Dietmar Abt

Dietmar Abt
Universität Konstanz
NITRITREDUKTASE AUS SULFATREDUZIERENDEN
BAKTERIEN:
REINIGUNG, BIOCHEMISCHE UND SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
Forschungsarbeit zur wissenschaftlichen Prüfung
für das Lehramt an Gymnasien und
Diplomarbeit zur Erlangung des akademischen Grades eines
Diplom-Biologen
an der Fakultät für Biologie
der Universität Konstanz
Juni 1998
FÜR MEINE ELTERN
Ich erkläre, daß ich die Arbeit selbständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln
angefertigt habe und daß alle Stellen, die dem Wortlaut oder dem Sinne nach anderen Werken
entnommen sind, durch Angabe der Quellen als Entlehnungen kenntlich gemacht worden
sind.
¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
Konstanz im Juni 1998
Dietmar Abt
„... to boldly go where no man has gone before.“
(Star Trek)
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
4
1.1 Der biogeochemische Schwefelkreislauf
4
1.2 Der biogeochemische Stickstoffkreislauf
5
1.3 Nitritreduktasen
7
1.3.1 Cytochrom c Nitritreduktasen
7
1.3.2 cd1-Nitritreduktasen
8
1.3.3 Kupferabhängige Nitritreduktasen
9
1.4 Nitratammonifikation bei Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
10
1.5 Aufgabenstellung
11
2 MATERIAL UND METHODEN
12
2.1 Chemikalien, Geräte, Bakterienstamm
12
2.1.1 Chemikalien
12
2.1.2 Geräte
14
2.1.3 Bakterienstamm
16
2.2 Kultivierung von Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
16
2.2.1 Kulturmedium
16
2.2.2 Kultivierung
17
2.2.3 Kryokulturen
17
2.3 Reinigung der membrangebundenen Cytochrom c Nitritreduktase
18
2.3.1 Ernte der Zellen
19
2.3.2 Aufschluß der Zellen
19
2.3.3 Präparation von löslicher Fraktion und Membranfraktion
19
1
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.4 Membranextraktion
20
2.3.5 Chromatographie
20
2.4 Analytische Methoden
22
2.4.1 Proteinbestimmung
22
2.4.2 Bestimmung der relativen molaren Masse
23
2.4.2.a SDS-PAGE
23
2.4.2.b Gelfiltration
26
2.4.3 Bestimmung des Hämgehaltes
27
2.4.4 Colorimetrische Bestimmung von Ammonium
28
2.4.5 Colorimetrische Bestimmung von Nitrit
29
2.4.6 Bestimmung von Nitrit und Nitrat mittels HPLC
30
2.4.7 Nitrit-Reduktase Aktivität
31
2.4.8 Isoelektrische Fokussierung
32
2.4.9 Aminoterminale Sequenzierung
33
2.5 Spektroskopische Methoden
33
2.5.1 Elektronenanregungsspektroskopie
33
2.5.2 Elektronen Paramagnetische Resonanz (EPR) Spektroskopie
34
3 ERGEBNISSE
35
3.1 Anzucht von Desulvovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
35
3.2 Reinigung der membrangebundenen Cytochrom c Nitritreduktase
36
3.2.1 Rohextrakt, Cytoplasmaextrakt und Membranextrakt
36
3.2.2 Solubilisation
36
3.2.3 Anionenaustauscher DE52
37
3.2.4 Anionenaustauscher MonoQÒ HR5/5
37
3.2.5 Größenausschlußchromatographie Superdex 200
38
3.2.6 Reinigungsbilanz
39
3.3 Charakterisierung der membrangebundenen Cytochrom c Nitritreduktase
41
3.3.1 Bestimmung der Molekularmasse mit SDS PAGE
41
3.3.2 Bestimmung der Molekularmasse durch Gelfiltration
42
2
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3 Elektronenanregungsspektren
43
3.3.4 Elektronen Paramagnetische Resonanz Spektren
45
3.3.5 Bestimmung des Hämgehaltes
46
3.3.6 Isoelektrische Fokussierung
47
3.3.7 Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz
48
4 DISKUSSION
49
4.1 Anzucht von D. desulfuricans (ATCC 27774)
49
4.2 Reinigung der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans
50
4.3 Charakterisierung der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans
52
4.3.1 Biochemische Charakterisierung
52
5 ZUSAMMENFASSUNG
59
6 LITERATUR
60
7 ANHANG
65
7.1 Verzeichnis der Abkürzungen und Trivialnamen
65
7.2 Abkürzungen für Aminosäuren
66
3
1 EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
1.1 Der biogeochemische Schwefelkreislauf
Schwefel findet sich vielerorts in der Natur in elementarer Form und ist daher schon seit
prähistorischen Zeiten bekannt. Die drei häufigsten Vorkommen sind elementarer Schwefel,
Sulfate und Sulfide. Erst im 18. Jahrhundert entdeckte man, daß Schwefel am Aufbau von
Pflanzen beteiligt ist. Wenig später wurde Schwefel in Tieren nachgewiesen (Greenwood und
Earnshaw, 1990).
Die biologische Reduktion von Sulfat zu Sulfid und die Oxidation reduzierter Formen
anorganischer Schwefelverbindungen sind weit verbreitete Prozesse in unserer Umwelt.
Schätzungsweise 75% des Schwefels in der Erdkruste wird auf diese Weise im biogeochemischen Schwefelkreislauf umgesetzt. In diesem Prozeß spielen Mikroorganismen eine
große Rolle, aber auch Pflanzen können Sulfat zum Zweck der Biosynthese von Aminosäuren
und Kofaktoren reduzieren. Sowohl Pflanzen als auch Tiere können reduzierte Schwefelverbindungen zu Sulfat oxidieren (Peck und Bramlett, 1982).
SO42Schwefel-Oxidation:
Thiobacillus
dissimilatorische Sulfatreduktion:
Desulfovibrio, Desulfotomaculum
S0
dissimilatorische Schwefelreduktion:
Desulfuromonas
Schwefel-Oxidation:
Beggiatoa, Thiobacillus
S2-
assimilatorische Sulfatreduktion:
Hefe, Bakterien, Pflanzen, Algen
Verwesung
RSH
Proteolyse
Abb. 1.1
Proteinsynthese
Protein
Der biogeochemische Schwefelkreislauf (Postgate, 1984; Schlegel, 1992).
4
1 EINLEITUNG
Die Reduktion von Sulfat zu Sulfid wird in zwei Prozesse eingeteilt: Die Reduktion von
Sulfat zur Biosynthese von Aminosäuren und Kofaktoren und die Reduktion von Sulfat zu
Sulfid in der Sulfatatmung (Postgate, 1984). Der assimilatorische Prozeß findet in Pflanzen
und Bakterien zur Deckung des Bedarfs an reduzierten Schwefelverbindungen statt. Die
dissimilatorische Sulfatreduktion wird von strikt anaeroben sulfatreduzierenden Bakterien zur
Energiekonservierung durchgeführt. Hierbei werden die durch Oxidation organischer
Verbindungen erhaltenen Redoxäquivalente im Gegensatz zur mitochondrialen Atmung auf
Sulfat als terminalen Elektronenakzeptor übertragen. Bei den sulfatreduzierenden Bakterien
gibt es gram-positive (Desulfotomaculum) und gram-negative (Desulfovibrio, Desulfobulbus,
Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus und Desulfosarcina) Eubakterien (Deuereux
et al., 1989). Das einzige Archaebakterium von welchem bekannt ist, daß es dissimilatorische
Sulfatreduktion durchführt, ist der Archaeoglobus fulgidus (Stetter et al., 1987).
1.2 Der biogeochemische Stickstoffkreislauf
Stickstoff ist das häufigste freie Element, das dem Menschen zugänglich ist. Obwohl der
Volumenanteil von Stickstoff in der Atmosphäre etwa 78% beträgt, wurde er erst 1772
entdeckt. Neben dem atmosphärischen Anteil an elementarem Stickstoff kommt Stickstoff in
gebundener Form in geringen Mengen vor allem als Salpeter (KNO3) oder als Chilesalpeter
(NaNO3), vor (Greenwood und Earnshaw, 1990).
Die biologische Fixierung von Stickstoff durch Mikroorganismen sowie die Oxidation von
Stickstoff durch elektrochemische Prozesse (Blitze) waren lange Zeit die einzigen Möglichkeiten, um atmosphärischen Stickstoff in eine biologisch verwertbare Form zu überführen.
Erst mit der Einführung des Haber-Bosch Verfahrens zur Ammoniaksynthese ist es dem
Menschen gelungen, Stickstoff in großen Mengen zu fixieren.
Neben Kohlenstoff, Schwefel und Sauerstoff unterliegt auch der Stickstoff einem biogeochemischen Kreislauf (Abb. 1.2). Alle Reaktionsschritte werden hier durch Oxidoreduktasen
katalysiert, die Metalle in ihren Aktivzentren gebunden haben (Kroneck et al., 1992).
5
1 EINLEITUNG
Denitrifikation (Thiobacillus, Pseudomonas, Agrobacterium)
+VNO
3
+IIINO
+IIINO
Nitratreduktion
zu Ammoniak,
dissimilatorisch bzw.
assimilatorisch
(Wolinella, Sulfurospirillum,
Desulfovibrio)
2
2
-
0N
+IN
+IINO
2O
Nitrifikation
(Nitrosobacter,
Nitrobacter)
2
N2-Fixierung
(Azotobacter, Rhizobium,
Anabaena)
-IIINH
3
Assimilation
Desaminierung
Organische Materie
Abb. 1.2
Der biogeochemische Stickstoffkreislauf (Schumacher, 1993; Becker et al., 1994).
Hierbei sollen vor allem zwei Wege der Energiekonservierung näher betrachtet werden, die
dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammoniak und die Denitrifikation. Beiden Prozessen ist
die Reduktion von Nitrat zu Nitrit gemeinsam. Sie wird durch Ferrocytochrom-NitratOxidoreduktasen katalysiert, die einen Molybdänkofaktor enthalten und in einem membranständigen Komplex mit Eisen-Schwefel-Proteinen assoziiert sind.
Die Denitrifikation ist derjenige Prozeß, durch den der Stickstoff des Nitrats und Nitrits als
Distickstoffmonoxid und Distickstoff der Atmosphäre wieder zugeführt wird. Sie verläuft
über
vier
Reaktionsschritte.
Die
dabei
beteiligten
Enzyme
bilden
eine
Elektronentransportkette über die Cytoplasmamembran der durchweg gramnegativen
Bakterien. Durch den Aufbau einer protonenmotorischen Kraft über diese Membran wird so
die chemische Nutzung der Redox-energie der einzelnen Schritte möglich.
NO3-
Mo
NO2-
Fe/Cu
NO
6
Fe
N2 O
Cu
N2
1 EINLEITUNG
Bei der Nitratammonifikation dagegen ist Nitrit die einzig freigesetzte Zwischenverbindung.
Nitrit wird in einem Sechs-Elektronen-Schritt zu Ammoniak reduziert.
NO2-
+
8 H+ +
6 e-
NH4+
+
2 H2 O
1.3 Nitritreduktasen
Die Nitritreduktasen der Nitratammonifikation sind entweder NADH-abhängige SirohämNitritreduktasen (Zarowny und Sanwal, 1963) oder Multihäm Cytochrom c Nitritreduktasen.
Bei der Denitrifikation unterscheidet man zwischen kupferabhängigen Nitritreduktasen oder
Cytochrom cd1 Nitritreduktasen.
1.3.1 Cytochrom c Nitritreduktasen
Cytochrom c Nitritreduktasen katalysieren die Umwandlung von Nitrit zu Ammonium. Dabei
werden sechs Elektronen übertragen (Schumacher et al., 1991). Sie wurden bisher bei
mehreren Organismen beschrieben: Escherichia coli (Fujita et al., 1966), Vibrio fischeri
(Prakash und Sadana, 1972), Desulfovibrio desulfuricans (Liu und Peck, 1981), Wolinella
succinogenes (Blackmore et al., 1986), Sulfurospirillum deleyianum (Schumacher et al.,
1991, 1997) und Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., 1995). In Tabelle 4.2 sind
einige Eigenschaften dieser Enzyme dargestellt.
Bei den Cytochrom c Nitritreduktasen handelt es sich um eine Gruppe von
Multihämenzymen, wobei die Anzahl der Hämzentren pro Molekül umstritten ist
(Schumacher et al., 1994, 1997; Eaves et al., 1998). In c-Typ Cytochromen sind die HämGruppen normalerweise kovalent über Thioetherbrücken an zwei Cysteinreste gebunden (Abb
1.3). Die Cysteinreste sind Teil des klassischen (Cys-X-X-Cys-His) oder des alternativen
(Cys-X-X-Cys-Lys) Hämbinde-motivs.
Die meisten Cytochrom c Nitritreduktasen werden als monomere Proteine (Mr 50 - 70 kDa)
beschrieben, die in vitro leicht aggregieren (Liu und Peck, 1981; Liu et al., 1983). So wurden
z.B. bei S. deleyianum und W. succinogenes heterooligomere Komplexe mit 55 und 22 kDa
7
1 EINLEITUNG
Untereinheiten (Mr 245 ± 15 kDa) isoliert. Die kleine Untereinheit ist dabei nicht kovalent,
z.B. über Disulfidbrücken, mit den großen Untereinheiten verknüpft (Schumacher et al.,
1994).
Elektronenanregungsspektren von Multihäm Nitritreduktasen im reduzierten Zustand weisen
die typischen Banden von reduzierten c-Typ Cytochromen auf. Das EPR-Spektrum der
Cytochrom c Nitritreduktasen im oxidierten Zustand zeigt für low-spin Häm-Fe(III) typische
Signale. Neben den low-spin Häm-Fe(III) Zentren liegt z.B. bei W. succinogenes und
D. desulfuricans je ein high-spin Häm-Fe(III) Zentrum vor, das vermutlich das reaktive
Zentrum der Nitritreduktasen darstellt (Blackmore et al., 1987, 1990; Costa et al., 1990; Nath,
1996; Moura, 1997).
S-Cys (Protein)
S-Cys (Protein)
N
N
Fe
N
N
COOH
COOH
Abb. 1.3
Kofaktor eines c-Typ Cytochroms.
1.3.2 cd1-Nitritreduktasen
Im Laufe der Denitrifikation katalysieren cd1-Nitritreduktasen die Ein-Elektronen-Reduktion
von Nitrit zu Stickstoffmonoxid.
NO2-
+
2 H+
+
e-
NO
+
H2O
Außerdem katalysieren diese Enzyme die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser in einem VierElektronen-Schritt.
