Allgemeine Molekulare Mikrobiologie 1

Allgemeine Molekulare
Mikrobiologie 1
(LvNr. 300415)
SS09
Fragenausarbeitung
GNU General Public License
VORWORT
Juni 2009
In dieser Ausarbeitung habe ich alles was ich gefunden habe (auch in den Foren) zusammenkopiert oder
auch aus dem Brock herausgearbeitet. Die ganz klein gedruckten Sachen sind entweder nicht wesentlich
zur Beantwortung der Frage und teilweise steht dort auch was sich die Leute in den Foren dazu gedacht
haben.
1.
KURZE Erklärung von relativer und absoluter Wachstumsgeschwindigkeit
Die absolute Wachstumsgeschwindigkeit entspricht der Bakterienzunahme / Zeiteinheit.
k = ∆n/∆t
Die absolute Wachstumsgeschwindigkeit steigt aufgrund der exponentiellen Zunahme der Zellzahl
bzw. Biomasse im Laufe der Kultivierung an.
Für einen kleinen Zeitraum ist die Zunahme der Biomasse (dx/dt) proportional der vorhandenen
(x) und relative Wachstumsrate μ.
dx/dt = μ x
Integriert über einen größeren Zeitraum von t0 bis t ergibt sich:
ln xt = ln x0 + μ (dt) oder xt = x0 eμdt
μ = ln(xt/x0) / t – t0 = ln (xt) - ln (x0) / t – t0
Für die Verdopplungszeit tgen (die Zeit t-t0, für die xt/x0 = 2 ist) ergibt sich einfach
μ = ln2/tgen = 0,693/tgen
Die Verdopplungszeit kann auch für die Ermittlung der absoluten Wachstumsgeschwindigkeit k
angewendet werden. k = 1/tgen
μ = 0,693k
2.
Beschreiben Sie den Unterschied zw. batch und kontinuierlicher Kultur und die Funktion und
Arbeitsweise des Chemostat
Eine batch Kultur ist eine mikrobielle Kultur in einem geschlossenen System. Ein fixes Volumen
eines Kulturmediums wird durch die metabolischen Aktivitäten wachsender Organismen
kontinuierlich verändert. (z.B. in einem Röhrchen, es wird kein Nährmedium zugefügt!) Bei der
Batch-Kultur gibt es dann auch diese 4 Phasen: lag-Phase, log-Phase, stationäre Phase, deathPhase.
Lag-Phase: es müssen zuerst Ribosomen usw. hergestellt werden müssen um mit der Synthese
zu beginnen, Zeit vor dem exponentiellen Wachstum, μ ~ 0
Log-Phase: alle Zellen befinden sich im selben Zustand, sie wachsen exponentiell μ = μmax
Ein ausgewogenes Wachstum gibt es so gut wie nicht in der Natur, es kann aber unter
Laborbedinungen stattfinden. (So können identische Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten
entnommen werden, die relative Syntheserate eines Zellbestandteils kann durch die Bestimmung
der Wachstumsrate ermittelt werden, reproduzierbarste Wachstumsstadium)
Stationary Phase: Wachstumsstop, da im geschlossenen System die Nährstoffe aufgebraucht
werden bzw. es zur Akkumulation von toxischen Stoffwechselendprodukten kommt, wachsende
und sterbende Zellen sind im Gleichgewicht, μ < μmax
Death Phase: Die Zahl der sterbenden Zellen ist größer als die der wachsenden Zellen,
μ < μmax
In batch Kulturen: bei niedrigen Konzentrationen wird die Wachstumsgeschwindigkeit reduziert,
bei mittleren/hohen Konzentrationen bleibt die Wachstumsgeschwindigkeit konstant, der Ertrag
nimmt zu.
Chemostat: ist ein Durchflusssystem mit konstanten Kulturvolumen und regulierbarer
Zufluss-/Verdünnungsrate. Der Chemostat ist eine kontinuierliche Kultur und ermöglicht die
Kultur von großen Bakterienmengen bei konstanten Bedingungen. Es stellt sich ein steady state
-1-
ein, bei dem die Kultur beliebig lange unter konstanten Bedingungen und bei einer
Substratkonzentration wächst.
Die relative Wachstumsgeschwindikeit μ ist eine Funktion des limitierenden Nähstoffes:
μ = μmax . S/(KS + S)
KS = Sättigungskonstante. Entspricht der Nähstoffkonzentration bei μ = μmax /2 meistens sehr
niedrig, daher ist S/(KS + S) normalerweise ~ 1
D.h. wenn ein Nährstoff in limitierenden Konzentrationen vorhanden ist, ist ein Log-Phasen
Wachstum nicht möglich.
Verdünnungsrate = D = Geschwindigkeit mit der frisches Medium zugefügt wird =
Geschwindigkeit mit der d verbrauchtes Medium /Zellen ausgewaschen werden.
D = F (Zuflussrate)/(Chemostatvolumen)
μ=D
Der spezifische Ertrag Y (produzierte Biomasse / verbrauchte Nährstoffe), der von der Art des
Substrats und der Art des Mikroorganismus abhängt, bleibt unverändert.
Solange S >> KS, kann konstantes Wachstum bei Wachstumsgeschwindigkeiten nah am μmax
aufrecht gehalten werden;d.H. im Chemostat reichern sich die MO an, die eine hohe Affinität für
den limitierenden Nährstoff haben.
Da ein Faktor limitierend ist, entspricht die Wachstumsphase dem Übergang von log zu
stationärer Phase.
3.
Erläutern Sie KURZ die Funktion und Arbeitsweise der Baby-Maschine.
Ist ein Inkubator, an dessen Boden sich eine Membran befindet. Werden Zellen in der Baby
Maschine inkubiert bleiben die Zellen an diesem Filter hängen, nun dreht man das Gerät auf den
Kopf und fügt von oben frisches Medium hinzu, dadurch werden alle Tochterzellen, die sich zu
diesem Zeitpunkt gerade geteilt haben gesammelt, da die Mutter durch elektrostatische
Anziehung am Filter hängen bleiben. Die Tochterzellen befinden sich alle im selben Stadium des
Zellzyklus sind also synchron und können für Wachstumsstudien herangezogen werden.
Forward: Die Zellen, die produziert werden, werden zu Tests und Untersuchung verwendet
z.B.: neue Baby-Zellen aus der ersten Minute werden genommen, dann wird nach vorgegebener
Zeit (z.B.: 5 Minuten) ein radioaktives Molekül dazu gegeben (gleich alte Zellen), dann die Zellen
untersuchen; da die Zellen alle gleich alt sind, sieht man ob das radioaktive Molekül in dem Alter
(5 Minuten) eingebaut wird
Backward: Tests vorher, dann Babymaschine, dann Untersuchung
z.B.: radioaktives Molekül dazu geben (verschieden alte Zellen), dann Babymaschine, neue Zellen
von Babymaschine untersuchen; die ersten Baby-Zellen von der Babymaschine sind von den
ältesten Zellen (20 Minuten alt bei Zugabe des radioaktiven Moleküls direkt vor Babymaschine);
wenn man Information über die Zellen will, die 5 Minuten alt waren, als das radioaktive Molekül
zugegeben wurde, nimmt man die Baby-Zellen die nach 15 Minuten geliefert werden (bei E.coli).
Bei dieser Methode sammeln wir in unterschiedlichen Fraktionen Zellen die unterschiedlich alt
sind.
Die Backward Methode gibt Auskunft über das Alter einer Zelle.
Es wird beobachtet wie sich die Makierung verändert:
Beispiel: Segregation des Cytoplasmas- Mütter 100% radioaktiv, nach der 1. Teilung sind die
Töchter 50% radioaktiv, bei der 2. 25% usw --> das lässt also auf dispersive Segregation
schließen.
4.
Was ist ein Replicon? Beschreiben Sie die Grundeigenschaften der Chromosomenreplikation,
sowie Experimente, die zu ihrer Entdeckung geführt haben.
(Wie funktioniert Replikation und durch welches Experiment wurde sie entdeckt?)
Das Replicon ist die DNA-Einheit, an der ein Replikationsvorgang abläuft. Das Replicon besitzt
einen Replikationsursprung und einen Terminus, der die Replikation beendet. Der oriC ist ein 240
bp Fragment der repetitive 9bp und AT-reiche 13 bp Sequenzen beinhaltet. Flankiert wird das oriC
von AT reicher DNA, die das Schmelzen der Stränge begünstigt. Der terC ist ein spezifischer
Bereich der sich ca.180° vom oriC befindet. Da sich die beiden Replikationsgabeln nicht unbedingt
-2-
gleichzeitig am terC treffen ist eine Replikationsgabel-Falle notwendig, um einer Fehlreplikation
vorzubeugen. terC setzt sich aus terC1 und terC2 zusammen. Jeder Bereich besteht aus einer 23
bp Sequenz, die nur in einer Orientierung aktiv ist. (In E.coli ist ein von tus kodiertes Protein
ebenfalls beteiligt)
Die Chromosomenreplikation ist ein semikonservativer Prozess (nicht konservativ oder dispersiv).
Um herauszufinden wie die DNA repliziert wird, wurden Bakterien auf einem Medium mit
schwerem Stickstoff (15N) gezüchtet. Dann wurden sie aus dem Medium entfernt und mit
normalen Stickstoff weiter vermehrt. Anschließend wurde die DNA der unterschiedlichen
Generationen verglichen. (Meselson-Stahl- Experiment) www.drd.de/helmich/bio/gen/reihe2/22/karte222s.html
Die Chromosomenreplikation verläuft bidirektional. Mittels Autoradiographie von DNA-Fasern kann
die bidirektionale Replikation nachgewiesen werden. Die Zellen werden für einige Minuten mit 3HThymidin markiert und anschließend elektronenmikroskopisch Untersucht. (Muster aufzeichnen)
5.
Beschreiben Sie Proteine, die bei der Initiation der DNA Replikation beteiligt sind.
Welche Proteine sind an der Initiation am oriC beteiligt und welche Funktion haben sie?
-
DnaA: nach Aktivierung durch ATP lagern sich viele Kopien an die 9mer des OriC und
bilden mit anderen Proteinen zusammen eine Schlaufe. Die Doppelhelix wird an den AT
reichen 13meren aufgeschmolzen.
DnaC: =Chaperon, bringt DnaB zu dem geöffneten Komplex.
DnaB: =Hexamer, die 6 Untereinheiten umklammern die DNA und entwinden sie in
3‘ Richtung
SSB: =single-strand binding proteins, binden an den geöffneten DNA, damit dieser
nicht gleich wieder hybridisiert.
DnaG= Primase, bindet an das Helikase-Hexamer und synthetisiert komplementär an
jeden Strang RNA-Primer.
- DNA Polymerase III: verlängert die RNA-Primer mit neuer DNA
α-Untereinheit fügt Nukleotide dem wachsenden 3’Ende der Kette hinzu (core)
β-Untereinheit (clamp): hängt das Enzym an die DNA und verbessert dadurch die
Prozessivität
γ-Komplex lädt die klemme auf die DNA bzw. entfernt sie wieder
ε-Untereinheit: entfernt mismatches
θ-Untereinheit: Funktion unbekannt
τ-Untereinheit: bewirkt die Dimerisierung von Pol III und beschleunigt Helikase,
hält Core 2 am lagging Strang
- DNA Polymerase I: entfernt die RNA-Primer und füllt die Lücke mit DNA
- DNA Ligase: verschmilzt die Fragmente
6.
