Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgische Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F.W. Neukam Die Expression melanomassoziierter Antigene A (MAGE-A) in Leukoplakien der Mundhöhle : Beurteilung der Bedeutung für das maligne Entartungsrisiko Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Vorgelegt von Patricia Gorecki aus Weiden i.d.Opf. Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan : Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler Referent : Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Emeka Nkenke Korreferent : Priv.-Doz. Dr. med. Dr. med. dent. Florian Stelzle Tag der mündlichen Prüfung: 16.04.2012 Die Promovendin ist Zahnärztin. In Dankbarkeit meinen Eltern gewidmet. Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung................................................................................................6 1.1. Hintergrund und Ziele......................................................................................6 1.2. Material und Methoden....................................................................................6 1.3. Ergebnisse.......................................................................................................6 1.4. Praktische Schlussfolgerung...........................................................................7 2. Summary...............................................................................................................8 2.1. Background and Aims......................................................................................8 2.2. Materials and Methods....................................................................................8 2.3. Results.............................................................................................................8 2.4. Practical Conclusion........................................................................................9 3. Einleitung.............................................................................................................10 4. Ziel der Arbeit......................................................................................................15 5. Material und Methoden....................... ................................................................16 5.1. Kontrollgewebe.............................................................................................16 5.2. Patienten.......................................................................................................16 5.3. Histologie......................................................................................................17 5.3.1.HE-Färbung...........................................................................................17 5.4. Immunhistochemie (IHC)..............................................................................18 5.4.1. Grundlagen...........................................................................................18 5.4.2. Färbevorgang.......................................................................................20 5.4.3. Auswertung der IHC Färbung...............................................................23 5.5. Statistik.........................................................................................................23 6. Ergebnisse..........................................................................................................24 6.1. Ergebnisse der HE-Färbung.........................................................................24 6.1.1. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP der Gruppe I................................................................................................24 6.1.2. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP der Gruppe II...............................................................................................26 6.1.3. Dysplasiegrad-Verteilung im gesamten Patientenkollektiv und deren Verteilung auf Gruppe I und II......... ....................................................27 6.1.4. Differenzierungsgrad und Stadieneinteilung der Tumore.....................29 6.1.5. Gewebeproben der Gruppe III..............................................................32 6.2. Ergebnisse der IHC Färbungen....................................................................32 6.2.1. Resultate der Gruppe I.........................................................................32 6.2.1.1. Darstellung der IHC – Färbungen...................................................32 6.2.1.2. Auswertung der LP in Gruppe I.......................................................38 6.2.1.3. Auswertung der Tumorfärbungen....................................................42 6.2.2. Ergebnisse der Gruppe II.....................................................................43 6.2.3. Resultate der Gruppe III.......................................................................47 6.2.4. Zusammenfassung der Färberesultate.................................................48 7. Diskussion...........................................................................................................50 8. Literaturverzeichnis.............................................................................................59 9. Abkürzungsverzeichnis........................................................................................65 10. Anhang..............................................................................................................66 10.1. Herstellerverzeichnis...................................................................................66 11. Danksagung.......................................................................................................68 6 1. Zusammenfassung 1.1. Hintergrund und Ziele Melanomassoziierte Antigene A (MAGE-A) gehören zu den Cancer/TestisAntigenen, die neben der Plazenta und den männlichen Keimdrüsen nur in maligne entartetem Gewebe exprimiert werden, so auch im Plattenepithelkarzinom (PEC). Die Familie besteht aus 12 Subtypen. Bei der Verwendung mehrerer Antigene ergibt sich ein hochspezifischer Marker für eine Malignität in der Mundhöhle, was bereits in mehreren Studien bestätigt wurde. Jedoch wurde ihre Expression in Leukoplakien (LP), der häufigsten Vorläuferläsion des PECs des Mund- und Rachensraumes, noch nicht ausreichend untersucht. Ziel der Studie war es zu prüfen, ob über die Expressionsanalyse von MAGE-A in LP der Mundhöhle und des Oropharynx auf eine zukünftige maligne Entartung des Gewebes geschlossen werden kann. 1.2. Material und Methoden Das zur Verfügung stehende historische Patientenkollektiv wurde in drei Gruppen unterteilt. Gruppe I beinhaltete 48 Patienten mit LP, auf deren Basis sich ein PEC entwickelt hat. In diesem Patientenkollektiv wurde neben der fakultativen Präkanzerose ebenfalls der korrespondierende Tumor untersucht. Gruppe II umfasste 50 LP, welche innerhalb von fünf Jahren keine maligne Entartung erfahren haben. In Gruppe III dienten 25 Proben gesunder Mundschleimhaut als Negativkontrolle. Zur histopathologischen Untersuchung wurden Schnitte von Formalin fixierten Paraffinproben angefertigt. Diese wurden zum Nachweis der Antigen-Expression mit zwei MAGE-A panspezifischen monoklonalen Antikörpern, dem 57B- und dem 6C1-Antikörper, gefärbt und ausgewertet. Dabei wurde die Diagnose mit der Expression und dem Dysplasiegrad, sowie die Expression mit dem Dysplasiegrad korreliert. Zur statistischen Untersuchung wurde der Chi-Quadrat-Test und der Mann-WhitneyU-Test unter Verwendung eines Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 herangezogen. 1.3. Ergebnisse Von den 48 LP in Gruppe I wiesen 85,4 % eine MAGE-A-Expression auf. Im Gegensatz dazu waren alle 50 Präkanzerosen in Gruppe II negativ. Somit scheint das maligne Entartungspotential von LP über die Expressionsanalyse 7 von MAGE-A hoch spezifisch einschätzbar zu sein, da nur LP, die die Grundlage eines späteren PECs waren, die Marker exprimierten (p ≤ 0,0001). Im Gesamtkollektiv (Gruppe I + II) bestand eine statistisch signifikante Korrelation zwischen maligner Entartung und Dysplasiegrad der Proben (p ≤ 0,0001). Ebenfalls waren Dysplasiegrad und MAGE-A-Expression statistisch signifikant miteinander korreliert (p ≤ 0,001). Bei LP der Gruppe I, die maligne entarteten, ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen Expression von MAGE-A und dem Dysplasiegrad der Proben (p = 0,71). Im Bezug auf die MAGE-A-Expression war der Unterschied zwischen Gruppe I und Gruppe III statistisch signifikant (p ≤ 0,0001). 1.4. Praktische Schlussfolgerung Der Nachweis von MAGE-A scheint ein nützlicher zusätzlicher Marker zur Risikobestimmung des malignen Potentials von LP zu sein. Zukünftig muss die Vermutung der vorliegenden Studie an größeren Patientenkollektiven geprüft werden. Möglicherweise sollte der MAGE-A-Nachweis bei LP als Entscheidungskriterium für die Wahl des Therapiekonzeptes herangezogen werden. 8 2. Summary 2.1. Background and Aims Melanoma-associated antigens A (MAGE-A) belong to the Cancer/Testisantigens family. Apart from the placenta and testis, they are only expressed in malignant tissue, including squamous cell carcinomas (SCC). The family consists of 12 subtypes. When making use of several antigens a highly specific marker emerges, which has been confirmed in a number of studies. To date their expression has not been sufficiently examined in leukoplakias (LP), the most common precursor lesions of head and neck SCC. The aim of this study was to evaluate, whether the expression of MAGE-A in LP of the head and neck can be used as an evidence of future malignant transformation of affected tissues. 2.2. Materials and Methods The histological samples of patients available was divided into three groups. Group I consisted of 48 patients with LP, which developed into a SCC. The corresponding tumour was also evaluated. 50 LP, which did not transform into a malignancy in a 5 years' period, were included in group II. 25 samples of healthy oral mucosa were part of group III, which served as a negative control. Formalin embedded samples were used for histopathological examination. In order to investigate antigen-expression they were stained with two MAGE-A pan-specific monoclonal antibodies, 57B and 6C1. In order to ascertain the impact of expression for the estimation of malignant transformation, its detection was compared to the course of disease and to the grade of dysplasia. In addition, the progress of disease and the grade of dysplasia were correlated. Statistical analysis was performed using the Chi-Square-test and MannWhitney-U-test. P-values ≤ 0.05 were considered as an indication of a statistical significance. 