2. Ergebnisse - OPUS

2. Ergebnisse
Die Calponin-Gene sind in die Regulation der Zellmigration, der
Proliferation und der Organentwicklung von Wirbeltierembryonen
involviert. Hierfür sprechen ihre funktionellen Eigenschaften und ihre
Expressionsmuster in sich entwickelnden Vertebraten (Samaha et al.,
1996; Miano et al., 1996).
Um die Funktion eines Genproduktes während der Entwicklung zu
ergründen, sollten folgende Kriterien berücksichtigt werden. Zunächst
muss das Expressionsmuster der Gene während der Entwicklung
untersucht werden, dann gilt es, die biologische Aktivität der Proteine in
vivo durch Funktionsgewinn- und verlustexperimente abzuklären (Slack,
2006).
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei weitere Calponin-Gene (Xclp1,
Xclp3) aus dem afrikanischen Krallenfrosch Xenopus laevis kloniert. Es
handelt sich dabei um das in anderen Vertebraten beschriebene Calponin
1 mit basischem Charakter und um das saure Calponin.
Mit Hilfe einer mRNA-Detektionstechnik wurden die Expressionsmuster
der drei Calponin-Gene (Xclp1, Xclp2 und Xclp3) während den
Entwicklungsstadien des Frosches untersucht. Dazu diente die In Situ
Hybridisierung (Sive et al, 2000), welche eine Methode zur Lokalisierung
von Genaktivität im Embryo darstellt.
Nach dem Färben wurden die Expressionsdomänen in Gewebeschnitten
histologisch untersucht. Dadurch erhielt man detailliertere Informationen
über die Aktivitätsmuster von Xclp1, Xclp2 und Xclp3. Die
Expressionsmuster ließen eine Beteiligung der drei Calponinvarianten an
den entscheidenden Entwicklungsprozessen des Embryos vermuten.
Anschließende Funktionsgewinnexperimente dienten zur Aufklärung der
Eigenschaften dieser Gene während der embryologischen Entwicklung
von Xenopus laevis. Aufgrund der hoch konservierten Sequenzen könnten
35
die ermittelten Ergebnisse stellvertretend für die Funktionen der CalponinProteine in anderen Spezies stehen.
2.1. Klonierung von Xclp1 und Xclp3 aus Xenopus laevis
Für die Klonierung von Genen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
sind Sequenzinformationen zur Synthese der spezifischen Oligonukleotide
notwendig. Diese Sequenzinformationen können aus einer Genom- oder
cDNA Datenbank stammen, die mit einer bekannten Sequenz
(beispielsweise aus einer anderen Spezies wie Maus oder Mensch)
verglichen werden. Da für Xenopus laevis kein Genomprojekt zur
Verfügung stand und der Abgleich mit den gängigen cDNA Datenbanken
zu keinem Erfolg führte, wurde eine sogenannte EST (Expressed
Sequence Tag) Datenbank herangezogen. EST Datenbanken bestehen
aus zufällig klonierten cDNA Sequenzen, die für zahlreiche
Entwicklungsstadien existieren. Ziel hierbei ist es, möglichst die
Gesamtheit aller exprimierten mRNAs zu einem bestimmten Zeitpunkt
darzustellen. Aufgrund ihrer Herstellungsweise sind EST Sequenzen meist
nicht vollständig und zeigen nur partielle Sequenzdaten einer mRNA auf.
Ein Sequenzvergleich mit humanem Calponin h1 bzw. dem sauren
Calponin ergab 4 bzw. 1 Xenopus laevis EST Sequenzen, die hohe
Homologien aufwiesen. Zum Erhalt der codierenden Sequenzen von
Xclp1 und Xclp3 wurden Polymerase-Kettenreaktionen mit den erzeugten
sequenzspezifischen Oligonukleotiden und cDNA durchgeführt. Die als
Matrize verwendete cDNA wurde aus der Gesamt-RNA von Xenopus
laevis in den Schwanzknospenstadien (St.32, St.38 und St.42)
transkribiert. Die codierenden Sequenzen wurden sequenziert.
36
2.1.1. Sequenzanalyse von Xclp1, 2 und 3
Der Grad der Aminosäurenhomologien zwischen den Vertebraten gibt
einen Hinweis auf die Identität der untersuchten Proteinsequenz und
darüber hinaus Hinweise auf eine mögliche Konservierung der
Proteinfunktion. Mit den BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
umfassenden Programmen wurden die translatierten Sequenzen von
Xclp1, Xclp2 und Xclp3 mit Datenbankeinträgen von bereits identifizierten
Calponinsequenzen von Mensch, Maus, Huhn und Fisch verglichen.
Xclp1
mCalponin 1
hCalponin 1
-MYGHFNKGPAYGLSAEVKNKLAQKYDPLKEAELRQWIDGLTGRTIGNNFMDSLKDGIIL
MSSAHFNRGPAYGLSAEVKNKLAQKYDHQREQELREWIEGVTGRRIGNNFMYGLKDGIIL
MSSAHFNRGPAYGLSAEVKNKLAQKYDHQREQELREWIEGVTGRRIGNNFMDGLKDGIIL
::***:******************* :* *** **:*:***.******. *******
Xclp1
mCalponin 1
hCalponin 1
CELINKLQPGSVRKINEATQNWHKLENIGNFIKGIMQYGVKPHDIFEANDLFENTNLTQV
CEFINKLQPGSVKKVNESTQNWHQLENIGNFIKAITKYGVKPHDIFEANDLFENTNHTQV
CEFINKLQPGSVKKINESTQNWHQLENIGNFIKAITKYGVKPHDIFEANDLFENTNHTQV
**:*********:*:** ***** *********:*. ******************* ***
Xclp1
mCalponin 1
hCalponin 1
QCTLLALASVAKSKGARVDIGVKYADRQERRFNPDKLKEGRNIIGLQMGTNKFASQKGMT
QSTLLALASMAKTKGNKVNVGVKYAEKQERRFEPEKLREGRNIIGLQMGTNKFASQQGMT
QSTLLALASMAKTKGNKVNVGVKYAEKQERKFEPGKLREGRNIIGLQMGTNKFASQQGMT
*:******* **:** :* :*****::***:* * **:****************** ***
Xclp1
mCalponin 1
hCalponin 1
SYGTRRHLYDPKLANEQPMDQATISLQMGTNKGASQAGMTAPGTKRQIFDQKLGMEHCDS
AYGTRRHLYDPKLGTDQPLDQATISLQMGTNKGASQAGMTAPGTKRQIFEPGLGMEHCDT
AYGTRRHLYDPKLGTDQPLDQATISLQMGTNKGASQAGMTAPGTKRQIFEPGLGMEHCDT
************:::**:******************************: *******:
Xclp1
mCalponin 1
hCalponin 1
QTVSLQMGSNKGASQHGMTVYGLPRQVYDSKYCNVPEFLMEGDEDGQYNNSHQYYNSE
LNVSLQMGSNKGASQRGMTVYGLPRQVYDPKYCLNPEYPELS-EPTHNHHPHNYYNSLNVSLQMGSNKGASQRGMTVYGLPRQVYDPKYCLTPEYPELG-EPAHNHHAHNYYNS:*************:************* *** **
*
:. *:****
297 AS; 33,2kDa
Abb.4 Vergleich der Aminosäurensequenz von Calponin 1 in Xenopus laevis, Mus
musculus und Homo sapiens.
Die übereinstimmenden Aminosäuren wurden grün und mit Stern gekennzeichnet. Die
verschiedenen Aminosäuren mit chemisch ähnlichen Eigenschaften wurden mit einem
Punkt, die Aminosäuren mit chemisch gleichen Eigenschaften mit zwei Punkten
gekennzeichnet. Die funktionellen Domänen wurden farbig unterlegt. Die Calponin
Homologie Domäne wurde grau, die erste Aktinbindedomäne hellblau und das Calponin
ähnliche Wiederholungsmodul (ABD 2) gelb unterlegt. Benutzt wurde das Programm
T-COFFEE,Version_1.41,http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html.
Xclp1 (Xenopus laevis); mCalponin 1 (Mus musculus) Acc. NP_034052, Vers. GI:
31560611; hCalponin 1 (Homo sapiens), basic smooth muscle Acc. AAH36307, Vers. GI:
33990056.
Die Aminosäurenabfolgen der Calponin-Proteine sind zwischen den
einzelnen Vertebraten sehr hoch konserviert. So beträgt die Homologie
von Calponin 1 zwischen Xenopus laevis und Mensch 95%, Danio rerio
37
(Zebrabärbling) 80%, Mus musculus (Hausmaus) 95% und Coturnix
coturnix (Wachtel) 93% (Tab.1; Abb.4).
