Dokument_5.

Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgische Klinik
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F.W. Neukam
Die Expression melanomassoziierter Antigene A
(MAGE-A) in Leukoplakien der Mundhöhle :
Beurteilung der Bedeutung für das maligne
Entartungsrisiko
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Patricia Gorecki
aus Weiden i.d.Opf.
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan :
Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Referent :
Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Emeka Nkenke
Korreferent : Priv.-Doz. Dr. med. Dr. med. dent. Florian Stelzle
Tag der mündlichen Prüfung: 16.04.2012
Die Promovendin ist Zahnärztin.
In Dankbarkeit meinen Eltern gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung................................................................................................6
1.1. Hintergrund und Ziele......................................................................................6
1.2. Material und Methoden....................................................................................6
1.3. Ergebnisse.......................................................................................................6
1.4. Praktische Schlussfolgerung...........................................................................7
2. Summary...............................................................................................................8
2.1. Background and Aims......................................................................................8
2.2. Materials and Methods....................................................................................8
2.3. Results.............................................................................................................8
2.4. Practical Conclusion........................................................................................9
3. Einleitung.............................................................................................................10
4. Ziel der Arbeit......................................................................................................15
5. Material und Methoden....................... ................................................................16
5.1. Kontrollgewebe.............................................................................................16
5.2. Patienten.......................................................................................................16
5.3. Histologie......................................................................................................17
5.3.1.HE-Färbung...........................................................................................17
5.4. Immunhistochemie (IHC)..............................................................................18
5.4.1. Grundlagen...........................................................................................18
5.4.2. Färbevorgang.......................................................................................20
5.4.3. Auswertung der IHC Färbung...............................................................23
5.5. Statistik.........................................................................................................23
6. Ergebnisse..........................................................................................................24
6.1. Ergebnisse der HE-Färbung.........................................................................24
6.1.1. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP der
Gruppe I................................................................................................24
6.1.2. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP der
Gruppe II...............................................................................................26
6.1.3. Dysplasiegrad-Verteilung im gesamten Patientenkollektiv und deren
Verteilung auf Gruppe I und II......... ....................................................27
6.1.4. Differenzierungsgrad und Stadieneinteilung der Tumore.....................29
6.1.5. Gewebeproben der Gruppe III..............................................................32
6.2. Ergebnisse der IHC Färbungen....................................................................32
6.2.1. Resultate der Gruppe I.........................................................................32
6.2.1.1. Darstellung der IHC – Färbungen...................................................32
6.2.1.2. Auswertung der LP in Gruppe I.......................................................38
6.2.1.3. Auswertung der Tumorfärbungen....................................................42
6.2.2. Ergebnisse der Gruppe II.....................................................................43
6.2.3. Resultate der Gruppe III.......................................................................47
6.2.4. Zusammenfassung der Färberesultate.................................................48
7. Diskussion...........................................................................................................50
8. Literaturverzeichnis.............................................................................................59
9. Abkürzungsverzeichnis........................................................................................65
10. Anhang..............................................................................................................66
10.1. Herstellerverzeichnis...................................................................................66
11. Danksagung.......................................................................................................68
6
1. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziele
Melanomassoziierte Antigene A (MAGE-A) gehören zu den Cancer/TestisAntigenen, die neben der Plazenta und den männlichen Keimdrüsen nur in
maligne
entartetem
Gewebe
exprimiert
werden,
so
auch
im
Plattenepithelkarzinom (PEC). Die Familie besteht aus 12 Subtypen. Bei der
Verwendung mehrerer Antigene ergibt sich ein hochspezifischer Marker für eine
Malignität in der Mundhöhle, was bereits in mehreren Studien bestätigt wurde.
Jedoch wurde ihre Expression in Leukoplakien (LP), der häufigsten
Vorläuferläsion des PECs des Mund- und Rachensraumes, noch nicht
ausreichend untersucht. Ziel der Studie war es zu prüfen, ob über die
Expressionsanalyse von MAGE-A in LP der Mundhöhle und des Oropharynx
auf eine zukünftige maligne Entartung des Gewebes geschlossen werden kann.
1.2. Material und Methoden
Das zur Verfügung stehende historische Patientenkollektiv wurde in drei
Gruppen unterteilt. Gruppe I beinhaltete 48 Patienten mit LP, auf deren Basis
sich ein PEC entwickelt hat. In diesem Patientenkollektiv wurde neben der
fakultativen Präkanzerose ebenfalls der korrespondierende Tumor untersucht.
Gruppe II umfasste 50 LP, welche innerhalb von fünf Jahren keine maligne
Entartung erfahren haben. In Gruppe III dienten 25 Proben gesunder
Mundschleimhaut als Negativkontrolle. Zur histopathologischen Untersuchung
wurden Schnitte von Formalin fixierten Paraffinproben angefertigt. Diese
wurden zum Nachweis der Antigen-Expression mit zwei MAGE-A panspezifischen monoklonalen Antikörpern, dem 57B- und dem 6C1-Antikörper,
gefärbt und ausgewertet. Dabei wurde die Diagnose mit der Expression und
dem Dysplasiegrad, sowie die Expression mit dem Dysplasiegrad korreliert. Zur
statistischen Untersuchung wurde der Chi-Quadrat-Test und der Mann-WhitneyU-Test unter Verwendung eines Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 herangezogen.
1.3. Ergebnisse
Von den 48 LP in Gruppe I wiesen 85,4 % eine MAGE-A-Expression auf. Im
Gegensatz dazu waren alle 50 Präkanzerosen in Gruppe II negativ. Somit
scheint das maligne Entartungspotential von LP über die Expressionsanalyse
7
von MAGE-A hoch spezifisch einschätzbar zu sein, da nur LP, die die
Grundlage eines späteren PECs waren, die Marker exprimierten (p ≤ 0,0001).
Im Gesamtkollektiv (Gruppe I + II) bestand eine statistisch signifikante
Korrelation zwischen maligner Entartung und Dysplasiegrad der Proben (p ≤
0,0001). Ebenfalls waren Dysplasiegrad und MAGE-A-Expression statistisch
signifikant miteinander korreliert (p ≤ 0,001). Bei LP der Gruppe I, die maligne
entarteten, ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen Expression von
MAGE-A und dem Dysplasiegrad der Proben (p = 0,71). Im Bezug auf die
MAGE-A-Expression war der Unterschied zwischen Gruppe I und Gruppe III
statistisch signifikant (p ≤ 0,0001).
1.4. Praktische Schlussfolgerung
Der Nachweis von MAGE-A scheint ein nützlicher zusätzlicher Marker zur
Risikobestimmung des malignen Potentials von LP zu sein. Zukünftig muss die
Vermutung der vorliegenden Studie an größeren Patientenkollektiven geprüft
werden.
Möglicherweise
sollte
der
MAGE-A-Nachweis
bei
LP
als
Entscheidungskriterium für die Wahl des Therapiekonzeptes herangezogen
werden.
8
2. Summary
2.1. Background and Aims
Melanoma-associated antigens A (MAGE-A) belong to the Cancer/Testisantigens family. Apart from the placenta and testis, they are only expressed in
malignant tissue, including squamous cell carcinomas (SCC). The family
consists of 12 subtypes. When making use of several antigens a highly specific
marker emerges, which has been confirmed in a number of studies. To date
their expression has not been sufficiently examined in leukoplakias (LP), the
most common precursor lesions of head and neck SCC.
The aim of this study was to evaluate, whether the expression of MAGE-A in LP
of the head and neck can be used as an evidence of future malignant
transformation of affected tissues.
2.2. Materials and Methods
The histological samples of patients available was divided into three groups.
Group I consisted of 48 patients with LP, which developed into a SCC. The
corresponding tumour was also evaluated. 50 LP, which did not transform into a
malignancy in a 5 years' period, were included in group II. 25 samples of
healthy oral mucosa were part of group III, which served as a negative control.
Formalin embedded samples were used for histopathological examination. In
order to investigate antigen-expression they were stained with two MAGE-A
pan-specific monoclonal antibodies, 57B and 6C1. In order to ascertain the
impact of expression for the estimation of malignant transformation, its
detection was compared to the course of disease and to the grade of dysplasia.
In addition, the progress of disease and the grade of dysplasia were correlated.
Statistical analysis was performed using the Chi-Square-test and MannWhitney-U-test. P-values ≤ 0.05 were considered as an indication of a statistical
significance.
2.3. Results
Out of the 48 potential precursor lesions in group I, 85.4% displayed MAGE-Aexpression. In contrast, all LP in group II were negative. Therefore, the risk for
malignant transformation of LP could be assessed significantly by evaluating
MAGE-A expression, as the marker was only detectable in lesions, that were
9
basis of a prospective tumour (p ≤ 0.0001). The whole patient population (group
I + II) showed a statistically significant correlation between malignant
progression and grade of dysplasia (p ≤ 0.0001). Likewise, malignant grade of
dysplasia and MAGE-A expression were correlated in a statistically significant
way (p ≤ 0.001). After evaluating LP of the group which progressed into a
malignancy, no significant correlation could be ascertained between MAGE-A
expression and the grade of dysplasia (p = 0.71). Referring to the MAGE-A
expression the difference between group I and group III showed statistical
significance (p ≤0.0001).
2.4. Practical Conclusion
The expression of MAGE-A seems to be an additional useful marker in order to
assess the potential of malignant transformation in LP. Prospectively, a larger
patient population has to be examined in order to prove whether the conclusion
suggested in this study could be a helpful tool for the evaluation of LP.
Conceivably, the evidence of MAGE-A in LP should be used as a criterion for
appropriate treatment planning.
10
3. Einleitung
Das Plattenepithelkarzinom (PEC) im Kopf- und Halsbereich steht an sechster
Stelle der am häufigsten auftretenden malignen Neoplasien beim Menschen
weltweit [28, 50, 76] und repräsentiert 3-5% aller Tumorarten [28]. Trotz der
Anwendung multimodaler Therapiekonzepte, welche eine operative Entfernung
des PECs, sowie eine Radiatio und/oder eine Chemotherapie beinhalten,
beläuft sich die 5-Jahresüberlebensrate durchschnittlich nur auf knapp über
50% [38, 49]. Neuere Statistiken des U.S. National Cancer Institute von 2009
zeigen diesbezüglich eine leichte Verbesserung mit Angaben von rund 60% [2].
Bei denjenigen Erkrankten, bei denen die Tumordiagnose in einem frühen
Stadium gestellt wird, beträgt die Überlebenswahrscheinlichkeit sogar rund 80%
[2, 29]. Allerdings werden rund zwei Drittel der erkrankten Patienten erst in
einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, wodurch die Überlebensrate auf
ungefähr 30% absinkt [2, 17, 21, 29, 40, 42].
Bei der Karzinogenese oraler maligner Neoplasien handelt es sich um einen
zweistufigen Prozess. Dabei geht dem Tumor oft eine Vorläuferläsion bzw. eine
Präkanzerose voraus [44, 57]. Die häufigste fakultativ präkanzeröse Läsion im
Mundraum ist die Leukoplakie (LP), welche in 1 bis 18% der Fälle maligne
entartet [57]. Insgesamt basieren zwischen 11 und 67% aller PECs der
Mundhöhle (PECM) auf dieser Art von Vorstufen [65]. Laut WHO handelt es
sich dabei um weiße, nicht abwischbare Veränderungen der Mundschleimhaut,
die keiner anderen Gewebeveränderung zugeordnet werden können [53]. Das
histologische Erscheinungsbild dieser fakultativen Präkanzerosen stellt sich in
Form einer epithelialen Hyperplasie (D0) oder Dysplasie (D1 – D3) dar. Heute
gilt je höher der Dysplasiegrad, desto höher wird das Entartungsrisiko
eingeschätzt [16, 24, 25, 53, 68, 75]. Bei Hyperplasien (D0) liegt es bei 0-3%,
bei leichten Dysplasien (D1) bei 0-30%, bei mäßigen Dysplasien (D2) bei 044% und steigt bei schweren Formen (D3) auf 20-67% an [4, 14, 26, 54].