2.3. Results Out of the 48 potential precursor lesions in group I, 85.4% displayed MAGE-Aexpression. In contrast, all LP in group II were negative. Therefore, the risk for malignant transformation of LP could be assessed significantly by evaluating MAGE-A expression, as the marker was only detectable in lesions, that were 9 basis of a prospective tumour (p ≤ 0.0001). The whole patient population (group I + II) showed a statistically significant correlation between malignant progression and grade of dysplasia (p ≤ 0.0001). Likewise, malignant grade of dysplasia and MAGE-A expression were correlated in a statistically significant way (p ≤ 0.001). After evaluating LP of the group which progressed into a malignancy, no significant correlation could be ascertained between MAGE-A expression and the grade of dysplasia (p = 0.71). Referring to the MAGE-A expression the difference between group I and group III showed statistical significance (p ≤0.0001). 2.4. Practical Conclusion The expression of MAGE-A seems to be an additional useful marker in order to assess the potential of malignant transformation in LP. Prospectively, a larger patient population has to be examined in order to prove whether the conclusion suggested in this study could be a helpful tool for the evaluation of LP. Conceivably, the evidence of MAGE-A in LP should be used as a criterion for appropriate treatment planning. 10 3. Einleitung Das Plattenepithelkarzinom (PEC) im Kopf- und Halsbereich steht an sechster Stelle der am häufigsten auftretenden malignen Neoplasien beim Menschen weltweit [28, 50, 76] und repräsentiert 3-5% aller Tumorarten [28]. Trotz der Anwendung multimodaler Therapiekonzepte, welche eine operative Entfernung des PECs, sowie eine Radiatio und/oder eine Chemotherapie beinhalten, beläuft sich die 5-Jahresüberlebensrate durchschnittlich nur auf knapp über 50% [38, 49]. Neuere Statistiken des U.S. National Cancer Institute von 2009 zeigen diesbezüglich eine leichte Verbesserung mit Angaben von rund 60% [2]. Bei denjenigen Erkrankten, bei denen die Tumordiagnose in einem frühen Stadium gestellt wird, beträgt die Überlebenswahrscheinlichkeit sogar rund 80% [2, 29]. Allerdings werden rund zwei Drittel der erkrankten Patienten erst in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, wodurch die Überlebensrate auf ungefähr 30% absinkt [2, 17, 21, 29, 40, 42]. Bei der Karzinogenese oraler maligner Neoplasien handelt es sich um einen zweistufigen Prozess. Dabei geht dem Tumor oft eine Vorläuferläsion bzw. eine Präkanzerose voraus [44, 57]. Die häufigste fakultativ präkanzeröse Läsion im Mundraum ist die Leukoplakie (LP), welche in 1 bis 18% der Fälle maligne entartet [57]. Insgesamt basieren zwischen 11 und 67% aller PECs der Mundhöhle (PECM) auf dieser Art von Vorstufen [65]. Laut WHO handelt es sich dabei um weiße, nicht abwischbare Veränderungen der Mundschleimhaut, die keiner anderen Gewebeveränderung zugeordnet werden können [53]. Das histologische Erscheinungsbild dieser fakultativen Präkanzerosen stellt sich in Form einer epithelialen Hyperplasie (D0) oder Dysplasie (D1 – D3) dar. Heute gilt je höher der Dysplasiegrad, desto höher wird das Entartungsrisiko eingeschätzt [16, 24, 25, 53, 68, 75]. Bei Hyperplasien (D0) liegt es bei 0-3%, bei leichten Dysplasien (D1) bei 0-30%, bei mäßigen Dysplasien (D2) bei 044% und steigt bei schweren Formen (D3) auf 20-67% an [4, 14, 26, 54]. Aus den erwähnten Daten und Tatsachen wird ersichtlich, dass eine frühzeitige Identifikation oraler Gewebeveränderungen mit einem hohen Malignitätspotential und eine Frühdiagnose der sich daraus entwickelten Tumore von höchster klinischer Bedeutung ist. Zur Einstufung des Dysplasiegrades und somit auch des Entartungsrisikos einer Läsion wird bis heute eine histopathologische Untersuchung des zuvor biopsierten und HE-gefärbten verdächtigen Gewebes durchgeführt [24]. An 11 diesem Ergebnis orientiert sich die weitere klinische Behandlungsplanung, was den hohen Stellenwert dieser Methode unterstreicht [27, 44, 57, 75]. Allerdings birgt die lichtmikroskopische Untersuchung Fehlerquellen in sich. Verschiedene Pathologen stufen dysplastisches Gewebe oft unterschiedlich ein und somit ist die Methode subjektiv [5, 14, 33, 43, 44, 57, 75]. Zudem bedeutet die Diagnose „hohe Dysplasie“ nicht zwingend eine zukünftige Entartung und maligne Neoplasien können sich in einigen Fällen auch aus zuvor nicht dysplastisch veränderten D0 - Läsionen entwickeln [16, 24, 25, 44, 53, 57, 68, 75]. Aus dieser Problematik lässt sich schlussfolgern, dass sowohl eine Objektivierung der bisher angewandten Methoden, als auch eine Verbesserung der Einschätzung Mundschleimhautveränderungen, vor des allem malignen von Potentials hyperplastischen von D0- Gewebeveränderungen, über neue Ansätze erforderlich ist [57]. Eine mögliche Lösung wäre hierfür die Verwendung von molekularbiologischen Markern [27, 44, 57]. Zu nennen wären hier die tumorassoziierten Antigene, welche in gesunden und malignen Zellen differenziell exprimiert werden. An Hand ihrer unterschiedlichen Expressionsmuster in verschiedenen Geweben könnte die Gefahr, die von einer klinisch festgestellten Veränderung ausgeht, beurteilt werden [57]. Meist werden diese im Vergleich zum gesunden Gewebe im entarteten vermehrt exprimiert. Es wurde bereits eine Reihe von Genen aus der genannten Gruppe, welche eine Signifikanz bei einem vorhandenen PECM aufweisen, identifiziert und ihre Assoziation mit dem gesicherten Tumor-Befund oder einer Epitheldysplasie postuliert. Hierzu gehören u.a. die Differenzierungsantigene und Proteine, die den Zellzyklus steuern [1, 7, 18, 19, 20, 23, 37, 57]. Differenzierungsantigene werden im Ursprungsgewebe des Tumors konstitutiv exprimiert und in malignen Neoplasien im Vergleich dazu überexprimiert. Im Fall des PECMs, wie auch anderer Karzinome epithelialer Herkunft, sind dies die Zytokeratine (CK), die am Aufbau des Zytoskeletts sowohl gesunder, als auch maligner Zellen beteiligt sind. Eine Überexpression von CK stellt einen diagnostischen und prognostischen Marker dar [69 - 72]. Ein regelrechter Ablauf des Zellzyklus wird u.a. vom Tumorsuppressorgen p53 (TP53) reguliert [57], welches Zellen davor schützt DNA-Mutationen zu akkumulieren [22, 34]. Der Wildtyp arretiert genetisch geschädigte Zellen in der G1-Phase und ermöglicht somit die Reparatur ihrer DNA vor der Replikation [6, 22]. Bei einer 12 irreversiblen DNA-Schädigung wird die Apoptose durch TP53 eingeleitet [6, 10, 15]. Mutationen von TP53, die zum Funktionsverlust führen, sollten daher die Tumorentstehung fördern. Veränderungen des Gens wurden bereits bei der Karzinogenese im oberen Aerodigestivtrakt dokumentiert und ihr diagnostischer und prognostischer Wert postuliert [3, 9, 74]. Das Defizit der bisher vorgestellten Gene ist allerdings ihre Anwesenheit in unveränderter, gesunder Schleimhaut. Dies bedeutet, dass die Beurteilung auf Grund der nötigen Intensitätsmessung bei der Verwendung in der Immunhistochemie (IHC) sehr aufwendig ist und weiterhin subjektiv verbleibt. Daher wären für die Diagnostik und Prognose veränderter Gewebe diejenigen Marker von großem Vorteil, deren Expression ausschließlich in malignen Zellen detektiert werden kann und welche in gesunder Mundschleimhaut nicht nachweisbar sind [31]. Diese Eigenschaft würde die geforderten Kriterien erfüllen und somit die Entscheidungsfindung erleichtern und objektivieren. Gene, die mit Ausnahme der männlichen Keimzellen und der Plazenta, nur in bereits maligne transformierten Zellen gefunden werden können, sind die Cancer/Testis (CT-) Antigene. Sie weisen eine 100%-ige Spezifität für malignes Gewebe auf [31, 62, 63, 64, 66]. Zu ihnen zählen melanomassoziierte Antigene (MAGE) – A, welche im Fall des PECMs nachgewiesen und bereits gut untersucht worden sind [47, 59, 60]. Insgesamt gehören zu dieser Genfamilie 12 Mitglieder, von denen MAGE-A7, ein Pseudogen, als einziges nicht transkribiert wird [8, 11, 31, 61]. Die einzelnen MAGE-A werden im oralen PEC mit unterschiedlicher Häufigkeit exprimiert, wobei die Expressionsfrequenz eines einzelnen Gens höchstens 54% beträgt. Zusätzlich ist das Expressionsmuster heterogen, was die Methode nicht sensitiv genug erscheinen lässt [12, 46, 59, 60]. Durch die Verwendung von mehreren Antigenen kann diese Problematik jedoch umgangen werden. Es konnte in vorhergehenden Studien bereits gezeigt werden, dass der Nachweis der Expression auf 72% bei der Untersuchung von sechs und auf 85% bei sieben Mitgliedern der MAGE-A Familie gesteigert werden kann [47, 59, 60]. Bei der Analyse von 10 Antikörpern konnte sogar eine Expressionsrate von 93% erzielt werden [58]. Somit erfüllt diese Gengruppe die Kriterien der Spezifität und Sensitivität für maligne transformierte Zellen der Mundschleimhaut und erlaubt eine Unterscheidung zwischen malignem und gesundem Gewebe. Ob die Antigene auch in 13 Vorstufen des PECMs exprimiert werden, ist bislang allerdings nur wenig erforscht. Krauss et al. widmeten sich in ihrer Studie als eine der ersten Gruppen benignen und potentiell malignen Vorläuferläsionen des oralen PECs [35]. Dabei konnten sie zeigen, dass MAGE-A in keiner gutartigen Gewebeveränderung nachweisbar waren. Zwischen 33% und 65% der potentiellen Präkanzerosen ließen sich mit Hilfe der Antigene anfärben. Sie kamen zu der Schlussfolgerung, dass zwischen der Expression von MAGE-A, der Art der Vorläuferläsion und dem Dysplasiegrad ein Zusammenhang bestehe. Dabei soll ein höherer Dysplasiegrad mit einer gesteigerten Expressionsrate korrelieren. Bei dieser Studie wurden allerdings nur potentiell maligne Vorstufen des PECMs untersucht ohne Berücksichtigung, ob die Läsion im Nachfolgenden maligne entartet ist oder nicht. Daher wäre als Nachteil der Arbeit zu nennen, dass keine Verlaufsuntersuchungen der Gewebeveränderungen vorlagen und somit nicht nachgewiesen wurde, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression von MAGE-A und der malignen Entartung der Mundschleimhautläsionen besteht. Außerdem wurden nur wenige Proben untersucht, die