich Tumor/Nekrose) gefunden (E, F, G). In Karzinomen mit
Verhornungsgebieten waren im Vergleich zum umgebenden Tumor vermehrt TUNELpositive Zellen nachweisbar (C, D).
Ergebnisse
40
Abb. 3.11.1: Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion. A) pos. Zellen im Karzinom; B) pos.
Zellen (Pfeilköpfe) in der Nekrosezone (Stern) sowie im nicht-nekrotischen Tumor (Pfeile); C-D) TUNELpositive Zellen in der Verhornungszone des Tumors.
Vergr.: A) 200-fach B) 100-fach C) 25-fach D) 200-fach
Ergebnisse
41
Abb. 3.11.2.: Nachweis apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Reaktion. E-G) immunositive Zellen (Pfeilköpfe)
in Tumoren mit Nekrosezone (Sterne)
Vergr.: E-F)100-fach G) 25-fach
Ergebnisse
3.3.2
42
Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 3 mit der TUNELMethode
Die Gegenüberstellung von TUNEL- und Effektorcaspase 3-Immunreaktion zeigt eine
ähnliche Kolokalisation positiver Zellen im Tumor auf (Abb. 3.12.1). Vermehrt stellten sich
auf beide Reaktionen pos. Zellen im Übergang zur Tumornekrosezone dar. Der übrige Tumor
zeigte nur vereinzelt pos.Reaktionen auf.
Abb. 3.12.1.: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit cCaspase-3-Immunreaktivität.
A) TUNEL pos. Tumorzelle; B-C) cCasp3 positive Zellen, teilweise mit Apoptosemorphologie D-E) Vergleich
TUNEL(D) mit cCaspase 3 pos. Zellen in Nekrose-/Apoptosezone (Pfeile zeigen pos. Tumorzellen an)
Vergr.: A-C) 400-fach; D-E) 100-fach
Ergebnisse
3.3.3
43
Korrelation der Immunreaktivität für die Effektorcaspase 6 mit der TUNELMethode
Die Gegenüberstellung von TUNEL- und Effektorcaspase 6-Immunreaktion zeigte im Tumor
eine ähnliche Kolokalisation wie bei Effektorcaspase 3 beschrieben auf (Abb. 3.12.2).
Abb. 3.12.2.: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit Caspase-6-Immunreaktivität.
F) pos. TUNEL-Reaktion (Pfeile), Nekrosezone (Stern), Inset: pos. Tunel Reaktion einer Zelle in Nekrosezone
G) cCasp-6 Reaktion in Übergangszone zw. SCC und Nekrose in morphologisch ähnlichem Gebiet H-I)
Abbildung ähnlicher Areale mit Darstellung von immunpositiven Zellen (Pfeile) ähnlicher Areale (H-TUNEL, IcCasp6), (Sterne-Nekrosezonen)
Vergr.: F-G) 100-fach; H) 200-fach; I) 100-fach
Ergebnisse
3.3.4
44
Korrelation der Immunreaktivität für die KAI1 mit der TUNEL-Methode
Eine Immunreaktion des Protein KAI1 war vermehrt in den Nekroseübergangszonen des
Tumors auffindbar. Die Stärke der KAI1-Immunreaktivität nimmt von der Außenzone zum
Nekroseareal hin zu.
Abb. 3.13: Ko-Lokalisation von apoptotischen Zellen (TUNEL) mit KAI1-Immunreaktivität.
A-C) verschiedene TUNEL-pos. Zellen in morphologisch ähnlichen Bereichen, welche z.T. verstärkt
Immunreaktion im Übergangsbereich zur Nekrose zeigen D-E) starke Immunreaktion mit dem KAI1-Antikörper
im Übergangsbereich Tumor/Nekrose.
Vergr.:A-E) 100-fach
3.4 Korrelation
der
klinikopathologischen
Befunde
mit
den
immunhistochemischen Befunden
Die Tabelle 3.4 zeigt die histopathologischen Befunde und den Lymphknotenstatus,
Fernmetastasierung sowie den klinischen Verlauf aller untersuchten PSCC in willkürlich
gewählter Reihenfolge in Korrelation mit Expressionsstärke von KAI1, nm23-H1, cCasp3
und cCasp6.
Ergebnisse
45
Tabelle 3.4: Übersicht klinikopathologischer Befunde
Nr. Alter
T
N M G St KAI NM C3
1
58
T1
N1 M1 G2 4
2
2
0
2
44
T1
N0 M0 G2 1
3
3
1
3
77
T2
N1 M0 G2 2
1
1
1
4
69
T1
N3 M0 G2 4
2
2
1
5
40
T1
N3 M1 G3 4
1
2
1
6
66
T3
N2 M0 G2 3
3
2
0
7
60
T3
N3 M1 G2 4
2
2
0
8
63
T2
N1 M1 G2 4
2
2
0
9
89
T3
N2 M1 G2 4
1
2
0
10 68
T3
N0 M0 G1 3
3
3
0
11 78
T4
N2 Mx G2 x
2
2
x
12 51 T0/PIN N0 M0 G0 0
3
3
2
13 88
T3
N2 Mx G1 x
2
2
0
14 78
T2
N0 M0 G2 2
3
3
1
15 56 T0/PIN N0 M0 G0 0
3
2
0
16 78
T2
N2 M1 G2 4
2
1
0
17 35
T1
N0 M0 G0 1
3
3
1
18 55 T0/PIN N0 M0 G0 0
3
3
0
19 68
T2
N0 M0 G2 2
3
3
1
20 62
T1
N2 M0 G2 3
3
2
1
21 76
T1
N1 M0 G2 2
3
3
1
22 87
T3
N2 Mx G3 x
2
2
1
23 67
T1
N0 M0 G2 1
3
3
1
24 87
T3
N0 Mx G2 x
3
3
1
25 58
T2
N3 M0 G2 4
2
2
1
26 59
T1
N0 M0 G1 1
3
3
0
27 59
T1
N0 M0 G2 1
3
2
x
28 69
T1
N0 M0 G2 1
3
2
1
29 55
T2
N1 M0 G2 2
3
2
1
30 61 T0/PIN N0 M0 G0 0
3
3
x
31 66
T2
N0 Mx G1 x
3
3
x
32 56
T1
N1 Mx G2 x
2
2
0
33 59
T1
N0 M0 G3 2
3
3
1
34 76
T3
N0 M0 G2 3
3
3
0
C6
1
3
3
3
3
1
0
0
0
0
x
2
2
2
x
3
2
0
0
1
1
1
1
0
0
2
2
1
0
2
3
0
2
1
Krankheitsverlauf
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
lebend mit Tumor
lebend mit Tumor
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
Tod andere Ursache
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
Tod, andere Ursache
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
lebend, krankheitsfrei
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
lebend, krankheitsfrei
Tod, andere Ursache
lebend, krankheitsfrei
lebend, krankheitsfrei
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
Tod durchTumor
lebend, krankheitsfrei
lebend, krankheitsfrei
Tod durch Tumor
Tod, andere Ursache
lebend, krankheitsfrei
ÜZ
23
36
96
36
8
78
6
101
2
60
12
73
31
33
1
10
47
123
105
47
83
43
76
16
122
73
63
17
29
40
125
13
30
28
-: Abk.: Nr.-Nummer, T-Tumorstadium, N-Nodalstatus, M-Metastasen, G-Grade, St-Stage, KAI/ NM-nm23 / CcCaspase-3/ C-cCaspase-6-Immunreaktivität, ÜZ-Überlebenszeit in Monaten , PIN-penile intraepitheliale
Neoplasie, x-nicht beurteilbar bzw. fehlen
3.5 Korrelation der KAI1-Expression mit klinikopathologischen Faktoren
In der Tabelle 3.5 sind die statistischen Beziehungen KAI1-Expression mit dem Alter, der
Tumorausdehnung, dem LK-Status, der Fernmetatstasierung, der Tumordifferenzierung, dem
WHO-Tumorstadium und der EAU-Risikoeinteilung dargestelllt. Die Prüfung der
Signifikanzen wurde mit dem exakten Fisher Test durchgeführt. Der Vergleich von Alter und
Ergebnisse
46
T-Stadium stellt sich als statistisch nicht signifikant dar (p≥0,05). Dagegen ist eine
Gegenüberstellung der KAI1-Expression mit N-Stadium (graphisch dargestellt in Abb. 3.14),
M-Stadium, der Differenzierung und dem WHO-Stadium statistisch signifikant (p <0,05). Für
die Immunreaktivität des KAI1-Antikörpers, dem Alter der Patienten, der Tumoreindringtiefe
(T-Stadium) sowie dem EAU-Risiko wurde keine statistische Signifikanz festgestellt.
Immunreaktivität KAI1 in
Prozent
100%
80%
---95% CI
60%
40%
20%
0%
0
1
Lymphknotenbefall
Abb. 3.14. Graphische Darstellung der signifikanten Beziehung der KAI1 Immunreaktivität und des LK-Befallls.
Zusammenhang von LK-Befall (0-nein, 1-ja) und der Abbnahme der Immunreaktivität von KAI1 auf, 4 PIN
nicht aufgenommen; Mittelwertvergleich (T-Test): N0=71% gegen N1=34% Immunreaktivität der Tumorzellen
(p<0,001). Ein Pkt. entspricht z.T. mehreren Fällen; 95% CI-Konfidenzintervall.
Ergebnisse
47
Tabelle 3.5: Korrelation der KAI1 Immunreaktivität mit klinikopathologischen Parametern
kliniko-pathologische
Parameter
Alter in Jahren
Tumor
Lymphknotenstatus,
N
Fernmetastasen,
M
Differenzierungsgrad
Stadium
EAURisiko
№.₧.
Anzahl
Level der KAI1 Expression
0
Anzahl
1
Anzahl
2
Anzahl
≤ 60 Jahre
14
1
4
9
>60 Jahre
20
2
6
12
Gesamt
34
3
10
21
0
4
0
0
4
1
13
1
3
9
2
8
1
3
4
3
8
1
3
4
4
1
0
1
0
Gesamt
34
3
10
21
0
13
0
0
13
1
6
1
3
2
2
7
1
4
2
3
4
1
3
0
Gesamt
30
3
10
17
0
18
1
2
15
1
6
2
4
0
Mx
6
0
4
2
Gesamt
30
3
10
17
0
5
0
0
5
1
4
0
1
3
2
21
1
7
13
3
4
2
2
0
Gesamt
34
3
10
21
0
4
0
0
4
1
6
0
0
6
2
6
1
0
5
3
4
0
0
4
4
nicht
beurteilbar
Gesamt
8
2
6
0
6
0
4
2
34
3
10
21
gering
6
0
0
6
mittel
9
0
2
7
hoch
19
3
8
8
Gesamt
34
3
10
21
p-Wert
1,00
0,614
<0,001
<0,001
0,035
<0,001
0,108
-: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistisch signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an;
sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen
Ergebnisse
48
3.6 Korrelation der nm23-H1 Expression mit klinikopathologischen
Parametern
Die Tabelle 3.6 stellt den Zusammenhang zwischen der Immunreaktivität für nm23-H1 mit
den klinikopathologischen Parametern mit dem exakten Fisher Test dar. Der Vergleich von
Alter, T-Stadium, Grade, Stage, M-Stadium und EAU-Risiko mit der Immunreaktivität war
dabei statistisch nicht signifikant (p>0,05).
Dagegen korrelierte das N-Stadium hochsignifikant (p<0,001) mit der nm23-H1
Immunreaktivität (Tab.3.7, Abb.3.15).
Immunreaktivität nm23 in
Prozent
100%
80%
60%
--- 95% CI
40%
20%
0%
0
1
Lymphknotenbefall
Abb. 3.15.: Das Streudiagramm zeigt graphisch den signifikanten Unterschied der nm23-H1 Immunreaktivität
und des LK-Befalls auf. Zusammenhang von LK-Befall (0-nein, 1-ja) und der Abnahme der Immunreaktivität
von nm23, 4 PIN nicht eingeschlossen. Mittelwertvergleich (T-Test): N0=64% gegen N1=31% Immunreaktivität
der Tumorzellen (p<0,001). Ein Pkt. entspricht z.T. mehreren Fällen; 95% CI-Konfidenzintervall.
Ergebnisse
49
Tabelle 3.6: Korrelation der nm23-H1 Immunreaktivität mit klinikopathologischen
Parametern
kliniko-pathologische
Parameter
Alter in Jahren
Tumor
Lymphknotenstatus,
N
Fernmetastasen,
M
Differenzierungsgrad
Stadium
EAU-Risiko
№.₧.
Anzahl
Level der nm23 Expression
0
Anzahl
1
Anzahl
2
Anzahl
≤ 60 Jahre
14
0
8
6
>60 Jahre
20
2
9
9
Gesamt
34
2
17
15
0
4
0
1
3
1
13
0
7
6
2
8
2
3
3
3
8
0
5
3
4
1
0
1
0
Gesamt
34
2
17
15
0
13
0
2
11
1
6
1
4
1
2
7
1
6
0
3
4
0
4
0
Gesamt
30
2
16
12
0
18
1
7
10
1
6
1
5
0
Mx
6
0
4
2
Gesamt
30
2
16
12
0
5
0
1
4
1
4
0
1
3
2
21
1
12
8
3
4
1
3
0
Gesamt
34
2
17
15
0
4
0
1
3
1
6
0
2
4
2
6
1
1
4
3
4
0
2
2
4
8
1
7
0
nicht beurteilbar
6
0
4
2
Gesamt
34
2
17
15
gering
6
0
1
5
mittel
9
0
5
4
hoch
19
2
11
6
Gesamt
34
2
17
15
p-Wert
0,551
0,447
<0,001
0,093
0,136
0,054
0,228
-: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an;
sämtliche PIN(n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen.
Ergebnisse
50
3.7 Statistischer Vergleich der Immunreaktion für KAI1 und nm23-H1
mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen
Die Immunreaktivität für KAI1 und nm23-H1 ist zwischen den Gruppen mit und ohne LKBefall unterschiedlich. Der Mittelwertunterschied der Proteinexpression mit dem LK-Befall
ist hochsignifikant (p<0,001)(Abb. 3.16).
mittlere Immunreaktivität in
Prozent
80%
KAI1
nm23
60%
40%
20%
0%
negativ
positiv
Lymphknotenbefall
Abb. 3.16.: Vergleich der mittleren Immunreaktivität der Antikörper gegen KAI1 und nm23-H1 mit dem
Lymphknotenbefall (Werte: siehe Abb. 3.14, 3.15)
3.8 Koexpression von nm23 und KAI1
Die Beziehung zwischen der nm23-H1 und KAI1-Immunreaktivität wird in Tabelle 3.7
veranschaulicht. Der statistische Zusammenhang zwischen beiden Größen ist hochsignifikant
(p<0,001). Die Korrelationanalyse ist stark positiv (Kendall-Tau-c: τ=0,720) und beschreibt
eine starke Koexpression beider Proteine im Tumor.
Tabelle 3.7: Koexpression von nm23 und KAI1
KAI1
nm23
≤50%
≤50%
13 (100%)
>50%
5 (23,8%)
>50%
0 (0%)
16 (76,2%)
F
p
19,860
<0,001
-: KAI1/ nm23-H1 Immunreaktivität schwach oder stark (≤50%/ >50%); dargestellt sind Absolutwerte sowie
Prozentwerte, F-Fisher-Exact-Test: Wert, p-Wahrscheinlichkeit
Ergebnisse
51
3.9 Korrelation der Effektorcaspase-3-Immunreaktion mit
klinikopathologischen Parametern
Tabelle 3.8
Level der Caspase 3
Expression
№.₧.
Anzahl
fehlende
Fälle
Anzahl
≤ 60 Jahre
14
1
6
6
1
>60 Jahre
20
3
7
10
0
Gesamt
34
4
13
16
1
0
4
1
2
0
1
1
13
1
3
9
0
2
8
1
2
5
0
3
8
0
6
2
0
4
1
1
0
0
0
Gesamt
34
4
13
16
1
0
13
2
3
8
0
1
6
0
3
3
0
2
7
1
4
2
0
3
4
0
1
3
0
Gesamt
30
3
11
16
0
0
18
1
4
13
0
1
6
0
5
1
0
Mx
6
2
2
2
0
Gesamt
30
3
11
16
0
0
5
1
2
1
1
1
4
1
3
0
0
Differenzierungsgrad 2
21
2
8
11
0
3
4
0
0
4
0
Gesamt
34
4
13
16
1
0
4
1
2
0
1
1
6
1
1
4
0
2
6
0
0
6
0
3
4
0
3
1
0
4
8
0
5
3
0
nicht beurteilbar
6
2
2
2
0
Gesamt
34
4
13
16
1
gering
6
1
3
1
1
mittel
9
1
2
6
0
hoch
19
2
8
9
0
Gesamt
34
4
13
15
2
kliniko-pathologische
Parameter
Alter in Jahren
Tumor
Lymphknotenstatus
N
Fernmetastasen
M
Stadium
EAURisiko
0
Anzahl
1
Anzahl
2
Anzahl
p-Wert
,575
,020
,427
,034
,023
,024
,145
-: Das Signifikanzniveau p<0,05 zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an;
sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung vom N-, M-Stadium nicht einbezogen; fehlende Fälle: waren
bei der Auswertung nicht verfügbar.
Ergebnisse
52
3.10 Korrelation der Effektorcaspase-6-Immunreaktion mit
klinikopathologischen Parametern
Tabelle 3.9
kliniko-pathologische
Parameter
№.₧.
Anzahl
fehlende
Fälle
Anzahl
≤60
14
>60
Alter in
Jahren
Tumor
N
M
Grade
Stadium
EAURisiko
Level der Caspase 6 Expression
0
Anzahl
1
Anzahl
2
Anzahl
3
Anzahl
1
5
1
5
2
20
1
5
7
3
4
Gesamt
34
2
10
8
8
6
0
4
1
1
0
2
0
1
13
0
1
5
4
3
2
8
0
4
0
1
3
3
8
0
4
3
1
0
4
1
1
0
0
0
0
Gesamt
34
2
10
8
8
6
0
13
0
3
3
5
2
1
6
0
3
2
0
1
2
7
1
1
3
1
1
3
4
0
2
0
0
2
Gesamt
30
1
9
8
6
6
0
18
0
4
6
5
3
1
6
0
3
1
0
2
Mx
6
1
2
1
1
1
Gesamt
30
1
9
8
6
6
0
5
1
1
0
3
0
1
4
0
1
0
2
1
2
21
1
8
7
3
2
3
4
0
0
1
0
3
Gesamt
34
2
10
8
8
6
0
4
1
1
0
2
0
1
6
0
0
2
3
1
2
6
0
2
1
2
1
3
4
0
1
3
0
0
4
8
0
4
1
0
3
nicht beurteilbar
6
1
2
1
1
1
Gesamt
34
2
10
8
8
6
gering
6
1
1
0
4
0
mittel
9
0
1
5
2
1
hoch
19
1
8
3
2
5
Gesamt
34
2
10
8
8
6
p-Wert
,20
,052
,231
,733
,015
,287
,016
-: Signifikanzniveau: p<0,05, zeigt den statistischen signifikanten Unterschied von der Nullhypothese an;
sämtliche PIN (n=4) wurden bei der Berechnung von N-, M-Stadium nicht einbezogen; fehlende Fälle: waren bei
der Auswertung nicht verfügbar.
Ergebnisse
53
Die Tabellen 3.8-3.9 stellen den Zusammenhang zwischen der Immunreaktion für die cCaspasen 3 und 6 und den histo-/klinikopathologischenen Befunden dar. Die Prüfung der
Signifikanzen wurde mit dem exakten Fisher Test durchgeführt.
Der Vergleich von T-Stadium, M-Stadium, Grad und Stage mit der Immunreaktion von cCaspase 3 ist statistisch signifikant (p<0,05).
