Funktion der Ammoniumtransporter AmtA und AmtB in

Funktion der Ammoniumtransporter AmtA und AmtB in
Corynebacterium glutamicum
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Britta Svenja Walter
aus Neuss
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
09. August 2007
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Burkovski
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Reinhard Krämer
INHALTSVERZEICHNIS
I
1
Zusammenfassung ........................................................................................ 1
2
Einleitung ...................................................................................................... 3
3
2.1
Corynebacterium glutamicum ................................................................................ 3
2.2
Ammoniumassimilation in C. glutamicum ............................................................. 6
2.3
Stickstoff-abhängige Regulation ............................................................................. 7
2.4
Ammoniumtransport in C. glutamicum ............................................................... 13
2.5
Zielsetzung dieser Arbeit ....................................................................................... 17
Material und Methoden ............................................................................. 18
3.1
Bakterienstämme und Plasmide ........................................................................... 18
3.2
Nährmedien und Kultivierungsbedingungen ...................................................... 22
3.2.1
Nährmedien für E. coli ..................................................................................... 22
3.2.2
Nährmedien für C. diptheriae, C. efficiens, C. glutamicum und C. jeikeium... 22
3.2.3
Antibiotika........................................................................................................ 23
3.2.4
Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 23
3.3
Biochemische Techniken........................................................................................ 25
3.3.1
Bestimmung der Methylammoniumaufnahme................................................. 25
3.3.2
Bestimmung von Methylammonium im Überstand ......................................... 25
3.3.3
Untersuchung des Methylammonium-Metabolismus ...................................... 26
3.3.4
Herstellung von Zellextrakten .......................................................................... 26
3.3.5
Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry......................................... 27
3.3.6
Ethanolische Zellextraktion.............................................................................. 27
3.3.7
Aminosäurebestimmung mittels reversed phase HPLC .................................. 28
3.3.8
Bestimmung von Enzymaktivitäten ................................................................. 29
3.3.8.1
Unphysiologischer Glutaminsynthetase-Test (Glutamyl-Transferase-Test) 29
3.3.8.2
Bestimmung der Glutamatdehydrogenaseaktivität ...................................... 30
3.3.9
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)....................................... 32
3.3.10
Färbung mit Coomassie Brilliant Blue............................................................. 33
3.3.11
Western Blot..................................................................................................... 33
3.4
Molekularbiologische Techniken .......................................................................... 35
3.4.1
DNA-Techniken ............................................................................................... 35
3.4.1.1
Plasmid-Präparationen aus E. coli................................................................ 35
3.4.1.2
Präparation chromosomaler DNA aus C. glutamicum ................................. 35
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1.3
Reinigung und Konzentrierung von DNA ................................................... 36
3.4.1.4
Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA ............................................ 36
3.4.1.5
Restriktion von DNA ................................................................................... 37
3.4.1.6
Ligation von DNA-Fragmenten ................................................................... 37
3.4.1.7
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)............................................................... 37
3.4.1.8
Interaktionsstudien mit dem Two Hybrid-System........................................ 38
3.4.1.9
Sequenzierung von DNA ............................................................................. 40
3.4.2
RNA Techniken................................................................................................ 40
3.4.2.1
Präparation von Gesamt-RNA und RNA-Gelelektrophorese ...................... 41
3.4.2.2
RNA-Hybridisierungen ................................................................................ 42
3.4.2.3
Waschen und Detektion der RNA-Hybridisierungen................................... 43
3.4.2.4
Präparation von RNA-Sonden durch in-vitro-Transkription ....................... 44
3.4.2.5
Quantitative Real Time RT PCR .................................................................. 45
3.5
4
II
Techniken zur Manipulation von Zellen.............................................................. 47
3.5.1
Herstellung kompetenter E. coli-Zellen ........................................................... 47
3.5.2
Transformation von kompetenten E. coli-Zellen ............................................. 47
3.5.3
Herstellung kompetenter C. glutamicum-Zellen .............................................. 48
3.5.4
Elektroporation von kompetenten C. glutamicum-Zellen ................................ 48
3.5.5
Konstruktion von Deletionsmutanten............................................................... 49
Ergebnisse ................................................................................................... 50
4.1
Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum ................................................... 50
4.1.1
Methylammoniumaufnahme der Transporter AmtA und AmtB...................... 50
4.1.2
Stickstoffkontrolle in den C. glutamicum-Stämmen LN-1.1, MJ2-38 ................
und JS-1............................................................................................................ 53
4.1.3
4.2
Diffusion von Methylamin ............................................................................... 56
Untersuchungen zur Funktion von AmtB............................................................ 58
4.2.1
Inhibition der Methylammoniumaufnahme durch Ammonium ....................... 58
4.2.2
Membranpotentialabhängigkeit der AmtB-Aktivität ....................................... 59
4.2.3
Ionenabhängigkeit der AmtB-Aktivität............................................................ 60
4.3
4.3.1
Strukturelle Betrachtung zu AmtA und AmtB ................................................... 61
Vergleich von AmtA und AmtB aus C. glutamicum mit Amt-Proteinen ...........
aus E. coli, Archaeoglobus fulgidus und L. esculentum................................... 61
INHALTSVERZEICHNIS
4.4
III
Methylammoniumaufnahme und metabolic trapping ......................................... 65
4.4.1
Verschiedene Techniken zur Ermittlung der Methylammoniumaufnahme
unabhängig von der Metabolisierung des Substrats ......................................... 66
4.4.2
Ermittlung
der
Methylammoniumaufnahme
unabhängig
von
der
Metabolisierung des Substrats durch Deletionsmutation ................................. 68
4.5
Untersuchung von AmtA unabhängig von Metabolisierung.............................. 74
4.5.1
Charakterisierung Mek-1.................................................................................. 75
4.5.2
Charakterisierung der AmtA-vermittelten Methylammoniumaufnahme ......... 77
4.5.3
Akkumulation von Methylammonium ............................................................. 79
4.6 Untersuchung
von
C.
glutamicum-Deletionsmutanten
bezüglich
der
Methylammoniumaufnahme ..................................................................................... 81
4.7 Interaktionen
von
AmtA
und
AmtB
mit
anderen
Komponenten
der
Stickstoffkontrolle ...................................................................................................... 87
4.7.1
Two Hybrid-Interaktionsstudien....................................................................... 87
4.7.2
Wechselwirkung zwischen AmtA und GS....................................................... 89
4.7.2.1 Einfluss
von
Glutamin
und
MSX
auf
die
AmtA-vermittelte
Methylammoniumaufnahme............................................................................. 90
4.7.3
Untersuchung von GlnE ................................................................................... 93
4.7.3.1
5
Stickstoffkontrolle in LNGLNE................................................................... 94
4.8
Methylammoniumaufnahme unter Stickstoffüberschuss................................... 97
4.9
(Methyl-)Ammoniumaufnahme in Corynebakterien.......................................... 99
Diskussion.................................................................................................. 101
5.1
Die Rolle von AmtB.............................................................................................. 102
5.2
AmtA – Transporter von NH3 oder NH4+? ........................................................ 104
5.3
C. glutamicum und metabolic trapping................................................................ 106
5.4
Einfluss von Metaboliten auf die Methylammoniumaufnahme....................... 108
5.5 Interaktion der Ammoniumtransporter mit Komponenten der ...............................
Stickstoffkontrolle ................................................................................................ 110
5.6
6
Stickstoffkontrolle in Corynebakterien.............................................................. 111
Anhang....................................................................................................... 113
6.1
Autoregulation des globalen Stickstoffregulators AmtR.................................. 113
6.2
Plasmidkonstruktionen........................................................................................ 115
INHALTSVERZEICHNIS
6.3
IV
Stammkonstruktionen ......................................................................................... 117
Literaturverzeichnis........................................................................................ 118
Eigene Publikationen ...................................................................................... 132
Symbol- und Abkürzungsverzeichnis............................................................ 133
ZUSAMMENFASSUNG
1
1 Zusammenfassung
AmtA
und
AmtB
aus
Corynebacterium
glutamicum
gewährleisten
unter
Stickstoffmangelbedingungen die Versorgung der Zellen mit Ammonium. Ebenso wie für die
weiteren Mitglieder der Amt/MEP/Rh-Proteinfamilie, ist auch für AmtA und AmtB der
Mechanismus der Translokation von Ammonium nicht vollständig verstanden. In dieser
Arbeit wurde die Aktivität der beiden Transportproteine charakterisiert. Aufnahmestudien
legten nahe, dass es sich bei AmtB, ähnlich wie beim Amt-Homolog aus Escherichia coli, um
einen Kanal handelt, der Ammonium bindet, dieses deprotoniert und schließlich ungeladenes
Ammoniak über die Membran transportiert.
In E. coli scheint die GS-Aktivität die treibende Kraft des AmtB-vermittelten Transports zu
sein. Durch die Metabolisierung wird eine Zugwirkung auf das Substrat ausgeübt, da durch
die Verstoffwechselung ein Konzentrationsgradient aufrechterhalten wird, an dem entlang
Ammonium bzw. Ammoniak in die Zelle gelangt. Innerhalb dieser Arbeit konnte erstmals ein
bakterielles Amt-Protein in der natürlichen Membranumgebung unabhängig von der
Substratmetabolisierung untersucht werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass entgegen dem
E. coli-Modell, die Aktivität des AmtA-Proteins aus C. glutamicum unabhängig von der
Verstoffwechselung des Substrats in der Zelle ist. Außerdem wurde gezeigt, dass AmtA
membranpotentialabhängig Methylammonium in der Zelle akkumuliert. Anhand dieser Daten
wurde
geschlussfolgert,
dass
es
sich
bei
AmtA
um
einen
aktiven
(Methyl-)Ammoniumtransporter handelt.
Verschiedene Metabolite des Stickstoffmetabolismus hatten auf die Aktivität von AmtA und
AmtB kaum Auswirkungen. Die bestehende Annahme, dass die interne Konzentration von
Glutamin nicht den Stickstoffstatus der Zelle signalisiert, wurde bestätigt.
Interaktionsstudien, mit denen Wechselwirkungen zwischen AmtA und AmtB und anderen
Proteinen des Stickstoffstoffwechsels in C. glutamicum untersucht wurden, konnten zeigen,
dass AmtA mit zwei Enzymen interagierte. Die Untersuchug der entsprechenden
Deletionsmutante
zeigte,
dass
das
Fehlen
des
einen
Enzyms
sich
auf
die
Methylammoniumaktivität von C. glutamicum auswirkte.
Durch Feststellung der Methylammoniumaufnahme in verschiedenen Corynebakterien konnte
der Verlust von Genen des Stickstoffmetabolismus in pathogenen Corynebakterien im
Vergleich zu nicht-pathogenen Organismen dieser Gattung dokumentiert werden.
SUMMARY
2
1 Summary
During periods of ammonium limitation Corynebacterium glutamicum employs AmtA and
AmtB to ensure ammonium transport into the cell. Ammonium transporters have been
identified and partly characterized from all domains of life. However, the underlying transport
mechanisms remain unclear. Thus, this work aimed at the examination of AmtA and AmtB
activity to draw conclusions on substrate translocation. Uptake studies indicated that AmtB
from C. glutamicum acts as a channel, which binds ammonium and after deprotonation
conducts ammonia. This corresponds to the model of substrate conductance which is
proposed for Escherichia coli AmtB.
In E. coli the activity of the assimilating enzyme GS seems to be the driving force for the
uptake of ammonia. The fast intracellular metabolization of the substrate maintains a
concentration gradient responsible for the ongoing facilitated diffusion of ammonia into the
cell. In contrast, this investigation of an Amt-protein in the natural context of its membrane
environment decoupled from subsequent metabolization reveleaed, that transport by AmtA is
independent from GS and other assimilating enzymes. Further results indicated, that AmtA
accumulates methylammonium in dependance of the membrane potential. On the basis of
these data it was concluded that AmtA is an active (methyl-)ammonium carrier.
Different metabolites of nitrogen metabolism had no severe effects on the activity of AmtA
and AmtB. The assumption, that internal glutamine is not the signal of the nitrogen status of
the cell, could be confirmed.
Bacterial two hybrid-studies indicated that AmtA interacts with two enzymes of the nitrogen
metabolism in C. glutamicum. Further studies confirmed these results for one of these
enzymes as the deletion of the corresponding gene led to a decrease of methylammonium
uptake activity.
The comparison with three other species of Corynebacterium revealed a broader spectrum of
genes for nitrogen transport and metabolism in non-pathogenic soil-living bacteria. Thus,
methylammonium uptake could be determined only for the non-pathogenic, but not for
pathogenic corynebacteria.
EINLEITUNG
3
2 Einleitung
Als Bestandteil von Makromolekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren ist Stickstoff ein
essentielles Element für alle Lebewesen. Die schnelle Anpassung an die gegebene
Stickstoffsituation ist daher für Mikroorganismen von zentraler Bedeutung. Aus diesem
Grund haben die meisten Mikroorganismen Mechanismen entwickelt, um in Abhängigkeit
von der Stickstoffverfügbarkeit die optimale Versorgung und damit die Aufrechterhaltung des
Stoffwechsels zu gewährleisten. Diese Regulationsmechanismen werden unter dem Begriff
Stickstoffkontrolle zusammengefasst. Zu diesen regulierten Prozessen gehören auch die
Aufnahme und die Verstoffwechselung der Stickstoffquelle Ammonium. Die Untersuchung
dieser Abläufe in C. glutamicum stand im Mittelpunkt dieser Arbeit.
2.1 Corynebacterium glutamicum
Als 1896 erstmals die Gattung Corynebacterium definiert wurde, wurde damit eine vielfältige
Gruppe von verschiedenen Mikroorganismen aufgrund von morphologischen Ähnlichkeiten
zusammengefasst (Lehmann & Neumann, 1896). Bei den beschriebenen Organismen handelte
es sich um eine heterogene Gruppe von unbeweglichen, pathogenen oder parasitären
Organismen. Erst mit der Möglichkeit der Sequenzierung konnte auch die Gattung
Corynebacterium genauer definiert werden. Die Gattung gehört zur großen Gruppe von
Gram-positiven Bakterien, deren DNA sich durch hohen G+C-Gehalt auszeichnet. Aufgrund
des hohen G+C-Gehalts und der komplexen Mykolsäure-haltigen Zellwand zählen
Corynebakterien phylogenetisch zu den Mykolsäure-haltigen Actinomyceten (Stackebrandt et
al.,
1997).
Coryneforme
Bakterien
sind
aerobe,
unbewegliche,
stäbchenförmige
Mikroorganismen mit den charakteristischen Kennzeichen, während des Wachstums
unregelmäßig geformte, keulen- oder V-förmige Zellanordnungen zu bilden. Die
keulenförmige Gestalt war dabei sogar namensgebend für diese Gattung (koryne = Keule
(griech.)). Die V-förmige Zellanordnung ist die Folge der besonderen Zellteilung (snapping
division), bei der die Zellen vor der eigentlichen Teilung noch seitlich miteinander verbunden
bleiben (siehe Abb. 2.1).
EINLEITUNG
4
A
B
Abb. 2.1: C. glutamicum-Zellen. Die Zellen wurden mit Licht (A)- und Elektronenmikroskopie (B) visualisiert.
Die namensgebende keulenförmige Morphologie und die Ausbildung einer V-Form während der Zellteilung sind
erkennbar (Quelle: Handbook of Corynebacterium glutamicum).
Der bekannteste und zuerst beschriebene Vertreter der Gattung ist Corynebacterium
diphtheriae, der Erreger der Atemwegserkrankung Diphtherie (Lehmann & Neumann, 1896).
C. diphtheriae-Stämme, die durch einen Bakteriophagen (den β-Phagen, der das
toxinkodierende tox-Gen trägt) lysogeniert werden, bilden das Diphtherietoxin. Dieses
hochwirksame Exotoxin inhibiert die eukaryotische Proteinsynthese und tötet so die Zellen
des Wirtes. Aus den abgestorbenen Wirts- und C. diphtheriae-Zellen bilden sich so genannte
Pseudomembranen, die im Verlauf der Krankheit den Luftstrom des Patienten blockieren und
zusammen mit der Gewebezerstörung durch das Toxin zum Tode des Patienten führen. Der
zur Verfügung stehende Impfstoff hat die Ausbreitung der Krankheit weitestgehend
eingedämmt. Im Jahr 2003 wurde die Genomsequenz dieses Organismus veröffentlicht
(Cerdeno-Tarraga et al., 2003).
Ein weiterer pathogener Vertreter dieser Gattung ist Corynebacterium jeikeium, ein
Bestandteil der auf der menschlichen Haut zu findenden Bakterienflora. Erstmals isoliert
wurde C. jeikeium aus der Achselhöhle eines Patienten, dessen Immunsystem aufgrund einer
Knochenmarkstransplantation durch Behandlung mit Immunsuppressiva geschwächt war. Die
Besiedlung
mit
C.
jeikeium
hat
bei
gesunden
Personen
keine
Auswirkungen,
immungeschwächte Personen sowie Personen mit Hautverletzungen hingegen können durch
C. jeikeium schwere Infektionen erleiden. Da sich dieser Erreger häufig in Krankenhäusern
findet, wird er zu den nosokomialen Pathogenen gezählt („Nosokomien“: Räumlichkeiten in
den Heilstätten im alten Griechenland). C. jeikeium gehört zu den so genannten „lipophilen“
Corynebakterien, d. h., das Wachstumsverhalten kann durch Zugabe von Fettsäuren ins
EINLEITUNG
5
Kulturmedium positiv beeinflusst werden. Dies kann dadurch erklärt werden, dass im
C. jeikeium-Genom ein Gen, dass für eine Fettsäuresynthase kodiert, fehlt (Tauch et al.,
2005). Die Aufnahme von externen Fettsäuren ist für C. jeikeium daher unerlässlich. Die
menschliche Haut, die von einem Film von Triglyceriden und Fettsäuren überzogen ist, ist
daher das ideale Habitat für C. jeikeium.
Bei der Suche nach einem hitzetoleranten Bakterium, das in der fermentativen Produktion von
Aminosäuren eingesetzt werden sollte, wurde Corynebacterium efficiens aus Bodenproben
und Zwiebelknollen isoliert (Fudou et al., 2002). Aufgrund der Temperaturtoleranz dieses
Bakteriums sollten die Kosten der fermentativen Herstellung von Aminosäuren gesenkt
werden, da eine teure Kühlung des Prozesses nicht mehr notwendig wäre.
Ein sehr enger Verwandter von C. efficiens ist C. glutamicum, der ebenfalls zu den
Aminosäure-produzierenden Corynebakterien zählt. Im Gegensatz zu den humanpathogenen
Vertretern, C. diphtheriae und C. jeikeium, wird C. glutamicum als apathogen eingestuft.
Aufgrund der guten Handhabbarkeit, des gut untersuchten Zentralmetabolismus und des
großen Repertoires an etablierten molekularbiologischen Methoden eignet sich C. glutamicum
als Modellorganismus sowohl für Gram-positive, als auch speziell für mykolsäurehaltige
Actinomyceten.
Innerhalb eines großangelegten Screening-Projektes zur Isolierung von Glutamatproduzierenden Mikroorganismen, wurde C. glutamicum erstmals aus Bodenproben aus dem
Ueno Zoo in Tokio isoliert (Kinoshita et al., 1957). Innerhalb dieser Untersuchungen zeigte
sich, dass C. glutamicum unter Biotinlimitierung Glutamat im Medium akkumuliert. Durch
kontinuierliche Stamm- und Prozessentwicklung wuchs auch die biotechnologische
Bedeutung von C. glutamicum. Heute gilt C. glutamicum als einer der wichtigsten
biotechnologisch genutzten Organismen. Inzwischen werden pro Jahr 1,5 Millionen Tonnen
L-Glutamat
und
ca.
650.000 Tonnen
L-Lysin
durch
Fermentation
verschiedener
C. glutamicum-Stämme produziert (Leuchtenberger et al., 2005). L-Glutamat wird in Form
seines Natriumsalzes in der Lebensmittelindustrie als Geschmacksverstärker eingesetzt, während L-Lysin als Futtermittelzusatz in der Viehhaltung benötigt wird und in der
pharmazeutischen Industrie Verwendung findet. Außerdem werden mit C. glutamicum andere
industriell bedeutsame Verbindungen wie die Aminosäuren L-Alanin, L-Isoleucin und LProlin sowie einige Vitamine und Nukleotide fermentativ hergestellt (Leuchtenberger et al.,
2005).
EINLEITUNG
6
Im Zuge der wachsenden wirtschaftlichen Bedeutung C. glutamicums wurde auch die
Erforschung dieses Organismus in den letzten Jahrzehnten verstärkt betrieben. Die
Genomsequenz wurde inzwischen veröffentlicht (Ikeda & Nakagawa, 2003; Kalinowski et
al., 2003). Ebenso konnten Kohlenstoffmetabolismus und Aminosäurebiosynthesewege
aufgeklärt werden. Viele der beteiligten Enzyme wurden bereits biochemisch charakterisiert
und die Erforschung der Metabolitenflüsse (Fluxom) trägt zum besseren Verständnis
interagierender Stoffwechselwege bei (siehe bspw. Dominguez et al., 1998; Tesch et al.,
1999; Kiefer et al., 2004; Krömer et al., 2004). Das komplexe Netzwerk der
Stickstoffkontrolle wurde hauptsächlich in den letzten Jahren untersucht (Burkovski, 2003a,
2003b, 2005).
2.2 Ammoniumassimilation in C. glutamicum
C. glutamicum ist in der Lage, verschiedene Stickstoffquellen zu nutzen. Die Aufnahme in die
Zelle kann dabei durch passive Diffusion oder einen aktiven Transportprozess erfolgen.
Ammonium gilt als die bevorzugte Stickstoffquelle. Die konjugierte Säure Ammonium
befindet sich mit der Base Ammoniak im Gleichgewicht. Bei hohen Konzentrationen von
Ammonium/Ammoniak außerhalb der Zelle ist die Diffusion des ungeladenen Ammoniak
ausreichend, um das Wachstum der Zelle zu gewährleisten. Das so in die Zelle gelangte
Ammoniak wird in der Zelle protoniert und über die Glutamatdehydrogenase (GDH, kodiert
von gdh) assimiliert. Die GDH katalysiert die oxidative Aminierung des Ammoniums auf
α-Ketoglutarat unter Bildung von L-Glutamat, wobei ein Mol NADPH pro Mol umgesetztes
Ammonium verbraucht wird. Bei GDH handelt es sich um ein niedrigaffines Enzym. Neben
der Assimilation über die GDH steht der Zelle noch ein weiterer Weg zur Verfügung, nämlich
Ammonium über die Glutaminsynthetase (GS, kodiert von glnA) zu assimilieren. Dieses
Enzym unterliegt jedoch bei guter Stickstoffversorgung einer Aktivitätsregulation durch
posttranslationale Adenylylierung und übernimmt nur 28 % der Ammoniumassimilation
(Tesch et al., 1999). Verringert sich die Konzentration von Ammonium im Medium und es
kann durch Diffusion nicht mehr genug Ammoniak/Ammonium in die Zellen aufgenommen
werden, um das Wachstum der Zelle zu sichern, wird Ammonium nicht länger über die
niedrigaffine GDH, sondern über die GS assimiliert, die dazu zunächst durch die ATase
(kodiert von glnE) deadenylyliert wird. Die GS besitzt eine hohe Substrataffinität und
überträgt Ammonium unter ATP-Verbrauch auf L-Glutamat, wobei L-Glutamin entsteht.
EINLEITUNG
7
L-Glutamin kann von der Glutamatsynthase (GOGAT, kodiert von gltBD) mit α-Ketoglutarat
in einer NADPH-H+-abhängigen Reaktion zu L-Glutamat umgesetzt werden. Um die
Bereitstellung von Glutamin für die Zelle zu gewährleisten, ist die GS auch unter
Stickstoffüberschuss teilweise aktiv, dennoch wird unter diesen Bedingungen die weniger
energieaufwändige GDH-katalysierte Reaktion bevorzugt.
A: Stickstoffüberschuss
α-Ketoglutarat + NH4+ + NADPH+H+
GDH
L-Glutamat + NADP+
B: Stickstoffmangel
L-Glutamat + NH4+ + ATP
L-Glutamin + α-Ketoglutarat + NADPH+H+
GS
GOGAT
L-Glutamin + ADP
2 L-Glutamat + NADP+
Abb. 2.2: Ammoniumassimilation in C. glutamicum. Unter Überschussbedingungen wird Ammonium über die
Glutamatdehydrogenase (GDH) assimiliert, während die Assimilation bei Mangelbedingungen für die Zelle
energieaufwändig ist und von den Enzymen Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOGAT)
katalysiert wird (nach Tesch et al., 1999).
2.3 Stickstoff-abhängige Regulation
Unter dem Begriff Stickstoffkontrolle werden Regulationsmechanismen zusammengefasst,
mit denen Mikroorganismen auf Aktivitäts- wie auch Transkriptionsebene Aufnahme und
Assimilation von Stickstoffquellen der aktuellen Verfügbarkeit von Stickstoffquellen
anpassen. Zunächst wurde das Modell zur Stickstoffkontrolle für das Gram-negative
Enterobakterium E. coli beschrieben (Merrick & Edwards, 1995; Reitzer, 2003; Ninfa &
Jiang, 2005). Zwei Proteine spielen innerhalb der Aktivitätsregulation tragende Rollen: die
Uridylyltransferase (UTase, kodiert von glnD) und das Signaltransduktionsprotein PII (kodiert
von glnB). Das bifunktionelle Enzym UTase reagiert auf die in der Zelle vorhandene Menge
an Glutamin. Bei guter Stickstoffversorgung ist die Konzentration von Glutamin in der Zelle
hoch, die uridylylierende Aktivität des Enzyms wird inhibiert und die deuridylylierende
Aktivität induziert (Javelle et al., 2004; Ninfa & Jiang, 2005). Bei Stickstoffmangel ist die
EINLEITUNG
8
Affinität der Glutamatdehydrogenase (GDH, kodiert von gdh) nicht ausreichend, um die
geringen Mengen an Ammonium in der Zelle umzusetzen, daher häuft sich α-Ketoglutarat in
der Zelle an. α-Ketoglutarat fungiert ebenfalls als Signal des Stickstoffstatus in der Zelle, es
bindet zusammen mit ATP an das als Trimer vorliegende PII und induziert dadurch eine
Konformationsänderung dieses Proteins. Die Bindung der Effektormoleküle ermöglicht eine
Interaktion zwischen PII und UTase, die jede Untereinheit des PII-Proteins an einem
spezifischen Tyrosylrest (Tyrosin 51) modifiziert, so dass das PII-Protein mit drei UMPResten vorliegt (Jiang et al., 1998a; Ninfa & Atkinson, 2000). PII-UMP und Glutamin
interagieren synergistisch mit der Adenylyltransferase (ATase, kodiert von glnE), die
wiederum die Glutaminsynthetase (GS, kodiert von glnA) durch Deadenylylierung reguliert,
so dass am Ende dieser Signalkaskade demodifizierte, und daher aktive GS vorliegt, die in der
Zelle vorliegendes Ammonium fixiert. Unter Stickstoffüberschussbedingungen stimuliert die
deuridylylierte Form von PII die Transferaseaktivität des bifunktionellen Enzyms ATase, die
durch Adenylylierung eines spezifischen Tyrosinrestes die Aktivität der GS reduziert. Die
intrazelluläre L-Glutaminkonzentration hat einen direkten Einfluss auf die Aktivität der
beiden Enzyme UTase und ATase, während die intrazelluläre α-Ketoglutaratkonzentration die
Konformation und Aktivität des PII-Proteins bestimmt. Die Funktion der Metabolite αKetoglutarat und Glutamin als Signal für den Stickstoffstatus konnte durch in-vitro-Studien
belegt werden (Jiang et al., 1998a, b, c).
Die Transkriptionsregulation der Stickstoffkontrolle erfolgt über das 2-Komponentensystem
NtrB/NtrC (siehe Abbildung 2.3). Dabei ist die Histidin-Proteinkinase NtrB für die
Reizerkennung und NtrC für die Auslösung der Antwort verantwortlich. NtrC wird unter
Stickstoffmangel von der Histidinkinase NtrB phosphoryliert, wobei diese Reaktion durch die
uridylylierte Form von PII stimuliert wird. Das phosphorylierte NtrC-Protein seinerseits
aktiviert in dieser Form die Expression unter Stickstoffregulation stehender Gene durch
Bildung eines Komplexes mit der RNA-Polymerase. Umgekehrt blockiert die unter
Stickstoffüberschussbedingungen
deuridylylierte
Form
von
PII
die
Phoshoporylierungsaktivität von NtrB und aktiviert stattdessen die Phosphataseaktivität von
NtrC (Kamberov et al., 1995). Durch die Dephosphorylierung des Aktivatorproteins NtrC
zerfällt der Komplex mit der RNA-Polymerase und die Transkription Stickstoff-regulierter
Gene wird gestoppt (Überblick, Merrick & Edwards, 1995a; Jiang et al., 1998a, b, c; Reitzer,
2003; Ninfa & Jiang, 2005).
EINLEITUNG
9
α-Ketoglutarat
PII
GSAMP
Glutamin
ATase
Glutamin
GS
UTase
P
NtrB
NtrC
NtrB
NtrC
Glutamin
PII-UMP
P
Transkription NtrCregulierter Gene
Aktivierung
Inhibition
Proteinmodifikation
Abb. 2.3: Modell der Sticksoffregulation in E. coli. Der Sensor für den Stickstoffstatus der Zelle ist die UTase.
Dieses Enzym katalysiert die reversible Uridylylierung von PII in Abhängigkeit von der internen
Glutaminkonzentration. PII fungiert als Sensor der α-Ketoglutarat-Konzentration. Durch Proteinmodifikationen
(PII/PII-UMP) und De/Phosphorylierungsreaktionen (NtrB/NtrC) wird das Signal weitergeleitet, wodurch die
Aktivität der Glutaminsynthetase (GS) reguliert wird und die Transkriptionskontrolle Stickstoff-regulierter Gene
erfolgt (Ninfa et al., 2005).
In E. coli findet sich ein weiteres PII-Protein, kodiert von glnK. Dieses zweite PII-Protein
GlnK ist für das fine tuning der Stickstoffregulation verantwortlich und tritt bei
Ammoniumkonzentrationen von unter 5 µM in Aktion. Unter diesen Bedingungen liegt das
GlnK-Protein in der vollständig uridylylierten Form vor. Parallel erfolgt über das uridylylierte
PII-Protein GlnB eine Weiterleitung des Signals an das 2-Komponentensystem NtrB/NtrC.
Das für einen Ammoniumtransporter kodierende amtB-Gen wird transkribiert und der
Ammoniumtransporter AmtB synthetisiert, welcher aktiv Ammonium in die Zelle
transportiert. Bei einer Verbesserung der Stickstoffsituation der Zelle auf eine
Ammoniumkonzentration von über 50 µM wird GlnK durch die UTase demodifiziert. In
dieser Form interagiert GlnK mit AmtB. Die Wechselwirkung dieser Proteine erfolgt über die
C-terminale Domäne des Transportproteins (Coutts et al., 2002). Durch diese Bindung wird
die Aktivität des Transporters reduziert. Für den Fall, dass die Ammoniumkonzentration im
Medium hoch bleibt, erfolgt eine Repression Stickstoff-regulierter Gene durch die
deuridylylierte Form des PII-Proteins GlnB (Atkinson & Ninfa, 1999; Coutts et al., 2002;
Javelle et al., 2004).
EINLEITUNG
10
Die Stickstoffkontrolle in C. glutamicum unterscheidet sich grundlegend von dem Modell in
E. coli (Burkovski, 2003a; 2003b, 2005). Die Signaltransduktion erfolgt hier durch die
Proteine GlnD, GlnK und AmtR. AmtR ist der globale Regulator der Stickstoffkontrolle, das
für dieses Protein kodierende Gen amtR wurde im Jahre 2000 charakterisiert und isoliert
(Jakoby et al., 2000). Das Repressorprotein AmtR gehört zur TetR-/AcrR-Familie und ist
vermutlich als Dimer aktiv. Bei guter Stickstoffverfügbarkeit reprimiert AmtR die Expression
von mindestens 36 Genen (Beckers et al., 2005). GlnD und GlnK sind bei guter
Stickstoffversorgung nur in geringer Kopienzahl in der Zelle vorhanden. Verschlechtert sich
die Stickstoffverfügbarkeit, wird der Stickstoffstatus von der Zelle registriert und über bisher
nicht bekannte Signale an GlnD weitergegeben. GlnD adenylyliert in der Folge GlnK, das in
dieser modifizierten Form an AmtR bindet (Strösser et al., 2004). Durch die Interaktion von
AmtR mit GlnK-AMP wird AmtR von der DNA gelöst, die Repression durch AmtR
aufgehoben und die Expression Stickstoff-regulierter Gene initiiert. Bei einer plötzlichen
Verbesserung der Stickstoffverfügbarkeit deadenylyliert GlnD GlnK (Strösser et al., 2004).
Da AmtR nicht mit demodifiziertem GlnK interagiert, kann AmtR wieder an die DNA binden
und die Expression Stickstoff-regulierter Gene unterdrücken (Beckers et al., 2005).
EINLEITUNG
11
???
NCgl1099
NCgl2300
2301
Glutamat
NCgl1362
NCgl1100
ATase
NH3
GS
NH3
Glutamin Glutamat
GluABCD
GOGAT
Peptide
Harnstoff
Glutamat
NCgl1915
-1918
UrtABCDE
AmtR
Harnstoff
AmtB
NH4+
AmtA
NH4+
Ketoglutarat
Urease
Carbaminsäure
H2CO3+2NH3
???
NCgl2302
GlnK
???
CodA
Creatinin
CrnT
GlnD
Creatinin
Methylhydantoin+NH3
???
Transporter
Enzyme
Signaltransduktion
unbekannte Proteine
Expressionsregulation durch AmtR
Aufnahme, Assimilation oder
Metabolisierung von Substraten
Protein-Protein-Interaktion
Abb. 2.4: Aktuelles Modell der Stickstoffkontrolle in C. glutamicum. Der globale Repressor AmtR blockiert
bei guter Stickstoffversorgung die Expression von mindestens 36 Genen. Der Stickstoffstatus der Zelle wird mit
Hilfe von einem oder mehreren noch unbekannten Sensor(en) gemessen. Die Information wird entweder direkt
oder über weitere Proteine an die Transferase GlnD oder die Adenylyltransferase (ATase) weitergeleitet. GlnD
modifiziert unter Stickstoffmangel das Signaltransduktionsprotein GlnK, welches dann mit AmtR interagiert und
für eine Derepression Stickstoff-regulierter Gene sorgt. In Abhängigkeit der Stickstoffverfügbarkeit wird die
Aktivität der Glutaminsynthetase (GS) durch die ATase reguliert, indem sie die GS unter guter
Stickstoffversorgung adenylyliert und bei Stickstoffmangel deadenylyliert (nach Silberbach, 2004).
EINLEITUNG
12
Mit Hilfe bioinformatischer Methoden und Transkriptomanalysen wurde das AmtR-Regulon
charakterisiert (Beckers et al., 2005). Die Expression von mindestens 33 Genen ist direkt
durch AmtR reguliert, für die Gene des vanABK-Operons konnte eine indirekte Regulation
nachgewiesen werden (Merkens et al., 2005). Funktionell sind die Genprodukte der meisten
Komponenten, die unter AmtR-Regulation stehen, Transportproteine und Enzyme. 17 dieser
Gene kodieren für Aufnahmesysteme alternativer Stickstoffquellen. So wird die Expression
der Gene für die beiden Ammoniumtransporter AmtA (kodiert von amtA, Jakoby et al., 2000)
und AmtB (kodiert von amtB, Meier-Wagner et al., 2001), das Gen für den
Glutamattransporter (kodiert von gluABCD, Kronemeyer et al., 1995), das Gen für den
Harnstofftransporter (kodiert von urtABCDE, Beckers et al., 2004), das Gen für die
Creatininpermease (kodiert von crnT, Bendt et al., 2004) und die Gene, die für ein putatives
Oligopeptidaufnahmesystem kodieren (NCgl1915-1918, Beckers et al., 2005), durch AmtR
reguliert. Der alleinige Transport dieser Substanzen in die Zelle reicht bei schlechter
Stickstoffverfügbarkeit
nicht aus, um die Stickstoffversorgung der Bakterien zu
gewährleisten. Eine gleichzeitige Regulation der Gene für entsprechende assimilatorische
Enzyme und der Gene der Signaltransduktionskaskade ist deshalb ebenfalls erforderlich.
Daher stehen weitere 14 Gene ebenfalls unter AmtR-Kontrolle. Hierzu zählen die Gene der
Glutamatdehydrogenase
GDH
(kodiert
von
gdh,
Beckers
et
al.,
2005),
der
Glutaminsynthetase GS (kodiert von glnA, Nolden et al., 2001a) und der Glutamatsynthase
GOGAT
(kodiert
von
gltBD,
Beckers
et
al.,
2001)
zur
Glutamat-
und
Ammoniumassimilation. Unter Kontrolle des Stickstoffregulators AmtR stehen außerdem die
Gene der Urease (kodiert von ureABCEFGD, Beckers et al., 2004) zur Verwertung von
Harnstoff durch Umsetzung in Kohlendioxid und Ammoniak, der Creatinindeaminase
(kodiert von codA, Bendt et al., 2004) zur Spaltung von Creatinin zu Methylhydantoin und
Ammonium
und
der
beiden
Proteine
der
Signalweiterleitung,
des
PII-
Signaltransduktionsproteins GlnK und der Transferase GlnD (kodiert von glnK bzw. glnD,
Nolden et al., 2001b). Fünf weitere Gene, namentlich NCgl1099 (putative Hydrolase),
NCgl1100 (nicht-ribosomales Peptidsynthetasemodul), NCgl1362 (CTP-Synthase, kodiert
von pyrG), NCgl2300 (putative Oxygenaseuntereinheit der Vanillat-o-demethylase, kodiert
von vanA) und NCgl2301 (putative Vanillat-o-demethylase, kodiert von vanB), konnten der
Stickstoffkontrolle zugeordnet werden.
EINLEITUNG
13
Neben der Regulation auf Transkriptionsebene durch die GlnD/GlnK/AmtR-Kaskade wird die
GS wie bereits beschrieben auch auf Aktivitätsebene durch Adenylylierung bzw.
Deadenylylierung
reguliert.
Die
unter
Stickstoffüberschussbedingungen
vorliegende
modifizierte Form der GS liegt inaktiv vor (Tesch et al., 1999; Nolden et al., 2001a). Die
Adenylylierungs-/Deadenylylierungsreaktion wird durch die ATase (kodiert von glnE)
katalysiert, das Gen glnE steht nicht unter AmtR-Kontrolle (Burkovski, 2003b).
2.4 Ammoniumtransport in C. glutamicum
In C. glutamicum finden sich zwei Ammoniumtransportsysteme (AmtA und AmtB). Die
Aufnahme von Ammonium durch AmtA erfolgt in Abhängigkeit zum Membranpotential in
einem Uniport-Mechanismus (Siewe et al., 1996). Neben Ammonium transportiert AmtA
auch das Substratanalog Methylammonium, welches radioaktiv-markiert erhältlich ist. Die
stabile
14
C-Markierung erlaubt es, die Aufnahme des Substrats in die Zellen direkt zu
verfolgen. Die Bestimmung des apparenten Km-Wertes bei verschiedenen pH-Werten legte
nahe, dass Methylammonium bzw. Ammonium und nicht Methylamin/Ammoniak Substrate
von AmtA sind. Bei pH 6,0, 7,0, und 8,5 wurde jeweils ein Km von AmtA für
Methylammonium von etwa 50 µM bestimmt (Siewe et al. 1996; Meier-Wagner et al., 2001).
Aufgrund des pK-Wertes von Methylammonium wäre dies nur bei einem Transport von
Methylammonium möglich. Die Aufnahme von Methylammonium durch AmtA wird bei
einer Endkonzentration von 100 µM durch etwa 10 µM Ammonium halbmaximal gehemmt.
Daraus wurde geschlossen, dass AmtA bevorzugt Ammonium transportiert (Meier-Wagner et
al., 2001).
Der zweite Ammoniumtransporter AmtB in C. glutamicum galt zu Beginn dieser Arbeit als
Ammoniumpermease, da eine Aufnahme von Methylammonium nicht gemessen werden
konnte.
Messungen
des
Ammoniumverbrauchs
zeigten
jedoch,
dass
die
amtA-
Deletionsmutante in der Lage ist, Ammonium aufzunehmen (Meier-Wagner et al., 2001). Mit
Hilfe dieser Ammoniumverbrauchsmessungen konnte in einer amtA/amtB-Deletionsmutante
ebenfalls ein niedriger Ammoniumverbrauch bestimmt werden (Meier-Wagner et al., 2001).
Dies deutete auf ein drittes, niedrigaffines Ammoniumaufnahmesystem hin.
