zellatmung - Ruhr-Universität Bochum

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ZELLATMUNG
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Im aeroben Metabolismus gebildetes ATP wird zum großen Teil in Mitochondrien synthetisiert und im Cytosol verbraucht. Bei der mitochondrialen ATP-Synthese wird die Oxidation
von Substraten wie NADH und Succinat durch Sauerstoff mit der Phosphorylierung von ADP
gekoppelt; dieser Prozess heißt oxidative Phosphorylierung. Er wird von Enzymen der
inneren Mitochondrienmembran katalysiert, wobei die Energie für die Bildung von ATP von
den Oxidationsvorgängen bereitgestellt wird.
Die Energieübertragung geschieht durch Ionen-Pumpen, die Protonen ohne begleitende
Anionen durch die innere Mitochondrien-Membran transportieren (elektrogener Protonentransport). Dabei entstehen gleichzeitig ein Protonengradient und ein Membranpotential (außen
positiv); beide können als Komponenten eines "elektrochemischen Protonengradienten" aufgefasst
werden. Bei der NADH-Oxidation verschwinden Protonen aus der Matrix:
NADH + H+ + ½ O2  NAD+ + H2O
Der Beitrag dieser skalaren (nicht elektrogenen) Protonen ist gering, da sie bei der Reduktion von NAD+ wieder freigesetzt werden, und soll hier nicht weiter besprochen werden.
Protonenpumpen, die durch Elektronentransport getrieben werden, sind in den Komplexen I,
III und IV enthalten; sie transportieren Protonen in den Intermembran-Raum. Die ATPSynthase ist eine Protonenpumpe, die diese Protonen zurück in die mitochondriale Matrix
fließen lässt und dadurch die Energie für die ATP-Synthese erhält. Auch dieser Protonentransport ist elektrogen, d.h. er findet ohne begleitende Anionen statt. Dieser Mechanismus
der oxidativen Phosphorylierung basiert auf der 1961 zuerst formulierten "chemiosmotischen
Theorie" des Engländers Peter Mitchell, für die er 1979 den Nobelpreis bekam.
Da ATP in der Mitochondrienmatrix synthetisiert, aber in der Regel im Cytosol verbraucht
wird, sind Transportvorgänge für Substrat und Produkt der oxidativen Phosphorylierung
wichtig. ADP und Phosphat werden in die Matrix und ATP wird in das Cytosol transportiert.
Dies geschieht durch zwei Transportsysteme.
1.
Die Adeninnukleotid-Translokase ermöglicht den Austausch von Matrix-ATP gegen
cytosolisches ADP:
Cytosol
Matrix
ADP-3
ADP-3
ATP-4
ATP-4
6
Dieser Prozess ist elektrogen und wird durch das Membranpotential getrieben: beim
ADP/ATP-Austausch wird durch ATP eine negative Ladung mehr in das Cytosol
transportiert, als durch ADP in die Matrix gelangt.
2.
Der Phosphat-Transporter katalysiert den Austausch von Matrix-OH- gegen
cytosolisches Phosphat:
Cytosol
Matrix
H2PO4)
H2PO4)
OH)
OH)
oder, davon nicht unterscheidbar, den Kotantransport von Phosphat und Protonen:
Cytosol
Matrix
H2PO4)
H2PO4)
H+
H+
Dieser Prozess ist elektroneutral und wird durch den pH-Gradienten getrieben.
Die Stöchiometrie der ATP-Bildung bei der Oxidation von NADH oder Succinat wird durch das
P/O-Verhältnis (oder ATP/O- oder ADP/O-Verhältnis, je nachdem, welche Reaktion betrachtet
wird) ausgedrückt. Theoretisch hängt das ATP/O-Verhältnis von der Zahl der elektrogenen
Protonen ab, die
1.
im Elektronentransport produziert,
2.
bei der ATP-Synthese und
3.
während des Substrat- und Produkt-Transports verbraucht werden.