8
1 EINLEITUNG
Diese Art von Nitritreduktasen wurde unter anderem in Paracoccus denitrificans (Moir et al.,
1993), Pseudomonas stutzeri (Weeg-Aerssens et al., 1991; Jüngst et al., 1991), Alcaligenes
eutrophus (Sann et al., 1994), Pseudomonas aeruginosa (Henry und Bessiers, 1984) und
Thio-bacillus denitrificans (Hole, 1996) isoliert und charakterisiert.
Gemeinsame strukturelle Eigenschaft der cd1-NiR ist die molekulare Masse von 120 kDa des
Homodimers (2 × 60 kDa). Jede der Untereinheiten trägt einen kovalent gebundenen Häm cKofaktor und einen nicht kovalent gebundenen Häm d1-Kofaktor (Abb. 1.4). NO-Bindungsstudien (Johnson et al., 1980, Liu et al., 1987) und Stopped-Flow-Untersuchungen (Silvestrini
et al., 1990) belegen, daß Häm d1 als das katalytische Zentrum des Enzyms angesehen werden
kann (Fülöp et al., 1995).
COOH
O
COOH
O
N
N
Fe
N
COOH
N
COOH
Abb. 1.4
Kofaktor eines d1-Typ Cytochroms.
1.3.3 Kupferabhängige Nitritreduktasen
Wie die cd1-Nitritreduktasen katalysieren auch diese Kupferabhängigen Enzyme (z.B. aus
Achromobacter cycloclastes (Godden et al., 1991) die Reduktion von Nitrit zu Stickstoffmonoxid. Diese NiR besitzt die Struktur eines Homotrimeren mit je einem Typ I-Kupfer und
einem Typ II-Kupfer pro Untereinheit. Die Typ II-Kupferzentren werden als Aktivzentrum
angesehen (Godden et al., 1991), wohingegen das Typ I-Kupfer als Elektronenüberträger
wirkt (Ye et al., 1994).
9
1 EINLEITUNG
1.4 Nitratammonifikation bei Desulfovibrio desulfuricans
(ATCC 27774)
Sulfatreduzierende Bakterien wurden lange als eine kleine und hochspezialisierte Gruppe
obligater Anaerobier mit einer geringen metabolischen Vielseitigkeit beschrieben. In den
sechziger Jahren wurden sie in zwei Gattungen (Desulfovibrio, Desulfotomaculum; Peck,
1984) eingeteilt. In den achziger Jahren wurden weitere fünf Gattungen (Desulfobacter,
Desulfosarcina, Desulfonema, Desulfobulbus, Desulfococcus; Peck, 1984) beschrieben. Die
Arten dieser sieben Gattungen nutzen Sulfat als terminalen Elektronenakzeptor und sind
obligate Anaerobier (Peck, 1984).
In der Literatur wurde vereinzelt über die Möglichkeit der Sulfatreduzierenden Bakterien,
auch Nitrat als terminalen Elektronenakzeptor zu benutzen, berichtet (Senez und Pichinoly,
1958). Von Desulfovibrio desulfuricans wurde ein Stamm (ATCC 27774) isoliert, der neben
Sulfat auch Nitrat und Nitrit reduzieren konnte (Peck, 1984).
Liu und Peck gelang es 1981, die membrangebundene Cytochrom c Nitritreduktase (NiR) aus
auf Lactat und Nitrat gezogenen Zellen von D. desulfuricans zu isolieren. Es konnte nachgewiesen werden, daß die NiR auch in Zellen exprimiert wird, die auf Lactat und Sulfat
gezogen wurden (Peck, 1984; G. Fritz, pers. Mitteilung).
Von Bursakov et al. (1997) wurde eine periplasmatische Nitratreduktase mit einer Molekularmasse von 74 kDa und einem molybdänhaltigen Kofaktor gereinigt.
Die NiR wurde als ein membranständiges Protein mit sechs c-Typ Cytochromen und einer
Molekularmasse von 66 kDa charakterisiert (Liu und Peck, 1981) Dieses Enzym besitzt eine
Tendenz, höhermolekulare Aggregate zu bilden. Vor kurzem konnten Pereira et al. (1996)
zeigen, daß die NiR aus D. desulfuricans (ATCC 27774) eine kleine Untereinheit von etwa
19 kDa besitzt und die Reduktion von Sulfit zu Sulfid katalysiert. Moura et al. (1997) zeigten,
daß fünf der sechs Hämgruppen low-spin Fe(III) Zentren besitzen. Die sechste Hämgruppe
besitzt ein high-spin Fe(III) Zentrum, das als Reaktionszentrum betrachtet wird.
10
1 EINLEITUNG
1.5 Aufgabenstellung
Eine auf Sulfat und DL-Lactat gezogene Kultur von Desulfovibrio desulfuricans (ATCC
27774) sollte an ein Wachstum mit Nitrat als terminalem Elektronenakzeptor und DL-Lactat
als Elektronendonor adaptiert werden. Während der Anzucht sollte das Wachstum der Bakterien sowie die Veränderungen der Nitrat-, Nitrit- und Ammoniumkonzentrationen im
Medium verfolgt werden.
Nach der Anzucht von D. desulfuricans sollte ein verbessertes Reinigungsprotokoll für die
membrangebundene Cytochrom c Nitritreduktase erarbeitet werden. Die Reinheit des Proteins
sollte durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Bestimmung der Nitritreduktaseaktivität
und der optischen Parameter überprüft werden.
Am gereinigten Enzym sollten die biochemischen und spektroskopischen Parameter
(Molekularmasse, Nitritreduktaseaktivität, Hämgehalt, Isoelektrischer Punkt, UV/VisSpektrum, EPR-Spektrum) ermittelt werden.
Um die NiR aus D. desulfuricans mit Cytochrom c Nitritreduktasen aus anderen Organismen
vergleichen zu können, sollte deren aminoterminales Ende sequenziert werden.
11
2 MATERIAL UND METHODEN
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Chemikalien, Geräte, Bakterienstamm
2.1.1 Chemikalien
· BASF, Ludwigshafen:
Eisendichlorid-Tetrahydrat
· BioRad, München:
Eichproteine für SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung; Ammoniumperoxodisulfat
· Boehringer, Mannheim:
N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propan sulfonat (SB12 = ZwittergentÒ 3-12)
· Fluka, Neu-Ulm:
Natriumdodecylsulfat (SDS); Dithiothreitol; 50% Natrium-DL-Lactat-Lösung; Hefe-Extrakt;
Sulfanilamid; 3a, 7a, 12a-Trihydroxy-5b-cholansäure Natriumsalz (Cholat)
· ICN Biomedicals, Eschwege:
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
· J. T. Baker, Deventer, Holland:
Methanol; Schwefelsäure; Pyridin; Acetonitril
· Merck, Darmstadt:
Natriumazid; Dikaliumhydrogenphosphat; Natriumsulfid × H2O (35% Na2S); KaliumHexacyanoferrat (III); Ammoniumsulfat; Wasserstoffperoxid; Natriumnitrit; Pferdeherz
Cytochrom c; Formaldehyd min. 37%; Phenol; Nitroprussidnatrium;
12
2 MATERIAL UND METHODEN
· Messer Griesheim, Düsseldorf:
Argon 4.8; Helium 4.6
· National Diagnostics, Manville, New Jersey, USA:
ProtogelTMAcrylamid-Mix 37.5 : 1, eine 30%ige (w/v) wäßrige Lösung
· Riedel-de-Haën, Seelze:
Natriumdithionit; Kaliumdihydrogenphosphat; Magnesiumchlorid-Hexahydrat;
Calciumchlorid-Dihydrat; Kaliumchlorid; Methanol Chromasolv für die Chromatographie;
Salzsäure 37.5%; 1-Butanol; Natriumhydroxid; Kaliumhydroxid; Natriumnitrat;
Natriumcarbonat-Dihydrat; Natriumacetat
· Roth, Karlsruhe:
Essigsäure 99 - 100%, Glycin; Silbernitrat; Glycerin; Ammoniumacetat; Natriumchlorid;
Tetramethylethylendiamin (TMEDA)
· Sauerstoffwerke, Friedrichshafen:
Stickstoff 5.0; Formiergas 95:5; Stickstoff : Kohlendioxid 80:20 (v/v)
· Serva, Heidelberg:
Rinderserumalbumin (BSA); Bromphenolblau, Natriumsalz; Coomassie Brilliant Blue G 250;
Ethylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalz; Methylviologen
· Sigma, Deisenhofen:
2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure (BCA); Eichproteine für die Gelfiltration;
L-Cystein × HCl × H2O; Triton X-100; 3,3’-5,5’-Tetramethylbenzidin (TMBZ)
· Whatman, Maidstone, England:
Diethylaminoethylzellulose (DE52)
13
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.2 Geräte
· Chromatographie
FPLC-Säulengehäuse, Pharmacia, Freiburg.
MonoQÒ HR5/5-Anionenaustauscher, Pharmacia, Freiburg.
SuperdexTM 200 HiLoadTM 26/60-Gelfiltrationssäule, Pharmacia, Freiburg.
Hydroxylapatit-Säule (2.6 x 13 cm), Fast flow, Calbiochem, Frankfurt.
FPLC-Anlage, Pharmacia, Freiburg.
HPLC-Anlage, Sykam, Gilching.
Anionentrennsäule LCA A08, Sykam, Gilching.
· Detektoren
280 nm: UV-1 Monitor, Pharmacia, Freiburg.
405 nm: Pharmacia LKB 2138 UVCORD S Monitor, Pharmacia, Freiburg.
220 nm: Sykam S 3300, Gilching.
· EPR-Spektroskopie
ESP 300 Spektrometer, Bruker, Karlsruhe.
EPR-Röhrchen Suprasil (Innendurchmesser 3-4 mm), Kummer, Freiburg.
· French Presse
Aminco, Urbana, USA.
· UV/Vis-Spektroskopie
Diodenarray-Spektralphotometer HP 8452 A mit HP 300 Workstation, Hewlett Packard,
Stuttgart.
UV/Vis Spektrophotometer Lambda 16, Perkin-Elmer, Überlingen.
· Ultrafiltration
Amicon-Druckfiltrationszellen mit Diaflo Ultrafiltrationsmembranen PM 30, 30 kDa
Ausschlußgrenze und PM 10, 10 kDa Ausschlußgrenze, Amicon, Witten.
Ultrafiltrationsröhrchen: Macrosep und Microsep, 10 kDa Ausschlußgrenze, Pall-Filtron,
Dreieich.
14
2 MATERIAL UND METHODEN
· Vakuumfiltration
Zur Puffer-Sterilisation wurde eine Filtrationsanlage von Sartorius (Göttingen) an eine
Membranpumpe angeschlossen. Ebenfalls von Sartorius stammten die dazugehörigen
Zelluloseacetat-Filter mit 0.2 µm Porengröße.
· Waagen
Mettler PL 200 für Gramm-Mengen (Mettler, Albstadt).
Mettler AT 100 für Milligramm-Mengen (Mettler, Albstadt).
· Zentrifugen
RC 5 B, Sorvall Instruments, Du Pont de Nemours, Bad Homburg.
Ultrazentrifuge OptimaÔ LE-80K, Beckman Instruments Inc., Palo Alto, USA.
Tischzentrifuge Wifug M, Lab Centrifuges, Bradford, England.
15
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.3 Bakterienstamm
Eine D. desulfuricans (ATCC 27774) Stammkultur wurde von der „Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ (DSM, Braunschweig) bezogen.
Eine auf Nitrat gezogene Kultur von D. desulfuricans wurde mir von Herrn Klaus Sulger zur
Verfügung gestellt.
2.2 Kultivierung von Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
2.2.1 Kulturmedium
Die Anzucht von D. desulfuricans (ATCC 27774) erfolgte nach Liu und Peck (1981). Das
Medium enthielt pro Liter die folgenden Komponenten:
Natrium-DL-Lactat (50%)
15 ml
85 mM
MgCl2 × 6H2O
0.58 g
2.8 mM
NaNO3
2.94 g
34.6 mM
CaCl2 × 2H2O
0.26 g
1.8 mM
K2HPO4 × 3H2O
0.65 g
2.9 mM
L-Cystein × HCl × H2O
0.26 g
1.6 mM
Na2S × 9H2O
0.26 g
1.1 mM
Hefe-Extrakt
1.0 g
FeCl2 × 4H2O
3.55 mg
89 µM
Tab. 2.1
Anzuchtmedium von D. desulfuricans nach Liu und Peck (1981).
Alle Komponenten, außer L-Cystein und Natriumsulfid, wurden in Wasser gelöst und
autoklaviert (2 h, 121°C). Nach Abkühlung unter einem N2:CO2 (80:20% (v/v)) Überdruck
von etwa 200 mbar wurde eine entsprechende Menge einer sterilen Natriumsulfidlösung
16
2 MATERIAL UND METHODEN
zugegeben. L-Cystein wurde in wenig Wasser gelöst und mit 2 M Natriumcarbonat-Lösung
auf pH 7.0 - 7.3 eingestellt. Die Lösung wurde mittels Sterilfiltration (0.2 µm Porengröße)
zum Medium zugegeben und mit steriler 1 M HCl oder 2 M Na2CO3 auf pH 7.0 - 7.3
eingestellt.
Für die Vorkulturen wurde das Medium anoxisch in Schraubdeckelflaschen abgefüllt.
2.2.2 Kultivierung
100 ml- und 1 l-Vorkulturen wurden mit je 10% Inokulum versetzt und bei 35°C für drei
Tage inkubiert. Hauptkulturen in einer 20 l-Steilbrustflasche wurden ebenfalls mit 10%
Inokulum versetzt und bei 35°C inkubiert.
Das Wachstum der Mikroorganismen wurde mikroskopisch, durch Kontrolle des pH-Wertes
sowie durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm und 436 nm gegen Wasser auf einem
Diodenarray-Spektralphotometer (Hewlett Packard, Stuttgart) verfolgt.
Die Hauptkultur stand während des Wachstums unter einem N2:CO2 (80:20% (v/v))
Überdruck von 200 - 600 mbar.
2.2.3 Kryokulturen
Eine mikroskopisch reine Zellkultur in der stationären Phase von D. desulfuricans wurde
20 min bei 10000 g in sterilen Zentrifugenbechern zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet
wurde mit steriler 80%iger Glycerinlösung versetzt (1:1 (w/v)) und homogenisiert.
Anschließend wurden 500 µl Aliquote abgefüllt und bei -20°C langsam eingefroren. Nach
24 h wurden die Zellen bei -70°C gelagert.
17
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3 Reinigung der membrangebundenen Cytochrom c
Nitritreduktase
Die Reinigung wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt:
Abb. 2.1
Chromatographische Reinigung der membrangebundenen Cytochrom c Nitritreduktase aus
Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774).
