Dissertation Ariane Dienst FINAL ohne Lebenslauf (2)
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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I Hämatologie und Onkologie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Funktionelle Charakterisierung und präklinische Evaluierung des rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF zur selektiven Okklusion von Tumorblutgefäßen und Optimierung der Effektorfunktion via Molecular Modelling Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Ariane Dienst aus Krefeld promoviert am 12. Juni 2013 Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I Hämatologie und Onkologie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Funktionelle Charakterisierung und präklinische Evaluierung des rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF zur selektiven Okklusion von Tumorblutgefäßen und Optimierung der Effektorfunktion via Molecular Modelling Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Ariane Dienst aus Krefeld promoviert am 12. Juni 2013 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2013 Druck: Hundt Druck GmbH, Köln Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. M. Koch Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin / eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 01.10.2012 1 2 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau Dr. med. C. Gottstein größtenteils von mir selbst ausgeführt worden. Einige Experimente wurden mit Unterstützung von Frau Dr. med. C. Gottstein und der biologisch-technischen Assistentin Frau M. Unruh durchgeführt. Die histologische und immunhistologische Aufarbeitung erfolgte durch die biologisch-technische Assistentin Frau M. Unruh bzw. durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Universität zu Köln. Die histologische Auswertung wurde von Frau Dr. med. C. Gottstein und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln) vorgenommen. 3 4 Danksagung Mein Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Andreas Engert. Besonders bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. med. Claudia Gottstein für die Überlassung des interessanten Themas dieser Arbeit und die hervorragende Betreuung. Ich danke ihr für die unermüdliche Unterstützung in scheinbar aussichtslosen Situationen, für die Bereitschaft mir jederzeit mit hilfreichen Ratschlägen, Ideen und Denkanstößen zur Seite zu stehen und für die Möglichkeit der Teilnahme an wissenschaftlichen Kongressen. Des Weiteren bedanke ich mich bei ihr für die Durchsicht und hilfreichen Anmerkungen zum Manuskript dieser Arbeit. Insbesondere nach ihrem Umzug in die USA und der damit verbundenen Ferne zwischen uns weiß ich das Zustandekommen dieser Arbeit sehr zu schätzen. Ganz herzlich möchte ich mich beim gesamten Team der Arbeitsgruppe für die freundliche Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbereitschaft bedanken. Mein Dank gilt Maike Unruh, Frau Dr. Andrea Grunow, Aiko Ferrari, Jana Seiffert, Samir Tawadros und Berit Rabausch. Des Weiteren bedanke ich mich bei den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. J. Fries und Tanja Roth, für die histologisch Aufarbeitung und Auswertung der Organschnitte. Mein Dank gilt nicht zuletzt meinen Eltern, die mich während meiner gesamten Ausbildung unterstützten und ohne deren Hilfe und Rückhalt mein Studium und die Promotion wohl kaum möglich gewesen wären. Außerdem bedanke ich mich bei Roland Schmidt, der immer für mich da war und mir die Freiräume gegeben hat, die ich für die Arbeit an dieser Promotion benötigte. 5 6 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 Angiogenese 19 Tumor-Angiogenese 20 Antiangiogenetische Therapie 20 Inhibition von Wachstumsfaktoren: Bevacizumab 21 Direkte Endothelzellinhibitoren: Endostatin 22 Inhibitoren von Integrinen: Cilengitide 22 Hindernisse bei der klinischen Entwicklung von AngiogeneseInhibitoren 23 Zielgerichtete antivaskuläre Agenzien 24 Vaskulär disruptive Agentien (VDAs) 25 Selektive Vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs) 26 Biochemische Konstrukte 27 Rekombinante Fusionsproteine 28 VCAM-1 32 Gerinnungsbiologie 34 Die Gerinnungsaktivierung 34 Tissue Factor (TF) und Truncated Tissue Factor (tTF) 36 TF-Expression auf Zellen 37 Zirkulierender TF 38 TF-Signaling 39 Faktor VII 39 Der FVIIa/TF-Komplex 39 Der prokoagulatorische Status bei Krebspatienten 41 Fragestellung 42 Herstellung des rekombinanten SVOA anti-VCAM-tTF-Prototyps und funktionelle Charakterisierung in vitro und in vivo 42 Untersuchung der molekularen Mechanismen der Koagulationsinduktion von TF-Fusionsproteinen und Verbesserung der Effektorfunktion via Molecular Modelling 43 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.2.1 1.4.2.2 1.5 1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.2.1 1.6.2.2 1.6.2.3 1.6.3 1.6.4 1.6.5 1.7 1.7.1 1.7.2 19 2 Material und Methoden 45 2.1 2.1.1 2.1.1.1 2.1.1.2 2.1.1.3 2.1.1.4 2.1.1.5 2.1.1.6 2.1.1.7 Material Reagenzien / Chemikalien Koagulationsfaktoren Molekularbiologische Reagenzien Sequenzierungsprimer (Oligonukleotide/Primer) Das Expressionsplasmid pswc4 Andere Reagenzien Selbst hergestellte Puffer und Lösungen Reagenzien- Kits 45 45 45 46 46 47 48 48 50 7 8 2.1.2 2.1.3 2.1.3.1 2.1.3.2 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.1.7 2.2 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.4 2.2.1.5 2.2.1.6 2.2.1.7 2.2.1.8 2.2.1.9 2.2.1.10 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.4.1 2.2.4.2 2.2.4.3 2.2.4.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.8.1 2.2.8.2 2.2.9 2.2.9.1 2.2.9.2 2.2.9.3 2.2.10 2.2.10.1 Antikörper 50 Zellkultur-Materialien 50 Zelllinien 50 Zellkulturmedien und Zusätze 52 Bakterienstämme (Escherichia coli) 52 Geräte 52 Verbrauchsmaterial 53 Versuchstiere 54 Methoden 54 Molekularbiologische Techniken 54 DNA-Präparation mittels QIAGEN Plasmid Mini-, Midi- und Maxi-Kit 54 DNA-Restriktionsspaltung 54 DNA-Extraktion: QIAEX II Agarose Gel Extraktion 55 DNA-Präzipitation 55 Bestimmung der DNA-Konzentration mittels AbsorptionsSpektrometrie 56 Sequenzanalyse 56 Primer-Duplex Insertion 57 Polymerasekettenreaktion zur Herstellung der tTF-Fragmente und der längeren Linker 58 Ligation PCR- und Restriktionsfragmente in Expressionsplasmid 58 Hitzeschock-Transformation 59 Proteinexpression 59 Proteinaufreinigung 60 Protein-Analyse 61 Protein-Konzentrationsbestimmung mittels Biuret-Reaktion 61 Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer und Gelelektrophorese 61 Gelfiltration und Endotoxinbestimmung 61 SDS-Gel-Elektrophorese mit dem Phast-System 61 Western-Blot 63 Durchflusszytometrie 64 Affinitätsmessung mit dem Biacore®-System 64 Koagulationstests 65 Zellfreier Koagulationstest 65 Zellgebundener Koagulationstest 66 Zellkultur 66 Kultivierung der Zellen 66 Ablösen der adhärenten Zellen 66 Bestimmung der Zellzahl 67 Tierversuche 67 Therapeutische in vivo Experimente mit anti-VCAM-1-tTF 67 9 10 2.2.11 2.2.12 Proteinstruktur-Homologie-Modelling Statistische Analyse 69 69 3 Ergebnisse 70 3.1 Herstellung und Charakterisierung des rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF 70 Proteinexpression und Aufreinigung 70 Biochemische Charakterisierung 70 Funktionelle Charakterisierung in vitro 73 Bindungsstudien 73 Koagulations-Induktion 74 Therapeutische Studien in vivo mit rekombinantem Fusionsprotein 76 Kurzzeit-Experimente 76 Langzeit-Experimente 78 Verträglichkeit des Fusionsproteins 84 Molekulare Mechanismen der Koagulationsinduktion durch tTFFusionsproteine 90 Einfluss von Phospholipiden 90 Einfluss der elektrischen Ladung der Endotheloberfläche 92 Testung von Saponin 92 Testung von LPS 94 Testung verschiedener H2O2-Konzentrationen mit und ohne Phospholipide 95 Einfluss anderer Gerinnungsfaktoren auf die FaktorXAktivierung 97 Testung von Faktor IX 97 Testung der Faktor VII-Aktivierung 98 Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation 100 Andere Faktoren 102 Testung unterschiedlicher Zellmengen 102 Testung verschiedener Inkubationszeiten 102 Verbesserung der Effektorfunktion durch optimierte dreidimensionale Ausrichtung des tTF-Moleküls zur ZellmembranOberfläche (Molecular Modelling) 104 Vorhersage der Proteinstruktur mit dem SWISS-Model 105 Klonierungsstrategie für Fusionsprotein-Varianten 105 Klonierung der neuen Fusionsprotein-Varianten 106 Modifikation der Linker 106 Modifikation des tTF-Anteils 107 Einfügen des MK27-scFv 110 Expression und Aufreinigung der neuen FusionsproteinVarianten 111 In-vitro-Charakterisierung der neuen Fusionsprotein-Varianten 113 Bindung 113 Koagulations-Induktion 114 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.4 3.1.4.1 3.1.4.2 3.1.4.3 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.2.1 3.2.2.2 3.2.2.3 3.2.3 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.4 3.2.5 3.2.5.1 3.2.5.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.3.1 3.3.3.2 3.3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.5.1 3.3.5.2 11 12 3.3.6 Vergleichende Analyse der neuen Fusionsproteine 115 4 Diskussion 124 4.1 4.2 Charakterisierung des Prototyps 124 Verbesserung der Effektorfunktion durch Molecular Modelling 131 5 Zusammenfassung 134 6 Literaturverzeichnis 136 7 Vorabveröffentlichung von Ergebnissen 152 8 Lebenslauf 153 13 14 Abkürzungsverzeichnis Å Angström aa Aminosäuren Aqua dest. Aqua destillata BED biologisch effektive Dosis BSA bovines Serumalbumin C Celsius CD Cluster of Differentiation CEP Circulating Endothelial Progenitors ddH20 doppelt destilliertes Wasser ddNTP Didesoxyribonukleosid-Triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonat DLT Dosis-limitierende Toxizität DMXAA 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosid-Triphosphate ED-B Extra Domain-B (von Fibronektin) EGF Epidermal-Growth-Factor (-artige Domäne) EGR-1 Early Growth Response-1 FAA Flavone Acetic Acid (Flavonoide) Fab Fragment antigen binding FACS Fluorescence activated cell sorting FCS Fötales Kälberserum FGF Fibroblast Growth Factor g Erdbeschleunigung Gla (γ-)Carboxyglutaminsäure (-reiche Domäne) GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor HBDt Heparin Binding Domain H&E Hämatoxylin & Eosin HGF Hepatocyte Growth Factor HIF Hypoxia-Inducible Transcription Factor His Histidin HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ICAM Intercellular Adhesion Molecule IGF Insulin-like Growth Factor IgG Immunglobulin G 15 IL Interleukin IP-10 Interferon-inducible Protein-10 Kb Kilobase kDa Kilodalton KT Koagulationstest LPS Lipopolysaccharide M Mol µg Mikrogramm MHC Major Histocompatibility Complex ml Milliliter mM Millimol MMP Matrix-Metalloproteinase MTD maximal tolerierte Dosis MTID minimale Ziel-hemmende Dosis ng Nanogramm NGF Nerve Growth Factor NF- κB nukleärer Transkriptionsfaktor κB NiNTA Nickel-Nitrilotriessigsäure NK Natürliche Killer (-Zellen) nm Nanometer NSCLC Non Small Cell Lung Cancer (Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom) OmpA Outer Membrane Protein-A PAR-2 Protease-activated-Receptor-2 PBS Phosphate buffered Saline PCR Polymerase-Kettenreaktion PECAM Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PL Phospholipide PS Phosphatidylserin PSMA Prostata-spezifisches Membran-Antigen RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur scFv single chain variable fragment SCID Severe Combined Immunodeficiency SDS-PAGE Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese sec Sekunden SPR Surface Plasmone Resonance 16 SVOA Specific Vascular Occluding Agents (Spezifische vaskuläre Okklusion induzierende Agenzien) TBE TRIS-Borat-EDTA (-Puffer) TF Tissue Factor TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α tTF trunkierter Tissue Factor USPIO Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide V Volt VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 VDA Vaskulär disruptive Agentien VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor VLA-4 Very Late Antigen-4 Vs. versus VTA Vascular Targeting Agent (zielgerichtetes antivaskuläres Agenz ) ZKT Zell-Koagulationstest 17 18 1 Einleitung 1.1 Angiogenese Ein entscheidender Faktor für das Überleben von Zellen in einem Organismus ist die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen und der Abtransport von Abfallprodukten über die Blutgefäße. Da die maximale Diffusionsstrecke für Sauerstoff bei 100-200 µm liegt, wird dieser kritische Abstand der Zellen zu den Kapillargefäßen in normalen Geweben in der Regel nicht unterschritten (Carmeliet 2000). Damit ein Gewebeverband diese Größe überschreiten kann, müssen neue Blutgefäße generiert werden. Diesen Prozess nennt man Vaskulo- und Angiogenese. Er wird reguliert durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht von pro- und antiangiogenetischen Faktoren. Die Vaskulogenese ist definiert als die de-novo-Formation neuer Blutgefäße aus endothelialen Vorläuferzellen (Madeddu 2005). Diese spielt eine wesentliche Rolle bei der Embryogenese und bei der postnatalen Neovaskularisation, die durch Verletzung, Ischämie oder Krebs getriggert wird. Die endothelialen Progenitoren stammen beim Embryo aus dem Mesoderm und bei der postnatalen Angiogenese aus dem Knochenmark. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ist ein zentraler Wachstumsfaktor in der Vaskulo- und Angiogenese. Als Angiogenese im engeren Sinne bezeichnet man die Entstehung neuer Gefäße durch Aktivierung existierender Endothelzellen, die proliferieren und migrieren. Dabei unterscheidet man Aussprossen und Intussuszeption (Teilen eines Gefäßes in mehrere Tochtergefäße). Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung verschiedener physiologischer und pathologischer Bedingungen, wie zum Beispiel bei der endometrialen Proliferation während des weiblichen Reproduktionszyklus, bei der Wundheilung, bei der postischämischen Regeneration und auch beim Tumorwachstum. Die Angiogenese läuft in verschiedenen Phasen ab: (I) Vasodilatation und Extravasation von Plasmaproteinen, die ein provisorisches Gerüst für migrierende Endothelzellen bilden; (II) Destabilisierung des Gefäßes und Unterbrechung der interzellulären Kontakte zwischen den Endothelzellen und Ablösung von der Basalmembran unter Mitwirkung von extrazellulären Matrix-Metalloproteinasen (MMPs); (III) Migration von Endothelzellen und Formation eines Gefäßstranges mit anschließender Bildung eines Lumens; (IV) Stabilisierung und Remodellierung der neu geformten Gefäße in ein dreidimensionales Netzwerk; und (V) Regression überflüssiger Mikrogefäße. Im Rahmen einer reduzierten Perfusion wird durch die resultierende Hypoxämie intrazellulärer HIF (Hypoxia-Inducible Transcription Factor) stabilisiert, der die Generierung verschiedener endothelialer Wachstumsfaktoren induziert. Schlüsselmoleküle der physiologischen und pathophysiologischen Angiogenese sind VEGF und Angiopoeitine. Weitere endotheliale Wachstumsfaktoren sind FGF (Fibroblast Growth Factor), HGF (Hepatocyte Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor), Neurotrophine wie z.B. 19 NGF (Nerve Growth Factor), Chemokine wie z.B. GM-CSF (Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor) und Transkriptionsfaktoren wie z.B. EGR-1 (Early Growth Response-1). Neben den Angiogenese-stimulierenden Faktoren gibt es auch hemmende Substanzen. Als wichtigster Vertreter sei hier das Thrombospondin-1 zu nennen. 1.2 Tumor-Angiogenese 1971 beschrieb Folkman die Abhängigkeit des Tumorwachstums und der Metastasierung von der Angiogenese (Folkman 1971). Den Beweis dieses Prinzips führten Gimbrone et al. 1972 in folgendem Experiment: Tumorfragmente wurden in die Kornea von Kaninchenaugen implantiert, also in einen Ort, der normalerweise nicht vaskularisiert ist. Die Implantate führten innerhalb weniger Tage zum Einsprießen neuer Kapillaren aus dem Limbus, um die expandierenden Tumoren zu vaskularisieren. Wurden die Kapillaren physikalisch am Erreichen des Implantates gehindert, so führte dieses zu einer Hemmung des Tumorwachstums. Der Durchmesser dieser Tumoren erreichte dann nur 0,4 mm. Hanahan und Weinberg fassten die grundlegenden Eigenschaften von Krebszellen zusammen und hoben die Fähigkeit zur Induktion von Angiogenese als eines der Wesensmerkmale von Krebs hervor. Die anderen Unterscheidungsmerkmale von Tumorzellen zu normalen Zellen sind autonome Wachstumssignale, Resistenz gegenüber wachstumshemmenden Signalen, Umgehung der Apoptose, unlimitiertes replikatives Potenzial und Fähigkeit zur Gewebsinvasion und Metastasierung (Hanahan 2000). Tumore können generell nur bis zu einer Größe von 1-2 mm wachsen, ohne ein eigenes Gefäßnetzwerk zu induzieren. Ein weiteres Wachstum erfordert Angiogenese. Diesen Schritt bezeichnet man als „angiogenic switch“ (Hanahan 1996). Dabei wird das Gleichgewicht, das zwischen Angiogenese-induzierenden und Angiogenese-hemmenden Faktoren herrscht, verschoben. Ein Mechanismus hierzu ist die veränderte Gentranskription. So findet man zum Beispiel in vielen Tumoren eine erhöhte VEGF- und FGF-Expression im Vergleich zum normalen Gewebe. In anderen Tumoren ist die Expression von Thrombospondin-1 herunterreguliert. 1.3 Antiangiogenetische Therapie Die Beobachtung, dass ein Entfernen des Primärtumors oft in einer vermehrten Metastasenbildung resultiert, führte zur Entdeckung der natürlich vorkommenden Angiogeneseinhibitoren Angiostatin und Endostatin (O’Reilly 1994). Eine Anwendung natürlicher oder synthetischer Angiogeneseinhibitoren zur Behandlung von Tumoren und Prävention von Metastasen erschien daher plausibel. Ein Vorteil der antiangiogenetischen Therapie sollte die verringerte Toxizität im Vergleich zu Chemotherapeutika sein. Ein anderes Motiv, die Gefäße statt der Tumorzellen ins Visier 20 zu nehmen, war, dass man unter Umständen die Entwicklung der Chemotherapie-Resistenz umgehen könnte, da Endothelzellen als nicht-maligne Zellen genetisch stabiler sind als Tumorzellen (Verheul 2005). Es stellte sich jedoch heraus, dass auch antiangiogenetische Substanzen zu einer Resistenzbildung führen können, da die Verabreichung in der Regel über viele Jahre erfolgt (Azam 2010). Weitere Vorteile der antiangiogenetischen Therapie sind: die direkte Zugänglichkeit der Tumorendothelzellen für die intravenös verabreichten Substanzen; der verstärkende Effekt des Verschlusses eines einzelnen Gefäßes, da eine einzelne Kapillare eine Vielzahl von Tumorzellen mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt; und des Weiteren sollte sich diese Strategie auf verschiedenste Tumorentitäten anwenden lassen, da deren Blutgefäße im Allgemeinen dieselben morphologischen und biochemischen Eigenschaften aufweisen (Thorpe 2000). Es findet sich eine Vielzahl antiangiogenetischer Substanzen in der klinischen Erprobung und Anwendung. Grundsätzlich lassen sich die antiangiogenetischen Substanzen nach ihrem Wirkungsmechanismus in vier Gruppen einteilen: (1) Inhibitoren der Signalwege von Wachstumsfaktoren; (2) direkte Inhibitoren des endothelialen Zellzyklus; (3) Substanzen, die in die endotheliale Zelladhäsion eingreifen, wie zum Beispiel Integrininhibitoren; und (4) andere Substanzen. Ich möchte im Folgenden nur auf einzelne Beispiele für die ersten drei Gruppen eingehen. 1.3.1 Inhibition von Wachstumsfaktoren: Bevacizumab Bevacizumab ist ein humanisierter anti-VEGF-Antikörper. VEGF ist ein PhosphotyrosinkinaseRezeptor, dessen Aktivierung unter anderem zur Proliferation, Migration und Überleben von Endothelzellen führt. In präklinischen Experimenten zeigte der murine Vorläuferantikörper in der Monotherapie eine Hemmung des Tumorwachstums und der Metastasierung in verschiedenen Tumormodellen, darunter Brust-, Kolon- und Nierentumoren. Des Weiteren führte der Antikörper zu einer reduzierten Tumorvaskularität und zu einer erhöhten Perfusion der verbleibenden Blutgefäße. Diese Normalisierung der Tumorgefäße könnte theoretisch die Verabreichung konventioneller Therapeutika erleichtern (Jain 2005). In einer großen Phase-III-Studie mit über 800 Patienten mit fortgeschrittenem Kolonkarzinom wurde die Kombinationstherapie (Irinotecan, 5-Fluorouracil, Leukovorin und Bevacizumab) gegen die alleinige Chemotherapie getestet. Mit der Kombinationstherapie verbesserte sich das Gesamtüberleben statistisch signifikant von 15,6 Monaten auf 20,3 Monate (Hurwitz 2004). Ebenso verbesserten sich das Gesamtansprechen (34,8 % versus 44,8 %) und die Dauer des Ansprechens (7,1 versus 10,4 Monate). Diese Studie führte zur Zulassung von Bevacizumab als erster Angiogeneseinhibitor. Die häufigsten Nebenwirkungen von Bevacizumab sind Hypertension, Proteinurie, Thrombosen, gastrointestinale Blutungen und Leukopenie. Die Substanz wird heute als Standard in der Firstline-Kombinationstherapie des fortgeschrittenen kolorektalen Karzinoms, 21 des Bronchialkarzinoms (NSCLC), des metastasierten Mammakarzinoms und des metastasierten Nierenzellkarzinoms eingesetzt (Jackson 2008, Socinski 2007, Bukowski 2010) und ist in den USA darüber hinaus zugelassen für die Behandlung des Glioblastoms. Des Weiteren werden Studien mit Bevacizumab bei Patienten mit Kopf-und-Hals-Tumoren (Seiwert 2008), Pankreaskarzinomen (Burris 2008) und anderen Entitäten durchgeführt. Weitere zugelassene Tyrosinkinase-Inhbitoren mit antiangiogenetischem Potenzial sind Erlotinib, Sorafenib und Sunitinib. 1.3.2 Direkte Endothelzellinhibitoren: Endostatin Endostatin wurde 1997 von Folkman als natürlich vorkommende antiangiogenetische Substanz identifiziert. In-vitro-Studien mit Endostatin belegten eine Hemmung der Proliferation und Migration von Endothelzellen, eine Induktion der epithelialen Apoptose und einen ZellzyklusArrest. Endostar® ist ein rekombinantes humanes Endostatin, welches in China entwickelt und hauptsächlich dort in verschiedenen Studien bei Lungenkarzinomen und anderen soliden Tumoren in Kombination mit einer Chemotherapie getestet wurde (Han 2011, Li 2010, Zhou 2011, Zhao 2011). In der randomisierten, Placebo-kontrollierten Studie von Han et al. wurden 126 Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom entweder mit Paclitaxel/Carboplatin plus Placebo oder mit Paclitaxel/Carboplatin plus Endostatin behandelt. Dabei zeigte sich ein signifikant verbessertes Ansprechen (39,3 % versus 23 %) für die EndostatinGruppe. Die Unterschiede im Progressions-freien Überleben und im Gesamt-Überleben erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Bemerkenswert ist, dass eine auf dem ASCO 2005 präsentierte Phase-III-Studie (Sun 2005), die für Endostar® gegen Placebo in Kombination mit Cisplatin/Vinorelbin bei fast 500 Patienten mit fortgeschrittenem, nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom ein hochsignifikant verbessertes Ansprechen ergeben hatte, bisher nicht als englischsprachige Vollpublikation erschienen ist (Möhle 2010). Diese Studie führte zur Zulassung von Endostar® in China für die Behandlung nicht-kleinzelliger Bronchialkarzinome. 1.3.3 Inhibitoren von Integrinen: Cilengitide Cilengitide ist ein Inhibitor der endothelialen Oberflächenrezeptoren ανβ3 und ανβ5 (Friess 2006). Diese Integrine dienen der Adhäsion von Endothelzellen an der extrazellulären Matrix. Im Tiermodell führte Cilengitide zur Hemmung von Tumorwachstum. In ersten Phase-I-Studien bei Patienten mit refraktären Gehirntumoren und malignen Gliomen zeigte die Substanz eine Wirkung (MacDonald 2008, Nabors 2007). In einer Phase-II-Studie bei Patienten mit fortgeschrittenem Pankreaskarzinom, die Gemcitabin plus Cilengitide mit Gemcitabin allein verglich, konnte 22 kein signifikanter Unterschied im Gesamt-Überleben, Progressions-freien Überleben oder Gesamt-Ansprechen zwischen den beiden Gruppen gesehen werden (Friess 2006). Aktuell wird Cilengitide in einer Phase-III-Studie bei Patienten mit neu diagnostiziertem Glioblastom untersucht (Stupp 2010). 1.3.4 Hindernisse bei der klinischen Entwicklung von Angiogenese-Inhibitoren Bei der Einführung der Angiogenese-Inhibitoren in die klinische Praxis gibt es immer noch zahlreiche Hürden zu überwinden (Verheul 2005). Zunächst galt es zu akzeptieren, dass solche Substanzen zu keiner schnellen und kompletten Remission führen. Ziel ist es vor allem, ein Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern. Das Design klinischer Studienprotokolle zur Evaluation von Chemotherapeutika kann nicht unverändert übernommen werden. In den klassischen Protokollen für Chemotherapie-basierte Phase-I- und Phase-II-Studien wurde eine mindestens 25%ige Reduktion des Tumorvolumens zur Fortführung der Studien verlangt. Bei Studien zu Angiogenese-Inhibitoren akzeptiert man eine 20%ige Progression der Erkrankung als Stable Disease. Traditionelle Phase-I-Studien dienen der Findung der maximal tolerierten Dosis (MTD) und der Dosis-limitierenden Toxizität (DLT), da für herkömmliche Chemotherapeutika eine direkte Korrelation zwischen Dosis, Aktivität und Toxizität existiert (Sarmiento 2008). Für antiangiogenetische Substanzen gibt es hingegen keine lineare Beziehung zwischen Dosis und Aktivität, jedoch steigt die Toxizität mit der Dosis. Es wurde vorgeschlagen, durch pharmakokinetische Studien einen sogenannten Ziel-Effekt zu identifizieren, um die biologisch effektive Dosis (BED) bzw. die minimale Ziel-hemmende Dosis (MTID) und das optimale Behandlungsschema zu finden. Des Weiteren wurden neue Methoden zur Evaluation der Medikamentenaktivität eingeführt, so zum Beispiel die Quantifizierung von angiogenen Wachstumsfaktoren, Messung der Tumorperfusion durch dynamische kontrastverstärkte Kernspintomographie und Quantifizierung der zirkulierenden Endothelzellen. Keine dieser Methoden kann aber verlässlich ein Ansprechen vorhersagen, so dass für Phase-II- und Phase-III-Studien das Gesamt-Überleben, die Zeit bis zum Progress und das Progressions-freie Überleben sinnvolle Endpunkte darstellen. Für Phase-IIIStudien mit antiangiogenetischen Substanzen spielt auch die Selektion der Patienten eine bedeutende Rolle. Die molekulare Charakterisierung des Tumors könnte in Zukunft ein wichtiges Stratifikations-Merkmal sein. Ein weiteres Problem im Studiendesign ist, dass Patienten mit großer Tumormasse, mit zahlreichen chemotherapeutischen Vortherapien und einer Chemotherapie-refraktären Erkrankung wahrscheinlich kaum von einer antiangiogenetischen Therapie profitieren werden. Möglicherweise ist deshalb eine Evaluation der antiangiogenetischen Substanzen in einem adjuvanten Setting ein guter Ansatz. 