Die C. glutamicum-Proteine AmtA und AmtB gehören zur großen Familie der Amt
(Ammoniumtransport)-Proteine, die sich in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und in Form von
Rhesus-assoziierten Glykoproteinen auch in menschlichen Erythrozyten finden (Saier, 1999;
EINLEITUNG
14
Howitt & Udvardi, 2000; Marini et al., 2000; Thomas et al., 2000; Huang & Peng, 2005).Alle
Amt-Proteine sind integrale Membranproteine, die eine ähnliche Topologie besitzen. Sie
bestehen aus 400 bis 450 Aminosäuren, die 11 Transmembranhelices mit einer extrazellulären
N-terminalen Domäne und einer C-terminalen Domäne im Cytoplasma bilden (Marini &
André, 2000; Thomas et al., 2000). Der Mechanismus des Substrattransports in diesen
Proteinen ist seit langem Gegenstand vieler Diskussionen (Kleiner & Castorph, 1982; Kleiner,
1985; Wirén & Merrick, 2004, Ludewig et al., 2001; Winkler, 2006).
Aufgrund des pH-abhängigen Gleichgewichts zwischen Ammoniak und Ammonium
(NH3
NH4+, pKa = 9,25) liegt unter physiologischen Bedingungen vorwiegend das
Ammoniumion vor. Bei neutralem pH ist das Gleichgewicht daher zugunsten des geladenen
NH4+ verschoben. Lipidmembranen sind für das Ammoniumion nicht durchlässig,
ungeladenes Ammoniak kann Membranen über Diffusion jedoch überwinden. Unter
Stickstoffmangelbedingungen
(Ammoniumtransport)-Proteine
ist
von
die
Aufnahme
essentieller
von
Bedeutung.
NH3/NH4+
Als
durch
Amt
zugrundeliegender
Transportmechanismus wurde lange Zeit ein sekundär aktiver Prozess angenommen.
Demnach wurde Ammonium bzw. das radioaktiv-markierte Substratanalog Methylammonium
im Antiport mit K+-Ionen transportiert. Die antreibende Kraft für den Transport wäre in
diesem Fall der elektrochemische K+-Gradient über der Membran (Jayakumar et al., 1985).
Diese Untersuchungsergebnisse wurden später durch Studien, die in E. coli, Salmonella
typhimurium und Saccharomyces cerevisiae durchgeführt wurden, widerlegt (Soupene et al.,
1998; Soupene et al., 2001; Soupene et al., 2002; Khademi et al., 2004; Javelle et al., 2005).
Aufnahmestudien mit [14C]-Methylammonium, Wachstumsexperimenten und pH-Wertbasierten Fluoreszenzstudien legten nahe, dass es sich bei den untersuchten Proteinen
vielmehr um Kanäle handelt, die ungeladenes Ammoniak transportieren. Auch für die AmtHomologe im Menschen, die Rhesus-assoziierten Glykoproteine RhAG, RhBG und RhCG,
wurde elektroneutraler Transport festgestellt, ob dabei NH4+ gegen H+ ausgetauscht wird oder
ob es sich um NH3-Kanäle handelt, ist bisher noch nicht geklärt (Westhoff et al., 2002;
Bakouh et al., 2004; Ludewig, 2004; Ripoche et al., 2004; Westhoff et al., 2004; Benjelloun
et al., 2005; Nakhoul et al., 2005; Zidi-Yahiaoui et al., 2005; Ludewig, 2006; Mak et al.,
2006; Mayer et al., 2006b).
Durch die Kristallisation des E. coli-AmtB-Proteins wurde die These, dass Amt-Proteine eher
Ammoniak als Ammonium über die Membran transportieren, unterstützt. Khademi et al. und
EINLEITUNG
15
Zheng et al. stellten unabhängig voneinander im Jahre 2004 die Strukur des AmtB-Proteins
aus E. coli vor. Die Strukturen verdeutlichten, dass die Pore des Proteins hauptsächlich von
hydrophoben Aminosäuren gebildet wird. Dies legt nahe, dass Ammoniak das transportierte
Substrat dieses Proteins ist, da die Hydrophobizität im Inneren des Proteins eine
Energiebarriere für Ammonium darstellen würden. Da bei physiologischen Bedingungen
hauptsächlich Ammonium und nicht Ammoniak vorliegt, dieses aber nicht das Substrat ist,
wurde folgender Transportmechanismus vorgeschlagen. Zunächst werden Ammoniumionen
auf der periplasmatischen Seite durch Kationen-π-Wechselwirkungen mit Tryptophan 148
und Phenylalanin 107 sowie durch eine Wasserstoffbrücke zu Serin 219 gebunden. Innerhalb
des ansonsten hydrophoben Kanals befinden sich zwei Histidinreste. Histidin 168 fungiert
jedoch als Wasserstoffbrückendonor für Threonin 273 und als Wasserstoffbrückenakzeptor
für Histidin 318. Daher steht in diesem Bereich kein freier Wasserstoffbrückenakzeptor zur
Verfügung. Auch die beobachtete Elektronendichte spricht dafür, dass nichtsolvatisiertes
Ammoniak durch den Kanal geschleust wird. Auf der cytoplasmatischen Seite wird
Ammoniak wieder protoniert (Khademi et al., 2004).
Periplasma
Trp148
Ser219
NH
Thr273
+
OH
His168
+ H
NH4 O
H
N
N
H
Phe107
NH3
NH3
H
N
His318
N
hydrophobe
Aminosäurereste
NH3
+
NH4
Cytosol
Abb. 2.5: Ammoniaktransport in E. coli. Auf Grundlage der Kristallstruktur wurde dieses Modell des
Ammoniaktransports entwickelt (nach Khademi et al., 2004).
Im Gegensatz zu den Amt-Proteinen aus E. coli, S. typhimurium und S. cerevisiae und den
Rhesus-assoziierten Glykoproteinen, die als NH3-Kanäle gelten, ist der durch Amt-Homologe
in Pflanzen vermittelte Transport elektrogen. Die Proteine AMT1;1 und AMT1;2 aus
Lycopersicon esculentum (Tomate) wurden mit Hilfe von elektrophysiologischen Messungen
EINLEITUNG
16
als membranpotentialabhängiger NH4+-Uniporter bestimmt (Ludewig et al., 2002; Ludewig et
al., 2003). Nach neueren Studien kann für diese Proteine auch NH3/H+-Cotransport nicht
ausgeschlossen werden (Mayer et al., 2006a; Mayer et al., 2006b). Auch für AMT1;1 aus
Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) wurde membranpotentialabhängiger NH4+-Uniport
bzw. NH3/H+-Cotransport festgestellt (Mayer & Ludewig, 2006; Ludewig, 2006; Wood et al.,
2006). Wie die beschriebenen Daten zeigen, unterscheiden sich die Mitglieder der AmtProteinfamilie in ihrer Funktionsweise. Die Frage nach dem transportierten Substrat kann
nicht allgemeingültig beantwortet werden.
A
B
C
Äußere Membran
NH4+
NH3
RhAG
H+
NH4+
pH 7,38
NH4+ NH4+
NH3
AmtB
Amt1
pH 5,5
∆V=–140 mV
pH 7,4
Periplasmatische
Membran
pH 7,28
NH4+
NH3
H+
NH3
Glutamat
H2O
ATP
ADP+Pi
Glutamin
NH3
Cytoplasma
TIP
∆V=+30 mV
pH 5,5
NH4+
NH4+
Vakuole
H+
NH4+
NH4+
NH4+
Abb. 2.6: Ammoniumtransport in Amt/Rh-Membranproteinen. Dargestellt ist die erleichterte Diffusion von
Ammoniak durch das Rhesus-assoziierte Glykoprotein RhAG in menschlichen Erythrozyten (A). Durch Abbau
von Glutamin kann es dazu kommen, dass Ammoniak, da keine großen pH-Differenzen bestehen, durch RhAG
die Zelle wieder verlässt. Auch in E. coli erleichtert das Amt-Homolog AmtB die Diffusion von Ammoniak (B).
Der Transport ist gefolgt von metabolic trapping, der Verstoffwechselung des Substrats. In Pflanzenzellen, wie
z. B. in L. esculentum (Tomate) wird das Ammoniumion in die Wurzel transportiert (C). Der nachfolgende
Ammoniak-Transfer über den Tonoplasten erfolgt mit Hilfe von TIP2-Aquaporinen (nach Ludewig et al., 2007).
EINLEITUNG
17
2.5 Zielsetzung dieser Arbeit
Im Fokus dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Ammoniumtransporter AmtA und
AmtB aus C. glutamicum. Bisherige Arbeiten zu diesen Proteinen legten nahe, dass es sich
bei AmtA um einen membranpotentialabhängigen Transporter von Ammonium sowie
Methylammonium handelt. AmtB wurde als Ammoniumpermease beschrieben (Siewe et al.,
1996; Meier-Wagner et al., 2001). Um den Aufnahmemechanismus zu analysieren, wurden
bestehende Methoden modifiziert. Für E. coli besteht das Modell des metabolic trappings,
d. h., die Aufnahme von Ammonium wird direkt mit der Verstoffwechselung dieses Substrats
in Beziehung gesetzt. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob ein ähnlicher
Zusammenhang zwischen Aufnahme und Assimilation auch in C. glutamicum vorliegt, womit
auch
Rückschlüsse
auf
den
Aufnahmemechanismus
der
C. glutamicum-
Ammoniumtransporter möglich wären.
In C. glutamicum, wie auch in E. coli, konnte eine direkte Wechselwirkung zwischen AmtB
und dem PII-Signaltransduktionsprotein GlnK nachgewiesen werden (Coutts et al., 2002;
Strösser et al., 2004), die im Falle von E. coli zu einer Verminderung der AmtB-vermittelten
Methylammoniumaufnahme führt. Innerhalb dieser Arbeit wurde analysiert, ob die
Ammoniumtransporter in C. glutamicum mit anderen Komponenten der Stickstoffkontrolle
interagieren.
Um weitere Einblicke in den Stickstoffmetabolismus von Corynebakterien zu erhalten, wurde
neben der Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum auch die Aufnahme in C. efficiens,
C. diphtheriae und C. jeikeium bestimmt.
MATERIAL UND METHODEN
18
3 Material und Methoden
3.1 Bakterienstämme und Plasmide
Die in dieser Arbeit verwendeten E. coli- und C. glutamicum-Stämme sind in Tabelle 3.1
aufgeführt; Tabelle 3.2 listet die eingesetzten Plasmide auf.
Tab. 3.1: In dieser Arbeit verwendete E. coli-, C. efficiens-, C. diphtheriae-, C. glutamicum- und
C. jeikeium-Stämme. In der Tabelle sind die Marker und Eigenschaften der eingesetzten Stämme aufgeführt
(NxR, Resistenz gegen Nalidixinsäure; SmR, Resistenz gegen Streptomycin).
Stamm
Genotyp, Phänotyp
Referenz
endA1 supE44 thi-1 λ- recA1 gyrA96 relA1
Grant et al., 1990
E. coli
DH5αmcr
deoR ∆(lacZYA-argF) U169 φ80∆lacZ
∆M15mcrA ∆(mmr hsdRMS mcrBC)
JM109
F`traD36 laclq ∆(lacZ)M15 proA+B+ / e14-
Yanisch-Perron et al.,
(McrA-) ∆(lac-proAB) thi gyrA96 (NxR)
1985
endA1 hsdR17 (r-km-k) relA1 supE44 recA1
JM110
F`traD36 laclq ∆(lacZ)M15 proA+B+ / rpsL
Yanisch-Perron et al.,
(SmR) thr leu thi lacY galK galT ara fhuA
1985
dam dcm glnV44 ∆(lac-proAB)
C. diphtheriae
DSM 44123
weitere Zuordnung: ATCC 27010,
Hauser et al., 1993
apathogenes Isolat unbekannten Ursprungs
C. efficiens
DSM 44549
weitere Zuordnung: YS-314, isoliert aus
Fudou et al., 2002
Bodenproben
C. glutamicum
ATCC 13032
Wildtyp
Abe et al., 1967
MATERIAL UND METHODEN
19
Stamm
Genotyp, Phänotyp
Referenz
BW1.3
ATCC 13032 ∆amtA∆amtR
diese Arbeit
BW3.12
ATCC 13032 ∆amtB∆amtR
diese Arbeit
BW2.6
ATCC 13032 ∆amtA∆amtB∆amtR
diese Arbeit
DA-1
ATCC 13032 ∆glnA∆glnA2
Ansorge, 2005
DA-2
ATCC13032 ∆glnA∆glnA2∆gdh
Ansorge, 2005
JS-1
ATCC 13032 ∆amtA ∆amtB, glnK- und
Strösser et al., 2004
glnD-Expression nicht beeinträchtigt
ATCC 13032 ∆amtB, glnK- und glnD-
Meier-Wagner et al.,
Expression nicht beeinträchtigt
2001
LN∆GDH
ATCC 13032 ∆gdh
Müller et al., 2006
LNGLNA2
ATCC 13032 ∆glnA2
Nolden et al., 2001a
LNGLNE
ATCC 13032 ∆glnE
Nolden et al., 2001a
LN∆GLTBD
ATCC 13032 ∆gltB ∆gltD
Nolden, 2001
LN∆GS
ATCC 13032 ∆glnA
Müller et al., 2006
Mek-1
ATCC 13032 ∆glnA∆glnA2∆gdh∆amtB
diese Arbeit
MJ6-18
ATCC 13032 ∆amtR
Jakoby et al., 2000
MJ2-38
ATCC 13032 ∆amtA
Meier-Wagner et al.,
LN-1.1
2001
TM∆gdh∆glnA
LN∆GDH∆glnA
Müller, 2005
Bewohner der menschlichen Hautflora,
Tauch et al., 2005
C. jeikeium
K411
Erreger nosokomialer Infektionen, isoliert
aus Blutkulturen
MATERIAL UND METHODEN
20
Tab. 3.2: Eingesetzte Plasmide mit ihren Markern und Eigenschaften (CmR, Resistenz gegen
Chloramphenicol; KmR, Resistenz gegen Kanamycin; TcR, Resistenz gegen Tetracyclin). Die Konstruktion der
Plasmide ist im Anhang beschrieben.
Plasmid
Eigenschaften
Referenz
pBT
lac-UV5 P, CmR, p15A ori, λcI
Stratagene, La Jolla,
E. coli-Vektor
Two-Hybrid USA
für
Interaktionsstudien
pBT-LGF2
Kontrollplasmid
mit
Dimerisierungsdomäne
der Stratagene, La Jolla,
des
Transkriptionsaktivator-Proteins
Gal4 USA
für
Interaktionsstudien mit dem Gal11 Protein
pBTglnA
pBT mit dem glnA-Gen für Two-Hybrid Strösser, 2005
Interaktionsstudien
mit
rekombinantem
pTRG
pBTglnD
pBT mit dem glnD-Gen für Two-Hybrid Strösser, 2005
Interaktionsstudien
mit
rekombinantem
pTRG
pBTglnE
pBT mit dem glnE-Gen für Two-Hybrid Strösser, 2005
Interaktionsstudien
mit
rekombinantem
pTRG
pK18∆amtB
pK18mobsacB mit 0,4 kb Fragment für Nolden, 2001
amtB-Deletion
pK18∆amtR
pK18mobsacB mit 1,5 kb Fragment für Jakoby et al., 2000
amtR-Deletion
pK18mobsacB
KmR, ori pUC, mob, sacB
Schäfer et al., 1994
Ipp P, lac-UV5 P, TcR, ColE1 ori, RNAPα
pTRG
E. coli-Vektor
für
Two-Hybrid
Stratagene, La Jolla,
USA
Interaktionsstudien
Kontrollplasmid mit einer mutierten Form
pTRG-Gal11
des Gal11 Protein für Interaktionsstudien mit
der Dimerisierungsdomäne des Gal4 Proteins
Stratagene, La Jolla,
USA
MATERIAL UND METHODEN
Plasmid
pTRGamtA
Eigenschaften
Referenz
pTRG mit dem amtA-Gen für Two-Hybrid
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
pTRG
pTRGamtAoCterm
21
mit
verkürztem
am
3´-Ende
amtA-Gen
für
um
162
diese Arbeit
bp
Two-Hybrid diese Arbeit
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
pTRG mit 190 bp großem Stück des 3´pTRGamtACterm
Endes des amtA-Gens für Two-Hybrid diese Arbeit
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
pTRGamtB
pTRG mit dem amtB-Gen für Two-Hybrid
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
diese Arbeit
pTRG mit am 3´-Ende um 77 bp verkürztem
pTRGamtBoCterm
amtB-Gen
für
Two-Hybrid diese Arbeit
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
pTRG mit dem 139 bp großem Stück des 3´pTRGamtBCterm
Endes des amtB-Gens für Two-Hybrid diese Arbeit
Interaktionsstudien mit rekombinantem pBT
MATERIAL UND METHODEN
22
3.2 Nährmedien und Kultivierungsbedingungen
3.2.1
Nährmedien für E. coli
E. coli-Stämme wurden standardmäßig in LB (Luria Bertani)-Medium kultiviert (Sambrook et
al., 1989, siehe auch Tab. 3.3). Für Agarplatten wurde dem Medium 15 g/l Bacto-Agar
(Difco, Detroit, USA bzw. Oxoid, Heidelberg) zugesetzt.
3.2.2 Nährmedien für C. diptheriae, C. efficiens, C. glutamicum und C. jeikeium
Zur Anzucht von C. diptheriae, C. efficiens und C. glutamicum kam als Vollmedium BHI
(Brain-Heart-Infusion)-Medium 37 g/l (Difco, Detroit, USA bzw. Oxoid, Heidelberg) zur
Anwendung. Für die Anzucht von C. jeikeium wurde das Vollmedium BYT verwendet,
welches neben BHI-Medium 37 g/l (Difco, Detroit, USA bzw. Oxoid, Heidelberg) zusätzlich
0,4 % Hefeextrakt und 0,2 % Tween 80 enthält (Tauch et al., 2005). Für die Herstellung der
Agarplatten wurde dem Medium 15 g/l Bacto-Agar (Difco, Detroit, USA bzw. Oxoid,
Heidelberg) zugesetzt. In LB (Luria Bertani)-Medium (siehe Tab. 3.3) wurden
C. glutamicum-Stämme für die Herstellung von elektrokompetenten Zellen kultiviert. Als
definiertes Minimalmedium wurde CgC-Medium (Keilhauer et al., 1993) bzw. CgCoNMedium (Jakoby et al., 2000) eingesetzt. Die Zusammensetzung dieser Medien ist in Tabelle
3.3 angegeben.
Tab. 3.3: Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien.
Medium
Zusammensetzung (pro l)
LB
10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl.
CgC
42 g MOPS, 20 g (NH4)2SO4, 5 g Harnstoff, 0,5 g KH2PO4, 0,5 g
K2HPO4, pH (NaOH) 7,0. Direkt vor Gebrauch Zugabe von: 10 ml
100 mM CaCl2, 10 ml 1 M MgSO4, 200 µg Biotin, 1 ml Spurensalze,
50 ml 50 % Glukose.
CgCoN
42 g MOPS, 0,5 g KH2PO4, 0,5 g K2HPO4, pH (NaOH) 7,0. Direkt
vor Gebrauch Zugabe von: 10 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 1 M MgSO4,
200 µg Biotin, 1 ml Spurensalze, 50 ml 50 % Glukose.
MATERIAL UND METHODEN
Medium
Zusammensetzung (pro l)
Spurensalze
28,5 g FeSO4 x 7H2O, 16,5 g MnSO4 x H2O, 6,4 g ZnSO4 x 7 H2O,
23
764 mg CuSO4 x 5 H2O, 128 mg CoCl2 x 6H2O, 44 mg NiCl2 x 6
H2O, 64 mg Na2MoO4 x 2 H2O, 48 mg H3BO3, 50 mg SrCl2, 50 mg
BaCl2 x 2 H2O, 28 mg KAl(SO4)2 x 12 H2O, pH (H2SO4) 1.
3.2.3 Antibiotika
Zur Selektion auf die entsprechenden Resistenzmarker für E. coli-Stämme wurden den
Medien nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 50°C Antibiotika in folgenden
Endkonzentrationen zugegeben: Chloramphenicol 25 µg/ml, Kanamycin 50 µg/ml, und
Tetracyclin 12,5 µg/ml. Für C. glutamicum-Stämme kam als Antibiotikum Kanamycin in
einer Endkonzentration von 25 µg/ml zum Einsatz. Für die Kultivierung frisch transformierter
C. glutamicum-Stämme wurde eine Kanamycin-Konzentration von 10 µg/ml eingesetzt. Es
wurden Stammlösungen in 1000-fach höherer Konzentration für Kanamycin in H2Odest bzw.
für Chloramphenicol und Tetracyclin in 70 % Ethanol hergestellt, sterilfiltriert und bis zum
Gebrauch bei -20°C gelagert.
3.2.4 Kultivierungsbedingungen
E. coli- sowie C. diptheriae-, C. jeikeium- und C. efficiens-Stämme wurden bei 37°C und
C. glutamicum-Stämme bei 30°C als Flüssigkulturen in Erlenmeyerkolben mit Schikanen
angesetzt und auf dem Schütteltisch bei 135 bzw. 125 rpm angezogen. Das Zellwachstum
konnte durch die Messung der optischen Dichte (OD600) ermittelt werden. Eine OD600 von 1
entspricht einer Bakterienkultur von etwa 109 Zellen pro ml.
Zur Präparation chemischkompetenter E. coli- und elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen
wurde eine 5 ml Vorkultur in Reagenzgläsern in LB- bzw. in LB-Medium mit 2 % Glukose
(siehe Tab. 3.3) hergestellt und weiter nach Punkt 3.5.1 für E. coli und 3.5.3 für
C. glutamicum vorgegangen. Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte wie unter Punkt
3.4.1.1 beschrieben, nachdem die E. coli-Zellen zuvor in 5 ml LB-Medium in Reagenzgläsern
vorkultiviert wurden.
Zur Untersuchung der Effekte von Stickstoffmangelbedingungen auf C. glutamicum-Stämme
wurde nach folgendem standardisiertem Animpfverfahren vorgegangen, um möglichst
reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten: 20 ml BHI-Medium (siehe Punkt 3.2.2) wurden
MATERIAL UND METHODEN
24
morgens mit dem zu untersuchenden Bakterienstamm beimpft und unter Schütteln
ca. 8 Stunden inkubiert. Diese Vorkultur wurde dann zum Animpfen von 50 ml CgC-Medium
auf eine OD600 von 0,5 eingesetzt und das CgC-Medium über Nacht unter Schütteln inkubiert,
wodurch eine optimale Anpassung der Zellen an das Minimalmedium erzielt wurde. Da für
alle Untersuchungen Zellen in der exponentiellen Phase benötigt wurden, wurde mit dieser
Übernachtkultur frisches CgC-Medium (50 ml) auf eine OD600 von 1 angeimpft und unter
Schütteln bis zum Erreichen der exponentiellen Phase (OD600 von 4-5) inkubiert. Zur
Induktion von Stämmen mit dem pEKEx2-Plasmid wurden die Zellen unter Schütteln bis
OD600 von 4 inkubiert und dann mit 500 µM IPTG für 2 Stunden induziert. Zur Induktion von
Stickstoffmangel wurden die Zellen abzentrifugiert (4.000 xg, 7 min, RT) und anschließend in
CgCoN-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden für 1-2 Stunden unter Schütteln inkubiert.
Für C. diphtheriae, C. efficiens, C. jeikeium wurde das standardisierte Animpfverfahren leicht
abgewandelt. Um direkte Vergleiche zu ermöglichen, wurde auch C. glutamicum nach diesem
Schema kultiviert. Es wurden 100 ml BHI- oder BYT-Medium mit den Bakterienstämmen
beimpft und über Nacht bei 30°C bzw. 37°C unter Schütteln inkubiert. Morgens wurden mit
diesen Vorkulturen 100 ml frisches BHI-oder BYT-Medium auf eine OD600 von ca. 0,2
angeimpft und wiederum unter Schütteln inkubiert. Nach 2-3 Stunden erreichten die
Bakterien die exponentielle Wachstumsphase. Die Kulturen wurden geteilt und geerntet
(4.000 xg,
7
min,
RT).
Während
Enzymaktivitätsbestimmungen
unter
der
eine Teil
für Aufnahmemessungen
Stickstoffüberschussbedingungen
verwendet
und
und
dementsprechend vorbereitet wurde (siehe 3.3.1 und 3.3.8), wurde der andere Teil der Kultur
Stickstoffmangel unterzogen. Dafür wurden die Pellets in CgCoN-Medium resuspendiert und
unter Schütteln für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet (4.000 xg,
7 min, 4°C) und ebenfalls für Aufnahmemessungen bzw. Enzymaktivitätsbestimmungen
vorbereitet.
Zur dauerhaften Lagerung von Bakterienstämmen wurden Dauerkulturen hergestellt. Dazu
wurden vorgefertigte Cryoröhrchen der Firma Roth (Karlsruhe) verwendet (Roti®-StoreCryoröhrchen). Die Anwendung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
MATERIAL UND METHODEN
25
3.3 Biochemische Techniken
3.3.1 Bestimmung der Methylammoniumaufnahme
Zur Bestimmung der Methylammoniumaufnahme wurden Zellen wie unter Punkt 2.3.1
beschrieben kultiviert. Es wurden 50 ml Zellen durch Zentrifugation geerntet (4.000 xg,
7 min, 4°C) und mit 10 ml MES/Tris-Puffer (4.000 xg, 7 min, 4°C) gewaschen. Die
Salzkonzentrationen
sowie
der
pH-Wert
dieses
Puffers
wurden
dem
jeweiligen
Versuchsaufbau angepasst. Die Zellen wurden in MES/Tris-Puffer resuspendiert, auf eine
OD600 zwischen 3 und 5 eingestellt und anschließend auf Eis aufbewahrt. Die
Methylammoniumaufnahme wurde durch die Verwendung von radioaktiv-markiertem
[14C]-Methylaminhydrochlorid
(200.000
counts
pro
Ansatz
(Hartmann
Analytic,
Braunschweig)) mit variierenden Endkonzentrationen bestimmt. Jeweils 2 bis 3 ml
Zellsuspension wurden dafür in ein Rührgefäß gegeben und im Wasserbad bei 30°C
vorinkubiert. Unter Rühren wurde dann die Transportmessung durch Zugabe von [14C]Methylammonium in verschiedenen Konzentrationen gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten
wurden Proben entnommen und auf Glasfaserfilter (Schleicher-Schuell, Dassel) pipettiert.
Das umgebende Medium wurde durch eine Mehrfachfiltrationsanlage (Hoefer, San Francisco,
USA) abgesaugt und der Rest des Mediums durch zweimaliges Waschen mit 2,5 ml 0,1 M
Lithiumchlorid-Lösung entfernt. Die Filter wurden dann in Szintillationsgefäße überführt, mit
3,8 ml Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint Eco Plus, Roth, Karlsruhe) versetzt und geschüttelt.
Die Radioaktivität wurde in einem Flüssig-Szintillationszähler (LS 6500, Beckman
Instruments GmbH, München bzw. Tri-Carb 2100 TR, Canberra-Packard, Schwadorf,
Österreich) ermittelt. Die Gesamtaktivität des Ansatzes wurde durch direktes Zählen von 200
µl Reaktionsansatz bestimmt. Die Aufnahmeraten wurden aus dem linearen Teil der
Aufnahmekinetik bestimmt.
3.3.2 Bestimmung von Methylammonium im Überstand
Mit Hilfe von Überstandsmessungen konnte die in Medium verbliebene Menge
[14C]-Methylammonium bestimmt werden. Die Vorbereitung der Zellen erfolgte wie oben
bereits beschrieben. Die Zellen wurden auch hier durch Filtration vom umgebenden Medium
getrennt. Dieses Medium wurde mit Szintillationsröhrchen, die unterhalb der Absaugstutzen
der Mehrfachfiltrationanlage befestigt worden waren, aufgefangen. Ein definiertes Volumen
MATERIAL UND METHODEN
26
dieses Filtrats wurde dann aus den Röhrchen entnommen, in neue Szintillationsgefäße
überführt, mit Szintillationsflüssigkeit versetzt und im Flüssig-Szintillationszähler ausgezählt.
MES/Tris-Puffer (Grundrezept)
50 mM Mes, 50 mM Tris, 10 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM Glucose, pH (NaOH) 8,0
3.3.3 Untersuchung des Methylammonium-Metabolismus
Zur Untersuchung des Methylammonium-Metabolismus in verschiedenen C. glutamicum
Stämmen wurden die Aufnahmemessungen wie unter Abschnitt 2.3.1 beschrieben
durchgeführt, wobei jedoch die Zelldichte (OD600 = 7) und die Menge an counts im Ansatz
verdoppelt wurde (400.000 counts pro Ansatz). Nach Filtration der Zellen über eine
Mehrfachfiltrationsanlage (Hoefer, San Francisco, USA) wurden die Glasfaserfilter
(Schleicher-Schuell, Dassel) zum Zellaufschluss und Abstoppen des Zellmetabolismus über
Nacht in 4 ml Stoplösung (70 % Ethanol, 0,05 % SDS) bei 80°C inkubiert. Die Inkubation der
Filter wurde so lange fortgesetzt, bis die Ansätze durch Verdunstung des Ethanols auf 2 ml
reduziert worden waren. Danach wurde die verbliebende Lösung in EppendorfReaktionsgefäße überführt und in einer Vakuumzentrifuge (Heraeus Christ, Osterode)
lyophilisiert. Die Pellets wurden in 20 µl H2Obidest aufgenommen und tropfenweise auf eine
Cellulose
Dünnschicht-Alufolien
(Merck,
Darmstadt)
aufgetragen.
Der
Lauf
der
Dünnschichtchromatographie wurde mit einem Gemisch aus N-Butanol : Eisessig : H2Obidest
(Verhältnis 4:1:1) durchgeführt. Die Produkte des Methylammonium-Metabolismus wurden
durch Autoradiografie über mehrere Tage detektiert.
3.3.4 Herstellung von Zellextrakten
Die C. glutamicum-Zellen für die Proteinpräparationen (Kultivierung siehe Punkt 3.2.4)
wurden nach Inkubation bei guter Stickstoffversorgung oder bei Stickstoffmangel geerntet
(4.000 xg, 7 min, 4°C). Bis zur weiteren Aufarbeitung konnten die Pellets bei -20°C gelagert
werden. Jedes Pellet wurde dann in 1 ml PBS-Puffer oder TE-Puffer resuspendiert. Die
Suspension wurde in 2 ml Cryoröhrchen mit 300 mg Glasperlen (Durchmesser 0,2 - 0,3 mm)
pipettiert. Der Aufschluss erfolgte durch hochfrequentes Schütteln im FASTPREP-Gerät
(FP120, QBIOGENE, Heidelberg) für 3 x 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von
6,5 m/s. Zwischen den Intervallen wurden die Röhrchen für 3 Minuten auf Eis gekühlt. Nach
MATERIAL UND METHODEN
27
dem Zellaufschluss wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (13.000 xg, 4°C, 25 min)
sedimentiert. Der Überstand, die Zellextraktfraktion, wurde abgenommen und bei -20°C bis
zur weiteren Verwendung gelagert.
PBS-Puffer
8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO4 x 7 H2O, 0,24 g KH2PO4 wurden in H2Obidest gelöst, der
pH-Wert mit HCl auf 7,4 eingestellt und die Lösung auf 1 Liter aufgefüllt.
TE-Puffer
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH (HCl) 7,5
3.3.5 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry
Die Proteinkonzentrationen von Zellextrakten aus C. glutamicum wurden mit der Methode
nach Lowry (modifiziert nach Dulley & Grieve, 1975) bestimmt. Für die Eichgerade wurden
2, 4, 12, 16 und 20 µg Rinderserumalbumin (BSA) eingesetzt. Die Proteinproben wurden in
H2Odest 1:10 und 1:50 verdünnt. Zu 100 µl verdünnter Probe wurden 20 µl 100 mM SDS
pipettiert. Das Färbereagenz wurde jeweils frisch angesetzt, 1 ml Färbereagenz zur
Probenlösung gegeben, gemischt und für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu jeder Probe
wurden dann 100 µl Folinreagenz (Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz, unverdünnt (Merck,
Darmstadt)) pipettiert, sofort gut gemischt und die Proben für weitere 20 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die optische Dichte wurde bei 650 nm bestimmt und die Konzentrationen mit Hilfe
der BSA-Eichgeraden ermittelt.
Färbereagenz:
100 ml Lösung A (2 g Na2CO3, 0,4 g NaOH/100 ml)
+ 2 ml Lösung B (2 % Na+K+-Tartrat)
+ 2 ml Lösung C (1 % CuSO4)
3.3.6 Ethanolische Zellextraktion
Für HPLC-Analysen wurden Zellen in kochendem Ethanol aufgeschlossen. Die Zellen
wurden wie in Abschnitt 2.2.4 beschrieben kultiviert. 2 ml dieser Zellkultur wurden
abzentrifugiert (4.000 xg, 7 min, 4°C) und das Pellet anschließend in 1 ml PBS-Puffer
gewaschen. Dem Pellet wurden 4 ml 80°C heißes Ethanol zugegeben, und die Lösung
MATERIAL UND METHODEN
28
anschließend im Wasserbad bei 80°C für 30 min inkubiert. Die Zellsuspension wurde
zentrifugiert (4.000 xg, 7 min, 4 °C) und der Überstand in einer Vakuumzentrifuge (Savant
DNA Speed Vac DNA 110, GMI, USA) lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 900 µl
H2Obidest aufgenommen. Bis zur HPLC-Messung wurden diese Extrakte bei -20°C verwahrt.
PBS-Puffer:
8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO4 x 7 H2O, 0,24 g KH2PO4 wurden in H2Obidest gelöst, der
pH-Wert mit HCl auf 7,4 eingestellt und die Lösung auf 1 Liter aufgefüllt.
3.3.7 Aminosäurebestimmung mittels reversed phase HPLC
Aminosäureanalysen mittels reversed phase HPLC wurden im Lehrstuhl für Biochemie der
Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt. Dazu wurden 10 µl einer 1:10 Verdünnung der
Zellextraktproben bzw. 10 µl der Standardlösungen derivatisiert. Die Proben sowie die
Standardlösungen mit 80 µl 0,2 M Borsäure pH 8,8 und 10 µl AccQ-tag Reagens (Waters,
Milford, USA (3 mg/ml in Acetonitril)) wurden gemischt, für 9 min bei 55°C inkubiert, in
konische HPLC-Probengefäße überführt und mittels HPLC aufgetrennt. Das AccQ-tag
Reagens (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat) erlaubt die fluorometrische
Detektion der Aminosäurederivate. Als Laufpuffer dienten 140 mM Natriumacetat pH 6,0
und 7 mM Triethanolamin, Acetonitril und Wasser. Alle Pufferlösungen wurden vor
Gebrauch filtriert und die Säule mindestens 3 Stunden vor Probeninjektion äquilibriert. Der
verwendete Gradient ist in Abbildung 2.1 dargestellt. Es wurde eine HPLC-Anlage der Firma
Dionex (Sunnyvale, USA), ausgestattet mit einer Gradientenpumpe (P680), einem
Fluoreszenzdetektor (RF2000), einem automatischen Probeneinspritzer (ASI-100) und einer
temperierbaren Säulenzelle (TCC-100), verwendet. Die Auftrennung erfolgte über eine
reversed phase Säule (Luna 5u C18(2), 250 x 4,6 mm) der Firma Phenomenex Ltd.
(Aschaffenburg). Bevor die Proben appliziert wurden, wurde der automatische Probennehmer
auf 4°C gekühlt, die Säule auf 37°C geheizt. Die Fluoreszenz wurde bei einer
Anregungswellenlänge von 300 nm und einer Emissionswellenlänge von 400 nm detektiert.
Eine Standardkurve für alle Aminosäuren wurde mitgeführt, mit deren Hilfe die
Aminosäuremenge in den Proben bestimmt werden konnte. Dazu wurde die Dionex
Chromeleon Software verwendet.
MATERIAL UND METHODEN
29
100%
90%
80%
70%
H
H2O
2O
Acetonitril
Acetonitril
Natriumacetat
Sodium
acetate
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
0,01
0,5
43,5
52,5
53,5
54,5
58,5
60
Zeit [min]
Abb. 3.1: HPLC-Gradient zur Auftrennung von Aminosäuren.
3.3.8 Bestimmung von Enzymaktivitäten
3.3.8.1 Unphysiologischer Glutaminsynthetase-Test (Glutamyl-Transferase-Test)
Neben ihrer physiologischen Aktivität, der Bildung von Glutamin aus Glutamat und
Ammoniak unter Verbrauch von ATP, kann die Glutaminsynthetase (GS) bei der
Anwesenheit von ADP und Arsenat auch die charakteristische Transferreaktion von Glutamin
und Hydroxylamin zu γ-Glutamylhydroxamat katalysieren. Das entstandene γ-Glutamylhydroxamat bildet mit Fe3+-Ionen einen bräunlichen Farbkomplex, der photometrisch
nachgewiesen werden kann. Die physiologische Reaktion des Enzyms ist dabei vollständig
inhibiert.
Glutamin + NH2OH
ADP
Arsenat
γ- Glutamylhydroxamat + H2O
Für den Test nach Shapiro & Stadtman (1970) wurden die C. glutamicum-Zellen wie unter
Punkt 2.2.4 beschrieben kultiviert. 20 ml Zellkultur wurden nach Inkubation bei
Stickstoffmangel geerntet (4.000 xg, 5 min, 4°C), einmal mit Aufschlusspuffer gewaschen
(4.000 xg, 5 min, 4°C) und in 700 µl Aufschlusspuffer resuspendiert. Die Zellsuspension
wurde in 2 ml Cryoröhrchen mit 300 mg Glasperlen (Durchmesser 0,2 - 0,3 mm) durch
hochfrequentes Schütteln für 4 x 30 Sekunden bei 6,5 m/s im FASTPREP-Gerät (FP120,
QBIOGENE, Heidelberg) aufgeschlossen. Zwischen den Intervallen wurden die Röhrchen für
MATERIAL UND METHODEN
30
3 Minuten auf Eis gekühlt. Nach der Zentrifugation (13.000 xg, 4°C, 30 min) konnte der
zellfreie Überstand für die Messung verwendet werden. Für einen Ansatz wurden 380 µl
Testpuffer, 20 µl ADP-Lösung (8 mM) und 10 bis 100 µl Zellrohextrakt zusammenpipettiert
und für 5 Minuten bei 30°C inkubiert. Der Start der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 20 µl
Hydroxylamin-Lösung (360 mM). Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 30°C wurde die
Reaktion durch Zugabe von 1 ml Stop-Lösung beendet. Pro Verdünnung des Rohextraktes
wurde ein Ansatz als Nullwert mitgeführt, bei dem statt Hydroxylamin H2Obidest zugegeben
wurde. Mit diesem Ansatz wurde das Photometer kalibiriert. Die Messung des Eisen-γGlutamylhydroxamat-Komplexes erfolgte bei einer Absorption von 540 nm. Die Menge des
gebildeten γ-Glutamylhydroxamates konnte anhand einer Eichreihe von Konzentrationen
zwischen 0 und 3 mM γ-Glutamylhydroxamat ermittelt werden.
Aufschlusspuffer:
2,5 mM MnCl2, 20 mM Imidazol, pH (HCl) 7,2
Testpuffer:
20 mM Glutamin, 25 mM KHAsO4, 0,27 mM MnCl2, 135 mM Imidazol, pH (HCl) 7,2
Stop-Lösung:
11 g FeCl3 x 6 H2O, 4 g TCA, 4,2 ml 37 % HCl wurden in H2Obidest gelöst und auf 200 ml
aufgefüllt.
3.3.8.2 Bestimmung der Glutamatdehydrogenaseaktivität
Die Aktivität der Glutamatdehydrogenase in Zellextrakten von C. glutamicum wurde nach
Meers & Tempest (1970) bestimmt. Die GDH katalysiert die Reaktion von α-Ketoglutarat
und Ammonium zu Glutamat, wobei NADPH zu NADP+ oxidiert wird. Die Abnahme der
NADPH-Konzentration bei 340 nm (ε = 6,3 x 103 L mol-1 cm-1) wird photometrisch erfasst.
