Zeitschrift für Naturforschung / B / 22 (1967) - ZfN - Max

Über die <z-&-Isomerie der Cyano-aquo-corrinoide
WILHELM
FRIEDRICH,
HENNING
OHLMS,
W A L T R A U D SANDECK u n d R A I N E R BIEGANOWSKI
Physiologisch-Chemisches Institut der Universität Hamburg
(Z. Naturforschg. 22 b, 839—850 [1967] ; eingegangen am 27. Febniar 1967)
Two isomers, a and b, of the tetracarbonic acid and some tri-, di- and monocarbonic acids, all
derived from cobyric acid, have been crystallized. Two cobinamide monocarbonic acids have also
been crystallized.
The two crystalline tetracarbonic acids are both stable at 20 °C. They differ from each other in
crystal shape. Some anions, carbon monoxide and light catalyze their thermal isomerisation in
aqueous medium. The equilibrium a ^ L b depends upon the PH of the medium only. At PH < 2 . 5
more than 53% and at PH > 4 . 5 about 20% of the tetracarbonic acid is in the a-form (6 = 100 —a).
The equilibrium shifts therefore as the carboxyls of the tetracarbonic acid (px = 3.15 and 3.85)
dissociate. The shift probably results from the action of the newly formed carboxylate anions,
which accelerate the reaction (a
b) in the direction
b. The isomerisation reaction is
slower in more dilute solutions. The 14CN group of the tetracarbonic acid undergoes thermally
dependent exchange with the CN group of the cobyric acid. This intermolecular exchange and the
isomerisation are perhaps analogous reactions, resembling the formation of cyanocobalamin from
aquocobalamin and cyano-aquocorrinoids. The two forms, a and b, of tetracarbonic acid, cobyric
acid, cobinamide phosphoric acid and cobinamide differ slightly in their absorption and CD spectra.
On the basis of these results it is probable that the CN group of the tetracarbonic acid is
bound "above" (in the 6-form) or "below" (in the a-form) the plane of the corrin ring and that
the CN ligand migrates during a collision of two molecules of tetracarbonic acid. The anion- and
light-catalysed isomerisation reactions are probably results of heterolysis and homolysis of the
Co —CN bond, respectively.
Chromatographie und Elektrophorese zahlreicher
nucleotidfreier saurer und neutraler Cyano-aquocorrinoide * (vgl. Abb. 1) bei ca. 3 ° C ergab, daß
diese sich jeweils in zwei Isomere, a und b, spalt e n * * l a s s e n 1 - 3 . In Wasser (Säulenchromatographie, Elektrophorese) ist die Spaltbarkeit bei einer
Monocarbonsäure, einer Dicarbonsäure, zwei Tricarbonsäuren und der Tetracarbonsäure weitaus
besser ausgeprägt als bei allen übrigen Corrinoiden
(vgl. Tab. 1) ; diese Gesetzmäßigkeit spricht dafür,
daß die Spaltung durch ein bestimmtes Propionatcarboxyl zusätzlich stimuliert w i r d 2 . In alkoholisch-wäßrigem Milieu, enthaltend organische Säuren, spalten sich die meisten der in Tab. 1 genannten neutralen und sauren Cyano-aquo-corrinoide papierchromatographisch 2 . Die beiden papier- bzw.
säulenchromatographisch verschieden rasch laufenden Zonen (a = langsam, b = schnell) unterscheiden sich jeweils geringfügig im Absorptions- und
im CD-Spektrum und zwar stets in gleichem Sinne 3 .
Die Isomeren a und b sind in Lösung thermolabil
und werden bereits bei Zimmertemperatur langsam
ineinander umgewandelt. Die Umwandlung wird
durch Blausäure beschleunigt 1 .
* Zur Nomenklatur vgl. IUPAC, J. biol. Chemistry 241,
2992 [1966] und 1. c . 1 ; die Buchstaben L, M und S (langsam, mittelschnell und schnell; vgl. Tab. 1) entsprechen
der papierchromatographischen Beweglichkeit im essigsauren Fließmittel in Gegenwart von Blausäure. Die Bezeichnung ß, y, ö wurde aus 4 entnommen; sie dient nur zur
Kennzeichnung der Cobinamid-monocarbonsäuren.
** Der Begriff „Spaltung" bzw. „Spaltbarkeit" bezieht sich
hier stets auf die a-6-Isomerie und ist vom Begriff „Trennung" zu unterscheiden, der hier nur bei den übrigen Isomeren gebraucht wird.
1
W . F R I E D R I C H , Biochem. Z . 3 4 2 , 1 4 3
[1965].
2
W. F R I E D R I C H , Z. Naturforschg. 21b, 138 [1966].
3
W. F R I E D R I C H , Z. Naturforschg. 21 b, 595 [1966].
4
H . B E I S B A R T H , Dissertation, Stuttgart 1962.
Diese Ergebnisse, über die bisher teilweise nur
kurz berichtet wurde, veranlaßten uns zu der Annahme, daß die Isomeren a und b sich duch die Lage
der Cyanogruppe („unten" bzw. „ o b e n " ; vgl.
Abb. 1) unterscheiden und daß die Isomerisierung
der beiden Formen durch eine Wanderung der
Cyanogruppe erfolgt 2 ' 3 . Diese Annahme wird durch
die neuen Befunde weitgehend gestützt. Hier wird
über diese Befunde sowie über einige ältere, bisher
nur kurz geschilderte Ergebnisse 2 ' 3 ausführlicher
berichtet.
Ergebnisse
Darstellung
der untersuchten
sauren
Corrinoide
Wir hydrolysierten Vitamin B 1 2 , Cobinamid, Cobyramid und Cobyrsäure mit Hilfe des stark sauren
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h ^ H A
9
^
cHz
c0^Hz
Abb. 1. Chemische Struktur des Cobyramides (ohne Axialliganden) . In den Mono- bis Tetracarbonsäuren sind eine bis
vier freie Carboxylgruppen (höchstwahrscheinlich „unten",
bezeichnet mit den Buchstaben b, d, e und f) frei. Im Cobinamid ist die Carboxylgruppe / mit l-Aminopropanol-2
amidiert.
Zur Anwendung von Dowex-50 veranlaßten uns vor
allem frühere Beobachtungen auf dem Gebiet der Proteinchemie, welche gezeigt hatten, daß dieser Austauscher sich zur Hydrolyse der Säureamidbindung besonders gut eignet 5 . Für die Wahl dieses Austauschers
sprachen ferner Versuche von B A R K E R et al. 6 , die das
B 12 -Coenzym und seine Analoga mit Erfolg an Dowex50-Säulen chromatographierten, ohne daß dabei Corrinoide verändert oder irreversibel festgehalten wurden.
Wir erzielten bei der Hydrolyse von Corrinoiden mit
Dowex-50 Gesamtausbeuten von ca. 9 7 % + (Arbeitsweise: Adsorption von ca. 100 mg Corrinoid an ca.
4 ml Dowex-50 X 2, 200 —400 mesh, Säureform; nach
erfolgter Hydrolyse Zusatz von etwas KCN, Neutralisation des Austauschers mit Ammoniak bis pH 9 und
Elution des Hydrolysates mit Wasser. Das Hydrolysat
ist salzfrei und kann direkt elektrophoretisch getrennt
werden.
Chromatographie
der sauren
an CM- und
Cyano-aquo-corrinoide
P-Cellulose-Säulen
Bei dieser Chromatographie 1 > 2 werden fast alle
der untersuchten Säuren jeweils in zwei Zonen, a
Ionenaustauschers Dowex-50 bei 2 0 — 4 0 ° C
Hydrolyse
von
Mono-, Di- und
Cobyramid
und
2.