keine Dysplasien enthielten und auch von diesen Patienten ist die klinische Weiterentwicklung der Gewebeveränderung nicht dokumentiert. Folglich konnte die oben erwähnte D0-Problematik in dieser Studie nicht geklärt werden. Zusätzlich wurde ein breites klinisches Spektrum von benignen, z.B. Ulcera oder Lichen planus, und fakultativen bzw. obligaten Präkanzerosen, wie z.B. LP oder Erythroplakien, der Mundschleimhaut untersucht, so dass das Patientenkollektiv in den einzelnen Untergruppen nicht sehr groß war. Dadurch ist die Aussagekraft der Ergebnisse im Vergleich zu Studien mit höheren Fallzahlen unterlegen. Es ist unerlässlich weitere Untersuchungen in diesem Bereich durchzuführen, welche Nachuntersuchungen von Schleimhautveränderungen mit einbeziehen, um den wahren Wert der Untersuchung der MAGE-A Expression für die Bestimmung des Krebsrisikos, das von der LP ausgeht, zu bestimmen. Ziel dieser Arbeit ist es, die Expressionsmuster der MAGE-A in Formalin fixierten Proben dysplastischen LP von histologisch eines möglichst gesicherten großen hyperplastischen Patientenkollektivs und mittels Immunhistologie zu bestimmen. Die Ergebnisse sollen mit dem Dysplasiegrad und mit der klinischen Entwicklung der fakultativen Präkanzerose korreliert 14 werden. Auf diese Weise soll geprüft werden, ob der Nachweis von MAGE-A als klinischer Parameter für das Malignitätspotential von LP verwendet werden kann. Außerdem soll untersucht werden, ob der Dysplasiegrad tatsächlich ein ausschlaggebender Hinweis für die maligne Entartung der Vorläuferläsionen ist oder ob nicht auch hyperplastische D0-Veränderungen eine potentielle Entartungstendenz besitzen. Die genaue Einschätzung der Prognose über den Nachweis des Markers wäre auch klinisch für die Planung der Therapie von entscheidender Bedeutung. Somit könnten LPs, die ein nachgewiesenes malignes Potential in sich tragen, frühzeitig und effektiv behandelt werden. Zudem könnten betroffene Patienten in kürzeren Intervallen zur Nachuntersuchung einbestellt werden. Eine spätere Entartung mit den drastischen Konsequenzen, einschließlich der für die Patienten sehr invasiven und beeinträchtigenden chirurgischen Rekonstruktion und der adjuvanten Therapiekonzepte, sowie ihrer Folgen bzw. Nebenwirkungen könnte umgangen werden. Nicht zuletzt könnten mit Hilfe der Antigene neue Behandlungsstrategien erforscht und entwickelt werden, wie z.B. eine mögliche Immuntherapie, welche den Patienten in Zukunft als alternative neoadjuvante oder adjuvante Begleittherapie zum operativen Eingriff angeboten werden könnte. 15 4. Zielsetzung Ziel der Studie ist es zu prüfen, ob durch den immunhistologischen Nachweis von MAGE-A in Leukoplakien der Mundhöhle und des Oropharynx auf die Entwicklung eines PECs geschlossen werden kann. Auf diese Weise soll beurteilt werden, ob die Expressionsanalyse von MAGE-A in LP der genannten Regionen einen Beitrag zur Früherkennung von Tumoren oder von Patienten, die ein erhöhtes Entartungsrisiko dieser Gewebeveränderungen besitzen, liefern kann. Die Hypothesen des Projekts sind wie folgt: • MAGE-A lassen sich immunhistologisch in LP der Mundhöhle und des Oropharynx in genauso großer Zahl wie in PEC nachweisen. • Wenn MAGE-A in einer LP der Mundhöhle oder des Oropharynx nachgewiesen wird, entwickelt sich im Verlauf ein PEC in der entsprechenden anatomischen Region. • Wenn MAGE-A in einer LP der Mundhöhle oder des Oropharynx nicht nachgewiesen wird, entwickelt sich in einem 5-Jahreszeitraum kein PEC im Mund- bzw. Rachenraum. Somit könnten bereits maligne transformierte Zellen durch molekularbiologische und immunhistologische Methoden in den Vorläufern des PECs der Mundhöhle bzw. des Oropharynx nachgewiesen werden und Hochrisikopatienten besser identifiziert werden. Diese Methode könnte neben der histopathologischen Untersuchung ein zusätzliches Kriterium für eine chirurgische und/oder eine adjuvante Therapieentscheidung, sowie ein Ansatz für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bilden. 16 5. Material und Methoden 5.1. Kontrollgewebe Für den Nachweis von MAGE-A diente als Positivkontrolle Gewebe von männlichen Keimzellen. Zudem lag Gewebematerial von bereits histologisch gesicherten Tumorpatienten vor, das als weitere Positivkontrolle mitgeführt wurde. Als Negativkontrolle wurde normale Mundschleimhaut gesunder Probanden verwendet. 5.2. Patienten Zur Untersuchung der Expressionsmuster von MAGE-A wurden in der Studie Formalin fixierte Paraffinproben verwendet. Diese stammen von einem historischen Patientenkollektiv mit Schleimhautveränderungen in der Mundhöhle und im Rachenraum, welche in einem Zeitraum zwischen 1997 und 2009 diagnostiziert, entnommen und archiviert wurden. Daraus ließen sich drei Patientengruppen bilden, welche in Tabelle 1 zusammengefasst sind: In Gruppe I wurden diejenigen Patienten aufgenommen, bei denen sich basierend auf einer LP innerhalb von 5 Jahren ein PEC der Mundhöhle oder des Oropharynx entwickelt hat. Neben der Vorläuferläsion wurde in diesem Patientenkollektiv ebenfalls das korrespondierende PEC untersucht und die Expression von MAGE-A analysiert. Gruppe II umfasst diejenigen Patienten, bei denen in den Jahren 1997 bis 2005 eine LP diagnostiziert wurde. Bei diesem Kollektiv sind „follow-up“ Untersuchungen vorhanden, um auszuschließen, dass sich in einem 5 -Jahreszeitraum aus der Schleimhautveränderung ein PEC entwickelt hat. Gruppe III besteht aus Proben gesunder Probanden, welche keine pathologischen Veränderungen des Mundschleimhautgewebes aufwiesen. Dieses Gewebematerial diente als Negativkontrolle. 17 Gruppe Krankheitsverlauf I LP auf deren Basis sich ein PEC entwickelt hat II LP ohne malige Entartung in einem Zeitraum von 5 Jahren III gesunde orale Schleimhaut Tabelle 1 : Gruppeneinteilung des vorhandenen Patientenkollektivs Die lichtmikroskopische Untersuchung der HE- und immunhistologisch gefärbten Gewebeproben wurde von zwei unabhängigen Pathologen durchgeführt, um die Beurteilung der Färbungen und die Diagnose zu objektivieren. 5.3 Histologie 5.3.1. HE-Färbung Diese histologische Methode wurde durchgeführt, um den Dysplasiegrad der LP einzustufen und das Grading der PECs durchzuführen. Dabei wurden die Formalin fixierten Paraffinschnitte aller Gewebeproben zunächst entparaffiniert. Hierzu verblieben die Schnitte dreimal 15 Minuten in Xylol und durchliefen danach eine absteigende Propanolreihe. Daraufhin wurden sie in Aqua dest. (AD) gegeben (Tabelle 2). Entparaffinierung Xylol Minuten 3 x 15' 100% Isopropanol 5' 100% Isopropanol 5' 96% Isopropanol 5' 96% Isopropanol 5' 90% Isopropanol 5 70% Isopropanol 5' 70% Isopropanol 5' Aqua dest. 2' Tabelle 2 : Protokoll zum Entparaffinieren der Schnitte 18 Für die eigentliche HE-Färbung wurden die Proben für fünf Minuten in Hämatoxylin (Fa. Sigma) getaucht und danach kurz in HCl-Alkohol differenziert. Sie wurden daraufhin fünf Minuten mit Wasser fließend gewässert, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Drei Minuten wurden sie in AD belassen, bevor sie für fünf Sekunden in Eosin (Fa. Sigma) getaucht wurden. Es folgte eine Spülung in AD und die Durchführung einer aufsteigenden Propanolreihe. Es wurden die gleichen Propanolkonzentrationen und Zeiteinheiten eingehalten, wie bei der bereits erwähnten absteigenden Alkoholreihe. Dabei löst das 70%-ige und 90%-ige Propanol den Farbstoff Eosin aus den Schnitten. Zuletzt verblieben die Proben zweimal je fünf Minuten in Xylol und wurden mit dem Eindeckmedium Entellan (Fa. Merck) eingedeckt. 5.4. Immunhistochemie (IHC) 5.4.1. Grundlagen Diese Methode ermöglicht es definierte Proteine mit Hilfe von spezifischen Antikörpern sichtbar zu machen und zu lokalisieren. Dabei spielt die Affinität des Antikörpers zu dem entsprechenden Epitop des Antigens eine entscheidende Rolle, da diese die Grundlage für eine starke Bindung und somit auch für den Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion ist. Das in diesem Projekt verwendete IHC Verfahren basiert auf einer indirekten Färbemethode, Methode der (Abbildung sogenannten 1). Dabei Labeled–Strept–Avidin-Biotin wird zunächst ein (LSAB-) unkonjugierter Primärantikörper auf das zu untersuchende Gewebe appliziert. In einem zweiten Schritt wird der biotinylierte Sekundärantikörper, welcher sich gegen die konstante Kette des primären richtet, aufgebracht. An diesen Komplex bindet dann Avidin bzw. Streptavidin, wobei Biotin als Bindungspartner fungiert. Jedes Avidin- bzw. Streptavidin-Molekül besitzt vier Bindungsstellen für BiotinMoleküle, wodurch eine Signalamplifikation erreicht wird. Eine anschließende Farbentwicklung wird durch die Inkubation mit einer Chromogen-Lösung ermöglicht, welche in diesem Projekt auf alkalischer Phosphatase basiert [39]. Die LSAB – Methode lässt sich wie folgt knapp zusammenfassen : Unkonjugierter Primärantikörper + biotinylierter Sekundärantikörper + AvidinBiotin-Enzymkonjugat + Substrat/Chromogen → Farbentwicklung 19 Streptavidin-BiotinEnzym-Komplex Biotinylierter Sekundärantikörper Primärantikörper Gewebeantigen Abbildung 1 : schematische Darstellung der LSAB – Methode (http://www.dako.com/de/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_9.pdf als Bildquelle, bearbeitet mit Microsoft Office PowerPoint 2007 ) Die Färbungen wurden an den vorhandenen Formalin fixierten Paraffinschnitten aus den drei gebildeten Patientengruppen durchgeführt. Zum Nachweis der MAGE-A auf Proteinebene wurden zwei monoklonale Primärantikörper verwendet, zum einen der 57B - (Prof. Spagnoli, Basel, Schweiz) und zum anderen der 6C1 – (abcam, Cambridge, UK bzw. Invitrogen Corporation, Camarillo, California, USA) Antikörper. Die Eigenschaften der Primärantikörper und die bei den Färbungen zur Anwendung gekommenen Konzentrationen können Tabelle 3 entnommen werden. Die genannten Antikörper erkennen gemeinsame Epitope, welche spezifisch für MAGE- A1, MAGE- A2, MAGE- A3, MAGE- A4, MAGE- A6, MAGE- A10 und MAGE-A12 sind. Dadurch wird der simultane Nachweis der Antigene ermöglicht. Eine Antikörperbindung ist eingetreten, wenn eine nukleäre und/oder eine zytoplasmatische Färbung der Zellen im Hellfeld erkennbar ist. 20 Primärantikörper Firma gewonnen aus gerichtet gegen Typus Konzentration d. Primärantikörpers 57B Prof. Giulio C. Spagnoli, Onkologische Chirurgie, University Hospital Basel, Schweiz Maus MAGE-A 1-4, monoklonal 6 und 12 1:20 6C1 (ab49386) abcam, Cambridge, UK