Das ATP/O-Verhältnis für die Oxidation von NADH oder Succinat wird gewöhnlich mit 3 bzw.
2 angegeben. Experimentell werden häufiger Werte um 2,5 für NADH und 1,5 für Succinat
gefunden.
Aus energetischen Gründen kann ATP nicht ohne gleichzeitig ablaufende Redoxvorgänge
synthetisiert werden. Umgekehrt würde die Oxidation von NADH oder Succinat ohne gleichzeitige
Phosphorylierung nur Wärme erzeugen. Eine kinetische Kontrolle, die Atmungskontrolle,
verhindert dies und lässt nennenswert schnelle Oxidation in der Atmungskette nur zu, wenn die
Möglichkeit der ATP-Synthese durch Anwesenheit von ADP gegeben ist.
7
Abb. 1:
Schematische Darstellung der oxidativen Phosphorylierung
Abb. 1 zeigt die wichtigsten Prozesse der oxidativen Phosphorylierung, die in der Mitochondrienmatrix und an der
inneren Mitochondrienmembran ablaufen. (I-IV) Komplex I-IV der Atmungskette; (F1/F0) ATP-Synthase; (Q)
Coenzym Q; (C) Cytochrom c; (T) Adeninnukleotid-Translokase; (P) Phosphat-Transporter; (EH/E-) Entkoppler im
protonierten bzw. dissoziierten Zustand; (dick gestrichelter Pfeil) Elektronenfluss; (dünn gestrichelter Pfeil)
Protonentransport.
Einige Teilschritte der oxidativen Phosphorylierung lassen sich durch spezifische Inhibitoren
hemmen.
1.
2.
Der Elektronentransport wird gehemmt
a)
zwischen NADH und Coenzym Q (Komplex I) durch Rotenon und Barbiturate
b)
Succinat und Coenzym Q (Komplex II) durch Malonat
c)
zwischen Coenzym Q und Cytochrom c (Komplex III) durch Antimycin,
d)
zwischen Cytochrom c und Sauerstoff (Komplex IV) durch Cyanid und Sulfid.
Die ATP-Synthese wird durch Oligomycin und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) direkt
gehemmt. Arsenat wirkt indirekt: es wird anstelle von Phosphat mit ADP verknüpft;
das so gebildete Arsenyl-ADP hydrolysiert spontan und bildet ADP und Arsenat
zurück.
3.
Der ADP/ATP-Austausch wird durch Atractylosid gehemmt.
4.
Der "elektrochemische Protonengradient" wird durch Entkoppler wie 2,4-Dinitrophenol
(DNP) kurzgeschlossen. DNP ist eine schwache Säure, die cytosolische Protonen
elektrogen in die Matrix transportiert, indem sie in neutraler Form (EH) in die Matrix
diffundiert, dort ein Proton an das alkalischere Milieu abgibt und dann als lipophiles
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Anion
(E-)
vom
Membranpotential
zurück
in
das
Cytosol
(bzw.
den
Intermembranraum) gezogen wird, wo der Zyklus erneut beginnen kann
Cytosol
H+ + E)
Matrix
EH
EH
E)
H+ + E)
E)
Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP), eine schwache Base, ist ebenfalls ein
sehr effektiver Entkoppler, dessen Wirkungsmechanismus sich in analoger Weise
beschreiben lässt.