Zur
Cobyrsäure
zu
(seltener) Tricarbonsäuren diente
Cobinamid
Cobyramid
Cobyrsäure
und b (schnell) gespalten, manche von
Cobyramid-monocarbonsäure
5 und Cobinamid-monocarbonsäure ß(S)
konnten
bisher nicht gespalten werden (vgl. Tab. 1 ) + + .
auch P-Cellulose
Ausgangssubstanz
(langsam)
ihnen auffallend gut;
Untersuchte Carbonsäuren
Cobyrsäure *
Cobinamid-monocarbonsäure
Cobinamid-monocarbonsäure
Cobinamid-monocarbonsäure
Cobyrsäure *
Cobyramid-monocarbonsäure
Cobyramid-monocarbonsäure
Cobyramid-monocarbonsäure
ö (L)***k
y (M) * k
ß (S)
L***k
M*k
S
Dicarbonsäure L * * * k
Dicarbonsäure M * * k
Dicarbonsäure S * * k
Tricarbonsäure L* * * k
Tricarbonsäure M * * *
Tricarbonsäure S * * k
Tetracarbonsäure * * * k
Tab. 1. Die untersuchten Carbonsäuren und ihre Spaltbarkeit in der CM-Cellulose-Säule (Fließmittel: Wasser) und Elektrophorese in schwach sauren Puffern. Spaltbarkeitsstufen: *** auffallend gut, ** mäßig, * schlecht; Cobyramid-monocarbonsäure S und Cobinamid-monocarbonsäure ß (S) sind hier nicht spaltbar. Die mit k bezeichneten Carbonsäuren wurden von
uns erstmalig in kristallinem Zustand erhalten (davon Tetracarbonsäure in zwei Formen).
+
5
Der Befund, daß bei Verwendung von Dowex-50 „die Ausbeute — vor allem an niedrigeren Carbonsäuren — infolge
schwerer Eluierbarkeit nicht zufriedenstellend ist" 7 bezieht sich auf eine andere Arbeitsweise 8 : Hydrolyse von
300 mg Cyanocobalamin mittels 200 ml Dowex-50 bei
30 °C und Elution der Corrinoide mit 60-proz. Essigsäure
bzw. mit 1-n. Ammoniak7. Die geringen Ausbeuten (40
bis 60%) dürften hier auf die Verwendung relativ großer
Mengen Austauscher sowie auf das Weglassen von Cyanid
bei der Elution zurückzuführen sein.
J . C. P A U L S O N U . F. E. D E A T H E R A G E , J . biol. Chemistry 2 0 5 ,
909 [1953] ; J . R. W H I T A K E R U . F. E. D E A T H E R A G E , J . Amer.
chem. Soc. 7 7 , 5298, 3 3 6 0 [1955].
6
H.
A.
BARKER, R .
SEN, J . J .
SON,
7
J.
D.
E.
VOLCANI, J .
SMYTH,
H.
N.
LADD,
B.
E.
MUNCH-PETER-
VOLCANI U. R .
WEISSBACH,
J. J.
TOOHEY, J .
N.
M .
WIL-
BARKER,
L A D D U.
B.
biol. Chemistry 235, 480 [1960].
BERNHAUER,
F.
WAGNER,
H.
BEISBARTH,
P.
RIETZ
U.
H.
Biochem. Z . 344, 289 [1966].
Bei der CM-Cellulose-Säulenchromatographie von Gemischen der beiden Tetracarbonsäuren wird die Menge der
a-Form visuell zu hoch geschätzt (z. B. ca. 65% statt ca.
53%). Diese Abweichung ist wahrscheinlich auf den Unterschied im Absorptionsspektrum der beiden Substanzen zurückzuführen.
VOGELMANN,
++
SMYTH, H . WEISSBACH, A .
biol. Chemistry 235, 181 [1960] ; H. A.
R.
K.
D.
TOOHEY, J .
W .
FRIEDRICW,
H.
OHLMS,
W .
SANDECK
und
R.
BIEGANOSSKI,
Über die a-b-Isomerie der Cyano-aquo-corrinoide
Abb. 2. Papierchromatographie (absteigend) von Cobinamid
und Cobyrsäure bei 3 °C im Dunkeln.
(S. 839).
Abbn 3 a bis 3 i. Mikroaufnahmen von Kristallen verschiedener Cyano-aquo-corrinoidcarbonsäuren. a) Cobyramid-monocarbonsäure M (lange, grobe Spieße), b) Cobinamid-monocarbonsäure <3(L) (flache, rechteckige Scheiben), c) Cobinamid-monocarbonsäure y(M) (mikrokristalline Stäbchen),
d) Dicarbonsäure S (lange, grobe Spieße). e) Dicarbonsäure
M (grobe Prismen). f) Dicarbonsäure L (grobe Prismen).
g) Tricarbonsäure L (äußerst feine Nadeln). h) Tetracarbonsäure a (grobe, rhombische Spieße). i) Tetracarbonsäure b
(sehr feine, lange Haare; im Zentrum amorphe Substanz, aus
der Kristalle wachsen).
Papierelektrophorese
saurer Corrinoide
sauren
in schwach
Puffern
Die Spaltung saurer Cyano-aquo-corrinoide kann
auch elektrophoretisch demonstriert werden *» 2 , wobei sich ein ähnliches Bild ergibt wie in der CMCellulose-Säule (vgl. Tab. 1 ) .
Die elektrophoretische Beweglichkeit der Cobyramid- und Cobinamidmonocarbonsäuren wurde genauer untersucht 2
(Puffer: 0,03-m. Formiat bzw.
0,03-m. Citrat, pn 3 bis 5 ; Bezugssubstanzen: Cyanocobalamin, Beweglichkeit = 0 ; Cobinamid, Beweglichkeit = 1 ) . Es ergab sich dabei, daß die Carboxylgruppe der Cobyramid-monocarbonsäure L und
Cobinamid-monocarbonsäure <5(L) im Isomer b den
Pk-Wert von ca. 3,15 a , im Isomer a jedoch den
Wert von ca. 3,85 a hat; ungefähr die gleiche Acidität (pk ca. 3,85) haben die Carboxyle der drei übrigen Cobyramid- und Cobinamid-monocarbonsäur e n b . Krist. Tetracarbonsäuren a und b wandern
unter diesen Bedingungen einheitlich, die Form a
erwartungsgemäß schneller als die Form b (a ist
basischer als b, weil in b ein Carboxyl stärker sauer
ist und die positive Ladung am Kobalt besser kompensiert) .
Kristallisation
der
Cyano-aquo-carbonsäuren
Die aus Cobyramid und Cobinamid darstellbaren
Monocarbonsäuren sowie die aus Cobyrsäure darstellbaren Di-, Tri- und Tetracarbonsäuren kristallisieren allgemein sehr gut aus Wasser als Cyanoaquo-Formen (vgl. Tab. 1 und A b b . 3 ; Kristallfarbe
stets orangerot). Auffallend ist der Formunterschied
der kristallinen Tetracarbonsäuren a und b. Die
erste kristallisiert in kurzen rhombischen Stäbchen,
die zweite bildet sehr feine, lange Haare — eine
Kristallform, die u. W . bisher auf dem B 12 -Gebiet
nicht bekannt war ( A b b . 3) *. Die Kristalle der Tetracarbonsäuren a und b sind bei Zimmertemperatur
stabil (verhalten sich also anders als ihre thermolabilen Lösungen) : nach ca. einjähriger Lagerung
im Exsikkator über Atznatron im Dunkeln konnte
keine Isomerisierung beobachtet werden. Die niederen Carbonsäuren sind relativ gut, die Tetracarbonsäuren wenig löslich in Wasser; von diesen löst sich
die 6-Form schlechter, entsprechend ihrer stark ausgeprägten Zwitterion-Struktur; sie kann jedoch mittels 0,04-m. Natriumacetat bzw. NatriumhydrogenAe
t
15
Papierchromatographie
10
Zahlreiche neutrale und saure
rinoide
lassen
Fließmitteln,
sich
Cyano-aquo-cor-
papierchromatographisch
die eine passende organische
mit
5
Säure
oder ein Säurengemisch enthalten, jeweils in zwei
orangerote
bzw. karminrote
Tab. 2 und A b b . 2 ) .