Aus den erwähnten Daten und Tatsachen wird ersichtlich, dass eine frühzeitige
Identifikation
oraler
Gewebeveränderungen
mit
einem
hohen
Malignitätspotential und eine Frühdiagnose der sich daraus entwickelten
Tumore von höchster klinischer Bedeutung ist.
Zur Einstufung des Dysplasiegrades und somit auch des Entartungsrisikos
einer Läsion wird bis heute eine histopathologische Untersuchung des zuvor
biopsierten und HE-gefärbten verdächtigen Gewebes durchgeführt [24]. An
11
diesem Ergebnis orientiert sich die weitere klinische Behandlungsplanung, was
den hohen Stellenwert dieser Methode unterstreicht [27, 44, 57, 75]. Allerdings
birgt
die
lichtmikroskopische
Untersuchung
Fehlerquellen
in
sich.
Verschiedene Pathologen stufen dysplastisches Gewebe oft unterschiedlich
ein und somit ist die Methode subjektiv [5, 14, 33, 43, 44, 57, 75]. Zudem
bedeutet die Diagnose „hohe Dysplasie“ nicht zwingend eine zukünftige
Entartung und maligne Neoplasien können sich in einigen Fällen auch aus
zuvor nicht dysplastisch veränderten D0 - Läsionen entwickeln [16, 24, 25, 44,
53, 57, 68, 75]. Aus dieser Problematik lässt sich schlussfolgern, dass sowohl
eine Objektivierung der bisher angewandten Methoden, als auch eine
Verbesserung
der
Einschätzung
Mundschleimhautveränderungen,
vor
des
allem
malignen
von
Potentials
hyperplastischen
von
D0-
Gewebeveränderungen, über neue Ansätze erforderlich ist [57].
Eine mögliche Lösung wäre hierfür die Verwendung von molekularbiologischen
Markern [27, 44, 57]. Zu nennen wären hier die tumorassoziierten Antigene,
welche in gesunden und malignen Zellen differenziell exprimiert werden. An
Hand ihrer unterschiedlichen Expressionsmuster in verschiedenen Geweben
könnte die Gefahr, die von einer klinisch festgestellten Veränderung ausgeht,
beurteilt werden [57]. Meist werden diese im Vergleich zum gesunden Gewebe
im entarteten vermehrt exprimiert. Es wurde bereits eine Reihe von Genen aus
der genannten Gruppe, welche eine Signifikanz bei einem vorhandenen PECM
aufweisen, identifiziert und ihre Assoziation mit dem gesicherten Tumor-Befund
oder
einer
Epitheldysplasie
postuliert.
Hierzu
gehören
u.a.
die
Differenzierungsantigene und Proteine, die den Zellzyklus steuern [1, 7, 18, 19,
20, 23, 37, 57].
Differenzierungsantigene werden im Ursprungsgewebe des Tumors konstitutiv
exprimiert und in malignen Neoplasien im Vergleich dazu überexprimiert. Im
Fall des PECMs, wie auch anderer Karzinome epithelialer Herkunft, sind dies
die Zytokeratine (CK), die am Aufbau des Zytoskeletts sowohl gesunder, als
auch maligner Zellen beteiligt sind. Eine Überexpression von CK stellt einen
diagnostischen und prognostischen Marker dar [69 - 72]. Ein regelrechter
Ablauf des Zellzyklus wird u.a. vom Tumorsuppressorgen p53 (TP53) reguliert
[57], welches Zellen davor schützt DNA-Mutationen zu akkumulieren [22, 34].
Der Wildtyp arretiert genetisch geschädigte Zellen in der G1-Phase und
ermöglicht somit die Reparatur ihrer DNA vor der Replikation [6, 22]. Bei einer
12
irreversiblen DNA-Schädigung wird die Apoptose durch TP53 eingeleitet [6, 10,
15]. Mutationen von TP53, die zum Funktionsverlust führen, sollten daher die
Tumorentstehung fördern. Veränderungen des Gens wurden bereits bei der
Karzinogenese
im
oberen
Aerodigestivtrakt
dokumentiert
und
ihr
diagnostischer und prognostischer Wert postuliert [3, 9, 74].
Das Defizit der bisher vorgestellten Gene ist allerdings ihre Anwesenheit in
unveränderter, gesunder Schleimhaut. Dies bedeutet, dass die Beurteilung auf
Grund
der
nötigen
Intensitätsmessung
bei
der
Verwendung
in
der
Immunhistochemie (IHC) sehr aufwendig ist und weiterhin subjektiv verbleibt.
Daher wären für die Diagnostik und Prognose veränderter Gewebe diejenigen
Marker von großem Vorteil, deren Expression ausschließlich in malignen Zellen
detektiert werden kann und welche in gesunder Mundschleimhaut nicht
nachweisbar sind [31]. Diese Eigenschaft würde die geforderten Kriterien
erfüllen und somit die Entscheidungsfindung erleichtern und objektivieren.
Gene, die mit Ausnahme der männlichen Keimzellen und der Plazenta, nur in
bereits maligne transformierten Zellen gefunden werden können, sind die
Cancer/Testis (CT-) Antigene. Sie weisen eine 100%-ige Spezifität für malignes
Gewebe auf [31, 62, 63, 64, 66].
Zu ihnen zählen melanomassoziierte Antigene (MAGE) – A, welche im Fall des
PECMs nachgewiesen und bereits gut untersucht worden sind [47, 59, 60].
Insgesamt gehören zu dieser Genfamilie 12 Mitglieder, von denen MAGE-A7,
ein Pseudogen, als einziges nicht transkribiert wird [8, 11, 31, 61]. Die
einzelnen MAGE-A werden im oralen PEC mit unterschiedlicher Häufigkeit
exprimiert, wobei die Expressionsfrequenz eines einzelnen Gens höchstens
54% beträgt. Zusätzlich ist das Expressionsmuster heterogen, was die
Methode nicht sensitiv genug erscheinen lässt [12, 46, 59, 60]. Durch die
Verwendung von mehreren Antigenen kann diese Problematik jedoch
umgangen werden. Es konnte in vorhergehenden Studien bereits gezeigt
werden, dass der Nachweis der Expression auf 72% bei der Untersuchung von
sechs und auf 85% bei sieben Mitgliedern der MAGE-A Familie gesteigert
werden kann [47, 59, 60]. Bei der Analyse von 10 Antikörpern konnte sogar
eine Expressionsrate von 93% erzielt werden [58]. Somit erfüllt diese
Gengruppe
die
Kriterien
der
Spezifität
und
Sensitivität
für
maligne
transformierte Zellen der Mundschleimhaut und erlaubt eine Unterscheidung
zwischen malignem und gesundem Gewebe. Ob die Antigene auch in
13
Vorstufen des PECMs exprimiert werden, ist bislang allerdings nur wenig
erforscht. Krauss et al. widmeten sich in ihrer Studie als eine der ersten
Gruppen benignen und potentiell malignen Vorläuferläsionen des oralen PECs
[35]. Dabei konnten sie zeigen, dass MAGE-A in keiner gutartigen
Gewebeveränderung nachweisbar waren. Zwischen 33% und 65% der
potentiellen Präkanzerosen ließen sich mit Hilfe der Antigene anfärben. Sie
kamen zu der Schlussfolgerung, dass zwischen der Expression von MAGE-A,
der Art der Vorläuferläsion und dem Dysplasiegrad ein Zusammenhang
bestehe. Dabei soll ein höherer Dysplasiegrad mit einer gesteigerten
Expressionsrate korrelieren. Bei dieser Studie wurden allerdings nur potentiell
maligne Vorstufen des PECMs untersucht ohne Berücksichtigung, ob die
Läsion im Nachfolgenden maligne entartet ist oder nicht. Daher wäre als
Nachteil der Arbeit zu nennen, dass keine Verlaufsuntersuchungen der
Gewebeveränderungen vorlagen und somit nicht nachgewiesen wurde, ob ein
Zusammenhang zwischen der Expression von MAGE-A und der malignen
Entartung der Mundschleimhautläsionen besteht. Außerdem wurden nur
wenige Proben untersucht, die keine Dysplasien enthielten und auch von
diesen Patienten ist die klinische Weiterentwicklung der Gewebeveränderung
nicht dokumentiert. Folglich konnte die oben erwähnte D0-Problematik in
dieser Studie nicht geklärt werden. Zusätzlich wurde ein breites klinisches
Spektrum von benignen, z.B. Ulcera oder Lichen planus, und fakultativen bzw.
obligaten
Präkanzerosen,
wie
z.B.
LP
oder
Erythroplakien,
der
Mundschleimhaut untersucht, so dass das Patientenkollektiv in den einzelnen
Untergruppen nicht sehr groß war. Dadurch ist die Aussagekraft der
Ergebnisse im Vergleich zu Studien mit höheren Fallzahlen unterlegen. Es ist
unerlässlich weitere Untersuchungen in diesem Bereich durchzuführen, welche
Nachuntersuchungen von Schleimhautveränderungen mit einbeziehen, um
den wahren Wert der Untersuchung der MAGE-A Expression für die
Bestimmung des Krebsrisikos, das von der LP ausgeht, zu bestimmen.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Expressionsmuster der MAGE-A in Formalin
fixierten
Proben
dysplastischen
LP
von
histologisch
eines
möglichst
gesicherten
großen
hyperplastischen
Patientenkollektivs
und
mittels
Immunhistologie zu bestimmen. Die Ergebnisse sollen mit dem Dysplasiegrad
und mit der klinischen Entwicklung der fakultativen Präkanzerose korreliert
14
werden. Auf diese Weise soll geprüft werden, ob der Nachweis von MAGE-A
als klinischer Parameter für das Malignitätspotential von LP verwendet werden
kann. Außerdem soll untersucht werden, ob der Dysplasiegrad tatsächlich ein
ausschlaggebender Hinweis für die maligne Entartung der Vorläuferläsionen ist
oder ob nicht auch hyperplastische D0-Veränderungen eine potentielle
Entartungstendenz besitzen.
Die genaue Einschätzung der Prognose über den Nachweis des Markers wäre
auch klinisch für die Planung der Therapie von entscheidender Bedeutung.
Somit könnten LPs, die ein nachgewiesenes malignes Potential in sich tragen,
frühzeitig und effektiv behandelt werden. Zudem könnten betroffene Patienten
in kürzeren Intervallen zur Nachuntersuchung einbestellt werden. Eine spätere
Entartung mit den drastischen Konsequenzen, einschließlich der für die
Patienten sehr invasiven und beeinträchtigenden chirurgischen Rekonstruktion
und
der
adjuvanten
Therapiekonzepte,
sowie
ihrer
Folgen
bzw.
Nebenwirkungen könnte umgangen werden. Nicht zuletzt könnten mit Hilfe der
Antigene neue Behandlungsstrategien erforscht und entwickelt werden, wie
z.B. eine mögliche Immuntherapie, welche den Patienten in Zukunft als
alternative neoadjuvante oder adjuvante Begleittherapie zum operativen
Eingriff angeboten werden könnte.
15
4. Zielsetzung
Ziel der Studie ist es zu prüfen, ob durch den immunhistologischen Nachweis
von MAGE-A in Leukoplakien der Mundhöhle und des Oropharynx auf die
Entwicklung eines PECs geschlossen werden kann. Auf diese Weise soll
beurteilt werden, ob die Expressionsanalyse von MAGE-A in LP der genannten
Regionen einen Beitrag zur Früherkennung von Tumoren oder von Patienten,
die ein erhöhtes Entartungsrisiko dieser Gewebeveränderungen besitzen,
liefern kann.
Die Hypothesen des Projekts sind wie folgt:
•
MAGE-A lassen sich immunhistologisch in LP der Mundhöhle und des
Oropharynx in genauso großer Zahl wie in PEC nachweisen.
•
Wenn MAGE-A in einer LP der Mundhöhle oder des Oropharynx
nachgewiesen wird, entwickelt sich im Verlauf ein PEC in der
entsprechenden anatomischen Region.
•
Wenn MAGE-A in einer LP der Mundhöhle oder des Oropharynx nicht
nachgewiesen wird, entwickelt sich in einem 5-Jahreszeitraum kein PEC
im Mund- bzw. Rachenraum.