18
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3.1 Ernte der Zellen
Die 20 l-Kulturen wurden in einer späten Wachstumsphase mit einem PelliconTM
Kassettenfiltrationssystem (Ausschlußgrenze 100 kDa, Millipore, Neu Isenburg) 15 - 20 fach
konzentriert und in einer Zentrifuge (Sorvall Instruments, DuPont, Bad Homburg) bei
10000 g und 4°C für 50 min sedimentiert. Charakteristischerweise betrug die Zellausbeute
einer 20 l Kultur 15 - 20 g Naßgewicht. Die Zellen wurden bis zur weiteren Verwertung in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt.
2.3.2 Aufschluß der Zellen
Die Zellen wurden in kaltem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8.3 resuspendiert (1:4 (w/v)) und
mit einigen Kristallen DNase I (aus Rinder Pankreas) sowie MgCl2 versetzt. Anschließend
wurden die Zellen dreimal in einer French Presse (Aminco, Urbana, USA) bei 70 MPa
aufgebrochen. Bei einem 10 minütigen Rühren bei Raumtemperatur fand der DNase Verdau
statt. Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen wurden anschließend durch
Zentrifugation (13200 g, 10 min, 4°C) sedimentiert. Der Überstand (Rohextrakt) wurde direkt
weiter-verarbeitet.
2.3.3 Präparation von löslicher Fraktion und Membranfraktion
Der Rohextrakt wurde durch Ultrazentrifugation (100000 g, 4°C, 75 min) in die lösliche
Fraktion (Cytoplasma und Periplasma im Überstand) und in die Membranfraktion (Sediment)
aufgetrennt. Die lösliche Fraktion wurde für Aktivitätsexperimente verwendet und
anschließend bei -70°C aufbewahrt. Die Membranen wurden zweimal mit 20 mM Tris-HCl
Puffer, pH 8.3 gewaschen (2/3 des Rohextraktvolumens), wobei die Membranen durch
Ultrazentrifugation (100000 g, 4°C, 75 min) zurückgewonnen wurden. Nach dem zweitem
Waschgang wurden die Membranen in 20 mM Tris-HCl Puffer, pH 8.3 resuspendiert (1/5 des
Rohextraktvolumens) und bei -70°C gelagert oder direkt weiterverarbeitet.
19
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3.4 Membranextraktion
Die resuspendierte Membranfraktion wurde in 20 mM Tris-HCl Puffer, pH 8.3, 1% Triton X100 (w/v) unter Rühren langsam eingetropft (Protein : Detergenz = 1:4 (w/w)) und für 30 min
bei Raumtemperatur gerührt.
Durch Ultrazentrifugation (100000 g, 4°C, 75 min) konnten nichtsolubilisierte Zellteile sedimentiert werden. Der Überstand wurde entweder bei -70°C eingefroren oder direkt weiterverarbeitet.
2.3.5 Chromatographie
Die Reinigung erfolgte mit einer FPLC-Anlage (Pharmacia, Freiburg). Diese bestand aus
zwei Pumpen (P-500), einem Gradientenmischer (GP-250), einer Probenschleife und einem
Fra-ktionskollektor (Frac-100). Die Elutionspuffer wurden vor der Verwendung über eine
0.2 µm Zelluloseacetat-Membran filtriert (Sartorius, Göttingen). Die Proteinlösungen wurden
vor dem Auftrag auf die Säulen zentrifugiert (9000 g; Sorvall Instruments Zentrifuge, DuPont
de Nemours, Bad Homburg), um präzipitiertes Protein abzutrennen. Die entsprechende Säule
wurde vor dem eigentlichen Lauf mit mehreren Säulenvolumen Startpuffer equilibriert. Die
Proteinproben wurden entweder über die Probenschleife (bei kleinen Auftragsvolumen bis zu
5.0 ml) oder direkt über die Pumpen aufgetragen. Das Elutionsprofil wurde bei 280 nm (UV-1
Monitor, Pharmacia, Freiburg) und bei 405 nm (Pharmacia LKB 2138 UVCORD S Monitor,
Pharmacia, Freiburg) verfolgt. Fraktioniert wurde mit dem Kollektor Frac-100. Entsprechend
dem Elutionsprofil, den UV/Vis Spektren (250 - 700 nm) sowie den Nitritreduktaseaktivitäten
wurden die Fraktionen vereinigt und zum Teil mit einer Ultrafiltrationszelle (Amicon, Witten)
über eine Polyethersulfonat-Membran (Ausschlußgrenze 30 kDa) aufkonzentriert.
20
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3.5.a Anionenaustauscher DE52
Die
Säule
bestand
aus
einem
Säulengehäuse
(Pharmacia,
Freiburg),
das
mit
Diethylaminoethyl-zellulose (pre swollen microgranular anion exchanger DE52, Whatman,
Maidstone, England) gefüllt wurde. Das Säulenvolumen betrug etwa 15 ml.
Es wurde mit folgendem Puffersystem gearbeitet:
Puffer A:
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100
Puffer B:
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 500 mM NaCl
Der Membranextrakt aus 2.3.4 wurde auf die DE52-Anionenaustauschersäule aufgetragen,
welche zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Nach dem Auftrag wurde solange mit
Puffer A eluiert, bis keine Absorption bei 405 nm mehr zu sehen war. Der Durchlauf wurde
gesammelt und auf Nitritreduktaseaktivität untersucht. Zur Elution wurde folgender Gradient
gestartet:
0 - 60 min
0 - 60% Puffer B
60 - 70 min
60 - 100% Puffer B
70 - 80 min
100% Puffer B
Die Fraktionsgröße betrug 3 ml bei einer Flußgeschwindigkeit von 3 ml/min. Die Fraktionen
wurden mit SDS-PAGE und Enzymaktivitätstests auf Nitritreduktaseaktivität untersucht und
anschließend vereinigt.
2.3.5.b Anionenaustauscher MonoQ
Eine fertig gepackte MonoQÒ HR5/5 (starker quarternärer Ammonium-Anionenaustauscher)
wurde von Pharmacia, Freiburg bezogen. Das Säulenvolumen betrug etwa 1 ml.
Es wurde mit folgendem Puffersystem gearbeitet:
Puffer A:
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100
Puffer B:
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 500 mM NaCl
Die Durchlauffraktion aus 2.3.5.a wurde auf die MonoQ-Anionenaustauschersäule aufgetragen, welche zuvor mit mehreren Säulenvolumina Puffer A equilibriert worden war. Nach
dem Auftrag wurde solange mit Puffer A eluiert, bis keine Absorption bei 405 nm mehr zu
21
2 MATERIAL UND METHODEN
sehen war. Der Durchlauf wurde gesammelt und auf Enzymaktivität untersucht. Zur Elution
wurde folgender Gradient gestartet:
0 - 60 min
0 - 20% Puffer B
60 - 120 min
20 - 100% Puffer B
120 - 130 min
100% Puffer B
Die Fraktionsgröße betrug 2.1 ml bei einer Flußgeschwindigkeit von 0.7 ml/min Die
Fraktionen wurden mit SDS-PAGE und Enzymaktivitätstests auf Nitritreduktaseaktivität
untersucht und anschließend vereinigt.
2.3.5.c Gelfiltration
Mittels Gelfiltration werden Proteine unterschiedlicher molarer Masse aufgetrennt. Die
MonoQ Fraktionen mit 20 - 50 mM NaCl wurden auf etwa 1.0 ml aufkonzentriert und auf
eine Super-dexTM 200 (HiLoadTM 26/60, Pharmacia, Freiburg) Gelfiltrationssäule
(Säulenausschlußvol-umen 109 ml) aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit drei
Säulenausschlußvolumina Elutions-puffer 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100,
150 mM NaCl equilibriert. Nach Durchlauf von etwa 100 ml des Elutionspuffers bei einer
Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min wurde mit einer Fraktionsgröße von 2 ml fraktioniert. Die
Fraktionen wurden mit SDS-PAGE und Enzymaktivitätstests auf Nitritreduktaseaktivität
untersucht und anschließend vereinigt.
2.4 Analytische Methoden
2.4.1 Proteinbestimmung
Protein wurde nach Smith et al. (1985) bestimmt. Die Absorptionsmessungen erfolgten an
einem HP Diodenarray-Spektralphotometer 8452 A mit HP 300 Workstation (Hewlett
Packard, Stuttgart).
Hierzu wurde zuerst eine Eichgerade erstellt, indem eine Rinderserumalbumin-Stammlösung
(1 µg/µl) auf 5, 10, 15, 20 und 25 µg/100 µl mit H2O verdünnt wurde. Die Konzentration der
22
2 MATERIAL UND METHODEN
BSA-Stammlösung wurde über die Absorption bei 279 nm bestimmt. Der Extinktionskoeffizient beträgt 0.667 (mg/ml)-1 cm-1 (Foster und Sterman, 1956). Jede Eichlösung hat ein
Endvolumen von 100 µl.
Die Enzymprobe wurde gleichfalls auf ein Volumen von 100 µl so verdünnt, daß ihre Endkonzentration in den Konzentrationsbereich der Eichgeraden fällt. Zu den Eichlösungen sowie
zu den Probenlösungen wurde 1 ml eines 50:1 (v/v) Gemisches von 2,2´-Bichinolin-4,4´dicarbonsäure (BCA) mit 4.0% (w/v) CuSO4 × 5H2O-Lösung zugegeben. Danach wurden alle
Proben mit einem Vortex-Rüttler gut durchmischt und anschließend 30 min bei 60°C
inkubiert. Zur Verhinderung einer Weiterreaktion wurden die Lösungen nach erfolgter
Inkubation auf Eis gestellt. Nach Abkühlung der Proben wurde erneut durchmischt und
anschließend eventuell vorhandenes Präzipitat abzentrifugiert, welches die folgende
Absorptionsmessung stören würde. Die Konzentration der Enzymproben ergab sich durch
Vergleich der Absorptionen bei 562 nm mit der Eichgeraden.
Nach Smith et al. beruht der Test auf der Reduktion von Cu2+ zu Cu+ durch Peptidbindungen
und andere Bestandteile des Proteins (Kofaktoren, basische Reste, Cystein- und MethioninReste, evtl. zugesetzte Detergentien) und anschließender Komplexierung des Cu+ durch je
zwei Moleküle BCA zu einem violetten Farbstoff, der bei 562 nm eine starke Absorption
besitzt.
2.4.2 Bestimmung der relativen molaren Masse
2.4.2.a SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde zur Bestimmung der molaren
Massen der Untereinheiten der Nitrit-Reduktase sowie zur Überprüfung der Reinheit der
Präparationen herangezogen. Sie wurde in einer vertikalen, wassergekühlten Elektrophoreseapparatur nach Lämmli (1970) durchgeführt. Es wurden folgende zwei Systeme verwendet:
1. BioRad Protean II (BioRad, München) für Gele (160 x 200 x 0.75 mm)
2. Hoefer Mighty Small II SE 250 (Hoefer Scientific Instruments, Heidelberg,) für Gele
(80 x 70 x 0.75mm)
23
2 MATERIAL UND METHODEN
Die Gele bestanden aus dem Trenngel (12.5% Polyacrylamid-Anteil) und dem Sammelgel
(3.9% Polyacrylamid-Anteil). Der Laufpuffer bestand aus 1.44% (w/v) Glycin (14.4 g/l),
250 mM Tris (3 g/l) und 0.1% (w/v) SDS (1 g/l). Nachdem den Proben jeweils 5 ml
reduzierender Probenpuffer (40% (w/v) Glycerin, 8% (w/v) SDS, 0.004% (w/v) Bromphenolblau, 5% (w/v) DTE in 240 mM Tris-HCl pH 6.8) zugegeben worden war, wurden sie
5 min bei 100°C denaturiert. Nach etwa 10 min Vorlauf des Gels bei 10 mA wurden die
Proben (1 - 20 mg Protein) in die dafür vorgesehenen Taschen aufgetragen und im Sammelgel
bei 20 mA Stromstärke gesammelt. Während des Laufes durch das Trenngel betrug die
Stromstärke 40 mA. Hier wurden die mit SDS denaturierten Proteine entsprechend ihrer
molaren Masse getrennt. Markerproteine (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low
Range, BioRad, München) wurden zur Eichung eingesetzt. Anschließend wurden die Gele
zunächst mit Coomassie Brillant Blue G 250 gefärbt. Diese Färbung gibt die relativen
Protein-mengen weitgehend korrekt wieder, ist aber weniger empfindlich als eine
Silberfärbung, die jeweils zusätzlich durchgeführt wurde.
Außerdem wurde eine für c-Typ-Cytochrome spezifische Farbreaktion, die Hämfärbung nach
Goodhew et al. (1986), verwendet. Die Elektrophorese wurde dabei wie oben beschrieben
durchgeführt, allerdings wurde dem Lämmli-Puffersystem noch 2 mM Ethylendiamintetraacetat-Tetranatriumsalz (EDTA) zugegeben. Da die Färbung lichtempfindlich ist, wurden alle
Schritte im Dunkeln bzw. bei Rotlicht ausgeführt.
Das Färbeprinzip beruht auf der Peroxidaseaktivität der Hämgruppen. 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMBZ) dient als Substrat und wird anschließend von H2O2 zu einem blauen Präzipitat oxidiert, das im Dunkeln etwa eine Stunde stabil ist. Zur Dokumentation wurden die
Gele innerhalb einer Stunde fotographiert und mit einem identisch behandelten Gel mit
Silber-färbung verglichen.
Färbevorschriften:
· Coomassie Brillant Blue G 250 nach Zehr et al. (1989) modifiziert:
Das Gel wurde mindestens eine Stunde in Färbelösung (5% (v/v) konz. Essigsäure, 10%
(v/v) Ethanol, 0.2% (w/v) Coomassie Brillant Blue G 250) inkubiert und anschließend
der Hintergrund mit 10% (v/v) Ethanol oder Wasser entfärbt.
24
2 MATERIAL UND METHODEN
· Coomassie Brillant Blue G 250 nach Zehr et al. (1989) modifiziert:
Das Gel wurde mindestens eine Stunde in Färbelösung (10% (v/v) konz. Essigsäure, 45%
(v/v) Methanol, 0.2% (w/v) Coomassie Brillant Blue G 250) inkubiert und anschließend
der Hintergrund mit 20% (v/v) Methanol entfärbt.
Diese Färbung ist sensitiver als die Färbung mit Coomassie Brillant Blue G 250/Ethanol.
· Silberfärbung nach Rabilloud (1990, 1988):
Das mit Coomassie gefärbte Gel wurde mit Wasser gewaschen, um die Essigsäure zu
entfernen, und anschließend 30 min mit 0.1% AgNO3 inkubiert. Danach wurde mit
wenig Wasser gewaschen und mit Entwickler (3% (w/v) Na2CO3, 0.05% (v/v) 3537%iger Formaldehyd-Lösung) entwickelt, bis die Banden deutlich hervortraten. Mit
1% (v/v) Essigsäure wurde die Entwicklung abgestoppt.
