Univ.-Prof. Dr. G. Riegger DER MEDIZINISCHEN FAKULTÄT DER
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AUS DER KLINIK UND POLIKLINIK FÜR INNERE MEDIZIN II DIREKTOR: Univ.-Prof. Dr. G. Riegger DER MEDIZINISCHEN FAKULTÄT DER UNIVERSITÄT REGENSBURG Myokardiale Hypertrophie und Zunahme der linksventrikulären Kontraktilität am Tiermodell des metabolischen Syndroms Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg vorgelegt von Christian Thumann aus Regensburg 2005 AUS DER KLINIK UND POLIKLINIK FÜR INNERE MEDIZIN II DIREKTOR: Univ.-Prof. Dr. G. Riegger DER MEDIZINISCHEN FAKULTÄT DER UNIVERSITÄT REGENSBURG Myokardiale Hypertrophie und Zunahme der linksventrikulären Kontraktilität am Tiermodell des metabolischen Syndroms Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Regensburg vorgelegt von Christian Thumann aus Regensburg 2005 Dekan: Prof. Dr. M. Nerlich 1. Berichterstatter: Prof. Dr. S. Holmer 2. Berichterstatter: Prof. Dr. A. Kurtz Tag der mündlichen Prüfung: 27. Mai 2005 Gewidmet meinen Eltern und meiner Familie. Inhaltsverzeichnis -5- Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................................... 5 1 Einleitung ........................................................................................................................... 9 2 Methoden und Material.................................................................................................... 12 2.1 Tierexperiment ......................................................................................................... 12 2.1.1 Versuchstiere .................................................................................................... 12 2.1.2 Behandlung der Ratten mit Insulin................................................................... 12 2.2 Bestimmung der biometrischen Daten..................................................................... 13 2.3 Echokardiographie ................................................................................................... 14 2.4 Gewebepräparation................................................................................................... 15 2.5 Bestimmung von HbA1c, Insulin und C-Peptid....................................................... 16 2.6 Histologie ................................................................................................................. 16 2.6.1 Herstellung der Gefrierschnitte ........................................................................ 16 2.6.2 Immunhistologische Färbungen....................................................................... 17 2.6.2.1 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Collagen I ............................................ 17 2.6.2.2 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Fibronectin .......................................... 18 2.6.2.3 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Laminin ............................................... 19 Inhaltsverzeichnis 2.6.3 -6- 2.7 Bildanalyse....................................................................................................... 20 RNA-Präparation...................................................................................................... 21 2.7.1 RNA-Isolation.................................................................................................. 21 2.7.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung.................................................... 22 2.7.3 Darstellung der RNA mittels Agarosegel- Elektrophorese ............................... 22 2.7.4 RNA-Northern Blotting nach dem Kapillarblotverfahren ............................... 23 2.8 Herstellung der cDNA-Sonden ................................................................................ 24 2.8.1 Gensonden aus Bakterienplasmiden................................................................. 24 2.8.1.1 Midi-Präparation von Plasmid-cDNA aus E. coli ........................................ 25 2.8.1.2 Restrik tionsverdau von Plasmiden............................................................... 25 2.8.2 Herstellung der Gensonden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) ............ 26 2.8.2.1 Reverse Transkription.................................................................................. 26 2.8.2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) ................................................................. 27 2.8.3 Darstellung der cDNA mittels Agarosegel-Elektrophorese ............................. 29 2.8.4 Extraktion der cDNA-Fragmente..................................................................... 30 2.9 Quantifizierung der mRNA-Expression................................................................... 31 2.9.1 2.9.1.1 Northern Blotting ............................................................................................. 31 Radioaktive Markierung der cDNA ............................................................. 31 Inhaltsverzeichnis 2.9.1.2 Hybridisierung von Northern Blots.............................................................. 32 2.9.1.3 Quantifizierung des autoradiographischen Signals ...................................... 33 2.9.1.4 Entfernung der markierten cDNA................................................................ 34 2.9.1.5 Normalisierung der Northern Blots.............................................................. 34 2.9.2 3 -7- Echtzeit PCR-Analyse ...................................................................................... 35 2.9.2.1 Transkription der RNA in cDNA................................................................. 35 2.9.2.2 Echtzeit-PCR-Analyse ................................................................................. 35 2.9.2.3 Quantifizierung der PCR-Produkte .............................................................. 38 2.9.2.4 Analyse der Ct-Werte nach der ddCt-Methode ............................................ 40 2.10 Statistische Auswertung ........................................................................................... 41 2.11 Substanzen und Verbrauchsmaterial........................................................................ 42 2.12 Lösungen und Inhaltsstoffe ...................................................................................... 47 2.13 Laborgeräte und Software ........................................................................................ 50 Ergebnisse ........................................................................................................................ 53 3.1 Biometrische Daten.................................................................................................. 53 3.2 Echokardiographie ................................................................................................... 57 3.3 Morphometrie ........................................................................................................... 61 3.4 Extrazelluläre Matrix................................................................................................ 64 Inhaltsverzeichnis 3.5 -8- mRNA-Expression von ANP und BNP ................................................................... 69 4 Diskussion........................................................................................................................ 72 5 Anhang ............................................................................................................................. 78 5.1 Ergebnistabellen....................................................................................................... 78 5.2 Literaturverzeichnis.................................................................................................. 84 Einleitung 1 -9- Einleitung Das metabolische Syndrom spielt eine zentrale Rolle im modernen Gesundheitssystem. Schätzungen ergaben, dass rund ein Viertel der Bevölkerung der westlichen Welt im Laufe des Lebens diese Erkrankung entwickeln [1]. Im Mittelpunkt steht dabei der Typ-2-Diabetes. An dieser „Volkskrankheit“ leiden in der Bundesrepublik Deutschland über 4 Millionen Menschen. Mehr als 90% der Betroffenen sind übergewichtig. Man geht davon aus, dass sich die Anzahl der Diabetiker in Deutschland bis zum Jahr 2010 verdoppeln wird [2]. Das metabolische Syndrom umschreibt das gemeinsame Auftreten eines gestörten Glukose- und Insulinmetabolismus. Weitere Merkmale sind Übergewicht, abdominelle Adipositas, Dyslipoproteinämie und arterielle Hypertonie [3]. Das gleichzeitige Vorhandensein all dieser Merkmale ist eher selten. Nach allgemeiner Vorstellung ist die Existenz von drei der vier Haupterscheinungsbilder ausreichend für eine klare Beschreibung dieses Syndroms. Die Merkmale des metabolischen Syndroms sind Hauptrisikofaktoren für den Diabetes mellitus Typ 2 und die Herzinsuffizienz [4]. Dies ist verbunden mit hoher kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität [5]. Die Vergrösserung der intraabdominellen Fettdepots ist der wichtigste Taktgeber für die klinische Manifestation des metabolischen Syndroms. Deshalb werden die einzelnen Komponenten häufig in Phasen der Gewichtszunahme klinisch manifest. Fettreiche, hyperkalorische Ernährung kann kurzfristig eine Insulinresistenz auslösen oder verstärken und alle Parameter des Glukose- und Lipidstoffwechsels verschlechtern [6]. Durch die herabgesetzte antilipolytische Wirkung des Insulins im Rahmen der Insulinresistenz und durch das vergrösserte abdominelle Fettdepot wird der Umsatz der freien Fettsäuren erhöht. Dies führt durch Störung der hepatischen Insulinextraktion und Insulindegradierung zu einer Verschlechterung der peripheren Glukosetoleranz und somit zu einer peripheren Hyperinsulinämie [7]. Im Rahmen der Framingham-Studie wurde gezeigt, dass die Inzidenz der kongestiven Herzinsuffizienz bei Diabetikern erhöht ist (2,5 – 5 fach gegenüber der Normalbevölkerung). Jeweils in Abhängigkeit vom Alter oder dem Vorhandensein von arterieller Hypertonie oder koronarer Herzerkrankung [8]. Diese Studie wurde 1949 initiiert, um die Epidemiologie kardiovaskulärer Erkrankungen zu untersuchen. Über 5.000 Personen im Alter zwischen 30 und 62 Jahren wurden zweimal pro Jahr bezüglich ihres internistischen Gesundheitszustands über Jahre hinweg untersucht [9]. Die häufigsten Folgeschäden bei Diabetikern stellen Einleitung - 10 - kardiovaskuläre Erkrankungen dar [10]. Für 75% der Diabetiker sind diese Erkrankungen lebenslimitierend. Klinisch zeigt sich dies in Komplikationen wie Myokardinfarkt, Schlaganfall oder dem vaskulärem diabetischen Fusssyndrom. Der kausale Zusammenhang dieser Pathologika war Mittelpunkt intensiver Forschung der letzten Jahrzehnte. Bis heute ist jedoch wenig bekannt über die Veränderungen am Herzen beim metabolischen Syndrom, die die Entwicklung einer Herzinsuffizienz ausreichend erklären könnten. Der Diabetes kann auch vom Bild einer Kardiomyopathie begleitet werden, bei der es trotz angiographisch normaler Koronararterien und trotz des Fehlens anderer erkennbarer Ursachen einer Herzkrankheit zu einem Herzversagen kommt. Über die genauen Zusammenhänge ist bislang jedoch nur wenig bekannt. Die meisten der bereits veröffentlichten experimentellen Studien über die kardialen Veränderungen beim Diabetes mellitus wurden an Tieren mit Alloxan- oder Streptozotocin- induziertem Insulin-defizienten Diabetes [11] durchgeführt. Auf diesem Weg sollte der insulin- abhängige Diabetes mellitus (Insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) simuliert werden. Die Patho logika dieser Tiere waren eine apoptotische Zerstörung der Kardiomyozyten [12] und eine interstitielle und perivaskuläre Fibrose [13]. Auch eine myokardiale Hypertrophie konnte an Streptozotocin-behandelten Ratten gezeigt werden [14]. Nur wenige Studien haben sich bis heute auf experimentelle Modelle des metabolischen Syndroms mit Diabetes mellitus Typ 2 konzentriert. Am häufigsten wurde dabei die Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat (OLETF-Ratte) zu Hilfe genommen. Dies ist ein Tiermodell mit eher mild ausgeprägter Adipositas einhergehend mit Hyperglykämie, die sich allerdings erst nach etwa 30 Lebenswochen signifikant manifestiert [15]. Um die kardiovaskulären Veränderungen im Rahmen des metabolischen Syndroms noch präziser beschreiben zu können, wurde für diese Arbeit die Zucker Diabetic Fatty Ratte (ZDF-Ratte) gewählt. Diese Züchtung ist charakterisiert durch ein frühes Auftreten eines hyperglykämischen Zustandes nach etwa neun bis zwölf Lebenswochen. Dies geht einher mit Hyperphagie, Adipositas, Hyperinsulinämie und Hyperlipidämie. Das sind charakteristische Merkmale der peripheren Insulinresistenz. Somit erfüllen diese Tiere die klinischen Kriterien des metabolischen Syndroms [16]. Im Rahmen genetischer Studien konnte gezeigt werden, dass die ZDF-Ratte eine Mutation des Leptin-Rezeptor-Gens aufweist [17]. Diese Mutation resultiert in einem Austausch der Aminosäure Glutamin in Prolin an Position 269 [19, 20]. Leptin wird ausschliesslich von Fettzellen gebildet, somit reflektiert dessen Plasmakonzentration die Grösse des Fettdepots. Es steigert über eine zentrale Aktivierung des Einleitung - 11 - sympathischen Nervensystems den Energieverbrauch und kann die Zusammensetzung der Körperfett-Anteile regulieren [18]. Ein falsches Splicing des genetischen Transskripts des Leptin- Rezeptors (obesity-receptor, OB-R) ist assoziiert mit ausgeprägter Adipositas [19]. Die adipösen Tiere sind alle homozygot bezüglich des Aminosäuren-Austausches am OBRezeptor (fa/fa), die Kontrolltiere sind alle heterozygot (+/fa) für diese Mutation [20]. In diesem Tiermodell tritt die Hyperinsulinämie mit der Zeit in die Phase des IDDM mit absolutem Insulinmangel über, so wie dies in vergleichbarer Weise beim Menschen geschieht. Obwohl gerade auch bei diesen Patienten die Behandlung mit Insulin eine häufig genutzte therapeutische Option darstellt, ist die Auswirkung einer solchen Therapie auf die morphologischen und funktionellen Veränderungen am Herzen weitestgehend unbekannt [21]. Gerade beim schlecht eingestellten und wenig gut kontrollierten nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (Noninsulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM) zeigt sich der Einsatz von Insulinen als einzige Behandlungsoption. Daten der Framingham-Studie lassen vermuten, dass die Langze ittherapie diabetischer Patienten mit Insulin das Risiko für die Entwicklung einer kongestiven Herzinsuffizienz fördert [8]. In-vitro-Studien konnten zeigen, dass Insulin trophische Effekte hat, die zu einer umfassenden Zell-Proliferation, unter anderem auch der Fibroblasten, führen kann [22]. Somit ist die Spekulation berechtigt, dass eine Insulin- Behandlung möglicherweise mit dem Prozess des ventrikulären Remodelings, einem myokardialen Umbauprozess einhergehend mit ventrikulären Form-, Grössen- und Dickenveränderungen [23, 48], in Verbindung steht. Ziel der vorgelegten Arbeit ist es, zum Verständnis der Pathophysiologie der diabetischen Kardiomyopathie beizutragen. Anhand tierexperimenteller Untersuchungen soll geklärt werden, welche Veränderungen an der Morphologie der Kardiomyozyten, der Expression von extrazellulären Matrixproteinen und deren funktionelle Konsequenzen in Ratten mit metabolischem Syndrom und Diabetes mellitus Typ 2 allein und in Kombination mit einer Behandlung mit Insulin zum Tragen kommen. Methoden und Material 2 - 12 - Methoden und Material 2.1 Tierexperiment 2.1.1 Versuchstiere Männliche Zucker Diabetic Fatty - Ratten (ZDF-Ratten) mit einem Ausgangs-Körpergewicht von 107 – 159 g und Zucker Lean - Ratten (Kontroll- Ratten, Ctr-Ratten) mit einem Gewicht von 86 – 118 g wurden im Alter von fünf Wochen bezogen. Dabei handelt es sich bei den ZDF-Ratten um Tiere mit einem genetisch homozygot determinierten Diabetes mellitus Typ 2, zusätzlich mit einer ausgeprägten Adipositas und bei den Kontroll-Ratten um heterozygote Tiere, die das Krankheitsbild des Diabetes mellitus Typ 2 nicht zeigen. Die Ursache hierfür liegt in einem Basenaustausch von Adenin in Cytosin an Position 880 des 3650 Basenpaare (bp) langen DNA-Stücks, welches für ein 1162 Aminosäuren-grosses Protein, den LeptinRezeptor, kodiert (Gen-Bank Nr. U52966). Die Tiere wurden in Einzelkäfigen bei RMH-B Rattenfutter (Inhaltsstoffe: 19% Rohprotein, 4% Rohfett, 7% Rohasche, 6% Rohfaser, 11,9 MJ/kg umsetzbare Energie) und Leitungswasser ad libitum gehalten. Der natürliche Tag-Nacht-Rhythmus der Tiere wurde durch Simulation eines 12-Stunden- hell/dunkel- Zyklus im Tierstall gewährleistet. 