Protein: Calponin 1
Coturnix coturnix
Danio rerio
Mus musculus
Homo sapiens
Länge
292
331
330
329
identisch
222/292 (74 %)
200/331 (60 %)
282/330 (85 %)
285/329 (87 %)
homolog
270/292 (93 %)
266/331 (80 %)
315/330 (95 %)
314/329 (95 %)
Tab.1 Identität und Homologie der Aminosäurensequenz zwischen Xclp1 und den
Calponin 1 anderer Vertebraten
Die Werte wurden numerisch und prozentual dargestellt.
Database: All non-redundant GenBank CDS, Translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).
Die Homologie von Calponin 2 zwischen Xenopus laevis und Homo
sapiens liegt bei 86%, Danio rerio 89% und Mus musculus 89% (Tab.2;
Abb.5).
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
-MSSQFNKGPSYGLSAEVKNKLAQKYDPQKETELKVWIEEVTGMSIGPDFQKGLKDGVIL
MSSTQFNKGPSYGLSAEVKNRLLSKYDPQKEAELRSWIEGLTGLSIGPDFQKGLKDGVIL
MSSTQFNKGPSYGLSAEVKNRLLSKYDPQKEAELRTWIEGLTGLSIGPDFQKGLKDGTIL
*:****************::::******* **: *** :**:*************.**
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
CELMNKLRPRAIPKVNVSRQNWHQLENLSNFIKAMSLYGMKSVDLFEANDLFENGNMTQV
CTLMNKLQPGSVPKINRSMQNWHQLENLSNFIKAMVSYGMNPVDLFEANDLFESGNMTQV
CTLMNKLQPGSVPKINRSMQNWHQLENLSNFIKAMVSYGMNPVDLFEANDLFESGNMTQV
*.***** * :**:* * **************** ***. ***********:******
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
QVSLLSLAGLAKTQGLQS-VDIGVKYSEKKERNFDDNTKKAGNCVIGLQMGTNKCASQSG
QVSLLALAGKAKTKGLQSGVDIGVKYSEKQERNFDDATMKAGQCVIGLQMGTNKCASQSG
QVSLLALAGKAKTKGLQSGVDIGVKYSEKQERNFDDATMKAGQCVIGLQMGTNKCASQSG
***** *** ***.**** ********** ****** * ***:*****************
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
MTAYGTRRHLYDPKNTILPPMDHSTISLQMGSNKGASQVGMTAPGTRRHIYDTKSGTEKC
MTAYGTRRHLYDPKNHILPPMDHCTISLQMGTNKCASQVGMTAPGTRRHIYDTKLGTDKC
MTAYGTRRHLYDPKNHILPPMDHSTISLQMGTNKCASQVGMTAPGTRRHIYDTKLGIDKC
***************.*******:*******:** ******************* * :**
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
DNSSMSLQMGYTQGANQSGQIFGLGRQIYDPKYCPTGNRDDLPHDENEQEQY----QQDF
DNSSMSLQMGYTQGANQSGQVFGLGRQIYDPKYCPQGSAADGAPAGDGQ----GEAPEYL
DNSSMSLQMGYTQGANQSGQVFGLGRQIYDPKYCPQGTVADGAPSGTGDCPDPGEVPEYP
********************:**************:*: *::
**: :
Xclp2
mCalponin 2
hCalponin 2
--------AYCQEEAGY
PYYQEEAGY
:*:******
Abb.5 Vergleich der Aminosäurensequenzen des Calponin 2 von Xenopus laevis,
Mus musculus und Homo sapiens
Die übereinstimmenden Aminosäuren wurden grün und mit Stern gekennzeichnet. Die
verschiedenen Aminosäuren mit chemisch ähnlichen Eigenschaften wurden mit einem
Punkt, die Aminosäuren mit chemisch gleichen Eigenschaften mit zwei Punkten
gekennzeichnet. Die funktionellen Domänen wurden farbig unterlegt.
Die Calponin Homologie Domäne wurde grau, die erste Aktinbindedomäne hellblau und
das Calponin ähnliche Wiederholungsmodul (ABD 2) gelb unterlegt.
Benutzt wurde das Programm T-COFFEE, Version_1.41,
38
http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html.
Xclp2 (Xenopus laevis), mCalponin 2 (Mus musculus) Acc.NP_031751, Vers.GI:
6680952, hCalponin 2 (Homo sapiens) Acc. CAG46609, Vers. GI: 49456577.
Protein: Calponin 2
Danio rerio
Mus musculus
Homo sapiens
Länge
307
305
309
identisch
220/307 (72%)
240/305 (79%)
242/309 (78%)
homolog
273/307 (89%)
270/305 (89%)
266/309 (86%)
Tab.2 Identität und Homologie der Aminosäurensequenz zwischen Xclp2 und den
Calponin 2 anderer Vertebraten
Die Werte wurden numerisch und prozentual dargestellt.
Database: All non-redundant GenBank CDS, Translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).
Die Homologie zwischen dem sauren Calponin 3 von Xenopus laevis und
Homo sapiens beträgt 95%, Danio rerio 95%, Gallus gallus (Haushuhn)
96% und Mus musculus 95% (Tab.3; Abb.6).
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
MANFNKGPAYGLSAEVKNKIAQKYDPQVEEDLRLWIEEVTGMIIGENFQQGLRDGVILCN
MTHFNKGPSYGLSAEVKNKIASKYDQQAEEDLRNWIEEVTGLGIGTNFQLGLKDGIILCE
MTHFNKGPSYGLSAEVKNKIASKYDHQAEEDLRNWIEEVTGMSIGPNFQLGLKDGIILCE
* ***** ************:*** *:***** *******: ** *** **:**:***:
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
LINKLQPGSIRKINEAKLNWHKLENIGNFIKSMQEYGMKPHDIFEANDLFENGNMTQVQT
LINKLQPGSVKKVNESSLNWPQLENIGNFIKAIQAYGMKPHDIFEANDLFENGNMTQVQT
LINKLQPGSVKKVNESSLNWPQLENIGNFIKAIQAYGMKPHDIFEANDLFENGNMTQVQT
*********::*:** .*** .********* :: *************************
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
SLVSLAGLAKTKGFHTSVDIGVKYAEKQRRQFGDEKMKAGQSVIGLQMGTNKCASQAGMT
TLVALAGLAKTKGFHTTIDIGVKYAEKQTRRFDEGKLKAGQSVIGLQMGTNKCASQAGMT
TLVALAGLAKTKGFHTTIDIGVKYAEKQTRRFDEGKLKAGQSVIGLQMGTNKCASQAGMT
:** ************::**********.*.* : *:***********************
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
AYGTRRHLYDPKMRTDKPFDQTTISLQMGTNKGASQAGMPAPGTRRDIYDQKAVSQPADN
AYGTRRHLYDPKMQTDKPFDQTTISLQMGTNKGASQAGMLAPGTRRDIYDQKLTLQPVDN
AYGTRRHLYDPKMQTDKPFDQTTISLQMGTNKGASQAGMLAPGTRRDIYDQKLTLQPVDN
*************.*************************:************: **:**
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
STISLQMGTNKVASQKGMSVYGLGRQVYDPKYCAAPTEPIIHNGSQGTGTNGSEISDSDY
STISLQMGTNKVASQKGMSVYGLGRQVYDPKYCAAPTEPVIHNGSQGTGTNGSEISDSDY
STISLQMGTNKVASQKGMSVYGLGRQVYDPKYCAAPTEPVIHNGSQGTGTNGSEISDSDY
***************************************:********************
Xclp3
mCalponin ac
hCalponin ac
QAEYPDEYQGEYPDDYPRDYHGQYSDQGIDYLEI
QAEYPDEYHGEYPDDYPREYQYG-DDQGIDY--QAEYPDEYHGEYQDDYPRDYQY--SDQGIDY--********.*** *****:*.
.******
Abb.6 Vergleich der Aminosäurensequenzen des sauren Calponin in Xenopus
laevis, Mus musculus und Homo sapiens
Die übereinstimmenden Amiosäuren wurden grün und mit Stern gekennzeichnet. Die
verschiedenen Aminosäuren mit chemisch ähnlichen Eigenschaften wurden mit einem
Punkt, die Aminosäuren mit chemisch gleichen Eigenschaften mit zwei Punkten
gekennzeichnet. Die funktionellen Domänen wurden farbig unterlegt. Die Calponin
Homologie Domäne wurde grau, die erste Aktinbindedomäne hellblau und das Calponin
ähnliche Wiederholungs Modul (ABD 2) gelb unterlegt.
