Hitzeschock-Transformation von E
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Institut für Molekularbiologie und Zellkulturtechnik Diplomarbeit Fachbereich Biotechnologie Charakterisierung von Parametern, die zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken in Escherichia coli beitragen eingereicht von: Claudia Gutperle Heidelberg, im Februar 2004 Die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit hatte Dr. Ario de Marco (European Molecular Biology Laboratory) Prof. Dr. Mathias Hafner (Fachhochschule Mannheim für Technik und Gestaltung) Claudia Gutperle Heppenheimer Str. 4 68519 Viernheim Matrikel Nr. 0010571 Erklärung Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Heidelberg, im Februar 2004 Danksagung An dieser Stelle danke ich all denen, die mich im Verlauf meiner Diplomarbeit unterstützt haben. Bei Herrn Dr. Ario de Marco möchte ich mich für die Überlassung der Themenstellung und die Unterstützung bei der Anfertigung meiner Arbeit am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) in Heidelberg bedanken. Herrn Prof. Dr. Mathias Hafner danke ich für die Betreuung während meiner Diplomarbeit von Seiten der Fachhochschule Mannheim für Technik und Gestaltung. Herrn Gunter Stier (EMBL, Heidelberg) möchte ich für seine Diskussionsbereitschaft und die modifizierten Vektoren danken, die er freundlicherweise der Protein Expression and Purification Facility zur Verfügung gestellt hat. Frau Dr. Silvia Curado (EMBL, Heidelberg) danke ich für die mir zur Verfügung gestellten Fliegen der Spezies Drosophila melanogaster und Frau Jennifer Volz (EMBL, Heidelberg) für die Bereitstellung des Antikörpers anti-Ser 4 rabbit polyclonal und die Durchführung des DFPLabelings. Ein riesiges Dankeschön geht an meine Freunde, besonders an Matthias, Nadja und Marina, für ihre moralische Unterstützung und Motivation. Ganz besonders möchte ich mich bei Tina und Thomas bedanken, die sich die Zeit genommen haben, meine Arbeit korrekturzulesen. Ein herzlicher Dank geht an meine Eltern, die mich oft finanziell unterstützt haben, besonders an meinen Vater, durch den ich dieses Studium erst begonnen habe. INHALTSVERZEICHNIS I EINLEITUNG................................................................................................................................... 1 I.1 ESCHERICHIA COLI ALS EXPRESSIONSSYSTEM ............................................................................. 2 I.1.1 SEKRETIONSSYSTEME ................................................................................................................... 4 I.1.1.1 Aktive Sekretion ........................................................................................................................ 4 I.1.1.2 Passive Sekretion ....................................................................................................................... 5 I.1.2 EXPRESSION IM CYTOPLASMA ...................................................................................................... 6 I.1.3 EXPORT INS PERIPLASMA .............................................................................................................. 8 I.1.4 CHAPERONE .................................................................................................................................. 9 I.1.4.1 Molekularer Mechanismus der Chaperone .............................................................................. 11 I.1.4.1.1 Hsp60-Chaperon ................................................................................................................... 11 I.1.4.1.2 Hsp70-Chaperon ................................................................................................................... 12 I.1.5 FUSIONSPROTEINE ....................................................................................................................... 14 I.2 PRODUKTION REKOMBINANTER ANTIKÖRPERFRAGMENTE IN ESCHERICHIA COLI ................ 16 I.2.1 ANTIKÖRPER ALS BESTANDTEILE DER HUMORALEN IMMUNANTWORT ..................................... 16 I.2.2 ANWENDUNG REKOMBINANTER ANTIKÖRPER ........................................................................... 16 I.2.3 AUFBAU DES „SINGLE-CHAIN“ ANTIKÖRPERFRAGMENTS (SCFV) .............................................. 18 I.2.4 EXPRESSION VON SCFV IN ESCHERICHIA COLI ............................................................................ 19 I.3 PROBLEMSTELLUNG..................................................................................................................... 21 II MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................ 22 II.1 MATERIAL ................................................................................................................................... 22 II.1.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ....................................................................... 22 II.1.2 ENZYME UND REAKTIONSKITS .................................................................................................. 23 II.1.3 ANTIKÖRPER UND ENZYM-KONJUGIERTE NACHWEISANTIKÖRPER .......................................... 24 II.1.4 BAKTERIENSTÄMME .................................................................................................................. 24 II.1.5 PLASMID-VEKTOREN ................................................................................................................. 25 II.1.6 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE .......................................................................................... 28 II.1.7 MEDIEN, PUFFER UND LÖSUNGEN ............................................................................................. 29 II.1.8 GERÄTE, APPARATUREN UND ZUBEHÖR ................................................................................... 30 II.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ................................................................................... 32 II.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR)............................... 32 II.2.1.1 PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten............................................................................ 32 II.2.2 DNA-KLONIERUNG ................................................................................................................... 34 II.2.2.1 Restriktionsenzym-Verdau von DNA..................................................................................... 34 II.2.2.2 DNA-Ligation......................................................................................................................... 34 II.2.3 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA .................................................. 34 II.2.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE .............................................................................................. 35 II.2.4.1 Analytische Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................ 35 II.2.4.2 Präparative Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................. 35 II.2.5 TRANSFORMATION VON E. COLI ................................................................................................ 36 II.2.5.1 Hitzeschock-Transformation von E. coli ................................................................................ 36 II.2.5.1.1 Zur Plasmid-Amplifikation.................................................................................................. 36 II.2.5.1.2 Zur Protein-Expression ........................................................................................................ 38 II.2.6 ANZUCHT VON E.COLI-KULTUREN ............................................................................................ 40 II.2.6.1 Zur Plasmid-Amplifikation..................................................................................................... 40 II.2.6.2 Zur Herstellung von Stammkulturen ...................................................................................... 40 II.2.6.3 Zur Protein-Expression........................................................................................................... 40 II.2.7 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI .......................................................................... 40 II.2.8 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS E. COLI ................................................................. 41 II.2.9 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA ...................................................................................... 41 II.3 PROTEINCHEMISCHE UND IMMUNOLOGISCHE METHODEN..................................................... 41 II.3.1 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI ................................................................ 41 II.3.1.1 Expression rekombinanter Proteine im „small-scale“ ............................................................ 44 II.3.1.2 Expression rekombinanter Proteine zur anschließenden Aufkonzentrierung ......................... 45 II.3.1.3 Expression rekombinanter Proteine im „large-scale“ ............................................................. 46 II.3.2 AUFKONZENTRIERUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS E. COLI ............................................ 46 II.3.2.1 Aufkonzentrierung mit Chromatographie-Säule..................................................................... 46 II.3.2.2 Aufkonzentrierung mit Dialyse-Membran.............................................................................. 47 II.3.3 ISOLIERUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS E. COLI ............................................................. 48 II.3.4 REINIGUNG VON PROTEINEN ..................................................................................................... 49 II.3.4.1 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) ............................................. 49 II.3.4.1.1 Im „small-scale“ .................................................................................................................. 49 II.3.4.1.2 Im „large-scale“ über FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) .................................. 52 II.3.5 SDS-PAGE VON PROTEINEN ..................................................................................................... 54 II.3.5.1 Homogenat-Präparation von Drosophila melanogaster ......................................................... 55 II.3.6 WESTERN-BLOT ANALYSEN ...................................................................................................... 55 II.3.7 AKTIVITÄTSTEST........................................................................................................................ 58 III ERGEBNISSE.............................................................................................................................. 59 III.1 AMPLIFIKATION DES SCFV ANTIKÖRPERFRAGMENTS ........................................................... 59 III.1.1 DNA-KLONIERUNG VON SCFV ANTIKÖRPERFRAGMENTEN .................................................... 64 III.2 ÜBEREXPRESSION IN GEGENWART DES BACTERIOCIN-FREISETZENDEN PROTEINS ........... 68 III.2.1 VORVERSUCH MIT FRINGE GLYCOSYLTRANSFERASE UND DKFZP564F2122......................... 68 III.2.2 MIT SERINPROTEASE-4............................................................................................................. 73 III.2.2.1 Charakterisierung löslich exprimierter Serinprotease-4 im Western-Blot ............................ 75 III.2.2.2 Aufkonzentrierung löslich exprimierter Serinprotease-4 ...................................................... 78 III.3 CHARAKTERISIERUNG DER SCFV FRAGMENTE ...................................................................... 81 III.4 CO-EXPRESSION VON SCFV MIT CHAPERONEN ...................................................................... 89 III.5 REINIGUNG DER SCFV FRAGMENTE ÜBER FPLC UND ÜBERPRÜFUNG DER FUNKTIONALITÄT IM WESTERN-BLOT ............................................................................................ 92 III.6 FUSION VON SCFV MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE ........................................................... 95 III.7 SCREENING-OPTIMIERUNG ...................................................................................................... 97 IV DISKUSSION............................................................................................................................. 105 V ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................................. 111 VI LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................................. 112 VII ANHANG .................................................................................................................................. 120 VII.1 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN ................................................................. 120 VII.2 ABKÜRZUNGEN ........................................................................................................................ 122 I Einleitung I EINLEITUNG Die molekularbiologische Forschung führt in vielen Bereichen, beispielsweise in der molekularen Medizin, Humangenetik, Virologie, Pharmakologie und Immunologie zur Entdeckung und Modifizierung biotechnologisch wertvoller Proteine, die potentielle Wirk- und Werkstoffe darstellen. Rekombinante Proteine sind das Ergebnis gentechnischer Modifikation von Mikroorganismen oder Zellen höherer Organismen, die zu vielen neuen Anwendungsgebieten führen. Bisher fanden sie mengenmäßig gesehen weitestgehend Einsatz als Viehfutter- oder Waschmittelenzyme (Bender und Dall, 2000). Die rekombinante Proteinproduktion für Diagnostik und Therapie hat sich jedoch zunehmend zu einem stark anwachsenden Wirtschaftszweig mit großem Marktanteil entwickelt (Bender und Dall, 2000). Ihre Bedeutung liegt in dem hohen Bedarf an natürlich produziertem und modifiziertem Protein, der nicht mehr gedeckt werden kann. Rekombinante, humanidentische Proteine bilden die Basis für Biopharmazeutika, die mit Hilfe biotechnologischer Methoden hergestellt werden (Düring, 2000). Zusätzlich zur Herstellung authentischer Proteine in Form rekombinanter Proteine, lassen sich durch die Gentechnik Wirkstoffvarianten erzeugen, die eine bessere Verträglichkeit, einen schnelleren Wirkungseintritt oder eine effizientere oder länger andauernde Wirksamkeit aufweisen. Neben den ersten Proteintherapeutika, wie Insulin oder Erythropoietin, eröffnen auch rekombinante Antikörper eine neue Dimension der Anwendung in der Medizin (Düring, 2000). Ebenso gewinnen rekombinante Proteine auch in biomedizinischen und technischen Anwendungen aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften zunehmend an Bedeutung und allein für die Bioanalytik müssen zur Aufklärung von Proteinstrukturen und Struktur- Funktionsbeziehungen ausreichende Mengen an nativem Protein zur Verfügung stehen (Lottspeich und Zorbas, 1998). Aufgrund des großen Interesses im akademischen und industriellen Bereich wurde eine Anzahl von Expressionssystemen in Bakterien, Hefen, Insekten, sowie in höheren Pflanzen und Tieren entwickelt. Geeignete Expressionssysteme sind Voraussetzung, um rekombinante Proteine in ausreichender Menge und Qualität herstellen zu können. Eine Limitierung stellen die posttranslationalen Modifikationen dar, da nicht alle biologischen Systeme heterologe Proteine glykosylieren, phosphorylieren, acylieren oder proteolytisch prozessieren (Lottspeich und Zorbas, 1998). 1 I Einleitung I.1 Escherichia coli als Expressionssystem Escherichia coli dient häufig als Wirt zur Produktion rekombinanter Proteine und ist mit Abstand der wichtigste und bislang am besten untersuchte Organismus in der Molekularbiologie. Die Vorteile von E. coli zur Nutzung heterologer Genexpression im Vergleich zu anderen Expressionssystemen liegen in den kurzen Kultivierungszeiten, der relativ hohen Ausbeute im Vergleich zu anderen Wirtssystemen, der relativ einfachen Manipulation des Organismus, der Verfügbarkeit zahlreicher Vektoren und Stämme, speziell entwickelt für maximale Expression, dem fundierten Wissen über Genetik und Physiologie von E. coli sowie dem Einfluss spezifischer genetischer Faktoren und Umgebungsfaktoren von E. coli auf die Expression heterologer Proteine. Die Kultivierung von Bakterien ist im Vergleich zur Kultivierung tierischer Zelllinien einfach und preiswert (Higgins und Hames, 1999). Allerdings steht der kostengünstigen Produktion rekombinanter Proteine im Großmaßstab die Notwendigkeit hoher Investitionen in die Fermentation sowie die Schwierigkeit beim „Scale-Up“ vom Labormaßstab über das Technikum zur Produktionsanlage gegenüber. Der limitierende Faktor von Bakterien im Vergleich zu eukaryotischen Expressionssystemen besteht aus den Phosphorylierung, fehlenden Acylierung posttranslationalen oder Modifikationen proteolytischer Prozessierung wie Glykosylierung, sowie umfassender Disulfidbrückenausbildung. Diese posttranslationalen Modifikationen sind bei heterologen Wirtssystemen verändert oder fehlen völlig, was der Funktionalität des rekombinanten Proteins schadet. Letztendlich ist es manchmal schwierig, aufgrund von Problemen wie Proteindegradation oder ineffizienter Translation, bedingt durch Strukturmerkmale der mRNA oder eukaryotischer, für E. coli nicht optimaler, Codon-Auswahl, ein ausreichend hohes Expressionslevel zu erreichen. Inclusion Bodies, die aufgrund der Missfaltung unlöslicher, in Aggregation vorliegender Proteine entstehen, liegen hochkonzentriert in der Zelle vor. Sie sind von Vorteil, wenn sich das rekombinante Protein gut renaturieren lässt, oder eine aktive Form des Proteins nicht von unmittelbarer Bedeutung ist. Rekombinante Proteine in Form von Inclusion Bodies liegen weder degradiert vor, noch sind sie toxisch für die Zelle (Lottspeich und Zorbas, 1998). 2 I Einleitung Es steht eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die eine einfache Übertragung von Genen auf E. coli ermöglichen. Die Wahl eines effizienten Expressionssystems mit starken konstitutiven oder induzierbaren Promotoren (Tab. I-1) ist bei der Überexpression heterologer Proteine von großer Bedeutung. Promotor Induktion durch lac IPTG trp Tryptophanmangel tac IPTG T7 IPTG araB Arabinose phoA Phosphatmangel Tab. I-1: Übersicht häufig verwendeter Promotoren (Weickert et al., 1996) Bei der Auswahl des Expressionsvektors ist die Möglichkeit gegeben, das rekombinante Protein direkt oder als Fusionsprotein zu exprimieren, sowie die Zelllokalisation des Expressionsproduktes zu bestimmen (Gassen und Schrimpf, 1999). Mit Ausnahme einer kleinen Klasse von Proteinen wie Toxine (Hirst et al., 1984) und Hämolysine (Goebel und Hedgpeth, 1982) gibt E. coli exprimierte Proteine nicht in den extrazellulären Raum ab. Das Thioredoxin- und das Glutaredoxin-System sind an der Aufrechterhaltung des reduzierten Redoxzustandes im Cytoplasma beteiligt und wirken der Disulfidbrückenausbildung im rekombinanten Protein entgegen. Es ist jedoch möglich, rekombinante Proteine, die im Cytoplasma produziert werden, in den periplasmatischen Raum zu exportieren, indem fremde oder native Signalsequenzen benutzt werden (MacIntyre et al., 1990; Kornacker und Pugsley, 1990; Hsiung et al., 1986; Matteucci und Lipetsky, 1986). Im Periplasma herrschen im Gegensatz zum Cytoplasma die notwendigen oxidierenden Bedingungen zur Disulfidbrückenausbildung. Die zur Ausbildung von Disulfidbrücken erforderlichen Disulfid-Oxidoreduktasen und Disulfidisomerasen wie DsbA, DsbB und DsbC liegen im Periplasma von E. coli vor und ermöglichen so die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken im rekombinanten Protein. Die Disulfid-Oxidoreduktase DsbA und Disulfid-Isomerase DsbC zeigen ebenfalls einen positiven Effekt auf das Expressionslevel bei Einsatz als Fusionspartner. Zusätzlich kann dem inserierten Gen eine kurze Peptidsequenz (Tag) N- oder C-terminal angehängt werden, die eine anschließende Reinigung über Affinitätschromatographie erlaubt (Gassen und Schrimpf, 1999). 3 I Einleitung I.1.1 Sekretionssysteme I.1.1.1 Aktive Sekretion Die optimale Sekretion rekombinanter Proteine in das Kulturmedium bringt folgende Vorteile mit sich: • Die Akkumulation exprimierter Proteine im Cytoplasma wird vermieden. Das Problem der Toxizität vieler Fremdproteine auf den Wirt sowie der proteolytische Abbau werden somit unterbunden. • Das Kulturmedium bietet mehr Raum zur Akkumulation des Targetproteins. • Die anschließende Proteinaufreinigung ist vereinfacht, da nur eine kleine Menge anderer kontaminierender Proteine die Membran passiert. Die Sekretion des gewünschten Proteins stellt somit den ersten Schritt der Proteinaufreinigung dar und erleichtert die nachfolgenden Schritte des Reinigungsprozesses. • Inclusion Bodies, die durch Überexpression entstehen, werden vermieden. • Fehlende oder unkorrekte Disulfidbrücken können aufgrund des notwendigen oxidierenden Redoxzustandes im Kulturmedium ausgebildet werden. • Der Export in das Kulturmedium ermöglicht die biotechnologische Produktion von Proteinen im Großmaßstab, da das Lysieren der Bakterienzellen entfällt. • Die Reinigung rekombinanter Proteine aus dem Kulturmedium ermöglicht die kontinuierliche Kultur der exprimierenden Zellen. Eine Aufkonzentrierung des Kulturmediums führt jedoch zur Präzipitation von Mediumskomponenten und kann zu Problemen bei der anschließenden Aufreinigung des rekombinanten Proteins führen. Große Mengen an Kulturmedium mit dem darin befindlichen rekombinanten Protein lassen sich bei der Aufreinigung schlechter handhaben als Zellpellets aus äquivalenten Mengen an Zellsuspension. Escherichia coli besitzt keine eigenen Sekretionssysteme, um Proteine in das Kulturmedium zu sezernieren. 4 I Einleitung I.1.1.2 Passive Sekretion Bacteriocin-freisetzende Proteine („bacteriocin release proteins“, BRPs) finden Anwendung in E. coli, um heterologe Proteine aus Periplasma und Cytoplasma in das Kulturmedium zu exportieren. Das Bacteriocin-freisetzende Protein, ein kleines Lipoprotein bestehend aus 28 Aminosäuren, wird als Prekursor mit einem Signalpeptid exprimiert, quer durch die Cytoplasmamembran sekretiert, wo es N-acetyliert und in die äußere Zellmembran eingefügt wird (Luirink et al., 1986). Dort erfolgt die Aktivierung von Phospholipase A, welche zur Freisetzung von Colicin führt, das für die Bildung permeabler Zonen in der äußeren Zellmembran verantwortlich ist (Lakey et al., 1994). Der exakte Mechanismus Bacteriocinfreisetzender Proteine ist nicht bekannt. Es konnte bisher nur die Aktivierung der in der äußeren Cytoplasmamembran lokalisierten Phospholipase A und der Effekt auf die äußere Membran gezeigt werden (Pugsley und Schwartz, 1984; Luirink et al., 1986; Cavard et al., 1987). Periplasmatische und cytoplasmatische Proteine können diese permeablen Zonen in der äußeren Zellmembran passieren und akkumulieren im Kulturmedium. Die Expression von BRP durch Einsatz des Vektors pJL3 unterliegt der Kontrolle des Lipoprotein Promotors und des lac Promotor/Operator Systems, sowie der Regulation durch den lac Repressor (MoBiTec Handbuch). Gemäßigte Induktion mit Isopropyl-1-thio-β-Dgalactopyranosid (IPTG) führt zur Expression von BRP und aufgrund der entstehenden permeablen Zonen zur Freisetzung periplasmatischer und auch cytoplasmatischer Proteine (MoBiTec Handbuch). Das Gen des BRP entspricht einer Größe von 84 bp und ist nicht auf dem gleichen Plasmid wie das Gen des Targetproteins lokalisiert. Durch die Wahl verschiedener Promotoren für das BRP und das Zielprotein ergibt sich die Möglichkeit, eine unabhängige und möglichst hohe Expression an Targetprotein und eine gemäßigte Expression an BRP zu induzieren. Eine unkontrollierte Induktion mit IPTG, die zur Überexpression von BRP führt, hat bei zu hoher Konzentration ein Lysieren der Wirtszellen in Flüssigmedium zur Folge (De Graaf und Oudega, 1986). 5 I Einleitung I.1.2 Expression im Cytoplasma Die Expression von biologisch aktiven rekombinanten Proteinen in E. coli bringt das Problem der Proteinfaltung mit sich. Die Proteinfaltung definiert den Prozess der Modifikation von der linearen Aminosäuresequenz einer Polypeptidkette zu einer definierten, für das native Protein charakteristischen, räumlichen Struktur. Unter physiologischen Bedingungen liegt das Cytoplasma in E. coli in einem reduzierten Zustand vor, der die Bildung von stabilen Disulfidbrücken erschwert, die zur Ausbildung der aktiven dreidimensionalen Struktur notwendig sein kann. Es benötigen jedoch nicht alle Proteine die Ausbildung von Disulfidbrücken, um ihre aktive, räumliche Struktur zu erreichen. Zudem exponieren elongierende Polypeptidketten und Faltungsintermediate hydrophobe Aminosäuren, was zur Aggregation der Proteinketten führen kann. Die Anzahl an theoretisch möglichen, aber falschen intermediären Konformationen eines Proteins ist sehr hoch. Die Information, die essentiell ist, um die aktive, dreidimensionale Struktur zu erreichen, ist in der dafür codierenden Aminosäuresequenz determiniert und wird als „assisted self assembly“ bezeichnet (Anfinsen, 1973). Einige Proteine benötigen Chaperone, um ihre korrekte Konformation zu erhalten. Stresssituationen wie hohe Salzkonzentration, hohe Temperatur und Überexpression rekombinanter Proteine führen zu Schwierigkeiten des Faltungsprozesses. Dabei ist der Faltungsprozess ein äußerst schneller Prozess, der innerhalb von Sekunden oder sogar Millisekunden erfolgt, wobei das Protein seine korrekte Konformation über verschiedene ungefaltete Zustände erreicht. Die letztendlich native Struktur repräsentiert den thermodynamisch günstigsten Zustand. Einige Proteine benötigen zusätzlich die korrekte Isomerie einer Peptidbindung zwischen einem Prolin und einer benachbarten Aminosäure sowie die korrekte Konformation von Disulfidbrücken, die für sekretorische Proteine besonders von Bedeutung sind. Ist dies nicht gegeben, kommt es zu unlöslichen Aggregationen (Mogk et al., 2001). Der reduzierte Zustand cytoplasmatischer Proteine in E. coli ist auf zwei unterschiedliche, aber kooperative Systeme zurückzuführen (Tab. I-2) (Bessette et al., 1999): 6 I Einleitung Protein Gen Funktion Thioredoxin 1 trxA Reduktase Thioredoxin 2 trxC Reduktase Thioredoxin-Reduktase trxB Reduktion von Thioredoxin durch NADPH Glutaredoxine 1 bis 3 grxA bis C Reduktase Glutathion- gor Reduktion von Glutathion durch NADPH Thioredoxin-System: Glutaredoxin-System: Oxidoreduktase Tab. I-2: das Thioredoxin- und Glutaredoxin-System Das Cytoplasma in E. coli beinhaltet somit zwei Thioredoxine und drei Glutaredoxine, wobei die oxidierte Form dieser Proteine die Bildung von Disulfidbrücken in Peptiden katalysiert. Im Cytoplasma liegen jedoch beide, Thioredoxine und Glutaredoxine, durch den Einfluss der Thioredoxin-Reduktase und der Glutaredoxin-Oxidoreduktase im reduzierten Zustand vor. Das Flavoenzym Thioredoxin-Reduktase benutzt NADPH (reduziertes Nicotinamid-AdeninDinukleotidphosphat), um Thioredoxin zu reduzieren, wobei die Glutaredoxine durch Glutathion reduziert werden. Die Reduktion von Glutathion erfolgt durch die Glutathion-Reduktase. Wie auch Thioredoxin-Reduktase ist Glutathion-Reduktase ein Flavoenzym, das NADPH nutzt, um sein Substrat zu reduzieren. Glutaredoxin ist in seiner Funktion als Reduktant von Disulfidbrücken weniger effizient als Thioredoxin (Åslund et. al., 1996; Holmgren, 1989). Die intrazelluläre Konzentration an Glutathion in E. coli beträgt etwa 5 mM und liegt fast ausschließlich in reduzierter Form vor (Hwang et. al., 1992). Das Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem Glutathion im Cytoplasma liegt bei 50:1 bis 200:1 (Hwang et. al., 1992). Ein ähnliches Niveau an oxidiertem und reduziertem Glutathion wirkt sich ebenfalls negativ auf die Disulfidbrückenausbildung in vitro aus (Hwang et. al., 1992; Saxena und Wetlaufer, 1970; Lyles und Gilbert, 1991; Walker und Gilbert, 1994). Essentielle cytoplasmatische Enzyme benötigen das Thioredoxin- und Glutaredoxin-System, um ihren katalytischen Zyklus durch Reduktion ihrer Disulfidbrücken zu vervollständigen. Eine Modifizierung des Redoxzustandes im Cytoplasma durch Mutation im Thioredoxin- und Glutaredoxin-System wirkt sich positiv auf die Löslichkeit rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken aus. Die Löslichkeit dieser rekombinanten Proteine kann somit durch die Wahl einer E. coli Doppelmutante in Thioredoxin-Reduktase (trxB) und Glutathion- Reduktase (gor) erhöht werden (Bessette et al., 1999). 