Bildung von Cyclonucleotiden bei Bestrahlung wäßriger Lösungen

Bildung von Cyclonucleotiden bei Bestrahlung wäßriger
Lösungen von Purinnucleotiden *
K la u s K eck * *
Radiologisches Institut der Universität Freiburg i. Br.
(Z . Naturforschg. 23 b, 1034— 1043 [1968] ; eingegangen am 7. Dezember 1967)
A 8,5'-cyclonucleotide was shown to be a product in the y-radiolysis of oxygen-free aqueous
solutions of adenosine-5'-monophosphate. Evidence for this was obtained by NMR-spectroscopy and
chemical degradation to 8 -formyladenine, 8 -hydroxymethyladenine and 8 -carboxyadenine. The
chromatographic and spectral data of these compounds are given. Irradiation of other purinnucleotides leads to similar cyclonucleotides.
Die Zersetzung wäßriger Lösungen von Purin­
nucleotiden durch Röntgenstrahlen wurde erstmals
von S c h o l e s und W e i s s 1 untersucht. Sie konnten
zeigen, daß die Radiolyse nach zwei Mechanismen
verlaufen kann, die jeweils zur Spaltung der glykosidischen Bindung führen. Greifen die durch die
Wasserradiolyse gebildeten Radikale an der Base
an, so wird diese verändert und durch Hydrolyse
Ribose-5-phosphat freigesetzt. Findet der primäre
A ngriff der Radikale am Zucker statt, so wird dieser
zerstört und es kann unverändertes Adenin freige­
setzt werden. H e m s 2’ 3 konnte zeigen, daß bei Be­
strahlung von Purinnucleosiden in Abwesenheit von
Sauerstoff die Riboside des 4-Amino-5-formamidopyrimidins entstehen.
Hier soll über eine Reaktion berichtet werden, die
beide Teile des Nucleotids zugleich verändert und
unter Ausbildung einer neuen Bindung zwischen
Zucker und Base zu einem Cyclonucleotid führt.
1. Ergebnisse
1.1. F ra k tio n ieru n g der B estrah lun gsp rod uk te
Werden 5 '1 0 _ 3 M wäßrige Lösungen von Adenosin-S'-monophosphat (A M P ) mit 2 ’ 106rad Rönt­
gen- oder 7-Strahlen in Abwesenheit von Sauerstoff
bestrahlt, so läßt sich das Reaktionsgemisch am A n ­
ionenaustauscher in fünf Hauptfraktionen zerlegen
(Abb. 1 a ). Fraktion C ist unzersetztes A M P. Frak­
tion A wird vom Austauscher nicht absorbiert, ent­
hält also keine sauren Verbindungen. Die Frak* Diese Arbeit ist ein Teil der Dissertation von K . K e c k ,
Freiburg i. Br. 1966.
* * Neue Anschrift: Kernforschungszentrum Karlsruhe, Institut
für Strahlenchemie.
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Abb. 1. a)
Trennung eines AMP-Bestrahlungsansatzes,
b) Rechromatographie von D nach Hydrolyse in 1 N HCl,
40min, 100°. Trennsystem: D o w e x -lX 8 in Formiatform,
Elution mit einem Ameisensäure-Gradienten 0 bis 2 N
H C O O H mit einem Plateau bei 0,1 N HCOOH.
tion enthält in der Hauptsache freies A denin1.
Fraktion B enthält das S'-Phosphat des von
H e m s 2’ 3 beschriebenen 4.6-Diamino-5-formamidopyrimidinribosids. Fraktion D läßt sich vom A M P
nur trennen, wenn der zur Elution verwendete
Ameisensäuregradient an dieser Stelle ein Plateau
aufweist. Die Fraktion konnte durch Rechromatogra­
phie gereinigt und durch Umkristallisieren in Form
weißer Nadeln gewonnen werden. Bei der Dünnschichtchromatographie in verschiedenen Laufmitteln
erwies sich die Substanz als einheitlich.
1
2
3
G. S c h o l e s u. J. W e i s s , Exp. Cell Res. Suplt.
[1952].