· Hämfärbung nach Goodhew et al. (1986)
Das Gel wurde 30 min in TMBZ Lösung (1.25mM TMBZ in 30% (v/v) Methanol,
70% (v/v) 250mM Natriumacetatpuffer pH 5.0) geschwenkt. Nun wurde 30% H2O2
(Endkonzentration 26 mM) zugegeben und weitere 15 min geschwenkt. Nach zweimaligem Waschen mit 1-Propanol/Acetatpuffer pH 5.0 (30/70 (v/v)) wurde das Gel
foto-grafiert.
Nach der Färbung wurden die Gele entwässert (15 min in 70% (v/v) Ethanol, 3% (v/v)
Glycerin), fotografiert und zwischen Cellophanfolie getrocknet.
25
2 MATERIAL UND METHODEN
Eichprotein
molare Masse (Da)
Phosphorylase B, Kaninchenmuskel
97400
Albumin, Rinder Serum
66200
Ovalbumin, Hühnereieiweiß
45000
Carboanhydrase, Rind
31000
Trypsin Inhibitor, Sojabohne
21500
Lysozym, Hühnereieiweiß
14400
Tab. 2.2
Eichproteine für Gelelektrophorese (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Range, BioRad,
München).
2.4.2.b Gelfiltration
Die molare Masse der Nitrit-Reduktase wurde mittels Gelfiltration an einer SuperdexTM 200
Säule (HiLoadTM 26/60, Pharmacia, Freiburg) bestimmt. Es besteht eine lineare Beziehung
zwischen dem Elutionsvolumen und dem Logarithmus der molaren Masse des Enzyms. Die
Eichung erfolgte unter den Bedingungen wie unter 2.3.5.c beschrieben. Eluiert wurde mit
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 150 mM NaCl.
Eichprotein
molare Masse (Da)
Elutionsvolumen (ml)
Blue Dextran (Ausschlußvolumen)
2000000
109
Thyroglobulin, Rind
669000
112
Apoferritin, Pferdemilz
443000
170
b-Amylase, Süßkartoffel
200000
160
Alkohol-Dehydrogenase, Hefe
150000
170
Albumin, Rinderserum
66000
186
Carboanhydrase, Rindererythrocyten
29000
230
Cytochrom c, Pferdeherz
12400
258
Tab. 2.3
Eichproteine für die Massenbestimmung der Nitrit-Reduktase mittels Gelfiltration an einer SuperdexTM
200 HiLoadTM 26/60 Säule.
26
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.3 Bestimmung des Hämgehaltes
· Alkalische Pyridin-Fe(II)-Methode
Die Anzahl der kovalent an Protein gebundenen Häm-Gruppen wurde nach der alkalischen
Pyridin-Fe(II)-Hämchromogen Technik (Furhop und Smith, 1975) bestimmt. Zu 1.5 ml Proteinprobe (etwa 1-5 µM Hämeisen Endkonzentration in 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05%
Triton X-100, 150 mM NaCl) wurde 0.36 ml 100% Pyridin (2 M Endkonzentration) und
0.18 ml 1 M NaOH (0.08 M Endkonzentration) zugegeben und auf zwei Halbmikroquarzküvetten (1 cm Weglänge, Hellma, München) aufgeteilt. Die Probe in der Referenzküvette
wurde durch Zugabe von 5 µl 10 mM K3[Fe(CN)6] vollständig oxidiert. Die Probe in der
Meß-küvette wurde durch Zugabe weniger Kristalle Na2S2O4 reduziert. Nun wurden im
Abstand von 3 min drei Elektronenanregungsspektren im Bereich von 500 - 600 nm
aufgenommen. Aus diesen Differenzspektren wurde die Absorptionsdifferenz [A (550 nm) A (536 nm)]
ermittelt
und
nach
dem
Lambert-Beerschen
Gesetz
der
Differenzextinktionskoeffizient berechnet. Als Standard diente Rinderherz Cytochrom c.
Bei diesem Verfahren wird die Hämgruppe, nach Denaturierung des Proteins durch Natronlauge,
durch
zwei
Pyridinmoleküle
koordiniert.
Diese
Komplexe
besitzen
eine
charakteristische a-Bande bei 550 nm sowie ein Absorptionsminimum bei 536 nm. Der
Differenzextinktions-koeffizient von Cytochrom c wird nun der Absorption einer Hämgruppe
gleichgesetzt. Die Zahl der Hämgruppen des zu untersuchenden Proteins ergibt sich somit aus
dem Verhältnis der Differenzextinktionskoeffizienten.
· Vergleich der Extinktionskoeffizienten
Die Anzahl der Hämgruppen der NiR wurde durch Vergleich der Extinktionskoeffizienten der
Soretbande der NiR und von Rinderherz Cytochrom c bestimmt. Nach der Reduktion mit
Natriumdithionit wurden die Extinktionskoeffizienten bei 415 nm (Rinderherz Cytochrom c)
und 420 nm (NiR) bestimmt und miteinander verglichen.
27
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.4 Colorimetrische Bestimmung von Ammonium
Ammonium wurde durch Indophenolbildung colorimetrisch nach Chaney und Marbach
(1962) bestimmt. Hierzu wurden folgende Reagenzien und Lösungen benötigt:
Reagenz A: 3 g Phenol und 3 mg Nitroprussidnatrium (Na2[Fe(CN)5NO] × 2H2O) wurden in
Wasser gelöst, auf 100 ml aufgefüllt und bei 4°C im Dunkeln gelagert.
Reagenz B: 2 g NaOH wurden in 80 ml Wasser gelöst. Nach dem Abkühlen wurden 0.5 ml
frische NaOCl-Lösung zugegeben und auf 100 ml aufgefüllt.
Ammonium: Wasserfreies Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4, p.a., >90.5%) wurde 24 h bei 80°C
bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und anschließend im Exsikkator über Trocknungsmittel
und Vakuum abgekühlt.
Eichung: Im Bereich von 0 - 500 nm NH4+ pro Ansatz wurde eine Eichgerade mit wasserfreiem Ammoniumsulfat aufgenommen.
Durchführung: 5 ml Probe, oder eine entsprechende Verdünnung, wurden mit je 1 ml
Reagenz A und Reagenz B versetzt, gemischt und für 60 min bei Raumtemperatur im
Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Absorption der Lösung bei 636 nm gegen einen
NH4+ freien Reagenzienleerwert bestimmt. Durch Vergleich mit der Eichgeraden erhält man
die Stoffmenge Ammonium pro Probe.
NH3
O
O
+
OCl-
+ NH2Cl + 3 OH-
N
+ O
Cl
NH2Cl +
[Fe(CN)5NO]2- 4 eOH- H2O, - Cl-
OH-
O
N
O
N
Cl
Indophenol
Abb. 2.2
Nachweis von Ammonium durch Bildung von Indophenol (Chaney und Marbach, 1962).
28
+ 3 H2O
O
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.5 Colorimetrische Bestimmung von Nitrit
Nitrit wurde mittels Diazotierung unter Verwendung von essigsaurem Sulfanilamid und N1(1-Naphthyl)-ethylendiamin × 2 HCl gemäß der modifizierten Methode nach Griess bestimmt
(Bolz und Taras, 1978).
Reagenz A: Sulfanilamid (0.165 g) wurde in 37.5 ml Wasser gelöst und mit 12.5 ml konz.
Essigsäure versetzt.
Reagenz B: N-1(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid (0.152 g) wurde in 15 ml Wasser
und 18.75 ml konz. Essigsäure gelöst und mit Wasser auf 75 ml aufgefüllt.
Eichung: Im Bereich von 0 - 200 µM Nitrit (0 - 100 nmol Nitrit pro Ansatz) wurde eine
Eichgerade mit wasserfreiem Natriumnitrit (p.a., > 99.5%) aufgenommen.
Durchführung: 0.5 ml Probe, oder eine entsprechende Verdünnung, wurden mit 0.5 ml
Reagenz A und 2.5 ml Reagenz B versetzt und gemischt. Nach 10 min Inkubation bei
Raumtemperatur wurde die Absorption bei 540 nm gegen einen Nitrit-freien Reagenzienleerwert bestimmt.
N2+
NH2
HNO2
+
H+
+
2 H2O
SO2NH2
SO2NH2
N2+
+
N
H
NH2
H2NO2S
- H+
N
N
N
H
SO2NH2
Abb. 2.3
Nitritbestimmung durch Diazotierung und anschließender Azokupplung (Boltz & Taras, 1978).
29
NH2
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.6 Bestimmung von Nitrit und Nitrat mittels HPLC
Nitrit und Nitrat wurden quantitativ mittels einer HPLC-Anlage (Sykam, Gilching) bestimmt.
Diese bestand aus einer Pumpe (Sykam S 1100), einem Gradientenmischer (Sykam S 8110)
und einem UV-Detektor (Sykam S 3300). Getrennt wurde über eine Anionentrennsäule
(Sykam LCA A08). Der Elutionspuffer wurde vor der Verwendung über eine 0.2 µm RCMembran (Vliesverstärkt, Sartorius, Göttingen) filtriert und mit Ultraschall entgast.
Es wurde mit folgendem Laufmittel gearbeitet:
65%
Acetonitril
15%
Methanol
20%
30mM KCl
Die Kompressibilität des Laufmittels wurde zu 0.74 berechnet.
Die Trennung von Nitrit und Nitrat gelang bei einer konstanten Flußgeschwindigkeit von
1.2 ml min-1. Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm. Jeweils 20 µl
Probenvolumen wurde auf die Säule aufgetragen.
Die Eichgerade wurde im Bereich von 0.2 - 20 nmol Nitrit und Nitrat mit wasserfreiem
Natriumnitrit bzw. Natriumnitrat aufgenommen.
30
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.7 Nitrit-Reduktase Aktivität
Die Nitrit-Reduktase Aktivität wurde in einem diskontinuierlichen Test nach einem
modifizierten Verfahren von Liu und Peck (1981) bestimmt. Im ersten Schritt diente
Natriumdithionit-reduziertes Methylviologen als Elektronendonor für die enzymkatalysierte
Umsetzung von Nitrit zu Ammonium. Im zweiten Schritt wurde dann das gebildete
Ammonium colorimetrisch nach Chaney und Marbach (1962) bestimmt. Die Enzymmenge,
die für die Umsetzung von 1 µmol NO2- zu NH4+ pro Minute notwendig war, entspricht 1
Unit.
Der Test (Reaktionsvolumen 1.0 ml) wurde bei 37°C in Eppendorf-Reaktionsgefäßen durchgeführt (Doppelbestimmungen).
Nitrit (100 mM in 125 mM KPi pH 7.6, 7.5 mM Endkonzentration), Methylviologen (10 mM
in Wasser, 0.5 mM Endkonzentration) und eine entsprechende Proteinmenge (0.07 - 0.15 U)
wurden mit 125 mM KPi-Puffer, pH 7.6 auf 950 µl aufgefüllt und für 5 min bei 37°C
vorinkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 50 µl frisch angesetzter
Natriumdithionit-Lösung (250 mM in 10 mM NaOH) gestartet. Nach 5 min wurde die
Reaktion durch Zugabe von 200 µl Schwefelsäure (1 M) abgestoppt (Entfärbung der Ansätze)
und aus einem Aliquot (150 µl) colorimetrisch Ammonium bestimmt. Zur Bestimmung der
Nullrate diente ein identisch behandelter Reaktionsansatz mit einer mittleren Proteinmenge,
dem das Reduktionsmittel erst nach dem Abstoppen der Reaktion zugegeben wurde.
S2O42-
H3C
2 SO2 -
+
N
+
N
CH3
2 H2O
e-
2 HSO3-
H3C
2 e-
CH3
MVred
+
N
N
+
+
N
N
MVox
Fe(III) + H C
3
2 H+
+
Fe(II) + H3C
CH3
+
N
+
N
MVox
MVred
Abb 2.4
Nitrit-Reduktase Aktivitätstest (Schumacher, 1993).
31
CH3
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.8 Isoelektrische Fokussierung
Die Isoelektrische Fokussierung ( = Elektrofokussierung) ist eine Trennmethode der Elektrophorese, bei der amphotere, geladene Teilchen (z.B. Proteine, Aminosäuren) im elektrischen
Feld durch einen pH-Gradienten bis zu dem pH-Wert wandern, an dem ihre Nettoladung null
ist. Dieser pH-Wert ist der Isoelektrische Punkt (pI) des Teilchens. Der Isoelektrische Punkt
ist eine charakteristische Größe für das Teilchen (Falbe, 1995).
Die Bestimmung des pI-Wertes der Nitritreduktase wurde mit einem PhastSystemÔIEF
(Pharmacia, Freibung) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Proteine wurden mit
einem PhastGel (IEF 3 - 9) im Bereich pH 3 - 9 getrennt.
Nach einer Silberfärbung der Proteine konnte der pI durch Vergleich mit Standardproteinen
(Tab. 2.4) ermittelt werden.
Eichproteine
Isoelektrischer Punkt
Cytochrom c
9.60
a-Chymotrypsin
8.80
Myoglobin, Wal
8.05
Myoglobin, Pferd
7.0
Carboanhydrase, Mensch
6.50
Carboanhydrase, Rind
6.0
b-Lactoglobulin B
5.10
Phycocyanin
4.65
Tab. 2.4
Standardproteine zur Ermittlung des Isoelektrischen Punktes (IEF Standards, Broad Range
pI 4.6 - 9.6, BioRad, München).
32
2 MATERIAL UND METHODEN
2.4.9 Aminoterminale Sequenzierung
Zur NH2-terminalen Aminosäuresequenzierung wurde die Nitritreduktase wie folgt behandelt:
Die Nitritreduktase wurde auf einem 12.5%-igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf
eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran (0.2 µm, BioRad, München) transferiert. Die
PVDF-Membran wurde nach Vorschrift des Herstellers vorbereitet und der Proteintransfer bei
150 mA (etwa 2 h, 8°C) durchgeführt. Anschließend wurde die Blotmembran 5 - 10 min
gefärbt (0.1% Coomassie, 50% Methanol, 7.5% Essigsäure) und zur Kontrastverstärkung mit
50% Methanol entfärbt. Die Transfermembran wurde getrocknet und die Proteinbanden (etwa
400 pmol Protein) ausgeschnitten. Die Probenaufbereitung erfolgte durch Herrn Klaus Sulger.
Die Aminosäureanalysen wurden durch Herrn L. Cobianchi (Universität Konstanz) an einem
Protein Sequenzierer (Applied Biosystems 477A) nach Vorschrift des Herstellers
durchgeführt.
2.5 Spektroskopische Methoden
2.5.1 Elektronenanregungsspektroskopie
UV/Vis-Spektren wurden von 250 - 800 nm mittels eines PE Lambda 16 Spektrophotometers
(Perkin Elmer, Überlingen) in Halbmikroquarzküvetten (Weglänge 1 cm, Hellma, München)
gemessen. Als Referenz diente die entsprechende Pufferlösung. Differenzspektren ergaben
sich durch Subtraktion der entsprechenden Originalspektren mit dem Computer.