7 I Einleitung I.1.3 Export ins Periplasma Der Export des Targetproteins in das Periplasma hat folgende Vorteile: • Die oxidierende Umgebung des Periplasmas erlaubt die Ausbildung von Disulfidbrücken, die im Cytoplasma nicht möglich wäre. • Das Periplasma beinhaltet die Disulfid-Oxidoreduktasen DsbA und DsbB sowie die Disulfid-Isomerase DsbC, die die Bildung und Isomerisierung von Disulfidbrücken katalysieren. • Im Periplasma liegt geringere Proteolyse vor. • Die Akkumulation an Protein, welches im Cytoplasma toxisch auf die Zelle wirkt, ist möglich. • Eine vereinfachte Aufreinigung des rekombinanten Proteins ist aufgrund verringerter Wirtszellproteine im Vergleich zu cytoplasmatischer Expression gegeben. Der Export in das Periplasma ist ein natürlicher Prozess und kann dazu genutzt werden, rekombinante Proteine in löslicher Form zu produzieren. Der maximale Anteil an exportiertem, rekombinantem Protein liegt bei nur etwa 5% des Gesamtzellproteins (Lottspeich und Zorbas, 1998). Der Export in das Periplasma, in dem, im Gegensatz zum Cytoplasma, oxidierende Bedingungen herrschen, erfolgt durch eine Leadersequenz in Form eines Signalpeptides am N-Terminus des Proteins. Die künstliche Leadersequenz kann mit einem rekombinanten Protein fusioniert werden. Häufig genutzt werden die Leadersequenzen der Gene pelB, wie in pET-20b(+), und ompT. Rekombinante Proteine werden mit Hilfe der Signalpeptide nach der Induktion der bakteriellen Expression in den periplasmatischen Raum von E. coli transportiert. Dies sollte zu einer korrekten Faltung und aufgrund der geringen Menge an Proteasen in diesem Zellkompartiment zu einer hohen Stabilität des rekombinanten Proteins führen. Das Pectat-Lyase Signalpeptid pelB leitet sich vom pelB-Gen des Bakteriums Erwinia carotovora ab und vermittelt den Export des mit ihm fusionierten Proteins in den periplasmatischen Raum, wo das Signalpeptid durch spezifische Proteasen abgespalten wird (Lottspeich und Zorbas, 1998). Der Ertrag fällt üblicherweise jedoch geringer aus und nicht das gesamte exprimierte Protein wird in das Periplasma exportiert. Die Sekretion in das Periplasma bietet jedoch die Möglichkeit einer konstitutiven Expression, da keine hohen intrazellulären Konzentrationen des rekombinanten Proteins entstehen. Bei zu hoher cytosolischer Synthese kann es aufgrund des limitierenden Membrantransportes zu einer Akkumulation von Vorläuferproteinen kommen (Lottspeich und Zorbas, 1998). 8 I Einleitung I.1.4 Chaperone Molekulare Chaperone (Tab. I-3) dienen der Kontrolle der Proteinfaltung und der Aggregation. Sie sind in allen Zellen, vom Bakterium bis hin zum Mensch, in hoher Konzentration vertreten. Dabei agieren sie unterstützend bei der de novo Proteinfaltung, sowie bei missgefalteten Proteinen, gewährleisten das Überleben der Zelle in Stresssituationen und fungieren als Schutzsystem aufgrund der besonderen Bedingungen innerhalb einer Zelle („molecular crowding“). Nicht alle Proteine benötigen Chaperone zur Ausbildung ihrer korrekten räumlichen Struktur. In Stresssituationen, die die Faltung beeinflussen, können jedoch alle Proteine mit Chaperonen interagieren. Die Synthese von Chaperonen innerhalb der Zelle wird durch Stresssituationen, wie z.B. Hitzeschock, induziert. Aus diesem Grund werden molekulare Chaperone auch als Hitzeschockproteine (Hsps) bezeichnet. In der Zelle agieren verschiedene Chaperon-Systeme zum Schutz vor Proteinaggregation, indem sie ungefaltete und partiell gefaltete Übergangszustände stabilisieren. Inkorrekte Faltungswege werden somit vermieden. Es wird vermutet, dass exponierte hydrophobe Bereiche der nasszierenden Polypeptidkette zum Schutz vor falschen Interaktionen und zur Unterstützung des Faltungsprozesses bereits am Ribosom vom Trigger-Faktor gebunden werden (Bukau et al., 2000). Dieses Chaperon kommt bei allen Eubakterien vor und wurde in Eukaryonten bisher nicht gefunden (Mogk et al., 2001). Ein Chaperon-System setzt sich aus DnaK (Hsp70) mit den Co-Chaperonen DnaJ und GrpE zusammen. Ein zweites System bilden GroEL (Hsp60) und GroES. Zeitlich agiert das ChaperonSystem DnaK, DnaJ, GrpE vor dem GroELS-Chaperon-System. ClpB und DnaK, DnaJ und GrpE sind an der Rückfaltung von Proteinen in ihre native Struktur beteiligt. GroELS greift direkt in die Faltung des vom Ribosom freigesetzten Polypeptids ein, wobei DnaK, DnaJ und GrpE mit der nasszierenden, sowie mit dem vom Ribosom freigesetzten Polypeptid agieren (Deuerling et al., 1999; Teter et al., 1999; Schaffitzel et al., 2001; Ewait et al., 1996). Adenosintriphosphat (ATP) wird bei der Faltung des Proteins in die native Struktur benötigt. Die kleinen Hitzeschock-Proteine (sHsps) IbpA und IbpB arbeiten unabhängig von CoChaperonen und werden innerhalb großer Proteinaggregate (Inclusion Bodies) gefunden, die häufig aufgrund der Überexpression heterologer Proteine in E. coli generiert werden. Ihre Funktion liegt in der Entstehung gemischter Aggregate, die zurückgefaltet werden können. 9 I Einleitung Familie Hsp60 Struktur 14-mer ATP- Vertreter Co- Bedarf (prok.) Chaperon + GroEL GroES Funktion in der Zelle - de novo Proteinfaltung - Aggregationsverhinderung von hitzedenaturierten Proteinen Hsp70 Monomer + DnaK DnaJ, GrpE - de novo Proteinfaltung - Aggregationsverhinderung von hitzedenaturierten Proteinen - Auflösung von Proteinaggregation zusammen mit ClpB - Regulation der Hitzeschockantwort Hsp90 Dimer + HtpG - - Resistenz gegen extremen Hitzschock Hsp100 6-7-mer + ClpA - - Proteolyse zusammen mit der Protease ClpP + ClpB - - Disaggregation zusammen mit Hsp70 SecB Tetramer - SecB - - Sekretion von Proteinen durch die Cytoplasmamembran 8-24-mer - IbpA - hitzedenaturierten Proteinen sHsp TriggerFaktor - Aggregationsverhinderung von Monomer - IbpB - - Bindung an Proteinaggegate - Trigger- - - de novo Proteinfaltung am Faktor Ribosom Tab. I-3: Struktur und Funktion der Chaperon-Familien (Mogk et al., 2001) 10 I Einleitung I.1.4.1 Molekularer Mechanismus der Chaperone Die meisten Chaperone binden an ein oder mehrere kurze hydrophobe Peptidsegmente (Mogk et al., 2001). In einem nativen Protein sind diese Peptidsegmente meist im Inneren, im hydrophoben Kern, lokalisiert. Nasszierende oder missgefaltete Proteine tragen diese Segmente nach außen und werden von Chaperonen gebunden oder aggregieren. Durch die Vermeidung der Assoziation mehrerer Segmente verschiedener Polypeptide wird eine Aggregation unterbunden. Diese Aktivität der Chaperone, Proteine in Lösung zu halten, ist Adenosintriphosphat (ATP)unabhängig, wohingegen die Faltung der Proteine z.B. durch das System DnaK, DnaJ, GrpE oder GroELS in die aktive dreidimensionale Struktur die Anwesenheit von ATP erfordert, da das ständige Schließen und Lösen von Wechselwirkungen zelluläre Energie in Anspruch nimmt. Im Folgenden wird der molekulare Mechanismus für je einen Hauptvertreter der ChaperonFamilien Hsp60 und Hsp70 beschrieben. Über die Struktur und Funktionsweise der anderen Chaperon-Familien aus Tabelle I-3 ist noch relativ wenig bekannt. I.1.4.1.1 Hsp60-Chaperon Abb. I-1: kryoelektronenmikroskopische Aufnahme der GroEL-Struktur mit und ohne Co-Chaperon GroES (Roseman et al., 1996) Missgefaltete Polypeptid-Ketten werden an die Innenseiten eines hohlraumähnlichen Doppelrings aus je sieben GroEL-Molekülen gebunden, woran ein Ring aus sieben GroESMolekülen als Co-Chaperon anlagert und nach der Bindung von ATP das im Innenraum befindliche Protein verschließt (Bukau et al., 2000 und Hartl et al., 1996). Beide GroEL-Ringe sind in der Lage, phasenverschoben Proteine zu falten. Eine GroEL-Faltungskammer bietet 11 I Einleitung jedoch nur Platz für Polypeptide kleiner als 60 kDa, was zu der Vermutung führt, dass GroELS an der Faltung größerer Proteine nicht beteiligt ist. I.1.4.1.2 Hsp70-Chaperon Abb. I-2: Sekundärstruktur der ATPase-Domäne (im Komplex mit ATP und Mg2+) und der SubstratbindungsDomäne (im Komplex mit einem Peptid) von DnaK (Flaherty et al., 1990; Zhu et al., 1996) Abb. I-3: der DnaK-Zyklus (Mogk et al., 2001) DnaK besteht aus einer ATPase-Domäne sowie einer Substratbindungs-Domäne und bindet ein kurzes Peptidsegment von ungefähr fünf Aminosäuren des missgefalteten Proteins. Die Hydrolyse von ATP, stimuliert durch DnaJ, kontrolliert die Bindung und Dissoziation des Substrat-Proteins, wobei die Co-Chaperone DnaJ und GrpE regulierend wirken und mit DnaK eine funktionelle Einheit bilden. Dieser Mechanismus ist von der Größe des Substrat-Proteins unabhängig (Deuerling et al., 1999 und Mogk et al., 1999). 12 I Einleitung Abb. I-4: Protein-Zyklus innerhalb der Zelle (Mogk et al., 2001) Kontrolle der Proteinfaltung durch molekulare Chaperone (rote Pfeile: β-Faltblatt, grüne Zylinder: α-Helices) Die einzelnen Chaperon-Familien bilden somit ein funktionelles Netzwerk in der Zelle. Ihre Bedeutung als Schutzsystem wird deutlich bei der Abwesenheit eines molekularen Chaperons aufgrund einer Mutation. Diese Zellen weisen häufig ein temperatursensitives Wachstum sowie erhöhte Aggregation an Protein bei erhöhter Temperatur auf (Mogk et al., 1999). Extreme Stresssituationen können zur Überlastung des Chaperon-Systems führen, die zur ungewünschten Aggregation sensitiver Proteine führt. Untersuchungen an der Hefe Saccharomyces cerevisiae, dem Bakterium Escherichia coli und der Pflanze Arabidopsis thaliana beweisen die Rückfaltung bereits aggregierter Proteine in ihre native Struktur in vivo und in vitro durch die Aktivität des Bi-Chaperon-Systems ClpB und DnaK, DnaJ, GrpE (Glover et al., 1998 und Mayer et al., 2000). Eine rekombinante Überexpression stellt eine Stresssituation für die Zelle dar. Chaperone können somit bei der Expression rekombinanter Proteine von Nutzen sein, wenn sie coexprimiert werden (Mogk et al., 2001). Die ideale Chaperon-Kombination ist jedoch für jedes rekombinante Protein verschieden und muss in einem Screening-Verfahren ermittelt werden. 13 I Einleitung I.1.5 Fusionsproteine Durch die rekombinante DNA-Technologie ist es möglich, ganze Proteine oder Proteindomänen mit heterologen Proteinen zu fusionieren (Lottspeich und Zorbas, 1998). Die Fusion rekombinanter Proteine mit zelleigenen Proteindomänen kann folgende Vorteile mit sich bringen: • Der proteolytische Abbau rekombinanter Proteine als Fusionsproteine in der Wirtszelle ist stark verlangsamt und die Toxizität vermindert. • Eine Aggregation wird häufig verhindert, wodurch die Bildung von Inclusion Bodies vermieden wird. • Die Fusion mit heterologen Proteinen, die zur Affinitätsreinigung eingesetzt werden, erleichtert die Proteinaufreinigung. • Die Disulfid-Oxidoreduktase (DsbA) und die Disulfid-Isomerase (DsbC) als Fusionspartner zeigen einen positiven Effekt auf die Löslichkeit heterologer Proteine, da sie Einfluss auf die Disulfidbrücken-Ausbildung nehmen können. Fusionspartner-Protein β-Galactosidase Herkunft Escherichia coli Molekulargewicht Ligand für in kDa Affinitätsreinigung 116 p-Aminophenyl-β-Dthiogalactosid (APTG) Glutathion-S-Transferase Schistosoma (GST) japonicum Intein/Chitin- Saccharomyces Bindungsdomäne cerevisiae/Bacillus 26 Glutathion 55 Chitin Escherichia coli 40 Amylose Staphylococcus 31 IgG 13 Biotin 4 Calmodulin circulans Maltose-Bindungsprotein (MBP) Protein A aureus Streptavidin Streptomyces avidinii Calmodulin-Bindungsprotein Homo sapiens (CBP) 14 I Einleitung Fusionspartner-Protein Herkunft Molekulargewicht in kDa DsbA Escherichia coli 23 DsbC Escherichia coli 26 Thioredoxin (Trx) Escherichia coli 12 NusA Escherichia coli 55 Herkunft Molekulargewicht Tab. I-4: Fusionen Tags für die Proteinreinigung poly-Arg Reinigung durch in kDa synthetisch 1-3 Ionenaustauschchromatographie; Bindung an Kationenaustauscher poly-Asp synthetisch 1-2 Ionenaustauschchromatographie; Bindung an Anionenaustauscher poly-His synthetisch 1 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC); Komplexierung mit Ni2+- oder Co2+-Ionen Asp-Tyr-Lys-Asp4-Lys synthetisch 1 Anti-FLAG-Antikörper TM (FLAG ) Tab. I-5: Tags 15 I Einleitung I.2 Produktion rekombinanter Antikörperfragmente in Escherichia coli I.2.1 Antikörper als Bestandteile der humoralen Immunantwort Antikörper (Ak), auch als Immunglobuline bezeichnet, sind Glycoproteine, die ganz spezifisch Antigene (Ag) erkennen. Sie stellen die zentralen Mediatoren der humoralen Immunantwort bei Vertebraten dar. Beim Eindringen des Antigens in den menschlichen oder tierischen Organismus wird die Immunabwehr initiiert, die mit der Produktion von Antikörpern durch B-Lymphozyten einhergeht. Die Antigen-Antikörper-Reaktion besteht aus der Anlagerung des Paratops eines Antikörpers an das Epitop des Antigens, das seine Bildung induziert hat, bzw. an eine Fremdsubstanz mit ähnlichen oder identischen Epitopen wie das Antigen (Kreuzreaktion). Die schnelle, reversible, nichtkovalente Bindung erfolgt über Wasserstoffbrückenbindungen, durch elektrostatische Kräfte, Van-der-Waals-Kräfte sowie hydrophobe Interaktionen. In einem zweiten Schritt entstehen dann bei Bivalenz von Antigen und Antikörper irreversible, unlösliche Immunkomplexe, die die Elimination des Antigens induzieren, z.B. durch Präzipitation oder Agglutination. Gedächtniszellen, d.h. funktionelle, ruhende, immunkompetente B- und TLymphozyten, ermöglichen eine schnelle Immunantwort nach erneutem Kontakt mit dem Antigen, da sie nach dem Kontakt mit einem Antigen nicht absterben. I.2.2 Anwendung rekombinanter Antikörper Ihre einzigartige Fähigkeit, Antigene mit hoher Affinität zu erkennen und zu binden, macht Antikörper zu einem interessanten Molekül für die medizinische und wissenschaftliche Forschung. Ein zentrales Problem bei der therapeutischen Anwendung stellt jedoch die Größe des Antikörpermoleküls mit seinem Molekulargewicht von 150 kDa dar, da die Penetration, z.B. in Tumorgewebe, zumeist unzureichend ist. Die Entwicklung und Anwendung rekombinanter DNA-Technologie führt daher auch zum Design mehrerer neuer Antikörper und Antikörperfragmente (Moldenhauer et al., 2002). Eine attraktive Alternative zu natürlichen Antikörpern ist das rekombinante „single-chain“ Antikörperfragment (scFv) mit einem Molekulargewicht von 30 kDa und den gleichen AntigenBindungseigenschaften wie bei einem kompletten Immunglobulin (Ig). Der Vorteil liegt zum einen in der geringen Größe des scFv, was eine bessere Penetrationsfähigkeit und Beweglichkeit 16 I Einleitung in Geweben ermöglicht (Milenic et al., 1991; Begent et al., 1996) und zum anderen in seiner Codierung als singuläres Gen, was die Konstruktion von Fusionsproteinen, wie z.B. bispezifischen Antikörpern oder Immunotoxinen (Lorimer et al., 1996; Coloma et al., 1997) sowie die Übertragung in unterschiedliche Expressionssysteme möglicht macht. Eine Multimerisierung von scFv Domänen soll jedoch eine erhöhte Affinität und eine verbesserte in vivo Stabilität aufweisen (Le Gall et al., 1999; Kipriyanov et al., 1999). Die Expression von Antikörperfragmenten auf filamentösen M13-Phagen (Phagen-Display) und die Generierung einer Phagen-Display Bibliothek ermöglicht die gezielte Selektion sowohl humaner als auch muriner Antikörperfragmente für beliebige Antigene in vitro mit erhöhter Affinität, Stabilität und Spezifität. Diese und andere Eigenschaften machen das „single-chain“ Fragment interessant für Anwendungen in Medizin und Forschung, Diagnostik und Therapie. Die Produktion von intrazellulärem scFv besitzt ein gewaltiges Potential für den Eingriff in biologische Prozesse in vivo durch Inaktivierung der Funktion von Proteinen auf hochspezifische Art und Weise. Neben der Klonierung von scFv Fragmenten besteht auch die Möglichkeit, Fab Fragmente (fragment antigen binding) zu klonieren und zu exprimieren. Sie besitzen eine höhere Avidität im Vergleich zu den scFv Fragmenten (Joosten et al., 2003) und beinhalten die Antigenbindungsstelle eines Antikörpermoleküls. Das Molekulargewicht des Heterodimers beträgt etwa 50 kDa (Better et al., 1988). 17 I Einleitung I.2.3 Aufbau des „single-chain“ Antikörperfragments (scFv) Abb. I-5: Struktur eines konventionellen Immunglobulin G (Joosten et al., 2003) konstante Domänen der schweren Ketten: CH1, CH2 und CH3; konstante Domänen der leichten Ketten: CL; variable Domänen der schweren Kette: VH; variable Domänen der leichten Kette: VL; Fab Region: fragment antigen binding Region Ein Antikörper besteht aus zwei identischen schweren (H) und zwei identischen leichten (L) Ketten, die über verschiedene Disulfidbrücken kovalent miteinander zu einem Molekül verknüpft sind. Schwere Ketten besitzen drei Strukturdomänen (CH1, CH2 und CH3) innerhalb ihrer konstanten Region. Die variablen Domänen (VH und VL) bilden das Idiotop, die AntigenErkennungsstelle. Abb. I-6: Struktur eines „single-chain“ Fragments scFv (Joosten et al., 2003) Das „single-chain“ Fragment scFv stellt die Minimalform eines funktionellen Antikörpers dar. Die Antigen-Erkennung des scFv beruht auf der Fusion der variablen Domäne der schweren (VH) und der leichten (VL) Kette über einen hydrophilen und flexiblen Peptidlinker, der Expression und Faltungseffizienz erlaubt (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988) sowie die 18 I Einleitung Entstehung des deutlich kleineren, aber voll funktionsfähigen Moleküls ermöglicht. Wie die meisten Ig Domänen, beinhaltet die variable Domäne zwei konservierte Cysteinreste, die zur Stabilisierung des gefalteten Polypeptids eine Disulfidbrücke ausbilden (Williams et al., 1988; Wörn et al., 1998). Aus diesem Grund beinhaltet ein typisches „single-chain“ Fragment zwei Disulfidbrücken (Glockshuber et al., 1992), um seine Faltung und Antigen- Bindungseigenschaften aufrechtzuerhalten. In den Ig Domänen werden Disulfidbrücken zur Stabilität der gefalteten Konformation und zur Fähigkeit, ein spezifisches Antigen zu erkennen, benötigt. I.2.4 Expression von scFv in Escherichia coli Die Produktion intrazellulärer Antikörper in E. coli wurde aufgrund des Problems der fehlenden Disulfidbrückenausbildung im Cytoplasma, einem notwendigen Schritt im Faltungsprozess der meisten Immunglobuline, für unwahrscheinlich gehalten. Das Cytoplasma von E. coli liegt unter physiologischen Bedingungen in einem reduzierenden Zustand vor, der die Ausbildung stabiler Disulfidbrücken in Proteinen erschwert. In E. coli werden Disulfidbrücken fast ausschließlich in Proteinen ausgebildet, die in das Periplasma exportiert werden. Dies hängt mit den im Periplasma lokalisierten DisulfidOxidoreduktasen (DsbA, DsbB) sowie der –Isomerase (DsbC) zusammen. Aus diesem Grund liegen „single-chain“ Fragmente im Cytoplasma von E. coli Wild-Typ Zellen in reduziertem und ungefaltetem Zustand vor, wohingegen ihre Faltung im Periplasma von der DsbA-Aktivität abhängt. Versuche zeigten jedoch, dass das Cytoplasma ausreichend oxidiert werden kann, um die effiziente Ausbildung nativer Disulfidbrücken zu erlauben, ohne sich auf die Lebensfähigkeit der Zellen negativ auszuwirken (Bessette et al., 1999). Funktionale Antikörperfragmente können somit effizient in E. coli Zellen, die eine Mutation in dem Glutathion-Oxidoreduktase Gen (gor) sowie in dem Thioredoxin-Reduktase Gen (trxB), tragen, sowie ein Derivat der DsbC-Isomerase (∆ssDsbC) ohne Signalsequenz co-exprimieren, produziert werden. ∆ssDsbC fördert die korrekte Faltung und Oxidation des scFv Fragments. Ohne Anwesenheit von ∆ssDsbC liegt nur ein geringer Anteil an exprimiertem scFv in funktionaler Form vor (Paola et al., 2002). Zu beachten ist jedoch die Tatsache, dass die CoExpression von ∆ssDsbA in E. coli trxB gor Doppelmutanten einen negativen Effekt auf die Aktivität von Proteinen mit Disulfidbrücken zeigt (Bessette et al., 1999). 19 I Einleitung E. coli Stämme, die eine Mutation im intrazellulären Thioredoxin- oder Glutathion/Glutaredoxin-System tragen, ermöglichen die Oxidation und Faltung von scFv Fragmenten im Cytoplasma (Jurado et al., 2002). Eine trxB Mutation allein, trotz Co-Expression intrazellulärer Disulfidbrücken-Isomerase (∆ssDsbC), reicht zur Produktion funktionaler scFv im Cytoplasma von E. coli nicht aus (Martineau et al., 1998; Bach et al., 2001). Des Weiteren wirkt sich eine Doppelmutation im trxB und gor Gen auf die Wachstumsgeschwindigkeit der E. coli Zellen aus, da das schnelle Wachstum unter aeroben Bedingungen entweder vom trx oder vom gor Gen abhängt (Prinz et al., 1997). 20 I Einleitung I.3 Problemstellung Das Ziel dieser Arbeit soll die Optimierung einiger Parameter sein, die die Löslichkeit rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken in Escherichia coli verbessern. Dabei soll der Einsatz des Bacteriocin-freisetzenden Proteins (BRP) Anwendung finden, um die Freisetzung periplasmatischer und bestimmter cytoplasmatischer Proteine ins Kulturmedium zu ermöglichen sowie die Co-Expression verschiedener Chaperon-Kombinationen. Mit den rekombinanten Proteinen Fringe Glycosyltransferase (Q24342) und DKFZp564F2122 (AL136604) soll die Funktionalität des BRP-Systems bewiesen werden und auf die Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae (Gen: ClipB14; Protein ID: CAB90819) sowie auf das scFv Fragment (von monoclonal antibody gegen RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster) übertragen werden. Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae beinhaltet in ihrer funktionellen dreidimensionalen Struktur sieben Disulfidbrücken und konnte mit den verschiedenen Fusions-Tags, durch CoExpression mit Chaperonen, Expression in Cyto- und Periplasma sowie in eukaryotischer Expression durch Anwendung des Baculovirus-Systems in aktiver Form bisher nicht gewonnen werden. Das BRP-System soll angewandt werden, um die Serinprotease-4 ins umgebende Kulturmedium von Escherichia coli zu sekretieren, um das rekombinante Protein in löslicher und funktioneller Form zu erhalten. Da die Serinprotease-4 aufgrund ihrer sieben Disulfidbrücken in der funktionellen dreidimensionalen Struktur ein kompliziertes Modellprotein darstellt, wurde das „single-chain“ Fragment (scFv) mit zwei Disulfidbrücken in der aktiven dreidimensionalen Struktur in E. coli kloniert und exprimiert, um die korrekte Disulfidbrückenausbildung überprüfen zu können. Ein weiteres Ziel der Klonierung von scFv Fragmenten soll die Fusion von scFv mit Alkalischer Phosphatase aus E. coli sein, die ein wichtiges Tool in der Immunologie darstellen kann. Ebenso wurden andere Methoden angewandt, die die Faltung und Ausbildung von Disulfidbrücken verbessern sollen, wie die Anwendung einer Doppelmutante in ThioredoxinReduktase (trxB) und Glutathion Reduktase (gor) zur Veränderung des Redoxzustandes im Cytoplasma, die Co-Expression von Chaperonen, der Export ins Periplasma durch Leadersequenzen sowie die Fusion mit oxidierenden Enzymen. Gleichzeitig wurde die angewandte Screening-Technologie optimiert, um eine gute Effizienz in der Bindung rekombinanter Proteine zu erhalten und unspezifische Bindung von Fremdproteinen zu vermeiden. 21 II Material und Methoden II MATERIAL UND METHODEN II.1 Material II.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Alle eingesetzten Chemikalien und Fertiglösungen besaßen mindestens den Reinheitsgrad p.a. und wurden von folgenden Firmen bezogen: 30 % Acrylamid/Bis Lösung Bio-Rad Laboratories GmbH, München Agarose GibcoBRL Life Technologies GmbH, Eggenstein Ammoniumpersulfat Serva Electrophoresis GmbH Ampicillin Natriumsalz Serva Electrophoresis GmbH L-(+)-Arabinose Sigma-Aldrich, Steinheim Borsäure Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Bromphenolblau Bio-Rad Laboratories GmbH, München Carbenicillin-Dinatriumsalz AppliChem Di-Kaliumhydrogenphosphat Tetrahydrat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Essigsäure Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Ethanol Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Ethidiumbromid Serva Electrophoresis GmbH Glutathion (reduziert) Sigma-Aldrich, Steinheim Glycerin Merck Eurolab GmbH, Darmstadt IPTG MBI Fermentas GmbH Kaliumdihydrogenphosphat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Lysozym (from chicken egg white) Sigma-Aldrich, Steinheim Natriumchlorid Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Natriumhydroxid Merck Eurolab GmbH, Darmstadt N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin Serva Electrophoresis GmbH PEG 20.000 Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Salzsäure (32 %) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt SDS Sigma-Aldrich, Steinheim Simply BlueTM SafeStain Invitrogen Spectinomycin Dihydrochlorid Sigma-Aldrich, Steinheim ® Titriplex III (Natrium-EDTA) ® Triton -X Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Serva Electrophoresis GmbH ® Sigma-Aldrich, Steinheim ® Serva Electrophoresis GmbH Trizma base (TRIS) Tween 20 22 II Material und Methoden Material zur Proteinaufreinigung: Bio-Spin® Disposable chromatography columns Bio-Rad Laboratories GmbH, München Dynabeads® TALONTM (magnetisch) Dynal Biotech, Norwegen Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow Amersham Biosciences His BindTM Magnetic Agarose Beads Novagen Ni-NTA Magnetic Agarose Beads Quiagen GmbH, Hilden spectra/Por® Membrane Spectrum TALON® Metal Affinity Resin BD Biosciences Clontech Verbrauchsmaterialien stammten von Applied Biosystems, Becton Dickinson Labware, Bio-Rad Laboratories GmbH (München), Brand GmbH + Co (Wertheim), Eppendorf (Hamburg), Kodak, Millipore (Eschborn), Schott (Mainz) und Ratiolab GmbH. II.1.2 Enzyme und Reaktionskits Sämtliche verwendete Restriktionsendonukleasen und die Alkalische Phosphatase, Calf Intestinal (CIP), wurden von der Firma New England Biolabs GmbH (Frankfurt a. M.) bezogen. Folgende Reaktionskits wurden verwendet und, soweit nicht anders beschrieben, nach Herstellerangaben eingesetzt: • Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) • LMW SDS Marker Kit (Amersham Biosciences) • NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel, Düren) • ProofStartTM DNA Polymerase Kit (Qiagen GmbH, Hilden) • QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden) • QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen GmbH, Hilden) • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden) • Quick LigationTM Kit (New England Biolabs GmbH, Frankfurt a. M.) 23 II Material und Methoden II.1.3 Antikörper und Enzym-konjugierte Nachweisantikörper In den immunologischen Untersuchungen zur Detektion bestimmter Proteine wurden folgende Antikörper und Enzym-konjugierte Nachweisantikörper verwendet: • anti-HIS HRP-conjugated (Amersham Biosciences) • anti-rabbit IgG Alkaline Phosphatase Conjugate (Sigma-Aldrich, Steinheim) • anti-rabbit IgG HRP-conjugated (Pierce Biotechnologie, Rockford) • anti-Ser 4 rabbit polyclonal (B14(1962)) (EMBL, Kafatos Gruppe, Heidelberg) II.1.4 Bakterienstämme Als Rezipienten für rekombinante DNA, zur Vermehrung und Isolierung von Plasmiden, sowie zur Proteinexpression wurden die in Tab. II-1 aufgeführten E. coli-Stämme verwendet: Stamm Genotyp BL21 (DE3) (Novagen) F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) DH5α (Life Technologies) F- φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK-, mK+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 E.coli K12 N3406* (MoBiTec) thr, leu, thi, lac Y, tonA, supE JB siehe BL21(DE3) (Novagen) + Vektor pJL3 JT siehe TOP10 (Invitrogen) + Vektor pJL3 Origami (DE3) (Novagen) ∆ara-leu 7697 ∆lacX74 ∆phoAPvull phoR araD 139 galE galK rspL F’[lac-(lacIq)pro] gor522::Tn10(TcR) trxB::kan (DE3) Top10 (Invitrogen) F-, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, araD139, ∆(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL, (StrR), endA1, nupG XL1-Blue (Stratagene) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Tab. II-1: Übersicht über die verwendeten E. coli-Stämme * Der E .coli Stamm K12 N3406 (MoBiTec) trägt bereits das Plasmid pJL3. 