23 1.4 Zielgerichtete antivaskuläre Agenzien Das Konzept der zielgerichteten antivaskulären Agenzien (Vascular Targeting Agents, VTAs) wurde in den frühen 80er Jahren von Juliana Denekamp vorgestellt (Denekamp 1982). Der Unterschied der VTAs zu den antiangiogenetischen Substanzen besteht darin, dass nicht die Ausbildung neuer Gefäße verhindert wird, sondern dass auch bestehende Tumorblutgefäße angegriffen werden. Diese Medikamente wirken daher auch bei Tumoren, die bereits ein ausgereiftes Gefäßnetz gebildet haben. VTAs verursachen einen Gefäßverschluss und konsekutiv eine Ischämie und Nekrose im Tumor. Sie wirken schneller als Angiogeneseinhibitoren, sind nicht für eine chronische Gabe konzipiert und könnten daher mit einer verringerten Resistenzbildung einhergehen. In einer Proof-of-Principle-Studie zu diesem Ansatz wurde im Mausmodell durch Transfektion ein experimenteller Tumorendothelmarker geschaffen, an den ein Ricin-konjugierter Antikörper binden konnte, was dann zur Okklusion der Gefäße mit konsekutivem Tumorregress führte (Burrows 1993). In nachfolgenden Studien fand man einen auf Tumorblutgefäßen selektiv hochregulierten Marker, das Endoglin, welches als Ziel für ein Immuntoxin (Konjugat aus Antikörper und intrazellulär wirkendem Toxin) diente (Burrows 1995). Andere Arbeitsgruppen verwendeten dann Konjugate von VEGF und Diphtherietoxin (Arora 1999), Endoglin und Ricin (Matsuno 1999) oder CD44-Antikörper und dem Zytostatikum Neocarcinostatin (Tsunoda 1999). Für diese Konstrukte konnte im Tiermodell eine Antitumoraktivität nachgewiesen werden. VTAs verursachen das charakteristische Muster einer ausgedehnten zentralen Nekrose in experimentellen Tumoren, die sich bis auf 95% der Tumormasse belaufen kann. In der Peripherie verbleibt jedoch meist eine schmale Randzone mit lebenden Tumorzellen. Dies ist dadurch zu erklären, dass die Tumorzellen im Randgebiet von normalen Blutgefäßen (mit)versorgt werden, welche auf die VTAs nicht ansprechen, aber wiederum für konventionelle Therapeutika zugänglich sind. Auf dieser Grundlage kann man sich einen synergistischen Effekt vorstellen, wenn man VTAs mit Chemotherapeutika kombiniert. Der vitale Ring von Tumorzellen nach VTA- Therapie stellt ein zentrales Problem dieser Medikamentengruppe dar, da die Tumoren von diesen Zellen ausgehend sehr schnell nachwachsen können. Es gibt mittlerweile vermehrt Anhaltspunkte dafür, dass dieses aggressive Neuwachstum durch Vaskulogenese unterstützt wird, das heißt von einwandernden endothelialen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (Daenen 2009). Dementsprechend konnte im Tierversuch eine Hemmung der Vaskulogenese die Ausdehnung dieses vitalen Rings drastisch verkleinern. Man unterscheidet zwei Untergruppen von VTAs: Vaskulär disruptive Agentien (VDAs) und spezifische vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs). Die Mehrzahl der VDAs ist nicht mit einem spezifischen Liganden versehen, sondern macht sich die pathophysiologischen Unterschiede zwischen dem Endothel normalen Gewebes und dem des Tumorgewebes zu Nutze. Solche Unterschiede, die das Tumorendothel auszeichnen, sind beispielsweise eine erhöhte 24 Proliferationsrate, eine erhöhte Permeabilität und die Abhängigkeit des Tubulin-Zytoskelettes zur Aufrechterhaltung der Zellform. Im Gegensatz hierzu binden Liganden-gerichtete VTAs selektiv an Moleküle, die vermehrt oder ausschließlich auf Tumorblutgefäßen exprimiert sind. 1.4.1 Vaskulär disruptive Agentien (VDAs) VDAs sind entweder Mikrotubuli-destabilisierende Substanzen oder Flavonoide (Hinnen 2007). Erstere binden an die Colchicin-Bindungsstelle des endothelialen Tubulins, woraufhin es zur Depolymerisation der Mikrotubuli kommt. Die Zerstörung des Zytoskeletts führt zu einer Konfirmationsänderung der Endothelzellen und daraufhin zu einer Reduktion des Blutflusses in den Gefäßen. Des Weiteren konnte für einen typischen Vertreter dieser Gruppe, das Combretastatin A4 Phosphat (CA4P), gezeigt werden, dass zusätzlich der VE-Cadherin/β-Catenin-Komplex zerstört wird. Dadurch kommt es zur Lösung von Zell-Zell-Kontakten, welches zum Einen eine Permeabilitätssteigerung verursacht, was den interstitiellen Druck erhöht und zur weiteren Reduktion des Blutflusses führt. Zum Anderen resultiert die Exposition der Basalmembran in einer Aktivierung der Koagulationskaskade mit nachfolgender Thrombusbildung. In diese Gruppe der Mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen fallen folgende Moleküle: das bereits erwähnte Combretastatin A4 Phosphat, AVE8062, ZD6126, ABT-751, MN-029 und TZT-1027. Diese Substanzen befinden sich alle in der klinischen Prüfung. Beispielhaft möchte ich auf die veröffentlichten Studien mit ABT-751 eingehen. ABT-751 ist ein Sulfonamidmolekül, welches über den oben bereits erwähnten Wirkungsmechanismus zur Depolymerisation der Mikrotubuli der Endothelzellen führt. Es kann in oraler Form verabreicht werden und hat in verschiedenen Tumormodellen eine signifikante Antitumor-Aktivität gezeigt. In verschiedenen Phase-I-Studien mit Patienten mit soliden Tumoren und akuten Leukämien bzw. myelodysplastischen Syndromen zeigten sich folgende häufigste Nebenwirkungen: Ileus, Obstipation, abdominelle Schmerzen, Dehydrierung und Müdigkeit. In einer Studie mit 39 Patienten mit soliden Tumoren erreichte ein Patient eine Minor Response und vier Patienten eine Stable Disease für mindestens sechs Monate (Hande 2006). In einer Phase-II-Studie mit 35 Patienten mit fortgeschrittenem, Taxan-refraktärem Bronchialkarzinom (NSCLC) erreichte ein Patient eine partielle Remission, die auch 567 Tage nach der initialen Dokumentation noch anhielt (Mauer 2008). Die mediane Zeit bis zur Tumorprogression bzw. das Gesamtüberleben betrugen 2,1 bzw. 8,4 Monate. Diese Ergebnisse sind vergleichbar zu anderen Substanzen, die bei diesem Patientenkollektiv als wirksam gelten. Die zweite Gruppe der VDAs sind die Flavonoide FAA (Flavone Acetic Acid) und DMXAA (5,6Dimethylxanthenone-4-acetic acid). FAA ist ein synthetisches Flavonoid, welches in experimentellen Tumoren eine beeindruckende Aktivität zeigte, sich jedoch in Tumorpatienten als zu toxisch erwies. Dies führte zu der Entwicklung des FAA-Analoges DMXAA, das auch als 25 ASA404 oder Vadimezan bezeichnet wird. Flavonoide haben einen dualen Wirkmechanismus mit sowohl direkter als auch indirekter antivaskulärer Aktivität (McKeage 2010). Zum Einen induzieren diese Substanzen direkt die Apoptose von Tumor-Endothelzellen. Das Absterben der Endothelzellen führt zur Exposition der Basalmembran, zur Ruptur der Tumor-Blutgefäße und zur Extravasation von Erythrozyten in das umliegende Gewebe. Zum Anderen verursachen Flavonoide indirekt eine Tumor-Gefäßschädigung, indem sie die intratumorale Konzentration von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), anderer Zytokine, wie Interferon-γ und Interferon-inducible Protein-10 (IP-10), und Stickstoffmonoxid erhöhen. Dabei scheint TNF-α die wichtigste Rolle zu spielen. Es induziert den Kollaps von Blutgefäßen, führt zu einer gesteigerten vaskulären Permeabilität und reduziert den Tumor-Blutfluss. Es gibt außerdem Hinweise, dass Flavonoide die Phosphorylierung des Inhibitors des nukleären Transkriptionsfaktors κB (NF- κB) stimulieren, was zur Aktivierung der NF- κB-gesteuerten Gentranskription führt. Dadurch kommt es wahrscheinlich zur Umorganisation des Zytoskelettes mit der daraus resultierenden Änderung der Endothelzellkonfirmation. Es wurden mehrere Phase-I-Studien mit Patienten mit refraktären soliden Tumoren veröffentlicht (u.a. Jameson 2003, Rustin 2003, McKeage 2006). Die häufigsten Nebenwirkungen waren Harninkontinenz, visuelle Störungen, Hypertonie, Konfusion, Tremor und transiente QT-Zeit-Verlängerung. In zwei der Studien konnte jeweils eine partielle Remission beobachtet werden (n = 46 bzw. 63 Patienten). In drei randomisierten Phase-II-Studien (Gabra 2006, McKeage 2008, Pili 2007) wurde DMXAA bei Patienten mit Bronchial-, Ovarial- und Prostatakarzinomen mit konventionellen Chemotherapeutika kombiniert. In der Studie von McKeage et al. wurden Patienten mit unbehandeltem fortgeschrittenem Bronchialkarzinom (NSCLC) entweder mit der Standardtherapie (Carboplatin und Paclitaxel) allein oder in Kombination mit DMXAA behandelt. Dabei zeigte sich ein verbessertes Ansprechen (31 vs. 22 %), eine verlängerte Zeit bis zum Progress (5,4 vs. 4,4 Monate) und ein verbessertes medianes Überleben (14,0 vs. 8,8 Monate) für die DMXAA-Kombinationstherapie. Es wurden zwei große randomisierte Phase-III-Studien durchgeführt: ATTRACT-1, die DMXAA in Kombination mit Paclitaxel und Carboplatin als First-Line-Therapie bei NSCLC im Stadium IIIB/IV untersuchte, und ATTRACT-2, mit DMXAA in Kombination mit Chemotherapie als Second-Line-Therapie für fortgeschrittene NSCLC. Die beiden Studien wurden 2010 gestoppt, nachdem die Interims-Analysen zeigten, dass die primären Endpunkte eines verbesserten Überlebens nicht erreicht wurden (Lara 2011 und Novartis-Homepage 2010). 1.4.2 Selektive Vaskuläre Okklusion induzierende Agentien (SVOAs) 26 SVOAs erzeugen eine lokale Gerinnungsaktivierung und verschließen hierdurch selektive Gefäßbetten. Die Selektivität wird über einen Liganden-vermittelten Targeting-Mechanismus erreicht. Für die Tumortherapie werden zum Beispiel Antikörper oder Peptide, die selektiv an Marker oder antigene Strukturen der Tumorblutgefäße binden, eingesetzt (Thorpe 2004). Vaskuläre Tumormarker sind Moleküle, die selektiv auf dem Tumorendothel hochreguliert sind. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl solcher Moleküle identifiziert: Moleküle der Angiogenese und des vaskulären Umbaus; Zell-Adhäsions-Moleküle, die durch inflammatorische Zytokine induziert werden können; physiologischerweise intrazellulär lokalisierte Moleküle, die auf der Oberfläche von Tumorendothel lokalisiert werden konnten; und Moleküle, die mit den prothrombotischen Veränderungen des Tumorendothels einhergehen. In der Tab. 1.1 sind einige Beispiele angeführt. Tab. 1.1: Oberflächenmoleküle, die selektiv auf Tumorendothel hochreguliert sind (modifiziert nach Thorpe 2004 und Stevens 2008) Klasse Tumorendothel-Marker Angiogenese/vaskulärer Umbau VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) -Rezeptor αvβ3-Integrine PSMA-1 (Prostata-spezifisches Membran-Antigen) CD44-related Antigen (TES-23) Fibronectin ED-B Domain Endoglin Endosialin (TEM1, Tumor Endothel Marker) Matrix-Metallo-Proteinasen (MMP2, MMP9) Aminopeptidase N (CD13) Robo4 VCAM-1 (CD106) E-Selektin Interleukin-11-Rezeptor Phosphatidylserin Tissue Factor Annexin A1 Nucleolin Zelladhäsion/Inflammation Prothrombotische Faktoren Intrazelluläre Antigene, die auf Tumorendothel lokalisiert sind An die Targeting-Einheit der SVOAs wird ein Effektormolekül, wie trunkierter Tissue Factor (tTF), gekoppelt, das die Okklusion der Tumorblutgefäße vermittelt. Daneben können auch Effektoren anderer Klassen durch Liganden-gerichtete VTAs selektiv am Tumorendothel lokalisiert werden: Toxine, zytotoxische Substanzen, Apoptose induzierende Agenzien, Zytokine oder Radioisotope (Thorpe 2004). 1.4.2.1 Biochemische Konstrukte Huang et al. (Huang 1997) setzten erstmalig trunkierten Tissue Factor (tTF) mit einem gegen ein Antigen auf Tumorblutgefäßen gerichteten Antikörper ein. tTF ist der extrazelluläre Anteil des 27 Tissue Factors, welcher per se nicht an Membranen binden kann, und somit seine Kofaktorfunktion im extrinsischen Tenasekomplex (siehe unter 1.6) nicht erfüllen kann. Erst durch Kopplung an einen spezifisch an die Endothelzelloberfläche bindenden Antikörper wird die Fähigkeit zur Koagulationsinduktion wieder hergestellt. In dieser wegweisenden Arbeit diente ein artifiziell induziertes Tumorzellantigen (MHC-Klasse-II-Antigen I-Ad) als Ziel. Die Arbeitsgruppe präparierte einen bispezifischen Antikörper, der auf der einen Seite I-Ad bindet und auf der anderen Seite ein Epitop des tTF. Mit diesem Antikörper-tTF-Konstrukt wurden Mäuse mit subkutanen Neuroblastomen behandelt. Nach 30 Minuten waren alle Tumorblutgefäße thrombosiert. Nach 4 Stunden waren erste Tumorzellschäden zu sehen. Nach 24 Stunden zeigte der Tumor eine fortgeschrittene Nekrose und nach 72 Stunden war die gesamte zentrale Region des Tumors nekrotisch. 38 % der mit dem Koaguligand behandelten Mäuse zeigten eine komplette Regression des Tumors, bei 24 % konnte eine Größenreduktion um mehr als 50 % gesehen werden. Nachdem der prinzipielle Beweis erbracht war, dass tTF in Kombination mit einem spezifischen membranbindenden Liganden einen selektiven Gefäßverschluss auslösen kann, konjugierte dieselbe Arbeitsgruppe um Philip E. Thorpe tTF an einen Antikörper gegen einen klinisch relevanten Tumorendothelzellmarker (Ran 1998): VCAM-1 ist ein Antigen, welches auf Tumorblutgefäßen überexprimiert ist (siehe 1.5). tTF wurde hierbei kovalent an den Antikörper gebunden. Das Konstrukt wurde an einem Xenograft-Mausmodell mit subkutanen Tumoren aus einer humanen Hodgkin-Zelllinie (L540) getestet. Neun von 15 Mäusen, die behandelt wurden, zeigten eine mehr als 50%ige Größenreduktion des Tumors. 1.4.2.2 Rekombinante Fusionsproteine Ein Problem bei biochemischen Konstrukten ist, dass die genaue Lokalisation der chemischen Kopplung im Antikörper nur begrenzt kontrolliert werden kann. Chemische Kopplungsmethoden basieren meist auf einer Bindung an Amingruppen (wie in Lysin oder Arginin) oder an Sulfhydrylgruppen (wie in Cystein). Diese variieren in verschiedenen Antikörpern, so dass Lokalisation und Anzahl der Effektoren von Antikörper zu Antikörper unterschiedlich ist. Wie in Abschnitt 1.7 genauer besprochen, kann dies einen großen Einfluss auf die Effektivität TF-basierter Medikamente haben. Im Gegensatz hierzu erlaubt die rekombinante Herstellung von Fusionsproteinen eine einfache Produktion von definierten homogenen Proteinen mittels standardisierter molekularbiologischer Methoden. Gezielte Veränderungen der Struktur sind auf DNA-Ebene möglich (Molecular Modelling). Um SVOAs rekombinant herstellen zu können, wurde daher ein Klonierungs- und ExpressionsSystem entwickelt, welches modular aufgebaut ist und die rekombinante Herstellung von Fusionsproteinen mit Liganden gegen Tumorgefäßmarker ermöglicht (Gottstein 2001). Als Ligand 28 wurden sogenannte scFv (single chain variable fragment) Antikörper verwendet, das heißt Antikörper, welche lediglich aus der variablen Region der leichten und schweren Kette von Immunglobulin bestehen, und mit einem synthetischen Linker verbunden sind (siehe Abb. 1.1). Mit diesem System wurden rekombinante Immuntoxine und SVOAs gegen Endoglin, VEGF:VEGFRKomplex und VCAM-1 hergestellt, welche in vitro funktionell aktiv waren und in Pilotversuchen in vivo eine spezifische Koagulation von Tumorgefäßen auslösten. AntigenBindungsstelle AntigenBindungsstelle AntigenBindungsstelle Abb. 1.1: Strukturen verschiedener Antikörper-Formate. (A) Immunglobulin-G-Antikörper, (B) Fab-Fragment und (C) single chain Fv-Fragment (scFv). VH, variable Region der schweren Kette; VL, variable Region der leichten Kette; CH, konstante Region der schweren Kette; CL, konstante Region der leichten Kette. (Smith 2004) 29 Analog hierzu benutzten Nilsson et al. im Folgenden die ED-B-Domäne des Fibronektins als antigene Zielstruktur (Nilsson 2001). Sie stellten ebenfalls ein scFv-tTF-Fusionsprotein her, welches in verschiedenen Tumormausmodellen eine komplette Remission bei 30 % der Mäuse verursachte. Dies war ein unerwartetes Ergebnis, da Fibronektin ein extravaskuläres, extrazelluläres Matrixprotein ist, welches also nicht zu einer intravasalen Gerinnungsinduktion beitragen kann. Bei den subkutan gelegenen Tumoren sah man ein bis zwei Stunden nach Injektion des scFv-tTFFusionsproteins makroskopisch eine Schwarzfärbung. Dieser makroskopische Befund tritt auch bei Endotoxin-induzierten hämorrhagischen Thrombosen auf, welche entweder durch hohe Dosen Endotoxin oder durch geringe Dosen Endotoxin in Kombination mit tTF hervorgerufen werden können (Philipp 2003). Liu et al. verwendeten das Prostata-spezifische Membran-Antigen (PSMA) als Target (Liu 2002). Ein Streptavidin-TF-Protein wurde dabei in Kombination mit einem Biotin-Komplex verabreicht, der einen Inhibitor der katalytischen Bindungsstelle des PSMA enthält, welcher selektiv an PSMA bindet. Es wurden Xenograft-Mausmodelle mit Prostatatumoren behandelt. Die mit dem Konjugat behandelten Tiere zeigten im Durchschnitt eine 70%ige Reduktion der Tumormasse. Eine Kombinationstherapie mit niedrig-dosiertem liposomalem Doxorubicin und dem Konjugat konnte für die behandelten Tiere einen signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zu der nur mit Doxorubicin behandelten Gruppe zeigen. Eine Hürde bei der Auswertung von anti-PSMAAgenzien ist das Fehlen eines geeigneten Mausmodells, da PSMA auf Tumorgefäßen der Maus nicht exprimiert wird (Arap 2002). In dieser Studie wurden PSMA-positive Tumorzellen verwendet, welche sich zum Teil in die Gefäßwand einbauen und so ein Mosaik von Mausendothelzellen und PSMA-positiven Tumorzellen bilden (Prinzip der Vasculogenic Mimicry, Hendrix 2003). Hu et al. testeten drei verschiedene tTF-Fusionsproteine im Mausmodell auf ihre Wirksamkeit (Hu 2003): chTNT-3/tTF, das an DNA bindet, welche in degenerativen Tumoranteilen exponiert wird; chTV-1/tTF, das an Fibronektin auf der Tumorgefäß-Basalmembran bindet, und RGD/tTF, das ebenfalls an Fibronektin – allerdings auf der luminalen Seite – bindet. Das letztere Konstrukt setzte erstmals ein Peptid anstelle eines Antikörpers ein. Die mit chTNT-3/tTF und chTV-1/tTF behandelten Tumore waren um mehr als 50 % kleiner als die in der Kontrollgruppe. RGD/tTF zeigte keine signifikante Hemmung des Tumorwachstums. Die Arbeitsgruppe um Mesters generierte ebenfalls tTF-haltige rekombinante Fusionproteine mit einem RGD-Peptid als Targeting-Faktor (Kessler 2005), und im Folgenden dann mit einem zweiten Peptid: GNGRAHA (Bieker 2009, Schwöppe 2010). Das NGR-haltige Peptid bindet spezifisch an eine Isoform der Aminopeptidase N (APN, CD13), dessen Expression auf Endothelzellen humaner und muriner Tumoren hochreguliert ist. Nach mehrfacher Injektion in Xenograft-Tumoren-tragende Mäuse (A549, humanes Adenokarzinom der Lunge und HT1080, humanes Fibrosarkom), kam es zu einer signifikanten Wachstumsverzögerung der Tumoren. Um die Gewebsperfusion der behandelten Tumoren zu quantifizieren, verwendete die Arbeitsgruppe ein 30 bildgebendes Verfahren mittels Magnet-Resonanz-Tomographie nach Injektion von ultrakleinen supramagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (USPIO). Dabei konnte eine signifikant reduzierte Perfusion der behandelten Tumoren gemessen werden. Das tTF-NGR-Konstrukt wurde schließlich erstmals in minimalen Dosierungen an zwei Tumor-Patienten im Endstadium (fortgeschrittenes Cholangiokarzinom und metastasiertes Adenokarzinom der Lunge) getestet. Die Tumoren dieser Patienten zeigten mit dem USPIO-MRT-Verfahren eine 25%ige bzw. 18%ige Reduktion des perfundierten Tumorvolumens. Bei guter Tolerabilität des Proteins musste die Therapie aufgrund von progredienten Erkrankungen abgebrochen werden. Drei weitere Patienten mit Tumorerkrankungen im Endstadium (Mesotheliom, Multiples Myelom mit extramedullären Manifestationen und metastasierter Keimzelltumor) wurden noch mit dem tTF-NGR behandelt und zeigten eine gute Verträglichkeit dieser Substanz. El-Sheikh et al. klonierten später ein tTF-basiertes rekombinantes Fusionsprotein mit der Heparin-bindenden Domäne von VEGF, genannt HBDt, als Targeting-Einheit (El-Sheikh 2005). Mittels Bindungsstudien und konfokaler Mikroskopie konnte eine selektive Bindung des Konstruktes an einen trimolekularen Komplex aus Chondroitin-C-Sulfat-Proteoglykan, Neuropilin-1 und VEGF-Rezeptor-2, der in angiogen aktiven Stellen von Tumoren hochreguliert ist, nachgewiesen werden. Dabei konnte in vitro eine Hemmung des Wachstums der endothelialen Sprossen von Tumoren gezeigt werden. Die Arbeitsgruppe präparierte mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markierte Tumorzellen in Agarose-haltige Sphäroide, die in Mäuse mit einer dorsalen RückenhautKammer implantiert wurden. Nach intravenöser Applikation des HBDt.tTF konnte mittels intravitaler Mikroskopie innerhalb von drei bis vier Minuten eine Thrombusbildung in den Tumorblutgefäßen beobachtet werden. Dabei wurde die Wirksamkeit des HBDt.tTF durch den Zusatz von FVIIa gesteigert und so die Menge der eingesetzten Substanz um bis zu 80 % reduziert. Um den Effekt des HBDt.tTF auf das Tumorwachstum zu untersuchen, wurde Mäusen, die Tumoren einer Mammakarzinom-Zelllinie in einer dorsalen Rückenhaut-Kammer enthielten, zweimal im Abstand von vier Tagen das Konstrukt injiziert. Die Tumorgröße reduzierte sich innerhalb von einer Woche nach der Behandlung um ungefähr 90 %. Die zuvor genannten tTF-basierten Fusionsproteine wurden alle als antineoplastisch wirksame Substanzen konzipiert. Huang et al. klonierten ein chimäres Protein, welches aus tTF und Annexin V, einem Phosphatidylserin (PS) bindenden Protein, besteht (Huang 2006). Ziel war es, die hämostatische Wirksamkeit dieses Proteins im Rahmen von vaskulären Verletzungen nachzuweisen. Dabei zeigte sich in vitro bei niedrigen Konzentrationen des Proteins eine prokoagulatorische Wirkung, hingegen bei höheren Konzentrationen eine antikoagulatorische. Dieses Phänomen wurde darauf zurückgeführt, dass die prokoagulatorische Wirkung sich nur dann entfalten kann, wenn genügend PS-Bindungsstellen für die anderen notwendigen Gerinnungsfaktoren FVII/VIIa, FX, FVIII, FIX, FV und FII verfügbar sind. Experimente mit Heparin-behandelten Mäusen konnten zeigen, dass die zuvor verlängerte Schwanz-Blutungszeit nach intravenöser Behandlung mit 31 dem tTF-AnnexinV wieder signifikant verkürzt wurde. Neben dem Einsatz als hämostatisch wirksames Agenz im Rahmen von Blutungen ist aber auch eine Anwendung als antineoplastisch wirksame Substanz denkbar, da PS – in Abwesenheit von vaskulären Verletzungen – auch einen selektiven Tumorendothel-Marker darstellt. 1.5 VCAM-1 Da VCAM-1 in der vorliegenden Arbeit als Zielantigen benutzt wurde, wird es in diesem Abschnitt genauer beschrieben. VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule), auch als CD106 definiert, ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie (Petruzzelli 1999). In dieser Familie ist eine Gruppe von Adhäsions-Molekülen zusammengefasst, die eine oder mehrere C2-Typ-Immunglobulin-artige, extrazelluläre Domänen enthalten. Diese sind charakterisiert durch zwei CysteinMoleküle, zwischen denen 55-75 Aminosäuren liegen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Nervensystems, bei der Immunantwort und in der embryonalen Entwicklung. Durch die Vermittlung der Zelloberflächenerkennung werden Zellverhalten und Zellaktivität beeinflusst. In diese Kategorie fallen auch die Zelladhäsionsmoleküle PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule), MAdCAM-1 (Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule) und ICAM-1 bis -5 (Intercellular Adhesion Molecules). Diese finden sich normalerweise auf Endothelzellen, wo sie die Leukozytenmigration durch die Gefäßwand regulieren und als Ankerstellen für sich entwickelndes Endothel im Rahmen der Angiogenese dienen. VCAM-1 ist ein transmembranäres Glykoprotein, welches aus 715 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von 100-110 kDa aufweist. Es enthält je nach Splice-Variante sechs oder sieben C2-Typ-Immunglobulin-Domänen (siehe Abb. 1 32 .2). Abb. 1.2: VCAM-1/ICAM-1/PECAM-1 Molekülstruktur (Williams 1988). Als Hauptligand für VCAM-1 wurde α4β1 (auch VLA-4) identifiziert (Cook-Mills 2011). α4β1 bindet außerdem an Fibronektin, Heparin und JAM-B (Junction Adhesion Molecule B). Neben α4β1 gibt es weitere Liganden für VCAM-1, wie α4β7 und αdβ2. Diese Integrine werden von Eosinophilen, Basophilen, Lymphozyten, Mastzellen und Monozyten exprimiert. VCAM-1 wurde auf folgenden Zellen nachgewiesen: aktivierte Neurone (Birdsall 1992), glatte Muskelzellen (Ardehali 1995), Fibroblasten (Meng 1995), Makrophagen (Kupffer-Zellen) (van Oosten 1995), dendritische Zellen (Huang 1995), Oozyten (Campbell 1995), Sertoli-Zellen (Riccioli 1995), Endothelzellen (Sano 1995) und Knochenmark-Stromazellen (Juneja 1993). VCAM1-positives Endothel findet sich nach Kuzu et al. allerdings nur vereinzelt in wenigen Geweben, wie Schilddrüse, Hoden und Thymus (siehe Tab. 1.2). Yoong et al. fanden zusätzlich in der Leber VCAM-1-exprimierende Endothelzellen (Yoong 1997). Im Gegensatz zu konstitutionell exprimierten Adhäsionsmolekülen, wie zum Beispiel ICAM, ist VCAM induzierbar und seine Expression wird durch verschiedene Zytokine, wie IL-1, TNF-α, IL-4 und IL-13, außerdem durch Lipopolysaccharide und Thrombin stimuliert (Petruzzelli 1999). Tab. 1.2: VCAM-1-Expression auf normalem Gefäßendothel (Kuzu 1993). Gewebe ICAM-1 VCAM-1 MUC-18 E-Selectin P-Selectin Niere + s,m,l,f,w - + s,m,f,w - - Leber + s,m,v - + s**,m,v - + m,v Lunge + s,m,v,w - + s,m,v,w - + m,l,v Nebenniere + s,m,v - + s,f - + m,l,v,w Schilddrüse + s,m,v + s,f + s,m,v + s,m,v,w + m,l,f,v Hoden + m,l,f + m,l,w + s,m,v - + l,m,f,v 33 Lymphknoten + HEV,s*,m,w - + s,HEV + HEV,m,v + HEV,m Tonsillen + m,HEV,v - + s,HEV + HEV,s,m + HEV,m Thymus - + HEV + s,HEV,w,v - + HEV,m Milz + s,m,l,f - + s,v - + m,l,w ZNS + s,m,w - +s - + s,m,v,w Plexus choroideus + s,m,l,v,f - + s,m,v - + s,m,l,w,v Pankreas + s,m,v,w - + m,v - + m,f Magen + s,m,l,v - +s - + m,l,v Kolon - - + s,v,w - + s,m,w,v Skelettmuskel + m,f - + m,v - +m Herz + s,m,w,v,f - + s,m,w,f - - Endometrium + s,m,l - +s - + m,l Plazenta + s,m,l,v - + s,m - + m,l,v Nabelschnur +v - - - + s: kleine Gefäße, Kapillaren und Sinus; s**: Lebersinusoidepithel nicht gelabeled; s*: mit Endothel ausgekleidete Lymphknoten-Sinus waren ungefärbt; m: mittelgroße Gefäße, Venolen und Arteriolen; l: große Gefäße, Arterien und Venen; HEV: High endothelial venules; v: variabel; w: schwach; f: nur wenige Gefäße waren gefärbt; ZNS: Zentrales Nervensystem. Bei verschiedenen nicht-tumorösen Erkrankungen, bei denen entzündliche Veränderungen eine Rolle spielen, wurde eine vermehrte VCAM-1-Expression nachgewiesen: Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Systemischer Lupus erythematodes und Multiple Sklerose (McMurray 1996), Arteriosklerose (Blankenberg 2003) und bakterielle Infektionen (Golias 2007). Die bestuntersuchte Funktion von VCAM-1 ist seine Rolle bei der Extravasation von Leukozyten. Insbesondere vermittelt die Bindung von α4β1 an VCAM-1 eine feste Adhäsion der Leukozyten an der Gefäßwand, nach dem Rollen und vor der Diapedese der zweite Schritt bei der Extravasation der Zellen (Petri 2006). VCAM-1 wurde mit immunhistochemischen Methoden auf dem Gefäßendothel unterschiedlicher Tumoren nachgewiesen: Hodgkin-Lymphome (Christiansen 1998), Non-Hodgkin-Lymphome und hyperplastische Lymphknoten (Renkonen 1992), Milz und Lymphknoten bei Patienten mit B-CLL (Christiansen 1998), Nicht-Kleinzellige Bronchialkarzinome (Staal-van den Brekel 1996), maligne Melanome (Jonjic 1992), hepatozelluläre Karzinome (Yoong 1997), kolorektale Karzinome, Magenkarzinome (Ding 2003), undifferenzierte nasopharyngeale Karzinome und maligne epitheliale Tumoren (Ruco 1994). 1.6 Gerinnungsbiologie 1.6.1 Die Gerinnungsaktivierung 34 Die klassische Kaskadentheorie der Blutgerinnung, bei der es zur sequentiellen Aktivierung der Gerinnungsfaktoren kommt, was zur Bildung des Prothrombinase-Komplexes (FXa/FVa), zur Bildung von aktivem Thrombin und schließlich zur Fibrin-Polymerisation führt, wird heutzutage durch eine physiologischere Betrachtung ersetzt (Weber 2006). In der Kaskadentheorie wurden zwei Aktivierungswege, das extrinsische und das intrinsische System, unterschieden. Grundlage hierfür bildeten laborchemische Gerinnungsuntersuchungen, die aber nur sehr unzureichend die Mechanismen der Gerinnung in vivo widerspiegeln. „Nach heutigen Vorstellungen verläuft die Blutgerinnung nicht über zwei parallel bzw. konvergent verlaufende Aktivierungswege, sondern findet als zeitliche Abfolge von drei nacheinander folgenden Gerinnungsphasen statt“: Initiationsphase, Vorbereitungsphase und Propagationsphase (Weber 2006). Mann hebt dabei die Bildung der drei zentralen Vitamin-K-abhängigen Enzymkomplexe, extrinsischer Xase-Komplex (auch als Tenase-Komplex bezeichnet), intrinsischer Xase-Komplex und Prothrombinase-Komplex, hervor (Mann 2003). In der Initiationsphase der Blutgerinnung kommt es durch eine Endothelverletzung zur Reaktion zwischen dem an der Innenseite der Zellmembran lokalisierten TF und im Blut zirkulierendem FVIIa. Dieser FVIIa-TF-Komplex, auch als extrinsischer FXase-Komplex bezeichnet, katalysiert die Aktivierung von FIX und FX (siehe Abb. 1.3), wobei der Letztere das effektivere Substrat darstellt und als membrangebundener FXa seinerseits ebenfalls zur FIX-Aktivierung beiträgt. In dieser Phase der Gerinnung wird die Bildung von Thrombin durch die Hemmung von FXa und FVIIa durch TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) noch gebremst. Der membrangebundene FXa aktiviert aber kleinste Mengen von Prothrombin zu Thrombin, die allerdings zur Bildung eines Thrombus nicht ausreichen. Dieses initiale Thrombin dient in der Vorbereitungsphase als Aktivator für Thrombozyten, FV und FVIII. FVIIIa bildet dann zusammen mit FIXa auf der aktivierten Thrombozytenmembran den intrinsischen FXase-Komplex, welcher dann zum hauptsächlichen Aktivator für FX wird. FXa formiert sich in der Propagationsphase zusammen mit FVa auf der aktivierten Thrombozytenmembran zur sogenannten Prothrombinase, die Prothrombin in Thrombin konvertiert. Die Prothrombinase ist dabei 300.000-mal effektiver in der ProthrombinAktivierung als FXa. Thrombin vermittelt schließlich die Spaltung von Fibrinogen und FXIII und somit die Entstehung eines Thrombus aus unlöslichem Fibrin. 