Die
Zonen
spalten
0
(vgl.
Papierchromatographie
wird manchmal durch schweflige Säure der Luft erheblich
gestört,
indem
die
Sulfito-Form
-5
gebildet
wird, welche oft fast gleichzeitig mit dem betreffenden a-Isomer als gelbe Zone wandert (Absorptionsspektrum identisch mit dem des
des 10-
u
Sulfitocobinami-
)c.
Diese pk-Werte liegen deutlich tiefer als die von B E R N et al. 7 an Cobinamid-monocarbonsäuren beobachteten: 4,1 bei iMSt und iMS2 bzw. 3,6 bei iMS 3 ; der zweite
Wert ist wohl als Mittel aus den pk Werten der Isomeren
a und b (3,85 und 3,15) aufzufassen,
b Der durch Titration von Cobyrsäure mit Natronlauge gefundene px-Wert von 5,7 9 dürfte zu hoch sein.
c Die Cyano-aquo-corrinoide sind gegenüber der schwefligen
Säure weitaus empfindlicher als Cyanocobalamin. Von den
erstgenannten Verbindungen dürften die a-Formen der
entsprechenden Säuren empfindlicher sein als die 6-For-
400
550
600
nm —
Abb. 4. CD-Spektrum der beiden isomeren Formen der Cobinamidphosphorsäure in Wasser bei Zimmertemperatur.
a
HAUER
8
9
500
men (dies wurde vor allem an den Tetracarbonsäuren beobachtet), vermutlich deshalb, weil hier — nach unserer
Auffassung — das Kobaltatom relativ leicht „von oben"
zugänglich ist.
K . B E R N H A U E R , Privatmitteilung.
K . B E R N H A U E R , F. W A G N E R U . P . Z E L L E R , Helv. chim. Acta
43, 696
10
450
K.
[ I 9 6 0 ] .
BERNHAUER, P .
RENZ U.
F.
WAGNER,
Biochem.
Z.
335,
443
[1962],
K . B E R N H A U E R U . O . W A G N E R , Biochem. Z . 3 3 7 ,
* Abbn. 2 und 3 a - i s. Tafel S. 841 a und b.
11
366
[1963].
Organische Säure(n) im Fließmittel
Art
Konz.
[Mol/1]
Ameisensäure
0,2
Essigsäure
0,2
0,6
Corrinoid
Beweglichkeit der
b-Form
a-Form == 1
Bi9=1
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Monochloressigsäure
0,2
Dichloressigsäure
0,2
Trichloressigsäure
0,2
Cobyrsäure
Cobinamid
Propionsäure
0,2
Oxalsäure
0,2
Bernsteinsäure
0,2
Milchsäure
0,2
Citronensäure
0,2
Benzoesäure
0,2
Salicylsäure
0,2
Phthalsäure
0,2
Essigsäure
Dichloressigsäure
Propionsäure
Dichloressigsäure
Milchsäure
Oxalsäure
Citronensäure
Oxalsäure
Benzoesäure
Oxalsäure
Salicylsäure
Oxalsäure
0,1]1
0,1)
0,111
0,1 j
0,111
0,1 j
0,u1
0,1)I
0,111
0,1)
0.111
0,1)I
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
Cobyrsäure
Cobinamid
1,34
1,34
1,4
1.35
1,4
1,4
1,52
1,55
1,37
1,43
b-Form *
[%]
1,34
1,34
1,17
1.3
1,27
1,37
1,63
1,65
1,63
1,54
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
Mäßig gut
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut; rot, nicht
unterscheidbar
vom B12
Keine Spaltung; rot,
nicht unterscheidbar
vom B12
Gut
1,4
1,37
50
45
50
45
0,96
1,3
0,8
0,8
1,07
1,06
1,48
1,46
1,05
1,17
1,33
1,75
1.74
1,7
1,53
1,47
1,4
1,47
1,41
1,41
1,42
1,5
1,28
1,3
1,45
1,57
1,52
1,7
1,42
1,44
1,4
1,42
1,4
1,43
1,4
1,4
1,31
1,37
1,4
1,45
1,4
1,48
Spaltungseffekt
Fleckfarbe
Sehr gut
Keine Spaltung
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
50
45
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut
Schlecht
Sehr gut; rot
Sehr gut; rot
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut
Sehr gut
Tab. 2. Papierchromatographische Beweglichkeit und Spaltbarkeit einiger Cyano-aquo-corrinoide in sec. Butanol, enthaltend
30 Vol.-% Wasser und organische Säure (n). Entwicklung 18 bis 48 Stdn., absteigend. Zonen der Cyano-aquo-corrinoide orangerot, falls nicht anders angegeben. * Werte geschätzt.
carbonat in Lösung gebracht werden (darin löst sich
Tetracarbonsäure a sofort, b nach längerem Rühren) ; die Tetracarbonsäuren sind in Methanol gut
löslich.
Corrinoid
men a und b von Cobinamid, Cobyrsäure, Tetracarbonsäure und Cobinamidphosphorsäure zeigten, daß
sie sich nur geringfügig unterscheiden. Die Unterschiede der Formen a und b sind jedoch gut repro-
430 nm
Maxima {A e)
490 nm 550 nm
Cobinamid
a
b
+ 16,0
+ 12,5
- 6,8
- 6,1
+ 3,3
Cobyrsäure
a
b
+ 14,6
+ 11,7
-
7,4
6,3
+ 3,2
Tetracarbonsäure
a
b
+ 14,3
+ 11,8
-
7,4
6,4
+ 3,8
Cobinamidphosphorsäure
a
b
+ 16,6
+ 11.5
- 5,6
-4,4
+ 4,6
Spektren
Zahlreiche Aufnahmen der CD-Spektren der For-
Isomer
Tab. 3. Maxima (in As) der CD-Spektren der beiden Isomeren einiger Cyano-aquo-corrinoide.
duzierbar und haben für alle genannten Substanzen
annähernd den gleichen Wert (vgl. Tab. 3 und
Abb. 4 ) .
Die Absorptionsspektren der a-Formen (sowie
auch die der 6-Formen) von Cobinamid, Cobyrsäure,
Tetracarbonsäure und Cobinamidphosphorsäure sind
untereinander praktisch gleich, es bestehen jedoch
geringe Unterschiede zwischen diesen beiden Grupp e n : in a sind die Banden a, ß und y etwas höher
als in b, die übrigen Teile des Spektrums verhalten
sich jedoch im umgekehrten Sinne. Erwärmt man
eine wäßrige Lösung eines Corrinoides der Gruppe
a oder b auf 70 ° C , dann erhält man ein MischSpektrum, dessen Kurve zwischen a und b liegt, entsprechend dem Mengenverhältnis der beiden Isomeren. Aus den Absorptionsspektren gleicher Konzentrationen verschiedener Isomerenpaare ist ersichtlich, daß die Schnittpunkte ungefähr konstant liegen. Die gleichen Schnittpunkte ergeben sich nach
erneuter Aufnahme der Spektren erwärmter Lösungen. Es handelt sich hier wohl um isosbestische
Punkte. Ihre genaue Bestimmung war allerdings
nicht möglich. Die Unterschiede der Absorptionsspektren der Formen a und b werden am Beispiel
der beiden krist. Tetracarbonsäuren erläutert (vgl.
A b b . 5 und Tab. 4 ) .