Benutzt wurde das Programm
T-COFFEE Version_1.41,http://www.ch.embnet.org/software/T-COFFEE.html.
39
Xclp3 (Xenopus laevis), mCalponin acidic (Mus musculus) Acc.NP_082320, Vers. GI:
21312564, hCalponin acidic (Homo sapiens) Acc.CAG46646, Vers. GI: 49456651.
Protein: saures
Calponin
Gallus gallus
Danio rerio
Mus musculus
Homo sapiens
Länge
identisch
homolog
331
329
330
329
289/331 (87 %)
271/329 (82 %)
282/330 (85 %)
285/329 (87 %)
317/331 (96 %)
313/329 (95 %)
315/330 (95 %)
311/329 (95 %)
Tab.3 Übereinstimmung und daraus resultierende Homologie zwischen Xclp3 und
saurem Calponin anderer Vertebraten
Die Werte wurden numerisch und prozentual dargestellt. Database: All non-redundant
GenBank CDS
Translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF,(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).
Die sehr hohe evolutive Konservierung der drei Calponin-Proteine
innerhalb der verschiedenen Vertebraten lässt vermuten, dass diese
Proteine an wesentlichen funktionellen Prozessen der sich entwickelnden
Organismen beteiligt sind.
2.2. Untersuchung der genetischen Aktivitätsmuster von
Xclp1, Xclp2 und Xclp3 in frühen Entwicklungsstadien von
Xenopus laevis
Um die Rolle der drei Calponin-Gene während der Embryonalentwicklung
zu untersuchen, wurden die zeitlichen und räumlichen Aktivitätsmuster in
Xenopus laevis Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien detailliert
untersucht.
2.2.1. Xclp1
Mit der RT (Reverse Transkriptase)-PCR Methode konnten geringe
Mengen an maternaler Xclp1 mRNA während den Furchungsstadien
nachgewiesen werden (nicht gezeigt).
Durch Expressionsanalysen in anderen Vertebraten gilt Calponin h1 als
prominenter Marker der differenzierten glatten Muskelzellen. Da die
40
Expression von Calponin h1 in den glatten Muskelzellen während deren
Entwicklung und Differenzierung zunimmt, wird ihm außerdem eine Rolle
bei der funktionellen Reifung der Muskel-Myofilamente in diesen Zellen
zugesprochen (Draeger et al., 1991; Gimona et al., 1992).
Abb.7 Xclp1 mRNA Expression während der Embryonalentwicklung
In Situ Hybridisierung mit einer Sonde gegen Xclp1 in Embryonen verschiedener
Entwicklungsstadien. Die Embryonen sind in links lateraler Ansicht gezeigt (A, B, C). Die
Lage der Transversalschnitte sind angedeutet. Um Artefaktfärbung zu vermeiden, wurde
bei den späten Kaulquappenstadien der Bauchraum geöffnet. Mit Hilfe von Anti-Sinn
RNA konnte Xclp1 in der Lungenanlage von Xenopus laevis nachgewiesen werden. Im
Schwanzknospenstadium St.37, wird Xclp1 mRNA in den Mesenchymzellen des dorsalen
splanchnischen Mesoderms (A, dsM, gelbe Pfeilspitze) exprimiert. Diese Zellen
differenzieren sich in der weiteren Entwicklung zu den die Lungen umgebenden glatten
Muskelzellen und stellen somit die Lungenanlage dar. In den Folgestadien St.42 bzw.
St.45 wurde die Expression von Xclp1 mRNA in den Glattmuskelzellen der
Lungenknospen (LK) und des Intestinaltraktes (B, C, blaue Pfeilspitze) gezeigt.
Auch im Frosch konnte Xclp1 mRNA in den Zellen der sich entwickelnden
glatten Muskulatur nachgewiesen werden (Abb.7).
41
Im Kaulquappenstadium (St.42), dem 3 Tage alten Embryo, exprimierten
die Mesenchymzellen des sich entwickelnden Intestinaltraktes erstmals
Xclp1 mRNA (Abb.7, B). Diese vom Mesoderm stammenden Zellen des
Darmes zeigen neben den Zellen des Entoderms zunächst nur wenig
Differenzierung. Tatsächlich erscheinen in diesem Entwicklungsstadium
erste Myoblasten außerhalb des intestinalen Epitheliums, die sich in glatte
Muskelzellen differenzieren (Nieuwkoop and Faber, 1967).
Die glatte Muskulatur des Darmes im Kaulquappenstadium von Xenopus
laevis besteht dann letztlich nur aus einer einzelnen sehr dünnen
Zellschicht (Kordylewski, 1983; Chalmers und Slack, 1998).
Ein an Intensität zunehmendes Xclp1 Signal lässt sich schließlich in den
sich differenzierenden zirkulär orientierten Glattmuskelzellen des Darmes
der 5 Tage alten Xenopus Kaulquappe erkennen (Abb.7, C). Diese innere
zirkulär orientierte Muskelschicht wird früher gebildet als die äußere
longitudinal orientierte Schicht (Nieuwkoop and Faber, 1967).
Die Expression von Xclp1 nimmt mit dem Differenzierungsgrad der glatten
Muskelzellen, welche die verschiedenen Abschnitte des
Verdauungstraktes wie den Oesophagus, den Magen, den Dünn- und
Dickdarm umgeben, zu (nicht gezeigt).
In den Froschembryonen konnte außer diesem prominenten
Aktivitätsmuster eine weitere interessante Expressionsdomäne
festgestellt werden. Neben den Zellen des Intestinaltraktes konnte Xclp1
Aktivität auch in den Zellen des sich entwickelnden Respirationstraktes
nachgewiesen werden.
Im Schwanzknospenstadium (St.37) erfolgte die Xclp1 Transkription
erstmals in den Zellen des splanchnischen Seitenplattenmesoderms
(Abb.7, A). Dies gilt als Vorläufergewebe der später den Respirationstrakt
umgebenden glatten Muskelzellen. In der Kaulquappe handelt es sich
dabei zunächst um sogenannte Lungenknospen, die sich bilateral
entwickeln. Der Frosch selbst besitzt erst nach der Metamorphose eine
funktionsfähige Lunge. Im Stadium 42 wurde Xclp1 mRNA in den
42
differenzierenden glatten Muskelzellen dieser Lungenknospen gezeigt. Die
tubulären Lungenknospen erstrecken sich nun als abgeschlossenes
System auf beiden Seiten des Darmes nach caudal (Abb.7, B). Die
Expression von Xclp1 mRNA in den Glattmuskelzellen der
Lungenknospen blieb auch im späten Kaulquappenstadium bestehen. So
wurde im Stadium 45, dem 5 Tage alten Embryo, positives Xclp1 Signal in
den funktionsfähigen glatten Muskelzellen der jetzt dorsoventral
zusammengepressten Lungenknospen nachgewiesen, die auf beiden
Seiten des Oesophagus und des Magens in den dorsalen Bereich der
Abdominalhöhle ragen (Abb.7, C).
2.2.2. Xclp2
Bereits im Rahmen meiner Diplomarbeit wurden Entwicklungsstadien der
späten Neurulation (St.19) und des Schwanzknospenstadiums (St.33) auf
Transkription von Xclp2 hin untersucht. Damals galt es zu prüfen, ob
Calponin als mögliches Zielgen von Pitx2 regulatorisch die asymmetrische
Organogenese von Herz oder Darm beeinflussen kann. Deshalb wurde
die Aktivität von Xclp2 während der Entwicklung des Herzens und des
Darmes untersucht. Die damaligen Analysen zeigten, dass Xclp2 dafür
nicht in Frage kam. Da die Funktion von Xclp2 weiterhin unklar war, wurde
in dieser Arbeit die Fragestellung breiter angelegt. Weitergehende
detaillierte Überprüfungen ergaben zusätzliche Expressionsmuster von
Xclp2 im sich entwickelnden Embryo.
Durch die Nutzung eines verbesserten Protokolls für die In Situ
Hybridisierung (Uyen Tran et al., 2003) konnten die bereits
beschriebenen, wie auch neue Xclp2 Expressionsmuster beobachtet
werden.
43
Abb.8 Xclp2 mRNA Expression während den embryonalen Entwicklungsstadien
von Xenopus laevis.
Definierte Stadien nach einer In Situ Hybridisierung mit Xclp2 Anti-Sinn RNA in caudaler
(A, B) und in links lateraler Ansicht (C, D). Die Positionen der Sagittal- (A´) und
Transversalschnitte wurden schematisch dargestellt (B´, C´, D´).
