Allgemeine Molekulare Mikrobiologie 1

Allgemeine Molekulare
Mikrobiologie 1
(LvNr. 300415)
SS09
Skriptum
GNU General Public License
1 Bakterielles Wachstum
Grundlegende Wachstumsbedingungen
•
•
•
•
Osmolarität – Wasseraktivität in der Umgebung. Unterscheidung in osmotolerant, osmophil
bzw. halotolerant, extrem halophil.
Temperatur – Einfluss auf die Enzymaktivät, die Fluidität der Membran. Bei zu geringer
kristallisieren die Lipide und der Stofftransport kommt zum Erliegen, anders bewirkt zu
hohe Proteindenaturierung. Unterscheidung in psychrophil, mesophil, thermophil und
extrem thermophil.
pH-Wert – Unterscheidung in acidophil, mesophil und basophil
Sauerstoff – Hinreichend bekannt, weiters bedürfen Bakterien klarerweise einer Reihe an
Mineralsalzen und organischen Nährstoffe.
Organismus
pH Minimum
pH Maximum
Optimum
Thiobacillus thiooxidans
0.5
4.0-6.0
2.0-2.8
Sulfolobus acidocaldarius
1.0
5.0
2.0-3.0
Bacillus acidocaldarius
2.0
6.0
4.0
Zymomonas lindneri
3.5
7.5
5.5-6.0
4.0-4.6
6.8
5.8-6.6
Staphylococcus aureus
4.2
9.0
7.0-7.5
Escherichia coli
4.4
9.3
6.0-7.0
5.0-5.8
8.5-9.0
6.0-7.6
Erwinia caratovora
5.6
9.3
7.1
Pseudomonas aerunginosa
5.6
8.0
6.6-7.0
Thiobacillus novellus
5.7
9.0
7.0
Streptococcus pneumoniae
6.5
8.3
7.8
Nitrobacter sp.
6.6
10.0
7.6-8.6
Lactobacillus acidophilus
Clostridium sporogenes
Kultivierungsmethoden
•
Streak Plate Method
◦ Öse in der Flamme sterilisieren
◦ In Probe eintauchen
◦ Ein Drittel der Agarplatte benetzen
◦ Sterilisieren
◦ Aus erstem Drittel in zweites Drittel ausstreichen
◦ Sterilisieren
◦ Aus zweitem Drittel in drittes Drittel ausstreichen
•
Pour Plate Method
◦ Probe verdünnen
◦ Auf Agar ausschütten
-1-
•
Limiting Dilution Method
◦ Durchführung wie bei Pour Plate Method, nur wird die letzte Verdünnung auf
verschiedene Medien aufgeteilt, das Ziel der Methode ist die Kultivierung in
Abhängigkeit eines Faktors, der im Medium enthalten ist
Bakterieller Zellzyklus
Ein aktiv wachsendes Bakterium durchläuft 3 Stadien einer zellzyklus-ähnlichen Entwicklung.
•
•
•
B-Periode. Auch I-Periode, Herstellung von Proteinen und Ribosomen für die Zellteilung
C-Periode. Chromosomenreplikation
D-Periode. Septumbildung und Chromosomensegregation
Die Menge an DNA/Zelle nimmt proportional zur Wachstumsrate zu. Bei hohen Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten die Tochterzellen jeweils teils replizierte DNA. Die sogenannte
multifork replication ermöglicht eine Generationzeit von 20 Minuten, obwohl die Chromosomen
replikation etwa 40 Minuten dauert. Die Dauer der D-Periode ist konstant und unabhängig von der
Wachstumsrate.
Zählmethoden
Methode
Vorteile
Zählkammer
Viable Cell Count
Nachteile
• Schnell
• billig
• Inakkurat
• zählt lebende
Zellen
tote
Inkubation verschiedener Verdünnungen
• Hohe Sensitivität
•
• erlaubt Selektion von •
Spezies durch Wahl des
Mediums
•
Turbidity Measurement
und
Kleine Kolonien übersehbar
Kolonieraggregate können
als eine zählen
Medium
diskriminiert
Spezies
Trübungsmessung mit Nephlometer (Lichtbrechung)
Spectrophotometer (Absorption) bei 400-600 nm
• Messung dauert < 1 • Zählt lebende
Minute
Zellen
• Akkurat, wenn Populationsdichte nicht zu groß
und
und
tote
Mathematische Beschreibung
Bakterien vermehren sich durch Zweiteilung. Eine Bakterienpopulation verhält sich daher
exponentiell. Die Zahl der Zunahme an Individuen lässt sich mit einer Exponentialgleichung
beschreiben, wobei n für die Generationszahl steht.
N t =N 0∗2 n
(1)
-2-
Durchschittliche Generationszeit tgen
Ist die Zeit, die eine aktiv wachsende Kultur zur Verdopplung braucht.
Gemessene Zeit / Anzahl der Generationen
⇒
t gen=t /n
(2)
Absolute Wachstumsgeschwindigkeit k
Entspricht der Bakterienzunahme pro Zeiteinheit. Aufgrund der exponentiellen Zunahme an Zellen
(Biomasse) nimmt die absolute Wachstumsgeschwindigkeit im Laufe der Kultivierung an.
k = n/ t
(3)
Relative Wachstumsrate µ
In einem kleinen Zeitraum (Verdopplungszeit) ist die Zunahme der Biomasse proportional der
vorhandenen. Man definiert einen Proportionalitätsfaktor µ.
X t = X 0∗e dt
(4)
Beispiel. Ermitteln der Generationszahl. Dazu wurden vor (N0) und nach (Nt) Beginn des
Wachstums die Bakterien gezählt. Durch Umformen der von (1) erhält man
n=
ln N t −ln N 0
ln 2
(5)
wo man nun die Anzahlen einsetzt. Daraus kann tgen und k berechnet werden.
Beispiel. Ermitteln der relativen Wachstumsrate. Man will aus einem gemessenen Zuwachs die
Wachstumsrate bestimmen. Die relative Beziehung des Wachstums in der Kultur gilt nur, wenn
Verdopplungszeit minus Generationszeit kleiner gleich 2 ist, daher ist xt/x0 = 2 für den Zeitraum tgen.
=
ln  xt / x 0 
t−t 0
⇒
=
ln2
t gen
(6)
Das Wachstum einer bakteriellen Kultur gliedert sich in vier Phasen, für Experimente wird aber ein
konstantes Wachstum ( Chemostat ) oder eine synchrone Kultur ( baby cell column ) benötigt.
Lag-Phase
Zeit vor dem exponentiellen Wachstum
µ~0
Log-Phase
Jede Zelle in der Kultur wächst und teit sich
µ = µmax
Stationary Phase
Wachstumsstopp durch Mangel eines limitierenden
Nährstoffs oder Anreicherung toxischer Metabolite.
Wachsende und sterbende Zellen vorhanden
µ < µmax
Death Phase
Zahl sterbender Zellen übersteigt Zahl der wachsenden
µ << µmax
Ein Chemostat ist ein Durchflusssystem mit konstantem Kulturvolumen und regulierbarer
Zuflussrate. Er ermöglicht die Kultivierung großer Bakterienmengen unter konstanten
Bedingungen. Es ist ein selbstregulierendes System, das über die Nährstoffkonzentration geregelt
wird. Jeder Tropfen Medium bringt Nährstoffe, die sofort verbraucht werden. Erhöht man den
Zufluss werden mehr Zellen ausgewaschen, die Wachstumsrate erhöht sich kurzzeitig, bis wieder
-3-
die ursprüngliche Zelldichte erreicht ist. Der spezifische Ertrag Y (produzierte Biomasse /
verbrauchte Nährstoffe) bleibt konstant. Das Wachstum entspricht dem am Übergang zwischen
Log- und Stationary Phase.
Ein Chemostat ist im Gegensatz zur batch-Kultur (statisch) eines kontinuierliche Kultur.
Die baby cell column ( Baby-Maschine ) ist ein Inkubator mit einer Membran als Boden, auf dem
Bakterien kultiviert werden. Nun dreht man das Gerät auf den Kopf und tropft von oben
kontinuierlich frisches Medium zu, wodurch Zellen ausgewaschen werden, die nicht an der
Membran haften. Das Gerät dient der Herstellung synchroner Zellkulturen, der output des Geräts
enthält also Zellen im gleichen Stadium des Zellzyklus. Man wendet es in zwei Methoden an.
Forward Methode. Nach einer Minute des Auswaschens wird eine Fraktion entnommen und nach
einer definierten Zeit eine Zeit lang auf einem Medium mit radioaktiv markiertem Inhalt inkubiert.
Dadurch erkennt man, ob der radioaktive Marker in diesem Zeitraum eingebaut wurde. So
untersucht man zum Beispiel die Segregation der Zellwand.
Backward Methode. Hier inkubiert man zuerst verschieden alte Zellen mit einem radioaktiven
Marker und synchronisiert dann die Kultur. Will man Informationen über Zellen, die Zugabe des
Markers 5 Minuten alt waren, entnimmt man die Zellen nach 15 Minuten aus dem output. Die
Minutenangaben beziehen sich auf die Generationszeit von E. coli.
-4-
2 Bauplan bakterieller Zellen
Die strukturellen Eigenschaften von Bakterien lassen sich grob in
drei Strukturbereiche einteilen:
•
•
•
Cytoplasma
Zellwand
Außenstrukturen
Das Cytoplasma ist umgeben von einer selektiv permeablen
Plasmamembran, ein Lipid-Bilayer mit 7 nm Dicke. Das Plasma
selbst besteht aus 80% Wasser, Nukleinsäuren, Enzymen,
Aminosäuren, Kohlehydraten, Lipiden, anorganischen Ionen und
einer Vielzahl anderer niedermolekularer Verbindungen. Hierin
vollzieht sich der Großteil des Stoffwechsels. Darin ist auch der
Kernbereich (Nukleoid) gelagert, ein die Erbinformation
enthaltendes kreisförmiges Chromosom.
Es sind an die 15.000 Ribosomen enthalten. Sie bestehen aus Ribonukleinsäure und Proteinen,
bilden also 25 nm große Ribozyme aus zwei verschieden dichten Untereinheiten ( 50S und 30S ). In
der Proteinbiosynthese lagern sich die subunits zu einem 70S Komplex zusammen. Die 30S
Untereinheit bindet die mRNA, die 50S Untereinheit die mit einer Aminosäure beladenen tRNA.
