Molekulare Genetik der Eukaryoten

Molekulare Genetik der Eukaryoten
Vorlesung Nr. 441: Biochemie I für Mediziner
Josef Jiricny
4. Auflage, August 2002
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
Inhaltsverzeichnis
1.
Organisation des Eukaryotischen-Genoms.......................................................................................1
1.1
DNA-Methylierung......................................................................................................................1
2.
Der Zellzyklus .....................................................................................................................................2
3.
DNA-Synthese: Replikation...............................................................................................................3
3.1
4.
RNA-Synthese: Transkription ...........................................................................................................4
4.1
4.1.1
5.
Hemmstoffe der Topoisomerasen...............................................................................................7
Hemmstoffe der Proteinsynthese ...............................................................................................9
Genumordnungen.............................................................................................................................10
7.1
7.1.1
8.
Hemmstoffe von Replikation und/oder Transkription .................................................................................................6
Synthese (Translation) von Proteinen...............................................................................................7
6.1
7.
Spleissen......................................................................................................................................5
Topoisomerasen ..................................................................................................................................6
5.1
6.
Telomerase..................................................................................................................................4
Retroviren.................................................................................................................................11
Inhibitoren der DNA-Synthese des HIV Virus............................................................................................................12
Mutagenese und DNA Reparatur ....................................................................................................13
8.1
Schädenumkehrung ...................................................................................................................13
8.2
Basenexcisionsreparatur (BER) ...............................................................................................14
8.3
Nukleotidexcisionsreparatur.....................................................................................................14
8.4
Fehlpaarungsreparatur ..............................................................................................................15
8.5
Strangbruchsreparatur ........................................................................................................................15
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
1. Organisation des
Eukaryotischen-Genoms
Die DNA bildet mit den basischen Histonen geordnete
Strukturen, die Nukleosomen. Ein Nukleosom Core besteht
aus etwa 146 Basenpaaren, die um je zwei H2A, H2B, H3
und H4 Histonmoleküle so herum gewunden sind, dass 13/4
Windungen einer linksgängigen Superhelix entstehen.
Einzelne Nukleosomen sind über kurze DNA-Abschnitte
perlschnurartig miteinander verbunden. Die einzelnen
Chromatinfäden liegen in den 46 Chromosomen in stark
kondensierter Form vor: Totale Länge der DNA = 2 m,
totale Länge aller 46 Chromosomen (in Metaphase) = 200
µm. Chromatinkondensierung ist abhängig auch vom DNAMethylierungszustand und der Histonmodifikation
(Acetylierung,
Methylierung,
ADP-Ribosylierung,
Phosphorylierung). Methylierte DNA (siehe unten)
interagiert stärker mit Histon H1. Nukleosome die H1
enthalten besitzen ungefähr 166 Basenpaare DNA. H1 wird
unmittelbar vor der Mitose phosphoryliert und nach der
Mitose wieder dephosphoryliert, was vermuten lässt, dass
diese kovalente Modifikation seine Fähigkeit steuert, die
DNA zu verdichten.
1
Acetylierung an Lysinresten von Histonen (z. B. H4) kann
ihre Affinität für DNA beeinflussen. Das Zusammenspiel
zwischen Histon-Acetylasen und –Deacetylasen, DNA
Methylasen und Histon-Kinasen ist insgesamt für die
Dichte der Chromatinverpackung verantwortlich.
Die am stärksten komprimierte DNA findet man in Spermienköpfen, wo die Histone durch Protamine ersetzt sind.
Die Protamine sind argininreiche Proteine, welche durch
Bindung an die DNA hochgradig α-helikal werden.
Weniger als 1% der Gesamt -DNA ist in den Mitochondrien
lokalisiert als kleine zirkuläre DNA. Mitochondriale Proteine
werden teils durch nukleäre, teils durch mitochondriale
DNA kodiert.
Menschliche DNA enthält pro diploide Zelle ca. 6.6 x 109
Basenpaare. Dies würde für ca. 3 x 106 Gene reichen. Tatsächlich rechnet man aber mit nur ca. 35’000 Genen. Dies
hätte eine viel kürzere DNA zur Folge, aber stark repetitive
DNA und Introns (nicht kodierende DNA-Abschnitte
zwischen den Exons) sind u.a. für die jetzige Länge der
menschlichen DNA verantwortlich.
