Molekulare Medizin

Andreas E. Kulozik- Matthias W. Hentze
Christian Hagemeier • Claus R. Bartram
Molekulare Medizin
Grundlagen - Pathomechanismen - Klinik
w
DE
G
Walter de Gruyter • Berlin • New York 2000
Inhalt
1
Was ist Molekulare Medizin?
1
2
Molekulare Anatomie
5
2.1
Aufbau des Zellkerns
5
2.2
2.2.1
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.1.3
2.2.1.4
Das menschliche Genom
Aufbau der Gene
Strukturgene
Gene für die ribosomale RNA (rRNA)
Gene für die Transfer RNA (tRNA)
Pseudogene
7
8
9
10
11
11
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.2.1
2.3.2.2
2.3.2.3
2.3.3
Chromosomen
Chromosomenaberrationen
Molekulare Cytogenetik
Mikrodissektion und Reverse Painting
Vergleichende genomische Hyridisierung (CGH)
Vielfarben-FISH (M-FISH, SKY)
X-Inaktivierung und pseudoautosomale Regionen
12
14
16
19
20
21
22
2.4
2.4.1
2.4.2
Nukleinsäuren
Chemischer Aufbau von DNA und RNA
Sekundärstruktur der DNA
25
25
28
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.3
Nukleare Proteine
Strukturproteine
Enzyme
Regulatorische Proteine
30
31
32
33
2.6
Ribonukleoprotein Partikel
33
3
Molekularmedizinische Physiologie und Biochemie
35
3.1
3.1.1
3.1.1.1
3.1.1.2
3.1.1.3
3.1.2
3.1.2.1
3.1.2.2
Transkription
Die Steuerelemente der RNA-Polymerase II vermittelten Genexpression . . .
Basale Promotorelemente
Proximale Promotorelemente
Distale Promotorelemente (Enhancer)
Regulierende Proteine der Transkriptionsinitiation
RNA-Polymerase II
Die Initiierung des Transkriptionsvorganges durch basale
Transkriptionsfaktoren
Regulative Transkriptionsfaktoren bestimmen die Rate der
Transkriptionsreinitiierung
Chromatin und Transkription
36
38
38
39
41
43
43
3.1.2.3
3.1.3
46
49
55
X
Inhalt
3.1.3.1
3.1.4
3.1.5
Nukleosom-modulierende Faktoren
DNA-Methylierung und CpG Islands
Elongation und Termination
56
57
59
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.3.1
3.2.3.2
3.2.3.3
3.2.3.4
3.2.3.5
3.2.4
3.2.4.1
3.2.4.2
RNA Prozessierung
Capping
Polyadenylierung
Spleißen
Expression anderer RNAs
Merkmale von Exons und Introns
Aufbau des Spleißosoms
Alternatives und reguliertes Spleißen
Ribozyme
mRNA Editierung
mRNA Editierung durch Basenumwandlung
mRNA Editierung durch U-Insertionen und Deletionen bei Protozoen . . . .
