Das Metagenom als Quelle neuer oxidativer Enzyme für die

Das Metagenom als Quelle neuer oxidativer Enzyme
für die Biotechnologie
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Anke Hummel
geboren am 05.02.1981
in Braunschweig
Greifswald, im Juli 2012
Dekan:
Prof. Dr. K. Fesser
1. Gutachter:
Prof. Dr. U. T. Bornscheuer
2. Gutachter:
Prof. Dr. W. Streit
Tag der Promotion:
28.08.2012
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ................................................................................................................................ 1
1.1. Aktuelle Trends in der Biotechnologie ........................................................................................................ 1
1.2. Der Metagenom-Ansatz - Neue Zugänge zur Biodiversität aus Umweltproben.......................... 3
1.3. Oxidative Enzyme ................................................................................................................................................ 9
1.3.1. Cytochrom P450-Monooxygenasen...................................................................................................10
1.3.2. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen .......................................................................................................15
1.3.3. Styrol-Monooxygenasen ........................................................................................................................21
1.3.4. Oxidasen .......................................................................................................................................................24
1.4. Transaminasen ...................................................................................................................................................26
2. ZIELSETZUNG .......................................................................................................................... 30
3. ERGEBNISSE............................................................................................................................. 31
3.1. Konstruktion metagenomischer Bibliotheken........................................................................................31
3.1.1. Die Isolierung von DNA aus Umweltproben ...................................................................................31
3.1.2. Erstellung metagenomischer Bibliotheken .....................................................................................35
3.2. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach oxidativen Enzymen ................................40
3.2.1 Screening nach Epoxidase-Aktivität....................................................................................................41
3.2.2. Screening nach hydroxylierenden Monooxygenasen .................................................................45
3.2.3. Komplementierung der Oxygenase durch Zugabe einer Reduktase-Untereinheit..........46
3.2.4. Screening nach Baeyer-Villiger-Monooxygenase Aktivität........................................................47
3.2.5. Screening nach Oxidase-Aktivität .......................................................................................................49
3.3. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach nicht-oxidativen Enzymen ....................52
3.3.1. Screening nach Amin-Transaminasen ...............................................................................................52
3.3.2. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach Hydrolasen ..........................................53
3.4. Oxidative Enzyme aus anderen Quellen ...................................................................................................55
3.4.1. Screening einer Stammsammlung nach Monooxygenase-Aktivität......................................55
3.4.2. Monooxygenase-Aktivität in Gordonia sp. CWB2 ..........................................................................57
4. DISKUSSION ............................................................................................................................ 61
4.1. DNA-Isolierung und Anlegen metagenomischer Bibliotheken ........................................................61
4.2. Screening nach oxidativen Enzymen .........................................................................................................65
4.2.1. Betrachtung der gewählten Hochdurchsatz-Assays ....................................................................66
4.2.2. Auffindungswahrscheinlichkeiten für oxidative Enzyme in metagenomischen
Bibliotheken............................................................................................................................................................68
4.3. Screening nach nicht-oxidativen Enzymen .............................................................................................71
4.4. Klassische Zugänge zu oxidativen Enzymen ...........................................................................................72
IV
5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................. 74
6. MATERIALIEN UND METHODEN ............................................................................................. 77
6.1. Materialien ...........................................................................................................................................................77
6.1.1. Geräte ............................................................................................................................................................77
6.1.2. Chemikalien, molekularbiologische Kits und Enzyme .................................................................78
6.1.2. Medien, Puffer und Lösungen ..............................................................................................................78
6.1.3. Bakterien-Stämme ....................................................................................................................................80
6.1.4. Molekularbiologische Primer & Vektoren.........................................................................................80
6.1.5. Software und Internet-Datenbanken.................................................................................................81
6.2. Mikrobiologische Methoden .........................................................................................................................81
6.2.1. Stammhaltung ...........................................................................................................................................81
6.2.2. Übernachtkulturen ...................................................................................................................................82
6.2.3. Kultivierung und rekombinante Proteinexpression in Schüttelkolben .................................82
6.2.4. Rekombinante Expression von StyAB aus Pseudomonas sp. VLB120 .....................................82
6.2.5. Rekombinante Expression von P450-BM3 aus Bacillus megaterium .......................................82
6.2.6. Rekombinante Expression der HAPMO aus Pseudomonas putida JD1 ..................................83
6.2.7. Rekombinante Expression der Reduktase-Untereinheiten PdR und PdX .............................83
6.2.8. Rekombinante Expression von Transaminasen .............................................................................83
6.2.9. Kultivierung und rekombinante Expression in Mikrotiterplatten............................................83
6.2.10 Kultivierung des Stammes Gordonia sp. CWB2 .............................................................................84
6.2.11. Gewinnung von Zellrohextrakten ....................................................................................................84
6.2.12. Chemisch-kompetente E. coli Zellen (Rubidiumchlorid-Methode) ......................................84
6.2.13. Hitzeschock-Transformation von chemo-kompetenten E. coli Zellen.................................85
6.2.14. Elektrokompetente Zellen ...................................................................................................................85
6.2.15. Transformation über Elektroporation .............................................................................................85
6.2.16. Herstellung Phagen-kompetenter Zellen ......................................................................................86
6.3. Molekularbiologische Methoden ................................................................................................................86
6.3.1. Isolierung von Plasmid- und Cosmid-Vektoren .............................................................................86
6.3.2. Sequenzierungen ......................................................................................................................................86
6.3.3. Probennahme von Umweltproben für die DNA-Isolierung.......................................................86
6.3.4. Extraktion metagenomischer DNA aus Bodenproben nach Yeates .......................................86
6.3.5. Extraktion metagenomischer DNA aus Bodenproben nach Zhou ..........................................87
6.3.6. Feinreinigung metagenomischer DNA über Spin-Säulchen .....................................................87
6.3.7. Feinreinigung metagenomischer DNA über ein Agarosegel I..................................................88
6.3.8. Feinreinigung metagenomischer DNA über ein Agarosegel II ................................................88
6.3.9. Extraktion metagenomischer DNA aus Strandsand .....................................................................88
6.3.10. Partieller Restriktionsverdau metagenomischer DNA...............................................................89
6.3.11. Restriktionsverdau ..................................................................................................................................90
6.3.12. Dephosphorylierung .............................................................................................................................90
6.3.13. Aufreinigung der Vektor-DNA mittels PCR-Aufreinigungskit .................................................90
6.3.14. Anlegen metagenomischer Cosmid-Bibliotheken .....................................................................91
V
6.3.15. Anlegen metagenomischer Plasmid-Bibliotheken.....................................................................91
6.3.16. DNA Extraktion aus Gordonia sp. CWB2 .........................................................................................92
6.3.17. Anlegen einer Genon-Bibliothek von Gordonia sp. CWB2 .......................................................92
6.3.18. Sequenz-basiertes Screening nach Styrol-Monooxygenasen in Gordonia sp. CWB2 ....92
6.4. Biochemische Methoden und Enzymassays ............................................................................................93
6.4.1. Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford .........................................................................93
6.4.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese .............................................................................................93
6.4.3. γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin (NBP) Assay auf Epoxidase-Aktivität ................................................94
6.4.4. p-Nitrothiophenolat-Assay auf Epoxidase-Aktivität .....................................................................94
6.4.5. p-Nitrophenoxyoktan Assay auf P450-Monooxygenase-Aktivität ..........................................94
6.4.6. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen: 4-Nitroacetophenon-Assay ...............................................95
6.4.7. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen: 4-Hydroxyacetophenon-Assay ........................................95
6.4.8. Oxidase-Assay.............................................................................................................................................95
6.4.9. Acetophenon-Assay auf Amin-Transaminase-Aktivität ..............................................................96
6.4.10. α-Naphthylacetat / FastRed Agarplatten-Assay ..........................................................................96
6.4.11. Tributyrin-Assay ......................................................................................................................................96
6.4.12. Protease-Assay .........................................................................................................................................96
6.4.13. Phosphatase-Assay ................................................................................................................................97
6.4.14. Screening einer Stammsammlung ...................................................................................................97
6.5. Analytik und Chemische Synthesen ...........................................................................................................97
6.5.1. GC-Analytik zum Screening der Stammsammlung ......................................................................97
6.5.2. Synthese von p-Nitrophenoxyoctan ..................................................................................................98
7 LITERATUR ................................................................................................................................ 99
8 ANHANG ................................................................................................................................ 114
VI
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AADH
A. dest.
A. bidest.
α-MBA
ATA
bp
BSA
BVMO
CHMO
Da
DH
DMF
DNA
dNTP
dwMTP
E
E. coli
EC
EDTA
ee
et al.
FAD
FMN
fw
g
GC
GDH
h
HAPMO
HEPES
HPLC
Aminosäure-Dehydrogenase
Aqua destillata, destilliertes
Wasser
zweifach destilliertes Wasser
α-Methylbenzylamin
Amin-Transaminase
Basenpaar(e)
Rinderserumalbumin
Baeyer-VilligerMonooxygenase
CyclohexanonMonooxygenase
Dalton
Dehydrogenase
Dimethylformamid
Deoxyribonucleic acid
Desoxyribonukleosid-5’triphosphat
Deepwell-Mikrotiterplatte
Enantioselektivität
Escherichia coli
Enzyme commission number
Ethylendiamintetraacetat
Enantiomerenüberschuss
et alii, und andere
Flavin-Adenin-Dinukleotid
Flavin-Mononukleotid
forward
Erdbeschleunigung
Gaschromatographie
Glucose-Dehydrogenase
Stunde
4-HydroxyacetophenonMonooxygenase
2-(4-(Hydroxyethyl)-1piperazinyl)ethansulfonsäure
High performance liquid
chromatography
HRP
IPTG
kb
l
LB
M
MAO
MCS
min
MS
NADH
NADPH
NBP
NMR
OD600
P450-MO
PLP
pNTP
PCR
PdR
PdX
RNA
rpm
RT
rv
sp.
StyMO
TA
TB
Tris
U
UV
X-Gal
horse
radish
peroxidase,
Meerrettich-Peroxidase
Isopropyl-β-D-thiogalactosid
Kilobasenpaar(e)
Liter
Luria-Bertani (Medium)
molar (mol * l-1)
Monoamin-Oxidase
multiple cloning site
Minute
Massenspektrometrie
Nicotinamidadenindinukleotid
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin
Kernspinresonanzspektroskopie
Absorption (Optische Dichte)
bei 600 nm
P450-Monooxygenase
Pyridoxal-5‘-phosphat
p-Nitrothiophenolat
Polymerase chain reaction
Putidaredoxin-Reduktase
Putidaredoxin
Ribonucleic acid
Umdrehungen pro Minute
Raumtemperatur
reverse
Spezies
Styrol-Monooxygenase
Transaminase
terrific broth (Medium)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Units [μmol * min-1]
Ultraviolett
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-βD-galactopyranosid
Außerdem wurden SIǦPräfixe und die üblichen Abkürzungen für Aminosäuren und SIǦEinheiten
verwendet.
VII
1. Einleitung
1. EINLEITUNG
1.1. Aktuelle Trends in der Biotechnologie
Proteine stellen neben Nukleinsäuren wohl die wichtigsten biologischen Makromoleküle dar.
Jedes uns bekannte Leben basiert auf ihren katalytischen, strukturgebenden und regulatorischen
Eigenschaften. Schon früh begann der Mensch, sich die katalytischen Fähigkeiten von
Mikroorganismen und ihren Enzymen zunutze zu machen, etwa bei der Herstellung von Brot,
Wein und Käse. Inzwischen werden Biokatalysatoren in vielen Bereichen eingesetzt, wie bei der
Herstellung von Pharmazeutika, Biopolymeren, Lebensmitteln, Papier oder Textilien.
Auch heute wird dabei die klassische Methode eingesetzt – die Biotransformation mit
mikrobiellen Zellen in Form von unveränderten Wildtyp-Organismen. Zunehmend bedient man
sich aber auch neuer Wege, die seit der Entwicklung der molekularen Gentechnik möglich sind.
Während Produktionsstämme zuvor durch jahrelange Studien optimiert wurden, können nun
durch Klonierung und Mutagenese gezielte Modifikationen durchgeführt werden, um einen
Biokatalysator zu verbessern. Die Anwendung dieser Möglichkeiten birgt allerdings auch
Gefahren und nicht umsonst ist der Bereich der Grünen Gentechnik, bei der gentechnisch
veränderte Organismen in die Umwelt ausgebracht werden, in der Gesellschaft nicht
unumstritten – bislang ist nicht abzusehen, welche Auswirkungen das Ausbringen veränderter
Organismen unter Berücksichtigung von horizontalem Gentransfer auf Ökosysteme haben wird.
In der Weißen Biotechnologie geht man andere Wege: Auch hier werden gentechnisch
veränderte Organismen eingesetzt, allerdings nur in geschlossenen Systemen und oft auch nur in
Form der reinen Biokatalysatoren, der Enzyme.
In vielen Anwendungsbereichen haben sich biotechnologische Prozesse inzwischen etabliert und
entweder bestehende chemische Verfahren abgelöst oder neue Syntheserouten aufgezeigt. In
der pharmazeutischen Industrie schätzt man die oftmals chemo-, regio- und stereoselektiven
Umsetzungen der Enzyme, da bei der Medikamentenherstellung reine Produkte hergestellt
werden müssen. Klassisch ist die enzymatische Synthese von Aminosäuren oder Antibiotika, aber
auch Insulin, Statine, Amine und viele weitere Feinchemikalien werden biokatalytisch hergestellt
[1-6]. Im Bereich der Chemikalien, die in größerem Maßstab produziert werden (bulk chemicals),
etablieren sich Biokatalysatoren erst langsam. Seit einigen Jahren gibt es mit Polylactat ein aus
Bakterien hergestelltes Bioplastik, das aufgrund des steigenden Ölpreises inzwischen preislich
ähnlich angesiedelt ist wie das petrochemische PET [7]. Die Vielfalt der aus Erdöl hergestellten
Plastik-Typen lässt sich zwar noch nicht durch Biopolymere ersetzen, mittlerweile ziehen aber
weitere Alternativen nach wie das Polymer aus Adipinsäure und 1,6-Hexandiol [5]. Aufstrebend ist
auch der Bereich der Biokraftstoffe [8]. Das zurzeit verfügbare Herstellungsverfahren der Energieträger aus Pflanzen, die auf den gleichen Flächen wie Nahrungsmitteln wachsen, führt jedoch zu
Landnutzungskonflikten und ist daher gesellschaftlich umstritten. Möglicherweise gelingt es hier
der Biotechnologie, Wege zu Biokraftstoffen zu entwickeln, die nicht in Konkurrenz zu
Nahrungsmitteln oder – wie im Fall der Palmölplantagen – in Konkurrenz zum Erhalt der
natürlichen Biodiversität und wertvoller Ökosysteme stehen.
1
1. Einleitung
Weit verbreitet ist in der Biotechnologie das Streben nach umweltverträglichen Prozessen, die
auch als „grüne“ Prozesse bezeichnet werden (nicht zu verwechseln mit der Grünen
Biotechnologie, die sich mit der gentechnischen Manipulation von Pflanzen befasst) [2, 9-12].
Aber wie kann beurteilt werden, welcher Prozess „nachhaltig“ ist, welcher „grüner“ als der andere?
Die Anfänge für eine solche Beurteilung gehen zurück auf Sheldon, der den sogenannten E-Faktor
(environmental factor) als Maß für die Umweltfreundlichkeit eines Herstellungsprozesses einführte
[13]. Dieser stellt zwar einen guten Anfang dar, vereinfacht aber die Zusammenhänge zu stark, da
lediglich die Menge erzeugten Abfalls pro erzielter Produktmenge ermittelt wird – die Qualität
des Abfalls wird dabei vernachlässigt. Daher wurde dazu übergegangen, jeder Chemikalie einen
Faktor zuzuteilen, der ihren schädigenden Einfluss auf die Umwelt widerspiegelt und in den
beispielsweise Toxizitäten für verschiedene Organismen, Akkumulation und Persistenz in der
Umwelt, Einfluss auf Ozonschicht und globale Erwärmung, die Bildung photochemischer
Oxidantien oder die Eutrophierung einfließen. Mittlerweile ist die Erfassung aller Einflussfaktoren
so komplex geworden, dass spezielle Software (wie EATOS, SABENTO oder UMBERTO) zur Ermittlung der Umweltverträglichkeit eines Prozesses entwickelt wurden, in denen außerdem noch die
Atomeffizienz berücksichtigt wird.
In eine umfassende Betrachtung der Umweltverträglichkeit eines Prozesses gehen neben dem
Umwelteinfluss der Chemikalien noch weitere Faktoren ein. Der von der OECD herausgegebene
Green Index berücksichtigt so vielfältige Faktoren wie die Energie (Menge und Herkunft), die
Rohmaterialien (Herstellung, Umwelteinfluss, Verfügbarkeit und Erneuerbarkeit), die Abfälle
(Menge, Bioabbaubarkeit, Recyclingmöglichkeit im Prozess, Nutzung für andere Zwecke und
Einfluss auf die Umwelt), den Aufbau des Prozesse (Zahl der Schritte und Prozessdauer) und die
Sicherheit (Gefährlichkeit der Produkte, Nebenprodukte und Katalysatoren, Temperatur, Druck,
Explosionsgefahr und Gefährdung der Mitarbeiter). So ergibt sich eine Checkliste für die
Beurteilung der Nachhaltigkeit von biotechnologischen Prozessen. Eine Reihe von
Herstellungsverfahren aus der pharmazeutischen und chemischen Industrie wurden als Fallstudien unter diesen Kriterien analysiert. Dabei wurde ermittelt, dass viele der biotechnologischen Prozesse umweltverträglicher sind als die chemischen [14].
Besonders für die Industrie ist neben der ökologischen Verträglichkeit eines biotechnologischen
Prozesses auch die ökonomische Betrachtung ausschlaggebend dafür, ob er einen chemischen
ersetzen kann. In großen Firmen werden daher beide Faktoren in Form von Ökoeffizienzanalysen
evaluiert, wie beispielsweise bei der SEEbalance Analyse [15, 16], die einen Vergleich zwischen
einzelnen Prozessen im Hinblick auf ökologische, ökonomische und soziale Aspekte ermöglicht.
Die Syntheseroute von Vitamin B2 wurde einer solchen Analyse unterzogen, und es wurde unter
vier Prozessen (einem chemischen und drei biotechnologischen) eine biotechnologische Variante
als effizienter ermittelt als das etablierte chemische Verfahren [17].
Häufig wird angeführt, dass enzymkatalysierte Reaktionen grundsätzlich immer umweltfreundlicher seien als chemokatalysierte, unter anderem, weil sie in der Regel in Wasser statt in
organischen Lösungsmitteln ablaufen. Auch hier lohnt sich ein genauerer Blick auf den Prozess,
da auch aus Wasser die Produkte einer Reaktion isoliert werden müssen, was meist mit Hilfe von
Lösungsmitteln geschieht [12]. Zudem ist die Entfernung von Wasser aus dem Produkt
beispielsweise durch thermische Verfahren in der Regel ein sehr energieintensiver Prozess und
2
1. Einleitung
deutlich teurer als die Entfernung organischer Lösungsmittel. Trotzdem leisten Biokatalysatoren
einen wichtigen Beitrag bei der Entwicklung umweltfreundlicher Syntheserouten. Ökoeffizienzanalysen stellen dabei ein wichtiges Werkzeug dar, um die Umweltverträglichkeit von
biotechnologischen Prozessen beurteilen zu können.
In Anbetracht der enormen Anzahl charakterisierter Enzyme stellt sich die Frage, warum noch
Forschungsprojekte notwendig sind, in denen es um die Entwicklung neuer Katalysatoren geht.
Zwar wurde inzwischen eine so große Anzahl an Enzymen charakterisiert, dass sich Hunderte von
Reaktionen durchführen lassen, wie im Bereich der Lipasen oder Esterasen, die inzwischen gut in
der industriellen Anwendung etabliert sind. Doch nach wie vor gibt es zahlreiche Anwendungsbereiche, für die zwar Enzyme beschrieben sind, die jedoch für den großtechnischen Einsatz zu
wenig aktiv oder selektiv gegenüber den gewünschten Substraten sind. Ein Grund dafür ist, dass
diese Enzyme nicht für den angestrebten Anwendungsbereich entwickelt wurden, sondern aus
der biochemischen Grundlagenforschung stammen, wo Enzymstabilität oder das Erfassen
unnatürlicher Substrate keine Rolle spielen. Dies trifft beispielsweise auf viele oxidative Enzyme
zu.
Insbesondere für die Verknüpfung chemo- und biokatalysierter Reaktionen muss gewährleistet
sein, dass der Biokatalysator robust ist, möglichst leicht zu handhaben (beispielsweise durch
Immobilisierung oder Lyophilisierung) und im Idealfall auch noch aktiv in organischen
Lösungsmitteln ist, damit er zusammen mit klassischen Chemokatalysatoren eingesetzt werden
kann. Wegweisende Arbeiten im Bereich der chemoenzymatischen Synthese sind von Gröger et
al. [18, 19] und Wohlgemuth et al. [1] beschrieben.
Um zu neuen Biokatalysatoren zu gelangen, gibt es grundsätzlich zwei Wege: Die Suche nach
neuen Enzyme oder die Verbesserung bestehender Enzyme. Obwohl die Methoden der
gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns zur Verbesserung von Enzymen immer
leistungsfähiger werden, wie aktuelle Reviews zeigen [20-26], lohnt es sich nach wie vor, auch die
Suche nach neuen Enzymen mit einzubeziehen, und damit den Zugang zu völlig neuen
Biokatalysatoren zu eröffnen, die auch Reaktionen katalysieren, die bisher nicht beschrieben sind.
Die bislang gewonnenen bioinformatischen Kenntnisse reichen noch nicht aus, um wirkungsvolle
Biokatalysatoren de novo zu designen, und auch wenn durch Baker et al. erste Schritte
unternommen wurden [27], wird dies in absehbarer Zeit wohl noch nicht möglich sein.
1.2. Der Metagenom-Ansatz - Neue Zugänge zur Biodiversität aus
Umweltproben
Der Metagenom-Ansatz hat sich in den vergangenen Jahren zu einem wertvollen Werkzeug für
die Entdeckung neuer Enzyme entwickelt. Der Begriff wurde 1998 von J. Handelsman geprägt
[28], die die ersten metagenomischen Bibliotheken aus Bodenproben erstellte und darin
enzymatisch aktive Klone fand, darunter DNAsen, Amylasen und antibiotische Aktivitäten [29].
Am Anfang jedoch, noch viele Jahre vor der Identifizierung der ersten Enzyme, stand die Frage,
wie sich Lebensgemeinschaften an extremen Standorten, deren Lebewesen nicht im Labor zu
kultivieren sind, charakterisieren lassen und wie sich untersuchen lässt, welche Arten dort leben.
Pace et al. stellten dazu 1984 eine Methode vor, ribosomale RNA (rRNA) verschiedener nicht3
1. Einleitung
kultivierbarer Mikroorganismen aus einer Tiefseeprobe zu isolieren und zu analysieren [30]. Die
Eingruppierung von Mikroorganismen nach ihren phylogenetischen Zusammenhängen wird
noch heute mit Hilfe von rRNA vorgenommen, wenn auch heute bevorzugt die 16S rDNA bei
Prokaryonten bzw. die 18S rDNA bei Eukaryonten statt der damals gewählten 5S rDNA
herangezogen wird [31]. Nach wie vor ist die phylogenetische Analyse von Umweltproben eines
der Gebiete, in denen der Metagenom-Ansatz am häufigsten eingesetzt wird.
Das Metagenom kann definiert werden als „die Gesamtheit aller (mikrobiellen) Genome einer
bestimmten Lebensgemeinschaft oder eines Biotops“ [32]. Der enorme Vorteil des MetagenomAnsatzes liegt darin, dass auch solche Organismen erfasst werden, die im Labor nicht kultivierbar
sind. Dies sind – in Abhängigkeit vom Biotop – bis zu 99 % aller in einer Umweltprobe vertretenen
Arten (Tabelle 1.1) [33-36]. Aufgrund des Phänomens, dass die Zahl der Kolonie-bildenden Zellen
(colony forming units) auf Agarplatten um das 100 bis 1.000-fache geringer ist als die Zahl der
Zellen, die sich mikroskopisch aus der gleichen Probe erfassen lassen, hat sich insbesondere für
Bodenproben der Ausdruck ‘great plate count anomaly‘ etabliert [37, 38]. Diese nicht
kultivierbaren, aber mikroskopisch erfassbaren Zellen sind in den meisten Fällen lebend, nicht
aber im Labor anzureichern, da entweder Kultivierungsbedingungen (wie Medium, Nährstoffe,
Temperatur oder Druck) nicht bekannt sind oder ausreichend reproduziert werden können, die
Wachstumsraten zu gering sind oder andere Mikroben als symbiontische Partner oder
Nährstofflieferanten anwesend sein müssen. Der Metagenom-Ansatz umgeht diese Limitierung,
ermöglicht die Identifizierung neuer Mikroorganismen und eröffnet Zugang zu deren
biotechnologischem Potential.
Tab. 1.1. Kultivierbarkeit ermittelt als prozentualer Anteil kultivierbarer Bakterien im Vergleich zu der
Gesamtzellzahl (gemessen als Kolonie-bildende Einheiten) nach Amann et al. [34].
Biotop
Meerwasser
Süßwasser
Mesotrophes Seewasser
unbelastetes Mündungswasser
Belebtschlamm
Sedimente
Boden
4
Kultivierbarkeit [%]
Quelle
0,001 – 0,1
0,25
0,1 – 1
0,1 – 3
[39-41]
[42]
[38]
[39]
1 – 15
0,25
0,3
[43, 44]
[42]
[45]
1. Einleitung
Umweltprobe
Metagenomische
DNA
Metagenomische
Bibliothek
Metagenomische
RNA
Sequenzierung
Sequenzierung
Funktions-basiertes
Screening
Sequenz-basiertes
Screening
Neuer
Biokatalysator
Phylogenetische
Analysen
Abb. 1.1. Überblick über den Metagenom-Ansatz. Aus einer Umweltprobe wird ohne vorherige
Kultivierung die gesamte DNA oder RNA isoliert. Um zu neuen Biokatalysatoren zu gelangen, gibt es zwei
prinzipielle Wege: Entweder wird die DNA kloniert, so dass eine metagenomische Bibliothek entsteht, die in
einem Funktions-basierten Screening auf Enzymaktivitäten untersucht werden kann, oder die metagenomische DNA wird sequenziert und über ein Sequenz-basiertes Screening aufgrund von Homologien auf
neue Enzyme durchmustert. Für phylogenetische Untersuchungen wird die ribosomale RNA der
Umweltprobe isoliert, sequenziert und in einem phylogenetischen Stammbaum eingeordnet. Alternativ
kann hierfür auch die für die rRNA codierende DNA genutzt werden.
5
1. Einleitung
Der wesentliche Schritt des Metagenom-Ansatzes (Abb. 1.1) steht gleich zu Beginn der Methode:
Die direkte Isolierung von DNA aus Umweltproben – ohne vorherige Kultivierungsschritte. Je
nach Beschaffenheit der Probe kommen dabei unterschiedliche Filtrations- oder Aufschlussmethoden zum Einsatz, um die Probenmatrix von den Organismen und deren DNA abzutrennen.
Ziel ist dabei immer eine möglichst hohe DNA-Qualität sowohl bezüglich der Fragmentgröße als
auch der Reinheit. In früheren Protokollen bestanden die ersten Schritte stets darin, zunächst die
Organismen aus den Umweltproben zu isolieren, also beispielsweise von den Bodenpartikeln
abzuwaschen, und sie anschließend aufzuschließen. Heute werden oft Methoden bevorzugt, bei
denen gleich zu Beginn lysierende Bedingungen angewandt werden, um auch die DNA zu
erfassen, die nicht mehr in intakten Mikroorganismen vorliegt. In parallelen Versuchsreihen
wurden allerdings keine Unterschiede bezüglich der phylogenetischen Diversität zwischen den
beiden Ansätzen festgestellt [46]. Die Herausforderung bei der DNA-Isolierung ist stets,
Bedingungen zu finden, unter denen sich die DNA möglichst aller Organismen der Umweltprobe
isolieren lässt, Gram-positiver wie Gram-negativer, Extremophiler wie Mesophiler, dennoch aber
nicht so harsche Bedingungen anzuwenden, dass die Qualität der DNA gemindert wird.
Insbesondere bei extremen Standorten ist dies manchmal schwierig, da hier unter anderem die
Gegenwart stabiler Nukleasen eine zusätzliche Herausforderung darstellt. Dennoch wurden
inzwischen zahlreiche Protokolle für die Isolation von DNA aus unterschiedlichen Umweltproben
entwickelt (z. B. [47]).
Bei phylogenetischen Untersuchungen folgte auf die Isolierung der DNA ursprünglich immer ein
Klonierungsschritt, um anschließend die ribosomale DNA zu amplifizieren und zu sequenzieren
[48] – heute ist dieser Umweg über die Klonierung je nach angewandter Sequenzierungstechnik
nicht mehr notwendig. Durch einen solchen Sequenz-basierten Metagenom-Ansatz konnten
mikrobielle Gemeinschaften untersucht werden, deren Komplexität durch klassische
Kultivierungsmethoden nicht zu erfassen ist, wie beispielsweise im Meeresboden [49], im Boden
oder in der Luft [50], wobei stets eine enorme Zahl zuvor unbekannter Spezies beschrieben
wurden.
Außer in phylogenetischen Studien kann der Sequenz-basierte Metagenom-Ansatz aber auch in
anderen Bereichen angewandt werden. So konnten vollständige Genome von Organismen
assembliert werden, die nicht zu kultivieren sind, wie das des Blattlaus-Symbionten Buchnera sp.
APS [51]. Auch eine Reihe von Krankheitserregern konnten sequenziert und darüber Wege für ihre
Diagnose und Therapie eröffnet werden, so beispielsweise für den Syphilis-Erreger Treponema
pallidum [52] oder für den Lepra-Erreger Mycobacterium leprae [53]. Heutzutage sind für
Sequenzierungen nur noch weit geringere Probenmengen notwendig als noch vor einigen
Jahren, daher sinkt hier die Relevanz der Frage, ob ein Mikroorganismus kultivierbar ist oder nicht.
Auch zählen die oben genannten Studien vielleicht nicht zum Metagenom-Ansatz im klassischen
Sinne, da sie nur das Genom eines einzelnen Organismus umfassen. Die Grenzen sind aber
fließend, seit der Aufwand für Sequenzierungen sinkt und immer größere Probenmengen
untersucht werden. Dies führt dazu, dass in einigen Biotopen derart viele Sequenzierungsdaten
vorliegen, dass die Genome von ganzen Organismen zusammengesetzt werden können, ohne
dass diese zuvor kultiviert worden wären. Durch Sequenzierung der DNA in einem acidophilen
Biofilm konnten je ein Genom eines Leptospirillum und eines Ferroplasma Bakteriums
6
1. Einleitung
zusammengesetzt und interessante Erkenntnisse bezüglich der Überlebensstrategien unter
extremen Bedingungen gewonnen werden [54].
Auch wenn es nicht mehr dem ursprünglichen, klassischen Metagenom-Ansatz entspricht, gibt es
doch zahlreiche Publikationen, in denen vor der Isolierung der DNA eine Anreicherung
durchgeführt wurde. Auf diese Weise lassen sich die Probleme minimieren, die durch die
Anwesenheit von störenden Komponenten während der DNA-Extraktion entstehen – allerdings
auf Kosten der Diversität. Erfolgreiche Beispiele sind die Studien von Streit et al. zur Biodiversität
in Bodenproben [55] und Biofilmen [56]. Insbesondere für angewandte Fragestellungen, die die
Probe nicht repräsentativ in ihrer phylogenetischen Diversität abbilden wollen, ist diese Methode
gut geeignet.
Bei anwendungsbezogenen Fragestellungen wie der Auffindung neuer Enzyme für die
Biokatalyse kann zwar auch ein Sequenz-basiertes Vorgehen beim Untersuchen von
Metagenomen angewandt werden, sehr viel sinnvoller ist aber ein Funktions-basierter Ansatz.
Dabei wird die metagenomische DNA nach ihrer Isolierung fragmentiert und kloniert, um so
metagenomische Bibliotheken zu erstellen. Nach der Proteinexpression werden die einzelnen
Klone dieser Bibliotheken auf das Vorhandensein funktioneller Enzyme untersucht. Dabei kann
grundsätzlich zwischen einem Screening und einer Selektion unterschieden werden. Die
Selektion ist der elegantere Ansatz, da hier die rekombinanten Mikroorganismen unter
Bedingungen angezogen werden, unter denen nur diejenigen wachsen können, die eine
bestimmte Enzymaktivität aufweisen. Nur für wenige Enzymklassen ist dies jedoch möglich,
beispielsweise wenn nach Enzymen gesucht wird, die Antibiotika oder Toxine abbauen. Ist eine
Selektion nicht möglich, wird im Rahmen eines Screenings jeder einzelne Klon betrachtet und auf
die gewünschte Enzymaktivität untersucht. Dabei ist es vorteilhaft, Methoden zur Verfügung zu
haben, die eine schnelle, aber trotzdem zuverlässige Durchmusterung großer Bibliotheken
ermöglichen, ähnlich wie sie auch in der gerichteten Evolution zum Einsatz kommen. Da es sich
um Tests von mitunter mehreren 10.000 Klonen handeln kann, sind Methoden, die eine Analyse
mittels Gaschromatographie (GC) oder Hochauflösender-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)
erfordern, nur begrenzt geeignet. Sehr viel besser geeignet sind colorimetrische Assays, bei
denen die Detektion aktiver Enzyme anhand einer Verfärbung der Kolonien oder des Reaktionsmediums erfolgt. Dies kann in Form von Agarplatten- oder Mikrotiterplatten-Assays erfolgen.
Grundsätzlich ist es bei einem Funktions-basierten Screening von Vorteil, wenn die einzelnen
metagenomischen Klone möglichst große DNA-Fragmente enthalten, da so die Zahl der zu
durchmusternden Klone sinkt. Daher werden inzwischen viele metagenomische Bibliotheken
nicht mehr mit Plasmiden, sondern mit Cosmiden oder Fosmiden konstruiert.
Tabelle 1.2 zeigt eine Auswahl an Enzymen, die in den letzten Jahren aus metagenomischen
Quellen isoliert werden konnten sowie das jeweils untersuchte Biotop. Insbesondere unter den
hydrolytischen Enzymen stellt die Tabelle nur eine Auswahl dar – eine Reihe weiterer Esterasen
und Lipasen sind aus dem Metagenom beschrieben worden. Die Tabelle verdeutlicht, dass vor
allem hydrolytische Enzyme detektiert worden sind. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass
hierfür relativ einfache Hochdurchsatz-Assays zur Verfügung stehen, aber auch darauf, dass viele
dieser Enzym-Klassen häufig vorkommen.
7
1. Einleitung
Aufgrund der gewählten Biotope konnte eine Reihe von Enzymen gefunden werden, die
ungewöhnliche Eigenschaften aufweisen, wie Temperaturoptima bei besonders hohen oder
niedrigen Temperaturen. Insgesamt ist bei einer Vielzahl der über ein Funktions-basiertes
Screening gefundenen Enzyme eine geringe Sequenzhomologie zu bekannten Proteinen
festgestellt worden.
Tab. 1.2. Enzyme, die mit Hilfe des Metagenom-Ansatzes gefunden wurden, das untersuchte Biotop sowie
die Screening-Methode.
Enzym
Biotop
ScreeningMethode
Quelle
Esterasen
Tiefsee-Sediment
Hypersalines
Tiefengewässer
Arktisches Sediment
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
[57]
[58]
[59]
[60]
Marines Sediment
Tiefsee-Sediment
Marines Sediment
Boden
Kläranlage
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
[61]
[62]
[63]
[64]
[65]
Kompost
Biogasanlage, Darm
Darm
Gewässerproben
Gewässerproben
Boden
Pansen
Funktionell
Funktionell
Funktionell
PCR
Funktionell
Funktionell
Funktionell
[66]
[67]
[68]
[69]
[70]
[71]
[72]
Boden und Sediment
Antarktisches Gewässer
Kompost
Funktionell
PCR
Funktionell
[73]
[74]
[75]
Boden
Kompost
Boden und Gewässer
Gletschereis
Belebtschlamm
Boden
Kompost
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
Funktionell
[76]
[75]
[77]
[78]
[79]
[80]
[75]
Tiefsee-Sediment
Lehmboden
Boden und Sediment
PCR
Funktionell
Funktionell
[81]
[82]
[83]
Lipasen
β-Lactamasen
Cellulasen
Chitinasen
Xylanasen
Amidasen
Proteasen
Lactonasen
Phosphatasen
Nitrilasen
DNA Polymerasen
Dioxygenasen
Alkan-Hydroxylasen
Styrol-Monooxygenasen
Alkohol-Dehydrogenasen
8
1. Einleitung
1.3. Oxidative Enzyme
Sauerstoff in Kohlenwasserstoff-Verbindungen einzuführen ist eine Herausforderung. Neben der
C-H-Bindung muss dazu auch der molekular vorliegende Disauerstoff gespalten werden. Die
Spaltung des Disauerstoffs ist zwar exotherm und damit thermodynamisch favorisiert, kinetisch
jedoch gehemmt, da die Reaktion zwischen molekularem Sauerstoff, der im Grundzustand in
Triplettmultiplizität vorliegt, mit Stoffen, die Singulettmultiplizität aufweisen (wie die meisten
organischen Moleküle) nach der Wignerschen Spinauswahlregel verboten ist [84]. Zur
Überwindung dieser hohen kinetischen Barriere setzen Enzyme diverse Cofaktoren ein, darunter
Metalle wie Kupfer, Mangan oder Eisen, oder Flavine, die in ihrer elektronenreichen reduzierten
Form in der Lage sind, molekularen Sauerstoff als Substrat zu nutzen. Auf chemischem Weg setzt
die notwendige Aktivierung des Sauerstoffs oft harsche Bedingungen voraus. Auf dem Weg zu
Prozessen, die umweltverträglicher sind als etablierte chemische Routen, spielen oxidative
Enzyme daher eine wichtige Rolle.
Enzyme, die oxidative Reaktionen katalysieren, gehören zur Enzymhauptklasse 1, den Oxidoreduktasen, die weiter unterteilt werden je nachdem, woher sie die für die Reaktion notwendigen
Elektronen beziehen. Sie umfassen unter anderem Mono- und Dioxygenasen, Oxidasen und
Dehydrogenasen [85].
OH
R1
R
O
O
R1
R
R
S
R1
R
O
S
R1
O
NH2
O
R
COOH
O
R
COOH
OH
O
R
R
Abb. 1.2. Auswahl Enzym-katalysierter oxidativer Reaktionen. Da die einzelnen Reaktionen je durch
unterschiedliche Enzyme unter Ausnutzung verschiedener Cofaktoren wie NAD(P)H, FAD, FMN oder PQQ
katalysiert werden können, wurden Katalysatoren und Cofaktoren im Sinne der Übersichtlichkeit hier nicht
aufgeführt.
Zu den Enzym-katalysierten oxidativen Reaktionen zählen die Hydroxylierung von aliphatischen
und aromatischen Kohlenwasserstoff-Verbindungen sowohl an C=C-Doppelbindungen als auch
an nicht-aktivierten C-H-Bindungen, die Baeyer-Villiger-Reaktion von Ketonen, die Epoxidierung
von C=C-Doppelbindungen und die Oxidation von Heteroatomen wie die Sulfoxidierung oder die
Aminoxidation (Abb. 1.2). Dabei katalysieren Monooxygenasen den Einbau eines der Sauerstoffatome aus molekularem Sauerstoff, während das andere Atom zu Wasser reduziert wird. Anders
die Dioxygenasen: Hier erfolgt der Einbau beider Sauerstoff-Atome in das Substrat, was die
Spaltung aromatischer Ringe wie Catechol ermöglicht. Bei Oxidasen dient der Sauerstoff als
9
1. Einleitung
terminaler Elektronenakzeptor und wird zu H2O2 reduziert, keines der beiden Atome wird in das
Substrat eingebaut.
Im Stoffwechsel haben viele oxidative Enzyme die Aufgabe, Substrate so umzubauen, dass sie in
den zentralen Stoffwechsel eingeschleust werden und als Kohlenstoff- und Energiequelle
verfügbar gemacht werden können. Dazu liegen eine Reihe von ihnen im Genom auf
benachbarten Abschnitten, wie beispielsweise in Pseudomonas putida JD1, für den ein Abbauweg
von 4-Hydroxyacetophenon postuliert wurde, an dessen Beginn eine Oxidation durch eine
Monooxygenase steht, gefolgt von einer Esterase, einer Dioxygenase, einer Dehydrogenase und
einer Reduktase, bis β-Ketoadipat entsteht, das über die bekannten Wege abgebaut werden kann
(Abb. 1.3) [86].
O
O
HAPMO
HO
NADPH
4-Hydroxyacetophenon + O2
HO
COH
COO
NADP+
+ H2O
NAD(P)+
4-Hydroxymucon- + H2O
semialdehyd
O
HO
Dehydrogenase
NAD(P)H
OH
Esterase
4-Hydroxyphenylacetat
HO
COO
COO
H2O
Reduktase
NAD(P)H
Maleylacetat
CH3COOH
O
HO
Hydrochinon
COO
COO
Dioxygenase
O2
E-Ketoadipat
Abbauweg
NAD(P)+
E-Ketoadipat
Abb. 1.3. Postulierter Abbauweg von 4-Hydroxyacetophenon zu β-Ketoadipat in Pseudomonas putida JD1
[86]. HAPMO = 4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase.
Innerhalb der Monooxygenasen ist eine Einteilung anhand der katalysierten Reaktionen
schwierig, da in einigen Fällen über unterschiedliche Mechanismen mithilfe verschiedener
Cofaktoren die gleichen Reaktionen durchgeführt werden. Eine Epoxidierung kann beispielsweise
sowohl durch Flavin-abhängige Styrol-Monooxygenasen als auch durch eisenhaltige P450Monooxygenasen katalysiert werden, eine Hydroxylierung durch Monooxygenasen, in denen das
Eisen in einer Häm-Gruppe vorliegt oder durch Nicht-Häm-haltige Eisen-Proteine, die ein [Fe-S]Cluster für die Katalyse nutzen. Eine Gruppierung ist daher am sinnvollsten über den Aufbau der
Enzyme und den Cofaktor, mit dem die Katalyse verwirklicht wird. Im Folgenden sollen mit den
P450-, den Baeyer-Villiger- und den Styrol-Monooxygenasen exemplarisch die für die Biokatalyse
relevanten Vertreter unter den oxidativen Enzymen vorgestellt werden.
1.3.1. Cytochrom P450-Monooxygenasen
Cytochrom P450-Proteine (CYP- oder P450-Monooxygenasen) tragen ihren Namen nicht
aufgrund ihrer katalytischen Funktion, sondern aufgrund ihrer spektrophotometrischen
Eigenschaften. In ihrem Zentrum befindet sich eine Häm-Gruppe, die für die Katalyse notwendig
10
1. Einleitung
ist. In den 1950er Jahren entdeckte man, dass dieses Pigment (P = Pigment) in seiner reduzierten,
Kohlenmonooxid-gebundenen Form ein Absorptionsmaximum bei 450 nm aufweist [87]. Diese
prosthetische Häm-Gruppe enthält ein Eisen-Ion, das von vier Porphyrin-Stickstoff-Atomen
koordiniert wird.