Somit könnten bereits maligne transformierte Zellen durch molekularbiologische
und immunhistologische Methoden in den Vorläufern des PECs der Mundhöhle
bzw. des Oropharynx nachgewiesen werden und Hochrisikopatienten besser
identifiziert werden. Diese Methode könnte neben der histopathologischen
Untersuchung ein zusätzliches Kriterium für eine chirurgische und/oder eine
adjuvante Therapieentscheidung, sowie ein Ansatz für die Entwicklung neuer
Therapiekonzepte bilden.
16
5. Material und Methoden
5.1. Kontrollgewebe
Für den Nachweis von MAGE-A diente als Positivkontrolle Gewebe von
männlichen Keimzellen. Zudem lag Gewebematerial von bereits histologisch
gesicherten Tumorpatienten vor, das als weitere Positivkontrolle mitgeführt
wurde.
Als Negativkontrolle wurde normale Mundschleimhaut gesunder Probanden
verwendet.
5.2. Patienten
Zur Untersuchung der Expressionsmuster von MAGE-A wurden in der Studie
Formalin fixierte Paraffinproben verwendet. Diese stammen von einem
historischen
Patientenkollektiv
mit
Schleimhautveränderungen
in
der
Mundhöhle und im Rachenraum, welche in einem Zeitraum zwischen 1997 und
2009 diagnostiziert, entnommen und archiviert wurden. Daraus ließen sich drei
Patientengruppen bilden, welche in Tabelle 1 zusammengefasst sind:
In Gruppe I wurden diejenigen Patienten aufgenommen, bei denen sich
basierend auf einer LP innerhalb von 5 Jahren ein PEC der Mundhöhle oder
des Oropharynx entwickelt hat.
Neben der Vorläuferläsion wurde in diesem Patientenkollektiv ebenfalls das
korrespondierende PEC untersucht und die Expression von MAGE-A analysiert.
Gruppe II umfasst diejenigen Patienten, bei denen in den Jahren 1997 bis 2005
eine
LP
diagnostiziert
wurde.
Bei
diesem
Kollektiv
sind
„follow-up“
Untersuchungen vorhanden, um auszuschließen, dass sich in einem 5 -Jahreszeitraum aus der Schleimhautveränderung ein PEC entwickelt hat.
Gruppe
III
besteht
aus
Proben
gesunder
Probanden,
welche
keine
pathologischen Veränderungen des Mundschleimhautgewebes aufwiesen.
Dieses Gewebematerial diente als Negativkontrolle.
17
Gruppe
Krankheitsverlauf
I
LP auf deren Basis sich ein PEC entwickelt hat
II
LP ohne malige Entartung in einem Zeitraum von 5 Jahren
III
gesunde orale Schleimhaut
Tabelle 1 : Gruppeneinteilung des vorhandenen Patientenkollektivs
Die lichtmikroskopische Untersuchung der HE- und immunhistologisch
gefärbten
Gewebeproben
wurde
von
zwei
unabhängigen
Pathologen
durchgeführt, um die Beurteilung der Färbungen und die Diagnose zu
objektivieren.
5.3 Histologie
5.3.1. HE-Färbung
Diese histologische Methode wurde durchgeführt, um den Dysplasiegrad der LP
einzustufen und das Grading der PECs durchzuführen.
Dabei wurden die Formalin fixierten Paraffinschnitte aller Gewebeproben
zunächst entparaffiniert. Hierzu verblieben die Schnitte dreimal 15 Minuten in
Xylol und durchliefen danach eine absteigende Propanolreihe. Daraufhin
wurden sie in Aqua dest. (AD) gegeben (Tabelle 2).
Entparaffinierung
Xylol
Minuten
3 x 15'
100% Isopropanol
5'
100% Isopropanol
5'
96% Isopropanol
5'
96% Isopropanol
5'
90% Isopropanol
5
70% Isopropanol
5'
70% Isopropanol
5'
Aqua dest.
2'
Tabelle 2 : Protokoll zum Entparaffinieren der Schnitte
18
Für die eigentliche HE-Färbung wurden die Proben für fünf Minuten in
Hämatoxylin (Fa. Sigma) getaucht und danach kurz in HCl-Alkohol differenziert.
Sie wurden daraufhin fünf Minuten mit Wasser fließend gewässert, um den
überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Drei Minuten wurden sie in AD
belassen, bevor sie für fünf Sekunden in Eosin (Fa. Sigma) getaucht wurden.
Es folgte eine Spülung in AD und die Durchführung einer aufsteigenden
Propanolreihe.
Es
wurden
die
gleichen
Propanolkonzentrationen
und
Zeiteinheiten eingehalten, wie bei der bereits erwähnten absteigenden
Alkoholreihe. Dabei löst das 70%-ige und 90%-ige Propanol den Farbstoff
Eosin aus den Schnitten. Zuletzt verblieben die Proben zweimal je fünf Minuten
in Xylol und wurden mit dem Eindeckmedium Entellan (Fa. Merck) eingedeckt.
5.4. Immunhistochemie (IHC)
5.4.1. Grundlagen
Diese Methode ermöglicht es definierte Proteine mit Hilfe von spezifischen
Antikörpern sichtbar zu machen und zu lokalisieren. Dabei spielt die Affinität
des
Antikörpers
zu
dem
entsprechenden
Epitop
des Antigens
eine
entscheidende Rolle, da diese die Grundlage für eine starke Bindung und somit
auch für den Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion ist.
Das in diesem Projekt verwendete IHC Verfahren basiert auf einer indirekten
Färbemethode,
Methode
der
(Abbildung
sogenannten
1).
Dabei
Labeled–Strept–Avidin-Biotin
wird
zunächst
ein
(LSAB-)
unkonjugierter
Primärantikörper auf das zu untersuchende Gewebe appliziert. In einem
zweiten Schritt wird der biotinylierte Sekundärantikörper, welcher sich gegen die
konstante Kette des primären richtet, aufgebracht. An diesen Komplex bindet
dann Avidin bzw. Streptavidin, wobei Biotin als Bindungspartner fungiert. Jedes
Avidin- bzw. Streptavidin-Molekül besitzt vier Bindungsstellen für BiotinMoleküle, wodurch eine Signalamplifikation erreicht wird. Eine anschließende
Farbentwicklung wird durch die Inkubation mit einer Chromogen-Lösung
ermöglicht, welche in diesem Projekt auf alkalischer Phosphatase basiert [39].
Die LSAB – Methode lässt sich wie folgt knapp zusammenfassen :
Unkonjugierter Primärantikörper + biotinylierter Sekundärantikörper + AvidinBiotin-Enzymkonjugat + Substrat/Chromogen → Farbentwicklung
19
Streptavidin-BiotinEnzym-Komplex
Biotinylierter
Sekundärantikörper
Primärantikörper
Gewebeantigen
Abbildung 1 : schematische Darstellung der LSAB – Methode
(http://www.dako.com/de/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_9.pdf
als Bildquelle, bearbeitet mit Microsoft Office PowerPoint 2007 )
Die Färbungen wurden an den vorhandenen Formalin fixierten Paraffinschnitten
aus den drei gebildeten Patientengruppen durchgeführt. Zum Nachweis der
MAGE-A auf Proteinebene wurden zwei monoklonale Primärantikörper
verwendet, zum einen der 57B - (Prof. Spagnoli, Basel, Schweiz) und zum
anderen der 6C1 – (abcam, Cambridge, UK bzw. Invitrogen Corporation,
Camarillo, California, USA) Antikörper. Die Eigenschaften der Primärantikörper
und die bei den Färbungen zur Anwendung gekommenen Konzentrationen
können Tabelle 3 entnommen werden.
Die genannten Antikörper erkennen gemeinsame Epitope, welche spezifisch für
MAGE- A1, MAGE- A2, MAGE- A3, MAGE- A4, MAGE- A6, MAGE- A10 und
MAGE-A12 sind. Dadurch wird der simultane Nachweis der Antigene
ermöglicht.
Eine Antikörperbindung ist eingetreten, wenn eine nukleäre und/oder eine
zytoplasmatische Färbung der Zellen im Hellfeld erkennbar ist.
20
Primärantikörper
Firma
gewonnen
aus
gerichtet
gegen
Typus
Konzentration
d. Primärantikörpers
57B
Prof. Giulio
C. Spagnoli,
Onkologische
Chirurgie,
University
Hospital
Basel,
Schweiz
Maus
MAGE-A 1-4, monoklonal
6 und 12
1:20
6C1
(ab49386)
abcam,
Cambridge,
UK
Maus
MAGE-A 1-4, monoklonal
6, 10 und 12
1:50
6C1
(35-6300)
Invitrogen,
Camarillo,
California,
USA
Maus
MAGE-A 1-4, monoklonal
6, 10 und 12
1:50
Tabelle 3 : Hersteller, Eigenschaften und angewandte Konzentrationen der
verwendeten Primärantikörper
5.4.2. Färbevorgang
Die Färbeprotokolle für beide zur Verwendung gekommenen Antikörper sind
identisch und werden daher zusammen beschrieben werden.
Damit eine spätere Antigen-Antikörper-Bindung stattfinden konnte, wurden die
Gewebeschnitte zunächst einer Vorbehandlung unterzogen. Hierfür wurden die
Proben mit Hilfe von Xylol entparaffiniert und nachfolgend über die absteigende
Propanolreihe mit 100%-, 96%-, 90%- und 70%-igem Isopropanol und AD
rehydriert. Anschließend folgte eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung im
EDTA - Puffer ( pH 9,0 ) bei 100°C für 20 Minuten. Nach Abkühlung der Proben
wurden diese über Nacht in AD im Kühlschrank gelagert.
Am folgenden Tag wurde der vollautomatische Hauptfärbevorgang mit Hilfe des
DAKO Cytomation Autostainers plus (DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg)
durchgeführt, in welchem die vorbehandelten Objektträger und benötigten
Reagenzien eingelegt waren.
Bei jedem Durchlauf wurde eine Positivkontrolle mitgeführt, die das gleiche
Procedere durchlief, wie die zu testenden Gewebeproben. Damit wurde
21
sichergestellt, dass eine adäquate Färbung vollzogen wurde. Zusätzlich wurde
eine Negativkontrolle mitgefärbt, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen.
Diese wurde mit denselben Reagenzien behandelt wie die restlichen Schnitte,
mit Ausnahme des jeweiligen Primärantikörpers.
Zuerst wurden die Proben mit Avidin (DAKO), danach mit Biotin (DAKO)
inkubiert, um falsch positive Ergebnisse durch eine mögliche Reaktion von
endogenem
Biotin
zu
verhindern.
Im
weiteren
Verlauf
folgte
eine
Proteinblockierung mit Protein-Block-Serum Free (DAKO) zur Vermeidung von
unspezifischen Reaktionen. Hierauf schloss sich die Behandlung mit einem der
beiden monoklonalen Antikörper an – dabei wurde 57B im Verhältnis 1:20, 6C1
im Verhältnis 1:50, mit Antibodydiluent (DAKO) verdünnt. Als sekundärer
Antikörper fungierten biotinylierte Ziege-Anti-Maus-Immunglobuline (DAKO
REAL Detection System AB2, DAKO). Durch die Markierung mit Biotin wird die
Empfindlichkeit des Detektionssystems erhöht, denn nachfolgend können
mehrere mit alkalischer Phosphatase konjugierte Streptavidin-Moleküle (DAKO
REAL Detection System AP, DAKO) mit dem gebildeten Komplex reagieren.
Diese Reaktion wird mit Hilfe des eigentlichen Farbstoffes Fast-Red
Chromogen (DAKO REAL RED, DAKO) sichtbar gemacht. Dazu wird das
Chromogen mit dem AP Substrate Buffer (DAKO REAL, DAKO) verdünnt,
nachdem diesem ein Tropfen Levamisol (DAKO REAL, DAKO) hinzugefügt
wurde. Die Aufgabe des Levamisols ist es die endogene alkalische
Phosphatase zu blockieren. Durch Fast-Red (Naphtol AS-MX-Phosphat) kommt
es durch die stattfindende Hydrolyse zu einem rot-braunen Farbprodukt. Dieser
Schritt stellt das Ende des vollautomatischen Hauptfärbevorgangs dar.