Maus MAGE-A 1-4, monoklonal 6, 10 und 12 1:50 6C1 (35-6300) Invitrogen, Camarillo, California, USA Maus MAGE-A 1-4, monoklonal 6, 10 und 12 1:50 Tabelle 3 : Hersteller, Eigenschaften und angewandte Konzentrationen der verwendeten Primärantikörper 5.4.2. Färbevorgang Die Färbeprotokolle für beide zur Verwendung gekommenen Antikörper sind identisch und werden daher zusammen beschrieben werden. Damit eine spätere Antigen-Antikörper-Bindung stattfinden konnte, wurden die Gewebeschnitte zunächst einer Vorbehandlung unterzogen. Hierfür wurden die Proben mit Hilfe von Xylol entparaffiniert und nachfolgend über die absteigende Propanolreihe mit 100%-, 96%-, 90%- und 70%-igem Isopropanol und AD rehydriert. Anschließend folgte eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung im EDTA - Puffer ( pH 9,0 ) bei 100°C für 20 Minuten. Nach Abkühlung der Proben wurden diese über Nacht in AD im Kühlschrank gelagert. Am folgenden Tag wurde der vollautomatische Hauptfärbevorgang mit Hilfe des DAKO Cytomation Autostainers plus (DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg) durchgeführt, in welchem die vorbehandelten Objektträger und benötigten Reagenzien eingelegt waren. Bei jedem Durchlauf wurde eine Positivkontrolle mitgeführt, die das gleiche Procedere durchlief, wie die zu testenden Gewebeproben. Damit wurde 21 sichergestellt, dass eine adäquate Färbung vollzogen wurde. Zusätzlich wurde eine Negativkontrolle mitgefärbt, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. Diese wurde mit denselben Reagenzien behandelt wie die restlichen Schnitte, mit Ausnahme des jeweiligen Primärantikörpers. Zuerst wurden die Proben mit Avidin (DAKO), danach mit Biotin (DAKO) inkubiert, um falsch positive Ergebnisse durch eine mögliche Reaktion von endogenem Biotin zu verhindern. Im weiteren Verlauf folgte eine Proteinblockierung mit Protein-Block-Serum Free (DAKO) zur Vermeidung von unspezifischen Reaktionen. Hierauf schloss sich die Behandlung mit einem der beiden monoklonalen Antikörper an – dabei wurde 57B im Verhältnis 1:20, 6C1 im Verhältnis 1:50, mit Antibodydiluent (DAKO) verdünnt. Als sekundärer Antikörper fungierten biotinylierte Ziege-Anti-Maus-Immunglobuline (DAKO REAL Detection System AB2, DAKO). Durch die Markierung mit Biotin wird die Empfindlichkeit des Detektionssystems erhöht, denn nachfolgend können mehrere mit alkalischer Phosphatase konjugierte Streptavidin-Moleküle (DAKO REAL Detection System AP, DAKO) mit dem gebildeten Komplex reagieren. Diese Reaktion wird mit Hilfe des eigentlichen Farbstoffes Fast-Red Chromogen (DAKO REAL RED, DAKO) sichtbar gemacht. Dazu wird das Chromogen mit dem AP Substrate Buffer (DAKO REAL, DAKO) verdünnt, nachdem diesem ein Tropfen Levamisol (DAKO REAL, DAKO) hinzugefügt wurde. Die Aufgabe des Levamisols ist es die endogene alkalische Phosphatase zu blockieren. Durch Fast-Red (Naphtol AS-MX-Phosphat) kommt es durch die stattfindende Hydrolyse zu einem rot-braunen Farbprodukt. Dieser Schritt stellt das Ende des vollautomatischen Hauptfärbevorgangs dar. Anschließend wurde von Hand eine Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO) vorgenommen Die überschüssige Farbe wurde unter fließendem Leitungswasser entfernt. Danach wurden die Schnitte in AD getaucht, bevor sie abschließend getrocknet und mit Aquatex (Fa. Merck, Darmstadt, Germany) eingedeckt wurden. Das vollständige Färbeprotokoll kann Tabelle 4 entnommen werden. 22 Zeitdauer (Minuten) Anwendung Entparaffinierung und Vorbehandlung von Hand 3 x 15' Xylol jeweils 3' absteigende Propanolreihe (2x100%, 2x96%, 1x90%, 2x70%) 3' AD 20' Kochen in EDTA-Puffer, pH 9,0, 100°C (Dako S2367) 20' Abkühlen in EDTA-Puffer über Nacht AD, im Kühlschrank Hauptfärbung im Autostainer 15' Avidin (Dako X0590) Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 15' Biotin (Dako X0590) Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 30' Proteinblock (Dako X0909) 60' Primärantikörper, verdünnt in Antibodydiluent (Dako S2022) 57B (Hybridomaüberstand, Prof. Spagnoli) – Verdünnung 1:20 6C1 (abcam ab49836 bzw. Invitrogen 35-6300) – Verdünnung 1:50 Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 15' Biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A, Dako REAL Detection System K5005) Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 15' Alkalische-Phosphatase-Streptavidin-Komplex (Lösung B, Dako REAL Detection System K5005) Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 8' Fast-Red-Chromogen (Chromogen 1/2/3 + APSubstratpuffer + Levamisol; Dako K5005) Spülung DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) 6' (bei 6C1-Färbung) bzw. Fast-Red-Chromogen (Chromogen 1/2/3 + AP4' (bei 57B-Färbung) Substratpuffer + Levamisol; Dako K5005) Spülung AD 23 Färbung von Hand 5' Hämalaun (Dako S3301) 5' Spülen unter fließendem Leitungswasser 5' AD Eindecken mit Aquatex (Fa. Merck) Tabelle 4 : Färbeprotokoll für die IHC Färbung mit 57B-/6C1-Primärantikörper 5.4.3. Auswertung der IHC-Färbung Die Gewebeproben wurden nach erfolgter Färbung und Eindeckung unter Verwendung eines Mikroskops mit integrierter Digitalkamera (Axio Cam, Carl Zeiss, Jena, Germany) ausgewertet und digitalisiert. Es wurden Bilder von 10-fachen, 20-fachen oder 40-fachen Vergrößerungen der Schnitte angefertigt und somit die hyperplastisch und dysplastisch veränderten Epithel-Areale dokumentiert. Die Bilder wurden im komprimierten Tif-Dateiformat gespeichert. Die HE- und IHC-angefärbten Schnitte wurden von zwei unabhängigen Pathologen bewertet und die Ergebnisse miteinander verglichen. 5.5. Statistik Das Tabellenkalkulationsprogram Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) diente dazu, die gewonnenen Ergebnisse tabellarisch und graphisch darzustellen. Zur statistischen Auswertung der Daten wurde das Statistikpaket SPSS für Windows Version 19.0 angewendet. Die Angaben für die Häufigkeitswerte im Rahmen der deskriptiven Statistik wurden als absolute und relative Häufigkeiten (%-Werte) angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Chi-QuadratTest und dem Mann-Whitney-U-Test für unabhängige Stichproben berechnet. Dabei wurde ein Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 verwendet. 24 6. Ergebnisse 6.1. Ergebnisse der HE-Färbungen Nach der Untersuchung der gefärbten Gewebeschnitte durch die Pathologen konnten genaue Angaben zu den Dysplasiegraden der vorhandenen LP, sowie zum Differenzierungsgrad (= Grading) und der Stadieneinteilung (= Staging) der Tumore und den jeweiligen prozentualen Verteilungen gemacht werden. 6.1.1. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP in Gruppe I Die Einschlusskriterien wurden nur von 26 oral lokalisierten LP erfüllt. Aus diesem Grund wurden auch fakultative Präkanzerosen aus dem Oropharynx in das Projekt mit einbezogen. Dadurch konnte die Fallzahl um 22 pharyngeale Gewebeveränderungen erweitert werden. Somit war es möglich insgesamt 48 LP immunhistochemisch zu untersuchen. Die zunächst angestrebte Fallzahl von 50 erkrankten Patienten konnte wegen vorgefallener Gewebeverluste des pathologischen Instituts nicht erfüllt werden. Von den 48 gefärbten Läsionen stammten 31 von männlichen Patienten, was einem Prozentsatz von 64,6 % entspricht, und 17 fakultative Präkanzerosen bzw. 35,4 % wurden bei weiblichen Patienten diagnostiziert. Das Verhältnis Männer : Frauen lag somit ungefähr bei 2 : 1 . Das Durchschnittsalter aller überprüften Patienten bei der Erstdiagnose der LP betrug 60,2 Jahre. Für beide Geschlechter getrennt betrachtet, ergaben sich folgende Werte: Die männlichen Erkrankten hatten im Schnitt ein Alter von 59,2 Jahren, die weiblichen ein Alter von 62,2 Jahren. Die mittlere Überlebensdauer (DFS-rate) bis zur Transformation der Vorläuferläsion in ein PEC lag insgesamt bei 18,5 Monaten. Bei den männlichen Patienten ergab sich eine durchschnittliche DFS-rate von 21,5 Monaten, bei den weiblichen lediglich von 12,8 Monaten. Die Läsionen manifestierten sich in der Periode zwischen 1997 und 2009. Es waren alle Dysplasiegrade – D0, D1, D2 und D3 – vertreten. Es folgt eine kurze Erläuterung zu den jeweiligen Stadien: 25 D0 bedeutet, dass keine Dysplasie des Epithels vorliegt. Im D1 Stadium liegt eine dysplastische Veränderung im basalen Drittel vor. D2 beschreibt eine Dysplasie sowohl im basalen, als auch im mittleren Drittel. Im Fall eines D3 Stadiums liegt eine dysplastische Veränderung in der gesamten Epithelschicht vor. Die genaue Verteilung und die korrespondierenden Prozentzahlen sind in Diagramm 1 und Tabelle 5 dokumentiert. Dysplasiegrad-Verteilung Gruppe I 31,25% 14,58% 31,25% 22,92% D0 D1 D2 D3 Diagramm 1 : Graphische Darstellung der Dysplasiegrad-Verteilung in Gruppe I Dysplasiegrad Anzahl Prozentanteil 0 15 31,25 % 1 11 22,92 % 2 15 31,25 % 3 7 14,58 % Total 48 100% Tabelle 5 : Dysplasiegrad-Verteilung für die LP in Gruppe I 26 6.1.2. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad Verteilung der LP in Gruppe II Dieses Kollektiv enthielt genau 50 Gewebeproben, die den Einschlusskriterien entsprachen. Die untersuchten Vorläuferläsionen entstammten alle der Mundschleimhaut. Davon wurden 52 % der LP bei männlichen Patienten diagnostiziert, was einer Anzahl von 26 fakultativen Präkanzerosen entspricht. Die restlichen 48 % bzw. 24 Gewebeveränderungen wurden bei Frauen festgestellt. Folglich lässt sich in dieser Gruppe ein nahezu gleiches Verhältnis Männer : Frauen von 1 : 1 erkennen. Das Durchschnittsalter der Patienten bei der Primärdiagnose der Läsion lag insgesamt bei 47, 2 Jahren. Betrachtet man die beiden Geschlechter erneut getrennt voneinander, waren die Männer im Schnitt 44,3 Jahre alt, die Frauen 50,4 Jahre. Im Gegensatz zu den LP der Gruppe I wiesen die Gewebeproben in Gruppe II keine Dysplasien des Grades 3 auf. Sie beinhalteten somit die Dysplasiegrade D0 bis D2. Die prozentuale Verteilung kann Diagramm 2 und Tabelle 6 entnommen werden. Dysplasiegrad-Verteilung Gruppe II 6,0% 52,0% 42,0% D0 D1 D2 Diagramm 2 : Graphische Darstellung der Dysplasiegradverteilung in Gruppe II 27 Dysplasiegrad Anzahl Prozentanteil 0 26 52,0 % 1 21 42,0 % 2 3 6,0 % Total 50 100% Tabelle 6 : Verteilung der Dysplasiegrade in Gruppe II 6.1.3. Dysplasiegrad-Verteilung im gesamten Patientenkollektiv und deren Verteilung auf Gruppe I und II Der Chi-Quadrat bzw. Mann-Whitney-U-Test (p ≤ 0.0001) zeigen, dass die maligne Transformation signifikant mit dem Dysplasiegrad der Läsion korreliert und somit mit zunehmendem Dysplasiegrad auch das Entartungsrisiko der LP steigt. Das wird auch dadurch verdeutlicht, dass mit insgesamt 63,42% im D0 Stadium mehr Läsionen, die innerhalb von fünf Jahren nicht entartet sind, vertreten sind, gegenüber derer (36,58%), auf deren Basis sich ein PEC entwickelt hat. Im Gegensatz dazu ist beispielsweise im Dysplasiegrad 2 eine fünffach höhere Anzahl an LP, die im weiteren Verlauf maligne entartet sind im Vergleich zu denen, die keine Transformation erfahren haben, vorhanden. Betrachtet man die Verteilung der Dysplasiegrade innerhalb der einzelnen Gruppen zeigt sich, dass von allen Gewebeveränderungen mit dem Dysplasiegraden D0 und D1 rund 36,58 bzw. 34,38% maligne entarten und dieses Risiko auf 83,33 und 100% für D2 und D3 ansteigt. Umgekehrt finden sich nur 16,67% Läsionen,welche nicht entarten, in D2. Festzustellen ist an dieser Stelle erstens, dass das potentielle Risiko, das von Läsionen mit geringen oder nicht auftretenden histologischen Veränderungen ausgeht, durch die histopathologische Untersuchung nicht vollständig erfasst wird, und zweitens, dass das Risiko, das von Veränderungen die als D0 und D1 klassifiziert wurden, ähnlich hoch ist. Die Verteilung der Dysplasiegrade des ganzen Patientenkollektivs ist in Tabelle 7 numerisch und in Tabelle 8 prozentual wiedergegeben. 