Diplomarbeit, Stand 02.08.2010

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Fakultät für Biologie
Regulation der autotrophen CO2-Fixierung in
Thermoproteus neutrophilus
DIPLOMARBEIT
zur Erlangung des Grades eines
Diplombiologen
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Vorgelegt von
Michael Weiss
aus Zaisenhausen
Freiburg, August 2010
Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von September 2009 bis Juli 2010 am
Institut für Biologie II der Biologischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
unter der Leitung von Prof. Dr. Georg Fuchs durchgeführt.
Tag der Abgabe der Arbeit: 03.08.2010
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung......................................................................................................... 1
Einleitung....................................................................................................................... 3
1 Autotrophe CO2-Fixierung in Crenarchaeota ................................................................ 3
2 Thermoproteus neutrophilus ............................................................................................. 4
3 Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus ..................................................................... 5
4 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus .................................................. 6
5 Offene Fragen .................................................................................................................... 8
6 Zielsetzung ......................................................................................................................... 9
Material und Methoden.............................................................................................. 11
1 Verwendete Materialien.................................................................................................. 11
1.1 Chemikalien ............................................................................................................... 11
1.2 Bakterienstämme........................................................................................................ 11
1.3 Enzyme....................................................................................................................... 11
1.4 Enzympuffer............................................................................................................... 12
1.5 Vektoren ..................................................................................................................... 12
1.6 Kits ............................................................................................................................. 12
2 Züchtung .......................................................................................................................... 12
2.1 Züchtung von Thermoproteus neutrophilus............................................................... 12
2.2 Bestimmung der Zellzahl ........................................................................................... 13
2.3 Züchtung von Escherichia coli .................................................................................. 13
2.4 Bestimmung des Zellwachstums................................................................................ 14
2.5 Herstellung von LB-Agarplatten ................................................................................ 14
2.6 Herstellung chemokompetenter Zellen ...................................................................... 14
2.7 Herstellung elektrokompetenter Zellen ...................................................................... 15
3 Molekularbiologische Methoden.................................................................................... 15
3.1 Genamplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................... 15
3.2 Restriktionsverdau von PCR-Produkten und Plasmiden............................................ 18
3.3 Verdau der Vektoren mit Alkaliner Phosphatase....................................................... 19
3.4 DNA-Isolierung aus Agarosegelen ............................................................................ 19
3.5 Ligation ...................................................................................................................... 19
3.6 Transformation chemokompetenter E. coli-Zellen .................................................... 19
3.7 Transformation elektrokompetenter E. coli-Zellen .................................................... 20
3.8 Plasmidisolierung und Kontrolle der Konstrukte....................................................... 20
4 Expression ........................................................................................................................ 21
4.1 Heterologe Expression von tneu_0419 aus T. neutrophilus....................................... 21
4.2 Heterologe Expression von tneu_0420 aus T. neutrophilus....................................... 21
4.3 Heterologe Expression von tneu_0751 aus T. neutrophilus....................................... 22
4.4 Heterologe Expression von tneu_1396 aus T. neutrophilus....................................... 22
5 Proteinreinigung.............................................................................................................. 22
5.1 Zellaufschluss mit der French Pressure Cell .............................................................. 22
5.2 Ultrazentrifugation und Hitzefällung ......................................................................... 23
5.3 Reinigung durch Nickel-Affinitätschromatografie .................................................... 23
5.4 Reinigung durch DNA-Affinitätschromatografie ...................................................... 24
5.5 Proteinbestimmung..................................................................................................... 24
Inhaltsverzeichnis
II
6 Elektrophoretische Methoden ........................................................................................ 25
6.1 Agarose-Gelelektrophorese........................................................................................ 25
6.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .............................................. 26
6.3 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).......................................................... 28
7 Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC)....................................................... 29
8 Enzymatische Tests ......................................................................................................... 30
8.1 Bestimmug der Enzymaktivität der Succinat-Semialdehyd-Reduktase..................... 30
8.2 Bestimmug der Enzymaktivität der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase ......................... 31
9 DNA-Affinitätschromatografie ...................................................................................... 33
9.1 Vorbereitung der Zellextrakte von T. neutrophilus.................................................... 33
9.2 Beladen der Affinitätssäule ........................................................................................ 34
10 Massenspektrometrie .................................................................................................... 34
11 Verwendete Software .................................................................................................... 35
Ergebnisse .................................................................................................................... 36
1 Fehlende Enzyme und Gene der autotrophen CO2-Fixierung in T. neutrophilus ..... 36
1.1 Vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase ............................................................ 36
1.2 Vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase ................................................................ 40
2 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in T. neutrophilus ................. 45
2.1 Isolierung möglicher Regulatorproteine aus Zellextrakt von T. neutrophilus ........... 46
2.2 Klonierung und heterologe Überproduktion von Tneu_0751 und Tneu_1396
(„ALBA“).................................................................................................................. 47
2.3 Gelshift assay mit den rekombinanten Proteinen Tneu_0751 und Tneu_1396
(„ALBA“).................................................................................................................. 51
Diskussion .................................................................................................................... 53
1 Fehlende Enzyme und Gene der autotrophen CO2-Fixierung in T. neutrophilus ..... 53
1.1 Vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase ............................................................ 53
1.2 Vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase ................................................................ 54
2 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in T. neutrophilus ................. 58
Anhang ......................................................................................................................... 61
1 Alignment von Tneu_0420 mit MT-ACS1 .................................................................... 61
2 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................... 62
Literatur....................................................................................................................... 65
Danksagung ................................................................................................................. 69
Zusammenfassung
1
Zusammenfassung
Autotrophe CO2-Fixierung ist eine ursprüngliche Stoffwechselleistung. Sie findet sich
oft in Bakterien und Archaea, die in vulkanischen Gebieten mit anorganischen Substraten
wachsen. Unter den Archaea sind es meistens die schwefelabhängigen thermophilen
Crenarchaeota, die anaerob Schwefel zu Schwefelwasserstoff reduzieren (Desulfurococcales
und Thermoproteales) oder aerob Schwefel zu Schwefelsäure oxidieren (Sulfolobales).
In den anaeroben schwefelreduzierenden Crenarchaeota wurde ein neuer CO2Fixierungsweg entdeckt, der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus. Dieser besteht im
Wesentlichen aus zwei Teilen: Im ersten Teil wird ein Molekül CO2 an ein Molekül AcetylCoA durch reduktive Carboxylierung angelagert, wodurch Pyruvat entsteht. Dieses wird zu
Phosphoenolpyruvat aktiviert und in einem zweiten carboxylierenden Schritt mit Bicarbonat
zu Oxalacetat umgesetzt, aus dem in vier weiteren Schritten Succinyl-CoA synthetisiert wird.
Im zweiten Teil werden durch die Reduktion von Succinyl-CoA zwei Moleküle Acetyl-CoA
gebildet.
Dabei
entstehen
die
Zwischenprodukte
Succinat-Semialdehyd
und
4-Hydroxybutyrat.
Am Beispiel von Thermoproteus neutrophilus (Thermoproteales) wurden zwei
wichtige Gene für diesen Stoffwechselweg identifiziert und die Regulation des Zyklus
untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1. Es wurden zwei bislang nicht isolierte Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus
charakterisiert:
Die Succinat-Semialdehyd-Reduktase (Tneu_0419) katalysiert die Reduktion von SuccinatSemialdehyd zu 4-Hydroxybutyrat. Dieses Enzym wurde heterolog in E. coli überproduziert,
gereinigt und charakterisiert.
2.
Die
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
(Tneu_0420)
aktiviert
4-Hydroxybuyrat
zu
4-Hydroxybutyryl-CoA. Sie wurde ebenfalls in E. coli überproduziert, anschließend gereinigt
und charakterisiert.
3. Die Gene für die Succinat-Semialdehyd-Reduktase und die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
liegen bei T. neutrophilus zusammen in einem Cluster mit den Genen für die
Phosphoenolpyruvat(PEP)-Carboxylase, die Succinyl-CoA-Reduktase, die 4-HydroxybutyrylCoA-Dehydratase sowie für die Fumarat-Reduktase. Alle diese Enzyme sind an der CO2-
Zusammenfassung
2
Fixierung beteiligt und ihre spezifischen Aktivitäten sind in autotroph gewachsenen Zellen
wesentlich höher als in Zellen, die auf organischen Säuren gewachsen waren. Inmitten dieses
Clusters liegt eine intergene Sequenz, die Promotorbereiche für zwei divergent transkribierte
Operons aufweist. Mit einer DNA-Affinitätssäule wurden mehrere Proteine identifiziert, die
an diese intergene DNA-Sequenz binden und so möglicherweise als Regulatoren des
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus dienen.
4. Zwei Kandidaten für eventuelle Regulationsproteine wurden überproduziert und gereinigt.
Zum einen handelt es sich dabei um ein bereits bekanntes Chromatinprotein, „ALBA“
(Acetylation Lowers Binding Affinity) (Tneu_1396), das im acetylierten Zustand eine
geringere Affinität zu Nukleinsäuren aufweist. Zum anderen wurde ein Protein von bislang
unbekannter Funktion identifiziert (Tneu_0751), das nur in autotrophen Thermoproteales
vorkommt.
5. Um die mögliche regulatorische Funktion der beiden Proteine, „ALBA“ und Tneu_0751,
zu untersuchen, wurde eine elektrophoretische Methode angewandt, der „Electrophoretic
Mobility Shift Assay“ (EMSA). Mit diesem Test wurde gezeigt, dass Tneu_0751 spezifisch
an den Promotorbereich bindet, der zwischen den zwei divergent transkribierten Operons
liegt. Dagegen bindet das „ALBA“-Protein zwar hochaffin, aber unspezifisch an DNA.
Einleitung
3
Einleitung
1 Autotrophe CO2-Fixierung in Crenarchaeota
Crenarchaeota stellen zusammen mit den Euryarchaeota die zwei großen Phyla der
Archaea dar. Die genaue phylogenetische Stellung der Nanoarchaeota, der Korarchaeota
sowie der mesophilen Crenarchaeota ist heute noch sehr umstritten (Abb. 1). Der einzigartige
Stoffwechsel von Mitgliedern der Archaea sowie deren Anpassung an extreme
Umweltbedingungen, wie sie vor 3-4 Milliarden Jahren auf der Erde geherrscht haben,
machen diese ursprünglichen Organismen zu interessanten Forschungsobjekten. Als
ursprüngliche Merkmale gelten: Anaerobe Lebensweise, chemolithotropher Energiestoffwechsel, autotrophe Kohlenstoff-Fixierung und Thermophilie. Alle diese Eigenschaften
treffen auf viele Vertreter der Crenarchaeota zu, zu denen die Ordnungen Sulfolobales,
Thermoproteales und Desulfurococcales gezählt werden. Ihre Habitate befinden sich in
ökologischen Nischen, wie heißen Quellen mit zum Teil stark saurem pH, in der Nähe zu
hydrothermalen Schloten sowie in weiteren anaeroben oder mikroaeroben Biotopen mit hoher
Temperatur (12, 18, 20, 24, 45, 46, 47).
Abbildung 1: Der phylogenetische Stammbaum der Archaea (verändert nach Referenz
12). Dem großen Phylum der Euryarchaeota stehen die Crenarchaeota gegenüber. Die
phylogenetische Zuordnung der Nanoarchaeota, der Korarchaeota und der mesophilen
Crenarchaeota wird derzeit noch diskutiert. Vertreter autotropher Archaea sind mit Kreisen an
den Astenden gekennzeichnet.
Einleitung
4
In autotrophen Crenarchaeota sind bislang zwei CO2-Fixierungswege bekannt. Der
Hydroxypropionat/Hydroxybutyrat-Zyklus
und
der
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-
Zyklus. Der Hydroxypropionat/Hydroxybutyrat-Zyklus wurde für die Ordnung Sulfolobales
beschrieben (10). Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus kommt in anaeroben und
mikroaeroben Vertretern der Desulfurococcales und Thermoproteales vor. Beiden Zyklen
gemeinsam ist das Ausgangsmolekül Acetyl-CoA, aus dem über zwei carboxylierende
Schritte ein Molekül Succinyl-CoA entsteht. Die enzymatischen Reaktionen sind bis zu
diesem Intermediat verschieden. Die Regeneration von Acetyl-CoA aus Succinyl-CoA
verläuft
in
beiden
CO2-Fixierungswegen
gleich.
Dabei
wird
Succinyl-CoA
zu
4-Hydroxybutyrat reduziert. Die aktivierte Form 4-Hydroxybutyryl-CoA wird anschließend
zu Crotonyl-CoA dehydratisiert. Crotonyl-CoA wird zu Acetoacetyl-CoA umgesetzt, das
schließlich in zwei Moleküle Acetyl-CoA gespalten wird. Somit ist der Zyklus unter der
Gewinnung eines zusätzlichen Moleküls Acetyl-CoA geschlossen (10, 11, 12, 24, 35).
2 Thermoproteus neutrophilus
Das Untersuchungsobjekt für die vorliegende Arbeit ist das strikt anaerobe,
hyperthermophile Crenarchaeon Thermoproteus neutrophilus, das zur Ordnung der
Thermoproteales gehört (Abb. 2). T. neutrophilus wurde in den frühen 1980er Jahren aus
einer heißen, solfatarischen Quelle im Kerlingarfjoll auf Island isoliert (21). Diese
nichtbeweglichen und nichtseptierten Stäbchen zeigen eine gram-negative Färbung und haben
eine Länge zwischen 1,5 und 8 µm, sowie einen Durchmesser von 0,4 bis 0,5 µm. Derartige
heiße Habitate sind reich an Schwefel und für gewöhnlich stark mit CO2- und H2-haltigem
überhitzten Dampf durchströmt. Nur thermophile, chemolithoautotrophe Spezialisten sind in
der Lage, unter diesen extremen Bedingungen zu existieren.
Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von T. neutrophilus (Aufnahme von
K. O. Stetter und R. Rachel, Universität Regensburg).
Einleitung
5
T. neutrophilus stellt einen solchen Spezialisten dar, dessen Temperaturoptimum bei
85 °C liegt. Energie wird durch Schwefelatmung gewonnen, bei der molekularer Wasserstoff
als Elektronendonor und Schwefel als Elektronenakzeptor dienen. Dadurch entsteht Schwefelwasserstoff (H2 + S H2S
∆G0’ = - 28 kJ/mol). T. neutrophilus ist dabei in der Lage, mit
CO2 als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Sind jedoch alternative organische Substrate,
wie Acetat oder Succinat vorhanden, so wächst er auch mixotroph; das heißt, diese
Verbindungen dienen als Kohlenstoff-Quelle für Biosynthesen, werden aber nicht zu CO2
oxidiert (4, 12, 18, 21, 25, 31, 35, 39).
3 Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus
Im Jahr 2008 wurde der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus (Abb. 3) für das
anaerobe,
autotrophe
und
hyperthermophile
Crenarchaeon
Ignicoccus
hospitalis
(Desulfurococcales) beschrieben (24). Dieser CO2-Fixierungsweg kommt ausschließlich bei
den Crenarchaeota vor und wurde außer bei I. hospitalis auch bei Pyrolobus fumarii
(Desulfurococcales)
und
T. neutrophilus
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus
(Thermoproteales)
kommen
nachgewiesen.
sauerstoffempfindliche
Enzyme
Im
und
Elektronencarrier vor. Deshalb existiert dieser CO2-Fixierungsweg lediglich bei Vertretern
anaerober oder mikroaerober Crenarchaeota.
Zuerst
wird
ein
Molekül
Acetyl-CoA
von
der
ferredoxinabhängigen,
sauerstoffempfindlichen Pyruvat-Synthase reduktiv zu Pyruvat carboxyliert. Durch die
Anlagerung
einer
Phosphatgruppe
aus
ATP
wird
das
entstandene
Pyruvat
zu
Phosphoenolpyruvat (PEP) aktiviert. Der zweite carboxylierende Schritt ist die Anlagerung
eines Moleküls Bicarbonat an das entstandene PEP; es entsteht Oxalacetat. Oxalacetat wird zu
Malat reduziert, das durch Wasserabspaltung zu Fumarat umgewandelt wird. Es folgt die
Reduktion zu Succinat, welches zu Succinyl-CoA aktiviert wird. Succinyl-CoA wird in zwei
Schritten
über
Succinat-Semialdehyd
zu
dem
charakteristischen
Zwischenprodukt
4-Hydroxybutyrat reduziert. 4-Hydroxybutyrat wird anschließend zu 4-Hydroxybutyryl-CoA
aktiviert, welches über einen Radikalmechanismus zu Crotonyl-CoA dehydratisiert wird (17,
30).
Über
β-Oxidation
wird
Crotonyl-CoA
zuerst
durch
Wasseranlagerung
zu
(S)-3-Hydroxybutyryl-CoA hydratisiert und dieses zu Acetoacetyl-CoA oxidiert. Diese zwei
Reaktionen werden von einem bifunktionellen Enzym katalysiert. In der abschließenden
Reaktion wird Acetoacetyl-CoA in zwei Moleküle Acetyl-CoA gespalten, wovon eines zur
Regeneration von Acetyl-CoA im Zyklus verbleibt, das andere für Biosynthesen zur
Verfügung steht (11, 12, 24, 35).
Einleitung
6
Abbildung 3: Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus (verändert nach Referenz 24).
Die beteiligten Enzyme sind [1] Pyruvat-Synthase, [2] Pyruvat-Wasser-Dikinase, [3] PEPCarboxylase, [4] Malat-Dehydrogenase, [5] Fumarat-Hydratase, [6] Fumarat-Reduktase, [7]
Succinyl-CoA-Synthetase, [8] Succinyl-CoA-Reduktase, [9] Succinat-SemialdehydReduktase, [10] 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase, [11] 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase,
[12] Crotonyl-CoA-Hydratase, [13] (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase, [14]
Acetoacetyl-CoA-β-Ketothiolase. Die in dieser Arbeit untersuchten enzymatischen Schritte
sind durch einen Kasten markiert.
4 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus
Wird T. neutrophilus auf Acetat kultiviert, so ist seine Generationszeit bis zu dreimal
kürzer (3 h), im Vergleich zu autotrophem Wachstum (9 h). Ebenso wird der
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in Gegenwart von Acetat heruntergefahren, indem
sämtliche Enzyme des CO2-Fixierungsweges reguliert werden (Abb. 4). Eine starke
Regulation liegt vor allem ab der Fumarat-Hydratase vor, da bei dem Wachstum auf Acetat
keine Regeneration des Ausgangsproduktes Acetyl-CoA durch die nachfolgenden Schritte des
Zyklus notwendig ist (35).