1.1
DNA-Methylierung
Das C-5 des Cytosins in CG–Sequenzen der Säuger-DNA
(in Pflanzen auch in CNG) wird durch die DNAMethyltransferase modifiziert. Die Methylgruppe wird von
S-Adenosylmethionin übertragen. Ungefähr 90% der CG–
Sequenzen in menschlicher DNA
NH2
sind methyliert. Im allgemeinen sind
CH3
aktive Gene weniger stark methyliert
N
als inaktive, vor allem in Promotoren.
Methylierte DNA wird von Histon
HO
N
H1 und anderen Proteinen (MBD,
methylated DNA binding proteins)
stärker gebunden. Dadurch wird sie
5-Methylcytosin
eher in Heterochromatin verpackt.
Viele "Haushaltgene" haben CG-reiche Promotoren, die so
genannten "CG-Inseln", die in der Regel immer
unmethyliert bleiben.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
2. Der Zellzyklus
Voraussetzung für jede Zellteilung (Mitose) ist die
Replikation der DNA, um identische Kopien für jede
Tochterzelle bereitzustellen. Die Replikation erfolgt in der
synthetischen oder S-Phase während der Interphase
(zwischen zwei Mitosen). Ein ganzer Zellzyklus (G1 - S - G2 M) dauert bei kontinuierlich sich teilenden Zellen (z.B.
Darmmucosa, Hautepithel, Erythrozyten-Vorstufe) ca. 16 20 Std. Andere Zellarten teilen sich nur auf ein Signal hin
(z.B. Lymphozyten), selten (Leber- und Nierenzellen) oder
sozusagen nie (Nerven- und Muskelzellen). In diesen
Fällen ist die G1-Phase von ca. 5 Std. auf Tage oder
Wochen verlängert. Eine derart lange G1-Phase wird auch
als G0 bezeichnet. S-, G2- und M-Phase dauern ca. 7, 3 und 2
Std.
2
Die katalytische Aktivität der cdc2-Kinase hängt auch von
ihrem Phosphorylierungszustand ab, der durch Signale von
Wakstumsfaktoren kontrolliert wird.
Der Eintritt in die Mitose wird von einer Protein-Kinase
(cdc2-Kinase) kontrolliert. Sie wird durch Cyclin B aktiviert,
ein im Zellzyklus synthetisiertes und abgebautes Protein.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
3
3. DNA-Synthese: Replikation
In höheren Eukaryoten sind mehr als zehn DNA-Polymerasen charakterisiert worden. Polymerase-α, -δ und -ε werden bei der
DNA-Replikation und -Reparatur gebraucht. Polymerase-β ist für die Basenexcisions Reparatur verantwortlich, während
Polymerase-γ für die Replikation des mitochondriellen Genoms sorgt. Die anderen sind in „By-pass“ von DNA-Schäden
involviert.
Die eukaryotische DNA wird semikonservativ und semidiskontinuierlich von mehreren tausend Startpunkten aus repliziert.
Der Leitstrang wird von der DNA-Polymerase-δ synthetisiert, deren Prozessivität ist durch die Komplexbildung mit PCNA
(Homolog der β-Untereinheit der bakteriellen Polymerase III) erhöht. Der Folgestrang wird diskontinuierlich von DNAPolymerase-α synthetisiert.
Eukaryotisches Enzym
Polymerase-δ
3‘-5‘ Exonuclease
Polymerase-α
Primase (2)
3‘5‘ Exonuclease
Polymerase-ε
Replikations-Faktor C (RFC) (5)
Replikations-Protein A (RPA) (3)
DNA Helikase
PCNA (Homotrimer)
Topoisomerase I, II
DNA-Ligase I
Bakterielles Homolog
Pol III (α-Untereinheit) Pol III (εUntereinheit)
Pol III (α-Untereinheit) DNA-Primase
Pol III (ε-Untereinheit)
Pol I
Pol III (γδ-Untereinheiten)
Ssb
DNA B-Protein
Pol III (β-Untereinheit)
DNA-Gyrase
DNA-Ligase
Die Länge der Okazaki-Fragmente bei Eukaryoten liegt bei 100-200 Nukleotiden, was darauf hindeutet, dass jeweils ein
Nukleosom pro Okazaki-Fragment entfernt wird.
