PRAKTIKUM BIOLOGEN-F / BIOCHEMIE III RNA

PRAKTIKUM
BIOLOGEN-F / BIOCHEMIE III
RNA-Biochemie
Iris Fransson, Nicolas Piganeau und Margot Binnewies
02.02.2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1
1.2
1.3
RNA-Interferenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ribozyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kontinuierliche in vitro Evolution . . . . . . . . . . . . . . . .
3
3
6
8
2 Praktikumsversuch: Untersuchung der Ribozymaktivität des
Hepatitis-δ -Virus
9
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
Herstellung des Templates mittels PCR . . . . . .
Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung
in-vitro T7 - Transkription . . . . . . . . . . . . .
UV-Shadowing . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Elution von RNA aus Polyacrylamidgelen . . . . .
Ribozymatische Spaltung . . . . . . . . . . . . . .
3 Praktikumsversuch: RNA-Interferenz
3.1
3.2
3.3
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Herstellung von eigener siRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1 Herstellung des DNA Templates mittels PCR zur siRNA Herstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung . . .
3.1.3 in-vitro T7 - Transkription . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.4 Gröÿen-Ausschluss-Chromatographie mit BioSpin P30 .
3.1.5 Hybridisierung der RNA . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.6 ShortCut RNase III Behandlung . . . . . . . . . . . . .
3.1.7 Ethanolfällung der siRNA . . . . . . . . . . . . . . . .
Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Subkultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Zellzahlbestimmmung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transfektion von eukaryotischen Zellen . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Transfektion und Stabilisierung von HeLa-Zellen mit
dem Grün-Fluoreszierenden Protein-Plasmid . . . . . .
3.3.2 Transfektion von HELA-Zellen mit siRNA . . . . . . .
1
9
10
11
12
12
12
14
14
16
16
17
17
18
18
19
19
20
20
22
22
23
3.3.3
Durchusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie . . . 24
4 Praktikumsversuch: kontinuierliche in vitro Evolution eines
Ligase Ribozyms
27
4.1
4.2
4.3
4.4
PCR zur Herstellung der DNA Matrize des Ligase-Ribozyms
4.1.1 PCR Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.2 Konzentrationsbestimmung der DNA . . . . . . . . .
Mutations PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 PCR Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Konzentrationsbestimmung der mutagenen DNA . . .
4.2.3 T7-Transkription der Mutations-PCR . . . . . . . . .
Durchführung der kontinuierliche in vitro Evolution . . . . .
4.3.1 Amplikation der selektierten DNA . . . . . . . . . .
4.3.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung . .
4.3.3 T7-Transkription der selektierten DNA und der Ausgangs ('wild-typ') DNA . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ligase-Ribozym Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 Allgemeine Arbeitsvorschriften
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Allgemeine Arbeitshinweise beim Arbeiten mit RNA . . . .
5.1.1 Herstellung von RNase-freien Lösungen . . . . . . . .
Agarose-Gel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1 Native Acrylamid Gelelektrophorese . . . . . . . . . .
5.3.2 Denaturierende Acrylamid Gelelektrophorese . . . . .
5.3.3 Nachweis von Nukleinsäuren in Gelen mittels Ethidiumbromidfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung von RNA
oder DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4.1 Phenol-Chloroform-Extraktion von RNA oder DNA .
5.4.2 Ethanolfällung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . .
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren . . . . . . . .
5.5.1 Anleitung zum NanoDrop Photometer . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
28
30
31
31
32
32
32
33
34
35
. 35
. 36
.
.
.
.
.
.
37
37
37
38
38
39
41
. 42
.
.
.
.
.
42
42
43
43
44
6 Puer und Lösungen
45
7 Anhang
47
2
Kapitel 1
Einleitung
Jahrzehntelang galt die Ribonukleinsäure als ein ebenso nützlicher, wie belangloser Bote der Erbsubstanz DNA: RNA kopiert die im Zellkern gespeicherte Abfolge der Erbinformation und transportiert die genetische Daten
innerhalb der Zelle zu den Ribosomen, wo dann die Proteinbiosynthese abläuft. Doch in den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass RNA weitaus mehr ist,
als ein simpler Bote. Die Entdeckung, dass RNAs, wie auch Proteinenzyme
katalytische Eigenschaften besitzen können, wurde 1989 mit dem Nobelpreis
geehrt [1, 2]. So konnte gezeigt werden, dass eine rRNA des Ciliaten Tetrahymena thermophilia in der Lage ist, sich selbstkatalytisch zu spalten [3]. Kleine
nichtkodierende RNA, die noch bis vor kurzem als zellulärer Ballast abgetan
wurden, entpuppten sich in den letzten Jahren als Schlüsselkomponeneten
eines evolutionär konservierten System einer RNA-basierten Genregulation
in Eukaryoten. Diese sogenannten miRNAs und siRNAs sind beteiligt an vielen molekularen Prozessen, wie Verteidigung gegen Viren und der Regulation
der Genexpression während der Entwicklung.
1.1 RNA-Interferenz
In den letzten Jahren wurde die Sequenzierung von Genomen verschiedener
Organismen fertiggestellt. Das führte zu einer immensen Menge an Informationen, vor allem hinsichtlich der Sequenzen und Expressionsmustern von unbekannten Genen, die in den nächsten Jahren oder Jahrzehnten ausgewertet
werden müssen. Für die Aufklärung von verschiedenen Genfunktionen stehen heutzutage eine Reihe von Hilfsmitteln zur Verfügung, wie zum Beispiel
knock-out Mutanten, antisense-Oligonukleotide, Aptamere oder Ribozyme.
Um diese Fragestellungen auf DNA-Ebene lösen zu können, werden bspw.
knock-out Mutanten generiert, d.h. Mutanten, bei denen Gene selektiv aus3
geschaltet worden sind. Dafür ist allerdings oft jahrelange Arbeit notwendig,
da dies bei ganzen Organismen sehr schwierig ist. Ein weiteres Problem besteht auch, wenn das Ausschalten eines Gens letal wirkt, dann sind solche
knock-out Varianten berhaupt nicht möglich. Daher werden solche Studien
jetzt immer öfter auf Ebene der mRNA durchgeführt. Eine Methode, die dabei benutzt werden kann, ist die antisense-Oligonukleotid-(as-ON)-Technik.
Die Inhibierung von Genexpression durch antisense-Nukleinsäuren ist schon
länger als 25 Jahre bekannt. Ende der 70-er Jahre wurde von Stephenson
und Zamecnik gezeigt, dass ein sequenzspezisches Binden von Oligos mit
der Translations-Maschinerie interferiert [4] . Desweiteren können as-ON auch
dazu verwendet werden, um spezisch eine Spleiss-Variante gegenber anderen
zu favorisieren. Die meisten Anwendungen mit as-ON zielen jedoch auf die
spezische Inhibierung der Genexpression entweder einfach durch Blockierung der Translation (siehe Abbildung 1.1) oder durch Aktivierung der Ribonuklease H. Alternativ zu synthetischen as-ON kann auch intrazellulär
exprimierte as-RNA die Genexpression inhibieren. Doch alle diese Ansätze
Abbildung 1.1: Verschiedende Mechanismen der Inhibierung der Genexpression
durch antisense-Oligonukleotide A Sind die antisense-ON komplementär zum 5'-
Ende der mRNA, verhindern sie die Bindung des Ribosoms durch Maskierung der
ribosomalen Bindungsstelle. B Binden die antisense-ON irgendwo innerhalb der
mRNA, so verhindern sie die ribosomale Translokation
können durch RNA-Interferenz (RNAi) ersetzt werden, da in dieser Technologie mehr Potential vorhanden ist Proteinfunktionen aufzuklären, als in
den oben genannten. Das Phänomen der RNA-Interferenz wurde erstmalig
1998 von Fire und Mello beschrieben [5]. Sie entdeckten, dass um die gleichen
inhibitorischen Eekte zu erzielen, bei einer gleichzeitigen Applikation von
sense und antisense RNA in C. elegans eine etwa zehnfach geringere Menge notwendig ist, im Vergleich zu antisense RNA allein. Sie konnten zeigen,
dass die Inhibierung der Genexpression, durch doppelsträngige Ribonukleinsäuren (dsRNA) ausgelöst wird und nannten das ganze RNA-Interferenz.
RNA-Interferenz ist der gemeinsame Nenner für ein posttranskriptionales
4
gene-silencing Phänomen, welches in einer Vielzahl eukaryotischer Organismen beobachtet werden kann. Die in die Zellen eingeschleuste dsRNA führt
zum Abbau endogener mRNA, die mit der dsRNA sequenzidentisch ist. Diese sehr eindrucksvolle Technik funktioniert jedoch sequenzspezisch in der
oben beschriebenen Art und Weise allerdings nur in Modellorganismen, wie
C.elegans und Drosophila, währenddessen Versuche diese Technologie auch
in Säugerzellen anzuwenden zu einer nichtspezischen Suppression der Genexpression führte. Längere dsRNA (grösser als 30 bp) induzieren in Säugerzellen eine Immunantwort, die zur Ausschüttung von Interferonen führt.
Diese Antwort führt zur Aktivierung verschiedener Enzyme, wie bspw. die
Proteinkinase R (PKR), die RNase L und die 2',5'-Oligo-Adenylat-Synthase
(2',5'-AS). Aktivierte PKR hemmt die Proteintranslation durch Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors eIF2α, währenddessen aktivierte 2',5'-AS
zu einer unspezischen mRNA-Degradierung führt, da 2',5'-Oligo-Adenylat
die RNase L aktiviert. Das ganze führt dann zu einer allgemeinen und sequenzunspezischen Hemmung der Genexpression und zu einem völlig verändertem Phänotyp. Durch die Aufklärung der molekularen Mechanismen
Abbildung 1.2: Vorgeschlagener Mechanismus von RNA-Interferenz. Nähere Erläuterungen im Text
von RNA-Intereferenz konnte dann auch dieses Problem umgangen werden.