Anschließend wurde von Hand eine Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO)
vorgenommen
Die
überschüssige
Farbe
wurde
unter
fließendem
Leitungswasser entfernt. Danach wurden die Schnitte in AD getaucht, bevor sie
abschließend getrocknet und mit Aquatex (Fa. Merck, Darmstadt, Germany)
eingedeckt wurden.
Das vollständige Färbeprotokoll kann Tabelle 4 entnommen werden.
22
Zeitdauer (Minuten)
Anwendung
Entparaffinierung und
Vorbehandlung von
Hand
3 x 15'
Xylol
jeweils 3'
absteigende Propanolreihe (2x100%, 2x96%, 1x90%,
2x70%)
3'
AD
20'
Kochen in EDTA-Puffer, pH 9,0, 100°C (Dako S2367)
20'
Abkühlen in EDTA-Puffer
über Nacht
AD, im Kühlschrank
Hauptfärbung im
Autostainer
15'
Avidin (Dako X0590)
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
15'
Biotin (Dako X0590)
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
30'
Proteinblock (Dako X0909)
60'
Primärantikörper,
verdünnt in Antibodydiluent (Dako S2022)
57B (Hybridomaüberstand, Prof. Spagnoli) –
Verdünnung 1:20
6C1 (abcam ab49836 bzw. Invitrogen 35-6300) –
Verdünnung 1:50
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
15'
Biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A, Dako REAL
Detection System K5005)
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
15'
Alkalische-Phosphatase-Streptavidin-Komplex (Lösung B,
Dako REAL Detection System K5005)
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
8'
Fast-Red-Chromogen (Chromogen 1/2/3 + APSubstratpuffer + Levamisol; Dako K5005)
Spülung
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
6' (bei 6C1-Färbung) bzw. Fast-Red-Chromogen (Chromogen 1/2/3 + AP4' (bei 57B-Färbung)
Substratpuffer + Levamisol; Dako K5005)
Spülung
AD
23
Färbung von Hand
5'
Hämalaun (Dako S3301)
5'
Spülen unter fließendem Leitungswasser
5'
AD
Eindecken mit Aquatex (Fa. Merck)
Tabelle 4 : Färbeprotokoll für die IHC Färbung mit 57B-/6C1-Primärantikörper
5.4.3. Auswertung der IHC-Färbung
Die Gewebeproben wurden nach erfolgter Färbung und Eindeckung unter
Verwendung eines Mikroskops mit integrierter Digitalkamera (Axio Cam, Carl
Zeiss, Jena, Germany) ausgewertet und digitalisiert.
Es wurden Bilder von 10-fachen, 20-fachen oder 40-fachen Vergrößerungen
der Schnitte angefertigt und somit die hyperplastisch und dysplastisch
veränderten Epithel-Areale dokumentiert. Die Bilder wurden im komprimierten
Tif-Dateiformat gespeichert.
Die HE- und IHC-angefärbten Schnitte wurden von zwei unabhängigen
Pathologen bewertet und die Ergebnisse miteinander verglichen.
5.5. Statistik
Das Tabellenkalkulationsprogram Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond, WA,
USA) diente dazu, die gewonnenen Ergebnisse tabellarisch und graphisch
darzustellen.
Zur statistischen Auswertung der Daten wurde das Statistikpaket SPSS für
Windows Version 19.0 angewendet. Die Angaben für die Häufigkeitswerte im
Rahmen der deskriptiven Statistik wurden als absolute und relative Häufigkeiten
(%-Werte) angegeben. Signifikante Unterschiede wurden mit dem Chi-QuadratTest und dem Mann-Whitney-U-Test für unabhängige Stichproben berechnet.
Dabei wurde ein Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 verwendet.
24
6. Ergebnisse
6.1. Ergebnisse der HE-Färbungen
Nach der Untersuchung der gefärbten Gewebeschnitte durch die Pathologen
konnten genaue Angaben zu den Dysplasiegraden der vorhandenen LP, sowie
zum Differenzierungsgrad (= Grading) und der Stadieneinteilung (= Staging) der
Tumore und den jeweiligen prozentualen Verteilungen gemacht werden.
6.1.1. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad-Verteilung der LP in
Gruppe I
Die Einschlusskriterien wurden nur von 26 oral lokalisierten LP erfüllt. Aus
diesem Grund wurden auch fakultative Präkanzerosen aus dem Oropharynx in
das Projekt mit einbezogen. Dadurch konnte die Fallzahl um 22 pharyngeale
Gewebeveränderungen erweitert werden. Somit war es möglich insgesamt 48
LP immunhistochemisch zu untersuchen. Die zunächst angestrebte Fallzahl
von 50 erkrankten Patienten konnte wegen vorgefallener Gewebeverluste des
pathologischen Instituts nicht erfüllt werden.
Von den 48 gefärbten Läsionen stammten 31 von männlichen Patienten, was
einem Prozentsatz von 64,6 % entspricht, und 17 fakultative Präkanzerosen
bzw. 35,4 % wurden bei weiblichen Patienten diagnostiziert. Das Verhältnis
Männer : Frauen lag somit ungefähr bei 2 : 1 .
Das Durchschnittsalter aller überprüften Patienten bei der Erstdiagnose der LP
betrug 60,2 Jahre. Für beide Geschlechter getrennt betrachtet, ergaben sich
folgende Werte: Die männlichen Erkrankten hatten im Schnitt ein Alter von 59,2
Jahren, die weiblichen ein Alter von 62,2 Jahren.
Die
mittlere
Überlebensdauer
(DFS-rate)
bis
zur
Transformation
der
Vorläuferläsion in ein PEC lag insgesamt bei 18,5 Monaten. Bei den
männlichen Patienten ergab sich eine durchschnittliche DFS-rate von 21,5
Monaten, bei den weiblichen lediglich von 12,8 Monaten.
Die Läsionen manifestierten sich in der Periode zwischen 1997 und 2009.
Es waren alle Dysplasiegrade – D0, D1, D2 und D3 – vertreten. Es folgt eine
kurze Erläuterung zu den jeweiligen Stadien:
25
D0 bedeutet, dass keine Dysplasie des Epithels vorliegt.
Im D1 Stadium liegt eine dysplastische Veränderung im basalen Drittel vor.
D2 beschreibt eine Dysplasie sowohl im basalen, als auch im mittleren Drittel.
Im Fall eines D3 Stadiums liegt eine dysplastische Veränderung in der
gesamten Epithelschicht vor.
Die genaue Verteilung und die korrespondierenden Prozentzahlen sind in
Diagramm 1 und Tabelle 5 dokumentiert.
Dysplasiegrad-Verteilung
Gruppe I
31,25%
14,58%
31,25%
22,92%
D0
D1
D2
D3
Diagramm 1 : Graphische Darstellung der Dysplasiegrad-Verteilung in Gruppe I
Dysplasiegrad
Anzahl
Prozentanteil
0
15
31,25 %
1
11
22,92 %
2
15
31,25 %
3
7
14,58 %
Total
48
100%
Tabelle 5 : Dysplasiegrad-Verteilung für die LP in Gruppe I
26
6.1.2. Klinische Kriterien und Dysplasiegrad Verteilung der LP in
Gruppe II
Dieses Kollektiv enthielt genau 50 Gewebeproben, die den Einschlusskriterien
entsprachen. Die untersuchten Vorläuferläsionen entstammten alle der
Mundschleimhaut. Davon wurden 52 % der LP bei männlichen Patienten
diagnostiziert, was einer Anzahl von 26 fakultativen Präkanzerosen entspricht.
Die restlichen 48 % bzw. 24 Gewebeveränderungen wurden bei Frauen
festgestellt. Folglich lässt sich in dieser Gruppe ein nahezu gleiches Verhältnis
Männer : Frauen von 1 : 1 erkennen.
Das Durchschnittsalter der Patienten bei der Primärdiagnose der Läsion lag
insgesamt bei 47, 2 Jahren. Betrachtet man die beiden Geschlechter erneut
getrennt voneinander, waren die Männer im Schnitt 44,3 Jahre alt, die Frauen
50,4 Jahre.
Im Gegensatz zu den LP der Gruppe I wiesen die Gewebeproben in Gruppe II
keine Dysplasien des Grades 3 auf. Sie beinhalteten somit die Dysplasiegrade
D0 bis D2.
Die prozentuale Verteilung kann Diagramm 2 und Tabelle 6 entnommen
werden.
Dysplasiegrad-Verteilung
Gruppe II
6,0%
52,0%
42,0%
D0
D1
D2
Diagramm 2 : Graphische Darstellung der Dysplasiegradverteilung in Gruppe II
27
Dysplasiegrad
Anzahl
Prozentanteil
0
26
52,0 %
1
21
42,0 %
2
3
6,0 %
Total
50
100%
Tabelle 6 : Verteilung der Dysplasiegrade in Gruppe II
6.1.3. Dysplasiegrad-Verteilung im gesamten Patientenkollektiv und
deren Verteilung auf Gruppe I und II
Der Chi-Quadrat bzw. Mann-Whitney-U-Test (p ≤ 0.0001) zeigen, dass die
maligne Transformation signifikant mit dem Dysplasiegrad der Läsion korreliert
und somit mit zunehmendem Dysplasiegrad auch das Entartungsrisiko der LP
steigt. Das wird auch dadurch verdeutlicht, dass mit insgesamt 63,42% im D0
Stadium mehr Läsionen, die innerhalb von fünf Jahren nicht entartet sind,
vertreten sind, gegenüber derer (36,58%), auf deren Basis sich ein PEC
entwickelt hat. Im Gegensatz dazu ist beispielsweise im Dysplasiegrad 2 eine
fünffach höhere Anzahl an LP, die im weiteren Verlauf maligne entartet sind im
Vergleich zu denen, die keine Transformation erfahren haben, vorhanden.
Betrachtet man die Verteilung der Dysplasiegrade innerhalb der einzelnen
Gruppen zeigt sich, dass von allen Gewebeveränderungen mit dem
Dysplasiegraden D0 und D1 rund 36,58 bzw. 34,38% maligne entarten und
dieses Risiko auf 83,33 und 100% für D2 und D3 ansteigt. Umgekehrt finden
sich nur 16,67% Läsionen,welche nicht entarten, in D2. Festzustellen ist an
dieser Stelle erstens, dass das potentielle Risiko, das von Läsionen mit
geringen oder nicht auftretenden histologischen Veränderungen ausgeht, durch
die histopathologische Untersuchung nicht vollständig erfasst wird, und
zweitens, dass das Risiko, das von Veränderungen die als D0 und D1
klassifiziert wurden, ähnlich hoch ist.
Die Verteilung der Dysplasiegrade des ganzen Patientenkollektivs ist in Tabelle
7 numerisch und in Tabelle 8 prozentual wiedergegeben.
28
Die dazugehörigen graphischen Darstellungen werden durch Diagramm 3 und
Diagramm 4 erfasst.
Dysplasiegrad
D0
D1
D2
D3
Insgesamt
Gruppe I
15
11
15
7
48
Gruppe II
26
21
3
0
50
Insgesamt
41
32
18
7
98
Tabelle 7 : Dysplasiegrad-Verteilung aller untersuchten Vorläuferläsionen
Dysplasiegrad-Verteilung
des gesamten Patientenkollektivs
7
18
41
D0
D1
D2
32
D3
Diagramm 3 : graphische Darstellung der Dysplasiegrad-Verteilung aller LP
Dysplasiegrad
D0
D1
D2
D3
Gruppe I
36,58 %
34,38 %
83,33 %
100 %
Gruppe II
63,42 %
65,62 %
16,67 %
0%
Tabelle 8 : prozentuale Dysplasiegrad-Verteilung aller untersuchten LP
29
Dysplasiegrad-Verteilung
Gruppe I & II
100,0%
90,0%
80,0%
Anzahl [%]
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
,0%
D0
D1
D2
D3
Dysplasiegrad
Gruppe I LP
Gruppe II LP
Diagramm 4 : Korrelation aller untersuchten LP zwischen ihrem Dysplasiegrad und
ihrer Gruppenzugehörigkeit
6.1.4. Differenzierungsgrad und Stadieneinteilung der Tumore
Die Läsionen wurden in dem Zeitraum zwischen 1997 und 2009 diagnostiziert
und behandelt. Auf Grund der Problematik mit Gewebeverlusten im
pathologischen Institut konnten nur in 36 Fällen die korrespondierenden PECs
zu den vorliegenden 48 LP gefärbt und analysiert werden. Dabei entstammten
20 Tumore dem Mundraum und 16 dem Oropharynx.
Die untersuchten PECs ließen sich den Differenzierungsgraden G1 bis G3
zuordnen. Dabei bedeuten die jeweiligen Grade folgendes :
G1 : gut differenzierter Tumor
G2 : mäßig differenziert Tumor
G3 : schlecht differenzierter Tumor
30
Diagramm
5
und
Tabelle
9
kann
die
exakte
Verteilung
der
der
Differenzierungsgrade entnommen werden.