28 Die dazugehörigen graphischen Darstellungen werden durch Diagramm 3 und Diagramm 4 erfasst. Dysplasiegrad D0 D1 D2 D3 Insgesamt Gruppe I 15 11 15 7 48 Gruppe II 26 21 3 0 50 Insgesamt 41 32 18 7 98 Tabelle 7 : Dysplasiegrad-Verteilung aller untersuchten Vorläuferläsionen Dysplasiegrad-Verteilung des gesamten Patientenkollektivs 7 18 41 D0 D1 D2 32 D3 Diagramm 3 : graphische Darstellung der Dysplasiegrad-Verteilung aller LP Dysplasiegrad D0 D1 D2 D3 Gruppe I 36,58 % 34,38 % 83,33 % 100 % Gruppe II 63,42 % 65,62 % 16,67 % 0% Tabelle 8 : prozentuale Dysplasiegrad-Verteilung aller untersuchten LP 29 Dysplasiegrad-Verteilung Gruppe I & II 100,0% 90,0% 80,0% Anzahl [%] 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% ,0% D0 D1 D2 D3 Dysplasiegrad Gruppe I LP Gruppe II LP Diagramm 4 : Korrelation aller untersuchten LP zwischen ihrem Dysplasiegrad und ihrer Gruppenzugehörigkeit 6.1.4. Differenzierungsgrad und Stadieneinteilung der Tumore Die Läsionen wurden in dem Zeitraum zwischen 1997 und 2009 diagnostiziert und behandelt. Auf Grund der Problematik mit Gewebeverlusten im pathologischen Institut konnten nur in 36 Fällen die korrespondierenden PECs zu den vorliegenden 48 LP gefärbt und analysiert werden. Dabei entstammten 20 Tumore dem Mundraum und 16 dem Oropharynx. Die untersuchten PECs ließen sich den Differenzierungsgraden G1 bis G3 zuordnen. Dabei bedeuten die jeweiligen Grade folgendes : G1 : gut differenzierter Tumor G2 : mäßig differenziert Tumor G3 : schlecht differenzierter Tumor 30 Diagramm 5 und Tabelle 9 kann die exakte Verteilung der der Differenzierungsgrade entnommen werden. Grading-Verteilung der PEC 22,2% G1 G2 G3 30,6% 47,2% Diagramm 5 : Graphische Darstellung der Grading-Verteilung innerhalb der untersuchten Tumorgewebeproben Tabelle Grading Anzahl Prozentsatz 1 11 30,6 % 2 17 47,2 % 3 8 22,2 % Total 36 100 % 9 : Verteilung Differenzierungsgrad der untersuchten Tumore in Bezug auf ihren 31 Neben dem Grading, konnten bei den vorhandenen PECs ebenfalls genaue Angaben zu der Stadienverteilung der jeweiligen malignen Neoplasien gemacht werden. Hierbei ließen sich alle Stadien – Stadium I, II, III und IV – nachweisen. Meist werden die Stadien I und II, sowie die Stadien III und IV zu je einer Gruppe zusammengefasst. Vor der Schilderung der Verteilung sollen diese zunächst kurz definiert werden: Stadium I und II beschreiben Anfangsstadien, bei denen klinisch noch keine Metastasen nachweisbar sind. Im Gegensatz dazu ist bei den fortgeschrittenen Stadien III / IV entweder eine Metastasierung in die Lymphknoten und / oder eine Fernmetastasierung und / oder eine Infiltration des PECs in Nachbarstrukturen, wie z.B. in angrenzende Knochenstrukturen dokumentierbar. Bei allen 20 PECMs konnte das entsprechende Stadium bestimmt werden. Von den restlichen 16 Patienten mit einem pharyngealen PEC war bei 7 allerdings keine TNM-Klassifikation vorhanden, wodurch das Tumorstadium nur bei 9 Fällen angegeben werden konnte. Tabelle 10 spiegelt die numerische und prozentuale Verteilung wieder. Stadium Anzahl Prozentsatz I / II 16 oral + 8 oropharyngeal 82,8 % III / IV 4 oral + 1 oropharyngeal 17,2 % Insgesamt 29 100 % Tabelle 10 : Stadien-Verteilung der vorhandenen PECs der Mundhöhle und des Oropharynx 32 6.1.5. Gewebeproben der Gruppe III Die Mundschleimhäute von gesunden Probanden dieser Gruppe dienten als Kontrollgewebe. Alle untersuchten 25 Gewebeproben wiesen keinerlei dysplastische Veränderungen auf und konnten somit als Negativkontrolle verwendet werden. 6.2. Ergebnisse der IHC Untersuchung 6.2.1. Resultate der Gruppe I 6.2.1.1. Darstellung der IHC - Färbungen Bevor detailliert auf die erzielten Ergebnisse eingegangen wird, dienen die folgenden Abbildungen zunächst der Veranschaulichung von den erfolgten Färbungen. Abbildung 2 bis Abbildung 6 zeigen Beispiele für epithelial nachgewiesene MAGE-A Expressionen. Es wird für die untersuchten Dysplasiegrade D0, D1, D2 und D3, sowie für ein PEC je ein Schnitt als Beispiel gezeigt. 33 2a ) 2b ) 2c ) 2d ) Abbildung 2 : Beispielbilder für LP mit Dysplasiegrad 0, 20-fache Vergrößerung → 2a ) : Grad D0 LP nach erfolgter 6C1 - Färbung → 2b ) : dieselbe fakultative Präkanzerose nach Anwendung der 57B – Färbung → 2c ) : Negativkontrolle der Vorläuferläsion → 2d ) : HE – Färbung der LP 34 3a ) 3b ) 3c ) 3d ) Abbildung 3 : Beispiele für eine LP Grad 1, 20-fache Vergrößerung → 3a ) : LP nach erfolgter 6C1 – Färbung → 3b ) : dieselbe LP nach Behandlung mit dem 57B – Antikörper → 3c ) : Negativkontrolle der dargestellten Vorläuferläsion → 3d ) : HE – Färbung der LP 35 4a ) 4b ) 4c ) 4d ) Abbildung 4 : IHC Färbungen einer LP des Dysplasiegrades 2, 20-fache Vergrößerung → 4a ) : epitheliale Färbung nach Applikation des 6C1 – Antikörpers → 4b ) : dieselbe fakultative Präkanzerose nach Verwendung der 57B – Antikörpers → 4c ) : IHC Färbung der Negativkontrolle → 4d ) : HE – Färbung der LP 36 5a ) 5b ) 5c ) 5d ) Abbildung 5 : Beispiel für eine dysplastische veränderte LP des Grades 3, 20-fache Vergrößerung → 5a ) : Epitheliale 6C1 Färbung → 5b ) : dieselbe LP 57B gefärbt → 5c ) : Negativkontrolle der fakultativen Präkanzerose → 5d ) : HE – Färbung der LP 37 6a ) 6b ) 6c ) 6d ) Abbildung 6 : Beispiel für eine PEC nach erfolgter IHC Färbung, 20-fache Vergrößerung → 6a ) : gefärbtes PECMs mit dem 6C1 – Antikörper → 6b ) : derselbe Tumor nach Anfärbung mit dem 57B – Antikörper → 6c ) : Negativkontrolle des Karzinoms → 6d ) : HE – Färbung des Tumors 38 6.2.1.2. Ergebnisse der Gruppe I Von den insgesamt 48 untersuchten fakultativen Präkanzerosen, die im Verlauf maligne entartet sind, lies sich bei 41 bzw. 85,4 % eine MAGE-A Expression mit mindestens einem der beiden verwendeten Antikörper nachweisen. Bei separater Betrachtung der Färbungen der einzelnen Primärantikörper, lassen sich folgende Ergebnisse festhalten: Durch den 57B – Antikörper konnte ebenfalls bei allen 41 Proben eine positive Antikörperreaktion verzeichnet werden, was erneut eine Färbung in 85,4 % der Gewebeproben widerspiegelt. Nur bei 7 LP konnte keine Reaktion auf die IHC Färbung nachgewiesen werden. Unter Verwendung des 6C1 – Antikörper zeigten 39 der Vorläuferläsionen eine MAGE-A Expression, 9 Schnitte stellten sich negativ dar. Dies entspricht einer positiven Reaktion in 81,3 % der Fälle. Die detaillierten Ergebnisse der Färbungen, sowie der korrespondierende Dysplasiegrad der untersuchten LP können Tabelle 11 entnommen werden. Die Analyse der Färberesultate in Gruppe I ermöglicht es, genaue Angaben zur Verteilung der MAGE-A Expression in den vorhandenen Dysplasiegraden D0, D1, D2 und D3 zu machen. Diese Verteilung wurde in Tabelle 12 numerisch und in Diagramm 6 prozentual wiedergeben. Patient Dysplasiegrad 57B-Färbung 6C1-Färbung 57B & 6C1 Färbungen 1 2 + + + 2 0 + + + 3 0 + + + 4 0 + + + 5 1 + - + 6 1 - - - 7 0 - - - 8 2 + + + 9 0 + + + 10 2 + + + 39 Patient Dysplasiegrad 57B-Färbung 6C1-Färbung 57B & 6C1 Färbungen 11 3 - - - 12 0 + + + 13 3 + + + 14 0 + + + 15 0 + + + 16 0 + + + 17 1 + + + 18 0 + + + 19 0 + + + 20 1 + - + 21 3 + + + 22 0 + + + 23 0 + + + 24 1 + + + 25 2 + + + 26 0 + + + 27 2 - - - 28 0 - - - 29 2 + + + 30 2 + + + 31 3 + + + 32 2 + + + 33 1 + + + 34 2 + + + 35 2 + + + 36 2 + + + 37 2 + + + 38 1 + + + 39 1 + + + 40 1 + + + 41 2 + + + 42 2 + + + 43 1 - - - 44 3 + + + 45 3 + + + 46 2 + + + 40 Patient Dysplasiegrad 57B-Färbung 6C1-Färbung 57B & 6C1 Färbungen 47 1 - - - 48 3 + + + Tabelle 11 : Tabellarische Darstellung der einzelnen Ergebnisse der IHC Färbungen Erklärung : Patient = Aufzählung der untersuchten Patienten 1 - 48 Dysplasiegrad = Dysplasiegrad der untersuchten LP 57B – bzw. 6C1 - Färbung = IHC Färbung unter Verwendung des 57B – bzw. des 6C1 – Antikörpers, dabei bedeutet : → '+' = LP zeigt MAGE-A Expression bzw. zelluläre Färbung im Epithel → ' - ' = bei der LP war keine MAGE-A Expression nachweisbar In der Spalte ' 57B & 6C1 – Färbungen' bedeutet → ' + ' = Antikörperreaktion ist bei mindestens einem der beiden Antikörper zu Stande gekommen → ' - ' = keiner der beiden Antikörper rief eine MAGE-A Expression hervor Dysplasiegrad negativ positiv Total 0 2 13 15 1 3 8 11 2 1 14 15 3 1 6 7 Total 7 41 48 Tabelle 12 : Tabellarische Darstellung der Färbeergebnisse bezogen auf den Dysplasiegrad der LP Erklärung : → positiv = MAGE-A Expression mit mindestens einem der beiden Antikörper nachweisbar → negativ = mit keinem der Antikörper ist eine Färbung im Epithel hervorgerufen worden 41 100,0% 90,0% 80,0% LP-Anzahl (Prozent) 70,0% 60,0% Negativ Positiv 50,0% Total 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% ,0% D0 D1 D2 D3 Total Dysplasiegrad Diagramm 6 : Graphische Darstellung der Färberesultate der LP bezogen auf ihren Dysplasiegrad Neben dieser Zuordnung wurde die prozentuale Expression von MAGE-A in den einzelnen Dysplasiegraden betrachtet, um daraus eine mögliche Korrelation zwischen der Entartungswahrscheinlichkeit und dem Dysplasiegrad beurteilen zu können. Tabelle 13 und Diagramm 7 geben dieses Verhältnis wieder. Dysplasiegrad positiv