5
Wird in eine Zelle dsRNA eingeschleust, so wird diese im ersten Schritt in
21-25 nt lange Fragmente, die sogenannten siRNAs (small interfering RNAs)
gespalten. Alle siRNAs besitzen an ihren 3'-Enden einen jeweils 2 Nukleotide langen Überhang. Das katalytisch aktive Enzym in diesem Schritt ist
DICER, eine RNase III-ähnliche Nuklease. Im zweiten Schritt lösen dann
diese Oligos die Hydrolyse von RNA mit gleicher Sequenz aus. Die siRNAs
sind demnach die aktive Komponente der RNA-Interferenz. Die Nuklease die
diesen zweiten Schritt katalysiert ist bisher noch unbekannt. Es wird vermutet, dass die siRNAs, sowie einige Proteine einen Ribonukleotid-ProteinPartikel bilden, der unter ATP-Verbrauch das Entwinden des RNA-Duplexes
fördert und letztendlich zur Aktivierung des RNA-induced silencing complex
(RISC) führt. Möglicherweise präsentiert RISC den antisense-siRNA-Strang
und führt schliesslich zum Abbau der mRNA (siehe Abbildung 1.2). RNAInterferenz ist in sehr vielen eukaryotischen Organismen relativ hoch konserviert und kann daher als Tool in vielen Zellen und auch Organismen eingesetzt werden. Während, wie schon gesagt, in C.elegans und Drosophila lange
dsRNA eingesetzt werden kann, muss in Säugerzellen siRNA verwendet werden, das Spaltprodukt des RISC/DICER-Komplexes und die eigentlich aktive
Komponente [6] . Die siRNAs, die für biochemische Fragestellungen eingesetzt werden sind meist 21 Nukleotide lang und bestehen damit aus einer
19 bp langen Doppelhelix mit jeweils 3'-Überhängen, die auf beiden Seiten 2
Nukleotide lang sind. siRNAs, die nur wenig kürzer oder länger sind als 21
Nukleotide, sind weniger inhibitorisch. Genauso wie die Länge der RNA ist
auch der 3'-Überhang kritisch, da gezeigt werden konnte, dass siRNAs ohne oder veränderten Überhängen (länger, kürzer oder 5'-Überhänge) weniger
aktiv sind. Im Praktikum soll nun am Beispiel der Repression des Grün Fluoreszierenden Proteins die Wirkungsweise von RNA-Intereferenz demonstriert
werden.
1.2 Ribozyme
Katalytisch aktive RNA wurde erstmalig Ende der 80-er Jahre beschrieben.
Der Gedanke, dass auch RNA katalytisch aktiv sein soll, war zunächst überraschend, da Nukleinsäuren die chemische Diversität von Proteinen fehlt.
Trotzdem können RNA-Enzyme, ähnlich wie auch Proteine Reaktionen um
den Faktor 105 bis 1011 beschleunigen. Erst in den letzten Jahren gab es grosse Fortschritte hinsichtlich der Aufklärung und im Verständnis von Struktur
und Funktion katalytisch aktiver RNA-Moleküle. Vor allem Kristallstrukturen, die von einigen Ribozymen mittlerweile existieren, haben detaillierte
Einblicke in die Ribozymwelt gestattet. Bisher konnten sieben Klassen na6
Abbildung 1.3: Mechanismus der RNA-Spaltung durch Säure-Base-Katalyse und
Zwei-Metall-Ionen-Katalyse. :B ist die allgemeine Base und H-A die allgemeine
Säure [8].
türlich vorkommender Ribozyme identiziert werden, von denen alle entweder die Spaltung oder Ligation von RNA-Molekülen katalysieren [7]. Einzige
Ausnahme bildet hier das Ribosom, von dem auch gezeigt werden konnte,
dass es als Ribozym wirkt. Grob einteilen lassen sich natürlich vorkommende Ribozyme einerseits in die sogenannten kleinen Ribozyme, wie z.B. das
Hammerhead-Ribozym, das hairpin-Ribozym oder das Hepatitis Delta Virus
Ribozym. Diese Ribozyme ndet man in viralen, virosoiden oder SatellitenRNA-Genomen, wobei sie für die Prozessierung der Replikationsprodukte, die
in einem rolling circle Mechanismus repliziert werden, verantwortlich sind.
Der Reaktionsmechanismus dieser Ribozyme ist dabei ganz ähnlich zu denen von RNasen (siehe Abbildung 1.3), wobei ein 2',3'-Cyclophosphat und
ein freies 5'-Hydroxylende entstehen. Weitere Ribozymklassen sind die bspw.
Gruppe I und II-Introns, die grösser und komplexer aufgebaut sind als die
kleinen Ribozyme. Desweiteren unterscheiden sie sich auch hinsichtlich des
Reaktionsmechanismus. Das Nukeophil und die zu spaltende Phosphatgruppe liegen hier entweder auf verschiedenen Molekülen (Gruppe I-Introns Abbildung 1.4) oder liegen auf dem gleichen Strang sind aber in der Primärsequenz weit voneinander entfernt (Gruppe II-Introns - Abbildung 1.4). Die
komplexe Faltung dieser Ribozyme dient daher vor allem dazu, das Nukeophil und die zu spaltende Phosphatgruppe in die richtige Orientierung zueinander zu bringen. Neben den natürlich vorkommenden Ribozymen, können
auch RNA-Moleküle selektiert werden, die bestimmte, auch nichtnatürliche
chemische Reaktionen katalysieren können. So konnten bspw. durch in vitro 7
Abbildung 1.4: Splicing Mechanismus der Gruppe I-Introns (links) und der Gruppe II-Introns (rechts)
Selektion RNAs gefunden werden, welche die Knüpfung einer C-C-Bindung
katalysieren [9, 10].
1.3 Kontinuierliche in vitro Evolution
Alle natürlich vorkommende Enzyme sind das Produkt Darwinscher Evolution. Dieser Prozess der natürlichen Evolution kann auch im Labor durchgeführt werden. Verschiedenste in vitro Evolutionsexperimente haben zur Selektion künstlicher Liganden (z.B. Aptamere) oder künstlicher Enzyme (z.B.
RNA Ligase Ribozym) geführt. Mittels kontinuierlicher in vitro Evolution
können die Veränderungen innerhalb einer Ribozympopulation, die durch
Veränderung der äusseren Bedingungen hervorgerufen werden, beobachtet
werden. Die kontinuierliche in vitro Evolution von Ribozymen ist möglich,
da RNAs den Genotyp und den Phänotyp vereinen. Daher ist es möglich
Ribozyme ähnlich wie Bakterien im Reagenzglas zu kultivieren, wobei nach
mehreren Generationen die ttesten Moleküle die Population dominieren (siehe auch Bild 4.1).
8
Kapitel 2
Praktikumsversuch:
Untersuchung der
Ribozymaktivität des
Hepatitis-δ -Virus
2.1 Herstellung des Templates mittels PCR
Zur Herstellung von RNA wird RNA in vitro transkribiert. Hierzu werden
virale Transkriptionssysteme eingesetzt, da diese Enzyme sehr spezisch ihre
eigenen Promotoren erkennen und aus einer einzigen Peptidkette bestehen.
Zur Anwendung kommen hier vor allem die T7- , die T3 und die SP6-RNAPolymerase aus den entsprechenden Bakteriophagen.
Als Template für die Polymerasen dient doppelsträngige lineare DNA. Das
kann entweder ein linearisiertes Plasmid oder wie in unserem Fall ein PCRProdukt sein. Die Darstellung des Templates über PCR hat auÿerdem den
Vorteil, dass über die Primer eventuell ein nicht vorhandener Promotor eingeführt werden kann.
9
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes, Gesamtvolumen 100 µL
PCR-Puer
Fermentas KCl (ohne MgCl2 )
Vorwärtsprimer
(pUC18_forward)
Rückwärtsprimer
(HDV_rev)
dNTP-Mix
MgCl2
Template
Taq-DNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
10x
1x
10 µL
100 µM
1 µM
1 µL
100 µM
10 mM each
25 mM
1 µM
200 µM
1,5 mM
500 pM
2U
ad 100 µL
1 µL
2 µL
µL
2 µL
2 µL
µL
1 U/µl
Der PCR-Ansatz wird mit dem folgenden Temperaturprogramm inkubiert.
CNTR
Lid
wait
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Tube
= 105◦ C
auto
2 min bei 95◦ C
für 30 cyclen
30 sec bei 95◦ C
30 sec bei 55◦ C bis 60◦ C
30 sec bei 72◦ C
nale Elongation
hold
5 min bei 72◦ C
4◦ C
Beginn Cyclus
Ende Cyclus
5 µL der PCR werden mit DNA-Ladepuer versetzt und auf einem 2%igen Agarosegel getrennt (siehe hierzu Vorschrift 5.2 ). Die zu erwartende
PCR-Bande sollte eine Länge von ca. 350 Basenpaare haben.
2.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung
Der PCR-Ansatz wird wie beschrieben in 5.4.1 mit Phenol-Chloroform extrahiert. Anschlieÿend ndet eine Ethanolfällung gemäÿ Vorschrift 5.4.2 statt.
10
Abbildung 2.1: T7 Transkription
Das Pellet wird in 10 µL RNase-freiem Wasser aufgenommen und komplett
zur T7-Transkription eingesetzt. Eventuell kann die Konzentration am NanoDrop Photometer gemäÿ Vorschrift 5.5.1 gemessen werden.
2.3 in-vitro T7 - Transkription
Bei der T7 Transkription wird doppelsträngige DNA als Matrize genutzt und
in RNA umgeschrieben. Hierbei dient als Transkriptionsstart eine spezische
Promotersequenz, die von der RNA-Polymerase erkannt wird. Es werden von
RNA Polymerasen nur doppelsträngige DNA Promotersequenzen erkannt.
Die T7-RNA Polymerase erkennt folgende T7-Promotersequenz (siehe Abbildung 2.1) und transkribiert wie dargestellt die DNA in RNA.
Zur T7-Transkription werden folgende Komponenten gemischt:
Transkriptions-Puer
von Fermentas
NTP-Mix
DNA Template
Ribonuclease Inhibitor
RiboLock von Fermentas
T7 RNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
5x
10 mM each
1x
2,0 mM
1 µg
50 u
10 µL
10 µL
10 µL
1,25 µL
40 u
ad 50 µL
2 µL
40 u / µL
20 u / µl
Der T7-Transkription-Ansatz wird für 1 Stunde (bis max 2 Stunden) bei
37◦ C inkubiert. Der Ansatz wird mit saurem Phenol-Chloroform extrahiert
11
(siehe 5.4.1) und mit Ethanol gefällt (siehe 5.4.2). Das getrocknete Pellet
wird in 10 µL 8 M Harnsto gelöst und anschlieÿend präparativ in einem
denaturierenden Acrylamid-Gel (siehe 5.3.2) getrennt. Die Banden werden
mittels UV-shadowing detektiert, ausgeschnitten und eluiert.