Einleitung
7
Abbildung 4: Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in T. neutrophilus. Die
Steigerungen der Enzymaktivitäten bei autotrophem Wachstum, verglichen mit Wachstum in
Gegenwart von Acetat, sind angegeben. Die Enzyme, die von dem hier besprochenen
Gencluster codiert werden (Abb. 5), katalysieren die fett markierten Reaktionen.
Um die Regulation zu untersuchen, wurde eine Proteomanalyse durchgeführt, bei der
mit Hilfe von 2-D-Gelelektrophorese nach autotroph induzierten Proteinen gesucht wurde.
Das Expressionsmuster zeigte, dass ein Großteil der Enzyme des Dicarboxylat/
Hydroxybutyrat-Zyklus bei autotrophem Wachstum induziert war (36).
Bei der Regulation handelt es sich um Transkriptionskontrolle, was bereits durch eine
Analyse des Transkriptoms gezeigt wurde (36). Zusätzlich wurde ein Gencluster identifiziert.
Gene, die sechs Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus codieren, liegen in diesem
Cluster zusammen (Abb. 5). Namentlich handelt es sich dabei um die Gene für die PEPCarboxylase, das Schlüsselenzym 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase, die FumaratReduktase und die Succinyl-CoA-Reduktase. Außerdem enthält das Cluster Gene für eine
CoA-Ligase (Tneu_0420), sowie eine Alkohol-Dehydrogenase (Tneu_0419). Das Gencluster
enthält zwei divergent transkribierte Operons (scr-4hbl bzw. 4hbd-frd).
Einleitung
cbs cbs cbs
8
pepc
ssr
4hbl
scr
4hbd
frdA
frdB
Abbildung 5: Gencluster für Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus im
Genom von T. neutrophilus. [pepc] PEP-Carboxylase, [ssr] vermutete SuccinatSemialdehyd-Reduktase, [4hbl] vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase, [scr] SuccinylCoA-Reduktase, [4hbd] 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase, [frdA] Fumarat-Reduktase
Untereinheit A, [frdB] Fumarat-Reduktase Untereinheit B. [cbs] Proteine mit Cystathionin-βSynthase-Domäne. Bei den Operons handelt es sich um scr-4hbl bzw. 4hbd-frd.
5 Offene Fragen
Die Aminosäuresequenz der Alkohol-Dehydrogenase Tneu_0419 weist eine starke
Ähnlichkeit zu der Succinat-Semialdehyd-Reduktase aus Metallosphaera sedula auf (27).
Diese Ähnlichkeit, sowie die Lage des Gens in dem Gencluster, das für andere stark regulierte
Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus codiert, machten sie zu einem guten
Kandidaten für die gesuchte Succinat-Semialdehyd-Reduktase. Allerdings gibt es im Genom
von T. neutrophilus weitere mögliche Alkohol-Dehydrogenasen, weshalb ein experimenteller
Nachweis notwendig war.
Die CoA-Ligase (Tneu_0420) wurde durch 2-D-Gele als autotroph induziert
nachgewiesen. Außerdem liegt das Gen für die CoA-Ligase zusammen mit dem der SuccinylCoA-Reduktase in einem Operon. Allerdings fehlte auch hier der experimentelle Nachweis.
Zwei weitere AMP-bildende CoA-Ligasen liegen im Genom von T. neutrophilus vor
(Tneu_1843 und Tneu_0385).
Der intergene Bereich zwischen den scr-4hbl- und 4hbd-frd-Operons enthält die
Promotorelemente archaeeller Transkriptionskontrolle (Abb. 6). Dies ist zum einen die
TATA-Box, eine adenin- und thyminreiche Region, die etwa 25 Basenpaare (bp)
stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes liegt. Zum anderen handelt es sich um das
direkt stromaufwärts anschließende „transcription factor B (TFB) recognition element“, BRE,
das eine wesentliche Rolle bei der Promotorstärke und -orientierung spielt.
Zur Transkriptionsinitiation in Archaea werden mindestens zwei Faktoren benötigt:
Das TATA-Box bindende Protein (TBP), welches im Bereich der TATA-Box an die kleine
Furche der DNA bindet und eine Krümmung des Nukleotidstranges bewirkt; TFB erkennt den
gekrümmten DNA-TBP-Komplex und interagiert mit der BRE-Region. Der gebundene TFB
rekrutiert über seine N-terminale Domäne die RNA-Polymerase, woraufhin die Transkription
beginnen kann. Es sind bereits Regulatorproteine bekannt, die eine Transkriptionsfaktor-
Einleitung
9
DNA-Interaktion oder eine Transkriptionsinitiationskomplex-RNA-Polymerase-Interaktion
beeinflussen (5, 6, 7, 9, 43).
Abbildung 6: Intergene Region zwischen den Genen der Succinyl-CoA-Reduktase und
der 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase. BRE-Elemente und zwei TATA-Boxen sind
dargestellt. Sternchen markieren die Konsensussequenz der archaeellen TATA-Box
(YTTAWA, wobei Y = C oder T; W = A oder T).
Für die Suche nach möglichen Regulatorproteinen des Dicarboxylat/HydroxybutyratZyklus wurde eine DNA-Affinitätschromatografie durchgeführt. Hierzu wurde die intergene,
121 bp lange Sequenz zwischen den scr-4hbl- und 4hbd-frd-Operons (Abb. 6) mit
5’-biotinylierten Primern amplifiziert. Das biotinylierte DNA-Fragment wurde auf eine
Streptavidinsäule geladen. Das Protein Streptavidin ist bekannt für seine starke Bindung an
Biotin, wodurch die biotinylierte DNA auf der Säule verbleibt. Zellextrakte von autotroph und
auf Acetat gewachsenen T. neutrophilus-Zellen wurden auf die Säule aufgetragen, um
Proteine mit möglicher DNA-Interaktion zu identifizieren.
6 Zielsetzung
Der Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus wurde bereits als CO2-Fixierungsweg für
T. neutrophilus nachgewiesen, allerdings sind noch nicht alle daran beteiligten Enzyme
eindeutig identifiziert. In dieser Arbeit sollten die vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase
und die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase heterolog in E. coli überproduziert, anschließend
gereinigt und charakterisiert werden. Die Succinat-Semialdehyd-Reduktase katalysiert die
Reduktion
von
Succinat-Semialdehyd
zu
dem
charakteristischen
Zwischenprodukt
4-Hydroxybutyrat. Dieses wird in der nachfolgenden Reaktion durch die 4-HydroxybutyratCoA-Ligase zu 4-Hydroxybutyryl-CoA aktiviert. Die Aktivitäten dieser beiden und einiger
Einleitung
10
anderer Enzyme sind bei autotrophem und mixotrophem Wachstum stark reguliert. Da die
Regulation auf Transkriptionsebene stattfindet, wird ein Regulatorprotein vermutet. Im
zweiten
Teil
dieser
Arbeit
sollte
Affinitätschromatografie gesucht werden.
nach
einem
Regulatorprotein
durch
DNA-
Material und Methoden
11
Material und Methoden
1 Verwendete Materialien
1.1 Chemikalien
Falls nicht anders angegeben, wurden die Chemikalien von den Firmen AppliChem
(Darmstadt), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roche Diagnostics (Mannheim), Serva
(Heidelberg), Sigma (Deisenhofen) und Roth (Karlsruhe) bezogen. Bacto-Agar, BactoTrypton und Hefeextrakt stammten von der Firma BD (Becton, Dickinson und Co., Le Pont
de Claix, Frankreich). Acetonitril wurde von der Firma SDS (Peypin, Frankreich),
Coenzym A, NADPH, NADP+, NADH und NAD+ wurden von der Firma Gerbu (Gaiberg)
bezogen. Gasgemische kamen von den Sauerstoffwerken Friedrichshafen (Friedrichshafen).
1.2 Bakterienstämme
Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
Stamm
Genotyp
T. neutrophilus
Wildtyp
F–, ø80dlacZ∆M15, ∆(lacZYAE. coli DH5α
Referenz
DSM 2338
Woodcock et al. (1989) (48)
argF)U169, deoR, recA1, endA1,
hsdR17(rK–, mK+), phoA,
supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1
E. coli Rosetta 2 (DE3)
F–, ompT, hsdSB(rB–, mB–), gal,
Merck, Darmstadt
dcm, lacY1, pRARE2, CamR
1.3 Enzyme
Tabelle 2: Verwendete Enzyme
Taq-DNA-Polymerase S (T. aquaticus)
5,0 U/µl
Genaxxon Bioscience (Stafflangen)
Pfu-DNA-Polymerase (P. furiosus)
2,5 U/µl
Genaxxon Bioscience (Stafflangen)
DNaseI (lyophilisiert)
> 3.000 U/mg
AppliChem (Darmstadt)
RNase A (lyophilisiert)
70 U/mg
AppliChem (Darmstadt)
NdeI-Restriktionsendonuclease
10 U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
HindIII-Restriktionsedonuklease
10 U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
EcoRI-Restriktionsendonuclease
10 U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
BamHI-Restriktionsendonuclease
10 U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
Myokinase
1.500 U/mg
Sigma (Deisenhofen)
Pyruvatkinase
378 U/mg
Sigma (Deisenhofen)
Lactat-Dehydrogenase
944 U/mg
Sigma (Deisenhofen)
T4-DNA-Ligase
1U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
CIAP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase)
1U/µl
Fermentas (St. Leon-Rot)
Material und Methoden
12
1.4 Enzympuffer
Tabelle 3: Verwendete Enzympuffer
Puffer
Komponenten
Tango Puffer 10x
33 mM Tris-Acetat
Referenz
Fermentas (St. Leon –Rot)
10 mM Mg-Acetat
66 mM K-Acetat
0,1 mg/ml BSA
T4-DNA Ligasepuffer 10x
400 mM Tris-HCl
Fermentas (St. Leon –Rot)
100 mM MgCl2
100 mM DTT
5 mM ATP
CIAP Puffer 10x
100 mM Tris –HCl, pH 7,5
Fermentas (St. Leon –Rot)
100 mM MgCl2
1.5 Vektoren
Tabelle 4: Verwendete Vektoren
Vektor
pUC18
Eigenschaften
High copy Plasmid, ampr, lacZ
Referenz
Fermentas (St. Leon-Rot)
pT7-7
Low copy Plasmid, ampr
Tabor und Richardson (1985) (41)
r
pET16b
Low copy Plasmid, amp ,
Novagen (Darmstadt)
T7-Promotor,
10xHis-Tag (N-terminal)
1.6 Kits
Tabelle 5: Verwendete Kits
Roti-Prep Plasmid
Roth (Karlsruhe)
QIAprep Spin Miniprep Kit
QIAGEN GmbH (Hilden)
QIAquick PCR-Purification
QIAGEN GmbH (Hilden)
QIAquick Gel Extraction
QIAGEN GmbH (Hilden)
illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit
GE Healthcare (München)
2 Züchtung
2.1 Züchtung von Thermoproteus neutrophilus
Die Züchtung von T. neutrophilus (DSM 2338) erfolgte anaerob in einem
Mineralmedium (Tab. 6) unter konstantem Rühren (220 rpm) bei pH 6,8 und einer
Temperatur von 85 °C. Als Elektronenakzeptor wurde elementarer Schwefel (1 M)
zugegeben; Wasserstoff als Elektronendonor stammte aus der gasförmigen Atmosphäre
(H2/CO2 im Verhältnis 80:20), die durch ständige Begasung über einen Sterilfilter mit der
Material und Methoden
13
Porengröße von 0,2 µm (Midistart 2000, Sartorius) aufrechterhalten wurde. Überdruck
konnte, durch ein H2O/H2O2 – Gemisch geleitet, entweichen. Zu Zellen, die auf Acetat
gezüchtet wurden, gab man zusätzlich noch 5 mM Natrium-Acetat zu.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Mineralsalzmediums
Grundmedium (10fach):
Spurenelementlösung (100fach):
(NH4)2SO2
13 g/l
KH2PO4
2,8 g/l
MgSO4
2,5 g/l
CaCl2·2 H2O
0,7 g/l
FeCl3
0,2 g/l
EDTA
58,5 g/l
MnCl2·4 H2O
180 mg/l
H3BO3
140 mg/l
ZnCl2
14 mg/l
Na2MoO4·2 H2O
48 mg/l
CoCl2·6 H2O
48 mg/l
NiCl2·2 H2O
120 mg/l
Nach dem Befüllen des 10 Liter Glasfermenters (Biostat V, B. Braun, Melsungen) mit
Wachstumsmedium wurde dieses autoklaviert und mit 1 M elementarem Schwefel
komplementiert, der zuvor im kochenden Wasserbad sterilisiert wurde. Anaerobe
Bedingungen wurden durch Zugabe des H2/CO2 – Gasgemisches und durch das
Reduktionsmittel Na2S (0,5 g/l) geschaffen. Anschließend wurde mit 1 l Vorkultur inokuliert
(38).
2.2 Bestimmung der Zellzahl
Aufgrund des schwefelhaltigen Wachstumsmediums war eine photometrische
Bestimmung der Zellzahl nicht möglich, weshalb diese durch Auszählen mit Hilfe einer
Neubauerkammer (Marienfeld, Lauda-Königshofen) mit einer Kammertiefe von 0,01 mm bei
einer 40-fachen Vergrößerung im Lichtmikroskop erfolgte.
2.3 Züchtung von Escherichia coli
Kulturen von E. coli DH5α und E. coli Rosetta 2 (DE3) wurden in LB-Medium
(lysogeny broth) (13, 14) (Tab. 7) angezogen. Die Vorkultur erfolgte im 5 ml Maßstab, mit
Material und Methoden
14
der 1 l LB-Medium in 2 l Schikanekolben beimpft wurde. Die Gefäße wurden bei 180 rpm
und 37 °C geschüttelt. Für Agarplatten wurden dem LB Medium 1,5 % (w/v) Agar
zugegeben. Die Anzucht auf den Platten erfolgte bei 37 °C in Brutschränken.
Tabelle 7: Zusammensetzung des LB-Mediums mit Antibiotika
Trypton
10 g/l
NaCl
5 g/l
Hefeextrakt
9 g/l
Ampicillinlösung (1000x)
Ampicillin-Natriumsalz
100 mg/ml in H2O dest.
Chloramphenicollösung (1000x)
Chloramphenicol
34 mg/ml in H2O dest.
2.4 Bestimmung des Zellwachstums
Das Wachstum wurde durch die Messung der optischen Dichte bei 578 nm verfolgt.
Die Messung wurde an einem Photometer (Pharmacia Novaspec II, Freiburg) in
Plastikküvetten durchgeführt.
2.5 Herstellung von LB-Agarplatten
Feste Nährböden wurden hergestellt, indem zu 300 ml LB-Medium 4,5 g Agar
zugegeben wurde. Dies wurde zusammen in 500 ml Schottflaschen autoklaviert.
Anschließend wurde der noch flüssige LB-Agar mit den entsprechenden Antibiotika versetzt
und unter der Sterilbank in Petrischalen gegossen. Die erkalteten Nährböden wurden bei 6 °C
in der Kühlwand gelagert.
2.6 Herstellung chemokompetenter Zellen
Mit einem Aliquot E. coli-Zellen (Stamm DH5α oder Rosetta 2 (DE3) wurden 50 ml
LB-Medium angeimpft und anschließend unter Schütteln bei 37 °C inkubiert, bis die Kultur
eine OD578 von ca. 0,6 aufwies. Danach wurde sie für 10 min bei 4 °C mit 6.000 × g
zentrifugiert (Hettich, Tuttlingen) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde vorsichtig
mit 2,7 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und anschließend 2,3 ml 50 % (w/v)
Glycerin zugegeben. Die Suspension wurde in Aliquots von 200 µl sofort in flüssigem
Stickstoff tiefgefroren und bei -70 °C gelagert.
Material und Methoden
15
2.7 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Für die Herstellung elekrokompetenter Zellen wurden 50 ml SOB-Medium (Tab. 8)
mit einem Aliquot eines entsprechenden E. coli-Stammes beimpft und bei 37 °C unter
Schütteln inkubiert. Bei einer OD578 von ca. 0,6 wurden die Zellen für 5 min bei 4 °C mit
9.000 × g zentrifugiert. Zum Entsalzen der Suspension wurde diese mehrmals mit steriler und
eiskalter Glycerin-Lösung gewaschen. Hierzu wurde zunächst das Zellpellet in 50 ml 10 %
(w/v) Glycerin gelöst, erneut 5 min mit 9.000 × g zentrifugiert und das Pellet anschließend in
25 ml Glycerinlösung 10 % (w/v) resuspendiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt
bei den gleichen Bedingungen wurde das Pellet in ca. 0,5 ml 10 % (w/v) Glycerin
aufgeschwemmt, Aliquots zu 100 µl abgenommen und diese sofort in flüssigem Stickstoff
tiefgefroren. Bis zur Verwendung wurden die Zellen bei -70 °C gelagert.
Tabelle 8: Zusammensetzung des SOB-Mediums
Trypton
20 g/l
Hefeextrakt
5 g/l
NaCl
0,58 g/l
KCl
0,19 g/l
3 Molekularbiologische Methoden
3.1 Genamplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mit der PCR ist ein schnelles und spezifisches Vervielfältigen einzelner DNASequenzen möglich (3, 33, 37). Spezielle synthetische Oligonukleotide (Primer) wurden vom
3’- bzw. 5’-Ende des gewünschten Gens abgeleitet. Diese Primer, die von den Firmen
biomers.net (Ulm) und Sigma-Aldrich (Deisenhofen) bezogen wurden, verfügen zum Teil
über sequenspezifische Restriktionsschnittstellen (Tab. 9).
Die Vervielfältigung der DNA wurde in einem Thermocycler (Progene thermal cyclerPCR, Techne, Staffordshire, UK) in 500 µl PCR-Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg)
durchgeführt (Tab. 11). Ein typischer PCR-Reaktionsansatz ist in Tabelle 10 aufgelistet.