Wellenlänge
[nm]
274
275,5
293
295
321
322
353,5
355
404
424
495
496
527
528
Maxima (e • 10-3) Minima (e • 10 -3 )
Isomer a Isomer b Isomer a Isomer b
11,1
11,2
(y)
27,78
4,83
(ß)
(«)
9,02
8,25
11,97
7,9
7,8
11,65
26.55
5,19
3,05
3,52
8,45
7,9
Tab. 4. Maxima und Minima der beiden krist. Isomeren der
Tetracarbonsäure in 0,04-m. Natriumacetat.
Die IR-Spektren der aus Cobyrsäure gewonnenen
Mono-, Di-, Tri- und Tetracarbonsäuren (die meisten davon kristallin, vgl. Tab. 1) unterscheiden sich
nur unwesentlich und ähneln weitgehendst dem IRSpektrum der Cobyrsäure 12 (dies bezieht sich vor
allem auf die Cobyramid-monocarbonsäuren S, M
und L ) . Es konnte ferner kein wesentlicher Unterschied zwischen den IR-Spektren der Tetracarbonsäuren a und b gefunden werden (es muß allerdings
damit gerechnet werden, daß bei der Herstellung
0.650
0,600
0.750
0,700
0.650
0,600
0,550
0,500
0,450
0,400
0.350
0.300
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
610
12
K. B E R N H A U E R , F.
279 [1961].
WAGNER
U.
D.
WAHL,
Biochem. Z.
334,
13
Abb. 5. Absorptionsspektren der beiden kristallinen Tetracarbonsäuren in 0,04-m. Natriumacetat. — Isomer a, • • • Isomer b, - - - Dicyanoform (pH 10; identisch für die beiden
Tetracarbonsäuren).
R. B O N N E T T , Chem. Rev. 6 3 , 573 [1963].
4000
1800
1300
950
10000 5000
3000 2500 2000
1600 1400
1200 1100 1000 900 850 800 750
4000
10000 5000
100
—I
3000 2500 2000
1
1 1
1800
1600
950
1300
1400 1200 1100 1000 900 850 800 750
—i—i
1
r~
700 cm-1
700 cm-1
| 90
I
80
70
•%60
.05
^ 40
£
20
Abb. 6. IR-Spektren von krist. Cobyramid-monocarbonsäure L (unten) und krist. Tetracarbonsäure a (oben) in KBr.
des KBr-Preßlings die Tetracarbonsäuren a und b
isomerisiert werden). In allen Spektren ist die der
CN-Gruppe zugeschriebene 1 3 Bande bei 2 1 3 6 c m - 1
vorhanden.
weitgehenden
Ähnlichkeit
werden hier nur die Aufnahmen der
Wegen
Cobyramid-
monocarbonsäure
der
L
und
Tetracarbonsäure
0,1-rc- Essig- Dauer der
Erwärmung auf
säure
50 °C
[ml]
[Stdn.]
0,5
0,25
0,25
0,25
0,25
1,25
1,25
1,25
1,25
a
( A b b . 6 ) als Beispiele wiedergegeben.
Zur Isomerisierung
der
Tetracarbonsäuren
Die Tetracarbonsäuren a und b werden, ähnlich
wie die übrigen Isomerenpaare aus der Gruppe der
Cyano-aquo-corrinoide,
in
Lösung
durch
Wärme
isomerisiert 1 . Die thermische Isomerisierung
wird
durch Licht und Medium weitgehend beeinflußt. Die
an zahlreichen Versuchsreihen mit den beiden Tetra-
nicht erwärmt
2,0
2,5
3,5
4,0
2,0
2,5
3,5
4,0
Sättigung mit Stickstoff
wie folgt zusammenfassen:
Atmosphäre
1. In mit Kohlenmonoxid * gesättigter
Lösung
* Kohlenmonoxid verändert unter den hier beschriebenen
Bedingungen die Tetracarbonsäure nicht, wie durch Elek-
0,0
28,3
32,8
36,5
38,8
13,7
15,9
18,6
21,0
Tab. 5. Abhängigkeit der Isomerisierungs-Geschwindigkeit
der Tetracarbonsäure b von Konzentration bei 50 °C. Versuche in zugeschmolzenen Glasampullen. Je Ampulle 250
nMol krist. Tetracarbonsäure b in verschiedenen Volumina
0,1-n. Essigsäure.
carbonsäuren gewonnenen Erkenntnisse lassen sich
findet die Isomerisierung viel rascher statt als nach
a-Form
[%]
ist
keit ungefähr
die
(Abbn. 7 und 9 ) . In 0 2 -
Isomerisierungs-Geschwindig-
die gleiche wie in
N 2 -Atmosphäre
(Tab. 7 ) .
trophorese bei ph 7 und Papierchromatographie bei
Cyanidüberschuß gezeigt werden konnte.
Reaktionsdauer
[Stdn.]
Radioaktivität (Impulse/min)
[%]
Cobyrsäure
Tetracarbonsäure
0,4
19,0
30,5
40,6
46
0
2
4
6
8
99,6
81,0
69,5
59,4
54,0
nol verläuft die Isomerisierung im Prinzip gleich
schnell wie in Wasser.
3. In konzentrierteren Lösungen ist die Isomerisierung rascher als in verdünnten Lösungen (Tab. 5).
4.
Die Lage
säure a ^
des
Gleichgewichtes
Tetracarbon-
Tetracarbonsäure b hängt vom pn-Wert
Tab. 6. Cyanidaustausch zwischen 14CN-Tetracarbonsäure
und Cobyrsäure bei 40 °C. Jeweils 50 nMol 14CN-Tetracarbonsäure (a + b) und 50 nMol Cobyrsäure wurden in 0,2 ml
Wasser verschieden lang erwärmt und dann chromatographiert
(CM-Cellulose-Säule 0,5-7 cm, Entwickler: Wasser). Die entwickelten Säulen wurden zerschnitten und die einzelnen Zonen mit 3-proz. Ammoniumcarbonat-Lösung eluiert (stets
2 ml Eluat). Zusatz von 15 ml Scintillator und Messung der
Radioaktivität.
Wässriges
Medium
Temperatur
[°C]
0,05-».
Essigsäure
0
21,5
0,05-m.
Na-Aeetat
0,05-m.
NaHC0 3
40
Sonstige Reaktionszeit
Reaktionsbedin[Stdn.]
gungen
L,
L,
L,
L,
L,
L,
L,
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
0,05-m.
Na 2 C0 3
0,1 -».
Essigsäure
70
40
CO
CO
o2
N2
N2
02
o2
02
N2
N2
1,0
2,5
4,0
5,0
1,0
2,5
4,0
1,0
2,5
4,0
0,5
2,0
0,5
1,0
2,0
3,0
0,5
1,0
2,0
3,0
2,0
4,0
4,0
2,0
4,0
1,0
2,0
4,0
2,0
4,0
a-Form
[%]
6,5
16,5
19,0
21,0
11,0
29,0
42,0
6,0
10,0
18,0
14,0
17,0
6,0
10,5
13,0
14,0
13,0
18,5
20,3
20,5
51,0
51,3
47,8
42,0
49,0
7,0
10,0
22,0
6,0
19,0
Tab. 7. Isomerisierung der Tetracarbonsäure unter verschiedenen Bedingungen. Versuche in zugeschmolzenen Glasampullen. Je Versuch 250 nMol Tetracarbonsäure b in 0,5 ml
verschiedener wäßriger Medien. Belichtete bzw. in CO-, 0 2 oder N2-Atmosphäre durchgeführte Versuche sind mit L, CO,
0 2 oder N® bezeichnet.
2. Die Isomerisierungs-Reaktion wird durch Licht
sowie durch Anionen, z . B . Acetat- und O H e - I o n e n ,
wesentlich beschleunigt (Abbn. 7 und 9 ) . In Metha-
1
2
3
Reaktionsdauer [StdnJ
4
*•
Abb. 7. Isomerisierung der Tetracarbonsäure b. Versuch in
Glasampullen. Je Ampulle 250 nMol krist. Tetracarbonsäure
in 0,5 ml 0,1 -n. Essigsäure (unteres Diagramm) bzw. 0,04-m.