24 II Material und Methoden II.1.5 Plasmid-Vektoren • pBADM-20 (abgeleitet vom kommerziellen pBAD/His A (Invitrogen)): Der pBADM-20 Vektor entspricht einer Größe von 4421 bp, trägt zur Selektion den Ampicillin® Resistenz Marker AmpR und ist mit einer TEV-site, Thioredoxin (TrxA) als N-terminalen Fusionspartner des Proteins und N-terminalem His-Tag ausgestattet. Das Arabinose-System in pBADM-20 besteht aus dem starken araB-Promotor und dem zugehörigen Repressor. Die Regulation des araB-Promotors unterliegt der Kontrolle von Arabinose. Dieses Expressionssystem ermöglicht ein regulierbares Expressionsniveau aufgrund der proportionalen Steuerung der Transkription durch die Induktorkonzentration. Ein Nachteil dieses Vektors ist die Katabolitrepression durch Glucose, Fructose und andere Kohlenstoffquellen. • pET-20b(+): Der pET-20b(+) Vektor (Novagen) besteht aus 3716 bp und trägt eine N-terminale pelB Signalsequenz zur periplasmatischen Lokalisation des Proteins, sowie eine C-terminale His-Tag Sequenz. Die Expressionsregion wird von der T7-RNA-Polymerase transkribiert. pET-20b(+) trägt den Ampicillin® Resistenz-Marker und den T7-Promotor. Der T7-Promotor vermittelt eine hohe Transkriptionseffizienz und wird von der T7-RNAPolymerase erkannt. Mit dem T7-Expressionssystem werden Expressionsniveaus von bis zu 50 % des Gesamtzellproteins erreicht (Lottspeich und Zorbas, 1998). Das Gen für die T7-RNAPolymerase ist bei geeigneten Wirtsstämmen im Genom des Bakteriums lokalisiert und wird über den lac-Operator reguliert. • pETM-11 (modifizierter pET-24d(+) (Novagen)): Ausgestattet ist der pETM-11 (6029 bp) mit dem Kanamycin® Resistenzmarker, einer TEV-site, einem N-terminalen His-Tag und einem T7-Promotor. Die Regulation der Expression unterliegt dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. 25 II Material und Methoden • pETM-13 (modifizierter pET-24d(+) (Novagen)): Der pETM-13 (6086 bp) trägt den Kanamycin® Resistenzmarker, einen C-terminalen His-Tag und einen T7-Promotor. Die Regulation der Expression unterliegt dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. • pETM-20 (modifizierter pET-32 (Novagen)): Die Größe des Vektors pETM-20 entspricht 6123 bp, trägt den Ampicillin® Resistenz Marker und ist mit einer TEV-site, Thioredoxin (TrxA) als N-terminalen Fusionspartner des Proteins und N-terminalem His-Tag ausgestattet. Die Regulation der Expression unterliegt ebenfalls dem lac Repressor. • pETM-50 (modifizierter pET-24d(+) (Novagen)): Die Größe des Vektors pETM-50 entspricht 6284 bp. Die Regulation der Expression unterliegt ebenfalls dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. Zusätzlich zu TEV-site und Nund C-terminalem His-Tag trägt der pETM-50 das Gen DsbA, welches für das Protein DsbA codiert, ein an der Disulfidverbrückung im Periplasma beteiligtes Protein. pETM-50 trägt den Kanamycin® Resistenz Marker. • pETM-80: Der Vektor pETM-80 ist ein modifizierter pET-24d(+) Vektor (Novagen) und trägt das DsbCGen mit Leadersequenz für den Transport des exprimierten Proteins in das Periplasma. Er ist ausgestattet mit einem T7-Promotor und die Regulation der Expression unterliegt dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. Neben dem DsbC-Gen trägt der pETM-80 einen Nterminalen His-Tag und eine TEV-site und ist resistent gegen Kanamycin®. • pETM-82: Der pETM-82 leitet sich vom pET-9d (Novagen) ab und trägt einen N-terminalen His-Tag, eine TEV-site, sowie ein Kanamycin®-Resistenzgen als Selektionsmarker. Die fehlende Leadersequenz führt zu cytoplasmatischer Expression mit DsbC-Fusion. • pETM-90 (modifizierter pET-24d(+) (Novagen)): pETM-90 besteht aus 6673 bp und trägt das Ampicillin®-Resistenzgen als Selektionsmarker. An den im Vektor verwendeten T7-Promotor bindet die T7-RNA-Polymerase. Der pETM-90 ist zusätzlich mit einem C-terminalen His-Tag, einer TEV-site, sowie dem Gen ftr, das für Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase, einem hyperthermophilen Enzym, codiert, 26 II Material und Methoden ausgestattet. Diese Fusion erlaubt die Hitzeaufreinigung des rekombinanten Proteins (de Marco et al., 2004). • pGEX-6P-1 (Pharmacia): pGEX-6P-1 ist ~ 4900 bp groß und trägt das Ampicillin®-Resistenzgen, das für β-Lactamase codiert und den tac-Promotor. Die Regulation der Expression unterliegt dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. Zusätzlich ist der pGEX-6P-1 mit einem N-terminalen GST (Glutathion-S-Transferase)-Tag ausgestattet. Der tac-Promotor ist ein Hybridpromotor und setzt sich aus dem lac- und trp-Promotor zusammen. Er vereint die hohe Transkriptionseffizienz des trp-Promotors mit der einfachen Induzierbarkeit des lac-Promotors. Da dieser Hybridpromotor nicht streng reprimiert wird, wird das rekombinante Protein auch in Abwesenheit des Induktors geringfügig exprimiert. • pJL3: Der Vektor pJL3 entspricht einer Größe von 8300 bp, trägt den Chloramphenicol® Resistenz Marker CmR und den p15A1 Replikationsursprung. pJL3 besitzt keinen Polylinker, beinhaltet jedoch das Bacteriocin-freisetzende Protein (BRP) unter der Kontrolle des E. coli LipoproteinPromotors lppp und des lac Promotor/Operator-Systems lacpo. Die Regulation der Expression unterliegt dem lac Repressor, für welchen das lacI Gen codiert. Abb. II-1: der Vektor pJL3 (MoBiTec Handbuch) 27 II Material und Methoden • pMAL-p2X: Der pMAL-p2X Vektor ist 6723 bp groß und beinhaltet ein malE Gen, welches für das MaltoseBindungs Protein (MBP) codiert. Die Expression führt zu einem N-terminalen MBPFusionsprotein, welches aufgrund des malE Signals durch die Cytoplasmamembran transportiert wird. Der pMAL-p2X Vektor ist mit einem starken tac-Promotor ausgestattet. Er beinhaltet den Replikationsursprung pMB1 von pBR322, den Replikationsursprung M13 sowie das Ampicillin®-Resistenzgen als Selektionsmarker. • pSTE2-215 (Yol) (Genebank accession no. Y18290): Der pSTE2-215 (Yol) ist ein Expressionsvektor zur Produktion eines scFv Fragments fusioniert mit Streptavidin. Er entspricht einer Größe von 4363 bp und trägt das Ampicillin®-Resistenzgen als Selektionsmarker. II.1.6 Synthetische Oligonukleotide Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Sigma-Aldrich (Steinheim) synthetisiert. Die entsalzten Primer konnten direkt nach entsprechender Verdünnung in 10 mM TRIS-HCl Lösung (pH 8,5) für PCR-Reaktionen zur Amplifikation von DNA eingesetzt werden (II.2.1.1). Name Sequenz Schmelztemp. Tm forward Alkalische 5’-CATGCATCATGAAACAAAGCACTATTGCACTG-3’ 75.2°C 5’-CGTGGTACCTTTCAGCCCCAGAGCG-3’ 77.0°C 5’-TCCGAGCTCCAAGTTCAGCTGCAGC-3’ 76.8°C 5’-GTCCTACCGAATTCCAAGTTCAGCTGCAGCAGTC-3’ 79.1°C 5’-TAGTTTGCGGCCGCGCCCGTTTGATTTC-3’ 82.3°C 5’-GATTGTAGCCTGCAGGTTAGCCCGTTTGATTTCCAG-3’ 79.8°C Phosphatase reverse Alkalische Phosphatase forward scFv (for pETM-13) forward scFv (for pMAL-p2X) reverse scFv (for pETM-13) reverse scFv (for pMAL-p2X) Tab. II-2: Primer zur DNA-Amplifikation Die Restriktionsschnittstellen sind farbig markiert. Die Schmelztemperaturen (Tm) stammen aus den Datenblättern der Primer (Sigma-Aldrich). 28 II Material und Methoden Name Sequenz M13/pUC Primer (upstream) 5’-dCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ malE Primer (downstream) 5’-dGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-3’ T7 Universal Primer 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ Tab. II-3: Primer zur DNA-Sequenzierung II.1.7 Medien, Puffer und Lösungen Alle verwendeten Medien, Puffer und Lösungen wurden mit doppelt destilliertem Wasser angesetzt. Spezielle Lösungen oder Puffer sind am Ende der jeweiligen Methode aufgeführt. Die pH-Wert Einstellung erfolgte, wenn nicht anders vermerkt, mit HCl oder NaOH. Nährmedien wurden durch Autoklavieren sterilisiert. Thermolabile Komponenten wurden sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren sowie Abkühlen zugesetzt. • 2X YT-Medium: 1 % Bacto Trypton 1 % Bacto Hefe-Extrakt 0,5 % NaCl pH 7,2 • SOC-Medium: 2 % Bacto Trypton 0,5 % Bacto Hefe-Extrakt 5 M NaCl 1 M MgCl2 1 M KCl 1 M MgSO4 20 % Glucose pH 7,2 • 0,2 M IPTG • 1 M MgCl2 • 20 % Glucose • 80 % Glycerin 29 II Material und Methoden • Antibiotika-Stammlösungen (1000x): Ampicillin®: 100 mg/mL Carbenicillin®: 100 mg/mL 10 ng/mL 34 ng/mL Kanamycin®: 30 mg/mL Spectinomycin®: 50 mg/mL Chloramphenicol®: II.1.8 Geräte, Apparaturen und Zubehör • Fluorimeter: Luminescence Spectrometer Aminco Bowman® Series 2 • Fotodokumentation: Documentation System MidiDocTM (Herolab) ICU-1 (Herolab) Kamera E.A.S.Y 429 K (Herolab) Video Graphic Printer UP-890CE (Sony) • FPLC-Anlage: Controller LCC-501 Plus (Amersham Biosciences) Fraktionssammler FRAC-100 (Amersham Biosciences) HiTrapTM 5 mL chelating HP column (Amersham Biosciences) HiTrapTM 5 mL desalting column (Amersham Biosciences) Pumpe P-500 (Amersham Biosciences) Software: FPLC director Version 1.10 Uvicord VW 2251 (Amersham Biosciences) • Gelelektrophorese-Apparatur: Electrophoresis Power Supply-EPS 301 (Amersham Biosciences) Gelträger, Probenkämme (Amersham Biosciences) Mighty Small multiple gel caster (Amersham Biosciences) miniVE vertical electrophoresis system (Amersham Biosciences) • PCR-Thermocycler: GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) • pH-Meter: Meterlab® PHM210 (Radiometer analytical) 30 II Material und Methoden • Pumpe: LKB Pump P-1 (Amersham Biosciences) • Roboter: KingFisher® instruments (Thermo Electron Corporation) • Rührer: MR 3001 (Heidolph) • Schüttler: Certomat® R (B. Braun Biotech International) C24KC Refrigerated Incubator Shaker (New Brunswick Scientific) DYNAL® sample mixer Innova 4430 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific) Model TC7 (New Brunswick Scientific) • Spektrophotometer: GeneQuant pro (Amersham Biosciences) • Thermoblöcke: Eppendorf Thermostat 5320 Grant QBT • Ultraschallbad: Ultrasonic cleaner (Branson 200) • UV-Transilluminator: Foto/PrepI (Fotodyne) • Vortexer: VORTEX-2 GENIE Model G-560 E (Scientific Industries) • Waagen: CP 124 S (Sartorius) SBC 51 (SCALTEC Instruments) • X-Ray Film Processor: RP X-OMAT Processor Model M6B (Kodak) KODAK® BioMax MR Film, MR-1 Entwicklungskassette (REGO) • Zentrifugen: Biofuge PICO (Heraeus) Labofuge 400R (Heraeus) Sorvall® RC 2B PLUS (Du Pont Instruments) L-70 Ultrazentrifuge (Beckman) 31 II Material und Methoden II.2 Molekularbiologische Methoden II.2.1 Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) II.2.1.1 PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten Mit der Methode der Polymerase-Kettenreaktion ist die enzymatische in vitro-Amplifikation und Modifikation bestimmter Nukleotidsequenzen (Saiki et al., 1988) möglich. Synthetische DNAOligonukleotide (Primer) hybridisieren an der Matrizen-DNA und dienen als Startermoleküle, da von deren 3’-Ende aus die hitzestabile DNA-Polymerase den neuen DNA-Doppelstrang synthetisiert. Der gegenläufig orientierte Primer legt die zu amplifizierende DNA-Sequenz fest, die aufgrund der zyklischen Wiederholung der Reaktionsschritte exponentiell amplifiziert wird. Über die eingesetzten Oligonukleotide wurden neue Restriktionsschnittstellen eingeführt, um die Klonierung der erhaltenen DNA-Fragmente in ein bestimmtes Expressionssystem zu ermöglichen. Der Reaktionsansatz von 50 µL zur PCR erfolgte in 0,2 mL „MicroAmp®“-Reaktionsgefäßen. Komponente Endkonzentration 10x ProofStart PCR Puffer 1x Primer A (forward) 1 µM Primer B (reverse) 1 µM dNTPs 300 µM genomische DNA/Plasmid-DNA 100 ng/50 ng ProofStart DNA-Polymerase 2,5 units Reinstwasser Tab. II-4: Parameter der Polymerase-Kettenreaktion Konstrukte Matrizen-DNA Alkalische Phosphatase genomische DNA aus E. coli (II.2.8) scFv (for pETM-13) pSTE2-215 (Yol) scFv (for pMAL-p2X) pSTE2-215 (Yol) Tab. II-5: Übersicht der amplifizierten Konstrukte aus der entsprechenden Matrizen-DNA 32 II Material und Methoden Die Amplifikation des gewünschten DNA-Fragments erfolgte im Thermocycler nach folgendem Programm: 1x 95°C 5 min initiale Denaturierung 35x 94°C 30 sec Denaturierung 1x 55°C* 30 sec Primer-Hybridisierung 72°C 1 min Primer-Verlängerung 72°C 7 min finale Verlängerung Die Durchführung der PCR-Reaktionen erfolgte im Thermocycler, wobei der Start der PCRReaktion von 5 Minuten bei 95°C aus der thermischen Denaturierung der Matrizen-DNA bestand. Die Hybridisierung der Primer fand bei 55°C* für 30 sec statt, wobei sich diese an die komplementäre Sequenz der einzelsträngig vorliegenden Matrizen-DNA anlagerten. *Da die optimale, sequenzabhängige Primer-Hybridisierungs-Temperatur (Tm-5°C) für jeden eingesetzten Primer (II.1.6) bei oder über der optimalen Amplifikationstemperatur der DNAPolymerase von 72°C lag, wurde zunächst die Temperatur von 55°C zur Primer-Hybridisierung gewählt. Da die Analyse des PCR-Produkts mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4) eine scharfe Bande des amplifizierten DNA-Fragments ergab, wurden sämtliche PCRReaktionen nach oben genanntem Programm durchgeführt. Bei zu niedrigen PrimerHybridisierungs-Temperaturen kann es jedoch auch zu unspezifischen Hybridisierungen mit anderen ähnlichen Sequenzbereichen der Matrizen-DNA kommen. Eine Inkubation von 1 min bei 72°C ermöglichte die Synthese des Sequenzabschnittes zwischen den Primern durch die DNA-Polymerase. Aufgrund einer thermostabilen DNA-Polymerase ist eine kontinuierliche PCR-Reaktion ohne weitere Enzymzugabe von etwa 35 Zyklen erst möglich. Das gewünschte DNA-Fragment wurde in 35 sich wiederholenden Zyklen (Denaturierung, Anlagerung der Oligonukleotide, DNA-Synthese) amplifiziert. Die anschließende Inkubation von 7 min bei 72°C gewährleistet die vollständige Verlängerung der DNA-Fragmente. Nach Beendigung der PCR-Reaktion erfolgte die Auftrennung und Analyse des PCR-Produkts mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4.2), um Ausbeute, Reinheit und Größe des 33 II Material und Methoden amplifizierten Fragments zu ermitteln. Für weitere Klonierungen wurde das PCR-Produkt aus dem Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben extrahiert. II.2.2 DNA-Klonierung II.2.2.1 Restriktionsenzym-Verdau von DNA Die DNA-Restriktionen erfolgten nach Vorschrift des Enzymherstellers (New England Biolabs) unter Verwendung der geeigneten Puffer und unter Beachtung der jeweiligen Temperatur- und Zeitoptima. Pro µg DNA wurden 2-10 U des jeweiligen Restriktionsenzyms eingesetzt, wobei der Anteil an Enzym 1/10 des Gesamtvolumens des Reaktionsansatzes nicht überschritt. Bei dem Verdau von Plasmid-DNA in einem Reaktionsansatz von 50 µL erfolgte nach 1 h die Zugabe von 1 µL Alkalischer Phosphatase, Calf Intestinal (CIP). Ein Aliquot des Reaktionsansatzes wurde anhand der analytischen Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4.1) auf die Vollständigkeit des Restriktionsenzym-Verdaus überprüft. Für eine anschließende Ligation wurde die verdaute DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt. II.2.2.2 DNA-Ligation Linearisierte DNA-Fragmente aus II.2.2.1 mit überhängenden, komplementären Enden wurden bei Raumtemperatur in „sticky end“-Ligationen TM Herstellerangaben des Quick Ligation mit Quick-T4-DNA-Ligase nach Kits (New England Biolabs) miteinander verknüpft. II.2.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA Zur Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA wurden analytische AgaroseGelelektrophoresen (II.2.4.1) durchgeführt. Die Ermittlung der DNA-Konzentration in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen erfolgte nach Gelelektrophorese (II.2.4.1) durch den Vergleich der Fluoreszenzintensität der Probenbanden mit den Banden bekannter Konzentrationen eines DNA-Markers (1 kb DNA Ladder (NEB, Frankfurt a. M.)) bei 302 nm (Sambrook et al., 1998). 34 II Material und Methoden II.2.4 Agarose-Gelelektrophorese II.2.4.1 Analytische Agarose-Gelelektrophorese Die Separation von DNA-Fragmenten in 1,0 %igen (w/v) Agarosegelen wurde verwendet, um Fragment- und Vektorgrößen aus DNA-Restriktionen und PCR-Reaktionen, sowie die Konzentration von DNA-Lösungen zu ermitteln und zu identifizieren, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Fragmente nicht ausschließlich von ihrer Kettenlänge, sondern auch von ihrer Konformation abhängt. Der Versuchsaufbau und seine Durchführung erfolgten nach SAMBROOK et al. (1989), wobei die Elektrophorese in 1x TBE-Puffer unter Zusatz von 0,1 µg/ml Ethidiumbromid durchgeführt wurde. Die Agarosegele wurden anschließend nach Visualisierung im UV-Licht bei 302 nm aufgenommen. • 1x TBE-Puffer: 89 mM Trizma®-base 89 mM Borsäure 2 mM EDTA II.2.4.2 Präparative Agarose-Gelelektrophorese Zur präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Fragmentgemisch, z.B. nach PCRReaktionen (II.2.1) oder nach Restriktionen (II.2.2.1), wurden präparative AgaroseGelelektrophoresen, wie für die analytische Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4.1) beschrieben, durchgeführt. Das gewünschte DNA-Fragment wurde auf einem UV-Illuminator bei 302 nm lokalisiert und mit einem sterilen Skalpell möglichst eng ausgeschnitten und mittels QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aus der Agarosematrix extrahiert. Die DNAKonzentration wurde für nachfolgende Experimente, wie in II.2.3 beschrieben, bestimmt. 35 II Material und Methoden II.2.5 Transformation von E. coli II.2.5.1 Hitzeschock-Transformation von E. coli II.2.5.1.1 Zur Plasmid-Amplifikation Zur Hitzeschock-Transformation wurden Hitzeschock-kompetente DH5α-Zellen langsam auf Eis aufgetaut, bis sie gerade flüssig waren. 1 ng der zu transformierenden Plasmid-DNA, bzw. 25 ng DNA (10 µL) aus dem Ligationsansatz aus II.2.2.2 wurden in Eppendorf-Cups, die sich auf Eis befanden, vorgelegt und 100 µL an DH5α-Zellen zugegeben, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte durch 45 sec Inkubation in einem Thermoblock von 42°C. Nach einer Abkühlung auf Eis für 5 min erfolgte die Zugabe von 1000 µL SOC-Medium. Während der anschließenden Inkubation von 1 h bei 37°C auf dem Schüttler (280 rpm) erfolgte die Regeneration der E. coli Zellen. Nach abschließender Zentrifugation (1 min bei 3000 rpm, Biofuge PICO) wurde der Überstand bis auf etwa 100 µL abgenommen, das Zellpellet vorsichtig resuspendiert und auf LBAgarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum (siehe Tab. II-6) ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. 36 II Material und Methoden Plasmid Antibiotika-Resistenz pET-20b(+) Ampicillin® pET-20b(+)-scFv Ampicillin® pETM-11 Kanamycin® pETM-11-scFv Kanamycin® pETM-13 Kanamycin® pETM-13-Alkalische Phosphatase Kanamycin® pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv Kanamycin® pETM-80 Kanamycin® pETM-80-scFv Kanamycin® pETM-82 Kanamycin® pETM-82-scFv Kanamycin® pETM-90 Ampicillin® pETM-90-scFv Ampicillin® pMAL-p2X Ampicillin® pMAL-p2X-scFv Ampicillin® pSTE2-215 (Yol) Ampicillin® Tab. II-6: Übersicht der amplifizierten Plasmide mit der entsprechenden Antibiotika-Resistenz Rekombinante Bakterienklone aus dem Ligationsansatz aus II.2.2.2 wurden nach der Transformation durch Plasmid-Minipräparation nach Herstellerangaben des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) und DNA-Restriktion (II.2.2.1) sowie anschließender analytischer Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4.1) identifiziert. 37 II Material und Methoden II.2.5.1.2 Zur Protein-Expression Zur Hitzeschock-Transformation wurden Hitzeschock-kompetente E. coli-Zellen (siehe Tab. II.7) langsam auf Eis aufgetaut, bis sie gerade flüssig waren. 50 ng der zu transformierenden Plasmid-DNA wurden in Eppendorf-Cups, die sich auf Eis befanden, vorgelegt und 100 µL an E. coli Zellen (siehe Tab. II.7) zugegeben, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte durch 45 sec Inkubation in einem Thermoblock von 42°C. Nach einer Abkühlung auf Eis für 5 min erfolgte die Zugabe von 1000 µL SOC-Medium. Während der anschließenden Inkubation von 1 h bei 37°C auf dem Schüttler (280 rpm) erfolgte die Regeneration der E. coli Zellen. Nach abschließender Zentrifugation (1 min bei 3000 rpm, Biofuge PICO) wurde der Überstand bis auf etwa 100 µL abgenommen, das Zellpellet vorsichtig resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum (siehe Tab. II-7) ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Plasmid Hitzeschock-kompetente Antibiotika-Resistenz E. coli Zellen der Transformanten BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® Origami (DE3) (Novagen) Kanamycin® pET-20b(+) Alkalische Phosphatase-scFv Alkalische Phosphatase-scFv scFv BL21(DE3) (Novagen) Ampicillin® pETM-11 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® pETM-90 scFv BL21(DE3) (Novagen) Ampicillin® pETM-80 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® pETM-82 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® pETM-11 scFv pETM-11 scFv Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® pETM-11 scFv pETM-90 scFv pETM-90 scFv pETM-80 scFv pETM-80 scFv BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 1 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 pETM-80 scFv BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® pETM-13 pETM-13 Insert Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® 38 II Material und Methoden Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® scFv BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 JB pETM-11 scFv JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pETM-90 scFv JB Ampicillin®; Chloramphenicol® pETM-80 scFv JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pETM-82 scFv JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pETM-11 Serinprotease-4 JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pETM-90 Serinprotease-4 JB Ampicillin®; Chloramphenicol® pETM-50 Serinprotease-4 JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pGEX-6P-1 Serinprotease-4 JB Ampicillin®; Chloramphenicol® pBADM-20 Serinprotease-4 JB Ampicillin®; Chloramphenicol® pGEX-6P-1 Serinprotease-4 JT Ampicillin®; Chloramphenicol® pBADM-20 Serinprotease-4 JT Ampicillin®; Chloramphenicol® pETM-82 scFv pETM-82 scFv pETM-82 scFv pET-20b(+) Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Ampicillin®; Chloramphenicol® Tab. II-7: Übersicht der verwendeten Plasmide und der verwendeten Hitzeschock-kompetenten E. coli Zellen mit entsprechender Antibiotika-Resistenz Chaperon- Plasmid origin Kombination Nr. of Antibiotika- Chaperone Resistenz replication 1 2 pBB528 pSC101 Chloramphenicol® pBB541 p15A Spectinomycin® pBB540 pSC101 Chloramphenicol® GrpE, ClpB pBB542 p15A Spectinomycin® GroELS, DnaK, DnaJ colE1 Ampicillin® IbpA, IbpB pBB540 pSC101 Chloramphenicol® GrpE, ClpB pBB542 p15A Spectinomycin® GroELS, DnaK, DnaJ colE1 Ampicillin® IbpA, IbpB 3 4 GroELS Tab. II-8: Übersicht der eingesetzten Chaperon-Kombinationen LB-Agarplatten mit den Transformanten aus II.2.5.1 wurden zur kurzzeitigen Lagerung von Bakterienklonen verwendet und bei 4°C gelagert. 39 II Material und Methoden II.2.6 Anzucht von E.coli-Kulturen II.2.6.1 Zur Plasmid-Amplifikation Nach der Transformation (II.2.5.1.1) erfolgte die Aufnahme jeweils einer Kolonie in 5 mL 2x YT-Flüssigmedium mit Zusatz des entsprechenden Antibiotikums (siehe Tab. II-6). Die so hergestellten E. coli Kulturen wurden als Schüttelkultur bei 280 rpm bei 30°C über Nacht inkubiert. Anschließend erfolgte die Isolierung der amplifizierten Plasmid-DNA nach II.2.7. II.2.6.2 Zur Herstellung von Stammkulturen Nach der Transformation (II.2.5.1.2) erfolgte die Aufnahme jeweils einer Kolonie in 5 mL 2x YT-Flüssigmedium mit Zusatz des entsprechenden Antibiotikums (siehe Tab. II-7). Stammkulturen wurden durch Mischen von 1 mL dieser Kulturlösung bei einem OD600 von etwa 0,6 mit 300 µL einer 80 %igen Glycerinlösung hergestellt und bei -80°C gelagert. II.2.6.3 Zur Protein-Expression Frisch angeimpftes 2x YT-Flüssigmedium aus der jeweiligen Stammkultur (II.2.6.2), gelagert bei -80°C, wurde als Schüttelkultur bei 280 rpm bei 30°C über Nacht kultiviert. Diese Flüssigkulturen wurden zum Inokulieren von frischem 2x YT-Medium eingesetzt, um einen OD600 von 0,6 bei allen Proben zum etwa gleichen Zeitpunkt für die Induktion zu erhalten. II.2.7 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Die Isolierung der Plasmid-DNA aus der E. coli Kultur (II.2.6.1) erfolgte unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben. Die Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA wurde anschließend photometrisch mit dem Spektrophotometer GeneQuant pro (Amersham Biosciences) bestimmt. 40 II Material und Methoden II.2.8 Isolierung von genomischer DNA aus E. coli Die Isolierung von genomischer DNA aus E. coli erfolgte unter Verwendung des NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben. Die Konzentration der gereinigten genomischen DNA wurde anschließend photometrisch mit dem Spektrophotometer GeneQuant pro (Amersham Biosciences) bestimmt und direkt zur PCR-Amplifikation II.2.1.1 eingesetzt, um das gewünschte Fragment Alkalische Phosphatase aus E. coli durch Einsatz entsprechender synthetischer Oligonukleotide mit den Restriktionsschnittstellen BspHI und Acc65I (II.1.6) zu modifizieren und zu amplifizieren. II.2.9 Sequenzierung von Plasmid-DNA Die Plasmid-DNA der positiven Bakterienklone wurde zum Sequenzieren (Genomic Core Facility, EMBL, Heidelberg) gegeben, um die DNA-Sequenz und nach deren Umschreibung die Aminosäure-Sequenz der klonierten scFv Fragmente sowie die der Fusion Alkalische Phosphatase-scFv zu erhalten. II.3 Proteinchemische und immunologische Methoden II.3.1 Expression rekombinanter Proteine in E. coli Nach Klonierung des scFv Fragments, gerichtet gegen die größte Untereinheit (215 kDa) der RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster (Kontermann et al., 1995; Krämer et al., 1980) und deren Überprüfung durch DNA-Sequenzierung wurden E. coli Zellen mit den entsprechenden Plasmiden (Tab. II-9) transformiert und die rekombinanten Proteine exprimiert. Ebenso wurde mit den rekombinanten Proteinen a) Fringe Glycosyltransferase (Q24342) aus Drosophila melanogaster, b) DKFZp564F2122 (AL136604) aus Homo sapiens und c) Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae (Gen: ClipB14; Protein ID: CAB90819) verfahren. 41 II Material und Methoden Konstrukte K1) Vektor pETM-13 angewandte proteinchemische der Transformanten + immunologische Methoden ® Screening Kanamycin Origami (DE3) (Novagen) Kanamycin® Screening pET-20b(+) BL21(DE3) (Novagen) Ampicillin® Screening pETM-11 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® Screening scFv BL21(DE3) (Novagen) Ampicillin ® Screening ® pETM-80 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin pETM-82 scFv BL21(DE3) (Novagen) Kanamycin® Screening Screening ® ® pET-20b(+) scFv JB Ampicillin ; Chloramphenicol Screening pETM-11 scFv JB Kanamycin®; Chloramphenicol® Screening ® ® pETM-90 scFv JB Ampicillin ; Chloramphenicol pETM-80 scFv JB Kanamycin®; Chloramphenicol® pETM-82 K4) Antibiotika-Resistenz BL21(DE3) (Novagen) pETM-90 K3) Wirt Alkalische Phosphatase-scFv Alkalische Phosphatase-scFv scFv pETM-13 K2) Insert scFv pET-20b(+) scFv pET-20b(+) scFv pETM-11 scFv pETM-11 scFv pETM-11 scFv pETM-90 scFv pETM-90 scFv JB BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 1 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 1 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 ® ® Kanamycin ; Chloramphenicol ® ® Screening Screening Screening, „large-scale“, Western-Blot Ampicillin ; Chloramphenicol ; Spectinomycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Screening Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Screening 42 Screening Screening Screening Screening Screening II Material und Methoden K5) pETM-80 scFv pETM-80 scFv pETM-80 scFv pETM-82 scFv pETM-82 scFv pETM-82 scFv pETM-11 Serinprotease-4 pETM-90 K6) Serinprotease-4 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) + Chaperon-Kombination Nr. 4 JB JB Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Screening, „large-scale“, Western-Blot Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Screening Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Kanamycin®; Chloramphenicol® Screening ® ® Ampicillin ; Chloramphenicol ® ® Screening Screening Screening, „large-scale“, Western-Blot Screening, Western-Blot Screening, Western-Blot pETM-50 Serinprotease-4 JB Kanamycin ; Chloramphenicol Screening, Western-Blot pGEX-6P-1 Serinprotease-4 JB Ampicillin®; Chloramphenicol® Screening, Aufkonzentrierung, Western-Blot ® ® pBADM-20 Serinprotease-4 JB Ampicillin ; Chloramphenicol Screening, Aufkonzentrierung, Western-Blot pGEX-6P-1 Serinprotease-4 JT Ampicillin®; Chloramphenicol® Screening, Western-Blot ® ® pBADM-20 Serinprotease-4 JT Ampicillin ; Chloramphenicol Screening, Western-Blot pETM-50 Fringe Glycosyltransferase DKFZp564F2122 JB Kanamycin®; Chloramphenicol® Screening JB Ampicillin®; Chloramphenicol® Screening pETM-20 Tab. II-9: Übersicht aller Konstrukte Mit „Screening“ wurde der 3 mL Ansatz zur Kontrolle der Expression im „small-scale“ bezeichnet. 