Dagegen
ist
Zusammenhang
der
c-Caspase
6
Immunreaktion
nur
mit
dem
Differenzierungsgrad und dem EAU-Risiko statistisch signifikant (p<0,05). Eine tendenzielle
Beziehung zum T-Stadium lässt sich mit der c-Caspase 6 Immunreaktion erkennen (p=0,052).
3.11 Statistischer Vergleich der Immunreaktion für Effektorcaspase 3 und
6 mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen
Die Abb.3.16 gibt graphisch die mittleren Immunreaktivitätsscores der cCasp3 und 6 in
Bezug auf den Lymphknotenstatus wieder. Die Werte sind annähernd gleich verteilt, sodass
kein Unterschied zwischen den Gruppen mit und ohne LK-Befall in Bezug auf die
Immunreaktion beider Antikörper besteht (p>0,05).
mittlerer Score
1,5
C3
C6
1
0,5
0
negativ
positiv
Lymphknotenbefall
Abb.3.16.: mittlere Immunreaktivität der cCasp3 und 6 bei LK-Befall neg./pos. (N0/N1); mittlerer Score
(Immunreaktivitätsgruppe): gebildet aus Reaktivitätsgruppen 0-3 (siehe 2.2.3.2), 4 PIN nicht aufgenommen;
Mittelwertvergleich (T-Test): cCaspase 3: mittlerer Immunreaktivitätsscore N0=0,73 gegen N1=0,56, p=0,467;
c-Caspase 6: mittlerer Immunreaktivitätsscore N0=1,25 gegen N1=1,13, p=0,77
Ergebnisse
54
3.12 Prädiktive Faktoren für die Metastasierung
In der univariaten Analyse mit dem exakten Fisher Test stellten sich die Faktoren
Differenzierung, Risikoeinteilung nach EAU (2004), Reaktivität für KAI1 und nm23-H1 als
statistisch signifikante Parameter (p<0,05) für eine nodale Metastasierung heraus. Das
Tumorstadium ergibt keine statistische Signifikanz (p>0,05).
Die Korrelationsanalyse mit dem Kendall-Tau Test (τ) zeigte eine mittelstarke positive
Korrelation (Korrelationskoeffizient: r>0,5) für die Differenzierung mit dem N-Status. Für die
Faktoren nm23-H1 und KAI1 bestehen starke negative Korrelationen (r>-0,7) mit der
Metastasierung.
In der multivariaten Analyse (logistische Regression) zeigte sich nur das Protein nm23-H1 als
prognostisch unabhängige Variable (p<0,05) für die Vorhersage von Metastasen in Bezug auf
T-Stadium/ Differenzierungsgrad/ EAU-Risiko bzw. auf die Expression von KAI1.
Die Effektorcaspasen wurden in die multivariate Analyse nicht mit einbezogen, da bereits bei
der Prüfung mit dem Fisher-Exakt-Test keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf den
Metastasenstatus vorlagen.
Das Streudiagramm in Abb. 3.17 stellt den Zusammenhang der Stärke der Immunreaktivität
von KAI1 bzw. nm23-H1 mit dem Lymphknotenbefall dar. Deutlich wird in dieser Abbildung
eine tendenzielle Zunahme der Metastasierung bei Abnahme der Immunreaktivität beider
Antikörper. Die Koexpression beider Proteine in Bezug auf den LK-Status ist in der
multivariaten Analyse statistisch jedoch nicht signifikant (siehe Tab.3.10. KAI1/ nm23-H1
[III]).
Ergebnisse
55
Tabelle 3.10: Analyse prädiktiver Faktoren für die Metatstasierung
Gesamt
n
T
Grade
Risiko
nach
EAU
KAI1
nm23H1
Prädiktive Faktoren für Metastasierung
Patn. mit
Fisher
Metastasen
τ
p-Wert
n (%)
0
4
0 (,0%)
1
13
6 (46,2%)
2
8
5 (62,5%)
3
8
5 (62,5%)
4
1
1 (100,0%)
0
5
0 (,0%)
1
4
1 (25,0%)
2
21
12 (57,1%)
3
4
4 (100,0%)
1
6
0 (0%)
2
9
4 (44,4%)
3
19
13 (68,4%)
0
3
3 (100,0%)
1
10
10 (100,0%)
2
21
4 (19,0%)
0
2
2 (100,0%)
1
17
14 (82,4%)
2
15
1 (6,7%)
0,201
Wert:5,754
0,009
Wert:9,932
0,012
Wert:8,742
<0,001
Wert:21,925
<0,001
Wert:21,070
Multivariat
p-Wert
I
II
III
0,037
r=0,398
,827
1,0
0,002
r=0,554
,346
,997
0,006
r=0,495
,697
,938
<0,001
r=-0,765
<0,001
r=-0,785
,997 ,998
,004
,045
-: Zusammenhänge zwischen Metastasierung (nodal) und der Tumoreindringtiefe (T), der Differenzierung
(Grade), und der Antikörperreaktion für KAI1 und nm23
Die Auswertung auf Signifikanz wurde mit dem Fisher-Exakt Test, die Korrelationanalyse mit Kendall-Tau-c
und die multivariate Analyse der Faktoren T-Stadium, Grade, EAU-Risikoeinteilung und nm23(I), KAI1(II)
bzw. KAI1/ nm23 (III) mit der binär logistischen Regression durchgeführt.
Ergebnisse
56
100%
KAI1 in Prozent
80%
60%
---95% CI
40%
Lymphknotenbefall
20%
negativ
positiv
0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
nm23 in Prozent
Abb. 3.17.: Darstellung der Abhängigkeit des LK-Befall mit der Immunreaktivität der Antikörper gegen KAI1
(Ordinate) und nm23-H1 (Abszisse). Fünfeck: kein LK-Befall; Stern: LK-Befall
nur Tumoren mit Invasionsverhalten wurden berücksichtigt, PIN (n=4) wurden ausgeschlossen
3.13 Risikoeinteilung für Lymphknotenmetastasen
Die Tabellen 3.11-12 zeigen in Anlehnung an die Einteilungen nach Solsona und EAU
Risikoabschätzungen für das Vorhandensein von positiven Lymphknoten in je drei Gruppen
mit den Überlebenswahrscheinlichkeiten dieser Gruppen. In den Tabellen wurden lediglich 29
Patienten in die Risikoeinteilung aufgenommen, da die ausgeschlossenen Patienten (n=5)
nicht krankheitsspezifisch verstorben sind. Nach der Solsona-Einteilung besteht eine
statistische Signifikanz weder für den LK-Befall (p ≥0,05) noch für einen postoperativen
Überlebensvorteil niedriger gegen höhere Risikogruppen (log rank ≥0,05).
Für die Einteilung nach EAU hingegen besteht ein signifikanter Unterschied der
Risikogruppen und dem LK-Befall, sodass eine niedrige Risikogruppe mit einer geringen
Metastasierungsneigung korreliert. Nicht signifikant ist der Zusammenhang dieser
Risikoeinteilung mit dem Überleben (log rank ≥0,05).
Ergebnisse
57
3.13.1 Risikoeinteilung nach Solsona für LK-Befall mit Überlebensstatistik
Tabelle 3.11
Risikogruppe
Gruppenbeschreibung
LK pos./
Gesamtzahl
der
Tumoren
1-niedriges Risiko
≤ T1G1
1/7
2-mittleres Risiko
T1G2-3 & T2G1
9/15
3-hohes Risiko
T2G2-3 & > T3
5/7
p-Wert
für
LK-Befall
n
(%)
Log rank
für
Überleben
6(85,71)
0,101
(Wert:5,182)
9(60,0)
0,586
(Wert:1,653)
4(57,14)
-: verändert nach Solsona (2001)
LK pos./Tumoren: positiver LK-Nachweis auf Gesamtanzahl der Tumoren in jeweiliger Risikogruppe; Fisherexakter Fisher Test; n-Anzahl und Prozentzahlen überlebender Patienten der jeweiligen Gruppe; die
Überlebensanalyse wurde nach Kaplan-Meier berechnet (log rank).
3.13.2 Risikoeinteilung nach EAU für LK-Befall mit Überlebensstatistik
Tabelle 3.12
Risikogruppe
Gruppenbeschreibung
LK pos./
Gesamtzahl
der
Tumoren
1-niedriges Risiko
< T1G2
0/6
2-mittleres Risiko
T1G2
4/9
> T1G2
13/19
3-hohes Risiko
p-Wert
für
LK-Befall
n
(%)
Log rank
für
Überleben
6(100)
0,012
(Wert:8,742)
4(50,0)
0,23
(Wert:2,93)
9(60)
-: verändert nach EAU (2004)
LK pos./Tumoren: positiver LK-Nachweis auf Gesamtanzahl der Tumoren in der jeweiligen Risikogruppe;
Fisher-exakter Fisher Test; n-Anzahl und Prozentzahlen überlebender Patienten der jeweiligen Gruppe; die
Überlebensanalyse wurde nach Kaplan-Meier berechnet (log rank).
3.14 Prognose
Im Verlauf des Beobachtungszeitraumes mit einer mittleren Beobachtungszeit von 49,59
Monaten (Spannweite: 1 bis 125 Monate) verstarben 15 (44,1%) Patienten, hiervon 5 (14,7%)
nicht tumorbedingt. Bei 2 (5,9%) von 19 (55,9%) der überlebenden Patienten wurde zum
Ende der Beobachtungszeit ein Fortschreiten der Tumorerkrankung festgestellt.
Ergebnisse
58
3.14.1 Nodalstatus und Prognose
Die mittlere Überlebenszeit und die 5-Jahres-Überlebensrate zeigen eine deutliche
Abhängigkeit vom Nodalstatus.
Die Ergebnisse des Nodalstatus in Bezug auf das Überleben zeigten nicht nur die
prognostische Bedeutung der Metastasierung (ja/nein) als Marker eines besseren Outcomes
auf, sondern auch eine bessere Prognose bei Patienten mit bis zu einem pos. Lymphknoten
(≤N1)(log rank<0,05). Der Vergleich zwischen N1 und N2 zeigte tendenziell, dass Patienten
mit geringerer lymphatischer Absiedelung bessere Prognosen haben, jedoch fehlte die
statistische Signifikanz (log rank: p=0,52).
Die Überprüfung auf Unterschiede des mittleren Beobachtungszeitraumes mittels T-Test aller
Gruppen ergab keine statistische Signifikanz (p≥0,05), so dass von einer gleichmäßigen
Verteilung für die Nachbeobachtungszeiten ausgegangen werden kann. Dies zeigt, dass eine
Selektion
bestimmter
Gruppenhäufigkeiten
durch
kürzere
oder
längere
Beobachtungsintervalle nicht statt fand.
Tabelle 3.13: Prognostische Bedeutung der Anzahl des LK-Befalls bei der Prognose
NN+
N0/1
≥N2
N-Status
N1
≥N2
Anzahl
n
14
15
20
9
6
9
BZR
Mittelwert
61,93
48,8
60,6
43,0
57,5
43,0
T
p-Wert
n.s.
0,355
n.s.
0,248
n.s.
0,484
5-JÜR
92,31%
39,11%
78,78%
30,86%
50,0%
30,86%
Log rank
0,0067
0,0171
0,54
-: Patienten, welche nicht krankheitsbedingt verstarben sind für die Berechnung ausgeschlossen worden
(eingeschlossen n=29).
n: Anzahl von Patienten in der jeweiligen Gruppe, BZR Mittelwert: mittlerer Beobachtungszeitraum in Monaten,
T: T-Test zum Vergleich der Mittelwerte der BZR mit zugehöriger Signifikanz, n.s.: nicht signifikant, 5-JÜR: 5Jahres-Überlebensrate (60-Monate) in Prozent, log rank: zeigt Signifikanz des Kapal-Meier-Testes; N-/N0_kein
LK-Befall; N+/≥N1/N2_pos. LK-Befall/einer/ mehr als ein LK befallen.
3.14.1.1 Korrelation von Nodalstatus und Überlebenszeit
Die beiden Überlebenskurven berechnet nach Kaplan-Meier
zeigen,
dass
Überlebenswahrscheinlichkeit signifikant vom Nodal-Status abhängt (log rank: 0,0067).
die
Ergebnisse
59
100%
Überleben in Prozent
90%
80%
Lymphknotenbefall
70%
60%
nein
nein-zensiert
ja
ja-zensiert
50%
40%
30%
0
25
50
75
100
125
Beobachtungszeitraum in Monaten
Abb. 3.18.: In die Berechnung wurden nur Patienten einbezogen die krankheitspezifisch verstarben und jene, die
mit/ohne Krankheit den Beobachtungszeitraum überlebten (n=29).
Lymphknotenbefall-zensiert: Ende des Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich
zwischen 30-100% wieder.
3.14.2 Korrelation der KAI1 Expression mit der Überlebenszeit
Die Überlebenskurven berechnet nach Kaplan-Meier, geben die unterschiedlichen
Überlebenszeitverteilungen bei verschieden starker Immunreaktivität des KAI1-AK im
Tumorgewebe wieder. Die differenten Kurvenverläufe zeigen einen Überlebensvorteil für die
Gruppe mit Immunreaktivität >50% (log rank: p=0,007). Die 3-JÜR betrug für die Gruppe
mit starker Expression 87,8%, gegen nur 45,5% der anderen Gruppen.
100%
Überleben in Prozent
90%
80%
KAI1
70%
<50%
>50%
60%
<50%-zensiert
>50%-zensiert
50%
40%
30%
0
25
50
75
100
125
Beobachtungszeitraum in Monaten
Abb. 3.19.: In die Berechnung wurden nur Patienten. einbezogen die krankheitspezifisch verstarben und jene, die
mit/ohne Krankheit den Beobachtungszeitraum überlebten (n=29).
KAI1: <50/ >50% (geringe/ starke) Immunreaktivität von KAI1-AK; (<50%)-(>50%)- zensiert: kennzeichnet
das Ende des Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich zwischen 30-100%
wieder.
Ergebnisse
60
3.14.3 Korrelation der nm23 Expression mit der Überlebenszeit
Die graphische Darstellung der Überlebenszeitanalyse nach Kaplan-Meier zeigt eine deutliche
Beziehung zwischen höherer Immunreaktivität und dem Überleben der Gruppe >50%. Die 3JÜR betrug für die Gruppe mit starker Expression 100%, wohingegen nur 50% der Patienten
der übrigen Gruppen den Zeitraum überlebten. Deutlich wird die bessere Prognose für die
Gruppe mit starker Reaktivität (log rank: p=0,0013).
100%
Überleben in Prozent
90%
nm23
80%
<50%
>50%
70%
<50%-zensiert
>50%-zensiert
60%
50%
40%
30%
0
25
50
75
100
125
Beobachtungszeitraum in Monaten
Abb. 3.20.: In die Berechnung wurden nur Patienten. Einbezogen, die krankheitspezifisch verstarben und jene,
die mit/ohne Krankheit im Beobachtungszeitraum überlebten (n=29).
nm23: 1-3 (geringe-starke) Immunreaktivität von nm23-AK; (+0)-(+2)- zensiert: Ende des
Beobachtungszeitraumes des jeweiligen Falles; Ordinate gibt den Bereich zwischen 30-100% wieder.
3.14.4 Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Expression beider Proteine im Tumor
Die Überlebenszeiten bei Gruppen deren Tumoren eine stark positive Reaktivität (>50%) auf
beide Antikörper (N+K+) zeigten, waren signifikant höher als die der Patienten mit Tumoren
der anderen Gruppen (N-K+/ N+K-/ N-K-) (log rank: p=0,0079). Ein signifikanter
Unterschied der Überlebenszeiten der drei anderen Gruppen untereinander bestand nicht (log
rank: p= 0,3974).
Tabelle 3.15: Mittlere Überlebenszeiten bei unterschiedlicher Proteinexpression
N+K+
104
Mittleres Überleben in Monaten
N+KN-K+
50
N-K47
-: zeigt das mittlere Überleben in Monaten der Gruppen mit unterschiedlich starker Reaktivität der Antikörper
(AK) nm23 (N) und KAI1 (K) im Tumor;
N+K+: Reaktivität beider AK >50%; N+K-: nm23 >50%, KAI1<50% (diese Gruppe enthält keinen Patienten);
N-K+: nm23<50%, KAI1>50%; N-K-:nm23/KAI1<50%.
Ergebnisse
61
3.14.4.1 Überlebenskurven für die Reaktivität der Antikörper nm23/KAI1
Überleben in Prozent
100%
80%
60%
40%
NM23&KAI1
20%
0%
0
25
50
alle anderen
1-zensiert
N+K+
2-zensiert
75
100
125
Überlebenszeit in Monaten
Abb. 3.21.: Kurven nach Kaplan-Meier zeigen den signifikanten Unterschied der Überlebenszeiten zwischen der
Gruppe nm23/KAI1 >50% (N+K+) und den übrigen Gruppen (einer oder beide AK negativ); log rank: p=
0,0079
3.14.5 Korrelation der Effektorcaspase 3 und 6 Expression mit der Überlebenszeit
Die Ergebnisse für die Effektorcaspasen 3 und 6 sind in Bezug auf das Überleben nicht
signifikant (log rank: C3=0,63; C6=0,85). Die Grafiken wurden wegen fehlender
Zusammenhänge nicht dargestellt.
3.15 Ergebnisse des Cox’schen Regressionsmodells für das Überleben
Mit Hilfe der Cox’schen Regression wurde in der multivariaten Analyse der Einfluss von
klinikopathologischen Faktoren (TNM-Stadium, Stadium nach WHO, Differenzierung) und
den immunhistochemischen Ergebnissen in Bezug auf das Überleben untersucht. Hierbei
erlangte nur das Protein nm23-H1 als unabhängiger prognostischer Faktor statistische
Signifikanz (p<0,05). Die Analyse zeigt eine Risikoreduktion (RR=0,056) in Bezug auf das
Überleben bei einer starken Immunoreaktivität von nm23-AK im Tumorgewebe.
Alle weiter aufgeführten Faktoren sind in der multivariaten Analyse nicht signifikant.
Ergebnisse
62
Tabelle 3.5: Multivariate Analyse von KAI1, nm23-H1 und klinikopathologischen
Faktoren mit dem Überleben
RR
KAI1
Nm23
Stadium
T
N
M
Grade
2,452
,056
,948
,461
1,795
1,419
,919
95,0% Konfidenzintervall für RR
untere Grenze
obere Grenze
,462
13,008
,005
,632
,211
4,254
,167
1,273
,385
8,362
,471
4,276
,328
2,579
p-Wert
,292
,020
,945
,135
,456
,534
,873
-: Auflistung prognostischer Faktoren mit Signifikanz (p-Wert), relativem Risiko (RR) und dem
Konfidenzintervall (gibt den kleinsten bzw. größten Wert des berechneten RR wieder) in Bezug auf das
Überleben.
In die Berechnung gingen 29 Patn. ein. Aufgrund eines nicht krankheitsspezifischen Todes wurden 5 Patn.
ausgeschlossen.
4 Diskussion
4.1 Klinische Tumorparameter und Prognose
Die Einteilung der Tumoren nach dem TNM-System und dem hieraus gebildeten WHOStadium wurde für diese Studie beibehalten, da die im angloamerikanischen Sprachraum
verwendete Jackson-Klassifikation in Deutschland unüblich in Bezug auf die Aussage für das
klinische Procedere ist, da hier nur die Tumorlokalisation (Glans, Corpus), nicht aber die
Differenzierung, Eindringtiefe oder die Ausdehnung des Lymphknotenbefalls Beachtung
finden. In Anlehnung an frühere Studien (Naumann et al. 2006) wurden in der vorliegenden
Untersuchung die prognostisch relevanten Faktoren in retrospektiver Auswertung überprüft.
4.1.1 Lokale Tumorausdehnung
Die bisher für die Prognose entscheidende Einbeziehung von Tumor-Stadium und
Metastasen-Status für eine Stadieneinteilung nach dem TNM-System scheint nicht
unproblematisch zu sein, da das T-Stadium in den meisten Untersuchungen keinen
unabhängigen prognostischen Faktor darstellt (Hiddemann and Hiddemann Huber 2004).
