Structural and functional investigations on the Na - ETH E

Research Collection
Doctoral Thesis
Structural and functional investigations on the Na�-translocating
oxaloacetate decarboxylases of Archaeoglobus fulgidus and
Vibrio cholerae
Author(s):
Dahinden, Pius
Publication Date:
2004
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-004908268
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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Diss. ETH No. 15827
Structural and functional investigations
on the Na+-translocating oxaloacetate
decarboxylases of Archaeoglobus fulgidus
and Vibrio cholerae
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the degree of
DOCTOR OF SCIENCES
presented by
PIUS DAHINDEN
Dipl. Natw. ETH
ETH Zürich
Born November 11, 1973
from Egolzwil (LU) and Entlebuch (LU)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Peter Dimroth, examiner
Prof. Dr. Hubert Hilbi, co-examiner
Zürich, 2005
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Enterobakterien wie Klebsiella pneumoniae und Salmonella typhimurium oder das
marine Bakterium Vibrio cholerae können in Abwesenheit von Sauerstoff mit Citrat als
einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Schlüsselenzyme des Na+-abhängigen
Citratfermentationswegs sind die Citrat Lyase und die Oxalacetat Decarboxylase. Die
Oxalacetat Decarboxylase (OAD) gehört zur Familie der Na+-abhängigen CarboxylsäurenDecarboxylasen (Na+-translocating carboxylic acid decarboxylases, NaT-DC), welche freie
Decarboxylierungsenergie in einen elektrochemischen Na+-gradienten umwandeln.
Die meisten OADs bestehen aus zwei membranständigen Untereinheiten (β und γ) und
einer cytosolischen α-Untereinheit. Die β-Untereinheit, welche die mit dem Transport von
Na+-Ionen gekoppelte Decarboxylierung von Carboxybiotin katalysiert, ist ein stark
hydrophobes, integrales Membranprotein bestehend aus 9 transmembranen α-Helices und
einem hydrophoben Segment, das in die Membran inseriert ist, diese aber nicht vollständig
durchdringt. Die periphere α-Untereinheit besteht aus der N-terminalen CarboxyltransferaseDomäne, welche die Carboxylgruppe von Position 4 von Oxalacetat auf die prosthetische
Biotingruppe der Biotin-bindenden Domäne überträgt. Diese beiden Domänen sind über zwei
flexible Linker-Peptide mit der Assoziations-Domäne verbunden, welche für die Bindung der
α-Untereinheit an die γ-Untereinheit verantwortlich ist. Die γ-Untereinheit ist mittels einer
einzigen α-Helix in der Membran verankert, über die sie mit der β-Untereinheit interagiert
und mit ihr einen βγ-Subkomplex bildet. Die lösliche, cytosolische Domäne der γ-Untereinheit weist an ihrem C-terminalen Ende ein Zinkbindungsmotiv auf. Das an diese Domäne
gebundene Zn2+-Ion beschleunigt nachweislich die Carboxyltransferreaktion. Die C-terminale
Domäne der γ-Untereinheit interagiert spezifisch mit der Assoziations-Domäne der
α-Untereinheit und vermittelt so den Zusammenhalt des OAD-Komplexes.
In V. cholerae wurden zwei oad-Gencluster identifiziert, die oad-1 und oad-2 genannt
wurden. Die oad-2-Gene sind Teil des Citrat-Operons von V. cholerae, während die oad-1Gene in einer genetischen Umgebung liegen, deren Gene nicht mit einem spezifischen
Fermentationsweg verbunden sind. Beide oad-Gencluster von V. cholerae wurden kloniert
und in Escherichia coli exprimiert. Pro Gramm Zellen wurden bis zu 0.4 mg OAD-1 mit einer
maximalen spezifischen Aktivität von 8 U/mg gereinigt. Von der OAD-2 wurden bis zu 0.8
mg pro Gramm Zellen mit einer spezifischen Aktivität von bis zu 80 U/mg gereinigt. Die
heterolog in E. coli exprimierte OAD-2 hatte dieselbe spezifische Aktivität wie das aus
V. cholerae gereinigte Enzym. Das pH-Optimum der OAD-2 lag bei pH 6.5. Das Chromato-
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Zusammenfassung
gramm der Gelfiltrationsanalyse der affinitätschromatographisch gereinigten OAD-2 zeigte
ein einzelnes, symmetrisches Signal, das einer apparenten Molekularmasse von 570 kDa
entspricht. Da die berechnete Molekularmasse eines einzelnen OAD-Moleküls 121 kDa
beträgt, liegt das native Enzym daher wahrscheinlich als Tetramer vor. Die Differenz
zwischen der Masse des Tetramers und der apparenten Molekularmasse entspricht der Masse
der Brij58-Detergens-Micelle.