43 II Material und Methoden II.3.1.1 Expression rekombinanter Proteine im „small-scale“ Zur Expression im „small-scale“ wurden 3 mL (für die Konstrukte K2): 2x 3 mL) frisches 2x YT-Medium mit Zusatz des entsprechenden Antibiotikums (siehe Tab. II-9) mit 30 µL der Vorkultur, wie in II.2.6.3 beschrieben, inokuliert und auf dem Schüttler bei 280 rpm und 37°C inkubiert. Die Induktion erfolgte bei den Konstrukten K1) bei 20°C mit 0,1 mM IPTG K2) bei 20°C mit 0,1 mM IPTG K3) bei 20°C mit 0,1 mM und 0,5 mM IPTG K4) bei 20°C mit 0,1 mM IPTG K5) bei 37°C mit 0,1 mM und 0,5 mM IPTG K6) bei 20°C mit 10 µM, 40 µM, 100 µM, 500 µM und 2000 µM IPTG bei 37°C mit 10 µM, 40 µM, 100 µM, 500 µM und 2000 µM IPTG bei einem OD600 von etwa 0,6. Zellen, die den Vektor pBADM-20 mit der Serinprotease-4 tragen, wurden 20 min nach der Zugabe von IPTG zusätzlich mit 0,25 mg/mL Arabinose induziert. 2 h vor Ablauf der Inkubationszeit von 20 h bei 20°C wurden die eine Hälfte der Kulturlösungen der Konstrukte K2) abzentrifugiert, das Zellpellet in 2,5 mL frischem Kulturmedium ohne IPTG resuspendiert (als N-Proben bezeichnet) und weitere 2 h mit der anderen, unbehandelten Hälfte der Kulturlösungen (als I-Proben bezeichnet) inkubiert. Die Überexpression des rekombinanten Proteins führt zu Missfaltungen der dreidimensionalen Proteinstruktur. Durch Entfernung von IPTG wird die rekombinante Expression blockiert und die Faltungsmaschinerie der Zelle kann aggregierte Proteine zurückfalten (Mar Carrió und Villaverde, 2001). 44 II Material und Methoden Nach 20 h für Konstrukte K1) 20 h für Konstrukte K2) 24 h, 48 h für Konstrukte K3) 20 h für Konstrukte K4) 20 h für Konstrukte K5) 1h, 4h, 5h, 8h, 20h für Konstrukte K6) wurden 1,5 mL Zellkultur zur Analyse der Bakterienzellen entnommen. Die Zellkultur wurde bei 3000 rpm (Biofuge PICO, Heraeus) für 5 min zentrifugiert, 1 mL des überstehenden Kulturmediums von JB- und JT-Zellen gesammelt und das Zellpellet bei -20°C bis zur Isolierung der rekombinanten Proteine eingefroren (II.3.3). Das im Kulturmedium befindliche rekombinante Protein aus den E.coli-Zellen, die das Plasmid pJL3 tragen, wurde sofort über Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) gereinigt. II.3.1.2 Expression rekombinanter Proteine zur anschließenden Aufkonzentrierung Zur Expression der Serinprotease-4 - in pBADM-20 und - in pGEX-6P-1 (Wirt: JB) zur anschließenden Aufkonzentrierung über a) Chromatographie-Säulen (Bio-Spin® Disposable chromatography columns) und b) Dialyse-Membranen (spectra/Por® Membrane MWCO : 6-8.000 (SPECTRUM)) wurden 100 mL frisches 2x YT-Medium mit Zusatz von Chloramphenicol® und Carbenicillin® mit 1 mL Vorkultur, wie in II.2.6.3 beschrieben, inokuliert und auf dem Schüttler bei 280 rpm und 37°C inkubiert. Die Induktion mit 0,5 mM IPTG erfolgte bei 37°C bei einem OD600 von etwa 0,6. Nach 20 h Inkubation wurden die Bakterienzellen bei 4500 rpm (Labofuge 400R, Heraeus) 15 min zentrifugiert und der Überstand, der das rekombinante Protein enthielt, zur Aufkonzentrierung (II.3.2) eingesetzt. 45 II Material und Methoden II.3.1.3 Expression rekombinanter Proteine im „large-scale“ Zur Expression im „large-scale“ wurden 1000 mL frisches 2x YT-Medium mit Zusatz von a) Kanamycin®, Chloramphenicol® und Spectinomycin® für Konstrukt: pETM-80 mit Chaperon-Kombination Nr. 2 Insert: scFv; Wirt: E. coli-Stamm BL21(DE3) b) Kanamycin® und Carbenicillin® für Konstrukt: pETM-82 mit Chaperon-Kombination Nr. 3 Insert: scFv; Wirt: E. coli-Stamm BL21(DE3) c) Chloramphenicol® und Kanamycin® für Konstrukt: pETM-82 Insert: scFv; Wirt: E. coli-Stamm BL21(DE3) + pJL3 (JB-Zellen) mit 5 mL der entsprechenden Vorkultur, wie in II.2.6.3 beschrieben, inokuliert und auf dem Schüttler bei 280 rpm und 37°C inkubiert. Die Induktion mit 0,1 mM IPTG erfolgte bei 20°C bei einem OD600 von etwa 0,6. Nach 20 h Inkubation wurden die Bakterienzellen aus a) und b) bei 4500 rpm (Sorvall® RC 2B PLUS, Du Pont Instruments) 15 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in 25 mL 1x PBS resuspendiert und bei 4500 rpm (Labofuge 400R, Heraeus) 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets bis zur Aufreinigung über FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) (II.3.4.1.2) bei -20°C gelagert. Bei c) wurde nach der ersten Zentrifugation zur Abtrennung des Kulturmediums bei 4500 rpm (Sorvall® RC 2B PLUS, Du Pont Instruments) für 15 min der Überstand gesammelt und nach Filtration (Porengröße: 0,45 µm) sofort zur Metallionenaffinitätschromatographie über FPLC (II.3.4.1.2) eingesetzt. II.3.2 Aufkonzentrierung rekombinanter Proteine aus E. coli II.3.2.1 Aufkonzentrierung mit Chromatographie-Säule 100 µL TALON® Metallaffinitätsharz (BD Biosciences Clontech) (für Serinprotease-4 von pBADM-20) bzw. 100 µL Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) (für Serinprotease-4 von pGEX-6P-1) wurden in eine Chromatographie-Säule (Bio-Spin® Disposable chromatography columns; Bio-Rad Laboratories GmbH) pipettiert und anschließend mit 2x 1 mL Waschpuffer gewaschen. 46 II Material und Methoden Das Probenvolumen von 100 mL aus II.3.1.2 (Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae (Gen: ClipB14; Protein ID: CAB90819) von pBADM-20 und von pGEX-6P-1) wurde mit einer Flussrate von 0,6 mL/min über die Säule gepumpt. Nach vollständigem Durchlauf der Probe erfolgte eine Waschung des Harzes mit 3 mL Waschpuffer. Das Harz mit dem gebundenen rekombinanten Protein wurde vorsichtig mit einer Pipette aus der Säule entfernt und mit 50 µL Elutionspuffer (Elutionspuffer-1: für IMAC; Elutionspuffer-2: für GST-Tag) versetzt. Nach 15 min wurde das Harz abzentrifugiert. Mit dem Überstand, der das rekombinante Protein enthielt, erfolgte eine Western-Blot Analyse (II.3.6) und ein Test zur Aktivitätsbestimmung (II.3.7). Das Harz wurde mit 300 µL Waschpuffer gewaschen und ebenfalls für die Western-Blot Analyse (II.3.6) und den Aktivitätstest (II.3.7) eingesetzt. II.3.2.2 Aufkonzentrierung mit Dialyse-Membran Von den 100 mL aus II.3.1.2 wurden 62 mL Kulturmedium mit Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae (Gen: ClipB14; Protein ID: CAB90819) von pBADM-20 und 58 mL Kulturmedium von pGEX-6P-1 mit einer Dialyse-Membran (spectra/Por® Membrane, SPECTRUM) aufkonzentriert. Die mit dem Probenvolumen (25 mL) gefüllte Dialyse-Membran wurde mit PEG 20.000 überschichtet und einige Stunden in Aluminium-Folie gelagert. Da das Probenvolumen aufgrund der hygroskopischen Eigenschaft des PEG kontinuierlich abnahm, konnte nach gewissen Zeitabständen erneut ein Teil der Probe hinzugefügt werden, bis das Probenvolumen nur noch etwa 10 % des ursprünglichen Volumens betrug. 60 µL TALONTM Metallaffinitätsharz (BD Biosciences Clontech) (für Serinprotease-4 von pBADM-20) bzw. 60 µL Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) (für Serinprotease-4 von pGEX-6P-1) wurden in ein 15 mL Falcon-Röhrchen vorgelegt, mit 500 µL Waschpuffer gewaschen und mit dem aufkonzentrierten Kulturmedium versetzt. Die Inkubation auf dem Schüttler erfolgte 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Harz abzentrifugiert, erneut mit 500 µL Waschpuffer gewaschen und mit 50 µL Elutionspuffer versetzt (Elutionspuffer-1: für IMAC; Elutionspuffer-2: für GST-Tag). Nach 15 min wurde das Harz abzentrifugiert. Mit dem Überstand, der das rekombinante Protein enthielt, erfolgte eine Western-Blot Analyse (II.3.6) und ein Test zur Aktivitätsbestimmung (II.3.7). Das Harz wurde mit 300 µL Waschpuffer gewaschen und ebenfalls für die Western-Blot Analyse (II.3.6) und den Aktivitätstest (II.3.7) eingesetzt. 47 II Material und Methoden • Waschpuffer-1 (für Serinprotease-4 von pBADM-20): 10 mM Kaliumphosphat pH 7,8 250 mM NaCl • Waschpuffer-2 (für Serinprotease-4 von pGEX-6P-1): 1x PBS • Elutionspuffer-1 (für Serinprotease-4 von pBADM-20): 300 mM Imidazol 150 mM NaCl 7 mM TRIS pH 7,9 • Elutionspuffer-2 (für Serinprotease-4 von pGEX-6P-1): 20 mM Glutathion (reduziert) in 50 mM TRIS pH 8,0 (erst kurz vor Gebrauch angesetzt) II.3.3 Isolierung rekombinanter Proteine aus E. coli Neben dem Wachstumsmedium der Expressionskulturen wurde auch das Zelllysat der E. coli Zellen auf das Vorhandensein von rekombinanten Proteinen untersucht. Zum Aufschluss wurden die gefrorenen Zellpellets aus II.3.1.1 für die anschließende Reinigung in 350 µL Extraktionspuffer für manuelle Methode, bzw. in 400 µL für automatisierte Methode resuspendiert, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und 3 min im Ultraschallbad behandelt, um ein homogenes Zelllysat zu erhalten. 4 µL dieses Homogenats wurde über SDS-PAGE (II.3.5) analysiert. Zelltrümmer und unlösliche Proteine des Bakterienlysats wurden durch Zentrifugation (13000 rpm/4 min) (Biofuge PICO, Heraeus) entfernt und 10 µL des klaren Überstandes wurden über SDS-PAGE (II.3.5) analysiert. 48 II Material und Methoden • Extraktionspuffer (BD TALONTM Metallaffinitätsharz): 20 mM Kaliumphosphat pH 7,8 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mg/mL Lysozym 2 µg/mL DNAse (für manuelle Methode) • Extraktionspuffer (Dynabeads® TALONTM Harz): 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 20 mM Imidazol 0,01 % Tween®20 10 % Glycerin 10 mM MgCl2 1 mg/mL Lysozym 2 µg/mL DNAse (für manuelle und automatisierte Methode) II.3.4 Reinigung von Proteinen II.3.4.1 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) II.3.4.1.1 Im „small-scale“ Die Reinigung des rekombinanten Proteins im „small-scale“ beruht auf der spezifischen Komplexierung des His-Tags durch Co2+-Ionen. Vorbereitung des TALONTM Metallaffinitätsharzes (BD Biosciences Clontech): Je 24 µL TALONTM Metallaffinitätsharz wurden in ein Eppendorf-Cup vorgelegt, 1 min bei 13000 rpm (Biofuge PICO, Heraeus) zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette vorsichtig abgenommen. Danach wurde das Harz mit 300 µL IMAC Bindungspuffer gewaschen und anschließend mit 25 µL Extraktionspuffer versetzt. 49 II Material und Methoden Vorbereitung des magnetischen Dynabeads® TALONTM Harzes: Je 10 µL Dynabeads® TALONTM Harz (magnetisch) wurden in ein Eppendorf-Cup vorgelegt und mit 300 µL Waschpuffer gewaschen. Nach Einsetzen des Magnetes in den Schüttler (Dynal) konnte der Überstand nach kurzer Zeit mit der Pipette abgenommen werden. Der Überstand nach der Zentrifugation aus II.3.3 wurde zu dem zuvor vorbereiteten Harz pipettiert und 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler (Dynal) inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde 3 min bei 13000 rpm (Biofuge PICO, Heraeus) zentrifugiert (TALONTM Metallaffinitätsharz) bzw. der Überstand nach Einsetzen des Magnetes (Dynabeads® TALONTM Harz) abgenommen und der Überstand verworfen. Zur Waschung des Harzes erfolgte die Zugabe von 300 µL Waschpuffer und eine weitere Inkubation von 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler (Dynal). Nach weiterer Zentrifugation bzw. Einsetzen des Magneten, Entfernen des Überstandes und einer abschließenden Waschung des BD TalonTM Metallaffinitätsharzes mit IMAC Bindungspuffer, bzw. Waschung des Dynabeads® TALONTM Harzes mit Waschpuffer, erfolgte die Analyse des gereinigten rekombinanten Proteins über SDSPAGE (II.3.5) durch Auftrennung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen und Größenvergleich mit einem Low Molecular Weight Marker (Amersham Biosciences). • Waschpuffer (BD TALONTM Metallaffinitätsharz): 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 15 mM Imidazol 0,04 % Triton® X-100 • Waschpuffer (Dynabeads® TALONTM Harz): 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 20 mM Imidazol 0,01 % Tween®20 10 % Glycerin • IMAC Bindungspuffer: 10 mM Kaliumphosphat pH 7,8 250 mM NaCl 50 II Material und Methoden Zur Optimierung der Screening-Technologie wurde das TALONTM Metallaffinitätsharz (BD Biosciences Clontech) mit dem Dynabeads® TALONTM Harz verglichen. Zusätzlich wurde das magnetische Dynabeads® TALONTM Harz in der manuellen Methode, wie in II.3.4.1.1. beschrieben, sowie in der automatisierten Methode (mit KingFisher® instruments) eingesetzt. Neben dem magnetischen Dynabeads® TALONTM Harz (Dynal Biotech) wurde das magnetische Ni-NTA Magnetic Agarose Harz der Firma Quiagen, sowie das magnetische His BindTM Magnetic Agarose Harz der Firma Novagen mit der automatisierten Methode untersucht, um die Screening-Technologie zu verbessern. Die automatisierte, patentierte Methode der Firma Thermo Electron Corporation nutzt die magnetische Eigenschaft des Dynabeads® TALONTM Harzes aus, indem das magnetische Harz mit Hilfe magnetischer Stäbe in die Probengefäße (siehe Tab. II-10) transferiert wird. Diese automatisierte Methode ermöglicht eine gleichzeitige Probenaufarbeitung von bis zu 15 Proben pro Durchlauf. Die isolierten Proteine können anschließend entweder von dem magnetischen Harz eluiert, oder für weitere Anwendungen an der Oberfläche der Magnetpartikel zurückgehalten werden. Gefäß Nr. Modifiziertes „His_tag_mL_2“ Protocol 1 350 µL Zelllysat1) 3) 450 µL Waschpuffer2) 2 15 µL Dynabeads® TALONTM Harz 925 µL Waschpuffer2) 3 1000 µL Waschpuffer2) 4 1000 µL Waschpuffer2) 5 40 µL Waschpuffer2) Tab. II-10: Parameter zur automatisierten Aufreinigung rekombinanter Proteine mit KingFisher® instruments 1) aus II.3.3 (zentrifugiert) 2) Waschpuffer (Dynabeads® TALONTM Harz) aus II.3.4.1.1 3) bzw. 500 µL Kulturmedium von JB-Zellen Die automatisierte Aufreinigung von rekombinanten Proteinen wurde nach Herstellerangaben (Thermo Electron Corporation) durchgeführt. 51 II Material und Methoden II.3.4.1.2 Im „large-scale“ über FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) Die Zellpellets aus II.3.1.3, erhalten aus 1000 mL Zellkultur, wurden in 20 mL Extraktionspuffer durch Vortexen vollständig gelöst und anschließend 5 min im Ultraschallbad behandelt. Nach der Zugabe von 1,25 mg/mL Lysozym und 10 µg/mL DNAse erfolgte die Inkubation der Zellsuspension für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler. Nach der Inkubation wurde die Probe für 35 min bei 45000 rpm (L-70 Ultrazentrifuge, Beckman) ultrazentrifugiert und der klare Überstand zur Affinitätschromatographie eingesetzt. Eine HiTrapTM chelating HP Säule (Amersham Biosciences) mit einem Säulenvolumen von 5 mL wurde mit 0,5 mL 100 mM CoCl2 versetzt und anschließend mit IMAC Puffer equilibriert. Eine definierte Menge des klaren Überstandes von 20 mL des Probenvolumens wurde mit einer Flussrate von 1 mL/min durch Einsatz eines FPLC-Systems bei Raumtemperatur über die Säule gepumpt. Die anschließende Waschung der Säule mit IMAC Puffer erfolgte solange, bis keine Proteinabsorption mehr bei 280 nm am Detektor zu messen war. Die Elution des rekombinanten Proteins erfolgte mit 5 mL Elutionspuffer bei Raumtemperatur mit einer Flussrate von 1 mL/min. Das rekombinante Protein wurde bei 280 nm detektiert und mit dem Fraktionssammler aufgefangen. Zum Entsalzen der Probe wurde diese erneut über eine mit 1x PBS gewaschene HiTrapTM Desalting Säule (Amersham Biosciences) mit einem Säulenvolumen von 5 mL gegeben, mit 1x PBS eluiert und in einem Probengefäß aufgefangen. Zur Abschätzung der Konzentration wurde die Absorption der entsalzten Probe gegen 1x PBS im Spektrophotometer GeneQuant pro (Amersham Biosciences) gemessen. Die aus der Affinitätschromatographie erhaltenen rekombinanten Proteine wurden zur WesternBlot Analyse (II.3.6) eingesetzt, um die Aktivität des scFv Fragments zu bestimmen. 52 II Material und Methoden • Extraktionspuffer: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 5 mM MgCl2 • IMAC Puffer: 10 mM Kaliumphosphat pH 7,8 250 mM NaCl • Elutionspuffer: 500 mM Imidazol 250 mM NaCl 10 mM TRIS pH 7,9 53 II Material und Methoden II.3.5 SDS-PAGE von Proteinen Zur Auftrennung und zum Nachweis von Proteinen wurde die diskontinuierliche Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen (Sammelgel: 4,5 % Polyacrylamid, pH 6,8 / Trenngel: 12 % Polyacrylamid, pH 8,8) nach LAEMMLI (1970) durchgeführt. Dabei erfolgt die Überdeckung der Eigenladung der Proteine durch das anionische Detergenz SDS, wodurch Mizellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen. Die Erhitzung auf 95°C im Überschuss von SDS bewirkt die Auflösung der Tertiär- und Sekundärstruktur durch Aufspaltung von Wasserstoffbrücken und Streckung des gesamten Moleküls. Die Zugabe von β-Mercaptoethanol bewirkt zudem die Aufspaltung der Disulfidbrücken. Die Trennung erfolgt allein nach dem Molekulargewicht. Die Proben wurden zunächst mit ½ Vol. 2x SDS-Probenpuffer versetzt, wobei die Proben aus dem Homogenat zuvor im Verhältnis 1:1,5 mit dest. H2O verdünnt wurden, um die Probenauftragung zu erleichtern. Die Zugabe an 2x SDS-Probenpuffer bei den Proben aus II.3.4.1.1 betrug 22 µL für das TALONTM Metallaffinitätsharz und 15 µL für das Dynabeads® TALONTM Harz. Anschließend wurden die Proben 3 min bei 95°C im Thermoblock hitzedenaturiert und sofort auf Eis gestellt. Nach anschließender kurzer Zentrifugation erfolgte die Beladung des Gels. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden mit Simply BlueTM SafeStain (Invitrogen) nach Herstellerangaben angefärbt und visualisiert oder im Western-Blot (II.3.6) auf PVDF-Membranen transferiert und in immunologischen Nachweisreaktionen spezifisch detektiert. • 2x SDS-Probenpuffer: 0,125 M TRIS-HCl, pH 6,8 4 % SDS (w/v) 20 % Glycerin (v/v) 0,02 % Bromphenol Blau (w/v) 0,2 M β-Mercaptoethanol • Laufpuffer: 0,025 M TRIS-HCl 0,192 M Glycin 0,1 % SDS (w/v) pH 8,3 54 II Material und Methoden II.3.5.1 Homogenat-Präparation von Drosophila melanogaster Zur Überprüfung der Aktivität des klonierten scFv Fragments (von monoclonal antibody, gerichtet gegen die größte Untereinheit der RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster) wurden 15 Fliegen der Spezies Drosophila melanogaster, die zuvor bei -20°C gelagert wurden, mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt und mit einem kleinen Pistill zerdrückt. Anschließend wurde die Lösung 5 min auf 95°C im Thermoblock erhitzt und 1 min bei 13000 rpm (Biofuge PICO, Heraeus) zentrifugiert. Der Überstand wurde 1:2,5 und 1:5 mit 5x SDS-Probenpuffer verdünnt zur SDS-PAGE eingesetzt. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine aus Drosophila melanogaster wurden mit Simply BlueTM SafeStain (Invitrogen) nach Herstellerangaben angefärbt und visualisiert, sowie im Western-Blot (II.3.6) auf PVDF-Membranen transferiert und in immunologischen Nachweisreaktionen mit dem klonierten scFv Fragment spezifisch detektiert. II.3.6 Western-Blot Analysen Die Durchführung des Western-Blots diente der Identifizierung des rekombinanten Proteins. Dabei wurden die mit SDS-PAGE (II.3.5) aufgetrennten Proteine in einer „Mini-Transblot“Apparatur innerhalb von 75 min unter Kühlung durch Anlegen einer Spannung (100 V) aus dem Gel auf eine PVDF-Membran transferiert (Towbin et al., 1979). Obwohl die PVDF-Membran eine stärkere Tendenz zu unspezifischen Hintergrundreaktionen aufgrund seiner hohen Proteinbindungskapazität besitzt, wurde diese Membran gewählt, da ein gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis mit Chemilumineszenz-Detektionssystemen bei dieser Membran vorhanden ist. Die Durchführung der Western-Blot Analyse ist in Tab. II-11 aufgeführt. 55 II Material und Methoden Schritt Konz./ Verd. Inkubation Temperatur 10 % Milch in 1x PBS + 0,1 % Tween®20 1 h / über Nacht RT / 4°C 1/1500 1h RT 1:10; 1:1000 1h RT 0,2 % Tween®20 in 1x PBS 6x 10 min RT - anti-rabbit IgG Alkaline Phosphatase Conjugate (Sigma-Aldrich) nach Herstellerangaben 1h RT - anti-rabbit IgG HRP-conjugated (Pierce Biotechnologie) nach Herstellerangaben 1h RT 1/500 1h RT 0,2 % Tween®20 in 1x PBS 6x 10 min RT Blockieren Inkubation mit Primärantikörper a) für Serinprotease-4: anti-Ser 4 rabbit polyclonal b) für Drosophila melanogaster RNA-Polymerase II: scFv Waschen der Membran Inkubation mit Sekundärantikörper a) für Serinprotease-4: b) für Drosophila melanogaster RNA-Polymerase II: anti-HIS HRP-conjugated (Amersham Biosciences) Waschen der Membran Tab. II-11: Parameter des Western-Blots 56 II Material und Methoden Zur Detektion wurden das Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit (Bio-Rad Laboratories GmbH, München), oder das ECL+Plus Western-Blotting detection system (Amersham Biosciences) mit extrem hoher Sensitivität nach Herstellerangaben verwendet. Die Visualisierung und Dokumentation der Signale bei der Chemilumineszenz erfolgte durch Exposition eines Röntgenfilms. • Transferpuffer: 0,05 M TRIS-HCl 0,38 M Glycin 0,02 % SDS 20 % Methanol • Blockierungspuffer: 10 % Milchpulver, fettfrei 0,1 % Tween®20 in 1x PBS • Waschpuffer: 0,2 % Tween®20 in 1x PBS 57 II Material und Methoden II.3.7 Aktivitätstest Anhand des Aktivitätstestes sollte die funktionelle Fähigkeit der löslichen rekombinanten Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae (Gen: ClipB14; Protein ID: CAB90819) überprüft und daraus die Ausbildung der korrekten, dreidimensionalen Struktur abgeschätzt werden. Da das spezifische Substrat der Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae nicht bekannt ist, wurde BSA gewählt, ein Substrat, das von der Serinprotease Trypsin abgebaut wird. 10 µL der Proben (Eluat + Harz) aus II.3.2 wurden mit 1 µL BSA, sowie 1 µL CaCl2 versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als positive Kontrolle wurde 1 µL Trypsin mit 9 µL H2O, 1 µL BSA und 1 µL CaCl2 versetzt. Die negative Kontrolle setzte sich aus 10 µL H2O, 1 µL BSA und 1 µL CaCl2 zusammen. Anschließend erfolgte eine SDS-PAGE nach II.3.5 (Sammelgel: 4,5 % Polyacrylamid, pH 6,8 / Trenngel: 10 % Polyacrylamid, pH 8,8). Die Visualisierung der Proteinbanden erfolgte mit Coomassie. • BSA: 2 µg/µL in 1x PBS • 500 mM CaCl2 Zusätzlich wurde die Funktionalität der Serinprotease-4 über radioaktives DFP (Diisopropylfluorophosphat)-Labeling (Kafatos Gruppe, EMBL, Heidelberg) überprüft. 58 III Ergebnisse III ERGEBNISSE III.1 Amplifikation des scFv Antikörperfragments Der Vorteil der Klonierung und Assemblierung der variablen Regionen vom monoklonalen Antikörper (mAk) zum scFv Fragment gegenüber dem Vollängen-Ak liegt in der geringen Größe, die zu einer besseren Penetrationsfähigkeit und Beweglichkeit in Geweben führt (Milenic et al., 1991; Begent et al., 1996). Die Größe des scFv Fragments weist mit seinem Molekulargewicht von etwa 30 kDa eine höhere Sensitivität in der Mikroskopie auf. Ein weiterer Vorteil besteht in ihrer Codierung als singuläres Gen, was die Konstruktion von Fusionsproteinen, sowie die Übertragung in unterschiedliche Expressionssysteme ermöglicht und somit Flexibilität in der Anwendung rekombinanter Ak Fragmente bietet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zunächst die variablen Regionen (VH und VL) von monoclonal antibody, gerichtet gegen die größte Untereinheit (215 kDa) der RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster, aus dem Vektor pSTE2-215 (Yol) (Genebank accession no. Y18290) sowie die Alkalische Phosphatase aus genomischer E. coli DNA zur späteren Klonierung und Expression in E. coli durch PCR amplifiziert werden. Die Domänen der schweren (VH) und der leichten (VL) Kette, die über einen hydrophilen und flexiblen Peptidlinker verbunden sind, bilden das gewünschte scFv Fragment mit der Sequenz aus Abb. III-1.1, das in diesem Versuch in die Vektoren pET-20b(+), pETM-11, pETM-90, pETM-80, pETM-82 und pMAL-p2X kloniert und exprimiert werden soll. Neben der Produktion rekombinanter scFv Fragmente, soll die Fusion von Alkalischer Phosphatase mit der Sequenz aus Abb. III-1.2 mit dem scFv Fragment in dem Vektor pETM-13 konstruiert und anschließend exprimiert werden. 59 III Ergebnisse 1 1 CAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATT Q V Q L Q Q S G A E L V R P G V S V K I 61 21 TCCTGCAAGGGTTCTGGCTACAAATTCACTGATTATGCTACGCACTGGGTGAAACAGAGT S C K G S G Y K F T D Y A T H W V K Q S 121 41 CATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACTTACTATGGTGATACTACTTAT H A K S L E W I G V I S T Y Y G D T T Y 181 61 AACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTCGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAT N Q K F K G K A T M T V D K S S S T A Y 241 81 ATGGAACTTCCCAGACTGACATCTGATGATTCTGCCATCTATTATTGTGCCCTGTTACGC M E L P R L T S D D S A I Y Y C A L L R 301 101 CCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTATCCTCAGGGAGTGCATCCGCC P F A Y W G Q G T T V T V S S G S A S A 361 121 CCAAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTGCTGACCCAATCT P K L E E G E F S E A R V D I V L T Q S 421 141 CCACTCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAG P L S L S V S A G E K V T M S C K S S Q 481 161 AGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAATAACGACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGG S L L N S G N Q N N D L A W Y Q Q K P G 541 181 CAACGTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGC Q R P K L L I Y G A S T R E S G V P D R 601 201 TTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAA F T G S G S G T D F T L T I S S V Q A E 661 221 GACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGTTAACGTTCGGTGCTGGC D L A V Y Y C Q N D H S Y P L T F G A G 721 241 ACCAAGCTGGAAATCAAACGGGC T K L E I K R Abb. III-1.1: DNA-Sequenz von scFv (von monoclonal antibody, gerichtet gegen die größte Untereinheit der RNAPolymerase II aus Drosophila melanogaster) 1 1 AAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC K Q S T I A L A L L P L L F T P V T K A 61 21 CGGACACCAGAAATGCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTGCTCAGGGCGATATTACTGCACCC R T P E M P V L E N R A A Q G D I T A P 121 41 GGCGGTGCTCGCCGTTTAACGGGTGATCAGACTGCCGCTCTGCGTGATTCTCTTAGCGAT G G A R R L T G D Q T A A L R D S L S D 181 61 AAACCTGCAAAAAATATTATTTTGCTGATTGGCGATGGGATGGGGGACTCGGAAATTACT K P A K N I I L L I G D G M G D S E I T 241 81 GCCGCACGTAATTATGCCGAAGGTGCGGGCGGCTTTTTTAAAGGTATAGATGCCTTACCG A A R N Y A E G A G G F F K G I D A L P 301 CTTACCGGGCAATACACTCACTATGCGCTGAATAAAAAAACCGGCAAACCGGACTACGTC 60 III Ergebnisse 101 L T G Q Y T H Y A L N K K T G K P D Y V 361 121 ACCGACTCGGCTGCATCAGCAACCGCCTGGTCAACCGGTGTCAAAACCTATAACGGCGCG T D S A A S A T A W S T G V K T Y N G A 421 141 CTGGGCGTCGATATTCACGAAAAAGATCACCCAACGATTCTGGAAATGGCAAAAGCCGCA L G V D I H E K D H P T I L E M A K A A 481 161 GGTCTGGCGACCGGTAACGTTTCTACCGCAGAGTTGCAGGATGCCACGCCCGCTGCGCTG G L A T G N V S T A E L Q D A T P A A L 541 181 GTGGCACATGTGACCTCGCGCAAATGCTACGGTCCGAGCGCGACCAGTGAAAAATGTCCG V A H V T S R K C Y G P S A T S E K C P 601 201 GGTAACGCTCTGGAAAAAGGCGGAAAAGGATCGATTACCGAACAGCTGCTTAACGCTCGT G N A L E K G G K G S I T E Q L L N A R 661 221 GCCGACGTTACGCTTGGCGGCGGCGCAAAAACCTTTGCTGAAACGGCAACCGCTGGTGAA A D V T L G G G A K T F A E T A T A G E 721 241 TGGCAGGGAAAAACGCTGCGTGAACAGGCACAGGCGCGTGGTTATCAGTTGGTGAGCGAT W Q G K T L R E Q A Q A R G Y Q L V S D 781 261 GCTGCCTCACTGAATTCGGTGACGGAAGCGAATCAGCAAAAACCCCTGCTTGGCCTGTTT A A S L N S V T E A N Q Q K P L L G L F 841 281 GCTGACGGCAATATGCCAGTGCGCTGGCTAGGACCGAAAGCAACGTACCATGGCAATATC A D G N M P V R W L G P K A T Y H G N I 901 301 GATAAGCCCGCAGTCACCTGTACGCCAAATCCGCAACGTAATGACAGTGTACCAACCCTG D K P A V T C T P N P Q R N D S V P T L 961 321 GCGCAGATGACCGACAAAGCCATTGAATTGTTGAGTAAAAATGAGAAAGGCTTTTTCCTG A Q M T D K A I E L L S K N E K G F F L 1021 341 CAAGTTGAAGGTGCGTCAATCGATAAACAGGATCATGCTGCGAATCCTTGTGGGCAAATT Q V E G A S I D K Q D H A A N P C G Q I 1081 361 GGCGAGACGGTCGATCTCGATGAAGCCGTACAACGGGCGCTGGAATTCGCTAAAAAGGAG G E T V D L D E A V Q R A L E F A K K E 1141 381 GGTAACACGCTGGTCATAGTCACCGCTGATCACGCCCACGCCAGCCAGATTGTTGCGCCG G N T L V I V T A D H A H A S Q I V A P 1201 401 GATACCAAAGCTCCGGGCCTCACCCAGGCGCTAAATACCAAAGATGGCGCAGTGATGGTG D T K A P G L T Q A L N T K D G A V M V 1261 421 ATGAGTTACGGGAACTCCGAAGAGGATTCACAAGAACATACCGGCAGTCAGTTGCGTATT M S Y G N S E E D S Q E H T G S Q L R I 1321 441 GCGGCGTATGGCCCGCATGCCGCCAATGTTGTTGGACTGACCGACCAGACCGATCTCTTC A A Y G P H A A N V V G L T D Q T D L F 1381 461 TACACCATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAA Y T M K A A L G L K Abb. III-1.2: DNA-Sequenz von Alkalischer Phosphatase aus E. coli 61 III Ergebnisse Als Template für die Amplifikation des scFv Fragments wurde die Plasmid-DNA von pSTE2215 (Yol), für die Amplifikation der Alkalischen Phosphatase genomische E. coli DNA aus II.2.8 eingesetzt. Die erwartete Größe der in der PCR-Reaktion amplifizierten scFv DNA-Fragmente umfasste 766 bp (zur Klonierung in pETM-13) bzw. 774 bp (zur Klonierung in pMAL-p2X) und 1430 bp für die Alkalische Phosphatase zur Klonierung in pETM-13. Die PCR Produkte setzten sich aus 744 bp (zur Klonierung in pETM-13) bzw. 755 bp (zur Klonierung in pMAL-p2X) des scFv Fragments sowie 1415 bp der Alkalischen Phosphatase plus 22 bp bzw. 19 bp sowie 15 bp zur Einführung von Restriktionsschnittstellen zusammen. Die PCR-Amplifikationen der DNA-Fragmente (II.2.1.1) wurden in einem Standardprogramm mit einer Primer-Anlagerungstemperatur von 55°C durchgeführt. Die benutzten Primer enthielten zur gerichteten Klonierung in den Vektor die entsprechenden Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen. Der „Front“-Primer zur Klonierung des scFv Fragments in den Vektor pMAL-p2X enthielt die Restriktionsschnittstelle EcoRI, der „Back“-Primer die Restriktionsschnittstelle SbfI. Für die Klonierung des scFv Fragments in den Vektor pETM-13 wurde der „Front“-Primer mit einer SacI und der „Back“-Primer mit einer NotI Restriktionsschnittstelle ausgestattet. Für die Alkalische Phosphatase wurden ein „Front“-Primer mit der Restriktionsschnittstelle NcoI und ein „Back“-Primer mit einer Acc65I Restriktionsschnittstelle gewählt. Als Negativ-Kontrolle diente ein Reaktionsansatz, der alle Komponenten ohne Template enthielt (Daten nicht dargestellt). In einer anschließenden analytischen Gelelektrophorese (II.2.4.1) wurden die DNA-Fragmente anhand ihrer Größe identifiziert. In Abb. III.1.3 sind die elektrophoretisch aufgetrennten scFv DNA-Fragmente der PCR-Amplifikation für die Klonierung in pMAL-p2X sowie der Vektor nach der Extraktion aus dem Agarosegel und der Aufreinigung nach dem Restriktionsverdau zu sehen. In Spur 3 in Abb. III-1.3 ist das mit den Restriktionsenzymen EcoRI/SbfI verdaute scFv Fragment mit der Größe von 755 bp sowie in Spur 4 der mit den Restriktionsenzymen EcoRI/SbfI verdaute Vektor pMAL-p2X mit der Größe von 6695 bp zu identifizieren. In Abb. III.1.4 werden die DNA-Fragmente zur Klonierung von Alkalischer Phosphatase, scFv und der Vektor pETM-13 nach Extraktion aus der Agarosematrix und Aufreinigung nach dem Restriktionsverdau ersichtlich. 