2.4 UV-Shadowing
Die Methode des UV-Shadowing bietet die Möglichkeit Nukleinsäuren aufgrund ihres hohen Absorptionskoezienten in Polyacrylamid-Gelen zu dokumentieren, ohne sie anfärben zu müssen. Dazu wird das in Klarsichtfolie
eingeschlagene Gel auf eine Dünnschichtchromatographieplatte mit Fluoreszenzindikator gelegt. Nukleinsäurenbanden können durch aufgestrahltes UVLicht (254 nm) mit einer Handleuchte als Schatten auf der Kieselgelplatte
detektiert werden. Durch die geringe Empndlichkeit (≥ 0,3 µg) eignet sich
diese Art der Detektion vor allem für präparative Reinigung von Nukleinsäuren. Um UV-induzierte Schäden an den Nukleinsäuren zu vermeiden, sollte
das UV-Licht möglichst kurz eingestrahlt werden. Die Banden werden mit
einem Folienmarker markiert und mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die
Gelstücke werden zerkleinert in ein 1,5 mL Gefäÿ überführt. Anschlieÿend
folgt die Elution der RNA aus dem Gel.
2.5 Elution von RNA aus Polyacrylamidgelen
Die mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigte und durch UV-Shadowing
detektierte RNA wird durch Diusionselution aus dem Gel extrahiert. Dazu
werden die zerkleinerten Gelstücke mit 500 µl RNA-Elutionspuer versetzt
und um eine vorzeitige Ribozymaktivität zu verhindern bei 4◦ C über Nacht
extrahiert. Anschliessend werden die Gelstücke abzentrifugiert, der Überstand in ein neues Tube überfuhrt und die extrahierte RNA mit 2 Volumina
Ethanol rund 60 min im Eis gefällt. Die gefällte RNA wird anschliessend
20 min bei 13.200 rpm zentrifugiert, mit 70%-igem Ethanol gewaschen und
an der Luft getrocknet. Das Pellet wird in 50 µL 2 mM EDTA-Lösung aufgenommen. 1 µL der Lösung werden in 50 µL Wasser verdünnt und die
Konzentration der Lösung wird photometrisch bestimmt (siehe 5.5.1).
2.6 Ribozymatische Spaltung
Für die ribozymatische Spaltung werden 9 pmol Ribozym RNA in 2 mM
EDTA-Lösung auf ein Volumen von 540 µl gebracht. Zur Molaritätsberech12
nung kann eine mittlere Molmasse von 340 g/mol pro Nukleotid verwendet
werden.
Um eine möglichst gleichmässige und native, dass heisst aktive Faltung zu
gewährleisten, wird der Ansatz zunächst für drei Minuten bei 94◦ C denaturiert, für zwei Minuten auf Eis inkubiert und anschliessend noch für fünf
Minuten bei 37◦ C inkubiert. Die Spaltung wird durch Zugabe von 60 µl Ribozymspaltungspuer eingeleitet.
Zur Kontrolle wird das gleiche Experiment mit Ribozymspaltungspuer OHNE Magnesiumchlorid durchgeführt.
Die Spaltungsansätze werden bei 37◦ C inkubiert und zum Zeitpunkt 0 und
nach 30 und 120 min werden jeweils 200 µl abgenommen, die sofort mit
NaAc und Ethanol (siehe 5.4.2) gefällt werden. Da die RNA-Konzentration
sehr gering ist, wird zur Unterstützung der Fällung 2 µl Glykogen (10 µg/µl)
als Carrier zugesetzt. Die Pellets werden jeweils in 10 µl 8M Harnstoösung
aufgenommen und auf einem 8 % - igen Harnsto-Polyacrylamidgel getrennt
(siehe 5.3.2).
Das gespaltene Ribozym sollte als 2 Banden in Höhe von ca. 100 bp und 180
bp laufen.
13
Kapitel 3
Praktikumsversuch:
RNA-Interferenz
In diesem Praktikumsversuch wird die Expression des grün-uoreszierenden
Proteins (GFP) mittels der Technik der RNA-Interferenz herunter geregelt.
Hierzu werden zum einen HeLa Zellen mit einem Plasmid transziert, dass
das grün-uoreszierende Protein kodiert, zum anderen wird eine mit GFP
stabil transzierte HeLa Zelllinie verwendet. Zur Herunterregulierung der
GFP Expression wird siRNA (small interfering RNA) verwendet. Hierbei
wird im Rahmen des Praktikums zum einen eigene siRNA hergestellt und
zum anderen kommerziell gekaufte siRNA (von der Firma Qiagen), die mit
dem roten Fluoreszenfarbsto Rhodamin gelabelt ist, verwendet.
3.1 Herstellung von eigener siRNA
Bei siRNA handelt es sich um kurze (17-25 nt) doppelsträngige RNA mit zwei
am 3'-überhängenden Nukleotiden. Solche siRNA lässt sich mit ShortCut
RNase III (von der Firma New England Biolabs) aus langer doppelsträngige
RNA herstellen.
Um RNA herzustellen wird doppelsträngige lineare DNA als Template
benötigt, die die RNA-Polymerase Promotersequenz trägt. Da in diesem Fall
doppeltsrängige RNA benötigt wird, muÿ am DNA Template sowohl am sense
als auch am antisense Strange jeweils am 5'-Ende die RNA-Promotersequenz
sich benden. Diese wird in diesem Fall mittels überhängende Primer in der
PCR eingebaut. Die DNA wird dann in vitro zu RNA transkribiert .
14
Abbildung 3.1: Schema zur Herstellung der ds RNA
15
3.1.1 Herstellung des DNA Templates mittels PCR zur
siRNA Herstellung
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes, Gesamtvolumen 100 µL
PCR-Puer
Fermentas KCl (ohne MgCl2 )
Primer Mix
(F1T7 und R4T7)
T7 Primer
dNTP-Mix
MgCl2
Template Plasmid pEGFP-N1
(Mly I verdaut)
Taq-DNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
10x
1x
10 µL
10 µM each
100 µM
10 mM each
15 mM
0,1 µM
2 µM
200 µM
1.5 mM
1 µL
2 µL
2 µL
10 µL
1 µL
1 u/µl
2u
ad 100 µL
2 µL
µL
Der PCR-Ansatz wird mit dem folgenden Temperaturprogramm inkubiert:
CNTR
Lid
wait
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Tube
= 105◦ C
auto
2 min bei 95◦ C
für 30 cyclen
30 sec bei 95◦ C
30 sec bei 50◦ C
30 sec bei 72◦ C
nale Elongation
hold
5 min bei 72◦ C
4◦ C
Beginn Cyclus
Ende Cyclus
5 µL der PCR werden mit DNA-Ladepuer versetzt und auf einem 2 %
- igen Agarosegel getrennt (siehe hierzu Vorschrift 5.2 ). Die zu erwartende
PCR-Bande sollte eine Länge von ca. 650 Basenpaare haben.
3.1.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung
Der PCR-Ansatz wird wie beschrieben in 5.4.1 mit Phenol-Chloroform extrahiert. Anschlieÿend ndet eine Ethanolfällung gemäÿ Vorschrift 5.4.2 statt.
16
Das Pellet wird in 10 µL Wasser aufgenommen und zur T7-transkription
eingesetzt.
3.1.3
in-vitro T7 - Transkription
Bei der T7 Transkription wird doppelsträngige DNA als Matrize genutzt und
in RNA umgeschrieben. Hierbei dient als Transkriptionsstart eine spezische
Promotersequenz, die von der RNA-Polymerase erkannt wird. Es werden von
RNA Polymerasen nur doppelsträngige DNA Promotersequenzen erkannt.
Die T7-RNA Polymerase erkennt folgende T7-Promotersequenz (siehe Abbildunng 2.1) und transkribiert wie dargestellt die DNA in RNA.
Zur T7-Transkription werden folgende Komponenten gemischt:
Transkriptions-Puer
von Fermentas
NTP-Mix
DNA Template
Ribonuclease Inhibitor
RiboLock von Fermentas
T7 RNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
5x
10 mM each
1x
2,0 mM
1 µg
50 u
10 µL
10 µL
10 µL
1,25 µL
40 u
ad 50 µL
2 µL
40 u / µL
20 u / µl
Der T7-Transkription-Ansatz wird entweder für 2-3 Stunde bei 37 ◦ C oder
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlieÿend wird zur Verdauung
des DNA Templates 5 µL DNase I zum Transkriptionsansatz zugegeben und
eine weitere Stunde bei 37 ◦ C inkubiert.
Der Ansatz wird mit saurem Phenol-Chloroform extrahiert (siehe 5.4.1)
und die wäÿrige Phase (maximal 75 µL) wird mit den BioSpin P30 Säulchen
von BioRad mittels Gröÿen-Auschluss-Chromatographie aufgereinigt.
3.1.4 Gröÿen-Ausschluss-Chromatographie mit BioSpin
P30
Auszug aus dem Original Protokol: Instructions for Use
1. Invert the column sharply several times to resuspend the settled gel.
Tap the column to remove all air bubbles. Snap o the tip and place the
column in a 2.0 ml microcentrifuge tube (supplied). Remove the cap.
If buer does not begin to ow from the column, push the cap back
17
on the column and remove it again to start the ow. Allow the excess
packing buer to drain by gravity to the top of the gel bed (about 2
min). Discard the drained buer and place the column back into the
2.0 ml tube.
2. Centrifuge for 2 min in a microcentrifuge at 1,000 x g (see Centrifugation Notes section) to remove the remaining packing buer. Note:
The speed is important to ensure proper performance of the columns.
Discard the tube.
3. Place the column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube (supplied with
25 and 100 packs). Carefully apply the sample (max 75 µL) directly
onto the top center of the gel bed. Do not disturb the gel bed. Application of more or less than the recommended sample volume may
decrease column performance.
