Industrie-Applikationen

Industrie-Applikationen
212
Integrierte Lösungen für RNAi-Experimente mit der
HiPerformance-Technologie von QIAGEN
Peter Hahn, Elizabeth Scanlan, Anja Grewe, Silvia Magyar, Cornelia Schmidt, Jie Kang
und Wolfgang Bielke
QIAGEN GmbH, Hilden
Die gezielte Gen-Inaktivierung (engl. Gene Silencing)
oder RNA-Interferenz (RNAi)
mittels synthetischer, kurzer
interferierender RNA-Moleküle (siRNA, für short interfering
RNA) dient als leistungsfähige
experimentelle Methode für die
funktionelle Genomforschung.
QIAGEN bietet mit seinen
Dienstleistungen Forschern integrierte Lösungen für optimales Design und Synthese der
siRNA. Diese werden durch ein
umfassendes Portfolio von HiPerformance RNAi-Produkten
zur Transfektion von Zellen und
zum Messen der DownstreamEffekte nach einer erfolgreichen
Gen-Inaktivierung ergänzt.
eine Vielzahl unterschiedlicher
siRNA-Duplexe getestet werden muss, bevor man eine
optimale Gen-Inaktivierung erzielt. Mit den „2-for-Silencing“
siRNA-Duplexen bietet QIAGEN
die Garantie, dass mit einer der
beiden siRNAs ein Knock-down
der betreffenden mRNA erreicht wird. Die „2-for-Silencing“ siRNA-Duplexe werden
mittels des innovativen HiPerformance-Algorithmus entworfen. Dieser Algorithmus basiert
auf der umfangreichsten Studie
zur siRNA-Funktionalität, die
gegenwärtig verfügbar ist; in ihm
ist zudem ein Homologieanalyse-Tool integriert, das eine ähnliche Sensitivität aufweist wie
der sogenannte Smith-Water-
man-Algorithmus, jedoch erheblich schneller ist. Mit den
„2-for-Silencing“ siRNA-Duplexen spart der Anwender Zeit
und Kosten beim Screening
nach wirksamen siRNAs.
Es stehen auch bereits veröffentlichte Oligonukleotid-Sequenzen in Form der LibrarysiRNA-Duplexe für viele verschiedene Zielgene zur Verfügung. Diese siRNA-Oligonukleotide werden anhand von
Sequenzen entworfen und synthetisiert, deren Funktionsfähigkeit in Fachjournalen veröffentlicht wurden. Als weitere
Option werden validierte Library-siRNA-Duplexe angeboten,
deren hohe Knock-down-Effizienz durch QIAGEN Wissen-
schaftler experimentell nachgewiesen wurde.
Transfektion der siRNA
Das
Transfektionsreagenz
RNAiFect™ basiert auf einer
Lipidformulierung, die speziell
für die Transfektion von siRNAs
in eukaryotische Zellen optimiert wurde. RNAiFect bietet
eine hohe Transfektionseffizienz
bei gleichzeitig niedriger Zytotoxizität. Dank einer strengen
Qualitätskontrolle sind außerdem niedrigste Endotoxin-Werte und das Fehlen von RNaseAktivität sichergestellt.
Die hohe Effizienz von mit
RNAiFect™ durchgeführten
siRNA Transfektionen konnte in
vielen Zellkultursystemen gezeigt werden. Beispielhaft wurden mehrere humane und MausZelllinien mit siRNAs transfiziert, die entweder spezifisch gegen die Lamin-A/C mRNA oder
gegen die mRNA der schweren
Kette von Ferritin gerichtet sind.
Kontrollexperimente wurden jeweils mit einer nicht-inaktivierenden siRNA durchgeführt, die
siRNA für die gezielte GenInaktivierung
Die für Gene-Silencing-Experimente eingesetzte HPP-siRNA (HPP = High Performance
Purity) weist einen Reinheitsgrad von > 90 % auf – eine weitere Aufreinigung mittels HPLC
oder PAGE ist daher nicht erforderlich. Das bei der siRNA-Synthese angewendete patentierte
TOM-Amidit-Verfahren gewährleistet hierbei eine hohe
Kopplungseffizienz. Der Prozess
ermöglicht sehr kurze Synthesezeiten, sodass die gewünschte
siRNA dem Kunden schnell zur
Verfügung steht. HPP-siRNA
wird in der stabilen DuplexKonformation ausgeliefert und
kann direkt für Transfektionsexperimente eingesetzt werden.
Für einen erfolgreichen
„Knock-down“ der zu untersuchenden Gene ist das optimale
Design einer hoch wirksamen,
spezifischen siRNA von entscheidender Bedeutung. Die
Verwendung herkömmlicher
Richtlinien für das siRNA-Design bedeutet in der Regel, dass
Abb. 1: Effiziente Gen-Inaktivierung in humanen und Maus-Zellen mit RNAiFect Reagenz. Die Zellen wurden mittels
RNAiFect Transfektionsreagenz mit Kontroll-siRNA bzw siRNA transfiziert, die spezifisch gegen Lamin-A/C -mRNA
oder gegen die schwere Kette von Ferritin gerichtet ist. Nach 48 Stunden wurde eine quantitative Real-Time-RT-PCRAnalyse durchgeführt; dabei wurde der QuantiTect® SYBR® Green PCR Kit verwendet, um den Gen-inaktivierenden
Effekt zu messen. Die Expression von Lamin A/C beziehungsweise der schweren Ferritin-Kette wurde auf die
GAPDH-Expression normalisiert
BIOspektrum · 2/04 · 10. Jahrgang
Industrie-Applikationen
213
24h nach Transfektion möglich,
eine fast vollständige Abnahme
der MAPK1 mRNA nachzuweisen.