P450-Monooxygenasen sind weit verbreitet und in allen Domänen des Lebens anzutreffen. Ihnen
kommen wichtige Funktionen sowohl im Primär- als auch im Sekundärstoffwechsel zu, wo sie
diverse Substrate meist unter Nutzung von molekularem Sauerstoff oxidieren – ein Atom wird in
das Substrat eingefügt, das andere zu Wasser reduziert. Sie sind in die Biosynthese wichtiger
Stoffwechselprodukte wie Steroide, Fettsäuren oder Eicosanoide und in den Abbau von
Xenobiotika wie Herbizide oder Insektizide involviert. Ihr Substratspektrum erstreckt sich von
kurz- und langkettigen Alkanen, Alkenen und Fettsäuren über Terpene und Alkaloide bis hin zu
komplexen Molekülen wie Steroiden. Dabei sind sie in der Lage, so unterschiedliche Reaktionen
wie Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Sulfoxidierungen, Deaminierungen oder Dehalogenierungen zu katalysieren [88, 89]. Viele P450-Monooxygenasen sind wichtige Leberenzyme, die
dafür verantwortlich sind, Substrate zu hydroxylieren, damit diese wasserlöslich werden und
somit leichter auszuscheiden sind [90].
Für eine erfolgreiche Katalyse (vgl. Abb. 1.4) müssen die Elektronen vom Cofaktor NAD(P)H zur
Häm-Gruppe transportiert werden, was durch eine Reduktase in der Regel mit Hilfe eines FlavinNukleotids (Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) oder Flavin-Mononukleotid (FMN)) erfolgt. Diese
Reduktase kann bei P450-Enzymen entweder in Form eines separaten zweiten Proteins vorliegen
oder als Fusion auf der gleichen Polypeptidkette wie die Oxygenase. In vielen Fällen sind darüber
hinaus ein oder zwei weitere Proteine in die Elektronentransportkette involviert wie
beispielsweise Ferredoxin oder andere Proteine mit Eisen-Schwefel-Clustern. Inzwischen werden
P450-Monooxygenasen bezüglich ihrer Elektronentransportkette in zehn verschiedene Klassen
eingeteilt [91], unter denen sich auch Sonderfälle befinden, wie das Archaeen-Enzym CYP119 aus
Sulfolobus solfataricus, bei dem die Elektronen nicht von einem Nicotinamid-Cofaktor stammen
[92, 93]. Viele der P450-Enzyme liegen nicht löslich im Cytosol vor, sondern sind in der Membran
verankert, entweder in der inneren Mitochondrien-Membran oder in der des Endoplasmatischen
Retikulums.
P450-Monooxygenasen stellen eine sehr große, diverse Proteinfamilie dar - in Datenbanken sind
aktuell mehr als 10.000 Enzyme verzeichnet [94, 95]. Trotz dieser großen Anzahl werden bislang
nur wenige Enzyme in der Biokatalyse eingesetzt. Die Gründe dafür liegen unter anderem in dem
oft komplexen Aufbau der aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Enzyme und der
damit verbundenen schwierigen Handhabung, was durch die oft membranständige Lokalisierung
zusätzlich erschwert wird. Viele Enzyme sind dadurch nur unzureichend rekombinant zu
exprimieren und darüber hinaus in isolierter Form oft instabil oder weisen nur geringe Aktivitäten
auf. Dennoch haben P450-Monooxygenasen aufgrund ihrer großen Vielfalt katalysierter
Reaktionen und des breiten Substratspektrums ein großes Potential für die Biokatalyse. Die oft
chemo-, regio- und stereoselektiven Umsätze machen sie umso attraktiver [96].
11
1. Einleitung
H
H
O
FeIII
R-O-H
H
R
O
R-H
(Cys)S
H-R
1
FeIII
FeIII
(Cys)S
(Cys)S
8
2
H-R
e
H2O2
H-R
O
FeIV
FeII
(Cys)S
7
H2O
(Cys)S
peroxide
shunt
H
3
H
HO
H-R
O
O
H-R
O
O2
FeIII
FeIII
(Cys)S
(Cys)S
6
O
H
H-R
O
4
e
FeIII
(Cys)S
R-H
: Porphyrin
: Substrat
5
Abb. 1.4. Katalysemechanismus von P450-Monooxygenasen [22]. Die Porphyrin-Ebene ist durch schwarze
Balken dargestellt. Zu Beginn der Katalyse (1) liegt das Eisen-Ion als Fe(III)-Spezies außerhalb der ProphyrinEbene vor. Im ersten Schritt (2) wird das Wasser durch das Substrat R-H ersetzt. Durch die Übertragung des
ersten Elektrons vom Redoxpartner wird das Eisen-Ion zu Fe(II) reduziert (3), und kann in dieser Form
Disauerstoff (O2) binden (4). Durch Übertragung des zweiten Elektrons wird eine Peroxo-Eisen-Spezies
gebildet (5), die im Anschluss protoniert wird zu einer Eisen-Hydroperoxo-Spezies (6). Die Abspaltung von
H2O führt zur Bildung von Spezies 7, welches dadurch in der Lage ist, eine Bindung zwischen dem
Sauerstoff und dem Substrat zu bilden (8). Die Abspaltung des oxidierten Substrats führt wieder zur Bildung
der ursprünglichen Fe(III)-Spezies.
Einige der Limitierungen können durch den Einsatz von Ganzzellsystemen umgangen werden. Da
die Enzyme hier in einer zellulären Umgebung vorliegen, sind sie in der Regel stabiler. Auch eine
Cofaktor-Regenerierung findet hier in situ statt. Bei Biotransformationen mit Wildtyp-Zellen ist
auch die membranständige Lokalisierung der Enzyme kein Hindernis – selbst die rekombinante
Expression von Membranenzymen wird immer einfacher [97].
Inzwischen sind eine Reihe von Syntheserouten entwickelt worden, in denen P450-Monooxygenasen zur Herstellung chiraler Bausteine für die pharmazeutische Chemie eingesetzt werden
[98]. So wurden zwei neue, semi-synthetische Wege für die Herstellung von Artemisinin
entwickelt, einem wichtigen Anti-Malaria-Medikament [99, 100], beide zwar noch mit
Limitierungen wie langen Kultivierungszeiten, geringen Aktivitäten und unerwünschten
Nebenprodukten, aber großem Potential, das teure Extraktionsverfahren aus der Pflanze Artemisia
12
1. Einleitung
annua zu ergänzen oder zu ersetzen. Auch für die Biosynthese des Isoprenoids Taxol, einem AntiTumor-Mittel, das natürlicherweise aus der Eibe Taxus brevifolia gewonnen wird, dessen
natürliches Vorkommen aber limitiert ist, werden Syntheserouten entwickelt, die den Einsatz von
P450-Monooxygenasen einschließen [101].
Für den Einsatz in der Biokatalyse sind vor allem lösliche Proteine attraktiv, wie sie beispielsweise
in der Familie der CYP102 zu finden sind [102]. Deren bekanntester Vertreter ist die
P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium P450-BM3, auch CYP102A1 genannt. Seit seiner
Identifizierung vor mehr als 25 Jahren [103] hat es sich zu einem der am meisten untersuchten
P450-Enzyme in der Biokatalyse entwickelt. Es weist eine breites Substratspektrum und hohe
Umsatzraten auf und ist besonders deswegen so attraktiv, weil es sich um ein natürliches
Fusionsprotein aus Oxygenase- und Reduktase-Untereinheit handelt, also keine weiteren Proteine
für den Transport der Elektronen vom Cofaktor zum Substrat notwendig sind. P450-BM3 wurde in
zahlreichen Studien modifiziert, so dass nun eine Vielzahl attraktiver Reaktionen möglich ist. Zu
den umgesetzten Substraten zählen unter anderem Alkane, Terpene, Alkaloide und Steroide,
darunter auch hier zahlreiche pharmazeutisch interessante Substrate wie das angstlösende
Pharmakon Buspiron [104]. Zahlreiche weitere Beispiele finden sich in aktuellen Reviews [102,
105, 106]. Anhand struktureller Untersuchungen wurde die Aminosäure an Position 87 als
wichtige Schlüsselstelle identifiziert, die Substratspezifität und Regioselektivität beeinflusst.
Durch Mutagenese dieser Position konnte beispielsweise die Aktivität gegenüber Terpenen
gesteigert werden [107] oder gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen wie
Naphthalin oder Fluoren [108], krebserregenden Umweltgiften, deren Abbau durch die P450Monooxygenase katalysierte Hydroxylierung eingeleitet werden kann. Neben P450-BM3 wurden
in Bacillus megaterium weitere Monooxygenasen gefunden, darunter CYP102A3, die ebenfalls als
natürliches Fusionsprotein vorliegt und eine sehr hohe Aktivität aufweist, allerdings relativ
unspezifisch ist, was bei Hydroxylierungsreaktionen oft beobachtet wird. Durch den Austausch
von nur zwei Aminosäuren wurde eine Variante gefunden, die das Modellsubstrat 1-Octan
spezifisch terminal zu 1-Octanol hydroxyliert [109].
Die Tatsache, dass P450-BM3 als natürliches Fusionsprotein vorliegt, diente in eine Reihe von
Studien als Inspiration für die Bildung artifizieller Fusionsproteine aus zwei P450-Untereinheiten.
Der Austausch des Teils der P450-BM3, der die Reduktase-Funktion übernimmt, gegen eine
Reduktase-Untereinheit aus Geobacillus stearothermophilus führte zu einer deutlichen Steigerung
der Thermostabilität des Fusionsenzyms [102]. Die Reduktase-Untereinheit RhFRED aus
Rhodococcus sp. NCIMB 9784, die den Elektronentransport von NADPH zur Häm-Domäne der
Oxygenase katalysiert [110, 111], erwies sich als hervorragend geeignet für die Fusion mit
anderen Oxygenasen. In mehreren Studien konnten so effiziente Katalysatoren generiert werden
[112-115]. Inzwischen wurde auch ein Vektor entwickelt (LICRED), in den diese ReduktaseUntereinheit so eingebaut ist, dass sich beliebige Oxygenase-Gene davor klonieren lassen. Dass
bei der Expression funktionelle Fusionsproteine gebildet werden, konnte anhand zahlreicher
Beispiele gezeigt werden [116].
13
1. Einleitung
Abb. 1.5. Strukturen der drei Komponenten der P450cam-Monooxygenase aus Pseudomonas putida. Links:
P450-Oxygenase (pdb-Code 1DZ6) [117], Mitte: Putidaredoxin PdX (ohne [2Fe-2S]-Cluster, pdb-Code 1PDX)
[118], rechts: Putidaredoxin-Reduktase PdR (pdb-Code 1Q1R) [119].
Neben P450-BM3 ist die P450cam (CYP101) aus Pseudomonas putida ein weiterer vielfach
untersuchter Vertreter der P450-Monooxygenasen. Natürlicherweise ist sie in den CampherMetabolismus involviert und oxidiert (+)-Campher zu 5-exo-Hydroxycampher [120]. Anders als
P450-BM3 besteht die Campher-Hydroxylase allerdings nicht nur aus einer Untereinheit, sondern
aus drei Komponenten: Neben der P450-Oxygenase sind eine NADH-abhängige FAD-haltige
Putidaredoxin-Reduktase (RdR) und ein [2Fe-S]-haltiges Putidaredoxin (PdX) als Elektronentransporter vom Nicotinamid-Cofaktor zum Substrat involviert. Die dreidimensionalen Strukturen
sowohl der P450-Monooxygenase [117, 121] als auch des Putidaredoxins [118, 122] und der
Putidaredoxin-Reduktase [119] sind veröffentlicht (Abb. 1.5), und deren Zusammenspiel in
zahlreichen Studien untersucht. Auch von diesem Enzym wurden inzwischen zahlreiche
Mutanten entwickelt, um sein Substratspektrum zu erweitern, beispielsweise um (+)-Pinen
umzusetzen [123].
HO
O
O
CYP107H1,
PdR, PdX
HO
O
OH
O
OH
NADH
+ O2
+
OH
NAD
+ H2 O
Abb. 1.6. Hydroxylierung von Daidzein zum 7,3‘,4‘-Trihydroxyisoflavon, das entzündungshemmende und
antiallergene Wirkung hat. Die Reaktion wird katalysiert durch eine aus drei Komponenten
zusammengesetzte Monooxygenase, von der die Oxygenase-Komponente CYP107H1 aus Bacillus subtilis
stammt und die beiden Reduktase-Komponenten Putidaredoxin (RdX) und Putidaredoxin-Reduktase (PdR)
aus Pseudomonas putida [124].
Auch die P450cam wurde für artifizielle Kombinationen von Enzym-Untereinheiten genutzt. Da es
sich aber um separate Proteinketten handelt, ist hier keine Erzeugung von Fusionsproteinen
notwendig. Das Zusammenfügen der Reduktase-Untereinheiten mit einer OxygenasenUntereinheit aus einer fremden Monooxygenase kann in vivo oder in vitro erfolgen und in beiden
Fällen funktionelle Enzyme liefern. Dies wurde am Beispiel von Daidzein gezeigt (Abb. 1.6), das
14
1. Einleitung
durch die Oxygenasen aus Bacillus subtilis oxidiert werden konnte, die mit den ReduktaseUntereinheiten PdR und PdX aus Pseudomonas putida komplementiert wurde [124]. Durch diese
Engineering-Methoden stehen neue Möglichkeiten zur Verfügung, oxidative Reaktionen durch
Biokatalysatoren zu verwirklichen.
1.3.2. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen
Wie P450-Monooxygenasen katalysieren auch Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) die
Oxidation von Substraten unter Einsatz von molekularem Sauerstoff. Analog zur chemischen
Baeyer-Villiger-Reaktion wird ein Sauerstoff-Atom zwischen einem Carbonyl-Kohlenstoff und dem
benachbarten C-Atom eingefügt. Bei der chemischen Reaktion erfolgt dies in der Regel unter
Einsatz von Persäuren, hochreaktiven und sicherheitstechnisch nicht unproblematischen
Oxidationsmitteln. Da diese bei der enzymatischen Reaktion nicht nötig sind, haben BVMOs ein
attraktives Potential für die Entwicklung alternativer, umweltschonender Prozesse. Anders als bei
P450-Monooxygenasen wird für die Katalyse kein Metall genutzt, sondern ein Flavin (FAD oder
FMN). Die Elektronen werden von NAD(P)H auf das Flavin übertragen.
Nach den ersten Berichten über eine biologische Baeyer-Villiger-Reaktion im Abbauweg von
Steroiden in den 1940er und 1950er Jahren [125, 126] folgte 1976 die Isolierung der zurzeit wohl
am besten charakterisierten BVMO, der Cyclohexanon-Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter
sp. NCIMB 9871 [127]. Seitdem sind zahlreiche BVMOs isoliert und charakterisiert worden, von
denen nahezu 60 kloniert und rekombinant exprimiert wurden, fast alle jedoch prokaryontischen
Ursprungs [128]. Erst im vergangenen Jahr gelang die Klonierung eines eukaryontischen Gens,
der Cycloalkanon-Monooxygenase aus dem Pilz Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 [129].
Die Klonierung neuer BVMOs wurde durch die Identifizierung eines konservierten Sequenzmotivs
deutlich erleichtert [130]. Fraaije et al. teilten die Flavin-abhängigen Monooxygenasen aufgrund
ihrer Sequenzhomologie in drei Klassen ein: BVMOs, Flavin-haltige-Monooxygenasen (FMOs) und
N-hydroxylierende-Monooxygenasen (NMOs). Während der Identifizierung von 23 neuen BVMOs
aus dem Organismus Rhodococcus jostii RHA1 anhand der Homologie zur CHMO aus Acinetobacter
bestätigte sich, dass dieses Sequenzmotiv in den meisten BVMOs vorhanden ist, in einigen
allerdings in modifizierter Form [131].
Obwohl weit mehr BVMOs aus mikrobiellen und pilzlichen Systemen charakterisiert sind, sind
durchaus auch Baeyer-Villiger-Reaktionen beschrieben, die durch tierische oder menschliche
Enzyme katalysiert werden. Die zugrundeliegenden Enzyme zählen allerdings zu den FMOs. Diese
dienen in Vertebraten hauptsächlich der Entgiftung von Xenobiotika wie Alkaloiden, Pestiziden
oder Medikamenten durch Oxidation von Heteroatomen wie Stickstoff, Schwefel oder Phosphor
[132, 133]. In den letzten Jahren mehrten sich die Beschreibungen, dass diese FMOs auch in der
Lage seien, Baeyer-Villiger-Reaktionen zu katalysieren. Dies wurde kürzlich für humane FMOs
bestätigt [134]. Dass FMOs durchaus auch in Mikroorganismen gefunden werden können, konnte
in den vergangenen Jahren wiederholt gezeigt werden, beispielsweise anhand des Enzyms aus
Methylophaga sp. SK1 [135]. Trotz hoher Homologie zwischen FMOs und BVMOs setzt dieses
Enzym aber keine typischen BVMO-Substrate wie Cyclohexanon oder Acetophenon um, dafür
katalysiert es die FMO-typische Sulfoxidation [136]. Für die Biokatalyse ist dieses Enzym
15
1. Einleitung
interessant, da es im Gegensatz zu den eukaryontischen FMOs löslich und nicht membranständig
vorliegt. Umgekehrt ist allerdings für BVMOs die Oxidation von Heteroatomen wie Schwefel,
Selen oder Phosphor beschrieben, so dass eine strikte Abgrenzung der beiden Klassen
voneinander weder anhand des phylogenetischen Ursprungs (Pro- / Eukaryont) noch anhand der
katalysierten Reaktion (Baeyer-Villiger-/ Heteroatom-Oxidation) aufrecht zu erhalten ist. Die
kürzlich von Grogan et al. klonierte FAD-haltige Monooxygenase aus dem marinen Bakterium
Stenotrophomonas maltophilia unterstreicht dies – sie katalysiert sowohl Baeyer-VilligerOxidationen als auch die Oxidation von Thioethern unter Einsatz von entweder NADH oder
NADPH [137].
In der Literatur wird üblicherweise zwischen zwei Typen von BVMOs unterschieden. Die Gruppe
der BVMOs des Typ I, zu denen die meisten bislang charakterisierten Enzyme zählen, umfasst
lösliche Enzyme, die aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen, FAD als prosthetische Gruppe
gebunden haben und NADPH als Cofaktor nutzen [138, 139]. BVMOs des Typ II dagegen bestehen
aus zwei separaten Polypeptidketten, einer Reduktase-Untereinheit, die FMN mit Hilfe von NADH
reduziert und einer Oxygenase-Untereinheit, die das aktivierte Flavin nutzt, um die Baeyer-Villiger
Reaktion durchzuführen. Im Gegensatz zu den zahlreichen charakterisierten BVMOs des Typ I
liegen nur wenige Berichte über charakterisierte und klonierte Typ II BVMOs vor, obwohl diese
aufgrund ihrer Cofaktor-Präferenz für NADH für die Biokatalyse interessant wären. Kürzlich wurde
die Klonierung und Charakterisierung zweier Diketocamphan-Monooxygenasen (DKCMO)
beschrieben, die im Abbauweg von Campher in Pseudomonas putida NCIMB 10007 involviert sind
[140-142], darüber hinaus wurde eine BVMO-Aktivität der beiden Luciferasen aus Photobacterium
phosphoreum NCIBM 844 und Vibrio fischeri ATCC 7744 [143] sowie eine weitere beim Abbau von
Limonen in Rhodococcus erythropolis DCL14 [144] nachgewiesen. Gänzlich aus dieser Einteilung in
zwei BVMO-Typen heraus fällt das Enzym MtmOIV, das ebenfalls eine Baeyer-Villiger-Oxidation
durchführt, aber nur eine sehr geringe Sequenzhomologie zu den zuvor genannten Enzymen
zeigt [145, 146]. Es spielt eine Schlüsselrolle in der natürlichen Biosynthese von Mithramycin in
Streptomyces argillaceus, das als Anti-Tumor-Medikament eingesetzt werden kann. Dies legt nahe,
dass eine Einteilung der Baeyer-Villiger-Oxidation katalysierenden Enzyme in die zwei Typen nur
als Orientierung, nicht aber als strikte Gruppierung verstanden und zumindest um eine weitere
Gruppe ergänzt werden sollte.
Eine dreidimensionale Struktur liegt bisher nur von wenigen BVMOs vor. 2004 wurde die
thermostabile Phenylaceton-Monooxygenase (PAMO) aus Thermobifida fusca [147, 148]
kristallisiert, wenig später folgten die CHMO aus Rhodococcus sp. HI-31 [149], die ein breiteres
Substratspektrum aufweist als die PAMO, und die Struktur der MtmOIV [145]. Die
Kristallstrukturen konnten den zuvor postulierten Mechanismus untermauern (Abb. 1.7). Diesem
Mechanismus zufolge [150] beginnt die Katalyse mit der Reduktion des Flavins durch den
Nicotinamid-Cofaktor. Das aktivierte FAD reagiert mit molekularem Sauerstoff zum Peroxy-Anion,
dem Pendant zur Persäure in der chemischen Baeyer-Villiger-Reaktion. Dieses Peroxy-FAD greift
nun die Carbonylgruppe des Substrates unter Bildung eines tetraedrischen Zwischenzustandes,
des sogenannten Criegee-Intermediates, nukleophil an. An diesem Punkt entscheidet sich, an
welche Stelle das Sauerstoff-Atom in Bezug auf die Carbonylfunktion eingefügt wird. In der Regel
wandert dabei das stärker nukleophile C-Atom, das die partiell positive Ladung am besten
16
1. Einleitung
stabilisieren kann. Normalerweise ist dies das am stärksten substituierte C-Atom, aber die
Wanderungspräferenz wird auch sterisch und konformativ beeinflusst [151]. Ein unnötiger
Verbrauch von NAD(P)H durch eine unkontrollierte Bildung von H2O2 aus dem Peroxo-Flavin wird
durch die Stabilisierung des Anions verhindert.
R
N
N
H OH
Hydroxy-FAD
N
O
NADPH
FAD
R
N
O
NH
N
H
O
reduziertes FAD
O
N
H2O
R
N
O
NH
O
N
H OH
Hydroxy-FAD
O2
O
R1
O
NH
N
H2O
R
N
N
N
O
NH
O
R3
O
S
R4
R2
R3
R
N
N
N
H O
O
O
O
R1
R2
R
N
O
NH
O
R1
R2
N
N
H O
O
O
Peroxy-Anion
R
N
O
NH
N
N
H O
O
HO
S
R4
O
NH
Hydroperoxid
Criegee-Intermediat
Abb. 1.7. Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenasen nach [152], erläutert im Text.
Dem Peroxo-Flavin kommt während der Katalyse ein ambivalenter Charakter zu. Neben der
Baeyer-Villiger-Oxidation sind viele BVMOs in der Lage, auch die Oxidation von Heteroatomen zu
katalysieren. Dabei bildet sich aus dem Peroxo-Anion das Hydroperoxid, das zum Hydroxy-Flavin
unter Oxidation des Substrates, beispielsweise eines Schwefelethers reduziert wird.
Bezüglich der von BVMOs umsetzbaren Substrate gibt es eine große Diversität. Drei Klassen von
Substraten können unterschieden werden: Am häufigsten sind BVMO-Reaktionen mit cyclischen
Ketonen beschrieben, darunter Cyclohexanon (umgesetzt z.B. durch die CHMO aus Acinetobacter
calcoaceticus [127] oder die CHMO aus Brevibacterium sp. HCU [153]) und Cyclopentanon (z.B. von
der Cyclopentanon-Monooxygenase aus Comamonas testosteroni [154]), aber auch die
Umsetzung größerer Ringe ist beschrieben z.B. durch die Cyclopentadecanon-Monooxygenase
aus Pseudomonas sp. HI-70 [155]. Daneben sind aber auch BVMOs beschrieben, die Arylketone
umsetzen (wie die HAPMOs aus Pseudomonas putida JD 1 [86] und aus Pseudomonas fluorescens
ACB [156] und die PAMO aus Thermobifida fusca [147]) sowie solche, die lineare Ketone zu Estern
17
1. Einleitung
oxidieren (wie die BVMO aus Pseudomonas fluorescens [157]). Auch die Umsetzung von Steroiden
ist dokumentiert [158] (Abb. 1.8).
O
O
O
O
O
HO
O
H
O
H
H
O
H
O
O
Abb. 1.8. Beispiele für Substrate, die von BVMOs akzeptiert und die zum Ester bzw. Lacton oxidiert werden
[86, 127, 140, 141, 147, 154, 157, 159, 160].
Darüber hinaus sind zahlreiche Biokatalysen mit substituierten Substraten beschrieben – allein
die CHMO aus A. calcoaceticus setzt mehr als 100 Substrate um. Aktuelle Reviews geben einen
umfassenden Überblick über die Vielfalt möglicher Produkte, die sowohl über eine
asymmetrische Synthese aus
prochiralen Verbindungen als auch über kinetische
Racematspaltung erzielt werden können – häufig mit exzellenten Enantioselektivitäten (aktuelle
Review: [128, 151, 152, 161-163]). Viele dieser Syntheserouten sind hervorragend geeignet, in der
organischen Synthese oder pharmazeutischen Industrie Anwendung zu finden.
Eine Limitierung der BVMOs bezüglich ihrer Anwendung im größeren Maßstab ist ihre CofaktorAbhängigkeit, insbesondere da die meisten das deutlich teurere NADPH bevorzugen. Eine
Möglichkeit, diese Limitierung zu umgehen, stellt der Einsatz von ganzen Zellen dar, entweder in
Form von wachsenden, ruhenden oder immobilisierten Zellen. Dies funktioniert allerdings nur
solange, wie Substrat und Produkt nicht toxisch für die Zellen sind und die Zellmembran
passieren können. Auch muss gewährleistet sein, dass der Wirt das Produkt nicht weiter
verstoffwechselt. Werden statt Ganzzellsystemen isolierte Enzyme eingesetzt, so muss stets die
Regeneration des Cofaktors sichergestellt werden (siehe hierzu auch Exkurs 1, S. 20). Neben den
klassischen Methoden der Zugabe eines zweiten, regenerierenden Enzymes (in der Regel einer
Dehydrogenase) oder einer elektrochemischen Regeneration wurde von Mihovolovic und Fraaije
eine elegante Lösung gefunden, bei der die BVMO über einen Linker mit einer PhosphitDehydrogenase gekoppelt wurde [164]. Die Aktivität beider Enzyme wurde durch die Fusion nicht
beeinträchtigt. Ein sehr interessanter Ansatz zur Cofaktor-Regenerierung wurde von Hollmann et
al. vorgestellt, die den Flavin-Cofaktor in Gegenwart eines Mediators mit Hilfe von Lichtenergie
regenerierten [165, 166]. Auch wenn die Umsätze noch sehr gering sind, stellt dies ein
vielversprechendes Konzept dar.
Wie viele andere Enzymklassen wurden auch die BVMOs in den letzten Jahren verstärkt mittels
Mutagenese modifiziert, um ihre Eigenschaften den jeweiligen Bedürfnissen anzupassen. Durch
error-prone PCR gelang es beispielsweise, die Enantioselektivität der BVMO aus P. fluorescens DSM
50106 gegenüber 4-Hydroxy-2-decanon deutlich zu verbessern [167] oder Mutanten einer CHMO
18
1. Einleitung
zu erzeugen, die den prochiralen Thioether Methyl-4-methylbenzylthioether enantioselektiv in
das chirale Sulfoxid überführen – dabei wurden unterschiedliche Mutanten gefunden, die die
entgegengesetzten Enantiomere bilden [168]. Die Aufklärung der Kristallstruktur der PAMO
ermöglichte in der Folge die Konstruktion von Mutanten durch rationales Design, was zu einer
Verbreiterung des Substratspektrums führte und auch die Umsetzung von Substraten
ermöglichte, die vom Wildtyp nicht akzeptiert werden [169]. Für weitere Beispiele der
Verbesserung von BVMOs sei auch hier auf aktuelle Reviews verwiesen [161, 170, 171].
Neue BVMOs wurden in der Vergangenheit in der Regel teils über die Anreicherung von WildtypOrganismen, teils in silico mit Hilfe des von Fraaije et al. beschriebenen Sequenzmotivs und teils
durch PCR anhand Sequenzhomologien zu bereits beschriebenen Enzymen identifiziert. Studien,
in denen BVMOs aus dem Metagenom isoliert werden konnten, gibt es mit einer Ausnahme nicht.
In besagter Studie wurde ein Teil einer BVMO bei einem Sequenzierungs-Metagenomprojekt
gefunden. Durch die Konstruktion einer Chimäre mit einer bekannten BVMO konnte ein
funktionelles Protein erlangt werden [172]. Studien, in denen BVMOs aufgrund ihrer Aktivität aus
dem Metagenom identifiziert wurden, sind bislang nicht bekannt. Im Gegensatz zu Lipasen und
Esterasen sind nur wenige Assays im Agarplatten- oder Mikrotiterplatten-Format für BVMOs
beschrieben. Die Verfolgung der Nicotinamid-Cofaktor-Abnahme ist zwar möglich, aber im
Ganzzellsystem stark fehlerbehaftet, da diese auch durch andere Enzymaktivitäten verursacht
werden kann. Für die gerichtete Evolution wurde eine Modifikation des Adrenalin-Assays
erfolgreich angewandt, bei der 4-Hydroxy-2-ketone durch die BVMO oxidiert werden und der
resultierende Ester durch eine Esterase gespalten wird. Das entstehende Diol reagiert mit
Adrenalin zu Adenochrom, das photometrisch detektiert werden kann [167]. Erst kürzlich wurden
zwei weitere BVMO-Assays veröffentlicht: Saß et al. berichten von einer Möglichkeit, die Aktivität
von HAPMOs zu detektieren, indem 4-Nitroacetophenon als Substrat eingesetzt wird, dessen
BVMO-Oxidationsprodukt anschließend von einer Esterase bzw. durch NaOH gespalten wird, so
dass das gelbe 4-Nitrophenol gebildet wird [173]. Neben diesen beiden Assays für BVMOs mit
Präferenzen für aliphatische bzw. arylaliphatische Substrate gibt es seit kurzem auch einen Assay,
der die Detektion von cyclischen Ketonen wie Cyclohexanon oder Cyclopentanon erlaubt [174],
die mit 3,5-Dinitrobenzoesäure zu einem Chromophor reagieren. Mit diesem Set an Enzym-Assays
für den Mikrotitermaßstab stehen nun neue Möglichkeiten zur Verfügung, auch in
umfangreicheren Bibliotheken BVMO-Aktivitäten nachzuweisen, seien diese durch Mutagenese
erzeugt oder aus metagenomischer DNA.
19
1. Einleitung
EXKURS 1: Cofaktor-Regenerierung
II. Chemisch
I. Enzymatisch
O
O
O
O
BVMO
NAD+
NAD(P)H
Gluconolacton
GlcDH
CO2
FDH
Phosphat
OH ADH
Glucose
Rh-Komplex
Formiat
Phosphit
PDH
Regenerierung von NAD(P)H,
FADH2 oder der Hämgruppe
durch einen chemischen
Katalysator wie den RhodiumKomplex [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+
[177-179].
III. Elektrochemisch
IV. Photochemisch
O2
Kathode
FADH2
O
R1
FAD
Regenerierung des FlavinCofaktors an einer Kathode
[180, 181].
h ·ν
BVMO
O
Zerfallsprodukte
FADH2
R2
O
StyMO
R1
20
HCO2- /
H2PO3-
NAD+
Regenerierung des Cofaktors
durch ein zweites Enzym, z. B.
Glucose-, Formiat- oder Phosphit-Dehydrogenase [164, 175,
176].
O
CO2 /
H2 PO4-
NADH
R2
FAD
EDTA
H2O
Reduktionsäquivalente für
die Cofaktor-Regenerierung
stammen von EDTA und
Lichtenergie [165].
1. Einleitung
1.3.3. Styrol-Monooxygenasen
Styrol-Monooxygenasen (StyMO, E.C. 1.14.14.11) sind Flavin-abhängige Enzyme, die bevorzugt
die Oxidation von Alkenen zu Epoxiden katalysieren. Natürlicherweise leiten sie den Abbau von
Styrol ein, indem sie es zu Styroloxid oxidieren, welches weiter zu Phenylessigsäure
verstoffwechselt wird, und anschließend als C-Quelle zur Verfügung steht [182, 183]. Die für
diesen Abbauweg notwendigen Gene, die für Styrol-Monooxygenase, Styroloxid-Isomerase und
Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase kodieren, liegen im Genom benachbart vor [184]. Die
meisten charakterisierten StyMOs wurden aus Pseudomonaden isoliert [184-187]; weitere StyMOs
wurden aus Rhodococcus opacus 1CP beschrieben [188, 189]. Neben den klassischen
Zugangswegen wurde unter 65.000 metagenomischen Klonen eine Styrol-Monooxygenase
anhand ihrer Fähigkeit, Indigo aus Tryptophan zu bilden, identifiziert [82].
Styrol-Monooxygenasen bestehen in der Regel aus zwei Untereinheiten, die jeweils als
Homodimer vorliegen [186]: Einer Flavin-haltigen Oxygenase (StyA) und einer NADH-abhängigen
Reduktase (StyB). Dabei übernimmt StyB den Transport der Elektronen vom Cofaktor NADH zum
Flavin. Das durch das NADH reduzierte FAD reagiert mit Sauerstoff unter Bildung eines
C4a-Hydroperoxids, das vom Styrol angegriffen wird, ein ähnlicher Mechanismus, wie er auch bei
den BVMOs zu finden ist [190, 191]. Die Reaktion führt zur Bildung von Styroloxid und des
Hydroxyflavins, das unter Eliminierung von Wasser wieder in seine oxidierte Flavin-Form
überführt wird, mit welcher der Katalyse-Kreis erneut beginnen kann. Der Katalyse-Mechanismus
wurde durch Modeling-Untersuchungen [192] und Strukturuntersuchungen [193] belegt.
Eine ungewöhnliche StyMO-Variante wurde von Tischler et al. entdeckt: Mit der StyA2B aus
Rhodococcus opacus 1CP wurde die erste StyMO gefunden, in der die beiden Untereinheiten
fusioniert sind [188]. Diese weist allerdings eine sehr schwache Aktivität gegenüber Styrol auf. In
der Nachbarschaft des styA2B Gens befindet sich jedoch das Gen für eine weitere Styrol-MO
Komponente, die Oxygenase StyA1, die allerdings ohne Reduktase nicht aktiv ist. Es konnte
gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von StyA1 und StyA2B zu einem guten Umsatz von
Styrol führt, was die Vermutung nahelegt, dass StyA2B vor allem als Reduktase für StyA1 fungiert
[189] – unklar ist, warum sie als Fusionsprotein mit einer weiteren Oxygenase-Untereinheit
vorliegt. Diese Oxygenase-Untereinheit StyA2 zeigt eine hohe Homologie zu anderen
Oxygenasen, so dass die geringe Aktivität auf die Fusion zurückzuführen sein könnte.
Viele StyMOs katalysieren die Oxidation vom Styrol zum Styroloxid mit hervorragender
Enantioselektivität (> 99 %ee). Dabei wird in der Regel das (S)-Enantiomer gebildet. Neben diesem
natürlichen Substrat werden aber auch eine Vielzahl von Derivaten akzeptiert, die teilweise mit
einer noch höheren Aktivität als Styrol umgesetzt werden, wie 4-Chlor- oder 3-Methyl-Styroloxid
durch die StyAB aus Pseudomonas sp. strain VLB120 [194]. Auch sperrigere Substrate wie Dihydronaphthalen [189], Indol [195] sowie nicht-konjugierte Alkene wie 3-Phenyl-1-Propen werden
akzeptiert [185]. Durch rationales Design konnte das Substratspektrum noch erweitert werden, so
dass durch den Austausch einer Aminosäure im aktiven Zentrum auch α-Methylstyrol und
α-Ethylstyrol epoxidiert werden [196]. Ähnlich wie bei den BVMOs wurde auch bei StyrolMonooxygenasen eine Sulfoxidierung beobachtet, beispielsweise für Methylphenylsulfid [189].
21
1. Einleitung
Abb. 1.9 zeigt eine Auswahl an Produkten, die durch biokatalytische Oxidation mit StyrolMonooxygenasen zugänglich sind.
a)
R1
b)
O
c)
O
O
S
R1
R2
R3
R1
R2
R1,
1
R2
= H oder CH3
R3 = H, CH3 oder O-CH3
R = CH3 , OH, F,
Cl oder Br
d)
O
O
R1, R2 = H oder CH3
O
N
Abb. 1.9. Produkte, die durch Styrol-Monooxygenasen gebildet werden können: a) Styrol und StyrolDerivate, b) arylaliphatische Epoxide, c) Sulfoxide, d) sperrige Bizyklen [197].
Die Entwicklung eines Prozesses, mit dem sich (S)-Styroloxid auch im industriellen Maßstab
herstellen lässt, ist maßgeblich durch die Arbeiten von A. Schmid et al. vorangetrieben worden, in
denen stets das Enzym StyAB aus Pseudomonas sp. VLB120 eingesetzt wird. Das Enzym wird
rekombinant in E. coli hergestellt und in Form von ganzen Zellen eingesetzt, um die CofaktorRegenerierung zu gewährleisten. Da Substrat und Produkt aber in größeren Mengen toxisch für
die Zellen sind, wird eine zweite Phase aus einem organischen Lösungsmittel eingesetzt, in dem
eine hohe Konzentrationen an Styrol und Styroloxid vorliegt, die nur in einem geringen Maß in
die wässrige Phase übergehen. Der Prozess wurde durch zahlreiche Variationen inzwischen
soweit optimiert, dass er unter ökologischen wie ökonomischen Aspekten mit chemischen
Prozessen mithalten kann. In einer Studie wurde der Vergleich zwischen drei chemischen und
diesem biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Styroloxid gezogen [198]. Dabei stellte
sich heraus, dass der biotechnologische Weg unter Einbeziehung von Betriebskosten und
Rohstoffkosten am kostengünstigsten ist. Für eine ökologische Betrachtung der Prozesse wurde
nicht nur der E-Faktor herangezogen, der lediglich die Menge an Abfall pro entstandener
Produktmenge betrachtet, sondern auch die Qualität des Abfalls einbezogen. Dabei fiel bei dem
biotechnologischen Prozess die Wahl des Lösungsmittels für die organische Phase, (bis(2-Ethylhexyl)phthalat) negativ ins Gewicht, so dass der Prozess hinter einem der drei chemischen
Prozesse zurückbleibt, die anderen beiden aber weit übertrifft. Insgesamt kann er als einer der
produktivsten oxidativen Biokatalyseprozesse angesehen werden.
22
N
OH
CONH-tBu
N
a
R
O
Ph
O
H
N
HIV-Protease-Inhibitor Indivar
N
R
b
OH
O
+
OH
O R
OH
O R
R
O
c
OH
H
N
CH3
CH3
O
Betablocker (R)-Nifenalol
O2N
O2N
Chirale Epoxide
OAc
O R
R
R2
R1
O
O
Cl
X
R3
R
H
N
O
R
HO
OH
O
O COO2Na
O COO2Na
e
R
Diabetes-Medikament [199]
OH
Cl
X
R2
d
R3
R1
a Styrol-Monooxygenase
b Lipase
c Monooxygenase
d Haloperoxidase
e Epoxid-Hydrolase
Biokatalytische Syntheserouten
1. Einleitung
EXKURS 2: Chirale Epoxide
23
1. Einleitung
1.3.4. Oxidasen
Oxidasen gehören wie die Monooxygenasen zu den oxidativen Enzymen, katalysieren die
Oxidation der Substrate aber auf eine andere Art und Weise: Sie nutzen Sauerstoff als
Oxidationsmittel und reduzieren es zu Wasserstoffperoxid. Dabei wird das Substrat oxidiert, ohne
dass ein Sauerstoffatom eingebaut wird, wie es bei den Monooxygenasen der Fall ist. Sie können
sowohl C-O-Bindungen als auch C-N-Bindungen oxidieren (Abb. 1.10). Alkohol-Oxidasen
katalysieren die gleiche Reaktion wie Alkohol-Dehydrogenasen, haben aber den Vorteil, dass
keine NAD(P)H-Regenerierung notwendig ist. Andere Enzyme, die C-N oder C-O oxidieren, sind
die Metall-abhängigen Laccasen, Tyrosinasen und Peroxidasen [200].
OH
Alkohol-Oxidase
R
R1
O
R
NH2
Aminosäure-Oxidase
R
COOH
NH
R
NH2
Monoamin-Oxidase
R
R1
R1
COOH
H2O
O
NH4+
R
COOH
NH
R
R1
Abb. 1.10. Überblick über Reaktionen, die von verschiedenen Oxidasen katalysiert werden.
Bei der Reaktion der Oxidasen entsteht stets Wasserstoffperoxid, das für Zellen wie auch für freie
Enzyme toxisch bzw. inhibierend sein kann. Daher werden Prozesse, in denen Oxidasen
eingesetzt werden, oft mit der Reaktion einer Katalase kombiniert, welche das H2O2 zu H2O und O2
umwandelt. Der Elektronentransport läuft in Oxidasen entweder über Flavin (FAD/FMN) oder
über Metall-Ionen. Bei Flavin-Oxidasen werden die Elektronen direkt vom Substrat zum oxidierten
Flavin transferiert, das reduziert und durch O2 wieder reoxidiert wird – der Sauerstoff wiederum
wird zu H2O2 reduziert. Bei Metalloenzymen wie der Galactose-Oxidase findet die Katalyse an
einem Kupfer-Zentrum und einem radikalen Tyrosinyl statt [201, 202].
Unter den Alkohol-Oxidasen ist die Kupfer-abhängige Galactose-Oxidase (EC 1.1.3.9) eines der am
besten untersuchten Enzyme [201]. Sie setzt als Wildtyp nur D-Galactose und D-Talose um,
Mutanten sind auch gegenüber Glucose und Fructose aktiv [203]. Galactose-Oxidasen werden
beispielsweise in Biosensoren zur Detektion von Glycoproteinen eingesetzt – dabei wird das
während der Reaktion freigesetzte Wasserstoffperoxid elektrochemisch detektiert [204].
Die Oxidation von C-N-Bindungen wird entweder durch Aminosäure-Oxidasen (L-Aminosäureoxidase (L-AAO) oder D-Aminosäure-Oxidase (D-AAO)) oder durch Monoamin-Oxidasen
katalysiert, wodurch Iminosäuren oder Imine entstehen. Die analoge chemische Reaktion fordert
in der Regel den Einsatz von Metall-basierten Katalysatoren unter relativ aggressiven
Bedingungen. Die FAD-abhängige D-AAO (EC 1.4.3.3) ist ein wichtiger Katalysator in der Synthese
24
1. Einleitung
von 7-Aminocephalosporinsäure, dem Grundgerüst von Cephalosporin-Antibiotika und wird
zusammen mit einer Glutarylacylase eingesetzt. Durch Modifikation der Seitenketten lassen sich
verschiedene Cephalosporin-Derivate erzeugen, die unterschiedliche Wirkungsspektren
aufweisen [205]. D-AAOs ermöglichen auch den Zugang zu enantiomerenreinen L-Aminosäuren
über eine Dynamisch-kinetische Racematspaltung (DKR). Dabei katalysiert die D-AAO die selektive
Oxidation der D-Aminosäure aus dem Racemat zur Iminosäure. Diese wird unselektiv zur D- und
L-Aminosäure reduziert, von denen wiederum nur das D-Enantiomer von der D-AAO oxidiert wird,
so dass sich die L-Aminosäure anreichert. Die Reduktion der Iminosäure kann dabei chemisch
oder elektrochemisch erfolgen. Auf diese Weise können beispielsweise L-Alanin oder L-Leucin
hergestellt werden [206, 207] (Abb. 1.11).