Dennoch wird das T-Stadium neben dem Differenzierungsgrad des Primärtumors und des
klinischen inguinalen Lymphknotenstatus als Indikation für die Lymphknotenentfernung
herangezogen. In verschiedenen Publikationen wurde gezeigt, dass eine Unterscheidung von
Patienten in Gruppen ohne (pTa-T1) bzw. mit Infiltration der Corpora spongiosa/ cavernosa
oder Urethra (pT2-3) sinnvoll ist. So schwankt die lymphatische Progression in der Gruppe
ohne Infiltration der Schwellkörper zwischen 5-11% (de Kernion et al. 1973; Hardner et al.
1972; McDougal 1995), wohingegen bei der Gruppe mit Inflitration die Progressionsrate auf
60-70% anstieg (Horenblas and van Tinteren 1994; McDougal 1995; Villavicencio et al.
1997).
Besonders problematisch scheinen sehr unterschiedliche Aufteilungen in Untergruppen zu
sein (Naumann et al. 2006). So werden nicht-invasive Tumoren (Ta und CIS) mit T1Tumoren subsumiert oder die höhere Metastasierungsrate bei schlechter differenzierten
Tumoren nicht berücksichtigt. Als Konsequenz dieser unterschiedlichen Einteilungen liegen
die Metastasierungsraten bei Tumoren bis T1 zwischen 0-58% (Naumann et al. 2006). In den
durch die europäische Gesellschaft für Urologie (EAU) herausgegebenen Leitlinien erfolgte
eine modifizierte Einteilung der Risikogruppen auf der Grundlage der Daten Solsona’s
Diskussion
64
(Solsona et al. 1992). Auch hier scheint die genaue Voraussage für die lymphatische
Metastasierung, insbesondere in der mittleren Risikogruppe (T1G2) nicht sicher zu gelingen.
So
fanden
Naumann
et
al.
(2006)
keine
Unterschiede
in
der
Metastasierungswahrscheinlichkeit bei T1 und T2 Tumoren. In der vorliegenden Arbeit
wurde ebenfalls kein statistischer Zusammenhang zwischen T-Stadium und dem Nodalstatus
bzw. der Überlebenswahrscheinlichkeit nachgewiesen (Tab. 3.2). Dennoch war bei höherer
Eindringtiefe eine tendenzielle Zunahme metastatischer Absiedelungen und auch die
Abnahme der Überlebenswahrscheinlichkeit augenscheinlich.
Die Gruppe der pTa-1 Tumoren zeigte in der vorliegenden Arbeit Tendenzen einer besseren
Prognose. So wiesen 67% der Patienten ohne Infiltration der Schwellkörper keine Metastasen
auf. Allerdings waren diese Korrelationen statistisch nicht signifikant (p=0,085; Daten nicht
aufgeführt).
4.1.2 Grading
In der Literatur wird die zunehmende Entdifferenzierung der Tumorzellen, mehr noch als das
bloße Vordringen des Tumors, für die Zunahme der Metastasierung verantwortlich gemacht
(Horenblas and van Tinteren 1994; Theodorescu et al. 1996; Villavicencio et al. 1997).
Ein Befall der inguinalen Lymphknoten fand sich bei dem in dieser Arbeit vorliegenden
Patientengut in 25% der gut differenzierten, in 57% der mittelgradig differenzierten und zu
100% bei schlecht differenzierten Tumoren. In der Literatur wurden sehr ähnliche
Verteilungen des Lymphknotenbefalls bei G1-3-Tumoren von 4-24%, 46-79% respektive 82100% beschrieben (Fraley et al. 1989; Heyns et al. 1997; Horenblas et al. 1993; Solsona et al.
1992; Theodorescu et al. 1996).
Die positive Korrelation des Differenzierungsgrades mit dem Nodal-Status war signifikant
und könnte somit zur Prognoseeinschätzung herangezogen werden (Tab. 3.25). Dies steht im
Einklang mit den Kriterien der von der EAU herausgegebenen Richtlinien für die
Durchführung einer Lymphadenektomie (Solsona et al. 2004). Eine Bestätigung der
prognostischen Wertigkeit des Gradings findet sich auch in einer Multicenter Studie von
Ficarra et al. (2005), die zudem die Mitberücksichtigung der Lymph- und Gefäßembolisation
für gute Vorhersageergebnisse empfiehlt.
Diskussion
65
4.1.3 Metastasierung
Die Metastasierung ist der entscheidende prognostische Faktor für das Überleben (Horenblas
2001; Ravi 1993). So konnte bei fortgeschrittenen Tumoren, welche die Corpora cavernosa
infiltrierten, eine 5-JÜR von 66-88% bei Patienten mit negativen und eine 5-JÜR von nur 038% der Patienten mit positivem LK-Status beobachtet werden (Pizzocaro et al. 1997).
Auch scheint die Anzahl der betroffenen LK Einfluss auf das Überleben zu haben. So sinkt
bei einem LK-Befall von mehr als 2 Lymphknoten die 5-Jahresüberlebensrate (5-JÜR) von
80% auf 20% (Fraley et al. 1989; Horenblas and van Tinteren 1994; Lopes et al. 1996;
McDougal et al. 1986; Skinner et al. 1972; Srinivas et al. 1987).
In der eigenen Untersuchung wurden ähnliche Beobachtungen gemacht. So hatten Patienten,
die keine oder nur einen solitären positiven Leistenlymphknotenbefall (≤N1) aufwiesen, eine
5-JÜR von 78,8% und jene mit mehr als einem positiven Lymphknoten (≥N2) eine 5-JÜR
von 30,9% (Tab.3.13). Bei der Unterscheidung Lymphknoten positiv ja/nein, lag ein
deutlicher Überlebensvorteil auf der Seite der Patienten ohne Lymphknotenbefall mit 92,3%
(5-JÜR) gegen 39,1% (5-JÜR) der Patienten mit Lymphknotenbefall.
4.1.4 Risiko-Einteilungen
Die Einteilung in drei Risikokategorien zur besseren Voraussage des Lymphknotenbefalls,
wie durch Solsona et al. (2001) vorgeschlagen, hat im vorliegenden Krankengut keine
statistische Signifikanz erreicht (p=0,1). In früheren Arbeiten wurden von der niedrigen bis
zur hohen Risikogruppe bei 0%, 33% respektive 83% der Patienten Metastasen nachgewiesen
(Solsona et al. 1992; Solsona et al. 2001). Die eigenen Patienten wiesen entsprechend den
Kriterien der Solsona-Einteilung in der niedrigen Risikogruppe in 14%, in der mittleren in
60% und in der hohen Risikogruppe in 71% der Fälle Metastasen auf. Im Gegensatz hierzu
zeigte sich entsprechend der neueren EAU-Risikoeinteilung (2004) eine signifikante
Beziehung zum Nodalstatus (p=0,012). Ficarra et al. (2005) bestätigten sowohl die
Beziehungen des lokoregionären LK-Status mit der Solsona-Einteilung als auch mit der EAURisikoeinteilung.
Im Vergleich der vorliegenden Arbeit mit anderen Studien ist festzustellen, dass das eigene
untersuchte Patientengut aus 34 Patienten bestand, während beispielsweise Ficarra et al.
(2005) Tumoren von weit über 100 Patienten untersuchten. Weiter ist es schwierig, die
verschiedenen retrospektiven Studien gegenüberzustellen, da einerseits unterschiedliche
Gruppenzusammensetzungen (siehe T-Stadium) bestanden oder unterschiedliche TNM
Klassifikationen herangezogen wurden (TNM 1978 oder 1997). Außerdem wird die
Diskussion
66
Ergebnisbewertung durch unvollständige Datenerhebung und fehlende multivariate Anlaysen
limitiert (Ficarra et al. 2005; Lopes et al. 1996; Slaton et al. 2001; Solsona et al. 2004;
Theodorescu et al. 1996; Villavicencio et al. 1997).
Es
kann
schlussfolgernd
festgehalten
werden,
dass
von
den
untersuchten
klinikopathologischen Parametern in der vorliegenden Arbeit die Tumordifferenzierung und
die EAU-Risikoeinteilung eine Aussage über den lymphatischen Befall zulassen. Der
Nodalstatus ist bisher der einzige klinische Parameter, der Aussagen über das Outcome der
Patienten gestattet. Dennoch kann für die Patienten der mittleren Risikogruppe (T1G2) nicht
genau bestimmt werden, welches therapeutische Procedere klinisch sinnvoll ist.
Möglicherweise
könnten molekulare Marker im Primärtumor die Entscheidung für das
weitere Vorgehen erleichtern.
4.2 KAI1
In den immunhistochemischen Untersuchungen wurde das KAI1 Glykoprotein im nichtneoplastischen Gewebe im Epithel, in Gefäßen und Keimzentren von Lymphfollikeln
nachgewiesen, wie es bereits früher beschrieben wurde (Fukudome et al. 1992; Huang et al.
1998; Imai et al. 1992; Okochi et al. 1997; Ward et al. 1998). Das Protein war dabei sowohl
in der Zellmembran als auch im Zytoplasma lokalisiert, was sich mit der Literatur deckt
(Okochi et al. 1997).
Die hohe KAI1 Expression in aktivierten Lymphozyten in Keimzentren von Lymphfollikeln
und eine verminderte Reaktivität an den Lymphozyten in der Randzonen stehen ebenfalls in
Einklang mit Resultaten anderer Arbeiten (Fukudome et al. 1992; Imai et al. 1992; LebelBinay et al. 1994). Die in der vorliegenden Arbeit festgestellte Expression an peripheren
Nerven dagegen wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben.
Im untersuchten Tumorgewebe war eine Reduktion der KAI1 Immunreaktivität bei
vorhandener Metastasierung evident. Dabei wurde im gesamten primären Tumormaterial eine
verminderte Proteinexpression (≤50%) bei 38,2% (n=13) der Tumore ausgemacht und alle
Patienten mit positiven LK-Status (n=13) zeigten eine deutlich geminderte Immunreaktivität,
die im Mittel bei 34,4% (SD±20,6) lag. Patienten hingegen mit negativen LK-Status wiesen
eine mittlere Immunreaktivität von 73,1% (SD±13,6) auf (Abb. 3.16).
Diskussion
67
Diese Beobachtungen sind vergleichbar mit Untersuchungen an humanen NSCLC, Pankreas-,
Brust-, Blasen-, Leber-, Kolonkarzinomen, obwohl gewisse Schwankungen bestehen (Adachi
et al. 1996; Dong et al. 1996; Geradts et al. 1999; Guo et al. 1996; Guo et al. 1998;
Higashiyama et al. 1998; Tagawa et al. 1999; Ueda et al. 1996; Yu et al. 1997). Die
Herunterregulation des Proteins wird dabei auf in der Translationsebene gelegene Vorgänge
zurückgeführt.
In vitro Untersuchungen an metastasierenden Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebe
ergaben eine Reduktion des Protein KAI1. So sind in ovarialen-, Prostata-, Blasen-,
endometrialen- und Lungenkarzinom-Zelllinien Expressionsminderungen von 50%, 75%,
38%, 88% respektive 91% im Vergleich zu nicht metastasierenden Zellen beobachtet worden.
In Melanom-Zelllinien wurde eine völliger Expressionsverlust beschrieben (White et al.
1998).
In der Literatur wird weiter auf die unterschiedliche Immunreaktivität des Proteins innerhalb
eines Zellverbandes (bei invasiven SCC von Lunge, Kopf/ Hals und Cervix uteri)
hingewiesen, die auch in dem hier untersuchten Probengut zu beobachten war.
Möglicherweise stellt diese lokale Expressionsminderung des Proteins einen möglichen Ort
zur Metastasenabsiedelung dar (Geradts et al. 1999).
Die KAI1 Expression in intraepithelialen Neoplasien ist unterschiedlich. Während Okochi et
al.(1997) keinen Verlust von KAI1 in intraepithelialen Neoplasien der Haut feststellten,
beschrieben Geradts et al. (1999) einen Verlust in der Cervix uteri (CIN). Allerdings wurde
nicht untersucht, ob diese Herunterregulation mit einer erhöhten Stromainvasion einhergeht.
Bei den PIN der vorliegenden Arbeit wurde keine Veränderung der Immunreaktivität im
Vergleich zum nicht-neoplastischen Gewebe festgestellt (4/4 Reaktivität >50%). Allerdings
wurde hierbei auch nicht auf eine lokale Reaktivitätsminderung z.B. an der Basis der Läsion
eingegangen. Dennoch steht dieses Ergebnis in Einklang mit Untersuchungen an frühen
Pankreaskarzinomen, die eine Hoch- und in metastatischen Stadien eine Herunterregulierung
von KAI1 beobachteten (Guo et al. 1996).
Die Gegenüberstellung der KAI1 Expression in den Tumorzellen mit klinischen Parametern
wies eine signifikant inverse Beziehung der KAI1 Immunreaktivität mit der Differenzierung
Diskussion
68
(Grade) auf (p<0,05). Hochsignifikant stellten sich Vergleiche mit dem N-, M-Status und dem
WHO-Stadium dar (p<0,001).
Die Reduktion der KAI1 Expression in Bezug auf klinikopathologische Parameter wird in der
Literatur unterschiedlich bewertet, zeigt jedoch tendenzielle Zusammenhänge mit der
Progression des Krankheitsverlaufes. So wurden in Karzinomen von Cervix, Ovar und Kolon
keine signifikanten Unterschiede der Expression von KAI1 in Bezug auf verschiedene
Tumorstadien
gefunden,
während
dieser
Unterschied
in
Prostata-,
Lungen-
und
Pankreastumoren nachweisbar war (Liu et al. 2001; Liu et al. 2000; Lombardi et al. 1999). Da
der Verlust von KAI1 nicht nur auf die späten Stadien und die Metastasierung beschränkt ist,
scheint die Herunterregulierung einen wichtigen Schritt bei der Progression vom in situ
Karzinom zum invasiven Zustand darzustellen.
In den untersuchten Tumoren dieser Arbeit zeigten 13 von 17 der Tumore mit LK-Befall eine
Reduzierung der Immunreaktivität. Ähnliche Verhältnisse finden sich in einer früheren
Studie, in der bei metastasierten Cervixkarzinomen in 5 von 6 Fällen eine reduzierte
Expression auftrat (Liu et al. 2001). Grund hierfür soll eher eine abweichende Glykosylierung
von KAI1 als eine Herabregulierung des Proteins sein (Adachi et al. 1996).
Dass in der vorliegenden Studie 4 der Tumoren mit LK-Befall eine starke Immunreaktivität
aufwiesen, könnte entweder an einer verminderten Funktion oder an einer Funktionsstörung
der N-Glykosylierung des KAI1 Proteins liegen (Tagawa et al. 1999) und sollte in weiteren
Untersuchungen aufgeklärt werden.
Patienten, die eine starke Immunreaktivität (>50%) des KAI1 Proteins aufwiesen, zeigten im
Vergleich der Überlebensstatistiken ein deutlich besseres Outcome (3-JÜR: 87,8% gegen
45,5% mit geringer Expression, Abb. 3.19). Ähnliche Ergebnisse zeigten Untersuchungen an
Lungen- und oralen Plattenepithelkarzinomen (Adachi et al. 1996; Farhadieh et al. 2004;
Higashiyama et al. 1998). Andererseits wurden keine signifikanten Unterschiede im
Überleben mit reduzierter KAI1 Expression an Mammakarzinomen beobachtet. Allerdings
lag ein tendenziell längeres Überleben bei hoher KAI1 Expression vor (Huang et al. 1998;
Yang et al. 2000).
Das bessere Outcome der Patienten der vorliegenden Studie Arbeit ist in der univariaten
Analyse (Abb. 3.19), nicht aber in der multivariaten Cox’schen Regression statistisch
signifikant (Tab. 3.30). In einer multivariaten Analyse an über 100 Adenokarzinomen der
Lunge zeigte sich ein deutlich besseres Outcome bei Tumoren mit hoher KAI1 Expression
Diskussion
69
(Adachi et al. 1996), so dass die fehlende Signifikanz der eigenen Ergebnisse auf die geringe
Fallzahl zurückzuführen sein kann.
Eine für die klinischen Parameter durchgeführte Korrelationsanalyse zeigte für alle
untersuchten Faktoren einen negativen Zusammenhang (τ= -0,402 bis -0,620) mit der KAI1
Expression. Für das untersuchte Material kann gefolgert werden, dass gut differenzierte
Tumoren
und
somit
eine
verminderte
Metastasierungstendenz
mit
einer
hohen
Immunreaktivität für KAI1 einhergehen.
Obwohl die Tumoreindringtiefe (T-Stadium) selbst nicht in signifikantem Zusammenhang mit
der Immunreaktivität steht, konnte dieser Zusammenhang für die WHO-Stadien, welche aus
den verschiedenen Komponenten der TNM-Stadien gebildet werden, aufgezeigt werden. Dies
kann ein Hinweis darauf sein, dass nicht das bloße Eindringen des Tumors in die
verschiedenen Schichten (subepithelial, CS/CC, Nachbarstrukturen) selbst die Metastasierung
bewirkt, sondern unter anderem erst die Herabregulierung der Expression des KAI1
Glykoproteins den Schritt der Metastasierung einleitet.
Diese Änderung des Expressionsverhaltens neoplastischer Zellen wurde auch in
experimentellen
Arbeiten
gezeigt,
in
denen
das
KAI1
Glykoprotein
je
nach
Expressionsniveau durch verschiedene Interaktionen mit anderen Zell-Proteinen die
Metastasierung hemmt bzw. fördert (He, B. et al. 2005; Lagaudriere-Gesbert et al. 1998;
Odintsova, E. et al. 2000; Ono, M. et al.2000).
Als methodisches Problem für allen untersuchten Antikörper wird in der Literatur auf eine
mögliche Verminderung der Reaktivität der Antikörper im Gewebe durch die durch
Einbettung und Bearbeitung verursachten Zellschäden hingewiesen. Dennoch scheint die
Immunhistochemie für die Auffindung der KAI1 Herunterregulation, weit zuverlässiger zu
sein als beispielsweise die PCR, da ohne eine Separierung von Tumorzellen aus
dem Gewebe auch Lymphozyten und Makrophagen im oft vorhandenen entzündlichen
Infiltrat mit untersucht werden. Da diese ebenfalls KAI1 stark exprimieren, kann es zur
Überlappung mit den inflammatorischen Zellen bei der Auswertung kommen, was
insbesondere
bei
der
Untersuchung
von
Lymphknotenmetastasen
zu
erheblichen
Schwierigkeiten führen kann (Schindl et al. 2002).
In der vorliegenden Untersuchung wurde erstmals gezeigt, dass der partielle oder komplette
Verlust der KAI1-Immunreaktivität in statistisch signifikanter Korrelation mit der Progression
Diskussion
70
und der Metastasierung beim Peniskarzinom steht. Weiter wurde festgestellt, dass KAI1 nicht
als unabhängiger prognostischer Faktor für die Metastasierung gesehen werden kann, da die
Prüfung auf Korrelation mit den Faktoren T-Stadium, Grade bzw. dem anti-nm23-H1
Antikörper (siehe unten) der multivariaten Analyse nicht standhielt (Tab. 3.10).
Es kann festgehalten werden, dass sich in dem begrenzten Untersuchungsgut starke
Korrelationen des Glykoproteins KAI1 mit verschiedenen klinischen Faktoren bestehen.
Diese lassen eine Etablierung eines prognostischen Faktors jedoch noch nicht zu, da hierfür
von verschiedenen Autoren eine statistisch signifikante multivariate Analyse als
Voraussetzung gilt (Horenblas 2001).
Dennoch
sind
deutliche
Tendenzen
zu
beobachten,
die
bei
verringerter
KAI1
Immunreaktivität mit einer schlechteren Prognose in Hinblick auf die Metastasierung und auf
das Gesamtüberleben der erkrankten Population einhergehen. Der Verlust der KAI1
Immunreaktivität des Primärtumors könnte somit einen Hinweis für ein radikales Procedere in
der operativen Therapie des PSCC darstellen. Eine Überprüfung der Anwendbarkeit kann
jedoch erst im klinischen Einsatz, prospektiv, mit größeren Fallzahlen erfolgen.