Die Proteinbestimmungen wurden mit einem HP Diodenarray-Spektrophotometer 8452 A
(Hewlett Packard, Stuttgart) durchgeführt.
33
2 MATERIAL UND METHODEN
2.5.2 Elektronen Paramagnetische Resonanz (EPR) Spektroskopie
Die EPR-Spektren wurden mit einem ESP 300-Spektrometer (Bruker, Karlsruhe) gemessen.
An das Spektrometer waren eine Mikrowellenbrücke ER 041 MR und ein NMR-Gaußmeter
ER 035 zur Messung der Magnetfeldstärke angeschlossen. Die Temperierung erfolgte durch
das Helitran-System LTD-3-110 C (Air Products, Allentown, USA), die Temperaturmessung
mit dem ADP-Tl-Thermometer. Die Mikrowellenfrequenz betrug ca. 9.5 GHz (X-Band) und
wurde über einen Autohet Counter Model 350 D (Dana Electronics, Darmstadt) kontrolliert.
Modulationsfrequenz und Modulationsamplitude betrugen bei allen Messungen 100 kHz bzw.
0.774 mT. Die Proben waren in Suprasil-Quarzröhrchen (Innendurchmesser 3 - 4 mm,
V = 250 ml) in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die g-Werte berechneten sich nach:
g = h×n/(b×H)
h = 6.6262 × 10-34 J × s (Planck’sches Wirkungsquantum)
n = Mikrowellenfrequenz in Hz
b = 9.274096 × 10-24 J/T (Bohr’sches Magneton)
H = Magnetfeld unter Resonanzbedingungen in Tesla (T)
34
3 ERGEBNISSE
3 ERGEBNISSE
3.1 Anzucht von Desulvovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
Zur Gewinnung der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans (NiR) wurden mehrere
20 l-Kulturen angezogen. Im Durchschnitt konnten etwa 17 g Zellen (Naßgewicht, 0.85 g/l
Medium) gewonnen werden. In Abbildung 3.1 ist eine typische Wachstumskurve dargestellt.
Man erkennt ein lineares Wachstum der Bakterienkultur. Eine exponentielle Wachstumsphase
wurde nicht beobachtet. Die Abnahme der Nitratkonzentration und die Zunahme der
Ammoniumkonzentration im Medium waren ebenfalls linear. Während der Anzucht der
Bakterien wurde kein Nitrit im Medium nachgewiesen.
1,4
26
24
22
20
1,0
16
0,8
12
0,6
8
0,4
6
4
0,2
2
0
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
Zeit [h]
Abb. 3.1
Wachstumskurve von Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774).
85 mM Natrium-DL-Lactat, 35 mM NaNO3, 1g l-1 Hefe-Extrakt, 35°C.
(¾¾ Nitrat, ¾¾ Nitrit, ¾¾ Ammonium, ¾¾ OD 578 nm)
35
80
90
100
-
10
-
14
+
18
NH4 /NO2 /NO3 [mM]
Optische Dichte
1,2
3 ERGEBNISSE
3.2 Reinigung der membrangebundenen Cytochrom c
Nitritreduktase
Ausgehend von den Reinigungsprotokollen von Liu und Peck (1981), Pereira et al. (1996)
und Schumacher (1993) für die Nitritreduktasen aus Desulfovibrio desulfuricans,
Sulfurospirillum deleyianum und Wolinella succinogenes wurde ein neues Verfahren zur
Reinigung des Enzyms aus D. desulfuricans erarbeitet.
Mit 37 g Zellen wurde das Reinigungsprotokoll (Abb. 2.1) erarbeitet. Es wurde mit den
Detergenzien Cholat, SB12 und Triton X-100 solubilisiert, mit verschiedenen Puffersystemen
(0.1 M KPi pH 7.6, 20 mM Tris-HCl pH 8.3) und mit unterschiedlichen Säulen (DE52, HAP,
MonoQ, Superdex) gearbeitet.
3.2.1 Rohextrakt, Cytoplasmaextrakt und Membranextrakt
Aus 17 g Zellen wurden 1890 mg Protein gereinigt. Die spezifische Nitritreduktaseaktivität
des Rohextraktes betrug 6.8 U mg-1 Protein. Nach der Trennung in Cytoplasmaextrakt und
Membranextrakt befanden sich etwa 60% der Nitritreduktaseaktivität im Membranextrakt.
Die Membranen enthielten etwa 30% der Proteinmenge des Rohextraktes. Nach dem
Waschen
der
Membranen
mit
20 mM
Tris-HCl
pH 8.3
wurde
im
Puffer
Nitritreduktaseaktivität nach-gewiesen. Eine Reinigung der löslichen Form der NiR aus dem
Cytoplasmaextrakt und den Waschpuffern wurde nicht durchgeführt.
3.2.2 Solubilisation
Bei der Solubilisation mit verschiedenen Detergenzien zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit der Solubilisation. Die Gesamtaktivität nach der
Solubilisation entsprach in allen Fällen der eingesetzten Aktivität des Membranextraktes.
Jedoch löste Triton X-100 bevorzugt die NiR. Besonders die im Membranextrakt
dominierenden Proteinbanden bei etwa 50 kDa, 46 kDa und 16 kDa (SDS-PAGE) traten im
Triton X-100 Solubilisat nicht auf (Abb. 3.4).
36
3 ERGEBNISSE
Die spezifische Nitritreduktaseaktivität des Solubilisats betrug 64 U mg-1 Protein. Die
solubilisierte Proteinmenge entsprach etwa 1/3 der eingesetzten Gesamtproteinmenge der
Membranen.
3.2.3 Anionenaustauscher DE52
Als ersten Reinigungsschritt wurde eine Anionenaustauschchromatographie mit dem relativ
weichen Anionenaustauscher DEAE Zellulose durchgeführt. Das Triton X-100 Solubilisat aus
Kap. 3.2.2 wurde auf die DE52 Säule aufgetragen, der Durchlauf aufgefangen. Anschließend
wurde mit einem Kochsalzgradienten eluiert.
Etwa 40% der aufgetragenen Proteinmenge und 90% der Nitritreduktaseaktivität befanden
sich im Durchlauf. Die restliche Proteinmenge konnte während der Elution mit einem
Kochsalz-gradienten aufgefangen werden.
Die spezifische Nitritreduktaseaktivität des Durchlaufes betrug 205 U mg-1 Protein.
3.2.4 Anionenaustauscher MonoQÒ HR5/5
Nachdem sich die NiR im Durchlauf der DE52 Säule befand, wurde im zweiten Reinigungsschritt der härtere Anionenaustauscher MonoQ verwendet, um das Protein auf der Säule zu
binden. Die NiR eluierte bei 30 - 50 mM NaCl (Abb. 3.2).
Die spezifische Nitritreduktaseaktivität dieser Fraktionen betrug 610 U mg-1 Protein. Bezogen
auf die eingesetzte Gesamtaktivität betrug die Ausbeute etwa 40%.
Auch im Durchlauf der MonoQ-Säule und in den Fraktionen mit höherer Salzkonzentration
wurde Nitritreduktaseaktivität nachgewiesen. In der Summe betrug sie jedoch weniger als
10% der eingesetzten Aktivität.
Bei der Kontrolle des Reinigungsschrittes mit SDS-PAGE zeigten sich noch zusätzliche
Proteinbanden bei etwa 45 und 31 kDa (Abb. 3.4). Deshalb wurde noch ein weiterer Reinigungsschritt durchgeführt.
37
3 ERGEBNISSE
100
60
40
NaCl [mM]
Absorption
80
20
0
10
20
30
40
0
Elutionsvolumen [ml]
Abb. 3.2
Elutionsprofil der Cytochrom c Nitritreduktase am Anionenaustauscher MonoQ mit steigendem NaClGradient von 0 - 100 mM NaCl. Aufgetragen wurde der Durchlauf der DE-52 Anionenaustauschersäule. Die Fraktionen des grau unterlegten Bereiches wurden vereinigt (¾¾ 280 nm, ¾¾ 405 nm,
¾¾ NaCl).
3.2.5 Größenausschlußchromatographie Superdex 200
Zur Bestimmung der Molekularmasse der NiR (Kap. 3.3.2) und zur weiteren Reinigung
wurden die MonoQ Fraktionen mit 30 -50 mM NaCl (Abb. 3.2) auf etwa 1 ml eingeengt und
auf eine SuperdexTM 200 HiLoadTM 26/60 Gelfiltrationssäule aufgetragen.
Die NiR eluierte bei einem Volumen von 136 ml. Die spezifische Aktivität betrug 530 U mg-1
Protein. Etwa 80% der eingesetzten Proteinmenge konnten wieder zurückgewonnen werden.
Die Kontrolle mit SDS-PAGE (Abb. 3.4) zeigte nun zwei Banden, eine bei 60.4 kDa und eine
bei 17.5 kDa.
Im Elutionsprofil (Abb. 3.3) tritt noch eine Bande bei einem Elutionsvolumen von etwa
160 ml und einer starken Absorption bei 280 nm auf. Jedoch konnte mit SDS-PAGE in diesen
kein Protein nachgewiesen werden.
38
Absorption
3 ERGEBNISSE
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Elutionsvolumen [ml]
Abb. 3.3
Elutionsprofil der Cytochrom c Nitritreduktase an einer Superdex 200 Säule. Aufgetragen wurden die
Fraktionen mit Nitritreduktaseaktivität aus der MonoQ Säule. Die Fraktionen des grau unterlegten
Bereiches wurden vereinigt (¾¾ 280 nm, ¾¾ 405 nm).
3.2.6 Reinigungsbilanz
Die Reinigungsbilanz der NiR aus der Membranfraktion von D. desulfuricans ist in Tabelle
3.1 zusammengefaßt. Aus 17 g Zellmaterial (Naßgewicht) wurden 6.1 mg NiR mit einer
spezifischen Aktivität von 528 U mg-1 Protein isoliert.
39
3 ERGEBNISSE
Reinigungsstufe
Protein-
Spezifische
Gesamt-
Ertrag
Reinigungs-
menge
Aktivität
aktivität
[%]
faktor
[mg]
[U mg-1]
[U]
Rohextrakt
1890
6.8
12852
100
1.0
Cytoplasmaextrakt
1248
3.4
4243
33
0.5
Membranextrakt
500
14.6
7306
57
2.1
Solubilisat
171
63.9
10927
85
9.4
DE52
64.0
205
13093
102
30.1
MonoQ
7.6
612
4651
36
90.0
Superdex 200
6.1
528
3244
25
77.6
Tab. 3.1
Bilanz der Reinigung der Cytochrom c Nitritreduktase aus 17 g D. desulfuricans Zellen.
40
3 ERGEBNISSE
3.3 Charakterisierung der membrangebundenen Cytochrom c
Nitritreduktase
3.3.1 Bestimmung der Molekularmasse mit SDS PAGE
Die Molekularmasse der membranständigen NiR wurde mittels SDS-PAGE unter
reduzierenden Bedingungen ermittelt. Durch Vergleich mit relativen Mobilitäten der
Standardproteine wurde die Molekularmasse zu 60.4 ± 3.2 kDa (große Untereinheit) und
17.5 ± 0.8 kDa (kleine Untereinheit) bestimmt.
Abb. 3.4
SDS-PAGE der Reinigung der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans. Silberfärbung nach
Rabilloud (1990).
M: Markerproteine: 1 Rohextrakt (30 µg), 2 Cytoplasmaextrakt (30 µg), 3 Membranextrakt (20 µg),
4 Solubilisat (10 µg), 5 Durchlauf DE52 (12 µg), 6 nach MonoQ (5 µg), 7 nach Superdex 200 (5 µg).
41
3 ERGEBNISSE
1
100
NiR
60.4 kDa
Mr [kDa]
2
3
4
5
6
NiR
17.5 kDa
10
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Rf
Abb. 3.5
Bestimmung der Molekularmasse der Cytochrom c Nitritreduktase durch SDS-PAGE unter
reduzierenden Bedingungen.
Standardproteine: 1 Phosphorylase B (97.4 kDa), 2 Serum Albumin (66.2 kDa),
3 Ovalbumin (42.7 kDa), 4 Carboanhydrase (31.0 kDa), 5 Trypsininhibitor der Sojabohne (21.5 kDa),
6 Lysozym (14.4 kDa) ( Standardproteine, ¾¾ Lineare Regression).
3.3.2 Bestimmung der Molekularmasse durch Gelfiltration
Während der Reinigung der NiR wurde ihre Molekularmasse unter nichtreduzierenden Bedingungen durch Gelfiltration an einer Superdex 200 Säule (20 mM Tris-HCl pH 8.3 0.05%
Triton X-100 150 mM NaCl) zu 365 ± 11 kDa bestimmt (Abb. 3.6).
42
3 ERGEBNISSE
1000
1
Mr [kDa]
2
3
NiR
365 kDa
4
100
5
6
7
10
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Elutionsvolumen [ml]
Abb. 3.6
Bestimmung der Molekularmasse der Cytochrom c Nitritreduktase durch Gelfiltration unter nichtreduzierenden Bedingungen (20 mM Tris-HCl pH 8.3 0.05% Triton X-100 150 mM NaCl).
Standardproteine: 1 Thyroglobulin (669 kDa), 2 Apoferritin (443 kDa), 3 ß-Amylase (200 kDa),
4 Alkohol-Dehydrogenase (150 kDa), 5 Serum Albumin (66 kDa), 6 Carboanhydrase (29 kDa),
7 Cytochrom c (12.4 kDa) ( Standardproteine, ¾¾ lineare Regression).
3.3.3 Elektronenanregungsspektren
Das Elektronenanregungsspektrum der NiR aus D. desulfuricans ist typisch für ein c-Typ
Cytochrom. Im oxidierten (wie präparierten) Zustand zeigen sich Absorptionsmaxima bei
280, 409 und 531 nm, nach Zugabe von Natriumdithionit sind Maxima bei 420, 523 und
552 nm sowie eine Schulter bei 533 nm erkennbar.
43
3 ERGEBNISSE
420 nm
409 nm
0,4
552 nm
0,08
0,07
523 nm
533 nm
0,06
0,05
0,3
Absorption
0,04
0,03
531 nm
0,2
0,02
0,01
0,1
0,00
357 nm
0,0
300
500
400
525
550
500
575
600
600
625
650
700
Wellenlänge [nm]
Abb. 3.7
Elektronenanregungspektrum der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans, 0.038 mg ml-1 in
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 150 mM NaCl (Superdex-Reinigungsstufe).
(¾¾ reduziert mit Na2S2O4, ¾¾ oxidiert, wie präpariert).