G. H e m s , Nature [London] 185, 525 [I9 6 0].
G. H e m s , Radiat. Res. 13, 7 7 7 [I960].
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2, 219
1.2. Eigenschaften der S u bsta n z D
Die Substanz zeigt ein UV-Spektrum, das dem des
A M P sehr ähnlich ist (Abb. 2 ). Der einzige Unter­
schied besteht in einer geringfügigen Verschiebung
des Maximums um etwa 5 mju in den langwelligen
Abb. 2. UV-Spektrum von D , -------— bei pH 1,
pH 6 bis 13.
bei
Bereich des Spektrums. Alkalische Phosphatase spal­
tet aus der Verbindung ein Mol Phosphat ab. Die
Phosphatgruppe muß also, wie in der Ausgangs­
verbindung, als Monoesterphosphat vorliegen. Bei
der Untersuchung der Zuckerkomponente wird eine
positive Orcinreaktion beobachtet. Das Absorptions­
maximum des gebildeten Farbstoffs (635 mju)
weicht etwas von dem des mit Ribose gebildeten
Farbstoffs (668 m,M) ab. Die Farbintensität, bezo­
gen auf den Phosphatgehalt, beträgt nur etwa die
Hälfte des mit A M P gemessenen Wertes. Bei der
Reaktion mit Perjodat wird, wie beim A M P ein Mol
des Reagenzes verbraucht. Die ciVGlykolstruktur
der Ribose muß also noch erhalten sein. Die Verbin­
dung gibt einen positiven W o o d h o u s sehen Adenintest4. Dies kann als Hinweis für die Unversehrt­
heit des Imidazolringes gewertet werden.
A M P läßt sich durch Reaktion mit Monophthalopersäure in das N ^O xid umwandeln 5. Dieselbe Re­
aktion läßt sich mit D durchführen. Abb. 3 zeigt die
UV-Spektren der am Ionenaustauscher gereinigten
4
D. L.
W
oodhouse,
Arch. Biochemistry 25, 347 [1950].
N-Oxide von D und A M P. Die auffallende Überein­
stimmung der Spektren im alkalischen und sauren
pH-Bereich, wiederum mit einer Verschiebung der
Maxima bei D um etwa 5 mju in den langwelligen
Bereich des Spektrums, läßt den Schluß zu, daß auch
am Pyrimidinteil der Base keine größere Verände­
rung aufgetreten sein kann. Dafür spricht auch die
Ähnlichkeit des UV-Spektrums der mit salpetriger
Säure desaminierten Verbindung D mit dem des
IM P , dem Desaminierungsprodukt des A M P.
Abb. 3. UV-Spektrum der N-Oxide von D bei pH 13 (A )
und pH 1 (B) und von A M P bei pH 13 (A ') und pH 1 ( B ') .
Bei Purinnucleotiden läßt sich die Base leicht
durch 5-minütiges Erhitzen in 0,1 N HCl auf 100 °
abspalten. Die Verbindung D zeigt unter diesen Be­
dingungen keine Veränderung. W ird die Hydrolyse
mit 1 N HCl bei 100° in 30 Min. durchgeführt, so
kann bei der anschließenden Trennung am Ionen­
austauscher eine neue, stärker basische Substanz D r,
die ebenfalls Phosphat enthält, isoliert werden
(Abb. 1 b ) . Das UV-Spektrum von D ’ (Abb. 4)
zeigt im Gegensatz zu dem von D eine Verschiebung
des Maximums im alkalischen pH-Bereich mit einem
spektroskopisch bestimmten p£-W ert von 10,8. Eine
ähnliche Veränderung des Spektrums wird bei der
Hydrolyse von A M P zu Adenin und Ribose-5-Phosphat beobachtet. Der pA^-Wert von 9,8 entspricht
hier der Dissoziation des Protons am N 9 des Imi5
H. K l e n o w u . S. F r e d e r i k s e n , Biochim. biophysica Acta
[Amsterdam] 52, 384 [1961].
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Abb. 4. UV.Spek.rum von D be, pH 13 (A ) und pH 1 (B ).
Abb. 6 . a) Chromatographie des hydrolysierten Dialkohols 2
( I N HCl, 100°, 60 min) an D o w e x -lX 8 mit einem linearen
^ meisens^ure.G ; adientei; 0 bis 0 j 5 N H COOH. (1) Vorfraktion, (2) Hydrolysenprodukt, (3) nicht hydrolysierter Dialkohol. b) Chromatographie der Reaktionsprodukte nach
Perjodatoxydation der Fraktion 2 aus (a), Fraktionen s. Text.