4. After loading the sample, centrifuge the column for 4 min at 1,000 x g.
5. The puried sample is now in 10 mM Tris buer.
3.1.5 Hybridisierung der RNA
Damit die RNA Einzelstränge sich passend zu den RNA doppelsträngen nden, wird ein Hybridisierungsschritt durchgeführt. Hierzu wird die RNA Probe 5 min auf 70 ◦ C erhitzt zur denaturierung der RNA und anschlieÿend auf
Eis abgekühlt.
Dann wird die RNA Konzentration der eluierten Lösung photometrisch bestimmt (siehe auch 5.5.1) und 10µg, bzw maximal 70 µL werden mit ShortCut
RNase III von New England Biolabs behandelt. 2 bis 5 µL der Probe werden
vorher als Kontrolle für das Gel abgenommen.
3.1.6 ShortCut RNase III Behandlung
Die hergestellte doppelsträngige RNA wird nun mittels der ShortCut RNase
III zu siRNA verdaut.
Folgende Lösungen werden zum ShortCut RNase III Verdau gemischt:
18
10x ShortCut reaction Puer
ds RNA
10x MnCl2 (200 mM)
ShortCut RNase III 1300u/mL
Wasser
Konzentration
im Ansatz
1x
10 µg
1x
13 u
Pipettierschema
10 µL
maximal 70 µL
10 µL
10 µL
ad 100 µL
Der Ansatz wird 20 min bei 37 ◦ C inkubiert. Zur Stoppung der Reaktion
wird 10 µL 10x EDTA Lösung zugegeben. Zur Aufreinigung und Aufkonzentration der siRNA wird eine Ethanolfällung durchgeführt (siehe 3.1.7).
3.1.7 Ethanolfällung der siRNA
Zur Probe werden 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH=5,5), 2 µL Glycogen
und 3 Volumen eiskalter 95 %-iger Ethanol zugegeben und gemischt. Der
Ansatz wird 2 h bei -20 ◦ C incubiert und anschlieÿend 15 min bei 14.000 g
zentrifugiert.
Nach Entfernung des Ethanols wird das Pellet mit 2 Volumen 80 %-igem
Ethanol gewaschen. Nach Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur wird
die Probe nochmals 5 min zentrifugiert und der Ethanol entfernt. Nach Lufttrockung des Pellets wird es in 10 µL Wasser aufgenommen. Die Konzentration der RNA sollte wieder photometrisch bestimmt werden. Hierzu wird
am besten 1 µL der Probe mit 50 µL Wasser verdünnt und photometrisch
vermessen. Diese Verdünnung kann dann auch fürs Kontrollgel verwendet
werden.
Auf einem 15 %-igen nativem Polyacrylamidgel 5.3.1 sollte der Erfolg des
Verdaus kontrolliert werden.
3.2 Zellkultur
Die hier verwendete Zelllinie HeLa liegt als normale und mit pEGFP-N1
stabil transzierte adhärente Zellkultur vor. Die Zellen werden mit RPMI
1640-Medium mit 2 mM Glutamin, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS; zur Hitzeinaktivierung das FKS 30 min bei 56◦ C inkubieren),
100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (beide Antibiotika dienen zum Schutz vor bakterieller Kontamination), sogenanntes Vollmedium
19
in Dauerkultur gehalten. Die stabil transzierte Zellkultur bekommt zusätzlich das Selektions-Antibiotikum G418 (im Verhältnis 1:1000) zum Vollmedium. Die Linien wachsen als konuente Monolayer-Kulturen in PolystyrolZellkulturaschen im Inkubator unter konstanten Bedingungen:
• Temperatur: 37◦ C
• Luftfeuchtigkeit 95%
• CO2 -Gehalt: 5%
Alle Arbeitsschritte der Zellkultivierung werden an einer sterilen Werkbank
durchgeführt.
3.2.1 Subkultivierung
Zur Subkultivierung konuent gewachsener Zellen wird zunächst mittels einer Pumpe das überstehende Medium abgesogen und die Zellen einmal mit
reinem Waschmedium (RPMI ohne Zusätze oder PBS) gewaschen. Anschliessend werden die Zellen mit 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung vom Boden der
Zellkulturasche gelöst. Die Dauer des Ablösevorgangs variiert zwischen den
unterschiedlichen Zelllinien. HeLa-Zellen benötigen dafür etwa 10-12 Minuten bei Raumtemperatur. Dieser Vorgang lässt sich um die Hälfte verkürzen,
wenn man die Flasche bei 37◦ C im Brutschrank lagert. Der Ablösevorgang
wird durch Zugabe von etwa 10 ml Vollmedium gestoppt, die Zellzahl bestimmt (siehe 3.2.2) und eingestellt. Die Zellen werden in spezischen Verdünnungen in neuen Kulturaschen angesetzt oder gemäss der anschliessenden Versuche weiterbehandelt.
3.2.2 Zellzahlbestimmmung
Die Zellzahl wird durch Zellzählung in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt. Durch Zugabe von Trypanblau lässt sich zusätzlich die Vitalität der
Zellen abschätzen. Trypanblau ist ein Farbsto, der die Plasmamembran lebender Zellen nicht durchqueren kann, jedoch das Cytoplasma toter Zellen
blau färbt. Lebende Zellen erscheinen damit im Mikroskop hell mit blau kontrastiertem Rand, während tote Zellen sich durch ihre dunkelblaue Färbung
deutlich von den lebenden abheben. Die Oberäche der Zählkammer ist durch
eingravierte Linien in ein feines Raster unterteilt (siehe Abbildung 3.2). Legt
man auf diese zentrale Fläche ein Deckglas, so beträgt der Abstand zwischen
der Unterseite dieses Glases und der Oberäche des Objekträgers genau 0,1
20
mm. Jedes der fünf Quadrate (in den vier Ecken und im Zentrum des Rasters) hat eine Fläche von 1 mm2 . Es berechnet sich ein Volumen von 0,1 µl
über jedem dieser Quadrate.
Abbildung 3.2: (a) Das Raster einer Zählkammer nach Neubauer. (b) Vergrös-
serung eines der 25 zentralen, kleinen Quadrate. Man erkennt, welche Zellen gezählt (O) und welche ignoriert (®) werden sollen. (aus Kultur tierischer Zellen,
Spektrum-Verlag 1994).
Durchführung
Es werden 10 µl der Zellsuspension mit 10 µl einer 0,5% (w/v) Trypanblaulösung gemischt und kurz bei Raumtemperatur inkubiert. 10 µl dieser Mischung werden mit einer Pipette vorsichtig am Rand des Deckglases auf den
zentralen, die Zählkammer umfassenden Teil des Objektträgers aufgebracht.
Kapillarkräfte ziehen dann die Probe sofort in den Spalt. Die Zellzahl wird
in den vier Grossquadraten (A-D) ermittelt und je Milliliter nach folgender
Formel berechnet:
(Zellzahl : 4) x 2 (bei Trypanblaufärbung) x 104
Der Anteil der blau gefärbten Zellen wird gesondert gezählt und der Prozentsatz der toten Zellen bestimmt.
21
3.3 Transfektion von eukaryotischen Zellen
3.3.1 Transfektion und Stabilisierung von HeLa-Zellen
mit dem Grün-Fluoreszierenden Protein-Plasmid
Im Rahmen des Praktikums werden HeLa Zellen mit einem Expressionsplasmid, dass das Grünuoreszierende Protein (GFP) kodiert, transziert. Ein
Teil der Zellen wird als Kontrollzellen zurück behalten und ein anderer Teil
dieser Zellen werden mit siRNA gegen das Grünuoreszierende Protein behandelt um eine Downregulierung der GFP Expression gegenüber den Kontrollzellen zu beobachten. Für das anschlieÿende siRNA Experiment werden
4 Wells der HeLa Zellen mit selbst transziertem Plasmid benötigt (siehe
auch Schema 3.3.2).
Die Transfektion erfolgt nach folgendem Protokoll:
1. Am Tag vor der Transfektion werden jeweils 60.000 - 75.000 Zellen pro
well einer 24-well Platte in 500 µl Medium mit Serum ausgesät. Die
Zellen werden bis zum nächsten Tag bei 37◦ C und 5% CO2 inkubiert,
sodass sie am nächsten Tag 50-80% konuent sind.
2. Am Tag der Transfektion werden pro well 0,4 µg DNA mit TransfektionsMedium (RPMI-Medium ohne Serum und Antibiotika) auf ein nales
Volumen von 21 µl gebracht und durch Vortexen gut gemischt. Anschliessend wird die DNA mit 4 µl Plus-Reagenz versetzt und das Ganze
gut gemischt (entweder kurz vortexen oder mehrmals auf und ab pippettieren). Die Proben werden anschliessend für 15 Minuten bei Raumtemperatur (15-25C) inkubiert.
3. In einem zweiten Tube werden pro well 1 µl Lipofectamin mit 24 µl
Transfektions-Medium gemischt und das Ganze nach der Inkubationszeit mit der pre-komplexierten DNA gemischt und das Ganze für 15
min bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Während diesen Inkubationszeiten wird von den Zellen vorsichtig das
Medium abgesaugt und durch 200 µl frisches Transfektions-Medium
ersetzt. Bitte darauf achten, dass die Zellen nicht austrocknen!
5. Anschliessend kann der fertig gebildete DNA-Komplex langsam und
tropfenweise auf die Zellen gegeben werden (50 µl pro well). Dabei sind
die Platten leicht zu schwenken, um eine homogene Verteilung der DNA
zu gewährleisten.
22
6. Die Zellen werden anschliessend für 3 Stunden bei 37◦ C und 5% CO2
inkubiert.
7. Nach den drei Stunden wird das Transfektionsmedium abgesaugt und
die Zellen werden mit siRNA behandelt wie unter 3.3.2 beschrieben. Die
Kontrollzellen werden mit 500 µl frischem Vollmedium versetzt und bei
37◦ C im Brutschrank inkubiert.