62
63
63
66
66
66
68
69
71
72
73
74
3.3
3.3.1
3.3.2
Nukleo-cytoplasmatischer Transport
Nuklearer Import
Export ins Cytoplasma
76
78
78
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.2.1
3.4.2.2
3.4.2.3
3.4.2.4
3.4.2.5
3.4.2.6
79
79
81
81
82
83
85
88
3.4.3
Cytoplasmatische Schritte der Genexpression
mRNA Lokalisierung
mRNA Translation
Der genetische Code
tRNAs dienen als Adaptermoleküle
Rolle der Ribosomen bei der Translation
Translationsinitiation
Translationselongation und -termination
Antibiotika nutzen Unterschiede zwischen eukaryonter und
prokayonter Translation
Abbau und Stabilität von mRNA
91
91
3.5
Genrekombination als Grundlage einer spezifischen Immunantwort
94
3.6
3.6.1
3.6.1.1
3.6.1.2
3.6.2
3.6.2.1
3.6.2.2
3.6.3
3.6.3.1
3.6.3.2
3.6.3.3
3.6.4
3.6.4.1
3.6.4.2
3.6.4.3
3.6.4.4
Zellzyklus
DNA Replikation und Zellteilung
DNA-Replikation . . . . '
Mitose
Regulation der Zellzyklusprogression
Cyclinabhängige Kinasen als Motor der Zellzyklusprogression
Positive und negative Regulatoren von CYC/CDK-Komplexen
Die Stimulation des Zellzyklus durch Wachstumsfaktoren
Der Start des Zellzyklus: Aktivierung der D-Typ Cycline
Die Regulation des Restriktionspunktes
Der efferente Schenkel des RB-Signalweges
P53-abhängige Zellzykluskontrolle
Kontrollfunktionen von P53 bei DNA-Schäden
Der P53-induzierte Gl-Kontrollpunkt nach Onkogenaktivierung
P53-vermittelte Apoptose und vorzeitige Zellalterung
P53: „Pannenhilfe" für den RB-Signalweg
102
103
104
109
111
112
113
117
118
120
121
123
125
125
125
126
3.7
3.7.1
DNA-Reparatur
Fehler der Nukleotidstruktur
128
132
Inhalt
3.7.1.1
3.7.1.2
3.7.2
3.7.2.1
XI
3.7.2.2
3.7.3
3.7.3.1
3.7.4
3.7.5
3.7.5.1
3.7.5.2
3.7.5.3
3.7.5.4
3.7.5.5
Nukleotid-Exzisionsreparatur: Xeroderma pigmentosum
Transkriptions-gekoppelte Reparatur: Das Cockayne Syndrom
Basenfehler
Reparatur von Basenfehlpaarungen: Dickdarmkarzinom ohne
Polyposis
Die Basen-Exzisionsreparatur
DNA Läsionen, die beide DNA Stränge betreffen
Reparatur von Doppelstrangbrüchen
Kopplung von DNA-Reparatur, Zellzyklus und Apoptose
Chromosomenbruchsyndrome
Ataxia teleangiectasia
Nijmegen Breakage Syndrom
Fanconi Anämie
Bloom-Syndrom
Werner-Syndrom
132
134
135
136
138
138
140
142
143
143
143
144
145
146
3.8
3.8.1
3.8.2
3.8.3
3.8.4
3.8.5
3.8.6
Apoptose
Funktionelle Bedeutung der Apoptose
ced-Gene und ihre menschlichen Homologe
Molekulare Grundlagen der Apoptose
Caspasen und ihre Zielmoleküle
Signalwege der Apoptose
P53 - Wächter des Genoms
146
147
147
149
150
152
158
3.9
3.9.1
3.9.2
Signalübertragung
Signalübertragung ohne Membranbarriere: NO
Signalübertragung mit Membranbarriere: Der RAS/RAF-Signalweg
160
163
167
4
Molekularmedizinische Methoden
169
4.1
4.1.1
4.1.1.1
4.1.1.2
4.1.1.3
4.1.1.4
4.1.1.5
4.1.2
4.1.3
Basiswerkzeuge
Vektoren zur Klonierung von DNA
Plasmide
Bakteriophagen
Cosmide
Expressionsvektoren
Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
Restriktionsendonukleasen
DNA-Hybridisierung
169
169
169
171
172
173
173
174
176
4.2
4.2.1
4.2.1.1
4.2.2
4.2.2.1
4.2.2.2
4.2.3
4.2.3.1
4.2.3.2
4.2.4
4.2.5
4.2.5.1
Untersuchung von DNA
Southern Blotting
Diagnostische Anwendungen des Southern Blotting
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
Restriktionsanalyse PCR-amplifizierter DNA