1 Unit GDH-Aktivität entspricht einem Umsatz von 1 µmol NADPH/min. Die spezifische
Aktivität entspricht der Aktivität pro eingesetzter Menge Protein (mg). Für den Zellaufschluss
wurden 15 ml Zellsuspension abzentrifugiert (4.000 xg, 7 min, 4°C), einmal mit 15 ml
eiskaltem
Kaliumphosphatpuffer
gewaschen
und
anschließend
in
1,5
ml
Kaliumphosphatpuffer resuspendiert. Die Zellen wurden durch dreimaliges hochfrequentes
MATERIAL UND METHODEN
31
Schütteln bei 6,5 m/s aufgeschlossen. Anschließend wurden Zelltrümmer und Glasperlen
durch Zentrifugation für 30 min bei 13.000 xg und 4°C sedimentiert. Der zellfreie Überstand
wurde für die Messung verwendet. Für den Test wurde folgendes Reaktionsgemisch in eine
Quarzküvette gegeben:
100 µl 1 M Tris (HCl) pH 8
100 µl 2,5 mM NADPH
100 µl 200 mM Ammoniumchlorid
10 µl Zellextrakt
590 µl H2Obidest
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 100 mM α-Ketoglutarat gestartet und die
Abnahme der Absorption bei 340 nm und 30°C für ca. 1 min im Photometer (V-560 UV/VISSpectrophotometer, JASCO, Gross-Umstadt) verfolgt, wobei alle zwei Sekunden ein
Messwert aufgezeichnet wurde. Zusätzlich wurde die Gesamtproteinkonzentration des
Zellextrakts bestimmt (2.3.4). Anhand der gemessenen Daten konnte die spezifische GDHAktivität mit Hilfe der folgenden Gleichung errechnet werden:
∆A · V
Aktivität =
ε · t ·m · d
Aktivität:
spezifische GDH-Aktivität
∆A:
Änderung der Absorption bei 340 nm
VT:
Gesamtvolumen (hier: 1,5 cm3)
ε:
Extinktionskoeffizient (hier: 6,3 cm2 µmol-1)
t:
Zeit [min]
m:
Proteinmenge im Reaktionsansatz
d:
Schichtdicke der Küvette (hier 1 cm)
MATERIAL UND METHODEN
32
Kaliumphosphatpuffer 200 mM, pH 7,0
400 mM Kaliumphosphat (Mono-Kaliumsalz): 54,4 g KH2PO4 in 500 ml H2O lösen und auf
1 l auffüllen. 400 mM Kaliumphosphat (Di-Kaliumsalz): 69,6 g K2HPO4 in 500 ml H2O lösen
und auf 1 l auffüllen. 39 ml der Mono-Kaliumsalz-Lösung und 61 ml der Di-KaliumsalzLösung mischen und auf 200 ml auffüllen.
3.3.9 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Untersuchung verschiedener Proteine wurden diese präpariert und auf 14 %-ige
Polyacrylamid-Gele aufgetragen (Schägger & von Jagow, 1987). Die Gele enthielten
Harnstoff und SDS, durch die die Proteine denaturiert wurden. Die Proben wurden mit
denaturierendem 5 x Gelladepuffer versetzt, für 5 Minuten bei 65°C inkubiert und zusammen
mit einem Protein-Marker aufgetragen (Prestained Protein Marker Broad Range, 10-180 kDa,
MBI Fermentas, Wilna bzw. peqGOLD Prestained Protein-Marker IV, peqlab Biotechnologie
GmbH, Erlangen). Als Laufpuffer wurden Kathoden- und Anodenpuffer eingesetzt. Die
Elektrophorese wurde bei 50 V gestartet und die Spannung auf 120 V erhöht, sobald die
Proben das Sammelgel durchlaufen hatten. Für große Gele wurde die achtfache Menge an
Trenn-bzw. Sammelgel benötigt. Diese Gele wurden bei 50 V über Nacht laufen gelassen.
14 %iges Trenngel:
1,875 ml Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (37,5 % / 1 %)
1,875 ml Gelpuffer
2,025 g Harnstoff
Unmittelbar vor dem Gießen wurden 18,75 µl 10 % APS und 1,875 µl TEMED zugegeben.
Als overlay solution für die Trenngele wurde H2Odest verwendet.
Sammelgel:
0,125 ml Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (37,5 % / 1 %)
0,3875 ml Gelpuffer
1 ml H2O
Unmittelbar vor dem Gießen wurden 12,5 µl 10 % APS und 1,25 µl TEMED zugegeben
MATERIAL UND METHODEN
33
Kathodenpuffer:
0,1 M Tris, 0,1 M Tricine, 0,1 % SDS
Anodenpuffer:
0,2 M Tris, pH (HCl) 8,9
Gelpuffer:
3 M Tris, 1 M HCl, 0,3 % SDS
Gelladepuffer (5 x):
20 % SDS, 60 % Glycerin (w/v), 250 mM Tris, 10 % Mercaptoethanol (v/v), 0,01 %
Servablau G, pH (HCl) 6,8
3.3.10 Färbung mit Coomassie Brilliant Blue
Auf SDS-Gelen (siehe Punkt 3.3.9) aufgetrennte Proteine wurden nach der Gelelektrophorese
mit Coomassie Brilliant Blue nach Sambrook et al. (1989) sichtbar gemacht. Die Gele wurden
eine Stunde in Färbelösung inkubiert. Die Entfärbung erfolgte über Nacht in 10 % Essigsäure.
Zur Lagerung wurden die Gele in Folie mit 10 % (w/v) Glycerin eingeschweißt und bei 4°C
aufbewahrt.
Färbelösung:
45 % Methanol, 10 % Essigsäure, 0,1 % Coomassie Brilliant Blue G-250
3.3.11 Western Blot
Zur Detektion von spezifischen Proteinen wurde ein Anitkörpernachweis durchgeführt. Nach
der gelelektrophoretischen Auftrennung der Proteine wurden diese aus den SDS-Gelen (siehe
Punkt 3.3.9) in einem semi-dry-Blot auf eine PVDF-Membran (Millipore Immobilon P, Roth,
Karlsruhe) übertragen. Dazu wurde die Membran kurz in 60 %-igem Methanol inkubiert und
in Transferpuffer äquilibriert. Die Membran wurde anschließend auf einen Stapel aus fünf in
Gelgröße zurechtgeschnittenen und in Transferpuffer getränkten Filter-Papieren (Schleicher
& Schuell, Dassel) in eine semi-dry-Blot-Apparatur gelegt. Auf die Membran wurde dann
sofort luftblasenfrei das Proteingel gegeben. Zum Schluss wurde auf das Gel noch ein
weiterer Stapel aus fünf in Transferpuffer getränkten Filter-Papieren gelegt und der
MATERIAL UND METHODEN
34
Proteintransfer auf die Membran bei 0,8 mA pro cm2 Oberfläche für eine Stunde
durchgeführt. Nach dem Transfer wurde die Membran zunächst für eine Stunde in
Blockierungspuffer bei Raumtemperatur geschüttelt und dann für eine weitere Stunde in dem
gleichen Puffer mit dem ersten Antikörper (GlnK-, GDH- oder GlutaminsynthetaseAntiserum) in einer Verdünnung von 1:10.000 inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit
Waschpuffer für je 20 Minuten wurde die Membran für eine Stunde mit dem zweiten
Antikörper in einer Verdünnung von 1:20.000 in Blockierungspuffer bei Raumtemperatur
geschüttelt. Als zweiter Antikörper wurde Anti-Kaninchen IgG (für GlnK- oder GDHAntiserum), Anti-Meerschweinchen IgG (für Glutaminsynthetase-Antiserum) Alkalische
Phosphatase-Konjugat (Sigma, Steinheim) verwendet. Die Detektion der Signale erfolgte über
Präzipitation eines Farbstoffs auf der Membran. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer
für je 20 Minuten wurden 65 µl NBT-Stammlösung (NBT, Roth, Karlsruhe) und 65 µl BCIPStammlösung (BCIP, Roth, Karlsruhe) in 10 ml Inkubationspuffer verdünnt und auf die
Membran gegeben. Die Membran wurde bis zur gewünschten Signalstärke im Dunkeln bei
Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion mit H2Obidest abgestoppt. Zuletzt wurde die
Membran auf Filter-Papieren (Schleicher & Schuell, Dassel) getrocknet.
Transferpuffer:
10 mM CAPS, 1,5 M NaCl, 10 % Methanol, pH (NaOH) 11
Waschpuffer:
50 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH (HCl) 7,5
Blockierungspuffer:
1 x Waschpuffer mit 5 % Milchpulver
NBT-Stammlösung:
0,5 g p-Nitrotetrazoliumblauchlorid (NBT) wurden in 10 ml 70 % Dimethylformamid gelöst,
in 500 µl Portionen aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.
MATERIAL UND METHODEN
35
BCIP-Stammlösung:
0,5 g 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat-p-Toluidinsalz (BCIP) wurden in 20 ml 100 %
Dimethylformamid gelöst, in 500 µl Portionen aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20°C
lichtgeschützt gelagert.
Inkubationspuffer:
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris, pH (NaOH) 9,5
3.4 Molekularbiologische Techniken
3.4.1 DNA-Techniken
3.4.1.1 Plasmid-Präparationen aus E. coli
Die Vorkultivierung der Zellen erfolgte wie unter Punkt 3.2.4 beschrieben. Für die PlasmidMini-Präparation aus E. coli wurde das NucleoSpin Plasmid-Kit (Macherey-Nagel, Düren)
eingesetzt.
3.4.1.2 Präparation chromosomaler DNA aus C. glutamicum
Die Präparation chromosomaler DNA erfolgte mit Hilfe der Phenol-Chloroform-Extraktion.
C. glutamicum-Zellen wurden über Nacht in 5 ml BHI-Medium (siehe Punkt 3.2.2)
angezogen. Morgens wurden die Zellen abzentrifugiert (4.000 xg, 10 min, 4°C), der
Überstand verworfen und das Pellet in 200 µl H2Obidest resuspendiert. Es wurden 200 µl
Phenol zugegeben, der Ansatz wurde gut gemischt und 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Vor
der Zugabe von 200 µl Chloroform wurde der Ansatz zunächst für 2 Minuten auf Eis gekühlt,
um ein Verdampfen des Lösungsmittels zu verhindern. Dann wurde der Ansatz gemischt und
zentrifugiert (13.000 xg, 5 min, 4°C). Der Überstand wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt und die organische Phase verworfen. Zum Ansatz wurde erneut 200 µl Chloroform
pipettiert und dieser zentrifugiert (13.000 xg, 5 min, 4°C). Der Überstand mit der gelösten
DNA wurde von der organischen Phase getrennt, die DNA 1:10 in H2Obidest verdünnt und bis
zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Für eine PCR-Reaktion (siehe Punkt 3.4.1.7)
wurde 1 µl chromosomale DNA als template in einem 20 µl Ansatz eingesetzt.
MATERIAL UND METHODEN
36
3.4.1.3 Reinigung und Konzentrierung von DNA
Die Trennung von Proteinen aus DNA-Lösungen oder die Aufkonzentrierung von gereinigter
DNA erfolgte durch Fällung mit Hilfe eines Ethanol-Essigsäure-Gemisches. Dafür wurde
dem Nukleinsäureansatz 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat pH 4,8 und das 3-fache Volumen
100 % Ethanol zugesetzt. Nach Inkubation für mindestens eine Stunde bei -20°C wurde die
präzipitierte Nukleinsäure zentrifugiert (13.000 xg, 30 min, 4°C), das Pellet zweimal mit
70 % Ethanol (13.000 xg, 5 min, 4°C) gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend wurde
das Sediment in einem geeigneten Volumen H2Obidest oder TE-Puffer aufgenommen.
TE-Puffer:
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH (HCl) 7,5
3.4.1.4 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA
Zur Größenauftrennung und Qualitäts- sowie Quantitätsbestimmungen von Nukleinsäuren
kamen Agarose-Gele mit einer Konzentration von 0,8 bis 2 % in 1 x TAE-Puffer (Sambrook
et al., 1989) zum Einsatz. Die jeweiligen Proben wurden mit 6 x Ladepuffer (Sambrook et al.,
1989) versetzt und als Referenz zusätzlich ein DNA-Marker aufgetragen (LambdaDNA/Eco911 (Bst(II)-geschnitten), MBI Fermentas, Wilna bzw. peqGOLD Leitermix, peqlab
Biotechnologie GmbH, Erlangen). Die Gele wurden mit einer Spannung von bis zu 10 V/cm
Gellänge aufgetrennt. Die Färbung der Nukleinsäure erfolgte in einem Ethidiumbromidbad
und konnte durch eine Geldokumentationsanlage (Doc Print 1000 Gel documentation, peqlab
Biotechnologie
GmbH,
Erlangen)
sichtbar
gemacht
und
dokumentiert
werden.
Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und die Detektion der DNA-Banden erfolgt durch
Fluoreszenzanregung von Ethidiumbromid mit UV-Licht (λ = 366 nm).
TAE-Puffer 50 x:
242 g Tris, 57,1 ml Eisessig, 100 ml 0,5 M EDTA wurden in H2Obidest gelöst, der pH-Wert mit
HCl auf 8,0 eingestellt und die Lösung auf 1 Liter aufgefüllt.
Ladepuffer 6 x:
0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylencyanol FF, 30 % (w/v) Glycerin
MATERIAL UND METHODEN
37
3.4.1.5 Restriktion von DNA
Die Restriktion von DNA wurde mit Restriktionsenzymen von NEB (Frankfurt/Main) nach
Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Restriktionsansätze wurden entweder mit dem
NucleoSpin Extract-Kit (Macherey-Nagel, Düren) direkt oder durch Agarose-Gelelektrophorese in TAE-Puffer (siehe Punkt 3.4.1.4) gereinigt. Aus den Agarose-Gelen wurden die
interessierenden DNA-Banden nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung mit einem
Skalpell unter UV-Licht (λ = 366 nm) ausgeschnitten und die DNA wurde unter Verwendung
des NucleoSpin Extract-Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach den Angaben des Herstellers
isoliert.
3.4.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde mit Ready-to-go Ligationsansätzen von Amersham
Biosciences (Freiburg) bzw. dem Rapid-DNA-Ligation Kit (MBI Fermentas, Wilna) oder mit
T4 DNA-Ligase der Firma NEB (Frankfurt/Main) nach Angaben der Hersteller durchgeführt.
Um die Anzahl der Kolonien pro Platte zu maximieren, wurden die Ansätze so gewählt, dass
das Insert-Fragment in dreifach höherer Konzentration eingesetzt wurde als das VektorFragment. Für eine Transformation von 200 µl chemisch kompetenten E. coli-Zellen wurden
5 µl Ligationsansatz eingesetzt.
3.4.1.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Zur in vitro-Vervielfältigung von DNA-Fragmenten wurde die Polymerase-Kettenreaktion
(Mullis et al., 1986) eingesetzt. Dazu wurden jeweils zwei Primer (forward, reverse) benutzt,
die den zu amplifizierenden DNA-Bereich flankierten. Ein wiederholter Zyklus aus DNADenaturierung, Primer-Anlagerung und Primer-Verlängerung über eine DNA-Polymerase
ermöglichte die Synthese des gewünschten DNA-Fragmentes. Die Primer wurden von
SIGMA-ARK (Darmstadt), Operon (Köln) und MWG (Ebersberg) bezogen und in H2Obidest
auf eine Konzentration von 100 pmol/µl gelöst. Routine-Amplifikationen von DNAFragmenten in einem Größenbereich von 0,1 bis 2 kb wurden mit der Taq-Polymerase aus
dem Master-Mix Kit (Qiagen, Hilden) bzw. PuRe Taq Ready-To-Go PCR beads (GE
Healthcare, München) vervielfältigt. Größere DNA-Fragmente, insbesondere vollständige
Gene, wurden mit der Phusion-Polymerase aus dem High-Fidelity-PCR Kit (NEB,
Frankfurt/Main) amplifiziert, die zusätzlich proofreading-Aktivität besitzt. Die AnnealingTemperatur wurde auf die beiden Primer (forward, reverse) abgestimmt. Für Guanin und
MATERIAL UND METHODEN
38
Cytosin mussten 4°C für die Trennung der Wasserstoffbrückenbindungen aufgebracht
werden, für Adenin und Thymin lediglich 2°C. Als template diente chromosomale DNA oder
eine 10 Minuten bei 95°C gekochte Suspension von Zellen in H2Obidest. Die PCR-Reaktion
wurde in Thermocyclern Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg) oder in Gene Amp
PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, Norwalk, USA) durchgeführt.
Zur Amplifikation mittels der Taq-Polymerase wurde das template zunächst 5 Minuten bei
95°C denaturiert. Im Anschluss erfolgte die Amplifikation des Fragmentes durch eine
Wiederholung
der
folgenden
Schritte:
Jeder
Zyklus
begann
mit
einer
kurzen
Denaturierungsphase bei 95°C für 30 Sekunden. Anschließend erfolgte die Hybridisierung der
beiden Primersequenzen (forward, reverse) an die komplementären Sequenzen des DNAFragmentes, indem die Temperatur für 30 Sekunden auf die Annealing-Temperatur erniedrigt
wurde. Es erfolgte eine Temperaturerhöhung auf 72°C für eine Minute pro kb zu
synthetisierendes DNA-Fragment. Durch die Polymerase wurde das Fragment synthetisiert
bis ein vollständiger Doppelstrang gebildet war (“Extension“). Die letzten drei Schritte
wurden wiederholt und das DNA-Fragment in 30 Temperaturzyklen amplifiziert. Zuletzt
wurde die Temperatur auf 72°C für 10 Minuten gehalten und die Synthese beendet. Bis zur
Entnahme des fertigen PCR-Produkts konnte dieses bei einer Temperatur von 4°C gelagert
werden, um die Entstehung von Einzelsträngen zu vermeiden. Zur Analyse der Größe der
amplifizierten DNA-Fragmente wurden die PCR-Proben auf ein Agarose-Gel aufgetragen und
die Elektrophorese in TAE-Puffer (siehe Punkt 3.4.1.4) durchgeführt.
Für den Ansatz mit der Phusion-Polymerase wurde das template zunächst für 30 Sekunden
bei 98°C denaturiert. Das DNA-Fragment wurde wie folgt amplifiziert: Der Denaturierungsphase bei 98°C für 8 Sekunden folgte die Hybridisierung der beiden Primersequenzen
(forward, reverse) bei 63°C für 20 Sekunden. Durch eine Temperaturerhöhung auf 72°C für
30 Sekunden pro kb wurde das Fragment synthetisiert. Die Wiederholung der letzten
drei Schritte führte zu einer Amplifikation des DNA-Fragmentes in 30 Temperaturzyklen. Die
übrigen Schritte erfolgten wie für die PCR-Reaktion mit der Taq-Polymerase beschrieben.
3.4.1.8 Interaktionsstudien mit dem Two Hybrid-System
Zur Untersuchung von Interaktionen zwischen unterschiedlichen Komponenten der
Stickstoffkontrolle
wurde
das
BacterioMatch
II
Two
Hybrid-System
gewählt
(BacterioMatch II Two Hybrid-System Vector Kit, Stratagene, La Jolla, USA) und nach
Angaben des Herstellers angewendet. Dieses E. coli-System ist in der Lage, Protein-Protein
MATERIAL UND METHODEN
39
Interaktionen zu detektieren, indem die Transkription bestimmter Gene aktiviert wird. Ein
Gen, das für einen der beiden möglichen Interaktionspartner (Köder oder bait) kodiert, wurde
so in den Vektor pBT stromabwärts des Gens für das Bacteriophage λcI Repressor-Protein
(λcI, 237 Aminosäuren) kloniert, dass es in frame mit diesem zusammen abgelesen wurde.
Das Repressor-Protein besteht aus einer aminoterminalen DNA-Bindedomäne und einer
carboxyterminalen Dimerisierungsdomäne. Das Gen für den anderen möglichen Interaktionspartner (Ziel oder target) wurde in den Vektor pTRG stromaufwärts des Gens, das für die
α-Untereinheit einer RNA-Polymerase (RNAPα, 248 Aminosäuren) kodiert, in frame
kloniert, so dass auch diese beiden Gene gemeinsam abgelesen wurden und ein
Fusionsprotein entstand. Beide rekombinanten Vektoren wurden in einem Reporterstamm
(BacterioMatch II Screening Reporter Competent Cells, Stratagene, La Jolla, USA) coexprimiert. Wenn nun die beiden ausgewählten Proteine (bait und target) miteinander
interagierten, wurde die Bindung der RNA-Polymerase α auf dem Promotorbereich der DNA
durch die Bindung des λcI Repressor-Proteins stabilisiert und die Transkription des HIS3
Reportergens aktiviert. Zusätzlich wurde noch ein zweites Gen, aadA, transkribiert, das für
eine Resistenz gegen Streptomycin kodiert, und so eine einfache Selektion bei einer
Interaktion der ausgewählten Proteine ermöglichte.
Die Gene, die für mögliche Interaktionspartner kodieren, wurden über PCR (siehe Punkt
3.4.1.7) amplifiziert und mit Hilfe der multiple cloning site von pBT sowie pTRG in frame
nach Angaben des Herstellers in die entsprechenden Vektoren ligiert (siehe Punkt 3.4.1.5 und
3.4.1.6). Die Transformation erfolgte in E. coli JM110 (siehe Punkt 3.5.1 und 3.5.2). Nach
einer Plasmid-Präparation (siehe Punkt 3.4.1.1) wurde die Richtigkeit des rekombinanten
Vektors durch Sequenzierung (3.4.1.9) überprüft. Für die abschließende Co-Transformation
wurden 50 ng des rekombinanten pBT-Vektors und des rekombinanten pTRG-Vektors
eingesetzt und die Co-Transformation in den Reporterstamm nach Angaben des Herstellers
durchgeführt. Die Plasmidkonzentration wurde mit Hilfe der Extinktion bei 260 und 280 nm
im Photometer ermittelt. Die Effizienz der Transformation des Reporterstammes wurde durch
die beiden Kontrollplasmide pBT-LGF2 und pTRG-GAL11P überprüft, welche die Gene des
Gal4- und Gal11-Proteins exprimierten, die untereinander eine deutliche Interaktion zeigten.
Um auszuschließen, dass die rekombinanten Vektoren bereits mit dem Leervektor pBT oder
pTRG eine Interaktion zeigten, wurden alle rekombinanten Plasmide zusätzlich mit den
entsprechenden Leervektoren co-transformiert. Die Auswertung der Tests erfolgte nach
MATERIAL UND METHODEN
40
Angaben des Herstellers, indem die Anzahl der Kolonien auf nicht-selektivem Medium ins
Verhältnis
zur
Anzahl
der
Kolonien
auf
selektivem
Medium
gesetzt
wurde
(BacterioMatch II Two-Hybrid System Vector Kit, Stratagene, La Jolla, USA)
3.4.1.9 Sequenzierung von DNA
Grundlage des angewendeten Verfahrens war die Kettenabbruchmethode von Sanger. Als
Terminatoren
der
Sequenzierreaktion
dienten
unterschiedlich
fluoreszenzmarkierte
Didesoxynukleotide, die als vorgefertigtes Reagens bezogen wurden (Big Dye Terminator
Mix, Perkin Elmer, USA). Die Durchführung der Sequenzierreaktion erfolgte nach
Empfehlungen des Herstellers. Sie wurde mit folgendem Programm durchgeführt:
25 x
96°C
19 s
55°C
5s
60°
4 min
Analysiert wurden die Produkte der Sequenzierreaktion mit dem ABI PRISM Genetic
Analyser 310 (Applied Biosystems, Freiburg). Die Analyse der Sequenzierdaten erfolgte mit
dem Programm Seqman (DNAstar, USA).
Weitere DNA-Sequenzierungen wurden im Servicelabor des Zentrums für Molekulare
Medizin (ZMMK) der Universität zu Köln durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung durch
Mitarbeiter des Servicelabors erfolgten auf einem ABI Prism 377 DNA Sequencer der Firma
Applied Biosystems (Freiburg) mit der Taq FS BigDye-terminator cycle sequencing Methode.
Zur Probenvorbereitung wurden 5 µl Probe mit 1 µl Primer (10 µM) verdünnt. Die erhaltenen
Sequenzdaten wurden mit den Programmen Sci Ed Central for Windows 95 (Scientific &
Educational Software, Cary, USA) und Chromas Lite Version 2.0 (Technelysium, Tewantin,
Australien) ausgewertet.
3.4.2 RNA Techniken
Alle RNA-Arbeiten wurden zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen unter sterilen
Bedingungen durchgeführt. Es wurden durchgehend Handschuhe getragen. Grundsätzlich
wurden alle Geräte und Lösungen, wenn möglich, zur Eliminierung von RNaseKontaminationen für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert.
MATERIAL UND METHODEN
41
3.4.2.1 Präparation von Gesamt-RNA und RNA-Gelelektrophorese
Zur Präparation von Gesamt-RNA aus C. glutamicum-Stämmen wurde das NucleoSpin
RNAII-Kit (Macherey-Nagel, Düren) eingesetzt. Die Zellanzucht für die RNA-Präparationen
erfolgte wie unter Punkt 3.2.4 beschrieben. Nach Kultivierung unter guter Stickstoffversorgung sowie bei Stickstoffmangel wurden je 1 ml Proben entnommen und
abzentrifugiert (13.000 xg, 30 s, 4°C). Die Zellen wurden vom Überstand getrennt und die
Pellets bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Zur Aufarbeitung wurden die Pellets
in 350 µl RA1-Puffer mit 10 µl/ml β-Mercaptoethanol (NucleoSpin RNAll-Kit, MachereyNagel, Düren) resuspendiert und in 2 ml Cryoröhrchen mit 300 mg Glasperlen (Durchmesser
0,2 - 0,3 mm) pipettiert. Hierauf erfolgte der Zellaufschluss durch hochfrequentes Schütteln
der Röhrchen im FASTPREP-Gerät (FP120, QBIOGENE, Heidelberg) für 2 x 30 Sekunden
bei einer Geschwindigkeit von 6,5 m/s. Zwischen den Intervallen wurde die Zellsuspension
für 3 Minuten auf Eis inkubiert und die Proben danach durch Zentrifugation (13.000 xg, 2
min, 4°C) sedimentiert. Der Überstand wurde mit 350 µl 100 % Ethanol versetzt, gut
gemischt und auf die Säulen des NucleoSpin RNAII-Kits gegeben. Weitere Arbeitsschritte
erfolgten nach Angaben des Herstellers, wobei die RNA während der Präparation
routinemäßig mit DNase behandelt wurde, um Kontaminationen durch chromosomale DNA
zu entfernen. Die Elution erfolgte in 92 µl RNase-freiem H2O. Da die RNA für realtime RT
PCR- sowie für RNA-Hybridisierungsexperimente benutzt wurde, wurde zusätzlich noch ein
RNase-freier-DNase-Verdau mit TURBO-DNase (Ambion, Austin, USA) durchgeführt. Es
wurden 10 µl 10 x Turbo DNase-Puffer und 1 µl TURBO-DNase (2 Units/µl) zur isolierten
RNA-Probe gegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine zweite
Aufreinigung der RNA mit dem NucleoSpin RNAII-Kit (Macherey Nagel, Düren)
durchgeführt, um die störenden Proteine zu beseitigen.
Die Konzentration der RNA-Proben wurde im Photometer (Ultrospec 2100 pro UV/Visible
Spectrophotometer, Amersham Biosciences, Freiburg) gemessen und die Qualität über
Gelelektrophorese kontrolliert. Für die Konzentrationsbestimmung wurde eine 1:50
Verdünnung der RNA-Probe in einer UV-Küvette bei 260 sowie 280 nm vermessen und die
Konzentration in ng/µl berechnet.
Für die qualitative Untersuchung der RNA wurde 3 µl Probe mit 5 µl Gelladepuffer versetzt
und auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Als Laufpuffer diente TAE-Puffer. Die
Elektrophorese wurde mit einer Spannung von bis zu 10 V/cm durchgeführt.
MATERIAL UND METHODEN
42
Die Detektion erfolgte wie bei einem DNA-Agarose-Gel mittels Ethidiumbromid. Bei
erfolgreicher RNA-Präparation waren auf dem Gel für jede Probe zwei charakteristische
Banden sichtbar, eine für die 16SrRNA und eine für die 23SrRNA, die durch eine
Geldokumentationsanlage (Doc Print 1000 Gel documentation, peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen) sichtbar gemacht und dokumentiert werden konnten.
Gelladepuffer:
0,2 % Bromphenolblau (w/v), 0,2 % Xylencyanol (w/v), 65 % Formamid (v/v), 12 %
Formaldehyd (v/v), 2 x MOPS, 2% Saccharose (w/v)
3.4.2.2 RNA-Hybridisierungen
Eine Untersuchung der Veränderung des Expressionsmusters verschiedener Gene erfolgte
über RNA-Hybridisierungen (Dot Blots). Pro Dot wurden jeweils gleiche RNA-Mengen
aufgetragen. 2,5 µg Gesamt-RNA wurden in 100 µl Bromphenolblau-markiertem 10 x SSC
verdünnt. Die positiv geladene Nylonmembran (Nylon Membranes positively charged, Roche
Diagnostics, Mannheim) wurde vor Gebrauch zum Äquilibrieren in 10 x SSC getränkt und die
Dot Blot-Apparatur (S & S Minifold I, Schleicher & Schuell, Dassel) gründlich mit
deionisiertem RNase-freiem H2O gewaschen. Auf die Siebplatte der Apparatur wurde zuerst
ein mit 10 x SSC befeuchtetes Filter-Papier (Schleicher & Schuell, Dassel) gelegt und darauf
luftblasenfrei die feuchte Membran gegeben. Der Zusammenbau der Apparatur erfolgte,
indem die Absaugplatte auf die Nylonmembran gespannt wurde. Durch Anlegen eines
Vakuums an die Apparatur wurden durch alle zu benutzenden Löcher 400 µl 10 x SSC bei
100 mbar gesaugt. Danach wurden die verdünnten RNA-Proben aufgetragen und bei 15 mbar
langsam auf die Membran transferiert. Zum Trocknen der Membran wurde die Pumpleistung
noch für einige Minuten auf 100 mbar erhöht, bevor die RNA durch UV-Bestrahlung im
Cross-Linker (UV Stratalinker 1800, Stratagene, USA) zweimal fixiert wurde (125 mJ/cm2,
Einstellung „Autocrosslink“). Die Hybridisierung der Membran erfolgte in einem
Hybridisierungsröhrchen. Zur Blockierung unspezifischer Bindungstellen auf der Membran
wurde die Membran für mindestens eine Stunde bei 50°C im Hybridisierungsofen
prähybridisiert. Danach wurde die Digoxigenin-markierte RNA-Sonde in derselben Lösung
verdünnt und die Membran über Nacht bei 68°C hybridisiert. Die Lösungen, die für die RNAHybridisierungen benötigt wurden, sind unter Punkt 3.4.2.3 aufgelistet.
MATERIAL UND METHODEN
43
3.4.2.3 Waschen und Detektion der RNA-Hybridisierungen
Nach der Hybridisierung der anti-sense-Sonde mit der RNA wurde die Membran (Nylon
Membranes positively charged, Roche Diagnostics, Mannheim) zur Entwicklung der Blots
zweimal in Waschlösung 1 bei Raumtemperatur für je 15 Minuten gewaschen und dann in
Waschlösung 2 zweimal bei 68°C für je 25 Minuten inkubiert. Nach Waschen mit
Waschpuffer für 5 Minuten erfolgte eine Inkubation der Membran für 35 Minuten bei
Raumtemperatur in 1 x Blocking-Reagenz. Hierauf wurde Anti-DIG-Alkalische PhosphataseKonjugat (Roche Diagnostics, Mannheim) in einer Verdünnung von 1:10.000 gegeben und
weitere 35 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Entfernen von nicht gebundenem
Antikörper-Konjugat wurde dreimal in Waschpuffer für je 20 Minuten bei Raumtemperatur
gewaschen. Danach wurde die Membran für 5 Minuten in Detektionspuffer äquilibriert. Zum
Nachweis der Hybridisierung wurde die Membran mit CSPD-Lösung benetzt und in
Klarsichtfolie eingeschweißt. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37°C konnten die Signale mit
Hilfe von Röntgenfilmen (Hyperfilm M, Amersham Biosciences, Freiburg) detektiert werden.
Prähybridisierungslösung:
50 ml Formamid, 20 ml 10 x Blocking-Reagenz, 25 ml 20 x SSC, 1 ml 10 % Na-Lauroylsarkosinat, 200 µl 10 % SDS wurden in RNase-freiem H2O auf 100 ml aufgefüllt.
20 x SSC:
3 M NaCl, 0,3 M Tri-Natriumcitrat, pH (HCl) 7,0
10 x Blocking-Reagenz:
10 g Blocking-Reagenz (Roche Diagnostics, Mannheim) wurden in 100 ml Maleinsäurepuffer
suspendiert und durch Erwärmen auf 60°C unter Rühren gelöst. Nach dem Autoklavieren
wurde die fertige Lösung bei Bedarf in Maleinsäurepuffer weiter verdünnt.
Waschlösung 1:
2 x SSC, 0,1 % SDS
Waschlösung 2:
0,2 x SSC, 0,1 % SDS
MATERIAL UND METHODEN
44
Maleinsäurepuffer:
0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH (NaOH) 7,5
Waschpuffer:
Maleinsäurepuffer mit 0,3 % Tween 20
Detektionspuffer:
0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH (NaOH) 9,0
CSPD-Lösung:
1:100-Verdünnung von CSPD-Reagenz (Roche Diagnostics, Mannheim) in Detektionspuffer.
3.4.2.4 Präparation von RNA-Sonden durch in-vitro-Transkription
Die für Hybridisierungen mit spezifischen mRNAs benötigten antisense-RNA-Sonden
wurden über in vitro-Transkription hergestellt, die von einem DNA-template ausging. Dazu
wurde zunächst durch PCR ein DNA-Fragment (150 - 500 bp) des zu untersuchenden Genes
hergestellt. Einer der beiden PCR-Primer trug dabei zusätzlich die Sequenz des T7Promotors, der so gesetzt war, dass ein antisense RNA-Molekül entstehen würde. Das PCRProdukt konnte direkt für die in vitro-Transkription eingesetzt werden oder noch zusätzlich
aufgereinigt werden.
Die Markierung der RNA-Sonden erfolgte mit Digoxigenin-11-dUTP.
Der in vitro-Transkriptionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
400 ng DNA-Fragment
2 µl
10 x DIG-RNA-Labeling Mix (Roche Diagnostics, Mannheim)
2 µl
10 x RNA-Polymerase-Puffer (Roche Diagnostics, Mannheim)
2 µl
T7-RNA-Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim)
RNase-freies H2O ad 20 µl
Der Reaktionsansatz wurde gut gemischt, kurz anzentrifugiert und für 2 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die template-DNA wurde durch Zugabe von 2 µl RNase-freier DNase (Roche
Diagnostics, Mannheim) und weiteren 25 Minuten Inkubation bei 37°C abgebaut. Die fertige
RNA-Sonde wurde bis zum Gebrauch bei -80°C gelagert.
MATERIAL UND METHODEN
45
Zur Überprüfung der Sondenqualität wurden 2 µl der hergestellten Sonde auf Nylonmembran
aufgetragen, und analog der RNA-Hybridisierungen (Punkt 3.4.2.3) gewaschen und detektiert.
3.4.2.5 Quantitative Real Time RT PCR
Die Real Time RT PCR-Experimente wurden im MyiQ Single-Color Real Time PCR
Detection System (Biorad, München) durchgeführt. Es wurde die relative Veränderung
spezifischer mRNAs in den Zellen ermittelt, indem zunächst in einer Reverse-TranskriptaseReaktion die RNA in cDNA umgewandelt wurde und die Produktzunahme in einer
anschließenden PCR durch eine fluorimetrische Echtzeitbestimmung erfasst wurde. Als
template wurden 100 ng DNA-freie Gesamt-RNA (siehe Punkt 3.4.2.1) eingesetzt. Die
Detektion des entstehenden DNA-Produktes geschah mit Hilfe des interkalierenden
Fluorophoren „SYBR Green 1“, der sich nur in doppelsträngige DNA einlagert und unter
diesen Umständen eine erhöhte Fluoreszenz aufweist. Für die Real Time PCR wurde das
QuantiTectTM SYBR® Green RT-PCR KIT (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers
verwendet. Die Primer wurden von MWG (Ebersberg) bezogen und in RNase-freiem H2O auf
eine Konzentration von 100 pmol/µl gelöst. Die Größe der amplifizierten DNA-Fragmente
betrug 80-184 bp, da nur so eine gleichbleibende Effizienz der Polymerase gewährleistet
werden konnte.
Für einen 20 µl Real Time RT PCR-Reaktionsansatz wurde folgendes zusammen pipettiert:
10 µl 2 x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix (Qiagen, Hilden)
1 µl
Primer forward [1 µM]
1 µl
Primer reverse [1 µM]
0,2 µl QuantiTect RT Mix (Qiagen, Hilden)
2 µl
Fluorescein [100 nM] (Biorad, München)
100 ng template Gesamt-RNA
RNase-freies H2O ad 20 µl
Die Zugabe von Fluorescein erlaubte Schwankungen, die durch Pipettierfehler zustande
gekommen sind, zu normalisieren.
MATERIAL UND METHODEN
46
Die Real Time RT PCR wurde nach folgendem Programm durchgeführt:
30 min
15 min
15 s
15 s
15 s
Schmelzkurve
50 °C
95 °C
94 °C
60 °C
72 °C
55°C-100°C
40 Zyklen
Im ersten Schritt erfolgte die Übersetzung der mRNA in cDNA bei 50°C, dann folgte eine
Denaturierung des DNA/RNA-Hybrids bei 95°C, bevor die cDNA in 40 Zyklen amplifiziert
wurde. Nach jedem Zyklus wurde die Zunahme des PCR-Produktes anhand des Anstiegs der
Fluoreszenz gemessen, der durch die Einlagerung des SYBR Green Farbstoffes in die DNA
detektierbar war. Am Ende der Real Time RT PCR wurde eine Schmelzkurvenanalyse
durchgeführt, um die Spezifität und die Reinheit des erhaltenen Produktes zu prüfen. Alle
Proben wurden jeweils als Dreifachbestimmungen vermessen. Die Qualität der Läufe wurde
über no template-Kontrollen gewährleistet. Zur Auswertung der einzelnen Läufe wurde die
vom Hersteller mitgelieferte Software benutzt. Mittels der Anwendung Gene Expression
Analysis konnten relative Expressionsunterschiede der target-Gene verglichen werden.
Tab. 3.4: Für Real Time RT PCR verwendete Primer.
Gen
Primer forward (5´-3`)
Primer reverse (5´-3`)
Fragmentlänge [bp]
amtA
amtA-realtime1
amtA-realtime2
80
GCGTCCACACAACCTTCCAC GCGGTACCACCATTGAATCC
amtB
amtR
glnA
gltB
gltD
amtB-realtime1
amtB-realtime2
AGTGGTGGTGGCATGGATG
GAATGCGATGAGCGCAGTAA
RT_amtR1
RT_amtR2
CGAAGCCCTCACCAACGTC
AGGCTGTCTGCGGAAAGCG
glnA-realtime1
glnA-realtime2
TCCATTCCACAGGCACCAA
CGAACTGGGGAGATCTCG
RT_gltB1
RT_gltB2
GGCCTGCGCGATCGTATTC
GTGGCAGACGCGCATCATG
RT_gltD1
RT_gltD2
CGCCGCATCGAGCAAATGG
ATCGTGGCCTGGAACTGAG
102
149
184
150
143
MATERIAL UND METHODEN
47
3.5 Techniken zur Manipulation von Zellen
3.5.1 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Chemischkompetente E. coli-Zellen wurden nach der Methode von Inoue et al. (1990)
hergestellt. Zunächst wurden E. coli-Zellen tagsüber in 20 ml LB-Medium (siehe Tab. 3.3)
kultiviert; von dieser Vorkultur wurden abends 1 ml in 250 ml SOB-Medium (Sambrook et
al., 1989) in einen 2 l Schüttelkolben gegeben und die Zellen unter Schütteln über Nacht bei
22°C angezogen. Am nächsten Morgen wurden die Zellen 10 Minuten auf Eis gekühlt und
abzentrifugiert (4.000 xg, 10 min, 4°C). Das Pellet wurde in 80 ml eiskaltem TB-Puffer
aufgenommen und erneut 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert
(4.000 xg, 10 min, 4°C) und in 6,4 ml TB-Puffer resuspendiert. Langsam wurden 0,4 ml
100 % DMSO zugegeben, die Zellen in 200 µl Portionen aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
TB-Puffer:
10 mM Pipes, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2, pH (KOH) 6,7
SOB-Medium:
5 g Trypton, 1,25 g Hefeextrakt, 0,125 g NaCl, 625 µl 1 M KCl wurden in H2Obidest gelöst und
auf 250 ml aufgefüllt. Nach dem Autoklavieren für 20 Minuten bei 121°C wurden 1,25 ml
steriles 2 M MgCl2 zugegeben.