Alte Histone verbleiben bei der DNA-Doppelhelix, die den Leitstrang enthält, während sich an der Doppelhelix mit dem
Folgestrang neue Histone zusammenlagern.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
3.1
Telomerase
Telomere, die Enden der Chromosomen, werden von einer
Reversen Transkriptase repliziert, die eine RNA-Matrize
enthält. Die Telomerase synthetisiert Tandemwiederholungen von G-reichen Hexanukleotiden (AGGGTT in
menschlicher DNA), um die Synthese des Folgestrangs zu
vollenden.
Weil somatische Zellen keine, oder nur wenig
Telomeraseaktivität haben, wird die Telomerenlänge mit
jeder Zellteilung kürzer. Daraus ist die Hypothese
entstanden, dass die Telomeraseaktivität die Ge schwindigkeit des Alterungsprozesses festlegt. Krebszellen zeigen
eine erhöhte Telomeraseaktivität und haben die Tendenz
„immortal“ zu werden. Die Telomerase könnte deswegen
ein Ziel der Tumortherapie werden.
Aug-02
4
4. RNA-Synthese: Transkription
In Eukaryoten sind drei RNA-Polymerasen bekannt. Die
RNA-Polymerase I sorgt für die Synthese der ribosomalen
RNA, RNA Polymerase II für die mRNA Synthese und
Polymerase III ist für tRNA-Synthese zuständig. Anders
als bei der Replikation der DNA werden bei der
Transkription immer nur Teile der DNA transkribiert. Für
die Initiation der Transkription werden besondere Erkennungssequenzen und auf diesen Erkennungssequenzen
bindende Proteine (Transkriptions- faktoren) gebraucht:
der Promoter (Ort der initialen Bindung der RNA
Polymerase) und ev. regulatorische Regionen (Enhancer).
Ein Promoter besteht meist aus einer TATA-Box (ca. 30
Basen upstream von der Initiationsstelle) und aus einer GCRegion, oft mit einer CAAT-Box, 50 - 100 Basen upstream.
Enhancer können up- oder downstream liegen.
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
Das primäre Transkriptionsprodukt ist die heterogene
nukleare RNA (hnRNA). Ein Teil dieser hnRNA wird
anschliessend in reife mRNA umgewandelt: Das 5’-Ende
erhält ein cap (methylierter Guanosylrest in 5’ ‡ 5' Bindung
zum ersten Nukleotid), Spaltung am 3’-Ende und Addition
von Poly-A (100 - 250 Reste), und Splicing, d.h. die
Entfernung von Introns und das Zusammenfügen
(Ligieren) der Exons zur reifen mRNA. Diese “mature
mRNA” gelangt dann durch Kernporen ins Cytosol als
Matrize für die Proteinsynthese.
5
4.1
Spleissen
Die Spleissosomen sind grosse (60 S) Aggregate aus
snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) und mRNA
Vorläufern. Das U1-snRNP erkennt die 5’-Spleissstelle, weil
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
die U1-snRNA eine Sequenz erkennt, die komplementär zu
diese Spleissstelle ist. Nun bindet das U2-snRNP die
Verzweigungsstelle in dem Intron. Die Assoziation von U1
und U2 bringt die 5’- und 3’-Enden des Introns zusammen,
was U1 in die Lage versetzt, auch mit der 3’-Spleissstelle
eine Basenpaarung einzugehen. Zu diesem Komplex stösst
jetzt eine bereits gebildete Anordnung aus U4, 5 und 6. Die
U2 und U6-snRNPs bilden höchstwahrscheinlich das
katalytische Zentrum des Spleissosoms.
4.1.1
Hemmstoffe von Replikation
und/oder Transkription
Hemmstoffe von Replikation und/oder Transkription bei
Eukaryoten können toxisch wirken (Aflatoxin, α-Amanitin)
oder als Cystostatika zur Krebsbekämpfung eingesetzt
werden (Cytosin-Arabinosid, Actinomycin); als Antibiotika
können Stoffe verwendet werden, welche selektiv nur die
Replikation oder Transkription von Prokaryoten hemmen
(Rifampicin).