Abb. 5. Kernresonanzspektrum (a) von
A M P , (b) von D in D 2 0. In Abb. 5 a
muß es an Stelle von H (3) H ( 8 ) heißen.
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dazolringes6. Offenbar wird auch bei der H ydro­
lyse von D zu D 7 die ./V-glykosidische Bindung ge­
spalten. Dafür spricht auch das Auftreten einer Carbonylgruppe nach der Hydrolyse.
Wenn die Spaltung der glykosidischen Bindung
nicht zur Freisetzung der Base führt, muß man an­
nehmen, daß durch die Bestrahlung eine neue Bin­
dung zwischen Base und Ribose gebildet worden
ist. D muß also ein Cyclonucleotid sein.
Uber die Position der neuen Bindung am Adenin
gibt das NMR-Spektrum * Aufschluß (s. auch 1. c. 7).
Das Spektrum des A M P (Abb. 5 a) zeigt die Signale
der beiden Protonen an C2 und C8 weit außerhalb
des Bereichs, in dem sich die Signale der anderen
Protonen mit denen des Wassers überlagern8. Im
Spektrum von D (Abb. 5 b) fehlt das Signal für das
Proton an C8 . Man kann annehmen, daß die neue
Bindung C8 des Adenins mit einem Kohlenstoff­
atom des Zuckers verbindet. Diese Annahme wird
auch durch die weitgehende Übereinstimmung der
UV-Spektren von Dr und synthetischem 8 -Hydroxymethyladenin bei verschiedenen pH-Werten unter­
stützt. Auch die Elementaranalyse steht mit einer
solchen Struktur im Einklang:
C10H 12N 5O7P -3 HäO
Ber. C 30,05
Gef. C 30,25
H 4,55
H 4,81
/
c
B
D
aJ
A
a
x
Abb. 7. Trennung der Bestrahlungsansätze (a) von IM P
(Ameisensäure-Gradient lin. von 0 bis 2 N H C O O H ),
(b) von G M P (Gradient wie angegeben) an Dowex-1 X 8 .
N 17,63,
N 17,68.
1.3. S tru k turbew eis durch A b b a u d er V erbind un g
Für die Position der neuen Bindung an der R i­
bose kämen prinzipiell außer C/ alle Kohlenstoff­
atome in Betracht. C 2' kann aber ausgeschlossen
werden, weil D’ ein Osazon bildet. An C/ wäre die
Bindung nur unter Konfigurationsumkehr vorstell­
bar. Die Struktur von D als ein S.S’-Cyclonucleotid
wurde durch die folgenden Abbauversuche bewiesen.
Perjodatoxydation von D führt zu der DicarbonylVerbindung 1, die durch anschließende Behandlung
mit Natriumborhydrid zu dem stabileren Dialkohol 2 reduziert wird. Zur Markierung des Kohlen­
stoffatoms S ' wurde die Reduktion mit NaB 3H 4
durchgeführt. Der Dialkohol erwies sich bei der
Chromatographie an Dowex -1 als einheitlich. Durch
sauere Hydrolyse kann aus 2 ein Mol Glykolaldehyd
abgespalten und mit dem D is c h e -B o h r e n fr e u n d Test 9 nachgewiesen werden.
c H. F. W. T a y l o r , J. diem. Soc. [London] 1948, 765.
* Für die Aufnahme und Interpretation der NMR-Spektren
danke ich Herrn Dr. F r i e b o l i n vom Institut für Elektrowerkstoffe der Fraunhofergesellschaft Freiburg i. Br.
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K e c k , U. H a g e n u. H . F r i e b o l i n , Naturwissenschaften
53, 3 0 4 [1966].
8 Ch. D. J a r d e t z k y u . O. J a r d e t z k y , J . chem. Soc., 82, 2 2 2
[I9 6 0 ].
7 K.
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ten Säure, oder besser deren Ester oder Anhydrid
darstellen.