NH2
R
D-AAO
COOH
(D)
NH
rac
R
H2O
COOH
O
R
+
NH4+
COOH
NH2
rac
R
COOH
(L)
= Racemisierung (chemisch
oder elektrochemisch)
D-AAO = D-Aminosäure-Oxidase
Abb. 1.11. Zugang zu enantiomerenreinen L-Aminosäuren durch dynamisch-kinetische Racematspaltung
mit Hilfe einer D-Aminosäure-Oxidase (D-AAO). Die Racemisierung kann chemisch oder elektrochemisch
erfolgen [207].
D-AAOs können des Weiteren in der Lebensmittelchemie eingesetzt werden, um die bakterielle
Kontamination von Lebensmitteln nachzuweisen. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze,
dass D-Aminosäuren Bestandteil der Peptidoglycanschicht der bakteriellen Zellwand sind – ihr
Auftreten in Lebensmitteln wie Milchprodukten kann daher auf einen mikrobiellen Befall
hindeuten [208]. Durch Mutagenese gelang es, das Substratspektrum der D-AAO so zu erweitern,
dass sie mit allen D-Aminosäuren reagiert, während sie zuvor saure Aminosäuren wie D-Glutamat
nur mit geringer Aktivität umgesetzt hat [209, 210].
Analog zu der in Abb. 1.11 dargestellten Herstellung enantiomerenreiner Aminosäuren durch
D-AAOs konnten Monoamin-Oxidasen eingesetzt werden, um enantiomerenreine Amine
herzustellen, wichtige Intermediate bei der Synthese vieler Pharmazeutika. Turner et al.
entwickelten einen Ansatz, bei dem eine Monoamin-Oxidase aus Aspergillus niger identifiziert
werden konnte, die α-Methylbenzylamin als Modellsubstrat umsetzt [211]. Durch Evolution wurde
das Substratspektrum des Katalysators zudem noch erweitert, so dass eine Vielzahl von
Substraten umgesetzt wird, die in α-Position zur Aminogruppe eine Methylgruppe sowie einen
sperrigen Aryl- oder Alkylrest aufweist [212].
25
1. Einleitung
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität von Oxidasen beruht in der Regel auf der Detektion
von Wasserstoffperoxid. Dieses kann einerseits elektrochemisch detektiert werden, wie es in
einigen Biosensoren angewandt wird. Für einen Enzymassay mit höherem Durchsatz in parallelen
Proben ist dies allerdings nicht geeignet. Daher wurden verschiedene alternative Methoden zum
Nachweis von H2O2 entwickelt. In der Regel basieren diese Methoden auf der Kopplung der
Oxidase-Reaktion mit einer weiteren Enzymreaktion: Das durch die Oxidase freigesetzte H2O2 wird
durch die Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase (HRP)) reduziert, während ein weiteres
Substrat oxidiert wird. Für diese Assays sind unterschiedliche HRP-Substrate getestet worden,
unter denen sich Diaminobenzidin (DAB) und das analoge Tetraaminobenzidin als sensitiver als
das häufig eingesetzte 2,2‘-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin) (ABTS) herausstellten [213, 214].
Durch Verwendung von DAB gelang die Etablierung eines Assays für Aminosäure-Oxidasen auch
für die Durchmusterung umfangreicher Bibliotheken. Ein alternativer Assay beruht in ähnlicher
Weise auf der Detektion des H2O2 durch die Umsetzung mit einer Peroxidase, deren Reaktion
durch die Bildung eines Farbstoffes aus 4-Aminoantipyrin und 2,4,6-Tribrom-3-Hydroxybenzoesäure nachgewiesen werden kann [215]. Weiterhin wurde von Wong et al. die Bildung
eines blauen Farbstoffes beschrieben, der durch die Reaktion von H2O2 mit 4-Aminoantipyrin und
Chromotropsäure durch eine Peroxidase entsteht [216]. Insgesamt stehen also vielfältige
Methoden zur Verfügung, die Aktivität von Oxidasen anhand des gebildeten Wasserstoffperoxids
zu detektieren.
1.4. Transaminasen
Noch vor gut fünf Jahren wurden Transaminasen von Woodley et al. neben Monooxygenasen als
zunehmend bedeutsame Enzymklassen für die Biokatalyse eingeschätzt [4, 9] – inzwischen haben
sie ihren festen Platz in der industriellen Biotechnologie gefunden. Bei großen BiotechnologieFirmen gehören sie mittlerweile in die Enzymplattform, mit denen Produkte im Tonnenmaßstab
hergestellt werden [3], weil sie Zugang zu enantiomerenreinen Aminen und Aminosäuren
eröffnen. Darunter befinden sich Intermediate von Medikamenten wie Sitagliptin, in dessen
Syntheseroute ein Rhodium-katalysierter Schritt unter hohem Druck durch einen Transaminasekatalysierten Schritt ersetzt werden konnte [217].
Transaminasen (TA, EC 2.6.1.x) gehören zur Enzymklasse 2, den Transferasen, welche die
Übertragung einer funktionellen Gruppe von einem Molekül auf ein anderes katalysieren. Im Fall
der Transaminasen wird eine Aminogruppe von einem Aminodonor auf den Carbonyl-Kohlenstoff
einer Ketogruppe übertragen. Der Aminodonor wird dadurch selbst zum Keton (Abb. 1.12). Da
Transaminasen im zentralen Stickstoffmetabolismus eine entscheidende Rolle spielen, sind sie in
fast allen Organismen zu finden – dies gilt zumindest für die sogenannten α-AminosäureTransaminasen, die α-Aminosäuren als Aminodonor nutzen. Dagegen sind Amin-Transaminasen
(ATA) eine seltenere Untergruppe, die nicht auf die Anwesenheit einer Carboxylgruppe
angewiesen sind.
26
1. Einleitung
NH2
R1
O
+
R2
R3
Aminodonor
O
ATA
R4
R1
NH2
+
R2
R3
R4
Aminoakzeptor
Abb. 1.12. Prinzip der Amin-Transaminase (ATA) -katalysierten reversiblen Enzym-Reaktion.
Für die Übertragung der Aminogruppe von einem Substrat auf das andere ist der Cofaktor
Pyridoxal-5‘-phosphat (PLP, Vitamin B6) notwendig, auf den die Aminogruppe vorübergehend
übertragen wird und der dabei zu Pyridoxaminphosphat wird. Das entstehende Ketoprodukt wird
freigesetzt und die Aminogruppe in einer zweiten Teilreaktion auf den Aminoakzeptor
übertragen [218]. Die Gesamtreaktion folgt einem Ping-Pong-Bi-Bi Mechanismus.
Die Gruppe der PLP-abhängigen Enzyme, zu denen auch Decarboxylasen, Racemasen, Lyasen und
Acyltransferasen zählen, wird in sieben verschiedene Faltungsklassen eingeteilt. Transaminasen
finden sich in zwei dieser Klassen, I und IV, wobei sie stets als Homodimer vorliegen, bei dem das
aktive Zentrum zwischen den beiden Monomeren liegt [219, 220].
Transaminasen können eingesetzt werden, um optisch reine Amine oder Aminosäuren
herzustellen. Dies kann entweder über eine kinetische Racematspaltung aus dem racemischen
Amin oder über eine asymmetrische Synthese aus einem prochiralen Keton erfolgen (Abb. 1.13).
Dabei sind durch dieselbe TA jeweils die entgegengesetzten Enantiomere zugänglich, also
beispielsweise das (S)-Enantiomer über die kinetische Racematspaltung und das (R)-Enantiomer
über die asymmetrische Synthese.
a)
NH2
R1
NH2
R2
R1
R2
Transaminase
+
+
NH2
O
O
R2
R1
NH2
COOH
R1
R2
COOH
b)
O
R1
NH2
Transaminase
R2
R1
NH2
R3
R4
R2
O
R3
R4
Abb. 1.13. Komplementäre Zugänge zu enantiomerenreinen Aminen mit Hilfe von Transaminasen.
a) kinetische Racematspaltung, b) asymmetrische Synthese (nach [221, 222]).
27
1. Einleitung
In einer asymmetrischen Synthese sind theoretisch Ausbeuten bis zu 100 % möglich;
Voraussetzung dafür ist allerdings, dass die Transaminase hochspezifisch ist und dass das
Gleichgewicht der Reaktion auf die richtige Seite verschoben wird. In der Regel wird dies durch
eine Entfernung oder ein Recycling des Keto-Nebenproduktes realisiert. Wenn die Reaktion mit
Alanin als Aminodonor abläuft und folglich Pyruvat als Nebenprodukt entsteht, kann man den
„PDC Trick“ anwenden, bei dem das Pyruvat mit einer Pyruvat-Decarboxylase zu Acetaldehyd und
CO2 umgesetzt wird, wobei das entstandene Gas aus dem Reaktionsgemisch entweicht. Dadurch
wird eine Komponente permanent aus einem möglichen Gleichgewicht entzogen, so dass die
Reaktion kontinuiertlich in Richtung einer verstärkten Produktbildung gelenkt wird (Abb. 1.14 a)
[223]. Ähnlich macht man sich die Flüchtigkeit eines entstehenden Produktes zunutze, wenn als
Aminodonor Isopropylamin eingesetzt werden kann: Das daraus gebildete Aceton kann durch
Anlegen eines leichten Vakuums entfernt werden – ein Weg, der allerdings ausgeschlossen ist,
wenn die anderen Reaktanden ebenfalls flüchtig sind (Abb. 1.14 b) [224]. Alternativ kann der
Aminodonor auch recycelt werden, beispielsweise mit Hilfe einer Aminosäure-Dehydrogenase,
was allerdings unter Verbrauch von NAD(P)H abläuft. Die Regenerierung dieses NicotinamidCofaktors erfordert den Einsatz eines dritten Enzyms, was den Reaktionsaufbau komplexer macht
(Abb. 1.14 c) [225]. Für eine kinetische Racematspaltung ist umgekehrt die Regenerierung des
Pyruvats vorteilhaft, was durch den Einsatz einer Aminosäure-Transaminase oder einer
Aminosäure-Oxidase verwirklicht werden kann (Abb 1.14 d) [226].
a)
O
R1
R2
R1
Ala
b)
NH2
ATA
O
R2
R1
Pyr
NH2
ATA
R2
R1
NH2
PDC
R2
O
CO2
Acetaldehyd
c)
O
R
1
R
2
R
Ala
d)
NH2
ATA
1
R
NH2
2
R1
R2
Pyr
R1
Pyr
AADH
R3
COOH
R2
NH2
+
R1
R2
Ala
NH2
NH4+
H2O
O
ATA
O
TA
R3
COOH
NAD(P)+ NAD(P)H
Abb. 1.14. Entfernung oder Recycling des Keto-Nebenproduktes in der kinetischen Racematspaltung oder
der asymmetrischen Synthese zur Herstellung optisch reiner Amine. ATA = Amin-Transaminase, PDC =
Pyruvat-Decarboxylase, AADH = Aminosäure-Dehydrogenase, TA = Aminosäure-Transaminase. Erläuterungen im Text [223-226].
28
1. Einleitung
Für die Identifizierung von neuen oder verbesserten Enzymen ist es nützlich, einen zuverlässigen
und sensitiven Hochdurchsatz-Assay zur Verfügung zu haben. In den letzten Jahren wurden
einige Assays veröffentlicht, die sich für die Detektion von Transaminasen eignen. Kim et al.
zeigten, dass sich die TA-Aktivität durch Reaktion der entstehenden Aminosäure mit
CuSO4/MeOH nachweisen lässt – ein Assay, der allerdings sehr störanfällig ist, nur als
Endpunktbestimmung geeignet ist und aufgereinigtes Enzym erfordert [227]. Besser geeignet ist
die Methode von Truppo et al. [225], bei der das entstandene Pyruvat von einer LactatDehydrogenase (LDH) zu Lactat umgewandelt wird. Diese Reduktion durch die LDH wird über
den Cofaktor an die Oxidation von Glucose durch eine Glucose-Dehydrogenase (GDH) gekoppelt.
Das entstehende Gluconolacton hydrolysiert zur Gluconsäure, deren Bildung über einen
pH-Indikator messbar ist. Die gleiche Gruppe um Turner veröffentlichte einen weiteren Assay, der
ebenfalls den zeitlichen Verlauf der TA-Reaktion erlaubt. Dabei wird die umgekehrte Reaktion
betrachtet und das aus Pyruvat gebildete Alanin detektiert, indem es von einer AminosäureOxidase oxidiert wird. Die Freisetzung des H2O2 wird mit einer Peroxidase und einer gekoppelten
Farbreaktion verfolgt [228].
In unserer Arbeitsgruppe wurde von Schätzle et al. eine Methode entwickelt, die den Verlauf der
Transaminase-Aktivität durch spektrophotometrische Detektion von Acetophenon ermöglicht.
Dabei wird α-Methylbenzylamin als Aminodonor eingesetzt, das zu dem bei 245 nm
absorbierenden Acetophenon reagiert [229]. Gegenüber den beiden Assays von Turner et al. hat
der Acetophenon-Assay den Vorteil, keine zusätzlichen Enzyme zu benötigen. Für die AktivitätsBestimmung von Transaminasen, die 2-Hydroxyketone umsetzen, wurde vor wenigen Monaten
ein Mikrotiterplatten-basierter Assay veröffentlicht. Die 2-Hydroxyketone reagieren mit
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TCC) unter Bildung eines roten Farbstoffes. Die durch eine
Transaminase erzeugten Amine reagieren nicht mehr mit dem TCC, so dass eine TA-Aktivität
anhand der Abnahme der Farbintensität verfolgt werden kann [230].
Ein innovativer Ansatz, um zu neuen Amin-Transaminasen (ATA) zu gelangen, wurde 2010 von
Höhne et al. veröffentlicht. Zuvor waren zwar eine Reihe von (S)-selektiven ATAs beschrieben,
allerdings keine (R)-ATAs. Da keine Kristallstruktur zur Verfügung stand, war die Änderung der
Enantiopräferenz durch rationales Design nicht möglich, so dass ein in silico-Ansatz entwickelt
wurde, um (R)-ATAs aus Gendatenbanken zugänglich zu machen. Durch Identifizierung der
Aminosäure-Schlüsselpositionen, die im aktiven Zentrum für die Ausbildung der
Enantioselektivität verantwortlich sind, gelang es einen Algorithmus zu entwickeln, über den
17 neue (R)-selektive Amin-Transaminasen gefunden, rekombinant exprimiert und charakterisiert
werden konnten [221].
29
2. Zielsetzung
2. ZIELSETZUNG
Der Metagenom-Ansatz hat sich in den vergangenen Jahren zu einem wertvollen Instrument
entwickelt, um Zugang zu neuen Biokatalysatoren zu erlangen. Die über diesen kultivierungsunabhängigen Weg identifizierten Enzyme tragen dazu bei, dass in der Industrie inzwischen in
immer größerem Umfang Biokatalysatoren in Syntheseschritten oder sogar in ganzen Syntheserouten eingesetzt werden, beispielsweise bei der Herstellung optisch reiner Feinchemikalien. In
vielen Fällen stellt die enzymatische Katalyse eine umweltschonende Alternative zu bestehenden
chemischen Verfahren dar. Auch wenn bereits zahlreiche Biokatalysatoren etabliert sind, so gibt
es doch Enzymklassen, in denen die bislang beschriebenen Enzyme die industriellen
Anforderungen bezüglich Aktivität, Stabilität und Selektivität häufig nicht erfüllen können. Neben
den Möglichkeiten, vorhandene Enzyme durch Mutagenese in ihren Eigenschaften zu verbessern,
stellt der Metagenom-Ansatz einen vielversprechenden Weg dar, dieses Spektrum durch das
Auffinden völlig neuer Biokatalysatoren zu erweitern.
Der Prozess des Screenings zur Identifizierung neuer Biokatalysatoren wird der Kern der
vorliegenden Arbeit sein. Dabei soll der Schwerpunkt auf oxidative Enzyme gelegt werden, die in
der Lage sind, diverse Substrate unter milden Reaktionsbedingungen durch Nutzung von
Sauerstoff als Oxidationsmittel zu oxidieren und damit eine Funktionalisierung dieser Verbindungen zu erreichen. Die klassischen Wege zum Auffinden neuer Enzyme bestehen aus einer
Anreicherungskultur oder dem Screening einer Stammsammlung. Diese Wege sollen hier zwar
auch begangen werden, der Fokus soll aber auf den Metagenom-Ansatz gelegt werden. Die
folgende Grafik verdeutlicht die wesentlichen Schritte zur Identifizierung neuer Biokatalysatoren
aus dem Metagenom:
Umweltprobe
Metagenomische
DNA
Metagenomische
Bibliothek
Neuer
Biokatalysator
Zu Beginn des Metagenom-Ansatzes steht die direkte Isolierung von DNA aus Umweltproben
ohne vorherige Kultivierungsschritte sowie deren Klonierung. Das Screening der erhaltenen
Bibliotheken soll mit Hilfe von Enzymassays im Mikrotiterplatten-Maßstab erfolgen. Dabei sollen
verschiedene Untergruppen von Monooxygenasen untersucht werden, wie Styrol-, P450- und
Baeyer-Villiger-Monooxygenasen. Des Weiteren soll ein Screening nach Oxidasen erfolgen. Für
einige dieser Enzymgruppen sind bislang nur wenige Vertreter bekannt, ein Zeichen dafür, dass
solche Enzyme nur selten vorkommen. Berücksichtigt man andererseits das sehr breite
Anwendungsspektrum insbesondere enantio- und regioselektiver Enzyme, ist es von großem
Interesse, neue oxidative Enzyme zu identifizieren und zu charakterisieren. Neben den oxidativen
Enzymen sollen die metagenomischen Bibliotheken auch auf Enzyme mit anderen Aktivitäten
untersucht werden, darunter Amin-Transaminasen und Hydrolasen.
30
3. Ergebnisse
3. ERGEBNISSE
3.1. Konstruktion metagenomischer Bibliotheken
3.1.1. Die Isolierung von DNA aus Umweltproben
Zu Beginn der Konstruktion metagenomischer Bibliotheken steht die Isolierung der DNA aus
Umweltproben. Seit der Etablierung des Metagenomansatzes wurden verschiedene Protokolle für
die DNA-Extraktion aus unterschiedlichsten Quellen entwickelt. Bei manchen Biotopen fällt dies
relativ leicht, bei anderen ist es eine große Herausforderung. Das Ziel ist stets die Isolierung
möglichst reiner und gleichzeitig hochmolekularer DNA, um molekularbiologische Folgeschritte
nicht durch co-extrahierte Stoffe zu inhibieren, und um eine möglichst geringe Fragmentierung
der Gene zu gewährleisten. Zur Isolierung von DNA aus Umweltproben gibt es zwei Herangehensweisen: die indirekte Methode, bei der die Zellen vor der Lyse aus der Matrix gelöst werden, und
die direkte Methode, bei der die Zellen in der Umweltprobe lysiert werden. Obwohl das
Artenspektrum, das mit beiden Methoden zu erfassen ist, laut einer Studie vergleichbar ist [46],
variiert die Menge und Qualität der DNA sehr stark. Da in einer vergleichenden Studie ermittelt
wurde, dass durch die direkte Methode etwa 100fach mehr DNA erhalten werden kann [231],
wurde dieser Weg für die vorliegende Arbeit gewählt.
Relativ reine DNA lässt sich beispielsweise aus wässrigen Proben erlangen. Hier macht sich
allerdings bemerkbar, dass der Anteil an Mikroorganismen und DNA pro Probenvolumen längst
nicht so hoch ist wie bei vielen anderen Umweltproben. Nach einigen Experimenten, in denen die
DNA aus Fluss- und Meerwasser extrahiert wurden, wurde dieses Biotop verworfen, da die
Quantität der DNA nicht ausreichend für Klonierungsexperimente war. Auf
Anreichungsexperimente wurde verzichtet, um eine möglichst unverfälschte Verteilung der DNA
der unterschiedlichen Organismen zu gewährleisten.
Umweltprobe
Metagenomische
DNA
Metagenomische
Bibliothek
Neuer
Biokatalysator
Für die vorliegende Arbeit wurden unterschiedliche Biotope gewählt, um ein breites Spektrum an
Mikroorganismen abzudecken. Es wurden Proben am Strand genommen, aus Kompost, aus
Waldboden und aus einem Spülschwamm. Der Strand stellt insbesondere in der tidalen Zone
durch die ständige Überspülung einen hochdynamischen Lebensraum dar, in dem eine Mischung
aquatischer und terrestrischer Organismen aufzufinden ist. Eine Besonderheit ist das Vorkommen
mikrobieller Matten, einer Form von Biofilmen aus einer komplexen Gemeinschaft
verschiedenster Organismen, die über extrazelluläre polymere Substanzen miteinander
31
3. Ergebnisse
verbunden sind. Häufig sind darin verschiedene Cyanobakterien vertreten, aber auch eine
Vielzahl anderer Mikroorganismen. Auch an den Stränden der deutschen Ostseeküste sind solche
mikrobiellen Matten beobachtet worden [232], die anhand einer dunklen Färbung des Sandes zu
erkennen sind. In der Literatur ist beschrieben, dass sich an Sand, der regelmäßig von Salzwasser
überflutet wird, DNA anhaften kann und sich anreichert [233]. Diese DNA kann recht einfach
extrahiert werden, indem sie nach einigen Waschschritten von den Sandkörnern gelöst wird. Es
wurden Bodenproben an zwei Stellen an der Ostsee am Greifswalder Bodden (Dänische Wieck
und Loissiner Strand) sowie eine Probe an der Nordsee in der Nähe von Bremerhaven genommen,
je aus dem Bereich, der regelmäßig überflutet wird. Die Ostsee-Proben wurden aus Bereichen
entnommen, an denen aufgrund der dunklen Farbe des Sandes auf eine hohe Zahl von
Mikroorganismen geschlossen wurde. Zur Einschätzung, ob in den Sandproben eine erhöhte
Konzentration an NaCl vorhanden sein muss, um DNA an den Sand zu immobilisieren, wurden
zwei weitere Umweltproben aus sandigen Stellen im Landesinnern genommen. Alle Proben
wurden mit Hochsalz-Puffer von Verunreinigungen befreit und die DNA mit TE-Puffer isoliert.
Abb. 3.1 zeigt eine solche DNA-Präparation des Strandsandes aus der Nähe von Greifswald. Aus
beiden Proben aus dem Landesinnern konnte keine DNA isoliert werden, dafür aber sowohl bei
der Nordsee- wie auch bei den Ostsee-Proben. Zur Anhaftung der DNA an den Sand scheint Salz
anwesend sein zu müssen, aber schon die Konzentration im Greifswalder Bodden (etwa 0,8 %)
reicht aus, um DNA auf den Sandkörnern zu immobilisieren.
M 1 2 3
10 kb
1 kb
Abb. 3.1. Agarosegel metagenomischer DNA aus Strandsand vom Greifswalder Bodden. M = 1kb DNAMarker, Spur 1, 2 und 3: metagenomische DNA aus drei Präparationen.
Der Kompost-Haufen stellt ein extrem interessantes Biotop dar. Durch die zahlreichen AbbauProzesse vielfältiger Ausgangsstoffe von Laub über Äste bis zu Küchenabfällen herrscht eine
enorme Biodiversität. Dazu kommen die Überreste von Insekten und anderen Tieren, die zur
Zersetzung der Ausgangsstoffe beigetragen haben. Zahlreiche Mikroorganismen konnten bereits
aus Kompost isoliert und ihre Enzyme als Biokatalysatoren eingesetzt werden (z. B. [234, 235]). Da
auch beim Kompost davon auszugehen ist, dass nur ein Bruchteil der Mikroorganismen über
klassische Anreicherungsexperimente zugänglich ist, wurde er hier in die Metagenom-Studie
miteinbezogen. Eine Probe wurde aus dem heimischen Gartenkompost aus einem Bereich
32
3. Ergebnisse
entnommen, der mittelmäßig gut zersetzt war. Neben Kompost wurden aus unterschiedlichen
Wäldern der Greifswalder Umgebung Bodenproben genommen und auf die gleiche Weise
aufgearbeitet.
Für die Isolierung von DNA aus Bodenproben gibt es in der Literatur zahlreiche Protokolle. Für die
vorliegende Arbeit wurden die beiden Protokolle von Yeates et al. [236] und von Zhou et al. [237]
für die DNA-Extraktion gewählt und die gewählten Umweltproben entsprechend der dort
beschriebenen Methoden aufgearbeitet. Diese sehen stets zunächst einen Schritt vor, in dem die
Bodenprobe aufgeschlossen wird. Dies geschieht in einem Puffer, der Proteinase K, RNase und
SDS enthält, gefolgt von einer klassischen Phenol-Chloroform-Extraktion. Die Herausforderung ist
es bei Bodenproben stets, die Co-Extraktion von störenden Huminstoffen zu umgehen oder diese
in einem späteren Reinigungsschritt abzutrennen. Bei Huminstoffen handelt es sich um eine
chemisch sehr diverse Gruppe hochmolekularer Verbindungen, die beim Abbau organischer
Substanzen entstehen [238]. Sie bestehen aus aromatischen, chinoiden und heterozyklischen
Ringen, die kondensiert oder durch Ether- oder Aliphatbrücken miteinander verbunden sind und
durch ihre Heterogenität schwer abzubauen sind. Sie weisen bezüglich ihrer Ladung und ihrer
molekularen Masse vergleichbare Eigenschaften auf wie DNA. Daher werden sie bei klassischen
Methoden der DNA-Extraktion zusammen mit der DNA aus der Probe isoliert und sind auch im
Nachhinein schwierig abzutrennen. Die isolierten DNA-Proben wiesen alle eine braune Färbung
auf, was auf die Anwesenheit von Huminstoffen in den Präparationen hindeutet. Diese hemmen
viele molekularbiologische Enzyme wie Restriktionsenzyme und müssen daher vor einer
Weiterverarbeitung der DNA abgetrennt werden [237, 239-241]. Eine Verbesserung der DNAQualität konnte erzielt werden, indem dem Aufschluss Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)
beigefügt wurde, das Verunreinigungen bindet, so dass diese nicht mit extrahiert werden. Die
dadurch erzielte Qualitätssteigerung der DNA war jedoch nicht ausreichend für Klonierungsexperimente, stets wurden durch Huminstoffe braungefärbte DNA-Präparationen erzielt. Daher
wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die co-extrahierten Verunreinigungen
abzutrennen, da diese die folgenden molekularbiologischen Experimente inhibieren.
Die untersuchten Feinreinigungsmethoden, die im Anschluss an die eigentliche Extraktion
durchgeführt wurden, umfassten: (1) eine Wiederholung der Chloroform-Extraktion, (2) die
Reinigung über Spin-Säulchen aus einem DNA-Aufreinigungs-Kit (DNeasy Blood & Tissue,
Qiagen), (3) die Auftrennung über ein Agarose-Gel mit niedrig schmelzender Agarose,
Ausschneiden der Fragmente und anschließendem Matrix-Verdau durch Agarase, (4) die
Auftrennung über ein Agarosegel, bis Huminstoffe (braun-gelbliche Färbung) von der DNA (im
UV-Licht sichtbar) getrennt sind, Ausschneiden eines Loches unterhalb der DNAWanderungsfront und Fortsetzen der Elektrophorese, so dass die DNA ist das Loch läuft, von dem
aus sie isoliert werden kann (nach [242], (5) die Amplifikation von DNA über eine Phi-Polymerase
(GenomiPhi-Kit), und (6) die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) während des anschließenden
Restriktionsverdaus. Eine Wiederholung der Chloroform-Extraktion brachte keine weitere
Verbesserung der DNA-Qualität. Eine sichtbare Qualitätssteigerung konnte jedoch durch die
Aufreinigung über Spin-Säulchen erzielt werden, wenn auch die DNA-Menge dadurch sank. Die
DNA war anschließend von brauner Farbe befreit und wies im Spektrophotometer einen
Absorptionsquotienten von A260 / A280 um 1,9 auf, was auf eine gute Reinheit hindeutet. Die
33
3. Ergebnisse
beiden Experimente, bei denen die Abtrennung der DNA von den Huminstoffen in einem
Agarosegel erfolgen sollte, lieferten nur eine sehr geringe (Experiment 3) oder gar keine
(Experiment 4) DNA-Ausbeute. Generell ist die DNA, die über Agarosegele aufgetrennt wurde,
auch nicht mehr für die Klonierung in größere Vektoren wie Cosmide geeignet, weshalb diese
Experimente nicht weiter optimiert wurden. Die Amplifikation der DNA durch die Phi-Polymerase
lieferte nur eine geringe Fragmentgröße, außerdem ist anzunehmen, dass es zu einer
ungleichmäßigen Anreicherung kommen könnte, weshalb auch diese Herangehensweise nicht
weiter untersucht wurde. Die Zugabe von BSA in den nachfolgenden Klonierungsschritten
(Experiment 6), stellte sich als sehr effektiv heraus. In der Literatur ist gezeigt worden, dass BSA an
Huminstoffe wie Huminsäure oder Fulvinsäure bindet [243], was hier genutzt werden konnte, um
deren inhibierenden Einfluss auf Restriktionsenzyme zu unterbinden. In parallelen Experimenten
mit und ohne Zusatz von BSA konnte die gleiche DNA-Probe mit der 100fach geringeren
Konzentration des Restriktionsenzyms Sau3AI verdaut werden, wenn während des Verdaus
10 mg/ml BSA zugesetzt wurden. Eine Inhibierung des Restriktionsenzyms durch die hohe BSAKonzentration (normalerweise wird bei einem Restriktionsverdau 0,1 mg/ml BSA zugesetzt)
wurde durch ein Kontrollexperiment ausgeschlossen.
Aufgrund der Untersuchungen zur Feinreinigung von DNA wurde für die Gewinnung von
möglichst reiner DNA aus Bodenproben während der Extraktion CTAB zugefügt, die DNA nach der
Extraktion über Spin-Säulchen aus einem DNA-Aufreinigungskit gegeben und in den
nachfolgenden molekularbiologischen Schritten 10 mg/ml BSA hinzugefügt, um den inhibierenden Einfluss von Huminstoffen zu minimieren. Abb. 3.2 zeigt zwei DNA-Präparationen aus
Kompost-Proben, wobei die DNA in Abb. 3.2 a nach Yeates [236] isoliert wurde. Es konnte zwar
hochmolekulare DNA extrahiert werden, die aber auch sehr stark fragmentiert war, so dass auch
viele Fragmente zu erkennen sind, die kleiner als 10 kb sind. Die Methode nach Zhou [237]
(Abb. 3.2 b) liefert einen größeren Anteil hochmolekularer DNA, weshalb diese Methode im
Folgenden eingesetzt wurde. Deutlich zu erkennen ist, dass die Qualität der DNA durch die
Feinreinigung (Abb. 3.2 b, Spur 4-5) steigt.
M
a)
1
1
2
3
4
5
M
b)
10
10
1 kb
1 kb
Abb. 3.2. Zwei DNA-Präparationen aus zwei Bodenproben aus Kompost. M = DNA-Marker a) DNAExtraktion nach Yeates et al. [236], b) Extraktion nach Zhou et al. [237]. Spur 1-3: DNA vor Feinreinigung,
Spur 4-5: DNA nach Feinreinigung.
34
3. Ergebnisse
Zum Anlegen von metagenomischen Bibliotheken stand darüber hinaus eine DNA-Präparation
aus einem Abluftfilter zur Verfügung, der regelmäßig mit Styrol-haltigen Verbindungen in Kontakt
gekommen war. Diese DNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Dr. D. Tischler (Universität
Freiberg) zur Verfügung gestellt. Die dunkle Farbe der Probe wies auch hier auf das
Vorhandensein von Huminstoffen hin (die Filteranlage bestand aus Rindenmulch-Materialien), so
dass sie vor den Klonierungsexperimenten den gleichen Feinreinigungsschritten unterzogen
wurde und anschließend eine farblose Präparation lieferte.
In einigen Bereichen stellen Küchen einen Ort großer mikrobieller Diversität dar. Insbesondere an
Spülschwämmen und Putztüchern kann durch die porösen Oberflächen und die
unterschiedlichen Substrate in Form von Speiseresten eine Vielfalt an Organismen vermutet
werden. Im Gegensatz zu Bodenproben ist es hier relativ einfach, saubere DNA zu extrahieren, da
keine Huminstoffe vorhanden sind. Ein Schwammtuch, das zuvor über einen Monat im Haushalt
für den Abwasch und die Reinigung der Küchenoberflächen genutzt worden war, diente als DNAQuelle. Nachdem es während des Gebrauchs regelmäßig ausgespült worden war, wurde es vor
der DNA-Extraktion für eine Woche feucht gehalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu
fördern, so dass sich ein schleimiger Biofilm bildete. Die Mikroorganismen und ihre DNA wurden
durch Waschschritte von der Schwammtuch-Matrix gelöst und durch eine ChloroformIsopropanol-Extraktion aus den Puffern extrahiert. Die isolierte DNA wies neben einer guten
Reinheit eine hochmolulare Fragmentgröße auf.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass durch Optimierung der Extraktionsmethoden aus
unterschiedlichen Biotopen metagenomische DNA isoliert werden konnte, die größtenteils eine
gute Reinheit und Fragmentgröße aufwies. Für die nachfolgenden Klonierungsexperimente stand
somit DNA aus Strandsand, Kompost und Waldboden, Abluftfilter und Spülschwamm zur
Verfügung.
3.1.2. Erstellung metagenomischer Bibliotheken
Zur Identifizierung von Enzymen aus der metagenomischen DNA gibt es prinzipiell drei Wege:
a) die komplette Sequenzierung aller DNA-Fragmente mit nachfolgender Annotierung und
Identifizierung Enzym-relevanter Genabschnitte, b) ein auf Homologie basierender PCR-Ansatz,
c) Klonierung der DNA und ein Funktions-basiertes Screening. Die Sequenz-basierten Methoden
a) und b) sind vor allem für phylogenetische und biogeochemische Untersuchungen interessant.
Für das Auffinden neuer Enzymaktivitäten ist dagegen der Aktivitäts-basierte Screening-Ansatz
besser geeignet. Zwar können auch über einen Sequenz-basierten Weg neue Enzyme gefunden
werden, aber nur solche mit einer hohen Homologie zu bekannten Proteinen. Völlig neue Enzyme
sind nur durch Detektion ihrer Aktivität zugänglich. Darüber hinaus stehen die so gefundenen
Gene nach einem Screening bereits in einem geeigneten Expressionssystem zur Verfügung, das
nur noch optimiert werden muss, während die funktionelle Expression von Genen, die mit Hilfe
von in silico-Methoden aufgefunden wurden, langwierig sein kann. Der folgende Abschnitt stellt
die Erstellung metagenomischer Bibliotheken aus der zuvor isolierten DNA dar, deren Klone
anschließend in einem Aktivitäts-basierten Screening durchmustert werden können.
35
3. Ergebnisse
Umweltprobe
Metagenomische
DNA
Metagenomische
Bibliothek
Neuer
Biokatalysator
Um die metagenomische DNA zu klonieren, muss sie zunächst fragmentiert werden, was mit zwei
verschiedenen Methoden erfolgen kann: einer mechanischen Scherung der DNA oder einer
enzymatischen Spaltung. Die mechanische Fragmentierung (z. B. mittels Ultraschall oder Glasperlen) hat den Vorteil, völlig zufällig zu sein, liefert aber unregelmäßige Enden, die mit einer
T4-Polymerase aufgefüllt werden müssen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein enzymatischer
Verdau durch Restriktionsenzyme gewählt, da auf diese Weise Fragmente entstehen, die für eine
direkte nachfolgende Klonierung geeignet sind, und da auf diese Weise die Fragmentgröße gut
einzustellen ist.
Die Wahl des Restriktionsenzyms und der angestrebten Fragmentgröße ist abhängig von der
Wahl des Vektors, mit dem die Bibliothek erstellt werden soll. Der ‘Klassiker‘ unter den
molekularbiologischen Transportvehikeln ist das Plasmid, das methodisch gut etabliert ist, aber
nur bis zu 10 kb große Fragmente aufnehmen kann. Da der Screening-Aufwand sinkt, je größer
die rekombinanten DNA pro Klon ist, ist es vorteilhaft, einen Vektor zu wählen, der größere
Fragmente aufnehmen kann wie das 25 – 40 kb-fassende Cosmid.
Cosmid-basierte Bibliotheken
Zum Anlegen Cosmid-basierter Bibliotheken muss die metagenomische DNA nur so stark
anfragmentiert werden, dass sie im Agarosegel eine leichte Bandenverbreiterung nach unten
aufweist. Man unterscheidet Restriktionsenzyme anhand der Länge ihrer Erkennungssequenz
zwischen 4-, 6- und 8-base cuttern. Aufgrund des statistischen Vorkommens der Schnittstellen
lässt sich die durchschnittliche Fragmentgröße errechnen, die bei einem vollständigen Verdau
entsteht. Diese liegt bei Sau3AI (einem 4-base cutter mit der Erkennungssequenz: ĻGATC) nur bei
44 bp (= 265 bp), die Fragmente wären bei einem vollständigen Verdau somit viel zu klein für eine
Klonierung. Dennoch ist ein Verdau mit Sau3AI als partieller Verdau sinnvoll und wird oft zum
Anlegen von (meta)genomischen Bibliotheken genutzt, da durch das häufige Vorkommen dieser
Schnittstelle eine Sammlung von Fragmenten entsteht, die nahezu zufällig geschnitten sind.
Für einen partiellen Verdau der metagenomischen DNA wurde diese in einem Vorversuch mit
graduell steigenden Sau3AI-Konzentrationen versetzt, um die optimalen Bedingungen zu
ermitteln. Die Inkubationszeit wurde dabei konstant bei 20 min gehalten. Für diese Experimente
wurde die DNA aus Schwammtuch, Abluftfilter und Kompost eingesetzt, während die Sand-DNA
durch die Präparation zu stark fragmentiert war und sich nicht für eine Klonierung in Cosmide
eignete.
36
Marker
unverdaute DNA
1:32000
1:16000
1:8000
1:4000
1:2000
1:1000
1:500
3. Ergebnisse
10 kb
1 kb
Abb. 3.3. Partieller Verdau der metagenomischen DNA aus Abluftfilter mit verschiedenen Konzentrationen
Sau3AI (1 : 500 bis 1 : 32.000) bei konstanter Inkubationszeit.
Abb. 3.3 zeigt einen partiellen Verdau der DNA aus Abluftfilter mit verschiedenen
Konzentrationen des Restriktionsenzyms. Dabei erkennt man eine Abnahme der Fragmentierung
mit steigender Verdünnung des Restriktionsenzyms (im Bild von links nach rechts). Für diese DNAPräparation ist eine Sau3AI-Verdünnung von 1 : 500 viel zu stark, die Verdünnungsstufe aber
1 : 32.000 noch nicht ausreichend, um die DNA in genügendem Maß zu verdauen. Es wurde für
dieses Experiment eine Verdünnung von 1 : 8.000 gewählt, da hier eine beginnende
Verbreiterung der größten DNA-Bande in Richtung Lauffront zu beobachten ist. Eine stärkere
Fragmentierung würde die Effizienz der Klonierung herabsetzen. Die in Abb. 3.3 gezeigte AbluftFilter-DNA wurden im großen Maßstab mit der ermittelten Sau3AI-Konzentration verdaut. Für die
anderen DNA-Präparationen wurde in der gleichen Weise die optimale Sau3AI-Konzentration
ermittelt. Im Anschluss an die Fragmentierung wurde die DNA durch Ethanol-Präzipitation
aufgereinigt.
Im Vergleich der DNA-Präparationen aus Abluftfilter und dem Schwammtuch wurde beobachtet,
dass sich bei gleicher DNA-Konzentration Schwammtuch-DNA bei etwa 10fach geringerer Sau3AIKonzentration gleich stark fragmentieren lässt wie die Abluftfilter-DNA. Dies kann dadurch erklärt
werden kann, dass nach wie vor einige Kontaminationen in der Abluft-Filter-DNA enthalten sind,
die das Restriktionsenzym hemmen. Bei allen Fragmentierungsexperimenten wurde 10 mg/ml
BSA zugesetzt, um diesen Effekt zu minimieren.
Als Cosmid wurde pWE15 gewählt, das mit BamHI linearisiert, dephosphoryliert und über eine
Säule gereinigt wurde. Für die Ligation wurden in parallelen Experimenten zwei verschiedene
molekulare Verhältnisse von DNA zu Cosmid eingesetzt (1 : 5 und 1 : 10) sowie eine Kontrolle
ohne Ligase; nachfolgend wurden die Ansätze über Nacht bei 14 °C inkubiert. Abb. 3.4 zeigt ein
Agarosegel eines Ligationsansatzes zwischen pWE15 und der metagenomischen DNA aus
Abluftfilter. Anders als bei Plasmiden werden bei der Ligation zwischen DNA und Cosmid keine
37
3. Ergebnisse
zirkulären Strukturen gebildet, sondern lineare Aneinanderlagerungen mehrerer Abfolgen von
Cosmid-DNA und Insert (sogenannte Concatemere). Diese lassen sich nicht über Transformation
in Zellen einbringen, sondern müssen in Phagen verpackt werden, mit denen die Wirtszellen
infiziert werden. Bei der Ligation sollen im Idealfall Fragmente von 45 - 52 kb Größe entstehen, in
denen die für die Verpackung notwendigen cos-sites (cohesive sites) vorhanden sind.
1
2
3
4
eDNA
10 kb
pWE15
1 kb
Abb. 3.4. Ligationsansätze zwischen pWE15 und partiell verdauter metagenomischer DNA aus Abluftfilter.
Spur 1: Marker, Spur 2: molekulares Verhältnis pWE15 : DNA 10 : 1, Spur 3: molekulares Verhältnis pWE15 :
DNA 5:1, Spur 4: Negativ-Kontrolle (Verhältnis pWE15 : DNA 10 : 1) ohne Ligase.
Die Ligationsprodukte wurden in Phagen verpackt und über Transfektion in frisch angesetzte
Phagen-kompetente E. coli VCS 257 -Zellen eingebracht. Dabei konnten aus den DNA-Präparationen aus den Proben, in denen Huminstoffe vorhanden sind (Kompost, Abluftfilter) trotz
zahlreicher Wiederholung und Variationen der Experimente keine rekombinanten Klone
gewonnen werden. Lediglich mit der DNA aus dem Schwammtuch ließ sich eine Cosmid-basierte
Bibliothek erstellen. Anhand eines Restriktionsverdaus von zehn Klonen wurde die Insertgröße auf
durchschnittlich 25 - 30 kb geschätzt; eine genaue Ermittlung der Insergröße über Kolonie-PCR ist
aufgrund der Fragmentgröße nicht möglich. Die auf diese Weise erstellte metagenomische
Bibliothek umfasste 483 Klone.
Plasmid-basierte Bibliotheken
Um eine größere Anzahl Klone für das Screening zur Verfügung zu haben und auch die Biotope
einbeziehen zu können, deren DNA sich nicht in Cosmide klonieren lassen, wurden Plasmidbasierte Bibliotheken angelegt. Für diese Bibliotheken wurden die DNA-Präparationen aus
Strandsand, Kompost, Waldboden und Abluftfilter genutzt.
Anders als bei normalen Klonierungsexperimenten ist es bei der Erstellung (meta)genomischer
Bibliotheken nicht möglich, die Vektoren durch die Wahl von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen so zu präparieren, dass eine Religation minimiert werden kann. Die DNA wird – sofern
sie nicht über mechanische Methoden fraktioniert und über blunt ends ligiert wird – mit einem
einzigen Enzym geschnitten, wodurch an beiden Seiten gleiche Schnittstellen entstehen und
38
3. Ergebnisse
auch das Plasmid nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden muss. Die Religation kann
zwar durch Dephosphorylierung des Plasmids reduziert, aber nicht für alle Moleküle verhindert
werden. Das von Dr. J. Altenbuchner (Universität Stuttgart) entwickelte Plasmid pJOE930 weist
eine Besonderheit auf, die es für die Konstruktion von Genbanken besonders geeignet macht: Es
besitzt zwei 337 bp lange palindromische Sequenzen, die durch eine nicht-palindromische
Sequenz von 124 bp unterbrochen sind [244]. Nach der Entfernung dieses mittleren Segmentes
ist eine Replikation des Plasmids nur dann möglich, wenn die Palindrome durch Ligation mit
fremder DNA (beispielsweise einem metagenomischen Fragment) räumlich voneinander
getrennt werden. Plasmide ohne Insert werden nicht vermehrt. Darüber hinaus enthält das
Plasmid zwei induzierbare lac-Promotoren, so dass das einklonierte Fragment in beide
Richtungen abgelesen werden kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit, ein funktionelles Enyzm zu
finden, verdoppelt wird im Vergleich zu herkömmlichen Plasmid-Vektoren.