Die Wirksamkeit Acyclovirs bei Herpes simplex Infektionen
ist dadurch gegeben, dass diese Substanz erst durch die
virale
Thymidin-Kinase
phosphoryliert
wird.
Acyclovirtriphosphat ist nur Substrat für die virale, nicht
aber für die menschliche DNA Polymerase. Deswegen wird
es ausschliesslich in die virale DNA eingebaut.
6
5. Topoisomerasen
Die meisten natürlich vorkommenden DNA-Moleküle sind
negativ superspiralisiert. Die negative Superspiralisierung
bereitet die DNA auf Prozesse vor, die eine Trennung der
beiden Stränge erfordern. Dazu gehören die Replikation, die
Rekombination und die Transkription. Die Verwindungszahl der DNA ist aber ein dynamisches Phänomen.
Prozesse, die Proteinbewegungen auf der DNA-Matrize
erfordern, ändern kontinuierlich den Superspiralisierungstand vor und hinter sich.
Topoisomerasen verändern die Verwindungszahl der DNA,
indem sie einen dreistufigen Prozess katalysieren:
1) Spaltung eines oder beider Stränge der DNA
2) Durchtritt eines DNA-Abschnitts durch die
entstandene Lücke
3) die Wiederverknüpfung der DNA-Bruchstelle.
Die Typ-I- Topoisomerasen spalten nur einen DNA-Strang.
Die Reaktion der Entspannung einer negativsuperspiralisierten DNA ist thermodynamisch gesehen mit
Energiegewinn verbunden. Die Verwindungszahl erhöht
sich bei jedem Katalysendurchgang um 1 (Relaxation).
ACYCLOVIR
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
7
Nalidixinsäure und Ciprofloxacin, die häufig zur
Behandlung von Harnwegs- und anderen Infektionen
eingesetzt werden, beeinträchtigen dagegen die Spaltung
und Wiederverknüpfung von DNA-Ketten.
Eukaryotische Topoisomerasen sind Angriffspunkte der
modernen Krebstherapie; Camptothecin (Topo-I Inhibitor)
und Etoposid (Topo-II Inhibitor) hemmen die Proliferation
der schnell-replizierenden Krebszellen.
6. Synthese (Translation) von
Proteinen
Bei Eukaryoten verläuft die Proteinsynthese im Cytosol
oder am rauhen ER ab, während bei Prokaryoten und in
Mitochondrien Transkription und Translation gekoppelt
sind. Im Cytosol bilden die aktiven Ribosomen, aufgereiht
an mRNA, sogenannte Polysomen, an denen vor allem
Proteine für den zelleigenen Bedarf synthetisiert werden. Im
rauhen ER, also an membrangebundenen Ribosomen,
werden vor allem Proteine für den Export (z.B.
Plasmaproteine) synthetisiert.
Enzyme des Typs II spalten dagegen beide Stränge und
führen negative Superhelices in die DNA ein. Diese Art
Superspiralisierung erfordert Energie. Die DNATopoisomerase II wandelt die freie Energie des ATP in die
Torsionsenergie von Superhelices um. Die Verwindungszahl der DNA wird bei jeder Reaktion um 2 reduziert.
5.1
Hemmstoffe der
Topoisomerasen
Das fundamentale Prinzip der Proteinsynthese bei
Eukaryoten ist dem bei Prokaryoten ähnlich. Einige
Uebereinstimmungen und Unterschiede sind im folgenden
zusammengestellt:
Die DNA-Gyrase (bakterielle Topo-II) ist Angriffspunkt
verschiedener Antibiotika, die das prokaryotische Enzym
viel stärker hemmen als das eukaryotische. Novobiocin
blockiert die Bindung des ATP an die Gyrase.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
8
1. Ribosomen.
Die Ribosomen der Eukaryoten sind grösser: Sie bestehen
aus einer grossen 60S- und einer kleinen 40S-Untereinheit;
beide treten zu einem 80S-Partikel zusammen. Die 40SUntereinheit enthält eine 18 S-RNA, die 60S-Untereinheit
enthält drei RNSs: die 5S- und die 28 S-RNA. Die 5,8 SRNA tritt nur bei Eukaryoten auf.