Während der Gastrulation wurde Xclp2 mRNA im zukünftigen neuralen (eN, rote
Pfeilspitze) und epidermalen (eE, rosa Pfeilspitze) Ektoderm, im zukünftigen Mesoderm
und Entoderm vor deren Invagination exprimiert (A´, St.12, Sagittalschnitt).
Die über die Urmundlippe in das Innere des Embryos involutierten Zellen verloren ihre
Xclp2 mRNA Expression (A´´, Ausschnittsvergrößerung, weiße Pfeilspitze).
44
Nach abgeschlossener Neurulation St.21 bzw. St.24 fand sich Xclp2 mRNA in den
migrierenden Neuralleistenzellen (rote Pfeilspitzen) des cranialen Bereiches (B, B´, C,
C´) und des Rumpfes (B, B´´, C, C´´).
Im frühen Schwanzknospenstadium St.24 (C) wanderten die Xclp2 mRNA positiven
mandibularen (mNLZ), hyoidalen (hNLZ) cranialen Neuralleistenzellen nach ventral.
Weiter posterior migrierten die Xclp2 mRNA exprimierenden Neuralleistenzellen des
Rumpfes (rNLZ) lateral zwischen den Somiten und der Epidermis.
Im Gegensatz zu früheren Entwicklungsstadien exprimierten nun die Zellen der
Herzanlage, die sich simultan auf beiden Seiten des Embryos in Richtung der ventralen
Mittellinie bewegten und dort fusionierten Xclp2 mRNA (C´´, Transversalschnitt durch die
Herzregion, grüne Pfeilspitze).
Die Expression in den Zellen der Chorda dorsalis (Chd) fand sich bis zum Stadium 24
(B´, B´´, C´, C´´, gelbe Pfeilspitzen). Im fortgeschrittenen Schwanzknospenstadium
erschien erstmals Xclp2 mRNA Transkription in den Zellen des sich nach caudal bis zur
Kloake erstreckenen Pronephrosganges (Pg) und in den Pronephrostubuli (Pt) (D, D´,
blaue Pfeilspitzen).
Xclp2 mRNA fand sich erstmals in Blastulastadien in der animalen Region
(nicht gezeigt). Diese mRNA war zum Zeitpunkt des MidblastulaÜbergangs entstanden, dem Moment indem das zygotische Genom
erstmals transkribiert werden kann. Eine maternale Transkription während
der Eireifung konnte durch die Abwesenheit eines Xclp2 Signals
ausgeschlossen werden (nicht gezeigt). Nach Beginn der embryonalen
Transkription während der Blastulastadien fand sich Xclp2 mRNA in den
animalen Zellen des epidermalen Ektoderms und des Neuroektoderms
des gastrulierenden Embryos (St.10,5 nicht gezeigt und St.12, Abb.8, A).
Auch die dorsalen und ventralen mesodermalen Zellen der Randzone
wiesen positives Xclp2 Signal auf. Diese Zellen, die zur Bildung der
entodermalen und mesodermalen Organstrukturen beitragen, werden in
das Innere des gastrulierenden Embryos verlagert. Nach dieser
Verlagerung verloren die Zellen ihr Xclp2 Signal und unterlagen einem
epithelial-mesenchymalen Übergang (Abb.8, A´´). Dabei kommt es zur
Veränderung der Polarität, des Adhäsionsverhaltens und der Zellgestalt.
Zudem wirken bei der Involution weitere Kräfte. Eine davon ist die aktive
Migration der mesodermalen Zellen auf der Basallamina unterhalb des
späteren Ektoderms. Eine weitere Kraft ist die konvergente Migration der
Zellen des Epithels (Bray, 2001).
45
Nach Abschluss der Neurulation fanden sich Xclp2 Transkripte in den
einzeln wandernden mesenchymalen cranialen und caudalen
Neuralleistenzellen (NLZ) des Embryos St.21 (Abb.8, B). Die NLZ werden
im embryonalen Ektoderm in den lateralen und dorsalen Regionen der
Grenze zwischen Neuralplatte und dem nicht neuralen Ektoderm, der
späteren Epidermis spezifiziert. Die Zellen können das Neuralrohr nicht
verlassen, solange sie noch fest miteinander verbunden sind. Nach der
Induktion beschreiben die NLZ einen epithelial-mesenchymalen Übergang
und erlangen die für die Migration notwendigen Fähigkeiten, d.h. sie
verlieren die Adhäsion an das sie umgebende Neuroepithelium und
verstärken gleichzeitig die Adhäsion an die extrazelluläre Matrix der
Migrationswege. Die cranialen Neuralleistenzellen beginnen kurz vor dem
Neuralrohrschluss nach ventral zu wandern (Abb.8, B´). Diese cranialen
Neuralleistenzellen emigrieren entlang der visceralen Bögen
(Schlundbögen) in drei verschiedenen Xclp2 exprimierenden Zellströmen
(Abb.8, C). Als 1) mandibularer Zellstrom als 2) hyoidaler Zellstrom und
als 3) branchialer Zellstrom.
Die Xclp2 exprimierenden Neuralleistenzellen des ersten Kiemenbogens
erscheinen zunächst als zusammenhängender Strom. Im frühen
Kaulquappenstadium (St.24) des Xenopus Embryos wandern die Zellen
des mandibularen Neuralleistenzellstromes anterior und posterior um die
Randgebiete der Augen (Abb.8, C). Der anteriore Zellstrom dient
höchstwahrscheinlich dem Aufbau der mesenchymalen und choroidalen
Schichten des Auges und der Cornea, sowie des benachbarten
Kopfmesenchyms. Der Hyoid-Bogen separiert den ersten und zweiten
Schlundbogen (Abb.8, C, C´). Später, weiter caudal, migrieren die
Rumpfneuralleistenzellen (Abb.8, B´´, C´´). Die Xclp2 exprimierenden
Zellen des Rumpfneuralleistenzellstroms wandern dorso lateral zwischen
dem Ektoderm und den Somiten (Abb.8, B´´, C´´).
Xclp2 wurde auch in motilen Zellen anderer Gewebe exprimiert, so zum
Beispiel in den migrierenden Myocardmyoblasten des Herzvorläufergewebes. Im Stadium 24 fanden sich Xclp2 Transkripte in diesen
46
migrierenden Herzvorläuferzellen ventral des Urdarmes (Abb.8, C´´). Die
Xclp2 exprimierenden Zellen fusionierten an der ventralen Mittellinie und
bildeten den linearen Herztubus (St.30), aus dem von anterior nach
posterior der Bulbus cordis, der Ventrikel, die Atrien und der Sinus
venosus hervorgehen. Die Xclp2 Expression blieb bilateral in den drei
Kammern, den zwei Atrien und dem Ventrikel (de Graaf, 1957) des
ausdifferenzierten Froschherzens bestehen (nicht gezeigt).
Eine weitere Expressionsdomäne von Xclp2 befand sich in den
Strukturen des sich paarig entwickelnden Pronephros (Abb.8, D). Der
Pronephros ist das erste Exkretionsorgan in der Kaulquappe und
entwickelt sich aus dem somatischen und splanchnischen intermediären
Mesoderm. Der Pronephros ist nur während der Kaulquappenstadien
funktionsfähig. Während der Metamorphose degeneriert er. Im
Schwanzknospenstadium St.38 wurde Xclp2 in den Zellen der
Pronephrostubuli (Abb.8, D´) und des Pronephrosganges (Abb.8, D)
exprimiert. Das tubuläre System gliedert sich an das Coelom über drei
Nephrostome, dünne zilientragende Trichter, an. Diese Nephrostome
transportieren den Urin aus dem Coelom in die Tubuli. Der
Pronephrosgang erstreckt sich nach caudal. Über ihn gelangen
schließlich die Abbauprodukte aus den Tubuli in die Kloake (Abb.8, D)
(Vize et al., 1995; Schultheiss et al., 2003).
2.2.3. Xclp3
Während den Furchungsstadien des Xenopus laevis Embryos fand sich
maternale Xclp3 mRNA im animalen Bereich der Blastomere (Abb.9, A,
A´). Nach dem Mid-Blastula-Übergang blieb die Xclp3 Expression
bestehen. Ob es sich dabei weiterhin um maternale oder bereits um vom
Embryo selbst transkribierte Xclp3 mRNA handelte war nicht
unterscheidbar.