3.5.2 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen
Die Transformation von chemischkompetenten E. coli-Zellen erfolgte mit Hilfe des
Hitzeschockverfahrens. Für die Transformation wurden die Zellen auf Eis aufgetaut. In einem
Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden zu 200 µl Zellen 1 µl Plasmid-DNA bzw. 5 µl Ligationsansatz gegeben. Dieser Ansatz wurde gemischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die
Aufnahme der DNA erfolgte durch einen Hitzeschock bei 42°C im Wasserbad für
35 Sekunden. Die Zellen wurden erneut für 2 Minuten auf Eis inkubiert und danach zur
Regeneration nach Zugabe von 800 µl SOC-Medium (Sambrook et al., 1989) für eine Stunde
bei 37°C und 135 rpm geschüttelt. Der gesamte Ansatz wurde zentrifugiert (13.000 xg, 30 s,
37°C) das Pellet im Rückfluss resuspendiert und auf eine Platte mit dem entsprechenden
Antibiotikum auf LB-Agar ausplattiert. Die Inkubation erfolgte einen Tag bei 37°C.
MATERIAL UND METHODEN
48
SOC-Medium:
5 g Trypton, 1,25 g Hefeextrakt, 0,125 g NaCl, 0,9 g Glukose, 625 µl 1 M KCl, 1,25 ml
steriles 2 M MgCl2 wurden in H2Obidest gelöst und auf 250 ml aufgefüllt. Sterilisation durch
Filtration.
3.5.3 Herstellung kompetenter C. glutamicum-Zellen
Elektrokompetente Zellen von C. glutamicum wurden nach Liebl et al. (1989) hergestellt. Die
Zellen wurden tagsüber in 5 ml LB-Medium (siehe Tab. 3.3) mit 2 % Glukose vorkultiviert.
Aus dieser Vorkultur wurden abends 200 ml LB-Medium mit Wachstumsinhibitoren in einem
2 l Schüttelkolben auf eine optische Dichte von 0,2 bis 0,3 angeimpft. Die Zellen wurden
dann unter Schütteln (200 rpm) über Nacht bei 22°C angezogen. Am nächsten Tag wurden
die Zellen nach 10-minütiger Kühlung auf Eis abzentrifugiert (4.000 xg, 5 min, 4°C) und in
80 ml 10 %-igem (v/v) sterilem, eiskaltem Glycerin resuspendiert. Die Zellen wurden erneut
abzentrifugiert (4.000 xg, 5 min, 4°C) und die Waschprozedur in 10 %-igem (v/v) sterilem,
eiskaltem Glycerin viermal wiederholt. Anschließend wurden die Zellpellets in 1 ml 10 %igem (v/v) sterilem, eiskaltem Glycerin resuspendiert, in 100 µl Portionen aliquotiert und in
flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung der Zellen erfolgte bei -80°C.
LB-Medium mit Wachstumsinhibitoren:
2 g Trypton, 1 g Hefeextrakt, 1 g NaCl, 5 g Glycin, 0,8 g Isonicotinsäurehydrazid, 200 µl
Tween 80 wurden in H2Obidest gelöst und auf 200 ml aufgefüllt. Sterilisation durch Filtration.
3.5.4 Elektroporation von kompetenten C. glutamicum-Zellen
Zur Transformation wurden die elektrokompetenten Zellen von C. glutamicum auf Eis
aufgetaut und 50 µl der Zellen in eisgekühlte, sterile Elektroporationsküvetten mit 2 mm
Elektrodenabstand (peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) pipettiert. Es wurden 2 µl
Plasmid-DNA zugegeben und die Ansätze vorsichtig gemischt. Unter Einsatz von
Hochspannungspulsen wurden die Zellen im BIORAD Gene-Pulser (BIORAD GmbH,
München) bei 2,5 kV Spannung, 600 Ω Parallelwiderstand und 25 µF Kapazität
elektroporiert. Die Zeitkonstanten lagen bei optimaler Durchführung im Bereich von 12 ms.
Sofort nach dem Elektroschock wurde 1 ml BHIS-Medium zugegeben, die Zellen wurden
gründlich resuspendiert, die Zellsuspension wurde in sterile Kulturröhrchen überführt und zur
Regeneration im Rundschüttler (125 rpm) bei 30°C für 1 bis 2 Stunden inkubiert. Der
MATERIAL UND METHODEN
49
gesamte Ansatz wurde zentrifugiert (13.000 xg, 30 s, 30°C), das Pellet im Rückfluss
resuspendiert und auf BHI-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. Die
Inkubation erfolgte 1 bis 2 Tage bei 30°C.
BHIS-Medium:
1,8 g BHI-Medium und 4,55 g D-Sorbitol wurden in H2Obidest gelöst und auf 50 ml aufgefüllt.
Sterilisation durch Filtration.
3.5.5 Konstruktion von Deletionsmutanten
Die Konstruktion von Deletionsmutanten von C. glutamicum erfolgte nach Schäfer et al.
(1994). Dazu wurde der Vektor pK18mobsacB verwendet. Dieser Vektor trägt zwei
Selektionsmarker: ein Kanamycin-Resistenzgen KmR und ein sacB-Gen, dessen Produkt, die
Levansucrose, für Zellen letal ist, die auf Saccharose-haltigem Medium wachsen.
pK18mobsacB kann ebenfalls nicht von den Zellen repliziert werden. Zur Konstruktion der
Deletion wurde ein Sequenzabschnitt von 500-1.000 bp stromauf- und -abwärts der
gewünschten
Deletionsstelle
in
pK18mobsacB
kloniert
und
das
Konstrukt
über
Elektroporation in die Zellen eingebracht. In den Zellen erfolgte eine Integration in das
Bakteriengenom durch homologe Rekombination. Die entstandenen Kanamycin-resistenten
Klone wurden über Nacht in LB-Medium ohne Antibiotikum inkubiert, um das Entstehen von
Klonen zu ermöglichen, die den Vektoranteil in einer zweiten Rekombination verloren haben.
Im Genom verbleibt entweder die markerfreie Deletion oder das native Gen wird wieder
hergestellt. Nach Ausplattieren der Zellen auf BHI-Medium mit 10 % Saccharose können nur
die Zellen wachsen, die den Vektoranteil verloren haben. Da das sacB-Gen anfällig für
Mutationen ist, wurden die Saccharose-resistenten Klone zur Bestätigung der Eliminierung
des Vektoranteils auf BHI-Medium mit Kanamycin ausgestrichen. Klone, die Kanamycinsensitiv waren, wurden über PCR auf das Vorhandensein der Deletion getestet.
ERGEBNISSE
50
4 Ergebnisse
4.1 Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum
Die Aufnahme von Ammonium bzw. Ammoniak ist für das Wachstum und die
Aufrechterhaltung des Stickstoffmetabolismus von Mikroorganismen von wesentlicher
Bedeutung. Der Transport von Ammonium über die Zellmembran erfolgt über die
membranständigen Amt (Ammoniumtransport)-Proteine. Diese Amt-Proteine stellen eine
Proteinfamilie dar, deren Mitglieder sich in Bakterien, Hefen, Pflanzen und auch im
Menschen finden. Trotz intensiver Studien konnte bisher kein allgemeingültiges Konzept für
den Transportmechanismus dieser Proteine vorgestellt werden, und auch auf die Frage nach
dem transportiertem Substrat (NH4+ oder NH3) gibt es bislang noch keine eindeutige Antwort.
C. glutamicum verfügt über zwei Ammoniumtransporter, AmtA und AmtB, die infolge einer
Stickstoffmangelsituation synthetisiert werden, um die Versorgung der Zelle mit Ammonium
zu gewährleisten. AmtA wurde identifiziert als hochaffines Aufnahmesystem für Ammonium
sowie Methylammonium. Die Ermittlung des apparenten Km-Wertes bei verschiedenen
externen pH-Werten wies darauf hin, dass AmtA das geladenene Ammonium transportiert
(Siewe et al., 1996; Meier-Wagner et al., 2001). AmtB wurde charakterisiert als Ammoniumspezifische Permease,
da für diesen Transporter keine Aufnahme des Analogs
Methylammonium festgestellt werden konnte, jedoch Ammoniumverbrauchsmmessungen
zeigten, dass AmtB-vermittelt Ammonium in die Zelle aufgenommen wird (Meier-Wagner et
al., 2001). Mittels Ammoniumverbrauchmessungen wurden auch Hinweise auf ein drittes
Aufnahmesystem gefunden (Meier-Wagner et al., 2001).
In den nächsten Abschnitten werden Ergebnisse dargestellt, die bei der weiteren
Charakterisierung der Ammoniumtransporter AmtA und AmtB ermittelt wurden.
4.1.1 Methylammoniumaufnahme der Transporter AmtA und AmtB
Zu Beginn dieser Arbeit existierten unterschiedliche Protokolle, nach denen Zellen für
Methylammoniumaufnahmestudien
präpariert
wurden.
Im
ersten
Protokoll
zur
Methylammoniumaufnahmebestimmung wurde nach der Inkubation in einem Stickstofffreien Mangelmedium die Zellen in 50 mM Kaliumphosphatpuffer gewaschen und für die
Messung darin aufgenommen. Vor dem Start der Messung wurden die Zellen mit 10 mM
ERGEBNISSE
51
Glukose vorinkubiert, um die Zellen zu energetisieren (Siewe, 1998). In späteren Protokollen
wurden die Zellen für die Aufnahmemessung im Stickstoffmangelmedium belassen (Jakoby,
1998; Meier-Wagner, 2000). Die Vorinkubation mit Glucose entfiel dabei, da das
Minimalmedium bereits Glukose enthielt.
Für die hier gezeigten Daten erwies sich eine weitere Methode der Probenvorbeitung als die
geeigneteste Vorgehensweise. Die Zellen wurden nach einem standardisierten Animpfschema
kultiviert. Da im weiteren häufig auf die Anzucht von Zellen verwiesen wird, wird diese hier
kurz beschrieben: Zunächst wurden Zellen für ca. acht Stunden in einem Vollmedium (BHI)
unter Schütteln inkubiert, anschließend wurde mit dieser Vorkultur Stickstoff-haltiges
Minimalmedium beimpft, welches über Nacht unter Schütteln inkubiert wurde. Am nächsten
Morgen wurde frisches Stickstoff-haltiges Minimalmedium auf eine bestimmte optische
Dichte (~ 0,5) mit der über-Nacht-Kultur beimpft und bis zum Erreichen der exponentiellen
Wachstumsphase unter Schütteln kultiviert. Um die Zellen Stickstoffmangel zu unterziehen,
wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und in Stickstoff-freiem Minimalmedium
resuspendiert und für ein bis zwei Stunden in diesem Minimalmedium inkubiert. Für
Methylammoniumaufnahmemessungen wurden die Zellen nach der Inkubation in Stickstofffreiem Mangelmedium mit MES/Tris-Puffer gewaschen und für die Messung darin
aufgenommen. Die Verwendung von MES/Tris-Puffer hatte sich bereits bei Bestimmungen
der Methioninaufnahme in C. glutamicum bewährt (Trötschel, 2005). Der Einsatz von
MES/Tris-Puffer erlaubte außerdem, pH-Wert und die Konzentration von Na+-und K+-Ionen
für verschiedene Anwendungen beliebig zu variieren.
Um die Aktivität der Ammoniumtransporter unabhängig voneinander zu ermitteln, wurden
neben dem C. glutamicum-Wildtyp ATCC13032, die C. glutamicum-Stämme, MJ2-38
(∆amtA), LN1.1 (∆amtB), in denen nur jeweils ein funktioneller Ammoniumtransporter
vorhanden ist, und die Doppeldeletionsmutante JS-1, in der sowohl das amtA- als auch das
amtB-Gen deletiert wurde, untersucht. Die Methylammoniumaufnahme wurde bei
verhältnismäßig hohen Substratkonzentrationen im Bereich von 500 µM bis 3 mM bestimmt.
AmtA ist bei einer Methylammoniumkonzentration von 100 µM bereits maximal gesättigt
(Siewe et al., 1996; Meier-Wagner et al., 2001).
ERGEBNISSE
52
Aufnahmerate [nmol min-1 (mg TG)-1
50
40
30
20
10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Methylammonium [µM]
Abb. 4.1: Bestimmung der Methylammoniumaufnahme von AmtA und AmtB. Dargestellt sind die
Aufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] des C. glutamicum-Wildtyps ATCC 13032 (■) und der Stämme LN1.1 (□), MJ2-38 (●), JS-1 (○) in Abhängigkeit zur eingesetzten Substratkonzentration. Die Messungen wurden
bei pH 8 durchgeführt.
Erwartungsgemäß zeigte der C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032, da er über zwei
Ammoniumtransportsysteme verfügt, im Vergleich zu den Deletionsmutanten, die höchsten
Aufnahmeraten. Die Aufnahmeraten des Stammes LN-1.1, in dem der AmtB-Transporter
fehlt, waren gegenüber dem Wildtyp etwas erniedrigt. Diese Differenz lässt sich auf das
Fehlen von AmtB zurückführen. Genau wie der Wildtyp befindet sich auch der Stamm
LN-1.1 bei den hier eingesetzten Methylammoniumkonzentrationen bereits in der Sättigung.
Diese Ergebnisse stimmen mit bereits gemachten Beobachtungen überein, da für die AmtAvermittelte Aufnahme ein Km von 44 ± 7 µM ermittelt wurde (Siewe et al., 1996; MeierWagner et al., 2001). Erstmals konnte AmtB-vermittelte Methylammoniumaufnahme
detektiert werden. Diese unterscheidet sich auffallend vom Aufnahmeverhalten des AmtATransporters. Im Gegensatz zur Methylammoniumaufnahme des Stammes LN-1.1 (∆amtB)
war die Methylammoniumaufnahme des amtA-Deletionsstammes sehr viel geringer und
zeigte bei den eingesetzten Substratkonzentrationen keine Sättigung, sondern stieg mit Höhe
der Methylammoniumkonzentration an. Dies lässt vermuten, dass AmtB aus C. glutamicum
eher dem E. coli-Modell eines Ammoniak-Kanals entspricht, als dass es sich hier ebenfalls
um einen aktiven Ammoniumtransporter handelt, wie es für AmtA aus C. glutamicum
vermutet wird. AmtB-vermittelte Methylammoniumaufnahme konnte bei bisherigen
Aufnahmestudien nicht detektiert werden (Meier-Wagner et al., 2001). Auch der signifikante
Unterschied zwischen den Aufnahmeraten des Wildtyps und denen des Stammes LN1.1
ERGEBNISSE
53
konnte hier erstmals gezeigt werden. Ein Grund für die Diskrepanz zwischen den hier
präsentierten Ergebnissen und früheren Untersuchungen liegt vermutlich in der veränderten
Probenaufbereitung.
Die
Doppelmutante
JS-1
zeigte
bezüglich
der
Methylammoniumaufnahme nur Restaktivität. Auch für diesen Stamm zeigte sich, dass die
Raten mit steigender Substratkonzentration ansteigen, wobei sich ein deutlicher Unterschied
zur AmtB-vermittelten Aufnahme zeigte.
Insgesamt ergänzten sich die Aufnahmeraten der Einzelmutanten LN-1.1 und MJ2-38 zur
Methylammoniumaufnahme des Wildtyps. Aufgrund dieser Beobachtung und der Tatsache,
dass die Doppeldeletionsmutante kaum Aufnahme zeigte, kann man schlussfolgern, dass die
Existenz eines dritten Ammoniumsystems in C. glutamicum, wie es von Meier-Wagner et al.
(2001) gefordert wurde, unwahrscheinlich ist.
4.1.2 Stickstoffkontrolle in den C. glutamicum-Stämmen LN-1.1, MJ2-38 und JS-1
Die Expression der Ammoniumtransportergene unterliegt einer strikten Kontrolle, der so
genannten Stickstoffkontrolle. Bei guter Stickstoffverfügbarkeit werden Gene, deren Produkte
an der Aufnahme und Assimilation von verschiedenen Stickstoffquellen beteiligt sind,
darunter auch die Gene amtA, amtB und glnA, durch den Repressor AmtR reprimiert. Bei
Stickstoffmangel kommt es zur Derepression und damit zur Transkription AmtR-regulierter
Gene. Um festzustellen, ob in den Einzeldeletionsstämmen LN-1.1 und MJ2-38 und im
Doppeldeletionsstamm JS-1 die Stickstoffregulation noch intakt ist, wurden Western BlotExperimente durchgeführt. Mit RNA-Hybridisierungsexperimenten wurde außerdem das
Expressionsmuster der Gene amtA und amtB in den Stämmen LN-1.1, MJ2-38 und JS-1
untersucht.
ERGEBNISSE
A
54
M
1
2
3
4
5
6
7
B
8
72
72
55
43
34
26
55
43
34
26
17
17
11
11
1
C
2
M
1
1
2
2
3
4
5
6
7
8
Wildtyp ATCC 13032
MJ2-38
LN-1.1
JS-1
amtA
amtB
Abb. 4.2: Stickstoffkontrolle im C. glutamicum Wildtyp ATCC 13032 und den Deletionsstämmen MJ2-38,
LN-1.1 und JS-1. Mit Western Blot-Experimenten wurde die Anwesenheit von GS (A)- und GlnK (B)-Protein
im Wildtyp (1, 2), sowie im amtA-Deletionsstamm MJ2-38 (3, 4), im amtB-Deletionsstamm LN-1.1 (5, 6) und
im amtA/amtB-Doppeldeletionsstamm JS-1 (7, 8) analysiert. 25 µg Gesamtprotein wurden jeweils aufgetragen.
Als Standard (M) wurde pEQGOLD Protein Marker (Prestained) der Firma pEQlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen verwendet. Ungerade Zahlen repräsentieren Zellen, die unter Stickstoffüberschuss geerntet wurden,
gerade Zahlen Zellen, die einstündigem Stickstoffmangel unterzogen wurden. Mit den genannten C. glutamicumStämmen wurden außerdem RNA-Hybridisierungsexperimente (C) durchgeführt, die unter Stickstoffüberschuss
(1) und Stickstoffmangel (2) kultiviert wurden. Die RNA-Hybridisierungen erfolgten mit amtA- und amtBSonde. Es wurde 1 µg Gesamt-RNA aufgetragen.
Da das AmtR-Bindemotiv vor dem glnA-Gen, welches für die Glutaminsynthetase kodiert,
relativ schlecht konserviert ist, ist die Repression des glnA-Gens weniger strikt, und die
Expression dieses Gens kann schon bei ausreichender Stickstoffverfügbarkeit beobachtet
werden (Nolden et al., 2001b; Beckers et al., 2005). Wie Abbildung 3.2 zeigt, konnte das
auch für die untersuchten C. glutamicum-Deletionsstämmen gezeigt werden. Das glnK-Gen
ist mit dem Gen glnD, welches für die Adenylyltransferase GlnD kodiert und dem
Ammoniumtransportergen amtB in einem Operon organisiert. Die Repression dieses Operons
durch AmtR ist besonders stark (Nolden et al., 2001b; Beckers et al., 2005). Dies ist auch in
den Stämmen MJ2-38, LN-1.1 und JS-1 der Fall, das GlnK-Protein ist nur nachweisbar, wenn
die
Zellen
Stickstoffmangel
unterworfen
worden
sind.
Unter
ERGEBNISSE
55
Stickstoffüberschussbedingungen lässt sich das Protein nicht nachweisen, da es dann nur in
sehr geringer Kopienzahl in der Zelle vorliegt.
Desweiteren wurde die Expression der Ammoniumtransportergene amtA und amtB in den drei
Deletionsstämmen sowie im Wildtyp untersucht. Mit Hilfe dieser Expressionsanalysen konnte
verifiziert werden, dass in den Stämmen LN-1.1 und MJ2-38 nur amtA bzw. amtB exprimiert
wurden und im Stamm JS-1 keins der beiden Gene exprimiert wurde, d. h., mit Hilfe der
Aufnahmestudien wurde jeweils die Aktivität von AmtA bzw. AmtB bestimmt. Um die
Expressionsanalysen mittels RNA-Hybridisierungsexperimenten zu verfizieren bzw. genauer
bewerten zu können, wurden zusätzlich Experimente mit der sensitiveren Methode der Real
Time RT PCR durchgeführt.
1800
relative fold expression
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Wildtyp ATCC 13032
Abb.
4.3:
Expression
der
Gene
amtA
MJ2-38
und
LN-1.1
amtB.
Untersucht
JS-1
wurde
die
Expression
der
Ammoniumtransportergene amtA (■) und amtB (□) in den Deletionstämmen MJ2-38, LN-1.1 und JS-1 und zum
Vergleich im C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032. Die Zellen der untersuchten Stämme wurden nach
Inkubation in Stickstoff-freiem Minimalmedium geerntet. Die Expression der beiden Gene im Wildtyp unter
Stickstoffüberschussbedingungen wurde gleich 1 gesetzt und die Expression unter Stickstoffmangelbedingungen
im Wildtyp sowie in den Deletionsstämmen daran angeglichen. Das Experiment wurde als Dreifachbestimmung
durchgeführt. Die Standardabweichungen sind angegeben.
Die Ergebnisse der Real Time RT PCR stimmten mit den RNA-Hybridisierungsexperimenten
insofern überein, dass sich ebenfalls zeigte, dass in den Einzeldeletionsstämmen nur das
jeweils andere Transportergen abgelesen wurde und im Doppeldeletionsstamm JS-1 keines
der Gene transkribiert wurde. Mit Hilfe der Real Time RT PCR konnten aber auch
Unterschiede im Expressionsmuster von amtA und amtB deutlich gemacht werden, die sich
mit den RNA-Hybridisierungsexperimenten so nicht zeigen ließen. Es konnte ein deutlicher
Unterschied zwischen der amtA-und amtB-Transkriptmenge festgestellt werden, was sich
ERGEBNISSE
56
besonders drastisch im C. glutamicum-Wildtyp zeigte. Interessanterweise schien die amtBExpression von der Deletion des amtA-Gens im Stamm MJ2-38 beeeinflusst zu werden. So
war die Transkription des amtB-Gens im amtA-Deletionsstamm MJ2-38 höher als im
Wildtyp. Durch verstärkte Expression des intakten Ammoniumtransportgens sollte scheinbar
der Verlust des hochaffinen Ammoniumtransporters AmtA komplementiert werden. In der
amtB-Deletionsmutante war der umgekehrte Fall, also die verstärkte Transkription des amtAGens nur in sehr geringem Ausmaß zu beobachten.
4.1.3 Diffusion von Methylamin
Für den Stamm JS-1 konnte im vorhergehenden Abschnitt gezeigt werden, dass Zellen dieses
Stammes kaum Methylammonium aufnehmen. Die für diesen Stamm ermittelte Restaktivität
wurde auf Diffusion des ungeladenen Substrats Methylamin zurückgeführt. Um diesen
Sachverhalt
weitergehend
zu
untersuchen,
wurden
Transportmessungen
mit
dem
Doppeldeletionsstamm bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Meier-Wagner et al.
(2001) konnten bereits zeigen, dass der apparente Km der Methylammoniumaufnahme
unabhängig vom pH-Wert ist, und AmtA vermutlich geladenes Methylammonium
transportiert. Ebenso wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, wurden auch die Zellen des
Doppeldeletionsstammes Stickstoffmangel unterzogen, auch wenn durch Deletion der Gene
amtA und amtB keine Derepression dieser AmtR-regulierten Gene notwendig war.
Aufnahme [nmol (mg TG)-1]
25
20
15
10
5
0
0
0,5
1
1,5
2
Zeit [min]
Abb. 4.4: Aufnahme von Methylamin. Zellen des Stammes JS-1 wurden nach zweistündiger Inkubation ohne
Stickstoffmangel in drei Fraktionen aufgeteilt, die jeweils mit Mes-Tris-Puffer mit pH 7 (■), 8 (□) oder 9 (●)
gewaschen und für die Aufnahmemessung in entsprechendem Puffer aufgenommen wurden. Der Start der
Aufnahmemessung erfolgte durch Zugabe von 500 µM Methylammonium (Endkonzentration). Die
Methylammoniumaufnahme [nmol (mg TG)-1] wurden in Abhängigkeit der Probennahmezeitpunkte [min]
dargestellt.
ERGEBNISSE
57
Wie Abbildung 3.3 zu entnehmen ist, zeigte sich im Doppeldeletionsstamm eine signifikante
Abhängigkeit der Aufnahme vom pH-Wert. So sind die ermittelten Werte bis zu 10-fach
höher, wenn die Zellen im MES/Tris-Puffer mit pH 9 vermessen wurden als im Puffer mit
pH 7. Daraus kann zunächst geschlossen werden, dass die Bindung des Substrats an die
Zellen, von Transport kann in diesen Zellen aufgrund der Deletion der Transportergene nicht
gesprochen werden, vom pH abhängig ist. Wie Abbildung 3.3 zeigt, kam es nur bei pH 9 zu
einer signifikanten Akkumulation radioaktiven Labels, somit konnte die Annahme verfiziert
werden, dass es sich bei der in Abbildung 3.1 gezeigte Restaktivität für den Stamm JS-1
lediglich um Diffusion des ungeladenen Methylamins handelt. Im weiteren wurden
Aufnahmemessungen, wenn nicht anders angegeben, im pH-Bereich 7,5-8 durchgeführt.
ERGEBNISSE
58
4.2 Untersuchungen zur Funktion von AmtB
4.2.1 Inhibition der Methylammoniumaufnahme durch Ammonium
Da
innerhalb
dieser
Arbeit
erstmals
AmtB-vermittelte
Methylammoniumaufnahme
nachgewiesen werden konnte, wurde dieser Transporter mit Hilfe von Aufnahmestudien
weiter charakterisiert. Um die kinetischen Parameter des Ammoniumtransports zu bestimmen,
wurden
Kompetitionsexperimente
Methylammoniumkonzentration
Ammoniumkonzentrationen
durchgeführt,
wurden
dem
zugegeben.
In
d.
h.,
bei
Reaktionsansatz
diesem
konstanter
verschiedene
Fall
wurde
eine
Methylammoniumkonzentration von 100 µM gewählt, die Ammoniumkonzentrationen lagen
im Bereich von 1-100 µM.
Aufnahme [nmol (mg TG)-1]
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,5
1
1,5
2
Zeit [min]
Abb. 4.5: Inhibition der Methylammoniumaufnahme durch Ammonium im amtA-Deletionsstamm
MJ2-38. Dargestellt sind die Aufnahmeraten (nmol (mg TG)-1) des Stammes MJ2-38 in Abhängigkeit von den
Probenahmezeitpunkten. Die Messung wurde mit 100 µM Methylammonium (■), mit 100 µM
Methylammonium und 1 µM Ammonium (□) und mit 100 µM Methylammonium und 10 µM Ammonium (●)
durchgeführt.
Die Aufnahme von 100 µM Methylammonium im Stamm MJ2-38 wurde bereits durch
Zugabe von 1 µM Ammonium vollständig inhibiert. Für alle weiteren getesteten
Ammoniumkonzentrationen
(2,
5,
10,
20,
50
µM)
konnte
ebenfalls
keine
Methylammoniumaufnahme mehr ermittelt werden. Exemplarisch sind in Abbildung 3.4 die
Methylammoniumaufnahmekinetiken
des
amtA-Deletionsstammes
ohne
Zugabe
von
Ammonium und mit 1 µM und 10 µM Ammonium dargestellt. Die Inhibierung durch
Ammonium war unerwartet stark. Die Aufnahme von Methylammonium durch AmtA wird
ERGEBNISSE
59
bei einer Endkonzentration von 100 µM durch etwa 10 µM Ammonium halbmaximal
gehemmt (Meier-Wagner et al., 2001).
4.2.2 Membranpotentialabhängigkeit der AmtB-Aktivität
Der
Vergleich
der
Methylammoniumaufnahme
des
AmtA-Proteins
mit
der
Methylammoniumaufnahme des AmtB-Proteins (Abb. 3.1) macht deutlich, dass es sich um
verschiedene Transportmechanismen handelt. Während AmtA ein hochaffiner Transporter ist,
der Sättigung zeigt, ist AmtB auch bei hohen Substratkonzentration nicht gesättigt und ähnelt
eher dem E. coli-Modell eines Kanals, der die Diffusion des ungeladenen Methylamins über
die Membran erleichtert. Um für AmtB zwischen Kanal- und Carrierfunktion differenzieren
zu können, wurde zunächst getestet, ob die Methylammoniumaufnahme durch Zugabe von
Valinomycin und Nigericin beeinflusst werden kann. Bei diesen Substanzen handelt es sich
um Antibiotika, die Zellmbranen durchdringen können, da sie eine hydrophobe Oberfläche
besitzen. Diese so gennanten Ionophore werden genutzt, um selektiv Ionen in die Zellen
einzuschleusen. Valinomycin komplexiert K+-Ionen in einer käfigartigen Struktur und
transportiert diese so durch die Zellmembran. Bei Nigericin handelt es sich um einen H+/K+-
Aufnahmerate [nmol min-1 (mg TG)-1]
Antiporter. Durch den Transport von Ionen in die Zellen wird das Membranpotential zerstört.
35
30
25
20
15
10
5
0
1
Wildtyp ATCC
13032
2
LN-1.1
Abb. 4.6: Membranpotentialabhängigkeit der AmtB-vermittelten Methylammoniumaufnahme. Untersucht
wurde die Membranpotentialabhängigkeit der Methylammoniumaufnahme in den C. glutamicum-Stämmen
Wildtyp ATCC 13032 und dem amtA-Deletionsstamm LN-1.1. Die Messung erfolgte ohne (■) und mit 20 µM
Valinomycin und 5 µM Nigericin (□). Die Messung wurde mit 500 µM Methylammonium (Endkonzentration)
bei einem externen pH von 7,5 durchgeführt. Die Proben wurden in einem Zeitraum von 15 s- 2 min entnommen
und die Aufnahmeraten aus dem linearen Teil der Kinetik bestimmt. Die Messungen wurden dreimal ausgeführt,
die Standardabweichung ist angegeben.
ERGEBNISSE
60
Die Methylammoniumaufnahme des Deletionsstammes LN-1.1 wurde durch die Zugabe von
Valinomycin und Nigericin erniedrigt. Die Membranpotentialabhängigkeit konnte für den
aktiveren Transporter AmtA bereits dargestellt werden (Meier-Wagner et al., 2001). Hier
konnte erstmals gezeigt werden, dass auch die AmtB-vermittelte Methylammoniumaufnahme
abhängig vom Membranpotential ist.
4.2.3 Ionenabhängigkeit der AmtB-Aktivität
Da Kalium- und Ammoniumionen über ähnliche Ionenradien verfügen (Weast, 1966), wird
seit längerem eine Beeinflussung der Methylammoniumaufnahme durch K+-Ionen diskutiert
(Kleiner,
1985;
Kustu
&
Inwood,
2006).
Zur
weiteren
Charakterisierung
der
Methylammoniumaufnahme durch AmtB, wurde die Methylammoniumaufnahme im amtADeletionsstamm MJ2-38 mit verschiedenen externen K+-Ionenkonzentrationen und zur
Kontrolle auch mit verschiedenen externen Na+-Ionenkonzentrationen ermittelt. Dazu wurden
die Zellen des C. glutamicum- Stammes MJ2-38 kultiviert und nach einstündiger Inkubation
in Stickstoff-freiem Minimalmedium in verschiedenen MES/Tris-Puffern gewaschen und
darin aufgenommen, wobei die Puffer unterschiedliche Konzentrationen von K+-und Na+Ionen enthielten. Die Puffer waren dabei so gewählt, dass eine Gesamtionenkonzentration von
20 mM erhalten blieb, d. h., bei geringer Menge K+-Ionen wurde diese ergänzt durch die
entsprechende
Menge
Na+-Ionen.
Mit
den
so
präparierten
Zellen
wurden
Aufnahmemessungen durchgeführt, wobei 100 µM Methylammonium (Endkonzentration)
eingesetzt wurde. Der pH-Wert der Puffer betrug 8,0.
Tab. 4.1: K+-Ionenabhängigkeit der Methylammoniumaufnahme des Stammes MJ2-38. Gezeigt werden die
Methylammoniumaufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] des C. glutamicum-Stammes, die unter verschiedenen
K+-Ionenbedingungen ermittelt wurden.
K+-Konzentration Methylammoniumaufnahme
[mM]
[nmol min-1 (mg TG)-1]
0
2,0
2
1,4
5
1,5
10
1,2
ERGEBNISSE
61
K+-Konzentration Methylammoniumaufnahme
[mM]
[nmol min-1 (mg TG)-1]
20
1,1
Wie Tabelle 3.1 zeigt, nahm die Methylammoniumaufnahme im amtA-Deletionsstamm mit
steigender K+-Konzentration leicht ab. Eine Veränderung der Aufnahme zeigte sich nicht,
wenn statt der K+- die Na+-Konzentration des Messpuffers erhöht wurde (Daten nicht
gezeigt). Dies ist ein Indiz dafür, dass die Aufnahme von Methylammonium durch K+-Ionen
beeinflusst wird, also die verschiedenen Ionen untereinander im Wettbewerb stehen und sich
verdrängen können. Das würde nahe legen, dass das geladene Methylammonium die
transportierte Substratform ist. Wurde der Versuch mit Messpuffern durchgeführt, deren
Ionenkonzentration nicht durch das jeweils andere Ion ergänzt wurde, sondern entweder K+oder Na+-Ionen in den Konzentrationen 0-20 mM enthielten, zeigte sich dieser Effekt nicht
(Daten nicht gezeigt). Die Methylammoniumaufnahme ließ sich mit diesen Puffern nicht
beeinflusssen. Auch für die Methylammoniumaufnahme des C. glutamicum-Wildtyps und des
Deletionsstamms LN-1.1 ließen sich unter diesen Bedingungen keine Veränderungen
feststellen.
Insgesamt bleibt der Effekt von K+-Ionen auf die Methylammoniumaufnahme auch in
C. glutamicum unklar, da sich bei alleiniger Variation von K+-Ionen mit sich gleichzeitig
ändernder Gesamtionenkonzentration kein Effekt zeigte.
4.3 Strukturelle Betrachtung zu AmtA und AmtB
4.3.1 Vergleich von AmtA und AmtB aus C. glutamicum mit Amt-Proteinen aus E. coli,
Archaeoglobus fulgidus und L. esculentum
Bei den dargestellten Untersuchungen zeigten sich große Unterschiede zwischen der
Aufnahme von AmtA und AmtB (siehe Abb. 4.1). Da diese Daten vermuten ließen, dass es
sich bei AmtA um einen aktiven Ammoniumtransporter und bei AmtB um einen Kanal
handelt, der die Diffusion von Ammoniak vermittelt, wurden Aminosäurevergleiche mit AmtProteinen aus anderen Organismen angestellt. Bei diesen handelte es sich zum einen um
Proteine, deren Kristallstruktur bereits bekannt ist und aufgrund dieser Daten als Kanäle für
ungeladenes Ammoniak gelten (Khademi et al., 2004; Zheng et al., 2004; Andrade et al.,
ERGEBNISSE
62
2005). Dies war neben dem Protein AmtB aus E. coli das Protein Amt-1 aus Archaeoglobus
fulgidus. Zum anderen wurde das Protein LeAmt1;1 aus L. esculentum (Tomate) in diese
Untersuchungen einbezogen. Dieses Amt-Homolog wurde im Gegensatz zu den beiden
anderen Amt-Homologen als aktiver Transporter des Ammoniumions bzw. des geladenen
Methylammoniums
beschrieben
(Ludewig
et
al.,
2002).
Die
Vergleich
der
Aminosäuresequenzen sollte Aufschluss darüber geben, ob es Unterschiede oder
Ähnlichkeiten zwischen den Proteinen gibt, die sie entweder als Kanal oder aktiven
Transporter ausweisen. Zusätzlich wurden die C. glutamicum-Transporter AmtA und AmtB
untereinander mittels Strukturmodellierungen verglichen, um auch hier Erklärungen für den
möglichen Einfluss struktureller Unterschiede auf die Aktivität zu finden. Diese
Strukturmodellierungen wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Heinrich Sticht, Institut
für Biochemie, Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
ERGEBNISSE
63
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
------------MKIATIKTGLASLAMLPGLVMAAPAVADKADN-AFMMICTALVLFMTIPGIALFYGGLIRGKNVLSML
---------------------------------------MDPSDLAWILAAFALVSLMF-PGLSLLYGGMLGGQHVLNTF
--------------------------------MGADQIAAVSGNSAWMLMSASLVLLMT-PALALFYGGMSRQKSVLNMM
---------------------------------------MSDGNVAWILASTALVMLMV-PGVGFFYAGMVRRKNAVNMI
MACSVDTLAPFLGPNTTNAVAAASYICNQFSGVSDRFVDTGYAIDSTYLLFSAYLVFSMQLGFAMLLAGSVR--NTMNIM
: :
: : :
...:: .*
.:. :
67
40
47
40
78
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
TQVTVTFALVCILWVVYGYSLAFGEG---NNFFGN-INWLMLKNIELTAVMGSIY------QYIHVAFQGSFACITVGLI
MMVMSSLGIISLVYIIYGHGLVLGNSIGGWGIIGNPLEYFGFRNIMEDDGT---------GDLMWAGFYILFAAISLALV
MMSFGALGVVTVIYLLWGWSMSYGTQSI-AGIFANPFEFFGLKDSIVDADGNYIEGAAGYPNIIDIGFQLTFAVISTALI
ALSFISLIITVLLWIFYGYSVSFGNDIS--GIIGG-LNYALLSGVKGED-------------LLFMMYQMMFAAVTIAIL
LTNVLDAAAGGLFYYLFGFAFALGGPSN--GFIGR--HFFGLKEIPSNS-----------FDYMNFLYQWAFAIAAAGIT
:.: .:* .. *
.::.
.: :
:
:
** : .:
137
111
126
104
143
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
VGALAERIRFSAVLIFVVVWLTLSYIPIAHMVWG-------------GGLL------------------ASHGALDFAGG
SSGAAGRMRFGAWLVFGVLWFTFVYAPLAHWVFAIDDPESGYV----GGWMKN-----------------VLEFHDFAGG
SGALAERVKFSTWLIFSGAWVTLVYFPLAHMVWG-------------GGLLGHNVTGFASWLFGSTDGEANIAPIDFAGG
TSAIAERAKVSSFILLSALWLTFVYAPFAHWLWG-------------GGWLA------------------KLGALDFAGG
SGSIAERTQFVAYLIYSSFLTGFVYPVVSHWFWTPDGWASPTNSNLLFG----------------------SGVIDFAGS
.. * * :. : ::
: * .:* .:
*
****.
186
170
193
153
201
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
TVVHINAAIAGLVGAYLIGKRVG-----FGKEAFKPHNLPMVFTGTAILYIGWFGFN-------------AGSAGTANEI
TAVHMNAGASGLALAIVLGRRH--------SMAVRPHNLPLILIGAGLIVAGWFGFN-------------GGTAGGANFL
TVVHISAGTAALVLAFIVGKRKT-----FGKAIARPHNLPMVMLGAALLWFGWFGFN-------------GGSAFAADGL
MVVHISSGFAALAVAMTIGKRAG-----FEEYSIEPHSIPLTLIGAALLWFGWFGFN-------------GGSALAANDV
GVVHMVGGIAGFYGALIEGPRIGRYDHTGRSVALRGHSASLVVLGTFLLWFGWYGFNPGSFNKILVTYGASGGYYGQWSA
.**: .. :.: *
* *
.
. *. .: . *: :: **:***
.*
248
229
255
215
281
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
AALAFVNTVVATAAAILGWIFGEWALRGKPSLLGACSGAIAGLVGVTPACGYIGVGGALIIGVVAGLAGLWGVTMLKRLL
ASYVVVTSLIAAAGGMMGFMLVERVFSGKPTFFGSATGTIAGLVAITPAADAVSPLGAFAVGALGAVVSFWAIS-WKKGH
AGLAWVNTTAATAAAMLGWLATEKFRDGHATSLGAASGVVAGLVAITPAAGALTPVTSLILGAIGGILACLGVG-LKYRF
AINAVVVTNTSAAVAGFVWMVIGWIK-GKPGSLGIVSGAIAGLAAITPAAGFVDVKGAIVIGLVAGIVCYLAMD-FRIKK
VGRTAVTTTLAGCTAALTTLFGKRILSGHWNVTDVCNGLLGGFAAITAGCSVVEPWAAIICGFVAALV-LIGFNMLAEKF
. . * : : . . : :
*:
. .* :.*:..:*.... :
:: * :..:
..
328
308
334
293
360
81
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
RVDDPCDVFGVHGVCGIVGCIMTGIFAASSLGGVGFAEG-------VTMG--HQLLVQLESIAITIVWSGVVAFIGYKLA
RVDDSFDVFAVHGMAGIAGALFVMLFGDP-LAPAGVSGV-------FFGGELSLLWREPLAIIVTLTYAFGVTWLIATIL
GFDDSLDVVGVHLVAGLWGTVGVGLLATD----IGWFSG-------GGMDGLKLFIVQIVIALVAVVFAGVITALIAFAL
KIDESLDAWAIHGIGGLWGSVAVGILANP-EVN-GYAGL-------LFG-NPQLLVSQLIAVASTTAYAFLVTLILAKAV
KYDDPLEAAQLHGGCGAWGIIFTGLFAKGEFVDQVYPGKPGRPHGLFMGGGGKLLGAHIIQILVIIGWVSATMGPLFYIL
*:. :. :*
* * : . ::.