Bakterien enthalten granulöse Einlagerungen aus Schwefel, Polyhodroxybutyrat ( PHB ) oder
Stärke, manche auch Lipide. Diese Speicher beinhalten Energiereserven oder Baumaterial als
Aggregate oder Kristalle. PHB findet man zB in Rhodospirillum.
Die Genera Bacillus und Clostridium sind zur Bildung von Endosporen befähigt, das sind ruhende
Dauerformen der Bakterien, die eine Schutzhülle um die Erbinformation bildet und unwirtliche
Wachstumsbedingungen überdauert.
Zur Grobstruktur Zellwand zählen die Cytoplasmamembran, das Peptidoglykan (Murein) und, bei
gram-negativen Bakterien, eine weitere Lipidschicht. Bei letzteren wird der Raum zwischen innerer
und äußerer Membran als periplasmatischer Raum bezeichnet. Er umgibt die gesamte Zelle und
kann bis zu 40 % des gesamten Zellvolumens ausmachen. Die Matrix, die den Raum ausfüllt, wird
als Periplasma bezeichnet. Das Periplasma unterscheidet sich deutlich vom Cytoplasma. Es ist von
gelartiger Konsistenz und enthält eine hohe Konzentration an Enzymen sowie Binde- und
Transportproteinen, die in verschiedene biochemische Prozesse eingebunden sind, zum Beispiel in
die Nährstoffaufnahme, Zellwandsynthese, Sekretion, Bewegung, Abbau toxischer Stoffe. Die
Vorgänge im Periplasma sind daher auch für die gesteigerte Antibiotikaresistenz mancher Bakterien
verantwortlich.
Neuerdings gibt es Hinweise auf die Existenz eines periplasmatischen Raumes auch bei grampositiven Bakterien, die allerdings keine äußere Membran besitzen. Hier befindet sich das
Periplasma zwischen der Zellmembran und der vielschichtigen Zellwand.
Die chemische Zusammensetzung der hydrophilen und hydrophoben Teile der Cytoplasmamembran
kann variieren. Die polaren Gruppen des Lipids und die Fettsäurereste sind je nach Spezies
unterschiedlich, was von der Wachstumstemperatur ( → Fluidität) abhängt. In die Membran sind
-5-
Proteine und Glykoproteine eingelagert (Sensorkinasen, Porine). Hopane, polycyclische, den
Steroiden strukturell ähnliche Verbindungen, stabilisieren die Membran.
Die Membran fungiert als Abgrenzung nach außen als Permeabilitätsbarriere, verhindert Ausrinnen,
steuert die selektive Aufnahme von Nahrstoffen und Mineralsalzen sowie die Abgabe von
Metaboliten. Sie führt Proteinsekretion durch und dient als Anker für Sensorproteine des
Transports, der Energiegewinnung (proton motive force) sowie Chemotaxis.
Bakterien besitzen spezifische Außenstrukturen. Gram-negative Bakterien haben
Lipopolysaccharid (LPS) in der äußeren Membran verankert, welches als Virulenzfaktor für
Pathogenität verantwortlich ist. Daneben finden sich Pili (Hohlröhrenstruktur) und Flagellae
(komplexe Struktur bestehend aus 50 Proteinen, darunter Motorproteine und Filamente).
Das Nukleoid ist eine Struktur aus Nukleinsäure und Proteinen, die strukturell den eukaryotischen
Histonen ähnlich sind. Es ist in E. Coli 1400 µm lang, bei einer Länge von 2-3 µm des Bakteriums die Lösung: Supercoiling mit Hilfe folgender Proteine, Bildung Nucleosomartiger Strukturen durch
Bindung 300 bp langer Sequenzen.
•
•
•
H-NS Histon-like Nucleoid structuring protein
IHF Integration host factor: Interkalierendes, hochspezifisch DNA-interagierendes Protein
HU Heat-unstable Protein: Unspezifisches DNA-Bindungsprotein, schaltet Virulenzgene an
Neben dem Kernäquivalent sind Plasmide im Cytoplasma enthalten. Das sind kleine Moleküle aus
doppelsträngiger helikaler extrachromosomaler DNA. Sie sind kreisförmig und beinhalten 5-100
Gene, genetische Information für die Synthese von Proteinen, die für das Wachstum nicht essentiell
sind (non-housekeeping genes). Plasmide können gewonnen oder verloren werden, ohne Schaden
anzurichten, stellen aber unter gewissen Bedingungen einen erheblichen Vorteil dar. An eine
Erbinformation sind grundsätzlich folgende Anforderungen gestellt:
1. Erbinformation muss in der Lage sein, genetische Information zuverlässig zu speichern.
2. Erbinformation muss veränderlich genug sein, um Anpassung durch Mutation zu erlauben.
Sonst sinkt die Fitness auf Grund fehlender biologischer Evolution.
3. Erbinformation muss die eigene Vermehrung veranlassen und durchführen können.
4. Erbinformation muss Prozesse in Gang setzen können, die die gespeicherte Information in
ein Merkmal umsetzen.
3 Replikation in E. Coli
Eine erfolgreiche Vermehrung zieht die Notwendigkeit der Vervielfältigung, der Replikation, der
genetischen Information nach sich, um vermehrungsfähige Tochterzellen zu erzeugen. Hat die
Replikation einmal begonnen, endet sie erst nach vollständiger Verdopplung des Genoms. Die
Replikation erfolgt an einem sogenannten Replicon ( replisome ), das ist ein DNA-Abschnitt, an
dem sich die Proteine des Replikationsvorgangs gerade aufhalten. Sie beginnt an einem
Replikationsursprung (ORI, oriC, origin) und endet an einem Terminus (terC). Jedes DNA-Molekül
mit einem ORI kann autonom repliziert werden.
Vorgang hat folgende Eigenschaften: (1) Es ist ein semikonservativer Prozess, an Matrizen
vollzieht sich eine Polymerisation geleitet durch komplentäre Basenpaarung. Die Eigenschaft wurde
durch 15N markierte Basen nachgewiesen. (2) Sie schreitet bidirektional voran, vom ORI aus
wandern 2 Replikationsgabeln in 5'-3'-Richtung. Der Nachweis gelang durch Autoradiographie.
-6-
Der Prozess gliedert sich als Polymerisationsreaktion in
1. Initiation (Start)
2. Elongation / Propagation (Strangsynthese)
3. Termination (Ende)
Die Initiation beginnt am Replikationsursprung, ein spezifischer DNA-Bereich (240bp), der für die
Replikation eines kreisförmigen Nukleinsäuremoleküls in E. coli ausreicht. Das 240bp-Fragment
beinhaltet repetitive 9bp-Segmente (9mers, DnaA-boxes) und 13bp Sequenzen (13mers), welche
reich an AT sind, die ein Aufschmelzen durch eine geringere Anzahl an H-Brücken begünstigt. Auf
molekularer Ebene spielt sich folgendes ab:
•
•
•
•
•
DnaA bindet an die 9mers (DnaA-boxes) und schmilzt die 13mers unter ATP-Verbrauch auf.
DnaC rekrutiert DnaB ( eine Helicase ) und leitet diese unter ATP-Verbrauch zum DnaAKomplex.
DnaB bildet einen hexameren Ring um einen Einzelstrang und wickelt nun die DNA in 5'3'-Richtung vom Ursprung weg ab.
SSB (single strand binding protein) stabilisiert die Einzelstränge, bis die Strangsynthese
vollzogen wird
DnaG (DNA-abhängige RNA-Polymerase) gesellt sich dazu, es entsteht der prepriming
complex. Nun wird ein RNA-primer synthetisiert, der die DNA-Polymerase III auf den Plan
ruft, sodass die Strangsynthese beginnen kann.
Die Strangsynthese findet kontinuierlich am Leitstrang (leading strand) in 3'-5'-Richtung und
diskontinuierlich am Folgestrang (lagging strand) in 5'-3'-Richtung statt. Die Replikationsgabeln
bewegen sich bidirektional vom oriC weg, Stränge, an denen das Replicon in 5'-3'-Richtung läuft,
sind Leitstränge.
Die DNA-Polymerase III ist ein hochkomplexes Protein mit mehreren Untereinheiten. Als core
enzyme wird der Komplex aus α, ε, Θ und γ bezeichnet. Die DNA-Polymerase liegt während der
Strangsynthese als Dimer vor.
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•
•
•
β-subunit: Verbindet in clamp-Konformation das core enzyme mit der DNA und verbessert
die Prozessivität. Hexamere Struktur.
γ-complex: Vermittelt die Bindung der clamp an die DNA oder entfernt die clamp.
Zweiteres ist bei der Folgestrangsynthese essentiell.
Θ-subunit: Funktion unbekannt.
ε-subunit: Hat Korrekturfunktion inne und entfernt mismatches.
α-subunit: Verbindet freie Nukleotide mittels Phosphodiesterbildung mit dem neuen Strang.
τ-subunit: Bewirkt die Dimerisierung der DNA-Polymerase III (Pol III) und beschleunigt
die Helicase.
Soweit die Proteine an der Replikationsgabel. Im Fall der Folgestrangsynthese wird eine weitere
DNA-Polymerase benötigt, und zwar DNA-Polymerase I (Pol I). An diesem Strang werden in
gewissen Abständen RNA-DNA-Hybridblöcke eingeführt (Okazaki-Fragmente), weil eine
Esterbildung in 3'-5'-Richtung nicht möglich ist. Deswegen löst der γ-Komplex des Pol III -Dimers
regelmäßig die Verbindung zum Folgestrang, wenn sie zum Okazaki-Fragment kommt und sich viel
Folgestrang in Syntheserichtung aufgestaut hat. Dann ersetzt Pol I die RNA und eine Ligase knüpft
den verbleibenden Phosphodiester.
-7-
Die Termination findet an terC statt, einem spezifischen Bereichetwa gegenüber von oriC. Die 2
Replikationsgabeln treffen sich bei terC, erreichen es aber nicht notwenigerweise gleichzeitig, was
eine Replikationsfaller erforderlich macht. Deshalb setzt sich terC aus terC1 und terC2 zusammen,
zwei 23bp lange Sequenzen, die nur in einer Richtung aktiv sind. Sie sind so angeordnet, dass die
Gabeln an den inaktiven vorbei müssen, bevor die Termination beginnen kann und die Replicons im
Überlappungsbereich stehen. In E. coli ist das von tus codierte Protein an der Bildung der Falle
beteiligt.