Material und Methoden
16
Tabelle 9: Verwendete Oligonukleotide [Primer]
Primer
Sequenz
Tneu_0421-0422TCATATGGCGCCCACCTCTC
Verwendung
Promotor-DNA für Protein-
forward-Biotin
DNA-Interaktion
Tneu_0421-0422-
ATGACACCGCGCCGACAG
reverse
Tneu_0421-forward-
CCATGTCCGTGCTGTAGTCC
Kontroll-DNA für Protein-
Biotin
DNA-Interaktion
Tneu_0421-reverse
CAGAACTGCAACGCCACCAAG
Tneu_1396 forward,
CAGCCTAACATATGGCAACCGAAC
Tneu_1396 in pT7-7 für
NdeI
EMSAs
Tneu_1396 reverse,
CCGTAGACTTGGAAGCTTGAGAGCTTTC
HindIII
Tneu_0751 forward,
TTACATACTCTCCCATATGCATATTGAG
Tneu_0751 in pT7-7 für
NdeI
EMSAs
Tneu_0751 reverse,
TGGCCATAGAATTCACGGAGACG
EcoRI
Tneu_0420 forward,
CGTCTTCGGATCCTGATATGTC
Tneu_0420 in pUC18 und in
pT7-7
BamHI
Tneu_0420 reverse,
GTTTGGCGAAGCTTAGCCGAG
HindIII
Tneu_0419 forward,
CACCTCTCATATGAAGGCGGCTGTGCTAAAC
Tneu_0419 in pUC18 und in
pET16b
NdeI
Tneu_0419 reverse,
GGAGGAGCTAAGCTTAAAACTCGGCTAAACACC
HindIII
Tabelle 10: Komponenten eines PCR-Ansatzes
Volumen [µl]
Komponente
2-6
Genomische DNA
Endkonzentration
ca. 0,2 µg/µl
5,0
dNTP-Mix (2 mM(dNTP)
0,2 mM
5,0
Primer forward (2 µM)
0,2 µM
5,0
Primer reverse (2 µM)
0,2 µM
5,0
10x Taq-Puffer
15 mM MgCl2
1,0
Taq-Polymerase
5 U / µl
1,0
Pfu-Polymerase
2,5 U/ µl
ad 50
H2O steril
In den PCR-Ansatz wurde ein Mix aus Taq (Thermus aquaticus)-Polymerase und Pfu
(Pyrococcus furiosus)-Polymerase gegeben. Die Taq-Polymerase amplifiziert mit einer
Geschwindigkeit von etwa 1.000 bp/min, die Pfu-Polymerase dagegen nur mit ca.
Material und Methoden
17
500 bp/min, allerdings besitzt letztere eine 3’-5’-Exonuklease-Aktivität, was die Fehlerrate
bei der Amplifikation verringert.
Tabelle 11: PCR-Programme
PCR-Programm für die Amplifikation von tneu_0420
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
50 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
2 min 30 s
DNA-Synthese
50 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
PCR-Programm für die Amplifikation von tneu_0419
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
60 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
1 min 20 s
DNA-Synthese
60 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
PCR-Programm für die Amplifikation von tneu_1396
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
55 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
30 s
DNA-Synthese
55 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
PCR-Programm für die Amplifikation von tneu_0751
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
51 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
40 s
DNA-Synthese
51 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
Material und Methoden
18
PCR-Programm für die Amplifikation von Promotor-DNA
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
60 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
20 s
DNA-Synthese
60 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
PCR-Programm für die Amplifikation von Kontroll-DNA
35 ×
94 °C
5 min
Denaturierung
94 °C
30 s
Denaturierung
55 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
12 s
DNA-Synthese
55 °C
30 s
Anlagerung der Primer
72 °C
5 min
DNA-Synthese
4 °C
Ende des Programms
Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde entsprechend ihrer Schmelztemperatur
angepasst. Die Elongationszeit richtete sich nach der Größe des zu amplifizierenden Gens.
Nach der Beendigung der PCR erfolgte die Reinigung des Ansatzes mit dem QIAquick PCRPurification Kit.
3.2 Restriktionsverdau von PCR-Produkten und Plasmiden
Um ein gewünschtes amplifiziertes Gen in einen Vektor zu inserieren, wurden beide
getrennt voneinander mit entsprechenden Restriktionsnukleasen verdaut. Der Reaktionsansatz
(Tab. 12) wurde in ein steriles 500 µl Reaktionsgefäß pipettiert und für mindestens 3 h bei
37 °C inkubiert. Als Grundlage des Reaktionsansatzes dienten die Empfehlungen „Fermentas
Conventional Restriction Enzymes“ der Firma Fermentas (St. Leon-Rot; Quelle:
http://fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/fivebuffer2008.pdf).
Tabelle 12: Komponenten eines Restriktionsansatzes
Volumen [µl]
16
Komponente
DNA (Vektor bzw. PCR-Produkt)
2
Restriktionspuffer 10 ×
1
Restriktionsenzym I
1
Restriktionsenzym II
Material und Methoden
19
3.3 Verdau der Vektoren mit Alkaliner Phosphatase
Durch die Behandlung des Vektors mit Alkaliner Phosphatase (Calf Intestine Alkaline
Phosphatase, CIAP) wird die Phosphatgruppe am 5’-Ende des doppelsträngigen Vektors
entfernt, was eine Religation des Vektors verhindert.
Hierzu wurde der Restriktionsansatz (Material und Methoden 3.2.) nach dem
Restriktionsverdau
für
20 min
auf
65 °C
erhitzt,
was
die
Inaktivierung
der
Restriktionsenzyme bewirken sollte. Nach 10-minütiger Ruhezeit auf Eis wurden dem Ansatz
(20 µl) ca. 2,5 µl CIAP-Puffer (10 ×) und 4 µl CIAP zugegeben und das Ganze anschließend
für 1 h bei 37 °C inkubiert.
3.4 DNA-Isolierung aus Agarosegelen
Um die gewünschten Vektorfragmente bzw. PCR-Produkte zu isolieren, wurden die
Ansätze nach dem Restriktions- oder CIAP-Verdau auf ein Agarosegel aufgetragen und
elektrophoretisch aufgetrennt (Material und Methoden 6.1). Nach der Gelelektrophorese
wurden die entsprechenden Banden unter schwachem UV-Licht (312 nm) sichtbar gemacht
und mit einem Skalpell aus dem Gel herausgetrennt. Die darin enthaltene DNA wurde mit
dem QIAquick Gel Extraction Kit eluiert.
3.5 Ligation
Die Konzentration isolierter DNA mit passenden Restriktionsschnittstellen an den
Enden („sticky ends“) wurde photometrisch bei 260 nm in Quarzküvetten bestimmt:
KonzentrationDNA(ng/µl) = OD260DNA × Verdünnungsfaktor V × Multiplikationsfaktor F,
wobei der Multiplikationsfaktor für doppelsträngige DNA einem Wert von 50 entspricht (32).
Für die Ligation wurde Vektor-DNA und Insert im Verhältnis von ca. 1:5 eingesetzt. Nach
Zugabe von T4-DNA-Ligase-Puffer (10 ×) und T4-DNA-Ligase (Fermentas, St. Leon-Rot)
wurde der Ansatz meist über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
3.6 Transformation chemokompetenter E. coli-Zellen
Ein 200 µl Aliquot chemokompetenter E. coli-Zellen wurde auf Eis aufgetaut,
anschließend mit 5 µl Ligationsansatz oder gereinigtem Plasmidvektor versetzt und für
Material und Methoden
20
weitere 30 min auf Eis inkubiert. Danach gab es einen Hitzeschock bei 42 °C für ca. 90 s,
gefolgt von einer erneuten Pause von 10 min auf Eis. Nun wurden der Suspension 500 µl
steriles LB-Medium zugegeben und die Zellen zur Erholung für 1 h auf 37 °C gebracht.
Schließlich wurden die Zellen auf einer Antibiotika enthaltenden LB-Agarplatte ausplattiert
und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3.7 Transformation elektrokompetenter E. coli-Zellen
Die zu transformierende DNA wird mittels eines elektrischen Impulses in den
Empfängerorganismus gebracht. Um bei dieser Elektroporation eine Lichtbogenbildung und
einen damit verbundenen Kurzschluss zu vermeiden, mussten die Ligationsansätze zuvor
durch Dialyse entsalzt werden. Hierfür wurde eine Petrischale mit sterilem, demineralisiertem
Wasser gefüllt und auf die Oberfläche eine Nucleopore Track-Etch Membran (25 mm, 0,3 µm
Porengröße, Whatman, Kent, UK) gelegt. Auf die Membran wurden 10 µl des Ligationsansatzes pipettiert und für ca. 30 min dialysiert. Anschließend wurde der Ansatz in eine
sterile, gekühlte Elektroporationsküvette (Biorad, München) gegeben und vorsichtig 100 µl
elektrokompetente E. coli-Zellen dazu pipettiert. Der Ansatz wurde für eine Pulszeit von
mindestens 5 ms einer Spannung von 1,7 kV ausgesetzt. Unmittelbar danach wurden 800 µl
steriles SOC-Medium (Tab. 13) zugegeben, der Ansatz in ein Eppendorfgefäß überführt und
für 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Erholungsphase wurden die Zellen auf einer Antibiotika
enthaltenden LB-Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Tabelle 13: Zusammensetzung des SOC-Mediums
SOB-Medium (vgl. Material und Methoden 2.7)
9,44 ml
1 M MgCl2 (steril)
200 µl
10 %ige Glucoselösung (sterilfiltriert)
360 µl
3.8 Plasmidisolierung und Kontrolle der Konstrukte
Von inkubierten, mit transformierten Zellen ausplattierten Agarplatten (Material und
Methoden 3.6 bzw. 3.7) wurden einzelne Kolonien gepickt und in 5 ml steriles LB-Medium
überführt, das zuvor mit dem entsprechenden Antibiotikum versetzt wurde. Die Kultur wurde
für mindestens 8 h im Schüttler bei 37 °C angezogen. Anschließend wurde die Plasmid-DNA
entweder mit dem Roti-Prep Plasmid Kit (Roth, Karlsruhe) oder dem QIAprep Spin Miniprep
Kit (QIAGEN, Hilden), entsprechend den Angaben der Hersteller, isoliert.
Material und Methoden
Zur
Kontrolle
21
der
Plasmide
wurden
diese
zunächst
in
silico
mit
Restriktionsendonukleasen verdaut, sodass wenige, größenmäßig gut unterscheidbare
Fragmente entstanden. Dies wurde ebenso in vitro durchgeführt (Material und Methoden 3.2)
und der Restriktionsansatz anschließend auf ein 0,9%iges Agarosegel aufgetragen, auf dem
die DNA-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt wurden (Material und Methoden 6.1).
Ebenso wurden Konstrukte durch Sequenzierung der Basenabfolge kontrolliert
(GATC Biotech AG, Konstanz).
4 Expression
4.1 Heterologe Expression von tneu_0419 aus T. neutrophilus
Das Gen für die vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase wurde in den
Expressionsvektor pET16b kloniert. Dieser Vektor fügt dem überproduzierten Protein einen
N-terminalen His10-Tag an. Eine Vorkultur mit pET16b::tneu_0419 transformierte E. coli
Rosetta 2 (DE3)-Zellen wurde in 2 l LB-Medium überführt und für 35 h unter Schütteln
(180 rpm) bei 30 °C inkubiert. E. coli Rosetta 2 (DE3) besitzt ein Plasmid, auf dem
verschiedene seltene tRNAs codiert sind (34). Dies ist wichtig, wenn man mit phylogenetisch
weit entfernten Organismen arbeitet, wie es z.B. bei Archea und dem Expressionsorganismus
E. coli der Fall ist, da diese Organismen einen unterschiedlichen Codongebrauch haben. Des
Weiteren findet man in E. coli Rosetta 2 (DE3) eine Chloramphenicolresistenz, sowie auf
pET16b eine Resistenz gegenüber Ampicillin. Deshalb wurden diese Antibiotika mit in das
Kulturmedium (Ampicillin 100 µg/ml, Chloramphenicol 34 µg/ml) gegeben, um dem
unerwünschten Wachstum fremder Organismen vorzubeugen. Zum Ernten wurden die Zellen
bei 9.000 × g und 4 °C für 12 min zentrifugiert (GS3 Rotor, Sorvall RC 50 Plus, Thermo
Fisher Scientific, Schwerte). Anschließend wurde das Feuchtgewicht der pelletierten
Zellmasse bestimmt und die Zellen bei – 20 °C bis zur Verwendung gelagert.
4.2 Heterologe Expression von tneu_0420 aus T. neutrophilus
Das Gen tneu_0420 wurde in den Expressionsvektor pT7-7 kloniert, da die
Überexpression mit His10-Tag im pET16b-Vektor kein aktives Enzym erzeugte. Das
Konstrukt pT7-7::tneu_0420 wurde wiederum in kompetente E. coli Rosetta 2 (DE3)-Zellen
transformiert und eine Vorkultur angesetzt. Mit dieser wurde 1 l LB-Medium angeimpft, das
Antibiotika enthielt (Ampicillin 100 µg/ml, Chloramphenicol 34 µg/ml). Das Wachstum
Material und Methoden
22
erfolgte für 38 h bei 30 °C. Das Ernten wurde durchgeführt, wie in Material und Methoden
unter 4.1 beschrieben.
4.3 Heterologe Expression von tneu_0751 aus T. neutrophilus
Das Gen für den möglichen Regulator der CO2-Fixierung von T. neutrophilus wurde
ebenfalls in den pT7-7-Expressionsvektor kloniert und dieser anschließend in E. coli
Rosetta 2 (DE3)-Zellen transformiert. Ein l LB-Medium wurde mit einer Vorkultur von
transformierten Zellen beimpft und bei 37 °C auf dem Schüttler (180 rpm) wachsen gelassen.
Das Medium enthielt Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (34 µg/ml). Bei OD578
von 1,8 wurde mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die
Kultur für weitere 4 h inkubiert. Das Ernten wurde wie in Material und Methoden 4.1
beschrieben durchgeführt.
4.4 Heterologe Expression von tneu_1396 aus T. neutrophilus
Das Gen für das „ALBA“-Protein wurde ebenfalls in den Expressionsvektor pT7-7
kloniert und anschließend in E. coli Rosetta 2 (DE3) transformiert. Eine Vorkultur mit
pT7-7::tneu_1396 transformierter E. coli-Zellen wurde in 1 l LB-Medium gegeben. Dieses
enthielt Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (34 µg/ml). Die Kultur wurde auf dem
Schüttler (180 rpm) bei 37 °C bis zu einer OD578 von 0,5 inkubiert und nach 10 min
Kälteschock bei 7 °C mit 0,1 mM IPTG induziert. Die Kultur wurde für weitere 4 h wachsen
gelassen und anschließend, wie unter Material und Methoden 4.1 beschrieben, geerntet.
5 Proteinreinigung
5.1 Zellaufschluss mit der French Pressure Cell
Die Menge aufzuschließender Zellen wurde im Verhältnis 1:1 in Aufschlusspuffer
(10 mM Tris/HCl, pH 7,8) resuspendiert. Eine kleine Spatelspitze DNase I verhinderte eine zu
starke Viskosität der Suspension. DNase I wurde nicht zugegeben, wenn die Zellextrakte
danach auf eine DNA-Affinitätssäule (Material und Methoden 9) aufgetragen wurden.
Anschließend wurde das Homogenisat mit einer gekühlten French Pressure Cell (American
Instruments Company, Maryland, USA) bei einem Druck von 7,6 MPa (1100 psi) zweifach
aufgeschlossen.
Material und Methoden
23
5.2 Ultrazentrifugation und Hitzefällung
Die aufgeschlossenen Zellen (Material und Methoden 5.1) wurden danach mit einer
Ultrazentrifuge (Ti70 Festwinkelrotor, L60 Ultracentrifuge, Beckman Coulter, Brea, USA)
bei 4 °C und 100.000 × g für 1 h abzentrifugiert. Der Überstand, der die löslichen
Proteinfraktionen enthielt, wurde sofort abgenommen und weiterverwendet.
In E. coli überproduzierte Proteine, die aus dem hyperthermophilen Organismus
T. neutrophilus stammen, lassen sich leicht durch eine Hitzefällung abtrennen, bei der die
meisten hitzelabilen Proteine aus dem Expressionsorganismus bereits denaturieren. Hierzu
wurde der Überstand aus der Ultrazentrifugation in Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und
diese anschließend im Wasserbad oder in einem Thermoblock für 15 min bei Temperaturen
zwischen 85 und 92 °C inkubiert. Die hitzegefällten Extrakte wurden für weitere 15 min auf
Eis inkubiert und danach in einer gekühlten Tischzentrifuge bei 16.000 × g und 4 °C für
15 min zentrifugiert. Der Überstand enthielt die hitzestabilen, überproduzierten Proteine aus
T. neutrophilus.
Da das „ALBA“-Protein (Tneu_1396) unspezifisch gebundene Nukleinsäuren des
Expressionsorganismus enthielt, wurde es einer Behandlung mit DNase I und RNase A
unterzogen. Hierfür wurde das rekombinante Protein in 100 mM Tris/HCl (pH 7,5), 2,5 mM
MgCl2, 0,1 mM CaCl2, DNase I (10 µg/ml) und RNase A (10 µg/ml) für 30 min bei 37 °C
inkubiert. Nach einer weiteren Hitzefällung und anschließender Zentrifugation wurde das
Protein bis zur Verwendung bei – 70 °C gelagert.
5.3 Reinigung durch Nickel-Affinitätschromatografie
Die vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase wurde mit einem His10-Tag
überproduziert und konnte so durch Affinitätschromatografie mit einer His-Trap FF 1 ml
Säule (GE Healthcare, München) gereinigt werden. Die Säule wurde hierzu an eine FPLCAnlage (Pump P500 oder P750, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)
angeschlossen und mit Bindepuffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,9, 250 mM KCl) äquilibriert. Die
Flussrate betrug 1 ml/min. Nach dem Auftragen des Zellextrakts interagieren die
N-terminalen Histidinreste des Enzyms mit den Ni2+-Ionen der Säule und das Protein wurde
dadurch immobilisiert. Es folgte ein Waschschritt (20 mM Tris/HCl, pH 7,9, 250 mM KCl,
100 mM Imidazol), bevor mit 500 mM Imidazol eluiert wurde. Imidazol verdrängt die
Histidinreste und bindet stattdessen an die Ni2+-Kationen. Die Elutionsfraktion wurde
anschließend in 25 % (w/v) Glycerin bei – 20 °C gelagert.
Material und Methoden
24
5.4 Reinigung durch DNA-Affinitätschromatografie
Überproduziertes Tneu_0751-Protein wurde einer Hitzefällung bei 92 °C unterzogen.