2. Initiator-tRNA.
In Eukaryoten ist die Initiatoraminosäure Methionin und
nicht N-Formylmethionin.
3. Startsignal.
Das Startcodon ist bei Eukaryoten immer AUG. Es wird
gewöhnlich das am nächsten zum 5'-Ende der mRNA
liegende AUG als Startstelle ausgewählt. Die 40SUntereinheit lagert sich an das Cap am 5'-Ende an und
sucht nach einem AUG-Codon, indem sie sich schrittweise
in 3'-Richtung bewegt. Dieser Abtastprozess wird durch
die Hydrolyse von ATP angetrieben.
4. Initiationskomplexe.
Neun sind bekannt. Zur Bezeichnung eines eukaryotischen
Initiationsfaktors wird die Vorsilbe eIF verwendet
5. Elongations- und Terminationsfaktoren.
Die GTP-Form des EF1α bringt die Aminoacyl-tRNA zur AStelle des Ribosoms, und EF1βγ katalysiert den Austausch
von GTP gegen gebundenes GDP. Das EF2 vermittelt die
von GTP angetriebene Translokation.
Die Translation wird in Eukaryoten durch Protein-Kinasen
kontrolliert, die einen Initiationsfaktor inaktivieren. Die
Termination wird durch den Freisetzungsfaktor eRF
ausgeführt.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
6.1
9
Hemmstoffe der
Proteinsynthese
Die Unterschiede zwischen den Proteinsynthesemaschinen
der Pro- und Eukaryoten ermöglichen den Einsatz von
Inhibitoren der Proteinsynthese von Prokaryoten als
Antibiotika:
Antibiotikum
Streptomycin
Wirkung
und andere Aminoglykoside
hemmen die Initiation und
verursachen Fehlablesungen der
mRNA (bei Prokaryoten)
Tetracyclin
lagert sich an die 30S-Untereinheit
an und hemmt die Bindung der
Aminoacyl-tRNAs (bei
Prokaryoten)
Chloramphenicol
hemmt die
Peptidyltransferaseaktivität der
50S-Ribosomenuntereinheit (bei
Prokaryoten)
Cycloheximid
hemmt die
Peptidyltransferaseaktivität der
60S- Ribosomenuntereinheit (bei
Eukaryoten)
Erythromycin
lagert sich an die 50S-Untereinheit
an und hemmt die Translokation
(bei Prokaryoten)
Puromycin
verursacht vorzeitigen
Kettenabbruch, weil es als
Analogon der Aminoacyl-tRNA
wirkt (bei Prokaryoten und
Eukaryoten)
Inhibitoren
der
Eukaryoten-Proteinsynthese
sind
gefährliche Toxine. Diphtherie-Toxin z.B. blockiert die Proteinsynthese durch ADP-Ribosylierung von EF-2, was die
Translokation verunmöglicht.
Röntgenstruktur der 30S-Untereinheit der E. coli Ribosoms
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
10
7. Genumordnungen
Bei der homologen Rekombination lagern sich Regionen der Eltern-DNA-Doppelhelices mit ähnlichen (homologen) Sequenzen
aneinander, und neue DNA-Moleküle werden durch den Austausch homologer Segmente gebildet. Die homologe
Rekombination spielt eine Schlüsselrolle bei der DNA-Reparatur.
Die ortsspezifische Rekombination von V-, D- und J-Genen erzeugt die immense Vielfalt im Immunsystem.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
11
Transposition ist die Bewegung eines Gens von einem Chromosom zu einem anderen oder von einem Ort zu einem anderen auf
demselben Chromosom. Im Gegenatz zur homologen Rekombination erfordert eine Transposition keine ausgeprägte Homologie
der Nucleotidsequenzen. Transposons sind mobile genetische Elemente, sie ermöglichen ein "Springen" der Gene zwischen
nichthomologen Orten in der DNA. Einige Transposonen bewegen sich via eine RNA-Zwischenstufe. Diese heissen
Retroposons:
7.1
Retroviren
Retroviren besitzen ein RNA-Genom, replizieren sich jedoch über ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt, das in das
Genom der Wirtszelle eingebaut wird. Rekombination spielt eine wesentliche Rolle in ihrem Lebenszyklus.