8 -Hydroxymethyladenin, das in der Literatur bis­
her noch nicht beschrieben wurde, konnte durch Re­
aktion von 4.5.6-Triaminopyrimidin mit Äthylglykolat dargestellt werden. Eine Methode, die von
A l b e r t 17 zur Synthese von 8 -Hydroxymethylpurin
benutzt wurde. 8 -Hydroxymethylhypoxanthin ist be­
reits auf andere Weise dargestellt w orden18, hier
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+
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k NJ k NJ - CH2-0H
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wurde die Verbindung jedoch besonders einfach
durch Desaminierung von 8 -Hydroxymethyladenin
gewonnen.
8 -Carboxyadenin wurde aus 8 -Hydroxymethyl­
adenin durch Oxydation mit einem Überschuß an
Natriumbichromat in Eisessig dargestellt. Die Säure
wurde offenbar bisher noch nicht beschrieben.
A l b e r t 19 berichtete, daß 8 -Carboxypurin bei kur­
zem Aufkochen der wäßrigen Lösung decarboxyliert
wird. 8 -Carboxyadenin ist unter diesen Bedingungen
stabil. Audi nach einstündigem Erhitzen der wäßri­
gen Lösung auf 100° konnte dünnschichtchromato­
graphisch kein Adenin nachgewiesen werden.
2. Diskussion
Obwohl ein exakter Strukturbeweis nur mit D amp
durchgeführt wurde, muß man aus den Versuchs­
ergebnissen folgern, daß auch die S.S’ -Cyclonucleotide des IM P, GMP und entsprechend des dAM P
und dGMP bei Bestrahlung der wäßrigen Nucleotidlösungen gebildet werden.
Während Cyclonucleotide bisher noch wenig be­
schrieben wurden, sind Cyclonucleoside von vielen
Pyrimidinen und Purinen bekannt. Die meisten ent­
halten eine Sauerstoffbrücke zwischen Zucker und
Base oder bilden den Ring durch Quaternierung
eines Stickstoffs wie z.B. das Ng^-Cycloadenosin.
H o g e n k a m p 20 hat über ein 8.5,-Cyclonucleosid
des S^Desoxyadenosins berichtet, das eine ähnliche
Struktur besitzt wie das Damp • Es entsteht bei der
Einwirkung von sichtbarem Licht auf Vitamin-B12-
Coenzym, das die 5 -Desoxyribose in einer Bindung
am Kobalt enthält. H o g e n k a m p ist es aber nicht ge­
lungen, die Struktur eindeutig zu klären. Weder
konnte er einen direkten Beweis für die Bindung am
C8 erbringen, z. B. durch NMR-Spektroskopie, noch
gelang ihm ein Abbau der Substanz zu einer be­
kannten oder synthetisierten Verbindung.
Besonders auffallend ist die erschwerte Hydrolyse
der glykosidisdien Bindung im Cyclonucleotid. Nach
D e k k e r 21 wird die saure Hydrolyse der glykosidischen Bindung durch eine Protonierung des Ring­
sauerstoffs eingeleitet. Diese Protonierung wird er­
leichtert, wenn sich in der Nachbarschaft dieses
Ringsauerstoffs eine basische Gruppe befindet, die
unter sauren Bedingungen ein Proton auf den Ringsauerstoff übertragen kann. So sind die Guanosinbzw. Adeninnucleotide besonders leicht hydrolysier­
bar, weil die Aminogruppe in 2-Stellung bzw. N 3
des Pyrimidinringes leicht ein Proton an den Ring­
sauerstoff des Zuckers abgeben kann. Beim Cyclo­
nucleotid ist dieser Sauerstoff an der anderen Seite
des Moleküls fixiert, und eine Protonübertragung
kann nicht stattfinden. Dieser Effekt ist auch dann
noch wirksam, wenn die Kohlenstoffkette des Zukkers gespalten ist, wie die erschwerte Hydrolyse
des durch Perjodatoxydation und NaBH4-Reduktion
gewonnenen Dialkohols 2 gegenüber der entspre­
chenden aus A M P gewonnenen Verbindung zeigt
(Einzelheiten s. 1. c. 22) .