4.3 Nm23-H1
Eine starke Expression von Nm23-H1 wurde im Oberflächenepithel der Haut (Stephenson et
al. 1993), im Urothel (Chow et al. 2000), im Kolonepithel (Martinez et al. 1995), in apikalen
Prostataepithelzellen (Myers et al. 1996) sowie in Talgdrüsen, Lymphfollikeln und vielen
anderen Geweben nachgewiesen (Lacombe et al. 1991). Nm23-H1 zeigte in den nichtneoplastischen Gewebensanteilen der Tumoren dieser Arbeit eine ähnliche Verteilung wie
bereits für die Harnblase beschrieben (Oberflächenepithel, Nerven und glatte Muskelzellen
kleinerer Gefäße (Chow et al. 2000).
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das Protein nm23-H1 beim Tumorprogress
und der Metastasierung des PSCC eine Rolle spielen könnte, da ein Zusammenhang zwischen
der Reduktion der Proteinexpression und einer verstärkten Metastasenbildung für
verschiedene Tumoren nachgewiesen wurde. So korreliert die Zunahme der Aggressivität mit
niedriger nm23-H1 Expression in malignen Melanomen (Florenes et al. 1992), ovarialen
(Mandai et al. 1994; Qian et al. 1997; Scambia et al. 1996; Srivatsa et al. 1996; Viel et al.
1995), hepatozellulären (Iizuka et al. 1995; Nakayama et al. 1992; Shimada et al. 1998;
Yamaguchi et al. 1994), laryngealen- (Gunduz et al. 1997; Lee et al. 1996), nasopharyngealen
Diskussion
71
Karzinomen (Guo et al. 1998) sowie in oralen (Lo Muzio et al. 1999; Otsuki et al. 1997) und
ösophagealen Plattenepithelkarzinomen (Iizuka et al. 1999).
In Pankreaskarzinomen (Nakamori et al. 1993) und Neuroblastomen (Hailat et al. 1991)
dagegen
ist
eine
hohe
Expression
von
nm23-H1
mit
der
Zunahme
der
Metastasierungsfähigkeit assoziiert. Bei Untersuchungen an Magen- und Kolonkarzinomen
liegen keine homogenen Ergebnisse über die Bedeutung der nm23-H1 Expression vor
(Hartsough and Steeg 2000).
Der Expressionsverlust von nm23-H1 ist also in nicht allen Tumoren ein signifikanter Faktor
für zunehmende Aggressivität, was auf genetische Instabilität und die Heterogenität der
Tumorentitäten zurückgeführt wird (Easty et al. 1996).
In der vorliegenden Untersuchung wurde eine starke Immunreaktivität bei weniger als der
Hälfte der untersuchten Proben beobachtet (44,1%, Tab. 3.3). Ähnliche Verhältnisse wurden
bei Ösophagus- (29-46%) (Iizuka et al. 1999; Patel et al. 1997) und Lungenkarzinomen (50%)
(Gazzeri et al. 1996; Volm et al. 1998) beschrieben. Stärkere Immunreaktivitäten dagegen
fanden sich bei Mammakarzinomen (81%) (Sawan et al. 1994). Für diese Schwankungen
werden zum einen immer wieder die unterschiedlichen Spezifitäten der verwendeten
Antikörper als auch Unterschiede in der Auswertung der Beobachtungen verantwortlich
gemacht (Tomita et al. 2001).
Die eigenen Ergebnisse zeigten für das PSCC eine Korrelation des Verlustes der nm23-H1
Immunreaktivität mit der Metastasierung und einem ungünstigen Outcome.
Erstaunlich war in der vorliegenden Untersuchung, dass die Fernmetastasierung nur
tendenziell eine inverse Korrelation mit der Immunreaktivität zeigte (p=0,09), obwohl der
Lymphknotenstatus hochsignifikant mit der nm23-H1 Expression korrelierte.
Andererseits besteht ein signifikanter Zusammenhang der Fernmetastasierung mit der
reduziertem nm23-H1 Immunreaktivität (p=0,03; Daten nicht gezeigt), wenn bei der
Berechnung die MX Patienten (keine Zuordnung in das Stadium M0-1) unberücksichtigt
bleiben. Dies verdeutlicht die Beeinflussung der Ergebnisse durch niedrige Fallzahlen und
deren eingeschränkte Aussagekraft in der Praxis.
Ein weiterer statistischer Zusammenhang der Stärke der nm23-H1 Immunreaktion mit Alter,
T-Stadium, Grade, WHO-Stadium wurde nicht gefunden, wobei mit dem WHO-Stadium
zumindest tendenziell ein statistischer Zusammenhang bestand (p=0,054).
Die Gegenüberstellung der nm23-H1 Immunreaktivität mit dem Überleben zeigte in den
vorliegenden Ergebnissen einen hochsignifikanten Vorteil für die Gruppe mit starker
Immunreaktivität. Dies steht zum Teil in Einklang mit früheren Untersuchungen in denen ein
Diskussion
72
Überlebensvorteil nur bei Patienten mit lymphatischer Metastasierung und hoher
Proteinexpression auftrat (Iizuka et al. 1999; Tomita et al. 2001). Übereinstimmend mit den
eigenen
Ergebnissen
wurden
bei
Mamma-,
Magen-,
Lungen-,
Prostata-
und
Schilddrüsenkarzinomen, bei Knochentumoren und malignen Melanomen Korrelationen mit
der Überlebenszeit gefunden (Arai et al. 1995; Florenes et al. 1992; Kawakubo et al. 1997;
Konishi et al. 1993; Oda et al. 1995).
Die Resultate der uni- und multivariaten Analyse der klinischen Faktoren einerseits und die
Korrelation mit KAI1 weisen nm23-H1 als einzigen unabhängigen Faktor sowohl in Bezug
zum Metastasenstatus als auch auf das Überleben aus (Tab. 3.10, 3.15). Dies ist
übereinstimmend mit multivariaten nm23-H1-Analysen anderer Tumoren (Guo et al. 1998;
Kawakubo et al. 1997). Aufgrund der Datenlage kann von einer Verbindung der
Überexpression von nm23-H1 in frühen Tumorstadien und dem Verlust der Expression in
weiter fortgeschritten Stadien ausgegangen werden. Allerdings sind weitere prospektive
Studien nötig, um den Wert des nm23-H1 Proteins als prognostischen Marker zu verifizieren.
Für nm23-H1 und KAI1 wurde in der vorliegenden Arbeit eine Abnahme der
Immunreaktivität im neoplastischen Gewebe im Vergleich zum nicht-neoplastischen Gewebe
bis schließlich zur Metastasierung nachgewiesen. Veränderungen der Proteinexpression und
die Korrelation mit dem Metastasenstatus liegen in vielen Tumoren vor, scheinen aber vom
zugrunde liegenden Tumortyp abzuhängen (Friess et al. 2001).
Während eine signifikante Koexpression beider Proteine in den Tumorzellen auftrat
(Tab.3.7), war eine Beziehung dieser Koexpression zum Lymphknotenstatus nicht evident
(Abb.3.17, Tab.3.10). Dennoch fiel die multivariate Analyse beider Proteine und dem LKStatus für nm23-H1 signifikant aus (p=0,045). Die fehlende Beziehung beider Proteine in der
multivariaten Analyse kann auf den niedrigen Fallzahlen beruhen, da in einer univariaten
Analyse sowohl für nm23-H1 (p<0,001) als auch für KAI1 (p<0,001) eine hochsignifikante
Beziehung wie auch eine stark negative Korrelation (r>-0,7) zur Metastasierung
nachgewiesen werden konnte (Tab.3.10).
Bisherige Untersuchungen ergaben, dass die Herunterregulierung der beiden Proteine in
keiner signifikanten Beziehung zum Nodalstatus stehen (Friess et al. 2001; Goncharuk et al.
2004). Hingegen wurde eine gemeinsam verminderte Expression von KAI1 und nm23-H1 bei
Fernmetastasen beobachtet (Goncharuk et al. 2004). Interessanterweise zeigte sich in der
vorliegenden Arbeit für die Patienten, deren Tumoren eine starke Immunreaktivität beider
Diskussion
73
Antikörper (nm23-H1/ KAI1>50%) aufwiesen, ein signifikant besseres Outcome (Abb.3.21).
So war eine starke Reaktion des Primärtumors mit einer statistisch fast doppelt so langen
Überlebenszeit im Vergleich zu den anderen Gruppen (mittlere Überlebenszeit: 104 gegen 53
Monate) assoziiert (Tab. 3.15). Trotz fehlender Signifikanz stellte sich eine tendenziell
inverse Beziehung der nm23-H1/ KAI1 Ko-Expression mit dem LK-Status und bei starker
Expression eine klare Beziehung beider Proteine mit dem besseren Outcome heraus.
4.4 Effektorcaspasen 3, 6 und TUNEL
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig untersucht, ob Beziehungen zwischen der
Expression der Effektorcaspase 3 und 6 beim Tumorprogress und der Metastasierung des
PSCC vorliegen.
Im gesunden Oberflächenepithel des Penis war eine moderate Immunreaktivität für die
aktivierten Caspasen 3 und 6 in allen Schichten nachweisbar. Eine Reaktion der äußeren
Hornschicht war in einigen der untersuchten Präparate, im Gegensatz zu anderen Studien
(Krajewska et al. 1997), vorhanden.
In verschiedenen Gewebeschnitten war im Epithel ein parakeratotisches Stratum corneum zu
beobachten, welches nicht Caspase-positiv war. Diese fehlende Reaktion könnte Ausdruck
eines ausbleibenden Zelltodes sein (Tobon-Arroyave et al. 2004).
Im Vergleich mit nicht-neoplastischem Gewebe waren die aktivierten Caspasen in den
Karzinomen deutlich seltener nachweisbar. Diese Beobachtung steht in Einklang mit früheren
Arbeiten, die eine verminderte Expression im Tumor, sowohl für die Caspasen 3 und 6 als
auch für die Caspasen 1, 2, 7, 8, 9 und 10 aufzeigten (Philchenkov et al. 2004).
Die teilweise nukleäre Lokalisation der Effektorcaspasen (neoplastische und nichtneoplastische Zellen) scheint auf die Translokation der aktivierten Caspasen zurückzugehen
(Duan et al. 2003). Im Kern können dann Proteine wie Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase
(PARP), Lamin, U1-RNP-70 kD und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen
Proteinkinase (Krajewski et al. 1997) abgebaut werden.
Die Immunreaktionen für die Caspasen 3 und 6 waren sich in ihrer Verteilung und Quantität
sowohl im soliden Tumorzellverband als auch in der Nekrose-/ Apoptoseübergangszone
ähnlich, wobei eine positive Immunreaktion für die Capasen 3 und 6 in 56,7%, respektive in
68,7% der untersuchten Tumoren nachgewiesen werden konnte.
Andere Untersuchungen zeigten an ösophagealen Plattenepithelzelkarzinomen bei 60% der
Tumoren eine positive Caspase 3 Reaktion (Hsia et al. 2003). In pulmonalen SCC lag die
Diskussion
74
positive Immunreaktivität bei 64% für Caspase 3, und 48% für Caspase 6 (TormanenNapankangas et al. 2001).
Die Schwankungen der Reaktivität im Gewebe der verschiedenen Arbeiten könnten sich
durch die unterschiedlich verwendeten Antiköper oder aber in der Gewebsspezifität erklären.
So benutzte Tormanen-Napankangas et al. (2001) beispielsweise polyklonale Antikörper, die
sowohl die 32-kD pro-Caspase 3 und die 17-kD Untereinheit der aktivierten Caspase 3
erkennen, wohingegen Hsia et al. (2003) einen monoklonalen Antikörper gegen aktivierte
Caspase nutzten. Außerdem erschwert ein differentes Scoring-System einen unmittelbaren
Vergleich der verschiedenen Arbeiten.
Auch scheint die Caspase-Immunreaktivität von der Lokalisation des Primärtumors
abzuhängen, was an laryngealen-SCC (stärkere Reaktivität an supraglottischen gegen
glottische Tumoren) und oralen-SCC (stärkere Reaktivität Lippe, Wange gegen schwächere
an Gaumen, Mundboden) gezeigt wurde (Cor et al. 2004; Hague et al. 2004).
An den eigenen Präparaten wurden signifikante Beziehungen der Reduktion der Caspase 3
Immunreaktivität mit Zunahme des T-Stadiums, dem Differenzierungsgrad, dem WHOStadium und der Fernmetastasierung gezeigt (p<0,05). Die Reduktion der Caspase 6
Immunreaktivität stand im signifikanten Zusammenhang mit der Tumordifferenzierung und
darüber hinaus in tendenziellem Zusammenhang mit dem T-Stadium (p=0,052). Dies könnte
einen Hinweis auf die Beteiligung der beiden Effektorcaspasen beim lokalen Tumorprogress
darstellen. Zur signifikanten Beziehung von Caspase 3 und der Fernmetastasierung kann am
vorliegenden Material keine definitive Wertung getroffen werden.
Während die eigenen Ergebnisse keine signifikante Beteiligung der Effektorcaspasen 3 und 6
bei der Metastasierung des PSCC zeigten (Tab. 3.8, 3.9), wiesen vergleichbare
Untersuchungen an SCC der Lunge in uni- und multivariater Analyse die inverse Beziehung
zwischen der Expression der Effektorcaspase 3 und dem Lymphknotenbefall nach (Volm et
al. 2002).
In den eigenen Untersuchungen konnte weiterhin keine Beziehung der Immunreaktivität
beider Proteine und dem Outcome der Patienten gefunden werden, ähnlich den Ergebnissen
von Blazquez et al. (2006) an Mammakarzinomen.
Dennoch gibt es Untersuchungen, die eine Zunahme der Caspase-Expression in oralen
Plattenepithelkarzinomen
mit
einem
aggressiveren
Tumorverhalten
und
kürzerer
Gesamtüberlebenszeit beschreiben (Hague et al. 2004). Zur Begründung werden eine durch
Diskussion
75
die Tumorlokalisation bedingte differente Karzinogenese sowie Unterschiede in der Ätiologie
als auch im Differenzierungsmuster der Tumoren (z.B. keratinisierende versus nichtkeratinisierende) angegeben. Hohe Level der Caspase-Expression und eine ungünstige
Prognose wurden darüber hinaus an Brust- (Parton et al. 2001) und Nicht-KleinzelligenBronchialkarzinomen (NSCLC) festgestellt (Tormanen-Napankangas et al. 2001). Keine
Beziehungen in der Expression von Effektorcaspasen und klinischen Faktoren der
Tumorprogression wurden beispielsweise an Prostatakarzinomen (Sohn et al. 2000)
beschrieben.
In den untersuchten Peniskarzinomen zeigten die Caspase-positiven Zellen häufig keine
morphologischen Merkmale der Apoptose (Apoptosekörperchen, Schrumpfung), was in
Einklang mit anderen Autoren steht (Cor et al. 2004; Duan et al. 2003). Dieses Phänomen
wird auf eine bevorstehende Apoptose zurückgeführt, bei der die Caspasen in den Zellen
bereits aktiviert werden, bevor histomorphologische Zeichen der Apoptose auftreten
(Krajewski et al. 1997). Demgegenüber muss die Apoptose nicht zwingend mit einer erhöhten
Caspase-Expression einhergehen, da die Apoptose auch durch eine Caspase-unabhängige
Kaskasde initiiert werden kann (Duan et al. 2003).
An ausgewählten Präparaten des eigenen Materials konnten Zellen mit positiver TUNELReaktion, als Apoptosenachweis, ausgemacht werden (Abb. 3.11).
In Tumorarealen mit Übergang zu zentralen Nekrose-Apoptosezonen wurde eine besonders
ausgeprägte Immunreaktion der Effektorcaspasen 3 und 6 sowie vermehrt positive TUNELReaktion nachgewiesen (Abb. 3.12). Diese Beobachtung wird in der Literatur mehreren
Ursachen zugewiesen. Zum einen wird die unspezifische Unterscheidung von Apoptose und
Nekrose angeführt, da bei letzterer eine Vielzahl entstehender DNA-Fragmente markiert
werden (Bonegio and Lieberthal 2002; Duan et al. 2003; Grasl-Kraupp et al. 1995; Mundle
and Raza 1995; Parton et al. 2001). Auf der anderen Seite tritt häufig ein begleitendes
Rundzellinfiltrat auf, in dem Lymphozyten eine pos. Caspase-Immunreaktion zeigen
(Krajewski et al. 1997).
Eine endgültige Beurteilung, ob in diesen Bereichen vermehrt Apoptose auftritt, kann mit den
durchgeführten Untersuchungen nicht getroffen werden. Auch die morphologischen
Apoptosezeichen sind nur schwer vom Zelldetritus in den Nekrosearealen abgrenzbar
(Abb.3.10) (Duan et al. 2003) und bringen keine weitere diagnostische Sicherheit.
Erwähnenswert
scheint
auch
die
Beobachtung
von
morphologisch
abgrenzbaren
apoptotischen Zellen, die keine Caspase-Immunreaktion aufwiesen (Abb. 3.8). Hague et al.
Diskussion
76
(2004) beschrieben ähnliche Beobachtungen an oralen Plattenepithelkarzinomen und
begründeten diese fehlende Immunreaktion mit einer nach der Caspase-Aktivierung
einsetzenden Degradation des Proteins während oder durch die Apoptose.
Im übrigen Tumorgewebe überwog die Reaktion der beiden Effektorcaspasen über TUNELpositive Zellen. Das Verhältnis der Caspase- zur TUNEL-Immunreaktion ähnelt den
Beobachtungen von Duan et al. (2003) an einer Prostatakrebszelllinie (3-fach höhere
Caspase3 Reaktion als TUNEL-positive Zellen), nicht aber den Beobachtungen von
Krajewski et al. (1997) an Lymphknoten (10-fach höhere Caspase 3-Reaktion).
Nach Untersuchungen von Duan et al. (2003) soll die Caspase-Immunreaktion als
zuverlässiger Apoptosenachweis in der Routine genutzt werden können.
Eine Abnahme der Immunreaktivität der Effektorcaspasen und damit einhergehend eine
verringerte Apoptoserate der Tumorzellen wird in der Literatur durch mehrere Autoren
bestätigt. So wurde die Expressionsminderung der Caspasen 3 und 6 in Cervixkarzinomen
(Cheung et al. 2002; Zanotti et al. 2003) sowie die Abnahme von Caspase 3 in
Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre (Hsia et al. 2003), bei hepatozellulären Karzinomen
(Cheung et al. 2002; Hsia et al. 2003; Sun et al. 2000; Zanotti et al. 2003), in NichtKleinzelligen-Bronchialkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen der Lunge (Koomagi and
Volm 2000; Volm et al. 2002) beschrieben. Bei der Transformation von kolorektalem Epithel
zum Karzinom war eine Veringerung der Apoptoserate (TUNEL-Methode) nachweisbar
(Bedi et al. 1995).
Die Herabregulierung proapoptotischer Gene und die Verringerung der Apoptoserate während
der malignen Transformation wird als Überlebensvorteil für Tumorzellen angesehen.
Hierdurch wird das Überleben dieser Zellen in einer durch Tumorvergrößerung zunehmend
hypoxischen und nährstoffarmen Umgebung ermöglicht (Cheung et al. 2002; Graeber et al.
1996; Zanotti et al. 2003).
Betrachtet man die eigenen und die zum Teil recht kontroversen Ergebnisse der Literatur
sowohl zu den Beziehungen der Proteinexpression mit klinikopathologischen Faktoren und
dem Outcome als auch die eher vagen Erklärungsmodelle für das Vorhandensein oder die
Abwesenheit in den verschiedenen Tumoren oder Lokalisationen, so
scheinen die
untersuchten Effektorcaspasen als Prognoseparameter beim Peniskarzinom nicht hilfreich zu
sein. Trotzdem sind die Beziehungen beim lokalen Tumorprogress nachweisbar, die
möglicherweise aufgrund der geringen Fallzahl nicht bei allen klinikopathologischen
Faktoren signifikant werden.