0,25
423 nm
0,20
Absorption
0,15
0,10
552 nm
0,05
523 nm
0,00
-0,05
-0,10
400
425
450
475
500
525
550
575
600
625
650
Wellenlänge [nm]
Abb. 3.8
Differenzspektrum (Na2S2O4-reduziert minus oxidiert, wie präpariert) der Cytochrom c Nitritreduktase
aus D. desulfuricans, 0.038 mg ml-1 in 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 150 mM NaCl.
44
3 ERGEBNISSE
3.3.4 Elektronen Paramagnetische Resonanz Spektren
Die NiR zeigt ein komplexes EPR-Spektrum (Abb. 3.9). Deutlich zu erkennen sind Resonanzen bei g = 5.19, 4.31, 3.93, 3.58, 3.14, 2.95, 2.27, 2.07 und 1.50, ferner ein scharfes
Signal bei g » 2.01. Die Linien bei g = 2.95, 2.28 und 1.50 sind charakteristisch für low-spin
Häm Fe(III). Über die Formel von Griffith (1971, gx2 + gy2 + gz2 » 16) sind diese Signale
miteinander verknüpft. Das Signal bei g = 2.01 deutet auf eine Verunreinigung der Probe
durch ein Fe/S-Protein hin. Das Signal bei g = 4.31 stammt von unspezifisch koordiniertem
Fe(III).
Die Signale bei g = 3.93 und 3.14 sind auf high-spin/low-spin-Häm Wechselwirkungen im
Molekül zurückzuführen (Schumacher et al. 1994, 1997, Moura et al., 1997).
2.95
3.14
2.272.07
2.01
1.50
3.58
5.19
4.31
3.93
100
150
200
250
300
350
400
450
Magnetfeld [mT]
Abb. 3.9
EPR Spektrum der Cytochrom c Nitritreduktase von D. desulfuricans, wie isoliert (oxidiert), 225 µM in
20 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.05% Triton X-100, 150 mM NaCl.
45
3 ERGEBNISSE
(Aufnahmebedingungen: Temperatur: 10 K, Frequenz: 9.66 GHz, Mikrowellenleistung: 2.0 mW,
Modulationsamplitude: 0.774 mT, Modulationsfrequenz: 100 kHz).
3.3.5 Bestimmung des Hämgehaltes
Nach einer Auftrennung der NiR mit SDS-PAGE wurde mit dem Gel eine Hämfärbung
durchgeführt. Sowohl die Banden der großen (60.4 kDa) als auch der kleinen Untereinheit
(17.5 kDa) zeigten die für Hämgruppen charakteristische blaue Färbung.
Der Hämgruppengehalt der NiR wurde nach zwei Methoden bestimmt, für die Berechnungen
wurde zum einen die minimale Molekularmasse von 60.4 kDa (analog zu Liu und Peck, 1981)
und zum anderen die Molekularmasse eines hypothetischen 1:1-Komplexes (77.9 kDa) aus
großer und kleiner Untereinheit verwendet.
· Alkalische Pyridin Fe(II)-Hämchromogentechnik (Furhop und Smith, 1975)
Es wurden 4.3 ± 0.2 mol Häm/mol NiR (n = 3, Mr = 60.4 kDa) bzw. 5.7 ± 0.2 mol
Häm/mol NiR (Mr = 77.9 kDa) gefunden.
Protein
Mr
De (550-536)
Anzahl der Hämgruppen
[kDa]
[mM-1 cm-1]
pro Molekül
Rinderherz Cytochrom c
14.4
23.6
1
NiR
60.4
104.5
4.3 ± 0.2
NiR
77.9
139.7
5.7 ± 0.2
Tab. 3.2
Bestimmung der Anzahl der Hämgruppen der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans nach
der alkalischen Pyridin Fe(II) Hämchromogenmethode (Furhop und Smith, 1975).
· Vergleich der Extinktionskoeffizienten bei 420 bzw. 415 nm
Es wurden 4.4 ± 0.1 mol Häm/mol NiR (n = 3, Mr = 60.4 kDa) bzw. 5.8 ± 0.1 mol
Häm/mol NiR (Mr = 77.9 kDa) gefunden.
46
3 ERGEBNISSE
Protein
e (420/415 nm) Anzahl der Hämgruppen
Mr
[kDa]
[M-1 cm-1]
pro Molekül
Rinderherz Cytochrom c
14.4
1.48 105
1
NiR
60.4
6.52 105
4.4 ± 0.1
NiR
77.9
8.51 105
5.8 ± 0.1
Tab. 3.3
Bestimmung der Anzahl der Hämgruppen der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans durch
Vergleich der Extinktionskoeffizienten bei 415 nm (Rinderherz Cytochrom c) und 420 nm (NiR).
3.3.6 Isoelektrische Fokussierung
Es wurden Proben der NiR der MonoQ und der Superdex Reinigungsstufe verwendet. Von
Frau Petra Stach wurde mir eine Präparation der NiR nach Liu und Peck (1981) zur
Verfügung gestellt.
Der Versuch der Bestimmung des pI der Nitritreduktase (MonoQ und Superdex 200
Reinigungsstufe, 20 mM Tris-HCl pH 8.3 0.05% Triton X-100 30 - 40 bzw. 150 mM NaCl)
mit dem IEF-Phastsystem schlug fehl, da die NiR nicht im elektrischen Feld wanderte
sondern an der Auftragstelle verblieb.
Bei der nach Liu und Peck (1981) präparierten NiR (100 mM KPi pH 7.5) konnte der pI zu
etwa pH 6.0 bestimmt werden. Die Auswertung erwies sich als schwierig, da die Standards
nach der Silberfärbung nur sehr schwer zu erkennen waren.
47
3 ERGEBNISSE
3.3.7 Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz
Vom N-Terminus der NiR aus D. desulfuricans wurden mit der Edman-Methode sechs
Aminosäuren bestimmt (Abb. 3.10) Die erste Aminosäure konnte nicht eindeutig zugeordnet
werden und ist deshalb mit X bezeichnet, die achte Aminosäure ist unsicher und ebenfalls in
Klammern gesetzt. Bisher sind keine Aminosäuresequenzen der NiR aus D. desulfuricans
bekannt. Von O. Einsle (pers. Mitteilung) stammt die fragmentarische Sequenz die in Abb.
4.2 wiedergegeben ist.
1
2
3
4
5
6
7
8
X
Q
D
V
K
K
K
(D)
Gln
Asp
Val
Lys
Lys
Lys
(Asp)
Abb. 3.10
N-terminale Aminosäuresequenz der Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans.
48
4 DISKUSSION
4 DISKUSSION
4.1 Anzucht von D. desulfuricans (ATCC 27774)
D. desulfuricans wurden routinemäßig bei 35°C unter N2/CO2 mit Nitrat als terminalen
Elektronenakzeptor und DL-Lactat als Elektronendonor kultiviert. Der durchschnittliche
Ertrag von 0.85 g Zellen (Naßgewicht) pro Liter Medium ist etwa halb so groß wie der Ertrag
(1.88 g Naßgewicht pro Liter Medium) bei Liu und Peck (1981). Unter den gewählten Bedingungen wurde stets eine lineare Wachstumskurve beobachtet (Abb. 3.1), eine
exponentielle Wachstumsphase ist nicht zu erkennen. Zum Zeitpunkt der Ernte, nach etwa
vier Tagen, lag die Konzentration von Nitrat im Medium bei etwa 8 mM. Das Medium
enthielt somit noch genügend Nitrat für ein weiteres Wachstum der Bakterien. Eine
Begrenzung des Wachstum könnte durch die hohe Konzentration des Entkopplers
Ammonium (24 mM nach vier Tagen) oder durch einen Lactatmangel bedingt sein. Die
Lactatkonzentration im Medium wurde nicht bestimmt.
Im Medium wurde während der gesamten Anzucht kein Nitrit gefunden. Nach Bursakov
(1997) ist die spezifische Aktivität der periplasmatischen Nitratreduktase (NAP) aus
D. desulfuricans etwa um den Faktor 30 geringer als die spezifische Aktivität der in dieser
Arbeit beschriebenen NiR. Das im Cytoplasma entstehende Nitrit wird von der NiR
umgesetzt, bevor es sich im Medium anreichern kann.
Andere Bakterien zeigen beim Wachstum auf Nitrat das Phänomen der Diauxie. Sulfurospirillum deleyianum reduziert zunächst stöchiometrisch Nitrat zu Nitrit (Schumacher, 1993).
Dies deutet darauf hin, daß Nitrat entweder die Synthese der Nitritreduktase reprimiert oder
die Nitritreduktion inhibiert (Cole, 1988). Die Akkumulation von Nitrit beeinflußt den
Stoffwechsel der Bakterien insoweit, als Nitrit mit Zellbestandteilen reagiert (Abb. 4.1).
Bei D. desulfuricans wird die NiR auch in Zellen exprimiert, die auf Sulfat gezogen wurden
(Peck, 1984; G. Fritz, pers. Mitteilung). Es ist deshalb wahrscheinlich, daß das Gen der NiR
unabhängig vom Gen der Nitratreduktase exprimiert wird. Eine Hemmung der Expression des
Genes der Nitritreduktase durch Nitrat ist nicht wahrscheinlich.
49
4 DISKUSSION
R NH2
A
+
HNO2
primäres Amin
- H2O
R N N OH
Diazoniumverbindung
NO2-
N
N
N
Desaminierung
O
N
H
H
Cytosin
R1 N R2
H
C
+
N N
Desaminierungsprodukt
O
NH2
B
R OH
H
O
Uracil
+
HNO2
R1 N R2
N O
- H2O
sekundäres Amin
N-Nitrosamin
Abb. 4.1
Mögliche Reaktionen von Nitrit mit Zellkomponenten.
A: Desaminierung von primären Aminen (z.B. Aminosäuren).
B: Mutagene Wirkung der Desaminierung.
C: Bildung von Nitrosaminen.
4.2 Reinigung der Cytochrom c Nitritreduktase aus
D. desulfuricans
Nach der Anzucht der Bakterien wurden die Zellen mit einer French Presse aufgebrochen und
der so entstandene Rohextrakt in Membran- und Cytoplasmafraktion aufgetrennt. Nach dem
Waschen der Membranen war im Waschpuffer Nitritreduktaseaktivität nachzuweisen. Es liegt
deshalb die Vermutung nahe, daß es sich bei der NiR um ein membranassoziiertes Protein
handelt. Beim rigiden Aufschluß der Zellen in der French Presse wird viel NiR von den
Membranen abgelöst und geht in den Cytoplasmaextrakt über. Die NiR in D. desulfuricans
liegt deshalb nur in einer membranassoziierten Form vor, die leicht von den Membranen
abgelöst werden kann. Aus anderen Bakterien z.B. S. deleyianum (Schumacher, 1993; Schumacher et al., 1994) wurde neben der membrangebundenen Form der Nitritreduktase auch
eine lösliche Nitritreduktase isoliert. Beide Formen der Nitritreduktase zeigen ähnliche Eigenschaften (Tab. 4.2).
50
4 DISKUSSION
Mit den Methoden von Liu und Peck (1981) und Pereira et al. (1996) war es möglich, die
Nitritreduktase aus den Membranen herauszulösen. Die verwendeten Detergenzien (Cholat
bzw. SB12) sind ionischer Natur. Nach dem ersten Reinigungsschritt (Chromatographie an
DE52) war die Nitritreduktase im Durchlauf zu finden. Der zweite Schritt (Chromatographie
an Hydroxylapatit) brachte keine Verbesserung. Das Problem lag vermutlich an der ionischen
Natur der Detergenzien. Die NiR eluierte in unterschiedlichen Ladungs- oder Aggregationszuständen, die mit SDS-PAGE nicht unterscheidbar waren. Ein Detergenzwechsel hin zu
einer nichtionischen Substanz erschien angebracht. Nach Bindung des Proteins an eine
MonoQ Säule konnte das Detergenz, durch Spülen mit einem Triton X-100 haltigen Puffer,
gewechselt werden. Die NiR eluierte unter diesen Bedingungen bei 30 - 50 mM NaCl als eine
Bande von der MonoQ Säule.
Mit diesen Erfahrungen konnte nun das Reinigungsprotokoll erstellt werden. Es gelang, die
NiR mit Triton X-100 zu solubilisieren. Nach dem ersten Reinigungsschritt befand sich die
NiR im Durchlauf der DE52 Säule. Im zweiten Schritt wurde die NiR bei pH 8.3 auf eine
MonoQ Säule gebunden und mit einem flachen NaCl Gradienten eluiert. Die spezifische
Aktivität der so erhaltenen NiR war mit 610 U mg-1 etwa doppelt so hoch wie bei Liu und
Peck (1981) beschrieben. Die Reinigung über die MonoQ kann noch verbessert werden, da
nur etwa 40% der aufgetragenen Aktivität zurückgewonnen wurde. Die spezifische Aktivität
der Nitrit-reduktase nach der abschließenden Gelfiltration betrug 528 U mg-1.
In Tab. 4.1 ist die in dieser Arbeit beschriebene Reinigung mit der Reinigung von Liu und
Peck (1981) verglichen.
Die Ausbeute ist mit 0.4 mg NiR pro 1 g Zellen nur etwa 1/3 so groß wie bei Liu und Peck
(1981) beschrieben. Dies liegt vor allem am MonoQ Reinigungsschritt (Tab. 3.1). Die
Protein-mengen im Rohextrakt und im Membranextrakt sind etwa halb so groß wie bei Liu
und Peck (1981).
Der Vorteil des neuen Reinigungsverfahrens liegt in der Zeitersparnis. Dies ist wichtig zur
Vermeidung einer Denaturierung des Proteins, was sich nachteilig auf die spezifische
Aktivität und auf zukünftige Kristallisationsexperimente auswirken könnte. Nach Liu und
Peck (1981) werden etwa 6-7 Tage für die Reinigung benötigt, mit dem in dieser Arbeit
beschriebenen Verfahren dauert die Reinigung maximal 2-3 Tage.
51
4 DISKUSSION
Liu und Peck,
1981
Protein Aktivität
[mg]
[U]
spez.
diese Arbeit
Aktivität
Protein Aktivität
[mg]
[U]
[U mg-1]
spez.
Aktivität
[U mg-1]
Rohextrakt
203
1258
6.2
Rohextrakt
111
756
6.8
Membranextrakt
60
680
11.3
Membranextrakt
29
430
14.6
Cholat-Solubilisat
8.0
767
95.3
Triton-Solubilisat
10
643
63.9
(NH4)2SO4-Fällung
2.5
708
282
DE52
3.8
770
205
Ultrogel ACA-32
1.7
590
345
MonoQ
0.5
274
612
Superdex 200
0.4
191
528
Tab 4.1
Vergleich der Reinigung der Cytochrom c Nitritreduktase mit Liu und Peck (1981), normiert auf 1 g
Zellen.