Für die Konstruktion einer metagenomischen Plasmid-Bibliothek wurde das Plasmid pJOE930 mit
BamHI oder mit EcoRI linearisiert und damit die innere, nicht-palindromische Sequenz entfernt.
Um eine Religation mit diesem inneren Fragment zu verhindern, wurde dieses gleichzeitig mit
SacI geschnitten. Das Plasmid wurde anschließend dephosphoryliert und über ein Agarosegel
aufgereinigt. Die metagenomische DNA wurde für diese Experimente stärker fragmentiert als für
die Klonierung in Cosmide, da Plasmide maximal 10 kb aufnehmen. Am besten geeignet sind
Größen zwischen 3 und 8 kb. Es wurden zwei verschiedene Restriktionsenzyme für die Fragmentierung genutzt, um eine Gewichtung bezüglich des GC-Gehaltes zu verhindern (Schnittstelle
BamHI GĻGATCC, EcoRI: GĻAATCC). Die DNA-Präparationen aus Strandsand, Kompost, Waldboden
und Abluftfilter wurden je zum Teil mit BamHI und EcoRI verdaut und auf einem Agarosegel
aufgetrennt. Die Fragmente von etwa 5 - 8 kb wurden ausgeschnitten und aus dem Gel extrahiert.
Für die Ligation wurden unterschiedliche Konzentrationsverhältnisse von DNA zu Insert
eingesetzt, wobei die besten Ergebnisse mit einem Verhältnis von 3 : 1 von Insert zu Vektor erzielt
wurden. Im Anschluss an die Ligation wurden kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen mit dem
Ligationsprodukt transformiert.
Generell ist die Unterscheidung zwischen Religanden und Insert-tragenden Kolonien mit Hilfe des
Blau-Weiß-Screenings sehr nützlich, hat hier aber einen Nachteil: Die Bibliotheken sollen im
weiteren Verlauf auf Monooxygenase-Aktivität untersucht werden. Diese Monooxygenasen sind
teilweise in der Lage, das im Medium vorhandene Tryptophan zu Indigo umzuwandeln – auf den
Agarplatten nehmen sie dann eine blaue Farbe an. Die blau gefärbten Kolonien sind aber genau
diejenigen, die in einem Blau-Weiß-Screening verworfen werden. Aus diesem Grund wurde keine
Auswahl der Kolonien über das Blau-Weiß-Screening durchgeführt. Die Religationsrate wurde anhand einer Kolonien-PCR ermittelt und lag unter 50 Kolonien bei 12 %. Es wurden 1.993 Klone aus
Strandsand-DNA gewonnen, 613 aus Abluftfilter-DNA, 495 aus Kompost und 384 aus Waldboden,
also knapp 3.500 Klone, die in Mikrotiterplatten abgelegt wurden. Die durchschnittliche
Fragmentgröße wurde über Kolonie-PCR ermittelt und lag über alle Banken gemittelt bei 5,1 kb.
Die Konstruktion metagenomischer Bibliotheken ergab insgesamt 483 Cosmid-basierte und
knapp 3.500 Plasmid-basierte Klone. Darüber hinaus konnten für das Screening auf oxidative
Enzyme und Transaminasen eine Cosmid-basierte Bibliothek aus Biofilm-DNA genutzt werden,
die freundlicherweise von Prof. W. Streit (Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt wurde. In
39
3. Ergebnisse
dieser Bibliothek sind in den vergangenen Jahren durch Streit et al. bereits interessante
hydrolytische Enzyme isoliert worden [56, 245], auf oxidative Enzyme oder Transaminasen ist sie
aber noch nicht durchmustert worden. Darüber hinaus stand eine 550 Klone umfassende Cosmidbasierte Bibliothek aus humanem Zahnbelag von M. Kadow zu Verfügung, die sie im Rahmen
ihrer Diplomarbeit angelegt hat. Tabelle 3.1 fasst die Bibliotheken und die darin erfasste DNAMenge zusammen. Nach Abzug der 12 % Religanden in der Plasmid-Bibliothek liegen insgesamt
etwa 90.000 kb DNA vor.
Tab. 3.1. Überblick über die metagenomischen Bibliotheken, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit für
das Screening zur Verfügung standen, die durchschnittliche Fragmentgröße und die daraus berechnete
enthaltene DNA-Menge (hochgerechnet unter Abzug der Religanden in der Plasmid-basierten Bibliothek).
Biotop
Sand
Abluftfilter
Kompost
Waldboden
Schwammtuch
Biofilm* [56]
Zahnbelag*
Vektor
Zahl der
Kolonien
Cosmid
1.993
613
495
384
483
Cosmid
Cosmid
2.000
550
Plasmid
Durchschnittliche
Fragmentgröße
Nukleotide
5,1 kb
15.000 kb
25 kb
12.000 kb
25 kb
25 kb
50.000 kb
14.000 kb
∑ 91.000 kb
(*) über Kooperationspartner erhaltene Bibliotheken
3.2. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach oxidativen Enzymen
Umweltprobe
Metagenomische
DNA
Metagenomische
Bibliothek
Neuer
Biokatalysator
Die metagenomischen Bibliotheken sollten daraufhin untersucht werden, ob sich darunter Klone
befinden, die Monooxygenase- oder Oxidase-Aktivität aufweisen. Dazu wurde der Funktionsbasierte Ansatz gewählt, bei dem die Untersuchung der Klone anhand ihrer exprimierten
Enzymaktivität erfolgt und nicht anhand der DNA-Sequenz. Das bedeutet aber auch, dass jeder
einzelne Klon betrachtet werden muss, da in diesem Fall keine Möglichkeit einer Selektion
besteht. Eine schnelle Methode, die Aktivität einiger Monooxygenasen nachzuweisen, ist ein
Agarplatten-basierter Assay, der sich die Fähigkeit einiger Monooxygenasen zunutze macht, mit
40
3. Ergebnisse
Tryptophan zu reagieren, so dass sich mit Luftsauerstoff Indigo bildet und die Kolonien blau
werden (Abb. 3.5) [246].
COOH
NH2
N
H
OH
O2
MO
Trpase
N
H NAD(P)H NAD(P)+
+ O2
O
N
H
N
H
H
N
O
+ H 2O
Abb. 3.5. Reaktion von Tryptophan zum blauen Indigo, katalysiert durch Tryptophanase (Trpase) und
Monooxygenase (MO).
Auf diese Weise wurde bereits zuvor in der Literatur eine Styrol-Monooxygenase aus
metagenomischen Bibliotheken gefunden [82]. Die Reaktion läuft in Anwesenheit von Sauerstoff
innerhalb von 24 – 48 Stunden ab. Die metagenomischen Bibliotheken wurden alle daraufhin
untersucht, ob sie innerhalb von drei Tagen eine Farbveränderung aufweisen. Dies trat bei keiner
der Kolonien auf. Daher wurden andere Enzymassays zur Detektion herangezogen, die auf einer
Farbreaktion im Mikrotiterplatten-Maßstab basieren.
3.2.1 Screening nach Epoxidase-Aktivität
Für die Detektion von epoxidierenden Monooxygenasen sind in der Literatur zwei Assays
beschrieben, denen beiden die Reaktion von Styrol zu Styroloxid als Modellreaktion zugrunde
liegt. Diese wird von Styrol-Monooxygenasen, aber auch von einigen P450-Monooxygenasen
katalysiert. Der NBP (γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin) Assay wurde in der Gruppe von Prof. F. Arnold
entwickelt [247]. Der Assay ermöglicht die Detektion des enzymatisch gebildeten Styroloxids,
welches in der Wärme mit NBP unter Bildung eines blauen, photometrisch quantifizierbaren
Farbstoffes reagiert. Dabei agiert das freie Elektronenpaar von NBP als Nucleophil, das den
Epoxid-Ring des Styroloxids unter Bildung des Chromophors angreift (Abb 3.6 a). Der Farbstoff
wird durch Zugabe von DMF und K2CO3 stabilisiert.
In Abb. 3.6 b. ist gut zu erkennen, dass der Assay den Nachweis von Styroloxid ermöglicht und
eine Detektion der blauen Farbe mit bloßem Auge ab 0,2 mM zulässt, eine photometrische
Bestimmung sogar ab 0,05 – 0,1 mM, was mit den Werten aus der Literatur übereinstimmt [247].
Das Substrat Styrol und das Hydrolyseprodukt des Epoxids, Phenyl-1,2-ethandiol, reagieren nicht
mit den Assaykomponenten.
41
3. Ergebnisse
a)
O
HO
NBP
Monooxygenase
NO2
N
DMF, K2CO3
Negativkontrolle
1,0 mM Styrol
1,0 mM Styroloxid
0,8 mM Styroloxid
0,6 mM Styroloxid
0,4 mM Styroloxid
0,2 mM Styroloxid
0,1 mM Styroloxid
b)
Ethanol (Lösungsmittel)
+ H2O
1,0 mM Phenyl-1,2-ethandiol
NAD(P)H
+ O2
NAD(P)+
Abb. 3.6. a) Prinzip des NBP-Assays. Eine Monooxygenase oxidiert Styrol zu Styroloxid, welches durch
Reaktion mit NBP einen photometrisch detektierbaren Farbstoff liefert [247]; b) Detektion verschiedener
Konzentrationen von Styroloxid, Styrol und Phenyl-1,2-ethandiol mit dem NBP-Assay in einer Mikrotiterplatte.
Die Funktionalität des Assays unter Screening-Bedingungen wurde mit Hilfe einer PositivKontrolle untersucht. Hierfür wurden freundlicherweise die beiden Enzyme P450-BM3 aus Bacillus
megaterium [248] von Prof. V. Urlacher (Universität Düsseldorf) und StyAB aus Pseudomonas sp.
VLB 120 [249] von Prof. A. Schmid (Technische Universität Dortmund) zur Verfügung gestellt.
Diese wurden wie in der Literatur beschrieben exprimiert und ihr Rohextrakt zur Durchführung
des Assays eingesetzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass es für das Funktionieren des Assays von
entscheidender Bedeutung ist, keine Mikrotiterplatten aus Polystyrol einzusetzen, da das Produkt
mit dem Material wechselwirkt. Stattdessen wurden Glas-beschichtete MTP eingesetzt, eine
Alternative wären Platten aus Polypropylen.
Zur Modifikation des Assays wurde untersucht, wie die Assaykomponenten mit anderen Epoxiden
neben Styroloxid reagieren, insbesondere aliphatische, terminale Epoxide waren dabei von
Interesse. Abb. 3.7 zeigt, wie die potentiellen Produkte der Monooxygenase-Reaktionen
Styroloxid, Epoxyhexan, Epoxyoctan, Epoxydecan und 2,3-Epoxypropylbenzol in diesem Assay
reagieren. Allerdings sind die Oxidationsprodukte der linearen Alkene auch in der relativ hohen
Konzentration von 5 mM nur sehr schwach nachweisbar. Gut detektieren lässt sich neben
Styroloxid das um eine CH2-Gruppe verlängerte 2,3-Epoxypropylbenzol.
42
Negativkontrolle
Ethanol
Phenyl-1,2-ethandiol
Epoxypropylbenzol
Epoxydecan
Epoxyoctan
Epoxyhexan
Styroloxid
Styrol
3. Ergebnisse
Abb. 3.7. Untersuchung der Nachweisbarkeit unterschiedlicher Epoxide durch den NBP-Assay. Die
Konzentration aller Substrate betrug 5 mM.
Für das Screening der metagenomischen Bibliotheken wurde der Assay mit den beiden
Substraten Styrol und 3-Phenyl-1-propen durchgeführt. Die Proteine wurden in DeepwellMikrotiterplatten exprimiert und ihr Rohextrakt gewonnen. Um eine Limitation der Reaktion
durch einen vorzeitigen Verbrauch des Cofaktors auszuschließen, wurde ein Cofaktorregenerierungssystem aus Glucose-Dehydrogenase und Glucose eingesetzt und außerdem nach
vier Stunden noch einmal eine Mischung von NADH und NADPH zugegeben. Nach acht Stunden
erfolgte die Detektion des Produktes. Bei der Überführung der Rohextrakte in die Assayplatten
wurden je zwei Vertiefungen mit dem Rohextrakt einer Positiv-Kontrolle gefüllt. Diese färbten sich
auf allen Platten nach Zugabe der Nachweisreagenzien blau, so dass davon ausgegangen werden
kann, dass die Durchführung des Assays den Nachweis einer Monooxygenase-Aktivität zulässt. In
den metagenomischen Banken konnte jedoch keine Enzymaktivität nachgewiesen werden.
In der Literatur ist ein weiterer Assay beschrieben, mit Hilfe dessen sich die Aktivität von Epoxidbildenden Monooxygenasen nachweisen lässt. Es ist beschrieben, dass dieser die Nachteile des
zuvor beschriebenen NBP-Assays umgeht, da keine Heiz- und Kühlschritte erforderlich sind und er
zuverlässiger funktioniere. In diesem von Schwaneberg et al. entwickelten Assay reagiert ebenfalls
das durch die Monooxygenase gebildete Styroloxid mit einem Reagenz, hier dem Farbstoff
p-Nitrothiophenolat (pNTP) [250]. Das gelb gefärbte pNTP öffnet während der Reaktion den
Epoxidring nukleophil unter Bildung farbloser Produkte (Abb. 3.8 a). Die Anwesenheit von
Styroloxid lässt sich also durch eine eintretende Entfärbung nachweisen.
Aus Abb. 3.8 b ist zu erkennen, dass die Sensitivität des pNTP-Assays geringer ist als die des NBPAssays. Eine deutlich nachweisbare Entfärbung tritt erst bei Konzentrationen ab 0,5 mM ein, zuvor
liegt die Absorption über 2 und damit in einem Bereich, in dem sich Differenzen photometrisch
nur stark fehlerbehaftet ermitteln lassen, obwohl der Assay laut zugrundeliegender Publikation
auch in diesem Bereich aussagekräftig sein soll [250]. Ein Vorteil des Assays gegenüber dem NBPAssay ist, dass es sich nicht um eine Endpunkt-Bestimmung handelt - die Reaktion läuft auch nach
Zugabe des pNTP weiter. Allerdings tritt im Laufe der Zeit eine Entfärbung auch ohne
Vorhandensein eines Epoxides ein, so dass das Reagenz erst zum Ende hinzugefügt wurde.
43
3. Ergebnisse
O
a)
Monooxygenase
NAD(P)+
+ H2O
NAD(P)H
+ O2
O2N
HO
OH
NO2
1 mM Phenyl-1,2-ethandiol
1 mM Styrol
10 mM Styroloxid
S
8 mM Styroloxid
6 mM Styroloxid
4 mM Styroloxid
NO2 +
2 mM Styroloxid
1 mM Styroloxid
0,5 mM Styroloxid
0,1 mM Styroloxid
S
b)
S
Abb. 3.8. a) Prinzip des p-Nitrothiophenolat-Assays zur Detektion von Styroloxid, das durch eine
Monooxygenase gebildet wird, durch Reaktion mit dem gelben pNTP unter Bildung farbloser Produkte
[250]; b) Detektion verschiedener Konzentrationen von Styroloxid, Styrol und Phenyl-1,2-ethandiol mit dem
pNTP-Assay in einer Mikrotiterplatte.
Ähnlich wie für den NBP-Assay wurde auch für den pNTP-Assay untersucht, inwieweit sich andere
Epoxide als Styroloxid nachweisen lassen, wobei die gleichen Substrate eingesetzt wurden wie
zuvor. Auch hier konnten die aliphatischen terminalen Epoxide nicht nachgewiesen werden, sie
zeigen keine Entfärbung der Reaktionslösung (Abb. 3.9). In höheren Konzentrationen (5 mM) kann
2,3-Epoxypropylbenzol detektiert werden, allerdings ist die Sensitivität nicht so hoch wie im NBPAssay, so dass das Screening ausschließlich mit Styrol als Substrat durchgeführt wurde.
44
Negativkontrolle
Ethanol (LM)
Epoxypropylbenzol
Epoxydecan
Epoxyoctan
Epoxyhexan
Styroloxid
Styrol
3. Ergebnisse
5 mM
1 mM
Abb. 3.9. Untersuchung der Nachweisbarkeit unterschiedlicher Epoxide durch den pNTP-Assay. Die
Konzentration aller Substrate betrug 1 mM bzw. 5 mM.
Der pNTP-Assay weist zwar eine geringere Sensitivität auf als der NBP-Assay, dafür entfällt aber
der Heizschritt auf 80 °C für 30 min. Die metagenomische Bibliothek wurde daher auch mit
diesem Assay auf Styrol-Monooxygenase-Aktivität untersucht. Dazu wurden Zellrohextrakte aus
einer Kultivierung in Mikrotiterplatten gewonnen und für 24 Stunden unter Schütteln mit Styrol
inkubiert. Um eine Verdunstung zu vermeiden, aber den Gasaustausch zu ermöglichen, wurden
sie mit einer luftdurchlässigen Folie verschlossen. Anschließend erfolgte die Detektion des
gebildeten Styroloxids durch Zugabe von pNTP und die Bestimmung der Absorption bei 410 nm.
Als Positiv-Kontrollen wurden auf allen Platten in zwei Vertiefungen die Rohextrakte einer StyrolMonooxygenase (StyAB) gegeben, was zu einer Entfärbung der Mikrotiterplatte führte. Darüber
hinaus ließ sich bei keiner anderen Vertiefung eine Farbabnahme messen. Zusammenfassend
lässt sich festhalten, dass über die hier eingesetzten Enzymassays keine Styrol-MonooxygenaseAktivität in den untersuchten metagenomischen Bibliotheken detektiert werden konnte.
3.2.2. Screening nach hydroxylierenden Monooxygenasen
Während nur eine geringe Gruppe von Monooxygenasen Styrol oxidieren kann und die
Wahrscheinlichkeit, ein solches Enzym zu finden, relativ gering ist, handelt es sich bei
hydroxylierenden Monooxygenasen um eine weit verbreitete Enzymklasse. Für die Detektion
eines Enzymes, das eine subterminale Hydroxylierung einer Fettsäure oder eines Alkans
durchführt, wurde von Schwaneberg et al. ein Assay beschrieben, der sich im MikrotiterplattenFormat durchführen lässt. Das Alkan [248] oder die Fettsäure [251] wird für den Assay terminal mit
p-Nitrophenol verethert – hier wurde Octan gewählt. Wird es durch die Monooxygenase in der
direkten Nachbarschaft der Etherbindung hydroxyliert, bildet sich ein instabiles Halbacetal,
welches spontan zerfällt. Das dabei freigesetzte p-Nitrophenolat-Anion ist gelb und photometrisch bei 410 nm detektierbar (Abb. 3.10)
45
3. Ergebnisse
NO2
NO2
O
NO2
O
H
Monooxygenase
NAD(P)H
+ O2
O
+
NAD(P)
+ H2 O
HO
+
spontan
O
Abb. 3.10. Prinzip des p-Nitrophenoxyoctan-Assays, mit dem die Aktivität einer P450-Monooxygenase
detektiert wird. Die Hydroxylierung des p-Nitrophenoxyoctans in Nachbarschaft zur Etherbindung führt zur
Bildung eines instabilen Halbacetalts, das spontan zerfällt und das gelbe p-Nitrophenolat-Anion freisetzt
[248, 251].
Da das Substrat für diesen Assay nicht kommerziell verfügbar ist, wurde es nach dem Prinzip der
Williamsonschen Ethersynthese synthetisiert. Als Positivkontrolle für diesen Assay diente die
P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450-BM3), mit der der Assay erfolgreich
durchgeführt und eine gelbe Färbung des Reaktionsgemisches nachgewiesen werden konnte.
Dieser Assay wurde zunächst wie auch die beiden Assays auf Epoxidase-Aktivität mit
Zellrohextrakt durchgeführt. Hierzu wurde eine Reaktionszeit von 24 Stunden gewählt, um eine
möglichst hohe Produktbildung zu erzielen. Da auf diese Weise in keinem der metagenomischen
Klone eine reproduzierbare Aktivität nachgewiesen werden konnte, wurde der Assay modifiziert
und mit ganzen Zellen als Biotransformation durchgeführt. Auch diese Wiederholung führte
jedoch nicht zu einer Farbbildung durch einen der metagenomischen Klone, so dass in den
metagenomischen Bibliotheken keine Monooxygenase detektiert wurde, die die Hydroxylierung
des Modellsubstrates katalysiert.
3.2.3. Komplementierung der Oxygenase durch Zugabe einer Reduktase-Untereinheit
Für den Reaktionsmechanismus der P450-Monooxygenasen sind stets eine Oxygenase- und eine
Reduktase-Funktionalität erforderlich. Diese beiden katalytischen Zentren liegen oft auf
verschiedenen Polypeptidketten und sind nur selten fusioniert wie beispielsweise bei der P450Monooxygenase BM3. Die Reduktase-Untereinheiten weisen dabei oft eine hohe Homologie auf,
zumindest innerhalb der Monooxygenase-Gruppen.
Die Tatsache, dass viele Monooxygenasen auch fremde Reduktase-Untereinheiten nutzen
können, wurde - wie in der Einleitung beschrieben - in der Literatur bereits genutzt, um artifizielle
Fusionsproteine zu bilden. Die Bildung solcher Fusionsproteine muss allerdings auf Plasmidebene
angelegt werden. Bei (meta)genomischen Bibliotheken lassen sich solche Konstrukte aufgrund
der zufälligen Fragmentierung der DNA nicht gezielt bilden. Dennoch soll hier die
Wahrscheinlichkeit, eine Monooxygenase in metagenomischen Bibliotheken zu finden dadurch
erhöht werden, dass eine Reduktase zugefügt wird. Dazu wurde das Putidaredoxin-System der
46
3. Ergebnisse
P450cam aus Pseudomonas putida genutzt. Diese Monooxygenase besteht aus drei
Untereinheiten, einer P450-Oxygenase, einem Putidaredoxin (PdX) mit einem [Fe-S]-Cluster und
einer NADH-abhängigen FAD-haltigen Putidaredoxin-Reduktase (PdR). In der Literatur wurde
gezeigt, dass eine Komplementierung der Oxygenase-Untereinheit durch Zugabe der beiden
Reduktase-Komponenten sowohl in vivo wie auch in vitro möglich ist [124]. Die Gene für diese
Monooxygenase wurden freundlicherweise von Prof. V. Urlacher (Universität Düsseldorf) zur
Verfügung gestellt und lagen in einem pET28a(+)-Vektor vor. Die Expression der ReduktaseUntereinheiten erfolgte in E. coli BL21 (DE3) durch Induktion mit IPTG. Die durch Lyse der Zellen
gewonnenen Zellrohextrakte wurden anschließend im Screening nach hydroxylierenden
Monooxygenasen zu den metagenomischen Zellrohextrakten hinzugefügt. Für die Durchmusterung der Klone wurde der p-Nitrophenoxyoctan-Assay genutzt und die Farbentwicklung
nach einer Inkubationszeit von 24 h durch Messung der Absorption bei 410 nm untersucht. Auch
durch Zugabe der Reduktase-Untereinheiten ließ sich aber in keinem der Klone eine
Farbentwicklung und damit keine Aktivität einer Monooxygenase in einem der
metagenomischen Klone nachweisen.
3.2.4. Screening nach Baeyer-Villiger-Monooxygenase Aktivität
Neben Styrol-Monooxygenasen und P450-Monooxygenasen stellen Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) die dritte hier untersuchte Klasse oxidativer Enzyme dar. Innerhalb der
BVMOs, die bevorzugt Arylketone umsetzen, gibt es bislang nur wenige beschriebene Enzyme,
weshalb es von großem Interesse ist, nach weiteren Vertretern zu screenen. Ein gut geeignetes
Substrat für diese Suche ist 4-Hydroxyacetophenon (HAP), das bevorzugte Substrat der
4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenasen (HAPMO). Das bei der Oxidation von HAP durch die
BVMO gebildete Hydrochinonmonoacetat ist braun gefärbt (Abb. 3.11), eine Tatsache, die für
einen qualitativen Nachweis von HAPMO-Aktivität auf Agarplatten genutzt werden kann. Liegt
eine aktive BVMO vor, die HAP als Substrat akzeptiert, färbt sich die Kolonie innerhalb von 24 - 48
Stunden nach Überimpfen braun. Als Positiv-Kontrolle dient hier die HAPMO aus Pseudomonas
putida JD1, die in unserem Arbeitskreis kloniert wurde [86].
O
O
HAPMO
HO
HO
NADPH
+ O2
O
NADP+
+ H2 O
Abb. 3.11. Reaktionsprinzip des Agarplatten-Assays zum Nachweis von HAPMO-Aktivität: Oxidation von
4-Hydroxyacetophenon zu Hydrochinonmonoacetat durch die HAPMO.
Zum Auffinden von neuartigen BVMOs, die HAP als Substrat akzeptieren, wurden Agarplatten mit
dem jeweiligen Induktor sowie 0,3 mM 4-Hydroxyacetophenon als Substrat hergestellt und die
metagenomischen Klone darauf überstempelt. Nach einer Inkubationszeit über Nacht bei
47
3. Ergebnisse
Raumtemperatur waren alle Kolonien gut angewachsen. Um die Kolonien der HAPMO aus
P. putida herum war eine leichte braune Färbung zu erkennen. Die Inkubation der Platten wurde
für drei Tage fortgesetzt. Im Verlauf dieser Zeit vertiefte sich die braune Farbe der PositivKontrolle. Außer dieser konnte keine Farbveränderung von Kolonien beobachtet werden.
Der Nachweis der braunen Farbe, die durch die Bildung von Hydrochinonmonoacetat aus HAP
durch eine HAPMO erzeugt wird, ist auf den Agarplatten nur schwer zu quantifizieren. Zwar ist
diese Färbung bei der Positiv-Kontrolle stets deutlich sichtbar, es ist aber möglich, dass ein
schwach aktives Enzym bei dieser Art des Screenings nicht detektiert werden kann. Daher wurde
ein weiterer Enzym-Assay für das Screening nach HAPMOs herangezogen. Ein dem HAP sehr
ähnliches Substrat ist 4-Nitroacetophenon (NAP), das ebenfalls von der HAPMO umgesetzt wird
und dabei zu 4-Nitrophenylacetat oxidiert wird. Koppelt man die Reaktion der Monooxygenase
mit der einer Lipase wie der Candida antarctica Lipase B (CAL-B), so entsteht ein photometrisch
detektierbares, gelbes Produkt, das p-Nitrophenolat-Anion (Abb. 3.12) [173], ein Assay, der bei uns
im Arbeitskreis etabliert wurde. Es muss allerdings berücksichtigt werden, dass die katalytische
Effizienz der HAPMO aus P. putida JD1 gegenüber NAP nur etwa 3 % beträgt im Vergleich zum
präferierten Substrat HAP, was auf die unterschiedliche Verteilung der Elektronendichte
zurückzuführen ist [86] und angenommen werden kann, dass eine solche Verringerung der
Enzymaktivität auch bei potentiellen neuen Enzymen vorliegt. Dennoch lassen sich mit diesem
Assay Enzymaktivitäten eindeutig nachweisen, weshalb er für das Screening nach HAPMOs
herangezogen wurde.
O
O
BVMO
O2N
NADPH
+ O2
NADP+
+ H2O
O2N
O
CAL-B
O
O 2N
Essigsäure
Abb. 3.12. Reaktionsgleichung 4-Nitroacetophenon-Assays. Das Oxidationsprodukt der Baeyer-VilligerMonooxygenase (BVMO) wird durch die Lipase Candida antarctica-Lipase B (CAL-B) gespalten, so dass das
gelbe 4-Nitrophenolat-Anion entsteht [173].
Der Assay wurde auf zwei verschiedene Weisen durchgeführt. Die metagenomischen Banken
wurden jedes Mal in Deepwell-Mikrotiterplatten angezogen und exprimiert. In einer Variante
wurden daraus die Zellrohextrakte gewonnen, die zusammen mit einem CofaktorRecyclingsystem aus Glucose-Dehydrogenase und Glucose in dem Assay eingesetzt wurden. Als
Positiv-Kontrolle diente wiederum die HAPMO aus Pseudomonas putida JD1, die je in zwei
Vertiefungen pro MTP exprimiert wurde. Im Screening wurde eine Substratkonzentration von
1 mM gewählt.
Da auf diese Weise abgesehen von der Positiv-Kontrolle keine aktiven BVMOs detektiert werden
konnten, wurde der Assay mit einem Ganzzellsystem wiederholt, da viele Enzyme in der zellulären
Umgebung stabiler sind. Die ruhenden Zellen wurden mit dem Substrat versetzt und für
24 Stunden inkubiert. Anschließend wurde zur Spaltung der Ester-Bindung CAL-B hinzugefügt,
48
3. Ergebnisse
wodurch eine gelbe Färbung der Positiv-Kontrolle sichtbar wurde. Für insgesamt 27 der
metagenomischen Klone ließ sich im ersten Screening-Durchlauf eine erhöhte Absorption
feststellen. Diese Kolonien wurden auf einer neuen Mikrotiterplatte vereinigt und erneut
gescreent. In der Wiederholung war keines der anscheinend positiven Ergebnisse zu
reproduzieren, so dass die erhöhten Messwerte aus dem ersten Screening auf
Messungenauigkeiten zurückgeführt wurden.
3.2.5. Screening nach Oxidase-Aktivität
Neben Monooxygenasen handelt es sich bei Oxidasen um eine weitere Klasse oxidativer Enzyme,
die insbesondere für industrielle Anwendungen interessant sind. Oxidasen können sehr
unterschiedliche Substrate umsetzen, so dass ein Screening sehr breit angelegt sein sollte. Aus
der Literatur stehen einige Screening-Methoden für den Hochdurchsatz zur Verfügung, die alle
auf der Detektion des bei der Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids beruhen. Am
zuverlässigsten erwies sich die Reaktion mit Chromotropsäure und 4-Aminoantipyrin in
Gegenwart einer Peroxidase zu einem spektrophotometrisch detektierbaren blauen Farbstoff
(Abb. 3.13) [216, 252].
CH2 OH
O
CH2OH
O
OH
Glucose Oxidase
OH
OH
O
OH
OH
OH
Glucose
OH
H2O
H2O2
4-Aminoantipyrin
+ Chromotropsäure
Gluconolacton
Peroxidase
Blauer Farbkomplex
Abb. 3.13. Prinzip des Oxidase-Assays am Beispiel einer Glucose-Oxidase. Bei der Reaktion der Oxidase
entsteht Wasserstoffperoxid, das durch die Reaktion einer Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und
Chromotropsäure zu einem blauen Farbkomplex reagiert [216, 252].
Der Assay war für die Reaktion der Oxidase mit einem einzigen Substrat (Sorbitol) beschrieben
[252] und es wurde in einem Vorversuch untersucht, ob der Assay auf andere Oxidase-Substrate
erweitert werden kann. Dazu wurde eine breite Palette an Substraten gewählt, die viele Typen
von Oxidasen abdecken sollen, so dass möglichst alle parallel innerhalb eines Screenings erfasst
werden. Es wurden eine Reihe von hydroxylierten Substraten und Polyolen gewählt, drei
Aminosäuren je mit beiden Enantiomeren (D,L-Lysin als basische, D,L-Alanin als unpolare,
hydrophobe und D,L-Aspartat als saure Aminosäure), ein aliphatischer und ein aromatischer
Aldehyd sowie ein Amin – insgesamt also 12 Substrate (Abb. 3.14).
49
3. Ergebnisse
H
HO
H
H
CHO
OH
H
OH
OH
CH2OH
H
HO
H
H
D-Glucose
CH2OH
OH
H
OH
OH
CH2OH
D-Sorbitol
H
H
H
H
OH
OH
OH
HO
Ethanol
Glycerol
O
1-Hexanol
COOH
CH3
H2 N
1,2-Phenylethandiol
O
CH3
Acetaldehyd
H2N
H2 N
CH2OH
H
H
HO
OH
H
Benzaldehyd
COOH
NH2
COOH
COOH
NH2
D,L-Alanin
D,L-Asparatat
D,L-Lysin
2-Phenylethylamin
Abb. 3.14. Substrate, die im Screening nach Oxidasen eingesetzt wurden.
Die in Abb. 3.14 gezeigten Substrate wurden zu je 50 mM (von jedem Enantiomer) in einer
einzigen komplexen Oxidase-Substratlösung angesetzt, mit 0,16 mM Hydroxylamin als KatalaseInhibitor versetzt und der Assay mit einer Sorbitol-Oxidase aus dem Arbeitskreis [252] als PositivKontrolle durchgeführt. Dazu wurde diese in einer Deepwell-Mikrotiterplatte in E. coli BL21 (DE3)
exprimiert, aufgeschlossen und das Zellrohextrakt entweder mit 50 mM Sorbitol oder mit 50 mM
der komplexen Substratlösung versetzt. Die Detektion des gebildeten Wasserstoffperoxids
erfolgte nach Zugabe von Peroxidreagenz aus Chromotropsäure und 4-Aminoantipyrin und
Peroxidase aus Meerrettich durch die Messung der Absorption bei 600 nm. Es wurde beobachtet,
dass der Assay auch beim parallelen Einsatz der vielen Substrate nicht gestört wurde, und in allen
Mikrotiterplatten-Vertiefungen, in denen die Positiv-Kontrolle vorlag, eine blauen Verfärbung
detektiert werden konnte.
Die zweite Modifikation, die an dem Assay durchgeführt wurde, betraf die Inkubationszeit. Der
Assay war zuvor auf hochaktive Enzyme ausgelegt, wobei die Inkubationszeit 5 min betrug. Da die
metagenomischen Klone aber nicht in einem optimierten Expressionssystem vorliegen, kann
angenommen werden, dass viele von ihnen nur eine geringe Aktivität aufweisen. Daher wurde
die Inkubationszeit des Assays verlängert, um die Produktbildung zu verstärken. Die Aktivität der
Positiv-Kontrolle ließ sich auch nach drei Stunden Inkubationszeit noch unvermindert
nachweisen. Nach einer längeren Inkubationszeit jedoch sank die detektierte Aktivität, und es
50
3. Ergebnisse
wurde außerdem das Einsetzen einer braunen Verfärbung beobachtet, so dass der Assay im
Folgenden mit einer Inkubationszeit von drei Stunden durchgeführt wurde.
Die dritte Modifikation des Assays betraf den pH-Wert. Der bislang etablierte Assay wurde bei
einem pH-Wert von 10 durchgeführt. Unter den bislang beschriebenen Oxidasen gibt es aber
auch viele, deren pH-Optimum im neutralen Bereich liegt. Daher wurde der Assay modifiziert und
bei einem pH-Wert von 7 wiederholt. Die kommerziell erhältliche Glucose-Oxidase aus Aspergillus
niger, deren pH-Optimum im neutralen bis leicht sauren pH-Bereich liegt, diente für diese
Experimente als Positiv-Kontrolle. Der Assay ließ sich auf diese Weise ebenso durchführen.
Während des folgenden Screenings wurden parallel beide pH-Werte untersucht.
Für die Durchmusterung der metagenomischen Bibliotheken auf Oxidase-Aktivität wurden die
6.500 Klone der metagenomischen Bibliotheken für 24 Stunden in Deepwell-Mikrotiterplatten
exprimiert, wobei auf jeder Platte zwei Vertiefungen mit der Positiv-Kontrolle beimpft wurden.
Die parallele Expression der Positiv-Kontrolle stellte sicher, dass Expressions- und Aufschlussbedingungen geeignet sind, Oxidase-Aktivität zu detektieren. Wie bei der Expression aller
oxidativen Enzyme wurde auf eine gute Durchlüftung durch eine geringe Befüllung der Platten
(800 μl pro Vertiefung) bei einer hohen Schüttelgeschwindigkeit (1000 rpm) während der
Expression geachtet. Die Luftzirkulation wurde durch Abkleben der Platten mit luftdurchlässigen
Folien gewährleistet. Im Anschluss an die Expression wurden die Zellen gewaschen,
aufgeschlossen und ihr Rohextrakt in einer flachen Mikrotiterplatte mit der komplexen
Substratlösung versetzt. Nach einer dreistündigen Inkubationszeit erfolgte die Detektion des
Wasserstoffperoxids durch Zugabe von Peroxid-Reagenz und Peroxidase und Messung der
Absorption bei 600 nm. Abb. 3.15 zeigt eine solche Screening-Platte, auf der die Aktivität der zwei
Positiv-Kontrollen gut zu erkennen ist. Neben diesen Positiv-Kontrollen konnte in keiner der
Vertiefungen eine Blau-Färbung beobachtet werden.
Abb. 3.15 . Assayplatte aus dem Oxidase-Screen der Metagenombanken. In zwei der Wells (A1 und G11)
wurde das Rohextrakt der Sorbitol-Oxidase als Positiv-Kontrolle eingesetzt, deren Aktivität gut sichtbar ist.
51
3. Ergebnisse
3.3. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach nicht-oxidativen
Enzymen
3.3.1. Screening nach Amin-Transaminasen
Neben Monooxygenasen stellen Transaminasen eine Enzymklasse von aufstrebender Bedeutung
für die Biokatalyse dar. Zwar sind bereits einige Enzyme beschrieben, eine Erweiterung der
Toolbox ist aber nach wie vor interessant. Für das Screening im mittleren oder hohen Durchsatz
stehen aus der Literatur verschiedene Enzym-Assays zur Verfügung, mit deren Hilfe die
metagenomischen Bibliotheken durchmustert wurden. Bislang ist kein Assay beschrieben, der
eine Detektion von Enzymaktivität auf Agarplatten erlaubt, daher wurde ein Mikrotierplattenbasiertes Screening durchgeführt.
O
R1
NH2
R2
R1
Transaminase
+
NH2
R2
+
O
Abb. 3.16. Reaktion, die dem Acetophenon-Assay zur Detektion von Transaminase-Aktivität zugrunde liegt.
Die Transaminase setzt α-Methylbenzylamin zu Acetophenon um, dessen Bildung spektrophotometrisch
bei 245 nm verfolgt werden kann [229].
Der Acetaldehyd-Assay (Abb. 3.16) [229] ermöglicht die Detektion von Amin-TransaminaseAktivität von Enzymen, die α-Methylbenzylamin (α-MBA) als Aminodonor akzeptieren. Dieses wird
durch die Transaminase zu Acetophenon umgewandelt, dessen Bildung oder Abnahme
spektrophotometrisch bei 245 nm verfolgt werden kann. Die Aminoakzeptoren müssen so
gewählt werden, dass sie nicht bei dieser Wellenlänge absorbieren. Der Assay ermöglicht zwar
auch die Bestimmung der Enantioselektivität von Transaminasen, indem nur eines der
Enantiomere von α-MBA eingesetzt wird, hier aber wurde das Racemat eingesetzt, um sowohl
(R)- als auch (S)-spezifische Enzyme detektieren zu können.
Der Acetophenon-Assay wurde eingesetzt, um die metagenomischen Bibliotheken auf die
Anwesenheit von Amin-Transaminasen hin zu untersuchen. Als Positiv-Kontrollen wurden drei
Enzyme eingesetzt, die im Arbeitskreis kloniert worden waren und unter denen sich sowohl
(R)- als auch (S)-spezifische Enzyme befinden. Dazu wurden die Transaminasen aus Gibberella
zeae, Vibrio fluvialis und Silicibacter pomeroyi gewählt, die rekombinant in E. coli BL21 vorlagen.
Um eine möglichst hohe Proteinkonzentration vorliegen zu haben, wurden die
metagenomischen Bibliotheken in Deepwell-Mikrotiterplatten exprimiert. Nach der Induktion
wurde die Expression für 18 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und
in PLP-haltigem Puffer aufgeschossen. Für den Acetophenon-Assay wurden je 2,5 mM α-MBA und
52
3. Ergebnisse
Aminoakzeptor eingesetzt. Der Einsatz von Rohextrakt ist dadurch limitiert, dass die darin
enthaltenen Proteine bei einer Wellenlänge von 245 nm ebenfalls absorbieren und den Assay
stören. Unter den gewählten Kultivierungsbedingungen wurden 50 μl Rohextrakt auf 200 μl
Reaktionsvolumen als maximal mögliches Volumen ermittelt, damit die Start-Absorption 0,5 nicht
übersteigt. Da hier sowohl (R)- als auch (S)-spezifische Enzyme detektiert werden sollten, wurde
als Aminodonor racemisches α-MBA eingesetzt.
Die metagenomischen Bibliotheken wurden exprimiert und auf die beschriebene Weise auf AminTransaminase-Aktivität untersucht. In zahlreichen Vertiefungen konnte bei einem einmaligen
Durchlauf eine Steigerung der Absorption bei 245 nm detektiert werden. Da es so viele waren,
dass von einer Transaminase-Aktivität ausgegangen werden kann, wurde der Assay dreifach
wiederholt. Im Mittelwert der Messwerte war bei keinem der untersuchten Kolonien eine
Absorptionssteigerung zu verzeichnen.
3.3.2. Screening der metagenomischen Bibliotheken nach Hydrolasen
Mit den gewählten Methoden konnte in den metagenomischen Bibliotheken, die im Rahmen
dieser Studie untersucht wurden, keine Aktivität von Monooxygenasen und Transaminasen
nachgewiesen werden. In der Literatur ist die Suche hydrolytischer Enzyme in metagenomischen
Bibliotheken in einer Reihe von Untersuchungen beschrieben und die Wahrscheinlichkeit,
Hydrolasen zu detektieren, wird höher eingeschätzt. Dies ist unter anderem darauf
zurückzuführen, dass Hydrolasen häufig vorkommen, sich oft gut exprimieren lassen und keine
Cofaktoren benötigen. Außerdem stehen eine Reihe von zuverlässigen Hochdurchsatz-Assays zur
Verfügung stehen, die schnell durchzuführen sind und eine gute Sensitivität aufweisen. Hier
wurden exemplarisch Esterasen, Proteasen und Phosphatasen gewählt, um zu untersuchen, ob
die angelegten metagenomischen Bibliotheken das Auffinden neuer Enzyme überhaupt
ermöglichen. Die folgenden Experimente wurden nur mit den im Rahmen dieser Studie
angelegten metagenomischen Bibliotheken durchgeführt und nicht mit denen aus Biofilm-DNA,
da diese bereits zuvor auf Hydrolasen untersucht worden waren [245].
Screening nach Esterase-Aktivität
Die Aktivität von Esterasen und Lipasen lässt sich unter anderem mit Hilfe eines AgarplattenAssays schnell und zuverlässig nachweisen, sofern das Substrat akzeptiert wird. Die Reaktion
basiert auf der Enzym-katalysierten Spaltung von α-Naphthylacetat und anschließender Reaktion
mit FastRed [253]. Substrat und Nachweisreagenz werden in Form eines Überschicht-Agars auf
die Platten aufgebracht.