Screeningmethoden für Punktmutationen
Single-Strand-Conformation Polymorphism (SSCP)
Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE)
DNA-Sequenzierung
Analyse hochpolymorpher Marker
DNA-Multilocus-Systeme (MLS)
:
177
177
180
187
189
190
192
193
193
195
197
197
XII
Inhalt
4.2.5.2
4.2.5.3
4.2.5.4
DNA-Singlelocus-Systeme (SLS)
Short Tandem Repeat-Systeme (STR)
Mitochondriale DNA-Analysen
4.3
4.3.1
4.3.2
Untersuchung von RNA
Northern Blotting
RT-PCR
4.4
Transfektion von eukaryonten Zellen
206
4.5
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.5.4
Proteinanalyse
Western Blotting (Immunoblotting)
Immunpräzipitation
Gel Retardation Assay
Yeast Two Hybrid System
208
209
209
212
214
4.6
4.6.1
4.6.2
4.6.2.1
Strategien zur DNA-Klonierung
cDNA
Genomische DNA
Chromosome walking und jumping
215
216
218
220
4.7
4.7.1
4.7.2
4.7.3
4.7.4
4.7.5
4.7.6
Genkartierung und Genidentifizierung
Kartierung monogener Erkrankungen
Analyse multifaktorieller Erkrankungen
Identifizierung von Genen durch funktionelle Klonierung
Die "Kandidatengen-Strategie
Positionsklonierung
Methoden in der Entwicklungsphase
223
224
228
228
229
230
232
4.8
4.8.1
4.8.2
4.8.2.1
4.8.2.2
234
234
235
235
4.8.2.3
4.8.2.4
4.8.2.5
Das Humangenomprojekt
Ziele und Logistik des HGP
Nutzung und Ausbau des Informationsgehaltes des HGP
Identifizierung aktiver Gene
Untersuchungen zur natürlichen genetischen Variabilität des
menschlichen Genoms
Funktionelle Analyse des menschlichen Genoms (functional genomics) . . . .
Ethische Aspekte des HGP
Genomwissenschaft als neuer Wissenschaftszweig
236
236
237
237
4.9
4.9.1
4.9.1.1
4.9.1.2
4.9.2
4.9.2.1
4.9.3
4.9.3.1
4.9.3.2
4.9.4.
4.9.4.1
4.9.4.2
Tiermodelle
Die Maus als Modellsystem für menschliche Erkrankungen
Natürliche Mutanten (Zufallsentdeckung)
Klassische Mutagenese
Transgene Mäuse
Beispiele
Knock-out und Knock-in Mäuse
Beispiel: Tiermodelle für Cystische Fibröse
Tiermodelle führen zur Identifizierung menschlicher Gendefekte
Konditionale Mutagenese
Gewebespezifische Mutagenese
Induzierbare Mutagenese
238
238
238
239
239
241
241
245
246
246
248
249
^
?
:
200
200
203
204
204
205
Inhalt
XIII
5
Hereditäre Erkrankungen
251
5.1
5.1.1
5.1.1.1
5.1.1.2
Krankheiten mit Mendelschem Vererbungsmodus
Autosomal rezessiver Erbgang
Mukoviszidose
Die ß-Thalassämie als Modell für Genotyp-Phänotypbeziehungen
bei rezessiven Erkrankungen
X-chromosomal rezessiver Erbgang
Dystrophinopathien
Autosomal dominanter Erbgang
Haploinsuffizienz am Beispiel der Familiären Hypercholesterinämie
(FHC)
Dominant negative Effekte des mutierten Alieis am Beispiel der
instabilen Hämoglobinopathien
Pathologische Aktivierung eines Genproduktes am Beispiel des
Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) Rezeptors bei angeborenen
Skeletterkrankungen
251
253
253
5.1.2
5.1.2.1
5.1.3
5.1.3.1
5.1.3.2
5.1.3.3
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.2.1
5.2.2.2
5.2.2.3
5.2.3
5.2.3.1
5.2.4
5.2.4.1
5.2.4.2
256
265
265
268
268
271
273
Der mitochondriale Erbgang
Physiologie und Biochemie des Mitochondriums
Das mitochondriale Genom
Struktur und kodierende Sequenzen
Regulation der Transkription und der Prozessierung
Regulation der Replikation
Mitochondriale Vererbung
Mutationen der mtDNA