35 Abb. 1.3: 1.6.2 Die drei zentralen Vitamin-K-abhängigen Gerinnungskomplexe (Mann 2003). Tissue Factor (TF) und Truncated Tissue Factor (tTF) Der Tissue Factor (TF), auch als CD142 beschrieben (im deutschen Sprachgebrauch: Gewebsfaktor oder Thromboplastin), ist das Initiatormolekül der Blutgerinnung. Dabei handelt es sich um ein glykosyliertes transmembranäres Protein, das aus 263 Aminosäuren besteht (Morrissey 2001). Das Molekulargewicht beträgt 29.593 für das reine Polypeptid und 45.000 für das glykosylierte Protein. Der extrazelluläre Anteil besteht aus 219, der transmembranäre Anteil aus 23 und der intrazelluläre Anteil aus 31 Aminosäuren (siehe Abb. 1.4). Abb. 1.4: Die molekulare Struktur des Tissue Faktors. Zeichnung von C. Gottstein. TF wurde ursprünglich als Gewebsbestandteil identifiziert, der durch Zugabe zu Plasma die Gerinnungskaskade aktiviert - daher der Name (Broze 1985). Er wurde erstmals 1985 aufgereinigt 36 und im Folgenden wurde seine DNA sequenziert. Drake et al. formulierten 1989 die Hypothese, dass TF um die Blutgefäße eine „hämostatische Hülle“ ausbildet, die die Gerinnung nach einer Verletzung des Gefäßes initiiert (Drake 1989). Als „truncated Tissue Factor“ (tTF, auch „soluble Tissue Factor“ = sTF) wird die extrazelluläre Domäne des TF bezeichnet. Sie besteht aus zwei Fibronektin-Typ-III-Domänen mit insgesamt 219 Aminosäuren (Morrissey 2001). Die Gerinnungs-induzierende Aktivität von trunkiertem TF ist 10.000-mal niedriger als die des kompletten TF. Schon früher zeigten Paborsky et al., dass der von seinem intrazellulären und transmembranären Anteil befreite tTF nach kovalenter Kopplung an einen Phosphatidylinositol-Anker wieder seine volle Wirksamkeit erlangt, da er durch die Bindung an die Zellmembran wieder in Kontakt zu den notwendigen negativ geladenen Phospholipiden tritt (Paborsky 1991). Der Membrananker ist essentiell für die volle proteolytische Aktivität im Zusammenspiel mit FVIIa. Dabei scheint die Beschaffenheit dieses Membranankers keine Rolle zu spielen. Es entstand die Idee, die transmembranäre Domäne durch einen Liganden zu ersetzen, der spezifisch an Endothelzellen bindet und so durch den Kontakt zur Zellmembran die Gerinnungs-induzierende Aktivität des tTF wieder herzustellen. 1.6.2.1 TF-Expression auf Zellen TF wird als integrales Membranprotein von verschiedenen Zellen exprimiert: Fibroblasten und glatten Muskelzellen der vaskulären Adventitia, Epithelzellen von Organkapseln und Körperoberflächen, Astrozyten des Gehirns, Alveolarzellen der Lunge, Trophoblasten der Plazenta und kardiale Myozyten (Mackman 2004). Diese streng extravaskuläre Expression von TF bildet eine protektive prokoagulatorische Hülle um das Gefäßsystem, welche fähig ist, das Gerinnungssystem zu aktivieren, wenn die Integrität der Gefäße unterbrochen wird. Des Weiteren sieht man eine verstärkte TF-Expression auf verschiedenen Zellen nach Stimulation mit unterschiedlichen Agenzien. So exprimieren Monozyten und Makrophagen vermehrt TF nach Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen (Eilertsen 2004). Eine pathologische TF-Expression sieht man auf aus Makrophagen hervorgegangenen Schaumzellen und auf glatten Muskelzellen in arteriosklerotischen Plaques, auf verschiedenen Tumorzellen und auf zirkulierenden Makrophagen in Patienten mit gramnegativer Endotoxämie (Eilertsen 2004). In Blutgefäßen ist TF wie oben beschrieben vorwiegend auf Zellen der Adventitia und Media lokalisiert. Auf normalen Endothelzellen konnte TF nicht nachgewiesen werden. Bestimmte pathologische Bedingungen, wie zum Beispiel invasiver Brustkrebs, können aber eine Expression von TF auf Endothelzellen induzieren, welche zu thrombogenem Potenzial führt (Contrino 1996). 37 In Tiermodellen wurde eine durch Lipopolysaccharide (LPS) stimulierte TF-Expression auf Endothelzellen in vivo nachgewiesen (Drake 1993); diese wird allerdings kontrovers diskutiert. Eilertsen schreibt, als mögliche Erklärung für den nachgewiesenen TF, diesen eher Mikropartikeln aus Monozyten zu, die an aktiviertes Endothel binden (Eilertsen 2004). Dennoch konnte in invitro-Studien eine TF-Expression nach LPS-Stimulation von Endothelzellkulturen nachgewiesen werden (Parry 1995, Brox 1984). 1.6.2.2 Zirkulierender TF In den letzten Jahren wurden verschiedene widersprüchliche Studien veröffentlicht, die sich mit dem Vorhandensein, der Konzentration und der funktionellen Aktivität von zirkulierendem TF – als lösliches Protein, als Bestandteil von Mikropartikeln und auf bzw. in verschiedenen Blutzellen – beschäftigen (Butenas 2009). Die dabei im Blut gesunder Probanden gemessenen Konzentrationen bewegen sich in sehr unterschiedlichen Größenordnungen, was wohl darauf zurück zu führen ist, dass validierte und verlässliche Assays für die Messung von TF und dessen Aktivität fehlen. Zirkulierender TF spielt möglicherweise eine wichtige Rolle in der Ätiologie verschiedener Erkrankungen. Erhöhte Konzentrationen wurden beispielsweise bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, Meningokokkensepsis, disseminierter intravasaler Gerinnung, Antiphospholipid-Antikörper-Syndrom und Sichelzellerkrankung nachgewiesen. Eine besondere Rolle scheinen hierbei TF-reiche Mikropartikel zu spielen. Diese prokoagulanten Mikropartikel stammen von Thrombozyten, Monozyten, Endothelzellen oder auch Tumorzellen (Morel 2006). Sie werden in geringen Konzentrationen auch im Blut gesunder Probanden nachgewiesen. Jedoch unterscheiden sich die Mikropartikel, die unter pathologischen Bedingungen gefunden werden, von denen gesunder Menschen. So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mikropartikel bei kardiovaskulären Erkrankungen eine Rolle bei der Dysregulation des Gefäßtonus spielen, wohingegen Mikropartikel gesunder Probanden keinen Effekt auf die Gefäße haben. Untersuchungen zur Rolle von Mikropartikeln beim Diabetes mellitus haben gezeigt, dass deren Phänotyp und prokoagulantes Potenzial je nach Typ des Diabetes und glykämischer Kontrolle variieren. Bei Patienten mit schlecht kontrolliertem Blutzucker konnte eine hohe prokoagulante Aktivität der Mikropartikel nachgewiesen werden. Butenas et al. diskutierten das umstrittene Thema des im Englischen sogenannten „encryptiondecryption process“, also des Encodierungs-Decodierungs-Prozesses (Butenas 2009). Die Lyse TF-positiver Zellen bewirkt einen signifikanten Anstieg der TF-Aktivität. Dies führte zu der These, dass TF in zwei Zuständen existiert: ein Zustand niedriger Aktivität (auch als encodierte Form bezeichnet) und ein Zustand hoher Aktivität (auch als decodierte Form bezeichnet). Beide 38 Formen binden FVII und FVIIa. Ein möglicher Mechanismus der Decodierung ist die Interaktion mit Phosphatidylserin. Dieses negativ geladene Phospholipid befindet sich normalerweise an der Innenseite der Membran und tritt bei Zerstörung dieser an die Zelloberfläche. 1.6.2.3 TF-Signaling Neben seiner Funktion im Gerinnungssystem spielt TF auch eine Rolle in der Krebs-Pathogenese (Schaffner 2009). So vermittelt der TF-VIIa-Komplex die Aktivierung des Protease-activatedReceptor (PAR) 2, was über Induktion einer Reihe von proangiogenetischen und immunmodulierenden Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren zu Veränderungen der Tumorumgebung, angiogenetischen Stimulation, Hemmung der Apoptose und Tumorzell-Migration führt. Studien von Garnier et al. konnten einen Zusammenhang zwischen onkogenen Ereignissen, Angiogenese und der gesteigerten Expression von TF auf verschiedenen Arten von Tumorzellen zeigen (Garnier 2010). TF-blockierende Antikörper hemmten dabei das Tumorwachstum, die Angiogenese und das Anwachsen des Tumors nach Injektion von tumorigenen Zellen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass der TF-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Formation der vaskulären Nische für die sogenannten Tumor-initiierenden Zellen, auch als Krebs-Stammzellen bezeichnet, spielt. In Bezug auf die vorliegende Dissertation ist zu erwähnen, dass hier nur der extrazelluläre Anteil des TF verwendet wurde, so dass dabei kein TF-Signaling zu erwarten ist. 1.6.3 Faktor VII FVII ist ein glykosyliertes Plasmaprotein, dessen Polypeptidkette aus 406 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von 50.000 Da aufweist (Morrissey 2001). Er besteht aus mehreren Domänen: eine γ-Carboxyglutaminsäure-reiche Domäne (Gla-Domäne), ein hydrophober oder aromatischer Anteil, zwei Epidermal-Growth-Factor-artige Domänen (EGF-Domänen) und eine Serin-Protease-Domäne. Die Gla-Domäne verleiht dem FVII die Fähigkeit, an Membranen zu binden, die negativ geladene Phospholipide enthalten, wobei diese Bindung abhängig ist von Calciumionen. Die Aktivierung von FVII erfolgt durch Proteolyse einer einzelnen Peptidbindung. Während FVII aus einer einzelnen Polypeptidkette besteht, besteht FVIIa aus zwei Polypeptidketten, die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. 1.6.4 Der FVIIa/TF-Komplex 39 Abb. 1.5: Die Röntgen-Kristallstruktur des FVIIa/TF-Komplexes. TF = Tissue Factor, F1 und F2 = Fibronektin-TypIII-Domänen, VIIa = Serin-Protease-Domäne des FVIIa, E1 und E2 = EGF-artige Domäne des FVIIa, G = Gla-Domäne des FVIIa (Morrissey 2001) Die kristalline Struktur des FVIIa/TF-Komplexes wurde bis auf 2 Å aufgelöst (Morrissey 2001). FVII ist ein langgestrecktes Protein, welches großflächig mit TF in Kontakt tritt (siehe Abb. 1 .5). Dabei liegen die Haupt-Kontaktstellen des TF in den beiden Fibronektin-Typ-III- Domänen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass gewisse Domänen (hauptsächlich die erste EGF-Domäne des FVIIa) wichtig sind zur Stabilisierung der Bindung, während andere (hauptsächlich die Protease-Domäne des FVIIa) wichtig sind für die allosterische Aktivierung des FVIIa. Die ermittelte kristalline Struktur des FVIIa/TF-Komplexes deckte auf, wie dieser sich auf der Zellmembran lokalisiert: Die Gla-Domäne befindet sich am C-Terminus des FVIIa-Moleküls und ist dafür verantwortlich, dass der FVIIa sowohl mit der Membranoberfläche als auch mit dem TF reversibel interagieren kann. Der C-Terminus von TF befindet sich intrazellulär. In dem kompletten TF-Molekül ist dieser Teil über eine kurze Linkersequenz mit dem Membrananker verbunden. 40 Abb. 1.6: Positionierung des aktiven Zentrums von FVIIa. FI = Fluoreszenz-Farbstoff, der an das aktive Zentrum von FVIIa bindet (Morrissey 2001) Mittels der Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Methode konnte die exakte Position des aktiven Zentrums des FVIIa zur Zellmembran ermittelt werden (siehe Abb. 1 .6). Dabei zeigte sich, dass dieses sich 83Å über der Membran positioniert, wenn FVIIa alleine auf der Membran bindet. Im FVIIa/TF-Komplex nähert sich das aktive Zentrum des FVIIa bis auf 75 Å an die Membranoberfläche. So scheint der TF die Position und Orientierung des aktiven Zentrums des FVIIa zu verändern. Dieses Positionieren von Serin-Proteasen und ihren Substraten ist wohl eine wesentliche Rolle von membrangebundenen Protein-Cofaktoren. Interessanterweise befindet sich in dem FVIIa/TF-Komplex das aktive Zentrum von FVIIa, bei dem die Gla-Domäne entfernt wurde, auf derselben Höhe wie bei intaktem FVIIa. Dieses legt nahe, dass TF alleine in der Lage ist, das FVIIa-Molekül zu positionieren. Es ist denkbar, dass auch umgekehrt trunkierter TF durch den vollständigen Faktor VIIa auf der Membranoberfläche gerinnungsaktiv positioniert werden kann (Philipp 2003). Freier FVIIa katalysiert die proteolytische Aktivierung seiner Substrate FIX und FX extrem langsam (Morrissey 2001). Wenn FVIIa an TF bindet, der in Phospholipid-Vesikel inkorporiert ist, wird seine Aktivität je nach Substrat um das 20- bis 100-fache verstärkt. 1.6.5 Der prokoagulatorische Status bei Krebspatienten Thromboembolische Ereignisse stellen eine wichtige Komplikation von Krebs dar und sind ein entscheidender Faktor in der Morbidität und Mortalität dieser Erkrankung (Lip 2002). Die Symptome des prothrombotischen Status von Krebspatienten reichen von asymptomatischen pathologischen Gerinnungstests bis hin zu massiven Thromboembolien und disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC). Vor über 150 Jahren postulierte Virchow, dass drei Faktoren, die sogenannte Virchow-Trias, die Thrombusbildung begünstigen: Veränderungen der Blutzusammensetzung (Hyperkoagubiliät), Veränderungen des Blutflusses und Endothelalterationen. Das Gerinnungssystem befindet sich normalerweise in einem Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Inhibierung von Thrombozyten, prokoagulatorischen, antikoagulatorischen und fibrinolytischen Faktoren. Ein prothrombotischer Status des Gerinnungssystems kann durch einen Überschuss an prokoagulatorischen Faktoren, wie TF, Fibrinogen oder Plasminogen-AktivatorInhibitor, oder einen Mangel an antikoagulatorischen Faktoren, wie Antithrombin III, Protein C und S oder Gewebsplasminogen-Aktivator, hervorgerufen werden. Diese Veränderungen wurden 41 in unterschiedlichen Studien bei Krebspatienten nachgewiesen. Eine besondere Rolle in der pathologischen Blutzusammensetzung bei Tumorpatienten scheinen TF-tragende Mikropartikel zu spielen (Zwicker 2008). Diese entstehen nach Stimulation oder Apoptose von Thrombozyten, Leukozyten und Endothelzellen, oder stammen direkt von Tumorzellen. Neben der prokoagulatorischen Wirkung des TF kommt es auf den Mikrovesikeln zur Externalisation von normalerweise auf der Membraninnenseite lokalisiertem Phosphatidylserin, welches als anionische Oberfläche die Bindung und katalytische Konversion von Gerinnungsfaktoren fördert. Verschiedene Arbeiten in Tier-Xenograft-Modellen haben in Tumorblutgefäßen Veränderungen der Blutflusseigenschaften nachgewiesen. So wurden Flussumkehr, Staupunkte, abnormale Verzweigungsmuster und der Einbau von Tumorzellen in die Gefäßwand gesehen. Endothelzellen können unter dem Einfluss inflammatorischer Zytokine, wie Tumornekrosefaktor (TNF) oder Interleukin-1, prothrombotisch werden. Diese Zytokine supprimieren die endotheliale fibrinolytische Aktivität, verstärken die Produktion von Interleukin-1, von-Willebrand-Faktor und Protein C und vermindern die Thrombomodulin-Produktion. Des Weiteren fördern sie die endotheliale Expression von TF, E-Selektin und Plättchen-aktivierender Faktoren. Einige Zytokine, wie zum Beispiel TNF-α, sowie reaktive Sauerstoffmoleküle und in vitro Hydrogenperoxid und Saponin induzieren eine Phosphatidylexternalisation auf Endothelzellen (Ran 2002). Tumorblutgefäße weisen eine gesteigerte Permeabilität auf, was eine Verlangsamung des Blutflusses und von daher eine höhere Thrombosewahrscheinlichkeit nach sich zieht. Insgesamt lässt sich zusammenfassen, dass Tumorendothelzellen eine Koagulation besser unterstützen als normale Endothelzellen, was für den in dieser Arbeit verwendeten Ansatz den Vorteil einer zusätzlichen Spezifität hat. Des Weiteren besteht bei soliden Tumoren oft das Problem einer systemischen Hyperkoagulabilität. Wäre es möglich, diese systemisch zirkulierenden prothombotischen Faktoren an einer Stelle (im Tumor) für die Gerinnungsinduktion einzusetzen, so könnte man sich durch den Verbrauch dieser Faktoren eine verminderte systemische Koagulabilität erhoffen. 1.7 Fragestellung Vor dem oben genannten Hintergrund sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen bearbeitet werden: 1.7.1 Herstellung des rekombinanten SVOA anti-VCAM-tTF-Prototyps und funktionelle Charakterisierung in vitro und in vivo Zu Beginn der Arbeiten waren noch keine ausführlichen in vivo Daten zu dem rekombinanten anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein vorhanden. Effizienz und Nebenwirkungen dieses Konstruktes 42 sollten detailliert in einem Tumormodell untersucht werden, um dies als Ausgangspunkt für Struktur-Funktionsanalysen entsprechender Mutanten zu verwenden. 1.7.2 Untersuchung der molekularen Mechanismen der Koagulationsinduktion von TF-Fusionsproteinen und Verbesserung der Effektorfunktion via Molecular Modelling Der Ansatz einer therapeutischen Gerinnungsinduktion erfordert ein hohes Maß an Selektivität und Kontrollierbarkeit, da off-target Gerinnungsinduktion in normalen Gefäßen zu ernsthaften Nebenwirkungen wie z.B. Schlaganfall, Herzinfarkt oder Organversagen führen kann. Daher ist es unabdingbar, die genauen Triggermechanismen für die Gerinnungsinduktion zu verstehen und zu kontrollieren. Das ursprüngliche Design Liganden-gekoppelter TF-Konstrukte zielt darauf ab, TF in Zellmembran-Nähe zu bringen. Sobald der Ligand einen Bindungspartner auf der Gefäßoberfläche findet – und nur dann – sollte es zur Gerinnungsinduktion kommen. Die Vorergebnisse insbesondere von D. Neri (Nilsson 2001) und C. Gottstein (Philipp 2003) lassen aber auch einen anderen Schluss zu. Möglicherweise dient der Ligand nur dazu, die lokale Konzentration an TF zu erhöhen, und die eigentliche Bindung an die Membran erfolgt über andere, unspezifische Faktoren, wie z.B. Faktor VIIa via Gla-Domäne (siehe Kap. 1.6.4). Grundsätzlich sind also zwei Szenarien denkbar, in welchen die Kopplung von tTF an den Antikörper eine Koagulationsinduktion des tTF ermöglicht: 1. „Liganden-vermittelte Komplexbildung“: Das resultierende Fusionsprotein bindet an VCAM1 und bringt tTF in ausreichende Nähe der Membran, woraufhin sich ein extrinsischer Tenasekomplex bildet. In diesem Szenario ist die Anwesenheit des Antikörpers zur Bildung des Tenasekomplexes erforderlich (siehe Abb. 1.7 A). 2. „ Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung“: Das resultierende Fusionsprotein bindet an VCAM-1, dissoziiert dann aber wieder, und die membranständige Bindung des Tenasekomplexes erfolgt vorrangig über Faktor VIIa. In diesem Falle würde der Antikörper dazu dienen, eine lokale Konzentrationserhöhung des Fusionsproteins zu bewirken, wäre aber für die Bildung des Tenasekomplexes nicht unbedingt erforderlich (siehe Abb. 1.7 B). Bei der zweiten Hypothese wären unter Umständen klinische Nebenwirkungen zu erwarten, sobald sich eine erhöhte Konzentration von Fusionsprotein in einem prokoagulatorisch aktivierten Gefäß befindet, auch durch passives (= Liganden-unabhängiges) Targeting. 43 Abb. 1.7: Hypothetische Möglichkeiten der Bindung des anti-VCAM-tTF: (A) Liganden-vermit- telte Komplexbildung mit Bindung über das scFv an VCAM-1 oder (B) Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung mit Bindung über die Gla-Domäne des Faktor VIIa Im zweiten Teil der Arbeit sollten die Triggermechanismen und strukturellen Voraussetzungen für eine effiziente Koagulationsinduktion untersucht werden. Diese Analysen sollten dann dem Design einer Struktur mit verbesserter Effektorfunktion dienen. Wie weiter oben bereits erwähnt, ist die Ausrichtung des TF und des FVIIa auf der Zellmembran von besonderer Bedeutung. Daher sollten verschiedene Varianten mit verlängerten Linkern und verlängerten transmembranären Anteilen des tTF generiert werden, um die Positionierung des Moleküls zu optimieren (siehe Abb. 1.8). Abb. 1.8: Modelle zur Positionierung des Tenase-Komplexes. (A) Optimale Position des TF im na- türlich vorkommenden Tenase-Komplex, (B) Hypothetisch suboptimale Position des tTF im ursprünglichen Konstrukt des anti-VCAM-tTF und (C) Verbesserte Position des tTF durch Modifikation von Linker und transmembranärem Anteil des tTF. Zeichnung von C. Gottstein, modifiziert. 44 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Reagenzien / Chemikalien Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Reagenzien und Chemikalien von den Firmen SigmaAldrich (Steinheim, D), Roth (Karlsruhe, D), Merck (Darmstadt, D) und Boehringer (Mannheim, D) bezogen und hatten die Qualitätsstufe „pro analysis“. 2.1.1.1 Koagulationsfaktoren Koagulationsfaktor VII, human Calbiochem, CA, USA Enzyme Research Lab., South Bend, USA Sigma-Aldrich, Steinheim, D Koagulationsfaktor VIIa, human Enzyme Research Lab., South Bend, USA 45 Humaner Faktor IX Sigma-Aldrich, Steinheim, D Koagulationsfaktor X, human Calbiochem, CA, USA Koagulationsfaktor Xa, human Amersham Biosciences, Piscataway, USA 2.1.1.2 Molekularbiologische Reagenzien 1 Kb DNA Ladder Gibco BRL, Karlsruhe, D 10 mM dNTP Mix Fermentas, Ontario, Kanada 100 bp DNA Ladder Invitrogen, Karlsruhe, D 100 mM dTTP Solution, PCR Grade Invitrogen, Karlsruhe, D BSA für den Restriktionsverdau New England BioLabs, Beverly, USA DNA Quantitation Standards Gibco BRL, Karlsruhe, D Glycogen Boehringer Mannheim, Mannheim, D 10X Puffer 1 und 2 für den Restriktionsver- New England BioLabs, Beverly, USA dau Restriktionsenzym Hind III New England BioLabs, Beverly, USA Restriktionsenzym Kpn I New England BioLabs, Beverly, USA Restriktionsenzym Sac I New England BioLabs, Beverly, USA Restriktionsenzym Xba I New England BioLabs, Beverly, USA T4 DNA Ligase mit Ligationspuffer Roche, Mannheim, D Polynukleotidkinase New England Biolabs, Beverly, USA Polymerase und Reaktionspuffer: Expand Roche, Mannheim, D High Fidelity PCR-System 2.1.1.3 Sequenzierungsprimer (Oligonukleotide/Primer) Oligonukleotide wurden nach Angabe von der Firma MWG/Eurofins (Ebersberg, D) synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der Primer sind in der Tab. 2.1 angegeben. Tab. 2.1: Nukleotidsequenzen der Primer Primername Sequenz Für tTF-Verlängerungs-PCR TTF 220 For TTF 221 For TTF 222 For TTF 223 For TTF 224 For TTF 225 For TTF 226 For 5’-CCA CCT GAG CTC TTA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 46 TTF 227 For TTF 228 For TTF BackKpn 5’-CCA CCT GAG CTC TTA CAC AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCA CCT GAG CTC TTA TAC CAC AGC TCC AAT GAT GTA GAA TAT TTC TCT GAA TTC-3’ 5’-CCG GGG TAC CTC AGG CAC TAC AAA TAC T-3’ Für Primer-Duplex-Insertion zur Modifizierung der Linker pswc10-DuA pswc10-DuC pswc11-DuA pswc11-DuB pswc12-DuA pswc12-DuC pswc13-DuA pswc13-DuB pswc14-DuA pswc14-DuB 5’-CTA GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGC GGT GGC GGT AC-3’ 5’-CGC CAC CGC CGT GAT GGT GAT GGT GAT GCT-3’ 5’-CTA GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA GGT AC-3’ 5’-CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CGT GAT GGT GAT GGT GAT GCT-3’ 5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT AC-3’ 5’-CGC CAC CGC CCT-3’ 5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA GGT AC-3’ 5’-CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CCT-3’ 5’-CTA GAG GGC GGT GGC GGT TCT GGA GGG GGA GGT TCA GGT GGA GGT GGT AC-3’ 5’-CAC CTC CAC CTG AAC CTC CCC CTC CAG AAC CGC CAC CGC CCT-3’ Für Reamplifizierung längerer Linker Linker Back Linker For 5’-TTG ACG GTA CCG GCG GCG GTT CC-3’ 5’-TTG ACG GTA CCC GAG CCG CCA CCG CCA GA-3’ Für Sequenzierung C24 N20 N26seq 2.1.1.4 CTG TAT CAG GCT GAA AAT CTT CTC CAA GGA CGA CGA TGA CAA GC CAT CAT AAC GGT TCT GGC AAA TAT Das Expressionsplasmid pswc4 47 Abb. 2.1: Expressionsvektor pswc4 (modifiziert nach Gottstein 2001) Die Generierung des Expressionsplasmids pswc4 ist in Gottstein 2001 beschrieben. Das Plasmid enthält zwischen HindIII und XbaI eine Klonierungsstelle für das scFv. Es folgt eine kurze Linkersequenz, die für 6 x His kodiert. Das tTF-Gen ist umrahmt von den beiden Schnittstellen für SacI und KpnI. Des Weiteren enthält das Expressionsplasmid noch eine ompA-Leadersequenz für Sekretion in das Periplasma und ein Ampicillin-Resistenzgen für die Selektion rekombinanter Bakterien. Die FLAG-Sequenz und die 6 x His Sequenz dienen zur Detektion und Aufreinigung. 2.1.1.5 Andere Reagenzien Agar Noble Difco, Detroit, USA Agarose Peqlab, Erlangen, D Bacto-Hefeextract Difco, Detroit, USA Bacto-Trypton Difco, Detroit, USA BenchMark Prestained Protein Ladder Invitrogen, Karlsruhe, D Kaleidoscope Prestained Standard Bio-Rad, München, D Entwickler ECL für Filme (Western Blot) Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA Leupeptin Roche, Mannheim, D Membrane-Blocking Reagent Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA NaCl 0,9 % Delta-Pharma, Pfullingen, D Ni2+-NTA-Matrix QIAGEN, Valencia, CA, USA Prestained Protein Ladder, 10-180 kDa Fermentas, Ontario, Kanada S-2765 Chromogenix, Mailand, Italien 2.1.1.6 Selbst hergestellte Puffer und Lösungen Calcium-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH = 8,1) 150 mM NaCl 2 mg/ml BSA 5 mM CaCl2 DEPC-behandeltes Wasser Destilliertes Wasser mit 0.1% (v/v) Diethylpyrocarbonat für mindestens eine Stunde bei 37 oC inkubieren, und dann autoklavieren 48 Ethidium-Bromid-Agarose 30 ml 0,5 x TBE (s.u.) 0,5 µl Ethidium-Bromid (10mg/ml wässrige Stammlösung) 0,8-1,5 % (w/v) Agarose FACS-Puffer PBS (s.u.) 0,02 % NaN3 0,2 % BSA Glycin-Puffer 10 mM Glycin (pH = 1,5) Laufpuffer Gelelektrophorese 4x Laemmli 5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 6,8) 4 ml Glycerol 8 ml 10 % SDS 2 ml 0,1 % Bromphenolblau Ad 20 ml H2O PBS 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 8,4 mM Na2HPO4 1,4 mM KH2HPO4 PBS-T 0,5 % PBS (s.o.) + 0,5 % Tween LB-Medium 10 g NaCl 10 g Bacto-Trypton 5 g Hefeextrakt Ad 1000 ml H2O (pH = 7,4) LB-Agar 1000 ml LB-Medium (s.o.) 15 g Bacto-Agar TBE-Puffer 54 g Tris-Aminomethan 27,5 g Borat 20 ml 0,5 M EDTA-Lösung (pH = 8) aus Ethylendiamintetraacetat-Dinatriumsalz Ad 1000 ml H2O TES 500 mM Sucrose 200 mM Tris-HCl (pH = 7,4) 0,5 mM EDTA Ad 1000 ml H2O Sämtliche Kulturmedien für Bakterien wurden bei 121° C und 2 bar für 20 Minuten autoklaviert. Nach Bedarf wurde dem Medium nach dem Autoklavieren 100µg/ml Ampicillin zugesetzt. 49 2.1.1.7 Reagenzien- Kits Amine-Coupling-Kit Biacore, Uppsala, Schweden (BR-1000-50) DC Protein Assay Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA (5000120) Sequenzierungskit Abi-Prism Big Dye Ter- Applied Biosystems (4303149) Applied Bio- minator v3.1 systems, CA, USA DNA Präparationskits: Mini, Midi, Maxi Qiagen, Hilden, D (27104, 12143, 12162) DNA Gelextraktionskit Qiaex II Qiagen, Hilden, D (20021) Super Signal Western Blot Chemilu- Pierce, Rockford, USA (34079) mineszenz Substrat 2.1.2 Antikörper Anti-FLAG M1 Antibody IBI-Kodak, Rochester, USA Anti-FLAG M2 Antibody Sigma-Aldrich, Steinheim, D Donkey anti-Sheep/Goat IgG, Fluorescein- Serotec, Oxford, UK konjugiert Intraglobin CP, human Biotest, Dreieich, D Mouse anti-Rat IgG, Fluorescein-konjugiert Jackson Immuno Research, Pennsylvania, USA Mouse anti-Rat IgG, Peroxidase-konjugiert Jackson Immuno Research, Pennsylvania, USA Rat anti-Mouse IgG, Peroxidase-konjugiert Jackson Immuno Research, Pennsylvania, USA Recombinant Mouse VCAM-1/CD106 Fc R&D Systems, Wiesbaden, D Chimera Sheep anti-Human Tissue Factor IgG Affinity Biologicals, Ontario, Kanada rabbit-anti-human-Fc Dianova, Hamburg, D anti-Maus-VCAM-1, MK271 ATCC, Manassas, USA anti-human-VCAM-1, 1G11B1 Chemicon, Temecula, USA 2.1.3 Zellkultur-Materialien 2.1.3.1 Zelllinien 50 Name: Ursprung: Spezies: Bezug: Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Endothelzellen aus Nabelschnurvenen Mensch PromoCell, Heidelberg, D Name: Ursprung: Spezies: Referenzen: Bezug: 2F2B Endothelzellen aus Lymphknoten, SV40-transformiert Maus O´Connell 1990 ATCC (American Type Culture Collection) CRL-2168 VCAM-1, konstitutionell Antigenexpression: Name: Ursprung: Spezies: Referenzen: Bezug: Antigenexpression: Name: Ursprung: Spezies: Referenzen: Bezug: b.End3 Endothelzellen aus Gehirn Maus Williams 1989 Zur Verfügung gestellt von Dr. B. Engelhardt, Max-Planck-Institut, Bad Nauheim (aktuelle Adresse: Universität Bern, Schweiz) VCAM-1, Zytokin-induziert L540rec Patient mit Hodgkin-Lymphom Mensch Diehl 1981 Instituts-eigen Name: Ursprung: ECV 304 / T24 Ursprünglich beschrieben als humane Endothelzellinie. Die Zuordnung wurde revidiert, da die Zellen eine genetische Übereinstimmung mit der Blasenkarzinom-Zellline T24 und somit einen epithelialen Ursprung aufweisen (Keratinozyten). Spezies: Mensch Referenzen: Takahashi 1990 Suda 2001 Bezug: ATCC (American Type Culture Collection) CRL-1998 Antigenexpression: VCAM-1, konstitutionell Name: Ursprung: Spezies: Referenzen: Bezug: Colo677 Ursprünglich beschrieben als humanes kleinzelliges Bronchialkarzinom, später jedoch revidiert als humanes multiples Myelom (Derivat der Zellinie RPMI-8226). Stammt von einer axillären Lymphknoten-Metastase eines 39-jährigen Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC) aus dem Jahr 1989; mittels DNA-Fingerprinting und zytogenetischer Analyse konnte jedoch eine Kontamination mit der Zelllinie RPMI-8226 nachgewiesen werden. Diese Zelllinie wurde 1966 etabliert aus dem peripheren Blut eines 61-jährigen Mannes mit multiplem Myelom (IgG lambda). Mensch www.dsmz.de (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) DSMZ, Braunschweig, D 51 Während viele humane Tumoren eine gute VCAM-1-Expression auf ihrem Gefäß-Endothel zeigen, findet man in Mäusen nur wenige Tumoren, die eine ausreichende VCAM-1-Expression haben. So exprimieren primär humane Hodgkin-Tumoren VCAM-1 auf ihren Blutgefäßen (Renkonen 1992, Christiansen 1998). Im Gegensatz dazu war die VCAM-1-Expression in den Xenograft-Tumoren aus der L540rec-Zelllinie nur gering (Dienst 2005). Nur nach vorheriger Injektion von LPS (Lipopolysaccharid, Endotoxin) ergab sich eine ausreichende VCAM-1Expression. In Colo677-Myelom-tragenden Mäusen zeigen sich immerhin etwa 30% der Blutgefäße positiv für VCAM-1. 