Zwei klassische Experimente stehen im Zusammenhang mit Replikation. Einerseits das MeselsonStahl-Experiment, mit dem sich nachweisen lässt, dass die Replikation der DNA semikonservativ
ist. Dabei wurde zuerst auf mit 15N inkubiert, anschließend auf ein 14N-Medium gewechselt.
Andererseits wurde im Taylor-Experiment mittels 3H-markiertem Thymidin nachgewiesen, dass
die DNA-Replikation bidirektional abläuft.
3.1 Regulation der Initiation
DnaA als Initiatorprotein bestimmt den zeitlichen Startpunkt der Replikation. Doch wie weiß es,
wann es agieren muss? Vorweg muss erwähnt werden, dass es sich im folgenden um Vermutungen
handelt, die noch nicht experimentell abgesichert sind.
DnaA kommt im Komplex mit ATP und ADP vor, nur erstere Form ist in der Initiation aktiv und hat
geringe intrinsische ATPase-Aktivität. Durch Hydrolyse des ATP-DnaA-Komplexes, also Zerfall in
DnaA, ADP und Pi, nimmt die β-subunit die sliding clamp Konformation ein. Replikation ist daher
mit DnaA-Inaktivierung gekoppelt.
Aktives DnaA ist eng an die Zellmasse gekoppelt, nicht aber an die sogenannte Initiationsmasse
(Masse/OriC). Die Massenkopplung ist besonders gut in langsam wachsenden Zellen beobachtbar,
wo nur eine Replikationsinitiation per Zellzyklus erfolgt. Aber es ist unklar, nach welchem
Prinzipien die Zellmasse an die Initiation gekoppelt ist.
Ein alternatives Modell zur Zellmassenkopplung ist die Regulation der Aktivität des DnaA
Proteins über intrazelluläre Titration der freien DnaA-Menge durch hochaffine Bindungsstellen
außerhalb des oriC, welche sich im datA Locus befinden. Der Locus enthält 5 hochaffine
Bindungsstellen für DnaA. Deletion von datA hatte im Experiment deregulierte (asynchrone)
Initiation zur Folge.
Die Modellannahme sieht vor, dass, sobald der datA Locus repliziert ist, die Menge an freiem DnaA
durch Bindung an datA erniedrigt wird, was eine verfrühte Neuinitiation verhindert, weil nicht
genügend DnaA für die Bindung an die 9mers und das Schmelzen der 13mers zur Verfügung steht.
Daneben wurden 2 weitere regulierende Mechanismen gefunden.
1. OriC und der dnaA Promoter enthalten GATC-Motive, welche an Adenin des neuen
Stranges durch Dam-Methylase methyliert werden. Dieser Vorgang braucht allerdings einige
Minuten, sodass relativ lang ein Zustand der Hemimethylierung aufrecht erhalten wird.
Dadurch wird eine Assoziation solcher Bereiche mit der Zellmembran vermutet, wodurch
oriC blockiert und die Promoteraktivierung von dnaA verhindert wird. Dieser Mechanismus
scheint sehr spezifisch zu sein, da er erst bei E. coli beobachtet wurde und zB B. subtilis gar
keine GATC-Motive hat.
2. In E. coli befinden sich weiters etwa 1000 Moleküle des Proteins SeqA, welches vom DamMethylase abhängt. Es wirkt negativ regulierend und hat möglicherweise Einfluss auf oriCAktivierung und Sequestrierung ( = Abkapselung des oriC aus dem aktiven Geschehen,
sprich Inaktivierung, damit nicht nochmal initiiert wird ).
-8-
Beobachtung 1 ist, dass seqA Mutanten frühzeitig, also vor Erreichen der Initiationsmasse
initiieren, Beobachtung 2, dass gereinigtes SeqA hemimethylierte DNA unabhängig von der
Sequenz und oriC unabhängig vom Methylierungszustand.
Daraus schließt man, dass die Bindung an oriC ein vorzeitiges Aufschmelzen verhindert und
dass eine Membranassoziation durch SeqA vermittelt wird.
3.2 Relax! Topoisomerasen in Aktion
Die Polymerisationsreaktion und das unwinding der DNA läuft mit einer Geschwindigkeit von etwa
300 bp/sec ab. Als logische Folge kommt es downstream zu einem enormen Stau an überwundener
(positive supercoil) und unterwundener (negative supercoil) DNA durch die Arbeit der Helicase, der
entspannt werden muss, um die Replikation fortzusetzen. Das ist die Aufgabe der Topoisomerasen.
Biochemisch wird zwischen Topoisomerase TypI und TypII unterschieden. TypI führt einen
einfachen Strangbruch ein, TypII einen Doppelstrangbruch, natürlich in kontrollierter Weise. TypI
schneidet also einzelsträngige DNA (TypI-A) oder einen Strang einer Doppelstrang-DNA.
Dadurch kommt es zu Rotation und Entwindung der superhelikalen Struktur.
E. coli enthält zwei Vertreter der TypII-Topoisomerasen, nämlich Topoisomerase IV und DNAGyrase. Topoisomerase IV vollzieht die Trennung von Catenanen ( kettenförmig verbundene
DNA-Ringe ) am Ende einer Replikationsrunde. Eine Besonderheit der Gyrase ist, dass sie neben
der Relaxation auch superheilkale Windungen einführen kann, um die Packungsdichte des
Nukleoids zu erhöhen.
Die tetramere DNA-Gyrase setzt sich aus zwei GyrA-Untereinheiten (aktive Zentren) und zwei
GyrB-Untereinheiten (ATPase) zusammen, die tetramere Topoisomerase IV aus zwei ParC
Untereinheiten und zwei ParE-Untereinheiten.
Wie erfolgt die Relaxation chemisch?
• Eine TypII-Topoisomerase bindet an Doppelstrang-DNA, welche nun als G(yrase)-Segment
bezeichnet wird.
• GyrB hydrolysiert ATP zu ADP, dadurch wird ein zweiter Doppelstrang ( T(ransfer)Segment ) gebunden, der durch das G-Segment geschleust werden soll, und die
Konformation von GyrA geändert.
• GyrA bildet mit einem Tyrosin in seinem aktiven Zentrum einen 5'-Phospho-Tyrosinester
mit der DNA, die zweite Kopie von GyrA macht das gleiche, es kommt zum Schnit des GSegments.
• Das T-Segments rutscht durch die Lücke im G-Segment, das G-Segment wird ligiert.
• Gyrase löst die Verbindung zur DNA, das T-Segment wird freigesetzt.
4 Chromosomensegregation
Nach erfolgreicher Verdopplung der Erbinformation muss dafür gesorgt werden, diese auf beide
Tochterzellen zu verteilen, was im sogenannten partitioning ( Chromosomensegregation ) passiert.
Voraussetzung dafür sind die erfolgte Dekatenierung und die Membranhaftung der Chromosomen,
sonst kommt zu Fehlern wie in:
✗
✗
par- Mutanten: Hier ist die Topoisomerase IV fehlerhaft, keine Dekatenierung
muk- Mutanten: Hier wandern gelegentlich beide Kopien in eine Tochterzelle.
Wie kann man die Wanderung von Chromosomen in Bakterien beobachten? Man führt Hybridgene
-9-
in ein Bakterium ein, welche in Hybridproteine translatiert werden, die zB Fluoreszenzmarker
(XFP) tragen.
Oder man macht mRNA sichtbar, indem man Nukleotide mit Floureszenzmarker in das
Nährmedium gibt, welche dann in der Transkription polymerisiert werden.
•
•
•
FISH: Fluorescent in situ hybridization
FROS: Flourescent repressor/operator system
parB/parS technique
4.1 Segregationsmodelle in E. coli
a) Passive Displacement: DNA-Replikation findet in der Zellmitte statt, Chromosomen haften
an der Membran und werden durch das Wachstum derselben auseinandergezogen.
b) Transertion: Replikation, Transkription und Translation sind gekoppelt, laufen parallel ab.
Die Synthese von neuem Membranmaterial, welches kotranslational in die Membran
eingefügt wird, bewirkt eine physische Kopplung der DNA mit der Membran. Es entsteht
ein Supermolekül aus DNA-Transkriptionsapparat-mRNA-Ribosom-Protein-Membran. Die
durch die Polymerasen bereit gestellte kinetische Energie könnte die Chromokinese vorantreiben.
c) Biased Transcription: Die Transkription stark exprimierter Gene findet meist vom
Replikationsursprung weg gerichtet statt, die mRNA wird also Richtung Zellmitte
ausgespuckt. Diese Direktionalität könnte reichen, um Chromosomen auseinander zu
schieben: Die RNA-Polymerase synthetisiert mRNA, welche Richtung Zellmitte strömt und
eine Rückstoßwirkung entfacht, wodurch die Chromosomen Richtung Zellpole beschleunigt
werden.
d) Extrusion capture: Die replizierten ORIs werden von Proteinen erkannt und gebunden. Sie
binden in der Nähe des Replikationsursprungs und kooperieren mit zwei weiteren Proteinen,
einem, das mit dem Zellpol in Wechselwirkung steht, und ein zweites, welches die Replikate
jeweils rekondensiert und packt, zB Gyrase oder IHF/HU/H-NS. Da die Nukleoide in
Polnähe rekondensieren, entsteht eine Zugwirkung auf den zu replizierenden Teil der noch
vorliegenden Theta-Struktur, die für eine vollständige Trennung der Chromosomen sorgt.
e) Aktive Segregation mittels Zytoskelett-ähnlichen Strukturen: Bakterien besitzen Aktinhomologe und Centromer-homologe Proteine. Die Segregation der Nukleoide könnte analog
der Migration von Metaphasenchromosomen ablaufen.
