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Research Collection
Doctoral Thesis
Enzyme engineering for intensified processes for the production
of rare monosaccharides
Author(s):
Bosshart, Andreas
Publication Date:
2014
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-010252699
Rights / License:
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DISS. ETH NO 22128
Enzyme engineering for intensified processes for the production
of rare monosaccharides
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Andreas Bosshart
Master of Science UZH in Biochemistry, University of Zurich
born on 29.11.1982
citizen of Fischingen (TG), Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Sven Panke (ETH Zurich, Switzerland), examiner
Prof. Dr. Andreas Plückthun (University of Zurich, Switzerland), co-examiner
Prof. Dr. Sai Reddy (ETH Zurich, Switzerland), co-examiner
2014
ABSTRACT
With the current trend in chemical industry towards more sustainable processes that produce
less waste and are less energy-intensive, enzyme-catalyzed reactions are gaining increasing
interest due to their striking selectivity and specificity and their ability to operate at ambient
conditions (neutral pH, aqueous solution, moderate temperatures). However, biocatalysts
considered for industrial application need to provide high reaction rates (i.e., a high specific
activity) and operational stability in order to be competitive in economic terms. In order to
overcome limitations in such properties, enzyme engineering procedures like directed evolution
or rational design have been successfully applied for a wide range of enzymes.
This thesis describes the development of a D-tagatose epimerase from Pseudomonas cichorii
(PcDTE) into an industrially suitable biocatalyst by directed evolution. D-Tagatose epimerase is
arguably the central enzyme in the synthesis of a wide range of rare monosaccharides,
carbohydrates that are not available in large amounts from natural resources, but have recently
attracted great interest as low-calorie sweetener, chiral building blocks, or active
pharmaceutical ingredients. They can be synthesized via simple isomerization or epimerization
reactions from readily available bulk sugars as e.g. D-glucose, D-fructose or D-galactose, but
these reactions suffer from an unfavorable position of the thermodynamic equilibrium,
limiting the yield and making these reactions economically unfeasible. Integration of enzymecatalyzed reaction and separation of product and reactant, e.g. by continuous chromatography,
into one continuous process can offer a highly attractive solution to overcome this limitation.
Such an integrated process, however, demands high standards of the biocatalyst in terms of
stability, selectivity and specific activity in order to enable an economic process.
Thermostability is one of the most frequent limitations in the application of biocatalysts for the
synthesis of fine and bulk chemicals, especially at elevated temperatures which are often
required in sugar-processing plants to avoid microbial contaminations, to reduce the viscosity
and to increase the reaction rate. Systematic screening of the subunit-subunit interface of
dimeric PcDTE in a medium-throughput in vitro assay format revealed several mutations that
increased the thermostability of PcDTE. Combination of all 9 beneficial sites by iterative
saturation mutagenesis (ISM) resulted in variant PcDTE Var8 that had an increase in
temperature stability of 21.4°C over wild-type. This variant showed no significant loss in
D-fructose conversion over 4 days in a long-term experiment at 50°C, while conversion
catalyzed by the WT decreased by 40% in the same time.
Next, this variant was taken as basis for improving the specific activity of the enzyme for the
reactions D-fructose/D-psicose and L-sorbose/L-tagatose. Saturation mutagenesis of 20
individual residues in the first sphere and 28 residues in the second sphere around the active
site revealed 8 mutations that increased activity towards D-fructose in variant IDF8 and 6
mutations that did so for L-sorbose in variant ILS6. IDF8 exhibited an increased specific activity
I
for D-fructose of 8.6-fold and ILS6 showed a 13.5-fold higher catalytic rate for L-sorbose. The
crystal structures of PcDTE Var8, IDF8 and ILS6 in presence of the respective substrates
indicated that modifications of the entrance tunnel afforded an increased catalytic rate for
IDF8 whereas the increase for ILS6 rather derived from differences in the hydrogen bonding
network to substrate and product. The operational performance of further developed variant of
IDF8, IDF10-3, was determined in an enzyme-membrane reactor at different temperatures in
presence of the respective substrate and confirmed that these final variants exhibited an up to
40-fold higher total turnover numbers compared to WT PcDTE.