Beschreiben sie DnaA, seine biolog., biochem. Funktion und seine Wirkung in der Regulation
Nach der Aktivierung durch ATP lagern sich viele DnaA Kopien an die 9mere des oriC und bilden
mit anderen Proteinen zusammen eine Schlaufe. Die Doppelhelix wird an den ATreichen 13meren
aufgeschmolzen.
Die Menge des aktiven DnaA ist eng an die Zellmasse gekoppelt, nicht unbedingt an die sog.
Initationsmasse. Die Massenkoppelung lässt sich besonders gut dann beobachten wenn Zellen
langsam wachsen und nur eine Replikationsinitation pro Zellzyklus erfolgt.
DnaA besitzt geringe intrinsische ATPase Aktivität, die für die Inaktivierung notwendig ist. Eine
effiziente Konversion von DnaA-ATP in DnaA-ADP erfordert die Konformation der β-Untereonheit
der Pol III, zusammen mit dem IdaB.
Titration: Der datA Locus enhält 5 hochaffine Bindungsstellen für DnaA. Sobald der datA Locus
repliziert ist, wird die Menge an freiem DnaA durch Bindung an datA erniedrigt. Hierdurch wird
eine verfrühte Neuinitiation verhindert.
Hemimethylierung und Sequestrierung des DnaA Gen Promoters: oriC und der Promotor des
DnaA Gens enthalten eine Reihe von GATC Sequenzen, welche durch die Dam Methylase am
-3-
Adenin methyliert werden.
Die Methylierung im neureplizierten Strang dauert länger als bei der restlichen → lang
andauernder Zustand der Hemimethylierung.
Hemimethylierte Bereiche können spezifisch mit der Zellmembran assoziieren, sodass eine
Neuinitiation und Promotoraktivierung verhindert werden.
Negative Regulation der Replikationsinitation durch SeqA Protein:
SeqA Protein bindet hemimethylierte DNA unabhängig von der Sequenz, und oriC unabhängig
vom Methylierungszustand. SeqA Bindung am oriC könnte das vorzeitige Aufschmelzen bei der
Initiation verhindern und könnte bei der Membranssoziation hemimethylierter DNA eine Rolle
spielen. SeqA verhindert vorzeitiges Binden von DnaA, bei Seq-Mutanten wird die Replikation
vorzeitig initiiert.
7.
Initiation der Replikation & Regulation der Initiation
siehe die letzten beiden Fragen
Der oriC ist ein 240 bp Fragment der repetitive 9bp und AT-reiche 13 bp Sequenzen beinhaltet.
Flankiert wird das oriC von AT reicher DNA, die das Schmelzen der Stränge begünstigt.
Dann bindet DnaA…
Regulation über DnaA
8.
Welche Enzyme entfernen positive/negative Supercoils? Welche Rolle spielen diese Enzyme in der
Replikation des bakteriellen Chromosoms?
Prinzipiell unterscheidet man Typ I Topoisomerasen für die Entfernung von negativen Supercoils
(ss-break) und Typ II Topoisomerasen für die positiven Supercoils (ds-break) bei Bakterien. Die
Topoisomerase IV sowie auch die bakterielle Gyrase gehören zur Gruppe der Typ II
Topoisomersen. Die Gyrase erhöht die Anzahl negativer Supercoils (positive behindern die
Replikation).
Die Topo I schneiden 1 Strang, 5‘ Ende wird an Tyrosin gebunden und das 3’Ende wird unter dem
anderen Strang durchgeführt und dann wieder verbunden.
Die DNA wird bei der Replikation mit einer Geschwindigkeit von 20 000 Windungen/min
entwunden und mit 300 bp/sec verlängert. Die Topoisomerasen entfernen die Supercoils, die bei
der Replikation entstehen und trennen schlussendlich die beiden Chromosomen. Gerade für die
Dekatenierung sind Topo V und II wichtig damit der Terminus repliziert werden kann. Das Prinzip
der Supercoils ist wesentlich, damit die DNA in der Zelle Platz hat andererseits ist das Prinzip
Relaxation wichtig damit Replikation stattfinden kann.
9.
Beendigung der Chromosomenreplikation
Wie findet bei E.Coli die Termination der Replikation statt?
Der terC ist ein spezifischer Bereich der sich ca.180° vom oriC befindet. Da sich die beiden
Replikationsgaben nicht unbedingt gleichzeitig am terC treffen ist eine Replikationsgabel-Falle
notwendig, um einer Fehlreplikation vorzubeugen. terC setzt sich aus terC1 und terC2
zusammen. Jeder Bereich besteht aus einer 23 bp Sequenz, die nur in einer Orientierung aktiv
ist. (In E.coli ist ein von tus kodiertes Protein ebenfalls beteiligt)
Und die Topoisomerase IV ist wesentlich für die Dekatenierung, damit die Replikation des terC
stattfinden kann (ohne Topo IV wäre die DNA zu verdreht).
10. Die verschiedenen Modelle der Chromosomensegregation angeben?
Vorraussetzungen: Dekatenierung und Membranhaftung der Chromosome
Par-Mutante:
Muk-Mutante: haben kein Chromosom, da Bewegung beider Chromosomen in die gleiche
Tochterzelle statt gefunden hat.
Nahe am oriC wurden Sequenzen eingebaut, an die Fluoreszenzproteine binden konnten. Weiters
-4-
wurden in die DNA-Polymerasen ebenfalls fluoreszierende Proteinsequenzen eingebaut. Dadurch
konnte die Bewegung des oriC sowie der Polymerasen beobachtet werden. Es wurde beobachtet,
dass sich bei der Initiation der Replikation sowohl oriC als auch Polymerasen in der Mittte der
Zelle befanden. Während der Replikation bleiben die Polymerasen in der Mitte der Zelle, während
die beiden oriCs in entgegen gesetzter Richtung zu den Zellpolen wanderten.
a. Passive displacement: DNA Replikation findet in der Zellmitte statt – Chromosome haften
an der Membran und werden durch das Wachstum derselben auseinander getrieben.
(Nicht möglich da Membran multifokal wächst und divpersiv verteilt wird)
b.
Transertion: Replikation, Transkription und Translation sind gekoppelt; die Neusynthese
von Membranproteinen, die ko-translationell in die Membran eingefügt werden, bewirkt
die dynamische Koppelung der DNA mit der Membran; die durch die Polymerasen
bereitgestellte Energie könnte die Chromokinese vorantreiben.
c.
Segregation durch biased transcription: Die Transkription stark exprimierter Gene und
Operone findet zumeist vom Replikationsursprung statt weg. Diese Direktionalität könnte
die durch die RNA Polymerase bereit gestellte Energie nutzen, um die neureplizierten
Chromosomen in Richtung der Zellpole zuschieben.
d.
Extrusion-capture/origin capture: die neureplizierten oris werden von Proteinen
eingefangen, welche in der Nähe des Replikationsursprung binden; diese wiederum
kooperieren mit ATPasen, die mit den Zellpolen wechselwirken und zwischen den Polen
pendel, und mit solchen, die die neureplizierte DNA rekondensierten; die durch die
statische Replikationsfabrik und durch die von den ATPasen erzeugte Energie könnte die
Chromokinese vorantreiben.
e.
Aktive Segregation durch Zytoskelett-ähnliche Strukturen: Bakterien besitzen sowohl
Aktinhomologe als auch Zentromeranologe Sequenzen; in den Zytoskelett-Mutanten ist
die Chromokinese gestört.
11. Erklärungen zu mukB?
Bakterielles mitotisches System:
MukB Gene sind wichtig für die Bewegung der Nukleoide von der Zellmitte zu den Polen und spielt
insofern eine Rolle bei der DNA-Segregation. Es ist ein multi-domain Protein von 170 kDa. Die
sekundäre Struktur weißt Ähnlichkeiten mit SMC-Proteienen auf. Es besteht aus:
- N-terminale, globuläre Domäne, welche ein Nukleotid-bindende Sequenz (Walker A motif)
enthält.
- Zentrale Region mit 2 helikalen coiled Domänen, getrennt durch ein „hinge“.
- C-terminale, globuläre Domäne, die DNA bindet.
In der Anwesendheit von ATP, komprimiert der MukBEF-Komplex die DNA in superhelikale,
Nukelosomen-ähnliche Strukturen.
In Bakterien: MreB = ähnlich dem Aktin, bindet an oriC und bewegt sich Richtung Pol
In der Plasmidsegregation: parC = Centromer, ParR = Centromer-bindendes Protein,
parM =ähnlich wie Aktin, führt oriC zu den Polen.
12. Was sind Protoplasten? Welche Form haben sie?
= Zellen ohne Peptidoglykan-Schicht also Zellwand. Sie sind rund und nur in isotonischen
Lösungen stabil. In hypotonen Lösungen würde die Zelle platzen sobald die Peptidoglykanschicht
durch das Lysozym zerstört wurde.
13. Beschreiben Sie die Struktur und Bausteine der Zellwand von gram-negativen und gram-positiven
Bakterien
Die Bakterien haben eine Zellwand, die aus einem engmaschigen molekularen Komplex besteht,
der Peptidoglykanschicht. Sie gibt den Bakterien ihre Form und schützt das Bakterium vor
osmotischer Lyse. Die Peptidoglykan ist ein Polymer aus 2 alternierenden Aminozuckern, NAG und
NAM (N-Acetylglucosaminsäure und N-Acetylmuraminsäure). Diese bilden über β 1-4
Verknüpfung lange Stränge. Die Peptidbrücken (Alanin, Glutamin, Lysine, DAP) die von NAM
-5-
ausgehen vernetzen die Zuckerstränge. Diese Vernetzung macht die Zellwand starr und
widerstandsfähig.
Gram + Hülle: Die Zellwand besteht aus mehreren miteinander verbundenen
Peptidoglykanschichten, diese machen 60-90 % aus (20-80 nm). In die Peptidoglykan sind
Teichonsäuren und Lipoteichonsäuren integriert. Lipoteichonsäuren stellen die Verbindung der
Zellwand zur Zellmembran dar. Die Teichonsäure ist ein Polymer aus Glycerol, Phosphaten und
Ribitol. Sie kann Calcium und Magnesium binden und ist auch teilweise für die negative Ladung
der Zelloberfläche verantwortlich.
Gram – Hülle: hier ist nur eine einfache Peptidoglykanschicht (2-3 nm)vorhanden. Es gibt weniger
Quervernetzungen als in Gram+ Bakterien und keine Peptid-Interbrücken. Die
Peptidoglykanschicht ist kovalent an Lipoprotein gebunden und dadurch mit der Außenmembran
verknüpft.
Es gibt hier auch eine äußere Membran auch Lipopolysaccharidschicht oder LPS genannt. Diese ist
auch eine Phospholipiddoppelmembran. Sie enthält auch Protein und Polysaccharide.
Gram-Färbung: Die Zellen werden mit Safranin gefärbt und mit Alkohol gewaschen. Bei
gramnegativen Bakterien zieht sich die Außenmembran zusammen und der Farbstoff kann nicht
entweichen, die Zellen bleiben rosa. Werden die Zellen kristallviolett gegengefärbt, so können nur
noch die grampositiven Zellen den Farbstoff aufnehmen und werden violett.
14. Wie funktioniert die Peptidoglykansynthese? Welcher Enzymkomplex etc.?
Einbau von Peptidoglykan in die bestehende Zellwand? Gegenwärtige Modell?
NAG befindet sich immer an der Plasmamembran. NAM wird im Cytoplasma erzeugt und durch
Bactoprenol an der Plasmamembran mit NAG verknüpft und zur Zellwand gebracht.