2.1.3.2 Zellkulturmedien und Zusätze Endothelial Cell Basal Medium 2 PromoCell, Heidelberg, D Supplement Pack / Endothelial Cell PromoCell, Heidelberg, D Fetales Rinderserum 2% Epidermal Growth Factor 5 ng/ml Hydrocortison 0,2 µg/ml Vascular Endothelial Growth Factor 0,5 ng/ml Basic Fibroblast Factor 10 ng/ml R3 IGF-1 20 ng/ml Ascorbinsäure 1µg/ml Heparin 22,5 µg/ml RPMI-Medium Gibco BRL, Karlsruhe, D Trypanblau-Lösung Gibco BRL, Karlsruhe, D HBSS Gibco BRL, Karlsruhe, D FCS (fötales Kälberserum) Gibco BRL, Karlsruhe, D Trypsin-EDTA Gibco BRL, Karlsruhe, D 2.1.4 Bakterienstämme (Escherichia coli) HB101 Zur Verfügung gestellt von Dr. Sally Ward, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas TX, USA TG-1 Zur Verfügung gestellt von Dr. Sally Ward, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA XL1-Blue Supercompetent Cells 2.1.5 Stratagene, CA, USA Geräte Autoklav Varioklav 400 EV Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D 52 Biacore 2000 Biacore, Uppsala, Schweden Elektrophorese-Kammer DNA Gibco BRL, Karlsruhe, D ELISA-Reader Immunoreader NJ-2000 Nunc, Wiesbaden, D FACScan Durchflusszytometer Becton Dickinson, Heidelberg, D Fein-Waage Sauter, Ebingen, D Film-Entwickler AGFA, Mortsel, Belgien Gel-Dokumentationssystem Eagle Eye Stratagene, CA, USA Inkubator Zellkultur Heraeus, Herrenberg, D Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochen, D Mikroskope (aufrecht, invers) Leica, Solms, D Mikrozentrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg, D Phast System® Separations- und Kontrollein- Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D heit Reaktionsgefäß-Schüttelinkubator Eppendorf, Hamburg, D Schüttelinkubator Innova 4400 New Brunswick Scientific, Eppendorf, Hamburg, D Sicherheitswerkbank Heraeus HS 12/2 Heraeus, Herrenberg, D Spektral-Photometer Shimadzu, Duisburg, D Thermocycler Primus 96 Plus MWG-Biotech, Ebersberg, D Vortex Genie Mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA Waage Sartorius, Göttingen, D Wasserbad WB-10 Memmert, Schwabach, D Zentrifuge Sorvall RC-5B Sorvall, Du Pont, Newton, USA 2.1.6 Verbrauchsmaterial 48- und 96-Well-Mikrotiter-Platten Nunc, Wiesbaden, D Blotting-Filterpapier Schleicher & Schuell, Dassel, D Blotting-Membran Hybond C Extra Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D CM5-Sensorchip Biacore, Uppsala, Schweden Dialyseschläuche Spectra/Por Spectrum, Garden, USA Film für Western Blot Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D Spritzenfilter Millex-GV13 Filter Unit 0,22 Millipore, Bedford, USA µm 53 Das Verbrauchsmaterial für die Zellkultur-Arbeiten wurde von den Firmen Greiner (Solingen, D), Falkon/Becton-Dickinson (Heidelberg, D), Nunc (Wiesbaden, D) und Sarstedt (Nümbrecht, D) bezogen. 2.1.7 Versuchstiere SCID-Mäuse Instituts-eigene Zucht oder von Charles River WIGA, Sulzfeld, D CD1-Nacktmäuse Charles River WIGA, Sulzfeld, D 2.2 Methoden 2.2.1 Molekularbiologische Techniken Die Klonierungsstrategien sind im Ergebnisteil (Kap. 3.3.2) aufgeführt. 2.2.1.1 DNA-Präparation mittels QIAGEN Plasmid Mini-, Midi- und Maxi-Kit Das Prinzip der DNA-Präparation und Aufreinigung bei den Plasmid-Präparationskits besteht in der alkalischen Lyse von plasmidtragenden Bakterien, mit nachfolgender Bindung der DNA an immobilisierte Silikonpartikel in Anwesenheit von chaotropischen Salzen. Nach Waschschritten wird die DNA dann mit reinem Wasser oder einem geeigneten Puffer eluiert. Das Qiagen Miniprep-Kit wurde zur Präparation der DNA nach Transformationen eingesetzt. Die DNA wurde aus 1,5 ml Übernachtkulturen, die von einzeln gepickten Bakterienklonen stammten, nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und in 50 µl Tris-aminomethanpuffer (1-10 mM, pH=8.0) eluiert. Die Qiagen Midi- und Maxi-Prep-Kits wurden zur Amplifizierung von Plasmid-DNA, die als Ausgangsmaterial für Klonierungen oder Proteinexpressionen eingesetzt wurde, benutzt. 500 ml Übernachtkulturen wurden gemäß Herstellerangaben lysiert und die DNA nach Vorschrift präpariert. 2.2.1.2 DNA-Restriktionsspaltung Die Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA wurde auf unterschiedlichen Ebenen des Klonierungsprozesses durchgeführt. Sie diente zum Einen zur Gewinnung von scFv-DNA für die Klonierung aus dem bereits im Labor vorhandenen Plasmid pswc4-MK27 (präparatives Gel). Zum Anderen wurde die DNA aus Mini- oder Maxi-Präparationen zur Kontrolle auf das Vorhandensein des zuvor klonierten Fragmentes geprüft (analytisches Gel). Die Restriktionsenzyme schneiden die DNA an einer für jedes Enzym spezifischen Stelle. Dabei wird aus dem Plasmid wie 54 weiter oben auf der Plasmidkarte ersichtlich (siehe Abb. 2.1) durch paarweisen Verdau mit HindIII und XbaI bzw. SacI und KpnI das scFv- bzw. das tTF-Gen ausgeschnitten. Die DNARestriktionsfragmente werden dann in einem 0,8%igen (Plasmide) bzw. 1,5%igen (Fragmente) Agarose-Ethidiumbromid-Gel bei 75 V nach ihrer Größe aufgetrennt und mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid angefärbt, unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht und fotografisch dokumentiert. Reaktionsansatz für analytische Ansätze: DNA aus Miniprep 5 µl 100X BSA 0,15 µl 10X Puffer 1 oder 2 1,5 µl Restriktionsenzym 1 0,1 µl Restriktionsenzym 2 0,1 µl Aqua dest. 8,15 µl Inkubation: 2 Stunden bei 37 °C im Wasserbad Inaktivierung: 20 min bei 65 oC im Wasserbad (optional) Für präparative Ansätze wurden entsprechend höhere Mengen eingesetzt. 2.2.1.3 DNA-Extraktion: QIAEX II Agarose Gel Extraktion Zum Aufreinigen von DNA nach PCR bzw. Restriktionsspaltung wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt (siehe Kap 2.2.1.2), die entsprechenden Banden ausgeschnitten und mittels des QIAEX-II-Agarose-Gel-Extraktions-Kits der Firma QIAGEN nach Angaben des Herstellers präpariert. Das Kit beruht auf dem Prinzip der Bindung von DNA an suspendierte Silikapartikel in Anwesenheit von chaotropischen Salzen. Die Partikel werden nach Auflösung des Gels und Bindung der DNA an Silika abzentrifugiert, gewaschen und die DNA mit Wasser oder einem geeigneten Puffer eluiert. Die Elution erfolgte hier mit 2 x 20 µl Wasser für die Molekularbiologie, da die DNA direkt weiter verarbeitet wurde. 2.2.1.4 DNA-Präzipitation Die Präzipitation der DNA dient der Konzentrierung und Aufreinigung, z.B. vor dem Laden größerer Mengen DNA auf ein Gel oder nach Ligation. Ansatz: 1 Vol. DNA 1/10 Vol. 3M NaOAc, pH=5.2 1 µl Glycogen (20mg/ml) 2,5 Vol. EtOH 100 % 55 Die Präzipitation erfolgte bei -20 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Reaktionsgefäße 30 min bei 4 °C und 16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Präzipitat mit 70%igem EtOH gewaschen. Es folgte eine 5-minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur. Der Überstand wurde abgenommen und das Präzipitat leicht luftgetrocknet. Es folgte die Resuspension in 50 µl ddH2O. 2.2.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration mittels Absorptions-Spektrometrie Das bei einer Wellenlänge von 260 nm absorbierte ultraviolette Licht ist der Nukleinsäure-Konzentration direkt proportional. Die Nukleinsäure-Konzentration errechnet sich nach LambertBeer (siehe Formel 1) aus der optischen Dichte bei 260 nm (OD260 nm), der Verdünnung und einem für DNA, RNA bzw. Oligonukleotide spezifischem Extinktionskoeffizienten. Für doppelsträngige DNA wurde ein Extinktionskoeffizient von 50 mgcmL-1 und für einzelsträngige Oligonukleotid-DNA von 20 mgcmL-1 verwendet. Aus dem Verhältnis der OD260 nm und der OD280 nm erhält man eine Aussage über die Reinheit bzw. Proteinkontamination der Probe. Formel 1: Lambert-Beer Gesetz A=εxcxd wobei A die Absorption oder optische Dichte bei der betreffenden Wellenlänge, ε der Extinktionskoeffizient, c die Konzentration und d die Schichtdicke der Küvette ist. 2.2.1.6 Sequenzanalyse Die Sequenzierungsreaktionen wurden mithilfe des ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits durchgeführt. Das Kit enthält eine optimierte Mischung aus dNTPs, ddNTP- Terminatoren mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (vier je nach Terminator verschiedene Dichlororhodamin-Akzeptor-Farbstoffe, welche durch Carboxyfluorescein angeregt werden), Polymerase, MgCl2 und PCR-Reaktionspuffer. In einer PCR-Reaktion wurde die DNA amplifiziert und mithilfe des Kits nach der Sanger-Kettenabbruchmethode fluoreszenzmarkiert. Die elektrophoretische Auftrennung und Bestimmung der DNA-Sequenz wurde im Anschluss durch das „Zentrum für molekulare Medizin der Universität zu Köln“ (ZMMK) durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit der Software Vector NTI®. PCR-Sequenzierungsreaktion: Reaktionsansatz: 0,5 µg DNA (entspricht ca. 5 µl eines Mini-Preps) 1 µl Sequenzier-Primer (10 µM) 56 Aqua dest. ad 16 µl 4 µl Big Dye ddNTP Terminator-Mix Inkubation: 35 Zyklen im Thermocycler (10 s 96 °C, 5 s 50 °C, 4 min 60 °C) Fällung: wie unter Kap. 2.2.1.4 beschrieben, jedoch ohne Glycogen und für 5 min bei RT 2.2.1.7 Primer-Duplex Insertion Um Linker verschiedener Länge zwischen dem scFv- und dem tTF-Gen einzufügen, wurde eine Primer-Duplex Insertion durchgeführt. Die Primersequenzen sind in Tab. 2.1 in Kapitel 2.1.1.3 aufgeführt. Für die Primer-Duplex Insertion wurden phosphorylierte Primer und dephosphorylierte Plasmide verwendet. Als ATP-Quelle diente Ligationspuffer. 2.2.1.7.1 Phosphorylierung der Oligonukleotid-Primer Reaktionsansatz: 10 µl Primer 2 µl 10X Ligationspuffer 0,5 µl Polynukleotidkinase 7,5 µl DEPC-behandeltes Wasser Inkubation: 30 Minuten bei 37 °C im Wasserbad Inaktivierung: 5 Minuten bei 80 °C im Wasserbad 2.2.1.7.2 Annealing der Oligonukleotid-Primer Reaktionsansatz: je 2 µl der komplementären Oligonukleotid-Primer aus obigem Phosphorylierungsansatz 1 µl TM-Puffer (500 mM Tris pH = 8,0; 100 mM MgCl2) 5 µl DEPC-behandeltes Wasser Inkubation: 5 Minuten bei 80 °C im Wasserbad, dann über mehrere Stunden auf Raumtemperatur abkühlen lassen 2.2.1.7.3 Reaktionsansatz: Ligation der Primer-Duplexe in das Expressionsplasmid 100 ng pswc4 (linearisiert durch Restriktionsspaltung mit XbaI und KpnI, im Gel aufgereinigt) 5 µl Oligonukleotid-Primer aus obiger Annealing-Reaktion 1,5 µl Ligationspuffer 1 µl Ligase 57 4,5 µl ddH2O Inkubation: über Nacht bei 16 °C 2.2.1.8 Polymerasekettenreaktion zur Herstellung der tTF-Fragmente und der längeren Linker Die verschieden langen tTF-Fragmente wurden ausgehend von dem im Labor vorhandenen pswc4-MK27-Plasmid mittels Hot-Start-PCR hergestellt. Reaktionsansatz für tTF-PCR: Mix A: 4 µl pswc4 1:100 (12 ng) 4 µl 20 µΜ Back-Primer (tTF-Back-Kpn) 4 µl 20 µΜ Forward-Primer (tTF220-228) 40 µl ddH2O Mastermix B (pro Ansatz): 10 µl Nukleotide (2 mM) 27.2 µl ddH2O 10 µl RB (Expand High Fidelity PCR Buffer) 0,8 µl Polymerase Die Reaktionsansätze wurden im Thermocycler bei 96 °C für 5 min denaturiert. Dann wurde das Gerät auf Annealing-Temperatur (55-60 °C) gebracht und 12 µl des Mastermixes hinzu gegeben. Anschließend wurden 35 Zyklen unter den folgenden Bedingungen gefahren: 5 Zyklen: 94 oC 30 sec 55/60 oC 30 sec o 72 C 30 sec 30 Zyklen: 94 oC 30 sec 57 oC 30 sec 72 oC 30 sec o o 72 C 5 min, 4 C unendlich Analog wurden unterschiedlich lange Linker amplifiziert (pswc17-19), das Ausgangsmaterial war das im Labor vorhandene Plasmid pswc4-390 (80 ng), die Primer waren Linker-For und LinkerBack. 2.2.1.9 Ligation PCR- und Restriktionsfragmente in Expressionsplasmid Um die neuen Expressionsplasmide herzustellen, wurden zunächst die tTF-kodierenden PCRProdukte in die Expressionsplasmide, welche nach der Primer-Duplex-Insertion bzw. PCR- 58 Fragment-Klonierung verschiedene Linker enthielten, ligiert. Im Anschluss wurde jeweils das MK27 scFv (ausgeschnitten vom Plasmid pswc4-MK27) in die resultierenden Plasmide ligiert. Reaktionsansatz: 20 ng Plasmid für tTF-Ligation bzw. 15 ng für scFv-Ligation 34 ng tTF-DNA bzw. 28 ng scFv-DNA 1,5 µl 10X Ligationspuffer 1 µl Ligase ddH2O ad 15 µl Inkubation: über Nacht bei 16 °C 2.2.1.10 Hitzeschock-Transformation 2.2.1.10.1 Herstellung von LB-Ampicillin-Platten Die LB-Ampicillin-Platten dienen der Selektionierung von Bakterien, die nach der Transformation das gewünschte Plasmid in sich tragen, auf welchem sich ein Ampicillin-Resistenz-Gen befindet. Autoklavierter LB-Agar wurde in der Mikrowelle zum Schmelzen gebracht. Nach Abkühlung auf 50 oC wurde das Selektivantibiotikum Ampicillin in einer finalen Konzentration von 100 µg/ml zugegeben und der Agar steril in 10 cm große Petrischalen pipettiert. Nach Erstarren wurden die Platten bei 4 °C gelagert. 2.2.1.10.2 Hitzeschock Chemokompetente E.coli-Bakterien des Stammes XL1-Blue (für Klonierungen) oder TG1 bzw. HB101 (für Protein-Expressionen) wurden auf Eis aufgetaut. 100 µl der Bakteriensuspension wurden mit 50 ng der zu transformierenden DNA versetzt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 45 Sekunden bei 41,5 °C wurden die Zellen erneut für 2 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 800 µl LB-Medium zugegeben und die Zellen für mindestens 45 Minuten bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgefäß 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment vorsichtig mit 200 µl LBMedium resuspendiert. Je 50 µl und 150 µl dieser Suspension wurden auf LB-AmpicillinSelektionsplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die anschließende Lagerung erfolgte bei 4 °C. 2.2.2 Proteinexpression 59 Für den Ansatz der Vorkultur wurde eine Kolonie der zuvor transformierten TG1- bzw. HB101Bakterien in 5 ml LB-Medium für 4 Stunden (ggf. länger) bei 37 °C im Schüttelinkubator bis zu einer photometrisch bestimmten optischen Dichte bei 600 nm (OD600nm) von 0,3-0,5 angezogen. Mit 250 µl dieser Vorkultur wurde dann in einem 2-Liter-Erlenmeyerkolben die Hauptkultur beimpft, die 500 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml Endkonzentration) und Glucose (1% Endkonzentration) enthielt. Diese wurde über Nacht bei 30 °C und 200 Upm in einem Schüttelinkubator herangezogen und am darauffolgenden Tag bei 37 °C bis zu einer OD600nm von 0,6 weiter kultiviert. Wenn am nächsten Morgen die gewünschte OD600nm von 0,6 noch nicht erreicht war, wurde die Temperatur des Inkubators auf 37 °C erhöht. Anschließend wurden die Hauptkulturen zweimalig in LB-Medium gewaschen. Das Sediment wurde in 500 ml Expressionsmedium überführt (LB mit finalen Konzentrationen von 100 µg/ml Ampicillin, 4 µM Leupeptin zur Proteolyseinhibition und 50 µM IPTG zur Induktion der Proteinexpression). Nach einstündiger Inkubation bei 24 °C im Schüttelinkubator wurden die Kulturen bei 4 °C zentrifugiert. Die Isolation des Periplasmas erfolgte durch einen osmotischen Schock in TES. Dazu wurde das Sediment in 20 ml eisgekühltem TES vorsichtig resuspendiert und dann 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach 20minütiger Zentrifugation bei 600 g und 4 °C wurde der Überstand 10 Minuten bei 16000 g klar zentrifugiert und direkt anschließend zur Aufreinigung auf die Ni-NTA-Chromatographiesäulen geladen. Das Sediment wurde in 20 ml TES 20 % auf Eis resuspendiert und erneut 30 Minuten inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 16000 g wurde auch dieser Überstand auf die Säulen geladen. Die Proteinexpressionen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA). Für die Expression von tTF wurde ein Denaturierungs-Renaturierungsprotokoll angewandt, welches von Maike Unruh durchgeführt wurde, und deshalb hier nicht näher beschrieben ist. 2.2.3 Die Proteinaufreinigung Aufreinigung der gewonnenen Proteine erfolgte durch eine Ni-NTA- Affinitätschromatographie. Dabei bindet das Proteinkonstrukt, welches ein Histidin-Tag enthält (6 x Histidin), an die Nickelionen der Chromatographie-Matrix. Die Elution erfolgt durch das Histidin-Analog Imidazol. Hierzu wurden Säulen mit 0,75 ml Bettvolumen in PBS äquilibriert. Das Periplasma-Isolat wurde unmittelbar im Anschluss an die Zentrifugation auf die Säule gegeben. Nach vollständiger Ladung der Säule wurde diese 30 Minuten mit PBS gewaschen. Die Eluation des Proteins erfolgte mit 100 mM Imidazol. Dabei wurden 10 Fraktionen á 1 ml aufgefangen. Nach Bestimmung des Proteingehaltes (siehe 2.2.4.1) und Auswahl der proteinhaltigen Fraktionen, wurden diese vereinigt und zur Entfernung des Imidazols über Nacht bei 4 °C gegen PBS dialysiert. Die Proteine wurden mit Hilfe eines Spritzenfilters sterilisiert und anschließend bei 4 °C gelagert. 60 Für Proteine, die im Tierversuch eingesetzt wurden, wurde zur Steigerung der Reinheit und Entfernung von LPS ein zweiter Reinigungsschritt mittels einer S200-Sephadex-Gelfiltration, ggf. ergänzt durch ein spezifisches Endotoxin-Affinitätsgel, durchgeführt. Dieses erfolgte durch Maike Unruh und ist hier deshalb nicht weiter beschrieben. 2.2.4 Protein-Analyse 2.2.4.1 Protein-Konzentrationsbestimmung mittels Biuret-Reaktion Zur Identifikation der proteinhaltigen Fraktionen aus der Säulenaufreinigung wurde das DCProtein-Assay (Bio-Rad) verwendet. Dieses Assay basiert auf einem modifizierten Lowry-Test. Das Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Dieser reduziert das Folin-Reagenz, welches dadurch eine blaue Farbe entwickelt, die photometrisch bestimmt wird und proportional der Proteinkonzentration ist. 50 µl jeder Fraktion wurden in eine Kunststoffküvette pipettiert. Nach der Zugabe von 20 µl Reagenz A (alkalische Cu2+-Tartrat-Lösung) und 1000 µl Reagenz B (Folin-Reagenz) erfolgte eine fünfminütige Inkubationszeit. Die Absorption wurde anschließend in einem Photometer bei 690 nm gemessen. Es wurden die Fraktionen vereinigt, deren Extinktion > 0,010 war. 2.2.4.2 Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer und Gelelektrophorese Die Konzentrationsbestimmung der gepoolten Proteine erfolgte mittels eines UV-Spektrometers. Aus der ermittelten Absorption bei 278 nm und Division durch den Extinktionskoeffizienten (ε0.1% = 1.2 g cm-1L-1) wurde nach Lambert-Beer (Formel 1) die Gesamtproteinkonzentration berechnet. Um die spezifische Proteinkonzentration zu bestimmen, wurde zusätzlich eine SDSGelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung durchgeführt (siehe Kap. 2.2.4.4). Die Fraktion des spezifischen Proteins wurde mit der Gesamtkonzentration multipliziert, um die spezifische Proteinkonzentration zu erhalten. 2.2.4.3 Gelfiltration und Endotoxinbestimmung Proteine, die im Tierversuch eingesetzt wurden, wurden auf Endotoxingehalt geprüft. Hierzu wurde ein Standard LAL (Limulus-Amöbozyten-Lysat)-Test von Maike Unruh (BTA) durchgeführt (siehe Dienst 2005 für Details). 2.2.4.4 SDS-Gel-Elektrophorese mit dem Phast-System 61 Für die elektrophoretische Auftrennung und Anfärbung der Proteine wurde das Phast-System der Firma Amersham Biosciences verwendet. Dieses System ermöglicht eine automatisierte ProteinElektrophorese und anschließende Färbung. Es besteht aus einer Trenn-Kontrolleinheit für die Systemkontrolle und Elektrophorese und aus einer Entwicklungseinheit für die automatisierte Färbung. Die Elektrophorese wird auf einer thermostatischen Platte ausgeführt, die Temperaturen zwischen 0 °C und 70 °C erzeugt. Es können zwei Gele gleichzeitig verwendet werden. Die Trennvorrichtung besteht aus zwei positiv geladenen Anoden und einer negativ geladenen Kathode für jedes Gel. Die Proben wurden 1:1 mit einem Laufpuffer verdünnt und mit Hilfe eines Plastikkammes auf das Gel (Polyacrylamid-Gradientengel 4-15 %) aufgebracht. Durch Starten des entsprechenden Programms an der Kontrolleinheit wurden die Gele automatisch separiert. Die Entwicklungseinheit besteht aus einer Färbekammer mit Halterung für zwei Gele. Über mehrere Anschlüsse können die entsprechenden Färbereagenzien mittels einer pneumatischen Pumpe in die Kammer und aus der Kammer heraus gepumpt werden. Außer für den Western-Blot wurden alle Gele mit einer Coomassie-Blau-Lösung durch Starten des entsprechenden Programms angefärbt. Die an die Färbekammer angeschlossenen Lösungen setzten sich wie folgt zusammen: Lösung I: Farbstoff Coomassie Stock IA 5 Tabletten Blue R in 400 ml Aqua dest., 10 Minuten mischen 600 ml Methanol hinzufügen Lösung mit Faltenfilter filtern Coomassie Stock IB 20%ige Essigsäure in Aqua dest. Lösung IA und IB wurden zu gleichen Teilen gemischt. Lösung II: Entfärber 300 ml Methanol 100 ml Eisessig 600 ml Aqua dest. Lösung III: Konservierung 50 ml Glycerol 100 ml Eisessig 850 ml Aqua dest. 62 Die Elektrophoresen und Färbungen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA). Programme für Protein-Gelelektrophorese A) Separationsprogramm: 4-15% SDS Gradientengel Sample appl Down Sample appl up Step 2.1 Step 2.2 Step 2.3 Step 2.4 2.1 2.1 250V 250V 250V 50V 0001 0010 10mA 1mA 10mA 0.1 mA 3W 3W 3W 0.5W 15 oC 15 oC 15 oC 15 oC 1 Vh 1 Vh 80 Vh 0 Vh B) Entwicklerprogramm: Coomassie-Blau-Färbung Step 1.1 Step 1.2 Step 1.3 Step 1.4 Step 1.5 2.2.5 Lösung 1 0.1 % Coomassie Blue, 30% MetOH, 10% HAc 2 30% MetOH, 10% HAc 2 30% MetOH, 10% HAc 2 30% MetOH, 10% HAc 3 5% Glycerol, 10% HAc IN 1 OUT 0 8 min 50 oC 2 2 2 9 0 0 0 0 5 min 8 min 10 min 5 min 50 oC 50 oC 50 oC 50 oC Western-Blot Der Western-Blot ist ein Verfahren, bei dem Proteine zunächst in einem Gel nach ihrer Größe elektrophoretisch aufgetrennt werden. Danach werden die Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, auf der sie immobilisiert werden. Anschließend können die Proteine durch Bindung geeigneter Antikörper-Enzymkonjugate und nachfolgender Inkubation mit Chemilumineszenz-, Fluoreszenz- oder chromogenen Substraten sichtbar gemacht werden. Die Proteine wurden mit Hilfe des Phast-Systems elektrophoretisch in einem Gel aufgetrennt und dann bei 70 °C mittels kapillären Hitzetransfers auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen durch 1% Membrane-Blocking Reagent blockiert. Die Membran wurde dann in 1 µg/ml des Primär-Antikörpers (muriner antiFLAG-Antikörper M2, im Antikörperverdünnungspuffer PBS-T mit 1% BSA und 10% FCS) für mindestens 45 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T wurde die Membran mit 0,2 µg/ml des Sekundär-Antikörpers (rat-anti-mouse-IgG-Peroxidase in Antikörperverdünnungspuffer) gefärbt. Zur Detektion wurde die Membran 3 Minuten in Luminol-Lösung (aus Supersignal Western 63 Blot Kit) inkubiert. Luminol ist ein Chemilumineszenz-Substrat für Peroxidase. Die Chemilumineszenz wurde anschließend mit dem Entwicklungsgerät auf einem lichtempfindlichen Film (Kodak) sichtbar gemacht. Die Protein-Banden können durch Vergleich mit einem vorgefärbten Protein-Größenstandard identifiziert werden. Die Western Blots wurden zum Teil von Andrea Grunow (Biologin) durchgeführt. 2.2.6 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie oder auch FACS (Fluorescence activated cell sorter)-Analyse ist ein Verfahren zur Quantifizierung von Zellen oder Partikeln aufgrund ihrer relativen Größe, Granularität oder Fluoreszenz-Intensität (Renz 2009) mit Hilfe von Laserstrahlung. Dabei passieren die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung als Einzelzellstrom einen Laserstrahl. Dieser wird in Abhängigkeit von Größe und Granularität in verschiedene Richtungen gestreut. Nach Markierung von Antigenen mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern können die Zellen außerdem aufgrund ihrer Fluoreszenz-Intensität differenziert werden. Mit Hilfe der FACS-Analyse wurde die Bindungsfähigkeit des scFv-Anteils der Fusionsproteine an VCAM-1 auf 2F2B-Zellen getestet. Es wurden 2 x 105 Zellen pro Röhrchen eingesetzt. Die Zellen wurden zweimal mit je 500 µl FACS-Puffer gewaschen. Das Sediment wurde in 10 µg/ml Primär-Antikörper (150 nM Fusionsprotein in FACS-Puffer) resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit je 500 µl FACS-Puffer gewaschen und mit dem Sekundär-Antikörper (sheep-anti-human-tTF, 10 µg/ml) 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen erfolgte die Zugabe des Fluoresceinisothiocyanat-markierten Antikörpers (donkey anti-sheep-FITC, Serotec STAR88F, 1:200), der 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert wurde. Nach zweimaligem Waschvorgang wurden die Proben in 500 µl FACSpuffer mit 2 µl Propidiumjodid (Endkonzentration 4 µg/ml) resuspendiert. Anschließend erfolgte die Messung im FACS-Gerät. Die Auswertung erfolgte anhand der Fluoreszenz-Histogramme. Es wurden Negativ- (Zellen ohne Primär-Antikörper) und Positiv-Kontrollen (MK271IgG, Markierung mit anti-rat-FITC) mitgeführt. Die FACS-Analysen erfolgten zum Teil mit Hilfe von Maike Unruh (BTA). 2.2.7 Affinitätsmessung mit dem Biacore®-System Das Verfahren zur Ermittlung der Affinität von Molekülen beruht auf der optischen Methode der Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Surface Plasmone Resonance, SPR). Zur AffinitätsBestimmung eines Antikörpers wird das entsprechende Antigen auf einem Sensorchip immobilisiert (Hermey 2010). Der Sensorchip besteht aus Glas und einer sehr dünnen Goldschicht, auf der 64 eine Dextranschicht aufgebracht ist, an die das Antigen kovalent gebunden wird. Über den Sensorchip wird kontinuierlich Puffer gespült. Der im Puffer enthaltene Antikörper bindet an das Antigen und dissoziiert anschließend wieder. Die Interaktionen der Moleküle können in Echtzeit beobachtet werden. Dabei wird der Brechungsindex des Lichtes, das auf den Sensor trifft, kontinuierlich gemessen. Der Brechungsindex hängt ab von der Masse der an die Dextranschicht gebundenen Moleküle. Die Auswertung der Messungen erfolgte mit Hilfe der BiaEvaluation-Software. Dabei wird ein Sensorgramm erstellt, in dem die Veränderung des Resonanzwinkels (Resonanzeinheiten = RU) gegen die Zeit aufgetragen ist. Dabei entspricht 1 RU einer Änderung um 0,0001 °, was mit einer Zunahme der Oberflächenkonzentration auf dem Sensorchip von 1 pg/mm² korrespondiert. In dieser Arbeit wurden 5000 RU eines rabbit-anti-human-Fc-Antikörper auf einem CM5Sensorchip immobilisiert. Dazu wurde das Amine-Coupling-Kit nach Vorschrift des Herstellers verwendet. Dann wurde ein chimäres Protein aus murinem VCAM-1 und humanem Fc-Fragment mit 400 RU aufgebracht. Das anti-VCAM-1-tTF-Fusionsprotein wurde mit ansteigenden Konzentrationen von 0,5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml und 20 µg/ml und einer Flussgeschwindigkeit von 30 µl/Minute injiziert. Die Flusszellen wurden mit Glycin-Puffer regeneriert. Eine leere Flusszelle ohne immobilisiertes VCAM-1 diente als Negativ-Kontrolle. Die Bindungskurven wurden mit der BiaEvaluation-Software 3.1 analysiert. Die SPR-Sensogramme wurden unter der Annahme einer homogenen 1:1 Assoziation (Langmuir- Bindungsmodell) angepasst. Die Messung und Auswertung der Biacore-Daten wurde mit Hilfe von Aiko Ferrari und Claudia Gottstein durchgeführt. 2.2.8 Koagulationstests 2.2.8.1 Zellfreier Koagulationstest Die in-vitro Koagulations-Aktivität der Fusionsproteine wurde in einem zellfreien Zwei-PhasenKoagulationstest analysiert, der die Faktor X-Aktivierung misst. Zunächst wurde ein sogenannter Koagulationsmix aus 10 nM Faktor VIIa, 5µM Phosphatidylserin und 15 µM Phosphatidylcholin in Calciumpuffer auf Eis hergestellt. Zwischen den einzelnen Pipettierschritten wurden die hydrophoben Bestandteile durch ständiges Mischen auf einem Vortex-Mischer in Suspension gehalten. Je 100 µl/Well des Koagulationsmixes wurden in 96-WellPlatten pipettiert. Dann wurden je 10 µl des in Calciumpuffer verdünnten Fusionsproteins (je 10 und 20 nM in Doppelbestimmungen) hinzugefügt. tTF wurde als Positiv-Kontrolle und Calciumpuffer als Negativ-Kontrolle eingesetzt. Die Platte wurde zugedeckt für 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 50 µl Faktor X (entspricht einer finalen Konzentration von 30 nM/L) pro Well pipettiert. Nach weiteren 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 µl S2765 65 (verdünnt in EDTA-Puffer, pH = 8,0) pro Well hinzugefügt, was einer finalen Konzentration von 0,3 mM/L entspricht. Der entstandene Faktor Xa hydrolysiert das chromogene Substrat S2765, welches die chromophore Gruppe p-Nitroanilin freisetzt, dessen Farbe gemessen werden kann. Die Messung erfolgte nach 3 Minuten in einem Photometer bei 405 nm (Absorptionsmaximum für das Substrat) minus die Absorption bei 650 nm (Hintergrund). 2.2.8.2 Zellgebundener Koagulationstest Die Optimierung und Etablierung des zellgebundenen Koagulationstests ist Bestandteil dieser Arbeit und wird detailliert im Ergebnis-Teil beschrieben. Es wurden verschiedene Zelllinien (2F2B, HUVEC, Bend3, ECV304) in verschiedenen Konzentrationen (meist 1-5 x 104 Zellen/Well) in 48-Well-Zellkultur-Platten gesät. Diese wurden 24 bis 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach erfolgte eine mikroskopische Kontrolle auf Sterilität und Unversehrtheit der Zellen. Das Zellkultur-Medium wurde entfernt und die Zellen dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 150 µl des zu untersuchenden Fusionsproteins (Konzentrationen zwischen 1 und 100 nM, verdünnt in Zellkultur-Medium) inkubiert. Als Negativ-Kontrollen dienten tTF und Zellkultur-Medium oder HBSS. Es folgten drei Waschschritte mit je 300 µl Calciumpuffer. Dann wurden je 100 µl Koagulations-Mix/Well (Calciumpuffer mit 10 nM FVIIa, 50 nM FIX (optional), 200 nM FX und 20 µM Phospholipide (optional)) hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 90 µl je Probe in 96-Well-Platten überführt. Es wurden 100 µl/Well des chromogenen Substrates S2765 (verdünnt in EDTA-Puffer, pH = 8) für eine Endkonzentration von 0,3 mM hinzugefügt. Die Messung bei 405-650 nm erfolgte nach 1 und 3 Minuten Inkubationszeit. 