Grading-Verteilung
der PEC
22,2%
G1
G2
G3
30,6%
47,2%
Diagramm 5 : Graphische Darstellung der Grading-Verteilung innerhalb der
untersuchten Tumorgewebeproben
Tabelle
Grading
Anzahl
Prozentsatz
1
11
30,6 %
2
17
47,2 %
3
8
22,2 %
Total
36
100 %
9
:
Verteilung
Differenzierungsgrad
der
untersuchten
Tumore
in
Bezug
auf
ihren
31
Neben dem Grading, konnten bei den vorhandenen PECs ebenfalls genaue
Angaben zu der Stadienverteilung der jeweiligen malignen Neoplasien gemacht
werden. Hierbei ließen sich alle Stadien – Stadium I, II, III und IV – nachweisen.
Meist werden die Stadien I und II, sowie die Stadien III und IV zu je einer
Gruppe zusammengefasst. Vor der Schilderung der Verteilung sollen diese
zunächst kurz definiert werden:
Stadium I und II beschreiben Anfangsstadien, bei denen klinisch noch keine
Metastasen nachweisbar sind.
Im Gegensatz dazu ist bei den fortgeschrittenen Stadien III / IV entweder eine
Metastasierung in die Lymphknoten und / oder eine Fernmetastasierung und /
oder eine Infiltration des PECs in Nachbarstrukturen, wie z.B. in angrenzende
Knochenstrukturen dokumentierbar.
Bei allen 20 PECMs konnte das entsprechende Stadium bestimmt werden. Von
den restlichen 16 Patienten mit einem pharyngealen PEC war bei 7 allerdings
keine TNM-Klassifikation vorhanden, wodurch das Tumorstadium nur bei 9
Fällen angegeben werden konnte.
Tabelle 10 spiegelt die numerische und prozentuale Verteilung wieder.
Stadium
Anzahl
Prozentsatz
I / II
16 oral + 8 oropharyngeal
82,8 %
III / IV
4 oral + 1 oropharyngeal
17,2 %
Insgesamt
29
100 %
Tabelle 10 : Stadien-Verteilung der vorhandenen PECs der Mundhöhle und des
Oropharynx
32
6.1.5. Gewebeproben der Gruppe III
Die Mundschleimhäute von gesunden Probanden dieser Gruppe dienten als
Kontrollgewebe. Alle
untersuchten
25
Gewebeproben
wiesen
keinerlei
dysplastische Veränderungen auf und konnten somit als Negativkontrolle
verwendet werden.
6.2. Ergebnisse der IHC Untersuchung
6.2.1. Resultate der Gruppe I
6.2.1.1. Darstellung der IHC - Färbungen
Bevor detailliert auf die erzielten Ergebnisse eingegangen wird, dienen die
folgenden Abbildungen zunächst der Veranschaulichung von den erfolgten
Färbungen.
Abbildung 2 bis Abbildung 6 zeigen Beispiele für epithelial nachgewiesene
MAGE-A Expressionen. Es wird für die untersuchten Dysplasiegrade D0, D1,
D2 und D3, sowie für ein PEC je ein Schnitt als Beispiel gezeigt.
33
2a )
2b )
2c )
2d )
Abbildung 2 : Beispielbilder für LP mit Dysplasiegrad 0, 20-fache Vergrößerung
→ 2a ) : Grad D0 LP nach erfolgter 6C1 - Färbung
→ 2b ) : dieselbe fakultative Präkanzerose nach Anwendung der 57B – Färbung
→ 2c ) : Negativkontrolle der Vorläuferläsion
→ 2d ) : HE – Färbung der LP
34
3a )
3b )
3c )
3d )
Abbildung 3 : Beispiele für eine LP Grad 1, 20-fache Vergrößerung
→ 3a ) : LP nach erfolgter 6C1 – Färbung
→ 3b ) : dieselbe LP nach Behandlung mit dem 57B – Antikörper
→ 3c ) : Negativkontrolle der dargestellten Vorläuferläsion
→ 3d ) : HE – Färbung der LP
35
4a )
4b )
4c )
4d )
Abbildung 4 : IHC Färbungen einer LP des Dysplasiegrades 2, 20-fache
Vergrößerung
→ 4a ) : epitheliale Färbung nach Applikation des 6C1 – Antikörpers
→ 4b ) : dieselbe fakultative Präkanzerose nach Verwendung der 57B – Antikörpers
→ 4c ) : IHC Färbung der Negativkontrolle
→ 4d ) : HE – Färbung der LP
36
5a )
5b )
5c )
5d )
Abbildung 5 : Beispiel für eine dysplastische veränderte LP des Grades 3, 20-fache
Vergrößerung
→ 5a ) : Epitheliale 6C1 Färbung
→ 5b ) : dieselbe LP 57B gefärbt
→ 5c ) : Negativkontrolle der fakultativen Präkanzerose
→ 5d ) : HE – Färbung der LP
37
6a )
6b )
6c )
6d )
Abbildung 6 : Beispiel für eine PEC nach erfolgter IHC Färbung, 20-fache
Vergrößerung
→ 6a ) : gefärbtes PECMs mit dem 6C1 – Antikörper
→ 6b ) : derselbe Tumor nach Anfärbung mit dem 57B – Antikörper
→ 6c ) : Negativkontrolle des Karzinoms
→ 6d ) : HE – Färbung des Tumors
38
6.2.1.2. Ergebnisse der Gruppe I
Von den insgesamt 48 untersuchten fakultativen Präkanzerosen, die im Verlauf
maligne entartet sind, lies sich bei 41 bzw. 85,4 % eine MAGE-A Expression
mit mindestens einem der beiden verwendeten Antikörper nachweisen. Bei
separater Betrachtung der Färbungen der einzelnen Primärantikörper, lassen
sich folgende Ergebnisse festhalten:
Durch den 57B – Antikörper konnte ebenfalls bei allen 41 Proben eine positive
Antikörperreaktion verzeichnet werden, was erneut eine Färbung in 85,4 % der
Gewebeproben widerspiegelt. Nur bei 7 LP konnte keine Reaktion auf die IHC
Färbung nachgewiesen werden.
Unter Verwendung des 6C1 – Antikörper zeigten 39 der Vorläuferläsionen eine
MAGE-A Expression, 9 Schnitte stellten sich negativ dar. Dies entspricht einer
positiven Reaktion in 81,3 % der Fälle.
Die detaillierten Ergebnisse der Färbungen, sowie der korrespondierende
Dysplasiegrad der untersuchten LP können Tabelle 11 entnommen werden.
Die Analyse der Färberesultate in Gruppe I ermöglicht es, genaue Angaben zur
Verteilung der MAGE-A Expression in den vorhandenen Dysplasiegraden D0,
D1, D2 und D3 zu machen.
Diese Verteilung wurde in Tabelle 12 numerisch und in Diagramm 6
prozentual wiedergeben.
Patient
Dysplasiegrad
57B-Färbung
6C1-Färbung
57B & 6C1 Färbungen
1
2
+
+
+
2
0
+
+
+
3
0
+
+
+
4
0
+
+
+
5
1
+
-
+
6
1
-
-
-
7
0
-
-
-
8
2
+
+
+
9
0
+
+
+
10
2
+
+
+
39
Patient
Dysplasiegrad
57B-Färbung
6C1-Färbung
57B & 6C1 Färbungen
11
3
-
-
-
12
0
+
+
+
13
3
+
+
+
14
0
+
+
+
15
0
+
+
+
16
0
+
+
+
17
1
+
+
+
18
0
+
+
+
19
0
+
+
+
20
1
+
-
+
21
3
+
+
+
22
0
+
+
+
23
0
+
+
+
24
1
+
+
+
25
2
+
+
+
26
0
+
+
+
27
2
-
-
-
28
0
-
-
-
29
2
+
+
+
30
2
+
+
+
31
3
+
+
+
32
2
+
+
+
33
1
+
+
+
34
2
+
+
+
35
2
+
+
+
36
2
+
+
+
37
2
+
+
+
38
1
+
+
+
39
1
+
+
+
40
1
+
+
+
41
2
+
+
+
42
2
+
+
+
43
1
-
-
-
44
3
+
+
+
45
3
+
+
+
46
2
+
+
+
40
Patient
Dysplasiegrad
57B-Färbung
6C1-Färbung
57B & 6C1 Färbungen
47
1
-
-
-
48
3
+
+
+
Tabelle 11 : Tabellarische Darstellung der einzelnen Ergebnisse der IHC Färbungen
Erklärung : Patient = Aufzählung der untersuchten Patienten 1 - 48
Dysplasiegrad = Dysplasiegrad der untersuchten LP
57B – bzw. 6C1 - Färbung = IHC Färbung unter Verwendung des 57B –
bzw. des 6C1 – Antikörpers, dabei bedeutet :
→ '+' = LP zeigt MAGE-A Expression bzw. zelluläre Färbung im Epithel
→ ' - ' = bei der LP war keine MAGE-A Expression nachweisbar
In der Spalte ' 57B & 6C1 – Färbungen' bedeutet
→ ' + ' = Antikörperreaktion ist bei mindestens einem der beiden Antikörper zu Stande gekommen
→ ' - ' = keiner der beiden Antikörper rief eine MAGE-A Expression
hervor
Dysplasiegrad
negativ
positiv
Total
0
2
13
15
1
3
8
11
2
1
14
15
3
1
6
7
Total
7
41
48
Tabelle 12 : Tabellarische Darstellung der Färbeergebnisse bezogen auf den
Dysplasiegrad der LP
Erklärung :
→ positiv = MAGE-A Expression mit mindestens einem der beiden Antikörper
nachweisbar
→ negativ = mit keinem der Antikörper ist eine Färbung im Epithel hervorgerufen
worden
41
100,0%
90,0%
80,0%
LP-Anzahl (Prozent)
70,0%
60,0%
Negativ
Positiv
50,0%
Total
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
,0%
D0
D1
D2
D3
Total
Dysplasiegrad
Diagramm 6 : Graphische Darstellung der Färberesultate der LP bezogen auf ihren
Dysplasiegrad
Neben dieser Zuordnung wurde die prozentuale Expression von MAGE-A in
den einzelnen Dysplasiegraden betrachtet, um daraus eine mögliche
Korrelation zwischen der Entartungswahrscheinlichkeit und dem Dysplasiegrad
beurteilen zu können. Tabelle 13 und Diagramm 7 geben dieses Verhältnis
wieder.
Dysplasiegrad
positiv
positiv [%]
Insgesamt
D0
13
86,7
15
D1
8
72,7
11
D2
14
93,3
15
D3
6
85,7
7
Tabelle 13 : Prozentualer Anteil der MAGE-A Expression in den einzelnen
Dysplasiegraden
42
100%
90%
LP-Anzahl (Prozent)
80%
70%
Negativ
Positiv
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
D0
D1
D2
D3
Dysplasiegrad
Diagramm 7 : Korrelation zwischen der MAGE-A Expression und dem Dysplasiegrad
Bei der Betrachtung von Tabelle 13 und Diagramm 7 zeigt sich, dass ein
ähnlich hoher Prozentsatz der D0 LP wie der D3 LP, ungefähr 86%, eine
MAGE-A Expression aufgewiesen hat. Zudem wird durch die Färbung deutlich,
dass 86% und 72,7% der D0 und D1 Läsionen mit malignem Potential
nachgewiesen werden konnten, welche nach reiner histopathologischen
Untersuchung
als
wenig
gefährlich
eingestuft
werden
würden.