Mitochondriale Stoffwechselstörungen
Pearson Syndrom und Kearns-Sayre Syndrom
MELAS (Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und
„stroke-like episodes")
275
276
277
277
278
279
279
282
282
284
Dynamische Mutationen
Mechanismen der Entstehung
Erkrankungen durch Dynamische Mutationen
Chorea Huntington als Beispiel für eine „gain of function" Mutation
Fragiles-X-(Fra-X) Syndrom als Beispiel für eine „loss of function"
Mutation
285
287
287
287
Genomisches Imprinting
Das Prader-Willi Syndrom (PWS) und das Angelman Syndrom (AS)
Klinik des PWS
Klinik des AS
Molekulargenetik und uniparentale Disomie (UPD)
Regulation des Genomischen Imprinting
Molekulargenetische Diagnostik des Prader-Willi Syndroms
und des Angelman Syndroms
296
297
297
298
298
299
6
Onkologische Krankheiten
303
6.1
Tumorgene
303
6.2
6.2.1
Identifikation von Onkogenen
Zelluläre Äquivalente viraler Onkogene
304
304
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.2.1
5.3.2.2
5.4
5.4.1
5.4.1.1
5.4.1.2
5.4.1.3
5.4:2
5.4.3
285
292
300
XIV
Inhalt
6.2.2
6.2.3
6.2.4
Insertionsmutagenese
DNA-Transfektionsassays
Klonierung von Bruchpunktregionen chromosomaler Translokationen
und Amplifikationen
307
6.3
Physiologische Bedeutung von Proto-Onkogenen
308
6.4
6.4.1
6.4.2
6.4.2.1
6.4.2.2
6.4.2.3
6.4.2.4
6.4.3
6.4.3.1
6.4.4
Aktivierung von Onkogenen
6.5
Fehlregulation der Apoptose
325
6.6
Störungen epigenetischer Modifikationen
327
6.7
6.7.1
6.7.2
6.7.2.1
Tumorsuppressorgene
p53
Die Zellzyklusinhibitoren P16 und RB
Retinoblastom
328
329
332
333
6.8
6.8.1
6.8.2
6.8.3
6.8.4
Familiäre Tumorerkrankungen
Familfäre medulläre Schilddrüsenkarzinome
Erbliches Mammakarzinom
Erbliche kolorektale Karzinome
Akkumulation genetischer Läsionen beim Kolonkarzinom
335
336
338
339
343
6.9
Klonale Rearrangements der Immunglobulin und T-Zell-Rezeptor Gene . .. 344
6.10
Nachweis sehr kleiner Mengen maligner Zellen
351
6.11
Antiangiogenetische Tumortherapie
356
6.12
Telomeraseaktivität in Tumorzellen
357
7
Infektionskrankheiten
359
7.1
7.1.1
7.1.1.1
7.1.1.2
7.1.1.3
7.1.1.4
7.1.1.5
7.1.2
Molekulare Bakteriologie
Genetik von Bakterien
Genom- und Genregulation bei Bakterien
Unterschiede zwischen Eukaryonten und Prokaryonten
Plasmide, Insertionselemente und Transposons
Genetische Variabilität der Bakterien
Restriktions- und Modifikationsprozesse
Der Mikroorganismus als Krankheitserreger: Prinzipien der molekularen
Pathogenitätsforschung
Pathogenitätsfaktoren und Virulenzmechanismen
Molekulare Diagnostik und Epidemiologie
Molekulare Nachweis- und Identifizierungsverfahren
Nicht kultivierbare Krankheitserreger
359
359
359
360
361
363
365
7.1.2.1
7.1.3
7.1.3.1
7.1.3.2
305
305
309
310
Onkogene Fusionsproteine
313
Die bcr-abl Rekombination
313
a//-7-Translokationen bei der Säuglingsleukämie
317
Retinsäurerezeptor a Rekombinationen bei der Promyelozytenleukämie . . . . 319
evw-Fusion bei Ewing Tumoren
321
Genamplifikationen
321
Neuroblastom
322
Austausch von Regulatorsequenzen am Beispiel des Burkitt Lymphoms . .. 324
ras-Mutationen
365
366
371
371
373
Inhalt
XV
7.1.3.3
7.1.4
7.1.4.1
7.1.4.2
7.1.4.3
7.IAA
7.1.5
Aufklärung von Infektketten
Resistenzmechanismen
Resistenz durch Mutation
Resistenz durch Aufnahme neuer Nukleinsäuren