2.2.9 Zellkultur 2.2.9.1 Kultivierung der Zellen Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in Kulturflaschen mit einer Kulturfläche von 175 cm². Bei konfluentem Wachstum wurden die Zellen neu passagiert. HUVEC-Zellen wurden in Endothelial Cell Basal Medium 2 kultiviert. 2F2B-, ECV304-, Bend3- und L540-Zellen wurden in RPMI-Medium mit Zusatz von 10% FCS kultiviert. 2.2.9.2 Ablösen der adhärenten Zellen Die adhärenten Zellen wurden zunächst mit Ca++- und Mg++-freiem PBS (Phosphate-BufferedSaline: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) gewaschen. Nach dreiminütiger Inkubation mit 2X Trypsin/EDTA-Lösung bei 37 °C wurden die Zellen abgelöst und zum Entfernen des Trypsins abzentrifugiert. 66 2.2.9.3 Bestimmung der Zellzahl Zur Ermittlung der Zelldichte wurden 50 µl der Zellsuspension mit 150 µl Trypanblau angefärbt. Die Zählung erfolgte dann mikroskopisch in einer Neubauer-Kammer. 2.2.10 Tierversuche Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Instituts-Richtlinien durchgeführt und folgten den Empfehlungen der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS). Die Mäuse wurden in einer abgeschlossenen Anlage mit dem Hygiene-Status „spezifisch und opportunistisch Pathogen-frei“ (SOPF) gehalten. Dabei wird die Luft gefiltert und mit Überdruck in der Anlage gehalten. Die Mäuse waren in einem separaten luftgefilterten Regal in Mikroisolator-Käfigen untergebracht. Der Hygienestatus der Tiere wurde regelmäßig von einem externen Labor überprüft. Der Zugang zu der Anlage war beschränkt. Alle von außerhalb kommenden Mäuse wurden von zertifizierten Anbietern mit adäquaten Gesundheitszeugnissen bezogen. Ein Teil der Mäuse stammte aus der eigenen Zucht, welche in demselben Raum in Isolatoren und Mikrofilter-Käfigen untergebracht war. Wir verwendeten weibliche Mäuse mit einem Alter von 4-5 Wochen und einem Gewicht von 20-25 Gramm. In einem Experiment war die Hälfte der Mäuse männlich. Diese wurden gleichmäßig auf die verschiedenen Behandlungsarme aufgeteilt. Alle Tierexperimente wurden mit Hilfe von Maike Unruh (BTA) und Samir Tawadros (Tierpfleger) durchgeführt. Die histologische und immunhistologische Aufarbeitung erfolgte durch Maike Unruh bzw. durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Universität zu Köln. Die histologische Auswertung erfolgte durch Frau Dr. med. Claudia Gottstein und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln). 2.2.10.1 Therapeutische in vivo Experimente mit anti-VCAM-1-tTF 2.2.10.1.1 Kurzzeit-Experimente Es wurden 30 SCID-Mäusen bzw. 72 CD1-Nacktmäusen jeweils 107 L540rec- (Hodgkin-Lymphom) bzw. Colo677-Zellen (multiples Myelom) subkutan an der rechten Flanke injiziert. Dabei entwickelten 90 % der SCID-Mäuse, die mit L540rec-Zellen behandelt wurden, und 73 % der Nacktmäuse, die mit Colo677-Zellen behandelt wurden, sichtbare Tumoren. Nachdem die Tumoren nach ein bis zwei Wochen eine tastbare Größe entwickelt hatten, wurden sie täglich mit einer Schieblehre in drei Ebenen vermessen. Die messenden Personen waren gegenüber den Behandlungsarmen verblindet. Für jedes einzelne Experiment wurden die Messungen immer von derselben Person durchgeführt. Die Tumor-Volumina wurden mit der Formel π/6 × a × b × c berechnet. 67 Bei einer Tumorgröße von 150-300 µl wurden Gruppen von 6 bis 13 Mäusen 20 µg des antiVCAM-1-tTF in 400 µl NaCl 0,9 % oder eine äquimolare Menge eines Kontroll-Reagenzes (10µg tTF, 10 µg scFv oder NaCl 0,9 %) in eine Schwanzvene injiziert. Bei den Lymphom-tragenden Mäusen wurden den Proben vor Injektion 500 ng LPS hinzugefügt, um die VCAM-1-Expression in den Tumorgefäßen zu induzieren. Da LPS die Gerinnung beeinflussen kann, wurden in allen Fällen die gleichen Mengen LPS im Behandlungs- und im Kontrollarm eingesetzt. Die Tiere wurden nach der Injektion bezüglich klinischer Zeichen von Toxizität zu festgelegten Zeitpunkten beurteilt (nach 5, 10, 15, 30, 60 und 120 Minuten und nach 1, 2 und 3 Tagen). Drei Tage nach der Behandlung wurden die Tiere mit einer Äther-Überdosis terminiert und es wurde eine Autopsie durchgeführt. Tumor und Organe (Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Milz, Dünndarm und Pankreas) wurden für die histologische Aufarbeitung entnommen. Hierzu wurden die Gewebsproben in 3%igem Formalin (in PBS) fixiert und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) oder immunhistochemisch angefärbt. Diese Arbeiten wurden im Institut für Pathologie der Universität zu Köln (Universitätsprofessor Dr. med. J. Fries und Tanja Roth) oder durch Maike Unruh (BTA) durchgeführt. Es wurden mehrere Schnitte von jedem Tumor lichtmikroskopisch analysiert. Der prozentuale Anteil der Gewebsnekrose bezogen auf die Gesamtfläche des Schnittes wurde lichtmikroskopisch und zum Teil mit Hilfe eines Densitometrie-Scans bestimmt. Die Organe (Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Milz, Dünndarm und Pankreas) jeder Maus aus den Kurzzeit-Experimenten wurden lichtmikroskopisch auf Thrombosen und Nekrosen untersucht. Die Anzahl thrombotischer oder nekrotischer Ereignisse pro Gewebsschnitt wurde dokumentiert. Die histologische Beurteilung wurde von zwei verschiedenen Untersuchern, Frau Dr. med. Claudia Gottstein und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. J. Fries (Institut für Pathologie der Universität zu Köln), unabhängig voneinander durchgeführt. 2.2.10.1.2 Langzeit-Experimente SCID-Mäusen (n = 40) wurden subkutan L540rec-Zellen und Nacktmäusen (n = 64) wurden subkutan Colo677-Zellen, wie bereits für die Kurzzeit-Experimente beschrieben (siehe Kap. 2.2.10.1.1), injiziert. Es entwickelten sich Tumoren bei 91 % der L540rec/SCID-Mäuse und bei 69 % der Colo677/Nacktmäuse. Sobald die Tumor-Volumina 200-250 µl erreicht hatten, wurden fünf bis zehn Mäuse pro Gruppe an den Tagen 0, 4, 8 und 12 (für Lymphom-tragende Mäuse) oder an den Tagen 0, 4 und 8 (für Myelom-tragende Mäuse) intravenös mit 20 µg anti-VCAM-1tTF in 400 µl NaCl 0,9 % oder äquimolaren Mengen eines Kontroll-Reagenzes (10 µg tTF, 10 µg scFv oder NaCl 0,9 %) behandelt. Bei den Lymphom-tragenden Tieren wurden allen zu injizierenden Reagenzien 500 ng LPS hinzugefügt. In dem Colo677/Myelom-Modell wurden zwei wei- 68 tere Gruppen mit einer Kombinationsbehandlung mit dem Fusionsprotein und Doxorubicin, welches nachgewiesen eine gute in-vivo-Wirksamkeit gegen Colo677-Zellen hat, oder Doxorubicin alleine behandelt. Diesen Mäusen wurden 8 mg/kg Doxorubicin an den Tagen 0, 7 und 11 zusätzlich zum Fusionsprotein oder der Kontrolle intravenös injiziert. Alle Tiere wurden täglich auf klinische Zeichen von Toxizität untersucht und regelmäßig gewogen. Sie wurden insgesamt zwei Wochen und die Mäuse mit regredienten Tumoren drei Wochen beobachtet. Die Tumoren wurden täglich wie bereits für die Kurzzeit-Experimente beschrieben (siehe Kap. 2.2.10.1.1) gemessen. Die Tiere wurden durch eine Ether-Überdosis terminiert. Die Tumoren wurden entfernt und in Paraffin eingebettet. 2.2.11 Proteinstruktur-Homologie-Modelling Es wurde versucht, die dreidimensionale Proteinstruktur der Fusionsproteine mit Hilfe des SWISS-Models zu analysieren. Dabei handelt es sich um ein Web-basiertes Programm, welches in einer Datenbank nach homologen Proteinen sucht, deren dreidimensionale Struktur bekannt ist, um so die Struktur des betreffenden Proteins vorherzusagen (Arnold 2005). 2.2.12 Statistische Analyse Die statistische Analyse für die in-vivo-Experimente wurde durchgeführt, um die Null-Hypothese zu testen, dass es zwischen den verschiedenen Behandlungsarmen keinen Unterschied in Tumorvolumina, Tumorgewicht und Anteil der Nekrose gibt. Für die Kurzzeit-Experimente wurde der prozentuale Anteil der Tumornekrose analysiert. Die Mittelwerte des Nekrose-Anteils von sechs bis 13 Mäusen pro Behandlungsarm wurden mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Tests miteinander verglichen. Für die Langzeit-Experimente wurden die Mittelwerte der Tumorvolumina aller Behandlungsarme (jeweils fünf bis zehn Mäuse) ebenfalls mit dem Mann-Whitney-U-Test miteinander verglichen. Die 95%-Konfidenzintervalle für die Unterschiede der Mittelwerte der Tumorvolumina wurden mit der normalen Approximationsmethode berechnet. Für die Analysen wurde die Software SPSS Version 11.0 verwendet. Die statistischen Auswertungen erfolgten mit Hilfe des Instituts für Medizinische Statistik, Informatik und Epidemiologie. 69 3 Ergebnisse 3.1 Herstellung und Charakterisierung des rekombinanten Fusionsproteins anti-VCAM-tTF 3.1.1 Proteinexpression und Aufreinigung Die Expressionsvektoren pswc4-MK271 (für Expression des anti-VCAM-1-tTF Fusionsproteins), pswc5-MK271 (für Expression des MK271 scFv-Antikörpers) und pswc7 (für Expression von tTF) waren im Labor vorhanden und wurden für die Proteinexpression verwendet. Es wurden in Zusammenarbeit mit Maike Unruh (BTA) und Berit Rabausch (Praktikantin) mehrere Chargen hergestellt, um ausreichend Protein für die in vivo Experimente zu gewinnen. Jede Einzelcharge wurde vor dem Poolen biochemisch und funktionell analysiert (siehe unten). 3.1.2 Biochemische Charakterisierung 70 Die mittels Affinitäts-Chromatographie aufgereinigten Proteine wurden auf einem SDSPolyacrylamid-Gel (Gradient 4-15 %) aufgetrennt und nach Coomassie angefärbt, um so den Reinheitsgrad zu bestimmen. Die Proteine zeigten bei der Analyse die erwarteten molekularen Massen: 60 kDa für das Fusionsprotein, 30 kDa für tTF und 27 kDa für das scFv (siehe Abb. 3.1). Der Reinheitsgrad für das spezifische rekombinante Protein lag nach dem ersten Reinigungsschrit typischerweise bei 5-30% für das Fusionsprotein, bei 30-60% für das scFv, und bei 80-100% für tTF. Nach dem zweiten Reinigungsschritt (S200-Sephadex-Gelfiltration, nur für Proteine die im Tierversuch eingesetzt wurden) lag der Reinheitsgrad bei 80-100%. Abb. 3.1: SDS-PAGE nach Coomassie-Färbung. (A) anti-VCAM-tTF (P781), (B) tTF (P703), (C) scFv (P748). Pfeile: spezifisches Protein. Größenstandard: Invitrogen Benchmark. Anhand eines Protein-Größenstandards wurde die betreffende Bande identifiziert und deren Intensität im Verhältnis zu den anderen Banden, die Verunreinigungen mit unspezifischen Proteinen entsprechen, abgeschätzt. Anschließend erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels UVSpektrometer. Durch Multiplikation mit dem Reinheitsgehalt wurde der spezifische Proteingehalt errechnet. Ein repräsentatives Absorptionsspektrum ist in Abb. 3.2 dargestellt 71 Abb. 3.2: Proteinkonzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer. Probe: anti-VCAM-tTF P781. Das Absorptionsspektrum zeigt das erwartete Maximum bei 278 nm. Die Identität der Proteine wurde mittels Western Blot bestätigt. Abb. 3.3 zeigt einen Western Blot nach dem NiNTA-Reinigungsschritt und nach dem S200-Gelfiltrationsschritt. Abb. 3.3: Western Blot des Fusionsproteins anti-VCAM-tTF. (1) Größenstandard Bio-Rad Kalei- doscope Prestained, (2) nach NiNTA-Aufreinigung, dünne Pfeile bei 30 und 60 kDa: freier tTF, Monomer und Dimer, (3) nach Aufreinigung mit S200-Gelfiltation. Dicker Pfeil: spezifisches Protein. Detektion mit murinem anti-tTF-Antikörper. 72 Für die Tierexperimente wurden die Konzentrationen des Endotoxins LPS, welches als bakterielle Verunreinigung auftritt, mittels eines LAL (Limulus Amöbozyten Lysat)-Assays bestimmt. Die Endotoxin-Werte lagen initial bei 300 pg/µg für das Fusionsprotein, bei 7 pg/µg für tTF und bei 90 pg/µg für das scFv, später für alle Proteine immer unter 3 pg/ml. Die genannten Analysen wurden vornehmlich durch Maike Unruh (BTA) durchgeführt. 3.1.3 Funktionelle Charakterisierung in vitro 3.1.3.1 Bindungsstudien 3.1.3.1.1 FACS-Analysen Die Bindungsfähigkeit des scFv-Anteils der anti-VCAM-tTF-Fusionsproteine wurde durchflusszytometrisch auf 2F2B-Zellen analysiert. Dabei zeigte das Protein wie erwartet eine gute Bindung an die VCAM-1-exprimierenden Zellen (siehe Abb. 3.4). Abb. 3.4: FACS-Analyse des anti-VCAM-tTF auf 2F2B-Zellen. Gestrichelte Linie: Zellen ohne Antikörper bzw. nur mit Sekundär-Antikörper. Durchgezogene Linie: Probe. (Dienst 2005) 3.1.3.1.2 Bindungskinetik mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz Das anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 15 und 300 nM auf den Biacore-Chip gegeben. Dabei wurde das Antigen VCAM-1 in einer niedrigen Dichte immobilisiert, so dass ein Bindungsverhältnis von 1:1 angenommen werden konnte. 73 Abb. 3.5: Biacore-Analyse der Bindung von α-mCD106-tTF an immobilisiertes VCAM-1. Die Kurven von oben nach unten zeigen die Bindung des Fusionsproteins in Konzentrationen von 20 µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml und 0,5 µg/ml. (Dienst 2005) Die Assoziationsrate des Fusionsproteins betrug 9,2 x 104 x mol-1 x Sekunde-1 und die Dissoziationsrate 1,5 x 103 x Sekunde-1. Daraus resultierte eine Dissoziationskonstante von 16 nM. 3.1.3.2 Koagulations-Induktion Die Koagulations-Aktivität des Fusionsproteins wurde gemessen, in dem die Fähigkeit des tTFAnteils, Faktor X zu Faktor Xa zu aktivieren, bestimmt wurde. Dazu wurde zunächst der zellfreie Koagulationstest verwendet. Der tTF-Anteil in dem Fusionsprotein zeigte eine ähnliche Aktivität wie freies tTF, welches als Positiv-Kontrolle diente. In dem zellgebundenen Koagulationstest wurde neben der Faktor X-Aktivierung auch die Bindung an die VCAM-1 tragenden 2F2B-Zellen getestet. Da freies tTF nicht oder nur minimal unspezifisch an die Zellen bindet, wurde es in diesem als Test Negativ-Kontrolle verwendet. Die Proben wurden in beiden Tests in Konzentrationen von 1 nM bis 50 nM eingesetzt. Abb. 3.6: Zellfreier Koagulationstest mit anti-VCAM-tTF (schwarze Punkte) und freiem tTF als Positiv-Kontrolle (weiße Punkte). Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Dreifachbestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen die 95%-Konfidenzintervalle. (Dienst 2005) 74 Abb. 3.7: Zellgebundener Koagulationstest mit anti-VCAM-tTF (schwarze Punkte) und freiem tTF als Negativ-Kontrolle (weiße Punkte). Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von Dreifachbestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen die 95%-Konfidenzintervalle. (Dienst 2005) Das Fusionsprotein zeigte eine Konzentrations-abhängige Faktor X-Aktivierung sowohl im zellfreien als auch im zellgebundenen Koagulationstest. Der zellgebundene Koagulationstest testet sowohl die Funktionsfähigkeit des tTF- als auch des scFv-Anteils. Die Bindung des Fusionsproteins war antigenspezifisch, da sie durch Zugabe von freiem MK27Antikörper inhibiert werden konnte (siehe Kap. 3.2.4) und da antigennegative humane Zellen keine Koagulation induzierten (Abb. 3.8). FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 067 0,250 0,200 2F2B 0,150 Bend3 -LPS 0,100 Bend3 +LPS ECV304 0,050 HUVEC 0,000 Abb. 3.8: P503 Zellgebundener Koagulationstest mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein zur Te- stung der Bindungsspezifität auf verschiedenen Zelllinien. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Bend3-Zellen sind murine Endothelzellen, welche VCAM-1 nach Stimulation mit LPS verstärkt exprimieren. Diese Zellen wurden zum Einen unstimuliert und zum Anderen nach Zugabe von 75 LPS (125 µg/ml, 4 Stunden Inkubation bei 37 °C) eingesetzt. Als Negativ-Kontrollen wurden des Weiteren die Zelllinien ECV304 (humane Keratinozyten) und HUVEC (humane Endothelzellen) verwendet. 3.1.4 Therapeutische Studien in vivo mit rekombinantem Fusionsprotein 3.1.4.1 Kurzzeit-Experimente Bei diesem Versuch wurde das Fusionsprotein Gruppen von 6 bis 13 Mäusen mit XenograftTumoren – Hodgkin-Lymphome und Myelome – einmalig in eine Schwanzvene injiziert (Dienst 2005). Der Anteil der Nekrose im Tumor wurde drei Tage später durch eine histologische Analyse mehrerer Schnitte von jedem Tumor bestimmt. In den Tumoren der Mäuse, die mit dem antiVCAM-tTF-Fusionsprotein behandelt wurden, sah man thrombosierte Blutgefäße und große Nekrose-Areale im Tumor. Dabei wurde die Thrombose definiert als Verschluss eines Blutgefäßes durch eine Fibrin-haltigen Pfropf. Eine bloße Erythrozyten-Aggregation wurde nicht als Thrombose gewertet. 76 Abb. 3.9: Histologische Analyse der Xenograft-Tumoren nach Kurzzeit-Behandlung mit dem Fu- sionsprotein (FP) anti-VCAM-tTF oder Kontrollen (NaCl, tTF, scFv). Paraffin-Schnitte nach H&EFärbung. (A-D) L540rec-Tumoren (Hodgkin-Lymphom). (A) 10-fache Vergrößerung eines Tumors von einer mit dem FP plus LPS behandelten Maus. Hier verbleibt nur noch ein kleiner Bereich mit vitalen Tumorzellen am linken Rand des Tumors (dunkler angefärbt). (B) 40-fache Vergrößerung desselben Schnittes. Neben der vitalen Randzone links sieht man eine inflammatorische Demarkationszone (weißer Pfeil), rechts daneben nekrotisches Tumorgewebe mit Fibrin-Thromben (schwarze Pfeile). (C) Nekrotisches Tumorgewebe (links) von einer mit tTF plus LPS behandelten Maus. Der Pfeil zeigt auf einen FibrinThrombus. (D) Tumorgewebe von einer Maus aus dem Kontrollarm (NaCl plus LPS). Hier sieht man zahlreiche Mitosefiguren als Zeichen einer hohen Proliferationsrate. (E-H) Colo677-Tumoren (Myelom). (E) Tumor von einer mit dem Fusionsprotein behandelten Maus. Das helle Areal zeigt einen Bereich mit nekrotischem Tumorgewebe. Der Pfeil zeigt auf einen Fibrin-Thrombus. (F) Der Tumor einer Maus aus dem tTF-Kontroll-Arm zeigt eine schmale subkapsuläre Nekrose (Pfeil). (G) Der Tumor einer Maus aus dem scFv-Kontroll-Arm zeigt mikrofokale Nekrosen (Pfeil) innerhalb vitalen Tumorgewebes. (H) Tumor einer Maus aus dem NaCl-Kontroll-Arm mit einer kleinen fokalen Nekrose (Pfeil). (Dienst 2005) 77 Tab. 3.1: Quantifizierung der Tumor-Nekrose in Xenograft-Tumoren nach Behandlung mit dem Fusionsprotein oder Kontrollen (Kurzzeit-Experimente). (Dienst 2005) Tumor / Behandlungsgruppe Anzahl % Nekrose Mäuse Mittelwert P* vs Kontrolle P* vs Fusionsprotein (95%KI) L540rec Hodgkin-Lymphom anti-VCAM-tTF + 500 ng LPS 6 74 (55 - 93) 0,001 tTF + 500 ng LPS 8 41 (24 – 58) 0,005 Vehikel + 500 ng LPS 13 13 (4 – 22) anti-VCAM-tTF 12 26 (16 – 36) 0,003 tTF 8 9 (2 – 16) 0,8 0,01 anti-VCAM (scFv) 11 11(7 – 15) 0,2 0,01 Vehikel 10 8 (2 – 14) 0,001 0,001 Colo677 SCLC 0,003 * P aus zweiseitigem Mann-Whitney-U-Test, KI = Konfidenzintervall Es gab einen gewissen Anteil an Nekrosen in den Kontroll-Tumoren, welcher aber wesentlich geringer war als der Anteil bei den mit Fusionsprotein behandelten Mäusen. In den LymphomModell waren bis zu 90 % des Tumors nekrotisch (Mittelwert = 74 %, 95 %-Konfidenzintervall = 55 bis 93). Diese Ergebnisse waren statistisch hoch signifikant (p=0.001). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten (Philipp 2003), führte auch die Behandlung mit tTF plus LPS zu statistisch signifikanter Erhöhung des Nekroseanteils (p=0.005). Jedoch war das Fusionsprotein wirksamer und auch der Unterschied zur tTF-Gruppe war hoch signifikant (p=0.001). In dem Myelom-Modell waren bis zu 50 % des Tumors nekrotisch (Mittelwert = 26 %, 95 %-Konfidenzintervall = 16 bis 36). In diesem Modell zeigte nur die Behandlungsgruppe mit Fusionsprotein eine statistisch signifikante Erhöhung des Nekroseanteils. 3.1.4.2 Langzeit-Experimente In den Langzeit-Experimenten wurde die Verzögerung des Tumorwachstums nach multiplen Injektionen mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein untersucht. Dabei wurden die gleichen Xenograft-Modelle wie in den Kurzzeit-Experimenten verwendet. In beiden Modellen wurde das Tumorwachstum durch die Injektionen mit dem Fusionsprotein verlangsamt. In dem LymphomModell wurde durch Zugabe von niedrig dosiertem LPS in allen Behandlungsgruppen die VCAM-1-Expression hochreguliert. In diesem Modell war das Tumorwachstum in der mit Fusionsprotein und LPS behandelten Gruppe signifikant langsamer (FP/L, Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 486 µl) als in den Kontrollgruppen, die mit dem Vehikel NaCl (Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 701 µl; Differenz = 215 µl, 95%-KI = -65 – 495, Mann-Whitney P = 0,02) oder scFv und LPS (Mittelwert des Tumorvolumens an Tag 16 = 847 µl; Differenz = 78 361, 95%-KI = 189 – 533, Mann-Whitney P = 0,005) behandelt wurden. Die Tumoren der mit FP/L behandelten Mäuse waren zwar kleiner als die der mit tTF/L behandelten Mäuse, eine statistische Signifikanz der Unterschiede der Tumorvolumina konnte aber aufgrund der geringen Fallzahl nicht erreicht werden. Wenn man den gesamten zweiwöchigen Beobachtungszeitraum betrachtet, zeigten in dem Colo677-Modell nur die mit Fusionsprotein und Doxorubicin (FP/D) oder mit Doxorubicin allein (D) behandelten Mäuse ein signifikant verlangsamtes Tumorwachstum im Vergleich zu den Kontrollen. Nach der zweiten Behandlung mit dem Fusionsprotein waren die Tumorvolumina in der Gruppe mit der Kombinations-Behandlung kleiner als die in den Gruppen, die mit dem Fusionsprotein oder Doxorubicin allein behandelt wurden. Der Vergleich der Tumorgrößen in den Gruppen mit der Kombinationsbehandlung bzw. mit der Einzelsubstanz-Behandlung durch den MannWhitney-U-Test zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied an den Tagen 5-7. Die mittleren Tumorvolumina an Tag 5 lagen bei 224 µl für die FP/D-behandelten Tiere und bei 574 µl für die mit dem Vehikel (NaCl) behandelten Tiere (Differenz = 350 µl, 95%-KI = 194 – 506 µl, Mann-Whitney P = 0,02), bei 454 µl für den FP-Arm (Differenz im Vergleich zum FP/D-Arm = 230 µl, 95%-KI 90 – 370, Mann-Whitney P = 0,02) und bei 285 µl für den D-Arm (Differenz im Vergleich zum FP/D-Arm = 61 µl, 95%-KI = -3 – 119, Mann-Whitney P = 0,04). Eine Varianzanalyse, die die FP-, die FP/D-, die D- und die Vehikel-Gruppe miteinander verglich, zeigte, dass sowohl das Fusionsprotein allein als auch Doxorubicin allein im Vergleich zum Vehikel zu einer statistisch signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums führten (P = 0,04 für FP und P = 0,001 für D). Neben der Verlangsamung des Tumorwachstums zeigten einige Tumoren in der FP-Gruppe und in der FP/D-Gruppe einen Regress. Ein Tumor von acht im FP-Arm, zwei von sieben Tumoren im FP/D-Arm und keiner von 22 Tumoren in den Kontroll-Armen (Vehikel, tTF und scFv) zeigten einen fast vollständigen Regress, das heißt, sie erreichten ein Volumen von weniger als 50 µl. Innerhalb des dreiwöchigen Beobachtungszeitraumes kam es bei diesen Tumoren nicht wieder zu einem Rückfall. Im D-Arm hatte eine Maus am Ende des Experiments nur noch einen kleinen Tumor von 56 µl. Die histologische Analyse des regredienten Tumors aus dem FP-Arm zeigte einen nekrotischen Kern und eine vitale Randzone, wie es typisch ist für Vascular-Targeting-Substanzen. Die Zellen in der Randzone zeigten jedoch nicht die Charakteristika von Tumorzellen, sondern ähnelten morphologisch Makrophagen. Die immunhistologischen Färbungen für Tumormarker (bcl-2 und Vimentin) und für Makrophagenmarker (F4/80) bestätigten, dass die Tumorzellen fast ausschließlich im nekrotischen Kern lagen und die vitale Randzone hauptsächlich aus Makrophagen bestand. Ähnlich verhielt es sich mit den regredienten Tumoren aus dem Kombinationsarm (FP/D), allerdings sah man hier etwas mehr vitale Tumorzellen in der Randzone. In dem kleinen 79 Tumor aus dem Doxorubicin-Arm waren kaum Makrophagen sichtbar und in der Randzone fanden sich noch viele bcl-2- und Vimentin-positive vitale Tumorzellen. 80 Tab. 3.2: Statistische Analyse der Tumorvolumina nach Behandlung mit Fusionsprotein allein oder in Kombination mit LPS oder Doxorubicin. (Dienst 2005) Tag 0 (vor Behandlung) Tumor/Behandlungsgruppe Anzahl Mittelwert P╪ vs Mäuse (95%-KI) Vehikel anti-VCAM-tTF + LPS 8 194 (185 – 204) 0,75 LPS 5 198 (177 – 220) tTF + LPS 8 anti-VCAM (scFv) + LPS Vehikel Tag 3 oder 5* P╪ vs FP§ Woche 2 Mittelwert P╪ vs P╪ vs (95%-KI) Vehikel FP§ - 168 (138 – 197) 0,01 - 0,88 0,71 232 (163 – 301) 1,00 195 (185 – 206) 0,83 0,92 198 (170 – 225) 5 222 (180 – 263) 0,46 0,11 8 208 (180 – 235) - anti-VCAM-tTF + Doxorubicin 7 233 (215 – 252) anti-VCAM -tTF 8 Doxorubicin Mittelwert (95%-KI) P╪ vs P╪ vs Vehikel FP§ 486 (413 – 559) 0,02 - 0,4 561 (200 – 923) 0,54 0,41 0,07 0,12 565 (412 – 719) 0,45 0,36 235 (202 – 268) 0,77 0,003 847 (624 – 1069) 0,11 0,005 0,75 235 (192 – 278) - 0,01 701 (423 – 979) - 0,02 0,85 - 224 (212 – 235) 0,001 - 135 (93 – 177) 0,001 - 222 (196 – 247) 0,10 0,25 454 (311 – 597) 0,29 0,002 1278 (779 – 1777) 0,29 0,008 7 233 (214 – 253) 0,44 0,80 285 (218 – 352) 0,001 0,04 165 (109 – 220) 0,001 0,40 tTF 6 219 (203 – 235) 0,06 0,12 563 (424 – 701) 0,83 0,003 1405 (861 – 1949) 0,19 0,003 anti-VCAM (scFv) 6 238 (205 – 271) 0,43 0,95 459 (364 – 553) 0,22 0,002 Nicht auswertbar ╫ - - Vehikel 10 248 (220-277) - 0,85 574 (421 – 727) - 0,001 1909 (1174 – 2644) - 0,001 L540rec Hodgkin-Lymphom 81 Colo677 SCLC * Für die Colo677-Tumoren ist aufgrund des anderen Behandlungsschemas Tag 5 gezeigt ╪ P aus Mann-Whitney-U-Test, zweiseitig § Vergleich zu α-mCD106-tTF plus LPS für L540rec-Tumoren bzw. zu α-mCD106-tTF + Doxorubicin für Colo677-Tumoren ╫ Nicht auswertbar, da die großen Tumoren durch andere Mäuse in den Käfigen teilweise zerstört wurden FP = Fusionsprotein, KI = Konfidenzintervall, Vehikel = NaCl 0,9% Abb. 3.10: Wachstum der L540rec- (Hodgkin) bzw. Colo677-Xenograft-Tumoren (Myelom) nach Langzeit-Behandlung mit dem Fusionsprotein anti-VCAM-tTF bzw. den Kontrollen. Datenpunkte bezeichnen den Mittelwert plus Standardabweichung der jeweiligen Behandlungsgruppe. (A) L540rec-Tumoren, Behandlung der Mäuse mit Vehikel-Kontrolle (0,9 % NaCl; N), mit 20 µg anti-VCAM-tTF plus 500 ng LPS (FP/L), mit 10 µg tTF plus 500 ng LPS (T/L) oder mit 500 ng LPS (L); (B) Großes Diagramm: Die Mäuse wurden behandelt mit der Vehikel-Kontrolle (0,9 % NaCl; N), mit 20 µg anti-VCAM -tTF (FP), mit 8 mg/kg Doxorubicin (D) oder mit 20 µg anti-VCAM-tTF plus 8 mg/kg Doxorubicin (FP/D). Kleines Diagramm: Vergrößerung der Tumorwachstums-Kurven für D und FP/D mit Behandlungsschema; die Pfeile zeigen die Behandlungstage (modifiziert nach Dienst 2005). 82 Abb. 3.11: Nacktmaus vor (links) und drei Wochen nach (rechts) der Behandlung mit dem Fusi- onsprotein anti-VCAM-tTF. Rechts sieht man makroskopisch einen fast vollständigen Regress des Colo677-Xenograft-Tumors drei Wochen nach der Behandlung Abb. 3.12: Histologische Analyse des Colo677-Tumorgewebes nach makroskopischem Regress durch Behandlung mit dem Fusionsprotein anti-VCAM-tTF. (A-C) H&E-Färbung. (A) Die 20-fache 83 Vergrößerung zeigt eine zentrale Nekrose mit einem vitalen Rand. In den höheren Vergrößerungen (B 100fach und C 400-fach) sieht man rechts unten nekrotische Zellen. (D-F) Tumorschnitte mit einer Färbung für bcl-2 als Marker für die Colo677-Zellen. (D) Die kleine Vergrößerung zeigt die Anfärbung der Tumorzellen im Zentrum (rotbraun), nicht aber in der Randzone. (E) Der nekrotische Kern (untere Hälfte) zeigt die Färbung für bcl-2. (F) In der größten Vergrößerung sieht man kleine Zellverbände vitaler Tumorzellen (links), daneben das nekrotische Areal (rechts). (G-I) Tumorschnitte mit einer Färbung für Vimentin ebenfalls als Marker für die Colo677-Zellen. (G) Die kleinste Vergrößerung zeigt die positive Färbung (rotbraun) der Tumorzellen im nekrotischen Zentrum. (H) In der mittleren Vergrößerung sieht man in der unteren Hälfte die angefärbten Tumorzellen des Nekrose-Areals. (I) Kleine Zellverbände vitaler Tumorzellen (links oben) neben dem nekrotischen Areal (rechts unten). (J-L) Tumorschnitte mit Färbung für den Makrophagen-Marker F4/80. Die meisten Zellen in der vitalen Randzone des Tumors sind keine Tumorzellen, sondern Makrophagen (braune Färbung). (M-O) Tumorschnitte mit einem Negativkontroll-Antikörper. (Dienst 2005) 3.1.4.3 Verträglichkeit des Fusionsproteins 3.1.4.3.1 Klinische Beobachtungen Die Mäuse wurden zu vordefinierten Zeitpunkten (5, 10, 15, 30, 60 und 120 Minuten, danach täglich) nach der Behandlung auf klinische Zeichen von Toxizität untersucht. Abgesehen von einer leicht verminderten Bewegungs-Aktivität 10 Minuten nach der Injektion in allen Behandlungsarmen, was möglicherweise auf die Zunahme des Zirkulations-Volumens zurück zu führen ist, wurden weder in den Kurzzeit- noch in den Langzeit-Experimenten klinische Zeichen für Toxizität des Fusionsproteins beobachtet. Mäuse, die mit einem LPS-haltigen Regime behandelt wurden zeigten eine leichte Hypoaktivität und milde Diarrhoen. In den Langzeit-Experimenten zeigte eine von den neun Mäusen, die mit tTF plus LPS behandelt wurden, einen Gewichtsverlust und einen Abfall der Leukozyten und Thrombozyten. Dieses Tier starb nach der dritten Behandlung. Von den 14 Mäusen, die ein Doxorubicin-haltiges Regime erhielten, entwickelten acht (57 %) Diarrhoen, Gewichtsverlust und eine Epidermiolyse an mechanisch beanspruchten Hautstellen. Einen Gewichtsverlust von mehr als 10 % verglichen mit dem Ausgangsgewicht wurde in einer von neun Lymphom-tragenden Tieren, die mit tTF plus LPS behandelt wurden, und in einer von fünf Lymphom-tragenden Tieren, die mit scFv und LPS behandelt wurden, beobachtet. Bei den Myelom-tragenden Mäusen wurde ein Gewichtsverlust von mehr als 10 % bei fünf von sieben Mäusen aus dem Doxorubicin-Arm und bei drei von sieben Mäusen aus dem Kombinationsarm (Fusionsprotein plus Doxorubicin) beobachtet. Alle anderen Tiere zeigten ein stabiles Körpergewicht. 