Diese
Feststellungen deuten somit darauf hin, dass in der Gruppe I keine Korrelation
zwischen der Entartungswahrscheinlichkeit und dem dysplastischen Stadium
der Gewebeveränderung besteht. Diese Vermutung konnte bei der statistischen
Untersuchung mit dem Chi-Square-Test und dem Mann-Whitney-U-Test
bestätigt werden. In beiden Fällen lies sich ein statistisch nicht signifikanter pWert von 0,71 errechnen. Folglich besteht kein signifikanter Zusammenhang
zwischen der MAGE-A Expression in LP und ihrem Dysplasiegrad in Gruppe I.
6.2.1.3. Auswertung der Tumorfärbungen
Bei den PECs der Mundhöhle und des Oropharynx konnte ein MAGE-A
43
Nachweis mit mindestens einem der beiden Antikörper in insgesamt 86,1 % der
untersuchten Fälle dokumentiert werden, nur 5 der 36 Proben stellten sich
negativ dar.
Betrachtet man die Resultate für die jeweiligen Primärantikörper erneut separat,
lässt sich folgendes festhalten: 30 der 36 Schnitte wiesen eine MAGE-A
Expression sowohl bei Verwendung des 57B –, als auch des 6C1 – Antikörpers
auf. Das entspricht in beiden Fällen einem Prozentsatz von jeweils 83,3 %. Es
konnte kein 100%-iger Zusammenhang zwischen der MAGE-A Expression in
LPs und in den korrespondierenden Tumoren festgestellt werden. Nicht alle der
untersuchten PECs erreichten die gleichen Antikörper-Reaktion wie die
fakultative Präkanzerose, auf deren Basis sie entstanden waren.
So stellte sich bei gemeinsamer Begutachtung der beiden Primärantikörper in
drei Fällen das PEC negativ dar, obwohl die entsprechende fakultativ
präkanzeröse Läsion zuvor eine positive Reaktion zeigte. Der 57B – Antikörper
allein wies ein solches Färbeverhalten in vier Fällen auf, der 6C1 – Antikörper
lediglich in zwei Fällen.
Eine umgekehrte Reaktion lies sich bei zwei Patienten nachweisen. In den
beiden Fällen konnte sowohl mit dem 57B -, als auch mit dem 6C1 - Antikörper
bei der Vorläuferläsion keine MAGE-A Expression nachgewiesen werden, der
korrespondierende Tumor allerdings zeigte eine Antikörperreaktion.
Alle anderen Gewebeproben hatten bei den beiden untersuchten histologischen
Veränderungen ein jeweils gleiches Färbeverhalten. In diesen Fällen färbten
sich sowohl die LP, wie auch das entsprechende PEC positiv bzw. negativ.
6.2.2 . Ergebnisse der Gruppe II
Alle 50 LP, die in Gruppe II untersucht wurden, zeigten keine epitheliale
Färbung und erwiesen sich somit zu 100 % als negativ. Auch die drei Proben
mit dem hohen Dysplasiegrad D2 zeigten keinerlei Reaktion.
Abbildung 7, 8 und 9 zeigen je ein Beispiel für jeden der vorhandenen
Dysplasiegrade.
44
7a )
7b )
7c )
7d )
Abbildung 7 : LP mit Dysplasiegrad D0, 20-fache Vergrößerung
→ 7a ) : Gewebeveränderung nach erfolgter 6C1 – Färbung
→ 7b ) : dieselbe LP nach durchgeführter 57B – Färbung
→ 7c ) : Kontrollgewebe der fakultativen Präkanzerose
→ 7d ) : HE – Färbung der LP
45
8a )
8b )
8c )
8d )
Abbildung 8 : Beispielbilder für eine LP des Dysplasiegrades 1, 20-fache
Vergrößerung
→ 8a ) : 6C1 – Färbung der Grad 1 LP
→ 8b ) : Läsion nach durchgeführter 57B – Färbung
→ 8c ) : Negativkontrolle der untersuchten LP
→ 8d ) : HE – Färbung
46
9a )
9b )
9c )
9d )
Abbildung 9: Darstellung eine D2 LP, 20-fache Vergrößerung
→ 9a ) : durchgeführte 6C1 – Färbung der Gewebeveränderung
→ 9b ) : 57B – Färbung derselben LP
→ 9c ) : die entsprechende Negativkontrolle.
→ 9d ) : HE – Färbung der Läsion
47
6.2.3. Resultate der Gruppe III
Diese Gruppe beinhaltet Gewebeproben von Mundschleimhäuten von 25
gesunden Probanden. Sowohl bei der Färbung mit dem 6C1 - Antikörper, als
auch mit dem 57B - Antikörper erwiesen sich die Schnitte in 100% als negativ.
Abbildung 10 zeigt eine der untersuchten oralen Schleimhäute als Beispiel.
10a )
10c )
10b )
10d )
Abbildung 10: Färbung einer gesunden Mundschleimhaut, 20-fache Vergrößerung
→ 10a ) : Färbung mit dem 57B – Antikörper
→ 10b ) : dieselbe Gewebeprobe nach erfolgter 6C1-Färbung
→ 10c ) : Negativkontrolle der oralen Schleimhaut
→ 10d ) : HE-Färbung des untersuchten Gewebes
48
6.2.4. Zusammenfassung der Färberesultate
Abschließend
ist
in
Tabelle
14
eine
Gesamtübersicht
über
die
Färbeergebnisse der einzelnen Gruppen dargestellt.
Gruppe
Anzahl
6C1+
57B+
Gesamt+
Gesamt+
[%]
[Chi-Square- Test]
p-Wert
I (LP)
48
39
41
41
85,4
≤ 0,0001
I (PEC)
36
30
30
31
86,1
≤0,0001
II
50
0
0
0
0,0
III
25
0
0
0
0,0
Tabelle 14 : Gesamtübersicht über alle Färbeergebnisse
Erklärung : I (LP) bzw. I (PEC) = Resultate der LP- bzw. PEC - Färbungen in Gruppe I
Anzahl = Stückzahl der untersuchten Gewebeproben pro Gruppe
6C1 + bzw. 57B + = MAGE-A Expression bei Verwendung des jeweiligen
Antikörpers nachweisbar
Gesamt+ = positive Färbereaktion des Gewebes auf mindestens einen der
beiden Antikörper
p-Wert: LP der Gruppe I in Bezug auf die LP der Gruppe II
PEC der Gruppe I in Bezug auf Gruppe III
Beim Vergleich der MAGE-A Expression in den Gewebeveränderungen der
Gruppe I mit denen der Gruppe II konnte ein statistisch hoch signifikanter Wert
von p ≤ 0,0001 errechnet werden. Das lässt die Schlussfolgerung zu, dass
eine
Einschätzung
des
malignen
Potentials
der
LP
über
die
Expressionsanalyse von MAGE-A möglich ist. Besonders hervorzuheben ist,
dass auch D0 LP, welche bislang nach erfolgter histopathologischer
Untersuchung
als
nicht
gefährlich
eingestuft
wurden,
mit
einer
Wahrscheinlichkeit von 86,7 % nachweisbar waren. Dieser Wert liegt über dem
errechneten Durchschnittswert von 85,4 % bei Betrachtung der MAGE-A
Expression aller LP.
49
Somit sind Risikoläsionen mit einer Spezifität von 100 % und einer Sensitivität
von 85,4 % nachweisbar.
Es konnte bestätigt werden, dass MAGE-A mit einer entsprechenden
statistischen Signifikanz von p ≤ 0,0001 im PEC der Mundhöhle und des
Oropharynx im Vergleich zu der normalen oralen Schleimhaut in Gruppe III
nachweisbar war und somit die Expression mit der Diagnose der Erkrankung
stringent korreliert ist.
50
7. Diskussion
Bisher wurden nur wenige Studien, welche das Thema der MAGE-A Expression
in fakultativen Präkanzerosen der Mundhöhle und des Oropharynx behandelt
haben, publiziert. Krauss et al. haben sich mit dieser Thematik befasst und
Mundschleimhautveränderungen immunhistochemisch untersucht [35]. Als
nachteilig einzustufen wäre bei dieser Arbeit, dass es sich um ein heterogenes
Patientenkollektiv verschiedener oraler Gewebeveränderung gehandelt hat und
dass somit die Anzahl von Probanden in den einzelnen Untergruppen relativ
schwach ausgeprägt war. Zudem wurden die untersuchten Vorläuferläsionen
des PECMs nicht mit ihrem klinischen Verlauf korreliert. So konnte lediglich ein
signifikanter Zusammenhang zwischen dem Dysplasiegrad und der MAGE-A
Expression dokumentiert werden, wobei eine vermehrte Antikörperreaktion bei
stärker dysplastisch veränderten Geweben gefunden werden konnte. Jedoch
blieb ununtersucht, ob die MAGE-A Expression auch mit einer nachfolgenden
Entartung der fakultativen Präkanzerose in Verbindung steht. Zudem war die
Anzahl nicht dysplastischer LP mit 32 Fällen sehr gering. In bisherigen
Publikationen wurden Entartungsraten solcher Hyperplasien mit einem Wert
von 0–3 % angegeben [4, 26, 54]. Unter Berücksichtigung dieser Daten kann
bei der niedrigen Fallzahl rein statistisch keine MAGE-A Expression gefunden
werden, die auf ein eventuelles Risiko, das von den Läsionen ausgeht,
hindeuten könnte. Somit konnte nicht überprüft werden, ob bereits in diesem
Stadium eine potentielle Malignität über MAGE-A Expression nachweisbar sein
könnte. Diesen ausstehenden Fragen wurde in der vorliegenden Studie
nachgegangen.
Es
wurden
ausschließlich
Patienten
mit
histologisch
gesicherten
hyperplastischen und dysplastischen LP für die IHC Untersuchung selektiert,
bei denen der klinische Verlauf mindestens fünf Jahre dokumentiert wurde.
Dadurch konnte ein einheitliches Kollektiv an fakultativen Präkanzerosen in
allen Dysplasiestadien untersucht werden
Es konnte gezeigt werden, dass ein hoch signifikanter Zusammenhang (p ≤
0,0001) zwischen dem Nachweis von MAGE-A im Epithel von LP und der
späteren Transformation dieser in einen Tumor besteht. Bei 85,4 % der LP, die
im weiteren Verlauf maligne entartet sind, konnte mit IHC Färbemethoden eine
51
MAGE-A Expression nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu fielen die
Gewebeveränderungen, die sich in einem Zeitraum von fünf Jahren nicht in ein
PEC weiterentwickelt haben, alle negativ aus. Folglich sprechen die Ergebnisse
dafür, dass der Nachweis von MAGE-A als ein hoch sensitiver und spezifischer
Parameter
zur
Beurteilung
von
klinisch
verdächtigen
Läsionen
und
Hochrisikopatienten angesehen werden kann.
Interessant ist in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass mit dem 57B Antikörper in einer vermehrten Anzahl von LP MAGE-A detektiert werden
konnte. Ein Antigen-Nachweis wurde in 85,4% der Fälle ermöglicht. Im
Gegensatz dazu kam eine Antikörperreaktion bei Verwendung des 6C1 Antikörpers in nur 81,3% der Proben zu Stande. Es war zudem insgesamt
auffällig, dass der 57B - Antikörper durchschnittlich eine stärkere und
intensivere
Färbung
hervorrufen
konnte,
sowohl
bei
den
fakultativen
Präkanzerosen, als auch bei den korrespondierenden PECs. Diese Tatsachen
würden für die Anwendung des 57B – Antikörpers im klinischen Alltag sprechen,
um einen Antigen-Nachweis in einer größeren Anzahl von LP mit malignem
Potential zu gewährleisten.