Evolution und Epdemiologie der Resistenz
Biochemische Mechanismen der Antibiotikaresistenz
Perspektiven und Paradigmenwechsel
374
375
376
378
379
380
383
7.2
7.2.1
7.2.1.1
7.2.1.2
7.2.1.3
7.2.2
7.2.3
7.2.3.1
7.2.3.2
7.2.3.3
7.2.3.4
7.2.4
7.2.5
7.2.5.1
7.2.5.2
7.2.5.3
7.2.6
7.2.6.1
7.2.6.2
7.2.6.3
7.2.6.4
7.2.6.5
7.2.6.6
7.2.7
7.2.7.1
7.2.7.2
7.2.7.3
7.2.7.4
1.2.1.5
Molekulare Virologie
Grundlagen
Taxonomie
Tropismus
Replikation
Retroviren
Replikationszyklus von Retroviren
Infektion
Reverse Transkription und Integration
Expression viraler Genprodukte
Zusammenbau („Assembly") und Reifung von Viruspartikeln
Das Humane Immundefizienzvirus (HIV)
Replikationszyklus von HIV
Infektion
Replikation und Integration
Expression und Regulation Hl-viraler Gene
Diagnostik und Therapie der HIV-Infektion
Inhibitoren der Reversen Transkriptase
Proteaseinhibitoren
Kombinationstherapie
Resistenzprüfung
Neue pharmakologische Therapieansätze
Gentherapie
Entwicklung einer HIV-Vakzine
Immunreaktionen auf die Wildtyp HIV-Infektion
Impfstoffe auf der Basis der HIV Glykoproteine
Komplexe Impfstoffe
DNA-Vakzine
Lebendvakzine mit attenuierten Viren
384
384
385
385
386
388
389
391
391
392
393
393
396
396
397
398
399
401
402
403
404
404
405
406
407
408
409
410
410
7.3
7.3.1
7.3.1.1
7.3.1.2
7.3.1.3
7.3.1.4
7.3.2
7.3.3
7.3.4
Prionen
411
Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei Mensch und Tier .. 412
Scrapie
412
Die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)
413
Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) und Kuru
413
Das Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) und die
familiäre fatale Insomnie (FFI)
414
Die Prionen-Hypothese
415
Das Prion-Protein
415
Der Infektionsmechanismus nach dem „protein-only"-Modell
416
8
Therapeutische Entwicklungen
421
8.1
Rekombinante Proteine
421
XVI
Inhalt
8.1.1
8.1.1.1
8.1.1.2
8.1.1.3
8.1.1.4
8.1.1.5
8.1.1.6
8.1.1.7
8.1.1.8
8.1.1.9
8.1.2
8.1.3
Vor- und Nachteile von Proteinen als Therapeutika
Stabilität
Applikationswege
Immunogenität körperfremder Proteine
Proteine als Impfstoffe
Zugänglichkeit von humanen Proteinen
Spezifität/Selektivität/Affinität
Entwicklungsrisiko
Sicherheit
Herstellungsprinzipien und Wirkstoffkosten
Proteinwirkstoffe „erster Generation"
Proteinwirkstoffe „zweiter Generation": Muteine
421
421
421
422
423
424
424
425
425
425
427
429
8.2
8.2.1
8.2.2
8.2.2.1
8.2.2.2
8.2.2.3
8.2.2.4
8.2.2.5
8.2.3
8.2.3.1
8.2.3.2
8.2.4
8.2.5
8.2.5.1
8.2.5.2
8.2.5.3
8.2.6
Gentherapie
Die Definition der Zielzelle
Die Suche nach dem geeigneten Vektor
Retrovirale Vektoren
Adenovirale Vektoren
AAV-Vektoren
Liposomale Vektoren
Nackte DNA
Gentherapie im weiteren Sinne
Antisense-Oligonukleotide
Ribozyme
Gene Targeting
Potentielle klinische Anwendungen
Hereditäre Krankheiten
AIDS
Maligne Krankheiten
Ausblick
434
435
436
437
439
439
439
440
440
440
441
444
446
446
448
448
450
9
Molekulare Medizin: ein ethisches Problem?
451
9.1
Molekulare Erforschung des Menschen
451
9.2
Gentherapie
453
9.3
Keimzellmanipulation beim Menschen
454
9.4
9.4.1
9.4.2
9.4.3
Molekulargenetische Diagnostik
Einzelfallbezogene Diagnostik
Screening-Programme
Ethische Prinzipien der genetischen Diagnostik
455
455
456
459
10
Glossar
461
Register
487