Nach der Zentrifugation wurde der Überstand für 24 h in 1 l Dialysepuffer (10 mM Tris/HCl,
pH 7,5, 1 mM EDTA) dialysiert. Hierfür wurde eine MWCO 12.000-14.000 Dialysemembran
(Roth, Karlsruhe) verwendet.
Auf eine 1-ml HiTrapTM Streptavidin-HP-Säule (GE-Healthcare, München) wurde
amplifizierte biotinylierte DNA aufgetragen, deren template aus dem intergenen Bereich
zwischen dem scr-4hbl und dem 4hbd-frd Operon stammte (Abb. 6). Die Primer (Tab. 9)
hatten einen Biotin-Tag (Biomers.net, Ulm). Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 11
angegeben. Das Biotin interagiert mit dem Streptavidin auf der Säule, wodurch die DNA auf
der Säule verbleibt.
Die Streptavidinsäule wurde mit 5 ml Puffer A (Tab. 14) äquilibriert. Die Flussrate
betrug zwischen 0,1 und 1 ml/min. Anschließend wurden ca. 1,5 mg Protein aufgetragen und
weitere 3 Säulenvolumen Puffer A eingesetzt. Es folgte ein Waschschritt mit 3 ml Puffer B
(Tab. 14), bevor mit 3 Säulenvolumen Puffer C (Tab. 14) eluiert wurde. Die
Elutionsfraktionen wurden gesammelt und über Nacht in 1 l Dialysepuffer (20 mM Tris/HCl,
pH 7,5) mittels einer MWCO 3.500 Membran (VWR, Darmstadt) dialysiert.
Tabelle 14: Zusammensetzung der Puffer für die Straptavidinsäule (nach 19)
Komponente
Puffer A [0,1 M NaCl] Puffer B [0,3 M NaC])
Puffer C [1 M NaCl]
Tris/HCl, pH 7,5
20 mM
20 mM
20 mM
NaCl
0,1 M
0,3 M
1M
Glycerin
10 % (v/v)
10 % (v/v)
10 % (v/v)
Triton-X-100
0,05 % (v/v)
0,05 % (v/v)
0,05 % (v/v)
EDTA
1 mM
1 mM
1 mM
DTT
1 mM
1 mM
1 mM
5.5 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung wurde nach einer modifizierten Methode nach Bradford (15)
durchgeführt. Diese Art der Proteinbestimmung basiert auf der Komplexbildung von
Coomassie mit basischen und aromatischen Aminosäureresten, wodurch sich das
Absorptionsmaxium proportional zur Proteinmenge nach 595 nm verschiebt.
Als Proteinstandard wurden
Lösungen von Rinderserumalbumin (BSA) in
verschiedenen Konzentrationen (0, 2, 4, 6, 8 µg/100 µl Aqua dest.) verwendet. Zu diesen
Standardlösungen wurden jeweils 900 µl Bradford-Reagenz (Tab. 15) gegeben und für 15 min
Material und Methoden
25
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Absorption photometrisch bei 595 nm
(Pharmacia Novaspec II, Freiburg) gemessen. Anhand dieser Werte konnte eine Eichgerade
erstellt werden. Parallel zur Messung der Proteinstandards wurde die Messung der Proben
mit unbekannter Konzentration durchgeführt. Hierzu wurden 100 µl verschiedener
Verdünnungsstufen mit 900 µl Bradford-Reagenz versetzt, wie den Proteinstandard inkubiert
und photometrisch bestimmt. Mit der erstellten Eichgerade und unter Berücksichtigung des
Verdünnungsfaktors konnte die Proteinkonzentration ermittelt werden.
Tabelle 15: Zusammensetzung des Bradford-Reagenzes
Komponente
100 mg Coomassie G250 in 99,5 % Ethanol
Volumen [ml]
50
85%ige Phosphorsäure
100
H2O (demin.)
ad 1000
6 Elektrophoretische Methoden
6.1 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung und Größenbestimmung von DNA-Fragmenten wurde die AgaroseGelelektrophorese benutzt. Dabei wurden die polyanionischen DNA-Moleküle in einem
konstanten elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt. Es wurden ausschließlich 0,9%ige
Agarosegele eingesetzt. Hierfür werden 450 mg Agarose in 50 ml 1 × TAE-Puffer (Tab. 16)
durch Aufkochen in der Mikrowelle vollständig gelöst. Nach kurzem Abkühlen auf eine
Temperatur von ca. 50 – 60 °C wurde die Lösung mit 1,5 µl GelRed (Biotium, Hayward,
USA) versetzt, durchmischt und in eine abgedichtete Gelkammer gegossen. Zum Formen der
Ladetaschen wurde noch ein Kamm eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren der Agarose
wurde der Kamm entfernt und das Gel in eine Elektrophoresekammer überführt, die mit 1 ×
TAE-Puffer gefüllt war. Bevor die zu analysierende DNA in die Geltaschen pipettiert wurde,
wurde sie mit 6 × DNA-Ladepuffer (Tab. 17) versetzt. Als Marker wurde ein Größenstandard
(1 kb Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen. Zur Auftrennung wurde eine konstante
Spannung von 120 Volt angelegt. Die Detektion der DNA-Fragmente erfolgte mit einer UVDurchlichtlampe (IL 200M, Bachhofer, Reutlingen) bei einer Wellenlänge von 312 nm.
Tabelle 16: Zusammensetzung von 50 × TAE-Puffer
Komponente
Konzentration
Tris
2 M, pH 8,0 wird mit Acetat eingestellt
EDTA
50 mM
Material und Methoden
26
Tabelle 17: Zusammensetzung von 6 × DNA-Ladepuffer
Komponente
Eingesetzes Volumen [ml]
Glycerin
6,0
50 × TAE-Puffer
1,2
Aqua dest.
2,8
Bromphenolblau 0,25 %
1,0
6.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
6.2.1 Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA)
Proteinlösungen mit zu geringer Konzentration bedurften der vorherigen Fällung mit
Trichloressigsäure (TCA). Die Proteinkonzentration wurde zuvor bestimmt (Material und
Methoden 5.5) und anschließend das gewünschte Probevolumen mit dem gleichen Volumen
einer 40%igen TCA-Lösung in einem Reaktionsgefäß gemischt, sodass sich eine
Endkonzentration an TCA von ca. 20 % ergab (22). Der Ansatz wurde für 10 min auf Eis
inkubiert und anschließend bei 4 °C in einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5402, Eppendorf,
Hamburg) für 10 min bei 16.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 µl 2 × SDSLadepuffer (Tabelle 18) resuspendiert und solange 1 M NaOH zugegeben, bis die violettblaue Färbung wieder eintrat.
Tabelle 18: Zusammensetzung eines 2 × SDS-Ladepuffer
Komponente
Glycerin
Eingesetzes Volumen [ml]
1,8
Tris/HCL, 0,5 M, pH 6,8
2,0
β-Mercaptoethanol
1,0
SDS, 10 %, (w/v)
4,0
Bromphenolblau, 0,25 % (w/v)
2,0
Aqua dest.
ad 20
6.2.2 Gelherstellung
Für die Gelherstellung wurden zwei Glasplatten mit ca. 8 × 8 cm gründlich von Fett
und Staub gesäubert. Anschließend wurden die Platten mit Abstandshaltern versehen und
deren Position mit Metallklammern fixiert. Fuß und Flanken der so hergestellten Kammer
wurden mit heißer 1%iger Agaroselösung abgedichtet. Danach wurde das gut durchmischte
Trenngel (Tabelle 19) bis ca. ¾ der Kammerhöhe zügig eingegossen und sofort mit
100%igem Isopropanol überschichtet. Nachdem das Trenngel auspolymerisiert war, konnte
das Isopropanol sorgfältig entfernt und das Sammelgel (Tabelle 19) eingegossen werden. Es
wurde noch der Taschenformer eingesetzt und das Gel konnte gleich nach dem
Material und Methoden
27
Auspolymerisieren verwendet oder auch, in feuchte Cellulosetücher verpackt, bei 7 °C in der
Kühlwand gelagert werden.
Tabelle 19: Zusammensetzung von SDS-Gelen, die Angaben sind ausreichend für zwei kleine Gele
Komponente
Sammelgel [6 %]
Trenngel [12,5 %]
Aqua dest.
3,78 ml
5,37 ml
2 M Tris/HCl
333 µl (pH 6,8)
3,15 ml (pH 8,8)
Acrylamid/Bisacrylamid Lösung (30 % (w/v), 0,8 % (w/v))
980 µl
6,2 ml
10 % SDS (w/v)
56 µl
150 µl
TEMED
6 µl
30 µl
10 % Ammoniumpersulfat (APS) (w/v)
30 µl
100 µl
6.2.3 Probenvorbereitung und Elektrophorese
Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient der Auftrennung
von Proteingemischen abhängig von der Masse der einzelnen Proteine (29). Dabei werden die
Proteine zuerst im Sammelgel fokussiert und anschließend im Trenngel aufgetrennt.
Vor der Elektrophorese wurde das fertige Gel in der Laufkammer fixiert und selbige
mit SDS-Laufpuffer (24,8 mM Tris/HCl (pH 8,8), 192 mM Glycin, 3,5 mM SDS) befüllt. Zur
Denaturierung wurden die Proben mit 2 × SDS-Ladepuffer (Tab. 18) versetzt und für 5 min
bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf das Gel aufgetragen. Als
Proteingrößenstandard wurde ein Gemisch aus 6 Proteinen verwendet (Tab. 20). Zu Beginn
der Elektrophorese wurde eine Spannung von 100 V angelegt. Diese wurde auf 150 V erhöht,
sobald die Lauffront in das Trenngel eingewandert war. Die Elektrophorese wurde gestoppt,
wenn die Lauffront das Gelende erreicht hatte.
Tabelle 20: Zusammensetzung des Proteingrößenstandards
Protein
Phosphorylase b
Masse [kDa]
97
Rinderserumalbumin
67
Ovalbumin
45
Lactat-Dehydrogenase
34
Carboanhydrase
29
Lysozym
14
6.2.4 Färben von SDS-Gelen
Nach erfolgter Elektrophorese wurden die Gele nach Zehr et al. (49) gefärbt. Hierzu
wurden die Gele aus der Elektrophoresekammer entnommen und in eine Färbelösung
überführt (0,25 % (w/v) Coomassie Blue R250, 30 % (v/v) Methanol, 20 % (v/v) Essigsäure).
Das Gel wurde über Nacht auf einem Schüttler inkubiert. Zum Entfärben wurde
Entfärberlösung I (30 % (v/v) Methanol, 20 % (v/v) Essigsäure) verwendet. Hierzu verblieb
Material und Methoden
28
das Gel solange in Entfärberlösung auf dem Schüttler, bis die Proteinbanden deutlich zu sehen
waren. Die entfärbten Gele wurden umgehend eingescannt (Perfection V700 Photo, Epson,
Nagano, Japan).
6.3 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Für
die
Untersuchung
spezifischer
Protein-DNA-Interaktionen
wurde
der
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) verwendet (19). Die dafür benötigte DNA
wurde durch PCR amplifiziert. Ein DNA-Fragment enthielt die Promotorbereiche des scr4hbl- und des 4hbd-frd-Operons. Als Kontroll-DNA wurde ein intragener DNA-Bereich
gleicher Länge (127 bp) auf dem scr-Gen gewählt. Die Primer enthielten einen Biotin-Tag
(Tab. 9). Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 11 angegeben.
6.3.1 Gelherstellung
Als Gele wurden 8%ige Polyacrylamidgele verwendet. Für deren Herstellung wurden
zwei Glasplatten von ca. 8 × 8 cm fett- und staubfrei gereinigt. Zwischen die Glasplatten
wurden Abstandshalter eingeführt und deren Position mit Metallklammern fixiert.
Anschließend wurden Fuß und die Flanken der Kammer mit heißer 1%iger Agaroselösung
abgedichtet. Die noch nicht auspolymerisierte Gellösung (Tab. 21) wurde in die Kammer
gegossen und ein Taschenformer eingesetzt. Das feste Gel konnte sofort verwendet oder auch
bei 7 °C in der Kühlwand gelagert werden.
Tabelle 21: Zusammensetzung von Polyacrylamidgelen [8 %], die Angaben sind ausreichend für vier
kleine Gele
Komponente
Eingesetztes Volumen
5 × TAE-Puffer
6,4 ml
Acrylamid/Bisacrylamid Lösung (30 % (w/v), 0,8 % (w/v))
8,6 ml
Aqua dest.
17 ml
TEMED
30 µl
10 % Ammoniumpersulfat (APS) (w/v)
150 µl
6.3.2 Probenvorbereitung und Elektrophorese
Für die EMSAs wurde DNA mit Protein für 30 min inkubiert. Um einem Verdau
durch DNase entgegenzuwirken betrug die Inkubationstemperatur 65 °C. Das Volumen der
Ansätze betrug 20 µl. Der Reaktionspuffer enthielt 10 mM Tris/HCl (pH 7,6), 50 mM NaCl,
1 mM DTT, 1 mM EDTA und 10 % (w/v) Glycerin. DNA wurde in Mengen von 100 - 200 ng
zugegeben. Die Proteinkonzentrationen betrugen das 0 - 100fache der molaren Menge der
Material und Methoden
29
DNA. Nach 30 min Inkubationszeit wurden pro Ansatz 3 µl 6 × DNA-Ladepuffer (Tab. 17)
zugegeben und vorsichtig auf ein natives Polyacrylamidgel aufgetragen. Als Laufpuffer
wurde 1 × TAE-Puffer (Tab. 16) verwendet. Die Elektrophorese wurde für 3 h mit einer
Spannung von 60 V bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Lauf wurden die Gele für
1 h mit 3 × GelRed™-Lösung (VWR, Darmstadt) inkubiert. Zur Detektion der DNAFragmente wurde eine UV-Durchlichtlampe (IL 200M, Bachhofer, Reutlingen) bei einer
Wellenlänge von 312 nm verwendet.
Die EMSAs wurden auch zum Auffinden möglicher Effektormoleküle verwendet.
Diese wurden in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Dabei handelte es sich um 5 mM
Adeninnukleotide (AMP, ADP, AMP-PNP, NAD+, NADH, NADP+, NADPH), 1 mM CoA,
Acetyl-CoA, Crotonyl-CoA, oder 3 mM Acetat, Succinat, 4-Hydroxybutyrat, Pyruvat,
Phosphoenolpyruvat und Fumarat.
7 Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC)
Mit Hilfe der HPLC (High Performance Liquid Chromatography) können
verschiedene Substanzen in einem Probengemisch durch Chromatographie aufgetrennt und
identifiziert werden. Dazu wird das Probengemisch in einer mobilen Phase mit hohem Druck
über eine stationäre Phase geleitet. Durch die Wahl der stationären Phase und des Laufmittels
verbleiben verschiedene Substanzen unterschiedlich lange auf der Säulenmatrix. Wird die
Polarität der mobilen Phase verändert, eluieren verschiedene Substanzen zu unterschiedlichen
Retentionszeiten von der Säule.
Es wurde ein RP-HPLC-Lauf (Reverse Phase HPLC) durchgeführt, um die Abnahme
von CoA und die Zunahme von 4-Hydroxybutyryl-CoA durch die katalytische Aktivität der
rekombinanten 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase zu messen. Als stationäre Phase diente eine
RP-C18-Säule (LICHROSPHERO 100 RP 18E 5,0 µm, 125 × 4,0 mm, Wicom GmbH,
Heppenheim). An die unpolare Matrix dieser Säule binden unpolare Moleküle sehr stark und
können durch unterschiedliche Laufmittelgemische eluiert werden. Zur Elution wurde ein
Acetonitrilgradient (Tab. 22) verwendet. Als Laufmittel diente ein KH2PO4-Puffer (50 mM,
pH 6,7). Das aufgetragene Volumen der jeweiligen Proben lag bei 100 µl und die Flussrate
betrug 1 ml/min. Zur Detektion der eluierten Substanzen wurde die Säule an ein Waters
Separationsmodul angeschlossen (2690 separation module, Waters, Eschborn), sowie an eine
Waters Photodiode (996 photodiode array detector, Waters, Eschborn) zur Aufnahme der UVAbsorption zwischen 210 und 400 nm.
Material und Methoden
30
Tabelle 22: HPLC-Laufprogramm
Zeit [min]
Puffer A [%]
Acetonitril
0
2
Puffer B [%]
50 mM KH2PO4, pH 6,7
98
30
10
90
35
45
55
40
2
98
43
2
98
Zum Nachweisen von enzymatischer Aktivität der rekombinanten 4-HydroxybutyratCoA-Ligase wurde ein Stopp-Test gewählt. Aus dem Reaktionsansatz (Tab. 23) wurden zu
den Zeitpunkten 0, 2 und 4 min 50 µl Proben entnommen und in 10 µl 1 M HCl gestoppt. Die
Reaktion fand bei 85 °C statt. Der Reaktionsstart wurde durch Zugabe von 4-Hydroxybutyrat
eingeleitet. Die mit HCl gestoppten Reaktionsansätze wurden für 10 min bei 16.000 × g und
4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, im Verhältnis 1:1 mit H2O gemischt
und in ein HPLC-Vial überführt. Kontrollreaktionen wurden durchgeführt, bei denen
entweder 4-Hydroxybutyrat oder ATP im Ansatz fehlte.
Tabelle 23: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes zur Aktivitätskontrolle rekombinanter
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Komponente
Endkonzentration
MOPS/KOH, pH 7,8
100 mM
MgCl2
5 mM
ATP
3 mM
4-Hydroxybutyrat
10 mM
CoA
1 mM
rekombinante 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
25 µg Protein pro Ansatz
Aqua dest.
ad 175 µl
8 Enzymatische Tests
8.1 Bestimmug der Enzymaktivität der Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Die Enzymaktivität der rekombinanten Succinat-Semialdehyd-Reduktase wurde bei
65 °C photometrisch bestimmt. Dabei wurde die Reduktion von Succinat-Semialdehyd zu
4-Hydroxybutyrat anhand der NADPH-Abnahme bei einer Wellenlänge von 365 nm
(ε365nm = 3.500 M-1 cm-1) verfolgt. Die Aktivitätsmessung wurde in Halbmikro-Glasküvetten
(Hellma, Müllheim) an einem Photometer (Ultraspec 2000, Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden) durchgeführt und mit einem Schreiber (LKB REC 102, Pharmacia Fine
Material und Methoden
31
Chemicals, Uppsala, Schweden) protokolliert. Der Reaktionsansatz (Tab. 24) hatte ein
Volumen von 500 µl und wurde nach Kockelkorn und Fuchs (27) zusammengestellt.