2.1.2 Behandlung der Ratten mit Insulin Im Alter von 13 Wochen, eine Woche nach Entwicklung der hyperglykämischen Stoffwechsellage, wurden die Tiere in drei Gruppen eingeteilt: 1. Zucker Lean - Ratten, unbehandelte Kontrollen (Ctr), n = 7 2. Zucker Diabetic Fatty - Ratten, unbehandelt (ZDF), n = 7 Methoden und Material - 13 - 3. Zucker Diabetic Fatty - Ratten, mit Insulin behandelt (ZDF+Ins), n = 6 Zur Applikation von Insulin wurden osmotische Alzet-Minipumpen, Modell 2ML2 verwendet. Diese wurden den Tieren unter kurzer intraperitonealer Anästhesie mit Xylazin/Ketamin (10 mg/kg Körpergewicht (KG) Xylazin + 20 mg/kg KG Ketamin i. p.) subkutan zwischen beide Scapulae implantiert. Die Pumpen infundierten dann für 14 Tage 25 IU/kg Körpergewicht / Tag humanes rekombinantes Insulin. Da es unter dieser Dosierung nur zu einem geringen Rückgang der Serumglucosespiegel kam, wurden die Pumpen nach diesem Zeitraum für weitere vier Wochen mit anderen vom Typ 2ML4 ausgetauscht, um eine höhere Konzentration an Insulin verabreichen zu können (75 IU/kg Körpergewicht / Tag). Die Kontrollratten (Ctr und ZDF) wurden dabei zu keinem Zeitpunkt mit einer Insulinpumpe versorgt. 2.2 Bestimmung der biometrischen Daten Das Körpergewicht aller Tiere wurde wöchentlich bestimmt, Blutglucose-Werte wurden alle zwei Wochen mit einem Accu-Chek ® Plus-Glucoseoxidoreductase-Teststreifen-Messgerät ermittelt. Hierfür wurden die Tiere in einem Tierkäfig fixiert, wobei der Schwanz aus dem Käfig ragte. Dieser wurde zunächst für ca. 30 s in 40 °C warmes Wasser gehalten, um die Durchblutung zu steigern und danach sorgfältig abgetrocknet. Anschliessend wurde mit einer feinen Kanüle (27 G) eine Schwanzvene punktiert und ein Tropfen Blut gewonnen, der dann der Glucose-Bestimmung zugeführt werden konnte. Im Alter von 18 Wochen wurden der systolische Blutdruck und die Herzfrequenz gemessen. Dabei wurde nicht-anästhesierten Ratten, fixiert in einem Käfig, eine Blutdruckmanschette über den Schwanz gestreift, möglichst proximal angebracht und solange aufgepumpt, bis der Druck in der Manschette über dem systolischen Blutdruck in der Schwanzarterie auf Herzhöhe lag [24]. Mit einem automatischen Puls-Detektions-System wurden dann Herzfrequenz und Blutdruck bestimmt. Methoden und Material 2.3 - 14 - Echokardiographie Im Alter von 19 Wochen, nach 6-wöchiger Insulin- Behandlung, wurden die Tiere unter intraperitonealer Xylazin/Ketamin-Narkose (10 mg/kg Körpergewicht (KG) Xylazin + 20 mg/kg KG Ketamin i. p.) echokardiographiert, um das Ausmass der linksventrikulären Dysfunktion evaluieren zu können. Mit Hilfe eines Ultraschallgerätes (Sonos 5500 mit 12,5 MHz Schallkopf) wurden zweidimensionale und Motion Mode-Bilder des linken Ventrikels im linksparasternalen Längsschnitt angefertigt (siehe Abbildung 1). Abbildung 1 Schematische Darstellung der linken Herzhöhle in Höhe der Sehnenfäden durch Selektion einer M-Mode-Linie (linker Bildausschnitt) aus dem 2D-Echo (rechts) der linksparasternalen langen Achse zur Vermessung folgender Parameter: Diastolischer (IDD, im Bild LVEDD) und systolischer (IDS, im Bild LVESD) Innendurchmesser, IVS: interventrikuläre Septumdicke, linksventrikuläre Hinterwanddicke (LVPW), ferner der Diameter des rechten Ventrikels (RV). Drei aufeinanderfolgende Herzzyklen wurden bei der M-Mode-Analyse gemittelt und nach der Leading-edge-Methode mit einer Auflösungsgenauigkeit von 0,1 mm [25] bei einer Aufzeichnungsgeschwind igkeit von 100 mm/s, bestimmt: 1. Diastolischer (IDD) und systolischer Innendurchmesser (IDS) 2. Diastolische (IVSD) und systolische interventrikuläre Septumdicke (IVSS) 3. Diastolische (LVPWD) und systolische linksventrikuläre Hinterwanddicke (LVPWS) Methoden und Material Diastolische und systolische - 15 - linksventrikuläre Volumina wurden anschliessend näherungsweise bestimmt nach Pawlush et al. (1993) [26] als IDD³ und IDS³, um weitere Parameter abschätzen zu können: 4. Ejektionsfraktion (EF) in % als (1 - (IDS³ / IDD³)) x 100 5. Verkürzungsfraktion (FS) in % als (IDD - IDS) / IDD x 100 6. Relative linksventrikuläre Wanddicke (RLVWT) als (IVSD + LVPWD) / IDD Die linksventrikuläre Masse (LVM) und der linksventrikuläre Masse-Index (LVMI) wurden nach einer modifizierten Formel von Devreux und Reicheck (1977) [27] berechnet: 7. LVM = 1,04 x ((IDD + 2 x LVPWD)³ - IDD³ - 13,6) 8. LVMI = 1,04 x ((IDD + 2 x LVPWD)³ - IDD³ - 13,6) / Körpergewicht Bei den verwendeten Geräten am Universitätsklinikum Regensburg lag die Varianz der oben dargestellten Parameter bei unter 3%. 2.4 Gewebepräparation Die Versuchstiere wurden nach 19 Wochen unter CO2 -Inhalation dekapitiert. Das Blut aus dem Truncus brachiocephalicus wurde sogleich für biochemische Analysen weggefroren. Nach Eröffnung des Thorax wurde das Herz entnommen, mit isotoner Kochsalzlösung (0,9% NaCl) gespült, getrocknet, von angrenzendem Fettgewebe befreit und anschliessend gewogen. Für histologische Analysen wurden Vier-Kammer-Schnitte angefertigt, diese mit Tissue-Tek® luftblasenfrei ausgespritzt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Am übrigem Herzgewebe wurden die Kammern von den Vorhöfen am atrio-ventrikulärem Ring getrennt, die Herzkammern ebenfalls aufgeteilt in rechten und linken Ventrikel, zerkleinert und in flüssigen Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte –80 °C. Methoden und Material 2.5 - 16 - Bestimmung von HbA1c, Insulin und C-Peptid Zur Beurteilung der langfristigen Blutzuckereinstellung wurde der HbA1c-Wert bestimmt. Gerade die Stoffwechsellage in den letzten 2 Wochen konnte so gut wiedergespiegelt werden. Darüberhinaus wurde zur Quantifizierung der endogenen Insulinsekretion bzw. des exogen zugeführten Insulins das C-Peptid bzw. der Plasmaspiegel für Insulin gemessen. Die HbA1c-Werte wurden mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) mit einem Diamad®-Analysegerät analog der Analyse humaner Proben bestimmt. Immunoreaktives Insulin wurde mittels Radioimmunoassay (RIA) mit einem polyklonalem antibovinem Insulin-Antiserum von Sigma bestimmt. C-Peptid wurde mit Hilfe eines Rattenspezifischen C-Peptid-Kits bestimmt. Für beide Assays wurden jeweils 100 µl Serum verwendet. Die Experimente wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. 2.6 Histologie Die histologische Aufarbeitung der Myokardproben erfolgte zur Beurteilung möglicher struktureller Veränderungen bei den diabetischen und nicht-diabetischen Versuchstieren. 2.6.1 Herstellung der Gefrierschnitte Um das gefrorene Gewebe auf die Schneideblöcke des Cryotoms zu fixieren, wurden die Schneideblöcke in ein Trockeneis/Ethanol- Bad gelegt und blasenfrei mit Tissue-Tek® beschichtet. Darauf wurde das Gewebe ausgerichtet und ebenfalls mit Tissue-Tek® überschichtet. Mit einem Stück Trockeneis wurde von oben solange gekühlt, bis das TissueTek® weiss und hart wurde. Die Blöcke wurden in das vorgekühlte Cryotom gestellt und sofort geschnitten. Es wurden Schnitte mit einer Dicke von 5 µm bei einer Temperatur von –20 °C angefertigt und auf Super-Frost®-Objektträger aufgetragen. Sofort nach dem Schneiden wurden die Präparate auf einer handwarmen Heizplatte für ca. 20 s gestreckt und anschliessend 30 min in Methoden und Material - 17 - eiskaltem Aceton bei –20 °C fixiert. Die Objektträger wurden dann etwa 1 h bei Raumtemperatur vollständig getrocknet und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C gelagert. 2.6.2 Immunhistologische Färbungen Die für die histologischen Färbungen vorgesehenen Objektträger wurden zunächst codiert, um später eine geblindete Auswertung der Daten zu gewährleisten. Zur Entfernung des Acetons wurden alle Objektträger in Glasküvetten gestellt und dreimal für 5 min in PBS-Lösung gewaschen. 2.6.2.1 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Collagen I Nach Entfernen der PBS-Waschlösung wurden alle Objektträger in den Glasküvetten für 10 min bei Raumtemperatur in 1% H2 O2 in PBS inkubiert, um eventuell vorhandene endogene Peroxidasen zu inaktivieren. Danach wurde wiederum dreimal mit PBS-Lösung jeweils 5 min gewaschen. Um unspezifische Bindungen zwischen dem später aufgetragenen 2. Antikörper und dem Gewebe zu reduzieren, wurden diese potentiellen Bindungsstellen mit 10% NSS (Normales Schweine Serum) in PBS für 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Es wurde auch darauf geachtet, dass alle ab diesem Zeitpunkt verwendeten Lösungen zusätzlich auch mit NSS versehen wurden, um während des gesamten Färbevorganges eventuell vorhandene Bindungsstellen zu blockieren. Anschliessend wurde nochmals dreimal gewaschen, die Objektträger aus den Glasküvetten genommen, vorsichtig abgewischt und auf Kunstoffblöcke in eine feuchte Kammer gelegt. Die feuchte Kammer ist eine Metallbox, die mit nassen Papiertüchern ausgelegt wurde und im verschlossenen Zustand für eine hohe Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur sorgte, so dass die Inkubationsflüssigkeit auf den Objektträgern nicht verdunsten konnte. Jetzt wurden auf jeden Schnitt 200 µl der Collagen I-Antikörper-Lösung gegeben und 1 h bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubiert. Der Antikörper gegen Collagen I stammte aus aufgereinigtem Ziegen-Antiserum, welches gegen humanes Typ I Collagen hyperimmunisiert wurde. Negativkontrollen, jeweils ein Schnitt aus jeder der vier Gruppen, wurden mitgeführt, jedoch an dieser Stelle nur mit 1,5% NSS in PBS ohne den Collagen I- Methoden und Material - 18 - Antikörper inkubiert. Anschliessend wurde die Inkubationsflüssigkeit vorsichtig abgekippt und alle Objektträger dreimal für 5 min in PBS-Lösung gewaschen, aus den Küvetten genommen und vorsichtig abgewischt, ohne dabei die Schnitte zu berühren. Diese wurden dann in der feuchten Kammer 1 h bei Raumtemperatur mit dem 2. Antikörper (Rabbit-Anti-Goat-Lösung), der spezifisch an den Fc-Teil des Collagen I-Antikörpers bindet, inkubiert. Dabei wurden ebenfalls 200 µl Lösung auf die Schnitte gegeben, ohne jedoch mit der Pipettenspitze das Gewebe zu berühren. Dieser Anti- Ziegenserum-Antikörper ist gereinigtes Immunglobulin aus Kaninchen, die gegen Ziegen-Serum hyperimmunisiert wurden. Zusätzlich wurde der Fc-Teil des Antikörpers mit hochspezifischer PferderettichPeroxidase konjugiert. Hiernach wurde die Antikörper-Lösung abgekippt und nochmals dreimal in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden dann in Glasküvetten gestellt und diese mit jeweils 40 ml Diaminobenzidin-Lösung aufgefüllt. Die Peroxidase-Reaktion wurde mit 1 ml 0,3% H2 O2 in PBS gestartet und die Küvette geschwenkt, bis nach ca. 3 min die typische Braunfärbung des Gewebes einsetzte, basierend auf der Glutaraldehyd-Methode nach Avrameas und Ternynck (1971) [28]. Nun wurde die DAB-Lösung abgekippt und die Objektträger in der Küvette vorsichtig ca. 10 min unter fliessendem Wasser gespült. Anschliessend wurde mit Hematoxylin Solution Gill No 2 3 min gegengefärbt und 3 min gewässert. Zum Dehydrieren wurden die Präparate schnell durch eine aufsteigende Alkoholreihe (70%, 96% Ethanol in Wasser) gezogen, in 100% Ethanol 1 min entwässert und schliesslich 15 min in reinem Xylol fixiert. Die Schnitte wurden in Entellan® eingebettet und unter dem Abzug langsam getrocknet. 2.6.2.2 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Fibronectin Die immunhistologische Färbung von Zell-bindendem Fragment (Fibronectin) wurde nach dem gleichen Protokoll durchgeführt wie die von Collagen I. Allerdings wurde als Lösungsmittel für alle Reagenzien nicht PBS-Lösung sondern Tween-PBS-Lösung in identischer Konzentration verwendet, da es sich gezeigt hat, dass sich der Einsatz von PBSLösung ungünstig auf die Qualität der Färbung auswirkte. PBS-Lösung wurde lediglich zum Waschen der Objektträger eingesetzt. Als Primärantikörper wurden monoklonale Antikörper Methoden und Material - 19 - eingesetzt, die vom Hersteller aus Mäusen gewonnen und mit Human-Fibronectin immunisiert wurden und als Anti-Fibronectin-Lösung auf die Schnitte aufgetragen wurden. Als Sekundärantikörper, konjugiert mit Peroxidase, kam dann Rabbit-Anti-Mouse-Lösung zum Einsatz. Die optimale Verdünnung des Primär- bzw. Sekundärantikörpers wurde in zahlreichen seriellen Voruntersuchungen ermittelt (siehe Tabelle 1). Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper Collagen I 1 : 20 1 : 200 Fibronectin 1 : 10 1 : 200 Laminin 1:1 1 : 100 Tabelle 1 Übersicht über die optimalen Verdünnungen des primären bzw. sekundären Antikörpers, der bei der indirekten Peroxidasefärbung zum Einsatz gekommen ist. Der Laminin-Primärantikörper wurde bereits vom Hersteller fertig vorverdünnt verwendet. 2.6.2.3 Indirekte Peroxidasefärbung gegen Laminin Die Peroxidase-Färbung gegen Laminin war nahezu identisch mit der gegen Fibronectin. Als Primärantikörper kamen 2 Tropfen pro Objektträger eines bereits Herstellerseitig fertig gelösten Kaninchen-Anti- Laminin-Antikörpers aus einem Laminin Staining Kit zur Anwendung. Da dieser Antikörper nicht in NSS-Blocking-Serum gelöst war, wurde der unmittelbar davor erforderliche Waschschritt weggelassen: Die Schnitte wurden sofort nach der einstündigen Inkubation in 10% NSS in Tween-PBS kurz abgewischt und mit dem AntiLaminin-Antikörper benetzt. Als Zweitantikörper kamen für jeden Objektträger jeweils 200 µl eines in Swine-Anti-Rabbit-Lösung gelösten Peroxidase-konjugierten Antikörpers aus Kaninchenserum zum Einsatz. Alle weiteren Schritte entsprachen dann der FibronectinFärbung. Methoden und Material 2.6.3 - 20 - Bildanalyse Zur quantitativen Auswertung der Immunhistologie des linken Ventrikels wurde ein rechnergestütztes Bildanalysesystem zu Hilfe genommen. Alle Schnitte wurden lichtmikroskopisch unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs mit einer kalibrierten Vergrösserung von x400 (Laminin, perivaskuläres Collagen I) bzw. x200 (Fibronectin, Gesamtcollagen I) dargestellt. Das von der Digitalkamera übertragene Gesichtsfeld hatte eine Bilschirmauflösung von 757 x 506 Bildpunkten, was 0,2053 µm/Bildpunkt entsprach. Die Fläche des digitalisierten Gesichtsfelds war damit 0,0161 mm². Bei der Analyse der Bilder kam ein 8-bit-color System zum Einsatz, das die Farben in 256 Graustufen umwandelte und hiernach mittels Analysesoftware ausgewertet werden konnten. Einzelne Zellen wurden analysiert, wenn der Zellkern zentral in der Zelle lokalisiert war und die Zellmembran intakt war. Ganze Zellverbände wurden ausgewertet, wenn keine Schnittoder Färbeartefakte vorhanden waren. Folgende Parameter wurden untersucht: 1. Der Durchmesser der Kardiomyozyten (CMW) wurde in der Art bestimmt, dass die Zellgrenzen unter Laminin-Färbung markiert wurden und nach der Methode von Anversa et al. (1985, 1986) [29, 30] berechnet werden konnte. 2. Das Volumen der Kardiomyozyten (CMV) wurde berechnet durch die Bestimmung der Kardiomyocytenlänge (CML) und anschliessend nach der Formel: (CMW / 2)² x pi x CML. 3. Die Dicke der Lamininschicht wurde gleichermassen durch Markieren der Laminingrenzen bestimmt, ebenso konnte die Dicke der Collagen I-Schicht um die Gefässe (perivaskuläre Fibrosierung) ermittelt werden. 4. Positiv gefärbte Anteile an Collagen I und Fibronectin zeigten sich durch eine flächige Braunfärbung, die in Relation zur Gesamtfläche des Gesichtsfeldes gesetzt wurde. Für jeden einzelnen Parameter wurden 20 zufällig ermittelte Gesichtsfelder geblindet analysiert. Bei Schichtdickebestimungen wurden pro Gesichtsfeld 50 zufällig ausgewählte gefärbte Bereiche vermessen. Im Rahmen der quantitativen Bildanalyse wurden die Summen Methoden und Material - 21 - aller positiven Areale in Bezug gesetzt zum Gesichtsfeld und der prozentuale Anteil davon bestimmt. 