Zum Screening auf Esterase-Aktivität wurden die metagenomischen Bibliotheken auf Agarplatten
mit Induktor überimpft und über Nacht bei Raumtemperatur anwachsen gelassen. Bei allen
Screenings, die auf Agarplatten basieren, wurde das Wachstum der Zellen bei Raumtemperatur
statt bei der für E. coli optimalen Temperatur von 37 °C gewählt, um die Bildung von inclusion
bodies in den Zellen zu reduzieren. Als Positiv-Kontrolle wurde die Esterase aus Pseudomonas
fluorescens (PFE) mit auf den Platten aufgetragen. Am nächsten Morgen wurden sie mit einem
53
3. Ergebnisse
Überschicht-Agar aus 0,5 % Agar, 80 mg/ml FastRed und 40 mg/ml α-Naphthylacetat übergossen.
Bei der PFE konnte innerhalb von einigen Minuten eine rotbraune Färbung der Kolonie
beobachtet werden. Neben diesem Enzym färbten sich aus den metagenomischen Kolonien zwei
Klone kräftig rot, was auf eine Esterase-Aktivität hindeutet.
Screening nach Protease-Aktivität
Der Nachweis von Proteasen kann ebenfalls auf Agarplatten erfolgen. Man macht sich dabei die
Tatsache zunutze, dass die Zugabe von Milchpulver in Agarplatten eine Trübung der Platten
bewirkt [254, 255]. Erfolgt eine enzymatische Spaltung des Proteins durch eine Protease, so
kommt es zu einer Klärung. Kolonien, die eine Protease-Aktivität aufweisen, können daran
erkannt werden, dass sie klare Höfe auf den trüben Platten bilden. Der Assay wurde mit der
Proteinase K aus Tritirachium alba als Positiv-Kontrolle getestet. Zum Screening der
metagenomischen Bibliotheken wurden Agarplatten mit Milchpulver und Induktor angesetzt, auf
die die Bibliotheken überimpft wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur
wurde um die Positiv-Kontrolle herum die Bildung eines klaren Hofes festgestellt. Bei keinem der
metagenomischen Klone kam es auch nach einer Inkubationszeit von fünf Tagen zu einer
vergleichbaren Hof-Bildung.
Screening nach Phosphatase-Aktivität
Die Aktivität von alkalischen Phosphatasen lässt sich auf Agar-Platten durch Zugabe von
X-Phosphat (5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat, BCIP) nachweisen [256]. Wird dieses durch eine
Phosphatase gespalten, entsteht Indoxyl, das durch Dimerierung zum blauen Indigo umgesetzt
wird. Die gleiche Reaktion wird auch bei der Detektion von Phosphatase-Aktivität während des
Immuno-Blottings eingesetzt. Für das Screening wurden Agarplatten nach dem Autoklavieren mit
2 % X-Phosphat versetzt. Nach dem Erkalten wurden die metagenomischen Klone darauf
überimpft und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden konnte
bei einigen Kolonien eine dunkle Blaufärbung beobachtet werden, bei anderen eine schwache
(Abb. 3.17). Wie aus der Abbildung, die zwei Tage nach Inokulation aufgenommen wurde, zu
erkennen ist, weisen alle Kolonien nach dieser Zeit eine schwache Blaufärbung auf, bei einigen ist
diese aber sehr viel intensiver. Insgesamt konnten bei drei Kolonien eine dunkelblaue, bei sieben
weiteren eine schwache Blaufärbung reproduzierbar nachgewiesen werden.
54
3. Ergebnisse
Abb. 3.17. Zwei Agarplatten, die mit Induktor und 2 % X-Phosphat versetzt sind und mit Kolonien aus den
metagenomischen Bibliotheken beimpft sind. Die Aufnahme wurde zwei Tage nach Inokulation gemacht
und zeigt neben einer blauen Hintergrund-Färbung aller Kolonien zwei Kolonien mit dunkler Färbung, die
auf eine Phosphatase-Aktivität in den Zellen hindeutet.
3.4. Oxidative Enzyme aus anderen Quellen
Im Rahmen dieser Studie konnten keine Monooxygenase-Aktivitäten mit Hilfe des MetagenomAnsatzes nachgewiesen werden. Neben diesem erst seit einigen Jahren etablierten Ansatz stehen
die klassischen Methoden des Screenings zur Verfügung, um zu neuen Enzymen zu gelangen.
Hier kann unterschieden werden zwischen dem Screening einer Stammsammlung, bei dem jeder
einzelne Stamm betrachtet wird, und einer Anreicherungskultur, bei der unter selektiven
Bedingungen diejenigen Stämme mit der gewünschten Stoffwechsel-Aktivität angereichert
werden. Hier wurden beide Wege untersucht, um zu neuen oxidativen Enzymen zu gelangen.
3.4.1. Screening einer Stammsammlung nach Monooxygenase-Aktivität
Ein klassischer Weg, um zu neuen Enzymen zu gelangen, ist das Screening einer
Stammsammlung. Auf diese Weise sind in der Vergangenheit zahlreiche interessante
Mikroorganismen und deren Enzyme beschrieben worden. Zum Auffinden einer neuen
Monooxygenase wurden Organismen von einem Kooperationspartner aus der Stammsammlung
des Forschungsinstituts Jülich durchmustert. Aus dieser Stammsammlung waren kurz zuvor im
Rahmen einer Diplomarbeit 123 Stämme angezogen und deren Zellrohextrakte gewonnen
worden. Diese wurden in eingefrorenem Zustand versandt.
Die Stammsammlung sollte nach Organismen durchsucht werden, die in der Lage sind, terminale
Alkene zu Epoxiden zu oxidieren, weil diese Reaktion bislang nur von wenigen Monooxygenasen
katalysiert wird. Dazu wurden als Modellsubstrate Styrol als Vertreter der aromatischen und
1-Octen als Vertreter der aliphatischen Alkene gewählt. Das Screening sollte durch eine
Inkubation der Zellrohextrakte mit den Substraten erfolgen, anschließender Extraktion und
55
3. Ergebnisse
Analyse der Reaktionsprodukte mittels Gaschromatographie. Zu Beginn stand daher die
Etablierung einer Analytik, die es erlaubt, alle Substrate und Produkte nebeneinander
nachzuweisen. Es wurde auch berücksichtigt, dass unter bestimmten Bedingungen die Epoxide,
die von der Monooxygenase gebildet werden, zu den Diolen hydrolysieren, daher wurden diese
Diole auch in die Analytik aufgenommen. Es wurde eine achirale GC-Säule gewählt (BPX-5) und
die Bedingungen so optimiert, dass Styrol, Styroloxid, Phenyl-1,2-ethandiol, 1-Octen, 1,2-Epoxyoctan und 1,2-Octandiol in einem Lauf nachgewiesen werden konnten (Abb. 3.18).
O
HO
a)
MO
OH
auto
NAD(P)H NAD(P)+
+ O2
+ H 2O
OH
MO
auto
O
OH
NAD(P)H NAD(P) +
+ O2
+ H2 O
b)
O
O
OH
OH
HO
OH
Abb. 3.18. a) Reaktion von Monooxygenasen (MO) mit den Alkenen Styrol und 1-Octen zu den jeweiligen
Epoxid und anschließende Autohydrolyse (auto) zu den Diolen; b) GC-Chromatogramm der EthylacetatExtraktion der sechs Substanzen aus Puffer aufgetrennt auf einer BPX-5-Säule (Temperatur-Programm:
10 min 40 °C, heizen mit 15 °C/min auf 180 °C, 5 min 180 °C).
An die Etablierung der Analytik schloss sich die Untersuchung des Extraktionsverhaltens der sechs
Substanzen an. Das Screening sollte mit je 10 mM der Alkene durchgeführt werden. In einem
wässrigen Puffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,5) wurden 10 mM aller sechs Stoffe gelöst und
zur Extraktion mit einem Volumenäquivalent Ethylacetat versetzt. Um die Interaktion der
Reaktanden mit Plastik zu vermeiden, wurden alle Experimente in Glasvials durchgeführt. Die
organische Phase wurde mittels GC analysiert, wobei alle sechs Substanzen wiedergefunden
werden konnten und die Peakflächen vergleichbar zu den nicht-extrahierten waren. In einem
56
3. Ergebnisse
weiteren Vorversuch wurde untersucht, ob die Stoffe unter den Reaktionsbedingungen auch
nach Ablauf der Reaktionszeit noch nachzuweisen sind oder ob sie sich verflüchtigen. Dazu wurde
der gleiche Ansatz aus 10 mM aller sechs Substanzen in Puffer für 24 Stunden bei 30 °C und
1400 rpm inkubiert. Die anschließende Extraktion und Analyse mittels GC zeigte die Abnahme
von Styrol und Styroloxid und die Zunahme der Diole. Dies ist vermutlich auf die Flüchtigkeit von
Styrol zurückzuführen und auf die Autohydrolyse der Epoxide zum Diol. Die Einbeziehung der
Diole in die Analytik ist daher sinnvoll, um die Reaktion der Monooxygenase detektieren zu
können. Um die Quantifizierung der Peaks zu erleichtern, wurde 1-Hexanol als interner Standard
eingesetzt.
Nach diesen Vorversuchen wurden die Mikroorganismen aus der Stammsammlung auf ihre
Fähigkeit untersucht, Styrol oder 1-Octen zu epoxidieren. Dazu wurden die Zellrohextrakte mit
Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) und je 10 mM Substrat versetzt. Als Cofaktoren wurden
je 0,25 mM NADH und NADPH eingesetzt, und zu deren Regeneration ein CofaktorRecyclingsystem aus Glucose-Dehydrogenase aus B. subtilis, das beide Cofaktoren akzeptiert, und
100 mM Glucose hinzugefügt. Die Glasvials wurden für 24 Stunden bei 30 °C und 1400 rpm
inkubiert. Anschließend wurden sie mit Ethylacetat extrahiert und über die GC analysiert.
Aus dem Screening von 123 Mikroorganismen konnte bei keinem der Zellrohextrakte ein Peak bei
der Retentionszeit der Epoxide oder Diole nachgewiesen werden. Bei einem der Stämme konnte
eine geringe Menge (0,5 % der Gesamtpeakflächen) Benzaldehyd gefunden werden, da aber der
Styrol-Peak nicht vermindert war, wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass dieses nicht aus dem
Styrol gebildet worden ist. Auf die untersuchte Weise konnte in den 123 Stämmen keine Bildung
von Styroloxid oder Epoxyoctan nachgewiesen werden.
3.4.2. Monooxygenase-Aktivität in Gordonia sp. CWB2
Eine Alternative zum Screening einer Stammsammlung auf eine Enzymaktivität ist die
Anreicherungskultur. Bei der Suche nach Organismen, die auf Styrol als einziger C-Quelle wachsen
können, konnte vom Kooperationspartner Dr. D. Tischler (Universität Freiberg) ein Mikroorganismus isoliert werden, der für weitere Experimente freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde.
Anhand seiner 16S rDNA wurde er als Gordonia sp. CWB2 bezeichnet und gehört zu den Grampositiven Acinetobacter-Stämmen. In diesem Stamm wird ein Abbauweg vermutet, der Styrol
über die Oxidation zu Styroloxid als C-Quelle zugänglich macht, eine Reaktion, für die der
Organismus über eine Monooxygenase verfügen muss. Zur Bestätigung dieser Enzymaktivität
wurde der Stamm auf Minimalmedium mit Styrol als einziger C-Quelle angezogen. Nach einem
Wachstum über sieben Tage wurden die Zellen und das Medium geerntet, die Zellen
aufgeschlossen und Zellsuspension wie auch Medium mit Ethylacetat extrahiert. Es wurden
sowohl das Medium als auch die Zellen untersucht, weil sich das gebildete Styroloxid innerhalb
oder außerhalb der Zellen befinden kann. Die organische Phase wurde gaschromatografisch
untersucht. Dabei konnte die Anwesenheit einer kleinen Menge Styroloxid nachgewiesen werden
(Abb. 3.19). Die geringe Menge im Vergleich zum Styrol kann dadurch erklärt werden, dass das
Styroloxid vermutlich gleich weiter verstoffwechselt wird und sich nicht anreichert. Eine
57
3. Ergebnisse
Autohydrolyse zum Diol kann ausgeschlossen werden, da diese mit der gewählten Methode in
der GC detektiert worden wäre.
O
Abb. 3.19. Gaschromatogramm der Ethylacetat-Extraktion einer Flüssig-Kultur von Gordonia sp. CWB2, die
auf Styrol als einziger C-Quelle angezogen wurde.
1 : 25
1 : 50
1 : 100
1 : 200
1 : 400
1 : 800
unverdaut
Marker
Um das Gen des Proteins zu identifizieren, das die Umsetzung von Styrol zu Styroloxid katalysiert,
wurde eine Genbibliothek des Organismus angelegt. Dazu wurde dieser im 500 ml-Maßstab über
sieben Tage angezogen. Die Zellen wurden geerntet, aufgeschlossen und die genomische DNA
mit Hilfe eines Kits isoliert. Für die Klonierung wurde zunächst in einem Vorversuch die
erforderliche Konzentration des Restriktionsenzyms ermittelt, bei der Fragmente einer
geeigneten Größe entstehen.
10 kb
1 kb
Abb. 3.20. Agarosegel eines partiellen Verdaus der genomischen DNA aus Gordonia sp. CWB2 mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI in verschiedenen Konzentrationen (1 : 25 bis 1 : 800), der unverdauten
genomischen DNA und des Markers.
Die Fragmentierung der DNA erfolgte in parallelen Ansätzen mit zwei verschiedenen
Restriktionsenzymen, um die Wahrscheinlichkeit zu vermindern, dass ein Gen nicht gefunden
werden kann, da es durch den Verdau fragmentiert wurde, hierzu wurden Sau3AI und EcoRI
58
3. Ergebnisse
gewählt. Abb. 3.20 zeigt die Fragmentierung der genomischen DNA aus Gordonia sp. CWB2 mit
dem Restriktionsenzym Sau3AI in verschiedenen Konzentrationen. Es wurden für beide
Restriktionsenzyme Bedingungen gewählt, bei denen Fragmente von 4 – 8 kb entstehen. Diese
wurden über ein Gel aufgetrennt, ausgeschnitten und aus der Matrix extrahiert. Als Vektor wurde
wie bei den metagenomischen Experimenten pJOE930 gewählt, da durch die palindromischen
Sequenzen eine Religation minimiert wird. Das Plasmid wurde mit BamHI (dieses liefert die
gleichen Schnittstellen wie Sau3AI) oder EcoRI geschnitten, dephosphoryliert und über ein
Agarosegel aufgereinigt. Für die Ligation wurden verschiedene Verhältnisse von Vektor zu Insert
zwischen 3 : 1 und 1 : 3 gewählt. Nach Transformation von E. coli BL21 (DE3) konnte eine
genomische Bibliothek mit knapp 2.000 Klonen mit einer Insertgröße von durchschnittlich 4,5 kb
erstellt werden, die in Mikrotiterplatten bei -80 °C gelagert wurden. In Übertragung von einer
anderen Gordonia-Art kann angenommen werden, dass das Genom etwa 5 * 106 bp aufweist. Bei
einer durchschnittlichen Insertgröße von 4,5 kb decken 2.000 Kolonien das Genom etwa zweifach
ab.
Die Genbibliothek wurde mit den beiden Epoxidase-Assays aus Kap. 3.2.1 auf die Anwesenheit
einer Styrol-Monooxygenase untersucht. Dazu wurden die Kolonien in DeepwellMikrotiterplatten exprimiert, das Zellrohextrakt gewonnen und dieses in den Assays eingesetzt.
Als Positiv-Kontrolle für den Assay wurde erneut die Styrol-Monooxygenase StyAB aus
Pseudomonas sp. VLB120 eingesetzt. Trotz zweifacher Durchmusterung konnte keine Aktivität
einer Monooxygenase in der Genbank nachgewiesen werden.
Es wurde daher eine alternative Strategie untersucht, um Zugang zu dem Monooxygenase-Gen
zu erlangen. Die Reaktion von Styrol zum Styroloxid kann zwar auch von einigen wenigen P450Monooxygenasen durchgeführt werden, weit häufiger sind aber FAD-abhängige StyrolMonooxygenasen. Die bislang beschriebenen Styrol-Monooxygenase-Gene weisen in manchen
Bereichen eine hohe Homologie auf, insbesondere innerhalb der Reduktase-Untereinheit. Ein
Sequenzalignment einiger bereits beschriebener Gene befindet sich im Anhang (Abb. 8.1 und
8.2). Aufgrund dieser Homologie wurden zwölf Primer erstellt, die in beiden Richtungen in
homologen Bereichen der StyA- oder der StyB-Untereinheit binden sollen. Die genomische DNA
von Gordonia sp. CWB2 war bereits für die Erstellung der Genbank isoliert worden und wurde nun
als Templat für eine PCR eingesetzt. Die Primer wurden in verschiedenen Kombinationen
eingesetzt, um ein Fragment des Gens aus dem Genom zu amplifizieren. In Folgeschritten kann
dieses über einen genome walking Ansatz an den beiden Enden vervollständigt werden.
59
3. Ergebnisse
a)
1
2
M
3
M
4
M
b) M 6
5
M
M
10 kb
10 kb
1 kb
1 kb
Abb. 3.21. Agarosegele der Amplifikation von Genabschnitten aus DNA von Gordonia sp. CWB2 mit Primern,
die anhand homologer Sequenzen zu Styrol-Monooxygenasen abgeleitet wurden. a) Für jeden der fünf
Ansätze (Spur 1 – 5) wurden unterschiedliche Primer-Kombinationen gewählt, die mit fünf verschiedenen
Annealing-Temperaturen (zwischen 50 und 70 °C) in der PCR eingesetzt wurden; b) für die Primer aus
Ansatz 5 wurden die PCR-Bedingungen soweit optimiert, dass drei klare Banden amplifiziert werden
konnten (Spur 6); M = 1 kb Marker.
Abb. 3.21 a zeigt ein Agarosebild, in dem die PCR Ansätze nach Amplifikation der Gordonia-DNA
mit verschiedenen Primer-Kombinationen aufgetragen sind. Bei einigen Primer-Kombinationen
lassen sich gar keine oder nur verschmierte Banden erkennen, was darauf hindeutet, dass die
Primer nicht an bestimmte Stellen im Genom haben binden können und sich verschiedene PCRProdukte vervielfältigen. An einigen Stellen waren jedoch klare Banden zu erkennen, die durch
Optimierung der Annealing-Temperatur noch deutlicher amplifiziert wurden, ein Beispiel ist in
Abb. 3.21 b zu sehen. Die PCR-Ansätze, bei denen sich durch geeignete Primer-Wahl und
Optimierung der Reaktionsbedingungen klare Banden amplifizieren ließen, wurden im größeren
Maßstab wiederholt, und die Ansätze nach Ablauf der PCR für 10 min bei 72 °C mit einer TaqPolymerase inkubiert, um A-Überhänge zu erzeugen. Die Fragmente wurden über ein Gel
aufgereinigt, in einen TOPO-Vektor kloniert und sequenziert. Die Sequenzierungergebnisse
hatten in keinem der Fälle Ähnlichkeit mit einem FAD-abhängigen Enzym. Daraus kann gefolgert
werden, dass entweder die Primer nicht für die Amplifikation des Monooxygenase-Gens geeignet
waren oder die vorliegende Monooxygenase keine ausreichend hohe Homologie zu bislang
beschriebenen Genen aufweist. Trotz verschiedener Ansätze konnte aus Gordonia sp. CWB2 kein
Gen für eine Monooxygenasen isoliert werden.
60
4. Diskussion
4. DISKUSSION
Ziel der vorliegenden Arbeit war das Screening nach neuen oxidativen Enzymen in
metagenomischen Bibliotheken. Dazu bestand der erste Schritt in der Erstellung von Bibliotheken
aus verschiedenen Umweltproben. Darauf folgten Experimente zur Durchmusterung der
Bibliotheken nach unterschiedlichen oxidativen Enzymen. Die angelegten Bibliotheken wurden
darüber hinaus für das Screening nach weiteren Enzymklassen genutzt. Außerdem wurden als
weitere Routen zu oxidativen Enzymen klassische Screening-Methoden eingesetzt. Das Screening
nach neuen oxidativen Enzymen blieb ergebnislos; daher soll der Schwerpunkt der Diskussion auf
die Erörterung der möglichen Gründe hierfür gelegt werden.
4.1. DNA-Isolierung und Anlegen metagenomischer Bibliotheken
Die metagenomische DNA zur Erstellung der Bibliotheken wurde aus unterschiedlichen Biotopen
isoliert. Aufgrund seiner hohen Artenvielfalt wurde Kompost gewählt. Unter den Enzymen, die
bislang aus metagenomischen Kompost-Bibliotheken isoliert wurden, sind vor allem Cellulasen
[27, 119] und andere Hydrolasen [75, 257, 258] beschrieben; oxidative Enzyme wurden hierfür mit
Ausnahme einer 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase [75] noch nicht gefunden. Obwohl in
Kompostböden auch anaerobe Abbauprozesse stattfinden, verlaufen die typischen Abbauwege
eher oxidativ [259], so dass dieses Biotop für die vorliegenden Experimente gut geeignet sein
sollte. Neben Kompost wurden auch Bodenproben aus Wäldern in die Untersuchungen
einbezogen und ihre DNA ebenfalls extrahiert. Auch diese Umweltprobe kann als geeignet für die
vorliegende Studie eingeschätzt werden, da bereits in der Literatur die Identifizierung einer
Styrol-Monooxygenase beschrieben ist, die in der metagenomischen DNA aus Lehmboden
gefunden wurde [82]. In den ursprünglichen Überlegungen zur Wahl der Umweltprobe war auch
die DNA aus dem Belebtschlammbecken einer Kläranlage einbezogen worden, weil gerade dort
eine Vielzahl von Mikroorganismen mit aeroben Abbauwegen vorliegen sollte. Weil aber die
Arbeiten mit Belebtschlamm in Mecklenburg-Vorpommern (wo die vorliegende Studie
durchgeführt wurde) in die Sicherheitsstufe 3 fallen, für die kein Labor zur Verfügung stand,
wurde dieses Biotop hier nicht untersucht. Da eine wesentliche Untersuchungsgruppe die Styrolabbauenden Monooxygenasen darstellten, wurde weiterhin DNA aus einem Abluftfilter isoliert,
der regelmäßig mit Styrol-haltigen Dämpfen in Kontakt gekommen war (die Isolierung erfolgte
durch den Kooperationspartner Dr. D. Tischler, Universität Freiberg). Dieser Abluftfilter bestand
aus Rindenmulch und wird hier daher zu den Boden-artigen Umweltproben gezählt. Weiterhin
wurden nicht-humusreichen Bodenproben aus Strandsand gewählt, sowie eine Biofilm-artige
Probe von einem feuchten Küchen-Schwammtuch. In diesen letzten beiden Biotopen ist nicht mit
einem übermäßig hohen Vorkommen an oxidativen Enzymen zu rechnen, sie wurden vor allem
gewählt, weil hier die DNA-Isolierung mit einfachen Methoden möglich ist. Obwohl die Proben
nicht speziell auf oxidative Enzyme angereichert worden sind, sind dennoch mit einer
durchschnittlichen Wahrscheinlichkeit auch Gene für Monooxygenasen in den Probe zu erwarten,
da es sich nicht um ausgesprochen anaeroben Biotope handelt.
61
4. Diskussion
Für die Isolierung der DNA aus Kompost- und Bodenproben wurde auf Protokolle aus der
Literatur zurückgegriffen [236, 237]. Dabei wurden in den anfänglichen Experimenten stets
braune DNA-Präparationen erhalten, was auf die Anwesenheit von Huminstoffen zurückzuführen
ist. Die nachfolgenden Klonierungsexperimente wurden dadurch so stark gestört, dass keine
Bibliotheken angelegt werden konnten. Dieses Problem ist aus der Literatur bekannt [239-241],
und es wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Huminstoffe von der DNA zu
trennen. Teils wurden hier gute Erfolge erzielt, wie durch die Zugabe von CTAB während der
Aufreinigung sowie durch die Feinreinigung der DNA über Spin-Säulchen aus einem DNAExtraktions-Kit, durch die zwar die DNA-Ausbeute sank, die Qualität aber so stark verbessert
wurde, dass farblose Präparationen erzielt werden konnten. Auch die in der Literatur
beschriebene Interaktion von BSA mit DNA [243] konnte dazu genutzt werden, eine DNA-Qualität
zu erreichen, die im nachfolgenden Restriktionsverdau keine signifikanten Inhibierungen mehr
aufwies. Teils führten die Experimente aber auch zu einer so geringen DNA-Ausbeute, dass diese
Methoden nicht weiter angewendet wurden, wie es für die Aufreinigung der DNA über ein
Agarosegel der Fall war. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass durch den Einsatz von
Feinreinigungsschritten eine DNA-Qualität aus Kompost- und Bodenproben erzielt werden
konnte, die sich für nachfolgende Klonierungsschritte eignete.
Die DNA-Isolierung aus Strandsand, an dem die DNA unter salzhaltigen Bedingungen haftet,
ergab stets farblose DNA-Präparationen, was auf einen geringen Gehalt an Huminstoffen
hindeutet. Allerdings war die Fragmentierung relativ stark und die DNA nur gut 10 kb groß.
Naviaux et al., die diese Isolierungsmethode beschrieben [233], ermittelten, dass die Größe der
isolierten DNA von Probe zu Probe schwankt, und dass auch innerhalb der einzelnen Proben sehr
unterschiedlich große Fragmente aufzufinden sind, die zwischen 5 und 300 kb liegen und eine
mittleren Größe von 30 kb aufweisen. Die teils starke Fragmentierung dürfte auf die mechanische
Belastung durch die Reibung der Sandpartikel zurückzuführen sein. Die Größe der in der hier
vorliegenden Studie isolierten DNA ist mit gut 10 kb kleiner als die in den Präparationen von
Naviaux et al., was durch eine Schwankung der Beschaffenheit der Umweltproben zu erklären ist.
Daher eignet sich diese DNA nicht für die Klonierung in Cosmide; die Methode kann aber für die
DNA-Gewinnung zum Anlegen von Plasmid-basierten Bibliotheken genutzt werden. Die reinste
DNA-Präparation mit den größten Fragmenten konnte aus dem Schwammtuch gewonnen
werden. Nachdem dieses für einige Wochen im Küchenbereich genutzt und dadurch immer
wieder ausgespült worden war, wurde er für eine Woche in einem Puffer inkubiert, um
Mikroorganismen anzureichern. Da sich durch die Feuchthaltung des Tuches darauf eine
Schleimschicht gebildet hatte, kann von einem Biofilm gesprochen werden. Dieser ließ sich gut
von der Schwamm-Matrix lösen und ermöglichte die Extraktion von farbloser, hochmolekularer
DNA. Dieses Biotop eignet sich also gut für die DNA-Isolierung, über die darin enthaltene
Artenvielfalt liegen aber keine Studien vor, so dass diese nicht im Vergleich zu den anderen
Umweltproben beurteilt werden kann.
Die metagenomische DNA wurde in zwei verschiedene Vektoren ligiert: Die DNA aus dem
Schwammtuch war hochmolekular und enthielt keine nennenswerten Kontaminationen, so dass
sie für eine Klonierung in Cosmide geeignet war. Hier wurde das Cosmid pWE15 gewählt, das
bereits in anderen Studien für die Konstruktion metagenomischer Bibliotheken genutzt wurde
62
4. Diskussion
[56]. Es wurde eine Bibliothek mit 483 Klonen angelegt, die Cosmide mit einer durchschnittlichen
Insertgröße von 25 kb enthielt. Mit der DNA aus Strandsand und aus den humushaltigen
Bodenproben ließen sich aufgrund geringer Fragmentgröße (unter 25 kb) bzw. zu starker
Kontaminationen trotz der Feinreinigungsschritte keine Cosmid-basierten Bibliotheken anlegen.
Um aber auch diese DNA in die vorliegende Untersuchung mit einbeziehen zu können, wurden
diese Präparationen in Plasmide kloniert. Hierfür war – anders als bei den Cosmiden – eine
Reinigung der DNA im Anschluss an die Fragmentierung über ein Agarosegel möglich. Unter den
zahlreichen zur Verfügung stehenden Plasmiden wurde pJOE930 gewählt [244]. Es weist zu
beiden Seiten im Bereich der multiple cloning site (MCS) 337 bp lange palindromische Sequenzen
auf, die die Religation leerer Plasmide unterdrücken. Nur wenn diese Palindrome durch
Einklonieren eines DNA-Fragmentes unterbrochen sind, ist eine Replikation möglich, da sich sonst
cruciforme Strukturen ausbilden. Das Plasmid wird somit zu den positiven Selektionsvektoren
gezählt. Darüber hinaus liegen zu beiden Seiten der MCS induzierbare lac-Promotoren, so dass
eine Expression von Genen auch unabhängig vom eigenen Promotor und ein Ablesen des
einklonierten Fragmentes in beide Richtungen ermöglicht wird und die Trefferwahrscheinlichkeit
beim Screening verdoppelt wird. Das Plasmid ist aus diesen beiden Gründen sehr gut für die
Konstruktion (meta)genomischer Bibliotheken geeignet und hierfür bereits in der Vergangenheit
erfolgreich eingesetzt worden [75]. Die Fragmentierung der DNA wurde mit zwei verschiedenen
Restriktionsenzymen vorgenommen, BamHI und EcoRI, die unterschiedliche Schnittstellen haben,
so dass eine Gewichtung bezüglich des GC-Gehaltes vermieden werden kann. Obwohl beim
Ausschneiden aus dem Agarosegel eine Fragmentgröße von 5 - 8 kb gewählt wurde, zeigte sich
durch eine Kolonie-PCR der transformierten Zellen, dass die durchschnittliche Insertgröße nur
5,1 kb betrug, was bedeutet, dass die kleinen Fragmente bevorzugt ligiert, oder Plasmide mit
kleinem Insert bevorzugt in kompetente Zellen aufgenommen werden. Dies entspricht den
üblicherweise bei molekularbiologischen Experimenten beobachteten Schwankungen. Obwohl
pJOE930 ein Blau-Weiß-Screening der Klone zum Ausschluss der Religanden ermöglicht, wurde
dieses nicht genutzt und die Bibliotheken nicht auf Platten mit X-GAL (5-Brom-4-chlor-3-indoxylβ-D-galactopyranosid) ausgestrichen. Die Kolonien, die ein religiertes Plasmid besitzen, würden
auf diesem Substrat blau werden und nicht in die Bibliothek aufgenommen werden. Gleichzeitig
sind aber rekombinante E. coli Zellen, die eine Styrol-Monooxygenase exprimieren, in der Lage,
aus dem im Medium enthaltenen Tryptophan Indigo herzustellen [246]. Die Kolonien nehmen
dann (sofern nicht der Vektor eine Hintergrundexpression absolut zuverlässig unterbindet) auf
Agarplatten innerhalb von 12 Stunden eine leicht blaue Färbung an, die sich im Laufe der Zeit
verdunkelt. Somit würden Klone, auf deren Aktivität die Bibliothek gescreent werden soll,
möglicherweise verworfen werden. Aus diesem Grund wurde auf ein Blau-Weiß-Screening
verzichtet und stattdessen der Vektor sehr sorgfältig präpariert und dephosphoryliert. Dennoch
ließ sich die Religation nicht komplett vermeiden und durch Kolonie-PCR wurde eine
Religationsquote von 12 % unter den Klonen ermittelt. Aus den vier Umweltproben konnten
insgesamt knapp 3.500 Klone gewonnen werden.
Neben den selbst konstruierten metagenomischen Bibliotheken standen für das Screening zwei
weitere Cosmid-basierte Bibliotheken zur Verfügung. Eine auf einem Trinkwasser-Biofilm
basierende Bibliothek wurde freundlicherweise von einem Kooperationspartner (Prof. W. Streit,
63
4. Diskussion
Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt und umfasste knapp 2.000 Klone. Darüber hinaus
wurde in unserem Arbeitskreis von M. Kadow im Rahmen ihrer Diplomarbeit eine Bibliothek aus
Zahnbelag-DNA angelegt, die auf die Anwesenheit von Enzymen gescreent worden war, die für
die Ausbildung einer Antibiotika-Resistenz sorgen. Diese Bibliothek umfasste 550 Klone mit
durchschnittlich 25 kb insertierter DNA. Unter Abzug der 12 % Religanden in den Plasmidbasierten Bibliotheken und durch Hochrechnung der ermittelten durchschnittlichen
Fragmentgrößen der untersuchten Klone stehen in den metagenomischen Bibliotheken gut
90.000 kb DNA für das Screening zur Verfügung. Davon liegen gut 75.000 kb in Form von
Cosmiden und 15.000 kb in Form von Plasmiden vor.
Die Verteilung zwischen den Vektoren zugunsten der Cosmide ist vorteilhaft, da die
Fragmentierung in diesen nicht so stark ist wie in den Plasmiden und die Wahrscheinlichkeit
höher ist, auch größere Gene zu finden. Dies ist umso wichtiger, als es sich bei oxidativen
Enzymen oft um recht große Proteine handelt. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen und Oxidasen
weisen im Schnitt 1.500 bp auf, während bei P450- und Styrol-Monooxygenasen allein die
Oxygenase-Untereinheiten in diesem Bereich liegen, hinzu kommen die Reduktasen. Je größer
das zu detektierende Gen ist, desto größer ist auch die Bibliothek, die gescreent werden muss. Für
Genom-Bibliotheken wird die Zahl der zu durchmusternden Kolonien N mit der folgenden Formel
ausgedrückt:
ܰൌ
Ž ሺͳ െ ሻ
Ž ሺͳ െ ሻ
Dabei drückt P die Wahrscheinlichkeit aus, dass ein Gen in der Bibliothek vorhanden ist, A die
Insertgröße und B die Gesamtlänge des Genoms des Organismus [260]. Eine analoge Berechnung
ist für metagenomische Experimente schwierig, da die Wahrscheinlichkeit P, mit der Ezyme einer
bestimmten Enzymklasse vorkommen, über alle Genome nur sehr fehlerbehaftet zu berechnen
ist. Darüber hinaus drückt die Formel viele wichtige Einflussfaktoren für Aktivitäts-basierte
metagenomische Experimente nicht aus: Die erwartete Genlänge, die Wahl des Wirtes und damit
die Wahrscheinlichkeit, dass das Gen aktiv exprimiert wird, die Sensitivität des Assays und die
Häufigkeitsverteilung unter den in der Umweltprobe enthaltenen Arten.
Lorenz und Schleper diskutierten die Frage, wie groß die ‘Größe des Metagenoms‘ sei bzw. wie
groß eine Bibliothek sei, die das Metagenom abdeckt [261]. Ausgehend von der Annahme, dass in
einer Bodenprobe mehrere Tausend Arten vorkommen, für die eine durchschnittliche
Genomgröße von 4 Megabasenpaaren angenommen wurde, würde das Metagenom der Probe
1010 bp umfassen. Die Größe der Genbank, die angelegt werden muss, um diese Menge
abzudecken, muss der oben genannten Formel zufolge 4,6 * 1010 bp umfassen, was in Form von
Plasmiden 107 Klonen (mit durchschnittlich 5 kb Insert) oder 106 BACs (mit durchschnittlich 100 kb
Insertgröße) entspricht. Diese Berechnungen vernachlässigen allerdings die Tatsache, dass die
Organismen in unterschiedlicher Häufigkeit in den Umweltproben vorkommen.
Eine solche Berechnung ist zwar hilfreich, um einen Eindruck von der ‘Größe des Metagenoms‘ zu
erlangen, für eine angewandte Fragestellung sind aber Auffindungsraten sinnvoller, die deutlich
machen, wie viele Enzyme sich pro durchmustertem kb DNA etwa finden lassen. Dazu können
64
4. Diskussion
inzwischen einige Erfahrungswerte aus der Literatur entnommen werden. Diese bewegen sich
zwischen einer Wahrscheinlichkeit von 1 Treffer pro 2.700 kb DNA, mit der eine Phosphatase
gefunden wurde und 1 Treffer pro 389.000 kb DNA, mit der eine Protease gefunden wurde (bei
vergleichbarer Fragmentgröße von etwa 4 kb) [262]. Die hier vorliegende Bibliotheksgröße von
gut 90.000 kb DNA liegt damit in einem guten Mittelbereich, in dem sich üblicherweise Treffer
identifizieren lassen. Ein größerer Umfang ist zwar stets wünschenswert, gleichzeitig steigt aber
auch der Screeningaufwand, so dass hier ein guter Kompromiss gefunden wurde, bei dem das
Screening mit Mikrotiterplatten-basierten Assays gut handhabbar ist und dennoch eine
durchschnittliche DNA-Menge abgedeckt wird.
4.2. Screening nach oxidativen Enzymen
Für das Screening der metagenomischen Bibliotheken wurde der Fokus auf oxidative Enzyme
gelegt. Diese sind für zahlreiche Anwendungsgebiete in der Biotechnologie interessant, doch in
vielen Enzymklassen weisen die zurzeit beschriebenen Enzyme Limitierungen auf, die einen
industriellen Einsatz bislang einschränken. Ausnahmen sind die erfolgreiche Überführung einer
Baeyer-Villiger-Oxidation durch eine rekombinante BVMO in Form einer Ganzzell-Biotransformation in den 200-Liter-Maßstab [263] sowie die Epoxidierung von Styrol zu Styroloxid, die
durch die zahlreichen Untersuchungen von A. Schmid et al. in den letzten Jahren optimiert wurde
[198]. Darüber hinaus werden zwar auch P450-Monooxygenasen inzwischen industriell eingesetzt
[3], insgesamt aber sind die oxidativen Enzyme bei weitem unterrepräsentiert gegenüber den
Hydrolasen. Neben den Optimierungsmethoden, die durch gerichtete Evolution und rationales
Proteindesign zur Verfügung stehen, öffnet das Screening nach neuen Enzymen Zugang zu
robusteren oder selektiveren Biokatalysatoren.
Ein Schwerpunkt des Screenings lag auf der Auffindung solcher Monooxygenasen, die eine
Epoxidierung von Alkenen katalysieren. Insbesondere wenn dies auf enantioselektive Weise
erfolgt, stehen Bausteine für zahlreiche pharmazeutisch relevante Substanzen zur Verfügung
[199, 264], da der Epoxid-Ring den Angriff unterschiedlicher Nukleophile zulässt. Diese EpoxidÖffnung kann chemisch oder enzymatisch erfolgen [264]. Biokatalytisch können chirale Epoxide
unter anderem über stereoselektive Epoxid-Hydrolasen gewonnen werden, welche eines der
Enantiomere hydrolysieren, des Weiteren über eine kinetische Racematspaltung mit einer Lipase
oder aber über Monooxygenasen (vgl. Exkurs 2, S. 23). Dabei gibt es mehrere MonooxygenaseUntergruppen, die die Oxidation von Alkenen zu Epoxiden katalysieren und dabei
unterschiedliche Mechanismen und Cofaktoren nutzen, darunter Styrol-Monooxygenasen und
P450-Monooxygenasen. Neben den Epoxidasen sollten die metagenomischen Bibliotheken auf
Aktivitäten von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen und Oxidasen untersucht werden. Hier sollen
nun zunächst die Enzym-Assays kritisch beleuchtet werden, die für das Screening nach oxidativen
Enzymen eingesetzt wurden, und im Anschluss die Auffindungswahrscheinlichkeiten für diese
Enzyme in metagenomischen Bibliotheken erörtert werden.
65
4. Diskussion
4.2.1. Betrachtung der gewählten Hochdurchsatz-Assays
Zum Screening nach Epoxidasen wurden zwei aus der Literatur bekannte Assays verwendet, der
γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin (NBP)-Assay und der p-Nitrothiophenolat (pNTP)-Assay [247, 250], die
beide auf der Detektion von Styroloxid beruhen, welches durch die Monooxygenase aus Styrol
gebildet wird. Diese beiden Assays sind die einzigen in der Literatur beschriebenen Methoden,
die Aktivitäten von Epoxidasen im Hochdurchsatz zu detektieren. Da für die vorliegende Studie
nicht nur die Epoxidierung von Styrol, sondern auch die weiterer Alkene von Interesse war, wurde
in einem Vorversuch untersucht, ob sich einer der Assays auch für andere Substrate eignet. Unter
den untersuchten aliphatischen terminalen Epoxiden (C6, C8 und C10) ließ sich jedoch keines mit
ausreichender Sensitivität durch einen der beiden Assays nachweisen. Das Epoxid von 3-Phenyl1-propen ließ sich ähnlich gut nachweisen wie Styroloxid und wurde in das Screening mit
einbezogen, allerdings unterscheiden sich die beiden Substrate nur in einer CH2-Gruppe, so dass
sie vermutlich von sehr ähnlichen Enzymen umgesetzt werden.
Neben epoxidierenden Monooxygenasen wurden auch Hydroxylasen in das Screening mit
einbezogen. Auch hier wurde der Fokus auf die Funktionalisierung der terminalen bzw.
subterminalen Position eines Alkans gelegt, die durch den p-Nitrophenoxyoctan-Assay von
Schwaneberg et al. [248, 251] erfasst werden kann. Des Weiteren wurden die metagenomischen
Bibliotheken nach Aktivitäten von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen gescreent. Für BVMOs stehen
erst seit kurzem hochdurchsatzfähige Assays zur Verfügung, darunter einer, der die Detektion von
4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenasen (HAPMOs) ermöglicht [173] sowie ein weiterer Assay,
der die Aktivität von BVMOs nachweist, die 4-Hydroxy-2-ketone umsetzen [167]. Ein dritter Assay
ermöglicht die Detektion von Cyclohexanon- und Cyclopentanon-Monooxygenasen [174]. Da
dieser aber erst vor wenigen Monaten veröffentlicht wurde, wurde er in die vorliegende Arbeit
nicht mit einbezogen. Darüber hinaus sind diese Enzyme bereits zahlreich in der Literatur
beschrieben, während BVMOs des HAPMO-Typs selten und neue Enzyme von Interesse für die
Biotechnologie sind. Daher wurde der Assays von Saß et al. genutzt und die metagenomischen
Bibliotheken mit diesem Assay auf HAPMO-Aktivität gescreent. Darüber hinaus wurden die
metagenomischen Bibliotheken neben Monooxygenasen auch auf Oxidasen durchmustert.
Hierfür wurde ein Assay aus der Literatur eingesetzt, bei dem das durch die Oxidase gebildete
Wasserstoffperoxid detektiert wird [216, 252].
Durch folgende Vorbetrachtung soll erläutert werden, inwieweit es möglich sein sollte, mit den
gewählten Assays die Aktivität von Styrol-Monooxygenasen in einem Screening nachzuweisen.
Die unteren Nachweisgrenzen bei beiden Assays, die die Bildung von Styroloxid detektieren,
liegen für den NBP-Assay bei 0,05 - 0,1 mM Styroloxid und bei etwa 0,5 mM Styroloxid für den
pNTP-Assay. Geht man von einem recht aktiven Enzym mit 1 U/ml Zellrohextrakt aus, so wird
innerhalb einer Minute die erforderliche Produktmenge für einen Nachweis gebildet. Es ist aber
davon auszugehen, dass sich unter den Monooxygenasen im Metagenom auch schwach aktive
Enzyme befinden, wie es bei den P450-Monooxygenasen der Fall ist. Veranschlagt man hier
1 mU/ml Zellrohextrakt, so würde 1 ml Zellrohextrakt innerhalb von 8,5 Stunden 0,5 mM
Styroloxid erzeugen. Die im Assay veranschlagte Inkubationszeit von 24 Stunden sollte also zur
Detektion von schwach aktiven Enzymen durchaus angemessen sein. Eine längere
Inkubationszeit ist nicht sinnvoll, da beim Einsatz von Zellrohextrakten mit Bewuchs zu rechnen
66
4. Diskussion
ist. Zudem unterliegt Styroloxid zu einem gewissen Teil einer Autohydrolyse und darüber hinaus
düfte sich die Flüchtigkeit von Styrol trotz einer atmungsaktiven Folie auf den Mikrotiterplatten
zunehmend bemerkbar machen. Innerhalb der Inkubationszeit sollten sich also auch schwach
aktive Enzyme nachweisen lassen, nicht jedoch sehr schwach aktive mit einer Aktivität deutlich
unter 1 mU/ml Zellrohextrakt. Da aber neben wissenschaftlichem Interesse an neuen oxidativen
Enzymen auch präparative Anwendungen mit diesen Enzymen angestrebt sind, sind sehr
schwach aktive Enzyme absehbar von geringem Interesse, so dass unter diesem Aspekt ein
Schnitt bei einer Basisaktivität von ca. 1 mU/mg durchaus gerechtfertigt ist.