Finally, to reduce the screening effort for the directed evolution of PcDTE, a growth-based
selection system was developed that was expected to facilitate the discovery of variants with
improved specific activity significantly. Therefore, a de novo metabolic pathway from D-allose
via D-psicose and D-fructose to fructose 6-phosphate was established by introduction of the
enzymes L-rhamnose isomerase, D-tagatose epimerase and fructokinase. Additionally, five
genes or complete operons of the E. coli host were deleted that were found to interfere with
the proposed metabolic pathway. Growth of the assembled selection system on D-allose as
sole carbon source could demonstrate the principle feasibility of the approach, but consistent
failures of the selections suggest that either a pathway intermediate had a toxic effect on the
selection host or that the catalytic activity of one of the pathway enzymes had too low activity
to effectively satisfy the flux requirement for growth on D-allose.
II
ZUSAMMENFASSUNG
Der Fokus der chemischen Industrie liegt zunehmend auf neuen Prozessen, die weniger Abfall
produzieren, weniger Energie verbrauchen und weniger gefährliche oder giftige Lösungsmittel
benötigen. Enzym-katalysierte Reaktionen können hier einen entscheidenden Beitrag leisten,
sowohl wegen ihrer erstaunlichen Spezifität und Selektivität, als auch wegen ihrer Fähigkeit,
Reaktionen in wässriger Lösung, bei beinahe neutralem pH und moderaten Temperaturen zu
katalysieren. Um sowohl prozesstechnischen als auch ökonomischen Ansprüchen zu genügen,
muss ein Biokatalysator jedoch bestimmte Anforderungen erfüllen, wie beispielsweise eine
seht gute spezifische Aktivität und Selektivität, als auch genügend Prozessstabilität
gewährleisten. Durch Protein-Engineering lassen sich praktisch alle dieser Parameter an die
Prozessbedürfnisse anpassen.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer D-Tagatoseepimerase vom Bakterium Pseudomonas
cichorii (PcDTE) behandelt, die durch gerichtete Evolution zu einem Biokatalysator verändert
wurde, der prozessbedingte Anforderungen erfüllen kann. D-Tagatoseepimerase ist das
zentrale Enzym in der Synthese von seltenen Zuckern, die in letzter Zeit grosses Interesse
geweckt haben durch ihre potentielle Rolle als kalorienarme Süssstoffe, als chirale Bausteine
für die Synthese von Arzneistoffen oder direkt als pharmazeutisch aktive Stoffe. Diese seltenen
Zucker kommen in der Natur nur in Spuren vor, lassen sich aber durch einfache enzymatische
Isomerisierungsreaktionen aus günstig verfügbaren Zuckern wie D-Glukose, D-Fruktose oder
D-Galaktose herstellen. Das Hauptproblem bei der Synthese dieser Stoffe durch enzymatische
Katalyse ist das thermodynamische Gleichgewicht der Iso- oder Epimerisierungsreaktionen,
was dazu führt, dass die Reaktionen unvollständig ablaufen und somit nur eine relativ geringe
Ausbeute ermöglichen. Durch eine Integration der enzymatischen Reaktion mit einer direkt
anschliessenden Trennung des Produkts von Ausgangs- und Zwischenprodukten und einem
Recycling des Ausgangsstoffs zurück in die Reaktion, lässt sich dieses Hindernis jedoch effektiv
überwinden. Andererseits stellt eine solche Integration hohe Anforderungen an den
Biokatalysator bezüglich Selektivität, spezifische Aktivität und vor allem Thermostabilität, die
indirekt – als Stellvertreter für Prozessstabilität allgemein – und in diesem Fall auch direkt
(siehe unten) von Bedeutung ist.
Ungenügende Prozess- und/oder Thermostabilität ist eine der häufigsten Limitationen bei der
Anwendung von Biokatalysatoren in der Synthese von Fein- und Massenchemikalien. Oftmals
werden erhöhte Temperaturen benötigt, speziell in der Zuckerindustrie, um Kontaminationen
durch Mikroorganismen zu verhindern, die Viskosität der Zuckerlösung zu reduzieren oder um
die Reaktionsrate zu erhöhen. Das Wildtypenzym PcDTE zeigte eine ungenügende Stabilität bei
solchen Bedingungen. Eine systematische Durchmusterung der Kontaktflächen der beiden
Untereinheiten des dimeren Enzyms PcDTE förderte mehrere Mutationen zutage, die eine
erhöhte Thermostabilität des Enzyms bewirkten, vermutlich indem sie die Trennung der
III
Untereinheiten als den die Enzyminaktivierung einleitenden Schritt hinauszögern. Die
Kombination von optimalen Mutationen in allen neun identifizierten Positionen durch iterative
Sättigungsmutagenese resultierte in einer finalen Variante namens PcDTE Var8, die einen T5020Wert (die Temperatur, bei der nach einer Inkubation von 20 min nur noch 50% der
ursprünglichen Aktivität gemessen werden kann) von 87°C erreichte, was einem Zuwachs von
21.4°C im Vergleich zum Wildtypenzym entspricht. Die darauffolgende Evaluation der
operationellen Stabilität unter Produktionsbedingungen in einem Enzym-Membran Reaktor
zeigte, dass Var8 auch nach 4 Tagen bei 50°C kaum Aktivität einbüsste, während der Wildtyp in
dieser Zeit 40% Aktivität verlor.