4.2 Segregation in B. subtilis und C. crescentus
Die molekulare Betrachtung von B. subtilis lässt die Frage aufkommen, ob es ein bakterielles
mitotisches System gibt. Man hat ein Protein, mukB, gefunden, dessen Sekundärstruktur den
eukayotischen SMC-Proteinen ( structural maintenance of chromosomes ) ähnelt. Es ist ein Dimer
mit N-terminalem globulärem Walker-A-motif, welches Nukleotide bindet, und zentraler coiledcoil-Region mit mittigem hinge. In Anwesenheit von ATP klappt der hinge um und es kommt zur
Bildung nukleosomenähnlicher Strukturen.
Weiters besitzen Bakterien ein Protocytoskelett mit Aktin-homolgen (MreB, Mbl) und Centromerhomologen Proteinen. Ein Indiz für deren Involvierung in der Chromokinese ist die gestörte
Chromokinese in Mutanten dieser Proteine. MreB und Mbl bilden eine Spiralstruktur von Pol zu
Pol in B. subtilis, die für eine polare Lokalisierung der ORIs und eine dynamische Lokalisierung
regulatorischer Proteine in Polnähe verantwortlich ist. FtsZ bildet als Tubulin-Homolog einen Ring
in der Zellmitte, der die spätere Teilungsfurche markiert. Die Bildung eines Abschnürungsstelle in
Polnähe wird durch das dort vorhandene MinC inhibiert.
- 10 -
5 Mureinsynthese
Die Zellwand (Peptidoglykan, Murein), eingelagert im Periplasma, besteht aus einem
engmaschigen, molekularem Komplex. Es ist ein Polymer aus 2 alternierenden Aminozuckern: NAcetylglucosaminsäure (NAM) und N-Acetylmuraminsäure (NAG). NAM-Einheiten sind durch
Peptidbrücken quervernetzt, in denen Diaminopimelinsäure, eine nicht-proteinogene Aminosäure,
vorkommt. Das Murein schützt vor osmotischer Lyse.
Gram+
Gram-
Dicke: 20-80 nm
Dicke: 2-3 nm
Einlagerung: Lipoteichonsäure
Einlagerung: Lipopolysaccharid
Die Mureinsynthese umfasst im Wesentlichen drei Schritte und hat zwei Anforderungen:
1. Bildung der Bausteine im Cytosol
2. Transfer der Bausteine zur Plasmamembran
3. Einbau der Bausteine in die Zellwand
1. Polare Moleküle wie Zucker müssen für den Transport durch die apolare Plasmamembran
hydrophob gemacht werden. Das erledigt ein Lipid-Carrier namens Bactoprenol, ein C55Isoprenoid-Alkohol.
2. Alle Polymerisationsprozesse in der Zellwand müssen Energie freisetzen, da im Periplasma
kein ATP verfügbar ist.
Die Mureinsynthese beginnt im Cytoplasman, mehrere Membrangebundene Enzyme einen
Precursor herstellen. D-Alanyl-Alanin-Transpeptidase/Transglykosylase stellt Park's nucleotide
her, das folgende Molekülkette ist: (UDP)-(NAM)-(L-Ala)-(D-Glu)-(L-Lys)-(D-Ala)2.
Monofunktionale Transglykosylase fügt NAG an NAM an.
Als nächstes bindet phosphoryliertes Bactoprenol, mit hydrophobem Ende permanent in der
Plasmamembran verankert, unter Abspaltung von UMP, welches im Cytoplasma verbleibt. Der
Precursor ist nun über ein Disphosphat an Bactoprenol gebunden, welches im flipping genannten
Vorgang, den Precursor durch die Membran schleust.
Im Perisplasma nimmt das membrangebundene Enzym D-Alanyl-Alanin-Endopeptidase/
Carboxypeptidase Anpassungen der Seitenketten vor der Transpeptidierung vor. Nun kommt es zur
Insertion der Precursor in die Mureinstränge der Zellwand. Dazu trennen lytische
Transglykosylasen die existierenden glykosidischen β-1,4-Bindungen in den Mureinsträngen sowie
die Verbindung zwischen Precursor und Bactoprenol, das wieder ins Cytoplasma klappt.
Die genannten Proteine gehören den PBPs an ( Penicillin binding proteins ), wie der Name schon
sagt, kann Penicillin den Einbau der Precursor verhindern. Sie sind in der Cytoplasmamembran
verankert. Die PBPs werden nach ihren formgebenden Aufgaben gegliedert:
a) Klasse A: PBP1A+PBP1B → Länge, Breite, Entwicklung
b) Klasse B: PBP2 + PBP3 → Länge, Teilung
c) LMW (low molecular weight): PBP5 + PBP6 → Gestalt, ohne side chain trimming
( afunktionelle Endopeptidase/Carboxypeptidase ) nehmen Zellen von B. subtilis amöboide
Gestalt an.
- 11 -
Three-for-one growth model
In diesem Modell schlagen Vollmer und Höltje 2001 eine konzertierte Reaktion vor, in der ein
Mureintriplett unter einen Akzeptorstrang (docking strand) der Zellwand gehängt wird. Das
Mureintriplett ist ein dreisträngiges Polymer, das zuvor im Periplasma synthetisiert wurde. Die
Depolymerisation des Akzeptorstrangs durch einen Komplex aus Transglykosylase und zwei
Endopeptidasen legt Aminoenden frei. Zwei monofunktionale Transpeptidasen schließen das
Triplett an diese an, sodass gleichzeitig mit dem Lösen der alten Interpeptide neue gebildet werden.
Diese Reaktion beginnt an rund 200 Insertionsstellen und setzt sich spiralig am Umfang des
Bakteriums fort entlang der MreB/Mbl Struktur fort. Eine komplette Runde des
Synthesekomplexes dauert 8 Minuten.
Um die mechanische Integrität während dem Wachstum zu gewährleisten, muss der Einsatz der
Enzyme räumlich und zeitlich streng koordiniert sein.
Die Länge des Bakteriums ist dann verdoppelt, wenn jeder zweite Strang durch drei neue ersetzt
wurde. Um den Durchmesser der Zelle konstant zu halten, müssen die inserierten Stränge genau die
Länge der resorbierten Akzeptorstränge haben, was automatisch erfüllt wird, da ein Akzeptorstrang
mittels der frei werdenden Aminotermini als Schablone für den synthetisierenden Komplex fungiert.
Das Bild zeigt die Ersetzung des Akzeptorstranges unter gleichzeitiger Resorption desselben und
den Synthesekomplex, yin-yang-Enzymkomplex genannt ( © Current Opinion in Microbiology) .
Gegen Ende der Mureinsynthese, am Beginn des eigentlichen Trennungsprozesses, wird preseptales Murein an der zukünftigen Teilungsstelle synthetisiert – es folgt die Bildung septalen
Mureins. Mit der Bildung des Septums, bewirkt Mureinhydrolase die Trennung des
aneinanderhaftenden Tochterzellen.
6 Septumbildung
An der Septumbildung in E. coli sind mindestens 10 Proteine beteiligt, die mit der
Einschnürungsstelle assoziieren und die Einschnürung sowie das Wachstum septalen Mureins
koordinieren. Sie bewirken die Trennung der Tochterzellen. Der Enzymkomplex, den sie bilden,
wird als Divisiosom oder Septosom bezeichnet.
Die beteiligten Proteine heißen FtsZ, FtsA, ZipA, FtsK, FtsQ, FtsL, FtsB (früher YgbQ), FtsW, FtsI
(PBP3) und FtsN. Die meisten Fts (filamentous temperature sensitive) Gene und die
Mureinsynthesegene befinden im mrA Gencluster.
- 12 -
FtsZ hat eine zentrale Rolle inne, da FtsZ-Mutanten ineffiziente bis keine Septumbildung zeigen
und neigen daher zu filamentösem Wachstum. Replikation und Chromosomensegregation
funktioniert in den Mutanten, die Septumbildung nicht.
FtsZ ist ein β-Tubulin-Homolog mit GTPase-Aktivität und befindet sich im Cytoplasma. Es bildet
den Z-Ring an der Einschnürungsstelle noch bevor die Nukleoide separiert wurden, die beginnende
Chromosomensegregation stimuliert dies. Die Bildung des Z-Rings beginnt an einer einzigen Stelle
und setzt sich bidirektional fort. Der Z-Ring setzt sich aus vielen kurzen Protofilamenten
zusammen, die gegeneinander verschiebbar sind. Der Carboxyterminus von FtsZ interagiert mit
FtsA und ZipA, zwei cytoplasmatischen Aktin-Homologen, die den Z-Ring an der Membran
verankern.
Es gibt zwei Modelle, wie FtsZ die Einschnürung der Zellwand vollzieht.
•
•
Gleitende Protofilamente. Die Protofilamente sind an der Membran verankert,
Motorproteine ziehen diese zusammen, sodass konzertiert mit der Mureinsynthese der
Zellinnenraum kontinuierlich durch das entstehende Septum in zwei Kompartimente
getrennt wird.
Depolymerisation. Weniger wahrscheinlich, da FtsZ tubulinhomolog ist und daher nur an
den Enden verkürzt, was aber nicht zur Kontraktion des Z-Rings führt. Würden Monomere
aus der Filamentmitte abgegeben, wird das Filament instabil.
FtsQ scheint ebenfalls in die Mureinsynthese einzugreifen, da es nur in zellwand-enthaltenden
Bakterien vorkommt.
FtsW und FtsI (PBP3) sind polytopische Proteine der SEDS-Familie (shape, elongation, division,
sporulation). SEDS-Gene liegen in der Nähe der Gene für PBPs der Klasse B ( side chain
trimming, strand replacement ), ftsW und ftsI sind im selben Operon. Deren Funktion ist die
Lokalisierung von PBPs zum Septum. FtsW schleust mit Precursor beladenes Bactoprenol durch die
Membran und übergibt ihn dem geeigneten PG-synthetisierenden Enzym (PBP3).
Die Septumbildung wird durch die replizierenden Nukleoide stimuliert, aber die Nukleoide
inhibieren die Fertigstellung des Septums. Das Septum wird also vor der erfolgten Chromosomensegregation nicht fertiggestellt, was dazu führt, dass Erbinformation in Form der Thetastruktur vom
schließenden Septum eingeschlossen wird und eine spezielle Machinerie dafür sorgen muss, dass
die Nukleoide segregiert werden und keine Strangbrüche durch das Septum passieren. Man kann
also das von Errington, Daniel, Scheffers 2003 aufgestellte Prinzip Nucleoid occlusion als
Regulationsmechanismus ansehen. FtsK reguliert die korrekte Segregation zu replizierender DNA.