: .
:
399
380
403
363
440
b0451
cg1785
cg2261
AF_0977
LeAmt1;1
Clustal Consensus
DLTVGLRVPEEQEREGLDVNSHGENAYNA------------------------------------------NKFMTLRITSEAEYEGIDRAEHAESAYHLNSNGIGMATRTNFGPEIPEETVPDAVQVGVDKQKIADTRKASK
KATVGWRVDDDVEQQGIDTHEHAESAYDTTGPEIR------------------------------------DAAVGLRVSSQEEYVGLDLSQHEEVAYT-------------------------------------------HKFKLLRISSEDEMAGMDLTRHGGFAYYHEEDPKLGMQMRRIEPTTST-----------------------.
*: .: * *:*
*
**
428
452
438
391
488
103
Abb. 4.7: Aminosäurevergleich von Amt-Proteinen. Gegenübergestellt wurden die Transporter aus E. coli
(Stamm K12 (b0451)), C. glutamicum (Wildtyp-Stamm ATCC 13032 (cg1785 AmtA, cg2261 AmtB)),
A. fulgidus (AF_0977) und LeAMT1;1 aus L. esculentum (LeAMT1;1). Die grauen Balken markieren die 11
Transmembrandomänen der Transporter. Die gelben Pfeile zeigen Aminosäuren an, denen anhand der
Röntgenstruktur aus E. coli eine besondere Bedeutung bezüglich der Substratbindung und Substrattranslokation
im Protein vorhergesagt wurde. Die grünen Pfeile markieren Aminosäuren, die sich zwischen AmtA und AmtB
unterscheiden.
Die Aminosäuren Phenylalanin 103, Phenylalanin 107, Tryptophan 148 und Serin 219 bilden
die Bindestelle für Ammonium bzw. Methylammonium am periplasmatischen Eingang des
E. coli AmtB-Proteins (Khademi et al., 2004; Zheng et al., 2004; Liu & Hu, 2006). Der
Vergleich der E. coli-AmtB-Proteinssequenz mit den Aminosäuresequenzen der Amt-Proteine
aus A. fulgidus und L. esculentum sowie AmtA und AmtB aus C. glutamicum zeigt, dass die
ERGEBNISSE
64
entscheidenen Aminosäuren hoch konserviert in den verschiedenen Organismen sind. Es
zeigten sich keine Unterschiede, die auf ein „Transporter“- bzw. „Kanalmuster“ schließen
lassen. Neben den periplasmatischen Phenylalaninresten 107 und 215 wird dem
cytoplasmatischen Phenylalanin 31 ebenfalls Bedeutung bei der Deprotonierung des
Ammoniums zugesprochen (Bostick & Brooks III, 2007). Auch bei dieser Aminosäure
handelt es sich um einen hochkonservierten Rest, lediglich im AmtA aus C. glutamicum und
im LeAMT1;1 aus L. esculentum finden sich an dieser Position Leucinreste. Dieser Austausch
zu Leucin könnte einen Effekt auf die Polarität der Pore haben.
Außerdem von Bedeutung für die AmtB-Aktivität in E. coli ist das Aspartat 160, welches in
allen untersuchten Organismen vorhanden ist. Mutationsstudien in E. coli, bei denen dieser
Rest gegen Alanin ausgetauscht wurde, zeigte, dass das AmtB-Protein mit der Mutation
D160A inaktiv war und kein Methylammonium mehr transportierte, wohingegen der
Austausch gegen eine ebenfalls saure Aminosäure (D160E) keine Auswirkung auf die AmtBAktivität hatte (Javelle et al., 2004). Daraus wurde geschlossen, dass Aspartat 160 der
Protonenakzeptor für Ammonium ist. In anderen Veröffentlichungen wird Aspartat 160 eine
Funktion als Stabilisator der helikalen Proteinstruktur zugeordnet (Khademi et al., 2004;
Zheng et al., 2004). Neuere bioinformatische Untersuchungen, mit denen die Dynamik des
Amt-Proteins dargestellt wurde, legten nahe, dass die Wahrheit in der Mitte liegt und D160
sowohl als Stabilisator als auch als Protonenakzeptor fungiert (Nygaard et al., 2006).
Interessanterweise findet sich diese hochkonservierte Aminosäure auch im LeAMT1;1Protein, das als Transporter des Ammoniumions beschrieben ist. Die Deprotonierung des
Ammoniums vor Eintritt des Moleküls in die AmtB-Pore würde in diesem Protein demnach
wenig Sinn haben. Für die Translokation von Ammonium aus der periplasmatischen
Vertiefung des AmtB-Proteins in die eigentliche Pore wird Alanin 162 verantwortlich
gemacht (Nygaard et al., 2006). Auch dieser Rest findet sich in allen untersuchten
Organismen. Innerhalb der AmtB-Pore befinden sich zwei Histidinreste, deren Bedeutung für
die Substratweiterleitung durch Austauschmutationen gezeigt wurde (Javelle et al., 2006).
Auch diese Aminosäuren, H168 und H318, sind hoch konserviert und in allen untersuchten
Organismen vorhanden.
Hat Ammoniak den Kanal passiert, wird das Molekül auf cytoplasmatischer Seite reprotoniert
und Ammonium ins Cytoplasma entlassen. Bei diesem Prozess ist Serin 263 beteiligt (Bostick
& Brooks III, 2007). Auch dieser Rest findet sich in fast allen untersuchten Organismen außer
ERGEBNISSE
65
im C. glutamicum-AmtA und im Tomaten-LeAmt1;1. Hier ähnelt das C. glutamicum-AmtBProtein wiederum dem E. coli-Protein, da sich an der Position 263 ein Serinrest findet, in
AmtA aber ein Threoninrest. Diese Threoninseitenkette ist für eine Beteiligung an der
Reprotonierung wahrscheinlich nicht flexibel genug.
Insgesamt zeigt sich, dass Aminosäuren, die für die Bindung und Deprotonierung von
Ammonium und den Transport von Ammoniak verantwortlich gemacht werden,
hochkonserviert sind, und in prokaryotischen und als auch in eukaryotischen Zellen
vorhanden sind. Erstaunlicherweise werden diese Aminosäuren auch in Proteinen gefunden,
die statt Ammoniak Ammonium transportieren, wie z. B. AmtA aus C. glutamicum und
LeAMT1;1 aus der Tomate. Unterschiede, die gefunden wurden, sind wenig drastische
Veränderungen, die die unterschiedlichen Transportereigenschaften nicht erklären können.
Ein Rückschluss von der Aminosäuresequenz oder von Strukturmodellen auf die Funktion der
Proteine ist daher kaum möglich.
4.4 Methylammoniumaufnahme und metabolic trapping
Bereits mehrere Jahre vor Veröffentlichung der Kristallstruktur des E. coli AmtB-Proteins
zeigten Daten, dass die Methylammoniumaufnahme in E. coli von der Metabolisierung des
Substrats durch die GS abhängig ist. Dieses Phänomen wurde als metabolic trapping
bezeichnet. Soupene et al. (1998) beobachteten, dass Methylammonium in die Zelle
aufgenommen und nahezu vollständig in ein Produkt umgewandelt wurde, bei dem es sich
vermutlich um Methylglutamin handelte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die
Methylammoniumaufnahme sank, wenn die GS fehlte oder defekt vorlag. Ähnliche
Beobachtungen wurden für C. glutamicum gemacht. So zeigte ein glnA-Deletionsstamm nur
eine sehr geringe Methylammoniumaufnahme (siehe auch Abschnitt 4.6). Für den
C. glutamicum-Wildtyp wurde außerdem gezeigt, dass das Substrat Methylammonium
vermutlich in Methylglutamin umgewandelt wurde (Meier-Wagner et al., 2001).
Interessanterweise konnte aber auch für den glnA-Deletionsstamm eine Umsetzung von
Methylammonium beobachtet werden (Meier-Wagner, 2000).
Die aktive GS besitzt eine hohe Affinität zu Ammonium (Km ~ 200 µM) und überträgt
Ammonium unter ATP-Verbrauch auf L-Glutamat, wobei L-Glutamin entsteht. L-Glutamin
und α-Ketoglutarat werden weiter mit der Glutamatsynthase (GOGAT), die sich aus der
großen Untereinheit GltB (kodiert von gltB) und der kleinen Untereinheit GltD (kodiert von
ERGEBNISSE
66
gltD) zusammensetzt, unter Verbrauch eines Reduktionsäquivalents NADPH+H+ zu
L-Glutamat umgewandelt. Aufgrund der hohen Substrataffinität ist die GS, vor allem unter
Stickstoffmangelbedingungen das wichtigste Ammonium-assimilierende Enzym. Neben der
bereits beschriebenen GS des Typs I-β, kodiert von glnA, existiert in C. glutamcum noch eine
weitere GS, die vom Gen glnA2 kodiert wird. Bei diesem zweiten Enzym handelt es sich um
eine GSI des Subtyps α. Im Gegensatz zu Synthetasen vom Subtyp β können diese Enzyme
nicht posttranslational modifiziert werden. Das Gen glnA2 befindet sich in einem Operon mit
glnE und wird konstitutiv transkribiert. Eine Deletion des Gens hat keine Auswirkungen auf
die GS-Aktivität und Wachstumsrate in Abwesenheit von Glutamin, so dass dem zugehörigen
Protein noch keine Funktion zugeordnet werden konnte (Nolden et al., 2001a). Um das
Produkt des Gens glnA2 von der GS unterscheiden zu können, wird das Protein im weiteren
mit GlnA2 bezeichnet. Ein weiteres Enzym, dass die Umsetzung von Ammonium und evtl.
auch von Methylammonium katalysiert, ist die Glutamatdehydrogenase (GDH, kodiert von
gdh). Die GDH katalysiert die oxidative Aminierung von Ammonium unter Verbrauch von
einem Reduktionsäquivalent NADPH+H+, wobei L-Glutamat entsteht. Allerdings hat die
GDH eine relativ niedrige Affinität zu Ammonium (Km ~ 1 mM). Metabolismusstudien
zeigten, dass auch ein gdh-Deletionsstamm Methylammonium zu einem Produkt umwandeln
kann (Meier-Wagner, 2000). Die Tatsache, dass sowohl im glnA- als auch im gdhDeletionsstamm Methylammonium zu einem Produkt umgesetzt wird, rückt die GlnA2
wieder in den Mittelpunkt des Interesses. Die Wahrscheinlichkeit, dass GlnA2 zwar nicht das
natürliche Substrat Ammonium, aber das Substratanalog Methylammonium umsetzen kann,
war nicht sehr hoch, musste hier aber dennoch in Betracht gezogen werden.
Die folgenden Abschnitte sollten die Fragen beantworten, ob man in C. glutamicum aufgrund
der bereits gezeigten Sachverhalte, die sehr den Gegebenheiten in E. coli ähneln, ebenfalls
von metabolic trapping sprechen kann.
4.4.1 Verschiedene Techniken zur Ermittlung der Methylammoniumaufnahme
unabhängig von der Metabolisierung des Substrats
Um die Methylammoniumaufnahme unabhängig von der Assimilation des Substrats in der
Zelle zu bestimmen, entwickelte die Arbeitsgruppe um Mike Merrick auf Grundlage einer
älteren Veröffentlichung (Jayakumar et al., 1985) einen so genannten unwashed assay
(Javelle et al., 2004). Für E. coli liegt die Vermutung nahe, dass der Ammmoniumtransporter
AmtB als Kanal fungiert und die Diffusion von Ammoniak über die Membran erleichtert.
ERGEBNISSE
Durch
die
67
Verstoffwechselung
von
Ammoniak
innerhalb
der
Zelle
durch
die
Glutaminsynthetase (GS) wird ein Konzentrationsgradient aufrechterhalten, entlang dessen
das Substrat mit Hilfe von AmtB über die Membran geschleust wird. Im Gegensatz zum
üblichen washed assay, der der in dieser Arbeit angewandten Filtrationsmessung entspricht,
werden beim unwashed assay Proben auf ein Filtersystem aufgetragen, das aus einem
Polycarbonatfilter sowie aus zwei Whatman-Filterpapieren besteht. Die Radioaktivität, die im
Polycarbonatfilter haftenblieb, wurde ausgezählt.
Wurden washed assay und unwashed assay verglichen, zeigten sich deutliche Unterschiede
zwischen den beiden Messmethoden für den E. coli-Wildtyp. Bei der Verwendung des
unwashed assays wurden sehr viel höhere Methylammoniumaufnahmeraten ermittelt als beim
washed assay, was dahingehend gedeutet wurde, dass mit dem washed assay demnach nur
metabolisierte Radioaktivität bestimmt wird, da freies Methylammonium in der Zelle durch
Waschen der Filter entfernt wird. Mit dem unwashed assay wird hingegen noch zusätzlich die
Menge an Methylammonium/Methylamin, welches frei in der Zelle vorliegt, detektiert. Es
wurde geschlossen, dass in E. coli die mit einem washed assay gemessenen
Methylammoniumaufnahmeraten nicht von der Aufnahmeaktivität des AmtB-Proteins
herrühren, sondern der Assimilation des Substrats durch die GS entsprechen (Javelle et al.,
2004).
Der Ansatz eines unwashed assays, also die Bestimmung der Ammoniumtransporteraktivität
unabhängig von der Substratverstoffwechselung in der Zelle, sollte für C. glutamicum
nachvollzogen werden. Dazu wurden die im weiteren vorgestellten Techniken verwendet. Da
bei einer Kombination von Filtern, wie sie dem unwashed assay entsprechen würde, durch
technische Probleme (Pumpleistung) zu einer zu langsamen Trennung von Medium und
Zellen kam, wurde versucht, die Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum mittels
Zentrifugation zu bestimmen. Ebenso wie bei der Filtration wurden Zellen mit dem
radioaktiven Substrat inkubiert und zu bestimmten Zeitpunkten Proben entnommen. Um die
entnommenen Zellen möglichst schnell vom umgebenden Medium zu trennen, wurden die
Proben in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, bei höchster Umdrehung zentrifugiert, der
Überstand abgesaugt und das Zellpellet in CTAB resuspendiert, um die Zellen
aufzuschließen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden dann direkt in Szintillationsröhrchen
gegeben und mit Szintillationsflüssigkeit aufgefüllt. Die Radioaktivität im Szintillationszähler
ermittelt. Diese Methode erwies sich jedoch nicht als erfolgreich, da weder für den
ERGEBNISSE
68
C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 noch für den amtA/amtB-Deletionsstamm JS-1 ein
Unterschied zwischen Filtration und Zentrifugation gezeigt werden konnte. Um den
unwashed assay der Arbeitsgruppe Merrick nachzuvollziehen, wurde auch der E. coli-Stamm
MG 1655 untersucht. Auch für diesen Organismus ließ sich der unwashed assay nicht
nachvollziehen.
Da
die
Zentrifugation
keine
zufriedenstellenden
Ergebnisse
lieferte,
wurde
die
Silikonölzentrifugation als weitere Methode zur Messung der Methylammoniumaufnahme
gewählt. Die Silikonölzentrifugation ist eine etablierte Anwendung, um z. B. die Exkretion
oder die Aufnahme von Aminosäuren in C. glutamicum zu bestimmen (Trötschel, 2005). Das
Medium wird dabei durch Passieren einer Silikonölschicht während der Zentrifugation von
den Zellen abgestreift und somit werden die Zellen keinem Waschschritt unterzogen, der
Radioaktiviät aus den Zellen entfernen könnte. Mit dieser Methode wurde neben dem
C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 auch der amtA/amtB-Deletionsstamm JS-1 untersucht.
Jedoch ließ sich auch hier kein Unterschied zwischen Methylammoniumraten, die mit
Silikonölzentrifugation oder Filtration bestimmt wurden, zeigen. Ein so genannter unwashed
assay konnte nicht etabliert werden.
4.4.2 Ermittlung
der
Methylammoniumaufnahme
unabhängig
von
der
Metabolisierung des Substrats durch Deletionsmutation
Ein
weiterer
Ansatz,
die
Methylammoniumaufnahme
unabhängig
von
der
Verstoffwechselung zu bestimmen, war die Untersuchung von Deletionsmutanten, denen
verschiedene assimilatorische Enzyme fehlten. Im Rahmen seiner Diplomarbeit konstruierte
Daniel Ansorge eine Deletionsmutante in der alle putativen Ammoniumassimilationswege in
C. glutamicum durch Deletion der Gene glnA, glnA2 und gdh zerstört wurden (2005).
Aufgrund der diskutierten Verknüpfung der Aufnahme von (Methyl-) Ammonium mit der
Verstoffwechselung des Substrats innerhalb der Zelle (metabolic trapping), wurde der Stamm
DA-2 innerhalb dieser Arbeit charakterisiert. Dazu wurden zunächst Western BlotExperimente, Expressionsanalysen mit Hilfe von RNA-Hybridisierungsexperimenten und
Real Time RT PCR sowie GS-und GDH-Aktivitätstests durchgeführt.
Durch Western Blot-Experimente konnte verifiziert werden, dass die Gene glnA und gdh
durch Deletion zerstört worden waren und die entsprechenden Proteine nicht mehr
synthetisiert wurden. Für das Gen glnA konnte dies auch auf Expressionsebene gezeigt
werden. Da glnA2 und dem zugehörigen Protein bisher keine Funktion bezüglich der
ERGEBNISSE
69
Umsetzung von Ammonium zugewiesen werden konnte, wurde die Deletion dieses Gens in
diesem Rahmen nicht weiter verifiziert. Da die Deletionsmutante DA-2 weder GS- noch
GDH-Aktivität zeigte, schien eine weitere Betrachtung in diesem Zusammenhang auch nicht
notwendig.
A
M
1
2
3
B
4
M 1
2
3
4
C
M
1
2
3
4
72
55
43
34
26
17
11
D
1
2
3
4
amtA
amtB
1, 5
GDH-Ak tiv ität [U/mg Protein]
E
1
0, 5
0
glnA
DA-2
1,5
GS-Aktiv ität [U/mg Pr ote in]
gltB
Wildtyp ATCC 13032
F
1
0,5
0
Wildtyp ATCC 13032
DA-2
Abb. 4.8: Charakterisierung der glnA/glnA2/gdh-Deletionsmutante DA-2. Es wurden Western Blot
Experimente mit Antikörpern gegen GDH (A), GS (B) und GlnK (C) durchgeführt. Dabei wurden Zellen des
Wildtyps, die unter Stickstoffüberschuss (1) oder Stickstoffmangel (2) geerntet wurden mit Zellen des Stammes
DA-2, die ebenfalls Stickstoffüberschuss (3) und Stickstoffmangel unterzogen wurden, verglichen. Es wurden
jeweils 25 µg Protein aufgetrennt. Als Standard (M) wurde pEQGOLD Protein Marker (Prestained) der Firma
pEQlab Biotechnologie GmbH, Erlangen verwendet Außerdem wurde die Expression der Gene amtA, amtB,
glnA und gltB im C. glutamicum Wildtyp ATCC 13032 unter Stickstoffüberschuss (1) oder Stickstoffmangel (2)
der Expression dieser Gene im Stamm DA-2 unter Stickstoffüberschuss (3) und Stickstoffmangel (4)
gegenübergestellt (D). Dazu wurde jeweils 1 µg Gesamt-RNA verwendet. Zusätzlich wurden GDH (E)- und GS
(F)-Aktivität des Wildtyps ATCC 13032 (■) und des Deletionsstammes DA-2 (□) bestimmt. Die Enzymtests
wurden jeweils dreimal durchgeführt, die Standardabweichung ist angegeben.
ERGEBNISSE
70
Wie der Western Blot C der Abbildung 4.8 zeigt und durch Expressionsanalysen der Gene
amtA, amtB und gltB bestätigt wird, ist die Expression von glnK, amtA, amtB und gltB im
Stamm DA-2 unter Stickstoffüberschussbedingungen nicht mehr durch AmtR reprimiert. Die
Ergebnisse der RNA-Hybridisierungen wurden für die Gene amtA, amtB und gltB zusätzlich
mit Real Time RT PCR nachvollzogen.
Tab. 4.2: Expressionsanalysen der Gene amtA, amtB und gltB im Wildtyp ATCC 13032 und im
Deletionstamm DA-2. Die Real Time RT PCR-Experimente wurden jeweils als Dreifachbestimmung
durchgeführt, die Standardabweichung ist angegeben. Die relative Expression der Gene im Wildtyp unter
Stickstoffüberschuss wurde gleich 1 gesetzt, die relative Expression der Gene im Wildtyp unter Stickstoffmangel
sowie im Stamm DA-2 bei guter Stickstoffverfügbarkeit und bei Stickstoffmangel wurde dazu ins Verhältnis
gesetzt.
Wildtyp ATCC13032
amtA
amtB
gltB
1 ± 0,15
1 ± 0,07
1 ± 0,01
bei Stickstoffüberschuss
Wildtyp ATCC13032
597,28 ± 72,58 157,26 ± 7,09
244,14 ± 48,45
bei Stickstoffmangel
DA-2
448,33 ± 17,74 246,86 ± 22,47 264,79 ± 23,94
bei Stickstoffüberschuss
DA-2
554,41 ± 33,08 79,89 ± 4,49
190,58 ± 20,71
bei Stickstoffmangel
Expressionsanalysen und Western Blot-Experimente bestätigten, dass die Stickstoffkontrolle
im Stamm DA-2 nicht mehr intakt ist. Die hier untersuchten Gene amtA, amtB und gltB sind
im Wildtyp in der Gegenwart von Ammonium sehr stark durch AmtR reprimiert. Im Stamm
DA-2 ist dies jedoch nicht mehr der Fall. Der Verlust der Gene und der zugehörigen
Genprodukte GS, GDH und GlnA2 führen demnach dazu, dass die Stickstoffkontrolle außer
Kraft gesetzt wird. Auffallend ist außerdem, dass die Expression der Gene amtB und gltB im
Stamm DA-2 bei guter Stickstoffverfügbarkeit niedriger ist als unter Stickstoffüberschuss.
Für Wachstumsexperimente wurden die Zellen des Stammes DA-2 nach standardisiertem
Animpfschema angezogen: Zunächst wurden Zellen des Stammes für etwa acht Stunden bei
30°C in 20 ml BHI-Vollmedium unter Schütteln kultiviert. Mit dieser Vorkultur wurden
50 ml Stickstoff-haltiges Minimalmedium CgC auf eine optische Dichte von 1 angeimpft und
ERGEBNISSE
71
über Nacht bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Aufgrund der für den Stamm DA-2
beschriebenen Glutamin-Bradytrophie wurde dem Minimalmedium 100 mM Glutamin
zugesetzt. Am nächsten Morgen wurde Stickstoff-haltiges Minimalmedium auf eine optische
Dichte von 1 angeimpft. Um die Auswirkung einer zusätzlichen Gabe von Glutamin zu
untersuchen, wurde einer weiteren Kultur 100 mM Glutamin zugesetzt. Das Wachstum wurde
durch stündliche photometrische Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt. Es
ergab sich eine Verdopplungszeit im Stickstoff-haltigen Minimalmediun von 3,3 h und für die
Kultur, der 100 mM Glutamin zugegeben eine Verdopplungszeit von 2,9 h. Das hier
verwendete Minmalmedium enthielt ca. 150 mM Ammoniumsulfat und ca. 80 mM Harnstoff.
Beide Stickstoffquellen können von diesem Stamm jedoch nicht verwertet werden, da die
Ammonium-verwertenden Enzyme durch Deletion der Gene glnA, glnA2 und gdh nicht mehr
vorhanden sind. Der enthaltene Harnstoff ist zwar ebenfalls eine sehr gute Stickstoffquelle,
und kann innerhalb der Zelle durch die Urease in Kohlendioxid und Ammoniak gespalten
werden (Beckers et al., 2004). Das enstandene Ammoniak kann jedoch im weiteren nicht
umgesetzt werden, da die dafür notwendigen Enzyme in diesem C. glutamicum-Stämmen
fehlen. Der Stamm wächst im Vergleich zum C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032, für den
bei Anwesenheit von 5 mM Ammoniumchlorid im Minimalmedium eine Verdopplungszeit
von 1,25 bestimmt wurde (Jakoby, 1998), langsamer, ein gravierender Wachstumsdefekt
konnte jedoch nicht festgestellt werden.
ERGEBNISSE
72
100
OD600
10
1
0,1
0
10
20
30
Zeit [h]
Abb. 4.9: Wachstum des C. glutamicum-Stammes DA-2 in Abhängigkeit von Glutamin. Die Zellen des
glnA/glnA2/gdh-Deletionsstammes DA-2 wurden in Stickstoff-haltigen Medium (■) und in Stickstoff-haltigen
Medium mit 100 mM Glutamin (□) inkubiert.
Desweiteren wurden HPLC-Studien durchgeführt, um die interne Konzentration von
Glutamin und Glutamat zu bestimmen. Im Falle des Verlustes der verstoffwechselnden
Enzyme sollte die Konzentration von Glutamin sowie von Glutamat im Stamm DA-2 sehr
viel geringer sein als im Wildtyp. Dazu wurden die Zellen des Wildtyps ATCC 13032 und
Zellen des Stammes DA-2 nach dem üblichen Animpfschema kultiviert und einem
einstündigen
Stickstoffmangel
unterworfen.
Anschließend
wurde
eine
ethanolische
Zellextraktion durchgeführt und die gewonnenen Zellextrakte für HPLC-Messungen
verwendet. Es konnte für den Wildtyp eine interne Glutaminkonzentration von 10,1 ± 1,7 mM
und eine interne Glutamatkonzentration von 73,6 ± 7,6 mM festgestellt werden. Für den
Stamm DA-2 ließen sich lediglich Werte von 0,08 ± 0,01 für Glutamin und 16,7 ± 2,3 mM für
Glutamat feststellen. Die sehr viel geringeren Werte für die beiden Metabolite im
Deletionsstamm lassen darauf schließen, dass tatsächlich keine funktionellen Enzyme in
diesem Stamm vorhanden sind, die die Verstoffwechselung von Ammonium bzw.
Methylammonium katalysieren könnten. Der Sensor bzw. das Signal aufgrundessen die
GlnD/GlnK/AmtR-Signalkaskade abläuft, ist noch unbekannt. Glutamat wurde als Signal
weitgehend
ausgeschlossen
wurde
(Müller
et
al.,
2006a).
In
C.
glutamicum-
ERGEBNISSE
73
Deletionsstämmen, in denen die Umsetzung von α-Ketoglutarat und Ammonium zu LGlutamat aufgrund des Fehlens der GDH nicht stattfindet, ist die Repression durch AmtR
unter Stickstoffüberschussbedingungen nicht vollständig (siehe auch Abschnitt 4.6).
Um genauen Aufschluss über den Methylammoniummetabolismus in der Deletionsmutante
DA-2 zu erhalten, wurden Dünnschichtchromatographien durchgeführt. Dazu wurden
C. glutamicum-Wildtyp-Zellen und Zellen des Stammes DA-2 wie bei Aufnahmemessungen
angezogen und präpariert, und anschließend für einige Minuten mit [14C]-Methylammonium
inkubiert. Proben dieser Ansätze wurden filtriert und zum Zellaufschluss und Abstoppen der
Reaktion über Nacht bei 80°C in 4 ml Stopplösung (70 % Ethanol; 0,05 % SDS) inkubiert.
Die verbliebende Lösung wurde in Eppendorff-Reaktionsgefäße überführt und in einer
Vakuumzentrifuge das Lösungsmittel verdampft. Die lyophilisierten Extrakte wurden in
Wasser aufgenommen und auf Cellulose-Dünnschichtplatten aufgetropft. Der Lauf der
Dünnschichtchromatographie
erfolgte
über
Nacht
mit
einem
Gemisch
aus
N-Butanol : Eisessig : H2Obidest (Verhältnis 4:1:1). Die Produkte des MethylammoniumMetabolismus wurden durch Autoradiografie über mehrere Tage detektiert. Das Ergebnis
einer solchen Dünnschichtchromatographie ist in Abbildung 4.10 dargestellt.
1
2
3
[14C]-Methylammonium
Produkt
Abb. 4.10: Metabolisierung von Methylammonium. Der C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 (2) und der
glnAglnA2gdh-Deletionsstamm DA-2 (3) wurden mit [14C]-Methylammonium inkubiert und ihre Zellextrakte
mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Als Kontrolle wurde [14C]-Methylammonium (1) aufgetragen.
Die Dünnschichtchromatographie zeigte, dass Methylammonium im C. glutamicum-Wildtyp
vollständig verstoffwechselt wird, während es im Stamm DA-2 nicht der Fall ist. Dies lieferte
erste Hinweise darauf, dass in diesem Stamm die Aufnahme von Methylammonium
unabhängig von der Verstoffwechselung des Substrats innerhalb der Zellen ist. Um diese
Annahme zu stützen, wurde die Methylammoniumaufnahme des Stammes DA-2 bestimmt.
ERGEBNISSE
74
Aufnahmerate [nmol min-1(mg TG)-1]
35
30
25
20
15
10
5
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Methylammonium [µM]
Abb. 4.11: Methylammoniumaufnahme unabhängig von der Assimilation des Substrats. Es wurden
Aufnahmestudien mit dem C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 (■) und dem Stamm DA-2 (□) durchgeführt.
Fünf verschiedene Methylammoniumkonzentrationen wurden eingesetzt (100 µM, 500 µM, 1 mM, 2 mM und
3 mM). Die Aufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] wurden in Abhängigkeit der eingesetzten
Substratkonzentration dargestellt. Die Aufnahmestudien wurden bei pH 8 durchgeführt.
Die Methylammoniumaufnahme des Wildtyps ATCC 13032 und des Stammes DA-2 wiesen
keine
signifikantenUnterschiede
auf.
Zusammen
mit
den
Ergebnissen
der
Metabolismusstudien kann hier also geschlossen werden, dass in C. glutamicum die
Aufnahme von Methylammonium unabhängig von der Verstoffwechselung des Substrats ist,
d. h., das Modell des metabolic trappings kann für C. glutamicum kaum angewendet werden
kann.
4.5 Untersuchung von AmtA unabhängig von Metabolisierung
Die dünnschichtchromatgraphischen Untersuchungen von DA-2 legen in Verbindung mit den
Methylammonniumaufnahmedaten
nahe,
dass
metabolic
trapping
den
Methylammoniumtransport in C. glutamicum nicht antreibt. Allerdings erlaubten diese Daten
keine Unterscheidung von AmtA und AmtB. Um diese getrennt untersuchen zu können,
wurde in den Stamm DA-2 über homologe Rekombination eine um 900 bp verkürzte Version
des amtB-Gens ins Genom des Stammes DA-2 eingeführt und somit das genomische amtBGen deletiert.
ERGEBNISSE
75
4.5.1 Charakterisierung Mek-1
Der
aus
dem
glnA/glnA2/gdh-Deletionsstamm
generierte
Stamm
Mek-1
(∆glnA∆glnA2∆gdh∆amtB) wurde zunächst auf seine Eigenschaften bezüglich der
Stickstoffkontrolle und Enzymaktivitäten untersucht.
A
M 1
72
2
3 4
B
M 1
2
3
4
C
M
1
2
3
4
55
43
34
26
17
D
1
2
3
4
amtA
amtB
glnA
gltB
F
GS-Aktiv ität [U/mg Protein]
E
GDH-Aktivität [U/mg Prote in]
11
1,5
1
0,5
0
F
Wildtyp ATCC 13032
Mek-1
Wildtyp ATCC 13032
Mek-1
1,5
1
0,5
0
Abb. 4.12: Charakterisierung des C. glutamicum-Deletionsstammes Mek-1. Es wurden Western BlotExperimente mit Antikörpern gegen GDH (A), GS (B) und GlnK (C) durchgeführt. Dabei wurden Zellen des
Wildtyps, die unter Stickstoffüberschuss (1) oder Stickstoffmangel (2) geerntet wurden, mit Zellen des Stammes
Mek-1, die ebenfalls Stickstoffüberschuss (3) und Stickstoffmangel unterzogen wurden, verglichen. Aufgetragen
wurden 25 µg Gesamtprotein. Als Proteinstandard wurde peqGOLD Prestained Protein-Marker IV (peqlab
Biotechnologie GmbH, Erlangen) verwendet (M). Außerdem wurde die Expression der Gene amtA, amtB, glnA
und gltB im C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 unter Stickstoffüberschuss (1) oder Stickstoffmangel (2) der
Expression dieser Gene im Stamm DA-2 unter Stickstoffüberschuss (3) und Stickstoffmangel (4)
gegenübergestellt (D). Pro Dot wurde 1 µg RNA aufgetragen. Außerdem wurden GDH (E)- und GS (F)Aktivität des Wildtyps ATCC 13032 (■) und des Deletionsstammes Mek-1 (□) bestimmt.
Ebenso wie der Vorgängerstamm DA-2 zeigte auch Mek-1 keine GDH- und keine GSAktivität mehr. Außerdem konnte mit Expressionsanalysen die erfolgreiche Deletion des
ERGEBNISSE
76
amtB-Gens nachgewiesen werden. Auch für diesen Stamm wurden einige der durchgeführten
RNA-Hybridisierungsexperimente mittels Real Time RT PCR verifiziert.
Tab. 4.3: Expressionsanalysen der Gene amtA, amtB und gltB im Wildtyp ATCC 13032 und im
Deletionstamm Mek-1. Die Real Time RT PCR-Experimente wurden jeweils als Dreifachbestimmung
durchgeführt, die Standardabweichung ist angegeben. Die relative Expression der Gene im Wildtyp unter
Stickstoffüberschuss wurde gleich 1 gesetzt, die relative Expression der Gene im Wildtyp unter Stickstoffmangel
sowie im Stamm DA-2 unter Stickstoffüberschuss und Stickstoffmangel wurde dazu ins Verhältnis gesetzt.
Wildtyp ATCC13032
amtA
amtB
gltB
1 ± 0,15
1 ± 0,07
1 ± 0,01
bei Stickstoffüberschuss
Wildtyp ATCC13032
597,28 ± 72,58 157,26 ± 7,09 244,14 ± 48,45
bei Stickstoffmangel
Mek-1
581,07 ± 32,36 0,38 ± 0,02
335,91 ± 62,88
995,63 ± 68,06 1,29 ± 2,33
291,50 ± 43,26
bei Stickstoffüberschuss
Mek-1
bei Stickstoffmangel
Die Untersuchungen im Stamm Mek-1 führten zu dem Ergebnis, dass in diesem Stamm,
ebenso wie im Ausgangsstamm DA-2 unter Stickstoffüberschussbedingungen keine
Repression durch AmtR stattfindet. Gene, die im Wildtyp unter der Regulation von AmtR
stehen, wie z.B. amtA und gltB, werden in den Deletionsstämmen DA-2 und Mek-1 auch
unter Stickstoffüberschussbedingen exprimiert.
Wachstumsexperimente wurden auch für den Deletionsstamm Mek-1 durchgeführt. Die
Durchführung erfolgte wie für für den Stamm DA-2 beschrieben (siehe Abschnitt 4.4.2). Die
Verdopplungszeit im Stickstoff-haltigen Minimalmedium betrug 2,38 h und in Stickstoffhaltigem Minimalmedium mit 100 mM Glutamin 2,78, d.h., auch in diesem Falle ist das
Wachstum verlangsamt, von einem Wachstumsdefekt kann jedoch nicht gesprochen werden.
ERGEBNISSE
77
100
OD600
10
1
0,1
0
10
20
30
Zeit [h]
Abb. 4.13: Wachstum des glnA/glnA2/gdh/amtB-Deletionsstamm Mek-1 in Abhängigkeit von Glutamin.
Die Zellen des Stammes Mek-1 wurden in Stickstoff-haltigen Medium (■) und in Stickstoff-haltigen Medium
mit 100 mM Glutamin (□) inkubiert.
Ebenso wurden für den Stamm Mek-1 die internen Konzentrationen von Glutamin und
Glutamat mittels HPLC ermittelt. Dabei ergaben sich für den Deletionstamm Werte von
0,07 ± 0,03 mM für Glutamin und 12,72 ± 3,2 mM für Glutamat (zum Vgl.: Wildtyp ATCC
13032 10,1 ± 1,7 mM Glutamin und 73 ± 7,6 mM Glutamat). Es konnte also auch für diesen
Stamm gezeigt werden, dass die Konzentrationen der Produkte aus den GS- und GDHkatalysierten Reaktionen sehr viel niedriger sind als im C. glutamicum-Wildtyp.
4.5.2 Charakterisierung der AmtA-vermittelten Methylammoniumaufnahme
Mit dem Stamm Mek-1 bestand nun die Möglichkeit, den Transporter AmtA in seiner
Aktivität unabhängig von der Verstoffwechselung des Substrats in der Zelle zu untersuchen.
Zunächst wurde die Methylammoniumaufnahme des Stammes Mek-1 bestimmt. Dazu wurden
die Zellen nach dem üblichen Animpfschema kultiviert und anschließend für eine Stunde in
Minimalmedium ohne Stickstoffquelle inkubiert.
78
Aufnahmerate [nmol min-1(mg TG)-1]
ERGEBNISSE
35
30
25
20
15
10
5
0
0
500
1000
1500
2000
Methylammonium [µM]
Abb.
4.14:
Methylammoniumaufnahme
des
Stammes
Mek-1
in
Abhängigkeit
von
der
Substratkonzentration im Reaktionsansatz. Die Probennahme erfolgte in einem Zeitraum von 2 min. Aus der
linearen Aufnahmekinetik wurden die Methylammoniumaufnahmeraten bestimmt, die hier in Abhängigkeit zur
eingesetzten Methylammoniumkonzentration dargestellt ist. Die Messung erfolgte dreimal. Angegeben sind hier
der Mittelwert und die Standardabweichung.
Es zeigte sich, dass der Stamm Mek-1 eine hohe Methylammoniumaufnahme zeigte. Beim
Vergleich der Aufnahme dieses Stammes mit der Aufnahme des C. glutamicum-Stammes
LN-1.1 (siehe Abbildung 4.1), zeigte sich, dass die Aufnahmeraten sehr ähnlich sind. Daraus
kann gefolgert werden, dass die Methylammoniumaufnahme durch AmtA unabhängig von
der internen Verstoffwechselung des Substrats ist. Um nun weiter die treibende Kraft der
Methylammoniumaufnahme in diesem Stamm zu bestimmen, wurde außerdem die Aufnahme
nach Zugabe der Entkoppler Valinomycin und Nigericin ermittelt. Die Probennahme erfolgte
in einem Zeitbereich von 25 s bis 30 min. In Abbildung 4.14. ist der lineare Teil der
Aufnahmekinetik dargestellt.
ERGEBNISSE
79
Aufnahme [nmol (mg TG)-1]
120
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Zeit [min]
Abb. 4.15: Methylammoniumaufnahme des Stammes Mek-1. Dargestellt ist die Aufnahme von
Methylammonium [nmol (mg TG)-1] in Abhängigkeit zu den Probennahmezeitpunkten. Die Messung erfolgte
ohne Zugabe von Entkopplern (■) und mit Zugabe der Entkoppler Valinomycin (20 µM) und Nigericin
(5 µM) (□). Die Zugabe der Entkoppler erfolgte 5 min vor Start der Messung. Es wurde 100 µM
Methylammonium
(Endkonzentration)
eingesetzt.
Die
Messungen
wurden
dreimal
wiederholt,
die
Standardabweichung ist angegeben.
Für den Stamm Mek-1 konnte eine Aufnahmerate von 17,4 ± 2,9 nmol (min)-1(mg TG)-1
ermittelt werden. Bereits nach drei Minuten zeigte der Stamm eine vollständige Sättigung der
Methylammoniumaufnahme. Durch die Zugabe der Entkoppler Valinomycin und Nigericin
kam die Methylammoniumaufnahme vollkommen zum Erliegen, es konnte nur eine
Methylammoniumaufnahmerate von 1,7 ± 0,2 nmol (min)-1(mg TG)-1 bestimmt werden. Die
Methylammoniumaufnahme durch AmtA ist demnach abhängig vom Membranpotential.
Diese Daten entsprechen früheren Ergebnissen, bei denen gezeigt werden konnte, dass die
AmtA-Methylammoniumaufnahme membranpotentialabhängig ist (Siewe et al., 1996; MeierWagner et al., 2001).