Bei gramnegativen Bakterien ist das Enzym das die Zellwand öffnet in der Außenmembran
verankert. Es schneidet die β 1-4 Bindungen der Zellwand auf, es kann auch die Verbindung
zwischen Bactoprenol und den einzubauenden Monomeren schneiden. Nach der Öffnung der
Zellwand katalysieren polymerisierende Enzyme (Transpeptidasen), die in der Zellwand verankert
sind, die Verknüpfung der Peptidbrücken und der Zucker untereinander.
Die Plasmamembran enthält D-alanyl-alanin-Transpeptidase/Transglycosylase (Klasse A PBPs: 1A
und 1B), D-alanyl-alanin-Transpeptidase (Klasse B PBPS: 2 und 3) und D-alanyl-alanin
Endopeptidase/Carboxypeptidase (LMW PBP 5 und 6).
Weiterhin gibt es noch lytische Transglycosylasen in der Außenmembran diese schneidet β 1-4
Bindungen zwischen präexistierenden Strängen, sowie zwischen Monomeren und Baktoprenol.
Diese Enzyme können durch Penicillin inhibiert werden. PBP = penicillin binding proteins. In
Anwesenheit von Penicillin wird dementsprechend das Wachstum der Zellwand inhibiert.
PBP1A und PBP1B sind für das Verhältnis zwischen Durchmesser und Länge verantwortlich. Sind
die Proteine nicht funktionstüchtig, werden die Zellen dünner und länger.
PBP2 ist für die Vermehrung der Zellmembran, PBP3 für die Septumbildung zuständig.
LMW = low molecular weight. LMW BPBs sind für die Formgebung während des Wachstums nötig.
Beim three-for-one-growth Model ist gleichzeitiger Auf- und Abbau von Mureinsträngen nötig.
Der Ab- und Aufbauvorgang wird durch den Holoenzymkomplex vermittelt. Für jeden abgebauten
Strang werden drei neue aufgebaut.
Diese drei neuen Mureinstränge kommen unter einen Akzeptorstrang - der sogenannte "docking
strang". Dieser wird im lytischen Teil der Mureinsynthese durch die lytische Transglycosylase und
2 Endopeptidasen bzw. Amidase entfernt. Dabei werden Interpeptidketten zerstört.
Die NH2-Gruppen, die an beiden Seiten des Akzeptorstrangs entstehen, werden durch 2
monofunktionale Transpeptidasen mit dem synthetisierten Triplett zusammen geschlossen. Die
Außenstränge dieses Tripletts werden anschließend durch 2 bifunktionale
Transpetidasen/Transglycosylasen polymerisiert.
yin-yang Multienzymkomplex:
Multienzymkomplex aus Mureinpolymerasen und Mureinhydrolisierenden Enzymen gleitet an
Akzeptorstrang im Murinnetz entlang, synthetisiert und hängt ein Mureintriplett unter den
Akzeptorstrang und löst diesen dann hydrolytisch auf, sodass das Triplett in den Sacculus
-6-
eingezogen werden kann.
Um den Durchmesser der Zelle konstant zu halten, dient der Akzeptorstrang als Schablone für
den Mureinsynthetisierenden Komplex--> Akzeptorstrang und drei neuen Stränge haben die selbe
Länge
- Murein wächst unidirektional um die Zelle
- ca. 200 Murein-Insertionsstellen/Zelle (bei Stäbchen: im zylindrischen Teil)
- Zellpole werden nach ihrer Herstellung metabolisch inaktiv
- Synthesekomplex: braucht 8min. um Zelle in spiralförmigem Muster zu umkreisen, diese
muster entspricht der Verteilung der Cytoskelett-Proteine Mb1/MreB
15. Beschreiben Sie Proteine deren Funktion und Vorgänge die die Positionierung des vegetativen
Septums bestimmen
Während der Zellteilung wird der membrangebundene Holoenzymkomplex nach innen gezogen
und die neusynthetisierten Triplette bilden ein dreischichtiges Septum, das durch die spezifische
Entfernung der Stränge, welche die mittlere Schicht bilden, gespalten wird.
Für die Zellteilung werden mindestens 10 Proteine benötigt (zumindest in E.coli):
FtsA, FtsB, FtsI (PBP3), FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ, FtsW, FtsZ, ZipA
Diese Proteine
- assoziieren mit der Einschnürungsstelle
- koordinieren die Einschnürung der Membran
- koordinieren das Wachstum des septalen Murein nach innen
- bewirken die Teilung der Töchterzellen
Die meisten Fts Gene und die Mureinsynthese Gene befinden sich im selben Gencluster (mrA).
FtsZ-Mutanten wachsen in filamentöser Form und es erfolgt keine Septumbildung.
FtsZ ist verwandt mit Tubulin und besitzt GTPase Aktivität. Man findet 5 000-20 000 FtsZMoleküle/Zelle. Sie bilden einen Ring auf der Innenseite der Plasmamembran an der
Zellteilungsstelle.
Es gibt 2 Theorien über die Funktionsweise:
a)gleitende Protofilamente (Die Ankerpunkte an der Membran werden an ein Motorprotein gebunden und die
beweglichen Filamente gleiten aneinander vorbei)
b)Depolymerisierung (durch Depolarisierung werden die Ankerpunkte zusammen gebracht)
•
•
Die Septumbindung erfolgt durch Polymerisierung (erfolgt wahrscheinlich durch GTP Spaltung)
von FtsZ Proteinen am zentralen Annulus zu Filamenten, damit FtsZ an den Annulus binden kann
benötigt es ein Ankerproteine, integrale Membranprotein in der Cytoplasmamembran, es gibt zwei
Theorien wie es zur Septumbildung kommt
Ein Motorprotein bindet an zwei FtsZ Filament und bewegt diese gegeneinander, dadurch wird der
Abstand der Ankerproteine kürzer und es kommt zur Einschnürung
Zwei Ankerproteine sind durch ein langes FtsZ-Filament verbinden, ein paar FtsZ Untereinheiten
depolymerisieren, dadurch wird das Filament zwischen den Ankerproteinen kürzer, durch
Verringerung des Abstands kommt es zur Einschnürung
Zuerst lagert sich FtsZ an die Einschnürungsstelle, anschließend kommen ZipA und FtsA hinzu.
FtsA ist ein membrangängiges Protein. ZipA ist nur leicht an die Membran gebunden und
verbindet FtsZ Filamente periodisch mit der Membran (ein ZipA/100FtsZ).
FtsA und ZipA sind MAPs verwandte Proteine und stabilisieren den Z-Ring.
FtsK ist ein polytopisches Protein (überquert mehrmals die Membran). Es führt die ATP-abhängige
Translokation von DNA durch ein sich verjüngendes Septum aus und es ist wichtig für die
Chromosomensegregation.
FtsK ist die schnellste bekannte DNA Pumpe. FtsKC∆ᵧ kristalisiert als Hexamer mit einem
zentralen Kanal.
FtsW gehört zu den polytopischen Proteinen der SEDS-Familie (shape, elongation, division and
sporulation). SEDS Gene befinden sich auf dem Chromosom in der Nähe der Gene, die für die
PBPs der Klasse B kodieren.
FtsW und FtsI befinden sich im selben Operon. Sie bringen die PBPs zum Septum, schleusen das
-7-
mit Vorläufer-beladenen Baktoprenol durch die Membran und übergeben es dem geeigneten PGsynthetisierenden Enzym (FtsI = PBP3).
Weitere Proteine siehe nächste Frage.
16. FtsZ und MinC,D,E bei der Septumbildung
Replizierende Nukleoide stimulieren die Septumbildung, solange jedoch keine
Chromosomensegregation stattgefunden hat wird die Fertigstellung des Septums inhibiert.
In den minE Mutanten wird der Z-Ring nicht gebildet (filamentöse Zellen).
In den minC Mutanten wird der E-Ring unabhängig vom Z-Ring gebildet. Der E-Ring bildet sich in
der Mitte, der Z-Ring nicht (Minizellen).
In den minD Mutanten kann Min E nicht an die Membran binden (Minizellen).
Bei minC und minD Überexpression kann der Z-Ring nicht gebildet werden (filamentöse Zellen).
Bei minC, D und FtsZ Überexpression kommt es zu normalen Zellen.
Min C oder MinD Mutation führen dazu, dass die polaren Annuli nicht inhibiert werden, FtsZ kann sich dort
anlagern und es kommt zur Ausbildung von Minizellen.
MinE Mutation führen dazu, dass sich FtsZ gar nicht am zentralen Annulus anlagern kann, es kommt zu keiner
Septumbildung und es entstehen filamentöse Zellen.
Überexpression führen dazu, dass FtsZ sich nicht anlagern kann (zentraler Annulus auch blockiert) es
entstehen filamentöse Zellen Überexpression von FtsZ führt dazu, dass sich FtsZ wieder anlagern kann, es
entstehen normale Zellen
MinC und D inhibieren FtsZ.
MinE inhibiert MinC und D.
Min D ist eine dynamin-verwandte ATPase und in Anwesenheit von ATP polymerisiert und bindet
es an die Membran. Es ist wichtig für die Rezeptor-vermittelte Endocytose, die Internalisierung
von caveolae, „membrane trafficking“ von LE und Golgi, die Einschnürung von Membranen und
der Spaltung von Membranen. Es bringt zudem Min C zu den polaren Regionen der Zelle und
bildet dynamische Filamente von einem Zellpol ausgehend.
MinD Monomere werden ins Cytosol freigesetzt, neue MinD Polymere werden am
gegenüberliegenden Pol gebildet.
Min E assoziiert mit den Endungen der Filamente und bewegt sich in Richtung Pol.
Wo sich minC und minD befinden kann sich kein FtsZ-Ring bilden. Dadurch, dass minC und minD
ständig aufgebaut werden und durch minE abgebaut werden, wandern sie immer von einem Pol
zum anderen, wodurch die minC Konzentration in der Mitte am geringsten ist und der FtsZ-Ring
dort gebildet wird.
MinC und MinD assoziieren an einen Pol miteinander und inhibieren dort die polaren Annuli, MinE bildet einen
Ringkomplex in der Nähe der Mitte der Zelle, FtsZ Protein dimerisieren am zentralen Annulus miteinander, der
MinE komplex bewegt sich in Richtung der Pole und verdrängt dort MinC und D, Min C und D wandern zum
gegenüberliegen Pol und Bilden wieder einen Komplex und können den polaren Annulus am anderen Pol
inhibieren, die Bildung des MinC/D Komplex am anderen Pol stimuliert die Bildung eines neuen MinE Ringes in
der Nähe der Mitte, der in Richtung des anderen Poles orientiert ist, MinE Ring wandert in Richtung des
anderen Pols und verdrängt dort wieder MinC/D, die sich wiederum am gegenüberliegenden Pol anlagern
(usw.). Durch den kontinuierlichen Stellungswechsel des MinC/D Komplexes (alle 20min in E.coli) kann sich
FtsZ nur am zentralen Annulus anlagern, da die polaren Annuli abwechselnd alle 20sec inhibiert sind.
Damit sich die Zellen letztendlich voneinander trennen können ist das EnvAGenprodukt
notwendig, es ist eine Murein-Amidase, die die Septen der beiden Tochterzellen voneinander
trennt.
17. Beschreiben Sie die Funktion des Proteins FtsK der Chromosomen bzw. Zellteilung -Lokalisierung
- Enzymatische Aktivität - Komplexbildung mit anderen am Prozess beteiligten Enzymen.