Diskussion
77
Die eigenen Beobachtungen unterstützen jene Arbeiten, die den Tumorprogress bei Verlust
der Selbstlimitierung des Tumorwachstums durch ein vermindertes Vorhandensein (Funktion)
der Effektorcaspasen annehmen (Zanotti et al. 2003).
Die Resultate der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Proteine KAI1 und nm23-H1 durchaus
als Parameter zur Prognoseabschätzung und hiermit ein entscheidendes Kriterium bei der
Entscheidung über die Durchführung einer Lymphadenektomie darstellen können.
Die Effektorcaspasen 3 und 6 erfüllen diese Anforderungen im Untersuchungsgut nicht, und
werden daher weder für die Abschätzung der Prognose noch als Entscheidungshilfe für das
therapeutische Vorgehen empfohlen.
Da die geringe Patientenzahl jedoch nur eine sehr beschränkte Aussagen und keine sicheren
Rückschlüsse auf die Grundgesamtheit einer Population zulassen, müssen weitere
Untersuchungen mit größeren Fallzahlen folgen, um eine Einführung in die klinische Routine
zu ermöglichen.
5 Zusammenfassung
Das Peniskarzinom ist mit bis zu 1/100000 Patienten pro Jahr ein seltener Tumor des Mannes.
Das Plattenepithelzellkarzinom (PSCC) ist mit 95% der meist anzutreffende Tumortyp. Die
bevorzugte Lokalisation ist neben dem Präputium die Glans penis. Von hieraus metastasiert
es vorwiegend lymphatisch in die oberflächlichen inguinalen Lymphknoten (LK), erst spät in
die iliakalen LK. Hinweise für eine Vorhersage des Lymphknotenbefalls und dem zu
erwartenden klinischen Verlauf geben momentan, neben apparativer Diagnostik, verschiedene
Parameter, wie Tumordifferenzierung, lymphatische und vaskuläre Invasion oder die
Tumoreindringtiefe am Primärtumor. Da für das Peniskarzinom zur Zeit keine etablierten
molekularen Marker zur Vorhersage der Metastasierungswahrscheinlichkeit vorliegen, ist die
Identifizierung neuer Prognosemarker wünschenswert. In dieser Arbeit wurden die
Metastasensuppressor-Proteine KAI1 und nm23-H1 sowie die aktivierten (c-cleaved)
Caspasen 3 und 6 auf ihre Relavanz für das Peniskarzinom überprüft, da sie bei Mamma-,
Lungen-, Leber- und Darmtumoren relevante Marker zur Vorhersage des klinischen Verlaufs
sind. KAI1 ist ein zur Familie der Tetraspanine zählendes Membranglykoprotein, das
physiologisch an der Weiterleitung externer Signale zum Zellkern beteiligt ist und in
verschiedenen Tumoren herauf- oder herunterreguliert sein kann. Das Protein nm23-H1
(NDPK; Nukleosid-Diphosphat-Kinase) katalysiert in seiner physiologischen Funktion die
Übertragung von Phosphatresten von Nukleosidtriphosphaten (NTP, z.B. ATP) auf
Nukelosidiphosphate (NDP, z.B. GDP) und ist in eine Reihe von Interaktionen eingebunden,
die eine Hemmung der Zellmotilität bewirken. Die Effektorcaspasen 3 und 6 sind
Schlüsselenzyme der Apoptose (programmierter Zelltod) und ihre Expression wird in vielen
Tumoren herunterreguliert.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ein Zusammenhang
zwischen
der
Expression
klinikopathologischen
der
genannten
Parametern
(TNM,
Proteine
im
Peniskarzinom
Differenzierungsgrad,
und
WHO-Stadium,
Risikoeinteilung) sowie dem postoperativen Verlauf besteht. Das Untersuchungsmaterial
stammte
von
34
Patienten,
die
sich
auf
Grund
eines
Penistumors
(30
Plattenepithelzellkarzinome und 4 Carcinoma in situ) einer Resektion unterzogen.
Immunhistochemische Untersuchungen wurden mit Antikörpern gegen KAI1, nm23-H1,
cCaspasen 3 und 6 durchgeführt. Mittels TUNEL-Methode (Terminale DesoxyribosylTransferase mediated dUTP Nick End Labeling) wurden apoptotische Zellen nachgewiesen.
Im nicht-neoplastischen Penisgewebe waren Immunreaktionen für KAI1 und nm23-H1 in
Zusammenfassung
79
Oberflächenepithelzellen, Gefäßwänden, Nervenfasern und Lymphozyten vorhanden. Die
immunhistochemische Lokalisation der beiden Effektorcaspasen im umliegenden Gewebe
erstreckte sich auf Epithelzellen und Rundzellinfiltrate. Eine positive Immunreaktivität für
KAI1 und nm23-H1 wurde in mehr als 90% der Tumoren nachgewiesen. Hingegen zeigten
die cCaspasen 3 und 6 nur in 57%, respektive 69% der Tumoren eine positive Immunreaktion
auf.
Die statistische Auswertung ergab für KAI1 und nm23-H1, dass eine starke Immunreaktivität
mit einer geringeren Metastasierung (N-, M-Status) korreliert. Weitere signifikant inverse
Beziehungen zeigten sich für die Tumordifferenzierung (Grading) und dem WHO-Stadium
(p<0,05). Auch wurde die signifikante Koexpression beider Metastasensuppressoren
festgestellt (p<0,001), die jedoch nicht in signifikantem Zusammenhang zum regionalen LKStatus stand. Des Weiteren wurde ein inverser Zusammenhang der cCaspase 3-Expression mit
dem T-Stadium, dem M-Stadium, dem Differenzierungsgrad und dem WHO-Stadium
nachgewiesen
(p<0,05).
Für
die
cCaspase
6
lagen
Korrelationen
mit
dem
Differenzierungsgrad und mit der EAU-Risikoeinteilung vor (p<0,05). In der univariaten
Analyse stellten sich die Differenzierung, die EAU-Risikoeinteilung sowie die Proteine KAI1
und nm23-H1 als signifikante Faktoren für die Vorhersage des lymphatischen Befalls dar. Die
multivariate Analyse mehrerer Parameter zeigte für nm23-H1 eine signifikante Beziehung in
Hinsicht auf den LK-Status. Eine signifikante Beziehung bestand außerdem zwischen
negativem LK-Status und der starken Expression von KAI1 bzw. nm23-H1 sowie deren
Koexpression mit einem günstigen postoperativen Verlauf der Erkrankung (log rank: p<0,01).
Die multivariate Cox’sche Analyse zeigte außerdem, dass die starke Expression des Proteins
nm23-H1 im Vergleich mit anderen untersuchten Faktoren (KAI1-Expression, TNMEinteilung, Grading, WHO-Stadium) mit einer günstigen Prognose korreliert (p=0,02).
Die Resultate der vorliegenden Arbeit bestätigen die Bedeutung des regionalen
Lymphknotenbefalls für die Prognose beim Peniskarzinom. Die Untersuchungen des
Primärtumors auf mögliche prädiktive Marker ergaben, dass die Expression der beiden
Effektorcaspasen
in
keinem
statistischen
Zusammenhang
mit
der
Prognose
des
Peniskarzinoms stehen. Im Gegensatz dazu zeigte die Expression von nm23-H1, auch im
Vergleich zu KAI1, eine eindeutige Korrelation in Bezug auf Metastasierung und
Überlebenswahrscheinlichkeit.
Ebenso
korrelierte
die
Koexpression
beider
Metastasensupressoren mit dem postoperativen Verlauf. Auf Grund der begrenzten
Patientenanzahl sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Bedeutung der
Metastasensuppressoren KAI1 und nm23-H1 beim Krankheitsverlauf des Peniskarzinoms zu
bestätigen.
6 Literaturverzeichnis
Adachi, M., T. Taki, Y. Ieki, C. L. Huang, M. Higashiyama and M. Miyake (1996).
"Correlation of KAI1/CD82 gene expression with good prognosis in patients with
non-small cell lung cancer." Cancer Res 56(8): 1751-5.
Alam, A., L. Y. Cohen, S. Aouad and R. P. Sekaly (1999). "Early activation of caspases
during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleavage in
nonapoptotic cells." J Exp Med 190(12): 1879-90.
Almgren, M. A., K. C. Henriksson, J. Fujimoto and C. L. Chang (2004). "Nucleoside
diphosphate kinase A/nm23-H1 promotes metastasis of NB69-derived human
neuroblastoma." Mol Cancer Res 2(7): 387-94.
Alnemri, E. S., D. J. Livingston, D. W. Nicholson, G. Salvesen, N. A. Thornberry, W. W.
Wong and J. Yuan (1996). "Human ICE/CED-3 protease nomenclature." Cell 87(2):
171.
Arai, T., T. Yamashita, T. Urano, A. Masunaga, S. Itoyama, K. Itoh, H. Shiku and I.
Sugawara (1995). Preferential reduction of nm23-H1 gene product in metastatic
tissues from papillary and follicular carcinomas of the thyroid. Mod Pathol. 8: 252-6.
Ashkenazi, A. and V. M. Dixit (1998). "Death receptors: signaling and modulation." Science
281(5381): 1305-8.
Bandyopadhyay, S., R. Zhan, A. Chaudhuri, M. Watabe, S. K. Pai, S. Hirota, S. Hosobe, T.
Tsukada, K. Miura, Y. Takano, K. Saito, M. E. Pauza, S. Hayashi, Y. Wang, S.
Mohinta, T. Mashimo, M. Iiizumi, E. Furuta and K. Watabe (2006). "Interaction of
KAI1 on tumor cells with DARC on vascular endothelium leads to metastasis
suppression." Nat Med 12(8): 933-8.
Baumler, C., F. Duan, K. Onel, B. Rapaport, S. Jhanwar, K. Offit and K. B. Elkon (2003).
"Differential recruitment of caspase 8 to cFlip confers sensitivity or resistance to Fasmediated apoptosis in a subset of familial lymphoma patients." Leuk Res 27(9): 84151.
Bedi, A., P. J. Pasricha, A. J. Akhtar, J. P. Barber, G. C. Bedi, F. M. Giardiello, B. A.
Zehnbauer, S. R. Hamilton and R. J. Jones (1995). "Inhibition of apoptosis during
development of colorectal cancer." Cancer Res 55(9): 1811-6.
Blazquez, S., J. J. Sirvent, M. Olona, C. Aguilar, A. Pelegri, J. F. Garcia and J. Palacios
(2006). "Caspase-3 and caspase-6 in ductal breast carcinoma: a descriptive study."
Histol Histopathol 21(12): 1321-9.
Berditchevski, F. (2001). "Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets the
eye." J Cell Sci 114(Pt 23): 4143-51.
Berdjis, N., A. Meye, J. Nippgen, D. Dittert, O. Hakenberg, G. B. Baretton and M. P. Wirth
(2005). "Expression of Ki-67 in squamous cell carcinoma of the penis." BJU Int 96(1):
146-8.
Berger, J. C., D. J. Vander Griend, V. L. Robinson, J. A. Hickson and C. W. Rinker-Schaeffer
(2005). "Metastasis suppressor genes: from gene identification to protein function and
regulation." Cancer Biol Ther 4(8): 805-12.
Bezerra, A. L., A. Lopes, G. H. Santiago, K. C. Ribeiro, M. R. Latorre and L. L. Villa (2001).
"Human papillomavirus as a prognostic factor in carcinoma of the penis: analysis of
82 patients treated with amputation and bilateral lymphadenectomy." Cancer 91(12):
2315-21.
Bonegio, R. and W. Lieberthal (2002). "Role of apoptosis in the pathogenesis of acute renal
failure." Curr Opin Nephrol Hypertens 11(3): 301-8.
Boucheix, C. and E. Rubinstein (2001). "Tetraspanins." Cell Mol Life Sci 58(9): 1189-205.
Literatur
81
Bouras, T. and A. G. Frauman (1999). "Expression of the prostate cancer metastasis
suppressor gene KAI1 in primary prostate cancers: a biphasic relationship with tumour
grade." J Pathol 188(4): 382-8.
Caligo, M. A., G. Cipollini, L. Fiore, S. Calvo, F. Basolo, P. Collecchi, F. Ciardiello, S. Pepe,
M. Petrini and G. Bevilacqua (1995). "NM23 gene expression correlates with cell
growth rate and S-phase." Int J Cancer 60(6): 837-42.
Chakravarti, D. and R. Hong (2003). "SET-ting the stage for life and death." Cell 112(5): 58991.
Charrin, S., S. Manie, C. Thiele, M. Billard, D. Gerlier, C. Boucheix and E. Rubinstein
(2003). "A physical and functional link between cholesterol and tetraspanins." Eur J
Immunol 33(9): 2479-89.
Cheung, T. H., T. K. Chung, K. W. Lo, M. Y. Yu, S. Krajewski, J. C. Reed and Y. F. Wong
(2002). "Apotosis-related proteins in cervical intraepithelial neoplasia and squamous
cell carcinoma of the cervix." Gynecol Oncol 86(1): 14-8.
Chiu, T. Y., H. S. Huang, M. K. Lai, J. Chen, T. S. Hsieh and S. C. Chueh (1998). "Penile
cancer in Taiwan--20 years' experience at National Taiwan University Hospital." J
Formos Med Assoc 97(10): 673-8.
Chow, N. H., H. S. Liu and S. H. Chan (2000). "The role of nm23-H1 in the progression of
transitional cell bladder cancer." Clin Cancer Res 6(9): 3595-9.
Cipollini, G., A. Berti, L. Fiore, G. Rainaldi, F. Basolo, G. Merlo, G. Bevilacqua and M. A.
Caligo (1997). "Down-regulation of the nm23.h1 gene inhibits cell proliferation." Int J
Cancer 73(2): 297-302.
Cohen, G. M. (1997). "Caspases: the executioners of apoptosis." Biochem J 326 ( Pt 1): 1-16.
Cor, A., J. Pizem and N. Gale (2004). "Immunohistochemical analysis of pro- and activecaspase 3 in laryngeal squamous cell carcinoma." Virchows Arch 444(5): 439-46.
Coupland, S. E., M. Hummel and H. Stein (2000). "[Lymphatic system and differentiation of
B and T lymphocytes]." Pathologe 21(2): 106-12.
Cryns, V. and J. Yuan (1998). "Proteases to die for." Genes Dev 12(11): 1551-70.
Cubilla, A. L., J. Barreto, C. Caballero, G. Ayala and M. Riveros (1993). "Pathologic features
of epidermoid carcinoma of the penis. A prospective study of 66 cases." Am J Surg
Pathol 17(8): 753-63.
Culkin, D. J. and T. M. Beer (2003). "Advanced penile carcinoma." J Urol 170(2 Pt 1): 35965.
Dabernat, S., M. Larou, K. Masse, T. Hokfelt, G. Mayer, J. Y. Daniel and M. Landry (1999).
"Cloning of a second nm23-M1 cDNA: expression in the central nervous system of
adult mouse and comparison with nm23-M2 mRNA distribution." Brain Res Mol
Brain Res 63(2): 351-65.
de Kernion, J. B., P. Tynberg, L. Persky and J. P. Fegen (1973). "Proceedings: Carcinoma of
the penis." Cancer 32(5): 1256-62.
De Maria, R., A. Zeuner, A. Eramo, C. Domenichelli, D. Bonci, F. Grignani, S. M.
Srinivasula, E. S. Alnemri, U. Testa and C. Peschle (1999). "Negative regulation of
erythropoiesis by caspase-mediated cleavage of GATA-1." Nature 401(6752): 489-93.
Delaguillaumie, A., C. Lagaudriere-Gesbert, M. R. Popoff and H. Conjeaud (2002). "Rho
GTPases link cytoskeletal rearrangements and activation processes induced via the
tetraspanin CD82 in T lymphocytes." J Cell Sci 115(Pt 2): 433-43.
Dong, J. T., W. B. Isaacs, J. C. Barrett and J. T. Isaacs (1997). "Genomic organization of the
human KAI1 metastasis-suppressor gene." Genomics 41(1): 25-32.
Dong, J. T., P. W. Lamb, C. W. Rinker-Schaeffer, J. Vukanovic, T. Ichikawa, J. T. Isaacs and
J. C. Barrett (1995). "KAI1, a metastasis suppressor gene for prostate cancer on
human chromosome 11p11.2." Science 268(5212): 884-6.
Literatur
82
Dong, J. T., H. Suzuki, S. S. Pin, G. S. Bova, J. A. Schalken, W. B. Isaacs, J. C. Barrett and J.
T. Isaacs (1996). "Down-regulation of the KAI1 metastasis suppressor gene during the
progression of human prostatic cancer infrequently involves gene mutation or allelic
loss." Cancer Res 56(19): 4387-90.
Duan, W. R., D. S. Garner, S. D. Williams, C. L. Funckes-Shippy, I. S. Spath and E. A.
Blomme (2003). "Comparison of immunohistochemistry for activated caspase-3 and
cleaved cytokeratin 18 with the TUNEL method for quantification of apoptosis in
histological sections of PC-3 subcutaneous xenografts." J Pathol 199(2): 221-8.
Easty, D. J., K. Maung, I. Lascu, M. Veron, M. E. Fallowfield, I. R. Hart and D. C. Bennett
(1996). "Expression of NM23 in human melanoma progression and metastasis." Br J
Cancer 74(1): 109-14.
Eckhart, L., C. Ballaun, A. Uthman, C. Kittel, M. Stichenwirth, M. Buchberger, H. Fischer,
W. Sipos and E. Tschachler (2005). "Identification and characterization of a novel
mammalian caspase with proapoptotic activity." J Biol Chem.
Emerson, R. E., T. M. Ulbright, J. N. Eble, W. A. Geary, G. J. Eckert and L. Cheng (2001).
"Predicting cancer progression in patients with penile squamous cell carcinoma: the
importance of depth of invasion and vascular invasion." Mod Pathol 14(10): 963-8.
Fan, T. J., L. H. Han, R. S. Cong and J. Liang (2005). "Caspase family proteases and
apoptosis." Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 37(11): 719-27.
Farhadieh, R. D., R. Smee, K. Ow, J. L. Yang, P. J. Russell, R. Crouch, P. Jackson and I. V.
Jacobson (2004). "Down-regulation of KAI1/CD82 protein expression in oral cancer
correlates with reduced disease free survival and overall patient survival." Cancer Lett
213(1): 91-8.
Ficarra, V., F. Zattoni, S. C. Cunico, T. P. Galetti, L. Luciani, A. Fandella, S. Guazzieri, D.
Maruzzi, T. Sava, S. Siracusano, S. Pilloni, A. Tasca, G. Martignoni, M. Gardiman, R.
Tardanico, T. Zambolin, A. Cisternino and W. Artibani (2005). "Lymphatic and
vascular embolizations are independent predictive variables of inguinal lymph node
involvement in patients with squamous cell carcinoma of the penis: Gruppo UroOncologico del Nord Est (Northeast Uro-Oncological Group) Penile Cancer data base
data." Cancer 103(12): 2507-16.
Fischer, U., R. U. Janicke and K. Schulze-Osthoff (2003). "Many cuts to ruin: a
comprehensive update of caspase substrates." Cell Death Differ 10(1): 76-100.
Florenes, V. A., S. Aamdal, O. Myklebost, G. M. Maelandsmo, O. S. Bruland and O. Fodstad
(1992). "Levels of nm23 messenger RNA in metastatic malignant melanomas: inverse
correlation to disease progression." Cancer Res 52(21): 6088-91.
Fossa, S. D., K. S. Hall, N. B. Johannessen, T. Urnes and O. Kaalhus (1987). "Cancer of the
penis. Experience at the Norwegian Radium Hospital 1974-1985." Eur Urol 13(6):
372-7.