Die Cyclisierungs-Reaktion entspricht formal
einer Dehydrogenierung. Der Mechanismus, der zur
Bildung des Cyclonucleotids führt, wird sicher durch
den Angriff eines OH-Radikals (oder eines H-Radi
kals 23) an einem Wasserstoff des C 5' eingeleitet wer
den. Das dabei gebildete C-Radikal 10 wird in einer
nachfolgenden intramolekularen Reaktion eine „radi
kalische Substitution“ am C8 des Purins durchfüh
ren. Auf die besondere Reaktivität dieser Position
gegenüber einem radikalischen Angriff wurde be
reits von P u l l m a n und P u l l m a n 24 hingewiesen
Wahrscheinlich bildet sich zunächst das Radikal 11
dieses könnte nun auf folgenden Wegen zum Cyclo
nucleotid führen: 1. Reaktion mit einem zweiten
OH-Radikal und Wasserabspaltung. Diese Reaktion
ist unwahrscheinlich, weil die OH-Radikale von dem
17 A .
21
18
22 K . K eck , Dissertation, Freiburg 1966.
A l b e r t , J. chem. Soc. [London] 1955, 2690.
M. I s t i d a t e u. H . Y u k i, Pharmac. Bull. [Tokyo] 5, 240
[1958].
19 A . A l b e r t , in: Cibasymposion 1957, 97.
20 H . P. C. H o g e n k a m p , J. biol. Chemistry 238, 477 [1963].
23
24
C. A.
G.
B.
D
ekker,
S ch oles,
P
ullm an
Ann. Rev. Biochem. 29, 463 [I9 6 0].
Progr. Biophysics 13, 60 [1963].
u . A. P u l l m a n , Nature, 189, 725 [1961].
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großen Uberschuß an A M P abgefangen werden.
2 . Disproportionierung zweier Radikale 11 unter
Bildung von einem Mol des Cyclonucleotids und
einem Mol der im Imidazolring hydrierten Verbin­
dung. Eine solche Verbindung konnte nicht isoliert
werden. 3. Disproportionierung mit einem anderen
in der Lösung anwesenden Radikal.
Als Vergleich sei hier zunächst kurz auf die Ra­
diolyse des freien Adenins eingegangen. Hier ent­
stehen als Hauptprodukte 4.6-Diamino-5-Formamidopyrimidin (G = 0 ,4 * ) und 8 -Hydroxyadenin
(G = 0,3) in etwa gleicher Ausbeute25. Da die bei­
den Verbindungen sicher durch einen radikalischen
Angriff an C8 entstehen, ist es naheliegend, den fol­
genden Reaktionsmechanismus anzunehmen:
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f
NH2
I
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N^^N
H
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I
If------LH
V N A jH
H
NH2
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4.
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NH,
n^ O
H
H
V
ff-----
N
Beim A M P wird das Ribotid des Diamino-5formamidopyrimidins 13 mit etwa der gleichen Aus­
beute gebildet wie das Cyclonucleotid. 8 -HydroxyA M P tritt aber, wenn überhaupt, nur in sehr gerin­
ger Menge auf 22. Das läßt sich verstehen, wenn man
annimmt, daß die Radikale 11 und 12 in der Weise
disproportionieren, daß 11 bevorzugt oxydiert und
12 bevorzugt reduziert wird.
Es ist nicht sicher, daß solche Cyclonucleotide
auch bei Bestrahlung von makromolekularen Nu­
cleinsäuren eine Rolle spielen. Viel interessanter ist
jedoch die Vorstellung, daß in den Nucleinsäuren
auf die gleiche Weise Dimerisierungen zwischen
einem C-Atom eines Zuckers und einem C8 einer be­
nachbarten oder gegenüberliegenden Base auftreten
könnten. Vielleicht sind solche Reaktionen an den
Crosslinkings beteiligt, die bei Bestrahlung von DNS
beobachtet wurden.
^ N ^ N ^ 0H
3. Methoden
I
3.1. Chemikalien
CHO
Die Nucleotide wurden von Calbiochem, Luzern, und
von Boehringer, Mannheim, bezogen und vor dem Ge-
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nh2
nh2
NH2
'N
n
6
OH
c h 2- o - ©
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C H -0 -®
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NH2
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* G -W ert=Z ah l der pro 100 eV absorbierter Energie umgesetzten Moleküle.
25
C. A.
P
onnam perum a,
Thesis University of California 1962.
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