Oxidasen weisen oft eine höhere spezifische Aktivität auf als Monooxygenasen. Viele GlucoseOxidasen setzen Glucose beispielsweise als rekombinantes Enzym mit über 100 U/mg um [265],
während Styrol-Monooxygenasen bei 2 U/mg liegen [186]. Bei Oxidasen ist weniger die
spezifische Aktivität als eine unzureichende Überexpression problematisch. Um ausreichend
große Proteinmengen zur Verfügung zu stellen, sind oft lange Kultivierungszeiten notwendig und
für viele Oxidasen ist eine rekombinante Expression in E. coli gar nicht möglich, da die Enzyme
toxisch für die Zellen sind, was wahrscheinlich auf das gebildete Wasserstoffperoxid
zurückzuführen ist. Daher wurde eine lange Kultivierungs- und Expressionszeit (24 Stunden) bei
niedrigen Temperaturen gewählt, so dass durch eine langsame Expression die Belastung für den
Wirt gering gehalten wird, aber trotzdem eine ausreichende Proteinmenge erlangt wird. Die
Oxidase, die als Positiv-Kontrolle mit exprimiert wurde, belegt, dass die gewählten
Kultivierungsbedingungen grundsätzlich geeignet sind.
Mit den oben beschriebenen Assays wurden die metagenomischen Bibliotheken nach
Monooxygenasen und nach Oxidasen gescreent. Um die Wahrscheinlichkeit, ein aktives Enzym
auch wirklich detektieren zu können, zu erhöhen, erfolgte die Proteinexpression in DeepwellMikrotiterplatten, so dass eine hohe Proteinkonzentration zur Verfügung stand. Darüber hinaus
wurden für die Assays lange Inkubationszeiten gewählt (24 Stunden). Lediglich für das Screening
nach BVMOs wurde die Expressionszeit auf 8 Stunden verringert, da beobachtet worden war, dass
bei vielen BVMOs die Enzymaktivität bei einer längeren Kultivierungsdauer sinkt (persönliche
Mitteilung aus dem Arbeitskreis von Prof. U. Bornscheuer). Für den Assay wurden aber auch hier
lange Inkubationszeiten von 24 Stunden gewählt. Trotz dieser Maßnahmen konnte in keiner der
Bibliotheken die Aktivität eines oxidativen Enzyms detektiert werden. Für die HAPMOs könnte
dies darauf zurückzuführen sein, dass das im Assay genutzte Substrat 4-Nitroacetophenon (NAP)
nicht das bevorzugte Substrat ist. Die bereits charakterisierte HAPMO aus Pseudomonas putida
JD1 weist gegenüber NAP nur ein Dreißigstel der Aktivität gegenüber 4-Hydroxyacetophenon auf
[86]. Dennoch lässt sich die Aktivität genau dieses Enzyms im Assay gut nachweisen, was auch im
Verlauf des Screenings als Positiv-Kontrolle genutzt wurde.
Um die Wahrscheinlichkeit, eine Monooxygenase in den metagenomischen Bibliotheken zu
finden, zu erhöhen, wurde das Screening nach Monooxygenasen so modifiziert, dass es auf die
Detektion der Oxygenase-Untereinheit reduziert wurde. Im folgenden Abschnitt ist dargelegt,
inwieweit diese Adaptation sinnvoll ist, um die Auffindungsrate von Monooxygenasen in
metagenomischen Bibliotheken zu erhöhen. Darüber hinaus wird anhand der Analyse der
typischen Anordnung der Gene im Genom erörtert, wie hoch die Wahrscheinlichkeit für das
Auffinden eines neuen oxidativen Enzyms ist.
67
4. Diskussion
4.2.2. Auffindungswahrscheinlichkeiten für oxidative Enzyme in metagenomischen
Bibliotheken
Die hohe Homologie zwischen den Reduktase-Untereinheiten wurde bereits in der Literatur
beschrieben und in vergangenen Studien genutzt, um Chimäre aus zwei fremden Proteinen
herzustellen, entweder durch Bildung von Fusionsproteinen [116] oder durch Komplementierung
mehrerer Untereinheiten bei Mehrkomponenten-Enzymen [124, 266]. Die Bildung von
Fusionsproteinen ist bei (meta)genomischen Experimenten nicht möglich, da die Fragmentierung
der DNA nicht vorher bestimmt werden kann und das zufällige Schneiden die Bildung
funktioneller Fusionsproteine nicht zulässt. Eine Komplementierung ist aber auch bei
(meta)genomischen Untersuchungen möglich. Die hier gewählten P450cam-ReduktaseKomponenten Putidaredoxin und Putidaredoxin-Reduktase sind bereits in der Literatur
erfolgreich für eine solche Ergänzung der Funktionalitäten von P450-MonooxygenaseKomponenten aus unterschiedlichen Organismen eingesetzt worden [124].
Für die Styrol-Monooxygenasen dürfte die Zugabe einer Reduktase-Untereinheit (StyB) zur
Komplementierung der StyA-Oxygenase nicht so relevant sein, da die Gene in den bislang
beschriebenen Fällen geclustert vorliegen, wie in Abb. 4.1 zu erkennen ist.
a)
stySc
styR
styA
styB
styC
styD
b)
sdr
styA1
styA2B
Abb. 4.1. Anordnung zweier Styrol-Monooxygenasen im Genom. Pfeile symbolisieren die Proteincodierenden Gen-Abschnitte. Die Ausrichtung des Pfeils spiegelt die Richtung wider, in der das Gen
abgelesen wird. a) Genabschnitt aus Pseudomonas sp. VLB120 in der Umgebung, die für die beiden Proteine
StyA und StyB codieren [184]. stySc: Gen für einen Sensor, styR: Gen für einen Regulator, styA: Gen der
Oxygenase-Untereinheit der Styrol-Monooxygenase, styB: Gen der Reduktase-Untereinheit der StyrolMonooxygenase, styC: Gen einer Isomerase, styD: Gen einer Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase;
b) Genabschnitt aus Rhodococcus opacus 1CP in der Umgebung, die für die beiden Proteine StyA1 und das
natürliche Fusionsprotein StyA2B codieren [188]. sdr: Gen für eine putative Dehydrogenase (short-chain
dehydrogenase), styA1: Gen, das für die Oxygenase-Untereinheit StyA1 codiert, styA2B: Gen, das für das
Fusionsprotein StyA2B codiert, das aus Oxygenase- und Reduktase-Untereinheit besteht.
Im Fall von Pseudomonas sp. VLB120 [184] liegen die beiden Gene styA und styB insgesamt auf
einem Abschnitt von 1.814 Nukleotiden (styA: 1.247 bp, nicht-codierende Region: 55 bp, styB:
512 bp). Rechnet man den upstream liegenden Promotor mit dazu, umfasst der Genabschnitt
knapp 2.000 bp. Im Genom von Rhodococcus opacus 1CP ist eine vergleichbar geclusterte
Anordnung der Styrol-Monooxygenasen zu finden [188]: Die Oxygenase styA1 hat eine Länge von
1.220 bp, hinter der ein nicht-codierender Bereich von 36 bp liegt, der gefolgt wird von dem
natürlichen Fusionsprotein StyA2B, in dem Oxygenase- und Reduktase-Untereinheit verbunden
68
4. Diskussion
sind, und dessen Gen 1.721 bp groß ist. Für beide Proteine zusammen liegt im Genom also ein
Cluster von 2.977 bp vor. In beiden Fällen sollte ein solches Fragment in einem Cosmid gut
aufzufinden sein.
Allerdings ist das Vorkommen von Styrol-Monooxygenasen in Genomen nach bisherigem
Kenntnisstand eher gering. In einer Studie von van Hellemond et al., die kurz vor Beginn der hier
vorliegenden Arbeit veröffentlicht wurde, wurden unter 65.000 Plasmid-basierten Klonen mit
durchschnittlich 5,5 kb Insertgröße zwei Kolonien gefunden, die für eine Styrol-Monooxygenase
codieren, die sich aber bei der Sequenzierung als identisch herausstellten [82]. Auf 65.000 Klonen
mit je 5,5 kb Insert liegen etwa 350.000 kb DNA vor, also etwa das 3,5fache der hier untersuchten
DNA-Menge. Die Zahl doppelter Genabschnitte wird als vergleichbar angenommen. Ein Vergleich
der Auffindungswahrscheinlichkeiten zwischen beiden Studien ist allerdings nur schwer möglich,
da die starke Fragmentierung in der Studie von van Hellemond et al. die Wahrscheinlichkeit
verringert, eine Monooxygenase zu finden, dort aber mehr Klone gescreent wurden. Untersucht
man Genom-Datenbanken auf Gene mit Homologie zu bislang beschriebenen StyrolMonooxygenasen, so finden sich neun weitere Styrol-Monooxygenasen mit zwischen 80 und
100 % Homologie zur StyA aus Pseudomonas sp. VLB120, die alle aus Pseudomonaden stammen,
sowie ein Gen aus einem Rhodococcus mit 66 % Homologie und das zu 63 % homologe Enzym aus
dem Metagenom (die Homologien sind jeweils bezogen auf das Gen aus Pseudomonas sp.
VLB120). Diese geringen Zahlen drücken das relativ seltene Vorkommen von StyrolMonooxygenasen in bislang sequenzierten Genomen aus. Daher kann auch für die vorliegende
Studie gut erklärt werden, warum in den untersuchten metagenomischen Bibliotheken keine
Styrol-Monooxygenase detektiert werden konnte.
Bei P450-Monooxygenasen ist die Anordnung der Enzyme im Genom anders als bei den StyrolMonooxygenasen nicht unbedingt geclustert. In vielen Studien in der Literatur wird der Fokus auf
die eigentliche P450-Oxygenase gelegt. Dabei wird aber in vielen Fällen die Betrachtung der
Reduktase-Komponenten nicht mitberücksichtigt. Bei der Untersuchung des Genoms des
Myxobakteriums Sorangium cellulosum So ce56 wurden 21 putative P450-Oxygenasen gefunden
[267], gleichzeitig aber als putative Redoxpartner nur acht Ferredoxine und zwei FerredoxinReduktasen [268]. Bernhardt et al. exprimierten fünf dieser Ferredoxine und die beiden
Reduktasen rekombinant und stellten fest, dass darunter zwei Ferredoxine in der Lage waren, der
Oxygenase CYP260A1 Elektronen für die Hydroxylierung von Nootkaton zur Verfügung zu stellen
[268]. Dafür können sie beliebig mit einer der beiden Ferredoxin-Reduktasen interagieren. Es
scheinen also alternative Elektronentransportketten zur Verfügung zu stehen, derer sich die
Oxygenasen bedienen können. Auch im Genom von Rhodopseudomonas palustris konnten zwar
sieben P450-Oxygenasen gefunden werden, nur bei zweien lagen aber im Genom benachbart
Komponenten für die Elektronentransportkette in Form von Ferredoxinen vor [269]. Bei keinem
der Gene liegt in der Nachbarschaft ein Gen, das Homologie zu einer Ferredoxin-Reduktase
aufweist. Entweder sind die Enzyme in der Nachbarschaft dennoch in der Lage, diesen
Elektronentransport zu übernehmen, auch wenn solchen angrenzenden Proteinen diese Funktion
bislang nicht nachgewiesen werden konnte, oder es liegt eine Form von natürlicher
Komplementierung in der Zelle vor, bei der die Reduktasen unabhängig von den Oxygenasen auf
dem Genom angeordnet sind und induziert werden. Möglicherweise liegen weit weniger
69
4. Diskussion
Reduktasen als Oxygenasen vor, die dann für den Elektronentransport zu mehreren
verschiedenen Oxygenasen verantwortlich sind. Daher ist bei P450-Monooxygenasen eine
Zugabe von Reduktase-Untereinheiten während des Screenings sehr sinnvoll, da hier nicht damit
gerechnet werden kann, dass alle für den Elektronentransport notwendigen Komponenten auf
dem Genom benachbart vorliegen.
Für das Screening der vorliegenden metagenomischen Bibliotheken wurden die beiden
Reduktase-Untereinheiten aus Pseudomonas putida rekombinant in E. coli exprimiert und im Assay
hinzugefügt. Auch diese in vitro Komplementierung ist in der Literatur bereits erfolgreich für eine
Monooxygenase-Aktivität nachgewiesen und genutzt worden [124]. Dennoch ließ sich keine
P450-Monooxygenase-Aktivität in einem der metagenomischen Klone nachweisen. Die
Wahrscheinlichkeit, P450-Monooxygenasen zu finden, ist sehr viel höher als dies für StyrolMonooxygenasen der Fall ist, da sie verhältnismäßig häufig anzutreffen sind. Eine mögliche
Erklärung dafür, dass dennoch keine aktiven P450-Monooxygenasen gefunden werden konnten,
ist, dass das Screening beschränkt war auf solche Enzyme, die die Hydroxylierung von Alkanen
übernehmen. Des Weiteren ist die Expression von Proteinen generell deutlich geringer, wenn sie
in (meta)genomischen Bibliotheken vorliegen als wenn sie in einem auf sie abgestimmten
Expressionssystem gezielt gebildet werden. In der Gen-Bibliothek ist die Expression zumindest bei
den Cosmid-basierten Bibliotheken auf den mitgebrachten Promotor angewiesen, der vom Wirt
erkannt werden muss. Um diese Limitierung zu umgehen, wäre es sinnvoll, die Bibliothek in einen
anderen Wirt zu klonieren und darin zu exprimieren. Janssen et al. konnten zeigen, dass in E. coli
nur rund 40 % der Gene einer Probe funktionell exprimiert werden können [270]. Als alternative
Wirte stehen beispielsweise Agrobacterium tumefaciens, Burkholderia graminis, Caulobacter
vibrioides, Pseudomonas putida, Ralstonia metallidurans [271], aber auch Streptomyces spp. [272]
und die Archeaen Sulfolobus solfatarius [273] und Thermus thermophilus [274] zur Verfügung. Dies
setzt aber von Anfang an eine Klonierung in einen Vektor voraus, der sich für mehrere Wirte
eignet, was in der vorliegenden Arbeit nicht berücksichtigt wurde. Dies ist ein Ansatz, bei dem
sich in nachfolgenden Studien anschließen ließe.
Eine weitere Schwierigkeit beim Screening nach P450-Monooxygenasen ist ihre oft membranständige Lokalisation. Diese Enzyme werden von dem hier durchgeführten Screening nicht mit
erfasst. Ein Teil der Experimente wurde mit Zellrohextrakten durchgeführt, für die die Membranfraktionen verworfen werden. Auch in den Experimenten, die mit ganzen Zellen durchgeführt
wurden, ist nicht damit zu rechnen, dass die Membranproteine in E. coli funktionell gefaltet und
zur Membran transportiert werden. Die Überexpression von Membranproteinen ohne Adaptation
des Wirtes ist oft toxisch für die Zellen oder führt zur Bildung von inclusion bodies. Daher werden
oft alternative Wirte wie Hefen oder Insektenzellen genutzt [97]. Hier könnte sich einzig die
niedrige Expressionsrate metagenomischer Proteine positiv auswirken.
Bezüglich ihrer Größe liegen die Gene von P450-Monooxygenasen im gleichen Bereich wie die
der Styrol-Monooxygenasen um 1.500 bp (z.B. P450cam), können aber auch größer sein.
Insbesondere wenn Oxygenase- und Reduktase fusioniert sind, liegt die Größe der Gene oft auch
über 3.000 bp (z.B. P450-BM3). Die Wahrscheinlichkeit, ein solches Gen in einer der Plasmidbasierten Bibliotheken mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 5,1 kb zu finden, ist relativ
70
4. Diskussion
gering. Bei den 25 kb großen Inserten der Cosmide sollte es allerdings gut möglich sein, auch
Gene über 3 kb zu finden.
Für die BVMOs des HAPMO-Typs ist das ergebnislose Screening wahrscheinlich auf ihr seltenes
Vorkommen zurückzuführen. In der Literatur sind lediglich zwei HAPMOs beschrieben: Das Enzym
aus Pseudomonas putida JD1 [86] und das aus Pseudomonas fluorescens ACB [156]. Eine Suche
nach homologen Proteinen in Internetdatenbanken ergibt außer dem jeweils anderen Enzym
keine weiteren Treffer – die Enzyme liegen in einem Stammbaum aller beschriebenen BVMOs auf
einem eigenen Zweig. Daher ist es zwar umso interessanter, neue Enzyme mit einem erweiterten
Substratspektrum zu finden, gleichzeitig ist aber auch die Chance, diese spezielle Untergruppe zu
finden, gering. Darin sind weitere Gründe zu finden, warum in dem hier durchgeführten
Screening keine BVMO-Aktivität gefunden werden konnte. In einer weiterführenden Studie wäre
es interessant, die Bibliotheken mit Hilfe des jüngst publizierten Assays auf CHMO-Aktivität zu
screenen, um neue Baeyer-Villiger-Monooxygenasen zu finden und um zu ermitteln, ob hierfür
die Auffindungsrate höher ist.
4.3. Screening nach nicht-oxidativen Enzymen
Aufgrund der vielen ergebnislosen Screening-Experimente im Bereich der oxidativen Enzyme
sollte anschließend untersucht werden, ob sich in den angelegten Metagenom-Bibliotheken
andere Enzymklassen nachweisen lassen, die von Interesse für die Biotechnologie sind. Dazu
wurden zum einen die Transaminasen gewählt, deren Untergruppe der Amin-Transaminasen
zurzeit verstärkt untersucht und eingesetzt wird, und zum anderen einige hydrolytische Enzyme.
Für das Screening nach hydrolytischen Enzymen wurden drei Agarplatten-basierte Assays
genutzt, um die Aktivität von Esterasen, Proteasen und Phosphatasen zu detektieren. Diese
Experimente wurden nur mit den selbst angelegten Bibliotheken durchgeführt, also mit 483
Cosmid-Klonen und mit knapp 3.500 Klonen in der Plasmid-basierten Bibliothek. Insgesamt
konnten in den so vorliegenden 27.000 kb DNA zwei Klone mit einer Esterase und drei mit einer
Phosphatase nachgewiesen werden. Da diese Enzymklassen nicht Gegenstand der vorliegenden
Untersuchungen waren, sondern nur zur Kontrolle der Beschaffenheit der Bibliotheken dienten,
wurden sie nicht kloniert und charakterisiert. In den Bibliotheken kann von einer
Auffindungsquote von einer Esterase pro 13.500 kb und einer Phosphatase pro 9.000 kb DNA
ausgegangen werden. Zum Vergleich kann die Literatur herangezogen werden, doch die
Ermittlung einer durchschnittlichen Auffindungsrate fällt aufgrund der Schwankungen schwer. In
einer Studie konnten Esterasen mit einer Quote von einem Enzym pro 4.800 kb DNA und
Phosphatasen mit einer Rate von einem Enzym pro 2.700 bp DNA gefunden werden [75]. In einer
anderen Studie wurde dagegen eine Esterase pro 33.300 kb DNA gefunden [257]. Aufgrund der
sehr unterschiedlichen Werte aus der Literatur lässt sich die eigene Fundrate schwer bewerten.
Insbesondere wird bei diesen Werten stets die Insertgröße nicht betrachtet, die aber eine
wesentliche Rolle spielen dürfte. In der Studie, in der eine Esterase pro 33.300 kb DNA gefunden
wurde, weist die durchschnittliche Insertgröße nur 2,5 kb auf, so dass sehr viele Klone
durchmustert müssen und dennoch das Risiko hoch ist, dass weitere potentielle Gene nicht aktiv
sind. Obwohl diese Daten keine zuverlässige Statistik erlauben und die Gene nicht subkloniert
71
4. Diskussion
wurden, konnte gezeigt werden, dass sich in den hier untersuchten Metagenom-Bibliotheken
überhaupt aktive Enzyme nachweisen lassen und die zuvor beschriebenen ergebnislosen
Experimente darauf zurückzuführen sind, dass Monooxygenasen über das Metagenom mit einer
deutlich geringeren Wahrscheinlichkeit zugänglich sind als Hydrolasen. Die gefundenen
Esterasen und Phosphatasen wurden nicht weiter untersucht, da bereits eine Vielzahl
hydrolytischer Enzyme in der Literatur beschrieben wurde, unter denen auch zahlreiche aus
metagenomischen Quellen stammen, und die Untersuchung dieser Enzymklassen nicht in die
Zielstellung des Projekts fiel.
Das Screening auf Amin-Transaminase-Aktivität verlief ebenfalls ergebnislos. Hierfür fällt eine
Erklärung schwer, da mit dem Acetophenon-Assay ein zuverlässiger Assay zur Verfügung steht.
Die Durchführung des Assays mit den drei Positiv-Kontrollen hat stets gut funktioniert. Es mag
sein, dass die Menge Rohextrakt, die eingesetzt werden konnte, zu gering war, um nicht
überexprimierte Enzyme zu detektieren. Diese Menge kann nicht erhöht werden, da dann die
Hintergrund-Absorption bei 245 nm durch die Aminosäuren in den Proteinen zu hoch ist. In
Folgeexperimenten könnte ein Screening nach Aminosäure-Transaminasen ein interessanter
Ansatzpunkt sein, um Transaminasen zu detektieren, da diese häufiger vorkommen als AminTransaminasen.
4.4. Klassische Zugänge zu oxidativen Enzymen
Zusätzlich zu den metagenomischen Studien wurde untersucht, inwieweit sich über klassische
Wege Zugänge zu neuen Monooxygenasen eröffnen lassen. Dazu wurde eine Stammsammlung
mit 123 Organismen auf ihre Fähigkeit gescreent, Styrol oder 1-Octen zu epoxidieren und eine
Genombibliothek eines Organismus angelegt, für den ein Wachstum auf Styrol als einziger
Kohlenstoff-Quelle nachgewiesen werden konnte.
Das Screening in der Stammsammlung wurde in Form einer Biokatalyse mit Zellrohextrakten
durchgeführt. Hierzu wurden die Zellrohextrakte mit den Substraten Styrol und 1-Octen sowie
einem Cofaktor-Regenerierungssystem inkubiert. Nach 24 Stunden erfolgte die Analyse mittels
Gaschromatographie. Bei der Analytik wurde berücksichtigt, dass die Epoxide einer
Autohydrolyse unterliegen und auch die Diole zu detektieren sein müssen. Obwohl dies
berücksichtigt wurde, ließ sich in keinem der Zellrohextrakte die Aktivität einer Epoxidase
nachweisen. Eine Bewertung dieser Funde ist schwierig, da kaum Zahlen verfügbar sind, wie oft
Epoxidasen vorkommen. Bei der gewählten Anzahl von 123 Stämmen kann davon ausgegangen
werden, dass eine Reihe von P450-Monooxygenasen vorhanden sind. Ob darunter aber auch
solche sein sollten, die Styrol oder 1-Octen umsetzen, ist schwer zu beurteilen, da diese speziellen
Enzyme selten sind. Das Screening wurde dennoch auf sie ausgelegt, da besonders unter den
Epoxidasen neue Enzyme einen interessanten Beitrag in der Biokatalyse leisten könnten. Darüber
hinaus ist ein einheitliches Screening nach allen Monooxygenasen des P450-Typs auf Aktivitätsbasiertem Weg nicht möglich, da diese so unterschiedliche Substrate umsetzen – dies wäre
höchstens auf Sequenzebene über Homologie möglich. Dass die gewählten Stämme aber nicht
sequenziert sind, schließt diese in silico Herangehensweise aus.
72
4. Diskussion
Eine mögliche Erklärung wäre aber auch, dass ein Teil der Stämme zwar über Gene für Epoxidasen
verfügen, deren Expression aber erst angeschaltet werden muss. Da die hier verwendeten
Zellrohextrakte auch noch im Screening nach anderen Enzymklassen eingesetzt werden sollten,
wurde die Möglichkeit der gezielten Induktion durch Zugabe von Substraten hier nicht verfolgt,
der Ansatz stellt aber einen Anknüpfungspunkt für folgende Experimente dar. Ein möglicher
weiterer Grund dafür, dass keine Monooxygenase gefunden wurde, ist, dass das Screening mit
Zellrohextrakten durchgeführt worden ist, die für den Transport vom Kooperationspartner
eingefroren wurden. Ein Teil der Enzyme geht möglicherweise durch den Einsatz von
Zellrohextrakten aus der Betrachtung verloren, sofern sie membranständig vorliegen, was bei
einigen P450-Monooxygenasen der Fall ist. Diese könnte in einer Biotransformation mit den
Wildtyp-Stämmen gefunden werden. Bezüglich des Einfrierens der Proben ist bekannt, dass dies
mitunter Enzyme zerstört. Dies muss aber nicht immer der Fall sein – zumindest in zwei Studien
ist beschrieben, dass P450-Monooxygenasen auch das Einfrieren überstehen [275, 276]. Eine
mangelnde Sensitivität kann in diesem Experiment aufgrund der Analytik mittels GC
ausgeschlossen werden.
Eine zweite Route zu Epoxidasen wurde begangen, indem ein Stamm näher untersucht wurde,
der auf Styrol als einziger C-Quelle wachsen kann. Die Bildung kleiner Mengen Styroloxid konnte
im GC nachgewiesen werden, so dass davon auszugehen ist, dass Gordonia sp. CWB2 über eine
Styrol-Monooxygenase verfügt, mit der er sich Styrol als Kohlenstoff-Quelle erschließen kann. Um
an das Gen dieses Proteins zu gelangen, wurden zwei Wege beschritten: Zum einen wurde eine
Gen-Bank angelegt, in der auf Aktivitäts-basiertem Weg nach einer Styrol-Monooxygenase
gesucht wurde. Zum anderen wurde ein Sequenz-basierter Weg gewählt, indem eine
Amplifizierung mittels PCR erfolgte. Allerdings gelang es auf keine der beiden Weisen, ein Gen für
eine Styrol-Monooxygenase zu identifizieren. Die Genom-Dankenbank deckte mit 2.000 Kolonien
mit durchschnittlich 4,5 kb Insertgröße das Genom des Organismus etwa zweifach ab, was die
Detektion eines relevanten Gens ermöglichen sollte. Im Sequenz-basierten Screening-Ansatz
konnten durch Optimierung der Reaktionszeiten- und temperaturen drei klare Banden im
Agarosegel gefunden werden. Diese wurden sequenziert, lieferten aber keine Homologie zu den
gesuchten Genen. Daraus kann gefolgert werden, dass die Wahl der Primer nicht optimal war.
Hier lohnen sich weiterführende Untersuchungen, um das Gen zu identifizieren, das das
Wachstum des Stamms auf Styrol ermöglicht.
73
5. Zusammenfassung
5. ZUSAMMENFASSUNG
Der Einsatz von Enzymen ist inzwischen für viele Bereiche der chemischen und pharmazeutischen
Industrie beschrieben. Dabei ermöglichen die Enzyme als Biokatalysatoren in vielen Fällen
Syntheserouten, die umweltverträglichere Wege zum gewünschten Produkt darstellen als die
vergleichbaren etablierten chemischen Routen. Insbesondere ihre oft stereo-, regio- und
chemoselektiven Umsätze eröffnen Zugang zu wichtigen pharmazeutisch relevanten Produkten
und Zwischenprodukten. Der Einsatz mancher Enzymklassen ist inzwischen etabliert, wie die
hydrolytische Spaltung durch Lipasen, Esterasen oder Amidasen. In anderen Enzymklassen
dagegen sind zwar eine Reihe von Enzymen beschrieben, diese erfüllen jedoch oft noch nicht die
industriellen Anforderungen hinsichtlich Aktivität, Stabilität oder Selektivität. Insbesondere bei
den oxidativen Enzymen besteht weiterhin Bedarf an neuen oder verbesserten Biokatalysatoren.
Diese Enzyme sind aber gerade für industrielle Anwendungen interessant, da sie die Aktivierung
von C-H-Bindungen durch Hydroxylierung oder die Bildung enantiomerenreiner Epoxide aus
Alkenen ermöglichen, beides Reaktionen, die chemisch schwierig sind oder unter
umweltbelastenden Bedingungen durchgeführt werden. Das Auffinden neuer Biokatalysatoren,
die eine Transformation von chemokatalysierten zu enzymatischen Prozessen ermöglichen, stellt
die Motivation für die vorliegende Arbeit dar.
Um Zugang zu neuen Enzymen zu erlangen, bestehen die klassischen Wege in einer
Anreichungskultur aus einer Umweltprobe und der nachfolgenden Isolierung eines Organismus,
der die gewünschte Enzymaktivität aufweist, oder in der Suche in bereits angelegten
Stammsammlungen. Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass sich die meisten Mikroorganismen
unter Laborbedingungen nicht kultivieren lassen, da die Wachstumsbedingungen nicht bekannt
sind, nicht reproduziert werden können, die Organismen zu geringe Wachstumsraten aufweisen
oder bestimmte Mikroorganismen durch andere Mikroorganismen in ihrem Wachstum gehemmt
werden. Diese Organismen und ihre Enzyme stehen der Biokatalyse daher über einen klassischen
Screening-Ansatz nicht zur Verfügung. Der Metagenom-Ansatz öffnet den Zugang zu eben diesen
Enzymen. Dazu wird der Kultivierungsschritt umgangen und die DNA aus einer Umweltprobe
direkt isoliert. Diese metagenomische DNA kann entweder über einen Aktivitäts-basierten oder
über einen Sequenz-basierten Ansatz auf neue Enzyme hin untersucht werden. In der
vorliegenden Arbeit wurde der Aktivität-basierte Weg gewählt, da auf diese Weise völlig neue
Enzyme gefunden werden können, die keine Homologie zu bereits beschriebenen aufweisen.
Darüber hinaus liegen die identifizierten Enzyme aktiv in einem funktionellen Expressionssystem
vor, das nur noch optimiert werden muss.
Als Grundlage für das Screening wurden zu Beginn der Arbeit metagenomische Bibliotheken aus
verschiedenen Umweltproben angelegt. Um die Anzahl der zu durchmusternden Klone gering zu
halten, wurde ein Großteil der DNA in Cosmide kloniert. Die für das Screening zur Verfügung
stehenden Klone wurden zusätzlich durch die Bibliotheken eines Kooperationspartners ergänzt,
so dass gut 6.500 metagenomische Klone mit gut 90.000 kb DNA zur Verfügung standen, wobei
80 % der DNA in Form von Cosmiden kloniert war. Als mikrobieller Wirt für die rekombinante
Expression diente in jedem Fall Escherichia coli.
74
5. Zusammenfassung
Der Prozess des Screenings stellte den wesentlichen Teil der Arbeit dar. Dazu wurden literaturbekannte Aktivitätstests eingesetzt, die auf der Detektion der durch die Enzyme gebildeten
Produkte beruhten. Die Anforderung an diese Assays bestand darin, dass sie aufgrund ihrer
Nachweisgrenze in der Lage sind, auch schwach aktive Enzyme zu detektieren. Außerdem sollten
sie in einer angemessenen Zeit einen mittelhohen Durchsatz ermöglichen, so dass Bibliotheken
mit mehrere Tausend Klonen durchmustert werden können.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag dabei auf den oxidativen Enzymen, insbesondere den
Monooxygenasen, für die colorimetrische Assays in Mikrotiterplatten zur Verfügung standen. Die
Reaktion von Monooxygenasen, die Alkene zu Epoxiden oxidieren (wie StyrolMonooxygenasen), wurde modellhaft durch die Oxidation von Styrol zu Styroloxid
nachgewiesen. Ein weiterer Assay ermöglichte die Detektion einer Hydroxylierungsreaktion durch
P450-Monooxygenasen an einem Modellsubstrat. Zum Nachweis von Baeyer-VilligerMonooxygenasen wurde ein Assay herangezogen, der die Reaktion der Untergruppe der
4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenasen anhand einer Farbreaktion ermöglicht. Neben den
Monooxygenasen wurden die metagenomischen Bibliotheken auf Oxidasen hin gescreent, was
durch Detektion des bei der Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids möglich ist.
Zum Screening der Bibliotheken wurden die Kolonien in Deepwell-Mikrotiterplatten angezogen
und die rekombinanten Enzyme exprimiert. Für die Assays wurden entweder Zellrohextrakte oder
die ruhenden Zellen in Form einer Ganzzellbiokatalyse eingesetzt. Abgesehen von den
mitgeführten Kontrollen führte allerdings keiner der oben beschriebenen Enzymassays zur
Detektion einer Enzymaktivität. Daher wurde der Versuchsaufbau modifiziert. Insbesondere von
P450-Monooxygenasen, die aus mehreren Komponenten bestehen, ist bekannt, dass die zum
Elektronentransport benötigten Reduktasen keine integralen Bestandteile dieser Enzyme sind; sie
müssen nicht einmal unbedingt in der Nachbarschaft zu den Genen der P450-Oxygenasen liegen.
Dies führt allerdings bei metagenomischen Bibliotheken, deren Klone immer nur ein DNAFragment enthalten, dazu, dass solche Monooxygenasen nicht aktiv sind. Daher wurden während
des Screenings die Reduktase-Untereinheiten einer bekannten P450-Monooxygenase zugefügt,
um eine funktionelle Komplementierung zu ermöglichen. Trotz dieser Modifikation der
Enzymassays konnten keine Monooxygenase-Aktivitäten in den metagenomischen Bibliotheken
detektiert werden. Auch die Aktivität einer Oxidase anhand des während der Reaktion gebildeten
Wasserstoffperoxids konnte nicht nachgewiesen werden. Eine Berechnung der üblicherweise
durch die jeweiligen Enzyme gebildeten Produktmengen ergab, dass die Nachweisgrenzen der
gewählten Assays ausreichen sollten, auch schwach aktive Enzyme zu detektieren, so dass die
Schlussfolgerung gezogen wurde, dass in den untersuchten metagenomischen Klonen entweder
keine Monooxygenase-Gene für die im Screening erfassen Enzyme vorhanden sind oder diese
nicht funktionell exprimiert werden können. Für einige Gruppen der hier untersuchten Monooxygenasen ist bekannt, dass es sich um relativ seltene Enzyme handelt, was das Screening
danach zwar attraktiv, die Auffindungsraten aber gering macht.
Um ihr Potential für die Biokatalyse dennoch ausschöpfen zu können, wurden die
metagenomischen Bibliotheken neben oxidativen Enzymen auch auf Amin-Transaminasen und
Hydrolasen hin untersucht. Dazu wurde ein Transaminase-Assay genutzt, der die Bildung von
Acetophenon aus dem Aminodonor α-Methylbenzylamin spektrophotometrisch verfolgt. Die
75
5. Zusammenfassung
Aktivität einer Transaminase ließ sich darüber in den metagenomischen Bibliotheken jedoch nicht
nachweisen. Eine Limitierung des Assays stellt die geringe Menge an Zellrohextrakt dar, die in der
Reaktion eingesetzt werden kann, so dass schwach aktive oder gering exprimierte Enzyme
möglicherweise nicht auffindbar sind. Abgesehen von diesem Assay gibt es zwar eine Handvoll
weiterer Assays, die aber alle Limitierungen aufweisen, so dass sie für das Screening nicht
geeignet waren. Neben Amin-Transaminasen wurden die metagenomischen Klone auf
Aktivitäten von Esterasen, Proteasen und Phosphatasen anhand von Agarplatten-Assays
untersucht. Hier konnten für zwei Klone eine Esterase- und für drei Klone eine PhosphataseAktivität gezeigt werden. Da von diesen Klassen aber bereits viele Enzyme beschrieben sind und
sie nicht die Zielgruppe dieser Arbeit darstellten, wurden sie hier nicht näher untersucht. Die
gefundenen Enzyme lassen aber die Schlussfolgerung zu, dass das Auffinden der hier
untersuchten oxidativen Enzyme auf einem Aktivitäts-basierten Weg weit weniger wahrscheinlich
ist als das Auffinden von Hydrolasen.
Zusätzlich zum Metagenom-Ansatz wurden auch die klassischen Wege zu neuen epoxidierenden
Monooxygenasen untersucht, indem Stämme einer Stammsammlung gescreent wurde. Dazu
wurden 123 Zellrohextrakte mit Styrol und 1-Octen inkubiert und die Bildung der möglichen
Produkte mittels Gaschromatographie verfolgt. Dabei wurde berücksichtigt, dass die Epoxide
möglicherweise einer Autohydrolyse unterliegen und die Analytik auf eine Weise etabliert, die die
Detektion sowohl der Epoxide als auch der Diole ermöglicht. Unter den Zellrohextrakten der
Stammsammlung konnte keine Produktbildung nachgewiesen werden. In einem weiteren Ansatz
zu neuen Monooxygenasen wurde die Bildung von Styroloxid in einem aus einer Anreicherungskultur isolierten Organismus mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Dieser Gordonia sp.
CWB2-Stamm war in der Lage, auf Styrol als einziger Kohlenstoff-Quelle zu wachsen, wobei er
Styroloxid als Intermediat bildete, was auf einen Abbauweg über eine Monooxygenase hindeutet.
Zur Identifizierung des Gens, das für die Monooxygenasen codiert, wurde eine Genombibliothek
angelegt und nach Styrol-Monooxygenase-Aktivität gescreent, sowie ein PCR-basierter
Amplifikations-Ansatz verfolgt.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die unterschiedlichen Wege, über den Aktivitätsbasierten Metagenom-Ansatz zu neuen oxidativen Enzymen zu gelangen, ausführlich diskutiert.
Die betrachteten Punkte betreffen die Auswahl der Biotope, die DNA-Isolierungsmethoden, die
Auswahl geeigneter Vektoren und Wirte sowie die Nachweisempfindlichkeit und HochdurchsatzFähigkeit der verwendeten Assays. Des Weiteren wurde der Zusammenhang zwischen der Größe
der oxidierenden Enzyme, der Insertgröße und der Größe der Bibliothek, die durchmustert
werden muss, um ein aktives Enzym nachweisen zu können, im Detail erörtert. Dabei wurde die
Schlussfolgerung gezogen, dass der Metagenom-Ansatz grundsätzlich ein großes Potential zur
Detektion neuer Enzyme für die Biotechnologie birgt, aber auch Grenzen beim Auffinden
komplexer, großer oder seltener Enzyme aufweist.
76
6. Materialien und Methoden
6. MATERIALIEN UND METHODEN
6.1. Materialien
6.1.1. Geräte
Tab. 6.1. Geräte und Hersteller.
Gerät
Spezifikation
Hersteller (Ort)
Autoklav
V-120
Systec (Wettenberg)
Brutschränke
Friocell
Incucell
Medcenter-Einrichtungen (Gräfelfing)
DNA-Elektrophorese
Mini-sub Cell GT
BioRad (München)
FrenchPress
French Pressure Cell Press
Thermo Fisher Scientific (Langenselbold)
Gaschromatograph
GC-2010
Shimadzu (Duisburg)
GC-MS
GCMS-QP 2010S
Shimadzu (Duisburg)
GC-Trennsäule BPX5
Forte BPX5 (5 % Phenyl
Polysilphenylenesiloxane)
(25 m x 0,25 mm)
SGE (Milton Keynes, USA)
Gefriertrockner
Alpha 1-2
Christ (Osterode am Harz)
Homogenisator
Ultra Turrax T25 basic
IKA Labortechnik (Staufen)
Inkubatoren
Minitron
Unitron
Infors AG (Bottmingen, CH)
MikrotiterplattenSpektrophotometer
Varioscan
FLUOstar Optima
Thermo Electron (Langenselbold)
BMG Labtech (Ortenberg)
Netzgeräte für Proteinund DNA-Elektrophorese
EPS 301
Amersham Biosystems (Uppsala, SE)
PCR-Geräte
Thermocycler ProGene
FlexCycler
Techne (Cambridge, UK)
Analytik Jena (Jena)
pH-Meter
Microprocessor HI 9321
Hanna Instruments (Kehl am Rhein)
Protein-Elektrophorese
Mini-PROTEAN 3
Biometra (Göttingen)
Thermomixer
Thermomixer comfort
Eppendorf (Wessling-Berzdorf)
Ultraschall
Sonoplus UW 2070
Bandelin electronic (Berlin)
UV/VIS
Spektrophotometer
UV Mini 1240
NanoDrop ND-1000
V-550
Shimadzu (Duisburg)
Peylab Biotechnologie (Erlangen)
Jasco (Groß-Umstadt)
Vakuumkonzentrator
Jouan RCT60 und RC 10-10
Thermo Electron (Langenselbold)
Waagen
R180D
AC120S
Satorius research (Göttingen)
Zellhomogenisator
Fastprep 24
MP Biomedicals (Illkirch Cedex, FR)
Zentrifugen
Biofuge fresco
Labofuge 400 R
Multifuge 3 S-R
Biofuge pico
Fresco 17
Thermo Fisher Scientific (Langenselbold)
77
6. Materialien und Methoden
6.1.2. Chemikalien, molekularbiologische Kits und Enzyme
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden von Fluka (Buchs, Schweiz), Sigma-Aldrich
(Steinheim), Merck (Darmstadt), VWR (Hannover), Roth (Karlsruhe), Fermentas (St. Leon-Rot) und
StarLab (Ahrensburg) bezogen. Primer wurden von Invitrogen (Paisley, Schottland) hergestellt.
Molekularbiologische Enzyme wurden von Fermentas (St. Leon-Rot) oder New England Biolabs
(Frankfurt) bezogen.
Tab. 6.2. Verwendete Materialien und Verbrauchsmittel sowie Bandenmuster des eingesetzten DNAGrößenmarkers für die Agarose-Gelelektrophorese (Abb. rechts).
Materialien
Hersteller (Ort)
1 kbp DNA-Leiter (siehe Abb. rechts)
Roth (Karlsruhe)
Gigapack Gold Packaging Extract
Invitrogen (Darmstadt)
Glasperlen (0,1-0,11 mm und 2 mm)
Satorius (Göttingen)
High Pure PCR Cleanup Micro Kit
Roche (Penzberg)
Plasmid-Isolations-Kit GeneJet
Fermentas (St. Leon-Rot)
QIAprep Spin Miniprep Kit
QIAquick PCR Purification Kit
QIAquick Gel Extraction Kit
DNeasy Blood & Tissue Kit
Qiagen (Hilden)
RotilabTM Verschlussfilm für Zellkulturplatten
Roth (Karlsruhe)
TOPO-TA Klonierungskit
Invitrogen (Darmstadt)
Ultrazentrifugationsfilter
Satorius (Göttingen)
6.1.2. Medien, Puffer und Lösungen
Tab. 6.3. Verwendete Medien und Zusätze.
78
Medium / Lösung
Zusammensetzung
Luria-Bertani Medium (LB)
0,5 % Hefeextrakt
1,0 % Trypton
1,0 % NaCl
in A. dest.