4.3 Charakterisierung der Cytochrom c Nitritreduktase aus
D. desulfuricans
4.3.1 Biochemische Charakterisierung
· Molekulare Masse
Die Gelelektrophorese der NiR nach der Chromatographie an MonoQ zeigte zwei dominierende Banden bei 60.4 kDa und 17.5 kDa, in Einklang mit Pereira et al. (1996) und Moura
et al. (1997). Gelfiltration an einer Superdex 200 Säule führte zu keiner Auftrennung der NiR.
Die NiR eluierte unter den nichtreduzierenden Bedingungen der Gelfiltration als ein Komplex
mit einer Molekularmasse von etwa 365 kDa.
Liu und Peck (1981) isolierten eine Nitritreduktase, die nur aus einer Untereinheit (Mr
66 kDa) besteht. Pereira et al. (1996) fanden zwei Untereinheiten mit den Massen 62 kDa und
18.8 kDa. Moura et al. (1997) fanden mit Elektrospray-Massenspektrometrie 62 kDa und
19 kDa.
52
4 DISKUSSION
Die Tendenz zur Komplexbildung oder zur Aggregation des Proteins wird bei Pereira et al.
(1996) erwähnt. Die Molekularmasse der aggregierten NiR wird dort mit ungefähr 750 kDa
angegeben. Dies ist etwa doppelt so groß wie in dieser Arbeit bestimmt.
· Enzymaktivität
Die spezifische Aktivität der Nitritreduktase wurde mit dem oben beschriebenen Verfahren
um den Faktor 80 (Superdex-Reinigungsstufe) gesteigert. Sie liegt um etwa das 1.5-fache
über den Werten von Liu und Peck (1981). Die etwas geringere Aktivität der NiR nach der
Gelfiltration im Vergleich zum Enzym nach der Chromatographie an MonoQ könnte auf die
Bildung von denaturiertem Protein zurückzuführen sein. Im EPR-Spektrum ist ein für
unspezifisch koordiniertes Eisen(III) typisches Signal bei g » 4.31 zu erkennen. Auch denkbar
ist der (teilweise) Verlust eines Kofaktors oder ein methodisch bedingter Fehler der
Proteinbe-stimmung.
· Spektroskopische Parameter
Die Elektronenanregungsspektrum der NiR im oxidierten als auch im reduzierten Zustand
sind typisch für c-Typ Cytochrome. Aus der zweiten Ableitung des Spektrums der reduzierten
NiR erkennt man, daß die a- und die b-Absorptionsbanden jeweils nur aus einer Bande bei
552 bzw. 523 nm bestehen. Die Soret-Bande resultiert aus der Überlagerung zweier Maxima
bei 419 und 426 nm. Bei 533 nm tritt eine deutlich erkennbare Schulter auf. Die Absorptionsbanden bei 419 und 550 nm können low-spin Fe(II) Hämen zugeordnet werden (Wood,
1984). Die Bande bei 427 nm werden high-spin Fe(II)-Zentren zugeordnet (Adachi et al.,
1993). Eine weitere high-spin Fe(II)-Bande bei etwa 555 nm ist nicht sichtbar.
Das EPR-Spektrum der oxidierten (wie präparierten) NiR zeigte ein Vielliniensignal
(Abb. 3.9). Die Signale mit g-Werten von 2.95, 2.27 und 1.50 werden low-spin Häm-Fe(III)
zugeordnet (Schumacher et al., 1994, 1997; Moura et al., 1997). Anhand von detaillierten
Mössbauer- und EPR Untersuchungen schlagen Moura et al. (1997) vor, daß die NiR im
oxidierten Zustand fünf low-spin Häme-Fe(III) und ein high-spin Häm-Fe(III) enthält. Vier
der sechs Häme sind magnetisch gekoppelt, was auf nahe beieinanderliegende Hämgruppen
hin-deutet. Von diesen Hämgruppen sind jeweils zwei Spin-Spin gekoppelt (Moura et al.,
53
4 DISKUSSION
1997). Das high-spin Häm Fe(III) ist in der Lage Sulfit, Kohlenmonoxid und
Stickstoffmonoxid zu binden. Es ist deshalb das Reaktionszentrum der NiR (Moura et al.,
1997).
· Aminosäuresequenz
Die in dieser Arbeit ermittelte N-terminale Aminosäuresequenz zeigt nur eine geringe
Homologie zu der Teilsequenz der NiR aus D. desulfuricans (Abb. 4.2, O. Einsle, pers.
Mitteilung). Nur die Aminosäureabfolge Q-D-V ist in der abgebildeten Sequenz ebenfalls
vertreten.
Aufgrund der sieben ermittelten Aminosäuren sind keine Aussagen zu Homologien zu
anderen Nitritreduktasen möglich. Von O. Einsle (pers. Mitteilung) stammen die Sequenzen
aus Wolinella succinogenes und Sulfurospirillum deleyianum sowie die noch unvollständige
Sequenz aus D. desulfuricans. In der bisher bekannten Sequenz ist erst ein klassisches
Hämbindemotiv der Form Cys-X-X-Cys-His zu finden (Pos. 267-271). Der N-Terminus weist
eine geringe Homologie zu bisher bekannten Nitritreduktasen auf. In der Umgebung des
Hämbindemotivs ist die Homologie zu anderen Nitritreduktasen bedeutend größer. Dies
deutet auf eine Aminosäuresequenz mit fünf Hambindemotiven, analog zu den in Abb 4.2
darge-stellten Sequenzen, hin.
Die Aminosäuresequenzen der Cytochrom c Nitritreduktasen aus W. succinogenes,
S. deleyianum, E. coli und H. influenzae (Abb. 4.2) weisen alle vier klassische Hämbindemotive der Form C-X-X-C-H auf. Ein fünftes Hämbindemotiv besitzt die alternative Form
C-X-X-C-K. Bei E. coli führt eine Mutation des Lysins des alternativen Hämbindemotivs in
ein Histidin, Leucin oder Isoleucin zu einem kompletten Verlust des physiologisch
bedeutsamen Elektronentransfers von Formiat zu Nitrit (Eaves et al., 1998).
54
4 DISKUSSION
· Hämgehalt
Nach einer Hämfärbung zeigte sowohl die 60.4 kDa als auch die 17.5 kDa Untereinheit die
für Hämgruppen typische Färbung. Liu und Peck (1981) ermittelten einen Hämgehalt von 6
mol Häm/mol NiR, bezogen auf eine Molekularmasse von 66 kDa. Aus anderen Bakterien
wurden Cytochrom c Nitritreduktasen mit 2 - 6 Hämgruppen pro Nitritreduktase isoliert
(Tab. 4.2). Die Sequenzen der Nitritreduktasen aus W. succinogenes, S. deleyianum, E. coli
und H. influenzae (Abb. 4.2) deuten bei diesen Organismen auf Pentahämenzyme hin. Eaves
et al. (1998) konnten zeigen, daß die Cytochrom c552 Nitritreduktase aus E. coli ein
Pentahämenzym ist.
Unter der Annahme einer Molekularmasse von 60.4 kDa wurde der Hämgehalt der NiR aus
D. desulfuricans in dieser Arbeit zu 4.3 mol Häm/mol NiR bestimmt. Dies deutet auf ein
Tetra- oder Pentahämenzym hin. Der Hämgehalt eines hypothetischen Heterodimeren aus je
einer 60.4 und 17.5 kDa Untereineit (Mr 77.9) wurde zu 5.7 berechnet (Tab. 3.2 und 3.3). Liu
und Peck (1981) fanden 6 mol Häm/mol NiR, bezogen auf eine Molekularmasse der NiR von
66 kDa und beschrieben das Enzym als ein Hexahämprotein.
Da bei der Isolation der NiR zwei Untereinheiten gefunden wurden wäre auch ein Komplex
aus einem Pentahämprotein (60.4 kDa Untereinheit) und einem Monohämprotein (17.5 kDa
Unter-einheit) mit insgesamt 6 mol Häm/mol NiR denkbar.
Schumacher et al. (1994) isolierten aus den Membranfraktionen von W. succinogenes und
S. deleyianum einen Nitritreduktasekomplex mit einer Molekularmasse von 245 ± 15 kDa (in
Gegenwart von Octyl ß-D-glucopyranosid). Diese Form des Enzyms ist ein Heterooligomer
aus 55 kDa und 22 kDa Untereinheiten. Das 22 kDa c-Typ Cytochrom ist nicht kovalent an
die großen Untereinheiten gebunden. Analog zu diesen Ergebnissen könnte die in dieser
Arbeit isolierte NiR ebenfalls ein Heterooligomer sein.
Eine SDS-PAGE ohne Dithiothreitol könnte zeigen, ob die kleine Untereinheit kovalent über
Disulfidbrücken mit der großen Untereinheit verbunden ist. Bei einer kovalenten
Verknüpfung müßte eine Bande bei etwa Mr = 78 kDa auftreten. Bei einem anderen
Verhältnis der Untereinheiten als 1:1 würden zusätzlich Banden bei etwa Mr = 60 bzw.
17 kDa auftreten. Wenn keine Disulfidbrücken vorliegen, genügt SDS, um die Untereinheiten
zu trennen. Es treten dann wieder zwei Banden bei Mr = 60.4 und 17.5 kDa auf.
55
4 DISKUSSION
Moura et al. (1997) teilen die Multihämnitritreduktasen in zwei Klassen ein:
(a) Membrangebundene, polymere Hexahämproteine mit fünf low-spin Häm Fe(III) und
einem high-spin Häm Fe(III). Der erste Vertreter ist die membrangebundene Cytochrom c
Nitrit-reduktase aus D. desulfuricans, die in dieser Arbeit isoliert und charakterisiert
wurde.
(b) Lösliche, monomere Tetrahämproteine mit drei low-spin Häm Fe(III) und einem high-spin
Häm Fe(III), z.B. die lösliche Cytochrom c Nitritreduktase aus S. deleyianum.
Die Frage ob die membrangebundene Cytochrom c Nitritreduktase aus Desulfovibrio desulfuricans der erste Vertreter einer neuen Klasse von Hexahäm-Nitritreduktasen ist, wird erst
nach der vollständiger Aufklärung der Aminosäuresequenz zu beantworten sein.
56
4 DISKUSSION
57
4 DISKUSSION
58
5 ZUSAMMENFASSUNG
5 ZUSAMMENFASSUNG
Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) wurden mit Nitrat als terminalem Elektronenakzeptor und DL-Lactat als Elektronendonor kultiviert. Es wurde gezeigt, daß diese sulfatreduzierenden Bakterien Nitrit nicht akkumulieren wie z.B. Sulfurospirillum deleyianum
(Schumacher, 1993), sondern direkt umsetzen.
Die membrangebundene Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans wurde mit Triton
X-100 solubilisiert und in drei chromatographischen Schritten nach Kriterien der Gelelektrophorese zur Homogenität gereinigt. Dabei konnte die Nitritreduktaseaktivität um den Faktor
80 auf 528 U mg-1, im Vergleich zu 345 U mg-1 (Liu und Peck, 1981), gesteigert werden.
Die Nitritreduktase ist ein Heterooligomer mit einer Molekularmasse des Komplexes von
365 kDa. Sie besteht aus zwei Untereinheiten der Massen 60.4 und 17.5 kDa. Bezogen auf
eine Molekularmasse von 60.4 kDa (77.9 kDa) enthält die NiR 4.3 (5.7) Hämgruppen.
Sowohl die große als auch die kleine Untereinheit zeigen nach einer Hämfärbung die für
Hämgruppen typische blaue Färbung. Die Elektronenanregungsspektren im Bereich von 280 800 nm im oxidierten und im reduzierten Zustand des Enzyms sind charakteristisch für c-Typ
Cyto-chrome. Das EPR-Spekrum zeigt für low-spin Häm-Fe(III) typische Signale bei
g = 2.95, 2.27 und 1.50. Neben dem charakteristischen Signal bei g » 3.93 sind Resonanzen
bei g » 5.19 und 3.14 zu erkennen, die auf high-spin/low-spin Häm Wechselwirkungen
hindeuten.
Durch Edman-Abbau wurden die ersten sieben Aminosäuren des aminoterminalen Endes der
NiR ermittelt.
59
6 LITERATUR
6 LITERATUR
Adachi S.-I., Nagano S., Ishimori K., Watanabe Y., Morishima I., Egawa T., Kitagawa
T., Makino R. (1993) Roles of proximal ligand in heme proteins: replacement of proximal
histidine of human myoglobin with cysteine and tyrosine by site-directed mutagenesis as
models for P-450, chloroperoxidase and catalase. Biochem. 32, 241-252
Becker U., Ganter S., Just C., Sauermost R. (1994) Herder-Lexikon der Biologie,
1. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg
Blackmore R., Roberton A.M., Brittain T. (1986) The purification and some equilibrium
properties of the nitrite reductase of the bacterium Wolinella succinogenes. Biochem. J. 233,
547-552
Blackmore R., Brittain T., Gadsby P.M.A., Greenwood C., Thomson A.J. (1987) Electron
paramagnetic Resonance and magnetic circular dichroism studies of a hexaheme nitrite
reductase from Wolinella succinogenes. FEBS Lett. 219, 244-248
Blackmore R., Gadsby P.M.A., Greenwood C., Thomson A.J. (1990) Spectroscopic
studies of partially reduced forms of Wolinella succinogenes nitrate reductase. FEBS Lett.
264, 257-262
Boltz D.F., Taras M.J. (1978) Nitrogen:. In: Boltz D.F., Howell J.A. (Hrsg.). Colorimetric
determination of nonmetals. Chemical analysis. Vol. 8, John Wiley & Sons Inc., New York,
Chichester, Brisbane, Toronto, 197-251
Bursakov S.A., Carneiro C., Almendra M.J., Duarte R.O., Caldeira J., Moura I., Moura
J.J.G. (1997) Enzymatic Properties an Effect of ionic Strength on Periplasmatic Nitrate
Reductase (NAP) from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774), Biochemical and
Biophysical Research Communications 239, 816-822
Chaney R., Marbach S. (1962) Colorimetric determination of nonmetals. In: Boltz D.F.,
Howell J.A. (Hrsg.) Chemical analysis Vol. 8, John Wiley & Sons Inc., New York,
Chichester, Brisbane, Toronto, 197-251
Cole J.A., (1988) Assimilatory and dissimilatory reduction of nitrate to ammonia. In: Cole,
J.A. & Ferguson, S. J. (Hrsg.) The nitrogen and sulphur cycles. Society for General
Microbiology, Cambridge University Press (281-329)
Darwin A., Hussain H., Griffith L., Grove,J., Sambongi Y., Busby S., Cole J.A., (1993)
Regulation and Sequence of the structural gene for cytochrome c552 from Escherichia coli: not
a hexahaem but a 50 kDa tetrahaem nitrite reductase. Mol. Microbiol. 9, 1255-1265
Deuereux R., Delaney M., Widdel F., Stahl H.D. (1989) Natural relationship among sulfatereducing eubacteria, J. Bacteriol. 171, 6689-6695
60
6 LITERATUR
Eaves D.J., Grove J., Staudenmann W., James P., Poole R.K., White S.A., Griffiths J.,
Cole J.A. (1998) Involvement of products of the nrfEFG genes in the covalent attachment of
haem c to a novel cysteine-lysine motif in the cytochrome c552 nitrate reductase from
Escherichia coli Molecular Microbiology 28, 205-216
Einsle O. Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried
Falbe J., Regitz M., (1995) Römpp Chemie Lexikon, Georg Thieme Verlag, Stuttgart
Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R.,
Bult C.J., Tomb J.-F., Dougherty B.A., Merrick J.M., McKenney K., Sutton G.,
FitzHugh W., Fields C., Gocayne J.D., Scott J., Shirley R., Liu L.I., Glodek A., Kelley
J.M., Weidman J.F., Philips C.A., Spriggs T., Hedblorn E., Cotton M.D., Utterback
T.R., Hanna M.C., Nguyen D.T., Saudek D.M., Brandon R.C., Fine L.D., Fritchman
J.L., Fuhrman J.L., Geoghagen N.S.M., Gnehm C.L., McDonald L.A., Small K.V.,
Fraser C.M., Smith H.O., Venter J.C. (1995) Whole-genome random sequenching and
assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496-512
Foster J.F., Sterman M.D. (1956) Conformation changes in bovine plasma albumin
associated with hydrogen ion and urea binding. II. Hydrogen ion titration curves. J. Am.