Eine besondere Eigenschaft der Oxalacetat Decarboxylase ist ihre Aktivierbarkeit durch
Na+-Ionen: in Abwesenheit von Na+-Ionen ist die OAD-2 inaktiv. Mit steigender Na+Konzentration nimmt die Aktivität zu. Bei 1 mM NaCl ist die Aktivierung halbmaximal, bei
10 mM wird Sättigung erreicht. Die gemessenen Daten passen am ehesten zu einem
Kurvenverlauf, der sich aus der Hill-Gleichung ergibt. Der entsprechende Hill-Koeffizienten
beträgt 1.8, was darauf hinweist, dass mindestens 2 Na+-Ionen kooperativ an das Enzym
binden. Durch hohe Na+-Konzentrationen (> 200 mM) wird das Enzym gehemmt, wobei die
Aktivität bei 1 M NaCl weniger als 10% der maximalen Aktivität beträgt. Der durch die
OAD-2
katalysierte
Transport
von
Na+-Ionen
wurde
mit
einer
kontinuierlichen
Untersuchungsmethode nachgewiesen, indem die Na+-Aufnahme in Proteoliposmen verfolgt
wurde, in deren Lumen der Na+-sensitive Fluorophor Natriumgrün eingeschlossen war.
Eine Voraussetzung für den gekoppelten Transport von Na+ durch die Oxalacetat
Decarboxylase ist die Bindung der α-Untereinheit an den βγ-Komplex. Es wurde bereits
früher mit dem Klebsiella-Enzym gezeigt, dass einer der vier Histidin-Reste am C-Terminus
der γ-Untereinheit essentiell für diese Reaktion ist. Auch die γ-Untereinheit der OAD-2 von
V. cholerae besitzt drei Histidin-Reste an ihrem C-terminalen Ende, von denen einer (H81) an
der Interaktion mit der α-Untereinheit beteiligt ist.
Um die Bindungsregion der α-Untereinheit zu bestimmen, die mit der γ-Untereinheit
intergiert, wurden eine Reihe von Deletionsmutanten erzeugt und zusammen mit der
C-terminalen Domäne der γ-2-Untereinheit (γ'-2) exprimiert. Darauf wurden die Proteine
entweder über den His-Tag der γ-Untereinheit oder über die prosthetische Biotingruppe der
α-Untereinheit affinitätschromatographisch gereinigt. Im Falle einer Co-Reinigung der beiden
Proteine wurde geschlossen, dass diese als Komplex vorliegen. Mit Hilfe dieser Strategie
wurde ein Bereich von 40 Aminosäuren innerhalb der α-Untereinheit identifiziert, der für die
Komplexbildung mit der γ-Untereinheit notwendig ist. Dieses Peptid repräsentiert eine
gesonderte Domäne innerhalb der α-Untereinheit, die Assoziations-Domäne genannt wurde.
Diese Assoziations-Domäne ist an ihrem N-Terminus mit einem flexiblen Linker-Peptid mit
der Carboxyltransferase-Domäne verbunden und an ihrem C-Terminus über einen weiteren
flexiblen Linker mit der biotinbindenden Domäne.
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Summary
Summary
Some enterobacteria like Klebsiella pneumoniae and Salmonella typhimurium or the
marine bacterium Vibrio cholerae are able to grow under anoxic conditions on citrate as sole
carbon and energy source. Key enzymes of the Na+-dependent citrate fermentation pathway
are citrate lyase and oxaloacetate decarboxylase. The oxaloacetate decarboxylase (OAD) is a
member of the Na+-translocating carboxylic acid decarboxylase (NaT-DC) family of enzymes
that convert the free energy of decarboxylation into an electrochemical gradient of Na+.