Tabelle 24: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes zur Aktivitätsbestimmung rekombinanter
Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Komponente
Endkonzentration
MOPS/NaOH, pH 7,9
100 mM
MgCl2
5 mM
DTT
5 mM
Succinat-Semialdehyd
1 mM
NADPH
0,5 mM
rekombinante Succinat-Semialdehyd-Reduktase
0,028 µg pro Ansatz
Die Komponenten des Reaktionsansatzes wurden für 3 min bei 65 °C vortemperiert
und die Küvette anschließend in den Strahlengang des Photometers eingeführt. Sobald das
Schreiberprotokoll einen linearen Messbereich anzeigte, wurde die Reaktion durch Zugabe
von Succinat-Semialdehyd gestartet. Zur Bestimmung des Km-Wertes für SuccinatSemialdehyd wurde dieses Substrat in Konzentrationen zwischen 0 und 0,5 mM zugegeben,
die NADPH-Konzentration wurde mit 0,5 mM konstant gehalten.
Bei der Ermittlung des Km-Wertes für NADPH wurde dieses in Konzentrationen
zwischen 0 und 1 mM eingesetzt. Für Konzentrationen größer als 0,6 mM NADPH wurde
eine Küvette mit 5 mm Schichtdicke verwendet. Die Succinat-Semialdehyd-Konzentration lag
bei 1 mM. Diese Reaktion wurde durch Zugabe des rekombinanten Enzyms gestartet.
8.2 Bestimmug der Enzymaktivität der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Die
Enzymaktivität
der
rekombinanten
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
wurde
photometrisch bei 85 °C bestimmt. Bei der Bildung von 4-Hydroxybutyryl-CoA wird AMP
freigesetzt, das in einem indirekten Test verfolgt wurde. Hierzu wurden drei Hilfsenzyme
benutzt. Die Myokinase katalysiert zuerst die Bildung von 2 ADP aus ATP und dem
freigesetzten AMP. Zwei ADP werden durch die Pyruvat-Kinase zu 2 ATP umgesetzt, indem
2 PEP zu 2 Pyruvat umgesetzt werden. Zwei Moleküle Pyruvat wiederum werden von der
Lactat-Dehydrogenase zu 2 Molekülen Lactat reduziert. Bei dieser Reaktion werden 2 NADH
zu
2
NAD+
oxidiert,
was
photometrisch
bei
einer
Wellenlänge
von
365 nm
(ε365nm = 3.400 M-1 cm-1) verfolgt wurde. Allerdings sind die Hilfsenzyme nicht hitzestabil,
weshalb dieser Test nicht bei 85 °C durchgeführt werden konnte. Bei einem kontinuierlichen
Material und Methoden
32
Testansatz bei 42 °C war die Aktivität der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase kaum messbar,
weshalb ein zweiteiliger Stopp-Test gewählt wurde.
Der erste Teil wurde bei 85 °C durchgeführt. Die Komponenten (Tab. 25) dieses
Ansatzes (350 µl) wurden für 3 min bei 85 °C vortemperiert, bevor die Reaktion mit dem
rekombinanten Enzym gestartet wurde. Zu den Zeitpunkten 0, 2 und 4 min wurden jeweils
100 µl entnommen, die Reaktion auf Eis gestoppt und anschließend mit 400 µl des zweiten
Ansatzes (Tab. 25) gemischt. Dieser Ansatz enthielt die Hilfsenzyme, sowie NADH, dessen
Abnahme mit einem Photometer (Lambda 2S, Perkin Elmer, Waltham, USA) verfolgt wurde.
Tabelle 25: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes zur Aktivitätsbestimmung rekombinanter
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligse
Komponente
Endkonzentration
Ansatz I:
MOPS/KOH, pH 7,8
100 mM
Ansatz II:
MgCl2
5 mM
ATP
3 mM
4-Hydroxybutyrat
10 mM
CoA
0,5 mM
rekombinante 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
50 µg pro Ansatz
Tris/HCl, pH 7,8
100 mM
MgCl2
5 mM
ATP
5 mM
KCl
20 mM
NADH
0,75 mM
PEP
1 mM
Myokinase
3,7 Units
Pyruvat-Kinase
3,2 Units
Lactat-Dehydrogenase
1,8 Units
Km-Wert.
Zur
Bestimmung
des
Km-Wertes
für
4-Hydroxybutyrat
wurden
Substratkonzentrationen zwischen 0 und 10 mM eingesetzt und die CoA-Konzentration mit
0,5 mM konstant gehalten.
Der Km-Wert für CoA sollte auch bestimmt werden. Hierzu wurden CoAKonzentrationen zwischen 0 und 5 mM eingesetzt. Die Konzentration an 4-Hydroxybutyrat
wurde in diesem Fall nicht variiert (10 mM).
Material und Methoden
33
Alternative Substrate. Neben 4-Hydroxybutyrat wurden noch die spezifischen
Aktivitäten alternativer Substrate bestimmt. Hierfür wurden jeweils Konzentrationen von
10 mM an Crotonat, Acetat, 3-Hydroxypropionat und 3-Hydroxybutyrat getestet. Mit
Ausnahme von 4-Hydroxybutyrat war der Testansatz identisch zu Tabelle 25.
9 DNA-Affinitätschromatografie
Mit der DNA-Affinitätschromatografie nach Cramer et al. (19) können Proteine aus
dem Zellextrakt ankonzentriert werden, die an eine spezifische DNA-Sequenz binden. Diese
DNA-Sequenz wurde mit biotinylierten Primern durch PCR amplifiziert. Über die spezifische
Biotin-Streptavidin-Bindung wurde die DNA mit Biotin-Tag auf der Säulenmatrix gehalten
und dadurch auch bestimmte DNA-bindende Proteine, die in den anschließend aufgetragenen
Zellextrakten enthalten waren. Mit steigenden Salzkonzentrationen wurden die Proteine von
der Säule eluiert.
9.1 Vorbereitung der Zellextrakte von T. neutrophilus
Diese Affinitätschromatografie diente der Identifizierung von Proteinen aus
Zellextrakt von T. neutrophilus, die an eine spezifische intergene DNA-Sequenz binden
(Abb. 6). Diese Sequenz liegt innerhalb eines Genclusters, in dem Enzyme des
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus codiert werden (Abb. 5). So wurden für diesen Versuch
T. neutrophilus-Zellen gezüchtet (Material und Methoden 2.1). Für jede Durchführung des
Affinitätstests wurden ca. 2 g Zellen verwendet. Diese wurden zunächst in 4 ml Waschpuffer
(Tab. 26) resuspendiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in
Aufschlusspuffer (1 ml/1 g Zellmasse) (Tab. 26) aufgenommen. Anschließend wurden die
Zellen mit einer French Pressure Cell aufgeschlossen (Material und Methoden 5.1), wobei
allerdings keine DNase zugegeben wurde. Auch Puffer und Geräte, die mit dem Affinitätschromatografiesystem in Kontakt kamen, wurden DNase-frei gehalten. Das aufgeschlossene
Zellmaterial wurde danach mit einer Ultrazentrifuge (Ti70 Festwinkelrotor, L60
Ultracentrifuge, Beckman Coulter, Brea, USA) bei 4 °C und 100.000 × g für 30 min
abzentrifugiert.
Der
Überstand
wurde
abgenommen
und
die
darin
enthaltene
Proteinkonzentration bestimmt (Material und Methoden 5.5). Für jede Durchführung wurden
Proteinmengen von etwa 50 mg benötigt. Anschließend wurde der Überstand noch mit 100 µg
Konkurrenz-DNA aus Lachssperma vorsichtig gemischt und für 10 min auf Eis inkubiert.
Material und Methoden
34
Tabelle 26: Zusammensetzung der Puffer für die Probenvorbereitung
Komponente
Endkonzentration
Waschpuffer:
Tris/HCl, pH 7,6
50 mM
Aufschlusspuffer:
NaCl
50 mM
Tris/HCl, pH 7,6
50 mM
Glycerin
10 % (v/v)
MgCl2
10 mM
EDTA
1 mM
DTT
1 mM
Protease-Inhibitoren
½ Tablette für 100 ml Aufschlusspuffer
9.2 Beladen der Affinitätssäule
Als Affinitätschromatografiesystem wurde eine 1-ml HiTrapTM Streptavidin-HP-Säule
(GE-Healthcare, München) verwendet. Diese wurde mit 5 Säulenvolumen Puffer A (Tab. 14)
äquilibriert. Mit einer sterilen Spritze wurden anschließend etwa 130 pmol biotinyliertes
PCR-Produkt auf die Säule aufgetragen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 9, das PCRProgramm in Tabelle 11 angegeben. Nichtgebundene DNA wurde mit 10 ml Puffer A von der
Säule gewaschen. Dann wurde die vorbereitete Proteinlösung (Material und Methoden 9.1)
aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit 10 ml Puffer A, wurden die gebundenen Proteine
mit Puffer B (Tab. 14) und Puffer C (Tab. 14) eluiert. Alle Schritte wurden bei
Raumtemperatur durchgeführt. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min. Die Elutionsfraktionen (1 ml)
wurden über Nacht in 1 l Dialysepuffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5) mittels einer MWCO 3.500
Membran (VWR, Darmstadt) dialysiert. Die Proben wurden mit TCA gefällt und durch SDSGelelektrophorese aufgetrennt (Material und Methoden 6.2).
10 Massenspektrometrie
Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurden von Dr. Andreas Schlosser
(Core Facility Proteomics, ZBSA, Freiburg) durchgeführt. Die Proben wurden proteolytisch
verdaut und durch nanoHPLC-MS/MS analysiert.
Material und Methoden
35
11 Verwendete Software
•
Ableiten von Primern, Erstellen von Nukleotidalignments, Plasmid- und Genkarten:
Clone Manger Suite7 (Sci Ed, Cary, USA)
•
Erstellen von Diagrammen: Prism 4 für Windows (GraphPad Software, La Jolla,
USA)
•
Analyse der HPLC-Ergebnisse: Millenium 2010 Chromatography Manager (Version
2.1, 1992-1995 Waters Corporation)
•
Phylogenetische Analysen wurden mittels BLAST-Suche mit der Datenbank des
NCBI (National Center for Biotechnology Information) durchgeführt
•
Erstellen von Alignments : BioEdit (Ibis Therapeutics, Carlsbad, USA)
•
Erstellen von Stammbäumen: MEGA4 (42)
Ergebnisse
36
Ergebnisse
1 Fehlende Enzyme und Gene der autotrophen CO2-Fixierung in
T. neutrophilus
In T. neutrophilus wurden die Aktivitäten der Enzyme des Dicarboxylat/
Hydroxybutyrat-Zyklus gemessen. Zu Beginn dieser Arbeit fehlte jedoch bei zwei Enzymen
noch der experimentelle Nachweis, der die Enzymfunktion einem Gen zuordnen sollte. Bei
diesen beiden Enzymen handelt es sich um die Succinat-Semialdehyd-Reduktase und die
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase.
1.1 Vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Die Succinat-Semialdehyd-Reduktase katalysiert die Reduktion von SuccinatSemialdehyd zu 4-Hydroxybutyrat. Im Genom von T. neutrophilus wurde ein guter Kandidat
(Tneu_0419) für diese Funktion entdeckt, der große Ähnlichkeit mit der bereits identifizierten
Succinat-Semialdehyd-Reduktase aus M. sedula aufweist.
1.1.1 Klonierungsstrategie und heterologe Überexpression in E. coli
Um zu zeigen, dass die vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase SuccinatSemialdehyd zu 4-Hydroxybutyrat reduziert, wurde das Enzym in E. coli Rosetta 2 (DE3)
überproduziert. Es wurde dieser Stamm verwendet, da phylogenetisch weit entfernte
Organismen einen unterschiedlichen Codongebrauch haben. Bei E. coli handelt es sich um ein
γ-Proteobakterium, bei T. neutrophilus um ein Crenarchaeon. Bei dieser relativ entfernten
Verwandtschaft könnte die heterologe Expression des Gens sehr ineffizient sein. Deshalb
besitzt E. coli Rosetta 2 (DE3) ein Plasmid, auf dem seltene tRNAs codiert sind (43).
Für die Klonierung wurde genomische DNA aus T. neutrophilus isoliert und das Gen
für Tneu_0419 durch PCR amplifiziert. Dabei wurden Primer eingesetzt, die NdeI- bzw.
HindIII-Schnittstellen enthielten. Das geschnittene PCR-Produkt wurde zuerst in den pUC18Vektor ligiert. Der Vektor pUC18 ist ein Klonierungsvektor („high copy“), mit dem man
größere Mengen des PCR-Produkts herstellen kann. Mit den gleichen Restriktionsenzymen
wurde das Gen aus pUC18::tneu_0419 ausgeschnitten und anschließend in pET16b ligiert
(Abb. 7). Bei pET16b handelt es sich um einen Expressionsvektor, der dem überproduzierten
Protein einen N-terminalen His10-Tag anfügt.
Ergebnisse
37
Abbildung 7: Klonierungsschema für Tneu_0419. Das Gen für die mögliche SuccinatSemialdehyd-Reduktase wurde zuerst in den Amplifikationsvektor pUC18 kloniert und
anschließend in die multiple cloning site von pET16b eingefügt. Als Restriktionsenzyme
wurden NdeI und HindIII benutzt. Die Plasmide enthielten eine Ampicillinresistenz (bla), die
der Selektion diente.
Die heterologe Überproduktion von Tneu_0419 wurde im 2 l Maßstab durchgeführt.
Nach dem Animpfen des LB-Mediums mit transformierten E. coli Rosetta 2 (DE3)-Zellen
wurde die Kultur für 35 h bei 30 °C inkubiert. Nach der Ernte wurden die Zellen mittels
French Pressure Cell aufgeschlossen und bei 100.000 × g abzentrifugiert. Der Überstand
wurde einer Hitzefällung bei 88 °C unterzogen, bei der hitzelabile Proteine von E. coli
denaturierten und abgetrennt werden konnten. Anschließend wurde das Protein durch
Affinitätschromatographie mittels einer His-Trap-Säule weiter gereinigt. Die Elution erfolgte
mit 500 mM Imidazol. Um einem Aktivitätsverlust des Enzyms vorzubeugen, wurde es in
Ergebnisse
38
25 % (w/v) Glycerin bei - 20 °C gelagert. Das berechnete Molekulargewicht der annotierten
Alkohol-Dehydrogenase mit dem angefügten His10-Tag beträgt 40,5 kDa.
Abbildung 8: SDS-PAGE (12,5%) der Succinat-Semialdehyd-Reduktase (Tneu_0419).
Spur 1: Proteinstandard, Spur 2: 100.000 × g Überstand (20 µg Protein), Spur 3: nach einer
Hitzefällung von 88 °C (5 µg Protein), Spur 4: nach einer His-Trap Reinigung bei einem
500 mM Imidazol Elutionsschritt (3 µg Protein).
1.1.2 Katalytische Eigenschaften der Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Das Enzym reduziert Succinat-Semialdehyd zu 4-Hydroxybutyrat unter NADPHVerbrauch, durch den die Enzymfunktion überprüft wurde. Die von Succinat-Semialdehyd
abhängige NADPH-Abnahme wurde bei einer Wellenlänge von 365 nm verfolgt. Der KmWert der rekombinanten Succinat-Semialdehyd-Reduktase für Succinat-Semialdehyd betrug
30 µM (Abb. 9), für NADPH betrug der Km-Wert 190 µM (Abb. 10). Die maximale
spezifische Aktivität (Vmax) wurde mit 580 µmol min-1 mg-1 Protein bestimmt. Die kinetischen
Konstanten zeigen, dass die gesuchte Semialdehyd-Reduktase gefunden wurde.
Ergebnisse
39
Abbildung 9: Km-Wert der Succinat-Semialdehyd-Reduktase für Succinat-Semialdehyd.
Der Testansatz (500 µl) enthielt 100 mM MOPS/NaOH-Puffer (pH 7,9), 0,5 mM NADPH
und verschiedene Konzentrationen des Substrates Succinat-Semialdehyd. Der Km-Wert betrug
30 µM, die spezifische Aktivität 580 µmol min-1 mg-1 Protein.
Abbildung 10: Km-Wert der Succinat-Semialdehyd-Reduktase für NADPH. Der
Testansatz (500 µl) enthielt 100 mM MOPS/NaOH-Puffer (pH 7,9), 1 mM SuccinatSemialdehyd und verschiedene Konzentrationen von NADPH. Der Km-Wert betrug 190 µM.
Ergebnisse
40
1.2 Vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase katalysiert die Aktivierung von 4-Hydroxybutyrat
zu 4-Hydroxybutyryl-CoA. Auf 2-D-Gelen von Zellextrakt autotropher und auf Acetat
gewachsenen T. neutrophilus–Zellen wurde das Protein Tneu_0420 als autotroph induziert
identifiziert. Im Genom sind drei mögliche AMP-bildende CoA-Ligasen vorhanden,
allerdings liegt eines, Tneu_0420, in einem Cluster zusammen mit weiteren Genen, die für
Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus codieren.
1.2.1 Klonierungsstrategie und heterologe Überexpression in E. coli
Um die Funktion von Tneu_0420 zu bestätigen, wurde das Protein in E. coli
überproduziert. Zunächst wurde das Gen mittels PCR amplifiziert. Die dafür abgeleiteten
Primer enthielten HindIII- bzw. BamHI-Schnittstellen. Das geschnittene PCR-Produkt wurde
zur Vervielfältigung in den Klonierungsvektor pUC18 ligiert. Anschließend wurde das Gen in
den
Expressionsvektor
pET16b
eingebracht.
Das
His10-Protein
wurde
in
E. coli
überproduziert und gereinigt. Es zeigte allerdings keine Aktivität in Anwesenheit von
4-Hydroxybutyrat und CoA.
Ergebnisse
41
Abbildung 11: Klonierungsschema für Tneu_0420. Das Gen für die vermutete
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase wurde zunächst in den Amplifikationsvektor pUC18 kloniert
und anschließend in den Expressionsvektor pT7-7 gebracht. Als Restriktionsenzyme wurden
BamHI und HindIII benutzt. Die Plasmide enthielten eine Ampicillinresistenz (bla).