84 3.1.4.3.2 Histologische Analyse der Organe Die histologischen Schnitte der wichtigsten Organe wurden lichtmikroskopisch hinsichtlich Thrombosen und Nekrosen untersucht (Dienst 2005). In keinem der untersuchten Organe wurden Nekrosen gefunden. Es zeigten sich einzelne thrombotische Ereignisse mit Extravasation von Erythrozyten in den Lungen (ein bis drei Thrombosen im gesamten Organschnitt) in einigen Mäusen. Solche Ereignisse wurden in allen Behandlungsarmen gefunden und sind möglicherweise durch die Injektion und/oder durch den prokoagulanten Status bedingt, der durch den Tumor verursacht wird. Gelegentlich wurden kleine Fibrin-Thromben in den Schnitten von Niere, Leber, Pankreas und Herz aus allen Behandlungsarmen gesehen, allerdings zeigten diese Ereignisse - im Gegensatz zu denen in den Lungen – keine damit verbundene Gewebsreaktion. Das Fehlen einer solchen Gewebsreaktion ist ein Hinweis darauf, dass das Ereignis post mortem auftrat und somit als Artefakt zu werten ist. Alle anderen Organe waren frei von Nekrosen und Thrombosen. 85 Abb. 3.13: Histologie der Organe nach Paraffin-Einbettung und Färbung nach Hämatoxylin & Eosin. (A) Herz, (B) Lunge, der Pfeil zeigt hier auf ein Fibrin-Gerinnsel mit leichten hämorrhagischen Veränderungen im benachbarten Gewebe, (C) Leber, der Pfeil zeigt hier auf ein kleines Fibrin-Gerinnsel ohne umgebende Gewebsreaktion, (D) Niere, (E) Gehirn, (F) Dünndarm, (G) Pankreas, (H) Milz. In keinem der Organe konnten Nekrosen gesehen werden. 86 Tab. 3.3: Anzahl der Mäuse mit thrombotischen Ereignissen (T) oder Nekrosen (N) in den Organen*. (Dienst 2005) Behandlungsgruppe (Anzahl der Mäuse) Herz Lunge Gehirn Leber Niere Milz Dünndarm Pankreas Andere╫ T N T N T N T N T N T N T N T N T N α-CD106-tTF + LPS (6) - - 2 - - - 2 - 1 - - - - - 1 - ND ND tTF + LPS (8) - - 4 - - - 4 - - - - - - - - - ND ND Vehikel + LPS (13) - - 1 - - - 4 - - - - - - - - - ND ND α-CD106-tTF (12) 1 - 7 - - - 2 - 1 - - - - - 3 - - - tTF (8) 1 - 3 - - - - - - - - - - - 2 - ND ND α-CD106 (11) 1 - 4 - - - 2 - - - - - - - - - ND ND Vehikel (10) - - 6 - - - 2 - 1 - - - - - 2 - ND ND L540rec (HL) Colo677 (SCLC) 87 * Durch histologische Analyse mehrerer H&E-gefärbter Schnitte pro Organ bestimmt. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die Anzahl von Mäusen, bei denen nekrotische Ereignisse detektiert wurden. Dabei wurden nur einzelne Foki, in der Regel zwischen ein und drei pro gesamtem Organschnitt, gesehen. ╫ Andere Organe: Kolon, Haut, Muskulatur, Nebenniere, Ovar, Harnblase - = weder Thrombosen noch Nekrosen ND = nicht durchgeführt In Zusammenschau aller vorliegenden Befunde wurde das Fusionsprotein sehr gut toleriert, wenn es allein verabreicht wurde. Die multiplen Gaben von LPS und hochdosiertem Doxorubicin waren toxisch, so dass in zukünftigen Kombinations-Behandlungen eine weniger toxische Substanz bzw. eine geringere Dosis eingesetzt werden sollte. 3.1.4.3.3 Laborparameter Um auch geringe Veränderungen der systemischen Gerinnung zu beobachten, wurden die Anzahl der Blutzellen (Hämoglobin, Leukozyten und Thrombozyten) und verschiedene Gerinnungs-Parameter (Thrombin-Antithrombin-Komplex, Antithrombin III und lösliches Fibrin) bestimmt (siehe Tab. 3.4) (Dienst 2005). Diese Analysen wurden ausschließlich durch Maike Unruh durchgeführt und sind hier aus Gründen der Vollständigkeit aufgeführt. Die verwendeten Methoden wurden veröffentlicht (Unruh 2005). Dabei wurde das Blut im Rahmen der Sektion drei Tage nach Behandlung durch eine Vena-cava-Punktion gewonnen. Um auch frühe Veränderungen zu sehen, wurden diese Parameter auch 15 Minuten, 30 Minuten, 4 Stunden und 24 Stunden (jeweils in drei Mäusen) nach der Behandlung gemessen. Bis auf einen leichten und reversiblen Abfall von Antithrombin III und Hämoglobin nach 30 Minuten in den mit dem Fusionsprotein behandelten Mäusen, lagen die Laborparameter im zuvor ermittelten Referenzbereich. Somit wurde in diesem Modell durch die Behandlung mit dem Fusionsprotein keine systemische Aktivierung des Gerinnungssystems induziert. 88 Tab. 3.4: Laborparameter der behandelten Mäuse aus den Kurzzeit-Experimenten* (modifiziert nach Dienst 2005). Behandlungsgruppe Hämoglobin [g/dl] Leukozyten [n/µl] Thrombozyten [1000/µl] TAT-Komplex [ng/ml] Antithrombin III [%] Lösliches Fibrin [% Mittelwert (SD) Mittelwert (SD) Mittelwert (SD) Mittelwert (SD) Mittelwert (SD) positive Mäuse] Range = 14-16 Range = 1000-5000 Range = 400-800 < 20 Range = 70-130 ≤ 33 anti-VCAM-tTF/LPS 72 h 15,6 (0,2) 2200 (566) 819 (202) 4,7 (1,2) 83 (16) ND tTF/LPS 72 h 14,9 (1,1) 2056 (897) 675 (233) 19,5 (21,9) 77 (12) ND ND ND ND 10,8 (9,6) 94 (15) ND anti-VCAM-tTF 15 Min. 16,2 (1,3) 2333 (473) 638 (22) 9,0 (5,0) 70 (4) 0 anti-VCAM-tTF 30 Min. 13,0 (1,9) 1617 (558) 737 (104) 3,3 (2,5) 69 (24) 0 anti-VCAM-tTF 4 h 14,3 (0,2) 1867 (382) 747 (360) 5,3 (4,2) 86 (1) 33 anti-VCAM-tTF 24 h 14,2 (0,1) 2667 (858) 528 (167) 1,3 (0,6) 77 (14) 0 anti-VCAM-tTF 72 h 14,8 (1,3) 3783 (2545) 715 (246) 4,3 (5,1) 74 (15) 17 tTF 72 h 15,2 (0,5) 1993 (789) 708 (211) 4,0 (4,0) 80 (9) 13 anti-VCAM 72 h 14,3 (0,9) 2914 (1009) 605 (127) 5,3 (4,5) 78 (18) 9 Vehikel 72 h 14,9 (0,8) 2300 (871) 581 (173) 4,0 (4,4) 84 (15) 40 Unbehandelte Mäuse L540rec (HL) Vehikel/LPS 72 h Colo677 (Myelom) 89 * Behandlungsgruppen: anti-VCAM-tTF, tTF und Vehikel (NaCl). Die Daten repräsentieren die Mittelwerte von jeweils drei bis elf Mäusen. ND = nicht durchgeführt SD = Standardabweichung 3.2 Molekulare Mechanismen der Koagulationsinduktion durch tTF-Fusionsproteine 3.2.1 Einfluss von Phospholipiden Typischerweise wird die Aktivität von löslichem (extrazellulärem) Tissue Factor in vitro nach Rekonstitution in Phospholipiden getestet, damit dieser sich auf einer Lipidmembran-Oberfläche orientieren kann. Bei unserem Ansatz wäre anzunehmen, dass Phospholipide nicht zwingend notwendig sind, da eine Assoziation mit der Membran durch die Antikörperbindung hergestellt wird. Es wurde daher getestet, in wie weit die Zugabe von Phospholipiden die Koagulationsinduktion von TF-basierten Fusionsproteinen verbessert. ZKT 088 0,900 0,800 0,700 0,600 0,400 0,500 0,400 0,300 0,200 FXa-Generation [OD 405nm] FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 075 P817 HBSS 0,100 0,000 0,300 0,250 0,200 P948 0,150 HBSS 0,100 0,050 0,000 mit PL Abb. 3.14: 0,350 ohne PL mit PL ohne PL Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von Phospholipiden (PL). Die Diagramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: für ZKT 075 P817 (anti-VCAMtTF), 30 nM, und für ZKT 088 P948 (anti-VCAM-tTF), 30 nM, Negativ-Kontrolle HBSS. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Es zeigte sich, dass die Werte für das Fusionsprotein und die Negativ-Kontrolle nach Zugabe von Phospholipiden entweder gleich bleiben (ZKT 075) oder unspezifisch erhöht sind (ZKT 088). Die Zunahme der Extinktionen im ZKT 088 ist als unspezifisch zu bewerten, da sich gleichzeitig auch die Extinktionen der Negativ-Kontrolle HBSS erhöhen. Das Verhältnis von Fusionsprotein zu HBSS bleibt in etwa gleich. Auszuschließen wäre hier noch, dass die bloße Anwesenheit der Phospholipide die Absorption bei 405 nm erhöht. Dies ist aber nicht der Fall, da bei Betrachtung von kinetischen Messungen (hier nicht dargestellt) mit Zunahme der Inkubationszeit des chromogenen Substrates auch die Messwerte zunehmen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in Anwesenheit der Phospholipide zwar teilweise eine vermehrte Koagulation induziert wird, jedoch 90 das Fusionsprotein auch ohne Phospholipide eine gute Koagulationsinduktion hervorruft. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Membranassoziation des tTF über den Antikörper hergestellt wird. Ein wichtiger Aspekt bei der klinischen Anwendung dieses Fusionsproteins wäre die Frage, in wieweit das Vorhandensein von PL-haltigen Mikropartikeln im Blut der Patienten eine Kontraindikation für die Behandlung mit TF-haltigen Medikamenten darstellt. Dazu wurde folgende Analyse retrospektiv durchgeführt und die Daten von zwei Koagulationstests fusioniert. Nach Zugabe von PL sieht man, analog zu oben, sowohl bei den beiden Fusionsproteinen als auch bei den Negativ-Kontrollen tTF und HBSS einen Signalzuwachs. Berechnet man den Quotienten der Proben mit zu ohne PL (P948 1,4, P944 1,2, tTF 1,3 und HBSS 1,4), so sieht man, dass das der Signalzuwachs bei TF (dem Analog zu ungebundenem Fusionsprotein in einer klinischen Anwendung) im Verhältnis nicht größer ist als bei der Puffer-Negativ-Kontrolle. Die Zugabe von TF führt also nicht zu einer Steigerung der unspezifischen Reaktion, die durch die PL alleine verursacht wird. Dies lässt den vorsichtigen Schluss zu, dass das Vorhandensein von Mikropartikeln nicht notwendigerweise eine Kontraindikation für eine Therapie mit TF-basierten Fusionsproteinen darstellt. Um diese Fragestellung genauer zu beleuchten, wäre es von Interesse, Mikropartikel von Patienten in einem analogen in vitro Assay zu untersuchen. ZKT 88/89 FXa-Generation [OD 405nm] 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 ohne PL 0,150 mit PL 0,100 0,050 0,000 P948 Abb. 3.15: P944 tTF HBSS Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von Phospholipiden (PL). Die Diagramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P948 und P944 (anti-VCAMtTF), jeweils 30 nM, Negativ-Kontrollen: tTF, 30 nM, und HBSS. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 91 3.2.2 Einfluss der elektrischen Ladung der Endotheloberfläche Die Koagulationsfaktoren II, VII. IX und X besitzen eine Proteindomäne, welche Vitamin-Kabhängig posttranslational carboxyliert wird, die sogenannte γ-Carboxy-Glutamic-acid-reiche Region, oder Gla-Domäne. Gla-Domänen binden calciumabhängig bevorzugt an negativ geladene Oberflächen. In der Zellmembran werden negativ geladene Phospholipide, wie z.B. Phosphatidylserin, durch einen aktiven Mechanismus in der inneren Schicht der Membrandoppelschicht gehalten. Ran et al. (Ran 2002) beschrieben eine Reihe von Substanzen, welche eine Umlagerung solcher anionischer Phospholipide in das äußere Blatt hervorrufen (Phosphatidylserin-Externalisierung). Zu diesen Substanzen gehören u.a. Saponin, LPS und Wasserstoffperoxid (H2O2). Der Einfluss einer negativen Membranoberfläche wurde hier nur indirekt getestet, indem die Zellen vor dem eigentlichen Koagulationstest mit Substanzen inkubiert wurden, welche eine Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen, und somit eine negative Ladung auf der Endotheloberfläche induzieren. Es ist allerdings anzumerken, dass alle verwendeten Substanzen auch andere Auswirkungen auf Zellen, unabhängig von der Ladungsänderung, haben. 3.2.2.1 Testung von Saponin Saponin ist eine Mischung aus Terpenoid-Molekülen und Glycosiden. Bedingt durch den amphiphilen Charakter setzt es die Oberflächenspannung herab und wirkt auf Membranlipide emulgierend. Durch Interaktion mit dem Cholesterin der Zellmembran führt es zur Permeabilisierung von Zellmembranen (Francis 2002). Im zellgebundenen Koagulationstest wurde das Saponin verwendet, um zu testen, ob eine gesteigerte Externalisierung von Phosphatidylserin die Funktionsfähigkeit der Fusionsproteine zu verbessert. Dabei wurden die Zellen nach der Inkubation mit den Fusionsproteinen mit 2 % (ZKT 007) bzw. mit 0,2 % Saponin (ZKT 008) bei Raumtemperatur inkubiert. Der Hintergrund (PBS) wurde hier nicht von den Probenwerten abgezogen, sondern als separate Säulen dargestellt. 92 FXa-Generation [OD 405-650 nm] ZKT 007 0,350 0,300 0,250 0,200 mit Saponin 0,150 ohne Saponin 0,100 0,050 0,000 P217 Abb. 3.16: tTF Pool PBS Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von 2 % Saponin. Die Dia- gramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P217 (anti-VCAM-tTF), 100 nM, Negativ-Kontrollen: tTF und PBS. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. FXa-Generation [OD 405-650 nm] ZKT 008 1,000 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 mit Saponin ohne Saponin P217 Abb. 3.17: P225 tTF Pool PBS Zellgebundener Koagulationstest zur Testung des Effekts von 0,2 % Saponin. Die Dia- gramme zeigen die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P217 und P255 (anti-VCAM-tTF), jeweils 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Im ZKT 007 (Abb. 3.16) kommt es durch die Zugabe von 2 % Saponin zu einer deutlichen Erhöhung der gemessenen Extinktionen im Vergleich zu den Proben ohne Saponin. Allerdings ist dieser Effekt in demselben Ausmaß sowohl bei dem Fusionsprotein als auch bei den Negativ-Kontrollen tTF und PBS zu beobachten, weshalb diese Reaktion als unspezifisch zu bewerten und am ehesten durch Freisetzung prokoagulatorischer Substanzen nach Zelltod zu erklären ist. 93 Im ZKT 008 (Abb. 3.17) zeigte sich kein signifikanter Unterschied nach Zugabe von 0,2 % Saponin im Vergleich zu unbehandelten Proben. 3.2.2.2 Testung von LPS Unsere Arbeitsgruppe hatte in einer früheren Arbeit gezeigt, dass LPS im zellgebundenen Test zu einer Verbesserung der Koagulationsfähigkeit von mit FVIIa präkomplexiertem tTF führt (Philipp 2003). Dieses Resultat konnte hier bestätigt werden. tTF alleine, d.h. ohne vorherige Komplexbildung mit FVIIa, zeigte hingegen keine erhöhte Koagulation, obwohl im Koagulationsmix FVIIa enthalten ist (siehe Abb. 3.18). Der Unterschied beruht darauf, dass Faktor VIIa die Bindung von tTF auf aktiviertem Endothel vermittelt, wobei nicht präkomplexierter tTF alleine nicht binden kann und im Waschschritt entfernt wird. Die Koagulationsinduktion durch das Fusionsprotein wurde jedoch durch LPS nicht erhöht (siehe Abb. 3 .19). Dieses Ergebnis spricht wiederum ebenfalls dafür, dass die Membranassoziation von tTF über den Antikörper stattfindet. Würde die Bindung über die FVIIa-Gla-Domäne vermittelt, so wäre wie im ZKT 019 auch im ZKT 010 eine verstärkte Koagulationsinduktion durch Zugabe von LPS zu erwarten. ZKT 019 FXa-Generation [OD 405nm] 0,300 0,250 0,200 ohne Stimulation 0,150 + LPS 0,100 0,050 0,000 tTF + FVIIa Abb. 3.18: tTF Zellgebundener Koagulationstest zur Testung von LPS. Das Diagramm zeigt die Mittel- werte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: Etox18 (tTF), 100 nM, für tTF + FVIIa Probe mit 100 nM FVIIa präkomplexiert. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 94 FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 010 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 ohne LPS mit LPS P282 Abb. 3.19: tTF-Pool Zellgebundener Koagulationstest zur Testung von LPS. Das Diagramm zeigt die Mittel- werte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P282 (anti-VCAMtTF), 50 nM und tTF, 50 nM, als Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 3.2.2.3 Testung verschiedener H2O2-Konzentrationen mit und ohne Phospholipide H2O2 ist ebenfalls dafür bekannt, eine Phosphatidylserin-Externalisierung hervorzurufen. Den 24 Stunden alten Kulturen von 2F2B-Zellen wurden unterschiedliche Mengen an H2O2 zugesetzt und für weitere 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Vor Testbeginn wurde der Zustand der Zellen mikroskopisch kontrolliert. Die Testreihe wurde parallel mit und ohne Zugabe von Phospholipiden (Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin) durchgeführt. ZKT 073 mit PL FXa-Generation [OD 405nm] 0,600 0,500 0,400 P719 0,300 HBSS 0,200 P719 minus HBSS 0,100 0,000 1 µM H2O2 Abb. 3.20: 25 µM H2O2 50 µM 1000 µM 5000 µM H2O2 H2O2 H2O2 Testung verschiedener H2O2-Mengen mit Zusatz von Phospholipiden. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P719 (anti-VCAM-tTF), 100 nM, HBSS als Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 95 ZKT 073 ohne PL FXa-Generation [OD 405nm] 0,600 0,500 0,400 P719 0,300 HBSS 0,200 P719 minus HBSS 0,100 0,000 1 µM H2O2 Abb. 3.21: 25 µM H2O2 50 µM 1000 µM 5000 µM H2O2 H2O2 H2O2 Testung verschiedener H2O2-Mengen ohne den Zusatz von Phospholipiden. Das Dia- gramm zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P719 (anti-VCAM-tTF), 100 nM, HBSS als Negativ-Kontrolle. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Bei der Testreihe mit Phospholipiden (Abb. 3 .20) zeigten sich sowohl für das Fusionspro- tein als auch für die Negativ-Kontrollen (tTF, hier nicht dargestellt, und HBSS) gesteigerte Extinktionen bei Zugabe von bis zu 50 µM H202. Ab 1000 µM H202 kam es wieder zu abnehmenden Extinktionen. Die Berechnung der Differenz zwischen Fusionsprotein und HBSS als Hintergrund ergab in dieser Testreihe keine Verbesserung der Koagulationsinduktion durch die Zugabe von H202. Die Zunahme der Extinktionen muss als unspezifische Reaktion bewertet werden, da diese ebenso bei Medium und TF-Kontrollen auftrat. Bei der mikroskopischen Kontrolle der Zellkulturen zeigte sich, dass es mit zunehmenden H2O2Mengen zur Zerstörung der Zellen kam. Dies wurde sichtbar durch Ablösen der Zellen, Vakuolenbildung oder Veränderungen der Zellform. Bei 1000 µM H2O2 zeigten sich mehr als 90 % der Zellen zerstört. Hierdurch wurde prothrombotisches Material freigesetzt, welches wahrscheinlich die Erhöhung der Werte verursachte. Waren die Zellen so beschädigt, dass sie im Waschschritt verloren gingen, verringerten sich die Werte für eine Koagulationsinduktion. In manchen Experimenten wurde auch bei niedrigen H2O2-Konzentrationen eine verringerte Koagulationsinduktion beobachtet. Diese Unterschiede könnten auf unterschiedliche H2O2-Präparationen (Zusatzstoffe, Stabilisatoren) zurückführbar sein. Dies wurde jedoch nicht systematisch untersucht. Phospholipide milderten die toxische Wirkung von H2O2, entweder direkt durch Membranstabilisation, oder indirekt durch Auffangen eines Teils der H2O2-Moleküle. 96 Bei der Testreihe ohne Phospholipide (Abb. 3.21) kam es ebenso sowohl beim Fusionsprotein als auch bei den Negativ-Kontrollen zu einer Steigerung der Extinktionen durch Zugabe von bis zu 50 µM H202. Bei größeren Mengen H202 sah man auch hier – bedingt durch die toxische Wirkung und den Verlust von Zellen - wieder eine Abnahme der Extinktionen. Nach Abzug des Hintergrundes zeigte sich bei dieser Testreihe jedoch eine deutlich verbesserte Koagulationsinduktion für das Fusionsprotein bei Zugabe von 50 µM H202 im Vergleich zu 1 µM H202 (0,205 versus 0,055). Diese deutliche Verbesserung der Koagulation konnte bei einer Wiederholung dieses Tests so nicht bestätigt werden. Dort zeigte sich lediglich eine gering verbesserte, manchmal sogar eine verminderte Koagluationsinduktion bei Zugabe von 50 µM H202. Möglicherweise spielte hier auch die Verwendung unterschiedlicher H202-Chargen eine Rolle. Einige Testreihen wurden dann mit 25 µM H202 und ohne die Zugabe von Phospholipiden durchgeführt. Schließlich wurde die Verwendung von H202 bei dem Koagulationstest aber wieder verlassen, da die toxische Wirkung auf die Zellen, die Freisetzung von prothrombotischem Material und das Ablösen der Zellen von der Platte als zu unkontrollierbar erschienen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass drei verschiedene Substanzen, die erhöhte Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen (Ran 2002) und damit die negative Ladung auf der Membranoberfläche erhöhen, die Koagulationsinduktion der Fusionsproteine nicht oder nur geringfügig verbesserten. Dies stützt die These, dass Koagulationsinduktion vorrangig vom Antikörperanteil abhängig ist. 3.2.3 Einfluss anderer Gerinnungsfaktoren auf die FaktorX-Aktivierung 3.2.3.1 Testung von Faktor IX Standardmäßig sind in Koagulationsmixen zur Bestimmung von Koagulationsinduktion die Gerinnungsfaktoren VIIa, IX und X enthalten. Da hier ausschließlich die Faktor X-Aktivierung gemessen wurde, ist ein Zusatz von Faktor IX nicht notwendig. Es wäre jedoch möglich, dass ein Zusatz von Faktor IX die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa kompetitiv inhibiert, da in beiden Fällen der TF-VIIa-Komplex das Enzym und den Kofaktor für diese Reaktion liefert. Um dies zu testen, wurden zwei verschiedene Koagulations-Mixe mit 10 nM Faktor VIIa, 200 nM Faktor X und 20 µM Phospholipiden hergestellt, wovon der eine zusätzlich 50 nM Faktor IX enthielt, der andere nicht. Es ergab sich kein Unterschied im Hinblick auf die Faktor Xa-Generierung in den getesteten Konzentrationsbereichen. 97 FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 012 0,600 0,500 0,400 0,300 ohne FIX 0,200 mit FIX 0,100 0,000 P282 Abb. 3.22: P292 Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener Koagulations-Mixe. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Proben: P282 und P292 (anti-VCAM-tTF), jeweils 10 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 3.2.3.2 Testung der Faktor VII-Aktivierung Morrissey beschrieb, dass auch durch den TF-VIIa-Komplex Faktor VII zu VIIa aktiviert werden kann, wobei er postulierte, dass ein TF-VIIa-Komplex mit einem TF-VII-Komplex interagiert (Morrissey 2001). Es wurde zunächst eine Konzentrationsreihe mit Faktor VIIa für die Faktor XGenerierung durchgeführt, und dann Faktor VII, mit verschiedenen Mengen Faktor VIIa eingesetzt. Hierbei ergab sich folgendes unerwartete Resultat: Mix Nummer 1 2 3 4 5 6 7 0,5 µg/ml FVIIa 0,1 µg/ml FVIIa 0,01 µg/ml FVIIa 0,5 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII 0,1 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII 0,01 µg/ml FVIIa + 2 µg/ml FVII 2 µg/ml FVII 98 ZKT 013 FXa-Generation [OD 405nm] 0,600 Mix 1 0,500 Mix 2 0,400 Mix 3 0,300 Mix 4 0,200 Mix5 0,100 Mix 6 Mix 7 0,000 P282 Abb. 3.23: Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener FVII- und FVIIa-Konzentrationen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von Zweifach-Bestimmungen. Probe P282 (anti-VCAM-tTF), 50 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Während Faktor VIIa wie erwartet konzentrationsabhängig die Faktor X-Aktivierung unterstützte (Säulen 1-3), konnte auch bei Zugabe von Faktor VII ohne jeden Faktor VIIa-Zusatz eine signifikante Menge von Faktor Xa erzeugt werden. Hinzufügen einer geringen Menge Faktor VIIa verbesserte die Koagulationsinduktion nicht, vielmehr zeigte sich ein Trend zu einer verminderten Faktor X-Aktivierung. Dieses unerwartete Ergebnis ist am ehesten dadurch zu erklären, dass das Faktor VII-Präparat schon eine geringe Menge an Faktor VIIa enthielt und eine weitere Zugabe von Faktor VIIa tTF-Stellen blockierte, die sonst für die weitere Aktivierung von Faktor VII zur Verfügung ständen. Wir konnten diese Annahme stützen, indem Faktor VII-Präparationen unterschiedlicher Hersteller untersucht wurden. Tatsächlich fand sich keine Aktivierung mit Faktor VII alleine, wenn dieser von einem anderen Hersteller bezogen wurde (siehe Abb. 3.24). In diesem Fall verbesserte die Zugabe einer sehr geringen Menge an Faktor VIIa zu Faktor VII die Gerinnungsinduktion deutlich, was den Schluss nahe legt, dass auch Faktor VII zu VIIa aktiviert werden kann. Dies ist von Bedeutung, da unter normalen Umständen nur sehr geringe Mengen an Faktor VIIa im Blut zirkulieren und dieser Faktor für eine Koagulationsinduktion durch den Tenasekomplex (TF, Faktor VIIa und die Substrate Faktor VII, Faktor IX oder Faktor X) limitierend sein kann. 99 Mix Nummer 1 2 3 4 FVIIa 0,01 µg/ml 0,01 µg/ml FVII Fa. Enzyme Res. 2 µg/ml 2 µg/ml - FVII Fa. Calbiochem 2 µg/ml 2 µg/ml ZKT 134 FXa-Generation [OD 405nm] 0,120 0,100 0,080 Mix 1 0,060 Mix2 0,040 Mix 3 0,020 Mix 4 0,000 -0,020 Abb. 3.24: P1011 Zellgebundener Koagulationstest zur Testung verschiedener FVII- und FVIIa-Konzen- trationen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund HBSS) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P1011 (anti-VCAM-tTF), 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 3.2.4 Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation In der Einleitung (siehe Kap. 1.7.2) wurden die beiden Szenarien erläutert, in welchen die Kopplung von tTF an den Antikörper eine Koagulationsinduktion des tTF ermöglicht: die Ligandenvermittelte Komplexbildung und die Liganden-vermittelte Konzentrationserhöhung. Der zellgebundene Koagulationstest besteht aus zwei Phasen, der Bindungs- und der Koagulationsphase (dazwischen ein Waschschritt). Beide können unabhängig voneinander durch freien Liganden inhibiert werden, so dass der Einfluss des Liganden (scFv-Antikörpers) auf diese beiden Prozesse getrennt analysiert werden kann. Es wurden daher Experimente durchgeführt, in denen freier Ligand (MK271-IgG, anti-MausVCAM-1-Antikörper) entweder in der Bindungsphase oder in der Koagulationsphase zugegeben wurde. Als Negativkontrolle für den freien Liganden wurde ein irrelevantes IgG (Intraglobin®, humanes unspezifisches Immunglobulin G) eingesetzt. Die Antikörper wurden für die Inhibierung der Bindungsphase in verschiedenen Konzentrationen (5 nM bis 5000 nM) verwendet und den Proben mit dem Fusionsprotein (5 nM) entweder in der Bindungsphase (Abb. 3.25) oder in der Koagulationsphase (Abb. 3.26) des Tests hinzugefügt. Für die Inhibierung der Koagulationsphase wurden die Antikörper in 66-fachem molaren Überschuss eingesetzt. 100 FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 056 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 Abb. 3.25: Zellgebundener Koagulationstest mit Inhibierung von anti-VCAM-tTF durch Im- munglobulin (Ig) und MK27 (anti-mVCAM-1-Antikörper) in der Bindungsphase, FP = Fusionsprotein ohne Antikörper-Zugabe. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Dreifach-Bestimmungen. Probe: P522 (anti-VCAM-tTF), 5 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Wie zu erwarten findet durch das unspezifische Immunglobulin keine Inhibierung des Fusionsprotein statt. Durch den spezifischen Antikörper MK27 lässt sich die Bindung des Fusionsproteins in der Bindungsphase vollständig inhibieren. FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 076 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 ohne Ak Abb. 3.26: MK27 Ig Zellgebundener Koagulationstest mit Inhibierung von anti-VCAM-tTF durch Zugabe der Antikörper (Ak) Immunglobulin (Ig) und MK27 (anti-VCAM-1-Antikörper) im Überschuss in der Koagulationsphase. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P797 (anti-VCAM-tTF), 50 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. In der Koagulationsphase war ebenfalls eine Inhibierung um ca. 50% zu beobachten. 101 3.2.5 Andere Faktoren 3.2.5.1 Testung unterschiedlicher Zellmengen Es wurde des Weiteren nachgewiesen, dass die Koagulationsinduktion zellabhängig ist, und nicht etwa auch auf der Oberfläche der Zellkulturplatten stattfinden kann. Hierzu wurden Zellen in verschiedenen Konzentrationen ausgesät, wobei sich nur bei den höheren Konzentrationen ein kontinuierlicher Zellrasen entwickelte. Dazu wurden 5 x 10³, 1 x 104, 2,5 x 104, 5 x 104 und 1 x 105 2F2B-Zellen pro Loch eingesetzt und 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. 