Neben der statistischen Signifikanz zwischen der MAGE-A Expression und der
Entartungswahrscheinlichkeit der LP, konnte ebenfalls die hohe Spezifität der
MAGE-A für bereits maligne entartetes Gewebe bestätigt werden. MüllerRichter et al. dokumentierten z.B. in ihrer Studie einen MAGE-A Nachweis beim
PECM in 55% der malignen Neoplasien [48]. Bei der Arbeit von Pastorcic-Grgic
et al. wurden PECs des Pharynx untersucht und ein Antigen-Nachweis in 70 %
erreicht [51]. Eine eigene unveröffentlichte Studie der MKG-Chirurgie Erlangen
zeigte eine Färbung von oralen PECs in 56% der Fälle. In der vorliegenden
Studie konnte ein MAGE-A Nachweis bei 86,1 % der untersuchten Tumore
erzielt werden, wobei sich ein statistisch hoch signifikanter Wert von p ≤ 0,0001
ergab. Der Unterschied zwischen den erwähnten Arbeiten ist, dass bei der
vorliegenden alle PECs aus zuvor diagnostizierten LP entstanden sind. Bei den
drei zuvor dargestellten Studien wurden Tumore untersucht ohne näher auf die
Vorläuferläsion einzugehen. Nun bietet es sich an die Hypothese aufzustellen,
dass bei PECs, die sich auf der Basis einer LP entwickelt haben, häufiger
MAGE-A exprimiert wird, als bei anderen. Diese Vermutung müsste allerdings
52
noch durch Erhöhung der Fallzahlen geprüft werden.
Gezeigt hat sich bei den Untersuchungen, dass die Färbemethode bei der
Verwendung mehrerer Antikörper zuverlässiger und somit klinisch relevanter zu
sein scheint. Sowohl der 57B – , als auch der 6C1 - Antikörper ermöglichten
jeweils bei 83,3 % der PECs einen Antigen-Nachweis. Zusammen betrachtet
konnten die zuvor erwähnten 86,1 % erzielt werden. Daher wäre es
empfehlenswert bei IHC Färbungen von Tumoren mehr als nur einem
Antikörper anzuwenden, um die Sensitivität des Nachweises zu erhöhen.
Wie in vielen früheren Publikationen, so auch in der bereits diskutierten Studie
von Krauss et al. [35], konnte bei Betrachtung des gesamten Patientenkollektivs
ein statistischer Zusammenhang zwischen dem Dysplasiegrad und dem Risiko
zur Ausbildung eines Tumors festgestellt werden. Diese Ergebnisse erwecken
den Anschein, dass das Risiko der Entartung tatsächlich mit dem Dysplasiegrad
und der Expression ansteigt und somit von D0 oder D1 Dysplasien kein oder
nur ein geringes Risiko ausgeht.
Allerdings verändert sich dieses Bild, wenn die untersuchten Patientengruppen
bezogen auf die jeweiligen Färberesultate getrennt voneinander betrachtet
werden.
Innerhalb
der
Gruppe
I
konnte
anders
als
im
gesamten
Patientenkollektiv keine Korrelation zwischen Dysplasiegrad der LP, der
malignen Transformation und der MAGE-A Expression festgestellt werden.
Folglich muss die anfängliche Vermutung revidiert werden. Alle Gewebeproben
der Gruppe II stellen sich, wie bereits erwähnt, negativ dar. Die LP der Gruppe I
waren jedoch unabhängig von ihrem Dysplasiegrad in durchschnittlich 85,4%
positiv. Auch nach statistischer Untersuchung ergab sich ein nicht signifikanter
Wert von p = 0,71. Allein bei Begutachtung der hyperplastischen D0 LP in
Gruppe I zeigte sich eine MAGE-A Expression in 86,7 % und bei D1
Gewebeveränderungen in 72,7 % der Fälle. Wenn nun von der Hypothese
ausgegangen
wird,
dass
mit
steigendem
Dysplasiegrad
auch
die
Entartungswahrscheinlichkeit zunimmt, wäre das genau der Prozentsatz an
Patienten, der außer Acht gelassen werden würde. Mit Hilfe des MAGE-A
Nachweises können bereits in diesen aus pathologischer Sicht wenig
gefährlichen
Stadien
diejenigen
Vorläuferläsionen
mit
einer
hohen
Entartungstendenz sowohl ausgefiltert, als auch frühzeitig und adäquat
53
behandelt werden.
Auf Grund der möglichen Früherkennung von malignen Neoplasien könnten
sich die Ergebnisse positiv auf die Überlebenswahrscheinlichkeit auswirken.
Bislang sind die 5-Jahresüberlebensraten nach pathologisch gesicherter
Tumordiagnose stark verbesserungswürdig, sie betragen nach Angaben des
U.S. National Cancer Institute nur rund 60%. Dabei spielt das Stadium, in
welchem sich das PEC bei der Erstdiagnose präsentiert, eine entscheidende
Rolle. Wenn weder angrenzende Nachbarstrukturen des Tumors, wie z.B.
Knochen bei einem Mundbodenkarzinom, noch Lymphknoten infiltriert wurden,
können Überlebensraten von rund 80 % erreicht werden. Bei vorhandenen
Metastasen sinkt die Überlebenswahrscheinlichkeit jedoch drastisch auf knapp
über 30% herab [2]. Dies unterstreicht die herausragende Bedeutung der
Früherkennung beim Kampf gegen die Tumorerkrankung. Wenn eine größere
Anzahl an Patienten in den frühen Stadien des PECs diagnostiziert würde,
ließen sich die 5-Jahresüberlebensraten sicherlich zu Gunsten der erkrankten
Personen steigern. Die genannten Fakten sind ebenfalls von Kantola et al. in
ihrer Studie über die prognostischen Faktoren bei einem PECM der Zunge
bestätigt worden. Sie räumen dem Tumorstadium die signifikanteste Rolle bei
der Überlebenswahrscheinlichkeit der Erkrankten ein [32].
Wenn durch MAGE-A das Malignitätspotential bereits anhand der LP beurteilt
werden kann, in denen die Basalmembran das Epithels noch nicht
durchbrochen und die Neoplasie noch keine invasiven Eigenschaften aufweist,
lässt
sich
erahnen,
welche
zukünftigen
Verbesserungen
in
der
5-
Jahresüberlebensrate erreicht werden könnten.
Neben dem positivem Effekt für die Früherkennung der Tumorerkrankung durch
die Einschätzung des malignen Potentials kann die Expressionsanalyse von
MAGE-A auch einen wichtigen Beitrag zur Objektivierung des Risikos, welches
von oraler Schleimhautveränderungen ausgeht, liefern. Dieser wird bislang
durch den Pathologen im Rahmen einer histologischen Untersuchung der
Gewebeveränderung durchgeführt. Nachteilig für die bisherige Methode spricht
jedoch ihre Subjektivität und mangelnde Reproduzierbarkeit unter Pathologen,
welche auch in mehreren Publikationen bemängelt wurde [5, 13, 14, 33, 36, 43,
54
44, 57, 67, 75]. Die Diskussion über den Dysplasiegrad und somit auch über die
adäquate Therapie könnte umgangen werden, da der Expressionsnachweis von
MAGE-A als zusätzliches Hilfsmittel zur pathologischen Einstufung des
Entartungsrisikos von Mundschleimhautveränderungen dienen könnte.
Für die Entartungswahrscheinlichkeit der verdächtigen Läsion spielt nach wie
vor der histologisch gesicherte Dysplasiegrad eine wichtige Rolle. Bisher wurde
die
These
unterstützt,
dass
je
höher
der
Dysplasiegrad
der
Gewebeveränderung sei, desto höher sei auch ihre Entartungstendenz [16, 24,
25, 53, 55, 68, 75]. Aus diesem Grund unterscheiden sich auch die
Therapieansätze bei LP mit leichter im Gegensatz zu denen mit schwerer
epithelialer Dysplasie [27, 44, 55, 57, 75]. Allerdings kam es in letzter Zeit zu
einem Gedankenumschwung, da Publikationen schilderten, dass die Entartung
von fakultativen Präkanzerosen unabhängig von dem zuvor bestimmten
Dysplasiegrad
sei.
So
können
durchaus
D0
LP
zukünftig
maligne
transformieren und einige D3-Veränderungen durchlaufen keine Entartung oder
bilden sich sogar zurück [16, 24, 25, 44, 53, 57, 67, 68, 75]. Diese
Beobachtungen konnten in dieser Studie, wie bereits diskutiert, bestätigt
werden. Somit bedürften die betroffenen hyperplastischen oder nur leicht
dysplastischen Schleimhautveränderungen einer entsprechenden Therapie
oder zumindest engmaschige Kontrolluntersuchungen. Das Problem liegt
allerdings darin, dass durch die fehlende Korrelation zwischen Dysplasiegrad
und Entartungstendenz selbst nach erfolgter Diagnose durch den Pathologen,
dieser nicht im Stande ist das wirkliche Malignitätspotential einer D0 oder D1 LP
vorhersagen zu können. Daher wäre es entscheidend das bislang verwendete
Verfahren der Diagnosestellung zu optimieren.
Beide Tatsachen, die Möglichkeit ein objektives und reproduzierbares Ergebnis
bei
der
Dysplasiegrad-Diagnose
zu
erreichen
und
das
tatsächliche
Entartungspotential auch von hyperplastischen und leicht dysplastischen
Gewebeveränderung zu beurteilen, sprechen für die künftige klinische
Anwendung von IHC Färbemethoden zum MAGE-A Nachweis. Diese könnten
als zusätzliches Instrument zur Durchführung und Komplettierung der
histologischen Untersuchung durch das pathologische Fachpersonal verwendet
werden.
55
Zudem bieten die positiven Ergebnisse der Arbeit weitere Ansätze für mögliche
Diagnostikverfahren von Vorläuferläsionen eines PECs. Bislang ist eine Biopsie
der
verdächtigen
Läsion
und
deren
anschließende
histopathologische
Untersuchung der Gold-Standard [41, 45, 55]. Doch es gibt auch weitere für
den Patienten weniger invasive Möglichkeiten der Diagnosestellung, wie z.B.
die Bürstenbiopsie. In ihrer Evaluation verschiedener Hilfsmitteln zur Diagnostik
von PECMs beurteilen Lingen et al. unter anderem auch die erwähnte Methode.
Sie kommen zu dem Ergebnis, dass die Anwendung der Bürstenbiopsie für die
Zukunft viel versprechend zu sein scheint, allerdings zur genauen Beurteilung
weitere Forschungsergebnisse benötigt werden. Es gibt jedoch durchaus
Szenarien bei denen die Bürstenbiopsie von Vorteil erscheint. So würden sie
Patienten mit multiplen verdächtigen Gewebeveränderungen in der Mundhöhle
der herkömmlichen Biopsie auf Grund der geringeren Invasivität bevorzugen
[41].
Mit dieser Thematik beschäftigten sich ebenfalls Metzler et al. in ihrer Studie,
welche sich den Vorzügen der Bürstenbiopsie in Verbindung mit dem MAGE-A
Nachweis widmet. Die Kombination aus diesem Verfahren und der MAGE-A
Expressionsanalyse mit Hilfe der Real Time RT-PCR ermöglichte bei einem
Patienten den Nachweis eines frühinvasiven PECM Rezidives, obwohl die
histopathologische Untersuchung nach erfolgter Biopsie zuvor keinen Hinweis
auf Malignität geliefert hatte. Somit kommen auch sie zu der Schlussfolgerung,
dass dieses Diagnostikverfahren in Verbindung mit dem hoch sensitiven und
spezifischen Tumormarker zur Früherkennung von PECMs zukünftig von
großer Bedeutung sein wird. [45].
Neben den Vorteilen für die Früherkennung und Diagnostik können aus den
positiven
Ergebnissen
der
Studie
auch
Konsequenzen
für
neue
Therapieansätze gezogen werden.
Bisher besteht in den meisten Fällen der Goldstandard aus der chirurgischen
Entfernung der malignen Neoplasie mit gleichzeitiger „elective neck dissection“
[30]. Dieses Behandlungskonzept wird vor allem bei PECs der frühen Stadien I
oder II gewählt. Alternativ kann eine Bestrahlungstherapie angewendet werden.
Bei fortgeschrittenen Tumoren in den Stadien III oder IV fällt die Entscheidung
auf ein multimodales Therapiekonzept, bestehend aus der chirurgischen
56
Exzision und / oder einer adjuvanten oder neoadjuvanten Radio- und / oder
Chemotherapie [17, 56]. Durch die Kombination des operativen Eingriffs mit
einer Bestrahlungstherapie konnte die 5-Jahresüberlebensrate von ungefähr
40% in den 1970er Jahren auf über 70% zu Beginn des 21. Jahrhunderts
gesteigert werden [73].