3.3.2 Transfektion von HELA-Zellen mit siRNA
Zur Transfektion der HeLa Zelllinien mit siRNA sind 3 verschiedene Zelltypen mit 3 unterschiedlichen siRNA zu transzieren. Als Zelltypen nutzen wir
zum einen HeLa Zellen, die stabil mit GFP transziert sind (diese werden
gestellt), HeLa Zellen, die im Rahmen des Praktikums selbst mit GFP transziert worden sind sowie als Kontrolle unbehandelte HeLa Zellen, die kein
GFP exprimieren. Als siRNA steht zum einen, die im Rahmen des Praktikums selbst hergestellte siRNA gegen GFP zu verfügung, zum anderen kommerziell erworbene siRNA gegen GFP, die mit dem roten Fluoreszenzfarbsto
Rhodamin gelabelt ist. Als Kontroll siRNA haben wir kommerziell erworbene
siRNA, die ebenfalls mit dem roten Fluoreszenzfarbsto Rhodamin gelabelt
ist und keine Funktionalität gegen GFP besitzt. Pro Transfektion wird ein
Well benötigt. Auÿerdem wird pro Zelltyp auch ein Well benötigt, das nicht
zur Transfektion eingesetzt wird als unbehandelter Vergleich.
Die Transfektion erfolgt nach folgendem Schema:
Zelltyp
HeLa-GFP,
stabil transziert
HeLa-GFP,
selbst transziert
HeLa Kontrollzellen
selbsthergestellte
siRNA
gegen GFP
ja
siRNA-GFP,
Rhodamin
gelabelt
ohne
siRNA
ja
KontrollsiRNA,
Rhodamin
gelabelt
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
Die Transfektion mit siRNA erfolgt nach folgendem Protokoll:
1. Am Tag vor der Transfektion werden jeweils 60.000 - 75.000 Zellen pro
well einer 24-well Platte in 500 µl Medium mit Serum und entsprechenden Antibiotika ausgesät. Die Zellen werden bis zum nächsten Tag bei
37◦ C und 5% CO2 inkubiert.
23
2. Am Tag der Transfektion werden pro well 1 µg siRNA (bei der kommerziellen siRNA von Qiagen entspricht das 3 µL der siRNA Lösung)
mit Medium (+Serum und bei GFP-Zellen das Antibiotika G418) auf
ein nales Volumen von 100 µl gebracht und durch Vortexen gut gemischt. Anschliessend werden für die Komplexbildung 6 µl RNAiFect
Transfektions-Reagenz zur RNA gegeben und das ganze gut gemischt
(entweder kurz vortexen oder mehrmals auf und ab pippettieren). Die
Proben werden anschliessend für 15 Minuten bei Raumtemperatur (1525◦ C) inkubiert.
3. Währenddessen wird von den Zellen vorsichtig das Medium abgesaugt
und durch 300 µl frisches Medium (+Serum und ggf. Antibiotika) ersetzt. Bitte darauf achten, dass die Zellen nicht austrocknen!
4. Anschliessend kann der fertig gebildete RNA-Komplex (106 µl pro well)
langsam und tropfenweise auf die Zellen gegeben werden. Dabei sind
die Platten leicht zu schwenken, um eine homogene Verteilung der RNA
zu gewährleisten.
5. Die Zellen werden anschliessend wieder bei 37◦ C und 5% CO2 inkubiert.
6. Falls notwendig ndet nach 24h eine Erneuerung des Medium statt
Nach 48 h werden die Zellen am Durchusszytometer (FACS) und am Mikroskop vermessen.
3.3.3 Durchusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie
Die Durchusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in
Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften.
Ein Durchusszytometer erlaubt die simultane Messung der relativen Zellgrösse, der Granularität sowie zwei bis drei verschiedener Fluoreszenzfarben
für mehrere tausend Einzelzellen in wenigen Sekunden. Zur Analyse wird
die in einem Probenröhrchen vorgegebene Zellsuspension über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in
die Messkammer werden die Zellen durch die sie umgebende Trägerüssigkeit (isotone Salzlösung) stark beschleunigt, es kommt zur Auftrennung von
kleineren Zellaggregaten und zur Hintereinanderreihung der Zellen (hydrodynamische Fokussierung). Am Analysepunkt trit der fokussierte Lichtstrahl
(Laser) für den Bruchteil einer Sekunde auf die durchströmende Zelle, und
die entstehenden Streulicht- und Fluoreszenzsignale werden mittels Spiegel-
24
Abbildung 3.3: Aufbau des FACS
und Filtersysteme auf die verschiedenen Fotoverstärker geleitet. Für die Messungen steht ein FACScan der Firma Becton Dickinson zur Verfügung. Die
Anregungswellenlänge des luftgekühlten Argon-Lasers beträgt 488 nm.
Durchführung:
Für die Analyse am FACS werden Zellen aus je einem well einer 24-well-Platte
verwendet. Dafür werden 250 µl Trypsinlösung auf den mit RPMI-Medium
gewaschenen Zellrasen gegeben und das ganze bei 37◦ C inkubiert (Sichtkontrolle). Haben sich die Zellen vollständig vom Boden abgelöst, so wird der
Vorgang durch Zugabe von 500 µl Vollmedium abgestoppt. Die Zellen werden
in Eppendorf-Tubes überführt und für 4 min bei 180 x g pelletiert. Anschliessend werden die Zellen mit 350 µl PBS resuspendiert und in FACS-Röhrchen
überführt. Die Proben können nun am Durchusszytometer analysiert werden.
25
Abbildung 3.4: Funktionsprinzip des FACS
26
Kapitel 4
Praktikumsversuch:
kontinuierliche in vitro Evolution
eines Ligase Ribozyms
In diesem Praktikumsversuch wird ein vorhandenes Ligase Ribozym, also
ein Ribozym, dass an sich selbst an das 5'-ende ein Oligonucleotid ligiert
als Ausgangsbasis verwendet. Die Sequenz des Ligase Ribozym wird mittels
mutagener PCR mutiert. Dabei wird die Sequenz pro Nukleotidposition mit
einer warscheinlichkeit von 10% mutiert. Die Mutations-PCR Reaktion dient
als Ausgangspool für die folgende Selektion. Die mutierte PCR Reaktion
dient als Matrize zur Herstellung von RNA mittels T7-RNA Tranksription.
Der so erhaltene RNA-Pool wird für die kontinuierliche in vitro Evolution
eingesetzt.
Die Selektion mittels kontinuierliche in vitro Evolution funktioniert vom
Prinzip her wie in Abblidung 4.1 dargestellt. In einem Reaktionsgefäÿ wird
der RNA-Pool an Ligase Ribozym mit dem Substrat gegeben. Das Substrat
ist in diesem Fall ein Oligonukleotid, dass am 5'-Ende die T7-Promoter Sequenz beinhaltet. Nur Funktionsfähige Ligase Ribozyme sind in der Lage, das
Substrat an ihr 5'-Ende zu ligieren. Anschlieÿend ndet eine reverse Transkription aller RNA Moleküle im Reaktionsgefäÿ statt. Die darauolgende
T7-RNA Transkription erfolgt aber nur für die RNA-Moleküle, die erfolgreich das Substrat an sich ligieren konnten, da nur diese RNA Moleküle die
T7-Promotersequenz besitzen.
27
Abbildung 4.1: kontinuierliche in vitro Evolution aus [11]
4.1 PCR zur Herstellung der DNA Matrize des
Ligase-Ribozyms
Die PCR sollte mind. in 2-facher Menge durchgeführt werden, d.h. 2 Ansätze
zu je 100 µL.
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes, Gesamtvolumen 100 µL
28
Abbildung 4.2: Aufbau des Ligase Ribozym
PCR-Puer
Fermentas KCl (ohne MgCl2 )
Vorwärtsprimer
(Primer 1)
Rückwärtsprimer
(Primer 3)
dNTP-Mix
MgCl2
Template
Taq-DNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
10x
1x
10 µL
100 µM
1 µM
1 µL
100 µM
10 mM each
15 mM
1 µM
200 µM
1.5 mM
1 u/µl
4u
ad 100 µL
1 µL
2 µL
10 µL
1 µL
4 µL
73 µL
Die PCR-Ansätze werden dann mit dem folgenden Programm inkubiert.
29
CNTR
Lid
wait
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Tube
= 105◦ C
auto
2 min bei 95◦ C
für 30 cyclen
30 sec bei 95◦ C
30 sec bei 55◦ C bis 60 ◦ C
30 sec bei 72◦ C
nale Elongation
hold
5 min bei 72◦ C
4◦ C
Beginn Cyclus
Ende Cyclus
5 µL der PCR werden mit DNA-Ladepuer versetzt und auf einem 10 %
- igen nativem Acrylamidgel getrennt (siehe hierzu Vorschrift 5.3.1 ). Die zu
erwartende PCR-Bande sollte eine Länge von ca. 180 Basenpaare haben.
4.1.1 PCR Aufreinigung
Der PCR-Ansatz wird mit dem PeqLAb kit 'cycle-pure' aufgereinigt Auszug
aus dem Originalprotokoll:
1. Laden und Binden
PCR Ansatz wird mit 2 Volumen XP1-Puer versetzt und durch vortexen vermischt.
Eine HiBind-Zentrifugensäule in ein 2 mL Sammeltube stecken und die
Mischung aus PCR Ansatz und XP1-Puer auf die Säule pipettieren.
Sammetube mit Säule für 1 Minute bei 10.000 x g und Raumtemperatur
zentrifugieren. Säulendurchuss verwerfen2. Waschen
750 u/µl des komplettierten SPW-Waschpuers auf die Säule pipettieren und fà 41 r 1 Minute bei 10.000 x gdurch die Säule zentrifugieren.
Säulendurchuss verwerfen und Waschschritt einmal wiederholen.
3. Trocknen
Zentrifugensäule in das geleerte 2 mL Sammel-Tube stecken und durch
einminütiges zentrifugieren bei 10.000 x g vollständig trocknen.
4. Elution
Zentrifugensäule in eine sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen stechen
und die DNA mit 30 u/µl sterilem Wasser oder TE-Puer eluieren.
Dazu die Elutionslösung direkt auf die Sälenmatrix pipettieren und für
1 Minute bei 10.000 x g zentrifugieren.
30
4.1.2 Konzentrationsbestimmung der DNA
Die Konzentration der DNA wird mittels UV-Photometrie bestimmt. Hierzu
werden 2 µl der Probe am NanoDrop Photometer vermessen. 5 ng des DNA
templates werden zur Mutations PCR eingesetzt. Die restliche DNA wird
zurückbehalten und dient später im Assay als Vergleichs Ligase Ribozym.
4.2 Mutations PCR
Die Mutations PCR erfolgt nach dem Protokol von Vartanian et al. [12].