2.7 RNA-Präparation Um Unterschiede im Expressionsmuster bestimmter Gene der Extrazellulärmatrix zu finden, war es nötig, die RNA aus den Zellen zu extrahieren. Angestrebt wurde ein hoher Reinheitsgrad der RNA, das heisst eine möglichst geringe Verunreinigug mit DNA und Proteinen. Die aus den Zellen gewonnene RNA wurde daraufhin unter denaturierenden Bedingungen im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und nach dem Kapillarblotverfahren auf eine Nylonmembran transferiert. 2.7.1 RNA-Isolation Grundsätzlich erfolgte jeder der Arbeitsschr itte der RNA-Präparation auf Eis (4 °C), um der Gefahr der Degradation der RNA vorzubeugen. Nach der Methode von Chomczynski und Sacchi (1987) [31] wurden die bei –80 °C gelagerten Gewebestücke der linken Ventrikel der Versuchstiere in Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen mit 3 ml Trizol®-Reagenz überführt (1 ml Trizol® auf 100 mg Gewebe). Die Homogenisation der Proben erfolgte mit einem Euroturrax®-Dispergiergerät, das vor jedem Homogenisationsvorgang zweimal mit DEPCWasser gereinigt wurde. Das Gewebe wurde dann im gekühlten Zentrifugenröhrchen etwa 4 min homogenisiert. Anschliessend wurde das Homogenat auf zwei 2 ml Reaktionsgefässe aufgeteilt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Hiernach wurden jeweils 300 µl Chloroform hinzugefügt (1/5 des Trizol®-Volumens), vorsichtig mit der Hand geschüttelt und weitere 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15 min Zentrifugation bei 12000 g und 4 °C bildeten sich drei Phasen aus, eine untere rote Phenol-Chloroform-, eine weissliche Intermediär- und eine obere wässrige Phase. Die organische untere und die weissliche Intermediär-Phase enthielten vor allem Proteine und DNA, während sich die RNA in der wässrigen Phase befand. Der wässrige Überstand wurde vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und in ein 2 ml Reaktionsgefäss mit 750 µl eiskaltem Isopropylalkohol zur Präzipitation transferiert (1/2 des Trizol®-Volumens). Die Methoden und Material - 22 - Präzipitation fand nach gründlichem Mischen der Proben bei Raumtemperatur für 10 min statt. Um anschliessend bessere Bedingungen für das Anheften des entstehenden Pellets zu schaffen, gewährleistet durch die konische Verjüngung von 1,5 ml Reaktionsgefässen, wurde nun der Inhalt der beiden zusammengehörenden 2 ml Reaktionsgefässe in drei 1,5 ml Reaktionsgefässe umgefüllt, so dass jetzt etwa 1 ml RNA-Isopropyl-Gemisch in jedem Reaktionsgefäss war. Nach 10 min Zentrifugation bei 12000 g und 4 °C formte die präzipitierte RNA ein weissliches Pellet am Boden und an der Seite des Reaktionsgefässes. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und verworfen. Daraufhin wurde dem Pellet 400 µl eiskaltes 75% Ethanol zugegeben, durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig gelöst, die Inhalte der drei zusammengehörenden Reaktionsgefässe in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäss zusammengefasst und wieder 5 min bei 7500 g und 4 °C zentrifugiert. Nach behutsamen vollständigem Abpipettieren des Überstandes wurde das Pellet bei Raumtemperatur ca. 5 min getrocknet und in 32 µl DEPC-Wasser durch Auf- und Abpipettieren und anschliessendem Rühren gelöst. 2.7.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung Der RNA-Gehalt der gewonnenen Proben wurde durch photometrische Konzentrationsbestimmung an einem Perkin- Elmer Lambda 2 Photometer ermittelt. Dazu wurden 2 µl der Probe in einer Verdünnung von 1 : 500 in eine Mikroküvette gegeben und die Extinktionen bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm bestimmt. Der RNA-Anteil hat ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Ist die optische Dichte im Bereich von 260 nm gleich eins, so entspricht dies einer RNA-Konzentration von 10 g/l. Eine Aussage über den Reinheitsgrad der RNA erhält man durch Bildung des Quotienten der Absorptionen bei 260 nm und 280 nm, welcher grösser als 1,6 sein sollte. Die Lagerung der RNA-Proben erfolgte ausschliesslich bei –80 °C. 2.7.3 Darstellung der RNA mittels Agarosegel- Elektrophorese Die Auftrennung der RNA erfolgte durch Elektrophorese im Agarosegel. Es wurde eine 1%ige Lösung mit Agarose und 1x MOPS durch etwa 2 min Aufkochen in der Mikrowelle hergestellt. Dieser Lösung wurden nach Abkühlung auf unter 50 °C 0,3 µg/ml Methoden und Material - 23 - Ethidiumbromid (10 µg entsprechend 1 µl Ethidiumbromid-Stamm) und 1,85% Formaldehyd zugegeben. Die sorgfältig gemischte Lösung wurde schliesslich in eine vorbereitete gereinigte Gelkammer mit Probenkamm blasenfrei gegossen. Nach einer Stunde war das Agarosegel ausgehärtet und konnte in eine mit 1x MOPS gefüllte Elektrophoresekammer überführt werden, wobei vorher der Probenkamm entfernt wurde. Die zur Auftrennung bestimmte RNA (pro Geltasche 20 µg, Gesamtvolumen 32 µl) wurde mit 20% 6x Loading Dye versetzt, gemischt und 2 min bei 70 °C im Heizblock inkubiert und sofort wieder auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden anschliessend vorsichtig in die Geltaschen pipettiert, eine Spannung von 50 V angelegt und für ca. 2 h elektrophoretisch aufgetrennt. Da der Farbstoff Ethidiumbromid zwischen die Basen der RNA interkalierte und bei UV-Bestrahlung leuchtete, konnte das Resultat der RNA-Auftrennung durch UV-Licht einer Wellenlänge von 312 nm sichtbar gemacht werden und photographisch dokumentiert werden (siehe Abbildung 2). Abbildung 2 Ethidiumbromid-haltiges Agarosegel (1%) nach elektrophoretischer Auftrennung von RNA (20 µg/Spur) unter denaturierenden Bedingungen. 28S: ribosomale RNA (4,7 kb). 18S: ribosomale RNA (1,9 kb). 2.7.4 RNA-Northern Blotting nach dem Kapillarblotverfahren Auf eine mit ca. 0,5 l 20x SSC gefüllte Kunststoffwanne wurde eine Kunststoff-Platte horizontal gestellt und mit 3 Lagen Filterpapier, bereits SSC-durchfeuchtet, luftblasenfrei bedeckt, welches beiderseits in die SSC-Lösung hinabhing. Das Agarosegel wurde direkt im Anschluss an die Gelelektrophorese, nach einer etwa 15 min Inkubation in 20x SSC bei Raumtemperatur zur vollständigen Entfernung des Formaldehyds, mit der Öffnung der Geltaschen nach unten blasenfrei auf das Filterpapier gelegt. Nun wurde die auf Gelgrösse Methoden und Material - 24 - zugeschnittene GeneScreen-Nylonmembran ebenfalls SSC-durchfeuchtet und blasenfrei auf die freiliegende Unterseite das Agarosegels gebracht, mit 3 Lagen zugeschnittenem SSCfeuchten Filterpapier blasenfrei überdeckt und mit einer ca. 10 cm dicken Lage Zellstoff überschichtet. Der Turm aus Zellstoff wurde mit einem Gewicht von etwa 500 g beschwert und die Blotting-Wanne mit Frischhaltefolie gegen Verdunstung geschützt. Durch die Kapillarkräfte des Filterpapiers kommt es zu einen ständigen Fluss der SSCLösung durch das Gel und die Nylonmembran hindurch [32]. Somit wird die RNA mit der SSC-Flüssigkeit aus dem Gel bis zu der Nylonmembran transportiert, wo sie an deren Oberfläche hängen bleibt. Nach Beendigung des Blotting-Vorgangs nach etwa 20 h wurde die Membran vom Gel abgelöst und der Erfolg des Transfers unter UV-Licht kontrolliert, wobei der interkalierte Farbstoff Ethidiumbromid wiederum die Markierung der 28S- bzw. 18SBande ermöglichte. Letztend lich wurde die RNA auf der Membran durch beidseitige 2 min UV-Bestrahlung mit einer Energie von 100.000 µJ/cm² am UV-Crosslinker fixiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei –20 °C gelagert. 2.8 Herstellung der cDNA-Sonden Um die gewonnene mRNA nun mittels Hybridisierung der Northern Blots analysieren zu können, war es zunächst erforderlich, geeignete cDNA-Sonden herzustellen, die, radioaktiv markiert in der Lage waren die entsprechenden RNA-Sequenzen auf der Nylonmembran zu identifizieren. 2.8.1 Gensonden aus Bakterienplasmiden Eine Möglichkeit der Herstellung der cDNA-Sonden besteht darin, bereits vorhandene Sonden-tragende Plasmide in Bakterien einzubauen, zu transferieren und diese nach Amplifikation der Bakterienkultur durch spezielle Verfahren in grossen Mengen zu extrahieren. Die Transformation kompetenter E. coli und die Amplifikation wurde freundlicherweise von Mitarbeitern des Labors durchgeführt. Methoden und Material - 25 - 2.8.1.1 Midi-Präparation von Plasmid-cDNA aus E. coli Während die Präparation von Plasmiden im grossen Massstab (Large-Scale-Präparation) drei bis vier Tage dauert, war es bei der sogenannten Midi-Präparation möglich, schnell eine kleinere, jedoch ausreichende Menge Plasmid herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ein HiSpeed Plasmid Midi Kit verwendet. Zunächst wurde die Bakteriensuspension 15 min bei 6000 g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Bakterienpellet wurde mit 6 ml 4 °C kaltem Resuspensions-Puffer P1 versetzt, bis alle Zellklumpen gelöst waren. Anschliessend wurde der Inhalt in ein frisches 50 ml Falcon®-Reaktionsgefäss überführt, 6 ml Lysis-Puffer P2 zugegeben, vorsichtig mit der Hand geschüttelt, um das Scheren der DNA zu vermeiden und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Lösung wurde anschliessend 6 ml gekühlter Neutralisations-Puffer P3 zuge geben, danach sofort vorsichtig geschüttelt und in ein zu dem Kit gehöriges QIAfilter Maxi Cartridge gegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit fielen Proteine, genomische DNA, Zelldebris und SDS aus, wobei anschliessend das Zelllysat davon getrennt wurde, indem es aus dem Cartridge mit wenig Druck gepresst und sofort auf eine Quiagen-Tip-Säule aufgetragen wurde (Volumen etwa 15 ml), die zuvor mit 4 ml Puffer QBT equilibriert wurde. Gleich darauf wurden 20 ml WaschPuffer QC auf die Säule aufgetragen und abgewartet, bis dieser vollständig durch das Quiagen-Tip gelaufen war. Hiernach wurde die Säule auf ein neues 50 ml Falcon®Reaktionsgefäss gestellt und durch Zugabe von 5 ml Eluierungs-Puffer QF die Plasmid-DNA aus der Säule eluiert. Die DNA wurde nun durch mischen mit 3,5 ml Isopropylalkohol und anschliessender Zentrifugation für 30 min bei 15000 g und 4 °C präzipitiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das Pellet mit 2 ml 70% Ethanol gewaschen und wieder 10 min bei 15000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Schliesslich wurde das getrocknete Pellet in 0,5 ml Tris-HCl-Puffer aufgenommen, in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäss überführt und der Konzentrationsbestimmung am Photometer zugeführt. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C. 2.8.1.2 Restriktionsverdau von Plasmiden Die aus den Bakterien isolierten Plasmide wurden nun einem Restriktionsverdau unterzogen. Dazu wurden pro Ansatz in einem 1,5 ml Reaktionsgefäss 50 µg Plasmid, ein zu den Methoden und Material - 26 - Restriktionsenzymen passender Puffer und die das Plasmid an der richtigen Stelle schneidenden Enzyme in 1 ml Endvolumen für 18 h bei 37 °C im Heizblock inkubiert (siehe Tabelle 2). Die verdauten Plasmide wurden im Anschluss daran bis zur Weiterverarbeitung mit den anderen Gensonden bei –20 °C gelagert. cDNA-Sonde Länge Endonukleasen Erkennungssequenz Puffer GAPDH 10 U Kpn I GGTAC/C 10 U Xba I T/CTAGA 608 bp 10x Puffer L Tabelle 2 Im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Endonukleasen zum Restriktionsverdau von GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase). 2.8.2 Herstellung der Gensonden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) Eine andere Möglichkeit der Herstellung der cDNA-Sonden war, mit Hilfe der PCR-Technik und zwei spezifischen Primern die Gensonden für die spätere Northern-Blot-Hybridisierung zu synthetisieren. Dabei wurde ein SuperScript One-Step RT-PCR verwendet. Hierbei wird RNA durch eine reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben und im Anschluss daran mit Hilfe der spezifischen Primer das gesuchte cDNA-Fragment durch die PCR amplifiziert. 2.8.2.1 Reverse Transkription Es wurden 2 µg Gesamt-RNA aus dem linken Ventrikel von Rattenherzen mit 1x Reaction Mix, jeweils 2 mM Sense- und Antisense-Random-Primern und 1,5 µl RT/Taq-Mix in einem Endvolumen von 50 µl auf Eis vermischt und in einem programmierbaren Heizblock für 30 min bei 53 °C reverse transkribiert. Nach 2 min Inaktivierung bei 94 °C konnte nun direkt anschliessend in diesem Cycler mit der PCR-Reaktion begonnen werden. Methoden und Material - 27 - 2.8.2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) Die aus der RT-Reaktion gewonnene cDNA wurde verwendet, um mit Hilfe der PCRTechnik eine Sonde zu synthetisieren, die ANP- bzw. BNP-RNA auf der Nylonmembran zu identifizieren vermochte. Bei den Primern handelte es sich um Oligo-cDNA-Fragmente, mit den in Tabelle 3 dargestellten Basenfolgen, die freundlicherweise von Frau Dr. Erdmann (Klinikum der Universität Regensburg) zur Verfügung gestellt wurden. ANP Länge des synthetisierten Fragments: 472 bp Forward-Primer: 5’- AGG GCT TCT TCC TCT TCC TG -3’ Reverse-Primer: 5’- GGA TCT TTT GCG ATC TGC TC -3’ Annealing-Temperatur: 59 °C BNP Länge des synthetisierten Fragments: 397 bp Forward-Primer: 5’- TCA CTT CTG CAG CAT GGA TC -3’ Reverse-Primer: 5’- TGC AGC CAG GAG GTC TTC -3’ Annealing-Temperatur: 58 °C Tabelle 3 Zur Herstellung der cDNA-Sonden verwendete Primer. Die eigentliche PCR verlief in 45 sich wiederholenden Zyklen, wobei jeder Zyklus die synthetisierte cDNA etwa verdoppelte. Die schematische Darstellung der Vorgänge innerhalb eines Zyklus sind in Abbildung 3 dargestellt. Der Zyklus begann immer mit einem 15 s Erhitzen auf 94 °C, wodurch die cDNA-Stränge voneinander getrennt wurden (Denaturierung). Die Ansätze wurden nun auf eine Primer-spezifische Annealing-Temperatur (Temperaturoptimum zur Anbindung, siehe Tabelle 3) abgekühlt und konstant für 30 s gehalten. In dieser Zeit kam es zur Bindung der Primer an die einzelsträngige cDNA. Durch 30 s Erhitzen der Ansätze auf 70 °C wurde ein Temperaturoptimum für die cDNA-Synthese durch die Taq-Polymerase ausgehend von den gebundenen Primern geschaffen (Extension). Erneutes Erhitzen auf 94 °C trennte die synthetisierten cDNA-Stränge und leitete den nächsten Zyklus ein. Methoden und Material - 28 - Abbildung 3 Schematischer Ablauf eines Zyklus einer Polymerasekettenreaktion (PCR). A: Denaturierung der cDNA zur Trennung der Doppelstränge. B: Annealing-Phase zur Bindung der kurzen Primer-Stücke an die einzelsträngige cDNA. C: Während der Extension komplementäre Erweiterung der Primer durch dNTPs mittels DNA-Polymerase nach Vorgabe des cDNA -Manuskripts. Am Ende des letzten Zyklus wurde das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase (72 °C) 10 min konstant gehalten (finale Extension) und die Ansätze anschliessend auf 4 °C abgekühlt. Die PCR-Produkte, jeweils 492 bp (ANP) bzw. 397 bp (BNP) lange DNA-Fragmente aus dem codierenden Abschnitt der Gene, wurden bei –20 °C gelagert. Methoden und Material 2.8.3 - 29 - Darstellung der cDNA mittels Agarosegel-Elektrophorese Die in der PCR synthetisierte cDNA und die im Restriktionsverdau der Plasmide gewonnenen DNA-Fragmente wurden mittels Elektrophorese im Agarosegel aufgetrennt. Zu Beginn wurde aus Agarose und 1x TBE durch kurzes Aufkochen in der Mikrowelle eine 2% Agaroselösung hergestellt. Nach Abkühlung der Lösung auf unter 50 °C wurden 0,3 µg/ml Ethidiumbromid zugegeben, die Lösung blasenfrei in einen Gelträger mit Probenkamm gegossen und nach Erstarren des Gels dieses in eine mit 1x TBE gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Nun wurden jeweils 50 µl der PCR- bzw. Restriktionsverdau-Ansätze mit 20% 6x Loading Dye versetzt und nach kurzem mischen in die Geltaschen pipettiert. Die Laufzeit betrug 1 h bei einer Spannung von 100 V. Um eine bessere Orientierung über die Grösse der in der Elektrophorese aufgetrennten cDNA-Fragmente zu haben, wurden 4 µg eines DNALängenstandards mit 20 definierten Fragmenten zwischen 24 und 726 bp aufgetragen (phiX174 DNA/Hinf I Markers) oder 4 µg eines DNA Molecular Weight Marker III mit 13 Fragmenten zwischen 125 und 21226 bp. Das Ergebnis der DNA-Auftrennung wurde unter UV-Licht kontrolliert und mittels eines Agarosegel-Dokumentationssystems dargestellt (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Abbildung 4 Ethidiumbromid-haltiges Agarosegel (2%) mit elektrophoretischer Auftrennung von DNA (1 µg/Spur). Nicht -verdaute bzw. mit den Restriktionsenzymen Xba I und/oder Kpn I geschnittene Plasmide, welche die cDNA-Sonde für Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) enthalten. Standard: Roche DNA Molecular Weight Marker III (links Originaldaten des Herstellers). Methoden und Material - 30 - Abbildung 5 Ethidiumbromid-haltiges Agarosegel (2%) mit elektrophoretischer Auftrennung der PCRProdukte für ANP und BNP. Standard: Promega Hinf I Marker (links Originaldaten des Herstellers). 