4.5.3 Akkumulation von Methylammonium
Eine weitere wichtige Frage bei der Betrachtung des Methylammoniumtransports durch AmtProteine ist die Frage, ob der Transporter in der Lage ist, Methylammonium im Inneren der
Zellen zu akkumulieren. Ein Kanal ist dazu nicht in der Lage, da dieser das Substrat entlang
eines Konzentrationsgradienten in die Zelle schleust, also die Diffusion erleichtert,
wohingegen ein aktiver Transporter unabhängig von der internen Konzentration Substrat in
die Zellen transportiert. Um die Akkumulation eines Substrats zu bestimmen, muss das
Verhältnis von interner und externer Konzentration bestimmt werden. Die Bestimmung der
ERGEBNISSE
80
internen Konzentration bzw. radioaktiven Labels erfolgte durch die bereits beschriebene
Filtermethode, mit der auch die anderen Aufnahmeraten innerhalb dieser Arbeit bestimmt
worden waren. Um die extern verbliebende Menge an radioaktiver Markierung bestimmen zu
können, musste eine neue Methode, die Überstandsmessung, etabliert werden. Die Zellen
wurden für die Überstandsmessung ebenso vorbereitet wie für die Filtrationsmethode,
wesentliche Unterschiede zwischen den Methoden fanden sich erst bei der Trennung der
Zellen
vom
umgebenden
Puffer.
Diese Trennung
geschah
auch
im
Falle der
Überstandsmessung mit Glasfaserfiltern über eine Mehrfachfiltrationsanlage, die jedoch
vorher so präpariert worden ist, dass das Medium aufgefangen werden konnte. Dafür wurden
Szintillationsröhrchen unterhalb der Absaugstutzen der Anlage festgeklebt. Die Proben
wurden auf die Glasfaserfilter pipettiert und das Medium wurde in Röhrchen aufgefangen.
Während der Etablierung dieser Methode zeigte es sich, dass die verwendeten Filter auf
keinen Fall in LiCl getränkt werden sollten, wie es bei der Filtration üblich ist, da diese
Restflüssigkeit im Filter die Werte im Szintillationsröhrchen „verwässert“. Aufgrund des
großen Volumens an Flüssigkeit, das in den Filtern verbleibt, wurde das entnommene
Probenvolumen von 200 µl (Filtration) auf 300 µl erhöht. Aus den Szintillationsröhrchen
wurde dann ein bestimmtes Volumen (hier 100 µl) entnommen, mit Szintillationsflüssigkeit
versetzt und die Radioaktivität vermessen. Aus dem Verhältnis von interner und externer
radioaktiver Markierung konnte die Akkumulation bestimmt werden. Mit Hilfe dieser
Überstandsmessungen wurden Kontrollversuche durchgeführt, um zu testen, inwiefern es zu
einer unspezifischen Bindung des radioaktiven Methylammoniums an die Zellmasse kommt.
Dazu wurden die Zellen vor Zugabe des radioaktiven Methylammoniums durch das
Detergens CTAB permeabilisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die unspezifische Bindung
an permeabilisierte Zellen vernachlässigbar ist (Daten nicht gezeigt).
Der Stamm Mek-1 erreichte bei einer eingesetzten Methylammoniumkonzentration von
100 µM eine 50000-fache Akkumulation. Dieser Wert wurde bei einem externen pH von 7,5
bestimmt. Die Höhe der Akkumulation ist ungewöhnlich und kann nur durch die Kraft des
Membranpotentials kaum erklärt werden. Erstaunlicherweise schien die Akkumulation von
Methylammonium abhängig vom externen pH-Wert zu sein, so wurde bei pH 6,5 nur 23000fache Akkumulation und bei pH 8,5 hingegen 52.000-fache Akkumulation bestimmt. Diese
pH-Abhängigkeit ist ungewöhnlich, da für AmtA bereits gezeigt wurde, dass die Aufnahme
von Methylammonium unabhängig vom pH ist, da nur das geladene Methylammonium
ERGEBNISSE
81
transportiert wird (Meier-Wagner et al., 2001). Neben der Abhängigkeit zum pH-Wert konnte
auch gezeigt werden, dass die Akkumulation an das Membranpotential gekoppelt ist. Die
Zugabe von Valinomycin und Nigericin führte zu einem Stop der Akkumulation.
Mit dem im Rahmen dieser Arbeit hergestellten C. glutamicum-Stamm Mek-1, in dem die
Gene amtB, glnA, gdh und glnA2 deletiert worden sind, wurde die Messung der AmtAvermittelten Methylammoniumaufnahme unabhängig von der Metabolisierung des Substrats
in vivo möglich. Aufnahmestudien zeigten, dass die Aktivität des Transporters AmtA
unabhängig von der Assimilation des Substrats ist. Dies wurde ebenfalls durch den
glnA/gdh/glnA2-Deletionsstamm DA-2 gezeigt. Mit Hilfe einer neu etablierten Methode, mit
der die externe Menge an radioaktiver Markierung bestimmt werden kann, konnte gezeigt
werden, dass AmtA Methylammonium in der Zelle akkumulieren kann. Dies spricht dafür,
dass es sich bei AmtA um einen aktiven Transporter handelt. Bekannte Daten, wie z. B. die
Membranpotentialabhängigkeit der Methylammoniumaufnahme durch AmtA konnten
bestätigt werden.
4.6 Untersuchung von C. glutamicum-Deletionsmutanten bezüglich der
Methylammoniumaufnahme
Neben den beiden Deletionsmutanten DA-2 und Mek-1 wurden weitere C. glutamicumDeletionsstämme untersucht. Dazu gehörten die Stämme LN∆GS (∆glnA), LN∆GDH (∆gdh),
TM∆gdh∆glnA
(∆gdh∆glnA)
und
DA-1
(∆glnA∆glnA2).
Außerdem
wurde
der
Deletionsstamm LNGLNA2 (∆glnA2) untersucht, da es sich beim glnA2-Genprodukt um eine
putative Glutaminsynthetase handelt, deren Funktion allerdings unklar ist. Als Indikator der
Stickstoffkontrolle wurde zum einen der Adenylylierungsstatus des GlnK-Proteins zum
anderen die Expression der Ammoniumtransportergene amtA und amtB in den genannten
Deletionsstämmen im Vergleich zm Wildtyp untersucht.
ERGEBNISSE
82
A
M
1
2
M
3
4
5
6
7
8
9 10
11
12 M
72
55
43
34
26
17
11
B
1
2
1
2
Wildtyp ATCC 13032
LN∆GS
LN∆GDH
LNGLNA2
TM∆gdh∆glnA
DA-1
amtA
amtB
Abb. 4.16: Beschreibung der Stickstoffkontrolle und Methylammoniumaufnahme in verschiedenen
C. glutamicum-Deletionsstämmen.
Zum
Nachweis
von
GlnK
wurden
Western
Blot-Experimente
durchgeführt (A). Die Gesamtproteinextrakte wurden aus Zellen des C. glutamicum-Wildtyps ATCC 13032
(1, 2), den Deletionsstämmen LN∆GS (3, 4), LN∆GDH (5, 6), LNGLNA2 (7, 8), TM∆gdh∆glnA (9, 10) und
DA-1 (11, 12). 25 µg Protein wurden jeweils aufgetrennt. Ungerade Zahlen stehen dabei für Zellextrakte, die aus
Zellen gewonnen wurden, die bei Stickstoffüberschuss inkubiert wurden, gerade Zahlen für Zellen, die
Stickstoffmangel unterzogen wurden. Als Proteinstandard wurde peqGOLD Prestained Protein-Marker IV
(peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) verwendet (M). Die Expression der Ammoniumtransportergene amtA
und amtB wurde im Wildtyp sowie in den genannten Deletionsstämmen untersucht (B). Die Gesamt-RNA der
verschiedenen C. glutamicum-Stämme wurde aus Zellen präpariert, die bei guter Stickstoffversorgung (1) und
bei Stickstoffmangel (2) inkubiert wurden. Es wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt.
Die in Abbildung 4.16 gezeigten Expressionsanalysen wurden zusätzlich mittels Real Time
RT PCR-Experimenten nachvollzogen.
ERGEBNISSE
A
83
B
1500
relative fold expression
relative fold expression
1500
1000
500
1000
0
0
1
Abb.
4.17:
500
Real
2
Time
3
4
RT
5
6
PCR-Experimente
1
zur
2
Analyse
3
des
4
5
6
Expressionsmusters
der
Ammoniumtransportergene. Untersucht wurde die Expression des amtA-Gens (A) und des amtB-Gens (B) im
C. glutamicum-Wildtyp (1), und den Deletionsstämmen LN∆GS (2), LN∆GDH (3), LNGLNA2 (4),
TM∆gdh∆glnA (5)
und
DA-1
(6).
Die
Gesamt-RNA
wurde
aus
Zellen
präpariert, die
unter
Stickstoffüberschuss (■) und bei Stickstoffmangelbedingungen (□) inkubiert wurden. Die relative Expression
wurde jeweils dreimal bestimmt. Die Expression der Gene im Wildtyp unter Stickstoffüberschuss wurde mit 1
festgelegt, die Expression der Gene in den anderen Stämmen wurde darauf bezogen.
Es zeigte sich, dass die RNA-Hybridisierungsexperimente durch die Ergebnisse der Real Time
RT PCR bestätigt wurden. Wie in vorherigen Real Time RT PCR-Experimenten konnte auch
hier beobachtet werden, dass die Expression des amtB-Gens in allen Stämmen, auch im
Wildtyp, niedriger ist als die Expression des amtA-Gens. Interessanterweise zeigte es sich,
dass im Stamm LN∆GDH die AmtR-Repression der Ammoniumtransportergene unter
Stickstoffüberschussbedingungen nicht vollständig ist. Dies spiegelte sich auf RNA- als auch
auf Proteinebene wider. Western Blot-Analysen zeigten für die gdh-Mutante LN∆GDH unter
Stickstoffüberschussbedingungen deadenylyliertes GlnK-Protein. Bei Stickstoffmangel war
nur noch die adenylylierte Form nachweisbar. Auch für den C. glutamicum-Wildtyp ATCC
13032 konnte bei guter Stickstoffversorgung eine geringe Menge an deadenylyliertem GlnKProtein nachgewiesen werden (Müller et al., 2006a). Ebenso konnte gezeigt werden, dass in
der gdh-Mutante neben deadenylylierten GlnK auch geringere Menge an adenylyliertem
GlnK unter Stickstoffüberschuss zu finden war, so dass eine Interaktion mit AmtR möglich
war und AmtR-regulierte Gene transkribiert werden konnten (Müller et al., 2006a). Der
Antikörpernachweis in den Stämmen LN∆GS, sowie im gdh/glnA-Deletionsstamm
TM∆gdh∆glnA und im glnA/glnA2-Deletionsstamm DA-1 lieferte ähnliche Ergebnisse, so
wurde bei guter Stickstoffversorgung als auch unter Stickstoffmangel die adenylylierte Form
des GlnK-Proteins nachgewiesen. Im Expressionsmuster von amtA und amtB zeigten sich
Unterschiede zwischen den verschiedenen Stämmen. Im Stamm LN∆GS und im Stamm
ERGEBNISSE
DA-1
wurde
84
keine
Expression
der
Gene
unter
Stickstoffüberschussbedingungen
nachgewiesen, aber es konnten amtA- und amtB-Transkripte unter Stickstoffmangel
dokumentiert werden, d. h., die Stickstoffregulation folgte auf Expressionsebene dem
gleichen
Muster
wie
im
Wildtyp.
Im
Stamm
TM∆gdh∆glnA
wurden
unter
Stickstoffüberschuss- und auch unter Mangelbedingungen die Gene amtA und amtB
transkribiert. Für den Stamm LNGLNA2, in dem das Gen glnA2 deletiert ist, konnte gezeigt
werden, dass die glnK-Expression unter Stickstoffüberschussbedingungen durch AmtR
reprimiert wird. Bei Betrachtung der Expressionsanalyse der Gene amtA und amtB im Stamm
LNGLNA2 zeigte sich, dass die Transkription der Ammoniumtransportergene unter
Stickstoffüberschussbedingungen
reprimiert
ist.
Diese
Repression
ist
unter
Stickstoffmangelbedingungen aufgehoben, die Gene werden transkribiert. Daraus kann
gefolgert werden, dass die Deletion von glnA2 keine Auswirkung auf die Stickstoffkontrolle
hat.
Um weitere Erkenntnisse über die Deletionsstämme LN∆GS, LN∆GDH, LNGLNA2,
TM∆gdh∆glnA und DA-1 zu gewinnen, wurde die Methylammoniumaufnahme dieser
Stämme bestimmt, und, da es sich um Stämme handelte, in denen eine oder mehrere
Komponenten der Ammoniumassimilation fehlten, wurden auch die internen Konzentrationen
von Glutamin und Glutamat mittels HPLC bestimmt. Für diese Untersuchungen, ebenso wie
für die Aufnahmemessungen, wurden die Zellen wie beschrieben angezogen und für eine
Stunde in Stickstoff-freiem Minimalmedium inkubiert, um dann, wie für die einzelnen
Experimente beschrieben, präpariert zu werden.
ERGEBNISSE
85
Aufnahmerate [nmol m in
-1
(mg TG)-1]
A
70
60
50
40
30
20
10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Me thylam monium [µM]
B
Interne Konzentration [mM]
100
80
60
40
20
0
Wildtyp
ATCC
Wildtyp
13032
ATCC 13032
MJ4-26
LN∆GS
LNDGDH
LN∆GDH
LNGLNA2
LNGLNA2
TMDgdhDglnA
TM∆gdh∆glnA
DA-1
DA-1
Abb. 4.18: Methylammoniumaufnahme (A) und interne Glutamin-und Glutamatkonzentration (B). Die
Methylammoniumaufnahme des Wildtyps (■) sowie die der C. glutamicum-Deletionsstämme LN∆GS (●),
LN∆GDH (□), LNGLNA2 (○), TM∆gdh∆glnA (∆) und DA-1 (▲) wurde bestimmt (A). Die
Methylammoniumaufnahmeraten [nmol min−1 (mg TG)−1] sind hier in Abhängigkeit zu den eingesetzten
Substratkonzentrationen (500 µM; 1 mM; 1,5 mM; 2 mM; 2,5 mM; 3 mM) dargestellt. Außerdem wurden die
internen Glutamin (■)- und Glutamatkonzentrationen (□) der C. glutamicum-Stämme Wildtyp ATCC 13032,
LN∆GS, LN∆GDH, LNGLNA2, TM∆gdh∆glnA und DA-1 ermittelt. Die Zellen wurden nach einstündiger
Inkubation in Minimalmedium ohne Stickstoff extrahiert und die Extrakte HPLC-Untersuchungen unterzogen.
Beim Vergleich der Methylammoniumaufnahmeaktivität mit der internen Konzentration der
Metabolite, lässt sich schnell feststellen, dass die Aktivität bzw. das Vorhandensein der
Enzyme GS, GDH oder GlnA2 keine Auswirkung auf die Aufnahme von Methylammonium
haben. Eine Kopplung der Methylammoniumaufnahme an die Verstoffwechselung des
Substrats innerhalb der Zelle wird seit langer Zeit diskutiert und wurde durch
Röntgenstrukturanalysen des E. coli AmtB-Proteins, die für das Protein eher die Funktion
eines Kanals als eine Funktion als aktiver Transporter nahelegt, unterstützt (Khademi et al.,
2004, Zheng et al., 2004). Auf Aktivitätsebene wurde diese Vermutung an Beobachtungen in
ERGEBNISSE
86
einer glnA-Mutante in E. coli geknüpft, weil diese eine Mutante eine sehr viel geringere
Aufnahme von Methylammonium zeigte als der Wildtyp. Daher wurde argumentiert, dass
durch das Fehlen der GS der Zug auf das Substrat ausbleibt und daher weniger bzw. kaum
Methylammonium in die Zellen aufgenommen wird (Soupene et al., 1998; Javelle et al.,
2005). Für einen der Ammoniumtransporter in C. glutamicum, nämlich AmtA, kann eindeutig
widerlegt werden, dass es sich dabei um einen Kanal handelt. Dennoch zeigte auch in
C. glutamicum
die
∆glnA-Mutante
LN∆GS
nur
sehr
niedrige
Methylammoniumaufnahmeraten (siehe Abbildung 4.18 A). Aufgrund der Deletion des glnAGens ist die interne Konzentration an Glutamin im Vergleich zum Wildtyp sehr niedrig, die
Konzentration an Glutamat ähnlich wie im C. glutamicum-Wildtyp. Die Argumentation, dass
auch in C. glutamicum die Methylammoniumaufnahme an die GS-Aktivität gekoppelt ist,
scheint durch die Ergebnisse für den Stamm LNGLNA2 entkräftet zu werden. Der Stamm
zeigte ähnlich niedrige Aufnahmeraten wie der glnA-Deletionsstamm, die interne
Konzentration von Glutamin war jedoch höher als im Wildtyp. Die Aktivität der GS scheint
in diesem Stamm erhöht, die Aufnahmeraten sind jedoch niedrig. Daher liegt der Schluss
nahe, dass die Aktivität der GS keine Auswirkung auf die Methylammoniumaufnahmerate
hat. Jedoch bleibt an dieser Stelle unklar, warum dieser Stamm, der sich weder im amtA-und
amtB-Expressionsmuster, im GlnK-Modifikationsmuster, noch in der internen Glutamin-und
Glutamat-Konzentration
kaum
vom
Wildtyp
unterscheidet,
sich
in
der
Methylammoniumaufnahme dennoch stark von diesem unterscheidet.
Für den glnA/glnA2-Deletionsstamm DA-1 wurden sehr niedrige Aufnahmeraten ermittelt.
Die Raten entsprechen der Hintergrundaktivität bzw. Diffusion, die für den Stamm JS-1
(∆amtA/∆amtB) gemessen wurden (siehe Abbildung 4.1). Die HPLC-Untersuchungen
ergaben für den Stamm DA-1 sehr hohe Glutamat-Konzentrationen und aufgrund der glnAund glnA2-Deletionen sehr niedrige Glutamin-Konzentrationen.
Ein Zusammenhang zwischen Glutamatkonzentration und Methylammoniumaufnahme zeigte
sich auch in den Stämmen LN∆GDH und TM∆gdh∆glnA. Da das Gen gdh in diesen
Stämmen deletiert wurde, war die Glutamat-Konzentration dementsprechend niedrig. In
Bezug auf die Methylammoniumaufnahme ähneln die Raten der beiden Stämme dem
C. glutamicum-Wildtyp, wobei die Aufnahme des Stammes LN∆GDH höher, die Aufnahme
des Stammes TM∆gdh∆glnA etwas niedriger als im Wildtyp waren. Glutamat wurde als
Marker für die Stickstoffversorgung und als Signal für die GlnD/GlnK/AmtR-Kaskade
ERGEBNISSE
87
ausgeschlossen (Müller et al., 2006a). Dennoch scheint Glutamat einen Einfluss auf die
Expression
AmtR-regulierter
Gene
zu
haben
und
auch
die
Aktivität
der
Ammoniumtransporter zu beeinflussen. Glutamin hingegen scheint keinen Einfluss auf die
Ammoniumtransporter auszuüben.
4.7 Interaktionen von AmtA und AmtB mit anderen Komponenten der
Stickstoffkontrolle
Die am besten beschriebene Interaktion eines Ammoniumtransporters aus C. glutamicum und
einer Komponente der Stickstoffkontrolle ist die Interaktion von AmtB mit dem PIISignalprotein GlnK. Es wurde gezeigt, dass das GlnK-Protein abhängig vom Stickstoffstatus
mit AmtB wechselwirkt (Strösser et al., 2004). Desweiteren wurden schon mehrere Versuche
durchgeführt, um eine mögliche Interaktion zwischen AmtA und der GS nachzuweisen
(Jakoby, 1998; Meier-Wagner, 2000).
4.7.1 Two Hybrid-Interaktionsstudien
Zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Ammoniumtransportern AmtA und AmtB
und unterschiedlichen Komponenten der Stickstoffkontrolle wurde das BacterioMatch II Two
Hybrid-System gewählt, da es die Möglichkeit bietet, gezielt Interaktionen zu untersuchen.
Dieses E. coli-System ist in der Lage, durch die Aktivierung der Transkription bestimmter
Gene Protein-Protein Interaktionen zu detektieren. Hierfür wurde ein Gen, das für eines der
beiden möglichen Interaktionspartner (Köder oder bait) kodiert, stromabwärts des Gens, das
für das Bakteriophage λ Repressor Protein (λcI, 237 Aminosäuren) kodiert, in den Vektor
pBT kloniert, so dass es in frame mit diesem zusammen abgelesen wurde. Das
Repressorprotein besteht aus einer aminoterminalen DNA-Bindedomäne und einer
carboxyterminalen Dimerisierungsdomäne. Das Gen, das für den möglichen anderen
Interaktionspartner kodiert (Ziel oder target), wurde stromaufwärts des Gens, das für die αUntereinheit einer RNA-Polymerase (248 Aminosäuren) kodiert, in frame in den Vektor
pTRG kloniert, so dass auch diese beiden Gene gemeinsam abgelesen wurden und ein
Fusionsprotein entstand. Interagierten die beiden potentiellen Interaktionspartner (bait und
target), wurde die Bindung der RNA-Polymerase über den λcI-Repressor auf dem
Promotorbereich der DNA stabilisiert und die Transkription des HIS3-Reportergens aktiviert.
Zusätzlich wurde noch ein zweites Gen, aadA, dass für ein Protein, das Streptomycinresistenz
ERGEBNISSE
88
vermittelt, transkribiert, so dass eine einfache Selektion bei einer Interaktion der
ausgewählten Proteine möglich war.
Für die folgenden Two Hybrid-Analysen wurden die Gene der Ammoniumtransporter AmtA
und AmtB in den pTRG-Vektor kloniert (amtA und amtB). Ferner wurden verkürzte
Versionen dieser Gene in den gleichen Vektor kloniert. Diesen verkürzten Versionen fehlten
Basenpaare, die für Aminosäuren der C-terminalen Region kodieren (amtAoCterm und
amtBoCterm). Außerdem wurden die Basenpaare, die für diese C-terminalen Proteinregionen
kodieren, in den Vektor pTRG kloniert (amtACterm und amtBCterm). Die Betrachtung der Cterminalen Domäne wurde hier miteinbezogen, da die C-terminale, cytoplasmatische Domäne
von Membranproteinen häufig Angriffspunkt für Interaktionen ist. Als mögliche
Interaktionspartner wurden die Glutaminsynthetase (GS), das GlnD-Protein und die vom
glnE-Gen kodierte ATase (im weiteren als GlnE bezeichnet) ausgewählt. Die möglichen
Interaktionspaare wurden in einem Reporterstamm co-exprimiert und selektiert. Zur Kontrolle
wurden die rekombinanten Plasmide mit dem entsprechend anderen Leerplasmid coexprimiert. Hier sollten keine Kolonien sichtbar sein.
Tab. 4.4: Two Hybrid-Interaktionsstudien. Dargestellt sind die Kombinationen, die auf mögliche Interaktionen
untersucht wurden. Nach erfolgter Cotransformation wurden die Kolonien ausgezählt und hier als colony
forming units angegeben. Fanden sich Kolonien auf nicht-sektivem Medium und selektivem Medium handelte es
sich um eine Interaktion. Hier sind nur Kombinationen angegeben, die auf eine Interaktion mit AmtA getestet
wurden. Zur Kontrolle wurden Cotransformationen mit den Leervektoren pBT und pTRG durchgeführt, die
keine Interaktion zeigten. Diese Interaktionsstudien wurden zweimal ausgeführt und zeigten dabei vergleichbare
Ergebnisse.
Untersuchte
colony forming units auf nicht- colony
Interaktion
selektivem Medium
selektivem Medium
pBT
pTRG
glnA
amtA
120
73
glnA
amtAoCterm
79
78
glnA
amtACterm
400
37
glnD
amtA
85
0
glnD
amtAoCterm
28
0
glnD
amtACterm
200
0
forming
units
auf
ERGEBNISSE
89
Untersuchte
colony forming units auf nicht- colony
Interaktion
selektivem Medium
selektivem Medium
pBT
pTRG
glnE
amtA
58
23
glnE
amtAoCterm
180
0
glnE
amtACterm
16
0
forming
units
auf
Eine Auswertung der Anzahl der Kolonien ergab die folgenden Interaktionen: Für GS-AmtA,
GS-AmtAoCterm und GS-AmtACterm konnte eine Interaktion nachgewiesen werden.
Außerdem interagierte GlnE mit AmtA, jedoch nicht mit den verkürzten Versionen des
Proteins. Für AmtB konnte keine Interaktion gezeigt werden. Auf die nachgewiesenen
Interaktionen des Ammoniumtransporters AmtA mit der GS und der ATase wird in den
folgenden Abschnitten näher eingegangen.
4.7.2 Wechselwirkung zwischen AmtA und GS
Two Hybrid-Interaktionsstudien wiesen auf eine direkte Interaktion der Glutaminsynthetase
mit dem Ammoniumtransporter AmtA hin, die bereits seit einiger Zeit diskutiert wird. Es
wurde beobachtet, dass Glutamin und Glutaminanaloga die Methylammoniumaufnahme in
Bakterien hemmen (Kleiner, 1985). In E. coli bildet Glutamin nach Aufnahme in die Zellen
einen Pool, der die Methylammoniumaufnahme durch feedback-Inhibition reduziert
(Jayakumar et al., 1987). Für C. glutamicum wurde ebenfalls gezeigt, dass die
Methylammoniumaufnahme im Wildtyp nach Zugabe von Glutamin und NaCl sank. Durch
die zusätzliche Gabe von NaCl wurde die Kopplung der Glutaminaufnahme an den Symport
von Na+ ausgenutzt (Siewe et al., 1995), um Glutamin in die Zellen zu schleusen. Die
Bestimmung der internen Konzentration von Glutamin und Glutamat zeigte, dass sich die
Glutaminkonzentration nach Zugabe von 1 mM Glutamin zu Zellen, die für eine Stunde bei
Stickstoffmangel
inkubiert
worden
sind,
kaum
änderte,
während
sich
die
Glutamatkonzentration etwa verdoppelte (Jakoby, 1998). Kaum in die Zellen aufgenommen,
wurde das Glutamin von der GOGAT in Glutamat umgewandelt, und diente nicht zum
Aufbau eines Glutamin-Pools. Eine feedback-Inhibition durch Glutamin kann also
ausgeschlossen werden. Auch das enstandene Glutamat konnte als Signal ausgeschlossen
werden.
Sequenzvergleiche
des
AmtA-Proteins
mit
der
Amonisäuresequenz
der
ERGEBNISSE
90
Glutaminsynthetase lenkten die Aufmerksamkeit auf die C-terminale Extension des AmtAProteins. Dieser Sequenzabschnitt wies große Ähnlichkeit mit einem Sequenzabschnitt aus
dem aktiven Zentrum von Glutaminsynthetasen auf. Die Vermutung, dass dies ein
Angriffspunkt für die Interaktion von AmtA mit der GS wäre, kann mit Hilfe der Two HybridInteraktionsstudien verneint werden, da diese Studien gezeigt haben, dass die GS mit allen
Versionen des AmtA-Proteins gleichermaßen interagiert. Der Frage, nach der Art einer
möglichen Interaktion zwischen AmtA und der GS, wird in den folgenden Abschnitten
nachgegangen.
4.7.2.1 Einfluss
von
Glutamin
und
MSX
auf
die
AmtA-vermittelte
Methylammoniumaufnahme
In Anlehnung an frühere Experimente wurde die Methylammoniumaufnahmerate des amtADeletionsstammes LN-1.1 nach Glutamin- bzw. nach Zugabe des Glutaminanalogs MSX
bestimmt.
Tab. 4.6: Einfluss von Glutamin und des Glutaminanalogs MSX auf die Methylammoniumaufnahme des
C. glutamicum Stammes LN-1.1. Es wurde die Methylammoniumaufnahmerate [nmol min-1 (mg TG)-1] des
Stammes LN-1.1 bestimmt. Den Zellen wurden 1 mM Glutamin und 10 mM NaCl oder MSX in verschiedenen
Konzentrationen (1 mM oder 10 mM) entweder mit oder ohne zusätzliches NaCl (10 mM) zugegeben. Der
Zeitpunkt der Zugabe ist in der Tabelle angegeben.
Zugabe von
1 mM Glutamin
Zugabe unmittelbar
Zugabe 10 min vor
Methylammonium-
bei Start der
Start der Messung
aufnahmerate
Messung
[nmol min-1 (mg TG)-1]
X
11,1
10 mM NaCl
1 mM Glutamin
X
9,3
10 mM NaCl
1 mM MSX
X
15,6
1 mM MSX
X
19,7
10 mM NaCl
1 mM MSX
X
18,0
10 mM NaCl
10 mM MSX
X
7,0
ERGEBNISSE
91
Zugabe von
Zugabe unmittelbar
Zugabe 10 min vor
Methylammonium-
bei Start der
Start der Messung
aufnahmerate
[nmol min-1 (mg TG)-1]
Messung
10 mM MSX
10 mM MSX
9,7
X
8,8
X
10 mM NaCl
10 mM MSX
7,2
X
10 mM NaCl
Als Kontrolle wurde die Methylammoniumaufnahmerate des Stammes ohne Zugabe von
Glutamin
oder
MSX
bestimmt.
Dabei
ergab
sich
eine
Aufnahmerate
von
20,5 nmol min-1(mg TG)-1. Durch die Gabe von 1 mM Glutamin und 10 mM NaCl zu den
Zellen wurde die Methylammoniumaufnahme etwa um die Hälfte reduziert. Dies deckt sich
mit Untersuchungen von M. Jakoby (1998), wobei in diesem Falle der Zeitpunkt der Zugabe,
also unmittelbar oder 10 min vor Methylammoniumzugabe, keine Rolle spielt. Das
Glutaminanalog MSX zeigte in der Konzentration von 1 mM keine Wirkung, unabhängig von
zusätzlicher NaCl-Zugabe oder dem Zeitpunkt der Zugabe. Bei zehnfach höherer
Konzentration (10 mM) reduzierte die Zugabe von MSX die Methylammoniumaufnahme in
der C. glutamicum-Mutante LN-1.1 um mehr als 50 %. NaCl hatte dabei keinen wesentlichen
Einfluss. Auch der Zeitpunkt der Zugabe spielte keine Rolle.
Um zu untersuchen, ob die Zugabe von MSX einen Effekt auf das Wachstum des amtADeletionsstammes LN-1.1 ausübt, wurde das Wachstum dieses Stammes in Anwesenheit des
Glutaminanalogs untersucht. Zusätzlich wurde der C. glutamicum-Wildtyp den gleichen
Kultivierungsbedingungen unterzogen. Die Zellen der beiden Stämme wurden zunächst für
ca. 8 Stunden bei 30°C unter Schütteln im Vollmedium BHI kultiviert. Mit diesen
Vorkulturen wurde Stickstoff-haltiges Minimalmedium beimpft und über Nacht bei 30°C
unter Schütteln inkubiert. Die Untersuchung des Wachstumsverhaltens erfolgte nach
Beimpfen von frischen Stickstoff-haltigem Minimalmedium mit den Vorkulturen auf eine
optische Dichte von 1. Um einen möglichen Effekt von MSX auf das Wachstum zu
überprüfen, wurden je einer Kultur 10 mM MSX bzw. 10 mM MSX und 10 mM NaCl
zugegeben.
ERGEBNISSE
A
92
B
100
100
10
OD600
OD600
10
1
1
0,1
0,1
0
5
10
15
20
25
0
5
Zeit [h]
10
15
20
25
Zeit [h]
Abb. 4.19: Wachstum des C. glutamicum Wildtyps ATCC13032 (A) und des Deletionsstammes LN-1.1 (B).
Zellen der beiden Stämmen wurden kultiviert in Stickstoff-haltigem Minimalmedium (■), in Stickstoff-haltigem
Minimalmedium mit Zugabe von 10 mM MSX (□) und in Stickstoff-haltigem Minimalmedium mit Zugabe von
10 mM MSX sowie 10 mM NaCl (●). Das Wachstum wurde durch stündliche photometrische Bestimmung der
optischen Dichte bei 600 nm bestimmt.
Der Vergleich des Wachstums von C. glutamicum-Wildtyp-Zellen mit Zellen des amtADeletionstammes
LN-1.1
macht
deutlich,
dass
es
zu
keinem
MSX-abhängigen
Wachstumsdefekt kam. Tesch et al. (1999) konnten zeigen, dass die Zugabe von MSX zu
C. glutamicum-Zellextrakten GS sowie GOGAT inhibiert. Die Inhibition dieser für die
Ammoniumassimilation essentiellen Proteine sollte demnach zu einem signifikanten
Wachstumsdefekt führen. Erstaunlicherweise hatte die Zugabe von MSX jedoch keinen
Einfluss auf das Wachstum von C. glutamicum-Wildtyp-Zellen. Nach Tesch et al. zeigten,
dass eine gdh-Mutante bei MSX-Konzentrationen von 100 µM im Medium nicht mehr wuchs.
Die Autoren führten dies darauf zurück, dass die GDH bei Inhibition von GS/GOGAT
Ammonium assimiliert, da kein inhibitorischer MSX-Effekt auf GDH festgestellt werden
konnte (Tesch et al., 1999). Innerhalb dieser Arbeit konnte allerdings auch die von Tesch et
al. gezeigte Auswirkung von MSX auf das Wachstum einer gdh-Deletionsmutante nicht
nachvollzogen werden (Daten nicht gezeigt).
ERGEBNISSE
93
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Glutamin und das Substratanalog MSX die AmtAvermittelte Methylammoniumaufnahme etwa um die Hälfte reduzieren. Nach welchem
Mechanismus Glutamin und MSX auf die Aufnahme wirken, ist dabei unklar.
4.7.3 Untersuchung von GlnE
Neben der Interaktion zwischen AmtA und der GS zeigten die Two Hybrid-Studien noch eine
Interaktion zwischen AmtA und GlnE. Zur Unterscheidung der von glnE von der von glnD
kodierten Adenylyltransferase wird die GlnE-ATase im weiteren als GlnE bezeichnet.
GlnE reguliert im Rahmen der Stickstoffkontrolle in C. glutamicum die Aktivität der
Glutaminsynthetase, kodiert von glnA. Unter Stickstoffüberschussbedingungen wird die
Aktivität
der
GS
durch
Anhängen
eines
Adenylylrestes
verringert,
unter
Stickstoffmangelbedingungen katalysiert GlnE die Deadenylylierung des Enzyms, wodurch
dessen Aktivität wiederhergestellt wird. Der Tyrosylrest 405 der Glutaminsynthetase konnte
dabei als die Adenylylierungsstelle identifiziert werden, so wurde nach Austausch des
Tyrosinrestes 405 gegen einen Phenylalaninrest die GS-Aktivität nicht mehr reguliert (Jakoby
et al., 1999). Die Deletion des glnE-Gens führte ebenfalls zu einer Deregulation der GSAktivität (Nolden et al., 2001a). Das Gen glnE befindet sich mit dem Gen glnA2 in einem
Operon und unterliegt selbst nicht der Stickstoffkontrolle.
Für Enterobakterien wurde gezeigt, dass über eine Interaktion von GlnE mit dem PII-Protein
GlnK der ATase der Stickstoffstatus der Zelle übermittelt wird (Merrick et al., 1995). Der
Mechanismus in C. glutamicum ähnelt eher dem Mechanismus in S. coelicolor. Für diesen
Organismus wurde gezeigt, dass das GlnE-Protein unabhängig vom PII-Typ-Signalprotein
GlnK arbeitet (Hesketh et al., 2002). RNA-Hybridisierungsexperimente zur Analyse der
Expression des Stickstoff-regulierten Gens (amtB) im C. glutamicum glnE-Deletionsstamm
LNGLNE
zeigten
das
typische
Regulationsmuster
in
Abhängigkeit
der
Stickstoffverfügbarkeit (kein Signal unter Stickstoffüberschuss, starkes Signal unter
Stickstoffmangel, kein Signal nach Zugabe von Ammoniumsulfat und 15-minütiger
Inkubation). Die Stickstoffkontrolle war demnach intakt. Die Stickstoff-abhängige
Modifikation des PII-Signalproteins GlnK unterschied sich hingegen von der des Wildtyps. So
wurde das Protein unter Stickstoffüberschuss ebenfalls nicht exprimiert, jedoch kam es nach
Stickstoffmangel und anschließendem Stickstoffpuls nicht zur Deadenylylierung des Proteins
und anschließenden Bindung des GlnK-Proteins an den Ammoniumtransporter AmtB
(Strösser, 2005).
ERGEBNISSE
94
Die weitere Untersuchung des GlnE-Einflusses auf die Stickstoffkontrolle sowie eine
Interaktion von GlnE mit AmtA stand im Mittelpunkt der folgenden Untersuchungen.
4.7.3.1 Stickstoffkontrolle in LNGLNE
Zunächst wurde die Auswirkung der Deletion des glnE-Gens auf die Stickstoffkontrolle
untersucht. Dazu wurden neben RNA-Hybridisierungsexperimenten auch die sensitivere
Methode der Real-Time RT PCR zur Expressionsanalyse genutzt. Die Expression der Gene
amtA, amtB, glnA, gltB und gltD im Stamm LNGLNE wurde untersucht, um die Auswirkung
des Fehlens von GlnE auf die Transkription Stickstoff-regulierter Gene zu analysieren.
ERGEBNISSE
95
B
1500
1350
1200
1050
A
900
60
750
2
3
4
relative fold expression
1
amtA
amtB
glnA
gltB
600
50
450
300
40
150
30 0
60
20
10
50
40
gltD
30
20
10
0
amtA
amtA
amtB
amtB
glnA
glnA
gltB
gltB
gltD
gltD
Abb. 4.20: Genexpressionsanalysen im Stamm LNGLNE. Untersucht wurde die Expression verschiedener
Gene der Stickstoffkontrolle unter Stickstoffüberschuss- und Stickstoffmangelbedingungen im Deletionsstamm
LNGLNE sowie im Wildtyp. Mit RNA-Hybridisierungsexperimenten (A) wurde die Expression der Gene amtA,
amtB, glnA, gltB und gltD untersucht. Die RNA wurde aus Wildtyp-Zellen präpariert, die unter
Stickstoffüberschuss (1) und unter Stickstoffmangelbedingungen (2) kultiviert wurden. Zellen des LNGLNEStammes wurden ebenfalls unter Stickstoffüberschuss- (3) und Stickstoffmangelbedingungen (4) kultiviert, um
daraus Gesamt-RNA zu isolieren. 1 µg der Gesamt-RNA wurde für die Hybridisierung eingesetzt. Außerdem
wurden Real Time RT PCR-Experimente durchgeführt (B). Für diese Experimente wurde RNA des Wildtyps
verwendet, der bei guter Stickstoffversorgung (■) und unter Stickstoffmangel (■) kultivert wurde. Ebenso wurde
der Stamm LNGLNE kultiviert, um aus den Zellen, die unter Stickstoffüberschuss (■) und Stickstoffmangel (■)
gezogen wurden, RNA zu präparieren. Die Expression der untersuchten Gene im Wildtyp unter
Stickstoffüberschussbedingungen wurde gleich 1 gesetzt, die Expression dieser Gene in den anderen Stämmen
wurde daran angeglichen. Die Real Time RT PCR-Experimente wurde jeweils dreimal durchgeführt.
RNA-Hybridisierungsexperimente zeigten für die getesteten Gene keine großen Unterschiede
zwischen
dem
Wildtyp
und
LNGLNE.
Diese
Daten
simmen
mit
den
RNA-
Hybridisierungsexperimenten von J. Strösser (2005) überein. Mit Hilfe der empfindlicheren
Methode der Real Time RT PCR wurden Unterschiede zwischen dem C. glutamicum-Wildtyp
und dem glnE-Deletionstamm jedoch offensichtlich. So wurde die Expression Stickstoffregulierter Gene unter Stickstoffüberschuss nicht mehr vollkommen reprimiert. Vor allem für
die Gene amtA, amtB, gltB und gltD wurde bereits deutliche Expression unter
ERGEBNISSE
96
Stickstoffüberschuss gezeigt. Die Repression Stickstoff-regulierter Gene ist unter diesen
Bedingungen nicht vollständig. Für glnA ist bereits bekannt, dass dort das Bindemotiv für den
Stickstoffregulator AmtR verkürzt vorliegt und daher die Repression dieses Gens unter
Stickstoffüberschuss nicht vollständig ist (Nolden et al., 2001; Beckers et al., 2005). Es ist
also nicht verwunderlich, dass auch im Wildtyp unter Stickstoffüberschuss glnA-Expression
messbar ist, jedoch zeigt auch hier der Stamm LNGLNE eine geringfügig höhere Expression
unter Stickstoffüberschuss. Western Blot-Experimente, mit denen das Vorhandensein der
Proteine GS und GlnK nachgewiesen wurden, zeigten erwartete Signale.
A
M
1
B
2
M
1
2
70
72
55
45
35
25
45
35
15
25
15
10
10
55
Abb. 4.21: Antikörpernachweis der Proteine GS und GlnK. Zum Nachweis von GS (A) und GlnK (B) in
Zellextrakten des Stammes LNGLNE wurden Western Blot Experimente durchgeführt. Die Zellen wurden bei
Stickstoffüberschuss (1) und Stickstoffmangel (2) kultiviert. Es wurde jeweils 25 µg Gesamtprotein aufgetrennt.