Während der Gastrulation zeigte sich ein dem Xclp2 entsprechendes
Expressionsmuster in den epithelialen Zellen der zukünftigen Epidermis
47
und des Neuroektoderms (Abb.9, B´, C´). Die dorsalen und ventralen
mesodermalen Zellen der Randzone exprimierten ebenfalls Xclp3 mRNA.
Die während der Gastrulation durch den Urmund eindringenden
Zellkohorten der Randzone verloren nach diesem Vorgang das positive
Xclp3 Signal und breiteten sich entlang der Innenseite des Blastoderms
als Urdarm (Archenteron) aus (Abb.9, C´, weiße Pfeilspitze).
Abb.9 Xclp3 mRNA Expression während der Entwicklung von Xenopus laevis.
Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien wurden mittels In Situ Hybridisierung
mit einer spezifischen Sonde auf Xclp3 Transkription untersucht.
Gezeigt werden Embryonen im vier-Zell-Stadium (A, caudale Ansicht), während der
Gastrulation (St.10,5 (B), St.12 (C), caudale Ansicht), in der Neurulation (St.18 (D),
frontale Ansicht) und in den Schwanzknospenstadien (St.24 (E) und St.37 (F), jeweils
links laterale Ansicht).
48
Die jeweiligen Schnittebenen wurden schematisch durch Striche dargestellt (medial (A´),
sagittal (B´, C´), transversal (D´, E´, F´).
Im vierzelligen Embryo fand sich Xclp3 mRNA im animalen Bereich der Blastomere (A,
A´).
Während der Gastrulationsstadien (St.10,5; St.12) wurde Xclp3 Expression in der
epithelialen und sensorischen Schicht des zukünftigen epidermalen Ektoderms (eE, rosa
Pfeilspitze) und des zukünftigen Neuroektoderms (eN, rote Pfeilspitze), im Mesoderm
und im Entoderm (C, C´) deutlich. Durch Invagination gelangen die beiden letzteren über
die dorsale Urmundlippe in das Innere des Embryos. Beim Übergang verloren die Zellen
ihre Xclp3 Expression (C´, weiße Pfeilspitze).
Im Neurula-Stadium (St.18) und während der Schwanzknospenstadien (St.24, St.37)
wurde Xclp3 mRNA im gesamten Neuroektoderm exprimiert (D, E). Positves Signal fand
sich in den Zellen der sich schließenden Neuralfalte (D, D´, rote Pfeilspitze) und später im
Neuralrohr und im Kopfneuroektoderm (E, E´, F, F´). Xclp3 mRNA Transkription fand sich
stadienübergreifend im dorsalen Entoderm (D´, E´´, F´, schwarze Pfeilspitze). Im
Schwanzknospenstadium (St.24) waren die Zellen des Herzmesoderms (cM) Xclp3
mRNA positiv (E´, grüne Pfeilspitze).
Im Stadium 37 wurde Xclp3 mRNA in den sich entwickelnden tubulären Strukturen des
Pronephros (Pt) und dem Pronephrosgang (Pg) transkribiert (F, F´, blaue Pfeilspitze).
Während den Neurulastadien wurde Xclp3 mRNA nur noch in Zellen des
zukünftigen Neuroektoderms transkribiert. Im Stadium 18 fand sich Xclp3
mRNA in den Zellen des sich schließenden Neuralrohrs. Nach Abschluss
der Neurulation, im frühen Schwanzknospenstadium (St.24), wurde Xclp3
anterior in den Kompartimenten des Gehirns und in den Zellen des
Neuralrohrs exprimiert (Abb.9, E, E´, E ´´). Die neurale
Expressionsdomäne von Xclp3 blieb im Stadium 37 während der weiteren
Entwicklung des zentralen Nervensystems im Gehirn und im Rückenmark
erhalten (Abb.9. F, F´). Sehr interessant war zudem die Expression von
Xclp3 in den Zellen des dorsalen Entoderms. Im späten
Neurulationsstadium (St.18) transkribierten die Zellen des dorsalen
Entoderms Xclp3 (Abb.9, D´). Dieses Expressionsmuster blieb während
der frühen und späten Kaulquappenstadien bestehen (Abb.9, E´, F´).
Übereinstimmend hierzu fand man saures Calponin in Neuronen während
der frühen Embryonalentwicklung und im Gehirn, der Lunge, der Aorta,
der Niere, dem Darm und dem Magen der adulten Ratte (Plantier M. et al.,
1999; Ferhat et al., 1996; Trabelsi-Terzidis et al., 1995). Mit dem Xclp2
Expressionsmuster identisch war die Xclp3 Transkription im frühen
Schwanzknospenembryo (St.24) in den wandernden Myocardmyoblasten
49
(Abb.9, E´). Später erschien Xclp3 mRNA ebenfalls bilateral symmetrisch
im Myocard, Epicard und Entocard des Frosch-Herzens (nicht gezeigt).
Eine weitere Koexpression von Xclp2 und Xclp3 erfolgte in der sich
entwickelnden Vorniere. Ab dem Schwanzknospenstadium (St.37) zeigten
die Zellen der Pronephrostubuli, sowie des Pronephrosgangs ein positives
Xclp3 Signal (Abb.9, F, F´).
2.2.4. Zusammenfassung der Expressionsdomänen
Während Xclp1 ausschließlich in den sich entwickelnden
Glattmuskelzellen der Lungenknospen und des Intestinaltraktes während
dessen Schleifenbildung exprimiert wurde, fanden sich Xclp2 und 3 mRNA
in anderen Geweben des frühen Embryos, die aktiven morphogenetischen
Prozessen unterliegen. So waren Xclp2 mRNA und Xclp3 mRNA in den
zukünftigen mesodermalen Zellen der dorsalen Randzone exprimiert.
Diese Expression ging jedoch während deren Involution in das Innere des
Keims verloren, welche mit dem Prozess des epithelial-mesenchymalen
Übergangs korreliert.
Am Ende der Gastrulation und in den Neurulastadien konnte Aktivität der
Gene Xclp2 in mesodermalen (Chorda dorsalis) oder Xclp3 in neuralen
Geweben (Neuralplatte) nachgewiesen werden, die sich durch den
Prozess der konvergenten Extension aktiv umordnen. Etwas später,
während den frühen Kaulquappenstadien wurde ein Xclp2 Signal
zusätzlich in den migrierenden cranialen und caudalen Neuralleistenzellen
gefunden.
Da die Calponin-Proteine in der Lage sind, durch Aktin-MyosinInteraktionen die funktionellen Mechanismen wie die Adhäsion, die
Migration oder die Proliferation zu beeinflussen, spricht deren
Expressionsmuster für eine wichtige Rolle bei zentralen Vorgängen auch
während der Embryogenese. Um dies nachzuweisen wurden zunächst
Überexpressionsexperimente in Xenopus laevis durchgeführt.
50
2.3. Funktionelle Analysen
Durch ektopische Überexpression der drei Gene im Froschkeim wurde
versucht, dessen embryonale Entwicklungsvorgänge zu manipulieren.
Die Analyse der auftretenden Fehlentwicklungen im Vergleich mit
Kontrollembryonen sollten Rückschlüsse auf die Funktion der CalponinProteine erlauben. Dafür erfolgte die Klonierung der für Calponin
codierenden Sequenzen in den für Xenopus laevis geeigneten
Expressionsvektor CS2+ (Turner und Rupp). Um einen direkten
Proteinnachweis zu ermöglichen wurden Xclp2 und 3 mit der
Nukleotidsequenz des Myc Epitops fusioniert und ebenfalls in den CS2+
Vektor eingebracht (CSMT; Vize et al., 1991). Diese MycCalponinFusionsproteine liessen sich nun mit Hilfe eines Anti-Myc Antikörpers im
Embryo immunhistochemisch oder im Western Blot nachweisen (Vize et
al., 1991).
Bei den Funktionsgewinnexperimenten wurden synthetische mRNA oder e
DNA Expressionskonstrukte in vier- bis achtzellige Embryonen injiziert.
Die Verwendung von mRNA oder DNA erlaubt eine zeitliche Komponente
des Überexpressionsexperiments. Denn während mRNA unmittelbar nach
der Injektion translatiert wird, und somit auch eine Wirkung während der
Furchungsstadien ausüben kann, findet eine Transkription des DNA
Konstrukts erst in Blastulastadien statt. Der Grund hierfür ist die späte
Aktivierung des zygotischen Genoms im Blastulastadium St.8.5 (MidBlastula-Transition). Das gleiche gilt für ein Expressionskonstrukt. Dies hat
zur Folge, dass erst ab diesem Zeitpunkt ein Anstieg der ektopischen
Proteinmenge auftritt. Damit können also nur die der Blastula folgenden
Entwicklungsprozesse beeinflusst werden.