Hierbei ist darauf zu achten, dass die Konzentrationen der einzelnen Nukleotide unterschiedlich ist. Zudem wird mit geringer Primerkonzentration und
mit MnCl2 zusätzlich zu MgCl2 gearbeitet. Eventuell müssen noch geeignete
Verdünnungen der einzelnen Lösungen angesetzt werden.
Die Mutations PCR setzt sich wie folgt zusammen. Achtung das MnCl2
ganz zum Schluss zugeben, da es sonst ausfallen kann!
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes, Gesamtvolumen 100 µL
PCR-Puer
Fermentas KCl (ohne MgCl2 )
Vorwärtsprimer
(Primer 1)
Rückwärtsprimer
(Primer 3)
dCTP
dTTP
dATP
dGTP
MgCl2
MnCl2 !
Template
Taq-DNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
10x
1x
10 µL
100 µM
1 µM
100 µM
10 mM
10 mM
10 mM
10 mM
15 mM
100 mM
1 µM
30 µM
1000 µM
30 µM
1000 µM
1.5 mM
0.5 mM
5 ng
5u
ad 100 µL
1 u/µl
5 µL
5 µL der PCR werden mit DNA-Ladepuer versetzt und auf einem 10 %
- igen nativem Acrylamidgel getrennt (siehe hierzu Vorschrift 5.3.1 ).
Der PCR-Ansatz wird dann mit dem folgenden Programm zur Mutatuions PCR inkubiert. Das PCR programm hat eine lange Elongationszeit,
31
damit die Fehlpaarungen (Mutationen) eingebaut werden können.
CNTR
Lid
wait
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Tube
= 105◦ C
auto
2 min bei 95◦ C
für 50 cyclen
30 sec bei 95◦ C
30 sec bei 50◦ C
2 min bei 72◦ C
nale Elongation
hold
5 min bei 72◦ C
4◦ C
Beginn Cyclus
Ende Cyclus
4.2.1 PCR Aufreinigung
Der Mutations PCR-Ansatz wird anschlieÿend erneut mit dem PeqLab kit
aufgereinigt wie beschrieben in 4.1.1.
4.2.2 Konzentrationsbestimmung der mutagenen DNA
Die Konzentration der DNA wird erneut mittels UV-Photometrie am NanoDrop bestimmt. (siehe auch 5.5.1).
4.2.3 T7-Transkription der Mutations-PCR
Zur T7-Transkription werden folgende Komponenten gemischt:
Transkriptions-Puer
von Fermentas
NTP-Mix
DNA Template
Ribonuclease Inhibitor
RiboLock von Fermentas
T7 RNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
5x
10 mM each
1x
2,0 mM
1 µg
50 u
10 µL
10 µL
µL
1,25 µL
40 u
ad 50 µL
2 µL
40 u / µL
20 u / µl
Der T7-Transkription-Ansatz wird entweder für 2-3 Stunde bei 37 ◦ C oder
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlieÿend wird zur Verdauung
32
des DNA Templates 5 µL DNase I zum Transkriptionsansatz zugegeben und
eine weitere Stunde bei 37 ◦ C inkubiert.
4.3 Durchführung der kontinuierliche in vitro
Evolution
Die Standardselektion des Ligase Ribozyms fand unter folgenden Bedingungen statt: Tris Puer pH = 8,5, Substratkonzentration von 100 pmol und
MgCl2 Konzentration von 25 mM.
Im Rahmen des Praktikums wollen wir die Selektionsbedingungen variieren.
Daher werden verschiedene Gruppe die Selektion unter unterschiedlichen Bedingungen durchführen.
• Selektionsbedingung A: statt Tris Puer pH = 8,5 , wird MES Puer
bei pH 6,5 verwendet
• Selektionsbedingung B: Die Substratkonzentration wird von 100 pmol
auf 25 pmol herabgesetzt
• Selektionsbedingung C: Die MgCl2 Konzentration wird von 25 mM auf
5 mM herabgesetzt
Ansatz der kontinuierliche in vitro Selektion:
Gesamtvolumen 25 µL, für die Selektionsansätze müssen 8,2 µL
abgezogen werden (Erklärung siehe unten)!
• 1 pmol RNA
• 100 pmol Substrat (bei Selektionsbedingung B: nur 25 pmol)
• 50 pmol Primer 1
• 1,25 u MMLV Reverse Transkriptase
• 50 u T7 RNA Polymerase
• 5 nmol each dNTP
• 50 nmol each NTP
• Reaktionspuer 1x von der Reversen Transkriptase (Fermentas), Zusammensetzung des 5x Puers: 250 mM Tris-HCl (pH=8,3), 250 mM
33
KCl, 20 mM MgCl2 , 50 mM DTT, Bei Selektionsbedingung A: folgenden Puer benutzen, wie oben aber statt Tris-HCl 250 mM
MES mit pH = 6,5; dieser Puer muss zuvor selbst angesetzt
und steril ltriert werden.
• MgCl2 Finalkonzentration 25 mM, da im Puer schon 4 mM MgCl2
vorhanden ist, muss noch 21 mM MgCl2 zugefügt werden
Bei Selektionsbedingung C: soll die Finalkonzentration an MgCl2
5 mM betragen, wobei in den ersten 3 Zyklen die Konzentration noch 12,5 mM und in den letzten 5 mM betragen sollte
Die kontinuierliche in vitro Selektion funktioniert so, dass der obige Ansatz 30 min bei 37◦ C inkubiert wird und dann 8,2 µL der Lösung in einen
frischen Ansatz wie oben beschrieben pipettiert werden. Dies sollte mindestens 10 mal geschehen (10 Zyklen). Dies bedeutet, dass vor dem Start der in
vitro Selektion, alle Probengefäÿe schon mit entsprechender Zusammensetzung vorbereitet werden sollte. Alle Lösungen sollten bei 37◦ C vorgewärmt
werden, damit durchs Aufwärmen der Lösungen sich nicht unterschiedliche
Reaktionszeiten ergeben.
Nach der Selektion ndet eine PCR statt zur Amplikation der selektierten
DNA.
4.3.1 Amplikation der selektierten DNA
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes, Gesamtvolumen 100 µL
PCR-Puer
Fermentas KCl (ohne MgCl2 )
Vorwärtsprimer
(Primer 1)
Rückwärtsprimer
(Primer 3)
dNTP-Mix
MgCl2
Selektierte DNA
Taq-DNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
10x
1x
10 µL
100 µM
1 µM
1 µL
100 µM
10 mM each
15 mM
1 µM
200 µM
1.5 mM
1 u/µl
4u
ad 100 µL
1 µL
2 µL
10 µL
10 µL
4 µL
µL
Die PCR-Ansätze werden dann mit dem folgenden Programm inkubiert.
34
CNTR
Lid
wait
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Tube
= 105◦ C
auto
2 min bei 95◦ C
für 30 cyclen
30 sec bei 95◦ C
30 sec bei 55◦ C bis 60 ◦ C
30 sec bei 72◦ C
nale Elongation
hold
5 min bei 72◦ C
4◦ C
Beginn Cyclus
Ende Cyclus
5 µL der PCR werden mit DNA-Ladepuer versetzt und auf einem 10 %
- igen nativem Acrylamidgel getrennt (siehe hierzu Vorschrift 5.3.1 ). Die zu
erwartende PCR-Bande sollte eine Länge von ca. 180 Basenpaare haben.
4.3.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung
Der PCR-Ansatz wird wie beschrieben in 5.4.1 mit Phenol-Chloroform extrahiert. Anschlieÿend ndet eine Ethanolfällung gemäÿ Vorschrift 5.4.2 statt.
Das Pellet wird in 10 µL Wasser aufgenommen und zur T7-Transkription
eingesetzt.
4.3.3 T7-Transkription der selektierten DNA und der
Ausgangs ('wild-typ') DNA
Zur T7-Transkription werden folgende Komponenten gemischt:
Transkriptions-Puer
von Fermentas
NTP-Mix
DNA Template
Ribonuclease Inhibitor
RiboLock von Fermentas
T7 RNA-Polymerase
Wasser
Konzentration
der Stammlösung
Konzentration
im Ansatz
Pipettierschema
5x
10 mM each
1x
2,0 mM
1 µg
50 u
10 µL
10 µL
µL
1,25 µL
40 u
ad 50 µL
2 µL
40 u / µL
20 u / µl
Der T7-Transkription-Ansatz wird entweder für 2-3 Stunde bei 37 ◦ C oder
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlieÿend wird zur Verdauung
35
des DNA Templates 5 µL DNase I zum Transkriptionsansatz zugegeben und
eine weitere Stunde bei 37 ◦ C inkubiert.
4.4 Ligase-Ribozym Assay
Für das Assay sollten eingesetzt werden das 'wild-typ' Ligase-Ribozym und
der selektierte Ligase-Ribozym Pool. Hierzu werden folgende Lösungen in 25
µL, 30 min bei 37◦ C inkubiert:
• 10 pmol RNA
• 100 pmol Substrat (bei Selektionsbedingung B: nur 25 pmol)
• Reaktionspuer, in dem die Selektion stattgefunden hat; beim 'wildtyp'-Ligase Ribozym wird der Tris- Puer pH = 8,5 mit MgCl2 Konzentration von 25 mM verwendet
• MgCl2 mit Finalkonzentration wie bei der Selektion
Nach der Inkubation wird der Assay auf einem 8%-igen denaturierenden
Polyacrylamid gel aufgetrennt.
Zum Verlgeich muss selektierte RNA, die nicht fürs Assay eingesetzt wurden
mit aufgetragen werden.
36
Kapitel 5
Allgemeine Arbeitsvorschriften
5.1 Allgemeine Arbeitshinweise beim Arbeiten
mit RNA
Ribonukleasen (RNasen) sind sehr stabile und aktive Enzyme, die normalerweise auch ohne Cofaktoren ihre Funktion ausüben können. Da RNasen
nur schwer zu inaktivieren sind und selbst kleinste Mengen ausreichen, um
RNA zu zerstören, sind beim Arbeiten mit RNA besondere Massnahmen zu
beachten. Aufgrund des ubiquitären Vorkommens von RNasen sollten, falls
die Gefahr einer Kontamination besteht, bei Arbeiten mit RNA-haltigen Lösungen Handschuhe getragen und auch regelmässig gewechselt werden. RNALösungen sollten zwischen den Experimenten stets auf Eis gehalten werden.