62 III Ergebnisse 1 2 3 4 6695 bp 755 bp Abb. III-1.3: 1 %iges Agarosegel mit verdautem Vektor pMAL-p2X und Insert scFv Spur 1: 1 kb DNA Ladder; Spur 2: 1 kb DNA Ladder zur Abschätzung der DNA Menge; Spur 3: Insert scFv (verdaut mit EcoRI/SbfI und aufgereinigt); Spur 4: Vektor pMAL-p2X (verdaut mit EcoRI/SbfI und aufgereinigt) Jeweils 2 µL DNA wurden in einem analytischen 1 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt (II.2.4.1). 1 2 3 4 5 5277 bp 1415 bp 744 bp Abb. III-1.4: 1 %iges Agarosegel mit verdautem Vektor pETM-13, Insert Alkalische Phosphatase und Insert scFv Spur 1: 1 kb DNA Ladder; Spur 2: Vektor pETM-13 unverdaut; Spur 3: Vektor pETM-13 (verdaut mit Acc65I/NcoI und aufgereinigt); Spur 4: Insert Alkalische Phosphatase (verdaut mit Acc65I/BspHI und aufgereinigt); Spur 5: Insert scFv (verdaut mit SacI/NotI und aufgereinigt) Nach der präparativen Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte (II.2.4.2) sowie anschließender Extraktion aus der Agarosematrix und Restriktionsverdau mit Aufreinigung konnte der geschnittene Vektor pETM-13 mit der Größe von 5277 bp, die Alkalische Phosphatase mit der Größe von 1415 bp sowie das scFv Fragment von 744 bp in Abb. III-1.4 identifiziert werden. 63 III Ergebnisse III.1.1 DNA-Klonierung von scFv Antikörperfragmenten Das scFv PCR-Produkt zur Klonierung in den Vektor pMAL-p2X (New England Biolabs) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI/SbfI geschnitten (II.2.2.1) und mit dem Vektor pMAL-p2X ligiert (II.2.2.2), der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde. Das Konstrukt pMAL-p2X-scFv aus dem Ligationsansatz (II.2.2.2) wurden nach der Plasmid-Minipräparation mit den Enzymen EcoRI/SbfI verdaut (II.2.2.1) und in einer anschließenden analytischen Gelelektrophorese (II.2.4.1) aufgetrennt und identifiziert (Abb. III-1.1.1). 1 2 3 6695 bp 755 bp Abb. III-1.1.1: 1 %iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von Vektor pMAL-p2X-scFv Spur 1: 1 kb DNA Ladder; Spur 2: Konstrukt pMAL-p2X-scFv unverdaut; Spur 3: Konstrukt verdaut mit EcoRI/SbfI Jeweils 5 µL DNA wurde in einem analytischen 1 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt (II.2.4.1). Das Insert scFv mit der Größe von 755 bp konnte nach dem Kontroll-Verdau von pMAL-p2XscFv mit den Restriktionsenzymen EcoRI/SbfI auf dem Agarosegel in Abb. III-1.1.1 identifiziert werden (Spur 3). 64 III Ergebnisse Die Klonierung der Fusion von Alkalischer Phosphatase aus E. coli (1415 bp) mit dem scFv Fragment (744 bp) in den Vektor pETM-13 erfolgte in zwei separaten Klonierungsschritten: Der Vektor pETM-13 wurde mit den Restriktionsenzymen Acc65I und NcoI verdaut. Die vollständige Restriktion wurde in einer analytischen Gelelektrophorese (II.2.4.1) überprüft (Daten nicht dargestellt). Da das Alkalische Phosphatase-Gen die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms NcoI in seiner Sequenz aufweist, erfolgte der Verdau der Alkalischen Phosphatase mit Acc65I und BspHI. Target-Gene oder PCR-Produkte, die in ihrer Sequenz die NcoI Schnittstelle haben, können mit dem Restriktionsenzym BspHI geschnitten werden und in eine NcoI Stelle kloniert werden, da kompatible Überhänge generiert werden. Die NcoI Schnittstelle im Vektor geht jedoch mit der anschließenden Ligation verloren. Die Alkalische Phosphatase kann weder mit NcoI noch mit BspHI wieder herausgeschnitten werden. Das Acc65I/BspHI-restringierte Alkalische Phosphatase PCR-Produkt wurde mit dem Acc65I/NcoI linearisierten Vektor pETM-13 ligiert (II.2.2.2) und das entstandene Plasmid pETM-13-Alkalische Phosphatase per Hitzeschock-Transformation (II.2.5.1.1) in den E. coli-Stamm DH5α übertragen. Rekombinante Bakterienklone, die die Alkalische Phosphatase als Insert tragen, wurden durch Plasmid-Minipräparation (II.2.7), DNA-Restriktion (II.2.2.1) und anschließender analytischer Agarose-Gelelektrophorese (II.2.4.1) identifiziert (siehe Abb. III.1.1.2). Für den Verdau des Vektors pETM-13-Alkalische Phosphatase zur Kontrolle der Ligation wurden die Restriktionsenzyme XbaI und Acc65I gewählt. Das erwartete DNAFragment Alkalische Phosphatase nach Kontroll-Verdau des Konstruktes pETM-13Alkalische Phosphatase mit den Restriktionsendonukleasen XbaI/Acc65I entspricht 1454 bp und wurde in allen zehn Kontroll-Ansätzen (Abb. III-1.1.2 (Spur 2-11)) identifiziert. 65 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1454 bp Abb. III-1.1.2: 1%iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von pETM-13-Alkaline Phosphatase Spur 1: 1 kb DNA Ladder; Spur 2-11: Konstrukt verdaut mit XbaI/Acc65I 5 µL DNA wurde in einem analytischen 1 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt (II.2.4.1). Das Konstrukt pETM-13-Alkaline Phosphatase wurde erneut mit den Restriktionsenzymen SacI und NotI geschnitten (II.2.2.1) und mit dem Insert scFv ligiert (II.2.2.2), das mit den gleichen Enzymen geschnitten wurde. Zur Kontrolle der Ligation wurden 5 µL des Vektors pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv nach Plasmid-Minipräparation (II.2.7) mit den Enzymen SacI und NotI geschnitten, in einer anschließenden Gelelektrophorese (II.2.4.1) aufgetrennt und das Insert mit der Größe von 744 bp identifiziert (Abb. III-1.1.3, Spur 2). 1 2 744 bp Abb. III-1.1.3: 1 %iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv Spur 1: 1 kb DNA Ladder; Spur 2: Konstrukt verdaut mit SacI/NotI 5 µL DNA wurde in einem analytischen 1 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt (II.2.4.1). 66 III Ergebnisse Die positiven Klone wurden zur Plasmid-Minipräparation (II.2.7) eingesetzt, sequenziert (II.2.9) und anschließend in den E. coli-Stamm BL21(DE3) (Novagen) und Origami (DE3) (Novagen) transformiert. Das scFv Fragment konnte direkt aus pSTE2-215 (Yol) in die folgenden Plasmid-Vektoren aus Tab. III-1.1.1 subkloniert werden, indem das gesamte scFv Fragment aus pSTE2-215 (Yol) mit den Enzymen NcoI und NotI herausgeschnitten (II.2.2.1) und mit den gleichartig restringierten Vektoren ligiert wurde (II.2.2.2): Plasmid-Vektor Restriktionsverdau mit 10 U/µg DNA pETM-11 NcoI; NotI pET-20b(+) NcoI; NotI pETM-90 NcoI; NotI pETM-80 NcoI; NotI pETM-82 NcoI; NotI Tab. III-1.1.1: verwendete Plasmid-Vektoren zur Subklonierung von scFv Die NcoI Restriktionsschnittstelle (CCATGG) am 5’-Ende der multiplen Klonierungsstelle setzte das ATG Start-Codon für das scFv Ak Fragment. Zur Kontrolle der Ligation wurden die Vektoren mit dem inserierten scFv Fragment mit den Enzymen NcoI und NotI geschnitten und in einer anschließenden analytischen Gelelektrophorese (II.2.4.1) aufgetrennt. Das scFv Fragment mit der Größe von 748 bp konnte nach dem Kontroll-Verdau auf dem Agarosegel identifiziert werden (Daten nicht dargestellt). Tab. III-1.1.2 stellt eine Übersicht über alle Konstrukte, die das scFv Fragment als Insert tragen, dar. 67 III Ergebnisse Konstrukt Lokalisation pETM-11-scFv Cytoplasma pET-20b(+)-scFv Periplasma pETM-90-scFv Cytoplasma pETM-80-scFv Periplasma pETM-82-scFv Cytoplasma pMAL-p2X-scFv Periplasma pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv Cytoplasma Tab. III-1.1.2: generierte scFv-Konstrukte III.2 Überexpression in Gegenwart des Bacteriocin-freisetzenden Proteins III.2.1 Vorversuch mit Fringe Glycosyltransferase und DKFZp564F2122 Die variablen Domänen der scFv Fragmente beinhalten zwei konservierte Cysteinreste, die zur Stabilisierung des gefalteten Polypeptids eine Disulfidbrücke ausbilden (Williams et al., 1988; Wörn et al., 1998). Die Struktur der scFv Fragmente weist somit zwei Disulfidbrücken auf (Glockshuber et al., 1992), um die Faltung und Antigen-Bindungseigenschaften aufrechtzuerhalten. Unter physiologischen Bedingungen liegt das Cytoplasma von E. coli in einem reduzierenden Zustand vor, der die Ausbildung von Disulfidbrücken erschwert. Der Mangel an Disulfidbrücken in cytoplasmatischen Proteinen ist auf die im Cytoplasma lokalisierten Thioredoxine und Glutaredoxine zurückzuführen, die der Ausbildung stabiler Disulfidbrücken entgegenwirken. Die Produktion von korrekt gefalteten scFv Fragmenten wird aufgrund der fehlenden Disulfidbrückenausbildung im Cytoplasma für unwahrscheinlich gehalten und ist vermutlich ausschließlich in der oxidierenden Umgebung von Periplasma und Kulturmedium möglich, die die Ausbildung von Disulfidbrücken erlauben. Der Export cytoplasmatischer und periplasmatischer Proteine in das Kulturmedium durch Bacteriocinfreisetzende Proteine soll zunächst anhand der Modellproteine Fringe Glycosyltransferase (Q24342), sowie DKFZp564F2122 (AL136604) untersucht werden. Dazu wurde der E. coliStamm JB (BL21(DE3) + Vektor pJL3, codierend für BRP) mit dem Konstrukt pETM-50-Fringe Glycosyltransferase mit Leadersequenz zum Transport in das Periplasma und mit pETM-20DKFZp564F2122 mit cytoplasmatischer Lokalisation transformiert (II.2.5.1.2). Die Expression des Bacteriocin-freisetzenden Proteins (BRP) initiiert die Freisetzung periplasmatischer und cytoplasmatischer Proteine aus E. coli in das Kulturmedium. Die 68 III Ergebnisse Aggregation überexprimierter Proteine im Cytoplasma von E. coli soll anhand dieser Methode unterbunden und die Bildung von Inclusion Bodies vermieden werden. BRP sowie Targetprotein unterliegen in dieser Arbeit der gemeinsamen Kontrolle von IPTG, wodurch BRP und Targetprotein parallel exprimiert und akkumuliert werden. Eine unkontrollierte Induktion mit IPTG, die zu einer Überexpression an BRP führt, bewirkt das Lysieren der Wirtszellen. Der Vorversuch mit einem im Periplasma lokalisierten Protein (Fringe Glycosyltransferase (Q24342)) und einem im Cytoplasma lokalisierten Protein (DKFZp564F2122 (AL136604)) soll die Bedingungen definieren, die zu einer optimalen Produktion an Targetprotein und zu einem effizienten Export des Targetproteins durch BRP in das Kulturmedium führt, ohne ein Lysieren der Wirtszellen zu verursachen. Parameter wie IPTG-Konzentration, Temperatur sowie Inkubationszeit sind in diesen Prozess involviert. Zur Expression im „small-scale“ (II.3.1.1) wurden von den transformierten Zellen zunächst Flüssigkulturen bis zu ihrer exponentiellen Phase (OD600 etwa 0,6) herangezogen. Mit dem Erreichen der exponentiellen Phase wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die rekombinanten Proteine aus Zelllysat und Kulturmedium über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt. Zelllysat, gereinigtes Protein aus Zelllysat und Kulturmedium aus Kulturen mit unterschiedlicher Inkubationszeit, Temperatur und IPTG-Konzentration wurden mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) miteinander verglichen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DKFZp564F2122 Fringe Glycosyltransferase Abb. III-2.1.1: gereinigtes Protein aus Zelllysat und Kulturmedium nach 20 h bei 20°C Spur 1-2: gereinigte Fringe Glycosyltransferase aus Zelllysat; Induktion mit 40 µM IPTG und 100 µM IPTG; Spur 3: LMW Protein-Marker; Spur 4-5: gereinigtes Protein DKFZp564F2122 aus Zelllysat; Induktion mit 40 µM IPTG und 100 µM IPTG; Spur 6-7: gereinigtes Protein aus Kulturmedium (Fringe Glycosyltransferase); Induktion mit 40 µM IPTG und 100 µM IPTG; Spur 8-9: gereinigtes Protein aus Kulturmedium (Protein DKFZp564F2122); Induktion mit 40 µM IPTG und 100 µM IPTG 69 III Ergebnisse Beide Modellproteine wurden in das Kulturmedium exportiert (Spur 7-9 in Abb. III-2.1.1). Durch den Vergleich von Spur 7 und Spur 9 aus Abb. III-2.1.1 wird deutlich, dass die im Periplasma lokalisierte Fringe Glycosyltransferase durch die Co-Expression von BRP in höherer Konzentration in das Kulturmedium abgegeben wird als das im Cytoplasma lokalisierte Protein DKFZp564F2122. Zudem ist die Akkumulation an rekombinantem Protein im Kulturmedium bei einer Induktion von 100 µM IPTG im Vergleich zu 40 µM IPTG signifikant. Nach 5 h Inkubationszeit bei 20°C ließ sich kein rekombinantes Protein im Kulturmedium nachweisen (Daten nicht dargestellt). a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 97,0 kDa 66,0 kDa DKFZp564F2122 45,0 kDa Fringe Glycosyltransferase Abb. III-2.1.2 a) gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 8 h bei 37°C Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2: Kontrolle ohne Induktion (Fringe Glycosyltransferase); Spur 3-7: Fringe Glycosyltransferase; Induktion mit 10 µM IPTG; 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; 500 µM IPTG; 2000 µM IPTG; Spur 8: Kontrolle ohne Induktion (Protein DKFZp564F2122); Spur 9-13: Protein DKFZp564F2122: Induktion mit 10 µM IPTG; 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; 500 µM IPTG; 2000 µM IPTG b) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 97,0 kDa 66,0 kDa DKFZp564F2122 45,0 kDa Fringe Glycosyltransferase Abb. III-2.1.2 b) gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C Spur 1: Kontrolle ohne Induktion (Fringe Glycosyltransferase); Spur 2: LMW Protein-Marker; Spur 3-7: Fringe Glycosyltransferase; Induktion mit 10 µM IPTG; 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; 500 µM IPTG; 2000 µM IPTG; Spur 8: Kontrolle ohne Induktion (Protein DKFZp564F2122); Spur 9-13: Protein DKFZp564F2122: Induktion mit 10 µM IPTG; 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; 500 µM IPTG; 2000 µM IPTG In Abb. III-2.1.2 a) wird deutlich, dass die im Periplasma lokalisierte Fringe Glycosyltransferase bereits ohne Induktion nach 8 h Inkubationszeit bei 37°C exprimiert und in das Kulturmedium exportiert wird (Spur 2). Der verwendete T7-Promotor in den Vektoren pETM-20 und pETM-50 ist nicht streng reprimiert, so dass rekombinantes Protein auch in Abwesenheit des Induktors (IPTG) geringfügig exprimiert wird (siehe Kontrollen ohne Induktion). Signifikante Unterschiede bei Induktion mit unterschiedlicher Menge an IPTG werden nach 8 h 70 III Ergebnisse Inkubationszeit bei 37°C nicht deutlich. Das Protein DKFZp564F2122 lässt sich bei einer Induktion mit 100 µM IPTG und 8 h Inkubation bei 37°C gut exprimieren und in das Kulturmedium exportieren (Abb. III-2.1.2 a) Spur 11, ~ 1000 ng Protein/mL). Die Menge an Fringe Glycosyltransferase im Kulturmedium nach 20 h (Abb. III.2.1.2 b)) im Vergleich zu 8 h (Abb. III.2.1.2 a)) verdeutlicht die Zunahme an akkumuliertem sezerniertem Protein mit Erhöhung der Inkubationszeit. Das rekombinante Protein DKFZp564F2122 weist nach 20 h Inkubationszeit (Abb. III-2.1.2 b)) im Vergleich zu 8 h (Abb. III-2.1.2 a)) keine signifikante Zunahme an sezerniertem Protein auf. 1 2 3 4 5 6 DKFZp564F2122 Fringe Glycosyltransferase Abb. III-2.1.3 Zelllysat nach 20 h bei 37°C Spur 1-3: Fringe Glycosyltransferase; Kontrolle ohne Induktion; Induktion mit 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; Spur 46: Protein DKFZp564F2122; Kontrolle ohne Induktion; Induktion mit 100 µM IPTG; 500 µM IPTG Die Menge an sezerniertem rekombinantem Protein (Abb. III.2.1.2 b)) ist jedoch im Vergleich zu dem aufgereinigten rekombinanten Protein aus dem Zelllysat (Abb. III.2.1.4) mit < 10% relativ gering (Tab. III-2.1.1 a)). Fringe Glycosyltransferase: IPTG-Zugabe [µM] Protein im Kulturmedium [ng/mL] 0 10 40 100 500 2000 25 100 150 300 1000 1000 gereinigtes Protein aus Zelllysat [ng/mL] 2000 Export in Prozent 5000 5000 ~3% ~6% ~1% Tab. III-2.1.1 a): Quantifizierung der exportierten Fringe Glycosyltransferase nach 20 h bei 37°C 71 III Ergebnisse DKFZp564F2122: IPTG-Zugabe [µM] Protein im Kulturmedium [ng/mL] 0 10 40 100 500 2000 0 25 25 800 150 150 Export in Prozent gereinigtes Protein aus Zelllysat [ng/mL] 1000 0% 100 25 ~ 90 % ~ 85 % Tab. III-2.1.1 b): Quantifizierung des exportierten Proteins DKFZp564F2122 nach 20 h bei 37°C 1 2 3 4 5 6 DKFZp564F2122 Fringe Glycosyltransferase Abb. III-2.1.4 gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 20 h bei 37°C Spur 1-3: Fringe Glycosyltransferase; Kontrolle ohne Induktion; Induktion mit 40 µM IPTG; 100 µM IPTG; Spur 46: Protein DKFZp564F2122; Kontrolle ohne Induktion; Induktion mit 100 µM IPTG; 500 µM IPTG In Abb. III-2.1.3 ist die totale Expression von Fringe Glycosyltransferase und DKFZp564F2122 verdeutlicht. Unterschiede im Expressionslevel (Fringe Glycosyltransferase) sind bei Induktionen mit 40 µM und 100 µM IPTG nicht zu erkennen (Abb. III-2.1.3, Spur 2+3). Das im Cytoplasma lokalisierte Protein DKFZp564F2122 wird mit 100 µM IPTG zur Induktion in größerer Menge exprimiert als mit 500 µM IPTG (Abb. III-2.1.3, Spur 5+6). Im aufgereinigten Zelllysat (Abb. III-2.1.4) ist die Menge an löslichem Protein DKFZp564F2122 in der Kontrolle ohne Induktion (Spur 4) höher als in den Proben mit Induktion (Spur 5+6). Die totale Menge an Protein DKFZp564F2122 nimmt mit steigender Konzentration an IPTG jedoch zu (Abb. III2.1.3, Spur 4-6). In Abb. III-2.1.4 wurde ohne Induktion mit IPTG Targetprotein überexprimiert (Spur 4). Die Initiierung der Freisetzung des Targetproteins ins Kulturmedium durch BRP konnte aber nicht erfolgen, da kein oder unzureichend BRP exprimiert wurde. Das gesamte exprimierte Targetprotein aus dem Zelllysat konnte aufgereinigt werden, da durch die fehlende Induktion und geringe Repression des Vektors vermutlich kaum unlösliches Targetprotein gebildet wurde. Das geringe Expressionslevel führte zu einer besseren Faltung und damit zu einer erhöhten Löslichkeit. Mit zunehmender Konzentration an IPTG erfolgte die Zunahme an Targetprotein im Zelllysat (Abb. III-2.1.3) und im Kulturmedium (Abb-2.1.2 b)). Aufgrund der 72 III Ergebnisse nur mäßigen Überexpression (Abb. III-2.1.3) und des Exportes ins Kulturmedium nimmt die Menge an aufgereinigtem Targetprotein ab (Abb. III-2.1.4, Spur 4-6). Eine Inkubation bei 20°C im Vergleich zur Inkubation bei 37°C (Abb. III-2.1.1 und III-2.1.4) führt zwar zu einer höheren Akkumulation an löslichem Protein DKFZp564F2122 im Zelllysat, jedoch auch zu geringerer Akkumulation an rekombinantem Protein im Kulturmedium (Abb. III2.1.1 und III-2.1.2 b)). Der Vorversuch zur Bestimmung der optimalen Inkubationszeit, Temperatur und optimaler Konzentration an IPTG zur Induktion des Plasmids pJL3 und des Plasmids mit dem Targetprotein im E.coli-Stamm BL21(DE3) führte zu den optimalen Wachstumsbedingungen von 20 h bei 37°C, wobei die optimale Konzentration an IPTG zur Induktion bei der im Periplasma lokalisierten Fringe Glycosyltransferase bei 500 µM und bei dem im Cytoplasma befindlichen Protein DKFZp564F2122 bei 100 µM IPTG lag. Diese Kulturbedingungen wurden für die Serinprotease-4 als weiteres Modellprotein mit sieben Disulfidbrücken angewandt, um diese mit Hilfe des Bacteriocin-freisetzenden Proteins in das Kulturmedium zu exportieren, da diese wie das scFv Fragment die Ausbildung von Disulfidbrücken zur korrekten Strukturausbildung benötigt. III.2.2 Mit Serinprotease-4 Es wurden verschiedene Plasmid-Vektoren zur Expression der Serinprotease-4 in E. coli eingesetzt, um das optimale Konstrukt zur Produktion löslicher Serinprotease-4 zu definieren. Der Vektor pBADM-20 mit N-terminalem Thioredoxin als Fusionspartner wurde gewählt, da er eine unabhängige Induktion von Ser-4 (Induktion mit Arabinose) und BRP (Induktion mit IPTG) in JB-Zellen (BL21(DE3) + pJL3) erlaubt. Der Vektor pETM-50 trägt zusätzlich das Gen DsbA und eine Leadersequenz zum Transport ins Periplasma mit oxidierender Umgebung, wobei das Protein DsbA an der Disulfidverbrückung im Periplasma beteiligt ist. pETM-90 ist mit dem Gen ftr ausgestattet, das für ein hyperthermophiles Enzym (Tetrahydromethanopterin- Formyltransferase) codiert. Im Falle einer guten Expression mit dem Vektor pETM-90 wäre hier eine Hitzeaufreinigung möglich (de Marco et al., 2004). Die Aufreinigung der Serinprotease-4, die mit dem Vektor pGEX-6P-1 exprimiert wurde, erfolgt im Gegensatz zu den anderen Vektoren nicht über den His-Tag, sondern über den GST-Tag. Die Expression der Serinprotease4 im Vektor pETM-11 führt zu keinem Fusionsprotein und fungiert als Kontrolle. Das Targetprotein bleibt im Cytoplasma lokalisiert. 73 III Ergebnisse Ziel des Einsatzes dieser verschiedenen Vektoren aus Tab. III-2.2.1 ist es, die Löslichkeit von rekombinanter Serinprotease-4 zu verbessern und das geeignete Expressionssystem zu definieren. Vektor Größe des Lokalisation Wirt exprimierten Proteins pETM-11 40,1 kDa Cytoplasma JB pETM-90 75,1 kDa Cytoplasma JB pGEX-6P-1 65,1 kDa Cytoplasma JB pBADM-20 51,8 kDa Cytoplasma JB pGEX-6P-1 65,1 kDa Cytoplasma JT pBADM-20 51,8 kDa Cytoplasma JT pETM-50 63,1 kDa Periplasma JB Tab. III-2.2.1: Größe der exprimierten Serinprotease-4 JB: Vektor pJL3 in BL21(DE3) (Novagen) JT: Vektor pJL3 in TOP10 (Invitrogen) In dem E. coli-Stamm BL21(DE3) (Novagen) ist das Gen der T7-Phagen-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors im Chromosom integriert. Das T7-Expressionssystem stammt aus dem Bakteriophagen T7, der durch seine starken Promotoren erfolgreich mit der gesamten Transkriptionsmaschinerie der Wirtszelle in Konkurrenz tritt und damit Expressionsniveaus von etwa 50% des Gesamtzellproteins ermöglicht. Nach der Zugabe von IPTG wird die T7-Phagen-RNA-Polymerase synthetisiert und transkribiert die heterologen Gene, die der Kontrolle des T7-Promotors unterliegen. BL21(DE3) ist defizient für die Proteasen ompT und Lon, die in E. coli zum cytosolischen Abbau rekombinanter Proteine führen können. Aufgrund der hohen Transkriptionseffizienz des T7-Promotors in den Vektoren pETM-11, pETM-90 und pETM-50, der von der T7-Phagen-RNA-Polymerase erkannt wird, wurde dieser Stamm gewählt. Der E. coli Stamm TOP10 (Invitrogen) besitzt keine T7-Polymerase, ist aber araBADC-. JTZellen (TOP10 + pJL3) wurden mit den Vektoren pGEX-6P-1-Ser-4 und pBADM-20-Ser-4 transformiert. Der Vektor pGEX-6P-1 trägt den tac-Promotor (Hybridpromotor aus lac- und trpPromotor), pBADM-20 den araB-Promotor. Der tac-Promotor in pGEX-6P-1 vereint die hohe Transkriptionseffizienz des trp-Promotors mit der einfachen Induzierbarkeit des lac-Promotors. Der Vektor pBADM-20 (abgeleitet vom kommerziellen pBAD/His A (Invitrogen)) benötigt 74 III Ergebnisse einen Stamm, der araBADC- ist, der die Aufnahme von Arabinose, aber nicht die Verstoffwechslung von Arabinose erlaubt. Eine Induktion der JT-Zellen mit IPTG, die den Vektor pGEX-6P-1-Ser-4 tragen, führt zur Expression des Targetproteins und zur Expression von BRP. Die Induktion mit IPTG und Arabinose in JT-Zellen, die den Vektor pBADM-20-Ser4 tragen, führt zur unabhängigen Expression von BRP und Serinprotease-4. Anhand der Serinprotease-4 sollten die verschiedenen Vektoren aus Tab. III-2.2.1 auf ihre Kompatibilität mit dem Vektor pJL3, codierend für BRP, untersucht werden. III.2.2.1 Charakterisierung löslich exprimierter Serinprotease-4 im Western-Blot Zur Expression im „small-scale“ (II.3.1.1) wurden von den transformierten Zellen zunächst Flüssigkulturen bis zu ihrer exponentiellen Phase (OD600 etwa 0,6) herangezogen. Mit dem Erreichen der exponentiellen Phase wurden die Zellen mit 100 µM, bzw. 500 µM IPTG induziert, und somit die Expression eingeleitet. 20 min nach der Induktion mit IPTG wurden Zellen, die den Vektor pBADM-20-Ser-4 tragen, zusätzlich mit 2,5 mg/mL Arabinose (aufgrund des Arabinose-Systems) induziert. Nach Ablauf der Inkubationszeit von 20 h bei 37°C wurden die rekombinanten Proteine aus dem Kulturmedium über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt. Um die Expression und Menge der Serinprotease-4 zu überprüfen, wurden die aus dem Kulturmedium isolierten Proteine mittels denaturierender, diskontinuierlicher SDS-PAGE (II.3.5) aufgetrennt und im Western Blot (II.3.6) auf eine PVDF-Membran transferiert. 75 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 97,0 kDa 66,0 kDa Ser-4 + GST (65,1 kDa) 45,0 kDa Ser-4 (40,1 kDa) 30,0 kDa DsbA 23 kDa ? 20,1 kDa Trx 11,7 kDa ? Abb. III-2.2.1.1: SDS-PAGE des gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2: pETM-11-Ser-4 in JB; Spur 3: pETM-90-Ser-4 in JB; Spur 4: pGEX-6P-1Ser-4 in JB; Spur 5: pBADM-20-Ser-4 in JB; Spur 6: pGEX-6P-1-Ser-4 in JT; Spur 7: pBADM-20-Ser-4 in JT; Spur 8: pETM-50-Ser-4 in JB In Abb. III-2.2.1.1 ist keine Überexpression an löslicher Serinprotease-4 erkennbar. Einige Proteinbanden entsprechen dem erwarteten Molekulargewicht der Serinprotease-4 (Spur 4+6) aus pGEX-6P-1 mit 65,1 kDa. Die anderen Proteinbanden könnten Abbauprodukte der Serinprotease-4 sein. Es wird vermutet, dass in Spur 5+7 die Thioredoxin-Fusion abgespalten wurde. Ob es sich bei der Proteinbande in der Größenordnung von 11,7 kDa tatsächlich um Thioredoxin handelt, ist nicht mit Sicherheit zu sagen. Die Proteinbanden in der Größenordnung von Thioredoxin (Trx) mit 11,7 kDa (Spur 5+7) und DsbA mit 23 kDa (Spur 8) könnten ein Hinweis auf den Verlust der Thioredoxin- sowie DsbA-Fusion sein. Eine Abspaltung von Fusionsproteinen wird laut Absprache mit Dr. Ario de Marco (Protein Expression and Purification Facility, EMBL, Heidelberg) häufig beobachtet. Der nachfolgende Western-Blot soll Aufschluss darüber geben, ob die Proteinbanden in Spur 4, 5, 6 und 8 aus Abb. III-2.2.1.1 tatsächlich der Serinprotease-4 entsprechen. 