Cytosol
H+ + E)
Matrix
EH+
E
EH+
H+ + E)
E
ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN
Zentrale Stoffwechselprozesse: Glykolyse, alkoholische Gärung, Glykogenstoffwechsel und
dessen Regulation, Citratzyklus, Atmungskette;
Prinzipien und Mechanismen der Stoffwechselregulation;
Unterschiedliche Mechanismen der ATP-Bildung;
Struktur und Funktion der Mitochondrien;
Chemiosmotische Theorie;
Membranstruktur;
Ionentransport durch die Mitochondrienmembran;
Ionen-Pumpen und Ionophore;
Prinzipien der Entkopplung;
Gruppenübertragungspotentiale;
Wasserstoffübertragende Coenzyme;
Funktionen von Nucleosidtriphosphaten
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ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
Mitochondrien, die auf schonende Weise aus frischer Rattenleber isoliert wurden, besitzen
die Fähigkeit zur ATP-Synthese. Diese läuft unter Verbrauch von Sauerstoff ab und ist
abhängig vom Vorhandensein von ADP und Phosphat. In den folgenden Versuchen sollen
-
das ADP/O-Verhältnis und der Atmungskontrollkoeffizient unter Verwendung der
beiden Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat ermittelt werden;
-
der Einfluss von Oligomycin, eines Inhibitors der ATP-Synthase und von Atractylosid,
das den ATP/ADP-Austausch hemmt, sowie des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol auf
die oxidative Phosphorylierung untersucht werden;
-
der Elektronenfluss der Atmungskette durch selektive Inhibitoren der Komplexe I bis
IV gehemmt werden.
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner
Für den Versuch werden folgende Lösungen benötigt:
-
Mitochondriensuspension (20 mg Protein/ml) in isotonischer Pufferlösung
-
Testpuffer "H" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M
Mannit) mit 20 mM 3-Hydroxybutyrat
-
Testpuffer "S" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M
Mannit) mit 20 mM Succinat
-
0,25 M ADP ( auf pH = 7.4 eingestellt)
-
0,1 M Succinat
-
0,5 M 3-Hydroxybutyrat
-
10 mM 2,4-Dinitrophenol (auf pH = 7.4 eingestellt)
-
0,5 mM CCCP*) in Ethanol
-
Oligomycin*) (1 mg/ml in Ethanol)
-
Atractylosid*) (1 mg/ml in Ethanol)
-
Rotenon*) (1 mg/ml in Ethanol)
-
1,0 M Malonat
-
Antimycin A*) (2 mg/ml in Ethanol) Formel s. Anlage
-
1 M Kaliumcyanid
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VERSUCHSANORDNUNG:
Als Messzelle für alle Versuche dient ein thermostatisierbares Glasgefäß, das eine
Sauerstoffelektrode enthält (Abb. 2). Diese besteht aus einem Silber/Platin-Elektrodenpaar, das
sich in einer Elektrolytlösung befindet und durch eine gasdurchlässige Teflonmembran
umschlossen wird. Ein Verstärker versorgt die Elektroden mit einer Polarisationspannung, wobei
Sauerstoff, der sich zwischen den Elektrodenflächen befindet vollständig reduziert wird. Dadurch
fließt zwischen den Elektroden ein Strom, der in einem direkten stöchiometrischen Verhältnis zum
verbrauchten Sauerstoff steht. Bei ausreichender Durchmischung des Probevolumens
(Magnetrührer!) erfolgt über die gasdurchlässige Teflonmembran ein rascher Sauerstoffaustausch
zwischen der Probe in der Messzelle und der Elektrolytlösung der Elektrode, so dass der zwischen
den Elektroden fließende Strom der jeweiligen Sauerstoffkonzentration in der Probe proportional
ist. Dieser Strom wird vom Verstärker in eine Spannung umgewandelt und so verstärkt, dass sich
eine Messgröße im Voltbereich ergibt, die mit Hilfe eines A/D-Wandlers und eines PCs in ihrem
zeitlichen Verlauf dargestellt werden kann. Auf diese Weise können zeitliche Änderungen der
Sauerstoffkonzentration registriert werden; die Steigung einer aufgezeichneten Linie entspricht der
Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs.