Die Menge der für die Überexpressionsexperimente eingesetzten DNA ist
jedoch begrenzt. Injektionen von Embryonen mit mehr als 100 pg
zusätzlicher DNA pro Embryo führen während der Gastrulation zu
51
abnormaler Entwicklung und Tod (Early Development, Laboratory Manual,
1998). Die in den folgenden Überexpressionsexperimenten verwendete
DNA Menge reichte von 41 pg bis 82 pg pro Embryo. Im Vergleich dazu
können bei mRNA Injektionen wesentlich höhere Mengen an Nukleinsäure
verwendet werden. Erst ab einer Menge von 5 ng zusätzlicher mRNA pro
Embryo wirkt diese toxisch während der Gastrulation (Early Development,
Laboratory Manual, 1998). In dieser Arbeit wurden 82 pg bis 2.4 ng mRNA
pro Embryo eingesetzt.
Um letztlich Artefakte jeglicher Art auszuschliessen dienten Injektionen mit
DNA-Vektoren bzw. mit mRNAs, die keinen Einfluss auf die Entwicklung
besaßen, als Kontrolle. Der CS2+ Leervektor oder ein CS2+-GFP (Green
Fluoreszent Protein, Chalfie et al., 1994) bzw. die mRNA, die für GFP oder
die bakterielle βGalaktosidase (βGal) codieren, wurden als Kontrollen für
die Calponin Überexpressionexperimente verwendet. In den meisten
Experimenten wurde neben Calponin (DNA bzw. mRNA) GFP oder ßGal
mRNA koinjiziert um festzustellen, welches Gewebe von der
Überexpression betroffen war.
Weil bereits im vierzelligen Froschembryo verschiedene Bereiche
unterschiedlichste Zellschicksale aufweisen, können spezifische Gewebe
gezielt durch Injektionen manipuliert werden. Aufgrund der
Expressionsmuster von Xclp1, Xclp2 und Xclp3 wurden drei Bereiche
ausgewählt.
52
Abb.10 Injektionsschema mit Zellschicksal.
Die Injektionsorte des vierzelligen Xenopus laevis Embryos wurden mit Rücksicht auf das
Zellschicksal der betroffenen Zellen gewählt. Bei den Injektionsorten handelte es sich um
das zukünftige Neuroektoderm (gelb markiert) das dorsale Mesoderm (orange markiert)
und den vegetalen Bereich des ventralen Mesoderms (grün markiert). In den farbig
entsprechenden Kästchen wurde das Schicksal der Zellen der jeweils injizierten Region
beschrieben.
2.3.1. Xclp1 Überexpression im sich entwickelnden Darm
Zunächst wurde Xclp1 DNA in den vegetalen Bereich des Mesoderms der
ventralen Blastomere von vier- bzw. achtzelligen Xenopus laevis
Embryonen (Abb.10, grünmarkierter Bereich) injiziert. Die
Zellschicksalskarte zeigt, dass diese Region vor allem in der Entwicklung
des Seitenplattenmesoderms involviert ist. Das splanchnische Blatt des
Seitenplattenmesoderms differenziert sich zu der zirkulären glatten
Muskulatur des Darmes. Während der Schleifenbildung des Darmes
besitzen dessen glatte Muskelzellen hohe Xclp1 Aktivität. Durch die
Fähigkeit von Xclp1 sowohl kontraktile (Winder et al., 1990; Abe et al.,
1990) als auch nicht kontraktile Prozesse (Gimona et al., 2003) zu
regulieren, könnte es möglich sein, durch dessen Überexpression Einfluss
auf die Dynamik des Zytoskeletts dieser Zellen zu nehmen. Die Folge
wären dann zum Beispiel Defekte der Darmschleifenbildung.
53
Die Analyse des Phänotyps wurde während der Kaulquappenstadien
kontinuierlich von St.26 bis St.45 durchgeführt. Nach einer Koinjektion von
GFP mRNA mit Xclp1 mRNA konnte Fluoreszenz in den Zellen des
Darmes detektiert werden.
Abb.11 Die Missexpression von Xclp1 in das zukünftige ventrale Mesoderm
resultierte nicht in einer Veränderung der embryonalen Entwicklung. Vierzellige,
bzw. achtzellige Embryonen wurden mit der DNA des Expressionskonstruktes
Xclp1CS2+ in das zukünftige ventrale Mesoderm injiziert (9 Exp., p = n.s.). Die
Embryonen wurden kontinuierlich während ihrer Entwicklung beobachtet und nach der
Fixierung im Kaulquappenstadium (St.45/46) auf mögliche phänotypische Veränderungen
analysiert. Die Überexpression von Xclp1 im Bereich des zukünftigen ventralen
Mesoderms, bzw. Entoderms hatte im Vergleich mit den Kontrollembryonen keinen
Einfluss auf die embryonale Entwicklung (A, B). Als Kontrolle dienten unbehandelte
Wildtypembryonen (wt). Der p-Wert wurde mit Hilfe des 2 x 2 Tables Chi Quadrat ermittelt
und nach Bonferroni korrigiert.
Rot: Anteil an resultierenden phänotypischen Veränderungen (veränd Pht), Blau: Anteil
an Wildtypembryonen (wt).
54
Als Kontrolle des Schicksals der injizierten Zellen wurde GFP mRNA coinjiziert. Die
Fluoreszenz des Proteins im Bereich des Entoderms zeigt, dass das Gewebe gemäß der
Zellschicksalskarte getroffen wurde (B).
Ko wt
Xclp1 DNA
n
120
116
wt
112 (93%)
108 (93%)
v.Pht
8 (7%)
8 (7%)
p
1,0
Tab.4 Die phänotypischen Veränderungen nach Überexpression von Xclp1 DNA im
ventralen vegetalen Bereich des vierzelligen Xenopus laevis Embryos
Die Werte wurden numerisch und prozentual angegeben.
wt: Wildtypembryonen; v.Pht: veränderter Phänotyp. Der p-Wert wurde mit Hilfe des 2 x 2
Tables Chi Quadrat ermittelt und nach Bonferroni korrigiert.
Trotz ortsspezifischer Überexpression von Xclp1 zeigten sich keine
Veränderungen bezüglich der Darmwindungen (9 Experimente (Exp.),
n = 116, p = 1,0). Die Anzahl der Embryonen mit verändertem Phänotyp
war im Vergleich mit den 120 nicht injizierten Kontrollwildtypembryonen
statistisch nicht signifikant (Tabelle. 4).
2.3.2. Überexpression von Calponin im dorsalen Mesoderm
Eine Injektion von Calponin in das zukünftige dorsale Mesoderm eines
vierzelligen Embryos trifft unter anderem die Region des Spemann
Organisators (s. Abb.10, orangefarbener Bereich). An der dorsalen
Urmundlippe beginnen die Gastrulationsbewegungen, also die Involution
der Zellschichten. Das Zellschicksal des injizierten Bereichs umfasst die
Chorda dorsalis, die Bodenplatte des Neuroektoderms und das
Herzmesoderm. Chorda und Bodenplatte erfahren während der
Gastrulation massive Umlagerungen durch konvergente
Extensionsbewegungen. Der Befund, dass nach der Verlagerung in das
Innere der Gastrula die Zellen Xclp2 bzw. Xclp3 Expression verlieren,
lässt auf eine Funktion des Aktin-Zytoskeletts bei diesem epithelialmesenchymal Übergang schliessen. Dieser wird möglicherweise durch
eine biomechanische Umstrukturierung mit Hilfe von Calponin
hervorgerufen.
55
Mit einer Überexpression beider Calponin-Proteine sollte deren Aktivität
auch nach der Involution aufrechterhalten werden. Die Folge hätten
Gastrulationsdefekte, wie die Inhibition der Involution und der
konvergenten Extensionsbewegungen mit folgender Exogastrula und
Achsendefekten sein können. Injiziert wurde die DNA der XclpCS2+ und
XclpCSMT Expressionskonstrukte, sowie die mRNA aller drei CalponinGene.
Die Analyse der resultierenden phänotypischen Veränderung erfolgte
während der Kaulquappenstadien. Es wurden 11 Experimente mit
Xclp1CS2+ DNA bzw. mRNA, 16 mit Xclp2CS2+ DNA bzw. 7 mit mRNA
und jeweils 7 Experimente mit Xclp3CS2+ DNA bzw. mRNA
durchgeführt. Die Koinjektion von GFP mRNA zeigte, dass das zu
manipulierende Gewebe (Chorda dorsalis, Bodenplatte) getroffen wurde.