2.8.4 Extraktion der cDNA-Fragmente Die elektrophoretische Auftrennung der cDNA ergab die für jede Sonde erwarteten spezifischen Fragmente, die es nun galt, aus dem Agarosegel zu extrahieren. Dazu wurde der jeweilige Gelabschnitt mit einem sterilem Skalpell unter UV- Licht-Kontrolle auf einer Glasscheibe aus dem Gelverband gelöst, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäss überführt und anschliessend das exakte Gewicht der Gelstücke festgestellt. Die Extraktion erfolgte nun unter Anwendung eines QUIAEX II®-DNA- Extraktions-Kits. Die Inhaltsstoffe der verwendeten Puffer unterliegen dem Betriebsgeheimnis des Herstellers. Als erstes wurde auf ein Gelvolumen das 3x Volumen an Puffer QX1 und 10 µl QUIAEX IILösung zugesetzt und die Gelstruktur durch 10 min Inkubation bei 50 °C im Heizblock und mehrmaligem zwischenzeitlichem mischen aufgelöst. Hiernach wurde kontrolliert, ob die Lösung noch eine gelbe Färbung aufwies, da durch eine Verschiebung des pH-Wertes der Lösung auf über 7,5 der enthaltene pH-Indikator-Farbstoff sich ändert und die Wasserstoffionen-Konzentration gegebenenfalls korrigiert werden musste, da eine Adsorption der cDNA an die QUIAEX II-Partikel in einem noch stärker basischen Bereich nicht mehr gewährleistet gewesen wäre. Anschliessend wurde die Lösung 30 s bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Um alle Agarosereste aus dem sich nun geformten Pellet zu entfernen wurden 500 µl Puffer QX1 hinzugegeben, das Pellet darin durch mischen gelöst und nochmals 30 s bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Zur Reinigung der gebundenen cDNA wurde zweimal mit 500 µl Puffer PE gewaschen und das Pellet danach etwa 10 min luftgetrocknet. Durch Zugabe von 30 µl Tris-HCl-Puffer wurde das Pellet durch mischen gelöst, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und 30 s bei 13000 g zentrifugiert. Im Methoden und Material - 31 - Überstand befand sich nun die Sonden-cDNA, die jetzt in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäss überführt, einer photometrischen Konzentrationsbestimmung unterzogen und bis zur Weiterverwertung bei –20 °C gelagert wurde. 2.9 Quantifizierung der mRNA-Expression Zur Quantifizierung verschiedener mRNA-Konzentrationen in den Kardiomyocyten der linken Ventrikel wurden zum einen Northern Blots mit radioaktiv markierter cDNA hybridisiert. Eine andere Möglichkeit der Untersuchung von Unterschieden in der Genexpression bestand darin, mRNA in cDNA zu transkribieren und diese anschliessend mit Hilfe der quantitativen PCR-Technik zu analysieren. 2.9.1 Northern Blotting Alle durch Plasmidverdau oder PCR-Technik synthetisierten cDNA-Sonden (siehe Tabelle 4) konnten nun nach radioaktiver Markierung für die Hybridisierung der Northern Blots eingesetzt werden. cDNA-Sonde Grösse des identifizierten Transkriptes ANP 787 bp BNP 628 bp GAPDH 1272 bp Tabelle 4 Darstellung aller verwendeten cDNA-Sonden. ANP: Atriales natriuretisches Peptid. BNP: Brain natriuretisches Peptid. GAPDH: Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase. 2.9.1.1 Radioaktive Markierung der cDNA Die cDNA-Sonden wurden mit Hilfe eines Random Primed DNA Labeling Kits nach der Methode von Feinberg und Vogelstein [33, 34] radioaktiv markiert. Dazu wurden 25 ng der Methoden und Material - 32 - jeweiligen cDNA in 9 µl Endvolumen für 10 min bei 98 °C denaturiert, um das spätere Anbinden der Primer an die sich nun in Einzelsträngen vorliegende DNA zu ermöglichen. Im weiteren Verlauf wurden dem Reaktionsansatz 2 µl Hexanucleotidgemisch (Random Primer) in 10x Reaktionspuffer, je 1 µl der Nukleotide dATP, dGTP und dTTP, 2 U Klenow-Enzym (DNA-Polymerase) und 5 µl [alpha- 32 P] dCTP (Redivue®) mit einer spezifischen Aktivität von 3.000 Ci/mmol zugegeben. Der Ansatz wurde schliesslich nach kurzem Mischen 30 min bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Die DNA-Polymerase war hierbei in der Lage, doppelsträngige DNA-Abschnitte zu erkennen (an den cDNA-Einzelsträngen gebundene Primer) und von dort ausgehend einen zweiten DNA-Strang unter Verwendung der Substrate dATP, dGTP, dTTP und [alpha- 32 P] dCTP zu synthetisieren. Als Matrize diente dabei der gegenläufige DNA-Strang. Um einerseits den Erfolg der Reaktion zu kontrollieren und andererseits die radioaktiv markierte Sonde von nicht-gebundenen Nukleotiden zu isolieren, wurde der Reaktionsansatz über eine equilibrierte Sephadex® G-50 Nick ®-Säule aufgetrennt. Nach Auftragen des Ansatzes wurde 6 mal mit 200 µl TE-Puffer gespült, die einzelnen Fraktionen gesammelt und im Szintillations-Zähler deren Radioaktivität bestimmt. Die Nick ®-Säule war mit porösen Kügelchen gefüllt, die beim Durchwandern der Reaktionslösung Nukleotide und besonders kurzkettige DNA-Fragmente aufnahmen, wohingegen die langen cDNA-Sonden an den Kügelchen vorbeiwanderten. Da diese Moleküle nun schneller eluiert wurden, fand man die markierte Sonden-cDNA bereits in den Fraktionen 3 und 4, während ungebundene Nukleotide und kurzkettige nicht-Sonden-cDNA erst ab Fraktion 6 auftraten. Die tatsächliche Sondenaktivität ergab sich folglich aus der Zahl der Zerfälle in den Fraktionen 3 und 4, während der Rest verworfen werden konnte. 2.9.1.2 Hybridisierung von Northern Blots Um unspezifische Bindungsstellen auf der Nylonmembran zu blockieren, wurde diese durch 4 h Vorhybridisieren im Ofen bei 42 °C in 10 ml Hybridisierungs-Lösung auf 100 cm² Membranoberfläche inkubiert. Die eigentliche Hybridisierung begann durch Zugabe der radioaktiv markierten Sonde in diese Lösung. Die benötigte Sondenmenge richtete sich nach deren Aktivität und lag zwischen 0,5 und 2,6 dpm/ml Hybridisierungs- Lösung. Die Sonde wurde 5 min bei 95 °C im Heizblock denaturiert, um die cDNA in einzelsträngigem Zustand Methoden und Material zu bekommen und - 33 - nach Abkühlung auf Raumtemperatur in die vorgewärmte Hybridisierungs-Lösung gegeben. Die Hybridisierung wurde bei gleichmässiger Rotation für 20 h bei 42 °C durchgeführt. Da die Sonde auch unspezifische Bindungen auf der Nylonmembran einging, wurde nach der Hybridisierung versucht, diese durch Waschen möglichst vollständig zu entfernen. Das Waschen erfolgte mit aufsteigender Stringenz, das heisst die Temperatur wurde im Laufe des Vorgangs angehoben, wohingegen die Salzkonzentration der Waschlösung verringert wurde. Zunächst wurde mit 2x SSC/0,1% SDS-Lösung 20 min bei Raumtemperatur und anschliessend bei 65 °C im Wärmebad bei leichtem Schütteln der Membran gewaschen. Darauf folgte ein Waschschritt mit 0,2x SSC/0,1% SDS-Lösung bei 65 °C für 20 min. Im Anschluss daran wurde die Blotmembran mit möglichst wenig Flüssigkeit in Plastikfolie eingeschweisst. 2.9.1.3 Quantifizierung des autoradiographischen Signals Zusammen mit einem Röntgenfilm wurde die Blotmembran in eine Bleikassette (zur Abschirmung der kosmischen Strahlung) gelegt und 22 – 28 h bei –80 °C exponiert. Hiernach wurde die Platte bei Raumtemperatur wieder aufgetaut und der belichtete Röntgenfilm in einem automatischen Entwickler entwickelt. Die Daten wurden mittels Analysesoftware in einem Densitometer ausgewertet. Dabei wurde jedem einzelnem Bildpunkt ein Grauwert zwischen 0 und 255 zugeordnet, so dass die Schwärzung eines jeden Punktes der jeweiligen Stärke des radioaktiven Signals entsprach. Die Stärke des Signals wurde in optischen Dichteeinheiten angegeben, da sie ganz wesentlich von der Expositionszeit abhingen. Die mittlere Dichte ergab sich aus der Summe aller Grauwerte der Bildpunkte eines Signals dividiert durch die Anzahl der Bildpunkte. Von dieser mittleren Dichte des Signals wurde die mittlere Dichte des Hintergrundes substrahiert. Diese berechnete sich aus der Summe aller Grauwerte der Bildpunkte direkt um die von der Radioaktivität geschwärzten Flächen der Membran, in der Art, dass sie gerade nicht mehr diese Flächen berührten, also ein Mass dafür sein konnte, wie der Hintergrund direkt neben den exponierten Flächen war. Das Ergebnis war demnach die semiquantitative Stärke des Signals multipliziert mit der Fläche unter Berücksichtigung der unspezifischen Methoden und Material - 34 - Hintergrundschwärzung. Diese Methode ermöglichte es, alle Signale eines Blots untereinander vergleichen zu können, zumal alle Proben auf eine Blotmembran aufgetragen werden konnten. 2.9.1.4 Entfernung der markierten cDNA Um die Nylonmembran erneut hybridisieren zu können, musste die radioaktiv markierte cDNA des letzten Versuchs vorher abgelöst werden. Der Blot wurde dazu in 0,2x SSC/0,1% SDS-Lösung 30 min bei 95 °C im Wärmebad bei leichtem Schütteln der Membran inkubiert. Die gewaschene Membran wurde anschliessend in Plastikfolie eingeschweisst und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert. Die Überprüfung dieses Vorgangs erfolgte durch Auflegen eines Röntgenfilmes. 2.9.1.5 Normalisierung der Northern Blots Um Beladungsartefakte auszugleichen, wurden alle Northern Blots mit einer radioaktiv markierten Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Sonde hybridisiert und danach quantifiziert. Dabei wird angenommen, dass das Enzym GAPDH zum einen in jeder Zelle ubiquitär ist und zum anderen dabei nicht reguliert wird. Somit entsprach der nach der densitometrischen Analyse für jede einzelne Spur des Northern Blots ermittelte relative Dichtewert deren eigentlicher Beladung mit RNA. Zur Normalisierung der Werte wurde nun jeder einzelne optische Dichtewert durch den korrespondierenden GAPDH-Dichtewert dividiert. Mit dem nun erhaltenem normalisiertem Wert des Ziel- Transkripts konnten Unregelmässigkeiten in der Beladung der Spuren ausgeglichen werden und bei der darauffolgenden statistischen Analyse experimentell bedingte Streuungen verringert werden. Methoden und Material 2.9.2 - 35 - Echtzeit PCR-Analyse Die Expression von Collagen I konnte durch Echtzeit PCR-Analyse bestimmt werden. 2.9.2.1 Transkription der RNA in cDNA Zunächst musste die extrahierte RNA in cDNA umgeschrieben werden. Hierzu wurden 2 µg Gesamt-RNA in ein 1,5 ml Reaktionsgefäss gegeben und mit 1,2 µg Random Primer in einem Gesamtvolumen von 10 µl nach kurzem Mischen 5 min bei 70 °C im Heizblock inkubiert. In dieser Zeit war es dem 6 Nukleotide-langen DNA-Fragment, dessen Sequenz zufällig determiniert war, möglich, sich an die komplementären Basen der RNA zu heften. Das Abdiffundieren der Primer wurde durch sofortiges Abkühlen auf 4 °C verhindert. Hiernach wurden 1x First Strand Puffer, 2 mM dNTP-Mix und 8 mM Dithiothreit (DTT) in einem Endvolumen von 25 µl hinzugefügt und vermischt. Im Anschluss daran wurden noch 200 U Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptase (M-MLV RT) durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren ergänzt und der Ansatz 60 min bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Die M-MLV reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, war nun in der Lage, die Nukleotide beginnend bei den angehefteten Primern an den komplementären RNAStrang in 3’-5’-Richtung entlang der RNA zu synthetisieren. Zum Stoppen der Reaktion wurde die Lösung 5 min bei 95 °C inkubiert, wobei dabei die M-MLV RT denaturierte. Anschliessend wurde bei 4 °C auf ein Volumen von 44 µl mit DEPC-Wasser aufgefüllt, um später in der PCR-Reaktion theoretisch bis zu 22 verschiedene Parameter analysieren zu können. Die cDNA wurde bei –20 °C gelagert. 2.9.2.2 Echtzeit-PCR-Analyse Mit einem ABI Prism 7700 Sequence Detector war es nun möglich, die transkribierte RNA mit Hilfe der PCR-Methode zu analysieren. Wie bereits Heid et al. 1996 erwähnten [35], war es hiermit möglich, ohne weitere Verarbeitung des PCR-Produkts sofort nach jedem Zyklus Erkenntnis über die Konzentration der gesuchten DNA-Sequenz zu erhalten. Dadurch war es gewährleistet, effizienter und sauberer zu arbeiten, da eine Kontamination der Lösungen bei Methoden und Material - 36 - der Manipulation der Proben nach erfolgter PCR vermieden werden konnte. Essentiell war dabei, dass die Probenmenge nicht erst ganz am Ende der PCR bestimmt wurde, so wie dies bei der quantitativ-kompetitiven PCR nach Becker-Andre 1991 [36] oder bei anderen Methoden, wie Agarose- und Polyacrylamidgel-Analyse, Fluoreszenz-Markierung von PCRProdukten nach Fasco et al. 1995 [37] oder der Sandwich-Probenhybridisierung nach Mulder et al. 1994 [38] geschah. Hier konnte direkt zu nahezu jedem Zeitpunkt die amplifizierte Menge an DNA festgestellt werden. Vorausgegangene Arbeiten über die Entdeckung der 5’-3’-Nukleaseaktivität der TaqPolymerase durch Holland et al. 1991 [39] ermöglichten die Generierung eines DNAFragments (TaqMan-Sonde), welches zusammen mit den Primern während des AnnealingVorganges an die einzelsträngige DNA ankondensiert und dann während der Extension durch die DNA-Polymerase hydrolysiert wurde und damit zur Bestimmung der Konzentration des PCR-Produkts beitrug (siehe Abbildung 3). Dies geschah, in dem man die TaqMan-Sonde mit zwei verschiedenen Farbstoffen markierte. Der eine, 6-carboxyfluorescein (6-FAM), als Reporter-Farbstoff bezeichnet, wurde am 5’-Ende der TaqMan-Sonde ankondensiert und der andere, 6-carboxy-tetramethylrhodamin (6-TAMRA) am 3’-Ende, in Übereinstimmung mit Vorarbeiten von Lee (1993) [40], Bassler (1995) [41] und Livak (1995) [42]. In diesem Zustand waren beide Farbstoffe über beide Enden des Oligonukleotids hinweg so miteinander verbunden, dass eine Färbung der Lösung nicht stattfinden konnte. Erst nach Hydrolyse durch die Polymerase wurden die Farbstoffe zusammen mit den Nukleotiden freigesetzt, wobei 6FAM zu einer Extinktionserhöhung bei einer Wellenlänge von 518 nm führte, die nun in Relation zur Konzentration der DNA gesetzt werden konnte. 