Da rekombinante Enzyme mit His10 oft inaktiv sind, wurde tneu_0420 in den
Expressionsvektor pT7-7 umkloniert (Abb. 11). Für die Überproduktion wurden mit
pT7-7::tneu_0420 transformierte E. coli-Zellen in 1 l LB-Medium angezogen. Das Wachstum
erfolgte für 38 h bei 30 °C. Die Zellen wurden mit der French Pressure Cell aufgeschlossen
und bei 100.000 × g zentrifugiert. Anschließend wurde der E. coli-Zellextrakt für 15 min bei
88 °C hitzegefällt. Das hitzestabile Tneu_0420 verblieb im Überstand und wurde in ca. 25 %
Glycerin bei - 20 °C gelagert. Es wurde eine SDS-PAGE durchgeführt, die eine markante
Bande knapp oberhalb des 67 kDa Proteinstandards zeigte (Abb. 12). Tneu_0420 hat eine
berechnete Masse von 71 kDa.
Abbildung 12: SDS-PAGE (12,5%) der rekombinanten 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase.
Spur 1: Proteingrößenstandard, Spur 2: 100.000 × g Überstand (20 µg), Spur 3: nach einer
Hitzefällung bei 88 °C (14 µg).
1.2.2 Produktanalyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC)
Die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase katalysiert die Bildung von 4-Hydroxybutyryl-CoA
aus 4-Hydroxybutyrat und CoA. Die Abnahme von CoA und die Bildung von
4-Hydroxybutyryl-CoA wurden mittels HPLC analysiert. CoA und 4-Hydroxybutyryl-CoA
wurden bei einer Wellenlänge von 260 nm detektiert. Es wurde eine unpolare C18E-Säule
(Wicom GmbH, Heppenheim) verwendet. Als mobile Phase diente ein Acetonitril-Gradient.
Ergebnisse
42
Zu den Zeitpunkten 0, 2 und 4 min wurden nach Inkubation bei 85 °C jeweils 50 µl
entnommen und die Reaktion mit 10 µl 1 M HCl gestoppt. Es wurden zwei Kontrollansätze
durchgeführt, die entweder kein 4-Hydroxybutyrat oder kein ATP enthielten. Nach 2 und 4
min nahm die CoA-Konzentration ab und 4-Hydroxybutyryl-CoA wurde gebildet. In den
Kontrollen ohne 4-Hydroxybutyrat bzw. ohne ATP wurde CoA nicht verbraucht und der
CoA-Ester nicht gebildet (Abb. 13).
Abbildung 13: HPLC-Chromatogramme der rekombinanten 4-Hydroxybutyrat-CoALigase. Der Reaktionsstopp erfolgte zu den Zeitpunkten 0, 2 und 4 min. CoA, mit einer
Ergebnisse
43
Retentionszeit von ca. 9 min, nimmt ab, 4-Hydroxybutyryl-CoA nimmt zu. Es wurden zwei
Kontrollen durchgeführt, bei denen 4-Hydroxybutyrat bzw. ATP im Ansatz fehlte. Hier wurde
kein Produkt gebildet.
1.2.3 Katalytische Eigenschaften der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Km-Wert. Bei der Bildung von 4-Hydroxybutyryl-CoA durch die 4-HydroxybutyratCoA-Ligase wird AMP freigesetzt. Zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms sollte die AMPFreisetzung in einem indirekten Test verfolgt werden. Hierzu sind drei weitere Hilfsenzyme
notwendig. In einem ersten Schritt katalysiert die Myokinase die Bildung von 2 ADP aus
AMP und ATP. Zwei ADP werden durch die Pyruvat-Kinase zu 2 ATP umgesetzt, indem 2
PEP zu 2 Pyruvat umgesetzt werden. Zwei Moleküle Pyruvat werden von der LactatDehydrogenase zu 2 Molekülen Lactat reduziert. Diese Reaktion geht mit der Oxidation von 2
NADH zu 2 NAD+ einher. Die Abnahme von NADH kann bei 365 nm photometrisch verfolgt
werden. Da sämtliche Hilfsenzyme nicht hitzestabil sind, konnte dieser Test nicht bei 85 °C
durchgeführt werden. Mit einem kontinuierlichen Testansatz bei 42 °C war allerdings die
Aktivität der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase so gering, dass die Messung keine Aussage
zuließ. So wurde ein Stopp-Test durchgeführt, der aus zwei Teilen bestand. Der erste Teil
wurde bei 85 °C durchgeführt. Hier wurde die rekombinante 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
eingesetzt. Nach jeweils 0, 2 und 4 min wurde ein Teil des Ansatzes entnommen und sofort
auf Eis gestellt. Im zweiten Teil wurden diese Proben in einen Ansatz mit den Hilfsenzymen
gegeben. Das gebildete AMP wurde so indirekt durch die NADH-Abnahme bei
Raumtemperatur photometrisch bei 365 nm verfolgt.
Bei einer Reaktionstemperatur von 85 °C wurde eine spezifische Aktivität von
0,8 µmol min-1 mg-1 Protein gemessen. Der Km-Wert für 4-Hydroxybutyrat betrug 0,7 mM
(Abb. 14). Die CoA-Konzentration im Ansatz betrug 0,5 mM. Bei dieser Konzentration zeigte
die rekombinante 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase die höchste spezifische Aktivität (Abb. 15).
ATP wurde in einer Konzentration von 3 mM eingesetzt; eine Verdopplung dieser
Konzentration veränderte die Aktivität des Enzyms nicht.
Ergebnisse
44
Abbildung 14: Km-Wert der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase für 4-Hydroxybutyrat. Der
Test bestand aus zwei Teilen. Im ersten Teil wurde 4-Hydroxybutyryl-CoA, unter AMPFreisetzung, durch die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase gebildet. Der Ansatz enthielt neben
dem Substrat 4-Hydroxybutyrat noch 3 mM ATP, 5 mM MgCl2 und 0,5 mM CoA.
Im zweiten Teil wurde das freigesetzte AMP mit den Hilfsenzymen Myokinase, PyruvatKinase und Lactat-Dehydrogenase durch die NADH-Abnahme photometrisch bei 365 nm
verfolgt. Der Km-Wert für 4-Hydroxybutyrat lag bei 0,7 mM, die spezifische Aktivität bei
0,8 µmol min-1 mg-1 Protein.
Alternative
Substrate.
Die
alternativen
Substrate
Crotonat,
Acetat,
3-Hydroxypropionat und 3-Hydroxybutyrat wurden getestet. Die spezifische Aktivität
erreichte bei Crotonat 22 % der Aktivität des Enzyms, verglichen mit dem Substrat
4-Hydroxybutyrat. Die Aktivitäten bei den anderen Substraten waren niedriger (Tab. 27). Das
Substratspektrum wird im nächsten Kapitel diskutiert.
Tabelle 27: Spezifische Aktivitäten für alternative Substrate
Substrat
Spezifische Aktivität [µmol min-1 mg-1 Protein]
4-Hydroxybutyrat
811
Prozentualer Vergleich
100 %
Crotonat
179
22,0 %
Acetat
105
12,9 %
3-Hydroxypropionat
74
9,1 %
3-Hydroxybutyrat
62
7,6 %
Posttranslationale
Modifikationen.
Für
Salmonella
enterica
ist
ein
Acetylierungs-/Deacetylierungssystem bekannt. Hier wird durch einen posttranslationalen
Acetylierungsschritt die Aktivität einer Acetat-CoA-Ligase herabgesetzt (40). Um
posttranslationale Modifikationen der rekombinanten 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase zu
Ergebnisse
45
überprüfen, wurde die Proteinbande aus dem SDS-Gel geschnitten und durch nanoHPLCMS/MS (Core Facility Proteomics, ZBSA, Freiburg) massenspektrometrisch analysiert. Dabei
wurde nach Acetylierungen, Formylierungen, Methylierungen, Dimethylierungen und
Trimethylierungen gesucht. Nur an einem konservierten Lysinrest (K-594) wurde eine
Acetylierung festgestellt, die möglicherweise die Enzymaktivität vermindert.
CoA-Abhängigkeit. Der Km-Wert der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase für CoA konnte
nicht bestimmt werden, da die CoA-Abhängigkeit keiner Michaelis-Menten Kinetik folgt
(Abb. 15). Die höchste Aktivität wurde bei einer CoA-Konzentration von 0,5 mM festgestellt,
höhere Konzentrationen scheinen sich hemmend auszuwirken. Dieses Phänomen wurde
bereits für die 3-Hydroxypropionat- CoA-Ligase aus M. sedula beschrieben (1).
Abbildung 15: CoA-Abhängigkeit der 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase. In Bezug auf die
Abhängigkeit von CoA folgte das Enzym keiner Michaelis-Menten-Kinetik. Die höchste
Aktivität wurde bei 0,5 mM CoA gemessen.
2 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in T. neutrophilus
Viele Enzyme des CO2-Fixierungsweges in T. neutrophilus sind stark reguliert. Ein
Großteil davon wurde auf 2-D-Gelen als autotroph induziert identifiziert, das heißt, sie
werden vom Organismus stärker exprimiert, wenn CO2 als einzige Kohlenstoffquelle vorliegt.
Die Regulation findet auf Transkriptionsebene statt. In dieser Arbeit sollte nach einem
Regulatorprotein gesucht werden.
Ergebnisse
46
2.1 Isolierung möglicher Regulatorproteine aus Zellextrakt von T. neutrophilus
Die Gene für sechs Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus liegen in einem
Cluster zusammen (Abb. 5). Unter anderem enthält das Cluster zwei divergent transkribierte
Operons. Das erste (scr-4hbl) codiert für die Succinyl-CoA-Reduktase und die
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase, das zweite (4hbd-frd) codiert für die 4-Hydroxybutyryl-CoADehydratase
sowie
für
die
zwei
Untereinheiten
der
Fumarat-Reduktase.
Deren
Enzymaktivitäten weisen große Unterschiede auf, je nachdem ob die Zellen auf Acetat oder
autotroph gewachsen waren. Zwischen diesen beiden Operons liegt eine 121 bp lange
intergene Region, die archaeelle Promotorelemente enthält (Abb. 6). Diese intergene Region
wurde mit biotinylierten Primern (Biomers.net, Ulm) mittels PCR amplifiziert. Das
vervielfältigte biotinylierte PCR-Produkt wurde auf eine 1-ml-Streptavidin-Säule geladen.
Durch die starke Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin verblieb das amplifizierte
DNA-Fragment auf der Säule.
T. neutrophilus wurde bei 85 °C autotroph mit elementarem Schwefel oder zusätzlich
mit 5 mM Acetat gezüchtet. Der Elektronendonor Wasserstoff sowie die Kohlenstoffquelle
CO2 stammten aus der Begasung mit einem H2/CO2 – Gasgemisch. Die Züchtung erfolgte im
10 l Maßstab (Material und Methoden 2.1). Bei einer Zellzahl von ca. 1 × 109 Zellen pro ml
wurde geerntet und die Zellen mit einer French Pressure Cell aufgeschlossen.
Die Zellextrakte wurden auf die vorbereitete DNA-Streptavidin-Säule aufgetragen.
Unspezifische Bindungen wurden mit einem 0,1 M NaCl Waschschritt aufgehoben.
Anschließend wurde mit 0,3 M und 1 M NaCl eluiert. Es wurden 1-ml-Fraktionen
aufgefangen, für 24 h in 20 mM Tris/HCl (pH 7,5) dialysiert und anschließend durch SDSPolyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (Abb. 16). Spezifische DNA-bindende Proteine
sind in der 1 M NaCl-Fraktion zu sehen, während andere Proteine bei 0,3 M NaCl eluierten.
Die Proteinbanden a bis e wurden ausgeschnitten und ein peptide mass fingerprint (PMF)
durch nanoHPLC-MS/MS angefertigt (Core Facility Proteomics, ZBSA, Freiburg).
Anschließend wurden die Daten mit der NCBI (National Center for Biotechnology
Information) Proteindatenbank abgeglichen.
Bei a handelte es sich um eine Thermosom-Untereinheit (Tneu_1525), bei b um ein
Sekretionssystemprotein (Tneu_0027), bei c um ein 18 kDa Protein mit bislang unbekannter
Funktion (Tneu_0751), bei d um das kleine Hitzeschockprotein Hsp20 (Tneu_1437) und bei e
um das Chromatinprotein „ALBA“ (Tneu_1396). Tneu_1525 und Tneu_0027 enthalten beide
eine ATP-Bindestelle, worauf möglicherweise eine unspezifische DNA-Bindung zurückgeführt werden kann.
Ergebnisse
47
Abbildung 16: SDS-PAGE (12,5%) der Proteine nach der DNA-Affinitätssäule. Spuren 1
und 3: 0,3 M NaCl Waschschritt, Spuren 2 und 4: Elutionsfraktion mit 1 M NaCl-Lösung. Die
Proteine aus den Spuren 1 und 2 stammen aus autotroph gewachsenen Zellen, die Proteine aus
den Spuren 3 und 4 aus Zellen, die auf Acetat wuchsen.
Bei den Banden handelt es sich um folgende Proteine: a: Thermosom-Untereinheit
Tneu_1525, b: Sekretionssystemprotein Tneu_0027, c: Tneu_0751, d: HSP20 Tneu_1437, e:
Chromatinprotein Tneu_1396 („ALBA“).
Das „ALBA“-Protein ist in der 0,3 M NaCl-Elutionsfraktion stark erhöht angereichert.
Die Acetylierung des Proteins vermindert sein DNA-Bindungsvermögen (8, 44), worauf auch
das Akronym „ALBA“ (Acetylation Lowers Binding Affinity) hinweist. Um eine mögliche
posttranslationale Modifikation des Proteins zu untersuchen, wurde es mit Trypsin, Elastase
und Thermolysin proteolyisch verdaut und erneut massenspektrometrisch analysiert.
Acetylierungen sowie Formylierungen befanden sich an den Lysinresten 59 und 63. Es
wurden jedoch keine Unterschiede der posttranslationalen Modifikation des „ALBA“-Proteins
festgestellt, das aus Zellextrakten autotroph oder auf Acetat gewachsener Zellen stammte. Bei
Tneu_0751 handelte es sich um ein bislang uncharakterisiertes Protein. Es kommt nur in
Vertretern autotropher Thermoproteales vor und weist keinerlei konservierte Domänen auf.
2.2 Klonierung und heterologe Überproduktion von Tneu_0751 und Tneu_1396
(„ALBA“)
Die Ergebnisse der Affinitätssäulenchromatografie machten Tneu_0751 und das
„ALBA“-Protein Tneu_1396 zu potenziellen Regulatorproteinen des an der CO2-Fixierung
beteiligten Genclusters. Für genauere Untersuchungen sollten sie in größeren Mengen zur
Verfügung stehen und wurden deshalb heterolog in E. coli überproduziert. Hierzu wurde das
Ergebnisse
48
Gen für Tneu_0751 mittels PCR amplifiziert. Die Primer enthielten eine NdeI- bzw. eine
EcoRI-Restriktionsschnittstelle. Das geschnittene PCR-Produkt wurde in den Expressionsvektor pT7-7 ligiert (Abb. 17).
Abbildung 17: Klonierungsschema für Tneu_0751. Das Gen wurde direkt in den
Expressionsvektor pT7-7 ligiert. Als Restriktionsenzyme dienten NdeI und EcoRI. Die
Plasmide enthielten eine Ampicillinresistenz (bla).
Mit pT7-7::tneu_0751 transformierte E. coli Rosetta 2 (DE3)-Zellen wurden im 1 l
Maßstab bei 37 °C in LB-Medium angezogen. Bei OD578 von 1,8 wurde mit 0,1 mM IPTG
induziert und die Kultur für weitere 4 h wachsen gelassen. Nach dem Ernten wurden die
Zellen mit einer French Pressure Cell aufgeschlossen, bei 92 °C einer Hitzefällung unterzogen
und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde für 24 h in 20 mM Tris/HCl (pH 7,5)
und 1 mM EDTA dialysiert.
Für einen zusätzlichen Reinigungschritt wurde eine weitere Streptavidin-Säule mit
biotinylierter DNA beladen, bei deren Amplifikation durch PCR der intergene Bereich
zwischen scr-4hbl und 4hbd-frd als template diente. Die dialysierte Proteinprobe wurde
anschließend auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte mit 1 M NaCl. Die gesammelten
Fraktionen wurden erneut für 24 h in 20 mM Tris/HCl (pH 7,5) dialysiert. Auf dem SDS-Gel
ist die Anreicherung des rekombinanten Tneu_0751 mittels DNA-Affinitätschromatografie zu
sehen (Abb. 18). Im Durchbruch befanden sich vor allem hitzestabile E. coli-Proteine, diese
wurden weitestgehend mit niedrigen Salzkonzentrationen eluiert, sodass im 1 M NaCl
Elutionsschritt fast ausschließlich DNA-bindendes Tneu_0751-Protein vorlag. Tneu_0751 hat
eine berechnete Größe von 18 kDa.
Ergebnisse
49
Abbildung 18: SDS-PAGE (12,5%) des Proteins Tneu_0751. In Spur 2 ist hitzegefällter
Zellextrakt vor der Streptavidinsäule aufgetragen. In Spur 3 ist der Durchbruch der Säule zu
sehen, auf Spur 4 der 0,3 M NaCl Waschschritt, auf Spur 5 die 1 M NaCl Elutionsfraktion. Es
sind jeweils 5-10 µg Protein aufgetragen. Auf Spur 1 wurde der Proteingrößenstandard
aufgetragen.
Das Gen tneu_1396 wurde ebenfalls durch PCR amplifiziert. Die dafür abgeleiteten
Primer enthielten Schnittstellen für die Restriktionsenzyme NdeI und HindIII. Das
geschnittene PCR-Produkt wurde direkt in den Expressionsvektor pT7-7 ligiert (Abb. 19). Für
die Überexpression wurden transformierte E. coli Rosetta 2 (DE3) in 1 l LB-Medium
angezogen. Die Kultur wurde bei einer Temperatur von 37 °C bis zu einer OD578 von
0,5 angezogen, mit 0,1 mM IPTG induziert und für weitere 4 h bei gleicher Temperatur
wachsen gelassen. Nach dem Ernten erfolgte der Aufschluss in einer French Pressure Cell
sowie eine Hitzefällung für 15 min bei 88 °C.
Tneu_1396 hat eine berechnete Größe von knapp 10 kDa. Eine verkürzte Form des
„ALBA“-Proteins wurde mitproduziert. Dies ist auf ein weiteres Startcodon innerhalb des
Gens zurückzuführen (Abb. 20).