76 III Ergebnisse 1 2 3 97,0 kDa 66,0 kDa Ser-4 + GST (65,1 kDa) 1 2 45,0 kDa Ser-4 + Trx (51,8 kDa) Ser-4 (40,1 kDa) 3 30,0 kDa 20,1 kDa Abb. III-2.2.1.2: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C Spur 1: pGEX-6P-1-Ser-4 in JT; Spur 2: pBADM-20-Ser-4 in JB; Spur 3: pGEX-6P-1-Ser-4 in JB Die Signale im Western-Blot zeigen zum einen die Expression löslicher Serinprotease-4, zum anderen konnte anhand des Protein-Markers die Größe der exprimierten Serinprotease-4 ermittelt werden. Fusionen von Serinprotease-4 und GST aus pGEX-6P-1-Ser-4 konnte in löslicher Form in JT-Zellen (Spur 1 in Abb. III-2.2.1.2) sowie in JB-Zellen (Spur 3 in Abb. III-2.2.1.2) in der korrekten Größe von 65,1 kDa exprimiert werden. Spur 2 in Abb. III-2.2.1.2 weist auf den Verlust der Thioredoxin-Fusion hin. Es wurden zwei Signale im Western-Blot detektiert, die die Serinprotease-4 (Bande 2) in Abb. III-2.2.1.2 mit Thioredoxin-Fusion und ohne Fusionspartner (Bande 3) in Abb. III-2.2.1.2 identifizieren. Die unabhängige Induktion von BRP und Targetprotein in den JB-Zellen, die den Vektor pBADM-20-Ser-4 tragen, führt zu löslicher Serinprotease-4 (Bande 2). Das Signal ist jedoch schwach im Vergleich zur Fusion von Serinprotease-4 und GST aus dem Vektor pGEX-6P-1Ser-4 (Bande 1). Es wurde nicht vermutet, dass lösliche Serinprotease-4 aus pBADM-20-Ser-4 in JB-Zellen (BL21(DE3) + pJL3) erhalten wird, da der E. coli-Stamm BL21(DE3) nicht araBADC- ist. In diesen Zellen konnte jedoch lösliche Serinprotease-4 exprimiert werden, da eine schwache Expression durch die Aufnahme von Arabinose gegeben war bevor diese abgebaut wurde. Aus den JT-Zellen (TOP10 + pJL3), die araBADC- sind, und somit die Aufnahme von Arabinose, aber nicht deren Metabolismus ermöglichen, konnte kein lösliches Targetprotein im Kulturmedium nachgewiesen werden. 77 III Ergebnisse III.2.2.2 Aufkonzentrierung löslich exprimierter Serinprotease-4 Aufgrund der geringen Menge an sezernierter Serinprotease-4 im Kulturmedium wurden je 2x 100 mL Flüssigkultur zur anschließenden Aufkonzentrierung mit den transformierten Zellen a) pGEX-6P-1-Ser-4 in JB und b) pBADM-20-Ser-4 in JB bis zu einem OD600 von etwa 0,6 herangezogen (II.3.1.2) und mit 500 µM IPTG induziert. 20 min nach der Induktion mit IPTG wurden die Zellen, die den Vektor pBADM-20-Ser-4 tragen, aufgrund des Arabinose-Systems mit 2,5 mg/mL Arabinose induziert. Nach Ablauf der Inkubationszeit von 20 h bei 37°C wurden die rekombinanten Proteine aus dem Kulturmedium mit einer Flussrate von 0,6 mL/min über eine Chromatographie-Säule gepumpt (II.3.2.1). Nach Elution der Serinprotease-4 wurde erneut eine Western-Blot Analyse (II.3.6) mit Eluat und Harz, sowie eine Aktivitätsbestimmung (II.3.7) der Serinprotease-4 durchgeführt. In einem zweiten Versuch zur Aufkonzentrierung von Kulturmedium wurde eine Dialyse-Membran eingesetzt (II.3.2.2). Dabei wurde die mit Kulturmedium gefüllte Dialysemembran mit PEG überschichtet und einige Stunden in Aluminium-Folie gelagert. Wegen der hygroskopischen Eigenschaft des PEG und der damit verbundenen Abnahme des Probenvolumens, konnte nach gewissen Zeitabständen erneut ein Teil der Probe hinzugefügt werden, bis das Probenvolumen nur noch etwa 10 % des ursprünglichen Volumens betrug. Serinprotease-4 (40,1 kDa) 1 2 3 4 Abb. III-2.2.2.1: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 nach Aufkonzentrierung des Kulturmediums mit Dialyse-Membran Spur 1: pGEX-6P-1-Ser-4 in JB (Eluat); Spur 2: pBADM-20-Ser-4 in JB (Eluat); Spur 3: pGEX-6P-1-Ser-4 in JB (Harz); Spur 4: pBADM-20-Ser-4 in JB (Harz) 6,25 µL Eluat bzw. Harz wurden zur Western-Blot Analyse eingesetzt. Nach der Aufkonzentrierung des Kulturmediums über die Chromatographie-Säule ließ sich keine Serinprotease-4 über die Western-Blot Analyse (II.3.6) (Daten nicht dargestellt) nachweisen. Im Versuch mit der Aufkonzentrierung über Dialyse-Membran war es jedoch möglich, löslich exprimierte Serinprotease-4 zu detektieren (Abb. III-2.2.2.1). Vermutlich hat Ser-4 aus pGEX6P-1 den GST-Tag verloren, da das Signal bei 40,1 kDa und nicht wie erwartet bei 65,1 kDa nachgewiesen werden konnte (Spur 1+3). Ser-4 aus pBADM-20 wurde ebenfalls bei einer Größe von 40,1 kDa (Abb. III.2.2.2.1, Spur 2+4) nachgewiesen, was zu der Vermutung führt, dass die 78 III Ergebnisse Thioredoxin-Fusion ebenfalls abgespalten wurde. Eine Expression von löslicher Serinprotease-4 aus pBADM-20-Ser-4 war möglich, obwohl BL21(DE3)-Zellen benutzt wurden, die nicht araBADC- sind. Arabinose wurde vermutlich nicht vollständig von den Zellen abgebaut, und führte so zur Expression des Targetproteins. Die Abspaltung der Fusionsproteine wurde laut Absprache mit Dr. Ario de Marco (Protein Expression and Purification Facility, EMBL, Heidelberg) häufig beobachtet. Der parallel durchgeführte Aktivitätstest (II.3.7) zur Überprüfung der funktionellen Fähigkeit der löslichen Serinprotease-4 aus pBADM-20-Ser-4 und pGEX-6P-1- Ser-4 fiel jedoch negativ aus (Daten nicht dargestellt). Da das spezifische Substrat der Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae nicht bekannt ist, wurde BSA als Substrat gewählt, das von der Serinprotease Trypsin abgebaut wird. Aufgrund der fehlenden Information des richtigen Substrates wurde die Aktivität der Serinprotease-4 ebenfalls über radioaktives DFP (Diisopropylfluorophosphat) -Labeling (Kafatos Gruppe, EMBL, Heidelberg) überprüft. Dieser Test fiel gleichfalls negativ aus. Die lösliche Serinprotease-4, exprimiert im Baculovirus, einem eukaryotischen Expressionssystem, führte ebenso zu einem negativen Ergebnis im Aktivitätstest. Modifikationen aus vorangegangenen Versuchen wie die Co-Expression von Chaperonen oder Akkumulation des Targetproteins im Periplasma, die zu einer Verbesserung der Faltung und Ausbildung von Disulfidbrücken führen sollen, ergaben keine Protease-Aktivität von Serinprotease-4. Möglicherweise entspricht das gewählte Substrat nicht dem spezifischen Substrat der Serinprotease-4, oder Serinprotease-4 benötigt zusätzlich einen Cofaktor zum Abbau des Substrates. Eine weitere Möglichkeit besteht in der nicht korrekten Ausbildung der dreidimensionalen, funktionellen Struktur der Serinprotease-4. Obwohl es nicht möglich war, Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae in funktioneller dreidimensionaler Struktur mit Ausbildung der sieben Disulfidbrücken zu exprimieren, konnte mit Co-Expression des Bacteriocin-freisetzenden Proteins lösliche Serinprotease-4 aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Zur Bestätigung der Versuchsergebnisse wurden erneut Kulturen im „small-scale“ (II.3.1.1) von pBADM-20-Ser-4 in JB, sowie pGEX-6P-1-Ser-4 in JB bis zu einem OD600 von etwa 0,6 herangezogen und mit jeweils 100 µM und 500 µM IPTG induziert (pBADM-20-Ser-4 nach 20 min zusätzlich mit Arabinose). Nach 20 h, 24 h und 28 h wurde das Kulturmedium über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie gereinigt und auf das Vorhandensein von löslicher Serinprotease-4 untersucht (II.3.4.1.1). 79 III Ergebnisse Serinprotease-4 + GST (65,1 kDa) Serinprotease-4 (40,1 kDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abb. III-2.2.2.2: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 in Kulturmedium nach 20 h, 24 h und 28 h bei 37°C [Spur 1-2: pBADM-20-Ser-4; 28 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG; Spur 3-4: 24 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG; Spur 5-6: 20 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG]; [Spur 7-8: pGEX-6P-1-Ser-4; 28 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG; Spur 9-10: 24 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG; Spur 11-12: 20 h Inkubation nach Induktion mit 500 µM und 100 µM IPTG] Die Serinprotease-4 in Kombination mit pGEX-6P-1 konnte mit der erwarteten Größe von 65,1 kDa (Spur 7+8) sowie ohne Thioredoxin-Fusion in Kombination mit pBADM-20 (Spur 2) nach 28 h Inkubation bei 37°C in der Western-Blot Analyse (Abb. III-2.2.2.2) nachgewiesen werden. Vermutlich ist bei der Aufkonzentrierung der Serinprotease-4 über Dialyse-Membran (II.3.2.2) der GST-Tag der Serinprotease-4 aus pGEX-6P-1-Ser-4 abgespalten worden (Abb. III.2.2.2.1). Bei Aufreinigung des Kulturmediums ohne anschließender Aufkonzentrierung konnte das lösliche Fusionsprotein von Serinprotease-4 mit GST nachgewiesen werden (Abb. III-2.2.2.2). Wie auch der Vorversuch mit dem im Cytoplasma lokalisierten Protein DKFZp564F2122 (III.2.1) bestätigt, ist die otimale IPTG-Konzentration 100 µM zur Induktion bei cytoplasmatischer Lokalisation von Serinprotease-4 und Freisetzung durch BRP. 80 III Ergebnisse III.3 Charakterisierung der scFv Fragmente Im Vorversuch mit Fringe Glycosyltransferase und dem Protein DKFZp564F2122 wurden die optimalen Bedingungen für das BRP (Bacteriocin release protein) System etabliert, um periplasmatische und cytoplasmatische Proteine in das Kulturmedium mit oxidierender Umgebung zur Ausbildung von Disulfidbrücken zu exportieren. Verschiedene Vektoren, Zelllokalisation, Bedingungen wie optimale Inkubationszeit, IPTG-Konzentration und Temperatur wurden anhand der Fringe Glycosyltransferase, dem Protein DKFZp564F2122 sowie der Serinprotease-4 untersucht. Es war möglich, das BRP System auf die Serinprotease-4 mit sieben Disulfidbrücken zu übertragen, und lösliches Targetprotein ins Kulturmedium zu exportieren. Die Ergebnisse aus den vorangegangenen Versuchen sollen nun angewandt werden, um die Produktion von scFv Fragmenten mit zwei Disulfidbrücken zu optimieren. Die scFv Fragmente sollten zunächst in löslicher Form exprimiert werden, über Metallionenaffinitätschromatographie aufgereinigt und anschließend auf ihre Funktionalität getestet werden. Dabei erfolgte die bakterielle Expression zunächst im E. coli-Stamm BL21(DE3) (Novagen), um den geeigneten Vektor aus Tab. III-3.1 für gute Expression von scFv zu definieren. Dieser Stamm ist geeignet zur Expression rekombinanter Proteine, da er defizient für die beiden Proteasen ompT und Lon ist (Sugimura und Higashi, 1988). Die Verringerung von Degradationen in proteasedefizienten Stämmen wurde auch von BAKER et al. (1984) beschrieben. Er weist bei vergleichenden Expressionen in unterschiedlichen E. coli-Stämmen die geringste Degradation heterolog exprimierter Proteine auf (Monecke, 1996). Nach Induktion mit IPTG wird die T7-Phagen-RNA-Polymerase exprimiert, da in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) (Novagen) das Gen der T7-Phagen-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors im Chromosom integriert ist. Anschließend sollten JB-Zellen (BL21(DE3) + Vektor pJL3) mit dem geeigneten Expressionssystem transformiert werden, um lösliches Targetprotein ins Kulturmedium mit oxidierender Umgebung zu exportieren. Ein weiterer Versuch mit der Co-Expression von Chaperonen (III.4) sowie die Expression von Fusionsproteinen (Maltose-Bindungsprotein-scFv) im pMAL System, das die malE Signalsequenz nutzt, um das Fusionsprotein durch die Cytoplasmamembran zu exportieren sollte die Löslichkeit von rekombinanten scFv Fragmenten im E. coli-Stamm BL21(DE3) verbessern. 81 III Ergebnisse Konstrukt Wirt pETM-11-scFv BL21(DE3) pET-20b(+)-scFv BL21(DE3) pETM-90-scFv BL21(DE3) pETM-80-scFv BL21(DE3) pETM-82-scFv BL21(DE3) pETM-11-scFv JB pET-20b(+)-scFv JB pETM-90-scFv JB pETM-80-scFv JB pETM-82-scFv JB pMAL-p2X-scFv BL21(DE3) Tab. III-3.1: scFv-Konstrukte Der Vektor pETM-11, der als Kontrolle eingesetzt wurde, führt bei Expression zu cytoplasmatischer Lokalisation des rekombinanten Proteins. pET-20b(+) ist mit einer Signalsequenz zur periplasmatischen Lokalisation des Proteins ausgestattet. Das Gen ftr im Vektor pETM-90 codiert für ein hyperthermophiles Enzym, das als Fusion mit dem Targetprotein über Hitzeaufreinigung zu erhalten ist. pETM-80 trägt ebenfalls eine Leadersequenz zum Transport des Proteins in das Periplasma, sowie ein DsbC-Gen als Fusionspartner des Targetproteins. Der Vektor pETM-82 führt zu cytoplasmatischer Expression mit DsbC Fusion. Zur Expression im „small-scale“ (II.3.1.1) wurden von den transformierten Zellen zunächst jeweils 2x 3 mL Flüssigkulturen bis zu ihrer exponentiellen Phase (OD600 etwa 0,6) herangezogen. Mit dem Erreichen der exponentiellen Phase wurden die Zellen mit 100 µM IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. 2 h vor Ablauf der Inkubationszeit von 20 h bei 20°C wurde eine Hälfte der Kulturlösungen abzentrifugiert, das Zellpellet in 2,5 mL frischem Kulturmedium resuspendiert (als N-Proben bezeichnet) und weitere 2 h mit der anderen, unbehandelten Hälfte der Kulturlösungen (als I-Proben bezeichnet) inkubiert. Anschließend wurden die rekombinanten Proteine aus 1,5 mL Zelllysat isoliert (II.3.3) und über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt. Zelllysat und gereinigtes Protein aus Zelllysat wurden mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. 82 III Ergebnisse 97,0 kDa 1 2 3 4 5 6 7 scFv + ftr 66,0 kDa scFv + DsbC 45,0 kDa scFv 30,0 kDa 20,1 kDa 14,4 kDa Abb. III-3.1: Zelllysat (Konstrukte in BL21(DE3)) Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2: Kontrolle ohne Induktion; pETM-11-scFv; Spur 3-7: Induktion mit 100 µM IPTG; pETM-11-scFv; pET-20b(+)-scFv; pETM-90-scFv; pETM-80-scFv; pETM-82-scFv 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 97,0 kDa 66,0 kDa scFv + DsbC 45,0 kDa scFv 30,0 kDa Abb. III-3.2: gereinigtes Protein aus dem Zelllysat (Konstrukte in BL21(DE3)) Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2: Kontrolle ohne Induktion; pETM-11-scFv; Spur 3-12: Induktion mit 100 µM IPTG; pETM-11-scFv I+N; pET-20b(+)-scFv I+N; pETM-90-scFv I+N; pETM-80-scFv I+N; pETM-82-scFv I+N In Abb. III-3.1 wird das Expressionsniveau der verschiedenen Vektoren deutlich. Mit den Vektoren pETM-11-scFv, pETM-90-scFv, pETM-80-scFv und pETM-82-scFv wird das scFv Fragment exprimiert (Spur 3, 5, 6, 7). pET-20b(+) führt zu keiner Überexpression von scFv Fragmenten (Spur 4). Wie aus Abb. III-3.2 deutlich wird, erhält man lösliches Targetprotein in Fusion mit DsbC (Spur 9-12), wobei die Menge an löslichem Protein mit cytoplasmatischer Zelllokalisation (Spur 11+12) etwa um Faktor 2 größer ist als bei periplasmatischer Lokalisation (Spur 9+10). Mit den Vektoren pETM-11, pET-20b(+) und pETM-90 lässt sich kaum lösliches Protein in dem E. coli- Stamm BL21(DE3) exprimieren. 83 III Ergebnisse Es besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den I- und N-Proben wie aus Abb. III-3.2 deutlich wird. Die Konstrukte pETM-80-scFv und pETM-82-scFv weisen die größte Ausbeute an löslichem scFv Fragment aus dem Zelllysat auf, wobei die Menge an Targetprotein aus pETM-82-scFv mit etwa 1000 ng scFv/mL Kultur ungefähr der doppelten Menge an löslichem Protein im Vergleich zum löslichen scFv aus pETM-80-scFv entspricht. Die Disulfid-Isomerase (DsbC) als Fusionspartner zeigt einen positiven Effekt auf die Löslichkeit heterologer Proteine, da sie Einfluss auf die Disulfidbrücken-Ausbildung nehmen kann. Die Genfusion mit DsbC in pETM80-scFv und pETM-82-scFv scheint somit einen positiven Einfluss auf die Löslichkeit rekombinanter scFv Fragmente zu zeigen. Die Vektoren pETM-11, pET-20b(+) und pETM-90 sind für die Expression von diesen scFv Fragmenten in dem E. coliStamm BL21(DE3) ungeeignet, da kaum lösliches Targetprotein exprimiert wird (Abb. III-3.2). Zur Gewinnung löslicher scFv wurde der E. coli-Stamm JB (BL21(DE3) + pJL3) mit den Konstrukten pETM-11-scFv, pET-20b(+)-scFv, pETM-90-scFv, pETM-80-scFv und pETM-82scFv transformiert (II.2.5.1.2), um die Freisetzung des scFv Fragments in das Kulturmedium durch Co-Expression von BRP zu initiieren. Disulfidbrücken können aufgrund des notwendigen oxidierenden Redoxzustandes im Kulturmedium ausgebildet werden. Die Zellen wurden während ihrer exponentiellen Phase (OD600 etwa 0,6) mit 100 µM IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. Nach Ablauf von 24 h wurden 1,5 mL an Zellsuspension entnommen. Rekombinante Proteine aus Zelllysat und Kulturmedium wurden zunächst isoliert (II.3.3), über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt und mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. Beim Screening wurde ausschließlich Targetprotein aus dem Konstrukt pETM-82-scFv in das Kulturmedium exportiert (Daten nicht dargestellt). Die Vektoren pETM-11-scFv, pET-20b(+)scFv, pETM-90-scFv und pETM-80-scFv sind für das BRP System zur Freisetzung periplasmatischer und cytoplasmatischer Proteine in das Kulturmedium nicht geeignet, da kaum lösliches scFv Fragment aus dem Kulturmedium aufgereinigt werden konnte. Möglicherweise sind diese Vektoren mit dem Vektor pJL3, codierend für BRP, nicht kompatibel. Zur Optimierung der Expression wurden erneut Zellen mit dem Konstrukt pETM-82-scFv während ihrer exponentiellen Phase mit 40 µM, 100 µM, 500 µM und 1000 µM IPTG induziert. Nach Ablauf von 24 h und 48 h wurden 1,5 mL an Zellsuspension entnommen, abzentrifugiert und 1,0 mL des Kulturmediums auf das Vorhandensein rekombinanter Proteine untersucht. 84 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 97,0 kDa 66,0 kDa scFv + DsbC 45,0 kDa Abb. III-3.3: gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 24 h und 48 h bei 20°C (Konstrukt: pETM-82-scFv) Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2: Kontrolle ohne Induktion; Spur 3: Kontrolle ohne Induktion + 1 % Glucose; Spur 4-7: pETM-82-scFv in JB; 24 h Inkubation nach Induktion mit 40 µM; 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG; Spur 8-11: pETM-82-scFv in JB; 48 h Inkubation nach Induktion mit 40 µM; 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG Ohne Induktion mit IPTG wird kein scFv Fragment in das Kulturmedium exportiert (Abb. III3.3, Spur 2+3). Die Akkumulation an exportiertem Protein im Kulturmedium ist für das Konstrukt pETM-82-scFv nach Inkubation von 48 h größer als nach Inkubation von 24 h bei 20°C. Eine Induktion mit 40 µM und 100 µM IPTG (Abb. III-3.3, Spur 8+9) bewirkt den optimalen Export von scFv in das Kulturmedium (~500 ng/mL). Wird die IPTG-Konzentration auf 500 µM oder 1 mM erhöht (Spur 10), nimmt der Anteil an rekombinantem Protein im Kulturmedium im Vergleich zur Induktion mit 100 µM IPTG um etwa Faktor 2 ab. Eine Inkubation von 48 h bei einer Temperatur von 20°C und der Konzentration von 40-100 µM IPTG scheinen die optimalen Parameter zur bakteriellen Expression von scFv in Kombination mit dem Vektor pETM-82 im E. coli-Stamm JB zur Sezernierung rekombinanter scFv Fragmente in das Kulturmedium zu sein. Zur Optimierung der Temperatur wurden erneut JB-Zellen, die das Konstrukt pETM-82-scFv tragen, mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen induziert, sowie nach 24 h und 48 h über Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt und über SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. 85 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 97,0 kDa 66,0 kDa scFv + DsbC (53,2 kDa) 45,0 kDa Abb. III-3.4: gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 48 h und 24 h bei 20°C und 37°C (Konstrukt: pETM-82-scFv) Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2-4: pETM-82-scFv in JB; 48 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (20°C); Spur 5-7: 48 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (37°C); Spur 8-10: pETM-82-scFv in JB; 24 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (20°C); Spur 11-13: 24 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (37°C) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 66,0 kDa scFv + DsbC (53,2 kDa) 45,0 kDa Abb. III-3.5: gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 48 h und 24 h bei 20°C und 37°C (Konstrukt: pETM-82-scFv) Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2-4: pETM-82-scFv in JB; 48 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (20°C); Spur 5-7: 48 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (37°C); Spur 8-10: pETM-82-scFv in JB; 24 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (20°C); Spur 11-13: 24 h Inkubation nach Induktion mit 100 µM; 500 µM; 1000 µM IPTG (37°C) In Abb. III-3.4 wird deutlich, dass bei einer Temperatur von 37°C nach 24 h und 48 h Inkubation kaum lösliches scFv Fragment im Kulturmedium akkumuliert ist (Spur 5-7, Spur 11-13). Die Inkubation bei einer Temperatur von 20°C zeigt, dass die optimale Inkubationszeit bei 48 h liegt (Spur 2-4). Im Vergleich zu der Inkubationszeit von 24 h ist der exportierte Anteil an Targetprotein im Kulturmedium nach 48 h Inkubation mit etwa 450 ng/mL um etwa Faktor 2 größer. Der Anteil an sezerniertem Targetprotein im Kulturmedium mit etwa 450 ng/mL beträgt im Vergleich zum löslichen aufgereinigten Targetprotein aus dem Zelllysat mit etwa 3500 ng/mL (Abb. III-3.5, Spur 2) mehr als 10 %. Abb. III-3.5 bestätigt, dass die optimale Konzentration an IPTG zur Induktion von BRP und Targetprotein ≤ 100 µM beträgt (Abb. III-3.5, Spur 2). Die optimale Konzentration an IPTG zur Induktion des für BRP codierenden Vektors pJL3 und pETM-82-scFv liegt bei 40-100 µM IPTG. Wird die IPTG Konzentration weiter erhöht, äußert sich dies nicht positiv auf das sezernierte scFv Fragment im Kulturmedium. Eine unkontrollierte Induktion mit IPTG, die zur Überexpression von BRP führt, hat bei zu hoher Konzentration das 86 III Ergebnisse Lysieren der Wirtszellen zur Folge (De Graaf und Oudega, 1986). Die Menge an sezerniertem scFv nimmt aufgrund der Abnahme der Wirtszellen ebenfalls ab (siehe Abb. III-3.3, Spur 10+11). Die Erhöhung der Inkubationszeit von 24 h auf 48 h äußert sich in einem deutlichen Anstieg an sezerniertem Protein. Eine Temperaturerhöhnung von 20°C auf 37°C äußert sich negativ auf das Expressionslevel. Die Kombination von 48 h Inkubation bei einer Temperatur von 20°C mit der Induktion von 40-100 µM IPTG führt zur optimalen Expression von Targetprotein und BRP. Maltose-Bindungsprotein (MBP) Der Vektor pMAL-p2X in Abb. III-3.6 beinhaltet die malE Signalsequenz, die das Fusionsprotein (MBP-Targetprotein) durch die Cytoplasmamembran exportiert und nutzt den starken tac-Promotor sowie die Initiationssignale zur Translation von MBP, um große Mengen an Fusionsprotein zu exprimieren. MBP als Fusionsprotein verbessert die Löslichkeit von Proteinen (Kapust et al., 1999). Der Vorteil der malE Signalsequenz liegt im Export des Targetproteins in das Periplasma, in dem oxidierende Bedingungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken herrschen. Das scFv Fragment wurde zunächst stromabwärts des malE-Gens (Struktur-Gen für MBP) in den Vektor pMAL-p2X (New England Biolabs) kloniert (III.1.1), um bei der Expression in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) ein MBP-scFv Fusionsprotein zu generieren, das ins Periplasma exportiert wird. Abb. III-3.6: der Vektor pMAL-p2X Die Zellen wurden während der exponentiellen Phase mit 300 µM IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. Nach Ablauf von 20 h wurden 1,5 mL an Zellsuspension entnommen. 87 III Ergebnisse 0,2 % Glucose wurde dem Kulturmedium hinzugefügt, um die Maltose-Gene auf den Chromosomen des E. coli-Stammes zu reprimieren. Eines dieser Gene codiert für Amylase, welche die Amylose des Affinitätsharzes degradieren kann. Rekombinante Proteine aus Zelllysat wurden zunächst isoliert (II.3.3), über Amylose Harz aufgereinigt und mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 97,0 kDa scFv + MBP (70,3 kDa) 66,0 kDa Abb. III-3.7: 20 h bei 20°C nach Induktion mit 300 µM IPTG Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2-5: Zelllysat; Kontrolle + 0,2 % Glucose-Zusatz im Kulturmedium, induzierte Probe + 0,2 % Glucose im Kulturmedium; Kontrolle ohne Glucose-Zusatz, induzierte Probe ohne Glucose-Zusatz; Spur 6-9: Überstand; Kontrolle + 0,2 % Glucose-Zusatz im Kulturmedium, induzierte Probe + 0,2 % Glucose im Kulturmedium; Kontrolle ohne Glucose-Zusatz, induzierte Probe ohne Glucose-Zusatz 1 97,0 kDa 2 3 4 5 scFv + MBP (70,3 kDa) 66,0 kDa Abb. III-3.8: gereinigtes Protein aus dem Zelllysat nach 20 h bei 20°C (Induktion mit 300 µM IPTG) Spur 1: LMW-Proteinmarker; Spur 2-5: Kontrolle + 0,2 % Glucose-Zusatz im Kulturmedium, induzierte Probe + 0,2 % Glucose im Kulturmedium; Kontrolle ohne Glucose-Zusatz, induzierte Probe ohne Glucose-Zusatz MBP-scFv-Fusionsprotein wird laut Abb. III-3.7 (Spur 3+5) überexprimiert. Abb. III-3.7 (Spur 7+9) und Abb. III-3.8 (Spur 3+5) verdeutlicht, dass sich kaum lösliches MBP-scFvFusionsprotein exprimieren ließ. In der erwarteten Größe von 70,3 kDa wurde nur eine schwache Proteinbande identifiziert (Abb. III-3.8; Spur 3+5). Folglich ist es mit dem pMAL-System nicht möglich, lösliches MBP-scFv-Fusionsprotein zu exprimieren, obwohl MBP-scFv-Fusionsprotein überexprimiert wird. 88 III Ergebnisse III.4 Co-Expression von scFv mit Chaperonen Die Co-Expression mit verschiedenen Chaperon-Kombinationen soll die korrekte Faltung positiv beeinflussen und damit die Löslichkeit des scFv Fragments erhöhen. Es wurden die vier verschiedenen Chaperon-Kombinationen aus Tab. III-4.1 zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter scFv Fragmente eingesetzt. Eine Kombination von Co-Expression mit Chaperone und dem BRP-System war nicht möglich, da die Plasmide nicht kompatibel sind. Chaperon-Kombination Nr. Chaperone 1 GroELS 2 GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB 3 IbpA, IbpB 4 GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB, IbpA, IbpB Tab. III-4.1: Übersicht der eingesetzten Chaperon-Kombinationen Vektor Insert Wirt/ChaperonenKombination pETM-11 scFv pETM-11 scFv pETM-11 scFv pETM-90 scFv pETM-90 scFv pETM-80 scFv pETM-80 scFv pETM-80 scFv pETM-82 scFv pETM-82 scFv pETM-82 scFv BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 4 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 1 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 4 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 2 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 3 BL21(DE3) (Novagen) / Chaperon-Kombination Nr. 4 Antibiotika-Resistenz Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Kanamycin®; Chloramphenicol®; Spectinomycin® Ampicillin®; Kanamycin® Chloramphenicol®; Spectinomycin®; Ampicillin®; Kanamycin® Tab. III-4.2: Übersicht der eingesetzten Konstrukte mit Chaperon-Kombinationen 89 III Ergebnisse Zellen aus Tab. III-4.2 wurden während ihrer exponentiellen Phase mit 100 µM IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. Nach Ablauf von 20 h wurden 1,5 mL an Zellsuspension entnommen. Rekombinante Proteine aus Zelllysat wurden zunächst isoliert (II.3.3), über immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt und mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 97,0 kDa 66,0 kDa 45,0 kDa 30,0 kDa Abb. III-4.1: Zelllysat nach 20 h bei 20°C Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2-4: pETM-11-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 3, 4; Spur 5+6: pETM-90scFv mit Chaperon-Kombination: 1, 2; Spur 7+8: pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 4; Spur 9-11: pETM-82-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 3, 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 97,0 kDa 66,0 kDa scFv + DsbC (53,2 kDa) 45,0 kDa 30,0 kDa Abb. III-4.2: gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 20 h bei 20°C Spur 1: LMW Protein-Marker; Spur 2-4: pETM-11-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 3, 4; Spur 5+6: pETM-90scFv mit Chaperon-Kombination: 1, 2; Spur 7+8: pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 4; Spur 9-11: pETM-82-scFv mit Chaperon-Kombination: 2, 3, 4 Das Zelllysat in Abb. III-4.1 zeigt, dass scFv von allen Vektoren überexprimiert wird. In Abb. III-4.2 wir deutlich, dass eine Expression von scFv Fragmenten in Kombination mit den Vektoren pETM-11 (Spur 2-4) und pETM-90 (Spur 5+6) trotz Co-Expression von Chaperonen zu keiner Überexpression an löslichem Targetprotein führt. scFv in Kombination mit dem Vektor pETM-80 und der Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) sowie in Kombination mit pETM-82 und den Chaperon-Kombinationen Nr. 2, 3 und 4 führt zu löslichem Targetprotein (Abb. III-4.2, Spur 7, Spur 9-11). 