Parallele Detektion für parallele Interaktionen – neue

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Parallele Detektion für parallele Interaktionen
– neue Konzepte zur miniaturisierten Analyse von
Proteinkomplexen in der zellulären Signaltransduktion
Oda Stoevesandt und Roland Brock
Interfakultäres Institut für Zellbiologie,
Eberhard Karls Universität Tübingen
Lebende Zellen sind in der Lage, auf
komplexe Stimuli aus ihrer Umwelt in
spezifischer Weise zu reagieren, indem sie
Information in Signalnetzwerken aus enzymatischen Reaktionen und ProteinProtein-Wechselwirkungen integrieren. Die
isolierte Betrachtung einzelner Reaktionen
oder molekularer Wechselwirkungen ist für
das Verständnis dieser komplexen Signaltransduktionsvorgänge unzureichend[1].
Eine Voraussetzung für die Aufklärung des
Zusammenspiels der Moleküle im Netzwerk ist daher die parallele Detektion
vieler oder aller der darin vorkommenden
Protein-Protein-Interaktionen. Klassische
Co-Immunpräzipitationen mit anschließender Elektrophorese und Western Blot
sind aufgrund der vielen Arbeitsschritte
und des relativ hohen Materialbedarfs nur
begrenzt parallelisierbar und geben daher
nur punktuelle Einblicke in solche Interaktionsnetzwerke.
왘 Wir entwickeln am Modell der T-Zell-Sig-
naltransduktion Ansätze zur miniaturisierten
und parallelisierten Detektion von ProteinProtein-Interaktionen. Dabei spielen Peptidmicroarrays und Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) zentrale
und komplementäre Rollen. Unsere Ansätze kommen ohne überexprimierte, mit einem Detektionsmarker (z. B. Pulldown-Tag,
GFP) versehene Fusionsproteine aus, durch
deren zusätzliche Expression das zelluläre
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Abb. 1: a) Kompetitions- und Rekrutierungseffekte führen zu signaltransduktionsabhängigen Änderungen von Signalen auf dem Peptidmicroarray. b) Objektträger mit 16 Peptidmicroarrays und
montierbarem 16-well-Rahmen für separate Inkubation. Darüber Arrays nach Inkubation mit Lysat
ruhender bzw. aktivierter Zellen und indirekter Immunfluoreszenzfärbung mit dem gleichen Primärantikörper (Falschfarbendarstellung).
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Signalgeschehen verzerrt werden könnte.
Stattdessen erlauben sie die Arbeit mit ausschließlich endogenen Proteinen.
T-Lymphozyten-Zellen sind Hauptakteure im adaptiven Immunsystem der Säugetiere, das die spezifische Abwehr von
Krankheitserregern erlaubt. Über den
TCR/CD3-Rezeptorkomplex auf ihrer
Oberfläche erkennen T-Zellen körperfremde Strukturen, die auf der Oberfläche anderer Zellen präsentiert werden. In der TZelle erfolgt die Signalweiterleitung über eine Kaskade von Tyrosin-Phosphorylierungen (pTyr), die zur Entstehung von Bindestellen für Proteine mit SH2-Domänen führen. SH3-Domänen und poly-Prolin-Motive
(polyPro) vermitteln weitere Interaktionen.
Eine Besonderheit der T-Zell-Signaltransduktion ist das häufige Auftreten dieser beiden, auf linearen Peptidmotiven basierenden, Interaktionstypen.
Diesen Umstand nutzen wir beim Einsatz
von Peptidmicroarrays für die Detektion von
Proteinkomplexen. Peptide, die den pTyroder polyPro-Motiven der T-Zell-Signalproteine entsprechen, werden anstelle der kompletten Proteine als Fängermoleküle im Microarrayformat immobilisiert. Bei Inkubation
mit Zelllysaten binden Proteine mit geeigneten Interaktionsdomänen an die Peptide
und werden anschließend mittels indirekter
Immunfluoreszenz detektiert. Zwei mit dem
zellulären Signalgeschehen assoziierte Effekte führen dabei zu Veränderungen der
Anbindung auf dem Array (Abb. 1a). Einerseits kann die Bildung von Proteinkomplexen Domänen involvieren, für die es auch
auf dem Array ein Bindemotiv gibt. Aufgrund dieser Maskierung der Bindungsdomänen kommt es zur verminderten Bindung
auf dem Array[2]. Andererseits können Proteine durch Integration in einen Komplex indirekt an ein immobilisiertes Peptid binden.