Fraley, E. E., G. Zhang, C. Manivel and G. A. Niehans (1989). "The role of ilioinguinal
lymphadenectomy and significance of histological differentiation in treatment of
carcinoma of the penis." J Urol 142(6): 1478-82.
Friedlander, R. M. (2003). "Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases." N Engl J
Med 348(14): 1365-75.
Friess, H., X. Z. Guo, A. A. Tempia-Caliera, A. Fukuda, M. E. Martignoni, A. Zimmermann,
M. Korc and M. W. Buchler (2001). "Differential expression of metastasis-associated
genes in papilla of vater and pancreatic cancer correlates with disease stage." J Clin
Oncol 19(9): 2422-32.
Friess, H., Z. Lu, H. U. Graber, A. Zimmermann, G. Adler, M. Korc, R. M. Schmid and M.
W. Buchler (1998). "bax, but not bcl-2, influences the prognosis of human pancreatic
cancer." Gut 43(3): 414-21.
Literatur
83
Frimberger, D., E. Hungerhuber, D. Zaak, R. Waidelich, A. Hofstetter and P. Schneede
(2002). "Penile carcinoma. Is Nd:YAG laser therapy radical enough?" J Urol 168(6):
2418-21; discussion 2421.
Fukudome, K., M. Furuse, T. Imai, M. Nishimura, S. Takagi, Y. Hinuma and O. Yoshie
(1992). "Identification of membrane antigen C33 recognized by monoclonal
antibodies inhibitory to human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1)-induced
syncytium formation: altered glycosylation of C33 antigen in HTLV-1-positive T
cells." J Virol 66(3): 1394-401.
Gandarillas, A., L. A. Goldsmith, S. Gschmeissner, I. M. Leigh and F. M. Watt (1999).
"Evidence that apoptosis and terminal differentiation of epidermal keratinocytes are
distinct processes." Exp Dermatol 8(1): 71-9.
Garrido, C. and G. Kroemer (2004). "Life's smile, death's grin: vital functions of apoptosisexecuting proteins." Curr Opin Cell Biol 16(6): 639-46.
Gazzeri, S., E. Brambilla, A. Negoescu, D. Thoraval, M. Veron, D. Moro and C. Brambilla
(1996). "Overexpression of nucleoside diphosphate/kinase A/nm23-H1 protein in
human lung tumors: association with tumor progression in squamous carcinoma." Lab
Invest 74(1): 158-67.
Georgatos, S. D., J. Meier and G. Simos (1994). "Lamins and lamin-associated proteins." Curr
Opin Cell Biol 6(3): 347-53.
Geradts, J., R. Maynard, M. J. Birrer, D. Hendricks, S. L. Abbondanzo, K. M. Fong, J. C.
Barrett and D. P. Lombardi (1999). "Frequent loss of KAI1 expression in squamous
and lymphoid neoplasms. An immunohistochemical study of archival tissues." Am J
Pathol 154(6): 1665-71.
Gervasi, F., F. Capozza, T. Bruno, M. Fanciulli and D. Lombardi (1998). "Identification of
novel mRNA transcripts of the nm23-M1 gene that are modulated during mouse
embryo development and are differently expressed in adult murine tissues." DNA Cell
Biol 17(12): 1047-55.
Gervasi, F., I. D'Agnano, S. Vossio, G. Zupi, A. Sacchi and D. Lombardi (1996). "nm23
influences proliferation and differentiation of PC12 cells in response to nerve growth
factor." Cell Growth Differ 7(12): 1689-95.
Goldberg, Y. P., D. W. Nicholson, D. M. Rasper, M. A. Kalchman, H. B. Koide, R. K.
Graham, M. Bromm, P. Kazemi-Esfarjani, N. A. Thornberry, J. P. Vaillancourt and
M. R. Hayden (1996). "Cleavage of huntingtin by apopain, a proapoptotic cysteine
protease, is modulated by the polyglutamine tract." Nat Genet 13(4): 442-9.
Goncharuk, V. N., A. del-Rosario, L. Kren, S. Anwar, C. E. Sheehan, J. A. Carlson and J. S.
Ross (2004). "Co-downregulation of PTEN, KAI-1, and nm23-H1 tumor/metastasis
suppressor proteins in non-small cell lung cancer." Ann Diagn Pathol 8(1): 6-16.
Graeber, T. G., C. Osmanian, T. Jacks, D. E. Housman, C. J. Koch, S. W. Lowe and A. J.
Giaccia (1996). "Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic
potential in solid tumours." Nature 379(6560): 88-91.
Grasl-Kraupp, B., B. Ruttkay-Nedecky, H. Koudelka, K. Bukowska, W. Bursch and R.
Schulte-Hermann (1995). "In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails
to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note."
Hepatology 21(5): 1465-8.
Gunduz, M., A. Ayhan, I. Gullu, M. Onerci, A. S. Hosal, B. Gursel, I. N. Hosal and D. Firat
(1997). "nm23 Protein expression in larynx cancer and the relationship with
metastasis." Eur J Cancer 33(14): 2338-41.
Guo, X., H. Friess, H. U. Graber, M. Kashiwagi, A. Zimmermann, M. Korc and M. W.
Buchler (1996). "KAI1 expression is up-regulated in early pancreatic cancer and
decreased in the presence of metastases." Cancer Res 56(21): 4876-80.
Literatur
84
Guo, X., H. Q. Min, M. S. Zeng, C. N. Qian, X. M. Huang, J. Y. Shao and J. H. Hou (1998).
"nm23-H1 expression in nasopharyngeal carcinoma: correlation with clinical
outcome." Int J Cancer 79(6): 596-600.
Guo, X. Z., H. Friess, F. F. Di Mola, J. M. Heinicke, M. Abou-Shady, H. U. Graber, H. U.
Baer, A. Zimmermann, M. Korc and M. W. Buchler (1998). "KAI1, a new metastasis
suppressor gene, is reduced in metastatic hepatocellular carcinoma." Hepatology
28(6): 1481-8.
Guo, X. Z., H. Friess, C. Maurer, P. Berberat, W. H. Tang, A. Zimmermann, M. Naef, H. U.
Graber, M. Korc and M. W. Buchler (1998). "KAI1 is unchanged in metastatic and
nonmetastatic esophageal and gastric cancers." Cancer Res 58(4): 753-8.
Hague, A., J. W. Eveson, M. MacFarlane, S. Huntley, N. Janghra and S. Thavaraj (2004).
"Caspase-3 expression is reduced, in the absence of cleavage, in terminally
differentiated normal oral epithelium but is increased in oral squamous cell
carcinomas and correlates with tumour stage." J Pathol 204(2): 175-82.
Hailat, N., D. R. Keim, R. F. Melhem, X. X. Zhu, C. Eckerskorn, G. M. Brodeur, C. P.
Reynolds, R. C. Seeger, F. Lottspeich, J. R. Strahler and et al. (1991). "High levels of
p19/nm23 protein in neuroblastoma are associated with advanced stage disease and
with N-myc gene amplification." J Clin Invest 88(1): 341-5.
Hajra, K. M. and J. R. Liu (2004). "Apoptosome dysfunction in human cancer." Apoptosis
9(6): 691-704.
Hall, M. C., J. S. Sanders, F. Vuitch, E. Ramirez and C. A. Pettaway (1998).
"Deoxyribonucleic acid flow cytometry and traditional pathologic variables in
invasive penile carcinoma: assessment of prognostic significance." Urology 52(1):
111-6.
Hammond, C., L. K. Denzin, M. Pan, J. M. Griffith, H. J. Geuze and P. Cresswell (1998).
"The tetraspan protein CD82 is a resident of MHC class II compartments where it
associates with HLA-DR, -DM, and -DO molecules." J Immunol 161(7): 3282-91.
Hardner, G. J., T. Bhanalaph, G. P. Murphy, D. J. Albert and R. H. Moore (1972).
"Carcinoma of the penis: analysis of therapy in 100 consecutive cases." J Urol 108(3):
428-30.
Hartsough, M. T., S. E. Clare, M. Mair, A. G. Elkahloun, D. Sgroi, C. K. Osborne, G. Clark
and P. S. Steeg (2001). "Elevation of breast carcinoma Nm23-H1 metastasis
suppressor gene expression and reduced motility by DNA methylation inhibition."
Cancer Res 61(5): 2320-7.
Hartsough, M. T. and P. S. Steeg (2000). "Nm23/nucleoside diphosphate kinase in human
cancers." J Bioenerg Biomembr 32(3): 301-8.
He, B., L. Liu, G. A. Cook, S. Grgurevich, L. K. Jennings and X. A. Zhang (2005).
"Tetraspanin CD82 attenuates cellular morphogenesis through down-regulating
integrin alpha6-mediated cell adhesion." J Biol Chem 280(5): 3346-54.
Hegyi, L., S. J. Hardwick, M. J. Mitchinson and J. N. Skepper (1997). "The presence of
apoptotic cells in human atherosclerotic lesions." Am J Pathol 150(1): 371-3.
Hemler, M. E. (2001). "Specific tetraspanin functions." J Cell Biol 155(7): 1103-7.
Hemler, M. E. (2005). "Tetraspanin functions and associated microdomains." Nat Rev Mol
Cell Biol 6(10): 801-11.
Heyns, C. F., P. van Vollenhoven, J. W. Steenkamp and F. J. Allen (1997). "Cancer of the
penis-a review of 50 patients." S Afr J Surg 35(3): 120-4.
Hiddemann, W. and B. Hiddemann Huber (2004). "Die Onkologie, Teil 2, Peniskarzinom."
(2): 1312-1320.
Higashiyama, M., K. Kodama, H. Yokouchi, K. Takami, M. Adachi, T. Taki, S. Ishiguro, S.
Nakamori, O. Yoshie and M. Miyake (1998). "KAI1/CD82 expression in nonsmall
Literatur
85
cell lung carcinoma is a novel, favorable prognostic factor: an immunohistochemical
analysis." Cancer 83(3): 466-74.
Horenblas, S. (2001). "Lymphadenectomy for squamous cell carcinoma of the penis. Part 1:
diagnosis of lymph node metastasis." BJU Int 88(5): 467-72.
Horenblas, S. (2001). "Lymphadenectomy for squamous cell carcinoma of the penis. Part 2:
the role and technique of lymph node dissection." BJU Int 88(5): 473-83.
Horenblas, S. and H. van Tinteren (1994). "Squamous cell carcinoma of the penis. IV.
Prognostic factors of survival: analysis of tumor, nodes and metastasis classification
system." J Urol 151(5): 1239-43.
Horenblas, S., H. van Tinteren, J. F. Delemarre, L. M. Moonen, V. Lustig and E. W. van
Waardenburg (1993). "Squamous cell carcinoma of the penis. III. Treatment of
regional lymph nodes." J Urol 149(3): 492-7.
Hsia, J. Y., C. Y. Chen, J. T. Chen, C. P. Hsu, S. E. Shai, S. S. Yang, C. Y. Chuang, P. Y.
Wang and J. Miaw (2003). "Prognostic significance of caspase-3 expression in
primary resected esophageal squamous cell carcinoma." Eur J Surg Oncol 29(1): 44-8.
Huang, C. I., N. Kohno, E. Ogawa, M. Adachi, T. Taki and M. Miyake (1998). "Correlation
of reduction in MRP-1/CD9 and KAI1/CD82 expression with recurrences in breast
cancer patients." Am J Pathol 153(3): 973-83.
Iizuka, N., M. Oka, T. Noma, A. Nakazawa, K. Hirose and T. Suzuki (1995). "NM23-H1 and
NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma." Cancer
Res 55(3): 652-7.
Iizuka, N., A. Tangoku, H. Hayashi, S. Yosino, T. Abe, T. Morioka and M. Oka (1999). "The
association between nm23-H1 expression and survival in patients with esophageal
squamous cell carcinoma." Cancer Lett 138(1-2): 139-44.
Imai, T., K. Fukudome, S. Takagi, M. Nagira, M. Furuse, N. Fukuhara, M. Nishimura, Y.
Hinuma and O. Yoshie (1992). "C33 antigen recognized by monoclonal antibodies
inhibitory to human T cell leukemia virus type 1-induced syncytium formation is a
member of a new family of transmembrane proteins including CD9, CD37, CD53, and
CD63." J Immunol 149(9): 2879-86.
Itoh, G., J. Tamura, M. Suzuki, Y. Suzuki, H. Ikeda, M. Koike, M. Nomura, T. Jie and K. Ito
(1995). "DNA fragmentation of human infarcted myocardial cells demonstrated by the
nick end labeling method and DNA agarose gel electrophoresis." Am J Pathol 146(6):
1325-31.
Jackson, P., D. Millar, E. Kingsley, G. Yardley, K. Ow, S. Clark and P. J. Russell (2000).
"Methylation of a CpG island within the promoter region of the KAI1 metastasis
suppressor gene is not responsible for down-regulation of KAI1 expression in invasive
cancers or cancer cell lines." Cancer Lett 157(2): 169-76.
Jaworowski, A. and S. M. Crowe (1999). "Does HIV cause depletion of CD4+ T cells in vivo
by the induction of apoptosis?" Immunol Cell Biol 77(1): 90-8.
Ji, L., M. Arcinas and L. M. Boxer (1995). "The transcription factor, Nm23H2, binds to and
activates the translocated c-myc allele in Burkitt's lymphoma." J Biol Chem 270(22):
13392-8.
Johnson, D. E. and R. K. Lo (1984). "Management of regional lymph nodes in penile
carcinoma. Five-year results following therapeutic groin dissections." Urology 24(4):
308-11.
Kauffman, E. C., V. L. Robinson, W. M. Stadler, M. H. Sokoloff and C. W. Rinker-Schaeffer
(2003). "Metastasis suppression: the evolving role of metastasis suppressor genes for
regulating cancer cell growth at the secondary site." J Urol 169(3): 1122-33.
Kawakubo, Y., Y. Sato, T. Koh, H. Kono and T. Kameya (1997). "Expression of nm23
protein in pulmonary adenocarcinomas: inverse 1orrelation to tumor progression."
Lung Cancer 17(1): 103-13.
Literatur
86
Kennedy, N. J., T. Kataoka, J. Tschopp and R. C. Budd (1999). "Caspase activation is
required for T cell proliferation." J Exp Med 190(12): 1891-6.
Kockx, M. M., J. Muhring, M. W. Knaapen and G. R. de Meyer (1998). "RNA synthesis and
splicing interferes with DNA in situ end labeling techniques used to detect apoptosis."
Am J Pathol 152(4): 885-8.
Konishi, N., S. Nakaoka, T. Tsuzuki, K. Matsumoto, Y. Kitahori, Y. Hiasa, T. Urano and H.
Shiku (1993). "Expression of nm23-H1 and nm23-H2 proteins in prostate carcinoma."
Jpn J Cancer Res 84(10): 1050-4.
Koomagi, R. and M. Volm (2000). "Relationship between the expression of caspase-3 and the
clinical outcome of patients with non-small cell lung cancer." Anticancer Res 20(1B):
493-6.
Kopczynski, C. C., G. W. Davis and C. S. Goodman (1996). "A neural tetraspanin, encoded
by late bloomer, that facilitates synapse formation." Science 271(5257): 1867-70.
Krajewska, M., H. G. Wang, S. Krajewski, J. M. Zapata, A. Shabaik, R. Gascoyne and J. C.
Reed (1997). "Immunohistochemical analysis of in vivo patterns of expression of
CPP32 (Caspase-3), a cell death protease." Cancer Res 57(8): 1605-13.
Krajewski, S., R. D. Gascoyne, J. M. Zapata, M. Krajewska, S. Kitada, M. Chhanabhai, D.
Horsman, K. Berean, L. D. Piro, I. Fugier-Vivier, Y. J. Liu, H. G. Wang and J. C.
Reed (1997). "Immunolocalization of the ICE/Ced-3-family protease, CPP32
(Caspase-3), in non-Hodgkin's lymphomas, chronic lymphocytic leukemias, and
reactive lymph nodes." Blood 89(10): 3817-25.
Kroon, B. K., S. Horenblas, A. P. Lont, P. J. Tanis, M. P. Gallee and O. E. Nieweg (2005).
"Patients with penile carcinoma benefit from immediate resection of clinically occult
lymph node metastases." J Urol 173(3): 816-9.
Lacombe, M. L., X. Sastre-Garau, I. Lascu, A. Vonica, V. Wallet, J. P. Thiery and M. Veron
(1991). "Overexpression of nucleoside diphosphate kinase (Nm23) in solid tumours."
Eur J Cancer 27(10): 1302-7.
Lagaudriere-Gesbert, C., S. Lebel-Binay, C. Hubeau, D. Fradelizi and H. Conjeaud (1998).
"Signaling through the tetraspanin CD82 triggers its association with the cytoskeleton
leading to sustained morphological changes and T cell activation." Eur J Immunol
28(12): 4332-44.
Lakso, M., P. S. Steeg and H. Westphal (1992). "Embryonic expression of nm23 during
mouse organogenesis." Cell Growth Differ 3(12): 873-9.
Lamkanfi, M., N. Festjens, W. Declercq, T. V. Berghe and P. Vandenabeele (2007).
"Caspases in cell survival, proliferation and differentiation." Cell Death Differ 14(1):
44-55.
Landis, S. H., T. Murray, S. Bolden and P. A. Wingo (1999). "Cancer statistics, 1999." CA
Cancer J Clin 49(1): 8-31, 1.
Laniado, M. E., C. Lowdell, H. Mitchell and T. J. Christmas (2003). "Squamous cell
carcinoma antigen: a role in the early identification of nodal metastases in men with
squamous cell carcinoma of the penis." BJU Int 92(3): 248-50.
Le Naour, F., M. Andre, C. Greco, M. Billard, B. Sordat, J. F. Emile, F. Lanza, C. Boucheix
and E. Rubinstein (2006). "Profiling of the tetraspanin web of human colon cancer
cells." Mol Cell Proteomics 5(5): 845-57.
Lebel-Binay, S., M. L. Gil, C. Lagaudriere, B. Miloux, C. Marchiol-Fournigault, A. QuilletMary, M. Lopez, D. Fradelizi and H. Conjeaud (1994). "Further characterization of
CD82/IA4 antigen (type III surface protein): an activation/differentiation marker of
mononuclear cells." Cell Immunol 154(1): 468-83.
Lebel-Binay, S., C. Lagaudriere, D. Fradelizi and H. Conjeaud (1995). "CD82, tetra-spantransmembrane protein, is a regulated transducing molecule on U937 monocytic cell
line." J Leukoc Biol 57(6): 956-63.
Literatur
87
Lee, C. S., A. Redshaw and G. Boag (1996). "nm23-H1 protein immunoreactivity in laryngeal
carcinoma." Cancer 77(11): 2246-50.
Lee, H. Y. and H. Lee (1999). "Inhibitory activity of nm23-H1 on invasion and colonization
of human prostate carcinoma cells is not mediated by its NDP kinase activity." Cancer
Lett 145(1-2): 93-9.
Lee, J. H., S. R. Park, K. O. Chay, Y. W. Seo, H. Kook, K. Y. Ahn, Y. J. Kim and K. K. Kim
(2004). "KAI1 COOH-terminal interacting tetraspanin (KITENIN), a member of the
tetraspanin family, interacts with KAI1, a tumor metastasis suppressor, and enhances
metastasis of cancer." Cancer Res 64(12): 4235-43.
Levy, S. and T. Shoham (2005). "The tetraspanin web modulates immune-signalling
complexes." Nat Rev Immunol 5(2): 136-48.
Li, J., G. W. Peet, D. Balzarano, X. Li, P. Massa, R. W. Barton and K. B. Marcu (2001).
"Novel NEMO/IkappaB kinase and NF-kappa B target genes at the pre-B to immature
B cell transition." J Biol Chem 276(21): 18579-90.
Lippens, S., M. Kockx, M. Knaapen, L. Mortier, R. Polakowska, A. Verheyen, M. Garmyn,
A. Zwijsen, P. Formstecher, D. Huylebroeck, P. Vandenabeele and W. Declercq
(2000). "Epidermal differentiation does not involve the pro-apoptotic executioner
caspases, but is associated with caspase-14 induction and processing." Cell Death
Differ 7(12): 1218-24.