90 III Ergebnisse Das scFv Fragment wird also mit N-terminaler DsbC-Fusion und Leadersequenz (pETM-80scFv) in das Periplasma exportiert sowie in Kombination mit dem Vektor pETM-82 für cytoplasmatische Expression mit DsbC-Fusion in löslicher Form exprimiert. Die Menge an löslichem scFv, aufgereinigt aus Zellen in denen Chaperone co-exprimiert wurden (2000 ng/mL) (Abb. III-4.2, Spur 11), war um etwa Faktor 4 größer als das aufgereinigte Protein aus Zellen ohne Co-Expression von Chaperonen (500 ng/mL) (Abb. III-3.2, Spur 11). Die Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) führt bei CoExpression mit scFv (pETM-80-scFv, pETM-82-scFv) zu löslichem Tragetprotein, was vermutlich bei dieser Kombination auf die Funktion bei der de novo Proteinfaltung, sowie auf die Auflösung von Proteinaggregationen zurückzuführen ist. scFv liess sich außerdem aus pETM-82-scFv mit den Chaperon-Kombinationen Nr. 3 (IbpA, IbpB Æ Bindung an Proteinaggregate) und Nr. 4 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB, IbpA, IbpB Æ Kombination aller verwendeten Chaperone) in löslicher Form exprimieren. Es wurden verschiedene Methoden zur Expression von löslichem scFv Fragment untersucht, um das optimale Expressionssystem zu finden. Die Kombination des Vektor pETM-82 mit scFv und dem BRP-System führte zu einem guten Expressionslevel an löslichem scFv. Die optimalen Bedingungen von 48 h Inkubationszeit bei 20°C mit einer Induktion von 100 µM IPTG führen im „small-scale“ zur Sezernierung von etwa 1 µg/mL an löslichem scFv in das Kulturmedium. Diese Vektor/Insert Kombination mit den genannten optimalen Bedingungen soll im 1 L Maßstab exprimiert werden, um genügend Material zur Überprüfung der Funktionalität des scFv Fragments in der Western-Blot Analyse zu erhalten. Die Co-Expression von scFv mit Chaperonen wies eine deutliche Verbesserung der Löslichkeit an scFv Fragment auf, und lässt daher eine positive Beeinflussung auf die korrekte Faltung des Proteins vermuten. scFv in Kombination mit dem Vektor pETM-80 mit periplasmatischer Lokalisation und DsbCFusion und Co-Expression von Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) sowie scFv in Kombination mit pETM-82 mit cytoplasmatischer Lokalisation und DsbCFusion sowie Co-Expression von Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB) sollen ebenfalls im 1 L Maßstab exprimiert werden und anschließend in der Western-Blot Analyse auf ihre Funktionalität überprüft werden. 91 III Ergebnisse III.5 Reinigung der scFv Fragmente über FPLC und Überprüfung der Funktionalität im Western-Blot Zur Überprüfung der Funktionalität der in dieser Diplomarbeit klonierten scFv Fragmente wurde ihre Reaktivität mit den entsprechenden Antigenen in der Western-Blot Analyse überprüft. scFv Fragmente von den Konstrukten pETM-82-scFv (in JB-Zellen) und pETM80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) in BL21(DE3) sowie pETM-82-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB) in BL21(DE3) wurden im Maßstab von 1 L exprimiert (II.3.1.3). Zunächst wurden die Zellkulturen von pETM-80-scFv im E. coli-Stamm BL21(DE3) sowie pETM-82-scFv im E. coli-Stamm BL21(DE3) abzentrifugiert und das Zellpellet zur Isolierung der rekombinanten Proteine aufgearbeitet (II.3.1.3). Das Kulturmedium von pETM-82-scFv in JB-Zellen wurde nach 48 h Inkubation entnommen (II.3.1.3). Rekombinante Proteine aus Zelllysat und Kulturmedium wurden zunächst isoliert und über FPLC (II.3.4.1.2) aufgereinigt. L1 L2-4 E1 E2 Abb. III-5.1: Proteinreinigung über FPLC (Induktion mit 100 µM IPTG) L1: 20 mL „Flow-Through“ nach Aufarbeitung des Zellpellets (pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2); E1: eluierte Fraktion aus pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2; L2-4: „Flow-Through“ des Kulturmediums (pETM-82-scFv) von JB-Zellen; E2: eluierte Fraktion aus Kulturmedium (pETM-82-scFv in JBZellen) E1 entspricht der Menge an Protein aus einem Gesamtvolumen von 1 L Zellsuspension. E2 entspricht der Menge an Protein aus 150 mL filtriertem Kulturmedium. In Abb. III-5.1 ist die eluierte Fraktion aus dem aufgearbeiteten Zellpellet der Kombination pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) (E1) sowie die eluierte Fraktion aus 150 mL Kulturmedium der Kombination pETM-82-scFv aus JBZellen (E2) ersichtlich. L1 in Abb. III-5.1 zeigt die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm während dem „Flow-Through“ des aufgearbeiteten Zellpellets (pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2). L2-4 in Abb. III-5.1 zeigt den „Flow-Through“ mit drei Peaks, da jeweils 50 mL filtriertes Kulturmedium (pETM-82-scFv) von JB-Zellen über die Säule gepumpt 92 III Ergebnisse wurde. Nicht-gebundene Fraktionen werden detektiert. Die Absorption bei 280 nm wurde während der Probenladung ermittelt. Erst bei einer Absorption von etwa 0,010 AU wurde mit der Elution der His-Tag-gebundenen scFv Fragmente von der Säule begonnen. Nach Elution der gebundenen Proteine von der Säule und der anschließenden Entsalzung erfolgte die Bestimmung der Proteinkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm im Spektrophotometer (GeneQuant pro), um einen Rückschluss auf die Konzentration des löslichen scFv Fragments zu ziehen. scFv aus Konstrukt Protein [mg/L Kultur] pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 0,2 (aus Zelllysat) pETM-82-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 3 0,25 (aus Zelllysat) Kulturmedium von pETM-82-scFv in JB-Zellen 0,8 Tab. III-5.1: Proteinkonzentration nach Aufreinigung über FPLC und anschließender Entsalzung scFv Fragment in 2 mL 1x PBS. Die aus dem Zellpellet isolierten Proteine (pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2) und die aus dem Kulturmedium (pETM-82-scFv in JB-Zellen) isolierten Proteine wurden mittels denaturierender, diskontinuierlicher SDS-PAGE (II.3.5) aufgetrennt. 1 2 scFv + DsbC (53,2 kDa) scFv 27,3 kDa DsbC 26 kDa Abb. III-5.2: gereinigtes Protein über FPLC (Induktion mit 100 µM IPTG) Spur 1: scFv aus pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2; Spur 2: scFv gereinigt aus Kulturmedium (pETM-82-scFv in JB-Zellen) 10 µL Probe wurden zur SDS-PAGE Analyse eingesetzt, um das scFv Fragment zu identifizieren. Die Ergebnisse sind in Abb. III-5.2 ersichtlich. Das Fragment in Spur 1 mit der Größe von 27,3 kDa entspricht vermutlich dem löslichen scFv Fragment aus pETM-80-scFv mit der ChaperonKombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB), wobei die DsbC-Fusion vermutlich 93 III Ergebnisse abgespalten wurde. In Spur 2 lässt sich eine Proteinbande in der Größenordnung von 53,2 kDa identifizieren, die der Größe des scFv Fragments in Fusion mit DsbC aus dem Kulturmedium (pETM-82-scFv in JB-Zellen) entspricht. Zur eindeutigen Identifikation wäre jedoch eine Western-Blot Analyse (II.3.6) nötig gewesen. Dieser Schritt wurde jedoch versäumt. Zur Überprüfung der Funktionalität des scFv Fragments wurde das Homogenat von Drosophila melanogaster (II.3.5.1) in diskontinuierlicher SDS-PAGE (II.3.5) aufgetrennt und in der Western-Blot Analyse (II.3.6) auf eine PVDF-Membran transferiert. Das rekombinante scFv Fragment wurde als Primärantikörper eingesetzt. Die Visualisierung der Proteinbanden erfolgte nach Inkubation mit dem Sekundärantikörper anti-HIS HRP-conjugated (Amersham Biosciences). Zur Detektion wurde das ECL+PLUS Western-Blotting detection system (Amersham Biosciences) verwendet. Die Visualisierung erfolgte durch Exposition eines Röntgenfilms. a) b) c) 97,0 kDa 66,0 kDa 45,0 kDa 30,0 kDa 30,0 kDa 20,1 kDa Abb. III-5.3 a): Western-Blot Analyse von löslichem scFv Fragment Spur 1: scFv aus pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 (1:1000 verdünnt); Spur 2: scFv gereinigt aus Kulturmedium (pETM-82-scFv in JB-Zellen) (1:10 verdünnt) Abb. III-5.3 b): SDS-PAGE von Homogenat: Drosophila melanogaster Spur 1: 1:5 verdünnt; Spur 2: 1:2,5 verdünnt Abb. III-5.3 c): LMW Protein-Marker Abb. III-5.3 a) zeigt das Ergebnis der Western-Blot Analyse des scFv Fragments. scFv aus dem Zelllysat der Kombination pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 (Spur 1) weist in der Western-Blot Analyse das gleiche Muster wie scFv aus dem Kulturmedium der Kombination pETM-82-scFv in JB-Zellen (Spur 2) auf. Mehrere Proteinbanden in der Größenordnung 30-35 kDa und 65-95 kDa wurden visualisiert. Das Targetprotein des scFv Fragments, die größte 94 III Ergebnisse Untereinheit von RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster (215 kDa), wurde in der Western-Blot Analyse jedoch nicht identifiziert. Das scFv Fragment scheint trotzdem spezifisch Proteine aus dem Homogenat von Drosophila melanogaster zu erkennen und ging vermutlich keine unspezifischen Bindungen ein, da die großen Proteinbanden aus SDS-PAGE ( ) in der Western-Blot Analyse nicht detektiert wurden. Eine Verdünnung des scFv Fragments von 1:1000 führte zu einer ausreichenden Detektion im Western-Blot. scFv Fragmente aus pETM-82 mit der Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB) wies in der Western-Blot Analyse (Daten nicht dargestellt) das identische Muster wie in Abb. III-5.3 a) auf. Eine Erklärung könnte sein, dass die als Nebenbanden erkennbaren Proteinfragmente, die bei der Western-Blot Analyse detektiert wurden, durch proteolytischen Abbau der RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster entstanden sind. Die Messung der Aggregationsrate am Fluorimeter (Nominé et al., 2001) weist darauf hin, dass die scFv Fragmente zur Aggregation neigen. Für das aufgereinigte scFv Fragment aus dem Kulturmedium betrug der Messwert 7,231, der einer hohen Aggregation entspricht. Im Gegensatz dazu hatte aus scFv Fragment von pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination einen Wert von 1,421, der auf eine geringe Aggregation hinweist. Die scFv Fragmente aggregieren zum Teil, wobei die Messwerte von aufgereinigtem scFv Fragment aus Kulturmedium und dem Konstrukt pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination verschieden sind. Die co-exprimierten Chaperone bewirken auch hier einen positiven Effekt auf die Faltung. III.6 Fusion von scFv mit Alkalischer Phosphatase Ziel der Klonierung des scFv Fragments als Fusionsprotein mit Alkalischer Phosphatase aus E. coli (III.1.1) war die Generierung eines Konstruktes, das als immunologisches Tool in der Molekularbiologie dient (Anwendung im Western-Blot, im ELISA („enzyme linked immuno sorbent assay“), molekulare Krebsdiagnostik usw.). Da das scFv Fragment direkt mit Alkalische Phosphatase fusioniert ist, die die Indikatorreaktion katalysiert und somit die spezifische Bindung durch Färbung der PVDF-Membran anzeigt, entfällt die Inkubation mit einem Sekundärantikörper in der Western-Blot Analyse sowie bei der Durchführung eines ELISAs. Alkalische Phosphatase dient in der molekularen Krebsdiagnostik als Tumorassoziierter Marker, der zu Diagnostik und Verlaufskontrolle einer Krebserkrankung herangezogen werden kann (Dingermann, 1999). 95 III Ergebnisse Das Alkalische Phosphatase-scFv-Fusionsprotein wurde in folgende E. coli-Stämme aus Tab. III-6.1 transformiert. Konstrukt Wirt pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv BL21(DE3) pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv Origami (DE3) Tab. III-6.1: Übersicht der Alkalische Phosphatase-scFv Konstrukte Zellen wurden während der exponentiellen Phase mit 100 µM IPTG induziert und somit die Expression eingeleitet. Nach Ablauf von 20 h wurden 1,5 mL an Zellsuspension entnommen. Rekombinante Proteine aus Zelllysat wurden zunächst isoliert (II.3.3), über Metallionenaffinitätschromatographie (II.3.4.1.1) aufgereinigt und mit Hilfe von SDS-PAGE (II.3.5) verglichen. 1 2 3 4 5 6 7 97,0 kDa 66,0 kDa Alkalische Phosphatase + scFv (78,9 kDa) 45,0 kDa 30,0 kDa Abb. III-6.1: Konstrukt pETM-13-Alkalische Phosphatase scFv Spur 1: Zelllysat aus Konstrukt in BL21(DE3); Spur 2: Zelllysat aus Konstrukt in Origami (DE3); Spur 3: Überstand aus Konstrukt in BL21(DE3); Spur 4: Überstand aus Konstrukt in Origami (DE3); Spur 5: gereinigtes Protein aus Konstrukt in BL21(DE3); Spur 6: gereinigtes Protein aus Konstrukt in Origami (DE3); Spur 7: LMW-Proteinmarker Ausschließlich in Spur 1 in Abb. III-6.1 ließ sich überexprimiertes Protein in der Größe des Fusionsproteins Alkalische Phosphatase-scFv von 78,9 kDa identifizieren. Trotzdem war es nicht möglich, in den E. coli-Stämmen BL21(DE3) (Novagen) und Origami (DE3) (Novagen), obwohl dieser als Doppelmutante in Thioredoxin-Reduktase (trxB) und Glutathion-Reduktase (gor) die Löslichkeit von rekombinanten Proteinen mit Disulfidbrücken erhöhen kann, lösliches Fusionsprotein zu exprimieren (Spur 3-6). Aus zeitlichen Gründen war es nicht möglich, das BRP-System, oder die Co-Expression mit den Chaperon-Kombinationen auf die Expression des Fusionsproteins Alkalische Phosphatase-scFv anzuwenden, um die Löslichkeit zu verbessern und die Funktionalität in der Western-Blot Analyse zu überprüfen. 96 III Ergebnisse III.7 Screening-Optimierung Das exprimierte rekombinante Protein kann effizient aufgereinigt werden, wenn durch Genfusion eine kurze, C- oder N-terminale Peptiddomäne (Tag) angefügt wurde, die eine Reinigung mittels immobilisierter Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht. Das Prinzip basiert auf der reversiblen Interaktion zwischen Aminosäure-Seitenketten und immobilisierten Metallionen. Abhängig vom immobilisierten Metallion können verschiedene Seitenketten in den Absorptionsprozess involviert werden. Vor allem Histidin-, Cystein- und Tryptophan-Seitenketten sind an der Bindung zu immobilisierten Metallionen beteiligt (Sulkowski, 1985; Hemdan und Porath, 1985 a+b); Zhao et al., 1991). Die Elution rekombinanter Proteine mit His-Tag von der Säule erfolgt durch Zugabe von Imidazol, welches das Poly-Histidin-Tag-enthaltende Protein kompetitiv aus dem Komplex verdrängt. Die Optimierung der Proteinexpression wurde durch Screening des löslichen Proteinertrages aus verschiedenen Vektor/Zell-Kombinationen getestet. Die Ergebnisse aus dem Screening müssen zuverlässig sein, d.h. falsch positive Ergebnisse müssen vermieden werden, und eine gute Bindungsaktivität der rekombinanten Proteine muss gegeben sein. Eine automatisierte Methode konnte im Vergleich zur manuellen Methode bei gleichen Bedingungen die Qualität des Screenings verbessern. Weitere Vorteile der Automatisierung liegen in der Geschwindigkeit der Probenaufarbeitung und der Probenanzahl, die in einem Probendurchlauf (15 Proben/Lauf) abgearbeitet werden. Es wurde die Möglichkeit genutzt, verschiedene Materialien und Techniken zu vergleichen, um die Screening-Technologie zu optimieren, auch wenn die Möglichkeit, dieses Wissen in dieser Diplomarbeit anzuwenden, aus zeitlichen Gründen nicht mehr gegeben war. Zur Optimierung des Screening-Verfahrens exprimierter rekombinanter Proteine wurden in dieser Diplomarbeit folgende Parameter untersucht: 97 III Ergebnisse a) b) Harz verschiedener Hersteller - Dynabeads® TALONTM Harz (Dynal Biotech) (magnetisch) - His BindTM Magnetic Agarose Harz (Novagen) - Ni-NTA Magnetic Agarose Harz (Quiagen) - TALONTM Metallaffinitätsharz (BD Biosciences, Clontech) manuelle Methode im Vergleich zur automatisierten Methode mit KingFisher® instruments (Thermo Electron Corporation) (II.3.4.1.1) c) Pufferzusammensetzung für magnetisches Harz (siehe Tab. III-7.1) Extraktionspuffer Waschpuffer 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 500 mM NaCl 15 mM Imidazol 15 mM Imidazol 0,04 % Triton®-X 0,04 % Triton®-X 10 mM MgCl2 1 mg/mL Lysozym 2 µg/mL DNAse Extraktionspuffer (modifiziert) Waschpuffer (modifiziert) 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 25 mM Kaliumphosphat pH 7,8 500 mM NaCl 500 mM NaCl 20 mM Imidazol 20 mM Imidazol 0,01 % Tween®-20 0,01 % Tween®-20 10 % Glycerin 10 % Glycerin 10 mM MgCl2 1 mg/mL Lysozym 2 µg/mL DNAse Tab. III-7.1: Puffer-Zusammensetzung 98 III Ergebnisse Bei der Optimierung der Screening-Technologie wurden - die Proteine 24b4c (AL136738) und RAB6 interacting protein 1 (Homo sapiens) (XP_290550), exprimiert im E. coli-Stamm BL21 (Novagen) (II.3.1.1), aus Zelllysat - sowie das scFv Fragment aus dem Konstrukt pETM-82-scFv, exprimiert in BL21(DE3) (Novagen) (II.3.1.1), aus Kulturmedium eingesetzt. Als Nullprobe diente der E. coli-Stamm BL21 (Novagen) ohne Konstrukt, um die unspezifische Affinität bakterieller Proteine zu dem Harz zu überprüfen. Die Zelllysate mit dem Protein 24b4c (AL136738) und RAB6 interacting protein 1 (Homo sapiens) (XP_290550) von jeweils 1,5 mL Zellsuspension nach 20 h Inkubation sowie das Kulturmedium mit scFv nach 48 h Inkubation wurden im anschließenden ScreeningVerfahren auf das Vorhandensein von rekombinanten Proteinen untersucht (II.3.4.1.1). Mit der Nullprobe BL21 (Novagen) ohne Konstrukt wurde ebenso verfahren. Das Zelllysat des Proteins 24b4c wurde direkt (Spur 2 in Abb. III-7.1) sowie abzentrifugiert (Æ Überstand wie in II.3.4.1.1 beschrieben, Spur 3+4) eingesetzt. Protein 24b4c wurde in einem Fall (zum Vergleich mit der Elution in Waschpuffer und anschließender Aufnahme in 2x SDS Probenpuffer) direkt in 40 µL 2x SDS Probenpuffer eluiert (Spur 4 in Abb. III.7.1). Die Ergebnisse sind in Abb. III-7.1 abgebildet. 99 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Abb. III-7.1: gereinigtes Protein Spur 1: LMW-Proteinmarker Spur 2: Zelllysat 24b4c Spur 3: 24b4c Spur 4: 24b4c in 2x Probenpuffer Dynabeads® TALONTM Harz Spur 5: Nullprobe (BL21) Spur 6: RAB6 interacting protein 1 Spur 7: 24b4c Dynabeads® TALONTM Harz Spur 8: Nullprobe (BL21) Spur 9: RAB6 interacting protein 1 Spur 10: 24b4c TALONTM Metallaffinitätsharz Spur 11: Nullprobe (BL21) Spur 12: RAB6 interacting protein 1 Spur 13: 24b4c Dynabeads® TALONTM Harz automatisierte Methode manuelle Methode Spur 2 in Abb. III-7.1, die dem Zelllysat (ohne vorheriger Zentrifugation) des Proteins 24b4c entspricht, weist eine schlechte Selektivität im Vergleich zu Spur 3, dem Überstand der identischen Probe nach der Zentrifugation, auf. Aufgrund der Anwesenheit von Nukleinsäuren ist das Zelllysat klebrig. Daher ist bei Einsatz von Zelllysat in der automatisierten Methode eine gute Waschung des Harzes nicht mehr gegeben. Es treten zu viele unspezifische Bindungen auf. Der Hintergrund der automatisierten Methode ist vergleichbar mit dem der manuellen Methode (Spur 5-7 im Vergleich zu Spur 11-13). Es werden unspezifisch Proteine gebunden. Die Bindungsaffinität bakterieller Proteine ist jedoch wesentlich geringer als bei Einsatz des Zelllysats ohne vorherige Zentrifugation (Spur 2). Das Dynabeads® TALONTM Harz (Spur 12+13) scheint mehr Targetprotein binden zu können als TALONTM Metallaffinitätsharz (Spur 9+10). Zusammen mit der erhöhten Bindungsaffinität bindet es jedoch auch einen größeren Anteil kontaminierender Proteine. Bei der Benutzung von nicht-magnetischem Harz, wie 100 III Ergebnisse TALONTM Metallaffinitätsharz, geht vermutlich auch ein Teil an Harz gebundenes, rekombinantes Protein durch Abnahme des Überstandes mittels Pipette verloren. Das Dynabeads® TALONTM Harz der Firma Dynal wurden mit dem Ni-NTA Magnetic Agarose Harz der Firmen Quiagen und dem His BindTM Agarose Harz der Firma Novagen in der automatisierten Methode mit KingFisher® instruments (Thermo Electron Corporation) verglichen. Die Ergebnisse sind in Abb. III-7.2 dargestellt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Abb. III-7.2: gereinigtes Protein aus dem Überstand nach Zentrifugation des Zelllysats Spur 1: LMW-Proteinmarker Spur 2: Nullprobe (BL21) Spur 3: RAB6 interacting protein 1 Spur 4: 24b4c Ni-NTA Magnetic Agarose Harz (Quiagen) Spur 5: Nullprobe (BL21) Spur 6: RAB6 interacting protein 1 Spur 7: 24b4c His BindTM Magnetic Agarose Harz (Novagen) Spur 8: Nullprobe (BL21) Spur 9: RAB6 interacting protein 1 Spur 10: 24b4c Dynabeads® TALONTM Harz (Dynal Biotech) Spur 11: Nullprobe (BL21) Dynabeads® TALONTM Harz Spur 12: RAB6 interacting protein 1 (Dynal Biotech) Spur 13: 24b4c nicht modifizierter Puffer modifizierter Puffer Das Ni-NTA Magnetic Agarose Harz der Firma Quiagen weist in Abb. III-7.2 (Spur 2-4) den geringsten Hintergrund auf. Das Harz bindet sehr spezifisch die mit dem His-Tag versehenen rekombinanten Proteine. Ähnlich verhält sich das Dynabeads® TALONTM Harz der Firma Dynal Biotech in Spur 8-13. In diesem Fall wird mehr Targetprotein aufgereinigt und der Hintergrund ist geringfügig stärker. Es werden unspezifisch bakterielle Proteine aus der Probe gebunden. Das 101 III Ergebnisse Ni-NTA Magnetic Agarose Harz der Firma Quiagen in Spur 3+4 scheint weniger Targetprotein binden zu können, und die geringere Menge an unspezifischen Bindungen im Vergleich zu dem Harz der Firma Dynal (Dynabeads® TALONTM Harz) ist vermutlich ein Verdünnungseffekt. Der modifizierte Puffer verbessert die totale Bindungsaffinität, folglich können mehr unspezifische Bindungen beobachtet werden (Spur 12+13). Dieser Effekt scheint jedoch Protein-spezifisch und nicht Harz-spezifisch zu sein ( ). Einige Proteinbanden korrelieren mit einem spezifischen Targetprotein und erhöhen ihre Intensität, wenn mehr Targetprotein gebunden ist ( ). Es wird vermutet, dass der Grad der Kontamination von der Effizienz der Zelllyse abhängt. Das gleiche Aufreinigungsprotokoll wurde angewandt für das Material in Abb. III-7.1 (Spur 5-7) und in Abb. III-7.2 (Spur 8-10). Der Anteil unspezifischer Bindungen ist jedoch in Abb. III-7.1 (Spur 5-7) wesentlich höher als in Abb. III-7.2 (Spur 8-10) trotz identischer Probenaufarbeitung. Einen schlechten Hintergrund und die schlechteste Bindungskapazität weist das His BindTM Magnetic Agarose Harz der Firma Novagen in Spur 5-7 auf. In einem dritten Versuch wurde zentrifugiertes und nicht-zentrifugiertes Kulturmedium eingesetzt, um den Waschvorgang des Dynabeads® TALONTM Harzes (Dynal Biotech) in der manuellen und automatisierten Methode sowie des TALONTM Metallaffinitätsharzes (BD Biosciences, Clontech) in der manuellen Methode zu überprüfen. Das nicht-zentrifugierte Kulturmedium enthielt keine Zellkomponenten mehr, jedoch präzipitierte Proteine nach der Lagerung des abzentrifugierten Kulturmediums bei -20°C. Die Ergebnisse sind in Abb. III7.3 dokumentiert. 102 III Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 Abb. III-7.3: gereinigtes Protein aus dem Kulturmedium Spur 1: LMW-Proteinmarker Spur 2: 0,5 mL Kulturmedium Spur 3: 0,5 mL Kulturmedium (zentrifugiert) KingFisher® instruments Spur 4: 0,5 mL Kulturmedium Spur 5: 0,5 mL Kulturmedium (zentrifugiert) TALONTM Metallaffinitätsharz Spur 6: 0,5 mL Kulturmedium Spur 7: 0,5 mL Kulturmedium (zentrifugiert) Dynabeads® TALONTM Harz manuelle Methode Das Dynabeads® TALONTM Harz erzielt in der automatisierten Methode in Abb. III-7.3 (Spur 2+3) im Vergleich zur manuellen Methode (Spur 6+7) vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf die Bindung des Targetproteins. Der Hintergrund bei der manuellen Methode ist jedoch stärker, was eventuell auf die Effizienz der Waschung des Harzes zurückzuführen ist. Der anschließende Waschschritt des nicht-magnetischen TALONTM Metall Affinitätsharzes nach Bindung des rekombinanten Proteins lässt sich nur unzureichend durchführen. Präzipitierte Proteine aus dem Kulturmedium konnten nicht eliminiert werden (Spur 4). Präzipitiertes rekombinantes Protein wurde somit auf SDS-PAGE in Abb. III-7.3 in Spur 4 detektiert und ergibt ein falsch positives Ergebnis. Die Anwendung magnetischer Partikel gewährleistet eine wesentlich gründlichere Waschung des Harzes. Ausschließlich lösliches rekombinantes Protein wird gebunden. 103 III Ergebnisse Schlussfolgerung: Das Dynabeads® TALONTM Harz der Firma Dynal liefert gute Ergebnisse trotz der Affinität einiger spezifischer bakterieller Proteine, die durch Sättigung der Harzoberfläche unterbunden werden kann. Das Zelllysat sollte vor Inkubation mit dem Harz zentrifugiert werden, um zu viele unspezifische Bindungen zu vermeiden. Die automatisierte Proteinaufarbeitung mit KingFisher® instruments und die manuelle Methode mit dem Dynabeads® TALONTM Harz liefern vergleichbare Ergebnisse. KingFisher® instruments vermeidet falsch positive Ergebnisse im Falle hochaggregierter und im Medium akkumulierter Proteine aufgrund des effizienteren Waschschrittes (Abb. III-7.3). 104 IV Diskussion IV DISKUSSION Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Systeme untersucht, um die Löslichkeit rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken, die in Escherichia coli exprimiert werden, zu verbessern. Dazu wurde das „single-chain“ Antikörperfragment (scFv) mit der Ausbildung von zwei Disulfidbrücken in der aktiven dreidimensionalen Struktur gewählt, in verschiedene Vektorsysteme kloniert, in E. coli exprimiert, und seine Funktionalität in der Western-Blot Analyse überprüft. Ein spezifisches Ziel war die Konstruktion eines Fusionsproteins von scFv mit Alkalischer Phosphatase mit der Absicht, ein wichtiges immunologisches Tool in der Molekularbiologie zu generieren, dass z.B. in der Western-Blot Analyse und bei der Durchführung eines ELISAs die Inkubation eines Sekundärantikörpers überflüssig macht. Das Problem der Expression intrazellulärer scFv Fragmente in E. coli besteht in der mangelnden Disulfidbrückenausbildung im Cytoplasma, wo reduzierende Bedingungen vorherrschen, die der Disulfidbrückenausbildung im rekombinanten Protein entgegenwirken. Im Cytoplasma von E. coli Wild-Typ Zellen liegen scFv Fragmente somit im reduzierten und ungefalteten Zustand vor, wobei ihre Faltung im Periplasma mit oxidierender Umgebung von der DsbA-Aktivität abhängt. Das Thioredoxin- und Glutaredoxin-System sind an der Aufrechterhaltung dieses reduzierenden Redoxzustandes beteiligt, um den katalytischen Zyklus cytoplasmatischer Enzyme durch Reduktion ihrer Disulfidbrücken zu vervollständigen. Mögliche Strategien, um die Ausbildung von Disulfidbrücken zu ermöglichen, sind a) der Export des Targetproteins ins Periplasma mit oxidierender Umgebung durch Addition einer Leadersequenz in Form eines Signalpeptids an den N-Terminus des Proteins, b) die Wahl einer E. coli-Doppelmutante in Thioredoxin-Reduktase (trxB) und Glutathion-Reduktase (gor) zur Modifizierung des Redoxzustandes im Cytoplasma, c) die Co-Expression des Targetproteins mit Chaperonen oder Chaperon-Kombinationen, die unterstützend in die Faltung des Targetproteins zum Erhalt der funktionellen dreidimensionalen Struktur eingreifen und d) die Fusion mit zelleigenen Proteindomänen, die einen positiven Effekt auf die Löslichkeit heterologer Proteine zeigen, da sie z.B. im Fall der Fusion mit DsbA oder DsbC Einfluss auf die Disulfidbrückenausbildung im Targetprotein nehmen können Es wurden verschiedene Methoden untersucht, um die Löslichkeit rekombinanter Proteine mit Disulfidbrücken in E. coli zu verbessern. Durch die Co-Expression von Bacteriocinfreisetzendem Protein (BRP) kommt es zur Aktivierung der in der äußeren Cytoplasmamembran lokalisierten Phospholipase A, die zur Freisetzung von Colicin führt, welches für die Bildung 105 IV Diskussion permeabler Zonen in der äußeren Cytoplasmamembran verantwortlich ist. Periplasmatische und cytoplasmatische Proteine können diese permeablen Zonen passieren und im Kulturmedium akkumulieren. Das System des Bacteriocin-freisetzenden Proteins (BRP) wurde zuvor mit Modellproteinen zur Überprüfung der Funktionalität des BRP-Systems, Proteine in das Kulturmedium zu exportieren, untersucht. Die korrekte Ausbildung der zwei Disulfidbrücken des scFv Fragments sollte anschließend nach Co-Expression von BRP und Export von scFv in das Kulturmedium überprüft werden. Ein Vorversuch mit einem im Periplasma lokalisierten Protein (Fringe Glycosyltransferase (Q24342)) und einem im Cytoplasma lokalisierten Protein (DKFZp564F2122 (AL136604)) definierte die optimalen Wachstumsbedingungen von 20 h bei 37°C, wobei die optimale Konzentration an IPTG zur Induktion bei der im Periplasma lokalisierten Fringe Glycosyltransferase bei 500 µM und bei dem im Cytoplasma befindlichen Protein DKFZp564F2122 bei 100 µM IPTG lag, die zu einer optimalen Produktion an Targetprotein und zu einem effizienten Export des Targetproteins durch BRP in das Kulturmedium führt, ohne schädlichen Einfluss auf die Wirtszellen zu nehmen. Der Export an löslicher Fringe Glycosyltransferase im „small-scale“ betrug bei einer Konzentration von 500 µM IPTG zur Induktion der Expression mit 1 µg/mL Kultur etwa 6 % des gesamten, exprimierten, löslichen Targetproteins. Das in das Kulturmedium