LB-Agar Nährmedium
1,5 % Agar in LB-Medium
LB-SOC Medium
10 % sterile 10x SOC-Lösung in sterilem LB-Medium
10x SOC Lösung
0,2 % KCl
2,0 % MgCl2
2,0 % MgSO4
4,0 % Glucose
sterilfiltriert
L-Rhamnose-Lösung
Stammlösung: 20 % L-Rhamnose in A. dest., sterilfiltriert
Endkonzentration: 0,2 %
IPTG-Lösung
Stammlösung: 1 M Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG)
in A. dest., sterilfiltriert
Endkonzentration: 0,5 mM
6. Materialien und Methoden
Medium / Lösung
Minimial-Medium nach Hundt [277]
Zusammensetzung
90 % sterile Salzlösung,
10 % sterile Spurenelementlösung
Salzlösung für Minimal-Medium
5,00 g NH4H2PO4
2,50 g K2HPO4
0,50 g NaCl
0,50 g MgSO4 x 7 H2O
0,46 g K2SO4
0,07 g CaCl2
auf 900 ml mit A. dest. aufgefüllt, pH 6,3 eingestellt,
autoklaviert
Spurenelementlösung für
Minimal-Medium
0,5 mg H3BO3
0,1 mg CuSO4 x 5 H2O
0,1 mg KI
0,4 mg MnSO4 x 5 H2O
0,4 mg ZnSO4 x 7 H2O
0,2 mg Na2MoO4
0,1 mg CoCl3
auf 100 ml mit A. dest. aufgefüllt, autoklaviert
Ampicillin
Stammlösung: 100 mg/ml in A. dest.
Endkonzentration: 100 μg/ml
Kanamycin
Stammlösung: 50 mg/ml
Endkonzentration: 50 μg/ml
Tab. 6.4. Verwendete Puffer und Lösungen.
Puffer / Lösung
Zusammensetzung
Agarose-Gel
0,8 – 2 % Agarose in 1x TAE-Puffer
APS-Lösung
10 % Ammoniumpersulfat in A. dest.
Bradford-Stammlösung
0,1 g Coomassie-Brilliant-Blue G 250; 50 ml 50 %
Ethanol; 100 ml 85 % Phosphorsäure; 250 ml A. dest.
Coomassie-Färbelösung
1 g Coomassie- Brilliant- Blue G 250; 100 ml Essigsäure;
300 ml Methanol; ad 1 l A. dest.
Entfärbe-Lösung
100 ml Essigsäure; 300 ml Ethanol; ad 1 l A. dest.
Lysispuffer
Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5); 1 %
BugBuster®; 0,1 % DNase-Lösung (1 mg/ml in A. dest.)
Natriumphosphatpuffer (50 mM
pH 7,5)
77,4 ml 1 M Na2HPO4; 22,6 ml 1 M NaH2PO4; ad 1 l A.
dest.
Probenpuffer für SDS-PAGE
3,55 ml A. dest.; 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl pH 8; 2,5 ml
Glycerol; 2,0 ml 10 % SDS; 0,2 ml 0,5 %
Bromphenolblau; 0,5 ml β-Mercaptoethanol; ad 10 ml
A. dest.
RF1-Lösung
100 mM RbCl2; 50 mM MnCl2; 30 mM KOAc; 10 mM
CaCl2; 15 % Glycerol; pH auf 5,8 mit 0,2 M CH3COOH
eingestellt; sterilfiltriert
RF2-Lösung
10 mM RbCl2; 75 mM CaCl2; 10 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure(MOPS); 15 % Glycerol; auf pH 7
eingestellt
SDS-PAGE Laufpuffer (10x)
30,3 g Tris; 144 g Glycin; 10 g SDS; in A. dest. lösen;
pH 8,4; ad 1 l A. dest.
79
6. Materialien und Methoden
Puffer / Lösung
Zusammensetzung
TAE-Puffer (50x)
242 g Tris; 57,1 ml Eisessig; 100 ml 0,5 M EDTA pH 8; ad
1 l A. dest.
TE-Puffer
10 mM Tris HCl, pH 8,1, 1 mM Na2EDTA
Tris-Puffer für SDS-PAGE
(Sammelgel)
6 g Tris; 0,1 g SDS; ad 100 ml A. dest.
Tris-Puffer für SDS-PAGE
(Trenngel)
18,2 g Tris; 0,1 g SDS; ad 100 ml A. dest.
6.1.3. Bakterien-Stämme
Tab. 6.5. Verwendete Bakterien-Stämme und deren Genotyp.
Stamm
Genotyp
Hersteller
E. coli DH5α
F- supE44 Δ lacU169 (Ф80lacZ_M15)
hsdR17
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 λ-
Novagen (Madison, USA)
E. coli BL21 (DE3)
F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)
Invitrogen (Carlsbad, USA)
E. coli VCS257
DP50 sup F[supE44 supF58 hsd53(rBmB)
dapD8 lacY1glnV44 Δ(gal-uvrB)47
tyrT58 gyrA29 tonA53 Δ(thyA57)]
Stratgene (Heidelberg)
E. coli JM101
F´ traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/
Δ(lac-proAB) glnV thi
New England Biolabs
(Frankfurt)
Gordonia sp. CWB2
Wildtyp
Stammsammlung der
Technischen
Bergakademie Freiberg
6.1.4. Molekularbiologische Primer & Vektoren
Tab. 6.6. Eingesetzte Primer für die Amplifikation einer Styrol-Monooxygenase.
80
Primer
Sequenz
StyAB_fw_1
CCG GCC TCC ATC TTG CCC TCG GCC T
StyAB_fw_2
TCG CCC TTC GAG AAG CCG CAA CGN GCN CT
StyAB_fw_3
GGC CAG GCG CGA ACA TGG CGT CCT A
StyAB_rv_1
CGG GTA GTT GAA GTT GTC CGT GAA CTC
StyAB_rv_2
AGG AAG GNG AGG AAC TCC GGC GGA AGT GCC G
StyAB_rv_3
GAA GGN GAG GAA CTC CGG CGG AAG TGC
StyAB_rv_4
CGC CAT GTT CGC GCC CTG GCC CAN GAC CGG
StyA2B_fw_1
GCN ATC GTC GGN GCC GGN NAC ANT CCG G
StyA2B_fw_2
CTC AAC GAT CCG NTC ACC GGG CAG GG
StyA2B_rv_1
GGN GTG GMG AAC TGC CGG GAC AGG TCG TGC
StyA2B_rv_2
CAG CGG CGG ATC GAK NGA CAC CGS G
StyA2B_rv_3
GCR GTC CAT CGG NCC GCC SGG CAC GCC
6. Materialien und Methoden
Tab. 6.7. Molekularbiologische Vektoren, die für die Konstruktion von (meta)genomischen Bibliotheken
genutzt wurden.
Vektor
Typ
Hersteller
pWE15
Cosmid
Stratagene (La Jolla, USA)
pJOE930
Plasmid
Altenbuchner et al. [244]
6.1.5. Software und Internet-Datenbanken
Tab. 6.8. Software und Internet-Datenbanken.
Datenbank
Internet-Seite (Stand: Juli 2012)
Anwendung
BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
Homologie-Recherche
von Nukleotid- und
Protein-Sequenzen
BRENDA
http://www.brenda-enzymes.info
Informationen über
Enzym-Eigenschaften
clustalW
http://www2.ebi.ac.uk/CLUSTALW
Alignment von Nukleotidund Protein-Sequenzen
NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Genom- und ProteinDatenbank des National
Center for Biotechnology
Information (USA)
P450-Datenbank
http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html
P450- Datenbank
P450-Datenbank
http://www.cyped.uni-stuttgart.de
P450-Engineering
Datenbank
Proteindatenbank
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
Informationen über
Protein-Strukturen
Pymol
http://pymol.sourceforge.net
Betrachung von ProteinStrukturen
http://www.geneious.com
Virtuelle Planung von
Klonierungsexperimenten
und Auswertung von
Sequenzierungen
GENEious
6.2. Mikrobiologische Methoden
6.2.1. Stammhaltung
Zur langfristigen Aufbewahrung von Mikroorganismen wurden Glycerolstocks angelegt, die bei
-80 °C gelagert wurden. Dazu wurden die Stämme für acht Stunden in einem sterilen Reagenzglas
in Flüssigmedium angezogen und mit 60 %igem sterilem Glycerol versetzt, so dass eine Endkonzentration von 20 % in 1,5 ml-Kulturen erreicht wurde. Mikrotiterplatten wurden nach einer
Kultivierung über Nacht bei 37 °C und 200 rpm mit 50 %igem sterilem Glycerol auf eine Endkonzentration von 10 – 15 % Glycerol verdünnt.
Die kurzfristige Lagerung von Stämmen erfolgte auf Agarplatten mit entsprechenden Antibiotika,
die bei 4 °C für maximal vier Wochen gelagert wurden.
81
6. Materialien und Methoden
6.2.2. Übernachtkulturen
Zur Anzucht von Übernachtkulturen (ÜN-Kulturen) wurden je 3 ml bzw. 5 ml LB-Medium verwendet. Die Kultivierung verlief in sterilen Reagenzgläsern, welche bei Bedarf mit entsprechenden
Antibiotika versetzt wurden. Mittels steriler Zahnstocher wurden die Medien mit Einzelkolonien
von Agarplatten oder von Glycerolkulturen angeimpft. Anschließend wurden die Reagenzgläser
über Nacht bei 37 °C und 220 rpm inkubiert.
6.2.3. Kultivierung und rekombinante Proteinexpression in Schüttelkolben
Zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in Form von Zellrohextrakten wurden 50 ml bis
400 ml Kultivierungsmedium (LB- oder TB-Medium) mit entsprechenden Antibiotika versetzt und
mit einer Übernachtkultur auf eine OD600 von 0,05 angeimpft (etwa 1:100). Die Inkubation erfolgte
bei 37 °C und 200 rpm bis zu der OD600, bei der die Proteinexpression induziert wurde, was in der
Regel um OD600 = 0,5 - 0,8 war. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe eines geeigneten
sterilfiltrierten Induktors ausgelöst. Bei pET Vektoren wurde IPTG in einer Endkonzentration von
0,5 mM eingesetzt, bei Vektoren der pJOE oder pGASTON Serien L-Rhamnose in einer Endkonzentraion von 0,2 %. Um die Bildung von inclusion bodies zu vermeiden, wurden die Kolben
anschließend bei einer niedrigeren Temperatur (20 – 25 °C) weiter inkubiert. In regelmäßigen
Abständen wurden Proben genommen, um Wachstum und Proteinexpression über die Zeit zu
verfolgen. Diese Proben wurden auf die Zellzahl normiert (1/OD600 oder 5/OD600), mit Ultraschall
oder Glasperlen aufgeschlossen und auf Polyacrylamid-Gele aufgetragen. Die Ernte der Zellen
erfolgte je nach Protein 4 bis 18 Stunden nach der Induktion.
6.2.4. Rekombinante Expression von StyAB aus Pseudomonas sp. VLB120
Die Monooxygenase StyAB aus Pseudomonas sp. VLB120 diente als Positiv-Kontrolle und wurde
wie in der Literatur beschrieben exprimiert [249]. Das Gen lag im Plasmid pSPZ10 in E. coli JM101
vor. Die Kultivierung erfolgte in LB-Kanamycin Medium mit einer Anfangs-OD600 von 0,05 bei 37 °C
bis zu einer OD600 von 0,5. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte durch Zugabe von 0,05 %
Dicyclopropylketon. Die Proteinexpression war innerhalb einer halben Stunde deutlich zu
erkennen, da das Kultivierungsmedium durch das gebildete Indigo eine tiefblaue Farbe annahm.
Sechs Stunden nach Induktion erfolgte die Ernte der Zellen durch Zentrifugation.
6.2.5. Rekombinante Expression von P450-BM3 aus Bacillus megaterium
Die Monooxygenase P450-BM3 aus Bacillus megaterium diente als Positiv-Kontrolle und wurde
wie in der Literatur beschrieben in E. coli DH5α exprimiert [248]. Das Gen lag in dem
Expressionsvektor pCYTEX1 unter Kontrolle des temperatur-induzierbaren PRPL-Promotors vor.
Der Stamm wurde in 500 ml TB-Ampicillin Medium unter Zusatz von Thiamin (5 μg/ml), δ-Aminolevulinsäure (0,0125 mg/ml) und 125 μl Spurenelementen (0,5 g MgCl2, 30,0 g FeCl2 x 6 H2O, 1,0 g
ZnCl2 x 4 H2O, 0,2 g CoCl2 x 6 H2O, 1,0 g Na2MoO4 x 2 H2O, 0,5 g CaCl2 x 2 H2O, 1,0 g CuCl2 und 0,2 g
H2BO3 in 1 l HCl Lösung bestehend aus 90 % dest. Wasser und 10 % conc. HCl). Nach der
Inoculation aus einer Übernacht-Kultur erfolgte die Anzucht bei 30 °C und 200 rpm. Kurz vor der
Induktion wurde 0,1 mg/l FeCl3 zugesetzt, um die Bildung aktiven Enzyms zu erhöhen. Bei einer
OD600 von 1,0 wurde die Proteinexpression ausgelöst durch Erhöhung der
82
6. Materialien und Methoden
Kultivierungstemperatur auf 42 °C. Nach fünf Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation bei
4 °C geerntet. Für den Aktivitätsassay wurde das Rohextrakt durch Ultraschall-Aufschluss
gewonnen.
6.2.6. Rekombinante Expression der HAPMO aus Pseudomonas putida JD1
Die 4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase aus Pseudomonas putida JD1 wurde wie in der
Literatur beschrieben kultiviert [173]. Das Gen lag in einer Codon-optimierten Variante in einem
pET28b Vektor vor und wurde in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Dazu wurde TB-Kanamycin Medium
mit einer OD600 von 0,05 aus einer Übernacht-Kultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,6 - 0,8
bei 37 °C angezogen. Die Expression wurde durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert und die
Kultivierung bei 20 °C fortgesetzt, um die Bildung von inclusion bodies zu vermeiden. Die Ernte
erfolgte 12 Stunden nach Induktion.
6.2.7. Rekombinante Expression der Reduktase-Untereinheiten PdR und PdX
Die Gene für die beiden Reduktase-Untereinheiten Putidaredoxin (PdX) und PutidaredoxinReduktase (PdR) lagen in einem pET28a(+)-Vektor vor und wurden in E. coli BL21 (DE3) exprimiert.
Dazu wurden die Zellen bis zu einer OD600 von 0,5 bei 37 °C inkubiert und die Proteinexpression
durch Zugabe von 0,5 mM IPTG induziert. Die Ernte erfolgte acht Stunden nach der Induktion.
6.2.8. Rekombinante Expression von Transaminasen
Drei Transaminasen wurden als positive Kontrollen exprimiert. Die Gene dafür waren bereits
zuvor im Arbeitskreis kloniert worden. Die Transminasen aus Vibrio fluvialis, Giberella zeae und
Silicobacter pomeroyi wurden in E. coli BL21 (DE3) in Schikanekolben exprimiert. Das Medium
wurde mit einer OD600 von 0,05 aus einer Übernachtkultur angeimpft, für eine Stunde bei 37 °C
inkubiert und anschließend bei 30 °C weiter angezogen bis zu einer OD600 von 0,8. Die Induktion
erfolgte mit 0,2 % Rhamnose (End-Konzentration) für den pGASTON Vektor bzw. mit 0,5 mM IPTG
(End-Konzentration) für den pET Vektor. Für die Expression wurden die Kulturen für weitere
12 Stunden bei 20 °C inkubiert.
6.2.9. Kultivierung und rekombinante Expression in Mikrotiterplatten
Zur Kultivierung von verschiedenen Klonen in Mikrotiterplatten wurden diese zunächst in einer
Vorkultur auf eine konstante Zelldichte gebracht, da beim Animpfen stets eine unterschiedliche
Zellzahl in die einzelnen Vertiefungen gelangt. Daher wurde eine Vorkultur der Platten über Nacht
bei 37 °C in 150 μl LB- oder TB-Medium inkubiert, wobei durch eine mit feuchtem Zellstoff
ausgelegte Box darauf geachtet wurde, dass die Platten nicht austrocknen. Die Zellen wurden für
die folgenden Experimente in frische Mikrotiterplatten überimpft. Dazu wurden die
angewachsenen Zellen entweder in frische, flache Mikrotiterplatten (50 μl ÜN-Kultur auf 200 μl
frisches Medium) oder in Deepwell-MTP (100 μl ÜN-Kultur auf 800 μl frisches Medium) überführt.
Die Kultivierung konnte anschließend in den frischen Mikrotiterplatten fortgesetzt werden. Wie
auch bei der Kultivierung in Schüttelkolben wurde die Expression der Proteine durch Zugabe
eines geeigneten Induktors ausgelöst und die Kultivierung anschließend bei verringerter
83
6. Materialien und Methoden
Temperatur (25 °C) fortgesetzt, um die Bildung von inclusion bodies zu veringern. Die Expression
wurde unterschiedlich lange durchgeführt, je nachdem, auf welches Enzym gescreent werden
sollte. Für Baeyer-Villiger Monooxygenasen ist bekannt, dass ihre Aktivität nach einer zu langen
Kultivierungszeit wieder abnimmt, so dass die Ernte bereits sechs bis acht Stunden nach
Induktion erfolgte. Zum Screening auf andere Enzymklassen wurden die Zellen für bis zu
24 Stunden exprimiert, um eine möglichst hohe Enzymmenge zu produzieren. Die Ernte erfolgte,
indem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden. Für die Experimente mit ganzen Zellen
wurden diese lediglich mit Natrium-Phosphatpuffer gewaschen. Für die Gewinnung von
Zellrohextrakt wurden die Zellen in Lysispuffer mit Lysozym und DNase aufgenommen, eine
Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend für eine Stunde bei 3.000 x g zentrifugiert, um im
Überstand das Zellrohextrakt zu gewinnen, mit dem die Aktivitätstests durchgeführt wurden.
6.2.10 Kultivierung des Stammes Gordonia sp. CWB2
Der Organimus Gordonia sp. CWB2 wurde auf Minimal-Medium nach Hundt [277] angezogen, das
Salze und Spurenelemente enthielt. Als Kohlenstoff-Quelle wurden 20 mM Styrol zugesetzt. Die
Anzucht erfolgte bei 25 °C und 180 rpm über mehrere Tage.
6.2.11. Gewinnung von Zellrohextrakten
Die Ernte der Zellen erfolgte stets durch Zentrifugation für 15 min bei 4.000 x g, bei kleinen
Volumina bei 13.000 x g für 10 min. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen mit Puffer
gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurden die Zellen
im Aufschlusspuffer aufgenommen. Die Puffer zum Waschen und für den Aufschluss waren in der
Regel Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5), bei Transaminasen ein HEPES Puffer (50 mM,
pH 8,0) mit 0,1 mM PLP (Lagerung für maximal eine Woche bei 8 °C). Der Zellaufschluss erfolgte in
Abhängigkeit vom Volumen mit Ultraschall, der FrenchPress oder einer Glasperlenmühle. Für den
Ultraschall-Aufschluss wurde bei größeren Volumina auf eine OD600 von 40 verdünnt und zweimal
für je 10 min mit 50 % Power aufgeschlossen. Kleine Proben für die SDS-PAGE wurden einmal für
1 min aufgeschlossen. Die FrenchPress wurde bei größeren Probemengen eingesetzt. Das
Zellpellet einer 400 ml Kultur wurde in 35 ml Aufschlusspuffer resuspendiert und zweifach in der
vorgekühlten French Press bei 1.700 psi homogenisiert. Für den Zellaufschluss mit Glaskügelchen
wurde ein FastPrep Zellhomogenisator verwendet. Die im Aufschlusspuffer resuspendierten
Zellpellets wurden mit Glasperlen (0,1 mm) versetzt und beispielsweise dreimal für je 20 sec bei
4 m/s homogenisiert. Für jedes Enzym wurde die Anzahl und Dauer optimiert. Zwischen den
Zyklen wurden die Proben auf Eis abgekühlt.
Nach dem Aufschluss wurden die Rohextrakte durch hochtouriges Zentrifugieren (30 min bei
8.000 x g) von den Zellbruchstücken befreit. Nach Bedarf wurden sie für eine Stunde bei – 80 °C
eingefroren und anschließend über Nacht lyophilisiert.
6.2.12. Chemisch-kompetente E. coli Zellen (Rubidiumchlorid-Methode)
Die Herstellung chemisch-kompetenter Zellen erfolgte nach der Rubidiumchlorid-Methode nach
Hanahan [278]. Hierfür wurden zunächst 100 ml LB-SOB-Medium mit einer Übernachtkultur des
entsprechenden Stammes angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,3 – 0,5 bei 37 °C inkubiert. Die
84
6. Materialien und Methoden
Zellen wurden für 15 min auf Eis inkubiert und anschließend durch Zentrifugation (10 min,
4.000 x g, 4 °C) pelletiert. Die folgenden Lösungen und Materialien wurden zuvor vorgekühlt. Das
Zellpellet wurde vorsichtig in 30 ml RF1-Lösung resuspendiert und erneut 15 min auf Eis
inkubiert. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für 10 min bei 4.000 x g und 4 °C, wonach
der Überstand verworfen und das Pellet in 4 ml RF2-Lösung resuspendiert wurde. Nach einer
letzten Inkubationszeit von 15 min auf Eis wurde die Zellsuspension in 50 μl Aliquots in sterile,
vorgefrorene 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und sofort bei – 80 °C tiefgefroren. Die auf diese
Weise erhaltenen kompetenten Zellen konnten anschließend mit Plasmid-DNA transformiert
werden.
6.2.13. Hitzeschock-Transformation von chemo-kompetenten E. coli Zellen
Zu 50 μl auf Eis aufgetauten, kompetenten E. coli Zellen wurden 2 μl Plasmid-DNA (ca. 40 ng/μl)
oder 10 μl eines Ligationsansatzes gegeben und die Mischung für 30 min auf Eis inkubiert. Der
Hitzeschock wurde ausgelöst, indem der Transformationsansatz für 45 sec in ein 42 °C heißes
Wasserbad gestellt wurde. Nach einer zweiminütigen Erholungszeit auf Eis wurden 500 μl
vorgewärmtest LB-SOC Medium zugegeben und die Zellen für eine Stunde bei 37 °C und 200 rpm
geschüttelt, um eine Antibiotikaresistenz auszubilden. Zur Selektion der transformierten Zellen
wurden 50 bis 500 μl der Zellsuspension auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika
ausplattiert und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
6.2.14. Elektrokompetente Zellen
Für die Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen wurden 50 ml LB-Medium mit einer
Übernachtkultur auf eine OD600 von 0,05 angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5 – 0,7 bei 37 °C
angezogen. Die Kultur wurde zunächst für 15 min auf Eis inkubiert, bevor die Zellen durch
Zentrifugation (10 min, 4000 x g, 4 °C) pelletiert wurden. Der Überstand wurde verworfen und das
Pellet drei- bis fünfmal mit je 20 ml sterilem, eiskaltem 10 %igem Glycerol in Wasser gewaschen,
um alle Salze zu entfernen. Schließlich wurde das Zellpellet in 500 μl eiskaltem 10 %igem Glycerol
resuspendiert und in sterile Reaktionsgefäße zu je 100 μl aliquotiert. Die elektrokompetenten
Zellen wurden sofort bei - 80 °C tiefgefroren und standen zur Elektroporation bereit.
6.2.15. Transformation über Elektroporation
Zu 100 μl elektrokompetenten E. coli Zellen wurden maximal 10 μl Plasmid-DNA (ca. 25 ng in
destilliertem Wasser) gegeben. Falls die Plasmid-DNA nicht in Wasser, sondern in TE-Puffer vorlag,
wurde sie zuvor entsalzt, indem ein Tropfen auf eine Entsalzungs-Membran gegeben wurde, die
schwimmend auf destilliertes Wasser gelegt wurde. Die Zellsuspension mit der Plasmid-DNA
wurde blasenfrei in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt und bis zur Elektroporation auf Eis gelagert. Die Elektroporation erfolgte für 5 ms bei 2.500 V. Direkt nach dem
Elektroimpuls wurde 1 ml vorgewärmtes LB-SOC Medium in die Küvette gegeben, die
Zellsuspension in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und für 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt.
Anschließend wurden die Zellen auf Agarplatten mit geeigneten Antibiotika ausplattiert und über
Nacht bei 37 °C inkubiert.
85
6. Materialien und Methoden
6.2.16. Herstellung Phagen-kompetenter Zellen
Als Wirtsstamm für die Transfektion mit Phagen diente der Stamm E. coli VCS 257. Von einer frisch
ausgestrichenen Platte wurden 10 ml LB-Medium mit 0,2 % Maltose und 10 mM MgSO4 angeimpft
und bis zu einer OD600 von 1 angezogen. Die Kultur wurde für 10 min auf Eis gekühlt und
abzentrifugiert (4 °C, 10 min, 2.000 x g). Das Pellet wurde in 5 ml 10 mM MgSO4 aufgenommen.
Die OD600 wurde gemessen und auf 0,5 eingestellt. Die Zellen wurden sofort mit den Phagen
infiziert.
6.3. Molekularbiologische Methoden
6.3.1. Isolierung von Plasmid- und Cosmid-Vektoren
Die Isolierung von Vektor-DNA aus E. coli erfolgte mit dem GeneJet Plasmid Miniprep von
Fermentas nach Angaben des Herstellers. Die Kontrolle der DNA-Qualität erfolgte über ein
Agarosegel und mit Hilfe eines NanoDrop Spektrophotometers, bei dem die Extinktion bei
260 nm und 280 nm gemessen wurde. Ein Quotient von E260nm / E280nm von 1,8 wies auf reine DNA
hin. Aus der Extinktion bei 260 nm ließ sich darüber hinaus die DNA-Menge bestimmen.
6.3.2. Sequenzierungen
Sequenzierungen wurden bei GATC Biotech (Konstanz) durchgeführt.
6.3.3. Probennahme von Umweltproben für die DNA-Isolierung
Generell wurde bei der Entnahme von Umweltproben beachtet, dass diese möglichst direkt auf
Eis gekühlt wurden und die DNA zeitnah extrahiert wurde. Die Probennahme erfolgte in einem
heimischen Komposthaufen an einer Stelle, die gut zersetzt war, in der sich aber auch noch
Überreste der Substrate befanden. Die Bodenproben aus Wäldern wurden in der Greifswalder
Umgebung genommen. Eine Probe wurde aus einem Buchenwald im Randbereich des Eldenaer
Elisenhains genommen am Übergang zum Offenland, eine Probe aus Lanken bei Ludwigsburg am
Übergang des Kiefernwaldes zum Strand und eine im Arboretum der Universität Greifswald. Die
Sandproben wurden am Greifswalder Bodden am Strand von Eldena und am Loissiner Strand
genommen sowie in der Nähe von Bremerhaven (diese Probe konnte nicht durchgehend gekühlt
werden) sowie auf einer sandigen Ruderalfläche in Greifswald, die nicht in der Nähe des Strandes
lag. Die Strandsandproben wurden aus dem Bereich entnommen, der regelmäßig mit
salzhaltigem Wasser überflutet wird. Zur Gewinnung von DNA aus einem Küchen-Schwammtuch
wurde dieses 4 – 6 Wochen im normalen Küchengebrauch zum Abwasch und zur Reinigung des
Küchenbereiches genutzt und dabei immer wieder ausgespült. Um die Bakterienmenge zu
erhöhen, wurde es im Anschluss für eine Woche feucht gelagert und in dieser Zeit nicht
ausgespült.
6.3.4. Extraktion metagenomischer DNA aus Bodenproben nach Yeates
Für die Extraktion von Bodenproben nach Yeates et al. [236] wurden 50 g Bodenprobe mit 50 ml
Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM Na2EDTA, pH 8,0, 1,5 mM NaCl) gemischt. Bei
86
6. Materialien und Methoden
zwei parallelen Experimentreihen wurde ein Teil der Probe mit Glasperlen (2 mm Durchmesser)
versetzt, der andere Teil nicht. Die Proben wurden für 2 min gevortext. Anschließend wurden
0,25 ml Proteinase K (20 mg/ml) hinzugegeben und die Proben für 30 min bei 37 °C unter
Schütteln inkubiert. Es wurden 5 ml einer 20 %igen SDS-Lösung hinzugefügt und die Proben für
zwei Stunden bei 65 °C aufgeschlossen. Durch einen Zentrifugationsschritt bei Raumtemperatur
(20 min bei 4.000 x g) wurde die feste Phase sedimentiert und der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion der festen Phase wurde wiederholt und die Überstände
aus beiden Schritten vereinigt.
Die vereinigten Überstände wurden mit einem halben Volumen einer Polyethylenglycol-Lösung
(30 % PEG, 1,6 M NaCl) versetzt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die vorgereinigte DNA wurde durch Zentrifugation (45 min bei 8.000 x g) pelletiert und in 10 ml TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 1 mM Na2EDTA) resuspendiert. Natriumacetat-Lösung (7,5 M) wurde zu
einer Endkonzentration von 0,5 M zugesetzt und die Proben auf Eis inkubiert. Durch
Zentrifugation (30 min bei 16.000 x g) wurden Proteine und Polysaccharide pelletiert. Der
wässrige Überstand wurde mit Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert und die DNA durch
Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol präzipitiert. Nach Inkubation für zwei Stunden bei
Raumtemperatur wurde die DNA durch Zentrifugation pelletiert und anschließend in 0,5 ml
TE-Puffer resuspendiert. Die Qualität wurde über ein Agarosegel und über Sepktroskopie mittels
NanoDrop überprüft.
6.3.5. Extraktion metagenomischer DNA aus Bodenproben nach Zhou
Das Protokoll von Zhou et al. [237] zur Extraktion von DNA aus Böden wurde modifiziert und wie
folgt durchgeführt: 10 g Bodenprobe wurden mit 26 ml Extraktionspuffer nach Zhou (100 mM
Tris, 100 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 0,1 % Cetyltrimethylammoniumbromid CTAB, pH 8,0) versetzt und
durch Vortexen gründlich durchmischt. Durch drei aufeinanderfolgende Frier-Tau-Zyklen in
flüssigem Stickstoff und einem Wasserbad mit 65 °C wurde die Probe mit 0,25 ml Proteinase K
(20 mg/ml) vesetzt und für 30 min bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden 3 ml
SDS (20 %) hinzugefügt und der Ansatz für zwei Stunden zu 65 °C in ein Wasserbad gestellt, wobei
er alle 20 min durch Schwenken gemischt wurde. Nach der Zentrifugation (15 min bei 4.000 x g,
RT) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Pellet erneut extrahiert.
Die Überstände wurden vereinigt, mit 1/10 Volumen 10 % CTAB-Lösung versetzt und noch einmal
zentrifugiert (15 min bei 4.000 x g). Zur Reinigung der DNA wurde diese wiederholt mit
Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert (durch Schütteln und anschließende Zentrifugation
für 10 min bei 4.000 x g) bis sich keine Interphase mehr bildete. Die wässrige Phase wurde auf 1 ml
Aliquots aufgeteilt und je mit 0,7 Volumen Isopropanol versetzt, für 2 Stunden bei RT inkubiert,
um die DNA zu fällen und zentrifugiert (30 min bei 13.000 x g und 4 °C). Die Pellets wurden mit
70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 μl Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) aufgenommen.
6.3.6. Feinreinigung metagenomischer DNA über Spin-Säulchen
Die metagenomische DNA wurde im Anschluss an die Extraktion über Spin-Säulchen aus dem
DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die Qualität
wurde anschließend über ein Agarosegel und über Spektrophotometrie (NanoDrop) kontrolliert.
87
6. Materialien und Methoden
6.3.7. Feinreinigung metagenomischer DNA über ein Agarosegel I
Um DNA aus einem Agarosegel zu isolieren, lässt sich neben den klassischen Aufreinigungs-Kits,
die für hochmolekulare DNA nicht geeignet sind, auch Agarase einsetzen, die die Agarose spaltet.
Dabei muss allerdings niedrig schmelzende Agarose verwendet werden. Die DNA wurde dazu auf
einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt bis sich die Abtrennung von DNA und Huminstoffen
beobachten ließ (Huminstoffe weisen eine gelb-bräunliche Färbung auf, DNA ist im UV-Bereich
sichtbar). Der Bereich mit der sauberen hochmolekularen DNA wurde mit Hilfe eines Skalpells
ausgeschnitten. Das Agarose-Fragment wurde bei 70 °C vollständig geschmolzen und anschließend bei 42 °C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Anpassungszeit an die Temperatur wurde
Agarase nach Angaben des Herstellers (New England Biolabs) hinzugefügt und die Lösung für
30 min inkubiert. Es wurden 0,25 M Ammoniumacetat hinzugefügt, unverdaute Kohlenhydrate
abzentrifugiert und die DNA aus dem Überstand durch Zugabe von zwei Volumina Ethanol
präzipitiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die gefällte DNA
pelletiert, gewaschen und in TE Puffer aufgenommen.
6.3.8. Feinreinigung metagenomischer DNA über ein Agarosegel II
Aufbauend auf einem Artikel von Harnpicharnchai et al. [242] wurde eine Methode durchgeführt,
um die Qualität der metagenomischen DNA zu erhöhen. Die DNA wurde zunächst aus einer
Bodenprobe isoliert und anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt (0,8 % Agarosegel, 30 min
90 V). Die Auftennung von DNA und Huminstoffen konnte anhand der Färbung der Lauffronten
der Huminstoffe (gelbbräunlich) und der DNA (im UV-Licht sichtbar) beobachtet werden.
Anschließend wurde knapp unterhalb der DNA mit Hilfe eines Skalpells ein Loch in das Gel
geschnitten, das nicht ganz bis zum Boden reichte. Dieses wurde mit einer 30 %igen PEG 8.000Lösung gefüllt. Nachdem das Loch knapp unterhalb der DNA-Bande geschnitten worden war,
wurde das Gel für weitere 20 min bei 90 V laufen gelassen, so dass die DNA in das Loch laufen
konnte. Die DNA-haltige PEG-Lösung konnte anschließend aus dem Loch herauspipettiert
werden. Durch eine Extraktion mit Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) wurde sie gereinigt, durch
Zugabe des zweifachen Volumens an 100 % kaltem Ethanol gefällt und nach Pelletierung durch
Zentrifugation in TE Puffer aufgenommen.
6.3.9. Extraktion metagenomischer DNA aus Strandsand
Die Extraktion von Strandsand wurde nach dem Protokoll von Naviaux et al. durchgeführt [233].
Zur Extraktion der DNA wurden 30 g (15 ml) des nassen Sandes in ein Falkon gefüllt und das
überstehende Meerwasser durch Dekantieren entfernt. Der Sand wurde zunächst dreimal mit je
2 Volumina (30 ml) Kochsalzlösung (35 g/l NaCl) und anschließend dreimal mit je 15 ml einer
Natriumiodid-Waschlösung (6 M NaI, 0,5 % Natriumsulfit) gewaschen. Bei jedem Waschschritt
wurde die Probe zunächst für 20 sec in der Waschlösung geschüttelt und anschließend zur
Sedimentation von Schwebstoffen gelassen, so dass die überstehende Waschlösung dekantiert
werden konnte. Der Sand wurde erneut dreimal mit je 2 Volumina Kochsalzlösung (35 g/l)
gewaschen, um die Ionenstärke auf die von Seewasser einzustellen. Der Sand wurde anschließend
drei- bis fünfmal mit 15 ml Ethanol-Waschlösung gewaschen (70 % Ethanol, 30 mM
Natriumacetat, pH 5,2) und dann von überstehendem Alkohol befreit. Es folgte die Elution der
88
6. Materialien und Methoden
DNA von der Sandmatrix, indem diese für zwei Stunden bei Raumtemperatur in 15 ml TE-Puffer
(10 mM Tris HCl, pH 8,1, 1 mM Na2EDTA) inkubiert wurde. Alle 15 min wurde die Probe von Hand
geschwenkt, dabei wurden starke mechanische Belastungen vermieden, um das Scheren der DNA
zu minimieren. Der DNA enthaltende TE-Puffer wurde abgenommen und in ein frisches
Falkongefäß überführt. Die Elution mit TE-Puffer wurde dreimal wiederholt, wobei die folgenden
Elutionsschritte bei 37 °C durchgeführt wurden. Die TE-Puffer Fraktionen wurden separat
gesammelt. Von diesem Elutionsfraktionen wurden grobe Schmutzpartikel durch einen Zentrifugationsschritt (2.500 x g, 15 min) entfernt, und die DNA anschließend präzipitiert (Zugabe eines
halben Volumens 7,5 M Ammoniumacetat und eines Volumens Isopropanol). Nach einer
Inkubation bei –20 °C für mindestens zwei Stunden (bevorzugt über Nacht) wurde die DNA durch
Zentrifugation bei 8.000 x g für 45 min pelletiert und anschließend in je 500 μL TE-Puffer wieder
aufgenommen. Die Qualität und Größe der DNA wurde auf einem Agarosegel überprüft.
Zur Feinreinigung der DNA wurde das Pellet statt in TE Puffer in 500 μl eines Proteinase K LysisPuffers (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % SDS) aufgenommen und mit
einer abgeschnittenen Spitze in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde
Proteinase K zu einer Endkonzentration von 500 μg/ml zugegeben und die Probe bei 50 °C über
Nacht (16 h) inkubiert. Die Proben wurden zweimal mit 1 Volumen Phenol und einmal mit einem
Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert und durch Zugabe von 0,3 M Natriumacetat (Stammlösung: 3 M Na-Acetat Lösung) und 2 Volumina 100 % eiskaltem Ethanol präzipitiert. Nach zwei Stunden bei - 20 °C wurde die DNA durch Zentrifugation (10 min 8.000 x g)
pelletiert, mit 70 % Ethanol gewaschen und nach Trockenen des Alkohols in 100 μl TE-Puffer
aufgenommen.
6.3.10. Partieller Restriktionsverdau metagenomischer DNA
Für den Restriktionsverdau metagenomischer DNA wurde das Enzym Sau3AI eingesetzt. Es hat
eine Erkennungssequenz von vier Basen und schneidet daher relativ häufig und regelmäßig. Die
erzeugten Schnittstellen sind kompatibel zu denen von BamHI, mit dem die Vektoren präpariert
wurden. Es wurde für jede DNA-Präparation eine Optimierung bezüglich der Konzentration des
Restriktionsenzyms durchgeführt. Dazu wurden Verdünnungsstufen des Restriktionsenzyms
zwischen 1 : 250 und 1 : 64.000 angesetzt, von denen je 1 μl pro 20 μl Reaktion eingesetzt wurden.
Es wurde zunächst eine Verdünnungsreihe des Enzyms in Verdauansätzen mit metagenomischer
DNA pipettiert. Dazu wurden 80 μl Mastermix mit 72 μl metagenomischer DNA und 8 μl Sau3AIPuffer (NEB) angesetzt. Bei den Bodenproben wurden darüber hinaus 10 mg/ml BSA hinzugefügt.
Weiterhin wurde eine 1 : 250 Verdünnung des Enzyms in sterilem A. bidest angefertigt. Jeweils 7 μl
vom Mastermix und der Enzymlösung wurden zusammengegeben und durch kurzes Pipettieren
mit einer abgeschnittenen, sterilen Pipettenspitze vorsichtig durchmischt. So wurde die
Verdünnung 1 : 500 erhalten. Aus diesem Reaktionsgefäß wurden wieder 7 μl entnommen und
mit 7 μl des Mastermixes vermischt. Dieser Vorgang ergab die 1 : 1.000 Verdünnung. Nach diesem
Schema wurden Verdünnungen bis 1 : 64.000 angefertigt. Die Ansätze wurden 20 min bei 37 °C
und anschließend 20 min bei 65 °C in einem Termocycler inkubiert. Anschließend wurde der Grad
des Verdaus auf einem 0,8 %igem Agarosegel analysiert und die geeignete Verdünnungsstufe für
den großen Ansatz des Verdaus ermittelt. Dieser wurde folgendermaßen hergestellt:
89
6. Materialien und Methoden
180 – x μl metagenomische DNA
20 μl Sau3AI-Puffer (NEB)
x μl Sau3AI-Lösung (in der optimierten Verdünnungsstufe)
Der Ansatz wurde wiederum 20 min bei 37 °C und 20 min bei 65 °C inkubiert und die DNA
anschließend mit Ethanol ausgefällt. Zur DNA-Lösung wurde das dreifache Volumen an
eisgekühltem Ethanol (unvergällt, 100 %) gegeben und gründlich durchmischt. Das Reaktionsgefäß wurde für zwei Stunden oder über Nacht bei - 20 °C inkubiert und anschließend 30 min bei
17.000 x g und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das restliche Ethanol
wurde unter dem Laminarluftstom abgedampft. Das Pellet wurde nicht gewaschen. Die DNA
wurde in der gewünschten Menge A. bidest für mindestens zwei Stunden bei 4 °C gelöst.
6.3.11. Restriktionsverdau
Ein Standard-Restriktionsansatz für die Präparation von Cosmid- und Plasmid-DNA enthielt:
30 μl Vektor-DNA
6 μl A. bidest
7 μl BSA (100 x)
5 μl NEBuffer (10 x)
1 – 2 μl Restriktionsenzym
Der Verdau erfolgte für drei Stunden bei 37 °C.
6.3.12. Dephosphorylierung
Um zu verhindern, dass sich Klonierungsvektoren, die mit einem Restriktionsenzym verdaut
wurden, rezirkularisieren, wurden diese mit antarktischer Phosphatase behandelt. Dieses Enzym
entfernt die 5’-Phosphate von DNA und RNA und erschwert somit die Religation der Vektorenden.
Die Antarktische Phosphatase hat gegenüber der Alkalischen Phosphatase den Vorteil, dass sie
schon durch 5 - 10-minütige Inkubation bei 65 °C inaktiviert wird. Nach dem Restriktionsverdau
wurden ohne vorherige Aufreinigung die entsprechende Menge Puffer, sowie 1 μl der
antarktischen Phosphatase hinzugegeben. Ein Beispiel für einen 60 μl Ansatz ist:
50 μl Restriktionsansatz
3 μl A. bidest
6 μl 10x Puffer für Antarktische Phosphatase
1 μl Antarktische Phosphatase (NEB)
Die Inkubation erfolgte für 20 min bei 37 °C und anschließend für 10 min bei 65 °C.
6.3.13. Aufreinigung der Vektor-DNA mittels PCR-Aufreinigungskit
Da die Ligationseffizienz von Klonierungsvektoren durch die Aufreinigung über Agarosegelelektrophorese stark herabsetzt wird, wurden die Vektoren nach dem Verdau und der
Dephosphorylierung über eine Säule aus dem High Pure PCR Cleanup Micro Kit von Roche
aufgereinigt. Die Vollständigkeit des Verdaus wurde auf einem analytischen Agarosegel
überprüft. Es wurden 300 μl Bindepuffer mit 100 μl Bindungsverstärker und 100 μl
Restriktionsansatz vermischt und wie in den Angaben des Herstellers vorgegeben behandelt. Die
Elution erfolgte mit 10 - 30 μl Elutionspuffer.
90
6. Materialien und Methoden
6.3.14. Anlegen metagenomischer Cosmid-Bibliotheken
Die DNA des Cosmids pWE15 wurde analog zu Plasmiden in E. coli DH5α vermehrt und isoliert. Die
Cosmid-DNA wurde den Angaben des Herstellers (Stratagene) folgend zunächst mit XbaI
linearisiert, dephosphoryliert, über eine Säule aufgereinigt und anschließend mit BamHI verdaut.
Die metagenomische DNA sollte für die Klonierung in Cosmide eine möglichst große
Fragmentgröße aufweisen und wurde daher vorsichtig präpariert und nur anverdaut. Hierfür
wurde das Restriktionsenzym Sau3AI verwendet, dessen Einsatzkonzentration für jede DNAPräparation wie in Abschnitt 6.3.10 beschrieben bestimmt wurde. Anschließend wurde der
Restriktionsverdau mit den optimalen Bedingungen in größerem Maßstab wiederholt, um die
DNA. Die DNA wurde gereinigt, indem sie mit Ethanol gefällt und in Wasser wieder aufgenommen
wurde.