positiv [%] Insgesamt D0 13 86,7 15 D1 8 72,7 11 D2 14 93,3 15 D3 6 85,7 7 Tabelle 13 : Prozentualer Anteil der MAGE-A Expression in den einzelnen Dysplasiegraden 42 100% 90% LP-Anzahl (Prozent) 80% 70% Negativ Positiv 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% D0 D1 D2 D3 Dysplasiegrad Diagramm 7 : Korrelation zwischen der MAGE-A Expression und dem Dysplasiegrad Bei der Betrachtung von Tabelle 13 und Diagramm 7 zeigt sich, dass ein ähnlich hoher Prozentsatz der D0 LP wie der D3 LP, ungefähr 86%, eine MAGE-A Expression aufgewiesen hat. Zudem wird durch die Färbung deutlich, dass 86% und 72,7% der D0 und D1 Läsionen mit malignem Potential nachgewiesen werden konnten, welche nach reiner histopathologischen Untersuchung als wenig gefährlich eingestuft werden würden. Diese Feststellungen deuten somit darauf hin, dass in der Gruppe I keine Korrelation zwischen der Entartungswahrscheinlichkeit und dem dysplastischen Stadium der Gewebeveränderung besteht. Diese Vermutung konnte bei der statistischen Untersuchung mit dem Chi-Square-Test und dem Mann-Whitney-U-Test bestätigt werden. In beiden Fällen lies sich ein statistisch nicht signifikanter pWert von 0,71 errechnen. Folglich besteht kein signifikanter Zusammenhang zwischen der MAGE-A Expression in LP und ihrem Dysplasiegrad in Gruppe I. 6.2.1.3. Auswertung der Tumorfärbungen Bei den PECs der Mundhöhle und des Oropharynx konnte ein MAGE-A 43 Nachweis mit mindestens einem der beiden Antikörper in insgesamt 86,1 % der untersuchten Fälle dokumentiert werden, nur 5 der 36 Proben stellten sich negativ dar. Betrachtet man die Resultate für die jeweiligen Primärantikörper erneut separat, lässt sich folgendes festhalten: 30 der 36 Schnitte wiesen eine MAGE-A Expression sowohl bei Verwendung des 57B –, als auch des 6C1 – Antikörpers auf. Das entspricht in beiden Fällen einem Prozentsatz von jeweils 83,3 %. Es konnte kein 100%-iger Zusammenhang zwischen der MAGE-A Expression in LPs und in den korrespondierenden Tumoren festgestellt werden. Nicht alle der untersuchten PECs erreichten die gleichen Antikörper-Reaktion wie die fakultative Präkanzerose, auf deren Basis sie entstanden waren. So stellte sich bei gemeinsamer Begutachtung der beiden Primärantikörper in drei Fällen das PEC negativ dar, obwohl die entsprechende fakultativ präkanzeröse Läsion zuvor eine positive Reaktion zeigte. Der 57B – Antikörper allein wies ein solches Färbeverhalten in vier Fällen auf, der 6C1 – Antikörper lediglich in zwei Fällen. Eine umgekehrte Reaktion lies sich bei zwei Patienten nachweisen. In den beiden Fällen konnte sowohl mit dem 57B -, als auch mit dem 6C1 - Antikörper bei der Vorläuferläsion keine MAGE-A Expression nachgewiesen werden, der korrespondierende Tumor allerdings zeigte eine Antikörperreaktion. Alle anderen Gewebeproben hatten bei den beiden untersuchten histologischen Veränderungen ein jeweils gleiches Färbeverhalten. In diesen Fällen färbten sich sowohl die LP, wie auch das entsprechende PEC positiv bzw. negativ. 6.2.2 . Ergebnisse der Gruppe II Alle 50 LP, die in Gruppe II untersucht wurden, zeigten keine epitheliale Färbung und erwiesen sich somit zu 100 % als negativ. Auch die drei Proben mit dem hohen Dysplasiegrad D2 zeigten keinerlei Reaktion. Abbildung 7, 8 und 9 zeigen je ein Beispiel für jeden der vorhandenen Dysplasiegrade. 44 7a ) 7b ) 7c ) 7d ) Abbildung 7 : LP mit Dysplasiegrad D0, 20-fache Vergrößerung → 7a ) : Gewebeveränderung nach erfolgter 6C1 – Färbung → 7b ) : dieselbe LP nach durchgeführter 57B – Färbung → 7c ) : Kontrollgewebe der fakultativen Präkanzerose → 7d ) : HE – Färbung der LP 45 8a ) 8b ) 8c ) 8d ) Abbildung 8 : Beispielbilder für eine LP des Dysplasiegrades 1, 20-fache Vergrößerung → 8a ) : 6C1 – Färbung der Grad 1 LP → 8b ) : Läsion nach durchgeführter 57B – Färbung → 8c ) : Negativkontrolle der untersuchten LP → 8d ) : HE – Färbung 46 9a ) 9b ) 9c ) 9d ) Abbildung 9: Darstellung eine D2 LP, 20-fache Vergrößerung → 9a ) : durchgeführte 6C1 – Färbung der Gewebeveränderung → 9b ) : 57B – Färbung derselben LP → 9c ) : die entsprechende Negativkontrolle. → 9d ) : HE – Färbung der Läsion 47 6.2.3. Resultate der Gruppe III Diese Gruppe beinhaltet Gewebeproben von Mundschleimhäuten von 25 gesunden Probanden. Sowohl bei der Färbung mit dem 6C1 - Antikörper, als auch mit dem 57B - Antikörper erwiesen sich die Schnitte in 100% als negativ. Abbildung 10 zeigt eine der untersuchten oralen Schleimhäute als Beispiel. 10a ) 10c ) 10b ) 10d ) Abbildung 10: Färbung einer gesunden Mundschleimhaut, 20-fache Vergrößerung → 10a ) : Färbung mit dem 57B – Antikörper → 10b ) : dieselbe Gewebeprobe nach erfolgter 6C1-Färbung → 10c ) : Negativkontrolle der oralen Schleimhaut → 10d ) : HE-Färbung des untersuchten Gewebes 48 6.2.4. Zusammenfassung der Färberesultate Abschließend ist in Tabelle 14 eine Gesamtübersicht über die Färbeergebnisse der einzelnen Gruppen dargestellt. Gruppe Anzahl 6C1+ 57B+ Gesamt+ Gesamt+ [%] [Chi-Square- Test] p-Wert I (LP) 48 39 41 41 85,4 ≤ 0,0001 I (PEC) 36 30 30 31 86,1 ≤0,0001 II 50 0 0 0 0,0 III 25 0 0 0 0,0 Tabelle 14 : Gesamtübersicht über alle Färbeergebnisse Erklärung : I (LP) bzw. I (PEC) = Resultate der LP- bzw. PEC - Färbungen in Gruppe I Anzahl = Stückzahl der untersuchten Gewebeproben pro Gruppe 6C1 + bzw. 57B + = MAGE-A Expression bei Verwendung des jeweiligen Antikörpers nachweisbar Gesamt+ = positive Färbereaktion des Gewebes auf mindestens einen der beiden Antikörper p-Wert: LP der Gruppe I in Bezug auf die LP der Gruppe II PEC der Gruppe I in Bezug auf Gruppe III Beim Vergleich der MAGE-A Expression in den Gewebeveränderungen der Gruppe I mit denen der Gruppe II konnte ein statistisch hoch signifikanter Wert von p ≤ 0,0001 errechnet werden. Das lässt die Schlussfolgerung zu, dass eine Einschätzung des malignen Potentials der LP über die Expressionsanalyse von MAGE-A möglich ist. Besonders hervorzuheben ist, dass auch D0 LP, welche bislang nach erfolgter histopathologischer Untersuchung als nicht gefährlich eingestuft wurden, mit einer Wahrscheinlichkeit von 86,7 % nachweisbar waren. Dieser Wert liegt über dem errechneten Durchschnittswert von 85,4 % bei Betrachtung der MAGE-A Expression aller LP. 49 Somit sind Risikoläsionen mit einer Spezifität von 100 % und einer Sensitivität von 85,4 % nachweisbar. Es konnte bestätigt werden, dass MAGE-A mit einer entsprechenden statistischen Signifikanz von p ≤ 0,0001 im PEC der Mundhöhle und des Oropharynx im Vergleich zu der normalen oralen Schleimhaut in Gruppe III nachweisbar war und somit die Expression mit der Diagnose der Erkrankung stringent korreliert ist. 50 7. Diskussion Bisher wurden nur wenige Studien, welche das Thema der MAGE-A Expression in fakultativen Präkanzerosen der Mundhöhle und des Oropharynx behandelt haben, publiziert. Krauss et al. haben sich mit dieser Thematik befasst und Mundschleimhautveränderungen immunhistochemisch untersucht [35]. Als nachteilig einzustufen wäre bei dieser Arbeit, dass es sich um ein heterogenes Patientenkollektiv verschiedener oraler Gewebeveränderung gehandelt hat und dass somit die Anzahl von Probanden in den einzelnen Untergruppen relativ schwach ausgeprägt war. Zudem wurden die untersuchten Vorläuferläsionen des PECMs nicht mit ihrem klinischen Verlauf korreliert. So konnte lediglich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Dysplasiegrad und der MAGE-A Expression dokumentiert werden, wobei eine vermehrte Antikörperreaktion bei stärker dysplastisch veränderten Geweben gefunden werden konnte. Jedoch blieb ununtersucht, ob die MAGE-A Expression auch mit einer nachfolgenden Entartung der fakultativen Präkanzerose in Verbindung steht. Zudem war die Anzahl nicht dysplastischer LP mit 32 Fällen sehr gering. In bisherigen Publikationen wurden Entartungsraten solcher Hyperplasien mit einem Wert von 0–3 % angegeben [4, 26, 54]. Unter Berücksichtigung dieser Daten kann bei der niedrigen Fallzahl rein statistisch keine MAGE-A Expression gefunden werden, die auf ein eventuelles Risiko, das von den Läsionen ausgeht, hindeuten könnte. Somit konnte nicht überprüft werden, ob bereits in diesem Stadium eine potentielle Malignität über MAGE-A Expression nachweisbar sein könnte. Diesen ausstehenden Fragen wurde in der vorliegenden Studie nachgegangen. Es wurden ausschließlich Patienten mit histologisch gesicherten hyperplastischen und dysplastischen LP für die IHC Untersuchung selektiert, bei denen der klinische Verlauf mindestens fünf Jahre dokumentiert wurde. Dadurch konnte ein einheitliches Kollektiv an fakultativen Präkanzerosen in allen Dysplasiestadien untersucht werden Es konnte gezeigt werden, dass ein hoch signifikanter Zusammenhang (p ≤ 0,0001) zwischen dem Nachweis von MAGE-A im Epithel von LP und der späteren Transformation dieser in einen Tumor besteht. Bei 85,4 % der LP, die im weiteren Verlauf maligne entartet sind, konnte mit IHC Färbemethoden eine 51 MAGE-A Expression nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu fielen die Gewebeveränderungen, die sich in einem Zeitraum von fünf Jahren nicht in ein PEC weiterentwickelt haben, alle negativ aus. Folglich sprechen die Ergebnisse dafür, dass der Nachweis von MAGE-A als ein hoch sensitiver und spezifischer Parameter zur Beurteilung von klinisch verdächtigen Läsionen und Hochrisikopatienten angesehen werden kann. Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass mit dem 57B Antikörper in einer vermehrten Anzahl von LP MAGE-A detektiert werden konnte. Ein Antigen-Nachweis wurde in 85,4% der Fälle ermöglicht. Im Gegensatz dazu kam eine Antikörperreaktion bei Verwendung des 6C1 Antikörpers in nur 81,3% der Proben zu Stande. Es war zudem insgesamt auffällig, dass der 57B - Antikörper durchschnittlich eine stärkere und intensivere Färbung hervorrufen konnte, sowohl bei den fakultativen Präkanzerosen, als auch bei den korrespondierenden PECs. Diese Tatsachen würden für die Anwendung des 57B – Antikörpers im klinischen Alltag sprechen, um einen Antigen-Nachweis in einer größeren Anzahl von LP mit malignem Potential zu gewährleisten. Neben der statistischen Signifikanz zwischen der MAGE-A Expression und der Entartungswahrscheinlichkeit der LP, konnte ebenfalls die hohe Spezifität der MAGE-A für bereits maligne entartetes Gewebe bestätigt werden. MüllerRichter et al. dokumentierten z.B. in ihrer Studie einen MAGE-A Nachweis beim PECM in 55% der malignen Neoplasien [48]. Bei der Arbeit von Pastorcic-Grgic et al. wurden PECs des Pharynx untersucht und ein Antigen-Nachweis in 70 % erreicht [51]. Eine eigene unveröffentlichte Studie der MKG-Chirurgie Erlangen zeigte eine Färbung von oralen PECs in 56% der Fälle. In der vorliegenden Studie konnte ein MAGE-A Nachweis bei 86,1 % der untersuchten Tumore erzielt werden, wobei sich ein statistisch hoch signifikanter Wert von p ≤ 0,0001 ergab. Der Unterschied zwischen den erwähnten Arbeiten ist, dass bei der vorliegenden alle PECs aus zuvor diagnostizierten LP entstanden sind. Bei den drei zuvor dargestellten Studien wurden Tumore untersucht ohne näher auf die Vorläuferläsion einzugehen. Nun bietet es sich an die Hypothese aufzustellen, dass bei PECs, die sich auf der Basis einer LP entwickelt haben, häufiger MAGE-A exprimiert wird, als bei anderen. Diese Vermutung müsste allerdings 52 noch durch Erhöhung der Fallzahlen geprüft werden. Gezeigt hat sich bei den Untersuchungen, dass die Färbemethode bei der Verwendung mehrerer Antikörper zuverlässiger und somit klinisch relevanter zu sein scheint. Sowohl der 57B – , als auch der 6C1 - Antikörper ermöglichten jeweils bei 83,3 % der PECs einen Antigen-Nachweis. Zusammen betrachtet konnten die zuvor erwähnten 86,1 % erzielt werden. Daher wäre es empfehlenswert bei IHC Färbungen von Tumoren mehr als nur einem Antikörper anzuwenden, um die Sensitivität des Nachweises zu erhöhen. Wie in vielen früheren Publikationen, so auch in der bereits diskutierten Studie von Krauss et al. [35], konnte bei Betrachtung des gesamten Patientenkollektivs ein statistischer Zusammenhang zwischen dem Dysplasiegrad und dem Risiko zur Ausbildung eines Tumors festgestellt werden. Diese Ergebnisse erwecken den Anschein, dass das Risiko der Entartung tatsächlich mit dem Dysplasiegrad und der Expression ansteigt und somit von D0 oder D1 Dysplasien kein oder nur ein geringes Risiko ausgeht. Allerdings verändert sich dieses Bild, wenn die untersuchten Patientengruppen bezogen auf die jeweiligen Färberesultate getrennt voneinander betrachtet werden. Innerhalb der Gruppe I konnte anders als im gesamten Patientenkollektiv keine Korrelation zwischen Dysplasiegrad der LP, der malignen Transformation und der MAGE-A Expression festgestellt werden. Folglich muss die anfängliche Vermutung revidiert werden. Alle Gewebeproben der Gruppe II stellen sich, wie bereits erwähnt, negativ dar. Die LP der Gruppe I waren jedoch unabhängig von ihrem Dysplasiegrad in durchschnittlich 85,4% positiv. Auch nach statistischer Untersuchung ergab sich ein nicht signifikanter Wert von p = 0,71. Allein bei Begutachtung der hyperplastischen D0 LP in Gruppe I zeigte sich eine MAGE-A Expression in 86,7 % und bei D1 Gewebeveränderungen in 72,7 % der Fälle. Wenn nun von der Hypothese ausgegangen wird, dass mit steigendem Dysplasiegrad auch die Entartungswahrscheinlichkeit zunimmt, wäre das genau der Prozentsatz an Patienten, der außer Acht gelassen werden würde. Mit Hilfe des MAGE-A Nachweises können bereits in diesen aus pathologischer Sicht wenig gefährlichen Stadien diejenigen Vorläuferläsionen mit einer hohen Entartungstendenz sowohl ausgefiltert, als auch frühzeitig und adäquat 53 behandelt werden. Auf Grund der möglichen Früherkennung von malignen Neoplasien könnten sich die Ergebnisse positiv auf die Überlebenswahrscheinlichkeit auswirken. Bislang sind die 5-Jahresüberlebensraten nach pathologisch gesicherter Tumordiagnose stark verbesserungswürdig, sie betragen nach Angaben des U.S. National Cancer Institute nur rund 60%. Dabei spielt das Stadium, in welchem sich das PEC bei der Erstdiagnose präsentiert, eine entscheidende Rolle. Wenn weder angrenzende Nachbarstrukturen des Tumors, wie z.B. Knochen bei einem Mundbodenkarzinom, noch Lymphknoten infiltriert wurden, können Überlebensraten von rund 80 % erreicht werden. Bei vorhandenen Metastasen sinkt die Überlebenswahrscheinlichkeit jedoch drastisch auf knapp über 30% herab [2]. Dies unterstreicht die herausragende Bedeutung der Früherkennung beim Kampf gegen die Tumorerkrankung. Wenn eine größere Anzahl an Patienten in den frühen Stadien des PECs diagnostiziert würde, ließen sich die 5-Jahresüberlebensraten sicherlich zu Gunsten der erkrankten Personen steigern. Die genannten Fakten sind ebenfalls von Kantola et al. in ihrer Studie über die prognostischen Faktoren bei einem PECM der Zunge bestätigt worden. Sie räumen dem Tumorstadium die signifikanteste Rolle bei der Überlebenswahrscheinlichkeit der Erkrankten ein [32]. Wenn durch MAGE-A das Malignitätspotential bereits anhand der LP beurteilt werden kann, in denen die Basalmembran das Epithels noch nicht durchbrochen und die Neoplasie noch keine invasiven Eigenschaften aufweist, lässt sich erahnen, welche zukünftigen Verbesserungen in der 5- Jahresüberlebensrate erreicht werden könnten. Neben dem positivem Effekt für die Früherkennung der Tumorerkrankung durch die Einschätzung des malignen Potentials kann die Expressionsanalyse von MAGE-A auch einen wichtigen Beitrag zur Objektivierung des Risikos, welches von oraler Schleimhautveränderungen ausgeht, liefern. Dieser wird bislang durch den Pathologen im Rahmen einer histologischen Untersuchung der Gewebeveränderung durchgeführt. Nachteilig für die bisherige Methode spricht jedoch ihre Subjektivität und mangelnde Reproduzierbarkeit unter Pathologen, welche auch in mehreren Publikationen bemängelt wurde [5, 13, 14, 33, 36, 43, 54 44, 57, 67, 75]. Die Diskussion über den Dysplasiegrad und somit auch über die adäquate Therapie könnte umgangen werden, da der Expressionsnachweis von MAGE-A als zusätzliches Hilfsmittel zur pathologischen Einstufung des Entartungsrisikos von Mundschleimhautveränderungen dienen könnte. Für die Entartungswahrscheinlichkeit der verdächtigen Läsion spielt nach wie vor der histologisch gesicherte Dysplasiegrad eine wichtige Rolle. Bisher wurde die These unterstützt, dass je höher der Dysplasiegrad der Gewebeveränderung sei, desto höher sei auch ihre Entartungstendenz [16, 24, 25, 53, 55, 68, 75]. Aus diesem Grund unterscheiden sich auch die Therapieansätze bei LP mit leichter im Gegensatz zu denen mit schwerer epithelialer Dysplasie [27, 44, 55, 57, 75]. Allerdings kam es in letzter Zeit zu einem Gedankenumschwung, da Publikationen schilderten, dass die Entartung von fakultativen Präkanzerosen unabhängig von dem zuvor bestimmten Dysplasiegrad sei. So können durchaus D0 LP zukünftig maligne transformieren und einige D3-Veränderungen durchlaufen keine Entartung oder bilden sich sogar zurück [16, 24, 25, 44, 53, 57, 67, 68, 75]. Diese Beobachtungen konnten in dieser Studie, wie bereits diskutiert, bestätigt werden. Somit bedürften die betroffenen hyperplastischen oder nur leicht dysplastischen Schleimhautveränderungen einer entsprechenden Therapie oder zumindest engmaschige Kontrolluntersuchungen. Das Problem liegt allerdings darin, dass durch die fehlende Korrelation zwischen Dysplasiegrad und Entartungstendenz selbst nach erfolgter Diagnose durch den Pathologen, dieser nicht im Stande ist das wirkliche Malignitätspotential einer D0 oder D1 LP vorhersagen zu können. Daher wäre es entscheidend das bislang verwendete Verfahren der Diagnosestellung zu optimieren. Beide Tatsachen, die Möglichkeit ein objektives und reproduzierbares Ergebnis bei der Dysplasiegrad-Diagnose zu erreichen und das tatsächliche Entartungspotential auch von hyperplastischen und leicht dysplastischen Gewebeveränderung zu beurteilen, sprechen für die künftige klinische Anwendung von IHC Färbemethoden zum MAGE-A Nachweis. Diese könnten als zusätzliches Instrument zur Durchführung und Komplettierung der histologischen Untersuchung durch das pathologische Fachpersonal verwendet werden. 55 Zudem bieten die positiven Ergebnisse der Arbeit weitere Ansätze für mögliche Diagnostikverfahren von Vorläuferläsionen eines PECs. Bislang ist eine Biopsie der verdächtigen Läsion und deren anschließende histopathologische Untersuchung der Gold-Standard [41, 45, 55]. Doch es gibt auch weitere für den Patienten weniger invasive Möglichkeiten der Diagnosestellung, wie z.B. die Bürstenbiopsie. In ihrer Evaluation verschiedener Hilfsmitteln zur Diagnostik von PECMs beurteilen Lingen et al. unter anderem auch die erwähnte Methode. Sie kommen zu dem Ergebnis, dass die Anwendung der Bürstenbiopsie für die Zukunft viel versprechend zu sein scheint, allerdings zur genauen Beurteilung weitere Forschungsergebnisse benötigt werden. Es gibt jedoch durchaus Szenarien bei denen die Bürstenbiopsie von Vorteil erscheint. So würden sie Patienten mit multiplen verdächtigen Gewebeveränderungen in der Mundhöhle der herkömmlichen Biopsie auf Grund der geringeren Invasivität bevorzugen [41]. Mit dieser Thematik beschäftigten sich ebenfalls Metzler et al. in ihrer Studie, welche sich den Vorzügen der Bürstenbiopsie in Verbindung mit dem MAGE-A Nachweis widmet. Die Kombination aus diesem Verfahren und der MAGE-A Expressionsanalyse mit Hilfe der Real Time RT-PCR ermöglichte bei einem Patienten den Nachweis eines frühinvasiven PECM Rezidives, obwohl die histopathologische Untersuchung nach erfolgter Biopsie zuvor keinen Hinweis auf Malignität geliefert hatte. Somit kommen auch sie zu der Schlussfolgerung, dass dieses Diagnostikverfahren in Verbindung mit dem hoch sensitiven und spezifischen Tumormarker zur Früherkennung von PECMs zukünftig von großer Bedeutung sein wird. [45]. Neben den Vorteilen für die Früherkennung und Diagnostik können aus den positiven Ergebnissen der Studie auch Konsequenzen für neue Therapieansätze gezogen werden. Bisher besteht in den meisten Fällen der Goldstandard aus der chirurgischen Entfernung der malignen Neoplasie mit gleichzeitiger „elective neck dissection“ [30]. Dieses Behandlungskonzept wird vor allem bei PECs der frühen Stadien I oder II gewählt. Alternativ kann eine Bestrahlungstherapie angewendet werden. Bei fortgeschrittenen Tumoren in den Stadien III oder IV fällt die Entscheidung auf ein multimodales Therapiekonzept, bestehend aus der chirurgischen 56 Exzision und / oder einer adjuvanten oder neoadjuvanten Radio- und / oder Chemotherapie [17, 56]. Durch die Kombination des operativen Eingriffs mit einer Bestrahlungstherapie konnte die 5-Jahresüberlebensrate von ungefähr 40% in den 1970er Jahren auf über 70% zu Beginn des 21. Jahrhunderts gesteigert werden [73]. Zusätzlich