5 x 104 und 1x 5 10 Zellen pro Loch zeigten bei der mikroskopischen Kontrolle einen konfluenten Zellrasen. Bei den geringeren Zellmengen lagen die Zellen noch einzeln ohne Kontakt zu den Nachbarzellen. Wie erhofft, nahm die Koagulationsaktivität mit wachsender Zellzahl zu (Abb. 3.27) und es wurden keine Artefakte durch Binden der Koagulationsproteine an die Zellkulturplatte beobachtet (siehe Abb. 3.28 und Abb. 3.29). Da Zellen nach Erreichen der Konfluenz abzusterben beginnen, und dann prothrombotisches Material freisetzen können, wurden die Zellen in den nachfolgenden Tests in der höchstmöglichen nicht konfluenten Zellzahl, d.h. mit 2,5 x 104 pro Loch eingesetzt. FXa-Generation [OD 405nm] ZKT 087 0,180 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 5.000 Zellen 10.000 Zellen 25.000 Zellen 50.000 Zellen 100.000 Zellen P947 Abb. 3.27: Testung verschiedener Zellmengen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hinter- grund Zellkulturmedium) von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P947 (anti-VCAM-tTF), 30 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 3.2.5.2 Testung verschiedener Inkubationszeiten Es wurden verschiedene Inkubationszeiten für die Proben (jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C) und für den Koagulations-Mix (jeweils 1 Stunde oder 15 Minuten bei 37 °C) getestet. Dabei wurde auch die Zelllinie ECV304 eingesetzt, die kein VCAM-1 exprimiert, um bei der Inkubation über Nacht möglicherweise entstehende unspezifische Bindungen an die 102 Zelloberfläche zu erkennen. Zu diesem Zwecke wurde bei der Darstellung im Diagramm das Zellkultur-Medium nicht wie sonst als Hintergrund von den Probenwerten abgezogen, sondern als separate Säulen dargestellt. Tab. 3.5: Test-Bedingungen ZKT 046 Test-Bedingungen #1 #2 #3 #4 Inkubation Probe 1 h RT 1h RT 4 °C über Nacht 4 °C über Nacht Inkubation Koagulations-Mix 1 Std. 37 °C 15 Min. 37 °C 1 Std. 37 °C 15 Min. 37 °C ZKT 046 FXa-Generation [OD 405nm] 0,350 0,300 0,250 0,200 P470 0,150 tTF 0,100 Medium 0,050 0,000 2F2B #1 Abb. 3.28: 2F2B #2 ECV304 #1 ECV304 #2 ohne Zellen #1 ohne Zellen #2 Zellgebundener Koagulationstest zur Testung der Inkubation mit unterschiedlichen Zeiten und Temperaturen auf 2F2B-Zellen, ECV304-Zellen und zellfrei. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P470 (anti-VCAM-tTF), 50 nM, Negativ-Kontrollen: tTF, 50 nM, und Zellkultur-Medium. Testbedingungen #1 und #2 (1 Stunde Inkubation für Bindungsphase) siehe Tabelle oben. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 103 ZKT 046 FXa-Generation [OD 405nm] 1,600 1,400 1,200 1,000 P470 0,800 tTF 0,600 Medium 0,400 0,200 0,000 2F2B #3 Abb. 3.29: 2F2B #4 ECV304 #3 ECV304 #4 ohne Zellen #3 ohne Zellen #4 Zellgebundener Koagulationstest zur Testung der Inkubation mit unterschiedlichen Zeiten und Temperaturen auf 2F2B-Zellen, ECV304-Zellen und zellfrei. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von Zweifach-Bestimmungen. Probe: P470 (anti-VCAM-tTF), 50 nM, Negativ-Kontrollen: tTF, 50 nM, und Zellkultur-Medium. Testbedingungen #3 und #4 (über Nacht Inkubation für Bindungsphase) siehe Tabelle oben. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Die Probeninkubation über Nacht (Test-Bedingung #3 und #4, siehe Abb. 3.29) führte zu sehr hohen Extinktionen sowohl beim Fusionsprotein als auch bei den Negativ-Kontrollen tTF und Medium. Die mikroskopische Kontrolle der Zellen zeigte, dass diese zum Teil nicht mehr intakt waren, was größere Mengen prothrombotischen Materials freisetzt. Dies erklärt auch die relativ hohen Extinktionen bei der ECV304-Zellinie, die hier als Negativ-Kontrolle eingesetzt wurde. Der Hintergrund (Zellkultur-Medium) wurde bei diesem Test nicht von den Probenwerten subtrahiert, da er gerade bei der Inkubation über Nacht sehr hohe Extinktionen zeigte, was ebenfalls als unspezifische Reaktion durch freigesetztes prothrombotisches Material zu erklären ist. Die Testung ohne Zellen wurde durchgeführt, um potenzielle unspezifische Bindungen an das Plastik der Platten auszuschließen. Die besten Ergebnisse brachte eine einstündige Probeninkubation in Kombination mit einer einstündigen Inkubation des Koagulationsmixes (Test-Bedingung #1, siehe Abb. 3.28). Diese Inkubationszeiten wurden für die weiteren Analysen verwendet. 3.3 Verbesserung der Effektorfunktion durch optimierte dreidimensionale Ausrichtung des tTF-Moleküls zur Zellmembran-Oberfläche (Molecular Modelling) Zur Verbesserung der Effektivität des vorhandenen Prototyps des anti-VCAM-tTFFusionsproteins sollte die Hypothese überprüft werden, dass die Positionierung und Ausrichtung 104 des aktiven Zentrums von FVIIa im FVIIa/TF-Komplex (siehe Kap. 1.6.4) durch Molecular Modelling weiter verbessert werden kann. Um die dreidimensionale Ausrichtung zur Membran zur verbessern, wurden neue Konstrukte entworfen. Diese sollten zunächst in silico getestet werden, dann rekombinant hergestellt und in funktionellen Assays ausgewertet werden. 3.3.1 Vorhersage der Proteinstruktur mit dem SWISS-Model Es wurde versucht, die dreidimensionale Molekülstruktur des Fusionsproteins mit Hilfe des SWISS-Models hervorzusagen. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des Proteins in das Programm eingegeben (http://swissmodel.expasy.org/). Für den scFv- und den tTF-Anteil konnten die in Abb. 3.30 gezeigten Homologiestrukturen ermittelt werden. Abb. 3.30: Mit Hilfe des SWISS-Models ermittelte Homologiestrukturen für scFv und tTF Da für die verschiedenen Linker-Sequenzen jedoch keine homologen Proteine in der Datenbank existierten, konnte das vollständige Protein leider nicht dargestellt werden. Daher wurden alle Konstrukte rekombinant hergestellt und in Koagulations-Assays getestet. 3.3.2 Klonierungsstrategie für Fusionsprotein-Varianten Ausgangsmaterial war das Plasmid pswc4, welches eine Peptidsequenz von HHHHHH als Linker zwischen dem jeweiligen scFv und tTF enthält, wobei tTF den extrazellulären Anteil von TF (Aminosäuren 1-219) darstellt. Das Ziel war, Varianten mit verschiedenen Linkerlängen (mit und ohne Histidin) und Varianten mit leicht verlängertem tTF (maximal neun der 24 Aminosäuren des Transmembrananteils zusätzlich) sowie alle möglichen Kombinationen hiervon herzustellen. Da das hier zu verwendete scFv eine Restriktionsstelle für KpnI enthält, konnte das scFv erst nach Klonierung von Linkerund tTF-Varianten eingesetzt werden. Deshalb wurde zunächst der 6H-Linker durch die neuen 105 Linker ersetzt, entweder mittels Primer-Duplex-Insertion oder durch Klonierung eines LinkerPCR-Fragmentes. Die Zwischenprodukte wurden sequenziert. Dann wurde jeweils das tTF-Fragment ausgeschnitten und durch die neuen tTF-PCR-Fragmente ersetzt. Nach Sequenzierung der Zwischenprodukte wurde schließlich das scFv MK271, welches aus einem vorhandenen Plasmid ausgeschnitten wurde, in diese Plasmide eingesetzt. Abb. 3.31: Klonierungs-Schema. (A) Ausschneiden des alten Linkers und Einsetzen der neuen Linker- Varianten (Livar), (B) Ausschneiden des alten tTF und Einsetzen der neuen tTF-Varianten, (C) Einsetzen des MK271-scFv. Schwarze Balken = Restriktions-Schnittstellen, HX = Klonierungsstelle für MK271-scFv (H = Restriktionsschnittstelle für HindIII, X = Restriktionsschnittstelle für XbaI). 3.3.3 Klonierung der neuen Fusionsprotein-Varianten 3.3.3.1 Modifikation der Linker Der Linker zwischen scFv und tTF im Originalkonstrukt besteht aus sechs Histidin-Molekülen. Durch Veränderung dieser Linkersequenz sollte das Molekül beweglicher werden und der tTF- 106 Anteil näher an die Zellmembran heran kommen. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Sequenzen der erhaltenen Linker. Tab. 3.6: Modifizierte Linker (sortiert in aufsteigender Länge) Plasmidbezeichnung Linkersequenz Interner Code pLi3 XbaI -Gly3-KpnI pswc12 pLi5 XbaI -Gly4-Ser-KpnI pswc17 pLi6H XbaI-His6-KpnI pswc4 pLi8 XbaI -Gly4-Ser-Gly3-KpnI pswc13 pLi9H XbaI -His6-Gly3-KpnI pswc10 pLi13 XbaI -Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly3-KpnI pswc14 pLi13H XbaI -His5-Gly4-Ser-Gly3-KpnI pswc15 pLi14H XbaI -His6-Gly4-Ser-Gly3-KpnI pswc11 pLi19 XbaI -Gly4-Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-KpnI pswc18 pLi51 XbaI -Gly4-Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly- pswc19 Thr-Gly3-Ser-Gly4-Ser-Gly4- Ser-Gly-Thr-Gly3Ser-Gly4-Ser-Gly4-Ser-KpnI 3.3.3.2 Modifikation des tTF-Anteils Wie in Kapitel 1.6.2 beschrieben, ist der Membrananker des TF essentiell für die volle proteolytische Aktivität im Zusammenspiel mit FVIIa. Bei unserem Fusionsprotein wurde die Bindung des Membranankers durch die Bindung des scFv an VCAM-1 ersetzt. Da das scFv jedoch aufgrund seiner Größe (ca. 50 Å) am N-Terminus fusioniert wurde, postulierten wir, dass eine geringfügige Verlängerung des tTF-Anteils am C-Terminus einen besseren Kontakt zur Zellmembran herstellen würde. Die TF-Verlängerung durfte jedoch nicht zu lang ausfallen, da sonst eine unspezifische Membraninsertion begünstigt würde. Daher wurden maximal die ersten neun Aminosäuren des transmembranären Anteils von TF angefügt. Es wurden neun Varianten des tTF mit 220-228 Aminosäuren (tTF220-228) hergestellt (siehe Tab. 3.7, Seite 110). Abb. 3.32 zeigt die Plasmide mit den neuen Linkern nach dem enzymatischen Verdau mit SacI und KpnI, der das 219aa tTF-Fragment freisetzt, zur Überprüfung der Intaktheit der KpnI-Restriktionsstelle. 107 Abb. 3.32: Analytisches Gel mit pswc10-15/MK271 nach Restriktionsenzym-Verdau mit SacI und KpnI zur Überprüfung der KpnI-Restriktionsstelle. Marker: links Invitrogen 100 bp DNA Ladder, rechts GIBCO 1 Kb DNA Ladder. Abb. 3.33: Präparatives Gel der neuen Plasmide nach Restriktionsenzym-Verdau mit KpnI und SacI zur Vorbereitung der Ligation mit der neuen tTF-DNA. Links GIBCO 1 Kb DNA Ladder, rechts Invitrogen 100 bp DNA Ladder Die unterschiedlich langen tTF-Fragmente wurden mittels PCR-Reaktion hergestellt (Abb. 3.34), und dann in die linearisierten Plasmide kloniert. Anschließend wurden aus den klonierten Bakterien Einzelkulturen angelegt und jeweils ein DNA-Miniprep angefertigt. Die Minipreps wurden durch einen Restriktionsverdau mit SacI und KpnI auf Vorhandensein des Fragmentes überprüft (Abb. 3.35). 108 Abb. 3.34: Agarose-Gel zur Überprüfung der PCR-Amplifikate. Von links nach rechts: tTF220228. Jeweils ganz außen: Invitrogen 100 bp Ladder. Abb. 3.35: Restriktionsenzym-Verdau von Minipreps mit KpnI und SacI zur Kontrolle des tTFInserts. Spur 1: Invitrogen 100 bp Ladder. Spur 2-20: verschiedene Minipreps der neuen Konstrukte. Spur 5-7: Minipreps mit fehlendem tTF-Insert. Das Endresultat waren 10 Expressionsplasmide mit unterschiedlich langen Linkern, die jeweils 10 verschiedene tTF-Fragmente enthielten. Die Sequenzen für die verlängerten tTF-Fragmente wurden überprüft und sind in Tab. 3.7 dargestellt. 109 Tab. 3.7: Neue tTF-Sequenzen mit 220-228 Aminosäuren tTF 220 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA glu phe arg glu ile tTF 221 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC glu phe arg glu ile phe tTF 222 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC glu phe arg glu ile phe tyr tTF 223 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC glu phe arg glu ile phe tyr ile tTF 224 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT glu phe arg glu ile phe tyr ile ile tTF 225 Nukleotidsequenz: AS : GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly tTF 226 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala tTF 227 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT GTG glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala val tTF 228 Nukleotidsequenz: AS: GAA TTC AGA GAA ATA TTC TAC ATC ATT GGA GCT GTG GTA glu phe arg glu ile phe tyr ile ile gly ala val val 3.3.3.3 Einfügen des MK27-scFv Aus dem vorhandenen Expressionsplasmid pswc4/MK271 wurde mittels Restriktionsenzymverdau mit HindIII und XbaI das MK271-scFv herausgeschnitten, auf einem 1,5%igen Agarose-Gel aufgetrennt und die scFv-Bande ausgeschnitten. Die neuen Expressionsplasmide wurden ebenfalls mit HindIII und XbaI verdaut, um die Insert-Stelle für das scFv zu öffnen. Auch hier erfolgte eine Aufreinigung auf einem Agarosegel mit anschließender Exzision der entsprechenden Plasmid-Banden. Die DNA wurde dann aus dem Gel extrahiert. Die DNA-Konzentrationen wurden in einem analytischen Gel bestimmt und so eingestellt, dass die molare Plasmid-Insert-Ratio für die folgende Ligation bei 1:10 lag. Die scFv-DNA wurde nun mittels Ligation in die neuen Plasmide kloniert. 110 Aus den klonierten Bakterien wurden DNA-Minipreps hergestellt und durch einen Restriktionsenzym-Verdau mit HindIII und XbaI auf das Vorhandensein des scFv-Inserts überprüft (siehe Abb. 3.36). Abb. 3.36: Restriktionsenzym-Verdau von Minipreps mit HindIII und XbaI zur Kontrolle des scFv-Inserts. Spur 1: Invitrogen 100 bp Ladder. Spur 2-11: Verdau der Minipreps Des Weiteren wurde eine Gensequenzierung der Minipreps durchgeführt. Aus den Minipreps mit der korrekten DNA-Sequenz (bzw. auch aus solchen mit stummen Mutationen) wurden nun Maxipreps gewonnen, welche für die Proteinexpressionen eingesetzt wurden. Zwei der Konstrukte enthielten eine konservative Mutation (pLi8-T221: Arg Lys; pLi13H-T225: Val Ala) und wurden ebenfalls für die Proteinexpression verwendet. 3.3.4 Expression und Aufreinigung der neuen Fusionsprotein-Varianten Aus Gründen der Kapazität der Schüttelinkubatoren und der Zentrifugen konnten maximal elf Proteine gleichzeitig exprimiert werden. Es wurde pro Protein jeweils 1 L Bakterienkultur angezogen. Die Ausbeute betrug nach NiNTA-Aufreinigung typischerweise 100-300 µg Gesamtprotein und 5-40 µg spezifisches Protein. Zur Bestimmung der spezifischen Proteinkonzentration wurden die Proteine im Spektrophotometer bei 278 nm vermessen (siehe Abb. 3.37), sowie mittels SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und nach Coomassie gefärbt (Abb. 3.38). 111 Abb. 3.37: Protein-Konzentrationsbestimmung mittels UV-Spektrometer. Probe P2000 (pLi51- T222). Abb. 3.38: SDS-PAGE der Fusionsproteine P1008-1011 nach Coomassie-Färbung. (1) Größenstan- dard Invitrogen BenchMark Protein Ladder, (2) P1008 (pLi8-T225), (3) P1009 (pLi8-T226), (4) P1010 (pLi8-T228), (5) P1011 (pLi6H -T219). Die Banden der Fusionsproteine sieht man bei 60 kDa. Das Fusionsprotein hat eine Größe von 60 kDa. Die Banden bei 45kDa repräsentieren ein Bakterienprotein, welches ebenfalls an NiNTA bindet und eine bekannte Kontamination ist. Die Banden bei 27/30kDa sind wahrscheinlich auf Zerfallsprodukte des Fusionsproteins zurückzuführen (scFv und tTF nach Proteolyse in der Linkerregion). Da der Reinheitsgrad der spezifischen Proteine teilweise nur 5 % betrug, war die Abschätzung der spezifischen Proteinkonzentration dementsprechend ungenau. Die Identität der neuen Fusionsproteine wurde stichprobenhaft per Western Blot bestätigt. 112 Abb. 3.39: Western Blot der Fusionsproteine. (1) Bio-Rad Kaleidoscope Protein Ladder, (2-4) tTF als Mengenstandard eingesetzt 32 ng, 16 ng, 4 ng, (5) pLi6H, (6) pLi9H, (7) pLi14H, (8) pLi3, (9) pLi8, (10) pLi13, (11) pLi13H, (12) Protein Ladder. Die Banden der Fusionsproteine sind bei 60 kDa zu erkennen (Pfeil). Die Banden bei 30 kDa in Spur 5,6 und 11 sind tTF-Monomere, in Spur 5 darüber tTF-Dimere. 3.3.5 In-vitro-Charakterisierung der neuen Fusionsprotein-Varianten 3.3.5.1 Bindung Die Bindungsfähigkeit der neuen Fusionsproteine wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die FACS-Auswertung erfolgte anhand der Histogramme der Fluoreszenz. Dabei ist auf der xAchse die Fluoreszenz-Intensität und auf der y-Achse die Zellzahl aufgetragen. Bei nicht ausreichender Bindungsfähigkeit der Konstrukte wurden diese verworfen und neu hergestellt. Beispielhaft seien hier einige FACS-Histogramme aufgeführt. Abb. 3.40: FACS-Auswertung zur Bindungsfähigkeit der neuen Konstrukte. Dünne Linie: Zellen ohne Antikörper bzw. nur mit Sekundär-Antikörper, dicke Linie: Proben, x-Achse: Fluoreszenz-Intensität, y-Achse: Zellzahl Im Vergleich zur Positivkontrolle zeigte sich eine ähnlich gute Bindungsfähigkeit der hier beispielhaft gezeigten Proteine P2000 und P1026. 113 3.3.5.2 Koagulations-Induktion Die Koagulationsfähigkeit der neuen Proteine wurde im zellfreien und im zellgebundenen Koagulationstest analysiert. Dabei wurde jeder Test mindestens einmal wiederholt. In der Abb. 3.41 und Abb. 3.42 sieht man repräsentative Beispiele. Faktor Xa-Generation [OD 405 nm] KT 316 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 Abb. 3.41: Zellfreier Koagulationstest der neuen Konstrukte. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Proben siehe unten, 20 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Proben: P1126 P1117 P1118 P1119 P1120 P1121 P1122 P1123 P1124 P1125 pLi6H +T219 (Originalkonstrukt) pLi6H +T220 pLi6H +T221 pLi6H +T222 pLi6H +T223 pLi6H +T224 pLi6H +T225 pLi6H +T226 pLi6H +T227 pLi6H +T228 114 Faktor Xa-Generation [OD 405 nm] ZKT 156 0,180 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 Abb. 3.42: Zellgebundener Koagulationstest der neuen Konstrukte. Das Diagramm zeigt die Mit- telwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Proben siehe oben, 100 nM. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. 3.3.6 Vergleichende Analyse der neuen Fusionsproteine Um Variationen der Funktionalität aufgrund von unterschiedlichen Expressionsbedingungen auszuschließen, wurden die Proteine nur innerhalb einer Expressionsreihe im Koagulationstest miteinander verglichen. Die zellfreien Assays (KT) wurden mit Doppelbestimmungen und die zellgebundenen Assays (ZKT) mit Dreifachbestimmungen durchgeführt. Beim zellgebundenen Koagulationstest wurden 100 nM des Proteins eingesetzt, bei den zellfreien Tests 10 nM und 20 nM, wobei hier die Ergebnisse für 20 nM gezeigt sind. Jeder Test wurde mindestens einmal wiederholt. Die Balkendiagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund, PBS beim zellfreien und tTF beim zellgebundenen Test) der Faktor Xa-Generation als x-fachen Wert über dem Originalkonstrukt pLi6H-T219 (pswc4+tTF219). Aufgrund der ungenauen Proteinbestimmung und der Schwierigkeit, die Vielzahl von Einflussfaktoren (Zellviabilität, Vorhandensein von Phospholipiden in Form von Zelldebris, EndotoxinVerunreinigungen, Proteinreinheit, Dimerbildungen etc.) immer genau konstant zu halten, war die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nicht optimal. Da 76 verschiedene Proteine jeweils zweibis dreimal exprimiert wurden und für jedes exprimierte Protein vier bis sechs Assays in Zweifach- oder Dreifachbestimmung durchgeführt wurden, konnten nur Methoden angewandt werden die mit einem hohen Durchsatz kompatibel waren. Auf der anderen Seite erlaubte die hohe Anzahl an Datenpunkten zumindest Trends zu erkennen. Dabei wurde auf eine Verbesserung der Koagulationsinduktion im zellgebundenen Assay bei nicht erhöhter oder verminderter Aktivität im zellfreien Koagulationstest geachtet. Erhöhte Aktivität im zellfreien Koagulationstest wurde als eine 115 höher als angenommene Proteinkonzentration interpretiert. In der Zusammenschau der Daten ergab sich bei dieser Auswertungsweise der Trend, dass Fusionsproteine mit längeren Linkern (19 oder 51 Aminosäuren statt sechs Aminosäuren) und unter den Proteinen mit längeren Linkern solche mit leicht verlängertem tTF (insbesondere 222 Aminosäuren, zum Teil auch 226 Aminosäuren statt ursprünglich 219 Aminosäuren) eine verbesserte Koagulationsinduktion hervorriefen. Einige Testreihen, die diese Beobachtung stützen, sind in den Abbildungen Abb. 3.43 bis Abb. 3.46 gezeigt. 116 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] KT 297 (Expressionsreihe P1021-1030) 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] KT 273 (Expressionsreihe P953-952) 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] KT 307 (Expressionsreihe P1070-1080) Abb. 3.43: 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Vergleich der Koagulationsinduktion im zellfreien Koagulationstest für verschiedene TF-Längen mit dem 19 aa langen Linker. Daten aus drei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Die neuen Konstrukte zeigten im zellfreien Test im Vergleich zum Originalkonstrukt (= Kontrolle) eine verminderte oder ähnliche Aktivität, daher sind Erhöhungen im zellgebundenen Koagulationstest (nächste Abbildung) eher eine Folge der dreidimensionalen Ausrichtung als eines Konzentrationsunterschiedes. 117 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 128 (Expressionsreihe P1021-1030) 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 83 (Expressionsreihe P944-953) 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 113 (Expressionsreihe P1070-1080) 3,000 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 -0,500 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 115 (Expressionsreihe P1070-1080) Abb. 3.44: 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 Vergleich der Koagulationsinduktion im Zell-Koagulationstest für verschiedene TF- Längen mit dem 19 aa langen Linker. Daten aus drei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme 118 zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Die neuen Konstrukte induzierten teilweise zwei- bis dreimal mehr Faktor Xa, insbesondere Konstrukte mit der TF-Länge 222aa. Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] KT 296 (Expressionsreihe P1034-1043) 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] KT 282 (Expressionsreihe P1045-1053) Abb. 3.45: 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 * Vergleich der Koagulationsinduktion im zellfreien Koagulationstest für verschiedene TF-Längen mit dem 51 aa langen Linker. Daten aus zwei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund PBS) von Zweifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Auch hier fand sich für die neuen Konstrukte im Vergleich zum Originalkonstrukt eine verminderte oder nur leicht erhöhte Aktivität. * In dieser Expressionsreihe fehlt pLi51-T224, da die Kultur nicht angewachsen ist. 119 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 125 (Expressionsreihe P1034-1044) 7,000 6,000 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 148 (Expressionsreihe P1034-1044) 20,000 15,000 10,000 5,000 0,000 -5,000 Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 106 (Expressionsreihe P1045-1054) 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 * Faktor Xa-Generation [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 121 (Expressionsreihe P1045-1054) 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0,000 * 120 Abb. 3.46: Vergleich der Koagulationsinduktion im Zell-Koagulationstest für verschiedene TF- Längen mit dem 51 aa langen Linker. Daten aus zwei verschiedenen Expressionsreihen. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Trotz der suboptimalen Reproduzierbarkeit zeigt sich auch hier ein Trend für die Überlegenheit des Konstruktes mit dem 222 aa langen TF. * In dieser Expressionsreihe fehlt pLi51-T224, da die Kultur nicht angewachsen ist. Die beobachteten Trends stehen im Einklang mit der ursprünglich aufgestellten Hypothese, dass ein längerer Linker dem Protein mehr Spielraum gäbe, um sich korrekt anzuordnen, und ein leicht verlängerter tTF sich besser an die Zellmembran anlagern würde. Um dies zu bestätigen, wurde das Protein pLi51-T222 in größerem Maßstab hergestellt und mit dem Prototyp pLi6H-T219 verglichen. Sowohl zellfreier als auch zellgebundener Koagulationstest wurde dreimal durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.47 dargestellt. 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 ZKT 141 FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle] FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle] ZKT 131 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle] 1,000 1,200 KT 314 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ZKT 157 FXa-Gen. [Vielfaches über Kontrolle] 1,200 KT 296 FXa-Generation [Vielfaches über… Faktor Xa-Generation [Vielfaches… KT 295 121 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Abb. 3.47: Zellfreier (KT) und zellgebundener Koagulationstest (ZKT) mit dem Vergleich pLi51- T222 und pLi6H -T219 (Kontrolle). Daten aus einer Expressionsreihe. KT und ZKT wurden jeweils dreimal wiederholt. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. Abb. 3.47 zeigt in allen Fällen eine bessere Koagulationsinduktion des neuen Konstruktes pLi51T222 im zellgebundenen Test (untere Reihe). Die Tatsache, dass im zellfreien Assay (obere Reihe) keine erhöhte, vielmehr eine leicht verminderte Faktor Xa-Generation beobachtet wurde, ist vereinbar mit der Interpretation, dass die verbesserte Funktionalität durch eine optimierte Präsentation des Fusionsproteins auf der Zellmembran erreicht wurde. Es blieb nun noch auszuschließen, dass dieses neue Konstrukt etwa auch unspezifische Koagulation unterstützt. Hierzu wurde das neue Fusionsprotein pLi51-T222 im Vergleich mit dem Prototyp auf drei verschiedenen Zelllinien getestet: 2F2B-Zellen, die konstitutiv murines VCAM-1 exprimieren; bEND3-Zellen, in welchen murine VCAM-1-Expression durch LPS induziert wird; und HUVEC-Zellen, die human sind und kein murines VCAM-1 exprimieren. Das Resultat ist in Abb. 3.48 dargestellt. ZKT 158 FXa-Generation [OD 405nm] 0,250 0,200 2F2B 0,150 Bend3 -LPS Bend3 +LPS 0,100 ECV304 HUVEC 0,050 0,000 pLi6H -T219 Abb. 3.48: pLi51-T222 Zellgebundener Koagulationstest auf verschiedenen Zelllinien zur Analyse der Spezi- fität. Proben: pLi51-T222 (neues Konstrukt) und pLi6H -T219 (Kontrolle). Das Diagramm zeigt die Mittelwerte (minus Hintergrund tTF) von Dreifach-Bestimmungen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes. pLi51-T222 zeigte erneut eine deutlich verbesserte Koagulationsinduktion auf antigenpositiven Zellen, nicht aber auf antigennegativen Zellen, induzierte also keine vermehrte unspezifische Gerinnungsaktivierung. 122 Damit ist als Ergebnis dieser Arbeit ein Konstrukt entwickelt worden, welches eine verbesserte spezifische, antikörpervermittelte Koagulationsinduktion im Vergleich zum Prototyp des antiVCAM-1-tTF aufweist. 123 4 Diskussion 4.1 Charakterisierung des Prototyps Im ersten Teil der Arbeit wurde das in der Arbeitsgruppe vorhandene Konstrukt des Prototyps des anti-VCAM-tTF in größeren Mengen rekombinant hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Ziel war es, ein rekombinantes spezifisches Fusionsprotein zu herzustellen, welches selektiv an luminale Tumorendothelzell-Marker bindet und die Tumorblutgefäße durch Aktivierung des Gerinnungssystems okkludiert (Dienst 2005). Neben der biochemischen und funktionellen Charakterisierung in-vitro wurde die klinische Anwendbarkeit in-vivo im Mausmodell getestet. Dabei wurde erstmals eine thrombogen induzierte Nekrose und Verzögerung des Tumorwachstums durch ein rekombinantes tTF-basiertes Fusionsprotein, welches über einen Antikörper an einen luminalen Endothel-Marker wie VCAM-1 bindet, gezeigt. Die in-vitro-Analysen des Fusionsproteins zeigten eine spezifische Bindungsfähigkeit des scFvAnteils an VCAM-1 und die Fähigkeit des tTF-Anteils die Gerinnung durch FXa-Aktivierung zu induzieren. Die in-vivo-Effektivität des Fusionsproteins wurde in verschiedenen Mausmodellen getestet. Da humane Hodgkin-Tumoren eine hohe VCAM-1-Expression aufweisen, wurde diese Entität als ein Modell ausgewählt. Im Hinblick auf die klinische Anwendung stellen Hodgkin-Patienten zudem ideale Kandidaten für die Therapie mit dem anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein dar, da sie in der Regel jung sind und somit keine vaskulären Komorbiditäten, wie z.B. Arteriosklerose, aufweisen. Aufgrund der nur geringen VCAM-1-Expressin in dem L540rec-Xenograft-Modell musste diese durch Stimulation mit LPS gesteigert werden. Es ist bekannt, dass die wiederholte Gabe und langfristige Anwendung von LPS durch eine Aktivierung verschiedener Zytokine, wie z.B. TNF-α, schwerwiegende Auswirkungen auf den Organismus, bis hin zum septischen Schock, hat (Beutler 1995). Das LPS verursachte auch in dieser Arbeit bei einigen Tieren Toxizität. Aus diesem Grund wurde ein zweites Modell, das Colo677-Myelom-Modell, verwendet, in welchem die VCAM-1-Expression des Endothels konstitutionell ausreichend hoch ist, so dass es sich für die Erprobung des Fusionsproteins gut eignet. Die beste Kontrolle des Tumorwachstums zeigte sich in der Kombinationsbehandlung mit Doxorubicin und dem Fusionsprotein. Unsere Arbeitsgruppe konnte in einer früheren Arbeit zeigen, dass LPS Tumorblutgefäße für die Gerinnungsinduktion mit TF-basierten Agenzien sensibilisieren kann (Philipp 2003). Möglicherweise führt die Behandlung mit Doxorubicin ebenfalls zu einer Steigerung der Empfindlichkeit des Tumorendothels gegenüber dem Fusionsprotein. Auf die Vorteile der Kombinationstherapie wird weiter unten noch einmal eingegangen. 