Für die Zellteilung werden mindestens 10 Proteine benötigt (zumindest in E.coli):
FtsA, FtsB, FtsI (PBP3), FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ, FtsW, FtsZ, ZipA
Diese Proteine
- assoziieren mit der Einschnürungsstelle
- koordinieren die Einschnürung der Membran
- koordinieren das Wachstum des septalen Murein nach innen
-8-
- bewirken die Teilung der Töchterzellen
Die meisten Fts Gene und die Mureinsynthese Gene befinden sich im selben Gencluster (mrA).
FtsK ist ein polytopisches Protein (überquert mehrmals die Membran). Es führt die ATP-abhängige
Translokation von DNA durch ein sich verjüngendes Septum aus und es ist wichtig für die
Chromosomensegregation.
FtsK ist die schnellste bekannte DNA Pumpe. FtsKC∆ᵧ kristalisiert als Hexamer mit einem
zentralen Kanal.
Es wurde ferner eine physische Interaktion zwischen Topo IV und der C-terminalen Domäne von
FtsK (filamenting temperature sensitive) nachgewiesen, einem Protein, das an der Septenbildung
beteiligt ist.
18. Beschreibung und Funktion von FtsZ
Für die Zellteilung werden mindestens 10 Proteine benötigt (zumindest in E.coli):
FtsA, FtsB, FtsI (PBP3), FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ, FtsW, FtsZ, ZipA
Diese Proteine
- assoziieren mit der Einschnürungsstelle
- koordinieren die Einschnürung der Membran
- koordinieren das Wachstum des septalen Murein nach innen
- bewirken die Teilung der Töchterzellen
Die meisten Fts Gene und die Mureinsynthese Gene befinden sich im selben Gencluster (mrA).
FtsZ-Mutanten wachsen in filamentöser Form und es erfolgt keine Septumbildung.
FtsZ ist verwandt mit Tubulin und besitzt GTPase Aktivität. Man findet 5 000-20 000 FtsZMoleküle/Zelle. Sie bilden einen Ring auf der Innenseite der Plasmamembran an der
Zellteilungsstelle.
Es gibt 2 Theorien über die Funktionsweise:
a)gleitende Protofilamente (Die Ankerpunkte an der Membran werden an ein Motorprotein gebunden und die
beweglichen Filamente gleiten aneinander vorbei)
b)Depolymerisierung (durch Depolarisierung werden die Ankerpunkte zusammen gebracht)
•
•
Die Septumbindung erfolgt durch Polymerisierung (erfolgt wahrscheinlich durch GTP Spaltung)
von FtsZ Proteinen am zentralen Annulus zu Filamenten, damit FtsZ an den Annulus binden kann
benötigt es ein Ankerproteine, integrale Membranprotein in der Cytoplasmamembran, es gibt zwei
Theorien wie es zur Septumbildung kommt
Ein Motorprotein bindet an zwei FtsZ Filament und bewegt diese gegeneinander, dadurch wird der
Abstand der Ankerprotein kürzer und es kommt zur Einschnürung
Zwei Ankerproteine sind durch ein langes FtsZ-Filament verbunden, ein paar FtsZ Untereinheiten
depolymerisieren, dadurch wird das Filament zwischen den Ankerproteinen kürzer, durch
Verringerung des Abstands kommt es zur Einschnürung
Zuerst lagert sich FtsZ an die Einschnürungsstelle, anschließend kommen ZipA und FtsA hinzu.
MinC und D inhibieren FtsZ.
19. E. coli-Generationszeit von 20 min - Wie vereinbar mit Replikation? (+ Definition von
Replikationszeit )
Wie lange braucht E. Coli für seine DNA-Replikation? Wie schnell kann es sich vermehren? Wie ist
das vereinbar?
Gibt es Bedingungen, unter denen die Generationszeit (definieren) eines Bakteriums kürzer ist,
als die Replikationszeit seiner DNA? Wie wird dieses bewerkstelligt?
Wie schnell kann seine Generationszeit sein und wie ist das mit der DNA-Replikation vereinbar?
Replikation dauert 40 min, Generationszeit 20 min (mindestens). Vereinbaren lässt sich das, weil
ein schnell wachsendes Bakterium nach jeder beendeten I-Phase (Zeit, in der die für die
Replikation benötigten Proteine synthetisiert werden) gleich wieder mit der Replikation beginnt.
Da die zweite I-Phase schneller beendet ist als die erste Replikation, bekommen die Tochterzellen
bereits ein halb repliziertes Chromosom mitgeliefert (eineinhalbfacher Chromosomensatz). Nach
weiteren Generationsrunden bekommen Tochterzellen sogar ein vollständig repliziertes Genom,
-9-
an dem die 3. Replikation schon begonnen hat → nur noch Septumbildung nötig, die 20 min
dauert, Generationszeit reduziert sich auf 20 min. → multifork replication
Generationszeit= die Zeit, die eine Population zum Verdoppeln ihrer Individuenzahl braucht.
z.B.: 60 min. GZ: Tochterzellen bekommen je 1 Genom (40 min. Repl, 20 min. Septumbildung)
40 min. GZ: TZ bekommen je zur Hälfte repliziertes Genom (20 min. Repl, 20 min. Septumbildung)
20 min. GZ: fertigrepliziertes Genom, Septumbildug setzt sofort ein (0 min. Repl, 20 min. Septumbildung)
20. Komponenten der Zellmembran und deren Funktion
Die cytoplasmatische Membran, auch Zell- oder Plasmamembran genannt, ist ca. 7nm dick. Sie
befindet sich innerhalb der Zellwand und umgibt das Cytoplasma des Bakteriums. Sie besteht hs.
aus Phospholipiden. Die polaren Gruppen sind je nach Spezies unterschiedlich, FS hängen sowohl
von der Spezies als auch von der Wachstumstemperatur ab.
Hopane sind polycyclische Verbindungen, die strukturell den Steroiden ähneln und die Membran
stabilisieren.
Ihre Hauptfunktionen sind:
- selektiv durchlässige Membran, bestimmt welche Stoffe aufgenommen/ausgeschieden werden
- umgibt das Cytoplasma
- Ort der Energieerzeugung
- Proteinsekretion
- Membransynthese
- Zellwandsynthese
Membransegregation: Zonenwachstum das Material bleibt an der Produktionsstelle, Zonenwachstum das
neue Material wird umverteilt, multifokales Wachstum.
Aufbau der Hülle
Die Integrität der Strukturen, die neu aufgebaut werden sollte, (Plasmamembran, Peptidoglykan,
Außenmembran) muss zu jedem Zeitpunkt gewährleistet sein.
Gleichzeitig muss Wachstum stattfinden können.
Alle Bestandteile müssen ihren Bestimmungsort erreichen, die richtige Stöchiometrie sowie die
korrekte Orientierung müssen gewährleistet sein.
Die Hülle muss während der Zellteilung zwischen den Tochterzellen aufgeteilt werden.
Die meisten für die Biosynthese von Lipiden notwendigen Enzyme befinden sich in der Membran selbst.
Im wässrigen Medium ordnet sich die Lipidschicht spontan mit den polaren Kopfteilen, die hydrophil sind,
nach außen, und mit den apolaren Enden nach innen.
Der Aufbau der Außenschicht der Membran braucht keine Energie, und wird durch die einfache Diffusion der
Phospholipide von der Innenschicht über hypothetischen „hairpin ben“ Strukturen in der Nähe von
Transmembranproteinen bewerkstelligt.
Es ist derzeit unklar, wodurch bestimmte Lipide für den Einbau in die Außen bzw. Innerschicht bestimmt
werden.
21. Beschreiben sie Funktion, Komponenten und Arbeitsweise des GSP?
General secretory pathway: Ohne diesen Proteinsekretionsweg sind Bakterien nicht lebensfähig.
3 Phasen:
Targeting (Protein wird zur Membran gebracht)
Translocation (Passieren der Membran)
Release (Freisetzung ins Periplasma)
Die Translokase schleust das Precursorprotein durch die Membran. N‘ = neuer N-Terminus des
sekretorischen Proteins nach Spaltung des Leaderpeptids.
Ad 1: Targeting:
SecB + Housekeeper-Proteine fungieren als Chaperone.
SecB hat 2 Aufgaben: Bindet an Leader-Sequence des Proteins damit es sich nicht falsch faltet
und kann das Protein auf SecA übertragen.
Ad2: Translokation:
- 10 -
Precursorprotein Translokase (SecA und Sec YEG, reguliert durch Sec D/SecF)
Bei der Translokation bindet SecA an SecB und Precursor-Protein.
SecA ist ein großes längliches dimeres Molekül, dass die meisten an der Translokation beteiligten
Proteine verbindet und Energie in Translokationsarbeit konvertiert.
SecA benutzt die Energie von ATP um Peptide durch die Pore zu translozieren. Während der
Translokation wird das Peptid von SecA gebunden, ein Stück durchgeschleust, und freigesetzt.
Dabei bleibt das Substrat an SecY gebunden. SecA bindet anschließend an eine weitere Stelle im
Peptid und startet einen neuen Translokationszyklus. Durch jeden Zyklus wird ein Teil des
Substrats in die SecYEG Pore freigesetzt. Die SecA-vermittelte Translokation ist prozessiv.
Ad 3: Release:
die Leader-Peptidase schneidet N-terminale Leadersequenz → Protein wird ins Periplasma
entlassen.
Leadersequenz der E. coli Membranproteine:
- Länge 15 – 40 AS (meist 20)
- geladener N-Terminus (basische AS) gefolgt von
- einer Reihe hydrophober AS, darunter befinden sich meistens 2 G oder P
- eine Reihe von basischen AS, die einen Translokationsstopp bewirken
Alle Proteine, die durch das sec-System transportiert werden, werden als Precursor-Protein
synthetisiert und erhalten am N-terminalen Ende ein leader-Peptid
Die Phospholipide sind notwendig für die SecA Aktivierung,
richtige Leaderpeptide/ Membraninteraktion und die SecYEG Stabilität.
22. Beschreiben sie die Biogenese der Zellmembran (GSP)?
Biogenese der Plasmamembran: Einbau von Proteinen
• Integrale Membranproteine (IMPs) weisen mehrere hochhydrophobe Sequenzbereiche auf, die
mit 20 Aminosäurenresten lang genug sind, um die Plasmamembran zu durchspannen.
• Diese Transmembransegmente verankern das Protein innerhalb des Lipidbilayers der Membran.
• Die Topographie des jeweiligen IMPs wird durch die Zahl der Transmembransegmente
festgelegt.
• Bezüglich der Orientierung des N-und C-Terminus unterscheidet man Transorientierung (Klasse
I-IMP; N-Terminus im Cytoplasma, C-Terminus im Periplasma) und Cisorientierung (Klasse II-IMP;
beide Enden im Cytoplasma.
• Manche Membranproteine existieren als multimolekulare Komplexe, die bestimmte Funktionen
ausüben. Das Durchschleusen eines Proteins durch die cytoplasmatische Membran
(Translokation)braucht: Energie und eine spezifische zelluläre Maschinerie
• IMPs werden vor der Vervollständigung der Translation durch SRP (signal recognition particle)
zur Membrantranslokase dirigiert.
• SRP = RNA-Proteinkomplex (Ffh Protein + Ffs RNA), erkennt hydrophobe Proteine und
verhindert die Faltung.
• SecA benötigt für die Insertion großer hydrophiler Domäne.