Die Bestimmung der Gen-Inaktivierung auf Proteinebene
mittels Western Blot zeigt ebenfalls eine nahezu vollständige
Unterdrückung des MAPK1
Proteins in humanen und murinen Zellen (Abbildung 2).
Integrierte Lösungen für GeneSilencing-Experimente
Abb. 2: MAPK1-Gen-Inaktivierung in HeLa-S3- und NIH/3T3-Zellen. Humane HeLa-S3- und murine
NIH/3T3-Zellen wurden mit MAPK1-siRNA oder mit einer nicht-inaktivierenden Kontroll-siRNA transfiziert (C). Als weitere Kontrolle dienten nur mit Transfektionsreagenz behandelte Zellen(Mock Transfection, M). Nach Transfektion und Inkubation wurden die Zelllysate durch SDS-PAGE elektrophoretisch
aufgetrennt und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Die erhaltenen Blots wurden mit dem
MAPK1-spezifischen Antikörper Tag·100- und einem Tubulin-spezifischen Primär-Antikörpern angefärbt
keine Homologie mit zellulären
mRNAs aufweist. Ergebnisse
von in verschiedenen Zelllinien
durchgeführten quantitativen
Real-Time-RT-PCR-Analysen
sind in Abbildung 1 dargestellt.
RNAi-Kontrollen
Ein wichtiger Faktor bei RNAiExperimenten, dem gelegentlich nicht die nötige Beachtung
geschenkt wird, ist die Durchführung von adäquaten Kontrollexperimenten. Die nicht-inaktivierende Kontroll-siRNA dient
dazu, die Möglichkeit eines unspezifischen Gene-Silencing-Effekts ausschließen zu können.
Eine Positivkontrolle, bestehend aus einer siRNA mit nachgewiesenem hohen Gen-inaktivierenden Effekt, sollte routinemäßig parallel zu der zu testenden siRNA transfiziert werden.
Dadurch erhält man die GewissBIOspektrum · 2/04 · 10. Jahrgang
heit, dass optimale Reaktionsbedingungen vorlagen. Der
„RNAi Human/Mouse Control
Kit“, der demnächst von QIAGEN erhältlich ist, ermöglicht
einfach durchzuführende Kontrollexperimente mit humanen
und murinen Zelllinien. Dieser
Kontroll-Kit enthält RNAiFect
Transfektionsreagenz sowie eine Positivkontrolle und eine
nicht-inaktivierende KontrollsiRNAs. Bei der nicht-inaktivierenden Kontrolle handelt es sich
um eine mit Alexa Fluor® 488
markierte siRNA, die zur Bestimmung der Transfektionseffizienz dient. Diese siRNA weist
keine Homologie zu einer Säuger-mRNA-Sequenz auf und
zeigt keine Gene-Silencing-Aktivität. Durch die Markierung
mit dem fluoreszierenden Alexa
Fluor 488 kann die erfolgreiche
Transfektion auf einfache Weise
mittels Fluoreszenzmikroskopie
kontrolliert werden. Der Kit enthält darüber hinaus eine validierte siRNA, die gegen eine Sequenz gerichtet ist, welche sowohl in der humanen als auch in
der Maus-mRNA für die Proteinkinase MAPK1 (auch Erk2
und MAPK2 genannt) vorkommt. Expressionsanalysen
von MAPK1 in vielen verschiedenen humanen und murinen
Zelllinien haben gezeigt, dass
dieses Protein ubiquitär exprimiert wird, sodass es als Positivkontrolle geeignet ist. Wird die
MAPK1-Positivkontroll-siRNA
in murine NIH/3T3-Zellen und
in humane HeLa-S3-Zellen
transfiziert,kann der Knockdown
sowohl auf Protein-Ebene als
auch auf mRNA-Ebene gemessen werden. Mit validierten real
time PCR Assays für humanes
sowie murines MAPK1 (Quantitect Hs_MAPK1 bzw. Quantitect Mm_MAPK1) ist es bereits
Die Methode der gezielten GenInaktivierung hat das Potenzial,
die funktionelle Genomforschung zu revolutionieren. Die
raschen Fortschritte in diesem
Forschungsgebiet werden auch
zukünftig neue Tools und Techniken hervorbringen. Weiter gehende Informationen über die
integrierten Gene-Silencing-Lösungen von QIAGEN stehen im
Internet unter www.qiagen.com/
siRNA zur Verfügung.
Korrespondenzadresse:
Dr. Bettina Hädrich
Sales Development Manager siRNA
and Genomic Services
QIAGEN GmbH
QIAGEN-Straße 1
D-40724 Hilden
Tel.: 02103-29-12400
Fax: 02103-29-22000
[email protected]
www.qiagen.com