konnte in den einzelnen Therapiekonzepten eine Vielzahl an Fortschritten erzielt werden. So lässt sich das Operationsergebnis durch innovative Rekonstruktionsmöglichkeiten und durch minimal invasive Techniken ästhetisch und funktionell verbessern. Vor allem bei ausgedehnten Tumorresektionen kann die Funktionalität durch mikrovaskuläre Transplantate enorm gesteigert werden. Durch Modulationen bei der Radio- und Chemotherapie kann deren Toxizität verringert werden, wie z.B. durch eine Verminderung der Bestrahlungsdosis [56]. Allerdings sind Nebenwirkungen trotz der erwähnten Verbesserungen zum Teil gravierend. So wird auf Grund der Ausdehnung des PECs häufig die Ästhetik, die Kau-, Sprech- und Schluckfunktion der Patienten beeinträchtigt. Durch Bestrahlung und Chemotherapie ist das Auftreten einer Mukositis, einer Dysphagie oder eine Xerostomie keine Seltenheit, um nur einige Beispiele zu nennen. Die beiden letztgenannten Therapien können sich zudem in vielen Fällen schädlich auf die körpereigene Immunantwort auswirken. Die Beeinträchtigung könnte in Zusammenhang mit dem Auftreten von Rezidiven oder Therapieversagen stehen [56]. Diese Bedenken werden ebenfalls von Perez-Sayans et al. in seinem Review aufgegriffen. So soll die Durchführung einer Bestrahlungstherapie vor einer Chemotherapie deren Erfolgsraten stark beeinträchtigen. Die durch die Tumorzellen erworbene Resistenz gegenüber Chemotherapeutika wird als Mehrfachresistenz oder multidrug resistance (MDR) bezeichnet. Dabei kommen den Zellen Mechanismen zugute, die es ihnen ermöglichen die für sie toxischen Substanzen aus dem Zellinneren zu schleusen. Diese Fähigkeit wird ebenfalls für eine Resistenz des PECMs gegen das Chemotherapeutikum Cisplatin verantwortlich gemacht. MDR wird heutzutage als Hauptursache für das Scheitern von Behandlungskonzepten aufgeführt [52]. Einer weitere Möglichkeit für das Versagen der genannten Therapien widmet sich Gath et. al. in seinem Review, dem Vorhandensein einer minimalen 57 Resterkrankung bzw. minimal residual disease (MRD). Hierbei handelt es sich um das Verbleiben okkulter Tumorzellen im Gewebe nach vollzogener Durchführung des gewählten Behandlungskonzeptes. Die Persistenz dieser Zellen kann ein lokales Rezidiv bei bis zu 20% der Patienten hervorrufen, obwohl sich bei ihnen die Resektionsränder des PECs histopathologisch als Tumor frei erwiesen haben. Ferner enthalten bei einer neck dissection entfernte Lymphknoten in bis zu 20% Mikrometastasen, obwohl sie bei der histopathologischen Untersuchung als negativ eingestuft wurden. Aufgrund dieser Mängel kommen Gath et al. zu der Schlussfolgerung, dass der Nachweis der tatsächlichen Ausbreitung von Tumorzellen die derzeitigen histopathologischen Methoden überschreitet [17]. Ferner wird postuliert, dass zahlreiche disseminierte Zellen des PECs in der G0-Phase des Zellzyklus verweilen. Dies könnte ein weiterer Grund für das Scheitern einer Chemo-/ bzw. Radiotherapie sein, da diese Methoden nur sich im Wachstum befindende Zellen angreifen. In diesem Zusammenhang wäre es für die Prognose erforderlich die verbliebenen okkulten Tumorzellen mit Hilfe von hochspezifischen Tumormarkern zu detektieren [17]. Nach den Ergebnissen der vorliegenden und vielen früheren Studien könnte hierfür ein MAGE-A Nachweis als Hilfsmittel bei der histopathologischen Untersuchung in Betracht gezogen werden. Es wäre für die betroffenen Personen von entscheidender Bedeutung weitere Therapiekonzepte zu entwickeln, welche auch eine geringere Toxizität und weniger Nebenwirkungen aufweisen würden. In diesem Zusammenhang spielt die Forschung an und die Entwicklung von Immuntherapien eine herausragende Rolle [56]. Es gibt heute bereits Ansätze für die Verwendung von CT-Antigenen bei der Entwicklung neuer Therapien. In ihrem Review gehen Rapidis et al. näher auf die bisherigen Forschungsergebnisse ein. Darin räumen sie ebenfalls MAGE-A eine wichtige Rolle ein, vor allem bei der Entwicklung von Tumorimpfungen. Es hat bereits eine klinische Studie mit zwei Patienten stattgefunden. Nach der Diagnose eines Ösophaguskarzinoms, erfolgter Resektion und Chemotherapie wurden die Betroffenen mit einer Impfung, welche MAGE-A1 und MAGE-A3 enthalten hat, therapiert. Der erste Patient verstarb nach 12 Monaten, der zweite hat zum Zeitpunkt der Publikation bereits 49 Monate überlebt. Des weiteren wird an einer Studie mit einer 58 Kombination aus HPV16 und MAGE-A3 als Impfstoff gearbeitet. Zusammenfassend beschreibt der Review die Immuntherapie als attraktives alternatives Behandlungskonzept mit möglicherweise weniger belastenden Nebenwirkungen und erfolgreicheren Resultaten bei der Tumorbekämpfung [56]. Aus den ersichtlich, geschilderten dass Publikation weiterhin eine und Vielzahl Forschungsergebnissen von wird verbesserungswürdigen Konzepten in Hinblick auf die Früherkennung und Therapie des PECs der Mundhöhle und des Oropharynx bestehen. In diesen Schwerpunkten wird stetig geforscht, um die Überlebensraten bei einer diagnostizierten Tumorerkrankung erheblich zu verbessern, den Patienten eine möglichst minimal invasive und verträgliche Therapie anzubieten und vor allem um eine maligne Entartung von fakultativen Präkanzerosen frühzeitig zu diagnostizieren und zu verhindern. Unsere Studie hat gezeigt, dass mit Hilfe der Expressionsanalyse von MAGEA die Tendenz zur malignen Transformation von LPs statistisch signifikant eingeschätzt werden kann. Bereits im hyperplastischen D0-Stadium ist es möglich das Entartungspotential abzuschätzen. Dadurch ist es vorstellbar, dass der Nachweis von MAGE-A in Zukunft als wichtiges Hilfsmittel zur Objektivierung und Komplettierung der histopathologischen Untersuchung des PECs und dessen Vorläuferläsionen angesehen werden kann. Mit dieser Zusatzmethode kann es entscheidende Verbesserungen bei der Einschätzung von Schleimhautveränderungen des Mund- und Rachenraumes, bei der Früherkennung von Tumoren und dementsprechend auch bei der Überlebenswahrscheinlichkeit der betroffenen Personen geben. Außerdem können alternative Diagnostikverfahren, wie z.B. die Bürstenbiopsie oder neue Therapieansätze, wie z.B. die Immuntherapie verbessert und entwickelt werden. 59 8. Literaturverzeichnis 1. Agarwal S, Mathur M, Shukla NK, Ralhan R: Expression of cyclin dependent kinase inhibitor p21waf1/cip1 in premalignant and malignant oral lesions: relationship with p53 status. Oral Oncol 1998 Sep; 34(5): 353-60. 2. Altekruse SF, Kosary CL, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Waldron W, Ruhl J, Howlader N, Tatalovich Z, Cho H, Mariotto A, Eisner MP, Lewis DR, Cronin K, Chen HS, Feuer EJ, Stinchcomb DG, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2007, National Cancer Institute. 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Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Erklärung MAGE-A Melanomassoziierte Antigene A PEC Plattenepithelkarzinom LP Leukoplakie SCC Squamous cell carcinoma WHO World Health Organisation D0-3 Dysplasiegrad 0 – 3 bzw. beziehungsweise PECM Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle HE- Färbung Hämatoxylin-Eosin Färbung CK Zytokeratine TP53 Tumorsupressorgen 53 IHC Immunhistochemie MAGE Melanoma-assoziierte Antigene CT – Antigene Cancer/Testis – Antigene AD destilliertes Wasser LSAB-Methode Labeled-Strept-Avidin-Biotin-Methode EDTA Ethylendiamintetraacetat TIF Tagged image file DFS-rate Disease free survival rate G1-3 Grading = Differenzierungsgrad 1 – 3 MDR multidrug resistance MRD minimal residual disease 66 10. Anhang 10.1. Herstellungsverzeichnis Objektträger Deckgläser Superfrost® Plus Gerhard Menzel GmbH Saarbrückener Str. 248 D - 38116 Braunschweig Menzel Deckgläser Gerhard Menzel GmbH Saarbrückener Str. 248 D - 38116 Braunschweig HE-Färbung 2-Propanol / Xylol Carl Roth GmbH + Co KG Schoemperlenstr. 3-5 D - 76185 Karlsruhe Hämatoxylin / Eosin Sigma-Aldrich Chemie GmbH Kappelweg 1 Industriegebiet Süd D - 91625 Schnelldorf Salzsäure-Alkohol Entellan Eindeckmedium Merck KGaA Frankfurter Straße 250 D - 64293 Darmstadt Immunhistochemie DAKO Cytomation Autostainer EDTA-Puffer, pH 9,0, (Dako S2367) DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006) Avidin (Dako X0590) Biotin (Dako X0590) Proteinblock (Dako X0909) Antibodydiluent (Dako S2022) Biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A, Dako REAL Detection System K5005) Alkalische-Phosphatase-StreptavidinKomplex (Lösung B, Dako REAL Detection System K5005) Fast-Red-Chromogen (Chromogen + APSubstratpuffer + Levamisol; Dako K5005) Hämalaun (Dako S3301) Dako Deutschland GmbH Neue Flora Stresemannstraβe 161 D-22769 Hamburg Primärantikörper 57B Prof. Giulio C. Spagnoli Onkologische Chirurgie University Hospital Basel Schweiz Primärantikörper 6C1 (ab49386) Abcam plc 330 Cambridge Science Park Cambridge CB4 0FL UK Primärantikörper 6C1 (35-6300) Invitrogen Corporation 542 Flynn Rd Camarillo California 93012-8027 USA 67 Eindeckmedium Aquatex® MERCK KGaA Frankfurter Straße 250 D - 64293 Darmstadt Auswertung Axioskop Axiocam Carl Zeiss Jena GmbH Zeiss Gruppe Unternehmensbereich Mikroskopie D- 07740 Jena Axio Vision Carl Zeiss Vision GmbH Zeppelinstr. 4 D- 85399 München-Hallbergmoos Microsoft SPSS 19.0 Microsoft Excel 2007 Microsoft Corporation Redmond WA USA 68 11. Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Emeka Nkenke für die Überlassung dieses hoch interessanten Themas bedanken, sowie bei Herr Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h. c. Friedrich Wilhelm Neukam für die Möglichkeit an der Mund-, Kieferund Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen diese Dissertation durchführen zu dürfen. An meine Betreuerin Frau Dr. rer. nat. Jutta Ries, die mir stets tatkräftig mit fachlicher Unterstützung und Beratung, sowie persönlichem Engagement zur Seite stand, richte ich einen ganz besonderen Dank. Zudem möchte ich Frau E. Diebel, Frau A. Krautheim-Zenk, Frau S. Schönherr, und Herrn L. Straßburg für die Einarbeitung, Beratung und ständige Hilfsbereitschaft im Labor herzlichst danken. Des Weiteren bedanke ich mich bei meiner Projektpartnerin, Frau Yeeun Kwon, für die freundschaftliche Zusammenarbeit und erfolgreiche Durchführung dieser Forschungsarbeit. Besonderer Dank gilt meinen Eltern, für ihre Anteilnahme, Unterstützung und Motivation, nicht nur bei der Durchführung der Dissertation, sondern während meiner gesamten Ausbildungszeit.