• Die Interaktion zwischen SRP und FtsY verursacht die Freisetzung des translatierten Teils des
IMPs und die Insertion in den SecY-Komplex (Translocon).
• Der Translocon kann die Topologie der IMPs beeinflussen und ihre Integration in die Membran
begünstigen.
• Die Interaktion der IMPs mit PE (periphere Einheit) in der Lipidschicht begünstigt die Faltung in
die native Konformation.
Biogenese der Außenmembran:
Findet an den "Bayer'schen Brücken" statt, dort, wo Plasma und Außenmembran im direkten
Kontakt sind (200-400/Zelle).
• spontaner Prozess = gereinigte LPS, OMP's und Murein + Lipoprotein bilden eine
Außenmembran im Reagenzglas.
OMP … Outer membrane protein
• OMPs werden im fast vollständig translatierten Stadium bzw. post-translational vom ChaperonProtein SecB zur Plasmamembran geführt.
• OMPs werden durch den SecY-Komplex (Translocon) durch die Membran geschleust.
- 11 -
• SecA benutzt die durch ATP-Hydrolyse gewonnene Energie um die Translokation voranzutreiben.
• Mehrere Proteine (Skp, PpiD, SulA) können als Chaperone agieren und die Faltung der OMPs im
Periplasma regulieren.
• Die Interaktion zwischen OMPs und LPS stimuliert die Faltung der OMPs in kompakten β-Barrel
Strukturen sowie ihre stabile Insertion in die OM.
Lipopolysaccharid: Das Kern-Oligosaccharid vom LPS wird auf der Innenseite der Plasmamembran
zusammengesetzt. Dabei wirkt Lipid A sowohl als "Primer" als auch als Träger. Die sich
wiederholenden O-spezifischen Polysaccharide werden auf Baktoprenol zusammengesetzt. Die
Translokation durch die Plasmamembran wird von der PMF angetrieben. Nach dem Transfer der
O-Kette auf das LPS-Kernstück wird das Baktoprenol freigesetzt. Das vollständige LPS migriert
zur Außenmembran.
Außenschicht der Außenmembran bei gram- aus Lipopolysacchariden: Schutz vor Immunabwehr
des Wirtes. Lipopolysaccharid besteht aus Lipid A und Kernpolysaccharid und O-Polysaccharid.
Lipid A hat keine Probleme in die Membran einzudringen, die folgenden Domänen kommen
allerdings nicht nach.
Phospholipide werden in der Plasmamembran produziert und werden dann transloziert zu der
Innenschicht der Außenmembran.
Dieser Prozess wird von der PMF (proton motive force) angetrieben.
Einbau von Lipiden:
- Die meisten für die Biosynthese von Lipiden notwendigen Enzyme befinden sich bereits in der Membran
- In wässrigem Medium ordnet sich die Lipidschicht spontan an, die polaren Köpfe/hydrophil: nach aussen, die
apolaren Enden: nach innen!
- Der Aufbau der Außenschicht der Membran braucht keine Energie und wird durch die einfache Diffusion der
Phospholipide von der Innenschicht bewerkstelligt.
- Derzeit unklar: wodurch bestimmte Lipide für den Einbau in die Außen- bzw. Innenschicht bestimmt sind.
23. Beschreiben sie die 3 Sekretionsapparate der gram-negativen Bakterien?
sec – abhängig:
Typ V: Autotransporter mit selbstprozessierender Protease
• C – terminale Domäne bildet einen Sekretionskanal (β- barrel)
• Passagier – Domäne durch Proteolyse freigesetzt
• keine Energie erforderlich
• IgA 1 Protease von N. gonorrhoeae
Single accessory factor pathway:
• ein weiteres Protein bildet den Sekretionskanal (β- barrel)
• keine Energie erforderlich
• FHA von B. pertussis
Chaperon/Usher Sekretionsweg
• keine Energie erforderlich
• Chaperon bindet an konservierte C – terminale Domäne der Untereinheit
• bringt die Untereinheit zum Türsteher, wo Einbau/Sekretion stattfindet
• die Untereinheiten interagieren durch die konservierten N – terminalen (black box) und C –
terminalen (white box) Motive (donor – strand exchange) um den Pilus aufzubauen
• der Türsteher lässt eine lineare Folge korrekt gefalteter Untereinheiten durch, und bewirkt
dadurch, dass der Pilus – Stab die typische helikale Konformation an der Zelloberfläche einnimmt
• P Pilus of E. coli
Typ II – Sekretionssystem
• 12 – 16 Hilfsproteine erforderlich (Sekreton) – die meisten sind mit der PM assoziiert
• 2 OM Komponenten, GspS und GspD (secretin – ringförmige Kanäle – Ø5 – 10nm)
• ein cytosolisches Protein (GspE), assoziiert mit der PM durch Interaktion mit GspL – GspE
erhält ein konservatives ATP – Bindungsmotiv und besitzt Autokinase – Aktivität. GspE
könnte die Sekretion regulieren bzw. die Energie dafür oder für den Aufbau des Sekretons
liefern.
• Substrate werden im Periplasma gespalten und gefalten!
Typ IV – Sekretionssystem
- 12 -
• Konjugationsähnlicher Pilus – Apparat
• sezerniert Proteine und ssDNA
• der Pilus könnte zur Sekretion von Proteinen/ssDNA in eukaryontischen Zielzellen dienen
• Proteinsekretion Sec-dependent, DNAsekretion ohne periplasmatische Zwischenstufen
• VirB4 und B11 binden an Nukleotide – könnten dadurch die Sekretion vorantreiben
• VirB7 (Lipoprotein) bildet ein Komplex mit VirB9, welcher den Einbau des Typ IV Apparatus in
die OM bewirken könnte
• VirB2, VirB5 Bestandteile des Pilus
• Prototyp-Substrate: Pertussis toxin von B.pertussis; Cag Protein von Helicobakter pylori
Sec-Unabhängig:
Typ1-Sekretionssystem
• benötigt: PM ABC Exporter
• Ein in der PM verankertes Protein, welches das Periplasma überbrückt (membrane fusion
protein MFP)
• ein AM Protein (OMP)
• MFP interagiert sowohl mit dem PM ABC exporter als auch mit dem OM Poren-bildendes Protein
(OMP) um die Sekretion des Substrats in einem Schritt, ohne periplasmatische Zwischenstufen,
zu bewerkstelligen.
• OMP und MFP bilden Homotrimere
• Die ATPase Aktivität des ABC-Proteins liefert die Energie für die Freisetzung des Substrats ins
Medium.
• Substrate haben keine N-terminale Signalsequenz
• Sondern ein C-terminales ~60 AS langes Sekretionssignal (Prototyp: a-hemolysin of E.coli)
Typ3-Sekretionstyp:
• Keine periplasmatische Zwischenstufe
• 20 Hilfsproteine (secreton) erforderlich – die meisten sind mit der PM assoziiert
• YscR–U und LcrD bilden einen zentralen Sekretionsapparatus, angetrieben durch YscN
(Homologie mit der Biogenese des Flagellums)
• OM Komponente (Sekretine)
• Substrate haben 2 N-terminale Signalsequenzen, 1 in der mRNA und die 2. als Bindungsstelle
für spezifische Syc Chaperone (Prototyp: Yops of Yersinia).
Für Pathogenität notwendig. Proteine werden direkt vom Cytosol in die Umgebung bzw. in eine andere
Eukaryontenzelle abgegeben. Es wird eine Verbindung zwischen Bakterien und Wirtszelle hergestellt.
1) IM-Protein für Energie
2) J Durchquerung des Periplasmas
3) C zur Durchquerung der OM
4) Hohlpilus
5) Protein das Wirtsmembran durchdringt
24. GSP bei gram+ Bakterien
Beschreiben Sie den Ablauf der Sec-abhängigen Sekretion in gram+ und gram- Bakterien.
Sec abhängige Protein- Sezernierung bei Gram + Bakterien?
Beschreibung des Sekretionsvorganges in Gram pos. Bakterien
=General Secretory Pathway
- beim Aufbau der Membran/ Zellwand
- Sekretion von Adhäsinen und Toxinen
Durch die Membran:
Sec-System – ähnlich den Gram-, aber ohne Sec B. Weniger bekannt als in Gram- Bakterien.
Ins Medium:
• immer Sec-abhängig
• SRP-ähnliche Chaperons, SecB-unabhängig
• Spaltung durch Signalpeptidasen
• Faltung durch Membran-assoziierte Peptidyl-prolyl Isomerase PrsA + Metall-Ionen
Display von Proteinen an der Oberfläche (Virulenzfaktoren)
• Die Oberfläche-Proteine der Gram+ Bakterien sind in der Zellwand verankert.
• Proteine, die die Signalsequenz aufweisen, werden durch das Sec-System sekretiert.
• Werden aber durch das C-terminale "sorting Signal (LPXTG + hydrophobe Domäne +geladenes
Endstück) in der Membran festgehalten.
• Die Sortase spaltet das sorting Signal nach dem Threonin und verbindet das COO- mit den
Peptidbrücken des PG.
- 13 -
• Manche Proteine interagieren stattdessen mit LTAs.
Im generellen funktioniert das GSP hier genau wie bei den gram -. Also ebenfalls die Übergabe an SecA
welches das dann das Protein durch den SecYEG-Komplex schleust...allerdings gibt es kein SRP, nur ein SRPähnliches Chaperon , welches SecB unabhängig ist! Außerdem wird die Signalsequenz von einer
Signalpeptidase geschnitten. Die Faltung erfolgt dann mittels Peptidyl-prolyl Isomerase und Metallionen (Folie
31) - das wäre zumindest meine antwort.
25. Beschreiben sie d. Funktion u. den Export des Lipoproteins der gram - Bakterien
Lipoprotein ist ein modifiziertes Protein, das die PG mit der OM verbindet. Nach der Translation
liegt es als Prolipoprotein vor, das durch eine Peptidase geschnitten wird (Apolipoprotein). An die
SH - und OH – Gruppen des Cysteins (C – Terminus) werden Fettsäuren angehängt, wodurch eine
Verankerung in der OM möglich ist. Das Lysin am N – terminalen Ende kann mit einer freien AS
im Peptidoglycan eine Peptidbindung eingehen →somit ist das Lipoprotein mit der OM und dem PG
verankert.
Lipoprotein wird zuerst als Prolipoprotein erzeugt, durch eine Peptidase wird der N-Terminus abgeschnitten,
um eine SH-Gruppe anzuhängen und das Apoprotein zu erhalten. Das Apoprotein wird mit einem
Fettsäurerest modifiziert. So wird Lipoprotein in der Außenmembran verankert und mit PG verbunden.
da ist doch die Verbindung zw. PG und OM gemeint? das herstellen versteh ich aber wie wird es exportiert
ich denke sie meint die normale Teilung, die andere wäre sporulativ statt vegetativ
da das Lipoprotein unter der Überschrift General Secretory Pathway steht tippt ich mal ganz stark auf Export
ins Periplasma durch das Sec System
26. Nennen und erklären Sie die aktiven Transportwege einer Bakterienzelle! (import)
Mechanismen, die für den aktiven Transport von Substraten in die Zelle verantwortlich sind
Nennen Sie die aktiven Transportsysteme (Import von Nährstoffen) der Bakterien. Für jedes
System, nennen Sie: a) die Energiequelle; b) eventuelle chemische Modifikationen des
transportierten Moleküls.
Aktiver Transport
• spezifisch: braucht ein Protein, welches das Substrat bindet, sowie eine Pumpe, welche das
Substrat gegen einen Konzentrationsgradient transportiert (innen >> außen).
