Nukleinsäuren II

Nukleinsäuren II
In der lebenden Zelle werden Nukleinsäuren ständig um-, ab- und aufgebaut. Dies
gilt beson-ders für sämtliche RNA-Arten. Aber auch die DNA wird z.B. in Folge von
DNA-Reparatur enzymatisch ab- und aufgebaut.
Beim Abbau von Polynukleotiden werden folgende Bindungen angegriffen:
a) N-glykosidische Bindung
b) 5’-Phosphatesterbindung
c) 3’-Phosphatesterbindung
Alle drei Bindungen können enzymatisch erkannt und gelöst werden. Dabei
reagieren die hydrolytischen Enzyme sehr spezifisch, und man kennt heute eine
Vielzahl von Nukleasen, bzw. Glycosylasen die auf unterschiedliche Weise die
Nukleinsäuren angreifen bzw. abbauen.
Eine nichtenzymatische hydrolytische Spaltung von Nukleinsäuren ist sowohl im
sauren als auch im alkalischen Bereich möglich, wobei die entstehenden
Reaktionsprodukte abhängig von der Art und Stärke der Säure bzw. Lauge sind.
In den nachfolgenden Versuchen sollen Nukleinsäuren sowohl chemisch als auch
enzymatisch hydrolysiert werden. Außerdem soll die Größe und Form von nativer
DNA anhand ihrer Viskosität und Ausfällung in Ethanol demonstriert werden.
Aufgabe:
1. Makromolekulare Struktur der DNA:
a) Viskosität von Doppelstrang-DNA:
Aufgrund der relativen Starrheit der Doppelhelix und des extremen Verhältnisses
zwischen Länge und Breite besitzen wässrige Lösungen aus Doppelstrang-DNA eine
hohe Viskosität. Die Hydrathülle, die das DNA-Molekül um mehrere Zehnerpotenzen
vergrößert, erhöht ebenfalls die Reibungskraft von DNA in wässriger Lösung. Die
Viskosität von verschiedenen DNA-Lösungen soll mit der Viskosität einer
Proteinlösung anhand der Durchlaufge-schwindigkeit dieser Lösungen durch eine 50
µl-Pipette verglichen werden.
Reagentien und Geräte:
− 0,05 mol/l KPO4 pH 7, enthaltend 0,15 mol/l KCl
− 2,5 mg/ml DNA (z.B. aus Lachsspermien) in Puffer 1 (am Vortag ansetzen)
− 10 mg/ml Rinderserumalbumin in Puffer 1
− Reagenzgläser
− 50 µl-Enzympipette mit intakter Spitze
− Stoppuhr
Durchführung:
Aus der DNA-Stammlösung werden mehrere Verdünnungen in Puffer 1 hergestellt (5
Konzentrationen: 2.5 mg/ml; 2 mg/ml; 1 mg/ml; 1.5 mg/ml; 0.5 mg/ml. In
Dreifachbestimmungen werden die Durchlaufgeschwindigkeiten der einzelnen DNALösungen durch die 50-µl-Pipette mit Hilfe der Stoppuhr gemessen. Dabei sollte sich
die Zeitmessung auf den Durchlauf von 0-40 µl beschränken (warum?). Jeder Wert
wird 2 x wiederholt. Daneben soll die Durchlaufgeschwindigkeit des reinen Puffers
und die der Proteinlösung gemessen werden. Es wird mit den Kontrollen (Puffer,
Proteinlösung) begonnen, danach werden die Versuche mit den niedrigen
Konzentrationen bis hin zu den hohen Konzentrationen durchgeführt.
Protokoll:
Die Ergebnisse werden in Abhängigkeit von der Konzentration in ein Diagramm
eingetragen. Die Kurve soll erklärt werden. Warum geht sie nicht durch den 0-Punkt?
b) Fällung von DNA:
Die fadenförmige Struktur der DNA kann durch vorsichtiges Fällen in der Kälte
demonstriert werden.