Für die Ligation der fragmentierten metagenomischen DNA mit dem Cosmid wurde die jeweilige
DNA-Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Es wurden stets drei Reaktionen angesetzt,
von denen zwei verschiedene Verhältnisse von metagenomischer DNA zu Cosmid enthielten
(10 : 1 und 5 : 1) und die dritte eine Kontrolle ohne Ligase war. Die Ligation erfolgte über Nacht
bei 14 °C. Da Cosmide zu groß sind, um über Transformation von Zellen aufgenommen zu
werden, müssen sie zuvor in Phagen verpackt werden und mit deren Hilfe in die Wirtszellen
eingebracht werden. Hierfür wurde ein Kit verwendet, das nach Angaben des Herstellers
eingesetzt wurde (Gigapack Gold Packaging Extract, Invitrogen), gefolgt von der Transfektion von
E. coli mit den Phagen (vgl. Abschnitt 6.2.16 zur Herstellung Phagen-kompetenter Zellen). Zur
Titerbestimmung wurde der Verpackungsmix 1 : 5, 1 : 10 und 1 : 50 mit SM-Puffer verdünnt und je
25 μl der phagen-kompetenten E. coli VCS 257 (OD600 = 0,5) mit 25 μl des verdünnten Verpackungsmixes versetzt und 30 min bei 22 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl LB-Medium
zugegeben, die Proben für eine Stunde bei 37 °C inkubiert und auf LB-Platten mit geeignetem
Antibiotikum ausplattiert. Der Rest des Verpackungsmixes wurde mit der optimalen Verdünnung
in E. coli Zellen überführt.
6.3.15. Anlegen metagenomischer Plasmid-Bibliotheken
Für die Erstellung metagenomischer Bibliotheken mit Plasmiden wurde die metagenomische
DNA stärker fraktioniert als für die Cosmid-basierten Experimente, da Plasmide nur bis zu 10 kb
große Inserte aufnehmen können. Die Menge des Restriktionsenzyms zur Einstellung der
gewünschten Fragmentlänge wurde wie in Abschnitt 6.3.10 beschrieben in einem Vorversuch
ermittelt und anschließend auf den großen Ansatz übertragen. Über ein Agarosegel wurde die
fragmentierte DNA aufgetrennt und im Bereich von 4 - 8 kbp aus dem Gel ausgeschnitten und mit
Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt.
Anschließend wurde die fragmentierte metagnemische DNA in die zuvor verdaute,
dephosphorylierte und aufgereinigte Plasmid-DNA ligiert. Ein typischer Ligationsansatz enthielt:
4 μl Vektor-DNA
14 μl Insert-DNA
2 μl T4 Ligase Puffer (10 x)
0,5 μl T4-DNA-Ligase
91
6. Materialien und Methoden
Dabei wurden die molekularen Verhältnisse zwischen Vektor und Insert zwischen 3 : 1 und 1 : 3
gewählt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 14 °C. Anschließend wurde das Enzym für 10 min
bei 70 °C hitzeinaktiviert und der Ligationsansatz für die Transformation kompetenter Zellen
eingesetzt.
6.3.16. DNA Extraktion aus Gordonia sp. CWB2
Um die genomische DNA aus Gordonia sp. CWB2 zu isolieren, wurde der Stamm zunächst in
einem Minimalmedium angezogen, das als einzige C-Quellen Styrol enthielt. Nach sieben Tagen
wurde die Zellmasse geerntet, pelletiert und die genomische DNA mit Hilfe des DNeasy Blood and
Tissue Kits (Qiagen) isoliert. Die Qualität wurde auf einem Agarosegel und mittels NanoDrop
ermittelt.
6.3.17. Anlegen einer Genon-Bibliothek von Gordonia sp. CWB2
Die genomische DNA aus Gordonia sp. CWB2 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
fragmentiert, auf einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente mit 4 – 8 kb ausgeschnitten
und aufgereinigt. Diese Fragmente wurden in einen Vektor (pJOE930) ligiert, der ebenfalls mit
BamHI geschnitten und zudem dephosphoryliert war. Mit den erhaltenen Ligationsprodukten
wurden kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen transformiert, so dass eine genomische Bibliothek
erhalten wurde. Die Klone wurden in Mikrotiterplatten abgelegt und in Form von Glycerolstocks
gelagert. Zum Durchmustern der genomischen Bibliothek wurde diese in Deepwell-Mikrotiterplatten in frischem Medium angezogen und exprimiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit
Lysispuffer versetzt und aufgeschlossen. Durch Zentrifugation wurde der Zellüberstand, das
Rohextrakt gewonnen, das für die Aktivitätstests eingesetzt wurde. Die Rohextrakte der
genomischen Bibliothek von Gordonia sp. CWB2 wurden mit den in Abschnitt 6.4.3 und 6.4.4
beschriebenen Enzymassays auf Aktivität überprüft.
6.3.18. Sequenz-basiertes Screening nach Styrol-Monooxygenasen in Gordonia sp. CWB2
Für die Sequenz-basierte Suche nach einer Styrol-Monooxygenase in Gordonia sp. CWB2 wurden
Primer aufgrund von Homologien zu bekannten Styrol-Monooxygenasen abgeleitet und diese in
unterschiedlichen Kombinationen von forward- und reverse-Primern in der PCR eingesetzt. Mittels
Gradienten-PCR wurden die Annealing-Temperaturen optimiert, so dass deutliche Banden im
anschließenden Agarosegel zu erkennen sind. Im Folgenden sind der PCR-Ansatz und das
Temperatur-Programm wiedergegeben:
PCR-Ansatz
1,5 μl Gordonia Genom. DNA
3 μl Primer forward
3 μl Primer reverse
10 μl Polymerase-Puffer
2 μl dNTP Mix
Ad 100 μl A. bidest
92
PCR Programm
5 min 95 °C
45 sec 95 °C
45 sec 50 – 70 °C
3 min 72 °C
7 min 72 °C
30 x
6. Materialien und Methoden
Im ersten Ansatz wurden die 100 μl des PCR-Ansatzes aufgeteilt und bei verschiedenen
Annealing-Temperaturen inkubiert. Die PCR mit Primer-Kombinationen, die klare Banden
amplifizieren konnten, wurden in größerem Maßstab bei einer Annealing-Temperatur von 70 °C
wiederholt, die Banden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, aufgereinigt und sequenziert.
6.4. Biochemische Methoden und Enzymassays
6.4.1. Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford
Für die quantitative Bestimmung des Proteingehalts wurde der Bradford-Assay verwendet. Dazu
wurde ein Volumenteil der Bradford-Stammlösung mit vier Volumenteilen Wasser versetzt und
frisch filtriert. Die Proteinbestimmung wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt in einem
Gesamtvolumen von 315 μl. Es wurden 300 μl der Bradford-Lösung mit je 15 μl Probe versetzt und
gut vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten im Dunkeln wurde die Absorption bei
600 nm im Photometer gemessen. Bei jeder Messreihe wurde eine Standardreihe aufgenommen
mit BSA in Konzentrationen zwischen 50 und 250 μl. Als Blindwert wurde 15 μl Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) eingesetzt.
6.4.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde in einem diskontinuierlichen System
(Minigel Twin, Biometra) durchgeführt. Es wurden 12,5 % ige Trenngele verwendet. Die Proben
wurden mit Probenpuffer versetzt und 5 min bei 95 °C denaturiert. Die elektrophoretische
Trennung erfolgte zunächst bei 10 mA pro Gel, bis die Proben das Trenngel erreicht hatten. Dann
wurde die Stromstärke auf 25 mA pro Gel erhöht. Anschließend wurden die Gele, um die
Proteinbanden sichtbar zu machen, mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt. Die Zusammensetzung
für 12,5 %ige Gele ist in Tab. 6.9 aufgeführt.
Tab. 6.9. Zusammensetzung der SDS-Polyacrylamid-Gele.
Lösung
Trenngel 12,5 %
Sammelgel 4 %
Trenngel-Puffer
(1,5 M Tris-HCl, 14 mM SDS, pH 8,8)
2,00 ml
-
Sammelgel-Puffer
(0,5 M Tris-HCl, 14 mM SDS, pH 6,8)
-
1,00 ml
30 % Acrylamid-, Bisacrylamidlösung im Verhältnis 37,5:1
3,33 ml
0,53 ml
A. dest.
2,67 ml
2,47 ml
APS (10%)
40 μl
40 μl
TEMED (N,N,N‘,N‘Tetramethylethylendiamin)
4 μl
4 μl
Die Polyacrylamidgele wurden 30 Minuten in der Färbelösung (0,1 % Coomassie-Brilliant-Blau
R -250, 30 % Ethanol, 10 % Eisessig) inkubiert. Die gefärbten Gele wurden in eine Entfärbelösung
93
6. Materialien und Methoden
(30 % Ethanol, 10 % Eisessig) überführt und solange inkubiert, bis der Hintergrund farblos wurde
und die Proteinbanden deutlich zu sehen waren.
6.4.3. γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin (NBP) Assay auf Epoxidase-Aktivität
Der NBP Assay wurde von Alcalde et al. [247] entwickelt und hier nach dem in der Publikation
beschriebenen Protokoll durchgeführt. Dazu wurden in einer Mikrotiterplatte (aus Polypropylen
oder Glas-beschichtet) 70 μl Phosphatpuffer (0,1 M, pH 8,0) mit 10 μl Styrol (100 mM in Methanol
oder Ethanol) und 10 μl Enzymlösung gemischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl einer
Mischung aus NADH und NADPH (20 mM in Phsophatpuffer) gestartet, so dass 10 mM Styrol,
2 mM NAD(P)H und 10 % Methanol (Ethanol) vorlagen. Die Platte wurde mit einer
atmungsaktiven Folie verschlossen und unter Schütteln bei Raumtemperatur für bis zu
24 Stunden inkubiert. Zur Detektion des gebildeten Styroloxides wurden 25 μl NBP (γ-(4-Nitrobenzyl)-pyridin) (Stammlösung 0,4 g in 10 ml Ethanol, frisch angesetzt) zugegeben, die Platte
durch Schütteln gemischt und mit einer luftdichten Folie verschlossen. Die Farbentwicklung
erfolgte in einem Heizschrank durch Inkubation bei 80 °C für 30 min. Anschließend wurde die
Platte für 10 min auf Eis gestellt, und es wurden zügig 150 μl Dimethylformamid und 25 μl 1 M
K2CO3 in jede Vertiefung zugegeben, um den gebildeten Farbkomplex zu stabilisieren. Die Platte
wurde erneut geschüttelt und sofort die Absorption bei 600 nm ermittelt.
6.4.4. p-Nitrothiophenolat-Assay auf Epoxidase-Aktivität
Der Assay wurde von Schwaneberg und Tee entwickelt und stellt eine alternative Methode zum
NBP-Assay dar, Styroloxid-bildende Enzyme zu detektieren [250]. Dazu werden 50 μl der Enzymlösung (Zellrohextrakt) in einer Mikrotierplatte (aus Polypropylen oder Glas-beschichtet) mit 20 μl
Tris-Puffer (Tris-HCl, 100 mM, pH 8,0) und 10 μl Styrol (100 mM in Ethanol) versetzt und für 5 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl einer Mischung aus
NADH und NADPH (je 20 mM) gestartet. Bei einem Experimentverlauf über mehrere Stunden
beim Durchmustern der metagenomischen Bibliotheken wurde der Cofaktor entweder nach
einigen Stunden erneut zugegeben oder ein Regenerierungssystem eingesetzt bestehend aus
Glucose und Glucose-Dehydrogenase, um zu verhindern, dass der Cofaktor der limitierende
Faktor der Reaktion ist. Für den Nachweis des gebildeten Styroloxids wurde das
Reaktionsgemisch mit 95 μl frisch angesetztem p-Nitrothiophenolat (1 mM in 100 mM Tris-HCl,
pH 8,0) versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln (800 rpm) inkubiert. Die
Absorption bei 405 nm wurde photometrisch detektiert.
6.4.5. p-Nitrophenoxyoktan Assay auf P450-Monooxygenase-Aktivität
Der p-Nitrophenoxyoctan-Assay wurde von Uli Schwaneberg et al. entwickelt, um die Aktivität
von P450-Monooxygenasen, die ihre Substrate hydroxylieren, nachzuweisen. Als Substrat dient
ein Alkan [248] oder eine Fettsäure [251], die terminal mit p-Nitrophenol verethert ist. Wird dieses
Substrat in der Nachbarschaft zum Ether hydroxyliert, so entsteht ein instabiles Halbacetal, das
zerfällt, wobei das farbige p-Nitrophenolat-Anion frei wird. Dieses kann spektrophotometrisch
detektiert werden. Der Assay wurde mit Zellrohextrakt durchgeführt, das in einem Tris-HCl Puffer
(50 mM, pH 8,2) aufgeschlossen worden war. In einer Mikrotiterplatte wurden 150 μl Lysat mit
94
6. Materialien und Methoden
150 μM p-Nitrophenoxyoctan in 1 % DMSO versetzt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
5 min wurden 1 mM NADH und 1 mM NADPH hinzugefügt. Bei einer längeren Inkubationszeit
wurden 50 ml eines Cofaktor-Recyclingsystem aus Glucose-Dehydrogenase (5 Units, akzeptiert
beide Cofaktoren) und 100 mM Glucose hinzugefügt, um zu verhindern, dass der Cofaktor der
limitierende Faktor der Reaktion ist. Als Positiv-Kontrolle für diesen Assay diente die
Monooxygenase P450-BM3.
6.4.6. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen: 4-Nitroacetophenon-Assay
Zur Identifizierung von BVMOs in Mikrotiterplatten wurde ein chromogener Assay angewandt.
Die Klone wurden wie zuvor beschrieben aus den Glycerolstocks angeimpft und über Nacht in
flachen MTP angezogen. Am nächsten Morgen wurden die Kulturen in Deepwell-MTP mit
frischem Medium überführt, dabei wurden 800 μl Medium mit 100 μl der Übernachtkultur
angeimpft. Nach einer Inkubation bei 37 °C für drei Stunden wurde die Expression induziert und
die Kultivierungstemperatur auf 25 °C abgesenkt. Die Expression der Enzyme wurde nur für sechs
bis acht Stunden durchgeführt, da die Erfahrung zeigte, dass BVMOs oft nach längerer
Expressionszeit an Aktivität verlieren. Der Assay wurde zum einen mit Zellrohextrakt, zum
anderen mit ganzen Zellen durchgeführt. In die Vertiefungen der Assay-Mikrotiterplatten wurden
je 158 μl Rohextrakt oder Zellsuspension, 20 μl NAD(P)H (200 μM Endkonzentration) und 20 μl
CAL-B (Endkonzentration 1 mg/ml) gegeben. Beim Ganzzellassay wurde auf NAD(P)H verzichtet.
Der Assay wurde durch Zugabe von 2 μl Substrat (p-Nitroacetophenon, Endkonzentration 1 mM)
gestartet. Die Platten wurden für drei Stunden bei 30 °C inkubiert und anschließend bei 410 nm
mit einem Photometer vermessen. Auf allen Platten wurde eine Positiv-Kontrolle (4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase) mitgeführt.
6.4.7. Baeyer-Villiger-Monooxygenasen: 4-Hydroxyacetophenon-Assay
Mit diesem Agar-Platten-Assay lässt sich schnell und einfach die Aktivität von Baeyer-VilligerMonooxygenasen gegenüber 4-Hydroxyacetophenon (4-HAP) nachweisen. Vor dem Gießen der
Platten wurde dem 60 °C warmen Agar 0,3 mM 4-HAP (aus 0,3 M Stammlösung in DMF) zugesetzt.
Nach Bedarf wurden Induktor und Antibiotika in geeigneten Konzentrationen zugegeben und die
Platten gegossen. Die Zellen wurden auf die frischen Platten überimpft und über Nacht bei 30 °C
inkubiert. Anschließend wurden sie bei Raumtemperatur für weitere drei Tage inkubiert. Bei einer
guten Expression wie der HAPMO in E. coli war die Braunfärbung der Kolonien nach etwa
48 Stunden deutlich sichtbar und verdunkelte sich im weiteren Verlauf zunehmend.
6.4.8. Oxidase-Assay
Für den Nachweis von Oxidase-Aktivität wurden die metagenomischen Bibliotheken 24 h lang
exprimiert, damit eine ausreichend große Enzymmenge vorlag. Der Assay wurde mit
Zellrohextrakt durchgeführt und beruht auf der Detektionsmethode von Wong et al. [216, 252].
Die Substratlösung enthielt je 50 mM Glucose, Sorbitol, 1,2-Phenylethandiol, Ethanol, 1-Hexanol,
Acetaldehyd, Benzaldehyd, D-/L-Alanin, D-/L-Lysin, D-/L-Aspartat und 2-Phenylethylamin, sowie
0,16 mM Hydroxylaminsulfat als Catalase-Inhibitor in Tris-HCl Puffer (50 mM, pH 9,0). Der pH-Wert
wurde in einem parallelen Experiment variiert, um auch Oxidasen mit einem anderen
95
6. Materialien und Methoden
pH-Optimum zu erfassen. Für den Assay wurden 50 μl der Substratlösung mit 30 μl des
Zellrohextraktes für drei Stunden bei 37 °C und 600 rpm inkubiert. Anschließend wurden 100 μl
Peroxid-Reagenz (200 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5 mit 12,5 mM Chromotrop-Säure und
0,6 mM 4-Aminoantipyrin) zum Stoppen der Reaktion und 15 μl Peroxidase-Lösung (104 U * ml-1
in 200 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5) für die Detektion des Wasserstoffperoxids zugegeben.
Die blaue Farbentwicklung konnte spektrophotometrisch bei 600 nm verfolgt werden.
6.4.9. Acetophenon-Assay auf Amin-Transaminase-Aktivität
Der von Schätzle et al. ethablierte Acetophenon-Assay weist die Aktivität von Transaminasen
gegenüber Acetophenon nach [229]. Zum Nachweis von Transaminase-Aktivität wurde beim
Aufschluss der Zellen HEPES-Puffer (100 mM, pH 8,0, 0,1 mM Pyridoxalphosphat) verwendet unter
Zusatz von 0,1 mM PLP. Der Assay wurde mit Zellrohextrakt durchgeführt. Die AcetophenonAssay-Reaktionslösung bestand aus HEPES (100 mM, pH 8,0) mit 0,5 % einer α-MethylbenzylaminStammlösung (1 M α-Methylbenzylamin in DMSO) sowie mit 0,5 % einer Pyruvat-Stammlösung
(1 M Pyruvat in HEPES-Puffer). In einer UV-Mikrotiterplatte (Greiner, Solingen) wurden 100 μl
Acetophenon-Assay-Reaktionslösung, 60 μl Enzymlösung und 40 μl HEPES-Puffer (100 mM,
pH 8,0) vermischt und die Absorption bei 254 nm verfolgt, wobei alle 10 sec ein Messpunkt
aufgenommen wurde. Alle Messungen wurden zweimal in parallelen Mikrotiterplatten
durchgeführt.
6.4.10. α-Naphthylacetat / FastRed Agarplatten-Assay
Die Aktivität von Esterasen lässt sich in einem schnellen Assay auf Agarplatten qualitativ
nachweisen. Als Substrat dient α-Naphthylacetat, dessen Hydrolyseprodukt mit FastRed zu einem
roten Farbstoff reagiert. Die Klone wurden auf LB-Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika
und Induktor überimpft und über Tag anwachsen gelassen. Anschließend wurden die Platten zur
Detektion von Esterase-Aktivität mit einem Softagar (0,5 % Agar, 80 mg/ml FastRed und 40 mg/ml
α-Naphthylacetat) überschichtet. Aktive Kolonien färben sich innerhalb kurzer Zeit rot [279].
6.4.11. Tributyrin-Assay
Die Aktivität von Esterase und Lipasen lässt sich über einen weiteren Assay auf Agarplatten
nachweisen, der ein anderes Substrat abdeckt. Durch Zugabe von Tributyrin in den Agar werden
die Platten eingetrübt. Überimpft man auf diese Platten Kolonien mit einer hydrolytischen
Aktivität gegenüber Tributyrin, so zeigen sich um die Kolonien herum klare Höfe, da die
Spaltprodukte besser löslich sind. Ein Gemisch aus 15 ml Tributyrin, 1,5 g Gummi arabicum und
50 ml Wasser wurde 2 min mit einem Ultraturrax homogenisiert und dann zu 1 l frisch autoklaviertem LB-Agar gegeben. Zusätzlich wurden ein entsprechendes Antibiotikum sowie ein
Induktor hinzugefügt und die Platten gegossen. Die metagenomischen Klone wurden überimpft
und über zwei Tage wachsen gelassen [280, 281].
6.4.12. Protease-Assay
Der Nachweis von Proteasen beruht auf einem ähnlichen Prinzip wie der Tributyrin Assay. Die
Agarplatten werden durch Zugabe des Substrates trüb und klaren sich um die Zellen mit
96
6. Materialien und Methoden
Protease-Aktivität. Der LB-Agar wurde neben Antibiotika und Induktor mit 4 % Magermilchpulver
und 1 % Lactose versetzt. Nach dem Überimpfen der Zellen wurden die Platten für 2 Tage
inkubiert, um eine Enzymaktivität anhand der Bildung klarer Höfe nachzuweisen [254, 255].
6.4.13. Phosphatase-Assay
Die Detektion von Phosphatasen lässt sich auf Agarplatten durch Zugabe von X-Phosphat
(5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat) durchführen. Nach dem Autoklavieren wurde zu 1 Liter
LB-Agar 2 ml einer sterilen 2 %igen X-Phosphat-Lösung hinzugefügt. Nach Zugabe entsprechender Antibiotika und Induktoren wurden die Platten gegossen und die zu untersuchenden
Kolonien darauf überimpft. Kolonien, die eine Aktivität gegenüber X-Phosphat aufweisen, färben
sich innerhalb von 24 Stunden blau [256], die Platten wurden zum Erfassen 48 Stunden bei RT
inkubiert. Nach einer längeren Zeit setzt eine blaue Hintergrund-Färbung aller Kolonien ein, was
die Detektion von Phosphatasen erschwert.
6.4.14. Screening einer Stammsammlung
Aus der Stammsammlung des Institutes für Enzymtechnologie (Forschungszentrum Jülich)
wurden 123 Rohextrakte zur Verfügung gestellt, die auf Monooxygenase-Aktivität untersucht
werden sollten. Eine Übersicht der Stämme sowie die Kultivierungsbedingungen ist den Tabellen
8.1, 8.2 und 8.3 im Anhang zu entnehmen. Das Screening wurde in folgendem Reaktionsansatz
durchgeführt: 100 μl Rohextrakt, 10 mM Styrol in DMSO, 10 mM 1-Octen in Acetonitril, 0,25 mM
NADH, 0,25 mM NADPH, 13,3 μM FAD, 5 Units Glucose-Dehydrogenase (rekombinant aus Bacillus
subtilis, akzeptiert NAD und NADP), 100 mM Glucose, aufgefüllt auf 500 μl mit
Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5). Die Reaktion erfolgte für 24 Stunden bei 30 °C und
1.400 rpm in Thermomixern. Es wurden zwei Proben genommen, nach vier und nach 24 Stunden.
Da die Substrate nicht homogen löslich sind und um eine gleichmäßige Probennahme zu
gewährleisten, wurde der Reaktionsansatz vor Zugabe der Substrate geteilt und in zwei gleichen
Ansätzen mit je 250 μl inkubiert. Der erste wurde nach vier Stunden tiefgefroren, der zweite nach
24 Stunden sofort aufgearbeitet. Die Vier-Stunden-Probe wurde nach Bedarf aufgearbeitet. Die
Extraktion der Proben erfolgte, indem zu je 250 μl wässriger Biokatalyse-Probe das gleiche
Volumen Ethylacetat zugesetzt wurde, welches zuvor mit 10 mM 1-Hexanol als Internem Standard
versetzt wurde und die Probe durch Vortexen durchmischt wurde. Zur Phasentrennung wurden
die Glasvials zentrifugiert. Die Analytik erfolgte mittels GC-MS (achirale BPX-5 Säule) (siehe
Abschnitt 6.5.1).
6.5. Analytik und Chemische Synthesen
6.5.1. GC-Analytik zum Screening der Stammsammlung
Für das Screening der Stammsammlung wurde mittels Gaschromatographie ermittelt, ob eine
Umsetzung von Styrol oder 1-Octen durch die Zellrohextrakte erfolgte. Nach der Extraktion und
Trocknung mit Na2SO4 wurden die Proben auf einer achiralen BPX-5-Säule analysiert. Dazu wurde
folgendes Temperaturprogramm verwendet: 10 min 40 °C, heizen mit 15 °C/min bis 180 °C,
97
6. Materialien und Methoden
weitere 5 min bei 180 °C. Die beobachteten Retentionszeiten sind: 4,3 min 1-Octen, 10,2 min
Styrol, 13,8 min 1,2-Epoxyoctan, 15,0 min Styroloxid, 17,3 min 1,2-Octandiol, 18,1 min 1,2- Phenylethandiol.
6.5.2. Synthese von p-Nitrophenoxyoctan
Das Substrat für den p-Nitrophenoxyoctan Assay ist nicht kommerziell verfügbar und wurde
daher synthetisiert wie in der Literatur beschrieben [248]. Der Reaktionstyp entspricht einer
Ethersynthese nach Williamson, bei der Alkoholat des p-Nitrophenols mit dem Halogenalkan (hier
Bromoktan) reagiert. 1-Bromoctan (1g, 5,18 mmol) und 4-Nitrophenol (Natriumsalz, 0,92 g,
5,71 mmol) wurden unter Rückfluss in 30 ml DMSO bei 120 °C für 5 Stunden gekocht. Das DMSO
wurde abrotiert und das orange-braune Reaktionsprodukt über eine Kieselgelsäule mit
Petrolether und Diethylether 10 : 1 aufgereinigt. Die Reaktion lieferte eine Ausbeute von 73 % und
die Reinheit des Produktes wurde über NMR nachgewiesen.
98
7. Literatur
7 LITERATUR
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8. Anhang
8 ANHANG
Tab. 8.1. Liste der Stämme, die im Rahmen des Screenings nach Monooxygenasen durchmustert wurden,
das verwendete Medium (DSMZ-Nummer) und die Kultivierungstemperatur. Die Stämme wurden aus der
Stammsammlung des Instituts für Enzymtechnologie IET (Universität Düsseldorf) erhalten.
IET - Nr.
114
Gr.
Medium
Temp
7 Alcaligenes sp.
Stamm - Name
B
1
30
8 Methylobacterium extorquens
B
1 + 1 % MeOH
30
9 Methylobacterium extorquens
B
1 + 1 % MeOH
30
11 Methylobacterium organophilum
B
1 + 1 % MeOH
30
12 Nocardia corynebacterioides
B
53
30
16 Nocardioides simplex
B
53
30
19 Ralstonia eutropha
B
1; 81
30
21 Kocuria rosea
B
53
30
23 Microbacterium lacticum
B
53
30
24 Brevibacterium linens
B
53
30
27 Deinococcus radiodurans
B
53
30
28 Lactobacillus buchneri
B
11
37
32 Pectobacterium carotovorum ssp. carotovorum
B
1
26
33 Rhizobium rhizogenes
B
1
26
35 Xanthobacter autotrophicus
B
1; 81; 428
30
38 Variovorax paradoxus
B
1; 81
30
39 Alcaligenes latus
B
1; 81
30
40 Streptomyces sulphureus
B
65
28
44 Methylobacillus glycogenes
B
1 + 1 % MeOH
30
49 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
B
11
30
50 Weissella confusa
B
11
30
51 Lactobacillus coryniformis ssp. coryniformis
B
11
30
52 Lactobacillus fructivorans
B
11
30
53 Lentinus lepideus
P
90
24
54 Lactobacillus collinoides
B
264
26
55 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
B
11
30
58 Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum
B
11
30
59 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus
B
11
37
60 Lactobacillus bifermentans
B
11
30
61 Rhodococcus rhodnii
B
65
28
62 Lactobacillus alimentarius
B
11
30
64 Gordonia rubripertincta
B
65
37
65 Candida parapsilosis
H
186
25
71 Pichia membranaefaciens
H
393
25
72 Yarrowia lipolytica
H
393
25
74 Rhodococcus ruber
B
65
28
75 Rhodotorula glutinis
H
186
25
76 Hanseniaspora guilliermondii
H
186
25
77 Gordonia rubripertincta
B
65
28
78 Sporidiobolus johnsonii
H
186
25
79 Candida boidinii
H
186
25
8. Anhang
Tab. 8.2. Fortsetung der Liste der Stämme aus der Stammsammlung des Instituts für Enzymtechnologie
(Universität Düsseldorf), die im Rahmen des Screenings nach Monooxygenasen durchmustert wurden.
IET - Nr.
Stamm - Name
Gr.
Medium
Temp
81 Debaryomyces hansenii
H
186
25
84 Rhodococcus fascians
B
53
30
28
93 Rhodococcus erythropolis
B
65
100 Rhodococcus coprophilus
B
65
28
103 Lactobacillus coryniformis ssp. torquens
B
11
30
105 Lactobacillus reuteri
B
11
37
114 Weissella viridescens
B
11
30
118 Lactobacillus brevis
B
11
30
120 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
B
11
30
133 Lactobacillus paracasei ssp. tolerans
B
11
30
134 Lactobacillus fermentum
B
11
37
137 Lactobacillus mali
B
11
30
143 Lactobacillus acidophilus
B
11
37
147 Bacillus subtilis ssp. spizizenii
B
1
30
152 Bacillus coagulans
B
1
37
154 Gluconobacter oxydans
B
92; 105
30
155 Arthrobacter sp.
B
53
30
157 Lactobacillus plantarum
B
11
30
161 Lactobacillus paracasei ssp. tolerans
B
11
30
163 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
B
11
30
165 Gluconobacter oxydans
B
92; 105
30
166 Cellulosimicrobium cellulans
B
53
30
170 Escherichia coli
B
1
37
173 Bacillus sp.
B
1
30
174 Zoogloea ramigera
B
1
30
177 Pichia quercuum
H
393
25
180 Streptococcus thermophilus
B
53
37
183 Brochothrix thermosphacta
B
53
30
189 Arthrobacter histidinolovorans
B
53
30
198 Bacillus licheniformis
B
1
37
216 Pseudomonas putida
B
1
26
217 Candida cariosilignicola
H
186
30
226 Rhodococcus erythropolis
B
65
28
235 Fennellia flavipes
P
90
24
240 Hyphopichia burtonii
H
186
24
246 Hanseniaspora osmophila
H
186
24
253 Saccharomyces cerevisiae
H
186
25
256 Waltomyces lipofer
H
186
25
257 Candida succiphila
H
186
25
261 Pachysolen tannophilus
H
186
25
262 Rhodococcus opacus
B
65
28
115
8. Anhang
Tab. 8.3. Fortsetung der Liste der Stämme aus der Stammsammlung des Instituts für Enzymtechnologie
(Universität Düsseldorf), die im Rahmen des Screenings nach Monooxygenasen durchmustert wurden.
Gr.
Medium
Temp
268 Rhodotorula mucilaginosa
H
186
25
272 Rhodococcus rhodochrous
B
65
28
273 Rhodococcus erythropolis
B
65
28
276 Rhodococcus erythropolis
B
65
28
277 Rhodococcus opacus
B
65
28
294 Intrasporangium calvum
B
65; 82
28
318 Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris
B
11
30
330 Gliocladium cibotii
P
90
24
332 Lactobacillus kefiri
B
11
30
333 Lactobacillus kefiri
B
11
30
344 Lactobacillus sakei ssp. sakei
B
11
30
347 Leuconostoc fructosum
B
11
30
353 Curtobacterium albidum
B
53
30
357 Aspergillus ochraceus
P
90
24
381 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
B
11
30
384 Amycolatopsis mediterranei
B
65
28
385 Amycolatopsis methanolica
B
65
28
388 Dactylosporangium aurantiacum
B
65
28
389 Dactylosporangium fulvum
B
65
28
391 Dactylosporangium roseum
B
65
28
400 Leuconostoc lactis
B
11
30
406 Pichia finlandica
H
186
25
407 Rhodotorula pustula
H
186
25
409 Hanseniaspora osmophila
H
186
25
410 Kluyveromyces lactis
H
393
25
412 Pichia angusta
H
186
25
413 Pichia anomala
H
186
25
414 Pichia carsonii
H
186
25
424 Rhodococcus zopfii
B
65
28
426 Nocardia carnea
B
65
30
429 Brevibacterium casei
B
53
30
431 Brevibacterium iodinum
B
53
30
432 Microbacterium oxydans
B
53
30
436 Gordonia amarae
B
65
28
451 Flammulina velutipes
P
90
24
453 Debaryomyces hansenii
H
90
25
598 Bacillus halodurans
B
1
30
599 Bacillus pumilus
B
1
30
IET - Nr.
116
Stamm - Name
600 Bacillus thuringensis
B
1
30
BL21 Escherichia coli BL21
B
1
37
XL1 Escherichia coli XL1
B
1
37
8. Anhang
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
MKKRIGIVGAGTAGLHLGLFLRQHDVDVTVYTDRKPDEYSGLRLLNTVAHNAVTVQREVA
MKKRIGIVGAGTAGLHLGLFLRQHDVDVTVYTDRKPDEYSGLRLLNTVAHNAVTVQREVA
MKKRIGIVGAGTAGLHLGLFLRQHDVDVTVYTDRKPDEYSGLRLLNTVAHHAVTVQREVA
MKKRIGIVGAGTAGLHLGLFLRQHDHDVTVYTDRQPDEYAGLRLLNTVAHHAVTVQREVD
MSKRIAIVGAGTAGLHLGLYLNEKGIDATIFTDRRPEEYANVRLLNTVAHHSVTVAHEDD
MRRRIGIVGAGIAGLHLALYLQKHGVDATLITDRAPDEYRGIRLLNTVAHHHVTIAREDY
* :**.***** *****.*:*.::. *.*: *** *:** .:********: **: :*
60
60
60
60
60
60
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
LDVNEWPSEEFGYFGHYYYVGGP-QPMRFYGDLKAPSRAVDYRLYQPMLMRALEARGGKF
LDVNEWPSEEFGYFGHYYYVGGP-QPMRFYGDLKAPSRAVDYRLYLPMLMRALEARGGKF
LDVNEWPSEEFGYFGHYYYVGGP-QPMRFYGDLKAPSRAVDYRLYQPMLMRALEARGGKF
LGVNEWPSDEFGYFGHYYYVGGP-QPMRFYGDLKAPSRAVDYRLYQPMLMRALEARGGKF
LGVNHWPND--GYFGHYYYIGVPSMPIEFYGDYAKPSRAVDYRIYLPQLMQDFEERGGKI
LGVNHWNDPKHHYYYHDHFFNFP-QPIGFRGYFSKPSRAVDYRIYLPVLMKDFADRGGRI
*.**.* .
*: * ::.. * *: * *
********:* * **: : ***::
119
119
119
119
118
119
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
CYDAVSAEDLEGLSEQYDLLVVCTGKYALGKVFEKQSENSPFEKPQRALCVGLFKGIKEA
CYDAVSAEDLEGLSEQYDLLVVCTGKYALGKVFEKQSENSPFEKPQRALCVGLFKGIKEA
CYDAVSTDDLEGLSEQYDLLVVCTGKYALGKMFEKQSENSPFEKPQRALCVGLFKGIKES
SYDAVSVEDLESLSDQYDLLVVCTGKNSLGQLFEKQPENSPFEKPQRALCVGLFKGIKEA
EYRPVGVEDLTDLSDEYDLVVVGTGKGGLGQLFARDEQTSPFSEPQRQLCVGLFKGIAEP
EYRRIEEGDIAPLVSKFDLLVVSSGKGPLGQLFAYRPEHSPYSQPQRRLCVGLYTGVREP
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*: * .::**:** :** **::*
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179
179
179
179
178
179
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
PIRAVTMSFSPGHGELIEIPTLSFNGMSTALVLENHIGSDLEVLAHTKYDDDPRAFLDLM
PIRAVTMSFSPGHGELIEIPTLSFNGMSTALVLENHIGSDLEVLAHTKYDDDPRAFLDLM
PTRALTMSISPGHGELIEIPTLSFNGMSTALVLENHIGSDLEILAHTKYEDDPRAFLDLM
PIRAVTMSFSPGHGELIEIPTLSFNGMTTALVLENHIGGDLEVLAHTKYEENPRAFLDLL
ETRAVTFYIAPGAGEMIEIPTVTFCGHSTALVMENHPGGDLEILAKTHYDDDPRAFLDLL
DPMNVTLSVSPGHGEMIVIPTITFDGIASALLMENVPGGDMEELATLSYEANPKHFLRVV
:*: .:** **:* ***::* * ::**::** *.*:* **
*: :*: ** ::
239
239
239
239
238
239
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
LEKLGKHHPSVAERIDPAEFDLANSSLDILQGGVVPAFRDGHATLNNGKTIIGLGDIQAT
LEKLRKHHPSVAERIDPAEFDLANSSLDILQGGVVPVFRDGHATLNNGKTIIGLGDIQAT
LKKLRKHHPSVAERIDPAEFDLANSSLDILQGGVVPVFRDGHATLNNGKTIIGLGDVQAT
FQKLHAHHPSIAERIDPEEFDLANSSLDILQGSVTPVFRNGHATLKNGKTIIGLGDVQAT
LEKLRTHYPTLVERIDVEEFDLANGPLDILQGGVTPTVRHGHIRLANGKLAVLLGDAHAT
LEKLEKHHPTTYDRIDTARFDLAQ-PLDLLQGGVVPTVRNTVVEFDGGKCAIALGDVHSV
::** *:*: :*** .****: .**:***.*.*..*.
: .** : *** ::.
299
299
299
299
298
298
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
VDPVLGQGANMASYAAWILGEEILAHSVYDLRFSEHLERRRQDRVLCATRWTNFTLSALS
VDPVLGQGANMASYAAWILGEEILAHSVYDLRFSEHLERRRQDRVLCATRWTNFTLSAFT
VDPVLGQGANMASHAAWILGEEILAHSVYDLRFIEHLERRRQDRVLCATRWTNFTLSAFT
VDPVLGQGANMASHAAWILGEEILSHSVYDHRFCEHLERRRQDRVLCATRWTNFTMGALQ
VDPMLGQGGNMASYAAHVLGEEIAGQEVFDELFCERVDARRANRVLGATRWTNYMLTNLR
VDPMMGQGANVASYAAFVLGEEIVNADVLDARFCEKVDLKRQDRVLAAARWTNIMLQPPS
***::***.*:**:** :*****
.* * * *::: :* :*** *:**** :
359
359
359
359
358
358
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
ALPPEFLAFLQILSQSREMADEFTDNFNYPERQWDRFSSPERIGQWCSQFAPTIAA---ELPPEFLTFLQILSQSREMADEFTDNFNYPELQWDRFSSPERIGQWCSQYAPTIAA---ELPPEFLAFLQVLSLSREMADEFTDNFNYPERQWDRFSSPERIGQWCSQYAPTIAA---ALPPEFIAFLQVLSQSREMADEFTDNFNYPERQWDRFSSPERIGHWCSQYAPTIAA---TLPNELVELLGAVSLDRKLADKFTDNFNYPEAQWDVFSSPENMKAWVEQNSTGAAEESER
E---ALGMLIGAMSQNQALADEFTENFNYPDHQWDRVASAERIQAWIERKTAPAAPVRAT
: :: :* .: :**:**:*****: *** .:*.*.: * .: :. *
415
415
415
415
418
415
AAC23718.1
ABX24519.1
CAA04000.1
ADE62390.1
BAL04132.1
ABV24041.1
--------------------------------PFAEAGAQS 427
A-------- 416
Abb. 8.1. Alignment der StyA-Untereinheiten aus sechs Organismen. Die Bezeichnungen entsprechen den
Eintrags-Nummern bei NCBI. AAC23718.1: Pseudomonas sp. VLB120, ABX24519.1: Pseudomonas putida,
CAA04000.1: Pseudomonas sp. Y2, ADE62390.1: Pseudomonas sp. LQ26, BAL04132.1: Rhodococcus sp. ST-5,
ABV24041.1: nicht-kultiviertes Bakterium.
117
8. Anhang
AAC23719.1
CAA04001.1
CAB06824.1
ADE62391.1
BAL04130.1
ABV24042.1
-----------MTLKKDMAVDIDSTNFRQAVALFATGIAVLSAETEEGDVHGMTVNSFTS
-----------MTLKKDMAVDIDSTNFRQAVALFATGIAVLSAETEEGDVHGMTVNSFTS
-----------MTLKKDVAVDIDSTCFRQAVALFATGIAVLSAETEEGEVHGMTVNSFTS
-----------MTLKTDAAVEIDAASFRQAVALFATGIAVLSAETADGEVHGMTVNSFTS
MSPQASTTSPTLTPTPEEVSAIAQMNFRTSVALFATGIAVVTMDDGDGGVHGVTVNSFTS
------------------MQRADPLAFRQAASRFATGVALLTALDSHGEVCGMTANSFVT
** :.: ****:*:::
.* * *:*.***.:
49
49
49
49
60
42
AAC23719.1
CAA04001.1
CAB06824.1
ADE62391.1
BAL04130.1
ABV24042.1
ISLDPPTVMVSLKSGRMHELLTQGGRFGVSLLGESQKVFSAFFSKRAMDDTPPPAFTIQA
ISLDPPTVMVSLKSGRMHELLTQGGRFGVSLLGESQKVFSAFFSKRAMDDTPPPAFTIQA
ISLDPPTVMVSLKSGRMHELLTRGGRFGVSLLGESQKVFSAFFSKRVMDDTPSPAFTIQA
ISLDPPTVMVSLKTGRMHELLTQGRRFGVSLLGEGQKVLSAFFSKRMLDDSPPPAFTVQN
ISLDPPTVMVSLRPGRAHDLISSAGVYGVSVLTQAQQNHSRYFTG-AREDNWSPEFLTGA
ISLSPPTVLVSVKPGRMHEAMSASRRYGVNVLPEYANALSRHFAGRPRQAH--PDYEIVE
***.****:**::.** *: :: . :**.:* : : * .*:
:
* :
109
109
109
109
119
100
AAC23719.1
CAA04001.1
CAB06824.1
ADE62391.1
BAL04130.1
ABV24042.1
GLPTLQGAMAWFECEVESTVQVHDHTLFIARVSACGTPEANTPQPLLFFASRYHGNPLPL
GLPTLQGAMAWFECEVESTVQVHDHTLFIARVSACGTPEANAPQPLLFFASRYHSNPLPL
GLPTLRDAMAWFECEVESTVQVHDHTLFIARVSACGTPEANAPQPLLFFASRYHGKPLPL
SLPTLQDAMAWFECEVESTVQIHDHTLFFARVSACGRPEATAPQPLLFFASRYHGNPLPL
TVPTLAGSLARFECRVTDTISVHDHTLFIARVEHCDSDQG---SPLMFFASKYHQPALTI
GLPRLSNCVAFFACEVTRTIDISDHTLFIAEVSGCDYCDS---LPLVFFSSRYHLGPGKP
:* * ..:* * *.* *:.: *****:*.*. *. :.
**:**:*:** .
169
169
169
169
176
157
AAC23719.1
CAA04001.1
CAB06824.1
ADE62391.1
BAL04130.1
ABV24042.1
N---N---N---N---SDKAT
VDR--
170
170
170
170
181
160
Abb. 8.2. Alignment der StyB-Untereinheiten aus sechs Organismen. Die Bezeichnungen entsprechen den
Eintrags-Nummern bei NCBI. AAC23719.1: Pseudomonas sp. VLB120, CAA04001.1: Pseudomonas sp. Y2,
CAB06824.1: Pseudomonas fluorescens, ADE62391.1: Pseudomonas sp. LQ26, BAL04130.1: Rhodococcus sp.
ST-10, ABV24042.1: nicht-kultiviertes Bakterium.
118
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer
anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin
angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne
Kennzeichnung übernommen habe.
Anke Hummel