Most OADs are composed of two membrane-bound subunits (β and γ) and a cytosolic
α-subunit. The β-subunit, which catalyzes the decarboxylation of carboxybiotin coupled to
the transport of Na+ ions, is a highly hydrophobic integral membrane protein consisting of 9
transmembrane α-helices and a hydrophobic segment inserted into the membrane but not
traversing it. The peripheral α-subunit is composed of the N-terminal carboxyltransferase
domain catalyzing the transfer of the carboxyl group at position 4 of oxaloacetate to the
prosthetic biotin group of C-terminal biotin-binding domain. Via flexible linker peptides these
two domains are connected to the association domain interacting with the γ-subunit. The
γ-subunit is anchored in the membrane by a single α-helix and interacts via this
transmembrane segment with the β-subunit to form a βγ-subcomplex. The soluble, cytosolic
domain of the γ-subunit possesses at its C-terminal end a zinc binding motif. The Zn2+ ion
bound to this motif was proven to accelerate the carboxyltransfer reaction. Moreover, this
C-terminal domain of the γ-subunit specifically interacts with the biotin-binding domain of
the α-subunit. The γ-subunit therefore mediates the coherence of the OAD complex.
In V. cholerae two copies of oad gene clusters have been identified, termed oad-1 and
oad-2. The oad-2 genes are part of the citrate operon of V. cholerae, whereas the oad-1 genes
are located in a region of genes not associated with a specific fermentation pathway. Both oad
genes from V. cholerae were cloned and expressed in Escherichia coli. Per gram of cells up to
0.4 mg OAD-1 were purified with a maximal specific activity of 8 U/mg. On the other hand
up to 0.8 mg OAD-2 with a specific activity of up to 80 U/mg were purified per gram of cells.
The OAD-2 which was synthesized heterologously by E. coli had the same specific activity as
the enzyme purified from V. cholerae cells. The pH optimum of the OAD-2 was pH 6.5. The
affinity-purified OAD-2 moved as a single symmetrical peak on a size exclusion
chromatography column with an apparent molecular mass of 570 kDa. As the calculated
molecular mass of a single OAD molecule is 121 kDa, the native enzyme presumably is a
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Summary
tetramer. The difference in the determined and calculated mass represents the mass of the
Brij58 detergent micelles.
A peculiar property of oxaloacetate decarboxylase is its specific activation by Na+ ions:
In the absence of Na+ ions the OAD-2 is inactive, but the activity increases with increasing
Na+ concentration to reach half-maximal activation at 1 mM and saturation at about 10 mM
NaCl. The measured data fit best to the Hill equation with a Hill coefficient of 1.8, indicating
that at least two Na+ ions bind to the enzyme in a cooperative manner. At high concentrations
of Na+ (> 200 mM), however, the enzyme becomes inhibited to reach less than 10% of the
maximal activity at 1 M NaCl. Transport of Na+ ions by the enzyme was shown in a
continuous assay with the Na+ sensing fluorophore Sodium Green enclosed in
proteoliposomes containing the reconstituted OAD-2 in their membrane.
A prerequisite for the coupled transport of Na+ by the OAD is the binding of the
α-subunit to the βγ-complex. It was shown previously with the Klebsiella enzyme that one of
the four histidine residues at the C-terminus of the γ-subunit is essential for this interaction.
Similarly, subunit γ of OAD-2 from V. cholerae contains three histidine residues at its
C-terminal end, and one of these (H81) is involved in complex formation with the α-subunit.
To identify the binding region on the α-subunit that interacts with the γ-subunit, a series
of deletion mutants was generated and expressed together with the C-terminal domain of the
γ-2-subunit (γ'-2). Subsequently, one of the co-expressed proteins was purified by affinity
chromatography either via an attached His-tag or via the prosthetic biotin group, and complex
formation was assessed by the co-purification of the other subunit. With this strategy a stretch
of 40 amino acids within the α-subunit was identified that is required for complex formation
with the γ-subunit. This peptide represents a separate domain of the α-subunit that has been
termed association domain. The association domain is linked at the N-terminus via a flexible
linker peptide to the carboxyltransferase domain and at the C-terminus via a second flexible
linker peptide to the biotin carrier domain.