Reagentien und Geräte:
− DNA-Lösung (wird mit Konzentrationsangabe ausgegeben)
− 5 mol/l NaCl
− Ethanol
− Zentrifugengläser
− dünner Glasstab
− Eisbad mit Kältemischung
− Mikroskop
Durchführung:
Alle Schritte werden im Eisbad durchgeführt. Kalte DNA-Lösung (0,5 ml) wird mit 2
ml eiskaltem Ethanol und 2 Tropfen der NaCl-Lösung überschichtet. Beide Phasen
werden mit einem Glasstab durch vorsichtiges Rühren gemischt. Was ist zu
beobachten, wenn man den Glasstab aus der Lösung hebt? Nachdem die DNA am
Glasstab gefällt ist, wird diese an der Luft getrocknet und die trockene DNA auf ihre
Faserigkeit und Struktur mikroskopisch untersucht.
2. Saure Hydrolyse von RNA:
Bei der sauren Hydrolyse von RNA entstehen verschiedene Produkte, je nachdem
welche Bindungsart im Molekül bevorzugt angegriffen wird. Bei einer "sanften"
Hydrolyse werden vornehmlich N-glykosidische Bindungen gelöst, wobei die von
Purinen wesentlich labiler sind als die von Pyrimidinen. Als Produkt bleibt in der DNA
unter Beibehaltung des Zucker-Phosphatgerüstes eine Apurin- bzw. Apyrimidinstelle
zurück. Zusätzlich werden C-5'-Phosphatesterbindungen von Pyrimidinnukleotiden
gespalten, so daß Mononukleotide mit freier 5'-OH-Gruppe entstehen. Die
Entstehung von Spaltprodukten soll mit der Dünnschicht-Chromatographie unter
Verwendung geeigneter Vergleichssubstanzen demonstriert werden.
Reagentien und Geräte:
− 2 mol/l Salzsäure
− RNA (r-RNA aus Hefe, Fa. Sigma) 4 mg/ml in Wasser, 5-6 geeignete
−
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Referenzsubstanzen, die sich der Praktikant selbst überlegen sollte, Substanzen
bei den Betreuern anfordern, Lösungen herstellen, je ca. 2 mg/ml in Wasser.
n-Butanol
Aceton
Eisessig
5 % NH4OH-Lösung
DC-Platten (Cellulose F254, 0,1 mm Schichtdicke)
Tischzentrifuge
Chromatographiekammer (mit Möglichkeit der Kammersättigung!)
UV-Lampe, Föhn, UV-Brille, Transparentpapier
Durchführung:
Es werden 0,25 ml der RNA-Lösung mit 0,25 ml HCl (2 mol/l) 30 min im Wasserbad
gekocht. Die Referenzsubstanzen werden in gleicher Weise mit HCL behandelt und
30 min gekocht. Falls beim Abkühlen der Proben ein Niederschlag entsteht, wird
dieser abzentrifugiert. Neben dem RNA-Hydrolysat sollte jede Referenzsubstanz
einzeln und alle Referenzsubstanzen gemischt aufgetragen werden. Dabei soll der
Abstand zum unteren Rand mindestens 2,5 cm, zum seitlichen Rand 0,6 cm und
zwischen den Proben 1,0 cm betragen. Jede Probe muß mindestens 6 x auf
demselben Fleck aufgetragen werden und sofort danach geföhnt werden.
Anschließend unter UV-Licht testen, ob genügend Probe aufgetragen worden ist. Die
aufgetragenen Proben müssen mit dem Föhn vollkommen getrocknet werden
(warum?). Die Chromatographie erfolgt mit Kammersättigung im Laufmittelsystem: nButanol: Aceton: Eisessig: 5 %ige NH4OH-Lösung: H2O = 4,5 : 1,5 : 1 : 1 : 2 (V : V :
V : V : V). Nach ca. 2-3 Std. wird das Chromatogramm der Kammer entnommen, im
Abzug getrocknet, und am nächsten Tag das Ergebnis unter der UV-Lampe auf
Transparentpapier durchgezeichnet. UV-Schutz aufsetzen!
Protokoll:
Anhand der Rf-Werte werden die Hydrolyseprodukte der RNA identifiziert.