56
Abb.12 Die Überexpression von Xclp1, Xclp2 und Xclp3 alleine oder in
Kombination in dem zukünftigen dorsalen Mesoderm hatte keine phänotypischen
Veränderungen zur Folge.
Die DNA und mRNA der XclpCS2+ Expressionskonstrukte wurden in das zukünftige
dorsale Mesoderm von vier- bzw. achtzelligen Xenopus laevis Embryonen injiziert. In
diesen Experimenten wurden die Xclp neben den CS2+ auch in den Myc-Epitop
enthaltenden Expressionsvektor (CSMT) kloniert. Somit konnte ein Fusionsprotein
synthetisiert werden. Die Embryonen wurden kontinuierlich während ihrer Entwicklung
beobachtet und in den späten Schwanzknospenstadien bzw. im Kaulquappenstadium
(St.45) fixiert und auf mögliche phänotypische Veränderungen analysiert. Als Kontrolle
dienten Wildtypembryonen (A, D, E), Injektionen mit der DNA des CS2+ Leervektors (B)
57
oder des CSMT Vektors (C) und ßGal- oder GFP mRNA Injektionen (B, C). Die
Injektionsexperimente mit XclpCS2+ DNA + mRNA in Kombination wurden durch die
Verwendung von CS2+ Leervektor DNA und βGal mRNA kontrolliert.
Der Anteil an veränderten Phänotypen war nach der Injektion der DNA von Xclp1CS2+
oder Xclp1 mRNA jeweils im Vergleich zu den Wildtypembryonen statistisch nicht
signifikant (A, 11 Exp., n.s.). Die Anzahl an embryonalen Entwicklungsstörungen nach
der Injektion von Xclp2CS2+ DNA (16 Exp.) oder Xclp2 mRNA (7 Exp.) war im Vergleich
zu den Kontrollen statistisch nicht signifikant (B, n.s). Der p-Wert wurde mit Hilfe des 2 x
2 Tables Chi Quadrat ermittelt und nach Bonferroni korrigiert.
Die Injektion von Xclp3 mRNA (7 Exp.), bzw. Xclp3CS2+ DNA (9 Exp.) als auch von
Xclp3CS2+ DNA und Xclp3 mRNA in Kombination (4 Exp.), führte im Vergleich mit den
Kontrollen zu keiner statistisch signifikanten Anzahl von veränderten Phänotypen (C,
n.s).
Die Koinjektion der mRNA von Xclp1+Xclp3 (5 Exp.) bzw. von Xclp2+Xclp3 (6 Exp.)
resultierte nicht in einer statistisch signifikanten Anzahl an auftretenden
Entwicklungsstörungen (D, E, n.s.). Rot: Anteil an resultierenden phänotypischen
Veränderungen (veränd Pht), Blau: Anteil an Wildtypembryonen (wt).
Das Schicksal der injizierten Zellen wurde immunhistochemisch über die MycXclpFusionsproteine oder durch Koinjektion von GFP mRNA über Fluoreszenz
nachgewiesen.
Die GFP-Fluoreszenz erstreckte sich auf die Chorda dorsalis und auf die Bodenplatte (F)
im Vergleich mit nichtinjizierten Kontrollembryonen (G).
In all diesen Experimenten waren die beobachteten phänotypischen
Veränderungen in den Calponin überexprimierenden Embryonen
statistisch nicht signifikant.
Ko wt
Xclp1 DNA
Xclp1 mRNA
n
108
150
165
wt
102 (95%)
138 (92%)
159 (95%)
v.Pht
6 (5%)
12 (8%)
8 (5%)
0,8606
0,3653
CS2+ DNA
Xclp2 DNA
285
285
259 (91%)
251 (88%)
26 (9%)
34 (12%)
0,2749
ßGal mRNA
Xclp2 mRNA
116
190
112 (97%)
186 (98%)
4 (3%)
4 (2%)
0,4750
CSMT DNA
Xclp3 DNA
147
130
142 (97%)
123 (95%)
5 (3%)
7 (5%)
0,4184
GFP mRNA
Xclp3 mRNA
108
120
106 (98%)
113 (94%)
2 (2%)
7 (6%)
0,2134
94
44
87 (93%)
41 (93%)
7 (7%)
3 (7%)
78
70 (90%)
8 (10%)
Ko wt
CS2+ DNA +ßGal
mRNA
Xclp3 DNA+mRNA
58
p
0,5243
Ko wt
Xclp1+Xclp3 mRNA
70
150
62 (89%)
134 (89%)
8 (11%)
16 (11%)
0,8659
Ko wt
Xclp2+Xclp3 mRNA
86
164
80 (93%)
152 (93%)
6 (7%)
12 (7%)
0,9212
Tab.5 Ergebnisse in Bezug auf die phänotypische Veränderungen nach der
Überexpression von Xclp1, Xclp2 und Xclp3 DNA und mRNA im zukünftigen
dorsalen Mesoderm des vierzelligen Xenopus laevis Embryos.
Die Werte wurden numerisch und prozentual dargestellt. Rot: Anteil an resultierenden
phänotypischen Veränderungen (v.Pht), Blau: Anteil an Wildtypembryonen (wt). Der pWert wurde mit Hilfe des 2 x 2 Tables Chi Quadrat ermittelt und nach Bonferroni
korrigiert.
Xclp3 mRNA + Xclp3 DNA
Um die Menge des translatierten Proteins zu erhöhen ohne in toxische
Bereiche der injizierten Nukleinsäuren zu kommen und um einen noch
stärkeren Funktionsgewinn zu erreichen, wurden Koinjektionen von
Xclp3CS2+ DNA- und mRNA durchgeführt. In den Experimenten konnten
jedoch auch mit der Kombination von Expressionsvektor und mRNA
keine statistisch signifikanten Unterschiede des Phänotyps im Vergleich
zu den Kontrollen beobachtet werden. Die z.T. überlappenden und doch
auch unterschiedlichen Expressionsmuster der Calponin-Gene lassen auf
spezifische Funktionen schliessen. Verschiedene Affinität zu F-Aktin und
Verteilung in Bezug auf die Aktin-Stressfasern des Zytoskeletts wurden
beschrieben (Danninger et al., 2000; Burgstaller et al., 2001). Diese
Befunde gaben Grund zur Annahme, dass durch deren gemeinsame
Überexpression synergistische Effekte während der Gastrulation und der
Organogenese hervorgerufen werden könnten. Deshalb wurden
Funktionsgewinnexperimente mit der Koinjektion von jeweils zwei
verschiedenen Calponin-Genen durchgeführt. Es wurden jeweils 5
Koinjektionsexperimente mit Xclp1- + Xclp3 mRNA (Abb.12, D) und
Xclp2- + Xclp3 mRNA (Abb.12, E) durchgeführt. Die daraus
resultierenden veränderten Phänotypen waren wiederum im Vergleich zu
den Kontrollembryonen statistisch nicht signifikant.
59
Damit hatte die Überexpression der Calponinvarianten in dem dorsalen
Mesoderm des Xenopus Embryos keine Veränderungen in den
hervorgehenden Geweben und keine phänotypischen Veränderungen des
gesamten Embryos zur Folge.
2.3.3. Überexpression im Neuroektoderm
Das Zellschicksal des dorsalen animalen Bereiches eines vierzelligen
Embryos ist das Neuroektoderm (s. Abb.10, gelb markierter Bereich).
Im Laufe der Entwicklung erfolgen in diesen Zellen verschiedene
dynamische Prozesse des Zytoskeletts. So finden Zellteilungen und
Zellwanderungen im Verlaufe der Epibolie während der Gastrulation statt.
Die Neuralplatte wird durch konvergente Extension ihrer Zellen
verlängert. Am dorsalen Ende dieser Zellen befindet sich eine parallele
Anordnung kreuzweise orientierter Aktinfilamente. Durch die
Mikrofilamentkontraktion der apikalen Zellenden werden die Zellen
keilförmig. Das Gewebe stülpt sich ein und bildet das Neuralrohr
(Campbell et al., 2003; Bray, 2001). Eine Beeinträchtigung dieser
Prozesse durch Calponin Überexpression könnte zu
Gastrulationsdefekten oder zu Neuralrohrschlussdefekten führen.
Morgan et al. untersuchten 1999, dass mit Xclp2 verwandte XclpH3 als
mögliches Zielgen des Transkriptionsfaktors Otx2 und als Inhibitor der
konvergenten Extensionsbewegungen im Telencephalon. Der
Funktionsgewinn von XclpH3 im Frosch führte zu
Neuralrohrschlussdefekten und Missbildungen von Kopfstrukturen.