Ein
essentieller
Bestandteil
des
Septosoms ist daher FtsK, eine DNAPumpe mit 7kb/s Translokationsrate. In
vitro kristallisiert es zu einem Hexamer
mit einem 30Å breiten Kanal.
Nach Brigo et al. 2007 arbeitet FtsK
nach einem Rotary Inchworm Model.
Monomeres FtsK transloziert dsDNA in
2bp Schritten, Hexamere erlauben eine
kontinuierliche Translokation durch
aufeinanderfolgende
Zyklen
von
- 13 -
ATPase-Aktivität und DNA-Bindung an der Innenseite des FtsK-Kanals. Das Bild zeigt die
essentielle Funktion von TopoIV, da die 2 Nukleoide noch eine superhelikale Struktur bilden. FtsK
zieht replizierte DNA in die Kompartimente. KOPS sind FtsK orienting polar sequences, zeigen
FtsK also die Syntheserichtung an, damit FtsK das richtige Nukleoid ins richtige Kompartiment
pumpt.
FtsN wirkt als negativer Regulator in diesem Prozess, er verhindert Überaktivität einzelner Proteine.
Wie wird die Zellmitte bestimmt bzw. welche Protein sind an der Positionierung des Z-Rings
beteiligt? Die Polymerisation von FtsZ wird durch die Min-Proteine gesteuert, Gitai und Shapiro
2003 haben den Einfluss des Min-Regulationssystems auf die Z-Ring-Positionierung beschrieben.
MinD ist eine Dynamin-verwandte ATPase, die in Anwesenheit von
ATP Filamente von einem Zellpol ausgehend bildet. Es bindet an die
Membran und MinC bindet an MinD, sodass MinC an den Zellpolen
lokalisiert wird. MinC destabilisiert die FtsZ-Protofilamente durch
Verdrängung von FtsA.
MinE assoziert an den MinD-Enden und stimuliert die Hydrolyse
des ATP, das an MinD gebunden ist, als Folge werden MinDMonomere ins Cytoplasma freigesetzt. Neue MinD-Filamente
werden vom gegenüberliegenden Pol aus gebildet. Genau in der
Zellmitte entsteht ein Bereich, der frei von MinC ist, sodass sich der
Z-Ring ausbilden kann.
7 Biogenese der Membranen
Für die Biogenese der Cytoplasmamembran und der Außenmembran bei gram - Bakterien respektive
müssen Membranbausteine ins Periplasma sekretiert werden. Die Membran muss zu jedem
Zeitpunkt Integrität gewährleisten und trotzdem Wachstum erlauben.
Biogenese der Plasmamembran
Da die Cytoplasmamembran aus Lipiden und IMPs ( integral membrane proteins ) besteht, muss
die Zelle über Mechanismen verfügen, diese im Zuge des Wachstums in die bestehende Membran
einzubauen.
Biogenese der Plasmamembran: Einbau von Lipiden
Die für die Synthese von Lipiden notwendigen Enzyme befinden sich in der Membran selbst. Der
Aufbau der äußeren Lipidschicht des Bilayers erfordert keine Energie und wird durch die einfache
Diffusion der Phospholipide von der inneren Schicht über hypothethische hairpin bends in der Nähe
von Transmembranproteinen bewerkstelligt. Es ist unklar, wodurch Lipide für den Einbau in die
Innenmambran oder Außenmembran bestimmt werden.
Biogenese der Plasmamembran: Einbau von Proteinen
Für den Einbau von IMPs besitzen Bakterien ein spezielles Sekretionssystem, das Sec-System, das
eine lebensnotwendige Eigenschaft darstellt und in weitere Sekretionswege involviert ist (siehe
später). IMPs besitzen hydrophobe Sequenzbereiche (20 AS), die die Membran durchspannen und
die Topographie des Proteins festlegen. Bezüglich der Orientierung von C- und N-Termini
unterscheidet man zwischen
- 14 -
•
Klasse-I-IMP →
•
Klasse-II-IMP →
Trans-Orientierung: N-Terminus reicht ins Cytoplasma, C-Terminus
ragt ins Periplasma
Cis-Orientierung: Beider Termini liegen im Cytoplasma
IMPs sind meist multimolekulare Komplexe mit spezifischen Aufgaben. Das Durchschleusen bzw.
der Einbau von IMPs erfordert Energie und eine spezielle membrangebundene Maschinerie, selbst
IMP. Diese Aufgaben werden durch den GSP – general secretory pathway wahrgenommen, auch
Sec-System oder Sec-abhängige Proteinsekretion genannt. Es ist ein dreistufiger Prozess.
1. Targeting des Leaderpeptids (basische AS – hydrophobe AS – basische AS) durch
Chaperone wie SRP, einem Ribozym
2. Bindung an Precursor-Translokase (Komplex aus SecA und SecYEG, reguliert durch SecD /
SecF → Translocon)
3. Durchschieben und Spaltung des Precursors durch Leaderpeptidase (Lep)
•
•
•
Das Ribozym SRP bindet das in statu nascendi befindliche Protein an hydrophoben
Domänen und verhindert eine vorzeitige Faltung.
Der membrangebundene Faktor FtsY löst die Bindung zwischen SRP und Protein. Danach
führt FtsY hydrophobe Bereiche des Proteins in den SecY-Kanal ein. SecA führt hydrophile
Bereiche in SecY ein. SecY ist ein röhrenförmiges Oligomer, das von SecE und SecG an
drei Seiten umgeben ist. Die dritte Mantelfläche ist offen – dadurch wird das freie
Abdiffundieren hydrophober Transmembrandomänen in die Membran ermöglicht.
Das zenrale Protein SecA, eine ATPase, ist für das prozessive Fortschreiten der
Translokation verantwortlich. Es bindet das Protein, schiebt es ein Stück durch den SecYKanal und setzt es wieder frei. Dabei bleibt das Substrat an SecY gebunden. Anschließend
packt SecA das Protein an einer anderen Stelle, 20-30 AS entfernt, und startet einen neuen
Translokationszyklus. So werden pro Zyklus 100Å des Proteins transloziert.
Biogenese der Außenmembran
Sie findet an „Bayer'schen Brücken“ statt, das sind direkte Kontaktstellen von Innen- und
Außenmembran, von denen es 200-400 pro Zelle gibt, selbstverständlich nur in gram- Bakterien.
Biogenese der Außenmembran: Phospholipide
Werden an der Innenmembran synthetisiert und zur Außenmembran transloziert, was von der
proton motive force angetrieben wird.
Biogenese der Außenmembran: Lipopolysaccharid (LPS)
•
•
•
•
Das Kern-Oligosaccharid wird auf Lipid A als Primer und Träge zusammengesetzt
Gleichzeitig werden die O-spezifischen Polysaccharide auf Bactoprenol synthethisiert
O-Polysaccharide werden auf Lipid A / Kernoligosaccharid übertragen
Flippase drückt das Ganze in die hydrophobe Zone, worauf es zur Außenmembran migriert
Biogenese der Außenmembran: outer membrane proteins (OMPs)
•
Werden im Gegensatz zu IMPs in fast oder vollständig translatiertem Zustand mittels SecB
zur Plasmamembran geführt
- 15 -
•
•
•
Es folgt Sekretion mittels GSP
Im Periplasma können mehrere Proteine als Chaperone agieren und die Faltung der OMPs
regulieren
Interaktion zwischen OMPs und LPS stimuliert die Faltung in kompakte β-barrel Strukturen
sowie ihre stabile Insertion in die Außenmembran
Biogenese der Außenmembran: Lipoprotein
Prolipoprotein: Ein Peptid-Precursor (Prolipoprotein) wird an Cystein zu Apolipoprotein gespalten
Apolipoprotein: Die Sulhydryl(SH)-Gruppe des Cystein wird mit einem Diglyceridrest verestert
Lipoprotein: Der N-Terminus des Esters wird mit einem Lysinrest des Mureins verbunden.
8 Selektiver Transport – Transportmechanismen
Abgesehen von fettlöslichen und kleinen ungeladenen Teilchen, benötigen alle Moleküle
Trägerproteine, um durch die Membran zu kommen.
Carrierproteine sind polytopische Transmembranproteine, d.h. Sie besitzen mehrere
Transmembransegmente, die die Membran durchqueren. So entsteht ein Durchgang, der vollständig
mit Protein ausgekleidet ist, vgl. β-barrels oder Porine.
Oft wird für den Transport von Stoffen durch die Membran Energie gebraucht. Es gibt 4
grundlegende Transportmechnismen, die elektroneutral bzw. elektrogen sein können:
1. Passive Diffusion
2. Erleichterte Diffusion
3. Aktiver Transport
4. Gruppentranslokation
Passive Diffusion
Kleine ungeladene Moleküle treten unbehelligt durch die Membran,
–
–
–
–
–
es wird kein Trägerprotein gebraucht
ist unspezifisch
läuft ohne Energieverbrauch ab
substrate müssen amphiphil sein
arbeitet nur in Richtung des Konzentrationsgefälles
Passive Diffusion am Beispiel von Wasser (Osmose). Die Bewegungsrichtung wird von der Innenund Außenkonzentration bestimmt, es ist keine Energie erforderlich.
•
•
•
Isotonisches Milieu: Es treten gleich viele Wassermoleküle in die Zelle wie aus der Zelle.
Hypertonisches Milieu: Die Wasserkonzentration außerhalb ist niedriger (durch höhere
Salzkonzentration = hohe Osmolarität), Wasser strömt aus der Zelle.
Hypotonisches Milieu: Die H2O-Konzentration außerhalb ist höher, H2O strömt in die Zelle.
Erleichterte Diffusion
–
–
Es sind spezifische Proteine involviert, Uniporter genannt: transportiert einen spezifischen
Stoff in Richtung seines Gradienten
Stoffe migrieren wie bei jedem Diffusionsvorgang von einem Ort höherer Konzentration zu
einem Ort niedriger Konzentration
- 16 -
Dieser Transportmechanismus wir von Bakterien im Zuge der Atmungskette als Energiequelle
genutzt. Durch Protonenefflux entsteht neben einem chemischen Gradienten ein elektrisches
Potential. Dadurch besteht eine hohe Tendenz der Protonen ins Kompartimentinnere zurück zu
kehren. Die beim Rückstrom anfallende Energie kann sofort von anderen Transportmechanismen
(Aktiver Transport) verwendet werden oder sie treibt die membrangebundene ATP-Synthase an, die
die Energie des Potentials (proton motive force) in Form von ATP speichert.