Sterile Polypropylen-Tubes sind für die Arbeit mit RNA am besten geeignet,
da diese Tubes normalerweise auch immer RNase-frei sind und daher keine
besondere Behandlung mehr benötigen. Anzusetzende Lösungen, sowie auch
Wasser werden mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) RNase-frei gemacht.
Achtung DEPC gilt als carcinogen und ist leicht üchtig! Alle Arbeiten mit DEPC werden daher ausschliesslich mit Handschuhen,
sowie unter einem Abzug durchgeführt.
5.1.1 Herstellung von RNase-freien Lösungen
1. Zu 100 ml einer RNase-frei zu machenden Lösung werden 0,1 ml DEPC
gegeben. Um das DEPC in Lösung zu bringen, wird die Lösung kräftig
geschüttelt oder gerührt.
37
2. Die Lösung wird für 12 Stunden bei 37◦ C unter weiterem Rühren inkubiert.
3. Das DEPC wird danach durch 15-minütiges Autoklavieren wieder entfernt.
Achtung
• DEPC reagiert mit primären Aminen und kann daher nicht direkt für
Tris-Puer verwendet werden. In Gegenwart von Tris zerfällt DEPC
sehr schnell in Ethanol und CO2 .
• Reste von DEPC reagieren mit Purin-Basen in RNA und carboxymethylieren diese. Es ist daher sehr wichtig DEPC durch Autoklavieren
vollständig aus den Lösungen zu entfernen
5.2 Agarose-Gel-Elektrophorese
Die Agarose wird in einer entsprechenden Menge 1xTAE-Puer suspendiert
und in einer Mikrowelle erhitzt, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Nach
Abkühlen auf etwa 60◦ C wird die Agaroselösung in die Giesvorrichtung gegossen und der Kamm aufgesetzt. Nach dem Erstarren wird der Kamm entfernt und die Kammer mit 1xTAE als Laufpuer gefüllt bis das Gel bedeckt
ist. Vor dem Auftragen werden die Proben mit der entsprechenden Menge
6xLoading-Dye versetzt und die Elektrophorese dann bei 100 bis 150 mA
durchgeführt bis die Orange G-Farbsto-Front das Gel-Ende erreicht hat.
5.3 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Der Multi-CastGiessstand In diesem Giessstand können mehrere Gele
(maximal 5) derselben Konzentration in einer Dicke von 0,75mm gleichzeitig
gegossen werden. Die drei roten Gummieinsätze (ein grosses dreieckiges und
zwei kleine halbrunde) müssen unten in die Kammer eingesetzt werden. Da
durch den Spalt im grossen Gummieinsatz eine Verbindung innerhalb der
gesamten Kammer besteht, werden dadurch alle Gele gleichzeitig gegossen.
Der Zusammenbau des Giessstandes Bei allen folgenden Arbeitsschritten ist mit Handschuhen zu arbeiten! Die Glasplatten, Spacer und Aluminiumplatten werden mit 70% Ethanol entfettet. Die oene Giesskammer
38
wird horizontal gelegt und zuerst mit den Platten zum Auüllen des Restvolumens versehen. Anschliessend werden die Sandwiches, bestehend aus einer Aluminium-Platte, zwei Spacern und einer Glasplatte, eingesetzt. Bei
den Spacern ist darauf zu achten, dass die Noppen aussen liegen. Ganz zum
Schluss wird dann der Deckel mit 2 Klammern seitlich xiert. Stellt man den
Giessstand auf den Kopf (vorsichtig! Hand darunter halten!), so sollten die
Platten nicht verrutschen.
Das Giessen der Gele Der Giessstand wird mit der Önung nach oben
auf eine ebene Fläche gestellt. Jetzt werden die Lösungen für das Gel zusammenpipettiert.
Achtung!! Acrylamid-Lösung ist hochgiftig! Hautkontakt sollte
unbedingt vermieden werden! Beim Arbeiten mit Acrylamid ist
daher immer auf geeignete Kleidung und Handschuhe zu achten!
5.3.1 Native Acrylamid Gelelektrophorese
Native Acrylamid Gele werden eingesetzt zur Auftrennung von DNA oder
nativer RNA. Die Acrylamidgele haben dabei im Vergleich zu Agarose Gelen
den Vorteil, dass sie bei kleinen Fragmentlängen (unter 500 bp) eine bessere
und schärfere Auösung der einzelnen Banden liefern.
Zusammensetzung eines nativen Acrylamid-Gels
Anzusetzende Menge für 5 Gele sind 50 mL. Zum Ansetzen der Gele sind 50
mL Einmal-Plastik Röhrchen zu verwenden!
• 10 ml 5xTBE
• 12,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid (40%; 19:1) für 10%-ige Gele bzw.
18,75 mL Acrylamid/Bisacrylamid (40%; 19:1) für 15%-ige Gele
• mit Wasser auf 50 mL auüllen
• 50 µl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylehtylendiamin)
• 350 µl 10% APS zugeben
39
Nach Zugabe von TEMED und APS, die Lösung schnell mischen und die
Gele zügig in die Kammer füllen bevor die Lösung polymerisiert. Das Gel
wird bis zum oberen Rand der Aluminiumoxidplatte gegossen und die entfetteten Kämme dann bis zum Anschlag in das noch üssige Gel eingesetzt.
Dabei sind Luftblasen zu vermeiden. Nach ca. 30-45 min ist das Gel auspolymerisiert und die Kämme können vorsichtig herausgezogen werden.
Die Elektrophorese von nativen Acrylamidgelen
Der 5fach-konzentrierte TBE-Puer wird 1:5 mit H2 O verdünnt. Die Taschen der Gele werden mit 1x TBE-Puer gespült. Sie können nun in die
Laufkammer eingesetzt werden. Jedes Sandwich wird mit 2 Klammern und
der Aluminiumoxid-Platte nach hinten in der Puerkammer befestigt. Pro
Kammer können zwei Gele gleichzeitig laufengelassen werden; wird nur ein
Gel benötigt, so wird auf der anderen Seite statt des Gels eine Glasplatte
eingesetzt. Die Kammern werden nun mit 1x TBE-Puer gefüllt. Die beiden
oberen Kammern werden bis zum Rand der Sandwiches, die untere halbvoll
mit Puer gefüllt. Die Proben werden mit DNA-Ladepuer versetzt und die
Elektrophorese wird bei 100-120 V durchgeführt. Die Elektrophorese ist beendet, wenn der als Referenz zugesetzte Orange G das untere Ende des Gels
erreicht hat (ca. 1,5 h). Um die Elektrophorese zu beenden, wird zunächst die
Spannungsquelle abgeschaltet! Erst wenn dies geschehen ist, kann die Elektrophoresekammer geönet werden. Die Klammern werden nun gelöst und
die Sandwiches vorsichtig von dem Dichtungsgummi abgehoben. Die Platten
werden vorsichtig voneinander getrennt, indem ein Spacer etwas herausgezogen wird und als Hebel eingesetzt wird. Es empehlt sich, die Orientierung
des Gels durch Abschneiden einer kleinen Ecke zu markieren.
Achtung!! Elektrophoresen werden mit Gleichspannung durchgeführt, die noch gefährlicher ist als Wechselspannung. 350-400V
Gleichstrom die bei der Elektrophorese angelegt werden, sind absolut lebensgefährlich! Sind daher während der Elektrophorese irgendwelche Arbeiten an der Apparatur notwendig, so ist unbedingt
darauf zu achten, dass die Spannungsquelle abgeschaltet ist.
40
5.3.2 Denaturierende Acrylamid Gelelektrophorese
Denaturierende Acrylamid Gele werden eingesetzt um RNA Stränge zu trennen. Da RNA in nativer Form gefaltet vorliegt, muss die RNA denaturiert
werden, damit die RNA Moleküle nach ihrer Länge aufgetrennt werden konnen. Ein nicht-denaturierte RNA würde auf dem Gel weiter migrieren und
somit ein RNA Strang kürzerer Länge vortäuschen. Zur Denaturierung der
RNA werden Acrylamid Gele mit Zusatz von Harnsto verwendet.
Zusammensetzung eines denaturierenden 8%-igen Harnsto-Gels
Anzusetzende Menge für 5 Gele sind 50 mL. Zum Ansetzen der Gele 50 mL
Einmal-Plastik Röhrchen verwenden!
• 8 M Harnsto (23,8 g)
• 10 ml 5xTBE
• 10 ml Acrylamid/Bisacrylamid (40%; 19:1)
• mit Wasser auf 50 mL auüllen und Harnsto unter erwärmen in Lösung bringen. Nach Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur
• 50 µl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylehtylendiamin)
• 350 µl 10% APS zugeben
Nach Zugabe von TEMED und APS, die Lösung schnell mischen und die
Gele zügig in die Kammer füllen bevor die Lösung polymerisiert. Das Gel
wird bis zum oberen Rand der Aluminiumoxidplatte gegossen und die entfetteten Kämme dann bis zum Anschlag in das noch üssige Gel eingesetzt.
Dabei sind Luftblasen zu vermeiden. Nach ca. 30-45 min ist das Gel auspolymerisiert und die Kämme können vorsichtig herausgezogen werden.
Die Elektrophorese von denaturierenden Gelen
Die Gele werden wie unter 5.3.1 beschrieben vorbereitet und in die Kammer
gesetzt. Als Laufpuer dient 1x TBE-Puer.
Zu Beginn der denaturierenden Gelektrophorese wird eine 30 minütige
Präelektrophorese zur Äquilibrierung ohne Proben bei 12 Watt durchgeführt.
Währenddessen werden die Proben mit dem 3-fachen Volumen an denaturierenden Probenpuer versetzt und für 10 min bei 70◦ C denaturiert. Die
Trennung erfolgt in 1x TBE als Laufpuer bei einer Leistung von 12 Watt.
41
Wichtig ist, dass das Gel während der Elektrophorese eine Temperatur von
etwa 50◦ C erreicht, um die vollständige Denaturierung der RNA zu erhalten.