Verwendete Proteinstandards (M): peqGOLD Prestained Protein-Marker IV (peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen (A)), Prestained Protein Marker Broad Range, 10-180 kDa (MBI Fermentas, Wilna).
Unter Stickstoffüberschuss wurde bereits GS nachgewiesen, unter Stickstoffmangel ein
geringfügig stärkeres Signal. GlnK-Protein wurde unter Stickstoffüberschuss in sehr geringer
Menge nachgewiesen, unter Stickstoffmangel zeigte sich ein stärkeres Signal. In beiden
Fällen wurde die adenylylierte Form von GlnK achgewiesen. Um zu überprüfen, ob GlnE
neben dem Einfluss auf die Expression Stickstoff-regulierter Genen auch Einfluss auf die
Funktion
dieser
Proteine
hat,
wurde
Deletionsstammes LNGLNE untersucht.
die
Methylammoniumaufnahme
des
glnE-
97
60
50
-1
-1
Aufnahmerate [nmol min (mg TG) ]
ERGEBNISSE
40
30
20
10
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Methylammonium [µM]
Abb. 4.22: Aufnahme von Methylammonium in LNGLNE. Zellen des Wildtyps (■) und des LNGLNEStammes (□) wurden Stickstoffmangel unterzogen und die Aufnahme von [14C]-Methylammonium bei
Substratkonzentrationen von 250 - 3000 µM bestimmt. Die Aufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] sind in
Abhängigkeit zu diesen Substratkonzentrationen dargestellt.
Im Gegensatz zum Wildtyp zeigte der Stamm LNGLNE eine deutlich geringere Aufnahme,
insgesamt jedoch ein ähnliches Sättigungsverhalten. Das Fehlen von GlnE wirkte sich direkt
auf die Aufnahme von Methylammonium aus.
Es wurden ebenfalls Methylammoniumaufnahmemessungen im glnE-Deletionsstamm
LNGLNE unter Stickstoffüberschuss durchgeführt, um zu testen, ob, wie im ∆amtR-Stamm
MJ6-18, die unter Stickstoffüberschuss exprimierten Transporter AmtA und AmtB
Methylammonium transportieren können. Für den Stamm LNGLNE konnte dies jedoch nicht
festgestellt werden.
4.8 Methylammoniumaufnahme unter Stickstoffüberschuss
Die durch AmtA und AmtB vermittelte Methylammoniumaufnahme wurde unter einem
weiteren Aspekt betrachtet. Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Experimenten wurden
die im folgenden dargestellten Aufnahmestudien mit Zellen durchgeführt, die unter
Stickstoffüberschussbedingungen geerntet wurden. Den Hintergrund für diese Studien lieferte
eine Veröffentlichung einer japanischen Arbeitsgruppe. Tachiki et al. (1983) beschrieben,
dass die Glutaminsynthetase aus C. glutamicum, das damals noch als Micrococcus glutamicus
bezeichnet wurde, eine höhere Affinität zu Ammonium als zu Methylammonium besitzt.
Durch Messen der Methylammoniumaufnahme unter diesen Bedingungen sollte gewährleistet
werden, dass das in der Zelle vorhandene Ammonium von der Glutaminsynthetase umgesetzt
ERGEBNISSE
98
wird, und daher das Substrat Methylammonium nicht dem Zug der GS unterliegt. Da unter
Überschussbedingungen die Expression Stickstoff-regulierter Gene durch AmtR reprimiert
wird und somit weder die Ammoniumtransporter noch die GS in vollem Ausmaß exprimiert
werden, wurde für diese Aufnahmestudien der amtR-Deletionsstamm MJ6-18 gewählt. Für
diesen C. glutamicum-Stamm wurde bereits gezeigt, dass der Verlust des AmtR-Proteins zur
konstitutiven Expression Stickstoff-regulierter Gene führt (Beckers et al., 2005).
Um
festzustellen,
ob
die
Methylammoniumaufnahme
mit
Zellen,
die
unter
Stickstoffüberschussbedingungen geerntet wurden, bestimmt werden kann, wurden zunächst
der C. glutamicum-Wildtyp ATCC13032 und der amtR-Deletionsstamm MJ6-18 untersucht.
Erwartungsgemäß zeigte der Wildtyp unter diesen Bedingungen keine Aufnahme. Für den
Stamm
MJ6-18
konnten
für
eine
Methylammoniumkonzentration
von
100
µM
Aufnahmeraten von 0,9 bzw. 1,1 nmol min-1(mg TG)-1 bestimmt werden, für 1,5 mM
Methylammonium Aufnahmeraten von 8,5 und 12,1 nmol min-1(mg TG)-1 (Müller et al.,
2006b). Dies deutete darauf hin, dass die Methylammoniumaufnahme unabhängig von der
Umsetzung von Methylammonium durch die GS ist. Um genauere Aussagen über die
einzelnen Transporter machen zu können, wurden weitere Deletionsstämme hergestellt. So
wurde in den Stämmen MJ2-38 (∆amtA), LN1.1 (∆amtB) und JS-1 (∆amtA∆amtB) über
homologe Rekombination das amtR-Gen deletiert. Für die vier Stämme MJ6-18 (∆amtR),
BW1.3 (∆amtA∆amtR), BW3.12 (∆amtB∆amtR) und BW2.6 (∆amtA∆amtB∆amtR) wurde
die Methylammoniumaufnahme unter Stickstoffüberschuss und Stickstoffmangel bestimmt.
B
60
Aufnahmerate [nmol min-1 (mg TG)-1]
Aufnahmerate [nmol min-1 (mg TG)-1]
A
50
40
30
20
10
0
0
500
1000
1500
2000
Methylammonium [µM]
2500
3000
60
50
40
30
20
10
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Methylammonium [µM]
Abb.: 4.23: Methylammoniumaufnahme unter Stickstoffüberschuss (A) und Stickstoffmangel (B). Die
Aufnahme des radioaktiv markierten Substrats Methylammonium wurde für die C. glutamicum-Stämme
MJ6-18 (□), BW1.3 (●), BW3.12 (■) und BW2.6 (○) mit vier verschiedenen Substratkonzentrationen bestimmt.
Die Aufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] sind in Abhängigkeit zu diesen Konzentrationen dargestellt.
ERGEBNISSE
99
Beckers et al. (2005) konnten zeigen, dass die Expression der Ammoniumtransportergene
amtA und amtB im amtR-Deletionsstamm MJ6-18 unabhängig vom Stickstoffstatus der Zelle
ist. Die Expression ist unter Stickstoffüberschuss genauso stark wie bei Stickstoffmangel.
Jedoch
zeigten
die
Zellen
des
MJ6-18-Stammes
nicht
annähernd
so
hohe
Methylammoniumaufnahmeraten unter Stickstoffüberschuss wie unter Stickstoffmangel. Dies
gilt ebenso für die Stämme BW1.3 und BW3.12, in denen je eins der Transportergene
deletiert wurde, diese zeigten jedoch nicht ähnlich hohe Methylammoniumaufnahmeraten wie
unter
Stickstoffmangel.
Daraus
lässt
sich
schließen,
dass
die
Aktivität
der
Ammoniumtransporter AmtA und AmtB unter Stickstoffüberschussbedingungen gesenkt
wird. Vermutlich wird die Aufnahme des Substratanalogs Methylammonium durch die
Anwesenheit von Ammonium in der Zelle gehemmt.
4.9
(Methyl-)Ammoniumaufnahme in Corynebakterien
Die Genome der drei Corynebakterien C. diphtheriae, C. efficiens und C. jeikeium wurden
nach Komponenten der Stickstoffkontrolle, die in C. glutamicum bereits charaktersiert sind,
analysiert. Dabei ließ sich feststellen, dass C. glutamicum und C. efficiens über eine größere
Anzahl Gene verfügen, die für Stickstoffkomponenten kodieren. So fanden sich in
C. glutamicum und C. efficiens zwei Gene für Ammoniumtransporter (amtA und amtB), in
C. jeikeium ein Gen (amtB), in C. diphtheriae hingegen keins. Um die Genomuntersuchungen
zu stützen, wurden Aufnahmemessungen mit [14C]-Methylammonium durchgeführt. Dafür
wurden die Zellen unter Stickstoffüberschussbedingungen im Vollmedium kultiviert oder
einstündigem
Minimalmedium
Stickstoffhunger
unterworfen,
kultiviert
wurden.
indem
Es
sie
im
wurden
Stickstoff-haltigem
verschiedene
Methylammoniumkonzentrationen (100, 500, 1000 µM) verwendet.
C. diphtheriae zeigte keine Methylammoniumaufnahme. Dies deckte sich mit den
Genomuntersuchungen, bei denen kein intaktes Ammoniumtransportergen, lediglich ein
Pseudogen, in diesem Organismus gefunden werden konnte. Erstaunlicherweise zeigte
C. jeikeium
ebenfalls
keine
Methylammoniumaufnahme,
obwohl
ein
Ammoniumtransportergen (amtB) in diesem Organismus identifiziert wurde und sich die
Expression des amtB-Gens mit RNA-Hybridisierungsexperimente nachweisen ließ. Mögliche
Erklärungen für die fehlende Aufnahme sind eine zu geringe Transporteraktivität, zu geringe
Genexpression oder fehlende Affinität des Transporters zu Methylammonium. C. glutamicum
ERGEBNISSE
und
C.
100
efficiens
zeigten
Methylammoniumaufnahme,
da
unter
unter
Stickstoffüberschuss
diesen
Bedingungen
ebenfalls
die
keine
Expression
der
Ammoniumtransportergene durch AmtR reprimiert wird. Nach Inkubation im Stickstofffreien Minimalmedium zeigten C. glutamicum und C. efficiens Methylammoniumaufnahme,
da unter diesen Bedingungen die Repression durch AmtR aufgehoben ist und die
Ammoniumtransporter synthetisiert werden.
Tab. 4.7: Methylammoniumaufnahme für C. glutamicum und C. e fficiens nach Kultivierung in Stickstofffreiem Minimalmedium. Die Methylammoniumaufnahmeraten [nmol min-1 (mg TG)-1] wurden für drei
verschiedene Methylammoniumkonzentrationen (100, 500, 1000 µM) bestimmt.
Methylammoniumkonzentration [µM]
100
500
1000
C. glutamicum 6,5 ± 0,8
9,3 ± 1,1
11,6 ± 0,4
0,5 ± 0,6
5,0 ± 2,2
6,9 ± 2,3
C. efficiens
Die Ammoniumtransporter aus C. efficiens zeigten sehr viel geringere Aktivität als die
entsprechenden
Transporter
in
C.
glutamicum.
Die
hier
gezeigten
Methylammoniumaufnahmeraten sind ebenfalls niedriger als die bisher in dieser Arbeit für
den C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032 gezeigten Raten. Diese Abweichungen lassen sich
mit den Anzuchtbedingungen, die sich vom standardisiertem Animpfschema der vorher
gezeigten Aufnahmestudien unterscheiden, erklären.
Insgesamt zeigt sich, dass nur in C. glutamicum und C. efficiens, in deren Genom sich zwei
Ammoniumtransportergene finden, Aufnahme von Methylammonium messbar war. Für die
pathogenen Vertreter C. diptheriae und C. jeikeium konnte keine Aufnahme detektiert
werden.
DISKUSSION
101
5 Diskussion
C. glutamicum reagiert mit der Synthese der Transportsysteme AmtA und AmtB auf
Stickstoffmangelbedingungen, um so die Versorgung der Zellen mit der Stickstoffquelle
Ammonium
zu
gewährleisten.
AmtA
und
AmtB
gehören
zur
Familie
der
Amt(Ammoniumtransport-)Proteine, zu denen neben den Vertretern aus Prokaryoten auch
membranständige Proteine aus Pflanzen und Menschen gehören. Diese Proteine garantieren
die Versorgung der Zellen mit Ammonium, wenn die Diffusion des ungeladenen Ammoniaks
über die Membran nicht mehr ausreicht, um Wachstum und Metabolismus der Zellen zu
gewährleisten. Der Mechanismus, mit dem Amt-Proteine die Translokation von Ammonium
über die Membran vermitteln, ist noch unklar. Diskutiert werden zum einen die erleichterte
Diffusion von ungeladenem Ammoniak (NH3) und zum anderen der aktive Transport von
geladenem Ammonium (NH4+). Die Kristallstrukturen von Amt-Homologen aus E. coli und
A. fulgidus zeigten, dass die innere Pore dieser Proteine von hydrophoben Aminosäuren
ausgekleidet wird und somit der Transport von Ammonium energetisch ungünstig wäre
(Khademi et al., 2004; Zheng et al., 2004; Andrade et al., 2005). Die Proteinstrukturen stellen
somit ein starkes Argument für den Transport von Ammoniak durch Amt-Proteine dar.
Computer-gestütze Simulationsstudien des Transportmechanismus von Amt-Proteinen legen
ebenfalls nahe, dass Ammoniak die transportierte Substratform ist (Lin et al., 2005; Liu &
Hu, 2006; Luzkhov et al., 2006; Nygaard et al., 2006; Yang et al., 2007). Jedoch wurde durch
Strukturmodellierungen des Ammoniumtransportproteins LeAMT1;1 aus L. esculentum
(Tomate), für das gezeigt wurde, dass der vermittelte Transport elektrogen ist,
erstaunerlichweise eine hohe Ähnlichkeit zum E. coli-AmtB-Protein festgestellt. Auch
hochkonservierte Reste, die im E. coli-Protein für die Bindung von Ammonium und
anschließenden Transport von Ammoniak diskutiert werden, konnten im Carrierprotein
LeAMT1;1 identifizert werden (Mayer et al., 2006a). Die alleinige Betrachtung von
Kristallstrukturen kann den Mechanismus des Ammoniumtransports demnach nicht
entschlüsseln. Innerhalb dieser Arbeit konnte mit Sequenzvergleichen ebenfalls gezeigt
werden, dass Aminosäuren, die im E. coli-AmtB am Ammonium- bzw. Ammoniak-Transport
beteiligt sind, in AmtA und AmtB ebenfalls zu finden sind. Mit Hilfe von
Aminosäuresequenzvergleichen konnten keine grundlegenden Unterschiede zwischen den
beiden Ammoniumtransportern in C. glutamicum bestimmt werden, die sich in ihrer Aktivität
DISKUSSION
102
jedoch stark unterscheiden. AmtA konnte bereits in früheren Studien als hochaffiner
Ammoniumtransporter beschrieben werden (Siewe et al., 1996; Meier-Wagner et al., 2001).
Die von AmtA transportierte Substratform ist dabei wahrscheinlich Ammonium. Dies legte
der apparente Km-Wert der Methylammoniumaufnahme bei verschiedenen pH-Werten nahe
(Meier-Wagner et al., 2001). AmtB wurde als Permease für Ammonium identifiziert, die
Ammonium,
jedoch
nicht
das
Substratanalog Methylammonium,
das
häufig
für
Aufnahmestudien verwendet wird, transportiert. Die weitere Charakterisierung von AmtA
und AmtB, vor allem vor dem Hintergrund der Diskussion um die von Amt-Homologen
transportierte Substratform, stand im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit.
5.1 Die Rolle von AmtB
Die Bestimmung der Aufnahme des Substratanalogs Methylammonium ist eine gängige
Methode, um damit auf die Aufnahme von Ammonium zu schließen. Es bestanden in unserer
Arbeitsgruppe zunächst verschiedene Protokolle zur Anzucht und Präparation der
C. glutamicum-Zellen für diese Aufnahmeexperimente. Die Standardisierung von Anzucht
der Zellen und Veränderung der Aufbereitung erlaubte erstmals die Bestimmung der
Methylammoniumaufnahme für AmtB. Das Protein zeigte eine niedrige Aufnahme, die auch
bei hohen Substratkonzentrationen (bis 3 mM) nicht sättigbar war. Die Aufnahme war linear
abhängig zu den eingesetzten Substratkonzentrationen. Dieses Aufnahmeverhalten schien
dafür zu sprechen, dass es sich bei AmtB aus C. glutamicum wie beim AmtB-Protein aus
E. coli um einen Ammoniak-Kanal handelt.
Untersuchungen zur treibenden Kraft des AmtB-vermittelten Transports in C. glutamicum
zeigten, dass die Aufnahme des Substrats abhängig vom Membranpotential ist. So reduzierte
die Zugabe der Entkoppler Valinomycin und Nigericin die AmtB-vermittelte Aufnahme
drastisch. Allerdings ist der Einfluss, den das Membranpotential auf die Aufnahmeaktivität
von Amt-Proteinen ausübt, umstritten und eine Aussage über den Transportmechanismus
anhand
der
Membranpotentialabhängigkeit
zu
treffen,
scheint
schwierig.
Methylammoniumaufnahmestudien des E. coli AmtB-Proteins zeigten, dass die Zugabe des
Entkopplers CCCP keine Auswirkungen auf die AmtB-Aktivität hatten. Die Aufnahme war
demnach, wie man es für einen Kanal erwarten würde, unabhängig vom Membranpotential.
(Javelle et al., 2005). Aufgrund struktureller Daten wird für AmtB aus E. coli jedoch
angenommen, dass das Membranpotential an der Rekrutierung von Ammoniumionen beteiligt
DISKUSSION
103
ist. Demnach sorgt das elektrische Feld dafür, dass sich die Ammoniumionen in der
periplasmatischen Bindetasche sammeln. Dort werden die Ionen deprotoniert und schließlich
wird das ungeladene Ammoniak über die Membran geschleust (Khademi et al., 2004). Die
Membranpotentialabhängigkeit des Ammoniumtransports ist demnach kein direktes Indiz für
einen aktiven Transporter, sondern kann auch für einen Kanal zutreffen. Eine genaue
Definition des Aufnahmemechanismus aufgrund der Membranpotentialabhängigkeit des
Transports ist demnach nicht ohne weiteres möglich.
Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der AmtB-Funktionsweise war die Analyse der
Beeinflussung der Aufnahmeaktivität durch Kaliumionen. Aufgrund der Tatsache, dass
Ammonium- und Kaliumionen vergleichbar große Ionenradien haben (Weast, 1966), können
Kaliumkanäle auch Ammonium transportieren (Moroni et al., 1998). Um zu testen, ob
umgekehrt AmtB auch Kaliumionen als Substrat erkennt, und ob daraus Schlüsse auf den
Transportmechanismus gezogen werden können, wurde die Methylammoniumaufnahme mit
verschiedenen externen Kaliumkonzentrationen bestimmt. Es zeigte sich, dass die
Methylammoniumaufnahme tatsächlich mit steigender Kaliumkonzentration sank. Dieses
Phänomen ließ sich allerdings nur beobachten, wenn zusätzlich Natriumionen im Puffer
vorhanden waren. Ohne Natrium ließ sich diese Veränderung der Aufnahme nicht
nachvollziehen. Der gezeigte Effekt lässt sich daher auf einen generellen Effekt der Ionen
zurückführen, mit dem die AmtB-Aktivität verändert wurde. Von Khademi et al. wurde
bereits
angedeutet,
dass
die
Wahrscheinlichkeit,
dass
Amt-Proteine
Kaliumionen
transportieren, aufgrund der strukutreller Gegebenheiten im E. coli-AmtB gering ist (2004).
Inzwischen haben Simulationsstudien, die auf Strukturanalysen des E. coli-AmtB-Proteins
beruhten, gezeigt, dass AmtB K+-Ionen nicht in der Bindetasche stabilisieren und somit auch
nicht transportieren kann (Nygaard et al., 2006). Eine mögliche Kompetition zwischen
Methylammonium und K+-Ionen ist aufgrund dieser Daten eher unwahrscheinlich. Insgesamt
bleibt der Effekt von K+-Ionen auf die Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum unklar.
Im Vergleich zur Aktivität des AmtA-Proteins war der von AmtB-vermittelte Transport
gering. So nimmt AmtA bei einer Konzentration von 500 µM Methylammonium das Substrat
mit einer Rate von 26 nmol min-1(mg TG)-1 auf, während AmtB bei derselben Konzentration
Methylammonium nur mit einer Rate von 2 nmol min-1(mg TG)-1 aufnimmt. Unterschiede
zwischen den beiden Transportern zeigten sich jedoch nicht nur auf Aktivitätsebene, sondern
auch auf Expressionsebene. Die für die Ammoniumtransporter kodierenden Gene stehen unter
DISKUSSION
der
Kontrolle
104
des
globalen
Stickstoffregulators
AmtR,
der
unter
Stickstoffüberschussbedingungen die Expression von amtA und amtB reprimiert. In Folge
einer Signalkaskade wird bei Stickstoffhunger die Repression durch AmtR aufgehoben und
die Gene amtA und amtB werden transkribiert (Jakoby et al, 2000; Nolden et al., 2001a;
Beckers et al., 2005). Die beiden Gene unterstehen den gleichen Kontrollmechanismen,
dennoch wird das Gen amtB im Vergleich zum amtA-Gen schwächer abgelesen. Dieses
Phänomen wurde bereits von Beckers et al. (2005) beobachtet.
In Abhängigkeit zur Stickstoffverfügbarkeit, nämlich bei plötzlichem Stickstoffüberschuss
nach längerem Stickstoffmangel, bindet das Signalprotein GlnK an das AmtB-Protein
(Strösser et al., 2005). In E. coli wurde diese Interaktion ebenfalls nachgewiesen und
zusätzlich wurde gezeigt, dass durch die Interaktion von AmtB mit dem PII-Signalprotein
GlnK die Transportaktivität reduziert wird (Coutts et al., 2002; Javelle et al., 2004). Dies soll
der Zelle den Vorteil bringen, dass bei wieder angestiegener externer Konzentration die
unnötige Aufnahme von Ammonium bzw. Ammoniak durch AmtB gestoppt wird, da die
Diffusion von Ammoniak über die Membran ausreichend für die Zelle ist. Ob in
C. glutamicum die Reduzierung der AmtB-Aktivität durch eine Interaktion mit GlnK
notwendig ist, bleibt fraglich, da es sich bei AmtB um ein schwaches, niedrigexprimiertes
Amt-Homolog handelt. Die dargestellten Ergebnisse legen nahe, dass AmtB ein NH3-Kanal
ist, der nicht die aktive Aufnahme, sondern lediglich die erleichterte Diffusion entlang des
Konzentrationsgradienten zur Aufgabe hat. Das schnelle „Abschalten“ von AmtB wäre
demnach
nicht
erforderlich,
da
die
erleichterte
Diffusion
für
die
Zelle
kein
energieaufwändiger Prozess ist. Ein futile cycling, d. h., den Abbau des Membranpotentials
durch einen zyklischen Prozess der Aufnahme von Ammonium und des Verlustes von
Ammoniak durch Diffusion muss nicht verhindert werden. Allerdings wird AmtB hier nur
nach der Aufnahme von Methylammonium beurteilt. Kompetitionsexperimente mit
Ammonium legten nahe, dass AmtB zwar nur eine niedrige Affinität zu Methylammonium,
aber eine sehr viel höhere Affinität zu Ammonium hat.
5.2 AmtA – Transporter von NH3 oder NH4+?
Die Verfechter des Kanal-Modells für Amt-Homologe stellen die Aufnahme von Ammoniak
oder Methylamin in direkte Beziehung mit der Verstoffwechselung des Substrats durch die
GS. Demnach bedingt die schnelle Metabolisierung innerhalb der Zelle die Aufrechterhaltung
DISKUSSION
105
eines Konzentrationsgradientens an dem entlang das Substrat Amt-vermittelt in die Zelle
gelangt (Soupene et al., 1998; Javelle et al., 2004). Die direkte Verknüpfung der Aufnahme
mit der Verstoffwechselung wird als metabolic trapping bezeichnet. Innerhalb dieser Arbeit
wurde
eine
Deletionsmutante
untersucht,
die
die
Bestimmung
der
Methylammoniumaufnahme unabhängig von der Substratmetabolisierung erlaubte. In dieser
Mutante wurden die für C. glutamicum bekannten Ammonium-assimilierenden Enzyme,
nämlich die beiden Glutaminsynthetasen GS und GlnA2 sowie die GDH, durch Deletion der
entsprechenden Gene ausgeschaltet. Es konnte gezeigt werden, dass Methylammonium
ähnlich wie im Wildtyp in die Zelle aufgenommen wird, jedoch nicht der Verstoffwechselung
unterliegt.
Mit
Hilfe
dieser
Mutante
war
die
Betrachtung
der
Methylammoniumaufnahmeaktivität in C. glutamicum zwar möglich, Aussagen über die
einzelnen Transporter erlaubte diese Mutante jedoch nicht. Daher wurde eine weitere
Deletionsmutante konstruiert, in der neben den Ammonium-assimilierenden Enzymen auch
der Ammoniumtransporter AmtB durch Deletion des entsprechenden Gens ausgeschaltet
wurde. Diese Mutante erlaubte die Untersuchung des Ammoniumtransporters AmtA
unabhängig von Substratmetabolisierung in der Zelle und unabhängig vom zweiten
Transportsystem.
AmtA
membranpotentialabhängiges
wurde
in
bisherigen
Transportsystem
für
Studien
als
(Methyl-)Ammonium
hochaffines,
beschrieben.
Aufnahmestudien bei verschiedenen pH-Werten legten ebenfalls nahe, dass es sich bei AmtA
um einen Transporter des Ammoniumions handelt (Siewe et al., 1996; Meier-Wagner et al.,
2001). Mit Hilfe der innerhalb dieser Arbeit vorgestellten glnA/glnA2/gdh/amtBDeletionsmutante (Mek-1) konnten die bisherigen Erkenntnisse zum AmtA-vermittelten
Transport bestätigt und ergänzt werden. So konnte auch für diese Mutante festgestellt werden,
dass die Methylammoniumaufnahme sehr hoch war. Die Aufnahme von Methylammonium
durch AmtA ist demnach unabhängig von der Zugwirkung der Metabolisierung. Der
Vergleich mit Aufnahmestudien einer amtB-Deletionsmutante zeigte zudem, dass in diesen
Stamm in gleicher Menge Methylammonium aufgenommen wurde wie in den
Deletionsstamm Mek-1. Dies lieferte einen deutlichen Hinweis darauf, dass AmtA ein aktiver
Transporter ist. Desweiteren wurde getestet, ob AmtA Methylammonium in der Zelle
akkumulieren kann. Ein Kanal, dessen Aktivität nur auf dem Substratkonzentrationsgefälle
über der Membran beruht, sollte dazu nicht in der Lage sein. Mit Hilfe einer innerhalb dieser
Arbeit entwickelten Modifizierung der Aufnahmemessung, die die Ermittlung von im
DISKUSSION
106
Medium verbliebener Radioaktivität sowie die in die Zellen aufgenommene Radioaktivität
erlaubte, konnte die Akkumulation bestimmt werden. Bei pH 7,5 kam es zu einer 50.000fachen Anreicherung des Substrats in den Zellen. Dieser außergewöhnlich hohe Wert kann
durch die Kraft des Membranpotentials kaum erklärt werden. Dennoch konnte gezeigt
werden, dass die Akkumulation durch Zugabe von Valinomycin und Nigericin, zwei
Substanzen, die das Membranpotential entkoppeln, gestoppt wird. Es konnte also für die
Akkumulation festgestellt werden, wie zuvor bereits für die AmtA-vermittelte Aufnahme
gezeigt wurde, dass die AmtA-Aktivität vom Membranpotential angetrieben wird.
Erstaunlicherweise war die Substratanreicherung in der Zelle zudem pH-abhängig. Für die
Aufnahme von Methylammonium konnte in früheren Studien gezeigt werden, dass diese
unabhängig vom pH-Wert ist. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde damals postuliert, dass
es sich bei AmtA um einen Transporter von geladenem (Methyl-)Ammonium handelt (MeierWagner et al., 2001). Zusammen mit der Tatsache, dass AmtA Methylammonium in der Zelle
akkumuliert, liegt es demnach nahe, dass es sich bei AmtA um einen aktiven Transporter
handelt.
Innerhalb dieser Arbeit konnte erstmals die Aktivität eines bakteriellen Amt-Homologs ohne
den
Einfluss
der
Substratmetabolisierung
in
der
natürlichen
Membranumgebung
nachgewiesen werden. Wie ausschlaggebend die Membran bzw. das Expressionsystem für die
Analyse Amt-homologer Proteine ist, stellte eine Veröffentlichung diesen Jahres
eindrucksvoll dar. So kamen verschiedene Untersuchungen desselben Proteins in
unterschiedlichen
Expressionsystemen
zu
gegensätzlichen
Schlüssen
bezüglich
des
transportierten Substrats (Javelle et al., 2007). Ein solcher Umweg über ein heterologes
Expressionsystem und dadurch eine mögliche Beeinflussung der AmtA-vermittelten
Aufnahme konnte hier durch die Konstruktion einer C. glutamicum-Deletionsmutante
umgangen werden.
5.3 C. glutamicum und metabolic trapping
Das Modell des metabolic trappings besagt, dass die Aufnahme von Amt-Proteinen
ausschließlich auf der Aktivität der Ammoniummetabolisierung innerhalb der Zelle beruht,
(Soupene et al., 1998; Javelle et al., 2005). Diese Kanäle erleichtern demnach nur die
Diffusion
des
ungeladenem
Ammoniaks
über
die
Membran
entlang
eines
Konzentrationsgradientes, der durch die Aktivität der GS aufrechterhalten wird. Die in dieser
DISKUSSION
107
Arbeit vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei AmtA um einen aktiven
Transporter des Ammoniumions handelt, der das Substrat innerhalb der Zelle akkumulieren
kann. AmtB scheint eher dem E. coli-Modell eines Kanals zu entsprechen. Mit verschiedenen
Methoden konnte gezeigt werden, dass das Modell des metabolic trappings für die AmtAvermittelte Methylammoniumaufnahme in C. glutamicum kaum anzuwenden ist. Für den
zweiten Transporter AmtB kann es jedoch aufgrund der hier erzielten Daten nicht
ausgeschlossen werden.
Es zeigte sich, dass in den Deletionsstamm DA-2, in dem alle bekannten Ammoniumassimilierenden Enzyme fehlen, das Substratanalog Methylammonium mit Wildtyp-ähnlicher
Aktivität aufgenommen, jedoch nicht verstoffwechselt wird. Das Substratanalog unterliegt
jedoch generell der Metabolisierung durch die Ammonium-assimilierenden Enzyme im
Wildtyp (Meier-Wagner et al., 2001). Der Stamm DA-2 zeigte ebenso wie der
glnA/gdh/glnA2/amtB-Deletionsstamm Mek-1 weder GS-Aktivität noch GDH-Aktivität. Auch
die
Aufnahmeaktivität
des
Stammes
Mek-1
war
unabhängig
von
der
Substratverstoffwechselung. Wie bereits erläutert, erlaubte die C. glutamicum-Mutante DA-2
jedoch keine Differenzierung der einzelnen Transportsysteme. Real Time RT PCR-Analysen
zeigten zudem, dass die Expression des amtB-Gens unter Stickstoffmangelbedingungen
niedriger ausfiel als unter denselben Bedingungen im C. glutamicum-Wildtyp. Das Gen amtA
hingegen wurde in der Deletionsmutante ähnlich stark wie im Wildtyp exprimiert. Die für die
Deletionsmutante festgestellte Methylammoniumaufnahmeaktivität spiegelt demnach eher die
AmtA-Aktivität als die Aktivität des AmtB-Transporters wider. An dieser Stelle kann
metabolic
trapping
für
AmtA,
auch
aufgrund
der
Untersuchungsergebnisse
der
glnA/glnA2/gdh/amtB-Deletionsmutante Mek-1, eindeutig ausgeschlossen werden.
Einen weiteren Hinweis darauf, dass das Modell des metabolic trappings für C. glutamicum
kaum anzuwenden ist, lieferten Untersuchungen des glnA2-Deletionsstammes. Die GS war in
diesem Stamm ähnlich aktiv wie im C. glutamicum-Wildtyp (Nolden et al., 2001a). Nach dem
Modell des metabolic trappings sollte demnach auch die Methylammoniumaufnahme mit
vergleichbare Raten zeigen. Jedoch wurden für diesen Stammn sehr viel geringere
Methylammoniumaufnahmeraten als im Wildtyp ermittelt.
DISKUSSION
108
5.4 Einfluss von Metaboliten auf die Methylammoniumaufnahme
Mit Hilfe verschiedener C. glutamicum-Mutanten wurde innerhalb dieser Arbeit untersucht,
ob Metabolite des Stickstoffstoffwechsels zum einen Einfluss auf die Stickstoffkontrolle und
zum anderen Einfluss auf die Aktivität der Ammoniumtransporter haben.
C. glutamicum-Stämme, in denen das für den Repressor AmtR kodierende Gen amtR deletiert
worden war, erlaubten die Untersuchung der Methylammoniumaufnahme in Zellen, die zuvor
keinem Stickstoffmangel unterzogen worden waren. Die Zellen wurden nach Inkubation im
Stickstoff-haltigen Medium, welches ca. 150 mM Ammoniumsulfat enthielt, geerntet und
anschließend gewaschen und für die Messung vorbereitet. Durch die Lagerung der Zellen im
Stickstoff-freien Messpuffer bestand das Risiko, dass das in die Zellen aufgenommene
Ammonium durch Diffusion in Form von Ammoniak die Zelle wieder verlassen könnte.
Untersuchungen in der amtA/amtB-Deletionsmutante legten jedoch nahe, dass im pH-Bereich
7-8 die Diffusion von Methylamin bzw. Ammoniak vernachlässigbar ist (siehe Abschnitt
4.1.3). Desweiteren sollte Ammonium auch nicht der Verstoffwechselung durch die GS
unterliegen, da diese unter Stickstoffüberschussbedingungen in der modifizierten, weniger
aktiven Form vorliegt (Tesch et al., 1999). Es kann daher davon ausgegangen werden, dass
unter den getesteten Bedingungen Ammonium in der Zelle vorlag.
Die Aufnahmestudien ergaben, dass der amtR-Deletionsstamm auch unter diesen
Bedingungen in geringem Maße Methylammonium in die Zellen aufnahm. C. glutamicumStämme,
in
denen
neben
Ammoniumtransportergene
dem
deletiert
amtR-Gen
worden
eines
waren,
der
zeigten
beiden
nur
oder
beide
sehr
wenig
Aufnahmeaktivität. Nach Inkubation in Stickstoff-freiem Mangelmedium stiegen die
Aufnahmeraten in allen Stämmen an und zeigten Aufnahmeraten, die mit denen der amtA-und
amtB-Einzeldeletionsmutanten sowie mit denen des Wildtyps durchaus vergleichbar waren.
Obwohl davon ausgegangen werden kann, dass die Ammoniumtransportergene unter beiden
getesteten Stickstoffbedingungen gleichermaßen exprimiert wurden, zeigten sie nach
Inkubation im Stickstoff-haltigen Medium geringere Aktvität als nach der Inkubation im
Stickstoff-freien Minimalmedium. In der Zelle vorhandenes Ammonium scheint eine
Inhibition auf die Transporter auszuüben, so dass die mit ihrem eigentlichen Substrat
gesättigten Zellen das Substratanalog Methylammonium nicht aufnehmen. Eine Kompetition
von Methylammonium und Ammonium, welches aus der Zelle in Form von Ammoniak
diffundiert ist, ist dabei unwahrscheinlich. Zum einen ist die Diffusion unter den gewählten
DISKUSSION
109
Versuchsbedingungen vernachlässigbar, und zum anderen ist das Außenvolumen ca. 300 mal
größer als das Innenvolumen, so dass die Menge des internen Ammoniums im Vergleich zum
eingesetzten Methylammonium verschwindend gering wäre.
Neben den Effekten, die Ammonium auf AmtA und AmtB ausübt, wurden auch mögliche
Einflüsse der Metabolite Glutamin und Glutamat auf die Aufnahmeaktivität untersucht. Das
Signal über den C. glutamicum Stickstoffmangel wahrnimmt und in der Folge die Repression
Stickstoff-relevanter
Gene
durch
AmtR
beendet,
um
effiziente
Aufnahme-,
Assimilationssysteme und Signalwege zu bereitzustellen, ist unbekannt. Von Müller et al.
vorgestellte Studien legen nahe, dass Glutamin und Glutamat als Stickstoffmangelsignal im
C. glutamicum-Wildtyp nicht in Frage kommen (2006a). Die Daten deuteten eher an, dass
α-Ketoglutarat und Ammonium die Signalmetabolite für Stickstoffmangel in C. glutamicum
sind. Entscheidend war dabei auch nicht die externe Menge von Ammonium, sondern die
Ammoniumkonzentration innerhalb der Zelle. Der Einfluss des internen Ammoniums auf die
Aktvität der Ammoniumtransporter wurde hier bereits dargestellt. Innerhalb dieser Arbeit
wurden die Synthese und Aktivität von AmtA und AmtB in direktem Zusammenhang mit den
internen Konzentrationen von Glutamin und Glutamat untersucht. Bei der Gegenüberstellung
der Ergebnisse für die Stämme LN∆GS (∆glnA), LN∆GDH (∆gdh), LNGLNA2 (∆glnA2),
TM∆gdh∆glnA (∆gdh/∆glnA), DA-1 (∆glnA/∆glnA2), DA-2 (∆glnA/∆glnA2/∆gdh) und
Mek-1 (∆glnA/∆glnA2/∆gdh/∆amtB) ließ sich kein klares Muster erkennen. Eine im
Vergleich zum Wildtyp erniedrigte interne Glutamatkonzentration ging mit Wildtypähnlichen Aufnahmeraten einher. Dies war der Fall für die Stämme LN∆GDH,
TM∆gdh∆glnA, DA-2 und Mek-1. Interessanterweise war in diesen Stämmen die Repression
der AmtR-regulierten Gene unter Stickstoffüberschussbedingen gestört, d. h., die
Stickstoffkontrolle war nicht mehr intakt. In Stämmen, in denen die Bestimmung der internen
Glutamatkonzentration
ähnliche
Werte
wie
im
Wildtyp
lieferte,
war
die
Methylammoniumaufnahme im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt. Dies wurde für die
Deletionsstämme LN∆GS und DA-1 beobachtet. Die interne Konzentration von Glutamin
schien
hingegen
wenig
Einfluss
auf
die
Stickstoffkontrolle
und
Aktivität
des
Methylammoniumtransports haben. Dies zeigte der Vergleich des Stammes LN∆GS, für den
aufgrund des Fehlens der GS die festgestellte Konzentration des Metabolites gering war, mit
dem Stamm LNGLNA2, für den eine erhöhte Konzentration von Glutamin gemessen wurde.
Obwohl sich die Konzentration von Glutamin zwischen den Stämmen sehr unterschied,
DISKUSSION
110
zeigten beide Stämme nur eine sehr geringe Methylammoniumaufnahme. Demnach übt
Glutamin keinen Einfluss auf die Aktivität der Transporter AmtA und AmtB aus. In den
beiden untersuchten Stämmen ist auch die Stickstoffkontrolle vollständig. Die Expression von
amtA
und
amtB
wurde
bei
guter
Stickstoffversorgung
reprimiert
und
unter
Stickstoffmangelbedingungen kam es zur Derepression.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kein Effekt des internen Glutamins auf die
Stickstoffkontrolle oder die Aktivität von AmtA und AmtB beobachtet werden konnte.
Ebenso
konnte
kein
Glutamat-abhängiges
Regulationsmuster
für
die
Ammoniumtransporteraktivität identifiziert werden. Allerdings wurde beobachtet, dass in
C. glutamicum-Stämmen, in denen die Glutamat-Konzentration im Vergleich zum Wildtyp
niedriger ist, dies mit der Deregulation der Stickstoffkontrolle einhergeht. Desweiteren legten
Studien mit dem eigentlichen Transportersubstrat nahe, dass internes Ammonium die
Aufnahme von Methylammonium durch AmtA und AmtB verringert.
5.5 Interaktion der Ammoniumtransporter
mit
Komponenten der
Stickstoffkontrolle
Für einen der Ammoniumtransporter aus C. glutamicum, nämlich AmtB, konnte die
Interaktion mit dem PII-Signalprotein GlnK bereits nachgewiesen werden (Strösser et al.,
2005). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob einer der Ammoniumtransporter noch mit einer
anderen Komponente der Stickstoffkontrolle interagiert. Untersuchungen mit dem
BacterioMatch II Two Hybrid-System deuteten auf eine Interaktion von AmtA mit GS und
auf eine Interaktion von AmtA mit GlnE hin. Der zweite Transporter AmtB zeigte keinerlei
Interaktionen.
Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente kann die Interaktion
zwischen GS und AmtA nicht weiter definiert werden, eine Verbindung zwischen diesen
Proteinen, wie es das Modell des metabolic trappings fordert, ist jedoch auszuschließen.
Mit Hilfe des BacterioMatch II Two Hybrid-Systems wurden Hinweise auf eine weitere
Interaktion des AmtA-Proteins gefunden. Auch in diesem Falle sollten weitere
Untersuchungen zeigen, ob sich die Wechselwirkung von AmtA mit GlnE bestätigen lässt.