• Keine chemische Veränderung des Substrates
• Stoffakkumulation im Cytoplasma
• Energieaufwendig (PMF).
Symport
Schleust gleichzeitig zwei Substratmoleküle ein. Hierdurch können Anionen oder (kleine) Moleküle
von der Zelle aufgenommen und in ihr akkumuliert werden.
Hier schleust der Symport einen Protons (H+) und ein Substrat durch die Membran.
Die Energie
kommt vom PMF.
Transport kann elektroneutral sein … 1+ und 1- Teilchen oder 1+ und 1+ Teilchen, wenn die Teilchen in
entgegen gesetzte Richtungen transportiert werden und sich das Membranpotential dadurch nicht ändert.
Transport kann elektrogen sein … 1+ und ein neutrales Teilchen. Wichtig ist, dass Kanäle in der korrekten
Ausrichtung im Medium eingebaut werden.
Antiport
Gleichzeitiger Transport von Substraten in entgegen gesetzte Richtungen durch die Membran.
Die
Energie kommt vom PMF.
Zwei Substanzen in entgegen gesetzter Richtung … Rotation wird vermutet, ist noch nicht bewiesen. Wichtig ist, dass Kanäle
in der korrekten Ausrichtung im Medium eingebaut werden.
Shock-sensitive Systeme
Spezifisches periplasmatisches-Protein (PBP) bringt das Substrat zu einem membranspannenden
Transporter, wenn das Bakterium unter Stress steht.
Substrat und ATP binden an das Carrier-Protein.
ATP Hydrolyse bewirkt die Konformationsänderung, die für den Eintritt des Substrats in die Zelle
notwendig ist. Die Energie kommt vom ATP.
- 14 -
Gruppentranslokation (für Glucose)
• spezifisch: braucht aktive Transportproteine
• Chemische Veränderung des Substrates
• Stoffakkumulation im Cytoplasma
• Energieaufwendig (PEP)
Das Phosphotransferase System
Eine energiereiche Phosphatgruppe wird vom Phosphoenolpyruvate (PEP) auf Glucose übertragen,
wobei Glucose-6-P entsteht. Glucose-6-P wird durch die Membran geschleust. Glucose-6-P kann
nicht mehr zurücktransportiert werden.
Das Phosphotransferase System ist das am besten untersuchte Gruppentranslokationsystem.
Carrier-vermittelter Import von Aminosäuren in E.coli:
• aktiver Transport oder
• shock-sensitive aktiver Transport
• Manche Systeme transportieren AS mit ähnlicher Struktur
• Manche sind monospezifisch
• Hoch- und niedrigaffine Systeme
Zu den aktiven Transportsystemen gehören:
- Symport
- Antiport
- Shock-sensitive Systeme (Bsp. ABC-Transporter)
(Spezialfall des aktiven Transports: Gruppentranslokation (Energiequelle PEP))
alle diese Systeme transportieren Substrate in die Zelle ohne sie dabei chemisch zu verändern (Ausnahme ist
die Gruppentranslokation, da findet eine Modifikation statt --> also das was in der Zelle ankommt ist nicht
das was draußen war)
Symporter/Antiporter - da nicht vergessen dass es elektroneutral/elektrogen ablaufen kann... kostet auch
einen von drei punkten...
27. Vergleich von aktiven und passiven Transportmechanismen + Beispiele
Aktiver Transport siehe vorige Frage
Selektiver Transport
Abgesehen von fettlöslichen und kleinen, ungeladenen Teilchen, benötigen alle Moleküle
Trägerproteine, um durch die Membran zu kommen. Carrierproteine sind MultipassTransmembranproteine, das heißt, sie besitzen Polypeptidketten, welche die Membran mehrmals
durchqueren. So wird ein Durchgang gebildet, der vollständig mit Protein ausgekleidet ist. Oft
wird für den Transport von Stoffen durch die Membran Energie gebraucht.
Es gibt 4 grundlegende Transportmechanismen:
• Passive Diffusion
• Erleichterte Diffusion
• Aktiver Transport
• Gruppentranslokation
Passive Diffusion
Kleine, unbeladene Moleküle werden durch passive Diffusion ein- und ausgeschleust
• Kein Trägerprotein
- 15 -
•
•
•
•
Nicht spezifisch
Kein Energieverbrauch
Kann nicht gegen einen Konzentrationsgradienten arbeiten
Die Substrate müssen amphiphil sein.
Osmose
• Bewegung von Wassermolekülen durch eine Membran
• Die Richtung wird von der Konzentration der im Wasser gelösten Stoffen bestimmt:
• Niedrige Solutenkonzentration ⇒ hohe Solutenkonzentration
• Kein Energieverbrauch
Erleichterte Diffusion (Passiver Transport)
• spezifisch: braucht ein Protein, welches das Substrat bindet
• aber: wie bei jedem Diffusionsvorgang, wandern die Substrate von einem Bereich mit hoher
Konzentration zu einem mit niedriger Konzentration.
• Keine Stoffakkomodation (Konzentration) möglich
• Kein Energieverbrauch, Uniporter transportieren nur einen Stoff in Richtung seines Gradienten.
Durch Poreneinbau wird Diffusion erleichtert. Spezifischer Prozess, da Proteinkanäle nur spezielle
Stoffe durchlassen. Es strömen aber nur solange Stoffe ein, bis Equilibrium herrscht.
Carrier-mediated import of some sugars and sugar alcohols in E.coli
Erleichterte Diffusion (Glycerol)
Na+ Symport (Melibiose)
H+ Symport (Laktose)
Shock-sensitive (Maltose)
Gruppentranslokation (Glukose)
Über Na+-Symport wird Malbiose eingeschleust über H+ Symport wird Lactose eingeschleust,
etc. Durch die Phosphoryllierungen von Glukose zu Glukose-6-Phosphat ist der erste Schritt zum
Abbau von Glukose gleich durch den Transport getan.
Gewinnung von Energie
• Die Reaktionen, die zur Gewinnung von Energie führen, finden an der Plasmamembran statt.
• Viele Zellen benutzen Atmungsketten zur Energiegewinnung. Dabei werden Elektronen von einem Donor D
(Reduktionsmittel) auf einen Elektronenakzeptor A (Oxidationsmittel) übertragen.
• Die bei dieser Reaktion frei werdende Energie wird für das Pumpen von Protonen oder anderen Ionen gegen
einen pH und/oder elektrischen Potentialgradienten verwendet.
Donors:
• Organische Verbindungen: Milchsäure aus der Umgebung, NADH, FADH2 in der Zelle
• Anorganische Verbindungen: H2, H2S, Fe2+, lithotrophe Bakterien
• H2O: Photosynthetische Pflanzen und Cyanobakterien.
Akzeptoren:
• Aerobe Respiration: O2
• Anaerobe Respiration: anorganische oder organische Verbindung in der Umgebung
(NO3-, SO42-, Fumarat, Trimethylaminoxid).
• Während des Ablaufs der Atmungskettenreaktionen werden Protonen gerichtet durch die Membran
befördert.
• Dieser Protonenflux ist zugleich mit einer Translokation elektrischer Ladung verbunden.
• Neben einem chemischen Gradienten von Protonen bildet sich demnach ein elektrisches Potential aus.
• Daher besteht eine starke Tendenz der Protonen (H+- Ionen) ins Kompartimentinnere zurückzukehren.
• Die beim Rückstrom anfallende Energie kann sofort angewendet werden (Proton Motive Force).
• Oder sie wird zur ATP-Synthese verwendet; das dazu benötigte Enzym ist eine membrangebundene ATPSynthetase.
28. Was sind die generellen Merkmale eines Zwei-Komponentensystems?
Erklären sie die generellen Aspekte eines 2-Komponentensystems bei Bakterien!
Beschreiben Sie generelle Eigenschaften eines zwei Komponenten-Systems?
= der Signaltransduktionsweg bei Bakterien. Ein System, wodurch Bakterien auf äußere Reize,
wie Umweltveränderungen, reagieren können.
Signaltransduktion:
- 16 -
• Der biochemische Prozess, durch den Organismen ihre Umgebung wahrnehmen können.
• auf ihre Umgebung reagieren/adaptieren können (z.B. durch Veränderung des Genexpressionsmusters).
Wichtig, dass die Veränderungen geordnet und nicht durcheinander geschehen … Phosphorylierung und
Methylierung muss voneinander getrennt geschehen. Dafür Signaltransduktionskomplexe wichtig.
Lokalisierung wichtig in Eukaryonten, wo es viele Zellkompartimente gibt.
Signaltransduktion wird implementiert durch
• reversible Modifikation von Botenproteinen
- Bindung eines Liganden
- kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Methylierung)
• Bildung von Signaltransduktionskomplexen
• Lokalisierung von Signaltransduktionskomplexen
Zweikomponentensystem aus einer Sensorkinase (Umgebungswahrnehmung) und response
regulator – erzwingt Antwort der Zelle.
Der Sensor (Transmembranprotein) besteht aus einer Input-Domäne (Rezeptor), die das Signal
wahrnimmt, (z.B. durch Ligandenbindung (kommt es zur Autophosphorylierung der Kinase)) und
aus einer Transmitterdomäne.
Dieser ist meist im Cytoplasma, die Input-Domäne fast immer extrazellulär.
Der Transmitter ist eine Kinase mit einer ATP -Bindungsstelle. Das Histidin wird unter ATPHydrolyse autophosphoryliert, sobald ein Ligand an den Rezeptor gebunden hat. Dadurch wird die
Receiver Domäne aktiviert.
Der Response Regulator (Botenprotein) besteht aus einer Receiver und einer Output-Domäne.
Das vorher phosphorylierte Histidin überträgt nun seine Phosphatgruppe auf das Aspartat der
Receiver Domäne, sodass der Response Regulator lokalisiert werden kann. Die Output-Domäne
bindet an einen spezifischen Ort und löst eine Reaktion des Bakteriums aus. z.B.:
Ein-/Ausschalten von Genen.
Sensor kinase = histidin kinase
Ein Kollege von mir hat geschrieben: Sensorkinase (Input, Transmitter) und ResponseRegulator (Receiver,
Output) - 2 Punkte von möglichen 5 Punkten
29. 2 Komponenten-System & erklären sie die Osmoregulation in e.coli
Was sind Zwei-Komponentensysteme? Beschreiben Sie das einfache Zwei-Komponentensystem,
welches die Osmoregulation in E. Coli reguliert.
2 Komponentensystem siehe letzte Frage
E.coli reguliert die Osmolarität durch Porine, die Kanäle in der OM bilden:
• OmpC bildet einen Kanal mit einem geringen Durchmesser, es wird dann synthetisiert, wenn
die Osmolarität hoch ist.
• OmpF bildet einen Kanal mit einem großen Durchmesser, es wird dann synthetisiert, wenn die
Osmolarität niedrig ist.
Der Regulator dieses Systems ist OmpR, wenn es phosphoryliert ist aktiviert es die Transkription
von ompC Genen und unterdrückt die Transkription der ompF Gene.
Das zwei-Komonentensystem besteht aus EnvZ und OmpR
EnvZ ist eine Sensor-Kinase an der Cytoplasmamebran, ist die Osmolarität hoch (=Signal)
kommt es zur Autophosphorylierung am Histidin, die P-Gruppe wird auf den RR OmpR
übertragen.