Natriumacetat (oberes Diagramm). Die gefüllten Ampullen
wurden mit N2 bzw. CO begast und nach Zuschmelzen im
Dunkeln (—) bzw. im Licht ( — ) auf 40 °C erwärmt.
Abb. 8. Gleichgewichtslage der Reaktion Tetracarbonsäure a
Z^l Tentracarbonsäure b in wäßrigen Medien verschiedener
Acidität. Versuche in Glasampullen. Je Ampulle 250 nMol
krist. Tetracarbonsäure b in 0,5 ml Lösungsmittel (0,05-m.
Säure, Salz bzw. Puffer). Ampullen mit CO begast, anschließend zugeschmolzen und bis 5 Stdn. auf 40 °C unter Belichtung (Punkte) bzw. auf 70 °C im Dunkeln (Kreise) erhitzt.
Die Kurvenwerte entsprechen stets der Gleichgewichtslage.
Lösungsmittel (in Klammern pH-Werte) : Weinsäure (2,2) ;
Citronensäure (2,3); Milchsäure (2,47) ; Ameisensäure (2,5);
Bernsteinsäure (2,75); Essigsäure (3,05) ; NatriumacetatEssigsäure-Puffer (3,6; 4,0; 4,55; 5,0; 5,55) ; Natriumacetat
(7,1) ; Natriumcarbonat (12).
ab: in verdünnten mittelstarken organischen Säuren
xyle vorkommen
( p H 2 bis 3 ) liegen ca. 5 3 % , bei p H > 4 , 5 ca. 2 0 %
gut spaltbaren Carbonsäuren (Tab. 1) durch die An-
a-Form vor
nahme
(6 = 1 0 0 - a ) , wenn man von Ansätzen
in CO-Atmosphäre ** ausgeht (vgl. A b b . 8 ) .
13 ,
erklären,
läßt sich die Zahl der auffallend
daß
ein
bestimmtes
Propionat-
carboxyl die Spaltbarkeit zusätzlich fördert; vermut-
5. Die Gleichgewichtslage ist die gleiche, unabhängig davon, ob von Tetracarbonsäure der a- bzw. der
6-Form ausgegangen wird ( A b b . 9 ) .
lich ist dieses Carboxyl auf Grund seiner sterischen
Lage befähigt, zu dem H. 2 0-(bzw.
OH-) Liganden
eine H-Brücke zu bilden und dadurch seine Acidität
zu erhöhen 2 . Entsprechend dieser Auffassung ver-
90
halten sich bei der papierchromatographischen Spaltung in Alkohol-Wasser alle geprüften Carbonsäu-
| 80
ren gleich 2 .
£
Zur Bildung einer intramolekularen H-Brücke müssen zwar im allgemeinen besondere sterische Voraussetzungen erfüllt sein 14 , hier handelt es sich jedoch um
flexible Seitenketten, die in günstigen Fällen die hierzu
erforderlichen sterischen Voraussetzungen
erfüllen
dürften + . Weniger wahrscheinlich ist die intramolekulare Koordination des Carboxylat-Ions der betreffenden
Propionsäurekette direkt mit dem Kobaltatom; ein
solcher Komplex dürfte ein anderes Absorptionsspektrum haben 10.
^ 70
CO
£
60
50
40
In der Papierchromatographie dürften die sauren
30
Komponenten der Fließmittel nicht an der Spaltung
teilnehmen
20
am
Kobalt
gebunden
sein)
und
zwar aus folgendem Grunde: es bilden sich stets nur
10
zwei Zonen, unabhängig davon, ob das Fließmittel
0
1
2
Reaktionsdauer
3
eine Säure oder zwei Säuren enthält; die beiden Z o -
[Stdn]—>-
nen sind stets gleichfarbig, auch nach Belichtung;
Abb. 9. Isomerisierung von Tetracarbonsäure a (obere Kurvenschar) und Tetracarbonsäure b (untere Kurvenschar) in
Wasser. Je 250 nMol Tetracarbonsäure in 0,5 ml Wasser in
Glasampullen gefüllt, dann mit N2 bzw. CO begast und nach
Zuschmelzen im Dunkeln ( —) bzw. im Licht (- - -) auf 40 °C
erwärmt.
Cyanidaustausch
zwischen
und
Zwischen
(d. h. nicht als Liganden an Stelle des
Wassermoleküls
Tetracarbonsäure
Cobyrsäure
1 4 C-CN-Tetracarbonsäure
die relativen Intensitäten der Zonen sind von der
Konzentration der sauren Komponente (0,2-m. bzw.
0,6-m.)
Cobyr-
säure findet ein Cyanidaustausch statt, der bei 4 0 ° C
Fließmittels
unabhängig.
Eine
Teil-
Essigsäure) an der Bildung von zwei Zonen (davon
eine lichtempfindlich)
wurde bei
der
Papierchro-
matographie des Diaquocobinamides beobachtet 1 0 .
Die
und
des
nahme der sauren Komponente des Fließmittels (der
papierchromatographische
Cyano-aquo-corrinoide
hat
Spaltung
der
wahrscheinlich
die
gleiche Ursache wie die Spaltung in der CM- und
nach ca. 8 Stdn. zur Gleichgewichtseinstellung führt
P-Cellulose-Säule
(Tab. 6 ) . Analog durchgeführte Versuche ergaben,
säure1'2)
daß bei 4 ° C während 24 Stdn. nur ca. 10% der
chen die CD- und Absorptionsspektren der beiden
Radioaktivität auf Cobyrsäure übertragen werden.
Zonen von Substanzen, die papierchromatographisch
Diskussion
(hier
bei
Cobinamidphosphor-
und in der Elektrophorese. Dafür spre-
(Cobinamid, Cobyrsäure) bzw. säulenchromatographisch (Tetracarbonsäure, Cobinamidphosphorsäure)
Da bei den niederen ( M o n o - bis Tetra-) Carbonsäuren höchstwahrscheinlich nur Propionsäurecarbo** Unter N2 ist die Gleichgewichts-Einstellung oft schwcr zu
erreichen, aus den Abbn. 7 und 9 sowie aus Tab. 7 ist jedoch ersichtlich, daß unter CO und N2 die Gleichgewichtslage annähernd die gleiche ist.
+
14
So bildet z. B. die Acetamidgruppe c im Kristall der Cobyrsäure eine intramolekulare H-Brücke zum H20-Molekül am
Kobalt ( D . C . H O D G K I N , Privatmitteilung).
E. S. G O U L D , Mechanismus und Struktur in der Organischen
Chemie, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1962, S. 33
bis 34.
gespalten wurden; aus den genannten Spektren geht
ferner hervor, daß die Reihenfolge der Zonen (a =
langsam, b = schnell) in der CM- und P-CelluloseSäule sowie in der Papierchromatographie die
gleiche ist. Für die Übereinstimmung der Spaltungseffekte in der CM-Cellulose-Säule und in der Elektrophorese spricht u. a. die Beobachtung, daß die
beiden kristallinen Tetracarbonsäuren (gewonnen
mittels der CM-Cellulose-Säule) elektrophoretisch im
schwach sauren pn-Bereich einheitlich wandern (a
erwartungsgemäß schneller als b).