Der Vorgang im Detail. Protonen diffundieren dem eigenen Konzentrationsgefälle folgend zurück
durch die Membran. Die ATP-Synthase stellt die einzig mögliche Membranpassage dar. Die
Protonen passieren das Enzym durch einen Kanal, das wie ein Mühlrad arbeitet. Die gewonnene
mechanische Energie wird in chemische Energie in Form von ATP umgewandelt.
Aktiver Transport
–
–
–
–
Carrierproteine hochspezifisch, es muss das Substrat gebunden und durchgepumpt werden
Keine chemische Modifikation der Substrate
Stoffakkomodation im Cytoplasma möglich
PMF als Energiequelle
Aktiver Transport ist in drei verschiedenen Strukturen realisiert.
•
•
•
Symport: Gleichzeitige Einschleusung zwei verschiedener Substrate. So werden Anionen
zusammen mit Protonen von der Zelle aufgenommen (Ladung bleibt gleich innen).
Antiport: Gleichzeitiger Transport zweier Substrate in entgegengesetzte Richtung durch die
Membran. So nimmt die Zelle Kationen auf, wenn sie Protonen ausschleust (Ladung bleibt
gleich innen)
Shock-sensitive System: Diese Transportmethode hat zwei Komponenten, ein
Transmembranprotein und einen periplasmatischen Kofaktor. Der Kofaktor bringt das
Substrat zum Transporter, der das Substrat zusammen mit ATP bindet. Die Hydrolyse des
ATP im Cytoplasma ruft eine Konformationsänderung des Transporters hervor, sodass das
Substrat ins Cytoplasma eintreten kann
Gruppentranslokation
–
–
–
Chemische Modifizierung des Substrats
Energiequelle PEP (Phosphoenolpyruvat)
Stoffakkomodation im Cytoplasma
Im Phosphatransferase-System kommt zur Translokation eines Phosphat-Restes von PEP auf
Glucose innerhalb eines Transmembranprotein-Kanals. Das entstandene Glucose-6-Phosphat wird
durch die Membran geschleust. Glucose-6-Phosphat kann nicht mehr zurücktransportiert werden.
Eigenschaft
Passive Diffusion
Erleichterte Diffusion
Aktiver Transport
Gruppentrans-lokation
Carrier vermittelt
-
+
+
+
Stoffakkomodation
-
-
+
+
Spezifität
-
+
+
+
Energieaufwändig
-
-
+
+
Chem. Modifikation
-
-
-
+
- 17 -
Einige essentiellen Nährstoffe von E. coli und deren korrespondierendes Importsystem:
Glycerol
Melibiose
Laktose
Maltose
Glucose
→ Erleichterte Diffusion
→ Na+ Symport
→ H+ Symport
→ Shock-sensitive System
→ Gruppentranlokation
9 Proteinsekretionswege
Gram- Bakterien haben mindestens fünf nicht-homologe Sekretionssysteme, mit denen sie neben
Proteinen auch ssDNA und mRNA in andere Zellen transportieren oder ins Medium abgeben
können.
Typ I - Sekretion
– Sec-unabhängig
– 3 Proteinkomponenten
a) IMP: ABC-Transporter mit ATPase-Aktivität, liefert Energie für Freisetzung ins
Medium.
b) MFP: Bildet als Homotrimer einen Kanal zwischen IMP und OMP, sodass die
Sekretion ohne periplasmatischen Zwischenstufen auskommen kann.
c) OMP: Bildet als Homotrimer eine Pore, Anker für MFP (membrane fusion protein)
– Die Substrate enthalten eine C-terminale Signalsequenz von etwa 60 AS Länge
– Substratbeispiel: α-Hämolysin von E. coli
Typ II - Sekretion
–
–
–
–
–
–
Sec-abhängig
Substrate werden im Periplasma gespalten und gefaltet
Das Sekreton setzt sich aus 12-16 Hilfsproteinen zusammen
Zwei Komponenten befinden sich in der Außenmembran: GspS und GspD, sie bilden 5-10
nm breite Kanäle
Das cytosolische GspE assoziiert mit der Plasmamembran. Es besitzt ein konserviertes ATPBindungsmotiv und Autokinaseaktivität. Des halb könnte es den Aufbau des Sekretons
regulieren und Energie bereitstellen.
Substratbeispiel: Pullulanase von Klebsiella oxytoca
Typ III - Sekretion
–
–
–
–
–
–
Sec-unabhängig
Es gibt keine periplasmatischen Zwischenstufen
Das Secreton setzt sich aus 20 Hilfsproteinen zusammen, die meisten davon sind mit der
Plasmamembran assoziiert. Im Zentrum befindet sich ein Komplex aus YscR-U und LcrD,
dieser Sekretionsapparat wird von YscN als Motor angetrieben
Homolog mit Biogenese des Flagellums
Substrate können mRNA und Proteine sein, letztere tragen eine N-termiale Bindungsstelle
für das Syc-Chaperon
Substratbeispiel: Yops (Yersinia outer proteins) von Yersinia
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Typ IV - Sekretion
–
–
–
–
–
Sec-(un)abhängig
Sekretion von ssDNA und Proteinen mittels einem Pilus-ähnlichem Apparat. Ermöglicht
beispielsweise die Injektion von ssDNA in eukaryotische Zellen
Hauptkomponenten:
a) VirB4 und VirB11 sind mit der Plasmamembran assoziiert und binden an Nukleotide
(vgl. Mechanismus von SecA)
b) VirB7 und VirB9 verankern den Apparat in der Außenmembran
c) VirB2 und VirB5 Bestandteile des Pilus
Die Sekretion von ssDNA ist Sec-unabhängig, die Sekretion von Protein Sec-abhängig
Substratbeispiele: Pertussis-Toxin (Bordetella pertussis) und Cag-Protein (Heliobacter
pilori)
Typ V – Sekretion, Autotransporter mit selbstprozessierender Protease
–
–
Sec-abhängig, in einem ersten Schritt Sekretion ins Periplasma
Verläuft ohne Energieaufwand
a) Autotransporter
• C-terminale Domäne des zu sekretierenden Proteins inseriert in die Membran und
bildet einen Sekretionskanal (β-barrel)
• Freisetzung der Passagierdomäne durch Proteolyse
• Substratbeispiel: IgA1-Protease von Neisseria gonorrhoeae
b) Single accessory pathway
• Ein zusätzliches Protein bildet einen Sekretionskanal
• Es erfolgt keine Proteolyse
• Substratbeispiel: FHA von Bordetella pertussis
Chaperon/Usher Sekretionsweg
–
–
–
–
Sec-System befördert Pilin unter Proteolyse ins Periplasma
Chaperon bindet Pilin am konservierten C-Terminus und bringt es zum Türsteher (usher)
Usher sekretiert eine lineare Folge korrekt gefalteter Untereinheiten und sorgt für die
typische helikale Konformation des Pilusstabes an der Zelloberfläche
Substratbeispiel: P-Pilus von E. coli
Gram+ Bakterien besitzen ebenfalls Sekretionsmechanismen für Proteine. Diese sind aber weniger
bekannt als bei gram-negativen Bakterien. Die Sekretion ähnelt dem Sec-System, es gibt allerdings
kein SecB, was auch logisch ist, da dieses bei gram-negativen OMP bindet, die es in gram-positiven
Bakterien nicht gibt. SRP-ähnliche Chaperone binden translatierte Peptide im ungefalteten
Zustand. Die Spaltung der Precursor erfolgt durch Signalpeptidasen und die Faltung durch
membranassoziierte Peptidyl-prolyl-Isomerase (PrsA) + Metallionen.
Wie erfolgt die Darstellung von Virulenzfaktoren (Proteinen) an der Oberfläche der Zellwand?
Oberflächenproteine sind bei gram+ Bakterien in der Zellwand verankert. Durch das Sec-ähnliche
System sezernierte Proteine werden durch ein sorting signal ( LPTXG + hydrophobe Domäne +
geladenes Endstück ) in der Membran festgehalten. Sortase spaltet das sorting signal bei Threonin
ab und verbindet den neuen C-Terminus des Proteins mit dem Peptidoglykan.
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Die Bilder zeigen die vorhin beschriebenen Sekretionswege gram- Bakterien. Von links oben nach
rechts unten: TypI, TypII, TypIII, TypIV, TypV, Chaperon/Usher.
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10 Signaltransduktion
Dieser biochemische Prozess ermöglicht es Organismen,
a) Ihre Umgebung wahrzunehmen
b) Auf ihre Umgebung zu reagieren (zB durch Anpassung des Genexpressionsmusters)
Signaltransduktion ist implementiert durch
1. Reversible Modifikation von Botenproteinen
a) Bindung eines Liganden
b) Kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Methylierung)
2. Bildung von Signaltransduktionskomplexen
3. Lokalisierung von Signaltransduktionskomplexen
Biochemisch ist Signaltransduktion mittels 2-Komponenten-Systemen implementiert, welche aus
einem Sensor (Histidinkinase, input/transmitter) und einem Response Regulator (receiver, output)
bestehen. Das Schema des Vorgangs ist folgendes: Ein Input führt zu Aktivierung des Sensors, der
autophosphoryliert. Ein Receiver dockt an, die Phosphatgruppe wird auf ihn transferiert, der Sensor
ist wieder im Grundzustand. Der Receiver entscheidet, ob das Signal versandet, indem er
desphosphoryliert oder mit dem Phosphat einen Output erzeugt, indem er selbst eine Funktion
ausübt oder das Signal weitergibt.
In der Osmoregulation in E. coli wird ein ein 2-Komponenten-System verwendet, das die Porinexpression steuert. EnvZ ist der Sensor, OmpR der Receiver. EnvZ kann in zwei Konformationen
vorliegen, bei hoher Osmolarität hat es Kinase-Aktivität, bei niedriger Osmolarität wirkt es als
Phosphatase. Es überträgt bzw. entfernt Phosphat auf/von OmpR, welches an das Porin-Operon
bindet und die Transkription unterschiedlicher Porine steuert.