Chem. Soc. 78, 3656-3660
Fritz G., Universität Konstanz, persönliche Mitteilung
Fuhrhop J.-H., Smith K.M. (1975) Preparation of metalloporphyrins from porphyrins and
isolation from natural sources. In: Smith K.M. (Hrsg.) Porphyrins and metalloporphyrins,
Elsevier, Amsterdam, New York, 757-861
Fujita T. (1966) Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. I. Detection,
purification and properties of cytochrome c552 in anaerobically grown cells. J. Biochem. 60,
204-215
Fülöp V., Moir J.W.B., Ferguson S.J., Hajdu J. (1995) The anatomy of a bifunctional
enzyme: structural basis for reduction of oxygen to water and synthesis of nitric oxide by
cytochrome cd1. Cell 81, 369-377
Godden J.W., Turley S., Teller D.C., Adman E.T., Liu M.-Y., Payne W.J., LeGall J.
(1991) The 2.3 Ångström X-ray structure of nitrite reductase from Achromobacter
cycloclastes. Science 253, 438-442
Goodhew C.F., Brown K.R., Pettigrew C.W. (1986) Haem Staining in Gels, a Useful Tool
in the Study of Bacterial c-Type Cytochromes, Biochim. Biophys. Acta 852 288-294
Greenwood N.N., Earnshaw A., (1990) Chemie der Elemente, 1. korr. Auflage, VCH
Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim
Griffith J.S., (1971) Theory of EPR Low Spin Ferric Hemoproteins, Mol. Phys. 21 135-139
61
6 LITERATUR
Henry Y., Bessieres P. (1984) Denitrification and nitrite reduction: Pseudomonas aeruginosa
nitrite reductase. Biochimie 66, 259-289
Hole U. (1996) Biochemische und molekularbiochemische Aspekte der Denitrifikation bei
Thiobacillus denitrificans. Dissertation, Universität Konstanz
Johnson M.K., Thomson A.J., Walsh T.A., Barber D., Greenwood C. (1980) Electron
paramagnetic studies on Pseudomonas nitrosyl nitrite reductase. Biochem. J. 189, 185-294
Jüngst A., Wakabayashi S., Mastubara H., Zumft W.G. (1991) The nirSTBM region
coding for cytochrome cd1-dependent nitrite respiration of Pseudomonas stutzeri consists of a
cluster of mono-, di- and tetraheme proteins. FEBS Lett. 279, 205-209
Kajie S.I., Anraku Y. (1986) Purification of a hexaheme Proteine c552 from Escherichia coli
K12 and its properties as a nitrate reductase. Eur. J. Biochem. 154, 457-463
Kroneck P.M.H., Beuerle J., Schumacher W. (1992) Metal-dependent conversion of
inorganic nitrogen and sulfur compounds. In: Sigel H., Sigel A. (Hrsg.) Metal ions in
biological systems. Vol 28. Marcel Dekker Inc., New York, Basel, Hong Kong, 455-505
Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680-685
Liu M.-C., Peck H.D., (1981) The Isolation of a Hexaheme Cytochrome from Desulfovibrio
desulfuricans and Its Identification as a New Type of Nitrite Reductase, J. Biol. Chem. 256
13159-13164
Liu M.C., Liu M.Y. Payne W.J. Peck Jr H.D. LeGall J. (1983) Wolinella succinogenes
nitrate reductase: purification and properties. FEMS Microbiol. Lett. 19, 201-206
Liu M.C., Huynh B.-H., Payne W.J., Peck H.D., DerVartanian D.V., LeGall J. (1987)
Optical EPR and Mössbauer spectroscopic studies on the NO derivatives of cytochrome cd1
from Thiobacillus denitrificans. Eur. J. Biochem. 169, 253-258
Liu M.C., Bakel B.W., Liu M.Y., Dao T.N. (1988) Purification of Vibrio fischeri nitrate
reductase and its characterisation as a hexahaeme c-type cytochrome Arch. Biochem. Biophys.
262, 259-265
Moir W.B., Baratta D., Richardson D.J., Ferguson S.J. (1993) The purification of a cd1type nitrite reductase from, and the absence of a copper-type nitrite reductase from, the
aerobic denitrifier Thioshaera pantotropha, the role of pseudoazurin as an electron donor.
Eur. J. Biochem. 212, 377-385
Moura I., Bursakov S., Costa C., Moura J. J. G. (1997) Nitrate and Nitrite Utilisation in
Sulfate-Reducing Bacteria. Anaerobe 3 279-290
Nath U. (1996) Spektroskopische (EPR) Untersuchungen an dem Tetrahämprotein
Cytochrom c Nitritreduktase aus Sulfurospirillum deleyianum. Diplomarbeit, Universität
Konstanz.
62
6 LITERATUR
Peck Jr. H.D. (1984) Physiological Diversity of the Sulfate-reducing Bacteria. Microbial
Chemoautotrophy, Ohio State University Press, 309-335
Peck Jr. H.D., Bramlett R. N. (1982) Flavoproteins in Sulfur Metabolism, in Flavins and
Flavoproteins (Massey, V. & Williams, C. H., ed.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam
Pereira I.C., Abreu I.A., Xavier A.V., LeGall J., Teixeira M. (1996) Nitrite Reductase
from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) - A Heterooligomer Heme Protein with
Sulfite Reductase Activity, Biochemical and Biophysical Research Communications, 224,
611-618
Postgate J.R. (1984) The sulphate reducing bacteria, 2nd ed., Cambridge University Press,
Cambridge
Prakash O., Sadana J.C. (1972) Purification, characterization and properties of nitrite
reductase of Achromobacter fischeri. Arch. Biochem. Biophys. 148, 614-632
Rabilloud T., Carpentier G., Tarroux P. (1988) Improvement and simplification of lowbackground silver staining of proteins by using sodium dithionite. Electrophoresis 9, 288-291
Rabilloud T. (1990) Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: A 10
years synthesis, Electrophoresis 11, 785-794
Sann R., Kosta S., Friedrich B. (1994) A cytochrome cd1-type nitrite reductase mediates the
first step of denitrification in Alcaligenes eutrophus. Arch. Microbiol. 161, 453-459
Schlegel H. G. (1992) Allgemeine Mikrobiologie, 7. Auflage, Thieme Verlag Stuttgart
Schröder I., Roberton A.M., Bokranz M., Unden G., Böcher R., Kröger A. (1985) The
membraneous nitrate reductase involved in the electron transport of Wolinella succinogenes.
Arch. Microbiol. 140, 380-386
Schumacher W., Kroneck P.M.H. (1991) Dissimilatory hexaheme c nitrite reductase of
“Spirillum” strain 5175: purification and properties. Arch. Microbiol. 156, 70-74
Schumacher W. (1993) Dissimilatorische Reduktion von Nitrat zu Ammoniak.
Biochemische und physikochemische Untersuchungen zur Cytochrom c Nitritreduktase aus
Sulfurospirillum deleyianum. Dissertation, Universität Konstanz
Schumacher W., Hole U., Kroneck P.M.H. (1994) Ammonia-forming Cytochrome c nitrate
reductase from Sulfurospirillum deleyianum is a tetrahäme protein: New aspects of the
molecular Composition and spectroscopic properties. Biochemical and biophysical research
communications 205, 911-916
Schumacher W., Neese F., Hole U., Kroneck P.M.H. (1997) Cytochrome c nitrate
reductase and nitrous oxide reductase: Two metallo enzymes of the nitrogen cycle with novel
metal sites. In: Transition Metals in Microbial Metabolism (Winkelmann G., Carrano C.J.
ed.), Harwood Academic Publishers, Amsterdam
63
6 LITERATUR
Senez J.C., Pichinoly F. (1958) Reduction de l’hydroxylamine liée à l’activité de
l’hydrogenase de D. desulfuricans I. Activité des cellules et des extraits. Biochim. Biophys.
Acta 27 569-580
Silvestrini M.C., Tordi M.G., Musci G., Brunori M. (1990) The reaction of Pseudomonas
nitrite reductase and nitrite. J. Biol. Chem. 265, 11783-11787
Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D.,
Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. (1985) Measurement of protein using
bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85
Stetter K.O., Lauerer G., Thomm M., Neuner A. (1987) Isolation of extremly thermophilic
sulfate reducers: evidence for a novel branch of archaebacteria, Science 236, 822
Weeg-Aerssens E., Wu W., Ye R.W., Tiedje J.M., Chang C.K. (1991) Purification of
cytochrome cd1 nitrite reductase from Pseudomonas stutzeri JM300 and reconstitution with
native and synthetic heme d1. J. Biol. Chem. 266, 7496-7502
Wood P.M., (1984) Bacterial proteins with CO-binding b- or c-type haem. Functions and
absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 768, 293-317
Ye R.W., Averill B.A., Tiedje J.M. (1994) Denitrification: production and consumption of
nitric oxide. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1053-1058
Zarowny D.P., Sanwal D.B. (1963) Characterization of an NADH specific NO2- reductase
from E. coli K12. Canadian Journal of Microbiology 9, 531-539
Zehr B.D., Savin T.J., Hall R.E. (1989) A one-step, low background coomassie staining
procedure for polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 182, 157-159
64
7 ANHANG
7 ANHANG
7.1 Verzeichnis der Abkürzungen und Trivialnamen
e
BCA
BSA
D. desulfuricans
DE-52/DEAE
DNA
DNase
DTE
EPR
FPLC
g
HAP
HPLC
IEF
kDa
KPi
M
MV
NiR
OD
PAGE
pI
PVDF
SB12
SDS
T
TMBZ
Tris
Triton X-100
U
Ve
molarer Extinktionskoeffizient
2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure Dikaliumsalz
Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
Diethylaminoethyl-Zellulose
Desoxyribonucleinsäure
Desoxyribonuclease
erythro-1,4-Dimercapto-2,3-butandiol (Dithioerythritol)
Elektronen Paramagnetische Resonanz
Fast Protein Liquid Chromatography
Erdbeschleunigung: 9.81 m·s-2
Hydroxylapatit
High Pressure Liquid Chromatography
Isoelektrische Focussierung
KiloDalton, 1 kDa = 1000 g·mol-1
Kaliumphosphat
mol l-1
1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumdichlorid (Methylviologen)
Cytochrom c Nitritreduktase aus D. desulfuricans (ATCC 27774)
Optische Dichte
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Isoelektrischer Punkt
Polyvinylidendifluorid
N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propan sulfonat (ZwittergentÒ312)
Natriumdodecylsulfat
Tesla (1 Gauß = 10-4 T)
3,3’-5,5’-Tetramethylbenzidin
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Alkylphenylpolyethylenglykol
Unit
Elutionsvolumen
65
7 ANHANG
7.2 Abkürzungen für Aminosäuren
A
Ala
Alanin
M
Met
Methionin
C
Cys
Cystein
N
Asn
Asparagin
D
Asp
Asparaginsäure
P
Pro
Prolin
E
Glu
Glutaminsäure
Q
Gln
Glutamin
F
Phe
Phenylalanin
R
Arg
Arginin
G
Gly
Glycin
S
Ser
Serin
H
His
Histidin
T
Thr
Threonin
I
Ile
Isoleucin
V
Val
Valin
K
Lys
Lysin
W
Trp
Tryptophan
L
Leu
Leucin
Y
Tyr
Tyrosin
66
DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die das Zustandekommen dieser
Arbeit erst ermöglicht haben:
· bei Herrn Prof. Dr. P. Kroneck für die interessante Aufgabenstellung, die gute Betreuung
bei der vorliegenden Arbeit sowie für die Erstellung des Erstgutachtens.
· bei Herrn Prof. Dr. B. Schink für die Erstellung des Gutachtens für das Landeslehrerprüfungsamt und des Zweitgutachtens.
· bei den Mitgliedern der Arbeitsgruppe Kroneck: Thomas Büchert für viele Tips und Tricks
rund um das Labor, für die Einführung in die Konstanzer Badeanstalten und das
Konstanzer Nachtleben; Günter Fritz für seine Hilfestellung bei der Proteinreinigung,
Stefanie Foerster für die Einweihung in die Geheimnisse von Spargel mit Sauce
Hollandaise, die EPR-Messungen sowie für das häufige Korrekturlesen dieser Arbeit,
Klaus Sulger für die Beantwortung unzähliger Fragen und Petra Stach für einen
Videoabend, die vielen Kommas in dieser Arbeit sowie für einige EPR-Messungen.
· Leo Cobianci für die Ansequenzierung der NiR.
· Oliver Einsle für die Überlassung der Aminosäuresequenzen.
· meinen Eltern und meinen Geschwistern, ohne deren vielfältige Unterstützung ich nie
soweit gekommen wäre.
· allen meinen Freunden aus den verschiedenen Fakultäten der Uni Konstanz für viele Feten,
Fußballspiele, Fitneßgymnastiken und Praktikumsprotokolle.
· Robert Bez und Reiner Schroff, für viele Abende bei Bier und Wein sowie allen anderen
Mitbewohnern in der Schloßbergstraße, Wolfgang und Anne Plössl, Hildegard Weiss und
Albert Meyer für eine gute Atmosphäre im Haus.
· dem Doschdeg Schdammdisch, dem Musikverein, dem TSV und allen anderen Freunden
und Bekannten für geniale Oich-Feschte, Kegelabende, Fußballübertragungen, Zeltfeschte,
Schdammdische, Ausflüge, Spiele, Urlaube, Geburtstagsfeten, Zockernachmittage, ...
67