Ergebnisse
50
Abbildung 19: Klonierungsschema für Tneu_1396. Das Gen wurde direkt in den
Expressionsvektor pT7-7 ligiert. Als Restriktionsenzyme wurden NdeI und HindIII
verwendet. Die Plasmide enthielten eine Ampicillinresistenz (bla).
Dem „ALBA“-Protein werden Funktionen in der Chromatinstrukturierung und im
RNA-Metabolismus zugeschrieben (2). Dies wurde auch bei der Überproduktion des Proteins
in E. coli beobachtet; auf Polyacrylamidgelen, auf die ausschließlich das rekombinante
„ALBA“-Protein aufgetragen wurde, waren Nukleinsäuren des Expressionsorganismus
enthalten. Deshalb wurde das Genprodukt einer Behandlung mit DNase I und RNase A
unterzogen.
Abbildung 20: SDS-PAGE (12,5%) des „ALBA“-Proteins (Tneu_1396). In Spur 1 ist ein
Proteinstandard zu sehen; in Spur 2 wurden 5 µg des Proteins nach einer Hitzefällung bei
88 °C aufgetragen (Pfeil). Das verkürzte Protein ist auf ein zweites ATG-Startcodon innerhalb
des Gens zurückzuführen.
Ergebnisse
51
2.3 Gelshift assay mit den rekombinanten Proteinen Tneu_0751 und Tneu_1396
(„ALBA“)
Um das DNA-Bindungsvermögen, und damit verbunden, eine mögliche regulatorische
Funktion der Proteine Tneu_0751 und „ALBA“ zu untersuchen, wurde ein Electrophoretic
Mobility Shift Assay (EMSA) verwendet (19). Hierfür wurde wiederum das Promotorsequenz
enthaltende, 121 bp lange DNA-Fragment verwendet, das zwischen den scr-4hbl- und 4hbdfrd-Operons liegt. Als Kontroll-DNA diente ein intragenes DNA-Fragment aus dem scr-Gen
(Abb. 6). Die jeweiligen DNA-Proben wurden für 30 min bei 65 °C mit unterschiedlichen
Proteinkonzentrationen inkubiert. Anschließend wurden die 20 µl großen Ansätze auf ein
Polyacrylamidgel aufgetragen und bei 60 V elektrophoretisch getrennt. Die DNA wurde
danach angefärbt.
Tneu_0751. Tneu_0751 wurde in Mengen von 0 bis 10-fach molarem Überschuss im
Vergleich zur DNA eingesetzt. Die Ausbildung einer Doppelbande war bei dem Ansatz mit
Promotor-DNA bereits bei einer 3-fachen Proteinmenge zu sehen (Abb. 21 A). Diese
Doppelbandenbildung lässt sich auf eine mögliche zweifache Bindung des Proteins an die
zwei Promotorregionen zurückführen. Bei dem Gel, das die Kontroll-DNA enthielt, blieb die
Bildung
einer
Doppelbande
aus
(Abb.
21
B).
Ein
DNA-Shift
bei
höheren
Proteinkonzentrationen war hier dennoch zu sehen, was sich mit einer unspezifischen
Bindung des Proteins erklären lässt.
Abbildung 21: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) mit Tneu_0751. Es wurden
pro Tasche 200 ng DNA aufgetragen, die zuvor mit Protein inkubiert wurde. Der
Proteingehalt entsprach der 0 bis 10-fachen molaren Menge der DNA. A: Promotor-DNA, B:
Kontroll-DNA.
Ergebnisse
52
Durch die spezifische Bindung des 0751-Proteins an die DNA-Sequenz, die die archaeellen
Promotorelemente für die Operons scr-4hbl und 4hbd-frd enthält, wird hiermit postuliert, dass
dieses Protein ein möglicher Regulator ist.
Ein Effektormolekül, das die Protein-DNA-Bindung beeinflussen könnte, wurde
ebenfalls gesucht. Dafür wurden folgende Moleküle zusätzlich in den EMSA mit Tneu_0751
eingesetzt: je 1 mM CoA, Acetyl-CoA oder Crotonyl-CoA, je 3 mM Acetat, Succinat,
4-Hydroxybutyrat, Malat, Pyruvat oder Phosphoenolpyruvat, oder je 5 mM Adeninnukleotide
(AMP, ADP, AMP-PNP, NAD+, NADH, NADP+, NADPH). Allerdings beeinflusste keine
dieser Verbindungen die DNA-Protein-Interaktion.
Das „ALBA“-Protein. Das „ALBA“-Protein wurde in einem molaren Verhältnis
Protein:DNA von 0 bis 100-fach eingesetzt. Ein deutlicher Shift war bei 50 × molarem
Überschuss des Proteins zu sehen. Allerdings unterschieden sich die Ansätze mit PromotorDNA (Abb. 22 A) und Kontroll-DNA (Abb. 22 B) nicht voneinander, was auf eine
unspezifische Protein-DNA-Interaktion schließen lässt.
Abbildung 22: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) mit “ALBA“-Protein. Es
wurden pro Tasche 100 ng DNA aufgetragen, die zuvor mit Protein inkubiert wurde. Der
Proteingehalt entsprach der 0 bis 100-fachen molaren Menge der DNA. A: Promotor-DNA,
B: Kontroll-DNA.
Diskussion
53
Diskussion
1 Fehlende Enzyme und Gene der autotrophen CO2-Fixierung in
T. neutrophilus
1.1 Vermutete Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Das Gen tneu_0419 liegt in einem Cluster mit Genen zusammen, die für die PEPCarboxylase,
Succinyl-CoA-Reduktase,
4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase
und
die
Fumarat-Reduktase codieren (Abb. 5). Diese Enzyme sind am Dicarboxylat/HydroxybutyratZyklus in T. neutrophilus beteiligt und ihre Biosynthese wird stark reguliert. Das Gen
tneu_0419 codiert für eine Alkohol-Dehydrogenase, in der eine NAD(P)-Bindestelle enthalten
ist. Die katalytische Funktion ließ sich auf Basis der Aminosäuresequenz nicht eindeutig
definieren. Allerdings zeigt Tneu_0419 53 % Identität bzw. 75 % Ähnlichkeit zu einer bereits
charakterisierten Succinat-Semialdehyd-Reduktase aus M. sedula (Msed_1424) (27). Das
Enzym scheint sehr konserviert in weiteren Vertretern der Ordnungen Sulfolobales und
Thermoproteales aufzutreten (Abb. 23).
Das Protein Tneu_0419 wurde in dieser Arbeit heterolog überproduziert und seine
Funktion als Succinat-Semialdehyd-Reduktase bestätigt. Die spezifische Aktivität betrug
580 µmol min-1 mg-1 Protein. Auch die rekombinante Succinat-Semialdehyd-Reduktase aus
M. sedula hatte eine hohe spezifische Aktivität von 700 µmol min-1 mg-1 Protein (27).
Hinsichtlich des Km-Wertes für Succinat-Semialdehyd ähneln sich die beiden Enzyme
ebenfalls (bei T. neutrophilus 30 µM, bei M. sedula 52 µM). Der Km-Wert der rekombinanten
Succinat-Semialdehyd-Reduktase
aus
T. neutrophilus
betrug
für
NADPH
190 µM.
Tneu_0419 enthält vermutlich auch Zink-Ionen, wie es für Msed_1424 nachgewiesen wurde
(27).
Der phylogenetische Stammbaum der Succinat-Semialdehyd-Reduktase ist in
Abbildung 23 dargestellt. Nur die NADPH-Abhängigkeit des Enzyms ist bei allen
autotrophen Crenarchaeota einheitlich. Während Thermoproteales und Sulfolobales über eine
ähnliche
Succinat-Semialdehyd-Reduktase
und
eine
weitere
vermutliche
Alkohol-
Dehydrogenase verfügen, findet man kein ähnliches Gen im Genom von I. hospitalis
(Desulfurococcales) (bester Treffer: e-value 3e-15). Anders sieht es bei dem mesophilen
Crenarchaeon Cenarchaeum symbiosum und dem nichtkultivierten marinen Crenarchaeon
HF400 aus, bei denen ein Kandidat gefunden wurde (Abb. 23). Die entsprechende SuccinatSemialdehyd-Reduktase in C. symbiosum könnte an dem postulierten Hydroxypropionat/
Hydroxybutyrat-Zyklus beteiligt sein (10).
Diskussion
54
Abbildung 23: Phylogenetischer Stammbaum für die Succinat-Semialdehyd-Reduktase
aus T. neutrophilus (Tneu_0419). Pro Analyse wurden 1000 Bootstrap-Wiederholungen
durchgeführt. Die Bootstrap-Werte sind an den entsprechenden Verzweigungen angegeben.
Tneu_0419 und Msed_1424 sind durch einen Kasten hervorgehoben. Der Stammbaum
beschreibt Identitäten bis 32 % und Ähnlichkeiten bis 53 %.
1.2 Vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Ebenso wie das Gen für die Succinat-Semialdehyd-Reduktase, so liegt auch das Gen
für die vermutete 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase von T. neutrophilus (Tneu_0420) in
demselben Gencluster für Enzyme des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus (Abb. 5). Dieses
Gen bildet zusammen mit dem Gen für die Succinyl-CoA-Reduktase (Tneu_0421) ein
Operon. Auf 2-D-Gelen wurde das Protein Tneu_0420 als autotroph induziert nachgewiesen
(36). Allerdings befinden sich im Genom von T. neutrophilus zwei weitere Gene für AMPbildende Synthetasen und CoA-Ligasen (Tneu_0385 und Tneu_1843). Somit musste ein
experimenteller Nachweis erbracht werden, um dem Gen seine physiologische Funktion
zuzuordnen.
Diskussion
55
Die Acetat-CoA-Ligase aus Pyrobaculum aerophilum (PAE2867) wurde bereits
charakterisiert (16) und ist zu 83 % identisch zu Tneu_1843 ist. Die Identität zu Tneu_0420
lag bei 49 % und die zu Tneu_0385 sogar nur bei 36 %. Dies spricht für Tneu_1843 als
Acetat-CoA-Ligase und wiederum für Tneu_0420 als 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase.
Das rekombinante Tneu_0420-Protein zeigte die 4-Hydroxybutyrat-CoA-LigaseFunktion mit spezifischer Produktbildung (Abb. 13). Der Km-Wert für 4-Hydroxybutyrat
betrug 0,7 mM und die spezifische Aktivität 0,8 µmol min-1 mg-1 Protein (Abb. 14).
Der relativ hohe Km-Wert des Enzyms könnte am Substrat 4-Hydroxybutyrat gelegen
haben, das sich teilweise spontan selbst zu 4-Hydroxybutyrolacton umlagert und dann nicht
mehr als Substrat für die Reaktion zur Verfügung steht.
Eine Erklärung für die relativ geringe spezifische Aktivität könnte in der
posttranslationalen Modifikation liegen. In Salmonella enterica wird die Acetat-CoA-Ligase
durch ein Acetylierungs-/Deacetylierungssystem reguliert. Dies geschieht an einem
spezifischen Lysinrest (K-609) (40). Durch nanoHPLC-MS/MS wurde die rekombinante
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase aus T. neutrophilus massenspektrometrisch analysiert und eine
Acetylierung an einem konservierten Lysinrest (K-594) festgestellt. Um zu untersuchen, ob
diese posttranslationale Modifikation eine Auswirkung auf die Enzymaktivität hat, käme eine
Behandlung des Enzyms mit Deacetylase in Frage.
Mit
der
Acetat-CoA-Ligase
(MT-ACS1)
des
methanogenen
Archaeon
Methanothermobacter thermautotrophicus wurden Mutationsexperimente durchgeführt (26).
Dabei wurde ein konservierter Tryptophanrest (W-416) gegen ein Glycin ausgetauscht. Dieser
Austausch hatte dramatische Auswirkungen auf die Substratspezifität zur Folge. Während der
Km-Wert für Acetat so hoch wurde, dass dieses Substrat katalytisch ineffizient war, erweiterte
sich das Substratspektrum enorm, sodass Verbindungen genutzt werden konnten, die dem
Wildtyp nicht zugänglich waren. Dabei handelte es sich um Butyrat und um Moleküle mit bis
zu acht Kohlenstoffatomen (Octanoat), oder auch um Verbindungen mit verzweigten Ketten,
wie Methylvalerat. Ein Alignment der Acetat-CoA-Ligase aus M. thermautotrophicus mit
Tneu_0420 zeigt an Position 416 unterschiedliche Aminosäuren (Abb. 26). Während sich dort
bei dem wildtypischen M. thermautotrophicus ein Tryptophan befindet, ist diese Position bei
Tneu_0420 mit einem Glycin besetzt (Abbildung im Anhang). Dies ist eine mögliche
Erklärung,
weshalb
die
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
aus
T. neutrophilus
mit
4-Hydroxybutyrat die höchste Aktivität (0,811 µmol min-1 mg-1 Protein = 100 %) zeigt.
Alternative Substrate sind Crotonat (22,0 %), Acetat (12,9 %), 3-Hydroxypropionat (9,1 %)
und 3-Hydroxybutyrat (7,6 %) (Tab. 27).
Diskussion
56
Ein weiterer Grund für das erweiterte Substratspektrum der 4-Hydroxybutyrat-CoALigase könnte auch in der Effizienz des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in einer
geothermalen Umwelt liegen. Durch thermische Instabilität könnten die Folgeprodukte
Crotonyl-CoA und (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA in CoA, Crotonat und 3-Hydroxybutyrat
zerfallen. Damit diese Verbindungen aber nicht unwiederbringlich aus dem Zyklus
ausgeschlossen bleiben, könnte die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase diese erneut aktivieren und
in den CO2-Fixierungsweg zurückführen.
Da die zweite Hälfte des Hydroxypropionat/Hydroxybutyrat-Zyklus und des
Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus analog verläuft (11), bietet es sich an, auf der Suche
nach Enzymen direkte Vergleiche zwischen den beiden Zyklen durchzuführen. Wird ein
Protein-BLAST von Tneu_0420 mit sämtlichen Proteinen von M. sedula durchgeführt, so
erhält man zwei gute Kandidaten für die mögliche 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase-Funktion,
Msed_1353 (46 % Identität) und Msed_1456 (45 % Identität). Msed_1456 wurde bereits aus
dem Zellextrakt von M. sedula gereinigt und als 3-Hydroxypropionat-CoA-Ligase
identifiziert (1). Somit ist Msed_1353 der letzte verbleibende gute Kandidat für die
4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase aus M. sedula, und nicht Msed_1422, wie ursprünglich
angenommen wurde (10). Im Genom von M. sedula gibt es noch zwei weitere AMP-bildende
CoA-Ligasen, deren Identität zu Tneu_0420 jedoch sehr gering ist (für Msed_1291 34 %
Identität und für Msed_0267 30 % Identität) (Abb. 24).
Diskussion
57
Abbildung 24: Phylogenetischer Stammbaum für die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase aus
T. neutrophilus (Tneu_0420). Pro Analyse wurden 1000 Bootstrap-Wiederholungen
durchgeführt. Die Bootstrap-Werte sind an den entsprechenden Verzweigungen angegeben.
Enzyme, die im Text diskutiert werden, sind durch einen Kasten hervorgehoben. Der
Stammbaum beschreibt Identitäten bis 46 % und Ähnlichkeiten bis 63 %. Aus Gründen der
Vollständigkeit wurden noch Tneu_0385 (Identität: 33%), Msed_1456 (Identität: 45%),
Msed_1291 (giI146304058, Identität: 34 %) und Msed_0267 (giI146303052, Identität: 30 %)
in die Abbildung mitaufgenommen.
Diskussion
58
2 Regulation des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in T. neutrophilus
Tneu_0751. Abgesehen von dem grundlegenden archaeellen Transkriptionssystem ist
sehr wenig über die Vielfalt und Steuerung der Genexpression in Archaea bekannt. In dieser
Arbeit wurde die Beteiligung DNA-bindender Proteine an der Transkriptionskontrolle in
T. neutrophilus untersucht. Durch DNA-Affinitätschromatografie wurde ein Protein
identifiziert, das eine starke und spezifische Interaktion mit dem intergenen DNA-Bereich
zwischen den scr-4hbl- und 4hbd-frd-Operons eingeht (Abb. 6). Diesem Protein, Tneu_0751,
wurde bislang noch keine Funktion zugeordnet. Es weist keine bekannten konservierten
Domänen auf, hat ein Molekulargewicht von 18 kDa und besitzt 157 Aminosäuren, von denen
14 % durch Arginine repräsentiert werden. Somit hat es auch eine positive Gesamtladung (5,6
bei pH 7,0) und einen isoelektrischen Punkt von 9,36. Mittels einer BLAST-Suche konnten
ähnliche Proteine nur in Vertretern autotropher Thermoproteales gefunden werden, wie z.B.
in Pyrobaculum islandicum (84 %), P. aerophilum (80 %), P. arsenaticum (73 %), und
P. calidifontis (74 %). Diese Proteine sind bei Vertretern dieser Gruppe stark konserviert
(Abb. 25).
Tneu_0751
Pisl_1735
PAE1786
Pars_0738
Pcal_0557
Tneu_0751
Pisl_1735
PAE1786
Pars_0738
Pcal_0557
1
1
1
1
1
10
20
30
40
50
60
70
80
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
MHIEIRDPSLVERLRRLLPRPDAPFDDVIVKLLEQPCKLRLKEIVEEVMAAANWDARVARAVEEALGRVLGDVDRRIAHS 80
MHIEIRDPSLVERLRRLLPRPDAPFDDVIVKLLEQPCKLRLKEIVEEVIVATNWDARVARAVEETLSRILGDLDKKMAHS 80
MHIEIRDPSLVERLRRLLPRPDAPFDEVIIKLLEQPCKLRIREIVEEVMASLNLEERVGKIVEEALSRNVGDLERRVAHS 80
MHIEIRDPTLVERLRRLLPRPDAPFDDVIIKLLEQPCKLRIREIVEEVVASLSLEERVGKIVEEAISRGLAEVERRVAHT 80
MHIEIRDPSLVERLRRLLPRPDAPFDDVIVKLLEQPCKLRIREIVEEVFASANLEERVAKAVEQAVSRSVGDLERRVVHA 80
81
81
81
81
81
90
100
110
120
130
140
150
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..