Porin
Ø
Expression bei hoher Osmolarität
Expression bei niedriger Osmolarität
OmpF 0,58 nm
niedrig
hoch
OmpC 0,54 mn
hoch
niedrig
Mittels Signaltransduktion sind Bakterien zu gerichteter Bewegung fähig, genannt Taxis. Man
unterscheidet nach Art der Reizquelle Chemotaxis, Phototaxis, Aerotaxis und Magnetotaxis.
Bakterien bewegen sich mittels Flagellae, das sind spiralförmige Proteinstrukturen, die in der
Plasmamembran verankert sind. Sie bestehen aus etwa 50 Proteinen der Familien Fli, Flg und Mot.
Nach Position der Flagellae unterscheidet man die Begeißelung in
monotrich
amphitrich
lophotrich
peritrich
→ ein Flagellum an einem Zellpol
→ ein Flagellum an jedem Zellpol
→ mehrere Flagellae an jedem Zellpol
→ Flagellae an jeder Stelle der Oberfläche möglich.
Ein Flagellum weist mehrere Strukturbereiche auf. Der Basalkörper verankert das Flagellum in der
Zelle, es beginnt an der Cytoplasmamembran und endet an der Außenmembran und bildet den
Motor für die Bewegung, ein Transportsystem für Flagellum-Proteine sowie ein Ringsystem für die
Verankerung. Der Motor ist in der Plasmamembran und im Peptidoglykan verankert. Er besteht aus
einem Rotor (MS-Ring und C-Ring aus FliF, G, M, N) und einem Stator (aus MotA und Mot B).
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Die Proteine des Drive-shafts (FlgB, C, F, G) stellen eine Verbindung zum Hook her, bushing (L
und P-Ring aus FlgH, I) verankert den Basalkörper im Peptidoglykan und der Aueßenmembran.
Hook (aus FlgE aufgebaut, an das ein FlgK und FlgL Element anschließen) ist ein unbewegliches
Element, das den Basalkörper und das eigentliche Flagellum verbindet.
Das Helikale Filament ist das eigentliche Flagellum. Es ist aus FliC aufgebaut und durch FliD
stabilisiert . Die Energie zum Antrieb des Flagellums kommt von der PMF.
Molekulare Steuerung des flagellaren Motors
Die beteiligten Proteine sind in den Operons MOCHA und MECHE abgelegt.
a) MOCHA → MotA, MotB, CheA, CheW
b) MECHE → CheY, CheB, CheZ, CheR
Alle chemotaktischen Reize passieren den Regulator CheA, das Che Y phophoryliert, welches
widerum auf die flagellaren Proteine wirkt, speziell auf die Konformation von MotA und MotB.
CheY ist das cytoplasmatische Bindeglied zwischen zwei Ereignissen, die an der Plasmamembran
stattfinden. Die Aktivität des rezeptorgebundenen CheA-Kinasekomplexes wird duch Schreck- oder
Lockreize gesteuert. Die ausglöste Phosphorylierung von CheY verändert seine Konformation
derart, dass CheY an FliM bindet, FliM bewirkt eine Konformationsänderung inFliG, es kommt zur
CW Bewegung des Flagellums, somit zum Tumbling, bindet CheY nicht an FliM kommt es zur
keiner Konformationsänderung in FliM und es kommt zu einer CCW-Bewegung, das Bakterium
schwimmt Die Energie für die Bewegung stammt von der PMF, MotA und MotB bilden einen
Protonenkanal in der Cytoplasmamemran, durch den Protonen in die Zelle gelangen, die für die
- 22 -
bewegung des Flagellums notwendig sind. CheY wird von CheZ dephosphoryliert.
Die Erkennung von Lock- oder Schreckstoffen erfolgt mittels eines MCP – Methyl-accepting
Chemotaxis Protein. Es kommt immer Dimer vor und enthält eine Bindungsstelle für Stoffe des
extrazellulären Mediums am Interface zwischen den Monomeren. Die Transmembrandomäne ist
durch dünne α-Helixbündel gekennzeichnet. Die intrazelluläre Domäne ist durch E- und Q-Reste
gekennzeichnet, die eine Modifikation durch eine Amidase/Esterase (CheB) und eine
Methyltransferase (CheR) zulassen. An die hochkonservierten turns sind CheA und CheW also
Adaptormodule gebunden.
CheA ist eine Histidinkinase mit 5 Domänen und liegt immer dimer vor. Die Domänen vom NTerminus aus sind:
•
•
•
•
•
H-Domäne: His-Autophosphorylierungsstelle
YB-Domäne: Bindet an den Chemotaxis Response Regulator (RR) CheY
D-Domäne: Dimerisierung
C-Domäne: Katalytische Region, das Zentrum des Enzyms
R-Domäne: Enthält ein Adaptormodul zur Vermittelung von
(Signaltransduktionskomplex)
MCP-Clustern
Die Kinaseaktivität kann moduliert werden, indem Lockstoffe gebunden werden, die die Anordnung
der extrazellulären Domäne verändern oder indem die elektrostatische Anziehung im
Rezeptorcluster durch Methylierung der Glutamat(E)-Reste reguliert wird.
Eine Methylierung bewirkt, dass die Affinität der MCP zum Substrat erniedrigt wird, somit wird
eine dauerhafte Bindung verhindert, da das Substrat keine Veränderung erfährt. Ein Lockstoff führt
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zu Demethylierung, die Domänenwechselwirkung sinkt, das Bakterium schwimmt. Ein
Schreckstoff hingegen führt zu Methylierung, die Domänenwecheselwirkung steigt, die Kinase wird
aktiv, das Bakterium taumelt.
Durch die Adaption wird sichergestellt, dass ein Bakterium auch bei hohen AttractansKonzentration noch Tumbeln kann und sich nach Orten einer höheren Attractens-Konzentration
orientieren und dann in diese Richtung schwimmen kann Ist die Attractans-Konzentration hoch,
würde die Kinaseaktivität von CheA fallen, da der Rezeptor immer einen Liganden gebunden hat,
CheY könnte nicht mehr phosphoryliert werden und das Bakterium könnte sich nicht neu
orientieren. Um das zu verhindern, besitzt das System eine Methyltransferase CheR, die
kontinuierlich Methylgruppen von S-Adenosyl-Methionin (Methyldonor) an die negativ geladene
Glutamate der Rezeptors überträgt. Sind die AS des Rezeptors vollständig methyliert, kann der
Rezeptor keinen Attractant mehr binden, es kommt zur Konformationänderung des Rezeptors
wodurch die Kinaseaktivität von CheA steigt, CheY wird phosphoryliert und es kommt zum
Tumbling und das Bakterium orientiert sich wieder nach höherer Konzentration. CheA
phosphoryliert aber auch CheB, das nun im phosphorylierten Zustand die Methylgruppen des
Rezeptors wieder wegnimmt (Demethylase), damit der Rezeptor wieder Attractans binden kann und
die Bewegung von neuem gestartet werden kann. Das System pendelt also zwischen aktiven und
inaktiven Rezeptor hin und her und kann sich dadurch immer neu orientieren.
11 Quorum sensing
Bakterien werden im allgemeinen als unabhängige einzellige Organismen gesehen. Einige
Bakterien weisen aber ein koordiniertes Verhalten auf, das einer ganzen Population von Bakterien
erlaubt, eine bestimmte Funktion koordiniert durchzuführen oder ihre individuelle Aktivität zu
modifizieren. Diese von der Zelldichte abhängige Regulation nennt man quorum sensing.
Bekterielle Verhaltensweisen beginnen den Organisationsformen von mehrzelligen Organismen
ähnlich zu werden. Quorum sensing nimmt Einfluss auf:
Virulenz
Sporulation
Biofilmbildung
Exopolysaccharidproduktion
Warnung vor eukaryotischen Organismen
Konjugation
Warnung vor sekundären Metaboliten
Biolumineszenz
Bestimmte Bakterielle Eigenschaften prägen sich nur dann aus, wenn eine entsprechende Anzahl an
Bakterien vorliegt. Dazu signalisieren sie der Umgebung ihre Anwesenheit und ermitteln, ob andere
Zellen in der Umgebung sind, mittels Signalmolekülen wie AHL(acyl-HSL) oder Peptiden.
Im Fall von Vibrio fischeri, einem Symbiont in den Leuchtorganen von Tiefseefischen, kommt ein
Autoinducer zum Einsatz, der die mit Luciferase katalysierte Oxidation von Luciferin zu
Oxyluciferin hervorruft.
Freilebende Zellen, also solche, die außerhalb von Leuchtorganen des Symbionten und außerhalb
anderer dichter Ansammlungen existieren, leuchten nicht. Zurückzuführen ist diese Beobachtung
auf einen zelldichtenabhängigen Regulationsmechanismus der Biolumineszenz von V. fischeri. Um
den mit einer Biolumineszenz einhergehenden Energieaufwand möglichst gering zu halten, lässt
dieser Kontrollmechanismus nur eine biolumineszente Aktivität zu, wenn dieselbe für das
Überleben des Symbionten auch erforderlich ist.
Ermöglicht wird diese Regulation durch Genprodukte des lux-Operons. Auf diesem sind nicht nur
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die zur Synthese der zur Biolumineszenz notwendigen Proteine codiert, sondern auch die
Informationen zur Herstellung eines Enzyms, der Autoinduktor-Synthetase, sowie eines
Apoaktivators. Im Cytoplasma werden von der Autoinduktor-Synthetase laufend
Autoinduktormoleküle aufgebaut, die durch die Zellwand hindurch in die Extrazellularflüssigkeit
diffundieren. Im Meerwasser werden sie dermaßen stark verdünnt, dass ein signifikanter
Konzentrationsanstieg nicht messbar ist. Sobald aber V. fischeri in einem Leuchtorgan in höherer
Zellzahl vorkommt, steigt die Konzentration der Autoinduktormoleküle deutlich. Da diese Moleküle
die Zellwände der Bakterien relativ leicht passieren können, gelangen sie auch vermehrt in
benachbarte Zellen - die freilich ebenfalls Autoinduktormoleküle herstellen. Insgesamt steigt also
auch die Konzentration dieser Moleküle innerhalb der Zellen, wo sie eine Verbindung mit den
Apoaktivator-Molekülen eingehen. Dieser Komplex besetzt den Operator des lux-Operons und
steigert die Transkriptionsrate der auf ihn folgenden Gene dramatisch: Es werden einerseits alle zur
Biolumineszenz notwendigen Proteine vermehrt synthetisiert, andererseits kommt es auch zu einer
deutlich vermehrten Transkription und Translation der Informationen zum Aufbau der
Autoinduktor-Synthetasen und der Apoaktivatoren.