Die vom Virus eingebrachte Reverse Transkriptase synthetisiert den (-)Strang der DNA und verdaut die virale (+)RNA. Zum
Schluss synthetisiert die Reverse Transkriptase den (+)Strang der DNA. Die Reverse Transkriptase führt also drei Reaktionen
durch: die RNA-abhängige DNA-Synthese, die RNA-Hydrolyse und die DNA-abhängige DNA-Synthese.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
12
Zusammen mit der Reversen Transkriptase bringt das Virus ein Integrationsprotein (IN) mit in die Zelle ein, das die
Rekombination der retroviralen DNA mit der DNA der Wirtszelle bewirkt.
Die Integration kann praktisch überall stattfinden - es wird keine bestimmte Sequenz ausgesucht.
NH2
N
OH
O
N
O
ddC
O
N
OH
N
NH
N
O
ddI
O
CH3
NH
OH
O
N
O
N3
AZT
7.1.1
Inhibitoren der DNA-Synthese des HIV Virus
Die dNTP Analogen AZT, ddI und ddC sind Substrate für die virale Reverse Transkriptase, nicht aber für die menschlichen
DNS Polymerasen δ und α. Deshalb vermögen sie spezifisch die Synthese viraler DNS zu blockieren ohne dabei die Replikation
oder Reparatur genomischer DNS zu stören. Die Nukleotidanalogen haben demnach auch keinen inhibierenden Einfluss auf die
Replikation der im Wirtsgenom integrierten Proviren, diese werden nämlich im Kontext der genomischen DNS durch die WirtsPolymerasen α und δ repliziert. Somit kann durch eine entsprechende Therapie eine HIV Infektion zwar in Schranken gehalten,
nicht aber geheilt werden.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
8. Mutagenese und DNA Reparatur
Mutationen
werden
durch
verschiedenartige
Veränderungen der Basensequenz in der DNA verursacht.
Verschiedene Mutationstypen sind bekannt: 1) die
Substitution eines Basenpaares durch ein anderes, 2) die
Deletion eines oder mehrerer Basenpaare und 3) die
Insertion (oder Addition) eines oder mehrerer Basenpaare.
Die Substitution eines Basenpaares durch ein anderes ist
der verbreitetste Mutationstyp. Eine Transition ist der
Ersatz eines Purins durch ein anderes oder eines Pyrimidins
durch ein anderes. Dagegen ist eine Transversion der
Ersatz eines Purins durch ein Pyrimidin oder umgekehrt.
Einige chemische Mutagene wirken sehr spezifisch
(z.B. 5-Bromuracil und 2-Aminopurin, die AT→GC
Transitionen verursachen). Andere Mutagene wirken
durch chemische Modifikation der DNA-Basen (z.B.
salpetrige Säure und Hydroxylamin, die durch
Desaminierung von Cytosin und Adenin, Transitionen von
CG→AT und AT→GC verursachen). Flache aromatische
Moleküle (Benzopyrene, Akridine) interkalieren in die
DNA. Sie führen dadurch zur Insertion oder Deletion von
einem oder mehreren Basenpaaren. Einwirkung von
ultraviolettem Licht auf DNA bildet Pyrimidindimere, die
auch mutagen wirken können.
13
Zellteilung an die nächste Generation weitergegeben
werden. Die Änderung der Genstruktur durch Mutation
kann sich in Verlust oder Änderungen der Aktivität eines
Proteins, seiner Regulierbarkeit, seiner Fähigkeit
spezifische Bindungen einzugehen (z.B. mit Cofaktoren,
Substraten) oder seiner Stabilität auswirken. Beispiele für
Störungen im Katabolismus sind: Galaktosämie,
Phenylketonurie, Glucose-6-P-Mangel, Glykogenspeicherkrankheiten. Beispiel für Störungen im Anabolismus:
Porphyrien. Beispiele für Störungen komplexer Funktionen:
Hämoglobinopathien,
Hämophilie,
Xeroderma
Pigmentosum, HNPCC.