Zusätzlich konnte in den einzelnen Therapiekonzepten eine Vielzahl an
Fortschritten erzielt werden. So lässt sich das Operationsergebnis durch
innovative Rekonstruktionsmöglichkeiten und durch minimal invasive Techniken
ästhetisch
und
funktionell
verbessern.
Vor
allem
bei
ausgedehnten
Tumorresektionen kann die Funktionalität durch mikrovaskuläre Transplantate
enorm
gesteigert
werden.
Durch
Modulationen
bei
der
Radio-
und
Chemotherapie kann deren Toxizität verringert werden, wie z.B. durch eine
Verminderung der Bestrahlungsdosis [56].
Allerdings sind Nebenwirkungen trotz der erwähnten Verbesserungen zum Teil
gravierend. So wird auf Grund der Ausdehnung des PECs häufig die Ästhetik,
die Kau-, Sprech- und Schluckfunktion der Patienten beeinträchtigt. Durch
Bestrahlung und Chemotherapie ist das Auftreten einer Mukositis, einer
Dysphagie oder eine Xerostomie keine Seltenheit, um nur einige Beispiele zu
nennen. Die beiden letztgenannten Therapien können sich zudem in vielen
Fällen
schädlich
auf
die
körpereigene
Immunantwort
auswirken.
Die
Beeinträchtigung könnte in Zusammenhang mit dem Auftreten von Rezidiven
oder Therapieversagen stehen [56].
Diese Bedenken werden ebenfalls von Perez-Sayans et al. in seinem Review
aufgegriffen. So soll die Durchführung einer Bestrahlungstherapie vor einer
Chemotherapie deren Erfolgsraten stark beeinträchtigen. Die durch die
Tumorzellen erworbene Resistenz gegenüber Chemotherapeutika wird als
Mehrfachresistenz oder multidrug resistance (MDR) bezeichnet. Dabei kommen
den Zellen Mechanismen zugute, die es ihnen ermöglichen die für sie toxischen
Substanzen aus dem Zellinneren zu schleusen. Diese Fähigkeit wird ebenfalls
für eine Resistenz des PECMs gegen das Chemotherapeutikum Cisplatin
verantwortlich gemacht. MDR wird heutzutage als Hauptursache für das
Scheitern von Behandlungskonzepten aufgeführt [52].
Einer weitere Möglichkeit für das Versagen der genannten Therapien widmet
sich Gath et. al. in seinem Review, dem Vorhandensein einer minimalen
57
Resterkrankung bzw. minimal residual disease (MRD). Hierbei handelt es sich
um das Verbleiben okkulter Tumorzellen im Gewebe nach vollzogener
Durchführung des gewählten Behandlungskonzeptes. Die Persistenz dieser
Zellen kann ein lokales Rezidiv bei bis zu 20% der Patienten hervorrufen,
obwohl sich bei ihnen die Resektionsränder des PECs histopathologisch als
Tumor frei erwiesen haben. Ferner enthalten bei einer neck dissection entfernte
Lymphknoten
in
bis
zu
20%
Mikrometastasen,
obwohl
sie
bei
der
histopathologischen Untersuchung als negativ eingestuft wurden. Aufgrund
dieser Mängel kommen Gath et al. zu der Schlussfolgerung, dass der Nachweis
der
tatsächlichen
Ausbreitung
von
Tumorzellen
die
derzeitigen
histopathologischen Methoden überschreitet [17].
Ferner wird postuliert, dass zahlreiche disseminierte Zellen des PECs in der
G0-Phase des Zellzyklus verweilen. Dies könnte ein weiterer Grund für das
Scheitern einer Chemo-/ bzw. Radiotherapie sein, da diese Methoden nur sich
im Wachstum befindende Zellen angreifen. In diesem Zusammenhang wäre es
für die Prognose erforderlich die verbliebenen okkulten Tumorzellen mit Hilfe
von
hochspezifischen
Tumormarkern
zu
detektieren
[17].
Nach
den
Ergebnissen der vorliegenden und vielen früheren Studien könnte hierfür ein
MAGE-A Nachweis als Hilfsmittel bei der histopathologischen Untersuchung in
Betracht gezogen werden.
Es wäre für die betroffenen Personen von entscheidender Bedeutung weitere
Therapiekonzepte zu entwickeln, welche auch eine geringere Toxizität und
weniger Nebenwirkungen aufweisen würden. In diesem Zusammenhang spielt
die
Forschung
an
und
die
Entwicklung
von
Immuntherapien
eine
herausragende Rolle [56]. Es gibt heute bereits Ansätze für die Verwendung
von CT-Antigenen bei der Entwicklung neuer Therapien. In ihrem Review gehen
Rapidis et al. näher auf die bisherigen Forschungsergebnisse ein. Darin
räumen sie ebenfalls MAGE-A eine wichtige Rolle ein, vor allem bei der
Entwicklung von Tumorimpfungen. Es hat bereits eine klinische Studie mit zwei
Patienten stattgefunden. Nach der Diagnose eines Ösophaguskarzinoms,
erfolgter Resektion und Chemotherapie wurden die Betroffenen mit einer
Impfung, welche MAGE-A1 und MAGE-A3 enthalten hat, therapiert. Der erste
Patient verstarb nach 12 Monaten, der zweite hat zum Zeitpunkt der Publikation
bereits 49 Monate überlebt. Des weiteren wird an einer Studie mit einer
58
Kombination
aus
HPV16
und
MAGE-A3
als
Impfstoff
gearbeitet.
Zusammenfassend beschreibt der Review die Immuntherapie als attraktives
alternatives Behandlungskonzept mit möglicherweise weniger belastenden
Nebenwirkungen und erfolgreicheren Resultaten bei der Tumorbekämpfung
[56].
Aus
den
ersichtlich,
geschilderten
dass
Publikation
weiterhin
eine
und
Vielzahl
Forschungsergebnissen
von
wird
verbesserungswürdigen
Konzepten in Hinblick auf die Früherkennung und Therapie des PECs der
Mundhöhle und des Oropharynx bestehen. In diesen Schwerpunkten wird
stetig
geforscht,
um
die
Überlebensraten
bei
einer
diagnostizierten
Tumorerkrankung erheblich zu verbessern, den Patienten eine möglichst
minimal invasive und verträgliche Therapie anzubieten und vor allem um eine
maligne
Entartung
von
fakultativen
Präkanzerosen
frühzeitig
zu
diagnostizieren und zu verhindern.
Unsere Studie hat gezeigt, dass mit Hilfe der Expressionsanalyse von MAGEA die Tendenz zur malignen Transformation von LPs statistisch signifikant
eingeschätzt werden kann. Bereits im hyperplastischen D0-Stadium ist es
möglich das Entartungspotential abzuschätzen. Dadurch ist es vorstellbar,
dass der Nachweis von MAGE-A in Zukunft als wichtiges Hilfsmittel zur
Objektivierung und Komplettierung der histopathologischen Untersuchung des
PECs und dessen Vorläuferläsionen angesehen werden kann. Mit dieser
Zusatzmethode kann es entscheidende Verbesserungen bei der Einschätzung
von Schleimhautveränderungen des Mund- und Rachenraumes, bei der
Früherkennung
von
Tumoren
und
dementsprechend
auch
bei
der
Überlebenswahrscheinlichkeit der betroffenen Personen geben. Außerdem
können alternative Diagnostikverfahren, wie z.B. die Bürstenbiopsie oder neue
Therapieansätze, wie z.B. die Immuntherapie verbessert und entwickelt
werden.
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65
9. Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Erklärung
MAGE-A
Melanomassoziierte Antigene A
PEC
Plattenepithelkarzinom
LP
Leukoplakie
SCC
Squamous cell carcinoma
WHO
World Health Organisation
D0-3
Dysplasiegrad 0 – 3
bzw.
beziehungsweise
PECM
Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
HE- Färbung
Hämatoxylin-Eosin Färbung
CK
Zytokeratine
TP53
Tumorsupressorgen 53
IHC
Immunhistochemie
MAGE
Melanoma-assoziierte Antigene
CT – Antigene
Cancer/Testis – Antigene
AD
destilliertes Wasser
LSAB-Methode
Labeled-Strept-Avidin-Biotin-Methode
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
TIF
Tagged image file
DFS-rate
Disease free survival rate
G1-3
Grading = Differenzierungsgrad 1 – 3
MDR
multidrug resistance
MRD
minimal residual disease
66
10. Anhang
10.1. Herstellungsverzeichnis
Objektträger
Deckgläser
Superfrost® Plus
Gerhard Menzel GmbH
Saarbrückener Str. 248
D - 38116 Braunschweig
Menzel Deckgläser
Gerhard Menzel GmbH
Saarbrückener Str. 248
D - 38116 Braunschweig
HE-Färbung
2-Propanol / Xylol
Carl Roth GmbH + Co KG
Schoemperlenstr. 3-5
D - 76185 Karlsruhe
Hämatoxylin / Eosin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Kappelweg 1
Industriegebiet Süd
D - 91625 Schnelldorf
Salzsäure-Alkohol
Entellan Eindeckmedium
Merck KGaA
Frankfurter Straße 250
D - 64293 Darmstadt
Immunhistochemie
DAKO Cytomation Autostainer
EDTA-Puffer, pH 9,0, (Dako S2367)
DAKO-Waschpuffer, pH 7,6 (Dako S3006)
Avidin (Dako X0590)
Biotin (Dako X0590)
Proteinblock (Dako X0909)
Antibodydiluent (Dako S2022)
Biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung
A, Dako REAL Detection System K5005)
Alkalische-Phosphatase-StreptavidinKomplex (Lösung B, Dako REAL Detection
System K5005)
Fast-Red-Chromogen (Chromogen + APSubstratpuffer + Levamisol; Dako K5005)
Hämalaun (Dako S3301)
Dako Deutschland GmbH
Neue Flora
Stresemannstraβe 161
D-22769 Hamburg
Primärantikörper 57B
Prof. Giulio C. Spagnoli
Onkologische Chirurgie
University Hospital Basel
Schweiz
Primärantikörper 6C1 (ab49386)
Abcam plc
330 Cambridge Science Park
Cambridge
CB4 0FL
UK
Primärantikörper 6C1 (35-6300)
Invitrogen Corporation
542 Flynn Rd
Camarillo
California 93012-8027
USA
67
Eindeckmedium Aquatex®
MERCK KGaA
Frankfurter Straße 250
D - 64293 Darmstadt
Auswertung
Axioskop
Axiocam
Carl Zeiss Jena GmbH
Zeiss Gruppe
Unternehmensbereich Mikroskopie
D- 07740 Jena
Axio Vision
Carl Zeiss Vision GmbH
Zeppelinstr. 4
D- 85399 München-Hallbergmoos
Microsoft SPSS 19.0
Microsoft Excel 2007
Microsoft Corporation
Redmond
WA
USA
68
11. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei meinem Doktorvater Prof. Dr.
med. Dr. med. dent. Emeka Nkenke für die Überlassung dieses hoch
interessanten Themas bedanken, sowie bei Herr Prof. Dr. med. Dr. med. dent.
Dr. h. c. Friedrich Wilhelm Neukam für die Möglichkeit an der Mund-, Kieferund Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen
diese Dissertation durchführen zu dürfen.
An meine Betreuerin Frau Dr. rer. nat. Jutta Ries, die mir stets tatkräftig mit
fachlicher Unterstützung und Beratung, sowie persönlichem Engagement zur
Seite stand, richte ich einen ganz besonderen Dank.
Zudem möchte ich Frau E. Diebel, Frau A. Krautheim-Zenk, Frau S. Schönherr,
und Herrn L. Straßburg für die Einarbeitung, Beratung und ständige
Hilfsbereitschaft im Labor herzlichst danken.
Des Weiteren bedanke ich mich bei meiner Projektpartnerin, Frau Yeeun Kwon,
für die freundschaftliche Zusammenarbeit und erfolgreiche Durchführung dieser
Forschungsarbeit.
Besonderer Dank gilt meinen Eltern, für ihre Anteilnahme, Unterstützung und
Motivation, nicht nur bei der Durchführung der Dissertation, sondern während
meiner gesamten Ausbildungszeit.