Abb. 2:
Versuchsanordnung zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von
Mitochondrien
Messung der Atmungskontrolle und des ADP/O-Verhältnisses mit den Substraten 3Hydroxybutyrat und Succinat
EICHUNG DER SAUERSTOFFELEKTRODE
Das Reaktionsgefäß wird mit Wasser gefüllt, das bei Raumtemperatur mit Luft gesättigt ist
und daher etwa 250 nmol O2 /ml enthält. Das Gefäß wird sofort mit einem Glasstopfen
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verschlossen und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch Betätigen des Start-Buttons im
Programm wird der Messvorgang gestartet. Sobald die auf dem Monitor dargestellte
Spannungslinie einen waagerechten oder nur geringfügig abfallenden, linearen Verlauf
anzeigt wird dem Wasser etwas Natrium-Dithionit (Reduktionsmittel) zugesetzt: dadurch wird
der im Wasser gelöste Sauerstoff verbraucht, und die registrierte Spannung fällt rasch ab,
um sich nach kurzer Zeit bei einem niedrigen Wert zu stabilisieren. Die Messung wird durch
Anklicken des Stopp-Buttons beendet. Die graphische Darstellung der Messwerte wird dann
ausgedruckt. Die Differenz der Spannung vor und nach Zugabe von Dithionit entspricht einer
Sauerstoffkonzentration von 250 nmol/ml.
BESTIMMUNG DES ATMUNGSKONTROLLKOEFFIZIENTEN UND DES ADP/O-QUOTIENTEN
Vor Versuchsbeginn wird die Zelle mit Hilfe einer Vakuumvorrichtung (Pipettenspitze)
entleert und dreimal mit Wasser nachgespült. Dabei ist drauf zu achten, dass das Wasser
der letzten Spülung möglichst vollständig entfernt wird. Entsprechend dem folgenden
Versuchsplan werden dann die Suspension von Rattenlebermitochondrien sowie der jeweils
erforderliche Testpuffer in die Messzelle pipettiert. Diese wird sofort mit einem Glasstopfen
verschlossen, der mit einer kapillaren Öffnung versehen ist, und der Magnetrührer wird
eingeschaltet. Durch Betätigen der Start-Taste im Programm wird der Messvorgang
gestartet, und die Sauerstoffkonzentration in der Messzelle kann am Monitor unmittelbar
verfolgt werden. Nach Erreichen einer konstanten Geschwindigkeit der Sauerstoffabnahme
wird mit Hilfe einer Mikroliterspritze durch die Kapillare des Glasstopfens ADP-Lösung,
entsprechend dem Versuchsplan, zugegeben. Nun wird der aktive Zustand der
Mitochondrien erreicht und eine erhöhte Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs
beobachtet, die so lange anhält, bis das zugegebene ADP nahezu vollständig in ATP
umgewandelt ist. Der Sauerstoffverbrauch nimmt wieder ab, die Mitochondrien befinden sich
im Ruhezustand. Die erneute Zugabe einer größeren Menge von ADP ergibt das gleiche
Bild.
Lediglich
die
Dauer
des
aktiven
Zustandes
und
damit
die
Höhe
des
Sauerstoffverbrauches verändern sich entsprechend der größeren Menge an zugegebenem
ADP. Nach Erreichen des Ruhezustandes wird die Messung durch Drücken des StoppButtons beendet.
Der Quotient aus den Geschwindigkeiten im aktiven und im Ruhezustand wird als
Atmungskontrollkoeffizient bezeichnet. Aus der zugegebenen ADP-Menge und der im
aktiven Zustand verbrauchten Sauerstoffmenge lässt sich der ADP/O-Quotient errechnen
(siehe Rechenbeispiel).
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Versuchsplan
Versuchsnummer
1.2.1
1.2.2
3-Hydroxybutyrat
Succinat
Testpuffer "H"
1,7 ml
-
Testpuffer "S"
-
1,75 ml
100 µl
50 µl
Benutztes Substrat
Mitochondriensuspension
Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!
ADP 0,25 M
1 µl
0.5 µl
Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist!
ADP 0,25 M
2 µl
1 µl
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HEMMUNG DER ATP-BILDUNG DURCH INHIBITOREN UND ENTKOPPLER
2.1
Hemmung der ATP-Synthese und des ADP/ATP-Austausches / Entkopplung
durch 2,4-Dinitrophenol
Wie in den vorherigen Versuchen (1.2.1 und 1.2.2) wird einer Suspension von
Rattenlebermitochondrien in Testpuffer, der 20 mmol/l 3-Hydroxybutyrat enthält, zunächst
ADP-Lösung zugesetzt. Nach Erreichen der Ruhephase werden die jeweiligen Inhibitoren
und etwa 1 min später weiteres ADP zugegeben, das nun keinen Effekt mehr zeigt. Erst die
Zugabe des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol stimuliert den Sauerstoffverbrauch.