124 Neben der Wirksamkeit des Fusionsproteins wurden auch seine Nebenwirkungen untersucht. Zum Einen erfolgte eine klinische und histologische Beurteilung der Mäuse, zum Anderen wurden im Rahmen eines weiteren Projektes in der Arbeitsgruppe auch dessen Auswirkungen auf das Gerinnungssystem untersucht. Diese laborchemischen Analysen verschiedener Komponenten des Gerinnungssystems sind zwar nicht Teil dieser Arbeit gewesen, werden hier aber aufgrund der Vollständigkeit erwähnt. Insgesamt zeigte sich das Fusionsprotein als gut verträglich. Von hervorragender Bedeutung für die gute Verträglichkeit war die sorgfältige Entfernung von Endotoxin. Auch mit empfindlichen Methoden ließ sich keine systemische Aktivierung des Gerinnungssystems feststellen. In den Kurzzeit-Experimenten wurden die Organe und Tumoren der Mäuse drei Tage nach einer Injektion mit dem Fusionsprotein histologisch aufgearbeitet und hinsichtlich des Auftretens von thrombotischen Ereignissen mit nachfolgender Nekrose untersucht. Beide Tumormodelle offenbarten dabei signifikante Tumornekrosen. Die Spezifität der Reaktion zeigte sich durch die Untersuchung der Organe der Mäuse. Hier konnten zwar in einigen Organen, wie Lungen, Nieren und Pankreas, einzelne thrombosierte Blutgefäße nachgewiesen werden, allerdings keine damit verbundenen Nekrosen. In den meisten Fällen konnte auch keine umgebende Gewebsreaktion festgestellt werden, was ein post mortem aufgetretenes Artefakt nahe legt. Diese Kurzzeit-Experimente können als „proof of principle“ für das anti-VCAM-1-tTF-Fusionsprotein betrachtet werden. Es wurden hier sowohl die Wirksamkeit in Form der Generierung von Thrombosen mit konsekutiven Nekrosen als auch eine Spezifität für die Tumorblutgefäße nachgewiesen. In den Langzeit-Experimenten mit dem Lymphom-Modell konnte nach Behandlung mit dem Fusionsprotein plus LPS eine statistisch signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums im Vergleich zu den meisten Kontrollen (NaCl und scFv plus LPS) beobachtet werden. Allerdings erreichte der Vergleich mit der Behandlung mit tTF plus LPS keine statistische Signifikanz, was wohl zum Einen auf die geringen Fallzahlen zurückzuführen ist. Zum Anderen konnte unsere Arbeitsgruppe in einer früheren Arbeit zeigen, dass auch tTF zusammen mit LPS durchaus eine Koagulationsinduktion in Tumorblutgefäßen mit nachfolgender Ausbildung von Nekrosen im Tumor hervorrufen kann (Philipp 2003). Dazu wurde die Hypothese aufgestellt, dass es durch das LPS über TNF-α zu einer gesteigerten Expression von endogenem TF und Phosphatidylserin auf den Tumorendothelzellen kommt. Der injizierte tTF bindet an im Blut in kleinen Mengen zirkulierenden Faktor VIIa, der dann über seine Gla-Domäne an die Tumorendothelmembran bindet. Durch die lokale Akkumulation von endogenem TF und tTF können sich TF-Dimere ausbilden, für die nachgewiesen wurde, dass sie die Autoaktivierung von Faktor VII zu Faktor VIIa fördern können (Donate 2000). Der neu gebildete Faktor VIIa erlaubt seinerseits nun die Bindung von weiterem tTF. Sowohl der tTF-VIIa-Komplex als auch der en- 125 dogene TF induzieren dann die lokale Koagulation. In der genannten Arbeit (Philipp 2003) zeigten die Tumoren drei Tage nach der Behandlung der Mäuse mit LPS bzw. tTF plus LPS einen Nekroseanteil von 11 % (statistisch nicht signifikant im Vergleich zur NaCl-Kontrolle, 1%) bzw. 33 % (statistisch signifikant). Diese Daten entsprechen in etwa den in den Kurzzeitexperimenten dieser Arbeit erhobenen Ergebnissen, wo nach Applikation von LPS versus tTF plus LPS ein Nekroseanteil von 13 % versus 41 % zu beobachten war. Vergleicht man hierzu die Daten aus den Langzeit-Experimenten dieser Arbeit, so zeigen diese auf den ersten Blick ein abweichendes Ergebnis. Die Messung der Tumorvolumina zwei Wochen nach der Behandlung zeigte für LPS einen Mittelwert von 561 µl und für LPS plus tTF 565 µl, also keinen Unterschied. Betrachtet man jedoch den dritten Tag des Experimentes, so sieht man hier einen Unterschied für LPS/tTF (Mittelwert 198 µl) im Vergleich zu LPS allein (232 µl). Eine statistische Signifikanz wird hier nicht erreicht, jedoch ist ein Trend ersichtlich. Der Grund für diesen nur zu Beginn bestehenden Unterschied ist wahrscheinlich eine vitale Randzone aus Tumorzellen, die beim Fortgang des Experimentes zum Nachwachsen des Tumors beiträgt. Auf dieses Phänomen der vitalen Randzone wird weiter unten näher eingegangen. In dem Myelom-Modell zeigten nur die Mäuse, die mit Doxorubicin allein oder mit der Kombination aus Doxorubicin und dem Fusionsprotein behandelt wurden, eine signifikante Wachstumsverzögerung des Tumors. Für die mit Fusionsprotein alleine behandelte Gesamtgruppe zeigte sich ein Trend zur Verlangsamung des Tumorwachstums. Bei einigen Mäusen, die mit dem Fusionsprotein allein, Doxorubicin allein oder mit der Kombination behandelt wurden, konnte sogar eine fast vollständige Rückbildung der Tumoren beobachtet werden. Die histologische Analyse dieser regredienten Tumoren, die mit dem Fusionsprotein behandelt wurden, zeigte das für VTAs charakteristische Muster einer zentralen Nekrose mit einer schmalen vitalen Randzone. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass diese Randzone zum größten Teil aus Makrophagen bestand. Wie bereits in der Einleitung beschrieben, macht die Kombination eines VTAs mit einem Chemotherapeutikum grundsätzlich Sinn. Die VTAs wirken am effektivsten an Gefäßen, die sich im Inneren des Tumors befinden, da hier ein erhöhter interstitieller Druck herrscht, der zum Kollaps der Blutgefäße beiträgt (Thorpe 2004). Im Gegensatz hierzu wirken direkt gegen die Tumorzellen gerichtete Substanzen, wie Chemotherapeutika, eher auf die sich schnell teilenden Zellen in der gut oxigenierten Peripherie des Tumors. Ausschlaggebend ist sicherlich auch die Auswahl des Kombinationspartners. Einige Chemotherapeutika generieren in Anwesenheit von Sauerstoff freie Radikale, die zu einer Schädigung der Tumorzell-DNA führen (Trédan 2007). So wird Doxorubicin durch eine chemische Reduktion zu einem Semiquinon-Radikal, welches Sauerstoff zu einem Superoxid umwandelt, das wahrscheinlich wesentlich zur Zytotoxizität der Substanz beiträgt. Da reaktive Sauerstoffspezies eine Phosphatidylserin-Externalisierung hervorrufen (Ran 126 2002) und somit eine prokoagulante Endothelzelloberfläche schaffen, könnte dies die Sensibilisierung von Gefäßen für VTAs erklären. Es ist durchaus denkbar, dass dieser Effekt schon bei weitaus geringeren Dosen eintritt, was in zukünftigen Studien getestet werden sollte. Eine wichtige Rolle für die Wirksamkeit des Fusionsproteins spielt der prokoagulante Status in den getesteten Tumormodellen. Hierbei ist zu bemerken, dass weder das Lymphommodell noch das Myelommodell vorbestehende Nekrosen aufweisen, im Gegensatz zu Sarkom- und Teratokarzinommodellen, welche typischerweise sehr sensitiv für eine Tumor-selektive Gerinnungsinduktion sind (Nawroth 1988, Nilsson 2001). Als weiterer Kombinationspartner in der Therapie mit vaskulären Targeting Agenzien (VTAs) bieten sich Substanzen an, die die Vaskulogenese inhibieren. Zuvor wurde bereits das Problem der vitalen Randzone des Tumors nach Applikation von VDAs beschrieben. Diese ist im Wesentlichen dafür verantwortlich, dass die Tumoren im Tierversuch nach der Therapie wieder nachwachsen. Dabei wird zunehmend die Rolle von zirkulierenden endothelialen Progenitorzellen (CEP), welche aus dem Knochenmark rekrutiert werden, als entscheidender Faktor erkannt. Shaked et al. konnten in mehreren Experimenten zeigen, dass es durch die Therapie mit VDAs in einer Art Stressreaktion zur Ausschüttung von CEPs aus dem Knochenmark kommt, sich diese in der Randzone der Tumoren ansiedeln und so wesentlich zum Nachwachsen des Tumors beitragen (Shaked 2006). Des Weiteren konnten sie zeigen, dass eine vorhergehende Behandlung der Mäuse mit DC101, einem Antikörper der murinen VEGFR-2 neutralisiert, zu einer signifikanten Reduktion der Größe der vitalen Randzone führte. DC101 inhibiert nicht nur die Angiogenese sondern auch die Rekrutierung von CEPs aus dem Knochenmark und damit die Vaskulogenese. Auch eine metronomische Therapie konnte, vermutlich über den gleichen Wirkmechanismus, die Ausbildung eines vitalen Ringes verhindern (Daenen 2009). Eine Kombinationstherapie von SVOAs und Vaskulogenese-Inhibitoren sollte demnach das Problem der vitalen Randzone verringern und zu einem erheblich verbesserten Therapieeffekt führen. Gegen VCAM-1 gerichtete Fusionsproteine wurden im Folgenden in unserer Arbeitsgruppe auch gegen humanes VCAM hergestellt und in Zusammenarbeit mit Jacques E. Nör (University of Michigan) in einem humanen Angiogenese-Modell getestet (Dienst 2005). Diese Studie war nicht Bestandteil dieser Arbeit, soll hier aber dennoch Erwähnung finden. Dabei wurde ein Mausmodell verwendet, bei dem humane Endothelzellen in einer biologisch abbaubaren Polymer-Matrix zusammen mit humanen Tumorzellen, in diesem Fall Colo677, transplantiert werden. Daraus entwickeln sich Tumoren mit humanen und murinen Blutgefäßen, was immunhistochemisch nachgewiesen wurde. In einer explorativen Studie wurden Gruppen von fünf bis sechs Mäusen mit dem humanen anti-VCAM-1-tTF bzw. den Kontrollen (NaCl, tTF) behandelt. Nach drei Tagen 127 zeigten sich bei den behandelten Mäusen signifikant kleinere Tumorvolumina als bei den Kontroll-Tieren (Mittelwert für das Fusionsprotein 74 µl, für tTF 128 µl und für NaCl 128 µl). Bei der histologischen Analyse der Tumoren zeigten diese entgegen der Erwartung keine größeren nekrotischen Areale. Möglicherweise wurde das nekrotische Material durch die für dieses Modell typischen Riesenzellen (Makrophagen) abgeräumt. Allerdings zeigte die immunhistochemische Analyse der Tumoren der mit dem Fusionsprotein bzw. mit tTF behandelten Mäuse Fibrin-Gerinnsel, die Tumoren der mit NaCl behandelten Tiere wiesen diese nicht auf. Auch wenn es sich hierbei nur eine erste explorative Studie handelte, so zeigt sich doch ein wesentlicher Vorteil der rekombinanten Antikörper-Fusionsproteine, die gegen ein murines Antigen gerichtet sind, das homolog auch im Menschen existiert. Durch die modulare Beschaffenheit des von unserer Arbeitsgruppe entwickelten Klonierungs- und Expressionssystems kann das zuvor im murinen Modell getestete Konstrukt relativ einfach in ein klinisch anwendbares Protein umgewandelt und im humanen Angiogenesemodell präklinisch evaluiert werden. Um die Wirksamkeit tTF-basierter Agenzien zu verbessern, ohne deren Nebenwirkungen zu verstärken, muss man die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen näher betrachten. Physiologischerweise dient TF in dem membrangebundenen extrinsischen Tenasekomplex als Kofaktor zur Aktivierung von FVII, FIX und FX. Da tTF seine Fähigkeit zur FVII-Aktivierung verloren hat, stellt FVIIa einen limitierenden Faktor dar (Neuenschwander 1992). In der oben bereits erwähnten Arbeit konnten wir zeigen, dass auch tTF in Anwesenheit einer ausreichenden Menge von FVIIa die Gerinnung induzieren kann (Philipp 2003). FVIIa vermittelt dabei die Bindung von tTF an die Zellmembran über seine Glutamin-reiche Domäne (Gla-Domäne). So liegen die Möglichkeiten der Wirksamkeitssteigerung von tTF-basierten Agenzien zum Einen darin, die notwendigen Mengen an FVIIa zur Verfügung zu stellen. Dieses ist denkbar durch den Einsatz des tTFAgenz in einer Umgebung mit vorbestehendem Gefäßschaden und aktiviertem Gerinnungssystem (Philipp 2003, Nilsson 2001, Hu 2003) oder durch die exogene Zufuhr von FVIIa (Liu 2004). Zum Anderen besteht die Möglichkeit, die Fähigkeit des tTF-Agenz FVII zu FVIIa zu aktivieren, wieder herzustellen. Letzteres erscheint am sinnvollsten, da durch die Bindung des spezifischen Liganden die Gerinnungskaskade effektiv angestoßen werden kann. Da die räumliche Anordnung des tTF im Fusionsprotein zur Zellmembran und zum FVIIa möglicherweise nicht optimal war, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Verbesserung der Effektorfunktion durch molekulares Modelling angestrebt. Eine weitere Möglichkeit der Wirksamkeitssteigerung von TF-basierten Fusionsproteinen besteht in der Sensibilisierung des Tumorendothels für die Koagulationsinduktion. Dass sich hierfür beispielsweise LPS eignet, wurde bereits erläutert. Da LPS aber schwerwiegende systemische Nebenwirkungen hervorrufen kann, müsste die Substanz spezifisch im Tumorendothel lokalisiert werden. Gosk et al. präparierten Immunoliposomen, an die ein anti-VCAM-Antikörper gekoppelt 128 ist (Gosk 2008). Für diese Immunoliposomen konnte in in-vivo-Studien Fluoreszenz-mikroskopisch eine spezifische Akkumulation im Tumorendothel nachgewiesen werden. Durch Inkorporation von sensibilisierenden Substanzen wie zum Beispiel TNF-α in solche Liposomen könnte eine lokale Akkumulation des Wirkstoffs in den Tumorblutgefäßen erreicht werden, und so das Tumorendothel selektiv für die Gerinnungsinduktion sensibilisiert werden. Die Auswahl von VCAM-1 als Ligand für unser Fusionsprotein erfolgte aufgrund mehrerer Kriterien. Zielstrukturen für VTAs sollten 1) in ausreichender Menge auf den Endothelzellen des Tumors exprimiert werden, 2) nur geringe Expression auf normalem Endothel zeigen, 3) auf der luminalen Seite der Gefäße lokalisiert sein und 4) eine geringe Internalisations-Rate aufweisen. Dabei entsprach das VCAM-1-Molekül den meisten dieser Bedingungen gut. Eine geringe Expression auf vereinzelten normalen Endothelzellen ist möglicherweise tolerabel, da der prokoagulante Status des Tumor-Endothels einen zusätzlichen Sicherheitsfaktor darstellt. Es gibt allerdings einige pathologische Bedingungen, wie Inflammation oder Arteriosklerose, wo sowohl VCAM1 auf normalem Endothel hochreguliert ist, als auch ein gesteigerter prokoagulanter Status herrscht. Es bliebe zu untersuchen, ob unter solchen Umständen die Anwendung des anti-VCAM1-tTF weiterhin eine nur für das Tumorendothel spezifische Thrombosierung zeigt. Bis dahin wären diese Komorbiditäten in klinischen Studien als Ausschlusskriterium zu definieren. Andere Tumorendothelmarker, wie z.B. E-Selektin, PSMA (Prostataspezifisches Membran-Antigen), und tTF-Hochregulierung stellen ebenfalls attraktive Ziele für einen VTA-Einsatz dar. Mit neuen Technologien, wie dem Proteomic Mapping, werden in Zukunft möglicherweise weitere neue interessante Zielstrukturen identifiziert werden können. Es gibt mehrere Arbeitsgruppen, die Arbeiten zu tTF-basierten, Liganden-gerichteten VTAs veröffentlicht haben, worauf in der Einleitung bereits eingegangen wurde. Am weitesten fortgeschritten sind dabei die Arbeiten der Münsteraner Arbeitsgruppe um Wolfgang E. Berdel. Dabei wird ein Fusionsprotein verwendet, welches aus tTF und dem Peptid GNGRAHA besteht, das an eine Isoform der Aminopeptidase N (APN, CD13) bindet, deren Expression auf Endothelzellen humaner und muriner Tumoren hochreguliert ist. Ein wesentlicher Vorteil in der Verwendung solch kleiner Peptide als die Zielstruktur bindende Einheit gegenüber Antikörpern ist die Tatsache, dass sie C-terminal an tTF fusioniert werden können, und somit möglicherweise eine bessere dreidimensionale Ausrichtung des tTF zur Membranoberfläche erlauben. Bieker et al. beschreiben zwar einen signifikanten Regress der Xenograft-Tumoren, komplette Remissionen, wie sie von Nilsson et al. (Nilsson 2001) berichtet wurden, wurden allerdings nur sporadisch nach subkutanen Injektionen von toxisch hohen Dosen des tTF-NGR erreicht. Dieses wird auf eine geringere Affinität des NGR zu seiner Zielstruktur im Vergleich zu den Antikörper-Fragmenten zurückgeführt. Eine 129 statistisch signifikante Reduktion des Tumorwachstums nach Behandlung mit tTF-NGR wurde erst nach mehrfachen Injektionen (bis zu sieben) erreicht. Wie in der Einleitung bereits erläutert, besteht bei Krebspatienten zumeist ein prothrombotischer Status mit einem in unterschiedlichem Ausmaß aktivierten Gerinnungssystem. Auf den ersten Blick erscheint es kontraproduktiv in dieser Situation gerinnungsaktivierende Substanzen zu applizieren. Auf den zweiten Blick könnte aber ausgerechnet diese Strategie hilfreich sein, da vorstellbar ist, dass durch die lokale Gerinnungsinduktion im Tumor ein Verbrauch an zirkulierenden prokoagulanten Substanzen bewirkt wird, welche sonst zur systemischen Gerinnungsaktivierung beitragen würden. Wie oben bereits erwähnt, konnten wir in unserem Mausmodell keine systemische Gerinnungsaktivierung nachweisen. Hier ist aber darauf hinzuweisen, dass das Gerinnungssystem von Mäusen im Vergleich zu dem der Menschen eher zur Fibrinolyse neigt. Aus diesem Grund ist die im Mausmodell beobachtete ausbleibende Gerinnungsaktivierung durch SVOAs unter Umständen nicht vollständig auf den Menschen übertragbar. Die bereits erwähnte Studie von Bieker et al., in der einige Patienten mit tTF-NGR behandelt wurden, konnte nur sehr milde und vollständig reversible Veränderungen im Gerinnungssystem, wie Thrombozytenabfall, Verminderung des α2-Antiplasmins und Abfall von Antithrombin, nachweisen (Bieker 2009). Dieses sind eher Veränderungen, die auf einen vermehrten Verbrauch und Fibrinolyse hindeuten als auf eine systemische Gerinnungsaktivierung. Eingangs wurde bereits über die Rolle von TF- und Phosphatidylserin-haltigen Mikropartikeln beim prothrombotischen Status von Krebspatienten berichtet. Denkbar ist, dass diese Mikropartikel zu einer unspezifischen Steigerung der durch SVOAs verursachten Gerinnungsinduktion und somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten. Die retrospektive Analyse einiger Daten im Hinblick auf diese Fragestellung erbrachte zwar Hinweise darauf, dass die Phospholipide für die spezifische Koagulationsinduktion des Fusionsproteins keine große Rolle spielen, jedoch lässt sich dadurch eine Bedeutung im klinischen Versuch nicht ausschließen. Da die vorhandene Menge dieser Mikropartikel von Patient zu Patient unterschiedlich ist, wäre es unter Umständen sinnvoll, diese im Vorfeld von klinischen Studien zu quantifizieren. Aufgrund der geringen Größe der Mikropartikel ist ihr durchflusszytometrischer Nachweis nicht einfach, gelingt jedoch mit einer Impedanz-basierten Methode (Furie 2006). Um den Einfluss des Mikropartikel-Status näher zu untersuchen, sollten diese in Koagulationstests wie unter Kapitel 3.2.1 beschrieben getestet werden. . Grundsätzlich stellt das Konzept der tTF-basierten VTAs eine sehr attraktive Therapie-Strategie dar, da es sich neben dem spezifischen Targeting durch Antikörper oder Peptide auch den prothrombotischen Status, der bei Tumorpatienten nachgewiesen wurde, zu Nutze macht. Dadurch wird eine zusätzliche Selektivität der Therapie erzeugt, die mehr Anwendungssicherheit schafft. 130 Insgesamt rechtfertigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und anderer Arbeitsgruppen weitere Studien an tTF-basierten VTAs. 4.2 Verbesserung der Effektorfunktion durch Molecular Modelling Die theoretische Grundlage für den zweiten Teil der Arbeit bildete die 2001 erschienene Veröffentlichung von Morrissey „Tissue Factor: An Enzyme Cofactor and a True Receptor“ (Morrissey 2001). Zum Einen wurde darin die Wichtigkeit des Membranankers für die volle proteolytische Aktivität des TF beschrieben. Im Wesentlichen gewährleistet dieser aber den Kontakt zu den negativ geladenen Phospholipiden der Zellmembran, wobei es keine Rolle zu spielen scheint, wodurch dieser Kontakt hergestellt wird. Zum Anderen erläuterte Morrissey die Bedeutung der räumlichen Positionierung des aktiven Zentrums von FVIIa im TF/VIIa-Komplex. Aus der Vorstellung heraus, dass bei dem Prototyp des anti-VCAM-tTF der Kontakt des tTF zur Zellmembran und die räumliche Ausrichtung des daran gebundenen FVIIa nicht optimal sein könnten, wurde die Idee entwickelt, das Molekül in seiner Struktur zu verändern. Durch Veränderung der Linkersequenz zwischen dem scFv und dem tTF-Anteil, sollte letzterer die Möglichkeit zur besseren Annäherung an die Zellmembran bekommen und somit auch die Position des anschließend gebundenen FVIIa optimieren. Durch die Verlängerung des tTF mit Aminosäuren der transmembranären Domäne sollte ein besserer Kontakt zu den Phospholipiden der Zellmembran hergestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 73 neue Fusionsproteine generiert und in vitro charakterisiert. Ein wesentliches Problem bei der Arbeit stellten die relativ geringen Protein-Ausbeuten bei der Expression dar. Im Vergleich zu scFv-Antikörpern oder tTF ist das rekombinante tTF-basierte Fusionsprotein erheblich schwieriger zu exprimieren. Die Abschätzung der Protein-Anteile auf den Coomassie-Gelen war aufgrund der geringen Konzentration und Reinheit manchmal sehr schwierig. Es waren daher zahlreiche Wiederholungen der Testreihen notwendig, sowie eine genaue Analyse aller Faktoren, die auf den Gerinnungstest einen Einfluss haben. Wenn auch die Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse suboptimal war, so ergab die Auswertung doch gewisse Trends, die dann im Anschluss durch Herstellung ausgewählter Proteine in größeren Mengen bestätigt werden konnten. In der Zusammenschau der Daten ergab sich die Tendenz, dass Fusionsproteine mit längeren Linkern (19 oder 51 Aminosäuren statt sechs Aminosäuren) und mit leicht verlängertem tTF (insbesondere 222 Aminosäuren, z.T. auch 226 Aminosäuren statt ursprünglich 219 Aminosäuren) eine verbesserte Koagulationsinduktion zeigten. Aus diesen Kandidaten wurde 131 das Protein pLi51-T222 ausgewählt, um es in größerem Maßstab im Vergleich zum Originalkonstrukt zu testen. pLi51-T222 zeigte hierbei reproduzierbar eine verbesserte Koagulationsinduktion. Diese Ergebnisse unterstützen die ursprünglich aufgestellte Hypothese, dass der verlängerte Linker eine bessere Ausrichtung des Moleküls ermöglichen würde und der verlängerte tTF-Anteil die Anlagerung an die Zellmembran verbessern würde. Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, ist es unabdingbar die genaue Molekülstruktur des anti-VCAM-tTF-Konstruktes und seiner Komplexbildung mit Faktor VIIa aufzudecken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch versucht mit dem SWISS-Model die dreidimensionale Molekülstruktur des Fusionsproteins zu evaluieren. Aufgrund nicht vorhandener Homologien gelang dies leider nicht. Als weitere etablierte Methoden stünden hier die Proteinkristallographie oder die kernmagnetische Resonanz zur Verfügung. Da es allerdings für das Verständnis der dreidimensionalen Ausrichtung des Moleküls zur Zellmembran-Oberfläche nicht ausreicht, dieses isoliert zu betrachten, wäre es sinnvoll eine Darstellung zu wählen, die eine Betrachtung des Moleküls auf der Membran erlaubt, wie die Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Da eine therapeutische Gerinnungsinduktion potenziell schwerwiegende Nebenwirkungen, wie Apoplex, Myokardinfarkt oder Organversagen, zur Folge haben könnte, sollten die Mechanismen der Selektivität der Reaktion gut kontrolliert sein. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, die Triggermechanismen für die Gerinnungsinduktion genauer zu beleuchten. Dazu wurden die beiden Hypothesen der Liganden-vermittelten Komplexbildung und der Liganden-vermittelten Konzentrationserhöhung formuliert (siehe Fragestellung, Kap. 1.7.2). Die Ergebnisse zur Untersuchung des Einfluss von Phospholipiden und LPS auf die Koagulationsinduktion durch tTF-Fusionsproteine unterstützen die erstgenannte Hypothese der Ligandenvermittelten Komplexbildung. Dieses Ergebnis ist für einen klinischen Einsatz des Fusionsproteins von Bedeutung, da dieser Reaktionsmechanismus ein geringeres Risiko für unspezifische Nebenwirkungen bietet. Bei den Ergebnissen aus den Experimenten zum Einfluss der Antikörper-vermittelten Membranassoziation (siehe Kap. 3.2.4) sahen wir in der Bindungsphase eine fast vollständige Inhibierbarkeit der Koagulationsinduktion durch den kompetitiven Antikörper MK271. Im Gegensatz dazu ließ sich die Reaktion in der Koagulationsphase nur zu etwa 50 % inhibieren. Hier sollte in weiter führenden Experimenten die Menge des kompetitiven Antikörpers gesteigert werden, um so möglicherweise eine komplette Hemmung der Koagulationsinduktion zu erreichen. Dieses war zum Zeitpunkt des Experimentes aus logistischen Gründen nicht möglich, da die Antikörper-produzierenden Hybridomzellen nur noch geringe Mengen des Antikörpers generierten, was erst nach Abschluss dieser Arbeit durch Subklonierung korrigiert werden konnte. 132 Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch gezielte Modifikationen auf DNA-Ebene und vergleichende Analysen ein anti-VCAM-tTF-Fusionsprotein generiert, welches im Vergleich zum Originalkonstrukt eine verbesserte in-vitro-Koagulationsfähigkeit zeigt. Ob sich diese verbesserte Wirksamkeit in vitro auch in einer Steigerung der Nekroseausbildung im Tumor und in einer vermehrten Verlangsamung des Tumorwachstums widerspiegelt, müssen in-vivo-Studien zeigen. 133 5 Zusammenfassung Die Hemmung der Tumor-Angiogenese und die Zerstörung bzw. Okklusion des bestehenden Gefäßsystems von Tumoren sind interessante therapeutische Strategien bei der Behandlung von Krebserkrankungen. Da hier – im Gegensatz zu den herkömmlichen Chemotherapien - ein anderes Ziel und Wirkungsprinzip verfolgt wird, können solche Ansätze eine sinnvolle Ergänzung der etablierten Therapieformen sein. Im ersten Teil der Arbeit wurde das in der Arbeitsgruppe vorhandene Konstrukt des Prototyps des anti-VCAM-tTF in größeren Mengen rekombinant hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Ziel war es, ein rekombinantes spezifisches Fusionsprotein zu herzustellen, welches selektiv an luminale Tumorendothelzell-Marker bindet und durch den Effektor Tissue Factor die Tumorblutgefäße durch Aktivierung des Gerinnungssystems okkludiert. Neben der biochemischen und funktionellen Charakterisierung in-vitro wurde die klinische Anwendbarkeit in-vivo im Mausmodell getestet. Dabei wurde erstmals eine thrombogen induzierte Nekrose und Verzögerung des Tumorwachstums durch ein rekombinantes tTF-basiertes Fusionsprotein, welches über einen Antikörper an einen luminalen Endothel-Marker wie VCAM-1 bindet, gezeigt. In zwei Tumormodellen - dem L540rec-Hodgkin-Lymphom-Modell und dem Colo677-MyelomModell - induzierte die Behandlung mit dem Fusionsprotein signifikante Tumornekrosen in Kurzzeit-Studien. In den Langzeit-Experimenten mit dem Hodgkin-Lymphom-Modell konnte nach Behandlung mit dem Fusionsprotein plus LPS eine statistisch signifikante Verlangsamung des Tumorwachstums im Vergleich zu den meisten Kontrollen (NaCl und scFv plus LPS) beobachtet werden. In dem Myelom-Modell zeigten nur die Mäuse, die mit Doxorubicin allein oder mit der Kombination aus Doxorubicin und dem Fusionsprotein behandelt wurden, eine signifikante Wachstumsverzögerung des Tumors. Bei einigen Mäusen, die mit dem Fusionsprotein allein, Doxorubicin allein oder mit der Kombination behandelt wurden, konnte eine fast vollständige Rückbildung in einem Teil der Tumoren beobachtet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollte der Prototyp des anti-VCAM-tTF durch Molecular Modelling funktionell verbessert werden. Es wurde die Hypothese getestet, welche annimmt, dass durch eine veränderte Proteinstruktur des Fusionsproteins die Positionierung des tTF-Anteils zur Zellmembran und zu den weiteren am extrinsichen Tenasekomplex beteiligten Gerinnungsfaktoren optimiert werden kann. Insbesondere wurde untersucht, ob eine Veränderung der Linkersequenz zwischen dem scFv und dem tTF-Anteil, sowie eine Verlängerung des tTF mit Aminosäuren der transmembranären Domäne zu verbesserter Koagulationsinduktion führen. 134 Durch gezielte Modifikationen auf DNA-Ebene wurden verschiedene Varianten des anti-VCAMtTF-Prototyps hergestellt und deren Funktionalität im zellgebundenen Koagulationstest miteinander verglichen. Ein Konstrukt mit einem auf 51 Aminosäuren verlängerten Linker und einem auf 222 Aminosäuren verlängerten tTF-Anteil zeigte eine verbesserte spezifische Koagulationsinduktion im Vergleich zum Prototyp. Diese Ergebnisse unterstützen die ursprünglich aufgestellte Hypothese, dass der verlängerte Linker eine bessere Ausrichtung des Moleküls ermöglichen würde und der verlängerte tTF-Anteil die Anlagerung an die Zellmembran verbessern würde. Grundsätzlich stellt das Konzept der tTF-basierten VTAs eine sehr attraktive Therapie-Strategie dar, da es sich neben dem spezifischen Targeting durch Antikörper oder Peptide auch den prothrombotischen Status, der bei Tumorpatienten nachgewiesen wurde, zu Nutze macht. Dadurch wird eine zusätzliche Selektivität der Therapie erzeugt, die mehr Anwendungssicherheit schafft. Insgesamt rechtfertigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und anderer Arbeitsgruppen weitere Studien an tTF-basierten VTAs. 135 6 Literaturverzeichnis 1. 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