Zu betonen ist, dass in beiden Fällen die Änderung des Signals nicht, wie sonst bei Arrayanwendungen üblich, eine Änderung der
Gesamtmenge des detektierten Proteins
wiedergibt, sondern eine durch Signaltransduktion hervorgerufene Änderung in dessen
Bindungszustand.
Pro Objektträger werden 16 identische
Peptidarrays mit je etwa 25 verschiedenen
Bindemotiven aus der T-Zell-Signaltransduktion pipettiert (Abb. 1b). Pro Array werden zwei Primärantikörper zur Detektion
eingesetzt, die über verschiedenfarbig fluoreszent markierte Sekundärantikörper differenziert werden. Die Auslesung erfolgt mit
einem Zweikanal-Arrayscanner. Dies ermöglicht pro Objektträger die Inkubation
der Arrays unter 16 verschiedenen Bedingungen (z. B. verschiedenartige Stimulation
der Zellen vor der Lyse, Detektion mit verschiedenen Antikörpern) und damit die Er-
zeugung von bis zu 800 Datenpunkten. Dabei müssen lediglich 16 Millionen Zellen
eingesetzt werden, im Gegensatz zu den
gängigen 1 – 10 Millionen Zellen für eine
einzige, klassische Co-Immunopräzipitation[3].
Ein Beispiel für die Komplexdetektion
auf einem Peptidarray ist die Interaktion von
ZAP-70 mit CD3ζ und ε2. In ruhenden Zellen ist ZAP-70 gleichmäßig verteilt, nach der
Stimulation, hier mit dem Phosphataseinhibitor Pervanadat (PV), bindet ZAP-70 an
phosphoryliertes CD3ζ/ε an der Plasmamembran (Abb. 2a). Die Komplexe liegen
auch nach Lyse der Zellen im Lysat vor
(Abb. 2b). Als Fängerpeptid auf dem Array
fungiert das phosphorylierte Bindemotiv aus
CD3ζ. Durch Kompetition mit den Bindemotiven der zellulären CD3ζ/ε-Proteine ist
nach Stimulation der Zellen weniger ZAP70 auf dem Array nachweisbar (Abb. 2c).
Durch weitere arraybasierte Analysen lässt
sich abschätzen, welcher Anteil der ZAP-70Moleküle durch die Stimulation der Zellen
ins Signalgeschehen involviert wird[2].
Auf den Arrays werden nicht die Proteinkomplexe selber nachgewiesen, sodass nur
indirekte Rückschlüsse auf die vorliegenden
Komplexe möglich sind. Hier kommt eine
zweite, von uns entwickelte Methode zur
miniaturisierten Komplexdetektion zum
Einsatz[4], die auf FCCS basiert. In einem
Schritt werden dem Lysat Primärantikörper
gegen die vermuteten Komplexpartner und
Abb. 2: Analyse von Proteinkomplexen durch Peptidmicroarrays und FCCS am Beispiel der Interaktion
von ZAP-70 mit CD3ζ/ε. a) Verteilung von ZAP-70 in ruhenden und Pervanadat-stimulierten Zellen.
Konfokale Aufnahmen von Zellen, ein Fusionsprotein von ZAP-70 mit YFP (Yellow Fluorescent Protein;
gelb) exprimieren. b) Schema der stimulationsabhängigen Phosphorylierung (rot) von CD3ζ/ε (blaugrau) und Bindung von ZAP-70 (gelb). c) Schema und experimentelle Bestätigung der komplexierungsabhängigen Verminderung der Bindung von ZAP-70 an den Peptidarray. Im Western Blot ist ZAP-70
nicht vermindert. d) Schema und experimentelles Beispiel der Komplexdetektion durch FCCS. Den
Lysaten zugesetzte Reagenzien: anti-ZAP-70 (Antikörper aus Maus), anti-CD3ε (biotinylierter Antikörper aus Hamster), anti-Maus Antikörper markiert mit Fluorophor Alexa488 und Streptavidin
markiert mit Cy5. e) Titration mit pTyr-Peptid aus CD3ζ zur Bestimmung des IC50-Wertes der Bindung
von ZAP-70 und CD3ε. FCCS von ZAP-70-YFP und indirekt Cy-5-markiertem CD3ε wie in Abbildung 2d.