Dadurch wird die Bindung von OmpR an die DNA verstärkt, dieser bindet an die Promoterregionen
von ompC und ompF Genen. Diese Bindung an ompC erhöht die Genexpression von OmpC bei
ompF verringert er die Genexpression (Repressor).
Dadurch wird OmpC hochreguliert und bildet kleine Kanäle, die Osmolarität sinkt, gleichzeitig wird
ompF runterreguliert.
Ist die Osmolarität niedrig, hat das EnvZ Phosphortase-Aktivität und dephosphoryliert OmpR,
dadurch kann er nicht mehr so gut an die Promoter von ompF und ompC binden. OmpC wird
runterreguliert und OmpF hochreguliert. OmpF bildet Kanäle mit großem Durchmesser und die
Osmolarität steigt wieder (OmpR kann auch durch andere Phosphat-Donor aktiviert werden, die
- 17 -
Wirkung ist aber schwächer)
30. Aufbau und Funktion eines Flagellums?
Flagellum: spiralförmiger, in der cytoplasmatischen Membran verankerter Faden
Zur Bewegung um Taxis ausführen zu können. Bestehen normalerweise aus einem Protein
(Flagellin). Bewegung nur durch Rotation, das Flagellum selbst bleibt steif.
Begeißelung:
monotrich (mit nur einer Geißel ausgestattet)
peritrich (Geißeln findet man rund um die Zelle)
lophotrich (mit Geißel an einem Pol ausgestattet)
amphitrich (mit Geißeln an beiden Polen ausgestattet)
Aufbau: (von innen nach außen)
• Basalkörper für die Verankerung des Flagellum in der Zelle, beginnt an der
Cytoplasmamembran und endet an der OM, er bildet den Motor für die Bewegung, ein
Transportsystem für Flagellum-Proteine und ein Ringsystem für die Verankerung
• Der Motor ist in der PM und PG verankert. Er besteht aus einem Rotor (MS-Ring und C-Ring
aus FliF, G, M, N) und einem Stator (aus MotA und Mot B).
• Drive-shaft(FlgB, C, F, G) stellen eine Verbindung zum Hook her, und bushing(Lx und P-Ring
aus FlgH, I) verankert den Basalkörper im PG und der OM
• Hook (aus FlgE aufgebaut, an das ein FlgK und FlgL Element anschließen), ein unbewegliches
Element, das den Basalkörper und das eigentliche Flagellum verbindet.
• Helikales Filament, das eigentliche Flagellum (aus FliC aufgebaut = Flagellin und durch FliD
stabilisiert)
nur in gram-
x
Die Energie um das Flagellum anzutreiben kommt von der PMF.
FliC: 11 Untereinheiten = 2 rechtsdrehende Windungen, es wird stabilisiert durch ein FliD Pentamer (CAP).
Zusätzliche Struktur des Flagellums bildet sich spontan.
Es gibt einen Stab durch beide Membranen zum Flagellum. Alle Proteine zur Bildung des Flagellums müssen
durch diesen Stab geleitet werden. Innerhalb der Zelle befindet sich der dafür notwendige Transportapparat.
L-Ring und P-Ring (Bushing) bringt Stabilität in die Membran.
31. Beschreiben sie kurz die wesentlichen Züge des Signaltransduktionswegs, welcher die Rotation
des Flagellums reguliert.
Alle Proteine für die Bewegung sind in 2 Operons codiert.
MOCHA Operon → CheA (Sensorkinase), CheW( Adaptor-Protein), MotA, MotB
MECHE Operon → CheR und CheB (modifizieren Rezeptoren), CheY (Botenprotein) CheZ
Die Aktivität des Flagellums wird durch das zwei Komponentensystem reguliert.
Es gibt einige Sensorproteine, welche die Anwesenheit von Schreck- und Lockstoffen wahrnehmen. Sie sind
selber keine Sensorkinase, aber sie interagieren mit cytoplasmatischen Sensorkinasen. Diese werden MCPs
genannt.
Struktur eines MCPs (Methyl-accepting-Chemotaxis-Protein)
• Kommt immer als Dimer vor
• Die Bindungsstelle für die Lockstoffe (D or S) befindet sich beim Interface zwischen den
Dimeren.
• Transmembran-Domäne charakterisiert durch dünne α-Helix-Bündeln
• Die intrazelluläre Domäne weist eine Reihe von E und Q Reste auf, welche
• durch eine Amidase/Esterase, CheB,
• bzw. eine Methyltransferase, CheR modfiziert werden
• Ein Adaptorprotein, CheW, und eine Histidin-Proteinkinase, CheA, binden durch
aneinandergrenzende, SH3-ähnliche Domäne an hochkonservierte Sequenzen in der Region der
Kehrtwende zwischen den antiparallelen α- Helixes.
CheA ist ein Dimer–jede Untereinheit bestehet aus 5 Domänen mit verschiedenen Funktionen
•H-Domäne, N-terminal, beinhaltet die His-Autophosphorylierungsstelle
•YB Domäne, bindet an den Chemotaxis response regulator CheY
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•D (Dimerisierung) and C (katalytische) Domänen bilden das Katalytische Zentrum der Kinase,
beide werden für die Autophosphorylierung der Histidine in der H-Domäne benötigt.
•R Domäne, beinhaltet ein Adaptor-Modul mit hintereinander geschalteten SH3-ähnlichen
Domänen (CheW-ähnlich), das die Bildung von Signaltransduktionskomplexen vermittelt
vermittelt Protein-Protein Interaktion von CheA/W mit dem Rezeptor
CheY (RR) ist das cytoplasmatische Bindeglied zwischen 2 Ereignissen, die sich an der Membran
abspielen. Histidinkinaseaktivität von CheA ist abhängig davon, was an Rezeptor (MCP) gebunden
ist:
•Attractant ist gebunden: CheA hat keine Kinaseaktivität, CheY wird nicht phosphoryliert der
Motor läuft default →das Flagellum läuft gegen den Uhrzeigersinn, das Bakterium schwimmt
•Repellent(oder auch kein Ligand) ist gebunden: Kinaseaktivität hoch(CheA/W kann an Rezeptor
binden), Histidin wird autophosphoryliert, Phosphat wird auf CheY übertragen, und bindet an
Motor des Flagellum →Tumbling, Bakterium sucht sich neue Richtung. - Es taumelt, das Flagellum
läuft im den Uhrzeigersinn
•die Phosphortase CheZ dephosporyliert CheY, sodass sich ein default wieder herstellt
CheW unterstützt CheA bei der Autophosphorylierung. CheA kann das Phosphat nicht nur auf Che
Y übertragen, sondern auch auf CheB (RR), dieser Transduktionsweg ist allerdings viel langsamer.
CheR ist eine Methyltransferase, hängt Methylreste an den Rezeptor.
CheB spaltet im phosphorylieren Zustand Methylrest von Rezeptor ab.
32. Erklären Sie das Phänomen der Adaption bei Bakterien anhand der Chemotaxis!
Erläutern sie den Begriff der 'Adaptation'!
Durch die Adaption wird sichergestellt, dass ein Bakterium auch bei hohen AttractansKonzentration noch Tumbeln kann und sich nach Orten einer höheren Attractans-Konzentration
orientieren und dann in diese Richtung schwimmen kann.
MCPs können methyliert werden. Dies kann durch CheR (Methyltransferase) geschehen, es
verwendet S-Adenosylmethionin als Methyldonor.
CheB (RR) ist eine Demethylase und entfernt die Methylgruppen wieder von den MCPs. Wenn
CheB phosphoryliert wird, wird seine Aktivität erhöht.
Die Methylierung erlaubt die Adaption an Sensorsignale:
Wenn die Konzentration von Attractans hoch bleibt, bleibt das Level der CheA Phosphorylierung
und somit auch CheY und CheB niedrig und die Zelle schwimmt (keine Neuorientierung möglich).
Das Level der Methylierung von MCPs erhöht sich ständig während dieser Periode, da CheB nicht
aktiv ist.
Wenn MCPs vollständig methyliert sind, gibt es keine Reaktion mehr auf Attractants.
Deswegen, selbst wenn die Attractant-Konzentration hoch bleibt, wird die Phosphorylierung von
CheA und CheB erhöht und die Zelle beginnt zu taumeln. Aber jetzt kann MCP eben wieder
demethyliert werden und wenn das passiert, werden sie auf „0“ gestellt und können weiterhin auf
die steigende oder sinkende Konzentration von Attractans reagieren.
Ist der Gradient höher, sind die „taumel“ – Phasen kürzer.
Bei Repellents kommt es genau zur umgekehrten Situation. Voll methylierte MCPs antworten
bestens auf eine steigende Repellent-Konzentration sodass die Zelle taumelt.
33. Def. Von quorum sensing, Mechaninsmen durch die es implementiert wird
Definieren Sie "quorum sensing"! Erläutern Sie die Funktionsweise.
Bakterien werden im Allgemeinen als unabhängige, einzellige Organismen gesehen.
Einige Bakterien weisen aber ein koordiniertes Verhalten auf, das einer ganzen Population von
Bakterien erlaubt, eine bestimmte Funktion koordiniert durchzuführen, oder ihre individuelle
Aktivität zu modifizieren, als Antwort auf die Größe oder die Aktivität der ganzen Kolonie um sie
herum.
Diese von der Zelldichte abhängige Regulation nennt man quorum sensing.
→ = die individuelle Zellen zählen wie viele Nachbarn sie haben und dann entscheiden sie ob sie
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eine bestimmte Funktion ausführen sollen um die Kolonie zu unterstützen.
Bakterielle Verhaltensweisen beginnen den Organisationsformen von mehrzelligen Organismen
ähnlich zu werden.
Quorum sensing: gute Gründe um es herauszufinden
Symbiose - Vibrio fischeri
Sporulation - Bacillus subtilis
Organisation in Biofilmen - Pseudomonas aeruginosa
Produktion von Virulenzfaktoren - Staphylococcus aureus
Produktion von Antibiotika - Pseudomonas aerofaciens
Weiterhin wird Quorum Sensing für Biolumineszenz (Vibrio fischeri) und Sporulation benötigt.
Autoinduktion: Zwei Komponentensystem
Typisch Quorum sensing: bestimmte bakterielle Eigenschaften prägen sich nur dann aus, wenn
eine entsprechende Anzahl von Bakterien vorliegt. Die kleinste Einheit, die zu solch koordinierten
Aktionen befähigt ist, stellt per Definition das Quorum dar.
1. Die Zellen signalisieren ihre Anwesenheit der Umgebung
2. Die Zellen ermitteln, ob andere Zellen in der Umgebung anwesend sind
In beiden Fällen ist das Signal ein einziges Molekül, der autoinducer.
Direkte Interaktion von jedem transcriptionalen Activator mit seinem autoinducer
lux operon: Genexpression wird nur induziert, wenn die individuelle Bakterienzelle einen
"Quorum" feststellt.
Quorum sensing: die Sprache von Gram- Bakterien
Gram- bacteria: Autoinduktion funktioniert mit der Produktion von diffusionsfähigen
Komponenten, so genannte Autoinducer oder Signalmoleküle.
• Autoinducer akkumulieren in der umliegenden Umgebung.
• Bei hoher Zelldichte erreicht die Konzentration der Autoinducer das Level, das für die
transkriptionale Aktivierung gebraucht wird (~ 10 nM).
• Autoinducer können die Zellmembran durchdringen. Sie diffundieren in die Zelle und
interagieren mit Transkriptionsaktivatoren, die von der Zelldichte abhängig sind (response
regulators)
• Induktion der quorum response und
• Positive Regulation von einer Autoinducer Synthetase, durch welche noch mehr Autoinducer für
die Antwort bereitgestellt wird.