Die Kristallisation der Isomeren a und b der
Tetracarbonsäure dürfte nützlich sein, da das kristalline Isomerenpaar zur Klärung der Strukturunterschiede der Cyano-aquo-corrinoide der beiden
Reihen (a und b) auf kristallographischem W e g e
herangezogen werden kann. Die Cyano-aquo-carbonsäuren galten früher als schlecht kristallisierbar; als
einzige kristalline Substanz dieser Gruppe mit unverändertem Corrinring war die Cobyrsäure bekannt 12 . Die besonders einfache Herstellung der kristallinen Tetracarbonsäure b durch Beimpfung des
amorphen Niederschlages mit Kristallen beruht
wahrscheinlich auf direkter Umwandlung der amorphen Substanz, da deren Löslichkeit in Wasser zu
gering ist, um die relativ rasche Kristallisation
(welche oft nach wenigen Stdn. bei 20 ° C weit fortgeschritten ist) zu erklären. Die Tatsache, daß die
Substanz manchmal weitgehend quantitativ auskristallisiert und die Kristalle stets aus reiner 6-Form
bestehen, dürfte auf die Umwandlung a-Form —>
6-Form zurückzuführen sein. Die Herstellung der
beiden Tetracarbonsäuren in kristalliner thermostabiler Form ermöglichte das Studium der Isomerisierung dieser Substanzen auf breiterer Basis; die Kristalle stellten hierzu ein bequemes Ausgangsmaterial
mit konstanten Eigenschaften dar. Bei diesem Studium kamen uns auch die Erkenntnisse zugute, die
bei den Versuchen zur Übertragung des CN-Liganden von Tetracarbonsäure auf Aquocobalamin gewonnen worden waren 1 5 . Diese Versuche ergaben,
daß durch Erwärmen einer Mischung aus Tetracarbonsäure und Aquocobalamin in Wasser Cyanocobalamin und Diaquotetracarbonsäure
gebildet
wird und daß diese intermolekulare Wanderung des
CN-Liganden durch Anionen und durch Kohlenmonoxid stark stimuliert wird. Auf der gleichen
Linie lagen die Versuche mit 1 4 CN-Tetracarbon15
W .
FRIEDRICH U. R .
[1967].
BIEGANOWSKI,
Z. Naturforschg.
22
b,
741
säure und Cobyrsäure, welche ergaben, daß der CNLigand von Tetracarbonsäure auf Cobyrsäure übertragen wird und daß diese Übertragung ungefähr so
schnell abläuft wie die a-6-Isomerisierung der Tetracarbonsäuren. Da Tetracarbonsäure und Cobyrsäure
sich strukturell nur wenig unterscheiden, waren
diese Versuche aufschlußreich.
Die genannten Versuche mit Aquocobalamin und
Cobyrsäure lieferten uns einen Hinweis darauf, wie
die Isomerisierung der Tetracarbonsäuren vor sich
gehen kann. W i r führten anschließend sehr zahlreiche Versuchsreihen an krist. Tetracarbonsäuren
(hauptsächlich der 6-Form) durch, die dem Studium der Isomerisierungs-Geschwindigkeit gewidmet waren. Es ergab sich dabei eine weitgehende
Analogie mit der Bildung von Cyanocobalamin aus
Aquocobalamin und Tetracarbonsäure 1 5 , die sich
für die beiden Umsetzungen (Isomerisierung und
Cyanocobalamin-Bildung) wie folgt zusammenfassen läßt:
1. N 2 -Atmosphäre,
schwach
saures
Milieu:
sehr
langsame bzw. keine Reaktion,
2. N 2 -Atmosphäre, neutrales Milieu: schnelle Reaktion,
3. CO-Atmosphäre: sehr schnelle Reaktion bei allen
geprüften pn-Werten.
Diese Analogie, ferner die erwähnten Versuche
mit Cobyrsäure sowie schließlich die Beobachtung,
daß die Isomerisierungs-Reaktion
Ansätzen
langsamer
abläuft,
in verdünnteren
waren
Stütze für unsere bereits f r ü h e r 2 '
3
eine
starke
ausgesprochene
Hypothese, daß die beiden Tetracarbonsäuren sich
durch die Lage der CN-Gruppe am Kobalt unterscheiden
und
daß
intermolekularen
die
Isomerisierung
Austausch
auf
einem
des CN-Liganden
be-
ruht.
Bei Belichtung verhalten sich die beiden Reaktionen
verschieden (die Cyanocobalamin-Bildung wird nicht
beeinflußt, die Isomerisierungs-Reaktion wird stark beschleunigt) , vermutlich deshalb, weil im Aquocobalamin der CN-Ligand fehlt. Im übrigen spricht die
Lichtempfindlichkeit der Isomerisierungs-Reaktion für
den von uns angenommenen Isomerisierungs-Mechanismus, da sie darauf hinweist, daß der CN-Ligand (der
durch Licht abspaltbar ist 1 3 ) an der Isomerisierung beteiligt ist.
Fußend auf unseren früheren Versuchen
15 ,
führ-
ten wir die Isomerisierungs-Reaktionen stets in genau definierter Atmosphäre
Die
( 0 2 , N 2 , CO)
Reaktionsgeschwindigkeit
in
durch.
N 2 -Atmosphäre
dürfte als „ n o r m a l " gelten
15 .
Es wird
Der Mechanismus der
angenommen,
daß ein Austausch
der
Stimulation der Isomerisierungs-Reaktion durch CO
CN-Gruppen zwischen zwei Molekülen Tetracarbon-
ist unklar, da bisher nichts Näheres über die Wir-
säure sich im Rahmen eines Zusammenstoßes ab-
kung dieses Gases auf Corrinoide bekannt
spielt. Der Austausch selbst läuft wahrscheinlich so
ist 1 5 .
Vermutlich handelt es sich hier um die Bildung eines
ab, daß keine CN®-Ionen bzw. keine Blausäure an
kurzlebigen CO-Liganden am Kobalt
das
Abhängigkeit
der
15a >*.
Die pn-
Isomerisierungs-Reaktion
ist
Medium
abgegeben
frühere Versuche
15 ,
werden;
dafür
sprechen
in denen beim Durchleiten von
sicherlich auf eine Stimulierung des Cyanidaustau-
No bzw. CO durch eine Lösung von Tetracarbon-
sches durch Anionen zurückzuführen. Die
Acetat-
säure bei 70 ° C keine Blausäure nachgewiesen wer-
Ionen dürften dabei stärker stimulierend wirken als
den konnte sowie analoge Versuche (s. Versuchsteil)
Hydrogencarbonat-Ionen
mit
(Tab. 7 ) .
Die
Anionen
wirken hier wahrscheinlich als nucleophile Agenzien
1 4 CN-Tetracarbonsäure
(Begasung mit N 2 bei
PH 4 und 7 ) , die ebenfalls nicht für eine Abspaltung
auf das positive Kobaltatom und „lockern" so die
freier Blausäure sprechen. Dabei dürfte es im Prin-
Co-CN-Bindung,
zip gleichgültig sein, ob der CN-Ligand als Anion
die heterolytisch
gespalten
wird.
Licht dürfte dagegen eine Homolyse der Co-CN-Bin-
(im Falle einer Heterolyse, im Dunkeln) oder als
dung herbeiführen.