Versuchsplan
Versuchsnummer
2.1.1
2.1.2
Benutzter Inhibitor
Oligomycin
Atractylosid
Testpuffer "H"
1,7 ml
1,7 ml
Mitochondriensuspension
100 µl
100 µl
Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!
ADP 0,25 M
1 µl
1 µl
Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist!
Oligomycin (1 mg/ml)
1 µl
-
Atractylosid (1 mg/ml)
-
1 µl
ca. 1 min warten
ADP 0,25 M
1 µl
1 µl
ca. 1 min warten
2,4-Dinitrophenol (10 mM)
2 µl
2 µl
14
2.2
Hemmung des Elektronentransports
Rattenlebermitochondrien werden in den jeweils angegebenen Substrat-Pufferlösungen
suspendiert. Sobald ein konstanter Sauerstoffverbrauch zu beobachten ist, wird die Atmung
durch Anwendung des Entkopplers CCCP aktiviert. Die Zugabe von Inhibitoren und weiteren
Substraten erfolgt entsprechend dem Versuchsplan.
Versuchsplan
Versuchsnummer
2.2.1
2.2.2
3-Hydroxybutyrat
Succinat
Rotenon / Antimycin A
Malonat / Canidé
Testpuffer "H"
1,7 ml
-
Testpuffer "S"
-
1,75 ml
100 µl
50 µl
benutztes
Substrat
benutzte Inhibitoren
Mitochondriensuspension
Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!
CCCP 0,5 mM
1 µl
1 µl
ca. 40 sec warten
Rotenon (1 mg/ml)
Malonat 1,0 M
1 µl
-
-
10 µl
ca. 2 min warten
Succinat 0,1 M
3-hydroxybutyrat 0,5 M
10 µl
-
-
10 µl
ca. 40 sec warten
Antimycin A (2mg/ml)
Kaliumcyanid 1M
1 µl
-
-
1 µl
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AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
1.
Berechnung des ADP/O-Verhältnisses und des Atmungskontrollkoeffizienten
Die Auswertung der Versuche erfolgt entsprechend den Abbildungen 3a und 3b. Entnehmen
Sie die Resultate dem bei der Versuchsdurchführung ausgedruckten Diagramm und
übertragen Sie diese in die entsprechenden leeren Kästchen der Abb. 4 (Messdaten).
1)
Berechnen Sie aus den Ergebnissen der Versuche 1.1, 1.2.1 und 1.2.2 folgende
Größen:
a)
die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat
b)
die Reaktionsgeschwindigkeiten (nmol O/(min  mg Protein)) für den aktiven Zustand
und den Ruhezustand mit beiden Substraten
c)
2.
die Atmungskontrollkoeffizienten für beide Substrate.
Vergleichen Sie die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs im aktiven Zustand,
die Atmungskontrollkoeffizienten und die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3Hydroxybutyrat und Succinat. Warum verwenden wir bei Mitochondrienversuchen 3Hydroxybutyrat statt NADH?
2.
Einfluss von Inhibitoren und Entkoppler auf den Sauerstoffverbrauch von
Rattenlebermitochondrien
1)
zu Versuch 2.1.1 und 2.1.2:
a)
Welches sind die Angriffspunkte für die Inhibitoren Oligomycin und Atractylosid?
b)
Warum lässt sich in Anwesenheit dieser Inhibitoren die Aktivität der Atmung zwar
durch Entkoppler, nicht aber durch ADP steigern?