VDRAVREALRHVQIGGAEVGGGWEAVVREALRRPDRCLTFAEIRKYYGKNLNSVMLRKRGFVQKERGVWCWPKETEQ
VERAVKEALRYVQIGAVEVGGGWDAVIREAMKRPDGCLTFAEIRKYYGKNLNSVMLRKKGFIQKERGVWCWPREVGQ
VEKAVKEALRHIQIASAEVGGGWEAVIREANKRPDGCLTFAEIRKYYGKNLNSVMLRKRGFVQKERGLWCLPKS--VERALKEGLRQLQISGEVGGGWEAVIREASRRPDKCLSFSEIRRYYGKNLNSVMLRKRGFVQKERGLWCLPESS--VERAVRDFLRSLPAGELAGGGWDAVIREAKRRPDGCLTFSEIRRLYGKNLNSVMLRKRGFVQRERGLWCLPKD----
157
157
154
154
153
Abbildung 25: Alignment von Tneu_0751. Das Gen für Tneu_0751 wurde nur in Vertretern
autotropher Thermoproteales gefunden. P. islandicum [Pisl], P. aerophilum [PAE],
P. arenaticum [Pars], P. calidifontis [Pcal].
Die Affinität des Tneu_0751-Proteins zu dem intergenen DNA-Bereich, der die
archaeellen Promotorelemente enthält, war sehr spezifisch. Eine Kontroll-DNA, die keine
Promotorelemente enthielt, zeigte bei Gelshift-Experimenten keine zweite Bande (Abb. 21).
Dass dieser Shift, der durch den Protein-Promotor-DNA-Komplex entstand, zwei Banden
hervorbrachte, lässt sich durch das Vorhandensein von zwei Promotorelementen erklären.
Diese liegen auf dem intergenen DNA-Bereich zwischen zwei divergent transkribierten
Operons (Abb. 5 und 6).
Diskussion
59
Tneu_0751 wird in T. neutrophilus möglicherweise konstitutiv exprimiert, was die
Vermutung nahe legt, dass es ein oder mehrere Effektormoleküle gibt, die die Bindung des
Proteins an die DNA beeinflussen. Deshalb wurden weitere Gelshift-Experimente
durchgeführt, bei denen ein mögliches Effektormolekül zu den Inkubationsansätzen von DNA
und Protein gegeben wurde. Bei den getesteten Molekülen handelte es sich um CoA, AcetylCoA, Crotonyl-CoA, Acetat, Succinat, 4-Hydroxybutyrat, Malat, Pyruvat, Phosphoenolpyruvat oder um Adeninnukleotide (AMP, ADP, AMP-PNP, NAD+, NADH, NADP+,
NADPH). Allerdings wurde bei keinem der getesteten Moleküle eine Veränderung der
Protein-DNA-Interaktion festgestellt.
Tneu_1396 („ALBA“). Durch DNA-Affinitätschromatografie wurde ein weiteres
Protein gefunden, dessen Affinität zu Nukleinsäuren bereits bekannt ist, das „ALBA“-Protein.
Dieses Protein ist in allen Crenarchaeota sehr dominant, in denen es 4-5 % der Gesamtmenge
löslicher Proteine darstellt. „ALBA“-homologe Proteine wurden bislang noch nicht in
Euryarchaeota gefunden (23, 44). „ALBA“ bindet, vor allem als Homodimer, doppelsträngige
DNA in einem kooperativen Mechanismus, ohne sie enger zu verpacken. Diese Bindung ist
nicht sequenzspezifisch. Möglicherweise stellt dieses Protein einen Schutz vor Degradation
durch DNase I dar (28, 44). Aufgrund seiner großen Ähnlichkeit zu RNase P wird dem
„ALBA“-Protein auch eine ursprüngliche Rolle im RNA-Metabolismus zugeteilt (2, 23). Eine
hochaffine Bindung zu RNA sowie zu DNA zeigte auch das rekombinante „ALBA“-Protein
aus T. neutrophilus, da es Nukleinsäuren aus dem Expressionsstamm E. coli Rosetta 2 (DE3)
enthielt. Diese unspezifisch gebundenen Nukleinsäuren wurden durch eine Behandlung mit
RNase A und DNase I entfernt.
An „ALBA“ aus Sulfolobus solfataricus wurde eine Modifikation an einem
bestimmten Lysinrest beschrieben (K-16), die sich direkt auf die DNA-Bindung auswirkt
(44). Das Regulatorprotein könnte abhängig von den Wachstumsbedingungen posttranslational modifiziert sein und dadurch seine Funktion ändern. Deshalb wurde das
„ALBA“-Protein aus T. neutrophilus nach der Reinigung aus dem Zellextrakt, mittels DNAAffinitätschromatografie, massenspektrometrisch auf posttranslationale Modifikationen hin
analysiert. An bestimmten Lysinresten wurden Acetylierungen und Formylierungen
festgestellt. Diese unterschieden sich jedoch nicht zwischen nativem „ALBA“-Protein aus
Zellen, die entweder autotroph oder auf Acetat gewachsen waren.
Diskussion
60
Tneu_0415 (CBS). Als ein weiterer guter Kandidat für die Regulation der CO2Fixierung galt das Protein Tneu_0415 mit CBS (Cystathionin-β-Synthase)-Domäne, da das
Gen zusammen mit regulierten Genen des Dicarboxylat/Hydroxybutyrat-Zyklus in einem
Cluster liegt (35) (Abb. 5). Für S. solfataricus sind DNA-bindende Regulatorproteine bekannt,
die an ein bestimmtes „downstream target“ und an ihren eigenen Promotor binden. Mit
diesem
effizienten
Mechanismus
der
Autoregulation
kann
schnell
auf
die
Transkriptionskontrolle in Organismen eingewirkt werden (9). Das Protein Tneu_0415 wurde
allerdings in keiner der durchgeführten DNA-Affinitätschromatografien mit Zellextrakten von
T. neutrophilus festgestellt. Das rekombinante Protein wurde in Gelshift-Experimenten
getestet, zeigte aber keinerlei Interaktion mit der Promotor-DNA (persönliche Mitteilung von
Hugo Ramos-Vera).
Anhang
61
Anhang
1 Alignment von Tneu_0420 mit MT-ACS1
Tneu_0420
MT-ACS1
10
20
30
40
50
60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
MS-----------------AEFVEVYRKSLEDPIG-------FWEKQAERLYWRERWEKT
MSKDTSVLLEEKRVFKPHYTVVEEAHIKNWEAELEKGKDHENYWAEKAERLEWFRKWDRV
Tneu_0420
MT-ACS1
70
80
90
100
110
120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
YDDSNPPFYRWFVGGKTNISYNALDRHVKGGRANKAALIWVSADGATRVLRYWDLYREVN
LDESNRPFYRWFVNGKINMTYNAVDRWLDTDKRNQVAILYVNERGDERKLTYYELYREVS
Tneu_0420
MT-ACS1
130
140
150
160
170
180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
RFAVLLKSLGVERGDRVAIYMPMIPEAMVAMLAVNRIGAVHTVVFSGFGPQALAERIKDA
RTANALKSLGIKKGDAVALYLPMCPELVVSMLACAKIGAVHSVIYSGLSVGALVERLNDA
Tneu_0420
MT-ACS1
190
200
210
220
230
240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EAKVVITADGMRRRGRVIPLKPTVDEALKIVGNDIFTVVYKHTGVEVPMK--QGRDLWWQ
RAKIIITADGTYRRGGVIKLKPIVDEAILQCPTIETTVVVKHTDIDIEMSDISGREMLFD
Tneu_0420
MT-ACS1
250
260
270
280
290
300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
EEIAKIPPNTYIEPEWVPGEAPLFILYTSGTTGKPKGILHLHGQYMVWIWYAFNHLTGAE
KLIEGE--GDRCDAEEMDAEDPLFILYTSGSTGKPKGVLHTTGGYMVGVASTLEMTF---
Tneu_0420
MT-ACS1
310
320
330
340
350
360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
RDFREDIVFFSTADIGWISGHHYGVHGPLLNGLTVLWYEDAPDYPHPGIWWEIADTYKVT
-DIHNGDLWWCTADIGWITGHSYVVYGPLLLGTTTLLYEGAPDYPDPGVWWSIVEKYGVT
Tneu_0420
MT-ACS1
370
380
390
400
410
420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
HMLFSPTAIRLLMKYGDEWPRRYKLDSIMALYPTGEVLNEEAYNWMRREVCRGRPDCQIA
KFYTAPTAIRHLMRFGDKHPKRYNLESLKILGTVGEPINPEAWMWYYRNIGREK--CPII
Tneu_0420
MT-ACS1
430
440
450
460
470
480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
DIWGQTETACFVTAPGSMNLGGFRYKYGSVGMPYPTLNLQILDDDGKPLPPGAKGHVVAK
DTWWQTETGMHLIAP----LPVTPLKPGSVTKPLPGIEADVVDENGDPVPLGKGGFLVIR
Tneu_0420
MT-ACS1
490
500
510
520
530
540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PPLPPAFLHTLWRDPERYVKSYWSRFPG-YYYTGDLGYIDQDGHLHIMGRSDDVIKVAGH
KPWP-AMFRTLFNDEQRYIDVYWKQIPGGVYTAGDMARKDEDGYFWIQGRSDDVLNIAGH
Tneu_0420
MT-ACS1
550
560
570
580
590
600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
RLSTREVEDILTSHPAVAEAAVVGVPDEVRGEVLGVFVVPKQGMKIT---EEEVVKHLRN
RIGTAEVESVFVAHPAVAEAAVIGKADPIKGEVIKAFLILKKGHKLNAALIEELKRHLRH
Tneu_0420
MT-ACS1
610
620
630
640
650
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
SLGPVAVIGKVAILDKLPKTRTGKVMRRVLRAMATGQPVGDLSTLEDEEALEELRKKLG
ELGPVAVVGEMVQVDSLPKTRSGKIMRRILRAREEGEDLGDTSTLEE------------
MT-ACS1 [Position 416]
Anhang
62
Abbildung 26: Alignment von Tneu_0420 mit MT-ACS1. Die 4-Hydroxybutyrat-CoALigase aus T. neutrophilus wurde mit der der Acetat-CoA-Ligase aus M. thermautotrophicus
verglichen. Der Aminosäureunterschied an Position 416 ist durch einen Kasten dargestellt.
2 Abkürzungsverzeichnis
% (v/v)
% (w/v)
°C
∆
∆G0’
ε
µ
2-D
4hbd
4hbl
A
Abb.
ADP
ALBA
amp
ampr
AMP
AMP-PNP
APS
Aqua dest.
ATP
bla
BLAST
bp
BRE
BSA
bzw.
C
c
ca.
cbs
CIAP
CoA
C. symbiosum
Da
DNA
dNTP
DTT
E. coli
EMSA
et al.
EDTA
Volumenprozent
Gewichtsprozent
Grad Celsius
Differenz
freie Standardenthalpie bei pH 7
Extinktionskoeffizient
Mikrozweidimensional
Gen für die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase
Gen für die 4-Hydroxybutyrat-CoA-Ligase
Adenin
Abbildung
Adenosindiphosphat
acetylation lowers binding affinity
Ampicillin
Ampicillin-Resistenz
Adenosinmonophosphat
Adenosin-5’(-imido)triphosphat
Ammoniumpersulfat
destilliertes Wasser
Adenosintriphosphat
β-Lactamase
basic local alignment search tool
Basenpaare
transcription factor B recognition element
Rinderserumalbumin
beziehungsweise
Cytosin
Centicirca
Gen für Protein mit Cystathionin-β-Synthase-Domäne
calf intestine alkaline phosphatase
Coenzym A
Cenarchaeum symbiosum
Dalton
Desoxyribonucleinsäure
Desoxynukleosid-5‘-triphosphat
Dithiothreitol
Escherichia coli
electrophoretic mobility shift assay
et alii (lat.) = und andere
Ethylendiamintetraacetat
Anhang
frdA
frdB
FPLC
g
g
G
gi
h
His
HPLC
I. hospitalis
IPTG
K
k
kb
kJ
Km
l
LB
m
M
mg
min
ml
mol
MPa
ms
M. sedula
M. thermautotrophicus
MOPS
MS
MWCO
n
NAD+/NADH
NADP+/NADPH
NCBI
ng
nm
OD
p
P.
Pa
PCR
PEP
pepc
Pfu
pH
pI
PMF
psi
RP-HPLC
63
Gen für die Fumaratreduktase (Untereinheit A)
Gen für die Fumaratreduktase (Untereinheit B)
fast protein liquid chromatography
Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
Gramm
Guanin
Genidentifikations-Nummer
Stunde
Histidin
high performance liquid chromatography
Ignicoccus hospitalis
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
Lysin
KiloKilobasenpaare
kiloJoule
Michaelis-Menten-Konstante
Liter
lysogeny broth
milliMol pro Liter („Molar“)
Milligramm
Minute(n)
Milliliter
Mol
Megapascal
Millisekunde
Metallosphaera sedula
Methanothermobacter thermautotrophicus
Morpholinopropansulfonsäure
Massenspektrometrie
molecular weight cut off
NanoNicotinamid-Adenin-Dinucleotid
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
National Center for Biotechnology Information
Nanogramm
Nanometer
Optische Dichte
pico
Pyrobaculum
Pascal
Polymerase-Kettenreaktion
Phosphoenolpyruvat
Gen für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
Pyrococcus furiosus
pondus Hydrogenii (lat.)
isoelektrischer Punkt
peptide mass fingerprint
pounds per square inch
reverse phase HPLC
Anhang
rpm
S.
scr
SDS
SDS-PAGE
SOB
SOC
ssr
T
Tab.
TAE
Taq
TBP
TCA
TEMED
TFB
T. neutrophilus
Tris
tRNA
U
UK
USA
UV
V
Vmax
W
ZBSA
64
Umdrehungen pro Minute
Sulfolobus
Gen für die Succinyl-CoA-Reduktase
Natriumdodecylsulfat
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
super optimal broth
super optimal catabolite repression
Gen für die Succinat-Semialdehyd-Reduktase
Thymin
Tabelle
Tris/Acetat/EDTA
Thermus aquaticus
transcription factor B binding protein
Trichloressigsäure
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
transcription factor B
Thermoproteus neutrophilus
Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
transfer-Ribonukleinsäuren
unit
United Kingdom
United States of America
Ultraviolett
Volt
maximale spezifische Aktivität
Tryptophan
Zentrum für Biosystemanalyse
Literatur
65
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Danksagung
69
Danksagung
Wenn ich gefragt werde, was ich mache und dann von meiner Diplomarbeit erzähle, höre ich
immer wieder „Laborarbeit, das ist nichts für mich; ich will lieber etwas machen bei dem ich
mit Menschen zu tun habe.“ In diesen Fällen muss ich sagen, dass in diesem Labor ein
Teamgeist existiert, der seinesgleichen sucht; es ist nicht nur eine coexistierende Kollegschaft,
sondern vielmehr ein synergetisches Miteinander, bei dem sehr viel auf Erfahrungsaustausch
und Hilfsbereitschaft basiert. Dieses scheinbare Selbstverständnis an Solidarität sowie die
nette und kameradschaftliche Atmosphäre im Labor machten meine Diplomarbeit nicht nur zu
einer Zeit, in der ich methodisch, inhaltlich und fachlich dazugelernt habe. Vielen Dank dafür.
Vielen Dank Herrn Professor Georg Fuchs für die Möglichkeit, meine Diplomarbeit in seiner
Arbeitsgruppe zu diesem spannenden Thema anzufertigen.
Vielen Dank Hugo für die hervorragende Betreuung und großartige Hilfe, besonders beim
Beginn der praktischen Untersuchungen sowie beim rigorosen Korrigieren des Manuskripts;
trotz seiner eigenen Arbeit konnte ich mich bei sämtlichen Fragen jederzeit vertrauensvoll an
ihn wenden.
Vielen Dank Michaela für ihre engagierte Unterstützung in vielen, für mich neuartigen
methodischen, inhaltlichen und organisatorischen Fragen; dadurch, dass ich ihr chronologisch
im Studienablauf knapp auf den Fersen war, konnte ich auch schon in diversen
Prüfungsvorbereitungen profitieren.
Vielen Dank Rafael für die Einführung ins molekularbiologische Arbeiten während meiner
Hiwizeit bei ihm, für großartige Hilfe mit Datenverarbeitungsprogrammen, insbesondere beim
Erstellen der Stammbäume sowie für den blauen Kasten.
Vielen Dank „dem großen“ Jan für seine Hilfsbereitschaft, seine fachlichen Ratschläge, fürs
Korrekturlesen dieser Arbeit sowie dafür, dass er mich auf die Skihänge mitgenommen hat.
Vielen Dank Ivan für die Hilfe bei den HPLC-Experimenten sowie für die großzügige
Einführung sämtlicher Mitarbeiter in russische Kulturgüter.
Vielen Dank der ganzen Arbeitsgruppe für Hilfe jeder Art, für die Laborlogistik, für
aufmunternde Worte, für Versorgung mit Nahrungsmitteln und Kaffee, für Kletter- und
Winterwochenenden, für Hilfe beim Formatieren dieser Arbeit, für lange Laborabende, die
dem Begriff Sozialraum eine ganz neue deskriptive Bedeutung gaben; vielen Dank Carla,
Christa, Eva, Hana, Julia, Katharina, Liv, Maria, Martina, Özlem, Daniel, Eric, Ilie, Jan, Juri,
Michal, Piotr, Robin, Sebastian, Tobi, Viktor und den „Geschers“.
Vielen Dank Ulrike Lanner, Stephanie Lamer und Andreas Schlosser vom ZBSA für die
massenspektrometrischen Untersuchungen.
Vielen Dank Christine Kaimer und Tobias Knust von der AG Graumann für Hilfestellung bei
den EMSAs.
Danksagung
70
Vielen Dank Yvonne fürs Korrekturlesen dieser Arbeit.
Vielen Dank allen Kommilitoninnen und Kommilitonen, die mich während meines Studiums
in Freiburg begleitet haben, für zuverlässige Praktikumspartnerschaften, für den Austausch
von Lehr- und Lernmaterial in Wort und Schrift, für Hüttenaufenthalte, für Kuchen, für
Notunterkünfte, fürs Eintragen in sämtliche versteckte Listen und für vieles mehr.
Vielen Dank allen, die ich möglicherweise aus Flüchtigkeit, nicht aus Bösartigkeit vergessen
habe zu erwähnen.
Und ganz besonders viel Dank schulde ich meiner Familie, auf die ich mich jederzeit
verlassen konnte, die mich in jeglicher Art und in all meinen Entscheidungen unterstützt hat.