Radikal (im Falle einer Homolyse, im Licht) wan-
Das Gleichgewicht Tetracarbonsäure a ^
carbonsäure
b
(Abbn. 7 - 9 ,
findet
hängt
praktisch
nur
vom
Tetrapu
Tab. 7 ) . Im p H -Bereich 2,5 bis 4,5
eine drastische Veränderung
der
dert
Die obigen Versuche zeigen, daß der CN-Ligand
ab
Gleichge-
wichtslage statt, die als Folge der Ionisierung der
sich
(zumindest in den
durch
beträchtliche
Cyano-aquo-carbonsäuren)
Beweglichkeit
auszeichnet,
die
bisher nicht beobachtet w u r d e 1 3 .
vier Carboxylgruppen der Tetracarbonsäure aufzu-
Aus den CD-Spektren 3 von Cobinamid,
Cobyr-
fassen ist, da diese im gleichen pn-Bereich dissoziie-
säure, Tetracarbonsäure
ren (pk 3,15 bzw. 3,85 2 ) . Im schwach sauren pn-
säure (Tab. 3, A b b . 4 ) ist ersichtlich, daß die Iso-
Bereich (pn 2 — 3 ) liegen im Gleichgewicht ca. 5 3 %
meren a und b dieser Corrinoide sich strukturell
a-Form vor, was etwa der statistischen Verteilung
wahrscheinlich durch das gleiche Merkmal unterschei-
des CN-Liganden entspricht
und
Cobinamidphosphor-
(beim Cobinamid, in
den (was ja unserer Vorstellung entspricht). Es ist
dem die Seitenketten bei allen pn-Werten keine La-
von Bedeutung, daß im Bereich von 4 0 0 bis 6 0 0 nm
dung tragen, müßte stets ein ähnliches Gleichgewicht
die CD-Spektren
bestehen; vgl. Tab. 2 ) . Sind die Carboxylgruppen
auch der Cobyrsäure, dem CD-Spektrum des Cyano-
dissoziiert
(pn
>4,5),
dann wirken die
der
Cyano-aquo-corrinoide,
also
eigenen
cobalamins in seiner am 5.6-Dimethylbenzimidazol
Anionen auf den CN-Liganden zusätzlich ein und
protonierten F o r m 1 7 sehr ähnlich sind. Aus der gro-
zwar im Sinne einer einseitigen Beschleunigung der
ßen Ähnlichkeit der CD-Spektren der
Reaktion a < ± b , wodurch das Gleichgewicht in Rich-
(deren zumindest eine Form die CN-Gruppe „unten"
tung a - > b von ca. 5 3 % auf ca. 2 0 % a-Form ver-
trägt 1 8 ) und des protonierten Cyanocobalamins (mit
schoben wird **. Damit lieferte das Studium der Reak-
der CN-Gruppe „ o b e n " ) ist ersichtlich, daß die Um-
Cobyrsäure
tionsgeschwindigkeit eine starke Stütze für die von
kehr der Lage der Axialliganden ( — CN und — H 2 0 )
uns f r ü h e r 2 vorgeschlagenen
nur geringfügige Änderungen im CD-Spektrum her-
Tetracarbonsäuren
Strukturformeln
(CN-Ligand
in
der
der
a-Form
„ u n t e n " , in der 6-Form „ o b e n " ; vgl. A b b . 1 ) .
* Ebenso wahrscheinlich ist jedoch die Reduktion zu einem
Co (II) -Komplex 15.
15a Vgl. hierzu E. W . A B E L , Quart. Rev. 1 7 , 1 3 3
[1963].
** Anm. b. d. Korr.: Die pH-bedingte Gleichgewichtsverschiebung ist bei den Carboxyl-ärmeren Corrinoiden geringer
und bei den Phosphorsäure-haltigen Corrinoiden nicht vorhanden (W. F R I E D R I C H U . M . M O S K O P H I D I S , in Vorbereitung) .
+ Alle in wäßrigen Lösungen belichteten Proben der Tetracarbonsäure zeigen bei der CM-Cellulose-Chromatographie
eine (meist sehr schwache) sehr langsam wandernde Zone,
die wahrscheinlich der Diaquotetracarbonsäure entspricht
(im Dunkeln erw ärmte Proben enthalten diese Zone nicht).
vorruft
19 .
Diese Tatsache ist — bezogen auf die bei-
den Isomeren der Cyano-aquo-corrinoide
16
17
18
19
— nicht
Ein geringer Teil der durch Licht vermutlich gebildeten
CN'-Radikale 16 reagiert wahrscheinlich mit dem Lösungsmittel bzw. mit sich selbst unter Bildung von HCN, HOCN
und (CN)2 und entzieht sich dadurch der Reaktion mit
Kobalt.
K . YOSHIDA
U. S. T S U T S U M I , J . org. Chemistry 3 1 , 3635
[1966].
L . V E L L U Z , M. L E G R A N D U. M. G R O S J E A N , Optical Circular
Dichroism, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1965,
S. 168.
D . C. H O D G K I N , Zit. nach 1. c. I 3 .
Vgl. hierzu auch H . A . O . H I L L , J . M. P R A T T U. R. J . P.
W I L L I A M S , Proc. Roy. Soc. A 2 8 8 , 352 [1965].
überraschend, denn die Formen a und b sind — nach
unserer Auffassung — Diastereoisomere, wodurch
eine Bandenumkehr im CD-Spektrum bei einer Umkehr der Konfiguration am Kobalt nicht unbedingt zu
erwarten ist.
Die Absorptionsspektren der neutralen und sauren Cyano-aquo-corrinoide hängen ähnlich mit der
Struktur zusammen wie die CD-Spektren; dies
wurde am Beispiel der Isomerenpaare von Cobinamid, Cobyrsäure, Tetracarbonsäure und Cobinamidphosphorsäure gezeigt 3 . Die Unterschiede in
den Absorptionsspektren der Formen a und b entsprechen grob den Gesetzmäßigkeiten, die für die
Cobalamine mit verschiedenen Kohlenstoff-Liganden
gefunden w u r d e n 2 0 : die /-Bande verschiebt sich
längerwellig und verliert an Intensität (unter gleichzeitiger Intensitätszunahme der kürzerwelligen Band e n ) , wenn das C-Atom weniger elektronegativ
wird. Daraus könnte geschlossen werden, daß der
CN-Ligand in der Form a etwas elektronegativer
ist als in der Form b.
Experimenteller Teil
Allgemeine Bemerkungen. Chromatographie, Elektrophorese und sonstige Operationen an Cyano-aquocorrinoiden wurden, falls nicht anders angegeben, in
HCN-freier Atmosphäre bei 0 °C bzw. 3 °C und weitgehendst reduzierter Beleuchtung (die gerade die
Durchführung der Versuche erlaubte) bzw. bei voller
Dunkelheit durchgeführt.
Ausgangssubstanzen. Wenn nähere Angaben fehlen,
vgl. 1. c . 1 5 .
Papier Chromatographie. Papier Schleidler & Schüll
2043 a, fallweise gewaschen mit Wasser und sec. Butanol. Fließmittel: sec. Butanol mit 30% Wasser, enthaltend zusätzlich eine oder zwei organische Säuren
(vgl. Tab. 2). Belastung: ca. 50 nmol Corrinoid/cm.
Spektren. Absorptionsspektren: Beckman DU und
Bausch u. Lomb, Spectronic 505; CD-Spektren: Dichrograph der Fa. Societe Jouan, Paris; IR-Spektren:
Beckman IR 4 (die Substanzen waren hier fein verteilt in KBr-Scheiben eingepreßt; jeweils 0,3% Corrinoid in KBr).
Isomerisierung
der Tetracarbonsäuren. Als Reaktionsgefäße dienten 2 ml fassende Glasampullen
(Jenaer, braun bzw. Fiolax, farblos), die in manchen
Versuchen mittels einer Aluminiumfolie vor Licht geschützt waren. Für Versuche im Licht benützte man
Ampullen aus farblosem Glas. Zur Herstellung einer
wäßrigen Lösung von Tetracarborsäure b wurde die
Substanz vorher in etwas Methanol aufgenommen
2 0
J.
A.
1964,
HILL, J. M .
5149;
A 1966,187.
J.
P R A T T U. R .
M .
PRATT
U.
J. P .
R.
WILLIAMS, J.
G.
THORP,
J.
chem. Soc.
chem. Soc.
