Tests auf replikationskompetente Retroviren (RCR

Tests auf replikationskompetente Retroviren (RCR-Assays)
a)
Sarcoma positive, Leukemia negative (S+L-) Assay
Im S+L--Assay werden feline PG-4 Zellen benutzt, um die Anwesenheit von replikationskompetenten Retroviruspartikeln zu detektieren. Die Zellinie PG-4 wurde 1980
am NIH hergestellt durch Transformation von G355 Zellen (Gehirnzellen der Katze )
mit Moloney Murine Sarcoma Virus (M-MSV). PG-4 Zellen enthalten ein MSV
Genom, das in mindestens zwei Funktionen defekt ist. Durch Superinfektion mit z.B.
amphotropen Maus Leukämie Viren können die Defekte komplementiert werden, und
die entstehenden replikationskompetenten Maus-Sarkoma Viren führen zu einer
schnellen Foci-Bildung im Zellrasen. PG-4 Zellen sind für verschiedene amphotrope
C-Retroviren permissiv, können jedoch von ecotropen Maus Leukämieviren nicht
infiziert werden.
Der potentiell mit RCR kontaminierte Zellkulturüberstand wird auf mit DEAE-Dextran
vorbehandelten PG-4 Zellen inkubiert (1 Stunde bei 37oC). Nach vier bis fünf Tagen
werden die Zellen auf Foci-Bildung untersucht. Mit dem S+L--Assay ist es möglich
einen RCR in 105 cfu replikationsdefektiven Vektorpartikeln zu entdecken.
PG-4-Zellen können von der American Type Culture Collection bezogen werden
(ATCC CRL-2032).
b)
Nachweis von replikationskompetenten Retroviren (Sekundär-Infektanten)
unter G418-Selektion
Falls ein neo-Resistenzgen Bestandteil des verwendeten retroviralen Vektors ist (z.B.
Vektorplasmid BAG lacZ neo), so kann die Bildung von replikationskompetenten
Retroviruspartikeln durch Kultivieren der fraglichen Zellen unter NeomycinSelektionsdruck detektiert werden. Sollte es zur Bildung von replikationskompetenten
Retroviren im Rahmen der Primär-Infektion kommen, so würden diese Viren in den
Überstand der Zellkultur abgegeben. Nach Übertragung des Kulturüberstandes auf
neue Zellen würden diese ebenfalls infiziert werden (Sekundär-Infektion). Die
Ausbildung von Zellklonen unter der Selektion mit G418 wäre dann ein Hinweis auf
Übertragung des Selektionsmarkers durch vorhandene replikationskompetente
Retroviren.