Die Sprache der Gram- Bakterien im quorum sensing ist die Autoinduktion. Sie beginnt mit der
Produktion diffundierbarer Botenstoffe, autoinducer genannt, die in die benachbarten Zellen
diffundieren können. Autoinducer aktivieren Transkriptionsfaktoren, aber einer Konzentration von
etwa 10 nM kommt es zum quorum response.
Gram+ Bakterien kommunizieren über ein 2-Komponenten-System, das durch Signalpeptide
angeregt wird. Die Peptide werden durch ABC-Transporter sezerniert, akkumulieren in der
Umgebung und binden an eine Histidinkinase, die über einen Responeregulator die Genexpression
reguliert.
Bei Vibrio harveyi wurde zum ersten Mal ein Hybridsystem entdeckt, das zwei Arten von
Autoinducern verwendet. AI-1 für die Steuerung des Lux-Operons, allerdings nicht über LuxI/R
sondern über eine membrangebundene Histidinkinase. AI-2 ist ungewöhnlich, da er von mehreren
bakteriellen Spezies produziert und erkannt wird. Kann dadurch eine Kommunikation zwischen
verschiedenen Spezies etabliert werden?
Biofilmbildung – Pseudomonas aerunginosa
Freischwimmende, planktonische Bakterien erkennen eine Oberfläche und haften daran mittels
Adhesinen fest. Sie teilen sich und rekrutieren weitere planktonische Zellen. Aus diesem
zweidimensionalen Wachstum ergeben sich Probleme wie Nahrungsknappheit oder Anreicherung
toxischer Metabolite. Als Lösung migrieren angehaftete Bakterien langsam von der Oberfläche
weg, indem sie eine extrazelluläre Matrix absondern, die Biofilmmatrix. Die Zellen verbinden sich
zu pilzartigen Strukturen mit Waserkanälen, durch die Nährstoffe hinein- und Abfallstoffe
hinausgelangen. Die Matrix besteht wie das Glykokalyx gram+ Bakterien aus viskosem
Polysaccharid- oder Polypeptidschleim.
12 Sporulation
Die Endosporenbildung findet bei Bakterien der Genera Bacillus, Clostridium und einiger anderer
seltenerer Genera statt. Es ist eine Reaktion auf extrem ungünstige Wachstumsbedingungen, wie sie
beispielsweise am Ende der Log-Phase auftreten.
Im Gegensatz zur normalen Zellteilung, bei der zwei gleich große Kompartimente entstehen, findet
man zwei unterschiedlich große bei der Sporulation. Eine Spore hat eine doppelte Zellmembranen,
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eine innere von der Tochterzelle und eine äußere von der Mutter (Sporangium), die die Vorspore mit
ihrer Membran umfließt.
Endosporen sind alternative ruhende Lebensformen. Manche haben in Bernstein 25 Millionen Jahre
überdauert. Sie sind wegen ihrem hohen Proteinanteil lichtbrechend und erscheinen als helle
Lichtpunkte im Phasenkontrastmikroskop. Nach der Lage der Spore im Sporangium unterscheidet
man terminale, subterminale und zentrale endosporenbildende Bakterien.
Eine Endospore gliedert sich als modifizierte Bakterienzelle in
•
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•
Cytoplasma – Kompakt, entwässert, wenig Ribosomen und Enzyme, Erbinformation an
SSB gebunden (Strahlungsschutz)
Cortex – Peptidoglykan mit niedriger Quervernetzung, enthält entwässerte Form der
Muraminsäure
Coat – Proteinhältige Schicht, quervernetztes Keratin verleiht Widerstandskraft gegen
Chemikalien, Hitze und Bestrahlung
Exosporium – Charakteristische Hülle mit Innen- und Außenmembran
Unterschiede zwischen Endosporen und vegetativen Zellen
Eigenschaft
Endospore
Vegetative Zelle
Ca++ Gehalt
Hoch
Niedrig
Dipicolinsäure
Anwesend
Abwesend
SASPs (small acid soluble proteins)
Anwesend
Abwesend
Wasser
10-25%
80-90%
Cytoplasmatischer pH-Wert
5,5-6
7
Enzymaktivität
Niedrig
Hoch
Metabolismus
Kryptobiose
Hoch
Chemikalien-/Hitzeresistenz
Hoch
Niedrig
Färbeverhalten
Spezielle Agentien
Gram Agentien
Lysozym
Resistent
Empfindlich
Sporulation ist eine primitive Form der Differenzierung. In B. Subtilis dauert der Prozess etwa 7
Stunden bei 37°C und involviert mehr als 200 Gene, sie sogenannten spo-Gene. Es werden acht
Stadien durchlaufen:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Normales Wachstum
Bakterielle Zellteilung
Asymmetrische Septierung
Kompartimentalisierung der Genexpression
Cortex-Synthese
Coat-Synthese
Lyse der Mutterzelle
Freie Spore
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Molekulare Basis der Sporulation
In der Mutterzelle wie in der Spore müssen unterschiedliche transkriptionelle Programme ablaufen
– wie wird das bewerkstelligt und reguliert? In den Kompartimenten kommt es zur kaskadenartigen
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren für die RNA-Polymerase, den σ-Faktoren. In der Spore
kommt es zur Expression der σ-Faktoren σF und σG, in der Mutterzelle σE und σK. Das gentische
Programm der Sporulation ist noch nicht in allen Details geklärt.
Schritt 1: Aktivierung (Phosphorylierung) von Spo0A
Dieses Initiatorsignal führt zur Aktivierung einiger Kinasen und Phosphatasen.
Schritt 2: Folgen der Spo0A-Aktivierung
Als Folge kommt es zur Transkription und Expression septierender und kompartimentalisierender
Proteine.
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•
•
spoIIA
spoIIE
spoIIG
unknown
→ entählt den σF-Faktor sowie SpoIIAA und SpoIIAB, die ihn regulieren
→ eine Phosphatase, die an der σF-Aktivierung beteiligt ist
→ eine Protease, die σE aktiviert
→ ein unbekanntes Gen, das die Assemblierung von FtsZ steuert
Schritt 3: Asymmetrische Zellteilung
FtsZ lokalisiert in Analogie zur vegetativen binary fission an der Septumbildungsstelle. SpoIIIE
lagert sich ins Septum ein, sodass es zwischen zwei Schichten FtsZ liegt, an die zu beiden Seiten
SpoIIE bindet.
Das Sporulationsseptum ist viel dünner als ein vegetatives Septum und liegt nicht in der Zellmitte.
Anstatt einer Zellteilung, umfließt die Mutterzelle die Spore. Die Genexpression wird nach der
Septumbildung kompartimentalisiert.
Schritt 4: Kompartimentalisierung der Genexpression
a) Aktivierung von σF
Im Grundzustand liegt σF im Komplex mit SpoIIAB inaktiv vor. SpoIIAA ist phosphoryliert. SpoIIE
(Phosphatase) dephosphoryliert SpoIIAA, sodass es SpoIIAB bindet und σF freisetzt.
Warum passiert das nur in der Vorspore bzw. woher weiß das Bakterium, welches Kompartiment die
Spore ist? Dazu gibt es zwei Theorien, die eine besagt, dass SpoIIE auf beiden Seiten des Septums
vorkommt, aber nur an einer aktiv ist, weil an einer Seite ein Inhibitor aktiv ist oder SpoIIAB
proteolytisch gespalten wird. Als zweite Erklärung gilt, dass SpoIIE nur auf einer Seite des Septums
vorkommt.
b) Aktivierung von σE
Die Aktivierung von σF führt dazu, dass die Protease SpoIIG, reguliert durch SpoIIR, in der
Mutterzelle pro-σE in σE spaltet, welches nun als Transkriptionsfaktor aktiv wird.
c) Aktivierung von σG
In der Spore liegt ein Komplex aus σG und SpoIIAB vor. In der Mutterzelle führt σE zur Expression
von SpoIIIA und SpoIIIJ, letzteres lagert sich in den Proteincoat ein und bewirkt eine Freisetzung
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von σG aus seinem Komplex in die aktive Form.
d) Aktivierung von σK
σG reguliert die Expression von SpoIVFB, das den σK-Precursor (pro-σK) proteolytisch zu aktivem
σK umwandelt, welcher die Expression von SpoIVA startet. Dieses Protein verbindet Proteincoat
und Exosporium.
Schritt 5: Chromosomentranslokation
Im letzten Schritt wird die Translokation des Nukleoids von der DNA-Translokase SpoIIIE
durchgeführt. SpoIIIE ist eine DNA-abhängige ATPase wie auch FtsK. Es pumpt analog dazu DNA
in ein anderes Kompartiment, generiert aber zusätzlich positive supercoils zur Verdichtung der
Erbinformation in der Spore. Das Bild zeigt den Ablauf der kompartimentalisierten Genexpression.
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13 Materialverzeichnis
Textunterlagen:
Baccarini, M. - Foliensätze
Unbekannt - Fragenausarbeitung Juni 2009
Skriptenforum - .../Skriptum:Allgemeine_und_Molekulare_Mikrobiologie_(Baccarini_Manuela)
Bildmaterial:
Bild 2.1 Bakterium - http://www.williamsclass.com/SeventhScienceWork/CellsOrganization.htm
Bild 5.1 Three-for-One growth model – Vollmer, Höltje, Current Opinion in Microbiology 2001,
4:625–633
Bild 6.1 FtsK – Baccarinifolie
Bild 6.2 MinC, MinD – Baccarinifolie
Bild 9.1 bis 9.6 – Baccarinifolien
Bild 10.1 Flagellum - http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n6/fig_tab/nrmicro1887_F2.html
Bild 10.2 MCP – Baccarinifolie
Bild 12.1 Genexpressionsprogramm – Baccarinifolie
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