Alle DNA-Schäden und Modifikationen müssen deswegen
effizient repariert werden. DNA-Schäden können repariert
werden, da die genetische Information in beiden Strängen
der Doppelhelix gespeichert ist, so dass die in einem Strang
verlorengegangene Information aus der im anderen Strang
ersetzt werden kann.
8.1
Schadenumkehrung
Ein UV-Pyrimidindimer kann photochemisch gespalten
werden und zurück zu zwei Thymidinen rekonvertiert
werden. Dies wird mit Licht und DNA-Photolyase
katalysiert.
6-O-Methylguanin, ein Produkt der Chemotherapie, wird
durch den Transfer der Methylgruppe auf das “Kamikaze”Enzym, DNA-Alkyltransferase, zu Guanin konvertiert.
DNA-Ligasen reparieren einfache (3’-OH, 5’-Phosphat)
Strangbrüche.
DNA-Polymerasen machen Fehlpaarungen. Manche DNAModifikationen blockieren die Replikations- und
Transkriptionsprozesse. Mutationen in Genen können zu
Zelltransformation und Krebs führen. Durch unreparierte
Schäden können Mutationen entstehen, die nach
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
8.2
Basenexcisionsreparatur (BER)
Beschädigte oder modifizierte Basen werden generell durch
Basenexcision entfernt. Z.B. Cytosin in der DNA
desaminiert zu einem merklichen Prozentsatz auch spontan
zu Uracil. Die Desaminierung des Cytosins ist potentiell
mutagen, da sich während der Replikation Uracil mit
Adenin paart. Somit wird eines der Tochtermoleküle ein
AU-Basenpaar anstelle des ursprünglichen GCBasenpaares haben.
14
8.3
Nukleotidexcisionsreparatur
Excision eines Thymindimeres, das durch Einwirkung von
ultraviolettem Licht auf DNA gebildet wird:
Ein Reparatursystem beugt dieser Mutation vor: das Uracil
wird als fremde Base in der DNA erkannt und entfernt.
Xeroderma pigmentosum entsteht durch einen Defekt in
der menschlichen UV-Excinuclease. Die betroffenen Gene
sind XPA-XPG. Das XPV (Variant) Protein ist nicht beteiligt
bei der Reparatur. Das Gen kodiert für eine Polymerase, die
Pyrimidindimere toleriert und übergehen kann (by-pass
polymerase), ohne durch die Lesion blockiert zu werden.
Aug-02
J. Jiricny
DNA Replikation, Transkription, Translation und Reparatur in Eukaryoten
8.4
Fehlpaarungsreparatur
Bei der Reparatur der Fehlpaarungen ist die Identifizierung
des Matrizen- und des Tochterstranges erforderlich.
Betrachten
wir
ein
GT-Basenpaar
in
einem
neusynthetisierten DNA-Molekül. Wie unterscheidet die
Reparaturmaschine zwischen dem authentischen Elternstrang und dem fehlerhaften Tochterstrang? Die Markierungen zur Identifizierung der Stränge bestehen in E. coli
aus Methylgruppen an Adeninresten in GATC-Sequenzen.
15
8.5
Strangbruchsreparatur
Strangbrüche werden entweder durch homologe
Rekombination (A) oder durch "non-homologous endjoining (NHEJ)" (B) repariert. Während der homologen
Rekombination wird das Schwesterchromatid als Matrize
verwendet. Somit geht keine genetische Information
verloren. Während des "non-homologous end-joining"
werden die beiden Enden zuerst exonukleolytisch abgebaut
und dann religiert. Dieser Prozess führt zum Verlust von
genetischer Information.
A
B
In Eukaryoten ist kein MutH Homolog gefunden worden.
MutS existiert als Heterodimer von hMSH2 und hMSH6,
MutL als Heterodimer von hMLH1 und hPMS2.
Der erbliche nichtpolypöse kolorektale Krebs (HNPCC,
hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ist die Folge
einer defekten DNA-Fehlpaarungsreparatur. Die am
häufigsten mutierten Gene in HNPCC Familien sind das
mutS homolog hMSH2 und mutL homolog hMLH1.
Aug-02
J. Jiricny