Die dorsale animale Region von vier- bis achtzelligen Embryonen wurde
mit den verschiedenen Calponinen injiziert und in Kaulquappenstadien
auf einen veränderten Phänotyp hin untersucht. Es wurden jeweils 7
Experimente mit Xclp1CS2+ DNA (Abb.13, A), 6 Experimente mit
Xclp3CS2+ DNA (Abb.13, C) und 22 Experimente mit Xclp2CS2+ DNA
60
(Abb.13, B) durchgeführt. Die synthetische mRNA von Xclp2 bzw. Xclp3
wurde in 18 bzw 7 Experimenten injiziert (Abb.13, B, C).
Abb.13 Die Missexpression von Xclp1, Xclp2 und Xclp3 in dem zukünftigen
Neuroektoderm hatte keine Auswirkungen auf die Entwicklung
Vier- bis achtzellige Xenopus laevis Embryonen wurden im dorso-animalen Bereich mit
DNA und mRNA der Expressionsvektoren XclpCS2+ bzw. MycXclp injiziert. Als
Kontrolle dienten Wildtypembryonen (wt), (A, C) oder die Injektion von CS2+, CSMT
Leervektor DNA (B, C) oder βGal- bzw. GFP mRNA (B, C).
Die Injektion von Xclp1- (A, 7 Exp.), Xclp2CS2+ DNA (B, 22 Exp.) oder von Xclp3CS2+
bzw. MycXclp3 DNA (C, 7 Exp.) resultierten im Vergleich mit den Kontrollen in einer
statistisch nicht signifikanten Anzahl veränderter Embryonen (n.s.).
Der Anteil an abweichender Entwicklung nach der Injektion von Xclp2- (B, 18 Exp.) oder
Xclp3 mRNA (C, 6 Exp.) war statistisch nicht signifikant (n.s.).
Durch die Verwendung von MycXclp konnte das Schicksal der injizierten Zellen mit Hilfe
des immunhistochemischen Nachweises durch Fluoreszenz des MycXclpFusionsproteins im zukünftigen Neuroektoderm nachgewiesen werden. Das Protein
befindet sich im neuralen Gewebe des Embryos im Schwanzknospenstadium (St.32, D).
61
Als Vergleich dienten uninjizierte Kontrollembryonen, die eine Autoimmunfluoreszenz
aufzeigten (E).
Rot: Anteil an resultierenden phänotypischen Veränderungen (veränd Pht), Blau: Anteil
an Wildtypembryonen (wt). Der p-Wert wurde mit Hilfe des 2 x 2 Tables Chi Quadrat
ermittelt und nach Bonferroni korrigiert.
Der Anteil, der aus der Überexpression der Calponinvarianten
resultierenden veränderten Embryonen war jedoch im Vergleich mit den
Kontrollembryonen statistisch nicht signifikant.
n
wt
v.Pht
p
Ko wt
Xclp1 DNA
104
116
99 (95%)
108 (93%)
5 (5%)
8 (7%)
0,8205
CS2+ oder
CSMT DNA
Xclp2 DNA
457
419 (92%)
38 (8%)
528
479 (91%)
49 (9%)
0,5945
ßGal mRNA
Xclp2
mRNA
273
411
246 (90%)
368 (90%)
27 (10%)
43 (10%)
0,8089
CS2+ oder
CSMT DNA
Xclp3 DNA
98
93 (95%)
5 (5%)
158
149 (94%)
9 (6%)
0,6169
94
108
145
92 (98%)
104 (96%)
137 (94%)
2 (2%)
4 (4%)
8 (6%)
0,5021
Ko wt
GFP mRNA
Xclp3
mRNA
Tab.6 Ergebnisse in Bezug auf phänotypische Veränderungen nach
Überexpression von Xclp1, Xclp2 und Xclp3 mRNA und DNA im dorso-animalen
Bereich des vierzelligen Xenopus laevis Embryos
Die Werte wurden numerisch und prozentual dargestellt.
Rot: Anteil an Embryonen mit resultierenden phänotypischen Veränderungen (v.Pht),
Blau: Anteil an Wildtypembryonen (wt). Der p-Wert wurde mit Hilfe des 2 x 2 Tables Chi
Quadrat ermittelt und nach Bonferroni korrigiert.
2.3.4. Detektion von Xclp2- und Xclp3-Protein
Das Fehlen phänotypischer Veränderungen als Folge der Calponin
Überexpression kann verschiedene Ursachen haben. Mögliche
Leserastermutationen konnten zwar durch Sequenzierung der Konstrukte
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ausgeschlossen werden (Daten nicht gezeigt), aber der Nachweis des
überexprimierten Proteins könnte andere Fehlerquellen, wie
proteolytische Degradation im Embryo oder instabile mRNA bzw.
superstabile RNA-RNA Hybride haben. Um zu prüfen ob tatsächlich das
Protein in vivo translatiert worden war, wurde neben dem XclpCS2+ ein
weiteres Expressionskonstrukt erzeugt. Die codierende Xclp2 und 3
cDNA Sequenzen wurden in den CSMT Expressionsvektor kloniert. In
diesem Vektor finden sich 6 Myc-Epitope. Das aus dem Onkogen Myc
stammende Epitop lässt sich durch spezifische Antikörper nachweisen.
Die Klonierung der Calponine in den Vektor erfolgte so, dass ein
Fusionsprotein, welches N-terminal den sogenannten Myc-tag trug,
entstand. In Überexpressionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass
sich die MycXclp2- bzw. MycXclp3-Fusionsproteine wie die WildtypProteine verhielten. Auch mit diesen veränderten Calponin-Proteinen
konnte kein veränderter Phänotyp in den injizierten Kaulquappen erzielt
werden (s.Abb.13, B, C, D).
Die Detektion des Xclp-Proteins erfolgte mit Hilfe des Western Blots oder
durch immunhistochemische Methoden.
Western Blot
Nach Überexpression mit MycXclp2- und Xclp3 Expressionskonstrukten
wurde das Gesamtprotein aus den Xenopus Embryonen im frühen
Schwanzknospenstadium (St.23, St.24) extrahiert. Nach der
Proteinisolation mit Freon wurden 30-60 µg Gesamtprotein aufgetrennt.
Die Detektion der Fusionsproteine erfolgte mit dem primären
unkonjugierten Anti-Myc Antikörper (9E10). Mit Hilfe eines mit Meerrettich
Peroxidase konjugierten zweiten Antikörpers konnten die detektierten
Proteine über Belichtung eines Filmes durch die, bei der Umsetzung von
Luminol entstehende Lumineszenz, sichtbar gemacht werden. Um
Aussagen über die molekularen Massen treffen zu können, wurde ein
definierter Protein Marker verwendet. Eine Berechnung der zu
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erwartenden Massen der Fusionsproteine ergab für MycXclp2 (294
Aminosäuren) 43,2 kDa und für MycXclp3 (331 Aminosäuren) 47,5 kDa.
Die Western Blot Analyse ergab, dass die Fusionsproteine mit der
vorhergesagten Masse in vivo exprimiert wurden.
Abb.14 Die MycXclp2-, 3-Fusionsproteine
wurden in den Xenopus laevis Embryonen
exprimiert.
Das Myc-Fusionskonstrukt von Xclp2 und
Xclp3 im CS2+ Vektor wurde in das
zukünftige dorsale Mesoderm vierzelliger
Embryonen injiziert.
Die errechneten Größen der XclpFusionsproteine betrugen für MycXclp2 294
AS (43,2 kDa) und für MycXclp3 331 AS (47,5
kDa).
Immunhistochemie
Daraufhin wurden erneute Überexpressionsexperimente mit den Epitop
markierten Xclp2 und Xclp3 durchgeführt. Zum immunhistochemischen
Nachweis der Fusionsproteine im Zielgewebe (dorsales Mesoderm bzw.
dorsales Neuroektoderm) der injizierten Embryonen wurden Stadien 32
bis 36 benutzt. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops konnte anschließend
die korrekte Expression der Fusionsproteine im Zentralen Nervensystem
bzw. in der Chorda dorsalis gezeigt werden (s. Abb.13, D, E).
Weder die Injektionen des Expressionskonstruktes noch die synthetische
mRNA hatten jedoch Einfluss auf die Embryonalentwicklung der
Kaulquappen. Die Inaktivität der Myc-Fusionsproteine von Xclp2 und 3
glich somit den wirkungslosen nativen Calponin-Proteinen in den zuvor
durchgeführten Funktionsgewinnexperimenten.
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