Die Elektrophorese ist beendet, wenn der als Referenz zugesetzte Farbsto
Xylencyanol (2. Farbstoront) das untere Ende des Gels erreicht hat (ca. 30
min). Um die Elektrophorese zu beenden, wird zunächst die Spannungsquelle
abgeschaltet! Die Platten werden vorsichtig voneinander getrennt, indem ein
Spacer etwas herausgezogen wird und als Hebel eingesetzt wird. Es empehlt sich, die Orientierung des Gels durch Abschneiden einer kleinen Ecke
zu markieren.
5.3.3 Nachweis von Nukleinsäuren in Gelen mittels Ethidiumbromidfärbung
Die Ethidiumbromidfärbung gehört zu den schnellsten und empndlichsten
Färbemethoden für kleine Nukleinsäuremengen (ab ca. 20 ng) Ethidiumbromid ist ein organischer Fluoreszenzfarbsto, der aufgrund seiner planaren
Struktur in Nukleinsäuren interkalieren kann. Die Gele werden in einer Lösung aus 4 µg/ml Ethidiumbromid in 1xTAE für 10 bis 15 min gefärbt. Nachdem der Gelhintergrund gegebenenfalls mit Wasser entfärbt wurde, kann es
auf einem UV-Transilluminator (312 nm) dokumentiert werden.
Achtung! Ethidiumbromid ist ein starkes Mutagen und gilt als
hoch krebserregend. Ethidiumbromid-Einbau in zelluläre DNA führt
im natürlichen Licht zu DNA-Einzelstrangbrüchen. Handschuhe
und Kittel sind unbedingt zu tragen!
5.4 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung von RNA oder DNA
5.4.1 Phenol-Chloroform-Extraktion von RNA oder DNA
Zur Phenol-Chloroform-Extraktion von RNA wird eine Mischung von Phenol:Chloroform (5:1, v:v ) verwendet, wobei das Phenol auf pH = 4,3 gepuert
ist.
Bei DNA wird eine Mischung von Phenol:Chloroform (1:1, v:v ) verwendet,
mit Phenol das auf pH = 7,6 - 8,0 gepuert ist.
Da das Phenol jeweils gepuert ist, bendet sich über der Mischung eine
wässrige Puerlösung. Daher sollte die Flasche nicht geschüttelt werden und
nur die Lösung aus der unteren Phase entnommen werden.
42
Die DNA oder RNA wird im Volumenverhältnis 1:1 mit der jeweiligen
Phenol-Chloroform-Mischung gut gemischt und 5 min zur Phasentrennung
zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wird in ein neues Gefäÿ überführt und
im Verhältnis 1:1 mit Chloroform-Isoamylakohol (24:1, v:v ) gegenextrahiert.
Zur Phasentrennung wird wieder 5 min zentrifugiert und die obere, wässrige
Phase wird vorsichtig in ein neues Gefäÿ überführt.
5.4.2 Ethanolfällung von Nukleinsäuren
Die nukleinsäurehaltigen Lösung wird mit 1/10 Volumen Na-acetat-Lösung
(3 M, pH 5,2) versetzt, so dass eine Endkonzentration von 0.3 M Na-acetat
entsteht. Die Fällung erfolgt durch Zugabe von 2 Volumen eiskaltem 95 % igem Ethanol und anschlieÿender Inkubation für 60 min auf Eis. Die gefällte
DNA bzw. RNA wird 20 min bei 4◦ C und 14.000 rpm abzentrifugiert, mit
eiskaltem 70%-igem Ethanol gewaschen und 5 min zentrifugiert. Das Pellet
wird bei Raumtemperatur getrocknet und anschlieÿend in dem gemäÿ der
Vorschrift angegebenem Volumen TE-Puer oder Wasser gelöst.
5.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentration von wässrigen Nukleinsäurelösungen kann photometrisch
bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt werden. Die aromatischen Ringe der Basen sind hierbei für die Absorption verantwortlich. Wenn der Extinktionskoezient der entsprechenden Nukleinsäure nicht bekannt ist, gilt
folgender Zusammenhang:
1 OD260 ≈ 50 µg/ml ds-DNA und ds-RNA
1 OD260 ≈ 33 µg/ml ss-RNA
Bei kürzeren Nukleinsäuren mit bekannter Sequenz kann man sich auf der
Internetseite http://paris.chem.yale.edu/extinct.html auch den Extinktionskoezienten berechnen lassen.
Um die Reinheit der Nukleinsäurelösung abschätzen zu können, insbesondere hinsichtlich Proteinkontamination wird zusätzlich noch die Extinktion
260nm
bestimmt. Saubere Nukleinbei 280 nm gemessen und der Quotient E
E280nm
säurelösungen zeigen einen Wert im Bereich von 1,8 bis 2.
43
5.5.1 Anleitung zum NanoDrop Photometer
Bei dem NanoDrop Photometer handelt es sich um eine Spezialphotometer
zur Bestimmung der Lichtabsorption in sehr kleinen Volumina (1 bis 2 µL).
Auf der Bedienungssoftware wird der Button Nukleinsäurenäusgewählt. Anschlieÿend muss zur Initialisierung des Gerätes 2 µL Wasser auf den Probenteller pipettiert. Nach der Initialisierung wird der Wassertropfen vom
Probenteller mit dem dort vorhandenen Kleenextuch abgewischt. Danach erfolgt die Nullpunkteinstellung ebenfalls mit 2 µL Wasser, bzw. Puer. Nach
Abwischen des Wasser/Puers wird 1 - 2 µL der Probe auf dem Probenteller
pipettiert und vermessen. Bei der Messung ist darauf zu achten, dass der
Probentropfen während der Messung nicht abreiÿt. Nach der Messung sollte
nochmals zur Kontrolle Wasser vermessen werden, damit sicher gestellt ist,
dass der Probenteller wieder sauber ist.
44
Kapitel 6
Puer und Lösungen
5xTBE-Puer, benötigte Menge: 1 L
• 54 g/L Tris-Base
• 22.5 g/L Borsäure
• 20 ml EDTA (0.5 M; pH 8.0)
• ad 1 L mit Wasser
50xTAE-Puer, benötigte Menge: 500 mL
• 2M Tris-Base (121 g/500 mL)
• Eisessig 28,6 mL / 500 mL
• 50 mM EDTA (0.5 M; pH 8.0) (50 mL / 500 mL)
• ad 500 mL mit Wasser
PBS (isotonischer Phosphatpuer nach Dulbeco), benötigte Menge: 2 mal
500 mL
• 137 mM NaCl
• 2,7 mM KCl
• 6,5 mM Na2 PO4 H
• 1,5 mM KH2 PO4
• pH 7,4 (muss nicht eingestellt werden)
45
RNA-Elutionspuer, benötigte Menge: 50 mL
Achtung diese Lösung muss RNase-frei sein, daher zum Ansetzen möglichst sterile
Röhrchen und sauberes Wasser (frisches bidest oder DEPC Wasser) verwenden.
• 0,3 M Na-acetat
• 1 mM EDTA
• 0,1 % SDS (w/v)
TE-Puer, benötigte Menge: 10 mL
• 10 mM Tris/HCl-Puer
• 1 mM EDTA
• pH 7
Na-acetat, benötigte Menge: 50 mL
• 3 M Na-acetat
• pH 5,2 mit Essigsäure
10xRibozymspaltungspuer, benötigte Menge: 10 mL
Achtung diese Lösung muss RNase-frei sein, daher zum Ansetzen möglichst sterile
Röhrchen und sauberes Wasser (frisches bidest oder DEPC Wasser) verwenden.
• 500 mM Tris/HCl-Puer
• 110 mM MgCl2
• pH 7,5
10xRibozymspaltungspuer ohne MgCl2 , benötigte Menge: 10 mL
Achtung diese Lösung muss RNase-frei sein, daher zum Ansetzen möglichst sterile
Röhrchen und sauberes Wasser (frisches bidest oder DEPC Wasser) verwenden.
• 500 mM Tris/HCl-Puer
• pH 7,5
6x DNA Ladepuer, nativ, wird gestellt
• 50% Saccharose (w/v)
• 1% SDS (w/v)
• 0,1 % Orange G (w/v)
DNA Ladepuer, denaturierend, wird gestellt
• 10 M Harnsto
• 0,025% Bromphenolblau (w/v)
• 0,025 % Xylene Cyanol (w/v)
46
Kapitel 7
Anhang
47
Abbildung 7.1: RNA Ladder Low Range
48
Abbildung 7.2: Gene Ruler DNA Ladder 50 bp
49
Literaturverzeichnis
[1] Waldrop, M. M. Catalytic rna wins chemistry nobel. Science 246(4928),
325, Oct 20 (1989).
[2] North, G. Nobel prizes: chemistry. rna's catalytic role.
341(6243), 556, Oct 19 (1989).
Nature
[3] Zaug, A. J. and Cech, T. R. The intervening sequence rna of tetrahymena is an enzyme. Science 231(4737), 4705, Jan 31 (1986).
[4] Stephenson, M. L. and Zamecnik, P. C. Inhibition of rous sarcoma viral
rna translation by a specic oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad
Sci U S A 75(1), 2858, January (1978).
[5] Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and
Mello, C. C. Potent and specic genetic interference by double-stranded
rna in caenorhabditis elegans. Nature 391(6669), 80611, Feb 19 (1998).
[6] Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and
Tuschl, T. Duplexes of 21-nucleotide rnas mediate rna interference in
cultured mammalian cells. Nature 411(6836), 4948, May 24 (2001).
[7] Doudna, J. A. and Cech, T. R. The chemical repertoire of natural
ribozymes. Nature 418(6894), 2228, Jul 11 (2002).
[8] Arenz, C. and Schepers, U. Rna interference: from an ancient mechanism
to a state of the art therapeutic application? Naturwissenschaften 90(8),
34559, August (2003).
[9] Jaschke, A. Rna-catalyzed carbon-carbon bond formation. Biol Chem
382(9), 13215, September (2001).
[10] Jaschke, A., Stuhlmann, F., Bebenroth, D., Keiper, S., and Wombacher,
R. Ribozyme-catalysed carbon-carbon bond formation. Biochem Soc
Trans 30(6), 113740, November (2002).
50
[11] Lehman, N. Assessing the likelihood of recurrence during rna evolution
in vitro. Articial Life 10, 122 (2004).
[12] Vartanian, J.-P., Henry, M., and Wai-Hobson, S. Hypermutagenic pcr
involving all four transitions and a sizeable proportion of tranversions.
Nucleic Acids Research 24(14), 26272631 (1996).
51