(0,1 ml MeOH je 1 mg Tetracarbonsäure) und erst
dann mit dem wäßrigen Medium versetzt. Füllen der
Ampullen mittels einer fein graduierten Injektionsspritze. Zum Durchleiten von Gas ( 0 2 , N 2 , CO) durch
den Ampulleninhalt diente eine Injektionskanüle. Begasung stets während 15 Min. bei 0 °C. Zuschmelzen
noch während der Begasung, um das Eindringen von
Luft in die Ampulle zu verhindern. Zur Herkunft und
Reinigung der Gase vgl. 1. c . 1 5 . Erwärmung und Belichtung (Lampe Philips A5, 25 Watt, 50 cm Entfernung) des Ampulleninhalts erfolgten im Wasserbad
(vgl. 1. c . 1 5 ) . Analyse der Versuche mittels CM-Cellulose-Säulenchromatographie 1 (Säulen 0,7-12 cm bis
0,7-21 cm, Entwickler: Wasser). Nach erfolgter Isomerenspaltung wurden die Säulen zerschnitten, die
Substanzen mittels 1-proz. KCN-Lösung eluiert und
nach Zusatz von etwas KCN photometrisch bei 367 nm
gemessen. Die meisten Versuchsreihen wurden mehrmals durchgeführt, wobei gewöhnlich die Art des Ampullenglases und des Lichtschutzes (z. B. zusätzlicher
Lichtschutz durch Einwickeln der Ampullen in Aluminiumfolie bzw. Verzicht darauf unter strengerer Raumverdunkelung) geändert wurde.
Kristallisation der Tetracarbonsäure b. Durchführung bei Zimmertemperatur. 130 mg Tetracarbonsäure
(NH 4 -Salz) in ca. 50 ml Wasser werden in eine CMCellulose-Säule (2,3-25 cm) gefüllt, sorgfältig mit
Wasser gewaschen und mit 2-proz. Blausäure eluiert.
Nach Einengen des dunkelvioletten Eluates im Vakuum
auf ca. 15 ml fällt die Tetracarbonsäure in Form amorpher Flocken aus, die nach Beimpfen mit krist. Tetracarbonsäure b bei Zimmertemperatur während ca.
48 Stdn. in feinen haarförmigen Nadeln kristallisieren.
Die Substanz wird abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Dunkeln über Ätznatron aufbewahrt. Ausbeute 105 mg. Die Substanz besteht aus
reiner Form b.
C 4 6 H 6 4 0 1 2 N 8 Co (980,02)
Ber.
Gef.
C 56,38 H 6,58 N 11,43,
C 56,51 H 6,52 N 11,62.
(Einwaage 3,750 mg)
Beim Trocknen bei 100 °C im Hochvakuum 4,32%
Wasserverlust, entsprechend ca. 2,5 Mol H 2 0 je 1 Mol
Tetracarbonsäure b.
Kristallisation der Tetracarbonsäure a. 100 mg Tetracarbonsäure (NH 4 -Salz) in 30 ml Wasser in eine
CM-Säule (2-15 cm) gefüllt. Beim Waschen mit Wasser spaltet sich die Substanz in zwei Zonen, a und b.
Die Säule wird zerschnitten und die Zone a mit Wasser
eluiert. Die Lösung wird rasch im Vakuum auf einige
ml eingeengt (oder lyophilisiert und der Rückstand anschließend in einigen ml Wasser gelöst). Die Substanz
kristallisiert meist während des Einengens in winzigen
Rhomboiden. Die Kristalle werden mit wenig kaltem
Wasser gewaschen und über Ätznatron aufbewahrt. Die
Substanz besteht aus reiner Form a.
C 4 6 H 6 4 0 1 2 N 8 Co (980,02)
Ber.
Gef.
C 56,38 H 6,58 N 11,43,
C 56,52 H 6,42 N 11,34.
(Einwaage 4,219 mg)
Beim Trocknen bei 100 °C im Hochvakuum 6,16%
Wasserverlust, entsprechend ca. 3,5 Mole H 2 0 je 1 Mol
Tetracarbonsäure a.
Markierung der Tetracarbonsäure mit 14C-NaCN.
1000 nMol Tetracarbonsäure in ca. 5 ml Wasser werden mit 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend ca.
2,5 /xC 14C-NaCN (entsprechend ca. 70 nMol NaCN)
versetzt und nach ca. 2 Stdn. bei 20 °C mit Hilfe einer
CM-Cellulose-Säule (0,7 • 7 cm) chromatographiert.
Radioaktivitätsmessungen. Die zu messende wäßrige
Probe (2,0 ml) wird mit 15 ml Scintillator (7 g 2.5-Diphenyloxazol, 0,3 g 1.4-Di-[2-(5-phenyloxazolyl)]-benzol und 50 g Naphthalin je 1000 ml Dioxan) gemischt
und in 20 ml-Meßgläschen mit Schraubverschluß (Fa.
Packard) gemessen. Meßgerät: Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer Modell 314-DC, Hochspannstufe
3 (810 V ) .
Versuch zur Abspaltung von HUCN aus UCN-Tetracarbonsäure. 50 nMol 14 CN-Tetracarbonsäure in 3 ml
0,04-m. Natriumacetat-Puffer (PH 4 bzw. 7) werden
bei 70 °C während 10 Stdn. mit N 2 begast und das
Gas (aus dem Ansatz) durch eine Gaswaschflasche
mit 0,1-ra. KOH geleitet. Es wurden stets nur ca. 2%
der ursprünglichen Radioaktivität der Tetracarbonsäure in der Gaswaschflasche gefunden.
Wir danken der D e u t s c h e n
Forschungsg e m e i n s c h a f t und der J o a c h i m - J u n g i u s G e s e l l s c h a f t d e r W i s s e n s c h a f t e n e. V.,
Hamburg, für die Unterstützung dieser Arbeit. Wir
sind ferner zu Dank verpflichtet: Prof. Dr. J. K Ü H N A U
für sein ständiges Interesse an unserer Arbeit und erwiesene Hilfe, Doz. Dr. H. P A U L S E N , Hamburg, und
Doz. Dr. G. S N A T Z K E , Bonn, für die Aufnahme und Diskussion der CD-Spektren, Dr. Dr. W. A R N O L D , Hamburg,
für die IR-Spektren und Dr. H. E C K S T E I N , Hamburg, für
die Mikroaufnahmen von Kristallen.
Immunochemical Studies on Myxoviruses
I. Heterogeneity of V-Antigens Obtained by Disruption Influenza Viruses
A . ROBERT NEURATH,
B. A . RUBIN
and
WALTER
A .
PIERZCHALA
Department of Research and Development, Wyeth Laboratories, Inc., Philadelphia, Pa., U.S.A.
( Z . N a t u r f o r s c h g . 22 b, 8 5 0 — 8 5 5
[ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 11. N o v e m b e r 1966)
Disruption of four different influenza viruses (strains A/PR8, At/Ann Arbor/1/57, A2/Japan/
170/62 and B/Maryland 1/59) by Tween-ether or sodium deoxycholate leads to polydisperse populations of strain-specific immunoprecipitating antigens which occur both associated with or separately from hemagglutinins and which seem to be heterogeneous with respect to antibody binding
sites. Besides yielding hemagglutinins with a sedimentation coefficient of about 70 s, Tween-ether
treatment also yields smaller 9 s antigens. A similar antigen is released from A/PR8 virus by
trypsin treatment. Treatment of the B/Maryland/1/59 virus with sodium deoxycholate results in the
release of a 9 s precipitating antigen, but more rapidly sedimenting antigens are obtained with the
other virus strains.
Despite extensive studies on influenza viruses, the
f o r other protein a n t i g e n s 4 - 7 , still awaits experi-
molecular basis of their antigenic variability still
mental verification in the case of influenza viruses.
remains unclear. Although evidence has been found
Genetic studies on Asian influenza viruses have
for the existence of at least 3 to 5 distinct poly-
revealed that altered antigenicity can be inherited
peptide chains in influenza virus proteins
1_3,
their
independently
on
other
markers,
including
the
relationship to antigenic specificity is not yet firmly
character of hemagglutinin 8 , and recent experiments
established. The contribution of proper assembly of
have directly proved the existence of strain-specific
the polypeptide chains into larger units (quarternary
antigens
structure) to antigenic specificity, though confirmed
glutinins
1
2
3
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5
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