Liu, F. S., J. T. Chen, J. T. Dong, Y. T. Hsieh, A. J. Lin, E. S. Ho, M. J. Hung and C. H. Lu
(2001). "KAI1 metastasis suppressor gene is frequently down-regulated in cervical
carcinoma." Am J Pathol 159(5): 1629-34.
Liu, F. S., J. T. Dong, J. T. Chen, Y. T. Hsieh, E. S. Ho and M. J. Hung (2000). "Frequent
down-regulation and lack of mutation of the KAI1 metastasis suppressor gene in
epithelial ovarian carcinoma." Gynecol Oncol 78(1): 10-5.
Liu, W. M. and X. A. Zhang (2006). "KAI1/CD82, a tumor metastasis suppressor." Cancer
Lett 240(2): 183-94.
Lo Muzio, L., M. D. Mignogna, G. Pannone, S. Staibano, M. Procaccini, R. Serpico, G. De
Rosa and C. Scully (1999). "The NM23 gene and its expression in oral squamous cell
carcinoma." Oncol Rep 6(4): 747-51.
Lombardi, D. (2006). "Commentary: nm23, a metastasis suppressor gene with a tumor
suppressor gene aptitude?" J Bioenerg Biomembr 38(3-4): 177-180.
Lombardi, D., M. L. Lacombe and M. G. Paggi (2000). "nm23: unraveling its biological
function in cell differentiation." J Cell Physiol 182(2): 144-9.
Lombardi, D., A. Sacchi, G. D'Agostino and G. Tibursi (1995). "The association of the
Nm23-M1 protein and beta-tubulin correlates with cell differentiation." Exp Cell Res
217(2): 267-71.
Lombardi, D. P., J. Geradts, J. F. Foley, C. Chiao, P. W. Lamb and J. C. Barrett (1999). "Loss
of KAI1 expression in the progression of colorectal cancer." Cancer Res 59(22): 572431.
Lopes, A., A. L. Bezerra, C. A. Pinto, S. V. Serrano, O. C. de Mell and L. L. Villa (2002).
"p53 as a new prognostic factor for lymph node metastasis in penile carcinoma:
analysis of 82 patients treated with amputation and bilateral lymphadenectomy." J
Urol 168(1): 81-6.
Lopes, A., G. S. Hidalgo, L. P. Kowalski, H. Torloni, B. M. Rossi and F. P. Fonseca (1996).
"Prognostic factors in carcinoma of the penis: multivariate analysis of 145 patients
treated with amputation and lymphadenectomy." J Urol 156(5): 1637-42.
Lopez-Neblina, F., A. H. Toledo and L. H. Toledo-Pereyra (2005). "Molecular biology of
apoptosis in ischemia and reperfusion." J Invest Surg 18(6): 335-50.
Los, M., C. Stroh, R. U. Janicke, I. H. Engels and K. Schulze-Osthoff (2001). "Caspases:
more than just killers?" Trends Immunol 22(1): 31-4.
Literatur
88
Lummen, G., H. Sperling, M. Pietsch, T. Otto and H. Rubben (1997). "[Treatment and followup of patients with squamous epithelial carcinoma of the penis]." Urologe A 36(2):
157-61.
Ma, D., J. R. McCorkle and D. M. Kaetzel (2004). "The metastasis suppressor NM23-H1
possesses 3'-5' exonuclease activity." J Biol Chem 279(17): 18073-84.
MacDonald, N. J., A. De la Rosa, M. A. Benedict, J. M. Freije, H. Krutsch and P. S. Steeg
(1993). "A serine phosphorylation of Nm23, and not its nucleoside diphosphate kinase
activity, correlates with suppression of tumor metastatic potential." J Biol Chem
268(34): 25780-9.
MacLennan, G. T., M. I. Resnick and D. G. Bostwick (2003). Pathology for urologists.
Philadelphia, Pa., Saunders.
Maecker, H. T., S. C. Todd and S. Levy (1997). "The tetraspanin superfamily: molecular
facilitators." Faseb J 11(6): 428-42.
Mandai, M., I. Konishi, M. Koshiyama, T. Mori, S. Arao, H. Tashiro, H. Okamura, H.
Nomura, H. Hiai and M. Fukumoto (1994). "Expression of metastasis-related nm23H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: correlation with clinicopathology,
EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression." Cancer
Res 54(7): 1825-30.
Martin, D. A., R. M. Siegel, L. Zheng and M. J. Lenardo (1998). "Membrane oligomerization
and cleavage activates the caspase-8 (FLICE/MACHalpha1) death signal." J Biol
Chem 273(8): 4345-9.
Martin, S. J. (1997). Apoptosis and cancer. Basel, Karger Landes Systems.
Martin, S. J. and D. R. Green (1995). "Protease activation during apoptosis: death by a
thousand cuts?" Cell 82(3): 349-52.
Martinez, J. A., S. Prevot, B. Nordlinger, T. M. Nguyen, Y. Lacarriere, A. Munier, I. Lascu, J.
C. Vaillant, J. Capeau and M. L. Lacombe (1995). "Overexpression of nm23-H1 and
nm23-H2 genes in colorectal carcinomas and loss of nm23-H1 expression in advanced
tumour stages." Gut 37(5): 712-20.
Martins, A. C., S. M. Faria, A. J. Cologna, H. J. Suaid and S. Tucci, Jr. (2002).
"Immunoexpression of p53 protein and proliferating cell nuclear antigen in penile
carcinoma." J Urol 167(1): 89-92; discussion 92-3.
Mashimo, T., S. Bandyopadhyay, G. Goodarzi, M. Watabe, S. K. Pai, S. C. Gross and K.
Watabe (2000). "Activation of the tumor metastasis suppressor gene, KAI1, by
etoposide is mediated by p53 and c-Jun genes." Biochem Biophys Res Commun
274(2): 370-6.
Mashimo, T., M. Watabe, S. Hirota, S. Hosobe, K. Miura, P. J. Tegtmeyer, C. W. RinkerShaeffer and K. Watabe (1998). "The expression of the KAI1 gene, a tumor metastasis
suppressor, is directly activated by p53." Proc Natl Acad Sci U S A 95(19): 11307-11.
Maurer, C. A., H. U. Graber, H. Friess, B. Beyermann, D. Willi, P. Netzer, A. Zimmermann
and M. W. Buchler (1999). "Reduced expression of the metastasis suppressor gene
KAI1 in advanced colon cancer and its metastases." Surgery 126(5): 869-80.
McDougal, W. S. (1995). "Carcinoma of the penis: improved survival by early regional
lymphadenectomy based on the histological grade and depth of invasion of the
primary lesion." J Urol 154(4): 1364-6.
McDougal, W. S., F. K. Kirchner, Jr., R. H. Edwards and L. T. Killion (1986). "Treatment of
carcinoma of the penis: the case for primary lymphadenectomy." J Urol 136(1): 38-41.
Mileo, A. M., E. Piombino, A. Severino, A. Tritarelli, M. G. Paggi and D. Lombardi (2006).
"Multiple interference of the human papillomavirus-16 E7 oncoprotein with the
functional role of the metastasis suppressor Nm23-H1 protein." J Bioenerg Biomembr
38(3-4): 215-25.
Literatur
89
Miyazaki, T., H. Kato, Y. Shitara, M. Yoshikawa, K. Tajima, N. Masuda, H. Shouji, K.
Tsukada, T. Nakajima and H. Kuwano (2000). "Mutation and expression of the
metastasis suppressor gene KAI1 in esophageal squamous cell carcinoma." Cancer
89(5): 955-62.
Müllner, M. (2005). Erfolgreich wissenschaftlich arbeiten in der Klinik evidence based
medicine. Wien, Springer.
Mundle, S. D. and A. Raza (1995). "The two in situ techniques do not differentiate between
apoptosis and necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in
apoptosis." Lab Invest 72(5): 611-3.
Murakami, M., K. Lan, C. Subramanian and E. S. Robertson (2005). "Epstein-Barr virus
nuclear antigen 1 interacts with Nm23-H1 in lymphoblastoid cell lines and inhibits its
ability to suppress cell migration." J Virol 79(3): 1559-68.
Muzio, M., B. R. Stockwell, H. R. Stennicke, G. S. Salvesen and V. M. Dixit (1998). "An
induced proximity model for caspase-8 activation." J Biol Chem 273(5): 2926-30.
Myers, R. B., S. Srivastava, D. K. Oelschlager, D. Brown and W. E. Grizzle (1996).
"Expression of nm23-H1 in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma."
Hum Pathol 27(10): 1021-4.
Nagarajah, N. S., N. Vigneswaran and W. Zacharias (2004). "Hypoxia-mediated apoptosis in
oral carcinoma cells occurs via two independent pathways." Mol Cancer 3(1): 38.
Nakagawara, A., Y. Nakamura, H. Ikeda, T. Hiwasa, K. Kuida, M. S. Su, H. Zhao, A. Cnaan
and S. Sakiyama (1997). "High levels of expression and nuclear localization of
interleukin-1 beta converting enzyme (ICE) and CPP32 in favorable human
neuroblastomas." Cancer Res 57(20): 4578-84.
Nakamori, S., O. Ishikawa, H. Ohhigashi, M. Kameyama, H. Furukawa, Y. Sasaki, H. Inaji,
M. Higashiyama, S. Imaoka, T. Iwanaga and et al. (1993). "Expression of nucleoside
diphosphate kinase/nm23 gene product in human pancreatic cancer: an association
with lymph node metastasis and tumor invasion." Clin Exp Metastasis 11(2): 151-8.
Nakatome, M., R. Matoba, Y. Ogura, Z. Tun, M. Iwasa, Y. Maeno, H. Koyama, Y. Nakamura
and H. Inoue (2002). "Detection of cardiomyocyte apoptosis in forensic autopsy
cases." Int J Legal Med 116(1): 17-21.
Nakayama, T., A. Ohtsuru, K. Nakao, M. Shima, K. Nakata, K. Watanabe, N. Ishii, N.
Kimura and S. Nagataki (1992). "Expression in human hepatocellular carcinoma of
nucleoside diphosphate kinase, a homologue of the nm23 gene product." J Natl Cancer
Inst 84(17): 1349-54.
Naumann, C. M., C. van der Horst, B. Volkmer, F. Kurtz, F. J. Martinez Portillo, C. Seif, S.
Hautmann, P. M. Braun, R. Hautmann and K. P. Junemann (2006). "[The influence of
the T stage on the risk of metastasis of penis cancer: T1 vs. T2.]." Urologe A.
Negoescu, A., P. Lorimier, F. Labat-Moleur, C. Drouet, C. Robert, C. Guillermet, C.
Brambilla and E. Brambilla (1996). "In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL
method: improvement and evaluation on cell preparations." J Histochem Cytochem
44(9): 959-68.
Nicholson, D. W. and N. A. Thornberry (1997). "Caspases: killer proteases." Trends Biochem
Sci 22(8): 299-306.
Nicholson, R. I., J. M. Gee and M. E. Harper (2001). "EGFR and cancer prognosis." Eur J
Cancer 37 Suppl 4: S9-15.
Niu, Y., X. Fu, A. Lv, Y. Fan and Y. Wang (2002). "Potential markers predicting distant
metastasis in axillary node-negative breast carcinoma." Int J Cancer 98(5): 754-60.
Oda, Y., H. Walter, K. Radig, I. Rose, W. Neumann and A. Roessner (1995).
"Immunohistochemical analysis of nm23 protein expression in malignant bone
tumors." J Cancer Res Clin Oncol 121(11): 667-73.
Literatur
90
Odintsova, E., T. Sugiura and F. Berditchevski (2000). "Attenuation of EGF receptor
signaling by a metastasis suppressor, the tetraspanin CD82/KAI-1." Curr Biol 10(16):
1009-12.
Okochi, H., M. Kato, K. Nashiro, O. Yoshie, K. Miyazono and M. Furue (1997). "Expression
of tetra-spans transmembrane family (CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 and CD82) in
normal and neoplastic human keratinocytes: an association of CD9 with alpha 3 beta 1
integrin." Br J Dermatol 137(6): 856-63.
Okochi, H., T. Mine, K. Nashiro, J. Suzuki, T. Fujita and M. Furue (1999). "Expression of
tetraspans transmembrane family in the epithelium of the gastrointestinal tract." J Clin
Gastroenterol 29(1): 63-7.
Ono, M., K. Handa, D. A. Withers and S. Hakomori (2000). "Glycosylation effect on
membrane domain (GEM) involved in cell adhesion and motility: a preliminary note
on functional alpha3, alpha5-CD82 glycosylation complex in ldlD 14 cells." Biochem
Biophys Res Commun 279(3): 744-50.
Ornellas, A. A., A. L. Seixas, A. Marota, A. Wisnescky, F. Campos and J. R. de Moraes
(1994). "Surgical treatment of invasive squamous cell carcinoma of the penis:
retrospective analysis of 350 cases." J Urol 151(5): 1244-9.
Orth, K., K. O'Rourke, G. S. Salvesen and V. M. Dixit (1996). "Molecular ordering of
apoptotic mammalian CED-3/ICE-like proteases." J Biol Chem 271(35): 20977-80.
Otsuki, K., R. E. Alcalde, T. Matsumura and N. Kimura (1997). "Immunohistochemical
analysis of nucleoside diphosphate kinases in oral squamous cell carcinomas."
Oncology 54(1): 63-8.
Otsuki, Y., M. Tanaka, S. Yoshii, N. Kawazoe, K. Nakaya and H. Sugimura (2001). "Tumor
metastasis suppressor nm23H1 regulates Rac1 GTPase by interaction with Tiam1."
Proc Natl Acad Sci U S A 98(8): 4385-90.
Parton, M., M. Dowsett and I. Smith (2001). "Studies of apoptosis in breast cancer." Bmj
322(7301): 1528-32.
Patel, D. D., J. M. Bhatavdekar, P. R. Chikhlikar, Y. V. Patel, N. G. Shah, N. Ghosh, T. P.
Suthar and D. B. Balar (1997). "Clinical significance of p53, nm23, and bcl-2 in T34N1M0 oesophageal carcinoma: an immunohistochemical approach." J Surg Oncol
65(2): 111-6.
Philchenkov, A., M. Zavelevich, T. J. Kroczak and M. Los (2004). "Caspases and cancer:
mechanisms of inactivation and new treatment modalities." Exp Oncol 26(2): 82-97.
Philchenkov, A. A. (2003). "Caspases as regulators of apoptosis and other cell functions."
Biochemistry (Mosc) 68(4): 365-76.
Pizzocaro, G., L. Piva, G. Bandieramonte and S. Tana (1997). "Up-to-date management of
carcinoma of the penis." Eur Urol 32(1): 5-15.
Postel, E. H., S. J. Berberich, S. J. Flint and C. A. Ferrone (1993). "Human c-myc
transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a
candidate suppressor of tumor metastasis." Science 261(5120): 478-80.
Protzel, C., J. Knoedel, U. Zimmermann, C. Woenckhaus, M. Poetsch and J. Giebel (2007).
"Expression of proliferation marker Ki67 correlates to occurrence of metastasis and
prognosis, histological subtypes and HPV DNA detection in penile carcinomas."
Histol Histopathol 22(11): 1197-204.
Qian, M., Y. Feng, L. Xu, S. Zheng and X. Zhou (1997). "Expression of antimetastatic gene
nm23-H1 in epithelial ovarian cancer." Chin Med J (Engl) 110(2): 142-4.
Rahman-Roblick, R., U. J. Roblick, U. Hellman, P. Conrotto, T. Liu, S. Becker, D.
Hirschberg, H. Jornvall, G. Auer and K. G. Wiman (2007). "p53 targets identified by
protein expression profiling." Proc Natl Acad Sci U S A 104(13): 5401-6.
Ravi, R. (1993). "Correlation between the extent of nodal involvement and survival following
groin dissection for carcinoma of the penis." Br J Urol 72(5 Pt 2): 817-9.
Literatur
91
Rinker-Schaeffer, C. W. and J. A. Hickson (2006). "Stopping cancer before it colonizes." Nat
Med 12(8): 887-8.
Ro, Y. S. and S. J. Jeong (1995). "Expression of the nucleoside diphosphate kinase in human
skin cancers: an immunohistochemical study." J Korean Med Sci 10(2): 97-102.
Roymans, D., R. Willems, D. R. Van Blockstaele and H. Slegers (2002). "Nucleoside
diphosphate kinase (NDPK/NM23) and the waltz with multiple partners: possible
consequences in tumor metastasis." Clin Exp Metastasis 19(6): 465-76.
Salerno, M., T. Ouatas, D. Palmieri and P. S. Steeg (2003). "!!!Inhibition of signal
transduction by the nm23 metastasis suppressor: possible mechanisms." Clin Exp
Metastasis 20(1): 3-10.
Salerno, M., T. Ouatas, D. Palmieri and P. S. Steeg (2003). "Inhibition of signal transduction
by the nm23 metastasis suppressor: possible mechanisms." Clin Exp Metastasis 20(1):
3-10.
Saraste, A., K. Pulkki, M. Kallajoki, K. Henriksen, M. Parvinen and L. M. Voipio-Pulkki
(1997). "Apoptosis in human acute myocardial infarction." Circulation 95(2): 320-3.
Sastre-Garau, X., M. L. Lacombe, M. Jouve, M. Veron and H. Magdelenat (1992).
"Nucleoside diphosphate kinase/NM23 expression in breast cancer: lack of correlation
with lymph-node metastasis." Int J Cancer 50(4): 533-8.
Satoh, K., K. Kaneko, M. Hirota, T. Toyota and T. Shimosegawa (2000). "The pattern of
CPP32/caspase-3 expression reflects the biological behavior of the human pancreatic
duct cell tumors." Pancreas 21(4): 352-7.
Sawan, A., I. Lascu, M. Veron, J. J. Anderson, C. Wright, C. H. Horne and B. Angus (1994).
"NDP-K/nm23 expression in human breast cancer in relation to relapse, survival, and
other prognostic factors: an immunohistochemical study." J Pathol 172(1): 27-34.
Scambia, G., G. Ferrandina, M. Marone, P. Benedetti Panici, C. Giannitelli, M. Piantelli, A.
Leone and S. Mancuso (1996). "nm23 in ovarian cancer: correlation with clinical
outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters." J Clin
Oncol 14(2): 334-42.
Schimmer, A. D., I. M. Pedersen, S. Kitada, E. Eksioglu-Demiralp, M. D. Minden, R. Pinto,
K. Mah, M. Andreeff, Y. Kim, W. S. Suh and J. C. Reed (2003). "Functional blocks in
caspase activation pathways are common in leukemia and predict patient response to
induction chemotherapy." Cancer Res 63(6): 1242-8.
Schindl, M., P. Birner, B. Bachtiary, G. Breitenecker, E. Selzer and G. Oberhuber (2002).
"KAI1 metastasis suppressor protein in cervical cancer." Am J Pathol 160(4): 1542-3;
author reply 1543.
Schoenfeld, N., M. K. Bauer and S. Grimm (2004). "The metastasis suppressor gene
C33/CD82/KAI1 induces apoptosis through reactive oxygen intermediates." Faseb J
18(1): 158-60.
Schwab, M. (2001). "Encyclopedic reference of cancer." Berlin ; Hong Kong, Springer.
Schwerk, C. and K. Schulze-Osthoff (2003). "Non-apoptotic functions of caspases in cellular
proliferation and differentiation." Biochem Pharmacol 66(8): 1453-8.
Seitz, C. S., R. A. Freiberg, K. Hinata and P. A. Khavari (2000). "NF-kappaB determines
localization and features of cell death in epidermis." J Clin Invest 105(3): 253-60.
Sekita, N., H. Suzuki, T. Ichikawa, H. Kito, K. Akakura, T. Igarashi, T. Nakayama, M.