Diese Variante wurde daraufhin als Ausgangspunkt gewählt, um die spezifische Aktivität
gegenüber den Substraten D-Fruktose und L-Sorbose zu verbessern. Sowohl die Positionen der
20 Aminosäuren, die das aktive Zentrum des Enzym direkt umgeben, als auch die 28 Positionen,
in
denen
sich
die
Aminosäuren
der
zweiten
Schicht
befinden,
wurden
durch
Sättigungsmutagenese randomisiert und die resultierenden Enzymvarianten auf erhöhte
Aktivität durchmustert. Dabei wurden insgesamt 8 Mutationen gefunden, die eine Erhöhung
der katalytischen Aktivität gegenüber D-Fruktose um das 8.6-fache bewirkten (Variante IDF8),
und 6 Mutationen wurden gefunden, die die Aktivität gegenüber L-Sorbose um das 13.5-fache
erhöhten (Variante ILS6). Die Enzymvarianten Var8, IDF8 und ILS6 wurden in Gegenwart ihrer
jeweiligen Substrate kristallisiert und ihre Kristallstruktur wurde bestimmt. Basierend auf
diesen Strukturen konnte die Hypothese aufgestellt werden, dass die Erhöhung der
katalytischen Rate von IDF8 für D-Fruktose durch eine Modifikation des Eingangstunnels für
das
Substrat
bedingt
ist,
während
für
ILS6
eine
Änderung
im
Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk, das die Positionierung des Substrats L-Sorbose im
aktiven Zentrum massgeblich beeinflusst, die Erhöhung der Aktivität verursacht.
Als nächstes wurden zwei vorteilhafte Mutationen in IDF8 eingeführt, die in einer parallelen
Durchmusterung einer Bibliothek gefunden wurden, die auf zufälliger Mutagenese beruhte.
Zusammen mit einer Rückmutation einer sehr destabilisierenden Mutation und einer weiteren
vorteilhaften Mutation ergab das die finale Variante IDF10-3 für die effiziente Umsetzung von
D-Fruktose zu D-Psikose. Die Varianten IDF10-3 und ILS6 wurden in Gegenwart des jeweiligen
Substrats auf ihr Verhalten unter operationellen Bedingungen in einem Enzym-Membran
Reaktor bei unterschiedlichen Temperaturen hin untersucht. Es zeigte sich, dass diese
verbesserten Varianten bis zu 40-mal höhere total Substratumsatzzahlen (total turnover
numbers, TTN) erzielten, verglichen mit dem ursprünglichen Wildtyp.
Um den Aufwand zu reduzieren, der für das Durchmustern von grossen Bibliotheken
aufgewendet werden muss, wurde ein wachstumsbasiertes in vivo Selektionssystem
entwickelt, das die Evaluation einer sehr grossen Anzahl Varianten in kurzer Zeit erlauben
sollte. Dafür wurde ein de novo metabolischer Pfad in einen Escherichia coli Wirt implementiert,
der von D-Allose über D-Psikose und D-Fruktose zu Fruktose 6-Phosphat führt, dass dann in die
IV
Glykolyse eingespeist wird. Dazu wurden die Gene von L-Rhamnoseisomerase, DTagatoseepimerase und Fruktokinase rekombinant exprimiert. Zusätzlich wurden 5 Gene und
Operons ausgeschaltet, die mit dem projektierten metabolischen Pfad interferierten.
Wachstum
des
zusammengesetzten
Selektionssystems
auf
D-Allose
als
einziger
Kohlenstoffquelle bestätigte die grundsätzliche Machbarkeit dieses Ansatzes, aber widerholte
Versuche für eine Selektion von verbesserten Mutationen war nicht erfolgreich. Dieses Resultat
wurde darauf zurückgeführt, dass entweder eines der Intermediate des neuen metabolischen
Pfades eine toxische Wirkung auf den Wirt ausübt, oder dass eines der neu eingeführten
Enzyme eine zu geringe spezifische Aktivität aufweist, um einen genügend grossen
metabolischen Fluss durch den Pfad zu ermöglichen.
V