2)
zu Versuch 2.2.1 und 2.2.2
a)
Worin unterscheidet sich die Wirkung der in dieser Versuchsgruppe benutzen
Inhibitoren von derjenigen der im vorherigen Experiment (2.1.1 und 2.1.2)
eingesetzten Hemmstoffe?
b)
Ordnen Sie die einzelnen Inhibitoren den entsprechenden Enzymen zu!
Inwieweit lässt sich diese Zuordnung durch das Versuchsergebnis bestätigen?
16
Rechenbeispiel
zu Aufgabe 1.1a)
Der ADP/O-Quotient gibt das Verhältnis von ADP-Einsatz und Sauerstoffverbrauch, bezogen
auf atomaren Sauerstoff, an.
ADP/O 
nmol ADP
2  nmol O
2
Der Sauerstoffverbrauch wird aus dem ausgedruckten Diagramm ermittelt, wie in
Abb. 3.dargesellt.
Dazu
werden
im
Bereich
des
2.
und
3.
Ruhezustandes
der
Sauerstoffverbrauchskurve (Abb. 3b) Tangenten angelegt. Die Strecke x entspricht dem
Sauerstoffverbrauch für die vorgegebene Menge an ADP. Die Strecke y in Abb. 3a gibt die
Differenz der Sauerstoffkonzentration von Wasser, welches bei Raumtemperatur mit Luft
gesättigt wurde, und von praktisch sauerstofffreiem Wasser an und entspricht somit einer
O2-Konzentration von 250 nmol/ml.
Abb. 3a:
Eichung der Sauerstoffelektrode
Abb. 3b:
Berechnung des Sauerstoffverbrauchs
17
Für den Sauerstoffverbrauch gilt dann:
Sauerstoff verbrauch 
250 nmol
y  ml
V  x
T
Im folgenden Beispiel beträgt das Volumen des Testansatzes (VT) 1,8 ml; y entspricht
7,2 cm und x = 2,6 cm.
Sauerstoff verbrauch 
250 nmol
7,2 cm  ml
 1,8 ml  2,6 cm
= 162 nmol O2
Die Aktivierung der mitochondrialen ATP-Synthese erfolgte durch Zugabe von 2 µl 0,25 M
ADP-Lösung, das entspricht 500 nmol ADP. Daraus ergibt sich:
ADP/O 
500 nmol
2  162 nmol
 1,54
zu Aufgabe 1b)
Reaktionsgeschwindigkeit =
Sauerstoffverbrauch/min
mg Protein im Ansatz
Der Sauerstoffverbrauch pro Minute wird entsprechend dem Sauerstoffverbrauch in Beispiel
1a) berechnet. Dabei wird jedoch der Ausdruck x (= Sauerstoffverbrauch) durch x/min (=
Sauerstoffverbrauch pro Minute) ersetzt. (Beachten Sie bitte, dass die eingesetzten
Proteinmengen (20 mg/ml) bei den einzelnen Versuchsansätzen differieren können!)
zu Aufgabe 1c)
Atmungskoe ffizient 
Reaktionsgeschwindig keit im aktiven Zustand
Reaktionsgeschwindig keit im Ruhezustand
18
Ergebnisse
zu Versuch 1.2.1 und 1.2.2
Substrat
Sauerstoffverbrauch
in der aktiven Phase
(nmol O2):
Eingesetzte Menge an
ADP (nmol):
ADP/O-Quotient:
Sauerstoffverbrauch/min
in der Ruhephase
(nmol O2/min):
Sauerstoffverbrauch/min
in der aktiven Phase
(nmol O2/min):
Eingesetzte Menge an
Protein (mg):
Reaktionsgeschwindigkeit
in der Ruhephase
(nmol O/(min · mg Protein)):
Reaktionsgeschwindigkeit
in der aktiven Phase
(nmol O/(min · mg Protein)):
Atmungskontrollkoeffizient:
3-Hydroxybutyrat
Succinat
19
zu Versuch 2.1.1 und 2.1.2
zu Versuch 2.2.1 und 2.2.2
20
SCHLUSSFOLGERUNGEN
21
F.
ANHANG
22