Quorum sensing: die Sprache von Gram+ Bakterien
Gram+ Bakterien: zwei Komponenten-System angeregt durch Zelldichte-abhängige Peptide.
• Die Peptide werden durch ABC Transporter sezerniert. Sie akkumulieren in der Umgebung und
binden an eine sensor Histidinkinase.
• Histidinkinase phosphoryliert einen Response Regulator
• Response Regulator verändert die Genexpression
Entwicklung von Biofilmen:
• freischwimmende (planktonische) Bakterien erkennen eine Oberfläche und haften daran fest.
• gebundene Zellen wachsen, teilen sich und rekrutieren weitere planktonische Zellen, welche an die Zellen
anhaften, die sich bereits auf der Oberfläche befinden.
Probleme mit zweidimensionalem Wachstum: extreme Überbevölkerung, Akkumulation von giftigen
metabolischen Abfällen.
Lösung: Schaff Platz! Angehaftete Bakterien migrieren langsam von der Oberfläche weg und sondern
extrazelluläre Polysaccharide ab, um eine Biofilmmatrix zu schaffen.
Die Zellen verbinden sich zu pilzartigen Strukturen mit Wasserkanälen, durch die die Nährstoffe hinein- und
die Abfallprodukte hinausgelangen.
bei der beantwortung der frage nicht vergessen dass bei gram+ bakterien ein abc-transporter das signal ausschleust... hat
mich einen von drei punkten gekostet...... soviel zu ihrer benotung
34. Was sind autoinducers, wie werden sie produziert, wie werden sie aufgenommen, welche
biochemische Antwort lösen sie in der Zelle aus, und welche Prozesse werden durch sie reguliert?
Autoinduktion: Zwei Komponentensystem
Typisch Quorum sensing: bestimmte bakterielle Eigenschaften prägen sich nur dann aus, wenn
eine entsprechende Anzahl von Bakterien vorliegt. Die kleinste Einheit, die zu solch koordinierten
Aktionen befähigt ist, stellt per Definition das Quorum dar.
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1. Die Zellen signalisieren ihre Anwesenheit der Umgebung
2. Die Zellen ermitteln, ob andere Zellen in der Umgebung anwesend sind
In beiden Fällen ist das Signal ein einziges Molekül, der autoinducer.
Direkte Interaktion von jedem transcriptionalen Activator mit seinem autoinducer
lux operon: Genexpression wird nur induziert, wenn die individuelle Bakterienzelle einen
"Quorum" feststellt.
Quorum sensing: die Sprache von Gram- Bakterien
Gram- bacteria: Autoinduktion funktioniert mit der Produktion von diffusionsfähigen
Komponenten, so genannte Autoinducer oder Signalmoleküle.
• Autoinducer akkumulieren in der umliegenden Umgebung.
• Bei hoher Zelldichte erreicht die Konzentration der Autoinducer das Level, das für die
transkriptionale Aktivierung gebraucht wird (~ 10 nM).
• Autoinducer können die Zellmembran durchdringen. Sie diffundieren in die Zelle und
interagieren mit Transkriptionsaktivatoren, die von der Zelldichte abhängig sind (response
regulators)
• Induktion der quorum response und
• Positive Regulation von einer Autoinducer Synthetase, durch welche noch mehr Autoinducer für
die Antwort bereitgestellt wird.
Quorum sensing: die Sprache von Gram+ Bakterien
Gram+ Bakterien: zwei Komponenten-System angeregt durch Zelldichte-abhängige Peptide.
• Die Peptide werden durch ABC Transporter sezerniert. Sie akkumulieren in der Umgebung und
binden an eine sensor Histidinkinase.
• Histidinkinase phosphoryliert einen Response Regulator
• Response Regulator verändert die Genexpression
Quorum sensing: the hybrid language
Gram- Bakterien: Autoinduktion funktioniert über die Produktion von diffundierfähigen Komponenten,
sogenannte autoinducer oder signaling molecules.
Gram+ Bakterien: zwei Komponenten-System, angeregt durch ein Zelldichte-abhängiges Peptid.
V. harvey: diffundierbare Autoinducer regen ein zwei Komponenten-System an
• Reagiert auf AI-2 Signale, die von Bakterien einer anderen Spezies produziert werden, (sofern diese ein
luxS homolog besitzen)
• Kommunikation über AI-2 signal response system: Mechanismen für Interaktion zwischen verschiedenen
Spezies?
35. Welche Mikroorganismen können Sporen bilden? Durch welche Eigenschaften unterscheiden sich
Sporen von vegetativen Zellen?
Die Genera Bacillus und Clostridium und weitere wenige Genera bilden Sporen.
36. Erklären Sie, wodurch bei der Sporulation verschiedene genetische Programme in Spore bzw.
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Mutterzelle ablaufen können.
Molekulare Vorgänge während der Sporulation: Für den Beginn der Sporulation ist die
Phosphorylierung von Spo0A notwendig, bei Spo0A Mutanten wird die Sporulation komplett
inhibiert, sie verbleiben in der Stage0.
1. Phosphorylierung von Spo0A
Spo0F wird durch die Kinasen KinA,B,C phosphoryliert, Spo0F gibt das Phosphat an die
Phosphotransferase Spo0B weiter und Spo0B gibt Phosphat an Spo0A weiter. Spo0A ist ein
Transkriptionsfaktor, durch die Phophorylierung von Spo0A wird die Genexpressionskaskade
gestartet. Solange die Zelle vegetativ lebt, sorgen Phosphatasen dafür, dass die Sporulation nicht
gestartet wird:
Spo0E dephosphoryliert Spo0A , RapA und RapB dephosphorylieren Spo0F.
Verschlechtern sich die Umweltbedingungen inhibiert PhrA* (wird durch quorum sensing
reguliert) RapA und RapB.
2. Konsequenzen der Spo0A Phosphorylierung
Spo0A-P schaltet nun die Genexpression folgender Gene ein:
SpoIIA Operon → SpoIIAA, SpoIIAB und σF
SpoIIE Operon → SpoIIE
SpoIIG Operon → SpoIIGA und σE
+ einige andere Gene
Sigma-Faktoren binden an Core Enzyme der RNA-Polymerase und dirigieren sie zu einem
bestimmten Genort. Ohne Sigma-Faktoren kann kein Gen transkribiert werden.
3. Sporulationsteilung (Asymmetrische Zellteilung)
Damit die verschiedenen Transkriptionsprogramme in der Mutter- und Tochterzelle ablaufen,
muss sich die Spore von der Mutter trennen. Dieser Vorgang benötigt die Ausbildung eines
asymmetrischen Septums, das Septum wird durch FtsZ gebildet(Spo0A-abhängig).
SpoIIE (Phosphatase) bindet an FtsZ (wird später für die Dephosphorylierung von SpoIIAA
benötigt).
SpoIIIE (Translokase) lagert sich ins Septum ein und transportiert die DNA in die Tochterzelle
(später).
Das Sporulationsseptum ist viel dünner als ein vegetatives Septum. Es ist asymmetrisch und die
Zellen teilen sich nicht; vielmehr umschließt die Mutterzelle die Spore.
Die Genexpression wird nach der Septumbildung kompartimentalisiert.
4. Kompartimentalisierung der Genexpression
Durch die Aktivierung unterschiedlicher Sigma-Faktoren.
Erst ist σE und dann σK in der Mutterzelle aktiv.
In der Mutterzelle ist σF an SpoIIAB gebunden (und somit inakiviert), SpoIIAA ist phosphoryliert
(ebenso inaktiv).
SpoIIA und SpoIIG (beide in mutterzelle aktiv, an aktivierung der sigmafaktoren E und K beteiligt, aber k.a. wie).
In der Vorspore ist erst σF und dann σG aktiv.
In der Vorspore wird SpoIIAA(-P) durch die Phosphatase SpoIIE dephosphoryliert.
Entweder SpoIIE verteilt sich gleichmäßig auf beiden Seiten des Septums, ABER die spezifische
Aktivität von SpoIIE ist in der Vorspore höher. ODER SpoIIE befindet sich ausschließlich auf der
Vorspore-Seite des Septums.
Daher kann es dort SpoIIAA dephosphorylieren und SpoIIAA kann nun an SpoIIAB binden und
somit σf verdrängen. Dieses wird nun in der Spore frei, unter der Kontrolle von σf synthetisiert
die RNA-Polymerase die frühen Sporulationsproteine anstatt der vegetativen Proteine.
σe ist nur in der Mutterzelle aktiv und kann nur dann eingeschalten werden, wenn σf bereits in
der Spore aktiv ist. σf schaltet in der Spore das SpoIIR Operon an. Die Genprodukte von SpoIIR
werden als Signal von der Spore zur Mutterzelle geschleust und aktiviert dort die SpoIIGAProtease, die den prä-σe-Faktor proteolytisch spaltet, der σe Faktor ist nun frei und aktiv.
σg, ist ein Genprodukt der frühen Sporulationsgene, er wird aktiviert durch die Aktivität von σe in
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der Mutterzelle, es vermittelt der RNA-Polymerase die Synthese der späten Sporulationproteine in
der Vorspore und ersetzt somit σf. Die zwei Genprodukte SpoIV FA und SpoIV FB dienen als
Signal zur proteolytischen Spaltung von σk in aktives σk in der Mutterzelle, das σe ersetzt und die
Transkription der späten Sporulationsgene in der Mutterzelle vermittelt, die unter anderem die
Lyse der Mutterzelle hervorrufen.
5. Lokalisierung der in der Mutterzelle produzierten Proteine an die Sporenmembran.
Kompartmentalisierung von SpoIVA ein Protein, welches den Coat” mit der Oberfläche der Spore
verbindet.
SSP lagert sich um DNA in der Spore und schützt diese!
daher sind Sporen auch so resistent gegen Strahlung, Hitze & Co. und vegetative Zellen nicht
37. Wie findet bei der Sporulation die kompartimentierte Genexpression statt?
Sporulation: Kompartimentalisierung der Genexpression und sigma Faktoren!
Welche Sigma Faktoren werden im Laufe der Sporulation in der Mutter, welche in der Tochterzelle
aktiviert? Wie wird diese kompartimentalisierte Aktivierung bewerkstelligt?
siehe Frage 36
38. Wie
Wie
Wie
Wie
Wie
wird die Replikation eingeleitet?
erfolgt die Replikation?
wird die Replikation beendet?
wird die Trennung der Chromosome bewerkstelligt?
wird der Anfang/das Ende der Replikation zeitlich festgelegt?
39. Lipoprotein Synthese und Einbau?
Beschreiben Sie die Funktion des Lipoproteins und dessen Export in Gram – Bakterien!
Beschreiben sie die Sekretion bei Gram + Bakterien!
40. Wie kann Wachstum erfolgen, ohne die Zellwand zu schwächen?
Wie wird der Durchmesser der Zellwand während des Wachstums konstant gehalten?
Wie kann die Zelle ihren Mittelpunkt bestimmen, so dass aus der Zellteilung zwei gleiche
Tochterzellen hervorgehen?
41. Worin besteht der Unterschied zwischen relativer Wachstumsrate und absolutem Wachstum?
Wie kann man bakterielles Wachstum untersuchen und mathematisch erfassen?
42. Wie werden die verschiedenen Phasen der Zellteilung definiert und kontrolliert?
43. Wie wird die Biosynthese der Bestandteile des Bakteriums mit der Zellteilung koordiniert?
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