6-TAMRA bewirkte eine Extinktionserhöhung bei 582 nm, welche als Kontrolle betrachtet werden konnte, inwieweit die 6-FAM-Daten tatsächlich valide waren. Der mitgeführte interne Standard ROX (lambdamax = 610 nm) wurde dazu verwendet, auftretende apparaturbedingte Variationen automatisch auszugleichen. Als PCR-Ansatz wurden 2 µl der zuvor reverse transkribierten DNA mit 1x PCR Puffer (GeneAmp®), 3 mM MgCl2 , 400 nM Forward-Primer, 400 nM Reverse-Primer, 200 nM TaqMan-Sonde (bei GAPDH-TaqMan-Sonde 600 nM), siehe hierzu Tabelle 5, 800 µM dNTP-Mix (GeneAmp®), 1 µl ROX-Standard und 2,5 U AmpliTaq Gold®-Polymerase vorsichtig in einem Endvolumen von 50 µl vermischt. Um während der PCR Extinktionsmessungen vornehmen zu können, mussten alle benutzten Reaktionsgefässe Methoden und Material - 37 - optisch durchlässig sein. Aus diesem Grund wurden ausschliesslich PCR Optical-Tubes und Optical-Cap-Strips verwendet. Um eine Verunreinigung der Ansätze durch z. B. fremde DNA sichtbar zu machen, wurde immer für jedes eingesetzte Primerpaar ein Kontrollansatz mitgeführt, der keine cDNA aus der RT-Reaktion enthielt. Weiterhin wurde auch eine Verdünnungsreihe angesetzt, die mit GAPDH-Primern und -Sonde versetzt wurde, um mehrere Reaktionsplatten miteinander vergleichen zu können. Die daraufhin stattgefundene PCR verlief in 45 sich wiederholenden Zyklen von 30 s bei 95 °C (Denatur ierung) und anschliessender 1 min Extension bei 58 °C. Davor wurden die Reaktionsplatten 30 s bei 50 °C inkubiert, um eventuell vorhandene Luftblasen auf den Flüssigkeitsoberflächen zu entfernen und danach 10 min bei 95 °C denaturiert. Die PCRProdukte wurden bei –20 °C gelagert, ein Agarosegel mit allen Proben wurde zur Kontrolle angefertigt. Die verwendeten Primer und Sonden (siehe Tabelle 5 Bei der Echtzeit-PCRAnalyse verwendete Primer und TaqMan-Sonden) wurden freundlicherweise von Dr. Zimmermann, Universität Erlangen zur Verfügung gestellt. Collagen I Typ a1 Länge des synthetisierten Fragments: 73 bp Forward-Primer: 5’- GGG CGA GTG CTG TCC TTT C -3’ Reverse-Primer: 5’- TGG GTC CCT CGA CTC CTA TG -3’ TaqMan-Sonde: 5’- (FAM) CCC AGA AGA ATA TGT ATC ACC AGA CGC AGA AG (TAMRA) -3’ GAPDH Länge des synthetisierten Fragments: 138 bp Forward-Primer: 5’- AAC TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA -3’ Reverse-Primer: 5’- CAG TCT TCT GAG TGG CAG TGA TG -3’ TaqMan-Sonde: 5’- (FAM) ATG GAC TGT GGT CAT GAG CCC TTC CA (TAMRA) -3’ Tabelle 5 Bei der Echtzeit-PCR-Analyse verwendete Primer und TaqMan-Sonden. Methoden und Material - 38 - 2.9.2.3 Quantifizierung der PCR-Produkte Nachdem jeder Reaktionsansatz alle 8,5 s laserchromatographisch vermessen wurde, konnte für jeden PCR-Zyklus der Quotient aus 6-FAM-Extinktion und ROX-Extinktion arithmetisch gemittelt werden. Davon wurde an jedem Messpunkt der Quotient aus 6-FAM-Extinktion und ROX-Extinktion zu Beginn der PCR (Leerwertkontrolle) substrahiert. Mittels rechnergestützer Analyse (ABI Prism 7700 Sequence Detection System Version 1.6) konnte nun eine Amplifikationsgraphik erstellt werden (siehe Abbildung 6). Hierbei konnten die Fluoreszenz-Einheiten dRn gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen werden. Da die Extinktionswerte der ersten 10 - 15 Zyklen sehr niedrig waren, konnten keine direkten Unterschiede zwischen den Zyklen ermittelt werden, so dass die Software diese Werte arithmetisch mittelte und als Grundlinie ausgab. Als dann die TaqMan-Sonden in ausreichender Menge hydrolysiert wurden, stieg die Intensität der Reporter-FluoreszenzEmission rapide an und nahm über alle Zyklen hinweg betrachtet einen sigmoiden Verlauf ein. Die Amplifikationsgraphik wurde sehr früh analysiert, an einem Punkt, der die log-Phase der PCR-Produkt-Akkumulation repräsentierte, da an dieser Stelle Extinktionsunterschiede am deutlichsten waren, weil sich die meisten Kurven in einer Plateau-Phase einem konstanten Wert näherten. Dieser Analyse-Punkt wurde bestimmt durch den Schnittpunkt zwischen Graph und einer Schwellenlinie, die als Parallele zur Abszissenachse, 10 Standardabweichungen über dem Mittelwert der ersten 15 Zyklen lag (Ct-Wert, cycle threshold). Der Ct-Wert repräsentierte demnach die Anzahl von PCR-Zyklen, die für eine bestimmte Intensität an Reporter-Fluoreszenz-Emission benötigt wurden. dRn (Fluoreszenz-Einheiten) Methoden und Material - 39 - Plateau 1,0 0,8 Ct-Wert 0,6 0,4 Schwellenlinie 0,2 0 Grundlinie 10 20 30 Anzahl der Zyklen 40 50 Abbildung 6 Schematische Darstellung der Amplifikationsgrafik eines Echtzeit-PCR-Ansatzes. dRn: 6-FAM-Extinktion in Relation zu Standard ROX, abzüglich des Leerwertes. Grundlinie: Arithmetisches Mittel der Extinktionen der ersten 15 Zyklen. Schwellenlinie: Parallele zur Grundlinie, 10 Standardabweichungen nach oben verschoben. Ct -Wert: Schnittpunkt zwischen Schwellenlinie und Amplifikationsgrafik (interpoliert). Wurden nun mehrere PCR-Ansätze gleichzeitig analysiert, so wurde für alle der gleiche Schwellenwert festgelegt (siehe Abbildung 7). Daraus resultierten nun unterschiedliche CtWerte, je nach 6-FAM-Extinktion. Verlief eine Kurve in der Amplifikationsgraphik flacher, dann hatte sie einen höheren Ct-Wert als eine Kurve, die steiler verlief und früher die Schwellenlinie schnitt. Dies bedeutete, dass die flachere Kurve mehr Zyklen benötigte, um die gleiche Fluoreszenz-Extinktion im PCR-Ansatz zu erreichen, als die steilere. Wenn man nun davon ausging, dass pro Zyklus die DNA etwa verdoppelt wurde, dann konnte man folgern, dass ein hoher Ct-Wert eine niedrigere Ausgangskonzentration an cDNA beinhaltete, da immer nur ein Molekül TaqMan-Sonde mit einem Molekül DNA hybridisieren konnte. Demnach bedeutete z. B. eine Linksverschiebung des Ct-Wertes um 3 - 3,5 Zyklen eine Konzentrationserhöhung um etwa das 10fache. Methoden und Material Abbildung 7 Amplifikationsgraph - 40 - für mehrere PCR-Ansätze gleichzeitig, wie er von der Analysesoftware des Perkin Elmer ABI Prism 7700 ausgegeben wird. Die Analyse der Daten findet in Bezug auf die Schwellenlinie statt. Cycle: Anzahl der Zyklen. dRn: 6-FAM-Extinktion abzüglich Leerwertkontrolle. 2.9.2.4 Analyse der Ct-Werte nach der ddCt-Methode Die Ct-Werte konnten nun untereinander quantitativ verglichen werden, nach der von Perkin Elmer (Foster City, USA) vorgeschlagenen ddCt-Methode (1997) [43] und unter der Annahme, dass die Amplifikationseffizienz des ABI Prism 7700 Sequence Detector gleich 1 ist, was von Perkin Elmer selbst so festgelegt wurde. Ausgehend davon, dass gilt 1. Anzahl der Moleküle bei Ct-Wert = Anzahl der Moleküle zu Beginn x 2 Ct-Wert = konstant, wurden die PCR-Produkte zunächst auf eine endogene Kontrolle, wie auch bei der Northern Blot Hybridisation, GAPDH (Referenz), normalisiert: 2. Probenmoleküle bei Ct / Referenzmoleküle bei Ct = (Probenmoleküle zu Beginn x 2Ct ) / (Referenzmoleküle zu Beginn x 2Ct ) = konstant Methoden und Material - 41 - 3. (Probenmoleküle zu Beginn / Referenzmoleküle zu Beginn) x 2Ct (Probe)-Ct (Referenz) = konstant 4. (Probenmoleküle zu Beginn / Referenzmoleküle zu Beginn) = konstant x 2-dCt Alle aus diesen Werten gewonnenen Mittelwerte jeder Gruppe wurden noch auf einen Kalibrator (Ctr) bezogen: 5. ((Probenmoleküle zu Beginn / Referenzmoleküle zu Beginn) einer Gruppe) / ((Probenmoleküle zu Beginn / Referenzmoleküle zu Beginn) des Kalibrators) = (konstant x 2-dCt der Gruppe) / (konstant x 2-dCt des Kalibrators) = 2dCt der Gruppe - dCt des Kalibrators = 2-ddCt Bei der Darstellung der Daten wurden die Mittelwerte jeder Gruppe mit deren Range dargestellt: 6. 2-ddCt + (Standardabweichung von ddCt) und 2-ddCt - (Standardabweichung von ddCt) 2.10 Statistische Auswertung Alle dargestellten Werte sind arithmetische Mittelwerte + Standardfehler (SEM). Die statistische Auswertung erfolgte mit einer Statistiksoftware (SPSS Version 10.0), wobei ein zweiseitiger parametrischer Zweistichproben-t-Test für unverbundene Stichproben zur Anwendung kam. Ein Levène-Test wurde vorgeschaltet, um die Varianzengleichheit der Daten zu gewährleisten. Die Stärke des Verhältnisses zweier Variablen wurde mittels Berechnung des Pearsonschen Korrelationskoeffizienten r bestimmt. Die Irrtumswahrscheinlichkeit für den Fehler erster Art (Niveau alpha) wurde, wie von BeckBornholdt und Dubben 1999 [44] beschrieben, nach internationaler Konvention auf 5% gesetzt. Demzufolge wurden Mittelwertunterschiede mit einem p-Wert von gleich oder weniger als 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Methoden und Material - 42 - 2.11 Substanzen und Verbrauchsmaterial [alpha- 32 P] dCTP Redivue® (3.000 Ci/mmol), Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK Aceton Merck, Darmstadt, Deutschland Agar Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Agarose Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Ampicillin Sigma, St. Louis, USA Anti-Fibronectin Boehringer, Mannheim, Deutschland Anti-Kaninchen- Peroxidase-Conjugated Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins, Immunglobuline Dako, Glostrup, Dänemark Anti-Mäuse- Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins, Immunglobuline Dako, Glostrup, Dänemark Anti- Ziegen- Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Goat Immunoglobulins, Immunglobuline Dako, Glostrup, Dänemark Bakterien XL1-Blue-Escherichia coli, Stratagene, La Jolla, USA Borsäure Merck, Darmstadt, Deutschland BSA Bovines Serumalbumin, Sigma, St. Louis, USA Chloroform Merck, Darmstadt, Deutschland Collagen I-Antikörper Goat Anti-Type I Collagen, Southern Biotech, Birmingham, US dATP dNTP Set, Life technologies, Maryland, USA dCTP dNTP Set, Life technologies, Maryland, USA dGTP dNTP Set, Life technologies, Maryland, USA Diaminobenzidin Sigma, St. Louis, USA Methoden und Material - 43 - Diethylpyrocarbonat Fluka, Buchs, Schweiz DNA Sigma, St. Louis, USA dNTP-Mix GeneAmp®, Perkin Elmer, Foster City, USA DTT Dithiothreit, Life technologies, Maryland, USA dTTP dNTP Set, Life technologies, Maryland, USA EDTA Sigma, St. Louis, USA Eindeckel-Substanz Entellan®, Merck, Darmstadt, Deutschland Einmal-Pipettenspitzen Safe-Seal-Tips®, Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland Ethidiumbromid Sigma, St. Louis, USA Falcon®-Reaktionsgefässe Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Faltenfilter Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland Farbdiafilm Scotchchrome ISO 640T/29°, Imation, Segrate, USA Ficoll Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK Filterpapier Whatman, Maidstone, UK First Strand Puffer Life technologies, Maryland, USA Formaldehyd 37% Merck, Darmstadt, Deutschland Formamid deionisiert Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Glucose Sigma, St. Louis, USA H2 O2 30% Fluka, Buchs, Schweiz Hämatoxylin- Lösung Hematoxylin Solution Gill No 2, Sigma, St. Louis, USA HCl Merck, Darmstadt, Deutschland Methoden und Material - 44 - HiSpeed Plasmid Midi Kit Quiagen, Valencia, USA Insulin Actrapid HM U500, Novo Nordisk, Mainz, Deutschland Insulinpumpen 2ML2, 2ML4, Charles River Wiga, Sulzfeld, Deutschland Isopropylalkohol Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Deutschland Kanülen Microlance3®, Becton Dickinson, Drogheda, Irland Ketamin WDT, Garben, Deutschland Ladepuffer 6x Loading Dye, Promega, Madison, USA Laminin Staining Kit Sigma, St. Louis, USA Längenstandard DNA Molecular Weight Marker III, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland Längenstandard PhiX174 DNA/Hinf I Markers, Promega, Madison, USA MgCl2 Merck, Darmstadt, Deutschland MgSO4 Sigma, St. Louis, USA MOPS 3-(N-Morpholino)-Propan-Sulfonsäure, Sigma, St. Louis, USA NaCl fest Merck, Darmstadt, Deutschland NaCl-Lösung 0,9% B. Braun, Melsungen, Deutschland NaH2 PO4 Merck, Darmstadt, Deutschland NaOH Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumacetat-Trihydrat Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumcitrat-Dihydrat Merck, Darmstadt, Deutschland Nick®-Säule Sephadex® G-50, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK Normales Schweine Serum Dako, Glostrup, Dänemark Nylonmembran GeneScreen, NEN, Boston, USA Methoden und Material - 45 - Objektträger Super-Frost®, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland PCR Puffer GeneAmp®, Perkin Elmer, Foster City, USA PCR-Gefässe Optical-Tubes, Applied Biosystems, Foster City, USA PCR-Verschlüsse Optical-Cap-Strips, Applied Biosystems, Foster City, USA Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Phosphatgepufferte Phosphate Buffered Saline, Sigma, St. Louis, USA Waschlösung Phosphatgepufferte Phosphate Buffered Saline with Tween, Sigma, St. Louis, USA Waschlösung mit Tween Plastikfolie Goldhand, Düsseldorf, Deutschland Polaroid-Film Polaroid ISO 3000 / 36°, St. Albans, UK Polyvinylpyrolidon Sigma, St. Louis, USA Primer für cDNA-Sonden Biotez, Berlin, Deutschland QUIAEX II®-DNA- Qiagen, Valencia, USA Extraktions-Kit Random Primed DNA Boehringer, Mannheim, Deutschland Labeling Kit Random Primer Roche, Mannheim, Deutschland Rattenfutter RMH-B, Hope Farms, Woerden, Niederlande Reaktionsgefässe 1,5 ml Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Reaktionsge fässe 2 ml Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland Restriktionsendonukleasen Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland Kpn I, Xba I Restriktionspuffer H Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland Methoden und Material - 46 - Restriktionspuffer L Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland Reverse Transkriptase Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptase, Life technologies, Maryland, USA Röntgenfilm XAR-5, Eastman Kodak, Rochester, USA ROX-Standard TIB Molbiol, Berlin, Deutschland SDS Natriumdodecylsulfat, Sigma, St. Louis, USA Skalpell Feather Nr. 21, PFM, Köln, Deutschland SuperScript One-Step RT- Life technologies, Maryland, USA PCR Kit TaqMan-Primer MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland TaqMan-Sonden MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland TaqPolymerase AmpliTaq Gold ®-Polymerase, Perkin Elmer, Foster City, USA Tissue-Tek® Sekura, Finetek Europe BV, Niederlande Tris-HCl USB, Cleveland, USA Trizol® Life technologies, Maryland, USA Tryptone Sigma, St. Louis, USA Ultrazentrifugenröhrchen Nalgene, Rochester, USA Versuchstiere Genetic Models, Indianapolis, USA Xylazin Rompun®, Bayer, Leverkusen, Deutschland Xylol Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Deutschland Yeast Extract Sigma, St. Louis, USA Zellstoff Pehazell®, Hartmann, Heidenheim, Deutschland Methoden und Material - 47 - 2.12 Lösungen und Inhaltsstoffe Anti-Collagen I-Lösung Goat Anti-Type I Collagen einer Ausgangskonzentration von 0,4 g/l in 1,5% NSS in PBS im Verhältnis 1 : 20 Anti-Fibronectin- Lösung Anti-Fibronectin einer Ausgangskonzentration von 0,1 g/l in 1,5% NSS in Tween-PBS im Verhältnis 1 : 10 DAB-Lösung 50% 3,3’-Diaminobenzidin in PBS-Lösung, gefiltert Denhardt’s Reagenz 50x 5% Ficoll, 5% Polyvinylpyrolidon, 5% Anti-Bovines Serum Albumin DEPC-Wasser 0,1% Diethylpyrocarbonat-Reagenz in deionisiertem Wasser, 18 h bei Raumtemperatur inkubiert, autoklaviert dNTP-Mix 2mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP First Strand Puffer 5x 250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 , pH 8,3 H2 O2 0,3% in PBS 0,3% H2 O2 in PBS-Lösung H2 O2 1% in PBS 1% H2 O2 in PBS-Lösung Hematoxylin Solution Gill 4 g/l Hämatoxylin, 35,2 g/l Aluminiumsulfat, 0,4 g/l No 2 Natriumiodat Hybridisierungs-Lösung 50% deionisiertes Formamid, 5x Denhardt’s Reagenz, 0,5 mg/ml denaturierte DNA aus Lachs- Testes, 5x SSC, 50 mM NaH2 PO4 , 1% Sodium-dodecyl-sulfat, pH 8,0 MOPS 1x 0,02 M 3-(N-Morpholino)-Propan-Sulfonsäure, 5 mM Natriumacetat-Trihydrat, 1 mM EDTA, pH 7,0, autoklaviert NSS 10% in PBS 10% Normales Schweine Serum in PBS-Lösung PBS-Lösung 10 g Phosphate Buffered Saline gelöst in 1 l deionisiertem Wasser entsprechend 0,01 M Na2 HPO4 , 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, pH 7,4 Methoden und Material - 48 - PCR Puffer 10x 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3 Puffer H 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithioerythrit, pH 7,5 Puffer L 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithioerythrit, 100 µg/ml Rinderserumalbumin, pH 7,5 Puffer P1 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A, pH 8,0 Puffer P2 200 mM NaOH, 1% SDS Puffer P3 3 M Natrium-Acetat, pH 5,5 Puffer QBT 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, 15% Isopropylalkohol, 0,15% Triton® X-100, pH 7,0 Puffer QC 1 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% Isopropylalkohol, pH 7,0 Puffer QF 1,25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 15% Isopropylalkohol, pH 8,5 Rabbit-Anti-Goat-Lösung Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Goat Immunoglobulins einer Ausgangskonzentration von 1,3 g/l in 1,5% NSS in PBS im Verhältnis 1 : 200 Rabbit-Anti-Mouse-Lösung Peroxidase-Conjugated Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins einer Ausgangskonzentration von 1,3 g/l in 1,5% NSS in Tween-PBS im Verhältnis 1 : 200 Reaction Mix 1x 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dTTP, 2,4 mM MgSO4 RMH-B Rattenfutter 19% Rohprotein, 4% Rohfett, 7% Rohasche, 6% Rohfaser, 11,9 MJ/kg umsetzbare Energie RT/Taq-Mix SuperScript II Reverse Transkriptase, hitzestabile Taq DNA Polymerase SSC 20x 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat-Dihydrat, pH 7,0, autoklaviert Methoden und Material Swine-Anti-Rabbit-Lösung - 49 - Peroxidase-Conjugated Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins einer Ausgangskonzentration von 0,24 g/l in 1,5% NSS in Tween-PBS im Verhältnis 1 : 100 TBE 1x 90 mM Tris-HCl, 2,5 mM EDTA, 90 mM Borsäure, pH 8,4 Tris-HCl-Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, autoklaviert Tween-PBS-Lösung 10 g Phosphate Buffered Saline with Tween 20 in 1 l deionisiertem Wasser entsprechend 0,01 M Na2 HPO4 , 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4 Methoden und Material - 50 - 2.13 Laborgeräte und Software Agarosegelkammer gross LMS Labortechnik, Dossenheim, Deutschland Agarosegelkammer klein B1, Owl Separation Systems, Portsmouth, USA Analysenwaage LC820, Sartorius, Göttingen, Deutschland Bildanalyse-Software analySIS Pro 2.11, SIS, Münster, Deutschland Cryotom Jung Frigocut 2800E, Leica, Bensheim, Deutschland Digitalkamera CCD Camera