exportierte Protein DKFZp564F2122, induziert mit 100 µM IPTG im „small-scale“, wurde mit einer Konzentration von 0,8 µg/mL in SDS-PAGE nachgewiesen, was etwa 90 % des gesamten, exprimierten, löslichen Targetproteins entsprach. Es konnte ein so hoher Prozentsatz an löslichem Targetprotein in das Kulturmedium exportiert werden, da das rekombinante Protein fast nur in löslicher Form im Cytoplasma der Zelle exprimiert wurde. Diese Kulturbedingungen wurden für die Serinprotease-4 als weiteres Modellprotein mit sieben Disulfidbrücken in der dreidimensionalen Struktur angewandt, um diese in das Kulturmedium mit Hilfe des Bacteriocin-freisetzenden Proteins zu exportieren. Da die Ergebnisse des Vorversuchs mit dem im Cytoplasma lokalisierten rekombinanten Protein DKFZp564F2122 bestätigen, dass die optimale Konzentration 100 µM IPTG betrug, wurde ebenso die Freisetzung der Serinprotease-4 bei cytoplasmatischer Expression mit 100 µM bei einer Inkubationszeit von 20 h bei 37°C durchgeführt. Ausschließlich die Expression der Serinprotease-4 in Kombination mit dem Vektor pGEX-6P-1 und der Kombination pBADM-20 in BL21(DE3)-Zellen mit pJL3, codierend für BRP, ermöglichte den Export löslicher Serinprotease-4 in das Kulturmedium, den die Western-Blot Analyse bestätigte. Die Thioredoxin A –Fusion mit dem Targetprotein von pBADM-20 führte 106 IV Diskussion zur Expression löslicher Serinprotease-4 im Gegensatz zu den anderen untersuchten Vektorsystemen, in denen die Produktion löslicher Serinprotease-4 nicht gegeben war. Obwohl der verwendete E. coli-Stamm BL21(DE3) nicht araBADC- ist und damit Arabinose, mit der die Expression induziert wurde, abgebaut wurde, führte das geringe Expressionsniveau zu löslichem Targetprotein. Die Faltung des rekombinanten Proteins wurde vermutlich durch das geringe Expressionslevel in dieser Vektor/Stamm-Kombination ermöglicht. Der tac-Promotor in pGEX6P-1 mit seiner hohen Transkriptionseffizienz stellte das beste Vektorsystem zur Expression löslicher Serinprotease in Kombination mit dem BRP-System dar. Zur Überprüfung der Expression löslicher Serinprotease-4 wurde ein Ansatz von 100 mL über eine Chromatographie-Säule aufkonzentriert. In einem zweiten Versuch wurde die gleiche Menge an Kulturmedium über eine Dialyse-Membran aufkonzentriert. Der sehr geringe Anteil löslicher Serinprotease-4 im Kulturmedium scheint bei einer Flussrate von 1 mL/min nicht an das Harz in der Chromatographie-Säule gebunden zu haben. Ausschließlich aus dem Versuch mit Aufkonzentrierung über Dialyse-Membran ließ sich lösliche Serinprotease-4 in der WesternBlot Analyse detektieren. Das Signal wurde bei einem Molekulargewicht von 40,1 kDa detektiert, was zu der Vermutung führt, dass der GST-Tag der Serinprotease-4 aus pGEX-6P-1Ser-4 sowie die Thioredoxin-Fusion der Serinprotease-4 aus pBADM-20-Ser-4 abgespalten wurden, was laut Absprache mit Dr. Ario de Marco (EMBL, Heidelberg) häufig beobachtet wird. Serinprotease-4 aus dem Vektor pGEX-6P-1 konnte mit der erwarteten Größe von 65,1 kDa in einer weiteren Western-Blot Analyse im Kulturmedium ohne Aufkonzentrierung über DialyseMembran nachgewiesen werden. Es war somit möglich, lösliche, rekombinante Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae mit CoExpression des Bacteriocin-freisetzenden Proteins im Kulturmedium von E. coli zu akkumulieren. Zur Überprüfung der Funktionalität löslicher Serinprotease-4 wurde ein Aktivitätstest durchgeführt, in dem BSA als Substrat gewählt wurde, da das spezifische Substrat der Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae nicht bekannt ist. Der Aktivitätstest der löslichen Serinprotease-4 fiel mit BSA als Substrat negativ aus. Die Expression löslicher Serinprotease-4 im Baculovirus, einem eukaryotischen Expressionssystem, dessen Vorteil darin besteht, dass viele mit diesem Expressionssystem produzierte, heterologe Proteine die korrekten posttranslationalen Modifikationen aufweisen, führte ebenso zu einem negativen Ergebnis im Aktivitätstest. Möglicherweise entspricht das gewählte Substrat nicht dem spezifischen Substrat der Serinprotease-4, oder es wird zusätzlich ein Cofaktor zum Abbau des Substrates benötigt. Eine weitere Möglichkeit besteht in der nicht korrekten Ausbildung der dreidimensionalen, funktionellen Struktur der Serinprotease-4. Modifikationen aus vorangegangenen Versuchen wie die Co-Expression von Chaperonen oder Akkumulation im Periplasma, die entweder zu einer 107 IV Diskussion Verbesserung der Faltung oder zur Ausbildung von Disulfidbrücken führen sollen, führten ebenso zu keiner Protease-Aktivität von Serinprotease-4. Die Ergebnisse aus dem Vorversuch mit Fringe Glycosyltransferase und dem Protein DKFZp564F2122 sowie der Serinprotease-4 wurden eingesetzt, um die Expression von scFv Fragmenten, die zwei Disulfidbrücken in ihrer dreidimensionalen Struktur haben, in E. coli zu optimieren. Die scFv Fragmente wurden zunächst in einem Screening auf ihre Löslichkeit getestet. Die ideale Kombination wurde anschließend nach Produktion im „large-scale“ auf ihre Funktionalität überprüft. Zur Gewinnung von löslichen scFv Fragmenten wurde der E. coli-Stamm JB (BL21(DE3) + pJL3) mit den Konstrukten pETM-11-scFv, pET-20b(+)-scFv, pETM-90-scFv, pETM-80-scFv und pETM-82-scFv transformiert, um die Freisetzung des scFv Fragments in das Kulturmedium durch Co-Expression von BRP zu initiieren. Die bakterielle Expression im E. coli-Stamm BL21(DE3) (Novagen) ergab, dass scFv ausschließlich in Kombination mit den Vektoren pETM-80 und pETM-82 zu löslichem Targetprotein führte. Die generierte DsbC-Fusion mit dem Targetprotein in beiden Vektoren zeigte einen positiven Effekt auf die Löslichkeit rekombinanter Proteine. Ausschließlich in Kombination mit pETM-82 wurden lösliche scFv Fragmente in das Kulturmedium exportiert. Dabei scheinen die Inkubation von 48 h bei einer Temperatur von 20°C und der Konzentration von 40-100 µM IPTG die optimalen Parameter zur Expression von löslichen scFv Fragmenten in Kombination mit dem Vektor pETM-82 in dem E. coli-Stamm JB zur Sezernierung rekombinanter scFv in das Kulturmedium zu sein. Obwohl vermutet wurde, dass im Periplasma lokalisierte Proteine durch Einsatz des BRP-Systems leichter in das oxidierende Kulturmedium exportiert werden, ist dies mit dem Vektor pETM-80 mit Leadersequenz zum Transport ins Periplasma und DsbC-Fusion nicht der Fall. Eine weitere Methode zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter Proteine in E. coli stellte die Co-Expression mit Chaperon-Kombinationen dar. Diese Methode soll die korrekte Faltung positiv beeinflussen und damit die Löslichkeit des scFv Fragments erhöhen. Es wurden vier verschiedene Chaperon-Kombinationen eingesetzt: (1) GroELS (Funktion bei der de novo Proteinfaltung); (2) GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB (Funktion bei der de novo Proteinfaltung und Auflösung von Proteinaggregation); (3) IbpA, IbpB (Bindung an Proteinaggregate, um diese in Lösung zu halten); (4) GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB, IbpA, IbpB (Kombination aller verwendeten Chaperone). Eine Expression von scFv Fragmenten von den Vektoren pETM-11 und pETM-90 führte jedoch trotz Co-Expression von Chaperonen zu keiner Überexpression an löslichem Targetprotein. Die Fusion mit DsbC (pETM-80), lokalisiert im Periplasma, und der 108 IV Diskussion Chaperon-Kombination (2) sowie die cytoplasmatische Fusion mit DsbC (pETM-82) und den Chaperon-Kombinationen (2), (3) und (4) erzielte mit Induktion von 100 µM IPTG eine höhere Produktion an löslichem Targetprotein. Das scFv Fragment wird also mit N-terminaler DsbC- Fusion und unabhängig von einer Leadersequenz (pETM-80 und pETM-82) in löslicher Form exprimiert. Eine Fusion mit MBP und der Export in das Periplasma führte nicht zu löslichem Targetprotein. Zur Charakterisierung der klonierten scFv Fragmente, d.h. zur Überprüfung ihrer Größe und ihrer Funktionalität in der Western-Blot Analyse, wurde lösliches scFv Fragment durch Anwendung des BRP-Systems mit Export des Targetproteins in das oxidierende Kulturmedium sowie durch Co-Expression von scFv mit Chaperonen im „large-scale“ exprimiert. Dazu wurden die geeigneten Kombinationen aus den Versuchen mit dem BRPSystem und der Co-Expression von scFv mit Chaperonen gewählt. Rekombinante Proteine aus dem Kulturmedium (pETM-82-scFv in JB-Zellen) und aus den Zellpellets der Konstrukte pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) in BL21(DE3) sowie pETM-82-scFv mit Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB) in BL21(DE3) wurden isoliert und über FPLC gereinigt. Anhand dieser Methoden zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter scFv Fragmente war es möglich, aus dem scFv-Konstrukt pETM-82-scFv in JB-Zellen 0,8 mg scFv/L Kultur in das Kulturmedium zu exportieren, sowie 0,2 mg scFv/L Kultur von dem Konstrukt pETM-80scFv und Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB) in BL21(DE3) und 0,25 mg scFv/L Kultur von dem Konstrukt pETM-82-scFv und Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB) in BL21(DE3) in löslicher Form zu erhalten. In abschließenden Untersuchungen konnten die Bindungsspezifitäten der klonierten scFv Antikörperfragmente zu der größten Untereinheit (215 kDa) von RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster nachgewiesen werden. In der Western-Blot Analyse mit anschließender His-Tag Immunreaktion konnte nachgewiesen werden, dass das scFv Fragment spezifisch Proteine aus dem Homogenat von Drosophila melanogaster zu erkennen scheint. Das Antigen (215 kDa) konnte aber nicht identifiziert werden. Die detektierten Proteinbanden scheinen spezifisch zu sein, da das scFv Fragment Proteinfragmente erkennt und bindet, die nur schwach vertreten sind. Dies führt zu der Vermutung, dass die RNA-Polymerase II degradiert wurde und die erkannten Nebenbanden den Proteinfragmenten der RNAPolymerase II durch proteolytischen Abbau entsprechen. Auch nach Verdünnung des scFv Fragments von 1:1000 war eine ausreichende Detektion im Western-Blot möglich. Das scFv 109 IV Diskussion Fragment aus den Zellen, transformiert mit pETM-82 und der Chaperon-Kombination Nr. 3 (IbpA, IbpB), und mit pETM-80 und der Chaperon-Kombination Nr. 2 (GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, ClpB, IbpA, IbpB) sowie aus dem Kulturmedium der Zellen, transformiert mit pETM-82scFv, wiesen in der Western-Blot Analyse ein identisches Muster auf. Der Messwert am Fluorimeter zur Bestimmung der Aggregationsrate aufgereinigter scFv aus dem Kulturmedium lag mit 7,231 um Faktor 5 höher als das aufgereinigte scFv aus dem Konstrukt pETM-80-scFv mit Chaperon-Kombination GroELS, DnaK, DnaJ, GrpE, und ClpB mit der Aggregationsrate von 1,421. Ein hoher Wert in der Aggregationsrate entspricht einer hohen Aggregation. Die co-exprimierten Chaperone zeigen einen positiven Effekt auf die Faltung rekombinanter scFv Fragmente. Die Expression des klonierten Alkalischen Phosphatase-scFv Fusionsproteins in dem E. coliStamm BL21(DE3) war erfolgreich. Überexprimiertes Protein in der erwarteten Größe von 78,9 kDa konnte mit SDS-PAGE nachgewiesen werden. Allerdings war es nicht möglich, lösliches Fusionsprotein Alkalische Phosphatase-scFv in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) und in Origami (DE3), einer Doppelmutante in Thioredoxin-Reduktase (trxB) und Glutathion-Reduktase (gor), zu exprimieren. Eine Anwendung der in dieser Diplomarbeit verwendeten Methoden zur Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter Proteine in E. coli auf das Alkalische PhosphatasescFv Fusionsprotein ist also sinnvoll, war aber aus zeitlichen Gründen in dieser Arbeit nicht mehr gegeben. Die Überprüfung der Funktionalität löslicher Alkalischer Phosphatase in Fusion mit dem scFv Fragment in einer Western-Blot Analyse steht somit noch aus. Die Screening-Optimierung ergab, dass das in dieser Diplomarbeit verwendete Dynabeads® TALONTM Harz der Firma Dynal gute Ergebnisse, trotz der Affinität einiger spezifischer bakterieller Proteine, liefert, die durch Sättigung der Harzoberfläche unterbunden werden kann. Die automatisierte Proteinaufarbeitung mit KingFisher® instruments und die manuelle Methode mit dem Dynabeads® TALONTM Harz liefern vergleichbare Ergebnisse. Maßgebend bei der Aufarbeitung ist die Zentrifugation des Zelllysats vor Inkubation mit dem Harz, um zu viele unspezifische Bindungen zu vermeiden. Der Aufreinigungszyklus bei Anwendung der automatisierten Methode mit KingFisher® instruments ist kurz, wobei die Vorbereitung zur automatisierten Probenaufarbeitung mit dem manuellen Vorpipettieren der Pufferlösungen in die Probengefäße keine signifikant schnellere Probenaufarbeitung mit sich bringt. Ein Vorteil der automatisierten Methode mit KingFisher® instruments liegt in der effizienteren Waschung des Harzes und vermeidet falsch positive Ergebnisse im Falle hochaggregierter Proteine. 110 V Zusammenfassung V ZUSAMMENFASSUNG Ziel der vorliegenden Diplomarbeit war die Produktion löslicher und funktioneller scFv Antikörperfragmente in E. coli. Ein spezifisches Ziel bestand in der Fusion von scFv mit Alkalischer Phosphatase aus Escherichia coli als immunologisches Tool zur Anwendung in z.B. Western-Blot Analysen und ELISAs. Das Cytoplasma von E. coli liegt jedoch unter physiologischen Bedingungen in einem reduzierenden Zustand vor, was die Produktion intrazellulärer Antikörperfragmente aufgrund des Problems der fehlenden Disulfidbrückenausbildung erschwert. Aus diesem Grund wurden geeignete Methoden untersucht, um die Löslichkeit rekombinanter scFv Fragmente im bakteriellen System zu verbessern. Der Export in das Periplasma mit oxidierender Umgebung wurde über eine Leadersequenz in Form eines Signalpeptids am N-Terminus des rekombinanten Proteins ermöglicht. Fusionen zelleigener Proteindomänen mit dem Targetprotein zeigten einen positiven Effekt auf die Löslichkeit heterologer Proteine. Eine weitere, in dieser Diplomarbeit getesteten, Möglichkeit besteht in der Co-Expression von Chaperonen, um die korrekte Faltung positiv zu beeinflussen und damit die Löslichkeit von scFv Fragmenten zu erhöhen. Die Systeme des Exportes ins Periplasma und die Fusion mit zelleigenen Proteindomänen wurden in Kombination mit dem Bacteriocin-abhängigen Export in das Kulturmedium untersucht. Das System des Bacteriocin-freisetzenden Proteins wurde zunächst auf die Modellproteine Fringe Glycosyltransferase und DKFZp564F2122 ohne Disulfidbrücken angewandt. Anschließend wurde untersucht, ob das System auf die Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae als weiteres Modellprotein mit sieben Disulfidbrücken übertragen werden kann. Mit den erhaltenen Informationen dieser Vorversuche konnte mit der Produktion von scFv begonnen werden. Lösliches scFv Fragment konnte vermutlich in funktioneller Form erhalten werden. Die Fusion von Alkalischer Phosphatase mit dem scFv Fragment als wichtiges immunologisches Tool konnte produziert werden. Es bedarf der Anwendung der untersuchten Methoden, um das Fusionsprotein Alkalische Phosphatase-scFv in löslicher Form zu exprimieren und auf seine Funktionalität in der Western-Blot Analyse zu überprüfen. Neben dieser Arbeit wurde ein System zum halb-automatisierten Screening rekombinanter Proteinproduktion etabliert. 111 VI Literaturverzeichnis VI Literaturverzeichnis 1. ANFINSEN, C. B. (1973): Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181: 223-230. 2. 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I-1: kryoelektronenmikroskopische Aufnahme der GroEL-Struktur mit und ohne CoChaperon GroES (Roseman et al., 1996) ....................................................................... 11 Abb. I-2: Sekundärstruktur der ATPase-Domäne (im Komplex mit ATP und Mg2+) und der Substratbindungs-Domäne (im Komplex mit einem Peptid) von DnaK (Flaherty et al., 1990; Zhu et al., 1996) ................................................................................................... 12 Abb. I-3: der DnaK-Zyklus (Mogk et al., 2001) .................................................................... 12 Abb. I-4: Protein-Zyklus innerhalb der Zelle (Mogk et al., 2001)......................................... 13 Abb. I-5: Struktur eines konventionellen Immunglobulin G (Joosten et al., 2003) ............... 18 Abb. I-6: Struktur eines „single-chain“ Fragments scFv (Joosten et al., 2003) ..................... 18 Abb. II-1: der Vektor pJL3 (MoBiTec Handbuch) ................................................................ 27 Abb. III-1.1: DNA-Sequenz von scFv (von monoclonal antibody, gerichtet gegen die größte Untereinheit der RNA-Polymerase II aus Drosophila melanogaster) ........................... 60 Abb. III-1.2: DNA-Sequenz von Alkalischer Phosphatase aus E. coli .................................. 61 Abb. III-1.3: 1 %iges Agarosegel mit verdautem Vektor pMAL-p2X und Insert scFv......... 63 Abb. III-1.4: 1 %iges Agarosegel mit verdautem Vektor pETM-13, Insert Alkalische Phosphatase und Insert scFv........................................................................................... 63 Abb. III-1.1.1: 1 %iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von Vektor pMAL-p2X-scFv...... 64 Abb. III-1.1.2: 1%iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von pETM-13-Alkaline Phosphatase ........................................................................................................................................ 66 Abb. III-1.1.3: 1 %iges Agarosegel mit Kontroll-Verdau von pETM-13-Alkalische Phosphatase-scFv ........................................................................................................... 66 Abb. III-2.1.1: gereinigtes Protein aus Zelllysat und Kulturmedium nach 20 h bei 20°C ..... 69 Abb. III-2.1.2 a) gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 8 h bei 37°C.......................... 70 Abb. III-2.1.2 b) gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C........................ 70 Abb. III-2.1.3 Zelllysat nach 20 h bei 37°C ........................................................................... 71 Abb. III-2.1.4 gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 20 h bei 37°C...................................... 72 Abb. III-2.2.1.1: SDS-PAGE des gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C ........................................................................................................................................ 76 Abb. III-2.2.1.2: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 aus Kulturmedium nach 20 h bei 37°C.......................................................................................................................... 77 Abb. III-2.2.2.1: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 nach Aufkonzentrierung des Kulturmediums mit Dialyse-Membran .......................................................................... 78 Abb. III-2.2.2.2: Western-Blot Analyse von Serinprotease-4 in Kulturmedium nach 20 h, 24 h und 28 h bei 37°C........................................................................................................ 80 Abb. III-3.1: Zelllysat (Konstrukte in BL21(DE3)) ............................................................... 83 Abb. III-3.2: gereinigtes Protein aus dem Zelllysat (Konstrukte in BL21(DE3)).................. 83 Abb. III-3.3: gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 24 h und 48 h bei 20°C (Konstrukt: pETM-82-scFv) .............................................................................................................. 85 Abb. III-3.4: gereinigtes Protein aus Kulturmedium nach 48 h und 24 h bei 20°C und 37°C86 (Konstrukt: pETM-82-scFv)........................................................................................... 86 Abb. III-3.5: gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 48 h und 24 h bei 20°C und 37°C ........ 86 (Konstrukt: pETM-82-scFv)........................................................................................... 86 Abb. III-3.6: der Vektor pMAL-p2X ..................................................................................... 87 Abb. III-3.7: 20 h bei 20°C nach Induktion mit 300 µM IPTG ............................................. 88 120 VII Anhang Abb. III-3.8: gereinigtes Protein aus dem Zelllysat nach 20 h bei 20°C (Induktion mit 300 µM IPTG)....................................................................................................................... 88 Abb. III-4.1: Zelllysat nach 20 h bei 20°C ............................................................................. 90 Abb. III-4.2: gereinigtes Protein aus Zelllysat nach 20 h bei 20°C........................................ 90 Abb. III-5.1: Proteinreinigung über FPLC (Induktion mit 100 µM IPTG)............................ 92 Abb. III-5.2: gereinigtes Protein über FPLC (Induktion mit 100 µM IPTG)......................... 93 Abb. III-5.3 a): Western-Blot Analyse von löslichem scFv Fragment .................................. 94 Abb. III-5.3 b): SDS-PAGE von Homogenat: Drosophila melanogaster ............................. 94 Abb. III-5.3 c): LMW Protein-Marker ................................................................................... 94 Abb. III-6.1: Konstrukt pETM-13-Alkaline Phosphatase scFv ............................................. 96 Abb. III-7.1: gereinigtes Protein........................................................................................... 100 Abb. III-7.2: gereinigtes Protein aus dem Überstand nach Zentrifugation des Zelllysats ... 101 Abb. III-7.3: gereinigtes Protein aus dem Kulturmedium.................................................... 103 Tab. I-1: Übersicht häufig verwendeter Promotoren (Weickert et al., 1996) .......................... 3 Tab. I-2: das Thioredoxin- und Glutaredoxin-System ............................................................. 7 Tab. I-3: Struktur und Funktion der Chaperon-Familien (Mogk et al., 2001) ....................... 10 Tab. I-4: Fusionen .................................................................................................................. 15 Tab. I-5: Tags ......................................................................................................................... 15 Tab. II-1: Übersicht über die verwendeten E. coli-Stämme................................................... 24 Tab. II-2: Primer zur DNA-Amplifikation ............................................................................. 28 Tab. II-3: Primer zur DNA-Sequenzierung............................................................................ 29 Tab. II-4: Parameter der Polymerase-Kettenreaktion............................................................. 32 Tab. II-5: Übersicht der amplifizierten Konstrukte aus der entsprechenden Matrizen-DNA 32 Tab. II-6: Übersicht der amplifizierten Plasmide mit der entsprechenden AntibiotikaResistenz......................................................................................................................... 37 Tab. II-7: Übersicht der verwendeten Plasmide und der verwendeten Hitzeschockkompetenten E. coli Zellen mit entsprechender Antibiotika-Resistenz ......................... 39 Tab. II-8: Übersicht der eingesetzten Chaperon-Kombinationen .......................................... 39 Tab. II-9: Übersicht aller Konstrukte ..................................................................................... 43 Tab. II-10: Parameter zur automatisierten Aufreinigung rekombinanter Proteine mit KingFisher® instruments ................................................................................................ 51 Tab. II-11: Parameter des Western-Blots ............................................................................... 56 Tab. III-1.1.1: verwendete Plasmid-Vektoren zur Subklonierung von scFv.......................... 67 Tab. III-1.1.2: generierte scFv-Konstrukte............................................................................. 68 Tab. III-2.1.1 a): Quantifizierung der exportierten Fringe Glycosyltransferase nach 20 h bei 37°C................................................................................................................................ 71 Tab. III-2.1.1 b): Quantifizierung des exportierten Proteins DKFZp564F2122 nach 20 h bei 37°C................................................................................................................................ 72 Tab. III-2.2.1: Größe der exprimierten Serinprotease-4......................................................... 74 Tab. III-3.1: scFv-Konstrukte................................................................................................. 82 Tab. III-4.1: Übersicht der eingesetzten Chaperon-Kombinationen ...................................... 89 Tab. III-4.2: Übersicht der eingesetzten Konstrukte mit Chaperon-Kombinationen ............. 89 Tab. III-5.1: Proteinkonzentration nach Aufreinigung über FPLC und anschließender Entsalzung ...................................................................................................................... 93 Tab. III-6.1: Übersicht der Alkalische Phosphatase-scFv Konstrukte ................................... 96 Tab. III-7.1: Puffer-Zusammensetzung .................................................................................. 98 121 VII Anhang VII.2 Abkürzungen Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper APTG p-Aminophenyl-β-D-thiogalactosid Ara Arabinose AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare BRP Bacteriocin freisetzendes Protein („bacteriocin release protein“) BSA Rinderserumalbumin („bovine serum albumin“) bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius CHI, CH2 und CH3 konstante Domänen der schweren Ketten ca. zirka CaCl2 Calciumchlorid CL konstante Domäne der leichten Kette Co2+ Cobalt-Ionen CoCl2 Cobaltchlorid dest. destilliert DFP Diisopropylfluorophosphat d.h. das heißt DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxynukleosid-Triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA enzyme linked immuno sorbent assay Fab fragment antigen binding FPLC Fast Protein Liquid Chromatography GST Glutathion-S-Transferase h Stunde(n) HCl Salzsäure HIS Histidin 122 VII Anhang HRP-Konjugat Meerrettichperoxidase-Konjugat („horseradish peroxidase-conjugate”) Hsps Hitzeschockproteine („heatshock proteins”) IgG Immunglobulin G IMAC Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid kb Kilobasenpaare KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton Konz. Konzentration L Liter LB Luria broth LMW Low Molecular Weight M Molar mAk monoklonaler Antikörper MBP Maltose-Bindungsprotein MCS Multiple Klonierungsstelle („multiple cloning site”) min Minute(n) mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat mL Milliliter mM Millimolar NaCl Natriumchlorid NADPH reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat NaOH Natronlauge ng Nanogramm nm Nanometer OD600 optische Dichte bei 600 nm PBS Phosphat gepufferte Saline PCR Polymerase-Kettenreaktion („polymerase chain reaction“) PEG Polyethylenglykol PVDF Polyvinylidendifluorid rpm Umdrehungen pro Minute („rounds per minute“) RT Raumtemperatur scFv „single-chain“ Antikörperfragment 123 VII Anhang SDS Natriumdodecylsulfat („sodiumdodecylsulfat“) SDS-PAA Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sec Sekunde(n) Ser-4 Serinprotease-4 aus Anopheles gambiae Tab. Tabelle TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer Tm Schmelztemperatur („melting temperature“) Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan U Unit (Enzymeinheit) u.a. unter anderem UV Ultraviolett V Volt VH variable Domäne der schweren Kette VL variable Domäne der leichten Kette Verd. Verdünnung Vol. Volumen YT „yeast tryptone“ z. B. zum Beispiel µg Mikrogramm µL Mikroliter µM Mikromolar % (v/v) Volumenprozent % (w/v) Massenprozent 124 VII Anhang Aminosäuren A Alanin M Methionin C Cystein N Asparagin D Asparaginsäure P Prolin E Glutaminsäure Q Glutamin F Phenylalanin R Arginin G Glycin S Serin H Histidin T Threonin I Isoleucin V Valin K Lysin W Tryptophan L Leucin Y Tyrosin Basen A Adenin C Cytosin G Guanin T Thymin 125