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eingesetzt werden. Die Titration der Interaktion von ZAP-70-YFP und CD3ε mit dem
pTyr-Peptid aus CD3ζ ergab einen IC50 von
1 µM (Abb. 2e)[4].
FCCS ermöglicht die Detektion von Protein-Protein-Interaktionen aus wenigen
Mikrolitern Lysat. Die Wechselwirkung der
Proteine kommt im physiologischen Kontext
der übrigen zellulären Komponenten zustande. Daher eröffnet diese Methode eine
Perspektive insbesondere für Screening und
Charakterisierung von Inhibitoren von Interaktionen, die auf signalabhängigen posttranslationalen Modifikationen beruhen.
Sowohl die Peptidmicroarrays als auch die
FCCS erlauben alleine oder in Kombination
eine umfassende Aufklärung der ProteinProtein-Wechselwiekungen, die den vielfältigen Antworten von Zellen auf ihre Umgebung zugrunde liegen.
Danksagung
Abb. 3: Messprinzip der Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie[5]. a) Wenige Mikroliter
Probe mit zwei verschieden Fluorophoren werden
mit zwei überlagerten Lasern angeregt. Die durch
Diffusion bedingten Fluoreszenzfluktuationen
beider Fluorophore in überlagerten konfokalen
Beobachtungsvolumina werden zeitaufgelöst
detektiert und kreuzkorreliert. b) Je höher der
Anteil von Partikeln, die beide Fluorophore
tragen, desto höher die Amplitude der Kreuzkorrelationsfunktion Gcc(τ).
Sekundärreagenzien zugegeben. Letztere
sind mit unterschiedlichen Fluorophoren
markiert und für jeweils einen der Primärantikörper spezifisch. Nach Inkubation dieser Ansätze bilden sich nur dann beide Fluorophore tragende Partikel, wenn im Lysat
Komplexe der beiden Interaktionspartner
vorliegen (Abb. 2d). Solche zweifarbig markierten Partikel in Lösung lassen sich mittels
FCCS nachweisen. Das Messprinzip der
FCCS ist in Abbildung 3 erläutert. Im Gegensatz zu Co-Immunpräzipitationen ermöglicht
FCCS die trennungsfreie Messung in wenigen Mikrolitern Zelllysat in Multiwellplatten. Zusammen mit dem auf einen einzigen Pipettierschritt reduzierten Probenansatz ist FCCS damit bestens geeignet zur
miniaturisierten und parallelisierten Detektion von Proteinkomplexen. Im Beispiel
wurde FCCS eingesetzt, um die PV-induzierte Interaktion von CD3ε mit ZAP-70 zu
verifizieren (Abb. 2e). Die FCCS-Messung
zeigt im Lysat stimulierter Zellen eine signifikant erhöhte Kreuzkorrelation gegenüber dem Lysat ruhender Zellen. Für die
weitergehende Charakterisierung von Proteinkomplexen kann FCCS zur Bestimmung
von IC50-Werten für Komplexinhibitoren
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Die Autoren danken der Volkswagenstiftung
(Nachwuchsgruppen an Universitäten, I/77
472) für die finanzielle Unterstützung dieser
Arbeiten.
Literatur
[1] Hunter, T. (2000): Signaling—2000 and beyond. Cell
100: 113–127.
[2] Stoevesandt, O., Elbs, M., Köhler, K., Lellouch, A. C., Fischer, R., André, T., & Brock, R.
(2005): Peptide Microarrays for the Detection of Molecular Interactions in Cellular Signal Transduction. Proteomics 5: 2010–2017.
[3] Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001): Molecular
cloning: a laboratory manual. (CSHL Press, New York).
[4] Stoevesandt, O., Köhler, K., Fischer, R., Johnston, I. C., & Brock, R. (2005): One-step analysis of
protein complexes in microliters of cell lysate. Nat
Methods 2: 833–835.
[5] Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., & Rigler, R.
(1997): Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophys. J. 72: 1878–1886.
Korrespondenzadresse:
PD Dr. Roland Brock
AG Zelluläre Signaltransduktion
Abteilung Molekularbiologie
Interfakultäres Institut für Zellbiologie
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