C5985-10, Hamamatsu, Herrsching, Deutschland Dispergiergerät Euroturrax® T25basic, IKA, Stauten, Deutschland Echtzeit-PCR-Gerät ABI Prism 7700 Sequence Detector, Perkin Elmer, Foster City, USA Einschweissgerät Krups Elektrogeräte, Solingen, Deutschland Elektrokorporationskammer MicroPulser®, Bio-Rad, Hercules, USA Elektrokorporationsküvette GenePulser®, Bio-Rad, Hercules, USA Entwickler Scopix® LR5200, Agfa-Gevaert, Mortsel, Belgien Gel- Quantity One Version 4.2.1, Bio-Rad, Hercules, USA Dokumentationssoftware Gel-Dokumentationssystem Gel-Doc 2000, Bio-Rad, Hercules, USA Glucose-Messgerät Accu-Chek® Plus, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland Heizblock BT1301, HLC, Scientific Plastics, UK Heizblock Liebisch, Bielefeld, Deutschland HPLC-Analysegerät Diamad®, Bio-Rad, Hercules, USA Hybridisierungsofen WTB Binder, Tuttlingen, Deutschland Methoden und Material - 51 - Hybridisierungsröhren Biometra, Göttingen, Deutschland Kontaminations-Monitor LB122, Bertho ld, Bad Wildbad, Deutschland Lichtmikroskop BX40F, Olympus Optical, Hamburg, Deutschland Magnetrührwerk mit MR3001, Heidolph, Kelheim, Deutschland Heizplatte Mikroküvette Hellma, Merck, Darmstadt, Deutschland Mikrowelle Privileg 9023, Quelle, Fürth, Deutschland Northern Blot- ImageQuant Version 3.3, Molecular Dynamics, Sunnyvale, Analysesoftware USA PCR-Analysesoftware ABI Prism 7700 Sequence Detection System Version 1.6, Applied Biosystems, Foster City, USA PCR-Heizblock T-Gradient-Cycler, Biometra, Göttingen, Deutschland pH-Meter Labor-pH-Meter 647, Knick, Berlin, Deutschland Photometer Lambda 2, Perkin-Elmer, Überlingen, Deutschland Pipetten Varipette® 4810, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland Puls-Detektions-System BP recorder 8005, W&W electronic AG, Basel, Schweiz Reagenzglasschüttler REAX2000, Heidolph, Kelheim, Deutschland Schüttelbad IKA, Stauten, Deutschland Spannungsquelle E835, Consort, Turnhout, Belgien Statistiksoftware SPSS Version 10.0, SPSS, Chicago, USA Szintillations- Zähler 1600TR, Canberra-Packard, Dreieich, Deutschland Ultraschallgerät Sonos 5500, Hewlett-Packard® Laboratories, Palo Alto, USA UV-Crosslinker CL-1000, UVP, Upland, USA Methoden und Material - 52 - UV-Lampe Bachhofer, Reutlingen, Deutschland Wärmebad GFL, Burgwedel, Deutschland Wasserdeionisierungsanlage Millipore, Eschborn, Deutschland Zellkulturzentrifuge Megafuge 1.0R, Heraeus, Hanau, Deutschland Zentrifuge Centrifuge 5415C, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Deutschland Ergebnisse 3 3.1 - 53 - Ergebnisse Biometrische Daten Wie in Abbildung 8 dargestellt, stieg das Körpergewicht der diabetischen Ratten über die Zeit im Vergleich zu den nichtdiabetischen Tieren konstant an. Dieses lag im Mittel um 10 – 20% höher. Gegen Ende des Versuches kam es zu einer gewissen Angleichung des Körpergewichtes. Die zusätzliche Behandlung mit Insulin ab der 13. Lebenswoche führte zu einem weiteren Anstieg des Körpergewichts. Dieser Unterschied war jedoch erst nach drei Körpergewicht [g] Wochen signifikant. 500 *# 400 * 300 200 Ctr ZDF 100 ZDF+Ins 0 5 10 15 20 Alter [Wochen] Abbildung 8 Änderung des Körpergewichts in Abhängigkeit vom Alter der Versuchstiere über einen Zeitraum von 14 Wochen. Insulin-Minipumpen wurden in Woche 13 implantiert (siehe Pfeil). Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, #: p < 0,05 vs. ZDF, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 6). Ergebnisse - 54 - Absolutes Herzgewicht [g] # 1 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 9 Absolutes Herzgewicht der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), #: p < 0,05 vs. ZDF, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 7). Das mittlere Herzgewicht lag bei den Kontrolltieren bei 1,4 + 0,04 g. Während bei den diabetischen Ratten keine Zunahme des absoluten Herzgewichtes zu verzeichnen war, führte die zusätzliche Insulinbehandlung zu einer geringen aber signifikanten Steigerung des Herzgewichtes (siehe Abbildung 9). Während die Blutzuckerspiegel in der neunten Woche in allen Gruppen normoglykämische Werte zeigten, kam es ab der zehnten Woche zu einem deutlichen Anstieg der Serumglukosekonzentrationen um das 3fache. Die zusätzliche Behandlung mit Insulin ab der 13. Woche führte zunächst zu einem Abfall auf Normwerte. Im weiteren Verlauf beobachtete man jedoch trotz Insulinbehandlung einen Anstieg der Glukosewerte (vergleiche Abbildung 10). Die langfristige Blutzuckereinstellung spiegelt sich im HbA1c-Wert wieder (siehe Abbildung 11). Der Anteil des glykosylierten Hämoglobins war bei den diabetischen Tieren um das 4fache und bei den insulintherapierten Ratten um das Doppelte erhöht. - 55 - Blutglukose [mg/dl] Ergebnisse 500 Ctr ZDF+Ins 400 ZDF *# 300 200 100 0 5 10 15 20 Alter [Wochen] Abbildung 10 Änderung des Blutzuckerspiegels in Abhängigkeit vom Alter der Versuchstiere über einen Zeitraum von 14 Wochen. Insulin-Minipumpen wurden in Woche 13 implantiert (Pfeil). Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=6), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, #: p < 0,05 vs. ZDF, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + bzw. - SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 8). 350 * HbA1c [%Ctr] 300 250 *# 200 150 100 50 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 11 Anteil glykosylierten Hämoglobins (HbA1c) in Prozent von Kontrolle (%Ctr) in Lebenswoche 19. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, #: p < 0,05 vs. ZDF, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) bezogen auf Kontrolle (100%) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 9). Ergebnisse - 56 - Die Plasma-C-Peptid-Werte, als Mass für die endogene Insulinsekretion, waren bei den diabetischen Tieren (Hyperinsulinämie) erhöht, auch wenn der Wert aufgrund der kleinen Fallzahl keine statistische Signifikanz erreicht (siehe Abbildung 12). Plasma C-Peptid [pM] 1000 750 500 250 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 12 Plasma C-Peptid-Werte im Serum der 19 Wochen alten Ratten. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=5), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 10). Wie in Abbildung 13 A gezeigt, war die durchschnittliche Herzfrequenz in Ruhe bei den diabetischen Tieren um ca. 15% niedriger als bei den nichtdiabetischen Kontrolltieren. Demgegenüber war der systolische Blutdruck bei den diabetischen Tieren, die mit Insulin behandelt wurden, um etwa 10 mmHg niedriger als bei den anderen beiden Versuchsgruppen (siehe Abbildung 13 B). Ergebnisse - 57 - A Herzfrequenz [1/min] 500 * * ZDF ZDF+Ins 400 300 200 100 0 Ctr Systolischer Blutdruck [mmHg] B 150 * 100 50 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 13 A Herzfrequenz der Tiere im Alter von 18 Wochen. B Systolischer Blutdruck der Tiere im Alter von 18 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 11 und Tabelle 12). 3.2 Echokardiographie Um die kardiale Funktion in vivo evaluieren zu können, wurde am Ende der Studie eine echokardiographische Untersuchung durchgeführt. Der innere diastolische Diameter des linken Ventrikels (IDD), der bei einer Vergrösserung Hinweis auf eine kardiale Dilatation ist, blieb in allen drei Gruppen unverändert (siehe Abbildung 14). Die interventrikuläre diastolische Septumdicke (IVSD) als Ausdruck einer kardialen Hypertrophie zeigte einen signifikanten Anstieg in der insulinbehandelten Gruppe von etwa 17%, jedoch nicht im Vergleich zu den unbehandelten Tieren (siehe Abbildung 15). - 58 - Innerer linksventrikulärer diastolischer Diameter [mm] Ergebnisse 8 6 4 2 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 14 Innerer linksventrikulärer Durchmesser im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle Interventrikuläre diastolische Septumdicke [mm] 13). * 2 1 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 15 Interventrikuläre diastolische Septumdicke im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 14). Der gleiche Trend zeichnete sich für die relative linksventrikuläre Wanddicke (RLVWT) und die linksventrikuläre Masse (LVM) ab, obgleich hier keine statistische Signifikanz erreicht wurde (siehe Abbildung 16 und Abbildung 17). Wohingegen die Verkürzungsfraktion (FS) als Indikator der linksventrikulären systolischen Funktion, wie dargestellt in Abbildung 18, Ergebnisse - 59 - bei den mit Insulin behandelten diabetischen Tieren im Vergleich zu den nicht-diabetischen Kontrollen signifikant erhöht waren. Relative linksventriluläre Wandstärke 0.6 0.4 0.2 0.0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 16 Relative Linksventrikuläre Wanddicke im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle Linksventrikuläre Masse [mg] 15). 1000 800 600 400 200 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 17 Linksventrikuläre Masse im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 16). Ergebnisse - 60 - * Verkürzungsfraktion [%] 60 40 20 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 18 Verkürzungsfraktion im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 17). Bezieht man jedoch die linksventrikuläre Masse auf das Körpergewicht der Tiere, so ergibt sich aufgrund des deutlich erhöhten Körpergewichts der diabetischen Versuchstiere kein Linksventrikulärer Masse-Index Unterschied mehr (siehe Abbildung 19). 2 1 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 19 Linksventrikulärer Masse-Index im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 18). Ergebnisse 3.3 - 61 - Morphometrie Zunächst sollte die Grössenveränderung einzelner Herzmuskelzellen untersucht werden, um deren funktionelle Auswirkung besser beschreiben zu können. Die morphometrische Bestimmung des Volumens einzelner Kardiomyozyten zeigte eine annähernde Verdoppelung des Zellvolumens in den diabetischen Gruppen (siehe Abbildung 20). Während die Zellänge in allen Gruppen annähernd gleich war (siehe Abbildung 21 A), beruhte dieser Effekt insbesondere auf einer Zunahme des Zellquerschnittes (Abbildung 21 B). A Kardiomyozytenvolumen [nl] B 400 * * ZDF ZDF+Ins 300 200 100 0 Ctr Abbildung 20 A Immunhistologische P räparate gefärbt mit Antikörper gegen Laminin (dunkle Farbpigmentierung) in 400facher Vergrösserung. B Durchschnittliches Volumen der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 50 Messungen pro Gesichtsfeld bei insgesamt 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=4), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=4), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 19). Ergebnisse - 62 - Länge der Kardiomyozyten [µm] A 100 50 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Durchmesser der Kardiomyozyten [µm] B * * ZDF ZDF+Ins 20 10 0 Ctr Abbildung 21 A Durchschnittliche Länge der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. B Mittlerer Durchmesser der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 50 Messungen pro Gesichtsfeld bei insgesamt 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 20 und Tabelle 21). Interessanterweise korreliert der Myozytendurchmesser signifikant mit dem HbA1c-Wert, was möglicherweise für einen Zusammenhang zwischen Zellgrösse und langfristiger Blutzucker-Einstellung spricht (siehe Abbildung 22). Ergebnisse - 63 - Durchmesser der Kardiomyozyten [µm] 30 20 10 0 0 100 200 300 400 HbA1c [%Ctr] Abbildung 22 Signifikante Korrelation zwischen dem Durchmesser der Kardiomyozyten und dem HbA1c-Wert (bezogen auf Prozent Kontrolle), n=19: Korrelationskoeffizient nach Pearson r=0,6306 bei p=0,004. Ergebnisse 3.4 - 64 - Extrazelluläre Matrix In der vorliegenden Arbeit wurden wichtige Bestandteile der extrazellulären Matrix auf quantitative Veränderungen hin untersucht. Dabei zeigten sich folgende wichtige Befunde: die perizelluläre Dicke der Lamininschicht war bei den diabetischen Ratten signifikant erhöht. Die zusätzliche Behandlung mit Insulin hatte keinen weiteren Effekt auf die Lamininschichtdicke (siehe Abbildung 23). A B * * ZDF ZDF+Ins Laminin [µm] 2 1 0 Ctr Abbildung 23 A Immunhistologische Präparate gefärbt mit Antikörper gegen Laminin (dunkle Farbpigmentierung) in 400facher Vergrösserung. B Durchschnittliche Lamininschichtdicke um die Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 50 Messungen pro Gesichtsfeld bei insgesamt 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 22). Ergebnisse - 65 - Demgegenüber zeigten sich keine Unterschiede im linksventrikulären Gehalt von Fibronectin oder Collagen I (vergleiche Abbildung 24 und Abbildung 25). Um mögliche Unterschiede in der Expression von Collagen I als Matrixextrazellulärprotein bei fibrotischen Umbauvorgängen im Herzen zu untersuchen, wurde zusätzlich die mRNA-Expression mittels quantitativer PCR bestimmt. Auch hier ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen, wie in Abbildung 26 dargestellt. A Anteil an Fibronectin [% Gesamtfläche] B 4 3 2 1 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 24 A Immunhistologische Präparate gefärbt mit Antikörper gegen Fibronectin (dunkle Farbpigmentierung) in 200facher Vergrösserung. B Mittlerer Anteil an Fibronectin in % der Gesamtfläche nach Fibronectin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 23). Ergebnisse - 66 - A Anteil an Collagen I (interstitiell) [% Gesamtfläche] B 4 3 2 1 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 25 A Immunhistologische Präparate gefärbt mit Antikörper gegen Collagen I (dunkle Farbpigmentierung) in 200facher Vergrösserung. B Mittlerer Anteil an interstitiellem Collagen I in % der Gesamtfläche nach Collagen I-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 20 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + mRNA-Expression von Collagen I [%Ctr] SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 24). 100 50 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 26 mRNA-Expression von Collagen I (Echtzeit-PCR-Analyse), Angaben in Bezug zur Kontroll-Gruppe (%Ctr) im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ergebnisse - 67 - Ratten (n=7), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 25). Interessanterweise fielen bei der histologischen Beurteilung des linksventrikulären Gewebes Unterschiede im Ausmass der perivaskulären Fibrose mittlerer und kleiner Arterien auf. Wie in Abbildung 27 gezeigt, war die perivaskuläre Collagenfibrose bei den diabetischen Tieren signifikant erhöht. Auch hier korrelierten perivaskuläres Collagen I bzw. die Dicke der Lamininschicht um die Kardiomyozyten signifikant mit den HbA1c-Werten (siehe Abbildung 28 und Abbildung 29). A Perivaskuläres Collagen I [µm] B * * 20 10 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 27 A Immunhistologische Präparate gefärbt mit Antikörper gegen Collagen I (dunkle Farbpigmentierung) in 200facher Vergrösserung. B Mittlere perivaskuläre Fibrosierung nach Collagen I-Färbung im Alter von 19 Wochen. Durchschnitt von 20 zufällig ausgewählten Arterien. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 24). - 68 - Perivaskuläres Collagen I [µm] Ergebnisse 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 HbA1c [%Ctr] Abbildung 28 Signifikante Korrelation zwischen der Dicke des perivaskulären Collagen I und dem Anteil glykosilierten Hämoglobins (HbA1c) in Prozent Kontrolle (%Ctr) in Lebenswoche 19. n=19, Korrelationskoeffizient nach Pearson r=0,6863 bei p=0,001. Lamininschichtdicke [µm] 4 3 2 1 0 0 100 200 300 400 HbA1c [%Ctr] Abbildung 29 Signifikante Korrelation zwischen der Dicke der Lamininschicht um die Kardiomyozyten und dem Anteil glykosilierten Hämoglobins (HbA1c) in Prozent Kontrolle (%Ctr) in Lebenswoche 19. n=19: Korrelationskoeffizient nach Pearson r=0,5858 bei p=0,008. Ergebnisse 3.5 - 69 - mRNA-Expression von ANP und BNP Die natriuretischen Peptide (ANP und BNP) sind wichtige molekulare Marker der Hypertrophie des Herzens [45] und der Herzinsuffizienz [46]. A B ANP mRNA [%Ctr] * * 200 100 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 30 A Exemplarische Darstellung eines original Northern Blot von ANP. 18S: ribosomale RNA (1,9 kb). B ANP mRNA-Expression in Prozent Kontrolle (%Ctr) normalisiert auf GAPDH (Northern-Blot-Analyse) in linksventrikulärem Gewebe von diabetischen und nichtdiabetischen Versuchstieren im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), *: p < 0,05 vs. Ctr, Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 27). Ergebnisse - 70 - A BNP mRNA [%Ctr] B 100 50 0 Ctr ZDF ZDF+Ins Abbildung 31 A Exemplarische Darstellung eines original Northern Blot von BNP. 18S: ribosomale RNA (1,9 kb). B BNP mRNA-Expression in Prozent Kontrolle (%Ctr) normalisiert auf GAPDH (Northern-Blot-Analyse) in linksventrikulärem Gewebe von diabetischen und nichtdiabetischen Versuchstieren im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen (n=7), ZDF: diabetische Ratten (n=6), ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung (n=6), Werte sind angegeben in Mittelwert (MW) + SEM. Vollständige Daten siehe Anhang (Tabelle 28). Die linksventrikuläre Expression von ANP, nicht aber von BNP, war im Vergleich zu den gesunden Kontrolltieren um das Doppelte bei Versuchstieren mit Diabetes erhöht. Die zusätzliche Behandlung mit Insulin hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von ANP oder BNP (siehe Abbildung 30 und Abbildung 31). Das Expressionsniveau von ANP korrelierte positiv mit dem HbA1c-Wert (siehe Abbildung 32). Ergebnisse - 71 - ANP mRNA [%Ctr] 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 HbA1c [%Ctr] Abbildung 32 Signifikante Korrelation zwischen der linksventrikulären mRNA-Expression von ANP in Prozent Kontrolle und dem Anteil glykosilierten Hämoglobins (HbA1c) in Prozent Kontrolle in Lebenswoche 19. n=19, Korrelationskoeffizient nach Pearson r=0,6682 bei p=0,002. Diskussion 4 - 72 - Diskussion Ziel des vorliegenden Forschungsprojektes war es, die Auswirkungen des metabolischen Syndroms des Diabetes mellitus Typ 2 auf den Phänotyp am Tiermodell (Zucker diabetic fatty rats) zu untersuchen. Die hierbei erzielten Ergebnisse zeigen erstmals, dass es im Rahmen des metabolischen Syndroms zu einer signifikanten Hypertrophie der Kardiomyozyten mit einer vermehrten Expression von atrialem natriuretischem Peptid (ANP) kommt. Dies war begleitet von einer Zunahme des perivaskulären Collagens. Interessanterweise wurde trotz der zellulären Grössenzunahme kein Anstieg des Herzgewichts beobachtet. Echokardiographisch konnte eine konzentrische Hypertrophie mit gesteigerter linksventrikulärer Funktion nachgewiesen werden. Die beobachteten Veränderungen waren unabhängig vom arteriellen Blutdruck bzw. von der Aktivierung des Renin-AngiotensinAldosteron-Systems (RAAS) [47]. Eine zusätzliche Behandlung mit Insulin bewirkte eine weitere Steigerung des Körpergewichts sowie eine Zunahme des Herzgewichts. Vorangegangene klinische Daten konnten zeigen, dass eine myokardiale Dysfunktion sehr häufig in Erscheinung tritt bei Patienten mit metabolischem Syndrom, oftmals in Abwesenheit von makro- bzw. mikrovaskulären Erkrankungen, welche die Existenz einer Kardiomyopathie bedingen könnten. Die Entstehungsmechanismen für eine sich bei diesen Patienten entwickelnde Kardiomyopathie sind bislang unklar. Der Prozess, durch welchen der Herzmuskel in Bezug auf Struktur und Funktion verändert wird, wird als kardiales Remodeling bezeichnet [48]. Der zentrale Vorgang ist dabei eine Zunahme der Ventrikelmasse und eine Hypertrophie der Myozyten auf zellulärer Ebene. Zahlreiche Faktoren konnten als ursächlich für eine Kardiomyozytenhypertrophie identifiziert werden: mechanischer Stress [49], der Einfluss des sympathischen Nervensystems [50], das RAAS [23], Wachstumsfaktoren und der Einfluss inflammatorischer Zytokine [51]. Eine andere Ursache hierfür könnte auch die chronische Volumenbelastung durch die Hyperglykämie der Versuchstiere einhergehend mit Polyurie und Polydipsie sein. Inwieweit dies als additiver Faktor eine Rolle bei diesem Tierexperiment spielt ist retrospektiv nicht mehr nachvollziehbar. Wie in dieser Arbeit demonstriert, zeigen Ratten mit Diabetes mellitus eine signifikante myokardiale Hypertrophie. Die ZDF-Ratte ist charakterisiert durch eine periphere Insulin- Diskussion - 73 - Resistenz einhergehend mit initialer Hyperinsulinämie und Adipositas [52] als Folge der beschriebenen Mutation des Leptin-Rezeptors [17]. Vorangegangene Studien konnten bereits eine wichtige Eigenschaft des Insulins, die Wirkung als Wachstumsfaktor auf verschiedenste Zellen, unterstreichen [53]. Insulin realisiert seine Effekte durch einen heterotetrameren transmembranösen Protein- Tyrosinkinase-Rezeptor (Insulin- Rezeptor), welcher auch auf der Oberfläche von Kardiomyozyten exprimiert wird [54]. Aktuelle in-vitro Daten lassen vermuten, dass Insulin, über die Aktivierung seines Rezeptors, in der Lage ist, den JAK2/STAT1-Signaltransduktionsweg am Herzen zu induzieren [55]. Dieser wird in Verbindung gebracht mit proliferationsinduzierenden Signalwegen, die durch verschiedene Peptide stimuliert werden können [56]. Ein indirekter Hinweis, dass Insulin per se eine kardiale Hypertrophie fördert, stammt von transgenen Versuchsansätzen: Eine Hydrolyse des Insulinsensitiven Glukose-Transporters GLUT4 im Maus-Tiermodell führte zu einer Hyperinsulinämie, die mit kardialer Hypertrophie assoziiert war [57]. In- vitro-Experimente von Flier et al. (1986) [58] konnten zeigen, dass die Synthese der DNA von Fibroblasten und der Transport von Aminosäuren als Antwort auf physiologische und supraphysiologische Insulinkonzentration komplett gehemmt wurden durch eine Vorbehandlung mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch und direkt gegen den Rezeptor des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors (insulin like growth factor 1, IGF-1) gerichtet waren. Auf die gleiche Weise mit Insulin behandelte T-Lymphozyten zeigten einen signifikanten Proliferationsanstieg. Auch dieser Effekt wurde gefördert durch Präinkubation mit einem Antikörper gegen den IGF-1-Rezeptor [59]. Diese Erkenntnisse lassen vermuten, dass in supraphysiologischen Konzentrationen Insulin wachstumshormonähnliche Effekte über IGF1-Rezeptoren vermittelt. Experimente dieser Art wurden an isolierten Kardiomyozyten bislang noch nicht durchgeführt. Dass IGF-1 in der Lage ist, eine kardiale Hypertrophie zu erzeugen, ist bekannt. Dazu gab es bereits therapeutische Ansätze. Die Hypothese, dass eine Hyperinsulinämie an einer kardialen Hypertrophie beteiligt ist, kann durch die Ergebnisse dieser Arbeit unterstrichen werden: Nach additiver Behandlung mit Insulin kam es zu einer Zunahme das Herzgewichts. Auch die Zunahme des absoluten Protein- Gehalts der linken Ventrikel konnte in weiterführenden Studien unserer Arbeitsgruppe festgestellt werden [47]. Zusammenfassend ist es somit durchaus möglich, dass supraphysiologische Konzentrationen von Insulin, wie sie in der Anfangsphase des Typ 2 Diabetes beobachtet werden, über direkte oder indirekte Mechanismen eine kardiale Hypertrophie erzeugen können. Entsprechende Diskussion - 74 - Versuche an isolierten Kardiomyozyten fehlen bislang, sind aber Gegenstand zukünftiger Experimente. Wie bereits von Phillips et al. (1996) [17] gezeigt wurde, ist der Phänotyp der ZDF-Ratte determiniert durch eine Mutation am Leptin- Rezeptor-Gen. Es wird angenommen, dass Leptin eine zentrale Rolle in der Entwicklung der Adipositas spielt. Leptin wird hauptsächlich vom Fettgewebe sezerniert. Dann erfolgt die Stimulation des sympathischen Nervensystems und eine Reduktion des Appetites [18]. Obwohl der Leptin-Rezeptor auf Kardiomyozyten gefunden werden kann und sein Aktivierungsweg über die sogenannte Janus-Kinase (JAK), die Signaltransduktoren und -aktivatoren der Transkription (STAT) oder über mitogenaktivierte Protein-Kinasen (MAP-Kinasen) vermittelt zu sein scheint, ist die exakte funktionelle Rolle der Hyperleptinämie im Rahmen der kardialen Hypertrophie bis heute noch nicht exakt beschrieben [60]. Im Alter von 19 Wochen, in der Frühphase der diabetischen Erkrankung, konnte mittels Echokardiographie eine Steigerung der Kontraktilität erkannt werden. Der sich dahinter verbergende Mechanismus ist komplexer Natur und kann nicht durch diesen experimentellen Ansatz erklärt werden. Ein Erklärungsversuch für dieses Phänomen könnte die beschriebene Erhöhung der kontraktilen Masse sein. Auch eine Nachlastsenkung durch eine signifikante Verminderung der Renin-Angiotensin- Aktivität bei diesem Tierversuch [47] könnte eine Rolle spielen. Man kann demnach davon ausgehen, dass Insulin zu Veränderungen in der myokardialen Genexpression führt, z. B. durch Hochregulation kontraktiler Proteine, welche potentiell zu einer verbesserten Pumpfunktion führen können. Interessanterweise stehen diese Erkenntnisse in Diskrepanz zu Experimenten von Zhou et al. (2000) [61], die anhand von echokardiographischen Daten von 20 Wochen alten ZDF-Ratten eine signifikante Reduktion der Verkürzungsfraktion zeigen konnten. Obwohl der experimentelle Aufbau mit dem dieser Arbeit vergleichbar war, ist eine mögliche Ursache, dass dieser Unterschied durch die kardiodepressive Wirkung der verwendeten Anästhetika (Natriumpentobarbital) erklärbar ist. Nebenbei war auch die Kontrollgruppe in dieser Arbeit sehr klein. Ren et al. (2000) [62] untersuchten das Kontraktionsverhalten isolierter Kardiomyozyten von 14 Wochen alten ZDF-Ratten. Sie fanden dabei eine signifikante Reduktion der maximalen Verkürzung, was ein guter Indikator für eine systolische und diastolische Dysfunktion darstellt. Ob dieser Widerspruch an den dabei verwendeten nicht-diabetischen Tieren (+/fa) liegt, ist unbekannt. Diskussion - 75 - Ergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe [47] zeigen eine signifikante Reduktion der PlasmaRenin-Aktivität in den diabetischen Ratten. Durch die additive Insulintherapie blieb diese jedoch unbeeinflusst. Dies stimmt mit Daten überein, die bei normotensiven diabetischen Patienten erhoben wurden [63]. Als ursächlich hierfür wird ein arterieller Hypertonus einhergehend mit diabetischer Nephropathie und eine autonome Dysfunktion gesehen. Ausserdem wurde eine Reduktion der Reninaktivität auch bei normotensiven Diabetikern ohne Nephropathie und ohne autonome Dysfunktion beschrieben, so dass man annimmt, dass auch andere, bislang unbekannte Faktoren bei der Freisetzung von Renin eine Rolle spielen. Bei Ratten mit Streptozotocin- induziertem Diabetes und ausgeprägter Hyperglykämie ist das Plasma-Renin erheblich reduziert [64]. In diesem Experiment war der Hämatokrit der Tiere nach acht Wochen vermindert, so dass man davon ausging, dass die Hyperglykämie als Folge einer Volumenexpansion eine Reduktion der Plasma-Renin-Aktivität bewirkt. Fredersdorf et al. (2004) [47] konnten bei den ZDF-Tieren eine signifikante inverse Korrelation zwischen den Blutzuckerwerten und der Plasma-Renin-Aktivität finden. Zu diskutieren ist auch eine mangelnde Stimulation des Sympathikus über den (defekten) Leptin-Rezeptor. Die erhöhte Expression von mRNA natriuretischer Peptide (ANP und BNP) wird als indirekter Marker für eine kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz gesehen. Als wichtigstes natriuretisches Hormon wird ANP in den Vorhofzellen gebildet und gespeichert, die Freisetzung erfolgt aufgrund einer Vorhofdehnung [65]. Steigt bei der Herzinsuffizienz der Füllungsdruck in den Vorhöfen, wird ANP sezerniert, bei schwerer Herzinsuffizienz versucht der Organismus die überschiessende Volumenbelastung dadurch zu vermindern, dass auch in den Herzkammern ANP gebildet wird [66]. Die unterschiedliche Expression von ANP und BNP in dieser Arbeit lässt vermuten, dass die Genexpression von BNP in der diabetischen Stoffwechsellage anders reguliert wird als die von ANP. Eine nicht gleiche Expression dieser beiden Peptide wurde bereits in anderen Modellen der experimentellen Herzinsuffizienz gefunden. Langenickel et al. (2000) [67] zeigten, dass eine Induktion von kleinen aorto-cavalen Gefässverbindungen in Ratten zu einem etwa 50%igen Anstieg im totalen Herzgewicht einhergehend mit chronischer Volumenüberladung ohne klinische Zeichen einer Herzinsuffizienz führt. Bei diesen Experimenten war die kardiale Hypertrophie begleitet von einem signifikanten Anstieg myokardialer ANP-Werte ohne BNPVeränderungen, während Tiere mit grossen Gefäss-Shunts und den klinischen Zeichen einer manifesten Herzinsuffizienz schon einen Anstieg in der Expression von BNP aufwiesen. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass die myokardiale ANP-Expression weniger Diskussion - 76 - beeinflusst wird von der Schwere der Herzinsuffizienz und bereits schon im Stadium der kompensierten Herzinsuffizienz, dann, wenn die Hypertrophie beginnt, induziert wird, während der enddiastolische Druck noch normal ist. Auch die Regulation von ANP und BNP auf molekularer Ebene ist unterschiedlich. Die regulativen Bereiche der proximalen PromoterRegion beider Gene besitzen nur eine 50%ige Sequenzhomologie [68], wobei man eine unterschiedliche Genexpression im Rahmen der diabetischen Stoffwechsellage annimmt. Es ist anzunehmen, dass durch die durch Hyperglykämie entstandene Volumenexpansion ANP aus dem Grund vermehrt gebildet wird, um einer Wasserretention entgegenzuwirken, um die physiologische Volumenhämostase wieder herzustellen. Dies bestätigt sich durch ein Ergebnis dieser Arbeit, nämlich dass die myokardiale ANP-Expression gut korreliert mit den HbA1c-Werten. Die ZDF-Ratten weisen eine signifikante perivaskuläre Fibrose auf, so wie dies an Herzen diabetischer Patienten bereits beobachtet wurde. Ausserdem beobachteten wir vermehrtes perizelluläres Laminin bei den diabetischen Tieren. Beide Veränderungen wurden auch bei den OLETF-Ratten gefunden [15] und wurden nicht durch eine Insulintherapie beeinflusst. Obwohl der exakte Mechanismus für dieses Phänomen noch unklar ist, so könnte der Wachstumsfaktor TGF-b1 ein vielversprechender Kandidat hierfür sein. Dieser wird mit einer sich entwickelnden Gewebefibrose in Zusammenhang gebracht, die durch extrazelluläre Matrixproteine stimuliert wird. Untersuchungen an der OLETF-Ratte konnten eine Hochregulation des kardialen TGF-b1 schon bereits im Zustand der pathologischen Glukoseutilisation, ca. 14 Wochen vor Ausbildung des Diabetes mellitus zeigen. Die Werte blieben dann auch erhöht, als die Tiere für einen Zeitraum über 54 Wochen insulinabhängig wurden. Diese Tiere bildeten dann auch im Alter von 30 Wochen eine signifikante perivaskuläre Fibrose aus, ohne dass eine interstitielle Bindegewebsvermehrung erkennbar war [15]. Dies führte zu der Vermutung, dass TGF-b1 das kardiale Remodeling im Rahmen der diabetischen Kardiomyopathie beeinflussen kann. Deswegen ist es sicherlich notwendig, weiterführende Untersuchungen bezüglich der funktionellen Wirkung von TGF-b1 im Rahmen der diabetischen Kardiomyopathie durchzuführen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass myokardiale Veränderungen im Tiermodell des metabolischen Syndroms durch die Ausbildung eines Diabetes mellitus verursacht sind. Dadurch kommt es zur Entwicklung einer kompensierten konzentrischen Hypertrophie des Herzens mit erhöhter Kontraktilität, unabhängig von Veränderungen der hämodynamischen Diskussion Eigenschaften. - 77 - Desweiteren entwickeln die Versuchstiere eine deutliche Kardiomyozytenhypertrophie. Zudem mit einer verstärkten Ausbildung einer perivaskulären Fibrosierung ohne Veränderung des interstitiellen Collagen-Gehaltes und einer Abnahme der Serumaktivität von Renin. Eine zusätzliche Behandlung mit Insulin scheint die Antwort mittels kardialer Hypertrophie noch zu verstärken. Diese Arbeit beschreibt somit erstmals die funktionellen und morphologischen Veränderungen am Herzen im frühen Stadium des Typ 2 Diabetes bei ZDF-Ratten. Anhang 5 5.1 - 78 - Anhang Ergebnistabellen Gruppe n MW (g) SEM p vs. Ctr Ctr 7 342 11 ZDF 7 379 8 0,018 ZDF+Ins 6 466 26 0,003 p vs. ZDF 0,019 Tabelle 6 Körpergewicht der Versuchstiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (g) SEM p vs. Ctr Ctr 7 1,4 0,04 ZDF 7 1,3 0,05 0,360 ZDF+Ins 6 1,5 0,06 0,144 p vs. ZDF 0,045 Tabelle 7 Absolutes Herzgewicht der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (mg/dl) SEM p vs. Ctr Ctr 6 89,3 13,7 ZDF 7 379,4 15,9 < 0,001 ZDF+Ins 6 205,8 68,4 0,126 p vs. ZDF 0,022 Tabelle 8 Blutzuckerspiegel der Versuchstiere im Alter von 19 Wochen. Insulin-Minipumpen wurden in Woche 13 implantiert. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang - 79 - Gruppe n MW (%Ctr) SEM (%) p vs. Ctr Ctr 7 100 4 ZDF 6 301 12 < 0,001 ZDF+Ins 6 179 19 0,001 p vs. ZDF < 0,001 Tabelle 9 Anteil glykosylierten Hämoglobins (HbA1c) in Prozent Kontrolle in Lebenswoche 19. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (pM) SEM p vs. Ctr Ctr 7 650 101 ZDF 6 913 65 0,059 ZDF+Ins 5 639 162 0,952 p vs. ZDF 0,128 Tabelle 10 Plasma C-Peptid-Werte im Serum der 19 Wochen alten Ratten. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (1/min) SEM p vs. Ctr Ctr 7 483 4 ZDF 7 416 13 < 0,001 ZDF+Ins 6 421 18 0,005 p vs. ZDF 0,818 Tabelle 11 Herzfrequenz der Tiere im Alter von 18 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (mmHg) SEM p vs. Ctr Ctr 7 135 3 ZDF 7 134 4 0,762 ZDF+Ins 6 125 3 0,032 p vs. ZDF 0,092 Tabelle 12 Systolischer Blutdruck der Tiere im Alter von 18 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang - 80 - Gruppe n MW (mm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 7,6 0,15 ZDF 7 7,7 0,23 0,749 ZDF+Ins 6 7,3 0,25 0,378 p vs. ZDF 0,329 Tabelle 13 Innerer linksventrikulärer Durchmesser nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (mm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 0,186 0,008 ZDF 7 0,179 0,010 0,624 ZDF+Ins 6 0,200 0,008 0,201 p vs. ZDF 0,126 Tabelle 14 Interventrikuläre diastolische Septumdicke nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (mm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 0,46 0,03 ZDF 7 0,47 0,04 0,998 ZDF+Ins 6 0,54 0,03 0,091 p vs. ZDF 0,157 Tabelle 15 Relative linksventrikuläre Wanddicke nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (mg) SEM p vs. Ctr Ctr 7 857 54 ZDF 7 941 68 0,352 ZDF+Ins 6 1.012 71 0,106 p vs. ZDF 0,485 Tabelle 16 Linksventrikuläre Masse nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang - 81 - Gruppe n MW (%) SEM p vs. Ctr Ctr 7 47 2,1 ZDF 7 53 1,9 0,054 ZDF+Ins 6 55 2,4 0,029 p vs. ZDF 0,541 Tabelle 17 Verkürzungsfraktion nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW SEM p vs. Ctr Ctr 7 2,4 0,10 ZDF 7 2,3 0,12 0,703 ZDF+Ins 6 2,1 0,10 0,059 p vs. ZDF 0,266 Tabelle 18 Linksventrikulärer Masse-Index nach Echokardiographie der Tiere im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (nl) SEM p vs. Ctr Ctr 4 155 5 ZDF 6 352 42 0,005 ZDF+Ins 4 370 43 0,002 p vs. ZDF 0,779 Tabelle 19 Durchschnittliches Volumen der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (µm) SEM p vs. Ctr Ctr 4 107 2 ZDF 6 108 6 0,932 ZDF+Ins 4 106 2 0,817 p vs. ZDF 0,856 Tabelle 20 Durchschnittliche Länge der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang - 82 - Gruppe n MW (µm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 14 0,3 ZDF 7 21 0,9 < 0,001 ZDF+Ins 6 21 0,8 < 0,001 p vs. ZDF 0,792 Tabelle 21 Mittlerer Durchmesser der Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (µm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 1,6 0,1 ZDF 7 2,2 0,16 0,005 ZDF+Ins 6 2,3 0,15 0,003 p vs. ZDF 0,842 Tabelle 22 Durchschnittliche Lamininschichtdicke um die Kardiomyozyten nach Laminin-Färbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (%) SEM p vs. Ctr Ctr 7 4,2 0,3 ZDF 7 3,9 0,2 0,443 ZDF+Ins 6 3,7 0,3 0,278 p vs. ZDF 0,591 Tabelle 23 Mittlerer Anteil an Fibronectin in % der Gesamtfläche nach Fibronectin-Färbung im Alter von 19 Wochen Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (%) SEM p vs. Ctr Ctr 7 2,7 0,5 ZDF 7 3,4 0,3 0,274 ZDF+Ins 6 3,4 0,4 0,317 p vs. ZDF 0,996 Tabelle 24 Mittlerer Anteil an interstitiellem Collagen I in % der Gesamtfläche nach Collagen IFärbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang - 83 - Gruppe n MW (%Ctr) SEM p vs. Ctr Ctr 7 100,0 15 ZDF 7 79,9 27 0,533 ZDF+Ins 6 80,6 46 0,679 p vs. ZDF 0,990 Tabelle 25 mRNA-Expression von Collagen I (Echtzeit-PCR-Analyse), Angaben in Bezug zur KontrollGruppe (%Ctr) im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (µm) SEM p vs. Ctr Ctr 7 13 1,4 ZDF 6 23 1,7 0,002 ZDF+Ins 6 21 0,9 < 0,001 p vs. ZDF 0,526 Tabelle 26 Mittlere perivaskuläre Fibrosierung nach Collagen I-Färbung im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (%Ctr) SEM p vs. Ctr Ctr 7 100 6 ZDF 7 204 42 0,031 ZDF+Ins 6 190 36 0,021 p vs. ZDF 0,805 Tabelle 27 ANP mRNA-Expression in Prozent Kontrolle (%Ctr) normalisiert auf GAPDH (NorthernBlot-Analyse) in linksventrikulärem Gewebe von diabetischen und nichtdiabetischen Versuchstieren im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Gruppe n MW (%Ctr) SEM p vs. Ctr Ctr 7 100 9 ZDF 7 115 19 0,497 ZDF+Ins 6 92 15 0,635 p vs. ZDF 0,379 Tabelle 28 BNP mRNA-Expression in Prozent Kontrolle (%Ctr) normalisiert auf GAPDH (NorthernBlot-Analyse) in linksventrikulärem Gewebe von diabetischen und nichtdiabetischen Versuchstieren im Alter von 19 Wochen. Ctr: unbehandelte Kontrollen, ZDF: diabetische Ratten, ZDF+Ins: diabetische Tiere mit Insulinbehandlung. Anhang 5.2 1 - 84 - Literaturverzeichnis Ferrannini E (1987) Insulin resistance in essential hypertension. 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OPf. 1979 – 1983 Grundschule am Schiessstättenweg in Neumarkt 1983 – 1992 Willibald-Gluck-Gymnasium Neumarkt mit Abschluss Abitur 1995 – 2003 Studium der Humanmedizin an der Universität Regensburg April 2003 Ärztliche Prüfung Oktober 2004 Approbation Juni 2003 – Dezember 2004 Arzt im Praktikum bzw. Assistenzarzt am Klinikum der Universität Regensburg bei Prof. Dr. Riegger Seit Januar 2005 Assistenzarzt am Klinikum St. Marien Amberg bei Prof. Dr. Groß Anhang - 93 - Danksagung Frau Dr. FREDERSDORF gilt mein besonderer Dank für die jederzeit vorbildliche leitende Betreuung der Arbeit. Herrn Prof. Dr. RIEGGER danke ich für die Möglichkeit, die Einrichtungen seines Labors zu benutzen. Herrn Prof. Dr. HOLMER gilt mein Dank für die Vergabe des Themas der Dissertation. Frau LABERER und Herrn SIMON danke ich für die Einführung in das molekularbiologische Arbeiten und vor allem für Ihre Hilfsbereitschaft zu jedem Zeitpunkt der Arbeit. Herrn Prof. Dr. ESCHENHAGEN danke ich für die grosszügige Möglichkeit, die Einrichtungen seines Labors zu benutzen und Herrn Dr. ZIMMERMANN für die Einführung und Anleitung der Techniken der TaqMan-PCR. Frau Dr. ERDMANN danke ich für die zahlreichen Tipps und Tricks im täglichen Laborbetrieb und vor allem für die Hilfestellung bei der Anwendung der PCR-Techniken. Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei Herrn PD Dr. WEIL für seine jederzeit ausgezeichnete, engagierte und vor allem freundschaftliche Betreuung in allen Phasen der Arbeit bedanken. Ohne seine kompetente und konstruktive Kritik und seine ausserordentliche Geduld hätte die Arbeit nur halb so viel Spass gemacht. Anhang - 94 - Publikationen Ein Teil der Ergebnisse dieser Arbeit wurde bereits wir folgt publiziert: Postervorstellung bei der Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie in Mainz im März 2001 (Naunyn Smiedeberg´s Arch Pharmacol 2001; 363:R413): ALTERATIONS IN MYOCARDIAL FUNCTION AND STRUCTURE IN A RAT MODEL OF NON-INSULIN DEPENDENT DIABETES MELLITUS (NIDDM) C. Thumann, S. Fredersdorf, A. Luchner, E. P. Kromer, J. Weil NIDDM is associated with the development of cardiomyopathy, which is independent of the myocardial disease produced by coronary atherosclerosis. Albeit several biochemical and metabolic defects have been observed in the diabetic heart, little is known about alterations in myocardial function and extracellular matrix proteins (ECM). Using an animal model for genetically determined IDDM (4.5 month old Zucker diabetic fat rats (ZDF) treated with or without continuous insulin (Ins) 25-75 IU/kg/d) we investigated left ventricular (LV) function by echocardiography (E) and alterations of ECM by quantitative immunhistochemistry (I). Furthermore, myocardial gene expression was measured by real time quantitative PCR. Zucker lean rats (ZDL) served as controls. Results (Mean+SEM; n=7 in each group; *p<0.05 vs. ZDL, #p<0.05 vs. ZDF ; Student’s t-Test): ZDL ZDF ZDF + Ins Body weight (g) 342+11 380+8* 466+26* # Heart weight (g) 1.4+0.04 1.34+0.05 1.5+0.06# Serum glucose (mg/dl) 96+7 478+26* 252+73* # Fraction of shortening (E;%) 47+2.1 53+1.9 55+2.4* Rel. wall thickness (E) 0.46+0.03 0.47+0.06 0.54+0.03. Cardiomyocyte diameter (I; µm) 14+0.4 20+1.1* 21+0.8* Perivascular collagen I (I; µm) 13+1.4 21+2.5* 21+0.9* Laminin (I; µm) 1.5+0.11 2.2+0.15* 2.3+0.15* TGF-b (PCR; CT-value) 26+0.2 26+0.3 28+0.1* Collagen I (PCR; CT-value) 18+0.2 18+0.3 17+0.5 Interstitial collagen I and fibronectin were not different between the groups. Conclusion: (1) These data suggest that early stages of IDDM are associated with hypertrophy of LV and specific changes in cardiac ECM. Additional insulin treatment seems to enhance these effects. (2) The ZDF rat is a useful model to study mechanisms of alterations in cardiac function and changes in gene expression in NIDDM. Anhang - 95 - Anhang - 96 - Postervorstellung bei der 68. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie Herz- und Kreislaufforschung im April 2002 in Mannheim: Veränderung der myokardialen Expression Calcium-regulierender Proteine beim Typ II Diabetes. S.Fredersdorf, Chr.Thumann, R.Vetter, G.Riegger, J.Weil Klinische und experimentelle Daten weisen darauf hin, daß ein Diabetes mellitus (DM) ein unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung einer chronische Herzinsuffizienz ist. Die Ursache hierfür ist unbekannt. Die Herzinsuffizienz ist unter anderem charakterisiert durch Störung des sarkoplasmatischen Calciumtransportes mit einer Abnahme der Ca++-ATPase (SERCA) sowie von Phospholamban (PLB). Über Veränderungen dieser für die Kontraktion wichtigen Proteine beim DM ist bislang wenig bekannt. Deshalb untersuchten wir (a) die Expression (Northern blot) von SERCA und PLB bei Ratten mit einem Typ II DM (Zucker diabetic fatty rat; ZDF) im Vergleich zu Kontrolltieren (ZDL), (b) die Auswirkung einer zusätzlichen Insulinbehandlung (ZDF+I), (c) die Ejektionsfraktion (echokardiographisch; EF); (d) die Oxalat-unterstützte Calciumtransportrate (CaTrans in µmol Ca++/g Feuchtgewicht/min) in Homogenaten von linksventrikulärem Myokard. KG (g) SERCA (OD) PLB (OD) EF (%) CaTrans ZDL (n=7) 353±11 0,59±0,04 2,8±0,06 85±2 1,58±0,1 ZDF (n=7) 402±9* 0,87±0,11* 2,1±0,27* 90±1* 1,85±0,06* ZDF+I (n=6) 478±25*# 1,26±0,05*# 2,2±0,21* 91±1* 2,03±0,1* Mittelwerte±SEM; KG=Körpergewicht; OD=optische Dichte; *p<0,05 vs ZDL; #p<0,05 vs ZDF+I Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen SERCA und CaTrans. Auch auf Proteinebene zeigt sich bei diabetischen Tieren eine signifikante Zunahme der SERCA Expression. Durch die Zunahme von SERCA bzw. die Abnahme von PLB kommt es zu einer erhöhten Calciumtransportrate im Herzen. Diese ist mit einer Zunahme der EF verbunden. Langfristig könnte der damit verbundene erhöhte Energieverbrauch des Herzens zum klinischen Bild der diabetischen Kardiomyopathie beitragen. Anhang - 97 - Postervorstellung beim 75. Kongress der American Heart Association im November 2002 in Chicago / Illinois (USA): Nitric Oxide and Apoptosis in Heart Failure Diabetic Cardiomyopathy (DC) Is Associated with Induction of Pro-Apoptotic Proteins and Can Be Reversed by Insulin Treatment in an Animal Model of Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM) Sabine A Fredersdorf, Univ of Regensburg, Regensburg, Germany; Christian Thumann, Univ of Regensburg, Regensburg, MD; Joachim Weil, Univ of Regensburg, Regensburg, GERMANY Clinical data have shown that diabetes mellitus promotes the development of chronic heart failure independently of marcro- or microvascular disease. The precise mechanism, however, leading to DC is largely unknown. We hypothesised that programmed cell death may play a role. Therefore, we investigated cardiac tissue from rats (age 19 weeks) with a genetically determined NIDDM (Zucker Diabetes Fatty rats; ZDF, n=7). Non-diabetic lean rats served as controls (ZDL, n=7). To study the influence of insulin treatment (ZDF + I, n=7), osmotic minipumps were subcutaneously implanted (at 13 weeks). Pro-and antiapoptotic proteins were determined by western blotting. Cardiomyocyte volumes were measured by quantitative morphometry. Results: As expected, blood glucose (477±26* vs. 96±7 mg/dl), HbA1c (1.9±0.08*vs. 0.6±0.03%) and body weight (402±9* vs. 352±11) were higher in ZDF rats compared to ZDL rats. By contrast, total heart weights (1.4±0.04 vs. 1.3±0.05) were similar in both groups, although cardiomyocyte volume was more than two fold higher in ZDF (35200±4* vs. 3 15400±0.5 µm , indicating that total cell number in ZDF rat hearts was markedly decreased. There was a significant increase in bax (197±21 vs. 305±14* arbitrary units) and caspase-3 expression (1701±532 vs. 4833±764* arbitrary units) in ZDF rats with no change in bcl-2. Insulin treatment further increased body weight (478±25 g) and decreased blood glucose (252±73 mg/dl) as well as HbA1c (1.1±0.12%) compared to non-treated animals. Total heart weight was significantly higher compared to non-treated ZDF. Most importantly, insulin treatment lead to a decrease of myocardial bax and caspase-3 expression to almost normal values whereas cardiomyocyte volume remained increased compared to ZDL. Conclusion: Early stages of NIDDM are associated with cardiac hypertrophy without increase in total heart wight but with an up-regulation of pro-apoptotic proteins in the heart. This suggests that one underlying mechanism of DC is programmed cell death. Treatment with insulin may reduce the number of apoptotic myocytes. Anhang - 98 - Postervorstellung bei der 69. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie Herz- und Kreislaufforschung im April 2003 in Mannheim: Induktion proapoptotischer Proteine am Herzen bei diabetischer Stoffwechsellage kann durch Insulin gehemmt werden. S.Fredersdorf, Chr.Thumann, J.Weil Klinische Daten zeigen, daß es bei Diabetikern gehäuft zu einer chronischen Herzinsuffizienz, unabhängig von einer arteriellen Hypertonie und/oder einer Makroangiopathie kommt. Der Pathomechanismus hierfür ist weitgehend ungeklärt. Es gibt jedoch Hinweise, daß apoptototische Vorgänge hierbei eine Rolle spielen. Daher untersuchten wir das Myokard von Ratten (19 Wochen alt) mit genetisch determiniertem NIDDM (Zucker Diabetic Fatty Rat, ZDF, n=7) sowie das von nichtdiabetischen Kontrollratten (ZDL, n=7). Um den Einfluß einer Insulintherapie zu untersuchen, wurden osmotische Minipumpen im Alter von 13 Wochen subcutan implantiert. Pro- und antiapoptotische Proteine wurden mittels Western Blot und das Volumen der Kardiomyozyten durch quantitative Bildanalyse bestimmt. Ergebnisse: Wie erwartet waren Glucose im Blut (477±26* vs. 96±7 mg/dl), HbA1c (1,9±0,08* vs. 0,6±0,03 %) und Körpergewicht (402±9* vs. 352±11 g) bei den ZDF-Ratten höher im Vergleich zur den ZDL-Ratten. Die Herzgewichte waren in beiden Gruppen gleich (1,4±0,04 vs. 1,3±0,05 g), obwohl das Zellvolumen bei diabetischen Ratten mehr als 2fach höher war (35200±4* vs. 15400±0.5 µm3). Eine Ursache hierfür könnte eine verminderte Gesamtzellzahl sein. Im Myokard diabetischer Ratten wurde eine signifikante Zunahme der proapoptotischen Proteine Bax (197±21 vs. 305±14* arbitrary units) und Caspase-3 (1701±532 vs. 4833±764* arbitrary units) beobachtet, ohne Änderung des antiapoptotischen Proteins Bcl-2. Die Behandlung mit Insulin führte zu einer weiteren Zunahme des Körpergewichtes (478±25 g) und einer Abnahme der Blutglucose (252±73 mg/dl) und des HbA1c-Wertes (1.1±0.12%) im Vergleich zu den unbehandelten ZDF Ratten. Das Herzgewicht der behandelten Tiere war signifikant erhöht, ohne das jedoch ein Unterschied im Volumen der Kardiomyozyten bestand. Interessanterweise führte Insulin zu einer Normalisierung der myokardialen Bax- und Caspase3-Expression. Frühe Stadien des NIDDM sind mit einer kardialen Hypertrophie ohne Zunahme des Herzgewichtes, aber mit einer Hochregulierung pro-apoptotischer Proteine im Herzen assoziiert. Dieser Befund legt nahe, daß der programmierte Zelltod ein möglicher Pathomechanismus für die Entstehung der diabetischen Kardiomyopathie ist. Eine Insulinbehandlung scheint die Apoptose zu hemmen.