Watanabe, T. Shiraishi, M. Toyota, O. Yoshie and H. Ito (2001). "Epigenetic
regulation of the KAI1 metastasis suppressor gene in human prostate cancer cell
lines." Jpn J Cancer Res 92(9): 947-51.
Shimada, M., K. Taguchi, H. Hasegawa, T. Gion, K. Shirabe, M. Tsuneyoshi and K.
Sugimachi (1998). "Nm23-H1 expression in intrahepatic or extrahepatic metastases of
hepatocellular carcinoma." Liver 18(5): 337-42.
Literatur
92
Shimizu, S., Y. Eguchi, W. Kamiike, Y. Itoh, J. Hasegawa, K. Yamabe, Y. Otsuki, H.
Matsuda and Y. Tsujimoto (1996). "Induction of apoptosis as well as necrosis by
hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl-XL." Cancer Res
56(9): 2161-6.
Shinohara, T., T. Miki, N. Nishimura, H. Nokihara, H. Hamada, N. Mukaida and S. Sone
(2001). "Nuclear factor-kappaB-dependent expression of metastasis suppressor
KAI1/CD82 gene in lung cancer cell lines expressing mutant p53." Cancer Res 61(2):
673-8.
Sigala, S., I. Faraoni, D. Botticini, M. Paez-Pereda, C. Missale, E. Bonmassar and P. Spano
(1999). "Suppression of telomerase, reexpression of KAI1, and abrogation of
tumorigenicity by nerve growth factor in prostate cancer cell lines." Clin Cancer Res
5(5): 1211-8.
Skinner, D. G., W. F. Leadbetter and S. B. Kelley (1972). "The surgical management of
squamous cell carcinoma of the penis." J Urol 107(2): 273-7.
Slaton, J. W., N. Morgenstern, D. A. Levy, M. W. Santos, Jr., P. Tamboli, J. Y. Ro, A. G.
Ayala and C. A. Pettaway (2001). "Tumor stage, vascular invasion and the percentage
of poorly differentiated cancer: independent prognosticators for inguinal lymph node
metastasis in penile squamous cancer." J Urol 165(4): 1138-42.
Sobin, L. H., C. Wittekind and International Union Against Cancer (2002). TNM
classification of malignant tumours. New York, Wiley-Liss.
Sohn, J. H., D. H. Kim, N. G. Choi, Y. E. Park and J. Y. Ro (2000). "Caspase-3/CPP32
immunoreactivity and its correlation with frequency of apoptotic bodies in human
prostatic carcinomas and benign nodular hyperplasias." Histopathology 37(6): 555-60.
Solsona, E., F. Algaba, S. Horenblas, G. Pizzocaro and T. Windahl (2004). "EAU Guidelines
on Penile Cancer." Eur Urol 46(1): 1-8.
Solsona, E., I. Iborra, J. V. Ricos, J. L. Monros, R. Dumont, J. Casanova and C. Calabuig
(1992). "Corpus cavernosum invasion and tumor grade in the prediction of lymph
node condition in penile carcinoma." Eur Urol 22(2): 115-8.
Solsona, E., I. Iborra, J. Rubio, J. L. Casanova, J. V. Ricos and C. Calabuig (2001).
"Prospective validation of the association of local tumor stage and grade as a
predictive factor for occult lymph node micrometastasis in patients with penile
carcinoma and clinically negative inguinal lymph nodes." J Urol 165(5): 1506-9.
Srinivas, V., M. J. Morse, H. W. Herr, P. C. Sogani and W. F. Whitmore, Jr. (1987). "Penile
cancer: relation of extent of nodal metastasis to survival." J Urol 137(5): 880-2.
Srinivasula, S. M., M. Ahmad, T. Fernandes-Alnemri and E. S. Alnemri (1998).
"Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization." Mol Cell 1(7):
949-57.
Srinivasula, S. M., T. Fernandes-Alnemri, J. Zangrilli, N. Robertson, R. C. Armstrong, L.
Wang, J. A. Trapani, K. J. Tomaselli, G. Litwack and E. S. Alnemri (1996). "The Ced3/interleukin 1beta converting enzyme-like homolog Mch6 and the lamin-cleaving
enzyme Mch2alpha are substrates for the apoptotic mediator CPP32." J Biol Chem
271(43): 27099-106.
Srivatsa, P. J., W. A. Cliby, G. L. Keeney, M. K. Dodson, V. J. Suman, P. C. Roche and K. C.
Podratz (1996). "Elevated nm23 protein expression is correlated with diminished
progression-free survival in patients with epithelial ovarian carcinoma." Gynecol
Oncol 60(3): 363-72.
Steeg, P. S., G. Bevilacqua, L. Kopper, U. P. Thorgeirsson, J. E. Talmadge, L. A. Liotta and
M. E. Sobel (1988). "Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic
potential." J Natl Cancer Inst 80(3): 200-4.
Literatur
93
Steeg, P. S., D. Palmieri, T. Ouatas and M. Salerno (2003). "Histidine kinases and histidine
phosphorylated proteins in mammalian cell biology, signal transduction and cancer."
Cancer Lett 190(1): 1-12.
Stephenson, T. J., J. A. Royds, S. S. Bleehen, P. B. Silcocks and R. C. Rees (1993). "'Antimetastatic' nm23 gene product expression in keratoacanthoma and squamous cell
carcinoma." Dermatology 187(2): 95-9.
Stipp, C. S. and M. E. Hemler (2000). "Transmembrane-4-superfamily proteins CD151 and
CD81 associate with alpha 3 beta 1 integrin, and selectively contribute to alpha 3 beta
1-dependent neurite outgrowth." J Cell Sci 113 ( Pt 11): 1871-82.
Subramanian, C., M. A. Cotter, 2nd and E. S. Robertson (2001). "Epstein-Barr virus nuclear
protein EBNA-3C interacts with the human metastatic suppressor Nm23-H1: a
molecular link to cancer metastasis." Nat Med 7(3): 350-5.
Sun, B. H., J. Zhang, B. J. Wang, X. P. Zhao, Y. K. Wang, Z. Q. Yu, D. L. Yang and L. J.
Hao (2000). "Analysis of in vivo patterns of caspase 3 gene expression in primary
hepatocellular carcinoma and its relationship to p21(WAF1) expression and hepatic
apoptosis." World J Gastroenterol 6(3): 356-360.
Tagawa, K., K. Arihiro, Y. Takeshima, E. Hiyama, M. Yamasaki and K. Inai (1999). "Downregulation of KAI1 messenger RNA expression is not associated with loss of
heterozygosity of the KAI1 gene region in lung adenocarcinoma." Jpn J Cancer Res
90(9): 970-6.
Takahashi, A., E. S. Alnemri, Y. A. Lazebnik, T. Fernandes-Alnemri, G. Litwack, R. D. Moir,
R. D. Goldman, G. G. Poirier, S. H. Kaufmann and W. C. Earnshaw (1996).
"Cleavage of lamin A by Mch2 alpha but not CPP32: multiple interleukin 1 betaconverting enzyme-related proteases with distinct substrate recognition properties are
active in apoptosis." Proc Natl Acad Sci U S A 93(16): 8395-400.
Takata, T., F. Tanaka, T. Yamada, K. Yanagihara, Y. Otake, Y. Kawano, T. Nakagawa, R.
Miyahara, H. Oyanagi, K. Inui and H. Wada (2001). "Clinical significance of caspase3 expression in pathologic-stage I, nonsmall-cell lung cancer." Int J Cancer 96 Suppl:
54-60.
Theodorescu, D., P. Russo, Z. F. Zhang, C. Morash and W. R. Fair (1996). "Outcomes of
initial surveillance of invasive squamous cell carcinoma of the penis and negative
nodes." J Urol 155(5): 1626-31.
Thompson, C. B. (1995). "Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease." Science
267(5203): 1456-62.
Tiso, N., A. Pallavicini, T. Muraro, R. Zimbello, E. Apolloni, G. Valle, G. Lanfranchi and G.
A. Danieli (1996). "Chromosomal localization of the human genes, CPP32, Mch2,
Mch3, and Ich-1, involved in cellular apoptosis." Biochem Biophys Res Commun
225(3): 983-9.
Tobon-Arroyave, S. I., F. A. Villegas-Acosta, S. M. Ruiz-Restrepo, B. Vieco-Duran, M.
Restrepo-Misas and M. L. Londono-Lopez (2004). "Expression of caspase-3 and
structural changes associated with apoptotic cell death of keratinocytes in oral lichen
planus." Oral Dis 10(3): 173-8.
Tomita, M., T. Ayabe, Y. Matsuzaki, M. Edagawa, M. Maeda, T. Shimizu, M. Hara and T.
Onitsuka (2001). "Expression of nm23-H1 gene product in esophageal squamous cell
carcinoma and its association with vessel invasion and survival." BMC Cancer 1: 3.
Tonoli, H. and J. C. Barrett (2005). "CD82 metastasis suppressor gene: a potential target for
new therapeutics?" Trends Mol Med 11(12): 563-70.
Tormanen-Napankangas, U., Y. Soini, K. Kahlos, V. Kinnula and P. Paakko (2001).
"Expression of caspases-3, -6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell
lung carcinoma." Int J Cancer 93(2): 192-8.
Literatur
94
Tseng, Y. H., D. Vicent, J. Zhu, Y. Niu, A. Adeyinka, J. S. Moyers, P. H. Watson and C. R.
Kahn (2001). "Regulation of growth and tumorigenicity of breast cancer cells by the
low molecular weight GTPase Rad and nm23." Cancer Res 61(5): 2071-9.
Ueda, T., T. Ichikawa, J. Tamaru, A. Mikata, K. Akakura, S. Akimoto, T. Imai, O. Yoshie, T.
Shiraishi, R. Yatani, H. Ito and J. Shimazaki (1996). "Expression of the KAI1 protein
in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer." Am J Pathol 149(5): 1435-40.
Vaghefi, H., A. L. Hughes and K. E. Neet (2004). "Nerve growth factor withdrawal-mediated
apoptosis in naive and differentiated PC12 cells through p53/caspase-3-dependent and
-independent pathways." J Biol Chem 279(15): 15604-14.
Varesco, L., M. A. Caligo, P. Simi, D. M. Black, V. Nardini, L. Casarino, M. Rocchi, G.
Ferrara, E. Solomon and G. Bevilacqua (1992). "The NM23 gene maps to human
chromosome band 17q22 and shows a restriction fragment length polymorphism with
BglII." Genes Chromosomes Cancer 4(1): 84-8.
Viel, A., L. Dall'Agnese, V. Canzonieri, F. Sopracordevole, E. Capozzi, A. Carbone, M. C.
Visentin and M. Boiocchi (1995). "Suppressive role of the metastasis-related nm23H1 gene in human ovarian carcinomas: association of high messenger RNA
expression with lack of lymph node metastasis." Cancer Res 55(12): 2645-50.
Villavicencio, H., J. Rubio-Briones, R. Regalado, G. Chechile, F. Algaba and J. Palou (1997).
"Grade, local stage and growth pattern as prognostic factors in carcinoma of the
penis." Eur Urol 32(4): 442-7.
Vogt, A. B., S. Spindeldreher and H. Kropshofer (2002). "Clustering of MHC-peptide
complexes prior to their engagement in the immunological synapse: lipid raft and
tetraspan microdomains." Immunol Rev 189: 136-51.
Volm, M., R. Koomagi, J. Mattern and T. Efferth (2002). "Protein expression profile of
primary human squamous cell lung carcinomas indicative of the incidence of
metastases." Clin Exp Metastasis 19(5): 385-90.
Volm, M., J. Mattern and R. Koomagi (1998). "Association between nm23-H1 expression,
proliferation and apoptosis in non-small cell lung carcinomas." Clin Exp Metastasis
16(7): 595-602.
Wagner, P. D. and N. D. Vu (2000). "Phosphorylation of geranyl and farnesyl pyrophosphates
by Nm23 proteins/nucleoside diphosphate kinases." J Biol Chem 275(45): 35570-6.
Wallet, V., R. Mutzel, H. Troll, O. Barzu, B. Wurster, M. Veron and M. L. Lacombe (1990).
"Dictyostelium nucleoside diphosphate kinase highly homologous to Nm23 and Awd
proteins involved in mammalian tumor metastasis and Drosophila development." J
Natl Cancer Inst 82(14): 1199-202.
Ward, J. M., N. Konishi, M. Ohshima, P. W. Lamb, C. L. Jorcyk and J. C. Barrett (1998).
"Expression of KAI1 in paraffin-embedded normal, hyperplastic and neoplastic
prostate and prostate carcinoma cell lines." Pathol Int 48(2): 87-92.
Welch, D. R., P. S. Steeg and C. W. Rinker-Schaeffer (2000). "Molecular biology of breast
cancer metastasis. Genetic regulation of human breast carcinoma metastasis." Breast
Cancer Res 2(6): 408-16.
Wellington, C. L., L. M. Ellerby, A. S. Hackam, R. L. Margolis, M. A. Trifiro, R. Singaraja,
K. McCutcheon, G. S. Salvesen, S. S. Propp, M. Bromm, K. J. Rowland, T. Zhang, D.
Rasper, S. Roy, N. Thornberry, L. Pinsky, A. Kakizuka, C. A. Ross, D. W. Nicholson,
D. E. Bredesen and M. R. Hayden (1998). "Caspase cleavage of gene products
associated with triplet expansion disorders generates truncated fragments containing
the polyglutamine tract." J Biol Chem 273(15): 9158-67.
White, A., P. W. Lamb and J. C. Barrett (1998). "Frequent downregulation of the
KAI1(CD82) metastasis suppressor protein in human cancer cell lines." Oncogene
16(24): 3143-9.
Literatur
95
Wittekind, C. and International Union Against Cancer (2004). TNM atlas : illustrated guide to
the TNM/pTNM classification of malignant tumours. Berlin ; London, Springer.
Wolf, B. B. and D. R. Green (1999). "Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase
family proteinases." J Biol Chem 274(29): 20049-52.
Wolozin, B., K. Iwasaki, P. Vito, J. K. Ganjei, E. Lacana, T. Sunderland, B. Zhao, J. W.
Kusiak, W. Wasco and L. D'Adamio (1996). "Participation of presenilin 2 in
apoptosis: enhanced basal activity conferred by an Alzheimer mutation." Science
274(5293): 1710-3.
Wong, C. W., A. Lee, L. Shientag, J. Yu, Y. Dong, G. Kao, A. B. Al-Mehdi, E. J. Bernhard
and R. J. Muschel (2001). "Apoptosis: an early event in metastatic inefficiency."
Cancer Res 61(1): 333-8.
Wu, D. H., L. Liu, L. H. Chen and Y. Q. Ding (2004). "KAI1 gene expression in colonic
carcinoma and its clinical significances." World J Gastroenterol 10(15): 2245-9.
Yamaguchi, A., T. Urano, T. Goi, K. Takeuchi, S. Niimoto, G. Nakagawara, K. Furukawa and
H. Shiku (1994). "Expression of human nm23-H1 and nm23-H2 proteins in
hepatocellular carcinoma." Cancer 73(9): 2280-4.
Yan, S. F., Y. S. Zou, M. Mendelsohn, Y. Gao, Y. Naka, S. Du Yan, D. Pinsky and D. Stern
(1997). "Nuclear factor interleukin 6 motifs mediate tissue-specific gene transcription
in hypoxia." J Biol Chem 272(7): 4287-94.
Yang, X., H. Y. Chang and D. Baltimore (1998). "Autoproteolytic activation of pro-caspases
by oligomerization." Mol Cell 1(2): 319-25.
Yang, X., H. Y. Chang and D. Baltimore (1998). "Essential role of CED-4 oligomerization in
CED-3 activation and apoptosis." Science 281(5381): 1355-7.
Yang, X., L. Wei, C. Tang, R. Slack, E. Montgomery and M. Lippman (2000). "KAI1 protein
is down-regulated during the progression of human breast cancer." Clin Cancer Res
6(9): 3424-9.
Yi, X. B., N. M. Seitzer and S. O. A. de (1996). "Neutralizing antibodies to nucleoside
diphosphate kinase inhibit the enzyme in vitro and in vivo: evidence for two distinct
mechanisms of activation of atrial currents by ATPgammaS." Biochim Biophys Acta
1310(3): 334-42.
Young, R. H., A. L. Cubilla and Armed Forces Institute of Pathology (2000). "Atlas of tumor
pathology." Washington, D.C..
Yu, Y., J. L. Yang, B. Markovic, P. Jackson, G. Yardley, J. Barrett and P. J. Russell (1997).
"Loss of KAI1 messenger RNA expression in both high-grade and invasive human
bladder cancers." Clin Cancer Res 3(7): 1045-9.
Zanotti, S., A. Fisseler-Eckhoff and H. G. Mannherz (2003). "Changes in the topological
expression of markers of differentiation and apoptosis in defined stages of human
cervical dysplasia and carcinoma." Gynecol Oncol 89(3): 376-84.
Zhang, X. A., B. He, B. Zhou and L. Liu (2003). "Requirement of the p130CAS-Crk coupling
for metastasis suppressor KAI1/CD82-mediated inhibition of cell migration." J Biol
Chem 278(29): 27319-28.
Zhang, X. A., W. S. Lane, S. Charrin, E. Rubinstein and L. Liu (2003). "EWI2/PGRL
associates with the metastasis suppressor KAI1/CD82 and inhibits the migration of
prostate cancer cells." Cancer Res 63(10): 2665-74.
Zhou, B., L. Liu, M. Reddivari and X. A. Zhang (2004). "The palmitoylation of metastasis
suppressor KAI1/CD82 is important for its motility- and invasiveness-inhibitory
activity." Cancer Res 64(20): 7455-63.
Danksagung
Herrn Prof. Dr. K.-J. Klebingat, Direktor der Klinik für Urologie, danke ich für die
Überlassung des Themas und die hervorragende Unterstützung.
Herrn Prof. J. Fanghänel, ehemaliger Direktor des Institutes für Anatomie und Zellbiologie,
und Herrn Prof. K. Endlich, Direktor des Institutes für Anatomie und Zellbiologie, danke ich
für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
Herrn Prof. J. Giebel danke ich für die Planung, die Durchführung und die kritische
Beurteilung
der
experimentellen
Versuchsergebnisse
sowie
für
fortwährende
Diskussionsbereitschaft, mit der ein wissenschaftliches Arbeiten möglich wurde.
Herrn Dr. C. Protzel danke ich für sein hohes persönliches Engagement, mit dem er sich in
unzähligen Stunden dem Thema widmete und der maßgeblich als Mentor für die Umsetzung
verantwortlich war.
Außerdem möchte ich Frau Bansemir, Mitarbeiterin des Institutes für Anatomie, danken, die
häufig in Rat und Tat, bei der Durchführung der Untersuchungen, unterstützend zur Seite
stand.
Meiner Großtante danke ich für die Durchsicht und die Korrektur von Unzulänglichkeiten bei
Rechtschreibung und Grammatik.
Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter, ohne ihre Unterstützung wären das Studium sowie
die Promotion nicht möglich gewesen.
97
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Christoph Kakies
98
Lebenslauf
Zur Person
Name:
Vorname:
Adresse:
Kakies
Christoph
E.-Böhmke-Str.12
17489 Greifswald
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Familienstand:
Konfession:
30.Mai 1980
Greifswald
ledig
evangelisch
Schulbildung
1986 - 1992
1992 - 1998
1998
Grundschule Greifswald
Gymnasium Greifswald
Abitur
Wehrdienst
1998 - 2000
Soldat auf Zeit im Sanitätsdienst der Bundeswehr,
Panzerbataillon 423 Brück
Studium
2000 - 2007
2007
Studium der Humanmedizin an der EMAU-Greifswald
Staatsexamen
Berufliche Tätigkeit
2007 - 2008
2008
Weiterbildungsassistent in den Fachbereichen Chirurgie/
Urologie am Neurologischen Rehabilitationszentrum
Greifswald
Weiterbildungsassistent im Fachbereich Pathologie an
der EMAU-Greifswald
Herunterladen
Explore flashcards