Dazu wurde die glnE-Deletionsmutante LNGLNE bezüglich der Stickstoffkontrolle und
Methylammoniumaufnahmeaktivität analysiert. Untersuchungen des Expressionsmusters
Stickstoff-regulierter
Gene
in
der
glnE-Deletionsmutante
zeigten,
dass
unter
DISKUSSION
111
Stickstoffüberschussbedingungen die Repression durch AmtR weniger stringent ist als im
Wildtyp. Auch auf Proteinebene konnte nachgewiesen werden, dass die AmtR-Repression
unter Stickstoffüberschuss dereguliert ist. Eine direkte Interaktion zwischen AmtR und GlnE,
die eventuell Einfluss auf die Repressionstringenz ausübt, konnte von J. Strösser mit Hilfe
von Pull Down-Experimenten nicht detektiert werden (2005). GlnE übt nicht nur Einfluss auf
die Expression Stickstoff-regulierter Gene aus, sondern beeinflusst Proteine auch auf
Aktivitätsebene. So ist die Methylammoniumaufnahme im glnE-Deletionsstamm LNGLNE
im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt, d. h., dass GlnE direkt oder indirekt die Aktivität der
Methylammoniumtransporter im C. glutamicum-Wildtyp steigert. Es konnte bereits gezeigt
werden, dass GlnE den Stickstoffstatus der Zelle unabhängig von GlnK und GlnD wahrnimmt
und die GS-Aktivität durch Adenylylierung bzw. Deadenylylierung dementsprechend
moduliert (Strösser, 2005). Diese Beobachtungen entsprechen Untersuchungergebnissen aus
Streptomyces coelicolor, die zeigten, dass die Regulation der GS ebenfalls unabhängig von
GlnD und GlnK ist (Hesketh et al., 2002). Das Protein GlnE scheint innerhalb der
Stickstoffkontrolle in C. glutamicum eine größere Rolle zu spielen als bisher angenommen.
5.6 Stickstoffkontrolle in Corynebakterien
In den Corynebakterien C. diphtheriae, C. efficiens und C. jeikeium wurden Analysen von
Komponenten des Stickstoffmetabolismus, die in C. glutamicum hinlänglich beschrieben sind,
durchgeführt (Walter et al., 2007). Dabei zeigte sich, dass die bodenlebenden
Corynebakterien C. efficiens und C. glutamicum über ein größeres Repertoire an Genen
verfügen, deren Produkte die Aufnahme oder Assimilation von Stickstoffquellen vermitteln.
So konnte C. efficiens zwar in geringerer Menge als C. glutamicum, aber als einziger der drei
getesteten Corynebakterien, Methylammonium aufnehmen. Die pathogenen Vertreter
C. diphtheriae und C. jeikeium zeichneten sich dadurch aus, dass weniger Gene des
Stickstoffmetabolismus in den Genomen gefunden wurden. In C. diphtheriae konnte zwar ein
Ammoniumtransportergen identifiziert werden, dessen Leseraster allerdings durch mehrere
Stopcodons unterbrochen ist. Ewartungsgemäß zeigte dieses Bakterium auch keine
Methylammoniumaufnahme. In C. jeikeium wurde ein Ammoniumtransportergen identifiziert,
welches auch exprimiert wurde. Die Expression schien jedoch nicht auszureichen, um genug
aktives Protein herzustellen oder der Transporter erkannte Methylammonium nicht als
Substrat, da für C. jeikeium kein Methylammoniumtransport festgestellt wurde. Der Verlust
DISKUSSION
112
von Genen in pathogenen Vertretern im Vergleich zu nicht-pathogenen Vertretern konnte
auch in der Gattung Mykobakterien nachgewiesen werden. So finden sich in Mycobacterium
leprae sehr viel weniger Gene als im nicht-pathogenen Mycobacterium smegmatis (Cole et
al., 2001; Vissa & Brennan, 2001).
ANHANG
113
6 Anhang
6.1 Autoregulation des globalen Stickstoffregulators AmtR
AmtR ist der globale Regulator der Stickstoffkontrolle in C. glutamicum und reguliert die
Transkription
von
mindestens
36
Genen,
deren
Expression
unter
Stickstoffüberschussbedingungen durch AmtR reprimiert wird (Beckers et al., 2005). Im Falle
einer Stickstoffmangelsituation kommt es zu einer Interaktion von AmtR mit dem
Signalprotein GlnK und die Repression durch AmtR wird aufgehoben. Zu den AmtRregulierten Genen gehören unter anderem die Ammoniumtransportergene amtA und amtB,
sowie Gene, deren Produkte an der Assimilation von Ammonium beteiligt sind, wie glnA und
gltBD. Außerdem kontrolliert AmtR die Expression der Signaltransduktionsproteingene glnK
und glnD. Bisher ist jedoch unbekannt, ob auch AmtR einer Regulation unterliegt. Auf der
Suche nach AmtR-Bindemotiven im C. glutamicum-Genom wurde auch vor dem amtR-Gen
selbst eine AmtR-Bindestelle gefunden (Beckers et al., 2005). Mit Real Time RT PCRExperimenten wurde innerhalb dieser Arbeit untersucht, ob AmtR durch sich selbst reguliert
wird, also eine Autoregulation vorliegt. Gesamt-RNA wurde dafür aus C. glutamicumWildtyp-Zellen gewonnen, die unter Stickstoffüberschuss- und Stickstoffmangelbedingungen
geerntet wurden. Mittels Real Time RT PCR wurde dann die Expression des amtR-Gens im
C. glutamicum-Wildtyp unter diesen Stickstoffbedingungen untersucht. Diese Untersuchung
wurde in einer Dreifachbestimmung vorgenommen und die amtR-Expression unter
Stickstoffüberschussbedingungen
gleich
1
gesetzt.
Stickstoffmangelbedingungen wurde dazu in Beziehung gesetzt.
Die
Expression
unter
ANHANG
114
relative fold expression
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Abb. 6.1: Expression des amtR-Gens im C. glutamicum-Wildtyp ATCC 13032. Die amtR-Expression wurde
unter Stickstoffüberschuss- (■) sowie unter Stickstoffmangelbedingungen (□) bestimmt. Die Expression ist als
relative fold expression angegeben. Das Experiment wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt.
Da
kaum
ein
Unterschied
zwischen
der
Expression
des
amtR-Gens
unter
Stickstoffüberschuss- und Stickstoffmangelbedingungen bestand, kann geschlussfolgert
werden, dass AmtR keiner Autoregulation unterliegt.
ANHANG
115
6.2 Plasmidkonstruktionen
Im folgenden sind die Konstruktionen der in Tabelle 2.2 aufgelisteten Plasmide beschrieben.
Die Bezeichnung der Plasmide ist in Klammern gesetzt. Wenn nicht anders angegeben, diente
für die PCR-Amplifikation chromosomale DNA von C. glutamicum als template. Die
fettgedruckten Basen stehen für die jeweilige Schnittstelle im forward oder reverse Primer.
pTRGamtA
Mit den Oligonukleotiden 5`-GCG CGC GAA TTC ACA TGG ACC CCT CAG ATT TAG3´ und 5´-GCG CGC ACT AGT TGT AGG TTG CGG TCA TTT TGA-3` wurde das
vollständige amtA-Gen über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI geschnitten und in EcoRI
und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid pTRG-Vektor in frame
stromabwärts des RNA-Polymerase α-Gens ligiert (pTRGamtA).
pTRGamtAoCterm
Mit den Oligonukleotiden 5´-GCG CGC GAA TTC ACA TGG ACC CCT CAG ATT TAG3´ und 5´-GCG CGC ACT AGT GCG GTC AAT GCC TTC ATA TT-3` wurde das um
162 bp verkürzte amtA-Gen über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI geschnitten und in
den EcoRI und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid pTRG-Vektor in
frame stromabwärts des RNA-Polymerase α-Gens ligiert (pTRGamtAoCterm).
pTRGamtACterm
Mit den Oligonukleotiden 5´-GCG CGC GAA TTC CAT GGA ATA TGA AAG GCA TTG
AC-3´ und 5´-GCG CGC ACT AGT TGT AGG TTG CGG TCA TTT TGA-3` wurde das
190 bp grosse Stück des 3´-Endes des amtA-Gens über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI
geschnitten und in den EcoRI und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid
pTRG-Vektor
in
(pTRGamtACterm).
frame
stromabwärts
des
RNA-Polymerase
α-Gens
ligiert
ANHANG
116
pTRGamtB
Mit den Oligonukleotiden 5´-GCG CGC GAA TTC AGG CAC TCC TTG AAC TCA TG-3´
und 5´-GCG CGC ACT AGT GAC AAT TGC GGT GAT GAG TTT-3´ wurde das
vollständige amtB-Gen über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI geschnitten und in EcoRI
und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid pTRG-Vektor in frame
stromabwärts des RNA-Polymerase α-Gens ligiert (pTRGamtB).
pTRGamtBoCterm
Mit den Oligonukleotiden 5´-GCG CGC GAA TTC AGG CAC TCC TTG AAC TCA TG-3´
und 5´-GCG CGC ACT AGT GCG CAG TAA TCA CAC CTG C-3` wurde das um 77 bp
verkürzte amtB-Gen über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI geschnitten und in den EcoRI
und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid pTRG-Vektor in frame
stromabwärts des RNA-Polymerase α-Gens ligiert (pTRGamtBoCterm).
pTRGamtBCterm
Mit den Oligonukleotiden 5´-GCG CGC GAA TTC ACA TGC TGC GCT CAT CGC A-3´
und 5´-GCG CGC ACT AGT GAC AAT TGC GGT GAT GAG TTT-3´ wurde die 139 bp
grosse Stück des 3´-Endes des amtB-Gens über PCR amplifiziert, mit EcoRI und SpeI
geschnitten und in den EcoRI und SpeI geschnittenen und dephosphorylierten Two Hybrid
pTRG-Vektor
in
(pTRGamtBCterm).
frame
stromabwärts
des
RNA-Polymerase
α-Gens
ligiert
ANHANG
117
6.3 Stammkonstruktionen
BW1.3
Der ∆amtA/∆amtR-Deletionsstamm BW1.3 wurde durch Elektroporation von MJ2-38
(∆amtA) mit dem Plasmid pK18∆amtR (Jakoby et al., 2000) und nachfolgende Selektion auf
Rekombinanten nach den Methoden von Schäfer et al. (1994) konstruiert. Klone mit amtRDeletion wurden über PCR identifiziert.
BW3.12
Der ∆amtB/∆amtR-Deletionsstamm BW3.12 wurde durch Elektroporation von LN-1.1
(∆amtB) mit dem Plasmid pK18∆amtR (Jakoby et al., 2000) und nachfolgende Selektion auf
Rekombinanten nach den Methoden von Schäfer et al. (1994) konstruiert. Klone mit amtRDeletion wurden über PCR identifiziert.
BW2.6
Der ∆amtA/∆amtB/∆amtR-Deletionsstamm BW2.6 wurde durch Elektroporation von JS-1
(∆amtA∆amtB) mit dem Plasmid pK18∆amtR (Jakoby et al., 2000) und nachfolgende
Selektion auf Rekombinanten nach den Methoden von Schäfer et al. (1994) konstruiert. Klone
mit amtR-Deletion wurden über PCR identifiziert.
Mek-1
Der ∆glnA/∆glnA2/∆gdh/∆amtB–Deletionsstamm Mek-1 wurde durch Elektroporation von
DA-2 (∆glnA/∆glnA2/∆gdh) mit dem Plasmid pK18∆amtB (Nolden, 2001) und nachfolgende
Selektion auf Rekombinanten nach den Methoden von Schäfer et al. (1994) konstruiert. Klone
mit amtB-Deletion wurden über PCR identifiziert.
LITERATURVERZEICHNIS
118
Literaturverzeichnis
Abe, S., Takayama, K. & Kinoshita, S. (1967). Taxonomical studies on glutamic acidproducing bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol. 13, 279-301.
Andrade, S. L., Dickmanns, A., Ficner, R. & Einsle, O. (2005). Crystal structure of the
archaeal ammonium transporter Amt-1 from Archaeoglobus fulgidus. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 102, 14994-14999.
Ansorge, D. (2005). Funktion und Regulation von GSI-α und GSI-β in Corynebacterium
glutamicum. Diplomarbeit, Universität zu Köln.
Atkinson, M. R. & Ninfa, A. J. (1998). Role of the GlnK signal transduction protein in the
regulation of nitrogen assimilation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 29, 431-447.
Bakhou, N., Bejelloun, F., Hulin, P., Brouillard, F., Edelman, A., Cherif-Zahar, B. &
Planelles, G. (2004). NH3 is involved in the NH4+ transport induced by the functional
expression of the human RhC glycoprotein. J. Biol. Chem. 279, 15975-15983.
Beckers, G., Nolden, L. & Burkovski, A. (2001). Glutamate synthase of Corynebacterium
glutamicum is not essential for glutamate synthesis and is regulated by the nitrogen status.
Microbiology 147, 2961-2970.
Beckers, G., Bendt, A. K., Krämer, R. & Burkovski, A. (2004). Molecular identification of
the urea uptake system and transcriptional analysis of urea transporter- and urease-encoding
genes in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 186, 7645-7652.
Beckers, G., Strösser, J., Hildebrandt, U., Kalinowski, J., Farwick, M., Krämer, R. &
Burkovski, A. (2005). Regulation of AmtR-controlled gene expression in Corynebacterium
glutamicum: mechanism and characterization of the AmtR-regulon. Mol. Microbiol. 58,
580-595.
LITERATURVERZEICHNIS
119
Bendt, A. K., Beckers, G., Silberbach, M., Wittmann, A. & Burkovski, A. (2004).
Utilization of creatinine as an alternative nitrogen source in Corynebacterium glutamicum.
Arch. Microbiol. 181, 443-450.
Benjelloun, F., Bakouh, N., Fritsch, J., Hulin, P., Lipecka, J., Edelman, A., Planelles, G.,
Thomas, S. R. & Chefir-Zahar, B. (2005). Expression of the human erythroid Rh
glycoprotein (RhAG) enhances both NH3 and NH4+ transport in HeLa cells. Pflügers Arch.
450, 155-167.
Bostick, D. L. & Brooks, C. L. III (2007). Deprotonation by dehydration: the origin of
ammonium sensing in the AmtB channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 9260-9255.
Burkovski, A. (2003a). I do it my way: regulation of ammonium uptake and ammonium
assimilation in Corynebacterium glutamicum. Arch. Microbiol. 179, 83-88.
Burkovski, A. (2003b). Ammonium assimilation and nitrogen control in Corynebacterium
glutamicum and its relatives: an example for new regulatory mechanisms in actinomycetes.
FEMS Microbiol. Rev. 27, 617-628.
Burkovski,
A.
(2005).
Nitrogen
metabolism
and
its
regulation.
Handbook
of
Corynebacterium glutamicum (Herausgeber: Bott, M. & Eggeling, L.) CRC Press LLC, Boca
Raton, FL.
Cerdeno-Tarraga, A. M., Efstratiou, A., Dover, L. G., Holden, M. T. G., Pallen, M.,
Bentley, S. D., Besra, G. S., Churcher, C., James, K. D., De Zoysa, A., Chillingworth, T.,
Cronin, A., Dowd, L., Feltwell, T., Hamlin, N., Holroyd, S., Jagels, K., Moule, S., Quail,
M. A., Rabbinowitch, E., Rutherford, K. M., Thomson, N. R., Unwin, L., Whitehead, S.,
Barrell, B. G. & Parkhill, J. (2003). The complete genome sequence of Corynebacterium
diphtheriae NCTC13129. Nucleic Acids Res. 31, 6516-6523.
Coutts, G., Thomas, G., Blakey, D. & Merrick, M. (2002). Membrane sequestration of the
signal transduction protein GlnK by the ammonium transporter AmtB. EMBO J. 21, 536-545.
LITERATURVERZEICHNIS
120
Dominguez, H., Rollin, C., Guyonvarch, A., Guerquin-Kern, J. L., Cocaign-Bousquet,
M. & Lindley, N. D. (1998). Carbon flux distribution in the central metabolic pathways of
Corynebacterium glutamicum during growth on fructose. Eur. J. Biochem. 254, 96-102.
Dulley, J. R. & Grieve, P. A. (1975). A simple technique for eliminating interference by
detergents in the Lowry method of protein determination. Anal. Biochem. 64, 136-141.
Eikmanns, B. J., Kleinertz, E., Liebl, W. & Sahm, H. (1991). A family of Corynebacterium
glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and
promoter probing. Gene 102, 93-98.
Fudou, R., Jojima, Y., Seto, A., Yamada, K., Rimura, E., Nakamatsu, T., Hirashi, A. &
Yamanaka, S. (2002). Corynebacterium efficiens sp. nov., a glutamic-acid-producing species
from soil and plant material. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1127-1131.
Grant, S. G. N., Jessee, J., Bloom, F. R. & Hanahan, D. (1990). Differential plasmid rescue
from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4645-4649.
Hauser, D., Popoff, M. R., Kiredijan, M., Boquet, P. & Bimet, F. (1993). Polymerase
chain reaction assay for diagnosis of potentially toxinogenic Corynebacterium diphtheriae
strains: correlation with ADP-ribosylation activity assay. J. Clin. Microbiol. 31, 2720-2723.
Hesketh, A., Fink, D., Gust, B., Rexer, H. U., Scheel, B., Chater, K., Wohlleben, W. &
Engels, A. (2002). The GlnD and GlnK homologues of Streptomyces coelicolor A3(2) are
functionally dissimilar to their nitrogen regulatory system counterparts from enteric bacteria.
Mol. Microbiol. 46, 319-330.
Howitt, S. & Udvardi, M. (2000). Structure, function and regulation of ammonium
transporters in plants. Biochim. Biophys. Acta 1465, 152-170.
LITERATURVERZEICHNIS
121
Huang, C. H. & Peng, J. (2005). Evolutionary conservation and diversification of Rh family
genes and proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15512–15517.
Ikeda, M. & Nakagawa, S. (2003). The Corynebacterium glutamicum genome: features and
impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 99-109.
Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.
Jakoby, M. (1998). Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur
Stickstoffkontrolle in Corynebacterium glutamicum. Dissertation, Universität zu Köln.
Jakoby, M., Krämer, R. & Burkovski, A. (1999). Nitrogen regulation in Corynebacterium
glutamicum: isolation of genes involved and biochemical characterization of corresponding
proteins. FEMS Microbiol. Lett. 173, 303-310.
Jakoby, M., Nolden, L., Meier-Wagner, J., Krämer, R. & Burkovski, A. (2000). AmtR, a
global repressor in the nitrogen regulation system of Corynebacterium glutamicum.
Mol. Microbiol. 37, 964-977.
Javelle, A., Severi, E., Thornton, J. & Merrick, M. (2004). Ammonium sensing in
Escherichia coli. Role of the ammonium transporter AmtB and AmtB-GlnK complex
formation. J. Biol. Chem. 279, 8530-8538.
Javelle, A., Thomas, G., Marini, A. M., Krämer, R. & Merrick, M. (2005). In vivo
functional characterisation of the E. coli ammonium channel AmtB: evidence for metabolic
coupling of AmtB to glutamine synthetase. Biochem. J. 390, 215-222.
Javelle, A., Lupo, D., Zheng, L., Li, X.-D., Winkler, F. K. & Merrick, M. (2006). A
unusual twin-His arrangement in the pore of ammonia channels is essential for substrate
conductance. J. Biol. Chem. 281, 39492-39498.
LITERATURVERZEICHNIS
122
Jayakumar, A., Epstein, W. & Barnes, E. M. Jr. (1985). Characterization of ammonium
(methylammonium)/potassium antiport in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 260, 7528-7532.
Jayakumar, A., Hong, J. S. & Barnes, E. M. Jr. (1987). Feedback inhibition of ammonium
(methylammonium) ion transport in Escherichia coli by glutamine and glutamine analogs.
J. Bacteriol. 169, 553-557.
Jiang, P., Peliska, J. A. & Ninfa, A. J. (1998a). Enzymological characterization of the
signal-transducing
uridylyltransferase/uridylyl-removing
enzyme
(EC
2.7.7.59)
of
Escherichia coli and its interaction with the PII protein. Biochemistry 37, 12782-12794.
Jiang, P., Peliska, J. A. & Ninfa, A. J. (1998b). Reconstitution of the signal-transduction
bicyclic cascade responsible for the regulation of Ntr gene transcription in Escherichia coli.
Biochemistry 37, 12795-12801.
Jiang, P., Peliska, J. A. & Ninfa, A. J. (1998c). The regulation of Escherichia coli glutamine
synthetase revisited: role of 2-ketoglutarate in the regulation of glutamine synthetase
adenylylation state. Biochemistry 37, 12802-12810.
Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N.,
Eggeling, L., Eikmanns, B. J., Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M.,
Huthmacher, K., Krämer, R., Linke, B., McHardy, A. C., Meyer, F., Möckel, B.,
Pfefferle, W., Pühler, A., Rey, D., Rückert, C., Rupp, O., Sahm, H., Wendisch, V. F.,
Wiegräbe, I. & Tauch, A. (2003). The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and
vitamins. J. Biotechnol. 104, 5-25.
Kamberov, E. S., Atkinson, M. R. & Ninfa, A. J. (1995). The Escherichia coli PII signal
transduction protein is activated upon binding of 2-ketoglutarate and ATP. J. Biol. Chem.
270, 17797-17807.
LITERATURVERZEICHNIS
123
Keilhauer, C., Eggeling, L. & Sahm, H. (1993). Isoleucine synthesis in Corynebacterium
glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603.
Khademi, S., O´Connell, J. 3rd, Remis, J., Robles-Colmenares, Y., Miercke, L. J. &
Stroud, R. M. (2004). Mechanism of ammonia transport by Amt/MEP/Rh: structure of AmtB
at 1.35 A. Science 305, 1587-1594.
Kiefer, P., Heinzle, E., Zelder, O. & Wittmann, C. (2004). Comparative metabolic flux
analysis of lysine-producing Corynebacterium glutamicum cultered on glucose or fructose.
Appl. Environ. Microbiol. 70, 229-239.
Kinoshita, S., Udaka, S. & Shimono, M. (1957). Studies on the amino acid fermentation,
Part I. Production of L-glutamic acid by various microorganism. J. Gen. Appl. Microbiol.
3, 193-205.
Kleiner, D. & Castorph, H. (1982). Inhibition of ammonium (methylammonium) transport
in Klebsiella pneumoniae by glutamine and glutamine analogues. FEBS Lett. 146, 201-203.
Kleiner, D. (1985). Bacterial ammonium transport. FEMS Microbiol. Rev. 32, 87-100.
Krömer, J. O., Sorgenfrei, O., Klopprogge, K., Heinzle, E. & Wittmann, C. (2004). Indepth profiling of lysine-producing Corynebacterium glutamicum by combined analysis of the
transcriptome, metabolome and fluxome. J. Bacteriol. 186, 1769-1784.
Kronemeyer, W., Peekhaus, N., Krämer, R., Sahm, H. & Eggeling, L. (1995). Structure of
the gluABCD cluster encoding the glutamate uptake system of Corynebacterium glutamicum.
J. Bacteriol. 177, 1152-1158.
Kustu, S. & Inwood, W. (2006). Biological gas channels for NH3 and CO2: evidence that
Rh (Rhesus) proteins are CO2 channels. Transfus. Clin. Biol. 13, 103-110.
LITERATURVERZEICHNIS
124
Lehmann, K. B. & Neumann, R. (1896). Atlas und Grundriss der Bakteriologie und
Lehrbuch der speciellen bakteriologischen Diagnostik (Erstausgabe). J. F. Lehmann,
München.
Leuchtenberger, W., Huthmacher, K. & Drauz, K. (2005). Biotechnical production of
amino acids and derivates: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69, 1-8.
Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. & Schleifer, K. (1989). High efficiency
electroporation of intact Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol. Lett. 65, 45-54.
Liu, Y. & Hu, X. (2006). Molecular determinants for binding of ammonium ion in the
ammonia transporter AmtB - A quantum chemical analysis. J. Phys. Chem. A. Mol.
Spectrosc. Kinet. Environ. Gen. Theory 110, 1375-1381.
Ludewig, U. (2004). Electroneutral ammonium transport by basolateral rhesus B
glycoprotein. J. Physiol. 559, 751-759.
Ludewig, U. (2006). Ion transport versus gas conduction: function of AMT/Rh-type proteins.
Transfus. Clin. Biol. 13, 111-116.
Ludewig, U., Neuhäuser, B. & Dynowski, M. (2007). Molecular mechanisms of ammonium
transport and accumulation in plants. 581, 2301-2308.
Ludewig, U., von Wirén, N., Rentsch, D. & Frommer, W. B. (2001). Rhesus factors and
ammonium: a function in efflux? Genome Biol. 2, 1010.1-1010.5
Ludewig, U., von Wirén, N. & Frommer, W. B. (2002). Uniport of NH4+ by the root hair
plasma membrane ammonium transporter LeAMT1;1. J. Biol. Chem. 277, 13548-13555.
Ludewig, U., Wilken, S., Wu, B., Jost, W., Obrdlik, P., El Bakkoury, M., Marini, A. M.,
Andre, B., Hamacher, T., Boles, E., von Wirén, N. & Frommer, W. B. (2003). Homo- and
hetero-oligomerization of AMT1;1 NH4+-uniporters. J. Biol. Chem. 278, 45603-45610.
LITERATURVERZEICHNIS
125
Ludewig, U., Neuhäuser, B. & Dynowski, M. (2007). Molecular mechanisms of ammonium
transport and accumulation in plants. FEBS Lett. 581, 2301-2308.
Mak, D. O., Dang B., Weiner, I. D., Foskett, J. K. & Westhoff, C. M. (2006).
Characterization of ammonia transport by the kidney Rh glycoproteins RhBG and RhCG.
Am. J. Renal. Physiol. 290, F297-F305.
Marini, A. M. & André, B. (2000). In vivo N-glycosylation of the Mep2 high-affinity
ammonium transporter of Saccharomyces cerevisiae reveals an extracytosolic N-terminus.
Mol. Microbiol. 38, 552-564.
Marini, A. M., Matasse, G., Raynal, V., André, B., Cartron, J.-P. & Chérif-Zahar, B.
(2000). The human Rhesus-blood-group associated RhAG protein and a novel kidney
homologue promote ammonium transport in yeast. Nature Genet. 26, 341-344.
Mayer, M. & Ludewig, U. (2006). Role of AMT1;1 in NH4+ acquisition in Arabidopsis
thaliana. Plant Biol. 8, 522-528.
Mayer, M., Dynowski, M. & Ludewig, U. (2006a). Ammonium ion transport by the
AMT/Rh homologue LeAMT1;1. Biochem. J. 396, 431-437.
Mayer, M., Schaaf, G., Mouro, I., Lopez, C., Colin, Y., Neumann, P., Cartron, J. P. &
Ludewig, U. (2006b). Different transport mechanisms in plant and human AMT/Rh-type
ammonium transporters. J. Gen. Physiol. 127, 133-144.
Meers, J. L. & Tempest, D. W. (1970). Regulation of glutamine synthetase synthesis in
some gram-negative bacteria. Biochem. J. 119, 603-605.
Meier-Wagner, J., Nolden, L., Jakoby, M., Siewe, R., Krämer, R. & Burkovski, A.
(2001). Multiplicity of ammonium uptake systems in Corynebacterium glutamicum: Role of
Amt and AmtB. Microbiology 147, 135-143.
LITERATURVERZEICHNIS
126
Meier-Wagner, J. (2000). Mechanismen und Regulation der (Methyl-)Ammoniumaufnahme
in Corynebacterium glutamicum. Dissertation, Universität zu Köln.
Merkens, H., Beckers, G., Wirtz, A. & Burkovski, A. (2005). Vanillate metabolism in
Corynebacterium glutamicum. Curr. Microbiol. 51, 59-65.
Merrick, M. J. & Edwards, R. A. (1995). Nitrogen control in bacteria. Microbiol. Rev.
59, 604-622.
Moroni, A., Bardella, A. & Thiel, G. (1998). The impermeant ion methylammonium blocks
K+ and NH4+ currents through KAT1 channel differently: evidence for ion interaction in
channel permeation. J. Membr. Biol. 163, 25-35.
Müller, T. (2005). Regulation of glutamate dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum
and its impact on nitrogen control. Dissertation, Universität zu Köln.
Müller, T., Strösser, J., Buchinger, S., Nolden, L., Wirtz, A., Krämer, R. & Burkovski,
A. (2006a). Mutation-induced metabolite pool alterations in Corynebacrterium glutamicum:
Towards the identification of nitrogen control signals. J. Biotechnol. 126, 440-453.
Müller, T., Walter, B., Wirtz, A. & Burkovski, A. (2006b). Ammonium toxicity in
bacteria. Curr. Microbiol. 52, 400-406.
Mullis, K. B., Farone, F. A., Schar, S., Saiki, R., Horn, G. & Ehrlich, H. (1986). Specific
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 51, 263-273.
Nakhoul, N. L., Dejong, H., Abdulnur-Nakhoul, S. M., Boulpaep, E. L., Hering-Smith,
K. & Hamm, L. L. (2005). Characteristics of renal RhBG as an NH4+-transporter.
Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F170-F181.
LITERATURVERZEICHNIS
127
Ninfa, A. J. & Atkinson, M. R. (2000). PII signal transduction proteins. Trends
Microbiol. 8, 172-179.
Ninfa, A. J. & Jiang, P. (2005). PII signal transduction proteins: sensors of alphaketoglutarate that regulate nitrogen metabolism. Curr. Opin. Microbiol. 8, 168-173.
Nolden, L. (2001). Mechanismen der Stickstoff-Kontrolle in Corynebacterium glutamicum.
Dissertation, Universität zu Köln.
Nolden, L., Farwick, M., Krämer, R. & Burkovski, A. (2001a). Glutamine synthetases in
Corynebacterium glutamicum: transcriptional control and regulation of activity. FEMS
Microbiol. Lett. 201, 91-98.
Nolden, L., Ngouoto-Nkili, C.-E., Bendt, A. K., Krämer, R. & Burkovski, A. (2001b).
Sensing nitrogen limitation in Corynebacterium glutamicum: The role of glnK and glnD.
Mol. Microbiol. 42, 1281-1295.
Nygaard, T. P., Rovira, C., Peters, G. H. & Jensen, M. O. (2006). Ammonium recruitment
and ammonia transport by E. coli ammonia channel AmtB. Biophys. J. 91, 4401-4412.
Reitzer, L. (2003). Nitrogen assimilation and global regulation in Escherichia coli. Annu.
Rev. Microbiol. 57, 155-176.
Ripoche, P., Bertrand, O., Gane, P., Birkenmeier, C., Colin, Y. & Cartron, J.-P. (2004).
Human Rhesus-associated glycoprotein mediates facilitated transport of NH3 into red blood
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 17222-17227.
Saier, M. H. (1999). Phylogenetic characterization of novel transport protein families
revealed by genome analysis. Biochim. Biophys. Acta 1422, 1-56.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory
manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
LITERATURVERZEICHNIS
128
Schägger, H. & von Jagow, G. (1987). Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.
Anal. Biochem. 166, 368-379.
Shapiro, B. M. & Stadtman, E. R. (1970). The regulation of glutamine synthesis in
microorganisms. Annu. Rev. Microbiol. 24, 501-524.
Siewe, R. M., Weil, B. & Krämer, R. (1995). Glutamine uptake by a sodium dependent
secondary transport system in Corynebacterium glutamicum. Arch. Microbiol. 164, 98-103.
Siewe, R. M., Weil, B., Burkovski, A., Eikmanns, B. J., Eikmanns, M. & Krämer, R.
(1996). Functional and genetic characterization of the (methyl)ammonium uptake carrier of
Corynebacterium glutamicum. J. Biol. Chem. 271, 5398-5403.
Schäfer, A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Thierbach, G. & Pühler, A. (1994).
Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids
pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium
glutamicum. Gene 145, 69-73.
Silberbach, M. (2004). Biochemische, biotechnologische und molekularbiologische Analyse
eines Signaltransduktionsweges in Corynebacterium glutamicum. Dissertation, Universität zu
Köln.
Soupene, E., He, L., Yan, D. & Kustu, S. (1998). Ammonia acquisition in enteric bacteria:
physiological role of the ammonium/methylammonium transport B (AmtB) protein. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 7030-7034.
Soupene, E., Lee, H. & Kustu, S. (2002). Ammonium/methylammonium transport (Amt)
proteins facilitate diffusion of NH3 bidirectionally. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 39263931.
LITERATURVERZEICHNIS
129
Soupene, E., Ramirez, R. M. & Kustu, S. (2001). Evidence that fungal MEP proteins
mediate the diffusion of the uncharged species NH3 across the cytoplasmic membrane. Mol.
Cell Biol. 21, 5733-5741.
Stackebrandt, E., Rainey, F. A. & Ward-Rainey, N. L. (1997). Proposal for a new
hierachic classification system, Actinobacteria classis nov. Int. J. System. Bacteriol. 47, 97102.
Stadtman, E. R. (1990). Discovery of glutamine synthetase cascade. Methods Enzymol. 182,
793-809.
Strösser, J. (2005). GlnK-abhängige Signaltransduktion in Corynebacterium glutamicum.
Dissertation, Universität zu Köln.
Strösser, J., Lüdke, A., Schaffer, S., Krämer, R. & Burkovski, A. (2004). Regulation of
GlnK activity: modification, membrane sequestration and proteolysis as regulatory principles
in the network of nitrogen control in Corynebacterium glutamicum. Mol. Microbiol. 54,
132-147.
Tachiki, T., Wakisaka, S., Kumagai, H. & Tochikura, T. (1983). Variation of Micrococcus
glutamicus glutamine synthetase brought about by divalent cations. Agric. Biol. Chem. 47,
287-292.
Tauch, A., Kaiser, O., Hain, T., Goesmann, A., Weishaar, B., Albersmeier, A., Bekel., T.,
Bischoff, N., Brune, I., Chakraborty, T., Kalinowski, J., Meyer, F., Rupp, O., Schneiker,
S., Viehoever, P. & Pühler, A. (2005). Complete genome sequence and analysis of the
multiresistant nosocomial pathogen Corynebacterium jeikeium K411, a lipid-requiring
bacterium of the skin flora. J. Bacteriol. 187, 4671-4682.
Tesch, M., de Graaf, A. A. & Sahm, H. (1999). In-vivo fluxes in the ammoniumassimilatory pathways in Corynebacterium glutamicum studied by
resonance. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1099-1109.
15
N nulcear magnetic
LITERATURVERZEICHNIS
130
Thomas, G., Mullins, J. G. L. & Merrick, M. (2000). Membrane topology of the Mep/Amt
family of ammonium transporters. Mol. Microbiol. 37, 331-344.
Trötschel, C. (2005). Methioninaufnahme und -Export in Corynebacterium glutamicum.
Dissertation, Universität zu Köln.
von Wirén, N. & Merrick, M. (2004). Regulation and function of ammonium carriers in
bacteria, fungi and plants. Trends Curr. Genet. 9, 95-120.
Weast, R. C. (1966). Handbook of chemistry and physics. 47th ed, The Chemical Rubber
Co., Cleveland, OH.
Wendisch V. F., de Graaf, A. A., Sahm, H. & Eikmanns, B. J. (2000). Quantitative
determination of metabolic fluxes during co-utilization of two carbon sources: comparative
analysis with Corynebacterium glutamicum during growth on acetate and/or glucose.
J. Bacteriol. 182, 3088-3096.
Westhoff, C. M., Ferreri-Jacobia, M., Mak, D. O. & Foskett, J. K. (2002). Identification
of the erythrocyte Rh-blood group glycoprotein as a mammalian ammonium transporter. J.
Biol. Chem. 277, 12499-12502.
Westhoff, C. M., Siegel, D. L., Burd, C. G. & Foskett, J. K. (2004). Mechanism of genetic
complementation of ammonium transport in yeast by human erythrocyte Rh-associated
glycoprotein (RhAG). J. Biol. Chem., M311853200.
Winkler, F. K. (2006). Amt/MEP/Rh proteins conduct ammonia. Pflügers Arch. 451, 701707.
Wohlleben, W., Muth, G. & Kalinowski, J. (1993). Genetic engineering of Gram-positive
bacteria. In: Genetic engineering of microorganisms (Pühler, A., Herausgeber). VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.
LITERATURVERZEICHNIS
131
Wood, C. C., Poree, F., Dreyer, I., Koehler, G. J. & Udvardi, M. K. (2006). Mechanisms
of ammonium transport, accumulation, and retention in oocytes and yeast cells expressing
Arabidopsis AtAMT1;1. FEBS Lett. 580, 3931-3936.
Yang, H., Xu, Y, Zhu, W., Chen, K. & Jiang, H. (2007). Detailed mechanism for AmtB
Conducting NH4+/NH3: Molecular Dynamics Simulations. Biophys. J. 92, 877–885.
Yanisch-Perron, C., Viera, J. & Messing, J. (1985). Improved M13 phage vectors and host
strains: nucleotide sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119.
Zheng, L., Kostrewa, D., Bernèche, S., Winkler, F. K. & Li, X.-D. (2005). The mechanism
of ammonia transport based on the crystal structure of AmtB in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101, 17090-17095.
Zidi-Yahiaoui, N., Mouro-Chanteloup, I., D´Ambrosio, A. M., Lopez, C., Gane, P., Le
Van, K. C., Cartron, J. P., Colin, Y. & Ripoche, P. (2005). Human Rhesus B and Rhesus C
glycoproteins: properties of facilitated ammonium transport in recombinant kidney cells.
Biochem. J. 391, 33-40.
EIGENE PUBLIKATIONEN
132
Eigene Publikationen
Müller, T., Walter, B., Wirtz, A. & Burkovski, A. (2006). Ammonium toxicity in bacteria.
Curr. Microbiol. 52, 400-406.
Silberbach, M., Hüser, A., Kalinowski, J., Pühler, A., Walter, B., Krämer, R. &
Burkovski, A. (2005). DNA microarray analysis of the nitrogen starvation response of
Corynebacterium glutamicum. (2005). J. Biotechnol. 119, 357-367.
Titgemeyer, F., Amon, J., Parche, S., Mahfoud, M., Bail, J., Schlicht, M., Rehm, N.,
Hillmann, D., Stephan, J., Walter, B., Burkovski, A. & Niederweis M. (2007). A genomic
view of sugar transport in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis.
J. Bacteriol., zur Veröffentlichung angenommen.
Walter, B., Hänssler, E., Kalinowski, J. & Burkovski, A. (2007). Nitrogen metabolism in
corynebacteria: variations of a common theme. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 131-138.
SYMBOL- UND ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Symbol- und Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ADP
Adenosindiphosphat
APS
Ammoniumperoxodisulfat
ATP
Adenosintriphosphat
bp
Basenpaare
BCIP
5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat-p-Toluidinsalz
CAPS
3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure
CSPD
Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2´-(5´-chloro)tricyclo
[3.3.1.13´7]decan}-4-yl)phenylphosphat
CTAB
N-cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid
DIG
Digoxigenin
DMSO
Dimethylsulfoxid
EDTA
Ethylendiaminotetraessigsäure
et al.
”et alii“ (und andere)
g
Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
GDH
Glutamatdehydrogenase
GOGAT
Glutamatsynthase
GS
Glutaminsynthetase
HPLC
High pressure liquid chromatography
IPTG
Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid
Km
Michaelis-Menten-Konstante
kDa
Kilodalton
MOPS
3-[N-Morpholino]propansulfonsäure
NAD(P)H
Nicotinamidadenindinukleotid (-2’-phosphat), reduziert
NBT
p-Nitrotetrazoliumblauchlorid
OD600
Optische Dichte bei 600 nm
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR
Polymerasekettenreaktion
PVDF
Polyvinylidendifluorid
SDS
Natriumdodecylsulfat
Tab.
Tabelle
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TCA
Trichloressigsäure
133
SYMBOL- UND ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
134
TE
Tris-EDTA
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamin
TG
Trockengewicht
Tris
2-Amino-Hydroxymethylpropan-1,3-diol
Vmax
Maximalgeschwindigkeit
v/v
Volumen/Volumen
w/v
Gewicht/Volumen
Einheiten
Vorsätze
bp
Basenpaare
k
Kilo
°C
Grad Celsius
m
Milli
Da
Dalton
µ
Mikro
g
Gramm
n
Nano
l
Liter
m
Meter
M
Molar
min
Minuten
s
Sekunden
U
Unit, Einheit
der Enzymaktivität
V
Volt
Aminosäure-Nomenklatur nach IUPAC-IUB-Vereinbarungen (1969)
A
Alanin
M
Methionin
C
Cystein
N
Asparagin
D
Asparaginsäure
P
Prolin
E
Glutaminsäure
Q
Glutamin
F
Phenylalanin
R
Arginin
G
Glycin
S
Serin
H
Histidin
T
Threonin
I
Isoleucin
V
Valin
K
Lysin
W
Tryptophan
L
Leucin
Y
Tyrosin